RS61351B1 - Postupci za lečenje stanja udruženih sa aktivacijom komplementa zavisnom od masp-2 - Google Patents

Description

Opis pronalaska

POZNATO STANJE TEHNIKE

[0001] Sistem komplementa obezbeđuje mehanizam ranog delovanja radi započinjanja, umnožavanja i usaglašavanja imunskog odgovora na mikrobnu infekciju i druge akutne povrede (M.K. Liszewski i J.P. Atkinson, 1993, u Fundamental Immunology, 3. izdanje, ur. W.E. Paul, Raven Press, Ltd. Nju Jork), kod ljudi i ostalih kičmenjaka. Uprkos činjenici da aktivacija komplementa obezbeđuje značajnu prvu liniju odbrane protiv potencijalnih patogena, aktivnosti komplementa koje pospešuju protektivan imunski odgovor takođe mogu predstavljati potencijalnu pretnju za domaćina (K.R. Kalli i saradnici, Springer Semin. Immunopathol.15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig.24:219-228, 1994). Na primer, proteolitički proizvodi C3 i C5 regrutuju i aktiviraju neutrofile. Iako su neophodni u odbrani domaćina, aktivirani neutrofili su neselektivni u svom oslobađanju razarajućih enzima i mogu prouzrokovati oštećenje organa. Pored toga, aktivacija komplementa može prouzrokovati deponovanje litičkih komponenti sistema komplementa na obližnjim ćelijama domaćinima, kao i na ciljnim mestima delovanja mikroba, što rezultuje u lizi ćelija domaćina.

[0002] Pretpostavlja se da je sistem komplementa od značaja i u patogenezi brojnih akutnih i hroničnih bolesnih stanja, uključujući: infarkt miokarda, moždani udar, ARDS, reperfuzionu povredu, septički šok, kapilarno izlivanje koje prati opekotine nastale dejstvom toplote, inflamaciju nakon uvođenja kardiopulmonarnog bajpasa, odbacivanje transplantata, reumatoidni artritis, multiplu sklerozu, mijasteniju gravis i Alchajmerovu bolest. U gotovo svim od ovih stanja, komplement obično nije osnovni uzrok, ali je jedan od nekoliko faktora uključenih u patogenezu. Ipak, aktivacija komplementa može biti glavni patološki mehanizam i predstavlja efektivnu tačku za kliničku kontrolu u mnogim od ovih bolesnih stanja. Sve veće prepoznavanje značaja povrede tkiva posredovane komplementom u mnoštvu bolesnih stanja, naglašava potrebu za efektivnim lekovima koji bi inhibitorno delovali na sistem komplementa. Do danas, Ekulizumab (Solaris®), antitelo na C5, jedini je lek koji ciljano deluje na sistem komplementa, a koji je odobren za upotrebu kod ljudi. Pored toga, C5 je jedan od nekoliko efektorskih molekula lociranih „nishodno“ u sistemu komplementa, tako da blokiranje C5 ne inhibira aktivaciju sistema komplementa. Inhibitor početnih koraka aktivacije komplementa bi stoga bio sa značajnim prednostima u odnosu na inhibitora komplementa koji je "nishodno" u putu aktivacije.

[0003] Trenutno je široko prihvaćeno da sistem komplementa može biti aktiviran kroz tri jasno različita puta: klasičan put, lektinski put i alternativan put. Klasičan put se obično aktivira kompleksom sastavljenim od antitela domaćina vezanih za stranu česticu (tj. antigen) i stoga zahteva prethodno izlaganje antigenu da bi se generisao specifičan odgovor antitelima. Pošto aktivacija klasičnog puta zavisi od prethodnog adaptivnog imunskog odgovora domaćina, klasičan put je deo stečenog imunskog sistema. Nasuprot tome, i lektinski i alternativan put su nezavisni od adaptivnog imuniteta i deo su urođenog imunskog sistema.

[0004] Rezultat aktivacije sistema komplementa je sekvencijalna aktivacija serin proteaznih zimogena. Prvi korak u aktivaciji klasičnog puta je vezivanje molekula specifičnog prepoznavanja, C1q, za IgG i IgM molekule koji su se vezali za antigen. C1q se zatim udružuje sa Clr i Cls serin proteaznim proenzimima, u vidu kompleksa nazvanog C1. Nakon vezivanja C1q za imunski kompleks, autoproteolitičko cepanje Arg-Ile mesta u C1r prate cepanje i aktivacija Cls posredovani sa Clr, čime se stiče sposobnost cepanja C4 i C2. C4 se cepa na dva fragmenta, označene kao C4a i C4b, a na sličan način se cepa i C2, na C2a i C2b. C4b fragmenti su u stanju da obrazuju kovalentne veze sa susednim hidroksilnim ili amino grupama i da generišu C3 konvertazu (C4b2a), nekovalentnom interakcijom sa C2a fragmentom aktiviranog C2. C3 konvertaza (C4b2a) aktivira dalje C3, njegovim proteolitičkim cepanjem na C3a i C3b potkomponente, što vodi generisanju C5 konvertaze (C4b2a3b) i dalje cepanju C5, dovodeći do obrazovanja treminalnog litičkog kompleksa (C5b je tada u kombinaciji sa C6, C7, C8 i C-9; kompleks je označen i kao „MAC“ od engl. membrane attack complex), a koji može oštetiti ćelijske membrane vodeći zapravo ćelijskoj lizi. Aktivirani oblici C3 i C4 (C3b i C4b) se takođe kovalentno talože na ciljnim površinama stranih čestica, što dalje prepoznaju receptori komplementa na višestrukim fagocitima.

[0005] Nezavisno od navedenog, prvi korak u aktivaciji sistema komplementa lektinskim putem takođe podrazumeva vezivanje molekula specifičnog prepoznavanja, nakon čega sledi aktivacija priruženih serin proteaznih proenzima. Međutim, umesto vezivanja imunskih kompleksa sa C1q, molekuli prepoznavanja u lektinskom putu uključuju grupu proteina koji se vezuju za ugljene hidrate (lektin koji vezuje manan (MBL), H-fikolin, M-fikolin, L-fikolin i C-tip lektina CL-11), zajedno nazvane lektinima. Pogledati J. Lu i saradnici, Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002); Holmskov i saradnici, Annu. Rev. Immunol.21:547-578 (2003); Teh i saradnici, Immunology 101:225-232 (2000)). Pogledati takođe J. Luet i saradnici, Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov i saradnici, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh i saradnici, Immunology 101:225-232 (2000); Hansen i saradnici, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010).

[0006] Ikeda i saradnici su prvi pokazali da, poput C1q, MBL može aktivirati sistem komplementa nakon vezivanja za eritrocite obložene mananom kvasca, na način koji je zavisan od C4 (Ikeda i saradnici, J. Biol. Chem.262:7451-7454, (1987)). MBL, član familije kolektinskih proteina, predstavlja lektin zavisan od kalcijuma koji vezuje ugljene hidrate sa 3 i 4 hidroksilne grupe orjentisane u ekvatorijalnoj ravni piranoznog prstena. Najistaknutiji ligandi za MBL su stoga D-manoza i N-acetil-D-glukozamin, dok su ugljeni hidrati koji se ne uklapaju u ovakav prostorni zahtev sa afinitetom za MBL koji se ne može detektovati (Weis i saradnici, Nature 360:127-134, (1992)). Interakcija između MBL-a i monovalentnih šećera je izrazito slaba, sa konstantama disocijacije koje su obično u jednocifrenom milimolarnom opsegu. MBL ostvaruje blisko, specifično vezivanje za glikanske ligande putem aviditeta, tj. istovremenim interagovanjem sa višestrukim monosaharidnim ostacima smeštenim u neposrednoj blizini jedog sa drugim (Lee i saradnici, Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992)). MBL prepoznaje ugljenohidratne obrasce koji uobičajeno krase površinu mikroorganizma, poput bakterija, kvasaca, parazita i određenih virusa. Nasuprot tome, MBL ne prepoznaje D-galaktozu i sijalnu kiselinu, šećere koji nastaju kao pretposlednji i konačni proizvodi u putu obrade, a koji se obično nalaze u okviru „zrelih“ složenih glikokonjugata prisutnih u glikoproteinima plazma membrane i ćelijske površine kod sisara. Smatra se da ovakva specifičnost vezivanja pospešuje prepoznavanje „stranih“ površina i da pomaže u zaštiti od „samoaktivacije“. Međutim, MBL se ne vezuje sa visokim afinitetom za klastere “prekusorskih” glikana sa visokim sadržajem manoze na N-vezanim glikoproteinima i glikolipidima koji se sekvestriraju u endoplazmatskom retikulumu i Goldži aparatu sisarskih ćelija (Maynard i saradnici, J. Biol. Chem.257:3788-3794, (1982)). Oštećene ćelije su stoga potencijalna ciljna mesta za aktivaciju lektinskog puta preko vezivanja MBL.

[0007] Fikolini poseduju različitu vrstu lektinskog domena od MBL-a, a koji je označen kao domen sličan fibrinogenskom. Fikolini vezuju ostatke šećera na način koji ne zavisi od Ca<++>. Kod ljudi, identifikovano je tri vrste fikolina (L-fikolin, M-fikolin i H-fikolin). Dva serumska fikolina, L-fikolin i H-fikolin, karakteriše zajednička specifičnost za N-acetil-D-glukozamin; H-fikolin se, međutim, vezuje i za N-acetil-D-galaktozamin. Razlika u specifičnosti za šećere kod L-fikolina, H-fikolina, CL-11 i MBL podrazumeva da različiti lektini mogu biti komplementarni i ciljano delovati na različite, iako preklapajuće, glikokonjugate. Ovakav koncept podržava nedavna studija u kojoj je pokazano da se, od lektina u lektinskom putu koji su poznati, L-fikolin specifično vezuje za lipoteičnu kiselinu, glikokonjugat ćelijskog zida koji se nalazi na svim Gram-pozitivnim bakterijama (Lynch i saradnici, J. Immunol. 172:1198-1202, (2004)). Kolektine (tj. MBL) i fikoline ne karakterišu značajne sličnosti u aminokiselinskoj sekvenci. Ipak, ove dve grupe proteina su sa sličnim domenskim organizacijama i, slično sa C1q, udružuju se u oligomerne strukture koje dalje do maksimuma povećavaju mogućnost vezivanja za višestruka mesta.

[0008] Serumske koncentracije MBL-a su visoko varijabilne u zdravoj populaciji i genetički su kontrolisane polimorfizmima/mutacijama, kako u promotorskom, tako i u kodirajućim regionima MBL gena. Pošto predstavlja protein akutne faze, ekspresija MBL-a je dodatno pozitivno regulisana tokom inflamacije. L-fikolin je prisutan u serumu u koncentracijama koje su slične onima za MBL. Stoga, Lfikolinska grana lektinskog puta se po snazi potencijalno može uporediti sa MBL krakom. MBL i fikolini takođe mogu funkcionisati kao opsonini, što omogućavaju fagocitima da ciljano deluju na površine dekorisane sa MBL-om i fikolinima (pogledati Jack i saradnici, J Leukoc Biol. 77(3):328-36 (2004), Matsushita i Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi i saradnici, J Immunol, 174(1):418-25(2005). Ovakva opsonizacija zahteva interakciju ovih proteina sa receptorima fagocita (Kuhlman i saradnici, J. Exp. Med.169:1733, (1989); Matsushita i saradnici, J. Biol. Chem.271:2448-54, (1996)), čiji indentitet još uvek nije utvrđen.

[0009] Humani MBL obrazuje specifične i interakcije visokog afiniteta, posredstvom svog domena sličnog kolagenskom, sa jedinstvenim serinskim proteazama sličnim C1r/C1s koje su označene kao serinske proteaze udružene sa MBL (MASP). Do danas su opisane tri MASP. Najpre je identifikovan jedan „MASP“ enzim koji je okarakterisan kao enzim odgovoran za započinjanje kaskade komplementa (tj. cepanje C2 i C4) (Matsushita i saradnici, J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji i saradnici, J. Immunol. 150:571-578, (1993)). Naknadno je utvrđeno da je aktivnost MASP posledica zapravo mešavine dve proteaze: MASP-1 i MASP-2 (Thiel i saradnici, Nature 386:506-510, (1997)). Pokazano je, međutim, i da je MBL-MASP-2 kompleks sam po sebi dovoljan za aktivaciju komplementa (Vorup-Jensen i saradnici, J. Immunol.165:2093-2100, (2000)). Pored toga, samo MASP-2 cepa C2 i C4 velikim brzinama (Ambrus i saradnici, J. Immunol. 170:1374-1382, (2003)). MASP-2 je stoga proteaza odgovorna za aktivacija C4 i C2 da bi se generisala C3 konvertaza, C4b2a. Navedeno je značajno različito od C1 kompleksa klasičnog puta, gde koordinisana aktivnost dve specifične serinske proteaze (C1r i C1s) vodi aktivaciji sistema komplementa. Pored toga, izolovana je treća, nova proteaza, MASP-3 (Dahl M.R. i saradnici, Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 i MASP-3 predstavljaju alternativno obrađene proizvode istog gena.

[0010] MASP proteaze zajednički karakteriše identična domenska organizacija sa onima koje su prisutne u C1r i C1s, enzimskim komponentama C1 kompleksa (Sim i saradnici, Biochem. Soc. Trans.

28:545, (2000)). Ovakvi domeni obuhvataju N-terminalni domen Clr/Cls/VEGF-a morskog ježa/morfogenog proteina kostiju (CUB), domen sličan domenu epidermalnog faktora rasta, drugi CUB domen, tandem domena kontrolnog proteina komplemenata i serin proteazni domen. Kao i kod C1 proteaza, aktivacija MASP-2 se odija cepanjem Arg-IIe veze koja se nalazi blizu serin proteaznog domena, čime se enzim razdvaja na A i B lance povezane disulfidnim vezama, i pri čemu se drugonavedeni sastoji od serin proteaznog domena.

[0011] MBL se može takođe udruživati sa alternativno obrađenim oblikom MASP-2, poznatim kao protein povezan sa MBL od 19 kDa (MAp19) ili mali protein povezan sa MBL (sMAP), kome nedostaje katalitička aktivnost MASP2. (Stover J., Immunol. 162:3481-90, (1999); Takahashi i saradnici, Int. Immunol. 11:859-863, (1999)). MAp19 sadrži prva dva domena MASP-2, nakon kojih sledi dodatna sekvecna od četiri jedinstvene aminokiseline. Funkcija Map19 nije jasna (Degn i saradnici, J Immunol. Methods, 2011). MASP-1 i MASP-2 geni se nalaze na humanim hromozomima 3 i 1, tim redom (Schwaeble i saradnici, Immunobiology 205:455-466, (2002)).

[0012] Nekoliko linija dokaza ukazuje da postoje različiti MBL-MASP kompleksi i da veliki udeo MASP proteaza u serumu nije u kompleksu sa MBL (Thiel i saradnici, J. Immunol.165:878-887, (2000)). Oba od H- i L-fikolina se vezuju za sve MASP i aktiviraju lektinski put aktivacije komplementa, kao što to čini MBL (Dahl i saradnici, Immunity 15:127-35, (2001); Matsushita i saradnici, J. Immunol.168:3502-3506, (2002)). Time i lektinski i klasičan put dovode do obrazovanja zajedničke C3 konvertaze (C4b2a) i upravo ovaj korak predstavalja tačku u kojoj dolazi do konvergencije ova dva puta.

[0013] Generalno se smatra da lektinski put ima glavnu ulogu u odbrani domaćina od infekcija kada je domaćin infektivno naivan. Snažan dokaz uključenosti MBL u odbranu domaćina potiče iz analize pacijenata sa smanjenim serumskim nivoima funkcionalnog MBL (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). Takve pacijente karakteriše podložnost povratnim bakterijskim i gljivičnim infekcijama. Ovi simptomi su obično uočljivi u ranom životnom dobu, upravo tokom “prozora” osetljivosti koji se jasno uočava kada dolazi do pada titra antitela poreklom od majke, a nije završen razvoj potpunog repertoara odgovora antitelima. Sindrom je često rezultat mutacija na nekoliko mesta u kolagenskom delu MBL, što utiče na pravilno obrazovanje MBL oligomera. Ipak, pošto MBL može funkcionisati kao opsonin nezavisno od komplementa, nije poznato do koje mere povećana podložnosti infekciji nastaje usled poremaja u aktivaciji komplementa.

[0014] Nasuprot klasičnim i lektinskim putevima, do sada nisu ustanovljeni inicijatori alternativnog puta koji bi ispunili funkcije prepoznavanja koje vrše C1q i lektini u ostala dva puta. Trenutno je široko prihvaćeno da alternativni put karakteriše spontan, stalno nizak nivo aktivacije koji sam sebe održava/obnavlja, a koji dalje lako može biti umnožen na stranim ili abnormalnim površinama (ćelijama inficiranim bakterijama, kvascima, virusima ili na oštećenom tkivu), kojima nedostaju pravilni molekulski elementi koji drže spontanu aktivaciju koplementa pod kontrolom. Postoje četiri proteina plazme koji su direktno uključeni u aktivaciju alternativnog puta: C3, faktori B i D i properdin.

[0015] Iako postoji opširan dokaz koji ukazuje da i klasičan i alternativni put komplementa imaju ulogu u patogenezi neinfektivnih humanih oboljenja, sa istraživanjima uloge lektinskog puta se zapravo tek započinje. Skorašnje studije su obezbedile dokaze da aktivacija lektinskog puta može biti odgovorna za aktivaciju komplementa i povezanu inflamaciju kod ishemijske/reperfuzione povrede. Collard i saradnici (2000) su prijavili da endotelske ćelije u kulturi podvrgavane oksidativnom stresu vezuju MBL i da ih karakteriše deponovanje C3 nakon izlaganja humanom serumu (Collard i saradnici, Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000)). Pored toga, tretman humanog seruma sa blokirajućim anti-MBL monoklonskim antitelima inhibira vezivanje MBL i aktivaciju komplementa. Ovi nalazi su prošireni upotrebom pacovskog modela ishemije-reperfuzije miokarda u kome je pokazano da kod pacova tretiranih sa blokirajućim antitelom usmerenim na pacovski MBL, dolazi do značajno manjeg oštećenja miokarda nakon okluzije koronarne arterije nego kod pacova tretiranih sa kontrolnim antitelom (Jordan i saradnici, Circulacion 104:1413-1418, (2001)). Molekulski mehanizam vezivanja MBL za vaskularni endotel nakon oksidativnog stresa nije jasan; skorašnja studija ukazuje da aktivacija lektinskog puta nakon oksidativnog stresa može biti posredovana vezivanjem MBL za vaskularne endotelne citokeratine, a ne za glikokonjugate (Collard i saradnici, Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001)). Ostale studije su takođe ukazale na ulogu klasičnog i alterantivnog puta u patogenezi ishemijske/reperfuzione povrede, dok uloga lektinskog puta u ovom oboljenju ostaje sporna (Riedermann N.C. i saradnici, Am. J. Pathol.162:363-367, 2003).

[0016] Skorašnja studija je takođe pokazala da je MASP-1 (a moguće i MASP-3) potreban za konvertovanje enzima aktivacije alternativnog puta, Faktora D, iz njegovog zimogenog oblika u njegov enzimski aktivan oblik (pogledati Takahashi M. i saradnici, J Exp Med 207(1):29-37 (2010)). Fiziološki značaj ovog procesa je naglašen odustvom funkcionalne aktivnosti alternativnog puta u plazmi miševa sa deficijencijom MASP-1/3. Proteolitičko generisanje C3b iz nativnog C3 je neophodno za funkcionisanje alternativnog puta. Pošto C3 konvertaza alternativnog puta (C3bBb) sadrži C3b kao esencijalnu subjedinicu, pitanje porekla prvog C3b u alternativnom putu je postavilo zagonetan problem i podstaklo značajan broj istraživanja.

[0017] C3 pripada familiji proteina (zajedno sa C4 i α-2 makroglobulinom) koji sadrže retku posttranslatornu modifikaciju poznatu kao tioestarska veza. Tioestarska grupa se sastoji od glutamina čija krajnja karbonilna grupa obrazuje kovalentnu tioestarsku vezu sa sulfhidrilnom grupom cisteina na udaljenosti od tri aminokiseline. Ovakva veza nije stabilna i elektrofilni glutamil-tioestar može reagovati sa nukleofilnim ostacima, poput hidroksilnih ili amino grupa, i time obrazovati kovalentnu vezu sa drugim molekulima. Tioestarska veza je prihvaljivo stabilna kada je poziciono izdvojena unutar hidrofobnog džepa intaktnog C3. Rezultat proteolitičkog cepanja C3 do C3a i C3b je, međutim, izlaganje visoko reaktivne tioestarske veze na C3b,, tako da, nakon nukleofilnog napada susedne grupe koja sadrži hidroksilne ili amino grupe, C3b postaje kovalentno vezan za ciljni molekul. Pored njegove dobro utvrđene uloge u kovalentnom vezivanju C3b za ciljne molekule komplementa, smatra se da je C3 tioestar i sa ključnom ulogom u pokretanju alternativnog puta. Prema široko prihvaćenoj „teoriji minimalne aktivacije“, alternativni put se inicira generisanjem tečno-fazne konvertaze, iC3Bb, koja se obrazuje iz C3 sa hidrolizovanim tioestrom (iC3; C3(H2O)) i faktorom B (Lachmann P.J. i saradnici, Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, (1984)). C3(H2O) sličan C3b se generiše iz nativnog C3 sporom spontanom hidrolizom unutrašnjeg tioestra u proteinu (Pangburn M.K. i saradnici, J. Exp. Med.

154:856-867, 1981). Kroz aktivnost C3(H2O)Bb konvertaze, C3b molekuli se nakupljaju na ciljnoj povšini čime se inicira alternativni put.

[0018] O inicijatorima aktivacije alternativnog puta se veoma malo zna. Smatra se da aktivatori obuhvataju ćelijske zidove kvasca (zimosan), mnoge od čistih polisaharida, zečije eritrocite, određene imunoglobuline, viruse, gljivice, bakterije, životinjske tumorske ćelije, parazite i oštećene ćelije. Jedina od zajedničkih karakteristika za sve od ovih aktivatora je prisustvo ugljenih hidrata, ali je složenost i raznovrsnost ugljenohidratnih struktura bitno otežala utrvđivanje zajedničkih molekulskih determinanti koje mogu biti prepoznate. Široko je prihvaćeno da se aktivacija alternativnog puta održava pod kontrolom kroz fini balans između inhibitornih regulatornih komponenti ovog puta, kao što su to faktor H, Faktor I, DAF i CR1, i dalje properdina, koji je jedini pozitivan regulator alternativnog puta (pogledati Schwaeble W.J. i Reid K.B. Immunol Today 20(1):17-21 (1999)).

[0019] Pored očigledno neregulisanog mehanizma aktivacije koji je prethodno opisan, alternativni put takođe može obezbediti snažnu amplifikacionu petlju za C3 konvertazu lektinskog/klasičnog puta (C4b2a), pošto bilo koja količina generisane C3b može učestvovati sa faktorom B u obrazovanju dodatne C3 konvertaze alternativnog puta (C3bBb). C3 konvertaza alternativnog puta se stabilizuje vezivanjem properdina. Properdin produžava poluživot C3 konvertaze alternativnog puta za od šest do deset puta. Svako dodavanje C3b na C3 konvertazu alternativnog puta, vodi obrazovanju C5 konvertaze alternativnog puta.

[0020] Smatra se da se sva tri puta (tj. klasičan, lektinski i alternativan) sustiču na C5, koji se dalje cepa da bi se obrazovali proizvodi sa višestrukim pro-inflamatornim dejstvima. Konvergentni put je stoga označavan i kao teminalni komplementni put. C5a je najpotentniji anafilatoksin koji indukuje izmene u glatkim mišićima i vaskularnom tonusu, kao i propustljivosti krvnih sudova. Takođe je snažan hemotaksin i aktivator kako neutrofila, tako i monocita. Ćelijska aktivacija posredovana sa C5a može značajno amplifikovati imunske odgovore indukovanjem oslobađanja višestrukih dodatnih medijatora inflamacija, uključujući citokine, hidrolitičke enzime, metabolite arahidonske kiseline i reaktivne vrste kiseonika. Cepanje C5 vodi obrazovanju C5b-9, poznatog i kao terminalni litički kompleks (MAC). Danas postoji snažan dokaz da sublitičko nakupljanje MAC može imati važnu ulogu u inflamaciji pored njegove uloge u litičkom kompleksu za obrazovanje pora.

[0021] Pored njegove suštinske uloge u imunskoj odbrani, sistem komplementa doprinosi oštećenju tkiva u mnogim kliničkim stanjima. Postoji stoga velika potreba za razvojem terapijski efektivnih inhibitora sistema komplemenata u cilju prevencije ovakvih štetnih efekata.

[0022] Prijave US 2013/26650, WO 2012/139081, WO 2005/123128 i WO 2012/151481 se odnose na MASP-2 antitela za terapiju.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0023] Predmetni pronalazak je sažet u priloženim patentnim zahtevima.

[0024] Primeri izvođenja i/ili primeri primene u opisu koji sledi, a koji nisu obuhvaćeni priloženim patentnim zahtevima, ne smatraju se delom predmetnog pronalaska. Ovde je opisan postupak inhibiranja aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 kod subjekta koji boluje, ili je sa rizikom da razvije trombotičnu mikroangiopatiju (TMA), pri čemu je TMA najmanje jedna od (i) TMA nastale sekundarno u odnosu na kancer; (ii) TMA nastale sekundarno u odnosu na hemoterapiju ili (iii) TMA nastale sekundarno u odnosu na transplantaciju, pri čemu postupak obuhvata primenu kompozicije koja sadrži određenu količinu inhibitornog agensa za MASP-2 subjektu, količine koja je efektivna u inhibiciji aktivacije komplementa zavisne od MASP-2. U pojedinim slučajevima, subjekat boluje od ili je sa rizikom da razvije TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na kancer, a inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje subjektu sistemski, u količini koja je efektivna u smanjenju rizika za razvoj TMA ili u smanjenju ozbiljnosti TMA. U pojedinim slučajevima, subjekat boluje od, ili je sa rizikom da razvije TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na hemoterapiju, a inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje subjektu sistemski, pre, tokom ili nakon hemoterapije, u količini koja je efektivna u smanjenju rizika za razvoj TMA ili u smanjenju ozbiljnosti TMA. U pojedinim slučajevima, subjekat boluje od, ili je sa rizikom da razvije TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na transplantaciju, a MASP-2 inhibitor se primenjuje subjektu sistemski, pre, tokom ili nakon procedure transplantacije, u količini koja je efektivna u smanjenju rizika za razvoj TMA ili u smanjenju ozbiljnosti TMA. U pojedinim slučajevima, procedura transplantacije je alogena transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija. U pojedinim slučajevima, subjekat je prethodno bio podvrgnut ili se trenutno leči sa inhibitorom terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata primenu subjektu inhibitora terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5, kao što je to humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, poput ekulizumaba.

[0025] Ovde je takođe opisan postupak inhibiranja aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 kod subjekta koji boluje od ili je sa rizikom da razvije Upšau-Šulmanov sindrom (USS), pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog agensa za MASP-2 koja je efektivna u inhibiciji aktivacije komplementa koja je zavisna od MASP-2. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata lečenje subjekta sa rizikom da razvije USS, pri čemu postupak obuhvata primena količine inhibitornog agensa za MASP-2 tokom vremenskog perioda koji je efektivan da se ublaži ili spreči jedan od više kliničkih simptoma povezanih sa TTP. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata periodično praćenje subjekta i primenu inhibitornog agensa za MASP-2 nakon pojave događaja za koga je poznato da je udružen sa aktivacijom kliničkih simptoma TTP. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata periodično praćenje subjekta i primenu inhibitornog agensa za MASP-2 nakon utvrđivanja prisustva anemije, trombocitopenije ili porasta kreatina. U pojedinim slučajevima, subjekat je prethodno bio podvrgnut, ili se trenutno podvrgava lečenju sa inhibitorom terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata primenu subjektu inhibitora terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5, kao što je to humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, poput ekulizumaba.

[0026] Ovde je opisan i postupak inhibicije aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 kod subjekta koji boluje od Degosove bolesti, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži određenu količinu inhibitornog agensa za MASP-2 koja je efektivna u inhibiciji aktivacije komplementa zavisne od MASP-2. U pojedinim slučajevima, subjekat je prethodno bio podvrgnut, ili se trenutno podvrgava lečenju sa inhibitorom terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata primenu subjektu inhibitora terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5, kao što je to humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, poput ekulizumaba.

[0027] Opisan je i postupak inhibiranja aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 kod subjekta koji boluje od katastrofalnog antifosfolipidnog sindroma (CAPS), pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog agensa za MASP-2 koja je efektivna u inhibiciji aktivacije komplementa zavisne od MASP-2. U pojedinim slučajevima, subjekat je prethodno bio podvrgnut, ili se trenutno podvrgava lečenju sa inhibitorom terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata primenu subjektu inhibitora terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5, kao što je to humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, poput ekulizumaba.

[0028] U pojedinim slučajevima bilo kog od ovde opisanih postupaka, inhibitorni agens za MASP-2 je inhibitorno antitelo za MASP-2 ili njegov fragment. U pojedinim slučajevima, inhibitorno antitelo za MASP-2 je sa smanjenom efektorskom funkcijom. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo ne inhibira značajno klasičan put. U pojedinim slučajevima, inhibitorni agens za MASP-2 je anti-MASP-2 monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za deo SEQ ID NO:6. U pojedinim slučajevima, anti-MASP-2 antitelo ili njegov fragment je izabrano iz grupe koja se sastoji od rekombinantnog antitela, antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom, himernog antitela, humanizovanog antitela i humanog antitela. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, Fab’, F(ab)2i F(ab’)2. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo je jednolančani molekul. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od IgG1 molekula, IgG2 i IgG4 molekula. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo je IgG4 molekul koji sadrži mutaciju tipa S228P. U pojedinim

1

slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo vezuje humani MASP-2 sa KDod 10 nM ili manje. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo vezuje epitop u CCP1 domenu MASP-2. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira deponovanje C3b u in vitro testu sa 1% humanim serumom uz IC50od 10 nM ili manje. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira deponovanje C3b u 90% humanom serumu sa IC50od 30 nM ili manje.

[0029] U pojedinim slučajevima bilo kog od ovde opisanih postupaka, MASP-2 inhibitorno monoklonsko antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 iz SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i (b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno monoklonsko antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID NO:70. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, specifično prepoznaje najmanje deo epitopa koga prepoznaje referentno antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca region kao što je navedeno u SEQ ID NO:70.

[0030] Ovde su dalje opisani i postupci za inhibiranje obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od atipičnog hemolitičkog uremijskog sindroma (aHUS), pri čemu postupci obuhvataju primenu subjektu količine MASP-2 inhibitornog antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koje su efektivne u inhibiciji aktivacije komplementa zavisne od MASP-2. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od aHUS za najmanje 40% u poređenju sa netretiranim serumom. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od aHUS sa nivoom koji je za najmanje 20% veći (npr. najmanje 30% veći, najmanje 40% veći ili najmanje 50% veći) od njegovog inhibitornog efekta na deponovanje C5b-9 u serumu iz istog subjekta. U pojedinim slučajevima, subjekat je u akutnoj fazi aHUS. U pojedinim slučajevima, subjekat je u fazi remisije aHUS. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo je monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za deo SEQ ID NO:6. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo, ili njegov fragment, je izabran iz grupe koja se sastoji od rekombinantnog antitela, antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom, himernog antitela, humanizovanog antitela i humanog antitela. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od Fv, Fab, Fab’, F(ab)2i F(ab’)2. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo je jednolančani molekul. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od IgG1 molekula, IgG2 i IgG4 molekula. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo je IgG4 molekul koji sadrži mutaciju tipa S228P. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo vezuje humani MASP-2 sa KDod 10 nM ili manje. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo vezuje epitop u CCP1 domenu MASP-2. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira deponovanje C3b u in vitro testu sa 1% humanim serumom uz IC50od 10 nM ili manje. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira deponovanje C3b u 90% humanom serumu sa IC50od 30 nM ili manje. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno monoklonsko antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i (b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno monoklonsko antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID NO:70. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, specifično prepoznaje najmanje deo epitopa koga prepoznaje referentno antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca region kao što je navedeno u SEQ ID NO:70.

[0031] Takođe su opisane kompozicije za inhibiranje štetnih efekata aktivacije komplementa zavisne od MASP-2, koje sadrže terapijski efektivnu količinu inhibitornog agensa za MASP-2, poput inhibitornog antitela za MASP-2, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Opisani su i postupci za proizvodnju medikamenta za upotrebu u inhibiranju štetnih efekata aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 kod živih subjekata kojima je to potrebno, a koji sadrže terapijski efektivnu količinu inhibitornog agensa za MASP-2 u farmaceutskom nosaču. Takođe su opisani postupci za proizvodnju medikamenata za upotrebu u inhibiranju aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 za lečenje svakog od stanja, oboljenja i poremećaja koji je ovde opisan u nastavku teksta.

[0032] Postupci, kompozicije i medikamenti koji su ovde opisani su korisni za inhibiranje štetnih efekata aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 in vivo, kod sisarskih subjekata, uključujući ljude koji boluju od ili su sa rizikom da razviju trombotičnu mikroangiopatiju (TMA), kao što je ovde dalje opisano.

OPIS SLIKA NACRTA

[0033] Prethodno naveden tekst će postati jasniji za sagledavanje ukoliko bude detaljnije objašnjen navođenjem detaljnog opisa pronalaska koji sledi, zajedno sa pratećim slikama, gde:

SLIKA 1 je dijagram koji ilustruje genomsku strukturu humanog MASP-2;

SLIKA 2A je šematski dijagram koji ilustruje domensku strukturu humanog MASP-2 proteina; SLIKA 2B je šematski dijagram koji ilustruje domensku strukturu humanog MAp19 proteina;

SLIKA 3 je dijagram koji ilustruje strategiju genetičkog isključivanja (knockout) mišjeg MASP-2; SLIKA 4 je dijagram koji ilustruje humani MASP-2 minigenski konstrukt;

SLIKA 5A predstavlja rezultate koji pokazuju da deficijencija MASP-2 dovodi do gubitka aktivacije C4 posredovane lektinskim putem, što je izmereno nedostatkom deponovanja C4b na mananu, kao što je opisano u Primeru 2;

SLIKA 5B predstavlja rezultate koji pokazuju da deficijencija MASP-2 dovodi do gubitka aktivacije C4 posredovane lektinskim putem, što je izmereno nedostatkom deponovanja C4b na zimosanu, kao što je opisano u Primeru 2;

SLIKA 5C predstavlja rezultate koji pokazuju relativne nivoe aktivacije C4 u uzorcima seruma dobijenim iz MASP-2+/-; MASP-2-/- i sojeva divljeg tipa, što je izmereno deponovanjem C4b na mananu i na zimosanu, kao što je opisano u Primeru 2;

SLIKA 6 predstavlja rezultate koji pokazuju da dodavanje mišjeg rekombinantnog MASP-2 u uzorke seruma MASP-2-/- soja obnavlja aktivaciju C4 posredovanu lektinskim putem na način koji zavisi od koncentracije proteina, što je izmereno deponovanjem C4b na mananu, kao što je opisano u Primeru 2;

SLIKA 7 predstavlja rezultate koji pokazuju da je klasičan put funkcionalan u MASP-2-/- soju, kao što je opisano u Primeru 8;

SLIKA 8A predstavlja rezultate koji pokazuju da anti-MASP-2 Fab2 antitelo #11 inhibira obrazovanje C3 konvertaze, kao što je opisano u Primeru 10;

SLIKA 8B predstavlja rezultate koji pokazuju da se anti-MASP-2 antitelo Fab2 #11 vezuje za nativni pacovski MASP-2, kao što je opisano u Primeru 10;

SLIKA 8C predstavlja rezultate koji pokazuju da anti-MASP-2 Fab2 antitelo #41 inhibira cepanje C4, kao što je opisano u Primeru 10;

SLIKA 9 predstavlja rezultate koji pokazuju da sva od ispitivanih anti-MASP-2 antitela koja inhibiraju obrazovanje C3 konvertaze takođe inhibiraju cepanje C4, kao što je opisano u Primeru 10;

SLIKA 10 je dijagram koji ilustruje rekombinantne polipeptide izvedene iz pacovskog MASP-2 koji su upotrebljavani za mapiranje epitopa anti-MASP-2 blokirajućeg Fab2 antitela, kao što je opisano u Primeru 11;

1

SLIKA 11 predstavlja rezultate koji pokazuju vezivanje anti-MASP-2 Fab2 #40 i #60 za MASP-2 polipeptide pacova, kao što je opisano u Primeru 11;

SLIKA 12 predstavlja rezultate koji pokazuju klirens azota uree iz krvi kod miševa divljeg tipa (+/+) i MASP-2(-/-) miševa 24 i 48 sati nakon reperfuzije u modelu bubrežne ishemijske/reperfuzione povrede, kao što je opisano u Primeru 12;

SLIKA 13A predstavlja rezultate koji pokazuju osnovne nivoe VEGF proteina u RPE-horoidnom kompleksu izolovanom iz miševa divljeg tipa (+/+) i MASP-2(-/-) miševa, kao što je opisano u Primeru 13;

SLIKA 13B prikazuje rezultate koji pokazuju nivoe VEGF proteina u RPE-horoidnom kompleksu kod miševa divljeg tipa (+/+) i MASP-2(-/-) miševa, 3 dana nakon povrede indukovane laserom u modelu makularne degeneracije, kao što je opisano u Primeru 13;

SLIKA 14 predstavlja rezultate koji pokazuju srednju zapreminu horoidne neovaskularizacije (CNV) 7. dana nakon povrede indukovane laserom kod miševa divljeg tipa (+/+) i MASP-2(-/-) miševa, kao što je opisano u Primeru 13;

SLIKE 15A i 15B predstavljaju krive odgovora na dozu za inhibiciju deponovanja C4b (SL. 15A) i inhibiciju aktivacije trombina (SL. 15B) nakon primene MASP-2 Fab2 antitela u normalan serum pacova, kao što je opisano u Primeru 14;

SLIKE 16A i 16B predstavljaju izmerenu agregaciju trombocita (izraženu kao površina agregata) kod MASP-2(-/-) miševa (SLIKA 16B) u poređenju sa agregacijom trombocita kod netretiranih miševa divljeg tipa i miševa divljeg tipa kod kojih je inhibiran put komplementa upotrebom otrovnog agensa tipa venomskog faktora kobre (CVF) i inhibitora terminalnog puta (antagoniste C5aR) (SLIKA 16A) u lokalizovanom Švarcmanovom modelu diseminovane intravaskularne koagulacije, kao što je opisano u Primeru 15;

SLIKA 17 grafički ilustruje nivoe azota iz uree u krvi (BUN) izmerene bilo u WT (+/+) (B6) ili MASP-2(-/-) miševima koji su bili recipijenti transplantata bubrega iz WT (+/+) davalaca, kao što je opisano u Primeru 16;

SLIKA 18 grafički ilustruje procenat preživljavanja WT (+/+) i MASP-2(-/-) miševa u funkciji broja dana nakon mikrobne infekcije u modelu podvezivanja i punkcije slepog creva (CLP), kao što je opisano u Primeru 17;

SLIKA 19 grafički ilustruje broj bakterija izmeren kod WT (+/+) i MASP-2(-/-) nakon mikrobne infekcije u modelu podvezivanja i punkcije slepog creva (CLP), kao što je opisano u Primeru 17; SLIKA 20 je Kaplan-Majerov dijagram koji ilustruje procenat preživljavanja WT (+/+), MASP-2(-/-) i C3 (-/-) miševa šest dana nakon izazova sistema sa intranazalnom primenom Pseudomonas aeruginosa, kao što je opisano u Primer 18;

SLIKA 21 grafički ilustruje nivo deponovanja C4b, izmeren kao % od kontrole, u uzorcima uzetim u različitim vremenskim tačkama nakon subkutane primene doze od bilo 0,3 mg/kg ili 1,0 mg/kg mišjeg anti-MASP-2 monoklonskog antitela WT miševima, kao što je opisano u Primeru 19;

SLIKA 22 grafički ilustruje nivo deponovanja C4b, izmeren kao % od kontrole, u uzorcima uzetim u različitim vremenskim tačkama nakon ip primene doze od 0,6 mg/kg mišjeg anti-MASP-2 monoklonskog antitela WT miševima, kao što je opisano u Primeru 19;

SLIKA 23 grafički ilustruje srednju zapreminu horoidne neovaskularizacije (CNV) sedmog dana nakon povrede indukovane laserom kod WT (+/+) miševa koji su prethodno tretirani jednokratnom ip injekcijom sa 0,3 mg/kg ili 1,0 mg/kg mišjeg anti-MASP-2 monoklonskog antitela; kao što je opisano u Primeru 20;

SLIKA 24A grafički ilustruje procenat preživljavanja MASP-2 (-/-) i WT (+/+) miševa nakon infekcije sa 5x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis, kao što je opisano u Primeru 21;

SLIKA 24B grafički ilustruje log cfu/ml za N. meningitidis izdvojenu u različitim vremenskim tačkama iz uzoraka krvi uzetih iz MASP-2 KO (-/-) i WT (+/+) miševa inficiranih sa 5x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis, kao što je opisano u Primeru 21;

SLIKA 25A grafički ilustruje procenat preživljavanja MASP-2 KO (-/-) i WT (+/+) miševa nakon infekcije sa 2x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis, kao što je opisano u Primeru 21;

SLIKA 25B grafički ilustruje log cfu/ml za N. meningitidis izdvojenu u različitim vremenskim tačkama iz uzoraka krvi uzetih iz WT (+/+) miševa inficiranih sa 2x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis, kao što je opisano u Primeru 21;

SLIKA 25C grafički ilustruje log cfu/ml za N. meningitidis izdvojenu u različitim vremenskim tačkama iz uzoraka krvi uzetih iz MASP-2(-/-) miševa inficiranih sa 2x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis, kao što je opisano u Primeru 21;

SLIKA 26A grafički ilustruje rezultate analize deponovanja C3b koji pokazuje da MASP-2(-/-) miševi zadržavaju funkcionalan klasičan put, kao što je opisano u Primeru 22;

SLIKA 26B grafički ilustruje rezultate analize deponovanja C3b na pločicama obloženim zimosanom, pokazujući da MASP-2(-/-) miševi zadržavaju funkcionalan alternativni put, kao što je opisano u Primeru 22;

SLIKA 27A grafički ilustruje gubitak tkiva izazvan ishemijskom/reperfuzionom povredom miokarda (MIRI) nakon ligacije leve anteriorne silazne grane koronarne arterije (LAD) i reperfuzije kod C4 (-/-) miševa (n=6) i odgovarajućih WT kontrola iz legla (n=7), pokazujući rizično područje (AAR) i veličinu infarkta (INF) kao što je opisano u Primeru 22;

1

SLIKA 27B grafički ilustruje veličinu infarkta (INF) u funkciji površine rizika (AAR) kod C4 (-/-) i WT miševa tretiranih kao što je opisano na SLICI 42A, pokazujući da su C4 (-/-)miševi podložni MIRI kao WT kontrole (isprekidana linija), kao što je opisano u Primeru 22;

SLIKA 28A grafički ilustruje rezultate analize deponovanja C3b upotrebom seruma iz WT miševa, C4 (-/-) miševa i seruma iz C4 (-/-) miševa koji je prethodno inkubiran sa mananom, kao što je opisano u Primeru 22;

SLIKA 28B grafički ilustruje rezultate analize deponovanja C3b na serumu iz WT, C4 (-/-) i MASP-2(-/-) miševa koji su bili pomešani sa različitim koncentracijama anti-mišjeg MASP-2 mAt (mAbM11), kao što je opisano u Primeru 22;

SLIKA 28C grafički ilustruje rezultate analize deponovanja C3b na humanom serumu iz WT (sa dovoljno C4) i serumu koji je deficijentan u C4, kao i serumu iz subjekata sa deficijencijom u C4 koji je prethodno inkubiran sa mananom, kao što je opisano u Primeru 22;

SLIKA 28D grafički ilustruje rezultate analize deponovanja C3b na humanom serumu iz WT (sa dovoljno C4) i iz subjekata sa deficijencijom C4 koji su bili pomešani sa anti-humanim MASP-2 mAb (mAbH3), kao što je opisano u Primeru 22;

SLIKA 29A grafički ilustruje uporednu analizu aktivnosti C3 konvertaze u plazmi iz raznih mišjih sojeva sa deficijencijom komplementa koji su ispitivani bilo pod uslovima specifičnim za ispitivanje aktivacije lektinskog puta ili pod uslovima za ispitivanje aktivacije klasičnog puta, kao što je opisano u Primeru 22;

SLIKA 29B grafički ilustruje vremenski raščlanjenu kinetiku aktivnost C3 konvertaze u plazmi raznih mišjih sojeva sa deficijencijom komplementa koji su ispitivani pod uslovima specifičnim za ispitivanje aktivacije lektinskog puta, kao što je opisano u Primeru 22;

SLIKA 30 ilustruje rezultate imunoblot analize koji pokazuju aktivaciju humanog C3, prikazanu prisustvom a' lanca, kao i supstratima trombina FXIa i FXa, kao što je opisano u Primeru 23;

SLIKA 31 prikazuje rezultate analize deponovanja C3 na uzorcima seruma dobijenim iz WT, MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11 (-/-)/C4 (-/-) i C4 (-/-), kao što je opisano u Primeru 23;

SLIKA 32A je Kaplan-Majerov dijagram preživljavanja koji pokazuje procenat preživljavanja tokom vremena nakon izlaganja zračenju od 7,0 Gy kod kontrolnih miševa i kod miševa tretiranih sa antitelom na mišji MASP-2 (mAbM11) ili sa antitelom na humani MASP-2 (mAbH6), kao što je opisano u Primeru 29;

SLIKA 32B je Kaplan-Majerov dijagram preživljavanja koji pokazuje procenat preživljavanja tokom vremena, nakon izlaganja zračenju od 6,5 Gy kod kontrolnih miševa i kod miševa tretiranih sa antitelom na mišji MASP-2 (mAbM11) ili sa antitelom na humani MASP-2 (mAbH6), kao što je opisano u Primeru 29;

1

SLIKA 33 je Kaplan-Majerov dijagram koji grafički ilustruje procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon primene infektivne doze od 2,6 x 10<7>cfu N. meningitidis serogrupe A Z2491, pokazujući da su miševi sa deficijencijom MASP-2 zaštićeni od mortaliteta indukovanog sa N. meningitidis, kao što je opisano u Primeru 30;

SLIKA 34 je Kaplan-Majerov dijagram koja grafički ilustruje procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon primene infektivne doze od 6 x 10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soja MC58, pokazujući da su miševi sa deficijencijom MASP-2 zaštićeni od mortaliteta indukovanog sa N. meningitidis serogrupe B soja MC58, kao što je opisano u Primeru 30;

SLIKA 35 grafički ilustruje log cfu/ml za N. meningitidis serogrupe B soja MC58 izolovanog u različitim vremenskim tačkama iz uzoraka krvi uzetih iz MASP-2 KO i WT miševa nakon i.p. infekcija sa 6x10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soja MC58 (n=3 u različitim vremenskim tačkama za obe grupe miševa, rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SEM), pokazujući da, iako su MASP-2 KO miševi bili inficirani sa istom dozom N. meningitidis serogrupe B soja MC58 kao WT miševi, MASP-2 KO miševi imaju pojačan klirens bakterijemije u poređenju sa WT, kao što je opisano u Primeru 30;

SLIKA 36 grafički ilustruje prosečan skor oboljenja kod MASP-2 i WT miševa 3, 6, 12 i 24 sata nakon infekcije sa 6x10<6>cfu/100 µl N. meningitidis Serogroupe B soja MC58, pokazujući da su miševi sa deficijencijom MASP-2 pokazali visoku rezistenciju na infekciju, sa mnogo nižim skorovima oboljenja nakon 6 sati, kao što je opisano u Primeru 30;

SLIKA 37 je Kaplan-Majerov dijagram koja grafički ilustruje procenat preživljavanja miševa nakon primene infektivne doze od 4 x 10<6>cfu/100 µl N. meningitidis serogrupe B soja MC58, nakon koje je sledila primena, 3 sata nakon infekcije, bilo inhibitornog anti-MASP-2 antitela (1 mg/kg) ili kontrolnog izotipskog antitela, pokazujući da je anti-MASP-2 antitelo efektivno za lečenje i poboljšanje preživljavanja kod subjekata inficiranih sa N. meningitidis, kao što je opisano u Primeru 31;

SLIKA 38 grafički ilustruje log cfu/ml za broj vijabilnih N. meningitidis serogrupe B-MC58 koje su izdvojene u različitim vremenskim tačkama iz humanog seruma koncentracije do 20% nakon i.p. infekcije sa 6,5x10<6>cfu/100 µl N. meningitidis serogrupe B soja MC58, a 0, 30, 60 i 90 minuta nakon inkubacije u prisustvu: (A) normalnog humanog seruma (NHS) sa dodatkom humanog anti-MASP-2 antitela; (B) normalnog humanog seruma (NHS) sa dodatkom izotipskog kontrolnog antitela; (C) MBL-/- humanog seruma; (D) normalnog humanog seruma (NHS) i (E) normalnog humanog seruma (NHS) inaktiviranog toplotom, pokazujući da je ubijanje N. meningitidis zavisno od komplementa u humanom serumu bilo značajno pojačano dodavanjem humanog anti-MASP-2 antitela, kao što je opisano u Primeru 32;

1

SLIKA 39 grafički ilustruje log cfu/ml za broj vijabilnih N. meningitidis serogrupa B-MC58 izdvojenih u različitim vremenskim tačkama u uzorcima seruma miša, pokazujući da su serumi MASP-2-/-miševa sa višim nivoom baktericidne aktivnosti za N. meningitidis nego serumi WT miševa, kao što je opisano u Primeru 32;

SLIKA 40 grafički ilustruje hemolizu (merenu oslobađanjem hemoglobina iz liziranih mišjih eritrocita (Crry/C3-/-) u supernatant, što je izmereno fotometrijom) kod mišjih eritrocita obloženih mananom sa humanim serumom širokog opsega koncentracija seruma. Ispitivani serumi su uključivali NHS neaktiviran toplotom (HI), MBL-/-, NHS anti-MASP-2 antitelo i NHS kontrolu, kao što je opisano u Primeru 33;

SLIKA 41 grafički ilustruje hemolizu (merenu oslobađanjem hemoglobina iz liziranih WT mišjih eritrocita u supernatant, što je izmereno fotometrijom) kod mišjih eritrocita koji nisu bili oblagani, sa humanim serumom širokog opsega koncentracija seruma. Ispitivani serum je podrazumevao NHS neaktiviran toplotom (HI), MBL-/-, NHS anti-MASP-2 antitelo i NHS kontrolu, pokazujući da inhibiranje MASP-2 inhibira lizu nesenzitizovanih WT mišjih eritrocita posredovanu komplementom, kao što je opisano u Primeru 33;

SLIKA 42 grafički ilustruje hemolizu (merenu oslobađanjem hemoglobina iz liziranih mišjih eritrocita (CD55/59-/-) supernatant, što je izmereno fotometrijom) kod mišjih eritrocita koji nisu bili oblagani, sa humanim serumom širokog opsega koncentracija seruma. Ispitivani serum je uključivao NHS neaktiviran toplotom (HI), MBL-/-, NHS anti-MASP-2 antitelo i NHS kontrolu, kao što je opisano u Primeru 33;

SLIKA 43 grafički ilustruje procenat preživljavanja tokom vremena (dana) nakon izlaganja zračenju od 8,0 Gy kod kontrolnih miševa i kod miševa tretiranih sa anti-humanim MASP-2 antitelom (mAbH6), kao što je opisano u Primeru 34;

SLIKA 44 grafički ilustruje vreme do početka mikrovaskularne okluzije nakon injeciranja LPS-a u MASP-2-/- i WT miševe, pokazujući procenat miševa kod kojih dolazi do obrazovanja trombova, što je mereno tokom perioda od 60 minuta, pokazujući da se obrazovanje tromba detektuje nakon 15 minuta kod WT miševa, pri čemu do 80% WT miševa pokazuje obrazovanje tromba u 60 minuta; nastuprot tome, kod nijednog od MASP-2-/- miševa nije uočeno obrazovanja tromba tokom perioda od 60 minuta (log rank: p=0,0005), kao što je opisano u Primeru 35;

SLIKA 45 grafički ilustruje procenat preživljavanja kontrolnih miševa tretiranih fiziološkim rastvorom (n=5) i miševa tretiranih MASP-2 antitelom (n=5) u HUS modelu indukovanom sa STX/LPS-om, tokom vremena (sati), pokazujući da su svi od kontrolnih miševa uginuli za 42 sata, dok je, nasuprot tome, 100% miševa tretiranih sa MASP-2 antitelom preživelo tokom vremenskog perioda eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 36;

1

SLIKA 46 grafički ilustruje, u funkciji vremena nakon indukcije povrede, procenat miševa sa mikrovaskularnom okluzijom u FITC/Dekstranskom UV modelu nakon tretmana sa izotipskom kontrolom ili sa humanim MASP-2 antitelom mAbH6 (10 mg/kg) koje je primenjivano 16 sati i 1 sat pre injeciranja FITC/Dekstrana, kao što je opisano u Primeru 37;

SLIKA 47 grafički ilustruje vreme okluzije u minutama, za miševe tretirane sa antitelom na humani MASP-2 (mAbH6) i izotipskim kontrolnim antitelom, pri čemu su podaci prikazani kao tačkasti dijagrami sa srednjim vrednostima (ucrtanim u horizontalnom pravcu) i vrednostima standardnih grešaka (ucrtanim u vertikalnom pravcu). Statistički test upotrebljavan za analizu je bio neuparen t test; gde simbol "*" označava p=0,0129, kao što je opisano u Primeru 37; i

SLIKA 48 grafički prikazuje vreme do okluzije u minutama za miševe divljeg tipa, MASP-2 KO miševe i miševe divljeg tipa koji su prethodno tretirani sa humanim MASP-2 antitelom (mAbH6), primenjivanim i.p. u dozi od 10 mg/kg 16 sati pre, i ponovo 1 sat pre indukcije tromboze u modelu tromboze sa povredom endotelnih ćelija indukovanom FITC-dekstranom/svetlošću, sa niskim intenzitetom svetlosti (800-1500), kao što je opisano u Primeru 37;

SLIKA 49 je Kaplan-Majerov dijagram koji prikazuje procenat miševa sa trombovima u funkciji vremena, kod trombotične mikroangiopatije indukovane sa FITC-Dekstranom na miševima tretiranim sa rastućim dozama inhibitornog antitela za humani MASP-2 (mAbH6) ili izotipskog kontrolnog antitela, kao što je opisano u Primeru 39;

SLIKA 50 grafički ilustruje medijane vremena do početka (minuti) obrazovanja tromba u funkciji doze mAbH6 (*p<0,01 u poređenju sa kontrolom), kao što je opisano u Primeru 39;

SLIKA 51 je Kaplan-Majerov dijagram koji prikazuje procenat miševa sa mikrovaskularnom okluzijom u funkciji vemena, kod trombotične mikroangiopatije indukovane FITC-Dekstranom na miševima tretiranim sa rastućim dozama inhibitornog antitela za humani MASP-2 (mAbH6) ili izotipskog kontrolnog antitela, kao što je opisano u Primeru 39;

SLIKA 52 grafički ilustruje medijanu vremena do mikrovaskularne okluzije u funkciji doze mAbH6 (*p<0,05 u poređenju sa kontrolom), kao što je opisano u Primeru 39;

SLIKA 53A grafički ilustruje nivo deponovanja MAC u prisustvu ili odsustvu monoklonskog antitela za humani MASP-2 (OMS646) pod uslovima ispitivanja specifičnim za lektinski put, pokazujući da OMS646 inhibira deponovanje MAC posredovano lektinom sa IC50vrednošću od približno 1 nM, kao što je opisano u Primeru 40;

SLIKA 53B grafički ilustruje nivo deponovanja MAC u prisustvu ili odsustvu monoklonskog antitela za humani MASP-2 (OMS646) pod uslovima ispitivanja koji su specifični za klasičan put, pokazujući da OMS646 ne inhibira deponovanje MAC posredovano klasičnim putem, kao što je opisano u Primeru 40;

1

SLIKA 53C grafički ilustruje nivo deponovanja MAC u prisustvu ili odsustvu monoklonskog antitela za humani MASP-2 (OMS646) pod uslovima ispitivanja koji su specifični za alternativan put, pokazujući da OMS646 ne inhibira deponovanje MAC posredovano alternativnim putem, kao što je opisano u Primeru 40;

SLIKA 54 grafički ilustruje farmakokinetički (PK) profil monoklonskog antitela za humani MASP-2 (OMS646) kod miševa, prikazujući koncentraciju OMS646 (srednja vrednost n=3 životinje/grupe) u funkciji vremena nakon primene u naznačenoj dozi, kao što je opisano u Primeru 40;

SLIKA 55A grafički ilustruje farmakodinamički (PD) odgovor monoklonskog antitela za humani MASP-2 (OMS646), izmeren kao pad sistemske aktivnosti lektinskog puta kod miševa nakon intravenske primene, kao što je opisano u Primeru 40;

SLIKA 55B grafički ilustruje farmakodinamički (PD) odgovor monoklonskog antitela za humani MASP-2 (OMS646), izmereno kao pad sistemske aktivnosti lektinskog puta kod miševa nakon supkutane primene, kao što je opisano u Primeru 40;

SLIKA 56 grafički ilustruje inhibitoran efekat MASP-2 antitela (OMS646) u poređenju sa sCR1 na deponovanje C5b-9 indukovano sa aHUS serumom na HMEC-1 ćelijama aktiviranim sa ADP-om, kao što je opisano u Primeru 41; i

SLIKA 57 grafički ilustruje inhibitoran efekat MASP-2 antitela (OMS646) u poređenju sa sCR1 na obrazovanje tromba indukovano aHUS serumom na HMEC-1 ćelijama aktiviranim sa ADP-om, kao što je opisano u Primeru 42.

OPIS LISTE SEKVENCI

[0034]

SEQ ID NO:1 cDNK za humani MAp19

SEQ ID NO:2 humani MAp19 protein (sa liderskom sekvencom)

SEQ ID NO:3 humani MAp19 protein (zreli oblik)

SEQ ID NO:4 cDNK za humani MASP-2

SEQ ID NO:5 humani MASP-2 protein (sa liderskom sekvencom)

SEQ ID NO:6 humani MASP-2 protein (zreli oblik)

SEQ ID NO:7 gDNK za humani MASP-2 (egzoni 1-6)

ANTIGENI: (U ODNOSU NA ZRELI MASP-2 PROTEIN)

[0035]

SEQ ID NO:8 CUBI sekvenca (ak 1-121)

2

SEQ ID NO:9 CUBEGF sekvenca (ak 1-166)

SEQ ID NO:10 CUBEGFCUBII (ak 1-293)

SEQ ID NO:11 EGF region (ak 122-166)

SEQ ID NO:12 serin proteazni domen (ak 429 - 671)

SEQ ID NO:13 neaktivan serin proteazni domen (ak 610-625 sa mutacijom tipa Ser618 u Ala) SEQ ID NO:4 TPLGPKWPEPVFGRL (CUBI peptid)

SEQ ID NO:15

TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (CUBI peptid)

SEQ ID NO:16 TFRSDYSN (centralni region vezivanja MBL)

SEQ ID NO:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (region vezanja MBL)

SEQ ID NO:18 IDECQVAPG (EGF PEPTID)

SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (centralni region vezivanja serinske proteaze) Detaljan opis

INHIBITORI PEPTIDA:

[0036]

SEQ ID NO:20 cDNK za MBL pune dužine

SEQ ID NO:21 MBL protein pune dužine

SEQ ID NO:22 OGK-X-GP (konsenzusna sekvenca vezivanja)

SEQ ID NO:23 OGKLG

SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G

SEQ ID NO:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO

SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG

SEQ ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (humani h-fikolin)

SEQ ID NO:28

GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGA OGEO (humani fikolin p35)

SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRWTIKANRPFLVFI (mesto cepanja C4)

INHIBITORI EKSPRESIJE:

[0037]

SEQ ID NO:30 cDNK za CUBI-EGF domen (nukleotidi 22-680 iz SEQ ID NO:4)

SEQ ID NO:31

5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'

Nukleotidi 12-45 iz SEQ ID NO:4, uključujući mesto započinanja translacija za MASP-2 (sens) SEQ ID NO:32

5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'

Nukleotidi 361-396 iz SEQ ID NO:4 koji kodiraju region koji sadrži mesto vezivanja MBL u MASP-2 (sens)

SEQ ID NO:33

5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'

Nukleotidi 610-642 iz SEQ ID NO:4 koji kodiraju region koji sadrži CUBII domen

PRAJMERI ZA KLONIRANJE:

[0038]

SEQ ID NO:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (5' PCR za CUB)

SEQ ID NO:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (3' PCR ZA CUB)

SEQ ID NO:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (3’ PCR ZA CUBIEGF)

SEQ ID NO:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (3’ PCR ZA CUBIEGFCUBII)

SEQ ID NO:38-47 su prajmeri kloniranja za humanizovana antitela

SEQ ID NO:48 je peptidna veza 9 aa

EKSPRESIONI VEKTOR:

[0039]

SEQ ID NO:49 je MASP-2 minigenski insert

SEQ ID NO:50 je cDNK za mišji MASP-2

SEQ ID NO:51 je mišji MASP-2 protein (bez liderske sekvence)

SEQ ID NO:52 je zreo oblik mišjeg MASP-2 proteina

SEQ ID NO:53 cDNK za MASP-2 pacova

SEQ ID NO:54 je pacovski MASP-2 protein (bez liderske sekvence)

SEQ ID NO:55 je zreo oblik pacovskog MASP-2 proteina

SEQ ID NO:56-59 su oligonukleotidi za mutagenezu usmerenu na mesto u humanom MASP-2 koji su upotrebljavani za generisanje humanog MASP-2A

SEQ ID NO:60-63 su oligonukleotidi za mutagenezu usmerenu na mesto u mišjem MASP-2 koji su upotrebljavani za generisanje mišjeg MASP-2A

SEQ ID NO:64-65 su oligonukleotidi za mutagenezu usmerenu na mestou u pacovskom MASP-2 koji su upotrebljavani za generisanje pacovskog MASP-2A

SEQ ID NO:66 DNK koja kodira varijabilni region teškog lanca (VH) iz 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) (bez signalnog peptida)

SEQ ID NO:67 polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca (VH) 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) SEQ ID NO:68 polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca (VH) 17N16mc

SEQ ID NO:69: DNK koja kodira varijabilni region lakog lanca (VL) 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)

SEQ ID NO:70: polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca (VL) 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) SEQ ID NO:71: polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca (VL) 17N16_dc17N9

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0040] Predmetni pronalazak obezbeđuje inhibitorni agens za MASP-2 za upotrebu u lečenju ili prevenciji trombotične mikroangiopatije (TMA) koja nastaje sekundarno u odnosu na transplantaciju, pri čemu je transplantat tipa alogenog transplantata hematopoetskih matičnih ćelija, i pri čemu se terapijski efektivna količina inhibitornog agensa za MASP-2 u farmaceutskom nosaču primenjuje subjektu koji boluje od ili je sa rizikom da razvije TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na transplantaciju, pri čemu je inhibitorni agens za MASP-2 monoklonsko anti-MASP-2 antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za deo SEQ ID NO:6 i selektivno inhibira aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2, gde anti-MASP-2 monoklonsko antitelo ili njegov fragment sadrži varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID NO:70.

I. DEFINICIJE

[0041] Ukoliko nije posebno definisano, svi termini koji su ovde upotrebljavani su sa istim značenjem koje se i uobičajeno podrazumeva od strane prosečno iskusnog stručnjaka iz oblasti tehnike koja je ovde opisana. Definicije koje slede su opisane da bi se obezbedila jasnoća u pogledu termina, imajući u vidu da su oni upotrebljeni u specifikaciji i patentnim zahtevima za opis predmetnog pronalaska.

[0042] Kao što se ovde upotrebljava, termin "aktivacija komplementa zavisna od MASP-2" obuhvata aktivaciju lektinskog puta zavisnu od MASP-2, koja se odvija pod fiziološkim uslovima (tj. u prisustvu

2

Ca<++>) i koja vodi obrazovanju C3 konvertaze lektinskog puta kao C4b2a, a po nakupljan proizvoda cepanja C3, C3b, odmah i obrazovanju konvertaze C5 konvertaze tipa C4b2a(C3b)n, za koju je utvrđeno da prvenstveno prouzrokuje opsonizaciju.

[0043] Kao što se ovde upotrebljava, termin „alternativan put“ se odnosi na aktivaciju komplementa koja se pokreće, na primer, zimosanom iz ćelijskih zidova gljiva i kvasaca, lipopolisaharidom (LPS-om) iz Gram negativnih spoljnih membrana i zečjim eritrocitima, kao i sa mnogim čistim polisaharidima, zečjim eritrocitima, virusima, bakterijama, životinjskim tumorskim ćelijama, parazitima i oštećenim ćelijama, a za koji se uobičajeno smatralo da proizilazi iz spontanog proteolitičkog generisanja C3b iz komplementnog faktora C3.

[0044] Kao što se ovde upotrebljava, termin "lektinski put" se odnosi na aktivaciju komplementa koja se odvija putem specifičnog vezivanja serumskih i ne-serumskih proteina koji se vezuju za ugljene hidrate, uključujući lektin koji vezuje manan (MBL), CL-11 i fikoline (H-fikolin, M-fikolin ili L-fikolin).

[0045] Kao što se ovde upotrebljava, termin "klasičan put" se odnosi na aktivaciju komplementa koja se pokreće antitelom vezanim za stranu česticu i koja zahteva vezivanje molekula prepoznavanja, C1q.

[0046] Kao što se ovde upotrebljava, termin „inhibitorni agens za MASP-2“ se odnosi na bilo koji agens koji se vezuje za, ili direktno interaguje sa MASP-2 i koji efektivno inhibira aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2, uključujući anti-MASP-2 antitela i njegove fragmente koji vezuju MASP-2, prirodne i sintetske peptide, male molekule, solubilne MASP-2 receptore, ekspresione inhibitore i izolovane prirodne inhibitore, pri čemu dodatno obuhvata i peptide koji mogu biti u kompeticiji sa MASP-2 u vezivanju za drugi molekul prepoznavanja (npr. MBL, H-fikolin, M -ficolin ili L-fikolin) u lektinskom putu, ali ne obuhvata antitela koja se vezuju za takve druge molekule prepoznavanja. Inhibitorni agensi za MASP-2 od koristi u postupku koji je ovde opisan, mogu smanjiti aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2 za više od 20%, kao što je više od 50%, kao što je više od 90%. U jednom slučaju, inhibitorni agens za MASP-2 smanjuje aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2 za više od 90% (tj. rezultuje u aktivaciji komplementa sa MASP-2 od samo 10% ili manje).

[0047] Kao što se ovde upotrebljava, termin "antitelo" obuhvata antitela i njihove fragmente antitela, izvedene iz bilo kog sisara koji proizvodi antitela (npr. miša, pacova, zeca i primata uključujući čoveka), ili iz hibridoma, selekcijom faga, rekombinantnom ekspresijom ili u transgenim životinjama (ili drugim postupcima za proizvodnju antitela ili fragmenata antitela"), koji se specifično vezuju za ciljni polipeptid, kao što su, na primer, MASP-2, polipeptidi ili njihovi delovi. Nije predviđeno da termin "antitelo" bude ograničavajući u pogledu izvora antitela ili načina na koji je napravljeno (npr. hibridomom, selekcijom faga, rekombinantnom ekspresijom, transgenom životinjom, peptidnom sintezom itd). Antitela za primer obuhvataju poliklonska, monoklonska i rekombinantna antitela; panspecifična, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela, trispecifična antitela); humanizovana antitela; mišja antitela; himerna, poput mišje-humanih, mišje-primatnih, primatno-humanih monoklonska antitela; kao i anti-idiotipska antitela, pri čemu to mogu biti intaktna antitela ili njihovi fragmenti. Kao što se ovde upotrebljava, termin "antitelo" obuhvata ne samo intaktna poliklonska ili monoklonska antitela, već i njegove fragmente (kao što su dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jedno-lančana antitela (ScFv), njihove sintetske varijante, varijante koje se javljaju u prirodi, fuzione proteine koji sadrže deo antitela sa fragmentom koji vezuje antigen tražene specifičnosti, humanizovana antitela, himerna antitela, kao i bilo koje druge modifikovane konfiguracije imunoglobulinskog molekula koji sadrže mesto ili fragment koji se vezuje antigen (mesto prepoznavanja epitopa) tražene specifičnosti.

[0048] "Monoklonsko antitelo" se odnosi na homogenu populaciju antitela gde je monoklonsko antitelo sačinjeno od aminokiselina (koje se javljaju u prirodi i koje se ne javljaju u prirodi) uključenih u selektivno vezivanje epitopa. Monoklonska antitela su visoko specifična za ciljni antigen. Termin "monoklonsko antitelo" obuhvata ne samo intaktna monoklonska antitela i monoklonska antitela pune dužine, već i njihove fragmente (kao što su Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednolančana antitela (ScFv), njihove varijante, fuzione proteine koji sadrže deo koji vezuje antigen, humanizovana monoklonska antitela, himerna monoklonska antitela i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju imunoglobulinskog molekula koja sadrži fragment koji vezuje antigen (mesto prepoznavanja epitopa) tražene specifičnosti i sposobnosti da se veže za epitop. Nije predviđeno da bude ograničavajući u pogledu izvora antitela ili načina na koji je ono napravljeno (npr. hibridomom, selekcijom faga, rekombinantnom ekspresijom, transgenom životinjom, itd.). Termin zapravo obuhvata celokupne imunoglobuline kao i fragmente itd. koji su prethodno opisani pod definicijom "antitelo".

[0049] Kao što se ovde upotrebljava, termin "fragment antitela" se odnosi na deo izveden iz ili koji je srodan sa antitelom pune dužine, kao što je, na primer, anti-MASP-2 antitelo, pri čemu u principu uključuje region vezivanja antigena ili njegov varijabilni region. Ilustrativni primeri fragmenata antitela obuhvataju Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2i Fv fragmente, scFv fragmente, dimerna antitela, linearna antitela, jednolančane molekuli antitela i multispecifična antitela obrazovana od fragmenata antitela.

[0050] Kao što se ovde upotrebljava, "jednolančani Fv" ili "scFv" fragment antitela saddrži VHi VLdomene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u vidu jednog polipeptidnog lanca. U principu, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena, koji omogućava da scFv obrazuje željenu strukturu za vezivanje antigena.

[0051] Kao što se ovde upotrebljava, „himerno antitelo“ je rekombinantan protein koji sadrži varijabilne domene i regione koji određuju komplementarnost izvedene iz antitela vrsta različitih od čoveka (npr. glodara), dok je ostatak molekula antitela izveden iz humanog antitela.

[0052] Kao što se ovde upotrebljava, "humanizovano antitelo" je himerno antitelo koje sadrži minimalnu sekvencu koja je prilagođena specifičnom regionu koji određuje komplementarnost

2

izvedenom iz imunoglobulina različitog od humanog, a koji je transplantiran u uokvirujući region humanog antitela. Humanizovana antitela su obično rekombinantni proteini u kojima su samo regioni koji određuje komplementarnost porekla različitog od humanog.

[0053] Kao što se ovde upotrebljava, termin "lektin koji vezuje manan" ("MBL") je ekvivalentan proteinu koji vezuje manan ("MBP").

[0054] Kao što se ovde upotrebljava, "terminalni litički kompleks" ("MAC" od engl. membrane attack complex) odnosi se na kompleks pet terminalnih komponenti sistema komplementa (C5b u kombinaciji sa C6, C7, C8 i C-9) koji se umeće u i remeti membrane (označen i kao C5b-9).

[0055] Kao što se ovde upotrebljava, "subjekat" obuhvata sve sisare, uključujući, bez ograničavanja samo na, ljude, primate različite od čoveka, pse, mačke, konje, ovce, koze, krave, zečeve, svinje i glodare.

[0056] Kao što se ovde upotrebljava, aminokiselinski ostaci su obeleženi skraćenicama na sledeći načini: alanin (Ala;A), asparagin (Asn;N), asparaginska kiselina (Asp;D), arginin (Arg;R), cistein (Cis;C), glutaminski kiselina (Glu;E), glutamin (Gln;Q), glicin (Gly;G), histidin (His;H), izoleucin (Ile;I), leucin (Leu;L), lizin (Lys;K), metionin (Met;M), fenilalanin (Phe;F), prolin (Pro;P), serin (Ser;S), treonin (Thr;T), triptofan (Trp;W), tirozin (Tyr;Y) i valin (Val;V).

[0057] U najširem smislu, aminokiseline koje se javljaju u prirodi mogu biti podeljene u grupe na osnovu hemijskih karakteristika bočnog lanca respektivnih aminokiselina. Pod "hidrofobnom" aminokiselinom se podrazumeva bilo koja od Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys ili Pro. Pod "hidrofilnom" aminokiselinom se podrazumeva bilo koja od Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg ili His. Ovakvo grupisanje aminokiselina može biti dodatno podrazumevati podelu na potklase na način koji sledi. Pod „nenaelektrisanom hidrofilnom“ aminokiselinom se podrazumeva bilo koja od Ser, Thr, Asn ili Gln. Pod „kiselom“ aminokiselinom se podrazumeva bilo Glu ili Asp. Pod „baznom“ aminokiselinom se podrazumeva bilo koja od Lys, Arg ili His.

[0058] Kao što se ovde upotrebljava, termin "konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ilustrovan supstitucijom među aminokiselinama unutar svake od sledećih grupa: (1) glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin, (2) fenilalanin, tirozin i triptofan, (3) serin i treonin, (4) aspartat i glutamat, (5) glutamin i asparagin i (6) lizin, arginin i histidin.

[0059] Termin "oligonukleotid", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na oligomer ili polimer ribonukleinske kiseline (RNK) ili dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili na njihove mimetike. Ovaj termin takođe pokriva one oligonukleobaze koje su sačinjene od nukleotida, šećera i kovalentnih internukleozidnih (u okosnici) veza koje se javljaju u prirodi, kao i oligonukleotide sa modifikacijama koje se ne javljaju u prirodi.

2

[0060] Kao što se ovde upotrebljava, "epitop" se odnosi na mesto na proteinu (npr. humanom MASP-2 proteinu) koje je vezano antitelom. „Preklapajući epitopi“ podrazumevaju one u kojima je prisutan najmanje jedan (npr. dva, tri, četiri, pet ili šest) zajedničkih aminokiselinskih ostataka, uključujući linearne i nelinearne epitope.

[0061] Kao što se ovde upotrebljava, termini „polipeptid“, „peptid“ i „protein“ se upotrebljavaju naizmenično i označavaju bilo kakav lanac aminokiselina povezanih peptidnom vezom, bez obzira na dužinu ili na post-translacionu modifikaciju. MASP-2 protein koji je ovde opisan može sadržavati ili biti protein divljeg tipa, ili može biti varijatna sa ne više od 50 (npr. ne više od jedne, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset , 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili 50) konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. Konzervativne supstitucije obično uključuju supstitucije unutar sledećih grupa: glicin i alanin; valin, izoleucin i leucin; asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; asparagin, glutamin, serin i treonin; lizin, histidin i arginin; i fenilalanin i tirozin.

[0062] U pojedinim slučajevima, humani MASP-2 protein može biti sa aminokiselinskom sekvencom koja je, ili je više od, 70 (npr.71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100)% identična humanom MASP-2 proteinu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 5.

[0063] U pojedinim slučajevima, peptidni fragmenti mogu biti dugi najmanje 6 (npr. najmanje 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ili 600 ili više) aminokiselinskih ostataka (npr. predstavljati najmanje 6 susednih aminokiselinskih ostataka iz SEQ ID NO: 5). U pojedinim slučajevima, antigeni peptidni fragment humanog MASP-2 proteina je dužine manje od 500 (npr. manje od 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ili 6) aminokiselinskih ostataka (npr. manji je od 500 susednih aminokiselinskih ostataka u bilo kojoj od SEQ ID NO: 5).

[0064] Procenat (%) identičnosti aminokiselinskih sekvenci se definiše kao procenat aminokiselina u sekvenci kandidatu koji je identičan aminokiselinama u referentnoj sekvenci, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ukoliko je to potrebno za postizanje maksimalnog procenta identičnosti sekvenci. Poravnanje u svrhe utvrđivanja procenta identičnosti sekvenci može biti postignuto na razne načine koji su uspostavljeni u oblasti tehnike, na primer, upotrebom javno dostupnog kompjuterskog programa kao što su to BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ili Megalign (DNKSTAR) softveri. Odgovarajući parametri za merenje poravnanja, uključujući bilo koje algoritme koji su potrebni za postizanje

2

maksimalnog poravnanja duž pune dužine sekvenci koje se porede, može biti utvrđen poznatim postupcima.

II. Pregled pronalaska

[0065] Lektini (MBL, M-fikolin, H-fikolin, L-fikolin i CL-11) su specifični molekuli prepoznavanja koji pokreću urođeni sistem komplementa, pri čemu sistem obuhvata lektinski put inicijacije i povezanu petlju pojačavanja terminalnog puta koja zapravo umnožava aktivaciju terminalnih efektorskih molekula sistema komplementa pokrenutU lektinom. C1q je specifičan molekul prepoznavanja koji pokreće stečeni sistem komplementa, pri čemu sistem obuhvata klasičan put inicijacije i povezanu petlju pojačavanja terminalnog puta koja dalje zapravo umnožava aktivaciju terminalnih efektorskih molekula iniciranih sa C1q. Ova dva glavna sistema aktivacije komplementa su ovde označeni kao sistem komplementa zavisan od lektina i sistem komplementa zavisan od C1q, tim redom.

[0066] Pored svoje ključne uloge u imunskoj odbrani, sistem komplementa doprinosi oštećenju tkiva u mnogim kliničkim stanjima. Postoji stoga jaka potreba da se razviju terapijski efektivni inhibitori sistema komplementa da bi se sprečili ovakvi neželjeni efekti. Prepoznavanje činjenice da je moguće inhibirati MASP-2 put posredovan lektinom, a tako da klasičan put ostaje intaktan, dovelo je do spoznaje da bi bilo veoma poželjno da se specifično inhibira samo sistem aktivacije komplementa koji prouzrokuje određenu patologiju, bez popunog isključivanja sposobnosti sistema komplementa za odbranu. Na primer, u bolesnim stanjima u kojima je aktivacija komplementa pretežno posredovana sistemom komplementa koji je zavisan od lektina, prednost može biti da se specifično inhibira samo ovaj sistem. Naime, na ovaj način bi sistem aktivacije komplementa koji zavisi od C1q ostao intaktan i u mogućnosti da procesuira imunske komplekse, čime bi se potpomogla odbrana domaćina od infekcije.

[0067] Poželjna proteinska komponenta kao ciljni molekul u razvoju terapijskih agenasa za specifično inhibiranje sistema komplementa zavisnog od lektina je MASP-2. Od svih poznatih proteinskih komponenti sistema komplementa zavisnog od lektina (MBL-a, H-fikolina, M-fikolina, L-fikolina, MASP-2, C2-C9, Faktora B, Faktora D i Properdina), samo MASP-2 je i istovremeno jedinstven za sistem komplementa zavisan od lektina i potreban je za funkcionisanje sistema. Lektini (MBL, H-fikolin, M-fikolin, L-fikolin i CL-11) su takođe jedinstvene komponente u sistemu komplementa zavisnog od lektina, međutim, gubitak bilo koje od lektinskih komponenti ne bi nužno inhibirao aktivaciju sistema usled njihove preobimne zastupljenosti. Da bi mogla da se postigne garancija u inhibiciji aktivacije sistema komplementa zavisnog od lektina, bilo bi stoga neophodno inhibirati svih pet lektina. Pored toga, pošto je poznato da MBL i fikoline, nezavisno od sistema komplementa, takođe karakteriše opsonska aktivnost, inhibicije ove funkcije bi bio zapravo gubitak ovog korisnog odbrambenog

2

mehanizma domaćina od infekcije. Nasuprot tome, ovakva opsonska aktivnost lektina nezavisna od komplementa bi ostala netaknuta ukoliko je MASP-2 ciljni molekul za inhibiciju. Dodatna prednost MASP-2 kao ciljnog molekula za terapiju inhibicijom aktivacije komplementa zavisne od lektina je i što je koncentracija MASP-2 u plazmi među najnižima u odnosu na bilo koji protein iz sistema komplementa (≈ 500 ng/ml); stoga, odgovarajuće niske koncentracije inhibitora MASP-2 visokog afiniteta bi mogle biti dovoljne za postizanje potpune inhibicije (Moller-Kristensen M. i saradnici, J. Immunol Methods 282:159-167, 2003).

