ES2987623T3 - Compuestos de aluminio para su uso en agentes terapéuticos y vacunas - Google Patents

Compuestos de aluminio para su uso en agentes terapéuticos y vacunas Download PDF

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Abstract

Una composición acuosa que comprende una proteína, un compuesto reactivo y una sal de aluminio, comprendiendo dicha composición menos de 350 ppb de metal pesado y menos de 2,5 ppb de Cu en base al peso de la composición acuosa, en donde el compuesto reactivo es un compuesto activo redox, un compuesto formador de radicales y/o un compuesto estabilizador, y en donde dicha proteína es una proteína viral o bacteriana inmunogénica o una parte inmunogénica de dicha proteína. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos de aluminio para su uso en agentes terapéuticos y vacunas
La invención se refiere a los campos de los productos farmacéuticos y las vacunas. Más particularmente, la invención se refiere al campo de los compuestos y composiciones que se coadministran con el medicamento y/o antígeno.
Los compuestos de aluminio (también denominados en la presente "aluminio"), incluyendo el fosfato de aluminio (AlPO4), el hidróxido de aluminio (Al(OH)3) y otras vacunas precipitadas con aluminio, son actualmente los adyuvantes más usados en las vacunas humanas y veterinarias. En la bibliografía los adyuvantes se denominan a menudo "alumbre".
Los adyuvantes de aluminio se han usado en la vacunación práctica desde hace más de medio siglo. Inducen una inmunidad protectora precoz, de alto título y duradera. A lo largo de los años se han administrado miles de millones de dosis de vacunas con adyuvantes de aluminio. Su seguridad y eficacia los han convertido en los adyuvantes más populares de las vacunas hasta la fecha. En general, los adyuvantes de aluminio se consideran seguros cuando se usan de acuerdo con los programas de vacunación actuales.
En la vacunación humana, los adyuvantes de aluminio se han usado desde hace tiempo en las vacunas contra el tétanos, la difteria, la tosferina y la poliomielitis, como parte de los programas estándar de vacunación infantil. Los adyuvantes de aluminio también se han introducido en las vacunas contra los virus de la hepatitis A y la hepatitis B, y vacunas contra el virus de la encefalitis japonesa (también denominado en la presente "JEV"). Hay disponibles otras vacunas adsorbidas con aluminio contra, por ejemplo, el ántrax, para grupos de riesgo especiales. En medicina veterinaria se han usado adyuvantes de aluminio en un gran número de formulaciones de vacunas contra enfermedades víricas y bacterianas, y en intentos de elaborar vacunas antiparasitarias.
Los adyuvantes típicamente sirven para poner en contacto el antígeno, la sustancia que estimula la respuesta inmunitaria protectora específica, con el sistema inmunitario e influyen en el tipo de inmunidad producida, así como en la calidad de la respuesta inmunitaria (magnitud o duración); los adyuvantes también pueden disminuir la toxicidad de ciertos antígenos y proporcionar solubilidad a algunos componentes de las vacunas. Los estudios han demostrado que muchas vacunas que contienen aluminio provocan respuestas de anticuerpos mayores y más prolongadas que vacunas comparables sin el adyuvante. El beneficio de los adyuvantes se ha observado habitualmente durante la serie de inmunización inicial más que con las dosis de refuerzo.
Hay tres tipos generales de adyuvantes que contienen aluminio: hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio y potasio (denominados colectivamente "alumbre").
La eficacia de cada sal como adyuvante depende de las características de la vacuna específica y de cómo la prepare el fabricante. Para que funcione como adyuvante, el antígeno típicamente se adsorber en el aluminio; es decir, se aglutina con la sal de aluminio para mantener el antígeno en el lugar de la inyección.
No todas las vacunas contienen sales de aluminio. A veces puede no haber sido necesario un adyuvante o se ha seleccionado otro adyuvante. Algunos ejemplos de vacunas comerciales que no contienen sales de aluminio son la vacuna inactivada contra el virus de la polio (IPV), la vacuna contra el sarampión, las paperas y la rubéola (MMR), la vacuna contra la varicela, la vacuna conjugada meningocócica (MCV4) y las vacunas contra la gripe. Que las vacunas comerciales no contengan sales de aluminio no significa típicamente que no funcione una sal de aluminio. Sólo significa que por alguna razón se seleccionó otro adyuvante.
Algunos ejemplos de vacunas infantiles autorizadas en los Estados Unidos que contienen adyuvantes de aluminio son: DTP (vacuna contra la difteria, el tétanos y la tosferina); DTaP (vacuna contra la difteria, el tétanos y la tosferina acelular); algunas pero no todas las vacunas conjugadas contra la Hib (Haemophilus influenzae tipo b); vacuna conjugada contra el neumococo; vacunas contra la hepatitis B; vacunas contra la hepatitis A; vacuna contra el virus del papiloma humano; vacuna contra el ántrax; y vacuna contra la rabia.
El aluminio es un elemento muy abundante en nuestro entorno. Está en muchos alimentos que comemos, en muchos productos de higiene personal que nos aplicamos en la piel (desodorantes, por ejemplo) y en muchos medicamentos que ingerimos. Varios organismos gubernamentales establecen directrices para la exposición a sustancias potencialmente tóxicas. Estas directrices se denominan "niveles mínimos de riesgo", es decir, la cantidad máxima a la que una persona puede estar expuesta a lo largo del tiempo, habitualmente a diario, sin sufrir daños.
La Agencia para el Registro de Sustancias Tóxicas y Enfermedades de Estados Unidos (ATSDR) estimó estos niveles para los lactantes teniendo en cuenta la cantidad de aluminio (por ejemplo, en forma de sal) que un niño comería, así como la que recibiría mediante la inyección de vacunas. La carga corporal de aluminio procedente de ambas fuentes está por debajo del nivel mínimo de riesgo, excepto transitoriamente después de las vacunaciones; como el 50-70% del aluminio inyectado se excreta en el plazo de 24 horas, se cree que no tiene ningún efecto negativo.
Los adyuvantes de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio se preparan generalmente exponiendo soluciones acuosas de iones de aluminio, a condiciones habitualmente ligeramente alcalinas en un entorno químico bien definido y controlado. Para la producción de hidróxido de aluminio pueden usarse varias sales de aluminio solubles. Los aniones presentes en el momento de la precipitación pueden coprecipitar (para una revisión, consultar, Lindblad, EB (2004) Immunol. and Cell Biol. Vol 82: 497-505).
La sal de aluminio también se usa en la fabricación y composición de medicamentos. Por ejemplo, el factor VIII se purifica a partir de crioprecipitado de plasma. El precipitado se solubiliza, se absorbe en hidróxido de aluminio y se trata para inactivar los virus con envoltura lipídica. Después de varios otros pasos de procesamiento, el concentrado se usa para tratar a pacientes con hemofilia A (Burnouf T, (1991) Vox Sang. Vol 60: pp 8-15).
El informe de evaluación de la Agencia Europea de Medicamentos para IXIARO® (2009) divulga una vacuna contra el virus completo de la encefalitis japonesa inactivado con formaldehído y adsorbido en hidróxido de aluminio que tiene una vida útil de 12 meses.
Estey et al. (2009) J.Pharmaceutical Science. Vol. 98, No.9: 2994-3012 divulga que las proteínas de la vacuna botulínica trivalente (rBoNTE(H<c>)) adyuvada con hidróxido de aluminio eran susceptibles a la oxidación y la desaminación, y que estas reacciones se aceleraban en presencia del adyuvante.
En la presente divulgación se ha demostrado que la estabilidad de un agente biológico en una composición que también comprende una sal de aluminio no siempre es la misma. La presente divulgación, por ejemplo, muestra que la estabilidad de un componente proteico (por ejemplo, como tal o dentro de un complejo como, por ejemplo, un virus u otro patógeno) en el contexto de una composición acuosa que también comprende sal de aluminio depende del contenido de metales pesados. Para estimar a priori si la proteína será estable en esta composición, la presente divulgación prevé que es necesario determinar el contenido de metales pesados residual en la composición (de lo contrario, la composición acuosa que comprende una proteína corre el riesgo de degradarse con el tiempo en particular la divulgación prevé que este riesgo es considerable cuando el contenido de metales pesados residual está por encima de 350 ppb (es decir, aproximadamente 350ng por ml) en dicha composición acuosa). Además, la invención también reveló que este contenido de metales pesados residual no puede eliminarse fácilmente del compuesto de aluminio. Con este fin, la divulgación proporciona un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio y una proteína dicho método que comprende
- combinar una sal de aluminio, dicha proteína y agua para producir dicha composición acuosa y
- determinar el nivel de un metal pesado en la composición acuosa y/o en la sal de aluminio. Las composiciones que contienen menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa pueden almacenarse en fase líquida a una temperatura comprendida entre 0 y 30 grados Celsius durante por lo menos 1 mes, como por ejemplo 20 meses a 2-8°C. El componente proteico de dicha composición es estable durante por lo menos 1 mes en dicha fase líquida. Las composiciones que contienen más de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa no pueden almacenarse durante un período prolongado en tales condiciones, ya que el componente proteico de dicha composición cambia en por lo menos un aspecto durante el período de tiempo indicado. Por tanto, un mililitro o un gramo de composición acuosa contiene preferiblemente no más de 350 nanogramos de metal pesado. La composición acuosa comprende preferiblemente entre 0,1 mg/ml y 2,5 mg/ml de aluminio. La dosis media de aluminio por administración es preferiblemente no mayor de 1,25 miligramos (mgramo). En una realización particularmente preferida, la dosis de aluminio por administración no es mayor de 0,25 mgramos de aluminio. Una dosis comprende típicamente entre 0,5 y 1 ml de la composición acuosa.
En un aspecto adicional de la presente divulgación se ha demostrado que la estabilidad de un agente biológico en una composición que comprende una sal de aluminio y un compuesto reactivo no es siempre la misma. La presente divulgación, por ejemplo, muestra que la estabilidad de un componente proteico (por ejemplo, como tal o dentro de un complejo como, por ejemplo, un virus u otro patógeno) en el contexto de una composición acuosa que también comprende sal de aluminio y un compuesto reactivo como, por ejemplo, un sulfito, depende críticamente del contenido de metales pesados. Para estimar a priori si el componente proteico (como, por ejemplo, el componente proteico dentro de un complejo como, por ejemplo, una partícula vírica; también denominada en la presente simplemente proteína) será estable en esta composición, es necesario determinar el contenido de metales pesados en la composición. Con este fin, la divulgación proporciona un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio y una proteína, dicho método comprendiendo
- combinar una sal de aluminio, dicha proteína y agua para producir dicha composición acuosa y
- determinar el nivel de un metal pesado en la composición acuosa y/o en la sal de aluminio. Las composiciones que comprenden menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa pueden almacenarse en fase líquida a una temperatura comprendida entre 0 y 30 grados Celsius durante por lo menos 1 mes como, por ejemplo, 20 meses a 2-8°C. El componente proteico de dicha composición es estable durante por lo menos 1 mes en dicha fase líquida, por ejemplo 20 meses a 2-8°C. Las composiciones que comprenden más de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa no pueden almacenarse durante un período prolongado en tales condiciones, ya que el componente proteico de dicha composición cambia en por lo menos un aspecto durante el período de tiempo indicado. Por tanto, un mililitro o un gramo de composición acuosa contiene preferiblemente no más de 350 nanogramos de metal pesado. La composición acuosa comprende preferiblemente entre 0,1 mg/ml (miligramo por mililitro) y 2,5 mg/ml de aluminio. La dosis media de aluminio por administración es preferiblemente de no más de 1,25 miligramos (mgramos). En una realización particularmente preferida, la dosis de aluminio por administración no es de más de 0,25 mgramos de aluminio. Una dosis comprende típicamente entre 0,5 y 1 ml de la composición acuosa. Una composición acuosa que comprende una proteína, una sal de aluminio, y opcionalmente un compuesto reactivo, dicha composición comprendiendo menos de 350 ppb de metal pesado y menos de 2,5 ppb de Cu sobre la base del peso de la composición acuosa, en donde la sal de aluminio es hidróxido de aluminio (Al(OH)3) o fosfato de aluminio (APO4), en donde el compuesto reactivo es con compuesto activo redox, y en donde dicha proteína es una proteína bacteriana o vírica inmunogénica o una parte inmunogénica de dicha proteína se denomina también en la presente "una composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo con la invención" o "una composición que comprende una proteína de acuerdo con la invención".
El contenido de aluminio de la composición acuosa es habitualmente de alrededor de 0,1 mg/ml a 2,5 mg/ml, y la vacuna media comprende aproximadamente de 0,5 a 1,5 mg/ml del adyuvante de aluminio. Con este fin, la invención proporciona una composición acuosa, una composición acuosa farmacéutica o de vacuna que comprende aluminio, un compuesto reactivo y una proteína, que comprende entre 5 mcgramos/ml y 50 mg/ml de aluminio y que no comprende más de 700 ppm de un metal pesado en comparación con el contenido de aluminio (gramo/gramo). En este contexto, 700 ppm de un metal pesado equivale a 700 mcgramos de metal pesado por gramo de aluminio.
La composición acuosa farmacéutica o vacunal que comprende aluminio, un compuesto reactivo y una proteína de acuerdo con la divulgación, puede comprender entre 5 mcgramos/ml y 50 mg/ml de aluminio y no comprende más de 450 ppm de un metal pesado cuando se compara con el contenido de aluminio (gramo/gramo). En este contexto, 450 ppm de un metal pesado equivale a 450 mcgramos de metal pesado por gramo de aluminio.
En una realización preferida, la composición acuosa, la composición acuosa farmacéutica o vacunal que comprende aluminio, un compuesto reactivo y una proteína, comprende entre 5 mcgramos/ml y 50 mg/ml de aluminio y no comprende más de 700 ppm de Fe en comparación con el contenido de aluminio (gramo/gramo). Preferiblemente, el contenido de Fe es de menos de 420 ppm de Fe en comparación con el contenido de aluminio. Preferiblemente, el contenido de Fe es de menos de 350 ppm, preferiblemente de menos de 100 y más preferiblemente de menos de 50 ppm en comparación con el contenido de aluminio (1 ppm = 1 mcgramo/gramo de Al). En una realización particularmente preferida, el contenido de Fe de la composición acuosa, el producto farmacéutico acuoso o la vacuna es de menos de 420 ppm en comparación con el contenido de aluminio. En una realización preferida, la composición acuosa, el producto farmacéutico acuoso o la vacuna comprende más de 10 ppm de Fe en comparación con el contenido de aluminio.
En una realización preferida, la composición acuosa, la composición acuosa farmacéutica o vacunal que comprende aluminio, un compuesto reactivo y una proteína, comprende entre 5 mcgram/ml y 50 mg/ml de aluminio y no comprende más de 35 ppm de Ni cuando se compara con el contenido de aluminio (gramo/gramo). Preferiblemente, el contenido de Ni es de menos de 18 ppm de Ni en comparación con el contenido de aluminio. Preferiblemente, el contenido de Ni es de menos de 9 ppm, preferiblemente de menos de 3 y más preferiblemente de menos de 1 ppm en comparación con el contenido de aluminio (1 ppm = 1 mcgramo/gramo de Al). En una realización particularmente preferida, el contenido de Ni de la composición acuosa, el producto farmacéutico acuoso o la vacuna es de menos de 18 ppm en comparación con el contenido de aluminio. En una realización preferida, la composición acuosa, el producto farmacéutico acuoso o la vacuna contiene por lo menos 200 ppb de Ni en comparación con el contenido de aluminio.
En una realización preferida, la composición acuosa, la composición acuosa farmacéutica o vacunal que comprende aluminio, un compuesto reactivo y una proteína, comprende entre 5 mcgram/ml y 50 mg/ml de aluminio y no comprende más de 5 ppm de Cu en comparación con el contenido de aluminio (gramo/gramo). Preferiblemente, el contenido de Cu es de menos de 2,5 ppm de Cu en comparación con el contenido de aluminio. Preferiblemente, el contenido de Cu es de menos de 1 ppm, preferiblemente de menos d 0,5 y más preferiblemente de menos de 0,25 ppm en comparación con el contenido de aluminio (1 ppm = 1 mcgramo/gramo de Al). En una realización particularmente preferida, el contenido de Cu de la composición acuosa, el producto farmacéutico acuoso o la vacuna es de menos de 2,5 ppm en comparación con el contenido de aluminio. En una realización preferida, la composición acuosa, la composición acuosa farmacéutica o vacunal comprende por lo menos 50 ppb de Cu en comparación con el contenido de aluminio.
En una realización particularmente preferida, el contenido de Fe de la composición acuosa, el producto farmacéutico acuoso o la vacuna es de menos de 420 ppm en comparación con el contenido de aluminio, el contenido de Ni de la composición acuosa, el producto farmacéutico acuoso o la vacuna es de menos de 18 ppm en comparación con el contenido de aluminio y el contenido de Cu de la composición acuosa, el producto farmacéutico acuoso o la vacuna es de menos de 2,5 ppm en comparación con el contenido de aluminio. En una realización preferida, la composición acuosa, el producto farmacéutico acuoso o la vacuna contiene más de 10 ppm de Fe en comparación con el contenido de aluminio, por lo menos 200 ppb de Ni en comparación con el contenido de aluminio, y por lo menos 50 ppb de Cu en comparación con el contenido de aluminio.
En un método para preparar una composición acuosa, una composición acuosa farmacéutica o vacunal que comprende una sal de aluminio, un compuesto reactivo y una proteína de acuerdo con la invención, o un método para preparar o seleccionar una sal de aluminio de acuerdo con la divulgación, o un método para preparar un precipitado de sal de aluminio de grado clínico de acuerdo con la divulgación, se prefiere que el contenido en metales pesados con respecto al contenido de aluminio sea como se ha indicado anteriormente en la presente. La divulgación por lo tanto proporciona un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio, un compuesto reactivo y una proteína dicho método comprendiendo
- preparar o seleccionar una sal de aluminio capaz de proporcionar una composición acuosa que tenga menos de 350 ppb de metales pesados sobre la base del peso de la composición acuosa, y
- combinar dicha sal de aluminio, dicho compuesto reactivo, dicha proteína y agua para producir dicha composición acuosa,
por lo cual la composición acuosa comprende entre 5 mcgramos/ml y 50 mg/ml de aluminio, preferiblemente entre 0,1 mg/ml y 2,5 mg/ml; y no más de 700 ppm de metales pesados y preferiblemente no más de 450 ppm de metales pesados en comparación con el contenido de aluminio; en donde dicha composición acuosa comprende no más de 420 ppm de Fe, preferiblemente no más de 100 ppm, en comparación con el contenido de aluminio; no más de 18 ppm, preferiblemente no más de 3 ppm, de Ni en comparación con el contenido de aluminio; y/o no más de 2,5 ppm de Cu, preferiblemente no más de 0,5 ppm, en comparación con el contenido de aluminio. En una realización preferida, dicha composición acuosa no comprende más de 700 ppm de metales pesados y preferiblemente no más de 450 ppm de metales pesados en comparación con el contenido de aluminio; no más de 420 ppm de Fe, preferiblemente no más de 100 ppm, en comparación con el contenido de aluminio; no más de 18 ppm, preferiblemente no más de 3 ppm de Ni en comparación con el contenido de aluminio; y no más de 2,5 ppm de Cu, preferiblemente no más de 0,5 ppm, en comparación con el contenido de aluminio.
Se ha observado que el componente de aluminio es una fuente importante de metal pesado en la composición acuosa. Por tanto, una forma de controlar la cantidad de metal pesado en la composición acuosa es controlar la cantidad de metal pesado en la fuente de aluminio usada para generar la composición acuosa. Por lo tanto, la divulgación proporciona además un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio y una proteína dicho método comprendiendo
- preparar o seleccionar una solución de sal de aluminio (como, por ejemplo, 10mg/ml de hidróxido de aluminio líquido (como, por ejemplo, alhydrogel® al 2% de Brenntag Biosector, número de catálogo 843261) que en la formulación proteica final no comprenda más de 350ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa (por ejemplopor ejemplo, para el alhydrogel® al 2% y una cantidad final de hidróxido de aluminio de 0,25 mgramos en la composición acuosa de 0,5 ml (= dosis), la solución de sal de aluminio seleccionada o preparada no debe contener más de 7 microgramos de metal pesado por mililitro de la solución de alhydrogel® al 2%, aproximadamente 7 ppm de contenido de metal pesado), y
- combinar dicha solución de sal de aluminio, dicha proteína, agua y opcionalmente un compuesto reactivo para producir dicha composición acuosa (con no más de 350ppb de metal pesado en la composición acuosa).
Por ejemplo, la solución de sal de aluminio, por ejemplo el líquido de hidróxido de aluminio (usado como componente que se mezclará para dar como resultado la composición acuosa final) no debe tener un contenido de metales pesados de más de 7ppm (dado como ejemplo en la presente en el que el líquido de hidróxido de aluminio de 10 mg/ml se diluirá a 0,5 mg/ml para dar como resultado un contenido de metales pesados de aproximadamente 350ppb con respecto a la composición acuosa, suponiendo que 1ppm = aproximadamente 1mg/ml) sobre la base del peso del líquido de hidróxido de aluminio. El límite de contenido de metales pesados aceptable también puede expresarse con respecto al peso de la sal de aluminio, como el hidróxido de aluminio en solución (denominado también "compuesto de aluminio de partida"). En este ejemplo, el contenido aceptable de metales pesados puede no superar los 7 microgramos de metales pesados por cada gramo de solución de hidróxido de aluminio (es decir, aproximadamente 7 ppm), es decir, la solución de alhydrogel® al 2%. Como se ha indicado anteriormente en la presente, la composición acuosa que comprende la proteína comprende preferiblemente (por ejemplo, si se usa como vacuna) entre 0,1 y 2,5 mg/ml del compuesto de aluminio. La concentración de metal pesado en la composición acuosa, sin embargo, de acuerdo con la invención no excede los 350ppb, es decir, aproximadamente 350ng por ml de la composición final y por tanto la selección o preparación del compuesto de aluminio de partida tiene que hacerse en consecuencia. Para ilustrar adicionalmente la selección de una solución de compuesto de aluminio de partida adecuada (por ejemplo, en forma de una solución concentrada (consultar más arriba alhydrogel® al 2%=10mg/ml), se muestra que una solución de compuesto de aluminio de 10mg/ml de hidróxido de aluminio con aproximadamente 7 ppm de impurezas de metales pesados corresponde a una concentración de metales pesados en la composición proteica cuando la concentración de aluminio es de aproximadamente 0,1mg/ml de aproximadamente 70 nanogramos/ml o 70 ppb (muy por debajo de los 350ppb proporcionados como límite del contenido de metales pesados según la divulgación). Una concentración de 2,5 mg/ml de hidróxido de aluminio en la composición acuosa final a partir de una solución de aluminio de 10mg/ml de hidróxido de aluminio que tiene aproximadamente 7 ppm de impurezas de metales pesados dará como resultado un contenido de metales pesados en la composición proteica acuosa que corresponde a una concentración de metales pesados de aproximadamente 1,75 microgramos/ml o aproximadamente 1.750ppm (muy por encima de los 350ppb previstos como límite del contenido de metales pesados según la invención). Por tanto, la solución de hidróxido de aluminio de 10mg/ml de hidróxido de aluminio en este caso (el contenido final de hidróxido de aluminio es de 2,5 mg/ml) no debería tener entonces más de 1,4ppm de impurezas de metales pesados.
Un método para preparar una composición acuosa que comprende una proteína comprende además preferiblemente envasar alícuotas de dicha composición acuosa que tengan menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa en recipientes de almacenamiento herméticos separados. La proteína en los recipientes de almacenamiento herméticos es estable y puede almacenarse durante por lo menos tres meses, como por ejemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 meses, preferiblemente 20 o 24 meses, más preferiblemente 20 meses a una temperatura de entre 2 y 8°C grados Celsius.
Sin querer estar limitados por la teoría, la degradación del antígeno en composiciones acuosas, como la composición inmunogénica, que comprende iones de metales pesados presentes en una sal de aluminio, como el hidróxido de aluminio, podría explicarse con una vía de degradación subyacente que asume radicales libres como, por ejemplo, radicales libres de sulfito. La formación de radicales libres puede ser catalizada por los iones de metales pesados presentes, por ejemplo, en el hidróxido de aluminio y este efecto (en caso de una cierta cantidad de metal pesado como se indica de acuerdo con la invención) podría ser el mecanismo subyacente de la causa principal de los problemas de estabilidad identificados como parte de la contribución inventiva. La parte experimental de esta solicitud muestra con gran detalle las evidencias de esta causa principal para la vacuna contra la encefalitis japonesa (también denominada "JEV") y hace una demostración similar para una composición simple de polipéptido adyuvado con aluminio que comprende un compuesto reactivo como el sulfito. Por tanto, es evidente que también puede producirse una reacción similar en otras composiciones acuosas que contengan aluminio (con un alto contenido de metales pesados, por ejemplo, mayor de 350ppb sobre la base del peso de la composición), proteínas y posiblemente un componente reactivo como el sulfito y/u otras partículas formadoras de radicales. La oxidación catalizada por metales pesados es una vía de degradación que provoca la modificación covalente de las proteínas. Las propiedades fisicoquímicas modificadas de la proteína oxidada/modificada o el antígeno pueden provocar la pérdida de actividad biológica (Li et al., 1995; Mayo et al., 2003; Stadtman, 1990).
Los siguientes esquemas de reacción (como posiblemente se produzcan en el producto JEV descrito en la parte experimental) son indicativos para composiciones de la divulgación que comprenden además de la proteína y el metal pesado también sulfito y/u otro compuesto reactivo como por ejemplo sulfito y/o formaldehído.
