ES2989929T3 - Ensayos relacionados con anti-VLA-4 - Google Patents

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Paula Hochman
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Abstract

Se describen métodos y aparatos para ensayar el nivel de analitos en una muestra, relacionados con VLA-4. Se describe un método para disminuir el nivel de un anticuerpo antiintegrina en un sujeto que incluye a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un agente de captura detectable asociado con un sustrato, en donde el agente de captura puede unirse a un anticuerpo antiintegrina en la muestra; b) detectar la unión del agente de captura con el nivel del anticuerpo antiintegrina; y c) tratar al sujeto con intercambio de plasma hasta que el nivel del anticuerpo antiintegrina en la muestra alcance un nivel predeterminado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayos relacionados con anti-VLA-4
Reivindicación de prioridad
Campo de la invención
La invención se refiere a ensayos asociados con terapias inmunomoduladoras
Resumen de la invención
La invención se basa, al menos en parte, en el desarrollo de una prueba para ensayar el nivel de un anticuerpo anti-integrina y el anticuerpo anti-(anticuerpo anti-integrina), por ejemplo, un anticuerpo anti-fármaco, en una muestra.
La presente invención proporciona un método para ensayar la eficacia de un tratamiento, comprendiendo el método:
a) poner en contacto una muestra biológica que se ha obtenido de un sujeto que está recibiendo un tratamiento con un anticuerpo anti-integrina alfa4 con un agente de captura asociado con un sustrato, en donde el agente de captura puede unirse a un anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 en la muestra para formar un complejo y en donde el sustrato es una porción de un sistema inmunocromatográfico; y
b) detectar la unión del agente de captura al anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 con un agente secundario que se une a dicho complejo dentro del sistema inmunocromatográfico de flujo lateral y correlacionar la unión del agente de captura con el nivel del anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 para determinar la eficacia del tratamiento, en donde el agente de captura es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
La invención proporciona además un kit para ensayar el nivel de un anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 en una muestra biológica en un sujeto que comprende:
(a) un comprobador que comprende:
un sistema inmunocromatográfico de flujo lateral que comprende una zona de recepción de la muestra, una zona de etiquetado y una zona de prueba, en donde
la zona de pruebas está aguas abajo de la zona de recepción de la muestra y contiene un agente de captura asociado con un sustrato, en donde el agente de captura se puede unir a un anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 en la muestra biológica para formar un complejo, y
la zona de etiquetado está ubicada aguas arriba de la zona de recepción de la muestra y contiene uno o más agentes secundarios, en donde los uno o más agentes secundarios son capaces de unirse al complejo que comprende el agente de captura y el anticuerpo anti-anti-integrina alfa4,
en donde el agente de captura es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente secundario es un anticuerpo anti-integrina alfa4, opcionalmente un anticuerpo anti-integrina alfa4 etiquetado; y
(b) un tampón de detección.
La puesta en contacto de la muestra con un agente de captura detectable y la detección y correlación de la unión del agente de captura puede incluir un ensayo en un sistema de flujo lateral. La unión del agente de captura al anticuerpo puede producir una señal detectable. La unión del agente de captura al anticuerpo se puede detectar mediante un agente secundario. La muestra biológica se puede obtener del sujeto antes del tratamiento o un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas después del tratamiento. La obtención de la muestra biológica se puede repetir una vez al día o una vez cada dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas. La muestra biológica puede ser sangre, plasma, suero, orina, saliva, fluido cefalorraquídeo, esputo, líquido del cristalino, sudor, leche, ascitis, mucosidad, fluido sinovial, fluido peritoneal, exudados transdérmicos, exudados faríngeos, lavado broncoalveolar, aspiraciones traqueales, semen, mucosidad cervical, secreción vaginal, secreción uretral o fluido amniótico.
El anticuerpo anti-anti-integrina puede ser un anticuerpo de cadena anti-anti-integrina alfa4. El agente de captura puede ser un anticuerpo.
Definiciones
Los artículos «un» y «una» se utilizan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno(es decir,al menos uno) del objeto gramatical del artículo A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
El término "aproximadamente" se usa en el presente documento para referirse a un valor ± 20 % de un valor numérico determinado. Por consiguiente, "aproximadamente un 60 %" significa un valor entre 60 ± (20 % de 60) (esdecir,entre 48 y 70).
El término "o" se usa en el presente documento, y se usa de manera intercambiable con, para referirse al término "y/o," a no ser que el contexto indique claramente lo contrario.
Tal como se usa en el presente documento, el término "purificar," "purificado," o "purificación" significa la extracción o el aislamiento de una molécula de su entorno mediante, por ejemplo, aislamiento o separación. Las moléculas "sustancialmente purificadas" están por lo menos aproximadamente un 60 % libres, por ejemplo, por lo menos aproximadamente un 75 % libres, o por lo menos aproximadamente un 90 % libres de otros componentes a los que están asociadas. En algunos casos, una molécula sustancialmente purificada está por lo menos un 60 % libre, un 75 % libre, un 90 % libre, o un 95 % libre de otros componentes. Tal como se usan en el presente documento, estos términos también se refieren a la extracción de contaminantes de una muestra.
Tal como se usa en el presente documento, "muestra" se refiere a cualquier cosa que pueda contener un analito para el que se desea un ensayo de analito. La muestra puede ser una muestra biológica, como un fluido biológico o un tejido biológico. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero, plasma, saliva, esputo, líquido del cristalino, sudor, orina, leche, ascitis, mucosidad, fluido sinovial, fluido peritoneal, exudados transdérmicos, exudados faríngeos, lavado broncoalveolar, aspiraciones traqueales, fluido cefalorraquídeo, semen, mucosidad cervical, secreciones vaginales o uretrales, fluido amniótico o similares. Los tejidos biológicos son agregados de células, usualmente de un tipo en particular junto con su sustancia intercelular que forman uno de los materiales estructurales de humanos, animales, plantas, bacterias, hongos o estructuras virales, incluyendo los tejidos conectivos, epiteliales musculares y nerviosos. Los ejemplos de tejidos biológicos también incluyen órganos, tumores, nódulos linfáticos, arterias y célula(s) individual(es).
Como se usa en el presente documento, "muestra fluida" se refiere a un material del que se sospecha que contiene un analito(s) de interés, material el cual presenta una fluidez suficiente para fluir a través de un dispositivo o ensayo descrito en el presente documento. Una muestra fluida se puede obtener de una fuente y ser usada directamente en un ensayo descrito en el presente documento o se puede tratar previamente para modificar su carácter. Estas muestras pueden incluir muestras humanas, animales o preparadas por personas. La muestra se puede preparar en cualquier medio que no interfiera con un ensayo descrito en el presente documento. Típicamente, la muestra es una solución acuosa o un fluido biológico descrito en el presente documento.
Una muestra fluida se puede derivar de cualquier fuente, como un fluido fisiológico, incluyendo sangre, suero, plasma, esputo, fluido del cristalino, sudor, orina, leche, ascitis, mucosidad, fluido sinovial, fluido peritoneal, exudados transdérmicos, exudados faríngeos, lavado broncoalveolar, aspiraciones traqueales, fluido cefalorraquídeo, semen, mucosidad cervical, secreciones vaginales o uretrales, fluido amniótico y similares. Homogenados fluidos de tejidos celulares, tales como, por ejemplo, legrados de pelo, piel y uñas. Además, se puede usar un material sólido para hacer un ensayo sobre la presencia de un analito como muestra de prueba después de haber sido modificado para formar un medio líquido, por ejemplo, un extracto, o para liberar un analito.
Tal como se usa en el presente documento, "antígeno" significa cualquier compuesto capaz de unirse a un anticuerpo o frente a los cuales pueden aparecer anticuerpos.
Tal como se usa en el presente documento, "anticuerpo" se refiere a un polipéptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulinas o genes de inmunoglobulinas, o fragmentos de los mismos. Los genes de inmunoglobulinas reconocidos incluyen las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon y mu, así como, innumerables genes de la región variable de inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gama, mu, alfa, delta o epsilon, que definen a su vez las clases de inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Típicamente, un anticuerpo es una inmunoglobulina que tiene un área en su superficie o en una cavidad que se une específicamente a, y por ello se define como complementaria, con una organización espacial y polar particular de otra molécula. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o fragmentos de la misma. Sus fragmentos pueden incluir, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fv de cadena simple (scFv) y similares. Los anticuerpos también pueden incluir anticuerpos quiméricos o fragmentos de los mismos producidos mediante métodos recombinantes. En algunos casos, el anticuerpo detectado es un anticuerpo IgG4. En un ensayo como se describe en el presente documento, se pueden detectar anticuerpos IgG4 incompletos, se pueden detectar anticuerpos IgG4 completos o se pueden detectar ambos anticuerpos IgG4 incompletos y anticuerpos IgG4 completos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "analito" se refiere a un componente conocido o desconocido de una muestra, que se unirá específicamente a un agente de captura si el analito y el agente de captura son miembros de un par de unión específico. Por lo general, los analitos son biopolímeros, por ejemplo, un oligómero o un polímero, tal como, un oligonucleótido, un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) o similares. En algunos casos, un analito puede existir en una fase móvil (como un fluido) a ser detectado por un agente de captura.
Tal como se usa en el presente documento, el término "reactivo etiquetado" se refiere a una sustancia que comprende una etiqueta detectable unida a un agente de unión específico. La unión puede ser un enlace covalente o no covalente, pero el método de unión no es crítico. La etiqueta permite que el reactivo etiquetado produzca una señal detectable que está relacionada con la presencia de un analito en una muestra descrita en el presente documento. El componente del agente de unión específico del reactivo etiquetado se selecciona para unirse directa o indirectamente a un analito. El reactivo etiquetado se puede asociar con un sustrato descrito en el presente documento, se puede combinar con una muestra fluida para formar una solución fluida, se puede añadir a un sustrato separadamente de una muestra o se puede depositar previamente o inmovilizar de forma reversible en el sustrato. Además, el agente de unión específico se puede etiquetar antes o durante la realización de un ensayo descrito en el presente documento mediante cualquier método de unión adecuado conocido en la técnica. La etiqueta detectable puede ser una etiqueta detectable directamente o una etiqueta que se detecta usando métodos indirectos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "señal detectable" se refiere a una señal producida por la unión de un agente de captura con un analito. Una señal detectable se puede detectar mediante inspección visual. Sin limitación, el tipo de señal producida depende de la etiqueta usada. Generalmente, las señales detectables que indican la presencia o ausencia de un analito en una muestra pueden ser evidentes por su propia cuenta, por ejemplo, detectables como líneas, signos de más o menos, o símbolos con formas en particular, o pueden ser evidentes mediante comparación con una referencia, como un indicador de color de referencia.
Tal como se usa en el presente documento, el término "agente de captura" se refiere a un agente que se une a un analito mediante una interacción que es suficiente para permitir que el agente se una específicamente a un analito. Por ejemplo, el agente de captura se puede unir específicamente a un analito con una constante de disociación (K<d>) inferior a aproximadamente 10<-6>M sin que se una a otras dianas. La interacción de la unión puede estar mediada por un sitio de unión del agente de captura. Los agentes de captura pueden incluir, por ejemplo, cualquier polipéptido, por ejemplo, un anticuerpo. Los agentes de captura se pueden unir a un sustrato o pueden estar presentes en solución.
Tal como se usa en el presente documento, el término "unión específica" se refiere a la unión preferente de un agente a un analito particular que está presente en una mezcla de diferentes analitos. Típicamente, la unión específica diferencia entre analitos deseados o no deseados en una muestra. Un agente de unión específica diferencia típicamente entre un analito deseado o no deseado mediante la unión de más de aproximadamente 10 a 100 veces o más a un analito deseado con preferencia a otros analitos. En algunos casos, dicha unión preferente puede ser de al menos 1.000 a 10.000 veces. Por ejemplo, la afinidad entre un agente de captura y un analito cuando están unidos específicamente en un complejo de agente de captura/analito es de al menos aproximadamente 10<-7>M, al menos aproximadamente 10<-8>M, al menos aproximadamente 10<-9>M, al menos aproximadamente 10<-10>M, o aproximadamente al menos 10<-11>, por ejemplo, al menos 10<-7>M, al menos 10<-8>M, al menos 10<-9>M, al menos 10<-10>M, o al menos 10<-11>.
