ES2988040T3 - Composiciones aerosolizadas que comprenden mitocondrias y sus métodos de uso - Google Patents

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Abstract

Esta divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas de composiciones aerosolizadas que contienen mitocondrias, métodos para preparar y utilizar las composiciones y dispositivos para administrar las composiciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones aerosolizadas que comprenden mitocondrias y sus métodos de uso
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a composiciones aerosolizadas que contienen mitocondrias, métodos de preparación de las composiciones y composiciones para su uso en métodos, y dispositivos para administrar las composiciones.
ANTECEDENTES
Las mitocondrias son orgánulos de doble membrana que se encuentran en el citoplasma de las células eucariotas nucleadas. Se encuentran en casi todas las células del cuerpo humano, excepto en los glóbulos rojos. Son el lugar principal del metabolismo energético de la célula y generan trifosfato de adenosina (ATP) para diferentes funciones celulares. Normalmente, más del 90% de las necesidades de ATP de una célula son suministradas por las propias mitocondrias de la célula.
Las mitocondrias están compuestas por dos membranas concéntricas, que tienen funciones especializadas. La membrana mitocondrial interna contiene proteínas para la ATP sintasa. La membrana mitocondrial externa, que contiene un gran número de proteínas de membrana integral, encierra todo el orgánulo.
La estructura de las mitocondrias presenta sorprendentes similitudes con algunos procariotas modernos. De hecho, se cree que las mitocondrias se originaron a partir de una antigua simbiosis cuando una célula nucleada engulló a un procariota aeróbico. En la relación de simbiosis, la célula huésped pasó a depender de la procariota engullida para la producción de energía, y la célula procariota empezó a depender del entorno protector proporcionado por la célula huésped.
Debido a la función primaria de la mitocondria en el metabolismo celular, el daño y la disfunción de la mitocondria pueden causar una serie de enfermedades humanas. Los daños en las mitocondrias pueden deberse a lesiones, toxicidad, quimioterapia y cambios relacionados con la edad. En particular, la lesión por isquemia/reperfusión puede causar daños mitocondriales, lo que repercutirá de manera negativa en el consumo de oxígeno y en la síntesis de energía. Los tratamientos en los que intervienen las mitocondrias pueden ser especialmente útiles para los trastornos relacionados con las mismas. Algunos de los primeros tratamientos consisten en administrar mitocondrias mediante una inyección intramuscular e intraarterial. Existe la necesidad de administrar mitocondrias en varios lugares objetivo de un sujeto a través de diferentes vías de administración para diversos fines.
Su et al. (Theranostics 6(8): 1244-1260, 2016) da a conocer que el trasplante mitocondrial atenúa la hiperreactividad de las vías respiratorias mediante la inhibición de la hiperactividad colinérgica.
El documento EP 3402490A0 da a conocer el uso terapéutico de mitocondrias y agentes mitocondriales combinados.
SUMARIO
La presente invención proporciona composiciones (por ejemplo, Composiciones aerosolizadas) que contienen mitocondrias, métodos para preparar las composiciones y composiciones para su uso en métodos, y dispositivos para administrar las composiciones.
La presente invención se define mediante las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes describen otras formas de realización de la invención.
De conformidad con la invención, la invención proporciona composiciones aerosolizadas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de mitocondrias para su uso en métodos de tratamiento de un sujeto que padece un trastorno respiratorio, comprendiendo el método la administración de dicha composición al sujeto a través de las vías respiratorias, en las que la composición comprende mitocondrias adecuadas para la respiración.
En una forma de realización, la composición se convierte en una forma de aerosol antes de su administración al sujeto mediante un nebulizador, un vaporizador, un pulverizador nasal, un inhalador dosificador presurizado o un inhalador dosificador presurizado activado por la respiración.
En una forma de realización, la forma de aerosol de la composición comprende gotículas que tienen un tamaño medio de 0,01 a 1000 microlitros (por ejemplo, de 0,1 a 1000 microlitros, de 1 a 1000 microlitros, de 0,1 a 100 microlitros, de 0,1 a 500 microlitros o de 1 a 500 microlitros). En algunas formas de realización, la gotícula tiene un tamaño de al menos 0,01,0,1,0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 microlitros. En algunas formas de realización, la gotícula tiene un tamaño inferior a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 microlitros.
En una forma de realización, el sujeto tiene una lesión pulmonar aguda, insuficiencia respiratoria, función respiratoria reducida, inflamación pulmonar, carcinoma pulmonar, arrugas en la piel, calvicie y/o cáncer. En algunas formas de realización, el sujeto tiene una lesión pulmonar aguda.
En una forma de realización, la concentración de mitocondrias en la composición es de aproximadamente 1x105 a 5x108 ml-1 (p. ej., 1x106 a 5x108 ml-1, 1x107 a 5x108 ml-1, 1x105 a 1x108 ml-1, 1x106 a 1x108 ml-1, 1x107 a 1x108 ml-1, 1x106 a 5x107 ml-1, 1x106 a 1x107 ml-1, 1x106 a 5x107 ml-1, 5x106 a 1x108 ml-1). En una forma de realización, se administra al sujeto 1x105 a 1x109 de mitocondrias por dosis (p. ej., 1x105 a 5x108, 1x106 a 5x108, 1x107 a 5x108, 1x105 a 1x108, 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x106 a 5x107, 1x106 a 1x107, 1x106 a 5x107, 5x106 a 1x108 mitocondrias por dosis). En una forma de realización, la dosis es de al menos 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, o 1x109, 5x109, o 1x1010 mitocondrias por dosis. En algunas formas de realización, la dosis es inferior a 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, o 1x109, 5x109, o 1x1010 mitocondrias por dosis.
En una forma de realización, las mitocondrias son autogénicas, alogénicas o xenogénicas.
En una forma de realización, la composición comprende, además, una solución seleccionada de entre el grupo constituido por: K+-HEPES con un pH de 7 a 8, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), suero y plasma, y/o la composición comprende, además, uno o más osmolitos seleccionados de entre el grupo constituido por: trehalosa, sacarosa, manosa, glicina, prolina, glicerol, manitol, sorbitol, betaína y sarcosina, y/o la composición comprende, además, un agente farmacéutico, y/o la composición comprende, además, un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
En una forma de realización, la composición comprende, además, un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a la mitocondria por un enlace covalente, estando integrado en la mitocondria o estando internalizado dentro de la mitocondria, de manera opcional, el agente terapéutico o el agente de diagnóstico es un agente de diagnóstico terapéutico, o de manera opcional, el agente terapéutico o el agente de diagnóstico comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o de manera opcional, el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a la mitocondria por un enlace covalente, o de manera opcional, el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está integrado o internalizado dentro de la mitocondria.
En una forma de realización, las mitocondrias están modificadas genéticamente.
En una forma de realización, las mitocondrias comprenden polipéptidos exógenos.
En una forma de realización, las mitocondrias comprenden polinucleótidos exógenos, ADN, ARN, ARNm, micro ARNs, ARN nuclear o SiARN.
En otro aspecto más, la invención se refiere a una composición aerosolizada que comprende una pluralidad de gotículas líquidas que contienen un tampón, en donde al menos una gotícula líquida de la pluralidad de gotículas líquidas comprende al menos una mitocondria.
En una forma de realización, el tampón se selecciona de entre el grupo constituido por: K+-HEPES con un pH de 7 a 8, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), suero y plasma, y/o la composición comprende, además, uno o más osmolitos seleccionados de entre el grupo constituido por: trehalosa, sacarosa, manosa, glicina, prolina, glicerol, manitol, sorbitol, betaína y sarcosina, y/o la composición comprende, además, un agente farmacéutico, y/o la composición comprende, además, un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
En una forma de realización, la composición comprende, además, un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a la mitocondria por un enlace covalente, estando integrado en la mitocondria o estando internalizado dentro de la mitocondria.
En una forma de realización, la composición comprende, además, un agente mitocondrial, en donde el agente mitocondrial se selecciona de entre el grupo constituido por un agente terapéutico, un agente quimioterapéutico o un agente de diagnóstico, de manera opcional, el agente mitocondrial comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno, o de manera opcional, el agente mitocondrial está unido a la mitocondria por un enlace covalente, o de manera opcional, el agente mitocondrial está integrado o internalizado dentro de la mitocondria.
En algunas formas de realización, la pluralidad de gotículas tiene un tamaño medio de 1 a 1000 microlitros.
En una forma de realización, la mitocondria está modificada genéticamente.
En una forma de realización, la mitocondria comprende polipéptidos exógenos.
En una forma de realización, la mitocondria comprende polinucleótidos exógenos.
En una forma de realización, la mitocondria antes de su administración al sujeto se incuba con una composición que comprende una enzima.
En una forma de realización, la composición comprende mitocondrias autogénicas, mitocondrias alogénicas, mitocondrias xenogénicas o una mezcla de las mismas.
En una forma de realización, la composición comprende mitocondrias autogénicas, mitocondrias alogénicas, mitocondrias xenogénicas o una mezcla de las mismas, y/o en donde la composición comprende de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1014, de aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 1013, de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 1012, de 1 x 106 a 1 x 1011, de 1 x 107 a 1 x 1010, de 1 x 103 a 1 x 107, de 1 x 104 a 1 x 106, de 1 x 107 a 1 x 1014, o de 1 x 108 a 1 x 1013, de 1 x 109 a 1 x 1012, de 1 x 105 a 1 x 108; o al menos o aproximadamente de 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x1012, 1 x 1013, o al menos o aproximadamente de 1 x 1014 mitocondrias, y/o en las que la pluralidad de gotículas tiene un tamaño medio de 0,01 a 1000 microlitros.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. En este documento se describen métodos y materiales para su uso en la presente invención; también pueden utilizarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en esta técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Otras características y ventajas de la invención se desprenderán de la descripción detallada y de las figuras siguientes, así como de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un método de aislamiento de mitocondrias.
La Figura 2A es un tejido muscular esquelético que fue obtenido mediante un punzón de biopsia.
La Figura 2B son imágenes microscópicas de mitocondrias aisladas bajo iluminación de contraste de fases (campo brillante, BF) (panel izquierdo), bajo fluorescencia marcada con MitoTracker Red CMXRos (panel central), y la imagen fusionada (el panel derecho).
La Figura 2C es un gráfico que muestra los resultados del rendimiento de mitocondrias por gramo de peso húmedo del tejido.
La Figura 2D son imágenes de microscopio electrónico de transmisión de mitocondrias aisladas.
La Figura 2E es un gráfico de barras que muestra los resultados de los ensayos de actividad para el complejo mitocondrial I-V.
La Figura 2F es un gráfico de barras que muestra los resultados para el estado 3 (activo) de consumo de oxígeno (respiración estimulada por ADP).
La Figura 2G es un gráfico de barras que muestra los resultados para el índice de control respiratorio (ICR; estado 3/estado 4) para el consumo de oxígeno inducido por malato (complejo I) e inducido por succinato (complejo II) en mitocondrias autólogas del pectoral mayor.
La Figura 3A son imágenes de microscopio superpuestas que muestran las mitocondrias trasplantadas localizadas dentro de los cardiomiocitos.
La Figura 3B son imágenes de microscopio superpuestas que muestran mitocondrias trasplantadas localizadas dentro de cardiomiocitos.
La Figura 3C muestra imágenes microscópicas superpuestas de mitocondrias trasplantadas localizadas en cardiomiocitos.
La Figura 3D son imágenes de microscopio superpuestas que muestran mitocondrias trasplantadas localizadas dentro de cardiomiocitos.
La Figura 4A es una imagen que muestra una imagen transversal representativa obtenida mediante tomografía por emisión de positrones (PET) de ratas a las que se administraron mitocondrias 18F Rodamina 6-G (6 x 107) suministradas a los pulmones mediante infusión vascular a través de la arteria pulmonar.
La Figura 4B es una imagen que muestra una imagen coronal representativa obtenida mediante PET de ratas a las que se administró mitocondria 18F Rodamina 6-G (6 x 107) administrada a los pulmones mediante infusión vascular a través de la arteria pulmonar.
La Figura 4C es una imagen que muestra una imagen representativa de los pulmones obtenida mediante PET de ratas a las que se administró mitocondria 18F Rodamina 6-G (6 x 107) administrada a los pulmones mediante infusión vascular a través de la arteria pulmonar.
La Figura 5A es una imagen de tinción inmunohistoquímica de tejido pulmonar de ratón tras la administración de mitocondrias exógenas mediante un nebulizador.
La Figura 5B es una imagen de tinción inmunohistoquímica de tejido pulmonar de ratón tras la administración de mitocondrias exógenas por la arteria pulmonar.
La Figura 6 son imágenes de pulmones murinos tras 2 horas de isquemia por lesión pulmonar aguda (LPA) del pulmón izquierdo y 24 horas de recuperación. El círculo rojo indica los pulmones sometidos al procedimiento LPA. El pulmón derecho se indica como R, el izquierdo como L. El corazón (H) se muestra en el centro.
La Figura 7A es un gráfico de barras que muestra la resistencia pulmonar en los pulmones de ratón (n=4) sometidos a 2 horas de isquemia pulmonar izquierda tras 24 horas de recuperación. Se administró un vehículo o mitocondrias por vía intravascular a través de la arteria pulmonar izquierda (V) o por nebulizador (N).
La Figura 7B es un gráfico de barras que muestra la elastancia en pulmones de ratón sometidos a 2 horas de isquemia pulmonar izquierda tras 24 horas de recuperación. Se administró un vehículo o mitocondrias por vía intravascular a través de la arteria pulmonar izquierda (V) o por nebulizador (N).
La Figura 8A es un gráfico de barras que muestra la cuantificación del ADNmt libre circulante determinado por PCR en tiempo real en muestras de sangre total en ratones BALB/cJ que recibieron solamente tampón de respiración (Sham (grupo de control simulado)) o mitocondrias (3 x 107 de mitocondrias en tampón de respiración).
La Figura 8B son imágenes de tejido pulmonar teñido con hematoxilina y eosina.
La Figura 8C son imágenes de tejido pulmonar teñido con tricrómico de Masson.
La Figura 8D son imágenes de microscopio electrónico de transmisión de los tejidos pulmonares desde el lóbulo inferior derecho.
La Figura 9A es una imagen que muestra la cuantificación de la captación mitocondrial y la biodistribución. Imágenes PET-microCT de mitocondrias marcadas con 18F-Rodamina 6G (1 x 109) administradas a los pulmones de ratas Wistar, ambas mediante inyección en el tronco pulmonar.
La Figura 9B es una imagen que muestra la cuantificación de la captación mitocondrial y la biodistribución. Imagen PET-microCT de mitocondrias marcadas con 18F-Rodamina 6G (1 x 109) administradas a los pulmones de ratas Wistar como aerosol mediante nebulización.
La Figura 10A es una imagen inmunohistoquímica (100x) que demuestra la absorción en el tejido pulmonar de mitocondrias exógenas procedentes de fibroblastos cardíacos humanos administradas por vía vascular.
La Figura 10B es una imagen inmunohistoquímica (100x) que muestra la absorción en el tejido pulmonar de mitocondrias exógenas procedentes de fibroblastos cardíacos humanos administradas por nebulización.
La Figura 11A es un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la distensibilidad dinámica de los pulmones que reciben mitocondrias por vía vascular.
La Figura 11B es un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la resistencia de los pulmones que reciben mitocondrias por vía vascular.
La Figura 11C es un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la amortiguación tisular de los pulmones que reciben mitocondrias por vía vascular.
La Figura 11D es un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la capacidad inspiratoria de los pulmones que reciben mitocondrias por vía vascular.
La Figura 11E es un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la presión inspiratoria máxima para los pulmones que reciben mitocondrias por vía vascular.
La Figura 12A muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la distensibilidad dinámica de los pulmones que reciben mitocondrias por nebulización.
La Figura 12B es un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la resistencia para los pulmones que reciben mitocondrias mediante nebulización.
La Figura 12C es un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la amortiguación tisular para los pulmones que reciben mitocondrias mediante nebulización.
La Figura 12D es un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la capacidad inspiratoria de los pulmones que recibieron mitocondrias mediante nebulización.
La Figura 12E es un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la presión inspiratoria máxima para los pulmones que reciben mitocondrias mediante nebulización.
La Figura 13 muestra resultados del análisis de la función pulmonar, en particular, bucles representativos de presiónvolumen.
La Figura 14A son imágenes que muestran hematoxilina y eosina (H&E), tinción de mieloperoxidasa (MPO), TUNEL e imágenes de Microscopio Electrónico de transmisión (EM) de secciones de tejido pulmonar para pulmones que reciben el vehículo mediante administración vascular; barras de escala: 500 gm.
La Figura 14B muestra imágenes de hematoxilina y eosina (H&E), tinción con mieloperoxidasa (MPO), TUNEL y Microscopio Electrónico de transmisión (EM) de secciones de tejido pulmonar para pulmones que reciben mitocondrias por vía vascular; barras de escala: 500 gm.
La Figura 14C son imágenes que muestran hematoxilina y eosina (H&E), tinción de mieloperoxidasa (MPO), TUNEL, e imágenes de Microscopio Electrónico de transmisión (EM) de secciones de tejido pulmonar para pulmones que reciben vehículo a través de nebulización; barras de escala: 500 gm.
La Figura 14D son imágenes que muestran hematoxilina y eosina (H&E), tinción de mieloperoxidasa (MPO), TUNEL e imágenes de Microscopio Electrónico de transmisión (EM) de secciones de tejido pulmonar para pulmones que recibieron mitocondrias mediante nebulización; barras de escala: 500 gm.
La Figura 14E son imágenes que muestran hematoxilina y eosina (H&E), tinción de mieloperoxidasa (MPO), TUNEL e imágenes de Microscopio Electrónico de transmisión (EM) de secciones de tejido pulmonar para el grupo simulado; barras de escala: 500 gm.
La Figura 15A es un gráfico de barras que muestra la gravedad de la lesión del tejido pulmonar a las 24 horas de la reperfusión para los pulmones que recibieron vehículo por vía vascular (Vehículo V), mitocondrias por vía vascular (Mito V) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluó la gravedad de la lesión pulmonar en secciones teñidas con H&E (15x) utilizando el sistema de puntuación descrito con anterioridad; cuanto peor era la lesión tisular, mayor era la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una disminución significativa de la infiltración de células inflamatorias y de la congestión intersticial sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones de Mito V y Mito Neb en comparación con los de Vehículo V y Vehículo Neb.
La Figura 15B es un gráfico de barras que muestra el recuento de neutrófilos a las 24 horas de la reperfusión para pulmones que recibieron vehículo por vía vascular (Vehículo V), mitocondrias por vía vascular (Mito V) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluó la gravedad de la lesión pulmonar en secciones teñidas con H&E (15x) utilizando el sistema de puntuación descrito con anterioridad; cuanto peor era la lesión tisular, mayor era la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una disminución significativa de la infiltración de células inflamatorias y de la congestión intersticial sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones de Mito V y Mito Neb en comparación con los de Vehículo V y Vehículo Neb.
La Figura 15C es un gráfico de barras que muestra los núcleos etiquetados con TUNEL por cada 100 núcleos a las 24 horas de la reperfusión para pulmones que recibieron vehículo por vía vascular (Vehículo V), mitocondrias por vía vascular (Mito V) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluó la gravedad de la lesión pulmonar en secciones teñidas con H&E (15x) utilizando el sistema de puntuación descrito con anterioridad; cuanto peor era la lesión tisular, mayor era la puntuación (1 -5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una disminución significativa de la infiltración de células inflamatorias y de la congestión intersticial sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones de Mito V y Mito Neb en comparación con los de Vehículo V y Vehículo Neb.
La Figura 15D es un gráfico de barras que muestra la gravedad de la lesión tisular pulmonar a las 24 horas de la reperfusión para pulmones que recibieron vehículo mediante nebulización (Vehículo Neb), mitocondrias mediante suministro vascular (Mito Neb) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluó la gravedad de la lesión pulmonar en secciones teñidas con H&E (15x) utilizando el sistema de puntuación descrito con anterioridad; cuanto peor era la lesión tisular, mayor era la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una disminución significativa de la infiltración de células inflamatorias y de la congestión intersticial sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones de Mito V y Mito Neb en comparación con los de Vehículo V y Vehículo Neb.
La Figura 15E es un gráfico de barras que muestra el recuento de neutrófilos a las 24 horas de la reperfusión para pulmones que recibieron vehículo mediante nebulización (Vehículo Neb), mitocondrias mediante suministro vascular (Mito Neb) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluó la gravedad de la lesión pulmonar en secciones teñidas con H&E (15x) utilizando el sistema de puntuación descrito con anterioridad; cuanto peor era la lesión tisular, mayor era la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una disminución significativa de la infiltración de células inflamatorias y de la congestión intersticial sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones de Mito V y Mito Neb en comparación con los de Vehículo V y Vehículo Neb.
La Figura 15F es un gráfico de barras que muestra los núcleos etiquetados con TUNEL por cada 100 núcleos a las 24 horas de la reperfusión para pulmones que recibieron vehículo mediante nebulización (Vehículo Neb), mitocondrias mediante suministro vascular (Mito Neb) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluó la gravedad de la lesión pulmonar en secciones teñidas con H&E (15x) utilizando el sistema de puntuación descrito con anterioridad; cuanto peor era la lesión tisular, mayor era la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una disminución significativa de la infiltración de células inflamatorias y de la congestión intersticial sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones de Mito V y Mito Neb, en comparación con los de Vehículo V y Vehículo Neb.
