ES2987778T3 - Conjugados de quelatos a base de manganeso para la imagenología por resonancia magnética molecular - Google Patents

Conjugados de quelatos a base de manganeso para la imagenología por resonancia magnética molecular Download PDF

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Abstract

En este documento se proporcionan ejemplos de ligandos quelantes de metales que tienen una alta afinidad por el manganeso. Los complejos metálicos resultantes se pueden utilizar como agentes de contraste para resonancia magnética y se pueden funcionalizar con fracciones que se unen a objetivos bioquímicos o provocan cambios de relaxividad en presencia de estos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de quelatos a base de manganeso para la imagenología por resonancia magnética molecular
REFERENCIA CRUZADA A APLICACIONES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional de EE.UU. No. 62/204,519, presentada el 13 de agosto de 2015, y la solicitud provisional de EE.UU. No. 62/356,732, presentada el 30 de junio de 2016.
INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADOS POR EL GOBIERNO FEDERAL
Esta invención se ha realizado con apoyo gubernamental en virtud de la subvención No. R01 CA161221 concedida por los Institutos Nacionales de Salud. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
CAMPO TÉCNICO
Esta invención se relaciona con ligandos quelantes de metales, y más particularmente a complejos de quelato de manganeso de estos ligandos que se pueden usar como agentes de contraste para imagenología por resonancia magnética.
ANTECEDENTES
Muchos de los ligandos quelantes de metales que se usan actualmente en resonancia magnética (RM) son ligandos quelantes de unión metálica de poliaminopolicarboxilato diseñados para la quelación de iones lantánidos (III) como el gadolinio (III). Todas las formulaciones de contraste de RM disponibles en el mercado contienen compuestos de quelato metálico de gadolinio (III). Sin embargo, en la última década se ha producido un aumento de la concienciación sobre la toxicidad inducida por gadolinio (III) en pacientes que reciben formulaciones de contraste de RM que contienen gadolinio (III). Esta toxicidad se manifiesta como fibrosis sistémica nefrogénica (NSF, por sus siglas en inglés). Los pacientes que padecen una enfermedad renal crónica son particularmente susceptibles a la NSF inducida por gadolinio (III), y las formulaciones de contraste de RM generalmente no se administran a pacientes que padecen una enfermedad renal crónica grave. Para evitar la posible toxicidad asociada al gadolinio (III), sería por lo tanto útil identificar agentes de contraste de RM que no contengan gadolinio (III).
Un agente de contraste efectivo debe contener varios atributos. Éste debe tener una alta relaxividad para generar contraste de imagen. La relaxividad es la capacidad del quelato metálico para relajar los protones del agua, y se define como el cambio en la velocidad de relajación del agua dividido por la concentración milimolar del quelato. La relaxividad depende de muchos factores moleculares. Para obtener una alta relaxividad, es ventajoso usar un ion metálico con un alto número cuántico de espín; es ventajoso tener una o más moléculas de agua directamente unidas al ion metálico; y la molécula de agua unida debe experimentar un intercambio químico muy rápido con otras moléculas de agua en el disolvente. La mayoría de los iones metálicos son tóxicos en las concentraciones necesarias para proporcionar contraste de RM. Por lo tanto, el ion metálico debe estar quelado por un ligando multidentado con la estabilidad suficiente para prevenir que el ion metálico se libere en el organismo en cantidades significativas.
También sería valioso identificar ligandos quelantes metálicos que formen compuestos de alta relaxividad que se unan o cambien de relaxividad en presencia de objetivos bioquímicos. Los compuestos que se unen a objetivos bioquímicos permitirían la detección de la proteína, enzima o célula objetivo en una fase retardada, después de que el compuesto en forma no unida se haya eliminado mediante excreción. Los compuestos que cambian la relaxividad en presencia del objetivo bioquímico proporcionarán un cambio en la intensidad de la señal de RMN en el lugar del objetivo. La capacidad de detectar cambios en los procesos bioquímicos con la IRM proporcionaría un medio no invasivo para estadificar o controlar la progresión de estados patológicos, tales como el cáncer, la inflamación, la fibrosis y la trombosis. Tales compuestos y métodos de imagenología también proporcionarían un medio no invasivo para rastrear la respuesta terapéutica.
BREVE DESCRIPCIÓN
Esta divulgación se basa en una o más modificaciones de un ligando quelante para unirse a un objetivo bioquímico, o potenciar la relaxividad de un quelato metálico resultante en presencia de un objetivo bioquímico, o proporcionar estabilidad adicional a un quelato metálico resultante para prevenir la disociación de iones metálicos en el organismo. Estas modificaciones incluyen el cambio de los grupos donantes (grupos funcionales que se coordinan directamente con el ion metálico), la introducción de grupos que organizan el agua en la segunda esfera de coordinación (por ejemplo, por puentes de hidrógeno), la introducción de grupos que facilitan el intercambio de agua dentro y fuera del ion metálico, la introducción de grupos que ralentizan el giro molecular, ya sea por el aumento del peso molecular o dirigiendo el quelato metálico a una macromolécula (por ejemplo, una proteína), y la introducción de grupos que apoyan o promueven un cambio en el estado de oxidación del metal. Los grupos donantes pueden incluir una serie de funcionalidades para explotar mecanismos de alta relaxividad, que incluyen, a modo de ejemplo, potenciar la relaxividad mediante la unión a un objetivo macromolecular, o cambiar el estado de oxidación en respuesta a la actividad enzimática.
Los quelatos metálicos preparados con los ligandos quelantes se pueden examinar con técnicas que incluyen medidas de relaxividad a diferentes campos magnéticos y temperaturas, y medidas de RMN con 17O a temperatura variable.
Por último, los ligandos quelantes pueden ser útiles para preparar composiciones diagnósticas y/o terapéuticas de iones metálicos radiactivos.
Como se describe en la presente (no forma parte de la presente invención, pero se usa para formar los quelatos metálicos de la presente invención) es un compuesto de Fórmula (I):
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
R<1>se selecciona del grupo que consiste en un alquileno de C2-C6, un cicloalquileno de C3-C10, un heterocicloalquileno de 4-10 miembros, un arileno de C6-C10, un heteroarileno de 5-10 miembros, un (dialquilo de C1-C6)(arileno de C6-C10) y un (dialquilo de C1-C6)(heteroarileno de 5-10 miembros), en donde el alquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno y heteroarileno están opcionalmente sustituidos por 1, 2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente, y en donde R<1>está unido a los nitrógenos adyacentes mediante las posiciones 1,2 o 1,3 de R<1>;
cada R<2>y R<3>se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, CO2H, (alquilo de C1-C6)CO2H, alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo de 5-6 miembros, heteroarilo de 5-6 miembros, C(O)NR<4>R<5>, CH2NHCOR4, C(O)N(OH)R<4>, C(O)NHSO2R<4>, CH2NHSO2R4, N(OH)C(O)R<4>, P(R<4>)O2R<5>, PO<3>R<4>R<5>, y [L]-[TBM];
cada R<4>y R<5>se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C1-C6 y [L]-[TBM], en donde el alquilo está opcionalmente sustituido por 1, 2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente;
DG se selecciona del grupo que consiste en:
y
en donde
cada Y es independientemente CH, CZ, N, O, S o NR<4>;
Q es CH;
cada Z se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, OH, OR<4>, CO2R4, -(alquilo de C1-C6)CO2H, alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo de 5-6 miembros, heteroarilo de 5-6 miembros, C(O)NR<4>R<5>, CH2NHCOR4, C(O)N(OH)R<4>, C(O)NHSO2R<4>, CH2NHSO2R4, N(OH)C(O)R<4>, P(R<4>)O2R<5>, PO3R<4>R<5>, y -[L]-[TBM], en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos por 1,2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente;
L es un enlazador;
TBM (por sus siglas en inglés) es un resto de unión a un objetivo, en donde cada TBM se selecciona independientemente de un TBM que se une a una o más de las siguientes: albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés); fibrina; un componente extracelular del miocardio que se selecciona de colágeno, elastina y decorina; una enzima extracelular secretada en la inflamación o el cáncer, que se selecciona de enzimas peroxidasas y proteasas; y un componente extracelular de una lesión que se selecciona de ácido hialurónico (HA, por sus siglas en inglés), heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato, versicano, biglicano, composición disregulada de tio/disulfuro, fragmentos proteolizados de proteínas transmembranales y fibronectina; y
cada RX se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CN, NO2, halo, pseudohalo, amino, tionilo, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, alquinilo de C2-C4, haloalquilo de C1-C4, cianoalquilo de C1-C4, hidroxialquilo de C1-C4, alcoxilo de C1-C4, aminoalquilo de C1-C4, di(alquilo de C<1>-C<4>)amino, alquilamino de C1-C4, fosfinato, éster de fosfinato, fosfonato, éster de fosfonato, fosfodiéster, alquilfosfodiéster de C1-C4, cicloalquilo de C3-C6, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros, heterocicloalquilo de 5-6 miembros, (alquilo de C<1>-C<4>)fenilo y -[L]-[TBM];
en donde si todos los Y son CH, al menos un de R<2>o R<3>no es H.
Opcionalmente, DG es:
Opcionalmente, Q es CH. En algunas realizaciones, Y es CH. Opcionalmente, al menos un Y es CZ, en donde Z se selecciona del grupo que consiste en CO2R4, alquilo de C1-C6 y OR<4>. Opcionalmente, un Y es CZ, en donde Z se selecciona del grupo que consiste en CO2R4, alquilo de C1-C6 y OR<4>, y todos los demás Y son CH. Opcionalmente, cada R<4>es H o alquilo de C1-C6, en donde el alquilo está opcionalmente sustituido por 1,2, 3 o 4 grupos OH.
Opcionalmente, R<2>y R<3>son H.
Opcionalmente, DG se selecciona del grupo que consiste en:
Opcionalmente, R<1>es cicloalquileno de C3-C10. Por ejemplo, R<1>es un cicloalquileno de C<6>. En algunas realizaciones, R<1>es:
Opcionalmente, R1 es un alquileno de C1-C6. Por ejemplo, R1 es un alquileno de C2.
Opcionalmente, R1 es:
' O '
Opcionalmente, R2 es H.
Opcionalmente, R3 es H.
Opcionalmente, el compuesto de Fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
También se describen en la presente (no forman parte de la presente invención, pero se usan para formar los quelatos metálicos de la presente invención) compuestos de Fórmula (VI):
R2 / R\ R3
R5
Yy Y'R4(v»
DG
en donde el compuesto de Fórmula (VI) es:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Además se describe en la presente (no forma parte de la presente invención, pero se usa para formar los quelatos metálicos de la presente invención) un compuesto de Fórmula (XV):
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
o bien
(a) R1 es 1,2-etileno; R2 es COOH; R3 es la Fórmula XVI, en donde X es N y cada ocurrencia de W es CH; y R4 es un resto de Fórmula XVI:
en donde X es CZ, N, O, S o NR4;
cada W es independientemente CH, CZ, N, O, S o NR4;
cada Z se selecciona independientemente entre H, OH, OR4, CO2H, -(alquilo de C1-C6)CO2H, alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo de 5-6 miembros, heteroarilo de 5-6 miembros, C(O)NR5R6, CH2NHCOR5, C(O)N(OH)R5, C(O)NHSO2R5, CH2NHSO2R5, N(OH)C(O)R5, P(R5)O2R6, PO3R5R6, y -[L]-[TBM], en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos por 1,2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente;
cada R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C1-C6y -[L]-[TBM], en donde el alquilo está opcionalmente sustituido por 1,2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente; L es un enlazador;
TBM es un resto de unión a un objetivo, en donde cada TBM se selecciona independientemente de un TBM que se une a una o más de las siguientes: albúmina sérica humana (HSA); fibrina; un componente extracelular del miocardio que se selecciona de colágeno, elastina y decorina; una enzima extracelular secretada en la inflamación o el cáncer, que se selecciona de enzimas peroxidasas y proteasas; y un componente extracelular de una lesión que se selecciona de ácido hialurónico (HA), heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato, versicano, biglicano, composición disregulada de tio/disulfuro, fragmentos proteolizados de proteínas transmembranales y fibronectina;
cada RX se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CN, NO2, halo, pseudohalo, amino, tionilo, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, alquinilo de C2-C4, haloalquilo de C1-C4, cianoalquilo de C1-C4, hidroxialquilo de C1-C4, alcoxilo de C1-C4, aminoalquilo de C1-C4, di(alquilo de C1-C4)amino, alquilamino de C1-C4, fosfinato, éster de fosfinato, fosfonato, éster de fosfonato, fosfodiéster, alquilfosfodiéster de C1-C4, cicloalquilo de C3-C6, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros, heterocicloalquilo de 5-6 miembros, (alquilo de C<1>-C<4>)fenilo y -[L]-[TBM]; o
(b) R<1>es 1,2-etileno; R<2>es COOH; R<3>es COOH; y R<4>es
(c) R1 es 1,2-etileno; R2 es COOH; R3 es COOH; y R4 es
(d) R1 es 1,2-etileno; R2 es COOH; R3 es COOH; y R4 es
Opcionalmente, el compuesto de fórmula (XV) se selecciona del grupo que consiste en:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
De acuerdo con la invención son compuestos de Fórmula (XVII):
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
R<1>se selecciona del grupo que consiste en un alquileno de C2-C6, un cicloalquileno de C3-C10, un heterocicloalquileno de 4-10 miembros, un arileno de C6-C10, un heteroarileno de 5-10 miembros, un (dialquilo de
C1-C6)(arileno de C6-C10) y un (dialquilo de C1-C6)(heteroarileno de 5-10 miembros), en donde el alquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno y heteroarileno están opcionalmente sustituidos por 1, 2, 3 o 4 grupos
RX que se seleccionan independientemente, y en donde R<1>está unido a los nitrógenos adyacentes mediante las posiciones 1,2 o 1,3 de R<1>;
cada R<2>y R<3>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, CO2H, (alquilo de C1-C6)CO2H,
alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo d miembros, heteroarilo de 5-6 miembros, C(O)NR<4>R<5>, CH2NHCOR4, C(O)N(OH)R<4>, C(O)NHSO2R<4>, CH2NHSO2R4, N(OH)C(O)R<4>, P(R<4>)O2R<5>, PO<3>R<4>R<5>, y [L]-[TBM];
cada R<4>y R<5>se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C1-C6 y [L]-[TBM], en
donde el alquilo está opcionalmente sustituido por 1, 2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente;
DG se selecciona del grupo que consiste en:
en donde
cada Y es independientemente CH, CZ, N, O, S, o NR<4>;
Q es CH;
cada Z se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, OH, OR<4>, CO2R4, -(alquilo de C1-C6)CO2H,
alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo de 5-6 miembros, heteroarilo de 5-6 miembros, C(O)NR<4>R<5>, CH2NHCOR4, C(O)N(OH)R<4>, C(O)NHSO2R<4>, CH2NHSO2R4, N(OH)C(O)R<4>, P(R<4>)O2R<5>, PO<3>R<4>R<5>, y -[L]-[TBM], en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos por 1,2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente;
L es un enlazador;
TBM es un resto de unión a un objetivo, en donde cada TBM se selecciona independientemente de un TBM que
se une a una o más de las siguientes: albúmina sérica humana (HSA); fibrina; un componente extracelular del miocardio que se selecciona de colágeno, elastina y decorina; una enzima extracelular secretada en la inflamación
o el cáncer, que se selecciona de enzimas peroxidasas y proteasas; y un componente extracelular de una lesión que se selecciona de ácido hialurónico (HA), heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato, versicano, biglicano, composición disregulada de tio/disulfuro, fragmentos proteolizados de proteínas transmembranales y fibronectina;
cada RX se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CN, NO2, halo, pseudohalo, amino, tionilo, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, alquinilo de C2-C4, haloalquilo de C1-C4, cianoalquilo de C1-C4, hidroxialquilo de C1-C4, alcoxilo de C1-C4, aminoalquilo de C1-C4, di(alquilo de C<1>-C<4>)amino, alquilamino de C1-C4, fosfinato, éster de fosfinato, fosfonato, éster de fosfonato, fosfodiéster, alquilfosfodiéster de C1-C4, cicloalquilo de C3-C6, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros, heterocicloalquilo de 5-6 miembros, (alquilo de C<1>-C<4>)fenilo y -[L]-[TBM]; y
M se selecciona del grupo que consiste en Fe (III), Mn (II), Mn (III), Cr (III), Cu (II), Cu (III), Dy (III), Ho (III), Er (III), Pr (III), Eu (II), Eu (III), Nd (III), La (III), Lu (III), Sm (III), Tb (III), Tb (IV), Tm (III), Y (III), In (III), Ga (III), Tc (III), Tc (IV), Tc (V), Re (III), Re (IV), Re (V), Bi (III), e Yb (III);
en donde, si todos los Y son CH, entonces al menos un de R<2>o R<3>no es H.
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (XVII) se selecciona del grupo que consiste en:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Además, en la presente se incluyen compuestos de fórmula (XVIII):
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde el compuesto es:
M se selecciona del grupo que consiste en Fe (111), Mn (II), Mn (III), Cr (III), Cu (II), Cu (III), Dy (III), Ho (III), Er (III), Pr (III), Eu (II), Eu (III), Nd (III), La (III), Lu (III), Sm (III), Tb (III), Tb (IV), Tm (III), Y (III), In (III), Ga (III), Tc (III), Tc (IV), Tc (V), Re (III), Re (IV), Re (V), Bi (III) e Yb (III).
También se proporcionan de acuerdo con la invención compuestos de Fórmula (XIX):
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
o bien
(a) R1 es 1,2-etileno; R2 es COOH; R3 es la Fórmula XVI, en donde X es N y cada ocurrencia de W es CH; y R4 es un resto de Fórmula XVI:
en donde X es CZ, N, O, S o NR4
cada W es independientemente CH, CZ, N, O, S o NR<4>;
cada Z se selecciona independientemente entre H, OH, OR<4>, CO2H, -(alquilo de C1-C6)CO2H, alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo de 5-6 miembros, heteroarilo de 5-6 miembros, C(O)NR<5>R<6>, CH2NHCOR5, C(O)N(OH)R<5>, C(O)NHSO2R<5>, CH2NHSO2R5, N(OH)C(O)R<5>, P(R<5>)O2R<6>, PO<3>R<5>R<6>, y -[L]-[TBM], en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos por 1,2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente;
cada R<5>y R<6>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C1-C6 y -[L]-[TBM], en donde el alquilo está opcionalmente sustituido por 1,2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente; L es un enlazador;
TBM es un resto de unión a un objetivo, en donde cada TBM se selecciona independientemente de un TBM que se une a una o más de las siguientes: albúmina sérica humana (HSA); fibrina; un componente extracelular del miocardio que se selecciona de colágeno, elastina y decorina; una enzima extracelular secretada en la inflamación o el cáncer, que se selecciona de enzimas peroxidasas y proteasas; y un componente extracelular de una lesión que se selecciona de ácido hialurónico (HA), heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato, versicano, biglicano, composición disregulada de tio/disulfuro, fragmentos proteolizados de proteínas transmembranales y fibronectina;
cada RX se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CN, NO2, halo, pseudohalo, amino, tionilo, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, alquinilo de C2-C4, haloalquilo de C1-C4, cianoalquilo de C1-C4, hidroxialquilo de C1-C4, alcoxilo de C1-C4, aminoalquilo de C1-C4, di(alquilo de C1-C4)amino, alquilamino de C1-C4, fosfinato, éster de fosfinato, fosfonato, éster de fosfonato, fosfodiéster, alquilfosfodiéster de C1-C4, cicloalquilo de C3-C6, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros, heterocicloalquilo de 5-6 miembros, (alquilo de C<1>-C<4>)fenilo y -[L]-[TBM]; o
(b) R<1>es 1,2-etileno; R<2>es COOH; R<3>es COOH; y R<4>es
(c) R1 es 1,2-etileno; R2 es COOH; R3 es COOH; y R4 es
(d) R1 es 1,2-etileno; R2 es COOH; R3 es COOH; y R4 es
M se selecciona del grupo que consiste en Fe (111), Mn (II), Mn (III), Cr (III), Cu (II), Cu (III), Dy (III), Ho (III), Er (III), Pr (III), Eu (II), Eu (III), Nd (III), La (III), Lu (III), Sm (III), Tb (III), Tb (IV), Tm (III), Y (III), In (III), Ga (III), Tc (III), Tc (IV), Tc (V), Re (III), Re (IV), Re (V), Bi (III) e Yb (III).
