ES2986343T3 - Anticuerpos contra CLAUDINA-6 y métodos para tratar el cáncer - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación proporciona proteínas de unión a antígeno que se unen a Claudin-6 (CLDN6). En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno se unen al bucle extracelular 2 (EL2) del dominio extracelular de CLDN6. En el presente documento se proporcionan además polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras y conjugados relacionados. Además, se proporcionan kits y composiciones farmacéuticas que comprenden dichas entidades. También se proporcionan métodos para elaborar una proteína de unión a antígeno y métodos para tratar a un sujeto que padece cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra CLAUDINA-6 y métodos para tratar el cáncer
Antecedentes
Los anticuerpos constituyen agentes terapéuticos potentes caracterizados por efectos secundarios limitados debido a su capacidad para dirigirse específicamente a un antígeno distinto en una célula, bacteria, virus o toxina. En 1986, se introdujo en el mercado el primer anticuerpo monoclonal terapéutico, Orthoclone OKT3. Desde entonces, esta clase de productos biofarmacéuticos ha crecido significativamente. A finales de 2014, cuarenta y siete productos de anticuerpos monoclonales habían recibido aprobación en los Estados Unidos o Europa para el tratamiento de una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades inflamatorias, cardiovasculares, respiratorias e infecciosas.
En la actualidad, está aprobada más de una docena de anticuerpos monoclonales por la Administración de Alimentos y Fármacos de EE.UU. para tratar cánceres. Entre estos agentes están alemtuzumab (Campath®), que está indicado para leucemia linfocítica crónica (LLC), y trastuzumab (Herceptin®), que se utiliza para tratar cáncer de mama. Algunos anticuerpos se marcan con fármacos quimioterapéuticos, incluyendo, por ejemplo, brentuximab vedotina (Adcetris®) y Ado-trastuzumab emtansina (Kadcyla®). Otros productos de anticuerpos, tales como blinatumomab (Blincyto) se diseñan para que reconozcan y se unan a dos antígenos diferentes. A pesar de la disponibilidad comercial de tales productos de anticuerpos, la incidencia actual del cáncer y las muertes por cáncer siguen siendo altas. Se ha informado de que la incidencia de cáncer es mayor de 450 por 100.000 hombres y mujeres por año, y la mortalidad por cáncer está algo por encima de 170 por 100.000 hombres y mujeres por año.
Compendio
La presente invención se define por las reivindicaciones. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a Claudina 6 (CLDN6) o fragmento de unión a antígeno del mismo en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se seleccionan de un grupo que consiste en un anticuerpo que se une a CLDN6 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: (a) (i) una CDR1 de HC que comprende la secuencia de aminoácidos de FTFSXYX (SEQ ID NO: 455), en donde X en la posición 5 es N y X en la posición 7 es W; (ii) una CDR2 de HC que comprende la secuencia de aminoácidos de iRl KXDXYAT (SEQ ID NO: 456), en donde X en la posición 5 es S y X en la posición 7 es N; (iii) una CDR3 de HC que comprende la secuencia de aminoácidos de XDGPPSGX (SEQ ID NO: 457), en donde X en la posición 1 es N y X en la posición 8 es S; (iv) una CDR1 de LC que comprende la secuencia de aminoácidos de EXIYSY (SEQ ID NO: 476), en donde X es N; (v) una CDR2 de LC que comprende la secuencia de aminoácidos de XAK (SEQ ID NO: 477), en donde X en la posición 1 es N; y (vi) una CDR3 de LC que comprende la secuencia de aminoácidos de QXHYXVPWT (SEQ ID NO: 454), en donde X en la posición 2 es H y X en la posición 5 es T; y (b) un anticuerpo que se une a CLDN6 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1-3 de cadena pesada (HC) de SEQ ID NO: 23, 24 y 25, y las secuencias de aminoácidos de CDR1-3 de cadena ligera (LC) de SEQ ID NO: 20, 21 y 22.
Según una realización preferida, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es (i) un anticuerpo monoclonal, y/o (ii) un anticuerpo humano, quimérico o humanizado.
Según una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende la secuencia del dominio variable de la cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 387 y la secuencia del dominio variable de la cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 389.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención; b) un producto conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de (a); c) una proteína de fusión que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de (a); d) un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de (a); e) un vector que comprende el ácido nucleico de (d); f) una célula que comprende el ácido nucleico de (d) o el vector de (e); o g) una combinación de los mismos; y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.
Según una preferencia, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición farmacéutica son para su uso en el tratamiento del cáncer.
La presente invención se refiere además a un métodoin vitropara detectar Claudina 6 (CLDN6) en una muestra que comprende (a) poner en contacto el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención con la muestra, y (b) someter a ensayo un inmunocomplejo que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo unidos a CLDN6.
Según una preferencia, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición farmacéutica son para su uso en un método que diagnostica in vivo un cáncer positivo para Claudina 6 (CLDN6) en un sujeto.
La presente invención se refiere adicionalmente a un método para producir la composición farmacéutica de la invención, que comprende combinar un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables; y uno cualquiera de los puntos (a)-(g) como se ha definido anteriormente en el presente documento.
Además, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención, o ii. una proteína de fusión que comprende la proteína de unión a antígeno de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico de la invención y una célula anfitriona que comprende el ácido nucleico o el vector de la invención,
Finalmente, la presente invención se refiere a un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o una proteína de fusión del mismo que se une a una proteína Claudina 6 (CLDN6), que comprende i. cultivar la célula anfitriona de la invención en un medio de cultivo celular, y ii. recoger el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o la proteína de fusión del medio de cultivo celular.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa un gráfico de la expresión de CLDN6 en tejidos normales (no cancerosos).
La Figura 2 representa un gráfico de la expresión de CLDN6 en líneas celulares de cáncer como se determina por la metodología Agilent44K.
La Figura 3 representa un gráfico de la expresión de CLDN6 en líneas celulares de cáncer según se determina mediante RNASeq.
La Figura 4 representa un conjunto de imágenes fluorescentes que representan la localización de CLDN6-GFP en diferentes modelos celulares.
La Figura 5 representa un alineamiento de secuencias de CLDN6 humana, CLDN3 humana, CLDN4 humana, CLDN9 humana y CLDN6 de ratón. Se muestran las secuencias de EL1 y EL2.
La Figura 6A representa un gráfico del volumen tumoral (mm3) de tumores en ratones portadores de tumores endometriales en función del tiempo (días) después del tratamiento con anticuerpo IgG2 de control, AB3, Ab1 de Referencia, Ab2 de Referencia, Ab3 de Referencia, AB2 y AB3. La Figura 6B representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 14 de los tumores en ratones portadores de tumores endometriales tratados con anticuerpo IgG2 de control, AB3, Ab1 de Referencia, Ab2 de Referencia, Ab3 de Referencia, AB2 o AB3.
La Figura 7A representa un gráfico del volumen tumoral (mm3) de tumores en ratones portadores de tumores de vejiga en función del tiempo (días) después del tratamiento con anticuerpo IgG2 de control, AB3, Ab1 de Referencia, Ab2 de Referencia y AB3. La Figura 7B representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 35 de los tumores en ratones portadores de tumores de vejiga tratados con anticuerpo IgG2 de control, A<b>3, Ab1 de Referencia, Ab2 de Referencia o AB3.
La Figura 8A representa un gráfico del volumen tumoral (mm3) de tumores en ratones portadores de tumores ováricos en función del tiempo (días) después del tratamiento con anticuerpo IgG2 de control, AB3, Ab1 de Referencia, AB2, y AB3. La Figura 8B representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 20 de los tumores en ratones portadores de tumores de ovario tratados con anticuerpo IgG2 de control, AB3, Ab1 de referencia, AB2 o AB3.
La Figura 9A representa un gráfico del volumen tumoral (mm3) de tumores en ratones portadores de tumores de melanoma en función del tiempo (días) después del tratamiento con anticuerpo IgG2 de control, AB3, Ab1 de Referencia, Ab2 de Referencia, Ab3 de Referencia y AB3. La Figura 9B representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 21 de los tumores en ratones portadores de tumores de melanoma tratados con anticuerpo IgG2 de control, AB3, Ab1 de Referencia, Ab2 de Referencia, Ab3 de Referencia, o AB3.
La Figura 10A representa un gráfico de % de inhibición del crecimiento tumoral conseguido en ratones portadores de tumor tratados con AB3, con respecto a ratones tratados con anticuerpo de control. La Figura 10B representa una imagen de una transferencia Western que demuestra los diferentes niveles de líneas celulares de cáncer endometrial con CLDN6 id (ARK2), líneas celulares de cáncer de vejiga (UMUC4), líneas celulares de cáncer ovárico (OV90) y líneas celulares de melanoma (M202) y células de control. Los niveles de a-tubulina fueron aproximadamente los mismos, demostrando una carga de proteína igual.
La Figura 11 representa un gráfico del% de cambio en el peso corporal de ratones portadores de tumor tratados con control de vehículo, anticuerpo de control, Ab1 de Referencia, Ab2 de Referencia, Ab3 de Referencia y AB3 en función del tiempo (días).
La Figura 12A representa un gráfico del volumen tumoral (mm3) de tumores en ratones portadores de tumores ováricos en función del tiempo (días) después del tratamiento con control de vehículo, anticuerpo IgG2 de control, AB3, Ab1 de Referencia, o uno de los anticuerpos anti-CLDN6 indicados. La Figura 12B representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 28 de los tumores en ratones portadores de tumores de ovario tratados con control de vehículo, anticuerpo IgG2 de control, AB3, Ab1 de Referencia, o uno de los anticuerpos anti-CLDN6 indicados.
La Figura 13 representa un gráfico del% de cambio en el peso corporal de ratones portadores de tumor tratados con control de vehículo, anticuerpo de control, Ab1 de referencia, y los anticuerpos anti-CLDN6 indicados en función del tiempo (días).
La Figura 14 representa una serie de curvas de respuesta a la dosis para varios anticuerpos anti-CLDN6 de la divulgación y Ab1 de Referencia y 2 de Referencia. Se utilizó IgG de ratón como control.
La Figura 15A representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 35 de los tumores en ratones portadores de tumores de vejiga tratados con control de vehículo, anticuerpo IgG de control, una forma de ratón de AB3, una primera forma humanizada de AB3 y una segunda forma humanizada de AB3. La Figura 15B representa un gráfico de los cambios en el volumen tumoral (mm3) para cada uno de los grupos en la Figura 15A.
La Figura 16A representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 35 de los tumores en ratones portadores de tumores de vejiga tratados con control de vehículo, anticuerpo IgG de control, una forma de ratón de AB3, una primera forma humanizada de AB3 y una segunda forma humanizada de AB3. También se someten a prueba en este experimento dos anticuerpos de control (uno de ratón y uno quimérico). La Figura 16B representa un gráfico de los cambios en el volumen tumoral (mm3) para cada uno de los grupos en la Figura 16A.
La Figura 17A representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 35 de los tumores en ratones portadores de tumores de vejiga tratados con control de vehículo, anticuerpo IgG de control, una forma de ratón de AB1 y una forma humanizada de AB1. La Figura 17B representa un gráfico de los cambios en el volumen tumoral (mm3) para cada uno de los grupos en la Figura 17A.
La Figura 18A representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 35 de los tumores en ratones portadores de tumores de vejiga tratados con control de vehículo, anticuerpo IgG de control, una forma de ratón de AB4 y una forma humanizada de AB4. La Figura 18B representa un gráfico de los cambios en el volumen tumoral (mm3) para cada uno de los grupos en la Figura 18A.
La Figura 19A representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 35 de los tumores en ratones portadores de tumores de vejiga tratados con control de vehículo, anticuerpo IgG de control, una forma de ratón de AB3, una forma quimérica de AB3, una primera forma humanizada de AB3, una segunda forma humanizada de AB3, una forma de ratón de Ab1, una forma humanizada de AB1, una forma de ratón de AB4, una forma humanizada de AB4 y cuatro anticuerpos de control (un anticuerpo tiene o bien una forma de ratón o bien una forma quimérica y un anticuerpo que tiene una forma de ratón o humana) también se someten a prueba en este experimento. La Figura 19B representa un gráfico de los cambios en el volumen tumoral (mm3) para cada uno de los grupos en la Figura 19A.
La Figura 20 representa un gráfico del cambio medio en el volumen tumoral (mm3) el Día 55 de los tumores en ratones portadores de tumores de vejiga tratados como se describe en la Figura 19A.
La Figura 21 representa un gráfico de% de cambio en el peso corporal de ratones portadores de tumor tratados el Día 32 tratados como se describe en la Figura 19A.
Descripción detallada
La familia de la claudina
Las uniones estrechas, también conocidas como uniones ocluyentes o zonula occludens, son estructuras de vertebrados localizadas entre dos células adyacentes que regulan la permeabilidad paracelular y mantienen la polaridad celular en láminas celulares epiteliales y endoteliales. La familia de genes de claudina (CLDN) codifica proteínas de membrana que son componentes importantes de uniones estrechas. Las proteínas CLDN comprenden cuatro hélices transmembrana (TM) (TM1, TM2, TM3 y TM4) y dos bucles extracelulares (EL1 y EL2). Los bucles extracelulares de las proteínas CLDN de células adyacentes interactúan entre sí para sellar la lámina celular y regular el transporte paracelular entre los espacios luminal y basolateral.
Las proteínas CLDN desempeñan un papel en diversas enfermedades y patologías humanas. Por ejemplo, se ha demostrado que mutaciones en el genCLDN1dan como resultado una descamación progresiva de la piel junto con la obstrucción de los conductos biliares. Los mutantes del genCLDN16causan un trastorno de pérdida de magnesio. Las mutaciones deCLDN19conducen a afecciones oculares, tales como coloboma macular y miopía, mientras que las mutaciones deCLDN14pueden conducir a sordera recesiva no sindrómica. Se sabe que CLDN3 y CLDN4 son receptores de superficie para la enterotoxina deClostridium perfringensen el intestino, y CLDN1, CLDN6, y CLDN9 son co-receptores para la entrada del virus de la hepatitis C (VHC). Se ha demostrado que varias proteínas CLDN se expresan de manera anormal en cánceres. Por ejemplo, CLDN1 está regulada por disminución en el cáncer de mama y colon, mientras que CLDN3 y CLDN4 están altamente reguladas por incremento en múltiples cánceres.
La claudina-6 (CLDN6) es un miembro de la familia CLDN. El gen que codifica la proteína CLDN6 humana se localiza en el brazo p del cromosoma 16 humano en 16p13.3 y se conserva en chimpancé, mono Rhesus, perro, vaca, ratón, rata, pez cebra y rana. CLDN6 se expresa generalmente en seres humanos como una proteína precursora de 220 aminoácidos; los primeros 21 aminoácidos de la cual constituyen el péptido señal. La secuencia de aminoácidos de la proteína precursora de CLDN6 está disponible públicamente en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) como Secuencia de Referencia de NCBI NP_067018.2 y se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 1. El aminoácido en la posición 143 de SEQ ID NO: 1 es Ile. En algunos casos, debido a un polimorfismo de nucleótido único (SNP) en la secuencia de ADN que codifica CLDN6, el aminoácido en la posición 143 es una Val. La secuencia de aminoácidos de CLDN6 humana que tiene una Val en la posición 143 se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 178.
Proteínas de unión a antígeno
Aunque la presente invención se define por las reivindicaciones, en el presente documento se proporcionan en general proteínas de unión a antígeno que se unen a Claudina-6 (CLDN6). Las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación adoptan la forma de un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, o un producto de proteína de anticuerpo. Las proteínas de unión a antígeno dirigidas contra CLDN6 son conocidas de la técnica anterior, p. ej., del documento WO 2012/156018.
En diversas implementaciones de la presente divulgación, la proteína de unión a antígeno comprende, consiste esencialmente en o consiste en un anticuerpo. Como se emplea en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a una proteína que tiene un formato de inmunoglobulina convencional, que comprende cadenas pesadas y ligeras, y que comprende regiones variables y constantes. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser una IgG que es una estructura en forma de Y de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena ligera (que tiene típicamente un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena pesada (que tiene típicamente un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Un anticuerpo tiene una región variable y una región constante. En los formatos de IgG, la región variable es generalmente de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos, comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), es responsable principalmente del reconocimiento de antígenos, y varía sustancialmente entre otros anticuerpos que se unen a diferentes antígenos. La región constante permite que el anticuerpo reclute células y moléculas del sistema inmunitario. La región variable está formada por las regiones N-terminales de cada cadena ligera y cadena pesada, mientras que la región constante está formada por las porciones C-terminales de cada una de las cadenas pesada y ligera (Janeway et al., Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4a ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)).
La estructura general y las propiedades de las CDR de los anticuerpos se han descrito en la técnica. Brevemente, en un armazón de anticuerpo, las CDR se incorporan dentro de un marco en la región variable de cadena pesada y ligera donde constituyen las regiones ampliamente responsables de la unión y reconocimiento de antígeno. Una región variable comprende típicamente al menos tres CDR de cadena pesada o ligera (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H Bethesda, Md; véase también Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de una región marco (denominadas regiones marco 1-4, FR1, FR2, FR3 y FR4, por Kabat et al., 1991; véase también Chothia y Lesk, 1987, más arriba).
Los anticuerpos pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. La IgG tiene varias subclases, incluyendo, pero sin limitación, IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tiene subclases, incluyendo, pero sin limitación, IgM1 e IgM2. Las implementaciones de la presente divulgación incluyen todas estas clases o isotipos de anticuerpos. La región constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda, p. ej., una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, regiones constantes de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu, p. ej., una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu humana. Por consiguiente, en diversas implementaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de isotipo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, incluyendo una cualquiera de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En diversos aspectos, el anticuerpo comprende una región constante que comprende una o más modificaciones de aminoácidos, con respecto a la contraparte natural, para mejorar la semivida/estabilidad o hacer que el anticuerpo sea más adecuado para su expresión/capacidad de fabricación. En diversos casos, el anticuerpo comprende una región constante en donde el residuo de Lys C-terminal que está presente en el homólogo de origen natural se elimina o se recorta.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. En algunas implementaciones, el anticuerpo comprende una secuencia que es sustancialmente similar a un anticuerpo de origen natural producido por un mamífero, p. ej., ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano y similares. A este respecto, el anticuerpo puede considerarse como un anticuerpo de mamífero, p. ej., un anticuerpo de ratón, anticuerpo de conejo, anticuerpo de cabra, anticuerpo de caballo, anticuerpo de pollo, anticuerpo de hámster, anticuerpo humano y similares. En ciertos aspectos, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo, tal como un anticuerpo humano. En ciertos aspectos, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene dominios de dos o más anticuerpos diferentes. Un anticuerpo quimérico puede, por ejemplo, contener los dominios constantes de una especie y los dominios variables de una segunda, o más generalmente, pueden contener tramos de secuencia de aminoácidos de al menos dos especies. Un anticuerpo quimérico también puede contener dominios de dos o más anticuerpos diferentes dentro de la misma especie. El término humanizado cuando se utiliza con relación a anticuerpos se refiere a anticuerpos que tienen al menos regiones CDR de una fuente no humana que se modifican por ingeniería genética para tener una estructura y función inmunológica más similar a los anticuerpos humanos verdaderos que los anticuerpos de la fuente original. Por ejemplo, la humanización puede implicar injertar una CDR de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de ratón, en un anticuerpo humano. La humanización también puede implicar seleccionar sustituciones de aminoácidos para hacer una secuencia no humana más similar a una secuencia humana. La información, incluyendo la información de secuencia para las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos humanos, está disponible públicamente a través de la base de datos Uniprot, así como otras bases de datos bien conocidas por los expertos en el campo de la ingeniería genética y producción de anticuerpos. Por ejemplo, la región constante de IgG2 está disponible en la base de datos Uniprot como número Uniprot P01859.
Un anticuerpo puede escindirse en fragmentos mediante enzimas, tales como, por ejemplo, papaína y pepsina. La papaína escinde un anticuerpo para producir dos fragmentos Fab y un único fragmento Fc. La pepsina escinde un anticuerpo para producir un fragmento F(ab')2 y un fragmento pFc'. En diversos aspectos de la presente divulgación, la proteína de unión a antígeno de la presente divulgación es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo (también conocido como fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, fragmento de unión a antígeno, porción de unión a antígeno). En diversos casos, el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno es un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2.