La Figura 15G es un gráfico de barras que muestra la relación peso húmedo/peso seco en porcentaje a las 24 horas de reperfusión para los pulmones que recibieron vehículo por vía vascular (Vehículo V), mitocondrias por vía vascular (Mito V), vehículo por nebulización (Vehículo Neb), mitocondrias por vía vascular (Mito Neb) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluó la gravedad de la lesión pulmonar en secciones teñidas con H&E (15x) utilizando el sistema de puntuación descrito con anterioridad; cuanto peor era la lesión tisular, mayor era la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una disminución significativa de la infiltración de células inflamatorias y de la congestión intersticial sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones de Mito V y Mito Neb en comparación con los de Vehículo V y Vehículo Neb.
La Figura 16 muestra los resultados cuantificados del análisis de citoquinas del BAL; todos los valores se expresan como media ± SEM. n = 4 para todos los grupos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención se refiere a composiciones que contienen mitocondrias (por ejemplo, mitocondrias viables y funcionales), métodos para preparar las composiciones y las composiciones para su uso en métodos, y dispositivos para administrar las composiciones a las vías respiratorias de un sujeto. La presente invención demuestra que las mitocondrias pueden administrarse de manera eficaz al sujeto a través de las vías respiratorias, y la administración de la forma aerosolizada de la composición que contiene mitocondrias a las vías respiratorias es inesperadamente tan eficaz como la administración intraarterial.
La presente invención también proporciona métodos que pueden generar, de forma segura y fiable, composiciones farmacéuticas que comprenden mitocondrias viables y funcionales. Las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden tener un mayor valor terapéutico, un mayor valor comercial y un menor coste de producción por dosis terapéutica.
En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones para su uso en métodos de administración de mitocondrias o agentes mitocondriales combinados a las células que recubren y rodean las vías respiratorias. Dichas composiciones farmacéuticas pueden ser absorbidas por las células y, una vez localizadas intracelularmente, las mitocondrias son capaces de conferir uno o más efectos biológicos. Estos efectos biológicos incluyen, pero no se limitan a, la producción de energía para la célula a través de la respiración, la producción de ATP (es decir, convertir ADP en ATP), regular el metabolismo celular, iniciar el ciclo del ácido cítrico o el ciclo de Krebs, producir calor, almacenar iones de calcio, señalizar a través de las especies reactivas de oxígeno mitocondriales, regular el potencial de membrana, inducir la muerte celular programada por apoptosis, participar en la señalización del calcio (por ejemplo, la apoptosis causada por el calcio), sintetizar hemo y/o esteroides e iniciar la señalización hormonal, etc.
Composiciones aerosolizadas
La presente invención proporciona composiciones aerosolizadas que comprenden mitocondrias aisladas y/o agentes mitocondriales combinados. La presente invención demuestra que los orgánulos celulares (por ejemplo, las mitocondrias) en una composición aerosolizada o en forma de aerosol pueden seguir siendo viables y funcionales, por lo que pueden administrarse de manera eficaz a las vías respiratorias de un sujeto.
Tal y como se utiliza en este documento, el término «aerosol» se refiere a una suspensión de partículas finas o gotículas en un gas portador. Tal como se utiliza en este documento, el término «aerosolización» se refiere al proceso o al acto de convertir una composición en la forma de un aerosol. La composición aerosolizada comprende una pluralidad de partículas (por ejemplo, gotículas, partículas sólidas, gotículas líquidas o partículas de hidrogel). En algunas formas de realización, la partícula tiene un tamaño (por ejemplo, un diámetro) de aproximadamente o menor que 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 gm, 2 gm, 3 gm, 4 gm, 5 gm, 6 gm, 7 gm, 8 gm, 9 gm, 10 gm, 20 gm, 30 gm, 40 gm, 50 gm, 60 gm, 70 gm, 80 gm, 90 gm, 100 gm, 200 gm, 300 gm, 400 gm, 500 gm,600 gm,700 gm,800 gm,900 gm o 1000 gm. En algunas formas de realización, la partícula tiene un tamaño (por ejemplo, un diámetro) de aproximadamente o mayor que 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 gm, 2 gm, 3 gm, 4 gm, 5 gm, 6 gm, 7 gm, 8 gm, 9 gm, 10 gm, 20 gm, 30 gm, 40 gm, 50 gm, 60 gm, 70 gm, 80 gm, 90 gm, 100 gm, 200 gm, 300 gm, 400 gm, 500 gm, 600 gm, 700 gm, 800 gm,900 gm o 1000 gm. En algunas formas de realización, la partícula tiene un tamaño (por ejemplo, un diámetro) de 500 nm a 10 gm, de 500 nm a 100 gm, de 1 gm a 10 gm, de 1 gm a 100 gm, de 5 gm a 100 gm, de 10 gm a 100 gm, o de 1 gm a 500 gm. Tal y como se utiliza en este documento, el término «diámetro» se refiere a la longitud del segmento de línea recta más largo cuyos puntos extremos se encuentran ambos en la superficie de una partícula.
En algunas formas de realización, la composición aerosolizada comprende partículas (por ejemplo, gotículas) de diferentes tamaños. En algunas formas de realización, aproximadamente o al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las partículas tienen entre 500 nm y 10 gm, entre 500 nm y 100 gm, entre 1 gm y 10 gm, entre 1 gm y 100 gm, entre 5 gm y 100 gm, entre 10 gm y 100 gm o entre 1 gm y 500 gm.
En algunas formas de realización, las partículas de la composición aerosolizada pueden tener un tamaño medio (p. ej., un diámetro medio) de aproximadamente o menor que 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 gm, 2 gm, 3 gm, 4 gm, 5 gm, 6 gm, 7 gm, 8 gm, 9 gm, 10 gm, 20 gm, 30 gm, 40 gm, 50 gm, 60 gm, 70 gm, 80 gm, 90 gm, 100 gm, 200 gm, 300 gm, 400 gm, 500 gm, 600 gm, 700 gm, 800 gm,900 gm o 1000 gm. En algunas formas de realización, las partículas pueden tener un tamaño medio (por ejemplo, un diámetro medio) de aproximadamente o mayor que 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 gm, 2 gm, 3 gm, 4 gm, 5 gm, 6 gm, 7 gm, 8 gm, 9 gm, 10 gm, 20 gm, 30 gm, 40 gm, 50 gm, 60 gm, 70 gm, 80 gm, 90 gm, 100 gm, 200 gm, 300 gm, 400 gm, 500 gm, 600 gm, 700 gm, 800 gm, 900 gm o 1000 gm. En algunas formas de realización, las partículas pueden tener un tamaño medio (por ejemplo, un diámetro medio) de 500 nm a 10 gm, de 500 nm a 100 gm, de 1 gm a 10 gm, de 1 gm a 100 gm, de 5 gm a 100 gm, de 10 gm a 100 gm, o de 1 gm a 500 gm. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término «tamaño medio» se refiere al tamaño medio (por ejemplo, el diámetro) determinado en función del volumen. Cuando se utiliza el término tamaño medio, se entiende que describe el tamaño de partícula que divide la población por la mitad, de forma que el 50 % de la población en base al volumen es mayor o menor que este tamaño.
Las composiciones aerosolizadas pueden elaborarse mediante diversos dispositivos conocidos en esta técnica. Entre los dispositivos, a modo de ejemplo, que pueden convertir la composición en una forma de aerosol antes de su administración se incluyen, por ejemplo, un nebulizador, un vaporizador, un pulverizador nasal, un inhalador, un inhalador de niebla suave, un nebulizador de chorro, un nebulizador de ondas ultrasónicas, un inhalador dosificador presurizado, un inhalador dosificador presurizado activado por la respiración o un dispositivo de malla vibratoria. Estos dispositivos pueden utilizar diversos gases portadores, tal como, por ejemplo, oxígeno, aire, nitrógeno o aire comprimido.
La composición antes de la aerosolización puede incluir uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Un portador farmacéuticamente aceptable puede incluir un compuesto o composición útil para facilitar el almacenamiento, la estabilidad, la administración, la orientación celular y/o la entrega de las mitocondrias y/o del agente mitocondrial combinado. El portador farmacéuticamente aceptable incluye, sin limitación, vehículos adecuados, diluyentes, disolventes, excipientes, modificadores del pH, osmolitos, sales, colorantes, modificadores reológicos, lubricantes, recubrimientos, cargas, agentes antiespumantes, polímeros, hidrogeles, tensioactivos, emulgentes, adyuvantes, conservantes, fosfolípidos, ácidos grasos, mono-, di- y tri-glicéridos y derivados de los mismos, ceras, aceites y agua. En algunas formas de realización, las mitocondrias aisladas y/o los agentes mitocondriales combinados se suspenden en agua, solución salina, tampón, tampón de respiración o tampón mitocondrial estéril para su administraciónin vivo.En una composición descrita en el presente documento, pueden incluirse sales, tampones o sistemas tampón farmacéuticamente aceptables, incluidos, sin limitación, la solución salina, el tampón fosfato, la solución salina tamponada con fosfato (PBS) o el tampón de respiración. Los vehículos que tienen la capacidad de facilitar la entrega a una célulain vivo,tales como los liposomas, pueden utilizarse para facilitar la entrega de mitocondrias o de los agentes mitocondriales combinados a las células objetivo.
Los tampones a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un tampón de respiración (por ejemplo, 250 mmol/L de sacarosa, 20 mmol/L de tampón K+-HEPES, pH 7,2, 0,5 mmol/L de K+-EGTA, pH 8,0). Los osmolitos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, trehalosa, sacarosa, manosa, glicina, prolina, glicerol, manitol, sorbitol, betaína y sarcosina.
Mitocondrias aisladas y agentes mitocondriales combinados
Las mitocondrias para su uso en las composiciones descritas actualmente pueden aislarse o proporcionarse a partir de cualquier fuente, por ejemplo, aisladas de células o tejidos cultivados. Las células a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, células de tejido muscular, fibroblastos cardíacos, células cultivadas, células HeLa, células de cáncer de próstata, levaduras, células sanguíneas, células cultivadas, y entre otras, y cualquier mezcla de las mismas. Los tejidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, el tejido hepático, el músculo esquelético, el corazón, el cerebro, la sangre y el tejido adiposo (por ejemplo, el tejido adiposo marrón). Las mitocondrias pueden aislarse de células de una fuente autógena, alogénica y/o xenogénica. En algunos casos, las mitocondrias se aíslan de células con una modificación genética, por ejemplo, células con ADNmt modificado o ADN nuclear modificado.
Las mitocondrias pueden aislarse de células o tejidos por métodos conocidos por los expertos en esta técnica. En algunas formas de realización, se recogen muestras de tejido o de células y, a continuación, se homogeneizan. Tras la homogeneización, las mitocondrias se aíslan por centrifugación repetitiva. De manera alternativa, el homogeneizado celular puede filtrarse a través de filtros de malla de nailon. Los métodos típicos de aislamiento de mitocondrias se describen, por ejemplo, en McCully et al., Inyección de mitocondrias aisladas durante la reperfusión temprana para la cardioprotección, Am J Physiol 296, H94-H105. PMC2637784 (2009); Frezza et al., Aislamiento de orgánulos: mitocondrias funcionales de hígado de ratón, músculo y filroblastos cultivados. Nature protocols, 2(2), 287-295 (2007); documento US20180057610; y documento US20180057610A1.
Las mitocondrias para el tratamiento pueden aislarse de células o tejidos de una fuente autógena, de una fuente alogénica y de una fuente xenogénica. En algunos casos, las mitocondrias se recogen de células o tejidos cultivados de un sujeto, y estas mitocondrias se administran de nuevo al mismo sujeto. En algunos otros casos, las mitocondrias se recogen de células o de tejidos cultivados de un segundo sujeto, y estas mitocondrias se administran a un primer sujeto. En algunos casos, las mitocondrias se recogen de células o de tejidos cultivados de una especie diferente (por ejemplo, ratones, cerdos, levaduras).
La presente invención también proporciona una composición que comprende agentes mitocondriales combinados. Los agentes mitocondriales combinados incluyen, por ejemplo, mitocondrias que están físicamente asociadas con un agente, tal como un agente terapéutico, un agente de diagnóstico y/o un agente de obtención de imagen.
Un agente terapéutico puede ser cualquier agente que tenga un uso terapéutico o profiláctico. Los agentes terapéuticos a modo de ejemplo incluyen, p. ej., agentes terapéuticos para trastornos relacionados con la isquemia, agentes citotóxicos para tratar el cáncer, entre muchos otros. En algunos casos, las mitocondrias pueden administrar agentes terapéuticos a células específicas, por ejemplo, células tumorales. El agente terapéutico puede ser, por ejemplo, un inhibidor intracelular, un desactivador, una toxina, una sustancia detenedora y/o una sustancia citostática/citotóxica que, una vez dentro de una célula, inhibe, destruye, detiene, modifica y/o altera la célula de manera que ya no puede funcionar con normalidad y/o sobrevivir. El agente terapéutico puede ser un agente para restaurar la función adecuada de una célula, por ejemplo, un vector de ADN para terapia génica. Un agente terapéutico puede ser, por ejemplo, un compuesto inorgánico u orgánico; una molécula pequeña (menos de 500 daltons) o una molécula grande; una molécula proteinácea, tal como un péptido, un polipéptido, una proteína, una proteína modificada postraduccionalmente o un anticuerpo; o una molécula de ácido nucleico, tal como un ADN de doble cadena, un ADN de cadena sencilla, un ARN de doble cadena, un ARN de cadena sencilla o una molécula de ácido nucleico de triple hélice. En algunas formas de realización, un agente terapéutico puede ser un producto natural derivado de cualquier organismo conocido (por ejemplo, de un animal, planta, bacteria, hongo, protista o virus) o de una biblioteca de moléculas sintéticas. En algunas formas de realización, un agente terapéutico puede ser un compuesto monomérico o polimérico. Algunos agentes terapéuticos, a modo de ejemplo, incluyen agentes citotóxicos, vectores de ADN, pequeños ARNs interferentes (siARN), micro ARN (miARN), péptidos reactivos, nanopartículas, microesferas y moléculas fluorescentes.
Un agente de diagnóstico es un agente que tiene utilidad diagnóstica. Como las mitocondrias transportan un agente de diagnóstico al interior de una célula, en algunas formas de realización, el agente de diagnóstico puede estar diseñado para determinar la condición dentro de una célula, por ejemplo, el pH y el estrés oxidativo dentro de una célula.
Un agente de diagnóstico por imagen es un agente que se emplea para su uso en técnicas de diagnóstico por imagen. Las técnicas o modalidades incluyen, pero no se limitan a, los rayos X, la tomografía computarizada (TC), la resonancia magnética (RM), la gammagrafía, la fluorescencia, los ultrasonidos, etc. El agente de obtención de imágenes puede ser fluorescente y/o radiactivo. En algunas formas de realización, un agente de obtención de imágenes puede ser también un agente de diagnóstico. Los agentes de obtención de imagen, a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los fluoróforos MitoTracker (Thermo Fisher Scientific Inc.), CellLight® RFP, BacMam 2.0 (Thermo Fisher Scientific Inc.), tintes fluorescentes pHrodo sensibles al pH (Thermo Fisher Scientific Inc.), 18F-Rodamina 6G, rodamina B marcada con 18F, nanopartículas magnéticas de óxido de hierro y nanopartículas basadas en oro y platino.
Tal como se ha descrito con anterioridad, un agente mitocondrial combinado comprende una mitocondria y un agente, que están en contacto físico directo y/o indirecto entre sí. Por ejemplo, un agente puede estar unido a la mitocondria, adherido a la mitocondria, integrado en la membrana mitocondrial o total o parcialmente encerrado en la mitocondria. En algunos casos, un agente farmacéutico puede estar unido a la mitocondria de forma covalente. En algunos casos, el agente se une a los componentes de la membrana mitocondrial directamente a través de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace carboxamida y un enlace disulfuro), o de manera indirecta a través de un enlazador (por ejemplo, un enlazador péptido) u otro agente unido de manera covalente. En otros casos, un agente puede unirse a la mitocondria de forma no covalente, por ejemplo, mediante una interacción hidrofóbica, una interacción de Van der Waals y/o una interacción electrostática, etc.
En algunas formas de realización, un agente mitocondrial combinado puede comprender dos o más tipos diferentes de agentes, por ejemplo, dos tipos diferentes de agentes terapéuticos, tres tipos diferentes de agentes de obtención de imagen, un agente terapéutico y un agente de obtención de imagen, un agente terapéutico y un agente de diagnóstico, etc. Un experto en esta técnica apreciará que cualquier variación es posible.
Un enlazador particularmente útil para unir mitocondrias y un agente proporciona una liberación sostenida del agente tras la inyección. Esto puede lograrse, por ejemplo, utilizando un grupo funcional de hidrazona. Por ejemplo, se forma una hidrazona para unir de manera covalente un agente a constituyentes de la membrana mitocondrial. Una vez que este agente mitocondrial combinado es captado por las células, el cambio de pH causará la hidrólisis de la hidrazona, liberando el agente unido dentro de la célula.
En algunas formas de realización, un agente terapéutico, un agente de diagnóstico y/o un agente de obtención de imágenes pueden unirse a la membrana mitocondrial externa mediante química de superficie funcionalizada. En algunos casos, las químicas heterobifuncionales pueden vincular un agente terapéutico, un agente de diagnóstico y/o un agente de obtención de imágenes a la superficie mitocondrial y, una vez internalizados, estos agentes pueden liberarse mediante interacciones con esterasas intercelulares (por ejemplo, mediante la interacción con un acetoximetil éster) o mediante una estrategia de activación por luz UV o luz infrarroja cercana. Las estrategias de activación por luz UV y por luz infrarroja cercana se describen, por ejemplo, en Zhou et al., «Avances en el campo de la construcción de plataformas de administración de fármacos sensibles a la luz del infrarrojo cercano»,Journal of Nanoscience and Nanotechnology16.3 (2016): 2111-2125; Bansal et al., «Sistemas de administración de nanopartículas fotocontrolados para aplicaciones biomédicas»,Accounts of Chemical research47.10 (2014): 3052-3060; Barhoumi et al., «Administración de fármacos mediada por luz ultravioleta: Principios, aplicaciones y retos»,Journal of Controlled Release219 (2015): 31-42; y documento US20180057610A1.
Los profesionales expertos apreciarán que, en algunos casos, una composición descrita en el presente documento puede incluir más de un tipo de agente mitocondrial combinado. Por ejemplo, se incluyen composiciones que comprenden mitocondrias en las que esencialmente cada mitocondria está asociada con múltiples tipos de agentes. También se incluyen las composiciones que comprenden mitocondrias en las que cada mitocondria está emparejada con solamente un tipo de agente, pero en las que la composición comprende una mezcla de emparejamientos mitocondria/agente.
Métodos de elaboración de agentes mitocondriales combinados
Los profesionales expertos apreciarán que un agente puede unirse a las mitocondrias de cualquier número de maneras, por ejemplo, adhiriéndose a las mitocondrias, integrándose de manera parcial o completa en la membrana mitocondrial, encerrándose en las mitocondrias o encapsulándose dentro de las mitocondrias.
Sin pretender ceñirse a ninguna teoría ni a ningún enfoque concreto, se cree que la membrana externa de las mitocondrias es adherente y, por tanto, especialmente susceptible de combinarse con diversos agentes. En algunas formas de realización, los agentes farmacéuticos pueden adherirse a la membrana externa de las mitocondrias simplemente por incubación. Por ejemplo, una cantidad eficaz de agentes farmacéuticos puede mezclarse completamente con mitocondrias aisladas en un tampón, por ejemplo, un tampón de respiración, a una temperatura favorable para las mitocondrias aisladas, por ejemplo, de 0°C a 26°C, de 0°C a 4°C, o aproximadamente de 0°C, 4°C, 26°C. Este procedimiento es de utilidad para fijar una cantidad eficaz de agentes farmacéuticos (por ejemplo, nanopartículas, vectores de ADN, vectores de ARN) a las mitocondrias.
En algunas formas de realización, los cationes orgánicos (por ejemplo, la rodamina y la tetrametilrosamina) son retenidos con facilidad por las mitocondrias en funcionamiento debido al potencial eléctrico de la membrana mitocondrial. Las membranas mitocondriales sanas mantienen una diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior del orgánulo, denominada potencial de membrana. Este potencial de membrana es el resultado directo de los procesos funcionales mitocondriales y puede perderse si las mitocondrias no funcionan de manera correcta. Los cationes solubles en lípidos son retenidos por las mitocondrias como consecuencia de su carga positiva y de su solubilidad tanto en los lípidos de la membrana interna como en el espacio acuoso de la matriz. Del mismo modo, en algunas otras formas de realización, los aniones pueden unirse a la membrana externa de las mitocondrias debido a su carga negativa. Para unir mitocondrias con estos agentes farmacéuticos, una cantidad eficaz de agentes farmacéuticos debe mezclarse completamente con mitocondrias aisladas en un tampón, por ejemplo, un tampón de respiración, a una temperatura favorable para las mitocondrias aisladas, por ejemplo, aproximadamente 0°C o 4°C.
