ES2986813T3

ES2986813T3 - Composiciones que comprenden polipéptidos de fusión NKG2D, CXCR2 y DAP10/DAP12 y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2986813T3
Application number: ES22718597T
Authority: ES
Inventors: John Maher; David Marc Davies; Daniel Larcombe-Young
Original assignee: Kings College London
Current assignee: Kings College London
Priority date: 2021-03-23
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2024-11-12
Anticipated expiration: 2042-03-23
Also published as: CN117750970A; US20250152715A1; CN117750970B; CA3212856A1; EP4421180A3; WO2022200442A1; FI4171622T3; JP2024511059A; EP4421180C0; IL306003A; EP4421180A2; BR112023019385A2; EP4171622A1; MX2023011262A; EP4171622B1; CN120349973A; EP4421180B1; AU2022242009A1; KR20230159476A; DK4171622T3

Abstract

Se proporcionan células inmunorresponsivas que comprenden un polipéptido NKG2D y un polipéptido CXCR2 y, opcionalmente, un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido activador de DNAX 10 (DAP10) y un polipéptido activador de DNAX 12 (DAP12). También se proporcionan métodos para producir y utilizar dichas células inmunorresponsivas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden polipéptidos de fusión NKG2D, CXCR2 y DAP10/DAP12 y métodos de uso de los mismos

1. Antecedentes

La inmunoterapia que utiliza células T diseñadas con receptores de antígenos quiméricos (CAR) ha demostrado ser transformadora en el tratamiento de la neoplasia maligna de células B y el mieloma múltiple. Sin embargo, la aplicación de esta tecnología a la inmunoterapia de tumores sólidos se ve obstaculizada por la falta de dianas selectivas para tumores. La mayoría de los antígenos tumorales son intracelulares y, de esta manera, las células T CAR no pueden reconocerlos fácilmente. En consecuencia, la mayoría de los CAR dirigidos a tumores sólidos que se encuentran actualmente en desarrollo atacan dianas que están reguladas positivamente en las células tumorales, pero que se encuentran en niveles más bajos en los tejidos normales.

Uno de los pocos grupos diana que presenta un alto grado de selectividad tumoral son los ligandos NKG2D. En el hombre, comprenden un grupo de ocho proteínas inducidas por el estrés (MICA, MICB, ULBP1-6) que se expresan de forma aberrante en prácticamente todos los tipos de células tumorales. Además, los ligandos de NKG2 D también se encuentran en elementos estromales asociados a tumores, tales como el endotelio, las células T reguladoras y las células supresoras derivadas de mieloides (Parihar, R., et al., 2019, Cancer Immunol. Res. 7(3):363-375; Schmiedel & Mandelboim, 2018, Front. Inmunol. (9)2040). Los ratones que son genéticamente deficientes en NKG2D demuestran una inmunovigilancia deteriorada para neoplasias malignas tanto epiteliales como linfoides. La evidencia de que los ligandos NKG2D son dianas terapéuticas seguras está respaldada por el hecho de que no se encuentran en tejidos sanos. Los ensayos clínicos que utilizan CAR autólogos dirigidos a NKG2<d>no han revelado ningún problema de seguridad significativo (véase https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30396908/).

El receptor NKG2D se expresa de forma natural en las poblaciones de células asesinas naturales (NK) y en algunas poblaciones de células T Cada homodímero NKG2D se asocia con dos moléculas adaptadoras homodiméricas DAP10 mediante aminoácidos cargados complementarios dentro de la membrana plasmática. Esta interacción es necesaria para la expresión y función de NKG2D en la superficie celular. DAP10 se parece a CD28 en su capacidad de proporcionar coestimulación mediante la fosfatidilinositol 3-quinasa pero, lo que es más importante, carece de un motivo de unión p56lck que promueve el reclutamiento no deseado de células T reguladoras (Kofler, et al., 2011, Mol. Ther. 19:760-767). La potencia de la coestimulación de DAP10 se ve subrayada por su capacidad continua de enviar señales después de la internalización. Sin embargo, dado que DAP10 carece de un motivo de activación basado en tirosina (ITAM) del inmunorreceptor, la participación de NKG2D no conduce a la activación completa de las células T

Se ha desarrollado una variedad de CAR que utiliza diferentes métodos para proporcionar la señal 1 dependiente de ITAM además de la coestimulación (también conocida como señal 2), ya que ambos tipos de señales son necesarios para provocar la activación completa de las células T. El primer CAR dirigido a NKG2D fue desarrollado por Sentman et al. y consiste en una fusión de NKG2D a CD3Z (Zhang et al, 2005, Blood 106:1544-1551). Aunque nominalmente es un CAR de primera generación, se asocia con DAP10 endógeno en las células T, lo que significa que se proporcionan ambas señales 1 y 2. Este CAR está actualmente en desarrollo clínico por parte de Celyad Oncology como Cyad-01. Más recientemente, Chang et al. (2013, Cáncer Res. 73:1777-1786) diseñaron células NK para coexpresar un CAR idéntico además de DAP 10 exógeno. También se han descrito otros dos NKG2D CAR que incorporan 4-1BB (Song et al., 2013, Hum. Gene Ther.

24:295-305) o CD28 (Lehner et al., 2012, PLoS One 7:e31210) para proporcionar formas alternativas de coestimulación en lugar de la proporcionada por DAP10. Todos estos CAR han permitido la destrucción de células tumorales mediada por célula T acompañada de la producción de citocinas, mientras que el CAR descrito por Chang et al., también demostró actividad antitumoral transitoria in vivo.

Los ligandos del receptor CXCR2 incluyen quimiocinas de la familia Cisteína-X-Cisteína (CXC) que contienen un motivo ELR (Glu-Leu-Arg), a saber, Cx c L1-3 y CXCL5-8. La producción de estas quimiocinas dentro de los tumores no sólo la realizan las células malignas, sino también los elementos estromales tales como los fibroblastos y los macrófagos (Thuwajit et al., 2018, Med Res Rev. 38:1235-54; Thongchot et al, 2021, Int J Oncol. 58:14). Además, las células tumorales pueden educar a las células estromales para que produzcan estos factores, permitiendo así la progresión de la enfermedad y la resistencia a la quimioterapia citotóxica (Le Naour, 2020, J Mol Cell Biol. 12:202-15).

El miembro mejor estudiado de la familia CXC es CXCL8, también conocido como interleucina (IL)-8. Los niveles de CXCL8 circulante están elevados en pacientes con determinados cánceres, incluidos los tumores de ovario (Zhang, et al., 2019, Oncol Lett. 17:2365-9), mesotelioma maligno (Judge, et al. 2016, Ann Surg Oncol. 23:1496-500), cáncer de páncreas (Hou, et al. 2018, J Clin Med. 7:502, cáncer de mama (Milovanovic, et al. 2019, Cytokine 118:93-98; Autenshlyus, et al. 2021, 35: 20587384211034089), cáncer de esófago (Huang, et al. Cancer Biomark. 29:139-149) y cáncer de cabeza y cuello (Rezaei, et al. 2019, 39:727-739). Además de CXCL8, también se ha descrito en varios cánceres un alto nivel de producción de los ligandos de CXCR2 CXCL1, CXCL3 y CXCL5.

2. Sumario

En un primer aspecto, en el presente documento se describe una célula inmunosensible que comprende un polipéptido NKG2D, un polipéptido CXCR2 y un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de activación de DNAX 10 (DAP10) o una variante funcional del mismo y un polipéptido 12 de activación de DNAX (DAP12) o una variante funcional del mismo. En algunas realizaciones, los polipéptidos NKG2D, CXCR2, DAP10 y DAP12 son cada uno de ellos polipéptidos de mamífero. En algunas realizaciones, los polipéptidos NKG2D, CXCR2, DAP10 y DAP12 son cada uno de ellos polipéptidos humanos. En algunas realizaciones, la secuencia del polipéptido NKG2D tiene al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de Se Q iD NO: 14. En algunas realizaciones, el polipéptido NKG2D es una variante funcional del polipéptido NKG2D humano y tiene una o más mutaciones que agregan, suprimen o sustituyen al menos uno de los aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, la variante funcional del polipéptido NKG2D es una versión truncada del polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, la variante funcional es un polipéptido NKG2D quimérico. En algunas realizaciones, la variante funcional es un polipéptido NKG2D quimérico humano-murino.

En algunas realizaciones, el polipéptido DAP10 es una variante funcional de DAP10 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido DAP10 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido DAP 10 es una variante funcional de DAP 10 que tiene una o más mutaciones puntuales que agregan, suprimen o sustituyen cualquiera de los aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido DAP10 es una variante funcional de DAP 10 que es una versión truncada del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido DAP10 comprende o consiste en la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-8.

En algunas realizaciones, el polipéptido DAP12 es una variante funcional de DAP12 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido DAP12 de SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, el polipéptido DAP12 es una variante funcional de<d>A<p>12 que tiene una o más mutaciones puntuales que agregan, suprimen o sustituyen cualquiera de los aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, el polipéptido DAP12 es una variante funcional de DAP12 que es una versión truncada del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, el polipéptido DAP12 comprende o consiste en la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 9-13.

En algunas realizaciones, el polipéptido DAP10 y el polipéptido DAP12 están unidos mediante un enlazante. En algunas realizaciones, el enlazante comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 18-46.

En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende una secuencia N-terminal. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende una secuencia C-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia N-terminal o C-terminal comprende una o más de una etiqueta His, etiqueta FLAG, etiqueta Arg, etiqueta T7, etiqueta Strep, etiqueta S, una etiqueta AviTag™, una etiqueta de aptámero, una etiqueta myc, una secuencia líder CD8a, un endodominio 4-1BB, una etiqueta V5 o un endodominio CD27. En realizaciones particulares, el polipéptido de fusión comprende o consiste en la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 60-63.

En algunas realizaciones, el polipéptido CXCR2 tiene una secuencia que tiene al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 87. En realizaciones particulares, el polipéptido CXCR2 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 87.

En algunas realizaciones, la célula inmunosensible de la divulgación es una célula T o una célula asesina natural (NK). En algunas realizaciones, la célula inmunosensible es una célula T a p, una célula T y 6, una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula asesina natural (NKT), o cualquier combinación de las mismas.

En un segundo aspecto, en el presente documento se describe una célula inmunosensible que comprende un polipéptido NKG2D quimérico y un polipéptido CXCR2. En algunas realizaciones, el polipéptido NKG2D quimérico comprende un dominio extracelular de NKG2D humano o una variante del mismo y un dominio transmembrana de NKG2D murino o una variante del mismo. En realizaciones particulares, el dominio extracelular NKG2D humano tiene la secuencia expuesta de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 95-97. En algunas realizaciones, el polipéptido quimérico NKG2D comprende una variante del dominio extracelular NKG2D humano que tiene al menos un 80%de identidad de secuencia con la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 95-97. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana NKG2D murino tiene la secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 98-101. En algunas realizaciones, el polipéptido NKG2D quimérico comprende una variante del dominio transmembrana de NKG2D murino que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 98-101. En algunas realizaciones, la célula inmunosensible comprende además al menos un polipéptido DAP12 o una variante del mismo. En algunas realizaciones, la célula inmunosensible comprende además al menos un polipéptido DAP10 o una variante del mismo. En una realización preferida, la célula comprende un polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 102.

También se describe en el presente documento una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido NKG2D, un polipéptido CXCR2 y, opcionalmente, un polipéptido de activación de DNAX (DAP 10), un polipéptido de activación de DNAX (DAP12) y/o un polipéptido de fusión.

También se describe en el presente documento un método para producir una célula inmunosensible que comprende las etapas de (i) transducir una célula T o una célula asesina natural (NK) con una molécula o vector de ácido nucleico como se describe en el presente documento, y (ii) cultivar la célula T o célula asesina natural (NK) de modo que la célula transducida exprese un polipéptido NKG2D, un polipéptido CXCR2 y, opcionalmente, un polipéptido de fusión DAP10/DAP12. En realizaciones preferidas, el polipéptido NKG2D se asocia con la membrana celular.

También se describe en el presente documento un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula inmunosensible descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, las células inmunosensibles se fabrican a partir de célula T o asesinas naturales (NK) autólogos del sujeto. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de tumor sólido. En algunas realizaciones, el cáncer de tumor sólido es cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer linfoide, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de útero, cáncer de tiroides, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado o cualquier combinación de los mismos.

3. Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción y los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 es un esquema que demuestra la estructura de cada uno de los constructos que se han generado. N1012 comprende un complejo que comprende una proteína NKG2D humana exógena y homodímeros DAP10/12 exógenos fusionados según la invención. N1012 comprende SEQ ID NO: 64, que se describe en la tabla 2. 1012_10_N comprende NKG2D coexpresado con DAP 10 y una fusión etiquetada con FLAG del dominio extracelular y transmembrana de DAP 10 fusionada al endodominio DAP12. El complejo NKG2D comprende una proteína NKG2D humana exógena que interactúa con DAP 10 endógeno ya presente en la célula y se proporciona únicamente con fines comparativos.

La figura 2 muestra la expresión de NKG2D tanto en la superficie celular como intracelularmente (ICS) en células 293T tres días después de la transfección con el plásmido retroviral que expresa N1012 (que se muestra esquemáticamente en la figura 1) o NKG2D solo, haciendo una comparación con células 293T no transducidas (UT).

Las figuras 3A-3B muestran el porcentaje de transducción (Figura 3A) e intensidad de fluorescencia mediana (MFI - Figura 3B) de la expresión de NKG2D en la superficie celular en el subconjunto CD4+ de células T, tras la transducción de células T humanas no fraccionadas activadas con vectores retrovirales que codifican NKG2D solo o N1012. También se muestra la expresión y el MFI en las células T UT a modo de comparación.

La figura 4 muestra un patrón de expresión representativo de la superficie celular NKG2D dentro del subconjunto CD4+ y CD8+ de célula T activados no fraccionados transducidos para expresar N1012, NKG2D o un CAR de control que carece de NKG2D. La expresión de NKG2D dentro de las células T UT se proporciona a modo de comparación.

La figura 5 muestra la viabilidad de 11 líneas celulares tumorales diferentes después del cocultivo con N1012+, NKG2D+ o células T UT en diferentes proporciones de célula T CAR: Diana. La viabilidad de las células tumorales se evaluó después de 72 horas mediante un ensayo MTT y se expresa como un porcentaje del observado en ausencia de cocultivo de células T.

Las figuras 6A-6B muestran los niveles de citocinas (IFN-<y>(Figura 6A) e IL-2 (Figura 6B) secretados por células T N1012, NKG2D y UT durante el cocultivo con 8 líneas de células tumorales diferentes en una proporción de célula T CAR:diana de 1:1. Los sobrenadantes del cocultivo se eliminaron después de 72 horas y se evaluó la presencia de citocinas mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Las figuras 7A-7F muestran la viabilidad del PS1 estrellado tumoral y/o pancreático después del cocultivo con N1012+, NKG2D+ o células T UT en diferentes proporciones de célula T CAR: Diana. La figura 7A muestra la viabilidad de las células PS1 estrelladas pancreáticas después del cocultivo con N1012+, NKG2D+ o células T UT en diferentes proporciones de célula T CAR: Diana. Cuando se agrega en una proporción de célula T CAR:diana de 1:1, las células T N1012+también demuestran una potente lisis de monocapas que consisten en células PS1 y BxPC3 cultivadas juntas en una proporción de 1:1 (Figura 7B). Esto contrasta con la falta de eficacia observada tras la adición de NKG2D+ o células T UT En ambos casos, la viabilidad de las células diana se evaluó después de 48 horas mediante el ensayo MTT y se expresa como un porcentaje de la observada en ausencia de cocultivo de célula T. La viabilidad de las monocapas de células tumorales y de células estromales después del cocultivo con N1012+, NKG2D+ o células T UT en una proporción de célula T CAR: Diana de 1:1 se muestra en la figura 7C (BxPC3_LT PS1) y la figura 7D (PaTU PS1). Mientras que con las células T N1012+ se observó una potente lisis de células tumorales y estromales, se observó una reducción mínima en la viabilidad de las células diana cuando se cocultivaron ya sea con célula T NKG2D o UT (Figura 7C-7D). La viabilidad de las células tumorales solas después del cocultivo con N1012+, NKG2D+ o células T UT en una proporción de célula T CAR: Diana de 1:1 se muestra en la figura 7C (BxPC3 _LT) y la figura 7D (PaTU_GFP). La viabilidad de las monocapas de células tumorales y de células estromales después del cocultivo con N1012+, A2028z+, NKG2D+ o células T UT en una proporción de célula T CAR: Diana de 1:1 se muestra en las figuras 7E y la figura 7F (después de hasta 5 reestimulaciones). La viabilidad de las células tumorales solas después del cocultivo con N1012+, A2028z+, NKG2D+ o células T UT en una proporción de célula T CAR: Diana de 1:1 también se muestra en la figura 7E (BxPC3_LT). A2028z es un CAR dirigido contra la integrina avp6 que mata las células tumorales, pero no las células estromales PS1 (Whilding, et al, 2017, Mol Ther. 25:2427). Las figuras 7G y 7H muestran el nivel de IFN-y secretado por N1012+, A2028z+, NKG2D+ y células T UT durante los cocultivos descritos anteriormente. El nivel de IFN-<y>secretado por el tumor solo se determinó como control negativo. Las figuras 7I y 7J muestran la viabilidad de esferoides tumorales en los que se mezclaron células tumorales PaTU que expresan GFP con células PS1 que expresan mCherry (proporción 1:1 durante 3 u 8 días respectivamente) después del cocultivo con N1012+, NKG2D+ o célula T UT.n.d. - no detectado. La figura 7K muestra los niveles de IFN-y secretados después de 72 horas por N1012+, células T UT y tumores solos durante los cocultivos con esferoides tumorales.

Las figuras 8A-8D muestran la capacidad de las células T que expresan N1012 para someterse a múltiples rondas de estimulación repetida ("reestimulación"), en comparación con las células T UT o aquellas que expresan NKG2D solo. Las células T que expresan N1012 median en la lisis de las células Ju77 del mesotelioma Ju77 y de las células del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) HN3_LUC mediante múltiples ciclos de estimulación (Figura 8A). El número total de ciclos de reestimulación exitosos cuando se cocultivan con células de mesotelioma (Ju77, Ren), HNSCC (HN3_LUC) o cáncer de páncreas (BxPC3 _LT) se muestra en la figura 8B. La proliferación de células T tras la estimulación repetida por células tumorales Ju77 o HN3 _LUC se muestra en la figura 8C. El nivel de cambio de la expansión máxima de las células T en comparación con el día 1 de cultivo con células tumorales Ju77, Ren o h N3 _LUC se muestra en la figura 8D. Por el contrario, las células T UT o aquellos que expresan NKG2D solo demuestran una lisis o proliferación mínima de las células diana.

Las figuras 9A-9B muestran la ingeniería por transducción retroviral de células T CAR para evaluaciónin vivoen ratones portadores de tumores. La figura 9A muestra la expresión en la superficie celular de NKG2D en células T<c>D4+ y CD8+ después de la transducción con N1012 o NKG2D. La comparación se realizó con células T del mismo donante que expresan pan-ErbB dirigido a CAR, T4, como se describe por Davies et al., 2012, Mol. Med. 18:565-576. También se utilizó un segundo CAR dirigido a pan-ErbB, denominado TMY, que carece del dominio 4ap contenido en T4 y también tiene una bisagra CD28 ligeramente alterada (en la que la secuencia MYPPPY se reemplaza con la secuencia de la etiqueta myc lineal de 10 aminoácidos). La figura 9B muestra la función citotóxicain vitrode las células T residuales contra las líneas celulares tumorales indicadas después de la transferencia adoptiva a ratones.

Las figuras 10A-10E muestran el crecimiento intraperitoneal (i.p.) de células BxPC3 etiquetadas con ffLUCin vivoen ratones NSG, según lo determinado mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI) antes y después del tratamiento i.p. con 10 * 106 de las células T CAR indicadas. En el caso de N1012, también se utilizó esta dosis (denominada "hi") o se administró una dosis más baja ("lo" - 4 * 106 células). La emisión de BLI agrupada de cada grupo de ratones se muestra en la figura 10A. La emisión de bioluminiscencia en serie de ratones individuales se muestra en la figura 10B. El peso de los ratones se muestra en la figura 10C. La emisión de bioluminiscencia en serie de ratones individuales después de una nueva exposición al tumor i.p. ffLUC BxPC3 el día 88 se muestra en la figura 10D. En la figura 10E se muestra una curva de supervivencia del experimento, que finalizó después de 145 días.

Las figuras 11A-11B muestran los resultados de otro experimento que demuestra el crecimiento i.p. de células BxPC3 etiquetadas con ffLUCin vivoen ratones NSG antes y después del tratamiento con las células T indicadas o PBS, según lo determinado mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI). El flujo total promedio de BLI (fotones/segundo) por grupo de tratamiento se muestra en la figura 11A, y el flujo total de BLI (fotones/segundo) por ratón individual se muestra en la figura 11B. Los ratones que estaban libres de tumores el día 41 (29 días después de la infusión de célula T) fueron reexpuestos i.p. (mostrado como una línea de puntos) con células BxPC3 etiquetadas con ffLUC.

Las figuras 12A-12B muestran el crecimiento i.p. de células de mesotelioma maligno H226 etiquetadas con ffLUCin vivoen ratones NSG antes y después del tratamiento con las células T indicadas o PBS, según lo determinado mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI). El flujo total promedio de BLI (fotones/segundo) por grupo de tratamiento se muestra en la figura 12A, y el flujo total de BLI (fotones/segundo) por ratón individual se muestra en la figura 12B. Para confirmar la persistencia de las células T y el mantenimiento de la función, todos los ratones libres de tumores fueron inoculados i.p. con 1x106 células H226 etiquetadas con ffLUC adicionales, 91 días después de la inoculación inicial del tumor. El momento de la nueva exposición al tumor se muestra como una segunda línea de puntos en el gráfico N1012.

La figura 13 muestra el porcentaje de transducción (panel izquierdo) y la intensidad de fluorescencia media (MFI) (panel derecho) de la expresión en la superficie celular de NKG2D, N1012 y una réplica del Cyad-01 CAR cuando se expresa en células T CD4+.

Las figuras 14A-14B comparan la reestimulación (Figura 14A) y el nivel de cambio de expansión máxima (Figura 14B) de células T N1012+ a células T NKG2D o aquellos que expresan una réplica Cyad-01, cuando se cocultivan con células BxPC3-LT (Figura 14A), Ren o Ju77 (Figura 14<b>).

La figura 15A muestra la viabilidad de los esferoides tumorales después del cocultivo con N1012, una réplica Cyad-01 o células T no transducidas durante 3 u 8 días. Los esferoides tumorales consistían en células tumorales PaTU que expresaban GFP y células PS1 que expresaban mCherry cocultivadas en una proporción de 1:1 durante 3 días antes de la adición de célula T. El número de células T agregadas reflejó una proporción final de célula T:GFP PaTU:mCherry PS1 de 2:1:1. La figura 15B muestra el nivel de proliferación de las células T durante los cocultivos con esferoides tumorales.

