RS65903B1 - Polipeptid, postupak za njegovu proizvodnju i njegova upotreba - Google Patents

Description

Opis

Tehnička oblast

[0001] Ovaj pronalazak pripada tehničkoj oblasti genetskog inženjeringa, i odnosi se na polipeptid, postupak za njegovu proizvodnju, i njegovu upotrebu.

Stanje tehnike

[0002] Kolagen je vrsta proteina koji je široko rasprostranjen u vezivnim tkivima ljudskog tela, i takođe je najzastupljeniji protein u ljudskom organizmu, čineći od 25% do 35% ukupnih proteina. Njegova glavna funkcija je da održava vanćelijsku sredinu, održava normalne fiziološke funkcije tkiva i organa, i da popravlja oštećenja u telu. Kolagen je prirodni biološki resurs koji ima biološku histokompatibilnost, pruža elastičnost ćelijama i mogućnost razgradnje koju drugi polimerni materijali ne mogu da postignu. Zbog toga se kolagen može široko koristiti u industrijama kao što su medicina i kozmetika.

[0003] Međutim, prirodni kolagen je nerastvorljiv u vodi i nije uniforman po prirodi, zbog čega je ljudskom telu teško da ga koristi i često je potrebno da se tretira hemijskim sredstvima. Štaviše, svi kolagenski proizvodi trenutno dostupni na tržištu se dobijaju iz tkiva životinja poput svinja, goveda i riba, i teško je izbeći virusnu infekciju, što, zajedno sa njihovom nekompatibilnošću sa ljudskim organizmom, može dovesti do imunološkog odbacivanja i simptoma alergije. Ako se kolagen ekstrahuje iz sirovina ljudske placente, to ne samo da ima ograničen izvor, već takođe može dovesti do teških pravnih kazni. Stoga se trenutni kolagen može koristiti samo u kozmetici i proizvodima za zdravstvenu zaštitu, a njegova izvorna biološka funkcija ne može se uopšte iskoristiti.

[0004] Strukturno, struktura prirodnog kolagena u ljudskom telu je veoma složena, što dovodi do toga da je veoma teško izraziti i masovno proizvoditi ljudski kolagen konvencionalnim postupcima. Prirodni kolagenski molekul ima poseban supernamotani oblik koji se sastoji od tri polipeptidna lanca koji nemaju međulančane vodonične veze i podržavaju ih samo međulančane vodonične veze. Ova spiralna struktura predstavlja levu spiralu sa tri aminokiselinska ostatka kao osnovnim ponavljanjem, pri čemu su ova tri aminokiselinska ostatka obično Gly-X-Pro. Gly (glicin) je ključan za obrazovanje vodoničnih veza u kolagenu; sam nema bočne lance, što dovodi do toga da se kolagen čvrsto slaže. Na višem strukturnom nivou, kolagenski supernamotani lanci će se dalje udruživati i obrazovati kolagenske fibrile. U organizmima, sinteza i modifikacija kolagena počinje sa prokolagenom i prolazi kroz mnoge hemijske promene poput hidroksilacije, glikozilacije i umrežavanja, a regulisana je različitim biološkim enzimima. Pored kolagenskog lanca, prokolagen takođe sadrži sferne glave i repove. Bez ovih glava i repova, kolagenski lanac ne bi se pravilno uvio u trostruku spiralu, što dovodi do gubitka biološke aktivnosti kolagena. Stoga je malo verovatno da će kolagen pripremljen prema originalnoj genetskoj sekvenci spontano organizovati in vitro kako bi obrazovao ispravnu prostornu strukturu. Ove poteškoće su ozbiljno otežale razvoj i proizvodnju ljudskog kolagena.

[0005] Tradicionalni postupak za proizvodnju kolagena je tretiranje životinjskih tkiva kiselinama, alkalima i enzimskom hidrolizom kako bi se ekstrahovali derivati kolagena. Kolagen dobijen ovim postupcima gubi svoju originalnu biološku aktivnost i stoga ne može da se primenjuje u oblasti biomedicine za obavljanje prave funkcije. Sa razvojem moderne biotehnologije, ljudi nastavljaju da pokušavaju da koriste transgene tehnike za pripremu rekombinantnog ljudskog kolagena u životinjskim, biljnim i mikrobnim sistemima eksprimiranja, što rešava mnoge nedostatke tradicionalnih postupaka ekstrakcije. Strani istraživački instituti su dobili mleko koje sadrži ljudski kolagen kultivisanjem miševa koji sadrže gen za ljudski kolagen, međutim, troškovi takve proizvodnje su previše visoki i ciklus proizvodnje je predug, što onemogućava masovnu proizvodnju.

[0006] Kineski patentni pronalazak br.201210482543.2 otkriva rekombinantni ljudski kolagen i postupak za proizvodnju istog, i otkriva rekombinantni ljudski kolagen dobijen povezivanjem peptidnog segmenta kolagena tipa III putem linkera i dodavanjem stabilne sekvence na C-kraju.

[0007] Međutim, postoji potreba u ovoj oblasti za više rekombinantnih ljudskih kolagena boljih karakteristika.

Kratak sadržaj pronalaska

[0008] Ovaj pronalazak obezbeđuje sledeći sadržaj:

1. Polipeptid koji obuhvata 16 ponavljanja sekvence definisane u SEQ ID br.1, pri čemu su ta ponavljanja sekvence direktno povezana, pri čemu taj polipeptid ne obuhvata sekvencu definisanu u SEQ ID br.2. 2. Polinukleotid koji kodira polipeptid prema stavki 1.

3. Ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid prema stavki 2, i opciono koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira SEQ ID br.4, pri čemu ta sekvenca nukleinske kiseline koja kodira SEQ ID br. 4 je direktno povezana sa 5' krajem kodirajuće sekvence nukleinske kiseline polipeptida, pri čemu ekspresioni vektor poželjno obuhvata sekvencu nukleinske kiseline iz SEQ ID br.5.

4. Ćelija domaćina koja obuhvata ekspresioni vektor prema stavki 3, pri čemu je ta ćelija domaćina poželjno Escherichia coli.

5. Postupak za proizvodnju polipeptida prema stavki 1, koji obuhvata:

(1) kultivisanje ćelije domaćina prema stavki 4 u podlozi za proizvodnju i proizvodnju polipeptida;

(2) sakupljanje polipeptida, i opciono digestiranje polipeptida, poželjno digestiranje polipeptida TEV proteazom; i

(3) prečišćavanje polipeptida Ni kolonom i/ili anjonskizmenjivačkom hromatografijom;

pri čemu opciono taj postupak za proizvodnju ne uključuje dodatnu fazu uklanjanja endotoksina; pri čemu poželjno prečišćeni polipeptid suštinski ne sadrži endotoksin ili sadrži manje od 5 EU/ml endotoksina.

6. Kompozicija koja obuhvata polipeptid prema stavki 1, pri čemu je ta kompozicija poželjno medicinsko sredstvo, proizvod inženjeringa tkiva, kozmetički proizvod ili proizvod za zdravstvenu zaštitu, pri čemu je polipeptid poželjno u obliku vodenog rastvora polipeptida, pri čemu kompozicija poželjno ne sadrži komponentu koja sprečava razgradnju polipeptida, i pri čemu ta kompozicija poželjno predstavlja kompoziciju za dugoročnu upotrebu, pri čemu je ta dugoročna upotreba poželjno duža od pola godine.

7. Upotreba polipeptida prema stavki 1 u proizvodnji kompozicije, poželjno medicinskog sredstva, proizvoda inženjeringa tkiva, kozmetičkog proizvoda, ili dodatka ishrani, pri čemu je polipeptid poželjno u obliku vodenog rastvora polipeptida, pri čemu kompozicija poželjno ne sadrži komponentu koja sprečava razgradanju polipeptida, i pri čemu je ta kompozicija za dugoorčnu upotrebu, pri čemu je ta dugoročna upotreba duža od pola godine.

8. Upotreba polipeptida prema stavki 1 za pospešivanje ćelijske adhezije.

9. Upotreba aminokiselinske sekvence iz SEQ ID br.4 ili ekspresionog vektora prema ovom pronalasku za proizvodnju polipeptida prema ovom pronalasku.