El agente terapéutico, de diagnóstico y/o de imagen puede unirse a fosfolípidos, péptidos o proteínas de la membrana mitocondrial mediante un enlace químico. Por ejemplo, moléculas que incluyen fluoróforos (pHrodo Red (Thermo Fisher Scientific, Inc.)) y partículas metálicas (por ejemplo, nanopartículas de óxido de hierro magnético de 30 nm (Sigma)) pueden unirse de manera covalente a grupos amina expuestos en proteínas y péptidos expuestos en la membrana exterior de mitocondrias intactas utilizando conjugados de ésteres de succinimidilo. Estos reactivos reaccionan con grupos aminos alifáticos no protonados, incluidos los extremos aminos de las proteínas y el grupo £-amino de los residuos de lisina, lo que crea un enlace carboxamida estable. En otro ejemplo, cuando el agente farmacéutico, por ejemplo, MitoTracker® Orange CMTMRos (Invitrogen, Carlsbad, Ca , ahora Thermo-Fisher Scientific, Cambridge, MA), se mezcla con mitocondrias funcionales, se oxida y posteriormente reacciona con los tioles de las proteínas y los péptidos de las mitocondrias para formar conjugados.
Existen numerosas moléculas químicas reactivas disponibles para unir agentes terapéuticos, de diagnóstico y/o de imagen a la superficie de las mitocondrias (por ejemplo, ácido carboxílico, amina funcionalizada, etc.).
Los agentes pueden fijarse mediante enlace proteínico, enlace amínico u otros métodos de fijación a la membrana mitocondrial externa o interna. De manera alternativa, o además, un agente puede fijarse a la membrana mitocondrial mediante interacción hidrofóbica, interacción de Van der Waals y/o interacción electrostática.
En muchos casos, los agentes terapéuticos, los agentes de diagnóstico y los agentes de obtención de imágenes pueden simplemente mezclarse con mitocondrias aisladas e incubarse en un tampón (por ejemplo, un tampón de respiración) durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, unos pocos minutos, 5 minutos, 10 minutos o 1 hora) en condiciones favorables (por ejemplo, de 0°C a 26°C, de 0°C a 4°C, o aproximadamente 0°C, 4°C, 26°C, pH 7,2~8,0).
Métodos a modo de ejemplo de preparación de agentes mitocondriales combinados se describen en McCully et al, Inyección de mitocondrias aisladas durante la reperfusión temprana para la cardioprotección, Am J Physiol 296, H94-H105. PMC2637784 (2009); y Masuzawa et al, Trasplante de mitocondrias de origen autólogo protege al corazón de la lesión por isquemia-reperfusión, Am J Physiol 304, H966-982. PMC3625892 (2013); y el documento US20180057610A1.
Composiciones para su uso en métodos de tratamiento
Las composiciones descritas en el presente documento incluyen métodos para el tratamiento de diversas enfermedades (por ejemplo, trastornos pulmonares, trastornos respiratorios), lesiones por isquemia de reperfusión y otras enfermedades diversas descritas en el presente documento. En general, los métodos incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende mitocondrias aisladas o un agente mitocondrial combinado, tal como se describe en el presente documento, a un sujeto que necesita, o que se ha determinado que necesita, dicho tratamiento. En algunas formas de realización, la composición se administra por vía respiratoria.
Tal como se utiliza en este contexto, «tratar» significa mejorar al menos un síntoma del trastorno (por ejemplo, falta de aliento, respiración rápida, bajo nivel de oxígeno en la sangre, insuficiencia pulmonar, insuficiencia respiratoria, insuficiencia cardiaca (por ejemplo, insuficiencia cardiaca derecha)). En algunas formas de realización, el tratamiento produce una mejora de las funciones pulmonares (por ejemplo, aumento del nivel de oxígeno en la sangre, reducción de la resistencia, reducción de la elastancia). En algunas formas de realización, las composiciones para uso aquí descritas pueden utilizarse para tratar la fibrosis pulmonar, la infección pulmonar (por ejemplo, por coronavirus), el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la embolia pulmonar, el cáncer de pulmón, la hipertensión pulmonar o la linfangioleiomiomatosis. En algunas formas de realización, las composiciones de uso aquí descritas pueden utilizarse para tratar la neumonía.
Los términos «sujeto» y «paciente» se utilizan indistintamente a lo largo de la especificación y describen a un animal, humano o no humano, al que se proporciona un tratamiento según los métodos de la presente invención. La presente invención contempla aplicaciones veterinarias y no veterinarias.
Un paciente humano puede ser un adulto o un niño, tal como un recién nacido. Por ejemplo, el sujeto humano puede tener al menos o aproximadamente 60 años, por ejemplo, al menos aproximadamente 65 años, 70 años, 75 años o al menos o aproximadamente 80 años. El sujeto humano puede tener menos o aproximadamente 18 años, por ejemplo, 15 años, 10 años, 9 años, 8 años, 7 años, 6 años, 5 años, 4 años, 3 años, 2 años, o menos o aproximadamente 1 año.
Además de los humanos, los sujetos pueden incluir, pero no limitarse a, no humanos, por ejemplo, ratones, ratas, hámsters, cobayas, conejos, hurones, gatos, perros y primates. Se incluyen, por ejemplo, primates no humanos (p. ej., mono, chimpancé, gorila y similares), roedores (p. ej., ratas, ratones, jerbos, hámsteres, hurones, conejos), lagomorfos, cerdos (p. ej., cerdo, cerdo miniatura), equinos, caninos, felinos, bovinos y otros animales domésticos, de granja y de zoológico.
La administración de las composiciones aquí descritas puede realizarse por diversos medios, por ejemplo, administración intravenosa, intradérmica, subcutánea, transdérmica (tópica), transmucosa, rectal, nasal, instilación nasal, insuflación (por ejemplo, aerosoles nasales), inhalación (a través de la nariz o de la boca), administración intrapulmonar, administración intratraqueal, inyección intraperitoneal, infusión o cualquier combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la composición se administra a través de las vías respiratorias.
En un aspecto, las mitocondrias aisladas y/o los agentes mitocondriales combinados pueden administrarse a los pulmones o al corazón para disminuir el aturdimiento y permitir el destete de los órganos tras una intervención quirúrgica (por ejemplo, cirugía pulmonar o cardíaca). En algunas formas de realización, las composiciones para uso en métodos implican administrar mitocondrias aisladas y/o agentes mitocondriales combinados a través de las vías respiratorias.
En un aspecto, las mitocondrias aisladas y/o los agentes mitocondriales combinados pueden administrarse en los oídos, los ojos, la piel (por ejemplo, para reducir las arrugas) o la cabeza (por ejemplo, para la calvicie).
Las composiciones aquí descritas pueden administrarse a un sujeto como un tratamiento único y singular o, de manera alternativa, como tratamientos múltiples, por ejemplo, un ciclo de tratamiento que continúe de forma intermitente o continua durante aproximadamente 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 o 60 días, un año, indefinidamente o hasta que un profesional sanitario determine que la administración de las mitocondrias o del agente mitocondrial combinado ya no es necesaria.
Las mitocondrias aisladas y/o los agentes mitocondriales combinados pueden administrarse a un sujeto cada vez como una dosis única o como una dosis múltiple administrada cada 5 minutos o a las 12-24 horas. En algunas formas de realización, las mitocondrias aisladas o los agentes mitocondriales combinados pueden administrarse a un sujeto cada 5 a 10 minutos (por ejemplo, cada 5 minutos, cada 10 minutos).
Conviene señalar que, en algunos casos, los efectos de las mitocondrias dependen de la duración del período de tiempo entre el momento del aislamiento y el momento de la utilización. De este modo, en algunos casos, las mitocondrias están recién aisladas y son viables. Las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados pueden administrarse a un sujeto dentro de aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 70 minutos, aproximadamente 80 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 100 minutos, aproximadamente 110 minutos, aproximadamente 120 minutos después de aislar las mitocondrias. En algunos casos, las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados se administran a un sujeto dentro de aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 70 minutos, aproximadamente 80 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 100 minutos, aproximadamente 110 minutos, aproximadamente 120 minutos después de iniciar el proceso de aislamiento de las mitocondrias. En algunos casos, las mitocondrias y/o los agentes mitocondriales combinados pueden almacenarse durante un breve periodo de tiempo (por ejemplo, aproximadamente 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos o 60 minutos) antes de su uso.
También conviene señalar que, en algunos casos, las mitocondrias congeladas-descongeladas no son viables y no son eficaces para determinados tratamientos descritos en el presente documento, por ejemplo, el tratamiento de lesiones por isquemia/reperfusión. De este modo, en algunos casos, las mitocondrias no se congelan y descongelan tras su aislamiento a partir de tejidos y/o células.
En algunas formas de realización, las composiciones para uso en los métodos aquí descritos pueden utilizarse para tratar trastornos asociados con los pulmones, los oídos, los ojos, la piel, el cuero cabelludo. Por ejemplo, las composiciones para uso en los métodos aquí descritos pueden utilizarse para tratar cánceres, arrugas (por ejemplo, arrugas en la piel) o calvicie. En algunos casos, las composiciones para uso en los métodos aquí descritos para mejorar las funciones de diversos tejidos y órganos (por ejemplo, pulmones, oídos, ojos, piel).
Administración a través de las vías respiratorias
El moco (de 1 a 10 gm de espesor) que recubre el epitelio pulmonar y el surfactante que recubre los alvéolos (de 0,1 a 0,2 gm de espesor) constituyen barreras físicas a la absorción pulmonar de partículas extrañas. Además, las proteasas y peptidasas asociadas a la membrana (epitelial y endotelial) e intracelulares (macrófagos, linfocitos, neutrófilos y mastocitos) degradan con facilidad los péptidos y proteínas administrados (Agu et al., «El pulmón como vía de administración sistémica de proteínas y péptidos terapéuticos». Investigación respiratoria 2.4 (2001): 198). También se ha demostrado que los macrófagos pulmonares segregan o liberan peroxidasas de vida corta, mediadores inflamatorios e inmunomoduladores (incluidos el factor estimulante de colonias de granulocitos, las interleucinas, los leucotrienos y las proteasas) y otras moléculas como parte de un mecanismo de defensa del huésped.
No obstante, la presente invención demuestra que la administración de una composición que comprenda mitocondrias o agentes mitocondriales combinados a través de las vías respiratorias puede promover de manera eficaz la función pulmonar, reducir la resistencia pulmonar, reducir la elastancia pulmonar, reducir la zona isquémica y/o reducir el edema y el daño celular en los pulmones.
Las composiciones aquí descritas pueden administrarse a través de las vías respiratorias por diversos medios, por ejemplo, administración nasal, instilación nasal, insuflación (por ejemplo, aerosoles nasales), inhalación (a través de la nariz o la boca), administración intrapulmonar, administración intratraqueal o cualquier combinación de las mismas. Tal como se utiliza en el presente documento, el término «instilación nasal» se refiere a un procedimiento que administra un agente terapéutico directamente en la nariz y sobre las membranas nasales, en donde una parte del agente terapéutico puede atravesar la tráquea y se administra en el pulmón.
Debido a la funcionalidad ocasionalmente limitada de los pulmones que necesitan tratamiento, un agente terapéutico a veces no puede administrarse de manera eficaz en los lugares objetivo de los pulmones (por ejemplo, bronquiolos o alvéolos) mediante la administración en las vías respiratorias. En estos casos, puede administrarse en primer lugar al sujeto un agente capaz de despejar las vías respiratorias. En algunas formas de realización, estos agentes pueden inducir la dilatación de las vías bronquiales y/o la vasodilatación muscular. Dichos agentes incluyen, pero no se limitan a, agonistas de los receptores adrenérgicos beta2, agentes anticolinérgicos, corticosteroides. En algunas formas de realización, puede utilizarse un agente para el tratamiento del asma.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a través de las vías respiratorias pueden incluir, por ejemplo, soluciones líquidas, soluciones acuosas (cuando sean solubles en agua) o dispersiones, etc. En algunas formas de realización, estas composiciones pueden comprender uno o más tensioactivos.
Tal como se utiliza en este documento, el término «vías respiratorias» se refiere a los conductos de aire desde la nariz hasta los alvéolos pulmonares, incluyendo la nariz, la garganta, la faringe, la laringe, la tráquea, los bronquios y cualquier parte de los pulmones. En algunas formas de realización, la composición se administra a los pulmones o a cualquier parte del sistema respiratorio.
En algunas formas de realización, las composiciones pueden administrarse a un sujeto mediante un sistema de administración que pueda convertir la composición en una forma de aerosol, por ejemplo, un nebulizador, un vaporizador, un pulverizador nasal, un inhalador, un inhalador de niebla suave, un nebulizador de chorro, un nebulizador de ondas ultrasónicas, un inhalador dosificador presurizado, un inhalador dosificador presurizado activado por la respiración o un dispositivo de malla vibratoria. Tal como se utiliza en este documento, el término «inhalador» se refiere a un dispositivo para administrar composiciones en forma de aerosol o polvo seco que se inhala (se respira de forma natural o se fuerza mecánicamente hacia los pulmones) a través de la nariz o la boca. En algunas formas de realización, los inhaladores incluyen, por ejemplo, un ventilador pasivo o activo (mecánico con o sin tubo endotraqueal), un nebulizador, un inhalador de polvo seco, un inhalador dosificador y un inhalador dosificador presurizado. Una vez que las mitocondrias se depositan o localizan cerca de las células, un subconjunto de las mitocondrias puede ser captado por las células.
En algunas formas de realización, los dispositivos pueden utilizar aire (por ejemplo, oxígeno, aire comprimido) o energía ultrasónica para romper las soluciones y suspensiones en pequeñas partículas de aerosol (por ejemplo, gotículas) que pueden inhalarse directamente desde la boquilla del dispositivo. En algunas formas de realización, los dispositivos utilizan una malla/membrana con orificios perforados con láser (por ejemplo, de 1000 a 7000 orificios) que vibra en la parte superior del depósito de líquido y, de este modo, presiona una niebla de gotículas muy finas a través de los orificios.
El sistema de suministro también puede tener un sistema de suministro de dosis unitaria. El volumen de solución o suspensión suministrado por dosis puede ser cualquiera desde aproximadamente 5 a aproximadamente 2000 microlitros, de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 microlitros, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 microlitros. Los sistemas de administración para estas diversas formas de dosificación pueden ser frascos cuentagotas, unidades exprimibles de plástico, atomizadores, nebulizadores o aerosoles farmacéuticos en envases de dosis unitaria o de dosis múltiple.
En algunas formas de realización, el dispositivo es una botella pequeña y dura a la que se acopla un pulverizador de dosis medida. La dosis medida puede administrarse introduciendo la composición en una cámara de volumen definido, cuya cámara tiene una abertura dimensionada para aerosolizar y obtener la formulación del aerosol formando una pulverización cuando se comprime un líquido en la cámara. La cámara se comprime para administrar la composición. En algunos dispositivos, la cámara es una disposición de pistón. Dichos dispositivos están disponibles comercialmente.
Como alternativa, puede utilizarse un frasco exprimible con una abertura o abertura dimensionada para aerosolizar una formulación en aerosol formando una pulverización cuando se aprieta. La abertura se encuentra normalmente en la parte superior del frasco, y la parte superior es por lo general cónica para encajar parcialmente en los conductos nasales para una administración eficaz de la formulación en aerosol. Preferiblemente, el inhalador nasal puede proporcionar una cantidad medida de la formulación en aerosol, para la administración de una dosis medida del agente terapéutico.
En algunas formas de realización, la aerosolización de una formulación líquida para su inhalación en el pulmón implica un propulsor. El propulsor puede ser cualquier propulsor por lo general utilizado en la técnica. Ejemplos específicos no limitantes de dichos propulsores útiles son un clorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono o un hidrocarbono, incluyendo trifluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y el 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos.
La presente invención también proporciona formulaciones en aerosol y formas de dosificación para su uso en el tratamiento de sujetos con diversas enfermedades pulmonares. En general, dichas formas de dosificación contienen el agente terapéutico en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables en dichas formulaciones en aerosol incluyen, pero no se limitan a, agua estéril, solución salina, solución salina tamponada, solución de dextrosa y similares. En ciertas formas de realización, un diluyente que puede utilizarse en la presente invención o en la formulación farmacéutica es la solución salina tamponada con fosfato o una solución salina tamponada por lo general entre el intervalo de pH 7,0-8,0 (por ejemplo, pH 7,4), o agua.
La formulación en aerosol también puede incluir de manera opcional portadores farmacéuticamente aceptables, diluyentes, agentes solubilizantes o emulsionantes, tensioactivos y excipientes.
La formulación puede incluir un portador. El portador es una macromolécula que es soluble en el sistema circulatorio y que es fisiológicamente aceptable, en donde la aceptación fisiológica significa que los expertos en esta técnica aceptarían la inyección de dicho portador en un paciente como parte de un régimen terapéutico. De manera preferible, el portador es relativamente estable en el sistema circulatorio con una semivida plasmática aceptable para su eliminación. Dichas macromoléculas incluyen, pero no se limitan a, la lecitina de soja, el ácido oleico y el trioleato de sorbitán.
Las formulaciones también pueden incluir otros agentes útiles para el mantenimiento del pH, la estabilización de la solución o la regulación de la presión osmótica. Algunos ejemplos de estos agentes son, pero no se limitan a, las sales, tales como el cloruro sódico o el cloruro potásico, y los hidratos de carbono, tales como la glucosa, la galactosa o la manosa, y similares.
La presente invención se refiere, además, a formulaciones en aerosol que comprenden la composición aquí descrita y otro agente terapéuticamente eficaz.
En algunas formas de realización, la composición puede administrarse en los vasos sanguíneos. La sangre puede transportar las mitocondrias o el agente mitocondrial combinado a un lugar objetivo, por ejemplo, un órgano, un tejido o una zona lesionada. Por ejemplo, los vasos sanguíneos pulmonares (p. ej., las venas pulmonares) pueden transportar las mitocondrias o el agente mitocondrial combinado al pulmón. En algunos casos, la composición aquí descrita puede utilizarse para mejorar la función del pulmón, los oídos, los ojos y la piel.
En algunas formas de realización, las composiciones se administran por vía respiratoria oral o nasal para un efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes farmacéuticamente aceptables pueden nebulizarse mediante el uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas pueden inhalarse directamente desde el dispositivo nebulizador o este último puede acoplarse a una mascarilla facial o a una máquina respiratoria de presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, suspensión o polvo pueden administrarse, por vía oral o nasal, desde dispositivos que administren la formulación de forma adecuada. Para la administración por inhalación, las composiciones pueden administrarse en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador a presión que contenga un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como el dióxido de carbono, o un nebulizador. Dichos métodos incluyen los descritos en las patentes de EE.UU. n.° 6.468.798; patentes de EE.UU. n.° 6.695.227; patentes de EE.UU. n.° 7.431.222; US20050224608.
De este modo, en algunas formas de realización, la composición aerosolizada puede administrarse a las vías respiratorias, los pulmones, los oídos, los ojos, el conducto nasal, el recto, la piel y la cabeza. En algunas formas de realización, la composición se administra a los pulmones, el conducto nasal, el recto, el intestino, la piel y los ojos para tratar cánceres o tumores en estos lugares.
En algunas formas de realización, la composición se administra a través de un pulverizador dosificador, un envase exprimible, un inhalador dosificador presurizado, un respirador o una máscara facial y una carpa de nebulización. Los sistemas de administración en aerosol, tales como el inhalador de dosis medida presurizado y el inhalador de polvo seco, se describen en Newman, S. P., Aerosols and the Lung, Clarke, S. W. y Davia, D. Editors, páginas 197-22. El paciente también puede inhalar la composición a través de un ventilador, que se ajustará a un caudal basado en la comodidad y en las necesidades del paciente. Esto se determina mediante gráficos pulmonares (es decir, frecuencia respiratoria, volúmenes corrientes, etc.). La composición también puede prepararse para permitir su inhalación por el paciente mediante una mascarilla o una carpa de nebulización. En ciertos casos, la composición puede envasarse en un dispositivo portátil (por ejemplo, un dispositivo inhalador portátil) y administrarse en una dosis medida, por ejemplo, para permitir el tratamiento intermitente de un receptor que no se encuentre en un entorno hospitalario. Los envases pueden contener diferentes concentraciones de la composición.
Una forma conveniente de administrar de manera eficaz la composición a los alvéolos es seleccionar un nebulizador que produzca partículas suficientemente pequeñas (por ejemplo, que produzca partículas con un diámetro medio de partícula inferior a 5,0 micras (pm), más preferiblemente que tengan un diámetro medio de partícula de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 4,0 pm, y más preferiblemente que tengan un diámetro medio de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 2 pm). Como alternativa a la selección de diámetros medios de partícula pequeños para lograr una deposición sustancial en los alvéolos, puede administrarse una dosis muy alta de la composición, con un diámetro medio de partícula mayor. En dicho enfoque, es beneficioso que la composición particular no sea demasiado irritante a la dosis requerida y que haya un número suficiente de partículas en la población total que tengan un diámetro en el margen de 0,5 a aproximadamente 5 pm para permitir la deposición en los alvéolos. Para la administración proximal en las vías respiratorias, el tamaño medio de las partículas puede ser mayor. Por ejemplo, los diámetros medios de partícula adecuados pueden ser por lo general inferiores a aproximadamentel 5 pm, por ejemplo, desde aproximadamente 4 pm a aproximadamente 15 pm, por ejemplo, de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 10 pm. La composición puede aerosolizarse mediante cualquier método apropiado. Para su uso con seres humanos u otros primates, el aerosol puede generarse mediante un sistema nebulizador médico que suministre el aerosol a través de una boquilla, mascarilla, etc., desde la que el paciente pueda aspirar el aerosol hacia los pulmones. Diversos nebulizadores son conocidos en la técnica y pueden utilizarse en el método aquí descrito. Véase, por ejemplo, patente de EE.UU n° 4.268.460; patente de EE.UU n° 4.253.468; patente de EE.UU n° 4.046.146; patente de EE.UU n° 3.826.255; patente de EE.UU n° 4.649.911; patente de EE.UU n° 4.510.829. La selección de un sistema nebulizador dependerá de si se desea una administración alveolar o a través de las vías respiratorias (es decir, tráquea, bronquios primarios, secundarios o terciarios, etc.).