El metabisulfito sódico (Na<2>S<2>O<s>) en solución se disuelve en bisulfito (S<2>O<52->), en una solución alcalina el equilibrio del bisulfito es hacia el sulfito (SO<32->) y en una solución ácida hacia H<2>SO<3>/SO<2>. Después de la disolución de Na<2>S<2>O<5>en agua, se hidroliza en NaHSO<3>de la siguiente manera Na<2>S<2>O<5>o 2 NaHSO<3>
A pH neutro podemos suponer el siguiente equilibrio: HSO<3->o H<+>+ SO<32->pKa=7,2
Esto significa que a pH 7 el equilibrio se desplaza hacia el HSO3- y en condiciones más básicas (por ejemplo, pH 8) hacia el SO<32->.
El formaldehído forma un aducto bisulfito durante la neutralización de acuerdo con la siguiente ecuación:
CH<2>O HSO<3->^ CH<2>(OH)(SO)<3->
Una vez agotado el bisulfato, la reacción prosigue hasta alcanzar el equilibrio de la siguiente manera:
CH<2>O SO<32->+ H<2>O ^ CH<2>(OH)(SO)<3->+ OH-
El formaldehído y el sulfito reaccionan entre sí, sin embargo, se ha comprobado que el formaldehído y el sulfito siguen estando presentes en equilibrio en la vacuna contra el virus de la encefalitis japonesa y pueden detectarse en el siguiente intervalo (n=49):
De acuerdo con la bibliografía (Ranguelova et al., 2010), los iones de metales de transición catalizan la autooxidación del (bi)sulfito mediante la formación de radicales aniónicos de trióxido de azufre (•SO<3->):
donde M puede ser cobre (Cu<2+>), hierro (Fe<3+>), oxivanadio (VO<2+>), manganeso (Mn<2+>), níquel (Ni<2+>) o anión cromato (CrO<42->) (Alipazaga et al. 2004; Berglund et al. 1993; Brandt y Elding 1998; Lima et al. 2002; Shi 1994).
Se demostró que tales radicales de sulfito son altamente reactivos y pueden oxidar varias sustancias, como el ascorbato, la hidroquinona y la histidina (Huie at al., 1985). Neta y Huie, 1985, publicaron una revisión de la química de los radicales libres del sulfito. Los autores también muestran que la formación de radicales también puede ser catalizada por fotoionización de sulfito de la siguiente manera:
La formación de radicales catalizada por la luz también podría explicar las diferencias observadas en los resultados de potencia y ELISA de jeringuillas desnudas no etiquetadas (usadas para pruebas de liberación y con propósitos de referencia) y muestras de lotes de vacunas finales totalmente envasadas para el producto JEV. Las muestras totalmente envasadas están completamente protegidas de la luz, mientras que las jeringuillas no etiquetadas podrían estar expuestas a la luz durante el almacenamiento y la manipulación.
Una reacción importante del radical sulfito en los sistemas de autooxidación es con el oxígeno molecular para formar un radical de peroxilo que es mucho más reactivo:
La solubilidad de O<2>en agua a 0°C y 20°C es de 0,4mM y 0,25mM, respectivamente. Suponiendo que la solubilidad del O<2>en una composición de la invención esté en un intervalo similar, hay una cantidad considerable de oxígeno para formar el radical peroxilo. Este radical es un oxidante mucho más fuerte en comparación con el ^SO<3->y puede oxidar ciertos sustratos que no están unidos por ^SO<3->en absoluto y que, de hecho, pueden formar radicales que oxidan iones de sulfito. En tales casos, cuando el potencial redox del sustrato es intermedio entre los del ^SO<3->y el •SO<s ->, es probable que se desarrolle una cadena de reacción en presencia de O2 siguiendo el patrón general:
La intermediación de un sustrato X puede potenciar el proceso en cadena de oxidación del sulfito por el oxígeno. La reducción de un electrón de •SO<s ->produce HSO<5->(peroximonosulfato), un oxidante muy fuerte capaz de oxidar muchos compuestos orgánicos (Lambeth etal., 1973; Ito & Kawanashi, 1991). El peroximonosulfato es también un radical de anión de sulfato precursor ^SO<4->.
El radical ^SO<4->.es un oxidante muy fuerte, casi tan fuerte como el radical hidroxilo (•OH), y es muy probable que oxide otras biomoléculas por oxidación de un electrón.
En una realización preferida, la composición que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación es una composición terapéutica o una composición inmunogénica, como una vacuna. Las composiciones terapéuticas se administran a individuos, como un humano o un animal. En particular para tales composiciones, es importante que la proteína dentro de la composición todavía tenga su efecto terapéutico en el momento en que se administra a dicho individuo. La degradación de la proteína o los cambios en su estructura pueden hacer que la proteína pierda su actividad terapéutica. De manera similar, la degradación o los cambios estructurales de la composición inmunogénica también llevarán a una reducción de la eficacia de la composición para inducir y/o potenciar una respuesta inmunitaria en un individuo. Una composición inmunogénica se administra preferiblemente a un individuo para contrarrestar o prevenir una infección vírica o bacteriana. La proteína contenida dentro de la composición inmunogénica acuosa puede ser una proteína única o una proteína multimérica o parte de un complejo que comprenda dicha proteína (por ejemplo, como parte de un virus o una célula, por ejemplo, bacteriana).
En una realización preferida, dicha proteína o complejo proteico comprende un virus o bacteria vivos atenuados, inactivados o mutados. De acuerdo con la divulgación la proteína comprende una proteína vírica o bacteriana inmunogénica o una parte inmunogénica de dicha proteína (por ejemplo, un péptido inmunogénico), virus o bacteria divididos o células bacterianas completas. Si dicha composición inmunogénica se administra para proporcionar protección contra una infección vírica o bacteriana, la degradación de la proteína puede provocar la pérdida de la capacidad protectora de la composición inmunogénica. Como se usa en la presente, un virus o bacteria "vivo atenuado" es un virus o bacteria que es menos patógeno que el virus o bacteria de tipo salvaje, pero que ha mantenido sus propiedades inmunogénicas. Como se usa en la presente, un virus o bacteria "inactivado" se refiere a un virus o bacteria que ha sido inactivado de tal manera que ya no es infeccioso, mientras que se han mantenido, por lo menos en parte, las propiedades inmunogénicas. Un virus o bacteria inactivado puede presentarse en forma de virus entero inactivado o de células bacterianas. Sin embargo, la inactivación puede dar como resultado la alteración de los virus o las células bacterianas. Por lo tanto, el virus o la bacteria inactivados también pueden estar en forma alterada. Como se usa en la presente, un virus o bacteria "dividido" se refiere a un virus o bacteria que se altera usando, por ejemplo, un detergente.
La composición acuosa de la divulgación comprende un compuesto reactivo, como el formaldehído, que generalmente está presente para inactivar un virus o bacteria. También puede estar presente un compuesto reactivo adicional o alternativo para inactivar cualquier formaldehído residual en la solución acuosa, como el compuesto reactivo sulfito. Como se ha detallado anteriormente, se cree que los metales pesados catalizan la oxidación del (bi)sulfito y la formación de radicales sulfito presentes en la composición acuosa, que a su vez pueden inducir la degradación de las proteínas presentes en la composición. Por lo tanto, es probable que las composiciones que comprenden virus o bacterias inactivados o partes inmunogénicas de los mismos contengan uno o más compuestos reactivos. Por lo tanto, la ausencia de metales pesados o la presencia por debajo de los niveles identificados por la presente invención, es de particular relevancia cuando la composición acuosa de la invención comprende un virus o bacteria inactivados o una parte inmunogénica de los mismos. En una realización particularmente preferida, una composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación comprende por tanto un virus inactivado. En una realización preferida, la composición acuosa, que es inmunogénica, comprende virus o bacteria inactivados. Dicho virus o bacteria se inactiva, por ejemplo, mediante un compuesto reactivo como el formaldehído, tal como se describe en la presente invención.
En otra realización preferida, la composición acuosa, composición inmunogénica o vacuna de acuerdo con la divulgación comprende un toxoide. Como se usa en la presente, un "toxoide" se refiere a una toxina bacteriana inactivada, como una exotoxina, como resultado de la cual la toxicidad se reduce o suprime mientras que las propiedades inmunogénicas se mantienen por lo menos en parte. Dicha toxina se inactiva, por ejemplo, mediante un compuesto reactivo como el formaldehído como se describe en la presente divulgación. Ejemplos de toxoides presentes en una composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación incluyen toxinas de difteria, tétanos y botulismo.
El término "proteína vírica o bacteriana inmunogénica" se refiere a una proteína vírica o bacteriana capaz de provocar una respuesta inmunitaria. El término "parte inmunogénica" se refiere en la presente a una parte de una proteína vírica o bacteriana capaz de provocar una respuesta inmunitaria. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria provocada reconoce tanto dicha parte de la proteína como la proteína completa. Por lo tanto, en una realización, una composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación es una composición inmunogénica. Dicha composición es preferiblemente una composición terapéutica y/o una composición profiláctica como una vacuna. También se proporciona una vacuna que es una composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo n la divulgación invención.
Una "composición inmunogénica" se define en la presente como una composición capaz de provocar una respuesta inmunitaria cuando se administra a un individuo. La respuesta inmunitaria provocada puede ser humoral, celular o una combinación de las mismas e incluye la producción de anticuerpos, células B, como células B activadas, y células T, como células T activadas. Una respuesta inmunitaria, como se usa en la presente, se dirige preferiblemente de manera específica a uno o más inmunógenos dentro de una composición que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación. Una composición inmunogénica de la presente divulgación puede administrarse a un individuo mediante cualquier técnica conocida en la técnica, incluyendo inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID), subcutánea (SC), intracraneal (IC), intraperitoneal (IP) o intravenosa (IV), administración transdérmica, oral, intranasal o rectal, y combinaciones de las mismas; se prefieren la inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID), subcutánea (SC), intracraneal (IC), intraperitoneal (IP) o intravenosa (IV). En una realización preferida, una composición inmunogénica que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación se usa para provocar una respuesta inmunitaria que puede ser útil en un contexto crónico (como el tratamiento del cáncer) o contexto profiláctico (como una vacuna típica). Se prefiere que la composición inmunogénica se use como vacuna, es decir, uso profiláctico. En esta realización típicamente hay aluminio como adyuvante.
Un "adyuvante", como se usa en la presente, se refiere a un agente farmacológico o inmunológico que modifica el efecto de otros agentes, como un agente inmunológico que aumenta la respuesta antigénica. Los adyuvantes sirven típicamente para poner en contacto el antígeno, la sustancia que estimula la respuesta inmunitaria protectora específica, con el sistema inmunitario e influir en el tipo de inmunidad producida, así como en la calidad de la respuesta inmunitaria (magnitud o duración); disminuir la toxicidad de ciertos antígenos; y proporcionar solubilidad a algunos componentes de las vacunas.
Un "individuo" se define en la presente como un humano o un animal. Los individuos incluyen pollos, patos, gansos, pavos, cisnes, emús, gallinas de Guinea y faisanes, humanos, cerdos, hurones, focas, conejos, gatos, perros y caballos. En una realización preferida de la divulgación, el individuo es un mamífero, preferiblemente un humano.
El "micro" en microgramo o microlitro u otra unidad se denomina a veces mc, el símbolo p o la letra u. Un valor de 3 mcgramos es, por tanto, 3 microgramos, 3 pl es 3 microlitros y 3 ugramo es 3 microgramos.
Un adyuvante de aluminio se prepara a menudo mediante la exposición controlada de una solución acuosa de iones de aluminio a condiciones alcalinas (para una revisión, consultar Lindblad, EB (2004) Immunol. and Cell Biol. Vol 82: 497-505). En la presente divulgación se ha descubierto para el producto JEV (ver la parte experimental) que una gran cantidad del metal pesado en esta solución acuosa de iones de aluminio acaba en el precipitado de sal de aluminio para el adyuvante de aluminio. Se ha descubierto además que la cantidad de metal pesado en el precipitado de aluminio afecta a la estabilidad de la vacuna durante su almacenamiento. Por tanto, la cantidad de metal pesado presente en la sal de aluminio puede controlarse determinando la cantidad de metal pesado en la sal, pero también, y preferiblemente, controlando la cantidad de metal pesado en la solución acuosa de iones de aluminio. Por tanto, la divulgación proporciona además un método para preparar un precipitado de sales de aluminio de calidad clínica para su incorporación en un medicamento y/o vacuna, dicho método comprendiendo preparar una solución acuosa de iones de aluminio y precipitar dichos iones de aluminio de dicha solución, y determinar el nivel de un metal pesado en la solución y/o el precipitado de sales de aluminio, preferiblemente en donde se determina que dicha solución y/o el precipitado de sales de aluminio comprenden una cantidad que da como resultado menos de 350ppb de metal pesado en la composición final, por ejemplo, cuando se vuelve a suspender en la composición final. La divulgación proporciona un método para preparar un precipitado de sal de aluminio de calidad clínica para su incorporación en un medicamento y/o vacuna, dicho método comprendiendo preparar una solución acuosa de iones de aluminio y precipitar dichos iones de aluminio de dicha solución, y determinar el nivel de un metal pesado en la solución y/o el precipitado de sal de aluminio, en donde se selecciona el precipitado que es capaz de proporcionar una composición acuosa que comprende entre 5 mcgram/ml y 50 mg/ml de aluminio, preferiblemente entre 0,1 mg/ml y 2,5 mg/ml, y que no comprenda más de 700 ppm de metal pesado y preferiblemente no más de 450 ppm de metal pesado en comparación con el contenido de aluminio, en donde dicha composición no comprende más de 420 ppm de Fe, preferiblemente no más de 100 ppm, en comparación con el contenido de aluminio, no más de 18 ppm, preferiblemente no más de 3 ppm, de Ni en comparación con el contenido de aluminio, y/o no más de 2.5 ppm de Cu, preferiblemente no más de 0,5 ppm, en comparación con el contenido de aluminio. En una realización preferida, dicho precipitado no comprende más de 700 ppm de metal pesado y preferiblemente no más de 450 ppm de metal pesado en comparación con el contenido de aluminio, no más de 420 ppm de Fe, preferiblemente no más de 100 ppm, en comparación con el contenido de aluminio, no más de 18 ppm, preferiblemente no más de 3 ppm, de Ni en comparación con el contenido de aluminio, y no más de 2,5 ppm de Cu, preferiblemente no más de 0,5 ppm, en comparación con el contenido de aluminio.
También se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína, que opcionalmente comprende además un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Un "diluyente farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente, se define como cualquier solución, sustancia o combinación de las mismas que no tiene actividad biológica o de otro tipo no deseada, lo que significa que puede administrarse a un individuo junto con otros componentes de una composición inmunológica sin provocar una reacción adversa sustancial. Ejemplos de portadores adecuados comprenden, por ejemplo, la hemocianina de lapa californiana (KLH), la albúmina sérica (por ejemplo, BSA o RSA) y la ovoalbúmina. En una realización preferida, dicho portador adecuado comprende una solución, como por ejemplo solución salina.
En un aspecto, un método de acuerdo con la divulgación se usa para prolongar la vida de almacenamiento o la vida útil de una composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación. Como se usa en la presente, el término "vida útil" se define como el periodo de tiempo durante el cual una composición que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación puede almacenarse sin volverse inadecuada para su uso, por ejemplo, debido a la degradación de la proteína (por ejemplo, está dentro de la especificación de potencia de la composición, por ejemplo, vacuna, según lo requerido por la agencia reguladora que aprobó o aprobará la vacuna). Durante el almacenamiento de composiciones acuosas como las descritas en la presente, puede producirse la degradación de la proteína, en particular cuando se supera un cierto nivel (como el descrito en la presente) de metales pesados. La degradación generalmente aumenta con el tiempo cuando se almacenan dichas composiciones acuosas. Ahora que se ha descubierto que la degradación de la proteína se reduce en una composición acuosa que comprende además de dicha proteína una sal de aluminio, si dicha composición comprende menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa, se ha hecho posible contrarrestar la degradación de la proteína en las composiciones acuosas. Al contrarrestar la degradación de la proteína con un método de acuerdo con la divulgación, se aumenta la estabilidad de dicha proteína dentro de dicha composición y se prolonga la vida de almacenamiento de una composición acuosa que comprende dicha proteína. Una composición acuosa de acuerdo con la presente divulgación proporciona la ventaja de que es estable y no experimenta degradación de la proteína durante un periodo prolongado. Dicha composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación es estable durante por lo menos un mes a temperatura elevada, como por ejemplo 20 o 37°C, preferiblemente durante por lo menos tres meses a temperatura elevada, como por ejemplo 20 o 37°C. Una composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación se almacena preferiblemente a una temperatura de entre 0° C y 20° C para contribuir a una mayor vida útil, más preferiblemente entre 2° C y 15° C, más preferiblemente entre 2° C y 10° C, lo más preferible entre 2° C y 8° C. La vida útil a una temperatura comprendida entre 2° C y 8° C es estable preferiblemente durante por lo menos tres meses, como por ejemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 meses, preferiblemente 20 o 24 meses, más preferiblemente 20 meses a una temperatura entre 2 y 8° C grados Celsius. Se proporciona por tanto una composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación que tiene una vida útil de alrededor de 12 a 24 meses. La divulgación proporciona además una solución acuosa de acuerdo con la divulgación que se ha almacenado durante por lo menos un mes, preferiblemente durante por lo menos dos meses, más preferiblemente durante por lo menos tres meses, más preferiblemente durante por lo menos seis meses. Una composición acuosa comprende preferiblemente una proteína y una sal de aluminio, dicha composición comprendiendo menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa, entre 5 mcgramos/ml y 50 mg/ml de aluminio, preferiblemente entre 0,1 mg/ml y 2,5 mg/ml, y no más de 700 ppm de metal pesado y preferiblemente no más de 450 ppm de metal pesado en comparación con el contenido de aluminio, en donde dicha composición comprende no más de 420 ppm de Fe, preferiblemente no más de 100 ppm, en comparación con el contenido de aluminio, no más de 18 ppm, preferiblemente no más de 3 ppm, de Ni en comparación con el contenido de aluminio, y/o no más de 2.5 ppm de Cu, preferiblemente no más de 0,5 ppm, en comparación con el contenido de aluminio. En una realización preferida, dicha composición no comprende más de 700 ppm de metal pesado y preferiblemente no más de 450 ppm de metal pesado en comparación con el contenido de aluminio, no más de 420 ppm de Fe, preferiblemente no más de 100 ppm, en comparación con el contenido de aluminio, no más de 18 ppm, preferiblemente no más de 3 ppm, de Ni en comparación con el contenido de aluminio, y no más de 2,5 ppm de Cu, preferiblemente no más de 0,5 ppm, en comparación con el contenido de aluminio.
Como se usa en la presente, "una composición proteica estable" significa que, en comparación con una composición de partida, no más del 50%, preferiblemente no más del 40%, incluso más preferiblemente no más del 30%, incluso más preferiblemente no más del 20%, incluso más preferiblemente no más del 10, incluso más preferiblemente no más del 5% de la proteína de dicha composición está degradada. "Degradada" en este contexto se refiere a cualquier modificación detectable de la proteína en comparación con la proteína de la composición de partida. Por ejemplo, una disminución en la detección de la proteína con un anticuerpo monoclonal como, por ejemplo, un anticuerpo que reconozca un epítopo neutralizante es adecuada y puede medirse con cualquier método conocido en la técnica, como ELISA (ver el Ejemplo 4). El nivel detectado puede, por ejemplo, compararse con el nivel detectado con un policlonal específico para la misma proteína como, por ejemplo, representando la cantidad de proteína total (modificada o no modificada). También se proporciona un método para prolongar la vida útil de una composición acuosa que comprende una proteína y una sal de aluminio, dicho método comprendiendo seleccionar y/o preparar una sal de aluminio que da como resultado una composición acuosa con un contenido de metales pesados de menos de 350ppb sobre la base del peso de la composición acuosa y la combinación de dicha sal de aluminio, dicha proteína y agua para producir dicha composición acuosa. Se proporciona además un método para mejorar la reproducibilidad de la vida útil de preparaciones de composiciones acuosas que comprenden una proteína y una sal de aluminio, dicho método comprendiendo obtener por lo menos dos preparaciones de sal de aluminio diferentes, determinar la cantidad de por lo menos un metal pesado en dichas preparaciones de sal de aluminio, seleccionar de dichas preparaciones de sal de aluminio, preparaciones de sal de aluminio que comprendan menos de 350ppb de dicho por lo menos un metal pesado; y combinar la sal de aluminio de dichas preparaciones seleccionadas con dicha proteína y agua para producir dichas composiciones acuosas. Preferiblemente se selecciona una composición que comprende entre 5 mcgramos/ml y 50 mg/ml de aluminio, preferiblemente entre 0,1 mg/ml y 2,5 mg/ml, y que no comprende más de 700 ppm de metal pesado y preferiblemente no más de 450 ppm de metal pesado en comparación con el contenido de aluminio, en donde dicha composición no comprende más de 420 ppm de Fe, preferiblemente no más de 100 ppm, en comparación con el contenido de aluminio; no más de 18 ppm, preferiblemente no más de 3 ppm, de Ni en comparación con el contenido de aluminio; y/o no más de 2.5 ppm de Cu, preferiblemente no más de 0,5 ppm, en comparación con el contenido de aluminio. Más preferiblemente, dicha composición no comprende más de 700 ppm de metal pesado y preferiblemente no más de 450 ppm de metal pesado en comparación con el contenido de aluminio, donde dicha composición no comprende más de 420 ppm de Fe, preferiblemente no más de 100 ppm, en comparación con el contenido de aluminio; no más de 18 ppm, preferiblemente no más de 3 ppm, de Ni en comparación con el contenido de aluminio; y no más de 2,5 ppm de Cu, preferiblemente no más de 0,5 ppm, en comparación con el contenido de aluminio.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para analizar la estabilidad de almacenamiento de una composición que comprende aluminio y un compuesto terapéutico o profiláctico, dicho método comprendiendo combinar en una composición una cantidad predeterminada de compuesto terapéutico o vacuna y una cantidad predeterminada de una sal de aluminio, dicho método comprendiendo además almacenar dicha composición durante por lo menos 2 semanas, preferiblemente por lo menos 4 semanas y preferiblemente por lo menos un mes, a una temperatura de no más de 20° C, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 22° C y determinar la estabilidad y/o la cantidad de proteína, preferiblemente compuesto terapéutico o profiláctico, en dicha composición. Como se demuestra en los Ejemplos 1 y 2, una temperatura de 22° C, que es una temperatura más alta en comparación con las condiciones normales de almacenamiento o de aproximadamente 2-8° C, da como resultado una degradación acelerada de la proteína en una composición acuosa que comprende proteína, una sal de aluminio y más de 350ppb de dicho metal pesado sobre la base del peso con respecto a dicha composición. Por tanto, una temperatura de aproximadamente 22° C y una duración de almacenamiento de por lo menos 2 semanas, preferiblemente de por lo menos 4 semanas, son adecuadas para determinar la estabilidad de almacenamiento de las composiciones acuosas que comprenden una proteína de acuerdo con la divulgación. La estabilidad de almacenamiento puede determinarse por cualquier método conocido en la técnica. La estabilidad de almacenamiento de una composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación se analiza preferiblemente determinando la estabilidad de almacenamiento de dicha proteína, preferiblemente determinando un epítopo sensible al almacenamiento en dicha proteína. Por ejemplo, como se describe en los Ejemplos 1 y 2, la estabilidad de una proteína, preferiblemente un antígeno, se determina determinando la relación entre el contenido de epítopo intacto sensible al almacenamiento, como epítopo antigénico intacto (por ejemplo, epítopo de un epítopo neutralizante), y el contenido de proteína total. "Epítopo intacto sensible al almacenamiento" o "epítopo antigénico intacto" como se usa en la presente significa que no se ha producido degradación en dicho epítopo. El contenido de epítopo antigénico intacto se mide, por ejemplo, determinando la proteína unida a un anticuerpo monoclonal dirigido específicamente contra dicho epítopo en, por ejemplo, un ELISA. El contenido total de proteína se mide, por ejemplo, determinando la proteína unida a un anticuerpo policlonal que se dirige contra varios epítopos de la proteína, por ejemplo mediante ELISA. El contenido relativo de epítopos específicos puede expresarse entonces como la relación entre el contenido total de antígeno determinado por la unión al anticuerpo monoclonal dividido por el contenido total de antígeno determinado por la unión al anticuerpo policlonal. Una relación alta indica un alto contenido de epítopos antigénicos y una relación baja indica un bajo contenido de epítopos antigénicos. Una relación baja medida para una composición acuosa después del almacenamiento a por lo menos 20°C, preferiblemente 22°C, durante por lo menos 2 semanas, preferiblemente 4 semanas, en comparación con la relación medida para dicha composición acuosa antes del almacenamiento, indica que se han producido cambios estructurales dentro del epítopo antigénico. Los cambios estructurales dentro de dicho epítopo antigénico indican una estabilidad de almacenamiento reducida de la composición acuosa.
