ES2984002T3 - Secuenciación de ácido nucleico con sensores de nanoporos híbridos - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para secuenciar ácidos nucleicos, que comprende: (a) proporcionar un aparato de detección que comprende: (i) un soporte sólido que comprende una matriz de nanoporos de estado sólido, en donde los nanoporos de estado sólido forman aberturas entre depósitos que están separados por el soporte sólido; (ii) una pluralidad de nanodiscos lipídicos en la superficie del soporte sólido, en donde cada uno de los nanodiscos lipídicos forma un sello en cada uno de los nanoporos de estado sólido, y en donde los nanodiscos lipídicos están separados entre sí por regiones intersticiales en la superficie del soporte sólido; y (iii) una pluralidad de nanoporos de proteína insertados en los nanodiscos lipídicos para crear aberturas en cada uno de los sellos; y (b) detectar el paso, a través de las aberturas en cada uno de los sellos, de (i) un ácido nucleico, (ii) una serie de nucleótidos eliminados del ácido nucleico, o (iii) una serie de sondas derivadas de nucleótidos incorporados en el ácido nucleico, determinando de ese modo la secuencia del ácido nucleico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Secuenciación de ácido nucleico con sensores de nanoporos híbridos

Antecedentes

Los dispositivos de nanoporos de proteína se han explorado para muchas aplicaciones de sensor, especialmente en el campo de la secuenciación de ADN/ARN. Se ha demostrado la discriminación de las bases de nucleótidos al leer la señal de la corriente iónica cuando la molécula de ADN pasa a través del nanoporo. A partir de estas observaciones iniciales, se ha postulado que los dispositivos de nanoporos basados en proteínas tienen un gran potencial para impulsar la tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos en términos de menor precio, rapidez de entrega y mayor longitud de lectura.

Una tecnología más madura, la secuenciación por síntesis (SBS, por sus siglas en inglés), ha progresado rápidamente en los últimos cinco años, duplicando el rendimiento aproximadamente cada seis meses, superando con creces la ley de Moore para la industria de los semiconductores. Este rápido progreso ha sido posible principalmente gracias a tres mejoras clave en los protocolos de SBS: (1) mejora en la química de secuenciación cíclica; (2) aumento en la densidad de las colonias de ácidos nucleicos en las superficies; y (3) mejora en la tecnología de formación de imágenes y escaneo. Estas tres mejoras tecnológicas han aumentado el rendimiento de los sistemas comerciales de aproximadamente 1 Gb por ejecución en enero de 2007 a más de 1 Tb por ejecución en junio de 2012. Sin embargo, estos avances tecnológicos no han demostrado ser directamente transferibles a tecnologías de nanoporos.

A pesar de este rápido progreso en la mejora de la SBS, los precios del genoma con cobertura de 30X son aún superiores a los 1000 dólares/genoma, con tiempos de respuesta superiores a una semana. Por otra parte, el ensamblaje de novo y la inferencia de haplotipos de genomas humanos obtenidos mediante SBS se enfrentan al reto de las lecturas cortas. La secuenciación de cadena a través de nanoporos puede leer hasta 50.000 bases en unos pocos minutos. Hasta la fecha, esta plataforma de una sola molécula parece alcanzar velocidad, pero a expensas de una paralelización muy reducida.

La paralelización de los nanoporos biológicos es notoriamente difícil. La fragilidad de la plataforma en sí, especialmente la naturaleza semifluida de la bicapa lipídica, que exige un manejo especializado, frecuentemente por parte de técnicos altamente capacitados, hace que los sistemas de nanoporos sean menos prácticos para una comercialización a gran escala. La técnica actual para el ensamblaje de dispositivos de nanoporos de proteína es principalmente manual, laboriosa y requiere mucho tiempo. Después de recubrir con una bicapa lipídica un sustrato que tiene una matriz con aberturas de tamaño micrométrico, el operador pone en contacto la matriz recubierta con una solución que tiene una cantidad de proteína cuidadosamente titulada. La cantidad de nanoporos se selecciona según las estadísticas de Poisson para maximizar el número de aberturas que adquieren un nanoporo y, al mismo tiempo, minimizar el número de aberturas que se cargan con más de un nanoporo. Una vez transcurrido un período de incubación específico, la solución que contiene nanoporos se elimina por lavado. La carga de Poisson requiere que el período de tiempo se seleccione cuidadosamente para lograr el mayor número posible de aberturas que tengan un solo nanoporo. Los resultados dependen en gran medida de la habilidad del operador y no se adaptan fácilmente a la fabricación de dispositivos a gran escala.

Por lo tanto, un desafío importante para la tecnología de nanoporos es aumentar la robustez de la plataforma y, al mismo tiempo, mejorar la paralelización, por ejemplo, en aplicaciones de secuenciación. La presente descripción aborda esta necesidad y también proporciona otras ventajas.

El documento US-2006/231419A1 describe un dispositivo de nanoporos, comprendiendo el nanoporo un primer y un segundo electrodos perimetrales separados por un elemento aislante y un canal biopolimérico colocado en dicho nanoporo. El documento US-2008/254995A1 describe un sustrato en estado sólido con nanoporos en su interior, métodos de fabricación de poros a nanoescala en el sustrato en estado sólido, métodos para funcionalizar nanoporos en el sustrato en estado sólido y métodos de secuenciación. El documento US-2012/055792A1 describe los nanoporos de Msp y los usos de los mismos. Bayburt y col., 2002, Nano Letters 2 (8) 853-856, describe bicapas lipídicas con proteínas estructurales de membrana.

Breve resumen

La presente invención proporciona un método para secuenciar un ácido nucleico diana, siendo el método el reivindicado en la reivindicación 1.

Los detalles de una o más realizaciones se exponen en los dibujos adjuntos y la siguiente descripción. Otras características, objetos y ventajas serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos y a partir de las reivindicaciones.

En la presente memoria se describe un nanoporo híbrido que consiste en un nanoporo de proteína insertado en un nanoporo en estado sólido. El nanoporo híbrido se crea con nanoporos de proteína insertados en nanodiscos de lípido, que se incluyen en última instancia. Según los métodos descritos en la presente memoria, los nanodiscos de lípido que contienen nanoporos pueden autoensamblarse.

Un nanoporo de proteína puede autoensamblarse inicialmente dentro de un nanodisco de lípido en solución libre, como se muestra en lafigura 1A; a continuación, el nanoporo de proteína se injerta con un ácido nucleico como se muestra en lafigura 1B; a continuación se usa la fuerza electroforética para conducir la cadena de ácido nucleico a través del nanoporo en estado sólido hasta que el nanodisco que contiene nanoporos de proteína entre en contacto con la superficie de nanoporo en estado sólido, como se muestra en lafigura 1C.

Las ventajas no limitantes del esquema de ensamblaje de nanoporos asistido por nanodiscos de lípido de la presente descripción, en comparación con las tecnologías típicas de fabricación de nanoporos que se basan en una membrana de lípido suspendida, incluyen, por ejemplo:

(1) estabilidad estructural: el nanoporo de proteína se inserta en una membrana híbrida y el nanoporo sólido sostiene la mayor parte de la membrana y proporciona una abertura de tamaño nanométrico.

(2) Fabricación escalable: la naturaleza de las interacciones entre el nanodisco de lípido que contiene nanoporos de proteína y el nanoporo en estado sólido es autolimitada, por lo que la fabricación es mucho menos inconstante que los métodos de ensamblaje que se basan en la carga de Poisson de nanoporos en aberturas en estado sólido. La inserción de un único nanoporo de proteína en la bicapa se puede lograr durante la reconstitución en un nanodisco de lípido. El tamaño del nanodisco de lípido (p. ej., de 10 a 13 nm en algunas realizaciones) se puede seleccionar para favorecer la incorporación de un solo nanoporo de proteína (p. ej., un poro de Msp de ~5 nm). Además, el tamaño del nanoporo en estado sólido (p. ej., una abertura de 7-10 nm de diámetro en algunas realizaciones) se puede seleccionar para permitir el ensamblaje de solo un complejo de proteína-nanodisco por cada abertura de nanoporo en estado sólido. Por lo tanto, en muchas realizaciones, no hay necesidad de una monitorización activa de las características eléctricas durante el ensamblaje y la detección de múltiples inserciones.

(3) Mejor aislamiento eléctrico: la inserción directa de un nanoporo de proteína en un nanoporo en estado sólido típicamente requiere una correspondencia detallada de tamaño y forma entre los dos nanoporos para lograr un aislamiento adecuado de la corriente iónica. En los métodos actualmente descritos, el nanodisco de lípido puede seleccionarse simplemente para que sea más grande que la entrada del nanoporo en estado sólido. La fuga de corriente se puede prevenir mediante una amplio rango de tamaños de nanodisco por encima de un valor mínimo, de modo que evitar la fuga de corriente ya no requerirá una correspondencia detallada de la forma entre los nanoporos de proteína y en estado sólido.

