ES2988145T3 - Anticuerpos humanizados contra c-kit - Google Patents

Abstract

La invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a c-Kit y métodos para utilizar dichos anticuerpos en el reemplazo de células madre y el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos humanizados contra c-kit

ANTECEDENTES

[0001]c-Kit (CD117) es un receptor tirosina quinasa de tipo III, que se une al factor de células madre (SCF), una sustancia que provoca el crecimiento de ciertos tipos de células, también conocida como "factor de acero" o "ligando de c-Kit". Cuando este receptor se une al factor de células madre, forma un dímero que activa su actividad tirosina quinasa intrínseca, que a su vez fosforila y activa moléculas de transducción de señales que propagan la señal en la célula. C-Kit es un marcador de superficie celular utilizado para identificar determinados tipos de HSPC en la médula ósea. Las células madre hematopoyéticas (HSC), los progenitores multipotentes (MPP) y los progenitores mieloides comunes (CMP) expresan altos niveles de c-Kit. Se ha propuesto que los anticuerpos contra c-Kit pueden utilizarse para ablacionar células endógenas en la terapia de sustitución de células madre (WO2016033201, WO2008067115). El documento US 2007/253951 describe anticuerpos c-Kit humanizados. El documento WO 2014/018625 describe anticuerpos anti-KIT y sus usos. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN REIVINDICADA

[0002]La invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a c-Kit humano que comprende una región variable pesada madura que tiene una secuencia de SEQ ID N.°: 13 excepto que la posición 1 puede ser E, y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de SEQ ID N.°: 53.

[0003]La invención proporciona además un anticuerpo de la invención expresado a partir de una célula CHO.

[0004]La invención proporciona además un ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada madura y la región variable de cadena ligera madura como se define según la invención.

[0005]La invención proporciona además una célula huésped que comprende un ácido nucleico de la invención.

[0006]Se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un anticuerpo que se une específicamente a c-Kit humano que comprende una región variable pesada madura que comprende CDR H1, H2 y H3 según la definición de Kabat de SEQ ID N.°:2-4 respectivamente, y una región variable de cadena ligera madura que comprende CDR L1, L2 y L3 según la definición de Kabat de SEQ ID N.°:6-8 respectivamente excepto que 1, 2, o 3 sustituciones de residuos CDR están presentes seleccionadas de N a A en la posición 60 de la cadena pesada, K a Q en la posición 64 de la cadena pesada y N a Q en la posición 30 de la cadena ligera, numerándose las posiciones según Kabat.

[0007]Opcionalmente, las CDR H1, H2 y H3 definidas por Kabat son SEQ ID N.°:2-4 respectivamente, y las CDR L1, L2 y L3 definidas por Kabat son SEQ ID N.°:6-8 respectivamente excepto que las sustituciones de K a Q en la posición 64 de la cadena pesada y de N a Q en la posición 30 de la cadena ligera están presentes.

[0008]Opcionalmente, las CDR H1, H2 y H3 definidas por Kabat son SEQ ID N.°:2-4 respectivamente, y las CDR L1, L2 y L3 definidas por Kabat son SEQ ID N.°:6-8 respectivamente excepto que las sustituciones de N a A en la posición 60 de la cadena pesada, K a Q en la posición 64 de la cadena pesada y N a Q en la posición 30 de la cadena ligera están presentes.

[0009]Opcionalmente, la región variable de la cadena pesada madura muestra al menos un 85, 90, 95, 98, o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.°:13, 17 o 21 (AH2, AH3 o AH4) y la región variable de la cadena ligera madura muestra al menos un 85, 90, 95, 98, o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID N.°:53 (NL2) siempre que cualquier variación con respecto a la SEQ ID N.° indicada esté fuera de las CDR.

[0010]Opcionalmente, la posición 1 de la cadena pesada según la numeración de Kabat es E. Opcionalmente, las siguientes posiciones de la región variable de la cadena ligera madura están ocupadas por aminoácidos como sigue: Posición 9 ocupada por L, Posición 12 ocupada por P, Posición 14 ocupada por T, Posición 15 ocupada por P, Posición 18 ocupada por P, Posición 20 ocupada por S, Posición 22 ocupada por S, Posición 37 ocupada por L, Posición 43 ocupada por S, Posición 45 ocupada por Q, Posición 74 ocupada por K, Posición 77 ocupada por R, Posición 78 ocupada por V, Posición 79 ocupada por E, Posición 84 ocupada por G. Opcionalmente, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID N.°: 13, 17 o 21 excepto que la posición 1 puede ser E, y la región variable de la cadena ligera madura tiene una secuencia de SEQ ID N.°:53. Opcionalmente, la región variable de cadena pesada madura está unida a una región constante de cadena pesada y la región variable de cadena ligera madura está unida a una región constante de cadena ligera madura. Opcionalmente, la región constante de la cadena pesada es IgG1 humana. Opcionalmente, el anticuerpo tiene una unión mejorada a c-Kit humano en relación con AMG191. Opcionalmente, el anticuerpo tiene un ADCP mejorado en relación con AMG191-lgG1. Opcionalmente, el anticuerpo ha mejorado la ADCC en relación con AMG191-lgG1.

[0011]La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como el descrito anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0012]La invención proporciona además un anticuerpo como se define en la reivindicación 1 para su uso en un método de ablación de HSPC endógenas, en el que el método comprende administrar un régimen eficaz de un anticuerpo como se ha descrito anteriormente a un sujeto que necesita ablación.

[0013]La invención proporciona además un anticuerpo como se define en la reivindicación 1 para su uso en un método de tratamiento de un cáncer que expresa c-Kit, en el que el método comprende administrar un régimen eficaz de un anticuerpo a un sujeto que tiene el cáncer.

DEFINICIONES

[0014]Los anticuerpos monoclonales u otras entidades biológicas se suministran típicamente en forma aislada. Esto significa que un anticuerpo u otra entidad biológica suele tener una pureza de al menos el 50% p/p de proteínas interferentes y otros contaminantes derivados de su producción o purificación, pero no excluye la posibilidad de que el anticuerpo monoclonal se combine con un exceso de portador(es) farmacéuticamente aceptable(s) u otro vehículo destinado a facilitar su uso. A veces, los anticuerpos monoclonales tienen una pureza de al menos el 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% p/p de proteínas interferentes y contaminantes procedentes de la producción o purificación. A menudo, un anticuerpo monoclonal aislado u otra entidad biológica es la especie macromolecular predominante que queda tras su purificación.

[0015]La unión específica es detectablemente superior en magnitud y distinguible de la unión inespecífica que se produce con al menos una diana no relacionada. La unión específica puede ser el resultado de la formación de enlaces entre grupos funcionales concretos o de un ajuste espacial particular (por ejemplo, tipo cerradura y llave), mientras que la unión inespecífica suele ser el resultado de fuerzas de van der Waals. Sin embargo, la unión específica no implica necesariamente que un anticuerpo se una a una sola diana. Los anticuerpos de la invención típicamente se unen específicamente a c-Kit con una afinidad de al menos 108, 109, 1010, 1011 o 1012 M-1.

[0016]La unidad estructural básica del anticuerpo es un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par con una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de entre 100 y 110 aminoácidos o más, responsable principalmente del reconocimiento del antígeno. Esta región variable se expresa inicialmente unida a un péptido señal escindible. La región variable sin el péptido señal se denomina a veces región variable madura. Así, por ejemplo, una región variable madura de cadena ligera significa una región variable de cadena ligera sin el péptido señal de cadena ligera. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora.

[0017]Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de unos 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también incluye una región "D" de unos 10 o más aminoácidos. Véase en general, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7.

[0018]Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (también denominada en el presente documento "dominio variable de cadena ligera" ("dominio VL") o "dominio variable de cadena pesada" ("dominio VH"), respectivamente) consta de una región "de entramado" interrumpida por tres "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las regiones de entramado sirven para alinear las CDR para la unión específica a un epítopo de un antígeno. Las CDR incluyen los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son los principales responsables de la unión al antígeno. Desde el amino-terminal hasta el carboxilo-terminal, los dominios VL y VH comprenden las siguientes regiones de entramado (FR) y CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4. Las CDR 1,2, y 3 de un dominio VL también se denominan en el presente documento, respectivamente, CDR-L1, CDR-L2, y CDR-L3; las CDR 1, 2, y 3 de un dominio VH también se denominan en el presente documento, respectivamente, CDR-H1, CDR-H2, y CDR-H3.

