RS56709B1 - Jedinjenja aluminijuma za primenu u terapeuticima i vakcinama - Google Patents

Description

Opis pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na oblasti farmaceutika i vakcina. Preciznije, pronalazak se odnosi na oblast jedinjenja i kompozicija koje se ko-administriraju sa lekom i/ili antigenom.

[0002] Jedinjenja aluminijuma (ovde se takođe nazivaju "aluminijum"), uključujući aluminijum fosfat (AlPO4), aluminijum hidroksid (Al(OH)3) i druge vakcine sa istaloženim aluminijumom, trenutno predstavljaju najčešće korišćene adjuvanse za humane i veterinarske vakcine. Ovi adjuvansi se u literaturi često nazivaju "alum".

[0003] Aluminijumski adjuvansi se u praksi vakcinacije primenjuju duže od pola veka. Oni indukuju rani, visoko-titarski, dugotrajni zaštitni imunitet. Milijarde doza vakcina sa aluminijumskim adjuvansima se daju već godinama. Njihova bezbednost i efikasnost ih je učinila najpopularnijim adjuvansima u vakcinama do danas. Generalno, smatra se da su aluminijumski adjuvansi bezbedni kada se upotrebljavaju po aktuelnim rasporedima vakcinacija.

[0004] Od humanih vakcinacija, stari aluminijumski adjuvansi se koriste u vakcinama protiv tetanusa, difterije, pertusisa (velikog kašlja) i poliomijelitisa kao dela standardnih programa vakcinacije dece. Aluminijumski adjuvansi su takođe uvedeni u vakcine protiv virusa hepatitisa A i hepatitisa B i u vakcinama protiv virusa japanskog encefalitisa (ovde se takođe naziva "JEV"). JEV-vakcina sa aluminijumom kao adjuvansom je opisana, između ostalog, u Srivastava et al Vaccine (2001) tom 19: str.4557-4565. Za posebne rizične grupe na raspolaganju se nalaze druge vakcine adsorbovane na aluminijumu, na primer, protiv antraksa. U veterinarskoj medicini aluminijumski adjuvansi se upotrebljavaju u velikom broju formulacija vakcina protiv virusnih i bakterijskih bolesti, kao i u pokušajima da se naprave antiparazitarne vakcine.

[0005] Adjuvansi obično služe za dovođenje antigena, supstance koja stimuliše specifičnu zaštitnu imunu reakciju, u kontakt sa imunim sistemom i utiču na tip stvorenog imuniteta, kao i na kvalitet imune reakcije (jačinu ili trajanje); adjuvansi takođe mogu smanjiti toksičnost izvesnih antigena, a mogu i obezbediti rastvorljivost izvesnih komponenata vakcine. Studije su pokazale da mnoge vakcine koje sadrže aluminijum izazivaju jače i duže reakcije antitela od uporedivih vakcina bez adjuvansa. Korist od adjuvanasa se obično uočava pre kod inicijalnih serija imunizacije nego kod doza za pojačanje, odn. revakcinaciju.

[0006] Postoje tri opšta tipa adjuvanasa koji sadrže aluminijum:

aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat i kalijum aluminijum sulfat (često se zajedno nazivaju "alum")

[0007] Efektivnost svake soli kao adjuvansa zavisi od karakteristika specifične vakcine i od toga kako proizvođač priprema vakcinu. Da bi delovao kao adjuvans, antigen se obično adsorbuje na aluminijumu; to jest, on se zgrudvava sa aluminijumovom soli tako da se antigen zadrži na mestu ubrizgavanja.

[0008] Ne sadrže sve vakcine aluminijumove soli. Ponekad adjuvans ne mora da bude potreban ili se bira drugi adjuvans. Primeri komercijalnih vakcina koje ne sadrže aluminijumove soli su vakcina sa inaktiviranim polio virusom (IPV), vakcina protiv malih boginja, zaušaka i rubeole (MMR), vakcina protiv varičela, vakcina sa meningokoknim konjugatom (MCV4), i vakcina protiv influence, odnosno gripa. To što komercijalne vakcine ne sadrže aluminijumove soli obično ne znači da aluminijumova so ne bi delovala. To samo znači da se iz nekog razloga bira neki drugi adjuvans.

[0009] Primeri vakcina za decu koje su licencirane u SAD i koje sadrže aluminijumske adjuvanse su: DTP (vakcina protiv difterije-tetanusa-pertusisa); DTaP (vakcina protiv difterije-tetanusa-acelularnog pertusisa); neke, ali ne sve vakcine sa Hib (Haemophilus influenzae tip b) konjugatom; vakcina sa pneumokoknim konjugatom; vakcine protiv hepatitisa B; vakcine protiv hepatitisa A; vakcina protiv humanog papiloma virusa; vakcina protiv antraksa; i vakcina protiv besnila.

[0010] Aluminijum je veoma rasprostranjen element u našem okruženju. On se nalazi u mnogim vrstama hrane koju jedemo, mnogim proizvodima za ličnu higijenu koje nanosimo na svoju kožu (dezodoransima, na primer), i mnogim lekovima koje uzimamo. Različite vladine agencije su donele smernice za izlaganje potencijalno toksičnim supstancama. Ove smernice se nazivaju "minimalno rizični nivoi" - maksimalna količina kojoj pojedinac može biti izložen u toku vremena - obično na dnevnoj bazi - bez očekivanja bilo kakve škodljivosti.

[0011] Agencija za registrovanje toksičnih supstanci i bolesti u SAD (engl. US Agency for Toxic Substances and Disease Registry, skr. ATSDR) određuje ove nivoe za malu decu uzimajući u obzir količinu aluminijuma (npr. u obliku soli) koju bi dete moglo pojesti, kao i primiti injekcijom vakcine.

Telesno opterećenje aluminijumom iz oba izvora je ispod minimalnog rizičnog nivoa izuzev prolazno posle vakcinacija; pošto se 50-70% ubrizganog aluminijuma izluči u toku 24 sata, veruje se da ovo nema negativni efekat.

[0012] Aluminijum hidroksid i aluminijum fosfat kao adjuvansi se generalno pripremaju izlaganjem vodenih rastvora aluminijumovih jona obično blago alkalnim uslovima u dobro definisanom i kontrolisanom hemijskom okruženju. Za proizvodnju aluminijum hidroksida se mogu upotrebiti različite rastvorljive aluminijumove soli. Anjoni koji su prisutni u vreme taloženja se mogu koistaložiti (za pregled vidi, Lindblad, EB (2004) Immunol. and Cell Biol. vol.82: 497-505).

[0013] Aluminijumova so se takođe upotrebljava u proizvodnji i kompoziciji lekova. Na primer, faktor VIII se prečišćava iz plazma krioprecipitata. Talog se rastvara, pa se apsorbuje na aluminijum hidroksidu, a onda se tretira da bi se inaktivirali virusi sa lipidnim omotačem. Posle nekoliko drugih procesnih koraka, koncentrat se upotrebljava za lečenje pacijenata sa hemofilijom A (Burnouf T, (1991) Vox Sang. vol.60: str.8-15).

[0014] Pronalaskom je realizovana vodena kompozicija koja sadrži protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži manje od 350 ppb teškog metala i manje od 1.25 ppb Cu bazirano na težini vodene kompozicije, i pri čemu pomenuti protein jeste protein u delovima virusa inaktiviranog formaldehidom.

[0015] Pronalaskom je dalje realizovan postupak za pripremanje vodene kompozicije, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- izbor aluminijumove soli zahvaljujući kojoj se može dobiti vodena kompozicija koja ima manje od 350 ppb teškog metala i koja ima manje od 1,25 ppb Cu bazirano na težini vodene kompozicije i - sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, reaktivnog jedinjenja, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija; i

pri čemu protein jeste protein u delovima virusa inaktiviranog formaldehidom; i pri čemu je reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od redoks aktivnog jedinjenja, jedinjenja koje obrazuje radikal, stabilizujućeg jedinjenja i bilo koje njihove kombinacije.

[0016] U predmetnom pronalasku je pokazano da biološka stabilnost u kompoziciji koja takođe sadrži aluminijumovu so nije uvek ista. Predmetni pronalazak, na primer, pokazuje da stabilnost proteinske komponente (npr. kao takve ili unutar kompleksa, kao što je npr. virus ili drugi patogen) u kontekstu vodene kompozicije koja takođe sadrži aluminijumovu so zavisi od sadržaja teških metala. Da bi se a priori utvrdilo da li će protein biti stabilan u ovoj kompoziciji, predmetnim pronalaskom je predviđeno kao neophodno da se odredi rezidualni sadržaj teškog metala u kompoziciji (u suprotnom, postoji rizik da se vodena kompozicija koja sadrži protein degradira tokom vremena, a pronalaskom je naročito utvrđeno da je ovaj rizik znatan kada je rezidualni sadržaj teškog metala veći od 350 ppb (tj. oko 350ng po ml) u pomenutoj vodenoj kompoziciji). Dalje, pronalaskom je takođe otkriveno da se ovaj rezidualni sadržaj teškog metala ne može lako odstraniti iz jedinjenja aluminijuma. Za ovu svrhu je opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- sjedinjavanje aluminijumove soli, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija i

- određivanje nivoa teškog metala u vodenoj kompoziciji i/ili aluminijumovoj soli. Kompozicije koje sadrže manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije, mogu se čuvati u tečnoj fazi na temperaturi između 0 i 30 stepeni Celzijusa, najmanje 1 mesec, kao što je npr.20 meseci na 2-8°C. Proteinska komponenta u pomenutoj kompoziciji je stabilna tokom najmanje 1 meseca u pomenutoj tečnoj fazi. Kompozicije koje sadrže više od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije ne mogu se čuvati tokom produženog perioda pod takvim uslovima, pošto se proteinska komponenta u pomenutoj kompoziciji menja u najmanje jednom aspektu tokom navedenog vremenskog perioda. Zato jedan mililitar ili jedan gram vodene kompozicije prvenstveno ne sadrži više od 350 nanograma teškog metala. Vodena kompozicija prvenstveno sadrži između 0,1 mg/ml i 2,5 mg/ml aluminijuma. Prosečna doza aluminijuma po administraciji prvenstveno nije veća od 1,25 miligrama (mgram). U posebno poželjnom primeru izvođenja doza aluminijuma po administraciji nije veća od 0,25 mgram aluminijuma. Doza obično sadrži između 0,5 i 1 ml vodene kompozicije.

[0017] U sledećem aspektu predmetnog pronalaska je pokazano da biološka stabilnost u kompoziciji koja sadrži aluminijumovu so i reaktivno jedinjenje nije uvek ista. Predmetni pronalazak, na primer, pokazuje da stabilnost proteinske komponente (npr. kao takve ili u okviru kompleksa, kao što je npr. virus ili drugi patogen) u kontekstu vodene kompozicije koja takođe sadrži aluminijumovu so i reaktivno jedinjenje, kao što je npr. sulfit, kritično zavisi od sadržaja teških metala. Da bi se a priori utvrdilo da li će proteinska komponenta (kao što je npr. proteinska komponenta u okviru kompleksa, kao što je npr. deo virusa; ovde se takođe jednostavno naziva proteinom) biti stabilna u ovoj kompoziciji, neophodno je da se odredi sadržaj teškog metala u kompoziciji. U ovom cilju je opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- sjedinjavanje aluminijumove soli, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija i

- određivanje nivoa teškog metala u vodenoj kompoziciji i/ili aluminijumovoj soli. Kompozicije koje sadrže manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije, se mogu čuvati u tečnoj fazi

na temperaturi između 0 i 30 stepeni Celzijusa, najmanje 1 mesec, kao što je npr.20 meseci na 2-8°C. Proteinska komponenta u pomenutoj kompoziciji je stabilna najmanje 1 mesec u pomenutoj tečnoj fazi, kao što je npr.20 meseci na 2-8°C. Kompozicije koje sadrže više od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije se ne mogu čuvati tokom produženog perioda pod takvim uslovima, pošto se proteinska komponenta u pomenutoj kompoziciji menja u najmanje jednom aspektu tokom navedenog vremenskog perioda. Shodno tome, jedan mililitar ili jedan gram vodene kompozicije prvenstveno ne sadrži više od 350 nanograma teškog metala. Vodena kompozicija prvenstveno sadrži između 0,1 mg/ml (milligrama po mililitru) i 2,5 mg/ml aluminijuma. Prosečna doza aluminijuma po administraciji prvenstveno nije veća od 1,25 miligrama (mgram). U posebno poželjnom primeru izvođenja doza aluminijuma po administraciji nije veća od 0,25 mgram aluminijuma. Doza obično sadrži između 0,5 i 1 ml vodene kompozicije. Vodena kompozicija koja sadrži protein, aluminijumovu so, i opciono reaktivno jedinjenje, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije, se ovde takođe pominje kao "vodena kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku" ili "kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku".

[0018] Sadržaj aluminijuma u vodenoj kompoziciji je obično od oko 0,1 mg/ml do 2,5 mg/ml, pri čemu prosečna vakcina sadrži približno od 0,5 do 1,5 mg/ml aluminijumskog adjuvansa. U tom cilju je opisana vodena kompozicija, odnosno vodena kompozicija leka ili vakcine koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, koja sadrži između 5 mcgram/ml i 50 mg/ml aluminijuma i ne sadrži više od 700 ppm teškog metala kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma (gram/gram). U ovom kontekstu 700 ppm teškog metala je jednako 700 mcgram teškog metala po gramu aluminijuma.

[0019] U poželjnom primeru izvođenja vodena kompozicija, odnosno vodena kompozicija leka ili vakcine koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, sadrži između 5 mcgram/ml i 50 mg/ml aluminijuma i ne sadrži više od 450 ppm teškog metala kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma (gram/gram). U ovom kontekstu 450 ppm teškog metala je jednako 450 mcgram teškog metala po gramu aluminijuma. U poželjnom primeru izvođenja vodena kompozicija, odnosno vodena kompozicija leka ili vakcine koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, sadrži između 5 mcgram/ml i 50 mg/ml aluminijuma i ne sadrži više od 700 ppm Fe kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma (gram/gram). Prvenstveno je sadržaj Fe manji od 420 ppm Fe kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. Prvenstveno je sadržaj Fe manji od 350 ppm, a prvenstveno je manji od 100 i još poželjnije je manji od 50 ppm kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma (1 ppm = 1 mcgram/gram Al). U posebno poželjnom primeru izvođenja sadržaj Fe u vodenoj kompoziciji, vodenom leku ili vakcini je manji od 420 ppm kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. U poželjnom primeru izvođenja vodene kompozicije, vodeni lek ili vakcina sadrži više od 10 ppm Fe kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma.

[0020] U poželjnom primeru izvođenja vodena kompozicija, odnosno vodena kompozicija leka ili vakcine koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, sadrži između 5 mcgram/ml i 50 mg/ml aluminijuma i ne sadrži više od 35 ppm Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma (gram/gram). Prvenstveno je sadržaj Ni manji od 18 ppm Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. Prvenstveno je sadržaj Ni manji od 9 ppm, a prvenstveno je manji od 3 i još poželjnije je manji od 1 ppm kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma (1 ppm = 1 mcgram/gram Al). U posebno poželjnom primeru izvođenja sadržaj Ni u vodenoj kompoziciji, odnosno vodenom leku ili vakcini je manji od 18 ppm kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. U poželjnom primeru izvođenja vodena kompozicija, odnosno vodena kompozicija leka ili vakcine sadrži najmanje 200 ppb Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma.

[0021] U poželjnom primeru izvođenja vodena kompozicija, odnosno vodena kompozicija leka ili vakcine koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, sadrži između 5 mcgram/ml i 50 mg/ml aluminijuma i ne sadrži više od 5 ppm Cu kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma (gram/gram). Prvenstveno je sadržaj Cu manji od 2,5 ppm Cu kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma.

Prvenstveno je Cu sadržaj manji od 1 ppm, a prvenstveno je manji od 0,5 i još poželjnije je manji od 0,25 ppm kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma (1 ppm = 1 mcgram/gram Al). U posebno poželjnom primeru izvođenja sadržaj Cu u vodenoj kompoziciji, vodenom leku ili vakcini je manji od 2,5 ppm kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. U poželjnom primeru izvođenja vodena kompozicija, odnosno vodena kompozicija leka ili vakcine sadrži najmanje 50 ppb Cu kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma.

[0022] U posebno poželjnom primeru izvođenja sadržaj Fe u vodenoj kompoziciji, vodenom leku ili vakcini je manji od 420 ppm kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, sadržaj Ni u vodenoj kompoziciji, vodenom leku ili vakcini je manji od 18 ppm kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma i sadržaj Cu u vodenoj kompoziciji, vodenom leku ili vakcini je manji od 2,5 ppm kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. U poželjnom primeru izvođenja vodena kompozicija, vodeni lek ili vakcina sadrži više od 10 ppm Fe kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, najmanje 200 ppb Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, i najmanje 50 ppb Cu kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma.

[0023] U postupku za pripremanje vodene kompozicije, vodene kompozicije leka ili vakcine koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein prema pronalasku, ili u postupku za pripremu ili izbor aluminijumove soli prema pronalasku, ili u postupku za pripremanje taloga aluminijumove soli kliničkog kvaliteta prema pronalasku, poželjno je da sadržaj teškog metala u odnosu na sadržaj aluminijuma bude kao što je navedeno gore. Shodno tome, pronalaskom je opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- pripremu ili izbor aluminijumove soli zahvaljujući kojoj se može dobiti vodena kompozicija koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog reaktivnog jedinjenja, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija,

pri čemu vodena kompozicija sadrži između 5 mcgram/ml i 50 mg/ml aluminijuma, a prvenstveno između 0,1 mg/ml i 2,5 mg/ml; i ne više od 700 ppm teškog metala i prvenstveno ne više od 450 ppm teškog metala kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma; pri čemu pomenuta vodena kompozicija ne sadrži više od 420 ppm Fe, a prvenstveno ne više od 100 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma; ne više od 18 ppm, a prvenstveno ne više od 3 ppm Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma; i/ili ne više od 2.5 ppm Cu, a prvenstveno ne više od 0.5 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. U poželjnom primeru izvođenja, pomenuta vodena kompozicija ne sadrži više od 700 ppm teškog metala, a prvenstveno ne više od 450 ppm teškog metala kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma; ne više od 420 ppm Fe, a prvenstveno ne više od 100 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma; ne više od 18 ppm, a prvenstveno ne više od 3 ppm Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma; i ne više od 2.5 ppm Cu, a prvenstveno ne više od 0.5 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma.

[0024] Uočeno je da je aluminijumska komponenta važan izvor teškog metala u vodenoj kompoziciji. Shodno tome, jedan način da se kontroliše količina teškog metala u vodenoj kompoziciji je da se kontroliše količina teškog metala u izvoru aluminijuma koji se upotrebljava za generisanje vodene kompozicije. Shodno tome, pronalaskom je dalje opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- pripremu ili izbor rastvora aluminijumove soli (kao što je npr. tečnost sa 10mg/ml aluminijum hidroksida (kao što je npr. alhydrogel® 2% firme Brenntag Biosector, kataloški broj 843261) koji u finalnoj formulaciji proteina ne sadrži više od 350ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije (npr. za alhydrogel® 2% i finalnu količinu od 0,25 mgram aluminijum hidroksida u vodenoj kompoziciji od 0.5ml (= doza), izabrani ili pripremljeni rastvor aluminijumove soli ne bi trebao da sadrži više od 7 mikrograma teškog metala po mililitru alhydrogel® 2% rastvora, odnosno sadržaj teškog metala od oko 7ppm), i

- sjedinjavanje pomenutog rastvora aluminijumove soli, pomenutog proteina, vode i opciono reaktivnog jedinjenja da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija (sa ne više od 350ppb teškog metala u vodenoj kompoziciji).

Na primer, rastvor aluminijumove soli, npr. tečnost sa aluminijum hidroksidom (koji se upotrebljava kao komponenta koja treba da se primeša da bi se dobila finalna vodena kompozicija) ne bi trebao da ima sadržaj teškog metala veći od 7 ppm (ovde je dato kao primer da će tečnost sa 10 mg/ml aluminijum hidroksida biti razređena do 0,5 mg/ml da bi se dobio sadržaj teškog metala od oko 350ppb u odnosu na vodenu kompoziciju, pretpostavljajući da 1ppm = oko 1mg/ml) bazirano na težini tečnosti sa aluminijum hidroksidom. Granica prihvatljivog sadržaja teškog metala takođe može biti izražena u odnosu na težinu aluminijumove soli, kao što je aluminijum hidroksid u rastvoru (takođe se naziva "polazno jedinjenje aluminijuma"). Prihvatljivi sadržaj teškog metala u ovom primeru onda ne sme preći 7 mikrograma teškog metala za svaki gram rastvora aluminijum hidroksida (tj. oko 7ppm), tj. alhydrogel® 2% rastvor. Kao što je ovde gore navedeno, vodena kompozicija koja sadrži protein prvenstveno (kao što je npr. kada se upotrebljava kao vakcina) sadrži između 0,1 do 2,5 mg/ml jedinjenja aluminijuma. Međutim, koncentracija teškog metala u vodenoj kompoziciji prema pronalasku ne bi trebala da pređe 350ppb, tj. oko 350ng po ml finalne kompozicije i zato izbor ili priprema polaznog jedinjenja aluminijuma treba da budu izvršeni u skladu sa time. Da bi se dalje ilustrovao izbor odgovarajućeg rastvora polaznog jedinjenja aluminijuma (npr. u obliku koncentrovanog rastvora (vidi gore alhydrogel® 2%=10mg/ml), pokazano je da rastvor jedinjenja aluminijuma sa 10mg/ml aluminijum hidroksida koji ima oko 7 ppm teškog metala kao nečistoće odgovara koncentraciji teškog metala u kompoziciji proteina kada je koncentracija aluminijuma od oko 0.1mg/ml do oko 70 nanogram/ml ili 70 ppb (znatno ispod 350ppb koliko je predviđeno kao granica sadržaja teškog metala prema otkrivanju pronalaska). Koncentracija od 2,5 mg/ml aluminijum hidroksida u finalnoj vodenoj kompoziciji polazeći od rastvora aluminijuma sa 10mg/ml aluminijum hidroksida koji ima oko 7 ppm teškog metala kao nečistoće će rezultovati sadržajem teškog metala u vodenoj kompoziciji proteina koja odgovara koncentraciji teškog metala od oko 1,75 mikrogram/ml ili oko 1,750ppm (znatno iznad 350ppb koliko je predviđeno kao granica sadržaja teškog metala prema otkrivanju pronalaska). Shodno tome, rastvor aluminijuma sa 10mg/ml aluminijum hidroksida u ovom slučaju (finalni sadržaj aluminijum hidroksida je 2.5 mg/ml) onda ne bi trebao da ima više od 1.4ppm teškog metala kao nečistoće.

[0025] Postupak pripremanja vodene kompozicije koja sadrži protein prvenstveno dalje sadrži pakovanje alikvota pomenute vodene kompozicije koji ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije u posebne kontejnere za čuvanje nepropusne za vazduh. Protein u kontejnerima za čuvanje nepropusnim za vazduh je stabilan i može se čuvati najmanje tri meseca, kao što je npr.4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 meseca, a prvenstveno 20 ili 24 meseca, još poželjnije 20 meseci, na temperaturi između 2 i 8°C stepeni Celzijusa.

[0026] Bez vezivanja za teoriju, degradacija antigena u vodenim kompozicijama, kao što je imunogena kompozicija, koje sadrže jone teškog metala prisutne u aluminijumovoj soli, kao što je aluminijum hidroksid, mogle bi biti objašnjene odgovarajućom putanjom degradacije pretpostavljajući prisustvo slobodnih radikala, kao što su npr. slobodni radikali sulfita. Formiranje slobodnih radikala može biti katalizovano jonima teškog metala koji su prisutni, na primer, u aluminijum hidroksidu i ovaj efekat (u slučaju izvesne količine teškog metala kao što je navedeno prema pronalasku) bi mogao da bude osnovni uzrok mehanizma koji uzrokuje problem stabilnosti, što je identifikovano kao deo inventivnog doprinosa. Eksperimentalni deo ove prijave veoma detaljno prikazuje dokaze ovog osnovnog uzroka kod vakcine protiv japanskog encefalitisa (takođe se naziva i "JEV"), kao i slično za jednostavnu kompoziciju polipeptida adjuvansiranu aluminijumom koja sadrži reaktivno jedinjenje kao što je sulfit. Shodno tome, evidentno je da se slična reakcija može takođe pojaviti u nekoj drugoj vodenoj kompoziciji koja sadrži aluminijum (sa visokim sadržajem teškog metala, npr. višim od 350ppb bazirano na težini kompozicije), protein i opciono reaktivnu komponentu kao što je sulfit i/ili neke druge čestice koje formiraju radikale. Oksidacija katalizovana teškim metalom je putanja degradacije koja rezultuje kovalentnom modifikacijom proteina. Modifikovana fizikohemijska svojstva oksidizovanog/modifikovanog proteina ili antigena mogu rezultovati gubitkom njegove biološke aktivnosti (Li et al., 1995; Mayo et al., 2003; Stadtman, 1990).

[0027] Sledeće reakcione šeme (kao što se možda događa kod JEV proizvoda, kao što je opisano u eksperimentalnom delu) su indikativne za kompozicije prema pronalasku koje pored proteina i teškog metala takođe sadrže sulfit i/ili drugo reaktivno jedinjenje, kao što je npr. sulfit i/ili formaldehid.

[0028] Natrijum-metabisulfit (Na2S2O5) se u rastvoru rastvara u bisulfit (S2O5<2->), u alkalnom rastvoru bisulfitna ravnoteža je prema sulfitu (SO3<2->), a u kiselom rastvoru prema H2SO3/SO2. Posle rastvaranja Na2S2O5u vodi, on se hidrolizuje u NaHSO3kao što sledi

Na2S2O5⇔ 2 NaHSO3

[0029] Za neutralni pH možemo pretpostaviti sledeću ravnotežu:

HSO3<->⇔ H<+>+ SO3<2->pKa=7.2

[0030] Ovo znači da se za pH 7 ravnoteža pomera prema HSO3-, a za alkalnije uslove (npr. pH 8) prema SO3<2->.

[0031] Formaldehid formira bisulfitni adukt tokom neutralizacije prema sledećoj jednačini:

CH2O HSO3<->→ CH2(OH)(SO3)-

[0032] Pošto se bisulfat potroši, reakcija se nastavlja sve dok se ne dostigne ravnoteža kao što sledi:

CH2O SO3<2->+ H2O → CH2(OH)(SO3)<->+ OH-

[0033] Formaldehid i sulfit reaguju jedan sa drugim, međutim, utvrđeno je da su formaldehid i sulfit još uvek prisutni u ravnoteži u JEV vakcini i mogu se detektovati u sledećem opsegu (n=49):

[0034] Prema literaturi (Ranguelova et al., 2010), joni prelaznih metala kataliziraju auto-oksidaciju (bi)sulfita putem formiranja anjonskog radikala sumpor trioksida (•SO3-):

M<n+>+ SO3<2->→ M<(n-1)+>+ •SO3-

gde M može biti bakarni (Cu<2+>), gvozdeni (Fe<3+>), oksivanadijumski (VO<2+>), manganov (Mn<2+>), niklov (Ni<2+>) ili hromatni anjon (CrO4<2->) (Alipazaga et al.2004; Berglund et al.1993; Brandt i Elding 1998; Lima et al.2002; Shi 1994).

[0035] Pokazano je da su takvi sulfitni radikali veoma reaktivni i da mogu oksidisati različite supstance, kao što su askorbat, hidrohinon i histidin (Huie at al., 1985). Pregled hemije slobodnih sulfitnih radikala su objavili Neta & Huie, 1985. Autori su takođe pokazali da formiranje radikala takođe može biti katalizovano fotojonizacijom sulfita kao što sledi:

SO3<2->+ hν → •SO3<->+ e-

Formiranje radikala katalizovano svetlošću takođe bi moglo da objasni razlike koje su uočene u potenciji i ELISA rezultatima uzoraka iz neobeleženih golih špriceva (upotrebljenih za testiranje oslobađanja i referentne svrhe) i potpuno zapakovanih uzoraka iz finalne partije vakcina za JEV proizvod. Potpuno zapakovani uzorci su potpuno zaštićeni od svetlosti, dok bi neobeleženi špricevi mogli biti izloženi svetlosti tokom čuvanja i rukovanja.

[0036] Važna reakcija sulfitnih radikala u autoksidacionim sistemima je sa molekulskim kiseonikom da bi se formirao peroksil radikal koji je mnogo reaktivniji:

•

SO3<->+ O2→ •SO5-

[0037] Rastvorljivost O2u vodi na 0°C i 20°C je 0.4mM i 0.25mM, respektivno. Pretpostavljajući da je rastvorljivost O2u kompoziciji prema pronalasku u sličnom opsegu, značajna količina kiseonika je prisutna u obliku peroksil radikala. Ovaj radikal je znatno jači oksidans u poređenju sa •SO3<->i može oksidizovati izvesne supstrate koji uopšte nisu vezani sa •SO3<->i koji, u stvari, mogu formirati radikale koji oksidiraju sulfitne jone. U takvim slučajevima, kada je redoks potencijal supstrata srednja vrednost između onih od •SO3<->i •SO5-, verovatno je da će se u prisustvu O2 razviti lančana reakcija koja prati sledeću šemu:

•

SO3<->+ O2→ •SO5-•

SO5<->+ X → SO5<2->+ •X<+>

•

X<+>+ SO3<2->→ X •SO3-

[0038] Međuproizvod supstrata X može pojačati lančani proces oksidacije sulfita kiseonikom. Redukcija •SO5<->pomoću jednog elektrona daje HSO5-(peroksimonosulfat), veoma jak oksidans koji može da oksidira mnoga organska jedinjenja (Lambeth et al., 1973; Ito & Kawanashi, 1991). Peroksimonosulfat je takođe prekursor radikala anjona sulfata •SO4-.

•

SO5<->+ HSO3<->→ •SO4-. HSO4-

[0039] •SO4-. radikal je veoma jak oksidans, skoro jak kao hidroksil radikal (•OH), i veoma je verovatno da će oksidirati druge biomolekule oksidacijom sa jednim elektronom.

