ES2987551T3

ES2987551T3 - Sistemas de detección óptica y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2987551T3
Application number: ES16752818T
Authority: ES
Inventors: Jianying Cao
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2015-02-18
Filing date: 2016-02-10
Publication date: 2024-11-15
Anticipated expiration: 2036-02-10
Also published as: EP3259574C0; EP3259574B1; CN107209102A; EP3259574A4; JP2021105616A; EP3259574A1; JP7230092B2; CN107209102B; JP2018509610A; WO2016133760A1; US20190113434A1; US20160238511A1; JP6937697B2; US10184879B2

Abstract

Se proporcionan sistemas de detección óptica configurados para recolectar y detectar la luz emitida por una muestra. Los aspectos de los sistemas incluyen un módulo de recolección de dispersión lateral selectiva (SSC) de la región central configurado para permitir la detección selectiva de la luz de longitud de onda SSC de una región central de luz recolectada. También se proporcionan métodos para utilizar los sistemas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Sistemas de detección óptica y métodos de uso de los mismos

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad con respecto a la solicitud de patente provisional de Estados Unidos con n.° de serie US-62/117.800, presentada el 18 de febrero de 2015.

Introducción

La citometría de flujo es una técnica utilizada para caracterizar y clasificar material biológico, tal como células de una muestra de sangre o partículas de interés en cualquier tipo de muestra biológica o química. La técnica puede usarse para registrar distribuciones o clasificar físicamente el material biológico.

Un citómetro de flujo incluye normalmente un receptáculo de muestra para recibir una muestra de fluido y un receptáculo de arrastre que contiene un fluido de arrastre. El citómetro de flujo transporta las partículas (incluidas las células) de la muestra de fluido como una corriente de células a una celda de flujo, al mismo tiempo que dirige el fluido de arrastre a la celda de flujo. Dentro de la celda de flujo, se forma una funda de líquido alrededor de la corriente de células para impartir una velocidad sustancialmente uniforme a la corriente de células. La celda de flujo enfoca hidrodinámicamente las celdas dentro de la corriente para pasar a través de un punto de interrogación donde se dirige la luz a la muestra (por ejemplo, luz láser). A medida que los componentes de la corriente de flujo se mueven a través de la luz en el punto de interrogación, la luz de los constituyentes de la corriente de flujo se emite y dispersa (en la zona de detección). Esta luz se recoge y se refleja, por ejemplo, utilizando un conjunto de lentes ópticas, y se transmite a un detector. Las variaciones en los materiales, tal como morfologías o etiquetas fluorescentes, provocan variaciones en la luz observada que permiten caracterización recogiendo la luz en uno o más detectores ópticos.

Muchos sistemas de detección óptica en plataformas de citómetros de flujo utilizan una combinación de un conjunto de lentes objetivo y un transportador de luz de fibra óptica multimodo (que transmite la luz recogida reflejada de la lente del objetivo a uno o más detectores) para tanto la recogida de luz de longitud de onda de fluorescencia como de dispersión lateral (SSC). En la mayoría de las plataformas, el diámetro del núcleo colector de luz de una fibra óptica es significativamente mayor que la imagen generada por el conjunto de lentes objetivo, lo que lleva a la detección de luz de fondo (o ruido). Para la medición de la luz de longitud de onda SSC, este ruido puede impedir la detección de partículas de tamaño subcelular (por ejemplo, partículas de tamaño submicrométrico) en una muestra. Sin embargo, debido en parte a la aberración cromática observada al obtener imágenes de múltiples longitudes de onda de luz diferentes con una lente del objetivo, la reducción del tamaño del núcleo colector de luz del transportador de luz de fibra óptica para abordar el ruido de una longitud de onda de luz recogida (por ejemplo, una longitud de onda SSC) da como resultado una reducción de la señal de imagen en otra longitud de onda de luz (por ejemplo, una longitud de onda de fluorescencia).

El resumen del documento US 4690561A establece: “ Se divulga un aparato de análisis de partículas que tiene un sistema óptico de irradiación para irradiar una partícula a examinar, que fluye en una sección de flujo de una celda de flujo, con un haz de luz, un sistema óptico de medición para medir la luz dispersada por la partícula, un sistema de detección óptica para proyectar un haz de luz de posicionamiento sobre una pared determinada de la celda de flujo y detectar la luz reflejada desde la pared, y un dispositivo para variar la posición relativa del sistema óptico de medición con respecto a la celda de flujo según la salida del sistema de detección óptica” .

El resumen del documento WO 2007/000574 A1 establece: “ Un sistema óptico adecuado para la medición de alta sensibilidad de partículas pequeñas mientras se desplazan a través de un punto de detección en una celda de flujo. El sistema consiste en componentes a lo largo de dos ejes ópticos, preferiblemente pero no necesariamente, aproximadamente en el ángulo de Brewster entre sí. El primer eje incorpora una celda de flujo, una lente de recogida de luz de alta abertura numérica, detectores de filtro espacial y ópticos. El segundo eje incorpora una fuente de radiación (normalmente un láser o una lámpara de arco) y una óptica de conformación del haz. Los dos ejes están colocados en un ángulo suficiente para permitir la recogida de la dispersión de luz de ángulo pequeño cerca del borde de la lente de recogida y para permitir la recogida de la dispersión de luz de ángulo medio y grande a través del centro y el lado opuesto de la lente de recogida. La invención permite el filtrado espacial en el plano de la imagen de la lente de recogida para excluir la radiación de las fuentes dominantes de dispersión no deseada en la celda de flujo, y también permite el uso de una lente de alta abertura numérica para recoger la radiación dispersada y fluorescente por las partículas de muestra” . El resumen del documento US 2011 222050 A1 establece: “ En la presente memoria se divulga un dispositivo de medición óptica que incluye: una sección de aplicación de luz configurada para aplicar luz excitadora a una muestra que fluye en un canal; y una sección de detección de luz dispersa configurada para detectar luz dispersa generada a partir de la muestra irradiada con la luz excitadora en el lado aguas abajo de la muestra en la dirección de desplazamiento de la luz excitadora; incluyendo la sección de detección de luz dispersa una máscara separadora de luz dispersa para separar la luz dispersa en un componente de abertura numérica baja que tiene una abertura numérica no mayor que un valor específico y un componente de abertura numérica alta que tiene una abertura numérica mayor que el valor específico; un primer detector para detectar el componente de abertura numérica baja; y un segundo detector para detectar el componente de abertura numérica alta” .

Resumen

Se proporcionan sistemas de detección óptica configurados para recoger y detectar la luz emitida por una muestra. Los aspectos de los sistemas incluyen un módulo de recogida de dispersión lateral (SSC) selectiva de la región central configurado para permitir la detección selectiva de luz de longitud de onda SSC desde una región central de luz recogida. La inclusión de un módulo de recogida de SSC selectiva de la región central en un sistema de detección óptica proporciona una detección mejorada de componentes de muestra, incluidas partículas de tamaño submicrométrico. La invención se menciona en las reivindicaciones adjuntas. A continuación se exponen aspectos y realizaciones adicionales de la divulgación.

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona sistemas de detección óptica que incluyen: un sistema de recogida de luz configurado para producir luz recogida reflejada de la lente del objetivo desde una zona de detección de una celda de flujo; un módulo de dispersión de luz configurado para separar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo en al menos dos longitudes de onda de luz; un primer detector configurado para detectar una primera de las al menos dos longitudes de onda de luz y un segundo detector configurado para detectar una segunda de las al menos dos longitudes de onda de luz, donde la primera longitud de onda de luz es luz de longitud de onda SSC; y una abertura colocada entre el sistema de recogida de luz y el módulo de dispersión de luz, donde la abertura comprende una máscara óptica configurada para bloquear selectivamente la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que está fuera de una región central para que no llegue al primer detector. En determinadas realizaciones, la abertura tiene un diámetro que oscila entre 50 p y 500 p para que coincida con la región central. En determinadas realizaciones, la máscara óptica no bloquea el paso de al menos una luz de longitud de onda distinta de SSC. En determinadas realizaciones, la luz de longitud de onda distinta de SSC es luz que se emite desde una partícula en la corriente de flujo. En determinadas realizaciones, el sistema de detección óptica incluye además un transportador de luz de fibra óptica colocado entre la abertura y el módulo de dispersión de luz, donde el transportador de luz de fibra óptica está configurado para transmitir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que ha pasado a través de la abertura al módulo de dispersión de luz. En determinadas realizaciones, el detector incluye un detector de luz basado en fotodiodos o un tubo fotomultiplicador (PMT). En determinadas realizaciones, el transportador de luz de fibra óptica incluye un núcleo que tiene un diámetro que es mayor que la región central.

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona sistemas de detección óptica que incluyen: un sistema de recogida de luz configurado para producir luz recogida reflejada de la lente del objetivo desde una zona de detección de una celda de flujo; un detector configurado para recibir la luz de longitud de onda SSC recogida reflejada de la lente del objetivo; un filtro óptico configurado para producir al menos una primera trayectoria y una segunda trayectoria de luz recogida reflejada de la lente del objetivo, donde la primera trayectoria incluye al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo, y donde la primera trayectoria se transmite al detector; y una abertura configurada para bloquear el paso de luz de longitud de onda SSC en la primera trayectoria que está fuera de una región central para que no llegue al detector. En determinadas realizaciones, la primera trayectoria incluye del 50 al 99 % de la luz de longitud de onda SSC recogida. En determinadas realizaciones, el sistema de detección óptica incluye además: un módulo de dispersión de luz configurado para separar la segunda trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo en al menos dos longitudes de onda de luz; y un segundo detector configurado para detectar una primera de las al menos dos longitudes de onda de luz y un tercer detector configurado para detectar una segunda de las al menos dos longitudes de onda de luz. En determinadas realizaciones, la abertura tiene un diámetro que oscila entre 50 p y 500 p para que coincida con la región central. En determinadas realizaciones, la segunda trayectoria incluye al menos una luz de longitud de onda distinta de SSC. En determinadas realizaciones, la luz de longitud de onda distinta de SSC es luz que se emite desde una partícula en la corriente de flujo. En determinadas realizaciones, el sistema de detección óptica incluye además un transportador de luz de fibra óptica colocado entre la abertura y el detector, donde el transportador de luz de fibra óptica está configurado para transmitir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que ha pasado a través de la abertura al detector. En determinadas realizaciones, el transportador de luz de fibra óptica incluye un núcleo que tiene un diámetro que es mayor que la región central. En determinadas realizaciones, la abertura está unida directamente al transportador de luz de fibra óptica. En determinadas realizaciones, la abertura está unida directamente al detector. En determinadas realizaciones, el filtro óptico está configurado para reflejar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria. En determinadas realizaciones, el filtro óptico está configurado para pasar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria.