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (XVIII) se selecciona del grupo que consiste en:
��
La presente divulgación proporciona además un compuesto de Fórmula(A):
(D1)a-(L1)b-TBM-(L2)c-(D2)d (A)
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
TBM es un resto de unión a un objetivo, en donde cada TBM se selecciona independientemente de un TBM que se une a una o más de las siguientes: albúmina sérica humana (HSA); fibrina; un componente extracelular del miocardio que se selecciona de colágeno, elastina y decorina; una enzima extracelular secretada en la inflamación o el cáncer que se selecciona de enzimas peroxidasas y proteasas; y un componente extracelular de una lesión que se selecciona de ácido hialurónico (Ha ), heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato, versicano, biglicano, composición disregulada de tio/disulfuro, fragmentos proteolizados de proteínas transmembranales y fibronectina;
cada D1 es independientemente un quelato metálico de cualquiera de las reivindicaciones 1-5;
cada D2 es independientemente un quelato metálico de cualquiera de las reivindicaciones 1-5;
L1 es un enlazador;
L2 es un enlazador;
a es un número entero de 0 a 4;
b es 0 o 1;
en donde si a es 0, b es 0;
c es 0 o 1;
d es un número entero de 0 a 4;
en donde si d es 0, c es 0;
en donde al menos uno de a y d es un número entero de 1 a 4.
En algunas realizaciones, [TBM] es:
En algunas realizaciones, [TBM] es:
En algunas realizaciones, D1 y D2 son un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R1 es 1,2-ciclohexileno, R2 es H, R3 es H, DG es la Fórmula II, Q es CH, el Y posicionado en a a Q es C-[L]-TBM, y todos los demás Y son CH, y L es -C(O)-.
En algunas realizaciones, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
También se proporciona en la presente un compuesto de acuerdo con la invención, para su uso en imagenología por resonancia magnética (RM) de un paciente, que comprende: a) administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto que comprende un quelato metálico como se proporciona en la presente; y b) adquirir una imagen por RM del paciente. Por ejemplo, un compuesto de la invención para el uso en la imagenología de un tumor en un paciente se proporciona en la presente, el uso que comprende: a) administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto que comprende un quelato de metal como se proporciona en la presente; y b) adquirir una imagen por RM del tumor. En algunas realizaciones, el uso puede incluir un uso para la imagenología de un coágulo sanguíneo en un paciente, el uso comprende: a) administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto que comprende un quelato metálico como se proporciona en la presente; y b) adquirir una imagen por R<m>del coágulo sanguíneo. En algunas realizaciones, el uso puede incluir un uso para la imagenología de una lesión cerebral en un paciente, el uso comprende: a) administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto que comprende un quelato metálico como se proporciona en la presente; y b) adquirir una imagen por RM de la lesión cerebral.
Además se proporciona en la presente un compuesto de la invención para usar en la detección de la presencia o ausencia de barrera hematoencefálica alterada en un paciente, el uso comprende:
a) administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto que comprenda un quelato metálico como se proporciona en la presente, en donde M es Mn (II);
b) adquirir una primera imagen por RM del cerebro del paciente;
c) adquirir una segunda imagen por RM del cerebro del paciente; y comparar las imágenes.
En algunas realizaciones, se proporciona un compuesto de la invención para usar en la detección de la presencia o ausencia de estenosis arterial en un paciente, el uso comprende:
a) administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto que comprenda un quelato metálico como se proporciona en la presente, en donde M es Mn (II);
b) adquirir una primera imagen por RM de las arterias de un paciente;
c) adquirir una segunda imagen por RM de las arterias del paciente inmediatamente después de la inyección del compuesto; y
d) comparar las imágenes.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o en las pruebas de la presente invención se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Además, los métodos, materiales y ejemplos son meramente ilustrativos y no están contemplados como limitantes.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción que se muestra a continuación. Otros atributos, objetos y ventajas de la invención se desprenderán de la descripción y de los dibujos, así como de las reivindicaciones.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIGURA 1 muestra que el compuesto20dirigido a la fibrina posee una alta afinidad por el producto soluble de degradación de la fibrina que comprende el complejo de un dominio D-dímero y un dominio E de la proteína que se denomina DD(E) (por sus siglas en inglés). Se muestra la anisotropía de polarización de fluorescencia del péptido de unión a fibrina marcado con fluoresceína en solución de DD(E) en función de la adición de Mn-FBP (por sus siglas en inglés, círculos rellenos) o de una molécula conocida de unión a fibrina EP2104R (por sus siglas en inglés, círculos abiertos) para determinar el Ki (por sus siglas en inglés) a DD(E).
La FIGURA 2 muestra que los iones de Mn en el compuesto20tienen un ligando de agua de intercambio rápido. Se muestra la relaxividad transversal del H217O en presencia del compuesto20(círculos abiertos) en función de la temperatura. Las líneas continuas se ajustan a los datos.
La FIGURA 3 muestra la imagenología por RMN de la trombosis de la arteria carótida en un modelo de rata con el compuesto20. Las imágenes axiales están ponderadas por Ti antes (A, C) y 35 minutos después de la administración intravenosa del compuesto20(B, D) en 1,5 T (C) y (D) son regiones ampliadas de (A) y (B), respectivamente, que muestran las arterias carótidas comunes. El compuesto20potencia notablemente la señal en el vaso ipsilateral (flecha abierta, D) tras la inyección del compuesto20, pero no en el vaso contralateral (flecha rellena, D) ni en el vaso antes de la inyección de Mn-FBP (C). (E) Secciones teñidas con hematoxilina y eosina de las arterias carótidas contralateral (izquierda) e ipsilateral (derecha) que muestran un trombo oclusivo en el vaso lesionado; barra de escala = 300 |jm.
La FIGURA 4 muestra la cuantificación de los datos de imagenología MR con el compuesto20. (A) y (B) muestran la relación señal-ruido normalizada (nSNR, por sus siglas en inglés) del trombo (círculos cerrados), la región del vaso contralateral (círculos abiertos) y el músculo (rombos cerrados) después de la administración del compuesto20y EP2104R, respectivamente, mostrando un trombo persistentemente potenciado con cada sonda y el lavado de la señal del tejido de fondo. (C) y (D) relación contraste-ruido (CNR, por sus siglas en inglés) del trombo respecto al músculo (círculos cerrados) y de la región del vaso contralateral respecto al músculo (círculos abiertos) después de la administración del compuesto20y EP2104R, respectivamente, mostrando una CNR grande y persistentemente alta para el trombo con cada sonda. N = 4 para cada sonda, las barras de error representan el error estándar de la media.
La FIGURA 5 muestra el aclaramiento sanguíneo del compuesto20en función del tiempo (N = 4),
La FIGURA 6 muestra el cambio de relaxividad en función del tiempo para el compuesto20reactivo de peroxidasa en presencia de peróxido de hidrógeno sin (círculos cerrados) o con (círculos abiertos) peroxidasa de rábano picante. La relaxividad se multiplica por 7 a los 3 minutos de exposición a la peroxidasa.
La FIGURA 7 muestra que la conversión del compuesto33en compuesto34se produce limpiamente y sin subproductos. El trazo superior es el compuesto33y el trazo inferior es el compuesto33(convertido en gran medida en el compuesto34) después del tratamiento con peróxido de hidrógeno y peróxido de rábano picante.
La FIGURA 8 muestra el cambio de relaxividad (1,41 T, 37 °C) en función del tiempo para el compuesto33reactivo de tiol mientras se incuba en plasma sanguíneo humano sin (círculos cerrados) o con 5 mol. equiv. L-cisteína (círculos abiertos).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
1. Definiciones
Las abreviaturas químicas usadas comúnmente que no se definen explícitamente en esta divulgación se pueden encontrar en The American Chemical Society Style Guide, Second Edition;American Chemical Society,Washington, DC (1997), "2001 Guidelines for Authors"J. Org. Chem.66(1), 24A (2001), y "A Short Guide to Abbreviations and Their Use in Peptide Science"J. Peptide. Sci.5, 465-471 (1999).
Los términos "ligando quelante", "resto quelante" y "resto de quelato" se usan indistintamente y se refieren a cualquier ligando polidentado capaz de coordinar un ion metálico, ya sea directamente o después de la eliminación de los grupos protectores, o es un reactivo, con o sin grupos protectores adecuados, que se usa en la síntesis de un agente de contraste de RMN y comprende sustancialmente todos los átomos que finalmente coordinarán el ion metálico del complejo metálico final. Los términos "quelato" o "quelato metálico" se refieren al complejo metalligando propiamente dicho. Se entiende que el ligando polidentado se puede eventualmente coordinar a un ion metálico de utilidad médica o diagnóstica.
El término "afinidad de unión específica", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de un agente de contraste de ser captado, retenido o unido a un componente biológico particular u objetivo en mayor grado que otros componentes biológicos no objetivo. Se dice que los agentes de contraste que tienen esta propiedad están "dirigidos" al componente "objetivo". Los agentes de contraste que carecen de esta propiedad se denominan agentes "no específicos" o "no objetivo". La afinidad de unión de un grupo de unión por un objetivo se expresa en términos de la constante de disociación de equilibrio "Kd" (por sus siglas en inglés).
El término "relaxividad", como se usa en la presente, se refiere al aumento de cualquiera de las cantidades de RM 1/Ti o1/T2por concentración milimolar (mM) de ion paramagnético o agente de contraste, cantidades que pueden ser diferentes si el agente de contraste contiene una multiplicidad de iones paramagnéticos, en dondeT1es el tiempo de relajación longitudinal o de espín reticular, yT2es el tiempo de relajación transversal o de espín-espín de los protones del agua u otros núcleos de imagenología o espectroscópicos, incluidos los protones que se encuentran en moléculas distintas del agua. La relaxividad se expresa en unidades de mM' V .
Los términos "unión al objetivo" y "unión" se refieren en la presente a las interacciones no covalentes de un agente de contraste con un objetivo. Estas interacciones no covalentes son independientes entre sí y pueden ser, entre otras, hidrofóbicas, hidrofílicas, dipolo-dipolo, pi-apilamiento, puentes de hidrógeno, asociaciones electrostáticas o interacciones ácido-base de Lewis.
La coordinación de los iones metálicos por el agua y otros ligandos se considera a menudo en términos de esferas de coordinación (ver, por ejemplo, D. T. Richens, The Chemistry of Aqua Ions,John Wiley and Sons,Nueva York, 1997, capítulo 1). La primera esfera de coordinación o primaria representa todos los ligandos directamente unidos al ion metálico y está definida por los ligandos. Existe una segunda esfera de coordinación en donde las moléculas de agua y los contraiones se unen a los grupos de la primera esfera de coordinación mediante puentes de hidrógeno e interacciones electrostáticas. Las esferas de coordinación terciarias y subsecuentes son típicamente denominadas "agua a granel" o "disolvente a granel". Las distinciones entre estas esferas son tanto espaciales como temporales. La primera esfera de coordinación está típicamente bien definida y el tiempo que un agua u otro ligando pasa en la primera esfera de coordinación es más largo que en otras esferas de coordinación. La segunda esfera está menos definida, pero aquí las aguas tienen una vida más larga que el tiempo de difusión típico del agua. Más allá de la segunda esfera, el agua se difunde libremente.
Como se usa en la presente, todas las referencias a "Mn (II)" o "manganeso (II)" significan el ion metálico paramagnético Mn (II); todas las referencias a "Mn (III)" o "manganeso (III)" significan el ion metálico paramagnético Mn (III). Como se usa en la presente, "alquilo" significa un grupo químico ramificado o de cadena lineal que contiene solamente carbono e hidrógeno, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo,terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, sec-pentilo y neopentilo. Los grupos alquilo pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes. En algunas realizaciones, los grupos alquilo incluyen de 1 a 9 átomos de carbono (por ejemplo, de 1 a 6 átomos de carbono, de 1 a 4 átomos de carbono o de 1 a 2 átomos de carbono).
Como se usa en la presente, "alquenilo" significa un grupo químico de cadena ramificada o lineal que contiene solamente carbono e hidrógeno y que contiene al menos una unión doble de carbono-carbono, tales como etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, y similares. En varias realizaciones, los grupos alquenilo pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes. Típicamente, los grupos alquenilo comprenderán de 2 a 9 átomos de carbono (por ejemplo, de 2 a 6 átomos de carbono, de 2 a 4 átomos de carbono o 2 átomos de carbono).
Como se usa en la presente, "alquinilo" significa un grupo químico de cadena ramificada o lineal que contiene solamente carbono e hidrógeno y que contiene al menos una unión triple de carbono-carbono, tales como etileno, 1-propinilo, 1-butileno, 2-butileno, y similares. En varias realizaciones, los grupos alquinilo pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes. Típicamente, los grupos alquilo comprenderán de 2 a 9 átomos de carbono (por ejemplo, de 2 a 6 átomos de carbono, de 2 a 4 átomos de carbono o 2 átomos de carbono).
Como se usa en la presente, "alquileno" significa un grupo químico bivalente ramificado o de cadena lineal que contiene solamente carbono e hidrógeno, tales como metileno, etileno, n-propileno, isopropileno, n-butileno, isobutileno, sec-butileno, terc-butileno, n-pentileno, isopentileno, sec-pentileno y neopentileno. Los grupos alquileno pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes. Los grupos alquileno pueden ser saturados o insaturados (por ejemplo, contener subunidades -C=C- o -CEC-), en una o varias posiciones. En algunas realizaciones, los grupos alquileno incluyen de 1 a 9 átomos de carbono (por ejemplo, de 1 a 6 átomos de carbono, de 1 a 4 átomos de carbono o de 1 a 2 átomos de carbono).
Como se usa en la presente, "alquenileno" significa un grupo químico bivalente ramificado o de cadena lineal que contiene solamente carbono e hidrógeno y contiene al menos una doble unión de carbono-carbono, tales como etenileno, 1-propenileno, 2-propenileno, 2-metil-1-propenileno, 1-butenileno, 2-butenileno, y similares. En varias realizaciones, los grupos alquenileno pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes. Típicamente, los grupos alquenileno comprenderán de 2 a 9 átomos de carbono (por ejemplo, de 2 a 6 átomos de carbono, de 2 a 4 átomos de carbono o 2 átomos de carbono).
Como se usa en la presente, "alquileno" significa un grupo químico bivalente de cadena ramificada o lineal que contiene solamente carbono e hidrógeno y que contiene al menos una unión triple de carbono-carbono, tales como etileno, 1-propinileno, 1-butileno, 2-butileno, y similares. En varias realizaciones, los grupos alquileno pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes. Típicamente, los grupos alquileno comprenderán de 2 a 9 átomos de carbono (por ejemplo, de 2 a 6 átomos de carbono, de 2 a 4 átomos de carbono o 2 átomos de carbono).
Como se usa en la presente, "cicloalquilo" o "carbociclilo" significa un sistema de anillos cíclicos que contiene solamente átomos de carbono en la cadena principal del sistema de anillos, tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y ciclohexenilo. Los carbociclilos pueden incluir múltiples anillos fusionados. Los carbociclilos pueden tener cualquier grado de saturación siempre que al menos un anillo del sistema de anillos no sea aromático. Los grupos carbociclilo pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes. En algunas realizaciones, los grupos carbociclilo incluyen de 3 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, de 3 a 6 átomos de carbono.
Como se usa en la presente, "cicloalquileno" significa un sistema de anillos cíclicos bivalentes que contiene solamente átomos de carbono en la cadena principal del sistema de anillos, tales como ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno y ciclohexenileno. Los cicloalquilenos pueden incluir múltiples anillos fusionados. Los cicloalquilenos pueden tener cualquier grado de saturación siempre que al menos un anillo del sistema de anillos no sea aromático. Los grupos cicloalquileno pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes.
En algunas realizaciones, los grupos cicloalquileno incluyen de 3 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, de 3 a 6 átomos de carbono.
Como se usa en la presente, "arilo" significa un grupo mono-, bi-, tri- o policíclico con solamente átomos de carbono presentes en la cadena principal del anillo que tiene de 5 a 14 átomos de anillo, alternativamente 5, 6, 9, o 10 átomos de anillo; y que tiene 6, 10, o 14 electrones pi compartidos en un conjunto cíclico; en donde al menos un anillo en el sistema es aromático. Los grupos arilo pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes. Los ejemplos de arilo incluyen fluorenilo, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, 2,3-dihidro-íH-indenilo, y otros. En algunas realizaciones, el arilo es fenilo.
Como se usa en la presente, "arileno" significa un grupo mono-, bi-, tri- o policíclico bivalente con solamente átomos de carbono presentes en la cadena principal del anillo que tiene de 5 a 14 átomos de anillo, alternativamente 5, 6, 9, o 10 átomos de anillo; y que tiene 6, 10, o 14 electrones pi compartidos en un conjunto cíclico; en donde al menos un anillo en el sistema es aromático. Los grupos arileno pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes. Los ejemplos de arileno incluyen fluorenileno, fenileno, naftileno, tetrahidronaftileno, 2,3-dihidroíH-indenileno, y otros. En algunas realizaciones, el arilo es fenileno.
Como se usa en la presente, "arilalquileno" significa un grupo arilalquileno en el que los restos arilo y alquileno son como se describen anteriormente. En algunas realizaciones, los grupos arilalquileno contienen un resto alquileno de C1-C4. Los grupos arilalquileno ejemplares incluyen bencilo y 2-fenetilo.
