ES2986902T3

ES2986902T3 - Formulaciones, kits y métodos altamente concentrados de baja viscosidad de anticuerpos inhibidores de MASP-2

Info

Publication number: ES2986902T3
Application number: ES17847485T
Authority: ES
Inventors: Gregory A Demopulos; Kenneth M Ferguson; William Joseph Lambert; John Steven Whitaker
Original assignee: Omeros Medical Systems Inc
Current assignee: Omeros Corp
Priority date: 2016-08-31
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2024-11-13
Anticipated expiration: 2037-08-30
Also published as: ECSP19021312A; DK3506886T3; SI3506886T1; UA122733C2; TWI730310B; ZA201901891B; US11628217B2; BR112019003479A2; CN109890367B; MY189411A; PH12019500365A1; EA201990598A1; TW201944983A; SG10202100697PA; JP2021105033A; SG11201901444PA; CA3035252C; KR102444154B1; AU2017321605A1; GEP20217252B

Abstract

La presente invención se refiere a formulaciones estables, de alta concentración y baja viscosidad de anticuerpos inhibidores de la MASP-2, kits que comprenden las formulaciones y métodos terapéuticos que utilizan las formulaciones y los kits para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de la MASP-2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones, kits y métodos altamente concentrados de baja viscosidad de anticuerpos inhibidores de MASP-2

Campo de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones estables de alta concentración y baja viscosidad de anticuerpo inhibidor de MASP-2, kits que comprenden las formulaciones y métodos terapéuticos que utilizan las formulaciones y kits para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Antecedentes

La terapia a base de anticuerpos se administra normalmente de forma regular y a menudo requiere la dosificación de varios mg/kg mediante inyección. Una forma preferida de suministro para tratar afecciones crónicas es la administración ambulatoria de anticuerpos monoclonales en dosis altas (varios mg por kg) mediante inyección subcutánea (sSC.) (Stockwin y Holmes, Expert Opin Biol Ther 3:1133-1152 (2003); Shireet al.,J Pharm Sci 93:1390-1402 (2004)). Son deseables formulaciones farmacéuticas muy concentradas de un anticuerpo terapéutico porque permiten la administración de volúmenes inferiores y/o menos administraciones que, por consiguiente, significan menos molestias para el paciente. Además, dichos volúmenes inferiores permiten el envasado de las dosis terapéuticas de un anticuerpo monoclonal en jeringas precargadas de dosis únicas individuales para autoadministración. El suministro s.c. mediante tecnología de jeringas o autoinyectores precargados permite la administración domiciliaria y mejor cumplimiento de la administración de fármacos por el paciente.

Sin embargo, el desarrollo de una formulación con una alta concentración de proteína supone retos relacionados con la estabilidad física y química de la proteína, así como dificultad con la fabricación, almacenamiento y suministro de la formulación de proteína (véase, por ejemplo, Wanget al.,J of Pharm Sci vol 96(1):1-26, (2007)). Un reto en el desarrollo de formulaciones de alta concentración de proteína es la viscosidad de la solución dependiente de la concentración. A una concentración de proteína dada, la viscosidad varía drásticamente en función de la formulación. En particular, se sabe que los anticuerpos monoclonales presentan perfiles de viscosidad-concentración peculiares y diversos que revelan un aumento exponencial marcado en la viscosidad de la solución con el aumento de la concentración de anticuerpo monoclonal (véase, por ejemplo, Connolly B.D.et al.,Biophysical Journal vol 103:69-78 (2012)). Otro reto con las formulaciones líquidas con alta concentración de anticuerpo monoclonal es la estabilidad física de la proteína (Alfordet al.,J. Pharm Sci 97:3005-3021 (2008); Salinaset al.,J Pharm Sci 99:82 -93 (2010); Sukumaret al.,Pharm Res 21:1087-1093 (2004)). Por lo tanto, la alta viscosidad de las formulaciones farmacéuticas de anticuerpo monoclonal en altas concentraciones, junto con la posibilidad de estabilidad reducida, puede impedir su desarrollo como productos adecuados para suministro subcutáneo y/o intravenoso.

El sistema del complemento juega un papel en la respuesta inflamatoria y se activa como resultado de daño tisular o infección microbiana. La activación del complemento debe estar estrictamente regulada para garantizar el direccionamiento selectivo a los microorganismos invasores y evitar daño autoinflingido (Ricklinet al.,Nat. Immunol. 11:785-797, 2010). Actualmente, está ampliamente aceptado que el sistema del complemento puede ser activado a través de tres vías distintas: la vía clásica, la vía de las lectinas y la vía alternativa. La vía clásica es desencadenada normalmente por un complejo compuesto por anticuerpos del hospedador unidos a una partícula extraña (es decir, un antígeno) y generalmente requiere exposición previa a un antígeno para la generación de una respuesta de anticuerpos específica. Dado que la activación de la vía clásica depende de una respuesta inmunitaria adaptativa previa por el hospedador, la vía clásica es parte del sistema inmunitario adquirido. En cambio, tanto la vía de las lectinas como la alternativa son independientes de la inmunidad adaptativa y son parte del sistema inmunitario innato.

Se ha demostrado que la serina proteasa-2 asociada a lectina de unión a manano (MASP-2) es necesaria para la función de la vía de las lectinas, una de las principales vías de activación del complemento (Vorup-Jensenet al.,J Immunol 165:2093-2100, 2000; Ambruset al.,J Immunol 170:1374-1382, 2003; Schwaebleet al.,PNAS 108:7523-7528, 2011). Es importante destacar que la inhibición de MASP-2 no parece interferir con la vía clásica de activación del complemento dependiente de anticuerpos, que es un componente crítico de la respuesta inmunitaria adquirida a la infección. Como se describe en la patente de EE. UU. n.° 9,011,860 (cedida a Omeros Corporation), se ha generado OMS646, un anticuerpo monoclonal completamente humano que se dirige a MASP-2 humana, que se une a MASP-2 humana con alta afinidad y bloquea la actividad del complemento de la vía de las lectinas y, por lo tanto, es útil para tratar diversas enfermedades y trastornos asociados a la vía del complemento de las lectinas.

Como se describe además en la patente de EE. UU. n.° 7,919,094, la patente de EE. UU. n.° 8,840,893, la patente de EE. UU. n.° 8,652,477, la patente de EE. UU. n.° 8,951,522, la patente UU. n.° 9,011,860; la patente de EE. UU. n.° 9,644,035, las solicitudes de patente de EE. UU. de n.° de publicación US2013/0344073, US2013/0266560, US 2015/0166675; US2017/0189525; y la solicitudes de patente de EE. UU. en tramitación con la presente de n.° de serie 15/476,154, 15/347,434, 15/470,647, 62/315,857, 62/275,025 y 62/527,926 (cada una de las cuales está cedida a Omeros Corporation, el cesionario de la presente solicitud), se ha implicado a la activación del complemento dependiente de MASP-2 como contribuyente a la patogénesis de numerosos estados de enfermedad agudos y crónicos. Por lo tanto, existe una necesidad de una formulación estable de alta concentración y baja viscosidad de un anticuerpo monoclonal contra MASP-2 que sea adecuada para administración parenteral (por ejemplo, subcutánea), para el tratamiento de sujetos que padecen enfermedades y trastornos asociados a la vía del complemento de MASP-2.

Compendio

La presente invención se expone en las reivindicaciones de la presente memoria. Otras divulgaciones de la presente memoria son para la asistencia al experto en la materia en la comprensión y puesta en práctica de la presente invención. La presente invención proporciona una formulación farmacéutica estable cuando se almacena entre 2 °C y 8 °C durante al menos seis meses y que tiene una viscosidad de entre 2 y 50 mPa-s (centipoise (cP)) cuando se mide a 25 °C, con una velocidad de cizalladura en el intervalo de 100 000-250000 l/seg, adecuada para administración parenteral a un sujeto mamífero, que comprende: (a) una solución acuosa que comprende un sistema de tampón que tiene un pH de 5,0 a 7,0, en donde el sistema de tampón comprende al menos un agente de tamponamiento seleccionado del grupo que consiste en citrato o histidina; (b) un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que se une específicamente a MASP-2 humana y comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, y dicho anticuerpo o fragmento del mismo está en una concentración de 50 mg/mL a 250 mg/mL; y (c) un agente modificador de la tonicidad en una cantidad suficiente para que la formulación sea hipertónica.

En la presente memoria se da a conocer una formulación farmacéutica estable adecuada para administración parenteral a un sujeto mamífero, que comprende: (a) una solución acuosa que comprende un sistema de tampón que tiene un pH de 5,0 a 7,0; y (b) un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que se une específicamente a MASP-2 humana en una concentración de aproximadamente 50 mg/mL a aproximadamente 250 mg/mL, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende CDR-H1,<c>D<r>-H2 y CDR-H3 de SEQ ID NO: 2 y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de SEQ ID NO: 3, o una variante del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos 95 % de identidad a SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos 95 % de identidad a SEQ ID NO: 3; en donde la formulación tiene una viscosidad de entre 2 y 50 mPa-s (centipoise (cP)), y en donde la formulación es estable cuando se almacena entre 2 °C y 8 °C durante al menos un mes. En algunos casos, la concentración del anticuerpo en la formulación es de aproximadamente 150 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL. En algunos casos, la viscosidad de la formulación es menos de 25 mPa-s (centipoise (cP)).

En algunos casos, el sistema de tamponamiento comprende histidina. En algunos casos, el sistema de tamponamiento comprende citrato. En algunos casos, la formulación comprende además un excipiente, tal como un agente modificador de la tonicidad, en una cantidad suficiente para que la formulación sea hipertónica. En algunos casos, la formulación comprende además un tensioactivo. En algunos casos, la formulación comprende además una enzima hialuronidasa en una cantidad eficaz para aumentar la dispersión y/o absorción del anticuerpo después de la administración subcutánea.

En otro caso, la formulación está contenida dentro de un dispositivo de administración subcutánea, tal como una jeringa precargada.

En otro caso, la presente divulgación proporciona un kit que comprende un envase precargado que contiene la formulación.

En otro caso, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica para utilización en el tratamiento de un paciente que padece, o tiene riesgo de desarrollar, una enfermedad o afección dependiente de MASP-2, en donde la composición es una forma farmacéutica estéril de un solo uso que comprende de aproximadamente 350 mg a aproximadamente 400 mg (es decir, 350 mg, 360 mg, 370 mg, 380 mg, 390 mg o 400 mg) de anticuerpo inhibidor de MASP-2, en donde la composición comprende de aproximadamente 1,8 mL a aproximadamente 2,2 mL (es decir, 1,8 mL, 1,9 mL, 2,0 mL, 2,1 mL o 2,2 mL) de una formulación de anticuerpo de 185 mg/mL, tal como se da a conocer en la presente memoria, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; y en donde la formulación es estable cuando se almacena entre 2 °C y 8 °C durante al menos seis meses. En algunos casos, la enfermedad o afección dependiente de MASP-2 se selecciona del grupo que consiste en SUHa, MAT-TCMH, NIgA y nefritis lúpica (NL).

También se describe en la presente memoria un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno susceptible de tratamiento con un anticuerpo inhibidor de MASP-2 que comprende administrar la formulación que comprende un anticuerpo MASP-2, como se da a conocer en la presente memoria.

Descripción de los dibujos

La FIGURA 1A ilustra gráficamente la cantidad de deposición de complejo de ataque a la membrana (CAM) dependiente de la vía de las lectinas en presencia de diferentes cantidades de anticuerpo monoclonal contra MASP-2 humana (OMS646), que demuestra que OMS646 inhibe la deposición de CAM mediada por lectinas con un valor de CI<50>de aproximadamente 1 nM, como se describe en el Ejemplo 1;

la FIGURA 1B ilustra gráficamente la cantidad de deposición de CAM dependiente de la vía clásica en presencia de diferentes cantidades de anticuerpo monoclonal contra MASP-2 humana (OMS646), que demuestra que OMS646 no inhibe la deposición de CAM mediada por la vía clásica, como se describe en el Ejemplo 1;

la FIGURA 1C ilustra gráficamente la cantidad de deposición de CAM dependiente de la vía alternativa en presencia de anticuerpo monoclonal contra MASP-2 humana (OMS646), que demuestra que OMS646 no inhibe la deposición de CAM mediada por la vía alternativa, como se describe en el Ejemplo 1;

la FIGURA 2A ilustra gráficamente los resultados del análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) para el cribado de excipientes de la formulación de OMS646, que muestra el diámetro de partícula general observado para formulaciones que contienen diversos excipientes candidatos, como se describe en el Ejemplo 2; la FIGURA 2B ilustra gráficamente los resultados del análisis de DLS para el cribado de excipientes de la formulación de OMS646, que muestra la polidispersidad general observada para formulaciones que contienen diversos excipientes candidatos, como se describe en el Ejemplo 2;

la FIGURA 3 ilustra gráficamente los resultados del análisis de viscosidad de un intervalo de concentraciones de OMS646 en diversas formulaciones como se mide a pH 5,0 y pH 6,0, como se describe en el Ejemplo 2; la FIGURA 4 ilustra gráficamente el porcentaje de recuperación de proteína después del intercambio de tampón para el estudio de solubilidad/viscosidad de OMS646 con diversas formulaciones candidatas, como se describe en el Ejemplo 2;

la FIGURA 5 ilustra gráficamente la viscosidad (como se determina mediante ajuste exponencial de los datos de viscosidad) frente a la concentración de proteína para el estudio de solubilidad/viscosidad de OMS646 con diversas formulaciones candidatas, como se describe en el Ejemplo 2;

la FIGURA 6 ilustra gráficamente los datos de viscosidad normalizados a la concentración de proteína para el estudio de viscosidad con diversas formulaciones candidatas de OMS646, como se describe en el Ejemplo 2; la FIGURA 7A ilustra gráficamente la carga promedio (lbf) de tres formulaciones de OMS646 candidatas en un estudio de jeringabilidad que utiliza agujas 27GA de 31,75 mm (1,25"), 25GA de 25,4 mm (1") y 25GA de pared delgada de 25,4 mm (1"), como se describe en el Ejemplo 3; y

la FIGURA 7B ilustra gráficamente la carga máxima (lbf) de tres formulaciones de OMS646 candidatas en un estudio de jeringabilidad que utiliza agujas 27GA (1,25"), 25GA (1") y 25GA de pared delgada (1"), como se describe en el Ejemplo 3.

Descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 proteína MASP-2 humana (madura)

SEQ ID NO: 2: polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) de OMS646

SEQ ID NO: 3: polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) de OMS646

SEQ ID NO: 4: polipéptido de longitud completa de cadena pesada de IgG4 mutada de cadena pesada de OMS646

SEQ ID NO: 5: polipéptido de longitud completa de cadena ligera de OMS646

SEQ ID NO: 6: ADN que codifica polipéptido de cadena pesada de longitud completa de OMS646

SEQ ID NO: 7: ADN que codifica polipéptido de cadena ligera de longitud completa de OMS646.

Descripción detallada

I. Definiciones

A menos que se definan específicamente en la presente memoria, todos los términos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entenderían los expertos en la materia de la presente invención. Las definiciones siguientes se proporcionan con el fin de proporcionar claridad en lo que respecta a los términos como se utilizan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones para describir la presente invención.

Se pueden utilizar técnicas estándar de ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se pueden realizar según las especificaciones del fabricante, como se llevan a cabo habitualmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Estas, y técnicas y procedimientos relacionados, se pueden realizar generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrooket al.,2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. y John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (compilado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); u otras publicaciones de Current Protocol relevantes y otras referencias similares. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, biología molecular, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descrita en la presente memoria es aquellos bien conocida y utilizada habitualmente en la técnica. Se pueden utilizar técnicas estándar de tecnología recombinante, biología molecular, microbiología, síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y suministro farmacéutico, y tratamiento de pacientes.

El término “formulación farmacéutica” se refiere a un preparado que está en forma tal que permite que la actividad biológica del agente activo (por ejemplo, anticuerpo inhibidor de MASP-2) sea eficaz para el tratamiento y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto en el que se administraría la formulación. Dichas formulaciones son estériles. En un caso, la formulación farmacéutica es adecuada para administración parenteral, tal como administración subcutánea.

El término “MASP-2” se refiere a la serina proteasa-2 asociada a lectina de unión a manano. La proteína MASP-2 humana (madura) se expone como SEQ ID NO: 1.

El término “activación del complemento dependiente de MASP-2” comprende la activación dependiente de MASP-2 de la vía de las lectinas, que se produce en condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca++), que conduce a la formación de la convertasa de C3 C4b2a de la vía de las lectinas y posteriormente, tras la acumulación del producto de escisión de C3 C3b, a la convertasa de C5 C4b2a(C3b)n.

El término “vía de las lectinas” se refiere a la activación del complemento que se produce a través de la unión específica de proteínas de unión a carbohidratos séricas y no séricas que incluyen la lectina de unión a manano (MBL), CL-11 y las ficolinas (ficolina H , ficolina M o ficolina L).

El término “vía clásica” se refiere a la activación del complemento que es desencadenada por un anticuerpo unido a una partícula extraña y requiere la unión de la molécula de reconocimiento C1q.

El término “anticuerpo inhibidor de MASP-2” se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a MASP-2 e inhibe eficazmente la activación del complemento dependiente de MASP-2 (por ejemplo, OMS646). Los anticuerpos inhibidores de MASP-2 útiles en el método de la presente divulgación pueden reducir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más de 20 %, tal como más de 30 %, o más de 40 %, o más de 50 %, o más de 60 %, o más de 70 %, o más de 80 %, o más de 90 %, o más de 95 %.

El término “anticuerpo monoclonal OMS646” se refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 2 y que comprende CDR- L1, CDR-L2 y CDR-L3 de la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 3. Este anticuerpo particular es un ejemplo de un anticuerpo inhibidor de MASP-2 que se une específicamente a MASP-2 e inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Un “anticuerpo monoclonal” se refiere a una población homogénea de anticuerpos en donde el anticuerpo monoclonal está compuesto por aminoácidos (de origen natural y de origen no natural) que están implicados en la unión selectiva de un epítopo. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos para el antígeno diana. El término “anticuerpo monoclonal” no solo abarca anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv), Fv monocatenario (scFv), variantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad y capacidad de unión a un epítopo requeridas. No pretende estar limitado en lo que respecta a la fuente del anticuerpo o la manera en la que se fabrica (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.). El término incluye inmunoglobulinas completas, así como los fragmentos, etc., descritos anteriormente en la definición de “anticuerpo”.

El término “fragmento de anticuerpo” se refiere a una porción derivada de, o relacionada con, un anticuerpo de longitud completa, tal como, por ejemplo, un anticuerpo inhibidor de MASP-2, que generalmente incluye la región variable o de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos ilustrativos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab)<2>, F(ab<')2>y Fv; fragmentos scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Como se emplea en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo “Fv monocatenario” o “scFv” comprende los dominios V<h>y V<l>de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido de Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios V<h>y V<l>, el cual permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno.

El término “región CDR” o “CDR” está destinado indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, como definen Kabatet al.,1991 (Kabat, E. A.et al.,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a edición y ediciones posteriores. Un anticuerpo contiene habitualmente 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El término CDR se utiliza en la presente memoria con el fin de indicar, según el caso, una de estas regiones, o varias, o incluso la totalidad de estas regiones que contienen la mayor parte de los residuos de aminoácido responsables de la unión, mediante afinidad del anticuerpo por el antígeno, del epítopo que reconoce.

Como se emplea en la presente memoria, el término “unión específica” se refiere a la capacidad de un anticuerpo de unirse preferentemente a un analito particular que está presente en una mezcla homogénea de diferentes analitos. En determinados casos, una interacción de unión específica discriminará entre analitos deseables e indeseables en una muestra, en algunos casos, más de aproximadamente 10 a 100 veces o más (por ejemplo, más de aproximadamente 1000 o 10000 veces). En determinados casos, la afinidad entre un agente de captura y un analito, cuando están unidos específicamente en un complejo de agente de captura/analito, está caracterizada por una K<d>(constante de disociación) de menos de aproximadamente 100 nM, o menos de aproximadamente 50 nM, o menos de aproximadamente 25 nM, o menos de aproximadamente 10 nM, o menos de aproximadamente 5 nM, o menos de aproximadamente 1 nM.

El término “anticuerpo aislado” se refiere a un anticuerpo que ha sido identificado y separado, y/o recuperado y/o purificado, a partir de un componente de su entorno natural o sistema de expresión en cultivo celular. En casos preferidos, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de 95 % en peso de anticuerpo y, de la forma más preferible, más de 99 % en peso; como se determina mediante un método adecuado para medir la concentración de proteína, tal como, por ejemplo, el método de Lowry o la absorbancia a DO280; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de cubeta giratoria; o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, utilizando tinción con azul de Coomassie o, preferiblemente, plata. Habitualmente, un anticuerpo aislado para utilización en las formulaciones dadas a conocer en la presente memoria se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Como se emplean en la presente memoria, los residuos de aminoácido se abrevian como se indica a continuación: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), tirosina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

En el sentido más amplio, los aminoácidos de origen natural se pueden dividir en grupos sobre la base de la característica química de la cadena lateral de los respectivos aminoácidos. Por aminoácido “hidrófobo” se entiende Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys o Pro. Por aminoácido “hidrófilo” se entiende Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg o His. Este agrupamiento de aminoácidos se puede subclasificar además como se indica a continuación. Por aminoácido “hidrófilo no cargado” se entiende Ser, Thr, Asn o Gln. Por aminoácido “ácido” se entiende Glu o Asp. Por aminoácido “básico” se entiende Lys, Arg o His.

Como se emplea en la presente memoria, el término “sustitución de aminoácidos conservadora” se ilustra mediante una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los grupos siguientes: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina.

Como se emplea en la presente memoria, “un sujeto” incluye todos los mamíferos, que incluyen, sin limitación, humanos, primates no humanos, perros, gatos, caballos, ovejas, cabras, vacas, conejos, cerdos y roedores.

El término “farmacéuticamente aceptable”, en lo que respecta a un excipiente en una formulación farmacéutica, significa que el excipiente es adecuado para administración a un sujeto humano.

El término “administración subcutánea” se refiere a la administración de una formulación bajo todas las capas de la piel de un sujeto.

El término “tampón” se refiere a una solución tamponada que resiste cambios de pH por la acción de sus componentes de conjugados ácido-base. El tampón de la presente divulgación tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 8; preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 7; y de la forma más preferible tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5. Los ejemplos de tampones que controlarán el pH en este intervalo incluyen acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato, y otros tampones de ácidos orgánicos. Un “agente de tamponamiento” es un compuesto que se utiliza para producir soluciones tamponadas.

El término “histidina” incluye específicamente L-histidina, a menos que se especifique de otro modo.

El término “ isotónica” se refiere a una formulación que tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas tendrán generalmente una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm/KgH<2>O. La isotonicidad se puede medir utilizando un osmómetro de presión de vapor o de depresión del punto de congelación, por ejemplo.

El término “hipertónica” se refiere a una formulación con una presión osmótica por encima de la humana (es decir, mayor de 350 mOsm/KgH<2>O).