El contenido en metales pesados de una composición acuosa preparada de acuerdo con la divulgación es de menos de 350 ppb sobre la base del peso de la composición acuosa. Generalmente, cuanto menos metal pesado contenga dicha composición acuosa, menor será la degradación de la proteína. Preferiblemente, por lo tanto, el contenido de metal pesado es de menos de 325 ppb sobre la base del peso de la composición acuosa, más preferiblemente de menos de 300 ppb, más preferiblemente de menos de 275, más preferiblemente de menos de 250 ppb y más preferiblemente de menos de 235 ppb basado en el peso de la composición acuosa. Como se usa en la presente, el término "metal pesado" se refiere a la cantidad total de elementos que presentan propiedades metálicas e incluye los metales de transición, metaloides, lantánidos y actínidos. Los metales de transición son elementos cuyo átomo tiene una subcubierta d incompleta, o que pueden dar lugar a cationes con una subcubierta d incompleta, e incluyen zinc, molibdeno, cadmio, escandio, titanio, tecnecio, paladio, vanadio, cromo, manganeso, hierro, cobalto, rodio, hafnio, cobre, níquel, itrio, niobio, ziorconio, rutenio, plata, tántalo, renio, tungsteno, osmio, meitnerio, platino, iridio, mercurio, bohrio, seaborgio, hassio. Los metaloides son el boro (B), el silicio (Si), el germanio (Ge), el arsénico (As), el antimonio (Sb), el telurio (Te) y el polonio (Po). Los lantánidos son los quince elementos químicos metálicos con números atómicos del 57 al 71: lantano, cerio, praseodimio, neodimio, prometio, samario, europio, gadolinio, terbio, disprosio, holmio, erbio, tulio, iterbio y lutecio. Los actínidos son los quince elementos químicos metálicos con números atómicos de 89 a 103, actinio, torio, protactinio, uranio, neptunio, plutonio, americio, curio, berkelio, californio, einsteinio, fermio, mendelevio, nobelio y lawrencio. El metal pesado es preferiblemente un metal del bloque D de la tabla periódica. El metal pesado es preferiblemente un metal del grupo 3-12 de la tabla periódica, incluyendo los lantánidos y los actínidos. En una realización particularmente preferida, el metal pesado es un metal del bloque D, o del grupo 3-12 de la tabla periódica y no incluye los lantánidos y los actínidos. Preferiblemente, dicho metal pesado es un elemento seleccionado entre los metales de transición. En otra realización preferida, el metal pesado se selecciona entre Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr, Pb, Rb y Mo. En otra realización preferida, dicho metal pesado es un metal que tiene una masa molar de entre 21 y 83, preferiblemente dicho metal pesado es un metal del bloque D de la tabla periódica que tiene una masa molecular de entre 21 y 83, más preferiblemente de entre Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr y Mo. Preferiblemente, dicho metal pesado es un metal del bloque D de la tabla periódica que tiene una masa molecular de entre 21-30 y 39-48, más preferiblemente de Cu, Ni, Co, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr y Mo. En un aspecto aún más preferido, el metal pesado se selecciona de los metales pesados Cu, Ni y Fe.
Como se demuestra en los Ejemplos, se identificó que el lote 4230 de hidróxido de aluminio (Alumbre) contribuye significativamente a la degradación del antígeno en la vacuna FVL09L37 contra JEV. En el Ejemplo 3 se muestra que este lote de alumbre contiene por lo menos los siguientes metales: Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V. Se observaron niveles más altos de iones de Fe, Ni y Cu en el lote de alumbre 4230 en comparación con otros lotes investigados. El lote 4230 fue el único en el que se detectaron iones de Cu residuales. Por lo tanto, preferiblemente dicho metal pesado se selecciona del grupo que consiste en Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, más preferiblemente de Fe, Ni y Cu.
La cantidad de metal pesado en la composición acuosa es preferiblemente de menos de 350 ppb sobre la base del peso de la composición acuosa. Preferiblemente, la cantidad de metal pesado en la composición acuosa es de menos de 250 ppb, preferiblemente de menos de 225, más preferiblemente de menos de 200, más preferiblemente de menos de 150, más preferiblemente de menos de 100, más preferiblemente de menos de 50, más preferiblemente de menos de 25 ppb sobre la base del peso de la composición acuosa. La cantidad de metal pesado en una composición acuosa de la divulgación se ha definido en la presente con anterioridad. Esta cantidad es típicamente para el total de metales pesados determinados, o para los metales pesados Fe, Cr y Ni, o una combinación de los mismos que constituyen los principales metales pesados en peso en la composición acuosa de la divulgación. Para metales pesados específicos pueden preferirse cantidades máximas diferentes. Por ejemplo, la cantidad de Fe en la composición acuosa de la divulgación es de menos de 350 ppb sobre la base del peso de la composición acuosa. En una realización preferida, la cantidad de Fe es de menos de 250 ppb, preferiblemente de menos de 210 ppb de Fe sobre la base del peso de la composición acuosa.
Hay pruebas fehacientes de que muchos de los efectos proinflamatorios de los adyuvantes de aluminio están mediados por la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS). En condiciones fisiológicas, el aluminio puede favorecer la reducción del Fe(III) a Fe(II) y la oxidación de este último. Por tanto, la combinación de Fe y Al en el adyuvante potenciará la formación y las actividades de las ROS (Exley, C (2010). Trends in Immunol. Vol. 31: pp 103 109). En la presente divulgación se ha descubierto que el Fe puede estar presente en una composición acuosa de la divulgación sin afectar significativamente a la estabilidad de almacenamiento de la composición. En esta realización de la divulgación se prefiere que la composición acuosa de la invención comprenda entre 5 ppb y 250 ppb de Fe sobre la base del peso de la composición acuosa. En estas cantidades, la formación de ROS durante el almacenamiento debido a la presencia de dicha cantidad de Fe (si hay ROS) no afecta significativamente a la estabilidad de almacenamiento de la composición acuosa, como se define en otro lugar de la presente. Sin embargo, las cantidades son suficientes para permitir efectos proinflamatorios después de la administración de la vacuna in vivo.
En la presente divulgación se ha descubierto que particularmente la presencia del metal pesado Cu afecta seriamente a la estabilidad de almacenamiento de la composición de la divulgación. La cantidad de Cu en una composición que contiene proteínas o en un método para producir la composición proteica es preferiblemente de menos de menos de 25 ppb. Preferiblemente menos de 5 ppb, más preferiblemente menos de 1 ppb, más preferiblemente menos de 0,2 ppb sobre la base del peso de la composición acuosa. Una composición acuosa puede comprender menos de 3 ppb de Cu sobre la base del peso de la composición acuosa. De acuerdo con la divulgación, la composición acuosa comprende menos de 2,5 ppb sobre la base del peso de la composición acuosa. La cantidad de Cu en una composición o método de la divulgación es en una realización particularmente preferida de menos de 1,25 ppb sobre la base del peso de la composición acuosa. En una realización particularmente preferida dicha composición acuosa comprende Cu a un nivel que está por debajo del límite de detección del método para la detección de cobre como se describe en los Ejemplos.
En la presente divulgación se ha descubierto que particularmente el metal pesado Ni afecta a la estabilidad de almacenamiento de la composición de la divulgación. La cantidad de Ni en una composición o método de la divulgación es preferiblemente de menos de 200 ppb. Preferiblemente menos de 40 ppb, preferiblemente menos de 9 ppb y preferiblemente menos de 2 ppb sobre la base del peso de la composición acuosa. En una realización particularmente preferida, una composición acuosa de la divulgación comprende por lo tanto menos de 40 ppb de Ni sobre la base del peso de la composición acuosa. Preferiblemente menos de 30 ppb, más preferiblemente menos de 20 pbb y más preferiblemente menos de 15 pbb Ni sobre la base del peso de la composición acuosa. En una realización particularmente preferida dicha composición acuosa comprende Ni a un nivel que está por debajo del límite de detección del método para la detección de níquel como se describe en los Ejemplos.
El metal pesado puede estar presente en forma neutra electrónica o puede estar ionizado. Típica y preferiblemente, el metal pesado está presente en forma iónica en una composición acuosa de la divulgación.
El contenido en metales de una composición puede determinarse de varias maneras. En un aspecto, un método de acuerdo con la divulgación comprende determinar el nivel de un metal pesado en una composición acuosa y/o la sal de aluminio presente en dicha composición acuosa. En la técnica se conocen los métodos para medir el nivel de uno o más metales pesados en una solución acuosa. Ejemplos de tales métodos incluyen la espectrometría de masas, como la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), la espectrometría de absorción atómica de llama (F-AAS), y/o la espectrometría de absorción atómica de horno de grafito (GF-AAS).
En el Ejemplo 3 se describe un ejemplo de ensayo que puede usarse para determinar el contenido de metales pesados. El ensayo implica tratar una muestra de una solución acuosa que contenga una sal de aluminio con HNO3 concentrado con calor hasta obtener una solución trasparente. A continuación, la solución trasparente puede diluirse y analizarse adicionalmente, por ejemplo mediante ICP-MS, F-AAS y/o GF-AAS, para detectar la presencia y el contenido de iones metálicos como Pb, Cd, Cr, Co, Fe, Cu, Ni, Ag, W y Al.
Los Ejemplos 1 y 2 demuestran que el antígeno del JEV muestra una mayor estabilidad a pH 7,5-8 en comparación con pH 7. En los Ejemplos, la estabilidad del antígeno se expresa como la relación ELISA monoclonal/policlonal. Se demostró que el anticuerpo monoclonal usado (clon 52-2-5) reconoce un epítopo neutralizante en la vacuna contra la encefalitis japonesa (JEV). El contenido relativo de epítopos específicos puede expresarse como la relación entre el contenido total de antígeno determinado por "ELISA monoclonal" dividido por el contenido total de antígeno determinado por "ELISA policlonal". Sin estar limitados por la teoría, el efecto de una mayor estabilidad del antígeno a pH 7,5-8 puede explicarse basándose en la supuesta química de reacción compleja subyacente de los sulfitos. El pH podría influir en las condiciones de reacción relacionadas con el equilibrio de la reacción sulfito/formaldehído y la carga superficial de ciertas proteínas/cadenas laterales de aminoácidos accesibles a la modificación. El pH puede afectar a la oxidación por influencia directa sobre los potenciales redox de los residuos de aminoácidos y los agentes oxidantes, por ejemplo, radicales libres. Por lo tanto, en una realización, un método de acuerdo con la divulgación comprende amortiguar dicha composición acuosa a un pH de entre 7,5 y 8,5.
Se están usando varias sales de aluminio en composiciones para su administración a un individuo. El adyuvante de aluminio contiene típicamente un óxido o sulfato de aluminio o una combinación de los mismos. La sal de aluminio comprende hidróxido de aluminio (Al(OH)3) o fosfato de aluminio (APO4).
La composición acuosa de la divulgación comprende además un compuesto reactivo. Típicamente, aunque no necesariamente, el compuesto reactivo está presente como resultado de una manipulación de la composición acuosa, por ejemplo para tratar o inactivar un agente infeccioso, si lo hay en la composición. El compuesto reactivo también puede estar presente por otra razón. El sulfito, por ejemplo, a veces está presente para inactivar cualquier formaldehído residual en la solución acuosa. El formaldehído es típicamente un producto químico que se usa a menudo para inactivar cualquier agente infeccioso.
El compuesto reactivo es un compuesto activo redox, un compuesto constructor de radicales y/o un compuesto estabilizador. En una realización preferida dicha composición acuosa de la invención comprende formaldehído, etanol, cloroform, tricloroetileno, acetona, triton-X-100, desoxicolato, dietilpirocarbonato, sulfito, Na2S2O5, beta-proprio-lacton, polisorbato como Tween 20®, Tween 80®, O2, fenol, copolímeros de tipo plurónico, o una combinación de los mismos.
El sulfito está presente preferiblemente en una cantidad de entre 0,1 mM y 5 mM, o preferiblemente entre 0,5-2mM. La formalina está presente preferiblemente en una cantidad de entre 0,1 mM y 5 mM, más preferiblemente entre 0,5 mM y 2mM. El oxígeno está presente preferiblemente en una cantidad equivalente a la solubilidad del O2 a la temperatura medida, el O2 está presente preferiblemente en una cantidad de entre 10 y 250 uM cuando se mide a 20 grados Celsius. Cuando se mide a una temperatura de 0 grados Celsius, el O2 está presente preferiblemente en una cantidad de entre 10 y 400 uM. Un compuesto estabilizador está preferiblemente presente en una cantidad de entre 10 y 400 uM. De manera similar, un compuesto activo redox está presente en una cantidad de entre 0,1 mM y 5 mM, o preferiblemente entre 0,5-2mM. Un compuesto formador de radicales está presente preferiblemente en una cantidad comprendida entre 0,1 mM y 5 mM, o preferiblemente entre 0,5-2mM. En este contexto y en aras de la claridad, es importante indicar que el compuesto activo redox, el compuesto constructor de radicales y/o el compuesto estabilizador se consumen en la producción de un radical, mientras que el metal pesado se indica en la presente con anterioridad, es un catalizador en la producción de un radical y no se consume, como tal. El compuesto activo redox, el compuesto constructor de radicales y/o el compuesto estabilizador no es, por tanto, un metal pesado.
La cantidad total de compuesto activo redox, el compuesto constructor de radicales y/o el compuesto estabilizador, aunque pequeña en cantidades absolutas, puede seguir siendo significativa con respecto al antígeno o la proteína en la composición acuosa de la divulgación. El antígeno/proteína está presente preferiblemente en una cantidad comprendida entre 0,1 nmol y 1 umol, más preferiblemente entre 1 nmol y 100 nmol.
La concentración de proteína, preferiblemente una proteína terapéutica o de vacuna, en una composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación está preferiblemente entre 1 ng/ml y 10 mg/ml, preferiblemente entre 10 ng/ml y 1 mg/ml, más preferiblemente entre 100 ng/ml y 100 mcg/ml, tal como entre 1 mcg/ml y 100 mcg/ml. La concentración es preferiblemente de por lo menos 1 ng/ml para garantizar que la proteína terapéutica o vacunal se encuentra en una concentración suficiente para ejercer su efecto terapéutico cuando se administra a un individuo. Sin embargo, es preferible que la concentración no supere los 10 mg/ml para evitar o reducir la aparición de posibles efectos secundarios asociados a la administración de dicha proteína a un individuo. En particular, la concentración de proteína vírica en una composición acuosa de acuerdo con la divulgación que comprende JEV está preferiblemente entre 0,01 pg/ml y 1 mg/ml, más preferiblemente entre 0,1 mcg/ml y 100 mcg/ml. En una realización ejemplar de la divulgación, una composición acuosa de acuerdo con la invención comprende aproximadamente 10 mcg/ml de JEV. La dosis de una administración única de una composición acuosa que comprende una proteína, preferiblemente una proteína terapéutica o de vacuna, de acuerdo con la divulgación está preferiblemente entre 0,1 ml y 10 ml, preferiblemente entre 0,5 ml y 5 ml, como 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, 2,5 ml, porque tal dosis permite una administración conveniente a un individuo, como un humano.
La composición acuosa de acuerdo con la divulgación puede comprender además una molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico puede administrarse con propósitos terapéuticos. En ese caso, la composición acuosa de acuerdo con la divulgación comprende preferiblemente una molécula de ácido nucleico, como un plásmido que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno o antígenos o virus o bacteria o parte inmunogénica de los mismos contra los que se busca una respuesta inmunitaria. La incorporación de dicha molécula de ácido nucleico depende de la producción in situ del antígeno, virus, bacteria o parte inmunogénica diana. En otra realización preferida, la composición acuosa de acuerdo con la divulgación comprende un ácido nucleico en forma de ARN antisentido, ARNi o imitación del mismo. En otra realización más, la composición acuosa de acuerdo con la divulgación comprende un ácido nucleico en forma de ARN antisentido, ARNi o imitación del mismo. En otra realización más, la composición acuosa de acuerdo con la divulgación comprende el ácido nucleico en forma de un agente infeccioso como, un virus o un virus modificado, como es el caso en muchos enfoques de terapia génica. La concentración de ácido nucleico en la composición acuosa, composición inmunogénica o vacuna de acuerdo con la divulgación está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mcg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 1 mcg/ml a aproximadamente 100 mcg/ml. La dosificación adecuada dependerá del sujeto al que se administre la composición y del tamaño de las secuencias de ácido nucleico presentes en la composición.
Una composición acuosa de acuerdo con la divulgación puede comprender además un polisacárido y/o un oligosacárido, preferiblemente la cápsula de polisacárido y/o oligosacárido de bacterias encapsuladas contra las que se busca una respuesta inmunitaria. Ejemplos de polisacáridos y oligosacáridos que pueden estar presentes en una composición acuosa de acuerdo con la divulgación, incluyen pero no se limitan a polisacáridos neumocócicos, polisacáridos meningocócicos, polisacáridoHaemophilus influenzaetipo b, polisacáridos estreptocócicos del grupo B, polisacárido Vi deSalmonella typhi,polisacáridos u oligosacáridos derivados de estreptococos del grupo A,Staphylococci, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Enterococci, E. coli, Pseudomonas aeruginosayBacillus anthracis.Dicho polisacárido y/u oligosacárido puede estar presente en la composición acuosa de acuerdo con la divulgación como tal o, alternativamente, el polisacárido y/u oligosacárido puede estar conjugado con una proteína. La concentración de polisacárido y/u oligosacárido en la composición acuosa, composición inmunogénica o vacuna de acuerdo con la divulgación está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 500 mcg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mcg/ml a aproximadamente 500 mcg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 1 mcg/ml a aproximadamente 50 mcg/ml. La dosificación adecuada dependerá del sujeto al que se administre la composición.
Un método de acuerdo con la divulgación se usa preferiblemente para aumentar la estabilidad de una composición inmunogénica, preferiblemente una vacuna, que comprende un adyuvante a base de sales de aluminio. Ejemplos de tales vacunas son las dirigidas contra la infección porBacillus anthracis(causante del ántrax),Corynebacterium diphtheriae(causante de la difteria),Clostridium tetani(causante del tétanos), Pseudomonas comoPseudomonas aeruginosa,Staphylococcus comoStaphylococcus aureusoStaphylococcus epidermidis,la bacteria de Haemophilus influenzae tipo B (Hib), el virus de la polio, el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis B, el virus del papiloma humano, el virus de la gripe, el virus de la encefalitis japonesa, el rotavirus, la bacteriaRickettsiae(causante del tifus), el virus de la fiebre amarilla, el virus de la varicela zóster, el meningococo, o combinaciones de los mismos, como DTP (difteria, tétanos, poliomielitis). Por lo tanto, una composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación comprende preferiblemente una proteína que es una proteína vírica o bacteriana, preferiblemente una proteína deBacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, labacteria de Haemophilus influenzae tipo B (Hib), el virus de la polio, el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis B, el virus del papiloma humano, el virus de la gripe, el virus de la encefalitis japonesa, el rotavirus, la bacteriaRickettsiae,el virus de la fiebre amarilla, el virus de la varicela zoster y/o el meningococo. En una realización preferida, dicha proteína contenida en una composición que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación es una proteína vírica de un virus de la familia Flaviviridae, preferiblemente de un virus de la encefalitis japonesa (JEV). Como se demuestra en los Ejemplos, la estabilidad de las composiciones acuosas que comprenden una proteína de JEV, una sal de aluminio y que comprenden menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa, y en particular en las que la cantidad de Cu es de menos de 3 ppb sobre la base del peso de la composición acuosa, se incrementa en comparación con la composición acuosa que comprende más de 350 ppb de metal pesado y más de 3 ppb de Cu. Por tanto, un método de acuerdo con la divulgación es particularmente adecuado para aumentar la estabilidad de una composición acuosa que comprende una proteína de JEV. En las tablas 25 y 26, se da una lista no limitativa de ejemplos de vacunas a base de aluminio, tanto para uso humano como para uso veterinario. También se describe un método de acuerdo con la divulgación que es particularmente adecuado para aumentar la estabilidad de una vacuna enumerada en la tabla 25 y/o en la tabla 26. Por lo tanto, una vacuna enumerada en la tabla 25 y/o en la tabla 26 se prepara preferiblemente usando un método de la divulgación.
En otra realización o aspecto preferido de la divulgación, dicha proteína contenida en una composición que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación es una proteína bacteriana de una bacteria de la familia de las Pseudomonas, preferiblemente dePseudomonas aeruginosa.Como se demuestra en los Ejemplos, la estabilidad de las composiciones acuosas que comprenden proteína de fusión dePseudomonas aeruginosa(SEQ ID NO: 1) y una sal de aluminio se reduce cuando hay más de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa.
Una composición acuosa que comprende una proteína de acuerdo con la divulgación es particularmente adecuada para su uso como composición inmunogénica o vacuna. Por ejemplo, tales composiciones son particularmente útiles para inmunizar a un individuo para tratar o prevenir una infección vírica o bacteriana. La divulgación por lo tanto proporciona un método para el tratamiento de un individuo que comprende obtener una composición acuosa inmunogénica que comprende una proteína y una sal de aluminio, dicha sal de aluminio teniendo menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa, preferiblemente menos de 3 ppb de Cu, y administrar la composición acuosa inmunogénica a un individuo que la necesite. También se proporciona un método para el tratamiento profiláctico de un individuo que comprende obtener una composición acuosa inmunogénica que comprende una proteína y una sal de aluminio, dicha sal de aluminio teniendo menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa, preferiblemente menos de 3 ppb de Cu, y administrar la composición acuosa inmunogénica a un individuo que lo necesite. Se proporciona además un método para inducir y/o potenciar una respuesta inmunitaria hacia un antígeno en un individuo, dicho método comprendiendo obtener una composición acuosa que comprende una proteína que comprende dicho antígeno y una sal de aluminio, dicha sal de aluminio teniendo menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa, preferiblemente menos de 3 ppb de Cu, y administrar la composición acuosa a un individuo que la necesite. La divulgación también proporciona un método para inmunizar a un individuo que comprende administrar a dicho individuo por lo menos dos composiciones inmunogénicas con un intervalo de por lo menos dos semanas entre cada administración, y en donde cada una de dichas por lo menos dos composiciones inmunogénicas comprende el mismo antígeno, y en donde por lo menos una de dichas composiciones inmunogénicas comprende además una sal de aluminio que tiene menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa, preferiblemente menos de 3 ppb de Cu, y administrar la composición acuosa inmunogénica a un individuo que la necesite. Las composiciones de ácido nucleico también se administran a veces junto con aluminio. Por tanto, para la presente divulgación es posible sustituir "proteína" en una composición acuosa de la invención por ácido nucleico. Por tanto, la divulgación proporciona un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio y un ácido nucleico dicho método comprendiendo
- combinar una sal de aluminio, dicho ácido nucleico y agua para producir dicha composición acuosa y
- determinar el nivel de un metal pesado en la composición acuosa y/o en la sal de aluminio.
La divulgación también proporciona un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio y un ácido nucleico dicho método comprendiendo
- preparar o seleccionar una sal de aluminio que contenga menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa final, preferiblemente menos de 3 ppb de Cu, y administrar la composición acuosa inmunógena a un individuo que la necesite y
- combinar dicha sal de aluminio, dicho ácido nucleico y agua para producir dicha composición acuosa.
En una realización preferida, dichos métodos comprenden además tamponar dicha composición acuosa a un pH de entre 7,5 y 8,5. En una realización particularmente preferida, dichos métodos comprenden además envasar alícuotas de dicha composición acuosa que tengan menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa en recipientes de almacenamiento herméticos separados. El ácido nucleico puede administrarse con propósitos terapéuticos. Por ejemplo, en forma de ARN antisentido, ARNi o imitación del mismo. El ácido nucleico también puede administrarse en forma de agente infeccioso, típicamente un virus o un virus modificado, como en el caso de muchos enfoques de terapia génica. En ese caso, el ácido nucleico está encerrado en una partícula que contiene proteína. La divulgación proporciona además una composición acuosa que comprende un ácido nucleico y una sal de aluminio, dicha composición comprendiendo menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa. La concentración de ácido nucleico en la composición acuosa, composición inmunogénica o vacuna de acuerdo con la divulgación está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mcg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 1 mcg/ml a aproximadamente 100 mcg/ml. La dosificación apropiada dependerá del sujeto al que se administre la composición y del tamaño de las secuencias de ácido nucleico presentes en la composición.
Las composiciones que comprenden polisacárido, oligosacárido o conjugado de polisacárido-polipéptido a veces también se administran junto con aluminio. Por tanto, para la presente divulgación es posible sustituir "proteína" en una composición acuosa de la divulgación por polisacárido, oligosacárido o conjugado de polisacárido-polipéptido o una combinación de los mismos. Dicho polisacárido u, oligosacárido es preferiblemente el polisacárido u oligosacárido de la cápsula de la bacteria encapsulada contra la que se busca una respuesta inmunitaria. Ejemplos de polisacáridos y oligosacáridos que pueden estar presentes en una composición acuosa de acuerdo con la divulgación, incluyen pero no se limitan a polisacáridos neumocócicos, polisacáridos meningocócicos, polisacáridoHaemophilus influenzaetipo b, polisacáridos estreptocócicos del grupo B, polisacárido Vi deSalmonella typhi,polisacáridos u oligosacáridos derivados de estreptococos del grupo A,Staphylococci, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, enterococos, E. coli, Pseudomonas aeruginosayBacillus anthracis.Dicho polisacárido y/u oligosacárido puede estar presente en la composición acuosa de acuerdo con la divulgación como tal o, alternativamente, el polisacárido y/u oligosacárido puede estar conjugado con una proteína. Por tanto, la divulgación proporciona un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio y un polisacárido u oligosacárido método que comprende
- combinar una sal de aluminio, dicho polisacárido u oligosacárido y agua para producir dicha composición acuosa y
- determinar el nivel de un metal pesado en la composición acuosa y/o en la sal de aluminio.