[0040] U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku je terapeutska kompozicija ili imunogena kompozicija, kao što je vakcina. Terapeutske kompozicije se daju pojedincima, kao što su čovek ili životinja. Za takve kompozicije je posebno važno da protein u okviru kompozicije još uvek ima terapeutski efekat u vreme kada se daje pomenutom pojedincu. Degradacija proteina ili promene strukture proteina mogu rezultovati time da protein izgubi svoju terapeutsku aktivnost. Slično tome, degradacija ili strukturne promene imunogene kompozicije će takođe dovesti do redukcije efektivnosti kompozicije koja indukuje i/ili pojačava imunu reakciju kod pojedinca. Imunogena kompozicija se prvenstveno daje pojedincu da bi delovala protiv virusne infekcije ili je sprečila. Protein koji je sadržan u okviru vodene imunogene kompozicije može biti samo jedan protein ili multimerni protein ili deo kompleksa koji sadrži pomenuti protein (npr. kao što je deo virusa ili ćelije).

[0041] Protein ili proteinski kompleks može sadržati živi oslabljeni, inaktivirani ili mutirani virus ili bakteriju ili imunogeni virusni ili bakterijski protein ili imunogeni deo takvog proteina (npr. imunogeni peptid), pokidani virus ili bakteriju, ili cele bakterijske ćelije. Ako se pomenuta imunogena kompozicija daje da bi se obezbedila zaštita protiv virusne ili bakterijske infekcije, onda degradacija proteina može rezultovati gubitkom zaštitnog svojstva imunogene kompozicije. Kada se ovde koristi, "živi oslabljeni" virus ili bakterija je virus ili bakterija koja je manje patogena od prirodnog tipa virusa ili bakterije, ali koja je zadržala imunogena svojstva. Kada se ovde koristi, "inaktivirani" virus ili bakterija se odnosi na virus ili bakteriju koja je inaktivirana tako da više nije infektivna, dok su imunogena svojstva zadržana bar delimično. Inaktivirani virus ili bakterija mogu biti u obliku inaktiviranog celog virusa ili bakterijskih ćelija. Međutim, inaktivacija može rezultovati kidanjem virusa ili bakterijskih ćelija. Zbog toga, inaktivirani virus ili bakterija takođe mogu biti u pokidanom obliku. Kada se ovde koristi, "pokidani" virus ili bakterija se odnosi na virus ili bakteriju koja je pokidana, na primer, korišćenjem deterdženta.

Vodena kompozicija prema pronalasku može sadržati reaktivno jedinjenje, kao što je formaldehid, koji je generalno prisutan da bi inaktivirao virus ili bakteriju. Dodatno ili alternativno reaktivno jedinjenje, kao što je reaktivno jedinjenje sulfit, takođe može biti prisutno u vodenom rastvoru da bi inaktiviralo eventualni rezidualni formaldehid. Kao što je detaljno opisano gore, smatra se da teški metali katalizuju oksidaciju (bi)sulfita i formiranje sulfitnih radikala prisutnih u vodenoj kompoziciji, koji dalje mogu indukovati degradaciju proteina prisutnog u kompoziciji. Zbog toga je verovatno da kompozicije koje sadrže inaktivirani virus ili bakterije ili njihove imunogene delove sadrže jedno ili više reaktivnih jedinjenja. Shodno tome, odsustvo teških metala ili njihovo prisustvo ispod nivoa koji su identifikovani predmetnim pronalaskom, je od posebnog značaja kada vodena kompozicija prema pronalasku sadrži inaktivirani virus ili njegov imunogeni deo. Zato u posebno poželjnom primeru izvođenja, imunogena kompozicija prema pronalasku sadrži inaktivirani virus. U poželjnom primeru izvođenja, vodena kompozicija, a prvenstveno imunogena kompozicija, prema pronalasku sadrži inaktivirani virus. Takav virus je, na primer, inaktiviran reaktivnim jedinjenjem, kao što je formaldehid, kao što je opisano predmetnim pronalaskom.

[0042] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, vodena kompozicija, imunogena kompozicija ili vakcina prema pronalasku sadrži toksoid. Kada se ovde koristi, "toksoid" se odnosi na inaktivirani bakterijski toksin, kao što je egzotoksin, usled čega se njegova toksičnost smanjuje ili nestaje, dok se imunogena svojstva bar delimično zadržavaju. Takav toksin je, na primer, inaktiviran reaktivnim jedinjenjem kao što je formaldehid, kao što je opisano predmetnim pronalaskom. Primeri toksoida koji su prisutni u imunogenoj kompoziciji prema pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na toksine difterije, tetanusa i botulizma.

Izraz "imunogeni virusni ili bakterijski protein" se odnosi na virusni ili bakterijski protein koji može da pobudi imunu reakciju. Izraz "imunogeni deo", kada se ovde koristi, se odnosi na deo virusnog ili bakterijskog proteina koji može da pobudi imunu reakciju. Prvenstveno pobuđena imuna reakcija prepoznaje i pomenuti deo proteina i ceo protein. Zbog toga je, u jednom primeru izvođenja, vodena kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku imunogena kompozicija. Pomenuta kompozicija je prvenstveno terapeutska kompozicija i/ili profilaktička kompozicija, kao što je vakcina. Takođe je predviđeno da je vakcina vodena kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku

[0043] "Imunogena kompozicija" je ovde definisana kao kompozicija koja može da pobudi imunu reakciju kada se daje pojedincu. Pobuđena imuna reakcija može biti humoralna, celularna ili njihova kombinacija i obuhvata, ali nije ograničena na proizvodnju antitela, B ćelija, kao što su aktivirane B ćelije, i T ćelija, kao što su aktivirane T ćelije. Kada se ovde koristi, imuna reakcija je prvenstveno specifično usmerena na jedan ili više imunogena u okviru kompozicije koja sadrži protein prema pronalasku. Imunogena kompozicija prema predmetnom pronalasku se može davati pojedincu bilo kojom tehnikom koja je poznata iz odgovarajuće oblasti uključujući, ali bez ograničavanja na intramuskularnu (IM), intradermalnu (ID), subkutanu (SC), intrakranijalnu (IC), intraperitonealnu (IP), ili intravensku (IV) injekciju, transdermalnu, oralnu, intranazalnu, ili rektalnu administraciju, i njihove kombinacije, a poželjne su intramuskularna (IM), intradermalna (ID), subkutana (SC), intrakranijalna (IC), intraperitonealna (IP), ili intravenska (IV) injekcija. U poželjnom primeru izvođenja se imunogena kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku upotrebljava za pobuđivanje imune reakcije koja može biti korisna u hroničnim okolnostima (kao što je lečenje raka) ili profilaktičkim okolnostima (kao što je tipična vakcina). Poželjno je da se imunogena kompozicija upotrebljava kao vakcina, tj. profilaktička primena. U ovom primeru izvođenja aluminijum je obično prisutan kao adjuvans.

Kada se ovde koristi, "adjuvans" se odnosi na farmakološki ili imunološki agens koji modifikuje efekat drugih agenasa, kao što je imunološki agens koji povećava antigenu reakciju. Adjuvansi obično služe za dovođenje antigene supstance koja stimuliše specifičnu zaštitnu imunu reakciju u kontakt sa imunim sistemom i utiču na tip stvorenog imuniteta, kao i na kvalitet imune reakcije (jačinu ili trajanje); smanjuju toksičnost izvesnih antigena; i obezbeđuju rastvorljivost za neke komponente vakcine.

[0044] "Pojedinac" je ovde definisan kao čovek ili životinja. Pojedinci obuhvataju, ali nisu ograničeni na piliće, patke, guske, ćurke, labudove, emue, morke i fazane, ljude, svinje, lasice, foke, kuniće, mačke, pse i konje. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska pojedinac je sisar, a prvenstveno je čovek.

[0045] "Mikro" u mikrogramu ili mikrolitru ili drugoj jedinici se ponekada označava kao mc, simbol μ ili slovo u. Vrednost od 3 mcgram je shodno tome 3 mikrograma, 3 μl je 3 mikrolitra i 3 ugram je 3 mikrograma.

[0046] Aluminijum kao adjuvans se često priprema kontrolisanim izlaganjem vodenog rastvora jona aluminijuma, alkalnim uslovima (za pregled vidi, Lindblad, EB (2004) Immunol. i Cell Biol. tom 82: 497-505). U predmetnom pronalasku za JEV proizvod (vidi eksperimentalni deo) je otkriveno da velika količina teškog metala u ovom vodenom rastvoru jona aluminijuma završava u talogu aluminijumove soli za aluminijumski adjuvans. Dalje je utvrđeno da količina teškog metala u talogu aluminijuma utiče na stabilnost vakcine tokom čuvanja vakcine. Shodno tome, količina teškog metala koja je prisutna u aluminijumovoj soli može biti kontrolisana određivanjem količine teškog metala u soli, ali takođe i prvenstveno, kontrolom količine teškog metala u vodenom rastvoru jona aluminijuma. Takođe je opisan postupak za pripremanje taloga aluminijumove soli kliničkog kvaliteta za inkorporaciju u lek i/ili vakcinu, pri čemu pomenuti postupak sadrži pripremu vodenog rastvora jona aluminijuma i taloženje pomenutih jona aluminijuma iz pomenutog rastvora, i određivanje nivoa teškog metala u rastvoru i/ili talogu aluminijumove soli, a prvenstveno pri čemu je utvrđeno da pomenuti rastvor i/ili talog aluminijumove soli treba da sadrži količinu koja rezultuje sa manje od 350ppb teškog metala u finalnoj kompoziciji npr. kada se resuspenduje u finalnoj kompoziciji. Takođe je opisan postupak za pripremanje taloga aluminijumove soli kliničkog kvaliteta za inkorporaciju u lek i/ili vakcinu, pri čemu pomenuti postupak sadrži pripremu vodenog rastvora jona aluminijuma i taloženje pomenutih jona aluminijuma iz pomenutog rastvora, i određivanje nivoa teškog metala u rastvoru i/ili talogu aluminijumove soli, pri čemu se bira talog pomoću koga se može dobiti vodena kompozicija koja sadrži između 5 mcgram/ml i 50 mg/ml aluminijuma, a prvenstveno između 0,1 mg/ml i 2,5 mg/ml, i koji ne sadrži više od 700 ppm teškog metala, a prvenstveno ne više od 450 ppm teškog metala kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, pri čemu pomenuta kompozicija ne sadrži više od 420 ppm Fe, a prvenstveno ne više od 100 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, ne više od 18 ppm, a prvenstveno ne više od 3 ppm Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, i/ili ne više od 2.5 ppm Cu, a prvenstveno ne više od 0.5 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti talog ne sadrži više od 700 ppm teškog metala, a prvenstveno ne više od 450 ppm teškog metala kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, ne više od 420 ppm Fe, a prvenstveno ne više od 100 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, ne više od 18 ppm, a prvenstveno ne više od 3 ppm Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, i ne više od 2.5 ppm Cu, a prvenstveno ne više od 0.5 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. Takođe je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku, koja dalje opciono sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač i/ili razređivač.

"Farmaceutski prihvatljivi razređivač", kada se ovde koristi, je definisan kao bilo koji rastvor, supstanca ili njihova kombinacija koja nema biološku ili neku drugu nepoželjnu aktivnost, što znači da može da se daje pojedincu zajedno sa drugim komponentama imunološke kompozicije bez toga da izazove znatnu neželjenu reakciju. Primeri podesnih nosača, na primer, obuhvataju hemocijanin iz prilepka Megathura crenulata (KLH), serumski albumin (npr. BSA ili RSA) i ovalbumin. U jednom poželjnom primeru izvođenja pomenuti podesni nosač sadrži rastvor, kao što je, na primer, slani rastvor.

[0047] U jednom aspektu, postupak prema pronalasku se primenjuje za produžavanje roka čuvanja ili roka trajanja vodene kompozicije koja sadrži protein prema pronalasku. Kada se ovde koristi, izraz "rok trajanja" je definisan kao vremenski period tokom koga se kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku može čuvati bez toga da postane nepodesna za upotrebu, na primer, zbog degradacije proteina (npr. u okviru specifikacije potencije kompozicije, npr. vakcine, što je traženo od strane regulatorne agencije koja je odobrila ili koja će odobriti vakcinu). Tokom čuvanja ovde opisanih vodenih kompozicija, može doći do degradacije proteina, a naročito kada se pređe izvesni nivo (kao što je ovde opisano) teških metala. Degradacija se generalno povećava tokom vremena kada se takve vodene kompozicije čuvaju. Sada je otkriveno da je degradacija proteina smanjena u vodenoj kompoziciji koja pored pomenutog proteina sadrži aluminijumovu so, kada pomenuta kompozicija sadrži manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije, pa je postalo moguće da se suprotstavi degradaciji proteina u vodenim kompozicijama. Suprotstavljanjem degradaciji proteina postupkom prema pronalasku, se povećava stabilnost pomenutog proteina u pomenutoj kompoziciji i rok čuvanja vodenih kompozicija koje sadrže pomenuti protein se produžava. Vodena kompozicija prema predmetnom pronalasku ima tu prednost što je stabilna i što nije podložna degradaciji proteina tokom produženog perioda. Takva vodena kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku je stabilna tokom najmanje jednog meseca na povišenoj temperaturi, kao što je npr.20 ili 37°C, a prvenstveno tokom najmanje tri meseca na povišenoj temperaturi, kao što je npr.20 ili 37°C. Vodena kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku se prvenstveno čuva na temperaturi između 0 °C i 20 °C da bi se doprinelo povećanju roka trajanja, još poželjnije između 2 °C i 15 °C, još poželjnije između 2 °C i 10 °C, najpoželjnije između 2 °C i 8 °C. Rok trajanja na temperaturi između 2 °C i 8 °C je stabilan prvenstveno najmanje tri meseca, kao što je npr.4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 meseca, a prvenstveno 20 ili 24 meseca, još poželjnije 20 meseci, na temperaturi između 2 i 8°C stepeni Celzijusa. Shodno tome, realizovana je vodena kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku koja ima rok trajanja od oko 12 do 24 meseca. Pronalaskom je dalje realizovan vodeni rastvor prema pronalasku koji se čuva najmanje jedan mesec, a prvenstveno najmanje dva meseca, još poželjnije najmanje tri meseca, još poželjnije najmanje šest meseci. Vodena kompozicija prvenstveno sadrži protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije, između 5 mcgram/ml i 50 mg/ml aluminijuma, a prvenstveno između 0,1 mg/ml i 2,5 mg/ml, i ne više od 700 ppm teškog metala i prvenstveno ne više od 450 ppm teškog metala kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, pri čemu pomenuta kompozicija ne sadrži više od 420 ppm Fe, a prvenstveno ne više od 100 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, ne više od 18 ppm, a prvenstveno ne više od 3 ppm Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, i/ili ne više od 2.5 ppm Cu, a prvenstveno ne više od 0.5 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. U poželjnom primeru izvođenja, pomenuta kompozicija ne sadrži više od 700 ppm teškog metala i prvenstveno ne više od 450 ppm teškog metala kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, ne više od 420 ppm Fe, a prvenstveno ne više od 100 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, ne više od 18 ppm, a prvenstveno ne više od 3 ppm Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, i ne više od 2.5 ppm Cu, a prvenstveno ne više od 0.5 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma.

[0048] Kada se ovde koristi, "stabilna kompozicija proteina" znači da kada se uporedi sa polaznom kompozicijom, onda se ne degradira više od 50%, a prvenstveno ne više od 40%, čak još poželjnije ne više od 30%, čak još poželjnije ne više od 20%, čak još poželjnije ne više od 10, čak još poželjnije ne više od 5% proteina u pomenutoj kompoziciji. "Degradira" se u ovom kontekstu odnosi na bilo koju detektabilnu modifikaciju proteina kada se uporedi sa proteinom u polaznoj kompoziciji. Na primer, smanjenje detekcije proteina sa monoklonskim antitelom, kao što je npr. antitelo koje prepoznaje neutralizujući epitop, je podesno i može se izmeriti bilo kojim metodom koji je poznat u odgovarajućoj oblasti, kao što je ELISA (vidi Primer 4). Detektovani nivo se može uporediti, na primer, sa nivoom detektovanim sa poliklonskim specifičnim za isti protein, kao što npr. predstavlja količina ukupnog proteina (promenjenog ili nepromenjenog). Takođe je opisan postupak za produženje roka trajanja vodenih kompozicija koje sadrže protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuti postupak sadrži biranje i/ili pripremanje aluminijumove soli koja rezultuje vodenom kompozicijom sa sadržajem teškog metala manjim od 350ppb bazirano na težini vodene kompozicije i sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija. Dalje je opisan postupak za poboljšanje roka trajanja reproduktibilnosti preparata sa vodenim kompozicijama koje sadrže protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuti postupak sadrži pripremanje najmanje dva različita preparata sa aluminijumovom soli, određivanje količine najmanje jednog teškog metala u pomenutom preparatu sa aluminijumovom soli, biranje između pomenutih preparata sa aluminijumovom soli, preparata sa aluminijumovom soli koji sadrži manje od 350ppb pomenutog najmanje jednog teškog metala; i sjedinjavanje aluminijumove soli iz pomenutog izabranog preparata sa pomenutim proteinom i vodom da bi se proizvele pomenute vodene kompozicije. Prvenstveno se bira kompozicija koja sadrži između 5 mcgram/ml i 50 mg/ml aluminijuma, a prvenstveno između 0,1 mg/ml i 2,5 mg/ml, i koja ne sadrži više od 700 ppm teškog metala i prvenstveno ne više od 450 ppm teškog metala kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, pri čemu pomenuta kompozicija ne sadrži više od 420 ppm Fe, a prvenstveno ne više od 100 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma; ne više od 18 ppm, a prvenstveno ne više od 3 ppm Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma; i/ili ne više od 2.5 ppm Cu, a prvenstveno ne više od 0.5 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma. Još poželjnije, pomenuta kompozicija ne sadrži više od 700 ppm teškog metala i prvenstveno ne više od 450 ppm teškog metala kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma, pri čemu pomenuta kompozicija ne sadrži više od 420 ppm Fe, a prvenstveno ne više od 100 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma; ne više od 18 ppm, a prvenstveno ne više od 3 ppm Ni kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma; i ne više od 2.5 ppm Cu, a prvenstveno ne više od 0.5 ppm, kada se uporedi sa sadržajem aluminijuma.

[0049] U sledećem aspektu pronalazak opisuje postupak za analiziranje stabilnosti pri čuvanju kompozicije koja sadrži aluminijum i terapeutsko ili profilaktičko jedinjenje, pri čemu pomenuti postupak sadrži sjedinjavanje u kompoziciju unapred određene količine terapeutika ili vakcine i unapred određene količine aluminijumove soli, pri čemu pomenuti postupak dalje sadrži čuvanje pomenute kompozicije tokom najmanje 2 nedelje, a prvenstveno najmanje 4 nedelje i prvenstveno najmanje jedan mesec, na temperaturi ne većoj od 20°C, a prvenstveno na temperaturi od oko 22 °C i određivanje stabilnosti i/ili količine proteina, a prvenstveno terapeutskog ili profilaktičkog jedinjenja, u pomenutoj kompoziciji. Kao što je demonstrirano u Primerima 1 i 2, temperatura od 22 °C, koja je viša temperatura u poređenju sa normalnim uslovima čuvanja ili od oko 2-8°C, rezultuje ubrzanom degradacijom proteina u vodenoj kompoziciji koja sadrži protein, aluminijumovu so i više od 350ppb pomenutog teškog metala bazirano na težini pomenute kompozicije. Shodno tome, temperatura od oko 22 °C i trajanje čuvanja od najmanje 2 nedelje, a prvenstveno najmanje 4 nedelje, su podesni za određivanje stabilnosti pri čuvanju vodenih kompozicija koje sadrže protein prema pronalasku. Stabilnost pri čuvanju se može odrediti bilo kojim metodom koji je poznat u odgovarajućoj oblasti. Stabilnost pri čuvanju vodene kompozicije koja sadrži protein prema pronalasku se prvenstveno analizira određivanjem stabilnosti pri čuvanju pomenutog proteina, a prvenstveno određivanjem epitopa na pomenutom proteinu koji je osetljiv pri čuvanju. Na primer, kao što je opisano u Primerima 1 i 2, stabilnost proteina, a prvenstveno antigena, se određuje određivanjem odnosa intaktnog epitopa koji je osetljiv pri čuvanju, kao što je sadržaj intaktnog antigenskog epitopa (npr. epitopa neutralizujućeg epitopa) i ukupnog sadržaja proteina.

"Intaktni epitop koji je osetljiv pri čuvanju" ili "intaktni antigenski epitop" kada se ovde koriste znače da nije došlo do degradacije u okviru pomenutog epitopa. Sadržaj intaktnog antigenskog epitopa se meri, na primer, određivanjem proteina vezanog za monoklonsko antitelo specifično usmereno protiv pomenutog epitopa, na primer, ELISOM. Ukupni sadržaj proteina se meri, na primer, određivanjem proteina vezanog za poliklonsko antitelo koje je usmereno protiv različitih epitopa u okviru proteina, na primer, ELISOM. Relativni sadržaj specifičnog epitopa se onda može izraziti kao odnos ukupnog sadržaja antigena određenog vezivanjem za monoklonsko antitelo podeljenog sa ukupnim sadržajem antigena određenog vezivanjem za poliklonsko antitelo. Visok odnos ukazuje na visoki sadržaj antigenskog epitopa, a mali odnos ukazuje na mali sadržaj antigenskog epitopa. Mali odnos koji je izmeren za vodenu kompoziciju posle čuvanja na najmanje 20°C, a prvenstveno na 22°C, najmanje 2 nedelje, a prvenstveno 4 nedelje, u poređenju sa odnosom izmerenim za pomenutu vodenu kompoziciju pre čuvanja, ukazuje da je došlo do strukturnih promena u okviru antigenskog epitopa. Strukturne promene u okviru pomenutog antigenskog epitopa ukazuju na smanjenu stabilnost pri čuvanju vodene kompozicije.

[0050] Sadržaj teškog metala vodene kompozicije pripremljene prema pronalasku je manji od 350 ppb bazirano na težini vodene kompozicije. Generalno što manje teškog metala sadrži takva vodena kompozicija, to će doći do manje degradacije proteina. Zato je sadržaj teškog metala prvenstveno manji od 325 ppb bazirano na težini vodene kompozicije, još poželjnije manji od 300 ppb, još poželjnije manji od 275, još poželjnije manji od 250 ppb i još poželjnije manji od 235 ppb bazirano na težini vodene kompozicije.

Kada se ovde koristi, izraz "teški metal" se odnosi na ukupnu količinu elemenata koja ispoljava metalna svojstva i obuhvata prelazne metale, metaloide, lantanide, i aktinide. Prelazni metali su elementi čiji atom ima nepotpunu d podljusku, ili koji mogu dovesti do pojave katjona sa nepotpunom d podljuskom, i obuhvataju cink, molibden, kadmijum, skandijum, titanijum, tehnecijum, paladijum, vanadijum, hrom, mangan, gvožđe, kobalt, rodijum, hafnijum, bakar, nikl, itrijum, niobijum, cirkonijum, rutenijum, srebro, tantal, renijum, volfram, osmijum, majtnerijum, platinu, iridijum, živu, borijum, siborgijum, hasijum.

Metaloidi su bor (B), silicijum (Si), germanijum (Ge), arsen (As), antimon (Sb), telur (Te), polonijum (Po). Lantanidi su petnaest metalnih hemijskih elemenata sa atomskim brojevima od 57 do 71, tj. lantan, cerijum, prazeodijum, neodimijum, prometijum, samarijum, europijum, gadolinijum, terbijum, disprozijum, holmijum, erbijum, tulijum, iterbijum i lutecijum. Aktinidi su petnaest metalnih hemijskih elemenata sa atomskim brojevima od 89 do 103, aktinijum, torijum, protaktinijum, uranijum, neptunijum, plutonijum, americijum, kirijum, berkelijum, kalifornijum, ajnštajnijum, fermijum, mendeljevijum, nobelijum i lorencijum. Teški metal je prvenstveno metal iz D-bloka periodnog sistema. Teški metal je prvenstveno metal iz grupe 3-12 periodnog sistema uključujući lantanide i aktinide. U posebno poželjnom primeru izvođenja teški metal je metal iz D-bloka, ili grupe 3-12 periodnog sistema i ne obuhvata lantanide i aktinide. Prvenstveno je pomenuti teški metal element koji je izabran između prelaznih metala. U sledećem poželjnom primeru izvođenja teški metal je izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr, Pb, Rb i Mo. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, pomenuti teški metal je metal koji ima molsku masu između 21 i 83, a prvenstveno je pomenuti teški metal metal iz D-bloka periodnog sistema sa molekulskom masom između 21 i 83, još poželjnije jedan od Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr i Mo. Prvenstveno je pomenuti teški metal metal iz D-bloka periodnog sistema sa molekulskom masom između 21-30 i 39-48, još poželjnije jedan od Cu, Ni, Co, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr i Mo. U jednom još poželjnijem aspektu, teški metal je izabran između teških metala Cu, Ni, i Fe.

[0051] Kao što je pokazano u Primerima, bilo je identifikovano da partija aluminijum hidroksida (aluma) 4230 značajno doprinosi degradaciji antigena u JEV vakcini FVL09L37. U Primeru 3 je pokazano da ova partija aluma sadrži bar sledeće metale: Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V. Kada je upoređena sa drugim ispitivanim partijama, u partiji aluma 4230 su bili uočeni viši nivoi Fe, Ni i Cu jona. Partija 4230 je bila jedina gde su bili detektovani rezidualni Cu joni. Zbog toga je prvenstveno pomenuti teški metal izabran iz grupe koja se sastoji od Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, još poželjnije između Fe, Ni i Cu.

Količina teškog metala u vodenoj kompoziciji je prvenstveno manja od 350 ppb bazirano na težini vodene kompozicije. Prvenstveno je količina teškog metala u vodenoj kompoziciji manja od 250 ppb, a prvenstveno je manja od 225, još poželjnije manja od 200, još poželjnije je manja od 150, još poželjnije je manja od 100, još poželjnije je manja od 50, još poželjnije je manja od 25 ppb bazirano na težini vodene kompozicije. Količina teškog metala u vodenoj kompoziciji prema pronalasku je definisana ovde gore. Ova količina je tipična za određene teške metale, ili za teške metale Fe, Cr i Ni, ili njihovu kombinaciju koja predstavlja većinu teških metala po težini u vodenoj kompoziciji prema pronalasku. Za specifične teške metale mogu biti poželjne različite maksimalne količine. Na primer, poželjno je da količina Fe u vodenoj kompoziciji prema pronalasku bude manja od 350 ppb bazirano na težini vodene kompozicije. U poželjnom primeru izvođenja količina Fe je manja od 250 ppb, a prvenstveno je manja od 210 ppb Fe bazirano na težini vodene kompozicije.

[0052] Postoje jaki dokazi da su mnogi pro-inflamatorni efekti aluminijumskih adjuvanasa posredovani formiranjem reaktivnih kiseoničnih vrsta (ROS). Pod fiziološkim uslovima aluminijum može promovisati redukciju Fe(III) u Fe(II) i oksidaciju zadnje pomenutog. Shodno tome, kombinacija Fe i Al u adjuvansu će potencirati formiranje i aktivnosti ROS (Exley, C (2010). Trends in Immunol. vol.31: str.103-109). U predmetnom pronalasku je otkriveno da Fe može biti prisutno u vodenoj kompoziciji prema pronalasku, a da to nema značajan uticaj na stabilnost kompozicije pri čuvanju. U ovom primeru izvođenja pronalaska je poželjno da vodena kompozicija prema pronalasku sadrži između 5 ppb i 250 ppb Fe bazirano na težini vodene kompozicije. U ovim količinama formiranje ROS tokom čuvanja zbog takve količine Fe (ako ima bilo kakvog ROS) ne utiče značajno na stabilnost vodene kompozicije pri čuvanju kao što je definisano ovde na drugom mestu. Međutim, te količine su dovoljne da omoguće proinflamatorne efekte posle administracije vakcine in vivo.

[0053] U predmetnom pronalasku je otkriveno da naročito prisustvo teškog metala Cu ozbiljno utiče na stabilnost pri čuvanju kompozicije prema pronalasku. Količina Cu u kompoziciji koja sadrži protein ili postupku za proizvodnju kompozicije proteina prema pronalasku je manja od 1,25 ppb bazirano na težini vodene kompozicije. U posebno poželjnom primeru izvođenja pomenuta vodena kompozicija sadrži Cu na nivou koji je ispod granice detekcije postupka za detekciju bakra kao što je opisano u Primerima.

[0054] U predmetnom pronalasku je otkriveno da naročito teški metal Ni utiče na stabilnost pri čuvanju kompozicije prema pronalasku. Količina Ni u kompoziciji ili postupku prema pronalasku je prvenstveno manja od 200 ppb. Prvenstveno je manja od 40 ppb, a prvenstveno je manja od 9 ppb i prvenstveno je manja od 2 ppb bazirano na težini vodene kompozicije. U posebno poželjnom primeru izvođenja vodena kompozicija prema pronalasku zbog toga sadrži manje od 40 ppb Ni bazirano na težini vodene kompozicije. Prvenstveno manje od 30 ppb, još poželjnije manje od 20 pbb i još poželjnije manje od 15 pbb Ni bazirano na težini vodene kompozicije. U posebno poželjnom primeru izvođenja pomenuta vodena kompozicija sadrži Ni na nivou koji je ispod granice detekcije postupka za detekciju nikla kao što je opisano u Primerima.

[0055] Teški metal može biti prisutan u elektronski neutralnom obliku ili može biti jonizovan. Obično i prvenstveno teški metal je prisutan u jonskom obliku u vodenoj kompoziciji prema pronalasku.

[0056] Sadržaj metala u kompoziciji se može odrediti na različite načine. Prema jednom aspektu, postupak prema pronalasku sadrži određivanje nivoa teškog metala u vodenoj kompoziciji i/ili aluminijumovoj soli koja je prisutna u pomenutoj vodenoj kompoziciji. U odgovarajućoj oblasti su poznati metodi za merenje nivoa jednog ili više teških metala u vodenom rastvoru. Primeri takvih metoda obuhvataju masenu spektrometriju, kao što je masena spektrometrija sa indukciono spregnutom plazmom (ICP-MS), atomska apsorpciona spektrometrija sa plamenom tehnikom (F-AAS), i/ili atomska apsorpciona spektrometrija sa elektrotermalnom tehnikom (GF-AAS).