El término “agente modificador de la tonicidad” se refiere a un agente farmacéuticamente aceptable adecuado para proporcionar una formulación isotónica o, en algunos casos, hipertónica.

El término “estéril” se refiere a un producto farmacéutico que es aséptico o está exento de bacterias, hongos u otros microorganismos viables, que se puede lograr mediante cualquier medio adecuado, tal como, por ejemplo, una formulación que se ha procesado y llenado asépticamente, o filtrado a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la preparación de la formulación, y llenado.

El término “formulación estable” se refiere al mantenimiento del nivel de pureza de partida durante un periodo de tiempo. En otras palabras, si una formulación es al menos 95 % pura, tal como al menos 96 % pura, al menos 97 % pura, al menos 98 % pura o al menos 99 % pura, en lo que respecta a una especie de anticuerpo dada (por ejemplo, anticuerpo inhibidor de MASP-2) en el momento 0, la estabilidad es una medida de cómo de bien y durante cuánto tiempo conserva sustancialmente este nivel de pureza la formulación (por ejemplo, sin formación de otras especies, tales como porciones fragmentadas (BPM) o agregados de la especie pura (APM)). Una formulación es estable si el nivel de pureza no disminuye sustancialmente cuando se almacena a aproximadamente 2-8 °C durante un periodo de tiempo dado, tal como al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses o al menos 24 meses. Por “no disminuye sustancialmente” se entiende que el nivel de pureza de la formulación cambia en menos de 5 %, tal como en menos de 4 %, o en menos de 3 %, o en menos de 2 % o en menos de 1 % por periodo de tiempo (por ejemplo, durante 6 meses, durante 9 meses, durante 12 meses o durante 24 meses). En un caso, una formulación estable es estable a una temperatura de 2-8 °C durante un periodo de al menos seis meses. En un caso preferido, una formulación estable es estable a una temperatura de 2-8 °C durante un periodo de al menos un año o durante un periodo de al menos dos años. En un caso, la formulación es estable si el anticuerpo inhibidor de MASP-2 permanece al menos 95 % monomérico durante el almacenamiento de 2 °C a 8 °C durante al menos un mes, o durante al menos seis meses, o durante al menos 12 meses, como se determina mediante SEC-HPLC.

El término “conservante” se refiere a un compuesto que puede ser incluido en una formulación para reducir esencialmente el crecimiento o contaminación bacterianos. Los ejemplos no limitantes de posibles conservantes incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos, tales como alcohol fenílico, butílico y bencílico, alquilparabenos, tales como metil- o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol.

El término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte en una formulación que imparte una propiedad física beneficiosa a una formulación, tal como mayor estabilidad de la proteína y/o viscosidad reducida. Los ejemplos de excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica), aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, glicina e histidina), sacáridos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, maltosa y trehalosa), polioles (por ejemplo, manitol y sorbitol), ácidos grasos y fosfolípidos (por ejemplo, sulfonatos y caprilato de alquilo).

El término “sustancialmente exenta” significa que no hay ninguna sustancia presente o solo están presentes trazas mínimas de la sustancia que no tienen ningún efecto sustancial sobre las propiedades de la composición. Si se hace referencia a ninguna cantidad de una sustancia, se debe entender como “ninguna cantidad detectable”.

El término “viscosidad” se refiere a la medida de la resistencia de un fluido que está siendo deformado mediante esfuerzo de cizalladura o esfuerzo de tracción; se puede evaluar utilizando un viscosímetro (por ejemplo, un viscosímetro de bola rodante) o un reómetro. A menos que se indique de otro modo, la medición de la viscosidad (mPa-s (centipoise (cP)) es aquella a aproximadamente 25 °C con una velocidad de cizalladura en el intervalo de 100000 a 250000 1/s.

El término “administración parenteral” se refiere a una vía de administración distinta a la de los intestinos e incluye la inyección de una forma farmacéutica en el cuerpo mediante una jeringa u otro dispositivo mecánico, tal como una bomba de infusión. Las vías parenterales pueden incluir las vías de administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. La inyección subcutánea es una vía de administración preferida.

El término “tratamiento” se refiere al tratamiento terapéutico y/o a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen los sujetos que ya tienen la enfermedad, así como aquellos en los que se debe prevenir la enfermedad. Por tanto, en la presente memoria, el paciente que se va a tratar puede haber sido diagnosticado como que tiene la enfermedad o puede estar predispuesto o ser propenso a la enfermedad.

El término “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad de una sustancia que proporciona el efecto deseado. En el caso de un principio activo farmacéutico, es la cantidad de ingrediente activo eficaz para tratar una enfermedad en el paciente. En el caso de un ingrediente de la formulación, por ejemplo, una enzima hialuronidasa, una cantidad eficaz es la cantidad necesaria para aumentar la dispersión y absorción del anticuerpo inhibidor de MASP-2 coadministrado de manera tal que el anticuerpo inhibidor de MASP-2 pueda actuar de una manera terapéuticamente eficaz como se ha indicado anteriormente.

Como se emplea en la presente memoria, el término “aproximadamente” sirve para especificar que el valor específico proporcionado puede variar hasta un determinado grado, tal como una variación en el intervalo de ±10 %, preferiblemente ± 5 %, de la forma más preferible ±2 % están incluidos en el valor dado. Por ejemplo, la expresión “una formulación farmacéutica que tiene aproximadamente 200 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2” significa que la formulación puede tener de 180 mg/mL a 220 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646). Cuando se indican intervalos, los extremos están incluidos en el intervalo, a menos que se indique de otro modo o sea evidente de otro modo a partir del contexto.

Como se emplean en la presente memoria, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen casos plurales, a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un excipiente” incluye una pluralidad de dichos excipientes y equivalentes de los mismos conocidos para los expertos en la materia; la referencia a “un agente” incluye un agente, así como dos o más agentes; la referencia a “un anticuerpo” incluye una pluralidad de dichos anticuerpos y la referencia a “una región de armazón” incluye la referencia a una o más regiones de armazón y equivalentes de las mismas conocidos para los expertos en la materia, y así sucesivamente.

En la presente memoria descriptiva, cada caso se debe aplicar por analogía a todos los demás casos, a menos que se indique expresamente de otro modo. Se contempla que cualquier caso comentado en la presente memoria descriptiva se puede implementar en lo que respecta a cualquier método, kit, reactivo o composición de la presente divulgación, y viceversa. Además, las composiciones de la presente divulgación se pueden utilizar para lograr métodos de la presente divulgación.

II. Resumen general de la invención

En la presente memoria se describen formulaciones farmacéuticas de anticuerpo inhibidor de MASP-2 estables de alta concentración y baja viscosidad adecuadas para administración parenteral (por ejemplo, administración subcutánea) y también adecuadas para dilución antes de la administración intravenosa. Son deseables formulaciones farmacéuticas de anticuerpo terapéutico muy concentradas porque permiten la administración volúmenes inferiores y/o menos administraciones que, por consiguiente, significan menos molestias para el paciente. Además, dichos volúmenes inferiores permiten el envasado de las dosis terapéuticas de anticuerpo inhibidor de MASP-2 en jeringas o viales precargados de dosis únicas individuales para autoadministración. Las formulaciones de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación comprenden una solución acuosa que comprende un sistema de tampón que tiene un pH de 4,0 a 8,0, más preferiblemente que tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, y un anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646) o fragmento de unión a antígeno del mismo en una concentración de aproximadamente 50 mg/mL a aproximadamente 250 mg/mL. En casos preferidos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646) está presente en las formulaciones de alta concentración adecuadas para administración subcutánea en una concentración de aproximadamente 100 mg/mL a aproximadamente 250 mg/mL. En casos particulares, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646) está presente en las formulaciones de alta concentración en una concentración de aproximadamente 150 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL, tal como aproximadamente 175 mg/mL a aproximadamente 195 mg/mL, tal como aproximadamente 185 mg/mL.

En diversos casos, las formulaciones farmacéuticas comprenden además, además del anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y el sistema de tampón, uno o más excipientes, tales como un agente modificador de la tonicidad (por ejemplo, un aminoácido con una cadena lateral cargada), y opcionalmente un tensioactivo no iónico. En algunos casos, las formulaciones farmacéuticas de conformidad con la presente divulgación comprenden además una enzima hialuronidasa.

Una ventaja significativa de las formulaciones farmacéuticas de anticuerpo inhibidor de MASP-2 muy concentradas de la presente invención es su baja viscosidad a concentraciones de proteína altas. Como saben los expertos en la materia, la alta viscosidad de las formulaciones farmacéuticas de anticuerpo monoclonal a concentraciones >100 mg/mL puede impedir su desarrollo como productos adecuados para suministro subcutáneo y/o intravenoso. Por lo tanto, las formulaciones farmacéuticas que tienen viscosidad inferior son muy deseables debido a su fabricabilidad, tal como, pero no limitada a, procesamiento, filtrado y llenado. Como se describe en los Ejemplos 2 y 3 de la presente memoria, las formulaciones de la presente divulgación que comprenden de 100 mg/mL a 200 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2 OMS646 tienen una viscosidad sorprendentemente baja, tal como una viscosidad de menos de aproximadamente 50 mPa-s (cP), tal como entre 2 y 50 mPa-s (cP), tal como entre 2 y 40 mPa-s (cP), tal como entre 2 y 30 mPa-s (cP), o entre 2 y 25 mPa-s (cP), o entre 2 y 20 mPa-s (cP), o entre 2 y 18 mPa-s (cP).

Además, las formulaciones farmacéuticas de anticuerpo inhibidor de MASP-2 muy concentradas y de baja viscosidad de la presente invención permiten que las formulaciones farmacéuticas se administren mediante jeringas y agujas estándar, dispositivos autoinyectores y dispositivos de microinfusión conocidos en la técnica. Como se describe en el Ejemplo 3, se determinó que las formulaciones farmacéuticas de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad, como se dan a conocer en la presente memoria, tienen jeringabilidad e inyectabilidad adecuadas para administración subcutánea. La jeringabilidad y la inyectabilidad son parámetros clave de comportamiento del producto de una formulación farmacéutica destinada a cualquier administración parenteral, por ejemplo, intramuscular o subcutánea, y permiten la administración de dichas formulaciones mediante inyección intramuscular o subcutánea mediante agujas de pequeño calibre utilizadas habitualmente para dichas inyecciones, tales como, por ejemplo, agujas 29GA ordinarias o de pared delgada, 27GA de 31,75 mm (1,25") ordinarias o de pared delgada, o 25GA de 25,4 mm (1") ordinarias o de pared delgada.

En algunos casos, la baja viscosidad de las formulaciones farmacéuticas de anticuerpo inhibidor de MASP-2, como se dan a conocer en la presente memoria, permite la administración de un volumen inyectado aceptable (por ejemplo, 1-3 cc) y el suministro al mismo tiempo una cantidad eficaz del anticuerpo inhibidor de MASP-2 OMS646 en una sola inyección en un solo punto de inyección.

Una ventaja significativa adicional de las formulaciones de la presente divulgación es que las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad (es decir, >100 mg/mL a 200 mg/mL) son estables cuando se almacenan de 2 °C a 8 °C durante al menos 30 días, hasta al menos 9 meses, o hasta al menos 12 meses o más, como se describe en los estudios de estabilidad de los Ejemplos 2 y 4.

La presente divulgación también proporciona un procedimiento para la preparación de las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad, envases que incluyen dichas formulaciones, kits terapéuticos que comprenden las formulaciones; y métodos terapéuticos para utilizar dichas formulaciones, envases y kits para el tratamiento de un sujeto que padece, o está en riesgo de desarrollar, una enfermedad o afección asociada a la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Anticuerpo inhibidor de MASP-2

Como se detalla en la presente memoria, la presente invención está dirigida a formulaciones que comprenden anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a MASP-2 e inhiben la activación del complemento dependiente de MASP-2, y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En determinados casos, un anticuerpo inhibidor de MASP-2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para utilización en las formulaciones reivindicadas es un anticuerpo inhibidor de MASP-2 denominado “OMS646”, como se describe en los documentos WO2012/151481 y US2015/0166676, que comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Como se describe en el documento WO2012/151481 y en el Ejemplo 1, OMS646 se une específicamente a MASP-2 humana con alta afinidad y tiene la capacidad de bloquear la actividad del complemento de la vía de las lectinas. En determinados casos, un anticuerpo inhibidor de MASP-2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para utilización en las formulaciones reivindicadas es un anticuerpo inhibidor de MASP-2 que comprende una región variable de cadena pesada que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de SEQ ID N<o>: 2, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de SEQ ID NO: 2, y iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-107 de SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de SEQ ID NO: 3, ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de SEQ ID NO: 3, y iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de SEQ ID NO: 3. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 para utilización en las formulaciones reivindicadas comprende una variante de OMS646 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos 95 % de identidad a SEQ ID NO: 2 y que comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos 95 % de identidad a SEQ ID NO: 3. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 para utilización en las formulaciones reivindicadas comprende una variante de OMS646 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a SEQ ID NO: 2, en donde el residuo 31 es una R, el residuo 32 es una G, el residuo 33 es una K, el residuo 34 es una M, el residuo 35 es una G, el residuo 36 es una V, el residuo 37 es una S, el residuo 50 es una L, el residuo 51 es una A, el residuo 52 es una H, el residuo 53 es una I, el residuo 54 es una F, el residuo 55 es una S, el residuo 56 es una S, el residuo 57 es un D, el residuo 58 es un E, el residuo 59 es una K, el residuo 60 es una S, el residuo 61 es una Y, el residuo 62 es una R, el residuo 63 es una T, el residuo 64 es una S, el residuo 65 es una L, el residuo 66 es una K, el residuo 67 es una S, el residuo 95 es una Y, el residuo 96 es una Y, el residuo 97 es una C, el residuo 98 es una A, el residuo 99 es una R, el residuo 100 es una I, el residuo 101 es una R, el residuo 102 es una R o A, el residuo 103 es una G, el residuo 104 es una G, el residuo 105 es una I, el residuo 106 es un D y el residuo 107 es una Y; y b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a SEQ ID NO: 3, en donde el residuo 23 es una S, el residuo 24 es una G, el residuo 25 es un E o D, el residuo 26 es una K, el residuo 27 es una L, el residuo 28 es una G, el residuo 29 es un D, el residuo 30 es una K, el residuo 31 es una Y o F, el residuo 32 es una A, el residuo 33 es una Y, el residuo 49 es una Q, el residuo 50 es un D, el residuo 51 es una K o N, el residuo 52 es una Q o K, el residuo 53 es una R, el residuo 54 es una P, el residuo 55 es una S, el residuo 56 es una G, el residuo 88 es una Q, el residuo 89 es una A, el residuo 90 es un W, el residuo 91 es un D, el residuo 92 es una S, el residuo 93 es una S, el residuo 94 es una T, el residuo 95 es una A, el residuo 96 es una V y el residuo 97 es una F.

En algunos casos, el anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646 o una variante del mismo) para utilización en las formulaciones reivindicadas es un anticuerpo monoclonal de longitud completa. En algunos casos, el anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo de longitud completa de IgG4 humana. En algunos casos, la IgG4 comprende una mutación puntual en la región de bisagra para potenciar la estabilidad del anticuerpo.

En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646 o una variante del mismo) está compuesto por regiones variables de origen humano fusionadas a regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera lambda de IgG4 humana, en donde la cadena comprende una mutación puntual en la región de bisagra (por ejemplo, en donde la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P) para potenciar la estabilidad del anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 es un tetrámero que consiste en dos cadenas pesadas idénticas que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 y dos cadenas ligeras idénticas que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5.

En algunos casos, la concentración del anticuerpo inhibidor de MASP-2 en la formulación es de aproximadamente 100 mg/mL a aproximadamente 250 mg/mL, tal como aproximadamente 150 mg/mL a aproximadamente 220 mg/mL, tal como aproximadamente 175 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL, o aproximadamente 175 mg/mL a aproximadamente 195 mg/mL. En determinados casos, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 está presente en la formulación en una concentración de aproximadamente 175 mg/mL a aproximadamente 195 mg/mL, tal como aproximadamente 180 mg/mL a aproximadamente 190 mg/mL, tal como aproximadamente 175 mg/mL, tal como aproximadamente 180 mg/mL, aproximadamente 181 mg/mL, aproximadamente 182 mg/mL, aproximadamente 183 mg/mL, aproximadamente 184 mg/mL, aproximadamente 185 mg/mL, aproximadamente 186 mg/mL, aproximadamente 187 mg/mL, aproximadamente 188 mg/mL, aproximadamente 189 mg/mL, o tal como aproximadamente 190 mg/mL.

En algunos casos, se contempla que variaciones leves en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos inhibidores de MASP-2 o fragmentos de los mismos están abarcadas por las formulaciones reivindicadas, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia a los anticuerpos inhibidores de MASP-2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en la presente memoria (es decir, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 2 y/o al menos al menos 90 %, al menos 95 %, al menos al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98%o al menos 99%de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 3) y conserven la capacidad de inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2.

Como se apreciará, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se formulan en el contexto de la presente divulgación se pueden producir utilizando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación en fagos, tecnologías sintéticas, o combinaciones de dichas tecnologías u otras tecnologías fácilmente conocidas en la técnica). Los métodos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar en, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, Capítulos 5-8 y 15.

Por ejemplo, se pueden expresar anticuerpos inhibidores de MASP-2, tales como OMS646, en una línea celular de mamífero adecuada. Las secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de un anticuerpo de interés particular tal como OMS646 (por ejemplo, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7) se pueden utilizar para transformar una célula hospedadora de mamífero adecuada. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación, encapsulación del polinucleótido o polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del<a>D<n>en núcleos.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (ATCC), que incluyen, pero no se limitan a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé (BNK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, HepG2), células epiteliales de riñón humano 293 (HEK293) y muchas otras líneas celulares.

Después de la fase de producción de proteína del procedimiento de cultivo celular, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 se recuperan del medio de cultivo celular utilizando técnicas comprendidas por un experto en la materia. En particular, en algunos casos, los polipéptidos de cadena pesada y ligera de anticuerpo inhibidor de MASP-2 se recuperan del medio de cultivo como polipéptidos secretados.

Los anticuerpos inhibidores de MASP-2 se pueden purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, y cualquier combinación de técnicas de purificación conocidas o todavía por descubrir, que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía con proteína A, fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSET®, cromatografía con una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato con amonio. El método de purificación puede comprender además etapas adicionales que inactivan y/o eliminan virus y/o retrovirus que podrían estar posiblemente presentes en el medio de cultivo celular de líneas celulares de mamífero. Está disponible un número significativo de etapas de aclaramiento viral, que incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con caótropos, tales como urea o guanidina, detergentes, etapas adicionales de ultrafiltración/diafiltración, separación convencional, tal como cromatografía de intercambio iónico o exclusión por tamaños, pH extremos, calor, proteasas, disolventes orgánicos o cualquier combinación de los mismos.

Los anticuerpos inhibidores de MASP-2 purificados requieren habitualmente concentración y un intercambio de tampón antes del almacenamiento o procesamiento adicional. Como ejemplo no limitante, se puede utilizar un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) para concentrar e intercambiar el tampón de elución procedente de la columna de purificación anterior por el tampón final deseado para el principio activo.

El anticuerpo monoclonal inhibidor de MASP-2 que se formula en la presente memoria es preferiblemente esencialmente puro y deseablemente esencialmente homogéneo (es decir, exento de proteínas contaminantes, etc.). Anticuerpo “esencialmente puro” significa una composición que comprende al menos 90 % en peso del anticuerpo, sobre la base del peso total de la composición, preferiblemente al menos 95 % en peso. Anticuerpo “esencialmente homogéneo” significa una composición que comprende al menos aproximadamente 99 % en peso de anticuerpo, sobre la base del peso total de la composición.

Soluciones acuosas

La formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación comprende una solución acuosa que comprende un sistema de tampón que tiene un pH de 4,0 a 8,0 (por ejemplo, que tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, o que tiene un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5) y un anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646 o una variante del mismo) o fragmento de unión a antígeno del mismo en una concentración de aproximadamente 50 mg/mL a aproximadamente 250 mg/mL (por ejemplo, de aproximadamente 100 mg/mL a aproximadamente 250 mg/mL). La solución acuosa para utilización en las formulaciones de la presente divulgación es una que es farmacéuticamente aceptable (segura y atóxica para administración a un humano) y es útil para la preparación de una formulación líquida. En algunos casos, la solución acuosa es agua, tal como agua estéril para inyección (WFI), que es un preparado de agua destilada estéril y exento de soluto. Alternativamente, se pueden utilizar otras soluciones acuosas que sean adecuadas para administración terapéutica y que no afecten negativamente a la estabilidad de la formulación, tales como agua desionizada. Otras soluciones acuosas adecuadas incluyen agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina estéril, solución de Ringer, u otras soluciones acuosas similares utilizadas para soluciones farmacéuticas.

Sistemas de tamponamiento

La formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación se ajusta hasta un pH de 5,0 a 7,0. El pH deseado se mantiene adecuadamente mediante la utilización de un sistema de tamponamiento. En algunos casos, el sistema de tampón comprende al menos un agente de tamponamiento farmacéuticamente aceptable con una constante de disociación ácida dentro de 2 unidades de pH del pH de la formulación. El sistema de tampón utilizado en las formulaciones de conformidad con la presente divulgación tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,0. Diversos agentes de tamponamiento son conocidos para el experto en la materia. Los ejemplos de agentes de tamponamiento que controlarán el pH en este intervalo incluyen acetato, succinato, gluconato, histidina, citrato y otros tampones de ácidos orgánicos. En algunos casos, el agente de tamponamiento se selecciona del grupo que consiste en succinato, histidina y citrato. El sistema de tampón comprende al menos un agente de tamponamiento seleccionado del grupo que consiste en citrato o histidina.

En algunos casos, las formulaciones farmacéuticas comprenden un sistema de tamponamiento con un agente de tamponamiento en una concentración de 1 a 50 mM, tal como de 10 a 40 mM, o tal como de 10 a 30 mM, o de 20 a 30 mM, o aproximadamente 20 mM.

En algunos casos, el agente de tamponamiento es un tampón de histidina. Un “tampón de histidina” es un tampón que comprende el aminoácido histidina. Los ejemplos de tampones de histidina incluyen histidina o cualquier sal de histidina, que incluye clorhidrato de histidina, acetato de histidina, fosfato de histidina y sulfato de histidina, incluyendo combinaciones de cualquiera de estas sales con o sin histidina. En un caso, el sistema de tamponamiento comprende tampón de clorhidrato de histidina (L-histidina/HCl). Dicho tampón de clorhidrato de histidina se puede preparar titulando L-histidina (base libre, sólida) con ácido clorhídrico diluido o utilizando la mezcla apropiada de histidina y clorhidrato de histidina. En algunos casos, el pH del tampón L-histidina/HCl es de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, tal como de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0, por ejemplo, aproximadamente 5,8 o aproximadamente 5,9.