[0019]La asignación de aminoácidos a cada dominio VL y VH se ajusta a cualquier definición convencional de CDR. Las definiciones convencionales incluyen la definición de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991), la definición de Chothia (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); un compuesto de CDR de Chothia Kabat en el que CDR-H1 es un compuesto de CDR de Chothia y Kabat; la definición AbM utilizada por el software de modelado de anticuerpos de Oxford Molecular; y, la definición de contacto de Martin et al. (world wide web bioinfo.org.uk/abs). Kabat proporciona una convención de numeración ampliamente utilizada (numeración de Kabat) en la que a los residuos correspondientes entre diferentes cadenas pesadas o entre diferentes cadenas ligeras se les asigna el mismo número. A menos que se especifique lo contrario, la numeración de las posiciones dentro de las regiones variables de los anticuerpos es la numeración de Kabat. Cuando se dice que un anticuerpo comprende CDR según una determinada definición de CDR (por ejemplo, Kabat), dicha definición especifica el número mínimo de residuos CDR presentes en el anticuerpo (es decir, los CDR de Kabat). No excluye que también estén presentes otros residuos incluidos en otra definición convencional de CDR pero fuera de la definición especificada. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende CDR definidas por Kabat incluye, entre otras posibilidades, un anticuerpo en el que las CDR contienen residuos de CDR de Kabat y ningún otro residuo de CDR, y un anticuerpo en el que la c Dr H1 es una CDR H1 compuesta de Chothia-Kabat y otras CDR contienen residuos de CDR de Kabat y ningún residuo de CDR adicional basado en otras definiciones.

[0020]El término "anticuerpo" incluye anticuerpos intactos y fragmentos de unión de los mismos. Por lo general, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del que derivan por la unión específica a la diana, incluidas las cadenas pesadas separadas, las cadenas ligeras Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dabs, nanocuerpos, y Fv. Los fragmentos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o por separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" también incluye un anticuerpo biespecífico y/o un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares diferentes de cadenas pesadas/ligeras y dos sitios de unión diferentes (véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)).

[0021]Los anticuerpos biespecíficos ejemplares también pueden ser: (1) un anticuerpo de doble dominio variable (DVD-Ig), en el que cada cadena ligera y cada cadena pesada contienen dos dominios variables en tándem a través de un enlace peptídico corto (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, En: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) un Tandab, que es una fusión de dos diabodies de cadena simple que da lugar a un anticuerpo biespecífico tetravalente que tiene dos sitios de unión para cada uno de los antígenos diana; (3) un flexibody, que es una combinación de scFvs con un diabody que da lugar a una molécula multivalente; (4) una molécula denominada "dock and lock", basada en el "dominio de dimerización y acoplamiento" de la proteína quinasa A, que, cuando se aplica a Fabs, puede dar lugar a una proteína de unión biespecífica trivalente consistente en dos fragmentos Fab idénticos unidos a un fragmento Fab diferente; o (5) una molécula denominada Scorpion, que comprende, por ej., dos scFv fusionados a ambos extremos de una región Fc humana. Algunos ejemplos de plataformas útiles para preparar anticuerpos biespecíficos son BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab y Mab2 (F-star), Fc-engineered IgGI (Xencor) o DuoBody (basado en el intercambio del brazo Fab, Genmab).

[0022]El término "epítopo" se refiere a un lugar de un antígeno al que se une un anticuerpo. Un epítopo puede estar formado por aminoácidos contiguos o no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una o más proteínas. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos (también conocidos como epítopos lineales) suelen conservarse al exponerlos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario (también conocidos como epítopos conformacionales) suelen perderse al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo suele incluir al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).

[0023]La competencia entre anticuerpos se determina mediante un ensayo en el que un anticuerpo sometido a prueba inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Un anticuerpo de prueba compite con un anticuerpo de referencia si un exceso de un anticuerpo de prueba (por ejemplo, al menos 2x, 5x, 10x, 20x o 100x) inhibe la unión del anticuerpo de referencia en al menos un 50% medido en un ensayo de unión competitiva. Algunos anticuerpos de prueba inhiben la unión del anticuerpo de referencia al menos en un 75%, 90% o 99%. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competencia (anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que se produzca impedimento estérico.

[0024]El término "farmacéuticamente aceptable" significa que el portador, diluyente, excipiente, o auxiliar es compatible con los demás ingredientes de la formulación y no es sustancialmente nocivo para el receptor de la misma y/o que dicho portador diluyente, excipiente o auxiliar está aprobado o puede ser aprobado por la FDA para su inclusión en una composición farmacéutica para administración parenteral a seres humanos.

[0025]El término "sujeto" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

[0026]A efectos de clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos se agrupan de la siguiente manera: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras implican sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Las sustituciones no conservativas consisten en cambiar un miembro de una de estas clases por otro de otra.

[0027]Las identidades de secuencia porcentuales se determinan con las secuencias de anticuerpos alineadas al máximo según la convención de numeración de Kabat. Tras el alineamiento, si se compara una región del anticuerpo sujeto (por ejemplo, toda la región variable madura de una cadena pesada o ligera) con la misma región de un anticuerpo de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones del anticuerpo sujeto y de referencia es el número de posiciones ocupadas por el mismo aminoácido tanto en la región del anticuerpo sujeto como en la de referencia dividido por el número total de posiciones alineadas de las dos regiones, sin contar los huecos, multiplicado por 100 para convertir a porcentaje.

[0028] Las composiciones o métodos que "comprenden" o "incluyen" uno o más elementos recitados pueden incluir otros elementos no recitados específicamente. Por ejemplo, una composición que "comprende" o "incluye" un anticuerpo puede contener el anticuerpo solo o en combinación con otros ingredientes.

[0029] La designación de un rango de valores incluye todos los enteros dentro del rango o que lo definen, y todos los subrangos definidos por enteros dentro del rango.

[0030] Salvo que se deduzca lo contrario del contexto, el término "aproximadamente" abarca variaciones insustanciales, como valores dentro de un margen estándar de error de medición (por ejemplo, SEM) de un valor declarado.

[0031] Significación estadística significa p<0,05.

[0032] Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado genéticamente en el que las CDR de un anticuerpo "donante" no humano se injertan en secuencias de anticuerpos "aceptores" humanos (véanse, por ejemplo, Queen, Us 5.530.101 y 5.585.089; Winter, US 5.225.539; Carter, US 6.407.213; Adair, US 5.859.205; y Foote, US 6.881.557). Las secuencias de anticuerpos aceptores pueden ser, por ejemplo, una secuencia de anticuerpos humanos maduros, un compuesto de tales secuencias, una secuencia consenso de secuencias de anticuerpos humanos, o una secuencia de región de línea germinal. Así, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene CDR total o sustancialmente de un anticuerpo donante y secuencias de entramado de región variable y regiones constantes, si están presentes, total o sustancialmente de secuencias de anticuerpos humanos. Una CDR de un anticuerpo humanizado es sustancialmente de una CDR correspondiente de un anticuerpo no humano cuando al menos el 85%, 90%, 95% o 100% de los residuos correspondientes (según la definición de Kabat) son idénticos entre las CDR respectivas. Las secuencias de entramado de región variable de una cadena de anticuerpos o la región constante de una cadena de anticuerpos proceden sustancialmente de una secuencia de entramado de región variable humana o de una región constante humana, respectivamente, cuando al menos el 85%, 90%, 95% o 100% de los residuos correspondientes definidos por Kabat son idénticos a una secuencia aceptora humana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0033]

Las Figs. 1A y 1B muestran las regiones variables maduras de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-c-Kit de ratón producido por un hibridoma depositado como HB-10716.

Las Fig. 2A y 2B muestran las regiones variables maduras de cadena pesada y ligera de cinco regiones variables maduras de cadena pesada humanizadas y dos regiones variables maduras de cadena ligera humanizadas comparadas con secuencias aceptoras de ratón y humanas. Los entramados de las regiones variables de las secuencias humanizadas son los mismos que los de AMG191, pero las CDR son diferentes.

La Fig. 2C compara la unión de AMG191 con variantes de la misma que tienen sustituciones de CDR. Todas las variantes con CDR sustituidas mostraron una unión mejorada.

La Fig. 2D compara la unión de AMG191 con variantes que tienen otras sustituciones de CDR. Estas variantes mostraron una unión reducida.