Como se usa en la presente, el término "heteroarilo" significa un grupo mono-, bi-, tri- o policíclico que tiene de 5 a 14 átomos de anillo, alternativamente 5, 6, 9, o 10 átomos de anillo; y que tiene 6, 10, o 14 electrones pi compartidos en un arreglo cíclico; en donde al menos un anillo en el sistema es aromático, y al menos un anillo en el sistema contiene uno o más heteroátomos que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en N, O, y S. Los grupos heteroarilo pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes. Los ejemplos de heteroarilo incluyen tienilo, piridinilo, furilo, oxazolilo, oxadiazolilo, pirrolilo, imidazolilo, triazolilo, tiodiazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, piranilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, triazinilo, tiazolilo benzotienilo, benzoxadiazolilo, benzofuranoilo, bencimidazolilo, benzotriazolilo, cinolinilo, indazolilo, indolilo, isoquinolinilo, isotiazolilo, naftiridinilo, purinilo, tienopiridinilo, pirido[2,3-d]pirimidinilo, pirrolo[2,3-¿]piridinilo, quinazolinilo, quinolinilo, tieno[2,3-c]pi ridinilo, pirazolo[3,4-¿]piridinilo, pirazolo[3,4-c]pi ridinilo, pirazolo[4,3-c]piridina, pirazolo[4,3-¿]piridinilo, tetrazolilo, cromano, 2,3-dihidrobenzo[jb][1,4]d¡ox¡na, benzo[d][1,3]dioxol, 2,3-dihidrobenzofurano, tetrahidroquinolina, 2,3-dihidrobenzo[jb][1,4]oxatiina, y otros. En algunas realizaciones, el heteroarilo se selecciona de tienilo, piridinilo, furilo, pirazolilo, imidazolilo, piranilo, pirazinilo y pirimidinilo.
Como se usa en la presente, el término "heteroarileno" significa un grupo bivalente mono-, bi-, tri- o policíclico que tiene de 5 a 14 átomos de anillo, alternativamente 5, 6, 9, o 10 átomos de anillo; y que tiene 6, 10, o 14 electrones pi compartidos en un arreglo cíclico; en donde al menos un anillo en el sistema es aromático, y al menos un anillo en el sistema contiene uno o más heteroátomos que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en N, O, y S. Los grupos heteroarileno pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes.
Como se usa en la presente, "halo", "haluro" o "halógeno" es un radical de átomo de cloro, bromo, flúor o yodo. En algunas realizaciones, un halo es un cloro, bromo o flúor. Por ejemplo, un haluro puede ser flúor.
Como se usa en la presente, "haloalquilo" significa un sustituyente hidrocarbonado, que es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal o ramificado sustituido con uno o más átomos de cloro, bromo, flúor y/o yodo. En algunas realizaciones, un haloalquilo es un fluoroalquilo, en donde uno o más de los átomos de hidrógeno han sido sustituidos por flúor. En algunas realizaciones, los haloalquilos tienen de 1 a aproximadamente 3 carbonos de longitud (por ejemplo, de 1 a aproximadamente 2 carbonos de longitud o 1 carbono de longitud). El término "haloalquileno" designa una variante diradical del haloalquilo, y tales diradicales pueden actuar como espaciadores entre radicales, otros átomos, o entre un anillo y otro grupo funcional.
Como se usa en la presente, "heterociclilo" significa un sistema de anillos cíclicos no aromáticos que comprende al menos un heteroátomo en la cadena principal del sistema de anillos. Los heterociclilos pueden incluir múltiples anillos fusionados. Los heterociclilos pueden estar sustituidos o no sustituidos con uno o más sustituyentes. En algunas realizaciones, los heterociclos tienen entre 5 y 7 miembros. En los heterociclos monocíclicos de seis miembros, el heteroátomo o heteroátomos se seleccionan de uno a tres de O, N o S, y en donde cuando el heterociclo es de cinco miembros, puede tener uno o dos heteroátomos seleccionados de O, N o S. Los ejemplos de heterociclilo son azirinilo, aziridinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, 1,4,2-ditiazolilo, dihidropiridinilo, 1,3-dioxanilo, 1,4-dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo, piranilo, pirrolidinilo, tetrahidrofurilo, tetrahidropiridinilo, oxazinilo, tiazinilo, tiinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, piperidinilo, pirazolidinilo, imidazolidinilo, tiomorfolinilo, y otros. En algunas realizaciones, el heterociclilo se selecciona de azetidinilo, morfolinilo, piperazinilo, pirrolidinilo y tetrahidropiridinilo.
Como se usa en la presente, por "heterociclilo monocíclico" se entiende un anillo cíclico no aromático único que comprende al menos un heteroátomo en la cadena principal del sistema de anillos. Los heterociclilos pueden estar sustituidos o no sustituidos con uno o más sustituyentes. En algunas realizaciones, los heterociclos tienen entre 5 y 7 miembros. En los heterociclos monocíclicos de seis miembros, el heteroátomo o heteroátomos se seleccionan de uno a tres de O, N o S, y en donde cuando el heterociclo es de cinco miembros, puede tener uno o dos heteroátomos seleccionados de O, N o S. Los ejemplos de heterociclilo son azirinilo, aziridinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, 1,4,2-ditiazolilo, dihidropiridinilo, 1,3-dioxanilo, 1,4-dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo, piranilo, pirrolidinilo, tetrahidrofurilo, tetrahidropiridinilo, oxazinilo, tiazinilo, tiinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, piperidinilo, pirazolidinilo, imidazolidinilo, tiomorfolinilo, y otros.
El término "sustituido" se refiere a restos que tienen sustituyentes que reemplazan a un hidrógeno en uno o más átomos de no hidrógeno de la molécula. Se entenderá que "sustitución" o "sustituido con" incluye la condición implícita de que dicha sustitución esté de acuerdo con la valencia permitida del átomo sustituido y del sustituyente, y que la sustitución resulte en un compuesto estable, por ejemplo, que no experimente espontáneamente transformaciones tales como reordenamiento, ciclado, eliminación, etc. Los sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, -(alquilo de C1-C9) opcionalmente sustituido con uno o más de hidroxilo, - NH2, -NH(alquilo de C1-C3), y -N(alquilo de C<1>-C<3>)<2>; -(haloalquilo de C1-C9); un haluro; un hidroxilo; un carbonilo [tales como -C(O)OR, y -C(O)R]; un tiocarbonilo [tales como -C(S)OR, -C(O)SR, y -C(S)R]; -(alcoxilo de C1-C9) opcionalmente sustituido con uno o más de haluro, hidroxilo, -NH2, -NH(alquilo de C1-C3), y -N(alquilo de C<1>-C<3>)<2>; -OPO(OH)2; un fosfonato [tales como -PO(OH)2 y - PO(OR')2]; -OPO(OR')R"; -NRR'; -C(O)NRR'; -C(NR)NR'R"; -C(NR')R"; un ciano; un nitro; un azido; -SH; -S-R; -OSO2(OR); un sulfonato [tales como -SO2(OH) y -s O2(OR)]; - SO2NR'R"; y -SO2R; en el que cada ocurrencia de R, R' y R" se selecciona independientemente de H; -(alquilo de C1-C9); arilo de C6-C10 opcionalmente sustituido con de 1-3R'” ; heteroarilo de 5-10 miembros que tiene de 1-4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O, y S y opcionalmente sustituido con de 1-3R'''; carbociclilo de C3-C7 opcionalmente sustituido con 1-3R'''; y heterociclilo de 3-8 miembros con 1-4 heteroátomos que se seleccionan independientemente de N, O y S y opcionalmente sustituido con 1-3R'''; en donde cada R''' se selecciona independientemente de -(alquilo de C1-C6), -(haloalquilo de C1-C6), un haluro (por ejemplo, F), un hidroxilo, -C(O)OR, -C(O)R, -(alcoxilo de C1-C6), -NRR', -C(O)n Rr ', isotiocianilo y un ciano, en el que cada ocurrencia de R y R' se selecciona independientemente de H y -(alquilo de C1-C6). En algunas realizaciones, el sustituyente se selecciona de -(alquilo de C1-C6), -(haloalquilo de C1-C6), un haluro (por ejemplo, F), un hidroxilo, -C(O)OR, -C(O)R, -(alcoxilo de C1-C6), - NRR', -C(O)NRR', y un ciano, en el que cada ocurrencia de R y R' se selecciona independientemente de H y -(alquilo de C1-C6).
Como se usa en la presente, los pseudohalogenuros o grupos pseudohalo son grupos que se comportan de forma sustancialmente similar a los halogenuros. Tales compuestos se pueden usar y tratar tal como los haluros. Los pseudohalogenuros incluyen, pero no se limitan a, cianuro, cianato, tiocianato, selenocianato, trifluorometoxilo y azida.
Como se usa en la presente, "sulfinilo" o "tionilo" se refiere a -S(O)-. Como se usa en la presente, "sulfonilo" o "sulfurilo" se refiere a -S(O)2-. Como se usa en la presente, "sulfo" se refiere a -S(O)2O-.
Como se usa en la presente, "fosfinato" se refiere a -P(R)O2H, y "éster de fosfinato" se refiere a -P(R)O2R'. Como se usa en la presente, "fosfonato" se refiere a -PO3H2, y "éster de fosfonato" se refiere a -PO3RR'. Como se usa en la presente, "fosfodiéster" se refiere a -OPO3R-, y "alquilfosfodiéster" se refiere a -OPO3RR'. En los grupos anteriores, R es H o alquilo, y R' es alquilo.
El término "mamífero" se usa en su sentido biológico usual. Así, incluye específicamente a los humanos, ganado vacuno, caballos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, ovejas, cerdos, cabras y primates no humanos, pero también a muchas otras especies.
Un "paciente", como se usa en la presente, significa un humano o un mamífero no humano, por ejemplo, un perro, un gato, un ratón, una rata, una vaca, una oveja, un cerdo, una cabra, un primate no humano o un ave, por ejemplo, un pollo, así como cualquier otro vertebrado o invertebrado. En algunas realizaciones, el paciente es un humano.
Diseño de ligandos quelantes
Se describen en la presente (pero no forman parte de la presente invención) ligandos quelantes útiles para preparar quelatos metálicos de la presente invención que tienen una alta relaxividad. En algunas realizaciones, los ligandos quelantes se pueden usar para preparar quelatos metálicos no específicos que tengan una alta relaxividad. Opcionalmente, los ligandos quelantes se pueden modificar para incorporar uno o más restos de unión a objetivos (TBM). Los ligandos quelantes que tienen uno o más restos de unión a un objetivo pueden permitir que los ligandos quelantes (y los quelatos metálicos) se dirijan a uno o más sitiosin vivo.Los ligandos quelantes y los quelatos metálicos se pueden modificar para incorporar restos autoensamblados (SAM, por sus siglas en inglés), que son grupos que promueven el autoensamblaje de los quelatos en micelas, liposomas, emulsiones, etc. En algunas realizaciones, los ligandos quelantes y los quelatos metálicos también son útiles como sondas luminiscentes para usar en la detección y el análisis de alto rendimiento, múltiplex y/o en tiempo real de moléculas biológicas (por ejemplo, inmunoensayos o aplicaciones de PCR en tiempo real, por sus siglas en inglés).
Los ligandos quelantes descritos en la presente se basan en derivados de cadenas principales funcionalizadas con diaminas. Los derivados se preparan modificando los restos de amina del andamio con uno a tres grupos R y uno o más grupos donantes basados en heterociclos ("DG", por sus siglas en inglés). El carbono que une la amina de la cadena principal y el DG se puede funcionalizar con un grupo "R" adicional. Típicamente son capaces de coordinar un ion metálico. Los grupos R y los DG se pueden seleccionar por su capacidad para potenciar la relaxividad del ligando quelante cuando se encuentra en forma de quelato metálico y/o para promover un estado de oxidación específico del ion metálico. La relaxividad se puede potenciar, por ejemplo, por el efecto de un DG sobre la tasa de intercambio de agua de un quelato metálico; su capacidad para disminuir la tasa de relajación electrónica del ion metálico; su capacidad para prevenir la coordinación de aniones (por ejemplo, por repulsión electrostática); o su capacidad para atrapar un estado de oxidación generado bioquímicamente. En algunas realizaciones, un DG también puede incorporar un resto de segunda esfera (SSM, por sus siglas en inglés), un grupo que aumenta la relaxividad por su capacidad de coordinar una segunda esfera de agua (por ejemplo, por puentes de hidrógeno). En algunas realizaciones, un DG también puede incorporar un TBM, opcionalmente a través de un enlazador (L, por sus siglas en inglés) como se discute más adelante. La relaxividad se puede potenciar aún más por la unión al objetivo del TBM o al formar sistemas autoensamblados tales como liposomas.
Se pueden preparar varios ligandos quelantes.
Como se describe en la presente (pero no forma parte de la presente invención), es un ligando quelante correspondiente a un compuesto de Fórmula (I):
0 una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
R<1>se selecciona del grupo que consiste en un alquileno de C2-C6, un cicloalquileno de C3-C10, un heterocicloalquileno de 4-10 miembros, un arileno de C6-C10, un heteroarileno de 5-10 miembros, un (dialquilo de C1-C6))(arileno de C6-C10) y un (dialquilo de C1-C6)(heteroarileno de 5-10 miembros), en donde el alquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno y heteroarileno están cada uno opcionalmente sustituido por 1, 2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente. Opcionalmente, el resto R<1>se une a los nitrógenos adyacentes a través de átomos adyacentes, tales como átomos de carbono adyacentes (por ejemplo, la unión a través de los carbonos 1 y 2 del etileno) o a través de átomos separados por un único metileno (por ejemplo, la unión a través de los carbonos 1 y 3 del propileno). Se puede observar una unión similar con los restos cíclicos de R<1>, por ejemplo, la unión a través de átomos de carbono adyacentes (por ejemplo, la unión a través de los carbonos 1 y 2 del ciclohexileno).
Opcionalmente, R<1>se selecciona del grupo que consiste en un alquileno sustituido o no sustituido, tales como 1,3-propileno o 1,2-etileno, como se muestra a continuación:
o 2,3-propileno-1-carboxilato, como se muestra a continuación,
o ácido 3,4-butileno-1-carboxílico, como se muestra a continuación,
o 1 -hidroxi-3,4-butileno, como se muestra a continuación,
o 1-amino-5,6-hexileno, como se muestra a continuación,
un cicloalquileno sustituido o no sustituido, tales como los que se muestran a continuación, por ejemplo,cis-o frans-1,2-ciclohexileno, como se muestra a continuación,
o frans-1,2-ciclohexileno, como se muestra a continuación,
ocis-o frans-1,2-ciclopentileno, como se muestra a continuación,
un heterociclilo monocíclico sustituido o no sustituido, tal como 2,5-dihidro-íH-pirroleno, como se muestra a continuación
1,2,3,6-tetrahidropiridineno, como se muestra a continuación,
2,3,6,7-tetrahidro-íH-azepineno, como se muestra a continuación,
y cualesquiera isómeros correspondientes de los compuestos heterocíclicos monocíclicos sustituidos o no sustituidos, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido y arilalquileno sustituido o no sustituido, tal como 1-propileno-4-isotiocianatobenceno, como se muestra a continuación,
Opcionalmente, R1 puede estar sustituido con [L]-[TBM], tal como 1-propileno-benceno funcionalizado con una tiourea (-NH-C(S)-NH-) [L] y el arilalquileno sustituido Tb M dirigido a la albúmina, 2,2',4,4',5,6'-hexametil-1,1'-bifenilo, como se muestra a continuación,
cada R<2>y R<3>se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, CO2H, (alquilo de C1-C6)CO2H, alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo de 5-6 miembros, heteroarilo de 5-6 miembros, C(O)NR<4>R<5>, CH2NHCOR4, C(O)N(OH)R<4>, C(O)NHSO2R<4>, CH2NHSO2R4, N(OH)C(O)R<4>, P(R<4>)O2R<5>, PO<3>R<4>R<5>, y [L]-[TBM];
cada R<4>y R<5>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C1-C6 sustituido o no sustituido, y [L]-[TBM]; y
DG se selecciona del grupo que consiste en:
y
en donde
Y es CH, CZ, N, O, S o NR<4>;
cada Q es CH; y
Z se selecciona del grupo que consiste en H, OH, OR<4>, CO2R4, -(alquilo de C1-C6)CO2H, alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo de 5-6 miembros, heteroarilo de 5 6 miembros, C(O)NR<4>R<5>, CH2NHCOR4, C(O)N(OH)R<4>, C(O)NHSO2R<4>, CH2NHSO2R4, N(OH)C(O)R<4>, P(R<4>)O2R<5>, PO<3>R<4>R<5>, y -[L]-[TBM], en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos por 1, 2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente;
L es un enlazador;
TBM es un resto de unión a un objetivo, en donde cada TBM se selecciona independientemente de un TBM que se une a una o más de las siguientes: albúmina sérica humana (HSA); fibrina; un componente extracelular del miocardio que se selecciona de colágeno, elastina y decorina; una enzima extracelular secretada en la inflamación o el cáncer, que se selecciona de enzimas peroxidasas y proteasas; y un componente extracelular de una lesión que se selecciona de ácido hialurónico (H<a>), heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato, versicano, biglicano, composición disregulada de tio/disulfuro, fragmentos proteolizados de proteínas transmembranales y fibronectina; y
cada RX se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CN, NO2, halo, pseudohalo, amino, tionilo, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, isotiocianilo, alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, alquinilo de C2-C4, haloalquilo de C1-C4, cianoalquilo de C1-C4, hidroxialquilo de C1-C4, alcoxilo de C1-C4, aminoalquilo de C1-C4, di(alquilo de C1-C<4>)amino, alquilamino de C1-C4, fosfinato, éster de fosfinato, fosfonato, éster de fosfonato, fosfodiéster, alquilfosfodiéster de C1-C4, cicloalquilo de C3-C6, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros, heterocicloalquilo de 5-6 miembros, (alquilo de C<1>-C<4>)fenilo, en donde el fenilo puede estar sustituido o no sustituido, y -[L]-[TBM];
De acuerdo con la invención, si todos los Y son CH, entonces al menos uno de R<2>o R<3>no es H. Opcionalmente, un compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (IA):
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R2, R3 y DG son como se definen para la Fórmula (I). Opcionalmente, un compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (IB):
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R2, R3 y DG son como se definen para la Fórmula (I). En algunas realizaciones, el DG ha sido modificado para dirigirse a proteínas plasmáticas de la sangre tales como la albúmina sérica.
Los ejemplos no limitantes de ligandos quelantes descritos en la presente y usados para formar quelatos metálicos de la presente invención incluyen:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Opcionalmente, uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6) ligandos quelantes están enlazados a un TBM que tiene alta afinidad por la fibrina. Por ejemplo, tal compuesto puede tener la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Opcionalmente, uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6) ligandos quelantes están enlazados a un TBM que tiene alta afinidad por el colágeno. Por ejemplo, uno de tales compuestos puede tener la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Opcionalmente, el ligando quelante enlazado a un TBM que tenga alta afinidad por los carbonilos proteicos, tal como las hidrazidas. Por ejemplo, un ligando quelante usado para formar un quelato metálico de la presente invención tiene la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro ejemplo, el ligando quelante unido a un TBM que tiene alta afinidad por la elastina. Por ejemplo, un ligando quelante tiene la fórmula que se muestra a continuación:
En una realización de la invención, el ligando quelante tiene DG y R que favorecen la unión de Mn (II), pero también R auxiliares que favorecen la unión de Mn (III), en donde los grupos R que favorecen Mn (II) en cada quelato o ligando quelante son diferentes de los que favorecen Mn (III). Por ejemplo, cuando M = Mn, los grupos R3 que favorecen el Mn (II) se pueden seleccionar independientemente de COOH, o fórmula XVI donde X = N, mientras que los grupos R4 que favorecen el Mn (III) se pueden seleccionar independientemente de COOH, o fórmula XVI donde X = C(OH). Los ejemplos no limitantes de tales compuestos incluyen:
Los protocolos sintéticos usados para preparar los ligandos quelantes son generales y se pueden extender ampliamente para incluir realizaciones adicionales.