En algunos casos, el agente de tamponamiento es un tampón de citrato. Dicho tampón de citrato se puede preparar titulando ácido cítrico, la sal monosódica del ácido cítrico y/o la sal disódica del ácido cítrico con solución de hidróxido de sodio diluida hasta el pH apropiado o utilizando la mezcla apropiada de ácido cítrico y la sal o sales para alcanzar este mismo pH. En otro caso, el tampón de citrato se puede preparar titulando una solución de citrato trisódico con solución de ácido clorhídrico diluida hasta el pH apropiado. En este caso, la fuerza iónica puede ser ligeramente superior que comenzando con ácido cítrico debido a la generación de iones adicionales de sodio y cloruro en la solución. En algunos casos, el pH del tampón de citrato es de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, tal como de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0, por ejemplo, aproximadamente 5,8 o aproximadamente 5,9. En algunos casos, el agente de tamponamiento es un tampón de succinato. En determinados casos, el pH del tampón de succinato es de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0, por ejemplo, aproximadamente 5,8 o aproximadamente 5,9.

En algunos casos, el agente de tamponamiento es un tampón de citrato de sodio, en donde el citrato de sodio está presente en la formulación en una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, tal como de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 25 mM, tal como aproximadamente 20 mM. En algunos casos, el agente de tamponamiento es un tampón de L-histidina, en donde la L-histidina está presente en la formulación en una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, tal como de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 25 mM, tal como aproximadamente 20 mM. En algunos casos, la formulación comprende citrato de sodio aproximadamente 20 mM y tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0. En algunos casos, la formulación comprende L-histidina aproximadamente 20 mM y tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0.

Excipientes

En algunos casos, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación comprende además al menos un excipiente. Los ejemplos de excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica), aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, glicina e histidina), sacáridos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, maltosa y trehalosa), polioles (por ejemplo, manitol y sorbitol), ácidos grasos y fosfolípidos (por ejemplo, sulfonatos y caprilato de alquilo).

En algunos casos, la formulación comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido con una cadena lateral cargada, un glúcido u otro poliol, y una sal. En algunos casos, la formulación comprende un glúcido u otro poliol, tal como, por ejemplo, sacarosa, trehalosa, manitol o sorbitol. En algunos casos, la formulación comprende una sal, tal como, por ejemplo, NaCl o una sal de un aminoácido.

En algunos casos, la formulación comprende un excipiente que es un agente modificador de la tonicidad. En algunos casos, el agente modificador de la tonicidad está incluido en la formulación en una concentración adecuada para proporcionar una formulación isotónica. En algunos casos, el agente modificador de la tonicidad está incluido en la formulación en una concentración adecuada para proporcionar una formulación hipertónica. En algunos casos, el agente modificador de la tonicidad para utilización en la formulación se selecciona del grupo que consiste en un aminoácido con una cadena lateral cargada, un glúcido u otro poliol, y una sal. En algunos casos, el agente modificador de la tonicidad es un aminoácido con una cadena lateral cargada (es decir, una cadena lateral cargada negativamente o una cadena lateral cargada positivamente) en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM. En algunos casos, el agente modificador de la tonicidad es un aminoácido con una cadena lateral cargada negativamente, tal como glutamato. En algunos casos, la formulación comprende glutamato en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM. En algunos casos, el agente modificador de la tonicidad es un aminoácido con una cadena lateral cargada positivamente, tal como arginina. En algunos casos, la formulación comprende arginina (por ejemplo, clorhidrato de arginina) en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, tal como de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 225 mM.

Las formulaciones farmacéuticas como se dan a conocer en la presente memoria son hipertónicas (es decir, tienen una presión osmótica superior a la sangre humana). Como se describe en la presente memoria, se observó inesperadamente que la hipertonicidad conducía a viscosidad reducida de la muestra, lo que se logró, por ejemplo, con aumentos moderados en la concentración de arginina. Como se describe en el Ejemplo 2, se observó inesperadamente que se lograban viscosidades bajas (por ejemplo, menos de 25 mPa-s (cP)) con las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración de citrato/arginina e histidina/arginina que comprendían una concentración de arginina de 200 mM o mayor en ausencia de CaCb. Por consiguiente, en algunos casos, la formulación comprende arginina (por ejemplo, clorhidrato de arginina) en un nivel hipertónico de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM.

Como se describe además en el Ejemplo 2, también se observó que las formulaciones que incluían cationes divalentes (CaCb o MgCb) tenían elevado material de alto peso molecular en comparación con las formulaciones que no incluían aditivos de CaCb o MgCb. Por consiguiente, en un caso, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación está sustancialmente exenta de un aditivo de CaCb. En un caso, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación está sustancialmente exenta de un aditivo de MgCb.

Como se describe además en el Ejemplo 2, se determinó que la inclusión de sacarosa estaba asociada a polidispersidad elevada en todos los sistemas de tamponamiento ensayados para las formulaciones de anticuerpo MASP-2 de alta concentración. Por consiguiente, en un caso, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación está sustancialmente exenta de sacarosa.

Como se describe además en el Ejemplo 2, también se determinó que la inclusión de sorbitol estaba asociada a polidispersidad elevada en todos los sistemas de tamponamiento ensayados para las formulaciones de anticuerpo MASP-2 de alta concentración. Por consiguiente, en un caso, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación está sustancialmente exenta de sorbitol.

Tensioactivos

Opcionalmente, en algunos casos, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación comprende además un tensioactivo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos no limitantes de tensioactivos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitano (por ejemplo, Tween), polietilen-polipropilenglicoles, estearatos de polioxietileno, polioxietilen alquil éteres (por ejemplo, polioxietilen monolauril éter), alquilfenilpolioxietilen éteres (por ejemplo, Triton-X), copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (por ejemplo, Poloxamer y Pluronic), y dodecilsulfato de sodio (SDS). En determinados casos, el tensioactivo farmacéuticamente aceptable es un éster de ácido graso de polioxietilensorbitano (polisorbato), tal como polisorbato 20 (vendido con la marca de fábrica Tween 20™) y polisorbato 80 (vendido con la marca de fábrica Tween 80™). En algunos casos, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación comprende un tensioactivo no iónico. El tensioactivo no iónico puede ser un polisorbato (por ejemplo, seleccionado del grupo de polisorbato 20, polisorbato 80 y copolímero de polietileno-polipropileno). En algunos casos, la concentración del tensioactivo es de aproximadamente 0,001 a 0,1 % (p/v), o 0,005 % a 0,1 % (p/v), o 0,01 a 0,1 % (p/v), o 0,01 a 0,08 % ( p/v), o 0,025 a 0,075 % (p/v), o más particularmente, aproximadamente 0,01 % (p/v), aproximadamente 0,02 % (p/v), aproximadamente 0,04 % (p/v), o aproximadamente 0,06 % (p/v), o aproximadamente 0,08 % (p/v), o aproximadamente 0,10 % (p/v). En algunos casos, la formulación comprende un tensioactivo no iónico (por ejemplo, polisorbato 80) en una concentración de aproximadamente 0,001 a 0,1 % (p/v), o 0,005 % a 0,1 % (p/v), o 0,01 a 0,1 % (p/v), o 0,01 a 0,08 % ( p/v), o 0,025 a 0,075 % (p/v), o más particularmente, aproximadamente 0,01 % (p/v), aproximadamente 0,02 % (p/v), aproximadamente 0,04 % (p/v), o aproximadamente 0,06 % (p/v), o aproximadamente 0,08 % (p/v), o aproximadamente 0,10 % (p/v). Como se describe en el Ejemplo 2, se observó inesperadamente que la inclusión del tensioactivo no iónico polisorbato 80 (PS-80) conducía a una reducción adicional en la viscosidad y también conservaba al mismo tiempo la recuperación de proteína, permitiendo de ese modo una concentración alta de anticuerpo OMS646 y manteniendo al mismo tiempo una viscosidad baja adecuada para utilización en un dispositivo de inyección, tal como un autoinyector.

Estabilizantes

Opcionalmente, en algunos casos, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación comprende además un estabilizante. El estabilizante (utilizado como sinónimo del término “agente estabilizante” en la presente memoria) puede ser un carbohidrato o sacárido, o un glúcido admitido por las autoridades reguladoras como aditivo o excipiente adecuado en formulaciones farmacéuticas, por ejemplo, trehalosa o sacarosa. La concentración habitual del estabilizante es de 15 a 250 mM, o 150 a 250 mM, o aproximadamente 210 mM. Las formulaciones pueden contener un estabilizante secundario, tal como metionina, por ejemplo, en una concentración de 5 a 25 mM o en una concentración de 5 a 15 mM (por ejemplo, metionina en una concentración de aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM o aproximadamente 15 mM).

Conservantes

Opcionalmente, en algunos casos, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación comprende además un conservante (por ejemplo, un agente antimicrobiano). Generalmente, se requieren agentes antimicrobianos para productos parenterales que están destinados a dosificación múltiple. Similarmente, se añaden conservantes a las formulaciones farmacéuticas envasadas asépticamente en viales de dosis únicas si el ingrediente o ingredientes activos no tienen propiedades bactericidas o bacteriostáticas, o son promotores del crecimiento. Algunos conservantes habituales utilizados son alcohol bencílico (0,9 % a 1,5 %), metilparabeno (0,18 % a 0,2 %), propilparabeno (0,02 %), cloruro de benzalconio (0,01 % a 0,02 %) y timerosal (0,001 % a 0,01 %).

Jeringabilidad

La vía de administración subcutánea requiere inyecciones utilizando dispositivos de inyección, tales como jeringas, autoinyectores, bombas portátiles u otros dispositivos, lo que restringe la formulación del producto en lo que respecta al volumen de inyección y la viscosidad de la solución. Además, la formulación del producto debe ser adecuada para utilización en un dispositivo de inyección en lo que respecta a la fuerza de inyección y el tiempo requerido para el suministro de la inyección. “Jeringabilidad”, como se emplea en la presente memoria, se refiere a la capacidad de un agente terapéutico inyectable de pasar fácilmente a través de una aguja hipodérmica al transferirlo desde un vial antes de una inyección. “ Inyectabilidad”, como se emplea en la presente memoria, se refiere al comportamiento de la formulación durante la inyección (véase, por ejemplo, Cilurzo F, Selmin F, Minghetti P,et al.,Injectability Assessment: An Open Issue. AAPS PharmSciTech.

2011;12(2):604-609). La jeringabilidad incluye factores tales como la facilidad de retirada, la tendencia a la obstrucción y formación de espumas, y la exactitud de las mediciones de dosis. La inyectabilidad incluye la presión o fuerza requerida para la inyección, la uniformidad de flujo y la ausencia de obstrucción (es decir, ausencia de oclusión de la aguja de la jeringa). La jeringabilidad e inyectabilidad se pueden ver afectadas por la geometría de la aguja, es decir, el diámetro interior, la longitud, la forma de la abertura, así como por el acabado superficial de la jeringa, especialmente en dispositivos de autoinyección, tales como plumas y autoinyectores (por ejemplo, equipados con agujas 29-31GA), y en jeringas precargadas para dosificación subcutánea (por ejemplo, equipadas con agujas 24-27GA). La fuerza de inyección (o fuerza de deslizamiento) es un factor complejo influenciado por la viscosidad de la solución, el tamaño de la aguja (es decir, el calibre de la aguja) y la tensión superficial del envase/cierre. Las agujas más pequeñas, por ejemplo, >calibre, provocarán menos sensación de dolor a los pacientes. Overcashier y colaboradores establecieron una relación viscosidad-fuerza de deslizamiento en función del calibre de la aguja sobre la base de la ecuación de Hagen-Poiseuille (Overcashieret al.,Am Pharm Rev 9(6):77-83 (2006). Por ejemplo, con una aguja de pared delgada de calibre 27, la viscosidad del líquido se debe mantener en 20 mPa-s (cP) o por debajo con el fin de no superar la fuerza de deslizamiento de 25 Newton (N).

En determinados casos, las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación están caracterizadas por tener una fuerza de deslizamiento de inyección de aproximadamente 25 N o menos cuando se inyectan mediante una aguja 27GA de 31,75 mm (1,25") a temperatura ambiente.

En determinados casos, las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación están caracterizadas por tener una fuerza de deslizamiento de inyección de aproximadamente 20 N o menos cuando se inyectan mediante una aguja 25GA de 25,4 mm (1") a temperatura ambiente.

Como se ejemplifica en el Ejemplo 3, las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad (por ejemplo, OMS646) de la presente divulgación tienen jeringabilidad e inyectabilidad sorprendentemente buenas. Las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad, como se dan a conocer en la presente memoria, permiten la administración de dichas formulaciones mediante inyección intramuscular o subcutánea con agujas de pequeño calibre utilizadas habitualmente para dichas inyecciones, por ejemplo, agujas 27G (1,25"), 27G de pared delgada, 25G de pared delgada (1"), o 25G (1"). En algunos casos, la baja viscosidad de las formulaciones farmacéuticas de anticuerpo inhibidor de MASP-2, como se dan a conocer en la presente memoria, permite la administración de un volumen inyectado tolerable (por ejemplo, 1-3 cc) y el suministro al mismo tiempo de una cantidad eficaz del anticuerpo inhibidor de MASP-2 en un sola inyección en un solo punto de inyección.

Estabilidad

Para todo lo anterior, cabe señalar que el anticuerpo inhibidor de MASP-2 o fragmento de unión a antígeno del mismo en la formulación conserva la capacidad de inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. Por ejemplo, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 conserva la capacidad de unir MASP-2 e inhibir la actividad de la vía de las lectinas como se describe en el Ejemplo 1 u otro ensayo de la vía de las lectinas, por ejemplo, como se describe en el documento WO2012/151481. Además de ensayos de potencia, se pueden utilizar diversos ensayos físico-químicos para evaluar la estabilidad, que incluyen enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía de exclusión por tamaños, y evaluación de partículas visibles y subvisibles.

En determinados casos, las formulaciones de la presente divulgación presentan estabilidad en un intervalo de temperaturas de -20 °C a 8 °C durante al menos 30 días, hasta al menos 9 meses o más, o hasta al menos 12 meses o más, como se describe en los estudios de estabilidad de los Ejemplos 2 y 4. Adicional o alternativamente, en determinados casos, las formulaciones son estables a la temperatura de -20 °C a 8 °C, tal como de 2 °C a 8 °C, durante al menos 6 meses, al menos 1 año, o al menos 2 años o más. En determinados casos, la estabilidad se puede evaluar, por ejemplo, mediante el mantenimiento de un nivel de pureza a lo largo del tiempo. Por ejemplo, en determinados casos, las formulaciones de la presente divulgación tienen menos de 5 % de disminución, tal como menos de 4 % de disminución, tal como menos de 3 % de disminución, tal como menos de 2 % de disminución, tal como menos de 1 % de disminución de la pureza al mes, 6 meses, 9 meses o 1 año cuando se almacenan de 2 °C a 8 °C, como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC), que realiza un seguimiento de la presencia o ausencia de fragmentos (BPM) y/o especies agregadas (APM).

En determinados casos, las formulaciones de la presente divulgación favorecen niveles bajos o indetectables de agregación y/o fragmentación, y mantienen la potencia después del almacenamiento durante un periodo definido. Descrito de otra manera, las formulaciones dadas a conocer en la presente memoria son capaces de mantener la integridad estructural del anticuerpo inhibidor de MASP-2 OMS646 presente en concentraciones altas en una solución, por ejemplo, en concentraciones mayores de 150 mg/mL, o mayores de 175 mg/mL, o de al menos 185 mg/mL, de modo tal que el anticuerpo inhibidor de MASP-2 pueda permanecer predominantemente monomérico (es decir, al menos 95 % o más) después del almacenamiento durante un periodo definido de aproximadamente 2 °C a 8 °C. Preferiblemente, no más de 5 %, no más de 4 %, no más de 3 %, no más de 2 %, no más de 1 %, y de la forma más preferible no más de 0,5 %, del anticuerpo forma fragmentos (BPM) o formas agregadas (APM), como se mide mediante SEC, después del almacenamiento durante un periodo definido de aproximadamente 2 °C a 8 °C.

[0095]Como se ejemplifica en el Ejemplo 4 descrito en la presente memoria, los inventores proporcionan formulaciones adecuadas para mantener un anticuerpo inhibidor de MASP-2, OMS646, en aproximadamente 185 mg/mL en forma predominantemente monomérica durante al menos 12 meses de aproximadamente 2 °C a 8 °C.

Modificador de la permeabilidad tisular

En otro caso, las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación comprenden además un modificador de la permeabilidad tisular que aumenta la absorción o dispersión del anticuerpo inhibidor de MASP-2 después de la administración parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea). En algunos casos, el modificador de la permeabilidad tisular es una enzima hialuronidasa que actúa como modificador de la permeabilidad tisular y aumenta la dispersión y absorción del anticuerpo inhibidor de MASP-2 inyectado. Un modificador de la permeabilidad tisular particularmente útil es la hialuronidasa (por ejemplo, una hialuronidasa humana recombinante). Las hialuronidasas funcionan como modificadores de la permeabilidad tisular rompiendo temporalmente la barrera de hialuronano para abrir el acceso a los vasos linfáticos y capilares, lo que permite que los fármacos y fluidos inyectados se absorban rápidamente en la circulación sistémica. El hialuronano se reconstruye de forma natural y la barrera se restablece completamente, por ejemplo, en un plazo de 48 horas. La adición de hialuronidasa en las formulaciones farmacéuticas inyectables aumenta la biodisponibilidad del anticuerpo inhibidor de MASP-2 después de la administración parenteral, particularmente la administración subcutánea. También permite mayores volúmenes en el punto de inyección (es decir, mayores de 1 mL) con menos dolor y molestias, y minimiza la incidencia de reacciones en el punto de inyección (por ejemplo, aplana la protuberancia en el punto de inyección).

En algunos casos, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad (por ejemplo, OMS646) de la presente divulgación comprende de aproximadamente 100 U/mL a aproximadamente 20000 U/mL de una enzima hialuronidasa. La concentración real de la enzima hialuronidasa depende del tipo de enzima hialuronidasa utilizada en la preparación de las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de la presente divulgación. El experto en la materia puede determinar una cantidad eficaz de la hialuronidasa. Debe proporcionarse en cantidad suficiente para que sea posible un aumento en la dispersión y absorción del anticuerpo inhibidor de MASP-2 coadministrado o administrado secuencialmente. La cantidad mínima de la enzima hialuronidasa es mayor de 100 U/mL. Más particularmente, la cantidad eficaz de la enzima hialuronidasa es de aproximadamente 150 U/mL a aproximadamente 20 000 U/mL, con lo que dicha cantidad corresponde a aproximadamente 0,01 mg a 0,16 mg de proteína sobre la base de una actividad específica supuesta de 100000 U/mg. En algunos casos, las formulaciones farmacéuticas comprenden hialuronidasa en una concentración de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20000 U/mL, tal como aproximadamente 1000 a aproximadamente 16000 U/mL. Alternativamente, la concentración de hialuronidasa es de aproximadamente 1500 a aproximadamente 12000 U/mL, o más particularmente aproximadamente 2000 U/mL a aproximadamente 12000 U/mL. Las cantidades especificadas en la presente memoria corresponden a la cantidad de hialuronidasa añadida inicialmente a la formulación farmacéutica. En algunos casos, la relación (p/p) de la hialuronidasa al anticuerpo inhibidor de MASP-2 está en el intervalo de 1:1000 a 1:8000, o en el intervalo de 1:4000 a 1:6000, o en el intervalo de aproximadamente 1:4000 a 1:5000.

La hialuronidasa puede estar presente como un componente de la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación, o se puede proporcionar como una solución independiente en un kit de componentes. Por tanto, en un caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 está coformulado con una hialuronidasa. En otro caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 y la hialuronidasa se formulan independientemente y se mezclan justo antes de la administración subcutánea. En todavía otro caso, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 y la hialuronidasa se formulan y administran cada uno independientemente, por ejemplo, la hialuronidasa se administra como una inyección independiente directamente antes o después de la administración de la formulación que comprende el anticuerpo inhibidor de MASP-2. En algunos casos, la hialuronidasa se administra por vía subcutánea de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 30 minutos antes de la inyección de la formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo inhibidor de MASP-2 de la presente divulgación, en la misma área del punto de inyección. En determinados casos, la formulación farmacéutica de anticuerpo inhibidor de MASP-2 y la solución de hialuronidasa están incluidas en cámaras independientes de un dispositivo farmacéutico que automatiza el suministro, simultáneamente (por ejemplo, utilizando una jeringa de doble cilindro) o secuencialmente.

Envases precargados

En un ejemplo adicional de la presente divulgación, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad como se da a conocer en la presente memoria está contenida en un envase sellado precargado en una cantidad suficiente para administración a un sujeto mamífero. Por tanto, una cantidad suficiente de composición de fármaco formulada de conformidad con la presente divulgación, que es igual o solo ligeramente mayor (es decir, no más de 25 % de exceso, tal como no más de 10 % de exceso) que la cantidad de anticuerpo inhibidor de MASP-2 que se desea administrar a un sujeto mamífero, está contenida dentro de un envase precargado que facilita la dispensación de la formulación de anticuerpo para administración parenteral (es decir, inyección o infusión). En algunos casos, el envase precargado comprende al menos una forma farmacéutica unitaria del anticuerpo inhibidor de MASP-2.

Por ejemplo, una cantidad de formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad de un solo uso deseada se puede envasar en un envase precargado, tal como, por ejemplo, un vial de vidrio cerrado con un tapón u otro cierre que incluya un tabique a través del cual se pueda introducir una aguja hipodérmica para retirar la formulación, o se puede envasar en una jeringa precargada u otro envase precargado adecuado para inyección (por ejemplo, inyección subcutánea) o infusión. Los ejemplos de dichos envases incluyen, sin limitación, viales, jeringas, ampollas, frascos, cartuchos y estuches. Preferiblemente, cada uno de los envases son jeringas precargadas de un solo uso, que pueden estar fabricadas adecuadamente de vidrio o un material polimérico, tal como polímeros de olefinas cíclicas o acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), policarbonato (PC), polioximetileno (POM), poliestireno (PS), tereftalato de polibutileno (PBT), polipropileno (PP), polietileno (PE), poliamida (PA), elastómero termoplástico (TPE) y sus combinaciones. Los cilindros de dichas jeringas se hacen funcionar con un émbolo de elastómero que se puede empujar a lo largo del cilindro para expulsar el contenido líquido a través de una aguja conectada a las mismas. En algunos casos de la presente divulgación, cada jeringa incluye una aguja fijada a la misma.

En algunos casos, la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad como se da a conocer en la presente memoria está contenida dentro de un envase precargado seleccionado del grupo que consiste en: una jeringa (por ejemplo, una jeringa de un solo cilindro o doble cilindro), un inyector de tipo pluma, un vial sellado (por ejemplo, un vial de doble cámara), un autoinyector, un casete y un dispositivo de tipo bomba (por ejemplo, una bomba de parche sobre el cuerpo, una bomba conectada o una bomba osmótica). Para suministro subcutáneo, la formulación puede estar contenida dentro de un dispositivo precargado adecuado para suministro subcutáneo, tal como, por ejemplo, una jeringa precargada, un autoinyector, un dispositivo de inyección (por ejemplo, el dispositivo INJECT-EASE™ o GENJECT™), una pluma de inyección (tal como GENPEN™) u otro dispositivo adecuado para administración subcutánea.