La divulgación también proporciona un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio y un polisacárido u oligosacárido dicho método comprendiendo
- preparar o seleccionar una sal de aluminio que tenga menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa final, preferiblemente menos de 3 ppb de Cu, y administrar la composición acuosa inmunógena a un individuo que la necesite y
- combinar dicha sal de aluminio, dicho polisacárido u oligosacárido y agua para producir dicha composición acuosa.
La concentración de polisacárido y/u oligosacárido en la composición acuosa, la composición inmunogénica o la vacuna de acuerdo con la divulgación está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 500 |jg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mcg/ml a aproximadamente 500 mcg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 1 mcg/ml a aproximadamente 50 mcg/ml. La dosificación adecuada dependerá del sujeto al que se administre la composición.
El conjugado polisacárido-polipéptido de acuerdo con la presente divulgación comprende por lo menos un polisacárido y por lo menos un polipéptido.
El polisacárido de acuerdo con la divulgación es preferiblemente un polisacárido capsular bacteriano. Los polisacáridos capsulares pueden prepararse mediante técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica.
En una realización, el polisacárido es un polisacárido capsular de S. pneumoniae. En otra realización, el polisacárido capsular de S. pneumoniae se selecciona del grupo que consiste en los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F, que representan los 23 serotipos neumocócicos que causan la gran mayoría de las enfermedades neumocócicas en todos los grupos de edad, de los más de 90 serotipos conocidos hasta la fecha.
El término "polisacárido", como se usa en la presente, se refiere a polisacáridos y/u oligosacáridos. Los polisacáridos se aíslan de bacterias y pueden despolimerizarse a un intervalo de tamaño preferido mediante métodos conocidos (consultar, por ejemplo, la EP 497524 y la EP 497525). Los oligosacáridos tienen un número bajo de unidades de repetición (típicamente 5-30 unidades de repetición) y son típicamente polisacáridos hidrolizados.
Los polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae comprenden unidades de oligosacáridos de repetición que pueden contener hasta 8 residuos de azúcar. Para una revisión de las unidades de oligosacáridos de los principales serotipos de Streptococcus pneumoniae, consultar Jones et al, An. Acad. Bras. Cienc, 2005, 77(2):293-324. En una realización, un antígeno de sacárido capsular puede ser un polisacárido de longitud completa, sin embargo en otras puede ser una unidad de oligosacárido, o una cadena de sacárido de longitud más corta que la nativa de unidades de oligosacáridos de repetición.
Los polisacáridos de longitud completa pueden "dimensionarse" o "despolimerizarse", es decir, su tamaño puede reducirse mediante varios métodos conocidos en la técnica (como se ha descrito anteriormente). El término "despolimerización" incluye la despolimerización parcial.
La despolimerización de los polisacáridos puede ir seguida de un paso de activación antes de la conjugación con un polipéptido portador. Por "activación" se entiende el tratamiento químico del polisacárido para proporcionar grupos químicos capaces de reaccionar con el polipéptido portador. En la técnica se conocen los métodos apropiados.
Por "polipéptido" o "proteína" se entiende cualquier cadena de aminoácidos que tenga por lo menos 10 y preferiblemente por lo menos 100 aminoácidos en enlace peptídico entre sí, independientemente de la modificación postraduccional. Los portadores polipeptídicos adecuados incluyen toxina diftérica, toxoide diftérico, CRM 197, toxoide tetánico, toxoide pertúsico, E. coli<L t ,>E. coli ST, exotoxina A, complejo de membrana externa c (OMPC), porina, proteína de unión a la transferrina, neumólisis, proteína de superficie neumocócica A (PspA), proteína adhesina neumocócica (PsaA), ovoalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina sérica bovina (BSA) o derivado proteico purificado de la tuberculina (PPD), y similares. Los polipéptidos portadores son preferiblemente polipéptidos que no son tóxicos ni reactogénicos y que pueden obtenerse en cantidad y pureza suficientes. En una realización particularmente preferida, el polipéptido portador comprende un toxoide tetánico. En otra realización preferida, el polipéptido portador comprende un derivado de cualquiera de los polipéptidos portadores mencionados anteriormente, por ejemplo una subunidad o una versión mutada de E. coli<l T ,>como LT o la subunidad A de LT (LTA) con una sustitución de aminoácidos en la posición de aa 192 (por ejemplo, LTG 192, LTT 192, LTS 192, LTA 192), LTK63 LTR 72, u otros mutantes como los descritos, por ejemplo, en la WO 98/42375, WO 02/64162, US 4,761,372,<U s>5,308,835. Los polipéptidos también pueden contener alargamientos en el extremo terminal carboxi o amino del polipéptido que facilitan la interacción con el compuesto o compuestos policatiónicos o inmunoestimuladores.
Además, los polipéptidos también pueden derivatizarse para que incluyan moléculas que mejoren la presentación de antígenos y el direccionamiento de los antígenos a las células presentadoras de antígenos.
El polipéptido puede activarse antes de la conjugación.
La naturaleza y tamaño del sacárido, la naturaleza y tamaño de la proteína o polipéptido, la proporción del sacárido y proteína/polipéptido, así como otros factores y condiciones para la preparación de un conjugado de acuerdo con la presente invención pueden ser determinados por un experto en la técnica, como se describe por ejemplo en Robbins et al, JAMA, 1996, 276(14): 1181-5. Por ejemplo, para un polisacárido de neumococo y un toxoide tetánico, una proporción preferida es de aproximadamente 2:1.
Por "conjugado" se entiende un compuesto en el que el polisacárido está enlazado covalentemente a un polipéptido portador. Hay muchas reacciones de conjugación conocidas en el estado de la técnica que se han empleado para enlazar covalentemente polisacáridos a polipéptidos para producir un conjugado polisacáridopolipéptido. Tres de los métodos más comúnmente empleados incluyen: 1) aminación reductora, en la que el grupo aldehído o cetona de un componente de la reacción reacciona con el grupo amino o hidrazida del otro componente, y el enlace doble C-N formado se reduce posteriormente a enlace sencillo C-N mediante un agente reductor; 2) conjugación por cianilación, en donde el polisacárido se activa mediante bromuro de cianógeno (CNBr) o mediante tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamoniopiridinio (CDAP) para introducir un grupo cianato en el grupo hidroxilo, que forma un enlace covalente con el grupo amino o hidrazida tras la adición del componente proteico; y 3) una reacción de carbodiimida, en la que la carbodiimida activa el grupo carboxilo en un componente de la reacción de conjugación, y el grupo carbonilo activado reacciona con el grupo amino o hidrazida en el otro componente. Estas reacciones también se emplean frecuentemente para activar los componentes del conjugado antes de la reacción de conjugación. El polisacárido puede conjugarse con el polipéptido directamente o a través de un conector. El enlace a través de un grupo conector puede realizarse usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en la US 4,882,317 y la US 4,695,624. Los conectores adecuados incluyen carbonilo, ácido adípico, B-propionamido (WO 00/10599), nitrofenil-etilamina (Gever et al., Med. Microbiol. Immunol, 1979, 165:171-288), haluros de haloacilo (US 4,057,685), enlaces glicosídicos (US 4,673,574; US 4,761,283; US 4,808,700), ácido 6-aminocaproico (US 4,459,286), ADH (US 4,965,338), fracciones C4 a Ci2 (US 4,663,160), etc.
Después de la conjugación del polisacárido con el polipéptido portador, el conjugado polisacárido-polipéptido puede purificarse (enriquecerse con respecto a la cantidad de conjugado polisacárido-polipéptido) mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Un objetivo del paso de purificación es eliminar el polisacárido y/o polipéptido no unido del conjugado polisacárido-polipéptido. Los métodos de purificación incluyen, por ejemplo, la ultrafiltración en presencia de sulfato de amonio, la cromatografía de exclusión por tamaño, la centrifugación en gradiente de densidad y la cromatografía de interacción hidrófoba.
Los adyuvantes de aluminio, como el hidróxido de alumiunio y los adyuvantes de fosfato de aluminio, se preparan generalmente exponiendo soluciones acuosas de iones de aluminio, a condiciones habitualmente ligeramente alcalinas en un entorno químico bien definido y controlado. Para la producción de hidróxido de aluminio pueden usarse varias sales de aluminio solubles. Los aniones presentes en el momento de la precipitación pueden coprecipitar con el hidróxido o el sulfato de aluminio. Después de la precipitación de la sal de amonio por cambio de pH usando, por ejemplo, NaOH, no es posible eliminar ningún metal pesado presente en el adyuvante de aluminio. Ni siquiera un lavado exhaustivo consigue reducir suficientemente el contenido de metales pesados. Por tanto, es importante controlar el metal pesado antes de la precipitación de la sal de aluminio, es decir, mediante la selección de materias primas adecuadas, el control de las condiciones del proceso, por ejemplo, como la alumbre de amoniaco y el sulfato de aluminio, u otras fuentes de aluminio están en solución no debe añadirse ningún metal, por ejemplo, otras sales como CuSO3. Alternativa o adicionalmente, cualquier metal pesado presente en la solución se elimina antes de la precipitación del adyuvante de aluminio. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante cristalización o intercambio iónico (catiónico), que son métodos bien conocidos en la técnica. El intercambio iónico se refiere a un proceso mediante el cual los iones (metálicos) en solución se transfieren a una matriz sólida que, a su vez, libera iones de un tipo diferente pero de la misma polaridad en la solución. Por tanto, los iones de la solución son sustituidos por iones diferentes presentes originalmente en la matriz sólida. La cristalización de metales se refiere a la precipitación de cristales metálicos insolubles a partir de iones metálicos en solución. Por lo tanto, la divulgación proporciona un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio, un compuesto reactivo y una proteína, dicho método comprendiendo
- preparar una sal de aluminio capaz de proporcionar una composición acuosa con menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa y
- combinar dicha sal de aluminio, dicho compuesto reactivo, dicha proteína y agua para producir dicha composición acuosa,
por lo que dicha sal de aluminio se prepara preparando una solución acuosa de iones de aluminio, eliminando los metales pesados de dicha solución acuosa, como por cristalización o intercambio iónico, preferiblemente intercambio catiónico, y precipitando dichos iones de aluminio de dicha solución, preferiblemente usando una base.
Se proporciona además un método para preparar un precipitado de sal de aluminio de calidad clínica para su incorporación en un medicamento y/o vacuna, dicho método comprendiendo preparar una solución acuosa de iones de aluminio, eliminar los metales pesados de dicha solución acuosa, como por cristalización o intercambio iónico, preferiblemente intercambio catiónico, y precipitar dichos iones de aluminio de dicha solución, y determinar el nivel de un metal pesado en la solución y/o el precipitado de sal de aluminio, en donde se selecciona el precipitado que es capaz de proporcionar una composición acuosa que comprende menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa.
La preparación de hidróxido de aluminio a partir de materias primas se describe, entre otros, en la CN101734698 y la WO98/14401.
La divulgación proporciona además un método para preparar una composición acuosa farmacéutica o de vacuna que comprende aluminio, un compuesto reactivo y una proteína dicho método comprendiendo
- seleccionar una sal de aluminio capaz de proporcionar una composición acuosa con menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa y
- combinar dicha sal de aluminio, dicho compuesto reactivo, dicha proteína y agua para producir dicha composición acuosa (i) que tiene menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa y (ii) que comprende entre 5 pg/ml y 50 mg/ml de aluminio;
en donde el compuesto reactivo se selecciona del grupo que consiste en un compuesto activo redox, un compuesto de construcción de radicales, un compuesto estabilizador y una combinación de cualquiera de los mismos.
El método comprende además preferiblemente tamponar dicha composición acuosa a un pH comprendido entre 6,5 y 8,5.
El método comprende además preferiblemente envasar alícuotas de dicha composición acuosa que tengan menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa en recipientes de almacenamiento herméticos separados.
La divulgación proporciona además un método para seleccionar un precipitado de sal de aluminio de calidad clínica para su incorporación en un medicamento y/o vacuna, dicho método comprendiendo preparar una solución acuosa de iones de aluminio y precipitar dichos iones de aluminio de dicha solución, y determinar el nivel de un metal pesado en la solución y/o el precipitado de sal de aluminio, en donde se selecciona el precipitado que es capaz de proporcionar una composición acuosa que comprende (i) menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa y (ii) entre 5 pg/ml y 50 mg/ml de aluminio. También se proporciona una composición acuosa farmacéutica o de vacuna que comprende una proteína, un compuesto reactivo y una sal de aluminio, dicha composición comprendiendo (i) menos de 350 ppb de metal pesado sobre la base del peso de la composición acuosa y (ii) entre 5 pg/ml y 50 mg/ml de aluminio, en donde el compuesto reactivo se selecciona del grupo que consiste en un compuesto activo redox, un compuesto constructor de radicales, un compuesto estabilizador y una combinación de cualquiera de los mismos. En una realización preferida, dicho metal pesado se selecciona entre Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr, Pb, Rb y Mo. El metal pesado se selecciona preferiblemente entre Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V. En una realización particularmente preferida, el metal pesado se selecciona entre Cu o Ni. El metal pesado está presente preferiblemente en forma iónica. La sal de aluminio es preferiblemente hidróxido de aluminio (Al(OH)3) o fosfato de aluminio (AlPO4). La sal de aluminio es preferiblemente hidróxido de aluminio (Al(OH)3). El compuesto reactivo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en formaldehído, etanol, cloroform, tricloroetileno, acetona, 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol, desoxicolato, dietilpirocarbonato, sulfito, Na2S2O5, beta-propriolacton, polisorbato como monolaurato de sorbitán de polietilenglicol, monooleato de sorbitán de polietilenglicol, O2, fenol, copolímeros de tipo plurónico, y una combinación de cualquiera de los mismos. La composición acuosa farmacéutica o vacunal comprende preferiblemente entre 50 pg/ml y 5 mg/ml de aluminio. La composición acuosa farmacéutica o vacunal comprende preferiblemente entre 5 ppb y 250 ppb de Fe sobre la base del peso de la composición acuosa. La composición acuosa farmacéutica o vacunal comprende preferiblemente menos de 3 ppb de Cu sobre la base del peso de la composición acuosa. La composición acuosa farmacéutica o vacunal comprende preferiblemente menos de 40 ppb de Ni sobre la base del peso de la composición acuosa. La proteína en dicha composición acuosa farmacéutica o vacunal es preferiblemente un agente terapéutico y/o una vacuna. La proteína es preferiblemente una proteína vírica o bacteriana. La proteína vírica es preferiblemente una proteína del virus de la encefalitis japonesa o una proteína de la bacteriaPseudomonas aeruginosa.La proteína es preferiblemente una proteína dentro de una partícula vírica inactivada con formaldehído. La composición acuosa farmacéutica o vacunal comprende además preferiblemente sulfito.
La divulgación proporciona además una vacuna que comprende una composición vacunal acuosa de acuerdo con la divulgación.
Cuando en la presente se indica un intervalo entre los valores X e Y, el intervalo incluye los valores X e Y.
La divulgación proporciona además un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio, un compuesto reactivo y una proteína dicho método comprendiendo
- preparar o seleccionar una sal de aluminio que pueda proporcionar una composición acuosa que tenga menos de 450 ppm de metal pesado sobre la base del peso del aluminio (gramo/gramo) y
- combinar dicha sal de aluminio, dicho compuesto reactivo, dicha proteína y agua para producir dicha composición acuosa. Preferiblemente, el contenido de Fe de la composición acuosa es de menos de 700 ppm sobre la base del peso del aluminio en la composición; el contenido de Ni es de menos de 18 ppm sobre la base del peso del aluminio en la composición; o el contenido de Cu es de menos de 2,5 ppm sobre la base del peso del aluminio en la composición acuosa, o una combinación de los mismos. Preferiblemente, el método comprende además tamponar dicha composición acuosa a un pH comprendido entre 6,5 y 8,5. Preferiblemente, el método comprende además envasar alícuotas de dicha composición acuosa que tengan menos de 450 ppm de metales pesados sobre la base del peso del aluminio en la composición en recipientes de almacenamiento herméticos separados.
La divulgación proporciona además un método para preparar un precipitado de sal de aluminio de calidad clínica para su incorporación en un medicamento y/o vacuna, dicho método comprendiendo preparar una solución acuosa de iones de aluminio y precipitar dichos iones de aluminio de dicha solución, y determinar el nivel de un metal pesado en la solución y/o el precipitado de sal de aluminio, en donde se selecciona el precipitado que sea capaz de proporcionar una composición acuosa que comprende menos de 450 ppm de metal pesado sobre la base del peso de los iones de aluminio (gramo/gramo) en la solución.
Se proporciona además una composición acuosa que comprende una proteína y una sal de aluminio, dicha composición comprendiendo menos de 450 ppm de metal pesado sobre la base del peso del aluminio en la composición. La composición acuosa se ha almacenado preferiblemente a temperaturas superiores a 20°C durante por lo menos 1 mes. El metal pesado se selecciona preferiblemente entre Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr y Mo. Preferiblemente, el metal pesado se selecciona entre Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V. En una realización especialmente preferida, el metal pesado se selecciona entre Cu o Ni. Preferiblemente, el metal pesado es Cu.
La divulgación se explica con más detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que simplemente sirven para clarificar la invención.
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Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Perfiles de elución RP-HPLC de extracto de tapón de clorobutilo (diluido 1:4) y JEV09L37 SN.
Figura 2: Perfiles de elución HPLC SEC de PS (2mg/ml) antes y después de la escisión con tripsina.
Figura 3: Perfiles de elución HPLC SEC de PS tratada con tripsina y PS degradada como la presente en NIV11A74. Tener en cuenta que los perfiles de elución se normalizaron a una altura de pico similar para permitir una mejor comparación.
Figura 4: Evaluación DOE de la relación ELISA monoclonal/policiclonal mediante análisis del diagrama de Pareto y gráficos de efectos principales (4 semanas a 22°C).
Figura 5: Evaluación DOE de la relación ELISA monoclonal/policiclonal mediante análisis del diagrama de Pareto y gráficos de efectos principales (8 semanas a 22°C).
Figura 6: Gráfico de contorno de la respuesta estimada
Figura 7: Gráfico de residuos de la respuesta estimada
Figura 8: Relación ELISA (monoclonal/policiclonal) para formulaciones de JEV a pH 7 en presencia de Ni, Cu y Cr. Las muestras se almacenaron a 22°C durante 5 semanas.
Figura 9: Resumen de los resultados obtenidos después de 7 semanas a 22°C. Se muestran los datos brutos de la relación en función del pH y del tipo de ion metálico y los resultados combinados de cada parámetro.
Figura 10: Relación media de las formulaciones DP preparadas con diferentes lotes de alumbre.
Las muestras se almacenaron durante 6 semanas a 22°C. Las barras de error representan el intervalo de confianza del 95% calculado a partir de la desviación estándar agrupada. Muestras de izquierda a derecha: Alum 3877, Alum 4074, Alum 4230 sin GI, Alum 4230 GI, Alum 4470, Alum 4563, Alum 4621, Alum Mezcla 4074_4230.
Figura 11: Distribución del tamaño de las partículas de las muestras de Alhydrogel®.
Figura 12: Curvas de titulación de Alhydrogel® en PBS. ■ AlOH no irradiado (RQCS0890), ▲ GI AlOH (RQCS1200), ♦ GI AlOH (RQCS1342), GI AlOH (RQCS0448).
Figura 13: Visión general de los lotes de Alhydrogel® probados. Se muestra la concentración total de iones metálicos contaminantes en ng/ml y parte de los principales iones metálicos Fe, Cry Ni.
Figura 14: Secuencia de aminoácidos de Ala-(His)6-OprF190-342 -OprI21-83 (SEQ ID NO: 1) - también denominada en la presente "proteína A".
Ejemplos
Ejemplo 1
Anteriormente se identificó que el lote 4230 de hidróxido de aluminio (Alumbre) contribuía significativamente a la degradación del antígeno en FVL09L37. En este lote de alumbre en particular se observó un contenido residual de iones metálicos mucho más alto en comparación con otros lotes de alumbre usados para la formulación del antígeno inactivado del JEV. Este ejemplo demuestra los estudios adicionales llevados a cabo para identificar el mecanismo subyacente de la causa principal y la influencia de los iones metálicos en la vía de degradación del JEV. Se realizó un diseño de experimentos (DOE) para determinar la influencia de los parámetros individuales sobre la estabilidad del antígeno.
Los parámetros probados en un DOE factorial completo de 25 fueron
• Hidróxido de aluminio Lote 4230 frente a hidróxido de aluminio Lote 4074
• Presencia de exceso de fragmentos de sulfato de protamina.
• Presencia de lixiviables procedentes del tapón de caucho clorobutílico
• Intervalo de pH de 7 a 8
• Contenido residual de formaldehído
El lote de alumbre 4230 contiene niveles mucho más altos de impurezas residuales de iones metálicos en comparación con otros lotes de alumbre usados para la formulación de JEV. Se seleccionó un "Diseño de Experimento" (DOE) para investigar más a fondo el mecanismo potencial de la causa principal y la interacción de los parámetros que finalmente podrían llevar a la degradación del producto. En los diseños factoriales, se investigan múltiples factores simultáneamente durante las pruebas. Al igual que en los diseños de un factor, pueden considerarse factores cualitativos y/o cuantitativos. El objetivo de estos diseños es identificar los factores que tienen un efecto significativo sobre la respuesta, así como investigar el efecto de las interacciones (dependiendo del diseño experimental usado). También pueden realizarse predicciones cuando están presentes factores cuantitativos, pero hay que tener cuidado, ya que ciertos diseños están muy limitados en la elección del modelo predictivo. Para obtener información sobre el DOE en general consultar (Siebertz, Karl; van Bebber, David, Hochkirchen, Thomas: Statistische Versuchsplanung: Design of Experiments (DoE). Editorial: Springer Berlin Heidelberg; 1a Edición (2010), ISBN-10: 3642054927).
1.1 Diseño del estudio DOE
1.1.1 Definición de parámetros y niveles para el diseño DOE
Para diseñar un experimento DOE apropiado se tuvieron en cuenta los siguientes parámetros y niveles:
• Contenido residual de iones metálicos del alumbre: Se seleccionaron los lotes 4230 y 4074 de hidróxidode aluminio como representativos de los dos extremos de calidad en cuanto al contenido de iones metálicos residuales del hidróxido de aluminio. El punto central fue una mezcla al 50/50% de ambos lotes de alumbre. El análisis inicial de las impurezas de iones metálicos restantes en la solución madre de hidróxido de aluminio al 2% mediante ICP-MS mostró diferencias significativas en el contenido de iones Cr, Fe, Ni y Cu entre estos dos lotes (consultar la Tabla 1).
• Fragmentos de sulfato de protamina:Los fragmentos de sulfato de protamina (PS) están presentes en baja cantidad (<5|jg/ml) en el lote final de la vacuna. Se comprobó si los fragmentos de PS podían contribuir a la modificación de la superficie del virus (por ejemplo, interacción/enlace covalente con las proteínas de superficie del virus) en combinación con el alumbre y otros factores usados en este estudio. Por lo tanto, se preparó una solución madre de fragmentos de PS mediante digestión con tripsina, seguida de inactivación por calor y ultrafiltración usando una membrana de 5kDa para la inactivación de la proteasa y la eliminación de la enzima. Esta solución madre se usó para añadir fragmentos PS adicionales en las formulaciones respectivas al nivel alto de 50 jg/ml. En las muestras de bajo nivel no se añadieron fragmentos de PS adicionales y el nivel real en las formulaciones fue de <5 jg/m l según el análisis HPLC.
• pH:El nivel inferior y superior de pH en las formulaciones fue de 7 y 8 con el punto central en pH 7,5.
• Lixiviables/Extraíbles del émbolo de la jeringuiMa:Émbolo de jeringuilla (hechode clorobutilo PH701/50 negro) que se usa actualmente en el sistema de cierre de envases. Se comprobó si los lixiviables del caucho de clorobutilo de la formulación podían contribuir a la modificación del antígeno. Por lo tanto, se preparó una solución madre de lixiviables y se usó para los experimentos de adición. Se estimó que el alto nivel de lixiviables en la formulación era, de media, 1,4 veces mayor en comparación con el Lote de Vacuna Final (FVL) comercial. Debido a las duras condiciones de extracción, se detectaron picos adicionales que no estaban presentes en las muestras de FVL. Por lo tanto, las formulaciones enriquecidas representan el "peor caso" con respecto a los lixiviables y extraíbles. Las formulaciones en el nivel bajo no contenían lixiviables del caucho de clorobutilo.
• Formaldehído residual:Para las formulaciones de bajo nivel no se añadió formaldehído adicional a las muestras de formulación. El nivel bajo era el formaldehído residual que seguía presente en la muestra diluida de NIV después de la inactivación/neutralización y la dilución a 2 veces estaba en el intervalo de aproximadamente 37 ppm (recalculado a partir del certificado analítico GMP de liberación de DS comercial). Para el nivel alto, se añadieron 40 ppm adicionales de formaldehído a la formulación correspondiente (contenido final total aproximado de 77 ppm). Se comprobó si el formaldehído residual, en combinación con el mayor nivel de iones metálicos presentes en el Alum 4230 y otros posibles factores, podría reaccionar adicionalmente con el virus, provocando la hiper-reticulación de las proteínas de superficie y la pérdida de epítopos relevantes.
Determinación de otras impurezas residuales relacionadas con el proceso:
El formaldehído, sulfito y sacarosa residuales en las formulaciones finales se estimaron basándose en los certificados GMP de la sustancia farmacéutica comercial JEV11A74. Los resultados se recalcularon mediante la dilución real de 2 veces de NIV a DS usada en los experimentos DOE.