Tal como se usa en el presente documento, el término "complejo de agente de captura/analito" es un complejo que resulta de la unión específica de un agente de captura con un analito.
Tal como se usa en el presente documento, "socios de unión" se refiere a pares de moléculas que se pueden encontrar en un complejo de agente de captura/analito, es decir, presentan una unión específica el uno con el otro.
Tal como se usa en el presente documento, el término "valoración" se refiere a cualquier forma de medida, e incluye la determinación de si un elemento está presente o no. Los términos "determinación", "medición", "evaluación", "valoración" y "ensayo" se usan de forma intercambiable e incluyen determinaciones cuantitativas y cualitativas.
Tal como se usa en el presente documento, una "etiqueta detectable" se refiere a un átomo (por ejemplo, un radionúclido), molécula (por ejemplo, fluoresceína) o complejo que se detecta o que se puede usar para detectar (por ejemplo, debido a una propiedad física o química) la presencia de un analito o para permitir la unión de otra molécula a la que está unido covalentemente o asociado de otra forma. El término también se refiere a moléculas unidas covalentemente o asociadas de otra forma (por ejemplo, una biomolécula, tal como, una enzima) que actúa en un sustrato para producir un átomo, molécula o complejo detectable. Las etiquetas detectables incluyen cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Por ejemplo, las etiquetas incluyen biotina para la tinción con conjugado de estreptavidina etiquetada, perlas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads™.), tintes fluorescentes (por ejemplo, rojo deTexas, rodamina, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde potenciada y similares), radioetiquetas (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, o 32P), enzimas (por ejemplo, hidrolasas, particularmente fosfatasas, tales como, fosfatasa alcalina, esterasas y glicosidasas u oxidoreductasas, particularmente peroxidasas, tales como, peroxidasa de rábano y otras usadas habitualmente en ensayos ELISA), sustratos, cofactores, inhibidores, grupos quimioluminiscentes, agentes cromogénicos y etiquetas colorimétricas, tales como, partículas coloidales metálicas (tales como el oro), partículas coloidales no metálicas (tales como selenio o telurio) o perlas de cristal coloreado o plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.). Los ejemplos no limitantes de patentes que dan a conocer dichas etiquetas incluyen las patentes de Estados Unidos, N.° 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241. Los medios para detectar dichas etiquetas son conocidos por los expertos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, los términos "sándwich", "sándwich ELISA", "diagnóstico por sándwich" y "captura ELISA" se refieren al concepto de detección de un analito con dos o más agentes de prueba diferentes. Por ejemplo, un agente de captura se puede unir directa o indirectamente a un sustrato y se puede pasar una muestra de prueba sobre la superficie del sustrato para permitir que el agente de captura se una específicamente a su analito cognado. Un reactivo etiquetado, por ejemplo, un anticuerpo etiquetado o un reactivo de detección alternativo (que se puede unir al analito), se puede usar entonces para determinar si un agente de captura se une específicamente al analito.
Tal como se usa en el presente documento, el término "sustrato" significa cualquier soporte capaz de unirse o de asociarse con un agente de captura. Los sustratos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosa y magnetita. La naturaleza del sustrato puede ser soluble hasta cierto punto o insoluble. La estructura del sustrato no es limitante, y el sustrato puede tener cualquier configuración estructural siempre y cuando el agente de captura sea capaz de unirse a un analito. Por consiguiente, la configuración estructural puede ser esférica, como en una perla, o cilíndrica, como la superficie interior de un tubo de ensayo o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana, tal como, una lámina, una placa de cultivo, una tira de prueba, etc. Los expertos en la técnica conocerán muchos otros sustratos adecuados para unirse o asociarse con un agente de captura, o pueden determinarlos de igual forma mediante experimentación rutinaria.
Tal como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal, por ejemplo, un mamífero, humano o no humano. Los sujetos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a ellos, humanos, primates no humanos, ratones, ratas, cobayas, ganado vacuno, ovejas, cabras, cerdos, perros, gatos, pájaros, ciervos, alce, conejo, reno, ciervo y caballos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "medición del nivel de" se refiere tanto a la medición cuantitativa como cualitativa.
Las siguientes figuras se presentan únicamente con el fin de ilustrar y no se pretende que sean limitantes.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un esquema del aparato de flujo lateral y los resultados de una prueba correspondiente al Ejemplo 1 tras la carga de varios componentes.
La FIG. 2 es un esquema del aparato de flujo lateral y los resultados de una prueba correspondiente al Ejemplo 2 tras la carga de varios componentes.
La FIG. 3 es un esquema del aparato de flujo lateral y los resultados de una prueba correspondiente al Ejemplo 3 tras la carga de varios componentes.
La FIG. 4 es un esquema del aparato de flujo lateral y los resultados de una prueba correspondiente al Ejemplo 4 tras la carga de varios componentes.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
Descripción detallada
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Los pacientes que reciben terapias con fármacos que son inmunomoduladores son vulnerables a algunas enfermedades como la leucoencefalopatía multifocal progresiva (por sus siglas en inglés, PML). Por ejemplo, la PML se ha descrito en pacientes tratados con natalizumab. Se ha descubierto que un método para tratar a dichos sujetos es reducir la cantidad (por ejemplo, la concentración plasmática) del agente terapéutico inmunomodulador (por ejemplo, natalizumab) en el paciente. Debido a la rápida progresión de la enfermedad y a la gran distribución geográfica de los pacientes, así como otras cuestiones, existe la necesidad de una prueba rápida y fiable que se pueda usar para determinar el nivel de fármaco en el paciente. Para la prueba, es una ventaja que se presente de forma que se pueda administrar e interpretar de forma precisa en un corto periodo de tiempo. Esta es una cuestión especial en una terapia inmunomoduladora, que puede ser difícil de diferenciar de los propios anticuerpos del paciente. Por consiguiente, este problema se ha resuelto usando un diseño de prueba rápida que los médicos pueden usar de forma precisa y fácil para determinar si el nivel de una terapia inmunomoduladora se ha modulado suficientemente para aumentar la probabilidad de mitigar la progresión de un caso activo de PML. Variando la dosis de la terapia inmunomoduladora se puede paliar la progresión de la fase de la enfermedad en un paciente. Debido a que la variación de la dosis de la terapia inmunomoduladora es importante para el tratamiento, también se pueden usar ensayos descritos en el presente documento para monitorizar rápidamente el nivel del fármaco en un paciente, por ejemplo, en pacientes con esclerosis múltiples incluyendo pacientes pediátricos. Los ensayos proporcionados en el presente documento pueden detectar anticuerpos anti-integrina en un sujeto que fue tratado con natalizumab y al que se ha diagnosticado, o se sospecha que presenta, una infección con virus JC. El virus JC es un tipo de poliomavirus humano que puede provocar<P m L>y otras enfermedades en pacientes con inmunodeficiencia o en pacientes tratados con un fármaco destinado a inducir un estado de inmunosupresión (por ejemplo, pacientes con trasplantes de órganos).
En el presente documento se proporcionan ensayos para detectar anticuerpos anti-fármacos. La presencia de estos anticuerpos en un sujeto puede afectar la exposición al fármaco y/o tener como resultado eventos adversos relacionados con la infusión, por ejemplo, como se ha descrito en tratamientos con el anticuerpo humanizado anti-VLA-4. Por consiguiente, los ensayos para la detección de anticuerpos anti-fármaco (por ejemplo, siendo el fármaco el anticuerpo anti-VLA-4; siendo los anticuerpos anti-fármaco anticuerpos anti-anti-VLA-4) pueden ser útiles para el tratamiento usando el fármaco de interés (por ejemplo, un fármaco anti-VLA-4, tal como, natalizumab).
Por lo general, el aparato es un sustrato sólido asociado con un agente de captura que se puede usar para detectar específicamente el agente terapéutico inmunomodulador (por ejemplo, el natalizumab) o anticuerpos contra el agente inmunomodulador (por ejemplo, un anticuerpo anti-fármaco como los anticuerpos contra el natalizumab). En algunos casos, la detección se calibra para proporcionar un método para determinar si la cantidad de agente terapéutico inmunomodulador o de anticuerpo anti-fármaco está por encima o por debajo de una concentración o título específicos. Esta información se puede correlacionar con si la terapia adicional (por ejemplo, plasmaféresis) es necesaria para reducir más la cantidad de agente terapéutico inmunomodulador en el paciente y mitigar, de este modo, el riesgo asociado a la PML.
También se proporciona en este documento un kit adecuado para probar la presencia de un anticuerpo antianti-integrina alfa4. Generalmente, un kit incluirá por lo menos un reactivo o aparato como el descrito en el presente documento para detectar el agente terapéutico inmunomodulador o anticuerpos contra un agente inmunomodulador. El kit también puede incluir instrucciones para usar los reactivos y/o el aparato. Estas instrucciones también pueden incluir el uso del kit para determinar la cantidad de un analito e interpretar los resultados del ensayo. Por ejemplo, las instrucciones pueden proporcionar una guía sobre si la detección de un nivel específico de un natalizumab es suficiente para tratar a un sujeto que presenta, o se sospecha que presenta, PML.
Aparato para ensayar analitos
Los expertos en la técnica conocen diversos dispositivos de análisis y dichos dispositivos de análisis se pueden adaptar para usar uno o más agentes de captura, por ejemplo, un anticuerpo descrito en el presente documento, para ensayar uno o más analitos, por ejemplo, un anticuerpo anti-integrina como el anti-VLA-4 (por ejemplo, un natalizumab), por ejemplo, un anticuerpo anti-fármaco, (por ejemplo, anti-natalizumab), descrito en el presente documento. Los ejemplos no limitantes incluyen varilla de medición o comprobador, flujo lateral, flujo dual y dispositivos de flujo directo, particularmente los que son inmunoensayos. Ejemplos no limitantes de dispositivos de flujo lateral incluyen los descritos en las Patentes de EE. UU. N.° 4,818,677, 4,943,522, 5,096,837 (RE 35,306), 5,096,837, 5,118,428, 5,118,630, 5,221,616, 5,223,220, 5,225,328, 5,415,994, 5,434,057, 5,521,102, 5,536,646, 5,541,069, 5,686,3 15, 5,763,262, 5,766,961, 5,770,460, 5,773,234, 5,786,220, 5,804,452, 5,814,455, 5,939,331, 6,306,642. Otros ejemplos no limitantes de dispositivos de flujo lateral incluyen las Patentes de EE. UU. N.° 4,703,017, 6,187,598, 6,352,862, 6,485,982, 6,534,320 y 6,767,714. Los ejemplos no limitantes de dispositivos de varilla de medición incluyen aquellos descritos en las patentes de Estados Unidos, N.° 4,235,601, 5,559,041, 5,712,172 y 6,790,611.
Un aparato para ensayar el nivel de un analito puede incluir un sustrato, por ejemplo, un sustrato con el que se asocia un agente de captura. Los ejemplos no limitantes de sustratos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosa y magnetita. El sustrato puede presentar cualquier configuración estructural siempre y cuando el agente de captura sea capaz de unirse a un analito.
En algunos casos, el sustrato está contenido en un soporte, por ejemplo, un soporte que es esférico, como en una perla, o cilindrico, como en la superficie interior de un tubo de ensayo o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, el sustrato o soporte puede ser plano, como una lámina, una placa de cultivo, una tira de prueba y similares.
En un ejemplo, el aparato es un aparato de flujo lateral que incluye una zona de recepción de la muestra, una zona de etiquetado, una zona de prueba y una zona de control. En algunos casos, una región de prueba comprende las zonas de prueba y de control. En algunos casos, la región de prueba, que comprende las zonas de prueba y de control, se puede observar.
En algunos ejemplos, la zona de recepción de la muestra acepta una muestra fluida que puede contener uno o más analitos de interés. En otro ejemplo, la zona de recepción de la muestra está sumergida en una muestra fluida. Una zona de etiquetado contiene uno o más reactivos móviles etiquetados que reconocen, o son capaces de unir, uno o más analitos de interés. Además, una región de prueba está dispuesta aguas abajo de la zona de etiquetado y contiene las zonas de prueba y de control. La(s) zona(s) de prueba contienen generalmente un agente de captura asociado con el sustrato en la zona de prueba. En algunos casos, el agente de captura está inmovilizado en el sustrato en la zona de prueba. Generalmente, el agente de captura inmovilizado se une específicamente al analito de interés.