Las figuras 16A-16C son esquemas de los constructos CAR N1012, N1012_CXCR2 y NKG2D (Figura 16A) y CYAD-01_10 (Figura 16B). En CYAD-01_10, se coexpresó una réplica Cyad-01 con dA p 10 adicional. La figura 16C muestra el porcentaje de transducción (panel izquierdo) y la intensidad de fluorescencia media (MFI) (panel derecho) de la expresión de NKG2D en la superficie celular en el subconjunto CD4+ de células T después de la transducción de células T humanas no fraccionadas activadas con vectores retrovirales que codifican N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01_10, réplica CYAD-01 o NKG2D. Los resultados de las células T no transducidas se muestran a modo de comparación.

La figura 17 muestra la viabilidad de dos líneas celulares de cáncer de ovario, Kuramochi_LT (izquierda) y Ovsaho_LT (derecha) después del cocultivo con N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01_10 y células T no transducidas en diferentes proporciones de célula T CAR: diana. Se muestran datos de dos donantes independientes. La viabilidad de las células tumorales se evaluó mediante ensayo MTT después de 72 horas y se expresa como porcentaje de células viables cultivadas en ausencia de células T.

La figura 18 muestra la capacidad mejorada de las células T N1012 y N1012_CXCR2 para persistir y proliferar después de rondas repetidas de estimulación, en comparación con una réplica de las células T CYAD-01 o CYAD-01_10.

Las figuras 19A-19B son gráficos de citometría de flujo que muestran el cambio casi completo en las células T N1012 y N1012_CXCR2 de una población CD4+ a CD8+ después de 16 ciclos de reestimulación (Figura 19A) y 23 ciclos de reestimulación (Figura 19B) en monocapas de células tumorales de Ren.

La figura 20 muestra los resultados de la citometría de flujo de células T N1012 evaluados para determinar la expresión de CD45RO, CD62L y CD27 después de 28 rondas de estimulación en monocapas de células tumorales Ren.

La figura 21 muestra los resultados de las células T N1012 evaluados para determinar la expresión de CD45RO y CD62L después de 31, 32 y 33 rondas de estimulación en monocapas de células tumorales Ren.

La figura 22 muestra gráficos de avidez de las células T CAR indicadas para células Lo68_CD19 (panel izquierdo) y células SKOV-3 (panel derecho) tras la aplicación de una rampa de fuerza acústica.

Las figuras 23A-23B muestran los niveles de citocinas IFN-y (Figura 23A) e IL-2 (Figura 23B) secretadas por N1012, N1012_CXCR2, réplica CYAD-01 y células T no transducidas cuando se cocultivan con cuatro líneas de células tumorales diferentes. Los sobrenadantes se eliminaron de las células cocultivadas y se evaluó la presencia de citocinas mediante ELISA.

La figura 24 muestra que la expansión de las células T N1012 y N1012_CXCR2 no estimuladas durante 12 días excede la expansión de las células T NKG2D y no transducidas, mientras que las réplicas de CYAD-01 y las células T CYAD-01_10 demuestran una expansión sustancialmente peor en comparación con las células T de control.

La figura 25 muestra la emisión de bioluminiscencia de xenoinjertos de tumores de Ovsaho que expresan luciferasa de luciérnaga (ffLuc) en ratones tratados con PBS o células T CAR (N1012, N1012_<c>X<c>R2, réplica CYAD-01 o no transducidas). Se administraron células T i.p. el día 6 y por vía intravenosa (i.v.) el día 7 después de la inoculación del tumor (indicada por líneas de puntos verticales). El desarrollo del tumor se mide como flujo total (fotones/s).

La figura 26 muestra resultados de imágenes de bioluminiscencia que demuestran actividad antitumoral en ratones que contienen xenoinjerto ffLuc Ovsaho tratados con células T N1012 y N1012_CXCR2 (paneles izquierdo y central) y un tráfico mejorado de células T N1012_CXCR2 a sitios de tumores en comparación con células T N1012 (panel derecho). El desarrollo del tumor se mide mediante la expresión de luciferasa de luciérnaga como flujo total (fotones/s). El tráfico de células T se controla mediante la expresión de luciferasa de renilla, cuantificada una vez más como flujo total (fotones/s).

La figura 27 muestra el desarrollo de xenoinjertos tumorales SKOV-3 que expresan ffLuc en ratones tratados con PBS o células T CAR (N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01_10 o constructo NKG2D de control) 7 días después de la inoculación del tumor. El desarrollo del tumor se mide mediante la expresión de luciferasa de luciérnaga como flujo total (fotones/s).

La figura 28 muestra los resultados de las evaluaciones del crecimiento tumoral (panel izquierdo) y del tráfico de célula T (panel derecho) en ratones que contienen xenoinjerto SKOV-3 tratados con células T CAR (N1012, N1012_CXCR2 o control informador "Luciferasa de Renilla").

La figura 29 muestra los resultados de las imágenes de bioluminiscencia de las células T CAR que expresan la luciferasa de renilla indicadas después de la administración i.v. a ratones NSG con un xenoinjerto de tumor SKOV-3 vía i.p.. Se muestran imágenes de células T que expresan rLuc N1012, rLuc N1012_CXCR2 o rLuc solo en diversos momentos.

La figura 30 muestra desarrollo de xenoinjertos de tumor pancreático CFPac-1 subcutáneos (s.c.) en ratones después de la administración de PBS o células T CAR (N1012_CXCR2, réplica CYAD-01, N1012 o NKG2D).

La figura 31 muestra imágenes de inmunohistoquímica CD3 de tumores CFPac-1 s.c. que demuestran una mejor infiltración de células T N1012_CXCR2 en comparación con las células T N1012 o NKG2D.

La figura 32 muestra el desarrollo a lo largo del tiempo de xenoinjertos de tumor pancreático CFPac-1 s.c. en ratones tratados 28 días después de la inoculación del tumor con PBS, dosis alta (10*106) células T CAR (N1012, N1012_CXCR2, réplica CYAD-01 o no transducidas) o dosis baja (4*106) células T CAR (N1012 o N1012_CXCR2).

La figura 33 muestra el desarrollo de xenoinjertos de tumor pancreático BxPC3 s.c. en ratones después de la administración de PBS o 10 * 106 células T C<a r>(réplica C<y>A<d>-01, N1012, N1012_CXCR2 o no transducidas) 14 días después de la inoculación del tumor.

La figura 34 es una curva de supervivencia de ratones que contienen xenoinjerto tumoral BxPC3 s.c., tratados con PBS o 10 * 106 células T CAR (réplica CYAD-01, N1012, N1012_CXCR2 o no transducidas).

La figura 35 muestra el desarrollo de un tumor de xenoinjerto derivado de un paciente con mesotelioma s.c. en ratones (PDX PD_008) después de la administración de PBS o 10 * 106 células T CAR (N1012_CXCR2, N1012, CYAD-01_10 o no transducidas) 111 días después del injerto tumoral.

La figura 36 muestra los resultados de imágenes de bioluminiscencia de célula T CAR que expresan ffLuc/dsTomato (LT) después de la administración a ratones NSG que contienen tumores de xenoinjerto derivados de pacientes con mesotelioma. Los ratones fueron tratados con 10 * 106 células T CAR (N1012_LT, N1012_CXCR2_LT o LT) en diversos momentos después de la administración de células T.

La figura 37 muestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones NSG con tumores SKOV-3 i.p. que se trataron i.p. con PBS o 10 * 106 células TCAR(N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01_10 o control NKG2D) 7 días después de la inoculación del tumor.

La figura 38 muestra el desarrollo de xenoinjertos tumorales ffLuc Ovsaho i.p. en ratones NSG tratados con PBS o células T CAR (N1012, N1012_C<x>C<r>2, réplica CYAD-01 o no transducidas). 5*106 células T se administraron i.p. el día 6 después de la inoculación del tumor y una dosis adicional de 5 * 106 células T se administraron por vía intravenosa al día siguiente. Los ratones se volvieron a exponer a células ffLuc Ovsaho 56 días después de la inoculación inicial del tumor.

La figura 39 muestra el desarrollo de xenoinjertos de tumor ffLuc Kuramochi i.p. en ratones NSG tratados con PBS o células T CAR (N1012, N1012_CX<c>R2 o no transducidas). 5*106 células T se administraron i.p. el día 17 después de la inoculación del tumor y una dosis adicional de 5 * 106 células T se administraron i.v. al día siguiente. Los ratones libres de tumores se volvieron a exponer a células ffLuc Kuramochi 86 días después de la inoculación inicial del tumor.

La figura 40 es una curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones portadores de tumores ffLuc Kuramochi i.p. que fueron tratados con PBS o células T CAR (N1012, N1012_c Xc R2 o no transducidas) 17 y 18 días después de la inoculación del tumor, como se describe en la figura 39.

La figura 41 muestra el desarrollo de xenoinjertos de tumor i.p. ffLuc Kuramochi en ratones NSG tratados con PBS o células T CAR (N1012, N1012_CX<c>R2 o no transducidas). 5*106 células T se administraron i.p. el día 17 después de la inoculación del tumor y una dosis adicional de 5 * 106 células T se administraron i.v. al día siguiente. Los ratones libres de tumores se volvieron a exponer a células ffLuc Kuramochi 86 días después de la inoculación inicial del tumor.

La figura 42 muestra los resultados de imágenes de bioluminiscencia de ratones NSG que contienen xenoinjerto de tumor de Kuramochi tratados con células T CAR etiquetadas con rLuc (N1012_rLuc, N1012_CXCR2_rLuc). La infiltración de células T se evaluó durante 4 días mediante imágenes de bioluminiscencia después de la administración de coelenterazina.

La figura 43 es una curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones NSG con tumores de Kuramochi que fueron tratados con PBS o células T CAR (N1012, N1012_CXCR2, réplica Cyad-01 o células T no transducidas). 5*106 células T se administraron i.p. el día 17 después de la inoculación del tumor y una dosis adicional de 5 * 106 células T se administraron i.v. al día siguiente.

La figura 44 muestra los volúmenes tumorales evaluados mediante mediciones con calibrador en ratones NSG individuales con un xenoinjerto derivado de un paciente con mesotelioma S.C. después de la administración i.v. de PBS o 10 * 106 células T CAR (N1012_CXCR2, N1012, CYAD-01_10 o células T no transducidas) 111 días después del injerto tumoral.

La figura 45 es una curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones NSG con un xenoinjerto derivado de un paciente con mesotelioma S.C. que fueron tratados i.v. con PBS o 10 * 106 células T CAR (N1012_CXCR2, N1012, CYAD-01_10 o células T no transducidas) 111 días después del injerto tumoral.

4. Descripción detallada

4.1. Definiciones

Los términos utilizados en las reivindicaciones y la memoria descriptiva se definen como se establece a continuación, a menos que se especifique lo contrario.

El término "mamífero", como se utiliza en el presente documento, incluye tanto humanos como no humanos e incluye, pero no se limita a, humanos, primates no humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos y porcinos.

El término "murino" se refiere a un roedor de la subfamilia Murinae. El término "murino" comprende rata y ratón.

El término "polipéptido NKG2D quimérico" se refiere a un receptor NKG2D formado por dominios de dos o más organismos diferentes. Los polipéptidos quiméricos NKG2D se describen con más detalle en el documento WO 2021/234163.

El término porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje específico de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para obtener la máxima correspondencia, medida usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias descritos a continuación (por ejemplo, BLASTP y BLASTN u otros algoritmos disponibles para personas con experiencia) o mediante inspección visual. Dependiendo de la aplicación, el porcentaje de "identidad" puede existir en una región de la secuencia que se está comparando, por ejemplo, en un dominio funcional o, alternativamente, existir en toda la longitud de las dos secuencias que se van a comparar.

Para la comparación de secuencias, por lo general una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se ingresan en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Luego, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados.

Para los fines del presente documento, el porcentaje de identidad y similitud de secuencia se realiza utilizando el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere ampliamente a cualquier animal, incluidos, pero no limitados a, animales humanos y no humanos (por ejemplo, perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, aves de corral, peces, crustáceos, etc.).

Como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una composición (por ejemplo, un péptido sintético) suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones y no pretende limitarse a una formulación o vía de administración particular.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad que es eficaz para mejorar un síntoma de una enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una "cantidad profilácticamente eficaz", ya que la profilaxis puede considerarse terapia.

Como se utilizan en el presente documento, los términos "administración" y "administrar" se refieren al acto de administrar un fármaco, profármaco u otro agente, o tratamiento terapéutico (por ejemplo, péptido) a un sujeto o célulasin vivo, in vitro,oex-vivo,tejidos y órganos. Las vías de administración de ejemplo al cuerpo humano pueden ser a través del espacio debajo de la membrana aracnoidea del cerebro o de la médula espinal (intratecal), los ojos (oftálmica), la boca (oral), la piel (tópica o transdérmica), la nariz (nasal), los pulmones. (inhalante), mucosa oral (bucal o lingual), de oído, rectal, vaginal, mediante inyección (por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, intratumoral, intraperitoneal, etc.) y similares.

Como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento" significa un enfoque para obtener un resultado clínico beneficioso o previsto. El resultado clínico beneficioso o previsto puede incluir el alivio de los síntomas, una reducción de la gravedad de la enfermedad, la inhibición de una causa subyacente de una enfermedad o afección, la estabilización de enfermedades en un estado no avanzado, el retraso del progreso de una enfermedad y/o mejora o alivio de las condiciones de la enfermedad.

Como se utiliza en el presente documento, el término "composición farmacéutica" se refiere a la combinación de un ingrediente activo con un portador, inerte o activo, haciendo que la composición sea especialmente adecuada para su uso terapéutico o de diagnósticoin vitro, in vivooex-vivo.

Los términos "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable", como se usan en el presente documento, se refieren a composiciones que no producen sustancialmente reacciones adversas, por ejemplo, reacciones tóxicas, alérgicas o inmunológicas, cuando se administran a un sujeto.

Como se utilizan en el presente documento, las palabras "comprende" y "contiene" y variaciones de las palabras, por ejemplo, "que comprende" y "comprende", significan "incluido, pero no limitado a", y no excluyen otros componentes, números enteros o etapas. Además, el singular abarca el plural a menos que el contexto requiera lo contrario: en particular, cuando se utiliza el artículo indefinido, debe entenderse que la memoria descriptiva contempla tanto la pluralidad como la singularidad, a menos que el contexto requiera lo contrario.

Debe observarse que, como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

4.2. Células inmunosensibles que comprenden NKG2D, CXCR2 y, opcionalmente, polipéptidos de fusión DAP10, DAP12 o DAP10/DAP12.

Las células inmunosensibles de la divulgación comprenden un polipéptido NKG2D, un polipéptido CXCR2 y, opcionalmente, un polipéptido de la proteína de activación de DNAX 10 (DAP10) o una variante funcional del mismo, un polipéptido de la proteína de activación de DNAX 12 (DAP12) o una variante funcional del mismo, y/ o un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido DAP10 o una variante funcional del mismo y un polipéptido DAP12 o una variante funcional del mismo.

4.2.1. Polipéptidos DAP10 y variantes funcionales de los mismos.

El polipéptido DAP10 puede expresarse endógenamente en determinados organismos y determinados tipos de células. En una realización, el polipéptido DAP10 o variante del mismo es endógeno. Alternativamente, el polipéptido DAP10 o variante del mismo puede ser exógeno.

El polipéptido DAP10 de la divulgación puede ser de mamífero, por ejemplo humano. El DAP10 humano de tipo salvaje está codificado por la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de UniProt: Q9UBK5 (SEQ ID NO: 1). Este es un polipéptido de 93 aminoácidos. Los primeros 18 aminoácidos se consideran una secuencia señal/líder, los aminoácidos 19-48 el dominio extracelular, los aminoácidos 49-69 el dominio transmembrana y los aminoácidos 70-93 el dominio citoplasmático/intracelular.

En una realización, un polipéptido DAP10 utilizado en el polipéptido de fusión de la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido DAP10 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un polipéptido DAP10 utilizado en el polipéptido de fusión de la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

En otra realización, una variante funcional del polipéptido DAP10 utilizado en el polipéptido de fusión de la divulgación puede comprender una o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) mutaciones puntuales que agregan, suprimen o sustituyen cualquiera de los aminoácidos de DAP 10 (tal como el de DAP 10 humano de tipo salvaje (S<e>Q ID NO: 1)).

También se pueden utilizar versiones truncadas de un polipéptido DAP10 en polipéptidos de fusión de la divulgación. Por ejemplo, una versión truncada de DAP10 que comprende solo los aminoácidos 19-93 de SEQ ID NO: 1 (es decir, que carece de los aminoácidos 1-18, la secuencia señal/líder) se puede utilizar en el polipéptido de fusión de la divulgación. Dicha secuencia se denomina SEQ ID NO: 2 en el presente documento. Otras versiones truncadas pueden comprender los aminoácidos 19-69 de SEQ ID NO: 1, dicha secuencia comprende simplemente los dominios extracelular y transmembrana de DAP10, y se hace referencia en el presente documento como SEQ ID NO: 3. Otra versión truncada de DAP10 utilizada en la invención puede comprender los aminoácidos 1-71 de SEQ ID NO: 1 (es decir, la secuencia señal/líder, el dominio extracelular, el dominio transmembrana y 2 aminoácidos del dominio citoplasmático/intracelular), denominada SEQ ID NO: 4 en el presente documento. Otra versión truncada de DAP10 utilizada en la invención puede comprender los aminoácidos 19-71 de SEQ ID NO: 1 (es decir, el dominio extracelular, el dominio transmembrana y 2 aminoácidos del dominio citoplasmático/intracelular), denominado SEQ ID NO: 5 en el presente documento. Otra versión truncada de DAP10 utilizada en la invención puede comprender los aminoácidos 70-93 de SEQ ID NO: 1 (es decir, el dominio intracelular), denominado SEQ ID NO: 6 en el presente documento. Aún otra versión truncada de DAP10 utilizada en la invención puede comprender los aminoácidos 49-93 de SEQ ID NO: 1 (es decir, los dominios transmembrana y citoplasmático/intracelular), denominado SEQ ID NO: 7 en el presente documento. Aún otra versión truncada de DAP10 utilizada en la invención puede comprender los aminoácidos 49-69 de SEQ ID NO: 1 (es decir, el dominio transmembrana), denominado SEQ ID NO: 8 en el presente documento.

Otras versiones mutadas o versiones truncadas del polipéptido DAP10 también son adecuadas para su uso en la divulgación. En algunas realizaciones, las versiones mutadas o las versiones truncadas que se usan como variantes funcionales de los polipéptidos DAP10 en la divulgación conservan la actividad del polipéptido de tipo salvaje que se muestra en la s Eq ID NO: 1.

En una realización, una variante funcional de un polipéptido DAP10 de la divulgación retiene al menos el 10 % (por ejemplo, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, 98 %, 99 % o más) de la actividad del polipéptido de tipo salvaje mostrado en la SEQ ID NO: 1. En una realización, la actividad se puede medir mediante la evaluación de la fosforilación de tirosina de DAP10 y/o el reclutamiento y activación de la subunidad p85 de la fosfatidilinositol 3-quinasa y la quinasa antiapoptótica aguas abajo, AKT.

Como apreciará el experto, DAP10 por lo general existe como un homodímero. De esta manera, en una realización, la célula inmunosensible comprende un homodímero de DAP10 que comprende dos polipéptidos de DAP10 según la divulgación. En una realización, la célula inmunosensible comprende un heterodímero DAP10, comprendiendo cada péptido del heterodímero DAP10 un polipéptido DAP10 diferente de la divulgación.

4.2.2. Polipéptidos DAP12 y variantes funcionales de los mismos.

El polipéptido DAP12 puede expresarse endógenamente en determinados organismos y determinados tipos de células. En una realización, el polipéptido DAP12 o variante del mismo es endógeno. Alternativamente, el polipéptido DAP12 o variante del mismo puede ser exógeno.

El polipéptido DAP12 de la divulgación puede ser de mamífero, por ejemplo humano. El DAP12 humano de tipo salvaje está codificado por la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de UniProt: 043914 (SEQ ID NO: 9). Los primeros 21 aminoácidos se consideran una secuencia señal/líder, los aminoácidos 22 40 el dominio extracelular, los aminoácidos 41-61 el dominio transmembrana y los aminoácidos 62-113 el dominio citoplasmático/intracelular.

En una realización, un polipéptido DAP12 utilizado en el polipéptido de fusión de la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido DAP12 de SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, un polipéptido DAP12 utilizado en el polipéptido de fusión de la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

En otra realización, una variante funcional del polipéptido DAP12 utilizado en el polipéptido de fusión de la divulgación puede comprender una o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) mutaciones puntuales que agregan, suprimen o sustituyen cualquiera de los aminoácidos de DAP12 (tal como el de DAP12 humano de tipo salvaje (S<e>Q ID NO: 9)).

También se pueden utilizar versiones truncadas de un polipéptido DAP12 en polipéptidos de fusión de la divulgación. Por ejemplo, una versión truncada de DAP12 que comprende solo los aminoácidos 22-113 de SEQ ID NO: 9 (es decir, que carece de los aminoácidos 1-21, la secuencia señal/líder) se puede utilizar en el polipéptido de fusión de la divulgación. Dicha secuencia se denomina SEQ ID NO: 10 en el presente documento. Otras versiones truncadas pueden comprender los aminoácidos 62-113 de SEQ ID NO: 9, dicha secuencia comprende simplemente el dominio citoplasmático/intracelular de DAP12, y se hace referencia en el presente documento como SEQ ID NO: 11. Otras versiones truncadas pueden comprender los aminoácidos 41-61 de SEQ ID NO: 9 (es decir, el dominio transmembrana), denominado SEQ ID NO: 12 en el presente documento. Otra versión truncada puede comprender los aminoácidos 22-61 de SEQ ID NO: 9 (es decir, los dominios extracelular y transmembrana), denominado SEQ ID NO: 13 en el presente documento.

Otras versiones mutadas o versiones truncadas del polipéptido DAP12 también son adecuadas para su uso en la divulgación. En algunas realizaciones, las versiones mutadas o las versiones truncadas que se usan como variantes funcionales de los polipéptidos DAP12 en la divulgación conservan la actividad del polipéptido de tipo salvaje que se muestra en la SEQ ID NO: 9.

En una realización, una variante funcional de un polipéptido DAP12 de la divulgación retiene al menos el 10 % (por ejemplo, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) de la actividad del polipéptido de tipo salvaje mostrado en la SEQ ID NO: 9. En una realización, la actividad se puede medir usando ensayos funcionales, tales como MTT y midiendo la secreción de citocinas mediante ELISA.

El experto apreciará que DAP12 por lo general existe como un homodímero. De esta manera, en una realización, la célula inmunosensible comprende un homodímero de DAP12 que comprende dos polipéptidos de DAP12 según la divulgación. En una realización, la célula inmunosensible comprende un heterodímero DAP12, comprendiendo cada péptido del heterodímero DAP12 un polipéptido DAP12 diferente de la divulgación.

4.2.3. Polipéptidos que se asocian con polipéptidos de fusión DAP10/DAP12

El polipéptido de fusión de la invención puede asociarse con otros polipéptidos. Tal asociación puede deberse a fuerzas electrostáticas, tales como las proporcionadas por aminoácidos con carga complementaria.