Las formulaciones de la presente divulgación se pueden preparar como formas farmacéuticas unitarias en un envase precargado, que puede ser particularmente adecuado para autoadministración. Por ejemplo, una posología unitaria por vial, cartucho u otro envase precargado (por ejemplo, jeringa precargada o pluma desechable) puede contener aproximadamente 0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL, 0,4 mL, 0,5 mL, 0,6 mL, 0,7 mL, 0,8 mL, 0,9 mL, 1 mL, 1,1 mL, 1,2 mL, 1,3 mL, 1,4 mL, 1,5 mL, 1,6 mL, 1,7 mL, 1,8 mL, 1,9 mL, 2,0 mL, 2,1 mL, 2,2 mL, 2,3 mL, 2,4 mL, 2,5 mL, 2,6 mL, 2,7 mL, 2,8 mL, 2,9 mL, 3,0 mL, 3,5 mL, 4,0 mL, 4,5 mL, 5,0 mL, 5.5 mL, 6,0 mL, 6,5 mL, 7,0 mL, 7,5 mL, 8,0 mL, 8,5 mL, 9,0 mL, 9,5 mL, o aproximadamente 10,0 mL o mayor volumen de la formulación de alta concentración que contiene diversas concentraciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646) que varían de aproximadamente 100 mg/mL a aproximadamente 250 mg/mL, aproximadamente 150 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL, aproximadamente 175 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL, tal como aproximadamente 185 mg/mL, lo que da como resultado una posología unitaria total de OMS646 por envase que varía de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 1000 mg, o superior.

En algunos casos, la formulación de la presente divulgación se prepara como una forma farmacéutica unitaria en un envase precargado, tal como un vial o jeringa, en una posología unitaria de aproximadamente 350 mg a 400 mg, tal como aproximadamente 350 mg, aproximadamente 360 mg, aproximadamente 370 mg, aproximadamente 380 mg, aproximadamente 390 mg o aproximadamente 400 mg.

En algunos casos, las formulaciones de la presente divulgación se preparan como formas farmacéuticas unitarias en una jeringa precargada con un volumen de 0,1 mL a 3,0 mL, tal como aproximadamente 0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL, 0,4 mL, 0,5 mL, 0,6 mL, 0,7 mL, 0,8 mL, 0,9 mL, 1 mL, 1,1 mL, 1,2 mL, 1,3 mL, 1,4 mL, 1,5 mL, 1.6 mL, 1,7 mL, 1,8 mL, 1,9 mL, 2,0 mL, 2,1 mL, 2,2 mL, 2,3 mL, 2,4 mL, 2,5 mL, 2,6 mL, 2,7 mL, 2,8 mL, 2,9 mL o aproximadamente 3,0 mL, que comprende de aproximadamente 20 mg a 750 mg del anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646). Como se describe en la presente memoria, las formulaciones estables preparadas como posologías unitarias se pueden administrar a un sujeto directamente (por ejemplo, mediante inyección subcutánea) o, alternativamente, se preparan para que sean adecuadas para dilución antes de la administración intravenosa.

Las formulaciones de la presente divulgación se pueden esterilizar mediante diversos métodos de esterilización adecuados para formulaciones de anticuerpos, tales como filtración estéril. En determinados casos, la formulación de anticuerpo se esteriliza por filtración, por ejemplo, con un filtro de 0,2 micrómetros preesterilizado. Las formulaciones esterilizadas de la presente divulgación se pueden administrar a un sujeto para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad o trastorno asociado a la activación del complemento dependiente de MASP-2.

En un caso relacionado, la presente divulgación proporciona un método para fabricar un artículo de fabricación que comprende llenar un envase con una formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración de la presente divulgación.

En un caso, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica para utilización en el tratamiento de un paciente que padece, o tiene riesgo de desarrollar, una enfermedad o afección dependiente de MASP-2, en donde la composición es una forma farmacéutica estéril de un solo uso que comprende de aproximadamente 350 mg a aproximadamente 400 mg (es decir, 350 mg, 360 mg, 370 mg, 380 mg, 390 mg o 400 mg) de anticuerpo inhibidor de MASP-2, en donde la composición comprende de aproximadamente 1,8 mL a aproximadamente 2,2 mL (es decir, 1,8 mL, 1,9 mL, 2,0 mL, 2,1 mL o 2,2 mL) de una formulación de anticuerpo de 185 mg/mL, tal como se da a conocer en la presente memoria, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3; y en donde la formulación es estable cuando se almacena entre 2 °C y 8 °C durante al menos seis meses. En algunos casos, la enfermedad o afección dependiente de MASP-2 se selecciona del grupo que consiste en SUHa, MAT-TCMH, NIgA y nefritis lúpica (NL).

Kits que comprenden formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad

La presente divulgación también proporciona kits terapéuticos que comprenden al menos un envase que incluye la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad como se da a conocer en la presente memoria.

En algunos casos, la presente divulgación proporciona un kit que comprende (i) un envase que comprende cualquiera de las formulaciones que comprenden anticuerpo inhibidor de MASP-2 descritas en la presente memoria; y (ii) un medio adecuado para suministrar la formulación a un paciente con necesidad de la misma. En algunos casos de cualquiera de los kits descritos en la presente memoria, el medio es adecuado para suministro subcutáneo de la formulación al paciente.

Diversos tipos de envases son adecuados para la contención de formulaciones farmacéuticas de anticuerpo inhibidor de MASP-2 incluidas en los kits de la presente divulgación. En determinados casos de los kits de la presente divulgación, el envase es una jeringa precargada (por ejemplo, una jeringa de un solo cilindro o de doble cilindro) o un vial sellado precargado.

En algunos casos, el envase que comprende una formulación que comprende anticuerpo inhibidor de MASP-2 es un envase precargado seleccionado del grupo que consiste en: una jeringa (por ejemplo, una jeringa de un solo cilindro o doble cilindro), un inyector de tipo pluma, un vial sellado (por ejemplo, viales de doble cámara), un autoinyector, un casete y un dispositivo de tipo bomba (por ejemplo, una bomba de parche sobre el cuerpo, una bomba conectada o una bomba osmótica). Para suministro subcutáneo, la formulación puede estar contenida dentro de un dispositivo precargado adecuado para suministro subcutáneo, tal como, por ejemplo, una jeringa precargada, un autoinyector, un dispositivo de inyección (por ejemplo, el dispositivo INJECT-EASE™ y GENJECT™), una pluma de inyección (tal como GENPEN™) u otro dispositivo adecuado para administración subcutánea.

Además de un envase precargado con una sola dosis de la formulación farmacéutica, el kit de la presente divulgación también puede incluir un envase exterior en el que se coloca dicho envase precargado. Por ejemplo, el envase exterior puede incluir una bandeja de plástico o cartón en la que se forman cavidades que reciben el envase precargado y lo inmovilizan durante el transporte y manipulación antes de su utilización. En algunos casos, el envase exterior es adecuadamente opaco y actúa para proteger el envase precargado de la luz y evitar la degradación inducida por la luz de los componentes de la formulación farmacéutica. Por ejemplo, la bandeja de plástico o cartón que recibe el envase precargado puede estar envasada además dentro de una caja de cartón que proporciona protección contra la luz. El kit de la presente divulgación también puede incluir un conjunto de instrucciones para la administración y utilización de las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de conformidad con la presente divulgación, que pueden estar impresas sobre el envase exterior o impresas sobre una hoja de papel que está contenida dentro del envase exterior.

En algunos casos, los kits comprenden un segundo envase (por ejemplo, una jeringa precargada) que contiene una dosis eficaz de una hialuronidasa.

El kit puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen agujas, jeringas, prospectos y similares.

Formulaciones ejemplares

Como se ha descrito anteriormente, las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 estables de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación incluyen anticuerpo inhibidor de MASP-2 en una concentración de 50 mg/mL a 250 mg/mL en una solución acuosa que comprende un agente de tamponamiento que tiene un pH de 5,0 a 7,0.

El sistema de tampón, tal como histidina, citrato o succinato, está incluido adecuadamente en una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, y preferiblemente en aproximadamente 20 mM. En algunos casos preferidos, la formulación comprende además un aminoácido con una cadena lateral cargada en una concentración de 50 mM a 300 mM. En algunos casos, la formulación comprende un aminoácido con una cadena lateral cargada positivamente, tal como arginina, en una concentración de 50 mM a 300 mM. En algunos casos preferidos, la formulación comprende además un tensioactivo no iónico, tal como polisorbato 80, en una cantidad de 0,001 % (p/v) a 0,1 % (p/v), tal como aproximadamente 0,05 % (p/v) a aproximadamente 0,1 % (p/v). En algunos casos, la formulación comprende además una enzima hialuronidasa en una cantidad eficaz para aumentar la dispersión y/o absorción del anticuerpo inhibidor de MASP-2 después de la administración subcutánea.

En algunos casos, las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 estables de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en una de las composiciones siguientes:

a) 100 a 200 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2; 10 a 50 mM de un tampón de histidina a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0; arginina 100 mM a 225 mM; y opcionalmente 100 a 20 000 U/mL de una hialuronidasa.

b) 100 a 200 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2; 10 a 50 mM de un tampón de histidina a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0; arginina 100 mM a 225 mM; aproximadamente 0,01 % a 0,08 % (p/v) de un tensioactivo no iónico; y opcionalmente 100 a 20000 U/mL de una hialuronidasa.

c) 100 a 200 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2; 10 a 50 mM de un tampón de citrato a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0; arginina 100 mM a 225 mM; y opcionalmente 100 a 20 000 U/mL de una hialuronidasa.

d) 100 a 200 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2; 10 a 50 mM de un tampón de citrato a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0; arginina 100 mM a 225 mM; aproximadamente 0,01 % a 0,08 % (p/v) de un tensioactivo no iónico; y opcionalmente 100 a 20000 U/mL de una hialuronidasa.

e) 100 a 200 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2; 10 a 50 mM de un tampón de succinato a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0; arginina 100 mM a 225 mM; y opcionalmente 100 a 20 000 U/mL de una hialuronidasa.

f) 100 a 200 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2; 10 a 50 mM de un tampón de succinato a un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0; arginina 100 mM a 225 mM; aproximadamente 0,01 % a 0,08 % (p/v) de un tensioactivo no iónico; y opcionalmente 100 a 20000 U/mL de una hialuronidasa.

En determinados casos, las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 estables de alta concentración y baja viscosidad de la presente divulgación comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en una de las composiciones siguientes:

g) 185 18,5 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2; tampón de citrato 20 ± 2 mM a un pH de aproximadamente 5,8; arginina 200 ± 20 mM, y opcionalmente, 100 a 20000 U/mL de una hialuronidasa.

h) 185 18,5 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2; tampón de citrato 20 ± 2 mM a un pH de aproximadamente 5,8; arginina 200 ± 20 mM, aproximadamente 0,01 % (p/v) de polisorbato 80, y opcionalmente, 100 a 20000 U/mL de una hialuronidasa.

i) 185 18,5 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2; tampón de histidina 20 ± 2 mM a un pH de aproximadamente 5,9; arginina 200 ± 20 mM, y opcionalmente, 100 a 20000 U/mL de una hialuronidasa.

j) 185 18,5 mg/mL de anticuerpo inhibidor de MASP-2; tampón de histidina 20 ± 2 mM a un pH de aproximadamente 5,9; arginina 200 ± 20 mM, aproximadamente 0,01 % de polisorbato 80, y opcionalmente, 100 a 20000 U/mL de una hialuronidasa.

Métodos para producir formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad

En otro caso, la presente divulgación proporciona un método para producir una formulación que comprende 100 mg/mL o más de un anticuerpo inhibidor de MASP-2, comprendiendo el método: (a) proporcionar una primera formulación farmacéutica que comprende OMS646 purificado, teniendo la primera formulación farmacéutica una primera formulación y comprendiendo no más de 50 mg/mL de la proteína OMS646; (b) someter la primera formulación farmacéutica a filtración para producir de ese modo una segunda formulación farmacéutica, en donde la segunda formulación farmacéutica tiene una segunda formulación como resultado de la filtración; y (c) concentrar la segunda formulación farmacéutica para producir una solución de anticuerpo concentrada que comprende 100 mg/mL o más de OMS646. La solución a granel formulada se ajusta habitualmente a una concentración de proteína fija para que el volumen de llenado deseado se pueda mantener constante. El procedimiento de fabricación de medicamentos líquidos implica habitualmente mezclar el anticuerpo inhibidor de MASP-2 con el sistema de tamponamiento, excipientes y, opcionalmente, tensioactivo, seguido de filtración aséptica, llenado en viales (u otro envase, tal como jeringas) y sellado (por ejemplo, taponado, tapado, o similares).

TABLA 1: Formulación de ejemplo 1

Componente (USP) añadido al agua para inyección Concentración

TABLA 2: Formula i n m l 2

Utilización de composiciones en métodos de tratamiento

También se describe en la presente memoria un método para tratar a un paciente que padece, o tiene riesgo de desarrollar, una enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de m As P-2 que comprende administrar una formulación de alta concentración y baja viscosidad que comprende un anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646) como se da a conocer en la presente memoria.

Como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7,919,094; la patente de EE. UU. n.° 8,840,893; la patente de EE. UU. n.° 8,652,477; la patente de EE. UU. n.° 8,951,522, la patente de EE. UU. n.° 9,011,860, la patente de EE. UU. n.° 9,644,035, las solicitudes de patente de EE. UU. de n.° de publicación US2013/0344073, US2013/0266560, US 2015/0166675, US2017/0137537, US2017/0189525 y las solicitudes de patente de EE. UU. en tramitación con la presente de n.° de serie 15/476,154, 15/347,434, 15/470,647, 62/315,857, 62/275,025 y 62/527,926 (cada una de las cuales está cedida a Omeros Corporation, el cesionario de la presente solicitud), se ha implicado a la activación del complemento dependiente de MASP-2 como contribuyente a la patogénesis de numerosos estados de enfermedad agudos y crónicos. Por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 8,951,522, la función principal del sistema del complemento, una parte del sistema inmunitario innato, es proteger al hospedador contra agentes infecciosos; sin embargo, la activación inadecuada o excesiva del sistema del complemento puede conducir a enfermedad grave, tal como microangiopatías trombóticas (MAT, que incluyen SUHa, PTT y SUH) en las que el daño endotelial, así como los trombos ricos en fibrina y plaquetas en la microvasculatura, conduce a daño orgánico. La vía de las lectinas juega un papel dominante en la activación del complemento en situaciones de estrés o lesión de las células endoteliales e, impidiendo la activación de MASP-2 y la vía de las lectinas, detiene la secuencia de reacciones enzimáticas que conducen a la formación del complejo de ataque a la membrana, la activación plaquetaria y el reclutamiento de leucocitos. Como se describe en la patente de EE. UU. n.° 8,652,477, además del inicio de la vía de las lectinas, MASP-2 también puede activar el sistema de la coagulación y es capaz de escindir protrombina a trombina.

Como se describe en el Ejemplo 1 y la patente de EE. UU. n.° 9,011,860, OMS646 es un potente inhibidor de la activación del complemento dependiente de las lectinas. Este anticuerpo no presenta unión significativa (afinidad al menos 5000 veces inferior) a las otras serina proteasas de la vía del complemento, C1r, C1s, MASP-1 y MASP-3, y no inhibe la activación del complemento dependiente de la vía clásica.

Por consiguiente, en algunos casos, el método comprende administrar a un paciente que padece, o tiene riesgo de desarrollar, una enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 una cantidad de cualquiera de las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad dadas a conocer en la presente memoria en una cantidad suficiente para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 en dicho sujeto mamífero y tratar de ese modo la enfermedad o trastorno. En algunos casos, los métodos se pueden realizar utilizando cualquiera de los kits o envases precargados (por ejemplo, jeringas o viales precargados) descritos en la presente memoria. En algunos casos, el método puede comprender además, antes de administrar la formulación al paciente, determinar que el paciente está aquejado de la enfermedad o trastorno asociado al complemento de las lectinas. En algunos casos, el método comprende además administrar un modificador de la permeabilidad tisular (por ejemplo, hialuronidasa) que aumenta la absorción o dispersión del anticuerpo inhibidor de MASP-2 después de la administración parenteral. El modificador de la permeabilidad tisular se puede coadministrar con la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 o administrar secuencialmente (por ejemplo, en un plazo de 5 minutos desde la administración de la formulación de anticuerpo inhibidor de MASP-2 en el mismo punto de inyección o cerca del mismo).

En algunos casos, el método comprende inyectar a un sujeto con necesidad de la misma una primera jeringa precargada que contiene una formulación de alta concentración y baja viscosidad que comprende anticuerpo inhibidor de MASP-2 (por ejemplo, OMS646) para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2. En algunos casos, el método comprende además inyectar al sujeto una segunda jeringa precargada que contiene un modificador de la permeabilidad tisular, en donde la inyección es en el punto de inyección de la inyección con el anticuerpo inhibidor de MASP-2 o cerca del mismo.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es una microangiopatía trombótica (MAT), que incluye púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), PTT resistente al tratamiento, síndrome de Upshaw-Schulman (SUS), síndrome urémico hemolítico (SUH), síndrome hemolítico atípico (SUHa), síndrome hemolítico atípico no dependiente del factor H, SUHa secundario a una infección, SUHa resistente a la terapia con plasma, una MAT secundaria a cáncer, una MAT secundaria a quimioterapia, una MAT secundaria a trasplante, o una MAT asociada a trasplante de células madre hematopoyéticas.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es una afección renal que incluye, pero no se limita a, glomerulonefritis mesangioproliferativa, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis membranoproliferativa (glomerulonefritis mesangiocapilar), glomerulonefritis posinfecciosa aguda (glomerulonefritis posestreptocócica), glomerulopatía C3, glomerulonefritis crioglobulinémica, glomerulonefritis semilunar necrosante pauciinmunitaria, nefritis lúpica, nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein y nefropatía por IgA.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es fibrosis renal (por ejemplo, fibrosis tubulointersticial) y/o proteinuria en un sujeto que padece, o tiene riesgo de desarrollar, nefropatía crónica, insuficiencia renal crónica, enfermedad glomerular (por ejemplo, glomeruloesclerosis focal y segmentaria), un trastorno de los complejos inmunitarios (por ejemplo, nefropatía por IgA, nefropatía membranosa), nefritis lúpica, síndrome nefrótico, nefropatía diabética, daño tubulointersticial y glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulopatía C3), o una enfermedad o afección asociada a proteinuria, que incluye, pero no se limita a, síndrome nefrótico, preeclampsia, eclampsia, lesiones tóxicas de los riñones, amiloidosis, enfermedades vasculares del colágeno (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico), deshidratación, enfermedades glomerulares (por ejemplo, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis focal y segmentaria, glomerulopatía C3, enfermedad con cambios mínimos, nefrosis lipoidea), ejercicio extenuante, estrés, proteinuria ortostática (postural) benigna, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, nefropatía por IgA (es decir, enfermedad de Berger), nefropatía por IgM, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatía membranosa, enfermedad con cambios mínimos, sarcoidosis, síndrome de Alport, diabetesmellitus(nefropatía diabética), toxicidad inducida por fármacos (por ejemplo, AINE, nicotina, penicilamina, carbonato de litio, oro y otros metales pesados, inhibidores de la ECA, antibióticos (por ejemplo, adriamicina), opiáceos (por ejemplo, heroína) u otras nefrotoxinas); enfermedad de Fabry, infecciones (por ejemplo, VIH, sífilis, hepatitis A, B o C, infección posestreptocócica, esquistosomiasis urinaria); aminoaciduria, síndrome de Fanconi, nefroesclerosis hipertensiva, nefritis intersticial, drepanocitosis, hemoglobinuria, mieloma múltiple, mioglobinuria, rechazo de órganos (por ejemplo, rechazo de trasplantes de riñón), fiebre hemorrágica del Ébola, síndrome ungueal rotuliano, fiebre mediterránea familiar, síndrome de hemólisis, enzimas hepáticas elevadas y bajo recuento de plaquetas (HELLP), lupus eritematoso sistémico, granulomatosis de Wegener, artritis reumatoide, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo 1, síndrome de Goodpasture, púrpura de Henoch-Schonlein, infección de las vías urinarias que se ha propagado a los riñones, síndrome de Sjogren y glomerulonefritis posinfeciosas.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es una reacción inflamatoria como resultado de trasplantes de tejidos u órganos sólidos, que incluyen, pero no se limitan a, alotrasplante o xenotrasplante de órganos completos (por ejemplo, riñón, corazón, hígado, páncreas, pulmón, córnea, y similares) o injertos de tejidos (por ejemplo, válvulas, tendones, médula ósea, y similares).

En algunos casos, el trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es una lesión por isquemia-reperfusión (I/R), que incluye, pero no se limita a, I/R miocárdica, I/R gastrointestinal, I/R renal e I/R después de la reparación de un aneurisma aórtico, I/R asociada a derivación cardiopulmonar, I/R cerebral, accidente cerebrovascular, trasplante de órganos o reimplantación de extremidades o dedos amputados o traumatizados; revascularización a trasplantes y/o replantes, y reanimación hemodinámica después de choque y/o procedimientos quirúrgicos.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es una complicación asociada a diabetes no obesa (diabetes de tipo 1 o diabetesmellitusdependiente de insulina) y/o complicaciones asociadas a diabetes de tipo 1 o tipo 2 (inicio en edad adulta), que incluyen, pero no se limitan a, angiopatía diabética, neuropatía diabética, retinopatía diabética o edema macular diabético.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es una enfermedad o trastorno cardiovascular, que incluye, pero no se limita a, nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico, vasculitis asociada a artritis reumatoide (también denominada artritis reumatoide maligna), vasculitis por complejos inmunitarios, y enfermedad de Takayasu; miocardiopatía dilatada; angiopatía diabética; enfermedad de Kawasaki (arteritis); embolia gaseosa venosa (EGV); e inhibición de la reestenosis después de la colocación de estents, aterectomía rotacional y/o angioplastia coronaria transluminal percutánea (ACTP).

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es un trastorno gastrointestinal inflamatorio, que incluye, pero no se limita a, pancreatitis, diverticulitis y trastornos intestinales, que incluyen enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable y enfermedad intestinal inflamatoria (EII).

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es un trastorno pulmonar, que incluye, pero no se limita a, síndrome de dificultad respiratoria aguda, lesión pulmonar aguda relacionada con transfusiones, lesión pulmonar aguda por isquemia/reperfusión, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, granulomatosis de Wegener, enfermedad de la membrana basal antiglomerular (enfermedad de Goodpasture), síndrome de aspiración meconial, neumonía por aspiración, síndrome de bronquiolitis obliterante, fibrosis pulmonar idiopática, lesión pulmonar aguda secundaria a quemadura, edema pulmonar no cardiogénico, depresión respiratoria y enfisema relacionados con transfusiones.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es una reacción inflamatoria desencadenada por exposición extracorporal y el método comprende tratar a un sujeto que se somete a un procedimiento de circulación extracorporal, que incluye, pero no se limita a, hemodiálisis, plasmaféresis, leucoféresis, oxigenación por membrana extracorporal (Om Ec ), oxigenación por membrana extracorporal inducida por heparina, precipitación de LDL (HELP) y derivación cardiopulmonar (DCP).