Entre los ejemplos de nebulizadores útiles para la administración alveolar se incluyen el nebulizador Acorn 1 y el sistema de nebulización Respirgard II™, ambos disponibles comercialmente en Marquest Medical Products, Inc., Inglewood, Colo. Otros nebulizadores disponibles comercialmente para su uso con la presente invención incluyen el nebulizador UltraVent™ disponible en Mallinckrodt, Inc. (Maryland Heights, Mo.); el nebulizador Wright (Wright, B. M., Lancet (1958) 3:24-25); y el nebulizador DeVilbiss (Mercer et al., Am. Ind. HYR. Assoc. J. (1968) 29:66-78; T. T. Mercer, Chest (1981) 80:6 (Sup) 813-817). Entre los nebulizadores útiles para la administración en las vías respiratorias se encuentran los utilizados habitualmente en el tratamiento del asma. Dichos nebulizadores también están disponibles comercialmente. Un experto en esta técnica puede determinar la utilidad de un nebulizador concreto midiendo el tamaño medio de las partículas generadas por el mismo con, por ejemplo, un impactador en cascada Mercer de 7 etapas (Intox Products, Albuquerque, N. Mex.).
La cantidad total de la composición administrada al sujeto dependerá de diversos factores, tales como la cantidad total aerosolizada, el tipo de nebulizador, el tamaño de las partículas, los patrones de respiración del paciente, la gravedad de la enfermedad pulmonar y la concentración en la solución aerosolizada, así como la duración de la terapia de inhalación. La cantidad de composición medida en los alvéolos puede ser prácticamente inferior a la que cabría esperar a partir de la cantidad de composición presente en el aerosol, ya que una gran parte de la composición puede ser exhalada por el paciente o quedar atrapada en las superficies interiores del aparato nebulizador.
Los profesionales expertos podrán diseñar con facilidad protocolos eficaces, sobre todo si se optimiza el tamaño de las partículas del aerosol. En algunos casos, resulta útil administrar dosis más altas cuando se tratan afecciones más graves. En caso necesario, el tratamiento puede repetirse de forma puntual en función de los resultados obtenidos. Si se repite el tratamiento, puede vigilarse al huésped mamífero para asegurarse de que no se produce una respuesta inmunitaria adversa al tratamiento. La frecuencia de los tratamientos depende de diversos factores, tales como la cantidad de composición administrada por dosis, así como la salud y el historial del paciente. Tal como se utiliza en el presente documento, la «cantidad nebulizada» o «cantidad aerosolizada» de la composición significa la cantidad que sale realmente desde el aparato en forma de aerosol, es decir, la cantidad introducida en el aparato menos la cantidad retenida en el depósito y en las superficies interiores del aparato al concluir una sesión de tratamiento.
Trastornos pulmonares
Los agentes terapéuticos aquí descritos pueden utilizarse para tratar diversos trastornos pulmonares. El sujeto puede tener cualquier enfermedad pulmonar que pueda beneficiarse del tratamiento, por ejemplo, isquemia, lesión por perfusión, hipoplasia pulmonar, hernia diafragmática congénita (HDC), síndrome de Poland, enfermedades de la pared torácica (por ejemplo,pectus excavatum),neumonectomía, displasia broncopulmonar, lesión pulmonar y lesión por inhalación, asma, fibrosis quística, etc. Por ejemplo, el sujeto puede tener hipoplasia pulmonar. En algunas formas de realización, una cantidad eficaz de la composición que comprende mitocondrias aisladas puede administrarse al paciente, por ejemplo, a través de las vías respiratorias.
En algunas formas de realización, las composiciones para uso aquí descritas pueden utilizarse para tratar el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), la lesión pulmonar aguda (LPA), la insuficiencia respiratoria, la función respiratoria reducida y/o la inflamación pulmonar.
En algunas formas de realización, las composiciones para uso aquí descritas pueden utilizarse para tratar la fibrosis pulmonar, la infección pulmonar (por ejemplo, por virus, coronavirus, gripe, bacterias u hongos), el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la embolia pulmonar, el cáncer de pulmón, la hipertensión pulmonar o la linfangioleiomiomatosis. En algunas formas de realización, las composiciones para uso aquí descritas pueden utilizarse para tratar la neumonía.
En algunas formas de realización, puede identificarse que el paciente tiene un desarrollo pulmonar insuficiente, incompleto o lento. Alternativa o adicionalmente, el paciente puede tener algún daño en los pulmones. Por ejemplo, el paciente puede ser un fumador habitual o un trabajador expuesto con frecuencia a la inhalación de humo.
Tratamiento de las lesiones relacionadas con la isquemia
Las composiciones aquí descritas pueden utilizarse para tratar pulmones isquémicos. Por ejemplo, puede administrarse una cantidad eficaz de mitocondrias aisladas a través de las vías respiratorias. Las mitocondrias pueden ser internalizadas por las células de los pulmones.
La lesión por reperfusión es el daño tisular por aporte sanguíneo cuando la sangre vuelve al tejido tras un periodo de isquemia o falta de oxígeno. La ausencia de oxígeno y nutrientes durante el periodo isquémico causa inflamación y daño oxidativo cuando se restablece el flujo sanguíneo. La respuesta inflamatoria conduce, además, a la lesión por reperfusión en el tejido. Por ello, en algunos casos, el tratamiento también consiste en administrar inmunosupresores al paciente. Los inmunosupresores pueden administrarse, por ejemplo, por separado, pero como tratamiento concurrente con el agente mitocondrial. Como alternativa, o además, los inmunosupresores pueden unirse a las mitocondrias para formar un agente mitocondrial combinado, que puede utilizarse para el tratamiento. Los inmunosupresores particularmente útiles son los bifosfonatos.
En algunas formas de realización, el paciente padece una lesión pulmonar aguda (LPA). La lesión pulmonar aguda se asocia a menudo con insuficiencia respiratoria aguda e hipoxemia refractaria. En algunas formas de realización, el paciente tiene infiltrados pulmonares bilaterales que son consistentes con edema pulmonar en ausencia de hipertensión auricular izquierda. El ALI complica una amplia variedad de afecciones médicas y quirúrgicas y refleja la respuesta pulmonar a agresiones pulmonares o a factores precipitantes. La causa más frecuente de LPA es la lesión por isquemia/reperfusión (IRI). La IRI puede producirse con el intercambio extracorpóreo de gases, el bypass cardiopulmonar y la ventilación pulmonar y se ha demostrado que tiene profundos efectos sobre la función pulmonar y la viabilidad celular y que contribuye de manera significativa a aumentar la morbilidad y la mortalidad tanto en pacientes pediátricos como en adultos. Se ha estimado que la incidencia de LPA en pacientes adultos sometidos a cirugía cardiaca oscila entre el 53,8% y el 73,5%. En los pacientes pediátricos, la LPA está presente en el 8-10% de los pacientes que requieren ventilación mecánica. Tanto en los pacientes pediátricos como en los adultos, la LPA tiene una mortalidad estimada del 20-75%. En la actualidad, no existen metodologías viables para tratar la LPA que se produce por IRI con el objetivo de aumentar la supervivencia y la función pulmonar.
Las composiciones aquí descritas pueden utilizarse para tratar la ALI. Por ejemplo, puede administrarse una cantidad eficaz de composición aerosolizada que comprenda mitocondrias o agentes mitocondriales combinados a las vías respiratorias de un paciente. Por ejemplo, pueden administrarse en el pulmón aproximadamente 1x107 mitocondrias o al menos una cantidad igual. Las mitocondrias inyectadas son internalizadas por las células endoteliales y pueden proporcionar un mayor consumo de oxígeno, reducir la resistencia y elastancia pulmonares, aumentar la distensibilidad y/o reducir la zona isquémica.
Vasodilatación y flujo sanguíneo
Las composiciones para su uso en los métodos aquí descritos pueden aumentar de manera significativa el flujo sanguíneo sin alterar la presión arterial media ni la frecuencia cardíaca. La capacidad de aumentar el flujo sanguíneo sin aumentar la frecuencia cardíaca permite su uso clínico en lesiones de tipo anginoso y en lesiones relacionadas con la isquemia/reperfusión y en zonas con daño tisular en las que sería necesario aumentar el flujo sanguíneo y el aporte de oxígeno. De este modo, las composiciones para uso en los métodos aquí descritos pueden emplearse en intervenciones arteriales para eliminar coágulos u obstrucciones en los vasos sanguíneos.
Las composiciones para uso en los métodos aquí descritos también pueden emplearse para aumentar el flujo sanguíneo y/o el suministro de oxígeno a diversos órganos o tejidos (por ejemplo, el corazón o los pulmones), e inducir la dilatación vascular en los órganos. En algunos casos, las mitocondrias aisladas o los agentes mitocondriales combinados pueden utilizarse para disminuir la resistencia vascular en un órgano (por ejemplo, el corazón o los pulmones). Las mitocondrias aisladas o los agentes mitocondriales combinados pueden utilizarse para aumentar el flujo sanguíneo. Las mitocondrias aisladas y/o los agentes mitocondriales combinados pueden añadirse a un agente de contraste y utilizarse en la identificación y eliminación de obstrucciones en los órganos.
Conviene señalar que los efectos de las composiciones dependen del tiempo transcurrido desde el aislamiento hasta el momento de su utilización. Los efectos vasodilatadores disminuyen a medida que se prolonga el tiempo desde el aislamiento. Sin pretender ceñirnos a ninguna teoría, se plantea la hipótesis de que las mitocondrias recién aisladas tienen ciertas sustancias químicas que pueden aumentar el flujo sanguíneo. Por lo tanto, en algunas composiciones, las mitocondrias están recién aisladas y son viables. Por ejemplo, las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados se administran a un paciente dentro de aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 70 minutos, aproximadamente 80 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 100 minutos, aproximadamente 110 minutos, aproximadamente 120 minutos después del momento en que se inicia el proceso de aislamiento de las mitocondrias o después de aislarlas. En algunos casos, las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados se administran a un paciente en un plazo de entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente 60 minutos (por ejemplo, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 60 minutos) después del momento en que se inicia el proceso de aislamiento de las mitocondrias o después de aislarlas.
En algunos casos, no es deseable aumentar el flujo sanguíneo (por ejemplo, en el tratamiento de la isquemia/reperfusión pulmonar o en el tratamiento del cáncer). En estos casos, las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados pueden almacenarse durante un breve periodo de tiempo (por ejemplo, desde aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos) antes de su uso. Esta composición puede utilizarse para aumentar la viabilidad de los tejidos (por ejemplo, para tratar lesiones por isquemia/reperfusión) sin causar un aumento del flujo sanguíneo. En estos casos, las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados se administran a un paciente al menos aproximadamente 60 minutos (por ejemplo, aproximadamente 65 minutos, aproximadamente 70 minutos, aproximadamente 80 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 100 minutos, aproximadamente 110 minutos, aproximadamente 120 minutos) después del momento en que se inicia el proceso de aislamiento de las mitocondrias o después de aislarlas.
Obtención de imágenes
Los agentes de obtención de imágenes pueden adherirse a las mitocondrias, a menudo mediante la co-incubación de las mitocondrias con los agentes de obtención de imágenes. Dichos agentes de obtención de imágenes incluyen, pero no se limitan a, los fluoróforos MitoTracker y pHrodo de Thermo Fisher Scientific Inc, la 18F-Rodamina 6G y las nanopartículas de óxido de hierro.
Los agentes mitocondriales combinados que incluyen un agente de obtención de imagen pueden administrarse al paciente a través de las vías respiratorias. Los tejidos que contienen las mitocondrias marcadas pueden examinarse mediante técnicas de obtención de imágenes, tales como la tomografía por emisión de positrones (PET), la tomografía microcomputarizada (pCT) y la obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM), el microscopio de campo claro y la microscopía de superresolución tridimensional, etc. Los profesionales expertos en esta técnica apreciarán que puedan utilizarse otras técnicas o modalidades de obtención de imágenes. Entre ellas se incluyen, pero no se limitan a, los rayos X, la gammagrafía, la fluorescencia y los ultrasonidos.
La tomografía por emisión de positrones es una técnica de obtención de imágenes que produce una imagen tridimensional en el cuerpo, y puede emplearse en composiciones para su uso en los métodos aquí descritos. El sistema detecta pares de rayos gamma emitidos indirectamente por un radioisótopo emisor de positrones (trazador). A continuación, se construyen imágenes tridimensionales de la concentración del trazador en el organismo mediante análisis informático. Entre los grupos de trazadores útiles se encuentran los isótopos radiactivos, tales como 11C, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 68Ga, 81mKr, 82Rb, 86Y, 89Zr, 111In, 123I, 124I, 133Xe, 201Tl, 125I, 35S 14C, 3H. En algunas composiciones para su uso en métodos, las mitocondrias pueden etiquetarse con isótopos radiactivos, por ejemplo, 18F, o por moléculas que incorporan isótopos radiactivos, por ejemplo, 18F-Rodamina 6G, rodamina B marcada con 18F. Después de que las mitocondrias sean internalizadas por las células objetivo, puede emplearse la técnica de obtención de imágenes PET, o una técnica similar, para visualizar las células objetivo.
La obtención de imágenes por resonancia magnética es una técnica médica de obtención de imágenes de la anatomía y de los procesos fisiológicos del cuerpo y puede emplearse en composiciones para su uso en los métodos aquí descritos. En algunos casos, puede utilizarse en conjugación con algunas otras técnicas de obtención de imágenes, por ejemplo, la PET. Las imágenes adquiridas con ambos dispositivos pueden tomarse de manera secuencial, en la misma sesión, y combinarse en una única imagen superpuesta (corregistrada). Las exploraciones PET/MRI pueden utilizarse para diagnosticar un estado de salud en seres humanos y animales, por ejemplo, con fines de investigación, médicos y agrícolas.
La tomografía microcomputarizada utiliza rayos X para crear secciones transversales de un objeto físico que pueden utilizarse para recrear un modelo virtual sin destruir el objeto original, y puede emplearse en composiciones para su uso en los métodos aquí descritos. En algunos casos, se utiliza en conjugación con algunas otras técnicas de obtención de imágenes, por ejemplo, la PET. Las imágenes adquiridas con ambos dispositivos pueden tomarse de manera secuencial, en la misma sesión, y combinarse en una única imagen superpuesta (corregistrada). De este modo, las imágenes funcionales obtenidas por PET, que describen la distribución espacial de la actividad metabólica o bioquímica en el organismo, pueden alinearse o correlacionarse con mayor precisión con las imágenes anatómicas obtenidas por TC. La reconstrucción de imágenes bidimensionales y tridimensionales puede realizarse en función de un software y un sistema de control comunes.
La microscopía de iluminación estructurada tridimensional, 3D-SIM, o microscopía de superresolución tridimensional, permite una visualización tridimensional completa de las estructuras del interior de las células y puede emplearse en las composiciones para su uso en los métodos aquí descritos. La microscopía de iluminación estructurada es un método de obtención de imágenes capaz de duplicar la resolución espacial de la microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional mediante el uso de luz de iluminación estructurada espacialmente. Mejora la resolución espacial recogiendo información del espacio de frecuencias fuera de la zona observable.
Las composiciones descritas para su uso en métodos, es decir, composiciones para su uso en métodos que incluyen la administración de mitocondrias y/o agentes mitocondriales combinados, son de utilidad para diagnosticar diversas enfermedades, tales como cánceres, (por ejemplo, cáncer de pulmón, cerebro, páncreas, melanoma, próstata, colon), enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, infarto de miocardio, aterosclerosis), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple, diabetes, síndrome del intestino irritable, celiaquía, enfermedad de Crohn) y enfermedades inflamatorias.
Las composiciones para su uso en métodos que utilizan agentes para la obtención de imágenes son bien conocidas en esta técnica y se describen, por ejemplo, en Bartholoma et al., Caracterización biológica de la Rodamina B marcada con F18, un posible trazador de perfusión para tomografía por emisión de positrones, Nucl Med Biol 40, 1043-1048, PMC3820364 (2013); Bartholoma et al, Rodaminas marcadas con 18F como posibles agentes de perfusión miocárdica: comparación de las propiedades farmacocinéticas de varias Rodaminas, Nucl Med Biol 42, 796-803, PMC4567415 (2015); y Pacak et al., Las nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro funcionan como una etiqueta de imagen multimodal a largo plazo para el seguimiento no invasivo de células progenitoras implantadas, PLoS ONE 9, e108695, PMC4177390 (2014).
Administración de fármacos
La presente especificación proporciona composiciones para su uso en métodos de administración de agentes farmacéuticos, por ejemplo, a células y/o tejidos de un paciente. Las mitocondrias son absorbidas por las células de los tejidos a través de un proceso de internalización dependiente de actina, proporcionando de este modo una forma de administrar agentes farmacéuticos directamente a las células. En algunos casos, los agentes mitocondriales combinados entran en los tejidos pulmonares o en los vasos sanguíneos a través de las vías respiratorias.
Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígenos puede enlazarse o unirse a las mitocondrias. Los profesionales expertos apreciarán que vincular el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno a las mitocondrias o al agente mitocondrial combinado puede permitir que las mitocondrias o el agente mitocondrial combinado se dirijan a lugares específicos, por ejemplo, a células y/o tejidos objetivo. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno están diseñados para dirigirse a tipos celulares específicos, por ejemplo, células musculares lisas del pulmón, células inmunitarias, macrófagos, etc.
En algunas formas de realización, la presente invención proporciona composiciones para su uso en métodos de administración de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, miARN), un vector, un péptido o una proteína a un lugar objetivo (por ejemplo, tejido pulmonar). Las mitocondrias aisladas pueden utilizarse como portadoras para introducir un ácido nucleico o un péptido en una célula. En algunos casos, los agentes mitocondriales combinados que incluyen polímeros de ácido nucleico pueden administrarse a un paciente para sustituir un gen mutado en el paciente que causa la enfermedad, para inactivar, o «noquear», un gen mutado, o para introducir un nuevo gen en el paciente. Los polímeros de ácido nucleico, a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, ADN de doble cadena, ADN de cadena sencilla, ARN de doble cadena, ARN de cadena sencilla o moléculas de ácido nucleico de triple hélice. En algunos casos, los polímeros de ácido nucleico son ADN, ARN de interferencia (siARN) y microARNs.
Minimización de la cardiotoxicidad
La quimioterapia es un tratamiento común para diversos tipos de cáncer, sin embargo, también causa varias complicaciones graves. La cardiotoxicidad inducida por la quimioterapia es una complicación que limita el uso clínico de los agentes quimioterapéuticos. Ciertos agentes quimioterapéuticos, tales como las antraciclinas, son muy eficaces contra las leucemias linfoblásticas y mieloblásticas agudas, pero son especialmente dañinos para el corazón debido a sus efectos sobre las mitocondrias. El daño a las mitocondrias conduce, además, a la cardiotoxicidad inducida por la quimioterapia. Angsutararux et al., Cardiotoxicidad inducida por la quimioterapia: Visión general de las funciones del estrés oxidativo. Oxid Med Cell Longev. 2015;2015:795602. doi: 10.1155/2015/795602 (2015); Guo et al., Toxicidades cardiovasculares del tratamiento sistémico del cáncer de mama, Front Oncol. 4:346. doi: 10.3389/fonc.2014.00346. eCollection (2014).
La presente invención proporciona composiciones para su uso en métodos para minimizar la cardiotoxicidad inducida por la quimioterapia. Los métodos consisten en administrar una cantidad eficaz de mitocondrias aisladas y/o un agente mitocondrial combinado a un paciente por vía respiratoria. Si el paciente necesita ser tratado con quimioterapia (por ejemplo, por prescripción de un médico o veterinario), el paciente puede ser tratado con mitocondrias y/o un agente mitocondrial combinado, antes, durante y/o después de la administración de la quimioterapia. Por ejemplo, los pacientes pueden ser tratados con mitocondrias y/o un agente mitocondrial combinado comenzando inmediatamente después de la administración, como tratamiento singular o continuando de forma intermitente o continua durante aproximadamente 1,2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 o 60 días, un año, indefinidamente o hasta que un médico determine que la administración de las mitocondrias y/o el agente mitocondrial combinado ya no es necesaria.
Tratamiento del cáncer
Las composiciones para su uso en los métodos descritos en el presente documento también permiten el tratamiento de cánceres (por ejemplo, cánceres de pulmón). Tras administrar al paciente de las composiciones aquí descritas a través de las vías respiratorias, las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados pueden ser captados por las células tumorales. En algunas formas de realización, se puede administrar un agente citostático o citotóxico al tumor para destruir las células cancerosas. En algunas formas de realización, el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico, por ejemplo, una antraciclina.
Los cánceres que pueden tratarse con las composiciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, el cáncer de boca/faringe, el cáncer de esófago, el cáncer de laringe, el cáncer de pulmón o cualquier cáncer del tracto respiratorio.