[0009] Polipeptid prema ovom pronalasku ima sledeće prednosti: njegova ćelijska adhezija je jača nego kod postojećih rekombinantnih kolagena tipa III; ima veću stabilnost u vodenom rastvoru, što je dokazano time što se ne razgrađuje duže od šest meseci, čime se eliminiše potreba za dodavanjem reagensa za sprečavanje degradacije polipeptida; većina endotoksina može da se ukloni prečišćavanjem putem Ni kolone i anjonskizmenjivačke hromatografije iz proizvoda polipeptida, a prečišćeni polipeptidni proizvod gotovo ne sadrži endotoksin ili sadrži 5 EU/ml ili manje endotoksina; polipeptid prema ovom pronalasku se dobija iz ćelija domaćina u većem prinosu i čistoći.

Kratak opis crteža

[0010]

Fig.1: Rezultati pikova masene spektrometrije eksprimiranog proizvoda;

Fig.2: Poređenje aktivnosti ćelijske adhezije između različitih rekombinantnih kolagena tipa III;

Fig.3: Nivoi ekspresije ćelija različitih rekombinantnih kolagena tipa III;

Fig.4: Prečišćavanje različitih rekombinantnih kolagena tipa III;

Fig.5: Stabilnost različitih rekombinantnih kolagena tipa III;

Fig.6: Rezidualni endotoksin različitih rekombinantnih kolagena tipa III;

Fig.7: Strukturna analiza rekombinantnog kolagena tipa III TE16C.

Detaljan opis

[0011] Opis u nastavku je dat radi lakšeg razumevanja ovog pronalaska.

[0012] Kako se ovde upotrebljava, "medicinski instrument" se odnosi na aparat, uređaje, aparate na struju, in vitro dijagnostičke reagense i kalibratore, materijale i druge slične ili povezane artikle koji se koriste direktno ili indirektno u ljudskom telu.

[0013] Kako se ovde upotrebljava, "proizvod inženjeringa tkiva" odnosi se na proizvod koji se koristi u inženjeringu tkiva. Inženjering tkiva je nova disciplina koja kombinuje ćelijsku biologiju i nauku o materijalima za konstrukciju tkiva ili organa in vitro ili in vivo.

[0014] Ovaj pronalazak se, delimično, oslanja na sledeće nalaze pronalazača: kada se polipeptid koji obuhvata više ponovljenih sekvenci SEQ ID br.1 eksprimira u E. coli, kako bi se poboljšalo svojstvo geliranja rekombinantno eksprimiranog polipeptida, često je potrebno dodati sekvencu kao što su aminokiseline zglobnih regiona GPPGPCCGGG (SEQ ID br.2) na C-kraju polipeptida kako bi se poboljšalo svojstvo geliranja (Reference: Journal of Biochemistry.2004; 136: 643-649) jer je protein od značaja okrnjeni protein i nedostaje mu struktura zglobnog proteina punog dužine. Stoga je konstruisana sekvenca polipeptida koja obuhvata SEQ ID NO.3 i SEQ ID br.2, na primer, sekvenca T16a iz SEQ ID br.9; međutim, otkriveno je da kada se polipeptid sekvence kao što je T16a kultiviše u sudu za mešanje ili fermentacionom rezervoaru, većina polipeptida od značaja obrazuje želatinasti talog koji se ne može rastvoriti i prečišćavati, tako da je prinos bio vrlo nizak. Prethodno je, kako bi se rešio ovaj problem, dodavanjem ne-kolagenskih aminokiselinskih linkera između ponovljenih sekvenci (SEQ ID br.1), dobijen polipeptid koji obuhvata više takvih ponovljenih sekvenci; pored toga, modifikacija takvog polipeptida je takođe bila uglavnom skoncentrisana na aminokiselinske ostatke linkera i aminokiseline C-terminalnog zglobnog regiona, takođe poznate kao C-terminalna stabilna sekvenca.

[0015] Iznenađujuće, nakon analize kristalne strukture SEQ ID br.1, pronalazači su otkrili da region SEQ ID br.1 može formirati veoma stabilnu kolagensku trimernu strukturu bez učešća zglobnog regiona. Stoga su pronalazači nastavili da modifikuju sekvencu polipeptida i otkrili da u postupku eksprimiranja polipeptida sekvence definisane u SEQ ID br.5, koja obuhvata sekvencu definisanu u SEQ ID br.4 i sekvencu definisanu u SEQ ID br.3, može se dobiti polipeptid koji obuhvata sekvencu definisanu u SEQ ID br.3 u velikim količinama, i da učešće C-terminalne stabilne sekvence više nije potrebno. Štaviše, u ovom trenutku, polipeptid ne formira koloidalnu strukturu prerano dok se rekombinantno eksprimira, čime se ne utiče na kasnije prečišćavanje proteina. Pored toga, pronalazači su iznenađujuće otkrili da, u poređenju sa rekombinantnim ljudskim kolagenom (SEQ ID br.6) iz Kineskog Patenta Inovacije br.

201210482543.2, polipeptid prema ovom pronalasku je stabilniji u vodenom rastvoru, može se dobiti iz ćelija domaćina u većem prinosu i čistoći, i ima značajno niži nivo endotoksina nakon prečišćavanja putem Ni kolone i anjonskizmenjivačke kolone.

[0016] U ovom pronalasku, korišćena sekvenca ponavljanja iz SEQ ID br.1 je GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP (SEQ ID br.1). Polipeptid prema ovom pronalasku može da obuhvata više sekvenci ponavljanja definisanih u SEQ ID br.1, pod uslovom da ne postoji linker između sekvenci ponavljanja, broj sekvenci ponavljanja je 16, tj. polipeptid koji obuhvata te sekvence je definisan u SEQ ID br.3:

[0017] Polipeptidna sekvenca ovog pronalaska može obuhvatati C-terminalnu sekvencu GPPGPCCGGG (SEQ ID br.2), čija verzija nije obuhvaćena zaštićenim pronalaskom. Kada se eksprimira polipeptid koji obuhvata više sekvenci ponavljanja, stručnjaci u ovoj oblasti obično razmatraju dodavanje navedene sekvence kako bi povećali stabilnost eksprimiranog polipeptida. Poželjno je da polipeptidna sekvenca ne obuhvata C-terminalnu sekvencu GPPGPCCGGG (SEQ ID br.2), čime se održava identitet sekvence sa ljudskim kolagenom tipa III bez uvođenja dodatnih aminokiselina.

[0018] Kada se eksprimira polipeptidna sekvenca ovog pronalaska, sekvenca ENLYFQ (SEQ ID br.4) bi trebalo da se doda na njen N-kraj, koji može da se odseče pomoću TEV proteaze kako bi se direktno dobila sekvenca SEQ ID br.3. Poželjno je da sekvenca ENLYFQ (SEQ ID br.4) bude direktno povezana sa N-krajem, kako bi se dobila sekvenca SEQ ID br.5:

[0019] U ovom pronalasku, polipeptidi su rekombinantni kolageni tipa III, koji se ovde naizmenično koriste sa rekombinantnim ljudskim kolagenima.

[0020] U ovom pronalasku, rekombinacija ljudskih kolagena može da se izvede konvencionalnim postupkom iz ove oblasti. Na primer, mogu da se proizvedu na sledeći način: (1) konstrukcijom genetski modifikovanih bakterija E. coli; (2) fermentacijom i kultivisanjem genetski modifikovanih bakterija E. coli; (3) indukcijom i eksprimiranjem rekombinantnog ljudskog kolagena; i (4) prečišćavanjem i, po potrebi, digestijom rekombinantnog ljudskog kolagena.

[0021] U fazi (1), konstrukcija genetski modifikovanih bakterija E. coli može da se izvede na sledeći način: (1) dobijanje fragmenta gena od značaja; (2) umetanje dobijenog fragmenta gena u PET-32a ekspresioni vektor kako bi se dobio rekombinantni ekspresioni plazmid; (3) transformacija rekombinantnog ekspresionog plazmida u kompetentne ćelije E. coli BL21 (DE3) i selekcija pozitivnih genetski modifikovanih bakterija E. coli.