En algunos ejemplos, la región de prueba comprende un material que es opaco en estado seco y transparente en estado húmedo. Por consiguiente, cuando se usa una zona de control que comprende una marca en el dispositivo, esta marca se sitúa aproximadamente en la región de prueba de forma que se vuelve visible en la región de prueba cuando la región de prueba está en un estado húmedo.
En otro ejemplo, la muestra fluida fluye a lo largo de una vía de flujo que va desde la zona de recepción de la muestra (aguas arriba), a las zonas de prueba y control (comprendidas conjuntamente en una región de prueba) (aguas abajo). Opcionalmente, la muestra fluida puede continuar después hacia la zona absorbente.
En otro ejemplo, la zona de recepción de la muestra está compuesta por una almohadilla de aplicación absorbente. Los materiales adecuados para la fabricación de almohadillas de aplicación absorbentes incluyen, pero sin limitarse a ellos, materiales o almohadillas de polietileno hidrófilo, fibra acrílica, fibra de vidrio, papel de filtro o almohadillas, papel deshidratado, pulpa de celulosa, tela, y similares. Por ejemplo, la zona de recepción de la muestra puede estar compuesta por un material como una fibra acrílica spunlace no tejida (por ejemplo, disponible en Dupont Nonwovens) o material HDK (disponible en HDK Industries, Inc., Rogersville, TN). En otro ejemplo, la zona de recepción de la muestra se construye a partir de cualquier material que sea capaz de absorber agua.
En otros ejemplos, el dispositivo de prueba se configura para llevar a cabo un ensayo inmunológico. En algunos casos, el transporte líquido a lo largo del sustrato se basa en la acción capilar. En otra situación, el transporte líquido a lo largo del sustrato se basa en un flujo lateral no absorbente, donde todos los componentes disueltos o dispersados de la muestra líquida se transportan a velocidades sustancialmente equivalentes y con un flujo lateral relativamente perfecto a través del sustrato, al contrario de la retención preferente de uno o más componentes que tendrían lugar, por ejemplo, en materiales que interactúan, química, física o iónicamente o de otro modo con uno o más componentes (veáse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos, N.° 4,943,522).
La zona de etiquetado de los dispositivos de los ensayos inmunológicos puede incluir reactivos de tipo control. Estos reactivos de control etiquetados comprenden frecuentemente restos detectables que no se verán restringidos en las zonas de pruebas y que se transportan a través de la región de prueba y la(s) zona(s) de control mediante el flujo de la muestra líquida a través del dispositivo. En algunos casos, estos restos detectables se acoplan a un miembro de un par de unión específico para formar un conjugado de control que puede después verse restringido en una zona de control separada de la región de prueba por un miembro correspondiente del par de unión específico para verificar que el flujo del líquido es como se espera. Los restos visibles usados en los reactivos de control etiquetados pueden ser del mismo o de color diferente, o del mismo o de tipo diferente, a los usados en el analito de los reactivos etiquetados específicos de interés.
La región de prueba generalmente incluye una zona de control que es útil para verificar que el flujo de la muestra es como se espera. Cada una de las zonas de control puede comprender una región espacialmente distinta que puede incluir un miembro inmovilizado de un par de unión específico que reacciona con un reactivo de control etiquetado. En algunos ejemplos, la zona de control procedimental contiene una muestra auténtica del analito de interés o un fragmento del mismo. En este caso, se puede usar un tipo de reactivo etiquetado, en donde la muestra fluida transporta el reactivo etiquetado a las zonas de prueba y de control; y el reactivo etiquetado que no está unido a un analito de interés se unirá entonces a la muestra auténtica del analito de interés situado en la zona de control. En otro ejemplo, la línea de control contiene un anticuerpo que es específico para, o de otro modo proporciona, la inmovilización del reactivo etiquetado. En el procedimiento, un reactivo etiquetado está restringido en cada una de las una o más zonas de control, incluso cuando alguno o todos los analitos de interés no están presentes en la muestra de prueba.
Agentes de captura
Se pueden usar varios agentes de captura en los métodos y el aparato descritos en el presente documento, siempre y cuando el agente de captura se una específicamente a un anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 para formar un complejo. El agente de captura puede ser un antígeno, por ejemplo, una integrina.
El agente de captura es un anticuerpo que se une a un anticuerpo anti-integrina anti-alfa4. Se puede usar como agente de captura cualquier anticuerpo que se une específicamente a un anticuerpo anti-anti-integrina alfa4. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo; un anticuerpo modificado, tal como, un anticuerpo quimérico, anticuerpo de forma modificada, anticuerpo humanizado, o fragmento del mismo (por ejemplo, Fab', Fab, F(ab')2); o un anticuerpo biosintético, por ejemplo, un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo de dominio simple (DAB), Fv, Fv de cadena simple (scFv), o similares.
Los métodos para la elaboración y el uso de anticuerpos policlonales y monoclonales se describen, por ejemplo, en Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory (1 de diciembre de 1998). Los métodos para preparar anticuerpos modificados y fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de forma modificada, anticuerpos humanizados, o fragmentos de los mismos, por ejemplo fragmentos de Fab', Fab, F(ab')2); o anticuerpos biosintéticos (por ejemplo, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos de dominio simple (DABs), Fv, Fv de cadena simple (scFv), y similares), son conocidos en la técnica y se pueden encontrar en, por ejemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag (15 de diciembre de 2000; 1.a edición).
El agente de captura es un anticuerpo que puede unir específicamente un anticuerpo anti-integrina (por ejemplo, un anticuerpo anti-anti-VLA-4, tal como, un anti-natalizumab), tal como, el anticuerpo de rata 12C2, anticuerpo murino 12C4, o un anticuerpo de conejo adecuado. En otra realización, el agente de captura es un anticuerpo anti-VLA-4, tal como, natalizumab, que se puede unir específicamente a un anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4).
Analitos
Los métodos y aparatos descritos en el presente documento se pueden usar para ensayar el nivel de un analito de interés, por ejemplo, en una muestra biológica de un sujeto. Los ejemplos de analitos incluyen, sin limitarse a ellos, toxinas, compuestos orgánicos, polipéptidos, microorganismos, bacterias, virus, aminoácidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, hormonas, esteroides, vitaminas, fármacos (incluyendo los administrados con fines terapéuticos, así como los administrados con fin ilícito), contaminantes, pesticidas y metabolitos de, o anticuerpos para cualquiera de las sustancias anteriores. Cualquier sustancia, hapteno, anticuerpo, macromoléculas antigénicas y las combinaciones de los mismos, pueden ser también un analito ensayado usando el procedimiento o un aparato descrito en el presente documento. En casos particulares, el analito es un anticuerpo, tal como, un anticuerpo anti-integrina.
Las integrinas son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Takeda et al., Genome Biol. 8:215 (2007)) y se puede ensayar el nivel de cualquier anticuerpo anti-integrina usando un método o un aparato descrito en el presente documento. Cualquier anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo; un anticuerpo modificado, tal como, un anticuerpo quimérico, anticuerpo de forma modificada, anticuerpo humanizado, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab', Fab, F(ab')2); o un anticuerpo biosintético, por ejemplo, un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo de dominio simple (DAB), Fv, Fv de cadena simple (scFv), o similares. El anticuerpo se puede producir de forma natural por el sujeto o uno que se administra al sujeto.
El analito según la invención es un anticuerpo anti-anti-integrina alfa4. En situaciones particulares, el analito puede ser un anticuerpo anti-VLA-4 administrado previamente al sujeto, por ejemplo, como un anticuerpo terapéutico. El analito puede ser, por ejemplo, un natalizumab. En otra situación, el analito es un anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4). El analito puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-natalizumab.
Muestras biológicas
Las muestras biológicas que se van a ensayar para la presencia de un analito usando los métodos y aparatos descritos en el presente documento se pueden obtener de cualquier sujeto, por ejemplo, un sujeto humano o no humano. La muestra biológica se obtiene de un sujeto humano vivo.
El sujeto del que se obtiene la muestra puede estar aparentemente sano, donde el ensayo se realiza como parte de un cribado de rutina. Al sujeto se le puede haber diagnosticado provisionalmente una enfermedad o trastorno y se ha sometido a tratamiento, por ejemplo, con un anticuerpo anti-integrina. La muestra biológica puede ser de un sujeto que ha sido tratado para disminuir la cantidad de analito. En algunos casos, se puede ensayar una muestra de un sujeto usando un procedimiento descrito en el presente documento antes de que el sujeto se someta a un tratamiento, por ejemplo, para modular la cantidad de analito en el sujeto o para establecer el nivel basal de analito en el sujeto o para establecer la idoneidad del tratamiento, y después de que el sujeto haya sido tratado, por ejemplo, para monitorizar y/o modular la cantidad de analito en el sujeto.
La muestra biológica se puede derivar de cualquier tejido, órgano o grupo de células del sujeto. En algunos casos, la muestra biológica es un legrado cervical, biopsia o lavado obtenido de un sujeto. En otros casos, la muestra es una muestra de sangre, plasma, suero u orina.
En algunas situaciones, la muestra biológica se puede procesar, por ejemplo, para extraer ciertos componentes que pueden interferir con un método descrito en el presente documento, usando métodos que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la muestra biológica se puede procesar para ser enriquecida en proteínas, por ejemplo, mediante precipitación salina y similares.
El nivel de un analito en una muestra se puede cuantificar y/o comparar con controles. Las muestras de control adecuadas pueden proceder, por ejemplo, de individuos que no hayan recibido un tratamiento. Las muestras de control pueden ser de individuos relacionados genéticamente con el sujeto que se ha de ensayar, pero también pueden ser de individuos genéticamente no relacionados. En algunos casos, el control es una referencia establecida. El nivel de un analito se puede cuantificar utilizando métodos conocidos. En otras situaciones, la presencia o ausencia de un analito en una muestra, se puede determinar mediante inspección visual del ensayo.
También se puede poner en contacto una muestra contacta con un agente de captura unido a un soporte sólido bajo condiciones adecuadas para la unión del agente de captura a analitos en la muestra, y, después de la separación de los analitos de muestra no unidos de los analitos unidos, los analitos unidos se detectan tal como se describe en el presente documento.
Métodos de ensayo
Se puede ensayar un analito usando un método seleccionado entre una variedad de métodos de inmunoensayo, tanto cualitativamente como cuantitativamente. Los procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo son conocidos y se describen en, por ejemplo, Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4.a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA. Los inmunoensayos se pueden llevar a cabo en cualquiera de las diversas configuraciones conocidas en la técnica y descritas en, por ejemplo, Maggio Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.(1980); Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon and van Knippenberg Eds., Elsevier (1985), pág 9-20; y Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, NY (1988).
Ensayos de unión inmunológicos:
Un analito se puede detectar y/o cuantificar usando cualquiera de una serie de ensayos de unión inmunológicos conocidos (véase, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. N.° 4,366,241, 4,376,110; 4,517,288; 4,837,168; y Asai, Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc. NY (1993).
Los inmunoensayos también pueden usar un reactivo etiquetado para unirse específicamente y etiquetar el complejo de agente de captura/analito. El reactivo etiquetado puede ser él mismo uno de los restos que comprenden el complejo de agente de captura/analito. Alternativamente, el reactivo etiquetado puede ser un tercer resto, tal como, un anticuerpo, que se une específicamente al analito a al complejo de agente de captura/analito.
El analito puede ser un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-integrina, o, por ejemplo, un anticuerpo anti fármaco, y el reactivo etiquetado puede ser un segundo anticuerpo que presenta una etiqueta.
Alternativamente, al segundo anticuerpo le puede faltar una etiqueta, pero puede, en su lugar, unirse mediante un reactivo etiquetado que incluye un tercer anticuerpo específico para anticuerpos de las especies de las que se deriva el segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo se puede modificar con un resto detectable, tal como, biotina, a la que se puede unir específicamente un reactivo etiquetado, tal como, estreptavidina etiquetada con enzima.