La arquitectura de los anticuerpos se ha explotado para crear un intervalo creciente de formatos de anticuerpos alternativos que abarca un intervalo de peso molecular de al menos aproximadamente 12-150 kDa y tiene un intervalo de valencia (n) de monomérico (n = 1), a dimérico (n = 2), a trimérico (n = 3), a tetramérico (n = 4) y potencialmente superior; tales formatos de anticuerpos alternativos se denominan en el presente documento "productos proteicos de anticuerpo". Los productos proteicos de anticuerpo incluyen aquellos basados en la estructura de anticuerpo completa y aquellos que imitan fragmentos de anticuerpo que conservan la capacidad de unión a antígeno completa, p. ej., scFv, Fab y VHH/VH (analizados a continuación). El fragmento de unión a antígeno más pequeño que conserva su sitio de unión a antígeno completo es el fragmento Fv, que consiste completamente en regiones variables (V). Se utiliza un conector peptídico de aminoácido flexible soluble para conectar las regiones V a un fragmento scFv (fragmento variable de cadena sencilla) para la estabilización de la molécula, o se añaden los dominios constantes (C) a las regiones V para generar un fragmento Fab [fragmento, unión a antígeno]. Tanto los fragmentos scFv como Fab pueden producirse fácilmente en células anfitrionas, p. ej., células anfitrionas procarióticas. Otros productos proteicos de anticuerpo incluyen scFv estabilizado con enlace disulfuro (ds-scFv), Fab de cadena sencilla (scFab), así como formatos de anticuerpo di- y multiméricos como di-, tri- y tetraanticuerpos o minianticuerpos (miniAb) que comprenden diferentes formatos que consisten en scFv conectados a dominios de oligomerización. Los fragmentos más pequeños son VHH/VH de Ab de cadena pesada de camélido, así como Ab de dominio único (sdAb). El elemento esencial que se utiliza más frecuentemente para crear formatos de anticuerpo novedosos es el fragmento de anticuerpo de dominio variable (V) de cadena sencilla (scFv), que comprende dominios V de la cadena pesada y ligera (dominio VH y VL) conectados por un conector peptídico de ~15 restos de aminoácidos. Un pepticuerpo o fusión péptido-Fc es otro producto proteico de anticuerpo. La estructura de un pepticuerpo consiste en un péptido biológicamente activo injertado en un dominio Fc. Los pepticuerpos están bien descritos en la técnica. Véase, p. ej., Shimamoto et al., mAbs 4(5): 586-591 (2012).
Otros productos proteicos de anticuerpo incluyen un anticuerpo de cadena sencilla (SCA); un dianticuerpo; un trianticuerpo; un tetraanticuerpo; anticuerpos biespecíficos o triespecíficos y similares. Los anticuerpos biespecíficos pueden dividirse en cinco clases principales: BsIgG, IgG anexada, fragmentos de anticuerpos biespecíficos (BsAb), proteínas de fusión biespecíficas y productos conjugados de BsAb. Véase, p. ej., Spiess et al., Molecular Immunology 67(2) Parte A: 97-106 (2015).
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno de la presente divulgación comprende, consiste esencialmente en o consiste en uno cualquiera de estos productos proteicos de anticuerpo. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno de la presente divulgación comprende, consiste esencialmente en o consiste en uno cualquiera de un fragmento scFv, Fab VHH/VH, Fv, ds-scFv, scFab, anticuerpo dimérico, anticuerpo multimérico (p. ej., un dianticuerpo, trianticuerpo, tetraanticuerpo), miniAb, pepticuerpo VHH/VH de anticuerpo de cadena pesada de camélido, sdAb, dianticuerpo; un trianticuerpo; un tetraanticuerpo; un anticuerpo biespecífico o triespecífico, BsIgG, IgG anexada, fragmento de BsAb, proteína de fusión biespecífica y producto conjugado de BsAb.
En diversos casos, la proteína de unión a antígeno de la presente divulgación es un producto proteico de anticuerpo en forma monomérica, o en forma polimérica, oligomérica o multimérica. En ciertas implementaciones en las que el anticuerpo comprende dos o más fragmentos de regiones de unión a antígeno distintos, el anticuerpo se considera biespecífico, triespecífico o multiespecífico, o bivalente, trivalente o multivalente, dependiendo del número de epítopos distintos que son reconocidos por el anticuerpo y que se unen al mismo.
En diversas implementaciones, un anticuerpo anti-CLDN6 o variante de anticuerpo del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo monomérico, un dianticuerpo, un trianticuerpo, un tetraanticuerpo, un fragmento Fab, un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3 y un anticuerpo IgG4.
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno de la presente divulgación está conectada a un agente terapéutico. Como se describe a continuación, el agente terapéutico puede ser cualquiera conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes quimioterapéuticos, citocinas y factores de crecimiento, agentes citotóxicos y similares. Véase"Productos conjugados"más abajo.
CLDN6 y epítopos
Las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CLDN6. En diversos aspectos, la CLDN6 es una CLDN6 humana que tiene la secuencia de aminoácidos de:
MASAGMQILGVVLTLLGWVNGLVSCALPMWKVTAFIGNSIVVAQVVWEGLWM SCVVQSTGQMQCKVYDSLLALPQDLQAARALCVIALLVALFGLLVYLAGAKCTT CVEEKDSKARLVLTSGIVFVISGVLTLIPVCWTAHAXIRDFYNPLVAEAQKRELG ASLYLGWAASGLLLLGGGLLCCTCPSGGSQGPSHYMARYSTSAPAISRGPSEY
PTKNYV, en donde X es Ile o Val (SEC ID NO: 202).
En diversos aspectos, la CLDN6 humana comprende la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de SEQ ID NO: 1, 178 y 200-202.
En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a un epítopo dentro de una secuencia de aminoácidos de CLDN6. En diversos aspectos, CLDN6 es una CLDN6 humana y las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a un epítopo dentro de una secuencia de aminoácidos de CLDN6 humana, p. ej., SEQ ID NO: 1, 178 y 200-202. Por "epítopo" se entiende la región de o dentro de CLDN6 que se une a la proteína de unión a antígeno. En algunas implementaciones, el epítopo es un epítopo lineal. "Epítopo lineal" se refiere a la región de o dentro de la CLDN6 que se une a la proteína de unión a antígeno y cuya región está compuesta por aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la CLDN6. Los aminoácidos de un epítopo lineal son adyacentes entre sí en la estructura primaria de la CLDN6. Por consiguiente, un epítopo lineal es un fragmento o porción de la secuencia de aminoácidos del antígeno, es decir, CLDN6. En otras diversas implementaciones, el epítopo es un epítopo conformacional o estructural. Por "epítopo conformacional" o "epítopo estructural" se entiende un epítopo que está compuesto por aminoácidos que están localizados muy próximos entre sí solo cuando la CLDN6 está en su estado plegado correctamente. A diferencia de los epítopos lineales, los aminoácidos de un epítopo conformacional o estructural no son adyacentes entre sí en la estructura primaria (es decir, la secuencia de aminoácidos) de la CLDN6. Un epítopo conformacional o estructural no está formado por aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos del antígeno (CLDN6).
En diversos aspectos, el epítopo se localiza dentro del dominio extracelular (ECD) de CLDN6, p. ej., CLDN6 humana. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno se une al Bucle Extracelular 2 (EL2) del ECD de CLDN6 que tiene la secuencia de aminoácidos de WTAHAIIRDFYNPLVAEAQKREL (SEQ ID NO: 2). En diversos aspectos, el epítopo al que se une la proteína de unión a antígeno está dentro de SEQ ID NO: 2. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno de la presente divulgación se une a una porción N-terminal de SEQ ID NO: 2, p. ej., TAHAIIRDFYNPL (SEQ ID NO: 3). En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno de la presente divulgación se une a una porción C-terminal de SEQ ID NO: 2, p. ej., LVAEAQKREL (SEQ ID NO: 4). En diversos casos, la proteína de unión a antígeno de la presente divulgación se une a EL2, pero no al Bucle Extracelular 1 (EL1) de CLDN6. En diversos aspectos, el epítopo o los epítopos a los que se unen las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación son diferente del epítopo unido al anticuerpo anti-CLDN6 que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 185 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 186. En diversos aspectos, el epítopo o los epítopos a los que se unen las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación son diferente del epítopo unido a un anticuerpo anti-CLDN6 que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 181 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 182.
En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno se unen a CLDN6 humana y a CLDN6 no humana. En diversos casos, la CLDN6 no humana es una CLDN6 de chimpancé, mono Rhesus, perro, vaca, ratón, rata, pez cebra o rana. En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno se unen a CLDN6 humana y CLDN6 de ratón.
Afinidad y avidez
Las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se unen a CLDN6 de una manera no covalente y reversible. En diversas implementaciones, la fuerza de unión de la proteína de unión a antígeno a CLDN6 puede describirse en términos de su afinidad, una medida de la fuerza de interacción entre el sitio de unión de la proteína de unión a antígeno y el epítopo. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento tienen alta afinidad por CLDN6 y, por tanto, se unirán a una mayor cantidad de CLDN6 en un período de tiempo más corto que las proteínas de unión a antígeno de baja afinidad. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno tiene una constante de asociación en equilibrio, Ka que es al menos 105 mol-1, al menos 106
mol'1, al menos 107 mol-1, al menos 108 mol-1, al menos 109 mol-1 o al menos 1010 mol-1 o al menos 1010 mol-1 menos 1010 mol-1. Como entiende el experto en la técnica, K<a>puede estar influenciada por factores que incluyen el pH, la temperatura y la composición del tampón.
En diversas implementaciones, la fuerza de unión de la proteína de unión a antígeno a CLDN6 se puede describir en términos de su sensibilidad. La Kd es la constante de disociación en equilibrio, una razón de koff/kon, entre la proteína de unión a antígeno y CLDN6. Kd y Ka están inversamente relacionadas. El valor de Kd se refiere a la concentración de la proteína de unión a antígeno (la cantidad de proteína de unión a antígeno necesaria para un experimento particular) y, por lo tanto, cuanto menor sea el valor de K<d>(concentración más baja) mayor es la afinidad de la proteína de unión a antígeno. En diversos aspectos, la fuerza de unión de la proteína de unión a antígeno a CLDN6 puede describirse en términos de K<d>. En diversos aspectos, la K<d>de las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en la presente memoria es aproximadamente 10-1, aproximadamente 10-2, aproximadamente 10-3, aproximadamente 10-4, aproximadamente 10-5, aproximadamente 10-6 o menos. En diversos aspectos, la Kd de las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento es micromolar, nanomolar, picomolar o femtomolar. En diversos aspectos, la Kd de las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento está dentro de un intervalo de aproximadamente 10-4 a 10-6 o de 10-7 a 10-9 o de 10-10 a 10-12 o de 10-13 a 10-15. En diversos aspectos, la Kd de las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento están dentro de un intervalo de aproximadamente 1,0 x 10-12 M a aproximadamente 1,0 x 10-8 M. En diversos aspectos, Kd de las proteínas de unión a antígeno está dentro de un intervalo de aproximadamente 1,0 x 10-11 M a aproximadamente 1,0 x 10-9 M.
En diversos aspectos, la afinidad de las proteínas de unión a antígeno se mide o clasifica utilizando un ensayo basado en citometría de flujo o Clasificación Celular Activada por Fluorescencia (FACS). Los ensayos de unión basados en citometría de flujo son conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., Cedeno-Arias et al., Sci Pharm 79(3): 569-581 (2011); Rathanaswami et al., Analytical Biochem 373: 52-60 (2008); y Geuijen et al., J Immunol Methods 302(1-2): 68-77 (2005). En diversos aspectos, la afinidad de las proteínas de unión a antígeno se mide o clasifica utilizando un ensayo de competición como describen Trikha et al., en Int J Cancer 110: 326-335 (2004) y Tam et al., en Circulation 98(11): 1085-1091 (1998), así como a continuación. Véase la sección titulada"Ensayos de competición”más abajo. Trikh et al., utilizaron células que expresaban el antígeno en un radioensayo. La unión de la proteína de unión al antígeno marcada con 125I (p. ej., anticuerpo) al antígeno de superficie celular se mide con las células en suspensión. En diversos aspectos, la afinidad relativa de un anticuerpo contra CLDN6 se determina mediante un ensayo basado en FACS en el que diferentes concentraciones de un anticuerpo contra CLDN6 conjugado con un fluoróforo se incuban con células que expresan CLDN6 y se determina la fluorescencia emitida (que es una medida directa de la unión anticuerpo-antígeno). Se realiza una curva que representa la fluorescencia para cada dosis o concentración. El valor máximo es la concentración más baja a la que la fluorescencia se estabiliza o alcanza un máximo, que es cuando se produce la saturación de la unión. La mitad del valor máximo se considera una CE50 o una CI50 y el anticuerpo con la CE50/CI50 más baja se considera que tiene la afinidad más alta con relación a otros anticuerpos sometidos a prueba de la misma manera. Tal ensayo se describe en el presente documento en el Ejemplo 5.
En diversos aspectos, el valor de CI50, como se determina en un ensayo de inhibición de unión competitiva, se aproxima a la K<d>de la proteína de unión al antígeno. En diversos casos, como se analiza a continuación, el ensayo de competición es un ensayo basado en FACS realizado con un anticuerpo de referencia, anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo y células que expresan CLDN6. En diversos aspectos, las células se modifican por ingeniería genética para expresar en exceso CLDN6. En algunos aspectos, las células son células HEK293T transducidas con un vector viral para expresar CLDN6. En aspectos alternativos, las células expresan endógenamente CLDN6. Antes de llevar a cabo el ensayo basado en FACS, en algunos aspectos, las células que expresan endógenamente CLDN6 se predeterminan como células con baja expresión de CLDN6 o células con alta expresión de CLDN6. En algunos aspectos, las células son células cancerosas o tumorales. En diversos aspectos, las células son células de una línea celular, p. ej., una línea celular ovárica, línea celular endometrial, línea celular de vejiga, línea celular pulmonar, línea celular gastrointestinal (GI), línea celular hepática, línea celular pulmonar y similares. En diversos aspectos, las células que expresan endógenamente CLDN6 se seleccionan del grupo que consiste en células ováricas OVCA429, células endometriales ARK2, células ováricas OAW28, células de vejiga UMUC-4, células ováricas PEO14, células ováricas OV177, células pulmonares H1693, células del tracto GI superior MKN7, células ováricas OV-90, células hepáticas HUH-7, células ováricas JHOS-4, células pulmonares H1435 y células del tracto GI superior NUGC3. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno inhibe la interacción de unión entre CLDN6 humana expresada por las células y el anticuerpo de referencia, cuyo anticuerpo de referencia se sabe que se une a CLDN6, pero no es una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación. En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación compiten con el anticuerpo de referencia por la unión a CLDN6 humana y, por lo tanto, reducen la cantidad de CLDN6 humana unida al anticuerpo de referencia según lo determinado por un ensayo de unión competitivain vitro.En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación inhiben la interacción de unión entre CLDN6 humana y el anticuerpo de referencia y la inhibición se caracteriza mediante una CI50. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 2500 nM para inhibir la interacción de unión entre CLDN6 humana y el anticuerpo de referencia. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 2000 nM, menos de aproximadamente 1500 nM, menos de aproximadamente 1000 nM, menos de aproximadamente 900 nm, menos de aproximadamente 800 nm, menos de aproximadamente 700 nm, menos de aproximadamente 600 nm, menos de aproximadamente 500 nm, menos de aproximadamente 400 nm, menos de aproximadamente 300 nm, menos de aproximadamente 200 nm, o menos de aproximadamente 100 nm. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 90 nM, menos de aproximadamente 80 nM, menos de aproximadamente 70 nM, menos de aproximadamente 60 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 40 nM, menos de aproximadamente 30 nM, menos de aproximadamente 20 nM o menos de aproximadamente 10 nM. En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación compiten contra un anticuerpo de referencia que se sabe que se une a CLDN6 (cuyo anticuerpo de referencia es diferente de cualquiera de las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación) por la unión a CLDN6. Véase la descripción adicional a continuación enEnsayos de competición.
La avidez da una medida de la fuerza global de un complejo anticuerpo-antígeno. Depende de tres parámetros principales: afinidad de la proteína de unión a antígeno por el epítopo, valencia tanto de la proteína de unión al antígeno como de CLDN6, y disposición estructural de las partes que interaccionan. Cuanto mayor sea la valencia de una proteína de unión a antígeno (número de sitios de unión a antígeno), mayor será la cantidad de antígeno (CLDN6) a la que se puede unir. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno tienen una fuerte avidez por CLDN6. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno son multivalentes. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno son bivalentes. En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno de antígeno son monovalentes.
Reactividad cruzada
En diversas implementaciones, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CLDN6 y no se unen a ningún otro miembro de la familia de CLDN, p. ej., no reaccionan de manera cruzada con ningún otro miembro de la familia de CLDN. En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación son específicas de CLDN-6. En diversas implementaciones, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación tienen una selectividad para CLDN6 que es al menos 10 veces, 5 veces, 4 veces, 3 veces, 2 veces mayor que la selectividad de la proteína de unión a antígeno para CLDN3, CLDN4, CLDN9 o una combinación de las mismas. En diversas implementaciones, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación tienen una selectividad para CLDN6 que es al menos 10 veces, 5 veces, 4 veces, 3 veces, 2 veces mayor que la selectividad de la proteína de unión a antígeno para cada uno de CLDN3, CLDN4 y CLDN9. La selectividad puede basarse en la K<d>mostrada por la proteína de unión al antígeno para CLDN6, o un miembro de la familia CLDN, en donde la K<d>se puede determinar mediante mecanismos conocidos en la técnica, p. ej., resonancia de plasmón superficial, ensayos de afinidad basados en FACS.
En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CLDN6 y no se unen a ninguna de Claudina3 (CLDN3), Claudina4 (CLDN4) y Claudina9 (CLDN9). En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno no se unen a ninguna de CLDN3, CLDN4 y CLDN9 y exhiben una CI50 de menos de aproximadamente 1200 nM (p. ej., menos de aproximadamente 1000 nM, menos de aproximadamente 750 nM, menos de aproximadamente 500 nM, menos de aproximadamente 250 nM) en un ensayo basado en FACS con células OVCA429 que expresan endógenamente CLDN6. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno no se unen a ninguna de CLDN3, CLDN4 y CLDN9 y la concentración a la que se logra 50% de saturación de unión con células OVCA429 que expresan endógenamente CLDN6 es menor de aproximadamente 1200 nM (p. ej., menor de aproximadamente 1000 nM, menor de aproximadamente 750 nM, menor de aproximadamente 500 nM, menor de aproximadamente 250 nM). En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran al menos una selectividad de 5 veces para CLDN 6 mayor que para CLDN3, CLDN4 y CLDN9 y la concentración a la que se logra 50% de saturación de unión con células OVCA429 que expresan endógenamente CLDN6 es menor de aproximadamente 1200 nM (p.ej. menor de aproximadamente 1000 nM, menor de aproximadamente 750 nM, menor de aproximadamente 500 nM, menor de aproximadamente 250 nM). En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 1200 nM (p. ej., menos de aproximadamente 1000 nM, menos de aproximadamente 750 nM, menos de aproximadamente 500 nM, menos de aproximadamente 250 nM) para modelos artificiales y endógenos de CLDN6 y muestran una razón mayor de aproximadamente 5 veces que separa las CI50 de CLDN6 de CLDN3, CLDN4 y/o CLDN9. En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 1200 nM (p. ej., menos de aproximadamente 1000 nM, menos de aproximadamente 750 nM, menos de aproximadamente 500 nM, menos de aproximadamente 250 nM) para CLDN6 y muestran una CI50 para una cualquiera de CLDN3, CLDN4 y CLDN9 al menos 5 veces mayor que la CI50.
En diversas implementaciones, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CLDN6 y reaccionan de manera cruzada con (p. ej., se unen a) al menos otro miembro de la familia CLDN. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CLDN6 y una o más de CLDN3, CLDN4 y CLDN9. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CLDN6 y CLDN4 o CLDN9, pero no se unen a CLDN3. En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CLDN6 y CLDN4, pero no se unen ni a CLDN3 ni a CLDN9. En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CLDN6 y CLDN9, pero no se unen a CLDN3 o CLDN4.
Ensayos de competición
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno inhibe una interacción de unión entre CLDN6 humana y un anticuerpo de referencia, cuyo anticuerpo de referencia se sabe que se une a CLDN6, pero no es una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación. En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación compiten con el anticuerpo de referencia por la unión a CLDN6 humana y, por lo tanto, reducen la cantidad de CLDN6 humana unida al anticuerpo de referencia según lo determinado por un ensayo de unión competitivain vitro.En diversas implementaciones, el anticuerpo de referencia se une a un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CLDN6 humana, opcionalmente, dentro de EL2 o EL1. En diversos aspectos, el anticuerpo de referencia comprende una secuencia variable de cadena ligera codificada por SEQ ID NO: 179 y una secuencia variable de cadena pesada codificada por SEQ ID NO: 180. En diversos aspectos, el anticuerpo de referencia comprende una secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 181 y una secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 182. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación inhiben la interacción de unión entre CLDN6 humana y el anticuerpo de referencia y la inhibición se caracteriza por una CI50. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 2500 nM para inhibir la interacción de unión entre CLDN6 humana y el anticuerpo de referencia. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 2000 nM, menos de aproximadamente 1500 nM, menos de aproximadamente 1000 nM, menos de aproximadamente 900 nm, menos de aproximadamente 800 nm, menos de aproximadamente 700 nm, menos de aproximadamente 600 nm, menos de aproximadamente 500 nm, menos de aproximadamente 400 nm, menos de aproximadamente 300 nm, menos de aproximadamente 200 nm, o menos de aproximadamente 100 nm. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 90 nM, menos de aproximadamente 80 nM, menos de aproximadamente 70 nM, menos de aproximadamente 60 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 40 nM, menos de aproximadamente 30 nM, menos de aproximadamente 20 nM o menos de aproximadamente 10 nM.