[0022] U fazama (2) i (3), kultura fermentacije E. coli genetski modifikovanih bakterija E. coli i indukcija i eksprimiranje rekombinantnog ljudskog kolagena mogu da se izvedu na sledeći način: (1) biranje optimalnih pojedinačnih kolonija genetski modifikovanih bakterija E. coli sa LAB ploče, postavljenja u u 10 mL LB podloge, i kultivisanje na 37°C uz 220 o/m za 12-16 sati; (2) inokulacija bakterijskog rastvora u 2xYT podlozi u odnosu 1:100 za kultivisanje u većem obimu, i kultivisanje na 37°C oko 3 sata, a kada OD600dostigne između 0,4 i 0,6, dodavanje IPTG do konačne koncentracije od 0,5 mM za indukciju, nastavljanje kultivacije na 16°C tokom 20 sati, i prikupljanje bakterija centrifugiranjem.

[0023] U fazi (4), prečišćavanje i digestija rekombinantnog ljudskog kolagenskog polipeptida mogu da se izvedu na sledeći način: (1) resuspendovanje bakterija u fosfatnom puferu (40 mM

NaCl, pH 7,8) pre ultrazvučne obrade, i sakupljanje supernatanta centrifugiranjem; (2) korišćenje NI-NTA afinitetne kolone za vezivanje rekombinantnog ljudskog kolagena, a nakon pranja nečistih proteina sa 10 mM imidazola, dodavanje TEV proteaze, izvođenje enzimske digestije na koloni na 4°C tokom 16 sati, i

na kraju dobijanje kolagenskog polipeptida od značaja.

[0024] Ćelija domaćin može biti eukariotska ćelija, kao što su gljivice i kvasci, ili prokariotska ćelija, kao što je bakterija iz porodice Enterobacteriaceae. Stručnjacima iz ove oblasti će biti jasno da se gore navedeni soj E. coli može zameniti drugim ekspresionim sojevima kao ćelijom domaćinima.

[0025] Ovaj pronalazak dodatno obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid ovog pronalaska. Nukleinska kiselina može biti DNK ili cDNK. Molekul nukleinske kiseline može u osnovi da se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid ovog pronalaska, ili može da se sastoji isključivo od sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid ovog pronalaska. Takav molekul nukleinske kiseline može da se sintetiše postupcima poznatim u ovoj oblasti. Zbog degeneracije genetskog koda, stručnjaci iz ove oblasti će razumeti da molekuli nukleinske kiseline različitih sekvenci nukleinske kiseline mogu da kodiraju aminokiselinsku sekvencu.

[0026] Ovaj pronalazak dodatno obezbeđuje vektor koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline ovog pronalaska. Pogodni vektori su poznati u oblasti konstrukcije vektora, uključujući izbor promotera i drugih regulatornih elemenata, kao što su elementi pojačivača. Vektor ovog pronalaska obuhvata sekvencu pogodnu za uvođenje u ćeliju. Na primer, vektor može biti ekspresioni vektor; u vektoru, kodirajuća sekvenca polipeptida je pod kontrolom svog vlastitog cis-aktuelnog regulatornog elementa, a konstrukcija vektora olakšava integraciju gena ili zamenu gena u ćeliji domaćinu.

[0027] Stručnjaci iz ove oblasti će znati da u ovom pronalasku, pojam "vektor" uključuje DNK molekul, na primer, plazmid, fag, virus ili druge vektore; obuhvata jednu ili više heterolognih ili rekombinantnih sekvenci nukleinske kiseline. Pogodni fagovi i virusni vektori uključuju, ali bez ograničenja na, lambdafag, EMBL fag, simijanski virus, virus goveđeg papiloma, Epstein-Barr virus, adenovirus, herpes virus, virus mišjeg sarkoma, virus tumora dojke kod miševa, lentivirus i slično.

[0028] Polipeptid prema ovom pronalasku obuhvata sekvencu navedenu u SEQ ID br.3, ili sekvencu u kojoj je jedna ili više aminokiselina supstituisane, obrisane, umetnute i/ili dodate u sekvenci definisanoj u SEQ ID br.3 (čiji način ostvarivanja nije obuhvaćen zaštićenim pronalaskom), sve dok polipeptid prema ovom pronalasku zadržava efekat ćelijske adhezije aminokiselinske sekvence SEQ ID br.3. "Više" može biti 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 11.

[0029] Dodavanje aminokiselina se odnosi na dodavanje aminokiseline(a) na C-kraju ili N-kraju aminokiselinske sekvence, npr. SEQ ID br.3, sve dok polipeptid prema ovom pronalasku zadržava efekat ćelijske adhezije aminokiselinske sekvence SEQ ID br.3 (čiji način ostvarivanja nije obuhvaćen zaštićenim pronalaskom).

[0030] Aminokiselinska supstitucija se odnosi na zamenu aminokiselinskog ostatak na položaju u nekoj aminokiselinskoj sekvenci, npr. sekvenci iz SEQ ID br.3, drugim aminokiselinskim ostatkom, sve dok polipeptid prema ovom pronalasku zadržava efekat ćelijske adhezije aminokiselinske sekvence iz SEQ ID br. 3 (čiji način ostvarivanja nije obuhvaćen zaštićenim pronalaskom).

[0031] Umetanje aminokiselina se odnosi na umetanje aminokiselinskog ostat(a)ka na odgovarajućem položaju/ima u aminokiselinskoj sekvenci, npr. sekvenci iz SEQ ID br.3, pri čemu svi ili deo umetnutih aminokiselinskih ostataka mogu biti jedan pored drugog ili međusobno udaljeni, sve dok polipeptid prema ovom pronalasku zadržava efekat adhezije ćelija koji pruža aminokiselinska sekvenca SEQ ID br.3 (čiji način ostvarivanja nije obuhvaćen zaštićenim pronalaskom). Pozicije umetnutih aminokiselina ovde nisu između ponovljenih sekvenci.

[0032] Brisanje aminokiseline znači da 1, 2, 3 ili više aminokiselina mogu biti izbrisane iz aminokiselinske sekvence iz SEQ ID br.3, sve dok polipeptid prema ovom pronalasku zadržava efekat ćelijske adhezije aminokiselinske sekvence iz SEQ ID br.3 (čiji način ostvarivanja nije obuhvaćen zaštićenim pronalaskom).

[0033] U ovom pronalasku, supstitucija može biti konzervativna aminokiselinska supstitucija, što znači da 3, poželjnije 2 ili 1 aminokiselina se zamenjuje aminokiselinom sa sličnim ili istim svojstvom kako bi se obrazovao peptid u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID br.3. Ove konzervativne varijante peptida mogu da proizvedu aminokiselinske zamene prema tabeli 1.

[0034] U ovom kontekstu, pojmovi "uslovi srednje stringencije", "uslovi srednje-visoke stringencije", "visoki uslovi stringencije" ili "veoma visoki uslovi stringencije" opisuju uslove za hibridizaciju i pranje nukleinskih kiselina. Smernica za izvođenje hibridizacionih reakcija je opisana u knjizi Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Ova referenca opisuje postupke koje uključuju upotrebu vode i postupke koji ne uključuju vodu, pri čemu se može koristiti bilo koja od njih. Na primer, specifični uslovi hibridizacije su sledeći: (1) uslovi niske stringencije: hibridizacija u 6X natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC) na oko 45°C, nakon čega slede dva pranja u 0,2 X SSC, 0,1% SDS na najmanje 50°C (za uslove niske stringencije, temperatura pranja može se povećati na 55°C); (2) uslovi srednje stringencije: hibridizacija u 6X SSC na oko 45°C, nakon čega slede jedno ili više pranja u 0,2 X SSC, 0,1% SDS na 60°C; (3) uslovi visoke stringencije: Hibridizacija u 6X SSC na oko 45°C, nakon čega slede jedno ili više pranja u 0,2 X SSC, 0,1% SDS na 65°C; i poželjno (4) uslovi veoma visoke stringencije: 0,5 M natrijum fosfat, 7% SDS, nakon čega slede jedno ili više pranja u 0,2 X SSC, 1% SDS na 65°C.

