ES2986457T3

ES2986457T3 - Polipéptido, procedimiento para su producción y uso del mismo

Info

Publication number: ES2986457T3
Application number: ES19211389T
Authority: ES
Inventors: Xia Yang
Original assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2024-11-11
Anticipated expiration: 2039-11-26
Also published as: US20200165319A1; DK3660045T3; EP3660045B1; FI3660045T3; RS65903B1; US11396537B2; SI3660045T1; HUE068092T2; HRP20241179T1; LT3660045T; CN109593126A; SMT202400340T1; PL3660045T3; EP3660045A1; PT3660045T; CN109593126B

Abstract

La presente invención se refiere a un polipéptido, a un procedimiento para su producción y a un uso del mismo. El polipéptido de la presente invención tiene un excelente efecto de adhesión y es muy estable en una solución acuosa. Las endotoxinas se pueden eliminar más fácilmente del producto del polipéptido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido, procedimiento para su producción y uso del mismo

Campo técnico

La invención pertenece al campo técnico de la ingeniería genética, y se refiere a un polipéptido, a un procedimiento para la producción del mismo, y a un uso del mismo.

Técnica anterior

El colágeno es un tipo de proteína ampliamente distribuida en los tejidos conectivos del cuerpo humano, y también es la proteína más abundante en el cuerpo humano y puede representar de 25% a 35% de las proteínas totales. Su función principal es mantener el entorno extracelular, mantener las funciones fisiológicas normales de los tejidos y órganos, y reparar el daño corporal. El colágeno es un recurso biológico natural, que tiene la histocompatibilidad biológica, la elasticidad de soporte para las células y la degradabilidad que no pueden conseguir otros materiales poliméricos. Por lo tanto, el colágeno se puede utilizar ampliamente en industrias tales como medicina y cosmética.

Sin embargo, el colágeno natural es insoluble en agua y no es de naturaleza uniforme, y por lo tanto es difícil de utilizar por el cuerpo humano y a menudo necesita ser tratado por medios químicos. Por otra parte, todos los productos de colágeno actualmente disponibles en el mercado se toman de tejidos de animales tales como cerdos, ganado vacuno y peces, y es difícil evitar la infección viral, que, junto con su incompatibilidad con el cuerpo humano, puede conducir a rechazo inmunitario y síntomas de alergia. Si el colágeno se extrae de materias primas de placenta humana, no solo tiene una fuente limitada, sino que también se enfrenta a un castigo grave de la ley. Por lo tanto, el colágeno actual solo se puede utilizar en cosméticos y productos para el cuidado de la salud, y la función biológica original del colágeno no se puede ejercer en absoluto.

Estructuralmente, la estructura del colágeno natural del cuerpo humano es muy complicada, dando como resultado que es muy difícil expresar y producir en masa colágeno humano por medios convencionales. La molécula de colágeno natural tiene una estructura superenrollada especial que consiste en tres cadenas polipeptídicas que no tienen enlaces de hidrógeno intracatenarios y están soportadas sólo por enlaces de hidrógeno intercatenarios. Esta estructura helicoidal es una hélice levógira con tres restos de aminoácidos como repetición básica, y estos tres restos de aminoácidos son típicamente Gly-X-Pro. Gly es esencial para la formación de enlaces de hidrógeno en el colágeno; no tiene por sí misma cadenas laterales, dando como resultado que el colágeno se amontona estrechamente. A un nivel estructural más alto, las superbobinas de colágeno se asociarán adicionalmente para formar fibrillas de colágeno. En organismos, la síntesis y modificación de colágeno comienza con procolágeno y experimenta muchos cambios químicos tales como hidroxilación, glicosilación y entrecruzamiento, y están regulados por una variedad de enzimas biológicas. Además de la cadena de colágeno, el procolágeno también contiene cabezas esféricas y colas. Sin estas cabezas y colas, la cadena de colágeno no se plegaría en la triple hélice correcta, conduciendo a la pérdida de la actividad biológica del colágeno. Por lo tanto, es poco probable que el colágeno preparado según la secuencia génica original se organice espontáneamentein vitropara formar la estructura espacial correcta. Tales dificultades han obstaculizado seriamente el desarrollo y la producción de colágeno humano.

El procedimiento tradicional para la producción de colágeno consiste en tratar tejidos derivados de animales mediante métodos ácidos, alcalinos y de enzimólisis y extraer derivados de colágeno. El colágeno extraído por estos métodos ha perdido la actividad biológica original y por tanto no puede aplicarse al campo biomédico para realizar la función verdadera. Con el desarrollo de la biotecnología moderna, las personas continúan tratando de utilizar técnicas transgénicas para preparar colágeno humano recombinante en sistemas de expresión animales, vegetales y microbianos, lo que resuelve muchos inconvenientes de los procedimientos de extracción tradicionales. Los institutos de investigación extranjeros han obtenido leche que comprende colágeno humano cultivando ratones que contienen un gen de colágeno humano, aunque el coste de tal producción es demasiado alto y el ciclo de producción es demasiado largo, de modo que no puede ponerse en producción en masa.

La Invención de Patente China Núm. 201210482543.2 divulga un colágeno humano recombinante y un procedimiento para producir el mismo, y divulga un colágeno humano recombinante obtenido conectando un segmento peptídico de colágeno de tipo III a través de un conector y añadiendo una secuencia estable en el extremo C-terminal.

Sin embargo, existe la necesidad en la técnica de más colágenos humanos recombinantes con mejores características.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona los siguientes contenidos:

1. Un polipéptido que comprende 16 repeticiones de una secuencia expuesta en SEQ ID No. 1, las repeticiones de la secuencia están conectadas directamente, en donde el polipéptido no comprende una secuencia expuesta en SEQ ID No. 2.

2. Un polinucleótido que codifica el polipéptido según el punto 1.

3. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según el punto 2, y que comprende opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID No. 4, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID No. 4 está conectada directamente al extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico codificante del polipéptido, preferiblemente el vector de expresión comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 5.

4. Una célula anfitriona que comprende el vector de expresión según el punto 3, en donde la célula anfitriona es preferiblementeEscherichia coIí.

5. Un procedimiento para la producción del polipéptido según el punto 1, que comprende:

(1) cultivar la célula anfitriona según el punto 4 en un medio de producción y producir el polipéptido; (2) recoger el polipéptido, y opcionalmente digerir el polipéptido, preferiblemente digerir el polipéptido con proteasa TEV; y

(3) purificar el polipéptido mediante columna de Ni y/o cromatografía de intercambio aniónico; en donde opcionalmente el procedimiento para la producción no incluye una etapa adicional de eliminación de endotoxina; en donde preferiblemente el polipéptido purificado está sustancialmente libre de endotoxina o contiene menos de 5 UE/mL de endotoxina.

6. Una composición que comprende el polipéptido según el punto 1, en donde la composición es preferiblemente un dispositivo médico, un producto de ingeniería de tejidos, un producto cosmético o de cuidado de la salud, preferiblemente el polipéptido está en forma de una solución acuosa del polipéptido, preferiblemente la composición está libre de un componente que previene la degradación del polipéptido, y preferiblemente la composición es una composición para uso a largo plazo, siendo el uso a largo plazo preferiblemente más de medio año de uso.