En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación compiten con el anticuerpo de referencia por la unión a CLDN6 humana y, por lo tanto, reducen la cantidad de CLDN6 humana unida al anticuerpo de referencia según lo determinado por un ensayo de unión competitivain vitro.En diversos aspectos, el ensayo de unión competitivain vitroes un ensayo basado en FACS en el que se mide la fluorescencia de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo que se une al Fc del anticuerpo de referencia en ausencia o presencia de una cantidad particular de la proteína de unión a antígeno de la presente divulgación. Tal ensayo basado en FACS se describe en el presente documento en los EJEMPLOS. En diversos aspectos, el ensayo basado en FACS se lleva a cabo con el anticuerpo de referencia, anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo y células que expresan CLDN6. En diversos aspectos, las células se modifican por ingeniería genética para expresar en exceso CLDN6. En algunos aspectos, las células son células HEK293T transducidas con un vector viral para expresar CLDN6. En aspectos alternativos, las células expresan endógenamente CLDN6. Antes de llevar a cabo el ensayo basado en FACS, en algunos aspectos, las células que expresan endógenamente CLDN6 se predeterminan como células con baja expresión de CLDN6 o células con alta expresión de CLDN6. En algunos aspectos, las células son células cancerosas o tumorales. En diversos aspectos, las células son células de una línea celular, p. ej., una línea celular ovárica, línea celular endometrial, línea celular de vejiga, línea celular pulmonar, línea celular gastrointestinal (GI), línea celular hepática, línea celular pulmonar y similares. En diversos aspectos, las células que expresan endógenamente CLDN6 se seleccionan del grupo que consiste en células ováricas OVCA429, células endometriales ARK2, células ováricas OAW28, células de vejiga UMUC-4, células ováricas PEO14, células ováricas OV177, células pulmonares H1693, células del tracto GI superior MKN7, células ováricas OV-90, células hepáticas HUH-7, células ováricas JHOS-4, células pulmonares H1435 y células del tracto GI superior NUGC3. En diversos casos, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CLDN6 expresada endógenamente por una o más de células ARK2, células OVCA429, células LS513 o células MCF7 con alta afinidad. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 3000 nM, según se determina en un ensayo de inhibición de la unión competitiva basado en FACS utilizando una o más de células ARK2, células OVCA429, células LS513 o células MCF7. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 2500 nM, menos de aproximadamente 2000 nM, menos de aproximadamente 1750 nM, menos de aproximadamente 1500 nM, menos de aproximadamente 1250 nM, menos de aproximadamente 1000 nM, menos de aproximadamente 750 nM o menos de aproximadamente 500 nM, como se determina en un ensayo de inhibición de unión competitiva basado en FACS utilizando una o más de células ARK2, células OVCA429, células LS513 o células MCF7. En diversos aspectos, las proteínas de unión a antígeno muestran una CI50 de menos de aproximadamente 400 nM, menos de aproximadamente 300 nM, menos de aproximadamente 200 nM, menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 75 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 25 nM o menos de aproximadamente 10 nM, como se determina en un ensayo de inhibición de unión competitiva basado en FACS utilizando una o más de células ARK2, células OVCA429, células LS513 o células MCF7.
Otros ensayos de unión, p. ej., ensayos de unión competitiva o ensayos de competición, que someten a prueba la capacidad de un anticuerpo para competir con un segundo anticuerpo por la unión a un antígeno, o a un epítopo del mismo, se conocen en la técnica. Véanse, p. ej., Trikha et al., Int J Cancer 110: 326-335 (2004); Tam et al., Circulation 98 (11): 1085-1091 (1998).). Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Núm. US20140178905, Chand et al., Biologicals 46: 168-171 (2017); Liu et al., Anal Biochem 525: 89-91 (2017 y Goolia et al., J Vet Diagn Invest 29(2): 250-253 (2017).). Asimismo, se conocen en la técnica otros métodos de comparación de dos anticuerpos, e incluyen, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial (SPR). La SPR se puede utilizar para determinar las constantes de unión del anticuerpo y el segundo anticuerpo y se pueden comparar las dos constantes de unión.
Métodos de producción de anticuerpos y métodos relacionados
Los métodos adecuados para preparar proteínas de unión a antígeno (p. ej., anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno y productos proteicos de anticuerpo) se conocen en la técnica. Por ejemplo, los métodos de hibridoma convencionales para producir anticuerpos son descritos, p. ej., por Harlow y Lane (eds.), en Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988- y CA. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5a ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)). En los EJEMPLOS se proporciona en el presente documento un método diverso de preparación de anticuerpos monoclonales contra CLDN6 de la presente divulgación.
Dependiendo de la especie anfitriona, se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica que conduce a una mayor producción de anticuerpos por el anfitrión. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. Los BCG (bacilos Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son adyuvantes humanos potencialmente útiles.
Otros métodos de producción de anticuerpos se resumen en la Tabla 1.
TABLA 1
Los métodos para someter a prueba la capacidad de los anticuerpos para unirse al epítopo de CLDN6 independientemente de cómo se produzcan los anticuerpos son conocidos en la técnica e incluyen cualquier ensayo de unión anticuerpo-antígeno, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, SPR y ensayos de inhibición competitiva (véanse, p. ej., Janeway et al., más abajo, y Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2002/0197266, y la sección anterior relativa a ensayos de competición).
Secuencias/ Estructura
En el presente documento se proporcionan proteínas de unión a antígeno que comprenden (a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de la cadena pesada (HC) expuesta en la Tabla A o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 11, 17, 23, 29, 35, 41,47, 53, 59, 65, 71,77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125 y 131, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC expuesta en la Tabla A o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 86, 102, 108, 114, 120, 126 y 132, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC expuesta en la Tabla A o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127 y 133, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) expuesta en la Tabla A o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 8, 14, 20, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122 y 128, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC expuesta en la Tabla A o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 9, 15, 21,27, 33, 39, 45, 51,57, 63, 69, 75, 81,87, 93, 99, 105, 111, 117, 123 y 129, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC expuesta en la Tabla A o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124 y 130, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos o más cualesquiera de (a)-(f).
TABLA A
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de LC, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC expuestas en la Tabla A y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC expuestas en la Tabla A. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de HC, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC expuestas en la Tabla A y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC expuestas en la Tabla A.
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende al menos 3, 4 o 5 de las secuencias de aminoácidos designadas por SEQ ID NO: en una única fila de la Tabla A. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende cada una de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC designadas por SEQ ID NO: en una única fila de la Tabla A. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende cada una de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende las 6 secuencias de aminoácidos de CDR designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende seis secuencias de aminoácidos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 74-79; (b) SEQ ID NO: 50-55; (c) SEQ ID NO: 122-127; (d) SEQ ID NO: 26-31; (e) SEQ ID NO: 128-133; (f) SEQ ID NO: 38-43; (g) SEQ ID NO: 62-67; (h) SEQ ID NO: 80-85; (i) SEQ ID NO: 44-49; (j) SEQ ID NO: 86-91; (k) SEQ ID NO: 104-109; (l) SEQ ID NO: 56-61; (m) SEQ ID NO: 32-37; (n) SEQ ID NO: 110-115; (o) SEQ ID NO: 98-103; (p) SEQ ID NO: 92-97; (q) SEQ ID NO: 116-121; (r) SEQ ID NO: 8-13; (s) SEQ ID NO: 68-73; (t) SEQ ID NO: 14-19; y (u) SEQ ID NO: 20-25.
En diversos casos, las secuencias de aminoácidos de la Tabla A están separadas por al menos uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) aminoácidos intermedios. En diversos casos, hay de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos entre las secuencias de la CDR1 de LC y la CDR2 de LC y de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 aminoácidos entre las secuencias de la CDR2 de LC y la CDR3 de LC. En diversos casos, hay de aproximadamente 14 a aproximadamente 16 aminoácidos entre las secuencias de la CDR1 de LC y la CDR2 de LC y de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 aminoácidos entre las secuencias de la CDR2 de LC y la CDR3 de LC. En diversos casos, hay de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos entre las secuencias de la CDR1 de HC y la CDR2 de HC y de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 aminoácidos entre las secuencias de la CDR2 de HC y la CDR3 de HC. En diversos casos, hay de aproximadamente 14 a aproximadamente 16 aminoácidos entre las secuencias de la CDR1 de HC y la CDR2 de HC y de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 aminoácidos entre las secuencias de la CDR2 de HC y la CDR3 de HC.
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada expuesta en la Tabla B o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171,173 y 175, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera expuesta en la Tabla B o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174 y 176, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b).
TABLA B
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 156 y 157; (b) SEQ ID NO: 148 y 149; (c) SEQ ID NO: 172 y 173; (d) SEQ ID NO: 140 y 141; (e) SEQ ID NO: 174 y 175; (f) SEQ ID NO: 144 y 145; (g) SEQ ID NO: 152 y 153; (h) SEQ ID NO: 158 y 159; (i) SEQ ID NO: 146 y 147; (j) SEQ ID NO: 160 y 161; (k) SEQ ID NO: 166 y 167; (l) SEQ ID NO: 150 y 151; (m) SEQ ID NO: 142 y 143; (n) SEQ ID NO: 168 y 169; (o) SEQ ID NO: 164 y 165; (p) SEQ ID NO: 162 y 163; (q) SEQ ID NO: 170 y 171; (r) SEQ ID NO: 134 y 135; (s) SEQ ID NO: 154 y 155; (t) SEQ ID NO: 136 y 137; y (u) SEQ ID NO: 138 y 139.
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno no comprende un par de secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de SEQ ID NO: 179 y 180. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno no comprende un par de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 y 182. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno no comprende un par de secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de SEQ ID NO: 183 y 184. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno no comprende un par de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 y 186.
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es similar a una secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente, aunque la proteína de unión a antígeno conserva sustancialmente su función biológica, p. ej., su capacidad para unirse a CLDN6 humana, reducir el crecimiento tumoral, tratar el cáncer.
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en solo 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más aminoácidos, con relación a la secuencia o secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia variante de la secuencia mencionada, cuya secuencia variante difiere en solo uno o dos aminoácidos, con relación a la secuencia mencionada. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que se producen fuera de las CDR, p. ej., las una o más sustituciones de aminoácidos se producen dentro de la región o regiones marco de la cadena pesada o ligera. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una o más sustituciones de aminoácidos, pero la proteína de unión a antígeno conserva las secuencias de aminoácidos de las seis CDR. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene solo 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más sustituciones de aminoácidos conservativas, con relación a la secuencia o secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas. Como se emplea en el presente documento, la expresión "sustitución de aminoácido conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, p. ej., tamaño, carga, carácter hidrófobo, carácter hidrófilo y/o aromaticidad, e incluye intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:
I. Restos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. Restos polares cargados negativamente y sus amidas y ésteres: Asp, Asn, Glu, Gln, ácido cisteico y ácido homocisteico;
III. Restos polares cargados positivamente: His, Arg, Lys; ornitina (Orn);
IV. Restos grandes, alifáticos, no polares: Met, Leu, Ile, Val, Cys, Norleucina (Nle), homocisteína;
V. Restos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina.
En diversos aspectos, la sustitución de aminoácidos conservativa es un intercambio dentro de uno de los siguientes grupos de aminoácidos:
I. aminoácidos alifáticos: Gly, Ala, Val, Leu, Ile
II. aminoácidos no aromáticos que comprenden un hidroxilo de cadena lateral: Ser, Thr
III. aminoácidos que comprenden una cadena lateral de azufre: Cys, Met
IV: aminoácidos que comprenden un anillo aromático en la cadena lateral: Phe, Tyr, Trp
V: aminoácido ácido: Glu; Asp
VI: aminoácido alcalino: Arg; Lys
VII: aminoácido que comprende una amida en la cadena lateral: Gln, Asn
VIII: aminoácido que comprende un imidazol de cadena lateral: His, ácido alfa-dimetil imidazol acético (DMIA)
IX: iminoácido: Pro, 4-hidroxi-Pro, 4-amino-Pro
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene más de o aproximadamente 30%, más de o aproximadamente 50%, o más de o aproximadamente 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o tiene más del 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o tiene más de un 90% de identidad de secuencia a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente.
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia variante de la secuencia mencionada, cuya secuencia variante tiene al menos o aproximadamente 70% de identidad de secuencia, con respecto a la secuencia mencionada anteriormente. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia variante de la secuencia mencionada, cuya secuencia variante tiene al menos o aproximadamente 80% de identidad de secuencia, con respecto a la secuencia mencionada anteriormente. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia variante de la secuencia mencionada, cuya secuencia variante tiene al menos o aproximadamente 90% de identidad de secuencia, con respecto a la secuencia mencionada anteriormente. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia variante de la secuencia mencionada, cuya secuencia variante tiene al menos o aproximadamente 95% de identidad de secuencia, con respecto a la secuencia mencionada anteriormente.
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende una, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de SEQ ID NO en una única fila de la Tabla A y al menos una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 8-133. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende una, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de un conjunto de secuencias seleccionadas de: (a) SEQ ID NO: 74-79; (b) SEQ ID NO: 50-55; (c) SEQ ID NO: 122-127; (d) SEQ ID NO: 26-31; (e) SEQ ID NO: 128-133; (f) SEQ ID NO: 38-43; (g) SEQ ID NO: 62-67; (h) SEQ ID NO: 80-85; (i) SEQ ID NO: 44-49; (j) SEQ ID NO: 86-91; (k) SEQ ID NO: 104-109; (l) SEQ ID NO: 56-61; (m) SEQ ID NO: 32-37; (n) SEQ ID NO: 110-115; (o) SEQ ID NO: 98-103; (p) SEQ ID NO: 92-97; (q) SEQ ID NO: 116 121; (r) SEQ ID NO: 8-13; (s) SEQ ID NO: 68-73; (t) SEQ ID NO: 14-19; y (u) SEQ ID NO: 20-25, en donde la proteína de unión a antígeno comprende adicionalmente al menos una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias del conjunto. Por ejemplo, en diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende cuatro secuencias de SEQ ID NO: 74-79, concretamente, SEQ ID NO: 74-77, en donde la proteína de unión a antígeno comprende dos secuencias variantes: una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 78 y otra secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 79.
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende un par de secuencias variantes que tienen al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 134-175. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende un par de secuencias variantes que tienen al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con (a) SEQ ID NO: 156 y 157; (b) SEQ ID NO: 148 y 149; (c) SEQ ID NO: 172 y 173; (d) SEQ ID NO: 140 y 141; (e) SEQ ID NO: 174 y 175; (f) SEQ ID NO: 144 y 145; (g) SEQ ID NO: 152 y 153; (h) SEQ ID NO: 158 y 159; (i) SEQ ID NO: 146 y 147; (j) SEQ ID NO: 160 y 161; (k) SEQ ID NO: 166 y 167; (l) SEQ ID NO: 150 y 151; (m) SEQ ID NO: 142 y 143; (n) SEQ ID NO: 168 y 169; (o) SEQ ID NO: 164 y 165; (p) SEQ ID NO: 162 y 163; (q) SEQ ID NO: 170 y 171; (r) SEQ ID NO: 134 y 135; (s) SEQ ID NO: 154 y 155; (t) SEQ ID NO: 136 y 137; y (u) SEQ ID NO: 138 y 139. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende un par de secuencias: una secuencia de la Tabla B y otra secuencia que es una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 134-175. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende un par de secuencias: una secuencia seleccionada entre (a) SEQ ID NO: 156 y 157; (b) SEQ ID NO: 148 y 149; (c) SEQ ID NO: 172 y 173; (d) SEQ ID NO: 140 y 141; (e) SEQ ID NO: 174 y 175; (f) SEQ ID NO: 144 y 145; (g) SEQ ID NO: 152 y 153; (h) SEQ ID NO: 158 y 159; (i) SEQ ID NO: 146 y 147; (j) SEQ ID NO: 160 y 161; (k) SEQ ID NO: 166 y 167; (l) SEQ ID NO: 150 y 151; (m) SEQ ID NO: 142 y 143; (n) SEQ ID NO: 168 y 169; (o) SEQ ID NO: 164 y 165; (p) SEQ ID NO: 162 y 163; (q) SEQ ID NO: 170 y 171; (r) SEQ ID NO: 134 y 135; (s) SEQ ID NO: 154 y 155; (t) SEQ ID NO: 136 y 137; y (u) SEQ ID NO: 138 y 139, y otra secuencia que es una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con una secuencia de (a) - (u). Por ejemplo, en diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de SEQ ID NO: 134 y la proteína de unión a antígeno comprende adicionalmente una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO 135.
En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente con una o más sustituciones de aminoácidos para reducir o eliminar aminoácidos reactivos para disminuir o prevenir reacciones de cadena lateral no deseadas. Por ejemplo, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente con uno o más (i) restos de Trp sustituidos por His, Tyr o Phe; (ii) restos de Asn sustituidos por Gln, Ser, Ala o Asp; (iii) restos de Asp que aparecen inmediatamente antes de un resto de Pro sustituido por Ala, Ser o Glu, (iv) restos de Asn sustituidos por Gln, Ser o Ala; y/o (v) restos de Cys sustituidos por Tyr, Ser o Ala. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente con una sustitución de aminoácidos que se pronostica que tiene mayor afinidad de unión, mayor estabilidad u otro atributo positivo, basándose en eventos de SHM o basándose en análisis estadísticos de una multitud de otras secuencias de anticuerpos similares. En algunos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de HC expuesta en la Tabla A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 452, 455, 461,465, 71 y 472, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70 (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC expuesta en la Tabla A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 475, 456, 462, 466, 468 y 473; o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC expuesta en la Tabla A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 453, 457, 463, 467, 469 y 474; o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de LC expuesta en la Tabla A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 449, 476, 458, 464, 68 y 470; o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC expuesta en la Tabla A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 450, 477, 459, 57, 69 y 471; o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC expuesta en la Tabla A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 451,454, 460, 58, 70 y 112, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p.ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia o (g) una combinación de dos o más cualesquiera de (a)-(f).
Tabla A1
En algunos aspectos, la CDR1 de HC comprende Gly inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 452 y, opcionalmente, en algunos aspectos, la CDR1 de HC comprende MX inmediatamente C-terminal de SEQ 452, en donde X es H, N o S. En diversos aspectos, la CDR3 de HC comprende Ala inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 453. En diversos aspectos, la CDR1 de LC comprende adicionalmente TAS inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 449 y, opcionalmente, XH inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 449, en donde X es H, S, Y o Q. En algunos aspectos, como se describe a continuación, el primer aminoácido de SEQ ID NO: 449 es S o Q. En algunos aspectos, como se describe a continuación, el primer aminoácido de SEQ ID NO: 451 es S o Q.
En diversos aspectos, la CDR1 de HC comprende Gly inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 455 y, opcionalmente, en diversos aspectos, la CDR1 de HC comprende MX inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 455, en donde X es N, S o H. En algunos aspectos, la CDR2 de HC comprende Gln inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 456 y, opcionalmente, H inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 456. En diversos aspectos, la CDR1 de LC comprende RIS inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 476, y opcionalmente, comprende LA inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 476. En diversos aspectos, la CDR2 de LC comprende XLVE inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 477, en donde X es I o S.
En diversos aspectos, la CDR1 de HC comprende MH inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 461. En diversos aspectos, la CDR2 de HC comprende Tyr inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 462, y opcionalmente, TH inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 462. En aspectos ilustrativos, la CDR3 de HC no incluye los dos primeros aminoácidos de SEQ ID NO: 463. En diversos aspectos, la CDR1 de LC comprende RSS inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 458, y opcionalmente, LN inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 458. En diversos aspectos, la CDR2 de LC comprende XRFS inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 459, en donde X es Q, S, A o D.
En diversos aspectos, la CDR1 de HC comprende MH inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 465. En diversos aspectos, la CDR2 de HC comprende YI inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 466 y, opcionalmente, Xaa inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 466, en donde Xaa es N, S, Q o A. En diversos aspectos, la CDR1 de LC comprende LAS inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 464 y, opcionalmente, LA inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 464. En diversos aspectos, la CDR2 de LC comprende S<l>AD inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 57.