También se pueden usar como reactivo etiquetado otras proteínas que se pueden unir específicamente a regiones constantes de la inmunoglobulina, tales como, la proteína A o la proteína G. Estas proteínas son constituyentes normales de las paredes celulares de las bacterias estreptocócicas. Presentan una reactividad no inmunogénica fuerte con regiones constantes de la inmunoglobulina de diversas especies (véase, por ejemplo, Kronval et al., J. Immunol. 111: 1401-1406 (1973), y Akerstrom et al., J. Immunol., 135: 2589-2542 (1985)).
Durante los métodos y ensayos descritos en el presente documento, pueden ser necesarias etapas de incubación y/o lavado después de una o más combinaciones de reactivos. Las incubaciones llevadas a cabo durante el ensayo pueden variar entre aproximadamente 5 segundos a varias horas, en general, desde aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. El tiempo de incubación dependerá del formato del ensayo, del analito, del volumen de solución, de las concentraciones y similares. En general, un ensayo se lleva a cabo a temperatura ambiente, aunque se puede realizar un ensayo en un intervalo de temperaturas, tales como, aproximadamente 4°C a aproximadamente 40°C, por ejemplo, 4°C-10°C o 4°C-25°C.
1. Formatos de ensayos no competitivos
Los inmunoensayos para la detección de un analito de interés, por ejemplo, un anticuerpo anti-integrina, o, por ejemplo, un anticuerpo anti-fármaco, en las muestras pueden ser competitivos o no competitivos. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los que la cantidad de analito en un complejo de agente de captura/analito se mide directamente. En un ensayo "sándwich", por ejemplo, el agente de captura se puede unir directamente a un sustrato sólido donde está inmovilizado. Estos agentes de captura inmovilizados se pueden unir después específicamente a un analito presente en una muestra de prueba. El analito, por ejemplo, un anticuerpo anti-integrina, o, por ejemplo, un anticuerpo anti-fármaco, inmovilizado de este modo se une después mediante un reactivo etiquetado, como un segundo anticuerpo que presenta una etiqueta. Alternativamente, al segundo anticuerpo le puede faltar una etiqueta, pero puede, en su lugar, unirse mediante un reactivo etiquetado que es un tercer anticuerpo específico para anticuerpos de las especies de las que se deriva el segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo se puede modificar con un resto detectable, como biotina, al que se puede unir específicamente un tercer reactivo etiquetado, tal como, estreptavidina etiquetada con enzima.
2. Formatos de ensayos competitivos
En los ensayos competitivos, la cantidad de analito (tal como un anticuerpo anti-integrina o un anticuerpo anti fármaco) presente en una muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de analito añadido (exógeno) desplazado (o desplazado por competición) de un agente de captura (por ejemplo, un anticuerpo específico para el analito) por el analito presente en la muestra. En un ensayo competitivo, una cantidad conocida de un analito, por ejemplo, anticuerpo anti-integrina, o, por ejemplo, un anticuerpo anti-fármaco, se añade a la muestra y la muestra se pone después en contacto con el agente de captura, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un anticuerpo anti-integrina: La cantidad de analito unido al agente de captura, por ejemplo, anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración de analito presente en la muestra. En un ejemplo particular, el agente de captura, por ejemplo, un anticuerpo que se une a un anticuerpo anti-integrina está inmovilizado en un sustrato sólido. Por ejemplo, la cantidad del analito, por ejemplo, anticuerpo antiintegrina, o, por ejemplo, un anticuerpo anti-fármaco, unido al agente de captura, por ejemplo, anticuerpo que se une a un anticuerpo anti-integrina o, por ejemplo, un fármaco al que se une un anticuerpo anti-fármaco se puede determinar midiendo la cantidad de analito presente en un complejo de agente de captura/analito, o, alternativamente, midiendo la cantidad de analito no complejado restante. La cantidad de analito se puede ser detectar proporcionando un reactivo etiquetado.
3. Otros formatos de ensayo
Cuando el analito es un polipéptido, se puede usar un análisis por western blot (immunoblot) para detectar y cuantificar la presencia del polipéptido en una muestra. La técnica comprende generalmente la separación de las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel en base al peso molecular, transferencia de las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado (tal como, por ejemplo, un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nailon o un filtro derivado de nailon), y la incubación de la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido de interés. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a un polipéptido de interés en el soporte sólido. Estos anticuerpos se pueden etiquetar directamente o alternativamente se pueden detectar posteriormente usando anticuerpos etiquetados (por ejemplo, anticuerpos de oveja anti-ratón etiquetados) que se unen específicamente a los anticuerpos contra el polipéptido de interés.
Otros formatos de ensayo incluyen unos inmunoensayos de liposoma (LIA), que usan liposomas diseñados para unirse a moléculas específicas (por ejemplo, anticuerpos) y liberar etiquetas o reactivos encapsulados. Los productos químicos son detectados después de acuerdo con las técnicas estándar (véase, por ejemplo, Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev.5:34-41(1986))
4. Reactivos etiquetados
La etiqueta detectable usada en un método o aparato descrito en el presente documento no es limitante siempre y cuando no interfiera significativamente con la unión específica del reactivo etiquetado usado en el método o aparato. La etiqueta detectable puede ser cualquier material que presenta una propiedad física o química detectable. Dichas etiquetas detectables se han desarrollado bastante en el campo de los inmunoensayos y, en general, la mayoría de las etiquetas útiles en tales métodos, se pueden usar en los métodos y aparatos descritos en el presente documento. Una etiqueta puede ser, por ejemplo, cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las etiquetas útiles en los métodos y aparatos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, perlas magnéticas (por ejemplo DynabeadsTM), tintes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceina, Rojo deTexas, rodamina y similares), radioetiquetas (por ejemplo, , 3H, 125I, 35S, 14C, o 32P), enzimas (por ejemplo peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otras que se pueden usar en un ensayo ELISA), y etiquetas colorimétricas o en partículas, tales como, oro coloidal o perlas de cristal coloreado o plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).
La etiqueta se puede acoplar directamente o indirectamente al componente deseado del ensayo según métodos conocidos en la técnica. Como se describe en el presente documento, se puede usar una amplia variedad de etiquetas, dependiendo la elección de la etiqueta de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación, los requisitos de estabilidad, los instrumentos disponibles y los suministros disponibles.
Las etiquetas no radioactivas se pueden unir por medios indirectos. Las moléculas también se pueden conjugar directamente a compuestos que generan señales, por ejemplo, mediante la conjugación con una enzima o un compuesto fluorescente. Se pueden usar varios compuestos enzimáticos y fluorescentes con los métodos y aparatos descritos en el presente documento y son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de<e E .>UU., N.° 4,391,904.).
Los medios para detectar etiquetas son conocidos por los expertos en la técnica. Por consiguiente, por ejemplo, cuando la etiqueta es una etiqueta radioactiva, los medios para la detección incluyen un contador de centelleo o una película fotográfica como en una autoradiografía. Cuando la etiqueta es una etiqueta fluorescente, se puede detectar mediante excitación del fluorocromo con la longitud de onda de la luz adecuada y detectando la fluorescencia resultante. La fluorescencia se puede detectar visualmente, mediante una película fotográfica, mediante el uso de detectores electrónicos, tales como, dispositivos de carga acoplada (por sus siglas en inglés, CCD) o fotomultiplicadores y similares. De modo similar, las etiquetas enzimáticas se pueden detectar proporcionando los sustratos adecuados para la enzima y detectando el producto de reacción resultante. Finalmente, las etiquetas colorimétricas simples se pueden detectar directamente observando el color asociado con la etiqueta. Por consiguiente, en varios ensayos con varilla de medición, el oro conjugado aparece frecuentemente rosa, mientras que varias perlas conjugadas aparecen con el color de la perla.
Algunos formatos de ensayo no requieren el uso de reactivos etiquetados. Por ejemplo, los ensayos de aglutinación se pueden usar para detectar la presencia de anticuerpos diana. En este caso, las partículas revestidas de antígeno se aglutinan por muestras que comprenden anticuerpos diana. En este formato, no es necesario que ninguno de los componentes del ensayo esté etiquetado, y la presencia del anticuerpo diana se detecta mediante una sencilla inspección visual.
Después de la detección de una señal detectable, la señal se puede comparar con una referencia y/o correlacionar con un nivel predeterminado que corresponde a las recomendaciones del tratamiento. Por ejemplo, en un ensayo para detectar el nivel de un anticuerpo anti-VLA-4 en un sujeto que está siendo tratado con plasmaféresis para reducir la cantidad del anticuerpo, un nivel de la señal inferior al nivel predeterminado puede estar correlacionado con la recomendación de que no es necesario realizar más plasmaféresis. Una señal correlacionada con un nivel más elevado puede indicar que es recomendable realizar plasmaféresis adicional.
La detección de una señal en un ensayo descrito en el presente documento puede ser visual, pero también se puede realizar usando un lector para detectar la señal. Tales lectores incluyen, por ejemplo, lectores automáticos de placas, lectores EIA y similares Los lectores se pueden usar para la determinación semicuantitativa o cuantitativa de la concentración de los analitos probados. La determinación semi-cuantitativa o cuantitativa de la concentración se puede representar usando un sistema colorimétrico.
5. Agentes secundarios
Los agentes secundarios usados en un método o aparato descritos en el presente documento se pueden usar para detectar la unión del agente de captura al anticuerpo. El agente secundario puede ser un anticuerpo que tiene una etiqueta detectable unida, covalentemente o no covalentemente. La etiqueta detectable unida al agente secundario puede ser una etiqueta detectable como se ha descrito anteriormente. El agente secundario puede ser un anticuerpo no específico, o anticuerpos que reconocen el analito o fragmentos del mismo o polipéptidos que reconocen el analito. El agente secundario puede incluir un anticuerpo anti-IgG4, por ejemplo, un anti-IgG4 humana o un anti-IgG4 humana que reacciona con la porción Fc de la cadena pesada de la IgG4 humana.
6. Tiempo
La unión del agente de captura al anticuerpo puede ser detectable en aproximadamente 30 segundos, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 hora, 2 horas, 5 horas, o 10 horas después de la unión.
7. Tampón
Se puede usar cualquier tampón adecuado para ensayos inmunológicos como tampón de detección que sea determinado por un experto en la técnica. El tampón de detección puede incluir un tensioactivo. Se puede usar cualquier tensioactivo adecuado. Un agente tensioactivo puede ser un tensioactivo polisorbato como TWEEN 20 ®, TWEEN 40 ®, TWEEN 60 ®, TWEEN 80 ®, SPAN 20 ®, SPAN 40 ®, SPAN 60 ®, SPAN 65 ®, y SPAN 80 ®. El tampón puede incluir una solución salina tamponada, tal como, la solución salina tamponada con Tris (TBS) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). El tampón puede incluir también un agente bloqueante, por ejemplo, una proteína, tal como, la seroalbúmina bovina (BSA), leche o gelatina.
Tratamientos
Los ensayos descritos en el presente documento se pueden realizar antes y/o después de la administración de un tratamiento a un sujeto. En algunos casos, el tratamiento es un tratamiento para extraer un analito o componente del sujeto, tal como, por ejemplo, de la sangre de un sujeto. En situaciones particulares, el tratamiento es aféresis sanguínea, tal como, un intercambio de plasma, para extraer uno o más anticuerpos del sujeto.
La aféresis sanguínea es un uso médico habitual de separación continua de fluidos. La aféresis tiene muchos usos clínicos, incluyendo muchas terapias que implican la extracción de sangre del cuerpo de un sujeto, la separación de la sangre en componentes, la alteración de uno o más de los componentes y la introducción de alguna mezcla o selección del fluido extraído y/o alterado de nuevo en el cuerpo del sujeto. Algunos ejemplos de procedimientos con aféresis terapéutica incluyen el intercambio terapéutico de plasma (TPE o PLEX) (un procedimiento mediante el cual se extrae el plasma sin células y se sustituye con solución coloide/salina); citoreducción (un proceso mediante el cual se extraen las plaquetas y leucocitos); fotoféresis (un procedimiento mediante el cual las células mononucleares recolectadas mediante aféresis terapéutica se exponen a una luz ultravioleta-A y psolareno y se vuelven a inyectar en el sujeto); y adsorción selectiva (un proceso mediante el cual se adsorbe el plasma en una columna y se devuelve al sujeto).