Además, en algunas formas de realización, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno puede unirse o adherirse a las mitocondrias. Los profesionales expertos apreciarán que vincular el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno a mitocondrias o a agentes mitocondriales combinados puede permitir que las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados se dirijan a lugares específicos, por ejemplo, a células y/o tejidos objetivo. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno están diseñados para dirigirse a tipos celulares específicos, por ejemplo, células cancerosas.
Dosificación
Una «cantidad eficaz» es una cantidad suficiente para conseguir los resultados beneficiosos o deseados. Por ejemplo, una cantidad terapéutica es aquella que consigue el efecto terapéutico deseado. Esta cantidad puede ser igual o diferente de una cantidad profilácticamente eficaz, que es una cantidad necesaria para prevenir la aparición de la enfermedad o de los síntomas de la enfermedad. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o varias administraciones, aplicaciones o dosis. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico (es decir, una dosis eficaz) depende de los agentes terapéuticos seleccionados. Las composiciones pueden administrarse desde una o varias veces al día hasta una o varias veces a la semana; incluso una vez cada dos días. El experto en esta técnica apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el momento requeridos para tratar de manera eficaz a un paciente, incluyendo, pero no limitándose a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del paciente, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un paciente con una cantidad terapéuticamente eficaz de los agentes terapéuticos aquí descritos puede incluir un tratamiento único o una serie de tratamientos.
La dosis, la toxicidad y la eficacia terapéutica de los agentes terapéuticos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren los agentes que presentan índices terapéuticos elevados. Aunque se pueden utilizar agentes que presenten efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado de diseñar un sistema de administración que dirija dichos agentes al lugar del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, de este modo, reducir los efectos secundarios. La forma de estimar un intervalo seguro para un paciente humano se describe, por ejemplo, en Food and Drug Administration, «Guía para la industria: estimación de la dosis inicial máxima segura en ensayos clínicos iniciales de terapias en voluntarios adultos sanos». Centro de Evaluación e Investigación de Medicamentos (CDER) (2005).
Los datos obtenidos de los ensayos en cultivos celulares y los estudios en animales pueden utilizarse en la formulación de un margen de dosificación para su uso en humanos. La dosificación de dichos agentes se encuentra preferiblemente dentro de un margen de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este margen dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier agente empleado en las composiciones de uso aquí descritas, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Dicha información puede utilizarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Los profesionales expertos apreciarán que la cantidad de mitocondrias y/o agentes mitocondriales combinados, por ejemplo, composiciones que comprenden mitocondrias y/o agentes mitocondriales combinados, que debe administrarse a un paciente variará en función de, por ejemplo, el tipo de trastorno a tratar, la vía de administración, la duración del tratamiento, el tamaño de una zona a tratar y/o la ubicación del lugar de tratamiento en la paciente, entre otros factores. Los profesionales cualificados podrán determinar las dosis a administrar en función de estas y otras variables. Por ejemplo, podrá administrarse a un paciente un total de aproximadamente 1 x 1010 a 1 x 1014 de mitocondrias (por ejemplo, para tratar una isquemia localizada en los pulmones). En el caso de lesiones focales pequeñas, pueden administrarse al paciente de 1 x 103 a 1 x 106 mitocondrias. Por lo tanto, una cantidad eficaz de mitocondrias o agentes mitocondriales combinados (o composiciones que los contengan) es la cantidad total de mitocondrias o agentes mitocondriales combinados suficiente para causar un efecto terapéutico deseado. Una cantidad eficaz puede ser, por ejemplo, al menos o aproximadamente 1 x 102 mitocondrias o agentes mitocondriales combinados, por ejemplo, desde aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1014, desde aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 1013, desde aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 1012, desde aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1011, desde aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1010, desde aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 107, desde aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 106, desde aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1014, desde aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1013, desde aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1012, desde aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 108; o al menos o aproximadamente 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x1011, 1 x 1012, 1 x 1013, o al menos o aproximadamente 1 x 1014, o, por ejemplo, una cantidad superior a 1 x1014. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término «cantidad total» en el contexto de la administración a un paciente puede referirse a la cantidad total de mitocondrias o agentes mitocondriales combinados en una única administración o en múltiples administraciones, en función del régimen de dosificación que se lleve a cabo.
Composiciones farmacéuticas
La invención proporciona composiciones que comprenden mitocondrias aisladas, composiciones que comprenden agentes mitocondriales combinados, composiciones que comprenden tanto mitocondrias aisladas como agentes mitocondriales combinados, y composiciones para su uso en métodos.
Una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede incluir mitocondrias y/o agentes mitocondriales combinados y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en este documento, la expresión «portador farmacéuticamente aceptable» incluye una solución salina, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. En algunas formas de realización, el portador farmacéuticamente aceptable es una solución salina tamponada con fosfato, solución salina, tampón de Krebs, solución de Tyrode, medio de contraste u omnipaque, o una mezcla de los mismos. En algunas formas de realización, el portador farmacéuticamente aceptable es un tampón mitocondrial estéril (300 mM de sacarosa; 10 mM de K+-HEPES ((ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinaetanosulfónico, tamponado con potasio, de pH 7,2); 1 mM de K+-EGTA, (ácido etilenglicol tetraacético, tamponado con potasio, de pH 8,0)). En algunas formas de realización, el portador farmacéuticamente aceptable es el tampón de respiración (250 mM de sacarosa, 2 mM de KH2PO4, 10 mM de MgCl2, 20 mM de tampón K-HEPES (pH 7,2) y 0,5 mM de K-EGTA (pH 8,0)).
Las composiciones farmacéuticas suelen formularse para que sean compatibles con su vía de administración prevista.
Una composición farmacéutica puede formularse para diversos usos clínicos, por ejemplo, la obtención de imágenes, el tratamiento de heridas, el tratamiento de lesiones, la conservación de órganos, la mejora de las funciones mitocondriales en órganos o tejidos y el cuidado de la piel. En algunos casos, el portador farmacéuticamente aceptable es un agente de contraste para la obtención de imágenes. En algunas formas de realización, la composición farmacéutica puede incluir agentes antisépticos, agentes antibacterianos (por ejemplo, antibióticos), agentes antifúngicos, desinfectantes, agentes analgésicos, agentes anestésicos, esteroides, suplementos nutricionales, aceites etéreos, etc. Un agente anestésico es un fármaco que puede evitar el dolor durante una intervención quirúrgica o un tratamiento. Los agentes analgésicos, a modo de ejemplo, incluyen, sin limitación, el paracetamol, los antiinflamatorios no esteroideos, los salicilatos, el ibuprofeno y la lidocaína. Los agentes antibacterianos a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, el alcohol diclorobencílico, el amilmetacresol y los antibióticos. Los antibióticos a modo de ejemplo incluyen, penicilinas carbapenémicas, cefalosporinas aminoglucósidas, bacitracina, gramicidina, mupirocina, cloranfenicol, tiamfenicol, lincomicina, clindamicina, macrólidos, novobiocina, polimixinas, rifamicinas, espectinomicina, tetraciclinas, vancomicina, teicoplanina, estreptograminas, agentes antifólicos, sulfonamidas, trimetoprima, pirimetamina, nitrofuranos, mandelato de metenamina, hipurato de metenamina, nitroimidazoles, quinolonas, fluoroquinolonas, isoniazida, etambutol, pirazinamida, ácido para-aminosalicílico, cicloserina, capreomicina, etionamida, protionamida, tiacetazona y viomicina. Los agentes antisépticos son sustancias antimicrobianas que pueden aplicarse a tejidos vivos/piel para reducir la posibilidad de infección, sepsis o putrefacción. Los antisépticos, a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, la clorhexidina y sus sales, el benzalconio y sus sales, el triclosán y el cloruro de cetilpiridio. Los agentes antifúngicos, a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, tolnaftato, miconazol, fluconazol, clotrimazol, econazol, ketoconazol, itraconazol, terbinafina, anfotericina, nistatina y natamicina. Los esteroides, a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, acetato de prednisona, valerato de prednisona, prednisolona, dipropionato de alclometasona, acetónido de fluocinolona, dexametasona, metilprednisolona, desonida, pivolato, pivolato de clocortolona, acetónido de triamcinolona, prednicarbato, propionato de fluticasona, flurandrenolida, furoato de mometasona, desoximetasona, betametasona, dipropionato de betametasona, valerato de betametasona, propionato de betametasona, benzoato de betametasona, diacetato de diflorasona, fluocinonida, halcinonida, amcinonida, propionato de halobetasol y propionato de clobetasol. Los suplementos nutricionales, a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, vitaminas, minerales, productos herbales y aminoácidos. Las vitaminas incluyen, sin limitación, la vitamina A, las de la familia de la vitamina B, la vitamina C, las de la familia de la vitamina D, la vitamina E y la vitamina K. Los aceites etéreos incluyen, sin limitación, los derivados de la menta, la salvia, el abeto, la lavanda, la albahaca, el limón, el enebro, el romero, el eucalipto, la caléndula, la manzanilla, el naranjo y similares. Muchos de estos agentes se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008152626.
Las composiciones que comprenden mitocondrias y/o agentes mitocondriales combinados pueden formularse en cualquier forma, por ejemplo, líquidos, semisólidos o sólidos. Las composiciones, a modo de ejemplo incluyen, líquidos, cremas, ungüentos, bálsamos, aceites, emulsiones, formulaciones liposomales, entre otros.
Las mitocondrias aisladas o los agentes mitocondriales combinados pueden incluirse en composiciones diseñadas para su uso en el trasplante de órganos, tejidos o células. La composición puede incluir mitocondrias aisladas y/o agentes mitocondriales combinados y un líquido adecuado para su administración a pacientes y/o órganosin situoex vivo,por ejemplo, para el mantenimiento de órganos, tejidos o célulasex vivo.En general, el líquido será una solución acuosa. Algunos ejemplos de soluciones son la solución salina tamponada con fosfato (PBS), la solución Celsior™, la solución Perfadex™, la solución Collins, la solución de citrato, los medios de cultivo de tejidos (por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)), la solución de histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK) y la solución de la Universidad de Wisconsin (UW) (Oxford Textbook of Surgery, Morris y Malt, Eds., Oxford University Press, 1994).
La solución de conservación en frío de la Universidad de Wisconsin se considera una solución estándar para el trasplante de órganos. Incluye lo siguiente: 100 mM de lactobionato de potasio, 25 mM KH2PO4, 5 mM MgSO4, 30 mM de rafinosa, 5 mM de adenosina, 3 mM de glutationa, 1 mM de alopurinol y 50 g/L de hidroxietilalmidón. A estos líquidos pueden añadirse mitocondrias aisladas o agentes mitocondriales combinados para la conservación de órganos, tejidos y células.
Cuando se administran por determinadas vías, tales como el tracto respiratorio (por ejemplo, la nariz, una traqueostomía o mediante un tubo endotraqueal [ETT]), los tensioactivos pueden permitir que la composición llegue a las vías respiratorias distales. De este modo, en algunas formas de realización, las composiciones aquí descritas (por ejemplo, soluciones líquidas, soluciones acuosas (cuando son solubles en agua), formulaciones en aerosol, dispersiones, polvos estériles, etc.) pueden comprender uno o más tensioactivos.
El tensioactivo puede seleccionarse de entre el grupo formado por tensioactivos no iónicos, catiónicos, aniónicos y zwitteriónicos. También pueden utilizarse mezclas de tensioactivos. Entre las clases, a modo de ejemplo, de tensioactivos se incluyen los éter sulfatos de alcohol, los sulfatos de alcohol, las alcanolamidas, los alquil sulfonatos, los óxidos de amina, los tensioactivos anfotéricos, los tensioactivos aniónicos, los derivados de betaína, los tensioactivos catiónicos, los disulfonatos, el dodecilbenceno, ácido sulfónico, alcoholes etoxilados, alquilfenoles etoxilados, ácidos grasos etoxilados, hidrotropos de ésteres de glicerol, sulfatos de laurilo, mono y diglicéridos, tensioactivos no iónicos, ésteres de fosfato, tensioactivos cuaternarios y derivados del sorbitán.
Para que sean adecuados para su administración a través de las vías respiratorias, también pueden utilizarse otros portadores farmacéuticos apropiados. Estos portadores incluyen, por ejemplo, liposomas, nano y micropartículas, ciclodextrinas, microemulsiones, micelas, suspensiones o soluciones. En algunas formas de realización, estos portadores están hechos de lípidos (por ejemplo, liposomas, niosomas, microemulsiones, micelas lipídicas, nanopartículas lipídicas sólidas) o compuestos de polímeros (por ejemplo, micelas poliméricas, dendrímeros, nanopartículas poliméricas, nonogeles, nanocápsulas). Estos portadores pueden transportar el agente terapéutico al pulmón de forma controlada. También pueden utilizarse nanotransportadores. La terapia localizada del órgano objetivo suele requerir dosis totales más pequeñas para lograr resultados clínicamente eficaces. Para alcanzar este objetivo, los nanotransportadores pueden diseñarse para que se degraden lentamente, reaccionen a los estímulos y sean específicos del lugar.
Las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden incluirse en un recipiente, envase o dosificador junto con instrucciones para su administración. Las composiciones farmacéuticas aquí descritas también pueden prepararse en una forma adecuada para convertirse en una forma aerosolizada (por ejemplo, mediante un nebulizador adecuado).
EJEMPLOS
La invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplo 1: Aislamiento de mitocondrias a partir de músculo esquelético autólogo de un sujeto
Las mitocondrias se aislaron de tejido muscular esquelético autólogo. La fuente de tejido dependía del punto de entrada y acceso quirúrgico. El trasplante mitocondrial de alta eficacia suele requerir mitocondrias recién aisladas, viables y funcionales. Las mitocondrias no viables (por ejemplo, las congeladas previamente), las fracciones mitocondriales (proteínas, complejo I-V), el ADN y el ARN mitocondriales y el ATP o ADP exógenos no suelen tener suficiente funcionalidad.
Métodos
Para permitir el aislamiento de mitocondrias viables adecuadas para la respiración, se desarrolló un método rápido para el aislamiento y la purificación de mitocondrias que puede realizarse en 20-30 minutos (Figura 1). Las principales ventajas de este método son: (1) solamente requiere una pequeña cantidad de tejido que puede aislarse utilizando un punzón de biopsia del n° 6 (menos que 0,01 g de tejido); (2) utiliza un proceso de disociación tisular estandarizado que permite una homogeneización uniforme y consistente del tejido que no se consigue con facilidad con los métodos de homogeneización manual; y (3) el uso de la filtración diferencial, en lugar de la centrifugación, elimina las etapas de centrifugación repetitivas y que requieren mucho tiempo y acorta el tiempo de preparación. En resumen, se obtuvieron dos pequeños trozos de tejido muscular esquelético (menos que 0,1 gramos) utilizando un sacabocados de biopsia del n° 6. El tejido se homogeneizó en un volumen de 5 mL de tampón de aislamiento (300 mmol/L de sacarosa, 10 mmol/L de HEPES-KOH, 1 mmol/L de EGTA-KOH, con un pH 7,4) y luego se incubó durante 10 minutos con Subtilisina A enzimática en hielo. A continuación, el tejido digerido se filtró a través de una serie de filtros previamente humedecidos con tampón de aislamiento, y las mitocondrias se precipitaron posteriormente por centrifugación a 9 x G durante 5 minutos a 4°C.
Resultados
Las Figuras 2A-2G muestran resultados representativos del aislamiento de mitocondrias a partir de músculo esquelético. La Figura 2A muestra tejido muscular esquelético que se obtuvo utilizando el punzón de biopsia. La Figura 2B muestra imágenes microscópicas representativas de mitocondrias aisladas bajo iluminación de contraste de fase (campo brillante, BF) (panel izquierdo) y bajo fluorescencia marcada con MitoTracker Red CMXRos (panel central). La imagen fusionada se muestra en el panel derecho. Las mitocondrias obtenidas por este método tienen por término medio una viabilidad superior al 99%. La Figura 2C muestra resultados representativos del rendimiento mitocondrial por gramo de peso húmedo del tejido. La Figura 2D muestra imágenes representativas de microscopio electrónico de transmisión de mitocondrias aisladas. Las mitocondrias aisladas eran electrónicamente densas y menos del 0,01% de las mitocondrias estaban fracturadas o dañadas (*). La Figura 2E muestra los resultados representativos de la actividad del complejo mitocondrial I-V. La Figura 2F muestra los resultados representativos para el estado 3 (activo) de consumo de oxígeno (respiración estimulada por ADP). La Figura 2G muestra resultados representativos para el índice de control respiratorio (ICR; estado 3/estado 4) para el consumo de oxígeno inducido por malato (complejo I) e inducido por succinato (complejo II) en mitocondrias de pectoral mayor autólogas energizadas. Los datos indicaron que las mitocondrias aisladas mantienen el potencial de membrana y la viabilidad. Además, los datos indicaron que el consumo de oxígeno y el índice de control respiratorio del complejo I inducido por malato y del complejo II inducido por succinato eran iguales a los de las mitocondrias aisladas por algunos otros métodos.
Ejemplo 2: Las mitocondrias aisladas estuvieron presentes y fueron viables durante al menos 28 días tras la inyección en el miocardio.
Una vez aisladas por el método descrito en el ejemplo 1, las mitocondrias se utilizaron de manera inmediata para el trasplante mitocondrial.
Dosificación mitocondrial
Se realizaron experimentos para determinar la dosis óptima de mitocondrias autólogas. Estos experimentos han demostrado que 2 x 105 mitocondrias por gramo de peso húmedo de tejido proporciona una eficacia óptima.
Administración de mitocondrias aisladas
Las mitocondrias aisladas se administraron mediante inyección directa en la zona isquémica del pulmón por infusión vascular o mediante un nebulizador.
(a) . La inyección directa de mitocondrias proporciona una distribución localizada de las mitocondrias. Las mitocondrias se inyectaron en la arteria pulmonar o en la aurícula derecha utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de 28 g.
(b) . La administración intravascular de mitocondrias simplifica la entrega de mitocondrias al tejido y permite una amplia distribución de mitocondrias autólogas dentro del tejido.
(c) . Administración de mitocondrias por nebulizador. Para aumentar la aplicabilidad y permitir una intervención temprana, no quirúrgica y posquirúrgica, las mitocondrias autólogas se administraron mediante un nebulizador a los pulmones.
La administración vascular proporciona una administración localizada. Se realizaron experimentos preliminares para demostrar la seguridad y eficacia de la administración de mitocondrias autólogas por vía intravascular a través de la aurícula derecha y a través de la arteria pulmonar. Los resultados de los experimentos preliminares demostraron que el trasplante mitocondrial autólogo administrado a través de cualquiera de estas vías proporciona una administración y captación de mitocondrias específica para cada tejido y es seguro y eficaz, mejorando de manera significativa la función pulmonar tras 2 horas de isquemia y 24 horas de recuperación.
Resultados
La microscopía de fluorescencia y la obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM) han demostrado que las mitocondrias trasplantadas estuvieron presentes y fueron viables durante al menos 28 días tras la inyección en el miocardio. La mayoría de las mitocondrias se encontraron inicialmente en los espacios intersticiales entre las células. En los 30 minutos posteriores a la inyección, las mitocondrias trasplantadas se internalizaron en las células por endocitosis y se observaron dentro de los cardiomiocitos residiendo cerca del sarcolema entre las líneas Z de los sarcómeros y en grupos alrededor de las mitocondrias endógenas dañadas, así como en la proximidad del núcleo. La enumeración de las mitocondrias inyectadas ha demostrado que el 43,52% ± 4,46 (media ± SEM) de las mitocondrias inyectadas están adheridas o se encuentran dentro de los cardiomiocitos. Se utilizaron la microscopía de superresolución tridimensional y el microscopio electrónico de transmisión para determinar el destino intracelular de las mitocondrias exógenas endocíticas en cardiomiocitos humanos derivados de iPS y fibroblastos cardíacos primarios. Los resultados mostraron que las mitocondrias aisladas se incorporaban a las células cardiacas en cuestión de minutos y luego eran transportadas por endocitosis al interior de las células, en donde se fusionaban con la red mitocondrial endógena.
Las Figuras 3A-3D muestran resultados representativos de la captación y el transporte endocítico de mitocondrias extracelulares en cardiomiocitos. La Figura 3A muestra imágenes representativas de iPS-CMs que fueron expuestas a mitocondrias HCF marcadas con oro durante 2,5, 5 y 10 minutos y fotografiadas mediante TEM. Las mitocondrias marcadas tenían depósitos densos de electrones y eran evidentes en los tres tiempos de estudio fuera de las células, adyacentes a la superficie celular apical, soportando endocitosis, y dentro de las células (de izquierda a derecha e indicadas con flechas). Las imágenes son representativas de cuatro experimentos a 5 min; barras de escala, 0,5 pm. La Figura 3B muestra imágenes representativas de cuatro SR-SIM 3D en color de la colocalización de mitocondrias exógenas con endosomas tempranos a las 4 horas. Los núcleos se tiñeron con DAPI y tanto las mitocondrias endógenas como las exógenas se detectaron con el anticuerpo MTC02. Se muestran la imagen combinada (izquierda) y cada color (derecha); barras de escala, 10 pm. La Figura 3C muestra imágenes de microscopio superpuestas representativas de mitocondrias y endosomas tardíos de HCF a 1 hora; barras de escala, 10 pm. La Figura 3D muestra imágenes microscópicas superpuestas representativas de mitocondrias con lisosomas a las 4 horas; barras de escala, 10 pm. En las Figuras 3C y 3D, las flechas indican ejemplos de mitocondrias exógenas asociadas con cada compartimento, que también reaccionaron con el anticuerpo antimitocondrias MTC02. Los núcleos se tiñeron con DAPI y las imágenes representan doce volúmenes separados analizados en cada momento (0,5, 1, 2 y 4 horas); barras de escala, 0,5 pm.