En diversos aspectos, la CDR1 de HC comprende MH inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 71. En diversos aspectos, la CDR2 de HC comprende Tyr inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 468 y opcionalmente IY inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 468. En diversos aspectos, la CDR1 de LC comprende RAS inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 68, y opcionalmente SYIH inmediatamente C-terminal de SEQ 68. En diversos aspectos, la CDR2 de LC comprende XLES inmediatamente C-terminal con respecto a SEQ ID NO: 69, en donde X es N, Q, S, A o D.
En diversos aspectos, la CDR1 de LC comprende KSS inmediatamente N-terminal de SEQ ID NO: 470, y opcionalmente YLA inmediatamente C-terminal de SEQ 470. En diversos aspectos, la CDR2 de LC comprende TRES inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 471. En diversos aspectos, la CDR1 de HC comprende MN inmediatamente C-terminal de SEQ ID NO: 472. En diversos aspectos, la CDR2 de HC comprende Xaa inmediatamente N-terminal de SEQ 473, en donde Xaa es N, Q, S o A, y opcionalmente, Thr inmediatamente C-terminal de SEQ 473.
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de LC, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC expuestas en la Tabla A1 y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC expuestas en la Tabla A1. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de HC, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC expuestas en la Tabla A1 y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC expuestas en la Tabla A1.
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende al menos 3, 4 o 5 de las secuencias de aminoácidos designadas por SEQ Id NO: en una única fila de la Tabla A1. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende cada una de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A1 y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A1. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende cada una de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A1 y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A1. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende las 6 secuencias de aminoácidos de CDR designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A1. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende seis secuencias de aminoácidos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 449-453 y 475; (b) SEQ ID NO: 476-477, 454-457; (c) SEQ ID NO: 458-463; (d) SEQ ID NO: 57, 58, 464-467; (e) SEQ ID NO: 68-71 y 468-469; y (f) SEQ ID NO: 112 y 470-474.
En diversos casos, las secuencias de aminoácidos de la Tabla A1 están separadas por al menos uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) aminoácidos intermedios. En diversos casos, hay de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos entre las secuencias de la CDR1 de LC y la CDR2 de LC y de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 aminoácidos entre las secuencias de la CDR2 de LC y la CDR3 de LC. En diversos casos, hay de aproximadamente 14 a aproximadamente 16 aminoácidos entre las secuencias de la CDR1 de LC y la CDR2 de LC y de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 aminoácidos entre las secuencias de la CDR2 de LC y la CDR3 de LC. En diversos casos, hay de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos entre las secuencias de la CDR1 de HC y la CDR2 de HC y de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 aminoácidos entre las secuencias de la CDR2 de HC y la CDR3 de HC. En diversos casos, hay de aproximadamente 14 a aproximadamente 16 aminoácidos entre las secuencias de la CDR1 de HC y la CDR2 de HC y de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 aminoácidos entre las secuencias de la CDR2 de HC y la CDR3 de HC.
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada expuesta en la Tabla B1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 478, 480, 482, 484, 486 y 488, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera expuesta en la Tabla B1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 479, 481,483, 485, 487 y 489, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b).
Tabla B1
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 478 y 479; (b) SEQ ID NO: 480 y 481; (c) SEQ ID NO: 482 y 483; (d) SEQ ID NO: 484 y 485; (e) SeQ ID NO: 486 y 487; y (f) SEQ ID NO: 488 y 489. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia variante de una secuencia que tiene un SEQ ID NO: enumerado en la Tabla B1 que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia, en donde los diferentes aminoácidos se aparecen en las posiciones descritas a continuación en "Anticuerpos humanizados".
Anticuerpos humanizados
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de una proteína de unión a antígeno descrita en la Tabla A, Tabla A1, Tabla B o Tabla B1.
AB1 humanizado
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB1 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35) sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena pesada en una o más de las siguientes posiciones: 5, 8, 11, 12, 13, 20, 31,33, 35, 38, 40, 48, 50, 55, 57, 59, 61,65, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 80, 82, 87, 90, 91,98, 101 y 116. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 428. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB1 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena pesada en una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) de las siguientes posiciones: 20, 31,35, 48, 50, 59, 67, 70, 74, 79, 98, 101. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 429. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB1 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena ligera en una o más, p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o 41) de las siguientes posiciones: 1, 3, 4, 9, 10, 11, 15, 17, 21, 24, 27, 29, 32, 34, 35, 43, 44, 48, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 61, 67, 71,72, 73, 79, 80, 81, 84, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 101, 107. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 430. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB1 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena ligera en una o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13) de las siguientes posiciones: 4, 21,32, 34, 48, 51,53, 61,67, 79, 84, 91 y 93. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 431. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
AB3 humanizado
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB3 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena pesada en una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32 o 33) de las siguientes posiciones: 3, 5, 18, 19, 23, 31,33, 35, 40, 42, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61,64, 76, 79, 80, 81, 87, 94, 95, 99, 106, 112, 114. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 432. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB3 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena pesada en una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7) de las siguientes posiciones: 31,35, 50, 55, 79, 99, 106. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 433. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB3 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena ligera en una o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) de las siguientes posiciones: 9, 17, 18, 25, 27, 28, 30, 34, 40, 43, 45, 48, 50, 52, 53, 55, 56, 70, 72, 74, 76, 84, 85, 90, 91,93, 94, 97 y 100. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 434. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB3 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena ligera en una o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9) de las siguientes posiciones: 25, 34, 48, 53, 55, 84, 85, 90 y 93. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 435. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
AB4 humanizado
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB4 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena pesada en una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35 o 36 de las siguientes posiciones: 5, 11, 12, 13, 20, 29, 31,33, 37, 38, 40, 45, 48, 50, 55, 56, 57, 59, 61,62, 65, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 82, 84, 87, 91, 97, 101, 117. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 436. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB4 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena pesada en una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19) de las siguientes posiciones: 20, 29, 31,37, 45, 48, 56 , 59, 61,62, 65, 66, 68, 70, 74, 79, 84, 97 y 101. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 437. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB4 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena ligera en una o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24) de las siguientes posiciones: 7, 14, 17, 18, 31,33, 39, 41,42, 44, 50, 51,55, 57, 60, 81,88, 92, 94, 95, 96, 99, 100, 105. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 438. En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB4 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena ligera en una o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7) de las siguientes posiciones: 33, 39, 55, 57, 81, 95 y 96. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 439. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
AB18 humanizado
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB18 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena pesada en una o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25) de las siguientes posiciones: 5, 9, 11, 12, 20, 38, 40, 41,43, 44, 48, 61, 65, 67, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 82, 84, 87, 91 y 116, opcionalmente, una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4 o 5) de las siguientes posiciones: 20, 48, 68, 70, 79. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 440 o 441. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB18 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena ligera en una o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16) de las siguientes posiciones: 1,3, 9, 15, 18, 19, 21,22, 49, 51,69, 93, 84, 78, 105 y 111, opcionalmente, una o más (p. ej., 1,2 o 3) de las siguientes posiciones: 19, 21 u 84. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 442 o 443. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
AB9 humanizado
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB9 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena pesada en una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) de las siguientes posiciones: 1, 5, 9, 11, 12, 20, 38, 40, 41,43, 44, 48, 61, 63, 65, 67, 69, 70, 72, 73, 74, 76, 79, 84, 87, 91, 93, 112 y 113. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 444. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB9 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena ligera en una o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15) de las siguientes posiciones: 9, 11, 15, 17, 18, 43, 45, 70, 72, 73, 74, 80, 84, 85 y 100. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 445. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
AB11 humanizado
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB11 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena pesada en una o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15) de las siguientes posiciones: 1, 15, 18, 19, 42, 49, 63, 75, 76, 78, 80, 84, 88 y 93. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 446. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una versión humanizada de AB11 como se expone en la Tabla B o B1 con una o más sustituciones de aminoácidos en la región variable de cadena ligera en una o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15) de las siguientes posiciones: 4, 9, 17, 22, 64, 78, 80, 81,82, 83, 84, 87, 89, 104 y 110, opcionalmente, una o más de las siguientes posiciones: 4, 82, 110. En diversos casos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 447 o 448. En diversos aspectos, los aminoácidos en las posiciones mencionadas anteriormente se seleccionan entre los aminoácidos según la tabla siguiente:
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada expuesta en la Tabla C o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 376-379, 384-387, 391 -396, 403-408, 412, 413, 416-419 y 422-427 o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70%, o aproximadamente 80%, o aproximadamente 85%, o aproximadamente 90%, o aproximadamente 95% de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera expuesta en la Tabla C o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 380-383, 388-390, 397-402, 409-411,414, 415, 420 y 421 o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70%, o aproximadamente 80%, o aproximadamente 85%, o aproximadamente 90%, o aproximadamente 95% de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b).
TABLA C
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno humanizada comprende un par de secuencias de aminoácidos como se muestra en la Tabla D.
TABLA D
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende un par de secuencias variantes, teniendo cada una al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con un SEQ ID NO: enumerado en la Tabla C. En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende un par de secuencias: una secuencia seleccionada entre un SEQ ID NO: enumerado en la Tabla C y otra secuencia que es una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con una secuencia que tiene un SEQ ID NO: enumerado en la Tabla D una secuencia que tiene un SEQ ID NO: enumerado en la Tabla C.
En diversas implementaciones, la proteína de unión a antígeno comprende un par de secuencias: una secuencia seleccionada entre un SEQ ID NO: enumerado en la Tabla D, y otra secuencia que es una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con una secuencia que tiene un SEQ ID NO: enumerado en la Tabla D. Por ejemplo, en diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia de SEQ ID NO: 419 y la proteína de unión a antígeno comprende adicionalmente una secuencia variante que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO 421.
Ácidos nucleicos
La presente divulgación proporciona adicionalmente ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación. Como se emplea en el presente documento "ácido nucleico" incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico" y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, o formas modificadas del mismo, que puede ser de hebra sencilla o de doble hebra, sintetizado u obtenido (p. ej., aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace fosforamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación. En diversos aspectos, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a antígeno que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR) 1 de la cadena pesada (HC) expuesta en la Tabla A o A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 11, 17, 23, 29, 35, 41,47, 53, 59, 65, 71,77, 83, 89, 95, 101,107, 113, 119, 125, 131,452, 455, 461,465 y 472, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 85%, al menos o aproximadamente 90%, al menos o aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC expuesta en la Tabla A o A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 86, 102, 108, 114, 120, 126, 132, 475, 456, 462, 466, 468 y 473; o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 85%, al menos o aproximadamente 90%, al menos o aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC expuesta en la Tabla A o A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 13, 19, 25, 31,37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91,97, 103, 109, 115, 121, 127, 133, 453, 457, 463, 467, 469 y 474; o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 85%, al menos o aproximadamente 90%, al menos o aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera (LC) expuesta en la Tabla A o A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 8, 14, 20, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128, 449, 476, 458, 464 y 470; o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 85%, al menos o aproximadamente 90%, al menos o aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC expuesta en la Tabla A o A1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81,87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129, 450, 477, 459 y 471; o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 85%, al menos o aproximadamente 90%, al menos o aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; (f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC expuesta en la Tabla A o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130, 451,454 y 460, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 85%, al menos o aproximadamente 90%, al menos o aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; o (g) una combinación de dos o más cualesquiera de (a)-(f). En diversos aspectos, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de LC, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de LC expuestas en la Tabla A o A1 y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC expuestas en la Tabla A o A1. En diversos aspectos, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de HC, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC expuestas en la Tabla A o A1 y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC expuestas en la Tabla A o A1. En diversas implementaciones, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a antígeno que comprende (a) al menos 3, 4 o 5 de las secuencias de aminoácidos designadas por SEQ ID NO: en una única fila de la Tabla A o A1, (b) cada una de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A o A1 y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A o A1, (c) cada una de las secuencias de aminoácidos de CDR de HC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A o A1 y al menos 1 o 2 de las secuencias de aminoácidos de CDR de LC designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A o A1, (d) las 6 secuencias de aminoácidos de CDR designadas por SEQ ID NO: de una única fila de la Tabla A, y/o (e) seis secuencias de aminoácidos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 74-79; (b) SEQ iD NO: 50-55; (c) SEQ ID NO: 122-127; (d) SEQ ID NO: 26-31; (e) SEQ ID NO: 128-133; (f) SEQ ID NO: 38-43; (g) SEQ ID NO: 62-67; (h) SEQ ID NO: 80-85; (i) SEQ ID NO: 44-49; (j) SEQ ID NO: 86-91; (k) SEQ ID NO: 104-109; (l) SEQ ID NO: 56-61; (m) SEQ ID NO: 32-37; (n) SEQ ID NO: 110-115; (o) SEQ ID NO: 98-103; (p) SEQ ID NO: 92-97; (q) SEQ ID NO: 116 121; (r) SEQ ID NO: 8-13; (s) SEQ ID NO: 68-73; (t) SEQ ID NO: 14-19; (u) SEQ ID NO: 20-25, (v) SEQ ID NO: 449 453 y 475; (w) SEQ ID NO: 476-477, 454-457; (x) SEQ ID NO: 458-463; (y) SEQ ID NO: 57, 58, 464-467; (z) SEQ ID NO: 68-71 y 468-469; y (aa) SEQ ID NO: 112 y 470-474. En diversas implementaciones, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a antígeno que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada expuesta en la Tabla B o B1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 478, 480, 482, 484, 486 y 488, o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 85%, al menos o aproximadamente 90%, al menos o aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; o (b) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera expuesta en la Tabla B o B1 o una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 479, 481,483, 485, 487 y 489 o una secuencia variante de la misma que difiere en solo uno o dos aminoácidos o que tiene al menos o aproximadamente 70% (p. ej., al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 85%, al menos o aproximadamente 90%, al menos o aproximadamente 95%) de identidad de secuencia; o (c) tanto (a) como (b). En diversas implementaciones, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a antígeno que comprende un par de secuencias de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 156 y 157; (b) SEQ ID NO: 148 y 149; (c) SEQ ID NO: 172 y 173; (d) SEQ ID NO: 140 y 141; (e) SEQ ID NO: 174 y 175; (f) SEQ ID NO: 144 y 145; (g) SEQ ID NO: 152 y 153; (h) SEQ ID NO: 158 y 159; (i) SEQ ID NO: 146 y 147; (j) SEQ ID NO: 160 y 161; (k) SEQ ID NO: 166 y 167; (l) SEQ ID NO: 150 y 151; (m) SEQ ID NO: 142 y 143; (n) SEQ ID NO: 168 y 169; (o) SEQ ID NO: 164 y 165; (p) SEQ ID NO: 162 y 163; (q) SEQ ID NO: 170 y 171; (r) SEQ ID NO: 134 y 135; (s) SEQ ID NO: 154 y 155; (t) SEQ ID NO: 136 y 137; y (u) S<e>Q ID NO: 138 y 139. En diversas implementaciones, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a antígeno que comprende un par de secuencias de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en los pares enumerados en la Tabla D. En diversos aspectos, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de uno cualquiera o más de SEQ ID NO: 208-375. En algunas implementaciones, el ácido nucleico no comprende ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. En otras implementaciones, el ácido nucleico comprende una o más inserciones, deleciones, inversiones, y/o sustituciones.
En algunos aspectos, los ácidos nucleicos de la presente divulgación son recombinantes. Como se emplea en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas uniendo segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas en (i) anteriormente. Para los fines del presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.
Los ácidos nucleicos en algunos aspectos se construyen basándose en reacciones de síntesis química y/o ligación enzimático utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., más arriba; y Ausubel et al., más arriba. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico utilizando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de diversas maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (p. ej., derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N-sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, uno o más de los ácidos nucleicos de la presente divulgación pueden adquirirse de compañías tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).
Vector
Los ácidos nucleicos de la presente divulgación en algunos aspectos se incorporan a un vector. A este respecto, la presente divulgación proporciona vectores que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos divulgados en el presente documento. En diversos aspectos, el vector es un vector de expresión recombinante. Para los fines de la presente memoria, el término "vector de expresión recombinante" significa una construcción de oligonucleótido o polinucleótido modificada genéticamente que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula anfitriona, cuando la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para que el ARNm, proteína, polipéptido o péptido se expresen dentro de la célula. Los vectores de la presente divulgación no son de origen natural en su conjunto. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser de origen natural. Los vectores divulgados en el presente documento pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluyendo, pero sin limitación, ADN y ARN, que pueden ser de hebra sencilla o de doble hebra, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores pueden comprender enlaces internucleotídicos de origen natural o de origen no natural, o ambos tipos de enlaces. En algunos aspectos, los nucleótidos alterados o los enlaces internucleotídicos de origen no natural no impiden la transcripción o replicación del vector.
El vector de la presente divulgación puede ser cualquier vector adecuado, y se puede utilizar para transducir, transformar o transfectar cualquier anfitrión adecuado. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambas, tales como plásmidos y virus. El vector puede ser un vector de expresión basado en plásmidos. En diversos aspectos, el vector se selecciona del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, Wl), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También se pueden utilizar vectores bacteriófagos, tales como AGTIO, AGTI1, AZapll (Stratagene), AEMBL4 y ANMI 149. Los ejemplos de vectores de expresión vegetales incluyen pBIOI, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animales incluyen pEUK-CI, pMAM y pMAMneo (Clontech). En algunos aspectos, el vector es un vector viral, p. ej., un vector retroviral. En diversos aspectos, el vector es un vector de adenovirus, un vector de virus adenoasociado (AAV), un vector de VBirus del Herpes Simple (HSV), un vector de Virus de la estomatitis vesicular (VSV), vector de virus vaccinia o vector de lentivirus. Véase, p. ej., Howarth et al., Cell Biol. Toxicol. 26(1): 1-20 (2010). En diversos aspectos, el vector es un vector de baculovirus que infecta artrópodos, p. ej., insectos. En diversos aspectos, el vector de baculovirus es un virus nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV) o de la polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV). Véanse, p. ej., Khan, Adv Pharm Bull 3(2): 257-263 (2013); Miller, Bioessays 11 (4): 91-96 (1989); Atkinson et al., Pestic Sci 28: 215-224 (1990).
Los vectores de la presente divulgación se pueden preparar utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales descritas, por ejemplo, por Sambrook et al., más arriba, y Ausubel et al., más arriba. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, se pueden preparare para que contengan un sistema de replicación funcional en una célula anfitriona procariótica o eucariótica. Los sistemas de replicación pueden derivar, p. ej., de ColEl, plásmido de 2 p, A, SV40, virus del papiloma bovino, y similares.
En algunos aspectos, el vector comprende secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos para el tipo de anfitrión (p. ej., bacteria, hongo, planta o animal) en el que va a introducirse el vector, según sea apropiado y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN.
El vector puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de anfitriones transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, p. ej., resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un anfitrión auxótrofo para proporcionar prototrofia, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión divulgados en el presente documento incluyen, p. ej., genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina, y genes de resistencia a ampicilina.
El vector puede comprender un promotor nativo o normativo conectado operablemente a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales del mismo), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria a o que hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. La selección de promotores, p. ej., fuerte, débil, inducible, específico de tejido y específico de desarrollo, está dentro del conocimiento práctico del experto en la técnica. De manera similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro del conocimiento práctico del experto en la técnica. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, p. ej., un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.
Células anfitrionas
En el presente documento se proporcionan células anfitrionas que comprenden un ácido nucleico o vector de la presente divulgación. Como se emplea en el presente documento, el término "célula anfitriona" se refiere a cualquier tipo de célula que puede contener el vector divulgado en el presente documento y es capaz de producir un producto de expresión codificado por el ácido nucleico (p. ej., ARNm, proteína). La célula anfitriona en algunos aspectos es una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. La célula anfitriona en diversos aspectos es una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, p. ej., un ser humano. La célula anfitriona puede ser de cualquier tipo celular, puede originarse a partir de cualquier tipo de tejido, y puede ser de cualquier fase de desarrollo.
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno es una proteína glicosilada y la célula anfitriona es una célula competente para glicosilación. En diversos aspectos, la célula competente para glicosilación es una célula eucariótica, incluyendo, pero sin limitarse a, una célula de levadura, célula de hongo filamentoso, célula de protozoo, célula de alga, célula de insecto o célula de mamífero. Tales células anfitrionas se describen en la técnica. Véase, p. ej., Frenzel, et al.,Front Immunol4: 217 (2013). En diversos aspectos, las células eucarióticas son células de mamífero. En diversos aspectos, las células de mamífero son células de mamífero no humanas. En algunos aspectos, las células son células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y derivados de las mismas (p. ej., CHO-K1, CHO pro-3), células de mieloma de ratón (p. ej., NS0, GS-NS0, Sp2/0), células modificadas para que tangan deficiencia de actividad de dihidrofolatorreductasa (D<h>FR) (p. ej., D<u>K<x>-X11, DG44), células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) o derivados de las mismas (p. ej., HEK293T, HEK293-EBNA), células de riñón de mono africano verde (p. ej., células COS, células VERO), células de cáncer de cuello uterino humano (p. ej., HeLa), células epiteliales de osteosarcoma óseo humano U2-OS, células epiteliales basales alveolares humanas adenocarcinómicas A549, células de fibrosarcoma humano HT1080, células tumorales cerebrales de ratón CAD, células de carcinoma embrionario P19, células de fibroblastos embrionarios de ratón NIH 3T3, células de fibroblastos de ratón L929, células de neuroblastoma de ratón N2a, células de cáncer de mama humano MCF-7, células de retinoblastoma Y79, células de retinoblastoma humano SO-Rb50, células de cáncer de hígado humano Hep G2, células de mieloma B de ratón J558L o células de riñón de cría de hámster (BHK) (Gaillet et al. 2007; Khan, Adv Pharm Bull 3(2): 257-263 (2013)).