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es artritis inflamatoria o no inflamatoria y otros trastornos musculoesqueléticos, que incluyen, pero no se limitan a, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, gota, artropatía neuropática, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante u otras espondiloartropatías y artropatías cristalinas, distrofia muscular y lupus eritematoso sistémico (LES).

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es un trastorno cutáneo, que incluye, pero no se limita a, psoriasis, dermatosis ampollosas autoinmunitarias, espongiosis eosinofílica, penfigoide ampolloso, epidermólisis ampollosa adquirida, dermatitis atópica, herpes gestacional y otros trastornos cutáneos, y para el tratamiento de quemaduras térmicas y químicas que incluyen fuga capilar causada por las mismas.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es un trastorno o lesión del sistema nervioso periférico (SNP) y/o del sistema nervioso central (SNC), que incluye, pero no se limita a, esclerosis múltiple (E<m>), miastenia grave (MG), enfermedad de Huntington (EH), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), síndrome de Guillain Barré, reperfusión después de accidente cerebrovascular, discopatía degenerativa, traumatismo cerebral, enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), síndrome de Miller-Fisher, traumatismo cerebral y/o hemorragia, lesión cerebral traumática, desmielinización y meningitis.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es sepsis o una afección como resultado de sepsis, que incluye, sin limitación, sepsis grave, choque séptico, síndrome de dificultad respiratoria aguda como resultado de sepsis, anemia hemolítica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, o choque hemorrágico.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociada al complemento dependiente de MASP-2 es un trastorno urogenital que incluye, pero no se limita a, síndrome de vejiga dolorosa, síndrome de vejiga sensorial, cistitis abacteriana crónica y cistitis intersticial, infertilidad masculina y femenina, disfunción placentaria, aborto espontáneo y preeclampsia.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es una reacción inflamatoria en un sujeto que está siendo tratado con quimioterapia y/o radioterapia, que incluye, pero no se limita a, para el tratamiento de afecciones cancerosas.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es un cáncer dependiente de la angiogénesis, que incluye, pero no se limita a, tumor o tumores sólidos, tumores hematógenos, tumores carcinoides de alto riesgo y metástasis tumorales.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es un tumor benigno dependiente de la angiogénesis, que incluye, pero no se limita a, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, tumores carcinoides y granulomas piógenos.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es un trastorno endocrino, que incluye, pero no se limita a, tiroiditis de Hashimoto, estrés, ansiedad y otros posibles trastornos hormonales que implican la liberación regulada de prolactina, factor de crecimiento o factor de crecimiento similar a la insulina, y adrenocorticotropina desde la hipófisis.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es una enfermedad o trastorno oftálmico que incluye, pero no se limita a, degeneración macular senil, glaucoma y endoftalmitis.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es una enfermedad o afección angiogénica ocular que incluye, pero no se limita a, degeneración macular senil, uveítis, melanoma ocular, neovascularización corneal, pterigión primario, queratitis estromal por HSV, linfangiogénesis corneal inducida por HSV-1, retinopatía diabética proliferativa, edema macular diabético, retinopatía del prematuro, oclusión de la vena retiniana, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, hemorragia vítrea secundaria a retinopatía diabética proliferativa, neuromielitis óptica y rubeosis.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 es coagulación intravascular diseminada (CID) u otro trastorno de la coagulación mediado por el complemento, que incluye CID secundaria a sepsis, traumatismo grave, que incluye traumatismo neurológico (por ejemplo, lesión aguda en la cabeza, véase Kumuraet al.,Acta Neurochirurgica 85:23-28 (1987), infección (bacteriana, viral, fúngica, parasitaria), cáncer, complicaciones obstétricas, hepatopatía, reacción tóxica grave (por ejemplo, mordedura de serpiente, picadura de insecto, reacción a transfusiones), choque, golpe de calor, rechazo de trasplantes, aneurisma vascular, insuficiencia hepática, tratamiento del cáncer mediante quimioterapia o radioterapia, quemaduras o exposición accidental a radiación.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 se selecciona del grupo que consiste en síndrome agudo por radiación, enfermedad por depósitos densos, enfermedad de Degos, síndrome antifosfolipídico catastrófico (SAFC), enfermedad de Behcet, crioglobulinemia; hemoglobinuria paroxística nocturna (“HPN”) y enfermedad por crioaglutininas.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2 se selecciona del grupo que consiste en SUHa, MAT-TCMH, NIgA y nefritis lúpica (NL).

Síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa)

El síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa) es parte de un grupo de afecciones denominadas “microangiopatías trombóticas”. En la forma atípica de SUH (SUHa), la enfermedad está asociada a regulación defectuosa del complemento y puede ser esporádica o familiar. Los casos familiares de SUHa están asociados a mutaciones en genes codificantes de proteínas de activación del complemento o reguladoras del complemento, que incluyen el factor H, factor I, factor B del complemento, el cofactor de membrana CD46, así como la proteína 1 relacionada con el factor H del complemento (CFHR1) y la proteína 3 relacionada con el factor H del complemento (CFHR3). (Zipfel, PF,et al.,PloS Genetics 3(3):e41 (2007)). La característica unificadora de esta diversa gama de mutaciones genéticas asociadas al SUHa es una predisposición a activación del complemento potenciada sobre las superficies celulares o tisulares. Un sujeto tiene riesgo de desarrollar SUHa tras la aparición de al menos uno o más síntomas indicativos de SUHa (por ejemplo, la presencia de anemia, trombocitopenia y/o insuficiencia renal) y/o la presencia de microangiopatía trombótica en una biopsia obtenida del sujeto. La determinación de si un sujeto tiene riesgo de desarrollar SUHa comprende determinar si el sujeto tiene una predisposición genética a desarrollar SUHa, lo que se puede llevar a cabo evaluando información genética (por ejemplo, a partir de una base de datos que contenga el genotipo del sujeto), o realizando al menos una prueba de cribado genético en el sujeto para determinar la presencia o ausencia de un marcador genético asociado al SUHa (es decir, determinando la presencia o ausencia de una mutación genética asociada al SUHa en los genes que codifican el factor H (CFH), factor I (CFI), factor B (CFB) del complemento, el cofactor de membrana CD46, C3, la proteína 1 relacionada con el factor H del complemento (CFHR1), o THBD (que codifica la proteína anticoagulante trombodulina), la proteína 3 relacionada con el factor H del complemento (CFHR3), o la proteína 4 relacionada con el factor H del complemento (CFHR4)), mediante secuenciación del genoma o análisis específico de genes (por ejemplo, análisis por PCR) y/o determinando si el sujeto tiene antecedentes familiares de SUHa. Los métodos de cribado genéti

Como se describe en el documento US2015/0166675, en un modelo experimental humanoex vivode microangiopatía trombótica (MAT), OMS646 inhibió la activación del complemento y la formación de trombos en células endoteliales microvasculares expuestas a muestras de suero de pacientes con SUHa, tanto en la fase aguda como en remisión. Como se describe además en el documento US2017/0137537, los datos obtenidos en un ensayo clínico de fase 2 abierto (administración i.v. de 2-4 mg/kg de anticuerpo inhibidor de MASP-2 OMS646 una vez a la semana durante 4 semanas consecutivas), el tratamiento con OMS646 demostró eficacia en pacientes con SUHa. Los recuentos de plaquetas de los tres pacientes con SUHa en las cohortes de dosis medias y altas (dos en la cohorte de dosis medias y uno en la de dosis altas) volvieron a la normalidad, con un aumento medio estadísticamente significativo desde el momento basal de aproximadamente 68000 plaquetas/mL (p = 0,0055).

MAT asociada a trasplante de células madre hematopoyéticas (MAT-TCMH)

La MAT asociada a trasplante de células madre hematopoyéticas (MAT-TCMH) es una complicación potencialmente mortal que es desencadenada por lesión endotelial. El riñón es el órgano más habitualmente afectado, aunque la<m>AT-TCMH puede ser una enfermedad multisistémica que también implica al pulmón, intestino, corazón y cerebro. La aparición de MAT, incluso leve, está asociada a insuficiencia renal a largo plazo. El desarrollo de MAT asociada a pos-TCMH alogénico difiere en frecuencia sobre la base de diversos criterios de diagnóstico y pautas profilácticas de acondicionamiento y de la enfermedad del injerto contra el hospedador, siendo los inhibidores de la calcineurina los fármacos más frecuentes implicados (Ho VTet al.,Biol Blood Marrow Transplant, 11 (8):571 -5, 2005).

Como se describe en el documento US2017/0137537, en un ensayo clínico de fase 2 (administración i.v. de 4 mg/kg de anticuerpo inhibidor de MASP-2 OMS646 una vez a la semana durante 4 a 8 semanas consecutivas), el tratamiento con OMS646 mejoró los marcadores de MAT en pacientes que padecían MAT-TCMH, lo que incluyó una mejora estadísticamente significativa en los niveles de LDH y haptoglobina. Los pacientes con MAT-TCMH tratados con OMS646 representan algunos de los más difíciles de tratar, demostrando de ese modo indicios clínicos de un efecto terapéutico de OMS646 en pacientes con MAT-TCMH.

Nefropatía por inmunoglobulina A (NIgA)

La nefropatía por inmunoglobulina A (NIgA) es una nefropatía autoinmunitaria que produce inflamación intrarrenal y lesión renal. La NIgA es la enfermedad glomerular primaria principal más habitual a nivel mundial. Con una incidencia anual de aproximadamente 2,5 por cada 100000, se estima que 1 de cada 1400 personas en los EE. UU. desarrollará NIgA. Hasta 40 % de los pacientes con NIgA desarrollarán nefropatía terminal (NT). Los pacientes presentan habitualmente hematuria microscópica, con proteinuria leve o moderada, y niveles variables de insuficiencia renal (Wyatt R.J.,et al.,N Engl J Med 368(25):2402-14, 2013). Marcadores clínicos tales como función renal alterada, hipertensión sostenida y proteinuria grave (más de 1 g al día) están asociados a mal pronóstico (Goto Met al.,Nephrol Dial Transplant 24(10):3068-74, 2009; Berthoux F.et al.,J Am Soc Nephrol 22(4):752-61,2011). La proteinuria es el factor pronóstico más fuerte, independiente de otros factores de riesgo, en múltiples estudios observacionales y ensayos prospectivos grandes (Coppo R.et al.,J Nephrol 18(5):503-12, 2005; Reich H.N.,et al.,J Am Soc Nephrol 18(12):3177-83, 2007). Se estima que, si no se trata, 15-20 % de los pacientes alcanzan NT en el plazo de 10 años desde la aparición de la enfermedad (D'Amico G., Am J Kidney Dis 36(2):227-37, 2000). La seña distintiva diagnóstica de la NIgA es el predominio de depósitos de IgA, sola o con IgG, IgM o ambas, en el mesangio glomerular.

Como se describe en el documento US2017/0189525, en un ensayo renal de fase 2 abierto (administración i.v de 4 mg/kg de anticuerpo inhibidor de MASP-2 OMS646 una vez a la semana durante 12 semanas consecutivas), los pacientes con nefropatía por IgA que fueron tratados con OMS646 presentaron una disminución clínicamente significativa y estadísticamente significativa en las relaciones de albúmina a creatinina en orina (ACRo) durante todo el ensayo y reducción de los niveles de proteína en orina de 24 horas desde el momento basal hasta el final del tratamiento.

Nefritis lúpica (NL)

Una complicación principal del lupus eritematoso sistémico (LES) es la nefritis, también conocida como nefritis lúpica, que se clasifica como una forma secundaria de glomerulonefritis. Hasta 60 % de los adultos con LES tienen alguna forma de afectación renal posteriormente en el curso de la enfermedad (Koda-Kimbleet al.,Koda-Kimble and Young's Applied Therapeutics: the Clinical Use of Drugs, 10.a edición, Lippincott Williams & Wilkins: páginas 792-9, 2012), con una prevalencia de 20-70 por cada 100000 personas en los EE. UU. La nefritis lúpica se presenta a menudo en pacientes con otros síntomas de LES activo, que incluyen fatiga, fiebre, erupción cutánea, artritis, serositis o enfermedad del sistema nervioso central (Pisetsky<d>Set al.,Med Clin North Am 81(1 ):113-28, 1997). Algunos pacientes tienen nefritis lúpica asintomática; sin embargo, durante el seguimiento regular, las anomalías de laboratorio, tales como niveles de creatinina sérica elevados, niveles de albúmina bajos, o proteína o sedimento urinario, sugieren nefritis lúpica activa.

Como se describe en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 15/470,647, en un ensayo renal de fase 2 abierto (administración i.v. de 4 mg/kg de anticuerpo inhibidor de MASP-2 OMS646 una vez a la semana durante 12 semanas consecutivas), 4 de 5 pacientes con nefritis lúpica (NL) que fueron tratados con un anticuerpo anti-MASP-2 presentaron una disminución clínicamente significativa en los niveles de proteína en orina de 24 horas desde el momento basal hasta el final del tratamiento.

Administración

Las formulaciones de anticuerpo inhibidor de MASP-2 de alta concentración y baja viscosidad descritas en la presente memoria se pueden administrar a un sujeto con necesidad de tratamiento utilizando métodos conocidos en la técnica, tal como mediante inyecciones o infusiones únicas o múltiples durante un periodo de tiempo de una manera adecuada, por ejemplo, inyección o infusión por vía subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular. Como se describe en la presente memoria, las formulaciones parenterales se pueden formular en forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la posología. Como se emplea en la presente memoria, el término “forma farmacéutica unitaria” se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como posologías unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con la solución acuosa farmacéutica seleccionada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la posología adecuada del anticuerpo inhibidor de MASP-2 dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la gravedad y el curso de la enfermedad. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una sola vez o durante una serie de tratamientos. En función del tipo y gravedad de la enfermedad, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se puede administrar en una dosis fija o en una dosis de miligramos por kilogramo (mg/kg). Las posologías ejemplares del anticuerpo inhibidor de MASP-2 contenido en las formulaciones descritas en la presente memoria incluyen, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, tal como aproximadamente 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg o 20 mg/kg, que se pueden administrar una vez al día, dos veces a la semana, una vez a la semana, cada dos semanas o cada mes.

Las dosis fijas ejemplares del anticuerpo inhibidor de MASP-2, tales como las formulaciones descritas en la presente memoria incluyen, por ejemplo, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1000 mg, tal como aproximadamente 50 mg a aproximadamente 750 mg, tal como aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, tal como aproximadamente 200 mg a aproximadamente 400 mg, tal como aproximadamente 200 mg, aproximadamente 225 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 275 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 325 mg, aproximadamente 350 mg, aproximadamente 375 mg, o aproximadamente 400 mg, que se pueden administrar una vez al día, dos veces a la semana, una vez a la semana, cada dos semanas o cada mes.

En lo que respecta al volumen de suministro de las formulaciones, la concentración del anticuerpo en una formulación utilizada para una aplicación terapéutica se determina sobre la base de proporcionar el anticuerpo en una posología y volumen que sean tolerados por el paciente y de valor terapéutico para el mismo. Para una formulación de anticuerpo terapéutica que se va a administrar mediante inyección, la concentración de anticuerpo será dependiente del volumen de inyección (normalmente de 0,5 mL a 3 mL). Las terapias basadas en anticuerpos pueden requerir varios mg/kg de dosificación al día, a la semana, al mes o cada varios meses. Por consiguiente, si se va a proporcionar un anticuerpo inhibidor de MASP-2 en 1 mg/kg a 5 mg/kg (por ejemplo, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg o 5 mg/kg) de peso corporal del paciente, y un paciente promedio pesa 75 kg, será necesario suministrar de 75 mg a 375 mg del anticuerpo en un volumen de inyección de 0,5 mL a 3,0 mL. Alternativamente, la formulación se proporciona en una concentración adecuada para suministro en más de un punto de inyección por tratamiento.

En un caso preferido en el que la concentración del anticuerpo OMS646 en la formulación es aproximadamente 185 mg/mL, para una posología de 1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal del paciente (suponiendo 75 kg), la formulación se suministraría por vía subcutánea en un volumen de inyección de aproximadamente 0,40 mL a aproximadamente 2,0 mL.

Como se describe en la presente memoria, las formulaciones de la presente divulgación son adecuadas tanto para posología intravenosa (i.v.) como para administración subcutánea (s.c.).

En función del tipo y gravedad de la enfermedad, el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se puede administrar por vía intravenosa en una dosis fija o en una dosis de miligramos por kilogramo (mg/kg). Las posologías ejemplares del anticuerpo inhibidor de MASP-2 contenido en las formulaciones descritas en la presente memoria se pueden administrar por vía intravenosa diluyendo una cantidad apropiada de la formulación de alta concentración descrita en la presente memoria con un diluyente farmacéuticamente aceptable antes de la administración, de modo tal que el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se administre a un sujeto humano en una posología de, por ejemplo, aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, tal como aproximadamente 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg o 20 mg/kg, que se pueden administrar una vez al día, dos veces a la semana, una vez a la semana, cada dos semanas o cada mes

El anticuerpo inhibidor de MASP-2 también se puede suministrar por vía intravenosa en una dosis fija diluyendo una cantidad apropiada de la formulación de alta concentración descrita en la presente memoria con un diluyente farmacéuticamente aceptable antes de la administración, de modo tal que el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se administre a un sujeto humano en una posología de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1000 mg, tal como aproximadamente 50 mg a aproximadamente 750 mg, tal como aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, tal como aproximadamente 200 mg a aproximadamente 400 mg, tal como aproximadamente 200 mg, aproximadamente 225 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 275 mg, aproximadamente 300 mg, tal como aproximadamente 300 mg a aproximadamente 400 mg, tal como aproximadamente 310 mg, aproximadamente 320 mg, aproximadamente 325 mg, aproximadamente 330 mg, aproximadamente 340 mg, aproximadamente 350 mg, aproximadamente 360 mg, aproximadamente 370 mg, aproximadamente 375 mg, aproximadamente 380 mg, aproximadamente 390 mg o aproximadamente 400 mg, que se pueden administrar una vez al día, dos veces a la semana, una vez a la semana, cada dos semanas o cada mes.

En algunos casos, la formulación que comprende el anticuerpo inhibidor de MASP-2 se diluye en un diluyente farmacéuticamente aceptable antes del suministro sistémico (por ejemplo, intravenoso). Los diluyentes ejemplares que se pueden utilizar incluyen agua para inyección, dextrosa al 5 %, solución salina al 0,9 %, solución de Ringer y otros diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados para suministro intravenoso. Sin pretender ser limitantes de ninguna manera, las posologías ejemplares de un anticuerpo inhibidor de MASP-2 que se va a administrar por vía intravenosa para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno del complemento dependiente de MASP-2 incluyen, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, tal como aproximadamente 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/ kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/ kg o 20 mg/kg, que se pueden administrar una vez al día, dos veces a la semana, una vez a la semana, cada dos semanas o cada mes. Las posologías fijas ejemplares del anticuerpo inhibidor de MASP-2 que se va a administrar por vía intravenosa para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno del complemento dependiente de MASP-2 incluyen, por ejemplo, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1000 mg, tal como aproximadamente 50 mg a aproximadamente 750 mg, tal como aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, tal como aproximadamente 200 mg a aproximadamente 400 mg, tal como aproximadamente 200 mg, aproximadamente 225 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 275 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 325 mg, aproximadamente 350 mg, aproximadamente 375 mg o aproximadamente 400 mg, que se pueden administrar una vez al día, dos veces a la semana, una vez a la semana, cada dos semanas o cada mes.

En algunos casos, la formulación se diluye en un diluyente farmacéuticamente aceptable y se administra a un sujeto con necesidad de la misma con una dosis de carga i.v. inicial (por ejemplo, aproximadamente 300 mg a aproximadamente 750 mg, tal como aproximadamente 400 mg a aproximadamente 750 mg, tal como aproximadamente 300 mg a aproximadamente 500 mg, tal como aproximadamente 300 mg a aproximadamente 400 mg, tal como aproximadamente 300 mg, aproximadamente 310 mg, aproximadamente 320 mg, aproximadamente 330 mg, aproximadamente 340 mg, aproximadamente 350 mg , aproximadamente 360 mg, aproximadamente 370 mg, aproximadamente 380 mg, aproximadamente 390 mg o aproximadamente 400 mg), seguida de una o más inyecciones subcutáneas de la formulación con una posología de 1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, o una posología fija de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 400 mg, tal como aproximadamente 100 mg, aproximadamente 150 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 350 mg o aproximadamente 400 mg. Por ejemplo, una dosis de carga i.v. inicial puede ser la vía de administración preferida en casos particulares, tal como cuando un paciente está en el hospital o en una clínica y padece una afección aguda (por ejemplo, SUHa) que requiere una dosis de carga inicial seguida de dosificación de mantenimiento con inyección subcutánea de la formulación.

Ejemplos

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra que OMS646, un anticuerpo monoclonal que se dirige a MASP-2 humana, se une a MASP-2 humana con alta afinidad y bloquea la actividad del complemento de la vía de las lectinas.

Antecedentes

Se generó un anticuerpo monoclonal completamente humano que se dirige a MASP-2 humana (expuesto como SEQ ID NO: 1), denominado “OMS646”, como se describe en el documento WO2012/151481. El anticuerpo monoclonal OMS646 comprende una región variable de cadena pesada (VH) expuesta como SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera (VL) expuesta como SEQ ID NO: 3. OMS646 está compuesto por regiones variables de origen humano fusionadas a regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera lambda de IgG4 humana y es secretado como un tetrámero glicosilado enlazado mediante puentes disulfuro que consiste en dos cadenas pesadas idénticas (que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta como 4) y dos cadenas ligeras lambda idénticas (que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 5). El residuo de asparagina (N) en la posición 295 de la cadena pesada (SEQ ID NO:4) está glicosilado y está indicado en negrita y texto subrayado.

Región variable de cadena pesada

A continuación se presenta la secuencia de la región variable de cadena pesada (VH) para OMS646. Las CDR de Kabat (31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-107 (H3)) están en negrita y las CDR de Chothia (26-32 (H1), 52-56 (H2) y 95-101 (H3)) están subrayadas.

Región variable de cadena pesada (VH) de OMS646 (SEQ ID NO: 2) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTV SGFSLSRGKMGV SWIRQPPGKALEWL AHIFSSDEKS YR TSLKSRLTISKDTSKNOVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGOGTLVTVSS

Región variable de cadena ligera

A continuación se presenta la secuencia de la región variable de cadena ligera (VL) para OMS646. Las CDR de Kabat (24-34 (L1); 50-56 (L2) y 89-97 (L3) están subrayadas. Estas regiones son las mismas, ya sea numeradas mediante el sistema de Kabat o de Chothia.