De acuerdo con la invención, el ligando quelante se coordina a un metal para formar un compuesto de fórmula general como sigue:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde todos los restos son como se definen en las reivindicaciones.
Por ejemplo, el ligando quelante coordinado a un metal puede formar un compuesto de fórmula general:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (no todo forma parte de la invención).
En tales realizaciones, M puede ser un isótopo estable o inestable que se selecciona de Fe (III), Mn (II), Mn (III), Cr (III), Cu (II), Cu (III), Dy (III), Ho (III), Er (III), Pr (III), Eu (II), Eu (III), Nd (III), La (III), Lu (III), Sm (III), Tb (III), Tb (IV), Tm (III), Y (III), In (III), Ga (III), Tc (III), Tc (IV), Tc (V), Re (III), Re (IV), Re (V), Bi (III) e Yb (III). En algunas realizaciones, M es Mn (II) o Mn (III).
En algunas realizaciones, el DG del complejo quelato-metal se ha modificado para que tenga como objetivo proteínas plasmáticas de la sangre tal como la albúmina sérica.
Los ejemplos no limitantes de quelatos metálicos como se proporcionan en la presente incluyen:
10
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro ejemplo de realización, uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6) complejos quelato-metal están enlazados a un TBM que tiene alta afinidad por la fibrina. Por ejemplo, uno de tales complejos quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización, uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6) complejos quelato-metal están enlazados a un TBM que tiene alta afinidad por el colágeno. Por ejemplo, un complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En o tra rea liza c ió n , el lig a n d o qu e la n te en la za d o a un T B M que t ie n e a lta a fin id a d po r los ca rb o n ilo s p ro te icos , tal com o las h id raz idas . P o r e jem p lo , un ligan do q u e la n te t ie n e la fó rm u la que se m uestra a con tinu ac ió n :
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización, el ligando quelante enlazado a un TBM que tiene alta afinidad por la elastina. Por ejemplo, un ligando quelante tiene la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización, el complejo quelato-metal tiene DG y R que favorecen la unión de Mn (II), pero también R auxiliares que favorecen la unión de Mn (III), en donde los grupos R que favorecen Mn (II) en cada quelato o ligando quelante son diferentes de los que favorecen Mn (III). Tras la oxidación del Mn (II) a Mn (III), los grupos R que favorecen al Mn (III) se unen al ion Mn (III) oxidado. El cambio de Mn (II) a Mn (III) resulta en una disminución de la relaxividad.
En una realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En o tra rea liza c ió n de e jem p lo , e l c o m p le jo q u e la to -m e ta l tiene la fó rm u la que se m ue stra a co n tinu ac ió n :
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
En otra realización de ejemplo (que no forma parte de la invención), el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En o tra rea liza c ió n de e jem p lo , e l c o m p le jo q u e la to -m e ta l tiene la fó rm u la que se m ue stra a co n tinu ac ió n :
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
De forma relacionada, el complejo quelato-metal tiene DG y R que favorecen la unión de Mn (III), pero también R auxiliares que favorecen la unión de Mn (II), en donde los grupos R que favorecen Mn (III) en cada quelato o ligando quelante son diferentes de los que favorecen Mn (II). Por ejemplo, cuando M = Mn, los grupos R4 que favorecen Mn (III) se pueden seleccionar independientemente de la fórmula XVI, en donde X = C(O<h>), mientras que los grupos R3 que favorecen Mn (II) son COOH, o en algunas realizaciones fórmula XVI, en donde X = N. Tras la reducción de Mn (III) a Mn (II), los grupos R que favorecen Mn (II) se unen al ion Mn (II) reducido. El cambio de Mn (III) a Mn (II) resulta en un aumento de la relaxividad.
En una realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
En otra realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
En otra realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
En otra realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
En otra realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización de ejemplo, el complejo quelato-metal tiene la fórmula que se muestra a continuación:
Los complejos quelato-metal que pueden alternar entre los estados de oxidación Mn (II) y Mn (III) se pueden "encender" y "apagar" en respuesta a estímulos bioquímicos. Por ejemplo, el compuesto puede ser un compuesto en el que el ion Mn se encuentra en el estado de oxidación Mn (II), como se muestra en la fórmula a continuación:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El complejo Mn (II) compuesto, al reducirse, puede ser un compuesto en el que el ion Mn se encuentra en el estado de oxidación Mn (III):
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Tales agentes de contraste que pueden cambiar su relaxividad y propiedades de generación de señales en respuesta a un estímulo oxidante o reductor se pueden usar para detectar regiones de estrés oxidativo que se producen en el cuerpo, por ejemplo, debido a isquemia miocárdica en el contexto del síndrome coronario agudo o infarto de miocardio; o en el ictus; o en la inflamación; o en la esteatohepatitis no alcohólica; o en la enfermedad inflamatoria intestinal; o en la esclerosis múltiple; o en la placa aterosclerótica de alto riesgo; o en otras enfermedades caracterizadas por la isquemia de tejidos u órganos; o en enfermedades de inflamación crónica tales como la artritis reumatoide o el lupus. Las células cancerosas en proliferación requieren un entorno más reductor que las células normales y, así, estos agentes de contraste pueden ser útiles para distinguir el tejido canceroso del normal, o usarse para estadificar la agresividad de un cáncer específico.
Los protocolos sintéticos usados para preparar los ligandos quelantes son generales y se pueden extender ampliamente para incluir realizaciones adicionales.
Grupos objetivo
Los ligandos quelantes se pueden modificar para incorporar uno o más restos de unión al objetivo (TBM), como se ha indicado anteriormente. Los TBM incluyen péptidos, ácidos nucleicos o pequeñas moléculas orgánicas, de las que se dan ejemplos a continuación. Los TBM permiten unir ligandos quelantes y quelatos metálicos a objetivosin vivo.Típicamente, un TBM tiene afinidad por un objetivo. Por ejemplo, el TBM se puede unir a su objetivo con una constante de disociación menor a 10|jM, o menor a 5|jM, o menor a 1|jM, o menor a 100 nM. En algunas realizaciones, el TBM tiene una afinidad de unión específica para un objetivo específico en relación con otros objetivos fisiológicos. Por ejemplo, el TBM puede mostrar una constante de disociación menor para la fibrina en relación con su constante de disociación para el colágeno. Algunos TBM no se adhieren necesariamente a un objetivo, sino que promueven un cambio en la relaxividad del agente de contraste en presencia de un objetivo específico. Por ejemplo, un TBM puede promover un cambio en la relaxividad en presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) generadas por enzimas peroxidasas.
Los TBM se pueden sintetizar y conjugar con los ligandos quelantes mediante métodos bien conocidos en la técnica, incluidos los métodos estándar de síntesis de péptidos y ácidos nucleicos (ver, por ejemplo, WO 01/09188, WO 01/08712 y las patentes de EE.UU. Nos. 6,406,297 y 6,515,113). En algunas realizaciones, un TBM está unido covalentemente al ligando quelante. Por ejemplo, el TBM se puede unir covalentemente al ligando quelante a través de un enlazador opcional (L). Como se indica en las estructuras anteriores, un TBM puede estar en cualquier lugar de un ligando quelante. Por ejemplo, el TBM puede estar unido, opcionalmente mediante un L, a cualquier Rs o DG. En algunas realizaciones, la incorporación de múltiples TBM al ligando quelante puede resultar en una mayor afinidad y avidez por el objetivo. Los ligandos quelantes contienen típicamente de 1-4 unidades (L-TBM), por ejemplo, un ligando quelante puede estar unido a una unidad L-TBM, o un ligando quelante puede estar unido a dos unidades L-TBM, o un ligando quelante puede estar unido a tres unidades L-TBm , o un ligando quelante puede estar unido a cuatro unidades L-TBM. En otras realizaciones puede ser preferible unir múltiples ligandos quelantes a una o más unidades de L-TBM para aumentar la capacidad de generación de señal de<r>M<n>del agente de contraste. En tales realizaciones, un agente de contraste contendrá típicamente 1-4 unidades (L-TBM) unidas a 2-8 ligandos quelantes, por ejemplo, dos ligandos quelantes pueden estar unidos a un L-TBM, o tres ligandos quelantes pueden estar unidos a un L-TBM, o cuatro ligandos quelantes pueden estar unidos a un L-TBM, o seis ligandos quelantes pueden estar unidos a un L-TBM, u ocho ligandos quelantes pueden estar unidos a un L-TBM.
Los ligandos quelantes que tienen un TBM se pueden probar para determinar los valores de relaxividad (como el quelato metálico) en presencia o ausencia del objetivo, por ejemplo, cuando el TBM está unido o no al objetivo, respectivamente. Típicamente, un quelato metálico que tenga un TBM mostrará una mayor relaxividad cuando se una a un objetivo debido al efecto RIME (por sus siglas en inglés, ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos.
4,899,755 y 4,880,008).
Los objetivos típicos incluyen la albúmina sérica humana (HSA), la fibrina, un componente extracelular del miocardio (por ejemplo, colágeno, elastina y decorina), enzimas extracelulares secretadas en inflamaciones o cáncer (por ejemplo, enzimas peroxidasas o proteasas) o un componente extracelular de una lesión (por ejemplo, ácido hialurónico, heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato, versicano, biglicano, composición desregulada de tioles y disulfuros).
Los TBM para la unión a HSA son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir una variedad de restos hidrofóbicos o anfifílicos. Por ejemplo, un TBM para la unión a HSA puede tener una de las siguientes fórmulas:
(CH2)nCHa;
(CH2)nPh;
en donde n es de 2 a 20 y Ph es fenilo (ver, por ejemplo, WO 96/23526).
En la solicitud de patente de EE.UU. con No. Ser. 10/209,183, titulada PEPTIDE-BASED MULTIMERIC TARGETED CONTRAST A<g>E<n>TS, presentada el 30 de julio de 2002, se describen TBM útiles para la unión a fibrina. Por ejemplo, los péptidos de unión a fibrina se pueden elegir entre el péptido cíclico con un puente disulfuro C-P*-Y*-X-L-C (SEQ ID NO: 1), en donde P* es prolina o su derivado 4-hidroxiprolina, Y* es tirosina o su derivado no natural sustituido en la posición 3 con un resto del grupo de F, Cl, Br, I o NO2, y X es glicina o ácido D- o L-aspártico. Otro ejemplo de péptidos puede ser X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6 (SEQ iD NO: 2), en donde X1se selecciona de W, 5, F, Y, o Y sustituido o F sustituido; X2se selecciona de E, H, dH, S; X3se selecciona de G, D, dD; X4se selecciona de H, F, Y, y W; X5se selecciona de I, L, V, y N; y X6 se selecciona de N, Q, I, L, V, o X6 no está presente.
Los TBM para unir un componente extracelular de una lesión incluyen péptidos con afinidad por el ácido hialurónico (HA). Se conocen péptidos que tienen afinidad por el HA. Por ejemplo, se han aislado péptidos que se unen al HA a partir de una biblioteca de péptidos de fagos aleatorios de 12 marcadores (ver, por ejemplo, Mummert, M., Mohamedzadeh, M., Mummert, D., Mizumoto, N., and Takashima, A. J.,Exp. Med.(2000) 769-779). Uno de estos péptidos, GAHWQFNALTVR (SEQ ID NO: 3), se une al HA con una Kd-1 |jM. Como se describe en la presente, todos los péptidos se escriben desde su N-terminal hasta su C-terminal. Otros péptidos de unión al HA son TSYGRPALLPAA (SEQ ID NO: 4), MDHLAPTRFRPAI (SEQ ID NO: 5), TLRAIWPMWMSS (SEQ ID NO: 6) e IPLTANYQGDFT (SEQ ID NO: 7).
Además, los péptidos con afinidad por el HA pueden incluir un motivo de unión consensuado que se encuentra en muchos péptidos de unión al HA, como RHAM<m>(por sus siglas en inglés), CD44 y la proteína de enlace. El motivo de consenso puede ser B(X)7, en donde B es un residuo básico (por ejemplo, Lys, His o Arg) y X es un residuo no ácido.
En otras realizaciones, un péptido dirigido a la lesión puede tener afinidad por la heparina, y puede incluir un motivo de unión a la heparina que se encuentra en las proteínas de unión a la heparina. Los motivos de unión a heparina para su inclusión en los péptidos incluyen XBBXBX o XBBBXXBX, en donde B es un residuo básico (por ejemplo, Lys, His o Arg) y X es un residuo no ácido. Por ejemplo, el péptido de unión a la heparina ACQWHRVSVRWG (Se Q ID NO: 8) se ajusta a la secuencia XBBXXXBX (ver, por ejemplo, Nielsen, P.K., Gho, Y.S., Hoffman, M.P., Watanabe, H., Makino, M., Nomizu, M., and Yamada, Y.,J. Biol. Chem.(2000) 275, 14517-14523). Por último, también se puede incluir en un péptido el motivo de la secuencia heparina sulfato / proteína que interactúa con la heparina (HIP, por sus siglas en inglés). Un ejemplo de tal motivo es CRPKAKAKAKAKDQTK (SEQ ID NO: 9).
En otras realizaciones, un péptido objetivo de lesión puede tener afinidad por fragmentos proteolizados de proteínas transmembranales tales como la proteína tirosina fosfatasa receptora (PTPj , por sus siglas en inglés) (ver, por ejemplo, Burden-Gully, S. M., Zhou, Z., Craig, S. E. L., Lu, Z.-R., Brady-Kalnay, S. M.,Transí. Oncol.(2013) 6, 329-337). Un ejemplo de tal motivo es CGEGDDFNWEQVNTLTKPTSD (SEQ ID NO: 10).
En otras realizaciones, un péptido dirigido a lesiones puede tener afinidad por la fibronectina (ver, por ejemplo, Zhou, Z., Qutaish, M. Han, Z. Schur, R. M., Liu, Y., Wilson, D. L., and Lu, Z.-R.,Nat. Commun.(2015) 6, 7984 7994). Un ejemplo de tal motivo es CREKA (SEQ ID NO: 11).
Los TBM útiles para dirigirse a la fibrina incluyen los péptidos de unión a la fibrina para permitir la imagenología específica de la fibrina (por ejemplo, trombos, tumores sólidos y placas ateroscleróticas) dentro de un mamífero. Se puede usar cualquier péptido capaz de unirse a la fibrina. Por ejemplo, se pueden usar los péptidos divulgados en WO 2008/071679, las patentes de EE.UU. Nos. 6,984,373; 6,991,775; y 7,238,341 y la solicitud de patente de EE.UU. No. 2005/0261472. Un péptido puede tener de aproximadamente 2 a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud (por ejemplo, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20, de aproximadamente 5 a aproximadamente 18, de aproximadamente 8 a aproximadamente 15, y de aproximadamente 10 a aproximadamente 14).
Los TBM útiles para dirigirse a las enzimas secretadas en la inflamación y el cáncer incluyen la 5-hidroxitriptamina, que se muestra a continuación
y el 5-hidroxitriptófano, que se muestra a continuación,
que se oxidan y subsecuentemente se oligomerizan en presencia de ROS generadas por enzimas peroxidasas, tales como la mieloperoxidasa (ver por ejemplo, Shazeeb, M. S., Xie, Y., Gupta, S., and Bogdanov, A. A. Jr.,Mol. Imaging.(2012) 11, 433-443). La oligomerización resulta en quelatos más grandes, que giran más lentamente y tienen mayor relaxividad.
En otras realizaciones, los restos dirigidos a ROS pueden incluir DG o grupos R que pueden ser oxidados por agentes oxidantes biológicos, tales como oxígeno, peróxido de hidrógeno, superóxido, enzimas peroxidasas, ácido hipocloroso o disulfuros. En ausencia del agente oxidante, el grupo DG o R favorece la formación de un quelato metálico con el ion metálico en un estado de oxidación de alta valencia, tal como Mn (III). Cuando se oxida el grupo DG o R, posteriormente el grupo DG o R oxidado favorece la formación de un quelato metálico con el ion metálico en un estado de oxidación de baja valencia, tal como Mn (II). El cambio de Mn (III) a Mn (II) resulta en un aumento de la relaxividad.
En otras realizaciones, los quelatos metálicos que comprenden grupos R y DG que favorecen, y se unen a, iones metálicos en estados de oxidación de baja valencia, tal como Mn (II), pueden incluir grupos R auxiliares, no coordinantes, que favorecen la unión a estados de oxidación de metales de alta valencia, tal como Mn (III). Tales grupos R auxiliares pueden unirse y atrapar Mn (III) generado a partir de la oxidación de Mn (II) por agentes oxidantes biológicos, tales como oxígeno, peróxido de hidrógeno, superóxido, enzimas peroxidasas, ácido hipocloroso o disulfuros. El cambio de Mn (II) a Mn (III) resulta en una disminución de la relaxividad.
En otras realizaciones, los quelatos metálicos que comprenden grupos R y DG que favorecen, y se unen a, iones metálicos en estados de oxidación de alta valencia, tal como Mn (III), pueden incluir grupos R auxiliares, no coordinantes, que favorecen la unión a estados de oxidación de metales de baja valencia, tal como Mn (II). Tales grupos R auxiliares pueden unirse y atrapar Mn (II) generado a partir de la reducción de Mn (II) por agentes reductores biológicos, tales como tioles, ácido ascórbico, mitocondrias, superóxido, enzimas reductasas, NADH o NADPH (por sus siglas en inglés, respectivamente). El cambio de Mn (III) a Mn (II) resulta en un aumento de la relaxividad.
Los TBM útiles para dirigirse a enzimas secretadas en la inflamación y el cáncer pueden incluir sustratos peptídicos para enzimas proteasas (ver Jastrzebska, B., Lebel, R., Therriault, H., McIntyre, J. O., Escher, E., Guerin, B., Paquette, B., Neugebauer, W. A., and Lepage, M. J.,Med. Chem.(2009) 52, 1576-1581). La actividad de la enzima proteasa sobre el sustrato peptídico puede provocar un cambio en la solubilidad del complejo quelato-metal. La disminución de la solubilidad resulta en una retenciónin vivoen el sitio del objetivo bioquímico.
Los TBM útiles para dirigirse al colágeno incluyen los péptidos derivados del propolipéptido del factor von Willebrand, que se sabe que se une al colágeno. Como se usa en la presente, todos los péptidos se escriben desde el N-terminal al C-terminal. Adicionalmente, los péptidos que contienen dos o más residuos de cisteína pueden formar puentes disulfuro en condiciones no reductoras. Un péptido dirigido al colágeno puede incluir la siguiente fórmula general: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO: 12), en donde X1puede ser W, C o A; X2puede ser R, C o A; X3puede ser E, C, A, K o T; X4puede ser P, C o A; X5puede ser D, G, S, C o A; X6puede ser F, R, C o A; X7puede ser C, M o A; X8 puede ser A, E o C; X9puede ser L, M, R, C o A; y X10puede ser S, N, G, L, C o A; en donde no más de 3 de X1-X10son C o A, independientemente, y en donde el número total de residuos C y A en XI- X10es un máximo de 4. Por ejemplo, un péptido puede tener las siguientes secuencias: WREPSFCALS (SEQ ID NO: 13); WREPSFMALS (SEQ ID NO: 14); y WREPGFCALS (SEQ ID NO: 15).