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona sistemas de detección óptica que incluyen: un sistema de recogida de luz configurado para producir luz recogida reflejada de la lente del objetivo desde una zona de detección de una celda de flujo; un detector configurado para recibir la luz de longitud de onda SSC recogida reflejada de la lente del objetivo; un filtro óptico configurado para producir al menos una primera trayectoria y una segunda trayectoria de luz recogida reflejada de la lente del objetivo, donde la primera trayectoria incluye al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo, y donde la primera trayectoria se transmite al detector; y un transportador de luz de fibra óptica configurado para transmitir selectivamente luz de longitud de onda SSC en la primera trayectoria desde una región central de la luz de longitud de onda SSC al detector. En determinadas realizaciones, la primera trayectoria incluye del 50 al 99 % de la luz de longitud de onda SSC recogida. En determinadas realizaciones, el sistema de detección óptica incluye además: un módulo de dispersión de luz configurado para separar la segunda trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo en al menos dos longitudes de onda de luz; y un segundo detector configurado para detectar una primera de las al menos dos longitudes de onda de luz y un tercer detector configurado para detectar una segunda de las al menos dos longitudes de onda de luz. En determinadas realizaciones, el núcleo transmisor de luz del transportador de luz de fibra óptica tiene un diámetro de sección transversal que oscila entre 50 p y 500 p para que coincida con la región central. En determinadas realizaciones, la segunda trayectoria incluye al menos una luz de longitud de onda distinta de SSC. En determinadas realizaciones, la luz de longitud de onda distinta de SSC es luz que se emite desde una partícula en la corriente de flujo. En determinadas realizaciones, el detector incluye un detector de luz basado en fotodiodos o un tubo fotomultiplicador (PMT). En determinadas realizaciones, el filtro óptico está configurado para reflejar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria. En determinadas realizaciones, el filtro óptico está configurado para pasar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria.

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona citómetros de flujo que incluyen: una fuente de luz; una celda de flujo que incluye una zona de detección; y un sistema de detección óptica como se ha expuesto anteriormente (y en otros sitios en la presente memoria).

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para analizar una corriente de flujo que incluyen: irradiar una corriente de flujo con una fuente de luz; generar luz reflejada de la lente del objetivo recogida desde una zona de detección de la corriente de flujo irradiada; y pasar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo a través de una abertura hasta un módulo de dispersión de luz, donde: (i) la abertura incluye una máscara óptica que bloquea selectivamente que la luz de longitud de onda de dispersión lateral (SSC) fuera de una región central pase a través; y (ii) el módulo de dispersión de luz está configurado para separar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo en al menos una primera y una segunda longitud de onda de luz, donde la primera longitud de onda de luz es luz de longitud de onda SSC; y detectar la primera y segunda longitudes de onda de luz para analizar la corriente de flujo. En determinadas realizaciones, la abertura tiene un diámetro que oscila entre 50 p y 500 p para que coincida con la región central. En determinadas realizaciones, la abertura tiene un diámetro que oscila entre 200 p y 400 p de diámetro para que coincida con la región central. En determinadas realizaciones, la máscara óptica no bloquea el paso de al menos una longitud de onda distinta de SSC de luz. En determinadas realizaciones, la longitud de onda distinta de SSC de luz es luz que se emite desde una partícula en la corriente de flujo. En determinadas realizaciones, el método incluye además transmitir la luz reflejada de la lente del objetivo que pasa a través de la abertura mediante un transportador de luz de fibra óptica al módulo de dispersión de luz.

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para analizar una corriente de flujo que incluyen: irradiar una corriente de flujo con una fuente de luz; generar luz reflejada de la lente del objetivo recogida desde una zona de detección de la corriente de flujo irradiada; dirigir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo hacia un filtro óptico configurado para producir al menos una primera trayectoria y una segunda trayectoria de luz recogida reflejada de la lente del objetivo, donde la primera trayectoria incluye al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo; y transmitir la primera trayectoria de luz de longitud de onda SSC recogida a través de un transportador de luz de fibra óptica configurado para transmitir selectivamente una región central de la luz de longitud de onda SSC en la primera trayectoria a un detector; para analizar la corriente de flujo. En determinadas realizaciones, el núcleo transmisor de luz del transportador de luz de fibra óptica tiene un diámetro de sección transversal que oscila entre 50 p y 500 p para que coincida con la región central. En determinadas realizaciones, el filtro óptico está configurado para reflejar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria. En determinadas realizaciones, el filtro óptico e está configurado para pasar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria. En determinadas realizaciones, la primera trayectoria incluye del 50 al 99 % de la luz de longitud de onda SSC recogida. En determinadas realizaciones, la luz de longitud de onda SSC que está en la segunda trayectoria de la luz de longitud de onda SSC recogida se detecta por un segundo detector. En determinadas realizaciones, el detector incluye un detector de luz basado en fotodiodos o un tubo fotomultiplicador (PMT). En determinadas realizaciones, la segunda trayectoria incluye al menos una luz de longitud de onda distinta de SSC, donde el método incluye además detectar al menos una longitud de onda distinta de SSC de luz. En determinadas realizaciones, la luz de longitud de onda distinta de SSC es luz que se emite desde una partícula en la corriente de flujo.

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para analizar una corriente de flujo que incluyen: irradiar una corriente de flujo con una fuente de luz; generar luz reflejada de la lente del objetivo recogida desde una zona de detección de la corriente de flujo irradiada; dirigir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo hacia un filtro óptico configurado para producir al menos una primera trayectoria y una segunda trayectoria de luz recogida reflejada de la lente del objetivo, donde la primera trayectoria incluye al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo; y pasar la primera trayectoria de luz de longitud de onda SSC recogida a través de una abertura hasta un detector, donde la abertura bloquea que la luz de longitud de onda de dispersión lateral (SSC) fuera de una región central pase a través; para analizar la corriente de flujo. En determinadas realizaciones, la abertura tiene un diámetro que oscila entre 50 p y 500 p para que coincida con la región central. En determinadas realizaciones, el filtro óptico está configurado para reflejar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria. En determinadas realizaciones, el filtro óptico está configurado para pasar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria. En determinadas realizaciones, la primera trayectoria incluye del 50 al 99 % de la luz de longitud de onda SSC recogida. En determinadas realizaciones, la luz de longitud de onda SSC que está en la segunda trayectoria de la luz de longitud de onda SSC recogida se detecta por un segundo detector. En determinadas realizaciones, el detector incluye un detector de luz basado en fotodiodos o un tubo fotomultiplicador (PMT). En determinadas realizaciones, la segunda trayectoria incluye al menos una luz de longitud de onda distinta de SSC, donde el método incluye además detectar al menos una longitud de onda distinta de SSC de luz. En determinadas realizaciones, la luz de longitud de onda distinta de SSC es luz que se emite desde una partícula en la corriente de flujo. En determinadas realizaciones, el método incluye además transmitir la primera trayectoria de luz que ha pasado a través de la abertura mediante un transportador de luz de fibra óptica al detector. En determinadas realizaciones, la abertura está unida directamente al transportador de luz de fibra óptica. En determinadas realizaciones, la abertura está unida directamente al detector.

Breve descripción de las figuras

Los aspectos de la divulgación pueden entenderse mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras:

La FIG. 1A ilustra un ejemplo de un sistema de detección óptica que incluye los siguientes elementos: 10 celda de flujo con una zona de detección; 11 conjunto de lentes objetivo; 12 transportador de luz de fibra óptica; 13 módulo de dispersión de luz; 14 primer detector de luz de longitud de onda de fluorescencia; 15 segundo detector de luz de longitud de onda de fluorescencia; 16 detector de luz de longitud de onda SSC. La trayectoria de luz está representada por las flechas punteadas.

FIG. 1B. El panel izquierdo ilustra el tamaño de la imagen central de la luz (20) recogida de la lente del objetivo que es más pequeño que el tamaño de la superficie de un elemento (22) transportador de luz (o la superficie de un detector de luz). El panel derecho ilustra un transportador de luz (o detector) que tiene una superficie receptora de luz que está configurada para tener el tamaño aproximado de la imagen (24) central, evitando así que se detecte luz distinta del núcleo.

La FIG. 1C ilustra el impacto de la aberración cromática en los sistemas de detección óptica. Trayectorias de luz y puntos/distancias focales para tres longitudes de onda diferentes de luz (pares de líneas24,26, y28) recogida por lente32. La distancia focal es donde se cruzan las líneas del mismo número (a veces llamado punto focal). Debido a la aberración cromática, cuando una abertura30que bloquea el paso de la luz de región no central de longitud de onda24(la apertura en la abertura está indicada por34) se coloca entre el sistema de recogida de luz y un detector (no mostrado), bloqueará porciones significativas de luz en otras longitudes de onda (por ejemplo, líneas26y28) lo que influye negativamente en su detección, por ejemplo, usando detectores/transmisores de luz adicionales.

La FIG. 2A ilustra un esquema de una realización de la divulgación que tiene una abertura como se detalla en la presente memoria. La designación de elementos10a16son como en la FIG. 1A. En esta realización, la luz reflejada recogida (la flecha de línea de puntos muestra la trayectoria de luz) se dirige a través de la abertura17que tiene una máscara óptica que bloquea selectivamente que la luz de longitud de onda SSC que está fuera de una región central llegue al detector SSC16(a través del transportador12de luz de fibra óptica y módulo13de dispersión de luz). La máscara óptica no bloquea las longitudes de onda fluorescentes de luz detectadas por los detectores14y15de fluorescencia.

La FIG. 2B ilustra un esquema de una realización de la divulgación que incluye un filtro óptico configurado para generar una primera trayectoria y una segunda trayectoria de luz reflejada recogida. La luz reflejada recogida (la flecha de línea de puntos muestra la trayectoria de la luz) se dirige a un filtro18óptico que está configurado para reflejar al menos una porción de luz de longitud de onda SSC para formar la primera trayectoria de luz mientras permite que otras longitudes de onda de luz pasen a través para formar una segunda trayectoria (las trayectorias primera y segunda se indican mediante los cuadros de líneas de puntos). La primera trayectoria (en este caso la trayectoria reflejada de luz desde el filtro18óptico) se dirige a través de la abertura19que bloquea la luz de longitud de onda SSC que está fuera de una región central para que no llegue al detector SSC 16b (a través del transportador12bde luz de fibra óptica). Obsérvese en esta realización que la abertura19puede bloquear toda la luz, ya que las longitudes de onda de luz adicionales se detectan en la segunda trayectoria. Además, la luz de longitud de onda SSC que no se desvió a la primera trayectoria se detecta por el detector16de longitud de onda SSC separado en la segunda trayectoria (como en las FIG. 1A y 2A). Esta configuración permite la detección de longitud de onda SSC dual como se detalla en la presente memoria.

La FIG. 2C ilustra un esquema de una realización adicional similar a la que se muestra en la FIG. 2B excepto que la primera trayectoria de la luz de longitud de onda SSC se envía directamente al detector16b(es decir, el elemento12btransportador de luz de la FIG. 2B se elimina en esta realización).