Un ejemplo de dicho polipéptido que puede asociarse con un polipéptido de fusión de la invención es el polipéptido NKG2D (Wu et al., 2000, J. Exp. Med., 192(7):1059-1067 y Rosen et al., 2004, J. Immunol., 173(4):2470-2478).

En una realización, tales polipéptidos pueden codificarse genéticamente como parte de un constructo quimérico contigua con el gen que codifica el polipéptido de fusión de la divulgación. El polipéptido de fusión y otro polipéptido pueden luego separarse durante la traducción (por ejemplo, usando un péptido omitido ribosómico) o mediante escisión posterior a la traducción (por ejemplo, usando un sitio de escisión con furina). Por lo tanto, el polipéptido de fusión y otro polipéptido pueden unirse mediante un enlazante opcional. Dicho enlazante puede comprender un sitio de escisión para facilitar la escisión.

4.2.3.1. Polipéptidos NKG2D y variantes funcionales de los mismos.

El polipéptido NKG2D de la divulgación puede ser de mamífero, por ejemplo humano. El NKG2D humano de tipo salvaje está codificado por la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de UniProt: P26718 (SEQ ID NO: 14). Se considera que el polipéptido comprende un dominio citoplasmático (aminoácidos 1-51), un dominio transmembrana (aminoácidos 52-72) y un dominio extracelular (aminoácidos 73-216).

En una realización, un polipéptido NKG2D utilizado en la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido NKG2d de SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, un polipéptido NKG2D utilizado en la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En otra realización, una variante funcional del polipéptido NKG2D utilizado en la divulgación puede comprender una o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) mutaciones puntuales que agregan, suprimen o sustituyen cualquiera de los aminoácidos de los aminoácidos de NKG2D (tal como el de NKG2D humano de tipo salvaje (SEQ ID NO: 14)).

También se pueden utilizar versiones truncadas de un polipéptido NKG2D en los polipéptidos de la divulgación. Por ejemplo, una versión truncada de NKG2D que comprende solo los aminoácidos 73-216 de SEQ ID NO: 14 (es decir, el dominio extracelular) puede utilizarse en la divulgación. Dicha secuencia se denomina SEQ ID NO: 15 en el presente documento. Otras versiones truncadas pueden comprender los aminoácidos 82-216 de SEQ ID NO: 14, dicha secuencia comprende parte del dominio extracelular de NKG2D y se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 16. Otra versión truncada comprende los aminoácidos 52-216 de SEQ ID NO: 14 (es decir, los dominios transmembrana y extracelular), denominado SEQ ID NO: 17 en el presente documento.

Otras versiones mutadas o versiones truncadas del polipéptido NKG2D también son adecuadas para su uso en la divulgación. Por supuesto, cualquiera de tales versiones mutadas o versiones truncadas que se utilicen como variantes funcionales de polipéptidos NKG2D en la divulgación deberían conservar preferiblemente la actividad del polipéptido de tipo salvaje mostrado en la SEQ ID NO: 14.

En una realización, una variante funcional de un polipéptido NKG2D de la divulgación retiene al menos el 10 % (por ejemplo, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) de la actividad del polipéptido de tipo salvaje mostrado en la SEQ ID NO: 14. En una realización, la actividad se puede medir usando citometría de flujo para confirmar la unión continua a ligandos de NKG2D y mediante diversos ensayos de cultivo celular (tales como MTT y ELISA) destinados a confirmar la lisis de las células diana, la secreción de citocinas y la coestimulación.

En algunas realizaciones, el polipéptido NKG2D es un polipéptido quimérico. En realizaciones particulares, el polipéptido NKG2D es un polipéptido quimérico humano-murino. En una realización, el polipéptido NKG2D quimérico comprende desde el extremo N al extremo C el dominio transmembrana de NKG2D murino o una variante del mismo y un dominio extracelular de NKG2D humano o una variante del mismo. Los polipéptidos quiméricos NKG2D se describen con más detalle en el documento WO 2021/234163, cuya divulgación se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.

4.2.3.2. Polipéptidos CXCR2 y variantes funcionales de los mismos.

El polipéptido CXCR2 de la presente divulgación puede ser de mamífero, por ejemplo humano. El CXCR2 humano de tipo salvaje está codificado por la secuencia de aminoácidos que tiene el número de acceso de UniProt: P25025 (SEQ ID NO: 87).

En una realización, el polipéptido CXCR2 de la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido CXCR2 de SEQ ID NO: 87. En una realización, el polipéptido CXCR2 de la divulgación tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87.

En una realización, el polipéptido CXCR2 de la divulgación es una variante funcional del polipéptido CXCR2 de SEQ ID NO: 87. En una realización, una variante funcional del polipéptido CXCR2 comprende una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) mutaciones puntuales que agregan, suprimen o sustituyen aminoácidos de CXCR2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 87).

En una realización, una variante funcional del polipéptido CXCR2 de la divulgación retiene al menos el 10 % (por ejemplo, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) de la actividad del CXCR2 humano de tipo salvaje (SEQ ID NO: 87). En una realización, la actividad del polipéptido se mide usando citometría de flujo para confirmar la unión de CXCR2 al ligando (por ejemplo, IL-8). En una realización, la actividad del polipéptido se mide mediante ensayos de cultivo celular conocidos en la técnica.

4.2.4. Enlazantes

Las unidades estructurales DAP10 y DAP12 de los polipéptidos de fusión DAP10/DAP12 descritos en el presente documento pueden unirse directamente entre sí en una cadena polipeptídica contigua, o pueden unirse indirectamente entre sí mediante un enlazante adecuado. El enlazante puede ser un enlazante peptídico. Los enlazantes peptídicos se utilizan habitualmente en polipéptidos de fusión y los métodos para seleccionar o diseñar enlazantes son bien conocidos. (Véase, por ejemplo, Chen X et al., 2013, Adv. Drug Deliv. Rev.

65(10):135701369 y Wriggers W et al., 2005, Biopolymers 80:736-746). También se pueden utilizar enlazantes para unir el polipéptido de fusión de la divulgación a otro polipéptido (tal como un polipéptido NKG2D) en un constructo quimérico como se describió anteriormente.

Los enlazantes peptídicos generalmente se clasifican como i) enlazantes flexibles, ii) enlazantes que forman hélices y iii) enlazantes escindibles, y se conocen ejemplos de cada tipo en la técnica. En un ejemplo, se incluye un enlazante flexible en los polipéptidos de fusión descritos en el presente documento. Los enlazantes flexibles pueden contener una mayoría de aminoácidos estéricamente libres, tales como por ejemplo glicina y alanina. El aminoácido hidrofílico Ser también se utiliza convencionalmente en enlazantes flexibles. Ejemplos de enlazantes flexibles incluyen, sin limitación: poliglicinas (por ejemplo, (Gly)4y (Gly)s), polialaninas poli(Gly-Ala) y poli(Gly-Ser) (por ejemplo, (Glyn-Sern)n o (sern-Glyn)n, en la que cada n es independientemente un número entero igual o mayor que 1 ).

Los enlazantes peptídicos pueden tener una longitud adecuada. La secuencia del enlazante peptídico puede ser al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más residuos de aminoácidos de longitud. Por ejemplo, un enlazante peptídico puede tener una longitud desde aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud; desde aproximadamente 10 a aproximadamente 40 aminoácidos de longitud; desde aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos de longitud; o desde aproximadamente 15 a aproximadamente 20 aminoácidos de longitud. La variación en la longitud del enlazante peptídico puede retener o mejorar la actividad, dando lugar a una eficacia superior en los estudios de actividad. La secuencia enlazante peptídica puede estar compuesta de aminoácidos de origen natural o no natural, o una mezcla de aminoácidos de origen tanto natural como no natural.

En algunos aspectos, los aminoácidos glicina y serina comprenden los aminoácidos dentro de la secuencia enlazante. En determinados aspectos, la región enlazante comprende conjuntos de repeticiones de glicina (GSG3)n (SEQ ID NO: 18), donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1 (por ejemplo 1 a aproximadamente 20). Más específicamente, la secuencia enlazante puede ser GSGGG (SEQ ID NO: 19). La secuencia enlazante puede ser GSGG (SEQ ID NO: 20). En determinados otros aspectos, la orientación de la región enlazante comprende conjuntos de repeticiones de glicina (SerGly3)n, donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1 (por ejemplo de 1 a aproximadamente 20) (s Eq ID NO: 21).

En otras realizaciones, un enlazante puede contener glicina (G) y serina (S) en un patrón aleatorio o repetido. Por ejemplo, el enlazante puede ser (GGGGS)n (SEQ ID NO: 22), en el que n es un número entero que varía desde 1 a 20, por ejemplo desde 1 a 4. En un ejemplo particular, n es 4 y el enlazante es GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23). En otro ejemplo particular, n es 3 y el enlazante es GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 24).

En otras realizaciones, un enlazante puede contener glicina (G), serina (S) y prolina (P) en un patrón aleatorio o repetido. Por ejemplo, el enlazante puede ser (GPPGS)n, en el que n es un número entero que oscila entre 1 y 20, por ejemplo 1-4. En un ejemplo particular, n es 1 y el enlazante es GPPGS (SEQ ID NO: 25).

En general, el enlazante no es inmunogénico cuando se administra a un paciente, tal como un ser humano. De esta manera, los enlazantes pueden elegirse de manera que tengan una inmunogenicidad baja o se piense que tienen una inmunogenicidad baja.

Los enlazantes descritos en el presente documento son de ejemplo y el enlazante puede incluir otros aminoácidos, tales como Glu y Lys, si se desea. Los enlazantes peptídicos pueden incluir múltiples repeticiones de, por ejemplo, (G3S) (SEQ ID NO: 26), (G4S) (SEQ ID NO: 27), (GYS) (SEQ ID NO: 28), y/o (GlySer) (SEQ ID NO: 29), si lo desea. En determinados aspectos, los enlazantes peptídicos pueden incluir múltiples repeticiones de, por ejemplo, (SG4) (SEQ ID NO: 30), (SG3) (SEQ ID NO: 31), (SG2) (SEQ ID NO: 32), (SG)2 (SEQ ID NO: 33) o (SerGly) (SEQ ID NO: 34).

En otros aspectos, los enlazantes peptídicos pueden incluir combinaciones y múltiplos de unidades de secuencia de aminoácidos repetidas, tales como (G3S)+(G4S)+(GlySer) (SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 29). En otros aspectos, Ser se puede reemplazar con Ala, por ejemplo, (G4A) (SEQ ID NO: 35) o (G3A) (SEQ ID NO: 36). Aún en otros aspectos, el enlazante comprende el motivo (EAAAK)n, donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1, por ejemplo de 1 a aproximadamente 20 (SEQ ID NO: 37). En determinados aspectos, los enlazantes peptídicos también pueden incluir enlazantes escindibles.

Los enlazantes pueden comprender dominios y/o características adicionales, tales como un sitio de escisión de furina (RRKR) (SEQ ID NO: 38), un péptido omitido ribosómico P2A (ATNFSLLKQAGDVEENPGP) (SEQ ID NO: 39) y/o un péptido omitido ribosómico T2A (EGRGSLLTCGDVEENPGP)(SEQ ID NO: 40). Ejemplos de enlazantes que comprenden estos dominios incluyen SGSG un péptido omitido ribosómico P2A (SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP) (SEQ ID NO: 41), SGSG un péptido omitido ribosómico T2A (SGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP) (SEQ ID NO: 42), y versiones que también incluyen un sitio de escisión de furina, es decir, sitio de escisión de furina SGSG un péptido omitido ribosómico P2A (RRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP) (SEQ ID NO: 43) y el sitio de escisión de furina SGSG un péptido omitido ribosómico T2A (RRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP) (SEQ ID NO: 44). Los péptidos omitidos ribosómico alternativos que pueden utilizarse en la invención incluyen F2A (VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP) (SEQ ID NO: 45) y E2A (QCTNYALLKLAGDVESNPGP) (SEQ ID NO: 46).

4.2.5. Secuencias N-terminales y secuencias C-terminales

Se pueden unir diversas secuencias al extremo N o C de los polipéptidos de fusión de la divulgación, o a los polipéptidos NKG2D divulgados en el presente documento. Estos pueden ser funcionales, tales como péptidos señal, etiquetas/secuencias de purificación o unidades estructurales de extensión de semivida, o pueden comprender simplemente secuencias espaciadoras. Alternativamente, pueden comprender una función, tal como una función estimuladora de célula T.

4.2.5.1. Etiquetas y marcadores de purificación.

Se pueden unir una variedad de etiquetas o marcadores al extremo N o C de los polipéptidos de fusión de la divulgación para ayudar con la purificación. Se puede combinar cualquier etiqueta de afinidad con los polipéptidos de fusión de la divulgación para ayudar con la purificación. Ejemplos de tales etiquetas de afinidad son una etiqueta His, una etiqueta FLAG, una etiqueta Arg, una etiqueta T7, una etiqueta Strep, una etiqueta S, una etiqueta aptámero, una etiqueta V5, AviTagTM, una etiqueta de epítopo myc o cualquier combinación de estas etiquetas. En una realización, la etiqueta de afinidad es una etiqueta His (que normalmente comprende de 5-10 residuos de histidina), por ejemplo una etiqueta 6His (es decir, HHHHHH) (SEQ ID NO: 47). En otra realización, la etiqueta de afinidad es una etiqueta FLAG (es decir, DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 48). En otra realización, la etiqueta de afinidad es una AviTagTM (es decir, GLNDIFEAQKIEWHE) (SEQ ID NO: 49). En otra realización, la etiqueta de afinidad es una etiqueta V5 (GKPIPNPLLGLDST) (SEQ ID NO: 50) o (IPNPLLGLD) (SEQ ID NO: 51). En otra realización, la etiqueta de afinidad es una etiqueta de epítopo myc reconocida por el anticuerpo 9e10 (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 52). Se conocen bien en la técnica diversas otras etiquetas para utilizar en la divulgación.

También se pueden utilizar combinaciones de tales etiquetas de afinidad, que comprenden una o más etiquetas en el extremo N, una o más etiquetas en el extremo C, o una o más etiquetas en cada uno de los extremos N y extremos C. Ejemplos de tales combinaciones incluyen una etiqueta His (H) combinada con una AviTag (A), o una etiqueta His (H) combinada con una AviTag (A) y una etiqueta FLAG (F). Las etiquetas pueden estar en cualquier orientación, por lo que la etiqueta AviTag/His puede tener la orientación N-AH-C o N-HA-C, mientras que la etiqueta Avi/His/FLAG puede tener la orientación N-AHF-C, N- FHA-C, etc.

En una realización, un polipéptido de fusión según la divulgación comprende una etiqueta "AHF" que tiene la secuencia "GLNDIFEAQKIEWHEGGHHHHHHDYKDDDDK" (SEQ ID NO: 53). En otra realización, un polipéptido de fusión según la divulgación comprende una etiqueta "FHA" que tiene la secuencia "DYKDDDDKHHHHHHGGGLNDIFEAQKIEWHE" (SEQ ID NO: 54).

La secuencia líder CD8a (aminoácidos 1-21 de UniProt: P01732 o un derivado abreviado que comprende los aminoácidos 1-18), es una secuencia de células T comúnmente utilizada y se denomina SEQ ID NO: 55 en el presente documento.

4.2.5.2. Secuencias coestimuladoras

Se conocen diversas secuencias de activación coestimuladora de célula T a partir de trabajos anteriores para diseñar células T CAR. Estos también pueden agregarse a polipéptidos de fusión de la divulgación.

El endodominio 4-1BB (aminoácidos 214-255 de UniProt: Q07011) también se puede utilizar como secuencia N- o C-terminal. El endodominio 4-1BB se denomina SEQ ID NO: 56 en el presente documento. El endodominio 4-1BB puede actuar como dominio coestimulador.

El endodominio CD27 (aminoácidos 213-260 de UniProt: P26842) también se puede utilizar como secuencia N- o C-terminal. El endodominio CD27 se denomina SEQ ID NO: 57 en el presente documento. El endodominio CD27 puede actuar como dominio coestimulador.

La bisagra de la IgG1 humana (aminoácidos 218-229 o 218-232 de UniProt: P0DOX5) también se puede utilizar como secuencia N- o C-terminal. La bisagra de IgG1 humana se denomina SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 104.

Una bisagra CD8a truncada (aminoácidos 138-182 de Uniprot: P01732) también se puede utilizar como secuencia N- o C-terminal. La bisagra CD8a truncada se denomina SEQ ID NO: 59.

4.2.6. Constructos de ejemplo

La presente divulgación proporciona los siguientes constructos de polipéptidos de fusión de ejemplo en la tabla 1:

Tabla 1: Constructos de polipéptidos de fusión DAP10/DAP12 de ejemplo

Además, como se mencionó anteriormente, los polipéptidos de fusión de la divulgación se pueden expresar como un constructo quimérico única con un polipéptido NKG2D, para escisión asociada a la traducción o postraduccional. En tales constructos, después de la expresión, los polipéptidos traducidos se escinden para crear polipéptidos separados que luego se autoasocian para formar un CAR. En una realización, un polipéptido de fusión de la divulgación se escinde de un polipéptido NKG2D. En la tabla 2 se muestran ejemplos de tales constructos:

Tabla 2: Constructos quiméricos de ejemplo

4.2.7. Moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de fusión NKG2D, CXCR2, DAP10, DAP12 y DAP10/DAP12 de la divulgación.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más polipéptidos de la divulgación. Esto puede ser como ADN o ARN. A menos que se limite específicamente en el presente documento, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades similares a las del ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos naturales. Ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosforatos quirales, 2-O-metilribonucleótidos y ácidos péptidonucleicos (PNA). A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, como se detalla a continuación, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., 1985, J. Biol. Chem.

260:2605-2608; and Rossolini et al., 1994, Mol. Cell. Probes 8:91-98).

De esta manera, la divulgación también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia polipeptídica de una cualquiera o más de las SEQ ID NOs: 60-69, 87, 90 y 102.

La divulgación proporciona además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con un ácido nucleico que codifica cualquiera de las SEQ ID NOS: 60-69, 87, 90 y 102. La identidad de secuencia por lo general se mide a lo largo de toda la secuencia de referencia.

La divulgación proporciona además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 70-79, 88, 91 y 103.

La divulgación también proporciona un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 70-79, 88, 91 y 103. La divulgación también proporciona un ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 70-79, 91 y 103.

Las secuencias de polinucleótidos pueden producirse mediante síntesis de ADN en fase sólida de novo o mediante mutagénesis por PCR de una secuencia existente (por ejemplo, secuencias como se describen en los siguientes ejemplos). La síntesis química directa de ácidos nucleicos se puede lograr mediante métodos conocidos en la técnica, tales como el método del fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; el método del fosfodiéster de Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109; El método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al., 1981, Tetra. Lett., 22:1859; y el método de soporte sólido de la Patente de los Estados Unidos No. 4,458,066. La introducción de mutaciones en una secuencia de polinucleótidos mediante PCR se puede realizar como se describe, por ejemplo, en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, Ny , N.Y, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990; Mattila et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:967; and Eckert et al., 1991, PCR Methods and Applications 1:17.

4.2.8. Vectores

La presente divulgación también proporciona vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico de la divulgación.

Para la expresión en células hospedadoras, el ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos de la divulgación puede estar presente en un vector adecuado y después de la introducción en un hospedador adecuado, la secuencia puede expresarse para producir el o los polipéptidos codificados según la clonación estándar y técnicas de expresión, que son conocidas en la técnica (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1989). La divulgación también se refiere a dichos vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico según la divulgación.

Se pueden emplear diversos vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican el o los polipéptidos de la divulgación. Se pueden utilizar vectores de expresión tanto virales como no virales para producir el o los polipéptidos en una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora de mamífero. Los vectores y sistemas no virales incluyen plásmidos, vectores episomales, por lo general con un casete de expresión para expresar una proteína o ARN, y cromosomas artificiales humanos (véase, por ejemplo, Harrington et al., 1997, Nat Genet. 15:345). Por ejemplo, vectores no virales útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos de la divulgación en células de mamíferos (por ejemplo, humanas) incluyen pThioHis A, B y C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B y C, (Invitrogen, San Diego, California), vectores MPS V y muchos otros vectores conocidos en la técnica para expresar otras proteínas. Los vectores virales útiles incluyen vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, vectores basados en SV40, virus del papiloma, virus HBP de Epstein Barr, vectores de virus vaccinia y virus del bosque de Semliki (SFV). Véase Brent et al., supra; Smith, 1995, Annu. Rev. Microbiol. 49:807; y Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143. En particular, se usan comúnmente vectores retrovirales, lentivirales, adenovirales o adenoasociados para la expresión en células T. Ejemplos de tales vectores incluyen el vector de expresión retroviral SFG (véase Riviere et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:6733-6737). En una realización se utiliza un vector lentiviral, entre los que se incluyen vectores lentivirales autoinactivantes (los denominados vectores SIN).

La elección del vector de expresión depende de las células hospedadoras previstas en las que se va a expresar el vector. Los vectores de expresión para células hospedadoras de mamíferos pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (véanse, por ejemplo, Queen, et al., 1986, Immunol. Rev. 89:49-68), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Estos vectores de expresión normalmente contienen promotores derivados de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos de tipo celular, específicos de fase y/o modulables o regulables. Los promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de metalotioneína, el promotor tardío principal constitutivo de adenovirus, el promotor MMTV inducible por dexametasona, el promotor SV40, el promotor MRP polIII, el promotor constitutivo MPS V, el promotor CMV inducible por tetraciclina (tales como el promotor CMV inmediato-temprano humano), el promotor CMV constitutivo, el promotor alfa EF1, el promotor fosfoglicerato quinasa (PGK) y combinaciones de promotor-potenciador conocidas en la técnica.

Los cultivos de organismos transformados se pueden expandir en condiciones no inductoras sin sesgar a la población para que codifique secuencias cuyos productos de expresión sean mejor tolerados por las células hospedadoras. Además de los promotores, también pueden ser necesarios o deseados otros elementos reguladores para la expresión eficaz del polipéptido o polipéptidos de la divulgación. Estos elementos por lo general incluyen un codón de iniciación ATG y un sitio de unión a ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véase, por ejemplo, Scharf et al., 1994, Results Probl. Cell Differ. 20:125; y Bittner et al., 1987, Meth. Enzymol., 153:516). Por ejemplo, se puede utilizar el potenciador SV40 o el potenciador CMV para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.

La divulgación proporciona un vector de clonación o expresión que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con un ácido nucleico que codifica cualquiera de las SEQ ID NOS: 60-69, 87, 90 y 102. Además, la divulgación proporciona un vector de clonación o expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una o más de las s Eq ID NOs: 60-69, 87, 90 y 102. La divulgación proporciona un vector de clonación o expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 70-79, 88, 91 y 103.

4.2.9. Células hospedadoras

Se proporcionan células hospedadoras que comprenden un polipéptido de la divulgación, un ácido nucleico de la divulgación, un vector de la divulgación o combinaciones de ya sea uno o ambos de los mismos. Tales células se utilizan generalmente para la expresión del o de los polipéptidos según la divulgación.

El ácido nucleico o vector puede transfectarse en una célula hospedadora mediante técnicas estándar.

Se pretende que las diversas formas del término "transfección" abarquen una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariótica o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección con DEAE-dextrano y similares.