Región variable de cadena ligera (VL) de OMS646 (SEQ ID NO: 3) OPVLTOPPSLSVSPGOTASITCSGEKLGDKYAYWYOOKPGOSPVLVMYODKORPSGIPERE SGSNSGNTATLTISGTOAMDEADYYCOAWDSSTAVFGGGTKLTVL

Polipéptido de longitud completa de cadena pesada mutada de IgG4 de cadena pesada de OMS646 (445 aa) (SEQ ID NO: 4) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDT SKNQWLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Polipéptido de longitud completa de cadena ligera de OMS646 (212 aa) (SEQ ID NO: 5) QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS GTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKA DSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

Como se describe en el documento WO2012/151481, OMS646 se une a MASP-2 e inhibe selectivamente la vía de las lectinas y no inhibe sustancialmente la vía clásica (es decir, inhibe la vía de las lectinas dejando al mismo tiempo la vía clásica del complemento intacta), y también presenta al menos una o más de las características siguientes: dicho anticuerpo une MASP-2 humana con una K<d>de 10 nM o menos, dicho anticuerpo une un epítopo en el dominio CCP1 de MASP-2, dicho anticuerpo inhibe la deposición de C3b en un ensayoin vitroen suero humano al 1 % con una CI<50>de 10 nM o menos, dicho anticuerpo inhibe la deposición de C3b en suero humano al 90 % con una CI<50>de 30 nM o menos, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de Fv, Fab, Fab', F(ab)<2>y F(ab')<2>, en donde el anticuerpo es una molécula monocatenaria, en donde dicho anticuerpo es una molécula de IgG2, en donde dicho anticuerpo es una molécula de IgG1, en donde dicho anticuerpo es una molécula de IgG4, en donde la molécula de IgG4 comprende una mutación S228P.

Como se describe en el documento WO2012/151481, se determinó que OMS646 se une ávidamente a MASP-2 humana (SEQ ID NO: 1) con selectividad >5000 veces, en comparación con C1s, C1r, MASP-1 o MASP-3. Como se muestra en este ejemplo, OMS646 se une específicamente a MASP-2 humana con alta afinidad y tiene la capacidad de bloquear la actividad del complemento de la vía de las lectinas.

Como se ha mostrado anteriormente, OMS646 comprende (a) una región variable de cadena pesada que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de 31-35 de SEQ ID NO: 2, ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-65 de SEQ ID NO: 2, y iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de 95-107 de SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de 24-34 de SEQ ID NO: 3, ii) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de 50-56 de SEQ ID NO: 3, y iii) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de 89-97 de SEQ ID NO: 3.

Como se describe además en el documento WO2012/151481, se demostró que una variante de OMS646, que tiene una región variable de cadena pesada con al menos 95 % de identidad a SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera con al menos 95 % de identidad a SEQ ID NO: 3, tiene actividad funcional similar a OMS646. La variante de OMS646 descrita en el documento WO2012/151481, comprende a) una región variable de cadena pesada que comprende: SEQ ID NO: 2, o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a SEQ ID NO: 2, en donde el residuo 31 es una R, el residuo 32 es una G, el residuo 33 es una K, el residuo 34 es una M, el residuo 35 es una G, el residuo 36 es una V, el residuo 37 es una S, el residuo 50 es una L, el residuo 51 es una A, el residuo 52 es una H, el residuo 53 es una I, el residuo 54 es una F, el residuo 55 es una S, el residuo 56 es una S, el residuo 57 es un D, el residuo 58 es un E, el residuo 59 es una K, el residuo 60 es una S, el residuo 61 es una Y, el residuo 62 es una R, el residuo 63 es una T, el residuo 64 es una S, el residuo 65 es una L, el residuo 66 es una K, el residuo 67 es una S, el residuo 95 es una Y, el residuo 96 es una Y, el residuo 97 es una C, el residuo 98 es una A, el residuo 99 es una R, el residuo 100 es una I, el residuo 101 es una R, el residuo 102 es una R o A, el residuo 103 es una G, el residuo 104 es una G, el residuo 105 es una I, el residuo 106 es un D y el residuo 107 es una Y; y b) una región variable de cadena ligera que comprende: SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a SEQ ID NO: 3, en donde el residuo 23 es una S, el residuo 24 es una G, el residuo 25 es un E o D, el residuo 26 es una K, el residuo 27 es una L, el residuo 28 es una G, el residuo 29 es un D, el residuo 30 es una K, el residuo 31 es una Y o F, el residuo 32 es una A, el residuo 33 es una Y, el residuo 49 es una Q, el residuo 50 es un D, el residuo 51 es una K o N, el residuo 52 es una Q o K, el residuo 53 es una R, el residuo 54 es una P, el residuo 55 es una S, el residuo 56 es una G, el residuo 88 es una Q, el residuo 89 es una A, el residuo 90 es un W, el residuo 91 es un D, el residuo 92 es una S, el residuo 93 es una S, el residuo 94 es una T, el residuo 95 es una A, el residuo 96 es una V y el residuo 97 es una F.

1. OMS646 bloquea específicamente la activación dependiente de las lectinas de los componentes del complemento terminales

Métodos

El efecto de OMS646 sobre el complejo de ataque a la membrana (CAM) se analizó utilizando condiciones específicas de la vía para la vía de las lectinas, la vía clásica y la vía alternativa. Para este fin, se utilizó el kit de cribado del complemento Comp300 de Wieslab (Wieslab, Lund, Suecia) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Resultados

La FIGURA 1A ilustra gráficamente la cantidad de deposición de CAM dependiente de la vía de las lectinas en presencia de diferentes cantidades de anticuerpo inhibidor de MASP-2 humana (OMS646). La FIGURA 1B ilustra gráficamente la cantidad de deposición de CAM dependiente de la vía clásica en presencia de anticuerpo inhibidor de MASP-2 humana (OMS646). La FIGURA 1C ilustra gráficamente la cantidad de deposición de CAM dependiente de la vía alternativa en presencia de diferentes cantidades de anticuerpo inhibidor de MASP-2 humana (OMS646). Como se muestra en la FIGURA 1A, OMS646 bloquea la activación de la deposición de CAM mediada por la vía de las lectinas con un valor de CI<50>de aproximadamente 1 nM. Sin embargo, OMS646 no tuvo ningún efecto sobre la deposición de CAM generada a partir de la activación mediada por la vía clásica (FIGURA 1B) o a partir de la activación mediada por la vía alternativa (FIGURA 1C).

Ejemplo 2

Estudios de preformulación de OMS646

Antecedentes/Base teórica

La composición de una formulación de proteína de viscosidad reducida se determina mediante la consideración de diversos factores que incluyen, pero no se limitan a: la naturaleza de la proteína, la concentración de la proteína, el intervalo de pH deseado, la temperatura a la que se va a almacenar la formulación de proteína, el periodo de tiempo durante el que se va a almacenar la formulación de proteína, y cómo se va a administrar la formulación a un paciente. Para una formulación de viscosidad reducida que se va a administrar mediante inyección, la concentración de proteína es dependiente del volumen de inyección (normalmente de 1,0 mL a 2,25 mL). Si se va a proporcionar una proteína en 2 a 4 mg/kg de peso corporal de un paciente, y un paciente promedio pesa 75 kg, será necesario suministrar 150 mg-300 mg de proteína en un volumen de inyección de 1,0 mL a 1,62 mL. La viscosidad se mantiene idealmente por debajo de aproximadamente 25 mPa-s (cP) para garantizar un producto terapéutico subcutáneo realmente jeringable. En algunos casos, la viscosidad se mantiene por debajo de aproximadamente 20 mPa-s (cP) para permitir el suministro del producto terapéutico con un dispositivo de inyección, y también para permitir diversos tipos de bioprocesamiento, tal como filtración de flujo tangencial.

El objetivo principal de estos estudios era identificar componentes de la formulación que darían como resultado estabilidad química, física y estructural óptima del anticuerpo OMS646 en una formulación líquida que daría como resultado una formulación estable con una viscosidad de menos de 25 mPa-s (cP), tal como menos de 20 mPa-s (cP), con una alta concentración de OMS646 (100 mg/mL o mayor) adecuada para inyección subcutánea a un sujeto humano.

Métodos analíticos

Para ensayar diversas combinaciones de tampones y excipientes, se diluyó un preparado de anticuerpo OMS646 purificado (102 mg/mL en acetato de sodio 20 mM, 50 mg/mL de sorbitol, pH 5,0) hasta ~1 mg/mL en las soluciones de formulación seleccionadas, y se colocaron volúmenes de 4 mL en concentradores previamente enjuagados con el tampón apropiado. Cada unidad se centrifugó hasta ~1 mL a 3200 x g. Este procedimiento se repitió durante un total de tres rondas de intercambio de tampón.

El aspecto de la formulación se evaluó utilizando una lámpara de observación de Eisai Machinery, modelo MIH-DX, frente a agua utilizando fondos blancos y negros. Se ensayó cada muestra de formulación para determinar el color, la transparencia (opalescencia) y la presencia de materia particulada.

El contenido de proteína de las formulaciones de OMS646 se determinó utilizando un coeficiente de extinción de 1,49 mL/mg x cm. La medición de la absorbancia a 280 nm, con corrección para la absorbancia a 320 nm, se realizó utilizando UVettes desechables y una longitud de trayectoria de 0,2 cm. Las muestras se prepararon por duplicado mediante dilución con 1 x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) hasta una concentración final de ~2 mg/mL. Para las muestras de alta concentración, las soluciones puras se diluyeron primero 1:1 en tampón de formulación y a continuación se diluyeron hasta ~2 mg/mL en 1 x DPBS. Se promediaron las mediciones duplicadas para cada muestra y se calculó el porcentaje de desviación estándar relativa (DER). Para cualesquiera muestras duplicadas que presentaran >5 % de DER, se preparó y midió un conjunto de dilución adicional.

La concentración de proteína se calculó como se indica a continuación:

A280 corregida = A280 - A320

Concentración de proteína (mg/mL) =(A280 corregida x factor de dilución)/1,49 mL/mg x cm

Para evaluar la turbidez/dispersión de luz de la muestra, se midieron 100 pL de muestra no diluida a 320 nm en una UVette desechable utilizando una longitud de trayectoria de 1 cm. Para cada muestra, se calibró el espectrofotómetro con un blanco de la solución de intercambio de tampón apropiada sin la proteína presente. Después de la medición, se recuperaron las muestras y se utilizaron para el análisis del pH. Con el fin de normalizar las mediciones de turbidez para la concentración de las muestras, la A320 también se dividió por la concentración en mg/mL y se notificó el valor resultante en mAU x mL/mg.

Las mediciones de pH de todas las formulaciones y soluciones se realizaron a temperatura ambiente utilizando un medidor SevenMulti calibrado (Mettler Toledo) con un electrodo de compensación automática de temperatura.

La estabilidad térmica de las formulaciones de OMS646 se supervisó mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). Los datos de temperatura de fusión (T<m>) para el anticuerpo monoclonal se recogieron utilizando un calorímetro diferencial de barrido capilar MicroCal DSC. Las muestras de proteína se diluyeron hasta una concentración final de ~2 mg/mL en la solución de intercambio de tampón apropiada. La evaluación de las muestras mediante DSC se realizó mediante barrido de 20-110 °C a 1 °C/minuto o 2 °C/minuto. El termostato prebarrido se ajustó hasta 10 minutos, el termostato posbarrido hasta 0 minutos y el termostato posciclo se ajustó hasta 25 °C. Para el análisis de datos de T<m>, se sustrajo un barrido de tampón-tampón del barrido de tampón-muestra y a continuación se normalizó el termograma a la concentración de proteína (molar) utilizando una estimación del peso molecular de 150 kDa. Se generó una línea de base progresiva y se sustrajo de los datos para facilitar la determinación de Tf. Las temperaturas de fusión se determinaron utilizando la función de selección de picos del software científico Origin<®>asociado.

La dispersión dinámica de la luz (DLS) mide las fluctuaciones dependientes del tiempo en la intensidad de luz dispersada a partir de partículas en una muestra, donde se utiliza la ecuación de Stokes Einstein para calcular el radio hidrodinámico de la partícula o partículas en solución. Los experimentos de DLS para formulaciones de OMS646 se realizaron con muestras no diluidas duplicadas (30-40 pL) utilizando un instrumento DynaPro<™>Plate Reader II (Wyatt). Se realizaron un total de 10 barridos individuales a 25 °C, con un tiempo de adquisición de 5 segundos. La viscosidad se ajustó a la de la solución salina tamponada con fosfato, 1,019 mPa-s (cP).

Las representaciones gráficas de la distribución de intensidades resultante se compararon para evaluar los efectos de diversos componentes de la formulación sobre el tamaño de partícula medio mediante la intensidad (diámetro general), un parámetro de la anchura de la distribución de tamaños global (porcentaje general de polidispersidad o % de Pd), el diámetro de pico promedio del monómero de OMS646 (diámetro de pico 2), y el parámetro de anchura de ese pico (% de Pd del pico 2). El porcentaje de polidispersidad (general o del pico 2) es un parámetro de anchura que refleja la heterogeneidad detectada en la representación gráfica de la distribución de intensidades, donde % de Pd <20 % es indicativo de una solución casi monodispersa y/o conformación de especies.

La estabilidad frente a la desnaturalización química se evaluó utilizando el sistema de desnaturalización química isotérmica AVIA (Modelo 2304), que ensaya la estabilidad química en condiciones ambientales de forma automatizada mediante la generación de un gradiente desnaturalizante mezclando volúmenes constantes de proteína formulada con tampón de formulación y tampón de formulación que contiene urea. Brevemente, la proteína formulada se diluyó hasta 0,33 mg/mL en tampón de formulación. Para una formulación dada, también se preparó un segundo tampón de formulación que contenía urea 10 M. Debido a problemas de solubilidad, se prepararon soluciones de urea 9 M para las formulaciones que contenían sacarosa y sorbitol. Después de un tiempo de incubación uniforme (~30 minutos), se mide la fluorescencia intrínseca de la proteína (es decir, fluorescencia del triptófano) para cada punto de datos, donde el desplegamiento químico de la proteína da como resultado la exposición de triptófanos ocultos al disolvente con un desplazamiento hacia el rojo asociado en la señal de fluorescencia. Para cada formulación, se obtuvieron datos para un total de 24 concentraciones de urea (0-9,0 M para soluciones madre de urea 10 M y 0-8,1 M para soluciones madre de urea 9 M), y se utilizó la relación de Abs350/Abs330 para la sustracción de la línea de base de los cambios de fluorescencia de fondo, y se empleó un ajuste de mínimos cuadrados no lineal a los datos de transición de desplegamiento utilizando un modelo de 2 estados o 3 estados.

La viscosidad de las formulaciones se determinó usando un viscosímetro de bola rodante o un reómetro. Todas las mediciones de viscosidad se realizaron a 25 °C con una velocidad de cizalladura en el intervalo de 0,5 s_1 a 1000 s-1. Las mediciones con bola rodante se realizaron utilizando un viscosímetro AMVn de Anton Paar. Para las mediciones de viscosidad con bola rodante, se mide el tiempo que tarda una bola de oro en recorrer una distancia en un capilar lleno con la muestra después de inclinar el capilar hasta un ángulo predefinido (80 grados). Los capilares se inclinaron un total de tres veces y los resultados se promediaron para determinar la viscosidad dinámica final, un valor que no es dependiente de la densidad de la muestra. Para las mediciones con bola rodante, primero se lavó el capilar utilizando agua DI y metanol. La calibración del instrumento/capilar se confirmó mediante la medición de 10 mPa-s (cP), 50 mPa-s (cP) y/o 100 mPa-s (cP), patrones de viscosidad Brookfield. El capilar se volvió a lavar con agua DI y metanol antes de cada medición de las muestras y entre las mismas.

Las mediciones de viscosidad a base de reómetro se realizaron utilizando un reómetro programable DV-III Ultra que se calibró con fluido patrón de viscosidad Brookfield n.° 10 y n.° 50. Se midieron 0,5 mL de cada muestra a varias velocidades de husillo (velocidades de cizalladura). Las muestras que presentaban lecturas de viscosidad (mPa-s (cP)) con DER <10 % para todas las velocidades de cizalladura se consideraron newtonianas a lo largo de este intervalo, mientras que las muestras donde la viscosidad era dependiente de la velocidad de cizalladura se consideraron no newtonianas.

Las mediciones de densidad se llevaron a cabo utilizando un densitómetro DMA 4500 M de Anton Paar. Brevemente, el instrumento se purgó con agua DI varias veces, seguida de metanol. El instrumento se calibró para aire y agua antes de medir la densidad del agua como muestra. El instrumento se volvió a lavar con agua y metanol, y se realizó la medición de una sola muestra sobre ~175 mg/mL de material combinado procedente de varias formulaciones. El valor notificado se utilizó como una aproximación razonable de la densidad para formulaciones de OMS646 de alta concentración que se van a utilizar en mediciones de contenido gravimétricas.

Las mediciones de osmolalidad se realizaron utilizando un osmómetro de depresión del punto de congelación (osmómetro Multi-Osmette, modelo 2430 de Precision Systems), que mide la disminución en el punto de congelación de una solución a medida que aumenta la concentración de soluto.

Se utilizó un sistema de recuento de partículas líquidas (modelo 9703 de Hach, modelo de sensor: HRLD-150) para determinar el tamaño y abundancia de partículas en muestras de formulación de OMS646. Los datos de las muestras se obtuvieron utilizando una sola extracción de muestra de 500 pL (volumen de tara de 200 pL). Brevemente, se permitió que el instrumento se calentara durante 30 minutos y se purgó tanto la jeringa (1 mL) como el sistema con agua desionizada durante al menos 10 ciclos antes de su utilización. La idoneidad del medio se ensayó demostrando que 25 mL de agua desionizada no contenían más de 25 partículas de tamaño >10 pm. La idoneidad del sistema se confirmó analizando una sola extracción de 500 pL de patrones 2, 5, 10 y 15 |jM utilizando tamaños de canal apropiados. Si los recuentos/mL acumulados detectados se encontraban dentro de la especificación dada para el patrón, el sistema se consideraba adecuado para el ensayo de muestras. Antes de la primera medición de muestras, el sistema se purgó una vez con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) para garantizar que las muestras no precipitaran tras entrar en contacto con el agua desionizada. Las muestras se analizaron utilizando una sola extracción de 500<j>L y los recuentos/mL acumulados para canales de 2 jm , 5 jm , 10 jm y 25 jm se determinaron hasta el número entero más próximo.

Se utilizó cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) para evaluar la cantidad de agregados y productos de degradación presentes en las formulaciones de OMS646. Brevemente, se equipó un sistema de HPLC Agilent 1100 con una columna de SEC G3000SWxl (Tosoh, 7,8 * 300 mm, tamaño de partícula de 5 jm ). Las muestras de formulación de OMS646 se diluyeron hasta 2,5 mg/mL en fase móvil de SEC (fosfato de potasio 140 mM, cloruro de potasio 75 mM, pH 7,0) y se inyectaron 20 j L de muestra en la columna de HPLC. El sistema se hizo funcionar utilizando un caudal de 0,4 mL/min, y la proteína eluida se detectó mediante absorción a 280 nm (ancho de banda 4 nm) sin corrección de la referencia. Para evaluar la idoneidad del sistema, todas las muestras se agruparon mediante inyecciones de blancos de fase móvil y patrones de filtración en gel, y el material de referencia se inyectó por duplicado al comienzo de la secuencia. Se determinaron los porcentajes de abundancia para especies de alto peso molecular (APM) y especies de bajo peso molecular (BPM) individuales y totales, además del porcentaje de monómero y el área de pico integrada total.

El análisis mediante electroforesis capilar en gel con SDS reducido (SDS-CE) se realizó con un sistema de electroforesis capilar PA 800 Plus de Beckman Coulter y un módulo de detección PDA, utilizando un kit de análisis SDS-MW. Las muestras y la referencia se diluyeron primero hasta 1,0 mg/mL en tampón de muestra de SDS-MW. Se añadieron 5 j L de p-mercaptoetanol y 2 j L de patrón interno (10 kDa) a 95 j L de esta solución de trabajo. Todas las muestras se centrifugaron a 300 x g durante 1 minuto, se calentaron a 70 ± 2 °C durante ~10 minutos, se transfirieron a un vial de PCR y se mantuvieron a 25 °C hasta el análisis. Las separaciones se realizaron aplicando 15 kV (polaridad inversa) a través del capilar durante 30 minutos y aplicando una presión de 138 kPa (20,0 psi) tanto en la entrada como en la salida. Los datos se adquirieron a 220 nm con una velocidad de recogida de 4 Hz. La referencia (OMS646 no procesado) se inyectó dos veces al comienzo de cada secuencia. Se notificaron los porcentajes de LC, HC e IgG.

Los análisis de electroforesis capilar en gel con SDS no reducido se llevaron a cabo como se describe para CE-SDS reducido, con la excepción de que se utilizó yodoacetamida 250 mM recién preparada en lugar de agente reductor, y las separaciones se realizaron durante 35 minutos. Se notificó el área de electroferograma total y el % de IgG.

Se generó un preparado purificado de anticuerpo OMS646 (102 mg/mL) utilizando métodos recombinantes como se describe en el documento WO2012/151481. Descrito brevemente, se generó anticuerpo OMS646 en células CHO que contenían construcciones de expresión que codificaban los polipéptidos de cadena pesada y cadena ligera de OMS646, y se purificó utilizando técnicas estándar.

1. Comparación de sistemas de tamponamiento candidatos:

Métodos

En los estudios de preformulación, la estabilidad del anticuerpo inhibidor de MASP-2 OMS646 se evaluó inicialmente frente a un panel de tampones candidatos que incluían los utilizados habitualmente en la formulación de anticuerpos terapéuticos (citrato, histidina, fosfato), así como tampones menos convencionales (acetato, succinato), con el fin de cubrir un intervalo de pH amplio (pH 4,0-pH 8,0). Para este estudio, la proteína se intercambió en tampones 20 mM de succinato (pH 4,0; 5,0 y 5,5), acetato (pH 4,0; 5,0 y 5,5), citrato (pH 5,0; 6,0 y 7,0), histidina (pH 6,0 y 7,0) y fosfato (pH 6,0; 7,0 y 8,0) utilizando concentradores Amicon Ultra-4 (límite de exclusión de PM de 10 kDa). Se diluyó un preparado purificado de anticuerpo OMS646 (102 mg/mL en acetato de sodio 20 mM, 50 mg/mL de sorbitol, pH 5,0) hasta ~1 mg/mL en cada una de las 14 soluciones de formulación, y se colocaron volúmenes de 4,0 mL en concentradores previamente enjuagados con el tampón apropiado. Cada unidad se centrifugó hasta ~1 mL a 3200 x g. Este procedimiento se repitió durante un total de tres rondas de intercambio de tampón. Durante la ronda final de concentración, la proteína se sobreconcentró hasta <1 mL. El volumen y tiempo de centrifugación aproximados de cada solución se registraron después de cada ciclo.