La FIG. 3 ilustra ejemplos representativos de tres configuraciones de detección de luz en una primera trayectoria de luz desde un filtro óptico. El elemento50representa la primera trayectoria entrante de luz que incluye al menos una porción de luz de longitud de onda SSC recogida. En el panel izquierdo, la primera trayectoria (es decir, una porción de luz de longitud de onda SSC) se dirige a través de un elemento19de abertura que bloquea el paso de la primera trayectoria de luz que está fuera de una región central para que no llegue al detector. La porción del elemento de abertura a través de la cual pasa40la primera trayectoria de luz es el diámetro de la región central. La región central de la primera trayectoria42(es decir, la luz que pasa a través40) se detecta directamente (no mostrado) o se transmite mediante un transportador12bde luz, en este caso un transportador de luz de fibra óptica que tiene un núcleo44(es decir, la superficie transportadora de luz) que tiene un diámetro que es mayor que la región central. En el panel central, el elemento19de abertura se coloca directamente sobre (se fija directamente a) el transportador de luz (o al detector; no mostrado). En tales realizaciones, se puede decir que el transportador/detector de luz está colocado directamente detrás de la abertura. En el panel derecho, el transportador12bde luz está configurado de manera que su núcleo44es el tamaño de la región central de la primera trayectoria de luz y, por tanto, no se requiere un elemento de abertura. En algunas realizaciones, el detector tiene una región de detección de luz que es del tamaño de la región central y, por lo tanto, no se requiere una abertura (no mostrado).

Descripción detallada

Se proporcionan sistemas de detección óptica configurados para recoger y detectar la luz emitida por una muestra. Los aspectos de los sistemas incluyen un módulo de recogida de dispersión lateral (SSC) selectiva de la región central configurado para permitir la detección selectiva de luz de longitud de onda SSC desde una región central de luz recogida. La inclusión de un módulo de recogida de SSC selectiva de la región central en un sistema de detección óptica proporciona una detección mejorada de componentes de muestra, incluidas partículas de tamaño submicrométrico.

Antes de que la presente invención se describa con mayor detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a realizaciones particulares descritas, ya que tales pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene por objeto describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención se limitará únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está abarcado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están abarcados dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluya uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria también se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales ilustrativos representativos.

Todas las publicaciones y patentes citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en la presente memoria como referencia como si cada publicación o patente individual estuviera específica e individualmente indicada para incorporarse como referencia y se incorporan en la presente memoria como referencia para revelar y describir los métodos y/o materiales en conexión con los cuales se citan las publicaciones. La cita de cualquier publicación es para su divulgación anterior a la fecha de presentación, y no debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.

Cabe señalar que tal como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “ un” , “ una” y “ el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se observa además que las reivindicaciones se pueden redactar para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como “ únicamente” , “ solamente” y similares en relación con la recitación de los elementos de las reivindicaciones, o el uso de una limitación “ negativa” .

Como resultará evidente para los expertos en la técnica al leer esta divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en la presente memoria tiene componentes y características discretos que pueden separarse fácilmente o combinarse con las características de cualquiera de las otras diversas realizaciones sin abandonar el ámbito o espíritu de la presente invención. Cualquier método recitado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos recitados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

Sistemas de detección óptica

Como se ha resumido anteriormente, se proporcionan sistemas de detección óptica configurados para recoger y detectar la luz emitida por una muestra. Los aspectos de los sistemas incluyen un módulo de recogida de dispersión lateral selectiva (SSC) de la región central. Los módulos de recogida de SSC de la región central, como se describen en la presente memoria, están configurados para permitir la detección selectiva de luz de longitud de onda SSC de una región central de luz recogida. En algunas realizaciones, la inclusión de un módulo de recogida de SSC selectiva de la región central en un sistema de detección óptica proporciona una detección mejorada de componentes de muestra, incluidas partículas de tamaño submicrométrico.

Los sistemas de detección óptica que incluyen un módulo de recogida de SSC de la región central como se describe en la presente memoria encuentran uso para mejorar la relación señal-ruido en la detección de SSC en comparación con los sistemas actualmente disponibles. Esto permite, por ejemplo, una mejora en la detección de partículas de tamaño subcelular, por ejemplo, partículas que están en el intervalo de tamaño submicrométrico. En determinadas realizaciones, el sistema de detección óptica está configurado para proporcionar detección de SSC dual, lo que permite la detección y el análisis simultáneos de células y partículas de tamaño subcelular. A continuación se describen en mayor detalle ejemplos de tales realizaciones.

La FIG. 1A proporciona un esquema de un sistema de detección óptica general que incluye una celda de flujo que tiene una zona (10) de detección, conjunto (11) de lentes objetivo para producir luz recogida reflejada desde la zona de detección, y un transportador (12) de luz que transmite la luz recogida a un módulo (13) de separación de luz y detectores uno o más detectores (que se muestran como14,15, y16en la FIG. 1A). La trayectoria de luz está representada por las flechas punteadas. En esta figura, los detectores14y15representan detectores de longitud de onda de fluorescencia (para dos longitudes de onda diferentes) y el detector16representa un detector de luz de longitud de onda SSC.

En los sistemas de detección óptica, el tamaño de la imagen de la luz recogida de la lente del objetivo (véase la FIG.

1B,20) puede ser significativamente más pequeño que el tamaño de la superficie de un elemento transportador de luz del sistema que transmite la luz recogida a un detector (FIG. 1B,22), por ejemplo, el núcleo de un transportador de luz de fibra óptica. (Los protocolos de fibra óptica adecuados que propagan luz a la superficie activa del detector incluyen, aunque no de manera limitativa, protocolos de fibra óptica de citómetro de flujo, tales como los descritos en la patente de Estados Unidos n.° 6.809.804, la divulgación de la cual se incorpora en la presente memoria como referencia.) Por ejemplo, determinados sistemas de detección óptica incluyen un sistema de recogida de luz que produce imágenes de aproximadamente 200 micrómetros de diámetro (también denominada la “ región central” ), mientras que el diámetro del núcleo de un transportador de luz de fibra óptica es de aproximadamente 800 micrómetros. Esta diferencia de tamaño permite que cantidades significativas de luz de longitud de onda SSC de fondo recogida se transmitan al detector, reduciendo así la relación señal-ruido. Por lo tanto, eliminar o reducir la detección de luz de longitud de onda SSC reflejada de la región no central en un sistema de detección óptica reducirá significativamente el ruido óptico sin afectar la eficiencia de la detección (representada en la FIG. 1B,24).

Como se detalla a continuación, los módulos de recogida de SSC selectiva de la región central pueden incluir uno o más elementos que solos o en combinación permiten la detección selectiva de la región central de la luz de longitud de onda<s>S<c>recogida reflejada de la lente del objetivo seleccionada de: una o más aberturas que tienen una máscara óptica que selectivamente bloquea el paso de la luz SSC que está fuera de la región central, uno o más filtros ópticos, uno o más elementos transportadores de luz, uno o más detectores y cualquier combinación de los mismos. A continuación se proporcionan realizaciones representativas.

En determinadas realizaciones, se proporciona un sistema de detección óptica que incluye un sistema de recogida de luz configurado para producir luz recogida reflejada de la lente del objetivo desde una zona de detección de una celda de flujo, un detector configurado para recibir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo y una abertura colocada entre el sistema de recogida de luz y el detector, donde la abertura incluye una máscara óptica configurada para bloquear la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que está fuera de una región central para que no llegue al detector. En otras palabras, la abertura tiene un tamaño (definido por la máscara óptica) que se adapta a la región central de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo.

El sistema de recogida de luz de los sistemas de detección óptica divulgados puede configurarse de cualquier manera conveniente. En determinados aspectos, el sistema de recogida de luz incluye una o más lentes del objetivo, que pueden incluir una o una combinación de una lente colimadora, una lente de enfoque, una lente de aumento, una lente de desmagnificación u otra lente, que están configuradas para recibir luz desde una zona de detección de una celda de flujo y producir luz reflejada que se transmite a uno o más detectores en el sistema. Se puede utilizar cualquier sistema conveniente de recogida de luz configurado para producir luz recogida reflejada de la lente del objetivo desde una zona de detección de una celda de flujo. Ejemplos de sistemas de recogida de luz que pueden emplearse incluyen los descritos en las patentes estadounidenses números 3.960.449; 4.347.935; 4.667.830; 5.245.318; 5.464.581; 5.483.469; 5.602.039; 5.643.796; 5.700.692; 6.372.506 y 6.809.804.

En determinadas realizaciones, la región central de la luz de longitud de onda SSC recogida reflejada de la lente del objetivo tiene un diámetro que oscila entre 50 micrómetros ( j) y 500 |j, incluyendo de 70 j a 450 |j, de 70 j a 400 |j, de 100 j a 400 j , de 200 j a 400 j , etc. Como tal, en determinadas realizaciones, la región central tiene un diámetro de o aproximadamente 500 j , de o aproximadamente 475 j , de o aproximadamente 450 j , de o aproximadamente 425 j , de o aproximadamente 400 j , de o aproximadamente 375 j , de o aproximadamente 350 j , de o aproximadamente 325 j, de o aproximadamente 300 j , de o aproximadamente 275 j , de o aproximadamente 250 j , de o aproximadamente 225 j, de o aproximadamente 200 j , de o aproximadamente 175 j , de o aproximadamente 150 j , de o aproximadamente 125 j, de o aproximadamente 100 j , de o aproximadamente 75 j , de o aproximadamente 50 j , o cualquier punto intermedio.

En determinadas realizaciones, el sistema de detección óptica está configurado para recoger y detectar longitudes de onda de luz distintas a la luz de longitud de onda SSC. Como se conoce en la técnica, la distancia focal de diferentes longitudes de onda de luz recogidas y reflejadas por un sistema de recogida de luz, por ejemplo, con un conjunto de lentes del objetivo, a menudo son diferentes entre sí. Este fenómeno se denomina aberración cromática y está esquematizado en la FIG. 1C. Esta figura muestra las trayectorias de luz y los puntos/distancias focales para tres longitudes de onda diferentes de luz recogida por la lente32(con las longitudes de onda de luz representadas por pares de líneas24,26, y28; la distancia focal es donde se cruzan las líneas del mismo número; a veces llamado punto focal). Debido a la aberración cromática, cuando una abertura30que bloquea el paso de la luz de región no central de longitud de onda24(la apertura en la abertura está indicada por34) se coloca entre el sistema de recogida de luz y el detector (no mostrado), bloqueará porciones significativas de luz en otras longitudes de onda (líneas26y28) lo que influye negativamente en su detección, por ejemplo, usando detectores/transmisores de luz adicionales.