[0057] Primer testa koji se može primeniti za određivanje sadržaja teških metala je opisan u Primeru 3. Test obuhvata tretiranje uzorka vodenog rastvora koji sadrži aluminijumovu so sa koncentrovanim HNO3pod dejstvom toplote sve dok se ne dobije bistri rastvor. Bistri rastvor se onda može dalje razređivati i analizirati, na primer, pomoću ICP-MS, F-AAS i/ili GF-AAS, u pogledu prisustva i sadržaja metalnih jona, uključujući Pb, Cd, Cr, Co, Fe, Cu, Ni, Ag, W i Al.

[0058] Primeri 1 i 2 pokazuju da JEV antigen ispoljava veću stabilnost za pH 7.5-8 u poređenju sa pH 7. U Primerima je stabilnost antigena izražena kao odnos monoklonske/poliklonske ELISE. Pokazano je da upotrebljeno monoklonsko antitelo (klon 52-2-5) prepoznaje neutralizujući epitop u vakcini protiv japanskog encefalitisa (JEV). Relativni sadržaj specifičnog epitopa može biti izražen kao odnos ukupnog sadržaja antigena određenog "monoklonskom ELISOM" podeljenim sa ukupnim sadržajem određenim "poliklonskom ELISOM". Bez vezivanja za teoriju, efekat veće stabilnosti antigena na pH 7.5-8 može biti objašnjen na osnovu fundamentalne pretpostavljene kompleksne reakcione hemije sulfita. pH bi mogao uticati na ravnotežne uslove reakcije za reakciju sulfita / formaldehida i površinsku promenu izvesnih bočnih lanaca proteina/aminokiselina dostupnih za modifikaciju. pH može uticati na oksidaciju direktnim uticajem na redoks potencijale aminokiselinskih ostataka i oksidanasa, npr. slobodnih radikala. Zbog toga, u jednom primeru izvođenja, postupak prema pronalasku sadrži puferovanje pomenute vodene kompozicije na pH između 7.5 i 8.5.

[0059] Različite aluminijumove soli se koriste u kompozicijama za administraciju pojedincu.

Aluminijumski adjuvans obično sadrži aluminijum oksid ili sulfat ili njihovu kombinaciju. U poželjnom primeru izvođenja aluminijumova so sadrži aluminijum oksid (Al2O3), aluminijum hidroksid (Al(OH)3) ili aluminijum fosfat (AlPO4). U poželjnom primeru izvođenja vodena kompozicija prema pronalasku dalje sadrži reaktivno jedinjenje. Obično, mada ne i nužno reaktivno jedinjenje je prisutno kao rezultat manipulacije vodenom kompozicijom, na primer, zbog tretiranja ili inaktivacije infektivnog agensa, ako ga ima u kompoziciji. Reaktivno jedinjenje takođe može biti prisutno iz drugog razloga. Na primer, sulfit je ponekad prisutan zbog inaktivacije eventualno prisutnog rezidualnog formaldehida u vodenom rastvoru. Formaldehid je obično hemikalija koja se često koristi za inaktivaciju infektivnog agensa.

[0060] Reaktivno jedinjenje je prvenstveno redoks aktivno jedinjenje, jedinjenje koje obrazuje radikal i/ili stabilizujuće jedinjenje. U poželjnom primeru izvođenja pomenuta vodena kompozicija prema pronalasku sadrži formaldehid, etanol, hloroform, trihloroetilen, aceton, triton-X-100, deoksiholat, dietilpirokarbonat, sulfit, Na2S2O5, betaproprio-lakton, polisorbat kao što je Tween 20®, Tween 80®, O2, fenol, kopolimere pluronskog tipa, ili njihovu kombinaciju.

[0061] Sulfit je prvenstveno prisutan u količini između 0,1 mM i 5 mM, ili prvenstveno između 0,5-2mM. Formalin je prvenstveno prisutan u količini između 0,1 mM i 5 mM, još poželjnije između 0,5 mM i 2mM. Kiseonik je prvenstveno prisutan u količini koja je ekvivalentna rastvorljivosti O2na izmerenoj temperaturi, O2je prvenstveno prisutan u količini između 10 i 250 uM kada se meri na 20 stepeni Celzijusa. Kada se meri na temperaturi od 0 stepeni Celzijusa O2je prvenstveno prisutan u količini između 10 i 400 uM. Stabilizujuće jedinjenje je prvenstveno prisutno u količini između 10 i 400 uM. Slično tome, redoks aktivno jedinjenje je prisutno u količini između 0,1 mM i 5 mM, ili prvenstveno između 0,5-2mM. Jedinjenje koje obrazuje radikal je prvenstveno prisutno u količini između 0,1 mM i 5 mM, ili prvenstveno između 0,5-2mM. U ovom kontekstu i radi jasnoće je važno naglasiti da se redoks aktivno jedinjenje, jedinjenje koje obrazuje radikal i/ili stabilizujuće jedinjenje troše pri stvaranju radikala, dok je teški metal koji je naveden ovde gore, katalizator pri stvaranju radikala i on se kao takav ne troši. Redoks aktivno jedinjenje, jedinjenje koje obrazuje radikal i/ili stabilizujuće jedinjenje zbog toga nisu teški metal.

Ukupna količina redoks aktivnog jedinjenja, jedinjenja koje obrazuje radikal i/ili stabilizujućeg jedinjenja, mada je mala u apsolutnim količinama, još uvek može biti značajna u odnosu na antigen ili protein u vodenoj kompoziciji prema pronalasku. Antigen/protein je prvenstveno prisutan u količini između 0,1 nmol i 1 umol, još poželjnije između 1 nmol i 100 nmol.

[0062] Koncentracija proteina, a prvenstveno proteina za lek ili vakcinu, u vodenoj kompoziciji koja sadrži protein prema pronalasku je prvenstveno između 1 ng/ml i 10 mg/ml, a prvenstveno između 10 ng/ml i 1 mg/ml, još poželjnije između 100 ng/ml i 100 mcg/ml, kao što je između 1 mcg/ml i 100 mcg/ml. Koncentracija je prvenstveno najmanje 1 ng/ml da bi se obezbedilo da protein za lek ili vakcinu bude u koncentraciji koja je dovoljan za ostvarivanje terapeutskog efekta kada se daje pojedincu. Međutim, koncentracija prvenstveno ne bi trebalo da bude veća od 10 mg/ml da bi se sprečila ili smanjila pojava mogućih neželjenih dejstava povezanih sa administracijom pomenutog proteina pojedincu. Naročito je koncentracija virusnog proteina u vodenoj kompoziciji prema pronalasku koja sadrži JEV prvenstveno između 0.01 μg/ml i 1 mg/ml, još poželjnije između 0.1 mcg/ml i 100 mcg/ml. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja pronalaska, vodena kompozicija prema pronalasku sadrži oko 10 mcg/ml JEV. Doza za pojedinačnu administraciju vodene kompozicije koja sadrži protein, a prvenstveno proteina za lek ili vakcinu prema pronalasku je prvenstveno između 0.1 ml i 10 ml, a prvenstveno između 0.5 ml i 5 ml, kao što je 0.5 ml, 1 ml, 1.5 ml, 2 ml, 2.5 ml, jer takva doza omogućava podesnu administraciju pojedincu, kao što je čovek.

[0063] Vodena kompozicija prema pronalasku može dalje sadržati molekul nukleinske kiseline.

Nukleinska kiselina se može davati za terapeutske svrhe. U tom slučaju, vodena kompozicija prema pronalasku prvenstveno sadrži molekul nukleinske kiseline, kao što je plazmid, koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antigen ili antigene ili virus ili bakteriju ili njihov imunogeni deo protiv koga treba da se izazove imuna reakcija. Inkorporacija takvog molekula nukleinske kiseline se oslanja na proizvodnju in situ ciljnog antigena, virusa, bakterije ili njihovog imunogenog dela. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, vodena kompozicija prema pronalasku sadrži nukleinsku kiselinu u obliku antisensne RNK, RNKi ili njihovog mimika. U jednom drugom primeru izvođenja, vodena kompozicija prema pronalasku sadrži nukleinsku kiselinu u obliku infektivnog agensa kao takvog, virusa ili modifikovanog virusa, kao u slučaju mnogih pristupa u genskoj terapiji. Koncentracija nukleinske kiseline u vodenoj kompoziciji, imunogenoj kompoziciji ili vakcini prema pronalasku je prvenstveno u opsegu od oko 1 ng/ml do oko 10 mg/ml, a prvenstveno od oko 0.1 mcg/ml do oko 1 mg/ml, još poželjnije od oko 1 mcg/ml do oko 100 mcg/ml. Podesno doziranje će zavisiti od subjekta kome se kompozicija daje i veličine sekvenci nukleinske kiseline prisutnih u kompoziciji.

[0064] Vodena kompozicija prema pronalasku može dalje sadržati polisaharid i/ili oligosaharid, a prvenstveno polisaharidnu i/ili oligosaharidnu kapsulu kapsuliranih bakterija protiv kojih treba da se izazove imuna reakcija. Primeri polisaharida i oligosaharida koji mogu biti prisutni u vodenoj kompoziciji prema pronalasku, obuhvataju, ali nisu ograničeni na pneumokokne polisaharide, meningokokne polisaharide, polisaharid Haemophilus influenzae tip b, polisaharide streptokokne grupe B, polisaharid Salmonella typhi Vi, polisaharide ili oligosaharide dobijene od streptokokne grupe A, Staphylococci, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Enterococci, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, i Bacillus anthracis. Takav polisaharid i/ili oligosaharid može biti prisutan u vodenoj kompoziciji prema pronalasku kao takav, ili alternativno tome, polisaharid i/ili oligosaharid može biti konjugovan na proteinu. Koncentracija polisaharida i/ili oligosaharida u vodenoj kompoziciji, imunogenoj kompoziciji ili vakcini prema pronalasku je prvenstveno u opsegu od oko 10 ng/ml do oko 500 mcg/ml, još poželjnije oko 0.1 mcg/ml do oko 500 mcg/ml, još poželjnije oko 1 mcg/ml do oko 50 mcg/ml. Podesno doziranje će zavisiti od subjekta kome se kompozicija daje.

[0065] Postupak prema pronalasku se prvenstveno primenjuje za povećanje stabilnosti imunogene kompozicije, a prvenstveno vakcine, koja sadrži adjuvans na bazi aluminijumove soli. Primeri takvih vakcina su one koje su usmerene protiv infekcije sa Bacillus anthracis (izaziva antraks), Corynebacterium diphtheriae (izaziva difteriju), Clostridium tetani (izaziva tetanus), Pseudomonasom, kao što je Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcusom, kao što su Staphylococcus aureus ili Staphylococcus epidermidis, Haemophilus influenzae tip B bakterijom (Hib), polio virusom, virusom hepatitisa A, virusom hepatitisa B, humanim papilomavirusom, virusom influence, odn. gripa, virusom japanskog encefalitisa, rotavirusom, Rickettsiae bakterijom (izaziva tifus), virusom žute groznice, varičela zoster virusom, Meningococcusom, ili njihovim kombinacijama, kao što je, ali bez ograničavanja na DTP (difterija, tetanus, polio). Zbog toga vodena kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku prvenstveno sadrži protein koji je virusni protein, a prvenstveno protein iz Haemophilus influenzae, polio virusa, virusa hepatitisa A, virusa hepatitisa B, humanog papilomavirusa, virusa gripa, virusa japanskog encefalitisa, rotavirusa, virusa žute groznice i/ili varičela zoster virusa. U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti protein koji je sadržan u kompoziciji koja sadrži protein prema pronalasku je virusni protein iz virusa iz Flaviviridae porodice, a prvenstveno iz virusa japanskog encefalitisa (JEV). Kao što je demonstrirano u Primerima, stabilnost vodene kompozicije koja sadrži JEV protein, aluminijumovu so i koja sadrži manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije, a naročito pri čemu je količina Cu manja od 3 ppb bazirano na težini vodene kompozicije, je povećana u poređenju sa vodenom kompozicijom koja sadrži više od 350 ppb teškog metala i više od 3 ppb Cu. Shodno tome, postupak prema pronalasku je posebno podesan za povećanje stabilnosti vodene kompozicije koja sadrži JEV protein. U tabelama 25 i 26 je data neograničavajuća lista primera vakcina na bazi aluminijuma, i za humanu upotrebu i za veterinarsku upotrebu. Takođe je opisani postupak posebno podesan za povećanje stabilnosti vakcina navedenih u tabeli 25 i/ili tabeli 26. Zbog toga se , vakcine koje su navedene u tabeli 25 i/ili tabeli 26 prvenstveno pripremaju uz korišćenje ovde opisanog postupka.

[0066] Takođe je opisan bakterijski protein iz bakterije Pseudomonas porodice, a prvenstveno iz Pseudomonas aeruginosa. Kao što je pokazano u Primerima, stabilnost vodene kompozicije koja sadrži Pseudomonas aeruginosa fuzioni protein (SEQ ID NO: 1) aluminijumova so je smanjena kada je prisutno više od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije.

[0067] Vodena kompozicija koja sadrži protein prema pronalasku je posebno podesna za primenu kao imunogena kompozicija ili vakcina. Na primer, takve kompozicije su posebno korisne za imunizaciju pojedinca radi lečenja ili sprečavanja virusne infekcije. Takođe je opisan postupak za lečenje pojedinca koji sadrži pripremanje imunogene vodene kompozicije koja sadrži protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta aluminijumova so ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije, a prvenstveno manje od 3 ppb Cu, i davanje imunogene vodene kompozicije pojedincu kome je to potrebno. Takođe je opisan postupak za profilaktičko tretiranje pojedinca koji sadrži pripremanje imunogene vodene kompozicije koja sadrži protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta aluminijumova so ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije, a prvenstveno manje od 3 ppb Cu, i davanje imunogene vodene kompozicije pojedincu kome je to potrebno. Dalje je opisan postupak za indukovanje i/ili pojačanje imune reakcije protiv antigena kod pojedinca, pri čemu pomenuti postupak sadrži pripremanje vodene kompozicije koja sadrži protein koji sadrži pomenuti antigen i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta aluminijumova so ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije, a prvenstveno manje od 3 ppb Cu, i davanje vodene kompozicije pojedincu kome je to potrebno. U sledećem aspektu pronalaska je opisan postupak za imunizaciju pojedinca koji sadrži davanje pomenutom pojedincu najmanje dve imunogene kompozicije u intervalu od najmanje dve nedelje između svake administracije, i pri čemu svaka od pomenute najmanje dve imunogene kompozicije sadrži isti antigen, i pri čemu najmanje jedna od pomenutih imunogenih kompozicija dalje sadrži aluminijumovu so koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije, a prvenstveno manje od 3 ppb Cu, i davanje imunogene vodene kompozicije pojedincu kome je to potrebno. Kompozicije nukleinske kiseline se ponekad takođe daju zajedno sa aluminijumom. Moguće je da se "protein" u vodenoj kompoziciji prema pronalasku zameni sa nukleinskom kiselinom. Takođe je opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum i nukleinsku kiselinu, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- sjedinjavanje aluminijumove soli, pomenute nukleinske kiseline i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija i

- određivanje nivoa teškog metala u vodenoj kompoziciji i/ili aluminijumovoj soli.

[0068] Pronalaskom je takođe opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum i nukleinsku kiselinu, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- pripremu ili izbor aluminijumove soli koja ima 350 ppb teškog metala bazirano na težini finalne vodene kompozicije, a prvenstveno manje od 3 ppb Cu, i davanje imunogene vodene kompozicije pojedincu kome je to potrebno i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenute nukleinske kiseline i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija.

U poželjnom primeru izvođenja pomenuti postupci dalje sadrže puferovanje pomenute vodene kompozicije na pH između 7.5 i 8.5. U posebno poželjnom primeru izvođenja pomenuti postupci dalje sadrže pakovanje alikvota pomenute vodene kompozicije koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije u posebne kontejnere za čuvanje nepropusne za vazduh.

Nukleinska kiselina se može davati za terapeutske svrhe. Na primer, u obliku antisensne RNK, RNKi ili njihovog mimika. Nukleinska kiselina se takođe može davati u obliku infektivnog agensa, a obično virusa ili modifikovanog virusa, kao što je u slučaju mnogih pristupa u genskoj terapiji. U ovom slučaju nukleinska kiselina je zatvorena u delu koji sadrži protein. Shodno tome, pronalaskom je dalje opisana vodena kompozicija koja sadrži nukleinsku kiselinu i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije. Koncentracija nukleinske kiseline u vodenoj kompoziciji, imunogenoj kompoziciji ili vakcini je prvenstveno u opsegu od oko 1 ng/ml do oko 10 mg/ml, a prvenstveno od oko 0.1 mcg/ml do oko 1 mg/ml, još poželjnije od oko 1 mcg/ml do oko 100 mcg/ml. Odgovarajuće doziranje će zavisiti od subjekta kome se kompozicija daje i veličine sekvenci nukleinske kiseline koje su prisutne u kompoziciji.

[0069] Kompozicije koje sadrže polisaharid, oligosaharid ili konjugat polisaharid-polipeptid se ponekada takođe daju zajedno sa aluminijumom. Moguće je zameniti "protein" u vodenoj kompoziciji prema pronalasku sa polisaharidom, oligosaharidom ili konjugatom polisaharid-polipeptid ili njihovom kombinacijom. Takav polisaharid ili oligosaharid je prvenstveno polisaharid ili oligosaharid kapsule kapsuliranih bakterija protiv kojih treba da se izazove imuna reakcija. Primeri polisaharida i oligosaharida koji mogu biti prisutni u vodenoj kompoziciji prema pronalasku, obuhvataju, ali nisu ograničeni na pneumokokne polisaharide, meningokokne polisaharide, Haemophilus influenzae tip b polisaharid, polisaharide streptokokne grupe B, Salmonella typhi Vi polisaharid, polisaharide ili oligosaharide dobijene od streptokokne grupe A, Staphylococci, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Enterococci, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, i Bacillus anthracis. Takav polisaharid i/ili oligosaharid može biti prisutan u vodenoj kompoziciji prema pronalasku kao takav, ili alternativno tome, polisaharid i/ili oligosaharid može biti konjugovan na proteinu. Shodno tome, u jednom primeru izvođenja pronalaska je opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum i polisaharid ili oligosaharid, pri čemu taj postupak sadrži

- sjedinjavanje aluminijumove soli, pomenutog polisaharida ili oligosaharida i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija i

- određivanje nivoa teškog metala u vodenoj kompoziciji i/ili aluminijumovoj soli.

[0070] Pronalaskom je takođe opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum i polisaharid ili oligosaharid, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- pripremu ili izbor aluminijumove soli koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini finalne vodene kompozicije, a prvenstveno manje od 3 ppb Cu, i davanje imunogene vodene kompozicije pojedincu kome je to potrebno i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog polisaharida ili oligosaharida i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija.

[0071] Koncentracija polisaharida i/ili oligosaharida u vodenoj kompoziciji, imunogenoj kompoziciji ili vakcini je prvenstveno u opsegu od oko 10 ng/ml do oko 500 μg/ml, još poželjnije od oko 0.1 mcg/ml do oko 500 mcg/ml, još poželjnije od oko 1 mcg/ml do oko 50 mcg/ml. Odgovarajuće doziranje će zavisiti od subjekta kome se kompozicija daje.

[0072] Konjugat polisaharid-polipeptid sadrži najmanje jedan polisaharid i najmanje jedan polipeptid. Polisaharid je prvenstveno bakterijski kapsularni polisaharid. Kapsularni polisaharidi se mogu pripremiti standardnim tehnikama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0073] U jednom primeru izvođenja, polisaharid je S. pneumoniae kapsularni polisaharid. U sledećem primeru izvođenja, S. pneumoniae kapsularni polisaharid je izabran iz grupe koja se sastoji od serotipova 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F, koji predstavljaju 23 pneumokokna serotipa koji izazivaju veliku većinu pneumokoknih bolesti u svim starosnim grupama, od kojih je do sada poznato više od 90 serotipova.

[0074] Kada se ovde koristi, izraz "polisaharid" se odnosi na polisaharide i/ili oligosaharide. Polisaharidi su izolovani iz bakterija i mogu biti depolimerizovani do poželjnog opsega veličina poznatim metodama (vidi, na primer, EP 497524 i EP 497525). Oligosaharidi imaju manji broj jedinica koje se ponavljaju (obično od 5-30 jedinica koje se ponavljaju) i obično su hidrolizovani polisaharidi.

[0075] Streptococcus pneumoniae kapsularni polisaharidi sadrže oligosaharid koji se ponavlja i koji može sadržati do 8 šećernih ostataka. Za pregled oligosaharidnih jedinica za ključne Streptococcus pneumoniae serotipove vidi Jones et al, An. Acad. Bras. Cienc, 2005, 77(2):293-324. U jednom primeru izvođenja, kapsularni saharid antigen može biti polisaharid cele dužine, međutim, kod drugih to može biti jedna oligosaharidna jedinica, ili manje dužine od prirodnog saharidnog lanca sa oligosaharidnim jedinicama koje se ponavljaju. Polisaharidi cele dužine mogu biti "doterani po veličini" ili "depolimerizovani", tj. njihova veličina može biti redukovana različitim metodama koje su poznate u odgovarajućoj oblasti (kao što je gore opisano). Izraz "depolimerizacija" obuhvata parcijalnu depolimerizaciju.

[0076] Depolimerizacija polisaharida onda može biti praćena korakom aktivacije pre konjugacije na nosećem polipeptidu. Pod "aktivacijom" se podrazumeva hemijski tretman polisaharida da bi se obezbedile hemijske grupe koje mogu da reaguju sa nosećim polipeptidom. Odgovarajuće metode su poznate u odgovarajućoj oblasti.

[0077] Pod "polipeptidom" ili "proteinom" se podrazumeva bilo koji lanac aminokiselina koji ima najmanje 10, a prvenstveno najmanje 100 aminokiselina peptidno povezanih jedne sa drugima, bez obzira na post-translacione modifikacije. Podesni polipeptidni nosači obuhvataju, ali nisu ograničeni na toksin difterije, toksoid difterije, CRM 197, toksoid tetanusa, toksoid pertusisa, E. coli LT, E. coli ST, egzotoksin A, kompleks c spoljašnje membrane (OMPC), porin, protein koji vezuje transferin, pneumolizu, pneumokokni površinski protein A (PspA), pneumokokni adhezin protein (PsaA), ovalbumin, hemocijanin iz prilepka Megathura crenulata (engl. Keyhole limpit hemocyanin, skr. KLH), goveđi serumski albumin (BSA) ili prečišćeni proteinski derivat tuberkulin (PPD), i slično. Noseći polipeptidi su prvenstveno polipeptidi koji nisu toksični i nisu reaktogeni i mogu se dobiti u dovoljnoj količini i sa dovoljnom čistoćom. U posebno poželjnom primeru izvođenja, noseći polipeptid sadrži toksoid tetanusa. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, noseći polipeptid sadrži derivat bilo kog od gore pomenutih nosećih polipeptida, na primer, podjedinicu ili mutiranu verziju E. coli LT, kao što je LT ili A podjedinica LT (LTA) koja ima aminokiselinsku supstituciju na poziciji aa 192 (npr. LTG 192, LTT 192, LTS 192, LTA 192), LTK 63 LTR 72, ili druge mutante, kao što je opisano npr. u WO 98/42375, WO 02/64162, US 4,761,372, US 5,308,835. Polipeptidi takođe mogu sadržati produžetke, bilo na svom karboksi- ili na amino- terminusu polipeptida, što olakšava interakciju sa polikatjonskim jedinjenjem, odnosno jedinjenjima ili imunostimulatornim jedinjenjem, odnosno jedinjenjima.

[0078] Pored toga, polipeptidi takođe mogu biti derivatizovani da bi sadržali molekule koji pojačavaju prezentaciju antigena i ciljanje antigena na ćelijama koje prezentuju antigen.

[0079] Polipeptid može biti aktiviran pre konjugacije.

[0080] Prirodu i veličinu saharida, prirodu i veličinu proteina ili polipeptida, odnos saharida i proteina/polipeptida, kao i druge faktore i uslove za pripremu konjugata može odrediti stručnjak iz odgovarajuće oblasti, npr. kao što je opisano u Robbins et al, JAMA, 1996, 276(14): 1181-5. Na primer, za pneumokokus polisaharid i tetanus toksoid poželjni odnos je približno 2:1.

[0081] Pod "konjugatom" se podrazumeva jedinjenje u kome je polisaharid kovalentno vezan za noseći polipeptid. Postoji mnogo reakcija konjugacije koje su poznate u stanju tehnike, a koje se upotrebljavaju za kovalentno vezivanje polisaharida za polipeptide da bi se proizveo konjugat polisaharid-polipeptid.

Tri najčešće primenjivana metoda obuhvataju: 1) reduktivnu aminaciju, pri čemu aldehidna ili ketonska grupa na jednoj od komponenata reakcije reaguje sa amino ili hidrazidnom grupom na drugoj komponenti, a zatim se C-N dvostruka veza koja se formira redukuje u C-N jednostruku vezu pomoću redukujućeg agensa; 2) cijanilacionu konjugaciju, pri čemu se polisaharid aktivira bilo pomoću cijanogenog bromida (CNBr) ili pomoću 1-cijano-4-dimetilamonijumpiridinijum tetrafluoroborata (CDAP) da bi se uvela cijanatna grupa u hidroksilnu grupu, koja formira kovalentnu vezu sa amino ili hidrazidnom grupom posle adicije proteinske komponente; i 3) karbodiimidnu reakciju, pri čemu karbodiimid aktivira karboksilnu grupu na jednoj od komponenata reakcije konjugacije, a aktivirana karbonil grupa reaguje sa amino ili hidrazidnom grupom na drugoj komponenti. Ove reakcije se takođe često koriste za aktiviranje komponenata konjugata pre reakcije konjugacije. Polisaharid može biti konjugovan na polipeptidu direktno ili preko linkera. Vezivanje preko linker grupe se može izvršiti korišćenjem bilo koje poznate procedure, na primer, procedura opisanih u US 4,882,317 i US 4,695,624. Podesni linkeri obuhvataju karbonil, adipinsku kiselinu, B-propionamido (WO 00/10599), nitrofenil-etilamin (Gever et al., Med. Microbiol. Immunol, 1979, 165:171-288), haloacil halide (US 4,057,685), glikozidne veze (US 4,673,574; US 4,761,283; US 4,808,700), 6-aminokaprojevu kiselinu (US 4,459,286), ADH (US 4,965,338), C4 do C12 grupe (US 4,663,160), itd.

[0082] Posle konjugacije polisaharida na nosećem polipeptidu, konjugat polisaharid- polipeptid može biti prečišćen (obogaćen u pogledu količine konjugata polisaharid-polipeptid) mnoštvom tehnika koje su poznate iz odgovarajuće oblasti. Jedan cilj koraka prečišćavanja je da se iz konjugata polisaharidpolipeptid odstrani nevezani polisaharid i/ili polipeptid. Metode prečišćavanja obuhvataju npr. ultrafiltraciju u prisustvu amonijum sulfata, gel hromatografiju, centrifugiranje sa gradijentom gustine, i hromatografiju hidrofobnih interakcija.

[0083] Aluminijumski adjuvans, kao što su aluminijum hidroksid i aluminijum fosfat kao adjuvansi, generalno se pripremaju izlaganjem vodenih rastvora aluminijumovih jona, obično blago alkalnim uslovima u dobro definisanom i kontrolisanom hemijskom okruženju. Za proizvodnju aluminijum hidroksida se mogu upotrebiti različite rastvorljive aluminijumove soli. Anjoni koji su prisutni u vreme taloženja se mogu kotaložiti sa aluminijum hidroksidom ili sulfatom. Posle taloženja amonijumove soli promenom pH uz korišćenje, na primer, NaOH, nije moguće odstraniti teški metal koji je eventualno prisutan u aluminijumskom adjuvansu. Čak ni opsežno ispiranje ne rezultuje dovoljnim smanjenjem sadržaja teškog metala. Shodno time, važno je da se teški metal kontroliše pre taloženja aluminijumovih soli, tj. selekcijom odgovarajućih sirovina, kontrolom procesnih uslova, npr. pošto su izvori aluminijuma u rastvoru, ne bi trebalo da se dodaje metal, na primer, druge soli kao što je CuSO3. Alternativno ili dodatno tome, bilo koji od teških metala prisutnih u rastvoru se odstranjuje pre taloženja aluminijumskog adjuvansa. Ovo se može ostvariti, na primer, kristalizacijom ili izmenom jona (katjona), koji predstavljaju metode koji su dobro poznati iz odgovarajuće oblasti. Izmena jona se odnosi na proces pomoću koga se joni (metala) u rastvoru prenose na čvrstu matricu koja dalje oslobađa jone drugačijeg tipa, ali iste polarnosti u rastvor. Shodno tome, joni u rastvoru se zamenjuju drugačijim jonima od onih koji su originalno prisutni u čvrstoj matrici. Kristalizacija metala se odnosi na taloženje nerastvornih kristala metala od jona metala u rastvoru. Zato je opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži - pripremu aluminijumove soli zahvaljujući kojoj se može dobiti vodena kompozicija koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog reaktivnog jedinjenja, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija,

pri čemu se pomenuta aluminijumova so priprema pripremanjem vodenog rastvora jona aluminijuma, odstranjivanjem teških metala iz pomenutog vodenog rastvora, kao što je kristalizacijom ili izmenom jona, a prvenstveno izmenom katjona, i taloženjem pomenutih jona aluminijuma iz pomenutog rastvora, a prvenstveno korišćenjem baze.

[0084] Dalje je opisan postupak za pripremanje taloga aluminijumove soli kliničkog kvaliteta za inkorporaciju u lek i/ili vakcinu, pri čemu pomenuti postupak sadrži pripremu vodenog rastvora jona aluminijuma, odstranjivanje teških metala iz pomenutog vodenog rastvora, kao što je kristalizacijom ili izmenom jona, a prvenstveno izmenom katjona, i taloženje pomenutih jona aluminijuma iz pomenutog rastvora, i određivanje nivoa teškog metala u rastvoru i/ili talogu aluminijumovih soli, pri čemu se bira talog pomoću koga se može dobiti vodena kompozicija koja sadrži manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije.