(4) Requisitos de fabricación relajados para los nanoporos en estado sólido: los nanoporos en estado sólido con un diámetro de poro superior a 5 nm pueden formar nanoporos híbridos funcionales con nanodiscos de lípido que contienen nanoporos de proteína. Este tamaño característico se puede lograr fácilmente con la tecnología de semiconductores de última generación, mientras que la fabricación de poros de vanguardia, necesaria para crear nanoporos en estado sólido con diámetros en el rango de 2 a 3 nm requerido para la inserción directa de nanoporos de proteína, es muy variable, costosa y depende en gran medida de la habilidad del operador.

(5) Permite una paralelización masiva: la eliminación de las membranas lipídicas del tamaño de un micrómetro puede permitir que una plataforma de nanoporos en estado sólido alcance un alto grado de paralelización mediante la integración con amplificadores integrados en chip y circuitos de adquisición de datos. Amplificadores, circuitos y otro hardware ilustrativos útiles para la adquisición de datos se describen en la patente estadounidense n.° 8.673.550 o 8.999.716; Rosenstein y col., Nano Lett 13,2682-2686 (2013); o Uddin y col., Nanotechnology 24, 155501 (2013).

(6) Menor ruido intrínseco: los nanoporos en estado sólido típicamente requieren una humectación adecuada para una transconductancia estable. Dado que el nanoporo en estado sólido solo se utiliza como soporte mecánico en las realizaciones particulares del sistema descrito en la presente memoria, se espera que esas realizaciones muestren un ruido menor que un nanoporo en estado sólido independiente.

Las técnicas existentes para la secuenciación de ácido nucleico con nanoporos, especialmente los nanoporos biológicos en bicapas lipídicas, logran una alta velocidad y longitud de lectura a costa de una reducción considerable de la paralelización y el rendimiento de datos. La fragilidad de las plataformas existentes también las hace menos prácticas para la comercialización. Las composiciones y métodos de la presente descripción pueden superar estas limitaciones al establecer una estructura híbrida biológica-en estado sólido que se puede autoensamblar de una manera robusta y automatizada con alta eficiencia.

Como se describe con más detalle en la presente memoria, los portadores de canales biológicos basados en lípidos pueden ensamblarse en nanoporos en estado sólido que tienen diámetros superiores a 10 nm. Los métodos descritos en la presente memoria pueden usarse para la inserción de proteínas de nanoporos en nanodiscos de lípido, el ensamblaje autolimitado de los nanodiscos de nanoporos de proteína con nanoporos en estado sólido y las aplicaciones analíticas de la plataforma híbrida, tales como la detección y secuenciación de ácidos nucleicos. La plataforma resultante se puede configurar para proporcionar las características de velocidad y longitud de lectura de los sistemas de secuenciación de ácido nucleico basados en nanoporos de proteína, proporcionando al mismo tiempo una mayor paralelización y estabilidad del sistema, que se puede lograr utilizando tecnologías de semiconductores establecidas.

Breve descripción de los dibujos

Lafigura 1Amuestra una representación esquemática de un nanoporo de proteína que inicialmente se autoensambla dentro de un nanodisco de lípido en solución libre; lafigura 1Bmuestra el nanoporo de proteína injertado con un ácido nucleico; lafigura 1Cmuestra el ensamblaje del nanodisco que contiene un nanoporo de proteína con el nanoporo en estado sólido, debido a que la cadena de ácido nucleico se conduce a través del nanoporo en estado sólido hasta que los lípidos de nanodisco entran en contacto con la superficie en estado sólido.

Lafigura 2Amuestra una representación esquemática de un nanoporo en estado sólido de 7-10 nm ensamblado con un nanodisco de lípido que, a su vez, tiene un nanoporo de proteína insertado en la membrana de lípido, en donde se injerta un ácido nucleico en el nanoporo de proteína; lafigura 2Bmuestra una representación esquemática de un nanodisco de lípido de 10-13 nm (gris claro) limitado por una proteína estructural (anillo oscuro).

Lafigura 3muestra una representación esquemática de un proceso para la formación de nanodiscos de lípido.

Lafigura 4muestra una representación esquemática de una técnica de carga de nanodiscos de lípido en la que se añade proteína etiquetada con His (p. ej., se puede usar una porina en lugar de CYP3A4) a la mezcla inicial, y se usa una columna quelante de metal para separar los discos cargados con proteína de los discos en blanco.

Lafigura 5muestra fracciones de la expresión, reconstitución y purificación de MspA etiquetada con His cargada en un gel de poliacrilamida. Carril M, escaleras de proteínas; Carril S, fracción soluble de lisado celular; Carril F, flujo procedente de la columna de centrifugación de Ni-NTA; Carril W, primera fracción de lavado; Carril E, elución de MspA etiquetada con His.

Lafigura 6Amuestra un diseño de dispositivo de ensayo de nanoporos en estado sólido y lafigura 6Bmuestra una implementación del diseño. Se inserta un chip de nanoporo («chip de Si») en la ubicación indicada y se sella en su lugar mediante una junta de caucho con junta tórica. Los electrodos de Ag/AgCl en los lados cis y trans del poro proporcionan la fuente de corriente. La corriente se mide con un amplificador Axopatch 200B.

Lafigura 7muestra la medición de la translocación de bioporos de un ADN de 91 meros translocado a través de un bioporo de MspA insertado en una membrana suspendida. El eje vertical está normalizado a la corriente de estado abierto del poro.

Lafigura 8muestra una reacción en la que un nanodisco de lípido se incuba con ADN de colesterol-TEG para producir un anclaje de ADN en el nanodisco. El anclaje de ADN se puede usar para tirar electroforéticamente del nanodisco de lípido sobre un nanoporo en estado sólido.

Lafigura 9muestra un método para mejorar el acoplamiento entre un nanodisco de lípido y un nanoporo en estado sólido. La superficie de Si3N4 del soporte sólido se trata primero con un organosilano, seguido de un derivado de colesterol.

Lafigura 10muestra los resultados de la optimización de un protocolo para insertar MspA en un nanodisco de lípido.

Lafigura 11Amuestra una imagen TEM de la fracción de elución de alto peso molecular de la traza central de lafigura 10.

Lafigura 11Bmuestra una imagen TEM de la fracción de elución de bajo peso molecular de la traza media de lafigura 10. Los sitios de inserción de MspA se indican con flechas.

Descripción detallada

El método de la presente invención usa un sistema de nanoporos híbridos basado en un nanoporo en estado sólido sellado por un nanodisco de lípido embebido en poros de proteína. En lafigura 2se ilustra una ilustración conceptual de una realización particular.

Las plataformas actuales de secuenciación de cadenas por nanoporos se basan en la libre difusión e inserción de un nanoporo de proteína (también denominado en la presente memoria «poro biológico» o «bioporo») en una bicapa lipídica suspendida de tamaño micrométrico. Se han desarrollado varios métodos para detectar eventos de inserción individuales, ya sea monitorizando la corriente iónica o la impedancia de corriente alterna. Estos enfoques se basan en circuitos y programas de monitorización adicionales que pueden ampliar el espacio ocupado del dispositivo y aumentar la complejidad del sistema. La bicapa lipídica de tamaño micrométrico es susceptible a la vibración mecánica, lo que añade complejidad a la fabricación, el envío, el almacenamiento y la operación de los dispositivos. Alternativamente, los nanoporos en estado sólido con tamaños superiores a 10 nm son robustos y compatibles tanto con la fabricación como con el funcionamiento de alto rendimiento, lo que proporciona una plataforma útil para la tecnología de nanoporos. Como tal, la presente invención utiliza nanoporos en estado sólido como una plataforma para ensamblar nanoporos de proteína individuales con un nanodisco de lípido como sello del borde del nanoporo en estado sólido.

Algunas realizaciones particulares emplean la inserción de un nanoporo de proteína en un portador de nanodisco de lípido y aplican fuerza electroforética, posiblemente con un anclaje de ADN, para guiar el complejo proteína/lípido hasta el nanoporo en estado sólido. Un nanodisco de lípido puede ser, por ejemplo, un disco de bicapa lipídica de 7 a 13 nm de diámetro que, según la presente invención, se estabiliza mediante la proteína estructural de membrana (MSP), un derivado de la ApoA-I. Se entenderá que un nanodisco puede tener un diámetro inferior a 7 nm (p. ej., inferior a 6 nm, 5 nm, 4 nm, 2 nm o menos de diámetro) o superior a 13 nm (p. ej., superior a 15 nm, 20 nm o 25 nm o más de diámetro). Típicamente, el área del disco de lípido usada en un método o composición descrito en la presente memoria no es superior a aproximadamente 50.000 nm2 o, en algunos casos, no superior a aproximadamente 10.000 nm2 o, a veces, no superior a aproximadamente 1000 nm2 o incluso otras veces no superior a aproximadamente 500 nm2.