Primeri

[0035] Primeri u nastavku su obezbeđeni radi ilustrovanja ovog pronalaska. Stručnjaci iz ove oblasti će znati da su ovi primeri samo ilustrativni i nisu ograničavajući. Ovaj pronalazak je ograničen samo opsegom priloženih patentnih zahteva.

Primer 1: Konstrukcija i eksprimiranje rekombinantnih ljudskih polipeptida kolagena Konstrukcija i eksprimiranje TE16C genskog ekspresionog vektora

[0036]

1. Proteinska sekvenca pune dužine ljudskog kolagena TE16C korišćena u primeru 1 je sekvenca definisana u SEQ ID br.5 i ima punu dužinu od 486 aminokiselina, a odgovarajući gen ima punu dužinu od 1458 bp. Nakon optimizacije kodona za kodone E. coli (nukleotidna sekvenca: gaaaacctgtatttccagggtgaacgtggtgcaccaggttttcgtggtccggcaggtccgaatggaattccgggtga gaaaggaccggctggtgagcgtggtgcgccgggtgaacgtggagcgcctggttttcgtggcccagcaggtccga acggtattcctggtgaaaaaggtccggcgggagagcgtggtgcaccgggtgaacgcggtgcaccgggatttcgtg gtccagcaggaccgaatggtatccctggtgaaaaaggaccggcaggtgagcgtggagcgccaggtgaacgtgg

cgcaccgggttttcgtggaccggcaggcccgaatggtattccgggtgaaaaaggcccggcaggtgaacgtggtgc cccgggtgaacgtggtgcgcctggatttcgtggcccggcaggaccgaacggtatccctggagaaaaaggtcctgc aggtgagcgcggtgcgccgggcgagcgtggtgcccctggttttcgcggtccggcaggccctaatggtattcctgg agaaaaaggccctgcaggtgaacgcggagcaccgggtgagcgtggcgcacctggttttcgtggtcctgcaggcc cgaacggtattccgggcgaaaaaggtccagcaggtgaacgtggtgctccgggtgaacgtggtgcacctggatttc gcggtcctgctggtccgaatggtattccaggtgaaaaaggtccggcaggagagcgtggagcaccgggagaacgt ggtgcaccgggctttcgtggtccggccggtcctaacggtatcccaggtgaaaaaggtccggccggcgagcgtggc gcccctggtgagcgtggtgctcctggttttcgtggtccggctggtccgaacggaattcctggtgagaaaggtccggc tggcgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggtttccgtggtccggcgggtcctaatggtatcccgggt gaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgcggaccggcaggacc taatggtattccgggagaaaaaggacctgcgggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgt ggtccggcaggtcctaatggaattcctggagagaaaggacctgcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggt gcaccgggttttcgtggtccggcaggtccaaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcac cgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggcattcctggtgaaaaaggtccggcagg tgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggtattccgggtgaa aaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccg, SEQ ID br.7), Shanghai HuaGen Biotech Co., Ltd. je sintetisala genski fragment, i sintetisani TE16C genski fragment je umetnut u PET32a ekspresioni

vektor putem restriktivnih mesta BamH I (NEB kompanija, kat. br.: R0136L) i Xho I (NEB kompanija, kat. br.: R0146L).

2. Uspešno konstruisani ekspresioni plazmid je transformisan u kompetentne ćelije E. coli BL21 (DE3) (kompanija Merck). Specifičan postupak je bio sledeći: 1 µL plazmida je uzet i stavljen u 100 µL kompetentnih ćelija E. coli BL21 (DE3) i ostavljen da odstoji na ledu 30 minuta. Ova mešavina je toplotno aktivirana u vodenoj kupki na 42°C tokom 90 sekundi, zatim brzo stavljena na led i ostavljena da odstoji 2 minuta. Dodato je 600 µL neotporne LB tečne podloge u mešavinu, i kultivisano na 37°C uz 220 o/m (obrtaja u minuti) tokom 1 sata.200 µL bakterijskog rastvora je ravnomerno naneseno na LB ploču sa ampicilinskom rezistencijom (10 g/L pepton, 5 g/L ekstrakt kvasca, 10 g/L natrijum hlorid, 15 g/L agar, i 100 µg/mL ampicilin). Ploča je okrenuta naopako i kultivisana u inkubatoru na 37°C, i kultivisana oko 20 h da bi se razvile jasne kolonije.

3. Monoklonalne kolonije su uzete sa transformisane LB ploče i kultivisane u 10 mL LB podloge (koja sadrži 100 µg/mL ampicilina) tokom 12-16 sati, zatim su prenesene u 2xYT podlogu (16 g/L pepton, 10 g/L ekstrakt kvasca i 5 g/L natrijum hlorid) u odnosu 1:100 za kultivaciju u većem obimu, i kultivisane na 37°C i 220 o/m dok je OD600 bakterijskog rastvora bio između 0,4 i 0,6. Dodata je 0,5 mM IPTG (Sigma kompanija, Kat. br.: I5502-1G) za postizanje konačne koncentracije od 0,5 mM radi indukcije ekspresije. Uslovi indukcije su bili kultivacija na 18°C i 180 o/m tokom 20 sati. Na kraju, bakterije su sakupljene centrifugiranjem i čuvane na -20°C ili odmah se prešlo na sledeću fazu u postupku prečišćavanja.

4. (1L) Bakterijski peleti su resuspendovani u oko 50 mL fosfatnog pufera (pH 7.8) (40 mM natrijum dihidrogen fosfat, 500 mM natrijum hlorid), zatim su razbijeni pomoću opreme za razbijanje bakterija pod visokim pritiskom (Scientz Biotechnology Co., LTD.), i centrifugirani na 13,000 o/m tokom 30 minuta kako bi se rastvoreni proteini odvojili od inkluzionih tela.

5. Ni-NTA (Qiagen kompanija, kat. br.: 30210) afinitetna kolona je izbalansirana sa 5 zapremina kolone vezujućeg pufera (40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7.8). Zatim je dodat proteinski supernatant u kolonu i inkubiran na 4°C tokom 0,5-1 h kako bi se rekombinantni protein od značaja potpuno vezao za kolonu. Proteini nečistoće su isprani sa 200 mL pufera za pranje (10 mM imidazol, 40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7,8) koji sadrži 10 mM imidazola (Sigma kompanija). Na kraju, dodata je odgovarajuća količina His-tagged TEV proteaze (Sigma, SA T4455), a nakon inkubacije na 4°C tokom 16 sati, sakupljen je protok tečnosti, tj. kolagen od značaja odvojen od vektorskog proteina. Dobijeni proizvod je dijalizovan preko noći i liofilizovan u suvi prah za upotrebu.

6. Dobijeni TE16C protein je izmeren zbog čistoće putem SDS-PAGE. Konkretan postupak je bio sledeći. Uzeto je 40 µL prečišćenog proteinskog rastvora, dodato 10 µL 5x pufera za punjenje proteina (250 mM Tris-HCl (pH: 6.8), 10% SDS, 0.5% bromfenol plavi, 50% glicerol i 5% β-merkaptoetanol), stavljeno u ključalu vodu na 100°C i kuvano 10 minuta. Dobijeni rastvor je dodat u SDS-PAGE gel za proteine po 10 µL po bunaru i pokrenut na 80 V tokom 2 sata. Zatim je gel obojen sa Coomassie Brilliant Blue bojom (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 25% izopropil alkohol, i 10% glacijalne sirćetne kiseline) tokom 20 minuta, a zatim obezbojen sa rastvorom za obezbojavanje proteina (10% sirćetna kiselina, 5% etanol). Na kraju, aktivnost proteina je merena upoređivanjem sa ljudskim prirodnim kolagenom.

Konstrukcija i eksprimiranje HC16 genskog ekspresionog vektora

[0037]

1. Proteinska sekvenca pune dužine ljudskog kolagena HC16 kao kontrola korišćena u primeru 1 je sekvenca definisana u SEQ ID br.6 i ima punu dužinu 501 aa, i njen odgovarajući gen ima punu dužinu od 1503 bp. Nakon optimizacije za kodon E. coli (nukleotidna sekvenca: ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcagg cgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcg aaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccct aacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcg tggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcga gcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaac gtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaag ggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacgg cattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcc cggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtg gtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggc

gcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcct gcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattcc gggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggcc ggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgca cctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccct ggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcagg cgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtga gaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtccta atggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtcc ttgttgtggcggcggc, SEQ ID br.8), Shanghai HuaGen Biotech Co., Ltd. je sintetisala genski fragment, i sintetisani HC16 genski fragment je umetnut u PET32a ekspresioni vektor putem restriktivnih mesta BamH I (NEB kompanija, kat. br.: R0136L) i Xho I (NEB kompanija, kat. br.: R0146L).