Alternativamente, el ácido nucleico o el vector se puede administrar al interior de la célula hospedadora mediante transducción. Por ejemplo, se puede utilizar un vector viral, como se describe anteriormente, para la administración del ácido nucleico o vector.

Es posible expresar el o los polipéptidos de la divulgación en células hospedadoras procariotas o eucariotas. Las células hospedadoras representativas incluyen muchas cepas de E. coli, líneas celulares de mamíferos, tales como CHO, CHO-K1 y HEK293; células de insecto, tales como células Sf9; y células de levadura, tales como S. cerevisiae y P pastoris. En una realización, la célula hospedadora es una célula inmunosensible, tal como una célula n K (ya sea una célula NK primaria o una línea de células NK) o una célula T (ya sea una célula T primario o una línea de célula T). Otros tipos de células hospedadoras incluyen macrófagos, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), neutrófilos y células NKT invariantes (iNKT). La célula T puede ser una célula T CD4+ o CD8+. En una realización, la célula hospedadora es una célula humana. En una realización, la célula hospedadora es una célula T humano. En otra realización, la célula hospedadora es una célula T humano primario. Las líneas celulares que pueden utilizarse incluyen la línea celular NK NK-92.

Las células hospedadoras de mamífero para expresar el polipéptido(s) de la divulgación incluyen el ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas las células dhfr-CHO, descritas Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 utilizadas con un marcador seleccionable DH FR, por ejemplo, como se describe en R.J. Kaufman and PA. Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma n So , células COS y células SP2. En una realización, las células hospedadoras son células CHO K1PD. En otra realización, las células hospedadoras son células NSO1. En particular, para su uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión es el sistema de expresión del gen GS mostrado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y PE 338.841. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican polipéptidos en células hospedadoras de mamífero, los polipéptidos pueden producirse cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión de los polipéptidos en las células hospedadoras o la secreción de los polipéptidos en el medio de cultivo en la que se cultivan las células hospedadoras. Los polipéptidos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos estándar de purificación de proteínas.

4.3. Métodos de producción de células inmunosensibles de la divulgación.

La presente divulgación también proporciona métodos de producción de células inmunosensibles que comprenden polipéptidos de la divulgación. Dicho método puede comprender transducir una célula con un ácido nucleico o vector que codifica polipéptido(s) de la divulgación. El método puede comprender además cultivar la célula, de modo que los polipéptidos se expresen y se asocien con un polipéptido NKG2D para formar un CAR.

En una realización, la presente divulgación proporciona un método de preparación de una célula inmunosensible que comprende las etapas de (i) transducir una molécula de ácido nucleico o vector de la divulgación en la célula inmunosensible, y (ii) cultivar la célula inmunosensible de modo que la célula transducida exprese un polipéptido NKG2D, un polipéptido de fusión DAP10/DAP12 y un polipéptido CXCR2, en el que el polipéptido Nk G2D y el polipéptido de fusión DAP10/DAP12 se asocian en la membrana celular.

En una realización adicional, la presente divulgación proporciona un método que comprende, (i) obtener células T y/o células NK de un paciente, (ii) transducir un ácido nucleico o vector de la divulgación en células T y/o células NK, y (iii) cultivar las células T y/o las células NK de modo que la célula transducida exprese un polipéptido NKG2D, un polipéptido de fusión DAP10/DAP12 y un polipéptido CXCR2, en el que el polipéptido NKG2D y el polipéptido de fusión DAP10/DAP12 se asocian en la membrana celular.

Se conocen bien en la técnica diversos métodos para el cultivo de células inmunosensibles. Véase, por ejemplo, Parente-Pereira AC et al. 2014, J. Biol. Métodos 1(2):e7, Ghassemi S et al. 2018, Cáncer Immunol Res 6(9):1100-1109, y Denman CJ y cols. 2012, PLoS One 7(1): e30264.

4.4. Composiciones farmacéuticas

La divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos, ácido nucleico, vector o célula hospedadora como se describe en el presente documento. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender un diluyente y/o portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable. El portador generalmente se selecciona para que sea adecuado para el modo de administración previsto y puede incluir agentes para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la tasa de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Por lo general, estos portadores incluyen soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, incluidos medios salinos y/o regulados.

Los agentes adecuados para su inclusión en las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio), soluciones reguladoras (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos), agentes de carga (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)), agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), rellenos, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas), proteínas (tales como albúmina sérica libre, gelatina o inmunoglobulinas), agentes colorantes, saborizantes y diluyentes, agentes emulsionantes, polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sales (tale como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol), alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, surfactantes o agentes humectantes (tales como plurónicos; PEG; ésteres de sorbitán; polisorbatos tales como Polisorbato 20 o Polisorbato 80; Tritón; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal), agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, tales como cloruro de sodio o potasio, o manitol sorbitol), portadores de administración, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos.

Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio y Ringer lactato. Pueden incluirse espesantes fisiológicamente aceptables adecuados tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes y reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer. En algunos casos, se podrían incluir agentes para ajustar la tonicidad de la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en una composición farmacéutica. Por ejemplo, en muchos casos es deseable que la composición sea sustancialmente isotónica. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. La formulación precisa dependerá de la vía de administración. Son bien conocidos principios, métodos y componentes relevantes adicionales para formulaciones farmacéuticas (véase, por ejemplo Allen, Loyd V. Ed, (2012) Remington's Pharmaceutical Sciences, 22a Edición).

Una composición farmacéutica de la presente divulgación se puede administrar mediante una o más vías de administración usando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración para las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo mediante inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se utiliza en el presente documento significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitaria, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, Inyección e infusión subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. En una realización, la composición farmacéutica se administra por vía intratumoral. Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones farmacéuticas normalmente están en forma de una composición parenteralmente aceptable, estéril y libre de pirógenos. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es una solución isotónica estéril, adecuadamente conservada. La composición farmacéutica puede estar en forma de un liofilizado, tal como una torta liofilizada.

Alternativamente, la composición farmacéutica descrita en el presente documento puede administrarse mediante una vía de administración no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica es para administración subcutánea. Los componentes de formulación adecuados y los métodos para la administración subcutánea de agentes terapéuticos polipeptídicos (por ejemplo, anticuerpos, polipéptidos de fusión y similares) se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, los documentos US2011/0044977, US8465739 y US8476239. Por lo general, las composiciones farmacéuticas para administración subcutánea contienen estabilizadores adecuados (por ejemplo, aminoácidos, tales como metionina y/o sacáridos tales como sacarosa), agentes reguladores y agentes tonificantes.

Por lo general, en terapia celular, la composición que comprende la célula hospedadora se administra al paciente mediante infusión intravenosa.

La administración de la composición farmacéuticamente útil de la presente divulgación es preferiblemente en una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad profilácticamente eficaz" (según pueda ser el caso, aunque la profilaxis puede considerarse terapia), siendo esto suficiente para mostrar beneficio al individuo. La cantidad real administrada, y la velocidad y el tiempo de administración dependerán de la naturaleza y gravedad de la enfermedad de agregación de proteínas que se esté tratando. Prescripción de tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., son responsabilidad de los médicos generales y otros médicos, y normalmente tienen en cuenta el trastorno que se va a tratar, la condición del paciente individual, el lugar de entrega, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. Se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980.

Una composición se puede administrar sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultánea o secuencialmente dependiendo de la afección que se va a tratar.

4.5. Métodos de tratamiento

En algunas realizaciones, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores, células y/o composiciones farmacéuticas de la divulgación se usan para tratar una enfermedad o trastorno, profilaxis y/o para retrasar la aparición de síntomas de la enfermedad. Los métodos incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores, células y/o composiciones farmacéuticas de la divulgación.

La divulgación proporciona un polipéptido, ácido nucleico, vector, célula hospedadora o composición farmacéutica de la divulgación para su uso en terapia o como medicamento. La divulgación proporciona además un polipéptido, ácido nucleico, vector, célula hospedadora o composición farmacéutica de la divulgación para su uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico. La divulgación proporciona un polipéptido, ácido nucleico, vector, célula hospedadora o composición farmacéutica de la divulgación para su uso en el tratamiento o profilaxis del cáncer. También se proporciona la célula inmunosensible de la divulgación para su uso en el tratamiento o profilaxis del cáncer. La divulgación también proporciona el uso de un polipéptido, ácido nucleico, vector, célula hospedadora o composición farmacéutica de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno patológico. También se proporciona el uso de un polipéptido, ácido nucleico, vector, célula hospedadora o composición farmacéutica de la divulgación en el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico. La divulgación proporciona además un método para tratar a un paciente que sufre un trastorno patológico que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, ácido nucleico, vector, célula hospedadora o composición farmacéutica de la divulgación a dicho paciente.

Como se utilizan en el presente documento, los términos "enfermedad" y "trastorno patológico" incluyen cáncer, incluyendo, pero no limitando a, un cáncer de tumor sólido, un tumor de tejido blando, una lesión metastásica y un cáncer hematológico. Por ejemplo, el cáncer puede ser cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer linfoide, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, Enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula paratiroidea, cáncer de glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer de pene, leucemias crónicas o agudas incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos infantiles, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o de uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (CNS), linfoma primario del CNS, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de célula T, síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia mielógena crónica en fase crónica (CMLCP), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma cutáneo de célula T (CTCL), linfoma periférico de célula T (PTCL), carcinoma hepatocelular (HCC), estroma gastrointestinal tumores (GIST), carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN), cánceres inducidos ambientalmente, incluidos los inducidos por asbesto, y combinaciones de dichos cánceres. En particular, el cáncer puede ser cáncer de mama, tal como un cáncer de mama con receptor de estrógeno positivo (ER pos) y/o una forma metastásica de cáncer de mama.

En una realización, el cáncer es un cáncer de tumor sólido. En una realización, el tratamiento del trastorno patológico implica dirigirse a células no tumorales, tales como células estromales asociadas a tumores. Tipos de ejemplo de tales células estromales asociadas a tumores incluyen células estromales pancreáticas. Otros tipos de células no tumorales a las que se pueden atacar incluyen macrófagos, células T reguladoras y células supresoras derivadas de mieloides.

En una realización, el paciente ha sido pretratado con un agente quimioterapéutico.

En una realización, la administración de células hospedadoras al paciente da como resultado una disminución en el tamaño del tumor del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o incluso 100 %, en comparación con un tumor no tratado.

La cantidad de células hospedadoras administradas al paciente debe tener en cuenta la vía de administración, el cáncer que se está tratando, el peso del paciente y/o la edad del paciente. En general, aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 * 1011 células se administran al paciente. En una realización, aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 * 1010 células, o aproximadamente 1 * 108 a aproximadamente 1 * 109 células se administran al paciente.

4.6. Kits

En otro aspecto, los componentes o realizaciones descritos en el presente documento para el sistema se proporcionan en un kit. Por ejemplo, se puede proporcionar cualquiera de los plásmidos, así como las células de mamífero, soluciones reguladoras relacionados, medios, agentes desencadenantes u otros componentes relacionados con el cultivo celular y la producción de viriones, con componentes opcionales congelados y empaquetados como un kit, solos o junto con envases separados de cualquiera de los otros agentes e instrucciones de uso opcionales. En algunas realizaciones, el kit puede comprender recipientes de cultivo, viales, tubos o similares.

4.7. Ejemplos

A continuación se muestran ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Se han hecho esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, se deben permitir algunos errores y desviaciones experimentales.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de los conocimientos de la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la literatura.

4.7.1. Métodos

Aislamiento de célula T y transducción retroviral

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de muestras de sangre de voluntarios sanos mediante centrifugación mediada por densidad. Las células T se activaron con fitohemaglutinina durante 72 horas, y se agregaron 100 UI/mL de lL-2 durante las últimas 24 horas. 1*106 PBMC activadas se sembraron en una placa recubierta con RetroNectin que había sido pretratada con 3 mL de sobrenadante retroviral. Posteriormente, cada pocillo se trató con 3 mL de sobrenadante viral fresco y 100 UI/mL de IL-2. La transducción retroviral se realizó con partículas virales producidas por células empaquetadoras estables 293TVec pseudotipadas estables del virus de la leucemia del simio gibón (GALV). A partir de entonces, las células T se alimentaron con 100 UI/mL en medio RPMI1640 suero AB humano normal al 5 %, con medio nuevo e IL-2 (100 UI/mL) proporcionados tres veces por semana.

Citometría de flujo

La transducción de célula T y la transfección de células 293T se evaluaron mediante citometría de flujo, haciendo comparación, cuando esté indicado, con un control de isotipo apropiado. Para evaluar la expresión de los constructos basados en NKG2D, las células se tiñeron con CD4-FITC antihumano de ratón, NKG2D-PE antihumano de ratón y CD8-APC antihumano de ratón y se compensaron adecuadamente. Debido a los altos niveles de expresión endógena de NKG2D en células T CD8+, la eficiencia de la transducción se comparó con la expresión de NKG2D en células T CD4+ no transducidas. La expresión de los CAR T4 y TMY específicos de panErbB se evaluó utilizando EGF antihumano de cabra biotinilado, seguido de estreptavidina conjugada con PE. La eficiencia de transducción se calculó en comparación con células T N1012+ teñidos con los mismos reactivos. Antes de su uso, la eficiencia de la transducción se normalizó entre constructos agregando la proporción requerida de células T no transducidas. Esto aseguró que todas las condiciones fueran idénticas para el número total de células T CAR+ y concentración general de células T

Para realizar la tinción intracelular, las células 293T transfectadas se fijaron en formaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de lavarse dos veces en solución de permeabilización (PBS 0.5 % de BSA+ 0.1 %de saponina). Posteriormente, las células se tiñeron con 500 ng de NKG2D antihumano conjugado con PE, o un control de isotipo apropiado, en presencia de 100 pl de solución de permeabilización. Las células se lavaron además dos veces en solución de permeabilización antes del análisis mediante citometría de flujo.

Para evaluar la diferenciación de célula T después de múltiples rondas de estimulación, las células T se eliminaron de los cocultivos de células tumorales y se tiñeron con CD45RO antihumano conjugado con FITC, CD62L antihumano conjugado con aloficocianina (APC), CCR7 antihumano conjugado con PE, CD4 antihumano conjugado con FITC, CD8a antihumano conjugado con APCCy7 y anticuerpos CD27 antihumano conjugados con ficoeritrina cianina7 (PECy7). Después de lavar en 2 mL de PBS helado, las células se volvieron a suspender en 0.5 mL de PBS helado y se evaluaron mediante citometría de flujo. La eficacia de la tinción se evaluó utilizando células T teñidos con los controles de isotipo y fluorescencia menos uno (FMO) apropiados.

Ensayos de respuesta a la dosis

1*104 células tumorales se sembraron por pocillo (100 j l) de una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 durante la noche. Veinticuatro horas después se agregaron células T a proporciones de log2 célula T CAR: células tumorales que van desde 1: 1 a 1:64. Después de 72 horas, se eliminaron las células T y se agregaron 100 j l de solución de MTT (500 jg/mL), antes de que las placas se incubaran a 37 °C y 5 % de CO2 durante aproximadamente 1 hora. Después de retirar la solución de MTT, los cristales de formazán resultantes se solubilizaron en DMSO (100 jL/pocillo) y se midió la absorbancia a 560 nm. La viabilidad de las células tumorales se calculó de la siguiente manera: (Absorbancia de monocapa con células T/absorbancia de monocapa sin células T)* 100.

Ensayos de reestimulación

1*105 células tumorales se sembraron en pocillos por triplicado de una placa de 24 pocillos y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C y 5 % de CO2. Veinticuatro horas después, 1 mL que contiene 1*105 células T CAR+ se agregaron por pocillo. Después de 72 horas, se retiraron suavemente las células T y se lavó el pocillo con 1 mL de PBS. Después de retirar el PBS, se agregó 1 mL de MTT (a una concentración final de 500/pg/mL) a cada pocillo y la placa se incubó a 37 °C y 5 % de CO2 durante aproximadamente 1 hora. Se midió la absorbancia en los pocillos apropiados a 560 nm y se calculó la viabilidad de las células tumorales como se detalla en la sección "respuesta a la dosis". Una reestimulación se consideró exitosa si la viabilidad de las células tumorales se midió en menos del 50 %.

Las células T que se habían retirado de la placa se centrifugaron a 400 xg durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. Las pellas se volvieron a suspender en 3.2 mL de medio R5 y se agregó 1 mL a cada pocillo de monocapa tumoral fresca (1 x 105 células tumorales por pocillo de una placa de 24 pocillos) por triplicado. El número total de células T se evaluó mediante la exclusión con azul tripán de una pequeña alícuota de los 200 j l restantes.

Avidez de unión

La avidez de unión de las células T CAR a las células diana se evaluó midiendo el porcentaje de células T unidos a las células diana a niveles crecientes de fuerza acústica. células tumorales se sembraron LO68 o SKOV-3 diseñadas con CD19 en un chip de microfluidos z-Movi (Lumicks, Ámsterdam, Países Bajos) recubierto con poli-L-lisina y se cultivaron durante 16 horas. Al día siguiente, se hicieron fluir en serie células T CAR clasificados por flujo en los chips y se incubaron con las células diana durante 5 minutos antes de inicializar una rampa de fuerza lineal de 3 minutos. Durante la rampa de fuerza, el dispositivo z-Movi (Lumicks) capturó una serie temporal de imágenes utilizando un microscopio de campo brillante integrado en la plataforma. Las células separadas se hicieron levitar hacia los nodos acústicos, lo que permitió el seguimiento de las células en función de sus posiciones XY Los cambios en la posición Z dieron como resultado un cambio en el patrón de difracción, lo que permitió distinguir entre células adheridas al sustrato y células suspendidas en los nodos acústicos. Esta información se utilizó para correlacionar los eventos de desprendimiento de células con una fuerza de ruptura específica. El desprendimiento de células se adquirió utilizando (z-Movi Tracking_v1.6.0) y el análisis de imágenes posterior al experimento se realizó utilizando Cell Tracking offline analysis_v2.1.

ELISA

La secreción de IFN-<y>e IL-2 por las células T se evaluó en alícuotas de sobrenadante extraídas 24 horas después del inicio del cocultivo utilizando los kits ELISA Duo-set y Ready-Steady-Go, respectivamente.

Generación de esferoides tumorales.

Para generar esferoides tumorales, 1*103 células tumorales y 1*103 células estrelladas PS1 se agregaron por pocillo de una placa de 96 pocillos de afinidad ultrabaja y se incubaron durante 72 horas a 37 °C y 5 % de CO2. La generación de esferoides se confirmó mediante visualización con microscopio óptico estándar.

Estudios in vivo

Imágenes de bioluminiscencia

1*105 células BxPC3 etiquetadas con luciferasa de luciérnaga (ffLUC) se inyectaron en la cavidad intraperitoneal de ratones NSG. Doce días después de la inoculación del tumor, los ratones (n = 5 por grupo) fueron tratados por vía intraperitoneal con P<b>S, 4x106 (N1012+ (N1012 (lo)), T4+ o células T C<a>R TMY+) o 1*107 células T CAR+ (N1012 (hi) o NKG2D). Alternativamente, se inocularon ratones NSG i.p. con 1x106 Células de mesotelioma maligno H226 etiquetadas con ffLUC. Ocho días después de la inoculación del tumor, los ratones fueron tratados con PBS o 4*106 células T N1012+. Como control, un grupo de ratones fue tratado con 4*106 células T que expresan NKG2D solo.

En otros estudios, se inoculó a ratones NSG i.p. con 1*105 células Ovsaho que expresa ffLuc o 5*105 células SKOV-3 que expresan ffLuc. Los ratones inoculados con células de Ovasho se trataron con PBS o 5x106 células T CAR (N1012, N1012_CXCR2, réplica CYAD-01 o no transducidas) mediante inyección intraperitoneal (6 días después de la inoculación del tumor) o inyección intravenosa (7 días después de la inoculación). Los ratones inoculados con células SKOV-3 se trataron por vía intravenosa con PBS o 1x107 células T CAR (N1012, N1012_CXCR2 o CYAD-01_10) 14 días después de la inoculación del tumor.

Para evaluar el tráfico de células T, las células T se transdujeron dos veces para expresar un constructo CAR (N1012 o N1012_CXCR2) y un constructo indicador, ya sea luciferasa de renilla (rLuc) sola o un indicador dual que codifica tanto rLuc como GFP Los ratones inoculados con células de Ovasho fueron tratados con 5*106 células T CAR (N1012_Luciferasa de Renilla o N1012_CXCR2_Luciferasa de Renilla) mediante inyección intravenosa 7 días después de la inoculación del tumor. Los ratones inoculados con células SKOV-3 fueron tratados con 1x107 células T CAR (N1012_CXCR2_rLuc o N1012_rLuc) mediante inyección intravenosa 14 días después de la inoculación del tumor. Los ratones inoculados con células de Kuramochi fueron tratados con 2x l06 células T CAR (N1012_CXCR2_rLuc o N1012_rLuc) mediante inyección intravenosa 18 días después de la inoculación del tumor. Se administró coelenterazina, un sustrato de la luciferasa de renilla, por vía intravenosa a los ratones para controlar el seguimiento de las células T.

El crecimiento del tumor fue monitoreado por BLI, con todos los datos presentados como flujo total (fotones/segundo) o flujo total promedio (fotones/segundo) por tratamiento. Los ratones fueron monitoreados de cerca y pesados tres veces por semana para detectar signos de mala salud.

Volumen tumoral

1*105 células CFPac-1 o BxPC3 se inyectaron por vía subcutánea en 50 pl de Matrigel (PBS 1:1) en el flanco izquierdo de ratones NSG. Veintinueve días después de la inoculación con células CFPac-1 o catorce días después de la inoculación con células BxPC3, los ratones se trataron por vía intravenosa con PBS o 1x107 células T CAR (N1012_CXCR2, N1012, NKG2D, réplica CYAD-01, no transducidas (UT)).

El crecimiento del tumor se midió semanalmente mediante mediciones con calibre y se presentó como volumen del tumor (mm3).

Inmunohistoquímica

1*105 células CFPac-1 se inyectaron por vía subcutánea en 50 pl de Matrigel (PBS 1:1) en el flanco izquierdo de ratones NSG. Veintinueve días después de la inoculación, los ratones fueron tratados por vía intravenosa con PBS o 1x107 células T CAR (N1012_CXCR2, N1012, NKG2D, réplica CYAD-01 o células T no transducidas (UT)). Tres días después de las inyecciones de célula T, se sacrificaron tres ratones de cada uno de los grupos de tratamiento con célula T N1012, N1012_CXCR2 y NKG2D y se recogieron los tumores para análisis inmunohistoquímicos (IHC). En resumen, los tejidos se fijaron en formalina, se incluyeron en parafina, se seccionaron, se montaron en portaobjetos y se tiñeron con anticuerpo anti-CD3 humano (Abcam) utilizando métodos estándar.