Las mitocondrias trasplantadas no eran proarrítmicas, tal como lo demuestra el análisis de electrocardiogramas seriados de 12 derivaciones y el mapeo óptico. No hubo taquicardia ventricular, bradicardia, fibrilación ni defectos del sistema de conducción o heterogeneidad de la repolarización y no existen cambios en el ECG seriado, la duración del QRS o el intervalo QT corregido asociados con el trasplante mitocondrial. No hubo cambios en las alteraciones del movimiento de la pared ventricular, hipertrofia del ventrículo izquierdo, disfunción valvular, fibrosis o derrame pericárdico ni en el momento de la inyección ni en ningún momento hasta 4 semanas después del trasplante de mitocondrias autólogas. Además, las mitocondrias trasplantadas no produjeron ninguna respuesta inmunitaria o inflamatoria. La respuesta autoinmune medida por anticuerpos antimitocondriales mediante inmunofluorescencia indirecta fue indetectable.
Las mitocondrias trasplantadas pueden actuar tanto extracelular como intracelularmente. Una vez trasplantadas, las mitocondrias mantienen la viabilidad y la función durante al menos 28 días, el límite temporal de los estudios realizados hasta la fecha. Las mitocondrias trasplantadas también pueden aumentar de manera inmediata los niveles de ATP miocárdico y la síntesis de ATP y alterar con rapidez el proteoma miocárdico. El análisis proteómico a los 10 minutos de la inyección, cuando se observaron por primera vez mejoras en la función ventricular mediante ecocardiografía epicárdica, mostró que las vías proteicas de la mitocondria y la generación de metabolitos precursores para la energía y la respiración celular son, de manera significativa, mayores en los corazones tratados en comparación con los corazones de control (P menor que 0,05, Puntuación de enriquecimiento mayor que 2,0). A los 10-60 minutos del trasplante, las mitocondrias trasplantadas se internalizaron en los cardiomiocitos por endocitosis dependiente de actina. El número de mitocondrias que se internalizaron en los cardiomiocitos binucleados, fue de 40,9±11 por núcleo después de 1 hora y de 218,7 ± 63,7 después de 24 horas. Una vez internalizadas, las mitocondrias trasplantadas aumentan aún más (p menor que 0,05) el contenido de ATP celular y regulan al alza las citoquinas cardioprotectoras (factor de crecimiento epidérmico, oncogén relacionado con el crecimiento, IL-6 y proteína quimiotáctica de monocitos-3). Estas citoquinas se asocian a una mejora de la función cardiaca al estimular el crecimiento, la proliferación y la migración celular, mejorar la vascularización, proporcionar protección contra la apoptosis de los cardiomiocitos y mejorar la recuperación funcional cardiaca y la remodelación cardiaca independientemente de la regeneración de los miocitos cardiacos. La isquemia también daña el ADN mitocondrial y reduce la síntesis de ATP, alteraciones que se asociaron a una mala recuperación tras la cirugía cardiaca en humanos. Este ejemplo demostró que el trasplante mitocondrial sustituyó, al menos parcialmente, el ADN mitocondrial dañado por a Dn mitocondrial intacto y rescató la función celular miocárdica.
Ejemplo 3: Estudios preliminares en animales y en seres humanos:
La eficacia del trasplante mitocondrial se validó en una serie de modelos de corazón animal perfundidoin vitroein vivo.Los resultados de estos estudios demostraron que el trasplante mitocondrial rescata la viabilidad celular miocárdica y mejora de manera significativa la función miocárdica posisquémica tras una lesión por isquemia/reperfusión.
Utilizando protocolos de isquemia/reperfusión en el corazón perfundido aislado y en modelos de corazón regionalmente isquémico in situ, se demostró que el trasplante mitocondrial autólogo es seguro y eficaz. Los estudios demostraron que tanto la administración directa como la vascular de mitocondrias mejoran de manera significativa la lesión por isquemia/reperfusión y aumentan la viabilidad celular miocárdica y la recuperación funcional miocárdica post-isquémica. Estos efectos fueron evidentes durante al menos 28 días, el punto final de los experimentos de supervivencia in situ.
Los pacientes pediátricos con IRI significativa requieren soporte mecánico con oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO). El uso de ECMO ha demostrado ser una técnica que salva vidas, pero puede dar lugar a complicaciones de hemorragia, respuesta inflamatoria sistémica e infección, por lo que solamente puede utilizarse durante un periodo de tiempo limitado. Si no se consigue la recuperación miocárdica en el tiempo que dura la asistencia con OMEC, el paciente acaba sucumbiendo a las complicaciones de la OMEC, que pueden causar IRI tanto mientras el paciente está canulado como posteriormente. Los estudios han demostrado que los pacientes incapaces de ser destetados de la asistencia ECMO en un plazo de 72 horas es un indicador de pronóstico grave, con una supervivencia global inferior al 30%. Se realizó un estudio piloto en humanos que demostró que la inyección directa de mitocondrias autólogas mejoraba de manera significativa la función ventricular en cinco pacientes pediátricos para permitir la decanulación de la ECMO. Ninguno de los pacientes experimentó efectos adversos y no hubo complicaciones de arritmia, hematoma intramiocárdico o respuesta inflamatoria. Este estudio piloto fue la primera aplicación clínica de la novedosa técnica del trasplante mitocondrial autólogo para mejorar la función cardiaca en pacientes con IRI.
Ejemplo 4: La administración de mitocondrias exógenas en forma de aerosol a las vías respiratorias da lugar a su localización en (e internalización dentro de) las células que recubren las vías respiratorias
Para evaluar si las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol al tracto respiratorio dan lugar a la localización a (y la internalización dentro de) las células que recubren el tracto respiratorio, se preparó y administró un aerosol que contenía mitocondrias marcadas utilizando un sistema nebulizador, y se evaluó la biodistribución en el tejido pulmonar.
Métodos
Modelo animal
Para los experimentos se seleccionó el modelo murino de lesión por isquemia/reperfusión pulmonar. Los ratones C57BL/6J están bien caracterizados y son un modelo establecido para su uso en LPA que permite comparar los resultados.
Biodistribución
La visualización de la biodistribución de mitocondrias exógenas en el pulmón se realizó en la rata en lugar del ratón para mejorar la visualización y el análisis de la distribución. El modelo de ratón no proporciona una superficie suficiente para detectar la biodistribución. En resumen, se anestesió a ratas Wistar (200 g) con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg/kg) y se las mantuvo con isoflurano inhalado al 0,5 %. Se realizó una intubación endotraqueal oral con un catéter de plástico de 20 G y se ventiló mecánicamente a las ratas con un volumen corriente de 10 mL/kg y una frecuencia respiratoria de 130 - 140 respiraciones/minuto. Se realizó una toracotomía izquierda en el 3° espacio intercostal y se expuso la arteria pulmonar. Se determinó la biodistribución de mitocondrias exógenas marcando mitocondrias de fibroblastos cardíacos humanos con 18F-Rodamina 6-G. El uso de mitocondrias humanas en un modelo de rata, murino o porcino permite diferenciar entre mitocondrias nativas y mitocondrias trasplantadas basándose en la reactividad inmunológica a un anticuerpo monoclonal anti mitocondrias humanas.
Administración vascular
Las mitocondrias de fibroblastos cardíacos humanos marcadas con 18F-Rodamina 6-G se administraron en forma de bolo en 0,3 mL en tampón de respiración (250 mmol/L de sacarosa, 20 mmol/L de tampón K+-HEPES, pH 7,2, 0,5 mmol/L de K+-EGTA, pH 8,0) mediante inyección en la arteria pulmonar izquierda utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de 40 G.
Administración por nebulizador
Las mitocondrias de fibroblastos cardíacos humanos marcadas con 18F-Rodamina 6-G en 90 pL de tampón de respiración se administraron a todo el pulmón utilizando un nebulizador Flexivent, durante un tiempo total de 40s (10s de nebulización seguido de 1 minuto de ventilación mecánica regular, repetido 4 veces).
Medición de la concentración de mitocondrias
Se dejó que las mitocondrias circularan durante 30 minutos, tras la administración, para permitir el lavado y, a continuación, se practicó la eutanasia a las ratas mediante sobredosis de dióxido de carbono. La biodistribución mitocondrial se determinó mediante tomografía por emisión de positrones (PET) y tomografía microcomputarizada (pCT) utilizando un sistema de obtención de imágenes preclínicas Albira PET/SPECT/CT (Bruker, Billerica, MA).Cuantificación de la captación celular de las mitocondrias administradas
Para confirmar la presencia de mitocondrias exógenas en el tejido pulmonar e identificar la captación celular pulmonar, se obtuvieron secciones pulmonares de los pulmones derecho e izquierdo, se fijaron con parafina y se sometieron a análisis inmunohistoquímicos.
Resultados
Las Figuras 4A-4C muestran los resultados de la administración de mitocondrias 18F-Rodamina 6-G (6 x 107) a los pulmones mediante infusión vascular a través de la arteria pulmonar en un modelo de rata y la obtención de imágenes mediante tomografía por emisión de positrones (PET) y tomografía microcomputarizada (pCT) utilizando un sistema de obtención de imágenes Alvira (Bruker, Billerica, MA). Estos resultados muestran que la administración de mitocondrias a los pulmones da lugar a una distribución específica de las mitocondrias trasplantadas por todo el pulmón.
Las Figuras 5A-5B muestran los resultados de la detección inmunohistoquímica y la captación celular de mitocondrias exógenas en tejido pulmonar de ratón administrado mediante un nebulizador y a través de la arteria pulmonar. Las mitocondrias de fibroblastos cardíacos humanos se detectaron utilizando el anticuerpo anti mitocondrias humanas (MTC02 [biotina] - Abcam, Cambridge, Reino Unido, N° de catálogo: #ab79479) y Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y el cromógeno de sustrato AEC+ (Dako, Agilent, Santa Clara, CA). El uso de mitocondrias humanas en un modelo de rata, murino o porcino permite diferenciar entre mitocondrias nativas y mitocondrias trasplantadas basándose en la reactividad inmunológica a un anticuerpo monoclonal anti mitocondrias humanas. En las figuras, las mitocondrias se muestran como puntos negros. Se detectaron mitocondrias dentro y alrededor de las células endoteliales pulmonares, los neumocitos, el parénquima y los alvéolos.
Ejemplo 5: Las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol a las vías respiratorias pueden mejorar los síntomas de la isquemia pulmonar aguda (LPA)
Para evaluar si las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol a las vías respiratorias de un ratón son suficientes para mejorar los síntomas de la isquemia pulmonar aguda (LPA) en un modelo de LPA en ratón, se preparó y administró un aerosol que contenía mitocondrias marcadas utilizando un sistema nebulizador, y se realizaron ensayos para evaluar la función y la integridad pulmonares.
Métodos
Modelo animal
Se utilizaron ratones machos C57BL/6J (8-10 semanas) Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston y se ajustan a las directrices de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y uso de animales.
Aislamiento mitocondrial
Se aislaron mitocondrias de músculo esquelético obtenido de ratones C57BL/6J singénicos. No existe ninguna reacción directa o indirecta, aguda o crónica de alorreactividad, aloreconocimiento o moléculas de patrones moleculares asociados a daños (DAMPs) a las inyecciones únicas o en serie de mitocondrias singénicas. En resumen, se diseccionó músculo esquelético de ratones C57BL/6J y se utilizó de manera inmediata para aislar mitocondrias singénicas. Se aislaron las mitocondrias y se determinó el número y la viabilidad de las mitocondrias aisladas. Las mitocondrias aisladas se suspendieron en 0,3 mL de tampón de respiración y se utilizaron inmediatamente para el trasplante mitocondrial.
Modelo murino de ALI pulmonar:
Se realizó una intervención quirúrgica con oclusión del hilio izquierdo durante 2 horas para inducir una lesión por isquemia/reperfusión. En resumen, se anestesió a ratones C57BL/6J con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg/kg) y se les mantuvo durante la cirugía con isoflurano inhalado al 0,5 %. Se realizó una intubación endotraqueal oral con un catéter de plástico de 20 G y se ventiló mecánicamente a los ratones con un volumen corriente de 10 mL/kg y una frecuencia respiratoria de 130 - 140 respiraciones/min. Se realizó una toracotomía izquierda en el tercer espacio intercostal y se expuso el hilio pulmonar izquierdo.
Isquemia pulmonar aguda:
Se ocluyó el hilio izquierdo al final de la espiración durante 2 horas utilizando una pinza microvascular (Roboz Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, EE.UU.) y se redujo el volumen corriente a 7,5 mL/kg. La incisión quirúrgica se cubrió con una gasa empapada en solución de heparina que contenía (60UI de heparina/1ml). Al final del periodo de isquemia, se retiró la pinza.
Grupos experimentales:
Los animales se distribuyeron de manera aleatoria en tres grupos experimentales:
(a) . Administración vascular (V): Inmediatamente después del período de isquemia y de la retirada de la pinza, los animales fueron elegidos al azar para recibir 0,3 mL de tampón de respiración (Vehículo-V) o 0,3 mL de tampón de respiración que contenía mitocondrias (Mitocondrias-V). El vehículo y las mitocondrias se administraron en forma de bolo en 0,3 mL mediante inyección en la arteria pulmonar izquierda utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de 40 G. Las concentraciones de mitocondrias se determinaron mediante los métodos aquí descritos.
(b) . Nebulización (N): Inmediatamente después del período de isquemia y de la retirada de la pinza, se eligió de manera aleatoria a los animales para recibir 90 gl de tampón de respiración (Vehículo-N) o 90 uL de tampón de respiración que contenía mitocondrias (Mitocondrias-N). El vehículo y las mitocondrias se administraron a todo el pulmón utilizando un nebulizador Flexivent durante un tiempo total de 40s (10s de nebulización seguido de 1 minuto de ventilación mecánica regular, repetido 4 veces). Se determinaron las concentraciones de mitocondrias. Para tener en cuenta el volumen 2/3 mayor en los estudios con nebulizador (lóbulos derecho e izquierdo incluidos), se utilizó 3 x concentración.
(c) . A los ratones de control simulado se les practicó una toracotomía sin pinzamiento hiliar y se les ventiló mecánicamente durante 2 horas antes de devolverlos a la jaula. Se requiere un grupo de control simulado para aislar los efectos específicos causados por la anestesia, el traumatismo de la incisión y el traumatismo potencial del tejido animal durante la operación.
Determinación de la concentración mitocondrial óptima necesaria para permitir la mejora de la ALI.
2 x 105 mitocondrias autólogas por gramo de peso húmedo de tejido proporcionan cardioprotección en el corazón. Para determinar la concentración mitocondrial óptima para la seguridad y la eficacia en el pulmón para la LPA, se probaron varias dosis, concretamente 2 x 105, 2 x 106 y 2 x 107 mitocondrias por gramo de peso húmedo tisular.
Análisis funcional pulmonar
Tras 24 horas de recuperación (reperfusión del pulmón isquémico), se anestesió a los ratones con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (70 mg/kg). Se realizó una traqueotomía o una intubación endotraqueal con catéter de plástico 18G y se ventiló mecánicamente a los ratones. Se realizó una laparotomía media y una esternotomía para exponer el pulmón y se pinzó el hilio izquierdo para evaluar la función del pulmón izquierdo lesionado. Se redujo el volumen corriente (VT) a 5 mL/kg y a continuación se conectaron los ratones al ventilador especializado para roedores (FlexiVent, SCIREQ, Montreal, Quebec, Canadá) para evaluar la presión inspiratoria máxima (PIP), la resistencia del sistema respiratorio (Rrs), el cumplimiento del sistema respiratorio (Crs), la elastancia del sistema respiratorio (Ers) y la amortiguación tisular (G) del pulmón izquierdo.
Análisis de moléculas de patrones moleculares asociados a daños (DAMP)
Para determinar si existen lesiones relacionadas con DAMPs asociadas a la inyección de mitocondrias singénicas o alogénicas, se detectó ADN mitocondrial libre circulante. Se utilizaron cebadores exclusivos que permiten la estimación del ADNmt libre circulante, y el método tiene en cuenta las secuencias de inserción mitocondrial nuclear que pueden afectar a la cuantificación precisa del ADNmt. En resumen, el ADN total (nuclear y mitocondrial) se extrajo utilizando un kit DNeasy Blood & Tissue según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA). El ADN se cuantificó mediante Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE) y se ajustó a 10 ng/uL. El ADN mitocondrial libre circulante (ADNmt) se analizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real.
Cebadores (Eurofins Genomics, Louisville, KY) para ADNmt de ratón (mMitoF1, (5' ^ 3') CTAGAAACCCCGAAACCAAA (N2 IDE SEC.: 1); mMitoR1 (5' ^ 3') CCAGCTATCACCAAGCTCGT (N2 IDE SEC.: 2)), y microglobulina beta-2 de ratón (mB2MF1: (5' ^ 3') ATGGGAAGCCGAACATACTG (N° IDE SEC.: 3); mB2MR1: (5' ^ 3'): CAGTCTCAGTGGGGGTGAAT (N° IDE SEC.: 4)) se utilizaron para amplificar el ADNmt de ratón. La PCR en tiempo real se realizó utilizando el kit QuantiFast SYBR Green PCR (Qiagen, Valencia, CA). Todos los ensayos se realizaron utilizando un instrumento Eppendorf Mastercycler ep realplex2 (Eppendorf, Hauppauge, NY). Las condiciones de la PCR en tiempo real (qPCR) consistieron en una preincubación durante 5 minutos a 95°C seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 10 segundos, recocido a 56°C durante 15 segundos y extensión a 60°C durante 15 segundos. Una vez finalizada la ejecución de la qPCR, se realizó un análisis de la curva de fusión que consistió en la fusión a 95°C durante 5 segundos, enfriamiento a 65°C durante 60 segundos, seguido de calentamiento a 95°C con monitorización continua de la fluorescencia y, por último, enfriamiento a 40°C durante 30 segundos. El cambio del pliegue del ADNmt se normalizó con respecto al ADN nuclear de copia única utilizando la fórmula, 2-ACt (ACt=CtMtADN-CtB2M).
Tejido pulmonar teñido para evaluar la integridad pulmonar
Se recogieron los pulmones y se dividieron en 3 partes iguales. La parte superior del pulmón se utilizó para evaluar el edema tisular calculando la relación de peso húmedo/seco (w/d). Inmediatamente después de la recogida, se pesó el pulmón (peso húmedo), se introdujo en un horno a 70°C durante 72 horas, se volvió a pesar (peso seco) y se calculó la relación peso húmedo/peso seco (w/d). La parte media del pulmón se fijó inmediatamente en formalina al 10%. El tejido se embebió en parafina y se seccionó con un grosor de 5 pm. Se utilizaron secciones seriadas para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), la tinción con mieloperoxidasa y el ensayo TUNEL. La parte basal del pulmón se utilizó para microscopio electrónico de transmisión para analizar el daño estructural en el pulmón. Las secciones teñidas con H&E se evaluaron como lectura de la gravedad de la lesión pulmonar mediante un sistema de puntuación. Se analizaron 25 campos visuales aleatorios (20X) por sección. La lesión pulmonar se clasificó en función de la infiltración o agregación de células inflamatorias en el espacio aéreo o la pared vascular:
Grado 1: solamente pared;
Grado 2: pocas células (1-5 células) en el espacio aéreo;
Grado 3: intermedio; y
Grado 4: grave (espacio aéreo congestionado).
Para la congestión intersticial y la formación de membranas hialinas, se utilizan los siguientes grados:
Grado 1: pulmón normal;
Grado 2: moderado (25% de la sección pulmonar);
Grado 3: intermedio (25-50% de la sección pulmonar); y
Grado 4: grave (50% de la sección pulmonar);
Para la hemorragia, se utilizan los siguientes grados:
Grado 0: ausente; y
Grado 1: presente.
Resultados
La Figura 6 muestra imágenes macroscópicas representativas de pulmones murinos tras 2 horas de isquemia pulmonar izquierda ALI y 24 horas de recuperación. Los pulmones sometidos al procedimiento de isquemia se indican con el círculo rojo. El pulmón derecho se muestra como R, el pulmón izquierdo como L. El corazón (H) se muestra en cada imagen. Los pulmones del vehículo mostraron edema grave y daño celular (Vehículo-V). Por el contrario, los pulmones que recibieron el tratamiento con mitocondrias conservaron la estructura celular macroscópica.
Las Figuras 7A-7B muestran métricas cuantificadas de la integridad pulmonar, concretamente la resistencia pulmonar y la elastancia, en el pulmón de ratón (n=4). La resistencia (Figura 7A) y la elastancia (Figura 7B) se midieron en pulmones de ratón sometidos a 2 horas de isquemia pulmonar izquierda tras 24 horas de recuperación. Se administró vehículo o mitocondrias por vía intravascular a través de la arteria pulmonar izquierda (V) o por nebulizador (N). La concentración de mitocondrias fue de 2 x 107 mitocondrias por gramo de peso húmedo de tejido pulmonar. Las mitocondrias administradas por nebulizador fueron de 6 x 107 mitocondrias por gramo de peso húmedo de tejido pulmonar para tener en cuenta los volúmenes pulmonares añadidos. Estos resultados demuestran que el trasplante mitocondrial administrado por vía vascular o por aerosol mediante un nebulizador preserva de manera significativa la resistencia y elastancia pulmonares en comparación con los pulmones tratados con vehículo. Los resultados tampoco muestran diferencias significativas entre los controles simulados (sin isquemia) y los pulmones isquémicos que recibieron mitocondrias administradas por vía intravascular a través de la arteria pulmonar izquierda o mediante un nebulizador. Se han obtenido resultados similares para la amortiguación tisular y la distensibilidad pulmonar.