III. ULOGA MASP-2 U TROMBOTIČNIM MIKROANGIOPATIJAMA I TERAPIJSKI POSTUPCI U KOJIMA SE UPOTREBLJAVAJU INHIBITORNI AGENSI ZA MASP-2

Pregled

[0068] Trombotična mikroangiopatija (TMA) je patologija koju karakterišu krvni ugrušci u malim krvnim sudovima (Benz K. i saradnici, Curr Opin Nephrol Hypertens 19(3):242-7 (2010)). Veruje se da su stres ili povreda osnovnog vaskularnog endotela glavni pokretač. Klinički i laboratorijski nalazi TMA obuhvataju trombocitopeniju, anemiju, purpuru i bubrežnu insuficijenciju. Klasična TMA su hemolitički uremijski sindrom (HUS) i trombotična trombocitopenijska purpura (TTP). Karakteristično osnovno patološko obeležje TMA je aktivacija trombocita i obrazovanje mikrotrombova u malim arteriolama i venulama, ali je ukazano i na ulogu aktivacije komplementa pokrenute, barem delom, povredom ili stresom na mikrovaskularnom endotelu, u drugim TMA, uključujući katastrofalni antifosfolipidni sindrom (CAPS), sistemsku Degosovu bolest i TMA nastala sekundarno u odnosu na kancer, hemoterapiju i transplantaciju.

[0069] Direktni dokazi o patološkoj ulozi komplementa u mnoštvu nefritida su opisani u studijama na pacijentima sa genetičkim deficijencijama u specifičnim komponentama sistema komplementa. Brojni izveštaji su dokumentovali povezanost povrede bubrega sa deficijencijom u regulatornom faktoru H sistema komplementa (Ault B.H. Nephrol.14:1045-1053, 2000; Levy M. i saradnici, Kidney Int.30:949-56, 1986; Pickering M.C. i saradnici, Nat. Genet.31:424-8, 2002). Rezultat deficijencije u faktoru H su niski nivoi faktora B i C3 u plazmi usled potrošnje ovih komponenti povezane sa aktivacijom. Nivoi C5b-9 u cirkulaciji su takođe povišeni u serumu ovih pacijenata, što ukazuje na aktivaciju komplementa. Membranoproliferativni glomerulonefritis (MPGN) i idiopatski hemolitičko uremijski sindrom (HUS) su povezani sa deficijencijom faktora H ili sa mutacijama faktora H. Svinje sa deficijencijom faktora H (Jansen J.H. i saradnici, Kidney Int.53:331-49, 1998) i knockout miševi za faktor H (Pickering M.C.2002) pokazuju simptome slične MPGN, što potvrđuje značaj faktora H u regulaciji komplementa. Deficijencije ostalih komponenti sistema komplementa su povezani sa oboljenjem bubrega koje

2

nastaje sekundarno po razvijanju sistemskog eritematoznog lupusa (SLE) (Walport M.J. Davies i saradnici, Ann. N.Y. Acad. Sci.815:267-81, 1997). Deficijencija C1q, C4 i C2 snažno predisponira razvoj SLE putem mehanizama koji se odnose na defekt klirensa imunih kompleksa i apoptotskog materijala. Kod mnogih od ovih bolesnika sa SLE se javlja lupusni nefritis, koga karakteriše deponovanje imunskih kompleksa širom glomerula.

aHUS

[0070] Atipičan hemolitički uremijski sindrom (aHUS) je deo grupe stanja označenih kao „Trombotične mikroangiopatije“. U atipičnom obliku HUS (aHUS), oboljenje je udruženo sa defektnom regulacijom sistema komplementa i može biti sporadično ili familijarno. Familijarni slučajevi aHUS su povezani sa mutacijama u genima koji kodiraju proteine uključene u aktivaciju komplementa ili regulatorne proteine komplementa, uključujući komplementni faktor H, faktor I, faktor B, membranski kofaktor CD46, kao i protein povezan sa komplementnim faktorom H tipa 1 (CFHR1) i protein povezan sa komplementnim faktorom H tipa 3 (CFHR3). (Zipfel P.F. i saradnici, PloS Genetics 3(3):e41 (2007)). Objedinjujuća karakteristika ovog raznolikog niza genetičkih mutacija povezanih sa aHUS je predispozicija na pojačanu aktivaciju komplementa na ćelijskim ili tkivnim površinama. Prema tome, jedan slučaj koji je ovde opisan obuhvata lečenje pacijenta koji boluje od aHUS, a kod koga je to povezano sa deficijencijom u faktoru H, primenom efektivne količine inhibitornog agensa za MASP-2. Sledeći slučaj koji je ovde opisan obuhvata lečenje pacijenta koji boluje od HUS kod koga je stanje povezano sa deficijencijom u faktoru I, faktoru B, membranskom kofaktoru CD46, CFHR1 ili CFHR3, primenom efektivne količine inhibitornog agensa za MASP-2.

[0071] Nedavno je postignut značajan napredak u razumevanju molekulske patofiziologije u osnovi pojačane aktivacije komplementa u aHUS otkrićem da je ista prouzrokovana raznovrsnim setom mutiranih komplementnih faktora. Ovaj mehanizam je najbolje objašenjen za mutacije kod faktora H. Faktor H je zastupljen serumski protein koji sadrži 20 domena sa kratkim konsenzusnim ponovcima (SCR) i koji deluje kao negativan regulator aktivacije komplementa, kako u rastvoru, tako i na površinama ćelija domaćina. Ciljano deluje na aktiviran oblik C3 i, zajedno sa faktorom I i drugim kofaktorima, pospešuje njegovu inaktivaciju, sprečavajući time dalju aktivaciju komplementa. Da bi efektivno kontrolisao aktivaciju sistema komplementa na površinama ćelija domaćina, potrebno je da faktor H stupi u interakciju sa ćelijama domaćina, što je posredovano SCR domenima 16-20. Sve mutacije faktora H opisane do danas koje su povezane sa aHUS, grupisane su u C-terminalnom regionu koji obuhvata (SCR) domene 16-20. Ovakvi mutirani proteini faktora H su u potpunosti funcionalni u kontroli aktivacije C3 u rastvoru, ali nisu u mogućnosti da stupe u interakciju sa površinama ćelija domaćina i posledično ne mogu da kontrolišu aktivaciju C3 na ćelijskim površinama (Exp Med 204(6):1249-56 (2007)). Prema tome, određene mutacije faktora H su povezane sa aHUS pošto mutiran protein faktora H ne uspeva da interaguje sa ćelijskim površinama domaćina i stoga ne nije u stanjud da efektivno negativno moduliše aktivaciju koplementa na ćelijskim površinama domaćina, uključujući mikrovaskularni endotel. Rezultat je da, nakon što se dogodi početna aktivacija C3, naknadna aktivacija komplementa na površinama mikrovaskularnog endotela se nesmanjeno nastavlja kod pacijenata sa mutacijama faktora H. Ovakva nekontrolisana aktivacija komplementa konačno dovodi do progresivnog oštećenja vaskularnog endotela i dalje do naknadne agregacije trombocita i mikrovaskularne koagulacije, kao i do hemolize prouzrokovane jakim stresom cepanja pri prolasku RBC kroz delimično začepljene mikrosudove. Tako, manifestacije aHUS bolesti i klinički i laboratorijski nalazi su direktno povezani sa defektom negativne regulacije komplementa na površini mikrovaskularnog endotela.

[0072] Analogno mutaciji u faktoru H, mutacije tipa gubitka funkcije kod negativnih modulatora sistema komplementa, faktora I i membranskog kofaktorskog proteina (CD46), takođe su povezane sa aHUS. Suprotno je uočeno za faktor B proteina C3, za koji je utvrđeno da je u aHUS povezan sa mutacijom tipa dobitka funkcija u ovim proteinima (Pediatr Nephrol 25(12):2431-42 (2010)). Prema tome, mnoštvo konvergentnih podataka ukazuje na aktivaciju komplementa u patogenezi aHUS. Ovakvo zapaženj je najuverljivije podržano terapijskom efikasnošću ekulizumaba, monoklonskog antitela koje blokira terminalni C5 protein sistema komplementa u lečenju aHUS.

[0073] Iako je centralna uloga sistema komplementa kao efektorskog mehanizma u aHUS široko prihvaćena, pokretači koji iniciraju aktivaciju komplementa i uključeni molekulski putevi nisu razjašnjeni. Ne razviju sve osobe koje su sa prethodno opisanim mutacijama aHUS. U stvari, porodične studije su ukazale da penetranca aHUS samo ∼50% (Ann Hum Genet 74(1):17-26 (2010)). Prirodna istorija bolesti sugeriše da se aHUS najčešće razvija nakon inicijalnog događaja kao što je infektivna epizoda ili neka povreda. Poznato je da infektivni agensi aktiviraju sistem komplementa. U odsustvu prethodno postojećeg adaptivnog imuniteta, aktivacija komplementa infektivnim agensima može prvenstveno biti pokrenuta lektinskim putem. Prema tome, aktivacija lektinskog puta pokrenuta infekcijom može predstavljati inicijalni okidač za naknadno patološko pojačavanje aktivacije komplementa kod osoba sa predispozicijom da razviju aHUS, što na kraju može dovesti do progresije oboljenja. Shodno tome, drugi slučajevi koji su ovde opisani obuhvataju lečenje pacijenta koji boluje od aHUS koji je nastao sekundarno u odnosu na infekciju i to primenom efektivne količine inhibitornog agensa za MASP-2.

[0074] Ostali oblici povrede tkiva domaćina će aktivirati komplement preko lektinskog puta, naročito povreda vaskularnog endotela. Humane vaskularne endotelne ćelije koje se izlože, na primer, oksidativnom stresu, reaguju ekspresijom površinskih grupa koji vezuju lektine i aktiviraju lektinski put

1

komplementa (Am J. Pathol 156 (6):1549-56 (2000)). Vaskularna povreda nakon ishemije/reperfuzije takođe aktivira sistem komplementa posredstvom lektinskog puta in vivo (Scand J Immunol 61(5):426-34 (2005)). Aktivacija lektinskog puta u ovoj postavci je sa patološkim posledicama za domaćina, tako da inhibicija lektinskog puta blokiranjem MASP-2 sprečava dodatnu povredu tkiva domaćina i štetne ishode (Schwaeble PNAS 2011).

[0075] Poznati su tako i drugi procesi koji aktiviraju lektinski put komplementa i tako dovode do razvoja aHUS. Verovatno je stoga da lektinski put može predstavljati inicijalni mehanizam aktivacije komplementa koji je kod osoba sa genetičkom predispozicijom za aHUS neprimereno pojačan na neregulisan način, što započinje patogenezu aHUS. Zaključno se može očekivati da agensi koji blokiraju aktivaciju komplementa posredovanu lektinskim putem, uključujući anti-MASP-2 antitela, sprečavaju progresiju ili smanjuju pogoršanje kod osoba podložnih aHUS.

[0076] Dodatnoj podršci ovog koncepta je doprinela i skorašnja studija u kojoj je S. pneumonia identifikovana kao važan etiološki agens u pedijatrijskim slučajevima aHUS. (Nephrology (Carlton), 17:48-52 (2012); Pediatr Infect Dis J. 30(9):736-9 (2011)). Deluje da je ova posebna etiologija sa nepovoljnom prognozom, značajnim mortalitetom i dugotrajnim morbiditetom. Primetno je i da je kod ovih slučajeva pokazano učešće i infekcija van enteričkog sistema koje su dovele do manifestacija mikroangiopatije, uremije i hemolize bez dokaza o istovremenim mutacijama gena komplementa za koje je poznato da su u osnovi predispoziciju za aHUS. Važno je napomenuti i da je S. pneumonia naročito efektivna u aktivaciji komplementa i to pretežno kroz lektinski put. Prema tome, u slučajevima ne-enteričnog HUS povezanog sa pneumokoknom infekcijom, očekuje se da će manifestacije mikroangiopatije, uremije i hemolize biti prevashodno pokrenute aktivacijom lektinskog puta, kao i da se očekuje da agensi koji blokiraju lektinski put, uključujući anti-MASP-2 antitela, mogu da spreče progresiju aHUS ili smanje ozbiljnost oboljenja kod ovih pacijenata. Shodno navedenom, drugi slučaj koji je ovde opisan obuhvata lečenje pacijenta koji boluje od ne-enteričnog aHUS udruženog sa S. pneumonia infekcijom, primenom efektivne količine inhibitornog agensa za MASP-2.

[0077] U skladu sa prethodnim, u pojedinim slučajevima, u postavci subjekta sa rizikom da razvije bubrežnu insuficijenciju udruženu sa aHUS, opisan je postupak za smanjenje verovatnoće razvoja aHUS ili razvoja bubrežne insuficijencije udružene sa aHUS, koji obuhvata primenu količine inhibitornog agensa za MASP-2 tokom vremenskog perioda koji je efektivan da se poboljša ili spreči bubrežna insuficijencija kod subjekta. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata fazu utvrđivanja da li je subjekat sa rizikom da razvije aHUS pre pojave bilo kakvih simptoma povezanih sa aHUS. U drugim slučajevima, postupak obuhvata utvrđivanje da li je subjekat sa rizikom da razvije aHUS nakon pojave najmanje jednog ili više od simptoma koji ukazuju na aHUS (npr. prisustvo anemije, trombocitopenije i/ili bubrežne insuficijencije) i/ili da li je u biopsiji dobijenoj od subjekta prisutna

2

trombotična mikroangiopatija. Utvrđivanje da li je subjekat sa rizikom da razvije aHUS obuhvata utvrđivanje da li subjekat ima genetičku predispoziciju za razvoj aHUS, što se može izvesti prikupljanjem genetičkih informacija (npr. iz baze podataka koja sadrži genotip subjekta) ili izvođenjem najmanje jednog genetičkog skrining testa na subjektu da bi se utvrdilo prisustvo ili odsustvo genetičkog markera povezanog sa aHUS (tj. utvrđivanje prisustva ili odsustva genetičke mutacije udružene sa aHUS u genima koji kodiraju komplementni faktor H (CFH), faktor I (CFI), faktor B (CFB), membranski kofaktor CD46, C3, protein povezan sa komplementnim faktorom H tipa 1 (CFHR1) ili THBD (koji kodira antikoagulantni protein trombodulin) ili protein povezan sa komplementnim faktorom H tipa 3 (CFHR3), ili protein povezan sa komplementnim faktorom H tipa 4 (CFHR4)) bilo sekvenciranjem genoma ili analizom specifičnom za gen (npr. PCR analizom), i/ili određivanjem da li subjekat ima porodičnu istoriju aHUS. Postupci genetičkog skrininga za prisustvo ili odsustvo genetičke mutacije udružene sa aHUS su dobro uspostavljeni, na primer, pogledati Noris M i saradnici, "Atypical Hemolytic-Uremic Syndrome," 16. novembar 2007. godine [Ažurirano 10. marta 2011. godine]. U: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR i saradnici, ur. GeneReviews™, Seattle (WA): University of Washington, Seattle.

[0078] Na primer, ukupna penetracija oboljenja kod onih sa mutacijama u komplementnom faktoru H (CFH) je 48%, penetracija za mutacije u CD46 je 53%, za mutacije u CFI je 50%, za mutacije u C3 je 56%, dok je za mutacije u THBD je 64% (Caprioli J. i saradnici, Blood, 108:1267-79 (2006); Noris i saradnici, Clin J Am Soc Nephrol 5:1844-59 (2010)). Kao što je opisano u Caprioli i saradnici (2006), navedenom iznad, značajan broj osoba sa mutacijom u faktoru H komplementa (CFH) nikada ne razvija aHUS, tako da je postavljena hipoteza da je suboptimalna aktivnost CFH kod ovih osoba dovoljna da zaštiti domaćina od efekata aktivacije komplementa u fiziološkim uslovima, međutim, suboptimalna aktivnost CFH nije dovoljna da spreči C3b da bude deponovan na vaskularnim endotelnim ćelijama prilikom izlaganje agensu koji aktivira komplement proizvodnjom količine C3b koja je veća od normalne.

[0079] Shodno navedenom, u jednom slučaju, opisan je postupak za inhibiranje aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 kod subjekta koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije atipičan hemolitičko uremijski sindrom koji nije zavisan od Faktora H, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog agensa za MASP-2 koja je efektivna u inhibiciji aktivacije komplementa zavisne od MASP-2. U drugom slučaju, opisan je postupak za inhibiranje aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 kod subjekta sa rizikom da razvije atipičan hemolitičko uremijski sindrom koji je zavisan od Faktora H, pri čemu postupak obuhvata periodično praćenje subjekta da bi se utvrdilo prisustvo ili odsustvo anemije, trombocitopenije ili porasta kreatinina i dalje lečenje sa inhibitornim agensom za MASP-2 nakon utvrđivanja prisustva anemije, trombocitopenije ili porasta kreatinina. U sledećem slučaju, opisan je postupak za smanjenje verovatnoće da kod subjekta koji je sa rizikom da razvije aHUS zavisan od faktora H, dodje do kliničkih simptoma povezanih sa aHUS, pri čemu postupak obuhvata primenu inhibitornog agensa za MASP-2 pre, tokom ili nakon događaja za koga je poznato da je udružen sa pokretanjem kliničkih simptoma aHUS, kao što su to, na primer, izlaganje lekovima (npr. hemoterapiji), infekcija (npr. bakterijska infekcija), malignitet, povreda, transplantacija organa ili tkiva ili trudnoća.

[0080] U jednom slučaju, opisan je postupak za smanjenje verovatnoće da će subjekat sa rizikom da razvije aHUS imati kliničke simptome povezane sa aHUS, pri čemu postupak obuhvata periodično praćenje subjekta da bi se utvrdilo prisustvo ili odsustvo anemije, trombocitopenije ili porasta kreatinina, i dalje lečenje sa inhibitornim agensom za MASP-2 nakon što se utrdi da su anemija, trombocitopenija ili porast kreatinina prisutni.

[0081] U sledećem slučaju, opisan je postupak za smanjenje verovatnoće da će subjekat sa rizikom da razvije aHUS iskusiti kliničke simptome povezane sa aHUS, pri čemu postupak obuhvata primenu inhibitornog agensa za MASP-2 pre, tokom ili nakon događaja za koga je poznato da je udružen sa pokretanjem kliničkih simptoma aHUS, kao što su to, na primer, izlaganje lekovima (npr. hemoterapiji), infekcija (npr. bakterijska infekcija), malignitet, povreda, transplantacija organa ili tkiva ili trudnoća.

[0082] U pojedinim slučajevima, inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje tokom vremenskog perioda od najmanje jednog, dva, tri, četiri dana ili duže, pre, tokom ili nakon događaja povezanog sa pokretanjem kliničkih simptoma aHUS, a primena može biti ponovljena ukoliko tako odredi lekar sve dok se stanje ne razreši ili se stavi pod kontrolu. U postavci koja prethodi aHUS, inhibitorni agens za MASP-2 može biti primenjen subjektu sistemski, kao što su to intra-arterijska, intravenska, intramuskularna, inhalaciona, nazalna, supkutana ili druga vrsta parenteralne primene.

[0083] U pojedinim slučajevima, u postavci početne dijagnoze aHUS, ili kod subjekta koji pokazuje jedan ili više simptoma koji se podudaraju sa dijagnozom aHUS (npr. prisustvo anemije, trombocitopenije i/ili bubrežne insuficijencije), subjekat se podvrgava lečenju efektivnom količinom inhibitornog agensa za MASP-2 (npr. anti-MASP-2 antitela) kao prvom linijom terapije u odsustvu plazmafereze, ili u kombinaciji sa plazmaferezom. Kao prva linija terapije, inhibitorni agens za MASP-2 može biti primenjen subjektu sistemski, kao što je to intra-arterijskom, intravenskom, intramuskularnom, inhalacionom, nazalnom, supkutanom ili drugom vrstom parenteralne primene. U pojedinim slučajevima, inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje subjektu kao prva linija terapije u odsustvu plazmaferze da bi se izbegle potencijalne komplikacije plazmaferze, uključujući hemoragiju, infekciju i izloženost poremećajima i/ili alergijama svojstvenim davaocu plazme, ili kod subjekta za koga je plazmafereza na drugi način neodgovarajuća, ili u okruženju u kojem plazmafereza nije dostupna.

4

[0084] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu inhibitornog agensa za MASP-2 subjektu koji boluje od aHUS putem katetera (npr. intravenskog) tokom prvog vremenskog perioda (npr. od najmanje jednog dana do jedne ili dve nedelje), nakon čega sledi supkutana primena inhibitornog agensa za MASP-2 subjektu tokom drugog vremenskog perioda (npr. u vidu hronične faze od najmanje dve nedelje ili duže). U pojedinim slučajevima, primena u prvom i/ili drugom vremenskom periodu se odvija u odsustvu plazmafereze. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata utvrđivanje nivoa najmanje jednog faktora sistema komplementa (npr. C3, C5) kod subjekta pre lečenja, a opciono i tokom lečenja, pri čemu nalaz smanjenog nivoa najmanje jednog faktora sistema komplementa u poređenje sa standardnom vrednošću ili sa zdravim kontrolnim subjektom, ukazuje na potrebu za nastavkom lečenja sa inhibitornim agensom za MASP-2.

[0085] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu inhibitornog agensa za MASP-2, kao što je anti-MASP-2 antitelo, subjektu koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije aHUS, bilo intravenski, intramuskularno, ili poželjno, supkutano. Lečenje može biti hronično i primenjivati se svakodnevno do mesečno, ali je poželjno da to bude primne na svake dve nedelje. Anti-MASP-2 antitelo se može primenjivati samostalno, ili u kombinaciji sa inhibitorom C5, kao što je ekulizamab.

HUS

[0086] Poput atipičnog HUS, tipični oblik HUS karakterišu svi klinički i laboratorijski nalazi za TMA. Tipičan HUS je, međutim, često pedijatrijsko obljenje i obično je bez porodične komponente ili direktne veze sa mutacijama u genima komplementa. Etiologija tipičnog HUS je blisko povezana sa infekcijom određenim crevnim patogenima. Kod pacijenata se obično ispoljavaju akutna bubrežna insuficijencija, hemoglobinurija i trombocitopenija, a koje uobičajeno prate epizodu krvave dijareje. Stanje je prouzrokovano enteričnom infekcijom sa Shigella dissenteria, Salmonella ili sa enterohemoragnim sojevima E. Coli., poput E.Coli O157:H7, a koji proizvode toksin sličan šiga toksinu. Patogeni se unose zagađenom hranom ili putem vodovoda. HUS je hitno medicinsko stanje i sa mortalitetom je od 5-10%. Značajan deo preživelih razvija hroničnu bolest bubrega (Corrigan i Boineau, Pediatr Rev 22 (11):365-9 (2011)) što može zahtevati transplantaciju bubrega.

[0087] Mikrovaskularna koagulacija u tipičnom HUS-u se javlja pretežno, mada ne i isključivo, u bubrežnoj mikrovaskulaturi. Medijator u osnovi patofiziologije je tzv. Šiga toksin (STX). Izlučen od strane enteropatskih mikroba u lumen creva, STX prolazi kroz crevnu barijeru, ulazi u krvotok i vezuje se za vaskularne endotelne ćelije putem blobotriaozil ceramidnog receptora CD77 (Boyd i Lingwood Nephron 51:207 (1989)), koji je prioritetno eksprimiran na glomerularnom endotelu i posreduje u toksičnom efektu STX-a. Jednom vezan za endotel, STX izaziva niz događaja koji oštećuju vaskularni endotel, aktivirajući leukocite i prouzrokujući obrazovanje trombova zavisnog od vWF (Forsyth i saradnici, Lancet 2:411-414 (1989); Zoja i saradnici, Kidney Int.62:846-856 (2002); Zanchi i saradnici, J. Immunol.181:1460-1469 (2008); Morigi i saradnici, Blood 98:1828-1835 (2001); Guessou i saradnici, Infect. Immun. 73:8306-8316 (2005)). Ovi mikrotrombovi dovode do opstrukcija ili začepljenja arteriola i kapilara bubrega i drugih organa. Opstrukcije krvotoka u arteriolama i kapilarima mikrotrombovima povećava silu cepanja kojoj su eritrociti izloženi dok se probijaju kroz sužene krvne sudove. Ovo može dovesti do razaranja eritrocita silom cepanja i time do obrazovanja fragmenata eritrocita koji se nazivaju šistociti. Prisustvo šistocita je karakterističan nalaz u HUS-u. Ovaj mehanizam je poznat kao mikroangiopatska hemoliza. Pored toga, rezultat opstrukcije krvotoka je ishemija, što pokreće inflamatorni odgovor posredovan komplementom koji prouzrokuje dodatnu štetu u pogođenom organu.

[0088] Lektinski put komplementa doprinosi patogenezi HUS preko dva osnovna mehanizma: 1) direktnom aktivacijom kaskade koagulacije prouzrokovane povredom endotela u kojoj posreduje MASP-2 i 2) naknadnom aktivacijom komplementa indukovanom ishemijom koja je rezultat početne okluzije mikrovaskularnog krvotoka i posredovana je lektinom.

[0089] STX oštećuje mikrovaskularne endotelne ćelije, a poznato je da povređene endotelne ćelije aktiviraju sistem komplementa. Kao što je prethodno detaljno objašnjeno, aktivacija komplementa nakon povrede endotelnih ćelija je pretežno vođena lektinskim putem. Humane vaskularne endotelske ćelije izložene oksidativnom stresu reaguju izlaganjem površinskih struktura koje vezuju lektine i aktiviraju lektinski put komplementa (Collard i saradnici, Am J Pathol.156(5):1549-56 (2000)). Vaskularna povreda koja prati ishemiju/reperfuziju takođe aktivira komplement posredstvom lektinskog puta in vivo (Scand J Immunol 61(5):426-34 (2005)). Aktivacija lektinskog puta u oakvoj postaci je sa patološkim posledicama za domaćina, a inhibicija lektinskog puta blokadom MASP-2 sprečava dodatno oštećenje tkiva domaćina i štetne ishode (Schwaeble i saradnici, PNAS (2011)). Pored aktivacije komplementa, pokazano je da je rezultat aktivacije MASP-2 zavisne od lektina, cepanje protrombina da bi se stvorio trombin i pospešila koagulacija. Dakle, aktivacija lektinskog puta komplementa oštećenim endotelnim ćelijama može direktno aktivirati koagulacioni sistem. Lektinski put komplementa, zahvaljujući aktivaciji protombina posredovanoj sa MASP-2, verovatno je stoga dominantan molekulski put koji povezuje početnu povredu endotela STX-om sa koagulacijom i mikrovaskularnom trombozom koja se javlja u HUS-u. Stoga se očekuje da će inhibitori lektinskog puta, uključujći, ali ne ograničavajući se samo na, antitela koja blokiraju funkciju MASP-2, sprečiti ili ublažiti mikrovaskularnu koagulaciju, trombozu i hemolizu kod pacijenata koji boluju od HUS. Zapravo, primena anti-MASP-2 antitela izrazito štiti miševe u modelu tipičnog HUS. Kao što je opisano u Primeru 36 i prikazano na SLICI 45, svi kontrolni miševi koji su bili izloženi STX i LPS-u, razvili su ozbiljan oblik HUS i bili na samrti ili su umrli u roku od 48 sati. S druge strane, kao što je dodatno prikazano na SLICI 45, svi miševi tretirani sa anti-MASP-2 antitelom, a zatim izloženi STX-u i LPS-u, su preživeli (Fisherov egzaktni test p <0,01; N=5). Terapija sa anti-MASP-2 dakle izrazito štiti miševa u ovom modelu HUS. Očekuje se stoga da će primena inhibitornog agensa za MASP-2, kao što je MASP-2 antitelo, biti efektivna u lečenju pacijenata sa HUS i da će obezbediti zaštitu od mikrovaskularne koagulacije, tromboze i hemolize prouzrokovane infekcijom sa enteropatskom E. coli ili sa drugim patogenima koji proizvode STX.

[0090] Iako je ovde prikazana za HUS izazvan sa STX, očekuje se da će anti-MASP-2 terapija biti korisna i za sindrome slične HUS do kojih dolazi usled endotelne povrede izazvane drugim toksičnim agensima. Navedeno obuhvata agense kao što su mitomicin, tiklopidin, cikplatin, kinin, ciklosporin, bleomicin, kao i druge lekove za hemoterapiju i imunosupresive. Očekuje se stoga da će terapija anti-MASP-2 antitelom ili drugi modaliteti koji inhibiraju aktivnost MASP-2 efektivno sprečiti ili ograničiti koagulaciju, obrazovanje tromba i uništavanje eritrocita i tako sprečiti bubrežnu insuficijenciju kod HUS i drugih bolesti povezanih sa TMA (tj. aHUS i TTP).

[0091] Pacijenti koji boluju od HUS često karakteriše pojava dijareje i povraćanja, broj njihovih trombocita je obično smanjen (trombocitopenija), a smanjen je i broj eritrocita (anemija). Faza dijareje pre pojave simpotma HUS obično traje oko četiri dana, tokom kojih subjekti sa rizikom da razviju HUS obično pokazuju jedan ili više sledećih simptoma pored teške dijareje: nivo hematokrita do ispod 30% sa razmazima koji ukazuju na intravaskularno razaranje eritrocita, trombocitopenijau (broj trombocita <150 x 10<3>/mm<3>) i/ili prisustvo poremećene bubrežne funkcije (koncentracija kreatinina u serumu veća od gornje granice referentnog opsega za taj uzrast). Prisustvo oligoanurije (izlaz urina ≤0,5 ml/kg/h tokom >1 dana) može biti upotrebljen kao mera progresije ka razvoju HUS (pogledati C. Hickey i saradnici, Arch Pediatr Adolesc Med 165(10):884-889 (2011)). Analize se obično vrše da bi se utvdilo prisustvo infekcije sa E. coli bakterijom (E.coli O157:H7), ili sa Shigella ili Salmonela vrstama. Kod subjekata sa pozitivnim testom na infekciju enterogenom E. coli (npr. sa E. coli 0157:H7), upotreba antibiotika je kontra-indikovana, pošto upotreba antibiotika može povećati rizik da se razvije HUS kroz povećanu proizvodnju STX-a (pogledati Wong C. i saradnici, N Engl J. Med 342:1930-1936 (2000). Kod subjekata čiji su pozitivni testovi na Shigella ili Salmonela, antibiotici se obično daju radi uklanjanje infekcije. Druga dobro uspostavljena terapija prve-linije za HUS obuhvata povećanje volumena, dijalizu i plazmaferezu.

[0092] U skladu sa prethodnim, u pojedinim slučajevima, u postavci kada subjekat pati od jednog ili više simptoma koji su povezanih sa fazom pre HUS i sa rizikom je da razvije HUS (tj. subjekat ispoljava jedno ili više od sledećeg: dijareju, nivo hematokrita manji od 30% sa dokazima intravaskularnog razaranja eritrocita na razmazu, trombocitopeniju (broj trombocita manji od 150 x 10<3>/mm<3>) i/ili prisustvo oštećene bubrežne funkcije (koncentracija kreatinina u serumu veća od gornje granice referentnog opsega za taj uzrast)), opisan je postupak za smanjenje rizika da se razvije HUS ili za smanjenje verovatnoće bubrežne insuficijencije kod subjekta, koji se sastoji od primene količine inhibitornog agensa za MASP-2 tokom vremenskog perioda koji je efektivan za poboljšanje ili sprečavanje oštećene bubrežne funkcije. U pojedinim slučajevima, inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje tokom vremenskog perioda od najmanje jednog, dva, tri, četiri ili više dana i može biti ponovlje ukoliko to odredi lekar sve dok se stanje ne razreši ili ne stavi pod kontrolu. U postaci kada još nije došlo do razvoja HUS, inhibitorni agens za MASP-2 može biti primenjivan subjektu sistemski, kao što je to intra-arterijska, intravenska, intramuskularna, inhalaciona, nazalna, oralna, supkutana ili druga parenteralna primena.

[0093] Lečenje infekcije sa E. coli 0157:H7 baktericidnim antibiotikom, posebno β-laktamima, povezano je sa povećanim rizikom da se razvije HUS (Smith i saradnici, Pediatr Infect Dis J 31(1):37-41 (2012). U pojedinim slučajevima, u postaci kada subjekta pati od simpoma koji su povezani sa fazom pre pojave HUS, pri čemu je poznato da subjekat ima infekciju enterogenom E. coli za koju je upotreba antibiotika kontraindikovana (npr. E. coli 0157:H7), opisan je postupak za smanjenje rizika da se razvije HUS ili smanjenje verovatnoće bubrežne insuficijencije kod subjekta, koji obuhvata primenu količine inhibitornog agensa za MASP-2 tokom prvog perioda koji je efektivan da inhibira ili spreči prisustva oligoanurije kod subjekta (npr. od najmanje jednog, dva, tri ili četiri dana), pri čemu se primena inhibitornog agensa za MASP-2 tokom prvog vremenskog perioda vrši u odsustvu antibiotika. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata primenu subjektu inhibitornog agensa za MASP-2 u kombinaciji sa antibiotikom tokom drugog vremenskog perioda (kao što je najmanje jedna do dve nedelje).

[0094] U drugim slučajevima, u postavci kada subjekat pati od simptoma povezanih sa fazom pre razvoja HUS, pri čemu se zna da subjekat ima infekciju sa Shigella ili Salmonela, opisan je postupak za smanjenje rizika da se razvije HUS ili da se smanji verovatnoće bubrežne insuficijencije kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata primenu količine inhibitornog agensa za MASP-2 tokom vremenskog perioda koji je efektivan da se inhibira ili spreči prisustvo oligoanurije kod subjekta, pri čemu se inhibitorni agens za MASP-2 primenjuje ili u prisustvu ili u odsustvu odgovarajućeg antibiotika.

[0095] U pojedinim slučajevima, kada je postavka da je postavljena početna dijagnoza HUS ili da se kod subjekta uočavaju jedan ili više simptoma koji su u skladu sa dijagnozom HUS (npr. prisustvo bubrežne insuficijencije ili mikroangiopatska hemolitička anemija u odsustvu niskog nivoa fibrinogena, ili trombocitopenija) subjekat se podvrgava lečenju efektivnom količinom inhibitornog agensa za MASP-2 (npr. anti-MASP-2 antitela) kao prvom linijom terapije u odsustvu plazmafereze, ili u kombinaciji sa plazmaferezom. Kao terapija prve linije, inhibitorni agens za MASP-2 može biti primenjivan subjektu sistemski, putem intra-arterijske, intravenske, intramuskularne, inhalacione, nazalne, supkutane ili druge vrste parenteralne primene. U pojedinim slučajevima, inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje subjektu kao prva linija terapije u odsustvu plazmafereze, a da bi se izbegle komplikacije plazmafereze kao što su krvarenje, infekcija i izloženost poremećajima i/ili alergijama svojstvenim davaocu plazme, ili kada kod subjekta iz bilo kog drugog razloga plamafereza nije odgovarajuća, ili u okruženju plazmafereza samo nije nije dostupna.

[0096] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu inhibitornog agensa za MASP-2 subjektu koji boluje od HUS putem katetera (npr. intravenskog) tokom prvog vremenskog perioda (npr. akutne faze koja traje najmanje jedan dan do jedne ili dve nedelje), što dalje prati supkutana primena subjektu inhibitornog agensa za MASP-2 tokom drugog vremenskog perioda (npr. hronične faze od najmanje dve nedelje ili duže). U pojedinim slučajevima, primena u prvom i/ili drugom vremenskom periodu se izvodi u odsustvu plazmafereze. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata određivanje nivoa najmanje jednog faktora komplementa (npr. C3, C5) kod subjekta pre lečenja, a opciono i tokom lečenja, pri čemu nalaz smanjenog nivoa najmanje jednog faktora komplementa u poređenju sa standardnom vrednošću ili zdravim kontrolnim subjektom ukazuje na potrebu za lečenjem, a nalaz normalnog nivoa ukazuje na poboljšanje.

[0097] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu inhibitornog agensa za MASP-2, kao što je anti-MASP-2 antitelo, subjektu koji boluje od HUS ili je sa rizikom da razvije HUSbilo supkutano ili intravenski. Poželjno je svakodnevno lečenje, ali može biti i ređe, čak nedeljno ili mesečno. Lečenje će se nastaviti tokom najmanje od nedelju dana do čak 3 meseca. Anti-MASP-2 antitelo se može primenjivati samostalno ili u kombinaciji sa inhibitorom C5, kao što je ekulizamab.

TTP:

[0098] Trombotična trombocitopenijska purpura (TTP) je po život opasan poremećaj sistema koagulacije krvi, uzrokovan autoimunim ili naslednim disfunkcijama koje aktiviraju koagulacionu kaskadu ili sistem komplementa (George, JN, N Engl J Med; 354:1927-35 (2006)). Rezultat toga su brojni mikroskopski ugrušci ili tromboze u malim krvnim sudovima po celom telu. Crvene krvne ćelije se podvrgavaju stresu smicanja protoka koji oštećuje njihove membrane, što vodi intravaskularnoj hemolizi. Rezultat su smanjeni protok krvi i povreda endotela koji dovode do oštećenja organa, uključujući mozak, srce i bubrege. TTP klinički karakterišu trombocitopenija, mikroangiopatska hemolitička anemija, neurološke promene, bubrežna insuficijencija i groznica. U eri pre izmene plazme, stopa smrtnosti bila je 90% tokom akutnih epizoda. Čak i sa izmenom plazme, preživljavanje nakon šest meseci je oko 80%.

[0099] TTP može nastati usled genetičke ili stečene inhibicije enzima ADAMTS-13, metaloproteaze koja je odgovorna za cepanje velikih multimera fon Vilebrandovog faktora (vWF) na manje jedinice.

Inhibicija ili deficijencija ADAMTS-13 konačno rezultuje povećanom koagulacijom (Tsai, H. J Am Soc Nephrol 14:1072-1081, (2003)). ADAMTS-13 reguliše aktivnost vWF-a; u njegovom odsustvu, vWF obrazuje velike multimere koji će verovatnije da vežu trombocite i tako predisponirati pacijente za agregaciju trombocita i trombozu u mikrovaskulaturi.

[0100] Upšau-Šulmanov sindrom (USS, takođe opisan kao urođeni TTP) je urođena deficijencija aktivnosti ADAMTS13 usled genske mutacija u ADAMTS13 (Schulman i saradnici, Blood, 16(1):943-57, 1960; Upshaw i saradnici, New Engl. J. Med, 298 (24):1350-2, 1978). Kod osoba sa urođenim TTP su identifikovane brojne mutacije u ADAMTS13 (Kinoshita i saradnici, International Journal of Hematology, 74:101-108 (2001); Levy i saradnici, Nature, 413 (6855):488-494 (2001); Kokame i saradnici, PNAS 99(18):11902-11907 (2002); Savasan i saradnici, Blood, 101:4449-4451 (2003); Matsumoto i saradnici, Blood, 103:1305-1310 (2004) i Fujimura i saradnici, Brit. J. Haemat 144:742-754 (2008)). Subjekti sa USS su obično sa 5-10% od normalne aktivnosti ADAMTS13 (Kokame i saradnici, PNAS 99(18):11902-11907, 2002). Iako stečeni TTP i USS imaju neke sličnosti, USS je sa pojedinim važnim razlikama u kliničkim karakteristikama. USS se obično javlja u ranom detinjstvu ili nešto kasnije i karakteriše ga teška hiperbilirubinemija sa negativnim Coombs testom ubrzo nakon rođenja, kao i odgovor na infuziju sveže plazme i česti relapsi (Savasan i saradnici, Blood, 101:4449-4451, 2003). U pojedinim slučajevima, pacijenti sa ovom naslednom deficijencijom ADAMTS13 imaju blag fenotip pri rođenju i razvijaju simptome povezane sa TTP samo u kliničkim situacijama kada se poveća nivo fon Vilebrandovog faktora, kao što su infekcija ili trudnoća. Na primer, Fujimura i saradnici prijavljuju slučajeve 9 japanskih žena iz 6 porodica sa genetički potvrđenim USS kod kojih je postavljena dijagnoza poremećaja tokom prve trudnoće. Trombocitopenija se javljala tokom drugog do trećeg tromesečja u svakoj od njihovih 15 trudnoća i često je praćena sa TTP. Utvrđeno je da sve ove žene imaju ozbiljan nedostatak aktivnosti ADAMTS13 (Fujimura i saradnici, Brit. J. Haemat 144:742-754, 2008).

[0101] U skladu sa prethodnim, u pojedinim slučajevima, u postavci kada je subjekat sa Upšau-Šulmanovim sindromom (USS) (tj. kad je poznato da je subjekat sa deficijencijom aktivnosti ADAMTS13 i/ili je poznato da subjekat nosi jednu ili više ADAMTS13 genskih mutacija), opisan je postupak za smanjenje verovatnoće razvoja kliničkih simptoma udruženih sa urođenim TTP (npr. trombocitopenijom, anemijom, groznicom i/ili bubrežnom insuficijencijom), pri čemu postupak obuhvata primenu količine inhibitornog agensa za MASP-2 (npr. MASP-2 antitela) tokom vremenskog perioda koji je efektivan za poboljšanje ili sprečavanje jednog ili više od kliničkih simptoma udruženih sa TTP. U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata korak utvrđivanja da li je subjekat sa rizikom da razvije simptome udružene sa urođenim TTP pre pojave bilo kakvih simptoma udruženih sa TTP ili nakon pojave najmanje jednog ili više simptoma koji ukazuju na TTP (npr. prisustvo anemije,

4

trombocitopenije i/ili bubrežne insuficijencije). Utvrđivanje da li je subjekat sa rizikom da razvije simptome udružene sa urođenim TTP (tj. da subjekat ima USS), obuhvata utvrđivanje da li subjekat ima mutaciju u genu koji kodira ADAMTS13 i/ili utvrđivanje da li subjekat ima deficijenciju u aktivnosti ADAMTS13 i/ili utvrđivanje da li subjekat ima porodičnu istoriju USS. Postupci genetičkog skrininga za prisustvo ili odsustvo genetičke mutacije udružene sa USS su dobro uspostavljeni, na primer, pogledati Kinoshita i saradnici, International Journal of Hematology, 74:101-108 (2001); Levy i saradnici, Nature, 413 (6855):488-494 (2001); Kokame i saradnici, PNAS 99(18):11902-11907 (2002); Savasan i saradnici, Blood, 101:4449-4451 (2003); Matsumoto i saradnici, Blood, 103:1305-1310 (2004) i Fujimura i saradnici, Brit. J. Haemat 144:742-754 (2008).

[0102] U jednom slučaju, opisan je postupak za smanjenje verovatnoće da će subjekat kome je dijagnostikovan USS oboleti od kliničkih simptoma udruženih sa TTP, koji obuhvata periodično praćenje subjekta da bi se utvrdilo prisustvo ili odsustvo anemije, trombocitopenije ili porasta kreatinina, i lečenje inhibitornim agensom za MASP-2 (npr. MASP-2 antitelom) nakon utvrđivanja prisustva anemije, trombocitopenije ili porasta kreatinina, ili nakon prisustva događaja za koji je poznato da je udružen sa pokretanjem kliničkih simptoma TTP, kao što su, na primer, izloženost leku (npr. hemoterapiji), infekcija (npr. bakterijska infekcija), malignitet, povreda, transplantacija ili trudnoća.

[0103] U drugom slučaju, opisan je postupak za lečenje subjekta koji ima USS i boluje od kliničkih simptoma udruženih sa TTP, pri čemu postupak obuhvata primenu količine inhibitornog agensa za MASP-2 (npr. MASP-2 antitela) tokom vremenskog perioda koji je efektivan u ublažavanju ili sprečavanju jednog ili više od kliničkih simptoma udruženih sa TTP.

[0104] TTP se takođe može razviti usled pojave auto-antitela na ADAMTS-13. Pored toga, TTP se može razviti tokom pojave kancera dojke, gastrointestinalnog trakta ili prostate (George JN. Onkology (Williston Park).25:908-14 (2011)), trudnoće (drugo tromesečje ili nakon porođaja), George JN. Curr Opin Hematol 10:339-344 (2003)), ili je udružen sa oboljenjim kao što su to HIV ili autoimune bolesti poput sistemskog eritematoznog lupusa (Hamasaki K i saradnici, Clin Rheumatol, 22:355-8 (2003)). TTP takođe može biti prouzrokovan određenim terapijama lekovima, uključujući heparin, kinin, sastojak imunomedijatora, hemoterapijska sredstva za kancer (bleomicin, cisplatin, citozin arabinozid, daunomicin gemcitabin, mitomicin C i tamoksifen), ciklosporin A, oralne kontraceptive, penicilin, rifampin i anti-trombocitne lekove, uključujući tiklopidin i klopidogrel (Azarm T. i saradnici, J Res Med Sci.16:353-357 (2011)). Ostali faktori ili stanja udruženi sa TTP su toksini kao što su to venomi pčele, toksini sepsa, sekvestracije slezine, transplantacije, vaskulitis, vaskularna hirurgija i infekcija poput onih sa Streptococcus pneumonia i citomegalovirusom (Moake JL. N Engl J Med.347:589-600 (2002)).

TTP usled privremene funkcionalne deficijencije u ADAMTS-13, može nastati kao posledica povrede endotelnih ćelija koja je udružena sa S. pneumonia infekcijom (Pediatr Nephrol.26:631-5 (2011)).

[0105] Izmena plazme je standardni tretman za TTP (Rock GA i saradnici, N Engl J Med 325:393-397 (1991)). Izmena plazme zamenjuje aktivnost ADAMTS-13 kod pacijenata sa genetičkim defektima i uklanja ADAMTS-13 autoanti-tela kod onih pacijenata koji su stekli autoimunu TTP (Tsai H-M, Hematol Oncol Clin North Am.21(4):609-v (2007)). Dodatni agensi kao što su imunosupresivni lekovi, rutinski se dodaju u terapiju (George, JN, N Engl J Med, 354:1927-35 (2006)). Ipak, razmena plazme nije uspešna kod oko 20% pacijenata, a recidiv se javlja kod više od trećine pacijenata, dok je sama plazmafereza i skupa i tehnički zahtevna. Štaviše, mnogi pacijenti nisu u stanju da podnesu izmenu plazme. Posledično, ostaje suštinska potreba za dodatnim i boljim tretmanima za TTP.

[0106] Imajući u vidu da je TTP poremećaj koagulacione kaskade krvi, lečenje antagonistima sistema komplementa može pomoći u stabilizaciji i korigovanju oboljenja. Iako je patološka aktivacija alternativnog puta komplementa povezana sa aHUS, uloga aktivacije komplementa u TTP je manje jasna. Funkcionalna deficijencija ADAMTS13 je važna za podložnost TTP, međutim, nije i dovoljna da se prouzrokuju akutne epizode. Sredinski faktori i/ili druge genetičke varijacije mogu doprineti ispoljavanju TTP-a. Na primer, geni koji kodiraju proteine uključene u regulaciju kaskade koagulacije, vWF, funkciju trombocita, komponente površine endotelnih sudova ili sistem komplementa mogu biti uključeni u razvoj akutne trombotične mikroangiopatije (Galbusera, M. i saradnici, Haematologica, 94: 166-170 (2009)). Preciznije, pozano je da aktivacija komplementa ima ključnu ulogu; pokazalo se da serum iz trombotične mikroangiopatije udružene sa deficijencijom ADAMTS-13 prouzrokuje deponovanje C3 i MAC i posledično, aktivaciju neutrofila što bi moglo da se ukine inaktivacijom komplementa (Ruiz-Torres MP i saradnici, Thromb Haemost, 93:443-52 (2005)). Ddatno, nedavno je pokazano da tokom akutnih epizoda TTP dolazi do povišenja nivoa C4d, C3bBbP i C3a (M. Reti i saradnici, J Thromb Haemost. 28. februara (2012) doi: 10.1111/j.1538-7836.2012.04674.x.

[elektronski publikovano pre štampanja]), što je u skladu sa aktivacijom klasičnog/lektinskog i alternativnog puta. Ova povišena količina aktivacije komplementa u akutnim epizodama može inicirati aktivaciju terminalnog puta aktivacije i biti tako odgovorna za dodatno pogoršanje TTP.

[0107] Uloga ADAMTS-13 i vWF u TTP-u je očigledno odgovorna za aktivaciju i agregaciju trombocita i njihovu kasniju ulogu u stresu smicanja i taloženju u mikroangiopatijama. Aktivirani trombociti interaguju sa i pokreću i klasični i alternativni put komplementa. Trombocitima posredovana aktivacija komplementa povećava inflamatorne medijatore C3a i C5a (Peerschke E i saradnici, Mol Immunol, 47:2170-5 (2010)). Trombociti tako mogu poslužiti kao ciljni molekuli za klasičnu aktivaciju komplementa kod nasledne ili autoimune TTP.

[0108] Kao što je prethodno opisano, lektinski put komplementa, zahvaljujući aktivaciji protombina posredovanoj sa MASP-2, predstavlja dominantan molekulski put koji povezuje endotelnu povredu sa koagulacijom i mikrovaskularnom trombozom koje se javlja u HUS. Slično tome, aktivacija lektinskog puta komplementa može direktno pokretati sistem koagulacije u TTP. Aktivacija lektinskog puta može biti započeta kao odgovor na početnu povredu endotela prouzrokovanu deficijencijom ADAMTS-13 u TTP. Očekuje se stoga da će inhibitori lektinskog puta, uključujući, ali ne ograničavajući se samo na, antitela koja blokiraju funkciju MASP-2, ublažiti mikroangiopatije udružene sa mikrovaskularnom koagulacijom, trombozom i hemolizom kod pacijenata koji boluju od TTP.

[0109] Pacijenti koji boluju od TTP-a obično se nađu u hitnoj pomoći sa jednim ili više od sledećeg: purpurom, bubrežnom insuficijencijom, niskim nivoom trombocita, anemijom i/ili trombozom, uključujući moždani udar. Trenutni standard nege za TTP uključuje primenu putem katetera (npr. intravenskog ili drugog oblika katetera) zamenske plazmafereze tokom perioda od dve nedelje ili duže, obično tri puta nedeljno, ali i do jednog puta svakog dana. Ukoliko je subjekat pozitivan na prisustvo inhibitora ADAMTS13 (tj. endogeno antitelo na ADAMTS13), tada se plazmafereza može sprovoditi u kombinaciji sa imunosupresivnom terapijom (npr. sa kortikosteroidima, rituksanom ili ciklosporinom). Subjekti sa refraktornom TTP (približno 20% pacijenata sa TTP) ne reaguju bez najmanje dve nedelje terapije plazmaferezom.

[0110] U skladu sa prethodnim, u jednom slučaju, u postavci kada je tek postavljena dijagnoza TTP-a ili subjekat ispoljava jedan ili više simptoma shodno dijagnostičkim kriterijumima za TTP (npr. zahvaćenost centralnog nervnog sistema, teška trombocitopenija (broj trombocita manji ili jednak 5000/µL ukoliko se ne primenjuje aspirin, a manji ili jednak 20.000/µL ukoliko se primenjuje aspirin), ozbiljna zahvaćenost srca, ozbiljna zahvaćenost plućna, gastrointestinalni infarkt ili gangrena), opisan je postupak za lečenje subjekta efektivnom količinom inhibitornog agensa za MASP-2 (npr. anti-MASP-2 antitelom) kao prvom linijom terapije u odsustvu plazmafereze ili u kombinaciji sa plazmaferezom. Kao terapija prve linije, inhibitorni agens za MASP-2 može biti primenjivan subjektu sistemski, na primer, intra-arterijskom, intravenskom, intramuskularnom, inhalacionom, nazalnom, supkutanom ili drugom vrstom parenteralne primene. U pojedinim slučajevima, inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje subjektu kao terapija prve linije u odsustvu plazmafereze da bi se izbegle potencijalne komplikacije plazmafereze, kao što su krvarenja, infekcije i izloženost poremećajima i/ili alergijama svojstvenim davaocu plazme, ili kod primene subjektu kome je plazmafereza na neki drugi način neodgovarajuća, ili kada u okruženju plazmafereza nije dostupna. U pojedinim slučajevima, inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje subjektu koji boluje od TTP u kombinaciji (uključujući istovremenu primenu) sa imunosupresivnim agensom (npr. sa kortikosteroidima, rituksanom ili ciklosporinom) i/ili u kombinaciji sa koncentrovanim ADAMTS-13.

4

[0111] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu inhibitornog agensa za MASP-2 subjektu koji boluje od TTP putem katetera (npr. intravenskog) tokom prvog vremenskog perioda (npr. akutne faze koja traje najmanje jedan dan do jedne ili dve nedelje) nakon čega sledi primena inhibitornog agensa za MASP-2 subjektu supkutano tokom drugog vremenskog perioda (npr. hronične faze od najmanje dve nedelje ili duže). U pojedinim slučajevima, primena u prvom i/ili drugom vremenskom periodu se odvija u odsustvu plazmafereze. U pojedinim slučajevima, postupak se upotrebljava za održavanje subjekta, odnosno da bi se kod subjekta sprečilo da razvije jedan ili više od simptoma udruženih sa TTP.

[0112] U drugom slučaju, opisan je postupak za lečenje subjekta koji boluje od refraktorne TTP (tj. subjekta koji nije reagovao na najmanje dve nedelje terapije plazmaforezom), primenom količine MASP-2 inhibitora koja je efektivna u ublažavanju jednog ili više od simptoma TTP. U jednom slučaju, MASP-2 inhibitor (npr. anti-MASP-2 antitelo) se primenjuje subjektu sa refraktornom TTP na hroničnoj osnovi, tokom vremenskog perioda od najmanje dve nedelje ili duže, supkutanim ili drugim parenteralnom načinom primene. Primena može biti ponovljena ukoliko to odredi lekar sve doke se stanje ne razreši ili ne uspostavi kontrola oboljenja.

[0113] U pojedinim slučajevima, postupak dodatno obuhvata utvrđivanje nivoa najmanje jednog faktora komplementa (npr. C3, C5) kod subjekta pre lečenja, a opciono i tokom lečenja, pri čemu nalaz smanjenog nivoa najmanje jednog faktora komplementa u poređenju sa standardnom vrednošću ili sa zdravim kontrolnim subjektom ukazuje na potrebu za nastavkom lečenja inhibitornim agensom za MASP-2.

[0114] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu inhibitornog agensa za MASP-2, kao što je anti-MASP-2 antitelo, subjektu koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije TTP, bilo supkutano ili intravenski. Poželjno je da lečenje bude svakodnevno, ali može da bude i sa malom učeštalošću, npr. na dve nedelje. Lečenje se nastavlja sve dok broj trombocita subjekta ne bude veći od 150000/ml tokom najmanje dva uzastopna dana. Anti-MASP-2 antitelo može biti primenjivano samostalno ili u kombinaciji sa inhibitorom C5, kao što je ekulizamab.

[0115] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo ispoljava najmanje jednu ili više od sledećih karakteristika: navedeno antitelo vezuje humani MASP-2 sa KD.od 10 nM ili manje, navedeno antitelo vezuje epitop u CCP1 domenu MASP-2, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u in vitro analizi sa 1% humanim serumom uz IC50od 10 nM ili manje, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u 90% humanim serumom sa IC50od 30 nM ili manje, pri čemu je antitelo fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, Fab', F(ab)2i F(ab')2, pri čemu je antitelo jednolančani molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG2 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG1 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG4 molekul, gde IgG4 molekul sadrži mutaciju tipa S228P i/ili pri čemu pri čeu antitelo ne inhibira značajno klasičan put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put, a ne inhibira značajno alternativni put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i ne inhibira značajno klasičan put ili alternativni put (tj. inhibira lektinski put, dok klasičan i alternativan put komplementa ostaju intaktni).

[0116] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od TTP za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje od 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od TTP na nivou koji je za najmanje 20 procenata ili više, (kao što je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%) više u odnosu na inhibitorni efekat na deponovanje C5b-9 u serumu.

[0117] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu TTP pacijenta za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom.

[0118] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo se primenjuje subjektu putem intravenskog katetera ili drugog načina isporuke kateterom.

[0119] U jednom slučaju, ovde je opisan postupak za inhibiranje obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od TTP, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu MASP-2 inhibitornog antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, i pri čemu antitelo sadrži (I) (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 iz SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70, ili (II) njegovu varijantu koja sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 90% identičan sa SEQ ID NO :67 (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:67) i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 90% identičan (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:70.

[0120] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog antitela za MASP-2, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni

4

region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO: 67. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog antitela za MASP-2, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO: 70.

[0121] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži MASP-2 inhibitorno antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji specifično prepoznaju najmanje deo epitopa na humanom MASP-2 koga prepoznaje i referentno antitelo, OMS646, koje sadrži varijabilni region teškog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:70.

Degosova bolest

[0122] Degosova bolest, poznata i kao maligna atrofična papuloza, vrlo je retka TMA koja pogađa endotel malih sudova kože, gastrointestinalnog trakta i CNS-a. Ova vaskulopatija prouzrokuje začepljenje venula i artiola, što rezultuje lezijama kože, ishemijom creva i poremećajima CNS-a, uključujući moždane udare, epilepsiju i kognitivne poremećaje. U koži, nekroza vezivnog tkiva je posledica trombotične okluzije malih arterija. Ipak, uzrok Degosove bolesti je nepoznat. Ukazano je na učešće vaskulitisa, koagulopatije ili primarne disfunkcije endotelnih ćelija. Preživljavanje kod Degosove bolesti je 50% tokom samo dve do tri godine. Ne postoji efektivan tretman Degosove bolesti, iako se antitrombocitni lekovi, antikoagulansi i imunosupresivi koriste za ublažavanje simptoma.

[0123] Iako je mehanizam Degosove bolesti nepoznat, put komplementa je umešan. Margo i saradnici, identifikovali su značajne naslage C5b-9 u koži, gastrointestinalnom traktu i sudovima mozga kod četiri terminalna pacijenta sa Degosovom bolešću (Margo i saradnici, Am J Clin Pathol 135 (4):599-610, 2011). Eksperimentalno lečenje ekulizumabom je u početku bilo efektivno u lečenju kožnih i crevnih lezija, ali nije sprečio napredovanje sistemskog oboljenja (pogledati Garrett-Bakelman F. i saradnici, "C5b-9 is a potential effector in the pathophysiology of Degos disease; a case report of treatment with eculizumab" (Abstract), Jerusalem: International Society of Hematology; 2010, Poster #156; i Polito J. i saradnici, "Early detection of systemic Degos disease (DD) or malignant atrophic papulosis (MAP) may increase survival" (Abstract), San Antonio, TX: American College of Gastroenterology; 2010, Poster #1205).

[0124] Mnogi pacijenti koji boluju od Degosove bolesti su sa defektima u koagulaciji krvi. Trombotična okluzija malih arterija u koži je karakteristična za bolest. Pošto je ukazano da put aktivacije komplementa može biti umešan u ovo oboljenje, kao što je ovde opisano za druge TMA, očekuje se da će inhibitori lektinskog puta, uključujući, ali ne ograničavajući se samo na antitela koja blokiraju funkciju MASP-2, biti korisni u lečenju pacijenata koji boluju od Degosove bolesti.

4

[0125] Shodno navedenom, u drugom slučaju koji je ovde opisan, prijavljeni su postupci za lečenje Degosove bolesti, primenom kompozicije koja sadrži terapijski efektivnu količinu inhibitornog agensa za MASP-2, poput antitela na MASP-2 u farmaceutskom nosaču, subjektu koji boluje od Degosove bolesti ili stanja koje je rezultat Degosove bolesti. Inhibitorni agens za MASP-2 se kod subjekta koji boluje od Degosove bolesti ili stanja proisteklog iz Degosove bolesti primenjuje sistemski, na primer, intra-arterijskom, intravenskom, intramuskularnom, inhalacionom, supkutanom ili drugom vrstom parenteralne primene, ili potencijalno oralnom primenom za agense koji nisu peptidergički. Anti-MASP-2 antitelo može biti primenjivano samostalno ili u kombinaciji sa inhibitorom C5, kao što je ekulizamab.

[0126] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo ispoljava najmanje jednu ili više od sledećih karakteristika: navedeno antitelo vezuje humani MASP-2 sa KDod 10 nM ili manje, navedeno antitelo vezuje epitop u CCP1 domenu MASP-2, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u in vitro analizi sa 1% humanim serumom uz IC50od 10 nM ili manje, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u 90% humanim serumom sa IC50od 30 nM ili manje, pri čemu je antitelo fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, Fab', F(ab)2i F (ab')2, pri čemu je antitelo jednolančani molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG2 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG1 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG4 molekul, gde IgG4 molekul sadrži mutaciju tipa S228P i/ili pri čemu antitelo ne inhibira značajno klasičan put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put, a ne inhibira značajno alternativni put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i ne inhibira značajno klasičan put ili alternativni put (tj. inhibira lektinski put, dok klasične i alternativne puteve komplementa ostavlja intaktnima).

[0127] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od Degosove bolesti za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od Degosove bolesti sa nivoom od najmanje 20 procenata ili više (kao što je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%) veći od inhibitornog efekta na deponovanje C5b-9 u serumu.

[0128] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu pacijenta sa Degos bolešću za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom.

4

[0129] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo se primenjuje subjektu putem intravenskog katetera ili drugog načina isporuke kateterom.

[0130] U jednom slučaju, ovde je opisan postupak za inhibiranje obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od Degosove bolesti, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu MASP-2 inhibitornog antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, i pri čemu antitelo sadrži (I) (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 iz SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70, ili (II) njegovu varijantu koja sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 90% identičan SEQ ID NO:67 (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:67) i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 90% identičan (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:70.

[0131] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu MASP-2 inhibitornog antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO: 67. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog antitela za MASP-2, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:70.

[0132] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži MASP-2 inhibitorno antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji specifično prepoznaju najmanje deo epitopa na humanom MASP-2 koga prepoznaje i referentno antitelo, OMS646, koje sadrži varijabilni region teškog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:70.

Katastrofalni antifosfolipidni sindrom (CAPS)

[0133] Katastrofalni antifosfolipidni sindrom (CAPS) je ekstremna varijanta sindroma antifosfolipidnih antitela (APLA). CAPS karakteriše venska i arterijska tromboza usled patogenih antitela. CAPS je TMA sa trombozom višestrukih organa, ishemijom i otkazivanjem organa. Kao i kod drugih TMA, karakteristična je okluzija malih sudova u raznim organima. Stopa smrtnosti kod CAPS je oko 50% i

4

često je udružena sa infekcijom ili traumom. Kod pacijenata su prisutna antifosfolipidna antitela, uglavnom IgG.

[0134] Klinički, CAPS zahvata najmanje tri organa ili tkiva i uočavaju se histopatološki dokazi o začepljenju malih krvnih sudova. Periferna tromboza može zahvatiti vene i arterije CNS-a, kardiovaskularnog, bubrežnog ili plućnog sistema. Pacijenti se leče antibioticima, antikoagulansima, kortikosteroidima, izmenom plazme i intravenskim imunoglobulinom. Smrt, međutim, može nastati usled otkazivanja funkcije višestrukih organa.

[0135] Put komplementa je umešan u CAPS. Na primer, studije na životinjskim modelima pokazuju da inhibicija komplementa može biti efektivan način prevencije tromboze udružene sa CAPS (Shapira L. i saradnici, Arthritis Rheum 64(8):2719-23, 2012). Štaviše, kao što su dodatno prijavili Shapira i saradnici, primena ekulizumaba subjektu koji boluje od CAPS u dozama koje su blokirale put komplementa, prekinula je akutne progresivne trombotične događaje i revertovala je trombocitopeniju (pogledati takođe Lim W. Curr Opin Hematol 18(5):361-5, 2011). Kao što je ovde opisano i za druge TMA, očekuje se stoga da će inhibitori lektinskog puta, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitela koja blokiraju funkciju MASP-2, biti korisni u lečenju pacijenata koji boluju od CAPS.

[0136] Opisani su i postupci za lečenje CAPS primenom kompozicije koja sadrži terapijski efektivnu količinu inhibitornog agensa za MASP-2, kao što je MASP-2 antitelo u farmaceutskom nosaču, subjektu koji boluje od CAPS ili od stanja koje proističe iz CAPS. Inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje sistemski subjektu koji boluje od CAPS, ili stanja koje proističe iz CAPS, na primer, intra-arterijskom, intravenskom, intramuskularnom, inhalacionom, supkutanom ili drugom vrstom parenteralne primene, ili potencijalno oralnom primenom kod nepeptidergičkih agenasa. Anti-MASP-2 antitelo može biti primenjeno samostalno, ili u kombinaciji sa inhibitorom C5, kao što je ekulizamab.

[0137] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo ispoljava najmanje jednu ili više od sledećih karakteristika: navedeno antitelo vezuje humani MASP-2 sa KDod 10 nM ili manje, navedeno antitelo vezuje epitop u CCP1 domenu MASP-2, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u in vitro analizi sa 1% humanim serumom uz IC50od 10 nM ili manje, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u 90% humanom serumu sa IC50od 30 nM ili manje, pri čemu je antitelo fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, Fab', F(ab)2i F (ab')2, pri čemu je antitelo jednolančani molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG2 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG1 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG4 molekul, gde IgG4 molekul sadrži mutaciju tipa S228P i/ili pri čemu antitelo ne inhibira značajno klasičan put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i ne inhibira značajno alternativni put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno

4

inhibira lektinski put i ne inhibira značajno klasičan put ili alternativni put (tj. inhibira lektinski put, dok klasičan i alternativni put komplementa ostaju intaktni).

[0138] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od CAPS za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od CAPS na nivou koji je za najmanje 20 procenata ili više (kao što je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%) veći od inhibitornog efekta na deponovanje C5b-9 u serumu.

[0139] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu CAPS pacijenta za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom.

[0140] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo se primenjuje subjektu putem intravenskog katetera ili drugog načina isporuke kateterom.

[0141] U jednom slučaju, ovde je opisan postupak inhibiranja obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od CAPS, pri čemu se postupak sastoji od primene subjektu kompozicije koja sadrži količinu MASP-2 inhibitornog antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji dalje sadrže (I) (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 iz SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70, ili (II) njegovu varijantu koja sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 90% identičan SEQ ID NO:67 (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:67) i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 90% identičan (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:70.

[0142] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu MASP-2 inhibitornog antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:67. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu MASP-2 inhibitornog antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:70.

[0143] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži inhibitorno antitelo za MASP-2 ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji specifično prepoznaju najmanje deo epitopa na humanom MASP-2 koga prepoznaje i referentno antitelo, OMS646, koje sadrži teški lanac varijabilnog regiona kao što je navedeno u SEQ ID NO:67 i laki lanac varijabilnog regiona kao što je navedeno u SEQ ID NO: 70.

TMA nastala sekundarno u odnosu na kancer

[0144] Sistemski maligniteti bilo koje vrste mogu dovesti do kliničkih i patoloških manifestacija TMA (pogledati npr. Batts i Lazarus, Bone Marrow Transpantation 40:709-719, 2007). TMA udružen sa kancerom se često nalazi u plućima i deluje da je povezan sa tumorskim embolijama (Francis KK i saradnici, Commun Oncol 2:339-43, 2005). Embolusi tumora mogu smanjiti protok krvi i tako dovesti do hipoperfuzionog stanja u zahvaćenim arteriolama i venulama. Očekivano je stoga da će proizvedeni stres tkiva i povreda aktivirati lektinski put komplementa na lokalizovan način. Aktiviran lektinski put zauzvrat može aktivirati kaskadu koagulacije preko cepanja protrombina do trombina koje je zavisno od MASP-2, što dovodi do protrombotičnog stanja karakterističnog za TMA. Očekuje se takođe da će inhibicija MASP-2 u ovom okruženju smanjiti lokalizovanu aktivaciju trombina i time ublažiti protrombotično stanje.

[0145] Prema tome, kako je ovde opisano za druge TMA, očekuje se da će inhibitori lektinskog puta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, antitela koja blokiraju funkciju MASP-2, biti korisni u lečenju pacijenata koji boluju od TMA nastala sekundarno u odnosu na kancer.

[0146] Opisani su i postupci za lečenje ili prevenciju TMA nastale sekundarno u odnosu na kancer, primenom kompozicije koja sadrži terapijski efektivnu količinu inhibitornog agensa za MASP-2, kao što je to antitelo na MASP-2 u farmaceutskom nosaču, subjektu koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na kancer. Inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje subjektu koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na kancer sistemski, na primer, intra-arterijskom, intravenskom, intramuskularnom, inhalacionom, supkutanom ili drugom vrstom parenteralne primene, ili potencijalno oralnom primenom kod nepeptidergičnih agenasa. Anti-MASP-2 antitelo može biti primenjivano samostalno ili u kombinaciji sa inhibitorom C5, kao što je ekulizamab.

[0147] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo ispoljava najmanje jednu ili više od sledećih karakteristika: navedeno antitelo vezuje humani MASP-2 sa KDod 10 nM ili manje, navedeno antitelo vezuje epitop u CCP1 domenu MASP-2, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u in vitro analizi

1

sa 1% humanim serumom uz IC50od 10 nM ili manje, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u 90% humanom serumu sa IC50od 30 nM ili manje, pri čemu je antitelo fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, Fab', F(ab)2i F(ab')2, pri čemu je antitelo jednolančani molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG2 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG1 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG4 molekul, gde IgG4 molekul sadrži mutaciju tipa S228P i/ili pri čemu antitelo ne inhibira značajno klasičan put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i ne inhibira značajno alternativni put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i ne inhibira značajno klasičan put ili alternativni put (tj. inhibira lektinski put, dok klasičan i alternativni put komplementa ostaju intaktni).

[0148] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od TMA nastale sekundarno u odnosu na kancer za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom.

[0149] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz pacijenta koji boluje od TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na kancer za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom.

[0150] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo se primenjuje subjektu putem intravenskog katetera ili drugog načina isporuke katetera.

[0151] U jednom slučaju, ovde je opisan postupak za inhibiranje obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od TMA nastale sekundarno u odnosu na kancer, pri čemu se postupak sastoji od primene subjektu kompozicije koja sadrži količinu MASP-2 inhibitornog antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, i pri čemu antitelo sadrži (I) (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 iz SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70, ili (II) njegovu varijantu koja sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 90% identičan SEQ ID NO: 67 (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:67) i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 90% identičan (npr.

2

najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:70.

[0152] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog antitela za MASP-2, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:67. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog antitela za MASP-2, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:70.

[0153] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži inhibitorno antitelo za MASP-2 ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji specifično prepoznaju najmanje deo epitopa na humanom MASP-2 koga prepoznaje i referentno antitelo, OMS646, koje sadrži teški lanac varijabilnog regiona kao što je navedeno u SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:70.

TMA nastala sekundarno u odnosu na hemoterapiju kancera

[0154] TMA povezana sa hemoterapijom je stanje koje uključuje trombocitopeniju, mikroangiopatsku hemolitičku anemiju i bubrežnu disfunkciju koja se razvija kod 2-10% pacijenata sa istorijom malignih neoplazmi lečenih hemoterapijskim agensima poput gemcitabina, mitomicina, oksaliplatina i drugih. TMA udružena sa hemoterapijom je povezana sa visokim mortalitetom loših kliničkih ishoda (pogledati, npr. Blake-Haskins i saradnici, Clin Cancer Res 17(18): 5858-5866, 2011).

[0155] Smatra se da etiologija TMA koja je udružena sa hemoterapijom obuhvata nespecifičnu, toksičnu povredu mikrovaskularnog endotela. Direktna povreda endotelnih ćelija je pokazana u životinjskom modelu TMA indukovane sa mitomicinom (Dlott J. i saradnici, Ther Apher Dial 8:102-11, 2004). Pokazano je i da povreda endotelnih ćelija kroz različite mehanizme aktivira lektinski put komplementa. Na primer, Stahl i saradnici su pokazali da endotelne ćelije izložene oksidativnom stresu aktiviraju lektinski put komplementa in vitro i in vivo (Collard i saradnici, Am J Pathol.156(5):1549-56, 2000; La Bonte i saradnici, J Immunol. 15;188(2):885-91, 2012). In vivo, ovaj proces dovodi do tomboze, a pokazano je i da inhibicija lektinskog puta sprečava trombozu (La Bonte i saradnici, J Immunol. 15;188 (2):885-91, 2012). Štaviše, kao što je ovde prikazano u Primerima 37-39, u mišjem modelu TMA, gde je lokalizovana fotoekscitacija sa FITC-Dek upotrebljavana za indukovanje lokalizovane povrede mikrovaskulature sa daljim razvojem TMA odgovora, predmetni pronalazači su pokazali da inhibicija MASP-2 može sprečiti TMA. Oštećenje mikrovaskularnog endotela hemoterapijskim agensima može stoga aktivirati lektinski put komplementa koji zatim stvara lokalizovano protrombotično stanje i pospešuje TMA odgovor. Budući da je aktivacija lektinskog puta i obrazovanje protombičnog stanja zavisno od MASP-2, očekuje se da će inhibitori MASP-2, uključujući, ali bez ograničavanja samo na antitela koja blokiraju funkciju MASP-2, ublažiti TMA odgovor i smanjiti rizik od TMA udružene sa hemoterapijom kancera.

[0156] Opisani su i postupci za lečenje ili sprečavanje TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na hemoterapiju, primenom kompozicije koja sadrži terapijski efektivnu količinu inhibitornog agensa za MASP-2, kao što je to antitelo na MASP-2 u farmaceutskom nosaču, subjektu koji boluje ili je sa rizikom da razvije TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na hemoterapiju. Inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje sistemski kod subjekta koji je bio podvrgnut, podvrgava se ili će biti podvrgnut hemoterapiji, na primer, intra-arterijskom, intravenskom, intramuskularnom, inhalacionom, supkutanom ili drugom vrstom parenteralne primene, ili potencijalno oralnom primenom kod nepeptidergičnih agenasa. Anti-MASP-2 antitelo može biti primenjivano samostalno ili u kombinaciji sa C5 inhibitorom, kao što je ekulizamab.

[0157] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo ispoljava najmanje jednu ili više od sledećih karakteristika: navedeno antitelo vezuje humani MASP-2 sa KDod 10 nM ili manje, navedeno antitelo vezuje epitop u CCP1 domenu MASP-2, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u in vitro analizi sa 1% humanim serumom uz IC50od 10 nM ili manje, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u 90% humanog seruma sa IC50od 30 nM ili manje, pri čemu je antitelo fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, Fab', F(ab)2i F(ab')2, pri čemu je antitelo jednolančani molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG2 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG1 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG4 molekul, gde IgG4 molekul sadrži mutaciju tipa S228P i/ili pri čemu antitelo ne inhibira značajno klasičan put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i ne inhibira značajno alternativni put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i ne inhibira značajno klasičan put ili alternativni put (tj. inhibira lektinski put, dok klasičan i alternativni put komplementa ostaju intaktni).

[0158] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od TMA nastale sekundarno u odnosu na hemoterapiju kancera za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60 %, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom.

[0159] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu pacijenta koji boluje od TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na hemoterapiju kancera za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom.

4

[0160] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo se primenjuje subjektu putem intravenskog katetera ili drugog načina isporuke kateterom.

[0161] Ovde je takođe opisan i postupak za inhibiranje obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od TMA nastale sekundarno u odnosu na hemoterapiju kancera, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži inhibitorno antitelo za MASP-2 ili njegov fragment koji vezuje antigen, i pri čemu antitelo sadrži (I) (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 iz SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70, ili (II) njegovu varijantu koja sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 90% identičan SEQ ID NO:67 (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:67) i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 90% identičan (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:70.

[0162] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog antitela za MASP-2, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:67. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog antitela za MASP-2, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:70.

[0163] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži inhibitorno antitelo za MASP-2 ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji specifično prepoznaju najmanje deo epitopa na humanom MASP-2 koga prepoznaje i referentno antitelo, OMS646, koje sadrži teški lanac varijabilnog regiona kao što je navedeno u SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:70.

TMA nastala sekundarno u odnosu na transplantaciju

[0164] TMA udružena sa transplantacijom (TA-TMA) je razarajući sindrom koji se može javiti kod pacijenata sa transplantacijom, kao što su to primaoci alogenih transplantata hematopoetskih matičnih ćelija (pogledati npr. Batts i Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40:709-719, 2007). Patogeneza ovog stanja je slabo razjašnjena, ali verovatno uključuje sekvencu odgovora koji kulminiraju u povredi endotelnih ćelija (Laskin B.L. i saradnici, Blood 118(6):1452-62, 2011). Kao što je prethodno razmatrano, povreda endotelnih ćelija je prototip stimulusa za aktivaciju lektinskog puta i stvaranje protrombotičnog okruženja.

[0165] Noviji podaci dodatno podržavaju ulogu aktivacije komplementa posredstvom lektinskog puta u patogenezi TA-TMA. Laskin i saradnici su pokazali da je deponovanje C4d u bubrežnim arteriolama bilo mnogo uobičajenije kod subjekata sa histološkim TA-TMA (75%) u poređenju sa kontrolom (8%) (Laskin B.L. i saradnici, Transplantation, 27; 96(2):217-23, 2013). Prema tome, C4d može biti patološki marker TA-TMA, što ukazuje na lokalizovanu fiksaciju komplementa putem lektinskog ili klasičnog puta.

[0166] Pošto su aktivacija lektinskog puta i obrazovanje protombotičnog stanja zavisni od MASP-2, očekuje se da će inhibitori MASP-2, uključujući, ali bez ograničenja samo na antitela koja blokiraju funkciju MASP-2, ublažiti TMA odgovor i smanjiti rizik od TMA udružene sa transplantacijom (TA-TMA).

[0167] Opisani su i postupci za lečenje ili prevenciju TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na transplantaciju, primenom kompozicije koja sadrži terapijski efektivnu količinu inhibitornog agensa za MASP-2, kao što je to antitelo na MASP-2 u farmaceutskom nosaču, subjektu koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na transplantaciju. Inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje sistemski kod subjekta koji je bio podvrgnut, podvrgava se ili će biti podvrgnut postupku transplantacije, na primer, intra-arterijskom, intravenskom, intramuskularnom, inhalacionom, supkutanom ili drugom vrstom parenteralne primene, ili potencijalno oralnom primenom kod nepeptidergičnih agenasa. Anti-MASP-2 antitelo može biti primenjivano samostalno ili u kombinaciji sa inhibitorom C5, kao što je ekulizamab. U pojedinim slučajevima, ovde su opisani postupci za lečenje ili prevenciju TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na alogenu transplantaciju matičnih ćelija, pri čemu postupci obuhvataju primenu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog agensa za MASP-2, kao što je inhibitorno antitelo za MASP-2, subjektu pre, tokom ili nakon podvrgavanja alogenoj transplantaciji matičnih ćelija.

[0168] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo ispoljava najmanje jednu ili više od sledećih karakteristika: navedeno antitelo vezuje humani MASP-2 sa KDod 10 nM ili manje, navedeno antitelo vezuje epitop u CCP1 domenu MASP-2, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u in vitro analizi sa 1% humanim serumom uz IC50od 10 nM ili manje, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u 90% humanom serumu sa IC50od 30 nM ili manje, pri čemu je antitelo fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, Fab', F(ab)2i F(ab')2, pri čemu je antitelo jednolančani molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG2 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG1 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG4 molekul, gde IgG4 molekul sadrži mutaciju tipa S228P i/ili pri čemu antitelo ne inhibira značajno klasičan put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i ne inhibira značajno alternativni put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i ne inhibira značajno klasičan put ili alternativni put (tj. inhibira lektinski put, dok klasičan i alternativni put komplementa ostaju intaktni).

[0169] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz subjekta koji boluje od TMA nastale sekundarno u odnosu na transplantaciju za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom.

[0170] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu iz pacijenta koji boluje od TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na transplantaciju za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom.

[0171] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo se primenjuje subjektu putem intravenskog katetera ili drugog načina isporuke kateterom.

[0172] Ovde je takođe opisan postupak za inhibiranje obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na transplantaciju, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži inhibitorno antitelo za MASP-2 ili njegov fragment koji vezuje antigen, i pri čemu antitelo sadrži (I) (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 iz SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70, ili (II) njegovu varijantu koja sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 90% identičan SEQ ID NO:67 (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:67) i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 90% identičan (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:70.

[0173] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog antitela za MASP-2, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:67. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu inhibitornog antitela za MASP-2, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:70.

[0174] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži inhibitorno antitelo za MASP-2 ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji specifično prepoznaju najmanje deo epitopa na humanom MASP-2 koga prepoznaje i referentno antitelo, OMS646, koje sadrži varijabilni region teškog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:70.

IV. ULOGA MASP-2 U DRUGIM OBOLJENJIMA I STANJIMA I TERAPIJSKI POSTUPCI U KOJIMA SE UPOTREBLJAVAJU NHIBITORNI AGENSI ZA MASP-2

BOLESNA STANJA BUBREGA

[0175] Pretpostavlja se da aktivacija komplementa učestvuje u patogenezi širokog spektra bubrežnih oboljenja; uključujući i mezangioproliferativni glomerulonefritis (IgA-nefropatiju, Bergerovu bolest) (Endo M. i saradnici, Clin. Nephrology 55:185-191, 2001), membranski glomerulonefritis (Kerjashki D., Arch B Cell Pathol.58:253-71, 1990; Brenchley P.E. i saradnici, Kidney Int.41:933-7, 1992; Salant D.J. i saradnici, Kidney Int.35:976-84, 1989), membranoproliferativni glomerulonefritis (mezangiokapilarni glomerulonefritis) (Bartlow B.G. i saradnici, Kidney Int.15: 294-300, 1979; Meri S. i saradnici, J. Exp. Med.175:939-50, 1992), akutni postinfektivni glomerulonefritis (poststreptokokni glomerulonefritis), krioglobulinemični glomerulonefritis (Ohsawa I. i saradnici, Clin Immunol. 101:59-66, 2001), lupusni nefritis (Gatenby P.A., Autoimmunity 11:61-6, 1991), i nefritis Henoh-Šonlejnove purpure (Endo M. i saradnici, Am. J. Kidney Dis. 35:401-407, 2000). Uključenost komplementa u renalnom oboljenje se razmatra nekoliko decenija, ali još uvek postoji velika rasprava o tome kakva je tačno njegova uloga u nastaku, razvoju i fazi rezolucije bubrežnog oboljenja. Pod normalnim uslovima, doprinos komplementa za domaćina je koristan, ali neprimerena aktivacija i deponovanje komplementa mogu doprineti oštećenju tkiva.