Como se ilustra en lafigura 2B, los nanodiscos de lípido están compuestos por una bicapa de moléculas de lípido rodeadas por dos MSP paralelas en forma de cinturón en las que las hélices anfipáticas de las MSP estabilizan el ácido graso hidrófobo en el borde del disco de lípido. Los nanodiscos de lípido y las composiciones y métodos particularmente útiles para su fabricación se describen, por ejemplo, en Nath y col., Biochemistry 46, 2059-2069 (2007).

Los nanodiscos de lípido se pueden preparar mezclando MSP con fosfolípidos estabilizados con detergente. El autoensamblaje de los nanodiscos se produce durante la eliminación del detergente de la mezcla, como se indica a continuación. Se ha demostrado que la presencia de MSP limita la forma y el tamaño del nanodisco de lípido y proporciona una distribución de tamaño estrecha (± 3 %), una excelente reproducibilidad y una estabilidad excepcional en una solución acuosa sin detergente. La relación de MSP a detergente se puede seleccionar para lograr el tamaño y las características deseados de los nanodiscos. Por ejemplo, el número de unidades estructurales de la MSP puede variarse para permitir que el diámetro del nanodisco se ajuste de 9,8 nm a 12,9 nm, tal como se describe en Denisov y col.., J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004). Estos diámetros se adaptan bien a los nanoporos en estado sólido que se pueden fabricar de forma fiable con los métodos disponibles en el mercado. Los nanodiscos pueden ser un portador eficaz para incorporar proteínas de membrana. Se han integrado varias proteínas de membrana en nanodiscos, tal como el citocromo, las proteínas de siete segmentos transmembrana, los quimiorreceptores bacterianos y la proteína del canal aniónico dependiente del voltaje mitocondrial humano. Los métodos ilustrativos para incorporar proteínas de membrana en nanodiscos se describen en Raschle y col., J. Am. Chem. Soc. 131,17777 17779 (2009). Se pueden utilizar métodos similares para insertar nanoporos de proteína, tales como a-hemolisina, MspA, citolisina y otros, en los nanodiscos de lípido. Otros ejemplos de nanoporos de proteína útiles se describen en el documento u S-8.673.550.

El acoplamiento entre el nanodisco de lípido y el nanoporo en estado sólido se puede facilitar mediante la ingeniería química de la interfaz lípido/sólido. Por ejemplo, la superficie sólida se puede funcionalizar con cianopropilsilano, colesterol, polimerización RAFT u otros materiales que se unen o se adhieren a los lípidos y/o MSP. Los materiales y métodos ilustrativos para la funcionalización de las superficies se describen en White y col., JaM Chem Soc 129, 11766-11775 (2007) y Kwok y col., PLOS One DOI: 10.1371/journal.pone.0092880 (2014). Similarmente, el nanodisco de lípido (MSP o lípido) puede diseñarse para que contenga moléculas de acoplamiento o adaptadoras que permitan el acoplamiento con la funcionalización en la superficie del nanoporo en estado sólido. Dicha ingeniería puede proporcionar un aislamiento superior a 100 GS2 entre el nanodisco de lípido y el nanoporo en estado sólido. Estos niveles de aislamiento pueden facilitar altos niveles de discriminación de bases para aplicaciones de translocación y secuenciación de ácido nucleico.

En realizaciones particulares, el proceso para la formación de nanodiscos de lípido puede llevarse a cabo como se ilustra en lafigura 3y se detalla aún más en Baas «Characterization of monomeric human cytochrome P4503A4 and Cytochrome P450 Reductase in nanoscale phospholipid bilayer discs», Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, U.S.A. (2006), ISBN 0542987236, 9780542987236A. Como se muestra en la figura, la proteína estructural de membrana se puede autoensamblar con fosfolípidos solubilizados en detergente para formar nanodiscos. El autoensamblaje se produce cuando se retira el detergente, por ejemplo, utilizando Bio-Beads® (Bio-Rad, Hercules CA). El producto de la reacción de ensamblaje se puede purificar después con cromatografía de exclusión por tamaño. La optimización de la relación lípido/proteína da como resultado nanodiscos monodispersos con un tamaño determinado por la longitud de la proteína estructural de membrana.

La inserción de proteínas únicas e incluso múltiples en los nanodiscos se puede lograr mediante una etapa de purificación adicional que utilice una matriz de afinidad a base de níquel para unir específicamente una etiqueta de afinidad de polihistidina en la proteína de nanoporo, por ejemplo, utilizando métodos similares a los demostrados en Baas «Characterization of monomeric human cytochrome P450 3A4 and Cytochrome P450 Reductase in nanoscale phospholipid bilayer discs», Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, U.S.A. (2006), ISBN 0542987236, 9780542987236A. En lafigura 4se muestra una representación esquemática de un método útil para la separación basada en afinidad de nanodiscos que llevan bioporos.

La mutagénesis de poros biológicos se puede usar para optimizar los poros de proteínas para el ensamblaje o uso en una composición o método descrito en la presente memoria. Como se describió anteriormente, el proceso de incorporación de un canal de proteína en el nanodisco puede beneficiarse de una etiqueta de afinidad de polihistidina en la proteína y de la purificación de la población mixta de nanodiscos a través de una columna de afinidad de Ni. Las técnicas de ingeniería y mutagénesis de proteínas se pueden utilizar para mutar los poros biológicos y adaptar sus propiedades a aplicaciones específicas. La MspA con una etiqueta de 6xHis en el extremo C puede expresarse, reconstituirse y purificarse como lo demuestra el gel de SDS-PAGE que se muestra en lafigura 5(Carril M, escaleras de proteínas; Carril S, fracción soluble del lisado de células que expresan MspA etiquetada con His; Carril F, flujo procedente de la columna de centrifugación de Ni-NTA; Carril W, primera fracción de lavado de la columna de centrifugación de Ni-NTA; Carril E, elución de MspA etiquetada con His de la columna de espín de Ni-NTA). Se descubrió que la funcionalidad biológica de la MspA purificada etiquetada con His era similar a la de una MspA no etiquetada. También se pueden introducir otras mutaciones con fines de purificación. Por ejemplo, se puede introducir un resto de cisteína en la secuencia de proteína mediante mutagénesis y usarse para la conjugación química con restos reactivos con tiol (p. ej., maleimidas o yodoacetamidas) de etiquetas de afinidad. Las etiquetas de afinidad ilustrativas incluyen biotina (que puede mediar en la purificación mediante estreptavidina en fase sólida), ADN y ARN (que pueden mediar en la purificación mediante ácidos nucleicos en fase sólida que tienen secuencias complementarias), epítopos (que pueden mediar en la purificación mediante anticuerpos en fase sólida o fragmentos de anticuerpos) u otros ligandos (que pueden mediar en la purificación mediante receptores en fase sólida para esos ligandos).

Las etiquetas de afinidad (p. ej., las etiquetas His y otras descritas en la presente memoria) y las técnicas de conjugación química (p. ej., las modificaciones de las cisteínas descritas anteriormente) se pueden usar para unir los anclajes a los nanoporos para usar en una variedad de métodos, composiciones o aparatos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, los anclajes resultantes se pueden usar para atraer o unir un nanodisco que contiene nanoporo en o cerca de un nanoporo en estado sólido. Los anclajes también se pueden usar para unir un nanoporo a un electrodo u otro soporte en fase sólida.

En lafigura 6se muestra un sistema ilustrativo. En este ejemplo, el nanoporo en estado sólido se inserta en la ubicación indicada y se sella en su lugar mediante una junta tórica. Los electrodos de Ag/AgCl estándar en los lados cis y trans del poro proporcionan la fuente de corriente. Los datos del nanoporo se pueden adquirir con un amplificador Axopatch 200B. Los datos preliminares de una membrana sólida de SiN autoportante (sin nanoporos) han demostrado una resistencia superior a 100 GQ, lo que indica una celda de flujo herméticamente sellada (corriente de fuga inferior a 0,9 pA con una polarización de 200 mV). Este tipo de configuración es coherente con las configuraciones «estándar» bien establecidas que se utilizan para evaluar las capacidades analíticas en la técnica de los nanoporos. Los datos representativos de un ADN de 91 nucleótidos que se translocó a través de un nanoporo biológico en modo de desplazamiento de cadena se muestran en lafigura 7.

El aparato de detección puede incluir además electrodos embebidos en el soporte sólido. Los electrodos se pueden usar para monitorizar el ensamblaje de nanodiscos y/o nanoporos de proteína en los nanoporos en estado sólido. Los electrodos también se pueden usar para la recopilación de datos durante las etapas de detección de analitos. Los electrodos utilizados para la monitorización y la detección no necesitan embeberse en el soporte sólido y, en su lugar, pueden proporcionarse en un chip de circuito integrado de aplicación específica (ASIC, por sus siglas en inglés) separado, por ejemplo.