En un ejemplo de un procedimiento de aféresis, la sangre se extrae de un sujeto mediante una aguja insertada en la vena del sujeto. La aguja está unida a un extremo de un tubo de plástico que proporciona una vía de flujo para la sangre. El otro extremo del tubo conduce a un separador, tal como, una centrífuga, para separar la sangre en sus componentes. Las centrífugas de flujo continuo que permiten la entrada y salida de flujo continuado de materiales hacia y desde la centrífuga son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 4,425,112). La sangre que se separa en plasma y células puede devolverse al sujeto a través del otro brazo. Un sustituto de plasma o un plasma alterado se puede recombinar con los elementos sanguíneos que se van a devolver al sujeto. Ya que la tasa de sangre que se va extrayendo del sujeto y la sangre que vuelve al sujeto pueden ser la misma tasa, sólo una pequeña cantidad de la sangre del sujeto puede encontrarse fuera del cuerpo en cualquier momento.
Otro procedimiento de aféresis utiliza un sistema automatizado que usa circuitos fluidos desechables previamente esterilizados a través de los cuales fluye la sangre. Los circuitos de fluidos se montan en máquinas reutilizables que pueden tener bombas, válvulas, sensores y similares. Estos sistemas automatizados incluyen además un ordenador interno y programas de software asociados que controlan muchas de las funciones de procesamiento. Un ejemplo de sistema automatizado se describe en la patente de EE. UU. N.° 6,706,008. Otros métodos y aparatos para aféresis se describen en, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.° 7,267,771; 6,849,183; 5,200,090; y 4,954,128
En algunas situaciones, el nivel de un anticuerpo anti-integrina o un anticuerpo anti-fármaco descrito en el presente documento se puede ensayar antes de administrar un tratamiento a un sujeto. En otras situaciones, el nivel de un anticuerpo anti-integrina o un anticuerpo anti-fármaco también se puede ensayar después de administrar un tratamiento a un sujeto. Por ejemplo, el nivel de un anticuerpo anti-integrina o un anticuerpo anti-fármaco se ensaya un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas después de la administración del tratamiento. Estos ensayos se pueden administrar como parte de un régimen de tratamiento, por ejemplo, para monitorizar periódicamente los niveles de fármaco o los niveles de anticuerpos anti-fármaco. En algunos casos, se puede administrar el tratamiento y se ensaya el nivel de un anticuerpo anti-integrina o anticuerpo anti-fármaco en ciclos repetidos de tratamiento y ensayo, por ejemplo, hasta que el nivel del anticuerpo anti-integrina en la muestra alcance un nivel predeterminado. Por ejemplo, el nivel predeterminado puede ser aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 2 pg/ml, aproximadamente 3 pg/ml, aproximadamente 4 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 6 pg/ml, aproximadamente 7 pg/ml, aproximadamente 8 pg/ml, aproximadamente 9 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 15 pg/ml, o aproximadamente 20 pg/ml. En algunos casos, el nivel predeterminado es 1 pg/ml, 2 pg/ml, 3 pg/ml, 4 pg/ml, 5 pg/ml, 6 pg/ml, 7 pg/ml, 8 pg/ml, 9 pg/ml, 10 pg/ml, 15 pg/ml, o 20 pg/ml. Los tratamientos se pueden administrar, por ejemplo, una vez al día o una vez cada dos días, tres días, cuatros días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, cada tres meses, cada cuatro meses, casa seis meses o anualmente.
La invención se ilustra con más detalle mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan sólo con fines ilustrativos. En ningún sentido, deben ser interpretados como limitantes del alcance o contenido de la invención
Ejemplos
Ejemplo 1
Desarrollo de una prueba para ensayar anticuerpo anti-VLA-4 en un tampón usando mAb 12C2 de rata o mAb 12C4 de ratón y conjugados anti-IgG4 humana-oro.
Se utilizó un sistema de prueba inmunocromatográfico de flujo lateral para desarrollar una prueba específica anti-VLA-4. Haciendo referencia a la FIG. 1, el sistema de prueba de flujo lateral estaba compuesto por un casete con dos partes en plástico (parte superior 100 y parte inferior 101). La parte superior contenía dos aberturas- una abertura 102 para la aplicación de muestras 110 y tampón de detección 118 y una ventana 103 para la detección visual de los resultados. La parte inferior albergaba una tira de prueba de nitrocelulosa 104 en la cual el mAb 12C2 de rata o mAb 12C4 de ratón 105 se inmovilizó en un "sitio de prueba" ("T") 106 y un reactivo de captura de oro universal 107 en un "sitio control" ("C") (108).
Aguas arriba de los sitios de prueba y control, había una "almohadilla de oro" 109 de material fibroso donde se conjugó anti-IgG4 humana de ratón con partículas de oro, siendo el complejo 112. Más aguas arriba de la almohadilla de conjugado de oro se encontraba otra almohadilla de fibra 111 que recibió la muestra del anticuerpo humanizado anti-VLA-4 en tampón (110) y el tampón de detección 118 a través de la abertura 102. La almohadilla de muestra 111, la almohadilla de oro 109 y la membrana de nitrocelulosa 104 se encontraban en un orden secuencial, de modo que la muestra migró por acción capilar desde la almohadilla de muestra 111 hasta la almohadilla de oro 109 para formar un "primer complejo" de la muestra 110 y el conjugado 112 de anti-IgG4 humana de ratón/oro. Después el complejo se desplazó a través de la nitrocelulosa 104 donde se encontró con el mAb 12C4 de ratón o mAb 12C2 de rata 105 en el sitio de prueba 106. La muestra 110 reaccionó con el mAb 12C4 de ratón o mAb 12C2 de rata 105, formando un complejo de 112 y 110 que quedó atrapado en el sitio de prueba 106 y se visualizó como una línea roja 114. La muestra 110 también se puede añadir aguas abajo del conjugado de oro.
El exceso de anticuerpo libre etiquetado con oro (anti-IgG4 humana de ratón) se desplazó más al sitio de control donde un reactivo de captura de oro universal 107 capturó el anticuerpo libre etiquetado con oro (anti-IgG4 humana de ratón) provocando la aparición de una línea roja visible adicional 115 en el sitio control 108. Cualquier exceso de material, oro y tampón de detección fue absorbido en el extremo distal de la tira de nitrocelulosa por una almohadilla de filtro absorbente 116.
La especificidad de la prueba se debió al hecho de que el complejo en el sitio de prueba sólo se formó cuando la molécula de muestra contiene un resto de IgG4 humana o humanizada para capturar el conjugado de anti-IgG4 humana de ratón y oro y forman el primer complejo y el resto anti-VLA-4 para reaccionar con el anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) en el sitio de prueba. En una representación simple, la molécula anti-VLA-4 se colocó en sándwich entre la anti-IgG4 humana de ratón etiquetada con oro y el anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) inmovilizado en la membrana.
Materiales
mAb 12C4 de ratón anti-(anticuerpo anti-VLA-4) (Elan), 2,1 mg/ml
mAb 12C2 de rata anti-(anticuerpo anti-VLA-4) (Biogen Idee), 1,76 mg/ml
mAb de ratón anti-IgG4 humana (Southern Biotech), 0,5 mg/ml
Ab humanizado anti-VLA-4 (Biogen Idec), 20 mg/ml
Ab anti-VLA-1 (Biogen Idec),
IgG4 humana (CalBiochem), 1 mg/ml
Tampón de formulación de Ab humanizado anti-VLA-4 (Biogen Idec)
Reactivo universal de captura de oro
Tampón de detección (PBS con BSA al 1 % p/v y Tween 20 al 1 % p/v)
Conjugado de oro (40 nm)
Desarrollo de pruebas
El enfoque para el desarrollo de la prueba del anticuerpo anti-VLA-4 fue dirigirse al sitio de unión al antígeno con un anticuerpo específico de captura para el anticuerpo anti-VLA-4 (mAb 12C4 o 12C2) inmovilizado en la membrana, y un anticuerpo detector etiquetado con oro (anti-IgG4 humana) dirigido contra la región constante del anticuerpo anti-VLA-4, que comprende una molécula IgG4 humana.
Si el anticuerpo monoclonal 12C4 o 12C2 es altamente específico, no se captura ninguna otra molécula en la membrana y entonces la prueba es negativa. El anti-VLA-1 es un anticuerpo monoclonal humanizado frente a VLA-1. La región constante del anticuerpo es IgG1 humana, mientras que la región variable de unión al antígeno es de origen de ratón. Ya que VLA-1 y VLA-4 están estrechamente relacionados, se puede usar anti-VLA-1 como control adicional del sistema de prueba. Esta inclusión se puede usar para confirmar la especificidad del sistema de prueba.
Basándose en esto supuestos, se desarrolló un sistema inmunocromatográfico de flujo lateral con los mAb 12C4 o 12C2 dirigidos contra el anticuerpo humanizado anti-VLA-4. Para determinar la concentración adecuada del anticuerpo de captura, se usó 12C4 o 12C2, el cual se tituló entre 0,25 y 1,0 mg/ml en tiras de prueba separadas y se probó contra el anticuerpo humanizado anti-VLA-4 a 80 pg/ml. Después el anticuerpo 12C4 o 12C2 se inmovilizó en el sitio de prueba de la membrana a 1,0 mg/ml. Un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG4 humana (cadena gamma específico) a 30 pg/ml se conjugó con partículas de oro. El inmunoconjugado de anti-IgG4 humana de ratón y oro se liofilizó después en la almohadilla del conjugado y se usó como molécula detectora. En el sitio de control de la membrana, se usó un reactivo de oro universal a 3,0 mg/ml.
Resultados
Durante la titulación del anticuerpo monoclonal 12C4 o 12C2, se identificó una reacción positiva por la presencia de una banda en la porción superior de cada tira. Se seleccionó una concentración de anticuerpo de 1,0 mg/ml, puesto que dio como resultado una señal intensa con el mínimo ruido de fondo, y se inmovilizó en el sitio de prueba de la membrana.
El anticuerpo humanizado anti-VLA-4, el anti-VLA-1humanizado, IgG1 (mieloma), IgG4 (mieloma), anti-IgG1 y el tampón de formulación se probaron en un sistema de flujo con 12C4 o 12C2 inmovilizados. El anticuerpo humanizado anti-VLA-4 se ensayó en un intervalo de concentración de 0,015 y 500 pg/ml. El anticuerpo 12C4 o 12C2 fue capaz de detectar el anticuerpo humanizado anti-VLA-4 a una concentración de 0,08 pg/ml.
Después el anticuerpo 12C2 se usó para fabricar unos casetes de prueba. La Figura 1 ilustra la especificidad de la prueba usando los casetes de prueba. Todas las pruebas mostraron una banda única 115, que indica una prueba válida, pero sólo el casete para la prueba del anticuerpo humanizado anti-VLA-4 mostró una segunda banda 114 que indica una prueba positiva.
Ejemplo 2
Desarrollo de una prueba para ensayar anticuerpo anti-VLA-4 en suero usando mAb 12C2 de rata o mAb 12C4 de ratón y conjugados de anti-IgG4 humana-oro.
Para probar la viabilidad de la prueba utilizando un fluido biológico, se probó un ensayó usando suero enriquecido con anti-VLA-4. El casete con dos partes de plástico de este sistema de prueba de flujo lateral es el mismo que el del Ejemplo 1, con algunas modificaciones. En referencia a la FIG. 2, la parte superior 200 contenía tres aberturas- la abertura 202 es para la aplicación de muestras 210, la abertura 217 para un tampón de detección 218 y una ventana 203 para la detección visual de los resultados. El tampón de detección se puede añadir aguas abajo de la muestra o se puede añadir en la misma abertura que para la aplicación de muestras. La parte inferior 201 alojaba una tira de prueba de nitrocelulosa 204 en la cual el mAb 12C4 de ratón o mAb 12C2 de ratón 205 se inmovilizó en un "sitio de prueba" (T) 206 y un anticuerpo de cabra anti-ratón 207 en un "sitio control" (C) 208. Se puede usar como anticuerpo de control un anticuerpo frente a analitos específicos del suero (por ejemplo, seroalbúmina).