[0085] Priprema aluminijum hidroksida od sirovina, između ostalog, je opisana u CN101734698 i WO98/14401.

[0086] Dalje je opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije leka ili vakcine koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- izbor aluminijumove soli zahvaljujući kojoj se može dobiti vodena kompozicija koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog reaktivnog jedinjenja, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija (i) koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije i (ii) koja sadrži između 5 μg/ml i 50 mg/ml aluminijuma;

pri čemu je reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od redoks aktivnog jedinjenja, jedinjenja koje obrazuje radikal, stabilizujućeg jedinjenja i bilo koje njihove kombinacije.

[0087] Postupak dalje prvenstveno sadrži puferovanje pomenute vodene kompozicije na pH između 6.5 i 8.5.

[0088] Postupak dalje prvenstveno sadrži pakovanje alikvota pomenute vodene kompozicije koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije u posebne kontejnere za čuvanje nepropusne za vazduh.

[0089] Pronalaskom je dalje opisan postupak za izbor taloga aluminijumove soli kliničkog kvaliteta za inkorporaciju u lek i/ili vakcinu, pri čemu pomenuti postupak sadrži pripremu vodenog rastvora jona aluminijuma i taloženje pomenutih jona aluminijuma iz pomenutog rastvora, i određivanje nivoa teškog metala u rastvoru i/ili talogu aluminijumove soli, pri čemu se bira talog pomoću koga se može dobiti vodena kompozicija koja sadrži (i) manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije i (ii) između 5 μg/ml i 50 mg/ml aluminijuma.

[0090] Takođe je opisana vodena kompozicija leka ili vakcine koja sadrži protein, reaktivno jedinjenje i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži (i) manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije i (ii) između 5 μg/ml i 50 mg/ml aluminijuma, pri čemu je reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od redoks aktivnog jedinjenja, jedinjenja koje obrazuje radikal, stabilizujućeg jedinjenja i bilo koje njihove kombinacije. U poželjnom primeru izvođenja je pomenuti teški metal izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr, Pb, Rb i Mo. Teški metal je prvenstveno izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V. U posebno poželjnom primeru izvođenja teški metal je izabran između Cu ili Ni. Teški metal je prvenstveno prisutan u jonskom obliku. Aluminijumova so je prvenstveno aluminijum hidroksid (Al(OH)3) ili aluminijum fosfat (AlPO4).

Aluminijumova so je prvenstveno aluminijum hidroksid (Al(OH)3). Reaktivno jedinjenje je prvenstveno izabrano iz grupe koja se sastoji od formaldehida, etanola, hloroforma, trihloroetilena, acetona, 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilen glikola, deoksiholata, dietilpirokarbonata, sulfita, Na2S2O5, betaproprio-laktona, polisorbata, kao što su polietilen glikol sorbitan monolaurat, polietilen glikol sorbitan monooleat, O2, fenola, kopolimera pluronskog tipa, i bilo koje njihove kombinacije. Vodena kompozicija leka ili vakcine prvenstveno sadrži između 50 μg/ml i 5 mg/ml aluminijuma. Vodena kompozicija leka ili vakcine prvenstveno sadrži između 5 ppb i 250 ppb Fe bazirano na težini vodene kompozicije. Vodena kompozicija leka ili vakcine prvenstveno sadrži manje od 3 ppb Cu bazirano na težini vodene kompozicije. Vodena kompozicija leka ili vakcine prvenstveno sadrži manje od 40 ppb Ni bazirano na težini vodene kompozicije. Protein u pomenutoj vodenoj kompoziciji leka ili vakcine je prvenstveno terapeutik i/ili vakcina. Protein je prvenstveno virusni protein, Virusni protein je prvenstveno protein virusa japanskog encefalitisa. Protein je prvenstveno protein u delu virusa inaktiviranog formaldehidom. Vodena kompozicija leka ili vakcine dalje prvenstveno sadrži sulfit. Pronalaskom je dalje realizovana vakcina koja sadrži vodenu kompoziciju vakcine prema pronalasku.

[0091] Kada je ovde naveden neki opseg između vrednosti X i Y, onda taj opseg sadrži i vrednosti X i Y.

[0092] Pronalaskom je dalje opisan postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- pripremu ili izbor aluminijumove soli zahvaljujući kojoj se može dobiti vodena kompozicija koja ima manje od 450 ppm teškog metala bazirano na težini aluminijuma (gram/gram) i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog reaktivnog jedinjenja, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija.

Prvenstveno je sadržaj Fe u vodenoj kompoziciji manji od 700 ppm bazirano na težini aluminijuma u kompoziciji; sadržaj Ni je manji od 18 ppm bazirano na težini aluminijuma u kompoziciji; ili sadržaj Cu je manji od 2,5 ppm bazirano na težini aluminijuma u vodenoj kompoziciji, ili njihovoj kombinaciji. Prvenstveno postupak dalje sadrži puferovanje pomenute vodene kompozicije na pH između 6.5 i 8.5. Prvenstveno postupak dalje sadrži pakovanje alikvota pomenute vodene kompozicije koja ima manje od 450 ppm teškog metala bazirano na težini aluminijuma u kompoziciji u posebne kontejnere za čuvanje nepropusne za vazduh.

[0093] Pronalaskom je dalje opisan postupak za pripremanje taloga aluminijumove soli kliničkog kvaliteta za inkorporaciju u lek i/ili vakcinu, pri čemu pomenuti postupak sadrži pripremu vodenog rastvora jona aluminijuma i taloženje pomenutih jona aluminijuma iz pomenutog rastvora, i određivanje nivoa teškog metala u rastvoru i/ili talogu aluminijumove soli, pri čemu se bira talog pomoću koga se može dobiti vodena kompozicija koja sadrži manje od 450 ppm teškog metala bazirano na težini jona aluminijuma (gram/gram) u rastvoru.

[0094] Dalje je opisana vodena kompozicija koja sadrži protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži manje od 450 ppm teškog metala bazirano na težini aluminijuma u kompoziciji. Vodena kompozicija se prvenstveno čuva na temperaturama višim od 20°C tokom najmanje 1 meseca. Teški metal je prvenstveno izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr i Mo. Prvenstveno je teški metal izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V. U posebno poželjnom primeru izvođenja teški metal je izabran između Cu ili Ni. Prvenstveno je teški metal Cu.

[0095] Pronalazak je dalje objašnjen u sledećim primerima. Ovi primeri ne ograničavaju obim pronalaska, već služe samo za razjašnjenje pronalaska.

Reference

[0096]

Alipazaga MV, Moreno RGM, Coichev N.2004. Synergistic effect of Ni(II) and Co(II) ions on the sulphite induced autoxidation of Cu(II)/tetraglycine complex. Dalton Trans 13:2036-2040.

Arunee Wittayanukulluk, Dongping Jiang, Fred E. Regnier, Stanley L. Hem, "Effect of microenvironment pH of aluminum hydroxide adjuvant on the chemical stability of adsorbed antigen", Vaccine 22 (2004) 1172-1176

Berglund J, Fronaeus S, Elding LI.1993. Kinetics and mechanism for manganese-catalyzed oxidation of sulfur(IV) by oxygen in aqueous solution. Inorg Chem 32:4527-4538.

Brandt C, Elding LI.1998. Role of chromium and vanadium in the atmospheric oxidation of sulfur (IV). Atmos Environ 32(4):797-800.

Exley, C (2010). Trends in Immunol. Vol.31: str.103-109.

Ito, Kimiko and Kawanashi, Shosuke. Site-specific fragmentation and modification of Albumin by sulphite in presence of metal ions or peroxidase/H2O2: Role of Sulphate radical. Biochem and Biophys Res Comm., 1991, 176, 1306-1312

Huie R.E., Neta P. One-electron redox reaction in aqueous solutions of sulphite with hydroquinone and other hydroxyphenols. J. Phys. Chem., 1985, 89 (18), 3918-3921

Kalina Ranguelova, Marcelo G. Bonini, and Ronald P. Mason: (Bi)sulphite Oxidation by Copper, Zinc-Superoxide Dismutase: Sulphite- Derived, Radical-Initiated Protein Radical Formation.

Environmental Health Perspectives 2010, 118 (7), 970-975

Lambeth D.O., Palmer G. The kinetics and mechanism of reduction of electron transfer proteins and other compounds of biological interest by dithionite. J.Biochem. Chem.1973, 248, 6095-6103 Li S, Schöneich C, Borchardt RT. Chemical instability of protein pharmaceuticals: Mechanisms of oxidation and strategies for stabilization. Biotechnol Bioeng.1995 Dec 5;48(5):490-500 Lindblad, EB (2004) Immunol. and Cell Biol. Vol 82: 497-505.

Lima S, Bonifacio RL, Azzellini GC, Coichev N.2002. Ruthenium(II) tris(bipyridyl) ion as a luminescent probe for oxygen uptake on the catalyzed oxidation of HSO3-. Talanta 56:547-556.

Mayo JC, Tan DX, Sainz RM, Natarajan M, Lopez-Burillo S, Reiter RJ. Protection against oxidative protein damage induced by metal-catalyzed reaction or alkylperoxyl radicals: comparative effects of melatonin and other antioxidants. Biochim Biophys Acta.2003 Mar 17;1620(1-3):139-50.

Neta P., Huie R.E.: Free Radical Chemistry of Sulphite. Environmental Health Perspectives 1985, 64, 209-217

Shi X.1994. Generation of •SO3- and OH radicals in SO32- reactions with inorganic environmental pollutants and its implications to SO32- toxicity. J Inorg Biochem 56(3):155-165.

Stadtman ER. Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences. Free Radic Biol Med.1990;9(4):315-25.

Kratki opis slika nacrta

[0097]

Fig.1: RP-HPLC profili eluiranja sa ekstraktom čepova od hlorobutila (1:4 razređen) i JEV09L37 SN.

Fig.2: SEC HPLC profili eluiranja za PS (2mg/mL) pre i posle tripsinskog kidanja.

Fig.3: SEC HPLC profili eluiranja za tripsinom tretirani PS i degradirani PS koji je prisutan u NIV11A74. Treba napomenuti da su profili eluiranja bili normalizovani za slične visine pikova da bi se omogućilo bolje poređenje.

Fig.4: DOE evaluacija odnosa monoklonske/poliklonske ELISE analizom Paretovog dijagrama i glavni efekti dijagrama (4 nedelje na 22°C).

Fig.5: DOE evaluacija odnosa monoklonske/poliklonske ELISA analizom Paretovog dijagrama i glavni efekti dijagrama (8 nedelja na 22°C).

Fig.6: konturni dijagram procenjene reakcije.

Fig.7: rezidualni dijagram procenjene reakcije.

Fig.8: Odnos ELISA (monoklonske/poliklonske) za JEV formulacije za pH 7 u prisustvu Ni, Cu i Cr. Uzorci su bili čuvani 5 nedelja na 22°C.

Fig.9: rezime rezultata dobijenih posle 7 nedelja na 22°C. Prikazani su sirovi podaci za odnos kao funkcije pH i tipa metalnih jona i kombinovani rezultati za svaki parametar.

Fig.10: srednji odnos DP formulacija pripremljenih sa različitim partijama aluma. Uzorci su bili čuvani 6 nedelja na 22°C. Linije grešaka predstavljaju interval poverenja od 95% izračunato na bazi zajedničkog standardnog odstupanja. Uzorci sa leva na desno: Alum 3877, Alum 4074, Alum 4230 nonGI, Alum 4230 GI, Alum 4470, Alum 4563, Alum 4621, Alum Mix 4074_4230.

Fig.11: raspodela veličine čestica uzoraka Alhydrogela®.

Fig.12: Alhydrogel® titracione krive u PBS. ■ neozračeni AlOH (RQCS0890), ▲ GI AlOH (RQCS1200), ♦ GI AlOH (RQCS1342), GI AlOH (RQCSO448)

Fig.13: pregled testiranih šarži Alhydrogela®. Prikazani su ukupna koncentracija kontaminirajućih metalnih jona u ng/mL i udeo glavnih metalnih jona Fe, Cr i Ni.

Fig.14: aminokiselinska sekvenca Ala-(His)6-OprF190-342 -OprI21-83 (SEQ ID NO: 1) - koja se ovde takođe navodi kao "protein A".

Primeri

Primer 1

[0098] Prethodno je identifikovano da partija aluminijum hidroksida (aluma) 4230 značajno doprinosi degradaciji antigena u FVL09L37. Kod ove posebne partije aluma je bio uočen znatno veći sadržaj rezidualnih metalnih jona u poređenju sa drugim partijama aluma upotrebljenih za formulaciju inaktiviranog JEV antigena. Ovaj Primer demonstrira dodatne studije izvedene za dalje identifikovanje fundamentalnog uzročnog mehanizma i uticaj metalnih jona na putanju degradacije JEV. Dizajn eksperimenata (engl. design of experiments, skr. DOE) je bio izveden da bi se utvrdio uticaj pojedinačnih parametara na stabilnost antigena.

[0099] Testirani parametri u 25 potpuno faktorijelna DOE su bili

• Partija aluminijum hidroksida 4230 u odnosu na partiju aluminijum hidroksida 4074

• Prisustvo viška fragmenata protamin sulfata

• Prisustvo rastvorljivih materija iz čepa od hlorobutil gume

• pH opseg 7 do 8

• Sadržaj rezidualnog formaldehida

[0100] Partija aluma 4230 sadrži mnogo više nivoe rezidualnih metalnih jona kao nečistoća u poređenju sa drugim partijama aluma upotrebljenim za formulaciju JEV. Bio je izabran "dizajn eksperimenta" (DOE) za dalje ispitivanje mehanizma potencijalnog fundamentalnog uzroka i interakcije parametara koje bi konačno mogle dovesti do degradacije proizvoda. U faktorijelnim dizajnima, tokom testa se istovremeno ispituje više faktora. Za dizajne sa jednim faktorom se mogu razmatrati kvantitativni i/ili kvalitativni faktori. Cilj ovih dizajna je da se identifikuju faktori koji imaju značajan efekat na reakciju, kao i da se ispita efekat interakcija (u zavisnosti od primenjenog dizajna eksperimenta). Takođe se može predvideti kada su prisutni kvantitativni faktori, ali mora biti vođeno računa, pošto su izvesni dizajni veoma ograničeni u pogledu izbora prediktivnog modela. Za generalne informacije u vezi DOE vidi (Siebertz, Karl; van Bebber, David, Hochkirchen, Thomas: Statistische Versuchsplanung: Design of Experiments (DoE). izdavač: Springer Berlin Hajdelberg; 1. izdanje (2010), ISBN-10: 3642054927).

1.1 DOE dizajn studije

1.1.1 Definicija parametara i nivoa za dizajn DOE

[0101] Sledeći parametri i nivoi su bili uzeti u razmatranje za dizajn odgovarajućeg DOE eksperimenta:

• Sadržaj rezidualnih metalnih jona u alumu: Partija aluminijum hidroksida 4230 i partija 4074 su bile izabrane kao reprezentativne za dva ekstrema kvaliteta u pogledu sadržaja rezidualnih metalnih jona u aluminijum hidroksidu. Centralna tačka je bila smeša 50/50% obe partije aluma. Inicijalna analiza za preostale metalne jone kao nečistoće u 2% aluminijum hidroksidu kao osnovnom rastvoru pomoću ICP-MS je pokazala znatne razlike u sadržaju Cr, Fe, Ni i Cu jona između ove dve partije (vidi Tabela 1).

• Fragmenti protamin sulfata: fragmenti protamin sulfata (PS) su prisutni u maloj količini (<5μg/mL) u finalnoj partiji vakcine. Bilo je testirano da li bi PS fragmenti mogli da doprinesu modifikaciji površine virusa (npr. interakcijom/ kovalentnim vezivanjem za proteine površine virusa) u kombinaciji sa alumom i drugim faktorima koji su upotrebljeni u ovoj studiji. Zbog toga je osnovni rastvor PS fragmenata bio pripremljen digestijom sa tripsinom, koja je bila praćena inaktivacijom toplotom i ultrafiltracijom uz korišćenje 5kDa membrane za inaktivaciju proteaze i odstranjivanje enzima. Ovaj osnovni rastvor je bio upotrebljen za dodavanje spiking dodatnih PS fragmenata u odgovarajuće formulacije sa visokim nivoom od 50 μg/mL. U uzorke sa niskim nivoom nisu bili dodati dodatni PS fragmenti, a na osnovu HPLC analize aktuelni nivo u formulacijama je bio < 5μg/mL.

• pH: donji i gornji nivo pH u formulacijama je bio 7 i 8 sa centralnom tačkom za pH 7.5.

• rastvorljive/ekstraktibilne materije iz šprica sa klipom: špric sa klipom (napravljenim od hlorobutila PH701/50 crni) koji se trenutno koristi u sistemu za zatvaranje kontejnera. On je bio testiran u pogledu toga da li bi hlorobutil guma u formulaciji mogla da doprinese modifikaciji antigena. Zbog toga je bio pripremljen osnovni rastvor rastvorljivih materija i upotrebljen je za eksperimente sa dodavanjem. Bilo je utvrđeno da je visoki nivo dodatih rastvorljivih materija u formulaciji bio prosečno 1.4 x veći u poređenju sa komercijalnom finalnom partijom vakcine (FVL). Zbog oštrih uslova ekstrakcije bili su detektovani dodatni pikovi koji nisu bili prisutni u FVL uzorcima. Zbog toga su formulacije sa dodavanjem predstavljale "najgori slučaj" u pogledu rastvorljivih i ekstraktibilnih materija. Formulacije sa niskim nivoom nisu sadržale nikakve rastvorljive materije iz hlorobutil gume.

• Rezidualni formaldehid: za formulacije sa niskim nivoom nije bio dodat dodatni formaldehid u uzorke formulacije uzorci. Niski nivo je bio rezidualni formaldehid koji je još uvek bio prisutan u razređenom NIV uzorku posle inaktivacije/ neutralizacije i 2-strukog razređivanja, a koji je bio u opsegu od pribl.37 ppm (ponovo izračunato na osnovu komercijalnog DS oslobađanja GMP analitičkog sertifikata). Za visoki nivo je bilo dodato dodatnih 40 ppm formaldehida u odgovarajuću formulaciju (ukupni finalni sadržaj pribl.77 ppm). Bilo je testirano da li je rezidualni formaldehid u kombinaciji sa višim nivoom metalnih jona prisutan u alumu 4230 i da li bi eventualno drugi faktori mogli dalje reagovati sa virusom dovodeći do hiperumrežavanja površinskih proteina i gubitka relevantnih epitopa.

Određivanje drugih rezidualnih nečistoća vezanih za proces:

[0102] Rezidualni formaldehid, sulfit i saharoza u finalnim formulacijama su bili određeni na bazi GMP sertifikata za komercijalne lekovite supstance JEV11A74. Rezultati su bili ponovo izračunati pomoću aktuelnog 2-strukog razređivanja NIV do DS koja je upotrebljena u okviru DOE eksperimenata.

[0103] Rezidualni sulfit: koncentracija rezidualnog sulfita je bila konstantna u svom formulacijama, od pribl.93 ppm.

[0104] Rezidualna saharoza: koncentracija rezidualne saharoze je bila konstantna u svim formulacijama, od pribl.1% v/w.

1.1.2 Dizajn DOE

[0105] Ovih 5 faktora je bilo kombinovano u 25 DOE planu, što je rezultovalo ukupnim brojem od 34 eksperimenata uključujući 2 centralne tačke sa sledećim osnovnim dizajnom. Planiranje i evaluacija DOE su bili izvedeni na odgovarajućem softveru (Statgraphic Plus 3.0)

Osnovni dizajn: Faktorijel 25

Broj eksperimentalnih faktora: 5

Broj blokova: 1

Broj reakcija: 1

Broj centralnih tačaka po bloku: 2

Broj pokušaja: 34

Stepeni slobode greške: 18

Randomizovani: da

Kontinualni faktori<1)>Niski Visoki Jedinice pH 7.0 8.0

da

alum<2)>0.0 100.0 alum 4230 % da

dodati PS fragmenti<3>0 50 μg/mL ne

dodate rastvorljive materije<4)>0 1.4 relativni sadržaj u poređenju sa FVL ne dodati formaldehid<5)>0 40 ppm ne

Reakcije Jedinice ELISA (monoklonska, poliklonska) desorbovanog antigena AU/mL 1) kontinualan znači da je centralna tačka (srednja vrednost za visoki i niski nivo) prisutna u dizajnu studije. Bez centralne tačke znači da su u dizajnu studije prisutni samo niski i visoki nivo.

2) niski nivo (0%) znači da je formulacija bila pripremljena sa partijom aluma 4074. Visoki nivo (100%) znači da je formulacija bila pripremljena sa partijom aluma 4230. Za centralnu tačku formulacije je bila upotrebljena jednaka smeša (50/50%) od obe partije aluma.

3) Pošto je PS prisutan u NIV upotrebljen za pripremanje uzoraka lekovitog proizvoda, aktuelna koncentracija PS u ne-formulacijama sa dodavanjem je bila <5μg/mL i ∼50-55μg/mL za PS-formulacije sa dodavanjem.

4) Nije bilo pretpostavljeno prisustvo rastvorljivih materija u ne-formulacijama sa dodavanjem, pošto su uzorci bili pripremljeni/čuvani u Eppendorf epruvetama sa niskim vezivanjem. Ukupni sadržaj rastvorljivih materija iz klipa šprica od hlorobutil gume u uzorcima sa dodavanjem je bio pribl.1.4 puta veći u poređenju sa FVL.

5) Aktuelna koncentracija formaldehida u DP uzorcima bez dodataka je bila pribl.37ppm, dok je ukupna koncentracija formaldehida u uzorcima sa dodavanjem bila pribl.77ppm.

2 Definicije & skraćenice

[0106]

AcCN Acetonitril

DOE Dizajn eksperimenata

DS Lekovita supstanca

FVL Partija finalne vakcine

HPLC Tečna hromatografija visokih performansi

ICP-MS Masena spektrometrija sa indukciono spregnutom plazmom

PS Protamin sulfat

RP Reverzna faza

SEC Gel hromatografija

SN Supernatant

TFA Trifluorosirćetna kiselina

w/o bez

3 Materijali i metode

3.1 DOE studije

3.1.1 Materijali

[0107]

• Klipovi šprica kao čepovi: PH701/50/C crni Sil67002-1051 (dobijen od firme West, narudžbina br.

2116)

• Staklena boca od 100 mL (Schott) teflonom prevučeni navojni zatvarač

• Aluminijumska folija

• HQ voda

• Električno vodeno kupatilo (IKA, HBR 4 digital)

• LoBind Eppis 2ml (Eppendorf, kat. br.0030108.132)

• Speed Vac (Christ, RVC-2-25)

• HPLC bočice, providno staklo, 900 μL, Chromacol (VWR, kat.br.: 548-1124)

• HPLC bočice, PP, 900 μL, (Agilent, artikal br.5182-0567)

• Poklopci za HPLC bočice, prethodno isečeni (VWR, kat.br.: 548-1260)

• Falcon epruvete od 15ml (Greiner, kat. br.188724)

• Partija aluma 4470 (RQCS 1342); partija aluma 4230 (RQCS 1200)

• 10xPBS (Gibco, narudžbina br.14200-091)

• Parafilm

• Waters Atlantis T3 kolona; prečnik čestica 3μm; kolona prečnik/dužina 2.1x100mm (narudžbina br.

186003718; partija 0107372331)

• Acetonitril (Merck, kat. br.1.13358.2500)

• TFA (Sigma, narudžbina br.302031

• HPLC sistem Dionex 3000

• Stalak za rastvarače SR-3000

• Pumpa UltiMate-3000, analitička gradijentna pumpa niskog pritiska

• Autosampler WPS-3000 TSL, analitički autosempler - sa kontrolisanom temperaturom

• Komora za kolonu TCC-3200, sa kontrolisanom temperaturom

• PDA-detektor PDA-3000

• Rastvor formaldehida 37% (Merck, kat. br.1.040031000)

• Protamin sulfat (Intercell Biomedical Ltd, šarža br.086056)

• Ultrafiltracioni uređaj (Amicon® Ultra 3 kDa) (Millipore, kat. br. UFC900324)

• Inkubator Infors HT Incubator Multitron Standard (InforsAG)

• Tripsin (Sigma, narudžbina br.: T0303)

3.1.2 Procedura za pripremu ekstraktibilnih materija iz klipa šprica

[0108] Klipovi šprica (napravljeni od hlorobutila PH701/50 crnog) koji se trenutno upotrebljavaju u sistemu za zatvaranje FVL kontejnera su bili dobijeni od firme West (Nemačka). Zbog toga je bio pripremljen osnovni rastvor rastvorljivih materija termičkim tretmanom klipa šprica u vodi (90°C/2h), što je bilo praćeno koncentrovanjem u Speed vac-u. Relativni sadržaj rastvorljivih materija u ovom osnovnom rastvoru je bio određen pomoću RP-HPLC korišćenjem C18 kolone (Atlantis T3 kolona) i bio je upoređen sa FVL JEV09L37 supernatantom.

Metod ekstrakcije

[0109] Schott staklena boca od 100 mL sa teflonom prevučenim navojnim čepom i komadom aluminijumske folije su bili oprani vrelom vodom, pa su pažljivo isprani sa HQ vodom. U bocu je bilo stavljeno30 čepova, pa je bilo dodato 30ml HQ-vode. Boca je bila zatvorena sa aluminijumskom folijom postavljenom između boce i navoja, te je dodatno zaptivena Parafilmom. Boca je bila zagrevana u vodenom kupatilu na 90°C tokom 2 sata, što je bilo praćeno hlađenjem na sobnu temperaturu. Ekstrakt je bio prenet u 14 Eppendorf epruveta sa niskim vezivanjem (bilo je prikupljeno ukupno 28 mL ekstrakta). Dvanaest bočica (sa ukupno 24 mL) je bilo koncentrovano u Speed Vac-u tokom približno 44 sata i sakupljeno je u Falcon epruvetu da bi se dobilo 6 ml 4x koncentrovanog ekstrakta čepova. Kontrolni uzorak koji je sadržao 30 mL HQ vode w/o (bez) čepa je bio pripremljen na isti način da bi se odredila eventualna kontaminacija.

C18 RP-HPLC metod

[0110] Rastvorljive materije su bile izdvojene pomoću RP-HPLC C18 kolone (Atlantis T3) koja je radila na 40°C i 0.25 mL/min. Rastvarač A je bio 0.1% TFA u H2O, rastvarač B je bio 0.1% TFA u AcCN. Izdvajanje je bilo izvedeno pomoću linearnog gradijenta u opsegu od 0 do 95% B u 30 min. Detekcija je bila izvršena na 214 nm, 254 nm i 280 nm. Utvrđeno je da je ukupna relativna koncentracija koncentrovanog ekstrakta čepova bila 80-struko veća u poređenju sa pikovima koji su bili detektovani u supernatantu partije finalne vakcine (FVL SN; dobijena odstranjivanjem čestica aluma centrifugiranjem na 5000g/5min), što je bilo detektovano na 254 nm. Zbog toga je ukupni relativni sadržaj od 80 U/mL (arbitrarne jedinice U) bio pripisan osnovnom rastvoru, dok je ukupna relativna koncentracija rastvorljivih materija u FVL SN bila podešena na 1U/mL. Za DOE studije, osnovni rastvor je bio razređen 16-struko u odgovarajuće formulacije dajući pribl.5 U/mL ukupnih ekstraktibilnih materija.

3.1.3 Priprema fragmenata protamin sulfata

[0111] Osnovni rastvor PS fragmenata je bio pripremljen digestijom PS rastvora (2mg/mL u PBS) sa Tripsinom (200 ng/mL tokom 60 min na 37 °C). Enzim je zatim bio inaktiviran toplotom (90°C tokom 10 min), što je bilo praćeno ultrafiltracijom uz korišćenje 3kDa membrane (Amicon® Ultra centrifugalni filter). Zbog odsecanja membrane Tripsin je ostao u retentatu, dok su PS fragmenti bili prisutni u permeatu. Kompletna inaktivacija enzima je bila određena dodavanjem 500 μg/mL PS cele dužine u alikvot dobijenog PS fragmenta, što je bilo praćeno inkubacijom na 37°C tokom 18 h. Nije bila uočena degradacija PS cele dužine, što je predstavljalo indikaciju potpune inaktivacije/odstranjivanja Tripsina. Degradacija je bila praćena pomoću PS-SEC HPLC.

3.1.4 Plan DOE

[0112] Uzorci su bili pripremljeni u skladu sa šemom pipetiranja koja je prikazana u Tabeli 2. NIV šarža JEV11A74 dobijena iz komercijalne proizvodnje je bila upotrebljena kao polazni uzorak. NIV je bio razređen 2-struko do DS uz korišćenje PBS pufera, što je bilo praćeno podešavanjem pH. Alikvoti od 5 mL su bili odstranjeni i adjuvansirani odgovarajućom partijom aluma 4230, 4074 ili 50/50% smešom oba. Finalna dodata količina zalihe aluma (2% Al2O3) je bila 500μg/mL aluminijuma (0.1% Al2O3). Svaka formulacija (5 mL) je bila razdvojena na dva dela (2 x 2.5 mL) korišćenjem Lo-bind Eppendorf epruveta. Jedan alikvot je bio čuvan na 2-8°C, dok je drugi alikvot bio čuvan na 22 ± 1°C (Infors HT Inkubator) uz blago trešenje (20 rpm).

3.2 Inaktivirana JEV ELISA (poliklonski bazirana)

[0113] Desorpcija antigena iz aluma i ELISA analiza je bila izvršena korišćenjem poliklonskog ovčijeg anti JEV antitela za oblaganje ELISA ploča sa 96 bunarčica kao što je opisano u Primeru 4.