2. Uspešno konstruisani eksprimirajući plazmid je transformisan u E. coli kompetentnu ćeliju BL21 (DE3) (Merck kompanija). Konkretan postupak je prethodno opisan.

3. Monoklonalne kolonije su preuzete sa transformisane LB ploče i kultivisane u 10 mL LB podloge (koja sadrži 100 µg/mL ampicilina) tokom 12-16 sati. Zatim su prenete u 2xYT podlogu (16 g/L pepton, 10 g/L kvasni ekstrakt i 5 g/L natrijum hlorid) u odnosu 1:100 za kulturu u većem obimu, i kultivisane na 37°C uz 220 o/m (obrtaja u minuti) dok OD600 vrednost bakterijskog rastvora nije bila između 0,4 i 0,6. Dodata je 0,5 mM IPTG (Sigma, kat. br.: I5502-1G) za indukciju ekspresije, a uslovi indukcije su bili kultivisanje na 18°C i 180 o/m tokom 20 sati. Na kraju, bakterije su sakupljene centrifugiranjem i čuvane na -20°C ili se odmah prešlo na sledeći korak za prečišćavanje.

4. (1L) Bakterijski peleti su resuspendovani u oko 50 mL fosfatnog pufera (pH 7.8) (40 mM natrijum dihidrogen fosfat, 500 mM natrijum hlorid), zatim su razbijeni pomoću opreme za razbijanje bakterija pod visokim pritiskom (Scientz Biotechnology Co., LTD.), i centrifugirani na 13,000 o/m tokom 30 minuta kako bi se odvojili rastvorljivi proteini od inkluzionih tela.

5. Ni-NTA (Qiagen, kat. br.: 30210) afinitetna kolona je izjednačena sa 5 zapremina kolone vezivnog pufera (40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7.8). Zatim je proteinski supernatant dodat u kolonu i inkubiran na 4°C tokom 0,5-1 h kako bi se rekombinantni protein od značaja potpuno vezao za kolonu. Proteini nečistoće su isprani sa 200 mL pufera za pranje (10 mM imidazola, 40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7.8) koji sadrži 10 mM imidazola (Sigma). Na kraju je dodata odgovarajući količina His-tagged prescission proteaze (Ppase, na kratko) (Sigma, SAE0045), i nakon inkubacije na 4°C tokom 16 sati, fluid koji prolazi kroz kolonu, tj. kolagen od značaja odvojen od vektorskog proteina, je sakupljen. Dobijeni proizvod je dijalizovan preko noći i liofilizovan u suvi prah za dalju upotrebu.

6. Dobijeni HC16 protein je meren zbog čistoće postupkom SDS-PAGE. Konkretno, postupak je bio sledeći: uzeto je 40 µL prečišćenog proteinskog rastvora, pomešano sa 10 µL 5x proteina za punjenje (250 mM Tris-HCl (pH: 6.8), 10% SDS, 0,5% bromofenol plavi, 50% glicerol i 5% β-merkaptopetanol), i stavljeno u ključalu vodu na 100°C i kuvano je 10 minuta. Dobijeni rastvor je dodat na SDS-PAGE proteinski gel po 10 µL po bunaru, i pokrenut na 80 V tokom 2 sata. Zatim je gel obojen Coomassie Brilliant Blue bojom (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 25% izopropil alkohol i 10% glacijalna sirćetna kiselina) tokom 20 minuta, a zatim je obezbojen rastvorom za obezbojavanje proteina (10% sirćetna kiselina, 5% etanol). Na kraju, aktivnost proteina je merena u poređenju sa ljudskim prirodnim kolagenom. HC16 protein je verifikovan istim postupkom kao u kineskom patentnom pronalasku 201210482543.2, što je pokazalo ispravnu veličinu proteina.

Konstrukcija i eksprimiranje polipeptida T16a koji sadrži sekvence ponavljanja i C-terminalnu stabilnu sekvencu

[0038]

1. Ljudski kolagen T16a korišćen u primeru 1, koji se razlikuje od TE16C gena ili HC16 gena u kojem T16a obuhvata i SEQ ID br.3 bez vezujuće aminokiseline i aminokiseline zglobnog regiona SEQ ID br.2, ima punu dužinu od 490 aa, i njegova sekvenca je:

Njegov odgovarajući gen ima punu dužinu od 1407 bp. Nakon optimizacije kodona za kodon E. coli (nukleotidna sekvenca: ggtgaacgtggtgcaccaggttttcgtggtccggcaggtccgaatggaattccgggtgagaaaggaccggctggt gagcgtggtgcgccgggtgaacgtggagcgcctggttttcgtggcccagcaggtccgaacggtattcctggtgaaa aaggtccggcgggagagcgtggtgcaccgggtgaacgcggtgcaccgggatttcgtggtccagcaggaccgaat ggtatccctggtgaaaaaggaccggcaggtgagcgtggagcgccaggtgaacgtggcgcaccgggttttcgtgg accggcaggcccgaatggtattccgggtgaaaaaggcccggcaggtgaacgtggtgccccgggtgaacgtggtg cgcctggatttcgtggcccggcaggaccgaacggtatccctggagaaaaaggtcctgcaggtgagcgcggtgcg ccgggcgagcgtggtgcccctggttttcgcggtccggcaggccctaatggtattcctggagaaaaaggccctgcag gtgaacgcggagcaccgggtgagcgtggcgcacctggttttcgtggtcctgcaggcccgaacggtattccgggcg aaaaaggtccagcaggtgaacgtggtgctccgggtgaacgtggtgcacctggatttcgcggtcctgctggtccgaa

tggtattccaggtgaaaaaggtccggcaggagagcgtggagcaccgggagaacgtggtgcaccgggctttcgtg gtccggccggtcctaacggtatcccaggtgaaaaaggtccggccggcgagcgtggcgcccctggtgagcgtggt gctcctggttttcgtggtccggctggtccgaacggaattcctggtgagaaaggtccggctggcgaacgtggtgcacc gggtgaacgtggtgcaccgggtttccgtggtccggcgggtcctaatggtatcccgggtgaaaaaggtccggcagg tgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgcggaccggcaggacctaatggtattccgggaga aaaaggacctgcgggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtcctaat ggaattcctggagagaaaggacctgcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtc cggcaggtccaaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcac cgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggcattcctggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccggg tgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaa cgtggtgcaccgggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc, SEQ ID br.10), Shanghai HuaGen Biotech Co., Ltd. je sintetisala genski fragment, i taj sintetisani T16a genski fragment je umetnut u PET32a ekspresioni vektor preko restriktivnih mesta BamH I (NEB kompanija, kat. br.: R0136L) i Xho I (NEB kompanija, kat. br.: R0146L).

2. Uspešno konstruisani eksprimirajući plazmid je transformisan u E. coli kompetentnu ćeliju BL21 (DE3) (Merck kompanija). Konkretan postupak je prethodno opisan.

3. Monoklonalne kolonije su preuzete sa transformisane LB ploče i kultivisane u 10 mL LB podloge (koja sadrži 100 µg/mL ampicilina) tokom 12-16 sati. Zatim su prenete u 2xYT podlogu (16 g/L pepton, 10 g/L kvasni ekstrakt i 5 g/L natrijum hlorid) u odnosu 1:100 za kultivaciju u većem obimu, i kultivisane na 37°C uz 220 o/m (obrtaja u minuti) dok OD600 vrednost bakterijskog rastvora nije bila između 0,4 i 0,6. Dodato je 0,5 mM IPTG (Sigma, kat. br.: I5502-1G) za indukciju ekspresije, a uslovi indukcije su bili kultivacija na 18°C i 180 o/m tokom 20 sati. Na kraju, bakterije su sakupljene centrifugiranjem i čuvane na -20°C ili odmah prešle na sledeći korak za prečišćavanje.