Las Figs. 3A y 3B proporcionan la secuencia de seis regiones variables maduras de cadena pesada humanizadas y tres regiones variables maduras de cadena ligera humanizadas comparadas con AMG191, secuencias de ratón y secuencias aceptoras humanas. En estas cadenas humanizadas, los entramados de la región variable difieren de los del anticuerpo AMG191. Algunas de las cadenas humanizadas también difieren en las CDR.

La Fig. 3C compara la unión de AMG191 a un anticuerpo humanizado con las mismas CDR pero diferentes entramados de región variable (derivados del uso de diferentes secuencias aceptoras humanas). El anticuerpo con los nuevos entramados (NF) tiene mayor afinidad.

La Fig. 3D compara la unión de AMG191 a variantes humanizadas adicionales basadas en los nuevos entramados y que también tienen sustituciones de CDR relativas a AMG191. Los tres anticuerpos variantes tenían mayor afinidad.

La Fig. 4 compara la unión de AMG191 a tres anticuerpos humanizados que difieren de AMG191 por la presencia de sustituciones de CDR y un entramado de región variable de cadena ligera diferente (siendo el entramado de región variable de cadena pesada el mismo). Los tres anticuerpos variantes tenían mayor afinidad.

La Fig. 5 compara la actividad fagocítica de AMG191, una variante de AMG191 que tiene una región constante IgG1 de tipo salvaje, con cinco nuevos anticuerpos humanizados. Las nuevas variantes, en particular HF12 y NF112, mostraron un aumento de la fagocitosis, sobre todo a las concentraciones más bajas ensayadas.

La Fig. 6 compara la actividad ADCC de AMG191 con dos nuevas variantes humanizadas HF112 y HF12 y un control irrelevante emparejado por isotipo. HF112 y HF12 tuvieron más actividad ADCC. La Fig. 7 muestra la inhibición de la proliferación de HSPC inducida por SCF mediante HF12 y HF112 en comparación con AMG191, AMG191-IgG1 humana y un control negativo.

La Fig. 8 compara la degranulación de mastocitos de los anticuerpos anti-c-Kit en comparación con los controles positivos A23187 y IgE anti-IgE.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

[0034]

SEQ ID N.°:1-4 son la región variable pesada madura y las CDR-H1, H2 y H3 del anticuerpo de HB-10716.

SEQ ID N.°:S-8 son la región variable de la cadena ligera madura y las CDR-L1, L2 y L3 del anticuerpo de HB-10716.

SEQ ID N.°:9-12 son la región variable de la cadena pesada madura y las CDR-H1, H2 y H3 de la cadena pesada humanizada AH1.

SEQ ID N.°:13-16 son la región variable de la cadena pesada madura y las CDR-H1, H2 y H3 de la cadena pesada humanizada AH2.

SEQ ID N.°:17-20 son la región variable de la cadena pesada madura y las CDR-H1, H2 y H3 de la cadena pesada humanizada AH3.

SEQ ID N.°:21-24 son la región variable de la cadena pesada madura y las CDR-H1, H2 y H3 de la cadena pesada humanizada AH4.

SEQ ID N.°:25-28 son la región variable de la cadena pesada madura y las CDR-H1, H2 y H3 de la cadena pesada humanizada AH5.

SEQ ID N.°:29 es la región variable de la cadena pesada madura de AMG191.

SEQ ID N.°:30 es una secuencia de región variable de IGHV1-46*01.

SEQ ID N.°:31-34 son la región variable de la cadena ligera madura y las CDR-L1, L2 y L3 de la región variable de la cadena ligera humanizada AL1.

SEQ ID N.°:35-38 son la región variable de la cadena ligera madura y las CDR-L1, L2 y L3 de la cadena ligera humanizada AL2.

SEQ ID N.°:39 es la región variable de la cadena ligera madura de AMG191.

SEQ ID N.°:40-43 son la secuencia de la región variable y tres CDR-L1, L2 y L3, de IGKV4-1*01. SEQ ID N.°:44-50 son la región variable de la cadena pesada madura de las cadenas pesadas humanizadas NH, NH1, NH2, NH3, NH4 y NH5 y IGHV3-23*01.

SEQ ID N.°:51-54 son las regiones variables de la cadena ligera madura de las cadenas ligeras humanizadas NL, NL1, NL2, y IGKV2-28*01.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

I. General

[0035]La divulgación técnica que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la divulgación que no entran en el ámbito de las reivindicaciones se facilitan a título informativo.

[0036]Aquí se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a c-Kit humano (Swiss Prot P10721). Los anticuerpos representan formas humanizadas del anticuerpo anti-c-Kit de ratón previamente divulgado, producido por el hibridoma depositado como HB-10716, que tiene regiones variables maduras de cadena pesada y ligera de SEQ ID N.°:1 y 5 respectivamente. Este anticuerpo de ratón se ha humanizado previamente como AMG191 (véase el documento US 7915391). Las CDR Kabat del AMG191 son las mismas que las del anticuerpo de ratón del que se derivó. AMG191 está disponible comercialmente en Creative Biolabs.

[0037]Los presentes anticuerpos tienen CDR sustancialmente del anticuerpo de ratón depositado como HB-10716 injertado en secuencias aceptoras humanas, opcionalmente con sustituciones en ciertas posiciones como se describe más adelante. La invención se refiere a los anticuerpos definidos en las reivindicaciones.

[0038]Algunos anticuerpos comprenden una región variable pesada madura que comprende las CDR H1, H2 y H3 de SEQ ID N.°:1, y una región variable de cadena ligera madura que comprende las CDR L1, L2 y L3 de SEQ ID N.°:5 siempre que esté presente al menos una sustitución de residuos CDR. Las CDR H1, H2 y H3 comprenden preferiblemente SEQ ID N.°:2-4 respectivamente y las CDR L1, L2 y L3 comprenden preferiblemente SEQ ID N.°:6-8 (es decir, según la definición de Kabat) siempre que esté presente al menos una sustitución de CDR. La sustitución CDR se selecciona preferentemente de N a A en la posición 60 de la cadena pesada, de K a Q en la posición 64 de la cadena pesada y de N a Q en la posición 30 de la cadena ligera, numerándose las posiciones según Kabat. Puede haber una, dos o las tres sustituciones. Algunos anticuerpos incluyen las sustituciones en la posición 64 de la cadena pesada y en la posición 30 de la cadena ligera. Algunos anticuerpos incluyen las sustituciones en la posición 60 de la cadena pesada, en la posición 64 de la cadena pesada y en la posición 30 de la cadena ligera. Algunos anticuerpos incluyen las sustituciones en la posición 60 de la cadena pesada y en la posición 30 de la cadena ligera. Algunos anticuerpos incluían las sustituciones en la posición 60 de la cadena pesada y en la posición 64 de la cadena pesada. Algunos anticuerpos no tienen sustituciones de las CDR de Kabat, excepto las sustituciones en las posiciones 60 y 64 de la cadena pesada y en la posición 30 de la cadena ligera, individualmente o en las combinaciones enumeradas. Si hay otras sustituciones de los CDR de Kabat, se prefiere que no haya más de 1, 2, 3, 4, o 5 sustituciones de este tipo.

[0039]Algunos de los presentes anticuerpos difieren de AMG191 por la presencia de al menos una sustitución de un residuo CDR en relación con el residuo presente en AMG191. Las sustituciones preferidas son de N a A en la posición 60 de la cadena pesada, de K a Q en la posición 64 de la cadena pesada y de N a Q en la posición 30 de la cadena ligera, numerándose las posiciones según Kabat. Puede haber una, dos o las tres sustituciones. Algunos anticuerpos incluyen las sustituciones en la posición 64 de la cadena pesada y en la posición 30 de la cadena ligera. Algunos anticuerpos incluyen las sustituciones en la posición 60 de la cadena pesada, en la posición 64 de la cadena pesada y en la posición 30 de la cadena ligera. Algunos anticuerpos incluyen las sustituciones en la posición 60 de la cadena pesada y en la posición 30 de la cadena ligera. Algunos anticuerpos incluían las sustituciones en la posición 60 de la cadena pesada y en la posición 64 de la cadena pesada. Algunos anticuerpos no tienen sustituciones relativas a las CDR de Kabat de AMG191 excepto las sustituciones en las posiciones 60 y 64 de la cadena pesada y en la posición 30 de la cadena ligera individualmente o en las combinaciones enumeradas. Si hay otras sustituciones de los CDR de Kabat, se prefiere que no haya más de 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de este tipo.