7. El uso del polipéptido según el punto 1 en la fabricación de una composición, preferiblemente un dispositivo médico, un producto de ingeniería de tejidos, un cosmético o un suplemento sanitario, en donde preferiblemente el polipéptido está en forma de una solución acuosa del polipéptido, preferiblemente la composición está libre de un componente que previene la degradación de un polipéptido, y la composición es una composición para uso a largo plazo, siendo el uso a largo plazo más de medio año de uso.

8. El uso del polipéptido según el punto 1 para promover la adhesión celular.

9. El uso de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.4 o el vector de expresión según la presente invención para la producción del polipéptido según la presente invención.

El polipéptido de la presente invención tiene las siguientes ventajas: su adhesión celular es más fuerte que la de los colágenos de tipo III recombinantes existentes; tiene una estabilidad mayor en una solución acuosa, como se demuestra por la degradación en más de medio año, eliminando así la necesidad de añadir un reactivo para prevenir la degradación del polipéptido; la mayor parte de la endotoxina se puede eliminar por purificación mediante una columna de Ni y una cromatografía de intercambio aniónico a partir del producto del polipéptido, y el producto polipeptídico purificado está sustancialmente libre de endotoxina o contiene 5 UE/mL o menos de endotoxina; el polipéptido de la presente invención se obtiene a partir de una célula anfitriona con un rendimiento y pureza mayores.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Resultados de picos de espectrometría de masas del producto expresado;

Figura 2: Comparación de las actividades de adhesión celular entre diferentes colágenos de tipo III recombinantes;

Figura 3: Niveles de expresión celular de diferentes colágenos de tipo III recombinantes;

Figura 4: Purificación de diferentes colágenos de tipo III recombinantes;

Figura 5: Estabilidad de diferentes colágenos de tipo III recombinantes;

Figura 6: Endotoxina residual de diferentes colágenos de tipo III recombinantes;

Figura 7: Análisis de la estructura del colágeno de tipo III recombinante TE16C.

Descripción detallada

A continuación, se proporciona una descripción adicional para facilitar una comprensión de la invención.

Como se emplea en el presente documento, "instrumental médico" se refiere a aparatos, dispositivos, equipos, reactivos y calibradores de diagnósticoin vitro,materiales y otros artículos similares o relacionados de que se utilizan directa o indirectamente en el cuerpo humano.

Como se emplea en el presente documento, "producto de ingeniería de tejidos" se refiere a un producto utilizado en ingeniería de tejidos. La ingeniería de tejidos es una disciplina emergente que combina biología celular y ciencia de materiales para construir tejidos u órganosin vitrnoin vívo.

La presente invención se basa, en parte, en los siguientes hallazgos de los autores de la presente invención: cuando se expresa un polipéptido que comprende una pluralidad de secuencias repetidas de SEQ ID No. 1 enE. coIí,para aumentar la propiedad gelificante del polipéptido expresado recombinantemente, a menudo es necesario añadir una secuencia tal como los aminoácidos de la región bisagra GPPGPCCGGG (SEQ ID No. 2) al extremo C-terminal del polipéptido para ayudar a la gelificación (Referencia: Journal of Biochemistry. 2004; 136: 643-649) debido a que la proteína de interés es una proteína truncada y carece de la estructura de la proteína bisagra de la proteína de longitud completa. Por lo tanto, se diseñó una secuencia polipeptídica que comprendía SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 2, por ejemplo, la secuencia T16a de SEQ ID No. 9; sin embargo, se encontró que cuando el polipéptido de la secuencia tal como T16a se cultivaba en un matraz de agitación o un tanque de fermentación, la mayoría del polipéptido de interés formaba un precipitado gelatinoso que no podía disolverse y purificarse, por lo que el rendimiento fue muy bajo. Previamente, con el fin de resolver este problema, mediante la adición de conectores aminoacídicos que no eran de colágeno entre las secuencias repetidas (SEQ ID No. 1), se obtuvo un polipéptido que comprendía una pluralidad de tales secuencias repetidas; además, la modificación de tal polipéptido también se concentró principalmente en los restos de aminoácidos del conector y los aminoácidos de la región bisagra C-terminal, también conocida como secuencia estable C-terminal.

Sorprendentemente, después de analizar la estructura cristalina de SEQ ID No. 1, los autores de la presente invención descubrieron que la región de SEQ ID No. 1 puede formar una estructura trimérica del colágeno muy estable sin la implicación de una región bisagra. Por lo tanto, los autores de la presente invención siguieron modificando la secuencia polipeptídica y descubrieron que en el procedimiento de expresión de un polipéptido de la secuencia expuesta en SEQ ID No. 5, que comprende la secuencia expuesta en SeQ ID No. 4 y la secuencia expuesta en Se Q ID No. 3, un polipéptido que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID No. 3 se puede obtener en grandes cantidades, y ya no se requiere la implicación de la secuencia estable C-terminal. Por otra parte, en este momento, un polipéptido no forma una estructura coloidal prematuramente mientras se expresa de manera recombinante, no afectando de este modo a la purificación de proteínas posterior. Además, los autores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que en comparación con el colágeno humano recombinante (SEC ID No 6) en: la Invención de la Patente China Núm.

201210482543.2 el polipéptido de la presente invención es más estable en solución acuosa, se puede obtener a partir de células anfitrionas con un rendimiento y pureza superiores, y tiene una endotoxina significativamente inferior después de la purificación mediante una columna de Ni y una columna de intercambio aniónico.

GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGI

PGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPG

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PAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPRSPEFGPPGPCCG

GG (SEQ ID NO. 6).

En la presente invención, la secuencia repetida utilizada de SEC ID No 1 es GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP (SEC ID No 1). El polipéptido de la presente invención puede comprender una pluralidad de secuencias repetidas expuestas en SEQ ID No. 1, siempre que no haya conector entre las secuencias repetidas, el número de secuencias repetidas es 16, es decir, un polipéptido que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID No. 3:

GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGI PGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPG FRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGER GAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGI PGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPG FRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGER GAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGI PGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPG FRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGER GAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP (SEQ ID No. 3)

La secuencia polipeptídica de la invención puede comprender la secuencia C-terminal GPPGPCCGGG (SEQ ID No.

2), cuya realización no está cubierta por la invención reivindicada. Cuando se expresa un polipéptido que comprende una pluralidad de secuencias repetidas, los expertos en la técnica consideran típicamente añadir dicha secuencia para aumentar la estabilidad del polipéptido expresado. Preferiblemente, la secuencia polipeptídica puede no comprender la secuencia C-terminal GPPGPCCGGG (SEQ ID No. 2), manteniendo la identidad de secuencia con colágeno tipo III humano sin introducir aminoácidos adicionales.

Cuando se expresa la secuencia polipeptídica de la presente invención, la secuencia ENLYFQ (SEQ ID No.4) se debe añadir a su extremo N-terminal, que puede cortarse por la proteasa TEV para obtener directamente la secuencia de SEQ ID No. 3. Preferiblemente, la secuencia ENLYFQ (SEQ ID No. 4) está conectada directamente al extremo N-terminal, para obtener la secuencia de SEQ ID No. 5:

ENLYFQGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGP AGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPG ERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEK GPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGP AGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPG ERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEK GPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGP AGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPG ERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEK GPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP (SEQ ID NO. 5).