4. (1L) Bakterijski peleti su resuspendovani u oko 50 mL fosfatnog pufera (pH 7,8) (40 mM natrijum dihidrogen fosfat, 500 mM natrijum hlorid), zatim su razbijeni pomoću opreme za razbijanje bakterija pod visokim pritiskom (Scientz Biotechnology Co., LTD.), i centrifugirani na 13,000 o/m tokom 30 minuta kako bi se odvojili rastvorljivi proteini od inkluzionih tela i kolagena koloida.

5. Ni-NTA (Qiagen, kat. br.: 30210) afinitetna kolona je izjednačena sa 5 zapremina kolone vezivnog pufera (40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7.8). Zatim je proteinski supernatant dodat u kolonu i inkubiran na 4°C tokom 0,5-1 h kako bi se rekombinantni protein od značaja potpuno vezao za kolonu. Proteini nečistoće su isprani sa 200 mL pufera za pranje (10 mM imidazola, 40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7.8) koji sadrži 10 mM imidazola (Sigma). Na kraju je dodat odgovarajući količina His-tagged prescission proteaze (Ppase) (Sigma, SAE0045), i nakon inkubacije na 4°C tokom 16 sati, fluid koji prolazi kroz kolonu, tj. kolagen od značaja odvojen od vektorskog proteina, je sakupljen. Dobijeni proizvod je dijalizovan preko noći i liofilizovan u suvi prah za upotrebu.

6. Dobijeni T16a protein je meren zbog čistoće postupkom SDS-PAGE. Konkretno, postupak je bio sledeći: 40 µL prečišćenog proteinskog rastvora je uzeto, pomešano sa 10 µL 5x pufera za punjenje proteina (250 mM Tris-HCl (pH: 6.8), 10% SDS, 0,5% bromofenol plavog, 50% glicerola i 5% βmerkaptopetanol), i stavljeno je u ključalu vodu na 100°C i kuvano 10 minuta. Dobijeni rastvor je dodat na SDS-PAGE proteinski gel po 10 µL po bunaru, i pokrenut je na 80 V tokom 2 sata. Zatim je gel obojen rastvorom za bojenje Coomassie Brilliant Blue (0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 25% izopropil alkohol, i 10% ledna kiselina) tokom 20 minuta, a zatim obezbojen rastvorom za obezbojavanje proteina (10% octena kiselina, 5% etanol). Na kraju, aktivnost proteina je izmerena u poređenju sa ljudskim prirodnim kolagenom.

Konstrukcija i eksprimiranje polipeptida T16b koji sdrži sekvence ponavljanja i aminokiseline linkera [0039]

1. Ljudski kolagen T16b korišćen u primeru 1, koji se razlikuje od TE16C gena ili HC16 gena u tome što T16b uklanja aminokiselinu SEQ ID br.2 zglobnog regiona iz SEQ ID NO.6 sa aminokiselinama linkera, ima punu dužinu od 486 aa, i njegova sekvenca je:

Njen odgovarajući gen ima punu dužinu od 1458 bp. Nakon optimizacije kodona za kodon E.

coli (nukleotidna sekvenca: ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcagg cgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcg aaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccct aacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcg tggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcga gcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaac gtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaag ggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacgg cattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcc cggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtg

gtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggc gcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcct gcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattcc gggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggcc ggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgca cctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccct ggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcagg cgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtga gaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtccta atggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacct, SEQ ID br.12), Shanghai HuaGen Biotech Co., Ltd. je sintetisala genski fragment, i taj sintetisani T16a genski fragment je umetnut u PET32a ekspresioni vektor preko restriktivnih mesta BamH I (NEB kompanija, kat. br.: R0136L) i Xho I (NEB kompanija, kat. br.: R0146L).

2. Uspešno konstruisani eksprimirajući plazmid je transformisan u E. coli kompetentnu ćeliju BL21 (DE3) (Merck kompanija). Konkretan postupak je prethodno opisan.

3. Monoklonalne kolonije su preuzete sa transformisane LB ploče i kultivisane u 10 mL LB podlozi (koja sadrži 100 µg/mL ampicilina) tokom 12-16 sati. Zatim su prenete u 2xYT podlogu (16 g/L pepton, 10 g/L kvasni ekstrakt i 5 g/L natrijum hlorid) u odnosu 1:100 za kultivaciju u većem obimu, i kultivisane na 37°C uz 220 o/m (okretaja u minuti) dok OD600 vrednost bakterijskog rastvora nije bila između 0,4 i 0,6. Dodata je 0,5 mM IPTG (Sigma, kat. br.: I5502-1G) za indukciju ekspresije, a uslovi indukcije su bili kultivisanje na 18°C i 180 o/m tokom 20 sati. Na kraju, bakterije su sakupljene centrifugiranjem i čuvane na -20°C ili odmah se prešlo na sledeći korak prečišćavanja.

4. (1L) Bakterijski peleti su resuspendovani u oko 50 mL fosfatnog pufera (pH 7.8) (40 mM natrijum dihidrogen fosfat, 500 mM natrijum hlorid), zatim su razbijeni pomoću opreme za razbijanje bakterija pod visokim pritiskom (Scientz Biotechnology Co., LTD.), i centrifugirani na 13,000 o/m tokom 30 minuta kako bi se odvojili rastvorljivi proteini od inkluzionih tela.

5. Ni-NTA (Qiagen, kat. br.: 30210) afinitetna kolona je izjednačena sa 5 zapremina kolone vezivnog pufera (40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7.8). Zatim je proteinski supernatant dodat u kolonu i inkubiran na 4°C tokom 0,5-1 h kako bi se rekombinantni protein od značaja potpuno vezao za kolonu. Proteini nečistoće su isprani sa 200 mL pufera za pranje (10 mM imidazola, 40 mM NaH2PO3, 500 mM NaCl, pH 7.8) koji sadrži 10 mM imidazola (Sigma). Na kraju je dodata odgovarajuća količina His-tagged prescission proteaze (Ppase) (Sigma, SAE0045), i nakon inkubacije na 4°C tokom 16 sati, fluid koji prolazi kroz kolonu, tj. kolagen od značaja odvojen od vektorskog proteina, je sakupljen. Dobijeni proizvod je dijalizovan preko noći i liofilizovan u suvi prah za upotrebu.

6. Dobijeni T16b protein je izmeren zbog čistoće postupkom SDS-PAGE. Konkretno, postupak je bio sledeći.40 µL očišćene proteinske otopine je uzeto, pomešano sa 10 µL 5x pufera za punjenje proteina (250 mM Tris-HCl (pH: 6.8), 10% SDS, 0.5% bromofenol plavi, 50% glicerol i 5% β-merkaptopetanol), i stavljen u ključalu vodu na 100°C i kuvan 10 minuta. Rezultantna otopina je dodata na SDS-PAGE proteinski gel po 10 µL po bunaru, i elektroforezom je vođena na 80 V tokom 2 sata. Zatim je gel obojen rastvorom za obojanje Coomassie Brilliant Blue (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 25% izopropil alkohol, i 10% ledna sirćetna kiselina) tokom 20 minuta, a zatim obezbojen rastvorom za obezbojavanje proteina (10% octena kiselina, 5% etanol). Na kraju, aktivnost proteina je merena u poređenju sa ljudskim prirodnim kolagenom.

Primer 2: Masena spektrometrijska detekcija TE16C proteina

Eksperimentalni postupak

[0040]

[0041] Proteinski uzorak je bio podvrgnut DTT redukciji i alkilaciji jodoacetamidom, a zatim je dodat tripsin za digestaciju tokom noći. Peptidni segment dobijen nakon enzimske hidrolize je dejonizovan pomoću C18 ZipTip i zatim pomešan sa matricom α-ciano-4-hidroksicinamatskom kiselinom (CHCA) za nanošenje na pločicu. Na kraju, za analizu je korišćen masa spektrometar sa desorpcijom/ionizacijom uz pomoć matrice i analizom vremena leta MALDI-TOF/TOF Ultraflextreme™, Brucker, Nemačka (za tehniku otiska peptida, vidi: Protein J.2016; 35: 212-7).