[0040]Las sustituciones de CDR en las posiciones 60 y 64 de la cadena pesada y en la posición 30 de la cadena ligera, individualmente y en combinación, pueden conferir una mayor afinidad de unión a c-Kit humano. Las sustituciones también representan la sustitución de un residuo de ratón por un residuo de línea germinal humana para una posición, por lo que, en igualdad de condiciones, aumenta el carácter humano del anticuerpo humanizado. En la Tabla 1 se comparan los residuos que ocupan las posiciones 60 y 64 de la cadena pesada y la posición 30 de la cadena ligera en el anticuerpo de ratón depositado como HB-10716, AMG191 y tres de los presentes anticuerpos humanizados:

Tabla 1

[0041]Adicional o alternativamente, algunos de los presentes anticuerpos humanizados difieren de los de AMG191 por la presencia de diferentes secuencias de entramado de región variable. AMG191 se derivó injertando secuencias CDR de ratón en los entramados de la línea germinal de IGHV1-46*01 IGKV4-1*01 para las cadenas pesada y ligera respectivamente. La presente divulgación proporciona el injerto de CDR en una estructura de región variable de cadena pesada de IGH3-23*0l y un entramado de región variable de cadena ligera de IGKV2-28*01. Se ha descubierto que estos entramados confieren una mayor afinidad de unión que los de AMG191. Algunos anticuerpos preferidos de la invención incluyen un entramado de región variable de cadena pesada basado en IGHV1-46*01 que incorpora las mismas mutaciones posteriores que en la región variable de cadena pesada de AMG191 y un entramado de región variable de cadena ligera basado en IGKV2-28*01. Tal combinación de entramados combina ventajas de afinidad mejorada en relación con AMG191 con expresión mejorada sobre anticuerpos con una combinación de un entramado de región variable de cadena pesada de IGH3-23*01 y un entramado de región variable de cadena ligera de IGKV2-28*01.

[0042]Así, algunos anticuerpos preferidos divulgados en el presente documento tienen una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de cualquiera de las cadenas designadas SEQ ID N.°:13, 17 o 21 correspondientes a AH2, AH3, y AH4 y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de SEQ ID N.°:53 correspondiente a NL2. Las secuencias de la región variable de la cadena pesada difieren entre sí por tener sustituciones CDR en la posición 60 de la cadena pesada solamente, en la posición 64 de la cadena pesada solamente, o en las posiciones 60 y 64 de la cadena pesada, todas por numeración de Kabat. Aparte de las sustituciones de CDR, las secuencias de la región variable de la cadena pesada son las mismas que las de la región variable de la cadena pesada madura de AMG191. Las secuencias de cadena pesada de SEQ ID N.°:13, 17 y 21 incluyen sustituciones de entramado de región variable (es decir, residuo aceptor humano a donante de ratón) en las posiciones de Kabat 71 (R a A), 73 (T a K) y 78 (V a A). Hay una sustitución adicional en la posición 69 de M a I.

[0043]La región variable de cadena ligera madura de SEQ ID N.°:53 tiene una sustitución de CDR en la posición 30. La región variable de la cadena ligera madura de SEQ ID N.°:53 también difiere de la región variable de la cadena ligera madura de AMG191 en varias posiciones en el entramado de la región variable como sigue debido a las diferentes selecciones de aceptor:

Posición 9 ocupada por L

Posición 12 ocupada por P

Posición 14 ocupada por T

Posición 15 ocupada por P

Posición 18 ocupada por P

Posición 20 ocupada por S

Posición 22 ocupada por S

Posición 37 ocupada por L

Posición 43 ocupada por S

Posición 45 ocupada por Q

Posición 74 ocupada por K

Posición 77 ocupada por R

Posición 78 ocupada por V

Posición 79 ocupada por E

Puesto 84 ocupado por G.

[0044]La región variable de la cadena ligera madura de SEQ ID N.°:53 no contiene ninguna mutación retrospectiva del entramado de la región variable a residuos de ratón de la línea germinal humana.

[0045]También se divulgan en el presente documento anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera que representan variantes de secuencias ejemplificadas. Por ejemplo, anticuerpos que tienen una región variable de cadena pesada madura que tiene al menos 85%, 90%, 95%, 98 o 99% de identidad con cualquiera de las SEQ ID N.°:13, 17 o 21 y una región variable de cadena ligera madura que tiene al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N.°:53. Cualquier variación de las secuencias designadas se encuentra preferentemente fuera de las CDR definidas por Kabat. También es preferible que la variación no se produzca en las posiciones del entramado de la región variable objeto de mutaciones retrospectivas en las secuencias indicadas (posiciones 71, 73 y 78 según la numeración de Kabat). En algunos anticuerpos, cualquier sustitución no se encuentra en la posición 69 de la cadena pesada según la numeración de Kabat. En algunos anticuerpos, la variación se produce en la(s) posición(es) del entramado de la región variable distintas de aquellas en las que<s>E<q>ID N.°:53 difiere de la región variable de la cadena ligera madura de AMG191. En otros anticuerpos, la variación se produce en la posición o posiciones del entramado de la región variable en las que SEQ ID N.°:53 difiere de la región variable de la cadena ligera madura de AMG191, opcionalmente en combinación con otra posición o posiciones en los marcos de la región variable. En algunos anticuerpos, se conservan al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 de los residuos del entramado de la región variable en los que SEQ ID N.°:53 difiere del entramado de la región variable de la cadena ligera madura de AMG191. En algunos anticuerpos, la variación se produce mediante sustitución(es) conservadora(s). En algunos anticuerpos, la Q en la posición 1 de la cadena pesada puede sustituirse por una E que reduce el potencial de conversión del piroglutamato (Liu, et al., 2011, J. Biol. Chem., 286: 11211-11217). La conversión del ácido glutámico (E) en piroglutamato (pE) se produce más lentamente que a partir de la glutamina (Q). Debido a la pérdida de una amina primaria en la conversión de glutamina en pE, los anticuerpos se vuelven más ácidos. Una conversión incompleta produce una heterogeneidad en el anticuerpo que puede observarse como picos múltiples utilizando métodos analíticos basados en la carga. Las diferencias de heterogeneidad pueden indicar una falta de control del proceso.

[0046]Los anticuerpos pueden probarse para afinidad de unión a c-Kit humano, ADCP, ADCC e inhibición de la proliferación de HSPC inducida por SCF utilizando los ensayos proporcionados en los ejemplos. Los anticuerpos también pueden evaluarse en modelos animales, como se describe en el documento WO2016033201. Los anticuerpos preferidos de la invención tienen mayor afinidad de unión a c-Kit humano, mayor ADCP y/o mayor ADCC y/o mayor inhibición de la proliferación de HSPC inducida por SCF medida mediante tales ensayos que AMG191 o una forma IgG1 humana del mismo. Los anticuerpos preferidos también inhiben la unión de human-c-Kit a su ligando factor de células madre humanas.

[0047]Se divulga en el presente documento un medio para mejorar la unión a c-Kit humano y/o ADCP y/o ADCC contra células que expresan c-Kit humano en comparación con AMG191 o una forma IgG1 humana del mismo, donde la mejora se mide como en los presentes Ejemplos. Son medios ejemplares los anticuerpos que tienen una región variable de cadena pesada madura de cualquiera de los SEQ ID N.°:13, 17 o 21 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID N.°:53 con una región constante de cadena pesada IgG1 humana y una región constante de cadena ligera kappa humana. Las sustituciones relativas a AMG191 dentro de las CDR de N a A en la posición 60 de la cadena pesada, de K a Q en la posición 64 de la cadena pesada y/o de N a Q en la posición 30 de la cadena ligera contribuyen a las propiedades mejoradas de los medios ejemplares. Tales medios pueden incorporarse a una composición farmacéutica con un portador farmacéuticamente activo.

[0048]Los anticuerpos pueden o no estar sujetos a modificaciones postraduccionales, como la glicosilación, dependiendo de las condiciones de expresión o de la selección de la región constante, entre otros factores.

II. Selección de la Región Constante

[0049]Las regiones variables de cadena pesada y ligera descritas anteriormente pueden unirse a al menos una parte de una región constante humana. La elección de la región constante depende, en parte, de si se desea una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, una fagocitosis celular dependiente de anticuerpos y/o una citotoxicidad dependiente del complemento. Por ejemplo, los isotipos humanos IgG1 e IgG3 tienen citotoxicidad dependiente del complemento y los isotipos humanos IgG2 y IgG4 no. Las IgG1 y IgG3 humanas también inducen funciones efectoras mediadas por células más potentes que las IgG2 y IgG4 humanas. Se prefiere la IgG1 humana para los presentes anticuerpos. Las regiones constantes de la cadena ligera pueden ser lambda o kappa.