3.3 Inaktivirana JEV ELISA (monoklonski bazirana)

[0114] Bila je razvijena monoklonski (mAb) bazirana JEV ELISA. Test je bio primarno baziran na formatu testa "poliklonske JEV ELISE", samo što je za prevlačenje bilo upotrebljeno samo monoklonsko anti-JEV antitelo (klon 52-2-5). Pokazalo se da je upotrebljeno mab 52-2-5 specifično za JEV i da prepoznaje neutralizujući epitop. Mab klon 52-2-5 je bio dobijen subkutanom imunizacijom BALB/c miševa sa komercijalno raspoloživom partijom vakcina JEV08J14B. Ćelije slezine miševa su bile fuzionisane sa mijeloma ćelijama. Iz rezultujućih hibridoma ćelija su bili izabrani pojedinačni klonovi, pa su subklonirani. Klonovi su bili izloženi negativnom skriningu sa goveđim serumskim albuminom, protamin sulfatom i ekstraktom iz proizvodnje ćelijske linije JE-vakcine (Vero ćelije). Pozitivni skrining A je bio izvršen sa neutralizovanim inaktiviranim virusom (NIV) partije vakcine JEV08M20. Za skrining su mikrotitarske ploče bile obložene sa relevantnim antigenom i reagovale su sa supernatantom kultura selekcionisanih klonova. Za detekciju je bilo upotrebljeno kozje anti mišje poliklonsko antitelo konjugovano sa alkalnom fosfatazom. Pokazano je da mab klon 52-2-5 prepoznaje neutralizujući epitop na domenu III omotaču (E) proteina JEV koji sadrži Ser331 i Asp332 (Lin C.-W. i Wu W.-C. J Virol. 2003; 77(4):2600-6). Vezujuće mab za navedeni neutralizujući epitop se, na primer, određuje kao što je opisano u Lin i Wu (2003) mesno usmerenom mutagenezom domena III na poziciji 331 (na primer: S→R), i/ili alaninskim mutacijama na ili u blizini pozicije 331 domena III, na primer, ostataka Ser 331 i Asp332, što je praćeno imunoblotovima da bi se odredilo vezivanje mab za mutirane proteine. Negativni rezultati vezivanja ukazuju da je epitop od mab neutralizujući epitop koji su identifikovali Lin i Wu (2003). Neutralizujuće karakteristike ovog epitopa dovode do pretpostavke da bi taj epitop mogao biti važan da antigen pobudi zaštitnu imunu reakciju.

[0115] JEV uzorci su bili analizirani sa oba ELISA testa, poliklonskim i monoklonskim. Relativni sadržaj specifičnog epitopa se može izraziti kao odnos ukupnog sadržaja antigena određenog "monoklonskom ELISOM" (klon 52-2-5) podeljenim sa ukupnim sadržajem antigena određenim "poliklonskom ELISOM". Bilo kakva razlika odnosa može ukazivati na razlike u sadržaju specifičnog epitopa 52-2-5. Rezultati bliski 1 bi odgovarali visokim sadržajima epitopa, a rezultati bliski 0 bi odgovarali niskom relativnom sadržaju epitopa. Niski odnos ukazuje na prisustvo strukturnih promena u neutralizujućem epitopu.

[0116] U toku razvoja ove "mAb ELISE", detektovane su razlike između partija vakcine, koje bi bile u korelaciji sa rezultatima potencije ovih partija.

3.4 Protamin sulfat SEC-HPLC

[0117] PS (cele dužine) i njegovi fragmenti su bili analizirani pomoću gel HPLC (SEC-HPLC) uz korišćenje Superdex Peptide 10/300 GL, 10 x 300 mm, 13 μm (GE Healthcare) korišćenjem 0.1 % (v/v) trifluorosirćetne kiseline (TFA) u 30 % acetinitrila (CAN) kao mobilne faze sa protokom od 0.6 mL/min. Uzorci koji su sadržali PS su bili pripremljeni u duplikatu, tj. razređeni su mobilnom fazom pre ubrizgavanja.

4 Rezultati

4.1 Analiza rastvorljivih materija iz čepova korišćenih za eksperimente sa dodavanjem

[0118] RP-HPLC profili eluiranja koncentrovanog osnovnog rastvora dobijenog posle ekstrakcije čepova pod dejstvom toplote upoređeni sa FVL SN su prikazani na Fig.1. Sličan izgled pikova je bio uočen za oba uzorka. Zbog oštrih uslova ekstrakcije bili su detektovani dodatni pikovi u koncentratu koji nisu bili prisutni u FVL uzorcima ili su bili prisutni samo sa mnogo nižim relativnim sadržajem, zbog čega su formulacije sa dodavanjem predstavljale "najgori slučaj" u pogledu rastvorljivih i ekstraktibilnih materija. Ukupni relativni sadržaj pojedinačnih pikova u koncentratu ekstrakta i formulaciji sa dodavanjem u poređenju sa FVL SN je rezimiran u Tabeli 3. Ukupna količina rastvorljivih materija u osnovnom rastvoru je bila izračunata kao suma svih detektovanih pikova i izražena je u proizvoljnim jedinicama kao 67 U/mL. Pošto je osnovni rastvor bio razređen 16 puta u odgovarajuću formulaciju, bilo je procenjeno da je rezultujući ukupni sadržaj rastvorljivih materija bio 4.2 U/mL. Ovo odgovara prosečnom 1.4 strukom povećanju u poređenju sa FVL JEV09L37 supernatantom (3.0 U/mL).

4.2 Analiza fragmenata protamin sulfata

[0119] Fragmenti PS dobijeni posle kidanja PS cele dužine Tripsinom su prikazani na Fig.2. Slični profili pikova PS tretiranog Tripsinom i već degradiranog PS prisutnog u NIV11A74 su bili dobijeni pomoću HPLC (vidi Fig.3).

4.3 DOE evaluacija

[0120] Formulacije koje su pripremljene za ovaj DOE su bile analizirane posle 4 nedelje i 8 nedelja inkubacije pod ubrzavajućim uslovima (22°C). Očekivalo se da će bilo koja reakcija degradacije biti ubrzana kada se vrši čuvanje vrši na višoj temperaturi u poređenju sa normalnim uslovima čuvanja (2-8°C). Međutim, uzorci se još čuvaju na 2-8°C i biće analizirani u kasnijem vremenskom trenutku

meseci). Prve analize uzoraka čuvanih na 22°C tokom 4 i 8 nedelja su prikazane u Tabeli 4.

4.3.1 DOE evaluacija posle 4 nedelje na 22°C

[0121] Statistička evaluacija rezultata DOE matrice dobijenih posle 4 nedelje na 22°C pokazuju da su na specifični sadržaj epitopa 52-2-5 (izražen kao odnos desorbovanog antigena analiziranog monoklonskom/poliklonskom ELISOM) (95% nivo poverenja, vidi Tabelu 5) statistički značajno uticali sledeći faktori:

• niži specifični sadržaj epitopa 52-2-5 u prisustvu partije aluma 4230

• niži specifični sadržaj epitopa 52-2-5 za niži pH 7

• viši specifični sadržaj epitopa 52-2-5 za povećane koncentracije formaldehida

Prisustvo viših koncentracija PS fragmenata i rastvorljivih materija iz hlorobutil gume nisu ispoljili nikakav uticaj na sadržaj specifičnog epitopa. Nisu bile detektovane interakcije 2. ili višeg reda između pojedinačnih parametara.

[0122] ANOVA tabela deli varijabilnosti "odnosa posle 4 nedelje" na odvojene delove za svaki od efekata. Onda je testiran statistički značaj svakog efekta poređenjem srednjeg kvadrata u odnosu na procenu eksperimentalne greške. U ovom slučaju, 3 efekta (alum, pH, formaldehid) imaju P-vrednosti manje od 0.05, što ukazuje da su oni značajno različiti od nule za nivo poverenja od 95.0%. R-kvadratna statistika ukazuje da fitovani model objašnjava 74.85% varijabilnosti odnosa posle 4 nedelje. Podešena R-kvadratna statistika, koja je podesnija za poređenje modela sa različitim brojem nezavisnih promenljivih, je 51.27%. Standardna greška procene pokazuje da je standardno odstupanje reziduala 0.063. Srednja apsolutna greška (MAE) od 0.0353 je prosečna vrednost reziduala. Durbin-Watson (DW) statistika testira reziduale da bi se odredilo da li postoji bilo kakva značajna korelacija na osnovu reda u kome se oni pojavljuju u vašem dokumentu sa podacima. Pošto je DW vrednost veća od 1.4, verovatno da ne postoji bilo kakva ozbiljna autokorelacija u rezidualima. Efekti su takođe prikazani pomoću standardizovanog Paretovog dijagrama, a dijagrami glavnih efekata su prikazani na Fig.4.

4.3.2 DOE evaluacija posle 8 nedelja na 22°C

[0123] Statistička evaluacija rezultata DOE matrice dobijenih posle 8 nedelja na 22°C bila je slična rezultatima dobijenim posle 4 nedelje. Evaluacija pokazuje da su na sadržaj specifičnog epitopa 52-2-5 (izraženog kao odnos desorbovanog antigena analiziranog monoklonskom/poliklonskom ELISOM) statistički značajno uticali sledeći faktori:

• niži specifični sadržaj epitopa 52-2-5 u prisustvu partije aluma 4230

• niži specifični sadržaj epitopa 52-2-5 za niži pH 7

Prisustvo viših koncentracija PS fragmenata, rastvorljivih materija iz hlorobutil gume i formaldehida nije pokazalo bilo kakav uticaj na sadržaj specifičnog epitopa. Uočava se da je P-vrednost za formaldehid (P=0.08) sasvim bliska tome da bude značajna. Nisu bile detektovane interakcije 2. ili višeg reda između pojedinačnih parametara.

[0124] ANOVA tabela deli varijabilnosti "odnosa posle 8 nedelja" na odvojene delove za svaki od efekata. Onda je testiran statistički značaj svakog efekta poređenjem srednjeg kvadrata u odnosu na procenu eksperimentalne greške. U ovom slučaju, 2 efekta (alum i pH) su imala P-vrednosti manje od 0.05, što ukazuje da su oni značajno različiti od nule za nivo poverenja od 95.0%. R-kvadratna statistika ukazuje da fitovani model objašnjava 75.9% varijabilnosti "odnosa posle 8 nedelja". Podešena R-kvadratna statistika, koja je podesnija za poređenje modela sa različitim brojem nezavisnih promenljivih, je 53.3%. Standardna procenjena greška pokazuje da je standardno odstupanje rezidualnih materija 0.095. Srednja apsolutna greška (MAE) od 0.057 je prosečna vrednost rezidualnih materija. Efekti su takođe prikazani standardizovanim Paretovim dijagramom i dijagramima glavnih efekata kao što je prikazano na Fig.5.

[0125] Na fitovanim podacima je takođe bila izvršena regresiona analiza, a izračunati koeficijenti regresije su prikazani u Tabeli 7. Dole je prikazana jednačina regresije koja je bila fitovana za podatke uključujući pH, alum i formaldehid. Jednačina fitovanog modela je "odnos posle 8 nedelja" = 0.0228125 0.113125*pH - 0.00185625*alum 0.0315625*formaldehid, gde su vrednosti promenljivih specifikovane u njihovim originalnim jedinicama, osim za kategorijske faktore koji imaju vrednosti -1 za niski nivo i 1 za visoki nivo. Kontura procenjene reakcije i rezidualni dijagram su prikazani na Fig.6 i Fig.7. Odnos se povećava kada se relativni sadržaj partija aluma 4230 smanjuje i pH povećava.

[0126] Tabela 8 sadrži informacije u vezi vrednosti "odnosa posle 8 nedelja" generisane korišćenjem fitovanog modela. Ova tabela sadrži:

(1) uočenu vrednost "odnosa posle 8 nedelja"

(2) predviđenu vrednost "odnosa posle 8 nedelja" korišćenjem fitovanog modela

(3) 95.0% granice poverenja za srednju reakciju

[0127] Kao što je pokazano, regresioni model je dobro predvideo eksperimentalne rezultate.

5. Rezime

[0128] Od testiranih parametara, pokazalo se da partija aluma 4230 znatno doprinosi degradaciji antigena, što je bilo analizirano monoklonskom/poliklonskom ELISOM pod ubrzavajućim uslovima (22°C, vremenski trenuci testiranja 4 i 8 nedelja). DOE rezultati dobijeni posle 4 i 8 nedelja na 22°C pokazuju da je alum 4230 najznačajniji faktor za degradaciju antigena koja se detektuje odnosom monoklonske/poliklonske ELISE. Formulacije napravljene sa alumom 4074 (mnogo veće čistoće u pogledu rezidualnih metalnih jona) generalno ispoljavaju mnogo veći specifični sadržaj epitopa.

Formaldehid i pH takođe doprinose stabilnosti antigena, ali u manjoj meri. Efekat povećane stabilnosti antigena u uzorcima formulisanim sa alumom 4230 za viši nivo formaldehida je bio dobro demonstriran (npr. uzorci #19 i 29). Međutim, uticaj formaldehida je bio manje izražen posle produženog perioda čuvanja (8 nedelja na 22°C). Bolja stabilnost antigena je bila uočena za pH 8 u poređenju sa pH 7. Protamin sulfat i rastvorljive materije iz čepa od hlorobutil gume nisu doprinele degradaciji antigena.

Primer 2

[0129] U prethodnim studijama (vidi Primer 1) je bilo utvrđeno da je partija aluminijum hidroksida 4230 faktor koji značajno doprinosi uočenoj degradaciji antigena u FVL09L37. U ovoj konkretnoj partiji aluminijum hidroksida (aluma), bio je uočen mnogo viši sadržaj rezidualnih metalnih jona u poređenju sa drugim partijama aluma upotrebljenim za formulaciju inaktiviranog JEV antigena. Ovaj Primer rezimira dodatne studije izvedene radi evaluacije uticaja metalnih jona na stabilnost inaktiviranog JEV. Studije sa dodavanjem su bile izvedene sa antigenom prisutnim u rastvoru neutralizovanog inaktiviranog virusa (NIV) ili u suspenziji lekovitog proizvoda (DP) posle formulacije antigena sa aluminijum hidroksidom.

1 Opis studije

[0130] Prethodno je bilo pokazano da partija aluma 4230 sadrži mnogo više nivoe rezidualnih metalnih jona kao nečistoća u poređenju sa drugim partijama aluma upotrebljenim za formulaciju JEV (vidi takođe Primer 3). Bile su izvršene dodatne studije radi evaluacije uticaja metalnih jona na stabilnost i na potencijalnu modifikaciju površine JEV. Inaktivirani antigen je bio prisutan u rastvoru neutralizovanog inaktiviranog virusa (NIV) ili u suspenziji lekovitog proizvoda (DP), praćenim daljim razređivanjem NIV i formulacijom sa aluminijum hidroksidom. U sledećoj grupi eksperimenata bile su upotrebljene različite partije aluma koje su pokrivale široki opseg sadržaja rezidualnih metalnih jona i formulisane su sa samo jednom definisanom partijom NIV. Sve ove formulacije su još uvek sadržale rezidualni formaldehid i bisulfit u reprezentativnim koncentracijama u poređenju sa komercijalnim proizvodom. Osnovni rastvor metalnih soli je bio rastvoren u vodi i bio je dodat uzorcima do željene finalne koncentracije.

2 Definicije & skraćenice

AcCN Acetonitril

ANOVA Analiza varijanse

DOE Dizajn eksperimenata

DP Lekoviti proizvod

DS Lekovita supstanca

FBV Finalna polugotova vakcina

FVL Partija finalne vakcine

GI Ozračeno gama zračenjem

HPLC Tečna hromatografija visokih performansi

LSD Fišerov test najmanje značajne razlike

mAb Monoklonsko antitelo

NIV Neutralizovani inaktivirani virus

PS Protamin sulfat

RP Reverzna faza

SEC Gel hromatografija

SN Supernatant

TFA Trifluorosirćetna kiselina

w/o bez

3 Materijali i metode

3.1 Materijali

[0132]

• Gvožđe(II)hlorid tetrahidrat(Sigma, narudžbina br.44939)

• Gvožđe(III)hlorid heksahidrat (Sigma, narudžbina br.31232)

• Nikl(II)sulfat heksahidrat (Sigma, narudžbina br. N4882)

• Kobalt(II)hlorid heksahidrat (Sigma, narudžbina br.31277)

• Bakar(II)hlorid dehidrat (Sigma, narudžbina br.807483)

• Cinksulfat heptahidrat (Sigma, narudžbina br.24750)

• Hrom(III)hlorid heksahidrat (AlfaAesar, narudžbina br.42114)

• Etilendiamintetrasirćetna kiselina dinatrijumova so dehidrat (EDTA) (Sigma, E5134) • Aqua bidest. (Fresenius Kabi, art br.0712221/01 A)

• 10xPBS (Gibco, narudžbina br.14200-091)

• 37% rastvor formaldehida (Merck, kat. br.1.040031000)

• Protamin sulfat (Intercell Biomedical Ltd, šarža br.086056)

• LoBind Eppis 2 ml (Eppendorf, kat. br.0030108.132)

• Falcon epruvete od 15 ml (Greiner, kat. br.188724)

• Inkubator Infors HT Incubator Multitron Standard (InforsAG)

• 0.2 Ilm filter Mini Kleenpak 25 mm (Pall)

• NIV11A74 i Finalna polugotova vakcina (FBV, formulisana sa partijom aluma 4539) JEV 11D87 iz komercijalne proizvodnje je bila nabavljena od firme Intercell Biomedical (Livingston, UK) i čuvana je na 2-8°C sve do dalje prerade

• Osnovni rastvori metalnih soli u vodi (finalna koncentracija 1mM) upotrebljeni za eksperimente sa dodavanjem su bili pripremljeni i čuvani na 2-8°C sve do upotrebe

• Uzorci aluminijum hidroksida (2% Al2O3, Brenntag Biosector) su bili zadržani uzorci dobijeni od firme Intercell Biomedical ili su kupljeni direktno od firme Brenntag. Uzorci aluma su bili čuvani na 2-8°C. Sledeće partije aluma su bile upotrebljene u ovoj studiji: 4470, 4563, 4621, 3877, 4230 (neozračene gama zračenjem i ozračene gama zračenjem)

3.2 Priprema osnovnih rastvora metala

3.2.1 Osnovni rastvor gvožđa(II)

[0133] 20 mM osnovnog rastvora gvožđa(II) je bilo pripremljeno rastvaranjem 397 mg gvožđe(II)hlorid tetrahidrata u 100 mL aqua bidest.

3.2.2 Osnovni rastvor gvožđa(III)

[0134] 20 mM osnovnog rastvora gvožđa(III) je bilo pripremljeno rastvaranjem 540 mg gvožđe(III)hlorid heksahidrata u 100 mL aqua bidest.

3.2.3 Osnovni rastvor nikla(II)

[0135] 20 mM osnovnog rastvora nikla(II) je bilo pripremljeno rastvaranjem 525 mg nikl(II)sulfat heksahidrata u 100 mL aqua bidest.

3.2.4 Osnovni rastvor kobalta(II)

[0136] 20 mM osnovnog rastvora kobalta(II) je bilo pripremljeno rastvaranjem 476 mg kobalt(II)hlorid heksahidrata u 100 mL aqua bidest.

3.2.5 Osnovni rastvor bakra(II)

[0137] 20 mM osnovnog rastvora bakra(II) je bilo pripremljeno rastvaranjem 341 mg bakar(II)hlorid dihidrata u 100 mL aqua bidest.

3.2.6 Osnovni rastvor cinka

[0138] 20 mM osnovnog rastvora cinka je bilo pripremljeno rastvaranjem 575 mg cinksulfat heptahidrata u 100 mL aqua bidest.

3.2.7 Osnovni rastvor hroma(III)

[0139] 20 mM osnovnog rastvora hroma(III) je bilo pripremljeno rastvaranjem 533 mg hrom(III)hlorid heksahidrata u 100 mL aqua bidest.

3.3 Priprema radnih rastvora

[0140] Radni rastvori metalnih jona (1 mM finalne koncentracije, ako nije drugačije navedeno) su bili pripremljeni razređivanjem osnovnih rastvora metalnih jona sa aqua bidest i sterilnim filtriranjem preko filtera za špric od 0.2 μm.

3.4 Priprema formulacija

[0141] Sve formulacije su bile pripremljene pod sterilnim uslovima. NIV i FBV dobijenim iz komercijalne proizvodnje je bio podešen željeni pH i dodati su im alikvoti osnovnog rastvora metala. Svi uzorci su bili čuvani u plastičnim epruvetama, osim ako nije drugačije navedeno. U svim formulacijama sa upotrebom aluma, finalni sadržaj Al je 500μg/mL, što odgovara 0.1% Al2O3. Treba naglasiti da su metalni joni, a naročito gvožđe (II), gvožđe (III) i do izvesne mere Cr (III), koji formiraju talog sa fosfatnim jonima, prisutni u puferu, što rezultuje delimičnim kotaloženjem inaktiviranog virusa, što je predstavljeno malom rekuperacijom određenom pomoću gel HPLC (SEC-HPLC).

3.4.1 Eksperiment 20110913(NIV): NIV formulacija sa različitim koncentracijama metalnih jona Ni(II), Cu(II), Cr(III) sa ili bez prisustva PS fragmenata

[0142] NIV 11A74 je bio podešen na pH 7 i pH 8, što je bilo praćeno dodavanjem metalnih jona (Ni(II), Cu(II), Cr(III)) do 100/500/1000 ng/mL finalne koncentracije. Sve formulacije su bile čuvane u Eppendorf epruvetama sa niskim vezivanjem na 22°C. Alikvoti svih formulacija su takođe pripremljeni u prisustvu fragmenata protamin sulfata (50μg/mL). Ovo je bilo izvršeno radi evaluacije eventualnog efekta PS fragmenata na stabilnost JEV u prisustvu metala. Priprema fragmenata protamin sulfata (PS) je opisana u Primeru 1. Uzorci su bili pripremljeni istog dana (vidi Tabelu 9), a analizirani su posle tri nedelje. Svi uzorci su bili analizirani pomoću SEC-HPLC, dok su samo uzorci sa pH 8 (#21-40) bili analizirani pomoću ELISE.

3.4.2 Eksperiment 20110913(DP): DP formulacija sa različitim koncentracijama metalnih jona Ni(II), Cu(II), Cr(III)

[0143] FBV 11D87 (formulisan sa partijom aluma 4539) je bio upotrebljen u ovoj studiji. FBV je bio podešen na pH 7 i pH 8 i bili su mu dodati Ni(II)/Cu(II)/Cr(III) sa 100, 500 i 1000ng/mL da bi se evaluirao eventualni efekat zavisan od koncentracije metalnih jona /pH. Tabela 10 prikazuje eksperimentalni dizajn ovog eksperimenta. Sve formulacije su bile čuvane u Falcon epruvetama na 2-8°C i 22°C. Uzorci koji su čuvani na 22°C su bili analizirani pomoću SEC-HPLC i ELISE posle 5 nedelja.

3.4.3 Eksperiment 20110812-DP sa dodavanjem metala

[0144] Finalna polugotova vakcina 11D87 (formulisana sa partijom aluma 4539) je bila dobijena iz komercijalne proizvodnje i upotrebljena je u ovoj studiji. Rezidualni formalin u DS je bio analiziran kao 28.1ppm, rezidualni sulfit je bio 92.2ppm. Može se smatrati da je aktuelni sadržaj u DP u istom opsegu. FBV JEV11D87 je bila podešena na pH 7.0/7.4/7.8, pa je dodato 500ng/mL (finalna koncentracija) Fe(II), Fe(III), Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II). Takođe je bila pripremljena formulacija mešavine metalnih jona koja je sadržala sve pojedinačne metalne jone zajedno u rastvoru. Formulacije sa Cr(III) su bile pripremljene kasnije, a Cr(III) nije bio uključen u mešavinu metalnih jona. Kontrolnim formulacijama je bio samo podešen željeni pH, ali im nisu bili dodati metali. Sve formulacije (#1-24) su bile pripremljene istog dana i čuvane su u Falcon epruvetama na 2-8°C i 22°C. Dodatni uzorci sa dodatkom Cr(III) (#25-27) su bili pripremljeni uzimanjem alikvota kontrolnih uzoraka čuvanih na 2-8°C i bio im je dodat Cr(III) do finalne koncentracije od 500ng/mL. Formulacije su bile čuvane samo pod ubrzavajućim uslovima (22°C). Tabela 11 prikazuje eksperimentalnu postavku ovog eksperimenta. Svi uzorci koji su bili čuvani na 22°C su bili analizirani pomoću ELISE (monoklonske i poliklonske) posle 4 nedelje i 7 nedelja.

3.4.4 Eksperiment 20110819: DP formulacija uz korišćenje različitih partija aluma

[0145] Studije sa dodavanjem kao što je gore opisano mogu dati prvi dokaz moguće nestabilnosti formulisanog antigena u prisustvu izvesnih metala, ali možda ne bi mogle biti potpuno reprezentativne za realne uslove gde su metali koji su prisutni aluminijum hidroksidu inkorporirani u trodimenzionalnu strukturu gela, što rezultuje različitim lokalnim koncentracijama i orijentacijom/dostupnošću. Da bi se prevazišla ova ograničenja bila je započeta inicijalna studija kako bi se simulirali realni uslovi. Samo jedna šarža NIV (11A74) dobijena iz komercijalne proizvodnje je bila formulisana sa različitim partijama aluma proizvedenim od strane firme Brenntag koje su pokrivale široki opseg rezidualnih metala.4.75mL NIV je bilo pomešano sa 0.25mL aluma (2%) u Falcon epruvetama. Finalna koncentracija aluminijum hidroksida je bila 500μg/mL (=0.1% Al2O3). Uzorci formulisane vakcine su bili čuvani na 2-8°C i pod ubrzavajućim uslovima na 22°C. Sve ove partije aluma su sadržale rezidualne metalne jone u različitim koncentracijama. Partija aluma 4230 je imala najviši nivo Fe, Cu, Ni i V (vidi Primer 3). Treba naglasiti da valence metalnih jona ne mogu biti specifikovane pomoću ICP-MS. Mešoviti uzorak aluma koji je sadržao jednake količine 4230 i 4074 je takođe bio pripremljen da bi se dobio "srednji" nivo za Ni(II) i Cu(II). Uzorci su bili analizirani posle 6 nedelja čuvanja na 22°C. Rezidualne količine formaldehida i sulfita koje su procenjene rekalkulacijom na osnovu raspoloživih rezultata DS analize korigovanih za faktor razređenja NIV prema DS su bile 76ppm formaldehida i 192ppm sulfita, respektivno.

3.1 Desorpcija antigena iz aluminijum hidroksida za SEC-MALLS analizu

[0146] Delovi virusa su bili desorbovani iz aluminijum hidroksida. ∼625 μL DP je bilo centrifugirano (8°C, 5 min, 3300 x g), pa je supernatant bio odbačen, ukoliko nije inače bilo utvrđeno ili analizirano pomoću JEV-SEC-MALLS da se detekcije koncentracija nevezanog antigena. Virusne čestice su bile desorbovane suspendovanjem čestica aluminijum hidroksida sa 62.5 μL 0.8 M kalijum fosfatnog pufera (pH 8) koji je sadržao BSA (50 μg/mL). BSA je bio dodat desorpcionom puferu za SEC-MALLS analizu da bi se minimizirali gubici izazvani nespecifičnom adsorpcijom antigena. Posle mućkanja (500 rpm) čestica aluminijum hidroksida tokom 10 min na sobnoj temperaturi, čestice su bile odstranjene centrifugiranjem, a supernatant je bio sakupljen u LoBind Eppendorf epruvetu, pa je procedura desorpcije ponovljena na preostalom uzorku. Sakupljeni desorbovani antigen (∼53 koncentrovani uzorak; finalna zapremina 125μL; polazna zapremina ∼625 μL) je onda bio dalje analiziran pomoću SEC-MALLS.

3.2 SEC-MALLS HPLC metod

[0147] Desorbovani antigen je bio analiziran pomoću SEC-MALLS. Ukratko, posle desorpcije antigena iz aluminijum hidroksida 100 μL sakupljenog desorbovanog materijala (∼5× koncentrovan) je bilo posle toga stavljeno na Superose 610/300 GL SEC kolonu.1× PBS 250 mM NaCl su bili upotrebljeni kao mobilna faza. Ultraljubičasti (UV) 214 nm i MALLS signali delova virusa su bili snimljeni i analizirani korišćenjem Chromeleon i ASTRA softverskih paketa.

3.3 ELISA inaktivirane JEV (poliklonski bazirana)

[0148] Desorpcija antigena iz aluma i ELISA analiza su bili izvedeni uz korišćenje poliklonskog ovčijeg anti JEV antitela za oblaganje ELISA ploča sa 96 bunarčića kao što je opisano u Primeru 4.

3.4 ELISA inaktivirane JEV (monoklonski bazirana)

[0149] Tokom ovog ispitnog testiranja je bila razvijena monoklonski (mAb) bazirana JEV ELISA. Test je bio primarno baziran na formatu testa "poliklonske JEV ELISE", samo što je za prevlačenje bilo upotrebljeno samo monoklonsko anti-JEV antitelo (klon 52-2-5) i aktuelno poliklonsko antitelo za detekciju. Pokazalo se da je upotrebljeno mab 52-2-5 specifično za JEV i da prepoznaje neutralizujući epitop.

Mab klon 52-2-5 je bio dobijen subkutanom imunizacijom BALB/c miševa sa komercijalno raspoloživom partijom vakcina JEV08J14B. Ćelije slezine miševa su bile fuzionisane sa mijeloma ćelijama. Iz rezultujućih hibridoma ćelija su bili izabrani pojedinačni klonovi i subklonirani su. Klonovi su bili izloženi negativnom skriningu sa goveđim serumskim albuminom, protamin sulfatom i ekstraktom iz proizvodnje ćelijske linije JE-vakcine (Vero ćelije). Pozitivni skrining je bio izvršen sa neutralizovanim inaktiviranim virusom (NIV) partije vakcine JEV08M20. Za skrining su mikrotitarske ploče bile obložene sa relevantnim antigenom i reagovale su sa supernatantom kultura selekcionisanih klonova. Za detekciju je bilo upotrebljeno kozje anti mišje poliklonsko antitelo konjugovano sa alkalnom fosfatazom.