Otro ejemplo de péptido que se une al colágeno tiene la siguiente fórmula general: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-XI I- X12-X13(SEQ iD NO: 16), en donde X1puede ser W, C o A; X2puede ser R, C o A; X3puede ser E, C, A, K o T; X4puede ser P, C o A; X5puede ser D, G, S, C o A; X6 puede ser F, R, C o A; X7puede ser C, M o A; X8 puede ser A, E o C; X9puede ser L, M, R, C o A; X10puede ser S, N, G, L, C o A; X11puede ser C, M o A; X12puede ser P, A o C; y en donde X13puede ser K, Q, P, H, G, C o A; en donde no más de 4 de X1-X13son C o A, independientemente, y en donde el número total de residuos C y A en X1-X13es un máximo de 5.
Un péptido para unir colágeno también puede tener la siguiente fórmula general: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO: 17), en donde X1puede ser V, I, C o A; X2puede ser A, G, R, D o C; X3puede ser W, C o A; X4puede ser R, C o A; X5puede ser E, C, A, K o T; X6 puede ser P, C o A; X7puede ser D, G, S, C o A; X8 puede ser F, R, C o A; X9puede ser C, M o A; X10puede ser E, A o C; X11puede ser L, C, A, M o R; X12puede ser S, C, A, N, G., o L; X13puede ser C, M, o A; X14puede ser P, A, o C; y X15puede ser K, Q, P, H, G, C, o A; en donde no más de 4 de X1-X15son C o A, independientemente, y en donde el número total de residuos C y A en X1-X15es un máximo de 6.
Se encuentran péptidos adicionales dirigidos al colágeno en la patente de EE.UU. 8,034,898, titulada "Methods of Collagen Imaging", presentada el 29 de diciembre de 2006. Por ejemplo, los péptidos de unión a colágeno se pueden seleccionar de los péptidos cíclicos con un puente disulfuro W-H-C-X1-T-X2-F-P-H-H-Y-C (SEQ ID NO: 18), en donde X1se selecciona de Y, T o S, y X2puede ser cualquier aminoácido. Se pueden identificar otros péptidos dirigidos al colágeno al modificar (por ejemplo, mutar, truncar, alargar) los péptidos descritos anteriormente.
En WO 2004/112839, presentada el 17 de junio de 2004, se describen TBM útiles para unir receptores de folato, vitronectinas, integrinas alfa-v-beta-3 y alfa-v-beta-5, péptidos RGD (por sus siglas en inglés) para objetivos de MMP (por sus siglas en inglés), porfirinas y fosfonatos.
Los TBM útiles para unir elastina incluyen la siguiente fórmula:
La imagenología por resonancia magnética de objetivos de baja concentración se puede ver limitada por la relaxividad del agente de contraste. Se han empleado diferentes estrategias para ensamblar muchos quelatos juntos con el fin de mejorar la sensibilidad del agente de contraste, incluyendo el ensamblaje covalente y no covalente de ligandos quelantes y quelatos metálicos. El enfoque no covalente consiste en usar un grupo que pueda interactuar consigo mismo o con grupos similares para formar un conjunto de moléculas. Los ligandos quelantes se pueden modificar para incorporar uno o más restos autoensamblados (SAM), como se ha indicado anteriormente. Los SAM pueden incluir lípidos, grupos alquilo de cadena larga o alquilo sustituido, perfluorocarbonos, péptidos, ácidos nucleicos o pequeñas moléculas orgánicas. Los SAM permiten que los ligandos quelantes y los quelatos metálicos se asocien entre sí para formar agregados, partículas o ensamblajes mayores.
Los SAM se pueden sintetizar y conjugar con ligandos quelantes por métodos bien conocidos en la técnica, incluidos los métodos estándar de síntesis de péptidos y ácidos nucleicos; ver, por ejemplo, WO 01/09188, WO 01/08712 y las patentes de EE.UU. Nos. 6,406,297 y 6,515,113. Típicamente, un SAM está unido covalentemente a un ligando quelante, y puede estar unido covalentemente a un ligando quelante a través de un enlazador opcional (L). Como se indica en las estructuras anteriores, un SAM puede estar en cualquier lugar de un ligando quelante. Por ejemplo, el SAM puede estar unido, opcionalmente mediante un L, a cualquier Rs o DG.
Los ligandos quelantes que tienen un SAM se pueden probar para determinar los valores de relaxividad (como el quelato metálico) en o por encima de una concentración crítica de autoensamblaje. A concentraciones muy bajas, el quelato puede existir en forma predominantemente monomérica, no ensamblada; por encima de una concentración crítica de autoensamblaje, el quelato puede existir predominantemente en forma autoensamblada. Típicamente, un quelato metálico que tenga un SAM mostrará una mayor relaxividad cuando se encuentre en la forma autoensamblada debido al efecto RIME (ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 4,899,755 y 4,880,008).
Los SAM pueden incluir lípidos y grupos similares a los lípidos capaces de formar micelas (ver, por ejemplo, Nicolle, G.M., Toth, E., Eisenwiener, K.P., Macke, H.R., and Merbach, A.E.,J Biol Inorg Chem.20027:757-69) o liposomas (ver, por ejemplo, Mulder, W.J., Strijkers, G.J., van Tilborg, G.A., Griffioen, A.W., and Nicolay, K.,NMR Biomed.
2006 19:142-64). Los SAM también pueden facilitar la incorporación a liposomas o emulsiones mixtas (ver, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 6,869,591)
Los SAM también pueden ser grupos perfluoroalquilo que promueven el autoensamblaje (ver, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 6,916,461 y WO 2003/0232012). Alternativamente, los péptidos también pueden formar autoensamblajes (ver, por ejemplo, WO 2004/0204561).
Enlazadores
En algunas realizaciones, el TBM está unido covalentemente al ligando quelante a través de un enlazador (L). Un L puede incluir, por ejemplo, una secuencia peptídica lineal, ramificada o cíclica. En una realización, un L puede incluir la secuencia dipéptida lineal G-G (glicina-glicina). En realizaciones en donde el TBM incluye un péptido, el L puede taponar el N-terminal del péptido del TBM, el C-terminal, o ambos N- y C-terminales, como un resto de amida. Otros restos de tapón ejemplares incluyen sulfonamidas, ureas, tioureas y carbamatos. Los enlazadores también pueden incluir alcanos, alquenos o alquinos lineales, ramificados o cíclicos, y restos de fosfodiéster. Un L puede estar sustituido con uno o más grupos funcionales, incluyendo funcionalidades de cetona, éster, amida, éter, carbonato, sulfonamida o carbamato. Los enlazadores específicos contemplados incluyen -(O-(CH2)2-O)n, en donde n = 1-20.000, y más específicamente en donde n = 1-6; NH-CO-NH-; -CO-(CH2)n-NH-, en donde n = 1 a 10; dpr; dab (por sus siglas en inglés, respectivamente); -NH-Ph-; -NH-(CH2)n-, en donde n = 1-10; -CO-NH-; -(CH2)n-NH-, en donde n = 1-10; -CO-(CH2)n-NH-, en donde n = 1-10; -CS-NH-, y
En algunas realizaciones, L está enlazado al quelato mediante cualquier R o DG. Por ejemplo, un quelato puede tener la fórmula general:
V f A N ñA° OH (XXX|)
/ DG
[TBM] —[L] HO O
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (no todo forma parte de la invención).
Los ejemplos adicionales de enlazadores y metodologías sintéticas para incorporarlos a ligandos quelantes, particularmente ligandos quelantes que comprenden péptidos, se exponen en WO 01/09188, WO 01/08712, WO 2004/112839, la patente de EE.UU. con No. Ser. 10/209,183, titulada "Peptide-Based Multimeric Targeted Contrast Agents", presentada el 30 de julio de 2002, y la patente de E<e>.UU. con No. Ser. 11/618,564, titulada "COLLAGEN BINDI<n>G PEPTIDES", presentada el 29 de diciembre de 2006.
Propiedades de los ligandos quelantes y los quelatos metálicos
Los ligandos quelantes son capaces de unirse a uno o más iones metálicos para resultar en un quelato metálico. Los quelatos metálicos se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica; ver, por ejemplo, WO 96/23526, las patentes de EE.UU. Nos. 6,406,297 y 6,515,113, y los Ejemplos, a continuación.
Como se describe en la presente, los quelatos metálicos pueden incluir un ion metálico con un número atómico de 21-29, 40, 42 o 57-83. Por ejemplo, los quelatos metálicos pueden incluir un isótopo estable o inestable que se selecciona de Fe (III), Mn (II), Mn (III), Cr (III), Cu (II), Cu (III), Dy (III), Ho (III), Er (III), Pr (III), Eu (II), Eu (III), Nd (III), La (III), Lu (III), Sm (III), Tb (III), Tb (IV), Tm (III), Y (III), In (III), Ga (III), Tc (III), Tc (IV), Tc (V), Re (III), Re (IV), Re (V), Bi (III) o Yb (III). El ion metálico puede ser paramagnético. Típicamente, debido a la naturaleza química y al número de DG en los ligandos quelantes, el ion metálico está fuertemente unido por el ligando quelante, y se pueden hacer quelatos metálicos fisiológicamente compatibles. La constante de formación, K<e>, de un ligando quelante para un ion metálico es un indicador de la afinidad de unión, y típicamente es discutida con referencia a una escala log Ke. Los quelatos metálicos fisiológicamente compatibles pueden tener un log Ke en el rango de 10 a aproximadamente 25, es decir, la Ke está en el rango de 1010 y 1025 M-1. Para los quelatos metálicos de Mn (II), el log K<e>debe ser mayor a 12. Los métodos para medir K<e>son bien conocidos en la técnica; ver, por ejemplo, Martell, A.E. y Motekaitis, R.J., Determination and Use of Stability Constants, 2d Ed.,VCH Publishers,Nueva York (1992).
También se pueden valorar los valores de relaxividad de los quelatos metálicos. Si el quelato metálico incorpora un TBM, la relaxividad se puede medir en presencia y ausencia de la molécula objetivo. Los métodos para medir la relaxividad son bien conocidos en la técnica; ver, por ejemplo, WO 96/23526.
Uno de los retos a la hora de identificar nuevos quelatos de alta relaxividad es el hecho de que, para la mayoría de los quelatos metálicos, la relaxividad observada está limitada por la velocidad de giro (difusión rotacional) del quelato. Esto está bien documentado en revisiones, tales como R.B. Lauffer,Chem. Rev.1987, 87:901-27 y P Caravanet al., Chem. Rev.1999, 99:2293-2352. El efecto de muchos de los parámetros enlistados anteriormente (por ejemplo, el tiempo de residencia en agua y el efecto de segunda esfera) no son pronunciados para complejos metálicos de bajo peso molecular (< 1500 Da). Cuando los quelatos metálicos giran lentamente, ya sea uniéndose a moléculas grandes como las proteínas, enlazándose a estructuras poliméricas o autoensamblándose en grandes agregados, se puede observar el efecto de estos otros parámetros. Por lo tanto, una forma de identificar quelatos metálicos capaces de alcanzar relajaciones muy elevadas consiste en analizar la relaxividad de los quelatos bajo condiciones en donde la difusión rotacional es lenta.
Una forma de hacerlo es incorporar a cada quelato que se vaya a probar, un grupo TBM o SAM común. Al comparar quelatos que tienen un TBM común en presencia de la proteína objetivo (por ejemplo, albúmina), es posible clasificar los quelatos en orden de mayor a menor relaxividad y determinar qué grupos donantes y SSM son la combinación más favorable. Los quelatos de alta relaxividad identificados de este modo se pueden modificar aún más para incorporar un TBM diferente.
Los quelatos metálicos también se pueden evaluar en función del tiempo medio de permanencia de la molécula o moléculas de agua en la primera (o mayor) esfera o esferas de coordinación. El tiempo medio de residencia de las moléculas de agua es el inverso de la tasa de intercambio de agua y depende de la temperatura. El tiempo medio de permanencia del agua en la esfera de coordinación de los quelatos metálicos a 37 °C puede estar entre 1 y 100 ns. En algunas realizaciones, el tiempo de residencia medio del agua en la esfera de coordinación de los quelatos metálicos a 37 °C está entre 3 y 30 ns. La RMN con 17O se puede usar para evaluar el tiempo medio de residencia de las moléculas de agua. Ver, por ejemplo, el Ejemplo 7 a continuación.
Las mediciones del tiempo de vida de la luminiscencia se pueden usar para evaluar el número de moléculas de agua unidas a un quelato metálico. Los métodos para medir los tiempos de vida de la luminiscencia son conocidos en la técnica, y típicamente incluyen la monitorización de las transiciones emisivas del quelato a longitudes de onda particulares para la determinación del tiempo de vida, seguido del ajuste de los datos de decaimiento de la luminiscencia. Las mediciones de la vida útil de la luminiscencia también son útiles para evaluar la adecuabilidad de los quelatos metálicos como sondas luminiscentes. También se puede usar la RMN con 17O para quelatos de Mn (II) (ver Gale EM, Zhu J, Caravan P Direct Measurement of the Mn (II) Hydration State in Metal Complexes and Metalloproteins through 17O NMR Line Widths.J Am Chem Soc2013; 135:18600-18608).
Uso de ligandos quelantes y quelatos metálicos
Los ligandos quelantes se pueden usar para preparar quelatos metálicos, como se ha descrito anteriormente, con fines de diagnóstico. Por ejemplo, los quelatos metálicos preparados con Mn (II) pueden ser útiles como agentes de contraste en la imagenología por RM. Los agentes de contraste que incorporan un TBM se pueden unir a un objetivo y, por lo tanto, pueden ser particularmente útiles en aplicaciones de RM dirigidas, por ejemplo, para la imagenología del flujo sanguíneo, coágulos, lesiones o el miocardio. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 10 % (por ejemplo, al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 94 % o aproximadamente 96 %) del agente de contraste se puede unir al objetivo deseado a concentraciones fisiológicamente relevantes de agente de contraste y objetivo. El grado de unión de un agente de contraste a un objetivo se puede valorar por varios métodos de unión por equilibrio, por ejemplo, métodos de ultrafiltración; diálisis por equilibrio; cromatografía de afinidad; o inhibición de la unión competitiva o desplazamiento de compuestos sonda.
Los agentes de contraste pueden presentar una alta relaxividad como resultado de la unión al objetivo, lo que puede llevar a una mejor resolución de las imágenes de RM. En algunas realizaciones, el aumento de la relaxividad tras la unión es de al menos aproximadamente 1,5 veces (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces el aumento de la relaxividad) en comparación con el complejo quelato-metal no unido al objetivo o existente en un estado de oxidación diferente. Por ejemplo, un agente de contraste dirigido puede tener un aumento de 7 a 8 veces, de 9 a 10 veces, o incluso mayor de 10 veces en la relaxividad en comparación con el complejo quelato-metal no unido al objetivo o existente en un estado de oxidación diferente. En algunas realizaciones, la relaxividad de un agente de contraste de RMN como se proporciona en la presente a 60 MHz y 37 °C es de al menos 8 mM’V 1 por ion metálico paramagnético (por ejemplo, al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 60 m M 'V por ion metálico paramagnético). Por ejemplo, los agentes de contraste proporcionados en la presente pueden tener una relaxividad mayor a 10 m M 'V a 60 M<hz>y 37 °C.
Los quelatos metálicos de los lantánidos también pueden ser útiles como sondas luminiscentes. Las sondas de quelatos metálicos luminiscentes pueden ser útiles en varios ensayos, por ejemplo, para detectar, separar y/o cuantificar analitos químicos y biológicos en aplicaciones de investigación y diagnóstico, incluidas las aplicaciones de alto rendimiento, en tiempo real y multiplexadas. Por ejemplo, las sondas que incorporan un TBM se pueden unir a un analito objetivo de interés, y pueden tener tiempos de vida de la luminiscencia largos (por ejemplo, mayores a 0,1 |js, o 100 |js, o 1 ms), mejorando por lo mismo la sensibilidad y la aplicabilidad de varios formatos de ensayo. Ver, en general, las patentes de EE.UU. Nos. 6,406,297 y 6,515,113, para una descripción de ensayos adecuados para la inclusión de sondas de quelatos metálicos luminiscentes. Las sondas luminiscentes de quelatos metálicos son particularmente útiles en inmunoensayos y ensayos de detección de PCR en tiempo real.
Uso de agentes de contraste para IRM
Los agentes de contraste para RMN se pueden usar de la misma manera que los agentes de contraste para RMN convencionales. Por ejemplo, se administra una cantidad efectiva del agente de contraste a un paciente (por ejemplo, un animal, tal como un humano) y se adquiere una imagen por RM del paciente. En las realizaciones que tienen un TBM, se puede usar una secuencia de imagenología que potencia el contraste que aumenta preferentemente una relación de contraste de una señal de resonancia magnética del objetivo que tiene un agente de contraste unido dentro del mismo en relación con la señal de resonancia magnética de la sangre o tejido de fondo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de angiografía de sangre negra que tratan de oscurecer la sangre, tales como secuencias de eco de espín rápido; secuencias de eco de gradiente de flujo impregnado; y técnicas de supresión fuera de volumen para suprimir la sangre que entra. Estos métodos también incluyen técnicas independientes del flujo que potencian la diferencia de contraste debida a la diferenciaTientre el objetivo realzado por contraste y la sangre y el tejido, tales como secuencias preparadas de inversiónrecuperación o de saturación-recuperación que aumentarán el contraste entre el objetivo y los tejidos de fondo. Los métodos de preparación para las técnicasT2también pueden resultar útiles. Por último, los preparativos para las técnicas de transferencia de magnetización también pueden mejorar el contraste con los agentes de contraste.
Se pueden usar métodos que impliquen la adquisición y/o comparación de imágenes con y sin contraste y/o el uso de uno o más agentes de contraste adicionales. Los agentes de contraste adicionales pueden mostrar afinidad por un objetivo. Los métodos ejemplares como los expuestos en la patente de EE.UU. con No. Ser. 09/778,585, titulada MAGNETIC RESONANCE ANGIOGRAPHY DATA, presentada el 7 de febrero de 2001, y la patente de EE.UU. con No. Ser. 10/209.416, titulada SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED MAGNETIC RESONANCE IMAGING OF THE VASCULAR SYSTEM, presentada el 30 de julio de 2002.
Los agentes de contraste se pueden formular como una composición farmacéutica de acuerdo con los procedimientos habituales. Como se usa en la presente, los agentes de contraste pueden incluir derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. "Farmacéuticamente aceptable" significa que el agente se puede administrar a un animal sin efectos adversos inaceptables. Por "derivado farmacéuticamente aceptable" se entenderá cualquier sal, éster, sal de un éster u otro derivado farmacéuticamente aceptable de un agente de contraste o de composiciones que, tras su administración a un receptor, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un agente de contraste o un metabolito activo o residuo del mismo. Otros derivados son aquellos que aumentan la biodisponibilidad cuando se administran a un mamífero (por ejemplo, permitiendo que un compuesto administrado por vía oral se absorba más fácilmente en la sangre) o que potencian el suministro del compuesto original a un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático), aumentando así la exposición en relación con la especie original. Las sales farmacéuticamente aceptables de los agentes de contraste incluyen contraiones derivados de ácidos inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables y bases conocidas en la técnica, incluyendo, sin limitación, sodio, calcio y N-metilglucamina.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por cualquier vía, tanto oral como parenteral. La administración parenteral incluye, pero no se limita a, la administración subcutánea, intravenosa, intraarterial, intersticial, intratecal e intracavitaria. Cuando la administración es intravenosa, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar como un bolo, como dos o más dosis separadas en el tiempo, o como una infusión de flujo constante o no lineal. Así, los agentes de contraste se pueden formular para cualquier vía de administración.
Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en un amortiguador acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante, un agente estabilizador y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministrarán por separado, por ejemplo, en un kit, o mezclados en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como polvo seco liofilizado o concentrado libre de agua. La composición se puede almacenar en un envase herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobre indicando la cantidad de agente activo en unidades de actividad. Cuando la composición se administra por infusión, se puede dispensar con un frasco de infusión que contenga "agua para inyección" estéril de calidad farmacéutica, solución salina u otros fluidos intravenosos adecuados. Cuando la composición se vaya a administrar por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina, de modo que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración. Las composiciones farmacéuticas comprenden los agentes de contraste y sus sales farmacéuticamente aceptables, con cualquier ingrediente, excipiente, portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, se administra al paciente un agente de contraste en forma de composición inyectable. El método de administración de un agente de contraste se puede incluir parenteral, es decir, por vía intravenosa, intraarterial, intratecal, intersticial o intracavitaria. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a mamíferos, incluidos los humanos, de forma similar a otros agentes diagnósticos o terapéuticos. La dosis que se debe administrar y el modo de administración dependerán de varios factores, que incluyen la edad, el peso, el sexo, la condición del paciente y factores genéticos, y serán decididos en última instancia por el personal médico subsecuentemente a las determinaciones experimentales de la dosificación variable seguidas de la imagenología como se describe en la presente. En general, la dosis necesaria para la sensibilidad diagnóstica o la eficacia terapéutica estará en el rango de aproximadamente 0,001 a 50.000 |jg/kg, preferiblemente entre 0,01 y 25,0 |jg/kg de la masa corporal del hospedero.
EJEMPLOS
Métodos.
General. Todos los productos químicos y disolventes se adquirieron en el comercio y se usaron sin más purificación.
RMN. Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Varían de 500 MHz a 25 °C, a menos que se indique lo contrario. Los desplazamientos químicos se indican en 5 (ppm). Para los espectros de RMN con 1H y 13C, se usaron los picos del disolvente residual como referencia interna, excepto para la RMN con 13C registrada en D2O, en donde se usó dioxano como referencia interna (Fulmer, Organometallics 2010, 29, 2176). 1 Las medidas de relaxividad se realizaron en un Bruker mq60 Minispec, a 1,41 T y 37 °C. La relajación longitudinal (Ti) se adquirió mediante un experimento de recuperación de inversión usando 10 tiempos de inversión con una duración en el rango de 0,05 *Tiy 5 *Ti;la relajación transversal(T2)se midió usando un experimento de espín-eco de Carl-Purcell-Meiboom-Gill. La relaxividad(ri, 2)se determinó a partir de la pendiente de un gráfico de 1/Ti,2contra [Mn] para al menos 4 concentraciones. Los tiempos de relajación transversal (T2) del 17O se adquirieron a 11,7 T a partir del ancho completo a la mitad de la altura de la señal de H217O (Gale, Carvan,J. Am. Chem. Soc.2013, 135, 18600). La relaxividad deT2de 17O (
rr 2 °
) se calculó dividiendo el aumento de1/T2provocado por el Mn en relación con el H2O pura (pH 3) por la concentración de Mn en mM. 0,7-1,0 mL de las muestras de RMN se enriquecieron con 10 jL de H217O al 18 %.
Relaxividad en presencia de coágulos de fibrina. Las mediciones se realizaron como se ha descrito previamente (Carvan,J. Am. Chem. Soc.2008, 130, 6025). Brevemente, se añadió CaCh a una solución del compuesto 20, que se muestra a continuación, trombina y fibrinógeno humano para desencadenar la formación de fibrina (las concentraciones finales de CaCh, fibrinógeno y trombina fueron de 10 mM, 10 mg/mL y 0,6 U/mL, respectivamente). Los geles de fibrina resultantes se incubaron por 20 minutos a 37 °C antes de la medición.
Métodos HPLC. La cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS, por sus siglas en inglés) se usó un aparato Agilent Serie 1100 con una trampa<l>C/MSD (por sus siglas en inglés) y un detector dinodo de conversión Daly con detección UV a 220, 254 y 280 nm. Los métodos usados en este sistema son los siguientes: (A1) Columna Kromasil C18 (100 * 4,6 mm); eluyente C: 90 % de MeCN/10 % de 10 mM acetato de amonio, D: 10 mM acetato de amonio; gradiente 5 % de C a 95 % de C por 14 min; tasa de flujo 0,8 mL/min. La purificación semipreparativa en fase inversa se realizó en el sistema de HPLC (por sus siglas en inglés) Rainin Dynamax con detección UV de 220 a 280 nm usando una columna Phenomenex C18 o C5 (250 * 21,8 cm). La fase móvil A fue agua con 0,1 % de TFA añadido (por sus siglas en inglés); la fase móvil B fue MeCN con 0,1 % de TFA añadido; la fase móvil C fue un amortiguador de acetato de amonio 50 mM, pH 6,5; la fase móvil D fue una mezcla de 5 % del amortiguador de acetato de amonio 50 mM, pH 6,5 y 95 % de MeCN. Los métodos usados para la purificación son los siguientes: (P1) iniciando en 95 % de A / 5 % de B, la fracción de B se aumentó a 70 % a lo largo de 23 min. La columna se lavó con 95 % de B por 2 min y posteriormente se modificó el gradiente a 5 % de B. El sistema se recalibró a 5 % de B por 3 min, (P2) iniciando en 95%de C / 5%de D, la fracción de D se aumentó a 70% alo largo de 23 min. La columna se lavó con 95 % de D por 2 min y posteriormente se modificó el gradiente a 5 % de B. El sistema se recalibró a 5 % de B por 3 min, (P3) iniciando en 95 % de A / 5 % de B, la fracción de B se aumentó a 95 % a lo largo de 23 min. La columna se lavó con 95 % de B por 2 min y posteriormente se modificó el gradiente a 5 % de B. El sistema se recalibró a 5 % de B por 3 min, (P4) iniciando en 95 % de C / 5 % de D, la fracción de D se aumentó a 95 % a lo largo de 23 min. La columna se lavó con 95 % de D por 2 min y posteriormente se modificó el gradiente a 5 % de D. El sistema se recalibró a 5 % de B por 3 min, (P5) iniciando en 80 % de A / 20 % de B, la fracción de B se aumentó a 95 % a lo largo de 23 min. La columna se lavó con 95 % de B por 2 min y posteriormente se modificó el gradiente a 5 % de B. El sistema se recalibró a 5 % de B por 3 min, (P6) iniciando en 95 % de A / 5 % de B, la fracción de B se aumentó a 60 % a lo largo de 40 min. La columna se lavó con 95 % de B por 2 min y posteriormente se modificó el gradiente a 5 % de B. El sistema se recalibró a 5 % de B por 3 min, (P7) iniciando en 95 % de C / 5 % de D, la fracción de D se aumentó a 60 % a lo largo de 23 min. La columna se lavó con 95 % de D por 2 min y posteriormente se modificó el gradiente a 5 % de D. El sistema se recalibró a 5 % de D por 3 min, (P8) iniciando en 95 % de C / 5 % de D, la fracción de D se aumentó a 60 % a lo largo de 40 min. La columna se lavó con 95 % de D por 2 min y posteriormente se modificó el gradiente a 5 % de D. El sistema se recalibró a 5 % de D por 3 min, (P9) iniciando en 95 % de C / 5 % de D, la fracción de D se aumentó a 40 % a lo largo de 23 min. La columna se lavó con 95 % de D por 2 min y posteriormente se modificó el gradiente a 5 % de D. El sistema se recalibró a 5 % de D por 3 min.
Ensayo de unión a DD(E).La afinidad de las sondas se usó para usar un ensayo de desplazamiento de polarización de fluorescencia de DD(E) descrito anteriormente. 5 El desplazamiento de un péptido marcado con tetrametilrhodamina (TRITC-Tn6, por sus siglas en inglés) de DD(E) se detectó observando el cambio correspondiente en la anisotropía de fluorescencia. La Kd de la sonda TRITC-Tn6 se determinó titulándola con la proteína DD(E) y ajustando los datos de fluorescencia resultantes como se ha descrito previamente (Caravan,Bioconjugate Chem.2012, 23, 548). Este experimento se realizó a temperatura ambiente usando una concentración de TRITC-Tn6 de 0,1 |<j>M en el siguiente amortiguador de ensayo: Tris base (50 mM), NaCl (100 mM), CaCl2(2 mM), Tritón X- 100 (0,0l %), pH = 7,8. Las medidas de anisotropía se realizaron usando un lector de placas TECAN Infinity F200 Pro equipado con el conjunto de filtros apropiado para la tetrametilrhodamina (excitación 535 nm, emisión 590 nm).
Cuantificación de Mn en tejidos y sangre.Las concentraciones de metales se determinaron usando un sistema ICP-MS Agilent 8800-QQQ. Todas las muestras se diluyeron con Tritón X-100 al 0,1 % en ácido nítrico al 5 %. Para la cuantificación se generó diariamente una curva de calibración lineal para cada metal en el rango de 0,1 ppb a 200 ppb.
Estimación de la fijación de la albúmina.Las mediciones se realizaron en una serie de soluciones en el rango de 150-300<j>M de complejo quelato-metal en BSA (por sus siglas en inglés) al 4,5 % p/v o en plasma de sangre bovina. Se colocaron 150<j>L de cada solución en un recipiente de filtración Millipore Ultra Free MC a 5 kDa de corte y se forzaron ~10<j>L de la solución a través del filtro por centrifugación. El contenido de Mn en cada solución sin filtrar y en el filtrado se cuantificó por ICP-MS. El porcentaje de [Mn(PyC3A)(H2O)]‘ unido a la albúmina se estimó a partir de la diferencia de concentraciones de Mn entre la solución sin filtrar y el filtrado.
Modelo de trombosis de la arteria carótida en ratas.Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (Guide for the care and use of laboratory animals Bethesda, MD, 1985) y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales del Hospital General de Massachusetts. Para este estudio se usaron ratas Wistar macho adultas (N = 4; peso, 200-300 g; Charles River Laboratories). La trombosis arterial se indujo por la aplicación de 25 % p/v de AlCl3 (ac) a la pared exterior del vaso. Bajo anestesia de isoflurano, se expuso la arteria carótida común derecha y se aplicó una pequeña tira de papel de filtro empapada en la solución de AlCb. La lesión fue realizada 1-2 cm proximal a la bifurcación carotídea por el mismo investigador para minimizar la variabilidad. Se cateterizó la arteria femoral usando tubos de PE-50 (Fisher Scientific) para la inyección de la sonda. Las sondas, el compuesto20o el compuesto de control EP2104R que contiene gadolinio, se inyectaron 30 min después de la formación del trombo. A cada rata se le inyectó 0,01 mmol/kg de sonda (0,04 mmol/kg basado en el ion metálico). Para los experimentos de extracción de sangre, se cateterizó a las ratas en la vena femoral y la arteria para la inyección y la toma de muestras, respectivamente. Se extrajo sangre a los 2, 5, 10, 15, 30, 60 y 120 min, 24 h después de la inyección y se recolectó en viales heparinizados. Inmediatamente después de la extracción, se centrifugó una porción de sangre por 10 minutos a 5000 rpm y se separó y pesó el plasma, se diluyó 2 veces con amortiguador<p>B<s>(por sus siglas en inglés) y se inyectó en la columna analítica de HPLC.
Imagenología por RM de la trombosis en ratas.La imagenología se realizó en un sistema de 1,5 T para cuerpo humano (Avanto, Siemens Healthcare, Erlangen, Alemania) con una bobina de transmisión-recepción hecha a medida. Los animales fueron anestesiados con isoflurano (1-2 %) por la duración del experimento. Se colocaron catéteres en la vena femoral y la arteria femoral para la extracción de sangre y la administración de contraste, respectivamente. En primer lugar, se visualizaron la cabeza y el cuello con imágenes ponderadas enTien los planos sagital, coronal y axial, seguidas de un angiograma TOF 3D (por sus siglas en inglés) adquirido transversalmente. A continuación se realizaron imágenes moleculares en la línea de base con dos secuencias diferentes: eco de gradiente 3D ponderado enTi(GRE, por sus siglas en inglés) y eco de espín rápido 2D ponderado enTide sangre oscura (DB-TSE, por sus siglas en inglés). Una vez finalizadas todas las exploraciones de contraste previo, se inyectaron 0,01 mmol/kg de la sonda de imagenología, EP2104R o18, en forma de bolo mediante la arteria femoral. Las secuencias de imagenología molecular usadas al inicio se repitieron por 60 minutos después del suministro de contraste. El angiograma TOF se adquirió con los siguientes parámetros: secuencia de eco de gradiente 3D ponderada enTi,TR/TE/ángulo de inversión (por sus siglas en inglés, respectivamente)= 26 ms/5,75 ms/25°, FOV (por sus siglas en inglés) en el plano = 85 * 85 mm, matriz = 320 * 320, 58 cortes, grosor del corte = 0,47 mm, tamaño del vóxel = 0,3 * 0,3 * 0,47 mm, 1 promedio y tiempo de adquisición = 4:18 minutos. La secuencia GRE para la imagenología molecular tenía parámetros idénticos a los del angiograma TOF, pero menor cobertura de la cabeza a los pies (48 cortes) y TR más largo (35 ms) resultando en un tiempo de exploración de 6:34 minutos. Adicionalmente, se realizó una saturación inferior a la sangre arterial de entrada nula. El DB-TSE se realizó con TR/TE = 800 ms/20 ms, FOV en el plano = 85 * 85 mm, matriz = 320 * 320, 11 cortes, grosor del corte = 2 mm, tamaño del vóxel = 0,3 * 0,3 * 2 mm, longitud del tren de ecos = 11, 1 promedio y tiempo de adquisición = 4 minutos. GRE y DB-TSE tenían una cobertura volumétrica superpuesta y se adquirieron con orientación axial. Las imágenes se analizaron en Matlab (versión R2104a, MathWorks, Natick, MA) dibujando ROI y midiendo el SI medio del coágulo, la arteria contralateral y el músculo adyacente. El ruido se cuantificó como la desviación estándar (DE) de la señal medida en el aire fuera del animal. La SNR se calculó como se ha descrito anteriormente para cada tipo de tejido. También calculamos las relaciones contraste-ruido del coágulo y de la arteria contralateral en relación con el músculo: CNR = (SItejido - SImúsculo ady.) / DEaire. La SNR y la CNR se estimaron al inicio (SNRpre y CNRpre) a partir de imágenes previas al contraste y en varios momentos después de la inyección de contraste (SNRpost y CNRpost). Los valores de SNR normalizados (nSNR) se obtuvieron dividiendo la SNR en cada punto temporal por la SNRpre. Para el análisis estadístico se usó la prueba t de Student no pareada, en la que p < 0,05 se consideró significativa.
Histología.Las arterias carótidas fueron cosechadas 90 minutos después de la inducción de la trombosis, cuidadosamente enjuagadas en amortiguador de fosfato, embebidas en medio de montaje OCT (por sus siglas en inglés, Tejido-Tek) y ultracongeladas en isopentano a -45 °C. Las arterias se crioseccionaron en cortes de 20 |<j>M y se procesaron para la tinción con hematoxilina y eosina de acuerdo con el protocolo estándar. Las imágenes se adquirieron usando un microscopio Nikon TE-2000 (40 aumentos).
Ejemplo 1: Síntesis de ligandos quelantes que forman complejos de Mn (II) de unión a proteínas.
A. Síntesis de N-((5-metoxicarbonil)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato (éster de PyC3A-5-metilo) (4).
Esquema 1
N-((5-metoxicarbonil)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetri-terc-butilacetato (2).Se añadió 6-(bromometil)metilnicotinoato (0,450 g, 1,95 mmol) a3(1,00 g, 2,01 mmol), yoduro de potasio (0,243 g, l , 46 mmol) y diisopropiletilamina (0,468 g, 3,62 mmol) agitando en 4 mL de DMF (por sus siglas en inglés). Después de 3h, la reacción se diluyó a 100 mL con Et2O, se lavó con Na2CO3 saturado (ac), abundante agua y salmuera antes de secar sobre Na2SO4 y se concentró hasta obtener un aceite marrón. El producto bruto se purificó por cromatografía tipo flash (alúmina básica, hexano:EtOAc, 0 % a 20 % de EtOAc) y se aisló 1,02 g (1,68 mmol, 84 %) 6 como un aceite de color claro. 1H RMN (500 MHZ, CDCb, 5 del disolvente protio): 9,07 (s, 1H), 8,24 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 4,20 (d, 1H), 3,04 (s, 3H), 3,86 (d, 1H), 3,53-3,30 (m, 6H), 2,73 (a t, 1H), 2,58 (a t, 1H), 2,05 (a m, 2H), 1,69 (a m, 2H), 1,65 (a m, 2H), 1,45 (s, 18H), 1,43 (s, 9H), 1,26-1,09 (m, 4H). 13C RMN (125,7 MHZ, CDCla, 5 del disolvente): 171,8, 171,7, 166,4, 166,3, 149,9, 137,5, 124,3, 123,7, 80,7, 80,6, 63,7, 62,0, 56,4, 54,0, 53,0, 52,4, 28,3, 26,0, 25,9. ESI-MS:m/z= 606,4 [M+H]+; calculado: 606,4.
N-((5-metoxicarbonil)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato (éster de PyC3A-5-metilo) (3).Un lote de2(0,390 g, 0,645 mmol) se agitó en 5 mL 1:1 TFA:CH2Cl2por 16 h. La mezcla de reacción se concentró in vacuo y se purificó por RP-HPLC usando columna C18 y el método P1 para obtener3(0,184 g, 0,421 mmol, 65 % de rendimiento) como un sólido blanco. 1H RMN (500 Mh Z, D2O, 70 °C, 5 del disolvente protio): 9,83 (s a, 1H), 9,42 (s a, 1H), 8. 68 (s a, 1H), 5,04-4,80 (a m, 2H), 4,61 (s a, 3H), 4,47-4,27 (a m, 6H), 3,98 (s a, 1h), 3,74 (s a, 1h), 2,86-2,77 (a m, 2H), 2,46 (s a, 2H), 2,09-2,01 (a m, 2H), 1,89 (s a, 2H). 13C RMN (125,7 MHZ, CDCl3, 70 °C): 173,5, 170,7, 165,3 (una resonancia C=O de carboxilato no se resolvió, probablemente debido a la coincidencia con otra resonancia), 157,0, 146,0, 145,0, 128,7, 127,1, 64,6, 62,9, 54,1, 53,0, 52,4, (una resonancia CH2de carboxilato no se resolvió, probablemente debido a la coincidencia con otra resonancia), 24,7, 24,6, 24,5, 24,3. ESI-MS (por sus siglas en inglés):m/z= 438,2 [M+H]+; calculado: 438,2.
Na[Mn(éster de PyC3A-5-metilo)] (4).Se disolvió un lote de3(0,182 g, 0,416 mmol) en 10 mL de H2O y se ajustó el pH a 6,5 con acetato de amoniaco. Se añadió MnCh-4H2O (0,066 g, 0,130 mmol) y se reajustó el pH a 6,5. La mezcla de reacción se purificó por RPLC usando la columna C18 y el método P2 para obtener4(0,140 g, 0,273 mmol,66%de rendimiento) como un sólido blanco. ESI-MS:m/z= 491,1 [M+2H]+; calculado: 491,1.