Como se utiliza en la presente memoria, el término «cada uno», cuando se utiliza en referencia a una colección de artículos, pretende identificar un artículo individual en la colección, pero no se refiere necesariamente a cada artículo de la colección. Puede haber excepciones si la descripción explícita o el contexto claramente dictan lo contrario.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “soporte sólido” se refiere a un sustrato rígido que es insoluble en líquido acuoso y es incapaz de dejar pasar un líquido sin una abertura. Los soportes sólidos ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (que incluyen, acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon™, olefinas cíclicas, poliimidas, etc.), nailon, cerámicas, resinas, Zeonor, sílice o materiales basados en sílice que incluyen silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, haces de fibras ópticas y polímeros. Los soportes sólidos particularmente útiles comprenden silicio modificado, tal como membranas de SiN sobre un sustrato de Si. En algunos casos, los soportes sólidos se encuentran dentro de un aparato de celda de flujo u otro recipiente.

Como se utiliza en la presente memoria, el término «nanoporo en estado sólido» se refiere a un orificio que pasa a través de un soporte sólido para permitir el paso de un líquido o gas. Un nanoporo en estado sólido generalmente tendrá un lumen o abertura de entre aproximadamente 1 nm y 1 pm de diámetro. Sin embargo, son posibles diámetros más grandes o más pequeños. Un nanoporo en estado sólido generalmente está hecho de materiales de origen no biológico. Un poro en estado sólido puede ser de materiales inorgánicos u orgánicos. Los poros en estado sólido incluyen, por ejemplo, poros de nitruro de silicio, poros de dióxido de silicio y poros de grafeno.

Como se utiliza en la presente memoria, el término «nanodisco de lípido» se refiere a una lámina bicapa de lípido que ocupa un área entre aproximadamente 3 nm2 y 3 pm2. Por ejemplo, el área ocupada puede ser de al menos aproximadamente 5 nm2, 10 nm2, 50 nm2, 100 nm2, 1000 nm2, 10.000 nm2, 100.000 nm2 o más. Alternativa o adicionalmente, el área ocupada puede ser como máximo de aproximadamente 100.000 nm2, 10.000 nm2, 1000 nm2, 100 nm2, 50 nm2, 10 nm2, 5 nm2 o menos. Un nanodisco de lípido puede, pero no necesariamente, ocupar un área circular. El área circular ocupada por un nanodisco puede tener un diámetro de entre aproximadamente 1 nm y 1 pm. Sin embargo, son posibles áreas o diámetros más grandes o más pequeños. Un nanodisco de lípido puede, pero no necesariamente, ser plano. En condiciones particulares, un nanodisco de lípido se puede distinguir de una vesícula o liposoma debido a la ausencia de un lumen acuoso para el nanodisco y se puede distinguir de una micela debido a la presencia de una bicapa en el nanodisco. En la presente memoria se ilustran varias realizaciones usando nanodiscos de lípido. Se entenderá que un nanodisco también puede fabricarse a partir de otros materiales. Por ejemplo, se puede formar un nanodisco a partir de una membrana no lipídica tal como las que se describen a continuación.

Como se utiliza en la presente memoria, el término «membrana» se refiere a una lámina u otra barrera que impide el paso de corriente eléctrica o fluidos. La membrana es típicamente flexible o compresible en contraste con los soportes sólidos descritos en la presente memoria. La membrana puede estar hecha de material lipídico, por ejemplo, para formar una bicapa lipídica, o la membrana puede estar hecha de material no lipídico. La membrana puede estar en forma de una membrana de copolímero, por ejemplo, formada por polímeros dibloque o polímeros tribloque, o en forma de una monocapa, por ejemplo, formada por un bolalípido. Ver, por ejemplo, Rakhmatullina y col., Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids 24:6254-6261 (2008).

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "región intersticial" se refiere a un área en un sustrato o en una superficie que separa otras áreas del sustrato o superficie. Una región intersticial separa un nanoporo de una matriz de otro nanoporo de la matriz. Las dos regiones que se separan entre sí pueden ser discretas, sin contacto entre sí. En muchas realizaciones, la región intersticial es continua mientras que las características son discretas, por ejemplo, como es el caso de una pluralidad de poros o aberturas en una superficie de otro modo continua. Según la presente invención, el material lipídico no está presente en las regiones intersticiales.

Las regiones intersticiales pueden separar los nanodiscos de lípido en al menos 1 nm, 5 nm, 10 nm, 100 nm, 1000 nm o más en un aparato descrito en la presente memoria. Alternativa o adicionalmente, la separación puede ser de no más de 1000 nm, 100 nm, 50 nm, 10 nm o 5 nm.

Como se utiliza en la presente memoria, el término «nanoporo de proteína» se refiere a un polipéptido, formado como una o más subunidades, para crear una abertura a través de una membrana o soporte sólido. Los nanoporos de proteína ilustrativos incluyen a-hemolisina, porina A de Mycobacterium smegmatis, gramicidina A, maltocorina, OmpF, OmpC, PhoE, Tsx, F-pilus, SP1 (Wang y col., Chem. Commun., 49:1741-1743, 2013) y porina mitocondrial (VDAC)Xx , Tom40, (patente estadounidense n.° 6.015.714 y Derrington y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107:16060 (2010)). "La porina A de Mycobacterium smegmatis (MspA)" es una porina de membrana producida por micobacterias, que permite que las moléculas hidrófilas entren en la bacteria. MspA forma un octámero estrechamente interconectado y el barril beta transmembrana que se asemeja a una copa y contiene un canal/poro central. Otros poros útiles se describen en el documento US-8.673.550.

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "nanoporo híbrido" pretende significar una abertura que está hecha de materiales tanto de origen biológico como no biológico, que se extienden a través de una barrera tal como una membrana, por ejemplo, que permite que los iones hidratados y/o moléculas hidrosolubles crucen desde un lado de la barrera al otro lado de la barrera. Los materiales de origen biológico se han definido anteriormente e incluyen, por ejemplo, polipéptido y polinucleótido. Un poro híbrido biológico y en estado sólido incluye, por ejemplo, un poro híbrido polipéptido-en estado sólido y un poro polinucleótido-en estado sólido.

Como se utiliza en la presente memoria, el término «anclado» pretende referirse al estado en el que dos elementos se unen a través de un resto conector. La unión puede ser covalente, por ejemplo, de modo que una cadena ininterrumpida de enlaces covalentes una los dos elementos. Alternativamente, la unión puede estar mediada por al menos un enlace no covalente, tal como una interacción de unión específica entre un receptor y un ligando. Los pares receptor-ligando ilustrativos incluyen, sin limitación, estreptavidina (y análogos de la misma) y biotina (o análogos de la misma); anticuerpo (o fragmentos funcionales del mismo) y epítopos; lectinas e hidratos de carbono; ácidos nucleicos complementarios, proteínas de unión a ácidos nucleicos y sus sustratos de ácidos nucleicos.

Un «anclaje» es un resto conector que se puede usar opcionalmente para unir dos elementos. En algunas configuraciones, un anclaje se une a un solo elemento, tal como un nanoporo, un lípido, un material de membrana o un soporte sólido. Un anclaje que se une a un artículo puede, opcionalmente, unirse a un segundo artículo o usarse para otros fines. Un anclaje puede incluir nucleótidos o material de ácido nucleico. Alternativamente, un anclaje puede estar hecho de un material que no sea un material de ácido nucleico o puede estar desprovisto de nucleótidos.

Un aparato de detección para usar en la invención incluye nanoporos en estado sólido que forman aberturas entre los depósitos que están separados por el soporte sólido.

Un sello que se forma sobre un nanoporo en estado sólido puede impedir el flujo de fluidos y/o el flujo de corriente eléctrica. Sin embargo, un nanoporo de proteína forma una abertura en el sello.

Un nanoporo de proteína puede ocupar un área en la superficie de un nanodisco de lípido que tiene al menos aproximadamente 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm o más de diámetro. Alternativa o adicionalmente, un nanoporo de proteína puede ocupar un área en la superficie de un nanodisco de lípido que es como máximo de aproximadamente 1 micrómetro, 500 nm, 100 nm, 10 nm, 9 nm, 8 nm, 7 nm, 6 nm, 5, nm o menos.

En realizaciones particulares, un aparato de detección puede incluir al menos 10, 100, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106 0 más nanoporos en estado sólido.