En la presente invención, los polipéptidos son colágenos de tipo III recombinantes, que se utilizan indistintamente en el presente documento con colágenos humanos recombinantes.

En la presente invención, la recombinación de colágenos humanos se puede llevar a cabo mediante un método convencional en la técnica. Por ejemplo, se pueden producir como sigue: (1) construcción de bacteriasE. coIímodificadas por ingeniería genética; (2) cultivo de fermentación de bacteriasE. coIímodificadas por ingeniería genética; (3) inducción y expresión de colágeno humano recombinante; y (4) purificación y digestión opcional de colágeno humano recombinante.

En la etapa (1), la construcción bacteriasE. coIímodificadas por ingeniería genética se puede llevar a cabo como sigue: (1) obtener un fragmento génico de interés; (2) insertar el fragmento génico de interés obtenido en el vector de expresión PET-32a para obtener un plásmido de expresión recombinante; (3) transformar el plásmido de expresión recombinante en célulasE. coIícompetentes BL21 (DE3) y escrutar bacteriasE. coIímodificadas por ingeniería genética positivas.

En las etapas (2) y (3), el cultivo de fermentación de bacteriasE. coIímodificadas por ingeniería genética y la inducción y expresión de colágeno humano recombinante se pueden llevar a cabo como sigue: (1) recoger colonias individuales óptimas de colágeno humano recombinante de bacteriasE. coIímodificadas por ingeniería genética de placa de LAB, colocar en 10 mL de medio LB y cultivar a 37°C y 220 rpm durante 12-16 horas; (2) inocular solución bacteriana en medio 2xYT a 1:100 para cultivo a mayor escala y cultivar a 37°C durante aproximadamente 3 horas y cuando la DO<600>esté entre 0,4 y 0,6, añadir IPTG hasta una concentración final 0,5 mM para la inducción, continuar el cultivo a 16°C durante 20 horas, y recoger las bacterias por centrifugación.

En la etapa (4), la purificación y digestión del polipéptido de colágeno humano recombinante se puede llevar a cabo como sigue: (1) resuspender las bacterias con tampón fosfato (NaH2PO340 mM, NaCl 500 mM, pH 7,8) antes de la ultrasonicación, y recoger el sobrenadante por centrifugación; (2) utilizar una columna de afinidad NI-NTA para determinar la unión al colágeno humano recombinante, y después de lavar las proteínas de impurezas con imidazol 10 mM, añadir proteasa TEV, realizar digestión enzimática en columna a 4°C durante 16 horas, y finalmente obtener el polipéptido de colágeno de interés.

La célula anfitriona puede ser una célula eucariótica, tal como un hongo y una levadura, una célula procariótica, tal como una bacteriaEnterobacteriaceae.Se apreciará que los expertos en la técnica pueden remplazar la cepa deE. coIíanteriormente mencionada por otras cepas de expresión como célula anfitriona.

La presente invención proporciona adicionalmente una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención. El ácido nucleico puede ser ADN o ADNc. La molécula de ácido nucleico puede consistir esencialmente en una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención, o puede consistir únicamente en una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención. Tal molécula de ácido nucleico se puede sintetizar mediante métodos conocidos en la técnica. Debido a la degeneración del código genético, los expertos en la técnica apreciarán que las moléculas de ácido nucleico de diferentes secuencias de ácido nucleico pueden codificar la misma secuencia de aminoácidos.

La presente invención proporciona adicionalmente un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención. Los vectores adecuados se conocen en el campo de la construcción de vectores, incluyendo opciones de promotores y otros elementos reguladores, tales como elementos potenciadores. El vector de la presente invención comprende una secuencia adecuada para la introducción en una célula. Por ejemplo, el vector puede ser un vector de expresión; en el vector, la secuencia codificante del polipéptido está bajo el control de su propio elemento regulador que actúa en cis, y el diseño del vector facilita la integración génica o el reemplazo génico en una célula anfitriona.

Los expertos en la técnica apreciarán que, en la presente invención, el término "vector" incluye una molécula de ADN, por ejemplo, un plásmido, un fago, virus u otros vectores; comprende una o más secuencias de ácido nucleico heterólogas o recombinantes. Los fagos y vectores virales adecuados incluyen, pero no se limitan a, fago lambda, fago EMBL, virus de simio, virus del papiloma bovino, virus de Epstein-Barr, adenovirus, virus del herpes, virus del sarcoma murino, virus del tumor mamario murino, lentivirus y similares.

El polipéptido de la presente invención comprende una secuencia expuesta en SEQ ID No. 3, o una secuencia en la que uno o más aminoácidos son sustituidos, suprimidos, insertados y/o añadidos a la secuencia expuesta en SEQ ID No. 3 (cuya realización no está cubierta por la invención reivindicada), siempre que el polipéptido de la presente invención conserve el efecto de adhesión celular de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3. "Más" puede ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11.

La adición de aminoácidos se refiere a la adición de uno o varios aminoácidos al extremo C-terminal o el extremo N-terminal de una secuencia de aminoácidos, p. ej., SEQ ID No. 3, siempre que el polipéptido de la presente invención conserve el efecto de adhesión celular de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3 (cuya realización no está cubierta por la invención reivindicada).

Sustitución de aminoácidos se refiere al remplazo de un resto de aminoácido en una posición en una secuencia de aminoácidos, p. ej., la secuencia de SEQ ID No. 3, por otro resto de aminoácido, siempre que el polipéptido de la presente invención conserve el efecto de adhesión celular de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3 (cuya realización no está cubierta por la invención reivindicada).

Inserción de aminoácidos se refiere a la inserción de uno o varios restos de aminoácido en una o varias posiciones apropiadas en una secuencia de aminoácidos, p. ej., la secuencia de SEQ ID No. 3, y todos o parte de los restos de aminoácidos insertados también pueden ser adyacentes entre sí, o los restos de aminoácidos insertados no son adyacentes entre sí, siempre que el polipéptido de la presente invención conserve el efecto de adhesión celular de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3 (cuya realización no está cubierta por la invención reivindicada). Las posiciones del aminoácido insertado en el presente documento no están entre secuencias repetidas.

Deleción de aminoácidos significa que 1, 2, 3 o más aminoácidos pueden suprimirse de una secuencia de aminoácidos, p. ej., la secuencia de SEQ ID No. 3, siempre que el polipéptido de la presente invención conserve el efecto de adhesión celular de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3 (cuya realización no está cubierta por la invención reivindicada).

En la presente invención, la sustitución puede ser una sustitución de aminoácidos conservativa, lo que significa que 3, más preferiblemente 2 o 1 aminoácidos se reemplazan por un aminoácido que tiene una propiedad similar o igual para formar un péptido en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3. Estos péptidos variantes conservativos pueden producirse mediante remplazos de aminoácidos según la Tabla 1.