Pokazano je da mab klon 52-2-5 prepoznaje neutralizujući epitop na domenu III omotaču (E) proteina JEV koji sadrži Ser331 i Asp332 (Lin C.-W. i Wu W.-C. J Virol.2003; 77(4):2600-6). Vezujuće mab za navedeni neutralizujući epitop se, na primer, određuje kao što je opisano u Lin i Wu (2003) mesno usmerenom mutagenezom domena III na poziciji 331 (na primer: S→R), i/ili alaninskim mutacijama na ili u blizini pozicije 331 domena III, na primer, ostataka Ser 331 i Asp332, što je praćeno imunoblotovima da bi se odredilo vezivanje mab za mutirane proteine. Negativni rezultati vezivanja ukazuju da je epitop od mab neutralizujući epitop koji su identifikovali Lin i Wu (2003). Neutralizujuće karakteristike ovog epitopa dovode do pretpostavke da bi taj epitop mogao biti važan da antigen pobudi zaštitnu imunu reakciju. JEV uzorci su bili analizirani sa oba ELISA testa, poliklonskim i monoklonskim. Relativni sadržaj specifičnog epitopa se može izraziti kao odnos ukupnog sadržaja antigena određenog "monoklonskom ELISOM" (klon 52-2-5) podeljenim sa ukupnim sadržajem antigena određenim "poliklonskom ELISOM". Bilo kakva razlika odnosa može ukazivati na razlike u sadržaju specifičnog epitopa 52-2-5. Rezultati bliski 1 bi odgovarali visokim sadržajima epitopa, a rezultati bliski 0 bi odgovarali niskom relativnom sadržaju epitopa. Niski odnos ukazuje na prisustvo strukturnih promena u neutralizujućem epitopu.

[0150] U toku razvoja ove "mAb ELISE", bile su detektovane razlike između partija vakcina, koje bi mogle da budu u korelaciji sa rezultatima potencije ovih partija.

3.5 Statistička evaluacija

[0151] Statistička evaluacija je bila izvršena sa Statgraphic Plus 3.0.

4 Rezultati

4.1 Eksperiment 20110913(NIV): NIV formulacija sa različitim koncentracijama metalnih jona Ni(II), Cu(II), Cr(III) sa ili bez prisustva PS fragmenata

[0152] SEC-HPLC rezultati NIV formulacija (pH 7 i pH 8) koje su sadržale metalne jone [Ni(II), Cu(II), Cr(III)] sa i bez PS fragmenata su sumirani u Tabeli 12. SEC-HPLC rezultati pokazuju da je rekuperacija antigena za većinu uzoraka bila >80%. Neki uzorci (#7, #36, #38) su ispoljili slabo smanjenu rekuperaciju u opsegu od 70-80%. Treba naglasiti da je aktuelni sadržaj virusa prilično nizak, a preciznost HPLC rezultata se može proceniti pribl. ± 20%. Pošto su za uzorke #36 i #38 rekuperacije za sledeće formulacije (#37, #39) na sledećem nivou sadržaja pojedinačnih metalnih jona ponovo bile veće, ove razlike bi mogle biti izazvane varijabilnošću testa i ne smatraju se značajnim. Na bazi dobijenih rezultata nije bilo moguće razjasniti uticaj metalnih jona na rekuperaciju rastvorljivog inaktiviranog JEV. Međutim, SEC-HPLC daje samo informaciju u vezi sadržaja rastvorljivog virusa, ali ne i informaciju u vezi bilo kakve potencijalne modifikacije površine. Samo su formulacije pripremljene za pH 8 takođe bile analizirane pomoću ELISE (analiza u duplikatu). Bio je izračunat odnos monoklonske/poliklonske ELISE i mogao je da se koristi za svrhe poređenja rezultata. Analiza uzoraka pomoću ELISE (vidi Tabelu 13) ne pokazuje bilo kakav značajan uticaj testiranih metala na degradaciju inaktiviranog JEV za pH 8 posle tri nedelje na 22°C. Mogla bi postojati tendencija smanjenja odnosa u prisustvu Cu(II), ali generalno izgleda da vreme inkubacije od tri nedelje na 22°C izgleda da nije dovoljno za detekciju bilo kakve značajne degradacije. Kao što je takođe prikazano u DOE eksperimentima (Primer 1) izgleda da inaktivirani JEV ima veću stabilnost za pH 8 kada se čuva na ubrzavajućim uslovima na 22°C i ovo bi takođe doprinelo tome da ne budu uočeni značajni efekti. U ovom eksperimentu je takođe pokazano da PS fragmenti nemaju nikakav uticaj na stabilnost JEV. Ovo se takođe dobro slaže sa DOE rezultatima. NIV uzorci 1-20 formulisani za pH 7 su pokazali značajno smanjenje sadržaja monoklonskog epitopa u prisustvu Cu(II). Za najvišu testiranu koncentraciju (1000ng/mL) odnos je bio blizu nulte indikacije značajnih strukturnih promena antigena.

4.2 Eksperiment 20110913(DP): DP formulacija sa različitim koncentracijama metalnih jona Ni(II), Cu(II), Cr(III)

[0153] Analiza desorbovanog JEV antigena je sumirana u Tabeli 14 (SEC-HPLC) i Tabeli 15 (ELISA). Rekuperacija antigena za sve uzorke koje su određene pomoću SEC-HPLC je bila >80% posle 5 nedelja na 22°C, što ne ukazuje na značajan uticaj testiranih metalnih jona na rekuperaciju desorpcije. Kao što je prikazano na Fig.8, postoji tendencija smanjenja odnosa analiziranog pomoću ELISE u prisustvu Cu(II) i Cr(III) za pH 7. Izgleda da su formulacije za pH 8 stabilnije.

4.3 Eksperiment 20110812(DP): DP sa dodatim metalnim jonima

[0154] U ovom eksperimentu FBV11D87 je bio upotrebljen kao polazni materijal. pH vrednost formulacije je bila podešena u užem opsegu (pH 7.0, 7.4 , 7.8), a dodatni metalni joni su bili upotrebljeni za dodavanje, svaki sa 500ng/mL (finalna koncentracija). Mešavina metalnih jona je sadržala sve pojedinačne metalne jone, uz izuzetak Cr(III) u pojedinačnim formulacijama (svaki metal sa 500ng/mL). Rezultati ELISE dobijeni posle 4 nedelje i 7 nedelja na 22°C su sumirani u Tabeli 16. Rezultati su takođe prikazani kao grafici na Fig.9.

[0155] Bila je izvršena statistička evaluacija stabilnosti uzoraka čuvanih na 22°C tokom 7 nedelja. ANOVA (analiza varijanse) je pokazala značajne efekte parametara (pH i tipa metala) na stabilnost antigena, koja je izražena kao odnos monoklonske/poliklonske ELISE (vidi Tabelu 17). ANOVA tabela razdvaja varijabilnost odnosa na doprinose različitih faktora. Pošto je bio izabran Tip III zbira kvadrata, izmeren je doprinos svakog faktora, uz odstranjivanje efekata svih drugih faktora. P-vrednosti testiraju statističku značajnost svakog od faktora. Pošto su P-vrednosti za pH i tip metalnih jona manje od 0.05, ovi faktori imaju statistički značajan efekat na odnos na nivou poverenja od 95.0%.

[0156] U Tabeli 18 je primenjena procedura višestrukog poređenja da bi se odredio značaj uočenih razlika u pogledu srednjih vrednosti. Značajan efekat na odnos se ispoljio za Cu(II) i mešavinu metala u poređenju sa kontrolnim formulacijama bez dodavanja. Donja polovina izlaza pokazuje procenjenu razliku između svakog para srednjih vrednosti. Zvezdica je stavljena pored 7 parova, što ukazuje da ovi parovi ispoljavaju statistički značajne razlike sa nivoom poverenja od 95.0%. Na vrhu strane, identifikovane su 3 homogene grupe korišćenjem kolona X-ova. U okviru svake kolone, nivoi koji sadrže X-ove formiraju grupu srednjih vrednosti u okviru koje nema statistički značajnih razlika. Postupak koji se sada primenjuje za selekciju srednjih vrednosti je Fišerova procedura najmanje značajne razlike (LSD). Sa ovo metodom, postoji rizik od 5.0% da se svaki par srednjih vrednosti nazove značajno različitim kada je stvarna razlika jednaka 0. Značajan efekat na odnos se ispoljio za Cu(II) i mešavinu metalnih jona. Uticaj drugih metalnih jona bi mogao postati značajan tokom dužeg perioda čuvanja. Mešavina metalnih jona je sadržana u najvišoj ukupnoj koncentraciji i mogla bi predstavljati najgori slučaj. Međutim, zaključeno je da nekoliko metalnih jona koji su prisutni u alumu može doprineti degradaciji, i to svaki do različite mere. Ovi rezultati dalje podržavaju predloženi fundamentalni uzrok metalnim jonima katalizovane degradacije antigena. Treba naglasiti da eksperiment sa dodavanjem možda ne simulira u potpunosti realne uslove rezidualnih metalnih jona kao nečistoća koje su prisutne u alumu 4230. Metalni joni su inkorporirani u strukturu aluma, a lokalna koncentracija i orijentacija bi mogle biti različite od metalnih jona upotrebljenih u eksperimentima sa dodavanjem. Takođe je poznato da metalni joni (npr. Fe) imaju malu rastvorljivost u prisustvu fosfatnog jona (PO43-). Zbog toga su stvarna koncentracija rastvorljivih metalnih jona i doprinos metala prisutnih kao kompleks metal-fosfat na degradaciju JEV nepoznati.

4.4 Eksperiment 20110819: Priprema DP uzoraka sa različitim partijama aluma

[0157] Kao što je ranije opisano, studije sa dodavanjem mogu dati prvi dokaz o mogućoj nestabilnosti formulisanog antigena u prisustvu nekih metalnih jona, ali možda nisu potpuno reprezentativne za realne uslove gde se očekuje da ovi metalni joni koji su prisutni u aluminijum hidroksidu budu inkorporirani u trodimenzionalnu strukturu aluminijum hidroksid gela, što rezultuje različitim lokalnim koncentracijama i orijentacijom/dostupnošću. Da bi se prevazišla ova ograničenja bila je započeta jedna inicijalna studija radi simulacije realnih uslova. Samo jedna NIV (11A74) je bila formulisana sa različitim partijama aluma dobijenim od firme Brenntag koje su pokrivale široki opseg rezidualnih metala.

Formulisani uzorci vakcine su bili čuvani na 2-8°C i pod ubrzavajućim uslovima na 22°C. Sve ove partije aluma su sadržale rezidualne metalne jone u različitim nivoima. Partija 4230 je imala najviši nivo za Fe, Cu, Ni i V (vidi Tabelu 19). Treba naglasiti da je aktuelni sadržaj metalnih jona prisutnih u formulisanom proizvodu samo 1/20 koncentracije u osnovnom rastvoru aluma (2%). Treba naglasiti da valence metalnih jona ne mogu biti specifikovane pomoću ICP-MS. Analiza desorbovanog antigena pomoću ELISA uzoraka čuvanih na 22°C tokom 6 nedelja je prikazana u Tabeli 20.

[0158] Zajedničko standardno odstupanje je bilo izračunato za sve uzorke (zbirno ∼ 0.075) kao mera eksperimentalne neizvesnosti. Srednje vrednosti za odnos i 95% intervali poverenja (izračunato na zbirnoj bazi) su bile grafički prikazane u odnosu na pojedinačne formulacije (vidi Fig.10). Uzorci formulisani sa alumom 4230 su imali tendenciju prema nižem odnosu u poređenju sa drugim uzorcima. Međutim, razlike nisu bile suviše velike da bi se pokazale statistički značajne razlike između različitih formulacija.

5 Rezime

[0159] Pokazano je da metalni joni doprinose degradaciji inaktivirane JEV pod uslovima ubrzanog čuvanja (22°C). U studijama sa dodavanjem bila je upotrebljena viša koncentracija rezidualnih metalnih jona (opseg 100 -1000 ng/mL) od one koja je bila prisutna u FVL formulisanom sa partijom aluma 4230 (npr. Fe∼310 ng/mL; Cr∼64ng/mL; Ni∼52ng/mL). Cu sadržaj u FVL se može proceniti samo na 3ng/mL bazirano na ICP-MS podacima 2% osnovni rastvor aluma, pošto je LOD 25 ng/mL. Viša koncentracija metala i temperatura čuvanja su bile izabrane tako da povećaju brzinu bilo koje potencijalne reakcije degradacije. U stvari, za FVL JEV09L37 gubitak potencije je usledio posle 11 meseci čuvanja na 2-8°C. Takođe je pokazano da metali mogu da formiraju nerastvorljive komplekse sa fosfatnim jonima, što čini teškom procenu aktuelnih nivoa prisutnih metala.

[0160] U eksperimentima sa dodavanjem, rezultati ELISE su pokazali statistički značajne strukturne promene na površini virusa već za 4 nedelje na 22°C u prisustvu metalnih jona. Pokazano je da su ELISA odnosi za formulacije koje sadrže Cu(II) i mešavinu metalnih jona (koja sadrži Fe(II), Fe(III), Co(II), Cu(II) i Zn(II)) bili statistički značajno niži u poređenju sa kontrolnom formulacijom bez dodavanja. Cu(II) je takođe bio pronađen u partiji aluma 4230 (2% osnovni rastvor) sa 64ng/mL, što odgovara ∼3ng/mL u FVL. U svim drugim partijama aluma (2%) Cu(II) sadržaj je bio < 25ng/mL (ispod granice detekcije).

[0161] Za eksperimente sa formulacijama antigena uz korišćenje različitih partija aluma, bilo je potrebno duže vreme čuvanja (>6 nedelja na 22°C) na ubrzavajućim uslovima. Postoji tendencija da formulacije pripremljene sa alumom 4230 ispolje niže odnose ELISE u poređenju sa drugim partijama. Sporija brzina degradacije u poređenju sa formulacijom sa dodavanjem bi mogla doprineti nižem sadržaju metalnih jona u komercijalnim partijama aluma. Takođe je uočeno da antigen ispoljava veću stabilnost za pH 7.5-8 u poređenju sa pH 7 i da PS fragmenti ne doprinose bilo kojoj reakciji degradacije. Ovi rezultati se dobro slažu sa DOE rezultatima opisanim u Primeru 1.

Primer 3

[0162] Kao deo ispitivanja izvan specifikacije koja se odnosi na FVL JEV09L37, kao najverovatniji fundamentalni uzrok uočenog gubitka potencije je bila određena upotrebljena partija aluminijum hidroksida (partija 4230). Aluminijum hidroksid (koji se naziva alumom u toku procesa proizvodnje JE-PIV) je kupljen od firme Brenntag Biosector kao autoklavirana suspenzija pod nazivom "Alhydrogel® Aluminijum Hidroksid Gel Adjuvansi". Svaka šarža je bila sterilisana zračenjem pre upotrebe u procesu proizvodnje JEV.

[0163] Više različitih šarži Alhydrogela® je bilo analizirano u pogledu izgleda, sadržaja metalnih jona i fizičkih svojstava.

1 Uvod

1.1 Aluminijum hidroksid

[0164] Brenntag Biosector’s Alhydrogel® je imao specifikovani sadržaj aluminijuma od 10 mg/mL, koji se prevodi u 2% Al2O3 i 3% Al(OH)3, respektivno. Sledeće specifikacije su azot (maks 0.005%), slobodni sulfat (maks 0.05%), ukupni sulfat (maks 0.1%) i pH (6.5 ± 0.5). On je imao rok trajanja od 26 meseci kada je čuvan na sobnoj temperaturi.

1.2 Generisanje aluminijum hidroksida

[0165] Alhydrogel® 2% (naziva se aluminijum hidroksidom) je proizvela firma Brenntag (CAS br. 21645-51-2).

1.3 Upotreba partija aluminijum hidroksida u proizvodnji JEV

[0166] Za proizvodnju šarže komercijalne JEV vakcine do sada je bilo upotrebljeno 5 različitih partija Brenntag Alhydrogela® 2%.

2 Definicije & skraćenice

[0167]

Alhydrogel 2% rastvor aluminijum hidroksida (takođe se naziva alum)

DS/DP Lekovita supstanca / lekoviti proizvod

ESG Environmental Scientifics Group (Naučna grupa za životnu sredinu)

F-AAS Atomska apsorpciona spektrometrija sa plamenom tehnikom

FVL Partija finalne vakcine

GF-AAS Atomska apsorpciona spektrometrija sa elektrotermalnom tehnikom

ICP-MS Masena spektrometrija sa indukciono spregnutom plazmom

JEV Virus japanskog encefalitisa

JE-PIV Prečišćeni inaktivirani virus japanskog encefalitisa

LOQ Granica kvantifikacije

P&TD Patch & Technical Development

PSD Raspodela veličine čestica

PZC Tačka nultog naelektrisanja

QCI Kontrola kvaliteta imunologije

3 Materijali i metode

3.1 Šarže Alhydrogela®

[0168] Alhydrogel® 2% partije: 3877, 4074, 4187, 4230, 4414, 4470, 4539, 4563, 4587, 4621 (nisu sve ovde navedene partije aluma bile upotrebljene u formulaciji JE-PIV) Alhydrogel® 2% 7x isprane partije: 4577, 4580, 4596 (potiču od firme Brenntag, nisu tipični 2% alum koji je primljen za formulaciju)

3.2 Alhydrogel® PSD merenja

[0169] Raspodela veličine čestica aluminijum hidroksid (PSD) je bila analizirana na Malvern Mastersizer 2000μP sistemu sa uzorkom ćelija od 20mL. Alhydrogel® 2% polugotova supstanca je bila razređena na 1:20 u vodi i onda je bilo dodato 1mL uzorka ćelija. Finalno razređivanje uzoraka u uzorak ćelija je zbog toga bilo 400-struko (0.005% aluminijum hidroksida).

3.3 Alhydrogel® merenja zeta-potencijala

[0170] Zetapotencijal i nulta tačka naelektrisanja (PZC) je bila izmerena na Malvern Zetasizer ZS sistemu opremljenom sa MPT-2 autotitratorom. Alhydrogel® 2% polugotova supstanca je bila razređena 1:20 u PBS i uravnotežena je preko noći na sobnoj temperaturi. Za snimanje krive naelektrisanja-titracije pH je bio podešen uz korišćenje 100mM HCl i 100mM NaOH rastvora. PZC je bila određena ekstrapolacijom nultog naelektrisanja u titracionom dijagramu (presek titracione krive i xose). Nulta tačka naelektrisanja odgovara pH vrednosti za koju površina uzorka nema nikakvo naelektrisanje.

3.4 Analiza metalnih jona u aluminijum hidroksidu

[0171] Izabrani metalni joni su bili analizirani bilo masenom spektrometrijom sa indukciono spregnutom plazmom (ICP-MS), atomskom apsorpcionom spektrometrijom sa plamenom tehnikom (F-AAS) i atomskom apsorpcionom spektrometrijom sa elektrotermalnom tehnikom (GF-AAS) u Medical Laboratory Bremen (Nemačka). Ukratko, uzorci koji su sadržali aluminijum hidroksid su bili tretirani sa konc. HNO3 pod dejstvom toplote sve dok nije dobijen bistri rastvor. Bisti rastvor je onda dalje razređen i analiziran. Bili su određeni prisustvo i sadržaj sledećih metalnih jona: Pb, Cd, Cr, Co, Fe, Cu, Ni, Ag, W i Al. U zavisnosti od razređenja uzorka, granica kvantifikacije (LOQ) je bila od 5 do 25 ng/mL.

[0172] Pored toga, izvedeno je polu-kvantitativno skeniranje 70-Elemenata od strane ESG (UK) uz korišćenje kombinacije ICP-MS (Agilent 7500ce) i ICP-AES (Perkin Elmer Optima 4300DV), koje su bile kalibrisane uz korišćenje sertifikovanih standarda. Skeniranje elemenata je metod skeniranja i nije osetljiv kao analiza metala u tragovima za izabrane metale, koje je izvršeno od strane Medical Laboratory Bremen. Međutim, takav skrining daje dobar pregled u vezi prisustva i nivoa izvesnih metala.

4 Rezultati

4.1 Određivanje raspodele veličine čestica Alhydrogela®

[0173] Tabela 21 sumira PSD podatke za dve potpartije od obe partije Alhydrogela® 4230 i 4740. Rezultati raspodele su prikazani na Fig.11. Srednja čestica je imala ∼2-4μm sa populacijama manjih (<1μm) i većih (>20μm) čestica koje su bile prisutne u sva četiri uzorka. Četiri testirana uzorka Alhydrogela® nisu ispoljila značajne razlike u pogledu raspodele srednje veličine čestica.

4.2 Merenja zeta-potencijala

[0174] Dve potpartije svake od Alhydrogel® partija 4230 i 4740 (2% osnovni rastvor razređen 20-struko u PBS i uravnotežen preko noći na ST pre analize) su bile analizirane u vezi određivanja nulte tačke naelektrisanja. Tabela 22 sumira rezultate PZC za četiri uzorka koji ispoljavaju veoma sličan PZC u PBS puferu. Titracione krive su prikazane na Fig.12. Nije mogla biti uočena razlika kod titracionih krivih i PZC za četiri analizirana uzorka.

4.3 Određivanje sadržaja rezidualnih metalnih jona u Alhydrogel® šaržama

[0175] Aktuelne granice za Fe u 2% rastvorima aluminijum hidroksida u skladu sa Ph. Eur. su 15 ppm (= 15 μg/mL) i ukupni maksimum od 20 ppm (= 20 μg/mL) za druge teške metale (kao što je Pb).

Međutim, koncentracija od 15 ppm Fe bi odgovarala 0.27 mM Fe u rastvoru. Uzimajući u obzir da čak i tragovi količina rezidualnih metalnih jona mogu katalizovati mnoštvo reakcija degradacije kod proteina (npr. oksidaciju, aktivaciju proteaza itd.) i da metali ostaju stabilni u rastvoru, razlike u sadržaju metalnih jona između partija aluminijum hidroksida bi mogle dovesti do razlika u stabilnosti antigena tokom vremena.

[0176] Koncentracije više metalnih jona u komercijalno raspoloživim partijama aluminijum hidroksida su bile analizirane uz korišćenje ICP-MS. Rezultati ovih analiza su sumirani u Tabeli 23. Partije 4074, 4230, 4470, 4414 i 4539 su bile upotrebljene u proizvodnji komercijalne šarže JEV. Pošto 2% Alhydrogel® osnovni rastvor odgovara koncentraciji Al od 10 mg/mL, kvantifikacija sadržaja Al u različitim uzorcima se može upotrebiti kao referenca za rezultate dobijene za druge metalne jone. Zaista, mogao je da bude izmeren prosečni sadržaj aluminijuma od 10.3 mg/mL, što pokazuje preciznost i reproduktibilnost postupka.

[0177] Kada se upoređuju različite partije Alhydrogela® mogu se uočiti velike varijacije količina kontaminirajućih metalnih jona. Najznačajniji kontaminirajući metalni joni su Fe, Cr i Ni, koji su bili detektovani u svim šaržama. Pored toga, partija 4230 je sadržala detektabilne količine Cu, koji je bio ispod LOQ u svim drugim šaržama.

[0178] Međutim, treba naglasiti da nijedan od ovih metala nije bio detektovan u količinama bliskim gore navedenim specifikacijama za Alhydrogel®. Na primer, najveća koncentracija gvožđa nađena u partiji 4230 je bila 5.6 μg/mL ili približno 40% dozvoljene koncentracije.

"Poboljšani" Alhydrogel® je ispran 7 puta sa vodom tokom koraka prečišćavanja umesto samo 4 puta za standardni Alhydrogel®. Da bi se testiralo da li bi ovi dodatni koraci ispiranja rezultovali smanjenom kontaminacijom metalnim jonima, bile su analizirane tri različite partije (4580, 4596 i 4577). Rezultati su uključeni u Tabelu 23. Nije mogla biti uočena razlika u metalnim jonima poređenjem Alhydrogela® standardnog kvaliteta, što sugeriše da su metalni joni čvrsto vezani za površinu čestica aluminijum hidroksida ili da se u stvari ko-talože tokom procesa proizvodnje.

[0179] Fig.13 prikazuje poređenje različitih analiziranih partija Alhydrogela®. Ukupni sadržaji kontaminirajućih metalnih jona za sve testirane kontaminirajuće elemente prikazani apsolutnim udelima, za tri glavna metala Fe, Cr i Ni, su prikazani u različitim bojama. Kao što se može videti, partija 4074 ima veoma malo kontaminirajućih metalnih jona u poređenju sa većinom drugih analiziranih šarži. Samo partija 3877 je ispoljila sličnu kontaminaciju partije, dok je partija 4230 ispoljila daleko najvišu kontaminaciju od svih šarži analiziranih tokom ovog ispitivanja.

[0180] Tokom eksperimentalnog testiranja bila je uočena velika varijacija u sadržajima metalnih jona između različitih šarži Alhydrogela® (vidi Fig.13). Da bi se testiralo da li su ovi kontaminirajući metalni joni locirani u frakciji aluminijum hidroksida ili supernatantu, partija 4230 je bila razdvojena na supernatant i sedimentnu frakciju (vidi Tabelu 24). Kao što se može videti, u supernatantu je moglo biti detektovano manje od 2% metalnih jona, što ukazuje da su svi kontaminirajući metalni joni vezani za površinu čestica aluminijum hidroksida ili unutar struktura čestica. Zato se može proceniti da je lokalna koncentracija metalnih jona najmanje 50-100 puta veća, pošto je zapremina čvrste frakcije (zapremina pelete aluma posle centrifugiranja) od 0.1% Al2O3 (što odgovara 0.5 mg/mL Al) upotrebljene u formulaciji JEV vakcine pribl.10-20μL po 1000μL FVL.

5 Rezime

[0181] Alhydrogel® se upotrebljava kao adjuvans u aktuelnoj formulaciji JEV vakcina sa finalnom koncentracijom od 0.1%. Tokom ispitivanja rezultata potencije izvan specifikacija (engl. out-ofspecification, skr. OOS) za proizvodnju FVL JEV09L37 je bila inicirana evaluacija proizvodnog procesa Alhydrogel®. Bilo je analizirano ukupno 13 različitih partija Alhydrogel® u pogledu prisustva kontaminirajućih metalnih jona koji bi mogli smanjiti stabilnost proteina.

[0182] Bile su uočene velike varijacije koncentracije broja metalnih jona za različite partije Alhydrogela®. Kada su analizirani sirovi materijali, pokazalo se da su ove kontaminacije bile prisutne u istim koncentracijama koje su nađene u Alhydrogelu.

[0183] Viši nivoi Fe, Ni i Cu jona su bili uočeni u Alhydrogel® partiji 4230 kada je upoređena sa drugim ispitivanim partijama. Partija 4230 je bila jedina kod koje su detektovani rezidualni Cu joni. Ova partija 4230 je bila upotrebljena za formulaciju FVL JEV09L37.

[0184] Kada su analizirani supernatant i nerastvorna frakcija šarže Alhydrogela®, ovi kontaminirajući metalni joni su se mogli naći samo u talogu, što je ukazivalo da su ovi joni vezani za površinu čestica aluminijum hidroksida ili da su u stvari deo čestice.

[0185] Mada je makroskopski i po kompoziciji različita od drugih partija Alhydrogela® upotrebljenih za proizvodnju JEV, partija 4230 je ispunila sve zahteve postavljene od strane Ph. Eur. Takođe fizička karakterizacija (raspodela veličine čestica i tačka nulte promene) nije pokazala razlike između partije 4230 i drugih partija Alhydrogela® koje nisu ispoljile ove visoke kontaminacije metalnim jonima.

Primer 4

1.1. Materijali, oprema i metode

1.2. Oprema

[0186]

Analitička vaga (očitavanje od 0.1mg; npr. Mettler Toledo XP205DR/M)

Precizna vaga (očitavanje od 0.1g; npr. Mettler Toledo, Model br. XS6002S Delta Range) Filterske jedinice od 0.22μm (npr. Stericup kat.br. SCGPV01RE) ili filterski sistem od 0.2μm (npr.

50mL Millipore Steriflip)

Zamrzivač (- 20°C) i Ultra-zamrzivač (-80°C)

Frižider (+ 2 do 8°C)

Magnetni mešač (npr. KIKA Labortechnik RCT basic) i magnetne šipke za mešanje

Ispirač za mikroploče: npr. BioTek ELx405

Čitač mikroploča: npr. BioTek Synergy 2 i Gen5 Secure softver

Inkubator za mikroploče (37°C)

Mikrotitarska zaštitna traka (npr. Thermo Electron 9503130)

Višekanalne pipete i vrhovi (npr. Eppendorf Research Pro 50-1200μL,

Eppendorf Research, 10-100μL)

pH metar (npr. WTW Series ino Lab, Terminal 740 i pH/Cond.740)

Pipete i vrhovi (npr. Eppendorf Research, 0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 100-1000μL, 500-5000μL) Pipetor (npr. IBS Biosciences Pipetboy)

PP Epruvete 15mL (npr. Sarstedt 62.515.006) ili PP epruvete 50mL (npr. Greiner 227261) Rezervoar za reagens od 50mL (npr. Corning Incorporated 4870)

Serološke pipete (npr. Falcon, 2mL, 5mL, 10mL, 25mL, 50mL)

Titertube Mikro Epruvete - Bulk (BioRad 223-9391)

Vrtložni mikser (npr. VWR Analog Vortex Mixer, Model br.945304)

Eppendorf LoBind epruvete od 1.5mL ili 2.0mL (kat. br.0030108.116, kat. br.0030108.132, respektivno)

Mikroploča sa 96 bunarčića (F96 Cert. Maxisorp Nunc-Immunoplates)

Za analizu DP uzoraka, dodatno:

[0187]

Stiba centrifuga (npr. Beckman coulter, Mikrofuge 16 Centrifuge, kat.br. A46473)

Orbitalni šejker (npr. Eppendorfer Thermomixer compact)

PP epruvete od 50mL (npr. Greiner 227261)

1.3. Reagensi

[0188]

PBS 10x (npr. Gibco, kat.br.14200-083)

Tween 20 (npr. Sigma kat. br. P7949)

2M sumporna kiselina (volumetrijski rastvor, npr. Fisher, kat. br. J/8410/17) Dejonizovana voda, npr. (Milli-Q, 18.2Ω)

Kapsule natrijum karbonata - bikarbonata (npr. Sigma, kat. br. C3041)

Hlorovodonična kiselina (HCl) 1mol/L (npr. Merck, kat. br.1.09057.1000)

Natrijum hidroksid (NaOH) 1mol/L (npr. Merck, kat. br.1.09132.1000)

Glicerol (npr. Sigma)

Za analizu DP uzoraka, dodatno:

[0189]

Di-kalijum hidrogen fosfat trihidrat (npr. Sigma, kat. br. P5504)

Kalijum dihidrogen fosfat (npr. VWR, AnalaR Normapur, kat. br.26936.260)

Albumin, goveđi serumski (BSA), ELISA kvaliteta (npr. Sigma, kat. br. A3059)

TMB supstrat (npr. BioFX, TMBW-1000-01)

Konjugat magareće anti zečije IgG HRP Konjugat (Jackson Immuno Research, kat. br.711-035-152)

Rekonstitucija:

[0190] Sadržaj 1 bočice (0.4mg) je rekonstituisan u 0.5mL dejonizovane vode i pažljivo je mešan sve do potpunog rastvaranja. Dodato je 0.5mL glicerola i mešano je dalje sve do homogenizacije. Alikvoti su čuvani na -20°C sve do upotrebe. Inaktivirani JEV referentni standard (Intercell Biomedical Ltd.) Prečišćeni ovčiji anti-JEV (Intercell Biomedical Ltd.)