Por lo tanto, en determinadas realizaciones, la máscara óptica de la abertura bloquea selectivamente la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que está fuera de una región central para que no llegue al detector. Por “ bloquea selectivamente” se entiende que la máscara óptica no bloquea el paso de al menos una luz de longitud de onda distinta de SSC, incluyendo al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o más longitudes de onda de luz. En determinadas realizaciones, la máscara óptica de la abertura sólo bloquea el paso de luz de longitud de onda SSC. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, el elemento de máscara óptica de la abertura funciona de manera similar a los filtros ópticos (o de paso de banda), que se usan en una amplia variedad de aplicaciones de detección de luz (y se describen con más detalle a continuación).

En determinadas realizaciones, la luz de longitud de onda distinta de SSC es luz que se emite desde una partícula en la corriente de flujo, por ejemplo, una célula o una partícula subcelular. La luz puede emitirse desde la propia partícula y/o desde un constituyente sobre o dentro de la partícula que tiene propiedades emisoras de luz, por ejemplo, una molécula fluorescente. Tales realizaciones incluyen células o partículas que están unidas a anticuerpos marcados con fluorescencia y/o que están asociadas con o expresan una proteína fluorescente. No se pretende ninguna limitación a este respecto.

En determinadas realizaciones, el sistema de detección óptica incluye además un módulo de dispersión (o separador) de luz que procesa la luz recogida reflejada de la lente del objetivo antes de transmitirla a uno o más detectores. Un módulo separador/de dispersión de luz se refiere a un dispositivo que separa la luz policromática en las longitudes de onda que la componen (como tal, estos módulos a veces se denominan “ separadores de longitud de onda” ). La separación de longitud de onda, según ciertas realizaciones, puede incluir hacer pasar o bloquear selectivamente longitudes de onda específicas o intervalos de longitud de onda de la luz policromática. Los dispositivos de dispersión de luz de interés incluyen, pero sin limitarse a, vidrio coloreado, filtros de paso de banda, filtros de interferencia, espejos dicroicos, rejillas de difracción, monocromadores y combinaciones de los mismos, entre otros dispositivos de separación de longitud de onda. En determinados casos, el módulo de dispersión de luz incluye uno o más filtros de paso de banda que tienen anchos de banda mínimos que varían de 2 nm a 100 nm, tal como de 3 nm a 95 nm, tal como de 5 nm a 95 nm, tal como de 10 nm a 90 nm, tal como de 12 nm a 85 nm, tal como de 15 nm a 80 nm, e incluyendo filtros de paso de banda con anchos de banda mínimos que varían de 20 nm a 50 nm.

En determinadas realizaciones, el sistema de detección óptica incluye además un transportador de luz colocado entre la abertura y el detector, donde el transportador de luz está configurado para transmitir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que ha pasado a través de la abertura al detector. En algunas realizaciones, el transportador de luz es un transportador de luz de fibra óptica. En determinadas realizaciones, el transportador de luz está colocado entre un módulo de dispersión de luz y un detector. Además, pueden estar presentes múltiples transportadores de luz en el sistema de detección óptica, estando cada transportador de luz asociado con un detector correspondiente (diferente). Por ejemplo, un sistema de detección óptica como se describe en la presente memoria puede tener un transportador de luz y un detector configurado para detectar cada longitud de onda diferente de luz que se procesa (o se separa) por el módulo de dispersión de luz. En realizaciones en las que el transportador de luz es una fibra óptica, el diámetro del núcleo de la fibra óptica (que es la porción transportadora de luz de la fibra óptica) es mayor que el diámetro de la región central de la luz SSC recogida que pasa a través de la abertura. Por tanto, la abertura funciona para evitar que la luz de longitud de onda SSC que está fuera de la región central se transmita por el transportador de luz al detector, reduciendo así el ruido óptico en la luz recogida de longitud de onda SSC.

En los sistemas de detección óptica descritos en la presente memoria se puede utilizar cualquier detector conveniente para detectar la luz recogida reflejada. Los detectores de interés pueden incluir, pero sin limitarse a, sensores ópticos o fotodetectores, tales como sensores de píxeles activos (APS), fotodiodos de avalancha, sensores de imagen, dispositivos de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada intensificada (ICCD), diodos emisores de luz, contadores de fotones, bolómetros, detectores piroeléctricos, fotorresistores, células fotovoltaicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores (PMT), fototransistores, fotoconductores o fotodiodos de puntos cuánticos, y combinaciones de los mismos, entre otros fotodetectores. En determinadas realizaciones, la luz recogida se mide con un dispositivo de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada de semiconductores (CCD), sensores de píxeles activos (APS), sensores de imagen complementarios de semiconductores de óxido metálico (CMOS), o sensores de imagen de semiconductores de óxido metálico de tipo N (NMOS).

En algunas realizaciones, el sensor de imágenes es una cámara CCD. Por ejemplo, la cámara puede ser una cámara CCD multiplicadora de electrones (EMCCD) o una cámara CCD intensificada (ICCD). En otras realizaciones, el sensor de formación de imágenes es una cámara de tipo CMOS. Cuando la luz recogida se mide con un CCD, el área superficial de detección activa del CCD puede variar, tal como desde 0,01 cm2 a 10 cm2, tal como desde 0,05 cm2 a 9 cm2, tal como desde 0,1 cm2 a 8 cm2, tal como desde 0,5 cm2 a 7 cm2, e incluyendo desde 1 cm2 a 5 cm2.

El número de fotodetectores en los sistemas objeto puede variar, según se desee. Por ejemplo, los sistemas objeto pueden incluir un fotodetector o más, tal como dos fotodetectores o más, tal como tres fotodetectores o más, tal como cuatro fotodetectores o más, tal como cinco fotodetectores o más, e incluyendo diez fotodetectores o más. En determinadas realizaciones, los sistemas incluyen un fotodetector. En otras realizaciones, los sistemas incluyen dos fotodetectores.

Cuando los sistemas objeto incluyen más de un fotodetector, cada fotodetector puede ser el mismo, o la colección de dos o más fotodetectores puede ser una combinación de diferentes tipos de fotodetectores. Por ejemplo, cuando los sistemas objeto incluyen dos fotodetectores, en algunas realizaciones el primer fotodetector es un dispositivo de tipo CCD y el segundo fotodetector (o sensor de imagen) es un dispositivo de tipo CMOS. En otras realizaciones, tanto el primer como el segundo fotodetectores son dispositivos de tipo CCD. En otras realizaciones más, tanto el primer como el segundo fotodetectores son dispositivos de tipo CMOS. En otras realizaciones más, el primer fotodetector es un dispositivo de tipo CCD y el segundo fotodetector es un tubo fotomultiplicador (PMT). En otras realizaciones más, el primer fotodetector es un dispositivo de tipo CMOS y el segundo fotodetector es un tubo fotomultiplicador. En otras realizaciones más, tanto el primer como el segundo fotodetectores son tubos fotomultiplicadores.

En realizaciones de la presente invención, los detectores de interés están configurados para medir la luz recogida en una o más longitudes de onda, tal como en 2 o más longitudes de onda, tal como en 5 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 10 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 25 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 50 o más longitudes de onda diferentes, tales como en 100 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 200 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 300 o más longitudes de onda diferentes, e incluyendo medir la luz emitida por una muestra en la corriente de flujo en 400 o más longitudes de onda diferentes. En algunas realizaciones, 2 o más detectores en un sistema de detección óptica como se describe en la presente memoria están configurados para medir las longitudes de onda iguales o superpuestas de luz recogida (que se analiza más adelante).

En algunas realizaciones, los detectores de interés están configurados para medir la luz recogida en un intervalo de longitudes de onda (por ejemplo, 200 nm - 1000 nm). En determinadas realizaciones, los detectores de interés se configuran para recoger espectros de luz en un intervalo de longitudes de onda. Por ejemplo, los sistemas pueden incluir uno o más detectores configurados para recoger espectros de luz en uno o más de los intervalos de longitud de onda de 200 nm-1000 nm. En otras realizaciones más, los detectores de interés se configuran para medir la luz emitida por una muestra en la corriente de flujo en una o más longitudes de onda específicas. Por ejemplo, los sistemas pueden incluir uno o más detectores configurados para medir luz en uno o más de 450 nm, 518 nm, 519 nm, 561 nm, 578 nm, 605 nm, 607 nm, 625 nm, 650 nm, 660 nm, 667 nm, 670 nm, 668 nm, 695 nm, 710 nm, 723 nm, 780 nm, 785 nm, 647 nm, 617 nm, y cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, uno o más detectores pueden configurarse para emparejarse con fluoróforos específicos, tales como los utilizados con la muestra en un ensayo de fluorescencia.

En realizaciones, el detector se configura para medir luz continua o en intervalos discretos. En algunos casos, los detectores de interés están configurados para tomar mediciones de la luz recogida de forma continua. En otros casos, los detectores de interés se configuran para realizar mediciones en intervalos discretos, tales como medir la luz cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos, e incluyendo cada 1000 milisegundos, o algún otro intervalo.

Aspectos adicionales de la divulgación se refieren a sistemas de detección óptica que incluyen un sistema de recogida de luz configurado para producir luz recogida reflejada de la lente del objetivo desde una zona de detección de una celda de flujo, un detector configurado para recibir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo y un filtro óptico configurado para producir al menos una primera trayectoria y una segunda trayectoria de luz recogida reflejada de la lente del objetivo en el que la primera trayectoria comprende al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo y se transmite al detector, por ejemplo, a través de un transportador de luz.

Ejemplos de sistemas de recogida de luz y detectores que se usan en los sistemas de detección óptica divulgados se han proporcionado anteriormente y, por lo tanto, no se repiten en este caso.

En determinadas realizaciones, el filtro óptico está configurado para reflejar al menos una porción de luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria, mientras que en otras realizaciones, el filtro óptico está configurado para pasar al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria.

La FIG. 2A proporciona un esquema de una realización de la divulgación que tiene una abertura como se detalla en la presente memoria (obsérvese que la designación de elementos10a16son como en la FIG. 1A). En esta figura, la luz reflejada recogida (la flecha de línea de puntos muestra la trayectoria de luz) se dirige a través de la abertura17que tiene una máscara óptica que bloquea selectivamente que la luz de longitud de onda SSC que está fuera de una región central llegue al detector SSC16(a través del transportador12de luz de fibra óptica y módulo13de dispersión de luz). La máscara óptica no bloquea las longitudes de onda fluorescentes de luz detectadas por los detectores14y15de fluorescencia. La abertura 17 sirve, por tanto, para reducir el ruido en la luz de longitud de onda SSC sin afectar las longitudes de onda de luz detectadas por los detectores 14 y 15. Cabe señalar que en determinadas realizaciones, sólo se detecta una longitud de onda adicional de luz distinta de la longitud de onda SSC y, por tanto, sólo se utiliza un único detector adicional (es decir, detector14o detector15, no ambos).