Como se emplea en el presente documento, los términos "condiciones de restricción media", "condiciones de restricción media-alta", "condiciones de restricción alta" o "condiciones de restricción muy alta" describen condiciones para la hibridación y lavado de ácidos nucleicos. Se describe una guía para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. En esta referencia se describen tanto un método que implica agua como un método que no implica agua, y puede utilizarse cualquiera de ellos. Por ejemplo, las condiciones de hibridación específicas son las siguientes: (1) las condiciones de hibridación de baja restricción son la hibridación en 6X cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de dos lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1 % a al menos 50°C (para condiciones de hibridación de baja restricción, la temperatura de lavado se puede elevar a 55°C); (2) las condiciones de restricción media son la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1 % a 60°C; (3) las condiciones de restricción alta son la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y preferiblemente (4) condiciones de restricción muy alta son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7%, seguido de uno o más lavados en 0,2X<s>S<c>, SDS al 1% a 65°C, y después a 65°C.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que los ejemplos son meramente ilustrativos, pero no restrictivos. La presente invención está limitada únicamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: Construcción y expresión de polipéptidos de colágeno humano recombinante

Construcción y expresión del vector de expresión del gen TE16C

1. La secuencia proteica de longitud completa de colágeno humano TE16C utilizada en el ejemplo 1 es la secuencia expuesta en SEQ ID No. 5 y tiene una longitud completa de 486 aa, y su gen correspondiente tiene una longitud completa de 1458 pb. Después de la optimización de codones para el codón deE. coIí(secuencia de nucleótidos:

gaaaacctgtatttccagggtgaacgtggtgcaccaggttttcgtggtccggcaggtccgaatggaattccgggtga gaaaggaccggctggtgagcgtggtgcgccgggtgaacgtggagcgcctggttttcgtggcccagcaggtccga acggtattcctggtgaaaaaggtccggcgggagagcgtggtgcaccgggtgaacgcggtgcaccgggatttcgtg gtccagcaggaccgaatggtatccctggtgaaaaaggaccggcaggtgagcgtggagcgccaggtgaacgtgg cgcaccgggttttcgtggaccggcaggcccgaatggtattccgggtgaaaaaggcccggcaggtgaacgtggtgc cccgggtgaacgtggtgcgcctggatttcgtggcccggcaggaccgaacggtatccctggagaaaaaggtcctgc aggtgagcgcggtgcgccgggcgagcgtggtgcccctggttttcgcggtccggcaggccctaatggtattcctgg agaaaaaggccctgcaggtgaacgcggagcaccgggtgagcgtggcgcacctggttttcgtggtcctgcaggcc cgaacggtattccgggcgaaaaaggtccagcaggtgaacgtggtgctccgggtgaacgtggtgcacctggatttc gcggtcctgctggtccgaatggtattccaggtgaaaaaggtccggcaggagagcgtggagcaccgggagaacgt ggtgcaccgggctttcgtggtccggccggtcctaacggtatcccaggtgaaaaaggtccggccggcgagcgtggc gcccctggtgagcgtggtgctcctggttttcgtggtccggctggtccgaacggaattcctggtgagaaaggtccggc tggcgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggtttccgtggtccggcgggtcctaatggtatcccgggt gaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgcggaccggcaggacc taatggtattccgggagaaaaaggacctgcgggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgt ggtccggcaggtcctaatggaattcctggagagaaaggacctgcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggt gcaccgggttttcgtggtccggcaggtccaaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcac cgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggcattcctggtgaaaaaggtccggcagg tgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggtattccgggtgaa aaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccg, SEQ ID No. 7), se encargó a Shanghai HuaGen Biotech Co., Ltd. sintetizar un fragmento génico, y el fragmento génico TE16C sintetizado se insertó en el vector de expresión PET32a a través de sitios de restricciónBamHI (NEB Company, Núm. de Cat.: R0136L) yXHoI (NEB Company, Núm. de Cat.: R0146L).

2. El plásmido de expresión construido con éxito se transformó en célulasE. coIícompetentes BL21 (DE3) (Merck Company). El procedimiento específico fue el siguiente: 1: Se tomó 1 gl del plásmido y se colocó en 100 gl de célulasE. coIícompetentes BL21 (DE3) y se dejaron reposar sobre hielo durante 30 minutos. 2: Esta mezcla se activó por calor en un baño de agua a 42°C durante 90 s, después se colocó rápidamente en hielo y se dejó reposar durante 2 min. La mezcla se filtró y se secó. 3: Se añadieron 600 gl de medio líquido LB no resistente a la mezcla y se cultivaron a 37°C y 220 rpm durante 1 h. 4: Se extendieron uniformemente 200 gl de la solución bacteriana sobre una placa de LB con resistencia a ampicilina (10 g/l de peptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de cloruro de sodio, 15 g/l de agar y 100 gg/mL de ampicilina). 5: La placa se invirtió y se cultivó en una incubadora a 37°C, y se cultivó durante aproximadamente 20 h para cultivar colonias claras.

3. Se recogieron colonias monoclonales de la placa de LB transformada y se cultivaron en 10 mL de medio LB (que contenía 100 gg/mL de ampicilina) durante 12 h-16 h, después se transfirieron a medio 2xYT (16 g/l de peptona, 10 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de cloruro de sodio) a una razón de 1:100 para el cultivo a mayor escala, y se cultivaron a 37°C y 220 rpm hasta que la DO600 de la solución bacteriana estuvo entre 0,4 y 0,6, y se añadió IPTG 0,5 mM (Sigma Company, Núm. de Cat.: I5502-1G) a una concentración final de 0,5 mM para la expresión por inducción, y las condiciones de inducción fueron cultivo a 18°C y 180 rpm durante 20 h. Finalmente, las bacterias se recogieron por centrifugación, y se almacenaron a -20°C o se introdujeron inmediatamente en la siguiente etapa para la purificación.

4. (1L) Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en aproximadamente 50 mL de tampón fosfato (pH 7,8) (dihidrogenofosfato de sodio 40 mM, cloruro de sodio 500 mM), después se rompieron mediante un equipo de rotura de bacterias de alta presión (Scientz Biotechnology Co., LTD.), y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 30 min para separar las proteínas solubles de los cuerpos de inclusión.

5. Una columna de afinidad Ni-NTA (Qiagen Company, Núm. de cat. 30210) se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón de unión (NaH2PO340 mM, NaCl 500 mM, pH 7,8). Después, se añadió el sobrenadante de proteína a la columna y se incubó a 4°C durante 0,5-1 h para hacer que la proteína recombinante de interés se uniera completamente a la columna. Las impurezas proteicas se lavaron con 200 mL de tampón de lavado (imidazol 10 mM, NaH2PO340 mM, NaCl 500 mM, pH 7,8) que contenía imidazol 10 mM (Sigma Company). Finalmente, se añadió una cantidad apropiada de proteasa TEV etiquetada con His (Sigma, SA T4455), y después de la incubación a 4°C durante 16 h, se recogió el fluido de flujo continuo, es decir, el colágeno de interés separado de la proteína vectora. El producto resultante se sometió a diálisis durante una noche y se liofilizó hasta un polvo seco para su uso.

6. La proteína TE16C resultante se midió para determinar la pureza mediante SDS-PAGE. El procedimiento específico fue el siguiente. Se tomaron 40 gl de la solución de proteína purificada, se añadieron 10 gl de tampón de carga de proteína 5x (Tris-HCl 250 mM (pH: 6,8), SDS al 10%, azul de bromofenol al 0,5%, glicerol al 50% y p-mercaptoetanol al 5%), se colocaron en agua hirviendo a 100°C y se hirvieron durante 10 min. La solución resultante se añadió a gel de proteína SDS-PAGE a 10 gl por pocillo, y se hizo migrar a 80 V durante 2 h. Después, el gel se tiñó con solución de tinción de Azul Brillante de Coomassie (Azul Brillante de Coomassie R-250 al 0,1%, alcohol isopropílico al 25% y ácido acético glacial al 10%) durante 20 min, y después se decoloró con solución de decoloración de proteínas (ácido acético al 10%, etanol al 5%). Finalmente, se midió la actividad de la proteína en comparación con un colágeno nativo humano.