B. Síntesis de N-((5-hidroximetil)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato (PyC3A-5-hidroximetilo) (7).
Esquema 2
N-((5-hidroximetM)piridm-2-M)metM-N,N\N'-trans-1,2-ciclohexMendiammetri-terc-butMacetato (5).Se agitó un lote de2(0,200 g, 0,331 mmol) en 20 mL de MeOH a temperatura ambiente y se añadió NaBH4 (0,562 g, 14,9 mmoL) por partes en el transcurso de 24 h. La reacción se controló por HPLC. Al terminar, se añadieron 10 mL de agua y la mezcla de reacción se concentró al vacío hasta sequedad. El bruto5pasó directamente al paso siguiente sin más análisis ni caracterización por RMN. ESI-MS:m/z= 578,4 [M+H]+; calculado: 578,4.
N-((5-hidroximetil)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato (PyC3A-6-hidroximetilo) (6).El bruto5se agitó en6mL de TFA 1:1: CH2O2por 16 h. La mezcla de reacción se concentró in vacuo y posteriormente se purificó por RP-HPLC usando la columna C18 y el método P1 para obtener6(0,036 g, 0,082 mmol, 27 % de rendimiento) como un sólido blanco. 1H RMN (500 MHZ, D2O, 70 °C, 5 del disolvente protio): 9,32 (s a, 1H), 9,07 (s a, 1H), 8,65 (s a, 1H), 5,42 (a m, 2H), 4,92-4,71 (a m, 3H), 4,47-4,27 (a m, 3H), 4,16-4,07 (a m, 3H), 3,61 (s a, 1H). 2,83-2,78 (a m, 2H), 2,46 (s a, 2H), 2,04 (s a, 2H), 1,89 (s a, 2H). 13C RMN (125,7 MHZ, CDCla, 70 °C): 176,8, 171,5 (una resonancia de carboxilato C=O no se resolvió, probablemente debido a la coincidencia con otra resonancia), 153,7, 147,7, 163,0, 162,4, 129,6, 67,2, 63,8, 62,4, (una resonancia de carboxilato CH2no se resolvió, probablemente debido a la coincidencia con otra resonancia), 55,3, 54,3, 26,5, 26,5, 26,4, 26,2. ESI-MS:m/z= 410,2 [M+H]+; calculado: 410,2.
Na[Mn(PyC3A-5-hidroximetilo)] (7).Se disolvió un lote de6(0,036 g, 0,082 mmol) en 4 mL de H2O y se ajustó el pH a 6,5 por adición de acetato de amonio. Se añadió MnCl2-4H2O (0,014 g, 0,070 mmol) y se reajustó el pH a 6,5. La mezcla de reacción se purificó usando la columna C18 y el método P2 para obtener7(0,040 g,0 ,082mmol, 100 de rendimiento) como un sólido blanco. ESI-MS:m/z= 463,1 [M+2H]+; calculado: 463,1.
C. Síntesis de N-((3-etoxicarbonil)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato (éster de PyC3A-3-etilo) (10).
N-((3-etoxicarbonil)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetri-terc-butilacetato (8).Un lote de 0,042 g de1(0,092 mmol) se combinó con 0,152 g de 2-(bromometil)nicotinato de etilo (0,661 mmol) y 0,120 g de K2CO3(8,70 mmol) en 5 mL de MeCN y se calentó a 50 °C por 1 h. La mezcla de reacción bruta se concentró posteriormente hasta sequedad y se purificó por cromatografía tipo flash (gel de sílice, 30:70 hexano:EtOAc).8se aisló como aceite bruto con impurezas y se llevó directamente a la siguiente reacción sin caracterización.
N-((3-etoxicarbonil)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato ((éster de PyC3A-3-metilo) (9).0.092 g (0,148 mmol) de8se disolvió en 2 mL de TFA y se agitó por 16 h. El TFA se eliminó al vacío, el producto bruto se recolectó en CH2O2y se concentró al vacío. El producto se purificó por RP-HPLC usando la columna C18 y el método P3 para obtener 24 mg (0,053 mmol, 36 % de rendimiento). 1H RMN (500 MHZ, D2O, 5 del disolvente protio): 8,67 (d, 1H), 8,41 (d, 1H), 7,47 (t, 1H), 4,90 (s a, 1H), 4,33 (c, 2H), 4,16 (d, 1H), 3,80-3,30 (m,6H), 3,08 (a m, 2H), 2,28 (a m, 1H), 2,11 (a m, 1H), 1,84 (a m, 1H), 1,76 (a m, 1H), 1,57 (a m, 1H), 1,35 (t, 3H), 1,35-1,21 (m, 3H). ). 1H RMN (125,7 MHZ, da-DMSO): 174,7, 169,6, 166,4, 154,0, 152,6, 144,1, 126,4, 124,8, 66,3, 63,2, 61,9, 54,1, 50,4, 26,2, 26,2, 15,9, 25,6, 14,6. ESI-MS:m/z= 452,2 [M+H]+; calculado: 452,1.
Na[Mn(éster de PyC3A-3-etilo)] (10).Un lote de9(0,024 g, 0,053 mmol) y el pH se ajustó a 6,5. MnCh-4H2O (0,015 g, 0,076 mmol) se combinaron en 1,5 mL de agua y el pH se ajustó a 6,5. La mezcla de reacción se purificó por RP-HPLC usando columna C18 y el método P4 para obtener10(0,020 g, 0,031 mmol, 58%de rendimiento) como un sólido blanco. ESI-MS:m/z= 505,0 [M+2H]+; calculado: 505,1.
D. Síntesis de N-((4-metoxi-3,5-dimetil)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato (PyC3A-2-metoxi,3,5-dimetilo) (13).
N-((4-metoxi-3,5-dimetN)piridm-2-M)metM-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexMendiammetri-terc-butNacetato (11).Un lote de1(0,127 g, 0,278 mmol) se combinó con 2-(clorometil)-4-metoxi-3,5-dimetilpiridina (0,052 g, 0,280 mmol) y K2CO3(0,103, 0,746 mmol) en 10 mL de MeCN y se calentó a 72 °C por 24 h. La mezcla de reacción bruta se concentró posteriormente hasta sequedad.11se aisló como aceite bruto con impurezas y se llevó directamente a la siguiente reacción sin caracterización.
N-((4-metoxi-3,5-dimetil)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato (PyC3A-2-metoxi,3,5-dimetilo) (12).El bruto11se agitó en 1 mL de TFA por 16 h, posteriormente se concentró hasta obtener un aceite de color amarillo y se purificó por RP-HPLC usando la columna C18 y el método P3.12se aisló como un sólido blanco (0,022 g, 0,050 mmol, 18 % de rendimiento de1). ESI-MS:m/z= 438,2 [M+H]+; calculado: 438,2.
Na[Mn(PyC3A-4-metoxi-3,5-dimetilo) (13).Un lote de12(0,022 g, 0,050 mmol) y el pH se ajustó a 6,5. MnCl2-4H2O (0,012 g, 0,061 mmol) se combinaron en 1,2 mL de agua y el pH se ajustó a 6,5. La mezcla de reacción se purificó por RP-HPLC usando la columna C18 y el método P4 obtuvo13(0,021 g, 0,041 mmol, 82 % de rendimiento) como un sólido blanco. ESI-MS:m/z= 491,1 [M+2H]+; calculado: 491,1.
N'-(6-metN)mcatmoN-,N',N",N"-trans-1,2-ciclohexMendiammetri-tBu-acetato (14).Se combinaron hidróxido de litio (0,044 g, 1,84 mmol) y 2 (1,02 g, 1,69 mmol) en 16 mL de THF:H2O 1:1 y se agitó por 3 h a RT (por sus siglas en inglés). La reacción se concentró posteriormente hasta sequedad y se purificó por RP-HPLC preparativa usando la columna C18 y el método P5. Las fracciones que contenían producto puro se liofilizaron para obtener el producto como un sólido blanco (0,670 g, 1,13 mmol, 67 %). 1H RMN (500 MHZ, D2O, 5 del disolvente protio, agitado a lo largo de K2CO3(s)): 9,09 (s, 1H), 8,15 (d, 1H), 7,07 (d, 1H), 3,95 (d, 1H), 3,63 (d, 1H), 3,28 (d, 1H), 3,14-3,06 (m, 5H), 2,33 (a t, 2H), 1,94 (m, 2H), 1,68 (m, 2H), 1,43 (9H), 1,38 (18H), 1,18-0,99 (m, 4H). 13C RMN (125,7 MHZ, CDCla, 5 del disolvente protio, agitado a lo largo de K2CO3(s))): 172,2, 171,9, 170,8, 158,2, 151,1, 1380, 131,1, 122,9, 81,8, 81,5, 62,1,59,5, 55,9, 53,0, 52,6, 29,8, 28,1,28,0, 25,9, 25,7, 25,4, 24,8. ESI-MS:m/z= 592,3 [M+H]+; calculado: 592,4.
E. Síntesis de N-((ácido 5-carboxílico)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato (ácido PyC3A-5-carboxílico) (15).
N-((ácido 5-carboxílico)piridin-2-il)metil-N,N',N'-trans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato (ácido PyC3A-5-carboxílico) (15).Un lote de14(0,140 g, 0,237 mmol) se agitó en 5 mL de TFA por 16 h, y posteriormente se concentró para producir15como aducto de TFA (0,12 g, 0,223 mmol, 94 % de rendimiento) como un sólido blanco. ESI-MS:m/z= 424,2 [M+H]+; calculado: 424,2.
Na[Mn(ácido PyC3A-5-carboxílico) (16).A un lote de15(0,12 g, 0,223 mmol) ajustado a pH 6,5 se añadió con MnCl2-4H2O (0,047 g, 0,237 mmol) y el pH se volvió a ajustar a pH 6,5. Una porción de la mezcla de reacción se purificó usando el método P7 para obtener15puro. ESI-MS:m/z= 477,0 [M+2H]+; calculado: 477,1.
Ejemplo 2: Síntesis de complejos quelato-metálicos de Mn (II) dirigidos a la fibrina.
N-(6-metil)-N-hidroxisuccinimidilnicotinoíl-,N,N',N'-frans-1,2-ciclohexilendiaminetri-ferc-butilacetato (fBu-PyC3A-NHS) (17). 14(0,471 g, 0,797 mmol) se agitó con diciclohexilcarbodiimida (0,167 g, 0,809 mmol) y N-hidroxisuccinimida (0,109 g, 0,947 mmol) en 10 mL de THF (por sus siglas en inglés). En cuestión de segundos se formó un precipitado blanco. La LC-MS confirmó la conversión completa después de 16 h de agitación. El precipitado se eliminó por filtración y el licor madre claro se concentró en un aceite pálido e incoloro. El producto se puede llevar directamente al siguiente paso, o purificar por RP-HPLC usando la columna C18 y el método P5.
1H RMN (500 MHZ, D2O, 5 del disolvente protio): 9,15 (s, 1H), 8,32 (d, 1H), 8,21 (d, 1H), 4,33 (d, 1H), 4,15 (d, 1H), 3,55-3,25 (m, 6H), 2,91 (s, 4H), 2,73 (t, 1H), 2,50 (t, 1H), 1,91 (m, 2H), 1,81 (m, 2H), 1,45 (18H), 1,38 (9H), 1,18 1,02 (m 4H). 13C RMN (125,7 MHZ, CDCla, 5 del disolvente protio): 171,5, 169,3, 169,2, 161,3, 150,3, 138,2, 124,29, 119,7, 108,0, 98,5, 80,7, 80,6 (dos picos coincidentes), 68,6, 63,9, 62,2, 54,0, 52,8, 49,3, 34,0, 28,2 (dos picos coincidentes), 29,3, 25,9, 25,9 (dos picos coincidentes), 25,8, 25,7. ESI-MS:m/z= 689,3 [M+H]+; calculado: 689,4.
fBP-CyP3A4 protegido con íBu (18).El aceite se recolectó en 2 mL de DMF y se añadió a la L-2,4-diamino-N-butiramida-[Tyr-dGlu-Cys-Hyp-Typ(3-Cl)-Leu-Cys-Ile-Gln (3^-8) disulfuro]-1-(4-[(L-2,4-diaminobutirilamino)metil]bencilamida (EP2104/24: 0.211 g, 0,123 mmol)) y 4-dimetilaminopiridina (0 ,016g, 0,131 mmol) agitando en 2 mL de DMF. La reacción se ajustó a pH 6,5 con DIPEA (por sus siglas en inglés) y se agitó a RT. Después de 16 h de agitación, se añadieron por goteo 250 mL de una solución de NaCl a la mezcla de reacción para precipitar sólidos blancos. FBP-CyP3A4 protegida con fBu se purificó por RP-HPLC usando la columna C5 y el método P6. Las fracciones que contenían producto se liofilizaron para obtener producto como un sólido blanco (0,177 g, 0,0441 mmol, 35 %). ESI-MS:m/4z= 1004,0 [M+4H]4+; calculado: 1004,0.m/3z= 1338,4 [M+3H]3+; calculado: 1338,4.m/2z= 2007,6 [M+2H]2+; calculado: 2007,6.
FBP-CyP3A4 (19):El compuesto18(0,177 g, 44,1 |jmol) se agitó en 5 mL de una mezcla 91:3:3:3 de TFA:ácido metano sulfónico:n-dodecanotiol: agua por 90 min antes de diluir con 50 mL de Et2O. Los sólidos blancos floculentos se centrifugaron hasta obtener un precipitado sólido y el sobrenadante se decantó. Después de varios lavados con Et2O, los sólidos se secaron para obtener producto puro como un polvo blanco (0,147 g, 44,0 jmol, 100 %). ESI-MS:m/3z= 1113,6 [M+3H]3+; calculado: 1113,8. ESI-MS:m/z= 1670,1 [M+2H]3+; calculado: 1670,2.
Mn-FBP (20):A una solución de 10 mL de19(0,018 g, 5,4 |jmol) ajustada a pH 6,5 se añadió MnCl2-4H2O (0,0053 g, 27,0 jmol). La solución se reajustó a pH 6,5 y se purificó por RP-HPLC usando la columna C5 y el método P7. Las fracciones que contenían producto se liofilizaron para obtener producto puro en forma de polvo (0,0080 g, 2,2 jmol, 41 %). ESI-MS:m/3z= 1184,6 [M+8H]3+; calculado: 1184,4.m/2z= 1776,4 [M+6H]2+; calculado: 1776,5.
Ejemplo 3: Síntesis de complejos quelato-metálicos de Mn (II) dirigidos al colágeno. cBP-PyC3A4 protegido con íBu (21).A un lote del péptido Ep -3533 (ver Caravan, P, Biplab, D., Dumas, S., Epstein, F. H., Helm, P A., Jacques, V., Koerner, S., Kolodziej, A., Shen, L., Sun, W.-C., Zhang, Z.,Angew. Chem. Int. Ed.2007, 46, 8171) ( 0,154 g, 0,067 mmol) agitando en 3 mL DMF/ 1 mL H2O ajustado a pH 9 con DIPEA (papel de pH húmedo), se añadió 17 (0,280 g, 0,407 mmol) por porciones. Después de 16 h de agitación, la solución se diluyó con 100 mL de agua y se liofilizó hasta obtener un residuo blanco bruto. El compuesto21se llevó al siguiente paso sin purificación adicional. ESI-MS:m/3z= 1337,0 [M+3H]3+; calculado: 1337,0.CBP-PyC3A4(22).El compuesto21se agitó en 4 mL 91:3:3:3 TFA:ácido metanosulfónico:1-dodecanotiol:H2O por 2 h. La mezcla de reacción se añadió posteriormente a 100 mL de Et2O frío para precipitar el producto. Los sólidos se recogieron en el fondo de un tubo cónico de 50 mL por centrifugación y se separaron por decantación. El compuesto22se llevó al siguiente paso sin purificación adicional. ESI-MS:m/3z= 1168,0 [M+3H]3+; calculado: 1167,8.
Mn-CBP (23).Se añadió un lote de MnCh-4H2O (0,047 g, 0,237 mmol) al bruto22para formar23, que se purificó posteriormente por HPLC. ESI-MS:m/6z= 1221,0 [M+6H]3+; calculado: 1221,1.
Ejemplo 4: Síntesis de complejos quelato-metálicos oxidados de Mn (II) dirigidos al colágeno.
N-((5-hidrazida)piridm-2-il)metil-N,N',N'-frans-1,2-ciclohexilendiaminetriacetato (PyC3A-5-hidrazida) (24).
Se agitó un lote de17(0,180 g, 0,262 mmol) y terc-butilcarbazato (0,070 g, 0,606 mmol) en 5 mL de MeoH/ 2 mL de THF. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a ~9 (papel de pH húmedo). Después de 2 h de agitación, la mezcla de reacción se concentró hasta sequedad y se tomó en 5 mL de 6MHCl. Después de 2 h de agitación, la mezcla de reacción se concentró hasta obtener sólidos blancos y se tomó en H2O. Los sólidos se eliminaron por filtración. Se extrajeron pequeñas alícuotas de esta mezcla de reacción y se purificaron por el método P7 para obtener24como un polvo blanco. ESI-MS:m/z= 438,2 [M+H]+; calculado: 438,2.
Na[Mn(PyC3A-5-hidrazida)] (25).El compuesto25se preparóin situ.A una solución de24en amortiguador Tris de pH 7,4 (50 mM) se tituló MnCh-4H2O. La quelación del Mn se controló por HPLC. ESI-MS:m/z= 491,2 [M+2H]+; calculado: 491,1.
Ejemplo 5: Síntesis de un complejo reactivo de peroxidasa.
2-((hidroxi(piridin-2-il)metil)fenol (26).Un lote de 10,4 g (111 mmol) de fenol en 50 mL de CH2CI2se agitó con 18,4 g (193 mmol) de cloruro de magnesio y 8,42 g (115 mmol) de N,N-dimetiletilamina por 30 min. A esta mezcla se añadieron por goteo 5,85 g (55,0 mmol) de 2-piridinocarboxaldehído en 25 mL de CH2Cl2por 3 horas. Una vez completada la adición, la mezcla resultante, heterogénea y de color naranja brillante, se agitó a temperatura ambiente por 72 h. Se añadieron 100 mL de H2O a la reacción y la mezcla se valoró con HCl conc. hasta pH 1, que se ajustó a 9 por la adición de Na2CO3 conc. Se separó la fase orgánica y la parte acuosa se lavó de nuevo con 100 mL de CH2O2. Las porciones orgánicas se mezclaron, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron hasta obtener un jarabe de color naranja. El producto se purificó por cromatografía tipo flash (gel de sílice, hexano:EtOAc, 0-60 % EtOAc) para obtener 7,08 g (35,2 mmol, 64 % de rendimiento) de26como un sólido blanco. 1H RMN (500 MHZ, CDCb, 5 from TMS): 8,47 (d, 1H), 7,72 (t, 1H), 7,45 (d, 1H), 7,21 (d, 1H), 7,21 (m, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,89 (t, 1H), 6,96 (s, 1H). 13C RMN (125,7 MHZ, CDaCl, 5 from TMS): 161,7, 155,3, 147,6, 138,2, 129,5, 128,3, 127,0, 123,0, 120,4, 120,2, 118,5, 74,4. ESI-MS:m/z= 202,0 [M+H]+; calculado.: 202,0.