[0050] Uno o varios aminoácidos en el extremo amino o carboxi de la cadena ligera y/o pesada, como la lisina C-terminal de la cadena pesada, pueden faltar o derivatizarse en una proporción o en todas las moléculas. Se pueden realizar sustituciones en las regiones constantes para reducir o aumentar la función efectora, como la citotoxicidad mediada por complemento o ADCC, o eliminar un sitio de glicosilación (véase, por ejemplo, Winter et al., Patente de EE.UU. N.° 5.624.821; Tso et al., Patente de EE.UU. N.° 5.834.597; y Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), o para prolongar la semivida en humanos (véase, por ejemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Las sustituciones ejemplares incluyen una Gln en la posición 250 y/o una Leu en la posición 428 (la numeración EU se utiliza en este párrafo para la región constante) para aumentar la semivida de un anticuerpo. M252Y/S254T/T256E también aumentan la semivida, al igual que N434<a>o S, T250Q, y V3089P La sustitución en alguna o todas las posiciones 234, 235, 236 y/o 237 reduce la afinidad por los receptores Fcy, en particular el receptor FcyRI (véase, por ejemplo, US 6,624,821). Cualquiera de las siguientes sustituciones aumenta la función efectora: F243L/R292p /Y300L/V305I/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S298A/E333A/K334A, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, y S298A/E333A/K334A.

[0051] Las regiones constantes humanas muestran variación alotípica y variación isoalotípica entre diferentes individuos, es decir, las regiones constantes pueden diferir en diferentes individuos en una o más posiciones polimórficas. Los isoalotipos se diferencian de los alotipos en que los sueros que reconocen un isoalotipo se unen a una región no polimórfica de otro u otros isotipos.

III. Expresión de Anticuerpos Recombinantes

[0052] Los anticuerpos humanizados se producen típicamente por expresión recombinante. Las construcciones de polinucleótidos recombinantes suelen incluir una secuencia de control de la expresión unida de forma operable a las secuencias codificantes de las cadenas de anticuerpos, incluidos elementos de control de la expresión asociados de forma natural o heterólogos, como un promotor. Las secuencias de control de la expresión pueden ser sistemas promotores en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas o procariotas. Una vez que el vector se ha incorporado al hospedador apropiado, éste se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias nucleotídicas y la recogida y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada.

[0053] Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huéspedes, ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosómico huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección, por ejemplo, resistencia a la ampicilina o a la higromicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

[0054] E. coli es un huésped procariota útil para expresar anticuerpos, particularmente fragmentos de anticuerpos. Los microbios, como las levaduras, también son útiles para la expresión. Saccharomyces es una levadura huésped con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, según se desee. Los promotores típicos incluyen la 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores inducibles de la levadura incluyen, entre otros, los promotores de la alcohol deshidrogenasa, el isocitocromo C, y las enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa.

[0055] Pueden utilizarse células de mamífero para expresar segmentos nucleotídicos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Véase Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Se han desarrollado varias líneas celulares hospedadoras adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas intactas, e incluyen líneas celulares CHO, varias líneas celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L, y mielomas no productores de anticuerpos, incluidos Sp2/0 y NS0. Las células pueden ser no humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y los sitios de información de procesamiento necesarios, como los sitios de unión a ribosomas, los sitios de empalme de ARN, los sitios de poliadenilación, y las secuencias de terminación transcripcional. Las secuencias de control de la expresión pueden incluir promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, y similares. See Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).

[0056] Alternativamente, las secuencias codificantes de anticuerpos pueden incorporarse en transgenes para su introducción en el genoma de un animal transgénico y su posterior expresión en la leche del animal transgénico (véase, por ejemplo, Pat. de EE. UU. N.° 5.741.957; Pat. de EE. UU. N.° 5.304.489 y Pat. de EE. UU. N.° 5,849,992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias codificantes para cadenas ligeras y/o pesadas enlazadas operablemente con un promotor y un potenciador de un gen específico de la glándula mamaria, como la caseína o la beta lactoglobulina.

[0057] Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden transferirse a la célula huésped por métodos que dependen del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro cálcico se utiliza habitualmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato cálcico, la electroporación, la lipofección, la biolística, o la transfección vírica pueden emplearse para otros huéspedes celulares. Otros métodos utilizados para transformar células de mamíferos son el uso de polibreno, la fusión de protoplastos, los liposomas, la electroporación, y la microinyección. Para la producción de animales transgénicos, los transgenes pueden microinyectarse en ovocitos fecundados o incorporarse al genoma de células madre embrionarias, y los núcleos de dichas células transferirse a ovocitos enucleados.

[0058] Una vez introducidos los vectores que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos en el cultivo celular, se pueden analizar grupos de células para comprobar la productividad del crecimiento y la calidad del producto en medios libres de suero. Los grupos de células más productivos pueden someterse a clonación unicelular basada en FACS para generar líneas monoclonales. Pueden utilizarse productividades específicas superiores a 50 pg o 100 pg por célula y día, que corresponden a títulos de producto superiores a 7,5 g/L de cultivo. Los anticuerpos producidos por clones unicelulares también pueden someterse a pruebas de turbidez, propiedades de filtración, PAGE, IEF, barrido UV, HP-SEC, mapeo de carbohidratos-oligosacáridos, espectrometría de masas y ensayos de unión, como ELISA o Biacore. Un clon seleccionado puede almacenarse en múltiples viales y conservarse congelado para su uso posterior.

[0059] Una vez expresados, los anticuerpos pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo captura de proteína A, purificación por HPLC, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase en general, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

[0060] Puede emplearse metodología para la producción comercial de anticuerpos, incluyendo la optimización de codones, selección de promotores, selección de elementos de transcripción, selección de terminadores, clonación de células individuales sin suero, bancos de células, uso de marcadores de selección para la amplificación del número de copias, terminador CHO, o mejora de los títulos de proteínas (véase, por ejemplo, US 5.786.464; US 6.114.148; US 6.063.598; US 7.569.339; WO2004/050884; WO2008/012142; WO2005/019442; WO2008/107388; WO2009/027471; y US 5.888.809).

IV. Ácidos Nucleicos

[0061] Se divulgan aquí ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las cadenas pesadas y ligeras descritas anteriormente. Opcionalmente, dichos ácidos nucleicos codifican además un péptido señal y pueden expresarse con el péptido señal unido a la región constante Las secuencias codificantes de los ácidos nucleicos pueden unirse operablemente con secuencias reguladoras para asegurar la expresión de las secuencias codificantes, tales como un promotor, un potenciador, un sitio de unión a ribosomas, una señal de terminación de la transcripción, y similares. Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y ligeras pueden presentarse en forma aislada o clonarse en uno o más vectores. Los ácidos nucleicos pueden sintetizarse, por ejemplo, mediante síntesis en estado sólido o PCR de oligonucleótidos superpuestos. Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y ligeras pueden unirse como un ácido nucleico contiguo, por ejemplo, dentro de un vector de expresión, o pueden estar separados, por ejemplo, cada uno clonado en su propio vector de expresión.

V. Anticuerpos Conjugados

[0062] Los anticuerpos de la presente invención pueden conjugarse con moléculas citotóxicas o citostáticas para proporcionar un mecanismo adicional de citotoxicidad.

[0063] Algunos de estos anticuerpos pueden modificarse para actuar como inmunotoxinas. Véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. N.° 5,194,594. Por ejemplo, la ricina, una toxina celular derivada de las plantas, puede acoplarse a anticuerpos utilizando los reactivos bifuncionales anhídrido S-acetilmercaptosuccínico para el anticuerpo y 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo para la ricina. Véase Pietersz et al., Cancer Res. 48(16):4469-4476 (1998). El acoplamiento provoca la pérdida de la actividad de unión de la cadena B de la ricina, al tiempo que no afecta ni al potencial tóxico de la cadena A de la ricina ni a la actividad del anticuerpo. Del mismo modo, la saporina, un inhibidor del ensamblaje ribosómico, puede acoplarse a anticuerpos mediante un enlace disulfuro entre grupos sulfhidrilo insertados químicamente. Véase Polito et al., Leukemia 18:1215-1222 (2004).