Construcción y expresión del vector de expresión del gen HC16

1.La secuencia proteica de longitud completa de colágeno HC16 humano como control utilizada en el ejemplo 1 es la secuencia expuesta en SEQ ID No. 6 y tiene una longitud completa de 501 aa, y su gen correspondiente tiene una longitud completa de 1503 pb. Después de la optimización de codones para el codón deE. coIí(secuencia de nucleótidos:

ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcagg cgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcg aaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccct aacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcg tggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcga gcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaac gtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaag ggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacgg cattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcc cggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtg gtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggc gcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcct gcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattcc gggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggcc ggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgca cctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccct ggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcagg cgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtga gaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtccta atggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtcc ttgttgtggcggcggc, SEQ ID No. 8), se encargó a Shanghai HuaGen Biotech Co., Ltd. sintetizar un fragmento génico, y el fragmento génico HC16 sintetizado se insertó en el vector de expresión PET32a a través de sitios de restricciónBamHI (NEB Company, Núm. de Cat.: R0136L) yXhoI (NEB Company, Núm. de Cat.: R0146L).

2. El plásmido de expresión construido con éxito se transformó en células E.coIícompetentes BL21 (DE3) (Merck Company). El procedimiento específico es como el descrito anteriormente.

3. Se recogieron colonias monoclonales de la placa de LB transformada y se cultivaron en 10 mL de medio LB (que contenía 100 pg/mL de ampicilina) durante 12 h-16 h, después se transfirieron a medio 2xYT (16 g/l de peptona, 10 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de cloruro de sodio) a una razón de 1:100 para el cultivo a mayor escala, y se cultivaron a 37°C y 220 rpm hasta que la DO600 de la solución bacteriana estuvo entre 0,4 y 0,6, y se añadió IPTG 0,5 mM (Sigma Company, Núm. de Cat.: I5502-1G) a una concentración final de 0,5 mM para la expresión por inducción, y las condiciones de inducción fueron cultivo a 18°C y 180 rpm durante 20 h. Finalmente, las bacterias se recogieron por centrifugación, y se almacenaron a -20°C o se introdujeron inmediatamente en la siguiente etapa para la purificación.

5. Una columna de afinidad Ni-NTA (Qiagen Company, Núm. de cat. 30210) se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón de unión (NaH2PO340 mM, NaCl 500 mM, pH 7,8). Después, se añadió el sobrenadante de proteína a la columna y se incubó a 4°C durante 0,5-1 h para hacer que la proteína recombinante de interés se uniera completamente a la columna. Las impurezas proteicas se lavaron con 200 mL de tampón de lavado (imidazol 10 mM, NaH<2>PO<3>40 Mm NaCl 500 mM, pH 7,8) que contenía imidazol 10 mM (Sigma Company). Finalmente, se añadió una cantidad apropiada de proteasa de precisión (Ppasa, para abreviar) etiquetada con His (Sigma, SAE0045), y después de la incubación a 4°C durante 16 h, se recogió el fluido de flujo continuo, es decir, el colágeno de interés separado de la proteína vectora. El producto resultante se sometió a diálisis durante una noche y se liofilizó hasta un polvo seco para su uso.

6. La proteína HC16 resultante se midió para determinar la pureza mediante SDS-PAGE. El procedimiento específico fue el siguiente. Se tomaron 40 pl de la solución de proteína purificada, se añadieron 10 pl de tampón de carga de proteína 5x (Tris-HCl 250 mM (pH: 6,8), SDS al 10%, azul de bromofenol al 0,5%, glicerol al 50% y p-mercaptoetanol al 5%), se colocaron en agua hirviendo a 100°C y se hirvieron durante 10 min. La solución resultante se añadió a gel de proteína SDS-PAGE a 10 pl por pocillo, y se hizo migrar a 80 V durante 2 h. Después, el gel se tiñó con solución de tinción de Azul Brillante de Coomassie (Azul Brillante de Coomassie R-250 al 0,1%, alcohol isopropílico al 25% y ácido acético glacial al 10%) durante 20 min, y después se decoloró con solución de decoloración de proteínas (ácido acético al 10%, etanol al 5%). Finalmente, se midió la actividad de la proteína en comparación con un colágeno nativo humano. Se verificó mediante el mismo método que en la Invención de la Patente China 201210482543.2 que la proteína HC16 mostraba el tamaño de proteína correcto.

Construcción y expresión del polipéptido T16a que contiene secuencias repetidas y una secuencia estable C-terminal

1. El colágeno humano T16a utilizado en el Ejemplo 1, que difiere del gen TE16C o el gen HC16 en que T16a comprende tanto SEQ ID No. 3 que no tiene ningún aminoácido conector como SEQ ID No. 2 con aminoácidos de la región bisagra, tiene una longitud completa de 490 aa, y su secuencia es:

GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGI

PGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPG

FRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGER

GAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGI

PGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPG

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GAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGI

PGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPG

FRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGER

GAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGPPGPCCGGG (SEQ ID

No. 9)

Su gen correspondiente tiene una longitud completa de 1407 pb. Después de la optimización de codones para el codón deE. coIí(secuencia de nucleótidos:

ggtgaacgtggtgcaccaggttttcgtggtccggcaggtccgaatggaattccgggtgagaaaggaccggctggt gagcgtggtgcgccgggtgaacgtggagcgcctggttttcgtggcccagcaggtccgaacggtattcctggtgaaa aaggtccggcgggagagcgtggtgcaccgggtgaacgcggtgcaccgggatttcgtggtccagcaggaccgaat ggtatccctggtgaaaaaggaccggcaggtgagcgtggagcgccaggtgaacgtggcgcaccgggttttcgtgg accggcaggcccgaatggtattccgggtgaaaaaggcccggcaggtgaacgtggtgccccgggtgaacgtggtg cgcctggatttcgtggcccggcaggaccgaacggtatccctggagaaaaaggtcctgcaggtgagcgcggtgcg ccgggcgagcgtggtgcccctggttttcgcggtccggcaggccctaatggtattcctggagaaaaaggccctgcag gtgaacgcggagcaccgggtgagcgtggcgcacctggttttcgtggtcctgcaggcccgaacggtattccgggcg aaaaaggtccagcaggtgaacgtggtgctccgggtgaacgtggtgcacctggatttcgcggtcctgctggtccgaa tggtattccaggtgaaaaaggtccggcaggagagcgtggagcaccgggagaacgtggtgcaccgggctttcgtg gtccggccggtcctaacggtatcccaggtgaaaaaggtccggccggcgagcgtggcgcccctggtgagcgtggt gctcctggttttcgtggtccggctggtccgaacggaattcctggtgagaaaggtccggctggcgaacgtggtgcacc gggtgaacgtggtgcaccgggtttccgtggtccggcgggtcctaatggtatcccgggtgaaaaaggtccggcagg tgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgcggaccggcaggacctaatggtattccgggaga aaaaggacctgcgggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtcctaat ggaattcctggagagaaaggacctgcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtc cggcaggtccaaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcac cgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggcattcctggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccggg tgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaa cgtggtgcaccgggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc, SEQ ID No. 10), se encargó a Shanghai HuaGen Biotech Co., Ltd. sintetizar un fragmento génico, y el fragmento génico T16a sintetizado se insertó en el vector de expresión PET32a a través de sitios de restricciónBamHI (NEB Company, Núm. de Cat.: R0136L) yXhoI (NEB Company, Núm. de Cat.: R0146L).