Con el fin de amplificar o replicar el vector, la célula anfitriona es en algunos aspectos una célula procariótica, p. ej., una célula bacteriana.
También se proporciona por la presente divulgación una población de células que comprende al menos una célula anfitriona descrita en la presente memoria. La población de células en algunos aspectos es una población heterogénea que comprende la célula anfitriona que comprende los vectores descritos, además de al menos otra célula, que no comprende ninguno de los vectores. Alternativamente, en algunos aspectos, la población de células es una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células anfitrionas que comprenden (p. ej., que consisten esencialmente en) el vector. La población en algunos aspectos es una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula anfitriona que comprende un vector, de modo que todas las células de la población comprenden el vector. En diversas implementaciones de la presente divulgación, la población de células es una población clonal que comprende células anfitrionas que comprenden un vector como se describe en el presente documento.
Métodos de fabricación
También se proporcionan en el presente documento métodos para producir una proteína de unión a antígeno que se une a CLDN6. En diversas implementaciones, el método comprende cultivar una célula anfitriona que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de unión a antígeno como se describe en el presente documento en un medio de cultivo celular y recoger la proteína de unión a antígeno del medio de cultivo celular. La célula anfitriona puede ser cualquiera de las células anfitrionas descritas en el presente documento. En diversos aspectos, la célula anfitriona se selecciona del grupo que consiste en: células CHO, células NS0, células COS, células VERO y células BHK. En diversos aspectos, la etapa de cultivo de una célula anfitriona comprende cultivar la célula anfitriona en un medio de crecimiento para soportar el crecimiento y la expansión de la célula anfitriona. En diversos aspectos, el medio de crecimiento aumenta la densidad, la viabilidad y la productividad celulares del cultivo de una manera oportuna. En diversos aspectos, el medio de crecimiento comprende aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, glucosa y suero como fuente de factores de crecimiento, hormonas y factores de anclaje. En diversos aspectos, el medio de crecimiento es un medio químicamente definido que consiste en aminoácidos, vitaminas, oligoelementos, sales inorgánicas, lípidos e insulina o factores de crecimiento de tipo insulínico. Además de los nutrientes, el medio de crecimiento también ayuda a mantener el pH y la osmolalidad. Están disponibles comercialmente y se describen en la técnica varios medios de crecimiento. Véase, p. ej., Arora, "Cell Culture Media: A Review" MATER METHODS 3:175 (2013).
En diversos aspectos, el método comprende cultivar la célula anfitriona en un medio de alimentación. En diversos aspectos, el método comprende el cultivo en un medio de alimentación en un modo de alimentación discontinua. Los métodos de producción de proteínas recombinantes son conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Li et al., "Cell culture processes for monoclonal antibody production" MAb 2(5): 466-477 (2010).
El método para preparar una proteína de unión a antígeno puede comprender una o más etapas para purificar la proteína de un cultivo celular o el sobrenadante del mismo y preferiblemente recuperar la proteína purificada. En diversos aspectos, el método comprende una o más etapas de cromatografía, p. ej., cromatografía de afinidad (p. ej., cromatografía de afinidad de proteína A), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba. En diversos aspectos, el método comprende purificar la proteína utilizando una resina de cromatografía de afinidad de proteína A.
En diversas implementaciones, el método comprende adicionalmente etapas para formular la proteína purificada, etc., obteniendo de este modo una formulación que comprende la proteína purificada. Tales etapas se describen en Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing, eds. Jameel y Hershenson, John Wiley & Sons, Inc. (Hoboken, NJ), 2010.
En diversos aspectos, la proteína de unión a antígeno conectada a un polipéptido y la proteína de unión a antígeno son parte de una proteína de fusión. Por tanto, la presente divulgación proporciona adicionalmente métodos para producir una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a antígeno que se une a CLDN6. En diversas implementaciones, el método comprende cultivar una célula anfitriona que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión como se describe en el presente documento en un medio de cultivo celular y recoger la proteína de fusión del medio de cultivo celular.
Productos conjugados
La presente divulgación también proporciona proteínas de unión a antígeno ancladas, conectadas o conjugadas a un segundo radical (p. ej., un radical heterólogo, un radical conjugado). Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un producto conjugado que comprende una proteína de unión a antígeno y un radical heterólogo. Como se emplea en el presente documento, el término "radical heterólogo" es sinónimo de "radical conjugado" y se refiere a cualquier molécula (química o bioquímica, de origen natural o no codificada) que es diferente de las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación. Los diversos radicales heterólogos incluyen, pero no se limitan a, un polímero, un carbohidrato, un lípido, un ácido nucleico, un oligonucleótido, un ADN o ARN, un aminoácido, péptido, polipéptido, proteína, agente terapéutico, (p. ej., un agente citotóxico, citocina), o un agente de diagnóstico.
En algunas implementaciones, el radical heterólogo es un polímero. El polímero puede ser ramificado o no ramificado. El polímero puede ser de cualquier peso molecular. El polímero en algunas implementaciones tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que, en preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular indicado). El peso molecular promedio del polímero está en algún aspecto entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 40 kDa o entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 35 kDa.
En algunas implementaciones, el polímero se modifica para que tenga un único grupo reactivo, tal como un éster activo para acilación o un aldehído para alquilación, de modo que se puede controlar el grado de polimerización. El polímero en algunas implementaciones es soluble en agua de modo que la proteína a la que está anclado no precipita en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. En algunas implementaciones, cuando, por ejemplo, la composición se utiliza para uso terapéutico, el polímero es farmacéuticamente aceptable. Adicionalmente, en algunos aspectos, el polímero es una mezcla de polímeros, p. ej., un copolímero, un copolímero en bloque.
En algunas implementaciones, el polímero se selecciona del grupo que consiste en: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos y derivados de los mismos, incluidos polialquilenglicoles, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, incluidos poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) y poli(acrilato de octadecilo), polímeros de polivinilo, incluidos alcoholes polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos, haluros de polivinilo, poli(acetato de vinilo) y polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, celulosas, incluidas alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato butirato de celulosa, acetato ftalato de celulosa, carboxietilcelulosa, triacetato de celulosa, y sal sódica de sulfato de celulosa, polipropileno, polietilenos incluidos polietilenglicol), poli(óxido de etileno), y tereftalato de polietileno), y poliestireno.
Un polímero soluble en agua particularmente preferido para su uso en la presente invención es polietilenglicol (PEG). Como se emplea en el presente documento, polietilenglicol pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que pueden utilizarse para derivatizar otras proteínas, tales como mono-alcoxi(C1-C10)- o ariloxi-polietilenglicol. El PEG es un poliéter neutro lineal o ramificado, disponible en un amplio intervalo de pesos moleculares, y es soluble en agua y la mayoría de los disolventes orgánicos.
En algunas implementaciones, el radical heterólogo es un carbohidrato. En algunas implementaciones, el carbohidrato es un monosacárido (p. ej., glucosa, galactosa, fructosa), un disacárido (p. ej., sacarosa, lactosa, maltosa), un oligosacárido (p. ej., rafinosa, estaquiosa), un polisacárido (un almidón, amilasa, amilopectina, celulosa, quitina, calosa, laminarina, xilano, manano, fucoidano, galactomanano.
En algunas implementaciones, el radical heterólogo es un lípido. El lípido, en algunas implementaciones, es un ácido graso, eicosanoide, prostaglandina, leucotrieno, tromboxano, N-acil etanolamina), glicerolípido (p. ej., gliceroles
mono-, di-, tri-sustituidos), glicerofosfolípido (p. ej., fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina), esfingolípido (p. ej., esfingosina, ceramida), lípido tipo esterol (p. ej., esteroide, colesterol), lípido tipo prenol, sacarolípido o un policétido, aceite, cera, colesterol, esterol, vitamina liposoluble, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, un fosfolípido.
En algunas implementaciones, el radical heterólogo es un agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser cualquiera de los conocidos en la técnica. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se contemplan en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, enzimas naturales, proteínas derivadas de fuentes naturales, proteínas recombinantes, péptidos naturales, péptidos sintéticos, péptidos cíclicos, anticuerpos, agonistas de receptores, agentes citotóxicos, inmunoglobulinas, agentes de bloqueo beta-adrenérgicos, bloqueadores de canales de calcio, vasodilatadores coronarios, glicósidos cardíacos, antiarrítmicos, simpatomiméticos cardíacos, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), diuréticos, inotropos, reductores de colesterol y triglicéridos, secuestrantes de ácidos biliares, fibratos, inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril (HMG)-CoA reductasa, derivados de niacina, agentes antiadrenérgicos, agentes de bloqueo alfa-adrenérgico, agentes antiadrenérgicos de acción central, vasodilatadores, agentes ahorradores de potasio, tiazidas y agentes relacionados, antagonistas de receptores de angiotensina II, vasodilatadores periféricos, antiandrógenos, estrógenos, antibióticos, retinoides, insulinas y análogos, inhibidores de alfa-glucosidasa, biguanidas, meglitinidas, sulfonilureas, tiazolidinodionas, andrógenos, progestágenos, reguladores del metabolismo óseo, hormonas de la pituitaria anterior, hormonas hipotalámicas, hormonas de la pituitaria posterior, gonadotropinas, antagonistas de la hormona liberadora de gonadotropinas, estimulantes de la ovulación, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, agentes antitiroideos, hormonas tiroideas, agentes voluminizadores, laxantes, antiperistálticos, modificadores de la flora, adsorbentes intestinales, antiinfecciosos intestinales, antianorexicos, anticaquéxicos, antibulímicos, supresores del apetito, agentes antiobesidad, antiácidos, agentes para tracto gastrointestinal superior, agentes anticolinérgicos, derivados del ácido aminosalicílico, modificadores de la respuesta biológica, corticosteroides, antiespasmódicos, agonistas parciales de 5-HT4, antihistamínicos, cannabinoides, antagonistas de dopamina, antagonistas de serotonina, citoprotectores, antagonistas del receptor H2 de histamina, agente protector de mucosa, inhibidores de bomba de protones, terapia de erradicación de H. pylori, estimulantes de eritropoyesis, agentes hematopoyéticos, agentes contra la anemia, heparinas, antifibrinolíticos, hemostáticos, factores de coagulación sanguínea, inhibidores de difosfato de adenosina, inhibidores del receptor de glicoproteína, inhibidores de unión fibrinógeno-plaquetas, inhibidores tromboxano-A2, activadores del plasminógeno, agentes antitrombóticos, glucocorticoides, mineralcorticoides, corticosteroides, agentes inmunosupresores selectivos, antifúngicos, fármacos implicados en la terapia profiláctica, infecciones asociadas con el SIDA, citomegalovirus, inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosídicos, inhibidores de la transcriptasa inversa de análogos nucleosídicos, inhibidores de proteasas, anemia, sarcoma de Kaposi, aminoglicósidos, carbapenemos, cefalosporinas, glicopéptidos, lincosamidas, macrólidos, oxazolidinonas, penicilinas, estreptograminas, sulfonamidas, trimetoprim y derivados, tetraciclinas, antihelmínticos, amebicidas, biguanidas, alcaloides de cinchona, antagonistas de ácido fólico, derivados de quinolina, terapia con Pneumocystis carinii, hidrazidas, imidazoles, triazoles, nitroimidazoles, aminas cíclicas, inhibidores de neuraminidasa, nucleósidos, aglutinantes de fosfato, inhibidores de colinesterasa, terapia complementaria, barbituratos y derivados, benzodiacepinas, derivados de ácido gamma aminobutírico, derivados de hidantoína, derivados de iminoestilbeno, derivados de succinimida, anticonvulsivos, alcaloides de cornezuelo, preparaciones antimigrañas, modificadores de la respuesta biológica, ésteres de ácido carbámico, derivados tricíclicos, agentes despolarizantes, agentes no despolarizantes, agentes para la parálisis neuromuscular, estimulantes del SNC, reactivos dopaminérgicos, inhibidores de monoamino oxidasa, inhibidores de COMT, alquil sulfonatos, etileniminas, imidazotetrazinas, análogos de mostazas nitrogenadas, nitrosoureas, compuestos que contienen platino, antimetabolitos, análogos de purina, análogos de pirimidina, derivados de urea, antraciclinas, actinomicinas, derivados de camptotecina, epipodofilotoxinas, taxanos, alcaloides de vinca y análogos, antiandrógenos, antiestrógenos, inhibidores de aromatasa no esteroideos, antineoplásicos inhibidores de proteína quinasa, derivados de azaespirodecanodiona, ansiolíticos, estimulantes, inhibidores de recaptación de monoaminas, inhibidores selectivos de recaptación de serotonina, antidepresivos, derivados de benzisooxazol, derivados de butirofenona, derivados de dibenzodiazepina, derivados de dibenzotiazepina, derivados de difenilbutilpiperidina, fenotiazinas, derivados de tienobenzodiazepina, derivados de tioxanteno, extractos alergénicos, agentes no esteroideos, antagonistas de receptores de leucotrienos, xantinas, antagonistas de receptores de endotelina, prostaglandinas, tensioactivos pulmonares, mucolíticos, antimitóticos, uricosúricos, inhibidores de xantina oxidasa, inhibidores de fosfodiesterasa, sales de meteamina, derivados de nitrofurano, quinolonas, relajantes de músculos lisos, agentes parasimpaticomiméticos, hidrocarburos halogenados, ésteres de ácido aminobenzoico, amidas (p. ej., lidocaína, hidrocloruro de articaína, hidrocloruro de bupivacaína), antipiréticos, hipnóticos y sedantes, ciclopirrolonas, pirazolopirimidinas, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, opioides, derivados de para-aminofenol, inhibidor de alcohol deshidrogenasa, antagonistas de heparina, adsorbentes, eméticos, antagonistas de opoides, reactivadores de colinesterasa, terapia de sustitución de nicotina, análogos y antagonistas de vitamina A, análogos y antagonistas de vitamina B, análogos y antagonistas de vitamina C, análogos y antagonistas de vitamina D, análogos y antagonistas de vitamina E, análogos y antagonistas de vitamina K.
Las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se pueden conjugar con una o más citocinas y factores de crecimiento que son eficaces en la inhibición de metástasis tumoral, y en donde se ha mostrado que la citocina o el factor de crecimiento tienen un efecto antiproliferativo en al menos una población celular. Tales citocinas, linfocinas, factores de crecimiento, u otros factores hematopoyéticos incluyen, pero no se limitan a: M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFa, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoyetina, factor de células madre, y eritropoyetina. Los factores de crecimiento adicionales para su uso en el presente documento incluyen angiogenina, proteína morfogénica ósea 1, proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 3, proteína morfogénica ósea 4, proteína morfogénica ósea 5, proteína morfogénica ósea 6, proteína morfogénica ósea 7, proteína morfogénica ósea 8, proteína morfogénica ósea 9, proteína morfogénica ósea 10, proteína morfogénica ósea 11, proteína morfogénica ósea 12, proteína morfogénica ósea 13, proteína morfogénica ósea 14, proteína morfogénica ósea 15, receptor de proteína morfogénica ósea IA, receptor de proteína morfogénica ósea IB, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor neutrófico ciliar, receptor de factor neutrófico ciliar a, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 1, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 2 a, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 2 p, factor de crecimiento de células endoteliales p, endotelina 1, atrayente de neutrófilos derivado del epitelio, receptor de factor neutrófico derivado de líneas celulares gliales a 1, receptor de factor neutrófico derivado de líneas celulares gliales a 2, proteína relacionada con el crecimiento, proteína a relacionada con el crecimiento, proteína p relacionada con el crecimiento, proteína<y>relacionada con el crecimiento, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor de factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento I de tipo insulínico, receptor de factor de crecimiento de tipo insulínico, factor de crecimiento II de tipo insulínico, proteína de unión de factor de crecimiento de tipo insulínico, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibidor de leucemia, receptor de factor a inhibidor de leucemia, receptor de factor de crecimiento nervioso, neurotrofina-3, neurotrofina-4, factor estimulador del crecimiento de células pre-B, factor de células madre, receptor de factor de células madre, factor de crecimiento transformante a, factor de crecimiento transformante p, factor de crecimiento transformante p1, factor de crecimiento transformante p1.2, factor de crecimiento transformante p2, factor de crecimiento transformante p3, factor de crecimiento transformante p5, factor de crecimiento transformante latente p1, proteína I de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína II de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína III de unión al factor de crecimiento transformante p, receptor del factor de necrosis tumoral tipo I, receptor de factor de necrosis tumoral tipo II, receptor activador de plasminógeno de tipo uroquinasa, y proteínas quiméricas y fragmentos biológica o inmunológicamente activos de los mismos.
En algunas implementaciones, el producto conjugado comprende una proteína de unión a antígeno como se describe en el presente documento y un agente citotóxico. El agente citotóxico es cualquier molécula (química o bioquímica) que sea tóxica para una célula. En algunos aspectos, cuando un agente citotóxico se conjuga con una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación, los resultados obtenidos son sinérgicos. Es decir, la eficacia de la terapia combinada de una proteína de unión a antígeno y el agente citotóxico es sinérgica, es decir, la eficacia es mayor que la eficacia esperada de los efectos individuales aditivos de cada uno. Por lo tanto, la dosificación del agente citotóxico se puede reducir y, por lo tanto, el riesgo de los problemas de toxicidad y otros efectos secundarios se reduce concomitantemente. En algunas implementaciones, el agente citotóxico es un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, compuestos de coordinación de platino, inhibidores de topoisomerasa, antibióticos, alcaloides antimitóticos y difluoronucleósidos, como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 6.630.124.
En algunas implementaciones, el agente quimioterapéutico es un compuesto de coordinación de platino. El término "compuesto de coordinación de platino" se refiere a cualquier compuesto de coordinación de platino que inhibe el crecimiento de células tumorales que proporciona el platino en forma de un ion. En algunas implementaciones, el cisplatino es el compuesto de coordinación de platino empleado en las composiciones y métodos de la presente divulgación. En algunas implementaciones, el agente quimioterapéutico es un inhibidor de topoisomerasa. En algunos aspectos, el inhibidor de topoisomerasa es camptotecina o un análogo de camptotecina. En otras implementaciones más de la presente divulgación, el agente quimioterapéutico es un compuesto antibiótico. Los antibióticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, doxorrubicina, mitomicina, bleomicina, daunorrubicina y estreptozocina. En algunas implementaciones, el agente quimioterapéutico es un alcaloide antimitótico. En general, los alcaloides antimitóticos se pueden extraer de Cantharanthus roseus, y se ha demostrado que son eficaces como agentes quimioterapéuticos anticancerosos. En otras implementaciones de la presente divulgación, el agente quimioterapéutico es un difluoronucleósido. Se sabe en la técnica que los 2'-desoxi-2',2'-difluoronucleósidos tienen actividad antiviral. Tales compuestos se divulgan e ilustran en las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.526.988 y 4.808.614. La Publicación de Solicitud de Patente Europea Núm. 184.365 divulga que estos mismos difluoronucleósidos tienen actividad oncolítica.
La presente divulgación también proporciona productos conjugados que comprenden una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación conectada a un polipéptido, de manera que el producto conjugado es una proteína de fusión. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación conectada a un polipéptido. En diversas implementaciones, el polipéptido es un marcador de diagnóstico, p. ej., una proteína fluorescente, tal como proteína fluorescente verde u otra etiqueta, p. ej., etiqueta Myc. En diversos aspectos, el polipéptido es una de las citocinas, linfocinas, factores de crecimiento u otros factores hematopoyéticos enumerados anteriormente.