[0064] Algunos de estos anticuerpos pueden vincularse a radioisótopos. Ejemplos de radioisótopos son, por ejemplo, itrio90 (90Y), indio111 (111In), 131I, 99mTc, radiosilver-111, radiosilver-199, y Bismuto213. La unión de radioisótopos a anticuerpos puede realizarse con quelatos bifuncionales convencionales. Para la unión de radiosilver-111 y radiosilver-199, pueden utilizarse enlazadores a base de azufre. Véase Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). La unión de los radioisótopos de plata puede implicar la reducción de la inmunoglobulina con ácido ascórbico. Para radioisótopos como 111In y 90<y>, puede utilizarse ibritumomab tiuxetan, que reaccionará con dichos isótopos para formar 111In-ibritumomab tiuxetan y 90Y-ibritumomab tiuxetan, respectivamente. Véase Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:591-S95 (2001).

[0065] Algunos de estos anticuerpos pueden conjugarse con fármacos quimioterapéuticos tóxicos como maytansina, geldanamicina, inhibidores de tubulina como agentes de unión a tubulina (por ejemplo, auristatinas), o agentes de unión a surcos menores como calicheamicina.

VI. Aplicaciones Terapéuticas

[0066]Los anticuerpos de la invención o las composiciones farmacéuticas que incorporan dichos anticuerpos pueden utilizarse para el tratamiento de diversas afecciones. Por ejemplo, dichos anticuerpos pueden utilizarse en la ablación de células madre y progenitoras hematopoyéticas endógenas (HSPC) en un sujeto que lo necesite. La ablación de las HSPC endógenas es un paso inicial en la terapia de sustitución de células madre. La terapia de sustitución de células madre suele implicar la reducción o eliminación de las HSPC endógenas, defectuosas en algún aspecto, y su sustitución por HSPC de reemplazo. Las HSPC de sustitución pueden ser autólogas, alogénicas o xenogénicas. Las HSPC endógenas pueden ser defectuosas como resultado de una mutación hereditaria que afecte a su función o expresión (por ejemplo, anemia falciforme o talasemia), como resultado de un cáncer hematológico, o como resultado del daño producido por la quimioterapia utilizada en el tratamiento de un cáncer. Las HSPC endógenas también pueden sustituirse junto con un trasplante de órgano, ya que las HSPC endógenas provocarían un ataque inmunitario del trasplante.

[0067]Los anticuerpos contra c-Kit también pueden utilizarse en el tratamiento de cánceres que expresan c-Kit. Dichos cánceres incluyen cánceres hematológicos, como la AML, y tumores sólidos, como el cáncer de mastocitos, el cáncer del estroma testicular, el cáncer del estroma gastrointestinal, el melanoma, el cáncer de mama y el cáncer de pulmón. Es preferible que la expresión de c-Kit sea superior a la de las células de control normales emparejadas con el tejido, según lo determinado por el ensayo inmunohistoquímico.

[0068]Los anticuerpos se administran en un régimen eficaz, es decir, una dosis, vía de administración y frecuencia de administración que logre el propósito previsto, como la reducción de las HSPC endógenas o de las células cancerosas que expresan c-Kit. En algunos casos, la eficacia puede observarse en un paciente individual en relación con los controles históricos o la experiencia pasada en el mismo paciente. En otros casos, la eficacia puede demostrarse en un ensayo preclínico o clínico en una población de pacientes tratados en relación con una población de control de pacientes no tratados.

[0069]Las dosis ejemplares son de al menos 0,05 mg/k y hasta 10 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 0,05-10 mg/kg, o 0,1 a 5 mg/kg o 5-750 mg como dosis fija. La posología depende del estado del paciente y de la respuesta al tratamiento previo, si lo ha habido, de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico y de si el trastorno es agudo o crónico, entre otros factores.

[0070]La administración puede ser parenteral, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal o intramuscular. Algunos anticuerpos pueden administrarse en la circulación sistémica por vía intravenosa o subcutánea. La administración intravenosa puede ser, por ejemplo, por infusión durante un periodo como 30-90 min.

[0071]El anticuerpo puede administrarse una o varias veces. Si son varias veces, los intervalos pueden ser, por ejemplo, diarios, semanales, quincenales, mensuales o trimestrales.

VI. Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Uso

[0072]Las composiciones farmacéuticas que incorporan un anticuerpo de la invención para administración parenteral pueden ser estériles y sustancialmente isotónicas (250-350 mOsm/kg de agua) y fabricadas en condiciones GMP. Las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse en forma de dosis unitaria (es decir, la dosis para una sola administración). Las composiciones farmacéuticas pueden formularse utilizando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o auxiliares farmacéuticamente aceptables. La formulación depende de la vía de administración elegida. Para la inyección, los anticuerpos pueden formularse en soluciones acuosas, por ejemplo, en tampones fisiológicamente compatibles como la solución de Hank, la solución de Ringer, o la solución salina fisiológica o el tampón de acetato (para reducir las molestias en el lugar de la inyección). La solución puede contener agentes formuladores como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, los anticuerpos pueden estar en forma liofilizada para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

[0073]Los regímenes pueden administrarse en combinación con otro agente eficaz en el tratamiento de la afección tratada (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos o biológicos para el tratamiento del cáncer).

[0074]Después del tratamiento, la condición del sujeto tratado puede ser monitoreada por cambios que respondan al tratamiento (por ejemplo, números reducidos de HSPC endógenas) o números reducidos de células cancerosas que expresen c-Kit.

VII. Otros Usos

[0075]Los anticuerpos también pueden utilizarse para detectar c-Kit mediante inmunoensayo, como ELISA, Western blot, o inmunohistoquímica. Dichas pruebas pueden ser útiles para determinar si un cáncer expresa c-Kit, haciéndolo susceptible de tratamiento con los presentes métodos. Los anticuerpos también pueden utilizarse para el enriquecimiento de HSPC que expresan c-Kit mediante cromatografía de afinidad.

Ejemplos

1. Materiales y Métodos

[0076] Clonación y secuenciación del anticuerpo V.Se adquirió una línea celular de hibridoma de c-kit anti-humano de ATCC (HB-10716). Las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) fueron clonadas y secuenciadas por Genscript.

[0077] Humanización de anticuerpos y sustituciones de CDR.La humanización del HB-10716 se realizó instalando residuos CDR de anticuerpos de ratón en entramados (FR) de línea germinal humana. Brevemente, el VH de ratón se humanizó mediante el reclutamiento juicioso de los residuos CDR correspondientes y unos pocos residuos de entramado (FR) en IGHV1-46*01 o IGHV3-23*01 humanos. El VL de ratón se humanizó mediante el reclutamiento juicioso de los residuos CDR correspondientes y unos pocos residuos de entramado (FR) en IGKV4-1*01 o IGKV2-28*01 humanos. Las diferencias entre los residuos FR de ratón y humanos se modelaron individualmente para investigar su posible influencia en la conformación de las CDR. Para humanizar aún más el anticuerpo y aumentar la afinidad de unión de los anticuerpos humanizados, se seleccionaron residuos en las CDR y se mutaron a los residuos CDR correspondientes de secuencias de la línea germinal humana.

[0078] Transfección celular.Las células 293F se cultivaron en Freestyle™ 293 Expression Medium (Invitrogen). La transfección transitoria se realizó mediante la co-transfección de vectores de expresión que codificaban la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo utilizando el reactivo de transfección 293fectin (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Cuatro o cinco días después, se recogieron los sobrenadantes de las células transfectadas y se analizó la secreción de anticuerpos mediante ELISA. Brevemente, las placas de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con 1 ug/ml de anticuerpo gamma Fc anti-humano de cabra en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 16 h a 4°C. Tras bloquear durante 1 h con BSA al 0,4% en PBS a temperatura ambiente, se añadieron sobrenadantes aislados en diluciones secuenciales de 1/3 y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, las placas se lavaron tres veces y se incubaron con un anticuerpo específico kappa anti-humano de cabra conjugado con HRP durante 1 h a temperatura ambiente. Tras el lavado, las placas se revelaron con TMB. La reacción se detuvo con H2SO42M y la OD se midió a 450 nM.