4. (1L) Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en aproximadamente 50 mL de tampón fosfato (pH 7,8) (dihidrogenofosfato de sodio 40 mM, cloruro de sodio 500 mM), después se rompieron mediante un equipo de rotura de bacterias de alta presión (Scientz Biotechnology Co., LTD.), y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 30 min para separar las proteínas solubles de los cuerpos de inclusión y los coloides de colágeno.

5. Una columna de afinidad Ni-NTA (Qiagen Company, Núm. de cat. 30210) se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón de unión (NaH2PO340 mM, NaCl 500 mM, pH 7,8). Después, se añadió el sobrenadante de proteína a la columna y se incubó a 4°C durante 0,5-1 h para hacer que la proteína recombinante de interés se uniera completamente a la columna. Las impurezas proteicas se lavaron con 200 mL de tampón de lavado (imidazol 10 mM, NaH2PO3 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,8) que contenía imidazol 10 mM (Sigma Company). Finalmente, se añadió una cantidad apropiada de proteasa de precisión (Ppasa, para abreviar) etiquetada con His (Sigma, SAE0045), y después de la incubación a 4°C durante 16 h, se recogió el fluido de flujo continuo, es decir, el colágeno de interés separado de la proteína vectora. El producto resultante se sometió a diálisis durante una noche y se liofilizó hasta un polvo seco para su uso.

6. La proteína T16a resultante se midió para determinar la pureza mediante SDS-PAGE. El procedimiento específico fue el siguiente. Se tomaron 40 pl de la solución de proteína purificada, se añadieron 10 pl de tampón de carga de proteína 5x (Tris-HCl 250 mM (pH: 6,8), SDS al 10%, azul de bromofenol al 0,5%, glicerol al 50% y p-mercaptoetanol al 5%), se colocaron en agua hirviendo a 100°C y se hirvieron durante 10 min. La solución resultante se añadió a gel de proteína SDS-PAGE a 10 pl por pocillo, y se hizo migrar a 80 V durante 2 h. Después, el gel se tiñó con solución de tinción de Azul Brillante de Coomassie (Azul Brillante de Coomassie R-250 al 0,1%, alcohol isopropílico al 25% y ácido acético glacial al 10%) durante 20 min, y después se decoloró con solución de decoloración de proteínas (ácido acético al 10%, etanol al 5%). Finalmente, se midió la actividad de la proteína en comparación con un colágeno nativo humano.

Construcción y expresión del polipéptido T16b que contiene secuencias repetidas y aminoácidos conectores

1. El colágeno humano T16b utilizado en el Ejemplo 1, que difiere del gen TE16C o el gen HC16 en que T16b elimina SEQ ID No. 2 con aminoácidos de la región bisagra de SEQ ID No. 6 con aminoácidos conectores, tiene una longitud completa de 486 aa, y su secuencia es:

GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGI

PGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPG

FRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPRSGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGE

RGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNG

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GERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGP

NGIPGEKGPAGERGAPRSGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGE

RGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKG

PAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP (SEQ ID No. 11)

Su gen correspondiente tiene una longitud completa de 1458 pb. Después de la optimización de codones para el codón deE. coIí(secuencia de nucleótidos:

ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcagg cgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcg aaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccct aacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcg tggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcga gcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaac gtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaag ggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacgg cattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcc cggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtg gtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggc

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gcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattcc gggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggcc ggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgca cctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccct ggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcagg cgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtga gaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtccta atggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacct, SEQ ID No. 12), se encargó a Shanghai HuaGen Biotech Co., Ltd. para sintetizar un fragmento génico, y el fragmento génico T16a sintetizado se insertó en el vector de expresión PET32a a través de sitios de restricciónBamHI (NEB Company, Núm. de Cat.: R0136L) yXHoI (NEB Company, Núm. de Cat.: R0146L).

2. El plásmido de expresión construido con éxito se transformó en célulasE. coIícompetentes BL21 (DE3) (Merck Company). El procedimiento específico es como el descrito anteriormente.

5. Una columna de afinidad Ni-NTA (Qiagen Company, Núm. de cat. 30210) se equilibró con 5 volúmenes de columna de tampón de unión (NaH<2>PO<3>40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,8). Después, se añadió el sobrenadante de proteína a la columna y se incubó a 4°C durante 0,5-1 h para hacer que la proteína recombinante de interés se uniera completamente a la columna. Las impurezas proteicas se lavaron con 200 mL de tampón de lavado (imidazol 10 mM, NaH2PO340 mM, NaCl 500 mM, pH 7,8) que contenía imidazol 10 mM (Sigma Company). Finalmente, se añadió una cantidad apropiada de proteasa de precisión (Ppasa, para abreviar) etiquetada con His (Sigma, SAE0045), y después de la incubación a 4°C durante 16 h, se recogió el fluido de flujo continuo, es decir, el colágeno de interés separado de la proteína vectora. El producto resultante se sometió a diálisis durante una noche y se liofilizó hasta un polvo seco para su uso.

6. La proteína T16b resultante se midió para determinar la pureza mediante SDS-PAGE. El procedimiento específico fue el siguiente. Se tomaron 40 gl de la solución de proteína purificada, se añadieron 10 gl de tampón de carga de proteína 5x (Tris-HCl 250 mM (pH: 6,8), SDS al 10%, azul de bromofenol al 0,5%, glicerol al 50% y p-mercaptoetanol al 5%), se colocaron en agua hirviendo a 100°C y se hirvieron durante 10 min. La solución resultante se añadió a gel de proteína SDS-PAGE a 10 gl por pocillo, y se hizo migrar a 80 V durante 2 h. Después, el gel se tiñó con solución de tinción de Azul Brillante de Coomassie (Azul Brillante de Coomassie R-250 al 0,1%, alcohol isopropílico al 25% y ácido acético glacial al 10%) durante 20 min, y después se decoloró con solución de decoloración de proteínas (ácido acético al 10%, etanol al 5%). Finalmente, se midió la actividad de la proteína en comparación con un colágeno nativo humano.

Ejemplo 2: Detección espectrométrica de masas de la proteína TE16C

Método experimental

La muestra de proteína se sometió a reducción con DTT y alquilación de yodoacetamida, y después se añadió tripsina para digerir durante la noche. El segmento peptídico obtenido después de la enzimólisis se desaló mediante C18 ZipTip y después se mezcló con la matriz de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) para la aplicación puntual. Finalmente, se utilizó el espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con ionización por desorción láser asistida por matriz MALDI-TOF/TOF Ultraflextreme™ Brucker, Alemania para el análisis (para la técnica de la huella digital del péptido, véase: Protein J. 2016; 35: 212-7).