[0176] Postoje značajni dokazi da glomerulonefritis, zapaljenje glomerula, često započinje deponovanjem imunskih kompleksa na glomerularne ili tubularne strukture, čime se zatim pokreću aktivacija komplementa, inflamacija i oštećenje tkiva. Kahn i Sinniah su pokazali pojačano deponovanje C5b-9 na tubularnim bazalnim membranama u biopsijama uzetim iz pacijenata sa raznim oblicima glomerulonefritisa (Kahn T.N. i saradnici, Histopath.26:351-6, 1995). U studiji pacijenata sa IgA nefrologijom (Alexopoulos A. i saradnici, Nephrol. Dial. Transplant 10:1166-1172, 1995), deponovanje C5b-9 u tubularnim epitelnim/bazalnim membranskim strukturama je bilo u korelaciji je sa nivoom kreatinina u plazmi. Druga studija membranske nefropatije je pokazala vezu između kliničkog ishoda i nivoa sC5b-9 u urinu (Kon S.P. i saradnici, Kidney Int. 48:1953-58, 1995). Povišeni nivoi sC5b-9 su pozitivno korelisali sa lošom prognozom. Lehto i saradnici, izmerili su povišene nivoe C5b-9, regulatornog faktora sistema komplementa koji inhibira litički kompleks u plazma membranama, kao i C5b-9 u urinu iz pacijenata sa membranskim glomerulonefritisom (Lehto T. i saradnici, Kidney Int. 47:1403-11, 1995). Histopatološka analiza uzoraka biopsije uzetih od istih tih pacijenata pokazala je deponovanje proteina C3 i C9 u glomerulima, dok je ekspresija CD59 u tim tkivima bila smanjena u poređenju sa normalnim bubrežnim tkivom. Ovakav razovrsna istraživanja su ukazala različita ispitivanja sugerišu da glomerulonefritis posredovan komplementom koji je u toku dovodi od izlučivanja proteina komplementa urinom, što je u korelaciji sa stepenom oštećenja tkiva i prognozom bolesti.

[0177] Inhibicija aktivacije komplementa u raznim životinjskim modelima glomerulonefritisa takođe je pokazala značaj aktivacije komplementa u etiologiji oboljenja. U modelu membranoproliferativnog glomerulonefritisa (MPGN), rezultat infuzije anti-Thyl antiserumima kod pacova sa deficijencijom C6 (koji ne mogu obrazovati C5b-9) su bili za 90% manja glomerularna ćelijska proliferacijom, smanjenje infiltracije trombocita i makrofaga od 80%, smanjena sinteza kolagena tipa IV (marker ekspanzije mezangijalnog matriksa) i proteinurija za 50% manja nego kod C6+ normalnih pacova (Brandt J. i saradnici, Kidney Int.49:335-343, 1996). Ovi rezultati ukazuju da je C5b-9 glavni posrednik oštećenja tkiva komplementom u ovom anti-timocitnom serumskom modelu kod pacova. U drugom modelu glomerulonefritisa, infuzija graduisanih doza zečje anti-pacovske glomerularne bazalne membrane je proizvela dozno-zavisan influks polimorfonuklearnih leukocita (PMN) koji je bio umanjen prethodnim tretmanom sa venomskim faktorom kobre (da bi se utrošio komplement) (Scandrett A.L. i saradnici, Am. J. Physiol.268:F256-F265, 1995). Pacovi tretirani venomskim faktorom kobre takođe su pokazali narušenu histopatologiju, smanjenu dugotrajnu proteinuriju i niži nivo kreatinina od kontrolnih pacova. Koristeći tri modela GN kod pacova (antitimocitni serum, Con A anti-Con A i pasivni Hajmanov nefritis), Couser i saradnici su pokazali potencijalnu terapijsku efikasnost pristupa za inhibiranje komplementa upotrebom rekombinantnog sCR1 proteina (Couser W.G. i saradnici, J. Am. Soc. Nephrol. 5:1888-94, 1995). Pacove tretirane sa sCR1 je karakteriso značajno smanjen PMN, influks trombocita i makrofaga, smanjena mezangioliza i proteinurija u odnosu na kontrolne pacove. Dodatni dokazi o važnosti aktivacije komplementa u glomerulonefritisu opisani upotrebom anti-C5 MoAt u NZB/W F1 mišjem modelu. Anti-C5 MoAt inhibira cepanje C5, čime blokira obrazovanje C5a i C5b-9. Kontinuirana terapija anti-C5 MoAt tokom 6 meseci, dovela je do zančajnog ublažavanja toka glomerulonefritisa. Humanizovano anti-C5 MoAt monoklonsko antitelo (5G1.1) koje sprečava cepanje komponente C5 humanog sistema komplementa na njegove proinflamatorne komponente je trenutno u fazi razvoja od strane komapnije Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, Connecticut, kao potencijalni tretman za glomerulonefritis.

[0178] Direktan dokaz o patološkoj ulozi komplementa u oštećenju bubrega je opisan i u studijama na pacijentima sa genetičkim deficijencijama u određenim komponentama sistema komplementa. Brojni izveštaji su dokumentovali povezanost bubrežnih oboljenja sa deficijencijama regulatornog faktora H sistema komplementa (Ault B.H. Nephrol.14:1045-1053, 2000; Levy M. i saradnici, Kidney Int.30:949-56, 1986; Pickering M.C. i saradnici, Nat. Genet. 31:424-8, 2002). Deficijencija faktora H rezultuje niskim nivoima faktora B i C3 u plazmi i potrošnjom C5b-9. Sa deficijencijom faktora H su povezani i atipičan membranoproliferativni glomerulonefritis (MPGN) i idiopatski hemolitičko uremijski sindrom (HUS). Svinje sa deficijencijom faktora H (Jansen J.H. i saradnici, Kidney Int.53:331-49, 1998) i knockout miševi za faktor H (Pickering M.C., 2002) pokazuju simptome slične MPGN, što potvrđuje značaj faktora H u regulaciji komplementa. Deficijencije ostalih komponenti sistema komplementa su takođe povezane sa bubrežnim oboljenjima koja nastaju sekundarno u odnosu na razvoj sistemskog eritematoznog lupusa (SLE) (Walport M.J., Davies i saradnici, Ann. N.Y. Sci. 815:267-81, 1997). Deficijencija C1q, C4 i C2 snažno predisponira razvoj SLE mehanizmima koji podrazumevaju defektan klirens imunskih komleksa i apoptotičnog materijala. Kod mnogih od ovih bolesnika sa SLE se javlja lupusni nefritis, koga karakterišu naslage imunskih kompleksa širom glomerula.

[0179] Dodatni dokaz koji povezuje aktivaciju komplementa i bubrežnih oboljenja je opisan identifikacijom autoantitela usmerenih na komponente komplementa kod pacijenata, od kojih su neka bila direktno povezana sa bubrežnim oboljenjem (Trouw L.A. i saradnici, Mol. Immunol.38:199-206, 2001). Broj ovakvih autoantitela pokazuje tako visok stepen korelacije sa bubrežnom bolešću da je termin nefrotični faktor (NeF) uveden da ukaže na ovu aktivnost. U kliničkim studijama, oko 50% pacijenata pozitivnih na nefrotične faktore je razvilo MPGN (Spitzer R.E. i saradnici, Clin. Immunol. Immunopathol. 64:177-83, 1992). C3NeF je autoantitelo usmereno na C3 konvertazu alternativnog puta (C3bBb) i ono stabilizuje ovu konvertazu, pospešujući time aktivaciju alternativnog puta (Daha M.R. i saradnici, J. Immunol. 116:1-7, 1976). Slično tome, autoantitela sa specifičnošću za C3 konvertazu klasičnog puta (C4b2a), nazvana C4NeF, stabilizuju ovu konvertazu i time pospešuju aktivaciju klasičnog puta (Daha M.R. i saradnici, J. Immunol. 125:2051-2054, 1980; Halbwachs L. i saradnici, J. Clin. Invest. 65:1249-56, 1980). Opisana su i anti-Clq autoantitela koja su povezana sa nefritisom kod pacijenata sa SLE (Hovath L. i saradnici, Clin. Exp. Reumatol.19:667-72, 2001; Siegert C. i saradnici, J. Rheumatol. 18:230-34, 1991; Siegert C. i saradnici, Clin. Exp. Reumatol. 10:19-23, 1992), a prijavljeno je i da porast u titru ovih anti-Clq autoantitela predstavlja dobar prediktor nagle pojave nefritisa (Coremans I.E. i saradnici, Am. J. Kidney Dis. 26:595-601, 1995). Imunski depoziti eluirani iz bubrega bolesnika sa SLE nakon smrti, ukazali su na nagomilavanje ovakvih anti-Clq autoantitela (Mannick M. i saradnici, Arthritis Rheumatol. 40:1504-11, 1997). Sve ove činjenice ukazuju na patološku ulogu ovih autoantitela. Međutim, nemaju svi pacijenti sa anti-Clq autoantitelima bolest bubrega, a neki i zdravi pojedinci imaju nizak titar anti-Clq autoantitela (Siegert C.E. i saradnici, Clin. Immunol. Immunopathol.67:204-9, 1993).

[0180] Pored alternativnih i klasičnih puteva aktivacije komplementa, lektinski put takođe može imati važnu patološku ulogu u oboljenju bubrega. Povišeni nivoi MBL, serin proteaze povezane sa MBL-om i proizvoda aktivacije sistema komplementa, detektovani su imunohistohemijskim tehnikama na materijalu biopsija bubrega dobijenih iz pacijenata sa dijagnozom nekoliko različitih oboljenja bubrega, uključujući nefritis Henoh-Šonlejnove purpure (Endo M. i saradnici, Am. J. Kidney Dis.35:401-407, 2000), krioglobulinemični glomerulonefritis (Ohsawa I. i saradnici, Clin. Immunol. 101:59-66, 2001) i IgA neuropatiju (Endo M. i saradnici, Clin. Nephrology 55:185-191, 2001). Stoga, uprkos činjenici da je veza između sistema komplementa i bubrežnih oboljenja poznata već nekoliko decenija, podaci o tome kako komplement tačno utiče na ove bubrežna oboljenja su daleko od potpunih.

POREMEĆAJI KRVI

[0181] Sepsu prouzrokuje prekomerna reakcija pacijenta na invaziju mikroorganizama. Glavna funkcija sistema komplementa je da usaglasi inflamatorni odgovor na invaziju bakterija i drugih patogena. U skladu sa ovom fiziološkom ulogom, u brojnim studijama je pokazano da aktivacija komplementa ima glavnu ulogu u patogenezi sepse (Bone R.C. Annals. Internal. Med. 115:457-469, 1991). Definicija kliničkih manifestacija sepse se neprestano razvija. Sepsa se obično definiše kao sistemski odgovor domaćina na infekciju. Ipak, u mnogim prilikama, kod pacijenata sa simptomima sepse nisu pronađeni klinički dokazi o infekciji (npr. pozitivne bakterijske kulture krvi). Ovakvo razmimoilaženje je prvi put uzeto u obzir na Konsenzusnoj konferenciji 1992. godine, kada je ustanovljen termin „sindrom sistemskog inflamatornog odgovora“ (SIRS) i za koji nije bilo potrebno definisati prisustvo bakterijske infekcije (Bone R.C. i saradnici, Crit. Care Med.20:724-726, 1992). Sada postoji opšta saglasnost da su sepsa i SIRS praćeni nemogućnošću regulisanja inflamatornog odgovora. U svrhe ovog kratkog pregleda, u opisu će biti razmatrana klinička definicija sepse koja uključuje i tešku sepsu, septični šok i SIRS.

[0182] Prevladavajući izvor infekcije kod septičnih pacijenata pre kasnih 1980-ih su bile Gramnegativne bakterije. Bilo je naime poznato da lipopolisaharid (LPS), glavna komponenta ćelijskog zida Gram-negativnih bakterija, podstiče oslobađanje inflamatornih medijatora iz različitih tipova ćelija i indukuje akutne simptome infekcije kada se injecira životinjama (Haeney M.R. i saradnici, Antimikrobial Chemotherapy 41 (Suppl. A):41-6, 1998). Zanimljivo je da deluje da je spektar odgovornih mikroorganizama iz kasnih 1970-ih i 1980-ih prebacio sa pretežno Gram-negativnih

1

bakterija na pretežno Gram-pozitivne bakterije u sadašnjosti, iz razloga koji trenutno nisu jasni (Martin G.S. i saradnici, N. Eng. J. Med.348:1546-54, 2003).

[0183] Mnoga istraživanja su pokazala značaj aktivacije komplementa u posredovanju inflamacije i doprinosu karakteristikama šoka, posebno septičkog i hemoragičnog šoka. I Gram-negativni i Grampozitivni organizmi često dovode do septičkog šoka. LPS je moćan aktivator komplementa, pretežno alternativnim putem, mada se javlja i aktivacija klasičnog puta posredovana antitelima (Fearon D.T. i saradnici, N. Engl. J. Med.292:937-400, 1975). Glavne komponente Gram-pozitivnog ćelijskog zida su peptidoglikan i lipoteihoična kiselina, a obe komponente su snažni aktivatori alternativnog puta komplementa, iako u prisustvu specifičnih antitela mogu aktivirati i klasičan put aktivacije koplementa (Joiner K.A. i saradnici, Ann. Rev. Immunol.2:461-2, 1984).

[0184] Na učešće sistema komplementa u patogenezi sepse je u početku ukazano na osnovu zapažanja od strane istraživača da anafilatoksini C3a i C5a posreduju u raznovrsnim inflamatornim reakcijama koje bi se mogle javljati i tokom sepse. Ovi anafilatoksini izazivaju vazodilataciju i povećanje propustljivosti mikrovaskulture, što i predstavlja događaje sa centralnom ulogom u septičkom šoku (Schumacher W.A. i saradnici, Agents Actions 34:345-349, 1991). Pored toga, anafilatoksini indukuju bronhospazam, oslobađanje histamina iz mastocita i agregaciju trombocita. Štaviše, oni ispoljavaju brojna dejstva na granulocite, poput hemotaksije, agregacije, adhezije, oslobađanja lizozomskih enzima, obrazovanje toksičnog super-oksidnog aniona i obrazovanje leukotriena (Shin H.S. i saradnici, Science 162:361-363, 1968; Vogt W. Complement 3:177-86, 1986). Smatra se da ovi biološki efekti imaju važnu ulogu u razvoju komplikacija sepse poput šoka ili sindroma akutnog respiratornog distresa (ARDS) (Hammerschmidt D.E. i saradnici, Lancet 1:947-949, 1980; Slotman G.T. i saradnici, Surgery 99:744-50, 1986). Dodatno, povišeni nivoi anafilatoksina C3a su povezani sa fatalnim ishodom u sepsi (Hack C.E. i saradnici, Am. J. Med.86:20-26, 1989). U pojedinim životinjskim modelima šoka, određeni sojevi sa deficijencijom komplementa (npr. sa deficijencijom C5) otporniji su na efekte infuzije LPS-a (Hseuh W. i saradnici, Immunol.70:309-14, 1990).

[0185] Pokazano je takođe da blokada C5a generisana antitelima, tokom početka pojave sepse kod glodara, začajno poboljšava preživljavanje (Czermak B.J. i saradnici, Nat. Med.5:788-792, 1999). Slični nalazi su dobijeni kada je blokiran C5a receptor (C5aR), bilo sa antitelima ili sa inhibitorima tipa malih molekula (Huber-Lang M.S. i saradnici, FASEB J.16:1567-74, 2002; Riedemann N.C. i saradnici, J. Clin. Invest. 110:101-8, 2002). Ranije eksperimentalne studije na majmunima su sugerisale da je blokada C5a antitelima oslabila septički šok i sindrom respiratornog distresa kod odraslih indukovanih sa E. coli i (Hangen D.H. i saradnici, J. Surg. Res.46:195-9, 1989; Stevens, J.H. i saradnici, J. Clin. Invest.77:1812-16, 1986). Kod ljudi sa sepsom, C5a je bio povišen i u korelaciji sa značajno smanjenim stopama preživljavanja zajedno sa otkazivanjem mnogih organa, u poređenju sa onim kod manje ozbiljnih

2

septičnih pacijenata i preživelih (Nakae H. i saradnici, Rez. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol.84:189-95, 1994; Nakae i saradnici, Surg.Today 26:225-29, 1996; Bengtson A. i saradnici, Arch. Surg.123:645-649, 1988). Mehanizme kojima C5a ostvaruje štetne efekte tokom sepse je tek potrebno detaljnije istražiti, ali noviji podaci ukazuju da stvaranje C5a tokom sepse značajno ugrožava urođene imunološke funkcije neutrofila u krvi (Huber-Lang M.S. i saradnici, J. Immunol. 169:3223-31, 2002), njihovu sposobnost da dovedu do “respiratorne eksplozije” i njihovu sposobnost proizvodnje citokina (Riedemann N.C. i saradnici, Immunity 19:193-202, 2003). Pored toga, deluje da proizvodnja C5a tokom sepse ima prokoagulantne efekte (Laudes I.J. i saradnici, Am. J. Pathol.160:1867-75, 2002). Za protein CI INH koji moduliše komplement, takođe je pokazano da je efikasan u životinjskim modelima sepse i ARDS (Dickneite G. Behring Ins. Mitt.93:299-305, 1993).

[0186] Lektinski put takođe može imati ulogu u patogenezi sepse. Pokazano je tako da se MBL vezuje za čitav niz klinički važnih mikroorganizama, uključujući i Gram-negativne i Gram-pozitivne bakterije, kao i da aktivira lektinski put (Neth O. i saradnici, Infect. Immun.68:688, 2000). Lipoteihoična kiselina (LTA) se sve više smatra gram-pozitivnim pandanom LPS-a. Moćan je imunostimulans koji indukuje oslobađanje citokina iz mononuklearnih fagocita i pune krvi (Morath S. i saradnici, J. Exp. Med.

195:1635, 2002; Morath S. i saradnici, Infect. Immun.70:938, 2002). Nedavno je pokazano da se L-fikolin specifično vezuje za LTA izolovanu iz brojnih vrsta Gram-pozitivnih bakterija, uključujući Staphilococcus aureus, i da aktivira lektinski put (Lynch N.J. i saradnici, J. Immunol.172:1198-02, 2004). Pokazano je i da se MBL vezuje za LTA iz Enterococcus spp u kojima je poliglicerofosfatni lanac supstituisan glikozilnim grupama), ali ne i LTA iz devet drugih vrsta, uključujući S. aureus (Polotsky V.Y. i saradnici, Infect. Immun.64:380, 1996).

[0187] Ovde je opisan postupak za lečenje sepse ili stanja proisteklog iz sepse, primenom kompozicije koja sadrži terapijski efektivnu količinu inhibitornog agensa za MASP-2 u farmaceutskom nosaču, subjektu koji boluje od sepse ili stanja koje je posledica sepse, uključujući bez ograničavanja samo na, ozbiljnu sepsu, septični šok, sindrom akutnog respiratornog distresa koji je posledica sepse i sindrom sistemskog inflamatornog odgovora. Srodni postupci su opisani za lečenje drugih poremećaja krvi, uključujući hemoragični šok, hemolitičku anemiju, autoimunu trombotičnu trombocitopenijsku purpuru (TTP), hemolitički uremijski sindrom (HUS), atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS) ili druga destruktivna stanja kosne srži/krvi, primenom kompozicije koja sadrži terapijski efektivnu količinu inhibitornog agensa za MASP-2 u farmaceutskom nosaču, subjektu koji boluje od takvog stanja. Inhibitorni agens za MASP-2 se primenjuje subjektu sistemski, na primer, intra-arterijskom, intravenskom, intramuskularnom, inhalacionom (posebno u slučaju ARDS), supkutanom ili drugom vrstom parenteralne primene, ili potencijalno oralnom primenom u slučaju nepeptidergičnih agenasa. Sastav inhibitornog agensa za MASP-2 se može kombinovati sa jednim ili sa više dodatnih terapijskih agenasa za borbu protiv posledica sepse i/ili šoka. Za uznapredovalu sepsu ili šok, ili stanje distresa koje iz toga proizilazi, inhibitorna kompozicija za MASP-2 može biti adekvanto primenjena u doznom obliku brzog delovanja, poput intravenske ili intra-arterijske isporuke bolusa rastvora koji sadrži kompoziciju inhibitornog agensa za MASP-2. Ponovljena primena može biti izvedena ukoliko to odredi lekar dok se stanje ne razreši.

KOAGULOPATIJE

[0188] Razrađeni su i dokazi o ulozi sistema komplementa u diseminovanoj intravaskularnoj koagulaciji (DIC), kao što je DIC koji nastaje sekundarno u odnosu na značajnu telesnu traumu.

[0189] Prethodne studije su pokazale da C4-/- miševi nisu zaštićeni od povrede bubrežne reperfuzije. (Zhou W. i saradnici, "Predominant role for C5b-9 in renal ischemia/reperfusion injury," J Clin Invest 105:1363-1371 (2000)) Da bi se istražilo da li C4-/- miševi još uvek mogu da aktiviraju komplement bilo putem klasičnog ili lektinskog put, obrt C3 u C4-/- u plazmi je meren u analizama specifičnim bilo klasičan ili lektinski put aktivacije. Iako nije bil o moguće uočiti cepanje C3 prilikom pokretanja aktivacije klasičnim putem, visoko efikasna aktivacija C3 koja je zavisna od lektinskog puta je uočena u serumu sa deficijencijom C4 (SLIKA 30). Može se primetiti da je deponovanje C3b na mananu i zimosanu bilo ozbiljno kompromitovano kod MASP-2-/- miševa, čak i pod eksperimentalnim uslovima, što bi prema mnogim prethodno objavljenim radovima o aktivaciji alternativnog puta, trebalo da bude dozvoljeno za sva tri puta. Kada se koriste isti serumi u bunaricama obloženim imunoglobulinskim kompleksima umesto manana ili zimosana, deponovanje C3b i cepanje faktora B se uočavaju i u MASP-2 /+ mišjim serumima i u MASP-2-/- serumima, ali ne i u serumima osiromašenim za C1q. Navedeno ukazuje da je aktivacija altirantivnog puta olakšana u MASP-2-/- serumima kada je početni C3b opisan klasičnom aktivnošću. SLIKA 30C prikazuje iznenađujuće otkriće da C3 može biti efikasno aktiviran na način koji je zavisan od lektinskog puta u plazmi sa deficijencijom C4.

[0190] Ovo „zaobilaženje C4“se ukida inhibicijom aktivacije lektinskog puta, preinkubacijom plazme sa solubilnim mananom ili manozom.

[0191] Aberantna, neimunska aktivacija sistema komplementa je potencijalno opasna za čoveka i takođe može imati važnu ulogu u aktivaciji hematološkog puta, posebno u situacijama teških trauma u kojima se aktiviraju i inflamatorni i hematološki putevi. Kod normalno zdravih jedinki, konverzija C3 je <5% ukupnog C3 proteina u plazmi. U galopirajućoj infekciji, uključujući septikemiju i bolest imunog kompleksa, konverzija C3 se ponovo uspostavlja na oko 30% sa nivoima komplementa često nižim od normalnih, usled povećanog korišćenja i promena u distribuciji pula komponenti. Neposredna aktivacija puta sa C3 veća od 30% generalno proizvodi jasne kliničke dokaze vazodilatacije i gubitka tečnosti u tkivima. Kod konverzija C3 iznad 30%, pokretački mehanizmi pretežno nisu imunski, a

4

rezultujuće kliničke manifestacije su štetne za pacijenta. Izgleda stoga da su nivoi komplementa C5 u zdravlju i kod kontrolisanog oboljenja znatno stabilniji od C3. Značajno smanjenje i/ili konverzija nivoa C5 su povezani sa reakcijom pacijenta na abnormalnu politraumu (npr. saobraćajne nesreće) i verovatan razvoj sindroma šoka pluća. Prema tome, bilo koji dokaz o aktivaciji komplementa C3 iznad 30% vaskularnog pula ili o bilo kakvoj uključenosti C5, ili oba, mogu biti smatrani verovatnim pretečom štetne patološke promene kod pacijenta.

[0192] I C3 i C5 oslobađaju anafilatoksine (C3a i C5a) koji deluju na mastocite i bazofile da oslobađaju vazodilatacione hemikalije. Njima se postavljaju hemotaksični gradijenti kojima se polimorfonuklearne ćelije (PMN) usmeravaju do centra imunskih poremećaja (blagotvoran odgovor), ali se ovde uvodi irazlika pošto je C5 sa specifičnim dejstvom na razlikuju jer C5a ima specifično dejstvo tipa nakupljanja (agregiranja) ovih fagocitnih ćelija, čime se sprečava njihovo nasumično kretanje od mesto reakcije. U normalnoj kontroli infekcije, C3 aktivira C5. Međutim, u politraumi, deluje da je C5 široko aktiviran i da sistemski generiše C5a anafilatoksine. Ovakva nekontrolisana aktivnost prouzrokuje nakupljanje polimorfa u vaskularnom sistemu, a takve “grudvice” se zatim pomeraju u kapilare pluća, koji se začepe i generišu lokalne štetne efekte kao rezultat oslobađanja superoksida. Bez želje da bude ograničeno teroijom, mehanizam je verovatno važan u patogenezi akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS), iako je ovo stanovište nedavno osporeno. In vitro može biti pokazano da su C3a anafilatoksini snažni agregatori trombocita, ali njihovo učešće in vivo je manje definisano i oslobađanje supstanci iz trombocita i plazmina u sanaciji rane može samo sekundarno uključivati komplement C3. Moguće je takođe da je produženo povećanje aktivacije C3 neophodno za generisanje DIC.

[0193] Pored prethodno opisanih ćelijskih i vaskularnih efekata aktivirane komponente sistema komplementa koji bi mogli objasniti vezu između traume i DIC-a, nova naučna otkrića su identifikovala direktne molekulske veze i međusobne funkcionalne interakcije između sistema komplementa i koagulacije. Iz studija na miševima sa deficijencijom C3 su dobijeni podaci koji ovo podržavaju. Pošto je C3 komponenta koju dele svi putevi aktivacije komplementa, predviđalo se da miševima sa deficijencijom C3 nedostaju sve funkcije komplementa. Iznenađujuće je, međutim, što su miševi sa deficijencijom C3 savršeno sposobni da aktiviraju terminalnog komponente sistema komplementa. (Huber-Lang M. i saradnici, "Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway", Nat. Med 12:682-687 (2006)) Opsežne studije su ukazale da je aktivacija terminalnih komponenti sistema komplementa koja je nezavisna od C3, posredovana trombinom, enzimom koji ograničava brzinu koagulacione kaskade. (Huber i saradnici, 2006) Molekulske komponente koje posreduju u aktivaciji trombina nakon početne aktivacije komplementa ostaju ipak nerazjašnjene.

[0194] Pronalazači predmetne specifikacije su razjasnili ono za šta se veruje da je molekulska osnova međusovne interakcije između kaskada komplementa i zgrušavanja i identifikovali su MASP-2 kao centralnu kontrolnu tačku koja povezuje ova dva sistema. Biohemijske studije specifičnosti supstrata MASP-2 su identifikovale protrombin kao mogući supstrat, pored dobro poznatih proteina sistema komplementa C2 i C4. MASP-2 specifično cepa protrombin na funkcionalno relevantnim mestima, stvarajući trombin, enzim koji ograničava brzinu u kaskadi koagulacije. (Krarup A. i saradnici, "Simultaneous activation of complement i coagulation by MBL-associated serine protease 2", PLoS. ONE. 2:e623 (2007)) Trombin generisan sa MASP-2 je sposoban da pospeši taloženje fibrina u definisanom rekonstituisanom in vitro sistemu, što ukazuje na funkcionalnu važnost cepanja MASP-2. (Krarup i saradnici, 2007) Kao što je ovde diskutovano u primerima koji su navedeni u nastavku teksta, pronalazači su dodatno potvrdili fiziološki značaj ovog otkrića, dokumentovanjem aktivacije trombina u normalnom serumu glodara nakon aktivacije lektinskog puta, a pokazali su i da se ovaj proces blokira neutrališućim MASP-2 monoklonskim antitelima.

[0195] MASP-2 može predstavljati centralnu tačku grananja u lektinskom putu, koja je sposobna da pospeši aktivaciju i sistema komplementa i koagulacijonog sistema. Pošto aktivacija lektinskog puta predstavlja fiziološki odgovor na mnoge vrste traumatičnih povreda, pronalazači ovog pronalaska veruju da istovremena sistemska inflamacija (posredovana komponentama komplementa) i diseminovana koagulacija (posredovana putem zgrušavanja) mogu biti objašnjene kapacitetom MASP-2 da aktivirati oba puta. Ovaj nalaz jasno ukazuje na ulogu MASP-2 u generisanju DIC-a i na terapijsku korist inhibicije MASP-2 u lečenju ili prevenciji DIC-a. MASP-2 može obezbediti molekulsku vezu između sistema komplementa i sistema koagulacije, a aktivacija lektinskog puta do koje dolazi u uslovima traume može direktno inicirati aktivaciju sistema koagualcije preko MASP-2-trombin ose, što obezbeđuje mehanističku vezu između traume i DIC. Prema primerima koji su ovde opisani, inhibicija MASP-2 bi inhibirala aktivaciju lektinskog puta i smanjila obrazovanje oba anafilatoksina C3a i C5a. Veruje se da je produženo podizanje aktivacije C3 neophodna za generisanje DIC.

[0196] Mikrocirkulatorna koagulacija (ugrušci u kapilarima i malim krvnim sudovima) javlja se u uslovima poput septičkog šoka. Ustanoveljana je i uloga lektinskog puta u septičnom šoku, što dokazuje zaštićeni fenotip kod MASP-2 (-/-) mišjeg modela sepse koji je opisan u Primeru 17 i na SLIKAMA 18 i 19. Dodatno, kao što je prikazano u Primeru 15 i na SLIKAMA 16A i 16B, MASP-2 (-/-) miševi su zaštićeni u lokalizovanom Švarcmanovom reakcionom modelu diseminovane intravaskularne koagulacije (DIC), modelu lokalizovane koagulacije u mikronskim krvnim sudovima.

V. INHIBITORNI AGENSI ZA MASP-2

[0197] Ovde su opisani postupci inhibiranja aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 kod subjekta koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije trombotičnu mikroangiopatiju. Inhibitorni agensi za MASP-2 se primenjuju u količini koja je efektivna da inhibira aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2 kod živog subjekta. U praksi ovog primera koji je ovde opisan, reprezentativni inhibitori MASP-2 obuhvataju: molekule koji inhibiraju biološku aktivnost MASP-2 (kao što su inhibitori tipa malih molekula, anti-MASP-2 antitela ili blokirajući peptidi koji interaguju sa MASP-2 ili ometaju interakciju tipa protein-protein) i molekule koji smanjuju ekspresiju MASP-2 (kao što su antisens molekuli nukleinskih kiselina za MASP-2, RNKi molekuli specifični za MASP-2 i MASP-2 ribozimi), čime se sprečava da MASP-2 aktivira lektinski put komplementa lektina. Agensi za inhibiciju MASP-2 mogu biti upotrebljeni samostalno kao primarna terapija ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima kao adjuvansna terapija da bi se poboljšale terapijske koristi drugih medicinskih tretmana.

[0198] Inhibicija aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 karakteriše najmanje jedna od sledećih promena u komponenti sistema komplementa koja se dešava kao rezultat primene inhibitornog agensa za MASP-2 u skladu sa postupcima koji su ovde opisani: inhibicija stvaranja ili proizvodnje proizvoda sistema aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 poput C4b, C3a, C5a i/ili C5b-9 (MAC) (izmereno, na primer, kao što je opisano u Primeru 2), smanjenje aktivacije komplementa utvrđeno u hemolitičkoj analizi upotrebom nesenzibilisanih crvenih krvnih zrnaca zeca ili zamorca (izmereno, na primer, kao što je opisano u Primeru 33), smanjenje cepanja C4 i deponovanja C4b (izmereno, na primer, kao što je opisano u Primeru 2) ili smanjenje cepanja C3 i deponovanja C3b (izmereno, na primer, kao što je opisano u Primeru 2).

[0199] Kao što je ovde opisano, koriste se inhibitorni agensi za MASP-2 koji su efektivni u inhibiranju sistema aktivacije komplementa zavisne od MASP-2. Inhibitorni agensi za MASP-2 koji su korisni u praksi ovde opisanih primera obuhvataju, na primer, anti-MASP-2 antitela i njihove fragmente, inhibitorne peptide za MASP-2, male molekule, solubilne receptore za MASP-2 i inhibitore ekspresije. Inhibitorni agensi za MASP-2 mogu inhibirati sistem aktivacije komplementa zavisan od MASP-2, blokiranjem biološke funkcije MASP-2. Na primer, inhibitorni agens može efektivno blokirati MASP-2 interakcije tipa protein-protein, ometati dimerizaciju ili udruživanje MASP-2, blokirati vezivanje Ca<2+>, ometati serin proteazno aktivno mesto MASP-2 ili može sanjiti ekspresiju MASP-2 proteina.

[0200] U pojedinim slučajevima, inhibitorni agensi za MASP-2 selektivno inhibiraju aktivaciju komplementa sa MASP-2, ostavljajući sistem aktivacije komplementa zavisan od C1q funkcionalno intaktnim.

[0201] U jednom slučaju, inhibitorn agens za MASP-2 koji je od koristi u postupcima koji su ovde opisani, predstavlja inhibitorni agens specifičan za MASP-2 koji se specifično vezuje za polipeptid koji sadrži SEQ ID NO:6, sa afinitetom koji je najmanje deset puta veći u odnosu na druge antigene u sistemu komplementa. U drugom slučaju, inhibitorni agens za MASP-2 se specifično vezuje za polipeptid koji sadrži SEQ ID NO:6 sa afinitetom vezivanja koji je najmanje 100 puta veći nego za druge antigene u sistemu komplementa. Afinitet vezivanja inhibitornog agensa za MASP-2 može biti određen upotrebom odgovarajućeg testa vezivanja.

[0202] MASP-2 polipeptid karakteriše molekulska struktura slična MASP-1, MASP-3 i C1r i C1s, proteazama C1 sistema komplementa. Molekul cDNK naveden u SEQ ID NO:4 kodira reprezentativan primer MASP-2 (koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:5) i obezbeđuje humani MASP-2 polipeptid sa vodećom sekvencom (ak 1 -15) koji se cepi nakon sekrecije, što rezultuje zrelim oblikom humanog MASP-2 (SEQ ID NO:6). Kao što je prikazano na SLICI 2, humani MASP-2 gen obuhvata dvanaest egzona. Humana cDNK za MASP-2 je kodirana egzonima B, C, D, F, G, H, I, J, K I L. Alternativnom obradom nastaje protein od 20 kDa označen kao protein povezan sa MBL od 19 ("MAp19", takođe označen kao "sMAP") (SEQ ID NO:2), kodiran sa (SEQ ID NO:1) i to sa egzona B, C, D i E, kao što je prikazano na SLICI 2. Molekul cDNK naveden u SEQ ID NO:50 kodira mišji MASP-2 (koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:51) i obezbeđuje mišji MASP-2 polipeptid sa vodećom sekvencom koja se cepa nakon sekrecije, što rezultuje zrelim oblikom mišjeg MASP-2 (SEQ ID NO:52). Molekul cDNK naveden u SEQ ID NO:53 kodira pacovski MASP-2 (koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:54) i obezbeđuje pacovski MASP-2 polipeptid vodećom sekvencom koja se cepa nakon sekrecije, što rezultuje zrelim oblikom pacovskog MASP-2 (SEQ ID NO:55).

[0203] Stručnjacima iz oblasti tehnike će biti jasno da sekvence prijavljene u SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:50 i SEQ ID NO:53 predstavljaju pojedinačne alele humanog, mišjeg i pacovskog MASP-2, tim regom, kao i da se očekuje prisustvo alaskih variajcija i alternativne obrade. Alelske varijante nukleotidnih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:50 i SEQ ID NO:53, uključujući one koje sadrže “tihe” mutacije i one u kojima mutacije dovode do promene u aminokiselinskih sekvenci, pripadaju obimu predmetnog pronalaska. Alelske varijante MASP-2 sekvence mogu biti klonirane pretragom cDNK ili genomskih biblioteka iz različitih individua prema standardnim procedurama.

[0204] Domeni humanog MASP-2 proteina (SEQ ID NO:6) su prikazani na SLIKAMA 1 i 2A i obuhvataju N-terminalni C1r/C1s/ Vegf-a morskog ježa/morfogenog proteina kostiju (CUBI) domen (ak 1-121 iz SEQ ID NO:6), domen sličan domenu epidermalnog faktora rasta (ak 122-166), drugi CUBI domen (ak 167-293), kao i tandem domena kontrolnog proteina komplementa i serin proteaznog domena. Rezultat alternativne obrade MASP 2 gena je MAp19 koji je prikazan na SLICI 1. MAp19 je neenzimski protein koji sadrži N-terminalni CUB1-EGF region iz MASP-2 sa četiri dodatna ostatka (EQSL) izvedena iz egzona E, kao što je prikazano na SLICI 1.

[0205] Pokazano je da se nekoliko proteina vezuje za ili interaguje sa MASP-2 posredstsom interakcija tipa protein-protein. Na primer, poznato je da se MASP-2 vezuje za i da obrazuje komplekse koji su zavisni od Ca<2+>sa, lektinskim proteinima MBL, H-fikolinom i L-fikolinom. Pokazano je takođe svaki kompleks MASP-2 i lektina aktivira komplement putem cepanja proteina C4 i C2 koje je zavisno od MASP-2 (Ikeda K. i saradnici, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita M. i saradnici, J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita M. i saradnici, J. Immunol.168:3502-3506, 2002). Studije su dalje pokazale da su CUB1-EGF domeni MASP-2 od suštinskog značaja za udruživanje MASP-2 sa MBL (Thielens N.M. i saradnici, J. Immunol.166:5068, 2001). Takođe je pokazano da CUB1EGFCUBII domeni posreduju u dimerizaciji MASP-2, koja je potrebna za obrazovanje aktivnog MBL kompleksa (Wallis R. i saradnici, J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000). Agensi koji inhibiraju MASP-2 mogu stoga biti identifikovani kao oni koji se vezuju za ili ometaju ciljne regione MASŠ-2 za koje je poznato da su od važnosti za aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2.

ANTI-MASP-2 ANTITELA

[0206] Inhibitorni agens za MASP-2 obuhvata anti-MASP-2 antitelo koje inhibira sistem aktivacije komplementa zavisan od MASP-2. Ovde opisana anti-MASP-2 antitela od koristi u ovom slučaju, obuhvataju poliklonska, monoklonska ili rekombinantna antitela izvedena iz bilo kog antitela koje proizvode sisari i mogu biti multispecifična, himerna, humanizovana, anti-idiotipska i fragmenti antitela. Fragmenti antitela obuhvataju Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv fragmente, scFv fragmente i jednolančana antitela, kao što je ovde dodatno opisano.

[0207] U literaturi je opisano nekoliko anti-MASP-2 antitela, od kojih su neka navedena ispod, u TABELI 1. Ova prethodno opisana anti-MASP-2 antitela mogu biti skrinovana na sposobnost inhibiranja sistema aktivacije komplementa zavisnog od MASP-2, upotrebom analiza koje su ovde opisane. Na primer, identifikovana su anti-pacovska-MASP-2 Fab2 antitela koja blokiraju aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2, kao što je ovde detaljnije opisano u Primerima 10 i 11. Jednom kada se anti-MASP-2 antitelo identifikuje koje ono koje deluje kao inhibitorni agens za MASP-2, ono može biti upotrebljen za proizvodnju anti-idiotipskih antitela i upotrebljeno za identifikaciju drugih molekula koji se vezuju za MASP-2, kao što je dodatno opisano u nastavku teksta.

TABELA 1: ANTITELA SPECIFIČNA ZA MASP-2 IZ LITERATURE

ANTI-MASP-2 ANTITELA SA SMANJENOM EFEKTORSKOM FUNKCIJOM

[0208] Anti-MASP-2 antitela mogu imati smanjenu efektorsku funkciju da bi se smanjila inflamacija koja može nastati iz aktivacije klasičnog puta aktivacije komplementa. Pokazanoje da je za sposobnost IgG molekula da pokrene klasičan put aktivacije komplementa odgovoran Fc deo molekula (Duncan A.R. i saradnici, Nature 332:738-7401988). Molekuli IgG-a u kojima je Fc deo molekula bio uklonjen enzimskim cepanjem lišeni su ove efektorske funkcije (pogledati Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988). Shodno tome, antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom mogu biti generisana kao rezultat nedostatka Fc dela molekula putem genetičkog inženjeringa Fc sekvence koja efektorsku funkciju svodi na minimum ili tako što će predstavljati humani bilo IgG2ili IgG4izotipa.

[0209] Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom mogu biti proizvedena standardnom molekularno-biološkom manipulacijom Fc dela iz IgG teških lanaca, kao što je ovde opisano u Primeru 9 i takođe opisano u Jolliffe i saradnici, Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, 1993, kao i u Rodrigues i saradnici, J. Immunol. 151:6954-6961, 1998. Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom takođe obuhvataju humane IgG2 i IgG4 izotipove koji su sa smanjenom sposobnošću da aktiviraju komplement i/ili da interaguju sa Fc receptorima (Ravetch J.V. i saradnici, Annu. Rev. Immunol.9:457-492, 1991; Isaacs J.D. i saradnici, J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel J.G. i saradnici, Immunol. Today 14:215-221, 1993). Humanizovana ili potpuno humana antitela specifična za humani MASP-2, koja se sastoje od IgG2 ili IgG4 izotipova, mogu biti proizvedena jednim od nekoliko postupaka koji su poznati prosečno iskusnom stručnjaku iz oblasti tehnike, kao što je opisano u Vaughan T.J. i saradnici, Nature Biotechnical 16:535-539, 1998.

PROIZVODNJA ANTI-MASP-2 ANTITELA

[0210] Anti-MASP-2 antitela mogu biti proizvedena upotrebom MASP-2 polipeptida (npr. MASP-2 pune dužine) ili upotrebom antigenih peptida koji nose epitope MASP-2 (npr. deo MASP-2 polipeptida). Imunogeni peptidi mogu biti veoma mali kao što je pet aminokiselinskih ostataka. Na primer, polipeptid MASP-2 koji uključuje ceokupnu aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, može biti upotrebljen za indukovanje anti-MASP-2 antitela korisnih u postupku koji je ovde opisan. Određeni MASP-2 domeni za koje je poznato da su uključeni u interakcije tipa protein-protein, kao što su CUBI i CUBIEGF domeni, kao i region koji obuhvata serin proteazno aktivno mesto, mogu biti eksprimirani kao rekombinantni polipeptidi, kao što je opisano u Primeru 3, i upotrebljeni kao antigeni. Pored toga, peptidi koji sadrže deo MASP-2 polipeptida od najmanje 6 aminokiselina (SEQ ID NO:6) takođe su korisni za indukovanje MASP-2 antitela. Dodatni primeri antigena izvedenih iz MASP-2 koji su korisni za indukciju antitela na MASP-2 opisani su u nastavku, u TABELI 2. Peptidi i polipeptidi MASP-2 koji su upotrebljavani za proizvodnju antitela mogu biti izolovani kao prirodni polipeptidi ili rekombinantni ili sintetski peptidi i katalitički neaktivni rekombinantni polipeptidi, kao što je MASP-2A, kako je dodatno opisano u Primerima 5-7. U pojedinim primerima ovog slučaja koji su ovde opisani, antitela na MASP-2 se dobijaju upotrebom transgenog soja miša, kao što je opisano u Primerima 8 i 9 i dodatno opisano u nastavku.

[0211] Antigeni korisni za proizvodnju anti-MASP-2 antitela takođe obuhvataju fuzione polipeptide, poput fuzija MASP-2 ili njegovog dela sa imunoglobulinskim polipeptidom ili sa proteinom koji vezuje maltozu. Polipeptidni imunogen može biti molekul pune dužine ili njegov deo. Ukoliko je polipeptidni deo sličan haptenu, prednost takvog dela može biti da može biti spojen ili povezan sa makromolekulskim nosačem (kao što je hemocijanin prilepka (KHL), albumin goveđeg seruma (BSA) ili tetanusni toksoid) za imunizaciju.

1

TABELA 2: ANTIGENI IZVEDENI IZ MASP-2

POLIKLONSKA ANTITELA

[0212] Poliklonska antitela na MASP-2 mogu biti pripremljana imunizacijom životinje sa MASP-2 polipeptidom ili njegovim imunogenim delom, upotrebom postupaka koji su dobro poznati prosečno iskusnim stručnjacima iz oblasti tehnike. Pogledati, na primer, Green i saradnici, "Production of Polyclonal Antisera", u Immunochemical Protocols (Manson, ur.), strana 105, i kao što je dodatno opisano u Primeru 6. Imunogenost MASP-2 polipeptida može biti povećana upotrebom adjuvansa, uključujući mineralne gelove poput aluminijum hidroksida ili Frojndovog adjuvansa (kompletnog ili nekompletnog), površinski aktivne supstance kao što su to lizolecitin, pluronski polioli, polianjoni, uljane emulzije, hemocijanin prilepka i dinitrofenol. Poliklonska antitela se obično proizvode u životinjama kao što su konji, krave, psi, pilići, pacovi, miševi, zečevi, zamorci, koze ili ovce. Alternativno,

2

anti-MASP-2 antitelo korisno u predmetnom opisu mogu biti izvedeni i iz primata drugačijih od čoveka. Opšte tehnike za dobijanje dijagnostički i terapijski korisnih antitela kod babuna mogu se naći, na primer, u Goldenberg i saradnici, International Patent Publication No. WO 91/11465, i u Losman M.J. i saradnici, Int. J. Cancer 46:310, 1990. Serumi koji su sadržavali ovakva imunološki aktivna antitela su zatim proizvedeni iz krvi takvih imunizovanih životinja, upotrebom standardnih procedrua koje su dobro poznate u oblasti tehnike.

MONOKLONSKA ANTITELA

[0213] U pojedinim slučajevima, inhibitorni agens je anti-MASP-2 monoklonsko antitelo. Anti-MASP-2 monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena samo na jedan eptop iz MASP-2. Kao što se ovde upotreboljava, modifikujući termin "monoklonsko" ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela i nije ograničen tako da zahteva proizvodnju antitela pojedinim određenim postupkom. Monoklonska antitela mogu biti dobijena upotrebom bilo koje tehnike koja obezbeđuje proizvodnju molekula antitela kontinualnom ćelijskom linijom u kulturi, kao što je to hibridoma postupak opisan od strane Kohler-a G. i saradnika, Nature 256:495, 1975, ili mogu biti napravljena rekombinantnim DNK postupcima (pogledati, npr. U.S. patent br. 4,816,567, autora Cabilly). Monoklonska antitela takođe mogu biti izolovana iz biblioteka faga antitela, upotrebom tehnika opisanih u Clackson T. i saradnici, Nature 352:624-628, 1991, i Marks J.D. i saradnici, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991. Takva antitela mogu biti bilo koje imunoglobulinske klase, uključujući IgG, IgM, IgE, IgA, IgD i bilo koju od njihovu podklasa.

[0214] Na primer, monoklonska antitela mogu biti dobijena injeciranjem u odgovarajućeg sisara (npr. BALB/c miševe) kompozicije koja sadrži MASP-2 polipeptid ili njegov deo. Nakon unapred određenog vremenskog perioda, splenociti se uklanjaju iz miševa i resuspenduju u medijumu za rast ćelijske kulture. Splenociti se zatim fuzionišu sa imortalizovanom ćelijskom linijom da bi se obrazovao hibridom. Obrazovani hibridomi se gaje u ćelijskoj kulturi, nakon čega se podvrgavani skriningu u pogledu njihove sposobnosti da proizvode monoklonsko antitelo na MASP-2. Primer koji dodatno opisuje proizvodnju monoklonskih anti-MASP-2 antitela je opisan u Primeru 7. (Pgledati takođe Current Protocols in Immunology, tom 1. John Wilex & Sons, str.2.5.1-2.6.7, 1991.)

[0215] Humana monoklonska antitela mogu biti dobijena upotrebom transgenih miševa koji su konstruisani tako da proizvode specifična humana antitela u odgovoru na antigeni izazov. U ovoj tehnici, elementi humanih lokusa imunoglobulinskih teških i lakih lanaca su uvedeni u sojeve miševa izvedene iz embrionske linije matičnih ćelija koje su sadržavale ciljane prekide lokusa endogenih imunoglobulinskih teških lanca i lakihg lanca. Transgeni miševi mogu sintetisati humana antitela specifična za humane antigene, kao što su to ovde opisani MASP-2 antigeni, a ovi miševi mogu biti upotrebljeni i za proizvodnju hibridoma koji sekretuju humana MASP-2 antitela fuzijom B-ćelija iz takvih životinja sa odgovarajućih mijelomskim ćelijskim linijama, upotrebom konvencionalne Kohler-Milstein-ove tehnologije, kao što je dodatno opisano u Primeru 7. Transgeni miševi sa humanim imunoglobulinskim genomom su komercijalno dostupni (npr. od kompanija Abgenix, Inc. Fremont, CA, i Medarex, Inc. Annandale, N.J.). Postupci za dobijanje humanih antitela iz transgenih miševa su opisani, na primer, od strane Green L. L. i saradnici, Nature Genet.7:13, 1994; Lonberg N. i saradnici, Nature 368:856, 1994; i Taylor L. D. i saradnici, Int. Immun.6:579, 1994.

[0216] Monoklonska antitela mogu biti izolovana i prečišćena iz kultura hibridoma razovrsnim dobro utanovljenim tehnikama. Takve tehnike izolovanja obuhvataju afinitetnu hromatografiju sa Protein-A sefarozom, hromatografiju sa isključivanjem po veličini i jono-izmenjivačku hromatografiju (pogledati, na primer, Coligan na stranicama 2.7.1-2.7.12 i stranicama 2.9.1-2.9.3; Baines i saradnici, "Purification of Imunoglobulin G (IgG)", u Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc. tom 10, str.79-104, 1992).

[0217] Jednom proizvedena, poliklonska, monoklonska ili antitela izvedena iz faga se najpre analiziraju u pogledu specifičnosti vezivanja MASP-2. Raznovrsne analize koje su poznate stručnjacima iz obasti tehnike, mogu biti upotrebljene za detektovanje antitela koja se specifično vezuju za MASP-2. Primeri analiza obuhvataju imunoblot ili analizu imunoprecipitacijom, standardnim postupcima (npr. kao što je opisano u Ausubel i saradnici), imunoelektroforezu, imunosorbentnu analizu povezanu sa enziom, dot blot, analize inhibicije ili kompeticije i sendvič analize (kao što je opisano Harlow i Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Jednom kada se identifikuju antitela koja se specifično vezuju za MASP-2, ispituje se sposobnost anti-MASP-2 antitela da funkcionišu kao inhibitorn agens za MASP-2 u jednoj od nekoliko analiza kao što je, na primer, analiza cepanja C4 specifičnog za lektinski put (opisana u Primeru 2), analiza deponovanja C3b (opisana u Primeru 2) ili analiza deponovanja C4b (opisana u Primeru 2).

[0218] Afinitet anti-MASP-2 monoklonskih antitela može lako biti određena od strane prosečno iskusnog stručnjaka iz oblasti tehnike (pogledati, npr. Scatchard A., NY Acad. Sci.51:660-672, 1949). U jednom slučaju, anti-MASP-2 monoklonska antitela korisna za postupke koji su ovde opisani, vezuju se za MASP-2 sa afinitetom vezivanja od <100 nM, poželjno <10 nM i najpoželjnije <2 nM. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno monoklonsko antitelo korisno u postupcima koji su ovde opisani je MASP-2 inhibitorno monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu antitelo sadrži (I) (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 iz SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku

4

sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70, ili (II) njegovu varijantu koja sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 90% identičan SEQ ID NO: 67 (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:67) i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 90% identičan (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:70.

HIMERNK/HUMANIZOVANA ANTITELA

[0219] Monoklonska antitela korisna u postupku koji je ovde opisan obuhvataju himerna antitela u kojem je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca(lanaca) identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili koja pripadaju nekoj drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela (U.S. Patent No.4,816,567, Cabilly; i Morrison S.L. i saradnici, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).

[0220] Jedan oblik himernog antitela koji je koristan u opisu, je humanizovano monoklonsko anti-MASP-2 antitelo. Humanizovani oblici antitela koja nisu humana (npr. mišja su) su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz imunoglobulina različitog od humanog. Humanizovana monoklonska antitela se proizvode transferom regiona koji određuju komplementarnost (CDR) koji nisu humani (npr. mišji su), iz varijabilnih teških i lakih lanaca mišjih imunoglobulina u humani varijabilni domen. Obično se ostaci humanih antitela zatim supstituišu u uokvirujuće regione njihovih parnjaka koji nisu humani. Pored toga, humanizovana antitela mogu sadržavati ostatke koji se ne mogu naći ni u antitelu primaocu ni u antitelu donoru. Ovakve modifikacije se uvode da bi se dodatno fino podesile performanse antitela. U principu, humanizovano antitelo će sadržavati suštinski sve od najmanje jednog, a obično dva varijabilna domena u kojima sve ili suštinski sve od hipervarijabilnih petlji odgovaraju onima iz imunoglobulina koji nije humani, dok su svi ili suštinski svi Fv uokvirujući regioni oni iz humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo će takođe po izboru sadržavati najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), obićno onaj iz humanog imunoglobulina. Za dodatne detalje, pogledati Jones P.T. i saradnici, Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L. i saradnici, Nature 332:323-329, 1988; i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596, 1992.

[0221] Humanizovana antitela korisna u svrhe koje su ovde opisane, uključuju humana monoklonska antitela koja sadrže najmanje CDR3 region koji vezuje MASP-2. Pored toga, Fc delovi mogu biti zamenjeni tako da proizvode IgA ili IgM, kao i humana IgG antitela. Takva humanizovana antitela su posebno korisna za kliničku upotrebu pošto će specifično prepoznavati humani MASP-2 ali neće izazivati imunski odgovor kod ljudi na sopstvena antitela. Posledično, ovakva antitela više odgovaraju za in vivo primenu kod ljudi, posebno kada je potrebna ponovljena ili dugotrajna primena.

[0222] Primer proizvodnje humanizovanog anti-MASP-2 antitela iz mišjeg anti-MASP-2 monoklonskog antitela je ovde opisan u Primeru 6. Tehnike proizvodnje humanizovanih monoklonskih antitela su takođe opisane, na primer, u Jones P.T. i saradnici, Nature 321:522, 1986; Carter P. i saradnici, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, J.S. Crit. Rev. Biotech.12:437, 1992; Singer I.I. i saradnici, J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ur.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc. 1995; Kelley, "Engeneering Therapeutic Antibodies", u Protein Engineering: Principles i Practice, Cleland i saradnici (ur.), John Wiley & Sons, Inc. str.399-434, 1996; i u U.S. Patent No.5,693,762, autora Queen, 1997. Dodatno, postoje komercijalni entiteti koji sintetišu humanizovana antitela iz specifičnih regiona mišjih antitela, kao što je od kompanije Protein Design Labs (Mountain View, CA).

REKOMBINANTNA ANTITELA

[0223] Anti-MASP-2 antitela takođe mogu biti napravljena upotrebom rekombinantnih postupaka. Na primer, humana antitela mogu biti napravljena upotrebom ekspresionih biblioteka humanih imunoglobulina (dostupne, na primer, od kompanije Stratagene, Corp. La Jolla, CA) da bi se proizveli fragmenti humanih antitela (VH, VL, Fv, Fd, Fab ili F(ab')2). Ovakvi fragmenti se zatim upotrebljavaju za konstrukciju potpuno humanih antitela, upotrebom tehnika koje su slične onima za proizvodnju himernih antitela.

ANTI-IDIOTIPSKA ANTITELA

[0224] Kada se identifikujU MASP-2 antitela sa željenom inhibitornom aktivnošću, ova antitela mogu biti upotrebljena za generisanje anti-idiotipskih antitela koja liče na deo MASP-2, upotrebom tehnika koje su dobro poznate u oblasti tehnike. Polgedati, npr. Greenspan N.S. i saradnici, FASEB J. 7:437, 1993. Na primer, antitela koja se vezuju za MASP-2 i kompetitivno inhibiraju interakciju MASP-2 proteina potrebnu za aktivaciju komplementa, mogu biti upotrebljena za generisanje anti-idiotipova koji su nalik mestu vezivanja za MBL na MASP-2 proteinu i stoga se vezuju i neutrališu vezujući ligand za MASP-2, kao što je, na primer, MBL.

IMUNOGLOBULINSKI FRAGMENTI

[0225] Inhibitorni agensi za MASP-2 od koristi u postupku koji je ovde opisan, obuhvataju ne samo intaktne imunoglobulinske molekule, već i dobro poznate fragmente uključujućo Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2i Fv fragmente, scFv fragmente, dimerna antitela, linearna antitela, molekule jednolančanih antitela i multispecifična antitela obrazovana od fragmenata antitela.

[0226] Dobro je poznato u oblasti tehnike da je samo mali deo molekula antitela, paratop, uključen u vezivanje antitela za njegov epitop (pogledati, npr. Clark W.R. The Experimental Foundations of Modem Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986). pFc' i Fc regioni antitela su efektori klasičnog puta komplementa, ali nisu uključeni u vezivanje antigena. Antitelo iz koga je pFc' region enzimski isečen ili koje je proizvedeno bez pFc' regiona, označava se kao F(ab')2fragment i zadržava oba mesta vezivanja antigena iz intaktnog antitela. Izolovan F(ab')2fragment se označava ko bivalentan monoklonski fragment zbog njegova dva mesta vezivanja antigena. Na sličan način, antitelo iz koga je Fc region enzimski uklonjen isecanjem ili koje je proizvedeno bez Fc regiona, označeno je kao Fab fragment, i zadržava jedno od mesta vezivanja antigena iz intaktnog molekula antitela.

[0227] Fragmenti antitela mogu biti dobijeni proteolitičkom hidrolizom, kao što je digestija celokupnih antitela pepsinom ili papainom, konvencionalnim postupcima. Na primer, fragmenti antitela mogu biti proizvedeni enzimskim cepanjem antitela sa pepsinom da se obezbedio 5S fragment označen kao F(ab')2. Ovaj fragment će biti dodatno podvrgnut cepanju upotrebo tiolskih redukujućih agenasa da bi se proizveli 3.5S Fab' monovalentni fragmenti. Po izboru, reakcija cepanja može biti izvedena upotrebom blokirajuće grupe za sulfhidrilne grupe koje su rezultat cepanja disulfidnih veza. Kao alternativa, enzimsko cepanje upotrebom pepsina proizvodi direktno dva monovalentna Fab fragmenta i Fc fragment. Ovi postupci su opisan, na primer, u U.S. Patent No.4,331,647, Goldenberg; Nisonoff A. i saradnici, Arch. Biochem. Biophis. 89:230, 1960; Porter R.R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman i saradnici, U Methods in Enzimology 1:422, Academic Press, 1967; i Coligan na stranicama 2.8.1-2.8.10 i 2.10.-2.10.4.

[0228] U pojedinim slučajevima, upotreba fragmenata antitela kojima nedostaje Fc region je poželjna da bi se izbegla aktivacija klasičnog puta komplementa koji se pokreće nakon vezivanja Fc za Fcγ receptor. Postoji nekoliko postupaka kojima se može proizvesti MoAt koje zaobilazi interakciju sa Fcγ receptorom. Na primer, Fc region monoklonskog antitela se može ukloniti hemijski upotrebom delimične digestije proteolitičkim enzimima (kao što je digestija ficinom), čime se generišu, na primer, fragmenti antitela koji vezuju antigen poput Fab ili F(ab)2fragmenata (Mariani M. i saradnici, Mol. Immunol.28:69-71, 1991). Alternativno, humani γ4 IgG izotip, koji se ne vezuje sa Fcγ receptore, može biti upotrebljen tokom konstruisanja humanizovanog antitela, kao što je ovde opisano. Antitela, jednolančana antitela i domeni koji vezuju antigen kojima nedostaje Fc domen mogu takođe biti konstruisani upotrebom rekombinantnih tehnika koje su ovde opisane.

FRAGMENTI JEDNOLANČANIH ANTITELA

[0229] Alternativno, mogu biti kreirani molekuli za vezivanje u vidu jedinstvenog peptidnog lanca koji su specifični za MASP-2, u kojima su Fv regioni teškog i lakog lanca povezani. Fv fragmenti mogu biti povezani peptidnim linkerom radi obrazovanja jednolančanog proteina koji vezuje antigen (scFv). Ovakvi jednolančani proteini koji vezuju antigen se pripremaju konstruisanjem strukturnog gena koji sadrži DNK sekvence koje kodiraju VHi VLdomene povezane oligonukleotidom. Strukturni gen se zatim insertuje u ekspresioni vektor, koji se naknadno uvodi u ćeliju domaćina, kao što je E. coli. Rekombinantne ćelije domaćini sintetišu jedinstveni polipeptidni lanac sa linkerskim polipeptidomm koji premošćava dva V domena. Postupci za proizvodnju scFvs opisani su, na primer, u Whitlow i saradnici, "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird i saradnici, Science 242:423, 1988; U.S. Patent No.4,946,778, Ladner; Pack P. i saradnici, Bio/Technology 11:1271, 1993.

[0230] U vidu ilustrativnog primera, scFv specifični za MASP-2 mogu biti dobijeni izlaganjem limfocita MASP-2 polipeptidu in vitro i selekcijom u okviru fagne biblioteke za antitela ili sličnih vektora (na primer, putem upotrebe imobilisanog ili obeleženog MASP-2 proteina ili peptida). Geni koji kodiraju polipeptide sa potencijalnim domenima koji vezuju MASP-2 polipeptid mogu biti dobijeni postukom nasumičnog skrininga peptidne biblioteke prikaza na fagima ili na bakterijama poput E. coli. Ovakve nasumične biblioteke prikaza peptida mogu biti upotrebljene za skrining peptida koji interaguju sa MASP-2. Tehnike za kreiranje i skrining takvih nasumičnih biblioteka prikaza peptida su dobro poznate u oblasti tehnike (U.S. Patent No.5,223,409, Lardner; U.S. Patent No. 4,946,778, Ladner; U.S. Patent No.5,403,484, Lardner; U.S. Patent No.5,571,698, Lardner; i Kay i saradnici, Phage Display of Peptides i Proteins, Academic Press, Inc.1996), a biblioteke za nasumični prikaz peptida i kompleti za skrining takvih biblioteka su i komercijalno dostupni, na primer, od kompanija CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Kalifornija), Invitrogen Inc. (San Diego, Kalifornija), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Massachusetts) i Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.).

[0231] Još jedan oblik fragmenta anti-MASP-2 antitela koji je koristan u ovom primeru koji je ovde opisan, jeste peptid koji kodira jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) koji se vezuje za epitop na MASP-2 antigenu i inhibira aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2. CDR peptidi („minimalne jedinice prepoznavanja“) mogu biti dobijeni konstruisanjem gena koji kodiraju CDR iz antitela od interesa. Takvi geni se pripremaju, na primer, upotrebom lančane reakcije polimeraze radi sinteze varijabilnog regiona iz RNK ćelija koje proizvode antitela (pogledati, na primer, Larrick i saradnici, Methods: A Companion to Methods in Enzimology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, „Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies“, u Monoclonal Antibodies: Production, Engineering i Clinical Applications, Ritter i saradnici (ur.), stranica 166, Cambridge University Press, 1995; i Ward i saradnici, „Genetic Manipulation i Expresion of Antibodies“, u Monoclonal Antibodies: Principles i Applications, Birch i saradnici (ur.), stranica 137, Wiley-Liss, Inc.1995).

[0232] MASP-2 antitela koja su ovde opisana se primenjuju subjektu kome je to potrebno da bi se inhibirala aktivacija komplementa zavisna od MASP-2. U pojedinim slučajevima, inhibitorni agens za MASP-2 je visoko afinitetno humano ili humanizovano monoklonsko MASP-2 antitelo sa redukovanom efektorskom funkcijom.

PEPTIDNI INHIBITORI

[0233] Inhibitorni agens za MASP-2 koji je ovde opisan može obuhvatati izolovane peptidne inhibitore za MASP-2 peptida, uključujući izolovane prirodne peptidne inhibitore i sintetske peptidne inhibitore koji inhibiraju aktivacioni sistem komplementa zavisan od MASP-2. Kao što se ovde upotrebljava, termin "izolovani MASP-2 peptidni inhibitori " se odnosi na peptide koji inhibiraju aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2 vezivanjem za, kompeticijom sa MASP-2 za vezivanje za drugi molekul prepoznavanja (npr. MBL, H-fikolin, M -fikolin ili L-fikolin) u lektinskom putu i/ili direktno reagujući sa MASP-2 da bi inhibirali aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2, a koji su suštinski čisti i suštinski oslobođeni od drugih supstanci sa kojima se mogu pronaći u prirodi, a do obima koji je praktičan i pogodan za njihovu predviđenu upotrebu.

[0234] Peptidni inhibitori su uspešno upotrebljavani in vivo za ometanje interakcija tipa proteinproteina, kao i katalitičkih mesta. Na primer, peptidni inhibitori molekula adhezije koji su strukturno srodni LFA-1 su nedavno odobreni za kliničku upotrebu u koagulopatijama (Ohman E.M. i saradnici, European Heart J. 16:50-55, 1995). Opisani su kratki linearni peptidi (<30 aminokiselina) koji sprečavaju ili ometaju adheziju zavisnu od integrina (Murayama O. i saradnici, J. Biochem. 120:445-51, 1996). Duži peptidi, opsega dužina od 25 do 200 aminokiselinskih ostataka, takođe su uspešno upotrebljavani za blokiranje adhezije zavisne od integrina (Zhang L. i saradnici, J. Biol. Chem. 271 (47):29953-57, 1996). U principu, duže peptidne inhibitore karakterišu viši afiniteti i/ili sporije stope disocijacije u odnosu na kratke peptide i stoga mogu biti snažniji inhibitori. Pokazano je takođe da su ciklični peptidni inhibitori efektivni inhibitori integrina in vivo za lečenje humanih inflamatornih oboljenja (Jackson D.Y. i saradnici, J. Med. Chem.40:3359-68, 1997). Jedan postupak za proizvodnju cikličnih peptida obuhvata sintezu peptida u kome su terminalne aminokiseline u peptidu cisteini, što omogućava peptidu da postoji u cikličnom obliku uspostavljanjem disulfidne veze između terminalnih aminokiselina, a za šta se pokazalo da poboljšava afinitet i polu život in vivo prilikom tretmana hematopoetskih neoplazmi (npr. U.S. Patent No.6,649,592, Larson).

SINTETSKI PEPTIDNI INHIBITORI MASP-2

[0235] Peptidni inhibitori MASP-2 od koristi u postupcima koji su ovde opisani su prikazani kroz primer aminokiselinskih sekvenci koje oponašaju ciljne regione važne za funkciju MASP-2. Inhibitorni peptidi korisni u praksi postupaka koji su ovde opisani su opsega veličina od oko 5 aminokiselina do oko 300 aminokiselina. TABELA 3 obezbeđuje spisak inhibitornih peptida za primer, koji mogu biti korisni u praksi primera primene koji su ovde opisani. Za inhibitorni peptid koji je kandidat kao inhibitor za MASP-2, može biti naime ispitana sposobnost da funkcioniše kao inhibitorni agens za MASP-2 u jednom od nekoliko tipova analiza, uključujući, na primer, test cepanja C4 koje je specifično za lektinski put (opisan u Primeru 2) i test deponovanja C3b (opisan u Primeru 2).

[0236] U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorni peptidisu izvedeni iz MASP-2 polipeptida i izabrani su od zrelog MASP-2 proteina pune dužine (SEQ ID NO:6) ili od određenog domena MASP-2 proteina, kao što je, na primer, CUBI domen (SEQ ID NO:8), CUBIEGF domen (SEQ ID NO:9), EGF domen (SEQ ID NO:11) i serin proteazni domen (SEQ ID NO:12). Kao što je prethodno opisano, pokazano je da su CUBEGFCUBII regioni potrebni za dimerizaciju i vezivanje sa MBL (Thielens i saradnici, navedeno prethodno). Preciznije, pokazano je da je peptidna sekvenca TFRSDYN (SEQ ID NO:16) u CUBI domenu MASP-2 uključena u vezivanje za MBL, u studiji koja je identifikovala humanog nosioca homozigotne mutacije iz Asp105 u Gly105, a koja je dovela do gubitka MASP-2 iz MBL kompleksa (Stengaard-Pedersen K. i saradnici, New England J. Med.349:554-560, 2003).

[0237] U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorni peptidi su izvedeni iz lektinskih proteina koji se vezuju za MASP-2 i uključeni su u lektinski put aktivacije komplementa. Identifikovano je nekoliko različitih lektina koji su uključeni u ovaj put, uključujući lektin koji se vezuje za manan (MBL), L-fikolin, M-fikolin i H-fikolin. (Ikeda K. i saradnici, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M. i saradnici, J. Exp. Med.176:1497-2284, 2000; Matsushita M. i saradnici, J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). Ovi lektini su prisutni u serumu kao oligomeri homotrimernih podjedinica, od kojih svaka na N-kraju sadrži vlakna koja su slična kolagenu sa domenima za prepoznavanje ugljenih hidrata. Pokazano je se ovi različiti lektini vezuju za MASP-2 i da kompleks lektin/MASP-2 aktivira komplement putem cepanja proteina C4 i C2. H-fikolin sadrži amino-terminalni region od 24 aminokiseline, domen nalik kolagenom sa 11 ponovaka Gly-Xaa-Yaa, domen vrata od 12 aminokiselina i domen sličan fibrinogenskom od 207 aminokiselina (Matsushita M. i saradnici, J. Immunol.168:3502-3506, 2002). H-fikolin se vezuje za GlcNAc i aglutinira humane eritrocite obložene LPS-om izvedenim iz S. tiphimurium, S. minnesota i E. coli. Pokazano je se H-fikolin udružuje sa MASP-2 i MAp19 i aktivira lektinski put. Id. L-fikolin/P35 se takođe vezuje za GlcNAc i pokazano je da se udružuje sa MASP-2 i MAp19 u humanom serumu, kao i da ovaj kompleks aktivira lektinski put (Matsushita M. i saradnici, J. Immunol. 164:2281, 2000). Shodno tome, inhibitorni peptidi MASP-2 koji su korisni u predmetnom opisu mogu sadržavati region od najmanje 5 aminokiselina izabranih od MBL proteina (SEQ ID NO:21), H-fikolinskog proteina (pristupni broj u Genbank bazi NM_173452), M-fikolinskog proteina (pristupni broj u Genbank bazi 000602) i L-fikolinskog proteina (pristupni broj u Genbank bazi NM_015838).

[0238] Preciznije, naučnici su identifikovali mesto vezivanja MASP-2 na MBL unutar 12 Gly-X-Y tripleta „GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS“ (SEQ ID NO:26) koji se nalazi između zglobnog regiona i vrata u C-terminalnom delu domena sličnog kolagenskom u MBP (Wallis R. i saradnici, J. Biol. Chem.279:14065, 2004). Ovaj region mesta vezivanja za MASP-2 je takođe visoko očuvan u humanom H-fikolinu i humanom L-fikolinu. Opisano je i konsenzusno mesto vezivanja koje je prisutno u sva tri lektinska proteina koje sadrži aminokiselinsku sekvencu "OGK-X-GP" (SEQ ID NO:22) gde slovo "O" predstavlja hidroksiprolin, a slovo "X" hidrofobni ostatak (Wallis i saradnici, 2004, navedeno iznad). Shodno tome, u pojedinim slučajevima, inhibitorni peptid za MASP-2 od koristi u ovom slučaju koji je opisan, dužine je od najmanje 6 aminokiselina i sadrži SEQ ID NO:22. Pokazano je i da peptidi izvedeni iz MBL koji obuhvataju aminokiselinsku sekvencu „GLR GLQ GPO GKL GPO G“ (SEQ ID NO:24) vezuju MASP-2 in vitro (Wallis i saradnici, 2004, navedeno iznad). Da bi se pojačalo vezivanje za MASP-2, mogu biti sintetisani peptidi kojima su bočno postavljeni GPO tripleti na svakom od krajeva („GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O“ SEQ ID NO:25) da bi se pojačalo obrazovanje trostrukih heliksa koji se mogu naći i u nativnom MBL proteinu (kao to je dodatno opisano u Wallis R. i saradnici, J. Biol. Chem.279:14065, 2004).

[0239] MASP-2 inhibitorni peptiditakođe mogu biti izvedeni iz humanog H-fikolina, a koji sadrže sekvencu „GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO“ (SEQ ID NO:27) iz konsenzusne sekvence regiona vezivanja MASP-2 u H-fikolinu. Takođe su obuhvaćeni peptidi izvedeni iz humanog L-fikolina koji sadrže sekvencu „GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO“ (SEQ ID NO:28) iz konsenzusne sekvence regiona vezivanja MASP-2 u L-fikolinu.

[0240] MASP-2 inhibitorni peptidimogu takođe biti izvedeni iz mesta cepanja C4 kao što je se takođe dobiti iz mesta cepanja C4, kao što je „LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI" (SEQ ID NO:29), koje je mesto cepanja C4 povezano sa C-terminalnim delom antitrombina III (Glover G.I. i saradnici, Mol. Immunol.

25:1261 (1988)).

TABELA 3: INHIBITORNI PEPTIDI MASP-2 ZA PRIMER

1

[0241] Peptidi izvedeni iz mesta cepanja C4, kao i drugi peptidi koji inhibiraju serin proteazno mesto MASP-2, mogu biti hemijski modifikovani tako da su ireverzibilni proteazni inhibitori. Na primer, odgovarajuće modifikacije mogu obuhvatati, ali isto nisu nužno ograničene na, halometil ketone (Br, Cl, I, F) na C-kraju, Asp ili Glu, ili dodate funkcionalne bočne lance; haloacetilne (ili druge αhaloacetilne) grupe na amino grupama ili drugim funkcionalnim bočnim lancima; grupe koje sadrže epoksid ili imin na amino ili karboksi krajveima ili na funkcionalnim bočnim lancima; ili imidat estre na amino ili karboksi krajevima ili na funkcionalnim bočnim lancima. Ovakve modifikacije vi obezbedile prednost trajnog inhibiranja enzima kovalentnim vezivanjem peptida. Rezultat bi mogao biti niža efektivna doza i/ili potreba za ređom primenom peptidnog inhibitora.

2

[0242] Pored prethodno opisanih inhibitornih peptida, MASP-2 inhibitorni peptidi korisni u postupku koji je ovde opisan obuhvataju i peptide koji sadrže CDR3 region koji se vezuje za MASP-2 iz anti-MASP-2 MoAt, dobijen kao što je ovde opisano. Sekvenca CDR regiona za upotrebu u sintezi peptida može se odrediti postupcima poznatim u oblasti tehnike. Varijabilni region teškog lanca je peptid koji obično varira u dužini od 100 do 150 aminokiselina. Varijabilni region lakog lanca je peptid koji obično varira u dužini od 80 do 130 aminokiselina. CDR sekvence unutar varijabilnih regiona teškog i lakog lanca uključuju samo sekvence od približno 3-25 aminokiselina koje mogu lako biti sekvencirane od strane prosečo iskusnog stručnjaka.

[0243] Stručnjaci iz oblasti tehnike će prepoznati da će suštinski homologne varijacije inhibitornih peptida za MASP-2 koji su prethodno opisani takođe ispoljavati inhibitornu aktivnost na MASP-2. Varijacije za primer obuhvataju, ali nisu nužno ograničene na, peptide sa insercijama, delecijama, zamenama i dodatnim aminokiselinama na karboksilnom i amino-kraju predmetnih peptida i njihove smeše. Shodno tome, oni homologni peptidi koji su sa inhibitornom aktivnošću za MASP-2 se smatraju korisnima za postupke koji su ovde opisani. Opisani peptidi takođe mogu obuhvatati dulirajuće motive i druge modifikacije sa konzervativnim supstitucijama. Konzervativne varijante su ovde opisane na drugom mestu, i obuhvataju izmenu aminokiselina sa drugima sličnog naelektrisanja, veličine ili hidrofobnosti i tome slično.

[0244] MASP-2 inhibitorni peptidimogu biti modifikovani da bi se povećala rastvorljivost i/ili pozitivno ili negativno naelektrisanje povećalo do maksimuma, a da bi se postigla veća sličnost u odnosu na segment u intaknom proteinu. Derivat može ili ne mora imati tačnu primarnu aminokiselinsku strukturu peptida koji je ovde prijavljen sve dok derivat funkcionalno zadržava poželjno svojstvo inhibicije MASP-2. Modifikacije mogu obuhvatati supstituciju aminokiselina sa jednom od dvadeset opštepoznatih aminokiselina ili sa drugom aminokiselinom, sa derivatizovanom ili supstituisanom aminokiselinom sa pomoćnim poželjnim karakteristikama, kao što je otpornost na enzimsku razgradnju ili sa D-aminokiselinom, ili supstitucijom sa drugim molekulom ili jedinjenjem, kao što je ugljeni hidrat, koji oponaša prirodnu konfirmaciju i funkciju aminokiseline, aminokiselina ili peptida; deleciju aminokiselina; inserciju aminokiselina sa jednom od dvadeset opštepoznatih aminokiselina ili sa drugom aminokiselinom, sa derivatizovanom ili supstituisanom aminokiselinom sa pomoćnim poželjnim karakteristikama, kao što je otpornost na enzimsku razgradnju, ili sa D-aminokiselinom ili supstitucijom sa drugim molekulom ili jedinjenjem, kao što je ugljeni hidrat, koji oponaša prirodnu konfirmaciju i funkciju aminokiseline, aminokiselina ili peptida; ili supstitucija drugim molekulom ili jedinjenjem, kao što je monomer ugljenih hidrata ili nukleinskih kiselina, koji oponašaju prirodnu konformaciju, raspodelu naelektrisanja i funkciju matičnog peptida. Peptidi takođe mogu biti modifikovani acetilacijom ili amidacijom.

[0245] Sinteza derivatnih inhibitornih peptida se može oslanjanti na poznate tehnike biosinteze peptida, biosinteze ugljenih hidrata i slično. Kao početnu tačku, stručnjak može uzeti odgovarajući računarski program za određivanje konformacije peptida od interesa. Jednom kada je konformacija peptida koji je ovde opisan poznata, stručnjak može racionalno isplanirati vrste supstitucija koje mogu biti uvedene na jednom ili na više mesta da bi se oblikovao derivat koji zadržava osnovnu konformaciju i raspodelu naelektrisanja matičnog peptida, ali koji može posedovati karakteristike koje nisu prisutne ili su poboljšane u odnosu na one koje su prisutne u matičnom peptidu. Jednom kada se identifikuju molekuli derivata kao kandidati, derivati mogu biti analizirani da bi se utvrdilo da li funkcionišu kao inhibitorni agensi za MASP-2, upotrebom analiza koje su ovde opisane.

SKRINING INHIBITORNIH PEPTIDA ZA MASP-2

[0246] Može biti upotrebljeno i molekulsko modeliranje i racionalni molekulski dizajn za generisanje i pretragu peptida koji oponašaju molekulske strukture ključnih regiona vezivanja iz MASP-2 i dalje inhibiraju aktivnosti komplementa kao MASP-2. Molekulske strukture upotrebljene za modeliranje obuhvataju CDR regione anti-MASP-2 monoklonskih antitela, kao i ciljne regione za koje je poznato da su važni za funkciju MASP-2, uključujući region potreban za dimerizaciju, region uključen u vezivanje za MBL i aktivno serin proteazno mesto, kao što je prethodno opisano. Postupci za identifikaciju peptida koji se vezuju za određeno ciljno mesto su dobro poznati u oblasti tehnike. Na primer, molekulski imprintin može biti upotrebljen za de novo konstrukciju makromolekulskih struktura kao u peptidima koji se vezuju za određeni molekul. Pogledati, na primer, Shea K.J. "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties," TRIP 2(5) 1994.

[0247] Kao ilustrativni primer može poslužiti jedan od postupaka za pripremu mimika peptida vezivanja za MASP-2 koji je bio sledeći. Funkcionalni monomeri poznatog peptida koji se vezuje za MASP-2 ili regioni vezivanja anti-MASP-2 antitela koje karakteriše inhibicija MASP-2 (matrice) su polimerizovani. Matrica je zatim uklonjena, nakon čega je sledila polimerizacija druge klase monomera u praznini koja je ostala nakon uklanjanja matrice, a da bi se obezbedio novi molekul koga karakterišu jedan ili više od željenih osobina sličnih matrici. Pored pripreme peptida na ovaj način, mogu se pripremiti i drugi molekuli koji se vezuju za MASP-2 i koji su inhibitorni agenski za MASP-2, kao što su to polisaharidi, nukleozidi, lekovi, nukleoproteini, lipoproteini, ugljeni hidrati, glikoproteini, steroidi, lipidi i drugi biološki aktivni materijali. Ovaj postupak je korisan za dizajniranje širokog spektra bioloških mimika koji su stabilniji od njhovih prirodnih parnjaka, pošto se obično pripremaju slobodnoradikalskom polimerizacijom funkcionih monomera, što rezuluje u jedinjenju koje sa okosnicom koja ne podleže biorazgradnji.