En realizaciones particulares, un aparato de detección puede incluir nanodiscos de lípido que cubran al menos 10, 100, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106 o más nanoporos en estado sólido. Independientemente del número total de nanoporos en estado sólido, los nanodiscos de lípido pueden cubrir al menos el 10 %, el 25 %, el 50 %, el 75 %, el 90 %, el 95 %, el 99 % o más de los nanoporos en estado sólido de un aparato de detección. En consecuencia, un aparato de detección puede incluir al menos 10, 100, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106 o más nanodiscos.

En realizaciones particulares, un aparato de detección puede incluir nanoporos de proteína en los nanodiscos de lípido que cubren al menos 10, 100, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106 o más nanoporos en estado sólido. Independientemente del número total de nanoporos en estado sólido, los nanoporos de proteína se pueden insertar en nanodiscos de lípido que cubran al menos el 10 %, el 25 %, el 50 %, el 75 %, el 90 %, el 95 %, el 99 % o más de los nanoporos en estado sólido de un aparato de detección. En consecuencia, un aparato de detección puede incluir al menos 10, 100, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106 o más nanodiscos con nanoporos insertados.

En realizaciones particulares, un aparato de detección puede incluir un depósito cis en contacto con la matriz de nanoporos en estado sólido y un depósito trans en contacto con la matriz de nanoporos en estado sólido. Los depósitos cis y trans pueden contener electrodos ubicados para aplicar una corriente a través de las aberturas formadas por los nanoporos de proteína. Un depósito cis, un depósito trans o ambos pueden configurarse para mantener un líquido en comunicación fluida a granel con una pluralidad de nanoporos en un aparato descrito en la presente memoria. Alternativamente, uno o ambos depósitos pueden estar en contacto con solo uno o solo un subconjunto de los nanoporos que se encuentran en una matriz o aparato descrito en la presente memoria.

En casos particulares, cada uno de los nanodiscos de lípido que cubre un nanoporo en estado sólido de una matriz descrita en la presente memoria no tendrá más de un nanoporo de proteína insertado en el mismo. Sin embargo, también es posible fabricar y usar un aparato que tenga más de un nanoporo de proteína insertado por nanoporo en estado sólido. Similarmente, los nanodiscos individuales, cubran o no un nanoporo en estado sólido, pueden incluir no más de un nanoporo de proteína. Alternativamente, los nanodiscos individuales pueden incluir más de un nanoporo de proteína.

Un nanodisco de lípido se puede fabricar a partir de cualquiera de una variedad de membranas o lípidos. Las bicapas lipídicas adecuadas y los métodos para elaborar u obtener bicapas lipídicas son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos US-2010/0196203 y WO 2006/100484. Las bicapas lipídicas adecuadas incluyen, por ejemplo, una membrana de una célula, una membrana de un orgánulo, un liposoma, una bicapa lipídica plana y una bicapa lipídica soportada. Puede formarse una bicapa lipídica, por ejemplo, de dos capas opuestas de fosfolípidos, que están dispuestas de manera que sus grupos de cola hidrófobos se enfrentan entre sí para formar un interior hidrófobo, mientras que los grupos de cabeza hidrófilos de los lípidos están orientados hacia afuera hacia el entorno acuoso a cada lado de la bicapa. También se pueden formar bicapas lipídicas, por ejemplo, mediante el método de Montal y Mueller (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972; 69: 3561-3566), en el cual una monocapa lipídica se transporta en la interfase solución acuosa/aire más allá de cada lado de una abertura que es perpendicular a esa interfaz. Normalmente, el lípido se añade a la superficie de una solución de electrolito acuosa disolviéndolo primero en un disolvente orgánico y luego permitiendo que una gota del disolvente se evapore sobre la superficie de la solución acuosa a cada lado de la abertura. Una vez que el disolvente orgánico se ha evaporado, las interfaces de solución/aire a cada lado de la abertura se mueven físicamente hacia arriba y hacia abajo más allá de la abertura hasta que se forma una bicapa. Otros métodos comunes de formación de bicapa incluyen inmersión de puntas, pintura de bicapas y pinzamiento de parche de bicapas de liposomas. Una variedad de otros métodos para obtener o generar membranas son muy conocidos en la técnica y son igualmente aplicables a las composiciones y métodos de la presente descripción (p. ej., los que pertenecen a los nanoporos híbridos o los que pertenecen a los nanoporos anclados).

Un método para fabricar un aparato de detección incluye las etapas de (a) proporcionar un soporte sólido que tenga una matriz de nanoporos en estado sólido; (b) proporcionar una pluralidad de nanodiscos de lípido, en donde los nanodiscos de lípido incluyen nanoporos de proteína insertados en el lípido; (c) poner en contacto la pluralidad de nanodiscos de lípido con la matriz de nanoporos en estado sólido para cubrir los nanoporos en estado sólido individuales de la matriz con uno de los nanodiscos de lípido. El método se puede usar para fabricar un aparato de detección que tenga una o más de las características descritas en otra parte de la presente memoria.

En realizaciones particulares, la etapa (b) puede incluir además incubar los nanoporos de proteína con lípidos en condiciones que permitan insertar los nanoporos de proteína en los nanodiscos de lípido. Por ejemplo, los lípidos se pueden solubilizar con detergente y las condiciones pueden incluir una técnica para eliminar el detergente de los nanoporos de proteína.

Como se describe en otra parte de la presente memoria, los nanodiscos de lípido pueden atraerse eléctricamente a los nanoporos en estado sólido (p. ej., mediante electroforesis). Opcionalmente, los nanodiscos de lípido pueden incluir anclajes cargados para mediar en la atracción. Como ejemplo, los anclajes cargados pueden ser ácidos nucleicos, ya sea en una forma de origen natural o una forma análoga de origen no natural. El sitio de unión del anclaje se puede usar para insertar nanodiscos con una orientación particular dentro del nanoporo en estado sólido. Esto permite que el nanoporo de proteína se oriente en una dirección directa o inversa dentro del nanoporo en estado sólido. Las mezclas de sitios de unión del anclaje pueden generar cualquier relación deseada de poros biológicos directos e inversos en una matriz de nanoporos en estado sólido.

Para mejorar la captura del analito de la solución y facilitar la difusión bidimensional del analito dentro del plano de la membrana de nanoporos en estado sólido en las proximidades del nanoporo biológico, la membrana de nanoporos en estado sólido se puede derivatizar con un compuesto que interactúa de forma reversible con el analito. Las velocidades cinéticas de activación/desactivación entre el analito y la membrana se pueden seleccionar para permitir una rápida caminata aleatoria del analito a través de la superficie de la membrana de nanoporos en estado sólido. Los ejemplos de dichas interacciones incluyen una etiqueta de colesterol que interactúa con una monocapa o bicapa lipídica, una etiqueta de ADN que interactúa con una superficie de ADN y otras interacciones tales como las descritas en Yusko y col.., Nat Nanotechnol 6(4): 253-260 (2011). La interacción de la etiqueta de ADN con la superficie del ADN puede facilitarse mediante el uso de recombinasas que permiten caminar mediante la invasión de cadenas a través de la superficie de la membrana de nanoporos en estado sólido.

En algunas realizaciones de los métodos, la cantidad de nanodiscos de lípido que se ponen en contacto con una matriz de nanoporos en estado sólido supera la cantidad de nanoporos en estado sólido en la matriz. Los nanodiscos de lípido pueden incluir nanoporos de proteína insertados. Por lo tanto, no es necesario confiar en las estadísticas de Poisson para obtener nanoporos en estado sólido con solo un nanoporo de proteína. En cambio, las cantidades saturantes de los nanodiscos de lípido (con o sin nanoporos de proteína insertados) pueden ponerse en contacto con una matriz de nanoporos en estado sólido. Por ejemplo, la cantidad de nanodiscos de lípido (con o sin nanoporos de proteína insertados) puede exceder la cantidad de nanoporos en estado sólido en al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces o más.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona un método para secuenciar ácidos nucleicos. El método puede incluir las etapas de (a) proporcionar un aparato de detección que tenga: (i) un soporte sólido que incluye una matriz de nanoporos en estado sólido en donde los nanoporos en estado sólido forman aberturas entre los depósitos que están separados por el soporte sólido; (ii) una pluralidad de nanodiscos de lípido en la superficie del soporte sólido, en donde cada uno de los nanodiscos de lípido forma un sello en uno de los nanoporos en estado sólido, y en donde los nanodiscos de lípido están separados entre sí por regiones intersticiales en la superficie del soporte sólido, y en donde las regiones intersticiales carecen de cualquier material lipídico; en donde cada uno de los nanodiscos de lípido es un disco de bicapa lipídica estabilizado por una proteína estructural de membrana (MSP) y (iii) una pluralidad de nanoporos de proteína insertados en los nanodiscos de lípido para crear aberturas en cada uno de los sellos; y (b) detectar el paso de una especie de ácido nucleico, a través de las aberturas de cada uno de los sellos, en donde la especie de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) un polinucleótido, (ii) una serie de nucleótidos extraídos del ácido nucleico o (iii) una serie de sondas derivadas de nucleótidos incorporados en el ácido nucleico, determinando de este modo la secuencia del ácido nucleico.