Conectores
En algunas implementaciones, el producto conjugado está directamente conectado al radical heterólogo. En implementaciones alternativas, el producto conjugado comprende un conector que une el compuesto de la presente divulgación al radical heterólogo. En algunos aspectos, el conector comprende una cadena de átomos de 1 a aproximadamente 60, o de 1 a 30 átomos o más, de 2 a 5 átomos, de 2 a 10 átomos, de 5 a 10 átomos, o de 10 a 20 átomos de longitud. En algunas implementaciones, los átomos de la cadena son todos átomos de carbono. En algunas implementaciones, los átomos de loa cadena en la cadena principal del conector se seleccionan del grupo que consiste en C, O, N y S. Los átomos de la cadena y los conectores se pueden seleccionar según su solubilidad esperada (hidrofilia) para proporcionar un producto conjugado más soluble. En algunas realizaciones, el conector proporciona un grupo funcional que está sujeto a escisión por una enzima u otro catalizador o condiciones hidrolíticas encontradas en el tejido u órgano o célula diana. En algunas implementaciones, la longitud del conector es lo suficientemente larga para reducir el potencial de impedimento estérico. En algunas implementaciones, el conector es un aminoácido o un conector peptidílico. Tales conectores peptidílicos pueden tener cualquier longitud. Varios conectores tienen de aproximadamente 1 a 50 aminoácidos de longitud, de 5 a 50, de 3 a 5, de 5 a 10, de 5 a 15, o de 10 a 30 aminoácidos de longitud.
Composiciones, composiciones farmacéuticas y formulaciones
Las composiciones que comprenden una proteína de unión a antígeno, un ácido nucleico, un vector, una célula anfitriona o un producto conjugado como se divulga en el presente documento se proporcionan en la presente memoria. Las composiciones en algunos aspectos comprenden las proteínas de unión a antígeno en forma aislada y/o purificada. En algunos aspectos, la composición comprende un único tipo (p. ej., estructura) de una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación o comprende una combinación de dos o más proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación, en donde la combinación comprende dos o más proteínas de unión a antígeno de diferentes tipos (p. ej., estructuras).
En algunos aspectos, la composición comprende agentes que mejoran las características fisicoquímicas de la proteína de unión a antígeno, p. ej., mediante la estabilización de la proteína de unión a antígeno a ciertas temperaturas, p. ej., temperatura ambiente, aumento de la vida útil, reducción de la degradación, p. ej., degradación mediada por proteasa de oxidación, aumento de la semivida de la proteína de unión a antígeno, etc. En algunos aspectos, la composición comprende cualquiera de los agentes divulgados en el presente documento como un radical heterólogo o radical conjugado, opcionalmente mezclado con las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación o conjugado con las proteínas de unión a antígeno.
En diversos aspectos de la presente divulgación, la composición comprende adicionalmente un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables. En algunas implementaciones, la proteína de unión a antígeno, un ácido nucleico, un vector, una célula anfitriona o un producto conjugado como se divulgan en el presente documento (en lo sucesivo denominados "agentes activos") se formulan en una composición farmacéutica que comprende el agente activo, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables. A este respecto, la presente divulgación proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden un agente activo que está destinado a la administración a un sujeto, p. ej., un mamífero.
En algunas implementaciones, el agente activo está presente en la composición farmacéutica a un nivel de pureza adecuado para la administración a un paciente. En algunas implementaciones, el agente activo tiene un nivel de pureza de al menos aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99%, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptables. En algunas implementaciones, las composiciones contienen un agente activo a una concentración de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 30,0 mg/ml.
En diversos aspectos, las composiciones farmacéuticas comprenden un portador farmacéuticamente aceptable. Como se emplea en el presente documento, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los portadores farmacéuticos convencionales, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes. El término también abarca cualquiera de los agentes aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal de los Estados Unidos o enumerados en la Farmacopea de los Estados Unidos para su uso en animales, incluyendo seres humanos.
La composición farmacéutica puede comprender cualquier ingrediente farmacéuticamente aceptable, incluyendo, por ejemplo, agentes acidulantes, aditivos, adsorbentes, propelentes de aerosoles, agentes de desplazamiento de aire, agentes alcalinizantes, agentes antiapelmazantes, anticoagulantes, conservantes antimicrobianos, antioxidantes, antisépticos, bases, aglutinantes, agentes tamponadores, agentes quelantes, agentes de recubrimiento, agentes colorantes, desecantes, detergentes, diluyentes, desinfectantes, disgregantes, agentes dispersantes, agentes potenciadores de la disolución, colorantes, emolientes, agentes emulsionantes, estabilizantes de emulsiones, cargas, agentes formadores de película, potenciadores del sabor, agentes aromatizantes, potenciadores del flujo, agentes gelificantes, agentes granulantes, humectantes, lubricantes, mucoadhesivos, bases de pomadas, pomadas, vehículos oleaginosos, bases orgánicas, bases de pastillas, pigmentos, plastificantes, agentes de pulido, conservantes, agentes secuestrantes, penetrantes de la piel, agentes solubilizantes, disolventes, agentes estabilizantes, bases de supositorios, agentes tensioactivos, tensioactivos, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes terapéuticos, agentes espesantes, agentes de tonicidad, agentes de toxicidad, agentes de aumento de la viscosidad, agentes absorbentes de agua, co-disolventes miscibles con agua, descalcificadores, o agentes humectantes. Véanse, p. ej., The Handbook of Pharmaceutical Excipients, tercera edición, A.H. Kibbe (Pharmaceutical Press, Londres, RU, 2000), Remington's Pharmaceutical Sciences, decimosexta edición, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980).
En diversos aspectos, la composición farmacéutica comprende materiales de formulación que no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. En implementaciones específicas, las composiciones farmacéuticas comprenden un agente activo y una o más sales farmacéuticamente aceptables; polioles; tensioactivos; agentes de equilibrio osmótico; agentes de tonicidad; antioxidantes; antibióticos; antimicóticos; agentes voluminizantes; lioprotectores; agentes antiespumantes; agentes quelantes; conservantes; colorantes; analgésicos; o agentes farmacéuticos adicionales. En diversos aspectos, la composición farmacéutica comprende uno o más polioles y/o uno o más tensioactivos, opcionalmente, además de uno o más excipientes, incluyendo, pero sin limitarse a, sales farmacéuticamente aceptables; agentes de equilibrio osmótico (agentes de tonicidad); antioxidantes; antibióticos; antimicóticos; agentes voluminizantes; lioprotectores; agentes antiespumantes; agentes quelantes; conservantes; colorantes; y analgésicos.
En ciertas implementaciones, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En tales implementaciones, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes voluminizantes (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol); vehículos de suministro; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición, (A. R. Genaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para conseguir un pH fisiológicamente compatible. En algunas implementaciones, el pH de la composición farmacéutica puede estar, por ejemplo, entre aproximadamente 4 o aproximadamente 5 y aproximadamente 8,0 o aproximadamente 4,5 y aproximadamente 7,5 o aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,5. En diversas implementaciones, el pH de la composición farmacéutica está entre 5,5 y 7,5.
La presente divulgación proporciona métodos para producir una composición farmacéutica. En diversos aspectos, el método comprende combinar la proteína de unión a antígeno, producto conjugado, proteína de fusión, ácido nucleico, vector, célula anfitriona o una combinación de los mismos, con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.
Vías de administración
Con respecto a la presente divulgación, el agente activo, o la composición farmacéutica que comprende el mismo, se pueden administrar al sujeto a través de cualquier vía de administración adecuada. Por ejemplo, el agente activo se puede administrar a un sujeto mediante administración parenteral, nasal, oral, pulmonar, tópica, vaginal o rectal. La siguiente discusión sobre las vías de administración se proporciona simplemente para ilustrar diversas implementaciones y no se debe interpretar como limitante del alcance de ninguna manera.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que vuelven la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. El término "parenteral" significa no a través del canal alimentario sino por alguna otra vía tal como subcutánea, intramuscular, intraespinal o intravenosa. El agente activo de la presente divulgación se puede administrar con un diluyente fisiológicamente aceptable en un portador farmacéutico, tal como un líquido o mezcla de líquidos estériles, incluyendo agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, tal como etanol o alcohol hexadecílico, un glicol, tal como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, glicerol, cetales tales como 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, poli(etilenglicol) 400, aceites, ácidos grasos, ésteres o glicéridos de ácidos grasos, o glicéridos de ácidos grasos acetilados con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, agente de suspensión, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmacéuticos.
Los aceites, que se pueden utilizar en formulaciones parenterales incluyen petróleo, aceites animales, vegetales o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites incluyen cacahuete, soja, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina y mineral. Los ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.
Los jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales de ácidos grasos de metales alcalinos, amonio y trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetil dialquil amonio y haluros de alquil piridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, alquil-, aril- y olefino-sulfonatos, alquil-, olefino-, éter- y monoglicérido- sulfatos y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenpolipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, alquil-paminopropionatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquilimidazolina y (e) mezclas de los mismos.
Las formulaciones parenterales en algunas implementaciones contienen de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 25% en peso del agente activo de la presente divulgación en solución. Se pueden utilizar conservantes y tampones. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el sitio de inyección, tales composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones variará típicamente de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol y sorbitán, tales como monooleato de sorbitán y aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales en algunos aspectos se presentan en recipientes sellados de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en un estado secado por congelación (liofilizado) que requiere sólo la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyectables, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea en algunos aspectos se preparan a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente.
Las formulaciones inyectables están según la presente divulgación. Los requisitos para portadores farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos en la técnica (véanse, p. ej.,Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J. B. Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker y Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), y ASHPHandbook on Injectable Drugs,Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986)).
Dosificaciones
Se cree que los agentes activos de la divulgación son útiles en métodos para inhibir el crecimiento tumoral, así como en otros métodos, como se describe adicionalmente en el presente documento, incluyendo métodos para tratar o prevenir el cáncer. Para los fines de la divulgación, la cantidad o dosis del agente activo administrado debe ser suficiente para efectuar, p. ej., una respuesta terapéutica o profiláctica, en el sujeto o animal durante un intervalo de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del agente activo de la presente divulgación debe ser suficiente para tratar el cáncer como se describe en el presente documento en un período de aproximadamente 1 a 4 minutos, 1 a 4 horas o 1 a 4 semanas o más, p. ej., 5 a 20 o más semanas, desde el momento de la administración. En ciertas implementaciones, el período de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis se determinará por la eficacia del agente activo particular y la afección del animal (p. ej., humano), así como el peso corporal del animal (p. ej., humano) que se vaya a tratar.
Se conocen en la técnica muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los fines del presente documento, se podría utilizar un ensayo, que comprende comparar el grado en que se trata el cáncer tras la administración de una dosis dada del agente activo de la presente divulgación a un mamífero entre un conjunto de mamíferos, a cada uno de cuyos conjuntos se le administra una dosis diferente del agente activo, para determinar una dosis inicial que se va a administrar a un mamífero. El grado en que se trata el cáncer tras la administración de una dosis determinada puede representarse, p. ej., mediante el grado de regresión tumoral conseguido con el agente activo en un modelo de xenoinjerto de ratón. Los métodos para someter a ensayo la regresión tumoral se conocen en la técnica y se describen en el presente documento en los EJEMPLOS.
La dosis del agente activo de la presente divulgación también estará determinada por la existencia, naturaleza y extensión de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un agente activo particular de la presente divulgación. Típicamente, el médico a cargo decidirá la dosificación del agente activo de la presente divulgación con la que tratar a cada paciente individual, teniendo en cuenta una variedad de factores, tales como la edad, el peso corporal, la salud general, la dieta, el sexo, el agente activo de la presente divulgación que se vaya a administrar, la vía de administración y la gravedad de la afección que se está tratando. A modo de ejemplo y sin pretender limitar la presente divulgación, la dosis del agente activo de la presente divulgación puede ser de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal del sujeto que se está tratando/día, de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,001 g/kg de peso corporal/día, o de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal/día.
Formulaciones de liberación controlada
En algunas implementaciones, los agentes activos descritos en el presente documento se pueden modificar para producir una forma de depósito, de modo que la manera en la que el agente activo de la presente divulgación se libera en el organismo al que se administra se controla con respecto al tiempo y la ubicación dentro del organismo (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Núm. 4.450.150). Las formas de depósito de agentes activos de la presente divulgación pueden ser, por ejemplo, una composición implantable que comprende los agentes activos y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, en donde el agente activo está encapsulado por o difundido a través del material y/o degradación del material no poroso. El depósito se implanta después en la ubicación deseada dentro del organismo del sujeto y el agente activo se libera del implante a una velocidad predeterminada.
La composición farmacéutica que comprende el agente activo en ciertos aspectos se modifica para que tenga cualquier tipo de perfil de liberaciónin vivo.En algunos aspectos, la composición farmacéutica es una formulación de liberación inmediata, liberación controlada, liberación sostenida, liberación extendida, liberación retardada o liberación bifásica. Los métodos para formular péptidos para liberación controlada son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Qian et al.,J Pharm374: 46-52 (2009) y las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 2008/130158, WO2004/033036; WO2000/032218; y WO 1999/040942.
Las presentes composiciones pueden comprender adicionalmente, por ejemplo, micelas o liposomas, o alguna otra forma encapsulada, o se pueden administrar en una forma de liberación prolongada para proporcionar un efecto de almacenamiento y/o suministro prolongado.
Uso
Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) por terapia.
Las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación son útiles para inhibir el crecimiento tumoral. Sin desear vincularse a una teoría particular, la acción inhibidora de las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento permite que tales entidades sean útiles en métodos de tratamiento del cáncer.
Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan métodos para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto y métodos para reducir el tamaño tumoral en un sujeto. En diversas implementaciones, los métodos comprenden administrar al sujeto la composición farmacéutica de la presente divulgación en una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento tumoral o reducir el tamaño tumoral en el sujeto. En diversos aspectos, se inhibe el crecimiento de un tumor de ovario, tumor de melanoma, tumor de vejiga o tumor endometrial. En diversos aspectos, se reduce el tamaño de un tumor de ovario, tumor de melanoma, tumor de vejiga o tumor endometrial.
Como se emplea en el presente documento, los términos "inhibir" o "reducir" y las palabras derivadas de los mismos pueden no ser una inhibición o reducción de 100% o completa. Más bien, existen grados variables de inhibición o reducción de los cuales un experto en la técnica reconoce que tienen un beneficio potencial o efecto terapéutico. A este respecto, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación pueden inhibir el crecimiento tumoral o reducir el tamaño tumoral en cualquier cantidad o nivel. En diversas implementaciones, la inhibición proporcionada por los métodos de la presente divulgación es al menos o aproximadamente 10% de inhibición (p. ej., al menos o aproximadamente 20% de inhibición, al menos o aproximadamente 30% de inhibición, al menos o aproximadamente 40% de inhibición, al menos o aproximadamente 50% de inhibición, al menos o aproximadamente 60% de inhibición, al menos o aproximadamente 70% de inhibición, al menos o aproximadamente 80% de inhibición, al menos o aproximadamente 90% de inhibición, al menos o aproximadamente 95% de inhibición, al menos o aproximadamente 98% de inhibición). En diversas implementaciones, la reducción proporcionada por los métodos de la presente divulgación es al menos o aproximadamente una reducción de 10% (p. ej., al menos o aproximadamente una reducción de 20%, al menos o aproximadamente una reducción de 30%, al menos o aproximadamente una reducción de 40%, al menos o aproximadamente una reducción de 50%, al menos o aproximadamente una reducción de 60%, al menos o aproximadamente una reducción de 70%, al menos o aproximadamente una reducción de 80%, al menos o aproximadamente una reducción de 90%, al menos o aproximadamente una reducción de 95%, al menos o aproximadamente una reducción de 98%).
En el presente documento se proporcionan adicionalmente métodos para tratar a un sujeto con cáncer, p. ej., cáncer que expresa CLDN6. En diversas implementaciones, el método comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica de la presente divulgación en una cantidad eficaz para tratar el cáncer en el sujeto.
Para los fines del presente documento, el cáncer de los métodos divulgados en el presente documento puede ser cualquier cáncer, p. ej., cualquier crecimiento maligno o tumor provocados por una división celular anormal e incontrolada que puede extenderse a otras partes del organismo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo. El cáncer en algunos aspectos es uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer óseo, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer del ano, canal anal o anorectum, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de la nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer esofágico, cáncer cervical, tumor carcinoide gastrointestinal, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, cáncer ovárico, cáncer pancreático, peritoneo, omento y cáncer de mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal (p. ej., carcinoma de células renales (RCC)), cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. En aspectos particulares, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cánceres de cabeza y cuello, de ovario, de cuello uterino, de vejiga y esofágico, cáncer pancreático, gastrointestinal, cánceres gástricos, de mama, endometriales y colorrectales, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, vejiga, cáncer de pulmón, p. ej., cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), carcinoma bronquioloalveolar. En diversos aspectos, el cáncer es cáncer de ovario, melanoma, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer endometrial. En diversos aspectos, el cáncer es cualquier cáncer caracterizado por una expresión de moderada a alta de CLDN6. Véanse, p. ej., las Figuras 1-3. En diversos aspectos, el cáncer es leucemia mieloide aguda, linfoma de células B grandes, cáncer de estómago, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de mama, carcinoma de células claras de riñón, cáncer de cabeza y cuello, sarcoma, cáncer cromófobo de riñón, glioma de grado inferior, cáncer adrenocortical, glioblastoma, carcinoma de células papilares de riñón, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer de tiroides, adenocarcinoma de pulmón, cáncer pancreático, cáncer endometroide, carcinosarcoma uterino o cáncer de ovario. En diversos aspectos, el cáncer se selecciona entre cáncer de ovario, cáncer endometroide, cáncer uterino, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de mama, Carcinoma de Células Escamosas de Cabeza y Cuello (CCECC), cáncer de cuello uterino y vejiga.
Como se emplea en el presente documento, el término "tratar", así como las palabras relacionadas con el mismo, no implican necesariamente un tratamiento de 100% o completo. Más bien, existen grados variables de tratamiento que un experto en la técnica reconoce como que tiene un beneficio potencial o efecto terapéutico. A este respecto, los métodos para tratar el cáncer de la presente divulgación pueden proporcionar cualquier cantidad o cualquier nivel de tratamiento. Además, el tratamiento proporcionado por el método de la presente divulgación puede incluir el tratamiento de una o más afecciones o síntomas o signos del cáncer que se está tratando. Asimismo, el tratamiento proporcionado por los métodos de la presente divulgación puede abarcar ralentizar la progresión del cáncer. Por ejemplo, los métodos pueden tratar el cáncer en virtud de la potenciación de la actividad de las células T o una respuesta inmunitaria contra el cáncer, la reducción del crecimiento tumoral o del cáncer, la reducción de la metástasis de células tumorales, el aumento de la muerte celular de células tumorales o cancerosas y similares. En diversos aspectos, los métodos realizan el tratamiento retrasando la aparición o recurrencia del cáncer en al menos 1 día, 2 días, 4 días, 6 días, 8 días, 10 días, 15 días, 30 días, dos meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años o más. En diversos aspectos, los métodos realizan el tratamiento aumentando la supervivencia del sujeto.
Las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación también pueden utilizarse para detectar CLDN6 en una muestra o diagnosticar un cáncer positivo para CLDN6. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona métodos para detectar Claudina6 (CLDN6) en una muestra. En diversas implementaciones, el método comprende poner en contacto la muestra con una proteína de unión a antígeno, un producto conjugado o una proteína de fusión, como se describe en el presente documento, y someter a ensayo un inmunocomplejo que comprende la proteína de unión a antígeno, producto conjugado o proteína de fusión unidos a CLDN6. La presente divulgación también proporciona métodos para diagnosticar un cáncer positivo a Claudina6 (CLDN6) en un sujeto. En diversas implementaciones, el método comprende poner en contacto una muestra biológica que comprende células o tejido obtenidos del sujeto con una proteína de unión a antígeno, un producto conjugado o una proteína de fusión, como se describe en el presente documento, y someter a ensayo un inmunocomplejo que comprende la proteína de unión a antígeno, producto conjugado o proteína de fusión unidos a CLDN6.
Sujetos
En algunas implementaciones de la presente divulgación, el sujeto es un mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos, mamíferos del orden Carnivora, incluyendo Félidos (gatos) y Cánidos (perros), mamíferos del orden Artiodactyla, incluyendo Bóvidos (vacas) y Suidos (cerdos) o del orden Perisodactyla incluyendo Équidos (caballos). En algunos aspectos, los mamíferos son del orden Primates, Ceboides o Simioides (monos) o del orden Antropoides (seres humanos y simios). En algunos aspectos, el mamífero es un ser humano.