2-Picoilfenol (27).A un lote de 1,41 g (7,01 mmol) de 2-(hidroxi(piridin-2-il)metil)fenol en 40 mL de dioxano se añadieron 0,418 g (3,77 mmol) de dióxido de selenio (IV). La mezcla se calentó a reflujo y se agitó por 90 min. La reacción se enfrió posteriormente, se eliminaron los insolubles negros, se filtró a través de celita y el licor madre se concentró hasta obtener un aceite amarillo verdoso. El aceite se purificó por cromatografía tipo flash (gel de sílice, hexano:EtOAc, 0-70 % EtOAc) y se aislaron 1,190 g (0,597 mmol, 85,2 %) como un aceite amarillo brillante.
2,2'-((íZ,í'ZHetano-1,2-diilbis(azamNdeno))bis(piridm-2-ilmetamlideno))difenol (28).A un lote de 0,168 g (2,80 mmol) de etilendiamina en 40 mL de MeOH se añadieron 1,190 g (5,98 mmol) de27. La reacción se calentó a reflujo y se agitó 30 min, posteriormente se enfrió a RT y se agitó por 16 h. Los sólidos amarillos resultantes se aislaron por filtración y se secaron al vacío, resultando en 0,942 g (2,22 mmol, 79,6 % de rendimiento) de28aislado como un sólido amarillo. 1H RMN (500 MHZ, CDCb, 5 from TMS): 12,36 (s, 1H), 8,75 (d, 1H), 8,13 (d, 1H), 7,95 (m, 2H), 7,53 (m, 2H), 7,07 (d, 1H), 6,92 (t, 1H). 13C RMN (125,7 MHZ, CDaCl, 5 from TMS): 197,3, 163,6, 155,5, 148,4, 137,6, 136,8, 134,5, 126,3, 124,7, 119,3, 119,0, 118,6. ESI-MS:m/z= 200,0 [M+H]+; calculado.: 200,1.
(+/-) (R,R/S,S) 2,2'-((etano-1,2-diilbis(azanediil))bis(piridin-2-ilmetileno))difenol (31).A un lote de 2,90 g (6,87 mmol) de28agitando en 50 mL de MeOH se añadieron 0,758 g (20,0 mmol) de borohidruro de sodio. Se observó efervescencia a medida que el color de la solución se decoloraba de amarillo a un beige claro. Después de 1 h, la reacción se apagó con 10 mL de agua y el MeOH se eliminó al vacío. Posteriormente, la reacción se repartió entre 50 mL cada una de NaHCO3 saturado (ac) y CH2O2. Las fases se separaron y la porción acuosa se lavó con otros 100 mL de CH2Cl2. Las porciones orgánicas se agruparon, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron hasta obtener 2,92 g de29de aceite amarillo (6,85 mmol, conversión de 100 % a diamina racémica). El aceite se recolectó en 30 mL de MeOH/ 10 mL de H2O y se añadieron 2,490 g de Zn(OTf)2(6,85 mmol). La solución se ajustó a pH 6,5 por la adición de acetato de amonio sólido y se agitó por 16 h antes de concentrarla hasta sequedad.
Los isómerosR,R/S,SyR,S/S,Rquelados con Zn30se separaron por RP-HPLC usando la columna C18 y el método P7. Un lote de 0,075 mmol (0,154 mmol) de isómeroR,R/S,Sse disolvió 200 mM de ácido dietilentriaminopentaacético y el pH se ajustó a 5,0. Después de 2 h de agitación, el pH se ajustó a > 8,0 y31se extrajo con CH2Cl2, se secó sobre Na2SO4 y se secó al vacío, aislándose producto puro a 0,066 g (0,154 mmol).
1H RMN (500 MHZ, CDCb, 5 from TMS): 8,57 (d, 2H), 7,60 (t, 2H), 7,21 (m, 4H), 7,03 (m, 4H), 6,84 (m, 4H), 4,94 (s, 2H), 2,94 (s, 4H).
Janus HBED/BPED "JED" (32).A un lote de 0,082 g (0,192 mmol) de31en 20 mL de MeOH se añadieron 1,03 g (12,3 mmol) de NaHCO3 y 0,889 g (9,66 mmol) de ácido glioxílico monohidratado). Se añadió un lote de 0,119 g (1,89 mmol) de cianoborohidruro de sodio por porciones en el transcurso de 8 h. Después de agitar por 16 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró hasta sequedad y se purificó por RP-HPLC usando la columna C18 y el método preparativo P8. El32puro se aisló como 0,104 g (0,192 mmol, rendimiento del 100 %) de un sólido blanco. ESI-MS:m/z= 543,0 [M+H]+; calculado: 543,2.
Mn (II)-JED (33).A un lote de 0,104 g (0,192 mmol) de32agitando en 4 mL cada uno de H2O:MeCN se añadieron 0,037 g (0,187 mmol) de MnCbH2O y la solución se ajustó a pH 6,5 por adición de acetato de amonio sólido. La mezcla de reacción se purificó por RP-HPLC usando la columna C18 y el método P7. El33puro se aisló como 0,041 g (0,069 mmol, 35,9 % de rendimiento) de un sólido blanco. ESI-M<s>:m/z= 596,0 [M+H]+; calculado: 596,2.
Ejemplo 6: Síntesis de un complejo reactivo tiol.
Mn (IM)-JED (34).A un lote de de32de 0,053 g (0,098 mmol) agitando en 10 mL de H2O a pH 9,1 se añadieron 0,009 g (0,080 mmol) de MnF3 y la solución se ajustó a pH 6,5. La mezcla de reacción se purificó por RP-HPLC usando la columna C18 y el método P9. El34puro se aisló en forma de sólido marrón de 0,018 mmol (0,029, 36,3 % de rendimiento). ESI-Ms :m/z= 595,0 [M+2H]+; calculado: 595,1.
Ejemplo 7: Relaxividad de complejos de Mn (II) que tienen como objetivo las proteínas a 1,41T, 37 °C.La incorporación de funcionalidad lipofílica en los complejos quelato-metal favorece la unión a proteínas plasmáticas tales como la albúmina sérica. Esta unión proporciona un cambio en la relaxividad medida en plasma sanguíneo humano en comparación con la medida en PBS. En la mayoría de los casos, se observa un gran aumento (40-170 %) de la relaxividad (n o r2) (Tabla 1).
La Tabla 1 muestra la relaxividad de cuatro complejos metal-quelato basados en Mn (II) que se unen a proteínas.
Ejemplo 8: 18 tiene una gran afinidad por el producto soluble de degradación de la fibrina DD(E).La afinidad de las sondas se usó para usar el ensayo de desplazamiento por polarización de fluorescencia DD(E) (ver Métodos, anteriormente). El desplazamiento de un derivado marcado con tetrametilrhodamina del péptido de unión a la fibrina (denominado TRITC-Tn6) de DD(E) en función de la concentración de18o EP2104R se detectó observando el cambio correspondiente en la anisotropía de fluorescencia (FIGURA 1). La Kd de la sonda TRITC-Tn6 se determinó titulándola con la proteína DD(E) y ajustando los datos de fluorescencia resultantes tal como describe Kolodziej(Bioconjugate Chem.53:548-556).18se une a DD(E) con la Kd = 110 nM; registramos la Kd = 240 nM para EP2104R en la misma preparación de DD(E).
Ejemplo 9: El Mn de 20 tiene un coligando de agua de esfera interna que se intercambia rápidamente.La presencia de un coligando de agua de intercambio rápido (tasa de intercambio = 108 s_1) se estableció mediante el seguimiento de la dependencia de la temperatura de la relaxividad transversal del H217O de20(FIGURA 2) (ver Métodos, anteriormente).
Ejemplo 10: 20 presenta una alta relaxividad en presencia de fibrina.Se registraron valores de relaxividad de 20 en amortiguador Tris de pH 7,4, plasma de sangre bovina, BSA al 4,5 % p/p, fibrinógeno humano y gel de fibrina humana a 1,4T, 37 °C (Tabla 2).18presenta una mayor relaxividad en presencia de gel de fibrina en comparación con el fibrinógeno humano o con abundantes proteínas plasmáticas
La Tabla 2 muestra la Tí-relaxividad de20medida en amortiguador Tris pH 7,4, plasma de sangre bovina, BSA al 4,5 % p/p, fibrinógeno humano y gel de fibrina humana a 1,4T, 37 °C.
Ejemplo 11: 20 detecta la trombosis de la arteria carótida.El compuesto20permite la visualización del trombo arterial con gran conspicuidad y la imagenología se apoya en la histologíaex vivo(FIGURA 3). Sorprendentemente, la sonda20proporciona un nSNR del trombo y una relación contraste-ruido (CNR) trombo-músculo equivalentes a los de la sonda de imagenología de fibrina EP2104R basada en Gd, que se sabe que tiene una relaxividad aún mayor(J. Am. Chem. Soc.2008, 130:6025) (FIGURA 4). Estos datos ponen aún más de relieve la eficacia del Mn para generar contraste de RM.
Ejemplo 12: El Mn-FBP inyectada por vía intravenosa se elimina por completo a las 24 horas.El compuesto20se elimina de la sangre con una vida media de 22,6 ± 6,8 min (FIGURA 5). El único aumento significativo de Mn respecto a los niveles basales se encontró en el riñón y el músculo, en donde permaneció 0,37 ± 0,14 y 0,02 ± 0,02 por ciento de la dosis inyectada por gramo, respectivamente (Tabla 3).
La Tabla 3 muestra los niveles endógenos de Mn en ratas Wistar macho (N = 4) y los niveles de Mn 24 h después de la inyección intravenosa de 0,01 mmol/kg de compuesto20(N = 4). Se observaron diferencias estadísticamente significativas (*, p < 0,05) en riñón y músculo y representan 0,37 ± 0,14 y 0,02 ± 0,02 por ciento de la dosis inyectada por gramo de tejido, respectivamente.
Ejemplo 13: La diferencia de relaxividad entre los compuestos 33 y 34 es muy grande e independiente del campo.La relaxividad de los compuestos33y34se midió en agua y en plasma sanguíneo humano (Tabla 4). Los cambios de relaxividad observados entre los estados de oxidación33y34son de 660 %, 900 %, 500 % y 400 % para las condiciones A-D, respectivamente.
La Tabla 4 muestra que el complejo33basado en Mn (II) muestra una relaxividad mucho mayor que su complejo hermano34basado en Mn (III) y que esta diferencia de relaxividad es en gran medida independiente del campo magnético aplicado.
Ejemplo 14: El compuesto 33 se convierte rápidamente en el compuesto 34 por las enzimas peroxidasas con un cambio de relaxividad de 7 veces.La relaxividad del compuesto33en PBS (1,41 T, 37 °C) se midió en presencia de una concentración en estado estacionario de peróxido de hidrógeno generado por 10 U/mL de glucosa oxidasa 8 mM de glucosa (FIGURA 6). Las mediciones se realizaron en ausencia o presencia de peroxidasa de rábano picante. Los círculos rellenos y abiertos representan la relaxividad en ausencia y presencia de la enzima peroxidasa, respectivamente. Las líneas continuas representan ajustes a los datos.
La FIGURA 7 muestra las trazas de HPLC tomadas después de un periodo de incubación de 1 h. El trazo superior de HPLC corresponde al de33, el trazo inferior corresponde al de después de 1 h de incubación con peróxido de hidrógeno y peroxidasa.34es el único producto formado.
Ejemplo 15: En el plasma sanguíneo humano, el compuesto 34 se puede convertir en el compuesto 33 mediante la adición de L-cisteína.La ri en función del tiempo (1,4T, 37 °C) de34en plasma sanguíneo humano sin y con 5 mol. equivalentes de L-cisteína se representa mediante los círculos rellenos y abiertos, respectivamente (FIGURA 8). Las líneas continuas representan ajustes a los datos. La adición de L-cisteína desencadena una rápida conversión del compuesto34en compuesto33, lo que provoca un gran aumento de ri.
Se han descrito varias realizaciones de la invención. No obstante, se entenderá que se pueden realizar varias modificaciones sin apartarse del alcance de la invención, de acuerdo con las reivindicaciones. Por consiguiente, otras realizaciones están dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (XVII):
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R1 se selecciona del grupo que consiste en un alquileno de C2-C6, un cicloalquileno de C3-C10, un heterocicloalquileno de 4-10 miembros, un arileno de C6-C10, un heteroarileno de 5-10 miembros, un (dialquilo de C1-C6)(arileno de C6-C10) y un (dialquilo de C1-C6)(heteroarileno de 5-10 miembros), en donde el alquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno y heteroarileno están opcionalmente sustituidos por 1, 2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente, y en donde R1 está unido a los nitrógenos adyacentes mediante las posiciones 1,2 o 1,3 de R1; cada R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, CO2H, (alquilo de C1-C6)CO2H, alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo de 5-6 miembros, heteroarilo de 5-6 miembros, C(O)NR4R5, CH2NHCOR4, C(O)N(OH)R4, C(O)NHSO2R4, CH2NHSO2R4, N(OH)C(O)R4, P(R4)O2R5, PO3R4R5, y [L]-[TBM]; cada R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C1-C6y [L]-[TBM], en donde el alquilo está opcionalmente sustituido por 1, 2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente; DG se selecciona del grupo que consiste en:
    y
    en donde cada Y es independientemente CH, CZ, N, O, S, o NR4; Q es CH; cada Z se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, OH, OR4, CO2R4, (alquilo de C1-C6)CO2H, alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo d miembros, heteroarilo de 5-6 miembros, C(O)NR4R5, CH2NHCOR4, C(O)N(OH)R4, C(O)NHSO2R4, CH2NHSO2R4, N(OH)C(O)R4, P(R4)O2R5, PO3R4R5, y -[L]-[TBM], en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos por 1,2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente; L es un enlazador; TBM es un resto de unión a un objetivo, en donde cada TBM se selecciona independientemente de un TBM que se une a una o más de las siguientes: albúmina sérica humana (HSA); fibrina; un componente extracelular del miocardio que se selecciona de colágeno, elastina y decorina; una enzima extracelular secretada en la inflamación o el cáncer, que se selecciona de enzimas peroxidasas y proteasas; y un componente extracelular de una lesión que se selecciona de ácido hialurónico (HA), heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato, versicano, biglicano, composición disregulada de tio/disulfuro, fragmentos proteolizados de proteínas transmembranales y fibronectina; cada RX se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CN, NO2, halo, pseudohalo, amino, tionilo, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, alquinilo de C2-C4, haloalquilo de C1-C4, cianoalquilo de C1-C4, hidroxialquilo de C1-C4, alcoxilo de C1-C4, aminoalquilo de C1-C4, di(alquilo de C1-C4)amino, alquilamino de C1-C4, fosfinato, éster de fosfinato, fosfonato, éster de fosfonato, fosfodiéster, alquilfosfodiéster de C1-C4, cicloalquilo de C3-C6, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros, heterocicloalquilo de 5-6 miembros, (alquilo de C1-C4)fenilo y -[L]-[TBM]; y M se selecciona del grupo que consiste en Fe (111), Mn (II), Mn (III), Cr (III), Cu (II), Cu (III), Dy (III), Ho (III), Er (III), Pr (III), Eu (II), Eu (III), Nd (III), La (III), Lu (III), Sm (III), Tb (III), Tb (IV), Tm (III), Y (III), In (III), Ga (III), Tc (III), Tc (IV), Tc (V), Re (III), Re (IV), Re (V), Bi (III), e Yb (III); en donde, si todos los Y son CH, posteriormente al menos uno de los R2 o R3 no es H.
  2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  3. 3. Un compuesto de fórmula (XVIII):
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto es:
    ; y M se selecciona del grupo que consiste en Fe (III), Mn (II), Mn (III), Cr (III), Cu (II), Cu (III), Dy (III), Ho (III), Er (III), Pr (III), Eu (II), Eu (III), Nd (III), La (III), Lu (III), Sm (III), Tb (III), Tb (IV), Tm (III), Y (III), In (III), Ga (III), Tc (III), Tc (IV), Tc (V), Re (III), Re (IV), Re (V), Bi (III) e Yb (III).
  4. 4. Un compuesto de fórmula (XIX):
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: o bien (a) R1 es 1,2-etileno; R2 es COOH; R3 es la Fórmula XVI, en donde X es N y cada ocurrencia de W es CH; y R4 es un resto de Fórmula XVI:
    en donde X es CZ, N, O, S o NR4; cada W es independientemente CH, CZ, N, O, S o NR4; cada Z se selecciona independientemente entre H, OH, OR4, CO2H, -(alquilo de C1-C6)CO2H, alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C4-C6, arilo de C6-C10, heterociclilo de 5-6 miembros, heteroarilo de 5-6 miembros, C(O)NR5R6, CH2NHCOR5, C(O)N(OH)R5, C(O)NHSO2R5, CH2NHSO2R5, N(OH)C(O)R5, P(R5)O2R6, PO3R5R6, y -[L]-[TBM], en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos por 1,2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente; cada R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C1-C6y -[L]-[TBM], en donde el alquilo está opcionalmente sustituido por 1,2, 3 o 4 grupos RX que se seleccionan independientemente; L es un enlazador; TBM es un resto de unión a un objetivo, en donde cada TBM se selecciona independientemente de un TBM que se une a una o más de las siguientes: albúmina sérica humana (HSA); fibrina; un componente extracelular del miocardio que se selecciona de colágeno, elastina y decorina; una enzima extracelular secretada en la inflamación o el cáncer, que se selecciona de enzimas peroxidasas y proteasas; y un componente extracelular de una lesión que se selecciona de ácido hialurónico (HA), heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato, versicano, biglicano, composición disregulada de tio/disulfuro, fragmentos proteolizados de proteínas transmembranales y fibronectina; cada RX se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CN, NO2, halo, pseudohalo, amino, tionilo, sulfinilo, sulfonilo, sulfo, alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, alquinilo de C2-C4, haloalquilo de C1-C4, cianoalquilo de C1-C4, hidroxialquilo de C1-C4, alcoxilo de C1-C4, aminoalquilo de C1-C4, di(alquilo de C1-C4)amino, alquilamino de C1-C4, fosfinato, éster de fosfinato, fosfonato, éster de fosfonato, fosfodiéster, alquilfosfodiéster de C1-C4, cicloalquilo de C3-C6, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros, heterocicloalquilo de 5-6 miembros, (alquilo de C1-C4)fenilo y -[L]-[TBM]; o (b) R1 es 1,2-etileno; R2 es COOH; R3 es COOH; y R4 es
    o (c) R1 es 1,2-etileno; R2 es COOH; R3 es COOH; y R4 es
    (d) R1 es 1,2-etileno; R2 es COOH; R3 es COOH; y R4 es
    y M se selecciona del grupo que consiste en Fe (III), Mn (II), Mn (III), Cr (III), Cu (II), Cu (III), Dy (III), Ho (III), Er (III), Pr (III), Eu (II), Eu (III), Nd (III), La (III), Lu (III), Sm (III), Tb (III), Tb (IV), Tm (III), Y (III), In (III), Ga (III), Tc (III), Tc (IV), Tc (V), Re (III), Re (IV), Re (V), Bi (III) e Yb (III).
  5. 5. El compuesto de la reivindicación 4, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
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