El ácido nucleico detectado en los métodos de la presente descripción puede ser monocatenario, bicatenario o contener secuencias tanto monocatenarias como bicatenarias. Las moléculas de ácido nucleico pueden originarse en una forma bicatenaria (p. ej., ADNbc) y pueden convertirse en una forma monocatenaria. Las moléculas de ácido nucleico también pueden originarse en una forma monocatenaria (p. ej., ADNmc, ARNmc) y el ADNmc puede convertirse en una forma bicatenaria. Los modos ilustrativos de translocación de polinucleótidos a través de un poro se describen en el documento WO 2013/057495.

En algunos casos, la secuenciación se puede llevar a cabo haciendo pasar un ácido nucleico a través de un nanoporo de proteína y detectando señales eléctricas indicativas del paso de un nucleótido o serie de nucleótidos en particular (p. ej., una «palabra» que consiste en 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos). En algunas realizaciones, se puede lograr un cierto nivel de translocación controlada de un polinucleótido a través de un nanoporo bajo la guía de un motor molecular, tal como una helicasa, translocasa o polimerasa, contra una diferencia de potencial eléctrico. Los motores moleculares pueden mover el polinucleótido de manera escalonada, normalmente con uno o más nucleótidos por etapa. Este trinquete controlado ralentiza la translocación de polinucleótidos a través del nanoporo de una tasa nativa de ps/nucleótido a ms/nucleótido.

Un método de detección puede utilizar una diferencia de potencial a través de una barrera (p. ej., una membrana). La diferencia de potencial puede ser una diferencia de potencial eléctrico, diferencia de potencial químico o una diferencia de potencial electroquímico. Se puede establecer una diferencia de potencial eléctrico a través de la barrera (p. ej., membrana) a través de una fuente de tensión que inyecta o administra corriente a al menos uno de los grupos de líquido. Se puede establecer un potencial químico a través de la barrera mediante una diferencia en la composición iónica de los dos grupos. Una diferencia de potencial electroquímico puede establecerse por una diferencia en la composición iónica de los dos grupos en combinación con un potencial eléctrico. La diferente composición iónica puede ser, por ejemplo, diferentes iones en cada grupo o diferentes concentraciones de los mismos iones en cada grupo.

La aplicación de un potencial eléctrico a través de un poro para forzar la translocación de un ácido nucleico a través del poro es muy conocida en la técnica y puede usarse según el presente aparato y métodos (Deamer y col., Trends Biotechnol., 18:147-151 (2000); Deamer y col., Acc Chem Res., 35:817-825 (2002); y Li y col., Nat Mater., 2(9) :611-615 (2003)). Un método descrito en la presente memoria puede llevarse a cabo con una tensión aplicada a través de un poro. El intervalo para la tensión puede seleccionarse de 40 mV hasta más de 1 V. Típicamente, un método descrito en la presente memoria se ejecutará en el rango de 100 a 200 mV. En casos específicos, el método se ejecuta a 140 mV o 180 mV. No se requiere que los voltajes sean estáticos durante el movimiento del motor. La polaridad de la tensión se aplica típicamente de tal modo que el ácido nucleico cargado negativamente es impulsado electroforéticamente hacia el poro. En algunos casos, la tensión se puede reducir, o la polaridad revertirse, para facilitar la función apropiada.

En algunos casos, la aplicación de diferenciales de presión puede utilizarse para forzar la translocación de un ácido nucleico a través de un poro. Pueden utilizarse diferenciales de presión en lugar de potenciales eléctricos u otras diferencias de potencial en los métodos ilustrados en el presente documento. Alternativamente, pueden utilizarse diferenciales de presión en combinación con potenciales eléctricos u otras diferencias de potencial en los métodos ilustrados en la presente memoria.

Los métodos de la presente invención pueden producir una o más señales que corresponden a la translocación de uno o más nucleótidos a través de un poro. En consecuencia, cuando un polinucleótido diana, o un mononucleótido o sonda derivada del polinucleótido diana o mononucleótido, transita a través de un poro, la corriente a través de la barrera cambia debido al bloqueo de la constricción dependiente de la base (o dependiente de la sonda), por ejemplo. La señal de ese cambio en la corriente puede medirse mediante el uso de cualquiera de una variedad de métodos como se describe en el presente documento o como se conoce de otra manera en la técnica. Cada señal es única para la especie de nucleótido(s) (o sondas) en el poro de modo que la señal resultante se puede usar para determinar una característica del polinucleótido. Por ejemplo, se puede determinar la identidad de una o más especies de nucleótido(s) (o sondas) que produce una señal característica. Las señales útiles en los métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, señales eléctricas y señales ópticas. En algunos aspectos, la señal eléctrica puede ser una medición de corriente, voltaje, efecto túnel, resistencia, voltaje, conducción; o medición eléctrica transversal (ver el documento WO 2013/016486). En algunos aspectos, la señal eléctrica es una corriente eléctrica que pasa a través de un poro.

Las señales ópticas útiles en los métodos de la presente descripción incluyen, por ejemplo, fluorescencia y señal Raman. Las señales ópticas pueden generarse acoplando el nucleótido diana a una etiqueta generadora de señal óptica, por ejemplo, un resto fluorescente o un resto generador de señal Raman. Por ejemplo, en dela Torre y col., Nanotechnology, 23(38):385308 (2012), se empleó el esquema óptico de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF, por sus siglas en inglés) para iluminar un área amplia de la membrana recubierta con TiO<2>. En Soni y col., Rev Sci Instrum., 81(1):014301 (2010), se usó un método para integrar dos modalidades de medición de una sola molécula, a saber, microscopía de reflexión interna total y detección eléctrica de biomoléculas mediante el uso de nanoporos. Las dos referencias anteriores se incorporan en la presente memoria.

Como se describe en la presente memoria, los nanoporos (ya sea nanoporos híbridos o nanoporos anclados) pueden acoplarse con un circuito de detección, que incluye, por ejemplo, un circuito de abrazadera de parche, un circuito de electrodo de tunelización o un circuito de medición de conductancia transversal (tal como una nanocinta de grafeno o un nanogap de grafeno), para registrar las señales eléctricas en los métodos de la presente descripción. Además, el poro también puede acoplarse con un sensor óptico que detecta marcadores, por ejemplo, un resto fluorescente o un resto generador de señal Raman, en los polinucleótidos.

Los motores moleculares pueden usar la energía de la hidrólisis de nucleótido para impulsar la translocación del polinucleótido diana a través del nanoporo. Una helicasa es un ejemplo en el cual la hidrólisis de ATP es la fuente de energía para la translocación de polinucleótido. Por ejemplo, en un modelo, un polinucleótido monocatenario se mantiene en una hendidura cargada negativamente que separa los dos dominios RecA de una helicasa de un tercer dominio. En ausencia de ATP, un residuo marcador (por ejemplo, T rp501 en la helicasa de VHC) y un residuo de pinza (por ejemplo, Arg393 en la helicasa de VHC) evitan que el polinucleótido monocatenario se deslice a través de una hendidura. Tras la unión de ATP, los dominios RecA giran, moviendo la pinza de Arg cargada positivamente. La pinza de Arg atrae el polinucleótido monocatenario cargado negativamente, lo que a su vez elimina el marcador. El polinucleótido monocatenario es repelido entonces por la hendidura cargada negativamente, y el polinucleótido monocatenario se transloca a través de la helicasa hasta que el ATP se hidroliza. Por lo tanto, en este modelo ilustrativo, la translocación de polinucleótidos a través de una helicasa implica al menos dos etapas: una primera etapa donde la helicasa se une a ATP y experimenta un cambio conformacional, y una segunda etapa donde se hidroliza el ATP y el polinucleótido se transloca a través de la helicasa.

Otras técnicas de detección que se pueden aplicar a un aparato descrito en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa, la detección de eventos, tales como el movimiento de una molécula o una porción de esa molécula, particularmente cuando la molécula es ADN o una enzima que se une al ADN, tal como una polimerasa. Por ejemplo, Olsen y col., JACS 135: 7855-7860 (2013), describe la bioconjugación de moléculas individuales del fragmento de Klenow (KF) de la ADN polimerasa I en nanocircuitos electrónicos para permitir registros eléctricos de la función enzimática y la variabilidad dinámica con la resolución de los eventos de incorporación de nucleótidos individuales. O, por ejemplo, Hurt y col., JACS 131: 3772-3778 (2009), describe la medición del tiempo de permanencia para complejos de ADN con el KF en la parte superior de un nanoporo en un campo eléctrico aplicado. O, por ejemplo, Kim y col., Sens. Actuators B Chem. 177: 1075-1082 (2012), describe el uso de un sensor de medición de corriente en experimentos que involucran ADN capturado en un nanoporo de a-hemolisina. O, por ejemplo, Garalde y col., J. Biol. Chem. 286: 14480-14492 (2011), describen la distinción de los complejos de KF-ADN partiendo de la base de sus propiedades cuando quedan capturados en un campo eléctrico en la parte superior de un poro de a-hemolisina. Otras referencias que describen mediciones que involucran a-hemolisina incluyen las siguientes, todas de Howorka y col.: PNAS 98: 12996-13301 (2001); Biophysical Journal 83: 3202-3210 (2002); y Nature Biotechnology 19: 636-639 (2001).