4.7.2. Ejemplo 1: Expresión de la proteína de fusión NKG2D y DAP10/12 en células 293T

Se transfectaron células 293T con el esqueleto del plásmido retroviral SFG que contenía la proteína de fusión DAP10/12 N1012 o el casete de expresión NKG2D. N1012 (SEQ ID NO: 64) comprende un complejo que comprende una proteína NKG2D humana exógena y homodímeros DAP10/12 exógenos de fusión según la invención. El plásmido N1012 comprende SEQ ID NO: 74, que codifica SEQ ID NO: 64. La expresión superficial de NKG2D se evaluó 72 horas después mediante citometría de flujo. Mientras que la expresión de NKG2D se detectó fácilmente en la superficie de las células 293T transfectadas con el plásmido N1012, no se detectó expresión de NKG2D en la superficie de las transfectadas con el plásmido que codifica el NKG2D de control (Figura 2, panel superior). Dado que la expresión en la superficie de NKG2D depende de la expresión de DAP 10, la falta de expresión en la superficie de NKG2D podría explicarse por la ausencia de coexpresión de DAP10 dentro del plásmido NKG2D. Para confirmar que la falta de expresión de NKG2D en la superficie en las células 293T transfectadas con NKG2D no se debió a una transfección deficiente, se realizó una tinción intracelular para detectar la presencia de NKG2D. Fundamentalmente, se observó expresión intracelular de NKG2D en células 293T transfectadas con el plásmido N1012 o NKG2D (Figura 2, panel inferior). Esto demuestra la expresión exitosa de NKG2D a partir de ambos constructos y también confirma el requisito de la coexpresión de DAP10 para lograr la expresión superficial de NKG2D.

4.7.3. Ejemplo 2: Expresión de N1012 y NKG2D en células T humanas primarios

Las células T humanas primarios se activaron con perlas paramagnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 humano y anti-CD28 humano. Cuarenta y ocho horas después de la activación, las células T fueron diseñados mediante transducción retroviral para expresar N1012 o NKG2D. La expresión superficial de NKG2D se evaluó mediante citometría de flujo y tinción conjunta para la expresión de CD4 y CD8. La expresión porcentual (Figura 3A) y la intensidad de fluorescencia media (MFI, Figura 3B) de NKG2D se comparó con células T no transducidas. Debido a la expresión endógena de NKG2D en células T CD8+, los datos están controlados en células T CD4+. Como se muestra, tanto los constructos NKG2D como N1012 se expresan de manera reproducible en niveles altos en la superficie de las células T humanas primarios, en contraste con las células T UT o las células T que expresan un CAR de control (Figura 4).

4.7.4. Ejemplo 3: Evaluación de la destrucción y el reconocimiento de células diana por parte de las células T N1012.

Para evaluar la capacidad citolítica, las células T N1012+ se cultivaron conjuntamente con once líneas celulares de tumores humanos diferentes, que representan cinco tipos de tumores diferentes (mesotelioma, cáncer de ovario, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de páncreas y cáncer de mama), o con células estromales asociadas a tumores (PS1) en diferentes proporciones E:T. Después de 72 horas, se eliminaron las células T y se realizó el ensayo MTT para evaluar la viabilidad de las células tumorales. Mientras que se observó una reducción mínima en la viabilidad del tumor cuando las células diana se cultivaron conjuntamente con células T UT o con aquellas que expresan NKG2D, células T N1012+ demostraron una potente lisis de todas las líneas celulares diana, incluso en proporciones E:T bajas (Figuras 5 y 7A y 7B). El análisis de los sobrenadantes de cocultivo mediante ELISA demostró una secreción sustancial tanto de interferón-Y (IFN-<y>) como de interleucina-2 (IL-2) por células T N1012+, pero no por células T UT ni por aquellas que expresan la constructo NKG2D de control (Figuras 6A y 6B). Estos datos demuestran la capacidad de las células T N1012+ para reconocer y lisar una amplia variedad de tipos de tumores, incluidas las células estromales asociadas a tumores.

4.7.5. Ejemplo 5: Ejemplificación de la destrucción de esferoides tumorales por células T N1012

Para evaluar la capacidad de las células T N1012+ para mediar en la lisis de las células diana dentro de un sistema 3D, se cultivaron conjuntamente con esferoides tumorales. Después de la generación de esferoides, 6*103 células T etiquetadas con CellTracker Violet se agregaron por pocillo. La viabilidad de las células tumorales y de las células estrelladas se evaluó después de 3 y 8 días mediante microscopía fluorescente, midiendo GFP y RFP, respectivamente. La cuantificación de las señales GFP y RFP se realizó utilizando el software Image J y se expresó como un porcentaje de las lecturas de fluorescencia de los esferoides cultivados en ausencia de células T. Se observó una potente lisis de los esferoides con células T N1012+, pero no con célula T NKG2D o UT (Figuras 7I-7J). Además, sólo las células T N1012+ demostraron secreción de IFN-y (Figura 7K).

Alternativamente, se evaluaron la viabilidad de los esferoides y la proliferación de células T mediante citometría de flujo. Para lograr esto, los esferoides se retiraron de la placa, 3 u 8 días después de la adición de célula T y se colocaron en un tubo de citometría de flujo, con hasta cinco esferoides tratados con las mismas células T CAR agregados al mismo tubo. La desagregación de esferoides se logró utilizando una solución Accutase y una vigorosa resuspensión mediante una punta de pipeta. La suspensión de células individuales resultante se lavó en medio RPMI1640 suero AB humano normal al 5 % y posteriormente se volvieron a suspender en PBS que contenía perlas de recuento. Se adquirió un número igual de perlas de recuento por tubo y se determinó el número resultante de células tumorales (evaluadas mediante fluorescencia GFP y RFP) y célula T (evaluadas mediante fluorescencia CellTracker Violet). Los datos se muestran como porcentaje de la suma de células GFP y RFP presentes en esferoides cultivados en ausencia de células T (Figura 15).

4.7.6. Ejemplo 6: Ejemplificación del reconocimiento de dianas en serie por células T N1012

Para evaluar la capacidad de las células T N1012+ para llevar a cabo la lisis en serie de las células diana ("reestimulación"), se cultivaron conjuntamente con monocapa nueva dos veces por semana hasta que no se observó destrucción de la monocapa. Mientras que las células T UT o NKG2D+ mediaron una destrucción mínima de las células diana y no mostraron evidencia de proliferación, las células T N1012+ mediaron una potente lisis mediante múltiples rondas de reestimulación (Figuras 8A-8B). La destrucción de las células diana también se asoció con una proliferación sustancial y un nivel de cambio de expansión máxima de células T N1012+ (Figuras 8C-8D).

En comparación con la réplica CYAD-01 NKG2D CAR y las células T de control, las células T N1012+ se sometieron a significativamente más rondas de reestimulación sobre las células BxPC3_LT (Figura 14A). Además, las células T N1012+ también demostraron una proliferación sustancialmente mayor que las células T CYAD-01 o los controles (Figura 14B).

4.7.7. Ejemplo 7: Eficacia de las células T N1012 en modelos in vivo de cáncer de páncreas

Para determinar la capacidad de células T N1012+ para atacar células tumoralesin vivo,se generaron células T que expresan N1012, NKG2D o dos iteraciones diferentes de un pan-ErbB dirigido a CAR (T4 y TMY). Expresión de las diversas constructos dentro de las células T humanas primarios (Figura 9A) y se demostró la eficacia de las células Tin vitrocontra tres líneas de células tumorales después de un cocultivo de 72 horas en una proporción de 1:1 (Figura 9B). Para evaluar la funciónin vivo,se establecieron xenoinjertos de tumores BxPC3 etiquetados con luciferasa de luciérnaga intraperitoneal (ffLUC) durante 12 días en ratones NSG. Los ratones portadores de tumores fueron tratados por vía intraperitoneal con PBS, 4x106 células T (N1012 (lo), T4 o TMY), o 1*107 células T(N1012 (hi) o NKG2D) transducidos. El crecimiento del tumor se midió semanalmente mediante imágenes de bioluminiscencia, y los ratones se pesaron tres veces por semana. Los datos se presentan como flujo total promedio (fotones/segundo) por grupo de tratamiento (Figura 10A), o flujo total (fotones/segundo) por ratón individual (Figura 10B). Carga tumoral en ratones que reciben células T NKG2D+, T4+ o TMY+ era idéntica a las que recibieron PBS, lo que sugiere una falta de eficacia. Por el contrario, el tumor se erradicó completamente en 2/5 ratones y 4/5 ratones tratados con N1012 (lo) o N1012 (hi), respectivamente. Estos ratones permanecieron libres de tumores 76 días después de la administración de células T No se observó evidencia de toxicidad cuando se evaluó mediante la medición del cambio porcentual en el peso corporal (Figura 10C).

Para determinar si las células T N1012+ podían injertarse en ratones NSG y proporcionarles memoria inmunológica; aquellos ratones que habían rechazado completamente el tumor recibieron una segunda inoculación de 1*105 células BxPC3 etiquetadas con ffLUC en la cavidad peritoneal 88 días después de la inoculación inicial del tumor (76 días después de la infusión de células T). Si bien BLI observó un aumento en la luminiscencia 24 horas después de la nueva exposición al tumor, 4/5 ratones demostraron posteriormente una reducción sustancial en el tamaño del tumor, lo que indica la reactivación de las células T N1012+ (Figura 10D). El experimento finalizó después de 145 días y se generó una curva de supervivencia que demostró la potente eficacia antitumoral de las células T N1012 (Figura 10E).

Para confirmar aún más la eficacia de células T N1012+ contra un modelo de cáncer de páncreasin vivo,Se llevó a cabo un experimento repetido. 1*107 células T CAR+ o de control no transducidas se inyectaron i.p. en ratones NSG doce días después de la inoculación con 1x105 células BxPC3 etiquetadas con ffLUC. El crecimiento del tumor se controló semanalmente mediante imágenes de bioluminiscencia y los datos se presentan como flujo total promedio (fotones/segundo) por grupo de tratamiento (Figura 11 A), y flujo total (fotones/segundo) por ratón individual (Figura 11B). Una vez más se observó una regresión tumoral significativa y sostenida en ratones tratados con células T N1012+. De hecho, el tumor fue completamente erradicado en 5/6 ratones tratados con células T N1012+. Por el contrario, la cinética del crecimiento tumoral en ratones tratados con células T UT fue idéntica a la de los que recibieron PBS. Estos datos confirman que la erradicación del tumor fue N1012+-específica.

Para investigar la posible formación de células T de memoria, los ratones que estaban libres de tumores el día 41 (29 días después de la infusión de célula T) se volvieron a exponer i.p. a un bolo nuevo de 1*105 células BxPC3 etiquetadas con ffLUC. Se tomaron imágenes de los ratones el día 42 para confirmar la aparición del tumor. Las imágenes posteriores demostraron que 5/5 ratones reexpuestos redujeron la carga tumoral por debajo de la detección, y 3/5 ratones demostraron control tumoral a largo plazo (Figura 11B). Estos datos sugieren que las células T CAR N1012 pueden formar poblaciones de memoria que pueden reactivarse en respuesta al resurgimiento de la diana.

4.7.8. Ejemplo 8: Eficacia de las células T N1012 en un modelo in vivo de mesotelioma maligno

Para confirmar la eficacia de N1012 en otro modeloin vivo, se inocularon ratones NSG mediante inyección intraperitoneal con 1x106 células de mesotelioma maligno H226 etiquetadas con ffLUC. Ocho días después de la inoculación de células tumorales, los ratones fueron tratados con PBS o 4*106 células T N1012+. Como control, un grupo de ratones fue tratado con 4*106 células T que expresan NKG2D solo. El crecimiento del tumor se controló semanalmente mediante imágenes de bioluminiscencia y los datos se presentan como flujo total promedio (fotones/segundo) por tratamiento (Figura 12A) y como flujo total (fotones/segundo) por ratón individual (Figura 12B). Mientras que se observó un crecimiento tumoral constante en los ratones que recibieron PBS, se observó una erradicación del tumor del 100 % en los ratones que recibieron células T N1012+.

Para confirmar la persistencia de las células T y el mantenimiento de la función, todos los ratones libres de tumores fueron inoculados i.p. con 1x106 células H226 etiquetadas con ffLUC adicional, 91 días después de la inoculación inicial del tumor. La presencia del tumor se confirmó en todos los ratones después de 24 horas mediante imágenes de bioluminiscencia. Todos los ratones reexpuestos rechazaron el tumor, lo que confirma la persistencia de las células T N1012+ y la capacidad de estas células T para mediar en el control tumoral a largo plazo.

4.7.9. Ejemplo 9: Comparación de células T N1012 con la réplica de células T CYAD-01

El potencial de reestimulación y proliferación de las células T N1012 se comparó con la réplica de las células T CYAD-01. Como se señaló anteriormente, el CAR CYAD-01 consiste en una fusión de NKG2D con CD3Z y representa una versión humana del CAR de ratón descrito originalmente por Sentirían et al (Zhang et al, 2005, Blood 106:1544-1551). Aunque nominalmente es un CAR de primera generación, se asocia con DAP10 endógeno en las células T, lo que significa que se proporcionan ambas señales 1 y 2. El CYAD-01 CAR está actualmente en desarrollo clínico por parte de Celyad Oncology, y en estos ejemplos se proporciona una réplica de este CAR únicamente con fines de comparación.

La expresión superficial de la réplica CYAD-01 se confirmó en células T humanas primarios cuando se evaluó mediante citometría de flujo (Figura 13).

En resumen, se cocultivaron células T N1012 o réplica CYAD-01 con monocapa nueva dos veces por semana hasta que no se observó destrucción de la monocapa. Para lograr esto, 1*105 Las células tumorales se sembraron en pocillos por triplicado de una placa de 24 pocillos y se incubaron durante 24 horas a 37 °C y 5 % de CO2. Veinticuatro horas después, 1 * 105 células T<c>A<r>+ se agregaron por pocillo a una concentración final de 1x105 CAR+/mL. Después de 72 horas, se retiraron suavemente las células T y se lavó el pocillo con 1 mL de PBS. Después de retirar el PBS, se agregó 1 mL de MTT (a una concentración final de 500 pg/mL) a cada pocillo y la placa se incubó a 37 °C y 5 % de CO2 durante aproximadamente 1 hora. Se leyó la placa y se calculó la viabilidad de las células tumorales como se detalla anteriormente. Una reestimulación se consideró exitosa si la viabilidad de las células tumorales se midió en menos del 50 %.

Para investigar la proliferación de células T en respuesta al reconocimiento de células diana, las células T que se habían retirado de la placa se centrifugaron a 400 xg durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. Las pellas se volvieron a suspender en 3.2 mL de medio R5 y se agregó 1 mL a cada pocillo de monocapa tumoral nueva por triplicado. El número total de célula T se evaluó mediante la exclusión con azul tripán de una pequeña alícuota de los 200 pl restantes.

En comparación con la réplica CYAD-01, NKG2D CAR y las células T de control, las células T N1012+ se sometieron a muchas más rondas de reestimulación que las células BxPC3_LT (Figura 14A). Además, las células T N1012 también demostraron una expansión media sustancialmente mayor que las células T replicadas o los controles CYAD-01 (Figura 14B).

Cuando se cocultivó con esferoides tumorales, se observó una reducción significativa en la viabilidad de los esferoides con células T N1012+, pero no con célula T de control UT, ni con aquellas que expresan el CAR replicado funcional CYAD-01 (Figura 15A). Las células T N1012 también demostraron una proliferación significativa en comparación con las células T UT o réplica CYAD-01 (Figura 15B).

4.7.10. Ejemplo 10: Generación de células T N1012 y células T N1012_CXCR2

Se generaron células T que expresaban un constructo CAR (por ejemplo, N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01_10) aislando células mononucleares de sangre periférica (PBMC), activando las células T y transduciendo las células T con virus que contenía ácido nucleico que codifica el CAR (Figuras 16A-16B).

En resumen, para generar virus, 1.65*10® células HEK293T se sembraron en una placa de cultivo de tejidos 10 cm2 en 10 mL de medio IMDM que contiene 10 % de FBS y L-glutamina 2 mM (medio I10) y se incuba durante 24 horas a 37 °C con 5 % de CO2. Al día siguiente, se generó la mezcla de transfección para cada constructo CAR según el protocolo de la tabla 3. Las células HEK293T se transfectaron por separado con los siguientes plásmidos: N1012 (que codifica la proteína de fusión DAP10/12 y el receptor NKG2D humano (SEQ ID NO: 74)), N1012_CXCR2 (que codifica la proteína de fusión DAP10/12, el receptor NKG2D humano y CXCR2 (SEQ ID NO: 91)), CYAD-01 réplica (que codifica el receptor NKG2D fusionado a CD3Z (SEQ ID NO: 93)), y CYAD-01_10 (que codifica réplica CYAD-01 y DAP10 (SEQ ID NO: 94).

Tabla 3: Protocolo de transfección para constructos CAR (volúmenes por 10 cm2 plato)

Al finalizar la incubación de 15 minutos, se agregó gota a gota la mezcla B a las células HEK293T y se agitó suavemente. Luego las células se volvieron a colocar en la incubadora. El sobrenadante se recogió 48 horas después de la transfección, se recogió en tubos Falcon de 50 mL previamente enfriados y se almacenó a 4 °C.

Las células HEK293T se alimentaron con 10 mL de medio I10 fresco y se devolvieron a la incubadora. Después de 24 horas adicionales, el sobrenadante se recogió por segunda vez de las células HEK293T y se combinó con el sobrenadante recogido 48 horas después de la transfección. El sobrenadante combinado se dividió en alícuotas en tubos preetiquetados, se congeló rápidamente y se almacenó a -80 °C.

Las PBMC se aislaron utilizando centrifugación de densidad mediada por Ficoll Paque estándar. Una vez resuspendido a una concentración de 3*10® células/mL en RPMI suero AB humano normal al 5 % y L-glutamina 2 mM (medio 'R5'), las células T se activaron utilizando perlas paramagnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 humano y anti-CD28 humano (proporción de célula plomo 1:2), o fitohemaglutinina (PHA) en una concentración de 5 ug/mL. Cuarenta y ocho horas después de la activación, 1*10® células T se sembraron en placas no tratadas con cultivo de tejidos recubiertas con RetroNectin y se mezclaron con 3 mL de sobrenadante viral recolectado de células h Ek 293T transfectadas transitoriamente. Las células T se alimentaron con 100 UI/mL de IL-2 en medio RPMI1640 suero AB humano normal al 5 %, con medio nuevo e IL-2 (100 UI/mL) proporcionados tres veces por semana.

La expresión superficial de los CAR N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01 y CYAD-01_10 en las células T se evaluó mediante citometría de flujo. En resumen, las células T se tiñeron con anticuerpos CD4 antihumano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), NKG2D antihumano conjugado con ficoeritrina (PE), CXCR2 antihumano conjugado con Alexafluor_®47 (AF_®47) y CD8a antihumano conjugado con aloficocianina cianina7 (APCCy7) en hielo durante 30 minutos. Como control para la expresión de fondo de CXCR2, un tubo se tiñó con CD4 conjugado con FITC, NKG2D conjugado con PE, CD8a conjugado con APCCy7 y anticuerpos de isotipo conjugados con AF_®47. Después de lavar en 2 mL de PBS helado, las células se volvieron a suspender en 0.5 mL de PBS helado y se evaluaron mediante citometría de flujo. Debido a la expresión endógena de NKG2D en células T CD8+, la eficiencia de la transferencia de genes se calculó dentro de las células T CD4+ y en comparación con lo observado en células T no transducidas (UT). Los resultados mostrados en la figura 1®C demuestran que se logran altos niveles de transferencia de genes con todas los constructos (Figura 1®C, panel izquierdo) pero que N1012 tiene una expresión superficial significativamente mayor en comparación con otros CAR, incluido N1012_CXCR2 (Figura 1®C, panel derecho).

4.7.11. Ejemplo 11: Evaluación de la eficacia de las células T N1012_CXCR2 contra las células de cáncer de ovario humano

Se realizaron ensayos de citotoxicidad (MTT) para evaluar la eficacia antitumoral de las células T CARin vitrosobre las células de cáncer de ovario. En resumen, dos líneas celulares de cáncer de ovario epitelial representativas del cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC), Kuramochi y Ovsaho, se cultivaron por separado con células T CAR (N1012, N1012_CXCR2, réplica CYAD-01 o CYAD-01_10) en proporciones log2 efector:diana que van desde 1: 1 a 1:®4. La viabilidad de las células tumorales se evaluó 48 horas después de la adición de células T realizando ensayos de MTT como se describe anteriormente. La viabilidad de las células tumorales se expresó como porcentaje de células tumorales cultivadas en ausencia de células T (Figura 17). Los resultados muestran que las células T N1012, N1012_CXCR2, réplica CYAD-01 y CYAD-01_10 demostraron una potente citotoxicidad en ambas líneas de células tumorales (Figura 17). Por el contrario, las células T no transducidas mediaron una muerte insignificante de células tumorales.

4.7.12. Ejemplo 12: Las células T N1012 y N1012_CXCR2 demuestran una proliferación superior

Se realizaron ensayos de reestimulación para evaluar la capacidad de las células T CAR para someterse a múltiples rondas de lisis de células diana. En resumen, se cultivaron conjuntamente células T CAR con células tumorales de mesotelioma Ren en una proporción efectora de 1:1. Después de 72 horas, se retiraron suavemente las células T y cada pocillo se lavó suavemente con 1 mL de PBS. Después de retirar el PBS, se agregaron 0.5 mL de solución de MTT por pocillo y las placas se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 durante aproximadamente 1 hora. Después de retirar la solución de MTT, los cristales de formazán resultantes se solubilizaron en DMSO (0.5 mL/pocillo) y se midió la absorbancia a 5®0 nm. La viabilidad de las células tumorales se calculó de la siguiente manera: (Absorbancia de monocapa con célula T/absorbancia de monocapa sin célula T)* 100. Las células T que se habían retirado de la monocapa se centrifugaron a 400 xg durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. Las pellas se volvieron a suspender en 3.2 mL de medio R5 y se agregó 1 mL a cada pocillo de monocapa tumoral nueva por triplicado. El ensayo se repitió dos veces por semana hasta que las células T no lograron mediar en más del 40 % de la lisis de las células diana. Para investigar la proliferación de células T en respuesta al reconocimiento de células diana, se evaluó el número de células T mediante exclusión con azul tripán de una pequeña alícuota de los 200 pL restantes. El nivel de cambio de expansión se calculó de la siguiente manera (número total de células T más alto logrado durante la reestimulación/número inicial de células T sembrados).

Los resultados mostrados en la figura 18 demuestran una proliferación y persistencia significativamente mejoradas de las células T N1012 y N1012_CXCR2 durante los ensayos de reestimulación en comparación con la réplica CYAD-01 y las células T CYAD-01_10. Mientras que no se observó expansión de células T no transducidas o de células T que expresan NKG2D, todos las células T CAR+ proliferaron a partir del número sembrado inicialmente. El nivel de expansión de las células T N1012 y N1012_CXCR2 fue sustancialmente mayor que el observado con la réplica CYAD-01 o las células T CYAD-01_10. Además, si bien el número de réplica CYAD-01 y de células T<c>Y<a>D-01_10 disminuyó rápidamente con rondas adicionales de estimulación, tanto las células T N1012 como las N1012_CXCR2 demostraron una proliferación robusta. De hecho, las células T N1012 y N1012_CXCR2 demostraron una expansión máxima de 59.7 veces y 58.1 veces, respectivamente, en el número de células T, en comparación con el número de células sembradas inicialmente. También fue evidente que tanto las células T N1012 como las N1012_CXCR2 demostraron ráfagas de proliferación, seguidas de una contracción en el número de células T, a las que luego siguieron rondas adicionales de proliferación (Figura 18). Este patrón de proliferación y contracción refleja el de una respuesta inmunitaria endógena.