4

SINTEZA PEPTIDA

[0248] MASP-2 inhibitorni peptidimogu biti pripremljeni upotrebom tehnika koje su dobro poznate u oblasti tehnike, poput tehnika sinteze na čvst oj fazi inicijalno opisanih od strane Merrifield-a, u J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963. Automatizovana sinteza se može postići, na primer, upotrebom peptidnog sintetizera kompanije Applied Biosistems tipa 431A (Foster City, Kalifornija) u skladu sa uputstvima koja je opisao proizvođač. Ostale tehnike se mogu naći, na primer, u Bodanszki M. i saradnici, Peptide Synthesis, drugo izdanje, John Wiley & Sons, 1976, kao i u drugim referentnim radovima poznatim stručnjacima iz ove oblasti tehnike.

[0249] Peptidi mog biti pripremljeni i upotrebom standardnih tehnika genetičkog inženjeringa koje su poznate stručnjacima iz oblasti tehnike. Na primer, peptid može biti proizveden enzimski, insertovanjem nukleinske kiseline koja kodira peptid u ekspresioni vektor, ekspresijom DNK i translacijom DNK u peptid, u prisustvu potrebnih aminokiselina. Peptid zatim može biti prečišćen, upotrebom hromatografskih ili elektroforetskih tehnika ili putem nosača proteina za koje se mogu fuzionisati i potom sa istih ukloniti isecanjem, dok peptid može biti insertovan u ekspresioni vekotor u tako da bude u fazi sa sekvencom nukleinske kisline koja kodira protein nosača. Fuzioni protein-peptid može dalje biti izolovan hromatografskim, elektroforetskim ili imunološkim tehnikama (kao što je vezivanje za smolu preko antitela za protein-nosač). Peptid može biti podvrgnut cepanju upotrebom hemijske metodologije ili enzimski, kao na primer, hidrolazama.

[0250] MASP-2 inhibitorni peptidi koji su korisni u postupku koji je ovde opisan, mogu takođe biti proizvedeni u rekombinantnim ćelijama domaćina praćenjem konvencionalnih tehnika. Da bi se eksprimirala kodirajuća MASP-2 inhibitornog peptida, molekul nukleinske kiseline koji kodira peptid mora biti operativno povezan sa regulatornim sekvencama koje kontrolišu transkripcionu ekspresiju u ekspresionom vektoru i zatim uveden u ćeliju domaćina. Pored transkripcionih regulatornih sekvenci, poput promotora i pojačivača, ekspresioni vektori mogu sadržavati translacione regulatorne sekvence i markerski gen, koji su pogodni za selekciju ćelija koje nose ekspresioni vektor.

[0251] Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju MASP-2 inhibitorni peptid mogu biti sintetisani sa „genskim mašinama“ upotrebom protokola poput fosforamiditnog postupka. Ukoliko je za primenu poput sinteze gena ili fragmenta gena potrebna hemijski sintetisana dvolančana DNK, tada se svaki komplementaran lanac pravi zasebno. Proizvodnja kratkih gena (od 60 do 80 baznih parova) je tehnički jednostavna i može se postići sintezom komplementarnih lanaca i njihovim anilingom. Za proizvodnju dužih gena, sintetski geni (dvolančani) se udružuju u moularni oblik od jednolančanih fragmenata koji su dužine od 20 do 100 nukleotida. Za revijske preglede polinukleotidne sinteze, pogledati, na primer, Glick i Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNK", ASM Press, 1994; Itakura K. i saradnici, Annu. Rev. Biochem.53:323, 1984; i Climie S. i saradnici, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87:633, 1990.

INHIBITORI TIPA MALIH MOLEKULA

[0252] U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorni agensi predstavljaju inhibitore tipa malih molekula, uključujući prirodne i sintetske supstance sa malom molekulskom težinom, kao što su, na primer, peptidi, peptidomimetici i nepeptidni inhibitori (uključujući oligonukleotide i organska jedinjenja). Inhibitori MASP-2 tipa malih molekula mogu biti proizvedeni na osnovu molekulske strukture varijabilnih regiona anti-MASP-2 antitela.

[0253] Inhibitori tipa malih molekula takođe mogu biti dizajnirani i generisani na osnovu kristalne strukture MASP-2 upotrebom računarskog načina za dizajn lekova (Kuntz I.D. i saradnici, Science 257:1078, 1992). Opisana je kristalna struktura pacovskog MASP-2 (Feinberg H. i saradnici, EMBO J.

22:2348-2359, 2003). Upotrebom postupaka opisanih od strane Kuntz-a i saradnika, koordinate kristalne strukture MASP-2 se upotrebljavaju kao ulazna informacija za kompjuterski program kao što je DOCK, koji kao izlaznu informaciju daje lisut strutura malih molekula a koje se očekuje da se vežu za MASP-2. Upotreba takvih kompjuterskih programa je dobro poznata stručnjaku iz ove oblasti tehnike. Na primer, kristalna struktura inhibitora HIV-1 proteaze je upotrebljena za identifikovanje jedinstvenih nepeptidnih liganada koji su inhibitori HIV-1 proteaze, procenom uklapanja jedinjenja pronađenih u bazi podataka Cambridge Cristallographic sa mestom vezivanja enzima upotrebom programa DOCK (Kuntz I.D. i saradnici, J. Mol. Biol.161:269-288, 1982; DesJarlais R.L. i saradnici, PNAS 87:6644-6648, 1990).

[0254] Lista struktura malih molekula koji su računarskim postukom identifikovani kao potencijalni inhibitori MASP-2 pregleda se zatim upotrebom analize vezivanja za MASP-2, kao što je opisano u Primeru 10. Mali molekuli za koje se utvrdi da se vezuju za MASP-2, dalje se analiziraju u funkcionalnoj analizi poput one koja je opisana u Primeru 2, da bi se utvrdilo da li inhibiraju aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2.

SOLUBILNI RECEPORI ZA MASP-2

[0255] Veruje se da drugi pogodni inhibitorni agensi za MASP-2 uključuju solubilne receptore MASP-2, koji se mogu proizvesti upotrebom tehnika koje su poznate prosečno iskusnim stručnjacima iz oblasti tehnike.

INHIBITORI EKSPRESIJE MASP-2

[0256] Kao što je ovde takođe opisano, inhibitorni agens za MASP-2 može biti inhibitor MASP-2 ekspresije koji je u stanju da inhibira aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2. Reprezentativni inhibitori MASP-2 ekspresije obuhvataju antisens molekule nukleinskih kiselina za MASP-2 (kao što su antisens iRNK, antisens DNK ili antisens oligonukleotidi), MASP-2 ribozime i MASP-2 RNKi molekule.

[0257] Antisens molekuli RNK i DNK deluju tako što direktno blokiraju translaciju MASP-2 iRNK hibridizacijom za MASP-2 iRNK, sprečavajući tako translaciju MASP-2 proteina. Antisens molekul nukleinskih kiselina može biti konstruisan na brojne različite načine koji su opisani i u stanju je da interferira sa ekpsresijom MASP-2. Na primer, antisens molekul nukleinske kiseline može biti konstruisan invertovanjem kodirajućeg regiona (ili njegovog dela) MASP-2 cDNK (SEQ ID NO:4) u odnosu na njegovu normalnu orijentaciju za transkripciju, da bi se omogućila transkripcija njegovog komplementa.

[0258] Antisens molekul nukleinskih kiselina je obično suštinski identičan najmanje delu ciljnog gena ili ciljnih gena. Nukleinska kiselina, međutim, ne mora biti potpuno identična da bi inhibirala ekspresiju. U principu, viša homologija može biti upotrebljena za kompenzaciju upotrebe kraćeg antisens molekula nukleinske kiseline. Minimalan procenat identičnosti je obično veći od oko 65%, ali veći procenat identičnosti može izvršiti efektivniju represiju ekspresije endogene sekvence. Obično je poželjan značajno veći procenat identičnosti, od više od oko 80%, mada je najpoželjniji od oko 95% do apsolutne identičnosti.

[0259] Antisens molekul nukleinske kiseline ne mora imati isti obrazac introna ili egzona kao ciljni gen, a nekodirajući segmenti ciljnog gena mogu biti podjednako efektivni u postizanju antisens supresije ekspresije ciljnog gena kao i kodirajući segmenti. DNK sekvenca od najmanje oko 8 nukleotida ili slično, može biti upotrebljena kao antisens molekul nukleinske kiseline, mada je poželjnija duža sekvenca. U predmetnom opisu, reprezentativan primer korisnog inhibitornog agensa MASP-2 je antisens MASP-2 molekul nukleinske kiseline koji je najmanje devedeset procenata identičan komplementu MASP-2 cDNK koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja je navedena u SEQ ID NO:4. Sekvenca nukleinske kiseline navedena u SEQ ID NO:4 kodira MASP-2 protein koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:5.

[0260] Usmeravanje antisens oligonukleotida da vezuje MASP-2 iRNK je još jedan mehanizam koji može biti upotrebljen za smanjenje nivoa sinteze MASP-2 proteina. Na primer, sinteza poligalakturonaze i muskarinskog acetilholinkog receptora tipa 2 se inhibira antisens oligonukleotidima usmerenim na njihove odgovarajuće iRNK sekvence (U.S. Patent No. 5,739,119, Cheng, i U.S. Patent No.5,759,829, Shewmaker). Dodatno, demonstrirani su primeri antisens inhibicije sa nuklearnim proteinom ciklinom, genom višestruke rezistencije na lekove (MDG1), ICAM-1, Eselektinom, STK-1, GABAAreceptorom striatuma.i humanim EGF (pogledati, npr. U.S. Patent No.

5,801,154, Baracchini; U.S. Patent No.5,789,573, Baker; U.S. Patent No.5,718,709, Considine; i U.S. Patent No.5,610,288, Reubenstein).

[0261] Opisan je i sistem koji omogućava prosečno iskusnom stručnjaku da odredi koji oligonukleotidi su korisni u pronalasku, što uključuje ispitivanje pogodnih mesta u ciljnoj iRNK upotrebom proba i cepanja sa Rnazom H kao pokazateljem za dostupnost sekvenci unutar transkripata. Scherr M. i saradnici, Nucleic Acid Res. 26:5079-5085, 1998; Lloyd i saradnici, Nucleic Acids Res. 29:3665-3673, 2001. Smeša antisens oligonukleotida koji su komplementarni određenim regionima MASP-2 transkripta, dodata je ćelijskim ekstraktima koji eksprimiraju MASP-2, kao što su iz hepatocita, pa su hibridizovani da bi se kreirala mesta osetljiva na RNKazu H osetljivo mesto. Ovaj postupak se može kombinovati sa kompjuterski potpomognutim odabirom sekvenci koji može predvideti optimalan odabir sekvence za antisens kompozicije na osnovu njihove relativne sposobnosti da stvaraju dimere, strukture ukosnice ili druge sekundarne strukture koje bi smanjile ili sperčile specifično vezivanje za ciljnu iRNK u ćeliji domaćina. Ovakava analiza sekundarne strukture i razmatranje selekcije ciljnog mesta mogu biti sprovedeni upotrebom programa za analizu prajmera OLIGO (Rychlik, I. 1997) i softvera za algoritam BLASTN 2.0.5 (Altschul, S.F. i saradnici, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997). Poželjno je da antisens jedinjenja usmerena na ciljnu sekvencu sadrže od oko 8 do oko 50 nukleotida. Antisens oligonukleotidi koji sadrže od oko 9 do oko 35 nukleotida ili slično su posebno poželjni. Pronalazači smatraju da su sve oligonukleotidne kompozicije u opsegu od 9 do 35 nukleotida (tj. one dužine od 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili oko 35 baza) veoma poželjne za primenu postupaka zasnovanih na antisens oligonukleotidima koji su ovde opisani. Izuzetno poželjni ciljni regioni iRNK za MASP-2 su oni koji se nalaze na ili blizu AUG kodona inicijacije translacije, i one sekvence koje su značajno komplementarne sa 5' regionima iRNK, npr. između -10 i 10 regiona nukleotidne sekvence MASP-2 gena (SEQ ID NO:4). Inhibitori ekspresije MASP-2 za primer su opisani u TABELI 4.

TABELA 4: INHIBITORI EKSPRESIJE MASP-2 ZA PRIMER

[0262] Kao što je prethodno napomenuto, izraz "oligonukleotid" kako se ovde upotrebljava, odnosi se na oligomer ili polimer ribonukleinske kiseline (RNK) ili dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili na njihove mimetike. Ovaj termin takođe obuhvata one oligonukleobaze koje se sastoje od nukleotida, šećera i kovalentnih internukleozidnih veza (okosnice) koji se javljaju u prirodi, kao i oligonukleotide kod kojih se pojavljuju modifikacije koje se ne javljaju u prirodi. Ovakve modifikacije omogućavaju uvođenje određenih poželjnih osobina koja se nisu prisutne u prirodni oligonukleotidima, kao što su smanjena toksična svojstva, povećana stabilnost na razgradnju nukleazama i pojačano preuzimanje u ćelije. U ilustrativnim slučajevima, antisens jedinjenja koja su ovde opisana razlikuju se od nativne DNK po modifikaciji fosfodiestarske okosnice da bi se produžio životni vek antisens oligonukleotida u kome su fosfatni supstituenti zamenjeni fosforotioatima. Slično tome, jedan ili oba kraja oligonukleotida mogu biti supstituisani sa jednim ili sa više derivata akridina koji interkaliraju između susednih baznih parova unutar lanca nukleinske kiseline.

[0263] Druga alternativa antisens pristupu je upotreba „RNK interferencije“ (RNKi). Dvolančane RNK (dsRNK) mogu izazvati utišavanje gena kod sisara in vivo. Deluje da je prirodna funkcija RNKi i kosupresija, a zapravo zaštita genoma od invazije mobilnim genetičkim elementima kao što su retrotranspozoni i virusi koji proizvode aberantnu RNK ili dsRNK u ćeliji domaćina kada postanu aktivni (pogledati npr. Jensen J. i saradnici, Nat. Genet.21:209-12, 1999). Dvolančani RNK molekul može biti pripremljen sintezom dva RNK lanca sposobna da obrazuju dvolančani RNK molekul, pri čemu je svaki dužine od oko 19 do 25 (npr.19-23 nukleotida). Na primer, molekul dsRNK koristan u ovde opisanim postupcima, može sadržati RNK koja odgovara sekvenci i njenom komplementu navedenom u TABELI 4. Poželjno je da najmanje jedan lanac RNK ima 3' ispust od 1-5 nukleotida. Sintetisani RNK lanci se zatim spajau pod uslovima u kojima se obrazuje dvolančani molekul. RNK sekvenca može sadržavati najmanje 8 nukleotidnih delova SEQ ID NO:4 sa ukupnom dužinom od 25 nukleotida ili manje. Dizajn siRNK sekvenci za dato ciljano dejstvo je unutar veštine stručnjaka iz oblasti tehnike. Dostupne su i komercijalne usluge koje dizajniraju siRNK sekvencu i garantuju isključenje ekspresije od najmanje 70% (Qiagen, Valencia, Calif).

[0264] dsRNK može biti primenjena kao farmaceutska kompozicija i dobijati se poznatim postupcima, pri čemu se nukleinska kiselina uvodi u željenu ciljnu ćeliju. Uobičajene metode prenosa gena obuhvataju upotrebu kalcijum fosfata, DEAE-dekstrana, elektroporaciju, mikroinjeciranje i postupke sa virusima. Takvi postupci su objašnjeni u Ausubel i saradnici, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.1993.

[0265] Ribozimi takođe mogu biti upotrebljeni za smanjenje količine i/ili biološke aktivnosti MASP-2, kao što su ribozimi koji ciljano deluju na MASP-2 iRNK. Ribozimi su katalitički molekuli RNK koji mogu cepati molekule nukleinskih kiselina sa sekvencom koja je u potpunosti ili delimično homologna sekvenci ribozima. Moguće je dizajnirati ribozimske transgene koji kodiraju RNK ribozime koji se specifično uparuju sa ciljnom RNK i cepaju fosfodiestersku okosnicu na određenoj lokaciji, čime funkcionalno deaktiviraju ciljnu RNK. Izvodeći ovakvo cepanje, ribozim se sam ne menja, tako da je sposoban da se reciklira i da cepa druge molekule. Uključivanje ribozimskih sekvenci u antisens RNK obezbeđuje im aktivnost cepanja RNK, povećavajući time aktivnost antisens konstrukata.

[0266] Ribozimi korisni u praksi koja je ovde opisana, obično sadrže region hibridizacije od najmanje oko devet nukleotida, koji je po nukleotidnoj sekvenci komplementarni, barem delom, sa cilnom MASP-2 i RNK, kao i katalitički region koji je prilagođen da cepa ciljnu MASP-2 iRNK (za opšti pregled, pogledati EPA No.0321201; WO88/04300; Haseloff J. i saradnici, Nature 334:585-591, 1988; Fedor, M.J. i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1668-1672, 1990; Cech, T.R. i saradnici, Ann. Rev. Biochem.55:599-629, 1986).

[0267] Ribozimi mogu biti ili direknto usmereni na ćelije u obliku RNK oligonukleotida u koje su ugrađene sekvence ribozima, ili mogu biti uvedene u ćeliju kao ekspresioni vektor koji kodira željenu ribozimalnu RNK. Ribozimi se mogu koristiti i primenjivati na isti način kao što je opisano za antisens polinukleotide.

[0268] Anti-sens RNK i DNK, ribozimi i RNKi molekuli korisni u postupcima koji su ovde opisani, mogu biti pripremljeni bilo kojim postupkom poznatim u oblasti tehnike za sintezu molekula DNK i RNK. To obuhvata tehnike za hemijsku sintezu oligodezoksiribonukleotida i oligoribonukleotida koje su dobro poznate u oblasti tehnike, kao što je na primer, fosforamiditna hemijska sinteza na čvrstoj fazi. Alternativno, molekuli RNK mogu biti proizvedeni in vitro i in vivo transkripcijom DNK sekvenci koje kodiraju antisens molekul RNK. Takve sekvence DNK mogu biti ugrađene u u širok spektar vektora u koje su ugrađene i pogodni promotori RNK polimeraze, kao što su to T7 ili SP6 promotor polimeraze.

Alternativno, antisens cDNK konstrukti koji sintetišu antisens RNK konstitutivno ili inducibilno, u zavisnosti od upotrebljenog promotera, mogu se stabilno uvesti u ćelijske linije.

[0269] Razne dobro poznate modifikacije molekula DNK mogu biti uvedenu kao način za povećanje stabilnosti i poluživota. Korisne modifikacije obuhvataju, ali nisu ograničene na, dodavanja bočnih sekvenci ribonukleotida ili dezoksiribonukleotida na 5' i/ili 3' krajeve molekula ili upotrebu fosforotioata ili 2' O-metila umesto fosfodiesteraznih veza unutar oligodezoksiribonukleotida okosnice.

VI. FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE I POSTUPCI ISPORUKE DOZA

[0270] Ovde su opisane kompozicije za inhibiranje štetnih efekata aktivacije komplementa zavisne od MASP-2, kod subjekta koji boluje od oboljenja ili stanja koja su ovde opisana, kao i postupak koji obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži terapijski efektivnu količinu inhibitornog agensa za MASP-2 i farmaceutski prihvatljiv nosač. Inhibitorni agensi za MASP-2 mogu biti primenjivani subjektu kome je to potrebno, u terapijski efektivnim dozama, za lečenje ili ublažavanje stanja povezanih sa aktivacijom komplementa zavisnom od MASP-2. Terapijski efektivna doza se odnosi na količinu inhibitornog agensa za MASP-2 koja je dovoljna da rezultat bude ublažavanje simptoma udruženih sa bolešću ili stanjem.

[0271] Toksičnost i terapijska efektivnost agenasa za inhibiciju MASP-2 može biti utvrđena standardnim farmaceutskim postupcima koji koriste eksperimentalne životinjske modele, poput mišjeg model za mišji MASP-2 -/- koji eksprimira humani MASP-2 transgen, a koji je opisan u Primeru 1. Upotrebom takvih životinjskih modela, mogu biti određeni NOAEL (nema uočenog nivoa štetnih efekata) i MED (minimalna efektivna doza), standardnim postupcima. Odnos doze između NOAEL i MED efekata je terapijski odnos, koji se izražava kao odnos NOAEL/MED. Najpoželjniji su inhibitorni agensi za MASP-2 koje karakterišu veliki terapijski odnosi ili indeksi. Podaci dobijeni iz analiza u ćelijskim kulturama i iz studija na životinjama mogu biti upotrebljeni u formulisanju opsega doza za upotrebu kod ljudi. Doziranje inhibitornog agensa za MASP-2 poželjno je unutar opsega koncentracija u cirkulaciji koje uključuju MED sa malo ili nimalo toksičnosti. Doziranje može varirati u ovom opsegu, u zavisnosti od oblika doziranja koji se koristi i od načina primene koji se koristi.

[0272] Za bilo koju formulaciju jedinjenja, terapijski efektivna doza može biti utvrđena upotrebom životinjskih modela. Na primer, doza ože biti formulisana u životinjskom modelu da bi se postigao opseg koncentracije u cirkulišućoj plazmi koji podrazumeva MED. Kvantitativni nivoi inhibitornog agensa za MASP-2 u plazmi mogu takođe biti mereni, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.

1

[0273] Pored studija toksičnosti, efektivna doza se može ustanoviti na osnovu količine MASP-2 proteina koja je pristuna u živom subjektu i na osnovu afiniteta vezivanja inhibitornog agensa za MASP-2. Pokazano je da su nivoi MASP-2 kod normalnih humanih subjekata u serumu prisutni u niskim nivoima, opsega od 500 ng/ml, dok se nivoi MASP-2 kod određenog subjekta mogu odrediti upotrebom kvantitativnog ispitivanja za MASP-2 koje je opisano u Moller-Kristensen M. i saradnici, J. Immunol. Methods 282:159-167, 2003.

[0274] U principu, doza primenjenih kompozicija koje sadrže inhibitorne agense za MASP-2 varira u zavisnosti od faktora kao što su starost, težina, visina, pol, opšte medicinsko stanje i prethodna istorija bolesti subjekta. Kao ilustracija, agensi koji inhibiraju MASP-2, kao što su anti-MASP-2 antitela, mogu biti primenjivani u opsegu doza od oko 0,010 do 10,0 mg/kg, poželjno od 0,010 do 1,0 mg/kg, još poželjnije od 0,010 do 0,1 mg/kg telesne težine subjekata. U pojedinim slučajevima, kompozicija sadrži kombinaciju anti-MASP-2 antitela i peptida koji inhibiraju MASP-2.

[0275] Terapijska efikasnost inhibitornih kompozicija za MASP-2 i postupaka koji su ovde opisani kod datog subjekta, kao i odgovarajući dozni režim, mogu biti utvrđeni u skladu sa analizama komplementa koje su dobro poznate stručnjacima iz oblasti tehnike. Komplement generiše brojne specifične proizvode. Tokom poslednje decenije razvijene su osetljive i specifične analize koje su komercijalno dostupne za većinu ovih proizvoda aktivacije, uključujući male fragmente aktivacije C3a, C4a i C5a i velike fragmente aktivacije iC3b, C4d, Bb i sC5b-9. Većina ovih analiza koristi monoklonska antitela koja reaguju sa novim antigenima (neoantigenima) izloženim na fragmentu, ali ne i na nativnim proteinima od kojih nastaju, što čini ove analize vrlo jednostavnim i specifičnim. Većina analiza se takođe oslanja na ELISA tehnologiju, mada se radioimunski test ponekada još uvek upotrebljava za C3a i C5a. Poslednjenavedene analize mere i neobrađene fragmente i njihove „desArg“ fragmente, koji predstavljaju glavne oblike koji se mogu naći u cirkulaciji. Neobrađeni fragmenti i C5adesArgse brzo uklanjaju vezivanjem za receptore na ćelijskoj površini i stoga su prisutni u vrlo niskim koncentracijama, dok se C3adesArgne vezuje za ćelije i akumulira se u plazmi. Merenje C3a obezbeđuje osetljiv pokazatelj aktivacije komplementa koji je nezavisan od tipa aktiviranog puta. Aktivacija alternativnog puta se može proceniti merenjem Bb fragmenta. Detekcija proizvoda tečne faze puta aktivacije litičkog kompleksa, sC5b-9, obezbeđuje dokaz da se komplement aktivirao do krajnje komponente. Pošto i lektinski i klasični putevi generišu iste aktivacione proizvode, C4a i C4d, merenje ova dva fragmenta ne obezbeđuje nikakve informacije o tome koji je od ova dva puta generisao aktivacione proizvode.

[0276] Inhibiciju aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 karakteriše najmanje jedna od sledećih promena u komponenti sistema komplementa koja se javlja kao rezultat primene inhibitornog agensa za MASP-2 u skladu sa postupcima koji su ovde opisani: inhibicija stvaranja ili proizvodnje proizvoda

2

sistema aktivacije komplementa zavisnog od MASP-2 - C4b, C3a, C5a i/ili C5b-9 (MAC) (merena, na primer, kao što je opisano mereno, na primer, kao što je opisano u Primeru 2, smanjenje cepanja C4 i deponovanja C4b (mereno, na primer, kao što je opisano u Primeru 10), ili smanjenje cepanja C3 i deponovanja C3b (mereno, na primer, kao što je opisano u Primeru 10).

DODATNI AGENSI

[0277] Kompozicije i postupci u koje su uključeni inhibitorni agensi za MASP-2, mogu po izboru obuhvatai i jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa, koji mogu uvećati aktivnost agensa za inhibiciju MASP-2 ili koji obezbeđuju povezane terapijske funkcije na aditivan ili sinergistički način. Na primer, u kontekstu lečenja subjekta koji boluje od TTP, gde je subjekat pozitivan na inhibitora ADAM-TS13, jedan ili više inhibitornih agenasa za MASP-2 mogu biti primenjeni u kombinaciji (uključujući istovremenu primenu) sa jednim ili sa više imunosupresivnih agenasa. Pogodni imunosupresivni agensi obuhvataju: kortikosteroide, rituksan, ciklosporin i slično. U kontekstu lečenja subjekta koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije HUS ili aHUS, jedan ili više od inhibitornih agenasa za MASP-2 mogu biti primenjeni u kombinaciji (uključujući istovremenu primenu) sa odgovarajućim antibiotikom. U kontekstu lečenja subjekta koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije aHUS, jedan ili više inhibitornih agenasa za MASP-2 mogu biti primenjeni u kombinaciji (uključujući istovremenu primenu) sa drugim inhibitornim agensima za sistem komplementa kao što su to ekulizumab (Soliris), TT-30, antitelo na faktor B ili drugi agensi koji inhibiraju terminalne komponente sistema komplementa ili pojačavanje alternativnog puta.

[0278] Uključivanje i odabir dodatnog agensa/dodatnih agenasa će biti utvrđivani tako da se postigne željeni terapijski rezultat. U pojedinim slučajevima, inhibitorni agens za MASP-2 može biti primenjen sa jednim ili sa više anti-inflamatornih i/ili analgetičkih agenasa. Pogodni anti-inflamatorni i/ili analgetički agensi obuhvataju: antagoniste serotoninskih receptora; agoniste serotoninskih receptora; antagoniste histaminskih receptora; antagoniste bradikininskih receptora; inhibitore kalikreina; antagoniste tahikininskih receptora, uključujući antagoniste neurokininskih1i neurokininskih2podtipova receptora; antagoniste receptora peptida povezanog sa genom za kalcitonin (CGRP); antagoniste interleukinskih receptora; inhibitore enzima aktivnih u putu sinteze metabolita arahidonske kiseline, uključujući inhibitore fosfolipaze, uključujući inhibitore PLA2izoforme i PLCγ izoforme, inhibitore ciklooksigenaze (COX) (koji mogu biti za COX-1, COX-2 ili neselektivni COX-1 i -2 inhibitori), inhibitore lipooksigenaze; antagoniste prostanoidnih receptora, uključujući antagoniste podtipa ojkozanoidnog EP-1 i EP-4 receptora i antagoniste podtipa tromboksanskog receptora; antagoniste leukotrienskog receptora, uključujući antagoniste leukotrienskog receptora podtipa B4i antagoniste leukotrienskog receptora podtipa D4; agoniste opioidnih receptora, uključujući agoniste µ-opioidnih, δ-opioidnih i κ-opioidnih receptora; agoniste i antagoniste purinoceptora, uključujući antagoniste P2Xreceptora i agoniste P2Yreceptora; otvarače kalijumovih kanala osetljive na adenozin trifosfat (ATP); inhibitore MAP kinaze; inhibitore nikotin acetilholina; i agoniste alfa adrenergičkog receptora (uključujući alfa-1, alfa-2 i neselektivne alfa-1 i 2 agoniste).

[0279] Inhibitorni agensi za MASP-2 koji su ovde opisani takođe mogu biti primenjeni u kombinaciji sa jednim ili sa više drugih inhibitora komplementa, kao što je inhibitor C5. Do danas, Ekulizumab (Solaris®), antitelo na C5, jedini je lek koji ciljano deluje na sistem komplementa koji je odobren za upotrebu kod ljudi. Ipak, pokazano je da pojedini farmakološki agensi blokiraju komplement in vivo. K76COOH i nafamstat mezilat su dva agensa koji su pokazali određenu efektivnost u životinjskim modelima transplantacije (Miyagawa S. i saradnici, Transplant Proc.24:483-484, 1992). Pokazano je i da su heparini niske molekulske težine efektivni u regulisanju aktivnosti komplementa (Edens R.E. i saradnici, Complement Today, str.96-120, Basel: Karger, 1993). Veruje se da ovi inhibitori tipa malih molekula mogu biti korisni kao agensi za upotrebu u kombinaciji sa inhibitornim agensima MASP-2 koji su ovde opisani.

[0280] Ostali inhibitori komplementa koji se javljaju u prirodi mogu biti korisni u kombinaciji sa inhibitornim agensima za MASP-2 koji su ovde opisani. Biološki inhibitori komplementa uključuju solubilni komplementni faktor tipa 1 (sCR1). Ovo je prirodni inhibitor koji se može naći na spoljnoj membrani humanih ćelija. Ostali membranski inhibitori obuhvataju DAF, MCP i CD59. Aktivnost rekombinantnih oblika je ispitivana u kontekstu negativnog dejstva na komplement in vitro i in vivo. Pokazalo se da je sCR1 efektivan u ksenotransplantaciji, pri čemu sistem komplementa (i alternativan i klasičan) obezbeđuje pokretanje sindroma hiperaktivnog odbacivanja u roku od nekoliko minuta nakon perfuzije krvi kroz novopresađeni organ (Platt J.L. i saradnici, Immunol. Today 11:450-6, 1990; Marino I.R. i saradnici, Transplant Proc. 1071:6, 1990; Johnstone P.S. i saradnici, Transplantation 54:573-6, 1992). Upotreba sCR1 štiti i produžava vreme preživljavanja presađenog organa, ukazujući na ulogu komplementnog puta u patogenezi preživljavanja organa (Leventhal J.R. i saradnici, Transplantation 55:857-66, 1993; Pruitt S.K. i saradnici, Transplantation 57:363-70, 1994).

[0281] Pogodni dodatni inhibitori komplementa za upotrebu u kombinaciji sa ovde opisanim kompozicijama takođe obuhvataju, na primer, MoAbt kao što je anti-C5 antitelo (npr. ekulizumab) koje razvija kompanija Alexion Pharmaceuticals, Inc. New Haven, Connecticut i anti-properdin MoAt.

FARMACEUTSKI NOSAČI I NOSAČ ZA ISPORUKU

[0282] Generalno, kompozicije inhibitornog agensa za MASP-2 koje su ovde opisne, u kombinaciji sa bilo kojim drugim odabranim terapijskim agensima, pogodno su sadržani u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Nosač je netoksičan, biokompatibilan i izabran tako da ne utiče štetno na biološku aktivnost

4

inhibitornog agensa za MASP-2 (i bilo koje druge terapijske agense koji se sa njim kombinuju). Farmaceutski prihvatljivi nosači peptida za primer su opisani u U.S. Patent No. 5,211,657, Yamada. Anti-MASP-2 antitela i inhibitorni peptidi korisni u predmetnom pronalasku mogu biti formulisani u preparate čvrstog, polu-čvrstog, oblika gela, kao i tečnog i gasovitog oblika poput tableta, kapsula, praškova, granula, masti, rastvora, depozitorija, inhalanata i injekcija koji omogućavaju oralnu, parenteralnu ili hiruršku primenu. Opis takođe razmatra lokalnu primenu kompozicija oblaganjem medicinskih uređaja i slično.

[0283] Pogodni nosači za parenteralnu isporuku putem injektabilne, infuzione ili irigacione i topikalne isporuke obuhvataju destilovanu vodu, fiziološki rastvor puferisan fosfatom, normalan ili Ringerov rastvor sa laktozom, rastvor dekstroze, Hankov rastvor ili propandiol. Pored toga, sterilna, neisparljiva ulja mogu biti iskorišćena kao rastvarači ili medijum za resuspendovanje. U ovu svrhu, može biti upotrebljeno bilo koje biokompatibilno ulje uključujući sintetske mono- ili digliceride. Dodatno, masne kiseline poput oleinske kiseline nalaze upotrebu u pripremanju injekcija. Nosač i agens mogu biti izmešani u vidu tečnosti, suspenzije, gela koji može polimerisati ili ne može plimerisati, paste ili melema.

[0284] Nosač takođe može čini osnovu za isporuku radi održavanja (tj. produžavanja, odlaganja ili regulisanja) isporuke agensa(agenasa) ili radi pojačavanja isporuke, preuzimanja, stabilnosti ili farmakokinetike terapijskog agensa(agenasa). Takav nosač za isporuku može obuhvatati, u vidu neograničavajućih primera, mikročestice, mikrosfere, nanosfere ili nanočestice sastavljene od proteina, lipozoma, ugljenih hidrata, sintetskih organskih jedinjenja, neorganskih jedinjenja, polimernih ili kopolimernih hidrogelova i polimernih micela. Pogodni hidrogel i micelarni sistemi isporuke obuhvataju PEO:PHB:PEO kopolimere i kopolimer/ciklodekstrinske komplekse opisane u WO 2004/009664 A2 i PEO i PEO/ciklodekstrinske komplekse opisane u U.S. Patent Application Publication No.2002/0019369 A1. Ovakvi hidrogelovi se mogu injecirati lokalno, na mesto predviđenog dejstva, ili supkutano ili intramuskularno, da bi se obrazovao depo za kontinuirano oslobađanje.

[0285] Za intra-artikularnu isporuku, inhibitorni agens za MASP-2 može biti uključen u prethodno opisane tečne ili gel nosače koji se mogu injecirati, kao i u prethodno opisne nosače za isporuku sa kontinuiranim oslobađanjem ili u hijaluronsku kiselinu ili derivate hijaluronske kiseline.

[0286] Za oralnu primenu ne-peptidergičnih agenasa, inhibitorni agens za MASP-2 može biti uključen u inertni ispunjivač ili razblaživač poput saharoze, kukuruznog skroba ili celuloze.

[0287] Za topikalnu primenu, inhibitorni agens za MASP-2 može uključen u mast, losion, kremu, gel, kapi, supozitorije, sprej, tečnost ili prah, ili u gel ili mikrokapsularne sisteme isporuke putem transdermalnih flastera.

[0288] Razvijeni su razni nazalni i pulmonarni sistemi isporuke, uključujući aerosole, inhalatore sa dozatorom, inhalatore za suvi prah i nebulizatore koji mogu biti pogodno prilagođeni za isporuku koja je ovde opisana, upotrebom nosača za aerosol, inhalatore ili nebulizatore, tim redom.

[0289] Za intratekalnu (IT) ili intracerebroventrikularnu (ICV) isporuku, odgovarajući sterilni sistemi ispruke (npr. tečnosti; gelovi, suspenzije, itd.) mogu biti upotrebljeni za primenu kompozicija koje su ovde opisane.

[0290] Kompozicije koje su ovde opisane mogu takođe sadržavati biokompatibilne eksipijense, kao što su agensi za dispergovanje ili vlaženje, agense za resuspendovanje, razblaživači, puferi, pojačivači prodiranja, emulgatori, povezivači, agensi za zgušnjavanje, arome (za oralnu primenu).

FARMACEUTSKI NOSAČI ZA ANTITELA I PEPTIDE

[0291] Određenije u kontekstu anti-MASP-2 antitela i inhibitornih peptida, formulacije za primer mogu biti primenjivane parenteralno, u vidu rastvora ili supsenzija jedinjenja određenih doza koji se mogu injecirati, u fiziološki prihvatljivom razblaživaču sa farmaceutskim nosačem koji može biti sterilna tečnost poput vode, ulja, fiziološkog rastvor, glicerola ili etanola. U kompozicijama koje sadrže anti-MASP-2 antitela i inhibitorne peptide mogu dodatno biti prisutne pomoćne supstance kao što su agensi za vlaženje ili emulgatori, surfaktanti, puferi za podešavanje pH i slično. Dodatne komponente farmaceutske kompozicije uključuju petroleum (kao što je životinjskog, biljnog ili sintetskog porekla), na primer, sojino ulje i mineralno ulje. U principu, glikoli poput propilen glikola ili polietilen glikola su poželjni tečni nosači za rastvore koji se mogu injecirati.

[0292] Anti-MASP-2 antitela i inhibitorni peptidi takođe mogu biti primenjivani u obliko depo-injekcije ili implantantnih preparata koji mogu biti formulisani na takav način da se omogući produženo ili pulsno oslobađanje aktivnih agenasa.

FARMACEUTSKI PRIHVATLJIVI NOSAČI ZA INHIBITORE EKSPRESIJE

[0293] Određenije u kontekstu inhibitora ekspresije koji su korisni u postupcima koji su ovde opisani, opisane su i kompozicije koje sadrže inhibitora ekspresije, a koji su kao što je to prethodno opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. Kompozicija može dodatno sadržavati koloidni disperzioni sistem.

[0294] Farmaceutske kompozicije koje sadrže inhibitore ekspresije mogu uključivati, ali bez ograničavanja samo na, rastvore, emulzije i formulacije koje sadrže lipozome. Ovakve kompozicije mogu biti genersane od raznih komponenti koje obuhvataju, ali nisu ograničene na, prethodno pripremljene tečnosti, samoemulgujuće čvrste supstance i samoemulgujuće polučvrste supstance. Priprema takvih kompozicija obično obuhvata kombinovanje inhibitora ekspresije sa jednim ili više od sledećeg: puferima, antioksidansima, polipeptidima male molekulske težine, proteinima, aminokiselinama, ugljenim hidratima uključujući glukozu, saharozu ili dekstrine, helatne agense poput EDTA, glutation i drugi stabilizatori i pomoćne supstance. Neutralno puferisan fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa nespecifičnim serumskim albuminom su primeri pogodnih razblaživača.

[0295] U pojedinim slučajevima, kompozicije mogu biti pripremljene kao emulzije koje predstavljaju heterogene sisteme jedne tečnosti dispergovane u drugoj u vidu kapljica (pogledati, Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Vol.1, Rieger i Banker (ur.), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988). Primeri emulgatora koji se javljaju u prirodi i koji se upotrebljavaju u formulacijama emulzija obuhvataju akaciju, pčelinji vosak, lanolin, lecitin i fosfatide.

[0296] U jednom slučaju, kompozicije koje sadrže nukleinske kiseline mogu biti formulisane u vidu mikroemulzija. Mikroemulzija, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na sistem vode, ulja i amfifila, koji je jedan optički izotropni i termodinamički stabilan tečni rastvor (pogledati Rosoff u Pharmaceutical Dosage Forms, tom 1). U postupcima koji su ovde opisani se mogu upotrebiti i lipozomi za prenos i isporuku atisens oligonukleotida do željenog mesta.

[0297] Farmaceutske kompozicije i formulacije inhibitora ekspresije za lokalnu primenu mogu obuhvatati transdermalne flastere, masti, losione, kreme, gelove, kapi, supozitorije, sprejeve, tečnosti i praškove. Mogu se upotrebljavati i uobičajeni farmaceutski nosači, kao i vodene, praškaste ili uljne baze i zgušnjivači i slično.

NAČINI PRIMENE

[0298] Farmaceutske kompozicije koje sadrže inhibitorne agense za MASP-2 mogu biti primenjivane na brojne načine, u zavisnosti da li je za stanje koje se leči najprikladniji lokalni ili sistemski način primene. Pored toga, kao što je ovde prethodno opisano u vezi sa procedurama vantelesne reperfuzije, inhibitorni agensi za MASP-2 mogu biti primenjivani uvođenjem ovde opisanih kompozicija u recirkulišuću krv ili plazmu. Dodatno, kompozicija koje su ovde opisane mogu biti isporučene oblaganjem ili ugrađivanjem kompozicija na ili unutar medicinskih uređaja koji se mogu implantirati.

SISTEMSKA ISPORUKA

[0299] Kao što se ovde upotrebljava, predviđeno je da termini „sistemska isporuka“ i „sistemska primena“ obuhvataju, ali i da ne budu ograničeni na, oralne i parenteralne puteve primene, uključujući intramuskularne (IM), supkutane, intravenske (IV), intra-arterijske, inhalacione, sublingvalne, bukalne, topikalne, transdermalne, nazalne, rektalne, vaginalne i druge puteve primene čiji je efektivni rezultat raspoređivanje isporučenog agensa na jedno ili na više mesta predviđenog terapijskog delovanja.

Poželjni putevi sistemske isporuke predmetnih kompozicija obuhvataju intravenski, intramuskularni, supkutani i inhalacioni. Potrebno je ipak naglastiti da će konkretan put sistemske primene za odabrani agens u kome je isupotrebljena kompozicija koja je ovde opisana, delom biti određen na osnovu podložnosti agensa metaboličkim putevima obrade koji su povezani sa datim putem primene. Na primer, najpogodnije je da se peptidergički agensi primenjuju putevima koji su drugačiji od oralnog.

[0300] Inhibitorna antitela i polipeptidi za MASP-2 mogu biti isporučeni subjektu kome je to potrebno na bilo koji pogodan način. Postupci isporuke antitela i polipeptida za MASP-2 obuhvataju primenu oralnim, pulmonarnim, parenteralnim putem (npr. intramuskularnim, intraperitonealnim, intravenskim (IV) ili supkutanim injeciranjem), inhalacijom (na primer putem formulacije u vidu finog praha), kao i transdermalnim, nazalnim, vaginalnim i rektalnim ili sublingvalnimm načinima primene, pri čemu isti mogu biti formulisani u doznim oblicima koji su pogodni za svaki od ovih načina primene.

[0301] U vidu reprezentativnog primera, inhibitorna antitela i peptidi za MASP-2 mogu biti uvedeni u živi organizam primenom na telesnu membranu koja je u stanju da apsorbuje polipeptide, na primer, primenom na nazalnu, gastrointestinalnu i rektalnu membranu. Polipeptidi se obično primenjuju na membrane koje ih mogu apsorbovati zajedno za pojačivačem propusnosti. (Pogledati npr. Lee V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys.5:69, 1988; Lee V.H.L., J. Controlled Release 13:213, 1990; Lee V.H.L., ur., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer A.G. i saradnici, J. Controlled Release 13:241, 1990.) Na primer, STDHF je sintetski derivat fuzidinske kiseline, steroidnog surfaktanta koji je po strukturi sličan žučnim solima i koji je uporebljavan kao pojačivač propusnosti prilikom nazalne isporuke. (Lee W.A., Biopharm.22. novembar/decembar 1990.)

[0302] Inhibitorna antitela i polipeptidi za MASP-2 mogu biti uvedeni zajedno sa drugim molekulom, poput lipida, da bi se polipeptidi zaštitili od enzimske razgradnje. Na primer, kovalentno vezivanje polimera, posebno polietilen glikola (PEG), upotrebljavano je za zaštitu određenih proteina od enzimske hidrolize u organizmu, a time i za produžavanje njihovog poluživota (Fuertges F. i saradnici, J. Controlled Release 11:139, 1990). Za isporuku proteina su prijavljeni i mnogi polimerni sistemi (Bae Y.H. i saradnici, J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori R. i saradnici, Pharm. Res. 6:813, 1989; Yamakawa I. i saradnici, J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro I. i saradnici, J. Controlled Release 10:195, 1989; Asano M. i saradnici, J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt J. i saradnici, J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino K. J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura Y. i saradnici, J. Pharm. Sci.78:117, 1989; Takakura Y. i saradnici, J. Pharm. Sci.78:219, 1989).

[0303] Nedavno su razvijeni i lipozomi sa poboljšanom serumskom stabilnošću i poboljšanim poluvremenom u cirkulaciji (pogledati npr. U.S. Patent No.5,741,516, autor Webb). Štaviše, objavljen je revijski pregled raznih postupaka pripreme lipozomskih ili preparata sličim lipozomskim kao mogućim nosačima lekova (pogledati npr. U.S. Patent No. 5,567,434, autor Szoka; U.S. Patent No. 5,552,157, autor Yagi; U.S. Patent No.5,565,213, autor Nakamori; U.S. Patent No.5,738,868, autor Shinkarenko; i U.S. Patent No.5,795,587, autor Gao).

[0304] U svrhu transdermalne primene, MASP-2 inhibitorna antitela i polipeptidi se mogu kombinovati sa drugim pogodnim sastojcima, kao što su to nosači i/ili adjuvansi. Ne postoje posebna ograničenja u vezi prirode ovakvih drugih sastojaka, osim da oni moraju biti farmaceutski prihvatljivi za primenu koja je predviđena i da ne mogu pogoršavati aktivnost aktivnih sastojaka kompozicije. Primeri pogodnih nosača obuhvataju masti, kreme, gelove ili suspenzije, sa ili bez prečišćenog kolagena. Inhibitorna antitela i polipeptidi za MASP-2 mogu takođe biti impregnirani unutar transdermalnih flastera, gipseva i zavoja, poželjno u tečnom ili polutečnom obliku.

[0305] Kompozicije koje su ovde opisane mogu biti primenjivane sistemski tako da primena bude periodična, u intervalima za koje se utvrdi da su pogodni za održavanje željenog nivoa terapijskog dejstva. Na primer, kompozicije mogu biti primenjivane tako da to bude supkutano injeciranje na svake dve do četiri nedelje ili u ređe učeštalim intervalima. Režim doziranja će biti određeno od starena ordinirajućeg lekara uzimajući u obzir razne faktore koji mogu uticati na delovanje kombinacije agenasa. Ovakvi faktori će podrazumevati obim progresije stanja koje se leči, starost, pol i težinu pacijenta i druge kliničke faktore. Doze za svaki pojedinačni agens će varirati u zavisnosti od agensa za inhibiciju MASP-2 koji je uključen u kompoziciju, kao i od prisustva i prirode bilo kog nosača za isporuku leka (npr. nosača za isporuku sa odloženim oslobađanjem). Pored toga, količina u dozi može biti prilagođenja tako da budu uračunati varijacija u učestalosti primene i farmakokinetičko ponašanje isporučenog agensa/isporučenih agenasa.

LOKALNA ISPORUKA

[0306] Kao što se ovde upotrebljava, termin „lokalno“ obuhvata primenu leka u ili oko mesta za koje je predviđeno lokalizovano dejstvo, a navedeno može obuhvatati na primer topikalnu primenu na kožu ili druga pogođena tkiva, oftalmološku isporuku, intratekalnu (IT), intracerebroventrikularnu (ICV), intra-artikularnu, intrakavitetnu, intrakranijalnu ili intravezikularnu primenu, postavljanje ili irigaciju. Lokalna primena može biti poželjna da bi se omogućila primena u nižoj dozi, da bi se izbegli sistemski sporedni efekti i za omogući primenu niže doze, da bi se izbegli sistemski neželjeni efekti i za precizniju kontrolu vremenskih odrednica isporuke, kao i koncentracije aktivnih agenasa na mestu lokalne isporuke. Lokalna primena obezbeđuje poznatu koncentraciju na ciljnom mestu, bez obzira na varijabilnost u metabolizmu, protoku krvi itd. koja može biti prisutna među pacijentima. Poboljšana dozna kontrola je takođe opisana kroz direktne načine isporuke.

[0307] Lokalna isporuka inhibitornog agensa za MASP-2 može biti postignuta i u kontekstu hirurških posupaka za lečenje oboljenja ili stanja, kao što je to na primer tokom procedura poput operacije postavljanja arterijskog bajpasa, aterektomije, laserskih procedura, ultrazvučnih procedura, balonske angioplastike i postavljanje stentova. Na primer, inhibitor MASP-2 može biti primenjen subjektu zajedno sa procedruom balonske angioplastike. Procedura balonske angioplastike obuhvata umetanje katetera sa izduvanim balonom u arteriju. Izduvan balon se pozicionira u blizinu aterosklerotičnog plaka i naduvava se tako da se plak sabije uz vaskularni zid. Rezultat je da površina balona ostaje u kontaktu sa slojem vaskularnih endotelskih ćelija na površini krvnog suda. Inhibitorni agens za MASP-2 može biti vezan za balonski kateter za angioplastiku na način koji omogućava oslobađanje agensa na mestu aterosklerotičnog plaka. Agens može biti prikačen na balonski kateter u skladu sa standardnim postupcima koji su poznati u oblasti tehnike. Na primer, agens može biti uskladišten u odeljku balonskog katetera dok se balon ne naduva, u kom trenutku se oslobađa u lokalno okruženje. Alternativno, agens može biti impregniran na površini balona, tako da dolazi u kontakt sa ćelijama arterijskog zida dok se balon naduvava. Agens može biti isporučen i u perforiranom balonskom kateteru, kao što su oni prijavljeni u Flugelman M.I. i saradnici, Circulation 85:1110-1117, 1992. Pogledati takođe objavljenu PCT prijavu WO 95/23161 u kojoj je opisan primer procedure vezivanja terapijskog proteina za balonski kateter za angioplastiku. Slično navedenom, inhibitorni agens za MASP-2 može biti uključen u gel ili polimerni premaz naned na stent ili može biti ugrađen u meterijal stenta, tako da stent eluira inhibitorni agens za MASP-2 nakon vaskularnog postavljanja.

[0308] Inhibitorne kompozicije za MASP-2 koje su upotrebljavane u lečenju artritida i drugih muskuloskeletnih poremećaja mogu biti lokalno isporučene intra-artikularnim injeciranjem. Takve kompozicije mogu pogodno uključivati nosač za isporuku sa kontinualnim oslobađanjem. Kao dodatni primer slučejava u kojima može biti poželjna lokalna isporuka, inhibitorne kompozicije za MASP-2 koje su upotrebljavane u lečenju urogenitalnih stanja, mogu biti prikladno postavljene intravezikularno ili unutar druge urogenitalne strukture.

PREMAZI NA MEDICINSKOM UREĐAJU

[0309] Inhibitorni agensi za MASP-2, poput antitela i inhibitornih peptida, mogu biti imobilisani na (ili unutar) površine medicinskog uređaja koji se može implantirati ili pričvšćivati. Modifikovana površina će obično biti u kontaktu sa živim tkivom nakon implantacije u telo životinje. Predviđeno je da se pod „medicinskim uređajem za implantaciju ili pričvršćivanje“ podrazumeva bilo koji uređaj koji se ugrađuje/implantira u ili koji se pričvršćuje za tkivo životinjskog organizma tokom normalnog rada uređaja (npr. to su stentovi i uređaji za isporuku lekova koji se mogu implantirati). Takvi medicinski uređaji koji se mogu implantirati ili pričvrstiti mogu biti naprevljeni od, na primer, nitroceluloze, dijazoceluloze, stakla, polistirena, polivinilhlorida, polipropilena, polietilena, dekstrana, sefaroze, agara, skroba, najlona, nerđajućeg čelika, titanijuma i biorazgradivih i/ili biokompatibilnih polimera.

1

Pričvršivanje proteina za uređaj se može postići bilo kojom tehnikom koja ne uništava biološku aktivnost pričvršćenog proteina, na primer, pričvršivanje jednog ili oba od N- ili C-terminalnih ostatka proteina za uređaj. Pričvršivanje se takođe može izvršiti na jednom ili na više unutrašnjih mesta u proteinu. Mogu biti upotrebljena i višestruka pričvršćivanja (i unutra i na krajevima proteina). Površina medicinskog uređaja koji se može implantirati ili pričvrstiti može biti modifikovana tako da uključuje funkcionalne grupe (npr. karboksilnu, amidnu, amino, etarsku, hidroksilnu, cijano, nitrido, sulfanamido, acetilinsku, epoksidnu, silansku, anhidrida, sukciniminsku, azido) za imobilizaciju proteina na njih. Hemija kuplovanja obuhvata, ali nije ograničena na, obrazovanje estara, etara, amida, azido i sulfanamido derivata, cijanata i drugih veza sa funkcionalnim grupama koje su dostupne na MASP-2 antitelima ili inhibitornim peptidima. MASP-2 antitela ili inhibitorni fragmenti mogu takođe biti nekovalentno pričvršćeni, dodavanjem sekvence afinitetnih oznaka na protein, kao što su to GST (D.B. Smith i K.S. Johnson, Gene 67:31, 1988), polihistidini (E. Hochuli i saradnici, J. Chromatog.411: 77, 1987), ili biotin. Takve afinitetne oznake mogu biti upotrebljene za reverzibilno pričvršćivanje proteina za uređaj.

[0310] Proteini mogu takođe biti kovalentno pričvršćeni za površinu tela uređaja, na primer, kovalentnim aktivacijam površine medicinskog uređaja. Reprezentativan primer je pričvršćivanje matricelularnog (matricelularnih) proteina za kućište uređaja bilo kojim od sledećih parova reaktivnih grupa (jedan član para je prisutan na površini tela uređaja, a drugi član para je prisutan na matricelularnom proteinu (matricelularnim proteinima): hidroksilna/grupa karboksilne kiseline da bi se proizvela estarska veza; hidroksilna/anhidridna grupa da bi se proizvela estarska veza; hidroksilna/izocijanatna grupa da se proizvela uretanska veza. Površina tela uređaja koja ne poseduje korisne reaktivne grupe može biti tretirana plazmom sa radio-frekventnim pražnjenima (RFGD) koja ga nagriza, da bi se generisale reakativne grupe da bi se omogućilo deponovanje matricelularnog (matricelularnih) (npr. tretman kiseoničnom plazmom radi uvođenja grupa koje sadrže kiseonik; tretman sa propil amino plazmom radi uvođenje aminskih grupa).

[0311] Inhibitorni agensi za MASP-2 koji sadrže molekule nukleinskih kiselina, poput antisens molekula, RNKi ili DNK koji kodiraju peptidne inhibitore, mogu biti ugrađeni u porozne matrice pričvršćene za telo uređaja. Reprezentativne porozne matrice korisne za izradu površinskog sloja su one pripremljene od dermalnog ili kolagena tetiva, a koje mogu biti dobijene iz raznovrsnih komercijalnih izvora (npr. od kompanija Sigma i Collagen Corporation), ili to mogu biti matrice kolagena pripremljene kao što je opisano u U.S. Patent No. 4,394,370, autora Jefferies, i 4,975,527, autora Koezuka. Jedan od kolagenih materijala je oanj koji je imenovan kao UltraFiber™, a koji se može nabaviti od kompanije Norian Corp. (Mountain View, Kalifornija).

1 1

[0312] Ukoliko je to poželjnije, mogu biti iskoršćene i određene polimerne matrice, koje obuhvataju polimere akrilnih estara i polimere mlečne kiseline, kao što je prijavljeno, na primer, u U.S. Patent No.

4,526,909 i 4,563,489, autora Urist. Posebni primeri korisnih polimera su oni iz ortoestara, anhidrida, propilen-kofumarata ili je to polimer jedne ili više vrsta monomera α-hidroksi karboksilnih kiselina (npr. α-hidroksi sirćetne kiseline (glikolne kiseline) i/ili α-hidroksi propionske kiseline (mlečne kiseline)).

REŽIMI TRETMANA

[0313] U profilaktičkim primenama, farmaceutske kompozicije se primenjuju subjektu koji je podložan ili je na drugi način sa rizikom da oboli od stanja povezanog sa aktivacijom komplementa zavisnom od MASP-2, u količini koja je dovoljna da se eliminišu ili da se smanji rizik za razvoj simptoma stanja. U terapijskim primenama, farmaceutske kompozicije se primenjuju subjektu za kojeg se sumnja ili koji već boluje od stanja povezanog aktivacijom komplementa zavisnom od MASP-2, u terapijski efektivnoj količini koja je dovoljna da se ublaže ili barem delimično smanje simptomi stanja. I u profilaktičkim i u terapijskim režimima, kompozicije koje sadrže inhibitorne agense za MASP-2 mogu biti primenjivane u nekoliko doza sve dok se kod subjekta ne ostvari dovoljan terapijski ishod. Primena inhibitornih kompozicija za MASP-2 koje su ovde opisane, može se vršiti jednokratnom primenom kompozicije ili ograničenom sekvencom primena, radi lečenja akutnog stanja, npr. reperfuzione povrede ili druge traumatske povrede. Alternativno, kompozicija može biti primenjivana u periodičnim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda radi lečenja hroničnih stanja, npr. artritida ili psorijaze.

[0314] Ovde opisani postupci i kompozicije mogu biti upotrebljeni za inhibiranje inflamacije i srodnih procesa koji su obično rezultat dijagnostičkih i terapijskih medicinskih i hirurških procedura. Da bi inhibirala ovakve procese, inhibitorna kompozicija za MASP-2 može biti primenjivana periproceduralno. Kao što se ovde upotrebljava, "periproceduralno" se odnosi na primenu inhibitorne kompozicije preproceduralno i/ili intraproceduralno i/ili postproceduralno, tj. pre procedure, pre i tokom procedure, pre i nakon procedure, pre, tokom i nakon procedure, tokom procedure, tokom i nakon procedure ili nakon procedure. Periproceduralna primena može biti sprovedena lokalnom primenom kompozicije na mesto hirurške intervencije ili primene procedure, kao što je injeciranjem ili kontrinuiranom ili irigacijom mesta u više navrata, ili sistemskom primenom. Pogodni postupci za lokalnu perioperativnu isporuku rastvora inhibitornih agenasa za MASP-2 su prijavljeni u US Patent No. 6,420,432, autora Demopulos i 6,645,168, autora Demopulos. Pogodni postupci za lokalnu isporuku hondroprotektivnih kompozicija, uključujući inhibitorni(e) agens(e) za MASP-2, prijavljeni su u Međunarodnoj PCT patentnoj prijavi WO 01/07067 A2. Pogodni postupci i kompozicije za ciljanu

1 2

sistemsku isporuku hondroprotektivnih kompozicija, uključujući inhibitorni(e) agens(e) za MASP-2, prijavljeni su u Međunarodnoj PCT patentnoj prijavi WO 03/063799 A2.

[0315] Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu biti primenjena subjektu koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije trombotičnu mikroangiopatiju (TMA). U jednom slučaju, TMA je izabrana iz grupe koja se sastoji od hemolitičkog uremijskog sindromg (HUS), trombozne trombocitopenične purpure (TTP) i atipičnog hemolitičkog uremijskog sindroma (aHUS). U jednom slučaju, TMA je aHUS. U jednom slučaju, kompozicija se primenjuje pacijentu sa aHUS tokom akutne faze oboljenja. U jednom slučaju, kompozicija se primenjuje pacijentu sa aHUS tokom faze remisije (tj. kod subjekta koji se oporavio ili delimično oporavio od epizode akutne faze aHUS, pri čemu je takva remisija dokazana, na primer, povećanim brojem trombocita i/ili smanjenim koncentracijama LDH u serumu, na primer, kao što je opisano u Loirat C i saradnici, Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011, koja je ovde uključena u listu referenci). U jednom slučaju, subjekat boluje od, ili je sa rizikom da razvije TMA koja je (i) TMA nastala sekundarno u odnosu na kancer; (ii) TMA nastala sekundarno u odnosu na hemoterapiju; ili (iii) TMA nastala sekundarno u odnosu na transplantaciju (npr. transplantaciju organa, kao što je transplantacija bubrega ili alogena transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija). U jednom slučaju, subjekat boluje od, ili je sa rizikom da razvije Upšau-Šulmanov sindrom (USS). U jednom slučaju, subjekat boluje od, ili je sa rizikom da razvije Degosovu bolest. U jednom slučaju, subjekat boluje od, ili je sa rizikom da razvije katastrofalan antifosfolipidni sindrom (CAPS). U terapijskim primenama, farmaceutske kompozicije se primenjuju subjektu koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije TMA, u terapijski efektivnoj količini koja je dovoljna da se inhibira stvaranje tromba, ublaže, ili barem delimično smanje simptomi stanja.

[0316] I u profilaktičkim i u terapijskim režimima, kompozicije koje sadrže inhibitorne agense za MASP-2 mogu biti primenjivane u nekoliko doza sve dok se ne ostvari dovoljan terapijski ishod kod subjekta. U jednom slučaju koji je ovde opisane, inhibitorni agens za MASP-2 sadrži anti-MASP-2 antitelo za koje je pogodno da se primeni kod odraslog pacijenta (npr. kod odrasle osobe prosečne težina od 70 kg) u dozi od 0,1 mg do 10000 mg, a pogodnije od 1,0 mg do 5000 mg, još pogodnije od 10,0 mg do 2000 mg, još više pogodno od 10,0 mg do 1,000 mg i najpogodnije od 50,0 mg do 500 mg. Za pedijatrijske pacijente, doziranje može biti prilagođeno proporcionalno težini pacijenta. Primena inhibitornih kompozicija za MASP-2 koje su ovde opisane, može se vršiti jednokratnom primenom kompozicije ili ograničenom sekvencom primena u cilju lečenja TMA. Alternativno, kompozicija može biti primenjivana u periodičnim intervalima, kao što je to svakodnevno, dva puta nedeljno, na nedeljnoj bazi, svake druge nedelje, mesečno ili na svaka dva meseca tokom dužeg vremenskog perioda radi lečenja TMA.

1

[0317] U pojedinim slučajevima, subjekat koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije TMA, prethodno je bio podvrgnut ili se trenutno podvrgava lečenju sa inhibitorom terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu ovde opisane kompozicije koja sadrži MASP-2 inhibitor subjektu i dalje primenu subjektu inhibitora terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5. U pojedinim slučajevima, inhibitor terminalnog komplementa je humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U pojedinim slučajevima, inhibitor terminalnog komplementa je ekulizumab.

[0318] Farmaceutske kompozicije mogu biti primenjene subjektu koji je podložan ili je na drugi način sa rizikom da oboli od aHUS, u količini koja je dovoljna da se eliminiše ili da se smanji rizik za razvoj simptoma stanja. U terapijskim primenama, farmaceutske kompozicije se primenjuju subjektu za kojeg se sumnja ili koji već boluje od aHUS, u terapijski efektivnoj količini koja je dovoljna da se ublaže ili barem delimično smanje simptomi stanja. U jednom slučaju koji je ovde opisan, pre primene, subjekat može biti pregledan da bi se utvrdilo da li subjekat ispoljava jedan ili više simptoma aHUS, uključujući (i) anemiju, (ii) trombocitopeniju (iii) bubrežnu insuficijenciju i (iv) porast kreatinina, a tada kompozicija koja je ovde opisana može biti primenjena u efektivnoj količini i tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da se poboljšaju ovi simptomi.

[0319] Inhibitorne kompozicije za MASP-2 koje su ovde opisane mogu takođe biti upotrebljene za profilaktičko lečenje subjekta koji je sa povišenim rizikom da razvije aHUS, čime se može smanjiti verovatnoća da subjekat oboli od aHUS. Prisustvo genetičkog markera za koji je poznato da su udruženi sa aHUS-om kod subjekata, najpre se utvrđuje izvođenjem analize genetičkog skrininga na uzorku dobijenom od subjekta, i dalje identifikovanjem prisustva najmanje jednog genetičkog markera povezanog sa aHUS-om, kao što su to komplementni faktor H (CFH), Faktor I (CFI), Faktor B (CFB), membranski kofaktor CD46, C3, protein srodan komplementnom faktoru H (CFHR1), antikoagulansni protein trombodulin (THBD), protein srodan komplementnom faktoru H tipa 3 (CFHR3) ili protein srodan komplementnom faktoru H tipa 4 (CFHR4). Subjekat se zatim periodično nadgleda (npr. mesečno, kvartalno, dva puta godišnje ili godišnje) da bi se utvrdilo prisustvo ili odsustvo najmanje jednog simptoma aHUS, poput anemije, trombocitopenije, bubrežne insuficijencije i porasta kreatinina. Nakon utvrđivanja prisustva najmanje jednog od ovih simptoma, subjektu se može primeniti količina inhibitornog agensa za MASP-2 koja je efektivna u inhibiciji aktivacije komplementa zavisne od MASP-2, u efektivnoj količini i tokom dovoljnog vremenskog perioda da se poboljša jedan ili više od navedenih simptoma. U još jednom od slučajeva koji su ovde opisan, subjekat koji je sa povećanim rizikom da razvije aHUS, zahvaljujući činjenici da je prethodno pregledan i da je utvrđeno da ima jedan od genetičkih markera povezanih sa aHUS, može biti praćen da bi se ispratila pojava

1 4

događaja koji je povezan sa otpočinjanjem kliničkih simptoma aHUS, uključujući izloženost lekovima, infekciji (npr. bakterijskoj infekciji), malignitetu, povredi, transplantaciji organa ili tkiva i trudnoći.

[0320] Kompozicija koji sadrži količinu inhibitornog agensa za MASP-2 koja je efektivna u inhibiciji aktivacije komplementa zavisne od MASP-2, može biti primenjena kod oboljelih od ili sa rizikom da razviju atipičan hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS) koji nastaje sekundarno nakon infekcije. Na primer, pacijent koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije ne-enterički aHUS prouzrokovan infekcijom sa S. pneumonia, može biti lečen sa kompozicijama koje su ovde opisane.

[0321] Subjekat koji boluje od aHUS može se u početku lečiti sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2 koja je ovde opisana i koja se primenjuje putem kateterske linije, kao što je to intrevenska kateterska linija ili supkutana kateterska linija, a tokom prvog vremenskog perioda kao što je to jedan sat, dvanaest sati, jedan dan, dva dana ili tri dana. Subjekat zatim može biti tretiran tokom drugog vremenskog perioda sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2 primenjenom regularnim supkutanim injekcijama, kao što su injekcije primenjivane svakodnevno, dva puta nedeljno, jedan puta nedeljno, svake druge nedelje, mesečno ili dva puta mesečno.

[0322] Inhibitorna kompozicija za MASP-2 koja je ovde opisana može biti primenjena subjektu koji boluje od aHUS u odsustvu plazmafereze (tj. subjektu čiji aHUS simptomi nisu bili lečeni plazmaferezom i nisu bili lečeni plazmaferezom u vreme tretmana sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2), da bi se izbegle potencijalne komplikacije plazmaferze, uključujući hemoragiju, infekciju i izloženost poremećajima i/ili alergijama koje su svojstvene davaocu plazme, ili kod subjekta koji je na neki drugi način averzivan na plazmaferezu, ili u okruženju gde plazmafereza nije dostupna.

[0323] Inhibitorna kompozicija za MASP-2 koja je ovde opisana može biti primenjena subjektu koji boluje od aHUS i istovremeno sa lečenjem pacijenta sa plazmaferezom. Na primer, subjektu koji prima terapiju plazmaferezom može zatim biti primenjena inhibitorna kompozicija za MASP-2 bilo nakon ili naimenično sa izmenom plazme.

[0324] Subjekat koji boluje od ili je sa rizikom da razvije aHUS i koji se leči inhibitornom kompozicijom za MASP-2 koja je ovde opisana, može biti praćen periodičnim određivanjem, kao što je na svakih dvanaest sati ili na dnevnoj bazi, nivoa najmanje jednog komplementnog faktora, pri čemu utvrđivanje smanjenog nivoa najmanje jednog komplementnog faktora u poređenju sa standardnom vrednošću ili sa zdravim subjektom ukazuje na potrebu za nastavkom lečenja sa kompozicijom.

[0325] I u profilaktičkim i u terapijskim režimima, kompozicije koje sadrže inhibitorne agense za MASP-2 mogu biti primenjivane u nekoliko doza sve dok se ne postigne dovoljan terapijski ishod kod subjekta. U jednom slučaju koji je ovde opisan, inhibitorni agens za MASP-2 sadrži anti-MASP-2 antitelo za koje je pogodno da se primeni kod odraslog pacijenta (npr. odrasle osobe prosečne težine od 70 kg) u dozi od 0,1 mg do 10000 mg, pogodnije od 1,0 mg do 5000 mg, još pogodnije od 10,0 mg do 2000 mg, još

1

više pogodno od 10,0 mg do 1,000 mg i najpogodnije od 50,0 mg do 500 mg. Za pedijatrijske pacijente, doziranje može biti prilagođeno proporcionalno težini pacijenta. Primena ovde opisanih inhibitornih kompozicija za MASP-2 se može izvoditi jednokratnom primenom kompozicije ili ograničenom sekvencom primena radi lečenja aHUS. Alternativno, kompozicija može biti primenjivana u periodičnim intervalima, poput svakodnevne primene, primene dva puta nedeljno, jedan put nedeljno, svake druge nedelje, jedan put mesečno ili dva puta nedeljno tokom dužeg vremenskog perioda radi lečenja aHUS.

[0326] U pojedinim slučajevima, osoba koja boluje od aHUS je prethodno bila podvrgnuta ili se trenutno podvrgana lečenju sa inhibitorom terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5. Takvi postupci mogu obuhvatati primenu ovde opisane kompozicije koja sadrži MASP-2 inhibitor subjektu i dalje primenu inhibitora terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5 subjektu. U pojedinim slučajevima, inhibitor terminalnog komplementa je humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U pojedinim slučajevima, inhibitor terminalnog komplementa je ekulizumab.

[0327] Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu biti primenjene subjektu koji je podložan ili na neki drugi način sa rizikom da oboli od HUS, u količini koja je dovoljna da se eliminiše ili smanji rizik za razvoj simptoma stanja. U terapijskim primenama, farmaceutske kompozicije se primenjuju subjektu za kojeg se sumnja ili koji već boluje od HUS-a, u terapijski efektivnoj količini koja je dovoljna da se ublaže ili barem delimično smanje simptomi stanja.

[0328] Verovatnoća razvoja oštećene bubrežne funkcije kod subjekta sa rizikom da razvije HUS može biti smanjena primenom subjektu inhibitorne kompozicije za MASP-2 koja je ovde opisana, u količini koja je efektivna u inhibiranju aktivacije komplementa zavisne od MASP-2. Na primer, subjekat sa rizikom da razvije HUS i koga je potrebno lečini sa ovde opisanom inhibitornom kompozicijom za MASP-2 može ispoljavati jedan ili više simptoma povezanih sa HUS-om, uključujući dijareju, nivo hematokrita manji od 30% sa dokazima intravaskularnog razaranja eritrocita, trombocitopenije dobijenim analizom razmaza krvi, kao i porasta nivoa kreatinina. Dodatni primer je da pacijent sa rizikom za razvoj HUS, a koji se leči sa ovde opisanim inhibitornim kompozicijama MASP-2 može biti inficiran sa E. coli, šigelom ili salmonelom. Takvi subjekti inficirani sa E. coli, šigelom ili salmonelom se mogu lečiti ovde opisanom inhibitornom kompozicijom za MASP-2 istovremeno sa antibiotskim tretmanom ili oni mogu biti naizmenično tretirani sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2 bez istovremenog lečenja sa antibiotikom, posebno za enterogenu E. coli za koju je lečenje antibiotikom kontraindikovano. Subjekat inficiran enterogenom E. coli koji je lečen antibiotikom može biti sa povećani rizikom da razvije HUS i može biti pogodno lečen sa inhibitornom kompozicijom MASP-2 koja je ovde opisana da bi se smanjio taj rizik. Subjekat inficiran enterogenom E. coli se može lečiti sa ovde

1

opisanom inhibitornom kompozicijom za MASP-2 tokom prvog vremenskog perioda u odsustvu antibiotika, a zatim tokom drugog vremenskog perioda sa oba od ovde opisane inhibitorne kompozicije za MASP-2 i antibiotika.

[0329] Subjekat koji boluje od HUS-a može biti inicijalno lečen sa ovde opisanom inhibitornom kompozicijom za MASP-2 koja se primenjuje kroz katetersku liniju, kao što je intravenska kateterska linija ili supkutana kateterska linija, tokom prvog vremenskog perioda kao što je jedan sat, dvanaest sati, jedan dan, dva dana ili tri dana. Subjekat zatim može biti lečen tokom drugog vremenskog perioda sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2 primenjenom redovnim supkutanim injekcijama, kao što su injekcije primenjene svakodnevno, dva puta nedeljno, jedan put nedeljno, svake druge nedelje, mesečno ili dva puta mesečno.

[0330] Inhibitorna kompozicija za MASP-2 koja je ovde opisana može biti primenjena subjektu koji boluje od HUS u odsustvu plazmafereze (tj. subjektu čiji simptomi HUS nisu bili lečeni plazmaferezom i nisu tretirani sa plazmaferezom u vreme lečenja sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2 ), da bi se izbegle potencijalne komplikacije plazmaferze, uključujući hemoragiju, infekciju i izloženost poremećajima i/ili alergijama koji su svojstveni davaocu plazme, ili kod subjekta koji je na drugi način averzivan na plazmaferezu ili gde u okruženju u plazmafereza nije dostupna.

[0331] Inhibitorna kompozicija za MASP-2 koja je ovde opisana može biti primenjena subjektu koji boluje od HUS istovremeno sa lečenjem pacijenta sa plazmaferezom. Na primer, subjektu koji prima terapiju plazmaferezom može zatim biti primenjena inhibitorna kompozicija za MASP-2 nakon ili naizmenično sa izmeno plazme.

[0332] Subjekat koji boluje od ili je sa rizikom da razvije HUS i koji se leči inhibitornom kompozicijom za MASP-2 koja je ovde opisana može biti praćen periodičnim određivanjem, kao što je na svakih dvanaest sati ili na dnevnoj bazi, nivoa najmanje jednog komplementnog faktora, pri čemu utvrđivanje smanjenog nivoa najmanje jednog komplementnog faktora u poređenju sa standardnom vrednošću ili sa zdravim subjektom ukazuje na potrebu za nastavkom lečenja sa kompozicijom.

[0333] I u profilaktičkim i u terapijskim režimima, kompozicije koje sadrže inhibitorne agense za MASP-2 mogu biti primenjivane u nekoliko doza sve dok se ne postigne dovoljan terapijski ishod kod subjekta. Inhibitorni agensa za MASP-2 može sadržavati anti-MASP-2 antitelo za koje može biti pogodno da se primeni kod odraslog pacijenta (npr. kod odrasle osobe prosečne težina od 70 kg) u dozi od 0,1 mg do 10 000 mg, pogodnije od 1,0 mg do 5000 mg, još pogodnije od 10,0 mg do 2000 mg, još više pogodno od 10,0 mg do 1,000 mg i najpogodnije od 50,0 mg do 500 mg. Za pedijatrijske pacijente, doziranje može biti prilagođeno proporcionalno težini pacijenta. Primena ovde opisanih inhibitornih kompozicija za MASP-2 se može vršiti jednokratnom primenom kompozicije ili ograničenom sekvencom primena, za lečenje HUS. Alternativno, kompozicija može biti primenjivana u periodičnim intervalima, poput

1

svakodnevne primene, primene dva puta dnevno, jednom nedeljno, svake druge nedelje, mesečno ili dva puta mesečno tokom dužeg vremenskog perioda u cilju lečenja HUS.

[0334] U pojedinim slučajevima, osoba koja boluje od HUS-a je prethodno bila podvrgnuta ili se trenutno podvrgava lečenju inhibitorom terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu ovde opisane kompozicije koja sadrži MASP-2 inhibitor subjektu i dalje primenu inhibitora terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5 subjektu. U pojedinim slučajevima, inhibitor terminalnog komplementa je humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U pojedinim slučajevima, inhibitor terminalnog komplementa je ekulizumab.

[0335] Farmaceutske kompozicije mogu biti primenjen subjektu koji je podložan ili na drugi način sa rizikom da oboli od TTP, u količini koja je dovoljna da se eliminiše ili smanji rizik za razvoj simptoma stanja. U terapijskim primenama, farmaceutske kompozicije se primenjuju subjektu za kojeg se sumnja ili koji već boluje od TTP, u terapijski efektivnoj količini koja je dovoljna da se ublaže ili barem delimično smanje simptomi stanja.

[0336] Subjekat koji ispoljava jedan ili više simptoma TTP, uključujući zahvaćenost centralnog nervnog sistema, trombocitopeniju, ozbiljnu zahvaćenost srca, ozbiljnu zahvaćenost pluća, gastrointestinalni infarkt i gangrenu, može biti lečen sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2 koja je ovde opisana. Subjekat za koji je utvrđeno da je sa depersijom nivoa ADAMTS13 i koji je pozitivan na testu prisustva inhibitora (tj. antitela) ADAMTS13, može biti lečen sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2 koja je ovde opisana. U još jednom slučaju koji je ovde opisan, subjekat pozitivan na testu prisustva inhibitora ADAMTS13 može biti lečen imunosupresivom (npr. kortikosteroidima, rituksanom ili ciklosporinom) istovremeno sa lečenjem sa ovde opisanom inhibitornom kompozicijom za MASP-2. Subjekat za koji je utvrđeno da ima smanjeni nivo ADAMTS13 i da je pozitivan na testu prisustva inhibitora ADAMTS13 može biti lečen sa ADAMTS13 istovremeno sa lečenjem inhibitornom kompozicijom za MASP-2 koja je ovde opisana.

[0337] Subjekat koji boluje od TTP-a može biti inicijalno lečen sa ovde opisanom inhibitornom kompozicijom za MASP-2 koja se primenjuje kroz katetersku liniju, kao što je intravenska kateterska linija ili supkutana kateterska linija, tokom prvog vremenskog perioda kao što je jedan sat, dvanaest sati, jedan dan, dva dana ili tri dana. Subjekat zatim može biti lečen tokom drugog vremenskog perioda sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2 primenjenom redovnim supkutanim injekcijama, kao što su injekcije primenjene svakodnevno, dva puta nedeljno, jedan put nedeljno, svake druge nedelje, mesečno ili dva puta mesečno.

[0338] Inhibitorna kompozicija za MASP-2 koja je ovde opisana može biti primenjena subjektu koji boluje od HUS u odsustvu plazmafereze (tj. subjektu čiji TTP simptomi nisu bili lečeni plazmaferezom

1

i nisu tretirani sa sa plazmaferezom u vreme lečenja sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2 ), da bi se izbegle potencijalne komplikacije plazmaferze, uključujući hemoragiju, infekciju i izloženost poremećajima i/ili alergijama koji su svojstveni davaocu plazme, ili kod subjekta koji je na drugi način averzivan na plazmaferezu ili gde u okruženju u plazmafereza nije dostupna.

[0339] Inhibitorna kompozicija za MASP-2 koja je ovde opisana može biti primenjena subjektu koji boluje od TTP-a istovremeno sa lečenjem pacijenta sa plazmaferezom. Na primer, subjektu koji prima terapiju plazmaferezom može zatim biti primenjena inhibitorna kompozicija za MASP-2 nakon ili naizmenično sa izmenom plazme.

[0340] Subjekat koji boluje od refraktornog TTP, tj. simptoma TTP koji nisu adekvatno reagovali na drugi tretman, kao što je plazmafereza, može biti lečen sa inhibitornom kompozicijom za MASP-2 koja je ovde opisana, sa ili bez dodatne plazmafereze.

[0341] Subjekat koji boluje od ili je sa rizikom da razvije TTP i koji se leči inhibitornom kompozicijom za MASP-2 koja je ovde opisana može biti praćen periodičnim određivanjem, kao što je na svakih dvanaest sati ili na dnevnoj bazi, nivoa najmanje jednog komplementnog faktora, pri čemu utvrđivanje smanjenog nivoa najmanje jednog komplementnog faktora u poređenju sa standardnom vrednošću ili sa zdravim subjektom ukazuje na potrebu za nastavkom lečenja sa kompozicijom.

[0342] I u profilaktičkim i u terapijskim režimima, kompozicije koje sadrže inhibitorne agense za MASP-2 mogu biti primenjivane u nekoliko doza sve dok se ne postigne dovoljan terapijski ishod kod subjekta. U jednom slučaju koji je ovde opisan, inhibitorni agensa za MASP-2 sadrži anti-MASP-2 antitelo za koje može biti pogodno da se primeni kod odraslog pacijenta (npr. kod odrasle osobe prosečne težina od 70 kg) u dozi od 0,1 mg do 10000 mg, pogodnije od 1,0 mg do 5000 mg, još pogodnije od 10,0 mg do 2000 mg, još više pogodno od 10,0 mg do 1,000 mg i najpogodnije od 50,0 mg do 500 mg. Za pedijatrijske pacijente, doziranje može biti prilagođeno proporcionalno težini pacijenta. Primena ovde opisanih inhibitornih kompozicija za MASP-2 se može vršiti jednokratnom primenom kompozicije ili ograničenom sekvencom primena, radi lečenja TTP. Alternativno, kompozicija može biti primenjivana u periodičnim intervalima, poput svakodnevne primene, primene dva puta dnevno, jednom nedeljno, svake druge nedelje, mesečno ili dva puta mesečno tokom dužeg vremenskog perioda u cilju lečenja TTP.