[0079] Purificación y caracterización de anticuerpos.El sobrenadante del cultivo se aplicó a columnas de sefarosa de proteína A (GE Healthcare). La columna se lavó con PBS y las proteínas se eluyeron con tampón de elución (tampón citrato sódico 0,1 M, pH 3,0). Las fracciones recogidas se neutralizaron con 1 M Tris pH 9,0. Por último, las muestras purificadas se dializaron con PBS. La pureza de la fracción de anticuerpos eluida se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) en geles al 10% en condiciones reductoras o no reductoras. Las bandas se visualizaron mediante tinción con azul brillante de Coomassie.

[0080] Medición de la actividad de unión a antígeno por ELISA.Las placas de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con 1 ug/ml de proteína de fusión c-Kit-Fc humana en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 16 horas a 4°C. Tras bloquear durante 1 h con BSA al 0,4% en PBS a temperatura ambiente, se añadieron anticuerpos anti-c-Kit en diluciones secuenciales de 1/3, y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, las placas se lavaron tres veces y se incubaron con un anticuerpo específico kappa anti-humano de cabra conjugado con HRP durante 1 h a temperatura ambiente. Tras el lavado, las placas se revelaron con TMB. La reacción se detuvo con H2SO42M y la OD se midió a 450 nM.

[0081] Ensayo de fagocitosis in vitro.Se lavaron y contaron las células cancerosas MHC-1 y, a continuación, se añadieron a cada pocillo 25 j l que contenían 1 * 105 células en IMDM sin suero. El tratamiento con anticuerpos (en 25 |jl) con una concentración final de 10 jg/m L se añadió a los pocillos y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. A los 30 minutos, se contaron los macrófagos que se habían cosechado previamente con TrypLE y se sembraron 5 x 104 células en 50 j l de IMDM sin suero. Las placas se incubaron a 37°C durante 2 horas (Efector: Objetivo = 1:2). El porcentaje de fagocitosis se calculó mediante análisis de citometría de flujo en busca de macrófagos GFP+.

[0082] Ensayo ADCC.Las células asesinas naturales se aislaron de PBMC humanas utilizando el kit de selección positiva EasySep CD56 humana de Stemcell Technologies (Vancouver, Columbia Británica, Canadá, catálogo n.° 17855). Las células aisladas se cultivaron durante la noche en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de FBS y 100 U/mL de IL-2 humana recombinante (PeproTech, Rocky Hill, NJ, catálogo n.° 200-02). Las células GIST-T1 se marcaron con 5 uM de Calceína-AM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, catálogo #C3100m P) durante 10 minutos a 37°C, y luego se lavaron dos veces. El anticuerpo anti-c-Kit o el anticuerpo de control del isotipo se diluyeron en serie 10 veces, de 0,0003 a 30 ug/mL, y se transfirieron a una placa de ensayo de fondo en V. Las células GIST-T1 marcadas se añadieron a la placa de ensayo seguidas de células asesinas naturales activadas en una proporción final de 1:5 entre diana y efector. Tras 2 horas de incubación, se recogió el sobrenadante y se transfirió a una placa de fondo plano limpia. Las placas se leyeron en el lector de placas de fluorescencia SpectraMax M3 con excitación de 490 nm, emisión de 520 nm, y corte de 515 nm, con el software SoftMax Pro 7.0. El porcentaje de lisis específica se calculó basándose en la unidad de fluorescencia relativa (RFU) con la siguiente fórmula: [(RFU de ensayo - RFU media de fondo)/(RFU media máxima - RFU media de fondo)] X 100, donde fondo son las células efectoras células diana sin anticuerpo, y lisis máxima son las células efectoras células diana con tampón de lisis. Los datos se analizaron con GraphPad Prism 7.05. El porcentaje de lisis específica dependiente de anticuerpos se representó gráficamente en función de la concentración de anticuerpos.

[0083] Ensayo de proliferación de HSPC.Células madre/progenitoras CD34+ congeladas de sangre de cordón umbilical (ALLCELLS Catalog# CB005F) fueron resuspendidas en medio de retención HSC, StemSpan SFEMII (STEMCELL technologies Catalog# 09605) suplementado con 20 ng/ml de SCF recombinante humano (STEMCELL technologies Cat# 78062), 20 ng/ml de Flt3-Ligando recombinante humano (Peprotech Catalog# 300-19) y 20 ng/ml de TPO recombinante humano (Peprotech Catalog# 300-18). Se sembraron unas 3000 células madre por pocillo en tres placas COSTAR Ultra low cluster de 96 pocillos (Corning Catalog# 7007). Las placas se centrifugaron a 1250 rpm a 4°C durante 5 minutos y las células se resuspendieron en 200 ul de medio de retención HSC con o sin los anticuerpos anti-c-Kit por triplicado. Se probaron cuatro anticuerpos anti-c-Kit, AMG191, AMG191-G1, HF12 y HF112 a concentraciones de 0,1, 1, 10 y 50 ug/ml. La proliferación celular se comprobó utilizando perlas de recuento absoluto Countbright (InvitrogenTM Catalog# C36950) los días 1, 3, 5, y 11. AMG191 tiene una mutación de N a E en la posición 297 que la hace no glucosilada, reduciendo la función efectora. AMG191-G1 o -IgG1 tiene una región constante IgG1 humana de tipo salvaje.

2. Resultados

(a) Clonación y secuenciación de la región variable del hibridoma anti-c-Kit

[0084]Se adquirió una línea celular de hibridoma de c-kit anti-humano de ATCC (HB-10716). La especificidad del clon de hibridoma HB-10716 se examinó mediante ELISA de unión a c-Kit humano. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del HB-10716 se clonaron a partir del hibridoma utilizando cebadores universales de anticuerpos. Se secuenciaron múltiples clones de cada producto del gen V para controlar los errores inducidos por la PCR. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de VH y VL de HB-10716, y las secuencias de aminoácidos deducidas se muestran en las Figs. 1A y B, respectivamente.

(b) Humanización de anticuerpos y sustituciones de CDR

[0085]Para seleccionar los entramados de anticuerpos humanos (FR) que se utilizarán como plantillas para el injerto de CDR, se compararon las regiones VL y VH del ratón HB-10716 con las de las secuencias de la línea germinal humana. Se observó que los FR de la región VL del ratón HB-10716 presentaban una mayor homología con

[0086]subgrupo IGKV4-1, y los FR de la región VH mostraron una mayor homología con el subgrupo humano IGHV1-46. Por lo tanto, los FR de IGKV4-1 y IGHV1-46 humanos se utilizaron como base para diseñar el HB-10716 humanizado. Mediante modelado molecular se identificaron las posiciones de aminoácidos en las regiones FR que difieren entre las secuencias HB-10716 y IGKV4-1/IGHV1-46 y que pueden tener influencia en la unión al antígeno. Los residuos idénticos en los FR se mantuvieron y los residuos no idénticos se mantuvieron o sustituyeron en función del programa de modelización molecular. Además, se identificaron residuos en las regiones CDR de VH y VL mediante modelado molecular. Las sustituciones de CDR se realizaron mediante mutagénesis dirigida.

[0087]En la Tabla 2 se resumen los nuevos anticuerpos humanizados que se fabricaron y sus componentes de región variable madura de cadena pesada y ligera. En resumen, los anticuerpos designados AF tienen los mismos entramados de región variable que AMG191. Los anticuerpos designados NF tienen entramados de región variable diferentes a los de AMG191. Los anticuerpos designados HF tienen el mismo entramado de región variable de cadena pesada que AMG191 y un entramado de región variable de cadena ligera diferente. Los números 2-1, 11, 12, 112 y 3 indican la presencia de sustituciones CDR en las posiciones H54/L30, H60/L30, H64/L30, H60/H64/L30, H95/L30 respectivamente.

Tabla 2

[0088]Las sustituciones de CDR en H60, H64, y L30 aumentaron la unión, ya sea solas o combinadas (AF11, AF12, y AF112, Tabla 2, Figs.2A-C). Y lo que es más importante, los residuos en H60 y H64 se mutaron de nuevo a las secuencias de la línea germinal humana, aumentando la humanidad de los anticuerpos humanizados anti-c-Kit de AF11, AF12, y AF112. Además, la sustitución de un solo aminoácido CDR en H54, H95, o L27 (Tabla 2, Figs. 2A-B) afectó a la unión de los anticuerpos humanizados anti-c-Kit de AF-2-1, AF-3, y AF-1-1 (Fig. 2D).