Sulfito residual:La concentración de sulfito residual fue constante en todas las formulaciones con aproximadamente 93 ppm.
Sacarosa residual:La concentración de sacarosa residual fue constante en todas las formulaciones con aproximadamente un 1% v/p.
1.1.2 Diseño del DOE
Estos 5 factores se combinaron en un plan de 25 DOE que dio como resultado un número total de 34 experimentos, incluidos 2 puntos centrales, con el siguiente diseño base. La planificación y evaluación de DOE se llevaron a cabo con un software apropiado (Statgraphic Plus 3.0)
Diseño base: Factorial 25
Número de factores experimentales: 5
Número de bloques: 1
Número de respuestas: 1
Número de puntos centrales por bloque: 2
Número de series: 34
Grados de libertad del error: 18
Aleatorizado: Sí
1) Continuo significa que en el diseño del estudio hay un punto central (valor medio de los niveles alto y bajo). Si no hay punto central significa que en el diseño del estudio sólo están presentes los niveles bajo y alto.
2) Nivel bajo (0%) significa que la formulación se preparó con el lote de alumbre 4074. Nivel alto (100%) significa que la formulación se preparó con el lote de alumbre 4230. Para las formulaciones de punto central se usó una mezcla igual (50/50%) de ambos lotes de alumbre.
3) Como el PS está presente en el NIV usado para la preparación de las muestras del producto farmacéutico, la concentración real de PS en las formulaciones no enriquecidas fue de <5|jg/ml y ~50-55|jg/ml para las formulaciones enriquecidas con PS.
4) Se supuso que no había lixiviables en las formulaciones no enriquecidas, ya que las muestras se prepararon/almacenaron en tubos Eppendorf de baja unión. El contenido total de lixiviables del émbolo de la jeringuilla de caucho de clorobutilo en las muestras contaminadas fue aproximadamente 1,4 veces superior en comparación con el FVL.
5) La concentración real de formaldehído en las muestras DP no enriquecidas fue de aproximadamente 37 ppm, mientras que la concentración total de formaldehído en las muestras contaminadas fue de aproximadamente 77 ppm.___________________________________________________________________________________________
2 Definiciones y abreviaturas
AcCN Acetonitrilo
DOE Diseño de experimentos
DS Sustancia farmacéutica
FVL Lote final de vacunas
HPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento
ICP-MS Espectrometría de masas por plasma acoplado inductivamente
PS Sulfato de protamina
RP Fase invertida
SEC Cromatografía de exclusión por tamaño
SN Sobrenadante
TFA Ácido trifluoroacético
w/o sin
3 Materiales y métodos
3.1 Estudios DOE
3.1.1 Materiales
• Tapones de émbolo de jeringuilla: PH701/50/C negro Sil6 7002-1051 (se obtienen de West, N° de pedido 2116)
• Frasco de vidrio de 100 ml (Schott) tapón de rosca recubierto con teflón
• Papel de aluminio
• agua HQ
• Baño de agua eléctrico (IKA, HBR 4 digital)
• LoBind Eppis 2ml (Eppendorf, N° de cat. 0030 108.132)
• Speed Vac (Cristo, RVC-2-25)
• Viales para HPLC, vidrio transparente, 900 jl, Chromacol (VWR, N° de catálogo: 548-1124)
• Viales HPLC, PP, 900 jl, (Agilent, N° de artículo 5182-0567)
• Tapones para viales de HPLC, precortados (VWR, N° de cat.: 548-1260)
• Tubos Falcon de 15 ml (Greiner, N° de cat. 188724)
• Lote de alumbre 4470 (RQCS 1342); Lote de alumbre 4230 (RQCS 1200)
• 10xPBS (Gibco, N° de pedido 14200-091)
• Parafilm
• Columna Waters Atlantis T3; diámetro de partícula 3|jm; diámetro/longitud de columna 2,1x100mm (N° de Pedido 186003718; Lot 0107372331)
• Acetonitril (Merck, N° de Cat. 1.13358.2500)
• TFA (Sigma, N°° de pedido 302031
• Sistema HPLC Dionex 3000
• Gradilla para solventes SR-3000
• Bomba UltiMate-3000, bomba analítica de gradiente de baja presión
• Automuestreador WPS-3000 TSL, automuestreador analítico - temperatura controlada
• Compartimento de columna TCC-3200, temperatura controlada
• Detector PDA PDA-3000
• Solución de formaldehído al 37% (Merck, N° de Cat. 1.040031000)
• Sulfato de protamina (Intercell Biomedical Ltd, lote N° 086056)
• Dispositivo de ultrafiltración (Amicon® Ultra 3 kDa) (Millipore, N° de cat. UFC900324)
• Incubadora Infors HT Incubadora Multitron Standard (InforsAG)
• Tripsina (Sigma, N° de pedido: T0303)
3.1.2 Procedimiento de preparación de los extraíbles del émbolo de la jeringuilla
Los émbolos de jeringuilla (fabricados con clorobutilo negro PH701/50) que se usan actualmente en el sistema de cierre de envases de FVL se obtuvieron de West (Alemania). Por lo tanto, se preparó una solución madre de lixiviables mediante tratamiento térmico del émbolo de jeringuilla en agua (90°C/2h) seguido de concentración en un aspirador de alta velocidad. El contenido relativo de lixiviables en esta solución madre se estimó por RP-HPLC usando una columna C18 (columna Atlantis T3) y se comparó con el sobrenadante FVL JEV09L37.
Método de extracción
Se lavaron con agua caliente una botella de vidrio Schott de 100 ml con tapón de rosca recubierto de teflón y un trozo de papel de aluminio y se enjuagaron exhaustivamente con agua HQ. Se llenaron 30 tapones en la botella y se añadieron 30 ml de agua HQ. La botella se cerró con el papel de aluminio colocado entre la botella y el tornillo y se selló adicionalmente con Parafilm. La botella se calentó al baño maría a 90°C durante 2 horas y se dejó enfriar a temperatura ambiente. El extracto se transfirió a 14 tubos Eppendorf de bajo enlace (se recuperaron un total de 28 ml de extracto). Se concentraron doce viales (total de 24 ml) en un Speed Vac durante aproximadamente 44 horas y se agruparon en un tubo falcon para obtener 6 ml de extracto de tapón 4x concentrado. Se preparó de la misma manera una muestra de control que contenía 30 ml de agua HQ sin tapón para evaluar cualquier posible contaminación.
Método RP-HPLC C18
Los lixiviables se separaron mediante una columna RP-HPLC C18 (Atlantis T3) manejada a 40°C y 0,25 ml/min. El solvente A fue 0,1% de TFA en H2O, el solvente B fue 0,1% de TFA en AcCN. La separación se realizó mediante un gradiente lineal que variaba del 0 al 95% de B en 30 min. La detección se realizó a 214 nm, 254 nm y 280 nm. Se estimó que la concentración relativa total del extracto de tapón concentrado era 80 veces superior en comparación con los picos detectados en el sobrenadante del lote de vacuna final (FVL SN; obtenido por eliminación de las partículas de alumbre mediante centrifugación a 5000g/5min) detectado a 254 nm. Por lo tanto, se asignó un contenido relativo total de 80 U/ml (unidades arbitrarias U) para la solución madre, mientras que la concentración relativa total de lixiviables en el FVL SN se fijó en 1U/ml. Para los estudios DOE, la solución madre se diluyó 16 veces en las formulaciones respectivas, proporcionando aproximadamente 5 U/ml de extraíbles totales.
3.1.3 Preparación de fragmentos de sulfato de protamina
Se preparó una solución madre de fragmentos de PS digiriendo una solución de PS (2mg/ml en PBS) con tripsina (200 ng/ml durante 60 min a 37° C). La enzima se inactivó posteriormente por calor (90° C durante 10 min) seguido de ultrafiltración usando una membrana de 3kDa (filtro centrífugo Amicon® Ultra). Debido al corte de la membrana, la tripsina permaneció en el retentado, mientras que los fragmentos de PS estaban presentes en el permeado. La inactivación completa de la enzima se evaluó añadiendo 500 jg/m l de PS de longitud completa en una alícuota del fragmento de PS obtenido, seguido de incubación a 37°C durante 18 h. No se observó degradación de PS de longitud completa, lo que indicaba la inactivación/eliminación completa de la tripsina. La degradación se controló mediante HPLC PS-SEC.
3.1.4 Plan DOE
Las muestras se prepararon de acuerdo con el esquema de pipeteado que se muestra en la Tabla 2. Como muestra de partida se usó el lote JEV11A74 de NIV obtenido de una serie de producción comercial. La NIV se diluyó 2 veces a DS usando tampón PBS seguido de un ajuste del pH. Se extrajeron alícuotas de 5 ml y se adyuvaron con el lote correspondiente de Alumbre 4230, 4074 o una mezcla al 50/50% de ambos. La cantidad final de stock de Alumbre (2% de Al2O3) añadida fue de 500|jg/ml de aluminio (0,1% de Al2O3). Cada formulación (5 ml) se dividió en dos partes (2 x 2,5 ml) usando tubos Eppendorf Lo-bind. Una alícuota se almacenó a 2-8°C, otra alícuota se almacenó a 22 ± 1°C (incubadora Infors HT) bajo agitación suave (20 rpm).
3.2 ELISA para JEV inactivado (basado en policlonales)
La desorción del antígeno del alumbre y el análisis ELISA se llevaron a cabo usando anticuerpos policlonales de oveja anti JEV para recubrir las placas ELISA de 96 pocillos como se describe en el Ejemplo 4.
3.3 ELISA para JEV inactivado (basado en monoclonales)
Se desarrolló un ELISA para JEV basado en monoclonales (mAb). El ensayo se basa principalmente en el formato de ensayo "ELISA para j Ev policlonal", sólo que se usa un anticuerpo monoclonal anti-JEV (clon 52-2-5) para el recubrimiento. El mab 52-2-5 empleado demostró ser específico para JEV y reconocer un epítopo neutralizante. El clon 52-2-5 Mab se obtuvo mediante inmunización subcutánea de ratones BALB/c con la vacuna disponible comercialmente JEV08J14B. Las células del bazo de los ratones se fusionaron con células de mieloma. A partir de las células de hibridoma resultantes, se seleccionaron y subclonaron clones individuales. Los clones se analizaron negativamente contra la albúmina de suero bovino, el sulfato de protamina y un extracto de la línea celular de producción de la vacuna JE (células Vero). Se realizó un cribado positivo frente al Virus Inactivado Neutralizado (VIN) del lote de vacuna JEV08M20. Para el cribado, se recubrieron placas de microtitulación con el antígeno correspondiente y se hicieron reaccionar con sobrenadante de cultivos de los clones seleccionados. Para la detección se usó un anticuerpo policlonal de cabra antirratón conjugado con fosfatasa alcalina. Se demostró que el clon 52-2-5 de Mab reconoce un epítopo neutralizante en el dominio III de la proteína de la envoltura (E) del JEV que contiene Ser331 y Asp332 (Lin C.-W. y Wu W.-C. J Virol. 2003;77(4):2600-6). La unión del mab al epítopo neutralizante indicado se determina, por ejemplo, como se describe en Lin y Wu (2003) mediante mutagénesis dirigida al sitio del dominio III en la posición 331 (por ejemplo: S^-R), y/o mediante mutaciones de alanina en o cerca de la posición 331 del dominio III, por ejemplo de los residuos Ser 331 y Asp332, seguido de inmunotransferencia para determinar la unión del mab a las proteínas mutadas. Los resultados de unión negativos indican que el epítopo del mab es el epítopo neutralizante identificado por Lin y Wu (2003). La característica neutralizante del epítopo hace suponer que el epítopo podría ser importante para que el antígeno provoque una respuesta inmunitaria protectora.
Las muestras de JEV se analizaron mediante ambos ensayos ELISA, tanto policlonal como monoclonal. El contenido relativo de epítopos específicos puede expresarse como la relación entre el contenido total de antígeno determinado por "ELISA monoclonal" (clon 52-2-5) dividido por el contenido total de antígeno determinado por "ELISA policlonal". Cualquier diferencia en la relación puede indicar diferencias en el contenido de epítopos específicos 52-2 5. Los resultados cercanos a 1 corresponderían a un alto contenido de epítopos, y los resultados cercanos a 0 se corresponderían a un bajo contenido relativo de epítopos. Una relación baja indica la presencia de cambios estructurales del epítopo neutralizante.
Durante el desarrollo de este "mAb ELISA", se detectaron diferencias entre lotes de vacunas, que pudieron correlacionarse con los resultados de potencia de estos lotes.
3.4 Sulfato de protamina SEC-HPLC
La PS (longitud completa) y sus fragmentos se analizaron por HPLC de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) usando un Superdex Peptide 10/300 GL, 10 x 300 mm, 13 jm (GE Healthcare) usando ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % (v/v) en acetinitrilo (CAN) al 30% como fase móvil a un caudal de 0,6 ml/min. Las muestras que contenían PS se prepararon por duplicado, es decir, se diluyeron con la fase móvil antes de la inyección.
4 Resultados
4.1 Análisis de los lixiviables de los tapones usados en los experimentos de enriquecimiento
En la Figura 1 se muestran los perfiles de elución de RP-HPLC de la solución madre concentrada obtenida después de la extracción de tapones en caliente en comparación con FVL SN. Se observa un patrón de picos similar en ambas muestras. Debido a las duras condiciones de extracción, se detectaron picos adicionales en el concentrado que no estaban presentes en las muestras de FVL o sólo estaban presentes en un contenido relativo mucho menor. En la Tabla 3 se resume el contenido relativo total de los picos individuales en el concentrado de extracto y la formulación enriquecida en comparación con FVL SN. La cantidad total de lixiviables en la solución madre se calculó como la suma de todos los picos detectados y se expresó en unidades arbitrarias como 67 U/ml. Como la solución madre se diluyó 16 veces en la formulación respectiva, el contenido total resultante de lixiviables se estimó en 4,2 U/ml. Esto corresponde a un aumento medio de 1,4 veces en comparación con el sobrenadante FVL JEV09L37 (3,0 U/ml).
4.2 Análisis de los fragmentos de sulfato de protamina
En la Figura 2 se muestran los fragmentos de PS obtenidos después de la escisión de PS de longitud completa por tripsina. Mediante HPLC se obtuvieron perfiles de pico similares de PS tratada con tripsina y PS ya degradada presente en NIV11A74 (ver la Figura 3).
4.3 Evaluación de la DOE
Las formulaciones preparadas para esta DOE se analizaron después de 4 y 8 semanas de incubación en condiciones aceleradas (22°C). Se consideró que cualquier reacción de degradación se aceleraría al almacenarse a temperaturas más altas en comparación con las condiciones normales de almacenamiento (2-8°C). Sin embargo, las muestras se siguen almacenando a 2-8°C y se analizarán en un punto temporal posterior (~4-6 meses). En la Tabla 4 se muestran los primeros análisis de las muestras almacenadas a 22°C durante 4 y 8 semanas.
4.3.1 Evaluación DOE tras 4 semanas a 22°C
La evaluación estadística de los resultados de la matriz de DOE obtenidos después de 4 semanas a 22°C mostró que el contenido de epítopos específicos 52-2-5 (expresado como la proporción de antígeno desorbido analizado por ELISA monoclonal/policlonal) se veía influido de manera estadísticamente significativa (nivel de confianza del 95%, ver la Tabla 5) por los siguientes factores:
• menor contenido de epítopos específicos 52-2-5 en presencia del lote Alum 4230
• menor contenido de epítopos específicos 52-2-5 a pH 7 más bajo
• mayor contenido de epítopos específicos 52-2-5 a concentración aumentada de formaldehído.
La presencia de una mayor concentración de fragmentos de PS y de lixiviables de caucho de clorobutilo no mostró ninguna influencia sobre el contenido de epítopos específicos. No se detectaron interacciones de 2° orden ni de orden superior entre parámetros individuales.
La tabla ANOVA divide la variabilidad en "Relación de 4 semanas" en partes separadas para cada uno de los efectos. A continuación, comprueba la significancia estadística de cada efecto comparando la media cuadrática con una estimación del error experimental. En este caso, 3 efectos (Alumbre, pH, Formaldehído) tienen valores de P inferiores a 0,05, lo que indica que son significativamente diferentes de cero con un nivel de confianza del 95,0%. El estadístico R-cuadrado indica que el modelo ajustado explica el 74,85% de la variabilidad en la Relación de 4 semanas. El estadístico R-cuadrado ajustado, que es más adecuado para comparar modelos con distintos números de variables independientes, es del 51,27%. El error estándar de la estimación muestra que la desviación estándar de los residuos es de 0,063. El error medio absoluto (MAE) de 0,0353 es el valor medio de los residuos. El estadístico Durbin-Watson (DW) comprueba los residuos para determinar si hay cualquier correlación significativa basada en el orden en que aparecen en el archivo de datos. Como el valor de DW es superior a 1,4, es probable que no haya ninguna autocorrelación importante en los residuos. Los efectos también se muestran mediante el diagrama de Pareto estandarizado y los gráficos de efectos principales, como se muestra en la Figura 4.
4.3.2 Evaluación DOE después de 8 semanas a 22°C
La evaluación estadística de los resultados de la matriz DOE obtenidos después de 8 semanas a 22°C fueron similares a los obtenidos después de 4 semanas. La evaluación muestra que el contenido de epítopos específico 52 2-5 (expresado como la proporción de antígeno desorbido analizado mediante ELISA monoclonal/policlonal) se vio influido de manera estadísticamente significativa (nivel de confianza del 95%, consultar la Tabla 6) por los siguientes factores:
• menor contenido de epítopos específicos 52-2-5 en presencia del lote Alum 4230
• menor contenido de epítopos específicos 52-2-5 a pH 7 más bajo
La presencia de una concentración más alta de fragmentos de PS, lixiviable de caucho de clorobutilo y formaldehído no mostró ninguna influencia sobre el contenido de epítopos específicos. Tener en cuenta que el valor P para el formaldehído (P=0,08) está bastante cerca de ser significativo. No se detectaron interacciones de 2° orden ni de orden superior entre parámetros individuales.
La tabla ANOVA divide la variabilidad en "Relación de 8 semanas" en partes separadas para cada uno de los efectos. A continuación, comprueba la significancia estadística de cada efecto comparando al media cuadrática con una estimación del error experimental. En este caso, 2 efectos (alumbre y pH) tienen valores P inferiores a 0,05, lo que indica que son significativamente diferentes de cero con un nivel de confianza del 95,0%. El estadístico R-cuadrado indica que el modelo ajustado explica el 75,9% de la variabilidad en "Relación de 8 semanas". El estadístico R-cuadrado ajustado, más adecuado para comparar modelos con distintos números de variables independientes, es del 53,3%. El error estándar de la estimación muestra que la desviación estándar de los residuos es de 0,095. El error medio absoluto (MAE) de 0,057 es el valor medio de los residuos. Los efectos también se muestran mediante el diagrama de Pareto normalizado y los gráficos de efectos principales, como se muestra en la Figura 5.
También se realizó un análisis de regresión con los datos ajustados y en la Tabla 7 se muestran los coeficientes de regresión calculados. A continuación se muestra la ecuación de regresión que se ha ajustado a los datos incluyendo pH, alumbre y Formaldehído. La ecuación del modelo ajustado es
"Relación de 8 semanas" = 0,0228125 0,113125*pH - 0,00185625*Alumbre 0,0315625*Formaldehído donde los valores de las variables se especifican en sus unidades originales, excepto para los factores categóricos que toman los valores -1 para el nivel bajo y 1 para el nivel alto. El contorno de la respuesta estimada y el gráfico residual se muestran en la Figura 6 y la Figura 7. La relación aumenta cuando disminuye el contenido relativo de alumbre Lote 4230 y aumenta el pH.
La tabla 8 contiene información sobre los valores de "Relación de 8 semanas" generados usando el modelo ajustado. La tabla incluye:
(1) el valor observado de "Relación de 8 semanas"
(2) el valor previsto de "Relación de 8 semanas" usando el modelo ajustado
(3) Límites de confianza del 95,0% para la respuesta media
Como se muestra, el modelo de regresión predice bien los resultados experimentales.
5. Sumario
De los parámetros ensayados, se demostró que el lote Alumbre 4230 contribuía significativamente a la degradación del antígeno analizada mediante ELISA monoclonal/policlonal en condiciones aceleradas (22°C, puntos de tiempo de prueba de 4 y 8 semanas). Los resultados DOE obtenidos después de 4 y 8 semanas a 22°C muestran que el Alumbre 4230 es el factor más significativo con respecto a la degradación del antígeno detectada por la relación ELISA monoclonal/policlonal. Las formulaciones hechas con Alumbre 4074 (pureza mucho mayor con respecto a los iones metálicos residuales) muestran en general un contenido de epítopos específicos mucho mayor.
El formaldehído y el pH también contribuyeron a la estabilidad del antígeno, pero en menor medida. El efecto de una mayor estabilidad del antígeno en las muestras formuladas con Alumbre 4230 a un nivel más alto de formaldehído quedó bien demostrado (por ejemplo, las muestras N° 19 y 29). Sin embargo, la influencia del formaldehído fue menos pronunciada tras un periodo de almacenamiento prolongado (8 semanas a 22°C).
Se observó una mejor estabilidad del antígeno a pH 8 en comparación con pH 7. El sulfato de protamina y los lixiviables del tapón de goma de clorobutilo no contribuyeron a la degradación del antígeno.
Ejemplo 2
En estudios anteriores (ver el Ejemplo 1) se identificó que el lote 4230 de hidróxido de aluminio era un factor que contribuía significativamente a la degradación del antígeno observada en FVL09L37. En este lote particular de hidróxido de aluminio (Alumbre), se observó un contenido residual de iones metálicos mucho mayor en comparación con otros lotes de Alumbre usados para la formulación del antígeno inactivado de JEV. Este Ejemplo resume estudios adicionales realizados para evaluar la influencia de los iones metálicos sobre la estabilidad del JEV inactivado. Se realizaron estudios de adición con el antígeno presente en solución de virus neutralizado inactivado (NIV) o en suspensión de producto farmacéutico (PD) tras la formulación del antígeno con hidróxido de aluminio.
1 Descripción del estudio
Anteriormente se demostró que el lote de alumbre 4230 contiene niveles mucho más altos de impurezas residuales de iones metálicos en comparación con otros lotes de alumbre usados para la formulación de JEV (ver también el Ejemplo 3). Se realizaron estudios adicionales para evaluar la influencia de los iones metálicos sobre la estabilidad y sobre una posible modificación de la superficie del JEV. El antígeno inactivado estaba presente en solución de virus inactivado neutralizado (NIV) o en suspensión de producto farmacéutico (PD) después de una dilución adicional de NIV y formulación con hidróxido de aluminio. En otra serie de experimentos, se usaron diferentes lotes de alumbre que cubrían una amplia variedad de contenido de iones metálicos residuales y se formularon con un único lote definido de NIV. Todas estas formulaciones seguían conteniendo formaldehído y bisulfito residuales en concentraciones representativas en comparación con el producto comercial. Las soluciones madre de sales metálicas se disolvieron en agua y se añadieron a las muestras hasta alcanzar la concentración final deseada.
2 Definiciones y abreviaturas
AcCN Acetonitrilo
ANOVA Análisis de varianza
DOE Diseño de experimentos
DP Producto farmacéutico
DS Sustancia farmacéutica
FBV Vacuna final a granel
FVL Lote final de vacuna
GI Irradiado con rayos gamma
HPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento
LSD Diferencia mínima significativa de Fisher
mAb Anticuerpo monoclonal
NIV Virus inactivado neutralizado
PS Sulfato de protamina
RP Fase invertida
SEC Cromatografía de exclusión por tamaño
SN Sobrenadante
TFA Ácido trifluoroacético
w/o sin
3 Materiales y métodos
3.1 Materiales
• Tetrahidrato de cloruro de hierro (II) (Sigma, N° de referencia 44939)
• Hexahidrato de cloruro de hierro (III) (Sigma, N° de pedido 31232)
• Hexahidrato de níquel(II)sulfato (Sigma, N° de pedido N4882)
• Hexahidrato de cloruro de cobalto (II) (Sigma, N° de pedido 31277)
• Cloruro de cobre(II) deshidratado (Sigma, N° de pedido 807483)
• Zinksulfato heptahidratado (Sigma, N° de pedido 24750)
• Hexahidrato de cloruro de cromo (III) (AlfaAesar, N° de pedido 42114)
• Dehidrato de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Sigma, E5134)
• Aqua bidest. (Fresenius Kabi, N° de Art. 0712221/01 A)
• 10xPBS (Gibco, N° de pedido 14200-091)
• Solución de formaldehído al 37% (Merck, N° de Cat. 1.040031000)
• Sulfato de protamina (Intercell Biomedical Ltd, N° de lote 086056)
• LoBind Eppis 2 ml (Eppendorf, N° de ref. 0030 108.132)
• Tubos Falcon de 15 ml (Greiner, N° de Cat. 188724)
• Incubadora Infors HT Incubadora Multitron Standard (InforsAG)
• Filtro de 0,2 pm Mini Kleenpak 25 mm (Pall)
• La vacuna NIV11A74 y la vacuna final a granel (FBV, formulada con lote Alum 4539) JEV 11D87 de series de producción comercial se obtuvieron de Intercell Biomedical (Livingston, Reino Unido) y se almacenaron a 2-8°C hasta su posterior procesamiento.
• Las soluciones madre de sales metálicas en agua (concentración final 1mM) usadas para los experimentos de adición se prepararon y almacenaron a 2-8°C hasta su uso.