[0343] U pojedinim slučajevima, osoba koja boluje od HUS-a je prethodno bila podvrgnuta ili se trenutno podvrgava lečenju inhibitorom terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu ovde opisane kompozicije koja sadrži MASP-2 inhibitor subjektu i dalje primenu inhibitora terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5 subjektu. U pojedinim slučajevima,

1

inhibitor terminalnog komplementa je humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U pojedinim slučajevima, inhibitor terminalnog komplementa je ekulizumab.

[0344] I u profilaktičkim i u terapijskim režimima, kompozicije koje sadrže inhibitore MASP-2 mogu biti primenjivani u nekoliko doza dok se ne postigne dovoljan terapijski ishod kod subjekta. U jednom slučaju koji je ovde opisan, inhibitorni agens za MASP-2 sadrži anti-MASP-2 antitelo za koje je pogodno da se primeni može primeniti kod odraslog pacijenta (npr. Prosečna težina odrasle osobe od 70 kg) u dozi od 0,1 mg do 10000 mg, pogodnije od 1,0 mg do 5000 mg, pogodnije 10,0 mg do 2000 mg, pogodnije 10,0 mg do 1,000 mg i još pogodnije od 50,0 mg do 500 mg. Za pedijatrijske pacijente, doziranje se može prilagoditi proporcionalno težini pacijenta. Primena ovde opisanih inhibitornih kompozicija MASP-2 može se izvršiti jednokratnom primenom kompozicije, ili ograničenom sekvencom primena, za lečenje TTP. Alternativno, kompozicija se može primenjivati u periodičnim intervalima, poput dnevnog, dvonedeljnika, nedeljno, svake druge nedelje, mesečno ili dvomesečno, tokom dužeg vremenskog perioda u cilju lečenja TTP.

[0345] U pojedinim slučajevima, subjekat koji boluje od TTP-a je prethodno bio podvrgnut ili se trenutno podvrgava lečenjusa inhibitorom terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu ovde opisane kompozicije koja sadrži MASP-2 inhibitor subjektu i dalje primenu inhibitora terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5 subjektu. U pojedinim slučajevima, inhibitor terminalnog komplementa je humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U pojedinim slučajevima, inhibitor terminalnog komplementa je ekulizumab.

VI. PRIMERI

[0344] Primeri koji ne potpadaju unutar obima patentnih zahteva su uključeni kao referentni primeri u vidu asistencije za stručnjaka.

PRIMER 1

[0345] Ovaj Primer opisuje generisanje mišjeg soja sa deficijencijom MASP-2 (MASP-2-/-), ali sa dovoljno MAp19 (MAp19 /+).

[0346] Materijali i postupci: Ciljani vektor pKO-NTKV 1901 je dizajniran tako da se poremete tri egzona koji kodiraju C-terminalni kraj mišjeg MASP-2, uključujući egzon koji kodira serin proteazni domen, kao što je prikazano na SLICI 3. PKO-NTKV 1901 je upotrebljen za transfekciju mišje ES ćelijske linije E14.1a (SV129 Ola). Selektovani su zatim klonovi rezistentni na Neomicin i Timidin kinazu. Skrinovano je 600 ES klonova i od njih su Southern blot postupkom identifikovana i verifikovana četiri različita klona koji su sadržavali očekivane selektivne ciljne i rekombinantne događaje kao što je prikazano na SLICI 3.

11

Himere su generisane iz ova četiri pozitivna klona transferom embriona. Himere su zatim povratno ukrštene sa matičnom genetičkom osnovom C57/BL6 da bi se stvorili transgeni mužjaci. Transgeni mužjaci su ukršteni sa ženkama da bi generisale F1 sa 50% potomaka koji su bili heterozigotni za poremećen MASP-2 gen. Heterozigotni miševi su međusobno ukrštani da bi se generisalo potopstvo homozigotno u deficijenciji MASP-2, rezultat čega su bili heterozigotni i miševi divljeng tipa u odnosu od 1:2:1, tim redom.

[0347] Rezultati i fenotip: Utvrđeno je da su dobijeni homozigotni MASP-2-/- deficijentni miševi vijabilni i fertilni. Southern blot postupkom je zatim potvrđeno da je prisutan ispravan ciljni događaj i da su miševi sa deficijencijom MASP-2, dok je Northern blot analizom potvrđeno odsustvo iRNK za MASP-2, a dalje je imunoblot postupkom potvrđeno i odsustvo MASP-2 proteina (podaci nisu prikazani). Prisustvo iRNK za MAp19 i odsustvo iRNK za MASP-2 su dodatno potvrđeni upotrebo RT-PCR postupka u realnom vremenu na LightCycler mašini. MASP-2-/- miševi nastavljaju da eksprimiraju MAp19, MASP-1 i MASP-3 iRNK i protein, kao što se očekivalo (podaci nisu prikazani). Prisustvo i zastupljenost iRNK za Properdin, Faktor B, Faktor D, C4, C2 i C3 kod MASP-2-/- miševa su ispitani analizom na LightCycler aparatui utvređeno je da su identini onima kod kontrola divljeg tipa iz istih okota (podaci nisu prikazani). Plazma homozigotnih MASP-2-/- miševa je bbila u potpunosti deficijentna u aktivaciji komplementa posredovanoj lektinskim putem, kao što je dalje opisano u Primeru 2.

[0348] Generisanje MASP-2-/- soja na kompletno C57BL6 genetičkoj osnovi: MASP-2-/- miševi su povratno ukrštani sa čistom C57BL6 linijom tokom devet generacija pre upotrebe MASP-2-/- soja kao eksperimentalnog životinjskog modela.

[0349] Transgeni mišji soj koji je -/- za mišji MASP-2, MAp19 /+ i koji eksprimira humani MASP-2 transgen (mišji MASP-2 knock-out i humani MASP-2 knock-in) takođe je generisan na sledeći način:

Materijali i postupci: Konstruisan je i minigen koji kodira humani MASP-2 pod nazivom „mini hMASP-2“ (SEQ ID NO:49), koji je kao što je to prikazano na SLICI 4, a koji obuhvata promotorski region humanog MASP 2 gena, uključujući prva 3 egzona (od egzona 1 do egzon 3) praćene sa cDNK sekvencom koja predstavlja kodirajuću sekvencu sledećih 8 egzona, ćime se kodira MASP-2 protein pune dužine regulisan njegovim endogenim promotorom. Mini hMASP-2 konstrukt je injeciran u oplođena jajašca MASP-2-/- da bi se zamenio deficijentan mišji MASP 2 gen sa transgeno eksprimiranim humanim MASP-2.

PRIMER 2

[0350] Ovaj primer pokazuje da je MASP-2 potreban za aktivaciju komplementa preko lektinskog puta.

Postupci i materijali:

[0351] Analiza C4 cepanja specifičnog za lektinski put: Analiza cepanja C4 je opisana od strane Petersena i saradnika, J. Immunol. Methods 257:107 (2001) i meri aktivaciju lektinskog puta koja je rezultat nastanka lipoteihoične kiseline (LTA) iz S. aureus koja vezuje L-fikolin. Analiza opisana od strane Petersena i saradnika (2001) je prilagođena merenju aktivacije lektinskog puta putem MBL, prevlačenjem ploče sa LPS-om i mananom ili zimosanom pre dodavanja seruma iz MASP-2-/- miševa, kao što je opisano u nastavku teksta. Analiza je takođe modifikovana da bi se uklonila mogućnost cepanja C4 usled aktivnosti klasičnog puta. Navedeno je postignuto upotrebom pufera za razblaživanje uzorka koji je sadržavao 1 M NaCl, što omogućava vezivanje komponenata prepoznavanja lektinskog puta za njihove ligande sa visokim afinitetom, ali sprečava aktivaciju endogenog C4, čime se isključuje učešće klasičnog puta disocijacijom kompleksa C1. Ukratko opisano, u modifikovanoj analizi se uzorci seruma (razblaženi u puferu sa visokom koncentracijom soli (1 M NaCl)) dodaju na ploče obložene ligandom, nakon čega sledi dodavanje konstantne količine prečišćenog C4 u pufer sa fiziološkom koncentracijom soli. Vezani kompleksi za prepoznavanje koji sadrže MASP-2 cepaju C4, čega je rezultat deponovanje C4b.

Postupci analize:

[0352]

1) Maxisorb mikrotitarske ploče kompanije Nunc (Maxisorb, Nunc, kat. br.442404, Fisher Scientific) su oblagane sa mananom koncentracije 1 μg/ml (M7504 Sigma) ili sa bilo kojim drugim ligandom (npr. sa onima koji su navedeni u nastavku) razblaženim u puferu za oblaganje (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,6).

U analizi su upotrebljeni sledeći reagensi:

a. manan (1 µg/bunariću manana (M7504 Sigma) u 100 µl pufera za oblaganje):

b. zimosan (1 µg/bunariću zimosana (Sigma) u 100 µl pufera za oblaganje);

c. LTA (1 µg/bunariću u 100 µl pufera za oblaganje ili 2 µg/bunariću u 20 µl metanola)

d. 1 µg MAt 4H5 specifičnog za H-fikolin u puferu za oblaganje

e. PSA iz Aerococcus viridans (2 µg/bunariću u 100 µl pufera za oblaganje)

f. S. aureus DSM20233 (100 µl/bunariću) fiksiran u formalinu (OD550=0,5) u puferu za oblaganje.

2) Ploče su inkubirane preko noći na 4°C.

3) Nakon inkubacije preko noći, preostala mesta vezivanja za proteine su zasićena inkubiranim ploča sa 0,1% HSA-TBS puferom za blokiranje (0,1% (m/v) HSA u 10 mM Tris-CL, 140 mM NaCl, 1,5 mM NaN3, pH 7,4) tokom 1-3 sata, pa su ploče 3X isprane sa TBS/Tween/Ca<2+>(TBS sa 0,05% Tween-20 i 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,4).

4) Uzorci seruma koji su ispitivani su razblaživani u puferu za vezivanje MBL (1 M NaCl), nakon čega su razblaženi uzorci su dodati na ploče i inkubirani preko noći na 4°C. Bunarići u kojima se nalazio samo pufer su upotrebljavani kao negativne kontrole.

5) Nakon inkubacije preko noći na 4°C, ploče su isprane 3X sa TBS/Tween/Ca2+. Zatim je u ploče dodat humani C4 (100 µl/bunariću rastvora od 1 µg/ml razblaženog u BBS-u (sa 4 mM barbitala, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,4)) i ploče su inkubirane tokom 90 minuta na 37°C. Ploče su ponovo isprane 3X TBS/Tween/Ca<2+>.

6) Deponovanje C4b je detektovano anti-humanim C4c antitelom iz pileta konjugovanim sa alkalnom fosfatazom (razblaženim 1:1000 u TBS/Tween/Ca<2+>), koji je dodat u ploče i inkubiran 90 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim ponovo isprane sa 3X TBS/Tween/Ca<2+>.

7) Alkalna fosfataza je detektovana dodavanjem 100 µl rastvora p-nitrofenil fosfatnog supstrata, inkubiranjem na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta i konačno očitavanjem na OD405u čitaču mikrotitarskih pločica.

[0353] Rezultati: SLIKE 5A-B prikazuju količinu deponovanja C4b na mananu (SLIKA 5A) i zimosanu (SLIKA 5B) u razblaženjima seruma iz MASP-2+/+ (krstići), MASP-2+/- (obojeni krugovi) i MASP-2-/-(obojeni trouglovi). SLIKA 5C prikazuje relativnu aktivnost C4 konvertaze na pločama obloženim sa zimosanom (beli stubići) ili mananom (osenčeni stubići) za MASP-2-/+ miševa (n=5) i MASP-2-/- miševe (n=4) u odnosu na miševe divljeg tipa (n=5), dobijenu na osnovu merenja količine deponovanja C4b i normalizacijom u odnosu na serum divljeg tipa. Greške predstavljaju standardnu devijaciju. Kao što je prikazano na SLIKAMA 5A-C, pločama obloženim mananom i zimosanom, plazma MASP-2-/- miševa je u potpunosti deficijentna u aktivaciji komplementa posredovanoj lektinskim putem. Ovi rezultati jasno pokazuju da je MASP-2 efektorska komponenta lektinskog puta.

11

Rekombinantan MASP-2 rekonstituiše aktivaciju C4 zavisnu od lektinskog puta u serumu iz MASP-2-/- miševa

[0354] Da bi se utvrdilo da je odsustvo MASP-2 direktan uzrok gubitka aktivacije C4 zavisne od lektinskog puta kod MASP-2-/- miševa, ispitan je efekat dodavanja rekombinantnog MASP-2 proteina uzorcima seruma u analizi cepanja C4 koja je prethodno opisana. Rekombinantni proteini funkcionalno aktivnog mišjeg MASP-2 i katalitički neaktivnog mišjeg MASP-2A (u kome je ostatak serina iz aktivnog mesta u serin proteaznom domenu zamenjen ostatkom alanina) proizvedeni su i prečišćeni kao što je opisano ispod, u Primeru 3. Objedinjeni serumi iz 4 MASP-2-/- miša su prethodno inkubirani sa rastućim proteinskim koncentracijama rekombinantnog mišjeg MASP-2 ili neaktivnog rekombinantnog mišjeg MASP-2A pa je aktivnost C4 konvertaze ispitana kao što je to prethodno opisano.

[0355] Rezultati: Kao što je prikazano na SLICI 6, dodavanje funkcionalno aktivnog mišjeg rekombinantnog MASP-2 proteina (prikazano sa neobojenim trouglićima) serumu dobijenom iz MASP-2-/- miševa, obnovilo je aktivaciju C4 zavisnu od lektinskog puta na način koji je zavisio od koncentracije proteina, dok je katalitički neaktivan mišji MASP-2A protein (prikazano sa zvezdicama) nije obnovio aktivaciju C4. Rezultati prikazani na SLICI 6 su normalizovani u odnosu na aktivaciju C4 koja je uočena kod objedinjenog seruma iz miševa divljeg tipa (prikazano isprekidanom linijom).

PRIMER 3

[0356] Ovaj Primer opisuje rekombinantnu ekspresiju i proizvodnju proteina rekombinantnih humanih, pacovskih i mišjih MASP-2 pune dužine, polipeptida izvedenih iz MASP-2 i katalitički neaktivnih mutiranih oblika MASP-2

Ekspresija humanog, mišjeg i pacovskog MASP-2 pune dužine:

[0357] cDNK sekvenca pune dužine humanog MASP-2 (SEQ ID NO: 4) je takođe subklonirana u sisarski ekspresioni vektor pCI-Neo (Promega), koji pokreće eukariotsku ekspresiju pod kontrolom CMV pojačivačkog/promotorskog regiona (opisanog u Kaufman R.J. i saradnici, Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)). Mišja cDNK pune dužine (SEQ ID NO:50) i cDNK pacovskog MASP-2 (SEQ ID NO:53) su subklonirane u pED ekspresioni vektor. Ekspresioni vektori za MASP-2 su zatim transfektovani u adherentnu ćelijsku liniju jajnika kineskog hrčka DXB1, upotrebom standardne procedure transfekcije sa kalcijum-fosfatom koja je opisana u Maniatis i saradnici, 1989. Ćelije transfektovane sa ovakvim konstruktima su rasle vrlo sporo, što ukazuje da je kodirana proteaza citotoksična.

[0358] U drugom pristupu, minigenski konstrukt (SEQ ID NO:49) koji je sadržavao humanu cDNK MASP-2, pod kontrolom njegovog endogenog promotora, tranzijentno je transfektovan u ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO). Humani MASP-2 protein se izlučivao u medijum za kulturu i izolovan je kao što je opisano u nastavku teksta.

Ekspresija katalitički neaktivnog MASP-2 pune dužine:

[0359] Obrazloženje: MASP-2 se aktivira autokatalitičkim cepanjem nakon vezivanja subkomponenti prepoznavanja MBL ili fikolina (bilo L-fikolina, H-fikolina ili M-fikolina) za njihov odgovarajući obrazac ugljenih hidrata. Autokatalitičko cepanje čiji je rezultat aktivacija MASP-2, često se odvija tokom procedure izolacije MASP-2 iz seruma ili tokom prečišćavanja nakon rekombinantne ekspresije. Da bi se obezbedio stabilniji proteinski preparat za upotrebu u vidu antigena, katalitički neaktivan oblik MASP-2, označen kao MASP-2A, stvoren je zamenom serinskog ostatka koji je prisutan u katalitičkoj trijadi proteaznog domena, sa alaninskim ostatkom kod pacova (SEQ ID NO:55 Ser617 u Ala617); kod miša (SEQ ID NO:52 Ser617 u Ala617); ili kod čoveka (SEQ ID NO:3 Ser618 u Ala618).

[0360] Da bi se generisali katalitički neaktivni humani i mišji MASP-2A proteini, izvedena je mutageneza usmerena na mesto, upotrebom oligonukleotida prikazanih u TABELI 5. Oligonukleotidi u TABELI 5 su dizajnirani tako da dolazi do anilinga za region humane i mišje cDNK koji kodira enzimski aktivni serin, a oligonukleotid sadrži bazu koja je za pogrešno sparivanje da bi se serinski kodon izmenio u alaninski kodon. Na primer, PCR oligonukleotidi iz SEQ ID NO:56-59 su upotrebljavani u kombinaciji sa humanom MASP-2 cDNK (SEQ ID NO:4) da bi se umnožio region od start kodona do enzimski aktivnog serina i od serina do stop kodona, a radi generisanja kompletne sekvence sa otvorenim okvirom čitanja kod mutiranog MASP-2A koji sadrži mutaciju tipa Ser618 u Ala618. PCR proizvodi su prečišćavani nakon elektroforeze na agaroznom gelu i pripreme traka, a preklapanja sa po jednim adenozinom su generisana upotrebom standardne procedure upoređivanja „repova“ sekvenci. MASP-2A sa “repom” adenozina je zatim kloniran u pGEM-T easy vektor, transformisan u E. coli.

[0361] Katalitički neaktivan pacovski MASP-2A protein je generisan dejstvom kinaza i anilingom SEQ ID NO:64 i SEQ ID NO:65, i to spajanjem ova dva oligonukleotida u jednakim molarnim količinama, zagrevanjem na 100°C tokom 2 minuta i laganim hlađenjem do sobne temperature. Dobijeni anilovani fragmenti su bili sa krajevima kompatibilnim za Pst1 i Xbal i insertovani su zatim umesto Pst1-Xba1 fragmenta iz cDNK pacovskog MASP-2 divljeg tipa (SEQ ID NO:53) da bi se generisao pacovski MASP-2A.

5' GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (SEQ ID NO:64)

5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3’ (SEQ ID NO:65)

11

[0362] Svaki od humanog, mišjeg i pacovskog MASP-2A je dalje subkloniran u bilo koji od sisarskih ekspresionih vektora sisara pED ili pCI-Neo, nakon čega su transfektovani u ćelijsku liniju jajnika kineskog hrčka DXB1, kao što je opisano u nastavku teksta.

[0363] U drugom pristupu, katalitički neaktivan oblik MASP-2 je konstruisan upotrebom postupaka koji su opisani u Chen i saradnici, J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001. Ukratko, plazmid koji je sadržavao cDNK pune dužine za humani MASP-2 (opisanu u Thiel i saradnici, Nature 386:506, 1997) je podvrgnut digestiji sa Xho1 i EcoR1, nakon čega je MASP-2 cDNK (ovde opisana kao SEQ ID NO:4) klonirana u odgovarajuća restrikciona mesta iz pFastBac1 bakulovirusnog vektora za transfer (Life Technologies, NY). Serin proteazno aktivno mesto MASP-2 na Ser618 je zatim izmenjeno u Ala618 zamenom dvolančanih oligonukleotida koji kodiraju aminokiselinu peptidnog regiona 610-625 (SEQ ID NO:13) sa nativnim regionom aminokiselina od 610 do 625 da bi se storio MASP-2 polipeptid pune dužine sa neaktivnim proteaznim domenom. Konstrukt ekspresionih plazmida koji sadrže polipeptidne regione izvedene iz humango Masp-2.

[0364] Konstrukti koji slede su proizvedeni upotrebom MASP-2 signalnog peptida (ostaci 1-15 iz SEQ ID NO:5) u cilju sekrecije raznih domena MASP-2. Konstrukt koja eksprimira humani MASP-2 CUBI domen (SEQ ID NO:8) je napravljen PCR postupkom, umnožavanjem regiona koji kodira ostatke 1-121 iz MASP-2 (SEQ ID NO:6) (što odgovara N-terminalnom CUB1 domenu). Konstrukt koja eksprimira humani MASP-2 CUBIEGF domen (SEQ ID NO:9) je napravljen PCR postupkom, umnožavanjem regiona koji kodira ostatke 1-166 iz MASP-2 (SEQ ID NO:6) (što odgovara N-terminalnom CUBIEGF domenu). Konstrukt koja eksprimira humani MASP-2 CUBIEGFCUBII domen (SEQ ID NO:10) je napravljen PCR postupkom, umnožavanjem regiona koji kodira ostatke 1-293 iz MASP-2 (SEQ ID NO:6) (što odgovara N-terminalnom CUBIEGFCUBII domenu). Prethodno pomenuti domeni su umnoženi PCR postupkom upotrebom VentRpolimeraze i pBS-MASP-2 kao matrice, prema uspostavljenim PCR postupcima. U okviru sens prajmera, 5’ sekvenca (5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3’ SEQ ID NO:34) je uvela BamHI restrikciono mesto (podvučeno) na 5’ kraj PCR proizvoda. Antisens prajmeri za svaki od MASP-2 domena su prikazani ispod, u TABELI 5 i dizajnirani su tako da uvedu stop kodon (podebljana slova), nakon koga je sledilo EkoRI mesto (podvučeno) na kraju svakog PCR proizvoda. Jednom umnoženi, fragmenti DNK su podvrgavani digestiji sa BamHI i EkoRI, nakon čega su kolinirani u odgovarajuća mesta pFastBac1 vektora. Dobijeni konstrukti su okarakterisani restrikcionim mapiranjem i potvrđeni su dsDNK sekvenciranjem.

11

TABELA 5: PCR PRAJMERI ZA MASP-2

Rekombinantna eukariotska ekspresija MASP-2 i proteinska proizvodnja enzimski neaktivnog mišjeg, pacovskog i humanog MASP-2A.

[0365] Ekspresioni konstrukti MASP-2 i MASP-2A koji su prethodno opisani, transfekcijom su uvedeni u DXB1 ćelije upotrebom standardne procedure transfekcije sa kalcijum-fosfatom (Maniatis i saradnici, 1989). MASP-2A je proizveden u medijumu bez seruma da bi se osiguralo da preparati ne budu kontaminirani drugim serumskim proteinima. Medijumi su prikupljani sa konfluentnih ćelija svakog

11

drugog dana (ukupno četiri puta). Nivo rekombinantnog MASP-2A je u proseku iznosio približno 1,5 mg/litru medijuma za kulturu, za svaku od tri vrste.

[0366] Prečišćavanje MASP-2A proteina: MASP-2A (prethodno opisan Ser-Ala mutant) je prečišćen afinitetnom hromatografijom na MBP-A-agaroznim kolonama. Ova strategija je omogućila brzo prečišćavanje bez upotrebe egzogeno dodatih obeleživača (tagova). MASP-2A (100-200 ml medijuma razblaženog jednakom zapreminom pufera za nalivanje (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, koji je sadržavao 150 mM NaCl i 25 mM CaCl)2) je nanet na MBP-agaroznu afinitetnu kolonu (4 ml) prethodno uravnoteženu sa 10 ml pufera za nalivanje. Nakon pranja sa dodatnih 10 ml pufera za nalivanje, protein je eluiran u frakcijama od 1 ml sa 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, koji je sadržavao 1,25 M NaCl i 10 mM EDTA. Frakcije koje su sadržavale MASP-2A su identifikovane elektroforezom na SDS-poliakrilamidnom gelu. Kada je to bilo potrebno, MASP-2A je dodatno prečišćen jono-izmenjivačkom hromatografijom na MonoQ koloni (HR 5/5). Protein je dalje podvrgnut dijalizi sa 50 mM Tris-Cl pH 7,5 koja je sadržavala 50 mM NaCl, nakon čega je nanet na kolonu uravnoteženu u istom puferu. Nakon pranja, vezani MASP-2A je eluiran sa gradijentom 0,05-1 M NaCl u 10 ml.

[0367] Rezultati: Prinosi od 0,25-0,5 mg MASP-2A proteina su dobijeni iz 200 ml medijuma. Molekulska masa od 77,5 kDa je određena MALDI-MS postukom i bila je veća od izračunate vrednosti nemodifikovanog polipeptida (73,5 kDa) usled glikozilacije. Vezivanje glikana na svakom od N-glikozilacionih mesta doprinosi masi koja je uočena. MASP-2A migrira kao jedna traka na SDS-poliakrilamidnim gelovima, pokazujući da nije proteolitički obrađen tokom biosinteze. Težina -prosečna molekulska masa određena ravnotežnim ultracentrifugiranjem je bila u skladu sa izračunatom vrednošću za homodimere glikozilovanog polipeptida.

PROIZVODNJA REKOMBINANTNIH HUMANIH MASP-2 POLIPEPTIDA

[0368] Drugi postupak za proizvodnju rekombinantnih polipeptida izvedenih iz MASP-2 i MASP2A je opisana u Thielens N.M. i saradnici, J. Immunol. 166:5068-5077, 2001. Ukratko, ćelije insekta Spodoptera frugiperda (Ready-Plaque Sf9 ćelije nabavljene od kompanije Novagen, Madison, WI) su gajene i održavane u Sf900II medijumu bez seruma (Life Technologies), u koji je bilo dodato 50 IU/ml penicilinaa i 50 mg/ml streptomicina (Life Technologies). Ćelije insekta Trichoplusia ni (High Five) (opisani od strane Jadwiga Chroboczek-a, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, Francuska) održavane su u TC100 medijumu (Life Technologies) koji je sadržavao 10% FCS (Dominique Dutscher, Brumath, Francuska) i u koji je bilo dodato 50 IU/ml penicilina i 50 mg/ml streptomicina. Rekombinantni bakulovirusi su generisani upotrebom Bac-to-Bac sistema (Life Technologies). Bakmidna DNK je prečišćena upotrebom Midiprep sistema za prečišćavanje kompanije Qiagen (Qiagen) i upotrebljena je za transfekciju Sf9 ćelija insekata upotrebom cellfektin-a u Sf900 II SFM

11

medijumu (Life Technologies) kao što je opisano u protokolu proizvođača. Čestice rekombinantnih virusa su prikupljene 4 dana kasnije, titrirane su u analizi virusnih plakova, pa su umnožene kao što je opisano od strane autora King i Possee, u The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, str.111-114, 1992.

[0369] High Five ćelije (1,75 x 10<7>ćelija/falsku za kulturu tkiva od 175-cm<2>) je bilo inficirano sa rekombinantnim virusima koji su sadržavali MASP-2 polipeptide uz multiplicitet infekcije od 2, u Sf900 II SFM medijumu na 28°C, tokom 96 h. Supernatanti su prikupljeni centrifugiranjem, pa je dodavan diizopropil fosforofluoridat do finalne koncentracije od 1 mM.

[0370] Polipeptidi MASP-2 se izlučio u medijumu kulture. Supernatanti kulture su podvrgnuti dijalizi sa 50 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 50 mM trietanolamin hidrohloridom, pH 8,1, pa su naneti stopom od 15 ml/min na Q-sefaroznu kolonu za brzi protok (Amersham Pharmacia Biotech) (2,8 x 12 cm) uravnoteženu u istom puferu. Elucija je rađena primenom 1,2 litarskog linearnog gradijenta do 350 mM NaCl u istom puferu. Frakcije koje su sadržavale rekombinantne MASP-2 polipeptide su identifikovane imunoblot analizom, pa su istaložene dodavanjem (NH4)2SO4do 60% (m/v), nakon čega su ostavljene preko noći na 4°C. Talozi su resuspendovani u 145 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 50 mM trietanolamin hidrohlorida, pH 7,4, pa su naneti na TSK G3000 SWG kolonu (7,5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeriville, PA) uravnoteženu u istom puferu. Prečišćeni polipeptidi se zatim koncentrovani do 0,3 mg/ml ultrafiltracijom na Microsep mikrokoncentratorima (m.t. granična vrednost = 10 000) (Filtron, Karlstein, Nemačka).

PRIMER 4

[0371] Ovaj Primer opisuje postupak proizvodnje poliklonskih antitela na MASP-2 polipeptide.

Materijali i postupci:

[0372] MASP-2 Antigeni: Poliklonski anti-humani MASP-2 antiserum je proizveden imunizacijom zečeva sledećim izolovanim MASP-2 polipeptidima: humanim MASP-2 (SEQ ID NO:6) izolovanim iz seruma; rekombinantnim humanim MASP-2 (SEQ ID NO:6), MASP-2A koji je sadržavao neaktivan proteazni domen (SEQ ID NO:13), kao što je opisano u Primeru 3; i rekombinantni CUBI (SEQ ID NO:8), CUBEGFI (SEQ ID NO:9) i CUBEGFCUBII (SEQ ID NO:10) eksprimirane kao što je prethodno opisano u Primeru 3.

[0373] Poliklonska antitela: Šest nedelja stari zečevi su prajmovani sa BCG-om (vakcinom za Calmette-Guerin-ov bacil), pa su imunizovani injeciranjem 100 µg MASP-2 polipeptida u vidu rastvora koncentracije 100 µg/ml u sterilnom fiziološkom rastvoru. Injeciranja su rađena svake 4 nedelje, a titar

11

antiteela je praćem ELISA postupkom kao što je opisano u Primeru 5. Supernatanti kulture su prikupljani radi prečišćavanja antitela afinitetnom hromatografijom sa proteinom A.

PRIMER 5

[0374] Ovaj Primer opisuje postupak za proizvodnju mišjih monoklonskih antitela na pacovske ili humane MASP-2 polipeptide.

Materijali i postupci:

[0375] Mužjaci A/J miševa (Harlan, Houston, Teksas), stari 8-12 nedelja, subkutano su injecirani sa 100 µg rMASP-2 ili rMASP-2A polipeptida čoveka ili pacova (napravljenih kao što je opisano u Primeru 3) u kompletnom Frojndovom adjuvansu (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), u 200 µl fiziološkog rastvora puferisanog sa fosfatom (PBS) pH 7,4. U intervalima od dve nedelje, miševi su dva puta subkutano injecirani sa po 50 µg humanog ili pacovskog rMASP-2 ili rMASP-2A polipeptida u nepotpunom Frojndovom adjuvansu. Četvrte nedelje, miševi su injecirani sa 50 µg humanog ili pacovskog rMASP-2 ili rMASP-2A polipeptida u PBS-u i 4 dana kasnije su upotrebljavani za fuzije.

[0376] Za svaku fuziju je pripremana suspenzija pojedinačnih ćelija iz slezine imunizovanog miša i upotrebljavana je dalje za fuziju sa Sp2/0 ćelijama mijeloma. Fuzionisano je po 5x10<8>Sp2/0 i 5x10<8>ćelija slezine, u medijumu koji je sadržavao 50% polietilen glikol (M.T.1450) (Kodak, Rochestar, NY) i 5% dimetilsulfoksid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Koncentracija ćelija je zatim podešavana tako da bude 1,5x10<5>ćelija slezine na 200 µl suspenzije u Iscove medijumu (Gibco, Grand Island, NY), u koji je bilo dodato 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 jedinica/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina, 0,1 mM hipoksantina, 0,4 µM aminopterina i 16 µM timidina. Dve stotine mikrolitara ćelijske suspenzije je dodato u svaki od oko dvadeset bunarića mikrotitarske ploče za kulturu sa 96 mesta. Nakon desetak dana, supernatanti kultura su izvučeni da bi se uradio skrining reaktivnosti sa prečišćenim faktorom MASP-2 u ELISA testu.

[0377] ELISA test: Bunarići ploča Immulon 2 za mikortestiranja (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) su oblagani dodavanjem po 50 µl prečišćenog hMASP-2 koncentracije 50 ng/ml, ili rMASP-2 pacova (ili rMASP-2A), i inkubiranjem preko noći na sobnoj temperaturi. Niska koncentracija MASP-2 za oblaganje je omogućila odabir antitela sa visokim afinitetom. Nakon uklanjanja rastvora za oblaganje obrtanjem i treskanjem ploče, u svaki bunarić je dodavano po 200 µl BLOTTO (obranog mleka u prahu ) u PBS-u i ploča je inkubirana tokom jednog sata da bi se blokirala nespecifična mesta. Sat vremena kasnije, bunarići su isprani PBST puferom (PBS koji je sadržavao 0,05% Tween 20). Iz svakog bunarića za fuziju je zatim prikupljeno po pedeset mikrolitara supernatanata kulture koji su dalje pomešani sa 50 µl BLOTTO reagensa i dodati u pojedinačne bunariće ploča za mikrotestiranja. Nakon jednog sata

12

inkubacije, bunarići su isprani sa PBST-om. Vezana mišja antitela su detektovana potom reakcijom sa kozijim anti-mišjim IgG (specifičnim za Fc) konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.), razblaženim u BLOTTO reagensu u koncentraciji od 1:2000. Rastvor supstrata za peroksidazu koji je sadržavao 0,1% 3,3,5,5 tetrametil benzidina (Sigma, St. Louis, Mo.) i 0,0003% vodonik-peroksida (Sigma), dodat je u bunariće da bi se razvila boja tokom 30 minuta. Reakcija je završena dodavanjem 50 μl 2M H2SO4po bunariću. Optička gustina reakcione smeše je očitana na 450 nm upotrebom BioTek ELISA čitača (BioTek Instruments, Winooski, Vt.).

Analiza vezivanja MASP-2:

[0378] Supernatanti kultura koje su bile pozitivne u MASP-2 ELISA testu koji je prethodno opisan, mogu dalje biti ispitani u analizi vezivanja, da bi se za inhibitorni agens za MASP-2 odredio afinitet vezivanja za MASP-2. Slična analiza takođe može biti upotrebljena za određivanje da li se inhibitorni agensi vezuju za druge antigene u sistemu komplementa.

[0379] Bunarići polistirenskih mikrotitarskih ploča (Ploče umerenog vezivanja sa 96 mesta, Corning Costar, Cambridge, MA) su oblagani sa MASP-2 (20 ng/100 µl/bunariću, Advanced Research Technology, San Diego, CA) u fiziološkom rastvoru puferisanom sa fosfatom (PBS) pH 7,4, preko noći na 4°C. Nakon aspiracije rastvora MASP-2, bunarići su blokirani sa PBS-om koji je sadržavao 1% goveđeg serumskog albumina (BSA; Sigma Chemical) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Bunariće koji nisu bili obloženi sa MASP-2 su poslužili kao kotrole za merenje siganal pozadine. Alikvoti supernatanata hibridoma ili prečišćenih anti-MASP-2 MoAt, u varirajućim koncentracijama u rastvoru za blokiranje, dodati su zatim u bunariće. Nakon 2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi, bunarići su intenzivno isprani PBS-om. Anti-MASP-2 MoAt koja su bila vezana za MASP-2se su detektovana dodavanjem kozjeg anti-mišjeg IgG-a konjugovanog sa peroksidazom rena (Sigma Chemical) u rastvoru za blokiranje, nakon čega je ploča ostavljena da se inkubira na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Ploča je ponovo temeljno isprana sa PBS-om, pa je dodato 100 µl 3,3’,5,5'-tetrametil benzidinskog (TMB) supstrata (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Reakcija sa TMB je zaustavljena dodavanjem 100 µl 1M fosforne kiseline, nakon čega je ploča očitana na 450 nm u čitaču mikroploča (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[0380] Ispitivana je potom sposobnost supernatanata kultura iz pozitivnih bunarića da inhibiraju aktivaciju komplementa u funkcionalnom testu, kao što je postupak cepanja C4 koji je opisan u Primeru 2. Ćelije u pozitivnim bunarićima su potom klonirani ograničavanjem razblaživanja. Reaktivnost MoAt sa hMASP-2 je ponovo ispitana upotrebom ELISA testa kao što je to prethodno opisano. Selektovani hibridomi su gajeni u flaskovima za suspenzije ćelija (engl. spinner flask) i zatim je prikupljen utrošen supernatant radi prečišćavanje antitela afinitetnom hromatografijom sa proteinom A.

PRIMER 6

[0381] Ovaj Primer opisuje stvaranje i proizvodnju humanizovanih mišjih anti-MASP-2 antitela i fragmenata antitela.

[0382] Mišje anti-MASP-2 monoklonsko antitelo je generisano u mužjacima A/J miševa kao što je opisano u Primeru 5. Mišje antitelo je zatim humanizovano kao što je opisano u nastavku teksta, da bi se smanjila njegova imunogenost, zamenom mišjih konstantnih regiona sa njihovim humanim parnjacima i da bi se proizveo himerni IgG i Fab fragment antitela, koji su korisni za inhibiranje neželjenih efekata aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 kod humanih subjekata prema predmetnom opisu.

[0383] 1. Kloniranje gena za varijabilne regione anti-MASP-2 antitela iz mišjih hibridomskih ćelija.

Ukupna RNK je izolovana iz hibridomskih ćelija koje izlučuju anti-MASP-2 MoAt (dobijenih kao što je opisano u Primeru 7) upotrebom RNKzola prema protokolu proizvođača (Biotech, Houston, Teksas). Prvi lanac cDNK je sintetisan iz ukupne RNK upotrebom oligo dT kao prajmera. PCR je urađen upotrebom 3’ prajmera izvedenih iz konstantnog C regiona imunoglobulina i setova degenerisanih prajmera izvedenih iz liderskog peptida ili prvog uokvirujućeg regiona mišjeg VHili VKgena kao 5’ prajmera. Usidreni PCR je rađen kao što je opisano u Chen i Platsucas (Chen P.F., Scand. J. Immunol.

35:539-549, 1992). Za kloniranje VKgena, dvolančana cDNK je pripremana upotrebom Not1-MAK1 prajmera (5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3’, SEQ ID NO:38). Adapteri za aniling, AD1 (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3’, SEQ ID NO:39) i AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3', SEQ ID NO:40), su povezani ligacijom sa 5' i 3’ krajevima dvolančane cDNK. Adapteri na 3’ krajevima su zatim uklonjeni digestijom sa Notl. Proizvod dobijen digestijom je dalje upotrebljen kao matrica u PCR-u, sa AD1 oligonukleotidom kao 5’ prajmerom i sa MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SEQ ID NO:41) kao 3’ prajmerom. Fragmenti DNK od približno 500 bp su klonirani u pUC19. Nekoliko klonova je odabrano za analizu sekvence, da bi se potvrdilo da klonirana sekvenca obuhvata očekivani konstantni region mišjeg imunoglobulina. Oligonukleotidi Not1-MAK1 i MAK2 su izvođeni iz VKregiona i nalazili su se 182 i 84 bp, tim redom, nizvodno od prvog baznog para gena za C kapa. Izabrani su konačno klonovi koji su uključivali kompletan VKi liderski peptid.

[0384] Za kloniranje VHgena, dvolančana cDNK je pripremana upotrebom Not1 MAG1 prajmera (5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3’, SEQ ID NO:42). Adapteri za aniling, AD1 i AD2, su povezani ligacijom sa 5' i 3’ krajevima dvolančane cDNK. Adapteri na 3’ krajevima su zatim uklonjeni digestijom sa Notl. Proizvod dobijen digestijom je dalje upotrebljen kao matrica u PCR-u, sa AD1 oligonukleotidom AD1 i MAG2 (5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3’, SEQ ID NO:43) kao prajmerima. Fragmenti DNK dužine od 500 do 600 bp su klonirani u pUC19. Oligonukleotidi Notl-MAG1 i MAG2 su izvedeni iz mišjeg Cy.7.1 regiona i bili su 180, odnosno 93 bp, nishodno u odnosu na prvi bp mišjeg gena za Cy.7.1. Izabrani su konačno klonovi koji su obuhvatali kompletan VHi liderski peptid.

2. Konstrukcija ekspresionih vektora za himerni IgG i Fab specifičan za MASP-2.

[0385] Klonirani VHi VKgeni koji su prethodno opisani, upotrebljavani su kao matrice u PCR reakciji za dodavanje Kozak konsenzusne sekvence na 5’ kraj i donorske sekvence za obradu na 3' kraj nukleotidne sekvence. Nakon što su sekvence analizirane da bi se potvrdilo odsustvo PCR grešaka, VHi VKgeni su insertovani u kasete ekspresionih vektora koje su sadržavale humane C.γ1 i C. kapa, tim redom, da bi se dobili pSV2neoVH-huCγ1 i pSV2neoV-huCy. Plazmidne DNK vektora teškog i lakog lanca su zatim prečišćene CsCl gradijentom i upotrebljene su za transfekciju COS ćelija elekroporacijom. Nakon 48 sati, supernatant kulture je analiziran upotrebom ELISA testa da bi se potvrdilo prisustvo himernog IgG u koncentraciji od približno 200 ng/ml. Ćelije su dalje prikupljene i izolovana je ukupna RNK. Prvi lanac cDNK je sintetisan iz ukupne RNK upotrebom oligo dT kao prajmera. Ova cDNK je zatim upotrebljena kao matrica u PCR-u za generisanje Fd i kapa DNK fragmenata. Za Fd gen, PCR je urađen upotrebom 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3’ (SEQ ID NO:44) kao 5' prajmera i 3’ prajmera izvedenog iz CHI (5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3', SEQ ID NO:45). Potvrđeno je da DNK sekvenca sadrži kompletan VHi CHI domen humanog IgG1. Nakon digestije sa odgovarajućim enzimima, fragmenti Fd DNK su insertovani na HindIII i BamHI restrikciona mesta kasete ekspresionih vektora pSV2dhfr-TUS da bi se dobio pSV2dhfrFd. Plazmid pSV2 je komercijalno dostupan i sastoji se od segmenata DNK iz raznih izvora: pBR322 DNK (tanka linija) sadrži mesto početka replikacije DNK iz pBR322 (pBR ori) i laktamazni gen rezistencije na ampicilin (Amp); DNK SV40, predstavljena širim šrafiranjem i obeležena, sadrži mesto početka replikacije DNK iz SV40 (SV40 ori), rani promotor (5’ u odnosu na dhfr i neo gene) i signal poliadenilacije (3' u odnosu na dhfr i neo gene). Poliadenilacioni signal (pA) izveden iz SV40 je takođe bio postavljen na 3’ kraj Fd gena.

[0386] Za kapa gen, PCR je urađen upotrebom 5'-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3’ (SEQ ID NO:46) kao 5' prajmera i 3’ prajmera izvedenog iz CK(5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SEQ ID NO:47). Potvrđeno je da DNK sekvenca sadrži kompletne VKi humane CKregione. Nakon digestije sa odgovarajućim restrikcionim enzimima, kapa DNK fragmenti su insertovani na HindIII i BamHI restrikciona mesta kasete ekspresionih vektora pSV2neo-TUS da bi se dobio pSV2neoK. Ekspresiju oba od Fd i kapa gena je bila pod kontrolom pojačivačih i promotorskih elemenata izvedenih iz HCMV. S obzirom da Fd gen ne uključuje cisteinski aminokiselinski osatak koji je uključen u

12

međulančanu disulfidnu vezu, ovakav rekombinantan himerni Fab sadrži nekovalentno povezane teške i lake lance. Ovaj himerni Fab je označen kao cFab.

[0387] Da bi se dobio rekombinantan Fab sa disulfidnom vezom između teškog ili lakog lance, prethodno naveden Fd gen može biti proširen tako da obuhvata kodirajuću sekvencu za dodatnih 9 aminokiselina (EPKSCDKTH, SEQ ID NO:48) iz zglobnog regiona humanog IgG1. DNK segment BstEII-BamHI koji kodira 30 aminokiselina sa 3’ kraja Fd gena može biti zamenjen sa segmentima DNK koji kodiraju produženi Fd, čime se dobija pSV2dhfrFd/9aa.

3. Ekspresija i prečišćavanje himernih anti-MASP-2 IgG

[0388] Da bi se generisale ćelijske linije koje izlučuju himerni anti-MASP-2 IgG, NSO ćelije su elekroporacijom transfektovane sa prečišćenom plazmidnom DNK iz pSV2neoVH-huC.γ1 i pSV2neoV-huC kapa. Transfektovane ćelije su zatim selektovane u prisustvu 0,7 mg/ml G418. Ćelije su dalje gajene u flaskovima za ćelije u suspenziji od 250 ml, upotrebom medijuma koji je sadržavao serum.

[0389] Supernatant kulture iz flaska za suspenziju ćelija od 100 ml je nanošen na PROSEP-A kolonu od 10 ml (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.). Kolona je zatim ispravan sa PBS-om u zapremini od 10 zapremina kolone. Vezana antitela su eluirana sa 50 mM citratnim puferom, pH 3,0. Frakciji koja je sadržavala prečišćeno antitelo je zatim dodata jednaka zapremina 1 M Hepes-a, pH 8,0 da bi se pH podesio na 7,0. Rezidualne soli su uklonjene izmenom pufera sa PBS-om ultrafiltracijom na membrani kompanije Millipore (granična vrednost M.T.: 3000). Koncentracija proteina prečišćenog antitela je određena BCA postupkom (Pierce).

4. Ekspresija i prečišćavanje himernih anti-MASP-2 Fab

[0390] Da bi se generisale ćelijske linije koje izlučuju himerni anti-MASP-2 Fab, CHO ćelije su elektoporacijom transfektovane sa prečišćenom plazmidnom DNK iz pSV2dhfrFd (ili pSV2dhfrFd/9aa) i pSV2neokapa. Transfektovane ćelije su zatim selektovane u prisustvu G418 i metotreksata. Selektovane ćelijske linije su umnožene u rastućim koncentracijama metotreksata. Ćelije su zatim subklonirane u jednoćelijske linije upotrebom ograničavanja razblaživanja. Visokoproduktivne jednoćelijske subklonirane ćelijske linije su dalje gajene u flaskovima za ćelije u suspenziji od 100 ml, upotrebom medijuma koji nije sadržavao serum.

[0391] Himerni anti-MASP-2 Fab je prečišćen afinitetnom hromatografijom upotrebom mišjeg antiidiotipskog MoAt za MASP-2 MoAt. Anti-idiotipsko MASP-2 MoAt može biti napravljeno imunizacijom miševa sa mišjim anti-MASP-2 MoAt koje je konjugovano sa hemocijaninom prilepka i dalje skriningom za specifično vezivanje MoAt koje može biti u kompeticiji sa humanim MASP-2. Zarad prečišćavanja, 100 ml supernatanta iz kultura u supenziji CHO ćelija koje proizvode cFab ili cFab/9aa, naneto je na afinitetnu kolonu kuplovanu sa anti-idiotipskim MASP-2 MoAt. Kolona je zatim temeljno ipsrana sa PBS-om, nakon čega je vezani Fab eluiran sa 50 mM dietilaminom, pH 11,5. Preostale soli su uklonjene izmenom pufera kao što je prethodno opisano. Koncentracija proteina prečišćenog Fab je određena BCA postupkom (Pierce).

[0392] Sposobnost himernih MASP-2 IgG, cFab i cFAb/9aa da inhibiraju puteve komplementa zavisne od MASP-2 može biti određena upotrebom inhibitornih analiza opisanih u Primeru 2 ili Primeru 7.

PRIMER 7

[0393] Ovaj Primer opisuje in vitro analizu cepanja C4 koja je upotrebljavana kao funkcionalna pregledna analiza za identifikaciju inhibitornih agenasa za MASP-2 koji su u stanju da blokiraju aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2 posredstvom L-fikolina/P35, H-fikolina, M-fikolina ili manana.

[0394] Analiza cepanja C4: Analiza cepanja C4 je opisana od strane Petersen-a S.V i saradnika, J. Immunol. Methods 257:107, 2001, i meri aktivaciju lektinskog puta koja je rezultat vezivanja lipoteihoične kiseline (LTA) iz S. aureus za L-fikolin.

[0395] Reagensi: S. aureous (DSM20233) fiksirana u formalinu je pripremana na sledeći način: bakterije su gajene preko noći na 37°C u triptičnom medijumu od soje i krvi, nakon čega su oprane tri puta sa PBS-om, pa su fiksirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi u PBS/0,5% formalinu i isperane još tri puta sa PBS-om, pre ponovnog suspendovanja u puferu za oblaganje (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,6).

[0396] Analiza: Bunari MaxiSorb mikrotitarske ploče kompanije Nunc (Nalgene Nunc International, Rochestar, NY) obloženi su sa: 100 µl rastvora S. aureus DSM20233 (OD550=0,5) fiksirane u formalinu, u puferu za oblaganje sa 1 µg L-fikolina u puferu za oblaganje. Nakon inkubacije preko noći, bunarići su blokirani sa 0,1% humanim serumskim albuminom (HSA) u TBS-u (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, pH 7,4), pa su isprani sa TBS-om koji je sadržavao 0,05% Tween 20 i 5 mM CaCl2(pufer za pranje). Uzorci humanog seruma su razblaženi u 20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0,05% Triton X-100, 0,1% HSA, pH 7,4, čime je sprečavana aktivacija endogenog C4 i disociranje C1 kompleksa (sastavljenog od C1q, C1r i C1s). Inhibitorni agensi za MASP-2, uključujući anti-MASP-2 MoAt i inhibitorne peptide, dodati su uzorcima seruma u različitim koncentracijama. Razlaženi uzorci su dodavani zatim na ploču i inkubirani preko noći na 4°C. Nakon 24 sata, ploče se temeljno isprane sa puferom za pranje, pa je u svaki bunarić dodato po 0,1 µg prečišćenog humanog C4 (dobijenog kao što je opisano u Dodds A.W, Methods Enzimol.223:46, 1993) u 100 µl 4 mM barbitala, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,4. Nakon 1,5 h na 37°C, ploče se ponovo isprane i deponovanje C4b je detektovano upotrebom antihumanog C4c iz pileta konjugovanog sa alkalnom fosfatazom (nabavljenog od kompanije

12

Immunsystem, Uppsala, Švedska) i merenjima upotrebom kolorimetrijskog p-nitrofenil fosfatnog supstrata.

[0397] C4 analiza na mananu: Prethodno opisana analiza je prilagođena za merenje aktivacije lektinskog puta preko MBL-a, oblaganjem ploče sa LSP-om i mananom pre dodavanja seruma pomešanog sa raznim inhibitornim agensima za MASP-2.

[0398] C4 analiza na H-fikolinu (Hakata Ag): Prethodno opisana analiza je prilagođena za merenje aktivacije lektinskog puta preko H-fikolina, oblaganjem ploče sa LSP-om i H-fikolinom pre dodavanja seruma pomešanog sa raznim inhibitornim agensima za MASP-2.

PRIMER 8

[0399] Sledeći test pokazuje prisustvo aktivacije klasičnog puta kod MASP-2-/- miševa divljeg tipa.

[0400] Postupci: In situ su generisani imunski kompleksi oblaganjem mikrotitarskih ploča (Maxisorb, Nunc, kat. br.442404, Fisher Scientific) sa 0,1% humanim serumskim albuminom u 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,4 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je sledila inkubacija preko noći na 4°C sa ovčijim antiserumom na kompletan serum (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Škotska) razblaženim 1: 1000 u TBS/Tween/Ca<2+>. Uzorci seruma dobijeni iz miševa divljeg tipa i MASP-2-/-miševa, dodavani su na obložene ploče. Pripremljeni su i kontrolni uzorci iz uzoraka seruma miševa divljeg tipa i MASP-2-/- miševa u kojima je C1q bio osiromašen. MIšji serum osiromašenog sadržaja C1q je pripremljen upotrebom Dynabeads smola kuplovanih sa proteinom-A (Dynal Biotech, Oslo, Norveška) i obloženih sa zečjim anti-humanim C1q IgG (Dako, Glostrup, Danska), prema uputstvima dobavljača. Ploče su inkubirane tokom 90 minuta na 37°C. Vezani C3b je detektovan sa poliklonskim anti-humanim-C3c antitelom (Dako A 062) razblaženim 1:1000 u TBS/tv/Ca<++>. Sekundarno antitelo je bio kozji anti-zečji IgG.

[0401] Rezultati: SLIKA 7 prikazuje relativne nivoe deponovanja C3b na pločama obloženim sa IgG, u serumu miševa divljeg tipa, MASP-2-/- serumu, serumu osiromašenog sadržaja C1q iz miševa divljeg tipa i serumu osiromašenog sadržaja C1q iz MASP-2-/- miševa. Ovi rezultati pokazuju da je klasičan put intaktan u MASP-2-/- mišjem soju.

PRIMER 9

[0402] Sledeći test je upotrebljavan za ispitivanje da li inhibitorni agens za MASP-2 blokira klasičan put, analizom dejstva agensa za inhibiciju MASP-2 u uslovima u kojima se klasičan put aktivira sa imunskim kompleksima.

[0403] Postupci: Da bi se ispitalo dejstvo agensa za inhibiciju MASP-2 u uslovima u kojima se klasičan put aktivira sa imunskim kompleksima, triplikati uzoraka od 50 µl koji su sadržavali 90% NHS su

12

inkubirani na 37°C u prisustvu 10 µg/ml imunskog kompleksa (IC) ili PBS-a, a uključeni su i triplikati uzoraka (+/- IC) koji su sadržavali 200 nM anti-properdinskog monoklonskog antitela tokom inkubacije na 37°C. Nakon dvočasovne inkubacije na 37°C, svim uzorcima je dodata 13 mM EDTA da bi se zaustavila dalja aktivacije komplementa i uzorci su zatim odmah ohlađeni do 5°C. Uzorci su dalje čuvani na -70°C pre nego što su analizirani proizvodni aktivacije komplementa (C3a i sC5b-9) upotrebom ELISA kompleta (Quidel, kataloški brojevi A015 i A009) u skladu sa uputstvima proizvođača.

PRIMER 10

[0404] Ovaj Primer opisuje identifikaciju fragmenata anti-MASP-2 Fab2 antitela visokog afiniteta koji blokiraju aktivnost MASP-2.

[0405] Uvod i obrazloženje: MASP-2 je složen protein sa mnogo razdvojenih funkcionalnih domena, uključujući: mesto(mesta) vezivanja za MBL i fikoline, serin proteazno katalitičko mesto, mesto vezivanja proteolitičkog supstrata C2, mesto vezivanja proteolitičkog supstrata C4, mesto cepanja MASP-2 za autoaktivaciju MASP-2 zimogena i dva mesta vezivanja Ca<++>. Identifikovani su fragmenti Fab2 antitela koji se sa velikim afinitetom vezuju za MASP-2, a identifikovani fragmenti Fab2 antitela su analizirani u funkcionalnoj analizi da bi se utvrdilo da sli su u stanju da blokiraju funkcionalnu aktivnost MASP-2.

[0406] Da bi blokirali funkcionalnu aktivnost MASP-2, antitelo ili fragment Fab2 antitela moraju vezivati ili interferirati sa strukturnim epitopom na MASP-2 koji je potreban za funkcionalnu aktivnost MASP-2. Prema tome, mnoga ili sva od vezivanja anti-MASP-2 Fab2 fragmenata visokog afiniteta ne moraju inhibirati funkcionalnu aktivnost MASP-2, osim ukoiko se ne vežu za strukturne epitope na MASP-2 koji su direktno uključeni u funkcionalnu aktivnost MASP-2.

[0407] Funkcionalna analiza koja meri inhibiciju obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta je upotrebljavana za procenu "blokirajućih aktivnosti" anti-MASP-2 Fab2. Poznato je da je primarna fiziološka uloga MASP-2 u lektinskom putu da generiše sledeću funkcionalnu komponentu puta komplementa posredovanog lektinom, naime C3 konvertazu lektinskog puta. C3 konvertaza lektinskog puta je ključan enzimski kompleks (C4bC2a) koji proteolitički cepa C3 na C3a i C3b. MASP-2 nije strukturna komponenta C3 konvertaze lektinskog puta (C4bC2a); ipak, potrebna je funkcionalna aktivnost MASP-2 da bi se generisale dve proteinske komponente (C4b, C2a) koje čine C3 konvertazu lektinskog puta. Štaviše, deluje da su sve odvojen funkcionalne aktivnosti MASP-2 koje su prethodno inavedene potrebne da bi MASP-2 generisao C3 konvertazu lektinskog puta. Iz ovih razloga, smatra se da je poželjna analiza za upotrebu u proceni "blokirajućih aktivnosti" anti-MASP-2 Fab2 funkcionalna analiza kojom se meri inhibiciju obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta.

12

[0408] Generisanje Fab2 visokog afiniteta: Biblioteka sekvenci prikazanih u fagovima za sekvence varijabilnih lakih i teških lanaca humanih antitela i tehnologija automatske selekcije antitela radi identifikacije Fab2 koji reaguju sa odabranim ligandima od interesa, upotrebljavani su za obrazovanje Fab2 fragmenata visokog afiniteta za pacovksi MASP-2 protein (SEQ ID NO:55). Poznata količina pacovskog MASP-2 (~1 mg, čistoće >85%) proteina je upotrebljena za skrining antitela. Tri serije amplifikacije su upotrebljene za odabir antitela sa najboljim afinitetom. Za ELISA skrining je zatim izvučeno približno 250 različitih pogodaka koji eksprimiraju fragmente antitela. Pogoci sa visokim afinitetom su naknadno sekvencirani da bi se utvrdila jedinstvenost različitih antitela.

[0409] Prečišćeno je zatim pedeset jedinstvenih anti-MASP-2 antitela i po 250 µg svakog prečišćenog Fab2 antitela je upotrebljeno za karakterizaciju afiniteta vezivanja za MASP-2 i funcionalnu analizu puta komplementa, kao što je detaljnije opisano u nastavku teksta.

Analize upotrebljene za procenu inhibitorne (blokirajuće) aktivnosti anti-MASP-2 Fab2

1. Analiza za merenje inhibicije obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta:

[0410] Uvod: C3 konvertaza lektinskog puta je enzimski kompleks (C4bC2a) koji proteolitički cepa C3 na dva potentna proinflamatorna fragmenta, anafilatoksin C3a i opsonični C3b. Deluje da je obrazovanje C3 konvertaze ključan korak u lektinskom putu u pogledu posredovanja inflamacije. MASP-2 nije strukturna komponenta C3 konvertaze lektinskog puta (C4bC2a); anti-MASP-2 antitela (ili Fab2) stoga neće direktno inhibirati aktivnost postojeće C3 konvertaze. Ipak, serin proteazna aktivnost MASP-2 je potrebna da bi se generisale dve proteinske komponente (C4b, C2a) koje čine C3 konvertazu lektinskog puta. Prema tome, anti-MASP-2 Fab2 koji inhibira funkcionalnu aktivnost MASP-2 (tj. blokirajući anti-MASP-2 Fab2) će inhibirati de novo obrazovanje C3 konvertaze lektinskog puta. C3 sadrži neobičnu i visoko reaktivnu tioestarsku grupu kao deo svoje strukture. Nakon cepanja C3 upotrebom C3 konvertaze u ovoj analizi, tioestarska grupa na C3b može obrazovati kovalentnu vezu sa hidroksilnim ili amino grupama na makromolekulama koji su imobilisani na dnu plastičnih bunarića preko estarskih ili amidnih veza, što olakšava detekciju C3b u ELISA testu.

[0411] Manan kvasca je poznat aktivator lektinskog puta. U sledećem postupku za merenje obrazovanja C3 konvertaze, plastični bunarići obloženi mananom su inkubirani tokom 30 minuta na 37°C sa razblaženim serumom pacova da bi se aktivirao lektinski put. Bunarići su zatim isprani i analiziran je C3b koji je bio imobilisan u bunarićima, upotrebom standardnih ELISA postupaka. Količina C3b generisana u ovoj analizi predstavlja direktan odraz de novo obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta. Analizirani su konačno anti-MASP-2 Fab2 u odabranim koncentracijama da bi se utvrdila njihova sposobnost da inhibiraju obrazovanje C3 konvertaze i posledično obrazovanje C3b.

12

Postupci:

[0412] Ploče umerenog vezivanja sa 96 mesta kompanije Costar su inkubirane preko noći na 5°C sa mananom razblaženim u 50 mM karbonatnom puferu, pH 9,5, u koncentraciji od 1 ug/50 Tl/bunariću. Nakon inkubacije preko noći, svaki bunarić je ispran tri puta sa 200 TI PBS-a. Bunarići su zatim blokirane sa po 100 Tl/bunariću 1% goveđeg serumskog albumina u PBS-u, nakon čega su ploče inkubirane jedan sat na sobnoj temperaturi uz blago mešanje. Svaki bunarić je dalje ispran tri puta sa po 200 T1 PBS-a. Uzorci anti-MASP-2 Fab2 su razblaženi do odabranih koncentracija u GVB puferu (4,0 mM barbital, 141 mM NaCl, 1,0 mM MgCl2, 2,0 mM CaCl2, 0,1% želatina, pH 7,4) koji je sadržavao Ca<++>i Mg<++>, na 5 C. Prethodno pripremljenim uzorcima je zatim na 5°C dodat 0,5% serum pacova, pa je po 100 T1 ovog rastvora prebačeno u svaku bunarić. Ploče su pokrivene i inkubirane 30 minuta u vodenom kupatilu na 37°C da bi se omogućila aktivacija komplementa. Reakcija je zaustavljena premeštanjem ploča iz vodenog kupatila na 37°C u posudu koja je sadržavala mešavinu leda i vode. Svaki bunarić je dalje ispran pet puta sa 200 T1 PBS-Tween-a 20 (0,05% Tween 20 u PBS-u), nakon čega je ispran i dva puta sa 200 Tl PBS-a. U bunariće je zatim dodato po 100 Tl/bunariću rastvora sa primarnim antitelom koje je bilo razblaženo u odnosu 1:10000 (zečje anti-humano C3c, DAKO A0062) u PBS-u koji je sadržavao 2,0 mg/ml goveđeg serumskog albumina i ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi uz lagano mešanje Svaki bunarić je dalje ispran 5 x sa 200 T1 PBS-a, pa je dodato i po 100 Tl/bunariću sekundarnog antitela u razblaženju 1: 10000 (kozjeg anti-zečjeg IgG-a konjugovanog sa peroksidazom, American Qualex A102PU) u PBS-u koji je sadržavao 2,0 mg/ml goveđeg serumskog albumina, nakon čega je ploča inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi na šejkeru uz lagano mešanje. Svaki bunarić je konačno ispran pet puta sa 200 T1 PBS-a i dodato je 100 Tl/bunariću peroksidaznog supstrata TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories), pa je ploća inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Reakcija peroksidaze je zaustavljena dodavanjem 100 Tl/bunariću 1,0 M H3PO4i izmeren je OD450.

2. Analiza za merenje inhibicije cepanja C4 zavisne od MASP-2

[0413] Uvod: Serin proteazna aktivnost MASP-2 je visoko specifična i identifikovana su samo dva proteinska supstrata za MASP-2; C2 i C4. Cepanjem C4 nastaju C4a i C4b. Anti-MASP-2 Fab2 se može vezivati za strukturne epitope na MASP-2 koji su direktno uključeni u cepanje C4 (npr. mesto vezivanja u MASP-2 za C4; serin proteazno katalitičko mesto MASP-2) i tako inhibirati funkcionalnu aktivnost MASP-2 u cepanju C4.

[0414] Manan kvasca je poznat aktivator lektinskog puta. U sledećem postupku za merenje aktivnosti cepanja C4 za MASP-2, plastični bunarići obloženi mananom su inkubirani tokom 30 minuta na 37°C sa razblaženim serumom pacova da bi se aktivirao lektinski put. Pošto primarno antitelo upotrebljeno

12

u ovom ELISA testu prepoznaje samo humani C4, razblažen serum pacova je dopunjen i sa humanim C4 (1,0 Tg/ml). Bunarići su zatim isprani i analiziran je sadržaj C4 imobilisanog u bunarićima, upotrebom standardnih ELISA postupaka. Količina C4b generisanog u ovoj analizi je mera aktivnosti cepanja C4 koja je zavisna od MASP-2. Stoga je u ovom testu dalje analizirana sposobnosti odabranih koncentracija anti-MASP-2 Fab2 da inhibiraju cepanje C4.

[0415] Postupci: Ploče umerenog vezivanja sa 96 mesta kompanije Costar su inkubirane preko noći na 5°C sa mananom razblaženim u 50 mM karbonatnom puferu, pH 9,5, u koncentraciji od 1 ug/50 Tl/bunariću. Svaki bunarić je zatim ispran tri puta sa 200 TI PBS-a. Bunarići su potom blokirani dodavanjem 100 Tl/bunariću 1% goveđeg serumskog albumina u PBS-u, pa su ploče inkubirane jedan sat na sobnoj temperaturi uz blago mešanje. Svaki bunarić je dalje ispran 3X sa po 200 T1 PBS-a. Uzorci anti-MASP-2 Fab2 su razblaživani do odabranih koncentracija u GVB puferu (4,0 mM barbital, 141 mM NaCl, 1,0 mM MgCl2, 2,0 mM CaCl2, 0,1% želatin, pH 7,4) koji je sadržavao Ca<++>i Mg<++>, na 5 C. U ove uzorke je uključen i 1,0 Tg/ml humanog C4 (Quidel). Prethodno pripremljenim uzorcima je na 5°C dodat i 0,5% serum pacova, pa je po 100 T1 tog rastvora prebačeno u svaku bunarić. Ploče su pokrivene i inkubirane 30 minuta u vodenom kupatilu na 37°C da bi se omogućila aktivacija komplementa. Reakcija je zaustavljena premeštanjem ploča iz vodenog kupatila na 37°C u posudu koja je sadržavala mešavinu leda i vode. Svaki bunarić je dalje ispran pet puta sa 200 T1 PBS-Tween 20 (0,05% Tween 20 u PBS-u), nakon čega je ispran i dva puta sa 200 Tl PBS-a. U bunariće je zatim dodato po 100 Tl/bunariću anti-humanog C4c antitela iz pileta koje je bilo konjugovano sa biotinom u razblaženju od 1:700 (Immunsystem AB, Uppsala, Švedska) u PBS-u koji je sadržavao 2,0 mg/ml goveđeg serumskog albumina. Nastavljeno je zatim inkubiranje ploče na sobnoj temperaturi uz lagano mešanje tokom jednog sata. Svaki bunarić je dalje ispran 5 x sa 200 T1 PBS-a, pa je dodato i po 100 Tl/bunariću 0,1 Tg/ml sekundarnog antitela konjugovanog sa streptavidom (Pierce Chemical #21126) u PBS-u koji je sadržavao 2,0 mg/ml goveđeg serumskog albumina i ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi na šejkeru uz lagano mešanje. Svaki bunarić je konačno ispran pet puta sa 200 T1 PBS-a i dodato je 100 Tl/bunariću peroksidaznog supstrata TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories), nakon čega je ploča inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 16 minuta. Reakcija peroksidaze je zaustavljena dodavanjem 1,0 M H3PO4u zapremini od 100 Tl/bunariću i izmeren je OD450.

3. Analiza vezivanja MASP-2 Fab2 anti-pacova za 'nativni' pacov MASP-2

[0416] Uvod: MASP-2 je obično prisutan u plazmi kao dimerni kompleks MASP-2 koji takođe uključuje specifične lektinske molekule (protein koji vezuje manozu (MBL) i fikoline). Stoga, ukoliko je od interesa da se istraži vezivanje anti-MASP-2 Fab2 za fiziološki relevantan oblik MASP-2, važno je razviti analizu vezivanja u kojoj će biti upotrebljena interakcija između Fab2 i 'nativnog' MASP-2 u plazmi, pre

1

nego sa prečišćenim rekombinantnim MASP-2. U ovoj analizi vezivanja, 'nativan' kompleks MASP-2-MBL iz 10% seruma pacova je najpre imobilisan u okviru bunarića obloženih mananom. Afinitet vezivanja raznih anti-MASP-2 Fab2 fragmenata za imobilisan 'nativan' MASP-2 je zatim proučavan upotrebom standardne ELISA metodologije.

[0417] Postupci: Ploče visoko afinitetnog vezivanja sa 96 mesta kompanije Costar su inkubirane preko noći na 5°C sa mananom razblaženim u 50 mM karbonatnom puferu, pH 9,5, u koncentraciji od 1 ug/50 Tl/bunariću. Bunarići su zatim blokirani sa po 100 Tl/bunariću 0,5% obranog mleka u prahu u PBST-u (PBS sa 0,05% Tween 20) i inkubiranjem ploče na sobnoj temperaturi tokom jednog sata uz lagano mešanje. Svaki bunarić je zatim ispran 3X sa po 200 T1 TBS/Tween/Ca<++>pufera za ispiranje (fiziološki rastvor puferisan Tris-om, 0,05% Tween 20, koji je sadržavao 5,0 mM CaCl2, pH 7,4. Na ledu je pripremljen 10% serum pacova u puferu vezivanje sa visokom koncentracijom soli (20 mM Tris, 1,0 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0,05% Triton-XlOO, 0,1% (m/v) goveđeg serumskog albumina, pH 7,4), pa je dodato po 100 Tl/bunariću i ploča je nkubirana preko noći na 5°C. Bunarići su zatim isprani 3X sa 200 T1 TBS/Tween/Ca<++>pufera za pranje. Bunarići su dalje isprani 2X sa 200 Tl PBS-a, pa je dodato po 100 Tl/bunariću izabrane koncentracije anti-MASP-2 Fab2 razblaženog u GVB puferu (4,0 mM barbital, 141 mM NaCl, 1,0 mM MgCl2, 2,0 mM CaCl2, 0,1% želatin, pH 7,4) koji je sadržavao Ca<++>i Mg<++>i ploča je inkubirana tokom jednog sata na sobnoj temperaturi uz nežno mešanje. Svaki bunarić je dalje ispran 5 x sa 200 Tl PBS-a i dodato je po 100 Tl/bunariću kozjeg anti-Fab2 antitela konjugovanog sa HRP (Biogenesis Cat. Br. 0500-0099) koje je bilo razlbaženo 1:5000 u PBS-u koji je sadržavao 2,0 mg/ml goveđeg serumskog albumina. Nakon inkubacije ploče od jednog sata na sobnoj temperaturi uz nežno mešanje, svaki bunarić je ispran 5 x sa 200 Tl PBS-a. Konačno je dodato po 100 Tl/bunariću TMB peroksidaznog supstrata (Kirkegaard & Perry Laboratories) i ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 70 minuta. Reakcija peroksidaze je zaustavljena dodavanjem 100 Tl/bunariću 1,0 M H3PO4i izmeren je OD450.

REZULTATI:

[0418] Približno 250 različitih Fab2 koji su reagovali sa velikim afinitetom sa pacovskim MASP-2 proteinom su odabrani za ELISA skrining. Ovi Fab2 sa visokim afinitetom su zatim sekvencirani da bi se utvrdila jedinstvenost različitih antitela, a 50 jedinstvenih anti-MASP-2 antitela je prečišćeno za dalju analizu. Po 250 µg svakog prečišćenog Fab2 antitela je upotrebljeno za karakterizaciju afiniteta vezivanja za MASP-2 i funkcionalnog ispitivanja puta komplementa. Rezultati ove analize su prikazani ispod, u TABELI 6.

1 1

TABELA 6: ANTI-MASP-2 FAB2 KOJI BLOKIRA AKTIVACIJU KOMPLEMENTA U LEKTINSKOM PUTU

[0419] Kao što je prethodno prikazano u TABELI 6, od 50 ispitanih Fab2 anti-MASP-2, sedamnaest Fab2 je identifikovano kao blokirajući Fab2 za MASP-2 koji snažno inhibira obrazovanje C3 konvertaze, sa IC50koja je jednaka ili manja od 10 nM Fab2 (stopa pozitivnog pogotka od 34%). Osam od sedamnaest identifikovanih Fab2 je karkaterisao IC50u subnanomolarnom opsegu. Štaviše, svih sedamnaest blokirajućih Fab2 za MASP-2 prikazanih u TABELI 6 je dovelo do suštinski potpune inhibicije obrazovanja C3 konvertaze u analizi C3 konvertaze lektinskog puta. SLIKA 8A grafički ilustruje rezultate analize obrazovanja C3 konvertaze za Fab2 antitelo #11, koje je reprezentativno za druga ispitivana Fab2 antitela, čiji su rezultati prikazani u TABELI 6. Navedeno je važno razmatranje, pošto je teoretski moguće da "blokirajući" Fab2 može samo delimično inhibirati funkciju MASP-2 čak i kada je svaki molekul MASP-2 vezan sa Fab2.

[0420] Iako je manan poznat aktivator lektinskog puta, teoretski je moguće da prisustvo antimananskog antitela u serumu pacova takođe aktivira klasičan put i generiše C3b aktivnošću C3 konvertaze klasičnog puta. Ipak, svaki od sedamnaest blokirajućih anti-MASP-2 Fab2 koji je naveden u listi ovog primera, snažno inhibira generisanje C3b (> 95%), pokazujući tako da specifičnost ove analize za C3 konvertazu lektinskog puta.

1 2

[0421] Analize vezivanja su takođe rađene sa svih sedamnaest blokirajućih Fab2 da bi se izračunao tačan Kdza svakog od njih. Rezultati analiza vezivanja anti-pacovskih MASP-2 Fab2 za nativan pacovski MASP-2 za šest blokirajućih Fab2 su takođe prikazani u TABELI 6. SLIKA 8B grafički ilustruje rezultate analize vezivanja sa Fab2 antitela #11. Slične analize vezivanja su takođe izvedene za druge Fab2, čiji su rezultati prikazani u TABELI 6. U principu, tačan Kddobijen za vezivanje svakog od šest Fab2 za 'nativni' MASP-2 se prilično dobro podudaralo sa IC50za Fab2 u funkcionalnoj analizi C3 konvertaze. Postoje dokazi da MASP-2 podleže konformacionoj promeni iz „neaktivnog“ u „aktivan“ oblik nakon aktivacija njene proteazne aktivnosti (Feinberg i saradnici, EMBO J 22:2348-59 (2003); Gal i saradnici, J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005)). U normalnoj plazmi pacova koja je upotrebljavana u analizi obrazovanja C3 konvertaze, MASP-2 je prisutan prvenstveno u 'neaktivnoj' zimogenoj konformaciji. Nasuprot tome, u analizi vezivanja, MASP-2 je prisutan kao deo kompleksa sa MBL vezanim za imobilisani manan; stoga bi MASP-2 bio u 'aktivnoj' konformaciji (Petersen i saradnici, J. Immunol Methods 257:107-16, 2001). Posledično, ne bi nužno trebalo očekivati potpuno preklapanje između IC50i Kdza svaki od sedamnaest blokirajućih Fab2 koji su ispitani u ovde dve funkcionalne analize pošto bi se Fab2 u svakoj analizi vezivao za drugačiji konformacioni oblik MASP-2. Ipak, deluje da, sa izuzetkom Fab2 #88, postoji prilično blisko preklapanje između IC50i Kd koji se detektuje za svakog od ostalih šesnaest Fab2 koji su ispitani u ove dve analize (pogledati TABELU 6).

[0422] Nekoliko blokirajućih Fab2 je ispitivano i u pogledu inhibicije cepanja C4 posredovanog sa MASP-2. SLIKA 8C grafički ilustruje rezultate analize cepanja C4, pokazujući inhibiciju sa Fab2 #41, sa IC50=0,81 nM (pogledati TABELU 6). Kao što je prikazano na SLICI 9, utvrđeno je da svi ispitivani Fab2 inhibiraju cepanje C4 sa IC50koji su slični onima dobijenim u analizi C3 konvertaze (pogledati TABELU 6).

[0423] Iako je manan poznat aktivator lektinskog puta, teoretski je moguće da prisustvo antimananskog antiela u serumu pacova takođe aktivira klasičan put i tako generiše C4b cepanjem C4 koje je posredovano sa C1s. Međutim, identifikovano je nekoliko anti-MASP-2 Fab2 koji snažno inhibiraju obrazovanje C4b (>95%), ukazujući tako na specifičnost ove analize cepanja C4 posredovanog sa MASP-2. C4, poput C3, sadrži neobičnu i visoko reaktivnu tioestarsku grupu kao deo svoje strukture. Nakon cepanja C4 sa MASP-2 u ovoja analizi, tioestarska grupa na C4b može obrazovanti kovalentnu vezu sa hidroksilnim ili amino grupama na makromolekulama koji su imobilisani na dnu plastičnih bunarića putem estarske ili amidne veze, što olakšava detektovanje C4b u ELISA testu.

[0424] Ove studije jasno pokazuju stvarane FAB2 sa visokim afinitetom za pacovski MASP-2 protein koji funkcionalno blokira aktivnost i C4 i C3 konvertaze, sprečavajući tako aktivaciju lektinskog puta.

1

PRIMER 11

[0425] Ovaj Primer opisuje mapiranje epitopa za nekoliko od blokirajućih anti-pacovskih MASP-2 Fab2 antitela koja su generisana kao što je opisano u Primeru 10.

Postupci:

[0426] Kao što je prikazano na SLICI 10, proteini koji slede, svi sa N-terminalnim 6X His oznakama, eksprimirani su u CHO ćelijama upotrebom pED4 vektora:

pacovski MASP-2A, MASP-2 protein pune dužine, inakiviran izmenom serina u aktivnom centru u alanin (S613A);

pacovski MASP-2K, MASP-2 protein pune dužine izmenjen radi smanjenja autoaktivacije (R424K); CUBI-II, N-terminalni fragment pacovskog MASP-2 koji sadrži samo i CUBII domene; i CUBI/EGF-u sličan, N-terminalni fragment pacovskog MASP-2 koji sadržu samo CUBI i domene slične domenima EGF-a.

[0427] Ovi proteini su prečišćeni iz supernatanta kulture niklo-afinitetnom hromatografijom, kao što je prethodno opisano (Chen i saradnici, J. Biol. Chem.276:25894-02 (2001)).

[0428] C-terminalni polipeptid (CCPII-SP), koji je sadržavao CCPII i serin proteazni domen pacovskog MASP-2, eksprimiran je u E. coli kao tioredoksinski fuzioni protein upotrebom pTrkFus (Invitrogen). Protein je prečišćen iz ćelijskih lizata upotrebom Thiobond afinitetne smolea. Tioredoksinski fuzioni partner je ekprimiran sa praznim pTrkFus što je poslužilo kao negativna kontrola.

[0429] Svi rekombinantni proteini su podvrgnuti dijalizi u TBS puferu i njihove koncentracije su određene merenjem OD na 280 nm.

DOT BLOT ANALIZA:

[0430] Serijska razblaženja pet rekombinantnih MASP-2 polipeptida koji su prethnodno opisani i prikzanai na SLICI 10 (kao i tioredoksinski polipeptid kao negativna kontrola za CCPII-serin proteazni polipeptid) nakapavani su na nitroceluloznu membranu. Količina proteina po kapljici je bila opsega od 100 ng do 6,4 pg, pri čemu je upotrebljeno pet serijskih razblaženja polazeći do 6,4 pg. U kasnijim eksperimentima, količina nanošenih proteina je bila opsega od 50 ng do 16 pg, opet uz upotrebu pet serijskih razblaženja. Membrane su blokirane sa 5% obranim mlekom u prahu rastvorenim u TBS-u (pufer za blokiranje), pa su inkubirane sa anti-MASP-2 Fab2 koncentracije 1,0 µg/ml u puferu za blokiranje (koji je sadržavao 5,0 mM Ca<2+>). Vezanai Fab2 antitela su detektovana upotrebom antihumanog Fab konjugovanog sa HRP (AbD/Serotec; razblažen 1/10000) i ECL kompleta za detekciju

1 4

(Amersham). Jedna membrana je inkubirana sa poliklonskim zečjim anti-humanim MASP-2 At (opisanim u Stover i saradnici, J Immunol 163:6848-59 (1999)) kao pozitivnom kontrolom. U ovom slučaju, vezano At je detektovano upotrebom kozjeg anti-zečjeg IgG-a konjugovanog sa HRP (Dako; razblažen 1/2000).

Analiza vezivanja MASP-2

[0431] ELISA ploče su oblagane sa 1,0 μg/bunariću rekombinantnog MASP-2A ili CUBI-II polipeptida u karbonatnom puferu (pH 9,0), preko noći na 4°C. Bunarići su zatim blokirani sa 1% BSA u TBS-u, a zatim su dodata serijska razblaženja anti-MASP-2 Fab2 u TBS-u koji je sadržavao 5,0 mM Ca<2+>. Ploče su inkubirane jedan sat na ST. Nakon tri pranja sa TBS/Tween/Ca<2+>, dodat je anti-humani Fab konjugovan sa HRP-om (AbD/Serotec) u razblaženju od 1/10000 u TBS/Ca<2+>i ploče su inkubirane tokom još jednog sata na ST. Vezana antitela su detektovana upotrebom kompleta sa peroskidaznim TMB supstratom (Biorad).