La FIG. 2B proporciona un esquema de una realización de la divulgación en la que un filtro óptico está configurado para reflejar al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo hacia el detector. En esta figura, la luz reflejada recogida se dirige a un filtro18óptico que está configurado para reflejar al menos una porción de luz de longitud de onda SSC para formar una primera trayectoria de luz mientras permite que otras longitudes de onda de luz pasen a través para formar una segunda trayectoria. En determinadas realizaciones, la porción de luz de longitud de onda SSC que no se refleja en la primera trayectoria pasa a través del filtro18óptico como parte de la segunda trayectoria. Entonces, la primera trayectoria se dirige a través de la abertura19que bloquea la luz de longitud de onda SSC que está fuera de una región central para que no llegue al detector SSC16b(a través de transportador12bde luz de fibra óptica). Obsérvese en esta realización que la abertura19puede bloquear toda la luz, ya que las longitudes de onda de luz adicionales se detectan en la segunda trayectoria. Además, la luz de longitud de onda<s>S<c>que no se desvió a la primera trayectoria se detecta por el detector16de longitud de onda SSC separado en la segunda trayectoria (como en las FIG. 1A y 2A). Esta configuración permite la detección de longitud de onda SSC dual como se detalla en la presente memoria.

Se observa en este caso que también se contemplan realizaciones en las que el filtro óptico está configurado para pasar una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para formar la primera trayectoria (en lugar de reflejarla). Por tanto, en determinadas realizaciones, la luz reflejada recogida se dirige a un filtro óptico que está configurado para pasar al menos una porción de luz de longitud de onda SSC para formar una primera trayectoria de luz recogida mientras refleja otras longitudes de onda de luz para formar una segunda trayectoria. En determinadas realizaciones, la porción de luz de longitud de onda SSC que no pasa a través del filtro óptico (es decir, parte de la primera trayectoria) se refleja por el filtro óptico como parte de la segunda trayectoria. Entonces, la primera trayectoria se dirige a un detector como se describe para la primera trayectoria en la FIG. 2B.

En determinadas realizaciones, la primera trayectoria contiene del 50 % al 99 % de la luz de longitud de onda SSC recogida reflejada de la lente del objetivo, incluyendo del 55 % al 98 %, del 60 % al 96 %, del 70 % al 94 %, del 80 % al 92 %, del 85 % al 90 %, y cualquier intervalo intermedio. Por tanto, en determinadas realizaciones, la primera trayectoria comprende al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, y al menos aproximadamente el 99 % de la luz de longitud de onda SSC recogida reflejada de la lente del objetivo.

Como se señaló anteriormente, el filtro óptico puede configurarse de manera que la primera trayectoria se produzca mediante luz reflejada por el filtro óptico o puede configurarse de manera que la primera trayectoria se produzca mediante luz que pasa a través del filtro óptico.

En determinadas realizaciones, el sistema de detección óptica incluye un segundo detector configurado para recibir luz de longitud de onda SSC que está en la segunda trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo. En determinadas de estas realizaciones, el sistema de detección óptica está configurado de manera que el segundo detector detecta luz de longitud de onda SSC tanto de la región central como de la no central. En tales realizaciones, el sistema de detección óptica puede detectar partículas subcelulares usando el primer detector (luz de longitud de onda SSC de la región central en la primera trayectoria) y partículas más grandes (por ejemplo, células) usando el segundo detector. En determinadas de estas realizaciones, una mayor porción de luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo está presente en la primera trayectoria en comparación con la segunda trayectoria, por ejemplo, donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 99 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 1 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 98 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 2 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 97 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 3 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 96 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 4 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 95 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 5 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 90 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 10 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 80 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 20 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 70 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 30 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 60 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 40 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 51 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 49 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo. (Cabe señalar que en las figuras anteriores se excluye cualquier pérdida óptica debida al uso de un filtro óptico).

En determinadas realizaciones, el filtro óptico está configurado de manera que la segunda trayectoria incluya al menos una longitud de onda distinta de SSC de luz recogida. Por ejemplo, la segunda trayectoria puede incluir luz de longitud de onda distinta de SSC que se emite desde una partícula en la corriente de flujo, por ejemplo una partícula subcelular o una célula. Ejemplos de longitudes de onda distintas de SSC de luz y su detección se han proporcionado anteriormente y, por lo tanto, no se repiten en este caso.

Aspectos de la presente divulgación proporcionan un sistema para medir luz emitida por una muestra, donde el sistema incluye una fuente de luz, una celda de flujo que tiene una zona de detección y un sistema de detección óptica de la presente divulgación. Como se detalló anteriormente, los sistemas de detección óptica de la presente divulgación incluyen un módulo de recogida de dispersión lateral selectiva (SSC) de la región central de la presente divulgación. Los módulos de recogida de SSC de la región central están configurados para permitir la detección selectiva de luz de longitud de onda SSC de una región central de luz recogida. Se puede emplear cualquier configuración de módulos de recogida de SSC de la región central descritos anteriormente.

En determinados aspectos, el sistema de detección óptica del sistema para medir luz emitida por una muestra incluye un módulo de recogida de SSC selectiva de la región central que tiene uno o más elementos que solos o en combinación permiten la detección selectiva de la región central de la luz de longitud de onda SSC recogida reflejada de la lente del objetivo. Dichos elementos se pueden seleccionar entre: una o más aberturas que tienen una máscara óptica que bloquea selectivamente el paso de la luz SSC que está fuera de la región central, uno o más filtros ópticos, uno o más elementos transportadores de luz, uno o más detectores y cualquier combinación de los mismos.

Por lo tanto, en determinadas realizaciones, se proporciona un sistema para medir luz emitida por una muestra que incluye: una fuente de luz, una celda de flujo que tiene una zona de detección, un sistema de recogida de luz configurado para producir luz recogida reflejada de la lente del objetivo desde una zona de detección de una celda de flujo, un detector configurado para recibir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo y una abertura colocada entre el sistema de recogida de luz y el detector, donde la abertura incluye una máscara óptica configurada para bloquear la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que está fuera de una región central para que no llegue al detector. Por tanto, la abertura tiene un tamaño (definido por la máscara óptica) que se adapta a la región central de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo. En determinadas realizaciones, el sistema para medir luz emitida por una muestra está configurado para recoger y detectar longitudes de onda de luz distintas a la luz de longitud de onda SSC. Por tanto, en algunas realizaciones, la máscara óptica de la abertura no bloquea el paso de al menos una luz de longitud de onda distinta de SSC. Tales realizaciones se han descrito en detalle anteriormente y, por tanto, no se repiten en este caso.

Aspectos adicionales de la divulgación se refieren a un sistema para medir luz emitida por una muestra que incluye: una fuente de luz, una celda de flujo que tiene una zona de detección, un sistema de recogida de luz configurado para producir luz recogida reflejada de la lente del objetivo desde una zona de detección de una celda de flujo, un detector configurado para recibir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo y un filtro óptico configurado para producir al menos una primera trayectoria y una segunda trayectoria de luz recogida reflejada de la lente del objetivo en el que la primera trayectoria comprende al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo y se transmite al detector, por ejemplo, a través de un transportador de luz.

En determinadas realizaciones, el filtro óptico está configurado para reflejar al menos una porción de luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria, mientras que en otras realizaciones, el filtro óptico está configurado para pasar al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria. Tales realizaciones se han descrito en detalle anteriormente y, por tanto, no se repiten en este caso.

En realizaciones, la fuente de luz del sistema para medir luz emitida por una muestra puede ser cualquier fuente de luz de banda ancha o de banda estrecha adecuada. Dependiendo de los componentes en la muestra (por ejemplo, células, perlas, partículas no celulares, etc.), la fuente de luz puede configurarse para emitir longitudes de onda de luz que varía, oscilando de 200 nm a 1500 nm, tal como de 250 nm a 1250 nm, tal como de 300 nm a 1000 nm, tal como de 350 nm a 900 nm, e incluyendo de 400 nm a 800 nm. Por ejemplo, la fuente de luz puede incluir una fuente de luz de banda ancha que emite luz con longitudes de onda de 200 nm a 900 nm. En otros casos, la fuente de luz incluye una fuente de luz de banda estrecha que emite una longitud de onda que oscila de 200 nm a 900 nm. Por ejemplo, la fuente de luz puede ser un LED de banda estrecha (1 nm - 25 nm) que emite luz que tiene una longitud de onda que oscila entre 200 nm y 900 nm. En algunas realizaciones, la fuente de luz es un láser, tal como láser de onda continua. Por ejemplo, el láser puede ser un láser de helioneón (HeNe). En determinadas realizaciones, la fuente de luz es un láser en un citómetro de flujo.

En otras realizaciones, la fuente de luz es una fuente de luz no láser, tal como una lámpara, que incluye, entre otras, una lámpara halógena, una lámpara de arco de deuterio, una lámpara de arco de xenón, un diodo emisor de luz, tal como un LED de banda ancha con espectro continuo, diodo emisor superluminiscente, diodo emisor de luz semiconductor, fuente de luz blanca LED de amplio espectro, multi-LED integrado. En algunos casos, la fuente de luz no láser es una fuente de luz de banda ancha estabilizada acoplada a fibra, una fuente de luz blanca, entre otras fuentes de luz o cualquier combinación de las mismas.

La fuente de luz puede colocarse a cualquier distancia adecuada de la muestra (por ejemplo, la corriente de flujo en un citrómetro de flujo), tal como a una distancia de 0,001 mm o más de la corriente de flujo, tal como 0,005 mm o más, tal como 0,01 mm o más, tal como 0,05 mm o más, tal como 0,1 mm o más, tal como 0,5 mm o más, tal como 1 mm o más, tal como 5 mm o más, tal como 10 mm o más, tal como 25 mm o más, e incluyendo a una distancia de 100 mm o. Además, la fuente de luz irradia la muestra en cualquier ángulo adecuado (por ejemplo, con respecto al eje vertical de la corriente de flujo), tal como en un ángulo que varía de 10° a 90°, tal como de 15° a 85°, tal como de 20° a 80°, tal como de 25° a 75°, e incluyendo de 30° a 60°, por ejemplo en un ángulo de 90°.

La fuente de luz puede configurarse para irradiar la muestra de manera continua o en intervalos discretos. En algunos casos, los sistemas incluyen una fuente de luz que está configurada para irradiar la muestra de manera continua, tal como con un láser de onda continua que irradia continuamente la corriente de flujo en el punto de interrogación en un citómetro de flujo. En otros casos, los sistemas de interés incluyen una fuente de luz que está configurada para irradiar la muestra en intervalos discretos, tales como cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos, e incluyendo cada 1000 milisegundos, o algún otro intervalo. Cuando la fuente de luz está configurada para irradiar la muestra en intervalos discretos, los sistemas pueden incluir uno o más componentes adicionales para proporcionar una irradiación intermitente de la muestra con la fuente de luz. Por ejemplo, los sistemas en cuestión en estas realizaciones pueden incluir uno o más cortadores de haz láser, topes de haz controlados manualmente o por computadora para bloquear y exponer la muestra a la fuente de luz.