Prečišćeni zečiji anti-JEV (Intercell Biomedical Ltd.)

1.4. Rastvori

a) 0.05M karbonatnog pufera sa pH 9.6 (upotrebljen za oblaganje ELISA ploča)

[0191] Za 100mL pufera, rastvoriti jednu kapsulu bi-karbonatnog /karbonatnog pufera u 100mL dejonizovane vode. Proveriti pH i podesiti na 9.6 ± 0.1 sa HCl ili NaOH, ako je potrebno. Upotrebiti samo na dan pripreme. Čuvati ELISA pufer za prevlačenje na ST tokom dana upotrebe, a onda odbaciti.

b) ELISA pufer za ispiranje i deo bloka / razređivača za uzorke (PBS-T)

[0192] Pripremiti približno 1 litar za svaku upotrebljenu ploču. Razrediti 10x PBS zalihu 1+9 u dejonizovanoj vodi, dobro promešati i proveriti pH (7.4 /- 0.1), podesiti sa 1M HCl ili 1M NaOH, ako je potrebno. Dodati 0.05% (v/v) Tween20, dobro promešati.

npr. ELISA pufer za ispiranje (PBS-T) [1L]:

100mL 10x PBS

900mL dejonizovana voda

Dobro promešati, proveriti/podesiti pH (7.4 /- 0.1).

0.5mLTween20

Dobro promešati.

[0193] Upotrebiti samo na dan pripreme; čuvati ELISA pufer za ispiranje na ST tokom dana upotrebe, a onda odbaciti.

c) Blokirajući rastvor: 5% BSA u PBS-T

[0194] Pripremiti približno 25mL za svaku ploču. Odmeriti potrebnu količinu PBS-T u čistu staklenu bocu uz korišćenje serološke pipete. Dodati čistu magnetnu šipku za mešanje. Izmeriti potrebnu količinu BSA, dodati na površinu PBST i mešati nežno na magnetnom mešaču sve dok sav BSA ne pređe u rastvor. Filtrirati rastvor uz korišćenje filtera od 0.2μm (Steriflip filterski sistem ili filter za špric). npr. Blokirajući rastvor [100mL]

5g BSA

100mL PBS-T

[0195] Upotrebiti samo na dan pripreme; čuvati blokirajući rastvor na ST tokom dana upotrebe, a onda odbaciti.

d) Razređivač za uzorke: 1% BSA u PBS-T

[0196] Pripremiti kao što je gore navedeno, ali uz korišćenje 1g BSA po 100mL PBS-T, po ploči je potrebno približno 25mL.

npr. razređivač za uzorke [100mL]

1g BSA

100mL PBS-T

[0197] Upotrebiti samo na dan pripreme; čuvati razređivač za uzorke na ST tokom dana upotrebe, a onda odbaciti.

Za analizu DP uzoraka, dodatno:

e) 1x PBS

[0198] Pripremiti 1 deo 10x PBS sa 9 delova dejonizovane vode

npr.1x PBS [100mL]

10mL 10x PBS

90mL dejonizovana voda

[0199] Upotrebiti samo na dan pripreme; čuvati 1x PBS na ST tokom dana upotrebe, a onda odbaciti.

f) 20x ELISA pufer

[0200] Izmeriti odgovarajuću količinu BSA u podesni kontejner da bi se napravio 20x rastvor. Dodati odgovarajuću zapreminu 1x PBS. Dodati Tween20 finalnoj koncentraciji od 0.05%. Mešati na magnetnom mešaču sve dok se BSA potpuno ne rastvori. Filtrirati rastvor kroz filter od 0.2μm (korišćenjem Steriflip filterskog sistema ili filtera za špric) u sterilni kontejner (i alikvot, ako je potrebno). npr.20x ELISA pufer [25mL]

5g BSA

25mL 1xPBS

12.5μL Tween20

[0201] Rastvor se može čuvati na 2-8°C tokom 1 nedelje.

g) 2x ELISA pufer

[0202] Priprema se razređivanjem 20x ELISA pufera sa 1x PBS (1 deo 20x ELISA Pufer i 9 delova 1x PBS).

npr.2x ELISA Pufer [20mL]

2mL 20x ELISA pufer

18mL 1x PBS

[0203] Upotrebiti samo na dan pripreme; čuvati 2x ELISA pufer na ST tokom dana upotrebe, onda odbaciti.

h) Desorpcioni pufer

[0204]

○ Kalijum fosfatni osnovni rastvor: napraviti 3x osnovni rastvor kalijum fosfata (2.4M) rastvaranjem odgovarajuće zapremine di-kalijum fosfat trihidrata i kalijum dihidrogen fosfata u dejonizovanoj vodi. Staviti magnetni mešač i kada se završi rastvaranje dopuniti do potrebne zapremine, proveriti da li je pH rastvora 8.0+/- 0.1. Filtrirati kroz filter od 0.2μm.

npr.3x osnovni rastvor kalijum fosfata (2.4M) [50mL]

23.963g Di-kalijum fosfat trihidrat

2.041g Kalijum dihidrogen fosfat

dopuna do 50mL Dejonizovana voda

Čuvati na 2°-8°C do 1 mesec.

○ Napraviti desorpcioni pufer radne jačine (0.8M kalijum fosfatni pufer koji sadrži 1% BSA i 0.05% Tween20) dodavanjem odgovarajuće zapremine zalihe kalijum fosfata (2.4M), Tween20 i BSA potrebnoj zapremini dejonizovane vode. Mešati pažljivo i upotrebiti na dan pripreme.

npr. desorpcioni pufer radne jačine [15mL]

5mL Kalijum fosfat (2.4M)

7.5μL Tween20

0.15g BSA

10mL Dejonizovana voda

Čuvati desorpcioni pufer radne jačine na ST tokom dana upotrebe.

1.5. Testirani uzorci i antitela

Testirani uzorci:

[0205]

○ Lekovita supstanca i / ili NIV (različite šarže)

○ uzorci JEV vakcine (finalna polugotova vakcina i partija finalne vakcine) Inaktivirani JEV referentni standard (neutralizovani inaktivirani virus - NIV) (Intercell Biomedical Ltd.)

Poliklonsko antitelo:

[0206]

○ Antitelo za oblaganje: prečišćeni ovčiji anti-JEV (Intercell Biomedical Ltd.)

○ Primarno antitelo za detekciju: prečišćeni zečiji anti-JEV (Intercell Biomedical Ltd.)

[0207] Sekundarno konjugovano antitelo: konjugat magareći anti-zečiji HRP (Jackson Immuno Research kat. br.711-035-152)

2 Procedura

2.1. Oblaganje ploče

[0208]

○ Označiti ploču sa brojem ploče, datumom i analitičarem.

○ Pripremiti sveži 0.05M karbonatni pufer (pH 9.6) na dan oblaganja ploče. Ostaviti približno 12mL za svaku obloženu ploču.

○ Uzeti potreban broj alikvota antitela za oblaganje iz zamrzivača i ostaviti da se otope na ST. Pripremiti razređeni prečišćeni ovčiji anti-JEV u karbonatnom puferu. Dobro promešati preokretanjem epruvete.

○ Korišćenjem višekanalne pipete, naneti 100μL/bunarčiću na Maxisorp ploču sa 96 bunarčića u toku 15min od pripreme razređenog antitela.

○ Pokriti sa mikrotitarskom zaptivnom trakom i inkubirati od 17 do 72h na 2-8°C.

2.2. Ispiranje

[0209]

○ Uzeti ploču iz frižidera i ostaviti da se zagreje do sobne temperature.

○ Isprati ploču, odnosno ploče sa ispiračem mikrotitarskih ploča 3 puta uz korišćenje odgovarajućeg programa za pranje (300μL po bunarčiću, tri puta, finalna podela). Posle toga: odstraniti eventualno zaostali pufer za ispiranje odlivanjem. Preokrenuti ploču i obrisati je čistim papirnim ubrusom. Ne dozvoliti da se mikrotitarska ploča osuši između koraka ispiranja i dodavanja reagensa.

2.3. Blokiranje

○ Pripremiti blokirajući rastvor 5% (w/v) BSA u PBS-T kao gore.

○ Naneti 200μL blokirajućeg rastvora po bunarčiću, pokriti ploču, odnosno ploče sa pločom za pokrivanje i inkubirati na 37°C tokom 1 sata /- 10 min.

2.4. Priprema razređivanja za standardnu krivu

[0211]

○ Uzeti NIV referentni standard iz zamrzivača, ostaviti da se otopi na ST, dobro promešati. Pripremiti 1AU/mL razređivanja od zalihe aktuelnog referentnog standarda; upotrebiti najmanje 20μL NIV referentnog standarda po razređivanju. npr. NIV referentni standard

Prethodno razređivanje:

Koncentracija: 235AU/mL (partija br.03/2009)

Da bi se pripremio 1AU/mL radnog standarda razređenog rastvora, treba ga razrediti od 1 do 235 u razređivaču za uzorke:

4680 μL razređivač za uzorke

20 μL NIV referentni standard

○ Onda pripremiti sledeće radne standardne rastvore od 1AU/mL prethodnim razređivanjem:

0.8 AU/mL, 0.6 AU/mL, 0.4 AU/mL, 0.2 AU/mL, 0.1 AU/mL i 0.05 AU/mL u razređivaču za uzorke.

2.5. Uzorci za kontrolu kvaliteta

[0212]

a) Uzorci za kontrolu kvaliteta (QC) (na primer, sa 0.75, 0.30 i 0.18 AU/mL) bi trebali da budu napravljeni od svežeg NIV referentnog standarda prethodnim razređivanjem u vreme testa, a onda bi trebalo da se odbace kada se iskoriste.

b) Ove kontrole su deo kriterijuma podesnosti sistema i omogućavaju da se tokom vremena prate performanse testa.

2.6. Priprema testiranih uzoraka

Priprema lekovite supstance

[0213] Testirani uzorci lekovite supstance su primljeni za testiranje u nepoznatim koncentracijama. Oni će biti testirani u šest razređivanja u triplikatu. Razređivanja će biti napravljena nezavisno u opsegu standardne krive, npr. prethodnim razređivanjem od 1 u 15 ili drugim podesnim razređivanjem, a onda šest razređivanja sa puferom za uzorke.

Priprema NIV uzoraka

[0214] NIV uzorci će biti primljeni za testiranje u nepoznatim koncentracijama i prethodno su razređeni u opsegu standardne krive (npr.1 u 30 ili drugo podesno razređivanje), a onda će biti razređeni šest puta na isti način kao DS uzorci.

Priprema supernatanta lekovitog proizvoda

[0215]

a) Za analizu polugotovih-DP uzoraka dobro promešati uzorak vrtloženjem. Preneti tačno 1mL u LoBind Eppendorf epruvetu od 1.5mL.

Za analizu finalnog proizvoda preneti sadržaj 2 šprica uzoraka iz kontejnera (0.6mL po špricu) od iste partije u LoBind Eppendorf epruvetu 1.5mL. Promešati pažljivo sadržaj epruvete preokretanjem da bi se obezbedila homogenost DP i preneti tačno 1mL u svežu LoBind Eppendorf epruvetu od 1.5mL.

b) Centrifugirati epruvete, od kojih svaka sadrži 1mL DP, na 3300xg tokom 5 minuta.

c) Za svaki uzorak, pipetirati 25μL 20x ELISA pufera u svežu LoBind Eppendorf epruvetu.

d) Pažljivo odstraniti 475μL supernatanta bez remećenja alum pelete i preneti u epruvetu koja sadrži 20x ELISA pufera. Promešati nežno preokretanjem. Ponovo centrifugirati 2 min na 16,000xg. Čuvati uzorak na 2-8°C pre analize.

NAPOMENA: uzorci supernatanta DP pripremljeni na ovaj način bi trebali da budu izmereni upravo u triplikatu u inaktiviranoj JEV ELISI.

e) Pažljivo odstraniti što više rezidualnog supernatanta iz centrifugirane epruvete uz korišćenje pipete od 10-200μL bez remećenja alum pelete i odbaciti supernatant.

f) dobijena peleta je podvrgnuta proceduri desorpcije kao što je opisano dole.

Procedura desorpcije lekovitog proizvoda

[0216]

a) Dodati 158μL desorpcionog pufera radne jačine svakoj peleti koja je ostala u LoBind epruveti. b) Resuspendovati peletu pipetiranjem uz usisavanje i izbacivanje nekoliko puta da bi se obezbedila potpuna re-suspenzija pelete i homogenizacija uzorka.

c) Inkubirati uzorke tokom 10 min na ST na orbitalnom šejkeru na 500rpm.

d) Posle inkubacije centrifugirati uzorke na 3300xg tokom 5 minuta.

e) Za svaki uzorak pipetirati 250μL 2x ELISA pufera u svežu LoBind Eppendorf epruvetu.

f) Pažljivo odstraniti 83.3μL iz gornjeg dela supernatanta koji sadrži desorbovani proizvod bez remećenja pelete i preneti u epruvetu koja sadrži 2x ELISA pufera. Odstraniti preostali supernatant uz korišćenje pipete od 20-200μL bez remećenja pelete i odbaciti supernatant.

g) Dodati svakoj peleti još 158μL desorpcionog pufera radne jačine.

h) Izvesti još 2 ciklusa desorpcije (3 ukupno) sakupljanjem 3x 83.3μL desorbovanog materijala 250μL ELISA pufera u odgovarajuću epruvetu. Posle poslednjeg koraka, preostala peleta se može odbaciti.

i) Finalna koncentracija virusnog antigena u desorbovanom prikupljenom materijalu bi sada trebala da bude ista kao originalni 1mL DP iz koga je bio desorbovan. Zbog toga koncentracija sadržaja inaktiviranog JEV antigena izmerena u desorbovanom prikupljenom materijalu može biti u direktnoj relaciji u odnosu na originalni DP.

Napomena: analizirati desorbovane uzorke ELISOM na dan desorpcije.

j) Razrediti desorbovane DP uzorke:

[0217] Ovo će biti testirano sa šest razređivanja u triplikatu. Odgovarajuće prethodno razređivanje će biti izvršeno u opsegu standardne krive npr.1 u 15 (100μL do 1400μL razređivača) ili drugom podesnom razređivanju, a onda će biti napravljeno šest razređivanja 1 u 15 prethodnog razređivanja nezavisno uz korišćenje razređivača za uzorke.

2.7. Stavljanje uzorka i planiranje ploče

Pripremiti uzorke i standarde pre analize.

[0218] Posle blokiranja isprati ploču uz korišćenje ispirača ploča koji koristi JEV ELISA program. Posle toga, odstraniti eventualno zaostali pufer za ispiranje odlivanjem. Preokrenuti ploču i obrisati je čistim papirnim ubrusom. Ne dozvoliti da se mikrotitarska ploča osuši između koraka ispiranja i dodavanja reagensa.

Dodati 100μL/bunarčiću standarda / kontrola / uzoraka i pokriti sa pločom za pokrivanje i inkubirati 1 sat /- 10 min na 37°C.

Dodati 100μL razređivača za uzorke u sve bunarčiće koji nisu potrebni za testiranje.

2.8. Priprema primarnog antitela

[0219] Uzeti potreban broj alikvota primarnog antitela iz zamrzivača i ostaviti da se otopi na ST.

Pripremiti maks 15 min pre upotrebe zečijeg anti-JEV u razređivaču za uzorke uz podesno razređivanje. Posle inkubacije uzorka, isprati ploču uz korišćenje ispirača ploča koji koristi JEV ELISA program. Posle toga, odstraniti eventualno zaostali pufer za ispiranje odlivanjem. Preokrenuti ploču i obrisati je čistim papirnim ubrusom. Ne dozvoliti da se mikrotitarska ploča osuši između koraka ispiranja i dodavanja reagensa.

Dodati 100μL/bunarčiću razređenog primarnog antitela, pokriti sa pločom za pokrivanje i inkubirati 1 sat /- 10 min na 37°C.

2.9. Priprema konjugata sekundarnog antitela

[0220] Uzeti potreban broj alikvota konjugata sekundarnog antitela i ostaviti da se istopi na ST.

Pripremiti maks 15 min pre upotrebe rastvora magarećeg anti-zečijeg-HRP u razređivaču za uzorke; npr. za 1 u 10,000 razređivanje da bi se napravilo 1 u 100 prethodno razređivanje, a onda napraviti drugo razređivanje od 1 u 100.

[0221] Posle inkubacije primarnog antitela, isprati ploču uz korišćenje ispirača ploča koji koristi JEV ELISA program. Posle toga, odstraniti eventualno zaostali pufer za ispiranje odlivanjem. Preokrenuti ploču i obrisati je čistim papirnim ubrusom. Ne dozvoliti da se mikrotitarska ploča osuši između koraka ispiranja i dodavanja reagensa. Dodati 100μL/bunarčiću razređenog konjugata sekundarnog antitela, pokriti sa pločom za pokrivanje i inkubirati 1 sat /- 10 min na 37°C.

2.10. Inkubacija supstrata

[0222] Kada se doda konjugat, uzeti TMB iz frižidera sa 2-8°C. Pipetirati potrebnu zapreminu (12mL TMB po ploči) u epruvetu za centrifugiranje od 50mL, uz korišćenje serološke pipete. Ostaviti da TMB dostigne sobnu temperaturu u mraku. Posle inkubacije konjugata isprati ploču 3 puta sa ispiračem ploča uz korišćenjeJEV ELISA programa. Posle toga: odstraniti eventualno zaostali pufer za ispiranje odlivanjem. Preokrenuti ploču i obrisati je čistim papirnim ubrusom. Ne dozvoliti da se mikrotitarska ploča osuši između koraka ispiranja i dodavanja reagensa. Dodati 100μL/bunarčiću TMB i razvijati ploču u mraku na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta.

2.11. Zaustavljanje i očitavanje

[0223] Posle 10 minuta TMB inkubacije, zaustaviti razvoj dodavanjem 100μL/bunarčiću 2M sumporne kiseline. Očitati ploču na 450nm (referentni filter 630nm) u roku od 10 minuta od zaustavljanja uz korišćenje BioTek čitača i Gen5 Secure softvera.

2.12. Analiza podataka

Analiza NIV/DS podataka:

[0224] Gen5Secure softver će biti korišćen za izračunavanje % rekuperacije QCs, koncentracije x razređivanja, srednje koncentracije uzoraka korigovane za razređivanja, a ova vrednost će biti pomnožena sa 1.05 radi korekcije zbog dodavanja ELISA pufera.

Analiza DP podataka:

[0225] Gen5Secure softver će biti upotrebljen za izračunavanje % rekuperacije QCs, koncentracija x razređivanja i srednje koncentracije razređivanja uzoraka.

Za uzorke DP supernatanta:

[0226] Ako je koncentracija uzorka supernatanta ispod LLOQ testa (tj.0.05AU/ml), onda bi uzorak supernatanta trebalo da bude zabeležen kao <0.05 AU/ml

[0227] Ako je koncentracija uzorka supernatanta u okviru LOQs testa (tj. od 0.05AU/ml do 1.25AU/ml), onda je zabeležena vrednost koncentracije za uzorak supernatanta.

[0228] Ako je koncentracija uzorka supernatanta iznad ULOQ testa (tj.1.25AU/ml), onda bi priprema supernatanta lekovitog proizvoda trebalo da bude ponovljena. Uzorak supernatanta će biti ponovo testiran izvođenjem podesnog prethodnog razređivanja u opsegu standardne krive, praćenim sa 6 razređivanja uzorka. (uzorak desorbovanog lekovitog proizvoda ne mora da bude ponovljen.) Srednja koncentracija za razređivanja koja su u okviru LOQs testa (LLOQ od 0.05AU/ml do 1.25AU/ml) će biti snimljena vrednost koncentracije za uzorak supernatanta, uz uslov da je zadovoljena podesnost sistema i da su najmanje 4 od 6 razređenja uzoraka u okviru LOQs.

2.13. Kriterijumi prihvatljivosti testa

[0229]

a) Koeficijent korelacije za kalibracionu krivu mora biti > 0.980.

b) %CVs ≤15% za standarde i uzorke (izuzev DP supernatanta) za četiri najviše koncentracije razređivanja, %CV ≤15% za kontrole

c) Pojedinačni prazni ODs moraju biti ≤ 0.2.

d) Kontrole testa moraju biti u okviru specifikovanih definisanih granica (za sveže pripremljene kontrole 2 od 3 QCs bi trebalo da imaju uočene koncentracije u okviru ± 30% nominalne vrednosti; ili nivoa postavljenih tokom QC kvalifikacije) da bi test prošao.

e) Validnost testa će biti zabeležena na Gen5-print-out. Ako ploča ne zadovolji definisane kriterijume prihvatljivosti, test će se smatrati nevažećim.

2.14. Izveštavanje o podacima

NIV

a) Sadržaj antigena

[0230] Zabeležena vrednost za inaktivirani AU/mL je srednja vrednost koncentracija (koje su u okviru LOQs od 0.04 do 1.25AU/mL) izračunata za razređenja pojedinačnog uzorka korigovana odgovarajućim faktorima razređivanja, i srednja vrednost pomnožena korektivnim faktorom od 1.05 za uzimanje u obzir 5% zapremine 20x ELISA pufera koja je bila dodata svakom uzorku kada je bio uzet. Sadržaj antigena će biti zabeležen na Gen5 print-outu.

DS:

a) Identitet

[0231] Ako su apsorbanse uzoraka sa najnižim razređenjem (najvišom koncentracijom) veće od 3 standardna odstupanja iznad srednje vrednosti praznog, onda će rezultat biti zabeležen kao pozitivni b) sadržaj antigena

[0232] Zabeležena vrednost za inaktivirani AU/mL je srednja vrednost koncentracija (koje su u okviru LOQs od 0.04 do 1.25AU/mL) izračunata za razređenja pojedinačnog uzorka korigovana sa odgovarajućim faktorima razređivanja, i srednja vrednost pomnožena korektivnim faktorom od 1.05 za uzimanje u obzir 5% zapremine 20x ELISA pufera koja je bila dodata svakom uzorku kada je bio uzet. Sadržaj antigena će biti zabeležen na Gen5 print-outu.

Desorbovani DP:

a) Identitet:

[0233] Ako su apsorbanse uzoraka sa najnižim razređenjem (najvišom koncentracijom) veće od 3 standardna odstupanja iznad srednje vrednosti praznog rezultat će biti zabeležen kao pozitivan.

b) Sadržaj antigena

[0234] Zabeležena vrednost za inaktivirani AU/mL je srednja vrednost koncentracija (koje su u okviru LOQs od 0.05 do 0.08AU/mL) izračunata za razređenja pojedinačnog uzorka korigovana sa odgovarajućim faktorima razređivanja. Sadržaj antigena će biti zabeležen na Gen5 print-outu.

DP supernatant (stepen adsorpcije / stepen neadsorpcije):

[0235] Stepen adsorpcije je zabeležen u odnosu na lekovitu supstancu formulisanu sa aluminijum hidroksidom posle filtracije.

a) Za izračunavanje zabeležene vrednosti, zabeleženi sadržaj antigena (AU/mL) za odgovarajući DS uzorak (posle filtracije) korigovan za razređenje sa aluminijum hidroksidom (5%) će biti postavljen na 100% i procenat koncentracije izmerene u supernatantu (korigovan zbog dodavanja 5% ELISA pufera) će biti izračunat u odnosu na to. Vrednost koja se može zabeležiti će biti razlika između 100% i procenta izračunatog za supernatant. Rezultati će biti zabeleženi na 2 decimalna mesta.

Stepen neadsorpcije će biti izračunat kao što je dole navedeno, a rezultati će biti zabeleženi na 2 decimalna mesta.:

b) U slučaju da nerazblaženi supernatant ne sadrži merljivi antigen (tj. uočena koncentracija supernatanta je manja od LLOQ, gde je LLOQ = 0.05 AU/mL), LLOQ će biti upotrebljen za izračunavanje rezultata. Rezultat u ovom slučaju se beleži kao "veći od x%". Na primer, ako je izmeren DS uzorak kao 12.00AU/mL, a nije izmeren signal u supernatantu; sa LLOQ od 0.05AU/mL, onda je količina u supernatantu <0.05*1.05 = < 0.0525 AU/mL. Količina DS posle korekcije za pufer je 12.00*0.95 = 11.40AU/mL, a zabeleženi rezultat za stepen adsorpcije je < 100-0.0525/11.4*100 = > 99.54%. Stepen neadsorpcije će takođe biti zabeležen (tj.100 - % stepen adsorpcije).

Primer 5

Uvod:

[0236] Da bi se dalje ispitalo dejstvo koje dovodi do gubitka stabilnosti/potencije proizvoda JEV vakcine, bio je upotrebljen Ala-(His)6-OprF190-342-OprI21-83 (SEQ ID NO: 1, Fig.14) - koji se ovde takođe naziva "protein A" u preliminarnom testu skrininga koji je uključivao partije alhidrogela sa različitim sadržajima metala i sa dodavanjem bakarnih jona i sulfita.

Materijal:

[0237]

• Bakar(II)hlorid dihidrat (Sigma, narudžbina br.807483)

• 10xPBS (Gibco, narudžbina br.14200-091)

• 15ml Falcon epruvete (Greiner, kat. br.188724)

• Inkubator Infors HT Incubator Multitron Standard (InforsAG)

• Aqua bidest. (Fresenius Kabi, Art br.0712221/01 A)

Priprema osnovnih rastvora:

[0238]

• Osnovni rastvor bakra(II)

20 mM osnovnog rastvora bakra(II) je bilo pripremljeno rastvaranjem 341 mg bakar(II)hlorid dihidrata u 100 mL aqua bidest.

• Natrijummetabisulfitni osnovni rastvor

200 mM natrijummetabisulfitnog osnovnog rastvora je bilo pripremljeno rastvaranjem 1.52 g natrijummetabisulfita u 35 mL PBS. Ovom rastvoru je bio podešen pH na 7.3 sa NaOH i dopunjen je do zapremine od 40 mL sa PBS. Rastvor je onda bio filtriran preko filtera za špric od 0.2μ.

Priprema radnih rastvora

[0239] Radni rastvori su bili pripremljeni razređivanjem osnovnih rastvora metala sa aqua bidest. i sterilnim filtriranjem preko filtera za špric od 0.2μ. (Mini Kleenpak 25mm- Pall)

Priprema puferskih rastvora

• 1⁄3 PBS 0.9% NaCl

[0240] 1 x PBS puferski rastvor je bio pripremljen 1:10 razređenjem 10 x PBS sa aqua bidest. pH ovog puferskog rastvora je bio 7.5. PBS puferski rastvori podešeni na pH 7.3 i 8.0 su bili pripremljeni podešavanjem pH sa HCl ili NaOH, respektivno.

9 g NaCl je bilo rastvoreno u 333mL puferskog rastvora sa pH 7.3 ili pH 8.0, a onda je dopunjeno do 1000 mL sa aqua bidest., što je bilo praćeno filtriranjem preko filtera na vrhu boce od 0.2μ.

Priprema uzorka:

[0241] Formulacije proteina A i različite partije alhidrogela (partija 4230 & partija 4074) su bile pripremljene u 1⁄3 PBS 0.9% NaCl sa dve različite pH vrednosti i bio im je dodat sulfit prema sledećoj šemi:

[0242] Uzorci 1, 6, 11 i 16 su bili čuvani na 4°C (referentni uzorci). Svi drugi uzorci su bili inkubirani na 37°C tokom 96 sati.

[0243] Posle 96 sati svi uzorci su bili podvrgnuti proceduri desorpcije da bi se izdvojio antigen iz alhidrogela. Desorbovani antigen je bio analiziran pomoću RPC.

Rezultati:

[0244] Rezultati pokazuju ozbiljnu degradaciju antigena Proteina A u prisustvu sulfita. Degradacija je bila izraženija u uzorcima formulisanim sa alhidrogelom sa većim sadržajem metalnih nečistoća.

Tabela 1 : Sadržaj metalnih јопа u šaržama aluminijum hidroksida 4230 i 4074 analiziranim pomoću ICP-MS.

Tabela 2: DOE šema pipetiranja

Tabela 2 nastavak

Tabela 2 nastavak

Tabela 2 nastavak

Tabela 3: poređenja rastvorljivih materija iz čepa i JEV09L37 SN. Svi pikovi sa površinom >

0.1mAU.min su uključeni u ovu tabelu.