Kits
En algunas implementaciones, las proteínas de unión a antígeno de la presente divulgación se proporcionan en un kit. En diversos aspectos, el kit comprende la proteína o proteínas de unión a antígeno como una dosis unitaria. Para los fines del presente documento, "dosis unitaria" se refiere a una cantidad discreta dispersada en un portador adecuado. En diversos aspectos, la dosis unitaria es la cantidad suficiente para proporcionar a un sujeto un efecto deseado, p. ej., inhibición del crecimiento tumoral, reducción del tamaño tumoral, tratamiento del cáncer. Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan kits que comprenden una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación proporcionada opcionalmente en dosis unitarias. En diversos aspectos, el kit comprende varias dosis unitarias, p. ej., un suministro semanal o mensual de dosis unitarias, opcionalmente, cada una de las cuales se envasa individualmente o se separa de otras dosis unitarias. En algunas implementaciones, los componentes del kit/dosis unitaria se envasan con instrucciones para la administración a un paciente. En algunas implementaciones, el kit comprende uno o más dispositivos para la administración a un paciente, p. ej., una aguja y una jeringa, y similares. En algunos aspectos, la proteína de unión a antígeno de la presente divulgación, una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, un producto conjugado que comprende la proteína de unión a antígeno, o un multímero o dímero que comprenden la proteína de unión a antígeno, se preempaquetan en una forma lista para su uso, p. ej., una jeringa, una bolsa intravenosa, etc. En algunos aspectos, el kit comprende adicionalmente otros agentes terapéuticos o de diagnóstico o portadores farmacéuticamente aceptables (p. ej., disolventes, tampones, diluyentes, etc.), incluyendo cualquiera de los descritos en el presente documento. En aspectos particulares, el kit comprende una proteína de unión a antígeno de la presente divulgación, junto con un agente, p. ej., un agente terapéutico, utilizado en quimioterapia o radioterapia.
Los siguientes ejemplos se proporcionan simplemente para ilustrar la presente divulgación y de ninguna manera para limitar su alcance.
Ejemplos
Ejemplo 1
Este ejemplo demuestra un análisis de los niveles de ARN de CLDN6 en diferentes fuentes celulares y tisulares.
Con el fin de establecer una base de referencia para la expresión de CLDN6 en diferentes materiales fuente, se sometieron a ensayo los niveles de expresión de la expresión de CLDN6 en muestras de pacientes, tejido normal y líneas celulares creadas por el Laboratorio de Investigación Oncológica Traduccional (TORL).
Los niveles de ARN de CLDN6 en muestras de pacientes se midieron utilizando información contenida en la base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) gestionada por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI). Los niveles de CLDN6 en tejido normal se midieron utilizando información en la base de datos de Expresión de Tejido de Genotipo (GTEX) mantenida por el Fondo Común. El análisis de tejidos de la base de datos GTEX mostró que CLDN6 es detectable en diversos sitios, incluyendo cerebro, pituitaria, páncreas, riñón, pulmón, tiroides y cuello uterino, entre otros tejidos (Figura 1).
Los niveles de expresión de CLDN6 se midieron en líneas celulares de cáncer de TORL utilizando micromatrices Agilent 44K (chip de matriz 4x44K, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y ensayos de secuenciación de ARN (ARN-Seq). La RNASeq fue realizada por BGI Americas (Cambridge, MA) utilizando su servicio "RNASeq for quantification". Como se muestra en las Figuras 2 y 3, las células cancerosas de ovario, cabeza y cuello, pulmón y vejiga expresaron los niveles más altos de CLDN6, aunque los niveles de expresión de CLDN6 fueron detectables en células cancerosas de mama, riñón, colon, sarcoma e hígado.
Ejemplo 2
Este ejemplo demuestra la producción de células modificadas mediante ingeniería genética para expresar en exceso CLDN6.
Se generaron modelos modificados mediante ingeniería genética para expresar en exceso CLDN6. Estos modelos se utilizaron para determinar la eficacia de los anticuerpos contra CLDN6 descritos en el Ejemplo 5. Brevemente, se modificó mediante ingeniería genética una secuencia de nucleótidos que codificaba CLDN6 en un vector bicistrónico que tenía un promotor de CMV y un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) atenuado del virus de la encefalomiocarditis (EMCV). El IRES se localizó entre el ADNc del Gen de Interés (Go I) (CLDN6) y el ADNc de puromicina. Un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE) se localizó aguas abajo del ADNc de puromicina. El vector también expresó una secuencia marcadora de GFP o una etiqueta MycDDK. La secuencia del vector de expresión que contiene GFP se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 189.
El vector de expresión se transdujo viralmente en células HEK293T (para propósitos de escrutinio) y células NIH3T3 (para inmunizaciones). Las células transducidas positivamente se seleccionaron basándose en la supervivencia en medio que contenía puromicina (1 pg/ml). Las células positivas se subclonaron para obtener una población clonal, uniforme, estable de células que expresaban en exceso CLDN6.
La expresión de CLDN6 por el subclón se confirmó mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) contra CLDN6 de referencia en un citómetro de flujo BD Biosciences Accuri™ (San Jose, CA). Se utilizaron anticuerpo secundario y producto conjugado: anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Alexa Fluor® 647 (reactividad x mínima) (Biolegend, San Diego, CA; Núm. Cat. 405322) para detectar la actividad de unión entre el mAb contra CLDN6 de referencia y la CLDN6 expresada por el subclón.
La localización celular de CLDN6 se determinó mediante microscopía de fluorescencia utilizando Sistema de imagenología Cellavista® (Synentec (Mountain View, CA)) con células que expresan una proteína de fusión de CLDN6-proteína fluorescente verde (GFP). Como se muestra en la Figura 4, se detectó fluorescencia de la GFP en la membrana celular, evidenciando que CLDN6 se localiza en la membrana celular.
Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra la producción de anticuerpos de referencia y de control.
Se prepararon anticuerpos específicos de CLDN6 comparativo (referencia) y anticuerpos de control clonando las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo en el sistema de expresión ExpiCHO™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) para producir anticuerpos quiméricos IgG2A de ratón recombinantes. Estos anticuerpos se sometieron a prueba junto con anticuerpos específicos contra CLDN6 recién generados descritos en el Ejemplo 5.
Brevemente, los plásmidos que contenían las secuencias de anticuerpo de control y comparativos se transfectaron utilizando el Sistema de Expresión ExpiCHO™ (número de catálogo: A29133, ThermoFisher Scientific, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Las células se cultivaron a 37°C y 8% de CO2 el Día 1 y después a 32°C y 5% de CO2 posttransfección en medios proporcionados en el kit. Los anticuerpos se purificaron clarificando el medio de cultivo ExpiCHO™ mediante centrifugación a 1.000 g durante 10 min seguido de 5.000 g durante 30 min. El sobrenadante se filtró después utilizando un filtro de 0,45 pm seguido de un filtro de 0,22 pm. Posteriormente, el sobrenadante se sometió a purificación por afinidad utilizando resinas de proteína A/G (Life Technologies, Carlsbad, CA; Núm. de Catálogo 20424) según el protocolo del fabricante. Antes de la purificación por ELISA, se determinó aproximadamente el título de anticuerpos en el medio de cultivo para asegurar que la cantidad de medio cargado ocupaba menos de 80% de la capacidad de unión a la resina. Después de la incubación, las resinas se lavaron con PBS y se eluyeron con Tampón de Elución (Life Technologies, Núm. de Catálogo 21004). Las fracciones de elución se ajustaron inmediatamente a pH fisiológico añadiendo Tampón Tris, pH 8,0. Los anticuerpos purificados se sometieron posteriormente a intercambio de tampón y concentración de proteína utilizando la unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 (Life Technologies, Núm. de Catálogo UFC900324) en tampón PBS. La concentración de anticuerpos se determinó mediante el Ensayo de Proteínas BCA. Se llevaron a cabo SDS-PAGE y tinción de Coomassie para someter a ensayo la pureza del anticuerpo. La proteína purificada se dividió en alícuotas y se almacenó a -80°C durante un almacenamiento prolongado o se mantuvo a 4°C para su uso inmediato.
La integridad del anticuerpo se validó mediante SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie en condiciones no reductoras frente a reductoras; en condiciones no reductoras, se observó una banda dominante a alrededor de 150 kDa, mientras que, en condiciones reductoras, se observaron dos bandas, a 50 kDa y 25 kDa.
Se produjeron anticuerpos específicos para otros miembros de la familia CLDN que tenían similitud de secuencia (Figura 5), concretamente, CLDN3, CLDN4 y CLDN9, esencialmente de la misma manera, excepto que las secuencias de anticuerpo contenidas en los plásmidos eran secuencias de anticuerpo específicas para CLDN3, CLDN4 o CLDN9.
Ejemplo 4
Este ejemplo demuestra la caracterización de líneas celulares con alta expresión de CLDN6 endógena.
Se analizó un panel de líneas celulares de cáncer para determinar su expresión endógena de CLDN6 mediante FACS y transferencia Western. En resumen, la unión de los anticuerpos a las dianas se validó mediante FACS utilizando células que expresaban en exceso CLDN6 (p. ej., células HEK293T que expresaban en exceso CLDN6, descritas en el ejemplo 2), y líneas celulares que expresan endógenamente CLDN6 a niveles altos o bajos, como se determina en el Ejemplo 1. Las células que expresaban CLDN6 se incubaron con anticuerpos de referencia o de control (descritos en el Ejemplo 3) durante 30 min en hielo y, después de lavar, se incubaron con anticuerpo de Cabra anti-IgG de ratón conjugado con Alexa Fluor® 647 (reactividad x mínima), Biolegend Núm. de Cat. 405322 durante 30 min en hielo. La fluorescencia se leyó mediante un citómetro de flujo BD Biosciences Accuri™ (San Jose, CA).
Las transferencias Western se llevaron a cabo sobre nitrocelulosa con anticuerpos de referencia y de control. Brevemente, se hirvieron muestras de productos lisados celulares para desnaturalizar el contenido de proteína. Se utilizó SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS) para separar las proteínas desnaturalizadas por la longitud del polipéptido. Las proteínas separadas se transfirieron después del gel de acrilamida a una membrana de nitrocelulosa. Se utilizó una solución de Albúmina de Suero Bovino (BSA) al 2% para bloquear la membrana, minimizando la unión de anticuerpos no específicos. La membrana se incubó con anticuerpos de referencia o de control. La membrana se tiñó con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) que reconoce los anticuerpos de referencia o de control y la detección del anticuerpo secundario se realizó mediante quimioluminiscencia.
Las líneas con expresión en exceso se utilizaron para validar los anticuerpos de control y de referencia, y, una vez validadas, los anticuerpos de control y de referencia se utilizaron para caracterizar las líneas celulares endógenas. Las células que expresaban en exceso CLDN6 se incluyeron como controles positivos en estos ensayos.
Los ensayos FACS mostraron que cuatro líneas celulares de cáncer de ovario, además de una línea celular de cáncer endometrial, línea celular de cáncer de vejiga, línea celular de cáncer de pulmón y línea celular de cáncer GI superior, expresaban CLDN6 en la superficie a niveles elevados. Los altos niveles de expresión de CLDN6 también se detectaron mediante transferencia Western. Se demostró que dos líneas celulares adicionales de cáncer de ovario, una línea celular adicional de cáncer de hígado, una línea celular adicional de cáncer de pulmón y una línea celular adicional de cáncer GI superior expresaban CLDN6 a un nivel moderado en la superficie, como se detecta mediante transferencia Western. Las células tumorales endometriales y las células tumorales de vejiga también expresaron niveles elevados de CLDN6 como xenoinjertosin vivo.Los niveles de expresión endógena de CLDN6 por las líneas celulares cancerosas analizadas se resumen en la Tabla 2.
TABLA 2
Ejemplo 5
Este ejemplo demuestra la inmunización de ratones para la producción de anticuerpos específicos de CLDN6.
Se produjeron anticuerpos específicos de CLDN6 inmunizando ratones Balb/c y CD1 con una mezcla de tres inmunógenos peptídicos diferentes siguiendo las técnicas del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson. Los tres péptidos abarcaron el segundo bucle en el dominio extracelular de CLDN6 (es decir, EL2). Los péptidos incluyen la longitud completa de EL2, un péptido que abarca la primera mitad (N-terminal) de EL2, y un péptido que abarca la segunda mitad (C-terminal) de EL2. La Tabla 3 proporciona las secuencias de los tres péptidos.
TABLA 3
Los ratones también se inmunizaron con células 3T3 que expresaban en exceso CLDN6 de longitud completa utilizando un plásmido que comprendía un vector de expresión de CLDN6-myc-DDK humano.
Se recogieron esplenocitos de los ratones inmunizados y se fusionaron con líneas de mieloma mediante Electrofusión BTX (BTX, Holliston, MA) para generar hidridomas. Se generaron 7680 cultivos de hibridoma primarios y se cultivaron en placas de 384 pocillos. La capacidad de los anticuerpos para unirse al péptido se evaluó mediante matriz de cuentas utilizando cuentas que expresaban las tres dianas peptídicas diferentes. Se volvieron a disponer en matriz 1920 anticuerpos positivos potenciales en placas de 96 pocillos escrutadas adicionalmente mediante citometría de flujo frente a modelos de líneas celulares endógenos y artificiales.
Los sobrenadantes de hibridoma positivos se contraescrutaron a continuación mediante citometría de flujo frente a modelos endógenos y artificiales de proteínas que tienen similitud de secuencia con la región diana (p. ej., otras proteínas CLDN). Del escrutinio secundaria y el contraescrutinio, se eligieron ~20 anticuerpos específicos para CLDN6 para un estudio adicional. Estos anticuerpos se subclonaron y se determinaron las secuencias variables de las cadenas pesada y ligera. Véase la Tabla B y la lista de secuencias.
Los anticuerpos contra CLDN6 se formatearon como anticuerpos IgG de longitud completa utilizando la expresión ExpiCHO™. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos se clonaron en un vector de expresión de anticuerpos que se había modificado mediante ingeniería genética en el laboratorio basándose en un vector pcDNA™3.4-TOPO® (Número de catálogo: A14697, ThermoFisher Scientific, EE.UU.) y se había transfectado a células CHO (Según el protocolo proporcionado en el kit (Sistema de Expresión ExpiCHO™, Número de Catálogo: A29133, ThermoFisher Scientific, EE.UU.)). Los anticuerpos se purificaron y se determinaron la unión de la superficie celular de los anticuerpos a CLDN6 y la CI50 del anticuerpo mediante FACS en el que los anticuerpos contra CLDN6 se conjugaron directamente con Éster de NHS (Ester de Succinimidilo) Alexa Fluor® 647, Núm. de Cat. A20106 (ThermoFisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Los anticuerpos contra CLDN6 se probaron de 0,32 nM a 1000 nM (dilución en serie 1:5, 6 puntos) en un volumen de 50 pl con sistemas de 150.000 células.
Se utilizaron células que expresaban CLDN6 en ensayos FACS para determinar la capacidad del anticuerpo contra CLDN6 para unirse a CLDN6 sobre la superficie de las células y reaccionar de manera cruzada con otros miembros de la familia CLDN. Se utilizaron células HEK293 T modificadas mediante ingeniería genética para expresar CLDN6 humana fusionada a GFP, CLDN6 de ratón fusionada a GFP, CLDN9-GFP, CLDN4-GFP o CLDN3-<g>F<p>o GFP sola (sin CLDN6) como modelos artificiales de expresión de CLDN6. Se utilizaron células ARK2, OVCA429, LS513 y MCF7 como modelos endógenos de expresión de CLDN6, así como modelos para la expresión de CLDN3/4.
Para cada tipo de célula sometida a prueba y para cada mAb, las células se desprendieron de la superficie de los matraces de cultivo mediante EDTA (en lugar de tripsina) con el fin de proteger las proteínas de la superficie celular. Las células desprendidas se incubaron después con mAb contra CLDN6 marcados con Alexa Fluor® durante 30 min en oscuridad sobre hielo a una concentración predeterminada. Los mAb contra CLDN6 se marcaron directamente con Éster de NHS (Éster de Succinimidilo) Alexa Fluor®647. Después del lavado, las células se leyeron en un Citómetro de Flujo BD Accuri™ C6 para detectar la unión anticuerpo-proteína antigénica en el canal FL4H. Cada anticuerpo se sometió a prueba a concentraciones variadas para establecer una curva de dosis-fluorescencia. La CE50/CI50 de los anticuerpos (la concentración del anticuerpo a la que se calculó la mitad del valor máximo basándose en los valores de FL4H (seleccionados en células individuales viables) utilizando el kit de herramienta para CI50 Very Simple disponible en línea que permite representar gráficamente datos de dosis-respuesta biológicos y ajustarlos a tipos de curva para proporcionar la CE50/CI50. El valor máximo fue la concentración más baja del anticuerpo a la que la fluorescencia aumentaba. Los anticuerpos también se escrutaron para determinar su capacidad de reaccionar de manera cruzada con otras proteínas CLDN tales como CLDN9, CLDN3 y CLDN4. Estos valores se utilizaron para determinar la afinidad relativa de cada anticuerpo entre el conjunto de anticuerpos sometido a prueba. Los datos de reactividad cruzada se obtuvieron utilizando una metodología similar, pero con células que tenían un perfil de expresión diferente para CLDN6, CLDN3, CLDN4 y CLDN9.
Los datos de afinidad relativa y los datos de reactividad cruzada determinados de esta manera se exponen en las Tablas 4 y 5.
TABLA 4
Núm. AB corresponde a Núm. AB enumerado en las Tablas A y B.
TABLA 5
Núm. AB corresponde a Núm. AB enumerado en las Tablas A y B.
Ejemplo 6
Este ejemplo demuestra la caracterización de mAb IgG quiméricos de ratón.
Se llevaron a cabo ensayos de proliferación 3D en agar blando y ensayos de unión de xenoinjerto para caracterizar adicionalmente los mAb descritos en el Ejemplo 5. En resumen, una mezcla de 250 pl de la capa superior que contenía 10.000 células en agarosa SeaPlaque al 0,6% en 1x medio RPMI se sembró en la parte superior de una capa inferior de 250 pl solidificada de agarosa SeaPlaque al 0,6% en 1x medio RPMI para cada pocillo de una placa de 48 pocillos. Se colocó una capa alimentadora líquida de 250 pl que contenía 1x medio RPMI por encima de la capa superior solidificada. Las tres capas del ensayo de agar blando se prepararon con o sin Trastuzumab, mAb contra Cldn6 o control de IgG2a de ratón comenzando a 150 ng/ml (1 pM) y terminando a 1,5 ng/ml, diluyendo 1:10. Cada condición de prueba se realizó por duplicado. Se permitió que las células formaran colonias durante 3 semanas antes de teñirlas con rojo neutro al 0,05% y se tomaron imágenes en el microscopio óptico invertido EVOS XL. Las líneas celulares con una disminución >20% en el número de colonias en el control frente al tratado se consideraron sensibles.
Como se muestra en la Tabla 6, muchas de las líneas celulares exhibieron una disminución en el número de colonias cuando se trataron con el anticuerpo indicado.
TABLA 6
Se llevaron a cabo estudios de uniónin vivoen ratones de xenoinjerto a los que se habían inyectado líneas celulares de cáncer humano. En resumen, se establecieron modelos de xenoinjerto de líneas celulares de cáncer humano en ratones desnudos atímicos CD-1 de seis semanas de edad (Charles River Laboratories). Se siguieron las siguientes condiciones para la inyección subcutánea de cada línea celular: ARK20,75 x 107, UMUC4 1,0 x 107, OV90 1,0 x 107 y M2020,5 x 107 células todas con matrigel al 50% (BD Biosciences). Se inyectó un número suficiente de ratones para lograr 8 ratones por brazo de tratamiento. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de 150 a 300 mm3 los ratones se aleatorizaron en grupos de tratamiento. Para el tratamiento, cada anticuerpo terapéutico (AB3, AB2, Ab1 de Referencia, Ab2 de Referencia, Ab3 Referencia (trastuzumab) y control de IgG2 no dirigido se diluyeron en solución salina estéril a una concentración de trabajo de 1 mg/ml para inyección intravenosa (IV) en la vena caudal. Para el estudio M202, se dosificó trametinib (solvato de DMSO, MedChem Express) a 1,0 mg/kg (Cremophor al 10%, PEG400 al 10%) mediante PO en un programa de 5 días de actividad, 2 días de descanso para el primer ciclo semanal, seguido de reducción a 0,5 mg/kg durante las dos semanas restantes de dosificación. Los xenoinjertos tumorales se midieron con calibradores tres veces a la semana y el volumen tumoral en mm3 se determinó multiplicando la altura x anchura x longitud. Los ratones se trataron durante 2-7 semanas. Al final del estudio, los animales se sacrificaron y el tejido tumoral se extirpó y se dividió para almacenarse como tejido congelado instantáneamente o incluido en parafina fijado en formalina (FFPE) para el análisis de biomarcadores. Todo el trabajo con animales se llevó a cabo bajo un protocolo aprobado por IACUC y la Universidad de California en el Comité de Investigación Animal de Los Ángeles. Los datos se analizaron utilizando el soporte lógico StudyLog de StudyDirector (San Francisco, CA). Los resultados se presentan como volúmenes medios para cada grupo. Las barras de error representan el error típico (ET) de la media.