La Figura 8A muestra la cuantificación del ADNmt libre circulante determinada por PCR en tiempo real en muestras de sangre total en ratones BALB/cJ que recibieron solamente tampón de respiración (Sham (grupo de control simulado)) o mitocondrias (3 x 107 en el tampón de respiración). Las muestras de sangre se obtuvieron 10 días después de la inyección i.p. El cambio de pliegues del ADNmt (media ± SEM) se normalizó con respecto al ADN nuclear de copia única (Beta-2 microglobulina). Los resultados no muestran un aumento del ADNmt libre circulante con las inyecciones de mitocondrias en comparación con Sham (P = 0,96). La Figura 8B muestra micrografías representativas de tejido pulmonar teñido con hematoxilina y eosina. La Figura 8C muestra micrografías representativas de tejido pulmonar teñido con tricrómico de Masson. La histología pulmonar no mostró diferencias ultraestructurales en las secciones pulmonares seriadas con inyecciones de mitocondrias en comparación con Sham. Todas las secciones muestran epitelios normales de los conductos respiratorios y los alvéolos. La Figura 8D muestra micrografías electrónicas de transmisión representativas del lóbulo inferior derecho. Las imágenes de microscopía electrónica muestran endotelios y membranas de base conservados en todos los grupos. Las barras de escala son de 1 mm. Las flechas indican el espacio alveolar. El análisis histológico y de microscopía electrónica del tejido pulmonar no mostró indicios de inflamación o de daño celular. No hubo indicios de necrosis de las células miocárdicas, según se determinó mediante tinción con TTC, ni de aumento del contenido de colágeno en el tejido miocárdico o en los endotelios pulmonares ni de daños en la membrana de la base.
Ejemplo 6: Las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol a las vías respiratorias son suficientes para mejorar los síntomas en un modelo porcino de LPA
El pulmón porcino tiene volúmenes comparables a los pulmones humanos, lo que lo convierte en un modelo ventajoso para el estudio de la función respiratoria. Los pulmones porcinos tienen linajes y composición celulares comparables a los pulmones humanos. La distribución anatómica general de las vías respiratorias porcinas recapitula la del humano con algunas excepciones menores. El cartílago que rodea las vías respiratorias porcinas tiene una distribución más amplia que en los humanos y se extiende más abajo en el árbol traqueobronquial. El pulmón porcino solamente tiene 3 generaciones de bronquiolos después de la última placa de cartílago antes de llegar al lobulillo, mientras que los humanos tienen aproximadamente 10 generaciones. Otras diferencias menores incluyen bronquiolos terminales porcinos más largos que en los humanos, así como bronquiolos respiratorios porcinos más cortos y menos definidos. También de forma similar a los humanos, los cerdos tienen un arsenal completo de efectores inmunitarios innatos en el tracto respiratorio para proteger las superficies mucosas, causar respuestas inflamatorias y orquestar respuestas inmunitarias adaptativas. De este modo, replicar los experimentos en el modelo de animal grande (por ejemplo, un modelo porcino) utilizando los mismos instrumentos y protocolos empleados en humanos puede proporcionar una mayor relevancia para el uso clínico en humanos.
Métodos
Modelo animal
Se asignan de manera aleatoria cerdos Yorkshire (machos y hembras, de 40 a 50 kg) a cada grupo. El modelo porcino tiene muchas ventajas en términos de relevancia clínica. La fisiología porcina se asemeja mucho a la humana adulta y el modelo puede proporcionar relevancia quirúrgica para la prueba experimental antes de la traslación a la aplicación humana. El pulmón porcino es un modelo excelente para el pulmón humano normal y es un modelo establecido de lesión por isquemia-reperfusión pulmonar.
Protocolo experimental
Se induce a los cerdos con Telazol (4-6mg/kg, IM) y Xilacina (1,1-2,2mg/kg, IM) seguido de la colocación de un catéter en la vena auricular. Se intuba al animal con un tubo endotraqueal con manguito y se le ventila mecánicamente mediante ventilación controlada por volumen con TV 10 ml/kg, FiO2 0,4, PEEP 5 cm H2O, RR 12-15 respiraciones/minuto ajustada para obtener PaCO2 35-45 mmHg al inicio. La anestesia general se induce con isoflurano (hasta el 3%) y se mantiene con 0,5-4%).
Toma de muestras de sangre
Se coloca percutáneamente un catéter en la arteria femoral para monitorizar la presión arterial media (PAM) y para la toma de muestras de sangre arterial durante todo el procedimiento. De manera alternativa, puede utilizarse un catéter de la arteria carótida que se coloca a través de un corte. La vena femoral o la vena yugular pueden canularse con un catéter colocado percutáneamente para la monitorización de la PVC y la toma de muestras de sangre venosa. En el caso de que estos vasos no puedan cateterizarse mediante ecografía, se realiza una incisión y se coloca un catéter en el vaso bajo visualización directa. A continuación, se sutura la herida con hilo Vicryl o PDS (4-0). Se administra heparina sódica 200 UI/kg a través de la vena auricular antes de pinzar el hilio pulmonar izquierdo para alcanzar un ACT objetivo mayor de 300 segundos. El ACT se comprueba a lo largo de la cirugía y, si es necesario, la coagulación puede ajustarse con una dosis adicional de heparina para mantener un ACT mayor de 300 segundos. Si durante la cirugía se produce fibrilación ventricular, se administra al sujeto lidocaína al 1% (5 mL, intravenoso). Se infunde solución de anillos de lactato o solución salina a través de la vena auricular o la vena femoral durante todo el procedimiento para mantener la presión arterial. Tras la verificación de la anestesia profunda, se realiza una toracotomía izquierda sobre el 5° espacio intercostal para acceder al hilio pulmonar izquierdo. De manera alternativa, puede utilizarse una esternotomía media si el acceso al hilio es limitado en el abordaje por toracotomía. La arteria pulmonar se canula con un catéter umbilical de PVC para la monitorización de la PAP. A continuación, se canula la aurícula izquierda a través de la orejuela auricular izquierda con un catéter umbilical de PVC para medir la PAP y para la toma de muestras de sangre. La temperatura central se monitoriza de manera continua y se mantiene utilizando una almohadilla térmica.
Monitorización del flujo sanguíneo
La aorta ascendente y la arteria pulmonar principal pueden disecarse y se colocan sondas de flujo transónico para monitorizar el flujo sanguíneo.
Evaluación de la función miocárdica
La función miocárdica puede evaluarse colocando un catéter de conductancia directamente en la cavidad del VD y el VI. Los catéteres pueden insertarse a través de puntos de sutura. Los puntos de sutura puede evitar hemorragias y asegurar el catéter en su lugar. Como alternativa, el catéter del VD puede colocarse a través del sistema venoso central por la vena yugular. Los registros pueden obtenerse continuamente durante todo el experimento.
Ecocardiografía
Puede realizarse una ecocardiografía epicárdica para determinar la función miocárdica. Se obtienen ecocardiogramas 2D epicárdicos en la línea de base, inmediatamente antes de la inyección de mitocondrias autólogas o el tampón de respiración y a las 3 horas de la inyección.
Aislamiento mitocondrial
Se puede localizar y diseccionar el músculo pectoral mayor o el músculo recto abdominal y extraer quirúrgicamente dos pequeños trozos de tejido muscular (aproximadamente 0,01 g) con un punzón de biopsia y utilizarlos para el aislamiento mitocondrial en condiciones estériles. El aislamiento mitocondrial puede realizarse en menos de 30 minutos de conformidad con las normas de laboratorio actuales para mantener la relevancia clínica.
Isquemia aguda del pulmón izquierdo
El bronquio principal izquierdo puede ser objeto de abrasión en una longitud de 1 cm para ablacionar cualquier circulación bronquial. El hilio pulmonar - arteria, venas y bronquio, se pinza durante 90 minutos. La ventilación puede ajustarse para ventilación pulmonar única a TV 6 ml/kg, PEEP 5 cmH2O, ajustándose la FiO2 en función de los niveles de SO2. La ventilación pulmonar única se mantiene durante 90 minutos. Si durante el periodo isquémico la presión máxima de las vías respiratorias, Pmax, aumenta hasta 20-22 cmH2O, pudiendo la ventilación controlada por volumen conmutarse a ventilación controlada por presión con Pmax 20-22 cmH2O para evitar un barotrauma del pulmón. El pinzamiento bronquial puede confirmarse de manera visual por el pulmón izquierdo desinflado con ausencia de movimientos inspiratorios y espiratorios.
Grupos experimentales:
(a) Grupo de control simulado - el hilio izquierdo puede disecarse pero no pinzarse (no existe isquemia del pulmón izquierdo) y el animal puede monitorizarse durante 90 minutos y luego durante 3 horas adicionales, durante la reperfusión. Tras 90 minutos de isquemia del pulmón izquierdo, puede soltarse el pinza hiliar y el pulmón izquierdo recibe una única inyección de 15 mL de tampón de respiración estéril (Vehículo-V) o una única inyección de 15 mL de tampón de respiración estéril que contiene mitocondrias (Mitocondrias-V).
(b) La administración vascular de las inyecciones de mitocondrias o de vehículo puede administrarse como un bolo en la arteria pulmonar izquierda utilizando una aguja de 18 G. El lugar de la inyección puede suturarse con sutura Prolene de tamaño 4-0 para controlar la hemorragia.
(c) La administración por nebulizador puede realizarse utilizando un nebulizador de calidad comercial (Allied Health Care) fijado al circuito del ventilador.
La reperfusión puede continuar durante un período de 3 horas. Los animales permanecen bajo anestesia durante este tiempo.
Recogida de datos
Se registrarán la PAM, la PVC, la PAP y la LAP en la línea de base, al inicio del período de reperfusión, inmediatamente antes de la inyección de mitocondrias autólogas o del tampón de respiración, y a las 1, 2, 3 horas durante la reperfusión. Las mediciones de la respiración para la presión pico inspiratoria, la presión meseta inspiratoria y la sangre arterial y venosa mixta para la ABG se realizarán en la línea de base, al inicio del periodo de reperfusión, inmediatamente antes de la inyección de mitocondrias autólogas o del tampón de respiración, y a las 1, 2, 3 horas durante la reperfusión.
Lavado broncoalveolar
El lavado del pulmón izquierdo y del pulmón derecho puede realizarse al final del periodo de reperfusión. El lavado puede realizarse bajo guía broncoscópica tras introducir un catéter por la boca a través de la tráquea en el lóbulo caudal primero del pulmón izquierdo y luego del derecho. A continuación, pueden introducirse 30 ml de solución salina en el pulmón y aspirar el líquido al cabo de un minuto. A continuación, pueden introducirse otros 15 ml de solución salina en el pulmón y aspirarse al cabo de un minuto. El líquido aspirado puede tomarse para el análisis posterior. El líquido BAL puede centrifugarse inmediatamente a 4°C a 500 x G durante 5 minutos, y el sobrenadante puede recogerse y almacenarse a -80°C hasta su posterior análisis para determinar los niveles de expresión de citoquinas y quimioquinas. El análisis de citoquinas y quimioquinas puede ser realizado por Eve Technology (Calgary, AB, Canadá). Pueden analizarse los siguientes biomarcadores: Eotaxina, G-CSF, GM-CSF, IFNgamma, IL-1 alfa, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IP-10, KC, LIF, LIX, MCP-1, M-CSF,<MIG,>M<i>P-1<alfa, MIP-1beta, MIP-2, RANTES, TNFalfa,>V<e>G<f>.<Todas las muestras pueden analizarse por triplicado.>
Mediciones de resultados primarios
Mediciones hemodinámicas que incluyen, por ejemplo, FC, LVPDP, FC, LVEDP, dP/dT, CO, PVR, LAP, y mediciones de la función pulmonar que incluyen, por ejemplo, Oxígeno -PaO2, PpvO2, OI, SO2, AaDOz, cumplimiento, elastancia, resistencia, Cdyn, PEEP, Ccs, PIP, Rrs, Crs, Ers y G (amortiguación tisular del pulmón izquierdo) y presión pulmonar, los bucles de volumen pueden realizarse en la línea de base, al inicio del periodo de reperfusión, inmediatamente antes del tratamiento de mitocondrias autólogas o del tampón de respiración, y a las 1, 2, 3 horas de la reperfusión. Se realiza un lavado broncoalveolar del pulmón izquierdo y derecho al final del periodo de reperfusión. Pueden determinarse las respuestas bioquímicas y proteómicas, de citoquinas, quimioquinas e inmunitarias. Las respuestas inflamatorias pulmonares pueden examinarse analizando la IPP, la IO, la histología y las expresiones de citoquinas inflamatorias. La apoptosis pulmonar puede determinarse mediante TUNEL y el edema pulmonar. La función pulmonar antes y después de la isquemia puede determinarse para cada concentración mitocondrial y pueden realizarse análisis bioquímicos e histológicos para determinar la eficacia de cada concentración.
Plan estadístico y análisis de datos
El análisis de potencia indicó que un tamaño de muestra de 6 animales por grupo proporciona más de un 85% de potencia para detectar una diferencia igual al doble de la desviación estándar dentro del grupo (a=0,05, de dos caras), y un 82% para detectar una diferencia igual a 2,5 veces la desviación estándar dentro del grupo (a=0,0083, de dos caras, el criterio de significación ajustado de Bonferroni para comparaciones post hoc entre 5 grupos). Para la presencia/ausencia de un hallazgo, 6 animales por grupo tendrían una potencia del 95% para detectar un efecto que se produzca en al menos el 40% de los animales, mientras que 10 animales por grupo tendrían una potencia del 95% para detectar un efecto que se produzca en al menos el 26% de los animales. Una muestra de 10 animales puede proporcionar una potencia estadística del 80% (a de 2 colas = 0,05, p = 0,20) para detectar una diferencia media del 10% o superior entre los brazos de tratamiento y control, suponiendo una desviación estándar conjunta del 10% (tamaño del efecto = 1,0) con una prueba t de Student de grupos independientes (nQuery Advisor versión 7.0, Statistical Solutions, Cork, Irlanda). Este tamaño de muestra también puede proporcionar una potencia del 80% para captar una diferencia de 24 horas entre los grupos mediante la potencia de la prueba O de Mann-Whitney. Basándonos en estudios preliminares y en la mortalidad de los animales, normalmente cada grupo experimental consta de aproximadamente 6 a 10 animales. Se calcula la media ± el error estándar de la media de todos los datos para todas las variables. Las comparaciones simples antes y después de la intervención se realizan mediante una prueba T de Student de dos colas emparejadas, si los datos tienen una distribución normal, o una prueba de márgenes con signo de Wilcoxon para otros datos continuos. Cuando solamente existe una única variable distribuida normalmente para un animal, se utiliza un análisis de varianza unidireccional para comparar los grupos, y extensiones en el marco del modelo lineal generalizado para evaluar los efectos de otras variables. Cuando existen múltiples mediciones para un animal, puede utilizarse un análisis de varianza de modelo mixto (MM-ANOVA) para evaluar la significación estadística con el grupo y/o el fármaco como efectos fijos e incorporar las mediciones repetidas a lo largo del tiempo como un factor dentro del paciente. En general, pueden utilizarse correlaciones autorregresivas (AR (1)) para modelizar la relación entre las mediciones a lo largo del tiempo. AR (1) es un método estándar para modelar datos a lo largo del tiempo y significa que las mediciones cercanas entre sí están más correlacionadas que las mediciones más alejadas. Para las variables que no se distribuyen normalmente, pueden realizarse transformaciones de los datos para normalizarlos (por ejemplo, transformaciones logarítmicas), o los datos pueden analizarse utilizando ecuaciones de estimación generalizadas.
Significación estadística
Un umbral P menor que 0,05 indica significación estadística. Las comparaciones post hoc entre grupos se ajustan para comparaciones múltiples mediante una corrección de Bonferroni. La eficacia puede compararse mediante la prueba exacta de Fisher. La aleatorización puede realizarse empleando el paquete de software R basado en una asignación 1:1 utilizando un generador de números Uniforme (0,1). El análisis estadístico puede realizarse utilizando SAS versión 9.3 (SAS Institute, Cary, NC).
Resultados
Está previsto que las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol a las vías respiratorias sean suficientes para mejorar los síntomas en un modelo porcino de LPA.
EJEMPLO 7: Las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol a las vías respiratorias son suficientes para mejorar los síntomas en un modelo de ALI de ratón
Para evaluar si las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol a las vías respiratorias de un ratón son suficientes para mejorar los síntomas de la isquemia pulmonar aguda (LPA) en un modelo de LPA en ratón, se preparó y administró un aerosol que contenía mitocondrias marcadas utilizando un sistema nebulizador, y se realizaron ensayos para evaluar la función y la integridad pulmonares.
Métodos
Animales
Se utilizaron ratones machos C57BL/6J (8-10 semanas, n = 35; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston y se ajustaron a las directrices de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y uso de animales.
Aislamiento mitocondrial
Se diseccionó músculo gastrocnemio de ratones C57BL/6J (n = 6) y se utilizó inmediatamente para aislar mitocondrias singénicas. Se aislaron las mitocondrias y se determinó el número y la viabilidad de las mitocondrias aisladas tal y como se ha descrito con anterioridad. Las mitocondrias aisladas se suspendieron en 0,3 mL de tampón de respiración (250 mmol/L de sacarosa, 20 mmol/L de tampón K+-HEPES, pH 7,2, 0,5 mmol/L de K+-EGTA, pH 8,0) para el grupo de administración vascular o en 90 pL de tampón de respiración para el grupo de administración por nebulización y se utilizaron inmediatamente para el trasplante mitocondrial.
Modelo de IRI pulmonar murino
El protocolo experimental se muestra en la Figura 1. La cirugía se realizó según el procedimiento descrito con anterioridad con diversas modificaciones. En resumen, los ratones C57BL/6J (n = 29) se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg/kg) y se mantuvieron durante la cirugía con isoflurano inhalado al 0,5 %. Se realizó una intubación endotraqueal oral con un catéter de plástico de 20 G y se ventiló mecánicamente a los ratones con un volumen corriente de 10 mL/kg y una frecuencia respiratoria de 130 - 140 respiraciones/minuto. Se realizó una toracotomía izquierda en el 3° espacio intercostal y se expuso el hilio pulmonar izquierdo. El hilio izquierdo se ocluyó al final de la espiración durante 2 horas utilizando una pinza microvascular (Roboz Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, EE.UU.) y el volumen corriente se redujo a 7,5 mL/kg. La incisión quirúrgica se cubrió con una gasa empapada en solución de heparina que contenía (60UI de heparina/1ml). Al final del periodo de isquemia se retiró la pinza. Los animales se distribuyeron de manera aleatoria en 2 grupos experimentales: grupo de administración vascular (V) o de nebulización (Neb). En el grupo de administración vascular, al comienzo de la reperfusión, se administraron 1 x 108 mitocondrias en 0,3 ml de tampón de respiración (Mito V, n = 6) o 0,3 ml de tampón de respiración (Vehículo V, n = 7) al pulmón izquierdo mediante inyección en la arteria pulmonar izquierda utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de 40 G. En el grupo de administración, mediante nebulización, al inicio de la reperfusión se administraron 3 x 108 mitocondrias en 90 pl de tampón de respiración (Mito Neb, n = 6) o 90 pl de tampón de respiración (Vehículo Neb, n = 6) a todo el pulmón durante un tiempo total de 40 s (10 s de nebulización seguidos de 1 minuto de ventilación mecánica regular, repetido 4 veces). Se dejó que los ratones se recuperaran y se les devolvió a su jaula durante 24 horas. A los ratones de control simulados (Sham, n = 4) se les practicó una toracotomía sin pinzamiento hiliar y se les ventiló mecánicamente durante 2 horas antes de devolverlos a la jaula.
Biodistribución y captación mitocondrial
En experimentos adicionales, se utilizaron ratas Wistar (200-250 g, n = 6, Charles River Laboratories, Worcester, MA) para la visualización de la captación mitocondrial en el pulmón. Se utilizó una rata donante (n = 2) para el aislamiento de mitocondrias singénicas y el etiquetado mitocondrial con 18F-Rodamina 6G. Las ratas Wistar (n = 3) fueron anestesiadas y mantenidas con isoflurano inhalado al 2 - 3%. A continuación, en un conjunto de ratas, se realizó una esternotomía y se expuso el tronco pulmonar. Las mitocondrias marcadas con 18F-Rodamina 6G (1 x 109 en 0,5 mL de tampón de respiración) se administraron a los pulmones mediante inyección en el tronco pulmonar utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de 30 G.
En otro grupo de ratas Wistar (n = 3), se administraron mitocondrias marcadas con 18F-Rodamina 6G (1 x 109 en 0,3 mL de tampón de respiración) a los pulmones en forma de aerosol mediante nebulización. Diez minutos después de la administración de mitocondrias, se practicó la eutanasia a los animales en una cámara de CO2 y se obtuvieron imágenes mediante tomografía por emisión de positrones (PET) y tomografía microcomputarizada (gCT).