REZULTATI:

[0432] Rezultati dot blot analize koji pokazuju reaktivnost Fab2 sa različitim MASP-2 polipeptidima, opisani su u nastavku, u TABELI 7. Numeričke vrednosti opisane u TABELI 7 ukazuju na količinu nanetih protina koja je potrebna za dobijanje približno polovine maksimalne jačine signala. Kao što je prikazano, svi polipeptidi (sa izuzetkom samostalnog tioredoksinskog fuzionog partnera) su prepoznati od strane pozitivnog kontrolnog At (poliklonskih anti-humanih MASP-2 seruma, izolovnih iz zečeva).

TABELA 7: REAKTIVNOST SA RAZLIČITIM REKOMBINANTNIM PACOVSKIM MASP-2 POLIPEPTIDIMA U

DOT BLOT ANALIZI

1

aktivnost puta je uočena tokom druge i treće nedelje, sa potpunom obnovom aktivnosti lektinskog puta kod miševa 17 dana nakon primene anti-MASP-2 MoAt. NR = bez reakcije. Pozitivna kontrola antitela su poliklonski anti-humani MASP-2 serumi, izolovani iz zečeva.

[0433] Svi Fab2 su reagovali sa MASP-2A, kao i sa MASP-2K (podaci nisu prikazani). Većina Fab2 je prepoznala CCPII-SP polipeptid, ali ne i N-terminalne fragmente. Dva izuzetka su Fab2 #60 i Fab2 #57. Fab2 #60 prepoznaje MASP-2A i CUBI-II fragment, ali ne i CUBI/EGF-u-sličan polipeptid ili CCPII-SP polipeptid, što ukazuje da se vezuje za epitop u CUBII, ili da se proteže duž CUBII i EGF-u-sličnog domena. Fab2 #57 prepoznaje MASP-2A, ali ne i bilo koji od ispitivaih fragmenta MASP-2, što ukazuje da ovaj Fab2 prepoznaje epitop u CCP1. Fab2 #40 i #49 su bili vezani samo za kompletan MASP-2A. U ELISA testu vezivanja prikazanom na SLICI 11, Fab2 #60 se takođe vezao za CUBI-II polipeptid, mada sa nešto nižim afinitetom koji se mogao uočiti.

[0434] Ovi nalazi pokazuju identifikaciju jedinstvenih blokirajućih Fab2 u više regiona MASP-2 proteina

PRIMER 12

[0435] Ovaj Primer opisuje analizu MASP-2-/- miševa u mišjem renalnom ishemijskom/reperfuzionom modelu.

[0436] Uvod/Obrazloženje: Ishemijska-reperfuziona (I/R) povreda bubrega na telesnoj temperaturi je od značaja brojnim kliničkim uslovima, uključujući hipovolemijski šok, procedure okluziju i privremene okluzije bubrežne arterije.

[0437] Ishemija-reperfuzija bubrega (I/R) je važan uzrok akutne bubrežne insuficijencije, povezan sa stopom smrtnosti do 50% (Levy i saradnici, JAMA 275:1489-94, 1996; Thadhani i saradnici, N. Engl. J. Med. 334:1448-60, 1996). Bubrežna insuficijencija nakon transplantacije je česta i preteća komplikacija nakon transplantacije bubrega (Nicholson i saradnici, Kidney Int. 58:2585-91, 2000). Trenutno nije dostupan efektivan tretman I/R povrede bubrega, odnosno jedini dostupan tretman je još uvek samo hemodijaliza. Patofiziologija I/R povrede bubrega je komplikovana. Nedavne studije su pokazale da lektinski put aktivacije komplementa može imati važnu ulogu u patogenezi bubrežne I/R povrede (deVries i saradnici, Am. J. Path.165:1677-88, 2004).

1

Postupci:

[0438] MASP-2(-/-) miš je generisan kao što je opisano u Primeru 1 i povratno je ukršan tokom najmanje 10 generacija sa C57B1/6 miševim. Šest MASP-2(-/-) mužjaka i šest miševa divljeg tipa (+/+), težine između 22-25 g, primilo je intraperitonealnu injekciju Hipnovela (6,64 mg/kg; Roche products Ltd. Welvin Garden City, UK), pa su naknadno anestezirani inhalacijom izoflurana (Abbott Laboratories Ltd., Kent, UK). Izofluran je izabran pošto je blag inhalacioni anestetik sa minimalnom toksičnošću jetre; koncentracije se proizvode precizno i životinja se brzo oporavlja, čak i nakon produžene anestezije. Hipnovel je primenjen pošto dovodi do stanja neuroleptanske analgezije kod životinja što označava da je potrebna primena manje izoflurana. Ispod životinje je stavljana topla podloga da bi se održavala konstantna telesna temperatura. Zatim je napravljen srednji rez na stomaku i telesna šupljina je držana otvorenom upotrebom para retraktora. Vezivno tkivo iznad i ispod bubrežne vene i arterije desnog i levog bubrega je očišćeno, pa je hilus burega stegnut primenom stezaljki za mikroaneurizmu tokom 55 minuta. Ovaj period ishemije se u početku zasnivao na prethnodnoj studiji koja je rađena u ovoj laboratoriji (Zhou i saradnici, J. Clin. Invest. 105:1363-71 (2000)). Pored toga, izabrano je standardno ishemijsko vreme od 55 minuta nakon ishemijske titracije i utvrđeno je da 55 minuta dovodi do konstantne povrede koja je bila ireverzibilna, sa niskim mortalitetom, manjim od 5%. Nakon okluzije, u trbušnu duplju je sipano 0,4 ml toplog fiziološkog rastvora (37°C), pa je stomak zatvoren za period ishemije. Nakon uklanjanja stezaljki za mikroaneurizmu, bubrezi su posmatrani dok nije došlo do promene boje, što je pokazatelj ponovnog protoka krvi u bubrege. U trbušnu duplju je zatim sipano dodatnih 0,4 ml toplog fiziološkog rastvora i otvor je zašiven, nakon čega su životinje vraćene u kaveze. Uzorci repne krvi su uzimani 24 sata nakon uklanjanja stezaljki, a nakon 48 sati miševi su žrtvovani i uzet je dodatni uzorak krvi.

[0439] Procena povrede bubrega: Bubrežna funkcija je procenjivana 24 i 48 sati nakon reperfuzije, kod šest mužjaka MASP-2(-/-) i šest WT (+/+) miševa. Merenje kreatinina u krvi je vršeno masenom spektrometrijom, koja je obezbedila ponovljivi indeks bubrežne funkcije (osetljivost <1,0 µmol/L).

SLIKA 12 grafički ilustruje klirens azota iz uree u krvi kod kontrolnih C57B1/6 miševa divljeg tipa i MASP-2(-/-) miševa, 24 sata i 48 sati nakon reperfuzije. Kao što je prikazano na SLICI 12, kod MASP-2(-/-) miševa je bilo prisutno značajno smanjanje u količini uree u krvi u 24. i 48. satu, u poređenju sa kontrolnim miševima divljeg tipa, što ukazuje na protektivni funkcionalan efekat na oštećenje bubrega u modelu ishemijske/reperfuzione povrede.

[0440] Sveukupno, povećana urea u krvi je utvrđena i kod WT (+/+) i MASP-2(-/-) miševa 24 i 48 sati nakon hirurške procedure i ishemijske povrede. Nivoi uree u krvi kod neishemijskih operisanih WT (+/+) životinja su bili odvojeni utvrđeni i iznosili su 5,8 mmol/L. Pored podataka predstavljenih na SLICI 12, kod jedne MASP-2(-/-) životinja se mogla uočiti gotovo potpuna zaštita od ishemijske povrede, sa

1

vrednostima od 6,8 i 9,6 mmol/L u 24, odnosno 48 sati. Ova životinja je bila isključena iz grupne analize kao ona koja potencijalno odstupa, gde zapravo možda i nije prisutna ishemijska povreda. Konačna analiza koja je prikazana na SLICI 12 je stoga uključivala 5 MASP-2(-/-) miševa i 6 WT (+/+), miševa i utvrđeno je statistički značajno smanjenje uree u krvi 24 i 48 sati kod MASP-2(-/-) miševa (Studentov t-test p<0,05). Ovi nalazi ukazuju da bi se moglo očekivati da inhibicija aktivnosti MASP-2 deluje protektivno ili ima terapijski efekat na oštećenje bubrega usled ishemijske povrede.

PRIMER 13

[0441] Ovaj Primer opisuje rezultate MASP-2-/- u mišjem modelu makularne degeneracije.

[0442] Uvod/Obrazloženje: Starosna makularna degeneracija (AMD) je vodeći uzrok slepila nakon 55. godine u industrijalizovanom svetu. AMD se javlja u dva glavna oblika: kao neovaskularni (vlažni) AMD i atrofični (suvi) AMD. Neovaskularni (vlažni) oblik je u osnovi 90% ozbiljnih gubitaka vioda koji su povezani sa AMD, iako samo oko 20% osoba sa AMD-om razvija vlažni oblik. Klinička obeležja AMD obuhvataju pojavu višestrukog druzena, geografsku atrofiju i horoidnu neovaskularizaciju (CNV). U decembru 2004. godine, FDA je odobrila Macugen (pegaptanib), novu klasu oftalmoloških lekova za specifično ciljano dejstvo i blokiranje efekata vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), za lečenje vlažnog (neovaskularnog) oblika AMD (Ng i saradnici, Nat Rev. Drug Discov 5:123-32 (2006)). Iako Macugen predstavlja obećavajuću novu terapijsku opciju za podgrupu pacijenata sa AMD, i dalje ostaje pritiskajuća potreba za razvojem dodatnih tretmana za ovu složenu bolest. Višestruke, nezavisne linije istraživanja su ukazanel na centralnu ulogu aktivacije komplementa u patogenezi AMD-a. Patogeneza horoidne neovaskularizacije (CNV), najozbiljnijeg oblika AMD, može uključivati aktivaciju puteva komplementa.

[0443] Pre više od dvadeset i pet godina, Ryan je opisao model CNV povrede indukovan laserom kod životinja (Ryan S.J., Tr. AM. Opth. Soc. LXXVII: 707-745, 1979). Model je u početku razvijan upotrebom rezus majmuna, međutim, od tada se ista tehnologija upotrebljavala za razvijanje sličnih modlea CNV-a kod raznih životinja koje se upotrebljavaju u istraživanjima, uključujući miša (Tobe i saradnici, Am. J. Pathol. 153:1641-46, 1998). U ovom modelu, upotrebljava se laserska fotokoagulacija za razbijanje Bruhove membrane, što dovodi do stvaranja membrana sličnih CNV. Laserski indukovani model zadržava monge od važnih karakteristika humanog stanja (za nedavni pregled, pogledati Ambati i saradnici, Survey Ophthalmology 48:257-293, 2003). Mišji model indukovan laserom je sada dobro uspostavljen i upotrebljava se kao eksperimentalna osnova u velikom i sve većem broju istraživačkih projekata. Opšte je prihvaćeno da laserski indukovan model dkarakteriše dovoljeno biološke sličnosti sa CNV kod ljudi, tako da se ovaj model upotrebljava u prekliničkim studijama patogeneze i inhibicije lekovima kao relevantan za CNV kod ljudi.

1

Postupci:

[0444] MASP-2-/- miš je generisan kao što je opisano u Primer 1 i povratno je ukrštan tokomm 10 generacija sa C57B1/6. Predmetna studija je upoređivala rezultate analiza u kojima su mužjaci MASP-2(-/-) i MASP-2 (+/+) miševa ispitivani tokom CNV indukovanog laserom kao ubrzanim modelom neovaskularnog AMD-a, fokusirajući se na zapreminu laserski indukovanog CNV upotrebom skenirajuće laserske konfokalne mikroskopije kao mere povrede tkiva, kao i na određivanje nivoa VEGF-a, moćnog angiogenog faktora za koga se pretpostavlja da od značaja u CNV, a sve u pigmentnom epitelu mrežnjače (RPE)/horoidima nakon povrede laserom, ELISA postukom.

[0445] Indukcija horoidne neovaskularizacije (CNV): Laserska fotokoagulacija (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75 μm; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA) obavljena je na oba oka svake životinje Dana 0, od strane osobe kojoj nije bila poznata raspodela životinja u grupe tretmana. Laserski snopovi su primenjivani na standardan način oko optičkog nerva, upotrebom proreza na lampi sistema za isporuku i štitnika u vidu kontaktnog sočiva. Morfološki, krajnja tačka laserske povrede je bila pojava kavitacionog mehurića, znaka za koji se smatra da je u korelaciji sa remećenjem Bruhove membrane. Sledi detaljan opis postupaka i ishoda koji su analizirani.

[0446] Fluoresceinska angiografija: Fluoresceinska angiografija je rađena sa kamerom i sistemom za snimanje (TRC 501A kamera; ImageNet 2,01 sistem; Topcon, Paramus, N.J.) nakon jedne nedelje od laserske fotokoagulacije. Fotografije su snimljene 20-D sočivom u dodiru sa fundusom sočiva kamere, nakon intraperitonealne injekcije 0,1 ml 2,5% fluorescein natrijuma. Stručnjak za mrežnjaču koji nije bio uključen u lasersku fotokoagulaciju ili angiografiju, procenjivao je fluoresceinske angiograme u jednom pokušaju i bez upućivanja u vrste tretiranih grupa.

[0447] Zapremina horoidne neovaskularizacije (CNV): Nedelju dana nakon laserske povrede, oči su enukleisane i fiksirane sa 4% paraformaldehidom tokom 30 minuta na 4°C. Čašice očiju su dobijene uklanjanjem prednjih segmenata i isprane su tri puta u PBS-u, nakon čega su dehidratisane i rehidratisane serijama metanola. Nakon dva blokiranja u puferu (PBS koji je sadržavao 1% goveđeg serumskog albumina i 0,5% Tritona X-100) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, očne čašice su inkubirane preko noći na 4°C sa 0,5% FITC-izolektinskog B4 (Vector laboratories, Burlingame, CA) koji je bio razblažen sa PBS-om koji je sadržavao 0,2% BSA i 0,1% Tritona X-100 i koji vezuje terminalne β-D-galaktozne ostatke na površini endotelnih ćelija i time selektivno obeležava mišju vaskulaturu. Nakon dva ispiranja PBS-om koji je sadržavao 0,1% Triton-a X-100, neurosenzorna mrežnjača je nežno odvojena i odvojena od optičkog nerva. Napravljena su četiri relaksirajuća radijalna reza, pa je preostali kompleks RPE-horoid-sklera postavljen kao poravnat u medijum za sprečavanje gubitka signala (Immu-Mount Vectashield Mounting Medium; Vector Laboratories) i postavljena je pokrovna pločica.

1

[0448] Izravnati preparati su ispitivani skenirajućim laserskim konfokalnim mikroskopom (TCS SP; Leica, Heidelberg, Nemačka). Sudovi su vizualizovani ekscitacijom sa talasnom dužinom plavog argona (488 nm) i hvatanjem emisije između 515 i 545 nm. Za sve studije slika je upotrebljavan uljani imerzioni objektiv sa uvećanjem od 40X. Horizontalni optički preseci (korak od 1 µm) su dobijani sa površine kompleksa RPE-horoid-sklera. Kao dno lezije je identifikovana najdublja fokalna ravan u kojoj se mogla uočiti okolna horoidna vaskularna mreža povezana sa lezijom. Kao CNV je uzima svaki krvni sud u okviru površine ciljanog dejsva lasera koji je bio površinski u odnosu na ovu referentnu ravan. Slike svakog preseka su digitalno sačuvane. Područje fluorescencije povezane sa CNV je mereno kompjuterskom analizom slike upotrebom softvera mikroskopa (TCS SP; Leica). Zbir celokupne fluorescentne površine na svakom horizontalnom preseku je upotrebljen kao indeks zapremine CNV. Snimanje je vršio operater kome nije bila poznata raspodela životinja u eksperimentalne grupe.

[0449] Zbog verovatnoće da na svaku leziju laserom koja dovodi do razvoja CVN utiče grupa kojoj životinja pripada (usled specifičnost miša, oka i laserskog zraka), srednja zapremina lezije je upoređivana upotrebom linearnog mešovitog modela sa podeljenim dijagramom ponovljenih merenja. Celokupni faktor dijagrama je predstavljao genetičku grupu kojoj životinja pripada, dok je faktor podele dijagrama predstavljao oko. Statistička značajnost je utvrđen na nivou od 0,05. Post hoc poređenja srednjih vrednosti su vršena sa Bonferonijevim prilagođavanjem za višestruka poređenja.

[0450] ELISA za VEGF. Tri dana nakon povrede sa 12 tačaka dejstva lasera, RPE-horoidni kompleks je sonikovan u puferu za lizu (20 mM imidazol HCl, 10 mM KCl, 1 mM MgCL2, 10 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 1 mM Na molibdat i 1 mM EDTA sa proeaznim inhibitorom) na ledu tokom 15 minuta. Nivoi VEGF proteina u supernatantu su određeni upotrebom ELISA kompleta (R&D Systems, Minneapolis, MN) koji prepoznaje sve izofomne oblike, na 450 do 570 nm (Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) i normalizovanjem podataka na ukupne proteine. Duplikati merenja su rađeni od strane operatora koji nije bio uključen u fotokoagulaciju, slikanje ili angiografiju i koji nije bio upućen u raspodelu životinja. VEGF brojevi su predstavljeni kao srednja vrednost /- SEM iz najmanje tri nezavisna eksperimenta i upoređeni su upotrebom Mann-Whitney U testa. Nulta hipoteza je odbačena pri P<0,05.

REZULTATI:

Procena niva VEGF-a:

[0451] SLIKA 13A grafički ilustruje nivoe VEGF proteina u RPE-horoidnom kompleksu izolovanom iz C57B16 miševa divljeg tipa i MASP-2(-/-) miševa nultog dana. Kao što je prikazano na SLICI 13A, procena nivoa VEGF-a je ukazala na smanjenje osnovnih nivoa za VEGF kod MASP-2 (-/-) miševa u

14

poređenju sa C57bl kontrolnim miševima divljeg tipa. SLIKA 13B grafički ilustruje nivoe VEGF proteina izmerene trećeg dana nakon povrede izazvane laserom. Kao što je prikazano na SLICI 13B nivoi VEGF-a su se značajno povećali kod miševa divljeg tipa (+/+) tri dana nakon povrede izazvane laserom, u skladu sa objavljenim studijama (Nozaki i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2328-33 (2006)). Ipak, iznenađujuće vrlo niski nivoi VEGF-a su uočeni kod MASP-2 (-/-) miševa.

Procena horoidne neovaskularizacije (CNV):

[0452] Pored smanjenja nivoa VEGF-a nakon makularne degeneracije izazvane laserom, površina CNV je određena pre i nakon laserske povrede. SLIKA 14 grafički ilustruje zapreminu CNV izmerenu kod C57bl miševa divljeg tipa i MASP-2(-/-) miševa sedmog dana nakon povrede izazvane laserom. Kao što je prikazano na SLICI 14, MASP-2 (-/-) miševe je sedmog dana nakon oštećenja izazvanog laserom karakterisalo smanjenje u površini CNV-a od oko 30% u poređenju sa kontrolnim miševima divljeg tipa.

[0453] Navedeni nalazi ukazuju da je kod MASP (-/-) miševa u odnosu na kontrole divljeg tipa (+/+) došlo do smanjenja u VEGF-u i CNV i da bi blokada MASP-2 inhibitorom mogla biti sa preventivnim ili terapijskim dejsstvom u lečenju makularne degeneracije.

PRIMER 14

[0454] Ovaj primer pokazuje da do aktivacija trombina može doći nakon aktivacije lektinskog puta u fiziološkim uslovima i pokazuje stepen uključenosti MASP-2. U serumu normalnih pacova, aktivacija lektinskog puta dovodi do aktivacije trombina (procenjuje se u vidu deponovanja trombina) istovremeno sa aktivacijom komplementa (procenjuje se u vidu deponovanje C4). Kao što se može videti na SLIKAMA 15A i 15B, aktivacija trombina u ovom sistemu je inhibirana antitelom koje blokira MASP-2 (formata Fab2) koga karakteriše kriva koncentracije i inhibitornog odgovora (SLIKA 15B) koja je paralana onoj za aktivaciju komplementa (SLIKA 15A). Ovi podaci ukazuju da će aktivacija lektinskog puta kada se dogogi u traumi voditi aktivaciji i komplementa i sistema koagulacije u procesu koji u potpunosti zavisi od MASP-2. Shodno zaključku, antitela koja blokiraju MASP2 mogu se pokazati efikasnima u ublažavanju slučajeva prekomerne sistemske koagulacije, npr. diseminovane intravaskularne koagulacije, što je jedno od bitnih obeležja koja dovode do smrtnosti u slučajevima velikih trauma.

PRIMER 15

[0455] Ovaj primer obezbeđuje rezultate generisane upotrebom lokalizovanog Švarcmanovog reakcionog modela diseminovane intravaskularne koagulacije kod MASP-2 -/- deficijentnih i MASP-2 /+ miševa u cilju procene uloge lektinskog puta u DIC.

Uvod/Obrazloženje:

[0456] Kao što je prethodno opisano, blokada MASP-2 inhibira aktivaciju lektinskog puta i smanjuje obrazovanje oba anafilatoksina C3a i C5a. Može se pokazati da su anafilatoksini C3a snažni agregatori trombocita in vitro, ali je njihovo učešće in vivo manje dobro definisano, tako da oslobađanje supstanci trombocita i plazmina u sanaciji rane može samo sekundarno uključivati komplement C3. U ovom Primeru, uloga lektinskog puta je analizirana kod MASP-2 (-/) i WT (+/+) miševa da bi se ispitalo da li je produženo povišenje aktivacije C3 neophodno za generisanje diseminovane intravaskularne koagulacije.

Postupci:

[0457] MASP-2(-/-) miševi upotrebljeni u ovoj studiji su generisano kao što je to opisano u Primeru 1 i povratno su ukrštani tokom najmanje 10 generacija sa C57B1/6.

[0458] U ovom eksperimentu je upotrebljen lokalizovani Švarcmanov reakcioni model. Lokalizovana Švarcmanova reakcija (LSR) je odgovor izazvan lipopolisaharidima (LPS) sa dobro okarakterisanim doprinosima ćelijskih i humoralnih elemenata urođenog imunog sistema. Zavisnost LSR od komplementa je takođe čvrsto uspostavljena (Polak L. i saradnici, Nature 223:738-739 (1969); Fong J.S. i saradnici, J Exp Med 134:642-655 (1971)). U LSR modelu, miševi su prajmovani tokom 4 sata sa TNF alfa (500 ng, intraskrotalno), pa su miševi anestezirani i pripremljeni za intravitalnu mikroskopiju mišića kremaster. Za posmatranje su izabrane mreže postkapilarnih venula (prečnika 15-60 µm) sa dobrim protokom krvi (1-4 mm/s). Životinje su tretirane fluorescentnim antitelima da bi se selektivno obeležili neutrofili ili trombociti. Mreža sudova je sekvencijalno skenirana i slike svih sudova su digiatalno snimane za kasnije analize. Nakon snimanja bazalnog stanja mikrocirkulacije, miševi su primali jednu intravensku injekciju LPS-a (100 μg), bilo samostalno ili sa agensima koji su navedeni u nastavku teksta. U nastavku je ista mreža sudova skenirana na svakih 10 minuta tokom 1 sata. Specifična akumulacija fluorofora je identifikovana oduzimanjem fluorescencije pozadine i pojačana je promenom praga za analizu slike. Veličina reakcija je merena na snimljenim slikama. Prevenstveno su mereni podaci agregacija kao merila Švarcmanovih reakcija.

[0459] Studije su upoređivale miševe sa dovoljnom ekspresijom MASP-2 (+/+), odnosno miševe divljeg tipa, sa miševima koji su bili izloženi bilo poznatom agensu za depleciju puta komplementa, venomu otrova kobre (CVF) ili inhibitoru terminalnog puta (antagonisti C5aR). Rezultati (SLIKA 16A) pokazuju da su i CVF, kao i antagonista C5aR, sprečili pojavu agregata u vaskulaturi. Dodatno, kod miševa sa deficijencijom, MASP-2-/- (SLIKA 16B) takođe je pokazana potpuna inhibicija lokalizovane Švarcmanove reakcije, što podržava uključenost lektinskog puta. Ovi rezultati jasno pokazuju ulogu MASP-2 u generisanju DIC i podržavaju upotrebu inhibitora MASP-2 za lečenje i prevenciju DIC.

PRIMER 16

[0460] Ovaj Primer opisuje analizu MASP-2(-/-) miševa u mišjem modelu transplantacije bubrega.

Uvod/Obrazloženje:

[0461] Uloga MASP-2 u funkcionalnom ishodu transplantacije bubrega je ispitivana upotrebom mišjeg modela.

Postupci:

[0462] Funkcionalni ishod transplantacije bubrega je utvrđivan upotrebom izografta tipa jednog bubrega kod jednostrano nefrektomizovanih miševa primalaca, u grupi od šest WT (+/+) primalaca transplantata (B6) i šest MASP-2 (-/-) primalaca transplantata. Da bi se utvrdila funkcija transplantiranog bubrega, preostali nativni bubreg je uklonjen iz primaoca 5 dana nakon transplantacije, a funkcija bubrega je ispitivana 24 sata kasnije, merenjem nivoa azota uree u krvi (BUN).

Rezultati:

[0463] SLIKA 17 grafički ilustruje nivoe azota uree u krvi (BUN) za analiziran bubreg 6 dana nakon transplantacije bubrega kod WT (+/+) primalaca i MASP-2 (-/-) primalaca. Kao što je prikazano na SLICI 17, uočeni su snažno povišeni nivoi BUN kod WT (+/+) primalaca transplantata (B6) (normalni nivoi BUN kod miševa su bili <5 mM), što ukazuje na bubrežnu insuficijenciju. Nasuprot tome, MASP-2(-/-) miševi primaoci izografta pokazali su znatno niže nivoe BUN, što ukazuje na poboljšanu bubrežnu funkciju. Primetno je da su ovi rezultati dobijeni primenom graftova iz WT (+/+) davalaca bubrega, što ukazuje da je odsustvo funkcionalnog lektinskog puta kod primaoca transplantata samo po sebi dovoljno za postizanje terapijske koristi.

14

[0464] Zajednički posmatrano, ovi rezultati ukazuju da privremena inhibicija lektinskog puta putem inhibicije MASP-2 obezbeđuje postupak smanjenja morbiditeta i odložene funkcije transplantata u transplantaciji bubrega, kao i da će ovaj pristup verovatno biti koristan u drugim postavkama transplantacije.

PRIMER 17

[0465] Ovaj Primer pokazuje da su MASP-2 (-/-) miševi rezistentni na septički šok u mišjem modelu polimikrobnog septičkog peritonitisa.

Uvod/Obrazloženje:

[0466] Da bi se procenili potencijalni efekti MASP-2 (-/-) na infekciju, ispitivan je model podvezivanja i punkcije slepog creva (CLP) kao model polimikrobnog septičkog peritonitisa. Smatra se da ovaj model najtačnije oponaša tok septičkog peritonitisa kod ljudi. Model podvezivanja i punkcije slepog creva (CLP) je model u kome se slepo crevo podvezuje i probuši iglom, što dovodi do kontinuiranog curenja bakterija u trbušnu šupljinu, odakle bakterije limfnom drenažom stižu u krv i zatim se distribuiraju u sve abdominalne organe, a što dalje dovodi do višestrukog otkazivanja organa i septičnog šoka (Eskandari i saradnici, J Immunol 148(9):2724-2730 (1992)). CLP model oponaša tok sepse koja se uočava kod pacijenata i indukuje rani hiperinflamatorni odgovor praćen izraženom hipoinflamatornom fazom. Tokom ove faze, životinje su veoma osetljive na bakterijske infekcije (Wichterman i saradnici, J. Surg. Res.29(2):189-201 (1980)).

Postupci:

[0467] Smrtnost od polimikrobne infekcije primenom modela podvezivanja i punkcije slepog creva (CLP) izmerena je kod WT (+/+) (n=18) i MASP-2(-/-) miševa (n=16). Ukratko opisano, miševi sa deficijencijom MASP-2 i njihovi parnjaci iz istih okota divljeg tipa, anestezirani su pa je slepo crevo izvađeno i podvezano za 30% iznad distalnog kraja. Nakon toga, slepog crevo je jednom punktirano iglom prečnika 0,4 mm. Cecum je zatim vraćen u trbušnu šupljinu i koža je zatvorena stezaljkama. Preživljavanje miševa podvrgnutih CLP je praćeno tokom perioda od 14 dana nakon CLP-a. Peritonealna lavaže je prikupljana kod miševa 16 sati nakon CLP-a, da bi se izmerilo opterećenje bakterijama. Serijska razblaženja peritonealne lavaže su pripremana u PBS-u i inokulirana su u Mueller Hinton-ove ploče, nakon čega su inkubirane na 37°C u anaerobnim uslovima tokom 24 sata, pa je određeno opeterećenja bakterijama.

[0468] Citokinski odgovor TNF-alfa na bakterijsku infekciju je takođe meren kod WT (+/+) i MASP-2(-/-) miševa 16 sati nakon CLP u plućima i slezinama, kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze u realnom vremenu (qRT-PCR). Nivo TNF-alfa u serumu 16 sati nakon CLP-a kod WT (+/+) i MASP-2(-/-) miševa je kvantifikovan i sendvič ELISA postupkom.

Rezultati:

[0469] SLIKA 18 grafički ilustruje procenat preživljavanja životinja tretiranih sa CLP u funkciji dana nakon CLP procedure. Kao što je prikazano na SLICI 18, deficijencija lektinskog puta kod MASP-2 (-/-) miševa ne povećava smrtnost miševa nakon polimikrobne infekcije upotrebom modela podvezivanja i punkcije slapog creva u poređenju sa WT (+/+) miševima. Ipak, kao što je prikazano na SLICI 19, MASP-2 (-/-) miševe karakteriše značajno veće bakterijsko opterećenje (porast u broju bakterija od približno 1000 puta) u tečnosti peritonealne lavaže nakon CLP-a u poređenju sa njihovim WT (+/+) parnjacima iz istih okota. Ovi rezultati pokazuju da su miševi sa deficijencijom MASP-2 (-/-) rezistentni na septički šok. Smanjen bakterijski klirens kod miševa sa deficijencijom MASP-2 u ovom modelu može biti posledica oštećene fagocitoze posredovane sa C3b, pošto je pokazano da deponovanje C3 zavisi od MASP-2.

[0470] Utvrđeno je i da citokinski odgovor TNF-alfa na bakterijsku infekciju nije bio povišen kod MASP-2 (-/-) miševa u poređenju sa WT (+/+) kontrolama (podaci nisu prikazani). Takođe je utvrđeno da je koncentracija TNF-alfa u serumu kod WT (+/+) miševa bila značajno viša 16 sati nakon CLP-a za razliku od MASP-2 (-/-) miševa, gde je nivo TNF-alfa u serumu ostao skoro nepromenjen. Ovi rezultati ukazuju da je intenzivan inflamatorni odgovor na septičko stanje ublažen kod MASP-2 (-/-) miševa i da je omogućio životinjama da prežive u prisustvu višeg broja bakterija.

[0471] Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju potencijalne štetne efekte lektinskog puta aktivacije komplementa u slučaju septikemije i povećanog mortaliteta kod pacijenata sa preovladavajućom sepsom. Ovi rezultati dalje pokazuju da deficijencija MASP-2 moduliše inflamatoran imununski odgovor i smanjuje nivo ekspresije inflamatornih medijatora tokom sepse. Stoga, veruje se da bi inhibicija MASP-2 (-/), primenom inhibitornih monoklonskih antitela za MASP-2, bila efektivna u smanjenju inflamatornog odgovora kod subjekta koji boluje od septičnog šoka.

PRIMER 18

[0472] Ovaj Primer opisuje analizu MASP-2 (-/-) miševa u mišjem modelu intranazalne infektivnosti.

14

Uvod/Obrazloženje:

[0473] Pseudomonas aeruginosa je Gram negativan oportunistički humani bakterijski patogen koji prouzrokuje širok spektar infekcija, posebno kod imunski kompromitovanih osoba. Glavni je izvor stečenih bolničkih infekcija, posebno bolničke stečene pneumonije. Takođe je odgovoran za značajan morbiditet i mortalitet kod pacijenata sa cističnom fibrozom (CF). Plućnu infekciju sa P. aeruginosa karakteriše snažno regrutovanje neutrofila i značajno zapaljenje pluća što dovodi do zančajnih oštećenja tkiva (Palanki M.S. i saradnici, J. Med. Chem 51:1546-1559 (2008)).

[0474] U ovom Primeru je preduzeto istraživanje da bi se utvrdilo da li uklanjanje lektinskog puta kod MASP-2 (-/-) miševa povećava podložnost miševa na bakterijske infekcije.

Postupci:

[0475] Dvadeset dva WT (+/+) miša, dvadeset dva MASP-2 (-/-) miša i jedanaest C3 (-/-) miševa je inficirano intranazalnom primenom bakterijskog soja P. aeruginosa. Miševi su pražemo tokom perioda od šest dana nakon infekcije i konstruisne su Kaplan-Majerovi dijagrami koji prikazuju procenat preživljavanja.

Rezultati:

[0476] SLIKA 20 je Kaplan-Majerov dijagram procenta preživljavanja WT (+/+), MASP-2 (-/-) ili C3 (-/-) miševa šest dana nakon infekcije. Kao što je prikazano na SLICI 20, nisu uočene razlike kod MASP-2 (-/-) miševa u odnosu na WT (+/+) miševe. Međutim, rezultat uklanjanje klasičnog (C1q) puta kod C3 (-/-) miševa je bio ozbiljna podložnost bakterijoj infekciji. Ovi rezultati pokazuju da inhibicija MASP-2 ne povećava podložnost bakterijskoj infekciji, ukazujući dalje da je moguće smanjiti neželjene inflamatorne komplikacije kod pacijenata sa traumom inhibiranjem MASP-2 bez ugrožavanja sposobnosti pacijenta da se bori protiv infekcije upotrebom klasičnog puta aktivacije komplementa.

PRIMER 19

[0477] Ovaj Primer opisuje farmakodinamičku analizu reprezentativnih anti-MASP-2 Fab2 antitela visokog afiniteta koja su identifikovana kao što je opisano u Primeru 10.

Uvod/Obrazloženje:

[0478] Kao što je opisano u Primeru 10, da bi se identifikovala antitela sa visokim afinitetom koja blokiraju lektinski put pacova, za paniranje biblioteke prikazivanja u fagima je upotrebljen MASP-2

14

protein pacova. Ova biblioteka je dizajnirana tako da obezbedi visoku imunsku raznolikost i konstruisana je upotrebom potpuno humanih sekvenci imunoglobulinskih gena. Kao što je opisano u Primeru 10, identifikovano je približno 250 pojedinačnih fagnih klonova koji su se vezivali sa visokim afinitetom za pacovski MASP-2 protein u ELISA skriningu. Sekvenciranjem ovih klonova je identifikovano 50 faga koji kodiraju jedinstvena anti-MASP-2 antitela. Iz ovih klonova je eksprimiran Fab2 protein, koji je dalje prečišćen i analiziran da bi se utvrdio afinitet vezivanja za MASP-2, kao i stepen funkcionalne inhibicije lektinskog puta aktivacije komplementa.

[0479] Kao što je prikazano u TABELI 6 iz Primera 10, rezultat analize je bila identifikacija 17 anti-MASP-2 Fab2 sa funkcionalnom blokirajućom aktivnošću (stopa pogotka blokiranja antitela od 34%). Funkcionalna inhibicija lektinskog puta aktivacije komplementa upotrebom Fab2 je bila očigledna na nivou deponovanja C4, što je direktna mera cepanja C4 sa MASP-2. Važno je da je inhibicija bila podjednako evidentna kada je ispitivana aktivnost C3 konvertaze, pokazujući tako funkcionalnu blokadu lektinskog puta aktivacije komplementa. Sedamanest Fab2 koji blokiraju MASP-2 i koji su identifikovani kao što je opisano u Primeru 10, snažno inhibiraju obrazovanje C3 konvertaze sa IC50vrednošću koja je jednaka ili manja od 10 nM. Osam od 17 identifikovanih Fab2 je sa IC50vrednošću u dub-nanomolarnom opsegu. Dodatno, svih 17 blokirajućih Fab2 za MASP-2 je dovelo do suštinski potpune inhibicije obrazovanja C3 konvertaze u analizi C3 konvertaze lektinskog puta, kao što je prikazano na SLIKAMA 8A-C, i rezimirano u TABELI 6 Primera 10. Štaviše, svaki od 17 blokirajućih anti-MASP-2 Fab2 koji su prikazani u TABELI 6 snažno inhibiraju obrazovanje C3b (>95%), demonstrirajući time način specifičnost ove analize za C3 konvertazu lektinskog puta.

[0480] Izotipske varijatne pacovskog IgG2c i mišjeg IgG2a antitela pune dužine su izvedene iz Fab2 #11. Ovaj Primer opisuje in vivo karakterizaciju farmakodinamičkih parametara za ove izotipove.

Postupci:

[0481] Kao što je opisano u Primeru 10, paovski MASP-2 protien je upotrebljen za paniranje Fab fagne bilbioteke iz koje je identifikovan Fab2 #11. Izotipske varijatne pacovskog IgG2c i mišjeg IgG2a antitela pune dužine su izvedene iz Fab2 #11. In vivo su okarakterisani farmakodinamički parametri i izotipovi pacovskog IgG2c i mišjeg IgG2a antitela pune dužine in vivo na način koji sledi.

In vivo studija na miševima:

[0482] Farmakodinamička studija je urađena na miševima da bi se istražio efekat doziranja anti-MASP-2 antitela na aktivnost lektinskog puta u plazmi in vivo. U ovoj studiji je izmereno deponovanje C4 ex vivo, analizom lektinskog puta u različitim vremenskim tačkama nakon subkutane (sc) i

14

intraperitonealne (i.p.) primene 0,3 mg/kg ili 1,0 mg/kg mišjeg anti-MASP-2 MoAt (izotipa mišjeg IgG2a antitela pune dužine izvedenog iz Fab2 #11).

[0483] SLIKA 21 grafički ilustruje deponovanja C4b specifično za lektinski put, izmereno ex vivo u nerazblaženim uzorcima seruma uzetim iz miševa (n=3 miševa/grupe) u različitim vremenskim tačkama nakon subkutane primene doze od bilo 0,3 mg/kg ili 1,0 mg/kg mišjeg anti-MASP-2 MoAt. Uzorci seruma iz miševa koji su prikupljani pre primene doze antitela, služili su kao negativne kontrole (100% aktivnost), dok je serum u koji je in vitro dodato 100 nM istog blokirajućeg anti-MASP-2 antitelaje upotrebljen kao pozitivna kontrola (aktivnost 0%).

[0484] Rezultati prikazani na SLICI 21 ukazuju na brzu i potpunu inhibiciju deponovanja C4b nakon subkutane primene doze od 1,0 mg/kg mišjeg anti-MASP-2 MoAt. Delimična inhibicija deponovanja C4b je uočena nakon subkutane primene doze od 0,3 mg/kg mišjeg anti-MASP-2 MoAt.

[0485] Vremenski tok oporavka lektinskog puta je praćen tokom tri nedelje nakon jednokratne ip primene mišjeg anti-MASP-2 MoAt u dozi od 0,6 mg/kg miševima. Kao što je prikazano na SLICI 22, došlo je do naglog pada aktivnosti lektinskog puta nakon primene antitela koje je bilo praćeno potpunom inhibicijom lektinskog puta koja je trajala oko 7 dana nakon ip primene. Polako obnavljanje lektina

[0486] Ovi rezultati pokazuju da mišje anti-MASP-2 Moat izvedeno iz Fab2 #11 inhibira lektinski put kod miševa na način koji je zavisan od doze prilikom sistemske isporuke.

PRIMER 20

[0487] Ovaj Primer opisuje analizu mišjeg anti-MASP-2 Moat izvedenog iz Fab2 #11 da bi se utvrdila efikasnost u mišjem modelu starosne degeneraciju makule.

Uvod/Obrazloženje:

[0488] Kao što je opisano u Primer 10, pacovski MASP-2 protein je upotrebljen za paniranje Fab fagne biblioteke, iz koje je Fab2 #11 identifikovan kao funkcionalno aktivno antitelo. Antitela pune dužine pacovskog IgG2c i mišjeg IgG2a izotipa generisana su iz Fab2 #11. Za anti-MASP-2 antitelo pune dužine mišjeg IgG2a izotipa su okarakterisani famakodinamički parametri kao što je opisano u Primeru 19. U ovom Primeru, mišje anti-MASP-2 antitelo pune dužine izvedeno iz Fab2 #11 je analizirano u mišjem modelu starosne degeneracije makule (AMD), opisanom od strane Bora P.S. i saradnika, J Immunol 174:491-497 (2005).

14

Postupci:

[0489] Mišji IgG2a pune dužine anti-MASP-2 izotipskog antitela, izveden iz Fab2 #11 kao što je opisano u Primeru 19, ispitan je u mišjem modelu starosne degeneracije makule (AMD) kao što je to opisano u Primer 13, sa sledećim izmenama.

Primena mišjih-anti-MASP-2 MoAt

[0490] Dve različite doze (0,3 mg/kg i 1,0 mg/kg) mišjeg anti-MASP-2 MoAt su injecirane ip, zajedno sa tretmanom izotipskim MoAt, WT (+/+), miševima (n=8 miševa u grupi) 16 sati pre indukcije CNV

Indukcija horoidne neovaskularizacije (CNV)

[0491] Indukcija horoidne neovaskularizacije (CNV) i merenje zapremine CNV je rađeno upotrebom laserske fotokoagulacije kao što je opisano u Primeru 13.

Rezultati:

[0492] SLIKA 23 grafički ilustruje područje CNV izmereno 7 dana nakon laserske povrede kod miševa koji su tretirani bilo sa izotipskom kontrolom MoAt ili sa mišjim anti-MASP-2 MoAt (0,3 mg/kg i 1,0 mg/kg). Kao što je prikazano na SLICI 23, kod miševa koji su bili prethodno tretirani sa 1,0 mg/kg anti-MASP-2 MoAt, sedam dana nakon tretmana laserom je uočeno statistički značajno (p<0,01) smanjenje CNV od približno 50%. Kao što je dalje prikazano na SLICI 23, uočeno je i da doza od 0,3 mg/kg anti-MASP-2 MoAt nije bila efikasna u smanjenju CNV. Utvrđeno je takođe da doza od 0,3 mg/kg anti-MASP-2 MoAt delimično i privremeno inhibira deponovanje C4b nakon subkutane primene, kao što je opisano u Primeru 19 i prikazano na SLICI 21.

[0493] Rezultati opisani u ovom Primeru pokazuju da blokada MASP-2 sa inhibitorom, kao što je anti-MASP-2 MoAt, ima preventivni i/ili terapijski efekat u lečenju makularne degeneracije. Primećeno je takođe da su ovi rezultati u skladu sa rezultatima zapaženim u studiji urađenoj na MASP-2 (-/-) miševima, opisanoj u Primeru 13, u kojoj je zabeleženo smanjenje CNV od 30% 7 dana nakon laserskog tretmana kod MASP-2 (-/-) miševa u poređenju sa kontrolnim miševima divljeg tipa. Štaviše, rezultati u ovom Primeru dodatno pokazuju da sistemski isporučena anti-MASP-2 antitela obezbeđuju lokalnu terapijsku korist u oku, ističući time potencijal za sistemski način primene u lečenju pacijenata sa AMD. Ukratko, ovi rezultati pružaju dokaze koji podržavaju upotrebu MASP-2 MoAt u lečenju AMD.

14

PRIMER 21

[0494] Ovaj Primer pokazuje da su miševi sa deficijencijom MASP-2 zaštićeni od mortaliteta indukovanog sa Neisseria meningitidis nakon infekcije sa N. meningitidis i da imaju pojačan klirens bakterijemije u poređenju sa kontrolnim miševima divljeg tipa.

[0495] Obrazloženje: Neisseria meningitidis je heterotrofna gram-negativna diplokokna bakterija poznata po svojoj ulozi u meningitisu i drugim oblicima meningokokne bolesti kao što je meningokokemija. N. meningitidis je glavni uzrok morbiditeta i mortaliteta tokom detinjstva. Teške komplikacije obuhvataju septikemiju, Vaterhaus-Friderihsenov sindrom, insuficijenciju nadbubrežne žlezde i diseminovanu intravaskularnu koagulaciju (DIC). Pogledati npr. Rintala E. i saradnici, Critical Care Medicine 28(7):2373-2378 (2000). U ovom Primeru je analizirana uloga lektinskog puta kod MASP-2 (-/-) miševa i WT (+/+) miševa, da bi se istražilo da li bi miševi sa deficijencijom MASP-2 bili podložni mortalitetu indukovanom sa N. meningitidis.

Postupci:

[0496] MASP-2 knockout miševi su generisani kao što je opisano u Primeru 1 i povratno su ukrštani tokom najmanje 10 generacija sa C57B1/6. MASP-2 KO miševi stari 10 nedelja (n=10) i C57/B6 miševi divljeg tipa (n=10) inokulirani su intravenskom injekcijom bilo sa dozo od 5x10<8>cfu/100 µl, 2x10<8>cfu/100 µl ili 3x10<7>cfu/100 µl Neisseria meningitidis Serogrupe A Z2491 u 400 mg/kg gvožđe dekstrana. Preživljavanje miševa nakon infekcije je praćeno tokom vreenskog perioda od 72 sata. Uzorci krvi su nakon infekcije miševima uzimani u intervalima trajanja u satima i analizirani su da bi se utvrdio serumski nivo (log cfu/ml) N. meningitidis, a da bi se verifikovala infekcija i utvrdila brzina klirensa bakterija iz seruma.

Rezultati:

[0497] SLIKA 24A grafički ilustruje procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon primene infektivne doze od 5x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis. Kao što je prikazano na SLICI 24A, nakon infekcije najvećom dozom od 5x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis, 100% MASP-2 KO miševa je preživelo 72 sata nakon infekcije. Nasuprot tome, samo 20% WT miševa je još bilo živo 24 sata nakon infekcije. Ovi rezultati pokazuju da su miševi sa deficijencijom MASP-2 zaštićeni mortaliteta indukovanog sa N. meningitidis.

[0498] SLIKA 24B grafički ilustruje vrednosti log cfu/ml N. meningitidis izdvojenih u različitim vremenskim tačkama iz uzoraka krvi uzetih iz MASP-2 KO i WT miševa inficiranih sa 5x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis. Kao što je prikazano na SLICI 24B, kod WT miševa nivo N. meningitidis u krvi je dostigao

1

vrhunac od oko 6,5 log cfu/ml 24 sata nakon infekcije i pao je na nulu 48 sati nakon infekcije. Nasuprot tome, kod MASP-2 KO miševa nivo N. meningitidis je dostigao vrhunac od oko 3,5 log cfu/ml 6 sati nakon infekcije, nakon čega je pao na nulu 36 sati nakon infekcije.

[0499] SLIKA 25A grafički ilustruje procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon infekcije sa 2x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis. Kao što je prikazano na SLICI 25A, nakon infekcije sa dozom 2x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis, 100% MASP-2 KO miševa je preživelo 72 sata nakon infekcije. Nasuprot tome, samo 80% WT miševa je još bilo živo 24 sata nakon infekcije. U skladu sa rezultatima prikazanim na SLICI 24A, ovi rezultati dodatno pokazuju da su miševi sa deficijencijom MASP-2 zaštićeni od mortaliteta indukovanog sa N. meningitidis.

[0500] SLIKA 25B grafički ilustruje vrednosti log cfu/ml N. meningitidis izdvojenih u različitim vremenskim tačkama iz uzoraka krvi uzetih iz WT miševa inficiranih sa 2x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis. Kao što je prikazano na SLICI 25B, nivo N. meningitidis u krvi WT miševa inficiranih sa sa 2x10<8>cfu je dostigao vrhunac od oko 4 log cfu/ml 12 sati nakon infekcije i pao je na nulu 24 sata nakon infekcije.

SLIKA 25C grafički ilustruje vrednosti log cfu/ml N. meningitidis izdvojenih u različitim vremenskim tačkama iz uzoraka krvi uzetih iz MASP-2 KO miševa inficiranih sa 2x10<8>cfu/100 µl N. meningitidis. Kao što je prikazano na SLICI 25C, nivo N. meningitidis u krvi MASP-2 KO miševa inficiranih sa sa 2x10<8>cfu je dostigao vrhunac od oko 3,5 log cfu/ml 2 sata nakon infekcije i pao je na nulu 3 sata nakon infekcije. U skladu sa rezultatima prikazanim na SLICI 24B, ovi rezultati pokazuju da iako su MASP-2 KO miševi bili inficirani istom dozom N. meningitidis kao WT miševi, MASP-2 KO miševi imaju pojačani klirens bakterijemije u poređenju sa WT.

[0501] Procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon infekcije sa najmanjom dozom od 3x10<7>cfu/100 µl N. meningitidis je iznosio 100% u vremenskom periodu od 72 sata (podaci nisu prikazani).

Diskusija

[0502] Ovi rezultati pokazuju da su miševi sa deficijencijom MASP-2 zaštićeni mortaliteta indukovanog sa N. meningitidis i da imaju pojačani klirens bakterijemije u poređenju sa WT miševima. Stoga se, s obzirom na ove rezultate, očekuje da terapijska primena MASP-2 inhibitora, poput MASP-2 MoAt, bude efikasna u lečenju, prevenciji ili ublažavanju efekata infekcije sa N. meningitidis bakterijama (tj. sepse i DIC). Dodatno, ovi rezultati ukazuju da terapijska primena inhibitora MASP-2, poput MASP-2 MoAt, ne bi predisponirala subjekta povećanom riziku suočavanja sa N. meningitidis infekcijama.

PRIMER 22

[0503] Ovaj Primer opisuje otkriće novog načina aktivacije komplementa C3 posredovanog lektinskim putem i zavisnog od MASP-2 uz zaobilaženje C4.

1 1

Obrazloženje:

[0504] Glavna terapijska korist upotrebe inhibitora aktivacije komplementa za ograničavanje ishemijske/reperfuzione povrede miokarda (MIRI) ubedljivo je pokazana u eksperimentalnom pacovskom modelu infarkta miokarda pre dve decenije: Rekombinantan sCR1, solubilni skraćeni derivat receptora komplementa tipa 1 (CR1) sa ćelijske površine, davan je intravenski i ispitivano je njegovo dejstvo u pacovskom in vivo modelu MIRI. Lečenje sa sCR1 je smanjilo zapreminu infarkta za više od 40% (Weisma, H.F. i saradnici, Science 249:146-151 (1990)). Terapijski potencijal ovog rekombinantnog inhibitora je naknadno pokazan u kliničkom ispitivanju koje je pokazalo da je primena sCRl kod pacijenata sa MI sprečila kontraktilnu insuficijenciju u srcu nakon ishemije (Shandelya S. i saradnici, Cirkulation 87:536-546 (1993)). Primarni mehanizam koji dovodi do aktivacije komplementa u ishemijskom tkivu, međutim, nije konačno definisan, uglavnom usled nedostatka odgovarajućih eksperimentalnih modela, ograničenog razumevanja molekulskih procesa koji dovode do aktivacije komplementa od strane ćelija kojima je uskraćen kiseonikom, kao i međusobne interakcije i sinergizma između različitih puteva aktivacije komplementa.

[0505] Kao osnovna komponenta imunskog odgovora, sistem komplementa obezbeđuje zaštitu od napada mikroorganizama kroz mehanizme koji su zavisni od antitela i one koji od njih nisu zavisni. Sistem usaglašava mnoge ćelijske i humoralne interakcije unutar imunskog odgovora, uključujući hemotaksiju, fagocitozu, ćelijsku adheziju i diferencijaciju B-ćelija. Tri različita puta započinju kaskadu komplementa: klasičan put, alternativni put i lektinski put. Podkomponenta prepoznavanja klasičnog puta C1q se vezuje za niz ciljnih molekula - najistaknutiji su imunksi kompleksi - da bi započela postupna aktivacija povezanih serinskih proteaza, C1r i C1s, što obezbeđuje glavni mehanizam za klirens patogena i imunskog kompleksa nakon angažovanja adaptivnog imunskog sistema. Vezivanje C1q za imunske komplekse prevodi C1r zimogenski dimer u njegov aktivni oblik koji cepa i na taj način aktivira C1s. C1s prevodi vezivanje C1q u aktivaciju komplementa u dva koraka cepanja: najpre konvertuje C4 u C4a i C4b, a zatim cepa C2 koji se vezuje za C4b da bi se obrazovala C3 konvertaza C4b2a. Ovaj kompleks dalje konvertuje visoko zastupljenu komponentu plazme C3 u C3a i C3b. Akumulacija C3b u neposrednoj blizini C4b2a kompleksa pomera specifičnost supstrata za C3 na C5 da bi se obrazovala C5 konvertaza C4b2a(C3b)n. Kompleksi C3 i C5 konvertaze koji su generisani klasičnim putem aktivacije su identični onima koji se generišu putem aktivacije lektinskog puta. U alternativnom putu, spontana hidroliza komponente C3 niskog stepena dovodi do deponovanja proteinskog fragmenata na ćelijskim površinama, što pokreće aktivaciju komplementa na stranim ćelijama, dok regulatorni proteini povezani sa ćelijama na tkivima domaćina preusmeravaju aktivaciju, sprečavajući time samooštećenje. Kao i alternativni put, i lektinski put se može aktivirati u odsustvu imunskih kompleksa. Aktivacija započinje vezivanjem multi-molekulskog kompleksa za aktivaciju lektinskog puta

1 2

sa Patogen-asociranim molekulskim obrascem (PAMP), uglavnom ugljenohidratnim strukturama prisutnim na bakterijskim, gljivičnim ili virusnim patogenima ili aberantnim obrascima glikozilacije na apoptotičnim, nekrotičnim, malignim ili ćelijama lišenim kiseonikom (Collard C.D. i saradnici, Am. J. Pathol.156:1549-1556 (2000); Walport M.J., N. Engl. J. Med.344:1058-1066 (2001); Schwaeble W. i saradnici, Immunobiology 205:455-466 (2002); i Fujita T., Nat. Rev. Immunol.2:346-353 (2002)).

[0506] Lektin koji vezuje manan (MBL) je bio prva potkomponenta za prepoznavanje ugljenih hidrata za koju je pokazano da obrazuje komplekse sa grupom novih serinskih proteaza, nazvanih MBL-povezane serinske proteaze (MASP), a koje su numerisane prema redosledu njihovog otkrivanja (tj. MASP-1, MASP-2 i MASP-3). Kod čoveka, kompleksi za aktivaciju lektinskog puta mogu biti obrazovani sa četiri alternativne podkomponente za prepoznavanje ugljenih hidrata kojse su sa različitim specifičnostima vezivanja ugljenih hidrata, tj. to su MBL 2 i tri različita člana familij fikolina, naime L-fikolin, H-fikolin i M-fikolin i MASP proteini. Dva oblika MBL, MBL A i MBL C, kao i fikolin-A, obrazuju komplekse puteva za aktivacije lektina sa MASP u plazmi miša i pacova. Prethodno smo klonirali i okarakterisali MASP-2 i dodatni skraćeni proizvod MASP-2 gena od 19 kDa, nazvan MAp19 ili sMAP, kod ljudi, miša i pacova (Thiel S. i saradnici, Nature 386:506-510 (1997);. Stover C.M. i saradnici, J. Immunol.162:3481-3490 (1999); Takahashi M. i saradnici, Int. Immunol.11:859-863 (1999); i Stover C.M. i saradnici, J. Immunol. 163:6848-6859 (1999)). MAp19/sMAP je lišen proteazne aktivnosti, ali može regulisati aktivaciju lektinskog puta kompeticijom u vezivanju sa MASP za komplekse prepoznavanja ugljenih hidrata (Iwaki D i saradnici, J. Immunol.177:8626-8632 (2006)).

[0507] Postoje dokazi koji ukazuju da je od tri MASP-a potreban samo MASP-2 da prevođenje vezivanja kompleksa prepoznavanja lektinskog puta u aktivaciju komplementa (Thiel S. i saradnici (1997); Vorup-Jensen, T. i saradnici, J. Immunol.165:2093-2100 (2000); Thiel S. i saradnici, J. Immunol.165:878-887 (2000); Rossi V. i saradnici, J. Biol. Chem. 276:40880-40887 (2001)). Ovaj zaključak je naglašen fenotipom nedavno opisanog mišjeg soja sa deficijencijom MASP-1 i MASP-3. Osim kašnjenja u početku aktivacije komplementa posredovanog lektinskim putem in vitro - MASP-1/3 deficijentni miševi zadržavaju funkcionalnu aktivnost lektinskog puta. Rekonstitucijom seruma miševa sa deficijencijom MASP-1 i MASP-3 sa rekombinantnim MASP-1 prevazilazi se ovo kašnjenje u aktivaciji lektinskog puta, što ukazuje da MASP-1 može olakšati aktivaciju MASP-2 (Takahashi M. i saradnici, J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)). Najnovije istraživanje je pokazalo da je MASP-1 (a verovatno i MASP-3) potreban za konvertovanje ezima aktivacije alternativnog puta, Faktora D, iz njegovog zimogenog oblika u enzimski aktivan oblik (Takahashi M. i saradnici, J. Exp. Med.207:29-37 (2010)). Fiziološka važnost ovog procesa je posebno naglašena odsustvom funkcionalne aktivnosti alternativnog puta u plazmi miševa sa deficijencijom MASP-1/3,

1

[0508] Nedavno generisan mišji soj sa kombinovanim ciljnim deficijencijama u subkomponentama prepoznavanja ugljenih hidrata lektinskog puta, MBL A i MBL C, i dalje može započeti aktivaciju lektinskog puta preko preostale podkomponente za prepoznavanje lektinskog puta, fikolina A (Takahashi K. i saradnici, Microbes Infect. 4:773-784 (2002)). Odsustvo bilo kakve rezidualne funkcionalne aktivnosti lektinskog puta kod miševa sa deficijencijom MASP-2 predstavlja konačan model za proučavanje uloge ovog efektorskog kraka urođenog humoralnog imuniteta u zdravlju i bolestima.

[0509] Dostupnost mišjih sojeva sa deficijencijom C4 i MASP-2 omogućila nam je da definišemo novi put aktivacije komplementa C3 koji je specifičan za lektinski put, ali zavisan od MASP-2, a kojim se zaobilazi C4. Suštinski doprinos ovog novog puta aktivacije u kome se zaobilazi C4 i koji je posredovan lektinskim putem, u kontekstu gubitka tkiva nakon ishemije, naglašen je značajnim protektivnim fenotipom u MIRI usled deficijencije MASP-2, dok miševi sa deficijencijom C4 koji su ispitivani u istom modelu nije karakterisalo nikakvo protektivno dejstvo.

[0510] U ovom Primeru opisujemo novi put aktivacije komplementa C3 koji je posredovan lektinskim putem i zavisan od MASP-2, a kojim se zaobilazi C4. Fiziološka važnost ovog novog puta aktivacije je utvrđena protektivnim fenotipom kod deficijencije MASP-2 u eksperimentalnom modelu ishemijske/reperfuzione povrede miokarda (MIRI), gde životinje sa deficijencijom C4 ne karakteriše protekcija.

Postupci:

[0511] Miševe sa deficijencijom MASP-2 ne karakterišu značajne abnormalnosti. Miševi sa deficijencijom MASP-2 su generisani kao što je opisano u Primeru 1. Oba tipa, heterozigotni (<+/->) i homozigotni (<-/->) miševi sa deficijencijom MASP-2, su zdravi i plodni i ne izpoljavaju značajne abnormalnosti. Njihov očekivani životni vek je sličan onome kod njihovih WT parknjaka iz istih okota (>18 meseci). Pre proučavanja fenotipa ovih miševa u eksperimentalnim modelima oboljenja, naša MASP-2<-/->linija je povratno ukrštana jedanaest generacija sa C57BL/6 osnovnim sojem. Potpuno odsustvo MASP-2 iRNK je potvrđeno Northern blotovanjem izolata RNK iz jetre selektovanih kao poli A+, dok je iRNK od 1,2kb koja kodira MAp19 ili sMAP (skraćeni alternativni produkt obrade MASP2 gena) obilno eksprimirana.

[0512] qRT-PCR analiza, upotrebom parova prajmera specifičnih bilo za kodirajuću sekvencu serin proteaznog domena MASP-2 (B lanac) ili ostatak kodirajuće sekvence za A-lanac, pokazala je da nijedna iRNK koji kodira B lanac nije detektovana kod MASP-2<-/->miševa, dok je zastupljenost iRNK transkripata za poremećen A lanac bila značajno povećana. Slično tome, zastupljenost iRNK koja kodira MAp19/sMAP je bila povećana kod MASP-2<+/->i MASP-2<-/->miševa. Nivoi MASP-2 u plazmi, utvrđeni

1 4

ELISA postupkom kod 5 životinja svakog genotipa, iznosili su 300ng/ml kod WT kontrola (opseg 260-330ng/ml), 360ng/ml kod heterozigotnih miševa (opseg 330-395ng/ml) i nije bio detektabilan kod MASP-2<-/->miševa. Upotrebom qRT-PCR postupka su ustanovljeni profili ekspresije koji su pokazali da MASP-2<-/->miševi eksprimiraju iRNK za MBL A, MBL C, fikolin A, MASP-1, MASP-3, C1q, C1rA, C1sA, Faktor B, Faktor D, C4 i C3 u količinima sličnim onima koje su prisutne kod njihovih parnjaka iz istog legla sa dovoljno MASP-2 dovoljnih (podaci nisu prikazani).

[0513] Nivoi C3 u plazmi MASP-2<-/->(n=8) i MASP-2<+/+>(n=7) parnjaka iz istog lega je meren upotrebom komercijalno dostupnog ELISA kompleta za mišji C3 (Kamiya, Biomedical, Seattle, WA). Nivoi C3 kod miševa sa deficijencijom MASP-2 (prosečna vrednost od 0,84 mg/ml, /- 0,34) bili su slični nivoima kod WT kontrola (prosečna vrednost od 0,92, /- 0,37).

Rezultati:

MASP-2 je od suštinskog značaja za funkcionalnu aktivnost lektinskog puta.

[0514] Kao što je opisano u Primeru 2 i prikazano na SLICI 5, in vitro analize MASP-2<-/->plazme su ukazale na potpuno odsustvo funkcionalne aktivnosti lektinskog puta u kontekstu aktivacije na površinama obloženim mananom i zimosanom radi aktivacije C4. Slično tome, ni cepanje C4 ni C3 koji zavise od lektinskog puta nisu bili detektovani u MASP-2<-/->plazme na površinama obloženim sa N-acetil glukozaminom, koji vezuje i pokreće aktivaciju preko MBL A, MBL C i fikolina A (podaci nisu prikazani).

[0515] Analize seruma i plazme MASP-2-/- miševa su jasno pokazale da je MASP-2 suštinski potreban za aktivaciju komplementa putem lektinskog puta. Ukupni nedostatak funkcionalne aktivnosti lektinskog puta, međutim, ostavlja ostale puteve aktivacije komplementa netaknutima: MASP-2-/-plazma i dalje može aktivirati komplement putem klasičnog (SLIKA 26A) i alternativnog puta (SLIKA 26B). Na SLIKAMA 26A i 26B, simbol "*" označava serum iz WT (MASP-2 (+/+)); simbol "●" označava serum iz WT (osiromašen sa C1q); simbol "□" označava serum iz MASP-2 (-/-); i simbol "Δ" označava serum iz MASP-2(-/-) (osiromašen sa C1q).

[0516] SLIKA 26A grafički ilustruje da MASP-2-/- miševi zadržavaju funkcionalan klasičan put: deponovanje C3b je ispitivano na mikrotitarskim pločama obloženim imunskim kompleksima (generisanim in situ oblaganje sa BSA, a zatim dodavanjem kozjih anti-BSA IgG). SLIKA 26B grafički ilustruje da miševi sa deficijencijom MASP-2 zadržavaju funkcionalan alternativni put: deponovanje C3b je ispitivano na mikrotitarskim pločama obloženim Zimosanom pod uslovima koji dozvoljavaju samo aktivacije alternativnog puta (pufer koji je sadržavao Mg<2+>i EGTA). Rezultati prikazani na SLICI 26A i SLICI 26B predstavljaju srednju vrednost duplikata i tipični su za tri nezavisna eksperimenta. Uvek su upotrebljavani isti simboli za označavanje porekla plazme. Ovi rezultati pokazuju da je funkcionalan

1

alternativni put prisutan kod miševa sa deficijencijom MASP-2, što je očigledno na osnovu rezultati prikazanih na SLICI 26B pod eksperimentalnim uslovima dizajniranim tako da se direktno pokrene alternativan put, dok se istovremeno deaktiviraju i klasičan put i lektinski put.

Lektinski put aktivacije komplementa ključno doprinosi gubitku tkiva usled inflamacije kod ishemijske/reperfuzione povrede miokarda (MIRI).

[0517] U cilju proučavanja doprinosa funkcionalne aktivnosti lektinskog puta MIRI, uporedili smo MASP-2<-/->miševe i WT kontrolne parnjake iz istog legla u modelu MIRI nakon prolazne ligacije i reperfuzije leve prednje silazne grane koronarne arterije (LAD). Prisustvo ili odsustvo komplementa C4 nema uticaja na stepen gubitka tkiva prouzrokovanog ishemijom kod MIRI. Utvrdili smo i uticaj deficijencije C4 na veličine infarkta nakon eksperimentalnog MIRI. Kao što je prikazano na SLICI 27A i SLICI 27B, identične veličine infarkta su uočene i kod miševa sa deficijencijom C4 i kod njihovih WT parnjaka. SLIKA 27A grafički ilustruje gubitak tkiva indukovan sa MIRI, nakon podvezivanja LAD i reperfuzije kod C4-/- miševa (n=6) i odgovarajućih WT kontrola iz istih legala (n=7). SLIKA 27B grafički ilustruje INF kao funkciju AAR, jasno pokazujući da su C4-/- miševi podložni MIRI kao i njihove WT kontrole (isprekidana linija).

[0518] Ovi rezultati pokazuju da miševi sa deficijencijom C4 nisu zaštićeni od MIRI. Ovaj rezultat je bio neočekivan, pošto je u suprotnosti sa široko prihvaćenim mišljenjem da je glavni fragment aktivacije C4, C4b, esencijalna komponenta C3 konvertaze C4b2a klasičnog i lektinskog puta. Stoga smo ispitali da li se u mišjoj i humanoj plazmi sa deficijencijom C4 može detektovati rezidualna aktivacija komplementa C3 specifična za lektinski put.

Lektinski put može aktivirati C3 komplement u odsustvu C4 putem novog puta aktivacije zavisnog od MASP-2 i zaobilaženje C4.

[0519] Ohrabreni istorijskim izveštajima koji ukazuju na postojanje puta aktivacije koji zaobilazi C4 u serumu zamorca sa deficijencijom C4 (May J. E. i M. Frank, J. Immunol. 111:1671-1677 (1973)), analizirali smo da li miševi sa deficijencijom C4 mogu imati rezidualnu funkcionalnu aktivnost klasičnog ili lektinskog puta i pratili smo aktivaciju C3 pod uslovima specifičnim za odrešeni put koji isključuju doprinos alternativnog puta.

[0520] Deponovanje C3b je ispitivano upotrebom mikrotitarskih ploča obloženih mananom, kao i ponovno kalcifikovane plazme u koncentracijama plazme koje su ometajuće za aktivaciju alternativnog puta (1,25% i niže). Iako nije detektovano cepanje C3 u plazmi sa deficijencijom C4 kod koje je ispitivana aktivacija klasičnog puta (podaci nisu prikazani), jaka rezidualna aktivnost cepanja C3 je uočena u mišjoj plazmi sa deficijencijom C4 prilikom pokretanja aktivacije komplementa putem

1

lektinskog puta. Zavisnost od lektinskog puta je pokazana kompetitivnom inhibicijom cepanja C3 nakon predinkubacije razblaženja plazme sa deficijencijom C4 sa solubilnim mananom (pogledati SLIKU 28A). Kao što je prikazano na SLICI 28A-D, aktivacija C3 zavisna od MASP-2 je uočena u odsustvu C4. SLIKA 28A grafički ilustruje deponovanje C3b upotrebom C4+/+ (krstići) i C4-/- (neobojeni krugovi) mišje plazme. Prethodna inkubacija C4-/- plazme sa viškom (1 µg/ml) tečne faze manana pre ispitivanja, u potpunosti inhibira deponovanje C3 (ispunjeni krugovi). Rezultati su tipični za 3 nezavisna eksperimenta. SLIKA 28B grafički ilustruje rezultate eksperimenta u kome su plazme miševa divljeg tipa, sa deficijencijom MASP-2 (otvoreni kvadrati) i C4-/- miša (1%) pomešane u različitim koncentracijama sa anti-pacovskim MASP-2 mAbM11 (apscisa) i mereno je deponovanje C3b na pločama obloženim mananom. Rezultati predstavljaju srednja vrednost (± SD) 4 analize (duplikati po 2 za svaku vrstu plazme). SLIKA 28C grafički ilustruje rezultate eksperimenta u kome je humana plazma: objedinjena NHS (krstići), C4-/- plazma (prazni krugovi) i C4-/- plazma prethodno inkubirana sa 1 µg/ml manana (ispunjeni krugovi). Rezultati su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta. SLIKA 28D grafički ilustruje inhibiciju deponovanja C3b u humanoj plazmi sa dovoljno C4 i sa deficijencijom C4 (1%) sa anti-humanim MASP-2 mAbH3 (srednja vrednost ± SD iz triplikata). Kao što je prikazano na SLICI 28B, nije detektovana nikakva aktivacija C3 zavisna od lektinskog puta u MASP-2-/- plazmi koja je paralelno analizirana, što ukazuje da je ovaj put aktivacije C3 kojim se zaobilazi C4 zavisan od MASP-2.

[0521] Da bismo dalje potvrdili ove nalaze, ustanovili smo seriju rekombinantnih inhibitornih mAb izolovanih iz biblioteka faga za antitela, analizom afiniteta prema rekombinantnom MASP-2A čoveka i pacova (gde je serinski ostatak aktivnog domena proteaze zamenjen ostatkom alanina na mutagenezom usmerenom na mesto radi sprečavanja autolitičke razgradnje antigena). Rekombinantna anti-MASP-2 antitela (AtH3 i AtM11) su izolovana iz kombinatornih biblioteka antitela (Knappik A. i saradnici, J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000)), upotrebom rekombinantnih humanih i pacovskih MASP-2A kao antigena (Chen C. B. i Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001)). Antipacoski Fab2 fragment koji je snažno inhibirao aktivaciju lektinskog puta posredovanu aktivacijom C4 i C3 u mišjoj plazmi (IC50∼1 nM) konvertovan je u IgG2a antitelo pune dužine. Poliklonski anti-mišji MASP-2A antiserum je dobijen iz pacova. Ovi alati su nam omogućili da potvrdimo zavisnost ovog novog puta aktivacije C3 u kome se zaobilazi C4 i koji je specifičan za lektinski put od MASP-2, kao što je dalje opisano u nastavku teksta.

[0522] Kao što je prikazano na SLICI 28B, M211, inhibitorno monoklonsko antitelo koje se selektivno vezuje za mišji i pacovski MASP-2, inhibiralo je aktivaciju C3 koja zaobilazi C4 kod miša sa deficijencijom C4, kao i aktivaciju C3 u plazmi WT miševa lektinskim putem na način koji je zavisio od koncentracije,

1

sa sličnim IC50vrednostima. Sve analize su rađene sa visokim razblaženjima plazme, čineći put aktivacija alternativnog puta disfunkcionalnim (sa najvišom koncentracijom plazme od 1,25%).

[0523] Da bismo istražili prisustvo analogne aktivacije C3 u kojoj se zaobilazi C4 i specifična je za lektinski put kod ljudi, analizirali smo plazmu davaoca sa naslednom deficijencijom oba humana C4 gena (tj. C4A i C4B), što rezultuje potpunim odsustvom C4 (Yang Y. i saradnici, J. Immunol.173:2803-2814 (2004)). SLIKA 28C pokazuje da plazma ovog pacijenta efikasno aktivira C3 u visokim razblaženjima plazme (čineći alternativni put aktivacije nefunkcionalnim). Način aktivacije C3 koji je specifičan za lektinksi put na pločama obloženim mananom pokazan je u mišjoj plazmi sa deficijencijom C4 (SLIKA 28A) i humanoj plazmi sa deficijencijom C4 (SLIKA 28C) dodavanjem viška koncentracija manana u tečnoj fazi. Zavisnost ovog mehanizma aktivacije C3 od MASP-2 u humanoj plazmi sa deficijencijom C4 je ispitana upotrebom AtH3, monoklonskog antitela koje se specifično vezuje za humani MASP-2 i usporava funkcionalnu aktivnost MASP-2. Kao što je prikazano na SLICI 28D, AtH3 je inhibirao deponovanje C3b (i C3dg) kako u humanoj plazmi sa dovoljno C4, tako i uplazi sa deficijencijom C4, sa uporedivom potentnošću.

[0524] Da bismo procenili moguću ulogu ostalih komplementnih komponenti u aktivaciji C3 koja zaobilazi C4, ispitali smo plazmu MASP-1/3-/- i Bf/C2-/- miševa zajedno sa MASP-2-/-, C4-/- i C1q-/-plazmom (kao kontrolama) pod uslovima ispitivanja koji su specifični i za lektinski i za klasičan put. Relativna količina cepanja C3 je ucrtana u odnosu na količinu deponovanog C3 kada je upotrebljavana WT plazma.

[0525] SLIKA 29A grafički ilustruje uporednu analizu aktivnosti C3 konvertaze u plazmi iz mišjih sojeva sa deficijencijom u raznim komplementima, bilo pod uslovima aktivacije lektinskog puta ili klasičnog puta aktivacije. Paralelno su analizirani razblaženi uzorci plazme (1%) iz WT miševa (n=6), MASP-2-/-miševa (n=4), MASP-1/3-/- miševa (n=2), C4-/- miševa (n=8), C4/MASP-1/3-/- miševa (n=8), Bf/C2-/-(n=2) i C1q-/- miševa (n=2). Rekonstitucijom Bf/C2-/- plazme sa 2,5 μg/ml rekombinantnog pacovskog C2 (Bf/C2-/- C2) došlo je do oporavka deponovanja C3b. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost (± SD). **p<0,01 (u poređenju sa WT plazmom). Kao što je prikazano na SLICI 29A, značajno deponovanje C3 se primećuje u C4-/- plazmi ispitivanoj pod uslovima ispitivanja specifičnim za lektinski put, ali ne i pod uslovima specifičnim za klasičan put. Ponovo, nije uočeno deponovanje C3 u plazmi sa deficijencijom MASP-2 putem aktivacije lektinskog puta, dok je ista plazma deponovala C3 klasičnim putem. U MASP-1/3-/- plazmi, deponovanje C3 se odvijalo i u uslovima ispitivanja specifičnim za lektinski i za klasičan put. Nije uočeno deponovanje C3 u plazmi sa kombinovanom deficijencijom C4 i MASP-1/3, bilo upotrebom uslova specifičnih za lektinski put ili klasičan put. Deponovanje C3 se nije moglo detektovati u C2/Bf-/- plazi ni u slučaju aktivacije lektinskog ni klasičnog

1

puta. Rekonstitucija plazme C2/Bf-/- miša sa rekombinantnim C2, međutim, obnovila je cepljenje C3 posredovano i lektinskim i klasičnim putem. Uslovi ispitivanja su validirani upotrebom C1q-/plazme.

[0526] SLIKA 29B grafički ilustruje kinetiku u funciji vremena za aktivnosti C3 konvertaze u plazmi iz raznih mišjih sojeva sa deficijencijama komplementa kao što su WT, fB-/-, C4-/-, MASP-1/3-/- i MASP-2-/- plazme, ispitivanim pod uslovi koji su specifični za aktivaciju lektinskim putem (1% plazma, rezultati su tipični za tri nezavisna eksperimenta). Kao što je prikazano na SLICI 29B, dok u MASP-2-/-plazmi nije uočeno cepanje C3, fB-/- plazma cepa C3 sa sličnom kinetikom kao WT plazma. Značajno odlaganje konverzije C3 u C3b (i C3dg) koja zavisi od lektinskog puta, uočeno je kod C4-/-, kao i u pazi sa deficijencijom MASP-1/3. Za ovakvo odlaganje aktivacije C3 u MASP-1/3-/- plazmi je nedavno pokazano da je zavisno od MASP-1, pre nego od MASP-3 (Takahashi M. i saradnici, J. Immunol.

180:6132-6138 (2008)).

Diskusija:

[0527] Rezultati opisani u ovom Primeru snažno ukazuju da je funkcionalna aktivnost MASP-2 od suštinske važnosti za aktivaciju C3 preko lektinskog puta, i u prisustvu i u odsustvu C4. Štaviše, C2 i MASP-1 su potrebni da bi funkcionisao ovaj novi put aktivacije C3 sa zaobilaženjem C4 specifičan za lektinski put. Uporedna analiza funkcionalne aktivnosti lektinskog puta u MASP-2-/-, kao i C4-/- plazmi, otkrila je postojanje ranije neprepoznate rute aktivacije komplementa C3 koja je nezavisna od C4, ali i zavisna od MASP-2, a pokazala je i da C3 može biti aktiviran na naćin koji je zavisan od lektinskog puta u potpunom odsustvu C4. Iako detaljni molekulski sastav i redosled događaja aktivacije ovog novog načina aktivacije C3 konvertaze zavisne od MASP-2 ostaje da se razjasni, naši rezultati ukazuju da ovaj put aktivacije koji zaobilazi C4 dodatno zahteva prisustvo komplementa C2, kao i MASP-1. Gubitak aktivnosti cepanja C3 posredovanog lektinskim putem u plazmi miševa sa kombinovanom deficijencijom C4 i MASP-1/3 može se objasniti najnovijom opisanom ulogom MASP-1 u pojačavanju aktivacije komplementa zavisne od MASP-2 direktnim cepanjem i aktivacijom MASP-2 (Takahashi M. i saradnici, J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)). Slično tome, MASP-1 može popomoći funkcionalnoj aktivnosti MASP-2 zahvaljujući svojoj sposobnosti da cepa C2 (Moller-Kristensen i saradnici, Int. Immunol. 19:141-149 (2007)). Obe aktivnosti mogu objasniti smanjenu stopu kojom plazma sa deficijencijo MASP-1/3 cepa C3 putem lektinskog aktivacionog puta i zašto MASP-1 može biti potreban radi zadržavanja konverzije C3 preko puta aktivacije koji zaobilazi C4.

[0528] Pokazalo se da nesposobnost C2/fB-/- plazme da aktivira C3 lektinskim putem zavisi od C2 pošto je dodavanje rekombinantnog pacovskog C2 u C2/fB-/- plazmu obnovilo sposobnost rekonstituisane plazme da aktivira C3 na pločama obloženim mananom.

1

[0529] Nalaz da deficijencija C4 specifično remeti klasičan put aktivacije komplementa, dok lektinski put zadržava fiziološki kritičan nivo aktivnosti C3 konvertaze putem rute aktivacije koja zaobilazi C4 i zavisna je od MASP-2, zahteva ponovnu procenu uloge lektinskog puta u raznim modelima oboljenja, uključujući eksperimentalnu infekciju sa S. pneumoniae (Brown J. S. i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.99:16969-16974 (2002); eksperimentalni alergijski encefalomielitis (Boos L.A. i saradnici, Glia 49:158-160 (2005); i modele regeneracije mišje jetre zavisne od C3 (Clar, A. i saradnici, Mol. Immunol.

45:3125-3132 (2008)). Poslednje navedena grupa je pokazala da miševi sa deficijencijom C4 mogu aktivirati C3 na način koji nije zavisan od alternativnog puta, pošto in vivo inhibicija alternativnog puta putem deplecije funkcionalne aktivnosti Faktora B podredovane antitelom ne utiče na regeneraciju jetre zavisnu od cepanja C3 kod C4-/- miševa (Clark A. i saradnici (2008)). Ovaj put aktivacija C3 posredovan lektinskim putem koji zaobilazi C4 može takođe objasniti nedostatak protektivnog fenotipa deficijencije C4 u našem modelu MIRI, kao i u prethodno opisanom modelu odbacivanja bubrežnog alografta (Lin T. i saradnici, Am. J. Pathol. 168:1241-1248 (2006)). Nasuprot tome, naši skorašnji rezultati su nezavisno pokazali značajan zaštitni fenotip kod MASP-2-/- miševa u modelima bubrežne transplantacije (Farrar C.A. i saradnici, Mol. Immunol.46:2832 (2009)).

[0530] Sumarno, rezultati ovog Primera podržavaju stav da je aktivacija C3 zavisna od MASP-2 i kojom se zaobilazi C4, fiziološki relevantan mehanizam koji može biti važan pod uslovima kada dostupnost C4 ograničava aktivaciju C3.

PRIMER 23

[0531] Ovaj Primer opisuje aktivaciju C3 sa supstratima trombina i deponovanje C3 na mananu kod WT (+/+), MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11/C4 (-/-) i C4 (-/-) miševa.