4.7.13. Ejemplo 13: Evaluación de la diferenciación de células T, la proporción CD4:CD8 y la expresión de moléculas coestimuladoras después de la estimulación de células T

Se eliminó una pequeña alícuota de células T de los ensayos de reestimulación en curso después de la estimulación 16 y la estimulación 23 y las células T se tiñeron con anticuerpos anti-CD4 humano conjugados con FITC y CD8a conjugados con APCCy7. Las células T se tiñeron por separado para CD27 utilizando un anticuerpo conjugado con PECy7. Las células T se evaluaron mediante citometría de flujo. En ambos momentos, las células T N1012 y N1012_CXCR2 demostraron un cambio casi completo hacia el subconjunto CD8+, con muy pocas células CD4+ detectadas (Figuras 19A-19B). El cambio al CD8+ fue más pronunciado después de la estimulación 23 que de la estimulación 16 (comparando la figura 19B con la figura 19A). Fundamentalmente, las células T N1012 conservaron la expresión de una molécula coestimuladora clave, CD27, incluso después de 28 rondas de reestimulación (Figura 20, panel derecho). Los resultados también demuestran que las células T N1012 mantienen algunos células T de memoria (CD45RO+ CD62L+) después de 28 rondas de estimulación (Figura 20, panel izquierdo).

Las células T N1012 parecieron además circular entre células T de memoria central (CD45RO+ CD62L+) y células T de memoria efectoras (CD45RO+ CD62L'). La evidencia mínima de agotamiento terminal (CD45RO' CD62L') se observó, incluso en rondas avanzadas de reestimulación (Figura 21).

4.7.14. Ejemplo 14: Evaluación de la avidez de las células T CAR

Para evaluar la avidez de unión de las células T CAR dirigidos a NKG2D para las células diana, se midió el porcentaje de células T unidos a las células diana a niveles crecientes de fuerza acústica. En resumen, se sembraron células tumorales LO68 o SKOV-3 diseñadas con CD19 (ambas expresan ligandos NKG2D) en un chip de microfluidos z-Movi (Lumicks, Ámsterdam, Países Bajos) recubierto con poli-L-lisina y se cultivaron durante 16 horas. Al día siguiente, se hicieron fluir en serie células T CAR clasificadas por flujo en los chips y se incubaron con las células diana durante 5 minutos antes de inicializar una rampa de fuerza lineal de 3 minutos. Durante la rampa de fuerza, el dispositivo z-Movi (Lumicks) capturó una serie temporal de imágenes utilizando un microscopio de campo brillante integrado en la plataforma. Las células separadas se hicieron levitar hacia los nodos acústicos, lo que permitió el seguimiento de las células en función de sus posiciones XY Los cambios en la posición Z dieron como resultado un cambio en el patrón de difracción, lo que permitió distinguir entre células adheridas al sustrato y células suspendidas en los nodos acústicos. Esta información se utilizó para correlacionar los eventos de desprendimiento de células con una fuerza de ruptura específica. El desprendimiento de células se adquirió utilizando (z-Movi Tracking_v1.6.0) y el análisis de imágenes posterior al experimento se realizó utilizando el análisis fuera de línea de Cell Tracking _v2.1.

Los resultados mostrados en la figura 22 demuestran que la avidez de las células T CAR parecía reflejar el nivel de expresión de la superficie celular del CAR (Figura 16C). Las células T CAR N1012 mostraron una mayor avidez que las células T CAR N1012_CXCR2, la réplica c Ya D-01 y CYAD-01_10 tanto para las células Lo68-19 como para las SKOV3 (Figura 22). Todos las células T NKG2D CAR demostraron una menor avidez de unión que las células T específicos de CD19 (FMC63) para las células Lo68_19, lo que refleja la menor afinidad de NKG2D en comparación con FMC63 por sus ligandos.

4.7.15. Ejemplo 15: Evaluación de la secreción de citocinas de las células T N1012 y N1012_CXCR2

La secreción de interferón gamma (IFN-<y>) e interleucina-2 (IL-2) por las células T CAR se evaluó mediante ELISA después del cocultivo con diversas líneas de células tumorales. Las células T CAR se cultivaron conjuntamente por separado con células derivadas de cáncer de ovario (Kuramochi, Ovsaho) y cáncer de páncreas (CFPac-1) durante 24 horas. Posteriormente se eliminó el sobrenadante y se evaluó mediante ELISA como se describió anteriormente.

Los resultados demuestran que las células T N1012_CXCR2 secretan sustancialmente menos IFN-y (Figura 23A) e IL-2 (Figura 23B) que las células T N1012 en todas las líneas celulares probadas.

4.7.16. Ejemplo 16: Las células T N1012y N1012_CXCR2 no estimuladas demuestran una expansión mejorada exvivoen comparación con la réplica CYAD-01 o las células T CYAD-01_10

Se realizaron experimentos para evaluar la expansión y, en consecuencia, el potencial de ampliación de las células T N1012, N1012_CXCR2, réplica CYa D-01 y c Ya D-01_10. En resumen, las células T se transdujeron como se describió anteriormente y se alimentaron cada 48-72 horas con medio R5 al 100 % en volumen suplementado con 100 UI/mL de IL-2 humana recombinante. La expansión celular se calculó como el número total de célula T al final del período de cultivo de 12 días/número inicial de células T transducidas.

Los resultados muestran que tanto las células T N1012 como los N1012_CXCR2 demuestran niveles de expansión que superan ligeramente los de las células T no transducidas (Figura 24). Por el contrario, las células T réplica CYAD-01 y CYAD-01_10 demuestran una expansión sustancialmente peor en comparación con las células T de control (Figura 24).

4.7.17. Ejemplo 17: Evaluación de la eficacia antitumoral de las células T N1012_CXCR2in vivoen modelos de ratón de cáncer de ovario

Para evaluar la eficacia de las células T CAR en tumores de ovarioin vivo,se inyectaron células T CAR en ratones portadores de xenoinjertos de tumor de ovario Ovsaho que expresan luciferasa de luciérnaga (ffLuc), xenoinjertos de tumor de ovario SKOV-3 que expresan ffLuc o xenoinjertos de tumor de ovario Kuramochi que expresan ffLuc. Las células tumorales de Ovsaho expresan niveles bajos de IL-8; Las células tumorales SKOV-3 expresan niveles moderados de IL-8. Posteriormente se controló el crecimiento del tumor mediante imágenes de bioluminiscencia.

En resumen, 1x105 Ovsaho o Kuramochi que expresa ffLuc o 5*105 células SKOV-3 que expresan ffLuc se inyectaron en la cavidad intraperitoneal de ratones NSG. Los ratones inoculados con células de Ovasho se trataron con PBS [n = 5] o 5 * 106 células T CAR (N1012 [n=7], N1012_CXCR2 [n=7], réplica CYAD-01 [n=4] o células T no transducidas) administradas mediante inyección intraperitoneal (6 días después de la inoculación del tumor) o inyección intravenosa (7 días después de la inoculación). Los ratones inoculados con células SKOV-3 se trataron por vía intravenosa con PBS [n = 5] o 1x107 células T CAR (N1012 [n=11], N1012_CXCR2 [n=11] o CYAD-01_10 [n=8]) 14 días después de la inoculación del tumor. El día 17 después de la inoculación, los ratones inoculados con células de Kuramochi se trataron mediante inyección intraperitoneal con PBS o 2x106 células T CAR (N1012 o N1012_CXCR2) o células T no transducidas. El día 18, los ratones inoculados con células de Kuramochi fueron tratados mediante inyección intravenosa con PBS o 2x106 células T CAR (N1012 o N1012_CXCR2) o células T no transducidas.

Los resultados muestran un efecto antitumoral inicial en los tumores de células de Ovsaho en ratones tratados con células T N1012, N1012_CXCR2 y réplica CYAD_01 (Figura 25 y Figura 38). Los ratones con xenoinjerto de Ovasho se volvieron a exponer al tumor el día 56 después de la inoculación inicial del tumor mediante inyección intraperitoneal de 1x105 células de Ovsaho que expresan ffLuc. Después de volver a exponer el tumor, no se observó crecimiento tumoral en ratones que habían sido tratados con células T N1012 o N1012_CXCR2 (Figura 38). En comparación, los ratones que habían sido tratados con la réplica de células T CYAD-01 mostraron un marcado aumento en el crecimiento del tumor después de una nueva exposición al tumor (Figura 38). Los resultados demuestran la actividad antitumoral superior de las células T N1012_CXCR2 y N1012 en comparación con la réplica de células T CYAD-01.

Los ratones con xenoinjerto SKOV-3 tratados con células T N1012_CXCR2 mostraron una actividad antitumoral superior (Figura 27) y supervivencia (Figura 37) en comparación con ratones tratados con célula T N1012 o CYAD-01_10.

El tratamiento con células T N1012 o N1012_CXCR2 también demostró actividad antitumoral en ratones con xenoinjerto de Kuramochi (Figura 39 y Figura 41). Los ratones tratados con N1012y N1012_CXCR2 que habían rechazado tumores se volvieron a exponer al tumor el día 86 mediante inyección intraperitoneal de 1x105 células de Kuramochi que expresan ffLuc. El crecimiento del tumor se inhibió en algunos de los ratones reexpuestos, lo que demuestra que se conserva la actividad antitumoral en los ratones (Figura 39 y Figura 41). Las figuras 40 y 43 son curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los ratones portadores de xenoinjertos de Kuramochi tratados en los experimentos detallados en la figura 39 y la figura 41, respectivamente. Las células T utilizados en un único experimento procedían del mismo donante. Las células T utilizados en el experimento detallado en la figura 41 eran de un donante diferente al de las células T utilizados en el experimento detallado en la figura 39.

Para evaluar el tráfico de células T, las células T se transdujeron dos veces para expresar un constructo CAR (N1012 o N1012_CXCR2) y un constructo informadora (rLuc sola o rLuc coexpresada con GFP)).

Los ratones inoculados con células de Ovasho como se describió anteriormente fueron tratados con 5x106 células T CAR (N1012_SW [n=3] o N1012_CXCR2_rLuc/GFP [n=3]) mediante inyección intravenosa 7 días después de la inoculación del tumor. Los resultados de imágenes de bioluminiscencia (Figura 26, panel derecho) muestran que entre los días 1-3 después de la inyección de células T, las células T N1012_CXCR2_rLuc/GFP se movilizaron al peritoneo de manera más eficiente que las células T N1012_SW, mientras que se observó una actividad antitumoral equivalente en los dos grupos de tratamiento (Figura 26, paneles izquierdo y central). Dado que las células de Ovsaho expresan IL-8 en niveles moderados a bajos, el aumento del tráfico de célula T N1012_CXCR2_rLuc/GFP puede deberse a ligandos CXCR2 distintos de IL-8.

Los ratones inoculados con células SKOV-3 como se describió anteriormente se trataron con 1x107 células T CAR (N1012_CXCR2_rLuc/GFP o N1012_rLuc/GFP) mediante inyección intravenosa 14 días después de la inoculación del tumor. Los resultados mostrados en la figura 28 y la figura 29 demuestran que las células T N1012_CXCR2 se movilizaron de manera más eficiente que las células T N1012 en los primeros cuatro días después de la administración de células T (Figura 28, panel derecho y Figura 29). Los resultados mostrados en la figura 28 (panel izquierdo) demuestran además que los ratones tratados con células T N1012_rLuc/GFP y N1012_CXCR2_rLuc/GFP mantienen la actividad antitumoral más de 60 días después de la administración de células T.

Los ratones inoculados con células de Kuramochi como se describió anteriormente se trataron el día 18 después de la inoculación del tumor con 2x106 células T CAR cotransducidas con N1012 o N1012_CXCR2 y el informador dual, rLuc/GFP Los resultados mostrados en la figura 42 demuestran que las células T N1012_CXCR2 se movilizaron de manera más eficiente a la cavidad peritoneal que las células T N1012 en los primeros cuatro días posteriores a la administración de células T.

4.7.18. Ejemplo 18: Evaluación de la eficacia antitumoral de las células T N1012_CXCR2in vivoen modelos de ratón de cáncer de páncreas

Para evaluar la eficacia de las células T CAR en tumores pancreáticosin vivo,se inyectaron células T CAR en ratones que portaban células tumorales CFPac-1 o BxPC3.

En resumen, 1x105 células CFPac-1 o BxPC3 se inyectaron por vía subcutánea en 50 pl de Matrigel (PBS 1:1) en el flanco izquierdo de ratones NSG. Veintinueve días después de la inoculación con células CFPac-1 o catorce días después de la inoculación con células BxPC3, los ratones se trataron por vía intravenosa con PBS o 1x107 células T CAR (N1012_CXCR2, N1012, NKG2D, réplica CYAD-01 o células T no transducidas (UT)). Tres días después de las inyecciones de célula T, se sacrificaron tres ratones de cada uno de los grupos de tratamiento con célula T N1012, N1012_CXCR2 y UT y se recogieron los tumores para análisis de inmunohistoquímica (IHC). El crecimiento del tumor se midió semanalmente mediante mediciones con calibre y se presentó como volumen del tumor (mm3).

Los resultados muestran que los tumores en ratones con xenoinjerto CFPac-1 tratados con célula T N1012_CXCR2 se erradicaron por completo después de la administración de células T y no se observó ninguna recaída tumoral (Figura 30). Por el contrario, el crecimiento tumoral en ratones con xenoinjerto CFPac-1 tratados con células T N1012 y réplica CYAD-01 se inhibió inicialmente después de la administración de células T antes de la pérdida de la actividad antitumoral y la recaída del tumor (Figura 30). El análisis IHC mostró una mejor infiltración de células T N1012_CXCR2 en tumores CFPac-1 en comparación con las células T N1012 o NKG2D (Figura 31).

Los ratones con xenoinjerto BxPC3 tratados con células T N1012_CXCR2 mostraron una mejor inhibición tumoral (Figura 33) y supervivencia (Figura 34) en comparación con ratones tratados con células T N1012 o réplica CYAD-01, lo que sugiere que la presencia de CXCR2 mejora la localización de las células T CAR en los tumores BxPC3 productores de lL-8.

Se realizaron estudios adicionales a modo de comparación el tratamiento con dosis altas y bajas de células T CAR. En resumen, 1x105 se inyectaron células CFPac-1 en la cavidad intraperitoneal de ratones NSG. Veintiocho días después de la inoculación del tumor, los ratones fueron tratados con PBS [n=5], una dosis alta de 10*106 células T CAR (N1012 [n=7], N1012_CXCR2 [n=7], réplica CYAD-01 [n=5]) o una dosis baja de 4*106 células T CAR (N1012 [n=6], N1012_CXCR2 [n=7]). Los resultados mostrados en la figura 32 demuestran que la eficacia del tratamiento con una dosis baja de células T N1012_CXCR2 rastrea el tratamiento con una dosis alta de células T N1012.

4.7.19. Ejemplo 19: Evaluación de la eficacia antitumoral de las células T N1012_CXCR2 en un modelo tumoral de xenoinjerto (PDX) derivado de un paciente con mesotelioma

Se generó un modelo de tumor de ratón con xenoinjerto (PDX) derivado de un paciente con mesotelioma para evaluar la eficacia del tratamiento del mesotelioma con células T CAR N1012 y N1012_CXCR2in vivo.Para establecer el modelo PDX de mesotelioma, se injertaron fragmentos de tumor de mesotelioma del paciente primario (2 x 2 mm) por vía subcutánea en el flanco izquierdo de ratones NSG utilizando agujas de implante de trocar de 15G. Los tumores crecieron durante un período de seis meses y se pasaron tres veces a nuevas cohortes. En el pase 4, a una cohorte experimental de ratones NSG macho se les implantó material PDX en el flanco izquierdo. El día 111 después del injerto tumoral, a los ratones se les administró por vía intravenosa PBS [n = 8] o 1x107 células T CAR (no transducidas (UT), N1012_CXCR2 [n=8], N1012 [n=9] o CYAD-01_10 [n=5]). Un subgrupo de ratones fue tratado con células T transducidas con luciferasa y tomato TD (LT) con o sin CAR para rastrear las células T mediante imágenes de bioluminiscencia (N1012_<c>X<c>R2_LT [n=3], N1012_LT o LT solo [n=3 ]). El crecimiento del tumor se midió semanalmente mediante mediciones con calibre y se presentó como volumen del tumor (mm3).

Los resultados en la figura 35 y la figura 44 muestran que se observó actividad antitumoral en ratones tratados con células T N1012 y N1012_CXCR2. Por el contrario, los ratones tratados con células T CYAD-01_10 no respondieron bien al tratamiento. La figura 36 muestra imágenes de bioluminiscencia de células T, lo que demuestra que las células T N1012 y N1012_CXCR2 se localizaron en el sitio del tumor en los ratones PDX con mesotelioma, mientras que las células T transducidas solo con el indicador LT (sin CAR) no se localizaron en el tumor. En la figura 45 se muestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier de los ratones en estudio.

6. Secuencias

SEQ ID NO: 1 (secuencia completa de DAP10 humano)

MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVA

SLLIVGAVFL CARPRRSPAQ EDGKVYINMP GRG SEQ ID NO: 2 (DAP10 aa19-93 - falta secuencia líder)

QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLCARPRRSP

AQEDGKVYIN MPGRG SEQ ID NO: 3 (DAP10 aa19-69 - dominio extracelular/transmembrana)

QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV F SEQ ID NO: 4 (DAP10 aa1-71)

MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLLAGLVAADAVA

SLLIVGAVFL C SEQ ID NO: 5 (DAP10 aa19-71)

QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLC SEQ ID NO: 6 (DAP10 aa70-93 - dominio intracelular)

LCARPRRSPA QEDGKVYINM PGRG SEQ ID NO: 7 (DAP10 aa49-93 - dominio transmembrana e intracelular)

LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLCARPRRSP AQEDGKVYIN MPGRG SEQ ID NO: 8 (DAP10 aa49-69 - dominio transmembrana)

LLAGLVAADA VASLLIVGAV F SEQ ID NO: 9 (secuencia completa de DAP12 humano)

MGGLEPCSRL LLLPLLLAVS GLRPVQAQAQ SDCSCSTVSP GVLAGIVMGD LVLTVLIALA

VYFLGRLVPR GRGAAEAATR KQRITETESP YQELQGQRSD VYSDLNTQRP YYK

SEQ ID NO: 10 (DAP12 aa22-113 - falta secuencia líder)

LRPVQAQAQS DCSCSTVSPG VLAGIVMGDL VLTVLIALAV YFLGRLVPRG RGAAEAATRK

QRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK SEQ ID NO: 11 (DAP12 aa62-113 - dominio citoplasmático/intracelular)

YFLGRLVPRG RGAAEAATRK QRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK SEQ ID NO: 12 (DAP12 aa41-61 - dominio transmembrana)

GVLAGIVMGD LVLTVLIALA V

SEQ ID NO: 13 (DAP12 aa22-61 - dominios extracelulares y transmembrana)

LRPVQAQAQS DCSCSTVSPG VLAGIVMGDL VLTVLIALAV SEQ ID NO: 14 (secuencia completa de NKG2D humano)

SEQ ID NO: 15 (NKG2D humano aa73-216 - dominio extracelular)

IW SA V FLN SL FN Q E V Q IPLT ESYCGPCPKN WICYKNNCYQ FFDESKNWYE SQASCMSQNA

SLLKVYSKED QDLLKLVKSY HWMGLVHIPT NGSWQWEDGS I L S P N L L T I I EMQKGDCALY

A S SF K G Y IE N C STPN TY IC M QRTV SEQ ID NO: 16 (NKG2D humano aa82-216 - dominio extracelular)

L F N Q E V Q IP L T E S Y C G P C PK NW ICYKNNCY QFFDESKNW Y ESQASCM SQN A SLLK V Y SK E

DQDLLKLVKS YHWMGLVHIP TNGSWQWEDG S I L S P N L L T I IEM QKGDCAL Y A S S F K G Y IE

N C S T P N T Y IC MQRTV SEQ ID NO: 17 (NKG2D aa52-216 humano - dominio transmembrana y extracelular)

PF FF C C FIA V A M G IR FIIM V AIWSAVFLNS LFNQEVQIPL TESYCGPCPK NWICYKNNCY

QFFDESKNWY ESQASCMSQN ASLLKVYSKE DQDLLKLVKS YHWMGLVHIP TNGSWQWEDG

S IL S P N L L T I IEMQKGDCAL YASSFKGYIE NCSTPNTYIC MQRTV SEQ ID NO: 18 (enlazante)

GSG SEQ ID NO: 19 (enlazante)

GSGGG SEQ ID NO: 20 (enlazante)

GSGG SEQ ID NO: 21 (enlazante)

SGGG SEQ ID NO: 22 (enlazante)

GGGGS SEQ ID NO: 23 (enlazante)

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 24 (enlazante)

GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 25 (enlazante)

GPPGS SEQ ID NO: 26 (enlazante)

GGGS

SEQ ID NO: 27 (enlazante)

GGGGS SEQ ID NO: 28 (enlazante)

GYS SEQ ID NO: 29 (enlazante)

GS SEQ ID NO: 30 (enlazante)

SGGGG SEQ ID NO: 31 (enlazante)

SGGG SEQ ID NO: 32 (enlazante)

SGG SEQ ID NO: 33 (enlazante)

SGSG SEQ ID NO: 34 (enlazante)

SG SEQ ID NO: 35 (enlazante)

GGGGA SEQ ID NO: 36 (enlazante)

GGGA SEQ ID NO: 37 (enlazante)

EAAAK SEQ ID NO: 38 (sitio de escisión de furina)

RRKR SEQ ID NO: 39 (péptido omitido P2A)

ATNFSLLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO: 40 (péptido omitido T2A)

EGRGSLLTCGDVEENPGP SEQ ID NO: 41 (SGSG P2A)

SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO: 42 (SGSG T2A)

SGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP SEQ ID NO: 43 (furina SGSG P2A) RRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO: 44 (furina SGSG T2A) RRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP SEQ ID NO: 45 (péptido omitido F2A) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP

SEQ ID NO: 46 (péptido omitido E2A)

QCTNYALLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO: 47 (etiqueta His)

HHHHHH SEQ ID NO: 48 (etiqueta FLAG)

DYKDDDDK SEQ ID NO: 49 (etiqueta Avi)

GLNDIFEAQKIEWHE SEQ ID NO: 50 (etiqueta V5)

GKPIPNPLLGLDST SEQ ID NO: 51 (etiqueta V5)

IPNPLLGLD SEQ ID NO: 52 (etiqueta Myc)

EQKLISEEDL SEQ ID NO: 53 (etiqueta AHF)

GLNDIFEAQKIEWHEGGHHHHHHDYKDDDDK SEQ ID NO: 54 (etiqueta FHA)

DYKDDDDKHHHHHHGGGLNDIFEAQKIEWHE SEQ ID NO: 55 (secuencia líder CD8a)

MALPVTALLL PLALLLHAAR P SEQ ID NO: 56 (endodominio 4-1BB)

KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL SEQ ID NO: 57 (endodominio CD27)