La patente estadounidense n.° 8.652.779, concedida a Turner y col., describe composiciones y métodos de secuenciación de ácido nucleico usando un único complejo de enzima polimerasa que incluye una enzima polimerasa y un ácido nucleico molde unido de forma proximal a un nanoporo, y análogos de nucleótido en solución. Los análogos de nucleótido incluyen etiquetas de bloqueo de carga que se unen a la porción de polifosfato del análogo de nucleótido de modo que las etiquetas de bloqueo de carga se escinden cuando el análogo de nucleótido se incorpora a un ácido nucleico en crecimiento. Según Turner, el nanoporo detecta la etiqueta de bloqueo de carga para determinar la presencia e identidad del nucleótido incorporado y, por lo tanto, determinar la secuencia de un ácido nucleico molde. La publicación de patente estadounidense n.° 2014/0051069 se refiere a constructos que incluyen una subunidad de poro de proteína transmembrana y una enzima de manipulación de ácido nucleico.

Ejemplo i

Los dos objetivos principales del diseño experimental son: a) diseñar, sintetizar y purificar el complejo proteínananodisco; y (b) ensamblar el complejo en la plataforma de nanoporo en estado sólido mediante fuerzas electroforéticas. La fuerza impulsora electroforética se puede mejorar uniendo un polielectrolito o una molécula de ADN en el disco o la proteína formadora de poros. Es posible que se requiera un tratamiento de superficie adicional para mejorar el aislamiento en la interfaz de disco de lípido-nanoporo sólido.

OBJETIVO ESPECÍFICO n.° 1: Demostrar la incorporación del nanoporo de MspA en nanodiscos de lípido

Hitos: (a) ensamblar y caracterizar un nanodisco de lípido en blanco; (b) diseñar la proteína MspA con etiqueta His con el fin de separarla y purificarla; (c) incorporar la proteína MspA en el nanodisco de lípido, purificar el producto y caracterizar la morfología.

Sintetizar el nanodisco de lípido con bioporo incorporado

Los nanodiscos de lípido en blanco se sintetizan mediante la titulación de la relación de lípido a MSP. El enfoque experimental se revisó anteriormente en relación con lafigura 3. Se preparan mutantes de bioporo con etiquetas His en el extremo C. Se añaden los mutantes de bioporo etiquetados con His a la mezcla precursora de nanodisco antes de retirar el detergente, de modo que la incorporación del bioporo tendrá lugar durante el proceso de autoensamblaje del nanodisco de lípido. Se utiliza una cantidad excesiva de componente de nanodisco para garantizar un alto rendimiento de incorporación. El complejo de nanoporo-nanodisco se separa de los nanodiscos vacíos mediante una columna de afinidad con etiqueta His. Todo el proceso se monitoriza y analiza mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) y electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), y se caracteriza además mediante microscopía de fuerza atómica en fase líquida y microscopía electrónica de transmisión.

OBJETIVO ESPECÍFICO n.° 2: Lograr un sellado de más de 100 GQ del nanodisco de lípido insertado en un nanoporo en estado sólido

Hitos: a) establecer una infraestructura de nanoporo y electroforesis; (b) ensamblar electroforéticamente un nanodisco de lípido en blanco en un nanoporo en estado sólido; (c) si es necesario, funcionalizar químicamente el nanoporo en estado sólido para garantizar un sellado superior a 100 GS2; (d) demostrar la actividad biológica del poro de MspA en el sistema híbrido.

Construir un sistema de nanoporo en estado sólido

Los métodos de fabricación de nanoporos en estado sólido han utilizado históricamente la perforación con haz energizado, por ejemplo, con un haz de electrones en un microscopio electrónico de transmisión (TEM) (ver, por ejemplo, Storm y col., Nature Materials 2, 537-540 (2003)), un haz de iones de gas en un haz de iones enfocado (FIB, por sus siglas en inglés)) (ver, por ejemplo, Patterson y col., Nanotechnology 19, 235304 (2008)) o un haz de iones de helio (HIB, por sus siglas en inglés) (ver, por ejemplo, Yang y col., Nanotechnology 22, 285310 (2011)). Se utilizará un suministro comercial de nanoporos de 7-10 nm para la demostración inicial y el desarrollo del sistema. La creación inicial de prototipos del equipo requerido se lleva a cabo como se ha descrito anteriormente en relación con lafigura 6Ay lafigura 6B. Para trabajos adicionales de nanofabricación se utilizan herramientas de electrofisiología, tales como estaciones de trabajo electroquímicas y amplificadores de pinzamiento de parche, y una sala limpia.

Obtener nanoporos sellados con nanodiscos de lípido con una resistencia >100 GQ

La translocación de biomoléculas impulsada electroforéticamente a través de nanoporos en estado sólido se ha estudiado ampliamente en la última década. La misma estrategia se puede aplicar para sellar el nanoporo en estado sólido con un nanodisco de lípido de tamaño relativamente grande, dejando el nanoporo de proteína incorporado como la única vía para la corriente iónica y la única vía para los analitos que deben detectarse al pasar a través del poro. La eficacia del sellado se prueba con nanodiscos de lípido en blanco (sin bioporos). Dado que el nanodisco de lípido se carga ligeramente, se puede utilizar una molécula de ADN derivatizada con colesterol-TEG para mejorar el efecto de electroforesis de la captura del nanodisco de lípido. El ADN etiquetado con colesterol tiende a unirse a la membrana de lípido insertando la unidad de colesterol hidrófobo en la membrana. En lafigura 8se muestra una representación esquemática de un nanodisco en blanco que tiene un anclaje de ácido nucleico.

El campo eléctrico guía el nanodisco que contiene el anclaje capturando la cadena de ADN altamente cargada. La probabilidad de captura también se ve afectada por el tamaño de nanoporo, la fuerza iónica, la tensión y la viscosidad, que se pueden ajustar para lograr la carga deseada. En esta etapa intermedia son posibles múltiples inserciones de anclaje de ADN en un solo nanodisco, pero no deberían afectar a la capacidad de evaluar la eficiencia de sellado entre el nanodisco y la superficie de nanoporo en estado sólido.

Se pueden usar modificaciones adicionales para lograr un sellado >100 GQ, por ejemplo, en realizaciones donde un sello no se crea completamente mediante acción electroforética. Si es necesario, el nanoporo en estado sólido se puede funcionalizar para sellar las vías de fuga de la interfaz. Garantizar la hidrofobicidad de la interfaz puede evitar el transporte de iones solvatados. Una técnica consiste en recubrir la superficie superior del nanoporo en estado sólido con derivados de colesterol para garantizar que la superficie sea hidrófoba, mientras se insertan sus grupos terminales hidrófobos en la membrana. La química de superficie específica que se puede usar se muestra en lafigura 9.

Otro enfoque es el anclaje local del nanodisco de lípido, por ejemplo, como se describe en Stackmann Science 271, 43-48 (1996); Steinem y col. Biochim. Biophys. Acta, 1279, 169-180 (1996); Vallejo, Bioelectrochemistry 57, 1-7 (2002); y Avanti Polar Lipids, Inc. (octubre de 2013), «Preparation of Liposomes», obtenido de http://avantilipids.com/index.php?option=com_content&id=1384&Itemid=372If. Alternativa o adicionalmente, toda la superficie del chip de Si<3>N<4>puede recubrirse con una membrana, por ejemplo, como se describe en Yusko y col., Nature Nanotech. 6, 253 (2011). El bioporo de MspA se puede insertar entonces directamente después de la formación de este recubrimiento de membrana. Se puede aprovechar el impedimento estérico para garantizar que solo se pueda insertar una sola porina en cada abertura, y la conversión efectiva de la difusión de 3 dimensiones (es decir, en solución) a 2 dimensiones (es decir, en la membrana) puede proporcionar una eficiencia de inserción adecuada. Se pueden obtener vesículas unilaminares grandes con un diámetro de ~ 100 nm (ver, por ejemplo, Avanti Polar Lipids, Inc. (octubre de 2013), «Preparation of Liposomes», obtenido de http://avantilipids.com/index.php?option=com_content&id=1384&Itemid=372If) , y se pueden unir nanoporos en estado sólido más pequeños (p. ej., los nanoporos de ~10 nm descritos en este ejemplo).