Resultados: en general, los datos generados para los cinco tipos de tampón fueron comparables en lo que respecta a la velocidad de intercambio de tampón, la recuperación de contenido de proteína, la colorimetría diferencial de barrido (DSC), la dispersión dinámica de la luz (DLS) y la estabilidad química (datos no mostrados). Se seleccionó el acetato, citrato e histidina para evaluación adicional sobre la base de las aparentes propiedades térmicas y conformacionales óptimas generales de OMS646 en el intervalo de pH de 5,5 a 6,0. Se seleccionó el acetato sobre el succinato a pH 5,5 debido principalmente a la estabilidad térmica superior, mientras que se seleccionó la histidina y el citrato sobre el fosfato a pH 6,0 sobre la base de los datos de DLS.

2. Cribado de excipientes

La estabilidad de OMS646 se evaluó en presencia de diversos excipientes con propiedades estabilizantes del anticuerpo notificadas, utilizando sistemas de tamponamiento identificados durante el cribado de tampones inicial (acetato, pH 5,5; citrato, pH 6,0; e histidina, pH 6,0; 20 mM). Para este estudio, se intercambió el tampón del OMS646 por cada tampón candidato que contenía NaCl 150 mM, sorbitol 250 mM, sacarosa 250 mM, L-arginina 150 mM, L-glutamato 150 mM o L-prolina 250 mM utilizando concentradores Amicon Ultra-4 (límite de exclusión de PM de 10 kDa). La preparación de muestras se llevó a cabo como se describe en la comparación de sistemas de tampón en donde la concentración de proteína objetivo era 2,0 mg/mL.

Resultados

En lo que respecta a las recuperaciones de proteína, las recuperaciones de proteína estimadas variaron de ~72-106 %, lo que representaba una mejora moderada sobre las recuperaciones en ausencia de excipiente. El tampón de histidina parecía ser el preferido para la mayor parte de excipientes, y el acetato y citrato presentaron resultados mixtos.

En lo que respecta a la DSC, se observó que el tampón de citrato daba como resultado estabilización térmica de OMS646 para todos los excipientes ensayados. La FIGURA 2A ilustra gráficamente los resultados del análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) para el cribado de excipientes de la formulación de OMS646, que muestra el diámetro de partícula general observado para formulaciones que contienen diversos excipientes candidatos. La FIGURA 2B ilustra gráficamente los resultados del análisis de DLS para el cribado de excipientes de la formulación de OMS646, que muestra la polidispersidad general observada para formulaciones que contienen diversos excipientes candidatos. Como se muestra en las FIGURAS 2A y 2B, en lo que respecta a la DLS, la mayoría de las formulaciones produjeron resultados comparables. Sin embargo, para todos los sistemas de tamponamiento, la sacarosa estuvo asociada a polidispersidad elevada y a los diámetros generales y monoméricos más grandes. Después de la sacarosa, el sorbitol fue el menos preferido mediante DLS, presentando tamaños medios más grandes y mayor polidispersidad. Las formulaciones restantes fueron generalmente comparables mediante DLS, con diámetros de monómero de 10-12 nm (véase la FIGURA 2A) y polidispersidad <20 % que indica poblaciones monodispersas (véase la FIGURA 2B). En lo que respecta a la estabilidad frente a la desnaturalización química, como se evalúa utilizando el sistema de desnaturalización química isotérmica AVIA, se observó claramente una tendencia de tampón/pH donde las formulaciones de acetato pH 5,5 se desnaturalizaban a concentraciones de urea ~0,5 M inferiores a las formulaciones de citrato e histidina pH 6,0 para todos los excipientes ensayados. El citrato y la histidina fueron comparables para todos los excipientes.

En resumen, los datos respaldaron el citrato a aproximadamente un pH de 6,0 como la combinación de tampón/pH óptima, que se hizo avanzar a estudios de cribado de la solubilidad. Dados los malos datos de DLS observados con todos los tipos de tampón, se excluyó la sacarosa de consideración adicional.

3. Cribado de la solubilidad/viscosidad

Primer estudio de viscosidad

Métodos

Con el fin de establecer las condiciones para la solubilidad de OMS646 máxima, se utilizó citrato 20 mM (pH 5,0 y 6,0) y succinato 20 mM (pH 4,0) en presencia de diversas combinaciones isotónicas de NaCl, sorbitol, arginina, glutamato y prolina. Se intercambió el tampón del OMS646 utilizando unidades de concentradores Amicon 15 en múltiples ciclos y, en el ciclo final, el volumen de cada solución se redujo hasta ~1 mL. Se registraron y analizaron las velocidades de intercambio de tampón para todas las formulaciones y ciclos de intercambio. Después del intercambio de tampón, se midieron los contenidos de proteína, se calculó el porcentaje de recuperación y se almacenaron las muestras durante la noche a 5 °C. Durante el almacenamiento, se observó que la formulación de succinato/glutamato precipitaba y no se evaluó adicionalmente. Las formulaciones restantes se añadieron a unidades de concentradores Amicon 4 y se concentraron hasta que se alcanzó una concentración objetivo de ~200 mg/mL, o hasta que la centrifugación ya no daba como resultado reducción del volumen y/o la viscosidad de la muestra (mediante manipulación de muestras) se consideraba inmanejable.

Resultados

En lo que respecta a las velocidades de intercambio de tampón, las velocidades de intercambio más altas se observaron claramente en muestras de pH 4,0, y el succinato/sorbitol presentaron las velocidades de intercambio más rápidas en general. Las velocidades de intercambio a pH 5,0 y 6,0 fueron comparables, donde las formaciones que solo contenían excipientes de aminoácidos cargados presentaban velocidades superiores a las otras formulaciones. La velocidad de intercambio más lenta se observó para la formulación de citrato/sorbitol a pH 6,0. Esta formulación fue la única muestra con pH >5,0 y un componente de excipiente no cargado. Bajo el supuesto de que la velocidad de intercambio es un indicador sustituto de la autoasociación de OMS646, parece que las especies cargadas son importantes para mitigar este comportamiento a un pH más neutro. En lo que respecta a la DLS, todas las formulaciones de alta concentración presentaron diámetros generales comparables de ~12 nm, con la excepción del succinato/arginina pH 4,0, que presentó una distribución de tamaños global elevada a >18 nM.

Las muestras sometidas a intercambio de tampón se concentraron hasta que las soluciones se volvieron físicamente inviables debido a la alta viscosidad. Se alcanzaron concentraciones máximas en exceso de 225 mg/mL para ambas formulaciones de pH 4,0. Para las formulaciones con valores de pH superiores, las concentraciones de proteína OMS646 máximas variaban de 160,5 y 207,6 mg/mL. La viscosidad se evaluó para la mayor parte de las formulaciones utilizando un viscosímetro de bola rodante con una velocidad de cizalladura entre 0,5 s-1 y 1000 s-1, como se ha descrito anteriormente. La FIGURA 3 ilustra gráficamente los resultados del análisis de viscosidad para el cribado de la solubilidad de OMS646 a lo largo de un intervalo de concentraciones de proteína en diversas formulaciones, como se mide a pH 5,0 y pH 6,0. Como se muestra en la FIGURA 3, cuando se representa gráficamente frente a la concentración de proteína, se observó un aumento exponencial de la viscosidad en todas las formulaciones, con la viscosidad más alta registrada para citrato/arginina/glutamato pH 5,0 (161,1 mPa-s (cP) para una solución de 196,6 mg/mL). A pH 6,0 y una concentración de proteína OMS646 comparable, la formulación de citrato/sorbitol presentó viscosidad considerablemente superior a la formulación de sorbitol/glutamato o prolina/glutamato. La formulación de citrato/arginina/glutamato pH 6,0 (95,3 mg/mL) presentó aproximadamente la mitad de la viscosidad (5,8 frente a 9,3 mPa-s (cP)) de la muestra de citrato/NaCl pH 6,0 (87,5 mg/mL) a un contenido de proteína superior, lo que sugiere una importancia de los aminoácidos cargados sobre los excipientes iónicos.

Es importante señalar que, a una concentración dada (es decir, 125 mg/mL), la viscosidad varía drásticamente en función de la formulación. La viscosidad se mantiene idealmente por debajo de ~25 mPa-s (cP) para garantizar un producto terapéutico subcutáneo realmente jeringable. En algunos casos de la formulación de OMS646, la viscosidad se mantiene por debajo de aproximadamente 20 mPa-s (cP) para permitir el suministro del producto terapéutico con un dispositivo de inyección, y también para permitir diversos tipos de bioprocesamiento, tal como filtración de flujo tangencial.

Segundo estudio de viscosidad

En un esfuerzo por reducir la viscosidad de la formulación de OMS646 y, por tanto, maximizar la concentración de OMS646 en una formulación dada, se realizó un estudio adicional. Sobre la base de los resultados iniciales, se seleccionaron las formulaciones que era más probable que produjeran una formulación de viscosidad reducida a alta concentración, a saber: formulaciones de succinato/sorbitol pH 4,0 y formulaciones de citrato que contenían glutamato y arginina a pH 6,0. Sobre la base de estudios previos, los aminoácidos cargados estuvieron asociados a diversas propiedades beneficiosas a pH neutro, que incluyen mayor velocidad de intercambio de tampón, mayor recuperación del procesamiento de muestras y viscosidad reducida. Se evaluó el efecto de aminoácidos con una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, arginina) o aminoácidos con una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, glutamato) a lo largo de un intervalo de concentraciones (50 mM a 150 mM) para calibrar tanto la carga de excipiente como la concentración y viscosidad. Por último, se utilizó CaCb como aditivo en soluciones de citrato/glutamato, tanto isotónicas como hipertónicas, debido a sus posibles propiedades reductoras de la viscosidad, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7,390,786.

Las muestras se sometieron a intercambio de tampón y se concentraron como se ha descrito anteriormente. Después del intercambio de tampón, se calculó el contenido de proteína de todas las formulaciones. La excepción fue la formulación que contenía glutamato 50 mM y CaCb 50 mM, que precipitó después del intercambio de tampón y no se evaluó adicionalmente. Probablemente esto se debe en parte a la solubilidad limitada del citrato y los cationes divalentes, tales como Ca2+.

Resultados

La FIGURA 4 ilustra gráficamente el porcentaje de recuperación de proteína después del intercambio de tampón para el estudio de solubilidad/viscosidad de OMS646 con diversas formulaciones candidatas. Como se muestra en la FIGURA 4, se observó una tendencia al aumento de la recuperación con el aumento de la concentración de arginina, donde la formulación de arginina 150 mM presentó la recuperación de proteína más alta, 85 %. Las recuperaciones para las formulaciones restantes fueron comparables y variaban de 64-75 %. Las muestras se concentraron a continuación como se ha descrito anteriormente hasta que resultaron manualmente inviables. Se evaluó la viscosidad de todas las formulaciones como se ha descrito anteriormente y los resultados se muestran a continuación en la TABLA 3.

TABLA : R m n l vi i r n l ^ i r f rm l i n

Como se ha mostrado anteriormente en la TABLA 3, las viscosidades fueron >70 mPa-s (cP) para todas las formulaciones y, a pesar del amplio intervalo de concentraciones finales, se observaron tendencias claras. A partir de estos datos preliminares, era evidente que el aumento de la concentración de arginina o glutamato conducía a viscosidad reducida. La viscosidad de la formulación de succinato/sorbitol parecía comparable a las formulaciones de aminoácidos 150 mM. La inclusión de CaCl<2>demostró una reducción en la viscosidad, donde la viscosidad para esta formulación fue comparable a muestras con contenido de proteína 10 % inferior.

Se seleccionaron cuatro formulaciones (M1, M2, M5 y M8, mostradas en la TABLA 3) para un análisis de viscosidad más detallado, donde las muestras puras recuperadas se diluyeron gradualmente en tampón de formulación de 25 mg/mL. La FIGURA 5 ilustra gráficamente la viscosidad (como se determina mediante ajuste exponencial de los datos de viscosidad) frente a la concentración de proteína para el estudio de solubilidad/viscosidad de OMS646 con diversas formulaciones candidatas. El ajuste exponencial de los datos de viscosidad se determinó de conformidad con los métodos descritos en Connolly B.et al.,Biophysical Journal, volumen 103:69-78, 2012. Como se muestra en la FIGURA 5, las formulaciones de glutamato y arginina 150 mM presentaban curvas casi idénticas que presentaban la viscosidad más alta por unidad de concentración: una viscosidad de 25 mPa-s (cP) que equivale a ~150 mg/mL de OMS646. La formulación de succinato y sorbitol se comportó algo mejor, con 25 mPa-s (cP), que corresponden a un contenido estimado de OMS646 de ~160 mg/mL. La viscosidad general más baja se observó en la formulación que contenía CaCh, donde el contenido estimado a 25 mPa-s (cP) fue ~175 mg/mL. El resultado más intrigante de este análisis fue que la formulación hipertónica que incluía glutamato 150 mM y CaCh 50 mM redujo drásticamente la viscosidad de la muestra. Dado el deseo de la formulación líquida con la concentración más alta posible, la aplicación de cationes divalentes e hipertonicidad para la reducción de la viscosidad se hizo avanzar a un estudio de viscosidad adicional.

Tercer estudio de viscosidad

Sobre la base de los resultados de los estudios de viscosidad iniciales descritos anteriormente, se llevó a cabo un estudio adicional para determinar si las aparentes propiedades reductoras de la viscosidad de CaCh estaban relacionadas con el Ca2+ divalente o la hipertonicidad. Se realizó un cambio en el excipiente predominante, de glutamato a arginina, debido a las mejores velocidades de intercambio de tampón observadas para las formulaciones que contienen arginina. Se realizó la incorporación de histidina debido a la capacidad de quelación de Ca2+ por el citrato, que podría conducir a precipitación. Un subconjunto de muestras también evaluó el efecto del pH y el tensioactivo sobre la viscosidad de la muestra, así como el efecto del CaCb y la hipertonicidad sobre la formulación de succinato/sorbitol pH 4,0. Las muestras se sometieron a intercambio de tampón y se concentraron como se ha descrito para los estudios de viscosidad anteriores. La viscosidad de todas las formulaciones se midió utilizando un instrumento de bola rodante como se ha descrito anteriormente. Los datos de viscosidad se normalizaron a una concentración de proteína de la muestra de 170 mg/mL. Esto se realizó calculando primero una viscosidad teórica a partir del contenido de proteína medido utilizando la regresión exponencial a datos de viscosidad/solubilidad calculados previamente a partir de la formulación de citrato/arginina pH 6,0 (y = 0,0917e00361x). La viscosidad normalizada se calculó multiplicando la viscosidad teórica para citrato/arginina pH 6,0 a 170 mg/mL (42,4 mPa-s (cP)) por la viscosidad medida/viscosidad teórica (véase la Tabla 4, nota al pie b). Las viscosidades normalizadas resultantes revelan tendencias mucho más claras, suavizando la variabilidad asociada a la concentración (véase la TABLA 4 y la FIGURA 6).

TABLA 4. Resumen de los datos de viscosidad para formulaciones de OMS646 (170 mg/mL)

La FIGURA 6 ilustra gráficamente los datos de viscosidad normalizada para el estudio de viscosidad con diversas formulaciones de OMS646 candidatas sobre la base de los datos de la TABLA 4. Como se muestra en la FIGURA 6 y la TABLA 4, para formulaciones de citrato e histidina, el examen del conjunto de datos normalizados demuestra claramente que la hipertonicidad conduce a viscosidad reducida de la muestra, en donde la mayor parte del efecto se observa con solo aumentos moderados en la concentración de arginina. Por ejemplo, la viscosidad normalizada de la formulación 12 (histidina 20 mM con arginina 150 mM) es 57,7 mPa-s (cP), en comparación con las viscosidades de 22,3 y 22,0 mPa-s (cP) para las formulaciones de histidina que contienen arginina 200 y 225 mM, respectivamente. Se observó una tendencia similar para las formulaciones de citrato/arginina. No hubo ningún beneficio obvio de la inclusión de CaCh. Más bien, fue sorprendente descubrir que en ausencia de CaCl<2>, se lograban viscosidades bajas (por ejemplo, menos de 25 mPa-s (cP)) con las formulaciones de citrato/arginina e histidina/arginina con una concentración de arginina de 200 mM o mayor. La inclusión de PS-80 al 0,05 % dio como resultado la reducción sustancial de la viscosidad en dos de las tres formulaciones evaluadas a pH >5,0. Por último, las viscosidades a pH 5,0 parecían algo inferiores a las de formulaciones comparables a pH 6,0.

En vista de los resultados obtenidos a partir de los estudios de viscosidad, la arginina hipertónica, la presencia o ausencia de cationes divalentes, y las formulaciones de succinato/sorbitol pH 4,0 se hicieron avanzar a estudios de cribado de tensioactivos para evaluar adicionalmente el efecto sobre las propiedades físicas, conformación y estabilidad química de OMS646.

4. Cribado de tensioactivos

El efecto del tensioactivo sobre la estabilidad de OMS646 se evaluó utilizando formulaciones candidatas identificadas en estudios anteriores descritos en la presente memoria. Para los estudios de cribado de tensioactivos, se analizaron seis formulaciones como se indica a continuación:

citrato 20 mM, arginina 200 mM a pH 5,0;

citrato 20 mM, arginina 200 mM a pH 6,0;

succinato 20 mM, sorbitol 250 mM a pH 4,0;

histidina 20 mM, arginina 200 mM a pH 6,0;

histidina 20 mM, arginina 75 mM/CaCb 50 mM a pH 6,0;

histidina 20 mM, arginina 75 mM/MgCb 50 mM a pH 6,0.

Cada una de las seis formulaciones mostradas anteriormente se evaluó sin tensioactivo o en presencia de PS-80 al 0,01 % para un total de doce condiciones de formulación exclusivas. Para cada formulación, se intercambió OMS646 en soluciones de intercambio de tampón (sin PS-80), se concentró, se midió el contenido y se normalizaron las muestras a 175 mg/mL de proteína. A continuación, se dividió cada formulación y se añadió PS-80 a las muestras apropiadas hasta una concentración final de 0,01 % (p/v).

Cada una de las muestras formuladas se sometió a estrés mecánico por agitación y a la aplicación de ciclos de congelación/descongelación. Para ambos tipos de estrés, se transfirieron 0,5 mL de muestra a cuatro viales de vidrio de borosilicato de tipo 1 (2,0 mL) y se sellaron con tapones FluroTec®. Para el estrés por agitación, las muestras se colocaron en un agitador de microplacas a 600 rpm durante ~60 horas a temperatura ambiente. Las muestras de control de agitación se mantuvieron junto al agitador durante el periodo de estrés por agitación. Para la aplicación de ciclos de congelación/descongelación, las muestras se congelaron a -80 °C durante >60 minutos y a continuación se dejaron descongelar a temperatura ambiente, durante un total de 5 ciclos de congelación-descongelación. Después de someterlas a estrés, las muestras se almacenaron a 2-8 °C hasta el análisis. La muestra restante se mantuvo a 2-8 °C como control no sometido a estrés. Se realizaron mediciones del aspecto, A280, DLS y SEC para evaluar el efecto del tensioactivo sobre la agregación y estabilidad de OMS646.

Resultados

Después de someter a estrés las seis formulaciones de OMS646, ninguna muestra mostró indicios de materia particulada relacionada con el producto. El contenido de proteína fue esencialmente constante para todas las muestras de una formulación dada. El análisis de los datos de DLS para las muestras de congelación/descongelación y agitación solo reveló sutiles diferencias entre las formulaciones y los tipos de estrés, sin observarse tendencias globales claras en lo que respecta a la inclusión de PS-80. La única excepción fue la formulación de succinato/sorbitol pH 4,0, en la que la inclusión de PS-80 condujo a polidispersidad general alta (es decir, multimodal) para las muestras de congelación/descongelación y control a 5 °C. Esta formulación ácida también mostró indicios de agregación/autoasociación mediante DLS en ausencia de PS-80 tras la agitación.

Se realizó el análisis de los datos de SEC para evaluar cualquier producto de agregación y/o degradación que surgiera durante la aplicación de estrés a las muestras. Los resultados se resumen en las TABLAS 5A-5D.

TABLA 5A: Resumen de los datos de SEC para el cribado de tensioactivos de la formulación de OMS646 (2-8 °C)

TABLA 5B: Resumen de los datos de SEC para el cribado de tensioactivos de la formulación de OMS646 n l i n n l i n

TABLA 5C: Resumen de los datos de SEC para el cribado de tensioactivos de la formulación de OMS646 25 °C

TABLA 5D: Resumen de los datos de SEC para el cribado de tensioactivos de la formulación de OMS646 a itación

Como se ha mostrado anteriormente en las TABLAS 5A-5D, en general, los datos de SEC indican que la molécula OMS646 es generalmente insensible a la inclusión de PS-80 y al estrés tanto por congelación/descongelación (TABLA 5B) como por agitación (TABLA 5D), independientemente del tensioactivo. Se observó que las formulaciones de OMS646 que peor se comportaban eran las que contenían aditivos de cationes divalentes (CaCh y MgCh), donde el material de alto peso molecular (APM) para estas muestras era claramente elevado con respecto a otras muestras y se observaron los niveles más bajos de monómero.

5. Análisis de estabilidad en condiciones de estrés y ausencia de estrés durante 28 días.

Después de reducir las posibles combinaciones de tampón, excipiente y tensioactivo mediante los estudios de preformulación descritos anteriormente, se formularon tampones de citrato e histidina utilizando arginina 200 mM a lo largo del intervalo de pH de 5,5 a 6,5 a altas concentraciones, de 175 mg/mL y 200 mg/mL, de OMS646 para identificar la formulación más adecuada tanto en condiciones de estrés (40 °C) como en ausencia de estrés (5 °C). La arginina se incluyó a un nivel hipertónico (200 mM) debido a las propiedades reductoras de la viscosidad a esta concentración elevada. Sobre la base de la optimización numérica estadística de los datos de preformulación, se determinó que la formulación de OMS646 más adecuada era citrato 20 mM y arginina 200 mM. También se preparó un panel de muestras para evaluar el efecto de PS-80 al 0,01 % sobre formulaciones de citrato e histidina.

El intercambio de tampón se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente, las muestras se concentraron y diluyeron para lograr las concentraciones objetivo de 175 o 200 mg/mL de OMS646. Durante esta normalización final, se añadió PS-80 al 0,01 % para las formulaciones apropiadas. Las formulaciones se filtraron de forma estéril utilizando concentradores estériles de 0,22 pM Ultrafree-CL GV de Millipore. Se colocó un vial de cada formulación a 5 °C y otro a 40 °C durante un periodo de incubación de 28 días. Las muestras se analizaron a T<0>y 28 días en lo que respecta a la concentración, aspecto, turbidez, osmolalidad, pH, DLS, DSC y viscosidad. Después de la incubación de 28 días, se observó que las formulaciones de OMS646 de succinato/sorbitol de 175 y 200 mg/mL almacenadas a 40 °C desarrollaban una consistencia similar a un gel y, por tanto, no se analizaron.