En un conjunto separado de ratones C57BL/6J (n = 4), se aislaron mitocondrias de fibroblastos cardíacos humanos tal como se describió previamente29 y se administraron al tejido pulmonar de ratón mediante nebulizador y a través de la arteria pulmonar. El uso de mitocondrias humanas en pulmones de ratón permitió la diferenciación entre las mitocondrias endógenas de ratón y las mitocondrias humanas trasplantadas basándose en la reactividad inmunológica a un anticuerpo monoclonal anti mitocondrias humanas (biotina-MTCO2, Abcam, Cambridge, MA). Las mitocondrias se detectaron con el anticuerpo anti mitocondrias humanas y se visualizaron con Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y cromógeno de sustrato AEC+ (Dako, Agilent, Santa Clara, CA) tal como se ha descrito con anterioridad.
Función pulmonar
Tras 24 horas de reperfusión, se anestesió a los ratones con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (70 mg/kg). Se practicó una traqueotomía y una intubación endotraqueal con un catéter de plástico de 18G y se ventiló mecánicamente a los ratones. A continuación, se practicaron una laparotomía media y una esternotomía para exponer el pulmón y se pinzó el hilio derecho para evaluar la función del pulmón izquierdo lesionado. La TV se redujo a 5 mL/kg y a continuación se conectaron los ratones al ventilador especializado para roedores (FlexiVent, SCIREQ, Montreal, Quebec, Canadá) para evaluar la cumplimiento dinámico del sistema respiratorio (cumplimiento dinámico), la resistencia del sistema respiratorio (resistencia), la amortiguación tisular (como indicador de la resistencia tisular periférica), la presión inspiratoria máxima y la capacidad inspiratoria del pulmón izquierdo.
Análisis tisular
Tras 24 horas de reperfusión se recogió el pulmón izquierdo y se dividió cada pulmón en 3 partes.
La parte superior del pulmón izquierdo se utilizó para evaluar el edema tisular calculando la relación de peso húmedo/seco (w/d). Inmediatamente después de la recogida, se pesó el pulmón (peso húmedo), se introdujo en un horno a 70°C durante 72 horas, se pesó de nuevo (peso seco) y se calculó la relación peso húmedo/peso seco (w/d).
La parte media del pulmón izquierdo se fijó inmediatamente en formalina al 10%. El tejido se embebió en parafina y se seccionó con un grosor de 5 gm. Se utilizaron secciones seriadas para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), la tinción con mieloperoxidasa y el ensayo TUNEL.
Las secciones teñidas con H&E se evaluaron para determinar la gravedad de la lesión pulmonar utilizando el sistema de puntuación descrito con anterioridad. Se analizaron cinco campos visuales aleatorios (15X) por sección. La lesión pulmonar se calificó de la siguiente manera: El grado 1 representaba una histología pulmonar normal; el grado 2 indicaba infiltraciones leucocitarias de neutrófilos leves y congestión intersticial de leve a moderada; el grado 3 representaba infiltración leucocitaria de neutrófilos moderada, formación de edema perivascular y destrucción parcial de la arquitectura pulmonar y el grado 4 incluía infiltración leucocitaria de neutrófilos densa, formación de abscesos y destrucción completa de la arquitectura pulmonar.
La tinción con mieloperoxidasa (MPO) se realizó tal como se ha descrito con anterioridad y se evaluaron las secciones para detectar la infiltración de neutrófilos. El número de neutrófilos se determinó en 5 campos visuales aleatorios (15X) por sección.
El ensayo TUNEL se realizó tal como se ha descrito con anterioridad29. El número de núcleos TUNEL-positivos se expresó como porcentaje de todas las células contadas en 16 campos visuales aleatorios (10x) por sección.
La parte basal del pulmón izquierdo se utilizó tal como se ha descrito con anterioridad para el microscopio electrónico de transmisión (MET) con el fin de analizar el daño estructural en el pulmón.
Análisis del lavado broncoalveolar (BAL)
Tras la evaluación de la función pulmonar, el pulmón izquierdo se sometió a un BAL utilizando 1 mL de solución salina. El líquido BAL se centrifugó de manera inmediata a 4°C a 500 x G durante 5 minutos, y el sobrenadante se recogió y almacenó a -80°C hasta su posterior análisis para determinar los niveles de expresión de citoquinas y quimioquinas mediante Eve Technology (Calgary, AB, Canadá). Se analizaron los siguientes biomarcadores: Eotaxina, G-CSF, GM-CSF, IFNgamma, IL-1 alfa, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IP-10, KC, LIF, LIX, MCP-1, M-CSF, MIG, MIP-1 alfa, MIP-1beta, MIP-2, RANTES, TNFalfa, VEGF. Todas las muestras se analizaron por triplicado.
Análisis estadístico
Todos los datos fueron recogidos por observadores a ciegas de los tratamientos. Todos los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba no paramétrica O de Mann-Whitney para todos los datos excepto los resultados del análisis BAL, en los que las comparaciones entre grupos se evaluaron con ANOVA unidireccional. La significación estadística se definió por una P exacta de dos colas menor que 0,05.
Resultados
Captación pulmonar de mitocondrias radiomarcadas
Las mitocondrias radiomarcadas con 18F-Rodamina 6G administradas por vía vascular (Figura 9A) o por nebulización (Figura 9B) fueron captadas de forma difusa por los pulmones y no estuvieron presentes en ninguna otra zona del cuerpo.
Captación de mitocondrias humanas por el tejido pulmonar
Las mitocondrias exógenas de fibroblasto cardíaco humano, administradas por vía vascular (Figura 10A) o por nebulización (Figura 10B), se detectaron dentro y alrededor de las células endoteliales pulmonares, los neumocitos, el parénquima y los alvéolos.
Rendimiento funcional pulmonar
Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, los ratones que recibieron mitocondrias por vía vascular presentaron un aumento significativo del Cumplimiento Dinámico (10,79 ± 1,11 pL/cmhbO) y la Capacidad Inspiratoria (0,24 ± 0,02 mL) y una disminución significativa de la Resistencia (2,02 ± 0,28 cmhbO), la Amortiguación Tisular (10,49 ± 0,91 cmH2O/mL) y la Presión Inspiratoria Máxima (9,48 ± 0,40 cmhbO) en comparación con el Vehículo V (5,91 ± 0,46, 0,127 ± 0,01, 3,33 ± 0,40, 20,02 ± 2,75 y 11,96 ± 0,74 respectivamente, siendo P menor que 0,05 cada uno; Figura 11A-E). Todos los parámetros funcionales pulmonares en el grupo Mito V no fueron significativamente diferentes en comparación con los pulmones Sham (9,75 ± 0,35, 0,18 ± 0,01, 1,51 ± 0,20, 9,46 ± 0,63 y 8,62 ± 0,20, respectivamente, siendo P mayor que 0,05 en cada uno; Figura 11A-E). Todos los parámetros en los pulmones del Vehículo V fueron significativamente diferentes (P menor que 0,05) en comparación con los pulmones Sham, excepto la Capacidad Inspiratoria (P mayor que 0,05).
Después de 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, los ratones que recibieron mitocondrias mediante nebulización, presentaron un aumento significativo del Cumplimiento Dinámico (7,88 ± 1,05 pL/cmH2O) y de la Capacidad Inspiratoria (0,18 ± 0,02 mL) y una disminución significativa de la Resistencia (2,13 ± 0,23 cmH2O), la Amortiguación Tisular (13,63 ± 1,55 cmH2O/mL) y la Presión Inspiratoria Máxima (10,18 ± 0,40 cmH2O) y en comparación con el Vehículo Neb (5,13 ± 0,93, 0,10 ± 0,02, 4,74 ± 0,83, 34,02 ± 5,04 y 11,82 ± 0,53 respectivamente, P menor que 0,05 en cada uno; Figura 12A-D).
Todos los parámetros funcionales pulmonares en el grupo Mito Neb no fueron significativamente diferentes en comparación con los pulmones Sham (9,75 ± 0,35, 0,18 ± 0,01, 1,51 ± 0,20 y 9,46 ± 0,63, respectivamente, siendo P mayor que 0,05 en cada uno; Figura 3D-F, I, J) excepto la presión inspiratoria máxima (8,62 ± 0,20, P menor que 0,05). Todos los parámetros en los pulmones de Vehículo Neb fueron significativamente diferentes (P menor que 0,05) en comparación con los pulmones de Sham.
Los bucles representativos de presión-volumen demostraron que Vehículo V y Vehículo Neb tenían una capacidad de volumen pulmonar inferior y presiones superiores en comparación con los grupos Mito V, Mito Neb y Sham (Figura 13).
Lesión del tejido pulmonar
El análisis H&E mostró una disminución significativa de la infiltración de células inflamatorias y de la congestión intersticial sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones Mito V y Mito Neb en comparación con los grupos Vehículo V y Vehículo Neb, respectivamente (grado 1,8 ± 0,1, grado 2,5 ± 0,1; respectivamente para el grupo de administración vascular; grado 1,7 ± 0,1, grado 2,5 ± 0,1; respectivamente para el grupo de nebulización, siendo P menor que 0,05, en ambos; Figura 14, Figura 15A-E). Se observó una mejora significativa de la preservación del tejido pulmonar en los pulmones Sham en comparación con todos los grupos (grado 1,3 ± 0,1, P menor que 0,05). Se observó una disminución significativa del recuento de neutrófilos en los grupos Mito V y Mito Neb en comparación con el Vehículo V y el Vehículo Neb, respectivamente (120,2 ± 5,5, 159,9 ± 6,5; respectivamente para el grupo de administración vascular; 77,8 ± 3,8, 125,7 ± 4,9; respectivamente para el grupo de nebulización, siendo P menor que 0,05, en ambos casos, Figura 14, Figura 15B, Figura 15E). El recuento de neutrófilos se redujo significativamente en los pulmones Sham (55,3 ± 3,6; siendo P menor que 0,05) en comparación con los pulmones Mito V, Vehículo V y Vehículo Neb. No se observaron diferencias significativas en el número de neutrófilos en el grupo Sham en comparación con Mito Neb (P mayor que 0,05).
El análisis TUNEL mostró un recuento significativamente menor de núcleos positivos a la apoptosis observados en los grupos Mito V y Mito Neb en comparación con Vehículo V y Vehículo Neb, respectivamente (1,38 ± 0,25, 1,55 ± 0,18; respectivamente para el grupo de administración vascular; 3,1 ± 0,38, 3,15 ± 0,25; respectivamente para el grupo de nebulización, siendo P menor que 0,05, en ambos casos). No hubo diferencias significativas en el recuento de núcleos positivos a la apoptosis en los pulmones Sham (0,3 ± 0,1, siendo P menor que 0,05) en comparación con los grupos Mito V y Mito Neb (Figura 14, Figura 15C, Figura 15F).
Tras 24 horas de reperfusión, la TEM del lóbulo inferior izquierdo mostró endotelios y membranas de la base conservados en los grupos Vehículo V y Neb y Mito V y Neb. No existen diferencias en el espacio alveolar. Esto indica que no hay daños en la membrana de base (Figura 4).
No se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de peso húmedo a seco entre el pulmón izquierdo del Vehículo V (88,9 ± 0,5%) y el pulmón derecho (87,1 ± 1,1%), el pulmón izquierdo del Mito V (88,5 ± 0,3%) y el pulmón derecho (88,3 ± 0. 6%), Vehículo Neb izquierdo (87,5 ± 1,1%) y pulmón derecho (89,2 ± 1,1%) y Mito Neb izquierdo (88,5 ± 1,2%) y pulmón derecho (89,3 ± 0,6%) y Sham izquierdo (88,7 ± 1,0%) y pulmón derecho (90,1 ± 1,0%; siendo P mayor que 0,05 en cada uno; Figura 15G).
Citoquinas del lavado broncoalveolar
A las 24 horas de la reperfusión, no hubo diferencias significativas en las citoquinas y quimioquinas entre los grupos (Figura 16).
Examen crítico
El daño mitocondrial, consistente en toxicidad inducida por especies reactivas de oxígeno, fallo de la bioenergética celular, apoptosis regulada al alza, producción de citoquinas e inmunidad innata, durante la IRI que desempeña una función importante en la lesión pulmonar aguda. En este estudio, hemos demostrado la eficacia y la seguridad del trasplante mitocondrial en un modelo murino de IRI pulmonar. Tras 24 horas de reperfusión después de una lesión isquémica, el trasplante mitocondrial mejora el rendimiento funcional pulmonar y disminuye la lesión del tejido pulmonar.
En estudios anteriores en los que se investigó la IRI pulmonar murina se utilizaron entre 60 y 90 minutos de tiempo de isquemia. Estos experimentos proporcionaron un análisis detallado del daño tisular pulmonar. Sin embargo, o bien no proporcionaron ningún análisis funcional o la función pulmonar se midió en un sistemaex vivono fisiológico y aislado. En nuestro estudio se utilizó la máquina FlexiVent para lograr mediciones funcionalesin vivo.Basándonos en nuestros experimentos preliminares, elegimos 2 horas de tiempo de isquemia. Tiempos de isquemia más cortos causaron un IRI pulmonar insuficiente y no permitirían la evaluación funcional y el análisis comparativo entre nuestros grupos de estudio. Se utilizaron mitocondrias radiomarcadas con 18F-Rodamina 6G para demostrar la distribución de las mitocondrias administradas. Administramos mitocondrias radiomarcadas mediante administración vascular o nebulización. Nuestros resultados muestran la distribución mitocondrial a través de los pulmones en ambos grupos. Las mitocondrias administradas como aerosol mediante nebulización se encontraron a lo largo de la tráquea y el árbol bronquial, lo que sugiere que las mitocondrias se adhieren al tejido de las vías respiratorias ya durante el primer contacto.
En nuestros estudios, se utilizaron mitocondrias humanas para determinar la captación celular de las mitocondrias trasplantadas. Las mitocondrias humanas permiten el etiquetado selectivo de las mitocondrias trasplantadas y, por lo tanto, excluyen la posibilidad de etiquetar las mitocondrias murinas endógenas. Las mitocondrias humanas se encontraron en todas las células de los pulmones, lo que demuestra que las mitocondrias administradas a través de la vasculatura o la nebulización se trasplantaron de forma eficaz.
En este estudio, se utilizaron dos métodos diferentes de administración de mitocondrias. Las mitocondrias pueden administrarse al órgano objetivo a través de la vasculatura. Para permitir un método menos invasivo, pero aún clínicamente relevante y de fácil utilización, se utilizó la administración por vía de nebulización como grupo de estudio adicional. Tras 24 horas de reperfusión, se observó una mejora funcional significativa en los pulmones que recibieron mitocondrias tanto por vía vascular como por nebulización en comparación con los pulmones del vehículo. En un parámetro funcional, la PIP, se observó una diferencia significativa entre Mito V frente a Vehículo V, pero no se observó ninguna diferencia significativa al comparar Mito Neb frente a Vehículo Neb. Esto podría implicar una mayor eficacia de las mitocondrias suministradas a través de la vasculatura. Sin embargo, esta observación podría explicarse por el hecho de que las mitocondrias administradas por nebulización no llegan tan lejos como las administradas por vasculatura, y habría sido preferible administrar una mayor concentración de mitocondrias debido a su captación también en la tráquea y en el árbol bronquial. Se pueden realizar experimentos para determinar la concentración óptima de mitocondrias administradas por nebulización que sean necesarios. También es importante señalar, que el análisis de tejidos mostró una mejora significativa de la viabilidad celular después de 24 horas de reperfusión tanto en Mito V como en Mito Neb en comparación con sus grupos Vehículo.
En conclusión, hemos demostrado la eficacia y la seguridad del trasplante mitocondrial en un modelo murino de IRI pulmonar. Tras 24 horas de reperfusión después de una lesión isquémica, el trasplante mitocondrial mejora la función pulmonar y disminuye la lesión del tejido pulmonar. Estos resultados sugieren que esta terapia puede utilizarse para proteger el tejido pulmonar de la IRI, reduciendo de este modo la morbilidad y la mortalidad en varios escenarios clínicos tales como: trasplante pulmonar, reanimación cardiopulmonar, embolia pulmonar, sepsis y eventos y procedimientos hipotensivos durante el bypass cardiopulmonar o el soporte circulatorio mecánico.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una composición aerosolizada que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de mitocondrias para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece un trastorno respiratorio, comprendiendo el método la administración de dicha composición al sujeto a través de las vías respiratorias, en donde la composición comprende mitocondrias adecuadas para la respiración.
2. La composición aerosolizada para uso según la reivindicación 1, en donde la composición se convierte en forma de aerosol antes de su administración al sujeto mediante un nebulizador, un vaporizador, un pulverizador nasal, un inhalador dosificador presurizado o un inhalador dosificador presurizado activado por la respiración.
3. La composición aerosolizada para uso según la reivindicación 2, en donde la forma de aerosol de la composición comprende gotículas que tienen un tamaño medio de 0,01 a 1000 microlitros.
4. La composición aerosolizada para uso según la reivindicación 1, en donde el sujeto presenta una lesión pulmonar aguda, insuficiencia respiratoria, función respiratoria reducida, inflamación pulmonar, carcinoma pulmonar, arrugas en la piel, calvicie y/o cáncer.
5. La composición aerosolizada para uso según la reivindicación 1, en donde la concentración de mitocondrias en la composición es de aproximadamente 1x105 a 5x108 ml-1, y/o en donde se administra al sujeto aproximadamente de 1x105 a 1 x109 de mitocondrias por dosis.
6. La composición aerosolizada para uso según la reivindicación 1, en donde las mitocondrias son autogénicas, alogénicas o xenogénicas.
7. La composición aerosolizada para uso según la reivindicación 1, en donde la composición comprende, además, una solución seleccionada de entre el grupo constituido por: K+-HEPES con un pH de 7 a 8, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), suero y plasma, y/o en donde la composición comprende, además, uno o más osmolitos seleccionados de entre el grupo constituido por: trehalosa, sacarosa, manosa, glicina, prolina, glicerol, manitol, sorbitol, betaína y sarcosina, y/o en donde la composición comprende, además, un agente farmacéutico, y/o en donde la composición comprende, además, un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
8. La composición aerosolizada para uso según la reivindicación 1, en donde la composición comprende, además, un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a la mitocondria por un enlace covalente, está integrado en la mitocondria o está internalizado dentro de la mitocondria, de manera opcional en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico es un agente de diagnóstico terapéutico, o de manera opcional, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o de manera opcional, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a la mitocondria por un enlace covalente, o de manera opcional, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está integrado o internalizado dentro de la mitocondria.
9. La composición aerosolizada para uso según la reivindicación 1, en donde las mitocondrias están modificadas genéticamente, o en donde las mitocondrias comprenden polipéptidos exógenos, o en donde las mitocondrias comprenden polinucleótidos exógenos, ADN, ARN, ARNm, micro ARNs, ARN nuclear o SiARN.
10. La composición aerosolizada para uso según la reivindicación 1, en donde las mitocondrias son mitocondrias viables adecuadas para la respiración.
11. Una composición aerosolizada que comprende una pluralidad de gotículas líquidas que comprenden un tampón, en donde al menos una gotícula líquida de la pluralidad de gotículas líquidas comprende al menos una mitocondria.
12. La composición aerosolizada según la reivindicación 11, en donde el tampón se selecciona de entre el grupo constituido por: K+-HEPES con un pH de 7 a 8, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), suero y plasma, y/o en donde la composición comprende, además, uno o más osmolitos seleccionados de entre el grupo constituido por: trehalosa, sacarosa, manosa, glicina, prolina, glicerol, manitol, sorbitol, betaína y sarcosina, y/o en donde la composición comprende, además, un agente farmacéutico, y/o en donde la composición comprende, además, un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
13. La composición aerosolizada según la reivindicación 11, en donde la composición comprende, además, un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a la mitocondria por un enlace covalente, estando integrado en la mitocondria o estando internalizado dentro de la mitocondria.
14. La composición aerosolizada según la reivindicación 11, en donde la composición comprende, además, un agente mitocondrial, en donde el agente mitocondrial se selecciona de entre el grupo constituido por un agente terapéutico, un agente quimioterapéutico o un agente de diagnóstico, o de manera opcional en donde el agente mitocondrial comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno, o de manera opcional en donde el agente mitocondrial está unido a la mitocondria por un enlace covalente, o de manera opcional en donde el agente mitocondrial está integrado o internalizado dentro de la mitocondria.
15. La composición aerosolizada según la reivindicación 11, en donde la mitocondria está modificada genéticamente, o en donde la mitocondria comprende polipéptidos exógenos, o en donde la mitocondria comprende polinucleótidos exógenos, o en donde la mitocondria antes de su administración al sujeto se incuba con una composición que comprende una enzima.
16. La composición aerosolizada según la reivindicación 11, en donde la composición comprende mitocondrias autogénicas, mitocondrias alogénicas, mitocondrias xenogénicas o una mezcla de las mismas, y/o en donde la composición comprende aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1014, aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 1013, aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 1012, aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1011, aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1010, aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 107, aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 106, aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1014, o aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1013, aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1012, aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 108; o al menos o aproximadamente 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, o al menos o aproximadamente 1 x 1014 mitocondrias, y/o en las que la pluralidad de gotículas tiene un tamaño medio de 0,01 a 1000 microlitros.
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