En determinadas realizaciones, los sistemas objeto incluyen sistemas de citometría de flujo que emplean las boquillas de celda de flujo y subsistemas ópticos para detectar la luz emitida por una muestra en una corriente de flujo. Los sistemas y métodos de citometría de flujo adecuados para analizar muestras incluyen, pero sin limitarse a, los descritos en Ormerod (ed.),Flow Cytometry: A PracticaI Approach,Oxford Univ. Pulse (1997); Jaroszeski y col. (eds.),Flow Cytometry Protocols,Methods in Molecular Biology No. 91, Humana Press (1997);Practical Flow Cytometry,3.a ed., Wiley-Liss (1995); Virgo,y col.(2012)Ann Clin Biochem.Ene;49(pt 1):17-28; Linden,y col., Semin Throm Hemost.octubre de 2004;30(5):502-11; Alison,y col. J Pathol,diciembre de 2010; 222(4):335-344; y Herbig,y col.(2007)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.24(3):203-255. En determinados casos, los sistemas de citometría de flujo de interés incluyen el citómetro de flujo FACsCanto™ de BD Biosciences, los sistemas BD Biosciences FACSVantage™, BD Biosciences FACSort™, BD Biosciences FACSCount™, BD Biosciences FACScan™ y BD Biosciences FACSCalibur™, el clasificador de células BD Biosciences Influx™, el clasificador de células BD Biosciences Jazz™ y el clasificador de células BD Biosciences Aria™ o similares.

En determinadas realizaciones, los sistemas en cuestión son sistemas de citómetros de flujo que incorporan uno o más componentes de los citómetros de flujo descritos en las Patentes de EE. UU. n.° 3.960.449; 4.347.935; 4.667.830; 4.704.891; 4.770.992; 5.030.002; 5.040.890; 5.047.321; 5.245.318; 5.317.162; 5.464.581; 5.483.469; 5.602.039; 5.620.842; 5.627.040; 5.643.796; 5.700.692; 6.372.506;6.809.804; 6.813.017; 6.821.740; 7.129.505; 7.201.875; 7.544.326; 8.140.300; 8.233.146; 8.753.573; 8.975.595; 9.092.034; 9.095.494 y 9.097.640.

Métodos para medir luz emitida por una muestra

Aspectos de la divulgación incluyen métodos para medir luz emitida desde una muestra. En determinadas realizaciones, la luz emitida por la muestra se recoge y se mide usando un sistema de detección óptica que tiene un módulo de recogida de SSC de la región central como se describe en la presente memoria.

En determinadas realizaciones, se proporcionan métodos de análisis de una corriente de flujo, donde el método incluye: irradiar una corriente de flujo con una fuente de luz, generar luz reflejada de la lente del objetivo recogida de una zona de detección de la corriente de flujo irradiada, y pasar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo a través de un módulo de recogida de SSC de la región central hasta un detector, donde el módulo de recogida de SSC de la región central bloquea selectivamente la luz de longitud de onda de dispersión lateral (SSC) fuera de una región central para que no llegue al detector, analizando así la corriente de flujo.

La muestra analizada puede ser cualquier muestra que sea de interés para un usuario. En determinadas realizaciones, la muestra contiene un componente biológico o es una muestra biológica. El término “ muestra biológica” se utiliza en su sentido convencional para referirse a una muestra derivada de o que contiene un organismo completo, por ejemplo, células procariotas, células ecuariotas, plantas, hongos o un subconjunto de tejidos animales, células o partes componentes que puedan encontrarse en ciertos casos en la sangre, el moco, el líquido linfático, el líquido sinovial, el líquido cefalorraquídeo, la saliva, el lavado broncoalveolar, el líquido amniótico, la sangre del cordón amniótico, la orina, el fluido vaginal y el semen. Como tal, una “ muestra biológica” se refiere tanto al organismo nativo o a un subconjunto de sus tejidos como a: un homogeneizado; partículas biológicas aisladas, purificadas o enriquecidas (por ejemplo, ADN, ARN, proteínas, orgánulos subcelulares, etc.); y lisados o extractos preparados a partir del organismo o un subconjunto de sus tejidos, que incluyen, pero sin limitarse a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secciones de la piel, tractos respiratorio, gastrointestinal, cardiovascular y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. Las muestras biológicas pueden ser cualquier tipo de tejido orgánico, incluyendo tanto tejido sano como enfermo (p. ej., canceroso, maligno, necrótico, etc.). En determinadas realizaciones, la muestra biológica es una muestra líquida, tal como sangre o derivado de la misma, p. ej., plasma, lágrimas, orina, semen, etc., donde en algunos casos la muestra es una muestra de sangre, que incluye sangre completa, tal como sangre obtenida de punción venosa o punción digital (donde la sangre puede o no combinarse con cualquier reactivo antes del ensayo, tales como conservantes, anticoagulantes, etc.).

En determinadas realizaciones, la fuente de la muestra es un “ mamífero” o “ de la clase Mammalia” , donde estos términos se usan ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase Mammalia, incluyendo los órdenes carnívoros (p. ej., perros y gatos), roedores (p. ej., ratones, cobayas y ratas), y primates (p. ej., seres humanos, chimpancés y monos). En algunos casos, los sujetos son seres humanos. Los métodos pueden aplicarse a muestras obtenidas de sujetos humanos de ambos géneros y en cualquier etapa de desarrollo (es decir, neonatos, lactantes, juveniles, adolescentes, adultos), donde en determinadas realizaciones el sujeto humano es un juvenil, adolescente o adulto. Si bien las realizaciones de la presente divulgación pueden aplicarse a muestras de un sujeto humano, debe entenderse que los métodos también pueden realizarse en muestras de otros sujetos animales (es decir, en “ sujetos no humanos” ), tales como, pero sin limitarse a, aves, ratones, ratas, perros, gatos, ganado y caballos.

En la práctica de métodos según determinadas realizaciones, una muestra (p. ej., en una corriente de flujo de un citómetro de flujo) se irradia con luz desde una fuente de luz. Se puede emplear cualquier fuente de luz conveniente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra se irradia con una fuente de luz de banda ancha, que emite luz con una amplia gama de longitudes de onda, tal como, por ejemplo, que abarca 50 nm o más, tal como 100 nm o más, tal como 150 nm o más, tal como 200 nm o más, tal como 250 nm o más, tal como 300 nm o más, tal como 350 nm o más, tal como 400 nm o más, e incluyendo abarcar 500 nm o más. En otras realizaciones, los métodos incluyen irradiar con una fuente de luz de banda estrecha que emite una longitud de onda particular o un intervalo estrecho de longitudes de onda, tal como, por ejemplo, con una fuente de luz que emite luz en un intervalo estrecho de longitudes de onda como un intervalo de 50 nm o menos, tal como 40 nm o menos, tal como 30 nm o menos, tal como 25 nm o menos, tal como 20 nm o menos, tal como 15 nm o menos, tal como 10 nm o menos, tal como 5 nm o menos, tal como 2 nm o menos, e incluyendo fuentes de luz que emiten una longitud de onda específica de luz (es decir, luz monocromática). Cuando los métodos incluyen irradiar con una fuente de luz de banda estrecha, los protocolos de fuente de luz de banda estrecha de interés pueden incluir, aunque no de forma limitativa, un LED de longitud de onda estrecha, un diodo láser o una fuente de luz de banda ancha acoplada a uno o más filtros de paso de banda ópticos, rejillas de difracción, monocromadores o cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, los métodos incluyen irradiar la muestra con uno o más láseres, donde el tipo y la cantidad de láseres variarán dependiendo de la muestra así como de la luz deseada recogida. Como tal, el láser o láseres pueden seleccionarse entre: uno o más láseres de gas, uno o más láseres de colorante, uno o más láseres excímeros, uno o más láseres de vapor de metal, uno o más láseres de estado sólido y combinaciones de los mismos.

La muestra puede irradiarse con una o más de las fuentes de luz mencionadas anteriormente, tales como dos o más fuentes de luz, tales como tres o más fuentes de luz, tales como cuatro o más fuentes de luz, tales como cinco o más fuentes de luz, e incluyendo diez o más fuentes de luz. La fuente de luz puede incluir cualquier combinación de tipos de fuentes de luz. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos incluyen irradiar la muestra en la corriente de flujo con una matriz de láseres, tal como una matriz que tenga uno o más láseres de gas, uno o más láseres de tinte, y uno o más láseres de estado sólido.

La muestra puede irradiarse con longitudes de onda que varían de 200 nm a 1500 nm, tal como de 250 nm a 1250 nm, tal como de 300 nm a 1000 nm, tal como de 350 nm a 900 nm, e incluyendo de 400 nm a 800 nm. Por ejemplo, cuando la fuente de luz es una fuente de luz de banda ancha, la muestra puede irradiarse con longitudes de onda de 200 nm a 900 nm. En otros casos, donde la fuente de luz incluye una pluralidad de fuentes de luz de banda estrecha, la muestra puede irradiarse con longitudes de onda específicas en el intervalo de 200 nm a 900 nm. Por ejemplo, la fuente de luz puede ser una pluralidad de LED de banda estrecha (1 nm-25 nm) que cada uno emite de forma independiente luz con un intervalo de longitudes de onda entre 200 nm a 900 nm. En otras realizaciones, la fuente de luz de banda estrecha incluye uno o más láseres (tales como una matriz láser), y la muestra se irradia con longitudes de onda específicas que varían de 200 nm a 700 nm, tal como con una matriz láser que tiene láseres de gas, láseres excímeros, láseres de colorante, láseres de vapor de metal, y láser de estado sólido como se describió anteriormente.

Cuando se emplea más de una fuente de luz, la muestra puede irradiarse con las fuentes de luz de forma simultánea o secuencial, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, la muestra puede irradiarse simultáneamente con ambas fuentes de luz. En otras realizaciones, la corriente de flujo se irradia secuencialmente con ambas fuentes de luz. Cuando dos fuentes de luz irradian secuencialmente, el tiempo que cada fuente de luz irradia la muestra puede ser independientemente 0,001 microsegundos o más, tal como 0,01 microsegundos o más, tal como 0,1 microsegundos o más, tal como 1 microsegundo o más, tal como 5 microsegundos o más, tal como 10 microsegundos o más, tal como 30 microsegundos o más, e incluyendo 60 microsegundos o más. Por ejemplo, los métodos pueden incluir irradiar la muestra con la fuente de luz (p. ej., láser) durante una duración que varía de 0,001 microsegundos a 100 microsegundos, tal como de 0,01 microsegundos a 75 microsegundos, tal como de 0,1 microsegundos a 50 microsegundos, tal como de 1 microsegundo a 25 microsegundos, e incluyendo de 5 microsegundos a 10 microsegundos. En realizaciones donde la muestra se irradia secuencialmente con dos o más fuentes de luz, la duración de la muestra que se irradia por cada fuente de luz puede ser igual o diferente.

La muestra puede irradiarse continuamente o en intervalos discretos. En algunos casos, los métodos incluyen irradiar la muestra con la fuente de luz de forma continua. En otros casos, la muestra se irradia con la fuente de luz en intervalos discretos, tal como irradiar cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos, e incluyendo cada 1000 milisegundos, o algún otro intervalo.