[0042] Pretraživanje baze podataka je sprovedeno putem MS/MS Ion Search page na lokalnoj web stranici maskota. Rezultati identifikacije proteina dobijeni su na osnovu primarnog masenog spektra peptidnih segmenata proizvedenih nakon enzimske hidrolize. Parametri pretrage su: enzimska hidroliza tripsinom, sa postavljena dva promašena restriktivna mesta. Alkilacija cisteina je postavljena kao fiksna modifikacija, dok je oksidacija metionina podešena kao promenljiva modifikacija. Baza podataka korišćena za identifikaciju je NCBprot.

[0043] Rezultati pikova masene spektrometrije su prikazani na Fig.1.

[0044] Tabela 1: Detekcija masenom spektrometrijom molekulske mase i odgovarajućeg peptida Primećena vrednost Mr (očekivana vrednost) peptid

Pokrivenost detektovanog peptidnog fragmenta

[0045]

[0046] Više od 98,8% sekvence proteina TE16C može da se detektuje masenom spektrometrijom, i rezultati su veoma pouzdani. Karakteristični pikovi masene spektrometrije za neodređeni protein bili su 2246,2323, 2246,2323, 1738,8731, 1678,9003, 1660,8401, 1171,5966 i 1093,5636, te je zaključeno da je protein TE16C pravilno eksprimiran.

Primer 3: Detekcija svojstava rekombinantnih kolagena tipa III

[0047] Postupci za detekciju aktivnosti kolagena mogu se naći u referenci: Juming Yao, Satoshi Yanagisawa, Tetsuo Asakura, „Design, Expression, and Characterization of Collagen-like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens“, J Biochem.136, 643-649 (2004). Konkretan postupak primene je sledeći:

1. Koncentracije proteinskih uzoraka koji se ispituju merene su postupkom ultraljubičaste apsorpcije, uključujući kontrolni ljudski kolagen (Sigma, C7774), kontrolni stari kolagen HC16 tipa III, novi kolagen TE16C tipa III, kontrolni T16a protein i T16b proteinske uzorke. Konkretno, merena je odgovarajuća apsorpcija uzoraka na 215 nm i 225 nm, a odgovarajuća koncentracija proteina je izračunata pomoću empirijske formule C (µg/mL) = 144X (A215-A225), i trebalo di da se napomene da je detekcija izvedena pod uslovom da je A215<1.5. Princip postupka je određivanje karakteristične apsorpcije peptidne veze u daljem ultraljubičastom svetlu, i na ovaj postupak ne utiče sadržaj hromofora, ima malo interferentnih supstanci, lako se izvodi i pogodan je za detekciju ljudskog kolagena i njegovih analoga koji nisu obojeni Coomassie Brilliant Blue-om. (Referenca: Walker JM., The Protein Protocols Handbook, drugo izdanje, Humana Press, 43-45). Nakon detekcije koncentracije proteina, sve koncentracije ispitivanih proteina su prilagođene na 0,5 mg/mL sa PBS-om.

2. 100 µL svakog proteinskog rastvora se dodaje u ploču sa 96 bunarčića i poredi sa PBS rastvorom slepe probe, i ostavi se da stoji na sobnoj temperaturi 60 minuta.

3. 3T3 ćelije kultivisane u bunarčićima 10<5>(od Teacher Tong Pei, Tsinghua University) su dodate u svaki bunarčić i inkubirane na 37 °C tokom 60 min.

4. Svaki bunarčić je opran 4 puta sa PBS.

5. Apsorbanca OD492nm je merena pomoću kompleta za ispitivanje LDH (Roche, 04944926001). Na osnovu vrednosti kontrolnog uzorka, može se izračunati stopa prianjanja ćelija. Formula za izračunavanje je sledeća: brzina prijanjanja ćelija = (test bunarčić – bunarčić slepe probe) x 100% / (pozitivan bunarčić – bunarčić slepe probe). Brzina prijanjanja ćelija može da odražava aktivnost kolagena. Što je veća aktivnost proteina, to brže može da obezbedi ćeliju superiorne spoljašnje sredine kako bi se potpomoglo prijanjanje ćelija.

[0048] Za rezultate pogledati Fig.2.

[0049] Rezultati sa Fig.2 znače da ta dva ljudska rekombinantna kolagena (tj. tip III kolagen HC16 i tip III kolagen TE16C) imaju bolje aktivnosti prianjanja u poređenju sa komercijalnim ljudskim kolagenom, pri čemu rekombinantni kolagen tipa III TE16C prema ovom pronalasku postiže najjaču aktivnost prianjanja ćelija. Proteini dobijeni pomoću dva postupka konstrukcije T16a i T16b kao kontrole imaju manje aktivnosti prianjanja ćelija u poređenju sa TE16C proteinom prema ovom pronalasku.

Primer 4: Eksprimiranje i prečišćavanje rekombinantnih kolagena tipa III

Eksprimiranje i prečišćavanje TE16C proteina

[0050]

1. Prema fazama 1-5 u primeru 1, kolagen od značaja TE16C, odvojen od vektorskog proteina, je dobijen i dijalizovan u rastvor A (10 mM Na2CO3, pH 10,5, 10 mM NaCl) za anjonsku izmenjivačku kolonu. 2. Anjonska izmenjivačka kolona (Hitrap Q HP kolona, 5 mL, GE Healthcare Biosciences) je izjednačena sa 5 zapremina kolona rastvora A (10 mM Na2CO3, pH 10.5, 10 mM NaCl). Nakon toga, dijalizovani TE16C protein je nanesen na kolonu, i sakupljen je pik proteina koji je prošao kroz kolonu, tj. prečišćeni TE16C protein. Dobijeni proizvod je dijalizovan tokom noći i liofilizovan u suvi prah za upotrebu

3. Anjonska izmenjivačka kolona je eluirana sa 5 zapremina kolona rastvora B (10 mM Na2CO3, pH 10.5, 1 M NaCl) kako bi se isprali proteini nečistoće i endotoksini iz kolone.

[0051] HC16 protein, polipeptid T16a koji obuhvata sekvencu ponavljanja i stabilnu C-terminalnu sekvencu, kao i polipeptid T16b koji obuhvata sekvencu ponavljanja i linker aminokiseline, su tretirani na isti način.

[0052] Fig.3 prikazuje ekspresiju rekombinantnih kolagena tipa III. Nakon prečišćavanja kolagena tipa III HC16, može se dobiti oko 8 mg čistog proteina iz 1 L bakterijskog rastvora. Nakon prečišćavanja kolagena TE16C tipa III, može se dobiti oko 15 mg ili više čistog proteina iz 1 L bakterijskog rastvora. Nivoi ekspresije proteina dobijeni pomoću dva postupka konstrukcije T16a i T16b kao kontrole takođe nisu dostigli nivoe kao kod TE16C proteina iz ovog pronalaska. Važno je napomenuti da za postupak konstrukcije T16a količina rastvorljivog proteina u supernatantu je veoma mala zbog formiranja velike količine koloida tokom prečišćavanja proteina.

[0053] Fig.4 prikazuje prečišćavanje rekombinantnih kolagena tipa III. Kolagen HC16 tipa III imao je čistoću od oko 95% nakon Ni kolone i anjonske razmene, dok je kolagen tipa III TE16C mogao biti brzo prečišćen do čistoće veće od 99% Ni kolonom i anjonskom razmenom. Iako su proteini dobijeni postupcima konstrukcije T16a i T16b kao kontrolni imali visoke čistoće, njihovi prinosi nisu bili visoki i bili su mnogo niži od TE16C proteina ovog pronalaska.

Primer 5: Stabilizacija rekombinantnih kolagena tipa III u vodenim rastvorima

Ispitivanje stabilnosti

[0054]

1. Prečišćeni TE16C protein, kao i HC16, T16a i T16b proteini, dobijeni su prema primeru 4, a zatim su dijalizovani u odnosu na fiziološki rastvor (0,9% NaCl). Sakupljeni dijalizovani rastvori proteina su sakupljeni, sterilizovani filtracijom kroz filter membranu od 0,22 µm, a zatim su ostavljeni da odstoje duže vreme u okruženju temperature od 4-8 °C.