[0089]Se fabricó un anticuerpo humanizado anti-c-Kit, NF, mediante injerto CDR utilizando diferentes secuencias de línea germinal humana de IGHV3-23*01 y IGKV2-28*01 como entramados (Tabla 2, Fig. 3A-B). El anticuerpo NF mostró una mayor actividad de unión en comparación con AMG191 (Fig. 3C). A continuación, se aplicaron a la NF las mismas sustituciones de CDR en H54, H60, H64, H95, L27 y L30 (Tabla 2, Fig. 3A-B). Las sustituciones de CDR en H60, H64, y L30 no sólo funcionaron con anticuerpos que tenían entramados IGKV4-1/IGHV1-46, sino también con anticuerpos que tenían entramados IGHV3-23*01/I<g>K<v>2-28*01. Las sustituciones de CDR en H60, H64, y L30, solas o combinadas, aumentaron o mantuvieron la actividad de unión de NF11, NF12, y NF112 (Fig. 3D).

[0090]Los HF11, HF12, y HF112 humanizados fueron construidos combinando diferentes VHs y VLs como se muestra en la Tabla 2, y todos mostraron actividades de unión aumentadas, en comparación con AMG191 (Fig. 4).

(c) Los anticuerpos humanizados anti-c-Kit promueven la fagocitosis mediada por macrófagos

[0091]A continuación investigamos la capacidad de los anticuerpos humanizados anti-c-Kit para permitir la fagocitosis de células cancerosas humanas por macrófagos humanos derivados de sangre periférica. Como AMG191 tiene un Fc silenciado, hicimos AMG191-G1 que tiene las mismas secuencias que AMG191, excepto que AMG191-G1 tiene una región constante Fc de IgG1 humana activa. AMG191 no indujo la fagocitosis en comparación con el control PBS; sin embargo, AMG191-G1 indujo una mayor actividad fagocítica como era de esperar porque tiene un andamiaje de IgG1 humana activa (Fig. 5). AMG191-G1 indujo niveles similares de actividad fagocítica a 0,1, 1 y 10 ug/ml. A diferencia del AMG191-G1, los AF12, AF112, HF12, HF112, y NF112 humanizados fueron más potentes a concentraciones más bajas e indujeron una mayor actividad fagocítica que el AMG191-G1 a 0,1, 1, o incluso a 10 ug/ml, lo que sugiere que se requieren dosis terapéuticas más bajas para los AF12, AF112, HF12, HF112, y NF112 humanizados (Fig. 5). Los datos muestran que, aunque AMG191-G1, AF12, AF112, HF12, HF112, y NF112 son todos anticuerpos humanos con formato IgG1, AF12, AF112, HF12, HF112, y NF112 son más potentes. Posiblemente se deba a las mayores afinidades de unión de AF12, AF112, HF12, HF112, y NF112 atribuidas a entramados y/o sustituciones de CDR.

(d) Los anticuerpos humanizados anti-c-Kit inducen una potente ADCC

[0092]La capacidad del anticuerpo humanizado anti-c-Kit para inducir actividad ADCC fue probada contra células GIST. AMG191 no indujo ADCC en ninguna de las concentraciones probadas. HF12 y HF112 mediaron la ADCC de forma dosisdependiente (Fig, 6).

(e) Los anticuerpos humanizados anti-c-Kit inhiben la proliferación de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC)

[0093]Las células hematopoyéticas maduras se desarrollan a partir de células madre hematopoyéticas (HSC) a través de un proceso jerárquicamente organizado que produce células cada vez más restringidas a linajes con una capacidad de autorrenovación decreciente. La proteína tirosina quinasa de superficie celular c-Kit, que interactúa con su ligando afín, el factor de células madre (SCF), para regular la autorrenovación de las HSC. Al bloquear la interacción de c-Kit con SCF, probamos si los anticuerpos humanizados anti-c-Kit pueden inhibir la proliferación de HSPC. Como se muestra en la Fig. 7, el SCF indujo la proliferación de las HSPC en ausencia de cualquier tratamiento con anticuerpos. Sin embargo, AMG191, AMG191-G1, HF12, y HF112 inhibieron la proliferación de<h>S<p>C (Figura 7). Además, HF12 y HF112 son más potentes en la inhibición de la proliferación de HSPC que los de AMG191 y AMG191-G1 (Fig. 7). Posiblemente se deba a las mayores afinidades de unión de HF12 y HF112 atribuidas a entramados y/o sustituciones de CDR.

(f) El anti-c-kit humanizado no induce una degranulación significativa de los mastocitos.

[0094]cKIT se expresa en las células madre hematopoyéticas y en los mastocitos maduros. Los mastocitos derivan de progenitores hematopoyéticos CD34+ de la médula ósea. Tras la migración a diversos tejidos periféricos, estas células progenitoras se diferencian en mastocitos maduros que expresan cKIT junto con el receptor de IgE de alta afinidad, FcsRl. La unión del antígeno a un FcsRl cebado con IgE en los mastocitos desencadena la degranulación y la liberación de mediadores químicos como la histamina y la triptasa junto con citocinas, leucotrienos y proteasas. La liberación de mediadores químicos provoca los síntomas clásicos de la alergia. En el uso clínico, es deseable que un anticuerpo anticKIT reduzca las células madre hematopoyéticas sin inducir la degranulación de los mastocitos.

[0095]Mastocitos maduros fenotipados (CD34-, FcsRIa+, cKIT+) diferenciados de sangre total periférica de un donante humano sano se incubaron con diferentes concentraciones de anticuerpos HF12 y HF12 humanizados anti-c-Kit (10, 1, 0,1 y 0,01 |jg/ml) durante 7 horas. Como controles positivos se utilizaron A23187 (10 jM ) y IgE, más anti-IgE (10 ug/ml cada uno). La desgranulación se cuantificó midiendo la liberación de p-hexosaminidasa mediante el método de absorbancia descrito en los métodos.

[0096]Los mastocitos primarios humanos se diferenciaron in vitro y mostraron el fenotipo CD34-, FcsRIa+ y cKIT+ al final de la semana 9, lo que concordaba con las características fenotípicas de los mastocitos maduros. A continuación, las células se estimularon con el ionóforo de calcio A23187 o IgE en combinación con anti-IgE. A23187 y IgE anti-IgE indujeron eficazmente la degranulación de los mastocitos, medida por la liberación de p - hexosaminidasa.

[0097]El tratamiento directo de las células con anticuerpos anti-c-Kit o la reticulación de los anticuerpos anti-c-Kit por un anticuerpo anti-IgG no indujo una degranulación significativa de los mastocitos en comparación con los tratamientos con A23187 y anti-IgE (Fig. 8). La inmovilización de anticuerpos anti-c-Kit en una placa también tuvo poco efecto sobre la degranulación de los mastocitos. La coincubación de mastocitos y células NK en presencia de diversas concentraciones de anticuerpos anti-c-Kit tampoco indujo la degranulación de los mastocitos en todas las concentraciones probadas.

[0098]En conclusión, los anticuerpos anti-c-Kit HF12 y HF112 tuvieron poco efecto sobre la degranulación de mastocitos humanos primarios in vitro, en comparación con los del ionóforo de calcio A23187 o IgE en combinación con el tratamiento anti-IgE.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une específicamente a c-Kit humano que comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de SEQ ID N.°: 13 excepto que la posición 1 puede ser E, y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de SEQ ID N.°: 53.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la región variable de cadena pesada madura está unida a una región constante de cadena pesada y la región variable de cadena ligera madura está unida a una región constante de cadena ligera madura, opcionalmente en el que la región constante de cadena pesada es IgG1 humana.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:13 y una región variable de cadena ligera madura que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:53, donde la región variable de cadena pesada madura está unida a una región constante de cadena pesada de isotipo IgG1 humano y la región variable de cadena ligera madura está unida a una región constante de cadena ligera.

4. El anticuerpo de cualquier reivindicación precedente expresado a partir de una célula CHO.

5. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de cualquier reivindicación precedente y un portador farmacéuticamente aceptable.

6. El anticuerpo de cualquier reivindicación precedente para su uso en un método de ablación de HSPC endógenas, en el que el método comprende administrar un régimen eficaz del anticuerpo a un sujeto que necesita ablación.

7. El anticuerpo de cualquier reivindicación precedente para su uso en un método de tratamiento de un cáncer que expresa c-Kit, en el que el método comprende administrar un régimen eficaz del anticuerpo a un sujeto que tiene el cáncer.

8. Un ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada madura y la región variable de cadena ligera madura como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

9. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 8.