Obrazloženje:

[0532] Kao što je opisano u Primeru 14, utvrđeno je da se aktivacija trombina može dogoditi nakon aktivacije lektinskog puta u fiziološkim uslovima, a pokazuje je i obim uključenosti MASP-2. C3 ima centralnu ulogu u aktivaciju sistema komplementa. Aktivacija C3 je potrebna i za klasične i za alternativne puteve aktivacije komplementa. Urađen je stoga eksperiment da bi se utvrdilo da li se C3 aktivira trombinskim supstratima.

1

Postupci:

C3 Aktivacija trombinskim supstratima

[0533] Aktivacija C3 je merena u prisustvu sledećih aktiviranih oblika supstrata trombina; humanog FCXIa, humanog FVIIa, goveđeg FXa, humanog FXa, humanog aktiviranog proteina C i humanog trombina. C3 je inkubiran sa raznim trombinskim supstratima, pa je razdvojen pod redukujućim uslovima na 10% SDS-poliakrilamidnim gelovima. Nakon elektroforetskog tranfera upotrebom celulozne membrane, membrana je inkubirana sa monoklonskim pacovskim anti-mišjim C3 antitelom kuplovanim sa biotinom i detektovan upotrebomm kopleta sa streptavidinom-HRP i razvijanjem upotrebom ECL reagensa.

Rezultati:

[0534] Aktivacije C3 podrazumeva cepanje intaktnog a-lanca u skraćeni a' lanac i solubilni C3a (nije prikazano na SLICI 30). SLIKA 30 prikazuje rezultate imunoblot analize za aktivaciju humanog C3 sa supstratima trombina, pri čemu su neisečen C3 alfa lanac i produkt aktivacije u vidu a' lanca prikazani strelicama. Kao što je prikazano na SLICI 30, inkubacija C3 sa aktiviranim oblicima humanog faktora zgrušavanja XI i faktora X, kao i sa aktiviranim faktorom zgrušavanja goveda X, može dovesti do cepanja C3 in vitro u odsustvu bilo kakvih proteaza komplemenata.

Deponovanje C3 na mananu

[0535] Analize deponovanja C3 su vršene na uzorcima seruma dobijenim iz WT, MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11 (-/-)/C4 (-/-) i C4 (-/-). F11 je gen koji kodira faktor koagulacije XI. Da bi se izmerila aktivacija C3, mikrotitarske ploče su obložene mananom (1 µg/bunariću), nakon lega je dodat ovčiji anti-HSA serum (2 µg/ml) u TBS/Tween/Ca<2+>. Ploče su blokirane sa 0,1% HSA u TBS-u, pa su isprane kao što je navedeno prethodno. Uzorci plazme su razblaženi u 4 mM barbitala, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,4, pa su dodati u ploče i inkubirani tokom 1,5 h na 37°C. Nakon pranja, vezani C3b je detektovan upotrebom zečjeg anti-humanog C3c (Dako) i dalje primenom kozjeg anti-zečjeg IgG-a konjugovanog sa alkalnom fosfatazom i pNPP.

Rezultati:

[0536] SLIKA 31 prikazuje rezultate analize deponovanja C3 sa uzorcima seruma dobijenim iz WT, MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11 (-/-)/C4 (-/-) i C4 (-/-). Kao što je prikazano na SLICI 31, lektinski put je

1 1

funkcionalan čak i u potpunom odsustvu C4. Kao što je dalje prikazano na SLICI 31, za ovakav novi put aktiacije komplementa zavisne od lektinskog puta je potreban faktor koagulacije XI.

Diskusija:

[0537] Pre rezultata dobijenih u ovom eksperimentu, stručnjaci su verovali da je lektinski put komplementa potreban za aktivnost C4. Stoga su podaci iz C4 knockout miševa (i ljudi sa deficijencijom C4) protumačeni uz pretpostavku da su takvi organizmi sa deficijencijom lektinskog puta (pored deficijencije klasičnog puta). Sadašnji rezultati pokazuju da je ovakvo zapažanje netačno. Prema tome, zaključci prošlih studija koji ukazuju da lektinski put nije važan u određenim postavkama oboljenja zasnovan na fenotipu životinja sa deficijencijom C4 mogu biti netačni. Podaci opisani u ovom Primeru takođe pokazuju da u fiziološkom kontekstu celokupnog seruma lektinski put može aktivirati komponente kaskade koagulacije. Pokazano je stoga da postoji međusobna interakcija između komplementa i koagulacije koja uključuje MASP-2.

PRIMER 24

[0538] Ovaj Primer opisuje postupke za procenu efekta anti-MASP-2 antitela na lizu crvenih krvnih zrnaca iz uzoraka krvi dobijenih iz pacijenata sa paroksizmalnom noćnom hemoglobinurijom (PNH).

Uvod/Obrazloženje:

[0539] Paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH), označena i kao Marchiafava-Micheli-jev sindrom, stečeno je, potencijalno po život opasno oboljenje krvi, koje karakteriše intravaskularna hemolitička anemija izazvana komplementom. Obeležje PNH je hronična intravaskularna hemoliza koja je posledica neregulisane aktivacije alternativnog puta komplementa. Lindorfer M.A. i saradnici, Blood 115(11) (2010). Anemija u PNH nastaje usled uništavanja crvenih krvnih zrnaca u krvotoku. Simptomi PNH obuhvataju crvenu mokraću usled pojave hemoglobina u urinu, kao i trombozu. PNH se može razviti sam od sebe, što se označava kao „primarni PNH“, ili se može razviti u kontekstu drugih poremećaja kosne srži, poput aplastične anemije, kada se označava kao „sekundarni PNH“. Lečenje PNH obuhvata transfuziju krvi za anemiju, antikoagulaciju za trombozu i upotrebu monoklonskog antitela ekulizumaba (Soliris), koji štiti krvne ćelije od imunskog razaranja inhibiranjem sistema komplementa (Hillmen P. i saradnici, N. Engl. J. Med. 350(6):552-9 (2004)). Ipak, značajan deo PNH pacijenata lečenih ekulizumabom ostaje sa klinički značajnom hemolitičkom anemijom posredovanom imunskim sistemom pošto antitelo ne blokira aktivaciju alternativnog puta komplementa.

1 2

[0540] Ovaj Primer opisuje postupke za procenu efekta anti-MASP-2 antitela na lizu crvenih krvnih zrnaca iz uzoraka krvi dobijenih iz pacijenata sa PNH (koji nisu lečeni Solirisom) koji su inkubirani sa zakišeljenim normalnim humanim serumom podudarnog ABO.

Postupci:

Reagensi:

[0541] Eritrociti iz normalnih davalaca i iz pacijenata koji boluju od PNH (koji nisu lečeni Solirisom) dobijaju se punkcijom vena i pripremaju se kao što je opisano u Wilcox L.A. i saradnici, Blood 78:820-829 (1991), ovde uključenom u vidu reference. Anti-MASP-2 antitela sa aktivnošću funkcionalnog blokiranja lektinskog puta mogu biti generisani kao što je opisano u Primeru 10.

Analiza hemolize:

[0542] Postupak za određivanje efekta anti-MASP-2 antitela na sposobnost blokiranja hemolize eritrocita kod pacijenata sa PNH je urađen upotrebom postupka opisanog u Lindorfer M.A. i saradnici, Blood 15(11):2283-91 (2010) i Wilcox L.A. i saradnici, Blood 78:820-829(1991), pri čemu su obe reference ovde uključene kao reference. Kao što je opisano u Lindorfer i saradnici, eritrociti iz uzoraka pacijenata sa PNH su centrifugirani, aspiriran je sediment i ćelije su isprane u želatinskom veronalnom puferu (GVB) pre svakog eksperimenta. Analizirana je zatim podložnost eritrocita lizi posreduvanoj sa APC na sledeći način. Normalni humani serumi podudarnog ABO su razblaživani sa GVB koji je sadržavao 0,15 mM CaCl2i 0,5 mM MgCl2(GVB<+2>), pa su zakišeljeni do pH 6,4 (zakišeljeni NHS, aNHS) i upotrebljeni za rekonstituisanje eritrocita do hematokrita od 1,6% u 50% aNHS. Smeše su zatim inkubirane na 37°C, a nakon 1 sata, eritrociti su istaloženi centrifugiranjem. Optička gustina alikvota izdvojenog supernata je izmerena na 405 nM i upotrebljena je za izračunavanje procenta lize. Uzorci rekonstituisani u zakišeljenom serumu sa EDTA su obrađeni na sličan način i upotrebljeni za definisanje pozadinske lize posredovane elementima drugačijim od komplementa (obično manjom od 3%). Kompletna liza (100%) je određivana nakon inkubacije eritrocita u destilovanoj vodi.

[0543] Da bi se utvrdio efekat anti-MASP-2 antitela na hemolizu PNH eritrocita, eritrociti pacijenata sa PNH su inkubirani u aNHS u prisustvu rastućih koncentracija anti-MASP-2 antitela, a prisustvo/količina hemolize je naknadno kvantifikovana.

[0544] Imajući u vidu činjenicu da je pokazano da anti-MASP-2 antitela blokiraju naknadnu aktivaciju alternativnog puta komplementa, očekuje se da će anti-MASP-2 antitela biti efektivna u blokiranju hemolize PNH eritrocita posredovane alternativnim putem i da će biti korisna kao terapija za lečenje pacijenata koji boluju od PNH.

1

PRIMER 25

[0545] Ovaj Primer opisuje postupke za procenu efekta anti-MASP-2 blokirajućeg antitela na aktivaciju komplementa sa krioglobulinima u uzorcima krvi dobijenim iz pacijenata koji boluju od krioglobulinemije.

Uvod/Obrazloženje:

[0546] Krioglobulinemiju karakteriše prisustvo krioglobulina u serumu. Krioglobulini su pojedinačni ili pomešani imunoglobulini (obično IgM antitela) koji se podvrgavaju reverzibilnoj agregaciji na niskim temperaturama. Agregacija dovodi do aktivacije komplementa klasičnim putem i do inflamacije u vaskularnim džepovima prevashodno na periferiji. Kliničke prezentacije krioglobulinemije obuhvataju vaskulitis i glomerulonefritis.

[0547] Krioglobulinemija se na osnovu sastava krioglobulina može klasifikovati na sledeći način: Krioglobulinemija tipa I ili jednostavna krioglobulinemija, koja je rezultat monoklonskog imunoglobulina, obično imunoglobulina M (IgM); Krioglobulinemija tipa II i III (mešovita krioglobulinemija), koja sadrži reumatoidne faktore (RF), obično IgM u kompleksima sa Fc delom poliklonskog IgG-a.

[0548] Stanja povezana sa krioglobulinemijom obuhvataju infekciju hepatitisom C, limfoproliferativne poremećaje i druge autoimune bolesti. Imuni kompleksi koji sadrže krioglobuline rezultiraju kliničkim sindromom sistemske inflamacije, verovatno usled njihove sposobnosti da aktiviraju komplement. Dok imunski kompleksi IgG-a normalno aktiviraju klasičan put aktivacije komplementa, kompleksi koji sadrže IgM takođe mogu aktivirati komplement putem lektinskog puta (Zhang M. i saradnici, Mol Immunol 44(1-3):103-110 (2007) i Zhang. M. i saradnici, J. Immunol.177(7):4727-34 (2006)).

[0549] Imunohistohemijske studije su dodatno pokazale da imunokompleksi krioglobulina sadrže komponente lektinskog puta, a biopsije iz pacijenata sa krioglobulinemijskim glomerulonefritisom su pokazale imunohistohemijske dokaze aktivacije lektinskog puta in situ (Ohsawa I. i saradnici, Clin Immunol 101(1):59-66 (2001)). Ovi rezultati ukazuju da lektinski put može doprinositi inflamaciji i štetnim ishodima kod krioglobulemijskih oboljenja.

Postupci:

[0550] Postupak za utvrđivanje efekta anti-MASP-2 antitela na sposobnost blokiranja neželjenih efekata krioglobulinemije je urađen upotrebom analize za konveziju C3 tečne faze, kao što je opisano u Ng Y.C. i saradnici, Arthritis and Rheumatism 31(1):99-107 (1988), ovde uključenom u vidu reference. Kao što je opisano u Ng i saradnici, u esencijalnoj mešovitoj krioglobulinemiji (EMC), monoklonski

1 4

reumatoidni faktor (mRF), obično IgM, obrazuje kompleks sa poliklonskim IgG da bi se obrazovali karakteristični krioprecipitacioni imunski kompleksi (IC) (krioglobulin tipa II). Pokazano je i da su imunoglobulini i C3 prisutni u zidovima sudova u pogođenim tkivima poput kože, nerava i bubrega. Kao što je opisano u Ng i saradnici, mRF obeležen sa<125>J se dodaje u serum (normalni humani serum i serum dobijen iz pacijenata koji boluju od krioglobulinemije), nakon čega se serum inkubira 37°C i meri se vezivanje za eritrocite.

[0551] Konverzija C3 tečne faze se određuje u serumu (normalnom humanom serumu i serumu dobijenom iz pacijenata koji boluju od krioglobulinemije) u prisustvu ili odsustvu sledećih IC: BSA-anti BSA, mRF, mRF sa IgG, ili krioglobulina, u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela. Fiksiranje C3 i C4 za IC se meri upotrebom koprecipitacione analize sa F(ab’) 2 anti-C3 i F(ab') 2 anti-C4.

[0552] Imajući u vidu činjenicu da je pokazano da anti-MASP-2 antitel ablokiraju aktivaciju lektinskog puta, očekuje se da će anti-MASP-2 antitela biti efektivna u blokiranju neželjenih efekata povezanih sa krioglobulinemijom koji su posredovani sa komplementima i da će biti korisna kao terapeutik za lečenje pacijenata koji boluju od krioglobulinemije.

PRIMER 26

[0553] Ovaj Primer opisuje postupke za ispitivanje efekta anti-MASP-2 antitela na uzorke krvi dobijene iz pacijenata sa bolešću hladnih aglutinina, koja se manifestuje kao anemija.

Uvod/Obrazloženje:

[0554] Bolest hladnih aglutinina (CAD) je vrsta autoimune hemolitičke anemije. Hladna aglutinska antitela (obično IgM) se aktiviraju hladnim temperaturama i vezuju crvene krvne ćelije i agregiraju ih. Hladna aglutinska antitela se kombinuju sa komplementom i napadaju antigen na površini crvenih krvnih zrnaca. To dovodi do opsonizacije crvenih krvnih zrnaca (hemolize) koja pokreće njihov klirens retikuloendotelnim sistemom. Temperatura na kojoj se odvija aglutinacija varira od pacijenta do pacijenta.

[0555] CAD se manifestuje kao anemija. Kada stopa uništavanja crvenih krvnih zrnaca premaši kapacitet kosne srži da proizvede odgovarajući broj ćelija koje prenose kiseonik, tada se javlja anemija. CAD može biti prouzrokovana osnovnom bolešću ili poremećajem, kada se označava kao „sekundarna CAD“, kao što je kod infektivnih oboljenja (upale pluće prozrokovane mikoplazmom, zaušaka, mononukleoze), limfoproliferativnog oboljenja (limfoma, hronične limfocitne leukemije) ili poremećaja vezivnog tkiva. Smatra se da bolesnici sa primarnom CAD imaju limfoproliferativni poremećaj kosne srži niskog stepena. I primarna i sekundarna CAD su stečena stanja.

1

Postupci:

Reagensi:

[0556] Eritrociti iz normalnih davalaca i iz pacijenata koji boluju od CAD su dobijeni punkcijom vene. Anti-MASP-2 antitela sa aktivnošću blokiranja funkcije lektinskog puta mogu biti generisana kao što je opisano u Primeru 10.

[0557] Dejstvo anti-MASP-2 antitela na blokiranje aktivacije lektinskog puta posredovane sa hladnim aglutininima može biti utvrđeno na sledeći način. Eritrociti iz pozitivnih pacijenata krvne grupe I su osetljivi na hladne aggultinine (tj. IgM antitela), u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela. Kod eritrocita se zatim ispituje sposobnost aktivacije lektinskog puta merenjem vezivanja C3.

[0558] Imajući u vidu činjenicu da anti-MASP-2 antitela blokiraju aktivaciju lektinskog puta, očekuje se da će anti-MASP-2 antitela biti efektivna u blokiranju neželjenih efekata posredovanih komplementom koji su povezani sa bolešću hladnih aglutinina i da će biti korisna kao terapeutici za lečenje pacijenata koji boluju od bolesti hladnih aglutinina.

PRIMER 27

[0559] Ovaj Primer opisuje postupke za ispitivanje efekta anti-MASP-2 antitela na lizu crvenih krvnih ćelija u uzorcima krvi dobijenim iz miševa sa atipičnim hemolitičko uremijskim sindromom (aHUS).

Uvod/Obrazloženje:

[0560] Atipičan hemolitički uremijski sindrom (aHUS) karakterišu hemolitička anemija, trombocitopenija i bubrežna insuficijencija prouzrokovani trombovima trombocita u mikrocirkulaciji bubrega i drugih organa. aHUS je povezan sa defektnom regulacijom komplementa i može biti bilo sporadičan ili familijaran. aHUS je povezan sa mutacijama u genima koji kodiraju aktivaciju komplementa, uključujući komplementni faktor H, membranski kofaktor B i faktor I, kao i faktor srodan komplementnom faktoru H tipa H 1 (CFHR1) i faktor srodan komplementnom faktoru H tipa 3 (CFHR3). Zipfel P.F. i saradnici, PloS Genetics 3(3):e41 (2007). Ovaj Primer opisuje postupke za procenu efekta anti-MASP-2 antitela na lizu crvenih krvnih zrnaca iz uzoraka krvi dobijenih iz aHUS miševa.

Postupci:

[0561] Efekat anti-MASP-2 antitela na lečenje aHUS može biti utvrđen u mišjem modelu ovog oboljenja u kome je endogeni mišji fH gen zamenjen sa humanim homologom koji kodira mutiran oblik fH koji se često nalazi kod pacijenata sa aHUS. Pogledati, Pickering M.C. i saradnici, J. Exp. Med.

1

204(6):1249-1256 (2007), naveden ovde u vidu reference. Kao što je opisano u Pickering i saradnici, takvi miševi razvijaju patologiju sličnu aHUS. Da bi se ispitao efekat anti-MASP-2 antitela u lečenju aHUS, anti-MASP-2 antitela su primenjivana mutiranim aHUS miševia i upoređivana je zatim liza crvenih krvnih zrnaca dobijenih iz miševa tretiranih sa anti-MASP-2 At i netretiranih kontrola. Imajući u vidu činjenicu da je pokazano da anti-MASP-2 antitela blokiraju aktivaciju lektinskog puta, očekuje se da će anti-MASP-2 antitela biti efektivna u blokiranju lize crvenih krvnih ćellija kod sisarskih subjekata koji boluju od aHUS.

PRIMER 28

[0562] Ovaj Primer opisuje postupke za utvrđivanje efekta anti-MASP-2 antitela za lečenje glaukoma.

Obrazloženje/pozadina:

[0563] Pokazano je da nekontrolisana aktivacija komplementa doprinosi progresiji degenerativne povrede ganglijskih ćelija mrežnjače (RGC), njihovih sinapsi i aksona u glaukomu. Pogledati Tezel G. i saradnici, Invest Ophthalmol Vis Sci 51:5071-5082 (2010). Na primer, histopatološke studije humanih tkiva i in vivo studije na različitim životinjskim modelima su pokazale da se komponente komplementa, uključujući C1q i C3, sintetišu i da se terminalni kompleks komplementa obrazuje u glaukomatoznoj mrežnjači (pogledati Stasi K. i saradnici, Invest Ophthalmol Vis Sci 47:1024-1029 (2006), Kuehn M.H. i saradnici, Exp Eye Res 83:620-628 (2006)). Kao što je dodatno opisano u Kuehn M.H. i saradnici, Experimental Eye Research 87:89-95 (2008), sinteza i deponovanje komplementa je indukovano I/R mrežnjače, a poremećaj kaskade komplementa odlaže degeneraciju RGC. U ovoj studiji je utvrđeno da miševi sa ciljnim poremećaje C3komponente komplementa ispoljavaju odloženu degeneraciju RGC nakon privremene I/R mrežnjače u poređenju sa normalnim životinjama.

Postupci:

[0564] Postupak za određivanje efekta anti-MASP-2 antitela na degeneraciju RGC su urađeni u životinjskom modelu I/R mrežnjače kao što je opisano u Kuehn M.H. i saradnici, Experimental Eye Research 87:89-95 (2008), uključenom ovde u vidu reference. Kao što je opisano u Kuehn i saradnici, retinalna ishemija je uvođena anesteziranjem životinja, a zatim uvođenjem igle od 30 godža povezane sa rezervoarom koji je sadržavao fizilološki rastvor puferisan fosfatom, kroz rožnjaču u prednju komoru oka. Rezervoar sa fiziološkim rastvorom je zatim podignut da bi se postigao intraokularni pritisak od 104 mmHg, dovoljan da u potpunosti spreči cirkulaciju kroz vaskularnu mrežu mrežnjače. Povišena intraokularna ishemija je potvrđena bleđenjem dužice i mrežnjače, a ishemija je održavana tokom 45

1

minuta samo na levom oku; desno oko je služilo kao kontrola i nije prialo kanilaciju. Miševi se zatim eutanazirani 1 ili 3 nedelje nakon ishemijske povrede. Anti-MASP-2 antitela su primenjivana miševima bilo lokalno u oko ili sistemski, da bi se ispitao efekat aAnti-MASP-2 antitela primenjenog pre ishemijske povrede.

[0565] Imunohistohemija očiju je urađena upotrebom antitela na C1q i C3 da bi se detektovalo deponovanje komplementa. Oštećenje optičkog nerva može biti ispitano i upotrebom standardnih postupaka elektronske mikroskopije. Kvantifikacija preživelih RGC mrežnjače je rađena upotrebom obeležavanja gama sinukleina.

Rezultati:

[0566] Kao što je opisano u Kuehn i saradnici, kod normalnih kontrolnih miševa, rezultat privremene ishemije rožnjače su degenerativne promene očnog nerva i naslage C1q i C3 u mrežnjači koja mogu biti detektovane imunohistohemijom. Nasuprot navedenom, miševe sa deficijencijom C3 karakteriše značajno smanjenje aksonske degeneracije, tako da ispoljavaju samo minimalne nivoe oštećenja očnog nerva tipa 1 nedelju nakon indukcije. Na osnovu ovih rezultata, očekuje se da će se slični rezultati uočiti kada se ova analiza izvodi na MASP-2 knockout mišu i kada se anti-MASP-2 antitela primenjuju normalnom mišu pre ishemijske povrede.

PRIMER 29

[0567] Ovaj primer pokazuje da je inhibitor MASP-2, poput anti-MASP-2 antitela, efektivan za lečenje izlaganja zračenju i/ili za lečenje, ublažavanje ili prevenciju sindroma akutnog zračenja.

Obrazloženje:

[0568] Izloženost visokim dozama jonizujućeg zračenja prouzrokuje smrtnost posredstvom dva glavna mehanizma: toksičnošću za kosnu srž i gastrointestinalnim sindromom. Rezultat toksičnost u kosnoj srži je pad u svim hematološkim ćelijama, što predisponira organizam za smrt usled infekcije i krvarenja. Gastrointestinalni sindrom je ozbiljniji i posledica je gubitka funkcije crevne barijere usled dezintegracije epitelnog sloja creva i gubitka crevne endokrine funkcije. To dovodi do sepse i srodnog sindroma sistemskog inflamatornog odgovora što može rezultovati smrću.

[0569] Lektinski put komplementa je urođeni imunski mehanizam koji započinje inflamaciju kao odgovor na povredu tkiva i izlaganje stranim površinama (tj. bakterijama). Blokada ovog puta dovodi do boljih ishoda u mišjim modelima ishemijske povrede crevnog tkiva ili septičnog šoka. Postavljena je hipoteza da lektinski put može pokrenuti prekomernu i štetnu inflamaciju u odgovoru na povredu

1

tkiva indukovanu inflamacijom. Blokada lektinskog puta može stoga smanjiti sekundarnu povredu i povećati preživljavanje nakon akutnog izlaganja zračenju.

[0570] Cilj studije koja je sprovedena kao što je opisano u ovom Primeru, bio je da se proceni efekat blokade lektinskog puta na preživljavanje u mišjem modelu radijacione povrede, primenom anti-mišjih MASP-2 antitela.

Postupci i materijali:

[0571] Materijali. Ispitivani proizvodi upotrebljeni u ovoj studiji su bili (i) antitelo na mišji MASP-2 visokog afiniteta (mAbM11) i (ii) antitelo na humani MASP-2 visokog afiniteta (mAbH6), koja blokiraju MASP-2 proteinsku komponentu lektinskog puta komplementa proizvedenu u transfektovanim sisarskim ćelijama. Koncentracije za doziranje su bile 1 mg/kg antitela na mišji MASP-2 (mAbM11), 5 mg/kg antitela na humani MASP-2 (mAbH6) ili sterilnan fiziološki rastvor. Za svaku sesiju doziranja, pripremana je odgovarajuća zapremina svežih rastvora za doziranj.

[0572] Životinje. Mladi odrasli mužjaci Swiss-Webster miševa su nabavljeni od kompanije Harlan Laboratories (Houston, TX). Životinje su smeštene u kaveze sa čvrstim dnom obložene Alpha-Dri šuškom, a opisana sertifikovana PMI 5002 ishrana za glodare (Animal Specialties, Inc., Hubbard OR) i voda su bili dostupni ad libitum. Praćena je i temperatura prostorije životinjskog bloka, a dnevno-noćni ciklus u istoj je bio podešen na režim sa 12 častova svetosti i 12 časova tame.

[0573] Zračenje. Nakon dvonedeljnog prilagođavanja na boravak u životinjskom bloku, miševi su ozračeni izlaganjem celog tela zračenju od 6,5 i 7,0 Gy, u grupama od 10 i uz stopu primene doze od 0,78 Gy/min, upotrebom Therapax X-RAD 320 sistema opremljenog sa generatorom X-zraka visoke stabilnosti od 320-kV, metalkeramičkom rendgenskom cevi, varijabilnim kolimatorom X-zraka i filterom (Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT). Nivoi doze su odabrani na osnovu prethodnih studija sprovedenih sa istim sojem miševa koje su ukazale na LD50/30od između 6,5 i 7,0 Gy (podaci nisu prikazani).

[0574] Formulacija i primena lekova. Odgovarajuća zapremina koncentrovanih osnovnih rastvora je razblaživana sa ledeno hladnim fiziološkim rastvorom da bi se pripremili rastvori za doziranje od 0,2 mg/ml antitela na mišji MASP-2 (mAbM11) ili 0,5 mg/ml antitela na humani MASP-2 (mAbH6) prema protokolu. Primena anti-MASP-2 mAbM11 i mAbH6 antitela je vršena putem IP injeciranja, upotrebom igle od 25 godža, a shodno telesnoj težini životinje, da bi se isporučio 1 mg/kg mAbM11, 1,5 mg/kg mAbH6, ili fiziološki rastvor.

[0575] Dizajn studije. Miševi su nasumično raspoređivani u grupe kao što je opisano u Tabeli 8. Telesna težina i temperatura su svakodnevno mereni i beleženi. Miševi u Grupama 7, 11 i 13 su žrtvovani 7. dana nakon zračenja, a krv je prikupljana punkcijom srca u dubokoj anesteziji. Preživele životinje su 30

1

dana nakon zračenja žrtvovane na isti način i prikupljena je krv. Plazma je pripremana iz prikuljenih uzoraka krvi prema protokolu i vraćena je na analizu Sponzoru.

TABELA 8: Studijske grupe

[0576] Statistička analiza. Kaplan-Majerove krive preživljavanja su generisane i upotrebljene za upoređivanje srednjeg vremena preživljavanja između grupa tretmana upotrebom log-Rank i Wilcoxon postupaka. Prikazane su prosečne vrednosti sa standardnim odstupanjima ili srednje vrednosti sa standardnim greškama srednjih vrednosti. Statistička poređenja su urađena upotrebom dvostranog neuparenog t-testa između kontrolno ozračenih životinja i pojedinačnih grupa tretmana.

Rezultati

[0577] Kaplan-Majerovi dijagrami preživljavanja za grupe izlagane zračenju od 7,0 i 6,5 Gy su opisane na SLIKAMA 32A i 32B, tim redom, i sumirani su u nastavku, u Tabeli 9. Sveukupno, tretman antitelom

1

na MASP-2 (mAbM11) pre zračenja je povećao preživljavanje ozračenih miševa u poređenju sa kontrolno tretiranim ozračenim životinjama sa oba nivoa izloženosti od 6,5 (porast od 20%) i 7,0 Gy (porast od 30%). Na nivou izloženosti od 6,5 Gy, rezultat tretmana nakon zračenja sa At na mišji MASP-2 At je bio umereno povećanje preživljavanja (15%) u poređenju sa kontrolnim, ozračenim životinjama tretiranim nosačem.

[0578] U poređenju sa navedenim, sve tretirane životinje izlagane nivou od 7,0 Gy je karakteriso posast u preživljavanj u odnosu na kontrolne ozračene životnje tretirane nosačem. Najveća promena u preživljavanju se dogodila kod životinja koje su primale mAbH6, u vidu porasta od 45% u poređenju sa kontrolnim životinjama. Dodatno, pri nivou izloženosti od 7,0 Gy, smrtnost u grupi tretiranoj sa mAbH6 se prvi put pojavaila 15. dana nakon zračenja u poređenju sa 8. danom nakon zračenja kada je zapažena kod ozračenih kontrolnih životinja tretiranih nosačem, što je porast od 7 dana u odnosu na kontrolne životinje. Srednje vreme do smrtnosti za miševe koji su primali mAbH6 (27,3 ± 1,3 dana) je bilo značajno povećano (p=0,0087) u poređenju sa kontrolnim životinjama (20,7 ± 2,0 dana) pri nivou izloženosti do 7,0 Gy.

[0579] Tokom studije je zabeležen procenat promene u telesnoj težini u poređenju sa danom pre zračenja (Dan -1). Privremeni gubitak težine se dogovio kod svih ozračenih životinja, bez dokaza o diferencijalnim promenama usled lečenja sa mAbM11 ili mAbH6 u poređenju sa kontrolama (podaci nisu prikazani). Po završetku studije, sve preživele životinje je karakteriso porast telesne težine od početne (Dana -1) telesne težine.

TABELA 9: Stope preživljavanja ispitivanih životinja izloženih zračenju

1 1

Diskusija

[0580] Sindrom akutnog zračenja se sastoji od tri definisana podsindroma: hematopoetskog, gastrointestinalnog i cerebrovaskularnog. Uočen sindrom zavisi od doze zračenja, s hematopoetskim efektima koji se uočavaju kod ljudi sa značajnom delimičnom ili izloženošću celog tela radijaciji koja premašuje 1 Gy. Hemopoetski sindrom karakteriše ozbiljna depresija funkcije kosne srži koja dovodi do pancitopenije sa promenama u krvnoj slici, crvenim i belim krvnim ćelijama i trombocitima koji se javljaju istovremeno sa oštećenjem imunog sistema. Sa pojavom nadira, dolazi do pojave nekolicine neutrofila i trombocita prisutnih u perifernoj krvi, neutropenije, groznice, komplikacija sepse i nekontrolisanog krvarenja koji konačno dovode do smrti.

[0581] U ovoj studiji je utvrđeno da primena mAbH6 povećava preživljavanje nakon rendgenskog ozračivanja celog tela mužjaka Swiss-Webster miševa prilikom primene zračenja od 7,0 Gy. Primetno je da je na nivou izloženosti od 7,0 Gy, 80% životinja koje su primale mAbH6 preživelo 30 dana u poređenju sa 35% kontrolnih ozračenih životinja tretiranih nosačem. Važno je i da se prvi dan kada je zabeležena smrt u ovoj tretiranoj grupi dogodio tek 15. dana nakon ozračivanja, što predstavlja porast od 7 dana u odnosu na ono što je uočeno kod kontrolnih ozračenih životinja tretiranih nosačem. Zanimljivo je i da deluje da pri nižem nivou izloženosti X-zracima (6,5 Gy), primena mAbH6 utiče na preživljavanje ili kašnjenje smrtnosti u poređenju sa kontrolno ozračenim životinjama tretiranim nosačem. Za ovu razliku u odgovoru između nivoa izloženosti može biti više razloga, iako bi verifikacija bilo koje hipoteze mogla zahtevati dodatne studije, uključujući privremeno prikupljanje uzoraka za mikrobiološku kulturu i hematološke parametre. Jedno objašnjenje može jednostavno biti da broj životinja raspoređenih po grupama može isključiti uočavanje bilo kakve suptilne razlike povezane sa tretmanom. Na primer, kod grupa veličine n=20, razlika u preživljavanju između 65% (što je slučaj za mAbH6 i izloženost od 6,5 Gy) i 80% (što je slučaj za mAbH6 i izloženost od 7,0 Gy) je 3 životinje. S druge strane, razlika između 35% (što je slučaj za kontrolu sa nosačem i izloženost od 7,0 Gy) i 80%

1 2

(što je slučaj za mAbH6 i izloženost od 7,0 Gy) je 9 životinja i pruža čvrst dokaze o razlici koja je povezana sa tretmanom.

[0582] Ovi rezultati pokazuju da su anti-MASP-2 antitela efektivna u lečenju sisarskih subjekata kod kojih postoji rizik ili koji trpe štetne efekate sindroma akutnog zračenja.

PRIMER 30

[0583] Ovaj primer pokazuje da su miševi sa deficijencijom MASP-2 zaštićeni od smrtnosti nakon infekcije sa Neisseria meningitidis i to bilo sa N. meningitidis serogrupe A ili Neisseria meningitidis serogrupe B.

Postupci:

[0584] MASP-2 knockout miševi (MASP-2 KO miševi) su generisani kao što je opisano u Primeru 1. MASP-2 KO miševi stari 10 nedelja (n=10) i C57/BL6 miševi divljeg tipa (WT) (n=10) su inokulirani intraperitonealnom (i.p.) injekcijom u dozi od 2,6 x 10<7>CFU Neisseria meningitidis serogrupe A Z2491, u zapremini od 100 µl. Infektivna doza je primenjena miševima zajedno sa gvožđem dekstranom u finalnoj koncentraciji od 400 mg/kg. Preživljavanje miševa nakon infekcije je praćeno tokom vremenskog perioda od 72 sata.

[0585] U odvojenom eksperimentu, MASP-2 KO miševi stari 10 nedelja (n=10) i C57/BL6 miševi divljeg tipa (n=10) su inokulirani i.p. injekcija u dozi od 6 x 10<6>CFU Neisseria meningitidis serogrupe B soja MC58, u zapremini od 100 µl. Infektivna doza je primenjena miševima zajedno sa gvožđem dekstranom u finalnoj koncentraciji od 400 mg/kg. Preživljavanje miševa nakon infekcije je praćeno tokom vremenskog perioda od 72 sata. Status oboljenja je takođe određivan, i za WT i MASP-2 KO miševe, tokom vremenskog perioda od 72 sata nakon infekcije, na osnovu parametara za procenu oboljenja koji su opisani u nastavku, u TABELI 10, koji se zasniaju na šemi publikovanoj u Fransen i saradnici (2010) sa neznatnim izmenama.

TABELA 10: Status oboljenja povezan sa kliničkim znacima kod inficiranih miševa

1

[0586] Uzorci krvi su miševima uzimani nakon infekcije u intervalima od sata, pa su analizirani da bi se utvrdio serumski nivo (log cfu/mL) N. meningitidis i da bi se verifikovala infekcija, kao i da bi se utvrdio stepen klirensa bakterija iz seruma.

Rezultati:

[0587] SLIKA 33 je Kaplan-Majerov dijagram koja grafički ilustruje procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon primene infektivne doze od 2,6 x 10<7>cfu N. meningitidis serogrupe A Z2491. Kao što je prikazano na SLICI 33, 100% MASP-2 KO miševa je preživelo period od 72 sata nakon infekcije. Nasuprot tome, samo 80% WT miševa (p= 0,012) je bilo živo 24 sata nakon infekcije, dok je samo 50% WT miševa još bilo živo 72 sata nakon infekcije. Ovi rezultati pokazuju da su miševi sa deficijencijom MASP-2 zaštićeni od mortaliteta indukovanog infekcijom sa N. meningitidis serogrupe A Z2491.

[0588] SLIKA 34 je Kaplan-Majerov dijagram koja grafički ilustruje procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon primene infektivne doze od 6 x 10<6>cfu N. meningitidis soja serogrupe B MC58. Kao što je prikazano na SLICI 34, 90% MASP-2 KO miševa je preživelo preiod od 72 sata infekcije. Nasuprot tome, samo 20% WT miševa (str= 0,0022) je bilo još živo 24 sata nakon infekcije. Ovi rezultati pokazuju da su miševi sa deficijencijom MASP-2 zaštićeni od mortaliteta indukovanog infekcijom sa N. meningitidis serogrupe B soja MC58.

[0589] SLIKA 35 grafički ilustruje log cfu/ml za za N. meningitidis serogrupe B soja MC58 izdvojenu u različitim vremenskim tačkama iz uzoraka krvi uzetih iz MASP-2 KO i WT miševa nakon i.p. infekcije sa 6x10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soja MC58 (n=3 u različitim vremenskim tačkama za obe grupe miševa). Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM. Kao što je prikazano na SLICI 35, kod WT miševa je nivo N. meningitidis u krvi dostigao vrhunac od oko 6,0 log cfu/mL 24 sata nakon infekcije i pao je na oko 4,0 log cfu/mL do 36 sati nakon infekcije. Nasuprot tome, kod MASP-2 KO miševa je nivo N. meningitidis dostigao vrhunac od oko 4,0 log cfu/mL 12 sati nakon infekcije i pao je na oko 1,0 log cfu/mL do 36 sati nakon infekcije (simbol "*" označava p<0,05; simbol "**" označava p=0,0043). Ovi rezultati pokazuju da, iako su MASP-2 KO miševi bili inficirani istom dozom N. meningitidis serogrupe B soja MC58 kao WT miševi, MASP-2 KO miševi imaju pojačan klirens bakterijemije u poređenju sa WT.

[0590] SLIKA 36 grafički ilustruje prosečnu vrednost skora oboljenja kod MASP-2 KO i WT miševa 3, 6, 12 i 24 sata nakon infekcije sa 6x10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soja MC58. Kao što je prikazano na SLICI 36, miševe sa deficijencijom MASP-2 je karakterisala visoka otpornost na infekciju, sa znatno nižim rezultatima skora oboljenja 6 sati (simbol "*" označava p=0,0411), 12 sati (simbol "**" označava

1 4

p=0,0049) i 24 sata ( simbol "***" označava p=0,0049) nakon infekcije, u poređenju sa WT miševima. Rezultati na SLICI 36 su predstavljeni u vidu srednjih vrednosti ± SEM.

[0591] Ukratko, rezultati u ovom Primeru pokazuju da su miševi sa deficijencijom MASP-2 zaštićeni od mortaliteta indukovanog sa Neisseria meningitides nakon infekcije bilo sa N. meningitidis serogrupe A ili N. meningitidis serogrupe B.

PRIMER 31

[0592] Ovaj primer pokazuje da primena anti-MASP-2 antitela nakon infekcije sa N. meningitidis povećava preživljavanje miševa inficiranih sa N. meningitidis.

Uvod/Obrazloženje:

[0593] Kao što je opisano u Primeru 10, pacovski MASP-2 protein je iskorišćen za paniranje Fab fagne biblioteke, iz koje je Fab2 #11 identifikovan kao funkcionalno aktivno antitelo. Antitela pune dužine pacovskog IgG2c i pacovskog IgG2a izotipa su generisana iz Fab2 #11. Okarakterisani su i farmakodinamički parametri anti-MASP-2 antitela pune dužine mišjeg IgG2a izotipa (kao što je opisano u Primeru 19).

[0594] U ovom primeru, mišje anti-MASP-2 antitelo pune dužine, izvedeno iz Fab2 #11, analizirano je u mišjem modelu infekcije sa N. meningitidis.

Postupci:

[0595] Mišji IgG2a izotip anti-MASP-2 antitela pune dužine izveden iz Fab2 #11, generisan je kao što je prethodno opisano i ispitano je u mišjem modelu infekcije sa N. meningitidis na način koji sledi.

Primena mišjih anti-MASP-2 monoklonskih antitela (MoAt) nakon infekcije

[0596] C57/BL6 miševi stari 9 nedelja (Charles River) su tretirani inhibitornim mišjim anti-MASP-2 antitelom (1,0 mg/kg) (n=12) ili kontrolnim izotipskim antitelom (n=10) 3 sata nakon i.p. injeciranja N. meningitidis serogrupe B soja MC58 u visokoj dozi (4x10<6>cfu).

Rezultati:

[0597] SLIKA 37 je Kaplan-Majerov dijagram koja grafički ilustruje procenat preživljavanja miševa nakon primene infektivne doze od 4x10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soja MC58, praćenog primenom inhibitornog anti-MASP-2 antitela (1,0 mg/kg) ili kontrolnog izotipskog antitela 3 sata nakon infekcije. Kao što je prikazano na SLICI 37, 90% miševa tretiranih sa anti-MASP-2 antitelom je preživelo

1

vremenski period od 72 sata nakon infekcije. Nasuprot tome, samo 50% miševa tretiranih kontrolnim izotipskim antitelom je preživelo vremenski period od 72 sata nakon infekcije. Simbol "*" označava p=0,0301, utvrđen poređenjem dve krive preživljavanja.

[0598] Ovi rezultati pokazuju da je primena anti-MASP-2 antitela efektivna u lečenju i poboljšanju preživljavanja kod subjekata inficiranih sa N. meningitidis.

[0599] Kao što je ovde prikazano, upotreba anti-MASP-2 antitela u lečenju subjekta inficiranog sa N. meningitidis je efektivna kada se primenjuje unutar 3 sata nakon infekcije, a očekuje se i da bude efektina unutra perioda od 24 sata do 48 sati nakon infekcije. Meningokokna bolest (bilo meningokokemija ili meningitis) zahtevaju hitnu medicinsku pomoć i sa terapijom se obično započinje odmah kada se posumnja na meningokoknu bolest (tj. pre pozitivne identifikacije N. meningitidis kao etiološkog agensa).

[0600] Imajući u vidu rezultate dobijene na MASP-2 KO miševima koji su prikazani u PRIMERU 30, veruje se da bi primena anti-MASP-2 antitela pre infekcije sa N. meningitidis takođe bila efektivna za sprečavanje ili ublažavanje ozbiljnosti infekcije.

PRIMER 32

[0601] Ovaj primer pokazuje da je primena anti-MASP-2 antitela efektivna za lečenje infekcija sa N. meningitidis u humanom serumu.

Obrazloženje:

[0602] Pacijenti sa smanjenim nivoom funkcionalnog MBL u serumu pokazuju povećanu podložnost ponovljenim bakterijskim i gljivičnim infekcijama (Kilpatrick i saradnici, Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002)). Poznato je i da MBL prepoznaje N. meningitidis, a pokazano je i da serumi sa deficijencijom MBL ne liziraju Neiseriju.

[0603] Imajući u vidu rezultate opisane u Primerima 30 i 31, sprovedene su serije eksperimenata da bi se utvrdila efikasnost primene anti-MASP-2 antitela za lečenje infekcije sa N. meningitidis upotrebom humanih seruma sa deficijencijom komplementa i kontrolnih humanih seruma. Eksperimenti su rađeni sa visokim koncentracijama seruma (20%) da bi se očuvao put aktivacija komplementa.

1

Postupci:

1. Serumska baktericidna aktivnost u raznim humanim serumima sa deficijencijom komplementa i u humanim serumima tretiranim sa humanim anti-MASP-2 antitelom

[0604] U ovom eksperimentu su upotrebljeni sledeći humani serumi sa deficijencijom komplementa, kao i kontrolni humani serumi:

TABELA 11: Ispitivani uzorci humanih seruma (kao što je prikazano na SLICI 38)

[0605] Rekombinantno antitelo na humani MASP-2 je izolovano iz Kombinatorne biblioteke antitela (Knappik A. i saradnici, J. Mol. Biol.296:57-86 (2000)), upotrebom rekombinantnog humanog MASP-2A kao antigena (Chen C. B. i Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001)). U humanoj plazmi je identifikovan anti-humani scFv fragment koji je snažno inhibirao aktivaciju C4 i C3 posredovanu lektinskim putem (IC50∼20 nM) i dalje je preveden u humano IgG4 antitelo pune dužine.

[0606] N. meningitidis serogrupe B-MC58 je inkubirana na 37°C uz mućkanje sa različitim serumima prikazanim u TABELI 11, pri čemu je koncentracija svakog seruma iznosila 20%, sa ili bez dodavanja inhibitornog humanog anti-MASP-2 antitela (3 µg u ukupnoj zapremini od 100 μl). Uzorci su uzimani u sledećim vremenskim tačkama: intervalima od 0, 30, 60 i 90 minuta, nakon čega su ćelije izdvojene i određivan je broj vijabilnih ćelija. Humani serum inaktiviran toplotom je upotrebljavan kao negativna kontrola.

Rezultati:

[0607] SLIKA 38 grafički ilustruje log cfu/ml za broja vijabilnih N. meningitidis serogrupe B-MC58 koje su izvdvojene u različitim vremenskim tačkama iz uzoraka humanih seruma prikazanih u TABELI 11. TABELA 12 obezbeđuje rezultate Studentovog t-testa za SLIKU 38.

1

TABELA 12: Rezultati Studentovo t-testa za SLIKU 38 vremenska tačka - 60 minuta

[0608] Kao što je prikazano na SLICI 38 i u TABELI 12, ubijanje N. meningitidis zavisno od komplementa u 20%-nom humanom serumu je značajno poboljšano dodavanjem humanog anti-MASP-2 inhibitornog antitela.

2. Ubijanje N. meningitidis zavisno od komplementa u 20% (v/v) mišjem serumu sa deficijencijom MASP-2.

[0609] U ovom eksperimentu su upotrebljavani sledeći mišji serumi sa deficijencijom komplementa i kontrolni mišji serumi:

TABELA 13: Ispitivani uzorci mišjih seruma kao što je prikazano na SLICI 39

[0610] N. meningitidis serogrupe B-MC58 je inkubirana na 37°C uz mućkanje sa različitim mišjim serumima sa deficijencijom komplementa, pri čemu je svaki bio u koncentraciji od 20%. Uzorci su uzimani u sledećim vremenskim tačkama: intervalima od 0, 15, 30, 60, 90 i 120 minuta, nakon čega su ćelije izdvojene i određivan je broj vijabilnih ćelija. Humani serum inaktiviran toplotom je upotrebljavan kao negativna kontrola.

Rezultati:

[0611] SLIKA 39 grafički ilustruje log cfu/ml za broja vijabilnih N. meningitidis serogrupe B-MC58 koje su izdvojene u različitim vremenskim tačkama iz uzorka seruma miša prikazanih u TABELI 13. Kao što je prikazano na SLICI 39, serumi MASP-2-/- miševa su bili sa višim nivoom baktericidne aktivnosti za N. meningitidis nego WT mišji serumi. Simbol "**" označava p=0,0058, simbol "***" označava p=0,001.

TABELA 14 obezbeđuje razultate Studentovog t-testa za SLIKA 39.

1

TABELA 14: Rezultati Studentovog t-testa SLIKU 39

[0612] Ukratko, rezultati u ovom Primeru pokazuju da MASP-2-/- serume karakteriše viši nivo baktericidne aktivnosti za N. meningitidis u odnosu na WT serume.

PRIMER 33

[0613] Ovaj primer pokazuje inhibitorni efekat deficijencije MASP-2 na lizu crvenih krvnih zrnaca u uzorcima krvi dobijenim iz mišjeg modela paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH).

Uvod/Obrazloženje:

[0614] Paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH), označeni i kao Marchiafava-Micheli sindrom, je stečeno, potencijalno opasna po život oboljenje krvi, koje karakteriše intravaskularna hemolitička anemija indukovana komplementom. Obeležje PNH je hronična intravaskularna hemoliza posredovana komplementom, koja je posledica neregulisane aktivacije komplementa alternativnim putem usled odsustva regulatora komplementa CD55 i CD59 na PNH eritrocitima, sa naknadnom hemoglobinurijom i anemijom. Lindorfer M.A. i saradnici, Blood 115(11) (2010), Risitano A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011). Anemija u PNH nastaje usled uništavanja crvenih krvnih ćelija u krvotoku. Simptomi PNH obuhvataju crvenu mokraću zbog pojave hemoglobina u urinu, bolove u leđima, umor, otežano disanje i trombozu. PNH se može razviti sam od sebe, što se označava kao „primarni PNH“ ili može biti u kontekstu drugih poremećaja kosne srži, poput aplastične anemije, kada se označava kao „sekundarni PNH“. Lečenje PNH obuhvata transfuziju krvi za anemiju, antikoagulaciju za trombozu i upotrebu monoklonskog antitela ekulizumaba (Soliris®), koji štiti krvne ćelije od imunskog razaranja inhibiranjem sistema komplementa (Hillmen P. i saradnici, N. Engl. J. Med.350(6):552-9 (2004)). Ekulizumab (Soliris®) je humanizovano monoklonsko antitelo koje ciljano deluje na C5 komponentu komplementa, blokirajući time njegovo cepanje C5 konvertazama i dalje prevenciju proizvodnje C5a i udruživanje MAC. Rezultat lečenje PNH pacijenata ekulizumabom je bio smanjenje intravaskularne hemolize, što je izmereno laktat dehidrogenazom (LDH), a što je dovelo do stabilizacije hemoglobina i nezavisnosti od transfuzije kod oko polovine pacijenata (Hillmen P i saradnici, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11(6) (2011)). Dok gotovo svi pacijenti koji se podvrgavaju terapiji ekulizumabom postižu normalne ili gotovo normalne nivoe LDH (usled kontrole intravaskularne hemolize), samo oko trećine pacijenata dostiže vrednost hemoglobina iznad 11gr/dl,

1

dok preostale pacijente na ekulizumabu i dalje nastaljva da karakteriše umerena do ozbiljna anemija (tj. zavisna od transfuzije), u približno jednakim razmerama (Risitano A.M. i saradnici, Blood 113:4094-100 (2009)). Kao što je opisano u Risitano i saradnici, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011), pokazano je da su PNH pacijenti na ekulizumabu sadržavali C3 fragmente vezane za značajan deo njihovih PNH eritrocita (dok nelečeni pacijenti nisu), što je dovelo do zaključka da membranski vezani fragmenti C3 deluju kao opsonini na PNH eritrocitima, što rezultuje njihovim hvatanjem od strane retikuloendotelnih ćelija posredstvom specifičnih C3 receptora i dalje naknadnom ekstravaskularnom hemolizom. Terapijske strategije su stoga potrebne, pored upotrebe ekulizumaba, za one pacijente koji razvijaju ekstravaskularnu hemolizu posredovanu fragmentima C3, pošto je kod njih i dalje potrebna transfuzija crvenih ćelija.

[0615] Ovaj Primer opisuje postupke za utvrđivanje efekta seruma sa deficijencijom MASP-2 i seruma tretiranog inhibitornim agensom za MASP-2 na lizu crvenih krvnih zrnaca iz uzoraka krvi dobijenih iz mišjeg modela PNH i dalje pokazuje efikasnost inhibicije MASP-2 za lečenje subjekata koji boluju od PNH, a takođe podržava upotrebu inhibitora MASP-2 za ublažavanje efekata ekstravaskularne hemolize posredovane fragmentima C3 kod PNH subjekata koji se podvrgavaju terapiji sa C5 inhibitorom poput ekulizumaba.

Postupci:

Životinjski model PNH:

[0616] Uzorci krvi su dobijeni iz genetički izmenjenih miševa sa deficijencijama Crry i C3 (Crry/C3-/-) i iz miševa sa deficijencijom CD55/CD59. Ovakvim miševima nedostaju odgovarajući regulatori površinskog komplementa, pa su stoga njihovi eritrociti podložni spontanoj autolizi posredovanoj komplementom kao što su to čelije krvi u humanom PNH.

[0617] Da bi se ovi eritrociti još više učinili osetljivima, ove ćelije su upotrebljavane sa i bez oblaganja sa mananom i zatim je analizirana hemoliza u plazmi WT C56/BL6, plazmi MBL null, plazmi MASP-2-/-miševa, humanom NHS, humanoj MBL-/- plazmi i NHS tretiranom sa humanim anti-MASP-2 antitelom.

1

1. Analiza hemolize Crry/C3 i CD55/CD59 dvostruko deficijentnih mišjih eritrocita u MASP-2-deficijentnim osiromašenim serumima i kontrolama

Dan 1. Priprema mišjih crvenih krvnih ćelija (± oblaganje mananom)

[0618] Upotrebljeni materijali: sveža mišja krv, BBS/Mg<2+/>Ca<2+>(4,4 mM barbiturna kiselina, 1,8 mM natrijum barbiton, 145 mM NaCl, pH 7,4, 5 mM Mg<2+>, 5mM Ca<2+>), hrom hlorid, CrCl3·6H20 (0,5mg/ml u BBS/Mg2+/Ca2+) i manan, 100 µg/ml u BBS/Mg2+/Ca2+.

[0619] Puna krv (2 ml) je centrifugirana tokom 1-2 min na 2000xg, u rashlađenoj centrifugi na 4°C. Plazma i leukocitno-trombocitni međusloj su aspirirani. Uzorak je zatim ispran tri puta resuspendovanjem RBC taloga u 2 ml ledeno hladnog BBS/želatina/Mg2+/Ca2+ i ponavljanjem koraka centrifugiranja. Nakon trećeg pranja, talog je resuspendovan u 4 ml BBS/Mg2+/Ca2+. Zatim je na stranu odvojen alikvot eritrocita od 2 ml kao kontrola koja se neće podvrgavati oblaganju. U preostalih 2 mL je dodato 2 mL CrCl3 i 2 mL manana, pa je uzorak inkubiran uz lagano mešanje na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Reakcija je prekinuta dodavanjem 7,5 ml BBS/želatina/Mg2+/Ca2+. Uzorak je ponovo centrifugiran kao što je prethodno opisano, nakon čega je resuspendovan u 2 ml BBS/želatina/Mg2+/Ca2+ i ispan još dva puta kao što je prethodno opisano, a zatim čuvan na 4°C.

Dan 2. Analiza hemolize

[0620] Upotrebljeni materijali su bili BBS/želatin/Mg<2+>/Ca<2+>(sastava koji je prethodno naveden), serumi koji su ispitivani, ploče sa 96 bunarića okruglog dna i ravnog dna i spektrofotometar koji očitava ploče sa 96 bunarića na 410-414 nm.

[0621] Najpre je određena koncentracija eritrocita i gustina ćelija je podešena na 10<9>/ mL, pa su ćelije čuvane u ovoj koncentraciji. Pre upotrebe, pufer za analizu je razblažen do 10<8>/ mL, pa je upotrebljavano po 100 μl po bunariću. Hemoliza je izmerena na 410-414 nm (što omogućava veću osetljivost nego na 541nm). Razblaćenja ispitivanih seruma su pripremana u ledno hladnom BBS/želatinu/Mg2+/Ca2+. Po 100 μl svakog razblaženja seruma je pipetirano je u ploču sa bunarima okruglog dna (pogledati raspored uzorka na ploči). Zatim je dodato po 100µl odgovarajuće razblaženog preparata sa eritrocitima (tj.10<8>/mL) (videti raspored uzorka na ploči), ploča je inkubirana na 37°C oko 1 sata i praćena je liza ćelija. (Ploče se u ovom trenutku mogu fotografirati.) Ploča je zatim centrifugirna na maksimalnoj brzini tokom 5 minuta, pa je po 100 μl tečne faze aspirirano i prebačeno na ploče sa ravnim dnom, nakon čega je snimljen OD je zabeležen na 410-414 nm. Talozi eritrocita su zadržani (oni ogu naknadno biti lizirani sa vodom da bi se dobio inverzni rezultat).

1 1

Eksperiment #1:

[0622] Sveža krv je dobijena iz miševa sa dvostrukim deficijencijom CD55/CD59, a krv miševa sa dvostrukim deficijencijom Crry/C3 i eritrociti su pripremani kao što je to detaljno opisano u prethodno navedenom protokolu. Ćelije su podeljene i polovina ćelija je obložena mananom, dok je druga polovina ostala netretirana, nakon čega je finalna koncentracija ćelija podešena na 1x10<8>po ml, od čega je 100 μl upotrebljeno u analizi hemolize, koja je rađena kao što je prethodno opisano.

Rezultati Eksperimenta br.1: Lektinski put je uključen u lizu eritrocita u životinjskom modelu PNH

[0623] U početnom eksperimentu je utvrđeno je neobloženi WT mišji eritrociti nisu lizirani ni u jednom mišjem serumu. Dalje je utvrđeno da su Crry-/- mišji eritrociti obloženi mananom polako lizirani (tokom više od 3 sata na 37 stepeni) u WT mišjem serumu, ali i da nisu bili lizirani u MBL null serumu. (Podaci nisu prikazani).

[0624] Utvrđeno je takođe da su eritrociti Crry-/- miša obloženi mananom brzo lizirani u humanom serumu, ali ne i u NHS neaktiviranom toplotom. Važno je napomenuti da su Crry-/- mišji eritrociti obloženi mananom bili lizirani u NHS razblaženom do 1/640 (tj. svi su lizirani u razblaženjima od 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 i 1/640). (Podaci nisu prikazani). U ovom razblaženju, alternativni put ne deluje (funkcionalna aktivnost AP je značajno smanjena ispod koncentracije seruma od 8%).

Zaključci iz Eksperimenta br.1

[0625] Crry-/- mišji eritrociti obloženi mananom su vrlo dobro lizirli u visoko razblaženom humanom serumu sa MBL, ali ne i u onom bez MBL. Efikasna liza u svakoj ispitivanoj koncentraciji seruma ukazuje da alterantivni put nije uključen ili potreban za ovu lizu. Nesposobnost mišijeg seruma sa deficijencijom MBL i humanog seruma da liziraju obložene Crry-/- mišje eritrocite ukazuju da klasičan put takođe nema nikakve veze sa uočenom lizom. Kako su molekuli prepoznavanje u lektinskom putu potrebni (tj. MBL), ova liza je posredovana lektinskim putem.

Eksperiment br.2:

[0626] Sveža krv je dobijena iz miševa sa dvostrukim deficijencijom CD55/CD59 i CD55/CD59, a Crry-/- mišji eritrociti obloženi mananom su analizirani u analizi hemolize, kao što je prethodno opisano, u prisustvu sledećih humanog seruma: MBL null; WT; NHS prethodno tretiran humanim anti-MASP-2antitelom; i NHS inaktiviran toplotom kao kontrola.

1 2

Rezultati eksperimenta br.2: Inhibitori MASP-2 sprečavaju lizu eritrocita u životinjskom modelu PNH

[0627] Sa Crry-/- mišjim eritrocitima obeleženim mananom, NHS je inkubiran u razblaženjima razblaženim do 1/640 (tj. 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 i 1/640), upotrebljen je i humani MBL-/- serum, NHS prethodno tretiran sa anti-MASP-2 mAt i NHS neaktiviran toplotom kao kontrola.

[0628] ELISA mikrotitarska ploča je centrifugirana i nelizirani eritrociti su prikupljeni na dnu ploče sa okruglim bunarićima. Supernatant iz svakog bunarića je pokupljen i količina hemoglobina oslobođenog iz liziranih eritrocita je izmerena očitavanjem na OD415 nm u ELISA čitaču.

[0629] U kontrolnom NHS-u inaktiviranom toplotom (negativna kontrola), kao što se očekivalo, nije uočena liza. MBL-/- humani serum je lizirao mišje eritrocite obložene mananom u razblaženjima od 1/8 i 1/16. NHS prethodno tretiran anti-MASP-2 antitelom je lizirao mišje eritrocite obložene mananom u razblaženjima od 1/8 i 1/16, dok je WT humani serum lizirao eritrocite obložene mananom sve do razblaženja od 1/32,

[0630] SLIKA 40 grafički ilustruje hemolizu (merenu oslobađanjem hemoglobina liziranih mišjih eritrocita (Cryy/C3-/-) u supernatant, što je izmereno fotometrijom) mišjih eritrocita obloženih mananom upotrebom humanog seruma u opsegu koncentracija seruma u serumu iz toplotom inaktiviranog (HI) NHS-a, MBL-/-, NHS-a prethodno tretiranog anti-MASP-2 antitelom i NHS kontrola.

[0631] Iz rezultata prikazanih na SLICI 40, pokazano je da inhibicija MASP-2 sa anti-MASP-2 antitelom značajno pomera CH50i inhibira lizu senzitizovanih eritrocita sa deficijentnom zaštitom koja je posredovana komplementom od autologne aktivacije komplementa.

Eksperiment br.3

[0632] Sveža krv dobijena iz miševa sa dvostrukim deficijencijom Crry/C3 i CD55/CD59 u neobloženim Crry-/- mišjim eritrocitima je ispitivana u analizi hemolize kao što je prethodno opisano, u prisustvu: MBL-/-; WT serumi; NHS je prethodno tretiran sa humanim anti-MASP-2 antitelom i termički neaktiviranim NHS-om kao kontrolom.

Rezultati:

[0633] SLIKA 41 grafički ilustruje hemolizu (merenu oslobađanjem hemoglobina liziranih WT mišjih eritrocita u supernatant, što je izmereno fotometrijom) mišjih eritrocita koji nisu bili obloženi mananom, upotrebom humanog seruma u opsegu serumskih koncentracija, u serumu iz toplotom inaktiviranog NHS-a, MBL-/-, NHS-a prethodno tretiranog sa anti-MASP-2 antitelom i NHS kontrolom. Kao što je prikazano na SLICI 41, pokazano je da inhibiranje MASP-2 inhibira lizu nesenzibilizovanih WT mišjih eritrocita posredovanu komplementom.

1

[0634] SLIKA 42 grafički ilustruje hemolizu (merenu oslobađanjem hemoglobina liziranih mišjih eritrocita (CD55/59-/-) u supernatant, što je izmereno fotometrijom) mišjih eritrocita koji nisu bili obloženi mananom, upotrebom humanog seruma u opsegu serumskih koncentracija, u serumu iz toplotom inaktiviranog NHS-a, MBL-/-, NHS-a prethodno tretiranog sa anti-MASP-2 antitelom i NHS kontrolom.

TABELA 12: CH50vrednosti izražene kao koncentracije u serumu

[0635] Ukratko, rezultati u ovom Primeru pokazuju da inhibiranje MASP-2 inhibira komplementom posredovanu lizu senzitizovanih i nesenzitizovanih eritrocita sa deficijentnom zaštitom od autologne aktivacije komplementa. Inhibitori MASP-2 se mogu stoga upotrebljavati za lečenje subjekata koji boluju od PNH, a mogu biti upotrebljeni i za ublažavanje (tj. da inhibiraju, sprečavaju ili smanjuju ozbiljnost) ekstravaskularne hemolize kod pacijenata sa PNH koji se podvrgavaju lečenju sa inhibitorom C5 kao što je ekulizumab (Soliris®).

PRIMER 34

[0636] Ovaj Primer opisuje nastavak studije u odnosu na studiju opisanu prethodno u Primeru 29, obezbeđujući dodatne dokaze koji potvrđuju da je inhibitor MASP-2, kao što je to MASP-2 antitelo, efektivan za lečenje izloženosti zračenju i/ili za lečenje, ublažavanje ili prevencija sindroma akutnog zračenja.

[0637] Obrazloženje: U inicijalnoj studiji opisanoj u Primeru 29, pokazano je da je tretman pre zračenja sa anti-MASP-2 antitelom kod miševa povećao preživljavanje ozračenih miševa u poređenju sa ozračenim kontrolnim životinjama tretiranim nosačem pri nivoima izloženosti od 6,5 Gy i 7,0 Gy. U Primeru 29 je dalje pokazano da na nivou izloženosti od 6,5 Gy, tretman sa anti-MASP-2 antitelom nakon zračenja rezulturje u umerenom porastu preživljavanja u poređenju sa ozračenim kontrolnim životinjama tretiranim nosačem. Ovaj Primer opisuje drugu studiju zračenja koja je sprovedena da bi se potvrdili rezultati prve studije.

1 4

Postupci:

Dizajn studije A:

[0638] Swiss Webster miševi (n=50) su bili izloženi jonizujućem zračenju (8,0 Gy). Ispitivan je zatim efekat terapije anti-MASP-2 antitelima (mAbH65 mg/kg), primenjenima 18 sati pre i 2 sata nakon izlaganja zračenju, a potom i svake nedlje, na mortalitet.

Rezultati studije A:

[0639] Kao što je prikazano na SLICI 43, utvrđeno je da je primena anti-MASP-2 antitela mAbH6 povećala preživljavanje kod miševa izloženih 8,0 Gy, sa prilagođenom medijanom stope preživljavanja povećane sa 4 na 6 dana u poređenju sa miševima koji su primili kontrolu sa nosačem, kao ida je smrtnost smanjena za 12% u poređenju sa miševima koji su primili kontrolu sa nosačem (log-rank test, p=0,040).

Dizajn studije B:

[0640] Swiss Webster miševi (n=50) su bili izloženi jonizujućem zračenju (8,0 Gy) u sledećim grupama (I: nosač) fiziološki rastvor; (II: niska doza) anti-MASP-2 antitelo mAbH6 (5 mg/kg) primenjeno 18 sati pre zračenja i 2 sata nakon zračenja; (III: visoka doza) mAbH6 (10 mg/kg) primenjeno 18 sati pre zračenja i 2 sata nakon zračenja; i (IV: visoka doza nakon) mAbH6 (10mg/kg) primenjeno samo 2 sata nakon zračenja.

Rezultati studije B:

[0641] Primena anti-MASP-2 antitela pre i nakon zračenja je prilagodila srednju vrednost preživljavanja sa 4 na 5 dana u poređenju sa životinjama koje su primile kontrolu sa nosačem. Mortalitet kod miševa koji su tretirani anti-MASP-2 antitelom je bio smanjen za 6-12% u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim nosačem. Dodatno je zapaženo da se nisu mogli uočiti značajni štetni efekti tretmana (podaci nisu prikazani).

[0642] Sumarno, rezultati prikazani u ovom Primeru su u skladu sa rezultatima prikazanim u Primeru 29 i dodatno pokazuju da su anti-MASP-2 antitela efektivna u lečenju sisarskih subjekata sa riziko za ili koji pate od štetnih efekata sindroma akutnog zračenja.

1

PRIMER 35

[0643] Ova studija istražuje efekat deficijencije MASP-2 u mišjem modelu tromboze izazvane LPS-om (lipopolisaharidom).

Obrazloženje:

[0644] Hemolitički uremijski sindrom (HUS), koji je prouzrokovan infekcijom sa E. coli koja proizvodi Šiga toksin, vodeći je uzrok akutne bubrežne insuficijencije kod dece. U ovom Primeru je upotrebljen Švarcmanov model tromboze indukovane LPS-om (mikrovaskularne koagulacije) kod MASP-2-/-miševa (KO), da bi se utvrdilo da li je inhibicija MASP-2 efektivna u inhibiranju ili prevenciji obrazovanja intravaskularnih tromba.

Postupci:

[0645] MASP-2-/- (n=9) i WT (n=10) miševi su analizirani u Švarcmanovom modelu tromboze indukovane LPS-om (mikrovaskularne koagulacije). Miševima je primenjivan LPS iz Serratia i tokom vremena je praćeno obrazovanje tromba. Rađeno je i poređenje incidencije mikrotromba i mikrovaskularne koagulacije indukovane LPS-om.

Rezultati:

[0646] Primento je da svi ispitivani MASP-2-/- miševi (9/9) nisu obrazovali intravaskularne trombove nakon primene LPS-a iz Serratia. Nasuprot tome, mikrotrombovi su detektovani kod 7 od 10 paralelno ispitivanih WT miševa (p=0,0031, Fišerov egzaktan test). Kao što je prikazano na SLICI 44, vreme do početka mikrovaskularne okluzije nakon LPS infekcije je izmereno kod MASP-2-/- miševa i WT, pokazujući procenat WT miševa sa obrazovanim trombovima merenim tokom 60 minuta, sa obrazovanim tromba detektovanim već nakon oko 15 minuta. Do 80% WT miševa je karakterisalo obrazovanje tromba u 60 minuta. Nasuprot tome, kao što je prikazano na SLICI 44, nijedan od MASP-2-/- nije obrazovao trombove u 60 minuta (log rank: p=0,0005).

[0647] Ovi rezultati pokazuju da inhibicija MASP-2 štiti za razvoj intravaskularnih tromba u HUS modelu.

PRIMER 36

[0648] Ovaj Primer opisuje efekat anti-MASP-2 antitela u mišjem modelu HUS u kome je istovremeno intraperitonealno injeciran prečišćen Šiga toksin 2 (STX2) sa LPS-om.

1

Uvod:

[0649] Mišji model HUS-a je razvijen upotrebom istovremenog intraperitonealnog injeciranja prečišćenog Šiga toksina 2 (STX2) sa LPS-om. Biohemijska i analiza mišjih bubrega na genskim čipovima, ukazala je da se STX2 sa LPS-om jasno razlikuje od efekata bilo kog od agenasa samostalno. Analiza krvi i seruma ovih miševa je ukazala na neutrofiliju, trombocitopeniju, hemolizu crvenih ćelija i na povećan kreatinin u serumu i azot uree u krvi. Pored toga, histološka analiza i elektronska mikroskopija bubrega miša su ukazali na glomerularne naslage fibrina, kongestiju crvenih ćelija, obrazovanje mikrotromba i glomerularne ultrastrukturne promene. Ustanovljeno je da ovaj model HUS indukuje sve kliničke simptome humane HUS patologije kod C57BL/6 miševa, uključujući trombocitopeniju, hemolitičku anemiju i bubrežnu insuficijenciju koji definišu i humano oboljenje. (J. Immunol 187(1):172-80 (2011))

Postupci:

[0650] Ženke C57BL/6 miševa težine između 18 i 20 g su kupljene od komapnije Charles River Laboratories i podeljene su u 2 grupe (po 5 miševa u svakoj grupi). Jedna grupa miševa je prethodno tretirana intraperitonealnom (i.p.) injekcijom sa rekombinantnim anti-MASP-2 antitelom mAbM11 (100 µg po mišu; što odgovara finalnoj koncentraciji od 5 mg/kg telesne težine) razblaženim u ukupnoj zapremini od 150 µl fiziološkog rastvora. Kontrolna grupa je primila fiziološki rastvor bez antitela. Šest sati nakon i.p injekcije anti-MASP-2 antitela mAbM11, svi miševi su dobili kombinovanu i.p. injekciju subletalne doze (3 µg/životinja; što odgovara 150 µg/kg telesne težine) LPS-a iz Serratia marcescens (L6136; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i doza od 4,5 ng/životinji (što odgovara 225 ng/kg) STX2 (dvostruko veća od doze LD50) u ukupnoj zapremini od 150 µl. Za kontrolu je upotrebljen fiziološki rastvor.

[0651] Preživljavanje miševa praćeno na svakih 6 sati nakon primene doz. Miševi su odstranjivani čim su dostigli letargični stadijum HUS patologije. Nakon 36 sati, svi miševi su izbačeni i oba bubrega su uklonjena radi imunohistohemije i skenirajuće elektronske mikroskopije. Uzorci krvi su uzeti na kraju eksperimenta, punkcijom srca. Serum je izdvojen i čuvan smrznut na -80°C radi merenje nivoa BUN i serumskog kreatinina i u tretiranim i u kontrolnim grupama.

Imunohistohemija

[0652] Jedna trećina svakog bubrega miša je fiksirana u 4% paraformaldehidu tokom 24 sata, nakon čega je obrađena i ukalupljena u parafin. Preseci debeli tri mikrona su isečeni i postavljeni na naelektisane mikroskopske pločice za naknadno bojenje sa H & E bojom.

1

Elekstronska mikroskopija

[0653] Srednji deo bubrega je isečen na blokove od približno 1 do 2 mm<3>, pa je fiksiran preko noći na 4°C u 2,5% glutaraldehidu u Ik PBS-u. Fiksno tkivo je naknadno obrađeno od strane Centra za elektronsku mikroskopiju Univerziteta u Leicesteru

Kriostatski preseci

[0654] Preostala trećina bubrega je bila isečena na blokove od otprilike 1 do 2 mm<3>koji su trenutno zamrznuti u tečnom azotu i dalje držani na -80°C za pripremu kriostatskih preseka i analizu iRNK.

Rezultati:

[0655] SLIKA 45 grafički prikazuje procenat preživljavanja kontrolnih miševa tretiranih fiziološkim rastvorom (n=5) i miševa tretiranih anti-MASP-2 antitelom (n=5) u modelu indukovanom sa STX/LPS, tokom vremena (sati). Primetno je, kao što je prikazano na SLICI 45, da su svi kontrolni miševi su umrli za 42 sata. U oštrom kontrastu je da je 100% miševa tretiranih anti-MASP-2 antitelom preživelo tokom vremena eksperimenta. U skladu sa rezultatima prikazanim na SLICI 45, uočeno je da su svi netretirani miševi koji su ili umrli ili su morali da budu isključeni zbog znaka ozbiljnog oboljenja, bili sa značajnim glomerularnim povredama, dok su glomeruli svih miševa tretiranih anti-MASP-2 izgledali normalno (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati pokazuju da inhibitori MASP-2, poput anti-MASP-2 antitela, mogu biti upotrebljeni za lečenje subjekata koji boluju ili su sa rizikom za razvoj trombotične mikroangiopatije (TMA), poput hemolitičko uremijskog sindroma (HUS), atipičnog HUS (aHUS) ili trombozne trombocitopenijske purpure (TTP).

PRIMER 37

[0656] Ovaj Primer opisuje efekat deficijencije MASP-2 i inhibicije MASP-2 u mišjem modelu tromboze sa povredom endotelskih ćelija indukovanom sa FITC-dekstranom/svetlošću.

[0657] Uvod/Obrazloženje: Kao što je prikazano u Primerima 35 i 36, deficijencija MASP-2 (MASP-2 KO) i inhibicija MASP-2 (primenum inhibitornog MASP-2 antitela) štite miševe u modelu tipičnog HUS-a, pri čemu svi kontrolni miševi izloženi STX-u i LPS-u razvijajau ozbiljan HUS i postaju umirući ili umiru u roku od 48 sati. Na primer, kao što je prikazano na SLICI 54, svi miševi tretirani MASP-2 inhibitornim antitelom i zatim izloženi STX-u i LPS-u su preživeli (Fišerov egzaktan test, p<0,01; N=5). Dakle, anti-MASP-2 terapija štiti miševe u ovom modelu HUS-a.

[0658] Sledeći eksperimenti su sprovedeni da bi se analizirao efekat deficijencije MASP-2 i inhibicije MASP-2 u modelu trombotične mikroangiopatije (TMA) sa povredom endotelskih ćelija indukovanom

1

sa fluorescin izotiocijanatom (FITC)-dekstranom da bi se dodatno pokazala korist od MASP-2 inhibitora za lečenje HUS, aHUS, TTP i TMA sa drugim etiologijama.

Postupci:

Intravitalna mikroskopija

[0659] Miševi su pripremani za intravitalnu mikroskopiju kao što je opisano od strane Frommhold-a i saradnika, BMC Immunology 12: 56-68, 2011. Ukratko, miševi su anestezirani intraperitonealnom (i.p.) injekcijom ketamina (125 mg/kg telesne težine, Ketanest, Pfitzer GmbH, Karlsruhe, Nemačka) i ksilazina (12,5 mg/kg telesne težine; Rompun, Bayer, Leverkusen, Nemačka), pa su postvaljeni na podlogu za grejanje da bi se telesna temperatura održavala na 37°C. Intravitalna mikroskopija je sprovedena na uspravnom mikroskopu (Leica, Wetzlar, Nemačka) sa imerzionim objektivom za fiziološki rastvor (SW 40/0,75 numerički otvor, Zeiss, Jena, Nemačka). Da bi se olakšalo disanje, miševi su intubirani upotrebom PE 90 cevčica (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, SAD). Leva karotidna arterija je kanulisana sa PE10 cevčicama (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, SAD) radi uzimanja uzoraka krvi i sistemske primene monoklonskih antitela (mAt).

Priprema mišića kremastera

[0660] Hirurška priprema mišića kremastera za intravitalnu mikroskopiju izvedena je kao što je to opisano u Sperandio i saradnici, Blood, 97:3812-3819, 2001. Ukratko, skrotum je otvoren i mišić kremastera je mobilisan. Nakon uzdužnog reza i širenja mišića preko pokrovnog stakla, epididimis i testis su pomereni i zakačeni u stranu, omogućavajući potpun pristup za mikroskop do mikrocirkulacije mišića kremastera. Venule mišića kremastera su snimljane CCD kamerom (CF8/1; Kappa, Gleichen, Nemačka) na Panasonic S-VHS rekorderu. Mišić kremastera je superfundovan sa termokontrolisanim (35°C fiziološkim rastvorom puferisanim bikarbonatom) kao što je to opisano u Frommhold i saradnici, BMC Immunology 12:56-68, 20112011.

Model povrede svetlosnom ekscitacijom FITC-dekstrana

[0661] Kontrolisana vaskularna povreda endotela venula i arteriola mišića kremastera zavisna od doze svetlosti, indukovana je svetlosnom ekscitacijom fototoksičnog (FITC)-dekstrana (kat. br. FD150S, Sigma Aldrich, Poole, UK). Ovaj procedura je inicirala lokalizovanu trombozu. Kao fototoksičan reagens je upotrebljeno 60 µL 10% m/v rastvora FITC-dekstrana koji su injecirani kroz pristup za levu karotidnu arteriju, pa ostavljeni da se homogeno rašire kroz cirkulišuću krv tokom 10 minuta. Nakon odabira dobro perfundovane venule, halogena svetlost niskog do intenziteta srednjeg opsega (800-1500) je

1

fokusirana na krvni sud od interesa da bi se indukovala fluoresccencija FITC-dekstrana i blaga do umerena fototoksičnost na površinu endotela i time stimulisala tromboza na ponovljiv, kontrolisan način. Neophodan fototoksičan intenzitet svetlosti za pobuđivanje FITC-dekstrana je generisan upotrebom halogene lampe (12V, 100W, Zeiss, Oberkochen, Nemačka). Fototoksičnost koja nastaje usled ekscitacije fluorohroma izazvane svetlošću, zahteva prag intenziteta svetlosti i/ili trajanja osvetljenja i prouzrokovana je ili direktnim zagrevanjem površine endotela ili generisanjem reaktivnih radikala kiseonika kao što je opisano u Steinbauer i saradnici, Langenbecks Arch Surg 385:290-298, 2000,

[0662] Intenzitet svetlosti primenjivane na svaki sud je meren radi dodatnog podešavanja, upotrebom diodnog detektora za merenje male snage i za korekciju talasne dužine (Labmaster LM-2, Coherent, Auburn, USA). Analiza video skenova je rađena nakon snimanja, upotrebom računarski potpomognutog sistema za analizu mikrocirkulacije (CAMAS, dr. Zeintl, Heidelberg), a brzina crvenih krvnih zrnaca je merena kao što je to opisano u Zeintl i saradnici, Int J Microcirc Clin Exp, 8(3):293-302, 2000.

Primena monoklonskih anti-humanih MASP-2 inhibitornih antitela (mAbH6) i kontrole sa nosačem pre indukcije tromboze

[0663] Upotrebom slepog dizajna studije, 9 nedelja starim mužjacima C57BL/6 WT miševa iz istih legala su davane i.p. injekcije bilo rekombinantnog monoklonskog humanog anti-MASP-2 antitela (mAbH6), inhibitora funkcionalne aktivnosti MASP-2 (davan u finalnoj koncentraciji od 10 mg/kg telesne težine) ili iste količine kontrolnog izotipskog antitela (bez inhibitorne aktivnosti na MASP-2) 16 sati pre fototoksične indukcije tromboze u kremaster modelu intravitalne mikroskopije. Jedan sat pre indukcije tromboze, data je i druga doza mAbH6 ili kontrolnog antitela. MASP-2 knockout (KO) miševi su takođe analizirani u ovom modelu.

[0664] mAbH6 (uspostavljeno na rekombinanat humani MASP-2) je snažni inhibitor funkcionalne aktivnosti humanog MASP-2, koji unakrsno reaguje sa, vezuje se za i inhibira mišji MASP-2, ali sa nižim afinitetom usled njegove specifičnosti za vrstu (podaci nisu prikazani). Da bi se nadoknadio niži afinitet mAbH6 za mišji MASP-2, mAbH6 je davan u visokoj koncentraciji (10 mg/kg telesne težine) da bi se prevazišle razlike u specifičnosti za vrstu i niži afinitet za mišji MASP-2 i da bi se obezbedila efektivna blokada funkcionalne aktivnosti mišjeg MASP-2 pod in vivo uslovima.

[0665] U ovoj slepoj studiji, beleženo je vreme potrebno za potpuno začepljene svake pojedinačne ispitivane venule (selekcioni kriterijumi su podrazumevali uporedive prečnike i brzinu protoka krvi).

1

[0666] Procenat miševa sa mikrovaskularnom okluzijom, kao i vreme pojave i vreme do okluzije su procenjivani tokom perioda posmatranja od 60 minuta, upotrebom video zapisa intravitalne mikroskopije.