Dependiendo de la fuente de luz, la muestra puede irradiarse desde una distancia que varía tal como 0,01 mm o más, tal como 0,05 mm o más, tal como 0,1 mm o más, tal como 0,5 mm o más, tal como 1 mm o más, tal como 2,5 mm o más, tal como 5 mm o más, tal como 10 mm o más, tal como 15 mm o más, tal como 25 mm o más, e incluyendo 50 mm o más. Además, el ángulo o irradiación también puede variar, variando de 10° a 90°, tal como de 15° a 85°, tal como de 20° a 80°, tal como de 25° a 75°, e incluyendo de 30° a 60°, por ejemplo, en un ángulo de 90°.

En ciertas realizaciones, la luz emitida por la muestra irradiada se procesa mediante un sistema de recogida de luz, por ejemplo, un conjunto de lentes del objetivo, y se mide mediante un sistema de detección óptica que tiene un módulo de recogida de SSC de la región central como se ha descrito anteriormente.

Por tanto, en determinadas realizaciones, los métodos incluyen recoger luz emitida desde la muestra irradiada (por ejemplo, desde una zona de detección de una corriente de flujo irradiada) y generar luz reflejada de la lente del objetivo a partir de la misma. En ciertos aspectos, generar luz reflejada de la lente del objetivo incluye pasar la luz recogida a través de una o más lentes del objetivo, que pueden incluir una o una combinación de una lente colimadora, una lente de enfoque, una lente de aumento, una lente de desmagnificación u otra lente, que están configuradas para recibir luz recogida (por ejemplo, desde una zona de detección de una celda de flujo) y producir luz reflejada.

En ciertas realizaciones, el método incluye pasar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo a través de una abertura hasta un detector, donde la abertura tiene una máscara óptica que bloquea la luz de longitud de onda SSC fuera de una región central para que no llegue al detector. (Este aspecto de los métodos divulgados se puede describir como el bloqueo de la luz de longitud de onda SSC que está fuera de una región central para que no llegue al detector). Como se ha descrito anteriormente, en determinadas realizaciones, la región central de la luz de longitud de onda SSC recogida reflejada de la lente del objetivo tiene un diámetro que varía de 50 micrómetros (|j) a 500 |j, incluyendo de 70 ji a 450 |j, de 70 ji a 400 |j, de 100 ji a 400 ji, de 200 ji a 400 ji, etc. Como tal, en determinadas realizaciones, la región central tiene un diámetro de o aproximadamente 500 ji, de o aproximadamente 475 ji, de o aproximadamente 450 ji, de o aproximadamente 425 ji, de o aproximadamente 400 ji, de o aproximadamente 375 ji, de o aproximadamente 350 ji, de o aproximadamente 325 ji, de o aproximadamente 300 ji, de o aproximadamente 275 ji, de o aproximadamente 250 ji, de o aproximadamente 225 ji, de o aproximadamente 200 ji, de o aproximadamente 175 ji, de o aproximadamente 150 ji, de o aproximadamente 125 ji, de o aproximadamente 100 ji, de o aproximadamente 75 ji, de o aproximadamente 50 ji, o cualquier punto intermedio.

En determinadas realizaciones, la máscara óptica de la abertura bloquea selectivamente la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que está fuera de una región central para que no llegue al detector. Por “ bloquea selectivamente” se entiende que la máscara óptica no bloquea el paso de al menos una luz de longitud de onda distinta de SSC, incluyendo al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o más longitudes de onda de luz. En determinadas realizaciones, la máscara óptica de la abertura sólo bloquea el paso de luz de longitud de onda SSC. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, el elemento de máscara óptica de la abertura funciona de manera similar a los filtros ópticos (o filtros de paso de banda), que se usan en una amplia variedad de aplicaciones de detección de luz.

En determinadas realizaciones, el método incluye detectar una o más longitudes de onda distintas de SSC de luz que pasan a través de la máscara óptica de la abertura mediante uno o más detectores adicionales (por ejemplo, un segundo detector, un tercer detector, etc.). En determinadas realizaciones, la una o más longitudes de onda distintas de SSC de luz es luz que se emite desde una partícula en la corriente de flujo, por ejemplo, una célula o una partícula subcelular. La luz puede emitirse desde la propia partícula y/o desde un constituyente sobre o dentro de la partícula que tiene propiedades emisoras de luz, por ejemplo, una molécula fluorescente. Tales realizaciones incluyen células o partículas que están unidas a anticuerpos marcados con fluorescencia y/o que están asociadas con o expresan una proteína fluorescente. No se pretende ninguna limitación a este respecto.

En determinadas realizaciones, el método incluye además pasar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo a través de un módulo de dispersión (o separador) de luz que procesa la luz antes de transmitirla a uno o más detectores. Un módulo separador/de dispersión de luz se refiere a un dispositivo que separa la luz policromática en las longitudes de onda que la componen (como tal, estos módulos a veces se denominan “ separadores de longitud de onda” ). La separación de longitud de onda, según ciertas realizaciones, puede incluir hacer pasar o bloquear selectivamente longitudes de onda específicas o intervalos de longitud de onda de la luz policromática. Los dispositivos de dispersión de luz de interés incluyen, pero sin limitarse a, vidrio coloreado, filtros de paso de banda, filtros de interferencia, espejos dicroicos, rejillas de difracción, monocromadores y combinaciones de los mismos, entre otros dispositivos de separación de longitud de onda. En determinados casos, el módulo de dispersión de luz incluye uno o más filtros de paso de banda que tienen anchos de banda mínimos que varían de 2 nm a 100 nm, tal como de 3 nm a 95 nm, tal como de 5 nm a 95 nm, tal como de 10 nm a 90 nm, tal como de 12 nm a 85 nm, tal como de 15 nm a 80 nm, e incluyendo filtros de paso de banda con anchos de banda mínimos que varían de 20 nm a 50 nm.

Además de los aspectos detallados anteriormente, determinadas realizaciones de los métodos divulgados incluyen dirigir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo a un filtro óptico configurado para producir al menos una primera trayectoria y una segunda trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo. En realizaciones, el filtro óptico se usa en el lugar de la abertura que tiene una máscara óptica que bloquea selectivamente la luz de longitud de onda SSC como se ha descrito anteriormente. En tales casos, la primera trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo comprende al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo. En determinadas realizaciones, el filtro óptico refleja al menos una porción de luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria, mientras que en otras realizaciones, el filtro óptico pasa al menos una porción de la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo para producir la primera trayectoria.

En determinadas realizaciones, la primera trayectoria contiene del 50 % al 99 % de la luz de longitud de onda SSC recogida reflejada de la lente del objetivo, incluyendo del 55 % al 98 %, del 60 % al 96 %, del 70 % al 94 %, del 80 % al 92 %, del 85 % al 90 %, y cualquier intervalo intermedio. Por tanto, la primera trayectoria puede incluir al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % de la luz de longitud de onda SSC recogida reflejada de la lente del objetivo.

En determinadas realizaciones, la porción de luz de longitud de onda SSC que no está en la primera trayectoria de luz recogida está presente en la segunda trayectoria. En general, una mayor porción de luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo está presente en la primera trayectoria en comparación con la segunda trayectoria, por ejemplo, donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 99 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 1 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 98 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 2 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 97 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 3 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 96 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 4 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 95 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 5 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 90 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 10 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 80 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 20 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 70 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 30 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 60 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 40 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo; donde la primera trayectoria comprende aproximadamente el 51 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo y la segunda trayectoria comprende aproximadamente el 49 % de la luz de longitud de onda SSC recogida de la lente del objetivo.

En determinadas realizaciones, el método incluye además dirigir la primera trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo a través de una abertura hacia un detector, donde la abertura bloquea el paso de la luz de longitud de onda SSC que está fuera de una región central para que no llegue al detector (las dimensiones de la región central se han descrito anteriormente). En determinadas realizaciones, la región central de la luz de longitud de onda SSC en la primera trayectoria se detecta directamente o se transmite mediante un transportador de luz (por ejemplo, una fibra óptica) al detector, como se ha descrito en detalle anteriormente (véase, por ejemplo, la FIG.

3 y su descripción). En tales realizaciones, el transportador de luz puede tener una superficie transportadora de luz que tiene un diámetro que es mayor que la región central de la primera trayectoria que ha pasado a través de la abertura. En algunos casos, la abertura y el transportador de luz (o detector) están en contacto directo, mientras que en otras realizaciones no lo están (véase, por ejemplo, la FIG. 3, paneles izquierdo y central).

En determinadas realizaciones, el método incluye dirigir la primera trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo hacia la superficie transportadora de luz de un transportador de luz que tiene el tamaño de la región central, por ejemplo, una fibra óptica que tiene un núcleo que tiene el diámetro de la región central (véase la FIG. 3, panel derecho). En tales realizaciones, no se requiere un elemento de abertura. En realizaciones sin un transportador de luz (por ejemplo, una fibra óptica), la primera trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo se dirige a un detector que tiene una superficie de detección de luz que es del tamaño de la región central.

En determinadas realizaciones, el método incluye detectar una o más longitudes de onda de luz en la segunda trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo mediante uno o más detectores adicionales (por ejemplo, un segundo detector, un tercer detector, etc.). Dependiendo de la configuración del filtro óptico que produce las trayectorias primera y segunda, la segunda trayectoria puede ser luz recogida de la lente del objetivo que es reflejada por el filtro óptico o que se pasa por el filtro óptico.

En determinadas realizaciones, la una o más longitudes de onda de luz detectadas en la segunda trayectoria incluyen al menos una luz de longitud de onda distinta de SSC. En determinadas realizaciones, la al menos una luz de longitud de onda distinta de SSC es luz que se emite desde una partícula en la corriente de flujo, por ejemplo, una célula o una partícula subcelular (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente). En determinadas realizaciones, en la segunda trayectoria se detecta luz de longitud de onda tanto SSC como distinta de SSC. Como se señaló anteriormente, la luz de longitud de onda SSC en la segunda trayectoria es esa porción de luz de longitud de onda SSC que no está en la primera trayectoria. En general, la porción de luz de longitud de onda SSC en la segunda trayectoria es menor que la porción en la primera trayectoria. Cuando la luz de longitud de onda SSC se detecta por separado tanto en la primera como en la segunda trayectoria, se puede utilizar para evaluar diferentes aspectos de la muestra bajo interrogación. Por ejemplo, la luz de longitud de onda SSC en la primera trayectoria (que se procesa para bloquear la detección de la luz de longitud de onda SSC de la región no central) se puede usar para identificar partículas de tamaño submicrométrico en la muestra que se está interrogando (por ejemplo, orgánulos subcelulares, vesículas, etc.), mientras que la luz de longitud de onda SSC en la segunda trayectoria (que no se procesa para bloquear la detección de la luz de longitud de onda SSC de la región no central) se puede usar para identificar partículas más grandes en la muestra que se está interrogando.