QRRKYRSNKG ESPVEPAEPC HYSCPREEEG STIPIQEDYR KPEPACSP SEQ ID NO: 58 (bisagra de IgG1 humana - aa 218-229 de UniProt: P0DOX5)

EPKSCDKTHT CP SEQ ID NO: 59 (bisagra CD8a truncada)

TTTPAPRPPT PAPTIASQPL SLRPEACRPA AGGAVHTRGL DFACD SEQ ID NO: 60

MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPR

RSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK

SEQ ID NO: 61

MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLI

VGAVFYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK SEQ ID NO: 62

MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKEPKSCDKTHTCPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQED

GKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK SEQ ID NO: 63

M A LPV T A L LL PL A L L LH A A R PD Y K D D D D K T TT PA PR PPT PA PT IA SQ PL SL R PE A C R PA A G G A V H T R G L D FA C D L LA G LV A A D A V A SLLIV G A V FLCA RPRRS PA Q ED G K V Y IN M PG RG Y FLG RLV PRG RG A A EA A TRK Q RITETESPY Q ELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK SEQ ID NO: 64 (Constructo 1/N1012)

M IH L G H IL FL L L L P V A A A Q T T PG E R S SL PA F Y P G T S G S C SG C G SL SL PL L A G L V A A D A V A S L L IV G A V F L C A R PR RSPAQ EDG KVY INM PG RG Y FLG RLV PRG RG A A EA A TRK Q RITETESPY Q ELQ G Q RSD V Y SD LN TQ RPY Y K R RK RS G SGATNFSLLK QAG DVEENPG PM GW IRG RRSRH SW EM SEFHN YNLDLKK SDFSTRW Q KQR CPW KSK CREN ASPF FFC C FIA V A M G IR FIIM V A IW SA V FL N SLFN Q E V Q IPL TE SY C G PC PK N W IC Y K N N C Y Q FFD E SK N W Y E SQ A SC M SQ N A SLLK V Y SK ED Q D LLK LV K SY H W M G LV H IPTN G SW Q W ED G SILSPN LLTIIEM Q K G D C A LY A SSFK G Y IEN C ST PN TY IC M Q R T V SEQ ID NO: 65 (Constructo 3)

M A LPVTALLLPLALLLH A A RPD Y K D D D D K Q TTPG ERSSLPA FY PG TSG SCSG CG SLSLPLLA G LV A A D A V A SLLI VGAVFYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGEGRGSLLTCG D V EE N PG PM IH L G H IL FL L LL PV A A A Q T TPG E R SSL PA FY PG T SG SC SG C G SLSLPLL A G LV A A D A V A SL LIV G A VFLCARPRRSPAQEDGKVYINM PGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPM GW IRGRRSRHSW EM SEFHNYN L D L K K SD FSTR W Q K Q R C PW K SK C R E N A SPFFFC C FIA V A M G IR FIIM V A IW SA V FL N SLFN Q E V Q IPL TE SY C G PCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGS IL SPN L L T IIE M Q K G D C A L Y A S S FK G Y IEN C STPN TY IC M Q RTV SEQ ID NO: 66 (Constructo 8)

M IH LG H ILFL LL LPV A A A Q T T PG E R SSL PA FY PG TSG SC SG C G SL SL PL L A G L V A A D A V A SLL IV G A V FLC A R PR RSPAQEDGKVYINM PGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRS GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPM GW IRGRRSRHSW EM SEFHNYNLDLKKSDFSTRW QKQRCPW KSKCRENASPF FFCCFIA V A M G IR FIIM V A IW SA V FLN SLFN Q EV Q IPLTESY C G PC PK N W IC Y K N N C Y Q FFD ESK N W Y ESQ A SC M SQ NASLLKV YSK EDQDLLKLVKSYHW M GLVHIPTNGSW QW EDGSILSPNLLTIIEM QKGDCALYASSFKGYIENC STPN TY IC M Q R TV R R K R SG SG EG R G SLLTC G D V EEN PG PM IH LG H ILFLLLLPV A A A Q TTPG ER SSLPA FY PG TS G SC SG C G SLSLPLLA G LV A A D A V A SLLIV G A V FLC K R G R K K LLY IFK Q PFM R PV Q TTQ EED G C SC R FPEEEEG G C EL SEQ ID NO: 67 (Constructo 9)

M IH LG H ILFLLL LPV A A A Q T T PG E R SSL PA FY PG TSG SC SG C G SL SL PL L A G L V A A D A V A SLL IV G A V FLC A R PR RSPAQEDGKVYINM PGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRS GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPM GW IRGRRSRHSW EM SEFHNYNLDLKKSDFSTRW QKQRCPW KSKCRENASPF FFC C FIA V A M G IRFIIM V A IW SA V FLN SLFN Q EV Q IPLTESY CG PCPK N W ICY K N N CY Q FFD ESK N W Y ESQ A SCM SQNASLLKVYS KEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILS PNLLT11EM QKGDCALYAS S FK GYIENC STPNTYICM QRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPM ALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGER SSLPA FY PG TSG SCSG CG SLSLPLLA G LV A A D A V A SLLIV G A V FLCK RG RK K LLY IFK Q PFM RPV Q TTQ EED G CS C R FPEEEEG G C EL SEQ ID NO: 68 (Constructo 10)

M IHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPR

RSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRS

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPWKSKCRENASPF

FFCCFIAVAMGIRFIIMVAIW SAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNW YESQASCM

SQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENC

STPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTS

GSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYR

KPEPACSP SEQ ID NO: 69 (Constructo 11)

MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPR

RSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRS

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPWKSKCRENASPF

FFCCFIAVAMGIRFIIMVAIW SAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCM

SQNAS LLKVYS KEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILS PNLLT11EMQKGDCALYASS FKGYIENC

STPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGER

SSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEE

G STIPIQ ED Y R K PEPA C SP SEQ ID NO: 70 (polipéptido codificante de SEQ ID NO: 60)

ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGG

AGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTG

GCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGG

CGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTG

CCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAG

CTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG SEQ ID NO: 71 (polipéptido codificante de SEQ ID NO: 61) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGAC GACGACGACAAGCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGC AGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCtGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATC GTGGGCGCCGTGTTCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAG CAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAAC ACCCAGAGGCCCTACTACAAG SEQ ID NO: 72 (polipéptido codificante de SEQ ID NO: 62) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGAC GACGACGACAAGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACACACACATGCCCTCTTctggccggCCTGGTGGCCGCCGAC GCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGAC GGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCC GAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGAC GTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG SEQ ID NO: 73 (polipéptido codificante de SEQ ID NO: 63) ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGAC GACGACGACAAGACCACAACACCTGCTCCTAGACCTCCCACCCCTGCTCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGC CTGAGACCCGAGGCCTGCAGACCCGCTGCTGGCGGCGCTGTGCATACCAGAGGCCTGGATTTCGCCTGCGACCTT ctggccggCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCC AGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTG GTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAG GAG C T G CAG G G C CAG CGGAGCGACGTGTACAGCGACCT GAACAC C CAGAG G C C C TAC TACAAG SEQ ID NO: 74 (polipéptido codificante de SEQ ID NO: 64/constructo 1/N1012) ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGG AGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTG GCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGG CGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTG CCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAG CTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCT GGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGG AT C C G G G GAC G GAG GAG C C G G CACAG C T G G GAGAT GAG C GAGT T C CACAAC TACAAC C T G GAC C T GAAGAAGAG C GACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTC TTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTC CTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGG AT C T G C TACAAGAACAAC T G C TAC CAGT T C T T C GAC GAGAG CAAGAAC T G GTAC GAGAG C CAG G C CAG C T G CAT G AG C CAGAAC G C CAG C C T G C T GAAG G T GTACAG CAAG GAG GAC CAG GAC C T G C T GAAG C T G GT GAAGAG C TAC CAC TGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTG CTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGC AG CAC C C C CAACAC C TACAT C T G CAT G CAG C G GAC C GT G SEQ ID NO: 75 (polipéptido codificante de SEQ ID NO: 65/constructo 3)

ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGAC

GACGACGACAAGCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGC

AGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCtGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATC

GTGGGCGCCGTGTTCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAG

CAG C G GAT CAC C GAGAC C GAGAG C C C C TAC CAG GAG C T G CAG G G C CAG C G GAG C GAC GT GTACAG C GAC C T GAAC

ACCCAGAGGCCCTACTACAAGCGGAGAAAGCGCtccGGCTCCGGCGAGGGCcgcGGCAGCCTGCTGACCTGCGGC

GACGTGGAAGAGAACCCCGGACCCATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCT

GCCCAAACAACACCCGGCGAGAGATCCTCCTTGCCCGCTTTCTATCCCGGAACATCCGGAAGCTGTtccggaTGT GGATCCCTTTCTTTGcctttgCTTGCTGGATTGGTCGCAGCTGACGCTGTCGCTTCCCTCCTTATTGTCGGAGCT GTCTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGG GGCAGGCGGaagcgctccGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAAC CCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAAC

CTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGG

GAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCC

ATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGC CCCTGCCC C AAGAAC T G GAT C T G C T AC AAGAAC AAC T G C T AC C AGT T C T T C GAC GAGAG C AAGAAC T G GT AC GAG AGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAG CTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGC ATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAG G G C TACAT C GAGAAC T G CAG CAC C C C CAACAC C TACAT C T G CAT G CAG C G GAC C GT G SEQ ID NO:76 (polipéptido codificante de SEQ ID NO: 66/Constructo 8)

ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGG

AGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTG

GCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGG

CGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTG

CCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAG

CTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCT

GGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGG

AT C C G G G GAC G GAG GAG C C G G CACAG C T G G GAGAT GAG C GAGT T C CACAAC TACAAC C T G GAC C T GAAGAAGAG C

GACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTC

TTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTC

CTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGG

AT C T G C TACAAGAACAAC T G C TAC CAGT T C T T C GAC GAGAG CAAGAAC T G GTAC GAGAG C CAG G C CAG C T G CAT G

AG C CAGAAC G C CAG C C T G C T GAAG GT GTACAG CAAG GAG GAC CAG GAC C T G C T GAAG C T G GT GAAGAG C TAC CAC

TGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTG

CTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGC

AG CAC C C C CAACAC C TACAT C T G CAT G CAG C G GAC C GT GAGAAGAAAGAGAAG C G G CAG C G G C GAG G G CAGAG G C

AGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACccATGATTCATCTCGGACATATTCTCTTTCTCTTG

CTCTTGCCTGTCGCTGCCGCTCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCT

GGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCT

CTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTC

ATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGC

GAGCTG SEQ ID NO:77 (polipéptido codificante de SEQ ID NO: 67/constructo 9)

ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGG

AGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTG

GCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGG

CGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTG

CCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAG

CTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCT

GGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGG

GACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTC

TTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTC

CTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGG

AT C T G C TACAAGAACAAC T G C TAC CAGT T C T T C GAC GAGAG CAAGAAC T G G TAC GAGAG C CAG G C CAG C T G CAT G

AGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCAC

TGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTG

CTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGC

AG CAC C C C CAACAC C TACAT C T G CAT G CAG C G GAC C G T GAGAAGAAAGAGAAG C G G CAG C G G C GAG G G CAGAG G C

A G C C T G C T G A C C T G C G G C G A C G T G G A G G A G A A C C C C G G A C c T a tg g c tc tg c c tg tg a c a g c tc tg c tg c tg c c t c tg g c t c t g c t g c tg c a c g c c g c t a g a c c c g a t t a t a a g g a c g a c g a c g a c a a g C A A A C A A C T C C C G G A G A A A G A

TCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTC

GCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTAAGAGAGGCAGA

AAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGC

TGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTG SEQ ID NO:78 (polipéptido codificante de SEQ ID NO: 68/constructo 10)

ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGG

AGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTG

GCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGG

CGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTG

CCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAG

CTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCT

GGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGG

GACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTC

TTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTC

CTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGG

TGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTG

CTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGC

AGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACccATGATTCATCTCGGACATATTCTCTTTCTCTTG

CTCTTGCCTGTCGCTGCCGCTCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCT

GGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCT

CTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTCAGAGGCGGAAGTACCGGAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAG

CCTGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGTCCCCGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACCGG

AAGCCCGAGCCTGCCTGCAGCCCC SEQ ID NO:79 (polipéptido codificante de SEQ ID NO: 69/Constructo 11)

ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGG

AGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTG

GCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGG

CGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTG

CCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAG

CTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCT

GGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGG

GACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTC

TTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTC

CTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGG

TGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTG

CTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGC

AG CAC C C C CAAC AC C TAC AT C T G CAT G CAG C G GAC C GT GAGAAGAAAGAGAAG C G G CAG C G G C GAG G G CAGAG G C

A G C C T G C T G A C C T G C G G C G A C G T G G A G G A G A A C C C C G G A C cT atggctc tgcctg tgacagctc tgctgctgcct c tg g c tc tg c tg c tg c a c g c c g c ta g a c c c g a t ta ta a g g a c g a c g a c g a c a a g C A A A C A A C T C C C G G A G A A A G A

TCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTC

GCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTCAGAGGCGGAAG

TACCGGAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAGCCTGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGTCCCCGGGAGGAGGAG

GGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACCGGAAGCCCGAGCCTGCCTGCAGCCCC SEQ ID NO: 80 (péptido A20FMDV2)

NAVPNLRGDLQVLAQKVART SEQ ID NO: 81 (péptido señal CD124)

MGWLCSGLLFPVSCLVLLQVASSGN SEQ ID NO: 82 (CD28 aa114-220)

IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLH

SDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS SEQ ID NO: 83 (CD247 aa52-164)

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIG

MKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 84 (SEQ ID NO: 1 de WO 2019/182425)

MGWSCIILFLVATATGVHSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKTSGYTFTDYSMHWVNQAP

GKGLKWMGWINTETGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARTAV

YWGQGTTLTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGSL

SWLQQKPDGTIKRLIYAASTLNSGVPKRFSGRRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYSS

YPWSFGGGTKLEIKEPKSPDKTHTCPPCPSHTQPLGVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCW

VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV

SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES

NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSL

SLGKFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGGRLVPRG

RGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRVKFSRSADAPAYQQGQN

QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK

GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 85 (SEQ ID NO: 9 de WO 2019/182425)

ARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG SEQ ID NO: 86 (SEQ ID NO: 11 de WO 2019/182425) GRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK SEQ ID NO: 87 (secuencia del polipéptido CXCR2 humano expresado en N1012_CXCR2)

M ED FNM ESD SFED FW KGEDLSN YSY SSTLPPFLLD AAPCEPESLEINK YFW IIYA LV FLLSLLGN SLVM LVILY

SRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIW AASKVNGW IFGTFLCKW SLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVH

ATRTLTQKRYLVKFICLSIW GLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDM GNNTANW RM LLRILPQSFGFIVPLL

IM LFCYGFTLRTLFKAHM GQKHRAM RVIFAW LIFLLCW LPYNLVLLADTLM RTQVIQETCERRNHIDRALDATE

IL G IL H SC L N PL IY A FIG Q K FR H G L L K IL A IH G L ISK D SL PK D SR PSFV G SSSG H T ST T L SEQ ID NO: 88 (secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 87)

a t g g a g g a t t t c a a t a t g g a g a g c g a c t c c t t c g a g g a t t t t t g g a a g g g c g a g g a c c t g t c t a a c t a c a g c t a t a g c t c c a c a c t g c c c c c t t t t c t g c t g g a t g c c g c c c c t t g t g a g c c a g a g t c c c t g g a g a t c a a c a a g t a c t t c g t g g t c a t c a t c t a t g c c c t g g t g t t t c t g c t g t c t c t g c t g g g c a a t a g c c t g g t c a t g c t g g t c a t c c t g t a c t c c a g g g t g g g c c g c t c t g t g a c c g a c g t g t a t c t g c t g a a t c t g g c c c t g g c c g a t c t g c t g t t c g c a c t g a c a c t g c c a a t c t g g g c a g c a a g c a a g g t g a a c g g c t g g a t c t t c g g c a c c t t t c t g t g c a a g g t g g t g t c t c t g c t g a a g g a g g t g a a c t t c t a c a g c g g c a t c c t g c t g c t g g c c t g t a t c t c c g t g g a c c g g t a t c t g g c c a t c g t g c a c g c c a c c a g g a c a c t g a c c c a g a a g c g g t a c c t g g t g a a g t t c a t c t g c c t g a g c a t c t g g g g a c t g t c c c t g c t g c t g g c c c t g c c t g t g c t g c t g t t t a g g c g c a c a g t g t a c t c t a g c a a c g t g t c t c c a g c c t g t t a t g a g g a t a t g g g c a a c a a t a c c g c c a a t t g g a g g a t g c t g c t g c g c a t c c t g c c a c a g a g c t t c g g c t t t a t c g t g c c c c t g c t g a t c a t g c t g t t c t g c t a c g g c t t t a c a c t g c g g a c c c t g t t c a a g g c c c a c a t g g g c c a g a a g c a c c g g g c c a t g a g a g t g a t c t t c g c c g t g g t g c t g a t c t t t c t g c t g t g c t g g c t g c c c t a t a a c c t g g t g c t g c t g g c c g a c a c a c t g a t g c g g a c c c a g g t c a t c c a g g a g a c a t g c g a g c g g a g a a a c c a c a t c g a c a g a g c c c t g g a t g c c a c c g a g a t c c t g g g c a t c c t g c a c t c c t g t c t g a a t c c t c t g a t c t a t g c c t t c a t c g g c c a g a a g t t t a g g c a c g g c c t g c t g a a g a t c c t g g c c a t c c a c g g c c t g a t c t c c a a g g a c t c t c t g c c c a a g g a t a g c c g c c c t t c c t t c g t g g g c t c c t c t a g c g g c c a c a c c t c t a c c a c a c t g

SEQ ID NO: 89 (secuencia de ácido nucleico de SFG N1012_CXCR2)

gatccggattagtccaatttgttaaagacaggatatcagtggtccaggctctagttttgact caacaatatcaccagctgaagcctatagagtacgagccatagataaaataaaagattttatt tagtctccagaaaaaggggggaatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaag taacgccattttgcaaggcatggaaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggtcaggaacagatggaacagctgaataTgggccaaacaggatatctgtggtaagcagtTcctg ccccggctcagggccaagaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatcTgtgg taagcagt.T.cctgccccggctcagggccaagaacagatggt.c;cccagatgcggtccagccct cagcag LIccLayayaaccatcagaty LL Lccaggg IgecceaagyacetgaaaLgaccc Lg tgccttatctgaactaaccaatcagtccgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgcccccc gagctcaacaaaagagcccacaacccctcactcggggcgccactcctccgattgactgagtc gccrgggtacccgtgtatccaataaaccctottgcagttgcatccgacttgtggtctcgctg ttccttgggagggtctcctctgagtgattgactacccgtcagcgggggtctttcacaTgcag catgtatcaaaattaatttggtttttcttcttaagtatttacattaaatggccatagTactt aaagttacattggcttccttgaaataaacatggagtattcagaatgtgtcataaatazztct aattttaagatagtatctccattggcTttctactttttcttttatttttttttgtccTctgt ellccall_yllyllyllgllylltg_llylllylllyllggl Lgy llyy llaalllc _LL.L taaagatcctacactatagttcaagczagactattagctactctgtaacccagggtgacctt gaagtcatgggtagcct.gctgttttagccttcccacatctaagattac5ggtatgagcT.atc atttttggratattgattgattgattgattgatgtgtgtgtgtgtgattgtgtttgtgcgtg tgattgtgcatatgtgtgtatggttgTgtgtgattgtgtgtatgtatgtttgtgtgtgattg tgtgtgtgTgattgtgcatgtgtgtgTgtgtgattgtgtttatgtgtatgattgtgtgTgtg tgt.gtgtgT.gtgtgtgtgt.gtgt.gtgT.gtgt.gtgtgttgt.gtat ata tatttatggtagtga yayyeaaeyeleegyeleayglgleayy LLgy LLLLlyayaeayay lellleacLLayclly gaattcacTggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaataccgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttcTcct tacgcatcTgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcsctctcagtacaatctgctcTgatg ccgcatagTtaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcTtgt ctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctcccggagctgcatgtgtcagag gttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctattr.Ttat aggttaatgtcatgataataatggttTcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaaTgtg cgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagaca ataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacaTTtcc gtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacg ctggtgaaagtaaaagatgctgaagaTcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaacTgga tctcaacagcggtaagatccttgacagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagca cttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactc ggtcgccgcatacactattctcagaaTqacttggttgagtactcaccagtcacaqaaaaqca tcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgaTaaca ctgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctttttTgcac aacatgggggatcatgtaactcgcctTgatcgttgggaaccgcagctgaatgaagccaTacc aaacgacgagcgtgacaccacgatccctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactaTtaa ctggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggaTaaa gttgcaqgaccacttctqcgctcgccccttccggc.tggctggtttattgctgataaaTCtgg agccqgtqaqcqtgggtctcqcqqtaTcattqcaqcactqgqcccagatqqtaaqcccTCCC gtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatc gctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcacaccaagtttactcaTatat actttagaTtgatttaaaacttcattTttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctTTttg aLaa Le LcaLgaccaaaa LcccLLaacg Lgag LLLLeyllccaclyay eyLeayaceeec La gaaaagatcaaaggatcttcttgagaTcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaac aaaaaaaccaccgctaccagc.ggtcgT ttgttt gccggatcaagagctaccaactctTTttc cgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtag ttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatccTgtt accagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgacagt taccggataaggcgcagcggtcgggcTgaacggggggttcgtgcacacagcccagctTggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcc cgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacga gggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctga cttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaa cgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgt tatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaa accgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgact ggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccag gctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttca cacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctttgctcttaggagtttcctaatacat cccaaactcaaatatataaagcatttgacttgttctatgccctagggggcggggggaagcta agccagctttttttaacatttaaaatgttaattccattttaaatgcacagatgtttttattt cataagggtttcaatgtgcatgaatgctgcaatattcctgttaccaaagctagtataaataa aaatagataaacgtggaaattacttagagtttctgtcattaacgtttccttcctcagttgac aacataaatgcgctgctgagaagccagtttgcatctgtcaggatcaatttcccattatgcca gtcatattaattactagtcaattagttgatttttatttttgacatatacatgtgaaagaccc cacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaaatacat aactgagaatagaaaagttcagatcaaggtcaggaacagatggaacagctgaatatgggcca aacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggaacagc tgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaa cagatggtccccagatgcggtccagccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttcca gggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttc tcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactc ggcgcgccagtcctccgattgactgagtcgcccgggtacccgtgtatccaataaaccctctt gcagttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgattgact acccgtcagcgggggtctttcatttgggggctcgtccgggatcgggagacccctgcccaggg accaccgacccaccaccgggaggtaagctggccagcaacttatctgtgtctgtccgattgtc tagtgtctatgactgattttatgcgcctgcgtcggtactagttagctaactagctctgtatc tggcggacccgtggtggaactgacgagttcggaacacccggccgcaaccctgggagacgtcc cagggacttcgggggccgtttttgtggcccgacctgagtcctaaaatcccgatcgtttagga ctctttggtgcaccccccttagaggagggatatgtggttctggtaggagacgagaacctaaa acagttcccgcctccgtctgaatttttgctttcggtttgggaccgaagccgcgccgcgcgtc ttgtctgctgcagcatcgttctgtgttgtctctgtctgactgtgtttctgtatttgtctgaa aatatgggcccgggctagactgttaccactcccttaagtttgaccttaggtcactggaaaga tgtcgagcggatcgctcacaaccagtcggtagatgtcaagaagagacgttgggttaccttct gctctgcagaatggccaacctttaacgtcggatggccgcgagacggcacctttaaccgagac ctcatcacccaggttaagatcaaggtcttttcacctggcccgcatggacacccagaccaggt cccctacatcgtgacctgggaagccttggcttttgacccccctccctgggtcaagccctttg tacaecetaagcctccgcctcctcttcctceatccgccccgtctctcccccttgaacctcct cgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcactccttctctaggcgcccccat atggccatatgagatcttatatggggcacccccgccccttgtaaacttccctgaccctgaca tgacaagagttactaacagcccctctctccaagctcacttacaggctctctacttagtccag cacgaagtctggagacctctggcggcagcctaccaagaacaactggaccgaccggtggtacc tcacccttaccgagtcggcgacacagtgtgggtccgccgacaccagactaagaacctagaac ctcgctggaaaggaccttacacagtcctgctgaccacccccaccgccctcaaagtagacggc atcgcagcttggatacacgccgcccacgtgaaggctgccgaccccgggggtggaccatcctc tagactgccatgatccacctgggccacatcctgttcctgctgctgctgcccgtggccgctgc ccagaccacccctggcgagcggagcagcctgcctgccttctaccctggcaccagcggcagct gcagcggctgcggcagcctgagcctgcccctgctggccggcctggtggccgccgacgccgtg gccagcctgctgatcgtgggcgccgtgttcctgtgcgccaggcccaggcggagccctgccca ggaggacggcaaggtgtacatcaacatgcccggccggggctacttcctgggcaggctggtgc ccaggggcaggggcgctgccgaggctgccacccggaagcagcggatcaccgagaccgagagc ccctaccaggagctgcagggccagcggagcgacgtgtacagcgacctgaacacccagaggcc ctactacaagaggcggaaaaggtctgggagtggggctaccaatttctctctcctcaagcaag ccggagacgttgaggaaaaccctggacccatgggctggatccggggacggaggagccggcac agctgggagatgagcgagttccacaactacaacctggacctgaagaagagcgacttcagcac ccggtggcagaagcagcggtgccccgtggtgaagagcaagtgccgggagaacgccagcccct tcttcttctgctgcttcatcgccgtggctatgggcatccggttcatcatcatggtggccatc tggagcgccgtgttcctgaacagcctgttcaaccaggaggtgcagatccccctgaccgagag ctactgcggcccctgccccaagaactggatctgctacaagaacaactgctaccagttcttcg acgagagcaagaactggtacgagagccaggccagctgcatgagccagaacgccagcctgctg aaggtgtacagcaaggaggaccaggacctgctgaagctggtgaagagctaccactggatggg cctggtgcacatccccaccaacggcagctggcagtgggaggacggcagcatcctgagcccca acctgctgaccatcatcgagatgcagaagggcgactgcgccctgtacgccagcagcttcaag ggctacatcgagaactgcagcacccccaacacctacatctgcatgcagcggacagtgcggag aaagagatccggatctggagagggaagaggaagcctgctgacctgcggcgacgtggaggaga acccaggacccatggaggatttcaatatggagagcgactccttcgaggatttttggaagggc gaggacctgtctaactacagctatagctccacactgcccccttttctgctggatgccgcccc ttgtgagccagagtccctggagatcaacaagtacttcgtggtcatcatctatgccctggtgt ttctgctgtctctgctgggcaatagcctggtcatgctggtcatcctgtactccagggtgggc cgctctgtgaccgacgtgtatctgctgaatctggccctggccgatctgctgttcgcactgac actgccaatctgggcagcaagcaaggtgaacggctggatcttcggcacctttctgtgcaagg tggtgtctctgctgaaggaggtgaacttctacagcggcatcctgctgctggcctgtatctcc gtggaccggtatctggccatcgtgcacgccaccaggacactgacccagaagcggtacctggt gaagttcatctgcctgagcatctggggactgtccctgctgctggccctgcctgtgctgctgt ttaggcgcacagtgtactctagcaacgtgtctccagcctgttatgaggatatgggcaacaat accgccaattggaggatgctgctgcgcatcctgccacagagcttcggctttatcgtgcccct gctgatcatgctgttctgctacggctttacactgcggaccctgttcaaggcccacatgggcc agaagcaccgggccatgagagtgatcttcgccgtggtgctgatctttctgctgtgctggctg ccctataacctggtgctgctggccgacacactgatgcggacccaggtcatccaggagacatg cgagcggagaaaccacatcgacagagccctggatgccaccgagatcctgggcatcctgcact cctgtctgaatcctctgatctatgccttcatcggccagaagtttaggcacggcctgctgaag atcctggccatccacggcctgatctccaaggactctctgcccaaggatagccgcccttcctt cgtgggctcctctagcggccacacctctaccacactgtgacagccactcgag