Además, la funcionalización química del nanoporo en estado sólido puede realizarse para evitar cualquier vía de fuga residual a lo largo de la interfaz entre el nanodisco de lípido y el nanoporo en estado sólido. Por lo tanto, la superficie superior del nanoporo en estado sólido, con la que estará en contacto el disco de lípido, puede funcionalizarse químicamente con moléculas autoensambladas hidrófobas. Los restos ilustrativos que pueden usarse para la funcionalización son los derivados del colesterol que pueden insertar su porción hidrófoba en la membrana y, como resultado, impedir el transporte de iones hidratados a lo largo de la interfaz. La química de superficie útil para conjugar el derivado de colesterol sobre un sustrato sólido se ilustra en lafigura 9.

La funcionalización de superficie puede alterar la característica eléctrica del nanoporo en estado sólido. El efecto puede ser beneficioso al reducir los eventos de adherencia mediante la interacción del ADN con la superficie sólida. Sin embargo, el aumento de la hidrofobicidad del nanoporo en estado sólido puede afectar a sus propiedades de transporte (ver, por ejemplo, Powell y col., Nature Nanotechnology 6, 798-802 (2011)). Los dos efectos se pueden equilibrar para lograr un rendimiento óptimo del sistema).

Analizar la actividad del bioporo como parte del dispositivo híbrido de nanoporo

El objetivo específico n.° 2b demostrará el ensamblaje de un complejo de nanodisco/bioporo lipídico en un nanoporo en estado sólido. La caracterización eléctrica del nanoporo híbrido, el nivel de ruido y la estabilidad se pueden caracterizar en condiciones de secuenciación de ácido nucleico. El nanoporo híbrido puede poseer un ruido más alto que el de un dispositivo de nanoporo de proteína convencional, causado principalmente por el acoplamiento capacitivo a través del sustrato de soporte de silicio. Ver, por ejemplo, Waggoner y col., Journal of Vacuum Science & Technology B 29, 032206 (2011). El nivel de ruido se puede optimizar mediante la pasivación con resina del área de contacto del fluido o añadiendo SiO<2>de un espesor de micrones entre la película de Si3N4 y el sustrato de Si, por ejemplo, utilizando técnicas y materiales descritos en Rosenstein y col., Nature Methods 9, 487-492 (2012). La química actual de la secuenciación basada en nanoporos contiene polimerasa, ATP y sal en un tampón de pH casi neutro, lo que no se espera que afecte a la estabilidad de un complejo de disco de lípido/bioporo. El rendimiento del nanoporo híbrido se puede comparar con el de un bioporo convencional soportado por lípidos para caracterizar su rendimiento.

Ejemplo ii

Este ejemplo describe el progreso hacia el objetivo específico n.° 1 del ejemplo I. Más específicamente, se establecieron protocolos para (a) ensamblar y caracterizar nanodiscos de lípido en blanco con un diámetro de 10 13 nm, y (b) incorporar proteínas de nanoporo de MspA en nanodiscos de lípido y caracterizar la morfología del complejo.

Se usó cromatografía líquida de proteínas a alta velocidad (FPLC, por sus siglas en inglés) para optimizar la formación de nanodiscos y la inserción de MspA como se muestra en lafigura10. La traza inferior (negro) es solo para nanodiscos y muestra un pico de elución muy definido de un instrumento de FPLC. La adición de MspA a la mezcla precursora desestabilizó la reacción y dio como resultado un segundo pico de elución con un peso molecular más alto, como se muestra en la traza central (roja). El comportamiento fue similar al de la síntesis de nanodiscos puros en presencia de exceso de lípidos. Aunque no necesariamente pretende limitarse a una hipótesis, el surfactante requerido para estabilizar la proteína MspA en solución parece estar interactuando con el proceso de autoensamblaje del nanodisco. Al reducir en un tercio la cantidad de lípido utilizada durante la síntesis, se recuperó el comportamiento normal, como se muestra en la traza superior (azul).

Además, se realizó una caracterización mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés) en las dos fracciones de elución (A y B) de lafigura 10. Las muestras se tiñeron con acetato de uranilo antes de la obtención de imágenes por TEM para mejorar el contraste. Las imágenes por TEM resultantes se muestran en lafigura 11. Se observó una inserción aparente de MspA (discos con puntos oscuros) en ambas muestras, con una fuerte aglomeración en la fracción de alto PM, como se esperaba. Las imágenes por TEM de nanodiscos en blanco (no mostrados) no presentaron dichas características. Se puede obtener una confirmación adicional de la inserción de MspA mediante electroforesis de proteína y mediante la purificación del producto en columna metálica, como se documenta en el objetivo específico n.° 1 del ejemplo I.

Los resultados anteriores confirman el establecimiento de un protocolo para la síntesis de nanodiscos desnudos. Además, los resultados proporcionan una confirmación de prueba de principio de la inserción de MspA en nanodiscos autoensamblados.

El término que comprende se entiende en el presente documento como abierto, incluyendo no sólo los elementos citados, sino abarcando además cualquier elemento adicional.

Se ha descrito un número de realizaciones. No obstante, se entenderá que se podrán realizar diversas modificaciones. En consecuencia, otras realizaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   i.Un método de secuenciación de un ácido nucleico diana, que comprende:

   (a) proporcionar un aparato que comprende:

   (i) un soporte sólido que comprende una matriz de nanoporos en estado sólido, en donde los nanoporos en estado sólido forman aberturas entre los depósitos que están separados por el soporte sólido,

   (ii) una pluralidad de nanodiscos de lípido en una superficie del soporte sólido, en donde cada uno de los nanodiscos de lípido forma un sello en uno de los nanoporos en estado sólido, en donde los nanodiscos de lípido están separados entre sí por regiones intersticiales en la superficie del soporte sólido, en donde las regiones intersticiales carecen de cualquier material lipídico, en donde cada uno de los nanodiscos de lípido es un disco de bicapa lipídica estabilizado por una proteína estructural de membrana (MSP) y (iii) una pluralidad de nanoporos de proteína insertados en los nanodiscos de lípido para crear aberturas en cada uno de los sellos; y

   (b) detectar el paso de una especie de ácido nucleico a través de las aberturas, en donde la especie de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:

   (i) un polinucleótido,

   (ii) una serie de nucleótidos extraídos del ácido nucleico, y

   (iii) una serie de sondas derivadas de nucleótidos incorporados en el ácido nucleico;

   determinando de este modo la secuencia del ácido nucleico diana.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la detección comprende detectar una señal eléctrica indicativa del paso de un nucleótido o serie de nucleótidos en particular.
3. 3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde el paso de la especie se logra bajo la guía de un motor molecular contra una diferencia de potencial eléctrico, en donde el motor molecular se selecciona del grupo que consiste en una helicasa, una translocasa y una polimerasa.
4. 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el ácido nucleico diana es un polinucleótido monocatenario.
5. 5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el ácido nucleico diana es ADN.
6. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la corriente iónica apreciablemente solo fluye a través de los nanoporos de proteína y no a través del sello.
7. 7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde cada uno de los nanoporos en estado sólido tiene un diámetro de abertura de al menos 7 nm y como máximo de 5 micrómetros; y/o en donde cada uno de los nanoporos de proteína ocupa un área en el nanodisco de lípido que tiene al menos 5 nm de diámetro y como máximo 1 micrómetro; y/o en donde los nanodiscos de lípido tienen cada uno un diámetro de al menos 7 nm y como máximo 1 micrómetro.
8. 8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde los nanodiscos de lípido forman sellos para al menos el 50 % de los nanoporos en estado sólido; y/o los nanoporos de proteína se insertan en al menos el 50 % de los nanodiscos de lípido.
9. 9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en donde cada uno de los nanodiscos de lípido que forma un sello en un nanoporo en estado sólido de la matriz de nanoporos en estado sólido comprende no más de uno de los nanoporos de proteína.
10. 10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además anclajes de ácido nucleico unidos a los nanoporos de proteína o a los nanodiscos de lípido.
11. 11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde las regiones intersticiales separan los nanodiscos de lípido en al menos 5 nm.
12. 12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la matriz de nanoporos en estado sólido comprende al menos 1000 nanoporos en estado sólido, y/o comprende al menos 1000 nanodiscos de lípido, y/o comprende al menos 1000 nanoporos de proteína.
13. 13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde los depósitos comprenden un depósitocisen contacto con la matriz de nanoporos en estado sólido y un depósitotransen contacto con la matriz de nanoporos en estado sólido, en donde el depósitocisy el depósitotranscomprenden electrodos ubicados para aplicar una corriente a través de las aberturas formadas por los nanoporos de proteína.