En determinadas realizaciones, el método incluye además pasar la segunda trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo a través de un módulo de dispersión (o separador) de luz que procesa la luz antes de transmitirla al uno o más detectores (como se ha descrito anteriormente).

En la práctica de los métodos objeto, la luz propagada a través del sistema detección óptica, como se divulga en la presente memoria, se mide en una o más longitudes de onda, tal como en 5 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 10 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 25 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 50 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 100 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 200 o más longitudes de onda diferentes, tal como en 300 o más longitudes de onda diferentes, e incluyendo medir la luz recolectada en 400 o más longitudes de onda diferentes.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen medir la luz recolectada en un intervalo de longitudes de onda (p. ej., 200 nm-1000 nm). Por ejemplo, los métodos pueden incluir recoger espectros de luz en uno o más de los intervalos de longitud de onda de 200 nm-1000 nm. Aún en otras realizaciones, los métodos incluyen medir la luz recolectada en una o más longitudes de onda específicas. Por ejemplo, la luz recolectada puede medirse a uno o más de 450 nm, 518 nm, 519 nm, 561 nm, 578 nm, 605 nm, 607 nm, 625 nm, 650 nm, 660 nm, 667 nm, 670 nm, 668 nm, 695 nm, 710 nm, 723 nm, 780 nm, 785 nm, 647 nm, 617 nm, y cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, los métodos que incluyen medir longitudes de onda de luz que corresponden a la longitud de onda máxima de fluorescencia de determinados fluoróforos.

La luz recolectada puede medirse continuamente o en intervalos discretos. En algunos casos, los métodos incluyen tomar mediciones de la luz de forma continua. En otros casos, la luz se mide en intervalos discretos, tal como medir la luz cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos, e incluyendo cada 1000 milisegundos, o algún otro intervalo.

Las mediciones de la luz recolectada pueden realizarse una o más veces durante los métodos objeto, tales 2 o más veces, tal como 3 o más veces, tal como 5 o más veces, e incluyendo 10 o más veces. En determinadas realizaciones, la luz se mide dos o más veces, promediando los datos en determinados casos.

Las mediciones de luz pueden tomarse con cualquier protocolo conveniente, incluyendo, aunque no de forma limitativa, sensores ópticos o fotodetectores, tal como sensores de píxeles activos (APS), fotodiodo de avalancha, sensores de imagen, dispositivos de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada intensificada (ICCD), diodos emisores de luz, contadores de fotones, bolómetros, detectores piroeléctricos, fotorresistores, células fotovoltaicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, fototransistores, fotoconductores o fotodiodos de puntos cuánticos y combinaciones de los mismos, entre otros fotodetectores. En determinadas realizaciones, la luz transmitida se mide con un dispositivo de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada de semiconductores (CCD), sensores de píxeles activos (APS), sensores de imagen complementarios de semiconductores de óxido metálico (CMOS), o sensores de imagen de semiconductores de óxido metálico de tipo N (NMOS). En ciertas realizaciones, la luz se mide con un dispositivo de carga acoplada (CCD). Cuando la luz transmitida se mide con un CCD, el área superficial de detección activa del CCD puede variar, tal como desde 0,01 cm2 a 10 cm2, tal como desde 0,05 cm2 a 9 cm2, tal como desde 0,1 cm2 a 8 cm2, tal como desde 0,5 cm2 a 7 cm2, e incluyendo desde 1 cm2 a 5 cm2.

Kits

Los aspectos de la presente divulgación incluyen, además, kits, donde los kits incluyen un módulo de recogida de SSC selectiva de la región central como se ha descrito en la presente memoria. Los módulos de recogida de SSC de la región central, como se describen en la presente memoria, están configurados para permitir la detección selectiva de luz de longitud de onda SSC de una región central de luz recogida. Como tales, los kits pueden incluir uno o más elementos de abertura, por ejemplo, para bloquear o bloquear selectivamente la luz de longitud de onda SSC que está fuera de una región central, uno o más filtros ópticos, uno o más elementos transportadores de luz, uno o más detectores y cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, el (los) elemento(s) de abertura puede(n) tener una abertura ajustable para aumentar o disminuir el diámetro de la abertura, lo que ajustará el tamaño de la región central de la luz de longitud de onda SSC que pasa a través de ella. En determinadas realizaciones, un módulo de recogida de SSC selectiva de la región central está configurado para agregarse a un sistema de detección óptica existente, por ejemplo, un citómetro de flujo, y como tal puede incluir hardware para conectar o insertar el módulo.

Los diversos componentes de ensayo de los kits pueden encontrarse en recipientes separados, o algunos o todos ellos pueden combinarse/ensamblarse previamente. Por ejemplo, una abertura y un transportador de luz de fibra óptica pueden estar ensamblados y presentes en un único paquete sellado.

Además de los componentes anteriores, los kits objeto pueden incluir además (en determinadas realizaciones) instrucciones, por ejemplo, para agregar el módulo de recogida de SSC selectiva de la región central a un dispositivo de detección óptica o para usar un sistema que tiene el módulo de recogida de SSC selectiva de la región central según aspectos de los métodos objeto. Estas instrucciones pueden encontrarse en los kits objeto en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden encontrarse en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden presentarse es como información impresa sobre un medio o sustrato adecuado, p. ej., una pieza o piezas de papel sobre la que se imprima la información, en la envoltura del kit, en un prospecto, y similares. Otra forma más de estas instrucciones es un medio legible por ordenador, p. ej., un disquete, un disco compacto (CD), una unidad flash portátil, y similares, en el que se ha grabado la información. Otra forma más de estas instrucciones que pueden estar presentes es una dirección de sitio web que pueda utilizarse a través de internet para acceder a la información en un sitio eliminado.

Utilidad

Los sistemas de detección óptica que incluyen un módulo de recogida de SSC de la región central como se detalla en la presente memoria encuentran uso para mejorar la relación señal-ruido en la detección de SSC en comparación con los sistemas actualmente disponibles. Los módulos de recogida de SSC de la región central divulgados están configurados para tener en cuenta la aberración cromática observada con luz reflejada de la lente del objetivo que incluye múltiples longitudes de onda de luz. Esto permite, por ejemplo, una mejora en la detección de partículas de tamaño subcelular (o submicrométrico) en una muestra interrogada en una corriente de flujo, por ejemplo, en un citómetro de flujo, permitiendo una detección y análisis simultáneos mejorados de tanto partículas de tamaño submicrométrico como partículas más grandes, por ejemplo células.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de detección óptica que comprende:

un sistema de recogida de luz configurado para producir luz recogida reflejada de la lente del objetivo desde una zona de detección de una celda de flujo; y

un módulo de dispersión de luz configurado para separar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo en al menos dos longitudes de onda de luz; en donde el sistema está configurado para permitir la detección selectiva de luz de longitud de onda de dispersión lateral SSC desde una región central de luz recogida, a través de

(a) una abertura colocada entre el sistema de recogida de luz y el módulo de dispersión de luz, en donde la abertura comprende una máscara óptica configurada para bloquear solo la luz de longitud de onda SSC de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que está fuera de la región central, teniendo la abertura un tamaño definido por la máscara óptica que se adapta a la región central de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo; o (b) un filtro óptico colocado entre el sistema de recogida de luz y el módulo de dispersión de luz, en donde el filtro óptico está configurado para producir al menos una primera trayectoria y una segunda trayectoria de luz recogida reflejada de la lente del objetivo, en donde la primera trayectoria comprende al menos una porción de la luz de longitud de onda

SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo; y

una abertura configurada para bloquear selectivamente la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo en la primera trayectoria que está fuera de la región central;

y

un transportador de luz de fibra óptica configurado para transmitir selectivamente luz de longitud de onda SSC en la primera trayectoria desde la región central de la luz de longitud de onda SSC, en donde la abertura está unida directamente al transportador de luz de fibra óptica.

2. El sistema de detección óptica según la reivindicación 1, en donde el sistema comprende:

un primer detector configurado para detectar una primera de las al menos dos longitudes de onda de luz y un segundo detector configurado para detectar una segunda de las al menos dos longitudes de onda de luz, en donde la primera longitud de onda de luz es luz de longitud de onda SSC; y

la abertura colocada entre el sistema de recogida de luz y el módulo de dispersión de luz, en donde la abertura comprende la máscara óptica configurada para bloquear selectivamente la luz de longitud de onda SSC procedente de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que está fuera de la región central para que no llegue al primer detector.

3. El sistema de detección óptica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además

un transportador de luz de fibra óptica colocado entre la abertura y el módulo de dispersión de luz, en donde el transportador de luz de fibra óptica está configurado para transmitir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que ha pasado a través de la abertura al módulo de dispersión de luz.

4. El sistema de detección óptica según la reivindicación 3, en donde el transportador de luz de fibra óptica comprende un núcleo que tiene un diámetro que es mayor que la región central.

5. El sistema de detección óptica según la reivindicación 1, en donde el sistema comprende:

un detector configurado para recibir la luz de longitud de onda SSC recogida reflejada de la lente del objetivo;

el filtro óptico configurado para producir al menos la primera trayectoria y la segunda trayectoria de la luz recogida reflejada de la lente del objetivo, y

la abertura configurada para bloquear el paso de la luz de longitud de onda SSC en la primera trayectoria que está fuera de la región central para que no llegue al detector.

6. El sistema de detección óptica según la reivindicación 5, que comprende además:

un segundo detector configurado para detectar una primera de las al menos dos longitudes de onda de luz y un tercer detector configurado para detectar una segunda de las al menos dos longitudes de onda de luz.

7. El sistema de detección óptica según la reivindicación 6, que comprende además el transportador de luz

de fibra óptica que está colocado entre la abertura y el detector, y está configurado para transmitir la luz recogida reflejada de la lente del objetivo que ha pasado a través de la abertura al detector.

8. El sistema de detección óptica según la reivindicación 1, en donde el sistema comprende:

el transportador de luz de fibra óptica configurado para transmitir selectivamente luz de longitud de onda SSC en la primera trayectoria desde una región central de la luz de longitud de onda SSC al detector.

9. El sistema de detección óptica según la reivindicación 8, que comprende además:

10. El sistema de detección óptica según la reivindicación 1, en donde el ángulo entre el haz de fuente de luz usado para iluminar la corriente de flujo y el eje óptico de la lente del objetivo usada para recoger la luz desde la corriente de flujo iluminada es sustancialmente un ángulo de 90 grados.

11. Un citómetro de flujo que comprende:

una fuente de luz;

una celda de flujo que comprende una zona de detección; y

un sistema de detección óptica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Un método de análisis de una corriente de flujo, comprendiendo el método:

irradiar una corriente de flujo con una fuente de luz;

generar luz reflejada de la lente del objetivo recogida desde una zona de detección de la corriente de flujo irradiada; y

pasar la luz recogida reflejada de la lente del objetivo a través de un sistema de detección óptica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.