Aguas arriba de los sitios de prueba y control, había una almohadilla fibrosa ("almohadilla de muestra") 209 que recibía la muestra 210. Situados aguas arriba de los sitios de prueba y control, había una "almohadilla de oro" 211 de un material fibroso donde se conjugó anti-IgG4 humana ratón con partículas de oro, siendo el complejo 212. Se usó el ensayo en dos etapas. En la primera etapa, la muestra de suero 210 se aplicó en la abertura de la muestra 202 y migró hacia la zona de captura 205 delante del conjugado de oro para formar un complejo de una muestra 210 (anti-VLA4) con 12C4 de ratón o 12C2 de rata en la línea de prueba 205. En la segunda etapa, el tampón de detección 218 se aplicó en el puerto del tampón de detección 217 rehidrató el conjugado monoclonal de anti-IgG4 humana -oro 212. Después el conjugado 212 se desplazó hacia la línea de la prueba de captura 205 para formar un complejo con el anti-VLA-4 unido a la línea de captura 205 y la reacción en el sitio 206 se visualizó como una línea roja 214.
El exceso de anticuerpo libre etiquetado con oro (anti-IgG4 humana de ratón) se desplazó más al sitio de control 208 donde un anticuerpo de cabra anti-ratón 207 capturó el anticuerpo libre etiquetado con oro (anti-IgG4 humana de ratón), provocando la aparición de una línea roja visible adicional 215. Cualquier exceso de material, oro y tampón de detección fue absorbido en el extremo distal de la tira de nitrocelulosa por una almohadilla de filtro absorbente 216.
La especificidad de la prueba se debió al hecho de que el complejo en el sitio de prueba sólo se formó cuando la muestra contiene resto de anti-VLA-4 para reaccionar con el anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) en el sitio de prueba, y ser detectada por un resto anti-IgG4 humana de ratón conjugado con oro. En una representación simple, la molécula anti-VLA-4 se colocó en sándwich entre la anti-IgG4 humana de ratón etiquetada con oro y el anticuerpo anti-(anti-anticuerpo VLA-4) inmovilizado en la membrana. El éxito de este formato depende de cualquier resto endógeno que interfiera (por ejemplo, IgG4) en la muestra que se desplaza delante del conjugado de anti-IgG4 y oro, reduciendo su interferencia con la detección del anti-VLA-4 en la línea de prueba.
Se puede usar un lector para la determinación semi-cuantitativa de la concentración de los analitos probados. Para registrar los resultados del sistema de flujo lateral, se usó un lector basado en una puntuación visual positiva/negativa. El umbral visual del lector corresponde a valores que están en un intervalo de 20-40 unidades. Si la señal se registró como positiva visualmente dentro de este intervalo, entonces se debe considerar una línea rosa muy débil que podría no ser visible para todos los operadores.
Materiales
mAB 12C4 de ratón anti-(anticuerpo anti-VLA-4) (Elan), 2,1 mg/ml
mAB de ratón anti-IgG4 humana (Southern Biotech), 0,5 mg/ml
Ab humanizado anti-VLA-4 (Biogen Idec), 21 mg/ml
IgG4 humana (The Binding Site, San Diego, CA), 13,7 mg/ml
Tampón de formulación de Ab humanizado anti-VLA-4 (Biogen Idec)
Anticuerpo de cabra anti-ratón, 3,0 mg/ml
Tampón de detección (PBS con BSA al 1 % p/v y Tween 20 al 1 % p/v)
Conjugado de oro (40 nm)
Desarrollo de pruebas
El enfoque para el desarrollo de la prueba fue dirigirse al sitio de unión al antígeno con un anticuerpo de captura (mAb 12C4 o mAb 12C2) inmovilizado en la membrana, específico para el anticuerpo anti-VLA-4, y un anticuerpo detector etiquetado con oro (anti-IgG4 humana de ratón) dirigida contra la región constante del anticuerpo anti-VLA-4, que comprende una molécula IgG4 humana.
Si el anticuerpo monoclonal usado en el ensayo, tal como, 12C4 o 12C2 es altamente específico, no se captura ningún otro analito en la membrana y por consiguiente la prueba es negativa.
Basándose en esto supuestos, se desarrolló un sistema inmunocromatográfico de flujo lateral con el mAb 12C4 o 12C2 dirigido contra el anticuerpo humanizado anti-VLA-4. Para determinar la concentración adecuada de anticuerpo de captura, se usó 12C4 que se tituló en tiras de prueba separadas y se probó frente al anticuerpo humanizado anti-VLA-4 a diferentes concentraciones que varían desde 100 pg/ml hasta 0,25 pg/ml. Después, el anticuerpo 12C4 se inmovilizó en el sitio de prueba de la membrana a 2,1 mg/ml. Un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG4 humana (cadena gamma específico) se conjugó con partículas de oro de 40 nm. El inmunoconjugado de anti-IgG4 humana de ratón y oro se liofilizó después en la almohadilla del conjugado y se usó como molécula detectora. En el sitio de control de la membrana, se usó un anticuerpo de cabra anti-ratón al a 3,0 mg/ml.
Resultados
Durante la titulación del anticuerpo monoclonal 12C4 o 12C2, se indicaba una reacción positiva por la presencia de una banda en la porción superior de cada tira. Se seleccionó una concentración de anticuerpo de 2,1 mg/ml, puesto que dio como resultado una señal intensa con el mínimo ruido de fondo, y se inmovilizó en el sitio de prueba de la membrana. El protocolo consistió en la adición de 20 pl de suero (diluido previamente 1:10 en tampón de detección o sin diluir) en el puerto 202 seguido inmediatamente (< 1 minuto) por 150 pl de tampón de detección 218 en el puerto 217. La muestra se dejó incubando en el dispositivo durante 30 minutos a temperatura ambiente y humedad ambiente.
El anticuerpo humanizado anti-VLA-4, en una matriz de muestra, IgG4 (mieloma), anti-VLA-4 junto con IgG4 y el tampón de formulación se probaron en un sistema de flujo con 12C4 inmovilizado. El anticuerpo humanizado anti-VLA-4 se probó a un intervalo de concentración de 0,25 y 100 pg/ml. El anticuerpo 12C4 fue capaz de detectar el anticuerpo humanizado anti-VLA-4 a una concentración de 0,25 pg/ml.
Después, el anticuerpo 12C4 se usó para fabricar unos casetes de prueba. La Figura 2 ilustra la especificidad de la prueba usando los casetes de prueba. Todas las pruebas mostraron una banda única 215, que indica una prueba válida, pero sólo los casetes para la prueba del anticuerpo humanizado anti-VLA-4 mostraron una segunda banda 214 que indica una prueba positiva.
La prueba puede incluir componentes adicionales. El anti-VLA-1 es un anticuerpo monoclonal humanizado frente a VLA-1. La región constante de algunos anticuerpos anti-VLA-1 es IgG1, mientras que la región variable de unión al antígeno es de origen de ratón. El anti-VLA-1 se puede usar también como un control adicional para evaluar la especificidad del sistema de prueba. Los controles adicionales que se pueden incluir en el sistema de prueba incluyen la evaluación de la tolerancia de la prueba a niveles en exceso de analitos que se pueden encontrar en el suero, por ejemplo, IgG4, fármaco, o anticuerpos anti-fármaco. Se puede usar un lector para la determinación semi-cuantitativa o cuantitativa de las concentraciones del anti-VLA4.
Ejemplo 3
Desarrollo de una prueba para ensayar anticuerpo anti-VLA-4 usando conjugados de mAb anti-anti-VLA-4 con oro
Se realizaron experimentos para probar la capacidad de un formato diferente para detectar eficazmente el anticuerpo anti-VLA-4 en suero. El casete con dos partes de plástico de este sistema de prueba flujo lateral es el mismo del Ejemplo 2 con algunas modificaciones. En referencia a la FIG.3, la parte superior 300 contenía tres aberturas, una 302 es para la aplicación de las muestras 310, la abertura 317 para la aplicación del tampón de detección 318 y una ventana 303 para la detección visual de los resultados. La parte inferior 301 albergaba una tira de prueba de nitrocelulosa 304 en la que se inmovilizó el mAb de ratón 12C4305 en el "sitio de prueba" (T) 306 y un anticuerpo de cabra anti-ratón 307, en el "sitio control" (C) 308.
Aguas arriba de los sitios de prueba y control, se encontraba una almohadilla fibrosa ("almohadilla de muestra") 309 que recibía la muestra 310. Más aguas arriba de los sitios de prueba y control había una "almohadilla de oro" 311 de material fibroso donde se conjugó un anticuerpo anti-anti-VLA4 de ratón, 12C4 con partículas de oro, siendo el complejo 312. Se usó el ensayo en dos etapas. En la primera etapa, la muestra 310 se aplicó en la abertura de la muestra 302 y migró hacia la zona de captura 305 delante del conjugado de oro para formar un complejo de una muestra 310 (anti-VLA4) con el 12C4 de ratón o 12C2 de rata en la línea de prueba 305. En la segunda etapa, el tampón de detección 318 se aplicó en el puerto del tampón de detección 317 y rehidrató el conjugado de anticuerpo monoclonal anti-anti-VLA4 de ratón 12C4 y oro 312. Después, el conjugado 312 se desplazó hacia la línea de prueba de captura 305 para formar un complejo con el anti-VLA-4 unido a la línea de captura 305 y se visualizó la reacción en el sitio 306 como una línea roja 314.
El exceso de anticuerpo libre etiquetado con oro (mAb 12C4 de ratón) se desplazó más al sitio de control donde un anticuerpo de cabra anti-ratón 307 capturó el mAb, provocando la aparición de una línea roja visible adicional 315. Cualquier exceso de material, oro y tampón de detección fue absorbido en el extremo distal de la tira de nitrocelulosa por una almohadilla de filtro absorbente 316.
Cuando se usan muestras enriquecidas con natalizumab, este formato de prueba presenta un intervalo de detección más restringido que la prueba realizada con el conjugado de anti IgG4 -humana y oro, porque el complejo en el sitio de prueba sólo se formó cuando la molécula de la muestra puede reaccionar tanto con el conjugado anti-(anticuerpo anti-VLA-4)/oro y el anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) en el sitio de prueba. En una representación simple, la molécula anti-VLA-4 se extiende entre el anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) etiquetado con oro y el anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) inmovilizado en la membrana. Por lo tanto, esta prueba es menos sensible para la detección global del anticuerpo anti-VLA-4 cuando se usan muestras reales de pacientes. Este formato da como resultado una prueba más restringida en la que se detecta sólo natalizumab intacto, que es un anticuerpo a base de IgG4. Este formato no detecta moléculas intercambiadas de anticuerpos incompletos, que se observa en pacientes tratados con natalizumab y otros anticuerpos IgG4. Por lo tanto, los usos de este formato se restringen generalmente a la detección de fármaco intacto.
Materiales
mAB 12C4 de ratón anti-(anticuerpo anti-VLA-4) (Elan), 2,1 mg/ml
Ab humanizado anti-VLA-4 (Biogen Idec), 21 mg/ml
Tampón de formulación de Ab humanizado Anti-VLA-4 (Biogen Idec)
Anticuerpo de cabra anti-ratón, 3,0 mg/ml
Tampón de detección (PBS con BSA al 1 % p/v y Tween 20 al 1 % p/v)
Conjugado de oro (40 nm)
Desarrollo de pruebas
Se desarrolló un sistema inmunocromatográfico de flujo lateral con el mAb 12C4 dirigido contra el anticuerpo humanizado anti-VLA-4. Para determinar la concentración adecuada del anticuerpo de captura, el 12C4 se tituló en tiras de prueba separadas y se ensayó frente al anticuerpo humanizado anti-VLA-4 a diferentes concentraciones que varían desde 0,25 hasta 100 pg/ml. Después, el anticuerpo 12C4 se inmovilizó en el sitio de prueba de la membrana a 2,1 mg/ml. También, el anticuerpo 12C4 se conjugó con partículas de oro de 40 nm, liofilizadas en la almohadilla del conjugado y se usó como molécula detectora. En el sitio de control de la membrana, se usó un anticuerpo de cabra anti-ratón al a 3,0 mg/ml.