La recuperación de la base de datos se manejó a través de la página de Búsqueda de Iones MS/MS en el sitio web mascot local. Los resultados de identificación de proteínas se obtuvieron basándose en el espectro de masas primario de los segmentos peptídicos producidos después de la enzimólisis. Parámetros de recuperación: enzimólisis con tripsina, establecer dos sitios de restricción perdidos. La alquilación de cisteína se ajustó en una modificación fija, y la oxidación de metionina se ajustó en una modificación variable. La base de datos utilizada para la identificación es NCBprot.

Los resultados de los picos de espectrometría de masas se muestran en la Figura 1.

Tabla 1: Detección por espectrometría de masas del peso molecular y el péptido correspondiente

Cobertura del fragmento peptídico detectado GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGP NGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPG ERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIP GEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERG APGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEK GPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPG FRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPA GERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRG PAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGER GAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGP NGIPGEKGPAGERGAP

Más de 98,8% de la secuencia de la proteína TE16C que se debe determinar puede detectarse por espectrometría de masas, y los resultados son muy fiables. Los picos característicos espectrométricos de masas de la proteína indeterminada fueron 2246,2323, 2246,2323, 1738,8731, 1678,9003, 1660,8401, 1171,5966 y 1093,5636, y se concluyó que la proteína TE16C se expresaba correctamente.

Ejemplo 3: Detección de las propiedades de los colágenos de tipo III recombinantes

Los métodos para detectar la actividad del colágeno se pueden encontrar en la referencia Juming Yao, Satoshi Yanagisawa, Tetsuo Asakura, Design, Expression and Characterization of Collagen-like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crossslinking Sequences Derived from Native Collagens,J Bioohem.136, 643-649 (2004). El procedimiento de implementación específico es el siguiente:

1. Las concentraciones de las muestras de proteína que se iban a someter a prueba se midieron mediante el método de absorción ultravioleta, incluyendo muestras de colágeno humano de control (Sigma, C7774), colágeno de tipo III HC16 antiguo de control, proteína TE16C de colágeno de tipo III nuevo, proteína T16a de control y proteína T16b. Específicamente, se midió la respectiva absorción de luz ultravioleta de las muestras a 215 nm y 225 nm, y se calculó la respectiva concentración de proteína utilizando la fórmula empírica C (pg/ml) = 144X (A215-A225), y debe observarse que la detección se realizó en condiciones de A215<1,5. El principio del método consiste en determinar la absorción característica de un enlace peptídico bajo luz ultravioleta lejana, y el método no se ve afectado por el contenido de cromóforo, tiene pocas sustancias interferentes, es fácil de operar, y es adecuado para detectar colágeno humano y sus análogos que no están coloreados por Azul Brillante de Coomassie. (La referencia es Walker JM., The Protein Protocols Handbook, Segunda edición, Humana Press, 43-45). Después de la detección de la concentración de proteína, todas las concentraciones de las proteínas que se iban a someter a prueba se ajustaron a 0,5 mg/mL con PBS.

2. Se añadieron 100 pl de cada solución de proteína a una placa de 96 pocillos y se compararon con una solución de PBS de blanco, y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos.

3. Se añadieron 105 células 3T3 cultivadas en pocillos (de Teacher Tong Pei, Universidad de Tsinghua) a cada pocillo y se incubaron a 37°C durante 60 minutos.

4. Cada pocillo se lavó 4 veces con PBS.

5. La absorbancia a DO492nm se midió utilizando un kit de ensayo de LDH (Roche, 04944926001). Basándose en el valor del control del blanco, puede calcularse la tasa de anclaje de las células. La fórmula de cálculo es la siguiente: tasa de adherencia celular = (pocillo de prueba - pocillo de blanco) x 100% / (pocillo positivo - pocillo de blanco). La tasa de adherencia de las células puede reflejar la actividad del colágeno. Cuanto mayor es la actividad de una proteína, más rápidamente puede proporcionar una célula con un entorno externo superior para ayudar a que la célula se adhiera.

Véase la Figura 2 para los resultados.

Los resultados de la Figura 2 indican que los dos colágenos recombinantes humanos (es decir, colágeno de tipo III HC16 y colágeno de tipo III TE16C) tienen mejores actividades de adhesión que el colágeno humano comercial, y el colágeno de tipo III recombinante TE16C de la presente invención logra la actividad de adhesión celular más potente. Las proteínas obtenidas por los dos métodos de construcción de T16a y T16b como controles tienen actividades de adhesión celular más bajas que la proteína TE16C de la presente invención.

Ejemplo 4: Expresión y purificación de colágenos de tipo III recombinantes

Expresión y purificación de la proteína TE16C

1. Según las etapas 1 -5 del Ejemplo 1, se obtuvo el colágeno de interés TE16C separado de la proteína vectora y se sometió a diálisis en solución A (Na2CO310 mM, pH 10,5, NaCl 10 mM) de una columna de intercambio aniónico.

2. La columna de intercambio aniónico (columna Hitrap Q HP, 5 mL, GE Healthcare Biosciences) se equilibró con 5 volúmenes de columna de solución A (Na2CO310 mM, pH 10,5, NaCl 10 mM). La proteína TE16C sometida a diálisis se aplicó a continuación a la columna, y se recogió el pico de proteína que había pasado a través de la columna, es decir, la proteína TE16C purificada. El producto resultante se sometió a diálisis durante una noche y se liofilizó hasta un polvo seco para su uso.

3. La columna de intercambio aniónico se eluyó con 5 volúmenes de columna de solución B (Na2CO310 mM, pH 10,5, NaCl 1 M) para eliminar por lavado las impurezas proteicas y endotoxinas de la columna.

La proteína HC16, el polipéptido T16a que comprende secuencias repetidas y una secuencia estable C-terminal, y el polipéptido T16b que comprende secuencias repetidas y aminoácidos conectores se trataron de la misma manera.

La Figura 3 muestra la expresión de colágenos de tipo III recombinantes. Después de la purificación del colágeno de tipo III HC16, se pueden obtener aproximadamente 8 mg de proteína pura a partir de 1 L de la solución bacteriana. Después de la purificación del colágeno de tipo III TE16C, se pueden obtener aproximadamente 15 mg o más de proteína pura a partir de 1 L de la solución bacteriana. Los niveles de expresión de las proteínas obtenidas mediante los dos métodos de construcción de T16a y T16b como controles tampoco fueron tan altos como los de la proteína TE16C de la presente invención. Es importante observar que para el método de construcción de T16a, la cantidad de proteína soluble en el sobrenadante es muy baja debido a la formación de una gran cantidad de coloide durante la purificación de la proteína.

La Figura 4 muestra la purificación de colágenos de tipo III recombinantes. El colágeno de tipo III HC16 tenía una pureza de aproximadamente 95% después de la columna de Ni y la columna de intercambio aniónico, mientras que el colágeno de tipo III TE16C pudo purificarse rápidamente hasta una pureza de más de 99% mediante una columna de Ni y una columna de intercambio aniónico. Aunque las proteínas obtenidas mediante los dos métodos de construcción de T16a y T16b como controles tenían purezas altas, sus rendimientos no fueron altos y fueron mucho menores que la proteína TE16C de la presente invención.