Los resultados de los ensayos de xenoinjerto se muestran en las Figuras 6-10. Como se muestra en las Figuras 6A y 6B, cada uno de AB2 y AB3 provocó un cambio medio sustancial en el volumen tumoral el Día 14, con respecto al anticuerpo IgG2 de control, en ratones portadores de tumores endometriales. Como se muestra en las Figuras 7A y 7B, AB3 causó un cambio medio sustancial en el volumen tumoral el Día 35, con respecto al anticuerpo IgG2 de control, en ratones portadores de tumores de vejiga. Las Figuras 8A y 8B muestran que cada uno de AB2 y AB3 causaba un cambio medio sustancial en el volumen tumoral el Día 20, con respecto al anticuerpo IgG2 de control, en ratones portadores de tumores de ovario. Las Figuras 9A y 9B demuestran que AB3 funciona de una manera específica de CLDN, ya que el modelo utilizado en las Figuras 9A y 9B no expresó ninguno de CLDN6, CLDN3, CLDN4 y CLDN9 y, por lo tanto, se utilizó como control negativo. Los datos de las Figuras 9A y 9B también sugieren que AB3 tiene menos actividad inespecífica que Ab1 de Referencia y Ab2 de Referencia. La Figura 10A resume los resultados de las Figuras 6-9. Como se muestra en la Figura 10A, AB3 redujo significativamente el crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores endometriales, de vejiga y ováricos, cada uno de los cuales expresaba CLDN6, pero no redujo el crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores de melanoma, que no expresaban CLDN6 (Figura 10B). Como se muestra en la Figura 11, la cadena media en el peso corporal del ratón durante el tratamiento no cambió sustancialmente, sugiriendo la seguridad del tratamiento.
Se llevó a cabo un segundo conjunto de experimentos en modelos de xenoinjerto de una línea celular de cáncer de ovario humano, OV90. Se inyectó a los ratones uno de 10 mAb descritos en el Ejemplo 5 o un anticuerpo de control (anticuerpo IgG2a de ratón, ab contra CLDN6 de referencia) o con un control de vehículo de PBS. Hubo 8 ratones por grupo y a cada animal se le inyectaron por vía intravenosa 10 mg/kg de anticuerpo cada 4 días. Como se muestra en las Figuras 12A y 12B, varios anticuerpos descritos en el Ejemplo 5 redujeron el volumen tumoral en ratones portadores de tumores de ovario. Entre los que mejor funcionaban estaban AB3, AB4, AB7 y AB10, aunque todos los anticuerpos sometidos a prueba redujeron el volumen tumoral, con relación al control de vehículo. Como se muestra en la Figura 13, el peso corporal de los animales tratados con AB3, AB4, AB7 o AB10 no cambió significativamente, sugiriendo su seguridad.
Ejemplo 7
Este ejemplo demuestra la caracterización adicional de mAb IgG quiméricos de ratón.
Se llevaron a cabo ensayos de cuantificación de internalización. En resumen, el estudio de la internalización de la proteína CLDN6 desencadenada por la unión de Ab1 de referencia, AB3 o AB4 se realizó con un control positivo, receptor de transferrina (TfR) expresado ubicuamente que es un receptor de superficie celular conocido que se internaliza después de la unión del anticuerpo.
Los anticuerpos contra TfR y CLDN6 se marcaron con Rojo Texas™-X, Éster de Succinimidilo, isómeros mixtos, Núm. de Cat. T6134 (ThermoFisher Scientific). Las células se sembraron en una cámara de 8 Pocillos g-Slide (Núm. de Cat.
80826, ibidi Cells In Focus Inc.) un día antes del tratamiento con anticuerpo para permitir que las células se anclaran y crecieran. Las células se incubaron con anticuerpos marcados durante 30 min en la oscuridad sobre hielo. A continuación, la cámara que contenía células marcadas con CLDN6 o TfR se leyó mediante un microscopio de fluorescencia Echo lab para recoger imágenes antes de la internalización. La cámara se incubó a continuación a 37°C durante 40 min para permitir el proceso de internalización y las imágenes se recogieron nuevamente mediante el microscopio de fluorescencia Echo lab. AB3 y AB4 causaron un mayor grado de internalización de CLDN6, en comparación con el causado por el Ab1 de referencia (datos no mostrados).
Ejemplo 8
Este ejemplo demuestra la caracterización adicional de mAb IgG quiméricos de ratón.
Se llevaron a cabo ensayos de proliferación bidimensional (2D) con anticuerpos seleccionados descritos en el Ejemplo 5 como sigue: Las células se sembraron por duplicado de 5.000 a 20.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos. Al día siguiente, las células se trataron con seis diluciones 1-5 de mAb (comenzando a 100 nM de Trastuzumab, mAb contra Cldn6, o control de IgG2A de ratón) y una concentración fija de 1 ng/gl de anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Monometil auristatina E (MMAE) (Moradec, LLC) para generar curvas de respuesta a la dosis. Los pocillos de células no tratados se cuantificaron el Día 1, el día del tratamiento con anticuerpo, y más tarde el Día 6 para determinar el intervalo de crecimiento celular. Los pocillos tratados con mAb se cuantificaron el Día 6 y se determinó el crecimiento en cada condición de tratamiento como una razón porcentual normalizada frente al crecimiento de células no tratadas. La cuantificación se realizó en el Contador de Partículas Z1 (Beckman Coulter, Inc).
Los resultados se muestran en la Figura 14. AB2, AB3, AB4 y AB5 demostraron la mayor eficacia en la inhibición de la proliferación. La CI50 para cada uno de estos anticuerpos estaba entre 0,1 nM y 1 nM. Cada uno de AB7, AB10, AB11 y AB15 también demostró la capacidad de inhibir la proliferación en este ensayo, aunque en menor grado que AB2, AB3, AB4 y AB5.
Ejemplo 9
Este ejemplo demuestra la humanización de anticuerpos de las presentes divulgaciones.
Se seleccionó un subconjunto de anticuerpos enumerados en la Tabla A para el análisis de humanización. Las secuencias variables de cadena pesada (VH) y variables de cadena ligera (VL) de los anticuerpos AB1, AB3, AB4, AB9, AB11 y AB18 se compararon con una biblioteca de secuencias de línea germinal humana conocidas de genes de VH humanos y genes de VL kappa humanos (IMGT® sistema internacional de información ImMunoGeneTics® www.imgt.org; fundador y director: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Francia); las bases de datos utilizadas fueron genes de VH humanos de IMGT (F+ORF, 273 secuencias de la línea germinal) y genes de VL kappa humanos de IMGT (F+ORF, 74 secuencias de la línea germinal). La línea germinal humana aceptora se eligió entre las que tenían secuencias más cercanas al anticuerpo parental.
La Tabla 7 proporciona, para cada VH y VL de cada anticuerpo, información sobre las secuencias de la línea germinal humana elegidas como la secuencia aceptora y la región de unión elegida de la cadena pesada humana (gen J). La región de unión (gen J) se eligió entre secuencias de las regiones de unión humanas recopiladas enIMGT® International ImMunoGeneTics Information System®www.imqt.orq(fundador y director: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Francia).
TABLA 7
Las CDR se definieron según la definición de AbM (véase el sitio web del Dr. Andrew C. R. Martin www.bioinf.orq.uk/abs/ para una tabla que compara las definiciones de CDR).
Se podría requerir la alteración de las posiciones del marco de la línea germinal humana (es decir, restos no CDR en VH y VL) a la correspondiente secuencia murina parental para optimizar la unión del anticuerpo humanizado. Las secuencias para versiones de anticuerpos humanizados se proporcionan como SEQ ID NO: 376-421.
Para AB1, se determinó que cada uno de Asn52 (numeración secuencial) de CDR2 de la HC y Asn54 de CDR2 en la LC tenía un bajo potencial de desamidación basándose en la secuencia y conformación.
Para AB3, se determinó que cada uno de Asn31 (numeración secuencial) de CDR1 de la HC, Asn57 de CDR2 de la HC, Asn 28 de CDR1 de LC y Asn50 de CDR2 de la LC tenía un bajo potencial de desamidación basándose en la secuencia y conformación. Se determinó que Trp33 de CDR1 de la HC estaba probablemente expuesto al disolvente y tenía potencial para oxidación, especialmente en condiciones de estrés. En la CDR3 de la HC se determinó que hay una Cys106 libre dentro de la CDR que podría ser problemática cuando se fabrica el anticuerpo, ya que probablemente se expone al disolvente. Se recomendó la alteración de este resto de Cys a Tyr, Ser o Ala. Se somete a prueba el mantenimiento de la unión de estos anticuerpos alterados. Se determinó que Ile53 de CDR2 de la LC estaba expuesta al disolvente y pudo conducir a unión no específica. Se sugirió que este resto de Ile se alterara a Ser. Se somete a prueba el mantenimiento de la unión de este anticuerpo alterado.
Para AB4, se determinó que cada uno de Asn52 (numeración secuencial) de la CDR2 de HC y Asn58 de CDR2 de la LC tenía un bajo potencial de desamidación basándose en la secuencia y conformación. Se determinó que la secuencia DGNT en la CDR1 de la LC era problemática, ya que se determinó que tenía un alto potencial de formación de isoaspartato (en la secuencia DG) así como un potencial de desamidación (en la secuencia NT). Se recomendó la alteración de esta secuencia.
Para AB9, se determinó que Asn33 (numeración secuencial) en CDR1 de HC, y Asn52 y Asn59 en CDR2 de HC tenían un bajo potencial de desamidación basándose en la secuencia y conformación. Se determinó que Asn54 tenía un potencial medio para la desamidación basándose en la secuencia y conformación. Se determinó que la secuencia de NGG en CDR2 de la HC tenía un potencial alto/medio para la desamidación seguido de la formación de isoaspartato. Por tanto, se recomendó que esta secuencia de aminoácidos fuera alterada. Una Cys106 libre en la CDR3 de la HC puede ser problemática cuando se fabrica el anticuerpo, ya que se determina que es probable que esté expuesto al disolvente. Se sugiere la alteración de este resto de Cys a Tyr, Ser o Ala. Se somete a prueba el mantenimiento de la unión de estos anticuerpos alterados. Arg28 en CDR1 de HC no se encuentra a menudo en anticuerpos humanos. Este resto se altera a Thr y se somete a prueba el mantenimiento de la unión. Para el AB 9, se determinó que Trp32 (numeración secuencial) en la CDR1 de la LC estaba probablemente expuesto al disolvente y podría experimentar oxidación, especialmente en condiciones de estrés. La Leu24 de la misma CDR no se encuentra a menudo en anticuerpos humanos. Este resto se altera a Arg y se somete a prueba el mantenimiento de la unión.
Para AB11, se determinó que Asp54-Ser55 (numeración secuencial) en CDR2 del HC tenía un bajo potencial para la formación de isoaspartato. Se determinó que Asn57 en CDR2 de la LC tenía un bajo potencial de desamidación basándose en la secuencia y conformación.
Para AB18, se determinó que Asn33 y Asn50 CDR-H2 (numeración secuencial) en CDR1 de la HC tenían un bajo potencial de desamidación basándose en la secuencia y conformación. En la CDR2 de la HC, se determinó que la secuencia Asp-Pro (DP) tenía un potencial para experimentar fragmentación en condiciones ácidas. En el dominio VL, se determinó que Asn34 y Asn37 en la CDR1 de la LC tenían un bajo potencial de desamidación basándose en la secuencia y conformación. En la CDR3 de la LC, se determinó que Trp56 estaba probablemente expuesto al disolvente y podía experimentar oxidación, especialmente en condiciones de estrés.
La Tabla 8 muestra un esquema para combinar la VH y VL humanizadas. Si ninguna de las versiones humanizadas es equivalente al mAb quimérico. Los pares preferidos se muestran en negrita y subrayados.
TABLA 8
Los anticuerpos humanizados descritos en la Tabla 8 se construyeron y expresaron como se describe esencialmente en el Ejemplo 5. Se llevaron a cabo ensayos FACS como se describe esencialmente en el Ejemplo 5 para determinar las fuerzas relativas de unión al antígeno de los anticuerpos humanizados. Se probaron dos dosis (1,5 gg o 0,3 gg) de los anticuerpos humanizados para determinar la unión a CLDN6 humana o CLDN6 murina, cuyas proteínas se expresaron mediante clones 293T modificados mediante ingeniería genética. Los resultados de los ensayos se proporcionan en la Tabla 9.
TABLA 9
También se llevaron a cabo ensayos FACS para determinar las fuerzas de unión a antígeno relativas de los anticuerpos humanizados (a 1,5 gg o 0,3 gg) para la unión a CLDN6 tal como se expresa mediante las líneas celulares de cáncer indicadas. Los resultados de los ensayos se proporcionan en la Tabla 10. Se utilizó solo 2° Ab como control negativo. Se utilizaron 64A-chim, h64A y SC27-108-chim como anticuerpos de referencia Se utilizaron los correspondientes anticuerpos Parentales (anticuerpos antes de la humanización) como controles y se designaron con "chim".
TABLA 10
"chim" es una forma prehumanizada del anticuerpo.
Basándose en los datos de unión a antígeno invitro,se seleccionaron tres anticuerpos humanizados para pruebas y desarrollo adicionales. Los anticuerpos derivaron de AB1, AB3 y AB4.
Se llevaron a cabo estudios de uniónin vivode las versiones humanizadas de AB1, AB3 y AB4 en ratones con xenoinjerto a los que se inyectaron líneas celulares de cáncer de vejiga UMUC4, como se describe esencialmente en el Ejemplo 6. Brevemente, se establecieron modelos de xenoinjerto de UMUC4 en ratones desnudos atímicos CD-1 de seis semanas de edad (Charles River Laboratories). Después de que los tumores alcanzaran un tamaño medio de 150 a 300 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos de tratamiento. Los anticuerpos humanizados se diluyeron en solución salina estéril hasta una concentración de trabajo de 1 mg/ml para inyección intravenosa (IV) en la vena caudal. Los xenoinjertos tumorales se midieron con calibradores tres veces a la semana y el volumen tumoral en mm3 se determinó multiplicando altura x anchura x longitud. Los ratones se trataron durante 2-7 semanas. Al final del estudio, los animales se sacrificaron y el tejido tumoral se extirpó y se dividió para almacenarse como tejido congelado instantáneamente o incluido en parafina fijado en formalina (FFPE) para el análisis de biomarcadores.
Los resultados de los ensayos de xenoinjerto se muestran en las Figuras 15-21. La Figura 15 muestra los resultados del ensayo de xenoinjerto para dos versiones de AB3 humanizado (AB3-2 y AB3-4), en donde el tratamiento implicó 10 mg/kg de administrados Q4D. Los controles incluyeron control de vehículo (PBS), IgG humana (10 mg/kg Q4D) y la versión murina de AB3 (10 mg/kg Q4D). Como se muestra en esta figura, el AB3-4 humanizado demostró una disminución en el volumen tumoral durante el periodo de tratamiento de 35 días. La Figura 16 muestra los resultados del ensayo de xenoinjerto para los mismos tratamientos que los experimentos mostrados en la Figura 15, excepto que se llevaron a cabo dos controles adicionales (64A MSE y una versión quimérica del mismo (64A CHIM)). Como en la Figura 15, la Figura 16 muestra una disminución marcada en el volumen tumoral tras el tratamiento con AB3-4 humanizado.
La Figura 17 muestra los resultados del ensayo de xenoinjerto para AB1-5 humanizado. Los controles incluyeron control de vehículo (PBS), IgG humana (10 mg/kg Q4D) y la versión murina de AB1 (10 mg/kg Q4D). Como se muestra en la Figura 17, los ratones tratados con AB1-5 humanizado demostraron una disminución marcada en el volumen tumoral.
La Figura 18 muestra los resultados del ensayo de xenoinjerto para AB4-3 humanizado. Los controles incluyeron control de vehículo (PBS), IgG humana (10 mg/kg Q4D) y la versión murina de AB4 (10 mg/kg Q4D). Los ratones tratados con AB4-3 humanizado no demostraron una disminución marcada en el volumen tumoral.
Las Figuras 19-21 demuestran los resultados de un ensayo de xenoinjerto en donde se sometieron a prueba los 4 anticuerpos humanizados de las Figuras 15-18. Se utilizaron versiones de Ratón y Quiméricas de anticuerpos contra CLDN6 de referencia como controles. Como se muestra en la Figura 19, los ratones tratados con AB3-4 y AB1-5 humanizados demostraron disminuciones en el volumen tumoral. La Figura 20 demuestra el volumen tumoral a lo largo del tiempo hasta el Día 55. Los pesos corporales de los ratones en el ensayo se muestran en la Figura 21.
EJEMPLO 10
Se llevó a cabo un análisisin silicocon diferentes secuencias de AB1, AB3 y AB4. En particular, se alinearon las secuencias para (a) el clon parental original, (b) la secuencia de la línea germinal de ratón más cercana, (c) la secuencia de la línea germinal humana más cercana, y (d) la secuencia humanizada, para cada anticuerpo. Los aminoácidos que se cree que han experimentado maduración de la afinidad se marcan con un asterisco mientras que los aminoácidos que difieren de los aminoácidos en esa posición según la información de la base de datos de anticuerpos se marcan con una almohadilla. Las CDR para cada secuencia están en recuadros. Basándose en este análisis, se prepararán varios anticuerpos humanizados que tienen una secuencia enumerada en la TABLA 10.
TABLA 10
Se preparan múltiples anticuerpos que tienen una secuencia como se define por estas secuencias consenso como se describe esencialmente en el Ejemplo 5 y se someten a pruebain vitropara determinar la unión al antígeno mediante FACS (como se describe esencialmente en el Ejemplo 5) ein vivopara determinar la capacidad de disminuir el volumen tumoral en ratones (como se describe esencialmente en el Ejemplo 6).
Se debe interpretar que el uso de los términos "un", "uno", "una" y "el" y "la" y referentes similares en el contexto de la descripción de la divulgación (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan "que incluye, pero no se limita a") a menos que se indique lo contrario.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une a Claudina 6 (CLDN6) o fragmento de unión a antígeno del mismo en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se seleccionan de un grupo que consiste en
(a) un anticuerpo que se une a CLDN6 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden:
(i) una CDR1 de HC que comprende la secuencia de aminoácidos de FTFSXYX (SEQ ID NO: 455), en donde X en la posición 5 es N y X en la posición 7 es W;
(ii) una CDR2 de HC que comprende la secuencia de aminoácidos de IRLKXDXYAT (SEQ ID NO: 456), en donde X en la posición 5 es S y X en la posición 7 es N;
(iii) una CDR3 de HC que comprende la secuencia de aminoácidos de XDGPPSGX (SEQ ID NO: 457), en donde X en la posición 1 es N y X en la posición 8 es S;
(iv) una CDR1 de LC que comprende la secuencia de aminoácidos de EXIYSY (SEQ ID NO: 476), en donde X es N;
(v) una CDR2 de LC que comprende la secuencia de aminoácidos de XAK (SEQ ID NO: 477), en donde X en la posición 1 es N; y
(vi) una CDR3 de LC que comprende la secuencia de aminoácidos de QXHYXVPWT (SEQ ID NO: 454), en donde X en la posición 2 es H y X en la posición 5 es T; y
(b) un anticuerpo que se une a CLDN6 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1-3 de cadena pesada (HC) de SEQ ID NO: 23, 24 y 25, y las secuencias de aminoácidos de CDR1-3 de cadena ligera (LC) de SEQ ID NO: 20, 21 y 22.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es (i) un anticuerpo monoclonal, y/o
(ii) un anticuerpo humano, quimérico o humanizado.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende la secuencia del dominio variable de la cadena pesada como se proporciona en SEQ ID NO: 387 y la secuencia del dominio variable de la cadena ligera como se proporciona en s Eq ID NO: 389.
4. Una composición farmacéutica que comprende:
a) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores; b) un producto conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de (a); c) una proteína de fusión que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de (a); d) un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de (a);
e) un vector que comprende el ácido nucleico de (d);
f) una célula que comprende el ácido nucleico de (d) o el vector de (e); o
g) una combinación de los mismos;
y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.
5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición farmacéutica según la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento del cáncer.
6. Un métodoin vitropara detectar Claudina 6 (CLDN6) en una muestra que comprende (a) poner en contacto el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con la muestra, y (b) someter a ensayo un inmunocomplejo que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo unidos a CLDN6.
7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición farmacéutica según la reivindicación 4 para su uso en un método de diagnósticoin vivode un cáncer positivo para Claudina 6 (CLDN6) en un sujeto.
8. Un método para producir la composición farmacéutica de la reivindicación 4, que comprende combinar un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables; y uno cualquiera de los puntos (a)-(g) de la reivindicación 4.
9. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
i. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o ii. una proteína de fusión que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
10. Un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 9.
11. Una célula anfitriona que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9 o el vector de la reivindicación 10.
12. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o una proteína de fusión del mismo que se unen a una proteína Claudina 6 (CLDN6), que comprende
i. cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 11 en un medio de cultivo celular, y
ii. recoger el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o la proteína de fusión del medio de cultivo celular.
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