Rezultati:

[0667] SLIKA 46 grafički ilustruje, u funkciji vremena nakon indukcije povrede, procenat miševa sa mikrovaskularnom okluzijom u FITC/Dekstran UV modelu nakon tretmana sa izotipskom kontrolom ili humanim MASP-2 antitelom mAbH6 (10 mg/kg) primenjenog 16 sati i 1 sat pre injekcije FITC/Dekstrana. Kao što je prikazano na SLICI 46, kod 85% miševa divljeg tipa koji su primili izotipsko kontrolno antitelo je došlo do začepljenja u roku od 30 minuta ili manje, dok je samo 19% miševa divljeg tipa prethodno tretiranih humanim MASP-2 antitelom (mAbH6) bilo sa okluzijom u istom vremenskom periodu, a vreme do okluzije je bilo odloženo kod miševa kod kojih je na kraju došlo do okluzije u grupi tretiranos humanim MASP-2 antitelom. Dodatno je zapaženo da kod tri miša tretirana sa MASP-2 mAbH6 uopšte nije došlo do okluzije u toku perioda praćenja od 60 minuta (tj. bili su zaštićeni od trombozne okluzije).

[0668] SLIKA 47 grafički ilustruje vreme okluzije u minutama za miševe tretirane sa humanim MASP-2 antitelom (mAbH6) i izotipskim kontrolnim antitelom. Podaci su prikazani u vidu tačkastih dijagrama sa srednjim vrednostima (ucrtanim horizontalno) i standardnim greškama (ucrtanim vertikalno). Ova slika prikazuje vreme okluzije kod miševa kod kojih je okluzija bila uočljiva. Tako, tri miša tretirana sa MASP-2 antitelima kod kojih nije došlo do začepljenja tokom perioda posmatranja od 60 minuta nisu bili uključeni u ovu analizu (nije bilo kontrolno tretiranog miša koji nije bio sa okluzijom). Statistički test upotrebljen za analizu je bio neuparen t test; pri čemu simbol "*" označava p=0,0129. Kao što je prikazano na SLICI 47, kod četiri miša tretirana sa MASP-2 antitelom (mAbH6) kod kojih je bila prisutna okluzija, tretman sa MASP-2 antitelom je značajno povećao vreme venske okluzije u modelu tromboze sa povredom endotelnih ćelija indukovanom FITC-dekstranom/svetlošću pri niskom intenzitetu svetlosti (800-1500) u poređenju sa miševima tretiranim sa kontrolnim izotipskim antitelom. Prosečna vrednost vremena do pune okluzije kod izotipske kontrole je iznosilo 19,75 minuta, dok je prosečna vrednost pune okluzije kod grupe tretirane MASP-2 antitelom iznosila 32,5 minuta.

[0669] SLIKA 48 grafički prikazuje vreme do okluzije u minutama za miševe divljeg tipa, MASP-2 KO miševe i miševe divljeg tipa prethodno tretirane sa humanim MASP-2 antitelom (mAbH6) primenjenim i.p. kao 10 mg/kg 16 sati pre, a zatim ponovo primenjenim i.v.1 sat pre indukcije tromboze u modelu tromboze sa povredom endotelskih ćelija izazvanom FITC-dekstranom/svetlošću, i to sa svetlošću niskog intenziteta (800-1500). Na SLICI 48 su uključene samo životinje kod kojih je došlo do okluzije; n=2 za miševe divljeg tipa koji su primali kontrolno izotipsko antitelo; n=2 za MASP-2 KO; i n=4 za

1 1

miševe divljeg tipa koji su primali humano anti-MASP-2 antitelo (mAbH6). Simbol "*" označava p<0,01. Kao što je prikazano na SLICI 48, deficijencija MASP-2 i inhibicija MASP-2 (mAbH6 sa 10 mg/kg) povećali su vreme venske okluzije u modelu tromboze sa povredom endotelskih ćelija izazvanom FITC-dekstranom/svetlošću uz upotrebu niskog intenziteta svetlosti (800-1500).

Zaključci:

[0670] Rezultati u ovom Primeru dodatno pokazuju da inhibitorni agens za MASP-2 koje blokira lektinski put (npr. antitela koja blokiraju funkciju MASP-2), inhibira mikrovaskularnu koagulaciju i trombozu, obeležja višestrukih mikroangiopatskih poremećaja, u mišjem modelu TMA. Očekuje se stoga da će primena agensa za inhibiciju MASP-2, poput anti-MASP-2 inhibitornog antitela, biti efektivna terapija kod pacijenata koji boluju od HUS, aHUS, TTP ili drugih mikroangiopatskih poremećaja i da će obezbediti zaštitu od mikrovaskularne koagulacije i tromboza.

PRIMER 38

[0671] Ovaj Primer opisuje studiju koja pokazuje da humano inhibitorno antitelo za MASP-2 (mAbH6) nema uticaj na funkciju trombocita u humanoj plazmi bogatoj trombocitima.

Uvod/Obrazloženje: Kao što je opisano u Primeru 37, pokazano je da inhibicija MASP-2 sa humanim MASP-2 inhibitornim antitelom (mAbH6) povećava vreme venske okluzije u modelu tromboze sa povredom endotelskih ćelija izazvanom FITC-dekstranom/svetlošću. Sledeći eksperiment je sproveden da bi se utvrdilo da li MASP-2 inhibitorno antitelo (mAbH6) utiče na funkciju trombocita.

Postupci: Efekat humanog antitela mAbH6 za MASP-2 je ispitivan na agregaciju trombocita indukovanu sa ADP-om na način koji sledi.

Humano MASP-2 mAbH6 u koncentraciji od bilo 1 µg/ml ili 0,1 µg/ml u 40 µL rastvora je dodavano u 360 µL sveže pripremljene humane plazme bogate trombocitima. Kao negativna kontrola je upotrebljeno izotipsko kontrolno antitelo. Nakon dodavanja antitela u plazmu, indukovana je aktivacija trombocita dodavanjem ADP-a u finalnoj koncentraciji od 2 μM. Analiza je započeta mešanjem rastvora malim magnetom u kiveti od 1 ml. Agregacija trombocita je merena u dvokanalnom Chrono-log agregometru trombocita modela 700 za punu krv/optičkom Lumiagregometru.

Rezultati:

[0672] Procenat agregacije u rastvorima je meren tokom vremenskog perioda od pet minuta. Rezultati su prikazani u nastavku, u TABELI 13.

1 2

TABELA 13: Agregacija trombocita tokom vremenskog perioda od pet minuta.

[0673] Kao što je prethodno prikazano u TABELI 13, nije uočena značajna razlika između agregacije trombocita indukovane sa ADP-om nakon tretmana sa kontrolnim antitelom ili sa MASP-2 mAbH6 antitelom. Ovi rezultati pokazuju da humano MASP-2 antitelo (mAbH6) nema uticaj na funkciju trombocita. Prema tome, rezultati opisani u Primeru 37 koji pokazuju da inhibicija MASP-2 sa humanim MASP-2 inhibitornim antitelom (mAbH6) povećavaju vreme venske okluzije u modelu tromboze sa povredom endotelskih ćelija izazvanom FITC-dekstranom/svetlošću, nisu posledica dejstva mAbH6 na funkciju trombocita. Dakle, inhibicija MASP-2 sprečava trombozu bez direktnog uticaja na funkciju trombocita, što ukazuje na terapijski mehanizam koji je jasno različit od postojećih antitrombotskih agenasa.

PRIMER 39

[0674] Ovaj Primer opisuje efekat inhibicije MASP-2 na obrazovanje tromba i okluziju sudova u mišjem modelu TMA.

Uvod/Obrazloženje: Lektinski put ima dominantnu ulogu u aktivaciju sistema komplementa u okruženju stresa ili povrede endotelnih ćelija. Ovakva aktivacija se brzo pojačava alternativnim putem, koji je poremećen kod mnogih pacijenata sa aHUS. Očekuje se stoga da sprečavanje aktivacije MASP-2 i lektinskog puta zaustavi sekvencu enzimskih reakcija koje dovode do obrazovanja litičkog kompleksa, aktivacije trombocita i regrutovanja leukocita. Ovaj efekat ograničava oštećenje tkiva. Pored toga, MASP-2 je sa aktivnošću sličnom faktoru Xa i cepa protrombin obrazujući trombin. Ova aktivacija sistema koagulacije pokrenuta sa MASP-2 može dovesti do neravnoteže u hemostazi i rezultovati patologijom TMA. Prema tome, očekuje se da inhibicija MASP-2 upotrebom MASP-2 inhibitora, poput MASP-2 inhibitornog antitela koje blokira aktivaciju komplementa i koagulacionih sistema, poboljšava ishode u aHUS-u i drugim stanjima povezanim sa TMA.

Kao što je opisano u Primeru 37, pokazano je da inhibicija MASP-2 sa humanim MASP-2 inhibitornim antitelom (mAbH6) povećava vreme do venske okluzije u modelu tromboze sa povredom endotelskih

1

ćelija izazvanom FITC-dekstranom/svetlošću. U ovom TMA modelu, miševi su senzitizovani IV injekcijom FITC-dekstrana, praćenom lokalizovanom foto-aktivacijom FITC-dekstrana u mikrovaskulaturi mišjeg mišića kremastera (Thorlacius H i saradnici, Eur J Clin. Invest 30(9):804-10, 2000; Agero i saradnici, Toxicon 50(5):698-706, 2007).

Sledeći eksperiment je urađen da bi se utvrdilo da li je inhibitorno antitelo za MASP-2 (mAbH6) deluje sa dejstvom na obrazovanje tromba i okluziju sudova u mišjem modelu TMA koje zavisi od doze. Postupci: Lokalizovana tromboza je indukovana fotoaktivacijom dekstrana označenog fluorescein izotiocijanatom (FITC-dekstran) u mikrovaskulaturi mišjeg mišića kremastera C57 B1/6 miševa, a intravitalna mikroskopija je upotrebljena za merenje početka obrazovanja tromba i začepljenja sudova, upotrebom postupaka opisanih u Primeru 37, sa sledećim izmenama. Grupama miševa je intravenskim (iv) injeciranjem primenjivana različita doza mAbH6 (2 mg/kg, 10 mg/kg ili 20 mg/kg) ili izotipsko kontrolno antitelo (20 mg/kg) jedan sat pre indukcije TMA. Beleženo je zatim vreme do početka obrazovanja tromba i vreme do potpune okluzije sudova. Analiza reprodukcije video zapisa slika intravitalne mikroskopije snimljenih tokom 30 do 60 minuta, upotrebljena je za procenu veličine sudova, brzine protoka krvi, intenziteta svetlosti, stope početka obrazovanja tromba kao ekvivalenta adhezije trombocita, vremena do početka obrazovanja tromba, brzine ukupnog okluzije sudova i vreme do potpune okluzije sudova. Statistička analiza je sprovedena upotrebom programa SigmaPlot v12.0.

Rezultati:

Iniciranje obrazovanja tromba

[0675] SLIKA 49 je Kaplan-Majerov dijagram koji prikazuje procenat miševa sa trombovima u funciji vremena u trombotskoj mikroangiopatiji indukovanoj sa FITC-Dekstranom kod miševa tretiranih sa rastućim dozama inhibitornog antitela za humani MASP-2 (mAbH6 pri 2 mg/kg, 10 mg/kg ili 20 mg/kg) ili sa izotipskim kontrolnim antitelom. Kao što je prikazano na SLICI 49, iniciranje obrazovanja tromba je bilo odloženo kod miševa tretiranih sa mAbH6 na način koji je zavisio od doze u odnosu na kontrolno tretirane miševe.

[0676] SLIKA 50 grafički ilustruje medijanu vremena do početka (minuti) obrazovanja tromba u funkciji doze mAbH6 (*p<0,01 u poređenju sa kontrolom). Kao što je prikazano na SLICI 50, medijana vremena do početka obrazovanja tromba se povećavala sa povećanjem doza mAbH6 sa 6,8 minuta u kontrolnoj grupi na 17,7 minuta u grupi koja je tretirana sa mAbH6 u dozi od 20 mg/kg (p<0,01). Osnovni eksperimentalni podaci i statistička analiza su opisani u TABELAMA 14 i 15.

1 4

[0677] Vreme do početka obrazovanja tromba kod pojedinačnih miševa koje je beleženo na osnovu procena sa videografskog snimka i detaljno je opisano u TABELI 14.

TABELA 14: Vreme do početka obrazovanja tromba nakon povrede izazvane svetlošću

[0678] Statistička analiza za poređenje vremena do početka okluzije između kontrolnih i životinja tretiranih sa mAbH6 je prikazana u nastavku, u TABELI 15.

TABELA 15: Vreme do početka: podaci iz studije odgovora na dozu FITC Dekstrana

1

Mikrovaskularna okluzija

[0679] SLIKA 51 je Kaplan-Majerov dijagram koji prikazuje procenat miševa sa mikrovaskularnom okluzijom u funciji vremena kod trombotične mikroangiopatije indukovane sa FITC-Dekstranom u miševima tretiranim sa rastućim dozama inhibitornog antitela za humani MASP-2 (mAbH6 u dozama od 2 mg/kg, 10 mg/kg ili 20 mg/kg) ili sa izotipskim kontrolnim antitelom. Kao što je prikazano na SLICI 51, kompletna mikrovaskularna okluzija je bila odložena u grupama tretiranim sa mAbH6 u poređenju sa kontrolnim miševima.

[0680] SLIKA 52 grafički ilustruje medijanu vremena do mikrovaskularne okluzije u funkciji doze mAbH6 (*p<0,05 u poređenju sa kontrolom). Kao što je prikazano na SLICI 52, medijana vremena do kompletne mikrovaskularne okluzije se povećalo sa 23,3 minuta u kontrolnoj grupi na 38,6 minuta u grupi koja je tretirana sa 2 mg/kg mAbH6 (p<0,05). Doze od 10 mg/kg ili 20 mg/kg mAbH6 su se ponašale slično (medijana vremena do kompletne mikrovaskularne okluzije je iznosila 40,3, odnosno 38 minuta) kao i u grupi koja je tretirana sa 2 mg/kg mAbH6. Osnovni eksperimentalni podaci i statistička analiza su opisani u TABELAMA 16 i 17.

[0681] Vreme do kompletne okluzije sudova kod pojedinačnih miševa koje je beleženo na osnovu procena sa videografskog snimka i detaljno je opisano u TABELI 16.

TABELA 16: Vreme do kompletne okluzije nakon povrede izazvane svetlošću

[0682] Statistička analiza za poređenje vremena do kompletne okluzije između kontrolnih i životinja tretiranih sa mAbH6 je prikazana u nastavku, u TABELI 17.

1

TABELA 17: Vreme do kompletne mikrovaskularne okluzije: podaci iz studije odgovora na dozu FITC Dekstrana

Rezime

[0683] Kao što je sumirano u TABELI 18, iniciranje obrazovanja tromba je bilo odloženo kod miševa tretiranih sa mAbH6 na način koji zavisio od doze u odnosu na kontrolno tretirane miševe (medijana vremena do početka sa 10,4 na 17,7 minuta u odnosu na 6,8 minuta). Medijana vremena do potpune okluzije je značajno odložena u svim grupama tretiranim sa mAbH6 u odnosu na kontrolne grupe (Tabela 18).

TABELA 18: Medijana vremena do početka obrazovanja tromba i potpune okluzije

[0684] Ovi rezultati pokazuju da je mAbH6, humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za MASP-2 i blokira lektinski put sistema komplementa, smanjilo mikrovaskularnu trombozu na način koji je zavisio od doze, u eksperimentalnom mišjem modelu TMA. Očekuje se stoga da će primena inhibitornog agensa za MASP-2, kao što je to MASP-2 inhibitorno antitelo, biti efikasna terapija kod pacijenata koji

1

boluju od HUS, aHUS, TTP ili drugih mikroangiopatskih poremećaja kao što su drugi TMA, uključujući katastrofalni antifosfolipidni sindrom (CAPS), sistemsku Degosovu bolest i TMA nastao sekundarno u odnosu na kancer, hemoterapiju i transplantaciju i da obezbeđuje protekciju od mikrovaskularne koagulacije i tromboze.

PRIMER 40

[0685] Ovaj Primer opisuje identifikaciju, upotrebom prikaza u fagima, u potpunosti humanih scFv antitela koja se vezuju za MASP-2 i inhibiraju aktivaciju komplementa posredovanu lektinom, dok klasičan (zavisan od C1q) put i komponente alternativnog puta imunog sistema ostaju intaktne.

Pregled:

[0686] Potpuno humana anti-MASP-2 antitela visokog afiniteta su identifikovana skringom fagne biblioteke. Varijabilni fragmenti lakih i teških lanaca antitela su izolovani i u scFv formatu i u IgG formatu pune dužine. Humana anti-MASP-2 antitela su korisna za inhibiranje ćelijskih povreda povezanih sa aktivacijom alternativnog puta komplementa posredovanog lektinskim putem, dok klasična komponenta imunskog sistema (zavisna od C1q) ostaje intaktna. U pojedinim slučajevima, predmetna inhibitorna antitela za MASP-2 karakterišu sledeće osobine: (a) visok afinitet za humani MASP-2 (npr. KDod 10 nM ili manje) i (b) inhibiraju aktivnost komplementa zavisnu od MASP-2 u 90% humanom serumu sa IC50od 30 nM ili manje.

Postupci:

Ekspresija katalitički neaktivnog MASP-2 pune dužine:

[0687] Sekvenca cDNK pune dužine humanog MASP-2 (SEQ ID NO: 4), koja kodira humani MASP-2 polipeptid sa liderskom sekvencom (SEQ ID NO:5), subklonirana je u sisarski ekspresioni vektor pCI-Neo (Promega), koji pokreće eukariotsku ekspresiju pod kontrolom CMV pojačivačkog/promotorskog regiona (opisanog u Kaufman R.J. i saradnici, Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)). U cilju generisanja katalitički neaktivnog humanog MASP-2A proteina, izvršena je mutageneza usmerena na mesto kao što je opisano u US2007/0172483, ovde uključenom u vidu reference. PCR proizvodi su prečišćeni nakon elektroforeze na agaroznom gelu i pripreme traka, a preklapanja u po jednom adenozinu su generisana upotrebom standardnog postupka upoređivanja „repova“ sekvenci. MASP-2A sa “repom” adenozina je kloniran u pGEM-T easy vektor i transformisan je u E. coli. Humani MASP-2A je dalje subkloniran bilo u sisarski ekspresioni vektor pED ili pCI-Neo.

1

[0688] MASP-2A ekspresioni konstrukt koji je prethodno opisan je transfektovan u DXB1 ćelije upotrebom standardnog postupka transfekcije sa kalcijum-fosfatom (Maniatis i saradnici, 1989). MASP-2A je proizveden u medijumu bez seruma da bi se osiguralo da preparati nisu kontaminirani drugim serumskim proteinima. Medijumi su prikuljeni sa konfluentnih ćelija svakog drugog dana (ukupno četiri puta). Nivo rekombinantnog MASP-2A je u proseku iznosio približno 1,5 mg/litru medijuma za kulturu. MASP-2A (Ser-Ala mutant koji je prethodno opisan) je prečišćen afinitetnom hromatografijom na MBP-A-agaroznim kolonama

MASP-2A ELISA na klonovima kandidatima za ScFv identifikovanim pretraživanjem/scFv konverzijom i filter skriningom

[0689] Fagne biblioteka sekvenci varijabilnih regiona lakih i teških lanca humanih imunoglobulina je podvrgnuta pretraživanju sa antigenom, nakon čega su sledili automatizovan skrining antitela i selekcija da bi se identifikovala scFv antitela visokog afiniteta za humani MASP-2 protein. Urađene su tri serije paniranja scFv fagene biblioteke sa MASP-2A obeleženim sa HIS-tagom ili biotinom. Treća runda paniranja je najpre eluirana sa MBL, a zatim i sa TEA (alkalna). Da bi se ispratilo specifično obogaćivanje faga koji prikazuju fragmente scFv za ciljni MASP-2A, urađena je ELISA poliklonskih faga sa imobilisanim MASP-2A. ScFv geni iz serije 3 paniranja su klonirani u ekspresioni vektor pHOG i propušteni su radi skrininga na filteru malog obima da bi se potražili specifični klonovi na MASP-2A.

[0690] Selektovane su bakterijske kolonije iz treće serije koje su sadržavale plazmide koji su kodirali scFv fragmente, nakon čega su postavljene u vidu mreže na nitrocelulozne membrane i gajene preko noći u neindukujućem medijumu da bi se proizvele master ploče. Ukupno je 18.000 kolonija izabrano i analizirano iz trećeg kruga paniranja, pri čemu je polovina bila iz kompetitivne elucije, a polovina iz naknadne TEA elucije. Paniranje scFv fagemidne biblioteke na MASP-2A je pratila konverzija scFv i skrining na filteru, čime je dobijeno 137 pozitivnih klonova.108/137 klonova je bilo pozitivno u ELISA testu vezivanje za MASP-2 (podaci nisu prikazani), od kojih je kod 45 klonova dalje analizirana sposobnost blokiranja aktivnosti MASP-2 u normalnom humanom serumu.

Analiza za merenje inhibicije obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta

[0691] Funkcionalna analiza koja meri inhibiciju obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta je upotrebljavana za procenu "blokirajućih aktivnosti" klonova kandidata za MASP-2 scFv. Aktivnost MASP-2 serinske proteaze je potrebna da bi se generisale dve proteinske komponente (C4b, C2a) koje čine C3 konvertazu lektinskog puta. Prema tome, MASP-2 scFv koji inhibira funkcionalnu aktivnost MASP-2 (tj. blokirajući MASP-2 scFv), inhibiraće de novo obrazovanje C3 konvertaze lektinskog puta. C3 sadrži neobičnu i visoko reaktivnu tioestarsku grupu kao deo svoje strukture. Nakon cepanja C3 sa

1

C3 konvertazom u ovoj analizi, tioestarska grupa na C3b može obrazovati kovalentnu vezu sa hidroksilnim ili amino grupama na makromolekulama imobilisanim na dnu plastičnih bunarića preko estarskih ili amidnih veza, što olakšava detekciju C3b u ELISA testu.

[0692] Manan kvasca je poznat aktivator lektinskog puta. U sledećem postuku za merenje obrazovanja C3 konvertaze, plastične bunarići obloženi sa mananom su inkubirani sa razblaženim humanim serumom da bi se aktivirao lektinski put. Bunarići su zatim isprani i analizirana je C3b imobilisana u bunarićima upotrebom standardnih ELISA postupaka. Količina C3b generisane u ovoj analizi je direktan odraz de novo obrazovanje C3 konvertaze lektinskog puta. U ovoj analizi je dalje ispitivana sposobnosti MASP-2 scFv klonova da u odabranim koncentracijama inhibiraju obrazovanje C3 konvertaze i posledično obrazovanje C3b.

Postupci:

[0693] 45 klonova kandidata koji su identifikovani kao što je to prethodno opisano, eksprimirani su, prečišćeni i razblaženi do iste koncentracije osnovnog rastvora, koji je dalje ponovo razblaživa u GVB puferu (4,0 mM barbital, 141 mM NaCl, 1,0 mM MgCl2, 2,0 mM CaCl2, 0,1% želatina, pH 7,4) koji je sadržavao Ca<++>i Mg<++>, a da bi se osiguralo da svi klonovi imaju istu količinu pufera. Klonovi scFv su ispitivani u triplikatima, u koncentraciji od 2 μg/mL. Pozitivna kontrola je bila OMS100 Fab2 i ispitivan je na 0,4 µg/mL. Obrazovanje C3c je praćeno u prisustvu i odsustvu scFv/IgG klonova.

[0694] Manan je razblaživan do koncentracije od 20 µg/mL (1 µg/bunariću) u 50mM karbonatnom puferu (15mM Na2CO3+ 35mM NaHCO3+ 1,5 mM NaN3), pH 9,5, pa je njime oblagana ELISA ploča preko noći, na 4°C. Sledećeg dana, ploče obložene mananom su isprane 3 puta sa 200 μl PBS-a. Zatim je u bunariće dodato po 100 μl 1% HSA rastvora za blokiranje i ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane 3 puta sa po 200 μl PBS i dalje su čuvane na ledu sa 200 μl PBS-a do dodavanja uzoraka.

[0695] Normalni humani serum je razblažen do 0,5% u CaMgGVB puferu, pa su dodati scFv klonovi ili OMS100 Fab2 kao pozitivna kontrola, u triplikatima za 0,01 μg/ml; 1 µg/ml (kontrola sa samo OMS100) i 10 µg/ml u ovom pugeru, nakon čega je sve prethodno inkubirano 45 minuta na ledu pre dodavanja u blokiranu ELISA ploču. Reakcija je započeta inkubacijom tokom jednog sata na 37°C, pa je zaustavljena prenošenjem ploča u ledeno kupatilo. Deponovanje C3b je detektovano sa zečjim αmišjim C3c antitelom praćenim kozjim α-zečjim HRP. Negativna kontrola je predstavljala pufer bez antitela (bez antitela = maksimalno deponovanje C3b), dok je pozitivna kontrola bio pufer sa EDTA (bez deponovanja C3b). Signal pozadine je određen izvođenjem iste analize uz izuzetak što su bunarići bili bez manana. Signal pozadine u pločama bez manana je oduziman od signala bunarića obloženih

2

mananom. Granični kriterijum je bio postavljen na polovinu aktivnosti irelevantnog scFv klona (VZV) i samog pufera.

[0696] Rezultati: Na osnovu graničnog kriterijuma, utvrđeno je da ukupno 13 klonova blokira aktivnost MASP-2. Svih 13 klonova koji su proizveli supresije puta za >50% su selektovani i sekvencirani, i tako je dobijeno 10 jedinstvenih klonova. Utvrđeno je zatim da je svih deset klonova sa istom potklasom lakog lanca, λ3, ali i sa tri različite potklase teškog lanca: VH2, VH3 i VH6. U funkcionalnoj analizi, pet od deset kandidovanih scFv klonova je bilo sa IC50vrednošću u nM manjom od ciljnog kriterijuma od 25 nM uz upotrebu 0,5% humanog seruma.

[0697] Da bi se identifikovala antitela sa poboljšanom potencijom, tri matična scFv klona, identifikovana kao što je prethodno opisano, podvrgnuta su mešanju lakih lanaca. Ovaj proces je uključivao obrazovanje kombinatorne biblioteke koja se sastojala od VH svakog od matičnih klonova uparenih sa bibliotekom naivnih, humanih lambda lakih lanaca (VL) izvedenih od šest zdravih davalaca. Ova biblioteka je zatim pregledana za scFv klonove sa poboljšanim afinitetom vezivanja i/ili funkcionalnošću.

TABELA 19: Poređenje funkcionalne potencije u IC50(nM) za vodeće ćerke-klonove

i njihovih odgovarajuće matične klonove (svi u scFv formatu)

[0698] U nastavku su predstavljene sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) za matične i ćerkeklonove koji su prethodno prikazani u TABELI 19 i navedeni u vidu liste u nastavku, u TABELAMA 20A-F.

[0699] Kabat numeracija CDR sekvenci (31-35 (HI), 50-65 (H2) i 95-102 (H3)) je naznačena podebljanim slovima; CDR sekvence su podvučene za numeraciju po Čotiji (26-32 (HI), 52-56 (H2) i 95-101 (H3)).

[0700] 17D20_35VH-21N11VL varijabilni region teškog lanca (VH) (SEQ ID NO: 67, kodiran sa SEQ ID NO: 66)

2 1

[0701] d17N9 varijabilni region teškog lanca (VH) (SEQ ID NO: 68)

Varijabilni region teškog lanca

[0702]

TABELA 20A: Teški lanac (ak 1-20)

TABELA 20A: Teški lanac ak 21-40

TABELA 20C: Teški lanac ak 41-60

TABELA 20D: Teški lanac (ak 61-80)

2 2

TABELA 20E: Teški lanac ak 81-100

TABELA 20F: Teški lanac ak 101-118

[0703] U nastavku su predstavljene sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) za majke klonove i ćerke klonove, u vidu liste u TABELAMA 21A-F.

[0704] Kabat numeracija CDR sekvenci (24-34 (L1); 50-56 (L2); i 89-97 (L3) je naznačena podebljanim slovima; CDR sekvence su podvučene za numeraciju po Čotiji (24-34 (L1); 50-56 (L2) i 89-97 (L3) su podvučeni. Ovi regioni su isti bez obzira da li su numerisani po Kabatovom ili Čotija sistemu.

[0705] 17D20m d3521N11 varijabilni region lakog lanca (VL) (SEQ ID NO: 70, kodiran sa SEQ ID NO: 69)

[0706] 17N16m_d17N9 varijabilni region lakog lanca (VL) (SEQ ID NO: 71)

2

TABELA 21B: Laki lanacak 21-40

TABELA 21C: Laki lanacak 41-60

TABELA 21D: Laki lanacak 61-80

TABELA 21E: Laki lanacak 81-100

TABELA 21F: Laki lanacak 101-120

24

[0707] MASP-2 antitela OMS100 i MoAt_d3521N11VL, (koja sadrže varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID NO:70, takođe označena kao "OMS646" i "mAbH6"), pri čemu je za oba pokazano da se vezuju za humani MASP-2 sa visokim afinitetom i da imaju sposobnost da blokiraju funkcionalnu aktivnost komplementa, analizirana su u pogledu vezivanje epitopa dot blot analizom. Rezultati pokazuju da su OMS646 i OMS100 antitela visoko specifična za MASP-2 i da se ne vezuju za MASP-1/3, Nijedno od ovih antitela se nije vezivalo za MAp19, niti za fragmente MASP-2 koji nisu sadržavali CCP1 domen iz MASP-2, što dovodi do zaključka da mesta vezivanja obuhvataju CCP1.

[0708] Utvrđeno je da se anti-MASP-2 antitelo OMS646 sa aviditetom vezuje za rekombinantan MASP-2 (Kd 60-250pM) sa selektivnošću većom >5000 puta u poređenju sa C1s, C1r ili MASP-1 (pogledati TABELU 22 ispod):

TABELA 22: Afinitet i specifičnost interakcije OMS646 MASP-2 antitela sa MASP-2 procenjene ELISA studijama na čvrstoj fazi

OMS646 specifično blokira aktivaciju terminalnih komponenti komplementa zavisnu od lektina

Postupci:

[0709] Efekat OMS646 na deponovanje litičkog kompleksa (MAC) je analiziran upotrebom uslova specifičnih za lektinski put, klasičan put i alternativni put. U tu svrhu, upotrebljen je Comp300 komplet za skrining komplementa komanije Wieslab (Wieslab, Lund, Švedska) po uputstvima proizvođača.

Rezultati:

[0710] SLIKA 53A grafički ilustruje nivo deponovanja MAC u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) pod uslovima ispitivanja specifičnim za lektinski put. SLIKA 53B grafički ilustruje nivo deponovanja MAC u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) u uslovima ispitivanja

2

specifičnim za klasičan put. SLIKA 53C grafički ilustruje nivo deponovanja MAC u prisustvu ili odsustvu anti-MASP-2 antitela (OMS646) pod uslovima specifičnim za alternativni put.

[0711] Kao što je prikazano na SLICI 53A, OMS646 blokira aktivaciju MAC deponovanja posredovanu lektinskim putem sa IC50vrednošću od približno 1nM. Ipak, OMS646 nije imao efekta na deponovanje MAC generisano aktivacijom posredovanom klasičnim putem (SLIKA 53B) ili aktivacijom posredovanom alternativnim putem (SLIKA 53C).

Farmakokinetika i farmakodinamika OMS646 nakon intravenske (IV) ili supkutane (SC) primene miševima

[0712] Farmakokinetika (PK) i farmakodinamika (PD) OMS646 su analizirane u PK/PD studiji trajanja do 28 dana nakon njegove jednokratne primene miševima. Studija je ispitivala dozne nivoe od 5 mg/kg i 15 mg/kg OMS646 primenjenog supkutano (SC), kao i nivo doze od 5 mg/kg OMS646 primenjen intravenski (IV).

[0713] U pogledu PK profila OMS646, SLIKA 54 grafički ilustruje koncentraciju OMS646 (srednju vrednost za n=3 životinje/grupe) u funkciji vremena nakon primene OMS646 u naznačenoj dozi. Kao što je prikazano na SLICI 54, pri 5 mg/kg SC, OMS646 je postigao maksimalnu koncentraciju u plazmi od 5-6 ug/mL približno 1-2 dana nakon primene doze. Bioraspoloživost OMS646 kod 5 mg/kg SC približno je iznosila 60%. Kao što je dalje prikazano na SLICI 54, sa 15 mg/kg SC, OMS646 je postigao maksimalnu koncentraciju u plazmi od 10-12 ug/mL približno 1 do 2 dana nakon primene doze. Kod svih grupa, OMS646 je polako izbacivan iz sistemske cirkulacije sa krajnjim poluživotom od približno 8-10 dana. Profil za OMS646 je uobičajen za humana antitela kod miševa.

[0714] PD aktivnost OMS646 je grafički ilustrovana na SLIKAMA 55A i 55B. SLIKE 55A i 55B pokazuju PD odgovor (pad sistemske aktivnosti lektinskog puta) za svakog miša u grupama za 5 mg/kg IV (SLIKA 55A) i 5 mg/kg SC (SLIKA 55B). Isprekidana linija označava osnovnu liniju analize (maksimalna inhibicija; naivni mišji serum je in vitro spajkovan sa viškom OMS646 pre analize). Kao što je prikazano na SLICI 55A, nakon IV primene 5 mg/kg OMS646, sistemska aktivnost lektinskog puta se odmah spustila na nivo koji se ne može detektovati, a aktivnost lektinskog puta je pokazala samo umereni oporavak tokom perioda posmatranja od 8 dana. Kao što je prikazano na SLICI 55B, kod miševa kojima je primenjivana doza od 5 mg/kg OMS646 SC, uočena je vremenski zavisna inhibicija aktivnosti lektinskog puta. Aktivnost lektinskog puta je pala na nivo koji se gotovo nije mogao detektovati u roku od 24 sata nako primene leka i zadržao se na niskom nivou najmanje 7 dana. Aktivnost lektinskog puta se s vremenom postepeno povećavala, ali se nije vratila na nivo pre primene doze u periodu posmatranja od 28 dana. Aktivnost lektinskog puta u odnosu na vremenski profil uočen nakon primene 15 mg/kg SC, bio je sličan profilu za SC dozu od 5 mg/kg (podaci nisu prikazani), što ukazuje na zasićenost krajnje

2

tačke PD. Podaci su dalje ukazali da su nedeljne doze od 5 mg/kg OMS646, primenjene bilo IV ili SC, dovoljne za postizanje kontinuirane supresije sistemske aktivnosti lektinskog puta kod miševa.

PRIMER 41

[0715] Ovaj primer pokazuje da MASP-2 inhibitorno antitelo (OMS646) inhibira deponovanje komplementa C5b-9 indukovanog aHUS serumom na površini aktiviranih humanih mikrovaskularnih endotelnih ćelija (HMEC-1) nakon izlaganja serumu iz pacijenata sa atipičnim hemolitičkim uremijskim sindromom (aHUS) koji su uzimani tokom akutne faze i faze remisije bolesti.

[0716] Uvod/Obrazloženje: Studija koja seldi je rađena da bi se analiziralo deponovanje komplementa C5b-9 indukovano aHUS serumom na površini aktiviranih HMEC-1 ćelija nakon izlaganja serumu aHUS pacijenta dobijenih (1) tokom akutne faze i (2) tokom faze remisije bolest u prisustvu ili odsustvu OMS646, anti-MASP-2 antitela koje se specifično vezuje za MASP-2 i inhibira aktivaciju lektinskog puta.

Postupci:

[0717] Pacijenti: Četiri pacijenta sa aHUS-om, koji su proučavani tokom akutne faze oboljenja i tokom remisije, izabrana su za ovu studiju među onima koji su bili uključeni u Međunarodni registar za HUS/TTP i genotipizovani od strane Laboratorija za imunologiju i genetiku transplantacije i retkih bolesti Instituta Mario Negri. Jedan aHUS pacijent je bio sa heterozigotnom mutacijom p.R1210C komplementnog faktora H (CFH), jedan je imao anti-CFH autoantitela, dok kod druga dva aHUS pacijenta nisu pronađene mutacije ili antitela na CFH.

[0718] Tabele 23 i 24 sumiraju rezultate skrininga za mutacije gena komplementa i anti-CFH autoantitela kod četiri pacijenta sa aHUS koji su analizirani u ovoj studiji, zajedno sa kliničkim i biohemijskim podacima izmerenim bilo tokom akutne faze ili tokom remisije.

TABELA 23: Klinički parametri kod četiri pacijenta sa aHUS-om u ovoj studiji

2

TABELA 24: Parametri komplementa kod četiri pacijenta sa aHUS u ovoj studiji

[0719] Eksperimentalni postupci: Ćelije iz humane mikrovaskularne endotelne ćelijske linije (HMEC-1) dermalnog porekla, postavljene su na staklene pločice i upotrebljene su kada su dostigle konfluentnost. Konfuentne HMEC-1 ćelije su aktivirane sa 10 µM ADP-om (adenozin difosfatom) tokom 10 minuta, nakon čega su inkubirane četiri sata sa serumom iz četvorice od pacijenata sa aHUS koji su prethodno opisani u Tabelama 23 i 24, a koji su prikupljani ili tokom akutne faze bolesti ili su bili iz istih aHUS pacijenata u remisiji ili su bili iz 4 zdrava kontrolna subjekta. Serum je razblaživan u odnosu od 1:2 sa medijumom za ispitivanje (HBSS sa 0,5% BSA) u prisustvu ili u odsustvu MASP-2 inhibitornog antitela, OMS646 (100 ug/ml), generisanog kako je prethodno opisano u Primeru 40, ili u prisustvo solubilnog receptora komplementa tipa 1 (sCR1) (150 µg/mL), kao pozitivnom kontrolom za inhibiciju komplementa. Na kraju koraka inkubacije, HMEC-1 ćelije su tretirane zečjim anti-humanim komplementom C5b-9, nakon čega je sledila primena FITC-konjugovanog sekundarnog antitela. U svakom eksperimentu, serum jedne zdrave kontrole je ispitivan paralelno sa serumom aHUS pacijenta (u akutnoj fazi i remisiji). Za snimanja fluorescentnog bojenja na površini endotelnih ćelija, upotrebljen je invertovan konfokalni laserski mikroskop. Snimano je petnaest polja po uzorku i površina prekrivena fluorescentnim bojenjem je procenjivana automatskom detekcijom ivica upotrebom internih specifičnih fukcija kompjuterskog programa Image J, koja je dalje izražena u vidu piksel<2>po analiziranom polju. Polja sa najmanjim i najvišim vrednostima su isključena iz izračunavanja.

2

[0720] U statističkoj analizi (jednofaktorska ANOVA, praćena Tukijevim testom za višestruka poređenja) razmatrani su rezultati u pikselima<2>, sa 13 polja kod svakog eksperimentalnog stanja i za svakog pacijenta, a upotrebljavana je i kontrola.

Rezultati:

[0721] Rezultati analize deponovanja komplementa sa serumima iz četiri aHUS pacijenta su sumirani u nastavku, u Tabeli 25A, a rezultati sa serumima iz četiri zdrava ispitanika su sumirani ispod, u Tabeli 25B.

TABELA 25A: Efekat inhibitora komplementa na deponovanje C5b-9 indukovanog sa aHUS serumom, na HMEC-1 ćelijama aktiviranim sa ADP-om

TABELA 25B: Efekat inhibitora komplementa na serume četiri zdrava kontrolna subjekta (koji ne boluju od aHUS) na deponovanje C5b-9, na HMEC-1 ćelijama aktiviranim sa ADP-om

Za tabele 25A i 25B: Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± SE. °P<0,001 u odnosu na kontrolu; *P<0,001, **P<0,01 u odnosu na netretiranog pacijenta u akutnoj fazi aHUS; §P<0,001, §§P<0,01, §§§P<0,05 u odnosu na netretiranog pacijenta u fazi remisije aHUS.

2

[0722] Slika 56 grafički ilustruje inhibitorni efekat anti-MASP-2 antitela (OMS646) i sCR1 na deponovanje C5b-9 indukovano sa aHUS serumom, na HMEC-1 ćelijama aktiviranim sa ADP-om. Na slici 56, podaci predstavljaju srednje vrednosti ± SE. °P<0,001 u odnosu na kontrolu; *P<0,0001 u odnosu na netretiranog pacijenta u akutnoj fazi aHUS; ^P<0,0001 u odnosu na pacijenta u akutnoj fazi aHUS sCR1; §P<0,0001 u odnosu na na netretiranog pacijenta u fazi remisije aHUS i #P<0,0001 u odnosu na pacijenta u fazi remisije aHUS sCR1.

[0723] Kao što je prikazano u Tabelama 25A, 25B i na Slici 56, HMEC-1 ćelije stimulisane sa ADP-om koje su bile izložene serumu pacijenata sa aHUS (prikupljenom bilo u akutnoj fazi ili u remisiji) tokom četiri sata u statičkim uslovima, pokazale su intenzivno deponovanje C5b-9 na ćelijskoj površini što je detektovano konfokalnom mikroskopijom. Merenjem površine pokrivene sa C5b-9, uočena je znatno veća količina deponovanja C5b-9 na ćelijama izloženim serumu pacijenata sa aHUS nego na ćelijama izloženim serumu zdravih kontrolnih subjekata, bez obzira da li je serum uzet u aktutnoj fazi ili u remisiji aHUS. Nije uočena razlika u naslagama endotelnog C5b-9 indukovanog serumom između seruma akutne faze i remisije.

[0724] Kao što je dalje prikazano u Tabelama 25A, 25B i na Slici 56, dodavanje MASP-2 antitela OMS646 u aHUS serum (prikupljen iz pacijenata bilo u akutnoj fazi ili u remisiji) dovelo je do značajnog smanjenja deponovanja C5b-9 na površini endotelnih ćelija u poređenju sa netretiranim aHUS serumom. Ipak, inhibitorni efekat OMS646 na deponovanje C5b-9 bio je manje izražen u odnosu na efekte koje je ispoljio pan-inhibitor komplementa, sCR1. Zaista, uočena je statistički značajna razlika između naslaga C5b-9 indukovanih aHUS serumom u prisustvu OMS646 u odnosu na sCR1 (Slika 56 i Tabele 25A i 25B).

[0725] Kada je bila izračunata srednja vrednost za četiri pacijenta sa aHUS-om, procenti smanjenja naslaga C5b-9 (u poređenju sa naslagama C5b-9 indukovanim netretiranim serumom iz istog pacijenta kome je dodeljena vrednost od 100%) koji su uočeni u prisustvu inhibitora komplementa su bili sledeći:

Akutna faza:

[0726]

sCR1 (150 ug/ml): smanjenje naslaga C5b-9 od 91%

OMS646 (100 ug/ml): smanjenje naslaga C5b-9 od 40%

Faza remisije:

[0727]

sCR1 (150 ug/ml): smanjenje naslaga C5b-9 od 91%

OMS646 (100 µg/ml): smanjenja naslaga C5b-9 od 54%

21

[0728] Zaključak: Rezultati opisani u ovom Primeru pokazuju da je lektinski put komplementa stimulisan aktiviranim mikrovaskularnim endotelskim ćelijama i da je ova stimulacija značajan pokretač prekomernog odgovora u vidu aktivacije komplementa koji je karakterističan za aHUS. Pokazano je takođe da se ova stimulacija lektinskog puta i rezultujući prekomerni odgovor u vidu aktivacije komplementa javljaju i tokom akutne faze i u kliničkoj remisiji aHUS. Štaviše, deluje da ovaj nalaz nije ograničen na bilo koji određeni defekt komplementa povezan sa aHUS-om. Kao što je dodatno prikazano u ovom Primeru, selektivna inhibicija lektinskog puta sa MASP-2 inhibitornim antitelom poput OMS646, smanjuje deponovanje komplementa kod aHUS pacijenata sa različitim etiologijama.

PRIMER 42

[0729] Ovaj primer pokazuje da MASP-2 inhibitorno antitelo (OMS646) inhibira agregaciju trombocita indukovanu sa aHUS serumom i da obrazovanje tromba na površini aktiviranih humanih mikrovaskularnih endotelnih ćelija (HMEC-1) nakon izlaganja serumu pacijenta obolelih od aHUS koji je uzet tokom (1) akutne faze i (2) faze remisije aHUS.

Postupci:

[0730] Pacijenti: Tri pacijenta (pacijenti br. 1, br. 2 i br. 4, opisani u Tabelama 23, 24, 25A i 25B u Primeru 41) sa aHUS-om (jedan pacijent je imao heterozigotnu mutaciju p.R1210C CFH, dok nije bilo mutacije ili anti-CFH antitela koja su pronađena kod druga dva pacijenta) proučavani su i tokom akutne faze bolesti i tokom remisije. Pacijenti za ovu studiju su izabrani među onima koji su bili uključeni u Međunarodni registar za HUS/TTP i bili su genotipizovani od strane Laboratorija za imunologiju i genetiku transplantacije i retkih bolesti Instituta Mario Negri. Pet zdravih ispitanika je takođe izabrano od davaoca krvi za eksperimente perfuzije.

[0731] Postupci: Konluentne HMEC-1 ćelije su bile aktivirane sa 10 µM ADP-a tokom 10 minuta, nakon čega su inkubirane tokom tri sata sa serumima iz tri aHUS pacijenta (pacijenti br. 1, 2 i 4 opisani u Primeru 41) koji su bili priključljani tokom akutne faze bolesti, ili iz istih pacijenata u remisiji, ili sa kontrolnim serumima zdravih ispitanika. Serum je razblaživan u odnosu 1:2 sa medijumom za analizu (HBSS sa 0,5% BSA), u prisustvu ili u odsustvu MASP-2 inhibitornog antitela, OMS646 (100 μg/ml), generisanog kao što je opisano u Primeru 40; ili sa sCR1 (150 μg/mL), kao pozitivnom kontrolom za inhibiciju komplementa. Za pacijente br.1 i br.2 su inkubirani i dodatni bunarići sa serumima (iz akutne faze i remisije) koji su bili razlaženi u odnosu do 1:2 sa medijumom za analizu koji je sadržavao 100 µg/mL nerelevantnog izotipskog kontrolnog antitela ili je bio sa 20 µg/mL OMS646 (za drugonavedeno, slučaj br.1 je ispitivan samo u remisiji, a slučaju br.2 i tokom akutne faze i tokom remisije).

[0732] Na kraju koraka inkubacije, HMEC-1 ćelije su perfundovane u protočnoj komori sa heparinizovanom punom krvlju (10 UI/ml) koja je dobijena iz zdravih ispitanika (koja je sadržavala fluorescentnu boju mepakrin koja obeležava trombocite) uz stres cepanja koji se sreće u mikrocirkulaciji (60 dina/cm<2>, tri minuta). Nakon tri minuta perfuzije, jednoslojne endotelne ćelije su fiksirane u acetonu. Zatim je po petnaest slika po uzorku za trombove trombocita na površini endotelnih ćelija snimljeno invertnim konfokalnim laserskim mikroskopom, nakon čega su prekrivene površine analizirane upotrebom programa Image J. Polja u kojima su detektovane najniže i najviše vrednosti su isključena iz izračunavanja.

[0733] U statističkoj analizi (jednofaktorska ANOVA, praćena Tukijevim testom za višestruka poređenja) razmatrani su rezultati u pikselima<2>, sa 13 polja kod svakog eksperimentalnog stanja i za svakog pacijenta, a upotrebljavana je i kontrola.

Rezultati:

[0734] Rezultati eksperimenata za analizu obrazovanja tromba sa serumima iz tri pacijenta sa aHUS-om su sumirani u nastavku, u Tabeli 26A, dok su rezultati sa serumima pet zdravih ispitanika sumirani ispod, u Tabeli 26B.

TABELA 26A: Efekat inhibitora komplementa na obrazovanje tromba indukovanog sa aHUS serumom (piksel)<2>± SE) na HMEC-1 ćelijama aktiviranim sa ADP-om

TABELA 26B: Efekat inhibitora komplementa na serume pet zdravih kontrolnih subjekata (koji ne boluju od aHUS) u analizi obrazovanja tromba (piksel<2>± SE) na HMEC-1 ćelijama aktiviranim sa ADP-om

Za tabele 26A i 26B: Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± SE. °P<0,001 u odnosu na kontrolu; *P<0,001, ***P<0,05 u odnosu na netretiranog pacijenta u akutnoj fazi aHUS; §P<0,001, §§§P<0,05 u odnosu na netretiranog pacijenta u fazi remisije aHUS.

[0735] Slika 57 grafički ilustruje efekat anti-MASP-2 antitela (OMS646) i sCR1 na obrazovanje tromba indukovanog sa aHUS serumom na HMEC-1 ćelijama aktiviranim ADP-om. Na slici 57, prikazani podaci su srednja vrednost ± SF. °P<0,0001, °°P<0,01 u odnosu na kontrolu; *P<0,0001, **P<0,01 u odnosu na netretiranog pacijenta u akutnoj fazi aHUS; §P<0,0001 u odnosu na netretiranog pacijenta u fazi remisije aHUS.

[0736] Kao što je prikazano u Tabeli 26A i na Slici 57, uočen je značajan porast površine pokrivene trombovima na HMEC-1 ćelijama tretiranim sa aHUS serumom koji je prikuplja bilo tokom akutne faze ili u fazi remisije, u poređenju sa ćelijama koje su izlagane serumu zdravih kontrolnih subjekata (Tabela

21

26B i Slika 57). Kao što je prikazano na Slici 57 i u Tabeli 26A, OMS646 (i 100 μg/ml i 20 μg/ml) je doveo do delimične inhibicije obrazovanja tromba na ćelijama koje su bile prethodno izlagane aHUS serumu uzetom tokom akutne faze. Anti-trombogeni efekat je bio uporediv između dve različite doze OMS646 i nije se razlikovao od efekta sCR1 (Slika 57 i Tabela 26A). Dodavanje irelevantnog izotipskog kontrolnog antitela nije ispoljilo inhibitorni efekat na obrazovanje tromba indukovano sa aHUS serumom.

[0737] Kao što je dodanto prikazano na Slici 57 i u Tabeli 26A, inhibitorni efekat OMS646 bio je još očigledniji kod aHUS seruma prikupljenog tokom faze remisije. Zapravo, dodavanje OMS646, bilo u dozi od 100 μg/ml ili 20 μg/ml, serumu aHUS pacijenta prikupljenom u fazi remisije, doveo je do skoro potpune inhibicije obrazovanja tromba, slično onoj koja je uočena pri dodavanju sCR1. Irelevantno izotipsko kontrolno antitelo nije ispoljilo značajno inhibitorno dejstvo.

[0738] Kada je bila izračunata srednja vrednost za tri pacijenta sa aHUS-om, procenti smanjenja površine HMEC-1 prekrivene naslagama tromba (u poređenju sa površinom tromba indukovanom netretiranim serumima iz istih pacijenata kojima je dodeljena vrednost od 100%) koji su zabeleženi za inhibitore komplementa su bili sledeći:

Akutna faza:

[0739]

sCR1 (150 μg/ml): smanjenje od 60%

OMS646 (100 µg/ml): smanjenje od 57%

OMS646 (20 μg/ml): smanjenje od 45%

Faza remisije:

[0740]

sCR1 (150 ug/ml): smanjenje od 85%

OMS646 (100 µg/ml): smanjenje od 79%

OMS646 (20 ug/ml): smanjenje od 89%

Diskusija rezultata:

[0741] Rezultati u ovom Primeru pokazuju da inhibitorno antitelo za MASP-2, kao što je OMS646 (generisano kao što je opisano u Primeru 40), ispoljava snažan inhibitorni efekat na obrazovanje tromba indukovanod sa aHUS serumom na ćelijama HMEC-1. Iznenađujuće, inhibitorni efekat OMS646 na obrazovanje tromba je bio veći od njegovog efekta na naslage C5b-9 indukovano na HMEC-1 (kao što je opisano u Primeru 41). Takođe je iznenađujuće da je dodavanje OMS646, u dozi i od 100 µg/ml i 20 µg/ml, serumu aHUS pacijenta prikupljenom u fazi remisije, dovelo do gotovo potpune inhibicijom obrazovanja tromba. Još jedan iznenađujući nalaz je bilo zapažanje da je OMS646 i u akutnoj fazi i u remisiji bio efektivan koliko i pozitivna kontrola sCR1, koji je širok i gotovo potpun inhibitor sistema komplementa (Weisman H. i saradnici, Science 249:146-151, 1990; Lazar H. i saradnici, Circulation 100:1438-1442, 1999).

[0742] Primećeno je i da je kontrolni serum zdravih ispitanika takođe indukovao umereno obrazovanje tromba na HMEC-1 ćelijama. Nismo međutim primetili dosledan inhibitorni efekat na obrazovanje tromba iindukovano kontrolnim serumom ni sa OMS646 ni sa sCR1. Bez želje da bude vezano za neku određenu teoriju, veruje se da trombovi indukovani kontrolma ne zavise od komplementa, što podržava i činjenica i vrlo niskih naslaga C5b-9 koje su uočene na HMEC-1 ćelijama koje su bile inkubirane sa kontrolnim serumom (polgedati Primer 41).

Zaključak:

[0743] U zaključku, deluje da je detektovan antitrombotski efekat MASP-2 inhibitornog antitela, kao što je OMS646, načajno veći od onog koji bi se očekivao na osnovu inhibitornog efekta OMS646 na deponovanje C5b-9 koje je uočeno u ovom eksperimentalnom sistemu (kao što je opisano u Primeru 41 i prikazano na Slici 56). Na primer, kao što je opisano u Gastoldi i saradnici, Imunobiology 217:1129-1222 Apstrakt 48 (2012) pod naslovom "C5a/C5aR interaction mediates complement activation and thrombosis on endothelial cells in atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS)", utvrđeno je da dodavanje C5 antitela koje inhibira naslage C5b-9 (smanjenje od 60%) ograničava obrazovanje tromba na HMEC-1 u uporedivoj meri (smanjenje od 60%). Nasuprot tome, MASP-2 inhibitorno antitelo (OMS646 do 100 µg/mL) je inhibiralo obrazovanje naslaga C5b-9 sa srednjim vrednostima (akutna faza = smanjenje od 40%; faza remisije = smanjenje od 54%); kao i inhibiciju obrazovanje tromba u znatno većem procentu (akutna faza = smanjenje od 57%; faza remisije = smanjenje od 79%). U svhu poređenja, treba istači da je OMS646 inhibirao deponovanje komplementa u nižem procentu od inhibitora pozitivne kontrole komplementa (sCR1 od 150 µg/ml, inhibicija akutne faze deponovanja C5b-9 = smanjenje od 91%; faza remisije = smanjenje od 91%), ali je bio podjednako efikasan kao pozitivna kontrola sCR1 u inhibiranju obrazovanja tromba (sCR1 od 150 µg/ml, akutna faza = smanjenje od 60%; faza remisije = smanjenje od 85%). Ovi rezultati pokazuju da je MASP-2 inhibitorno antitelo (npr. OMS646) iznenađujuće efektivno u inhibiranju obrazovanja tromba u serumu dobijenom od aHUS subjekata kako u akutnoj fazi tako i u fazi remisije.

[0744] U skladu sa prethodno navedenim, u jednom slučaju koji je ovde opisan je postupak inhibiranja obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od, ili je sa rizikom da razvije tromboznu mikroangiopatiju

21

(TMA), a koji se sastoji od primene subjektu kompozicije koja sadrži količinu MASP-2 inhibitorna antitela koja efektivna u inhibiciji aktivacije komplementa zavisne od MASP-2. U jednom slučaju, TMA je izabrana iz grupe koja se sastoji od hemolitičkog uremijskog sindroma (HUS), trombozne trombocitopenijske purpure (TTP) i atipičnog hemolitičkog uremijskog sindroma (aHUS). U jednom slučaju, TMA je aHUS. U jednom slučaju, kompozicija se primenjuje pacijentu sa aHUS tokom akutne faze oboljenja. U jednom slučaju, kompozicija se primenjuje pacijentu sa aHUS-om tokom faze remisije (tj. kod subjekta koji se oporavio ili se delimično oporavio od epizode akutne faze aHUS, pri čemu je takva remisija dokazana, na primer, povećanim brojem trombocita i/ili smanjenjem koncentracije LDH u serumu, na primer, kao što je to opisano u Loirat C i saradnici, Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011, ovde uključenom u vidu reference).

[0745] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo karakteriše najmanje jedna ili više od sledećih karakteristika: navedeno antitelo vezuje humani MASP-2 sa KDod 10 nM ili manje, navedeno antitelo vezuje epitop u CCP1 domenu MASP-2, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u in vitro testu sa 1% humanim serumom sa IC50od 10 nM ili manje, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u 90% humanom serumu sa IC50od 30 nM ili manje, pri čemu antitelo predstavlja fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, Fab’, F(ab)2i F(ab’)2, pri čemu je antitelo jednolančani molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG2 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG1 molekul, pri čemu je navedeno antitelo IgG4 molekul, pri čemu IgG4 molekul sadrži mutaciju tipa S228P i/ili pri čemu antitelo suštinski ne inhibira klasičan put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i suštinski ne inhibira alternativni put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i suštinski ne inhibira klasičan put ili alternativni put (tj. inhibira lektinski put, dok klasičan i alternativni put komplementa ostaju intaktni).

[0746] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu kod subjekta koji boluje od TMA kao što je aHUS (akutna ili faza remisije), za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50 %, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretirani serum. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu kod subjekta koji boluje od aHUS na nivou od najmanje 20 procenata ili više (kao što je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%) više od inhibitornog efekta na deponovanje C5b-9 u serumu.

[0747] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu pacijenta sa aHUS-om u fazi remisije za najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom. U

21

pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu pacijenta sa aHUS-om u fazi remisije sa nivoom od najmanje 20 procenata ili više, (kao što je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%) više od inhibitornog efekta na deponovanje C5b-9 u serumu.

[0748] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo se primenjuje subjektu putem intravenskog katetera ili drugog načina isporuke kateterom.

[0749] U jednom slučaju koji je ovde opisan, postupak za inhibiranje obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od TMA se sastoji od primene subjektu kompozicije koja sadrži količinu MASP-2 inhibitornog antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji sadrži (I) (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 iz SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70, ili (II) njegovu varijantu koja sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 90% identičan sa SEQ ID NO:67 (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan sa SEQ ID NO:67) i varijabilni region lakog lanca sa je najmanje 90% identičan (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO:70,

[0750] U jednom slučaju, TMA je izabrana iz grupe koja se sastoji od atipičnog hemolitičkog uremijskog sindroma (aHUS) (bilo akutnog ili u fazi remisije), HUS i TTP. U jednom slučaju, subjekat je u akutnoj fazi aHUS. U jednom slučaju, subjekat je u fazi remisije aHUS.

[0751] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu kompozicije koja sadrži određenu količinu inhibitornog antitela za MASP-2 ili njegovog fragment koji vezuje antigen subjektu, pri čemu oni sadrže varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom SEQ ID NO:67. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu kompozicije koja sadrži određenu količinu inhibitornog antitela za MASP-2 ili njegovog fragment koji vezuje antigen subjektu, pri čemu oni sadrže varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom SEQ ID NO:70.

[0752] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži MASP-2 inhibitorno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, a koji specifično prepoznaju najmanje deo epitopa na humanom MASP-2 koga prepoznaje referentno antitelo OMS646, a koje sadrži varijabilni region teškog lanca naveden u SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca naveden u SEQ ID NO:70. Kompeticija između vezivanja čalnova može lako biti ispitana in vitro, na primer upotrebom ELISA postupka i/ili obeležavanjem specifičnog reporterskog molekula za jedan od članova vezivanja

21

koji dalje može biti detektovan u prisustvu ostalih neobeleženih vezujućih članova, da bi se omogućila identifikacija specifičnih vezujućih članova koji se vezuju za isti epitop ili preklapajući epitop. Prema tome, ovde je opisano specifično antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži mesto vezanja humanog antitela za antigen, koje je u kompeticiji sa referentnim anatietlom OMS646 u vezivanju za humani MASP-2.

PRIMER 43

[0753] Ovaj primer pokazuje da je humano inhibitorno antitelo za MASP-2 (OMS646) u stanju da inhibira indukciju apoptoze kod pacijenata sa TMA posredovanu plazmom u primarnim humanim mikrovaskularnim endotelnim ćelijama (MVEC) dermalnog porekla.

Uvod/Obrazloženje:

[0754] Poznato je da patofiziologija TMA uključuje povredu endotelnih ćelija izazvanu raznim faktorima, što dalje prate začepljenja malih sudova (npr. malih arteriola i kapilara) sa čepovima trombocita i/ili fibrinskim trombovima (Hirt-Minkowsk P. i saradnici, Nephron Clin Pract 114:c219-c235, 2010; Goldberg R.J. i saradnici, Am J Kidney Dis 56(6):1168-1174, 2010). Pokazano je i da MVEC podležu apoptotskoj povredi kada se in vitro izlažu plazmi iz pacijenata sa poremećajima povezanim sa TMA (pogledati Stefanescu i saradnici, tom 112 (2):340-349, 2008; Mitra D i saradnici, Blood 89:1224-1234, 1997). Apoptotska povreda povezana sa TMA je dokumentovana u MVEC dobijenom iz biopsija tkiva (kože, kostiju, kosne srži, slezine, bubrega, ileuma) takvih pacijenata. Takođe je pokazano da apoptotske povrede MVEC smanjuju nivoe regulatornih proteina sistema komplementa vezanih za membranu u MVEC (pogledati, npr. Mould & Morris, Immunology 102:359-364, 2001; Christmas i saradnici, Immunology 119:522, 2006).

[0755] Veruje se da je petlja pozitivne povratne sprege koja uključuje terminalne komponente sistema komplementa uključena u patofiziologiju TMA, uključujući atipičan hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS) i TMA povezane sa katastrofalnim antifosfolipidnim sindromom (CAPS), Degosovom bolešću i TMA nastalim sekundarno u odnosu na kancer, hemoterapiju kancera, autoimunost i transplantaciju, pri čemu je za svako od ovih stanja poznato ili se smatra da je reaktivno na anti-C5 terapiju sa mAb ekulizumabom (Chapin J. i saradnici, Brit. J. Hematol 157:772-774, 2012; Tsai i saradnici, Br J Haematol 162(4):558-559, 2013); Magro C. M. i saradnici, Journal of Rare Diseases 8:185, 2013).

[0756] Sledeći eksperiment je sproveden da bi se analizirala sposobnost inhibitornog antitela za humani MASP-2 (OMS646) da blokira indukciju apoptoze posredovanu sa serumom pacijenata sa TMA u primarnim humanim dermalnim MVEC u uzorcima plazme dobijenim iz pacijenata koji boluju od aHUS, trombozne trombocitopenijske purpure (TTP) povezane sa deficijencijom ADAMTS13, CAPS i

21

sistemske Degosove bolesti, kao i TMA nastalih sekundarno u odnosu na kancer, transplantaciju, autoimuna oboljenja i hemoterapiju.

Postupci:

[0757] Urađena je in vitro analiza da bi se ispitala efikasnost MASP-2 inhibitornog antitela (OMS646) da blokira indukciju apoptoze posredovanu sa serumom TMA pacijenata u primarnim humanim MVEC dermalnog porekla, kao što je opisano u Stefanescu R. i saradnici, Blood tom 112 (2):340-349, 2008, uključenom ovde u vidu reference. Upotrebljeni uzorci plazme su dobijeni iz kolekcije zdravih kontrolnih subjekata i iz osoba u akutnim fazama ili rekonvalescentnim tromboznim mikroangiopatijama. Prisustvo mikroangiopatije kod pacijenata sa TMA je procenjivano detekcijom šistocita na razmazu periferne krvi. Pored toga, TTP je dijagnostikovan kao što je opisano u Stefanescu R. i saradnici, Blood tom 112 (2):340-349, 2008,

Kultura endotelnih ćelija (EC)

[0758] Kao što je opisano u Stefanescu i saradnici, primarni humani MVEC dermalnog porekla su kupljeni od kompanije ScienCell Research Labs (San Diego, CA). MVEC su eksprimirale CD34 sve do pasaža 5 i 6 (Blood 89:1224-1234, 1997). MVEC ćelije su zatim gajene u polistirenskim flaskovima obloženim sa 0,1% želatina u vodi, u ECM1001medijumu (ScienCell Research Labs) koji je sadržavao suplement za rast endotelnih ćelija, penicilin, streptomicin i 15% fetalnog goveđeg seruma. Sve MVEC su upotrebljavane u pasažima od 2 do 6. Subkultivisanje je podrazumevalo izloženost ćelija dejstvu 0,25% tripsin-EDTA u trajanju od 5 do 10 minuta.

Analiza apoptoze

[0759] Reprezentativne primarne humane MVEC ćelije dermalnog porekla za koje je poznato da su podložne apoptozi indukovanoj sa TTP/HUS plazmom, isprane su fiziološkim rastvorom puferisanim sa fosfatom (PBS), pa su zasejane na mikroskopske pločice sa 12 komora, obložene sa 0,1% želatinom u vodi, u gustini od 0,15x10<6>vijabilnih ćelija/ml. Zasejane MVEC ćelije su zatim izlagane gladovanju u kompletnom medijumu tokom 24 sata, nakon čega su bile izlagane varirajućim koncentracijama (od 2% do 20% v/v) uzoraka plazme pacijenta sa TMA ili zdravoj donorskoj plazmi tokom 18 sati u prisustvu ili odsustvu MASP-2 mAt OMS646 (150 µg/ml), pa su ćelije prikuljene tripsinizacijom. Svaki uzorak seruma pacijenta sa TMA je analiziran u duplikatu. Stepen apoptoze posredovane plazmom je utvrđivan upotrebom bojenja sa propidijum jodidom (PI), uz >5 x10<3>ćelije analiziranih u citofluorografu i A0 pikove definisane računarskim softverom (MCycle Av, Phoeniy Flow Systems, San

21

Diego, CA). Kvantifikacija zasnovana na analizi imunosorpcije povezane sa enzimom (ELISA) za DNK fragmente udružene sa citoplazmatskim histomima iz ćelijskih lizata, takođe je urađena po uputstvima proizvođača (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemačka).

Rezultati:

[0760] Rezultati analize apoptoze MVEC ćelija indukovane plazmom iz TMA pacijenata u prisustvu MASP-2 mAt (OMS646) su prikazani ispod, u Tabeli 27.

Tabela 27: Plazme pacijenata sa TMA ispitivane na primarnim humanim MVEC dermalnog porekla u prisustvu MASP-2 mAb (OMS646)

22

[0761] U skladu sa rezultatima prijavljenim u Stefanescu R. i saradnici, Blood tom 112 (2):340-349, 2008, značajna apoptoza je uočena kod primarnih MVEC dermalnog porekla u prisustvu trinaest uzoraka plazme pacijenta sa TMA u odsustvu antitela za MASP-2. Paralelno su analizirani kontrolni uzorci plazme iz zdravih ljudi i pokazano je da oni nisu indukovali apoptozu u MVEC (podaci nisu prikazani). Kao što je prikazano u Tabeli 27, MASP-2 inhibitorno mAt (OMS646) je inhibiralo indukciju apoptoze posredstvaom plazme iz pacijenata sa TMA u primarnim MVEC („reaktivni“ u Tabeli 27) u 6 od 13 ispitanih uzoraka plazme pacijenta (46%). Preciznije, uočeno je da MASP-2 inhibitorni mAt (OMS646) inhibira apoptozu u plazmi dobijenoj iz pacijenata koji boluju od aHUS, TTP, Degosove bolesti, SLE, transplantacije i APLA (CAPS). S obzirom da u ovoj analizi kod sedam uzoraka iz pacijenata koji su ispitivani, MASP-2 mAb nije blokirao apoptozu („nereaktivni“ u Tabeli 27), uočeno je da apoptoza može biti inukovana posredstvom nekoliko puteva, od kojih nisu svi zavisni od komplementa. Na primer, kao što je prijavljeno u Stefanescu R. i saradnici, Blood tom 112 (2):340-349, 2008, apoptoza u EC testu zavisi od bazalnog stanja aktivacije EC na koje utiču faktori plazme koji mogu imati ulogu u određivanju nivoa povrede potrebnog za indukciju apoptoze. Kao što je dalje zaoaženo u Stefanescu R. i saradnici, u plazmi pacijenta sa TMA mogu biti prisutni dodatni faktori sposobni za modulaciju apoptoze, poput citokina i raznih komponenti sistema komplementa. Stoga, usled ovakvih faktora koji komplikuju situaciju, nije iznenađujuće što MASP-2 antitelo nije ispoljilo blokirajući efekat u svim uzorcima plazme kod kojih je uočena apoptoza indukovana TMA-plazmom.

[0762] Dodatno, u vezi sa navedenim, zapaženo je da su gotovo isti rezultati dobijeni u sličnoj analizi koja je urađena upotrebom testa za indukciju apoptoze sa TMA-plazmom i anti-C5 antitelom ekulizumabom (pogledati Chapin i saradnici, Blood (Sažeci godišnjeg sastanka ASH): Apstrakt br.3342, 120:2012). Deluje da je klinička efikasnost ekulizumaba, izuzetno uspešnog komercijalnog proizvoda, veća od efikasnosti pokazane u ovom modelu, što ukazuje da ovaj in vitro model može potceniti klinički potencijal lekova koji inhibiraju komplement.

[0763] Navedeni rezultati pokazuju da je inhibitorno antitelo za MASP-2, poput OMS646, efektivno u inhibiciji apoptoze indukovane sa TMA-plazmom u plazmi dobijenoj iz pacijenata koji boluju od TMA-a kao što su aHUS, TTP, Degosova bolest, SLE, transplantacija i APLA (CAPS). Poznato je i da oštećenje endotela i apoptoza imaju ključnu ulogu u patologiji TMA, kao što su idiopatska TTP i sporadičan HUS (Kim i saradnici, Microvascular Research tom 62(2):83-93, 2001). Kao što je opisano u Dang i saradnici, prisustvo apoptoze je pokazano u crvenoj pulpi slezine kod TTP pacijenata, ali ne i kod zdravih kontrolnih subjekata (Dang i saradnici, Blood 93(4): 1264-1270, 1999). Dokazi o apoptozi su uočeni i u bubrežnim glomerularnim ćelijama MVEC porekla kod pacijenta sa HUS-om (Arends M. J. i saradnici, Hum Pathol 20:89, 1989). Očekuje se stoga primena inhibitornog agensa za MASP-2, poput inhibitornog antitela za MASP-2 (npr. OMS646), bude efektivna terapija kod pacijenata koji boluju od TMA kao što su to aHUS, TTP ili drugi mikroangiopatski poremećaji, kao što su drugi TMA, uključujući CAPS, sistemsku Degosovu bolest i TMA nastalu sekundarno u odnosu na kancer; TMA nastalu sekundarno u odnosu na hemoterapiju ili TMA nastalu sekundarno u odnosu na transplantaciju.

[0764] U skladu sa prethodno navedenim činjenicama, u jednom slučaju koji je ovde opisan je postupak inhibiranja oštećenja endotelnih ćelija i/ili apoptoze endotelnih ćelija, i/ili obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od ili je sa rizikom da razvije tromboznu mikroangiopatiju (TMA), pri čemu postupak obuhvata prienu subjektu kompozicije koja sadrži količinu MASP-2 inhibitornog antitela koja je efektivna u inhibiciji aktivacije komplementa koja je zavisna od MASP-2. U jednom slučaju, TMA je izabrana iz grupe koja se sastoji od atipičnog hemolitičkog uremijskog sindroma (aHUS), trombozne trombocitopenijske purpure (TTP) i hemolitičkog uremijskog sindroma (HUS). U jednom slučaju, TMA je aHUS. U jednom slučaju, kompozicija se primenjuje pacijentu sa aHUS tokom akutne faze bolesti. U jednom slučaju, kompozicija se primenjuje pacijentu sa aHUS-om tokom faze remisije (tj. kod subjekta koji se oporavio ili delimično oporavio od epizode akutne faze aHUS, pri čemu je dokaz za takvu remisiju, na primer, povećan broj trombocita i/ili smanjenje koncentracije LDH u serumu, na primer kao što je opisano u Loirat C i saradnici, Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011, ovde uključenom u vidu reference).

U jednom slučaju, subjekat boluje od ili je sa rizikom da razvije TMA koji je (i) TMA nastala sekundarno u odnosu na kancer; (ii) TMA nastala sekundarno u odnosu na hemoterapiju; ili (iii) TMA nastala sekundarno u odnosu na transplantaciju (npr. transplantacija organa, kao što je transplantacija bubrega ili alogena transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija). U jednom slučaju, subjekat boluje od, ili je sa rizikom da razvije Upšau-Šulmanov sindrom (USS). U jednom slučaju, subjekat boluje od, ili je sa rizikom da razvije Degosovu bolesti. U jednom slučaju, subjekat boluje od, ili je sa rizikom da razvije Katastrofalan antifosfolipidni sindrom (CAPS).

[0765] U skladu sa bilo kojim od slučajeva koji su ovde opisani, inhibitorno antitelo za MASP-2 karakteriše najmanje jedna ili više od sledećih karakteristika: navedeno antitelo vezuje humani MASP-2 sa KDod 10 nM ili manje, navedeno antitelo vezuje epitop u CCP1 domenu MASP-2, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u in vitro analizi, u 1% humanom serumum, sa IC50od 10 nM ili manje, navedeno antitelo inhibira deponovanje C3b u 90% humanom serumu sa IC50od 30 nM ili manje, pri čemu je antitelo fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, Fab’, F(ab)2i F(ab’)2, pri čemu je antitelo jednolančani molekul, pri čemu je navedeno antitelo molekul IgG2, pri čemu je navedeno antitelo molekul IgG1, pri čemu je navedeno antitelo molekul IgG4, gde IgG4 molekul sadrži mutaciju tipa S228P, i/ili pri čemu antitelo suštinski ne inhibira klasičan put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i suštinski ne inhibira alternativan put. U jednom slučaju, antitelo se vezuje za MASP-2 i selektivno inhibira lektinski put i suštinski ne inhibira klasičan put (tj. inhibira lektinski put dok klasičan put aktivacije komplementa ostaje intaktan).

[0766] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira apoptozu MVEC indukovanu plazmom, u serumu subjekta koji boluje od TMA kao što su aHUS (akutna ili faza remisije), hemolitički uremijski sindrom (HUS), trombozna trombocitopenijska purpura (TTP), TMA nastala sekundarno u odnosu na kancer; TMA nastala sekundarno u odnosu na hemoterapiju; TMA nastala sekundarno u odnosu na transplantaciju (npr. transplantaciju organa, kao što je transplantacija bubrega ili alogena transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija), ili u serumu osobe koja boluje od Upšau-Šulmanovog sindroma (USS), ili u serumu osobe koja boluje od Degosove bolesti, ili kod subjekta koji boluje od Katastrofalnog antifosfolipidnog sindroma (CAPS), pri čemu je apoptoza MVEC indukovana plazmom inhibirana za najmanje 5%, kao što je najmanje 10%, kao što je najmanje 20%, kao što je najmanje 30%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 50%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje od 95% do 99%, u poređenju sa netretiranim serumom. U pojedinim slučajevima, MASP-2 inhibitorno antitelo inhibira obrazovanje tromba u serumu kod subjekta koji boluje od TMA (npr. kao što su to aHUS (akutna ili faza remisije), hemolitički uremijski sindrom (HUS), trombozna trombocitopenijska purpura (TTP), TMA nastala sekundarno u odnosu na kancer; TMA nastala sekundarno na hemoterapiju; TMA nastala sekundarno u odnosu na transplantaciju (npr. transplantaciju organa, kao što je transplantacija bubrega ili alogena transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija) ili u serumu od osobe koja boluje od Upšau-Šulmanovog sindroma (USS), ili u serumu subjekta koji boluje od Degosove bolesti ili kod subjekta koji boluje od Katastrofalnog antifosfolipidnog sindroma (CAPS)), na

22

nivou od najmanje 20 procenata ili više, (kao što je najmanje 30%, najmanje 40%, pri najmanje 50%) više od inhibitornog efekta na deponovanje C5b-9 u serumu.

[0767] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorno antitelo se primenjuje subjektu posredstvom intravenskog katetera ili drugog načina isporuke putem katetera.

[0768] U jednom slučaju koji je ovde opisan je postupak inhibiranja obrazovanja tromba kod subjekta koji boluje od TMA (kao što je aHUS (akutna ili faza remisije), hemolitički uremijski sindrom (HUS), trombozna trombocitopenijska purpura (TTP), TMA nastala sekundarno u odnosu na kancer; TMA nastala sekundarno u odnosu na hemoterapiju; TMA nastala sekundarno u odnosu na transplantaciju (npr. transplantacija organa, kao što je transplantacija bubrega ili alogena transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija), ili u serumu osobe koja boluje od Upšau-Šulmanovog sindroma (USS) ili u serumu subjekta koji boluje od Degosove bolesti ili kod subjekta koji boluje od katastrofalnog antifosfolipidnog sindroma (CAPS), pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži određenu količinu antitela koje inhibira MASP-2 ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koja sadrži (I) (a) varijabilni region teškog lanca koga čine: i) CDR-H1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 31-35 iz SEQ ID NO:67; i ii) CDR-H2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-65 iz SEQ ID NO:67; i iii) CDR-H3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 95-102 iz SEQ ID NO:67 i b) varijabilni region lakog lanca koga čine: i) CDR-L1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 24-34 iz SEQ ID NO:70; i ii) CDR-L2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 50-56 iz SEQ ID NO:70; i iii) CDR-L3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od 89-97 iz SEQ ID NO:70, ili (II) njegovu varijantu koja sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 90% identičan sa SEQ ID NO:67 (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:67) i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 90% identičan (npr. najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% je identičan SEQ ID NO:70.

[0769] U jednom slučaju, subjekat boluje od TMA izabranog iz grupe koja se sastoji od TMA nastale sekundarno u odnosu na kancer; TMA nastale sekundarno u odnosu na hemoterapiju; TMA nastale sekundarno u odnosu na transplantaciju (npr. transplantacija organa, kao što je transplantacija bubrega ili alogena transplantacija matičnih ćelija hematopoeze), kao i Upšau-Šulmanovog sindroma (USS), Degosove bolesti i Katastrofalnog antifosfolipidnog sindroma (CAPS).

[0770] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu antitela koja inhibira MASP-2, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koje sadrži varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom SEQ ID NO:67. U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži količinu antitela koja inhibira MASP-2, ili njegovog fragment koji vezuje antigen, koje sadrži varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:70.

[0771] U pojedinim slučajevima, postupak obuhvata primenu subjektu kompozicije koja sadrži MASP-2 inhibitorno antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koje specifično prepoznaje najmanje deo epitopa na humanom MASP-2 koga prepoznaje referentno antitelo OMS646 i koje sadrži varijabilni region teškog lanca kao što je to navedeno u SEQ ID NO:67 i varijabilni region lakog lanca što je to navedeno u SEQ ID NO:70.

22

22

22

22

22

�

21

22

�

��

2

�

2

�

�

24

24

24

24

24

��

24

2

21

22

2

24

2

2

2

2

�

�

21

22

�

24

�

�

2

�

2

2

21

22

�

��

2

�

�

2

2

2

21

22

2

24

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Inhibitorni agens za MASP-2, za upotrebu u lečenju ili prevenciji trombotične mikroangiopatije (TMA) koja nastaje sekundarno nakon transplantacije, pri čemu je transplantat tipa alogenog transplantata u vidu hematopoetskih matičnih ćelija i pri čemu se terapijski efektivna količina inhibitornog agensa za MASP-2 u farmaceutskom nosaču primenjuje subjektu sa rizikom razvoja TMA koja nastaje sekundarno u odnosu na transplantaciju, gde je inhibitorni agens za MASP-2 anti-MASP-2 monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za deo SEQ ID NO: 6 i selektivno inhibira aktivaciju komplementa zavisnu od MASP-2, pri čemu anti-MASP-2 monoklonsko antitelo ili njegov fragment sadrži varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO: 67 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID N0: 70.

2. Agens za upotrebu prema Patentnom zahtevu 1, pri čemu se agens primenjuje zajedno sa inhibitorom terminalnog komplementa koji inhibira cepanje komplementnog proteina C5.

3. Agens za upotrebu prema Patentnom zahtevu 1, pri čemu se inhibitorni agens za MASP-2 primenjuje subjektu sistemski, pre, tokom ili nakon primanja alogenog transplantata u vidu hematopoetskih matičnih ćelija.

4. Agens za upotrebu prema Patentnom zahtevu 1, pri čemu je navedeno inhibitorno monoklonsko antitelo za MASP-2, ili njegov fragment, izabrano iz grupe koja se sastoji od rekombinantnog antitela, antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom i himernog antitela.

5. Agens za upotrebu prema Patentnom zahtevu 1, pri čemu navedeno inhibitorno antitelo za MASP-2 predstavlja fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od Fv, Fab, Fab’, F(ab)2i F(ab’)2.

6. Agens za upotrebu prema Patentnom zahtevu 1, pri čemu je navedeno inhibitorno antitelo za MASP-2 jednolančani molekul.

7. Agens za upotrebu prema Patentnom zahtevu 1, pri čemu je navedeno inhibitorno antitelo za MASP-2 izabrano iz grupe koja se sastoji od IgG1 molekula, IgG2 i IgG4 molekula.

8. Agens za upotrebu prema Patentnom zahtevu 7, gde molekul IgG4 sadrži mutaciju tipa S228P.

2