Ejemplo 5: Estabilización de colágenos de tipo III recombinantes en soluciones acuosas

Estudio de estabilidad

1.La proteína TE16C purificada y las proteínas HC16, T16a y T16b se obtuvieron según el Ejemplo 4 y después se sometieron a diálisis frente a solución salina fisiológica (NaCl al 0,9%). Las soluciones de proteína sometidas a diálisis se recogieron, se esterilizaron por filtración a través de una membrana de filtro de 0,22 pM, y después se dejaron reposar durante un largo tiempo en un entorno de 4-8°C.

2. En diferentes puntos de tiempo, tales como un mes, dos meses, tres meses, medio año, un año, se recogieron soluciones acuosas de proteína TE16c y proteína HC16, y se midió la pureza mediante SDS-PAGE (véase el método del Ejemplo 1).

La Figura 5 muestra las imágenes de electroforesis de HC16, TE16C, T16a y T16b en el punto de tiempo de medio año. El colágeno de tipo III HC16 era inestable en la solución acuosa, se produjo una degradación significativa después de un mes, y la degradación después de seis meses era muy grave. Sin embargo, el colágeno de tipo III TE16C tiene una estructura estable, y después de colocarse en una solución acuosa durante medio año, más de 90% de la proteína permaneció como una proteína completa de longitud completa, y solo se degradó una pequeña cantidad. Las proteínas obtenidas por los dos métodos de construcción de T16a y T16b como controles también tenían diferentes grados de degradación, siendo la degradación de T16b más grave; su estabilidad es mucho menor que la de la proteína TE16C de la presente invención.

Ejemplo 6: Detección de endotoxina en colágenos de tipo III recombinantes

Detección de endotoxinas de proteína TE16c, proteína HC16, proteína T16a y proteína T16b

1. Se prepararon proteína TE16c, proteína HC16, proteína T16a y proteína T16b purificadas según el Ejemplo 4.

2. Se prepararon reactivos que incluían producto lisado de amebocitos de taquipleus (Zhanjiang A&C Biological Ltd., a=0,015 UE/ml) y diluyente I (Zhanjiang A&C Biological Ltd.).

3. Los patrones de endotoxina se diluyeron a E1, E0,5, E0,25, E0,125 y E0,0625. Las muestras se diluyeron 5, 8, 16, 32, 50, 100, 200, 300 y 400 veces con diluyente I, y las otras muestras se diluyeron con agua para la detección, para diluir las muestras 10, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 600 y 800 veces, respectivamente.

4. Los patrones de endotoxina y las muestras de proteína diluidas se añadieron al producto lisado de amebocitos de taquipleus para su observación. Los resultados se compararon con controles tanto negativos como positivos. Se calcularon las concentraciones de endotoxina de las muestras.

La Figura 6 muestra el estado de endotoxina residual de colágenos de tipo III recombinantes. El colágeno de tipo III no tiene una estructura uniforme y es fácil de unir a endotoxina, por lo que la endotoxina residual después de la columna de Ni y el intercambio aniónico es de aproximadamente 100 UE/mL, mientras que el nuevo colágeno de tipo III TE16C puede purificarse rápidamente para que contenga menos de 5 UE/mL de endotoxina mediante una columna de Ni y una columna de intercambio aniónico. Las proteínas obtenidas mediante los dos métodos de construcción de T16a y T16b como controles también están estrechamente unidas a endotoxina, y no es fácil eliminar la endotoxina.

Ejemplo 7: Análisis de colágenos de tipo III recombinantes

1. La secuencia de TE16C contiene el segmento del colágeno de tipo III humano Pro488 a Gly510, y se sintetizaron varios polipéptidos (Taihe Biotechnology Co., Ltd., Beijing) basándose en esta secuencia regional para un escrutinio extenso de cristales, p. ej., polipéptido G<f r>G<p a>G<p>NGIPGEKGPAGERG.

2. El polipéptido se disolvió en agua hasta una solución de 15 mg/mL, y los cristales se cultivaron mediante un método de gota colgante en el que la formulación de la solución del tanque era PEG 400 al 30% (p/v), acetato de sodio 0,1 M, pH 4,6, y Cloruro de Cadmio 0,1 M. Se tomaron 1 gl de cada una de la solución de polipéptido y la solución de tanque y se mezclaron, y después se sellaron con 1 mL de la solución de tanque.

3. Después de aproximadamente una semana, los monocristales del polipéptido crecieron gradualmente en la gotita, y se enfriaron rápidamente y se almacenaron con nitrógeno líquido después de extraerse.

4. Los cristales polipeptídicos recogidos se enviaron a Beamline BL-18U1 de la Instalación de Radiación Sincrotrón de Shanghai para la recogida de datos de difracción de cristales de rayos X, y al mismo tiempo el análisis de datos y el análisis de estructura se llevaron a cabo utilizando el calculador de la estación de línea. Los autores de la presente invención obtuvieron la estructura tridimensional de alta resolución de la región Pro488 a Gly510 del colágeno de tipo III humano contenida en el nuevo colágeno de tipo III TE16C mediante el método de cristalografía de proteínas, como se muestra en la Figura 7. Se confirmó que esta región formaba una estructura trimérica muy estable. Por lo tanto, se puede contar con la estructura y función del colágeno intacto sin añadir adicionalmente la secuencia C-terminal GPPGPCCGGG.

Claims

REIVINDICACIONES

2. Un polinucleótido que codifica el polipéptido según la reivindicación 1.

3. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 2, y que comprende opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID No. 4, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID No. 4 está conectada directamente al extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico codificante del polipéptido, preferiblemente el vector de expresión comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 5.

4. Una célula anfitriona que comprende el vector de expresión según la reivindicación 3, en donde la célula anfitriona es preferiblementeEscherichia coIí.

5. Procedimiento para la producción del polipéptido según la reivindicación 1, que comprende:

(1) cultivar la célula anfitriona según la reivindicación 4 en un medio de producción y producir el polipéptido; (2) recoger el polipéptido, y opcionalmente digerir el polipéptido, preferiblemente digerir el polipéptido con proteasa TEV; y

(3) purificar el polipéptido por columna de Ni y/o cromatografía de intercambio aniónico;

en donde opcionalmente el procedimiento para la producción no incluye una etapa adicional de eliminación de endotoxina; en donde preferiblemente el polipéptido purificado está sustancialmente libre de endotoxina o contiene menos de 5 UE/mL de endotoxina.

6. Una composición que comprende el polipéptido según la reivindicación 1, en donde la composición es preferiblemente un dispositivo médico, un producto de ingeniería de tejidos, un producto cosmético o de cuidado de la salud, preferiblemente el polipéptido está en forma de una solución acuosa del polipéptido, preferiblemente la composición está libre de un componente que previene la degradación del polipéptido, y preferiblemente la composición es una composición para uso a largo plazo, siendo el uso a largo plazo preferiblemente más de medio año de uso.

7. El uso del polipéptido según la reivindicación 1 en la fabricación de una composición, preferiblemente un dispositivo médico, un producto de ingeniería de tejidos, un cosmético o un suplemento sanitario, en donde preferiblemente el polipéptido está en forma de una solución acuosa del polipéptido, preferiblemente la composición está libre de un componente que previene la degradación de un polipéptido, y la composición es una composición para uso a largo plazo, siendo el uso a largo plazo más de medio año de uso.

8. El uso del polipéptido según la reivindicación 1 para promover la adhesión celular in vitro.

9. El uso de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4 o el vector de expresión según la reivindicación 3 para la producción del polipéptido según la reivindicación 1.