• Las muestras de hidróxido de aluminio (2% de Al2O3, Brenntag Biosector) eran muestras retenidas obtenidas de Intercell Biomedical o adquiridas directamente de Brenntag. Las muestras de alumbre se almacenaron a 2-8°C. En este estudio se usaron los siguientes lotes de alumbre: 4470, 4563, 4621, 3877, 4230 (irradiado gamma y no irradiado gamma)
3.2 Preparación de soluciones madre de metales
3.2.1 Solución madre de hierro(II)
Se preparó una solución madre de hierro (II) 20 mM disolviendo 397 mg de tetrahidrato de cloruro de hierro (II) en 100 ml de aqua bidest.
3.2.2 Solución madre de hierro(III)
Se preparó una solución madre de hierro (III) 20 mM disolviendo 540 mg de hexahidrato de cloruro de hierro (III) en 100 ml de aqua bidest.
3.2.3 Solución madre de níquel(II)
Se preparó una solución madre de níquel (II) 20 mM disolviendo 525 mg de hexahidrato de sulfato de níquel (II) en 100 ml de aqua bidest.
3.2.4 Solución madre de cobalto(II)
Se preparó una solución madre de Cobalto(II) 20 mM disolviendo 476 mg de hexahidrato de cloruro de Cobalto(II) en 100 ml de aqua bidest.
3.2.5 Solución madre de cobre(II)
Se preparó una solución madre de cobre(II) 20 mM disolviendo 341 mg de dihidrato de cloruro de cobre(II) en 100 ml de aqua bidest.
3.2.6 Solución madre de Zink
Se preparó una solución madre de Zink 20 mM disolviendo 575 mg de heptahidrato de Zinksulfato en 100 ml de aqua bidest.
3.2.7 Solución madre de Cromo(III)
Se preparó una solución madre de Cromo(III) 20 mM disolviendo 533 mg de hexahidrato de cloruro de Cromo(III) en 100 ml de aqua bidest.
3.3 Preparación de las soluciones de trabajo
Las soluciones de trabajo de iones metálicos (concentración final de 1 mM si no se indica lo contrario) se prepararon por dilución de soluciones madre de iones metálicos con aqua bidest y filtración estéril mediante filtro de jeringuilla de 0,2 pm.
3.4 Preparación de la formulación
Todas las formulaciones se prepararon en condiciones estériles. La NIV y la VFB obtenidas de series de producción comercial se ajustaron al pH deseado y se enriquecieron con alícuotas de solución madre de metal. Si no se indicaba lo contrario todas las muestras se almacenaron en tubos de plástico. En todas las formulaciones en las que se usó alumbre, el contenido final de Al fue de 500pg/ml, lo que corresponde a un 0,1% de Al2O3. Cabe señalar que los iones metálicos, especialmente el hierro (II), el hierro (III) y, en cierta medida, el Cr (III), formaron un precipitado con los iones fosfato presentes en el tampón, lo que dio como resultado una coprecipitación parcial del virus inactivado representada por la baja recuperación determinada por HPLC de exclusión por tamaño (SEC-HPLC).
3.4.1 Experimento 20110913(NIV): Formulación de NIV a diferentes concentraciones de iones metálicos de Ni(II), Cu(II), Cr(III) con o sin presencia de fragmentos PS
El NIV 11A74 se ajustó a pH 7 y pH 8 y a continuación se añadieron iones metálicos (Ni(II), Cu(II), Cr(III)) a una concentración final de 100/500/1000 ng/ml. Todas las formulaciones se almacenaron en tubos Eppendorf de baja unión a 22°C. También se prepararon alícuotas de todas las formulaciones en presencia de fragmentos de sulfato de protamina (50pg/ml). Esto se hizo para evaluar cualquier efecto de los fragmentos de PS sobre la estabilidad del JEV en presencia de metales. La preparación de los fragmentos de sulfato de protamina (PS) se describe en el Ejemplo 1. Las muestras se prepararon el mismo día (ver la Tabla 9) y se analizaron tres semanas después. Todas las muestras se analizaron por SEC-HPLC, pero sólo se analizaron por ELISA las muestras a pH 8 (N° 21-40).
3.4.2 Experimento 20110913(DP): Formulación de DP a diferentes concentraciones de iones metálicos de Ni(II), Cu(II), Cr(III)
En este estudio se usó FBV 11D87 (formulado con lote de alumbre 4539). El FBV se ajustó a pH 7 y pH 8 y se enriqueció con Ni(II)/Cu(II)/Cr(III) a 100, 500 y 1000ng/ml para evaluar cualquier efecto dependiente de la concentración de iones metálicos/pH. La Tabla 10 muestra el diseño experimental de este experimento. Todas las formulaciones se almacenaron en tubos Falcon a 2-8°C y 22°C. Las muestras almacenadas a 22°C se analizaron por SEC-HPLC y ELISA después de 5 semanas.
3.4.3 Experimento 20110812- DP enriquecido con metales
La Vacuna Final a Granel 11D87 (formulada con el Lote de Alumbre 4539) se obtuvo de una producción comercial y se usó en este estudio. La formalina residual en DS se analizó como 28,1ppm, los sulfitos residuales fueron 92,2ppm. El contenido real en DP puede considerarse dentro del mismo intervalo. FBV JEV11D87 se ajustó a pH 7,0/7,4/7,8 y se enriqueció con 500ng/ml (concentración final) de Fe(II), Fe(III), Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II). También se preparó una formulación de mezcla de iones metálicos que contenía todos los iones metálicos individuales juntos en solución. Las formulaciones con Cr(III) se prepararon posteriormente y el Cr(III) no se incluyó en la mezcla de iones metálicos. Las formulaciones de control sólo se ajustaron al pH deseado, pero no se les añadieron metales. Todas las formulaciones (N° 1-24) se prepararon el mismo día y se almacenaron en tubos Falcon a 2-8°C y 22°C.
Se prepararon muestras adicionales enriquecidas con Cr(III) (N° 25-27) tomando alícuotas de las muestras de control almacenadas a 2-8°C y enriquecidas con Cr(III) hasta una concentración final de 500ng/ml. Las formulaciones se almacenaron solamente en condiciones aceleradas (22°C). La tabla 11 muestra la configuración experimental de este experimento. Todas las muestras almacenadas a 22°C se analizaron mediante ELISA (monoclonal y policlonal) después de 4 y 7 semanas.
3.4.4 Experimento 20110819: Formulación de DP usando varios lotes de alumbre
Los estudios de enriquecimiento descritos anteriormente pueden aportar una primera prueba de la posible inestabilidad del antígeno formulado en presencia de ciertos metales, pero podrían no ser completamente representativos de las condiciones reales en las que los metales presentes en el hidróxido de aluminio se incorporan a la estructura tridimensional del gel, lo que da como resultado una concentración local y una orientación/accesibilidad diferentes. Para superar estas limitaciones, se inició un estudio inicial para simular las condiciones reales. Se formuló un único lote de NIV (11A74) obtenido de una producción comercial con varios lotes de alumbre producidos por Brenntag que cubrían una amplia gama de metales residuales. Se mezclaron 4,75 ml de NIV con 0,25 ml de alumbre (2%) en tubos Falcon. La concentración final de hidróxido de aluminio fue de 500|jg/ml (=0,1% de Al2O3). Las muestras de vacunas formuladas se almacenaron a 2-8°C y en condiciones aceleradas a 22°C. Todos estos lotes de Alumbre contenían iones metálicos residuales a diferentes concentraciones. El lote de alumbre 4230 tiene el nivel más alto para Fe, Cu, Ni y V (ver el Ejemplo 3). Tener en cuenta que las valencias de los iones metálicos no pueden especificarse mediante iCP-MS. También se preparó una muestra mixta de alumbre que contenía cantidades iguales de 4230 y 4074 para obtener un nivel "intermedio" para Ni(II) y Cu(II). Las muestras se analizaron después de 6 semanas de almacenamiento a 22°C. La cantidad residual de formaldehído y sulfito estimada por recálculo a partir de los resultados de análisis de DS disponibles corregidos por el factor de dilución de NIV a DS fue de 76ppm de formaldehído y 192ppm de sulfito respectivamente.
3.1 Desorción del antígeno del hidróxido de aluminio para el análisis SEC-MALLS
Las partículas víricas se desorbieron del hidróxido de aluminio. Se centrifugaron ~625 j l de DP (8° C, 5 min, 3300 x g) y el sobrenadante o se desechó si no se indicaba lo contrario o se analizó mediante JEV-SEC-MALLS para detectar la concentración de antígeno no unido. Las partículas víricas se desorbieron suspendiendo las partículas de hidróxido de aluminio con 62,5 j l de tampón de fosfato potásico 0,8 M (pH 8) que contenía BSA (50 jg/ml). Se añadió BSA al tampón de desorción para el análisis SEC-MALLS para minimizar las pérdidas causadas por la adsorción inespecífica del antígeno. Después de agitar (500 rpm) las partículas de hidróxido de aluminio durante 10 minutos a temperatura ambiente, se eliminaron las partículas por centrifugación y el sobrenadante se recogió en un tubo Eppendorf LoBind, repitiéndose el procedimiento de desorción con la muestra restante. Posteriormente se analizó el antígeno desorbido agrupado (~5* muestra concentrada; volumen final 125 jl; volumen inicial ~625 j l) mediante SEC-MALLS.
3.2 Método de HPLC SEC-MALLS
El antígeno desorbido se analizó mediante SEC-MALLS. En resumen, tras la desorción del antígeno del hidróxido de aluminio, se cargaron 100 j l del material desorbido agrupado (concentrado ~5x) en una columna SEC Superose 6 10/300 GL. Como fase móvil se usó 1x PBS 250 mM NaCl. Las señales ultravioleta (UV) 214 nm y MALLS de las partículas víricas se registraron y analizaron usando los paquetes de software Chromeleon y ASTRA.
3.3 ELISA para JEV inactivado (basado en policlonales)
La desorción del antígeno del alumbre y el análisis ELISA se llevaron a cabo usando anticuerpos policlonales de oveja anti JEV para recubrir las placas ELISA de 96 pocillos, como se describe en el Ejemplo 4.
3.4 ELISA para JEV inactivado (basado en monoclonales)
Durante el transcurso de esta prueba de investigación, se desarrolló un ELISA monoclonal (mAb) basado en el JEV. El ensayo se basa principalmente en el formato de ensayo "ELISA para JEV policlonal", sólo se usa un anticuerpo monoclonal anti-JEV (clon 52-2-5) para el recubrimiento y el anticuerpo policlonal actual para la detección. El mab 52-2-5 empleado demostró ser específico para el JEV y reconocer un epítopo neutralizante. El clon mab 52-2 5 se obtuvo mediante inmunización subcutánea de ratones BALB/c con el lote de vacunas JEV08J14B disponible en el mercado. Las células del bazo de los ratones se fusionaron con células de mieloma. A partir de las células de hibridoma resultantes, se seleccionaron y subclonaron clones individuales. Los clones se analizaron negativamente contra la albúmina de suero bovino, el sulfato de protamina y un extracto de la línea celular de producción de la vacuna JE (células Vero). Se realizó un cribado positivo frente al Virus Inactivado Neutralizado (NIV) del lote de vacuna JEV08M20. Para la selección, se recubrieron placas de microtitulación con el antígeno correspondiente y se hizo reaccionar con sobrenadante de cultivos de los clones seleccionados. Para la detección se usó un anticuerpo policlonal de cabra antirratón conjugado con fosfatasa alcalina. Se demostró que el clon de Mab 52-2-5 reconoce un epítopo neutralizante en el dominio III de la proteína de la envoltura (E) del JEV que contiene Ser331 y Asp332 (Lin C.-W. y Wu W.-C. J Virol. 2003;77(4):2600-6). La unión del mab al epítopo neutralizante indicado se determina, por ejemplo, como se describe en Lin y Wu (2003) mediante mutagénesis dirigida al sitio del dominio III en la posición 331 (por ejemplo: S^-R), y/o mediante mutaciones de alanina en o cerca de la posición 331 del dominio III, por ejemplo de los residuos Ser 331 y Asp332, seguido de inmunotransferencia para determinar la unión del mab a las proteínas mutadas. Los resultados de unión negativos indican que el epítopo del mab es el epítopo neutralizante identificado por Lin y Wu (2003). La característica neutralizante del epítopo hace suponer que el epítopo podría ser importante para que el antígeno provoque una respuesta inmunitaria protectora. Las muestras de j Ev se analizaron mediante ambos ensayos ELISA, policlonal y monoclonal. El contenido relativo de epítopos específicos puede expresarse como la relación entre el contenido total de antígeno determinado por "ELISA monoclonal" (clon 52-2-5) dividido por el contenido total de antígeno determinado por "ELISA policlonal". Cualquier diferencia en la relación puede indicar diferencias en el contenido de epítopos específicos 52-2-5. Los resultados cercanos a 1 corresponderían a un alto contenido de epítopos, y los resultados cercanos a 0 corresponden a un bajo contenido relativo de epítopos. Una relación baja indica la presencia de cambios estructurales del epítopo neutralizante.
Durante el desarrollo de este "mAb ELISA", se detectaron diferencias entre lotes de vacunas, que pudieron correlacionarse con los resultados de potencia de estos lotes.
3.5 Evaluación estadística
La evaluación estadística se realizó con Statgraphic Plus 3.0.
4 Resultados
4.1 Experimento 20110913(NIV): Formulación de NIV a diferentes concentraciones de iones metálicos de Ni(II), Cu(II), Cr(III) con o sin presencia de fragmentos PS
En la Tabla 12 se resumen los resultados de la SEC-HPLC de las formulaciones de NIV (pH 7 y pH 8) que contienen iones metálicos [Ni(II), Cu(II), Cr(III)] con y sin fragmentos PS. Los resultados de la SEC-HPLC muestran que la recuperación de antígenos de la mayoría de las muestras fue de >80%. Algunas muestras (N°7, N°36, N°38) mostraron recuperaciones ligeramente reducidas en el intervalo de 70-80%. Cabe señalar que el contenido real de virus es bastante bajo y la precisión de los resultados de la HPLC puede estimarse en aproximadamente ± 20%. Como para las muestras N°36 y N°38 las recuperaciones para las siguientes formulaciones (N°37, N°39) en el siguiente nivel de contenido individual de iones metálicos fueron de nuevo más altas, estas diferencias podrían deberse a la variabilidad del ensayo y no se consideraron significativas. Basándose en los resultados obtenidos, no fue posible aclarar la influencia de los iones metálicos con respecto a la recuperación del JEV soluble inactivado. Sin embargo, la SEC-HPLC sólo da información sobre el contenido de virus soluble, pero no sobre cualquier posible modificación de la superficie. Sólo las formulaciones preparadas a pH 8 se analizaron también mediante ELISA (análisis por duplicado). Se calculó la relación de ELISA monoclonal/policlonal, que puede usarse para comparar los resultados. El análisis de las muestras por ELISA (ver Tabla 13) no muestra ninguna influencia significativa de los metales probados en la degradación del JEV inactivado a pH 8 después de tres semanas a 22°C. Podría haber una tendencia a la disminución de la concentración de metales en el JEV inactivado. Podría haber una tendencia a la disminución de la relación en presencia de Cu(II), pero en general parece que un tiempo de incubación de tres semanas a 22°C no parece ser suficiente para detectar ninguna degradación significativa. Como también se mostró en el experimento DOE (Ejemplo 1) el JEV inactivado parece tener una mayor estabilidad a pH 8 cuando se almacena en condiciones aceleradas a 22°C y esto también contribuiría a que no se observaran efectos significativos. En este experimento también se demostró que los fragmentos PS no tienen ninguna influencia sobre la estabilidad del JEV. Esto también concuerda con los resultados del DOE. Las muestras de NIV 1-20 formuladas a pH 7 mostraron una reducción significativa del contenido de epítopos monoclonales en presencia de Cu(II). A la concentración más alta probada (1000ng/ml) la relación era cercana a cero, lo que indica cambios estructurales significativos del antígeno.
4.2 Experimento 20110913(DP): Formulación DP con diferentes concentraciones de iones metálicos de Ni(II), Cu(II), Cr(III)
El análisis del antígeno desorbido del JEV se resume en la Tabla 14 (SEC-HPLC) y en la Tabla 15 (ELISA). Las recuperaciones de antígeno para todas las muestras, determinadas por SEC-HPLC, fueron del >80% después de 5 semanas a 22°C, lo que indica que no hubo influencia significativa de los iones metálicos probados sobre la recuperación de la desorción. Como se muestra en la Figura 8, hay una tendencia a la disminución de la relación analizada por ELISA en presencia de Cu(II) y Cr(III) a pH 7. Las formulaciones a pH 8 parecen ser más estables.
4.3 Experimento 20110812(DP): DP enriquecido con iones metálicos
En este experimento se usó FBV11D87 como material de partida. El valor de pH de la formulación se ajustó en un intervalo más estrecho (pH 7,0, 7,4, 7,8) y se usaron iones metálicos adicionales para el enriquecimiento, cada uno a 500ng/ml (concentración final). La mezcla de iones metálicos contenía todos los iones metálicos individuales a excepción del Cr(III) en formulaciones individuales (cada metal a 500ng/ml). En la Tabla 16 se resumen los resultados de ELISA obtenidos después de 4 semanas y 7 semanas a 22°C. Los resultados también se muestran como gráficos en la Figura 9.
Se realizó una evaluación estadística de las muestras de estabilidad almacenadas a 22°C durante 7 semanas. El ANOVA (análisis de varianza) mostró efectos significativos de los parámetros (pH y tipo de metal) sobre la estabilidad del antígeno, que se expresa como la relación de ELISA monoclonal/policiclonal (ver Tabla 17). La tabla ANOVA descompone la variabilidad de la Relación en contribuciones debidas a varios factores. Como se han elegido sumas de cuadrados de tipo III, la contribución de cada factor se mide habiendo eliminado los efectos de todos los demás factores. Los valores P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Como los valores P para el pH y el tipo de ion metálico son inferiores a 0,05, estos factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre la Relación al nivel de confianza del 95,0%.
En la Tabla 18 se aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar la significancia de las diferencias observadas con respecto a las medias. Se mostró un efecto significativo sobre la proporción para el Cu(II) y la mezcla de metales en comparación con las formulaciones de control no enriquecidas. La mitad inferior de la salida muestra la diferencia estimada entre cada par de medias. Se ha colocado un asterisco junto a 7 pares, lo que indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente significativas al nivel de confianza del 95,0%. En la parte superior de la página, se identifican 3 grupos homogéneos usando columnas de X. Dentro de cada columna, los niveles que contienen X forman un grupo de medias dentro del cual no hay diferencias estadísticamente significativas. El método que se usa actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Con este método, hay un riesgo del 5,0% de que cada par de medias se considere significativamente diferente cuando la diferencia real es igual a 0.
Se observó un efecto significativo sobre la proporción en el caso del Cu(II) y la mezcla de iones metálicos. La influencia de otros iones metálicos podría ser significativa si el periodo de almacenamiento fuese más largo. La mezcla de iones metálicos contenía la mayor concentración total y podría representar el peor caso. Sin embargo, se llegó a la conclusión de que varios iones metálicos presentes en el alumbre podían contribuir a la degradación, cada uno en distinta medida. Estos resultados respaldan adicionalmente la causa principal propuesta de la degradación del antígeno catalizada por iones metálicos. Hay que tener en cuenta que el experimento de adición podría no simular completamente las condiciones reales de las impurezas residuales de iones metálicos presentes en el alumbre 4230. Los iones metálicos están incorporados en la estructura del alumbre y la concentración y orientación locales pueden ser diferentes de las de los iones metálicos usados en los experimentos de adición. También se sabe que los iones metálicos (por ejemplo, el Fe) tienen una baja solubilidad en presencia del ion fosfato (PO43-). Por lo tanto, se desconoce la concentración real de iones metálicos solubles y la contribución de los metales presentes como complejo metal-fosfato sobre la degradación del JEV.
4.4 Experimento 20110819: Preparación de muestras de DP con diferentes lotes de alumbre
Los estudios de enriquecimiento descritos anteriormente pueden proporcionar una primera prueba de la posible inestabilidad del antígeno formulado en presencia de algunos iones metálicos, pero podrían no ser completamente representativos de las condiciones reales en las que se espera que estos iones metálicos presentes en el hidróxido de aluminio se incorporen a la estructura tridimensional del gel de hidróxido de aluminio, lo que da como resultado una concentración local y una orientación/accesibilidad diferentes. Para superar estas limitaciones se inició un estudio inicial para simular las condiciones reales. Se formuló una única NIV (11A74) con varios lotes de alumbre obtenidos por Brenntag que cubrían una amplia variedad de metales residuales. Las muestras de vacunas formuladas se almacenaron a 2-8°C y en condiciones aceleradas a 22°C. Todos estos lotes de Alumbre contenían iones metálicos residuales a diferentes niveles. El lote 4230 tenía el nivel más alto para Fe, Cu, Ni y V (ver la Tabla 19). Tener en cuenta que el contenido real de iones metálicos presentes en el producto formulado es sólo de 1/20 de la concentración en la solución madre de Alumbre (2%). Tener en cuenta que las valencias de los iones metálicos no pueden especificarse por ICP-MS. En la Tabla 20 se muestra el análisis del antígeno desorbido por ELISA de muestras almacenadas a 22°C durante 6 semanas.
Se calculó la desviación estándar agrupada de todas las muestras (agrupadas ~ 0,075) como una medición de la incertidumbre experimental. Los valores medios de la relación y los intervalos de confianza del 95 % (calculados a partir de las agrupaciones) se trazaron en función de las formulaciones individuales (ver la Figura 10). Las muestras formuladas con alumbre 4230 mostraron una tendencia a una relación inferior en comparación con las otras muestras. Sin embargo, las diferencias no fueron tan grandes como para mostrar diferencias estadísticamente significativas entre las distintas formulaciones.
5 Sumario
Se demostró que los iones metálicos contribuyen a la degradación del JEV inactivado en condiciones de almacenamiento acelerado (22°). En los estudios de enriquecimiento se usaron concentraciones más altas de iones metálicos residuales (intervalo 100-1000 ng/ml) que las presentes en las FVL formuladas con el lote de alumbre 4230 (por ejemplo, Fe~310 ng/ml; Cr~64ng/ml; Ni~52ng/ml). El contenido de Cu en la FVL sólo puede estimarse en 3ng/ml basándose en los datos de ICP-MS de la solución madre de Alumbre al 2%, ya que el LD es de 25 ng/ml. Se eligió una concentración de metal y temperatura de almacenamiento más altas para aumentar la velocidad de cualquier reacción de degradación potencial. De hecho, para FVL JEV09L37, la pérdida de potencia se produjo después de 11 meses almacenado a 2-8°C. También se demostró que los metales pueden formar complejos insolubles con los iones fosfato, dificultando la estimación de los niveles reales de metales presentes.
En los experimentos de enriquecimiento, los resultados de ELISA mostraron cambios estructurales estadísticamente significativos de la superficie del virus en tan sólo 4 semanas a 22°C en presencia de iones metálicos. Se demostró que las relaciones de ELISA para las formulaciones que contenían Cu(II) y mezcla de iones metálicos (que contenían Fe(II), Fe(III), Co(II), Cu(II) y Zn(II)) eran estadísticamente significativamente inferiores en comparación con la formulación de control sin enriquecer. También se descubrió que el Cu(II) en el lote de alumbre 4230 (solución madre al 2%) a 64ng/ml, corresponde a ~3ng/ml en FVL. En todos los demás lotes de Alumbre (2%) el contenido de Cu(II) era < 25ng/ml (por debajo del límite de detección).
Para los experimentos de formulación del antígeno usando diferentes lotes de Alumbre, se requiere un tiempo de almacenamiento más largo (>6 semanas a 22°C) en condiciones aceleradas. Hay una tendencia a que las formulaciones preparadas con Alumbre 4230 muestren relaciones de ELISA más bajos en comparación con otros lotes. Una tasa de degradación más lenta en comparación con la formulación enriquecida podría estar contribuyendo a un menor contenido de iones metálicos en los lotes comerciales de Alumbre. También se observó que el antígeno muestra una mayor estabilidad a pH 7,5-8 en comparación con pH 7 y que los fragmentos de PS no contribuyen a ninguna reacción de degradación. Estos resultados concuerdan bien con los resultados de DOE descritos en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Como parte de la investigación fuera de especificación concerniente a FVL JEV09L37, se determinó que el lote de hidróxido de aluminio usado (lote 4230) era la causa principal más probable de la pérdida de potencia observada. El hidróxido de aluminio (denominado alumbre durante el proceso de fabricación de JE-PIV) se adquiere de Brenntag Biosector como suspensión de autoclave denominada "adyuvante de gel de hidróxido de aluminio Alhydrogel®". Cada lote se esteriliza por radiación antes de su uso en el proceso de producción de JEV.
Se analizó el aspecto, el contenido de iones metálicos y las propiedades físicas de una serie de diferentes lotes de Alhydrogel®.
1 Introducción
1.1 Hidróxido de aluminio
El Alhydrogel® de Brenntag Biosector tiene un contenido de aluminio especificado de 10 mg/ml, lo que se traduce en un 2% de Al2O3 y un 3% de Al(OH)3, respectivamente. Especificaciones adicionales son Nitrógeno (máx.
0,005%), Sulfato libre (máx. 0,05%), Sulfato total (máx. 0,1%) y pH (6,5 ± 0,5). Tiene una vida útil de 26 meses almacenado a temperatura ambiente.