Resultados

En lo que respecta al análisis de estabilidad, los valores de pH permanecieron estables durante toda la duración del estudio, independientemente de la formulación y las condiciones de almacenamiento. Después de 28 días, tanto el análisis mediante SEC como el análisis mediante SDS-CE indicaron aumentos sustanciales en el contenido de BPM para las formulaciones de pH 5,0 y pH 4,0 ácidas, eliminando estas formulaciones de consideración adicional. Para el citrato/arginina e histidina/arginina de pH 6,0 formulados con PS-80 al 0,01 %, la mayoría de las respuestas fueron prácticamente indistinguibles de las muestras exentas de tensioactivo asociadas. Sin embargo, la SEC mostró reducciones en el contenido de APM de 0,2 %-0,6 % con respecto a las formulaciones equivalentes exentas de tensioactivo. Junto con las aparentes propiedades reductoras de la viscosidad del tensioactivo, se eligió el polisorbato-80 (PS-80) para ser incluido en estudios de formulación adicionales.

La concentración y viscosidades de un total de 10 formulaciones se ensayaron después de 28 días a 5 °C. Los resultados representativos se muestran en la TABLA 6.

TABLA 6. Viscosidad de las formulaciones des ués de 28 días a 5 °C.

Como se ha mostrado anteriormente en la TABLA 6, las formulaciones de concentración superior presentaban viscosidades superiores. De considerable interés fue la observación de que la inclusión de PS-80 condujo a reducción en la viscosidad para las formulaciones de citrato (10,6 frente a 9,0 mPa-s (cP)) e histidina (12,7 frente a 7,8 mPa-s (cP)), conservando al mismo tiempo la recuperación de proteína. Dichas reducciones en la viscosidad tras la inclusión de PS-80 son beneficiosas, permitiendo una concentración superior de OMS646 y manteniendo al mismo tiempo una viscosidad baja que se considera que es jeringable en un entorno clínico y también adecuada para utilización en un autoinyector y otros dispositivos de inyección.

Resumen de los resultados

El objetivo principal de estos estudios era identificar componentes de la formulación que darían como resultado estabilidad química, física y estructural óptima del anticuerpo OMS646 de alta concentración en formulaciones líquidas. Además, se llevaron a cabo varios estudios específicos de la viscosidad con el objetivo de obtener una formulación final con concentración de anticuerpo OMS646 máxima que pudiera suministrarse de forma factible mediante administración subcutánea.

Se evaluaron varios tipos de tampón, condiciones de pH, excipientes y concentraciones de tensioactivo de una manera iterativa durante el curso de los estudios dirigidos a la evaluación de sistemas de tampón, excipientes, solubilidad, viscosidad, y los estudios de cribado de tensioactivos. El estudio de evaluación de tampones de referencia inicial ensayó cinco tipos de tampón diferentes (acetato, citrato, succinato, histidina y fosfato) en el intervalo de pH 4,0-8,0. El análisis mediante DSC, DLS y el sistema de desnaturalización química AVIA indicaron que las condiciones más ácidas y básicas eran las menos adecuadas para la estabilidad del anticuerpo OMS646. Sobre la base de los resultados, se seleccionaron los sistemas de tampón de acetato, citrato e histidina para evaluación adicional.

El cribado de excipientes evaluó el efecto de NaCI, L-arginina, L-glutamato, L-prolina, sacarosa y sorbitol sobre la estabilidad del anticuerpo OMS646 en cada uno de los tres sistemas de tampón elegidos. El citrato (pH 6,0) se hizo avanzar solo a estudios adicionales para maximizar el espacio de diseño para la evaluación adicional de excipientes. Solo se eliminó la sacarosa como posible excipiente debido a los malos datos de dispersión de la luz. El cribado de la solubilidad evaluó la capacidad de las formulaciones de citrato (pH 5,0 y pH 6,0) que contenían combinaciones isotónicas de NaCl, sorbitol, arginina, glutamato y prolina para soportar altas concentraciones de solución de anticuerpo OMS646. Todas las formulaciones se concentraron en exceso de 150 mg/mL de OMS646 sin indicios de agregación. Sin embargo, las formulaciones de succinato/arginina y succinato/glutamato presentaron indicios de precipitación/agregación después del almacenamiento a corto plazo y no se evaluaron adicionalmente. El análisis biofísico de las formulaciones de citrato mostró solo diferencias leves entre los excipientes a pH 6,0 y solo una reducción moderada del contenido de APM en las formulaciones equivalentes de pH 5,0.

Se obtuvieron datos interesantes de las mediciones de viscosidad de este subconjunto de muestras, que sugerían que el citrato/glutamato y succinato/sorbitol impartían las viscosidades más bajas. Dadas las estabilidades biofísicas similares observadas entre los excipientes y la importancia de obtener una formulación con contenido de OMS646 máximo, se realizaron estudios de viscosidad adicionales. Estos estudios de viscosidad identificaron a los cationes divalentes y/o la hipertonicidad moderada como un factor significativo en la reducción de la viscosidad de la formulación de anticuerpo OMS646 a un pH más neutro. Tanto el citrato (pH 5,0 y 6,0) como la histidina (pH 6,0) se evaluaron en presencia de arginina 200 mM. La histidina pH 6,0 también se evaluó en presencia de arginina 75 mM y CaCh 50 mM o MgCh 50 mM. Por último, se ensayó el succinato/sorbitol pH 4,0. Todas las combinaciones de tampón/excipiente se ensayaron en ausencia o presencia de PS-80 al 0,01 % para determinar si el tensioactivo favorecía la estabilidad del anticuerpo OMS646 en condiciones de estrés por agitación y congelación/descongelación. Todas las formulaciones parecían estables frente a los estreses ambientales aplicados, independientemente del tensioactivo. Una observación sorprendente fue el aumento en el contenido de APM de OMS646 observado mediante SEC para formulaciones que contenían cationes divalentes. Por lo tanto, CaCh y MgCh fueron eliminados de consideración adicional como excipientes. El succinato/sorbitol también presentó pureza de anticuerpo OMS646 reducida, que fue atribuible principalmente a un aumento aparente en las impurezas de BPM. Aunque las diferencias entre la formulación que contenía PS-80 al 0,01 % y la que carecía del mismo eran leves, las muestras que contenían tensioactivo parecían presentar un contenido de APM moderadamente mayor (~0,1 %) con respecto a sus equivalentes exentos de tensioactivo.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe un estudio en el que se compararon tres formulaciones de OMS646 muy concentradas y de baja viscosidad candidatas, identificadas sobre la base de los estudios de preformulación descritos en el Ejemplo 2, en lo que respecta a la jeringabilidad.

Antecedentes/Base teórica

El tiempo y fuerza requeridos para una inyección manual (o el tiempo requerido para una inyección utilizando un autoinyector) son importantes y pueden afectar a la facilidad de utilización del producto por el usuario final y, por tanto, al cumplimiento. La fuerza requerida para la inyección de una solución a una velocidad de inyección dada mediante una aguja de calibre y longitud predeterminados se denomina “jeringabilidad” (véase, por ejemplo, Burckbuchler, V.;et al.,Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 351-356, 2010). En lo que respecta a la jeringabilidad para administración a un sujeto humano, generalmente no se desea superar una fuerza de 25 N (aunque hay formulaciones comercializadas más viscosas que esta). Una aguja 27GA o una aguja 27GA de pared delgada se consideran generalmente agujas estándar para inyección subcutánea de anticuerpos monoclonales. La 27GA aguja de pared delgada tiene un diámetro interior prácticamente igual a una aguja 25GA (los números G más pequeños son diámetros más grandes).

El estudio siguiente se llevó a cabo para determinar la jeringabilidad de tres formulaciones de OMS646 de alta concentración y baja viscosidad candidatas.

Métodos

Sobre la base de los estudios de preformulación descritos en el Ejemplo 2, se seleccionaron y estudiaron adicionalmente las tres formulaciones de OMS646 de alta concentración candidatas siguientes, como se muestra en la TABLA 7. En este ejemplo, las formulaciones se prepararon utilizando clorhidrato de arginina, polisorbato 80 si estaba indicado, y citrato trisódico o histidina, ajustando el pH de aproximadamente 5,8 a 6,0 utilizando ácido clorhídrico.

TABLA 7: Formulaciones de OMS646 de alta concentración candidatas

1. Osmolalidad y viscosidad de formulaciones de OMS646 candidatas

La osmolalidad y viscosidad de las tres formulaciones candidatas generadas como se muestra en la TABLA 7 se determinó utilizando métodos descritos en el Ejemplo 2. El comportamiento fluido de la formulación se consideró que era no newtoniano si el % de DER era >10 en las velocidades de cizalladura ensayadas. Los resultados se ilustran en la TABLA 8.

TABLA 8. Osmolalidad Viscosidad

2. Jeringabilidad de formulaciones de OMS646 candidatas

Métodos

El análisis de jeringabilidad de las tres formulaciones de OMS646 se llevó a cabo en lo que respecta a la carga promedio y la carga máxima utilizando agujas 27GA de 31,75 mm (1,25"), 25GA de 25,4 mm (1") y 25GA de pared delgada de 25,4 mm (1"). Se inyectaron una vez réplicas por triplicado de cada formulación. Los resultados para las muestras de jeringabilidad son promedios de las réplicas por triplicado.

Resultados

Las tres formulaciones mostradas en la TABLA 7 (que contienen OMS646 en 185 mg/mL) se evaluaron para determinar su jeringabilidad utilizando jeringas 27GA de 31,75 mm (1,25"), 25GA de pared delgada de 25,4 mm (1") y 25GA de 25,4 mm (1"). Los resultados notificados son el promedio de réplicas por triplicado. Los resultados se muestran en la TABLA 9 y se ilustran gráficamente en las FIGURAS 7A y 7<b>. La FIGURA 7A ilustra gráficamente la carga promedio (lbf) de tres formulaciones de OMS646 candidatas utilizando agujas 27GA, 25GA y 25GA de pared delgada. La FIGURA 7B ilustra gráficamente la carga máxima (lbf) de tres formulaciones de OMS646 candidatas utilizando agujas 27GA, 25GA y 25GA de pared delgada.

TABLA 9. Jerin abilidad de las formulaciones de OMS646 de alta concentración candidatas

Como se ha descrito anteriormente, en lo que respecta a la jeringabilidad para administración a un sujeto humano, generalmente no se desea superar una fuerza de 25 N. Como se ha mostrado anteriormente en la TABLA 9, las tres formulaciones de OMS646 de alta concentración candidatas tienen jeringabilidad aceptable (es decir, una fuerza que no supera 25 N) cuando se inyectan mediante una jeringa 25GA o 25GA de pared delgada. La formulación n.° 2 también tiene jeringabilidad aceptable cuando se inyecta mediante una aguja 27G. La adición de 0,01 % de PS-80 provocó una mejora inesperada en la jeringabilidad.

3. Análisis mediante SEC de formulaciones de OMS646 candidatas posinyección

Se utilizó cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) para evaluar la cantidad de agregados y productos de degradación presentes en las formulaciones de OMS646 candidatas posinyección. Brevemente, se equipó un sistema de HPLC Agilent 1100 con una columna de SEC G3000SWxl (Tosoh, 7,8 x 300 mm, tamaño de partícula de 5 pm). Las muestras de OMS646 se diluyeron hasta 2,5 mg/mL en fase móvil de SEC (fosfato de potasio 140 mM, cloruro de potasio 75 mM, pH 7,0) y se inyectaron 20 pL de muestra en la columna de HPLC. El sistema se hizo funcionar utilizando un caudal de 0,4 mL/min, y la proteína eluida se detectó mediante absorción a 280 nm (ancho de banda 4 nm) sin corrección de la referencia. Para evaluar la idoneidad del sistema, todas las muestras se agruparon mediante inyecciones de blancos de fase móvil y patrones de filtración en gel, y el material de referencia se inyectó por duplicado al comienzo de la secuencia. Se notificaron los porcentajes de abundancia para especies de alto peso molecular (APM) y especies de bajo peso molecular (BPM) individuales y totales, además del porcentaje de monómero y el área de pico integrada total.

Resultados

Los resultados del análisis mediante SEC de las formulaciones de OMS646 de alta concentración candidatas posinyección se muestran en la TABLA 10.

TABLA 1 . An li i m i n E l f rm l i n M 4 l n nr i n in i n

Estos resultados muestran poco o ningún cambio en la pureza mediante SEC después de la expulsión a través de la aguja.

Resumen de resultados: los resultados del análisis de jeringabilidad demuestran que las tres formulaciones de OMS646 de alta concentración candidatas tienen jeringabilidad aceptable cuando se ensayan utilizando agujas adecuadas para administración subcutánea y que hay poco o ningún cambio en la pureza del OMS646 después de la expulsión a través de la aguja. La adición de 0,01 % de PS-80 proporcionó una mejora inesperada en la jeringabilidad de la formulación que contenía citrato de arginina.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe un estudio que se llevó a cabo para evaluar la estabilidad de formulaciones de anticuerpo OMS646 de alta concentración y baja viscosidad candidatas durante el almacenamiento a largo plazo.

Métodos

Este estudio se llevó a cabo para evaluar la estabilidad de formulaciones de anticuerpo OMS646 de alta concentración para inyección subcutánea después del almacenamiento a largo plazo.

Se evaluaron dos formulaciones candidatas como se indica a continuación:

A) citrato 20 mM, arginina 200 mM, PS-80 al 0,01 %, pH 5,8 (185 mg/mL de OMS646)

B) histidina 20 mM, arginina 200 mM, PS-80 al 0,01 %, pH 5,9 (185 mg/mL de OMS646)

Las muestras se llenaron en viales de tubo de vidrio Schott USP Tipo I de 13 mm y 2 mL de tamaño (West Pharmaceuticals), con un llenado de muestra de 1,0 mL, se sellaron con tapones Fluorotec de 13 mm (West Pharmaceuticals) y se taparon con tapas de aluminio 13FO con botones (West Pharmaceuticals o equivalente). Los viales de muestra se almacenaron en cámaras de estabilidad con puertas de vidrio de temperatura controlada a -75 ± 10 °C, -20 ± 5 °C, 5 ± 3 °C, 25 ± 2 °C/60 ± 5 % de HR y 40 ± 2 °C/75 ± 5 % de HR. Para el presente estudio se almacenó un objetivo de al menos 40 viales de muestra por formulación. Las muestras almacenadas como líquido se almacenaron en una orientación invertida, mientras que las muestras congeladas se almacenaron en posición vertical. Se extrajo el número requerido de viales en los momentos y condiciones asociados, y se caracterizaron las muestras mediante los métodos siguientes: aspecto mediante inspección visual, contenido de proteína mediante A280, osmolalidad, SEC-HPLC, pH y ELISA de MASP-2. Los datos de SEC-HPLC ejemplares se resumen en la TABLA 11 y demuestran que el anticuerpo OMS646 mantuvo su integridad después del almacenamiento a 5 °C durante 6, 9 y 12 meses. Los datos de ELISA confirmaron que el anticuerpo conservó su funcionalidad después del almacenamiento a 5 °C durante 6, 9 y 12 meses.

Resultados: los resultados de este estudio se resumen en la TABLA 11 a continuación.

TABLA 11. Estabilidad de las formulaciones como se analiza mediante SEC

Como se muestra en la TABLA 11, se observó poco o ningún cambio en la pureza de las muestras almacenadas hasta 9 meses a -20 °C o almacenadas a 5 °C hasta 12 meses, la temperatura de almacenamiento prevista. La pureza de las muestras almacenadas a 25 °C también se mantuvo durante 2 meses; sin embargo, se observaron ligeros cambios en la pureza a 25 °C durante 9 meses de almacenamiento.

Ejemplo 5

Se preparó una formulación ejemplar que contenía el anticuerpo inhibidor de MASP-2 OMS646 a pH 5,8 combinando OMS646 (185 mg/mL) con citrato (20 mM), arginina (200 mM) y polisorbato 80 (0,01 %). Se utilizó citrato de sodio dihidratado (4,89 mg/mL) y ácido cítrico monohidratado (0,71 mg/mL) para preparar el tampón de citrato, y se utilizó ácido clorhídrico y/o hidróxido de sodio para ajustar el pH según fuera necesario.

La viscosidad de esta formulación se midió con un viscosímetro capilar, y los resultados se muestran en la TABLA 12. Hay una ligera disminución en la viscosidad a velocidades de cizalladura superiores, estando todos los valores por debajo de 13 mPa-s (cP).

TABLA 12: Vi i n f rm l i n M 4 m l r m i if r n v l i iz ll r

Se determinó que la dosificación de sujetos humanos con la formulación de OMS646 de 185 mg/mL ejemplar descrita en este ejemplo (tanto mediante inyección subcutánea como mediante administración intravenosa después de la dilución) daba como resultado grados altos y sostenidos de inhibición de la vía de las lectinas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación farmacéutica estable cuando se almacena entre 2 °C y 8 °C durante al menos seis meses y que tiene una viscosidad de entre 2 y 50 mPa-s (centipoise (cP)), cuando se mide a 25 °C con una velocidad de cizalladura en el intervalo de 100000-250000 l/seg, adecuada para administración parenteral a un sujeto mamífero, que comprende:

(a) una solución acuosa que comprende un sistema de tampón que tiene un pH de 5,0 a 7,0, en donde el sistema de tampón comprende al menos un agente de tamponamiento seleccionado del grupo que consiste en citrato o histidina;

(b) un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que se une específicamente a MASP-2 humana y comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, y dicho anticuerpo o fragmento del mismo está en una concentración de 50 mg/mL a 250 mg/mL; y

(c) un agente modificador de la tonicidad en una cantidad suficiente para que la formulación sea hipertónica.

2. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde es aplicable al menos uno o más de los siguientes:

(a) en donde la concentración del anticuerpo en la formulación es de 100 mg/mL a 225 mg/mL, o de 150 mg/mL a 200 mg/mL, o de 175 mg/mL a 195 mg/mL;

(b) en donde la viscosidad de la formulación es de 2 mPa-s (cP) a 40 mPa-s (cP), o de 2 mPa-s (cP) a 30 mPa-s (cP), o de 2 mPa-s (cP) a 25 mPa-s (cP), o de 2 mPa-s (cP) a 20 mPa-s (cP), o de 2 mPa-s (cP) a 18 mPa-s (cP);

(c) en donde la viscosidad es menos de aproximadamente 25 mPa-s (cP), tal como menos de aproximadamente 20 mPa-s (cP), o tal como menos de aproximadamente 18 mPa-s (cP);

(d) en donde la concentración del anticuerpo es 185 mg/mL;

(e) en donde la formulación es estable cuando se almacena entre 2 °C y 8 °C durante al menos 12 meses; (f) en donde la fuerza de deslizamiento de inyección de la formulación es 25 Newton o menos cuando se inyecta mediante una aguja 27GA de 31,75 mm (1,25") a temperatura ambiente; o

(g) en donde la fuerza de deslizamiento de inyección de la formulación es 20 Newton o menos cuando se inyecta mediante una aguja 25GA de 25,4 mm (1") a temperatura ambiente.

3. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde al menos un agente de tamponamiento es citrato, tal como citrato de sodio, tal como en donde el citrato está presente en la solución en una concentración de 10 mM a 50 mM.

4. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el agente modificador de la tonicidad es un aminoácido con una cadena lateral cargada positivamente seleccionado del grupo que consiste en:

(a) en donde el aminoácido con una cadena lateral cargada positivamente está presente en la formulación en una concentración de 150 mM a 300 mM;

(b) en donde la cadena lateral cargada positivamente es arginina o L-arginina-HCl, y

(c) en donde la arginina está presente en la solución a un nivel hipertónico de 200 mM a 300 mM.

5. La formulación farmacéutica de la reivindicación 3, en donde la solución comprende citrato aproximadamente 20 mM y tiene un pH de aproximadamente 5,5 a 6,5, opcionalmente, en donde la solución comprende además arginina en una concentración de aproximadamente 200 mM.

6. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la solución comprende además un tensioactivo en una concentración de 0,001 % (p/v) y 0,1 % (p/v), opcionalmente, en donde el tensioactivo es un tensioactivo no iónico, tal como un polisorbato o un poloxámero, por ejemplo, polisorbato 80.

7. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde es aplicable al menos uno o más de los siguientes:

(a) en donde la formulación no incluye sacarosa o sorbitol;

(b) en donde la formulación no incluye CaCh;

(c) en donde la formulación no incluye MgCh;

(d) en donde la formulación no incluye CaCh y en donde la formulación no incluye MgCh; o

(e) en donde la formulación no incluye un aditivo de catión divalente.

8. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la formulación se selecciona del grupo que consiste en:

(i) una formulación que comprende:

(a) polisorbato 80 en una concentración de 0,01 a 0,08 % p/v;

(b) clorhidrato de L-arginina en una concentración de 150 mM a 200 mM;

(c) citrato de sodio en una concentración de 10 mM a 50 mM; y

(d) 150 mg/mL a 200 mg/mL del anticuerpo; y

(ii) una formulación que comprende:

(a) polisorbato 80 en una concentración de aproximadamente 0,01 p/v;

(b) clorhidrato de L-arginina en una concentración de aproximadamente 200 mM;

(c) citrato de sodio en una concentración de aproximadamente 20 mM; y

(d) 175 mg/mL a 195 mg/mL del anticuerpo.

9. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, consistiendo esencialmente la formulación en:

(a) polisorbato 80 en una concentración de 0,01 a 0,08 % p/v;

(b) clorhidrato de L-arginina en una concentración de 150 mM a 200 mM;

(c) citrato de sodio en una concentración de 10 mM a 50 mM; y

(d) un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que se une específicamente a MASP-2 humana en una concentración de 150 mg/mL a 200 mg/mL, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.

10. Un envase sellado que contiene una formulación según la reivindicación 1 o 9.

11. Un dispositivo de administración subcutánea que contiene la formulación de la reivindicación 1 o 9 en el mismo.

12. Un kit que comprende un envase precargado que comprende la formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-MASP-2 de la reivindicación 1 o 9 e instrucciones para la utilización de la formulación, tal como en donde el envase precargado se selecciona del grupo que consiste en: un jeringa, un inyector de tipo pluma, un vial sellado, un autoinyector y un dispositivo de tipo bomba, opcionalmente en donde el kit comprende además al menos un dispositivo de inyección adecuado para administrar la formulación en el vial sellado a un sujeto humano.

13. Una forma farmacéutica unitaria adecuada para administración parenteral a un humano, que comprende una formulación según la reivindicación 1 o 9 en un envase adecuado.

14. Una formulación de la reivindicación 1 o 9 para utilización en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno asociado al complemento dependiente de MASP-2, opcionalmente, en donde la formulación es adecuada para administración subcutánea, opcionalmente, en donde la formulación está contenida dentro de un jeringa precargada.

15. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la formulación comprende polisorbato 80 de 0,001 % p/v a 0,05 % p/v, citrato de sodio aproximadamente 20 mM y clorhidrato de L-arginina aproximadamente 200 mM, en donde la concentración del anticuerpo en la formulación es de 175 mg/mL a 195 mg/mL, y en donde la viscosidad es menos de 25 mPa-s (cP).

16. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la formulación es estéril.

17. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal de longitud completa, opcionalmente, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa de IgG4 humana, tal como un anticuerpo de IgG4 humana que comprende una mutación en la región de bisagra.