Tabela 5: Analiza varijanse za odnos monoklonske/poliklonske ELISE posle čuvanja od 4 nedelje na 22°C

Analiza varijanse za odnos posle 4 nedelje

izvor suma kvadrata Df srednji kvadrat F-odnos P-vrednost A:pH 0.02205 1 0.02205 5.48 0.0326 B:alum 0.117612 1 0.117612 29.20 0.0001 C:PS fragmenti 0.0008 1 0.0008 0.20 0.6618 D:ekstraktibilne materije 0.0008 1 0.0008 0.20 0.6618 E:formalin 0.0242 1 0.0242 6.01 0.0261 AB 0.0001125 1 0.0001125 0.03 0.8694 AC 0.00045 1 0.00045 0.11 0.7425 AD 0.01125 1 0.01125 2.79 0.1141 AE 0.00405 1 0.00405 1.01 0.3309 BC 0.0000125 1 0.0000125 0.00 0.9563 BD 0.0010125 1 0.0010125 0.25 0.6229 BE 0.0006125 1 0.0006125 0.15 0.7017 CD 0.0008 1 0.0008 0.20 0.6618 CE 0.0008 1 0.0008 0.20 0.6618 DE 0.0072 1 0.0072 1.79 0.1999 Ukupna greška 0.0644375 16 0.00402734

Ukupna (kor.) 0.2562 31

R-kvadratno = 74.8488 procenata

R-kvadratno (podešeno za d.f.) = 51.2695 procenata

Standardna greška proc. = 0.0634614

Srednja apsolutna greška = 0.0352734

Durbin-Watson statistika = 1.47556

Tabela 6: Analiza varijanse za odnos monoklonske/poliklonske ELISE posle čuvanja na 22°C tokom 8 nedelja

Analiza varijanse za odnos posle 8 nedelja

izvor suma kvadrata Df srednji kvadrat F-odnos P-vrednost A:pH 0.102378 1 0.102378 11.19 0.0041 B:alum 0.275653 1 0.275653 30.13 0.0000 C:PS fragmenti 0.00300312 1 0.00300312 0.33 0.5747 D:ekstraktibilne materije 0.0108781 1 0.0108781 1.19 0.2917 E:formalin 0.0318781 1 0.0318781 3.48 0.0804 AB 0.00137813 1 0.00137813 0.15 0.7031 AC 0.00382812 1 0.00382812 0.42 0.5269 AD 0.00137813 1 0.00137813 0.15 0.7031 AE 0.0166531 1 0.0166531 1.82 0.1961 BC 0.000253125 1 0.000253125 0.03 0.8700 izvor suma kvadrata Df srednji kvadrat F-odnos P-vrednost BD 0.00382813 1 0.00382813 0.42 0.5269 BE 0.00195313 1 0.00195313 0.21 0.6503 CD 0.00195313 1 0.00195313 0.21 0.6503 CE 0.000153125 1 0.000153125 0.02 0.8987 DE 0.00525313 1 0.00525313 0.57 0.4596 Ukupna greška 0.1464 16 0.00915

Ukupna (kor.) 0.606822 31

R-kvadratno = 75.8743 procenata

R-kvadratno (podešeno za d.f.) = 53.2565 procenata

Standardna greška proc. = 0.0956556

Srednja apsolutna greška = 0.0571484

Durbin-Watson statistika = 0.888586

Tabela 7: Regresiona analiza za "odnos posle 8 nedelja" koja obuhvata pH, alum i formaldehid.

Koeficijenti regresije za odnos posle 8 nedelja

konstanta = 0.0228125

A:pH = 0.113125

B:alum = -0.00185625

E:formalin = 0.0315625

Tabela 8: Procena rezultata za "odnos posle 8 nedelja" generisana korišćenjem fitovanog modela.

Procenjeni rezultati za odnos posle 8 nedelja

Red Uočena Fitovana Donji 95.0% CL za Gornji 95.0% CL za vrednost vrednost srednju vrednost srednju vrednost

1 0.58 0.5975 0.536766 0.658234

2 0.81 0.783125 0.722391 0.843859

3 0.9 0.84625 0.785516 0.906984

4 0.92 0.89625 0.835516 0.956984

6 0.99 0.84625 0.785516 0.906984

7 0.67 0.5975 0.536766 0.658234

8 0.99 0.89625 0.835516 0.956984

9 0.84 0.710625 0.649891 0.771359

10 0.78 0.710625 0.649891 0.771359

11 0.98 0.959375 0.898641 1.02011

12 0.59 0.5975 0.536766 0.658234

13 1.03 0.959375 0.898641 1.02011

14 0.78 0.660625 0.599891 0.721359

15 0.94 0.89625 0.835516 0.956984

16 0.81 0.77375 0.713016 0.834484

17 0.82 0.783125 0.722391 0.843859 Red Uočena Fitovana Donji 95.0% CL za Gornji 95.0% CL za vrednost vrednost srednju vrednost srednju vrednost 18 0.88 0.84625 0.785516 0.906984 19 0.82 0.77375 0.713016 0.834484 20 0.82 0.959375 0.898641 1.02011 21 0.82 0.959375 0.898641 1.02011 22 0.63 0.710625 0.649891 0.771359 23 0.74 0.84625 0.785516 0.906984 24 0.66 0.660625 0.599891 0.721359 25 0.67 0.783125 0.722391 0.843859 26 0.76 0.783125 0.722391 0.843859 27 0.64 0.710625 0.649891 0.771359 28 0.74 0.77375 0.713016 0.834484 29 0.73 0.77375 0.713016 0.834484 30 0.44 0.5975 0.536766 0.658234 32 0.87 0.89625 0.835516 0.956984 33 0.67 0.660625 0.599891 0.721359 34 0.59 0.660625 0.599891 0.721359 Tabela 9: plan za eksperiment 20110913(NIV)

Tabela 9 nastavak

Tabela 9 nastavak

Tabela 10: plan za eksperiment 20110913(DP)

Tabela 11 : plan za eksperiment 20110812: DP sa dodatim metalnim jonima

Tabela 11 nastavak

Tabela 11 nastavak

Tabela 12: Rekuperacija antigena određena pomoću SEC-HPLC eksp.20110913(NIV). Za pH 7 i pH 8 rekuperacije su bazirane na NIV kontrolnim uzorcima #1 i #21 bez dodavanja, respektivno. Uzorci su bili čuvani na 22°C tokom 3 nedelje. Uzorci označeni sa „n.o.“ nisu bili analizirani zbog prioritizacije uzoraka.

Tabela 13: Rezultati ELISE za eksp.20110913(NIV) dobijeni posle 3 nedelje za pH 8 (uzorci 21-40) i posle 7 nedelja za pH 7 (uzorci 1-20) na 22°C. Uzorci označeni sa „n.o.“ nisu bili analizirani zbog prioritizacije uzoraka.

Tabela 14: Rekuperacije antigena posle 5 nedelja na 22°C desorbovanog JEV dobijenog pomoću SEC-HPLC. Rekuperacije su bile bazirane na DP kontrolnim uzorcima bez dodavanja čuvanim na pH 7 ili pH

8

Tabela 15: ELISA rezultati desorbovanog JEV antigena posle 5 nedelja na 22°C

Tabela 16: ELISA rezultati desorbovanog JEV antigena posle 4 nedelje i 7 nedelja čuvanja na 22°C. Uzorci označeni sa "n.o" nisu bili analizirani zbog prioritizacije uzoraka

Tabela 17: ANOVA za stabilnost uzoraka čuvanih na 22°C tokom 7 nedelja.

Analiza varijanse za odnos - tip III suma kvadrata

Izvor Suma kvadrata Df Srednji kvadrat F-odnos P-vrednost GLAVNI EFEKTI

A:Tip metala 0.139643 8 0.0174554 3.00 0.0293 B:pH 0.0462028 2 0.0231014 3.97 0.0398 REZIDUALNI 0.0931046 16 0.00581904

UKUPNI (KORIGOVANI) 0.27895 26

Svi F-odnosi su bazirani na rezidualnom srednjem kvadratu greške.

Tabela 18: Test sa više opsega za odnos prema tipu metalnih jona.1=Fe(II); 2=Fe(III); 3=Ni(II);

4=Co(II); 5=Cu(II); 6=Zn(II); 7=Cr(III); 8=mešavina[1-6]; 9=kontrola bez dodavanja Testovi sa višestrukim opsezima za odnos prema tipu metala

Metod: 95.0 procenata LSD

Tip metala Impulsi LS srednja vrednost Grupe homogenosti

8 3 0.666087 X

5 3 0.770168 XX

2 3 0.793725 XXX

7 3 0.807248 XX

4 3 0.844388 XX

6 3 0.853867 XX

1 3 0.878563 XX

3 3 0.887505 XX

9 3 0.919926 X

Kontrast Razlika /- Granice 1 - 2 0.084838 0.132037 1 - 3 -0.0089421 0.132037 Kontrast Razlika /- Granice 1 - 4 0.0341754 0.132037 1 - 5 0.108395 0.132037 1 - 6 0.0246961 0.132037 1 - 7 0.0713155 0.132037 1 - 8 *0.212476 0.132037 1 - 9 -0.0413627 0.132037 2 - 3 -0.0937801 0.132037 2 - 4 -0.0506626 0.132037 2 - 5 0.0235569 0.132037 2 - 6 -0.0601419 0.132037 2 - 7 -0.0135225 0.132037 2 - 8 0.127638 0.132037 2 - 9 -0.126201 0.132037 3 - 4 0.0431175 0.132037 3 - 5 0.117337 0.132037 3 - 6 0.0336382 0.132037 3 - 7 0.0802576 0.132037 3 - 8 *0.221418 0.132037 3 - 9 -0.0324206 0.132037 4 - 5 0.0742195 0.132037 4 - 6 -0.00947935 0.132037 4 - 7 0.0371401 0.132037 4 - 8 *0.1783 0.132037 4 - 9 -0.0755381 0.132037 5 - 6 -0.0836988 0.132037 5 - 7 -0.0370794 0.132037 5 - 8 0.104081 0.132037 5 - 9 *-0.149758 0.132037 6 - 7 0.0466195 0.132037 6 - 8 *0.18778 0.132037 6 - 9 -0.0660588 0.132037 7 - 8 *0.14116 0.132037 7 - 9 -0.112678 0.132037 8 - 9 *-0.253838 0.132037 * označava statistički značajnu razliku.

Tabela 19: ICP-MS rezultati rezidualnih metalnih jona kao nečistoća prisutnih u različitim šaržama aluma (2%)

Tabela 20: Rezime sadržaja metalnih jona i analize DP uzoraka formulisanih sa različitim partijama aluma. Uzorci su bili analizirani u duprlikatu sa ELISOM i naveden je odnos monoklonske/poliklonske ELISE.. Formulacije su bile čuvane na 22°C for 6 nedelje.

Tabela 21: Rezultati PSD analize osnovnog rastvora Alhydrogela® (2%) u vodi.

Tabela 22: Rezultati Alhydrogel® titracionih krivih za određivanje POZ. Uzorci su bili analizirani u PBS (1:20 razređenje).

Tabela 23: Rezime analize metalnih jona za različite osnovne rastvore aluminijum hidroksida; napomena A 2% osnovni rastvor je jednak 10mg/mL A1

Tabela 24: Analiza supernatanta i aluminijum hidroksid (partija 4230) gel frakcije za kontaminirajuće metalne jone pokazuje da su metalni joni locirani u gelu, a ne u supernatantu

Tabela 25: Vakcine na bazi aluminijuma za humanu upotrebu

Tabela 26: Vakcine na bazi aluminijuma za veterinarsku upotrebu

[0245] Sledeći izrazi koji su korišćeni u ovom opisu su priznati registrovani žigovi:

"Triton", "Falcon", "UltiMate", "Infors", "Multitron", "LoBind", "Kleenpak", "Eppendorf’, "Superose", "Millipore", "Steriflip", "BioTek" i "Tween".

Opisani aspekti

[0246]

Aspekt 1. Postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- sjedinjavanje aluminijumove soli, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija i

- određivanje nivoa teškog metala u vodenoj kompoziciji i/ili aluminijumovoj soli.

Aspekt 2. Postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- pripremu ili izbor aluminijumove soli zahvaljujući kojoj se može dobiti vodena kompozicija koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija.

Aspekt 3. Postupak prema aspektu 1-2, koji dalje sadrži puferovanje pomenute vodene kompozicije na pH između 6.5 i 8.5, a prvenstveno na pH između 7.5 i 8.5.

Aspekt 4. Postupak prema aspektu 1-3, koji dalje sadrži pakovanje alikvota pomenute vodene kompozicije koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije u posebne kontejnere nepropusne za vazduh.

Aspekt 5. Postupak za pripremanje taloga aluminijumove soli kliničkog kvaliteta za inkorporaciju u lek i/ili vakcinu, pri čemu pomenuti postupak sadrži pripremu vodenog rastvora jona aluminijuma i taloženje pomenutih jona aluminijuma iz pomenutog rastvora, i određivanje nivoa teškog metala u rastvoru i/ili talogu aluminijumove soli.

Aspekt 6. Postupak prema aspektu 5, pri čemu je izabran talog pomoću koga se može dobiti vodena kompozicija koja sadrži manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije.

Aspekt 7. Vodena kompozicija koja sadrži protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije.

Aspekt 8. Vodena kompozicija prema aspektu 7, koja se čuva na temperaturama višim od 20°C tokom najmanje 1 meseca.

Aspekt 9. Vodena kompozicija prema aspektu 7, koja ima rok trajanja od najmanje 20 meseci.

Aspekt 10. Vodena kompozicija prema aspektu 7-9, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr, Pb, Rb i Mo.

Aspekt 11. Vodena kompozicija prema aspektu 7-10, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V.

Aspekt 12. Vodena kompozicija prema aspektu 7-11, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu ili Ni.

Aspekt 13. Vodena kompozicija prema aspektu 7-12, pri čemu je pomenuti teški metal prisutan u jonskom obliku.

Aspekt 14. Vodena kompozicija prema aspektu 7-13, pri čemu je aluminijumova so aluminijum hidroksid (Al(OH)3) ili aluminijum fosfat (AlPO4).

Aspekt 15. Vodena kompozicija prema aspektu 7-14, koja dalje sadrži reaktivno jedinjenje.

Aspekt 16. Vodena kompozicija prema aspektu 15, pri čemu je reaktivno jedinjenje is izabrano iz grupe koja se sastoji od redoks aktivnog jedinjenja, jedinjenja koje obrazuje radikal, stabilizujućeg jedinjenja i bilo koje njihove kombinacije.

Aspekt 17. Vodena kompozicija prema aspektu 15-16, pri čemu je reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od formaldehida, etanola, hloroforma, trihloroetilena, acetona, triton-X-100, deoksiholata, dietilpirokarbonata, sulfita, Na2S2O5, beta-proprio-laktona, polisorbata, kao što su Tween 20®, Tween 80®, O2, fenola, kopolimera pluronskog tipa, i bilo koje njihove kombinacije.

Aspekt 18. Vodena kompozicija prema aspektu 7-17, koja sadrži između 5 μg/ml i 50 mg/ml aluminijuma.

Aspekt 19. Vodena kompozicija prema aspektu 7-18, koja sadrži između 50 μg/ml i 5 mg/ml aluminijuma.

Aspekt 20. Vodena kompozicija prema aspektu 7-19, koja sadrži između 5 ppb i 250 ppb Fe bazirano na težini vodene kompozicije.

Aspekt 21. Vodena kompozicija prema aspektu 7-20, koja sadrži manje od 3 ppb Cu bazirano na težini vodene kompozicije.

Aspekt 22. Vodena kompozicija prema aspektu 7-21, koja sadrži manje od 40 ppb Ni bazirano na težini vodene kompozicije.

Aspekt 23. Vodena kompozicija prema aspektu 7-22, pri čemu je pomenuti protein terapeutik i/ili vakcina.

Aspekt 24. Vodena kompozicija prema aspektu 7-23, pri čemu je pomenuti protein virusni ili bakterijski protein.

Aspekt 25. Vodena kompozicija prema aspektu 7-24, pri čemu je pomenuti virusni protein protein virusa japanskog encefalitisa ili protein bakterije Pseudomonas aeruginosa.

Aspekt 26. Vodena kompozicija prema aspektu 7-25, pri čemu je pomenuti protein protein dela virusa inaktiviran u formaldehidu.

Aspekt 27. Vodena kompozicija prema aspektu 7-26, koji dalje sadrži sulfit.

Aspekt 28. Vodena kompozicija prema aspektu 7-27, koja je dobijena postupkom prema aspektu 1-6.

Aspekt 29. Vakcina koja sadrži vodenu kompoziciju prema aspektu 7-28.

Aspekt 30. Koncentrat aluminijum hidroksida koji a) sadrži 10 mg/ml pomenutog aluminijum hidroksida i b) manje od 7 mikrograma teškog metala, za primenu u proizvodnji leka, a prvenstveno za primenu u proizvodnji vakcine.

Aspekt 31. Koncentrat aluminijum hidroksida koji sadrži 10 mg/ml aluminijum hidroksida i manje od 7 mikrograma teškog metala, za primenu u proizvodnji leka, a prvenstveno za primenu u proizvodnji vakcine.

Aspekt 32. Koncentrat aluminijumove soli koji sadrži manje od 7ppm teškog metala bazirano na težini koncentrata, za primenu u proizvodnji leka, a prvenstveno za primenu u proizvodnji vakcine.

Aspekt 33. Koncentrat aluminijumove soli koji sadrži manje od 700ppm teškog metala bazirano na težini aluminijumove soli, za primenu u proizvodnji leka, prvenstveno za primenu u proizvodnji vakcine.

Aspekt 34. Koncentrat aluminijum hidroksida koji sadrži manje od 700ppm teškog metala bazirano na težini aluminijum hidroksida, za primenu u proizvodnji leka, a prvenstveno za primenu u proizvodnji vakcine.

Aspekt 35. Postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- pripremu ili izbor aluminijumove soli zahvaljujući kojoj se može dobiti vodena kompozicija koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog proteina, reaktivnog jedinjenja i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija.

Aspekt 36. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr, Pb, Rb i Mo.

Aspekt 37. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-36, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V.

Aspekt 38. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-37, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu ili Ni.

Aspekt 39. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-38, pri čemu je pomenuti teški metal prisutan u jonskom obliku.

Aspekt 40. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-39, pri čemu je aluminijumova so aluminijum hidroksid (Al(OH)3) ili aluminijum fosfat (AlPO4).

Aspekt 41. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-40, pri čemu je reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od redoks aktivnog jedinjenja, jedinjenja koje obrazuje radikal, stabilizujućeg jedinjenja i bilo koje njihove kombinacije.

Aspekt 42. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-41, pri čemu je reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od formaldehida, etanola, hloroforma, trihloroetilena, acetona, triton-X-100, deoksiholata, dietilpirokarbonata, sulfita, Na2S2O5, betaproprio-laktona, polisorbata, kao što su Tween 20®, Tween 80®, O2, fenola, kopolimera pluronskog tipa, i bilo koje njihove kombinacije.

Aspekt 43. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-42, koja sadrži između 5 μg/ml i 50 mg/ml aluminijuma.

Aspekt 44. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-43, koja sadrži između 50 μg/ml i 5 mg/ml aluminijuma.

Aspekt 45. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-44, koja sadrži između 5 ppb i 250 ppb Fe bazirano na težini vodene kompozicije.

Aspekt 46. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-45, koja sadrži manje od 3 ppb Cu bazirano na težini vodene kompozicije.

Aspekt 47. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-46, koja sadrži manje od 40 ppb Ni bazirano na težini vodene kompozicije.

Aspekt 48. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-47, koji dalje sadrži puferovanje pomenute vodene kompozicije na pH između 6.5 i 8.5, a prvenstveno 7.5 i 8.5.

Aspekt 49. Postupak za pripremanje vodene kompozicije prema aspektu 35-48, koji dalje sadrži pakovanje alikvota pomenute vodene kompozicije u posebne kontejnere nepropusne za vazduh.

Aspekt 50. Metod za prevenciju i/ili lečenje subjekta kome je to potrebno koji sadrži administraciju vodene kompozicije koja sadrži efektivnu dozu antigena, jedinjenje aluminijuma, reaktivno jedinjenje i manje od 350ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije.

Aspekt 51. Metod za prevenciju i/ili lečenje subjekta kome je to potrebno koji sadrži administraciju efektivne doze kompozicije prema aspektu 7-29.

Koncentrat aluminijum hidroksida koji a) sadrži 10 mg/ml pomenutog aluminijum hidroksida i b) manje od 7 mikrograma teškog metala, za primenu u proizvodnji leka, a prvenstveno za primenu u proizvodnji vakcine.

Aspekt 52. Koncentrat aluminijum hidroksida koji sadrži manje od 1.4 mikrograma teškog metala, za primenu u proizvodnji leka, a prvenstveno za primenu u proizvodnji vakcine.

Aspekt 53. Koncentrat aluminijumove soli koji sadrži manje od 1.4ppm teškog metala bazirano na težini koncentrata, za primenu u proizvodnji leka, a prvenstveno za primenu u proizvodnji vakcine.

Aspekt 54. Koncentrat aluminijumove soli koji sadrži manje od 140ppm teškog metala bazirano na težini aluminijumove soli, za primenu u proizvodnji leka, a prvenstveno za primenu u proizvodnji vakcine.

Aspekt 55. Koncentrat aluminijum hidroksida koji sadrži manje od 140ppm teškog metala bazirano na težini aluminijum hidroksida, za primenu u proizvodnji leka, a prvenstveno za primenu u proizvodnji vakcine.

[0247] Sledeći aspekti

Sledeći aspekt 1. Postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- pripremu ili izbor aluminijumove soli zahvaljujući kojoj se može dobiti vodena kompozicija koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog reaktivnog jedinjenja, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija.

Sledeći aspekt 2. Postupak prema sledećem aspektu 1, koji dalje sadrži puferovanje pomenute vodene kompozicije na pH između 6.5 i 8.5.

Sledeći aspekt 3. Postupak prema sledećem aspektu 1-2, koji dalje sadrži pakovanje alikvota pomenute vodene kompozicije koja ima manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije u posebne kontejnere nepropusne za vazduh.

Sledeći aspekt 4. Postupak za pripremanje taloga aluminijumove soli kliničkog kvaliteta za inkorporaciju u lek i/ili vakcinu, pri čemu pomenuti postupak sadrži pripremu vodenog rastvora jona aluminijuma i taloženje pomenutih jona aluminijuma iz pomenutog rastvora, i određivanje nivoa teškog metala u rastvoru i/ili talogu aluminijumove soli, pri čemu je izabran talog pomoću koga se može dobiti vodena kompozicija koja sadrži manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije.

Sledeći aspekt 5. Vodena kompozicija koja sadrži protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži manje od 350 ppb teškog metala bazirano na težini vodene kompozicije.

Sledeći aspekt 6. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5, koja se čuva na temperaturama višim od 20°C tokom najmanje 1 meseca.

Sledeći aspekt 7. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-6, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr, Pb, Rb i Mo.

Sledeći aspekt 8. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-7, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V.

Sledeći aspekt 9. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-8, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu ili Ni.

Sledeći aspekt 10. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-9, pri čemu je pomenuti teški metal prisutan u jonskom obliku.

Sledeći aspekt 11. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-10, pri čemu je aluminijumova so aluminijum hidroksid (Al(OH)3) ili aluminijum fosfat (AlPO4).

Sledeći aspekt 12. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-11, pri čemu je aluminijumova so aluminijum hidroksid (Al(OH)3).

Sledeći aspekt 13. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-12, pri čemu je reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od redoks aktivnog jedinjenja, jedinjenja koje obrazuje radikal, stabilizujućeg jedinjenja i bilo koje njihove kombinacije.

Sledeći aspekt 14. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-13, pri čemu je reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od formaldehida, etanola, hloroforma, trihloroetilena, acetona, triton-X-100, deoksiholata, dietilpirokarbonata, sulfita, Na2S2O5, beta-proprio-laktona, polisorbata, kao što su Tween 20®, Tween 80®, O2, fenola, kopolimera pluronskog tipa, i bilo koje njihove kombinacije.

Sledeći aspekt 15. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-14, koja sadrži između 5 μg/ml i 50 mg/ml aluminijuma.

Sledeći aspekt 16. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-15, koja sadrži između 50 μg/ml i 5 mg/ml aluminijuma.

Sledeći aspekt 17. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-16, koja sadrži između 5 ppb i 250 ppb Fe bazirano na težini vodene kompozicije.

Sledeći aspekt 18. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-17, koja sadrži manje od 3 ppb Cu bazirano na težini vodene kompozicije.

Sledeći aspekt 19. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-18, koja sadrži manje od 40 ppb Ni bazirano na težini vodene kompozicije.

Sledeći aspekt 20. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-19, pri čemu je pomenuti protein terapeutik i/ili vakcina.

Sledeći aspekt 21. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-20, pri čemu je pomenuti protein virusni ili bakterijski protein.

Sledeći aspekt 22. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-21, pri čemu pomenuti virusni protein je protein virusa japanskog encefalitisa ili protein bakterije Pseudomonas aeruginosa.

Sledeći aspekt 23. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-22, pri čemu pomenuti protein je protein dela virusa inaktiviranog u formaldehidu.

Sledeći aspekt 24. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-23, koji dalje sadrži sulfit.

Sledeći aspekt 25. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 5-24, dobijena postupkom prema sledećem aspektu 1.

Sledeći aspekt 26. Vakcina koja sadrži vodenu kompoziciju prema sledećem aspektu 5-24.

Sledeći aspekt 27. Postupak, vodena kompozicija ili vakcina prema bilo kom od sledećih aspekata 1-26, pri čemu je sadržaj teškog metala manji od 450 ppm bazirano na težini aluminijuma (gram/gram) u vodenoj kompoziciji.

Sledeći aspekt 28. Postupak prema bilo kom od sledećih aspekata 1-27, pri čemu je sadržaj Fe u vodenoj kompoziciji manji od 700 ppm bazirano na težini aluminijuma u kompoziciji; sadržaj Ni je manji od 18 ppm bazirano na težini aluminijuma u kompoziciji; ili je sadržaj Cu manji od 2,5 ppm bazirano na težini aluminijuma u vodenoj kompoziciji, ili njihova kombinacija.

Sledeći aspekt 29. Postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- pripremu ili izbor aluminijumove soli zahvaljujući kojoj se može dobiti vodena kompozicija koja ima manje od 450 ppm teškog metala bazirano na težini aluminijuma (gram/gram) i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog reaktivnog jedinjenja, pomenutog proteina i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija.

Sledeći aspekt 30. Postupak prema sledećem aspektu 29, koji dalje sadrži puferovanje pomenute vodene kompozicije na pH između 6.5 i 8.5.

Sledeći aspekt 31. Postupak prema sledećem aspektu 29 ili 30, koji dalje sadrži pakovanje alikvota pomenute vodene kompozicije koja ima manje od 450 ppm teškog metala bazirano na težini aluminijuma u kompoziciji u posebne kontejnere za čuvanje nepropusne za vazduh.

Sledeći aspekt 32. Postupak za pripremanje taloga aluminijumove soli kliničkog kvaliteta za inkorporaciju u lek i/ili vakcinu, pri čemu pomenuti postupak sadrži pripremu vodenog rastvora jona aluminijuma i taloženje pomenutih jona aluminijuma iz pomenutog rastvora, i određivanje nivoa teškog metala u rastvoru i/ili talogu aluminijumove soli, pri čemu se bira talog pomoću koga se može dobiti vodena kompozicija koja sadrži manje od 450 ppm teškog metala bazirano na težini jona aluminijuma (gram/gram) u rastvoru.

Sledeći aspekt 33. Vodena kompozicija koja sadrži protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži manje od 450 ppm teškog metala bazirano na težini aluminijuma u kompoziciji.

Sledeći aspekt 34. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 33, koja se čuva na temperaturama višim od 20°C tokom najmanje 1 meseca..

Sledeći aspekt 35. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 33 ili 34, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr i Mo.

Sledeći aspekt 36. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 33-35, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu, Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V.

Sledeći aspekt 37. Vodena kompozicija prema sledećem aspektu 33-36, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Cu ili Ni.

LISTA SEKVENCI

[0248]

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Vodena kompozicija koja sadrži protein i aluminijumovu so, pri čemu pomenuta kompozicija sadrži manje od 350 ppb teškog metala i manje od 1.25 ppb Cu bazirano na težini vodene kompozicije, i pri čemu pomenuti protein jeste protein u delovima virusa inaktiviranim formaldehidom.

2. Vodena kompozicija prema zahtevu 1, koja se čuva na temperaturama višim od 20°C tokom najmanje 1 meseca.

3. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 2, koja sadrži manje od 350 ppb teškog metala, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V, Cr, Pb, Rb i Mo.

4. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 3, koja sadrži manje od 350 ppb teškog metala, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Ni, W, Co, Os, Ru, Cd, Ag, Fe, V.

5. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 4, koja sadrži manje od 350 ppb teškog metala, pri čemu je pomenuti teški metal izabran između Ni.

6. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 5, koja sadrži manje od 350 ppb teškog metala, pri čemu je pomenuti teški metal prisutan u jonskom obliku.

7. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 6, pri čemu je aluminijumova so aluminijum hidroksid (Al(OH)3) ili aluminijum fosfat (AlPO4).

8. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 7, pri čemu je aluminijumova so aluminijum hidroksid (Al(OH)3).

9. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 8, koja dalje sadrži reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od redoks aktivnog jedinjenja, jedinjenja koje obrazuje radikal, stabilizujućeg jedinjenja i bilo koje njihove kombinacije.

10. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 9, koja dalje sadrži reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od formaldehida, etanola, hloroforma, trihloroetilena, acetona, polietilen glikol terc-oktilfenil etra, deoksiholata, dietilpirokarbonata, sulfita, Na2S2O5, beta-proprio-laktona, polisorbata, opciono Polisorbata 20 ili Polisorbata 80, O2, fenola, kopolimera pluronskog tipa, i bilo koje njihove kombinacije.

11. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 10, koja sadrži između 5 μg/ml i 50 mg/ml

aluminijuma.

12. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 11, koja sadrži između 50 μg/ml i 5 mg/ml aluminijuma.

13. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 12, koja sadrži između 5 ppb i 250 ppb Fe bazirano na težini vodene kompozicije.

14. Vodena kompozicija prema zahtevima 1 do 13, koja sadrži manje od 40 ppb Ni bazirano na težini vodene kompozicije.

15. Vakcina koja sadrži vodenu kompoziciju prema zahtevima 1 do 14.

16. Postupak za pripremanje vodene kompozicije koja sadrži aluminijum, reaktivno jedinjenje i protein, pri čemu pomenuti postupak sadrži

- izbor aluminijumove soli zahvaljujući kojoj se može dobiti vodena kompozicija koja ima manje od 350 ppb teškog metala i manje od 1,25 ppb Cu bazirano na težini vodene kompozicije i

- sjedinjavanje pomenute aluminijumove soli, pomenutog reaktivnog jedinjenja, pomenutog proteina u formaldehidom inaktiviranim virusnim česticama i vode da bi se proizvela pomenuta vodena kompozicija; i

pri čemu je reaktivno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od redoks aktivnog jedinjenja, jedinjenja koje obrazuje radikal, stabilizujućeg jedinjenja i bilo koje njihove kombinacije.

17. Postupak prema zahtevu 16, koji dalje sadrži puferovanje pomenute vodene kompozicije na pH između 6.5 i 8.5.