SEQ ID NO: 90 (proteína codificada por SEQ ID NO: 89 (incluye: (i) fusión del dominio intracelular DAP10/DAP12 de longitud completa; (ii) sitio de escisión de furina (r Rk R); (iii) enlazante SGSG; (i.v.) secuencia de P2A omitido; (v) NKG2D; (vi) sitio de escisión de furina (RRKR); (vii) enlazante SGSG; (viii) secuencia de T2A omitido; (ix) CXCR2)

MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPR

RSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRS

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPWKSKCRENASPF

FFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCM

SQNAS LLKVYS KEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILS PNLLT11EMQKGDCALYASS FKGYIENC

STPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDA

APCEPESLEINKYFWIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNG

WIFGTFLCKWSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRT

VYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAWLIFL

LCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLIS

KDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL

SEQ ID NO: 91 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 90)

ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAG

ACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAG

CCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCA

GGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTG

GTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCT

GCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTG

GGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGG

AGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTG

GCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCG

TGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTG

CAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTT

CGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGG

AGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAG

TGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAG

CAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACAGTGCGGAGAAAGAGAT

CCGGATCTGGAGAGGGAAGAGGAAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGACCCATGGAGGATTTCAAT

ATGGAGAGCGACTCCTTCGAGGATTTTTGGAAGGGCGAGGACCTGTCTAACTACAGCTATAGCTCCACACTGCCCCCTTT

TCTGCTGGATGCCGCCCCTTGTGAGCCAGAGTCCCTGGAGATCAACAAGTACTTCGTGGTCATCATCTATGCCCTGGTGT

TTCTGCTGTCTCTGCTGGGCAATAGCCTGGTCATGCTGGTCATCCTGTACTCCAGGGTGGGCCGCTCTGTGACCGACGTG

TATCTGCTGAATCTGGCCCTGGCCGATCTGCTGTTCGCACTGACACTGCCAATCTGGGCAGCAAGCAAGGTGAACGGCTG

GATCTTCGGCACCTTTCTGTGCAAGGTGGTGTCTCTGCTGAAGGAGGTGAACTTCTACAGCGGCATCCTGCTGCTGGCCT

GTATCTCCGTGGACCGGTATCTGGCCATCGTGCACGCCACCAGGACACTGACCCAGAAGCGGTACCTGGTGAAGTTCATC

TGCCTGAGCATCTGGGGACTGTCCCTGCTGCTGGCCCTGCCTGTGCTGCTGTTTAGGCGCACAGTGTACTCTAGCAACGT

GTCTCCAGCCTGTTATGAGGATATGGGCAACAATACCGCCAATTGGAGGATGCTGCTGCGCATCCTGCCACAGAGCTTCG

GCTTTATCGTGCCCCTGCTGATCATGCTGTTCTGCTACGGCTTTACACTGCGGACCCTGTTCAAGGCCCACATGGGCCAG

AAGCACCGGGCCATGAGAGTGATCTTCGCCGTGGTGCTGATCTTTCTGCTGTGCTGGCTGCCCTATAACCTGGTGCTGCT

GGCCGACACACTGATGCGGACCCAGGTCATCCAGGAGACATGCGAGCGGAGAAACCACATCGACAGAGCCCTGGATGCCA

CCGAGATCCTGGGCATCCTGCACTCCTGTCTGAATCCTCTGATCTATGCCTTCATCGGCCAGAAGTTTAGGCACGGCCTG

CTGAAGATCCTGGCCATCCACGGCCTGATCTCCAAGGACTCTCTGCCCAAGGATAGCCGCCCTTCCTTCGTGGGCTCCTC

T AG C G GC CACAC C T C T AC C AC AC T GT GACAGC CAC T C GAG

SEQ ID NO: 92 (secuencia de aminoácidos de una réplica del Cyad-01 CAR (NKG2D fusionada al dominio intracelular de CD3Z)

MRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI

GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQ

RCPWKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQ

FFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKG

DCALYASS FKGYIENCSTPNTYICMQRTV

SEQ ID NO: 93 (secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 92)

AT GAGAGT GAAGT T CAG CAG GAG C G CAGAC GCCCCcGCGTAC CAG CAG G G C CAGAAC CAG C T C TATAAC GAG C T C

AAT C TAG GAC GAAGAGAG GAGTAC GAT GT T T T G GACAAGAGAC GTGGCCGG GAC C C T GAGAT G G G G G GAAAG C C G

AGAAG GAAGAAC C C T CAG GAAG G C C T GTACAAT GAAC T G CAGAAAGATAA GAT G G C G GAG G C C TACAGT GAGAT T

GGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGAC

ACCTACGATGCATTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCATGGGCTGGATCCGCGGCCGCAGGAGCCGGCACAGC

T G G GAGAT GAG C GAGT T C CACAAC TACAAC C T G GAC C T GAAGAAGAG C GA C T T CAG CAC C C G GT G G CAGAAG CAG

CGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCt

ATGGGCATCCGGTTTATAATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTG

CAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAG

TTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTG

TACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACC

AACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGC

GACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATG

CAGCGGACCGTGtaa

SEQ ID NO: 94 (secuencia de ácido nucleico que codifica CYAD-01_10 - polipéptidos de SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 1)

ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGG

AGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTG

GCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGG

CGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGT GGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGAGAGTGAAGTTC AG CAG GAG C G CAGAC GCCCCcGCGTAC CAG CAG G G C CAGAAC CAG C T C TATAAC GAG C T CAAT C TAG GAC GAAGA

GAG GAGTAC GAT GT T T T G GACAAGAGAC GTGGCCGG GAC C C T GAGAT G G G G G GAAAG C C GAGAAG GAAGAAC C C T

CAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAG

CGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGgacacctacgatgcaTTG

CACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCATGGGCTGGATCCGCGGCCGCAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAG

TTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTG

AAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTT

ATAATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACC

GAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGC

AAGAAC T G GTAC GAGAG C CAG G C CAG C T G CAT GAG C CAGAAC G C CAG C C T G C T GAAG GT GTACAG CAAG GAG GAC

CAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAG

TGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTAC

GCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGtaa

SEQ ID NO: 95 (dominio NKG2D extracelular humano)

LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMG

LVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV

SEQ ID NO: 96 (dominio NKG2D extracelular humano)

IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLK LVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILS PNLLT11EMQKGDCALYASS FKGYIENCST PNTYICMQRTV

SEQ ID NO: 97 (SEQ ID NO: 95 menos 8 aminoácidos más N-terminales)

PLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNG SWQWEDGSILS PNLLT11EMQKGDCALYAS S FKGYIENCST PNTYICMQRTV

SEQ ID NO: 98 (dominio NKG2D TM del ratón; número de acceso UniProt: 054709)

WRVLAI ALAI RFTLNTLMW LAI

SEQ ID NO: 99 (dominio NKG2D TM del ratón)

KISPMFWRVLAIALAIRFTLNTLMWLAIFKETFQPV

SEQ ID NO: 100 (NKG2D de rata)

MSKCHNYDLKPAKWDTSQEHQKQRSALPTSRPGENGIIRRRSSIEELKISPLFWRVLVA

AMTIRFTVITLTWLAVFITLLCNKEVSVSSREGYCGPCPNDWICHRNNCYQFFNENKAWN

QSQASCLSQNSSLLKIYSKEEQDFLKLVKSYHWMGLVQSPANGSWQWEDGSSLSPNELTL

VKTPSGTCAVYGSSFKAYTEDCSNPNTYICMKRAV

SEQ ID NO: 101 (dominio NKG2DTM de rata; número de acceso de UniProt: 070215 aa 52-74)

LFWRVLVAAMTIRFTVITLTWL

SEQ ID NO: 102 (polipéptido N5)

MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRL VPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIH LGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSP AQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMKISPMFWRVLAIALAIRFTLNTLMWLAIFKE TFQPVLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKS YHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLT11EMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV

SEQ ID NO: 103 (polipéptido que codifica ácido nucleico de SEQ ID NO: 102)

ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGAC

GACGACGACAAGCTGAGACCCGTGCAGGCCCAGGCCCAGAGCGACTGCAGCTGCAGCACCGTGAGCCCCGGCGTG

CTGGCCGGCATCGTGATGGGCGACCTGGTGCTGACCGTGCTCATCGCCCTTGCCGTGTACTTCCTGGGCAGACTG

GT C C C CAG G G G CAGAG GAG C T G C C GAG GCCGCTAC CAGAAAG CAGAG GAT CAC C GAGACAGAGAG C C C C TAC CAG

GAG C T G CAG G G C CAGAGAT C C GAC GT GTACAG C GAC C T CAACAC C CAGAGAC C C TAT TACAAGAG G C G GAAG C G C

TCCGGCTCCGGCGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCCATGATCCAC

CTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAAACAACACCCGGCGAGAGATCCTCCTTG

CCCGCTTTCTATCCCGGAACATCCGGAAGCTGTTCCGGATGTGGATCCCTTTCTTTGCCTTTGCTTGCTGGATTG

GTCGCAGCTGACGCTGTCGCTTCCCTCCTTATTGTCGGAGCTGTCTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCT

GCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGAAGCGCTCCGGGAGTGGGGCTACC

AATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGACCCATGAAAATATCTCCAATGTTCGTT

GTTCGAGTCCTTGCTATAGCCTTGGCAATTCGATTCACCCTTAACACATTGATGTGGCTTGCCATTTTCAAAGAG

ACGTTTCAGCCAGTACTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCAAAA

AAT T G GAT C T G C TACAAGAACAAC T G C TAC CAGT T C T T C GAC GAGAG CAAGAAC T G GTAC GAGAG C CAG G C CAG C

TGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGC

TACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCC

AACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAG

AAC T G CAG CAC C C C CAACAC C TACAT C T G CAT G CAG C G GAC C GT G

SEQ ID NO: 104 (bisagra de IgG1 humana - aa 218-232 de UniProt: P0DOX5)

EPK SCDKTHTCPP CP

SEQ ID NO: 105 (secuencia de aminoácidos de CYAD-01_10 (NKG2D-CD3Z péptido omitido ribosómico DAP10))

M IH LG H ILFLLLLPV A A A Q TTPG ER SSLPA FY PG TSG SC SG C G SLSLPLLA G LV A A D A V A SLLIV G A V FLC A R PR RSPAQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRR EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL HM QALPPRM GW IRGRRSRHSW EM SEFHNYNLDLKKSDFSTRW QKQRCPW KSKCRENASPFFFCCFIAVAM GIRF IIM VAIW SAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNW ICYKNNCYQFFDESKNW YESQASCM SQNASLLKVYSKED QDLLKLVKSYHW M GLVHIPTNGSW QW EDGSILSPNLLTIIEM QKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICM QRTV

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula inmunosensible que comprende:

(a) un polipéptido NKG2D;

(b) un polipéptido de fusión que comprende (i) un polipéptido de activación de DNAX 10 (DAP10), o una variante funcional del mismo y (ii) un polipéptido de la proteína de activación de DNAX 12 (DAP12), o una variante funcional del mismo; y

(c) un polipéptido CXCR2.

2. La célula inmunosensible de la reivindicación 1, en la que cada uno del polipéptido NKG2D, el polipéptido DAP10, el polipéptido DAP12 y el polipéptido CXCR2 es un polipéptido de mamífero, opcionalmente en la que cada uno del polipéptido NKG2D, el polipéptido DAP 10, el polipéptido DAP12 y el polipéptido CXCR2 es un polipéptido humano.

3. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que

(i) la secuencia de aminoácidos del polipéptido NKG2D tiene al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 14, y/o

(ii) el polipéptido NKG2D es una variante funcional del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, opcionalmente en la que la variante funcional

(a) tiene una o más mutaciones puntuales que agregan, suprimen o sustituyen al menos uno de los aminoácidos de SEQ ID NO: 14,

(b) es una versión truncada del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o (c) es un polipéptido quimérico NKG2D.

4. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido de fusión tiene la fórmula, desde el extremo N al extremo C:

A-B-C-D-E,

en la que

A es una secuencia N-terminal opcional;

B es un polipéptido DAP10 o una variante funcional del mismo;

C es una secuencia enlazante opcional;

D es un polipéptido DAP12 o una variante funcional del mismo; y

E es una secuencia C-terminal opcional.

5. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la variante funcional del polipéptido DAP10, en la que la variante funcional del polipéptido DAP10

(i) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido DAP10 de SEQ ID NO: 1;

(ii) es una variante funcional de SEQ ID NO: 1 que tiene una o más (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) mutaciones puntuales que agregan, suprimen o sustituyen cualquiera de los aminoácidos del polipéptido DAP 10 de SEQ ID NO: 1; o

(iii) es una versión truncada del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, opcionalmente en la que la versión truncada de DAP 10 comprende o consiste en los aminoácidos 19-93, 19 69, 1-71, 19-71, 19-48, 49-69, 49-93 o 70-93 de SEQ ID NO: 1.

6. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el polipéptido DAP10 o la variante funcional del mismo comprende o consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-8.

7. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la variante funcional del polipéptido DAP12, en la que la variante funcional del polipéptido DAP12

(i) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido DAP12 de SEQ ID NO: 9;

(ii) es una variante funcional de SEQ ID NO: 9 que tiene una o más (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) mutaciones puntuales que agregan, suprimen o sustituyen cualquiera de los aminoácidos del polipéptido DAP12 de SEQ ID NO: 9; o

(iii) es una versión truncada del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, opcionalmente en la que la versión truncada de DAP12 comprende o consiste en los aminoácidos 22-113, 62 113, 22-61 o 41-61 de SEQ ID NO: 9.

8. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el polipéptido DAP12 o la variante funcional del mismo comprende o consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 9-13.

9. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido DAP10 o la variante funcional del mismo y el polipéptido DAP12 o la variante funcional del mismo están unidos por un enlazante, opcionalmente en la que el enlazante comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos citada en cualquiera de las SEQ ID NOs: 18-46, preferiblemente en la que el enlazante comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos citada en cualquiera de las SEQ ID NOs: 33 o 38-44.

10. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido de fusión comprende una secuencia N-terminal y/o una secuencia C-terminal, opcionalmente en la que la secuencia N-terminal o C-terminal comprende una o más de una etiqueta His, etiqueta FLAG, etiqueta Arg, etiqueta T7, etiqueta Strep, etiqueta S, un AviTag™, una etiqueta de aptámero, una etiqueta myc, una secuencia líder de CD8a, un endodominio 4-1BB, una etiqueta V5 o un endodominio CD27, preferiblemente en la que la secuencia N-terminal o C-terminal comprende una o más de una secuencia líder de CD8a, un endodominio 4-1BB, o un endodominio CD27.

11. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido de fusión comprende o consiste en la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 60 a 63.

12. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el polipéptido de fusión: (a) no comprende SEQ ID NO: 84; y/o

(b) no comprende un péptido anti-EpCAM; y/o

(c) no comprende SEQ ID NO: 85; y/o

(d) no comprende SEQ ID NO: 86; y/o

(e) no comprende ambas SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 86.

13. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido de fusión comprende o consiste en DAP 10 humano de longitud completa fusionado en su C-terminal al endodominio del polipéptido DAP12 humano, en la que el endodominio está codificado por los aminoácidos 62 113 de DAP12 humano, y/o, en la que el polipéptido de fusión tiene la secuencia de s Eq ID NO: 60.

14. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia de aminoácidos del polipéptido CXCR2 tiene al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de s Eq ID NO: 87, preferiblemente en la que el polipéptido CXCR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87.

15. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la célula inmunosensible es una célula T o una célula asesina natural (NK), preferiblemente en la que la célula inmunosensible es una célula T a p, una célula T y 6, una célula T CD4+, una célula T CD8+ o una célula asesina natural (NKT).

16. Una molécula de ácido nucleico que codifica:

(a) un polipéptido NKG2D;

(c) un polipéptido CXCR2.

17. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16, en la que la molécula de ácido nucleico es un polinucleótido quimérico, opcionalmente en la que la molécula de ácido nucleico codifica, desde 5' a 3', (i) DAP 10 humano en marco con el endodominio de DAP 12 humano; (ii) un primer sitio de escisión de proteasa; (iii) un primer enlazante; (iv) un primer péptido omitido ribosómico; (v) NKG2D humano; (vi) un segundo sitio de escisión de proteasa; (viii) un segundo enlazante; (viii) un segundo péptido omitido ribosómico; y (ix) CXCR2 humano.

18. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en la que la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 88, o tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 91.

19. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 16-18, opcionalmente en el que el vector es un vector lentiviral o un vector retroviral, preferiblemente en el que el vector es un vector retroviral SFG.

20. Un método para producir la célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende las etapas de:

(a) transducir una célula T o una célula asesina natural con la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 16-18 o un vector de la reivindicación 19; y

(b) cultivar la célula T o el célula asesina natural de modo que la célula transducida exprese un polipéptido n Kg 2D, un polipéptido de fusión DAP10/DAP 12 y un polipéptido CXCR2, en el que el polipéptido NKG2D y el polipéptido de fusión DAP10/DAP12 se asocian en la membrana celular.

21. La célula inmunosensible de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para su uso en el tratamiento o profilaxis del cáncer, opcionalmente en la que el cáncer es un cáncer de tumor sólido, preferiblemente seleccionado entre cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer linfoide, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, cáncer de tiroides, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado o cualquier combinación de los mismos.

22. Una célula inmunosensible que comprende:

(a) un polipéptido NKG2D quimérico que comprende un dominio extracelular de NKG2D humano o una variante del mismo y un dominio transmembrana de NKG2D murino o una variante del mismo;

(b) un polipéptido CXCR2; y

(c) al menos un polipéptido de la proteína de activación de DNAX 12 (DAP12) o una variante del mismo y al menos un polipéptido de la proteína de activación de DNAX 10 (DAP10) o una variante del mismo.

23. La célula inmunosensible de la reivindicación 22, en la que (i) el dominio extracelular NKG2D humano tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, o SEQ ID NO: 97, o es una variante que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 95, 96 o 97; y/o (ii) el dominio transmembrana NKG2D murino tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, S<e>Q ID NO: 100, o SEQ ID NO: 101, o es una variante que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 98, 99, 100 o 101.

24. La célula inmunosensible de la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en la que la célula comprende un polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 102.