1.2 Generación de hidróxido de aluminio
El Alhydrogel® al 2% (denominado hidróxido de aluminio) es fabricado por Brenntag (N° CAS 21645-51-2).
1.3 Uso de lotes de hidróxido de aluminio en la fabricación de JEV
Para la producción de lotes comerciales de vacunas contra el VJE se han usado hasta ahora un total de 5 lotes diferentes de Alhydrogel® al 2% de Brenntag.
2 Definicionesyabreviaturas
Alhydrogel Solución de hidróxido de aluminio al 2% (también denominada alumbre)
DS/DP Sustancia farmacéutica/Producto farmacéutico
ESG Grupo de Ciencias Medioambientales
F-AAS Espectrometría de absorción atómica de llama
FVL Lote final de vacunas
GF-AAS Espectrometría de absorción atómica en horno de grafito
ICP-MS Espectrometría de masas por plasma acoplado inductivamente
JEV Virus de la encefalitis Japonesa
JE-PIV Virus inactivado purificado de la encefalitis japonesa
LOQ Límite de cuantificación
P&TD Parches y desarrollo técnico
PSD Distribución del tamaño de las partículas
PZC Punto de carga cero
QCI Control de calidad Inmunología
3 Materiales y métodos
3.1 Lotes de Alhydrogel®
Alhydrogel® al 2% lotes: 3877, 4074, 4187, 4230, 4414, 4470, 4539, 4563, 4587, 4621 (no se usaron todos los lotes de Alumbre enumerados en la formulación de JE-PIV) Alhydrogel® al 2% 7x lotes lavados: 4577, 4580, 4596 (procedentes de Brenntag, no son típicos del 2% de Alumbre recibido para la formulación)
3.2 Mediciones de PSD con Alhydrogel®
La distribución del tamaño de las partículas (PSD) de hidróxido de aluminio se analizó en un sistema Malvern Mastersizer 2000|jP con una celda de muestra de 20ml. La sustancia a granel Alhydrogel® al 2% se diluyó 1:20 en agua y se añadió 1ml a la celda de muestra. La dilución final de la muestra en la celda de muestra fue, por tanto, de 400 veces (0,005% de hidróxido de aluminio).
3.3 Mediciones del potencial zeta del Alhydrogel®
El potencial zeta y el punto de carga cero (PZC) se midieron en un sistema Malvern Zetasizer ZS equipado con un autotitulador MPT-2. La sustancia a granel Alhydrogel® al 2% se diluyó 1:20 en PBS y se equilibró durante la noche a temperatura ambiente. Para el registro de la curva de valoración de carga se ajustó el pH usando soluciones de HCl 100mM y NaOH 100mM. La PZC se determinó por extrapolación de la carga cero en el gráfico de valoración (intersección de la curva de valoración y el eje x). El punto de carga cero corresponde al valor de pH en el que la superficie de la muestra no tiene carga neta.
3.4 Análisis de iones metálicos en hidróxido de aluminio
Los iones metálicos seleccionados se analizaron mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), espectrometría de absorción atómica de llama (F-AAS) y espectrometría de absorción atómica de horno de grafito (GF-AAS) en el Medical Laboratory Bremen (Alemania). En resumen, las muestras que contenían hidróxido de aluminio se trataron con HNO3 concentrado con calor hasta que se obtuvo una solución trasparente. A continuación, la solución trasparente se diluye y se analiza. Se determinó la presencia y el contenido de los siguientes iones metálicos: Pb, Cd, Cr, Co, Fe, Cu, Ni, Ag, W y Al. Dependiendo de la dilución de la muestra, el límite de cuantificación (LOQ) fue de 5 a 25 ng/ml.
Además, ESG (Reino Unido) realizó un análisis semicuantitativo de 70 elementos usando una combinación de ICP-MS (Agilent 7500ce) e ICP-AES (Perkin Elmer Optima 4300DV), que se calibraron usando estándares certificados. El escaneo de elementos es un método de cribado y no tan sensible como el análisis de metales traza seleccionados que realiza el Medical Laboratory Bremen. Sin embargo, dicho cribado ofrece una buena visión general sobre la presencia y los niveles de determinados metales.
4 Resultados
4.1 Determinación de la distribución del tamaño de las partículas de Alhydrogel®
La Tabla 21 resume los datos de PSD de dos sublotes cada uno de los lotes 4230 y 4740 de Alhydrogel®. Los resultados de la distribución se muestran en la Figura 11. La partícula media era de ~2-4jm, con poblaciones de partículas más pequeñas (<1jm) y más grandes (>20jm) presentes en las cuatro muestras. Las cuatro muestras de Alhydrogel® probadas no mostraron diferencias significativas en la distribución del tamaño medio de las partículas.
4.2 Mediciones del potencial zeta
Se analizaron dos sublotes cada uno de los lotes 4230 y 4740 de Alhydrogel® (solución madre al 2% diluida 20 veces en PBS y equilibrada durante la noche a TA antes del análisis) para determinar el punto de carga cero. La Tabla 22 resume los resultados de PZC para las cuatro muestras mostrando un PZC muy similar en tampón PBS. Las curvas de titulación se muestran en la Figura 12. No se observaron diferencias en las curvas de titulación ni en el PZC entre las cuatro muestras analizadas.
4.3 Determinación del contenido residual de iones metálicos en los lotes de Alhydrogel®
Los límites actuales para el Fe en soluciones de hidróxido de aluminio al 2<%>de acuerdo con la Ph. Eur. son de 15 ppm (= 15 |jg/ml) y un máximo total de 20 ppm (= 20 |jg/ml) para otros metales pesados (como el Pb). Sin embargo, una concentración de 15 ppm de Fe correspondería a 0,27 mM de Fe en solución. Teniendo en cuenta que incluso trazas de iones metálicos residuales pueden catalizar una variedad de reacciones de degradación de las proteínas (por ejemplo, oxidación, activación de proteasas, etc.) y que los metales permanecen estables en solución, las diferencias en el contenido de iones metálicos entre los lotes de hidróxido de aluminio podrían provocar diferencias en la estabilidad del antígeno a lo largo del tiempo.
Se analizaron las concentraciones de una serie de iones metálicos en lotes de hidróxido de aluminio disponibles en el mercado mediante ICP-MS. Los resultados de estos análisis se resumen en la Tabla 23. Los lotes 4074, 4230, 4470, 4414 y 4539 se usaron en la producción de lotes comerciales de JEV. Como una solución madre de Alhydrogel® al 2% equivale a una concentración de Al de 10 mg/ml, la cuantificación del contenido de Al en las diferentes muestras puede usarse como referencia para los resultados obtenidos para los otros iones metálicos. De hecho, pudo medirse un contenido medio de aluminio de 10,3 mg/ml, lo que demuestra la precisión y reproducibilidad del método.
Cuando se comparan los distintos lotes de Alhydrogel® se observaron grandes variaciones en la cantidad de iones metálicos contaminantes. Los iones metálicos contaminantes más notables son Fe, Cr y Ni, que se detectaron en todos los lotes. Además, el lote 4230 contenía cantidades detectables de Cu que estaban por debajo del LOQ en todos los demás lotes.
Sin embargo, hay que señalar que ninguno de estos metales se detectó en cantidades cercanas a las especificaciones del Alhydrogel® mencionadas anteriormente. Por ejemplo, la concentración de hierro más alta encontrada en el lote 4230 fue de 5,6 jg/ml, es decir, aproximadamente el 40% de la concentración permitida.
El Alhydrogel® "mejorado" se lava 7 veces con agua durante el paso de purificación, en lugar de sólo 4 veces para el Alhydrogel® estándar. Para comprobar si este lavado adicional reduciría la contaminación por iones metálicos, se analizaron tres lotes diferentes (4580, 4596 y 4577). Los resultados se incluyen en la Tabla 23. No se observaron diferencias en los iones metálicos en comparación con el Alhydrogel® de calidad estándar, lo que sugiere que los iones metálicos están fuertemente ligados a la superficie de las partículas de hidróxido de aluminio o realmente coprecipitan durante el proceso de producción.
La Figura 13 muestra una comparación de los diferentes lotes de Alhydrogel® analizados. Se muestra el contenido total de iones metálicos contaminantes de todos los elementos contaminantes analizados, con los porcentajes absolutos de los tres metales principales Fe, Cr y Ni representados en colores diferentes. Como puede verse, el lote 4074 tiene muy pocos iones metálicos contaminantes en comparación con la mayoría de los demás lotes analizados. Sólo el lote 3877 mostró una contaminación del lote similar, mientras que el lote 4230 muestra con mucho la contaminación más alta de todos los lotes analizados durante esta investigación.
Durante las pruebas de investigación se observó una gran variación en el contenido de iones metálicos entre los distintos lotes de Alhydrogel® (ver la Figura 13). Para comprobar si estos iones metálicos contaminantes se encuentran en la fracción de hidróxido de aluminio o en el sobrenadante, se separó el lote 4230 en una fracción de sobrenadante y otra de sedimento (ver la Tabla 24). Como puede verse, pudieron detectarse menos del 2% de los iones metálicos en el sobrenadante, lo que indica que todos los iones metálicos contaminantes están unidos a la superficie de las partículas de hidróxido de aluminio o dentro de las estructuras de las partículas. Por lo tanto, puede estimarse que la concentración local de iones metálicos es por lo menos 50-100 veces mayor, ya que la fracción de volumen sólido (volumen de Alumbre-gránulo después de la centrifugación) de Al2O3 al 0,1% (correspondiente a 0,5 mg/ml de Al) usada en la formulación de la vacuna JEV es de aprox. 10-20jl por 1000jl de FVL.
5. Sumario
El Alhydrogel® se usa a una concentración final del 0,1% como adyuvante en la formulación actual de la vacuna contra el JEV. Durante la investigación de un resultado de potencia fuera de especificación (OOS) para la producción FVL JEV09L37 se inició una evaluación del proceso de producción de Alhydrogel®. Se analizaron un total de 13 lotes diferentes de Alhydrogel® para detectar la presencia de iones metálicos contaminantes que pudieran reducir la estabilidad de la proteína.
Se observaron grandes variaciones en la concentración de una serie de iones metálicos en diferentes lotes de Alhydrogel®. Al analizar las materias primas se demostró que estas contaminaciones estaban presentes en la misma concentración que la encontrada dentro del Alhydrogel.
Se observaron niveles más altos de iones de Fe, Ni y Cu en el lote 4230 de Alhydrogel® en comparación con los otros lotes investigados. El lote 4230 fue el único en el que se detectaron iones de Cu residuales. Este lote 4230se usó para la formulación del FVL JEV09L37.
Al analizar el sobrenadante y la fracción insoluble de un lote de Alhydrogel®, estos iones metálicos contaminantes sólo pudieron encontrarse en el precipitado, lo que indica que estos iones están ligados a la superficie de la partícula de hidróxido de aluminio o realmente forman parte de la partícula.
Aunque macroscópicamente y en su composición difiere de otros lotes de Alhydrogel® usados para la producción de JEV, el lote 4230 cumplía todos los requisitos detallados por la Ph. Eur. Además, la caracterización física (distribución del tamaño de las partículas y punto de carga cero) no mostró diferencias entre el lote 4230 y otros lotes de Alhydrogel® que no presentaban estas altas contaminaciones de iones metálicos.
Ejemplo 4
1.1. Materiales, equipos y métodos
1.2. Equipo
Balanza analítica (legibilidad de 0,1 mg; por ejemplo, Mettler Toledo XP205DR/M)
Balanza de precisión (legibilidad de 0,1 g; por ejemplo, Mettler Toledo, modelo N°XS6002S Delta Range) Unidades de filtrado de 0,22 pm (por ejemplo, Stericup N° de Cat. SCGPV01RE) o sistema de filtrado de 0,2 pm (por ejemplo, Millipore Steriflip de 50 ml)
Congelador (- 20°C) y ultracongelador (-80°C)
Frigorífico (+ 2 a 8°C)
Agitador magnético (por ejemplo KIKA Labortechnik RCT basic) y barras agitadoras magnéticas
Lavador de microplacas: por ejemplo BioTek ELx405
Lector de microplacas: por ejemplo BioTek Synergy 2 y software Gen5 Secure
Incubadora de microplacas (37°C)
Cinta de sellado de microtitulación (por ejemplo Thermo Electron 95031)
Pipetas y puntas multicanal (por ejemplo Eppendorf Research Pro 50-1200pl, Eppendorf Research, 10-100pl) medidor de pH (por ejemplo WTW Series ino Lab, Terminal 740 y pH/Cond. 740)
Pipetas y puntas (por ejemplo Eppendorf Research, 0.5-10pl, 2-20pl, 20-200pl, 100-1000pl, 500-5000pl) Pipeteador (por ejemplo IBS Biosciences Pipetboy)
Tubos de p P 15ml (por ejemplo Sarstedt 62.515.006) o tubos de PP 50ml (por ejemplo Greiner 227261) Depósito de reactivos de 50ml (por ejemplo Corning Incorporated 4870)
Pipetas serológicas (por ejemplo Falcon, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml, 50ml)
Microtubos de titulación - a granel (BioRad 223-9391)
Mezclador de vórtice (por ejemplo mezclador de vórtice analógico VWR, Modelo N°945304)
Tubos Eppendorf LoBind de 1,5ml o 2,0ml (N° de Cat0030 108.116, N° de Cat 0030 108.132, respectivamente) Microplaca de 96 pocillos (F96 Cert. Maxisorp Nunc-Immunoplates)
Para el análisis de muestras DP además:
Centrifugadora de sobremesa (por ejemplo Beckman coulter, Microfuga 16 Centrífuga, N° de Cat. A46473) Agitador orbital (por ejemplo Eppendorfer Thermomixer compact)
Tubos PP de 50ml (por ejemplo Greiner 227261)
1.3. Reactivos
PBS 10x (por ejemplo Gibco, N° de cat. 14200-083)
Tween 20 (por ejemplo Sigma, N° de cat. P7949)
Ácido sulfúrico 2M (solución volumétrica, por ejemplo Fisher, N° de Cat. J/8410/17)
Agua desionizada, por ejemplo (Milli-Q, 18.20)
Carbonato sódico - cápsulas de bicarbonato (por ejemplo Sigma, N° de Cat. C3041)
Ácido clorhídrico (HCl) 1mol/L (por ejemplo Merck, N° de Cat. 1.09057.1000)
Hidróxido sódico (NaOH) 1mol/L (por ejemplo Merck, N° de Cat. 1.09132.1000)
Glicerol (por ejemplo Sigma)
Para el análisis de muestras de DP además:
Trihidrato de dihidrogenofosfato de potasio (por ejemplo Sigma, N° de Cat P5504)
Dihidrogenofosfato de potasio (por ejemploVw R,AnalaR Normapur, N° de Cat. 26936.260)
Albúmina, suero bovino (BSA), calidad ELISA (por ejemplo Sigma, N° de Cat. A3059)
Sustrato TMB (por ejemplo BioFX, TMBW-1000-01)
Conjugado HRp IgG de burro anti conejo (Jackson Immuno Research, N° de Cat. 711-035-152)Reconstitución:
El contenido de 1 vial (0,4mg) se reconstituye en 0,5ml de agua desionizada y se mezcla concienzudamente hasta su total disolución. Se añaden 0,5ml de Glicerol y se sigue mezclando hasta la homogeneidad. Las alícuotas se almacenan a -20°C hasta su uso.
Estándar de referencia JEV inactivado (Intercell Biomedical Ltd.)
Anti-JEV purificado de oveja (Intercell Biomedical Ltd.)
Anti-JEV purificado de conejo (Intercell Biomedical Ltd.)
1.4. Soluciones
a) Tampón de carbonato 0,05M a pH 9,6 (usado para el recubrimiento de las placas ELISA).
Para 100ml de tampón, disolver una cápsula de tampón de bicarbonato/carbonato en 100ml de agua desionizada. Comprobar el pH y ajustar a 9,6 ± 0,1 con HCl o NaOH si es necesario. Usar sólo el día de la preparación. Mantener el tampón de recubrimiento ELISA a temperatura ambiente durante el día de uso, después desechar. b) Tampón de lavado ELISA y parte de diluyente de bloque/muestra (PBS-T)
Preparar aproximadamente 1 litro por cada placa usada. Diluir 10 veces el stock 1+9 de PBS en agua desionizada, mezclar bien y comprobar el pH (7,4 /- 0,1), ajustar con HCl 1M o NaOH 1M según sea necesario. Añadir 0.05% (v/v) Tween20, mezclar bien.
por ejemplo, tampón de lavado ELISA (PBS-T) [1L]:
100 ml 10x PBS
900 ml agua desionizada
Mezclar bien, comprobar/ajustar el pH (7,4 /- 0,1).
0.5mlTween20
Mezclar bien.
Usar sólo el día de la preparación; mantener el tampón de lavado ELISA a TA durante el día de uso, después desechar. c) Solución de bloqueo: BSA al 5% en PBS-T
Preparar aproximadamente 25ml para cada placa. Medir la cantidad requerida de PBS-T en un frasco de vidrio limpio usando una pipeta serológica. Añadir una barra de agitación magnética limpia. Pesar la cantidad requerida de BSA, añadir a la superficie del PBS-T y mezclar suavemente en un agitador magnético hasta que toda la BSA haya pasado a la solución. Filtrar la solución usando un filtro de 0,2 pm (sistema de filtrado Steriflip o filtro de jeringuilla). por ejemplo, solución de bloqueo [100ml].
5g BSA
100 ml PBS-T
Usar sólo el día de la preparación; mantener la solución de bloqueo a TA durante el día de uso y después desecharla. d) Diluyente de la muestra: 1% de BSA en PBS-T
Preparar como antes pero usando 1g de BSA por 100ml de PBS-T, se requieren aproximadamente 25ml por placa.
por ejemplo, diluyente de muestra [100ml].
1g BSA
100 ml PBS-T
Usar sólo el día de la preparación; mantener el diluyente de la muestra a TA durante el día de uso, después desechar. Para el análisis de muestras de DP además:
e) 1x PBS
Preparar 1 parte de PBS 10x con 9 partes de agua desionizada
por ejemplo, 1x PBS [100ml]
10ml 10x PBS
90ml agua desionizada
Usar sólo el día de la preparación; mantener 1x PBS a TA durante el día de uso, después desechar. f) Tampón ELISA 20x
Pesar una cantidad apropiada de BSA en un recipiente adecuado para hacer una solución 20x. Añadir el volumen apropiado de 1x PBS. Añadir Tween20 a una concentración final del 0,05% Mezclar en el agitador magnético hasta que la BSA esté completamente disuelta. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 pm (usando el sistema de filtrado Steriflip o un filtro de jeringuilla) en un recipiente estéril (y dividir en alícuotas según sea necesario). por ejemplo 20x Tampón ELISA [25ml].
5g BSA
25ml IxPBS
12,5pl Tween20
La solución puede conservarse a 2-8°C durante 1 semana.
g) Tampón ELISA 2x
Se prepara por dilución del tampón ELISA 20x con 1x PBS (1 parte de tampón ELISA 20x y 9 partes de 1x PBS).
por ejemplo, 2x tampón ELISA [20ml]
2ml de tampón ELISA 20x
18ml de 1x PBS
Usar sólo el día de la preparación; mantener el tampón ELISA 2x a temperatura ambiente durante el día de uso, después desechar.
h) Tampón de desorción
Solución madre de fosfato de potasio: Preparar una solución madre 3x de fosfato de potasio (2,4M) disolviendo el volumen adecuado de trihidrato de di-fosfato de potasio y de fosfato de dihidrógeno de potasio en agua desionizada. Colocar en un agitador magnético y, una vez disuelto, completar el volumen necesario, comprobar que el pH de la solución sea 8,0+/- 0,1. Filtrar a través de un filtro de 0,2 pm.
por ejemplo, solución madre 3x de fosfato de potasio (2,4M) [50ml].
23.963g Trihidrato de difosfato de potasio
2.041g Dihidrogenofosfato de potasio
Hasta 50 ml Agua desionizada
Almacenar a 2°-8°C hasta 1 mes.
Preparar tampón de desorción de fuerza de trabajo (tampón de fosfato potásico 0,8M que contiene 1% de BSA y 0,05% de Tween20) añadiendo el volumen apropiado de solución madre de fosfato potásico (2,4M), de Tween20 y de BSA al volumen requerido de agua desionizada. Mezclar bien y usar el día de la preparación.
por ejemplo, tampón de desorción de fuerza de trabajo [15ml].
5 ml Fosfato potásico (2,4M)
7,5pl Tween20
0.15g BSA
10 ml Agua desionizada
Mantener el tampón de desorción de fuerza de trabajo a TA durante el día de uso.
1.5. Muestras de prueba y anticuerpos
Muestras de prueba:
o Sustancia farmacéutica y/o NIV (varios lotes)
o Muestras de vacuna JEV (vacuna a granel final y lote de vacuna final) Estándar de referencia JEV inactivado (virus inactivado neutralizado - NIV) (Intercell Biomedical Ltd.)
Anticuerpos policlonales:
o Anticuerpo de recubrimiento: Anti-JEV de oveja purificado (Intercell Biomedical Ltd.)
o Anticuerpo primario de detección: Anti-JEV de conejo purificado (Intercell Biomedical Ltd.)Anticuerpo secundario conjugado: Conjuugado de HRP de burro anti-conejo (Jackson Immuno Research N° de Cat. 711-035-152).
2 Procedimiento
2.1. Recubrimiento de placas
o Etiquetar la placa con número de placa, fecha y analista.
o Prepare tampón de carbonato 0,05M fresco (pH 9,6) el día del recubrimiento de la placa. Dejar aproximadamente 12 ml para cada placa recubierta.
o Sacar del congelador el número requerido de alícuotas del anticuerpo de recubrimiento y dejar descongelar a TA. Preparar una dilución de anti-JEV de oveja purificado en tampón de carbonato. Mezclar bien invirtiendo el tubo.
o Usar la pipeta multicanal, aplicar 100jl/pocillo en una placa Maxisorp de 96 pocillos en el plazo de 15min de la preparación de la dilución de anticuerpos.
o Cubrir con cinta de sellado de microtitulación e incubar de 17 a 72hrs a 2-8°C.
2.2. Lavado
o Retire la placa del frigorífico y dejar que se caliente a temperatura ambiente.
o Lavar la o las placas con el lavador de placas de Microtitulación 3 veces usando el programa de lavado respectivo (300jl por pocillo, tres veces, dispensación final). Después: eliminar cualquier resto de tampón de lavado por decantación. Invertir la placa y secarla contra una toalla de papel limpia. No dejar que la placa de microtitulación se seque entre los pasos de lavado y la adición de reactivos.
2.3. Bloqueo
o Preparar una solución de bloqueo al 5% (p/v) de BSA en PBS-T como antes.
o Aplicar 200|jl de solución de bloqueo por pocillo, cubrir la placa o placas con un cubreobjetos e incubar a 37°C durante 1 hora /-10 min.
2.4. Preparación de las diluciones de curva estándar
o Sacar el estándar de referencia NIV del congelador, dejar descongelar a TA, mezclar bien. Preparar una dilución madre de 1AU/ml del estándar de referencia actual; usar por lo menos 20jl de estándar de referencia NIV para la dilución.
por ejemplo Estándar de referencia NIV Predilución:
Concentración: 235AU/ml (lote N° 03/2009)
Para preparar una solución patrón de trabajo de 1AU/ml diluirla 1 a 235 en diluyente de muestra:
4680 jl diluyente de la muestra
20 jl Norma de referencia NIV
o Preparar luego las siguientes soluciones estándar de trabajo a partir de la predilución de 1AU/ml:
0,8 AU/ml, 0,6 AU/ml, 0,4 AU/ml, 0,2 AU/ml, 0,1 AU/ml y 0,05 AU/ml en diluyente de muestra.
2.5 Muestras de control de calidad
a) Las muestras de control de calidad (QC) (por ejemplo a 0,75, 0,30 y 0,18 AU/ml) deben prepararse a partir de la predilución del estándar de referencia NIV recién preparado en el momento del ensayo y desecharse una vez usadas.
b) Estos controles forman parte de los criterios de idoneidad del sistema y permiten monitorizar el rendimiento del ensayo a lo largo del tiempo.
2.6. Preparación de las muestras de prueba
Preparación de la sustancia farmacéutica
Se reciben muestras de prueba de sustancias farmacéuticas para su prueba a concentraciones desconocidas. Se analizarán en seis diluciones por triplicado. Las diluciones se realizarán independientemente en el intervalo de la curva estándar, por ejemplo, dilución previa de 1 en 15 u otra dilución adecuada y, a continuación, seis diluciones con tampón de muestra.
Preparación de muestras NIV
Las muestras de NIV se recibirán para su análisis en concentraciones desconocidas y se prediluirán en el intervalo de la curva estándar (por ejemplo, 1 en 30 u otra dilución adecuada) y luego se diluirán seis veces de la misma manera que las muestras deDs .
Preparación del sobrenadante del producto farmacéutico
a) Para el análisis de muestras de DP a granel mezclar bien la muestra mediante agitación con vórtice. Transferir exactamente 1ml a un tubo Eppendorf LoBind de 1,5ml.
Para el análisis de muestras de recipientes de producto final, transferir el contenido de 2 jeringuillas (0,6ml por jeringuilla) del mismo lote a un tubo Eppendorf LoBind de 1,5ml. Mezclar exhaustivamente el contenido del tubo por inversión para asegurar la homogeneidad de la PD y transferir exactamente 1ml a un nuevo tubo Eppendorf LoBind de 1,5ml.
b) Centrifugar los tubos que contienen 1ml de DP cada uno a 3300xg durante 5 minutos.
c) Para cada muestra, pipetear 25pl de tampón ELISA 20x en un nuevo tubo Eppendorf LoBind.
d) Retirar cuidadosamente 475pl del sobrenadante sin alterar el precipitado de alumbre y transferirlo al tubo que contiene el tampón ELISA 20x. Mezclar suavemente por inversión. Volver a centrifugar 2 min a 16.000xg. Almacenar la muestra a 2-8°C antes del análisis.