2. U različitim vremenskim tačkama, kao što su mesec dana, dva meseca, tri meseca, pola godine, godinu dana, sakupljeni su vodenasti rastvori TE16c proteina i HC16 proteina, i merena je njihova čistoća pomoću SDS-PAGE (videti postupak iz primera 1).

[0055] Fig.5 prikazuje slike elektroforeze HC16, TE16C, T16a i T16b u vremenskom trenutku od šest meseci. Kolagen HC16 tipa III bio je nestabilan u vodenom rastvoru; do značajne razgradnje je došlo nakon mesec dana, a razgradnja posle šest meseci je bila veoma ozbiljna. Nasuprot tome, kolagen tipa III TE16C ima stabilnu strukturu i nakon što je bio u vodenom rastvoru pola godine, više od 90% proteina ostalo je u obliku potpune pune dužine, dok je samo mala količina bila razgrađena. Proteini dobijeni postupcima konstrukcije T16a i T16b kao kontrolni takođe su imali različite stepene razgradnje, pri čemu je razgradnja T16b bila ozbiljnija; njihova stabilnost je znatno niža u poređenju sa stabilnošću TE16C proteina ovog pronalaska.

Primer 6: Detekcija endotoksina u rekombinantnim kolagenima tipa III

Detekcija endotoksina iz TE16c proteina, HC16 proteina, T16a proteina i T16b proteina

[0056]

1. Prečišćeni TE16c protein, HC16 protein, T16a protein i T16b protein su pripremljeni prema primeru 4.

2. Pripremljeni su reagensi koji uključuju tachypleus amebocitni lizat (Zhanjiang A&C Biological Ltd., λ=0.015EU/ml) i razblaživač I (Zhanjiang A&C Biological Ltd.).

3. Standardi endotoksina su razblaženi na E1, E0.5, E0.25, E0.125 i E0.0625. Uzorci su razblaženi 5, 8, 16, 32, 50, 100, 200, 300 i 400 puta sa razblaživačem I, dok su ostali uzorci razblaženi vodom za detekciju, kako bi se uzorci razblažili 10, 16, 32, 64, 100, 200, 400, 600 i 800 puta, redom.

4. Standardi endotoksina i razblaženi proteinski uzorci dodati su tachypleus amebocitnom lizatu radi posmatranja. Rezultati su upoređeni sa negativnim i pozitivnim kontrolama. Koncentracije endotoksina u uzorcima su izračunate.

[0057] Fig.6 prikazuje stanje preostalog endotoksina rekombinantnih kolagena tipa III. Kolagen tipa III nije ujednačen u strukturi i lako se vezuje za endotoksin, tako da je preostali endotoksin nakon Ni kolone i anjonske razmene oko 100EU/mL, dok se novi kolagen TE16C tipa III može brzo prečistiti do nivoa manje od 5EU/mL endotoksina pomoću Ni kolone i anjonske razmene. Proteini dobijeni postupcima konstrukcije T16a i T16b kao kontrolni takođe su čvrsto vezani za endotoksin, i nije lako odstraniti endotoksin.

Primer 7: Analiza rekombinantnih kolagena tipa III

[0058]

1. Sekvenca TE16C sadrži segment kolagena ljudskog tipa III od Pro488 do Gly510, i nekoliko polipeptida (Taihe Biotechnology Co., Ltd., Pekinf) su sintetisani na osnovu ove regionalne sekvence za opsežan skrining kristala, npr. polipeptida GFRGPAGPNGIPGEKGPAGERG.

2. Polipeptid je rastvoren u vodi do koncentracije od 15 mg/mL, a kristali su uzgajani postupkom viseće kapi, pri čemu je formulacija rastvora za rezervoar bila 30% (w/v) PEG 400, 0,1 M Na acetat pH 4,6, i 0,1 M kadmijum hlorid. Uzeto je po 1 µL svakog rastvora polipeptida i rastvora za rezervoar i pomešano, a zatim je zatvoreno sa 1 mL rastvora za rezervoar.

3. Nakon otprilike nedelju dana, pojedinačni kristali polipeptida su postepeno rasli u kapljici, a zatim su brzo ohlađeni i skladišteni u tečnom azotu nakon što su izvučeni.

4. Prikupljeni kristali polipeptida poslati su na BL-18U1 Beamline Shanghai Synchrotron Radiation Facility radi prikupljanja podataka o difrakciji X-zraka, dok su istovremeno izvedeni analiza podataka i analiza strukture pomoću kalkulatora na linijskoj stanici.

[0059] Dobijena je trodimenzionalna struktura ljudskog tipa III kolagena visoke rezolucije u regionu od Pro488 do Gly510, koja je sadržana u novom tipu III kolagena TE16C, postupkom protein kristalografije,

Claims (9)

kao što je prikazano na Fig.7. Potvrđeno je da ovaj region formira veoma stabilnu trimer strukturu. Stoga, struktura i funkcija netaknutog kolagena mogu se očuvati bez dodatnog dodavanja C-terminalne sekvence GPPGPCCGGG. Patentni zahtevi

1. Polipeptid koji obuhvata 16 ponavljanja sekvence definisane u SEQ ID br.1, pri čemu su ta ponavljanja sekvence direktno povezana, pri čemu taj polipeptid ne obuhvata sekvencu definisanu u SEQ ID br.2.

2. Polinukleotid koji kodira polipeptid prema zahtevu 1.

3. Ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid prema zahtevu 2, i koji opciono obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira SEQ ID br.4, pri čemu je ta sekvenca nukleinske kiseline koja kodira SEQ ID br.4 direktno povezana sa 5' krajem kodirajuće sekvence nukleinske kiseline polipeptida, pri čemu taj ekspresioni vektor poželjno obuhvata sekvencu nukleinske kiseline iz SEQ ID br.5.

4. Ćelija domaćina koja obuhvata ekspresioni vektor prema zahtevu 3, pri čemu je ta ćelija domaćina poželjno Escherichia coli.

5. Postupak za proizvodnju polipeptida prema zahtevu 1, koji obuhvata:

(1) kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 4 u podlozi za proizvodnju, i proizvodnju polipeptida; (2) sakupljanje polipeptida, i opciono digestiranje polipeptida, poželjno digestiranje polipeptida sa TEV proteazom; i

(3) prečišćavanje polipeptida Ni kolonom i/ili anjonskizmenjivačkom hromatografijom;

pri čemu opciono postupak za proizvodnju ne obuhvata dodatnu fazu uklanjanja endotoksina; pri čemu prečišćeni polipeptid poželjno suštinski ne sadrži endotoksin ili sadrži manje od 5 EU/ml endotoksina.

6. Kompozicija koja obuhvata polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu je ta kompozicija poželjno medicinsko sredstvo, proizvod inženjeringa tkiva, kozmetički proizvod ili proizvod za zdravstvenu zaštitu, pri čemu je taj polipeptid poželjno u obliku vodenog rastvora polipeptida, pri čemu ta kompozicija poželjno ne sadrži komponentu koja sprečava razgradnju polipeptida, i pri čemu ta kompozicija poželjno predstavlja kompoziciju za dugoročnu upotrebu, pri čemu ta dugoročna upotreba poželjno podrazumeva upotrebu dužu od pola godine.

7. Upotreba polipeptida prema zahtevu 1 u proizvodnji kompozicije, poželjno medicinskog sredstva, proizvoda inženjeringa tkiva, kozmetičkog proizvoda, ili dodatka ishrani, pri čemu je taj polipeptid poželjno u obliku vodenog rastvora polipeptida, pri čemu poželjno ta kompozicija ne sadrži komponentu koja sprečava razgradnju polipeptida, i pri čemu ta kompozicija predstavlja kompoziciju za dugoročnu upotrebu, pri čemu ta dugoročna upotreba poželjno podrazumeva upotrebu dužu od pola godine.

8. Upotreba polipeptida prema zahtevu 1 za pospešivanje ćelijske adhezije in vitro.

9. Upotreba aminokiselinske sekvence iz SEQ ID br.4 ili ekspresionog vektora prema zahtevu 3 za proizvodnju polipeptida prema zahtevu 1.