Resultados
Durante la titulación del anticuerpo monoclonal 12C4, se indicó una reacción positiva por la presencia de una banda en la parte superior de cada tira. Se seleccionó una concentración de anticuerpo de 2,1 mg/ml, puesto que dio como resultado una señal intensa con el mínimo ruido de fondo, y se inmovilizó en el sitio de prueba de la membrana. El protocolo consistió en la adición de 20 pl de suero (diluido previamente 1:10 en tampón de detección o sin diluir) en el puerto 302 seguido inmediatamente (< 1 minuto) por 150 pl de tampón de detección 318 en el puerto 317. La muestra se dejó incubando en el dispositivo durante 30 minutos a temperatura ambiente y humedad ambiente.
El anticuerpo humanizado anti-VLA-4 en una matriz, el anticuerpo anti-VLA-4 con IgG4 adicional añadida y el tampón de formulación se probaron en un sistema de flujo con 12C4 inmovilizado. El anticuerpo humanizado anti-VLA-4 se probó a un intervalo de concentración de 1 y 100 pg/ml. El anticuerpo 12C4 fue capaz de detectar el anticuerpo humanizado anti-VLA-4 a una concentración de 1 pg/ml.
Después, el anticuerpo 12C4 se usó para fabricar casetes de prueba. La Figura 3 ilustra la especificidad de la prueba usando los casetes de prueba. Todas las pruebas mostraron una banda única 315, que indica una prueba válida, pero sólo el casete para la prueba del anticuerpo humanizado anti-VLA-4 mostró una segunda banda 314 que indica una prueba positiva.
Ejemplo 4
Desarrollo de una prueba para ensayar anticuerpos anti-fármaco usando fármaco anti-VLA-4 y conjugado de anti-VLA-4 y oro
Se describen en este documento ensayos y métodos para detectar anticuerpos dirigidos contra un fármaco, por ejemplo, natalizumab. Para probar este ensayo, el casete con dos partes de plástico de este sistema de prueba de flujo lateral fue el mismo de los Ejemplos 1-3 con algunas modificaciones. En referencia a la FIG.4, la parte superior 400 contenía tres aberturas, la abertura 402 para la aplicación de las muestras 410, la abertura 417 para el tampón de detección 418 y una ventana 403 para la detección visual de los resultados. La parte inferior 401 albergaba una tira de prueba de nitrocelulosa 404 en la que se inmovilizó el anticuerpo anti-VLA-4 405 en el "sitio de prueba" (T) 406 y un anticuerpo de control 407, en un "sitio control" (C) 408.
Aguas arriba de los sitios de prueba y control, se encontraba una almohadilla fibrosa ("almohadilla de muestra") 409 que recibía la muestra 410. Más aguas arriba de los sitios de prueba y control había una "almohadilla de oro" 411 de material fibroso donde se conjugó un anti-VLA-4 con partículas de oro, siendo el complejo 412. Se usó el ensayo en dos etapas. En la primera etapa, la muestra 410 se aplicó en la abertura de la muestra 402 y migró hacia la zona de captura 405 delante del conjugado de oro para formar un complejo de una muestra 410 (anti-anti-VLA4) con el anti-VLA-4 en la línea de prueba 405. En la segunda etapa, el tampón de detección 418 se aplicó en el puerto del tampón de detección 417 y rehidrató el conjugado de anti-VLA-4 y oro 412. Después, el conjugado 412 se desplazó hacia la línea de prueba de captura 405 para formar un complejo con el anti-(anti-VLA-4) unido a la línea de captura 405 y la reacción en el sitio de prueba 406 se visualizó como una línea roja 414.
Cualquier exceso de material, oro y tampón de detección fue absorbido en el extremo distal de la tira de nitrocelulosa por una almohadilla de filtro absorbente 416.
La especificidad de la prueba fue debida al hecho de que el complejo en el sitio de la prueba sólo se formó cuando la molécula de muestra se debía unir a ambos, el anticuerpo anti-VLA en la línea de la prueba y al conjugado de anti-VLA-4 y oro. En una representación simple, el anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) se extiende entre el anticuerpo anti-VLA-4 etiquetado con oro y el anticuerpo anti-VLA-4 inmovilizado en la membrana, y, por consiguiente, en algunos casos, este tipo de ensayo se denomina "ensayo de puente".
El exceso de anticuerpo anti-VLA-4 libre etiquetado con oro y libre puede desplazarse más hacia el sitio control 408 donde un anticuerpo control 407 está disponible para capturar los componentes de la matriz, haciendo aparecer una línea roja adicional visible 415.
Se puede usar un lector para la determinación semi-cuantitativa de la concentración de los analitos probados. Para registrar los resultados del sistema de flujo lateral, se usó un lector basado en una puntuación visual positiva/negativa. El umbral visual del lector corresponde a valores que están en un intervalo de 20-40 unidades. Si la señal se registró como positiva visualmente dentro de este intervalo entonces se debe considerar una línea rosa muy débil que podría no ser visible para todos los operadores.
Materiales
mAB 12C4 de ratón anti-(anticuerpo anti-VLA-4) (Elan), 2,1 mg/ml
mAB de conejo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) (Biogen Idec), 1,1 mg/ml
mAb 12C2 de rata anti-(anticuerpo anti-VLA-4) (Biogen Idec), 1,76 mg/ml
Ab humanizado anti-VLA-4 (Biogen Idec), 21 mg/ml
Tampón de formulación de Ab humanizado Anti-VLA-4 (Biogen Idec)
Anticuerpo de control
Tampón de detección (PBS con BSA al 1 % p/v y Tween 20 al 1 % p/v)
Conjugado de oro (40 nm)
Desarrollo de pruebas
Se desarrolló un sistema inmunocromatográfico de flujo lateral con el anticuerpo anti-VLA-4 dirigido contra el anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4). Para determinar la concentración adecuada del anticuerpo de captura, se usó un anticuerpo anti-VLA-4, que se tituló en tiras de prueba separadas y se probó frente al anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) a diferentes concentraciones que varían desde 25 pg/ml hasta 0,5 pg/ml. Después, el anticuerpo anti-VLA-4 se inmovilizó en el sitio de prueba de la membrana a 0,5 mg/ml. Se conjugó un anti-VLA-4 con partículas de oro de 40 nm. El inmunoconjugado de anti-VLA-4 y oro se liofilizó después en la almohadilla del conjugado y se usó como molécula detectora. En el sitio de control de la membrana, se usó un anticuerpo de control.
Resultados
La concentración de 0,5 mg/ml del anticuerpo se seleccionó para la inmovilización basándose en los experimentos de titulación, que dio como resultado una señal intensa con el mínimo ruido de fondo. El protocolo consistió en la adición de 20 pl de suero (diluido previamente 1:10 en tampón de detección o sin diluir) en el puerto 402 seguido inmediatamente (< 1 minuto) por 150 pl de tampón de detección 418 en el puerto 417. La muestra se dejó incubando en el dispositivo durante 30 minutos a temperatura ambiente y humedad ambiente.
El anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) de ratón y de conejo, el anticuerpo anti-VLA-4 humanizado, la combinación de los anteriores y el tampón de formulación se ensayaron en un sistema de flujo con un anticuerpo anti-VLA-4 inmovilizado. El anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) se ensayó a un intervalo de concentración de 25 pg/ml a 0,5 pg/ml. El anticuerpo humanizado anti-VLA-4 fue capaz de detectar el anticuerpo anti-(anticuerpo anti-VLA-4) humano a una concentración de 0,5 pg/ml.
Después, el anticuerpo humanizado anti-VLA-4 se usó para fabricar los casetes de prueba. La Figura 4 ilustra la especificidad de la prueba usando los casetes de prueba. Todas las pruebas mostraron una banda única 415, que indica una prueba válida, pero sólo el casete para la prueba del anticuerpo anti-fármaco mostró una segunda banda 414 que indica una prueba positiva.
Se puede usar una línea de control o una línea de normalización adicional con el propósito de normalizar los datos en el ensayo de flujo lateral. Esta línea de normalización puede ser un anticuerpo inmovilizado contra uno de los componentes de la matriz (por ejemplo, suero) que presentan concentraciones similares en las muestras de la matriz individual. Alternativamente, una línea de normalización puede ser un anticuerpo inmovilizado contra una proteína de una especie irrelevante que no está presente en la matriz de prueba, pero añadida a las mismas concentraciones a cada muestra de la matriz antes de colocarla en un dispositivo de flujo lateral. Esta proteína se puede añadir a cada muestra directamente o, en el caso de que las muestras se diluyan con un tampón de detección, puede ser un componente del tampón de detección. Se puede usar un lector para la medición semi-cuantitativa o cuantitativa de las concentraciones del anti anti-VLA4.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Método para ensayar la eficacia de un tratamiento, comprendiendo el método:
a) poner en contacto una muestra biológica que se ha obtenido de un sujeto que está recibiendo un tratamiento con un anticuerpo anti-integrina alfa4 con un agente de captura asociado con un sustrato, en donde el agente de captura puede unirse a un anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 en la muestra para formar un complejo y en donde el sustrato es una porción de un sistema inmunocromatográfico; y
b) detectar la unión del agente de captura al anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 con un agente secundario que se une a dicho complejo dentro del sistema inmunocromatográfico de flujo lateral y correlacionar la unión del agente de captura con el nivel del anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 para determinar la eficacia del tratamiento, en donde el agente de captura es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
2. El método de la reivindicación 1, en donde un nivel del anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 por encima o por debajo de un nivel predeterminado es indicativo de la eficacia del tratamiento.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el agente secundario es un anticuerpo antiintegrina alfa4, opcionalmente un anticuerpo anti-integrina alfa4 etiquetado.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la eficacia se ensaya un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas después de la administración del tratamiento.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el tratamiento es natalizumab.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la eficacia se ensaya como parte de un régimen de tratamiento, opcionalmente un régimen de natalizumab.
7. El método de la reivindicación 6, en donde dicho régimen de tratamiento se administra una vez al día o una vez cada dos días, tres días, cuatros días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, cada tres meses, cada cuatro meses, casa seis meses o anualmente.
8. El método de la reivindicación 1, en donde:
(a) la muestra biológica se ha obtenido del sujeto un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas después del tratamiento; o
(b) la muestra biológica se ha obtenido repetidamente una vez al día, o una vez cada dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas.
9. El método de la reivindicación 8(a), en el que también se ha obtenido una muestra biológica del sujeto antes del tratamiento.
10. Un kit para analizar el nivel de un anticuerpo anti-integrina anti-alfa4 en una muestra biológica en un sujeto que comprende:
(a) un comprobador que comprende:
un sistema inmunocromatográfico de flujo lateral que comprende una zona de recepción de la muestra, una zona de etiquetado y una zona de prueba, en donde
la zona de pruebas está aguas abajo de la zona de recepción de la muestra y contiene un agente de captura asociado con un sustrato, en donde el agente de captura se puede unir a un anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 en la muestra biológica para formar un complejo, y
la zona de etiquetado está ubicada aguas arriba de la zona de recepción de la muestra y contiene uno o más agentes secundarios, en donde los uno o más agentes secundarios son capaces de unirse al complejo que comprende el agente de captura y el anticuerpo anti-anti-integrina alfa4,
en donde el agente de captura es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente secundario es un anticuerpo anti-integrina alfa4, opcionalmente un anticuerpo anti-integrina alfa4 etiquetado; y
(b) un tampón de detección.
11. El kit de la reivindicación 10, en donde:
(a) la unión del agente de captura al anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 produce una señal detectable; o (b) la unión del agente de captura al anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 se detecta mediante el agente secundario.
12. El kit de la reivindicación 10, en donde:
(a) el agente de captura es un anticuerpo anti-integrina alfa4, o una integrina; o
(b) el sustrato es nitrocelulosa, celulosa, acetato, papel de filtro, tela o papel de fibra de vidrio.
13. El kit de la reivindicación 10, en donde la muestra biológica puede ser sangre, plasma, suero, orina, saliva, fluido cefalorraquídeo, esputo, líquido del cristalino, sudor, leche, ascitis, mucosidad, fluido sinovial, fluido peritoneal, exudados transdérmicos, exudados faríngeos, lavado broncoalveolar, aspiraciones traqueales, semen, mucosidad cervical, secreción vaginal, secreción uretral o fluido amniótico.