NOTA: Las muestras de sobrenadante de DP preparadas de esta manera deben medirse por triplicado en el ELISA de JEV inactivado.
e) Extraer cuidadosamente la mayor cantidad posible de sobrenadante residual del tubo centrifugado con una pipeta de 10-200 pl sin alterar el precipitado de alumbre y desechar el sobrenadante.
f) El sedimento obtenido se somete al procedimiento de desorción descrito a continuación.
Procedimiento de desorción del producto farmacéutico
a) Añadir 158pl de tampón de desorción de fuerza de trabajo a cada sedimento que quede en el tubo LoBind. b) Volver a suspender el sedimento pipeteando arriba y abajo varias veces para asegurar la resuspensión completa del sedimento y la homogeneización de la muestra.
c) Incubar las muestras durante 10 minutos a TA en un agitador orbital a 500 rpm.
d) Después de la incubación, centrifugar las muestras a 3300xg durante 5 minutos.
e) Para cada muestra, pipetear 250pl de tampón ELISA 2x en un nuevo tubo Eppendorf LoBind.
f) Extraer cuidadosamente 83,3pl de la parte superior del sobrenadante que contiene el producto desorbido sin alterar el sedimento y transferir al tubo que contiene el tampón ELISA 2x. Eliminar el sobrenadante restante con una pipeta de 20-200pl sin alterar el sedimento y desechar el sobrenadante.
g) Añadir otros 158pl de tampón de desorción de fuerza de trabajo a cada precipitado.
h) Realizar 2 ciclos más de desorción (3 en total) agrupando los 3x 83.3pl del material desorbido 250pl de tampón ELISA en el tubo apropiado. Después del último paso, puede desecharse el sedimento restante.
i) La concentración final del antígeno vírico en la mezcla o mezclas desorbidas debe ser la misma que la de la muestra original de 1 ml de la que se desorbía. Por lo tanto, la concentración de contenido de antígeno JEV inactivado medida en el grupo desorbido puede relacionarse directamente con la DP original.
Nota: Analizar las muestras desorbidas por ELISA el día de la desorción.
j) Dilución de las muestras DP desorbidas:
Se probarán en seis diluciones por triplicado. Se realizará una dilución previa adecuada en el intervalo de la curva estándar, por ejemplo, 1 en 15 (diluyente de 100pl a 1400pl) u otra dilución adecuada, y a continuación se realizarán seis diluciones de la dilución previa de 1 en 15 de manera independiente usando diluyente de muestra.
2.7. Carga de la muestra y plan de placa
Preparar las muestras y los estándares antes del análisis.
Después del bloqueo, lavar la placa usando el lavador de placas empleando el programa ELISA para JEV. Después de eso, eliminar cualquier resto de tampón de lavado por decantación. Invertir la placa y transferirla contra una toalla de papel limpia. No dejar secar la placa de microtitulación entre los pasos de lavado y adición de reactivos.
Añadir 100pl/pocillo de estándares/controles/muestras y cubrir con placa de cobertura e incubar durante 1 hora+/-10 min a 37°C.
Añadir 100pl de diluyente de muestra a todos los pocillos que no sean necesarios para las pruebas.
2.8. Preparación del anticuerpo primario
Sacar del congelador el número requerido de alícuotas del anticuerpo primario y dejar descongelar a TA. Preparar un máximo de 15 minutos antes del uso de anti-JEV de conejo en diluyente de muestra a una dilución adecuada. Después de la incubación de la muestra, lavar la placa usando el lavador de placas empleando el programa ELISA para JEV. A continuación, eliminar cualquier resto de tampón de lavado por decantación. Invertir la placa ytransferirla contra una toalla de papel limpia. No permitir que la placa de microtitulación se seque entre los pasos de lavado y la adición del reactivo.
Añadir 100|jl/pocillo de anticuerpo primario diluido, cubrir con una placa de cobertura e incubar durante 1 hora /-10 min a 37°C.
2.9. Preparación del conjugado de anticuerpos secundarios
Sacar del congelador el número requerido de alícuotas del conjugado de anticuerpo secundario y dejar descongelar a TA. Preparar como máximo 15 minutos antes del uso una dilución de anti-HRP de conejo de burro en diluyente de muestra; por ejemplo, para una dilución de 1 en 10.000 hacer una dilución previa de 1 en 100 y después hacer una segunda dilución de 1 en 100.
Después de la incubación del anticuerpo primario, lavar la placa usando el lavador de placas empleando el programa ELISA para JEV. Después de eso, decantar el tampón de lavado restante. Invertir la placa y transferirla contra una toalla de papel limpia. No permitir que la placa de microtitulación se seque entre los pasos de lavado y la adición del reactivo. Añadir 100|jl/pocillo de conjugado de anticuerpo secundario diluido, cubrir con placa de cobertura e incubar durante 1 hora /-10 min a 37°C.
2.10. Incubación de sustratos
Una vez añadido el conjugado, sacar el TMB de la nevera a 2-8°C. Pipetear el volumen requerido (12ml de TMB por placa) en un tubo de centrífuga de 50ml, usando una pipeta serológica. Dejar que el TMB alcance la temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación del conjugado, lavar la placa 3 veces con el lavador de placas empleando el programa ELISA para JEV. Después de eso: eliminar cualquier resto de tampón de lavado por decantación. Invertir la placa y transferirla contra una toalla de papel limpia. No permitir que la placa de microtitulación se seque entre los pasos de lavado y la adición de reactivos. Añadir 100|jl/pocillo de TMB y desarrollar la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos.
2.11. Parada y lectura
Después de 10 minutos de incubación con TMB, detener el desarrollo añadiendo 100|jl/pocillo de ácido sulfúrico 2M. Leer la placa a 450 nm (filtro de referencia 630 nm) en el plazo de los 10 minutos siguientes a la parada usando el lector BioTek y el software Gen5 Secure.
2.12. Análisis de datos
Análisis de datos NIV/DS:
Se usará el software Gen5Secure para calcular el % de recuperación de los QC, concentración x diluciones, concentración media de las muestras corregida para las diluciones y este valor multiplicado por 1,05 para corregir la adición de tampón ELISA.
Análisis de datos DP:
Se usará el software Gen5Secure para calcular el % de recuperación de los QC, la concentración x diluciones y la concentración media de las diluciones para las muestras.
Para muestras de sobrenadante DP:
Si la concentración de la muestra de sobrenadante está por debajo del LLOQ del ensayo (es decir, 0,05 AU/ml), entonces la muestra de sobrenadante debe registrarse como <0,05 Au/ml.
Si la concentración de la muestra de sobrenadante está dentro de los LOQs del ensayo (es decir, de 0,05AU/ml a 1,25AU/ml), entonces se registra el valor de concentración para la muestra de sobrenadante.
Si la concentración de la muestra de sobrenadante está por encima del ULOQ del ensayo (es decir, 1,25AU/ml), deberá repetirse la preparación del sobrenadante del producto farmacéutico. La muestra de sobrenadante se volverá a probar realizando una predilución adecuada en el intervalo de la curva estándar seguido de 6 diluciones de la muestra. (La concentración media de las diluciones que estén dentro de los LOQ del ensayo (LLOQ de 0,05AU/ml a 1,25AU/ml) será el valor de concentración registrado para la muestra de sobrenadante, siempre que se cumpla la idoneidad del sistema y por lo menos 4 de las 6 diluciones de muestra estén dentro de los LOQ.
2.13. Criterios de aceptación del ensayo
a) El coeficiente de correlación de la curva de calibración debe ser >0,980.
b) %CV <15% para los estándares y las muestras (excepto el sobrenadante de DP) para las cuatro concentraciones más altas de las diluciones, %CV <15% para los controles.
c) Las DO individuales de las muestras en blanco deben ser < 0,2.
d) Los controles del ensayo deben estar dentro de los límites definidos especificados (para controles recién preparados, 2 de cada 3 controles de calidad deben tener concentraciones observadas dentro de ± 30% de los valores nominales; O los niveles establecidos durante la calificación del control de calidad) para que el ensayo sea aprobado.
e) La validez del ensayo se registrará en la impresión Gen5. Si la placa no cumple los criterios de aceptación definidos, el ensayo se considerará no válido.
2.14. Comunicación de datos
NIV
a) Contenido en antígenos
El valor notificado para AU/ml inactivada es la media de las concentraciones (que están dentro de los LOQ de 0,04 a 1,25AU/ml) calculadas para las diluciones de muestra única corregidas por los factores de dilución respectivos, y la media multiplicada por un factor de corrección de 1,05 para tener en cuenta el volumen del 5% de tampón ELISA 20x que se añadió a cada muestra cuando se tomó. El contenido de antígeno se registrará en la impresión Gen5.
DS:
a) Identidad
Si las absorbancias de las muestras en la dilución más baja (concentración más alta) superan en más de 3 desviaciones estándar el valor medio de la muestra en blanco, el resultado se considerará positivo.
b) Contenido en antígenos
El valor notificado para AU/ml inactivada es la media de las concentraciones (que están dentro de los LOQ de 0,04 a 1,25AU/ml) calculadas para las diluciones de muestras individuales corregidas por los factores de dilución respectivos, y la media multiplicada por un factor de corrección de 1,05 para tener en cuenta el volumen del 5% de tampón ELISA 20x que se añadió a cada muestra cuando se tomó. El contenido de antígeno se registrará en la impresión Gen5.
DP desorbido:
a) Identidad:
Si las absorbancias de las muestras en la dilución más baja (concentración más alta) son superiores a 3 desviaciones estándar por encima del valor medio de la muestra en blanco, el resultado se notificará como positivo.
b) Contenido en antígenos
El valor notificado para AU/ml inactivada es la media de las concentraciones (que están dentro de los LOQ de 0,05 a 0,8AU/ml) calculadas para las diluciones de muestras individuales corregidas por los factores de dilución respectivos. El contenido de antígeno se registrará en la impresión Gen5.
Sobrenadante de DP (grado de adsorción/grado de no adsorción):
Se informa del grado de adsorción con respecto a la sustancia farmacéutica formulada con hidróxido de aluminio después de la filtración.
a) Para calcular el valor notificado, el contenido de antígeno notificado (AU/ml) para la muestra de SD respectiva (postfiltración) corregido para la dilución con hidróxido de aluminio (5%) se fijará en el 100% y el porcentaje de la concentración medida en el sobrenadante (corregido para la adición de tampón ELISA al 5%) se calculará en relación con éste. El valor notificable será la diferencia entre el 100% y el porcentaje calculado para el sobrenadante. Los resultados se notificarán con 2 decimales.
El grado de no adsorción se calculará como se detalla a continuación y los resultados se notificarán con 2 decimales:
b) En caso de que el sobrenadante puro no contenga ningún antígeno medible (es decir, concentración de sobrenadante observada menor del<l>L<o>Q, donde LLOQ = 0,05 AU/ml), se usará el LLOQ para el cálculo del resultado. En este caso, el resultado se indica como "mayor del x%". Por ejemplo, si la muestra de DS se mide como 12,00 AU/ml y no se midió ninguna señal en el sobrenadante; con el<l>L<o>Q de 0,05 AU/ml, entonces la cantidad en el sobrenadante es <0,05*1,05 = < 0,0525 AU/ml. La cantidad de DS después de la corrección del tampón es 12.00*0.95 = 11.40AU/ml, y el resultado informado para el grado de adsorción es < 100-0.0525/11.4*100 = >99.54%. También se informará el grado de no adsorción (es decir, 100 - el % de grado de adsorción).
Ejemplo 5
Introducción:
Para investigar más a fondo el modo de acción que lleva a la inestabilidad del producto/pérdida de potencia de la vacuna contra el JEV, se usó Ala-(His)6-OprF190-342-OprI21-83 (SEQ ID NO: 1, Figura 14) - también denominada en la presente "proteína A"- en un ensayo de cribado preliminar que incorporaba lotes de alhydrogel con diferente contenido metálico y se enriquecía con iones de cobre y sulfito.
Material:
• dihidrato de cloruro de cobre (II) (Sigma, N° de pedido 807483)
• 10xPBS (Gibco, N° de pedido 14200-091)
• Tubos Falcon de 15 ml (Greiner, N° de Cat. 188724)
• Incubadora Infors HT Incubadora Multitron Standard (InforsAG)
• Aqua bidest. (Fresenius Kabi, N° de Art. 0712221/01 A)
Preparación de soluciones madre:
• Solución madre de cobre(II)
Se preparó una solución madre de cobre(II) 20 mM disolviendo 341 mg de dihidrato de cloruro de cobre(II) en 100 ml de agua...
• Solución madre de metabisulfito sódico
Se preparó una solución madre de metabisulfito sódico 200 mM disolviendo 1,52 g de metabisulfito sódico en 35 ml de PBS. Esta solución se ajustó el pH a 7,3 con NaOH y se llenó hasta un volumen de 40 ml con PBS. La solución se filtró con un filtro de jeringuilla de 0,2 p.
Preparación de soluciones de trabajo
Las soluciones de trabajo se prepararon por dilución de las soluciones madre de metal con aqua bidest. y filtración estéril mediante filtro de jeringuilla de 0,2p. (Mini Kleenpak 25mm- Pall)
Preparación de soluciones tampón
• 1/3 PBS NaCl 0,9%.
La solución tampón 1 x PBS se preparó mediante dilución 1:10 de 10 x PBS con aqua bidest.. El pH de esta solución tampón fue de 7,5. Las soluciones tampón PBS ajustadas a pH 7,3 y 8,0 se prepararon ajustando el pH con HCl o NaOH respectivamente.
Se disolvieron 9 g de NaCI en 333ml de solución tampón de pH 7.3 o pH 8.0 y se llevaron a 1000 ml con aqua bidest.. seguido de filtración mediante filtro de botella de 0.2|j.
Preparación de la muestra:
Se prepararon formulaciones de Proteína A y diferentes lotes de alhidrogel (Lote 4230 y Lote 4074) en 1/3 PBS 0,9% de NaCl a dos valores de pH diferentes y se les enriqueció con sulfito de acuerdo con el esquema siguiente:
Las muestras 1, 6, 11 y 16 se conservaron a 4°C (muestras de referencia). Todas las demás muestras se incubaron a 37° C durante 96 horas.
Pasadas 96 horas, todas las muestras se sometieron a un procedimiento de desorción para separar el antígeno del alhydrogel. El antígeno desorbido se analizó mediante RPC.
Resultados:
Los resultados mostraron una degradación grave del antígeno Proteína A en presencia de sulfito. La degradación fue más pronunciada en las muestras formuladas con alhydrogel de mayor contenido en impurezas metálicas.
-
t í
O
p
o
h
o<u
<u
Q-'o .
<D
T3
<D
= S
cC/5r
P
N
es
3
e2
Tabla 3: Comparación de los lixiviables del extracto de tapón y JEV09L37 SN. En esta tabla se incluyen todos los icos con un área > 01mAU.min.
Tabla 4: Resultados de DOE obtenido después de 4 y 8 semanas a 22° C. Se desorbió antígeno a partir de Alumbre se analizó mediante ELISA monoclonal oliclonal. * aumento de x veces en com aración con FVL
continuación
Tabla 5: Análisis de varianza para la relación ELISA monoclonal/policlonal después de 4 semanas de almacenamiento a 22°C
Tabla 6<:>Análisis de Varianza para la relación ELISA Monoclonal/Policlonal después de almacenamiento a 22°C durante 8 semanas.
T l 7: Anlii r r i n r "Rl i n mn " inl n H Al m r F rml hí .
T l : E im i n l r l "Rl i n mn " nr n l m l .
continuación
continuación
Tabla 9 continuación
continuación
Tabla 10 continuación
T l 11: Pln r x rimn 211 12 - DP nri i n i n m li
continuación
Tabla 11 continuación
Tabla 12: Recuperación de antígeno determinada mediante SEC-HPLC del experimento 20110913(NIV). Para pH 7 y pH 8, las recuperaciones se basan en muestras de control de NIV no enriquecidas N° 1 y N° 21, respectivamente. Las muestras se almacenaron a 22° C durante 3 semanas. Las muestras marcadas con "n.a." no nlizr n i l ri riz i n m r
Tabla 13: Resultados de ELISA del experimento 20110913(NIV) obtenidos después de 3 semanas a pH 8 (muestra 21-40) y 7 semanas a pH 7 (muestra 1-20) a 22° C. Las muestras marcadas con "n.a." no se analizaron debido a la priorización de muestras.
Tabla 14: Recuperaciones de antígeno después de 5 semanas a 22°C de JEV desorbido obtenido por SEC-HPLC. Las recuperaciones se basaron en muestras de control DP no enriquecidas almacenadas a pH 7 o pH 8.
Ár EV
Tabla 16: Resultados ELISA del antígeno de JEV desorbido después de 4 semanas y 7 semanas almacenado a 22° . L m r m r n "n." n nlizr n i l ri riz i n m r
°
Tabla 18: Prueba de rango múltiple para la relación por tipo de ion metálico.1=Fe(II); 2=Fe(III); 3=Ni(II); 4=Co(II);
= II =ZnII 7= rIII =Mix1-1 = nr l n nri i .
continuación
Tabla 19: Resultados ICP-MS de impurezas residuales de iones metálicos presentes en varios lotes de Alumbre
continuación
Tabla 20: Resumen del contenido de iones metálicos y análisis de las muestras de DP formuladas con varios lotes de Alumbre. Las muestras se analizaron por duplicado mediante ELISA y se indica la relación de ELISA monoclonal/policlonal. Las formulaciones se almacenaron a 22°C durante 6 semanas. *El rango es la diferencia absoluta entre 1st y 2nd análisis.
Tabla 21: Resultados del análisis PSD de la solución madre de Alh dro el® 2% en a ua.
Tabla 22: Resultados de las curvas de titulación de Alhydrogel® para la determinación de POZ. Las muestras se analizaron en PBS dilución 1:20.
Tabla 23: Resumen del análisis de iones metálicos para varias soluciones madre de hidróxido de aluminio; Nota:
Una solución madre al 2 %
Tabla 24: El análisis del sobrenadante y de la fracción de gel de hidróxido de aluminio (lote 4230) en busca de i nes metálicos contaminantes muestra ue los iones metálicos se encuentran en el el no en el sobrenadante.
continuación
continuación
T l 2 : V n l mini r v rinri
continuación
continuación
continuación
continuación
continuación
continuación
continuación
continuación
continuación
Los siguientes términos usados en esta memoria descriptiva son reconocidos como marcas registradas: "Tritón", "Falcon", "UltiMate", "Infors", "Multitron", "LoBind", "Kleenpak", "Eppendorf', "Superose", "Millipore", "Steriflip", "BioTek" y "Tween".

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Una composición acuosa que comprende una proteína, un compuesto reactivo y una sal de aluminio, dicha composición comprendiendo menos de 350 ppb de metal pesado y menos de 2,5 ppb de Cu sobre la base del peso de la composición acuosa, en donde la sal de aluminio es hidróxido de aluminio (Al(oH)<3>) o fosfato de aluminio (APO<4>), en donde el compuesto reactivo es un compuesto redox activo, y en donde dicha proteína es una proteína vírica o bacteriana inmunogénica o una parte inmunogénica de dicha proteína.
2. Una composición acuosa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteína es una parte inmunogénica de una proteína vírica o bacteriana.
3. Una composición acuosa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteína contenida dentro de la composición acuosa es una proteína individual.
4. Una composición acuosa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteína contenida dentro de la composición acuosa es una proteína multimérica.
5. Una composición acuosa de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde dicha proteína es una proteína deB ac illu s an th rac is , C o ryn e b a c te riu m d iph th e ria e , C los tr id ium te tan i,bacteria Haemophilus influenzae tipo B (Hib), virus de la polio, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus del papiloma humano, virus de la gripe, virus de la encefalitis japonesa, rotavirus, bacterias Rickettsiae, virus de la fiebre amarilla, virus de la varicela zoster o meningococo.
<6>. Una composición acuosa de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende entre 5 pg/ml y 50 mg/ml de aluminio, preferiblemente que comprende entre 50 pg/ml y 5 mg/ml de aluminio.
7. Una composición acuosa de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la composición acuosa comprende menos de 1,25 ppb de Cu sobre la base del peso de la composición acuosa.
<8>. Una composición acuosa de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el compuesto reactivo se selecciona del grupo que consiste en formaldehído, etanol, cloroform, tricloroetileno, acetona, 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-<2>-il)fenoxi]etanol, desoxicolato, dietilpirocarbonato, sulfito, Na<2>S<2>O<5>, beta-proprio-lacton, polisorbato, O<2>, fenol, y una combinación de cualquiera de los mismos, preferiblemente en donde el compuesto reactivo comprende sulfito.
9. Una vacuna que comprende una composición acuosa de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.
10. Un método para preparar una composición acuosa que comprende aluminio, un compuesto reactivo y una proteína, en donde dicho método comprende:
- seleccionar una sal de aluminio que sea capaz de proporcionar una composición acuosa que tenga menos de 350 ppb de metal pesado y que tenga menos de 2,5 ppb de Cu sobre la base del peso de la composición acuosa y
- combinar dicha sal de aluminio, dicho compuesto reactivo, dicha proteína y agua para producir dicha composición acuosa que tiene menos de 350 ppb de metal pesado y que tiene menos de 2,5 ppb de Cu sobre la base del peso de la composición acuosa;
en donde la sal de aluminio es hidróxido de aluminio (Al(OH)<3>) o fosfato de aluminio (APO<4>), y
en donde el compuesto reactivo es un compuesto redox activo; y
en donde dicha proteína es una proteína vírica o bacteriana inmunogénica o una parte inmunogénica de dicha proteína.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además tamponar dicha composición acuosa a un pH comprendido entre 6,5 y 8,5.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, que comprende además almacenar la composición acuosa durante por lo menos tres meses a una temperatura comprendida entre 2°C y<8>°C en un recipiente de almacenamiento hermético.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la degradación de la proteína durante el paso de almacenamiento se contrarresta de tal manera que:
(i) la composición acuosa es estable durante por lo menos tres meses a una temperatura comprendida entre 2°C y<8>°C;
(ii) la composición acuosa tiene una vida útil de 20 o 24 meses a una temperatura comprendida entre 2°C y<8>°C; (iii) la composición acuosa puede almacenarse durante 20 o 24 meses a una temperatura de entre 2°C y<8>°C sinvolverse inadecuada para su uso debido a la degradación de la proteína;
(iv) una vacuna que comprende la composición acuosa se mantiene dentro de la especificación de potencia después de<20>o 24 meses de almacenamiento a una temperatura comprendida entre<2>°C y<8>°C; o
(v) no se degrada más del 30% de la proteína de la composición después de 20 o 24 meses de almacenamiento a una temperatura comprendida entre 2°C y<8>°C.
14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la sal de aluminio que se selecciona comprende menos de 700 ppm de metal pesado, sobre la base del peso con respecto al contenido de aluminio.
15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que comprende además determinar el contenido de metales pesados en la composición acuosa y/o la sal de aluminio.
16. Un método para mejorar la reproducibilidad de la vida útil de preparaciones de composiciones acuosas, dicho método comprendiendo:
(a) obtener por lo menos dos preparaciones diferentes de sales de aluminio;
(b) determinar el contenido de metales pesados en dichas preparaciones de sales de aluminio;
(c) seleccionar, entre dichas preparaciones de sales de aluminio, una preparación de sal de aluminio que no contenga más de 700 ppm de metal pesado en relación con el contenido de aluminio;
(d) preparar una composición o composiciones acuosas de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones<10>a 15.
17. El uso de un concentrado de sal de aluminio que comprende menos de 700 ppm de metal pesado sobre la base del peso con respecto al contenido de aluminio, para preparar una composición acuosa o vacuna como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
18. El uso de un concentrado de sal de aluminio que comprende menos de 700 ppm de metal pesado sobre la base del peso con respecto al contenido de aluminio, para (i) contrarrestar la degradación de una proteína en una composición acuosa o vacuna; y/o (ii) prolongar la vida de almacenamiento de una composición acuosa o vacuna; en donde la composición acuosa o vacuna comprende la proteína, un compuesto reactivo y la sal de aluminio, en donde dicha composición acuosa o vacuna comprende menos de 350 ppb de metal pesado y menos de 2.5 ppb de Cu sobre la base del peso de la composición acuosa o vacuna, en donde el compuesto reactivo es un compuesto redox activo, y en donde dicha proteína es una proteína vírica o bacteriana inmunogénica o una parte inmunogénica de dicha proteína, y en donde la sal de aluminio es hidróxido de aluminio (Al(OH)<3>) o fosfato de aluminio (APO<4>).
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en donde (i) la degradación de la proteína en la composición acuosa o vacuna se reduce en comparación con la degradación de la proteína en una composición acuosa o vacuna comparativa; y/o (ii) la vida de almacenamiento de la composición acuosa o vacuna se prolonga en comparación con la vida de almacenamiento de una composición acuosa o vacuna comparativa; en donde la composición acuosa o vacuna comparativa comprende más de 350 ppb de metal pesado y más de 2,5 ppb de Cu sobre la base del peso de la composición acuosa.
20. Una composición acuosa, vacuna, método o uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el compuesto reactivo comprende formaldehído y/o sulfito.
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