14. El kit de la reivindicación 10, en donde la unión del agente de captura al anticuerpo anti-anti-integrina alfa4 se puede detectar en aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 60 minutos o más después de la unión.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2758780A4 (en) * 2011-09-22 2015-09-16 Marv Entpr Llc METHOD OF TREATING MULTIPLE SCLEROSIS
KR101515020B1 (ko) * 2013-11-13 2015-04-24 에스케이텔레콤 주식회사 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 이용하는 면역학적 측정 방법 및 상기 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정장치
BR112017021305A2 (pt) * 2015-04-06 2018-06-26 Bludiagnostics Inc dispositivo de teste de fluxo lateral, e, método e kit para detecção quantitativa de um analito em uma amostra de saliva
US9927443B2 (en) * 2015-04-10 2018-03-27 Conquerab Inc. Risk assessment for therapeutic drugs
US20170003284A1 (en) * 2015-06-30 2017-01-05 Alpha Diagnostic International, Inc. Western blot process validation and quantification system
US9903866B2 (en) 2016-04-05 2018-02-27 Conquerab Inc. Portable devices for detection of antibodies against therapeutic drugs
WO2018031887A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Abreos Biosciences, Inc. Detection and quantification of natalizumab
AT527879A1 (de) * 2023-12-18 2025-07-15 Tagtron Gmbh Vorrichtung für einen Lateral-Flow-Test

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3639350A (en) 1970-04-15 1972-02-01 Allied Chem Esterification of terephthalic acid with an alkylene glycol in the presence of guanidine or an alkyl guanidine
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4425112A (en) 1976-02-25 1984-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Flow-through centrifuge
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4235601A (en) 1979-01-12 1980-11-25 Thyroid Diagnostics, Inc. Test device and method for its use
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4517288A (en) 1981-01-23 1985-05-14 American Hospital Supply Corp. Solid phase system for ligand assay
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4703017C1 (en) 1984-02-14 2001-12-04 Becton Dickinson Co Solid phase assay with visual readout
US4938948A (en) 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
CA1291031C (en) 1985-12-23 1991-10-22 Nikolaas C.J. De Jaeger Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5763262A (en) 1986-09-18 1998-06-09 Quidel Corporation Immunodiagnostic device
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
DE3856421T2 (de) 1987-04-27 2000-12-14 Unilever Nv Spezifische Bindungstestverfahren
US4943522A (en) 1987-06-01 1990-07-24 Quidel Lateral flow, non-bibulous membrane assay protocols
US5120643A (en) 1987-07-13 1992-06-09 Abbott Laboratories Process for immunochromatography with colloidal particles
US4818677A (en) 1987-12-03 1989-04-04 Monoclonal Antibodies, Inc. Membrane assay using focused sample application
AU2684488A (en) 1988-06-27 1990-01-04 Carter-Wallace, Inc. Test device and method for colored particle immunoassay
US5221616A (en) 1988-07-15 1993-06-22 Quidel Corporation Prevention of spontaneous complement activation in mammalian biological fluids
US5096809A (en) 1988-07-25 1992-03-17 Pacific Biotech, Inc. Whole blood assays using porous membrane support devices
US4954128A (en) 1988-08-23 1990-09-04 Baxter International Inc. Therapeutics plasma exchange system
US5118630A (en) 1988-11-04 1992-06-02 Quidel Corporation Method for determining periodic infertility in females
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6352862B1 (en) 1989-02-17 2002-03-05 Unilever Patent Holdings B.V. Analytical test device for imuno assays and methods of using same
US5084828A (en) 1989-09-29 1992-01-28 Healthtech Services Corp. Interactive medication delivery system
US5252496A (en) 1989-12-18 1993-10-12 Princeton Biomeditech Corporation Carbon black immunochemical label
US5096837A (en) 1990-02-08 1992-03-17 Pacific Biotech, Inc. Immunochromatographic assay and method of using same
US5223220A (en) 1990-03-27 1993-06-29 Pacific Biotech, Inc. Solid phase immunoassay device and method of making same
US5200090A (en) 1990-03-30 1993-04-06 Baxter International Inc. Multiple fluid source isolation, metering and alarm system and method
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5118428A (en) 1990-11-13 1992-06-02 Quidel Method to remove red blood cells from whole blood samples
DE4139840B4 (de) 1990-12-04 2005-06-02 Quidel Corp., San Diego Antigen-Zubereitung zum Nachweis von H. pylori
WO1992012428A1 (en) 1991-01-11 1992-07-23 Quidel Corporation A one-step lateral flow nonbibulous assay
US5225328A (en) 1991-05-30 1993-07-06 Quidel Corporation Stable alkaline phosphatase compositions with color enhancement and their use in assays
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5686315A (en) 1991-06-14 1997-11-11 Quidel Corporation Assay device for one step detection of analyte
WO1993015217A1 (en) 1992-02-04 1993-08-05 Quidel Corporation Simplified extraction method for bacterial antigens using dried reagents
US5541069A (en) 1992-02-28 1996-07-30 Quidel Corporation Assay having improved dose response curve
JP2948318B2 (ja) 1992-03-10 1999-09-13 クイデル コーポレイション 特異的結合アッセイ用の赤血球の分離方法
DE69419721T2 (de) 1993-01-12 2000-04-27 Biogen, Inc. Rekombinante anti-vla4 antikörpermoleküle
ATE161730T1 (de) 1993-02-09 1998-01-15 Biogen Inc Antikörper zur behandlung von insulinabhängigen diabetes
US5415994A (en) 1993-08-02 1995-05-16 Quidel Corporation Lateral flow medical diagnostic assay device with sample extraction means
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
US5434057A (en) 1994-02-02 1995-07-18 Quidel Corporation Sperm motility assay and devices
US5521102A (en) 1994-08-08 1996-05-28 Quidel Corporation Controlled sensitivity immunochromatographic assay
US5845255A (en) 1994-10-28 1998-12-01 Advanced Health Med-E-Systems Corporation Prescription management system
US5712172A (en) 1995-05-18 1998-01-27 Wyntek Diagnostics, Inc. One step immunochromatographic device and method of use
US5804452A (en) 1995-04-27 1998-09-08 Quidel Corporation One step urine creatinine assays
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5786220A (en) 1995-04-28 1998-07-28 Quidel Corporation Assays and devices for distinguishing between normal and abnormal pregnancy
US6319676B1 (en) 1995-05-02 2001-11-20 Carter Wallace, Inc. Diagnostic detection device and method
US5773234A (en) 1995-08-07 1998-06-30 Quidel Corporation Method and device for chlamydia detection
DE19541844C1 (de) 1995-11-09 1997-07-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern und deren Verwendung
DE19543553B4 (de) 1995-11-22 2009-04-09 Deutsches Primatenzentrum Gmbh VP-Antigene des JC-Virus
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
US6305377B1 (en) 1996-12-12 2001-10-23 Michael T. Portwood System and method for improving compliance of a medical regimen
US6306642B1 (en) 1997-11-24 2001-10-23 Quidel Corporation Enzyme substrate delivery and product registration in one step enzyme immunoassays
US6623981B2 (en) * 1998-01-27 2003-09-23 Bristol-Myers Squibb Company Detection of patients at risk for developing integrin antagonist/agonist mediated disease states
US6014631A (en) 1998-04-02 2000-01-11 Merck-Medco Managed Care, Llc Computer implemented patient medication review system and process for the managed care, health care and/or pharmacy industry
US6045501A (en) 1998-08-28 2000-04-04 Celgene Corporation Methods for delivering a drug to a patient while preventing the exposure of a foetus or other contraindicated individual to the drug
US7171371B2 (en) 1999-09-03 2007-01-30 Smg Trust Method and system for providing pre and post operative support and care
SI1232392T1 (en) 1999-10-12 2003-10-31 Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Improved method for the detection of acid resistant bacteria of the genus helicobacter in stool
WO2001075449A1 (fr) * 2000-03-30 2001-10-11 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Technique d'investigation du cancer par epreuve biologique d'un autoanticorps contre mdm2 et reactif
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
US7018847B2 (en) * 2000-05-05 2006-03-28 Pharmacia Diagnostics Ab Assay device with timer function
US6620626B1 (en) * 2000-08-09 2003-09-16 Mission Research Corp. Antigen detection device and method
WO2002033417A1 (en) 2000-10-17 2002-04-25 Besst-Test Aps Assay for directly detecting a rs virus related biological cell in a body fluid sample
US6315720B1 (en) 2000-10-23 2001-11-13 Celgene Corporation Methods for delivering a drug to a patient while avoiding the occurrence of an adverse side effect known or suspected of being caused by the drug
US6485460B2 (en) 2001-01-12 2002-11-26 Bracco Diagnostics, Inc. Tamper evident syringe barrel
US6706008B2 (en) 2001-03-06 2004-03-16 Baxter International Inc. Automated system and method for withdrawing compounds from blood
US7291477B2 (en) * 2001-07-03 2007-11-06 Xenotope Diagnostics, Inc. Method and device for trichomonas detection
WO2003016909A1 (en) 2001-08-16 2003-02-27 Ludwig Institute For Cancer Research Method for determining protein component in a biological sample
US7205159B2 (en) 2001-08-20 2007-04-17 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd. Diagnostic testing process and apparatus
WO2003016902A1 (en) 2001-08-20 2003-02-27 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd Diagnostic testing process and apparatus
US6849183B2 (en) 2002-08-13 2005-02-01 Transvivo, Inc. Method and apparatus for therapeutic apheresis
DK1485127T3 (da) 2002-02-25 2011-10-03 Elan Pharm Inc Anvendelse af midler til behandling af inflammation
WO2004001539A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Mckesson Information Solutions Llc Closed loop medication use system and method
AU2003287697A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 Barnes-Jewish Hospital Uncoupled collagen synthesis and degradation assays
US7238538B2 (en) * 2003-09-19 2007-07-03 Freitag Helmut E Chromatographic assay device and methods
WO2005031355A1 (en) * 2003-09-22 2005-04-07 Quidel Corporation Devices for the detection of multiple analytes in a sample
JP4672263B2 (ja) 2004-01-27 2011-04-20 デンカ生研株式会社 簡便な検出法、検出装置及び検出キットとその製法
US7419666B1 (en) 2004-02-23 2008-09-02 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Treatment of ocular disorders
US20050283385A1 (en) 2004-06-21 2005-12-22 The Permanente Medical Group, Inc. Individualized healthcare management system
US20060027599A1 (en) 2004-07-21 2006-02-09 Lancer Partnership, Ltd. Method and apparatus for dispensing compressed ice
US8445293B2 (en) * 2005-02-09 2013-05-21 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method to increase specificity and/or accuracy of lateral flow immunoassays
EP1863940B1 (en) 2005-03-03 2012-06-06 Seedlings Life Science Ventures, LLC. Method of risk management for patients undergoing natalizumab treatment
DK2645106T4 (da) 2005-04-04 2024-12-02 Biogen Ma Inc Fremgangsmåder til evaluering af et immunrespons på et terapeutisk middel
US20060246513A1 (en) * 2005-05-02 2006-11-02 Bohannon Robert C Method and device to detect the presence of analytes in a sample
US20070207141A1 (en) 2006-02-28 2007-09-06 Ivan Lieberburg Methods of treating inflammatory and autoimmune diseases with natalizumab
US8410115B2 (en) 2006-02-28 2013-04-02 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating inflammatory and autoimmune diseases with alpha-4 inhibitory compounds
MX2008011176A (es) * 2006-03-03 2008-09-10 Elan Pharm Inc Metodos para tratar padecimientos inflamatorios y autoinmunes con natalizumab.
AU2007280929B2 (en) * 2006-07-26 2012-03-22 Abbott Rapid Diagnostics International Unlimited Company Analysis device for biological sample
WO2008021954A2 (en) * 2006-08-09 2008-02-21 Biogen Idec Ma Inc. Method for distribution of a drug
US7704702B2 (en) * 2006-08-10 2010-04-27 Inverness Medical Switzerland Gmbh Test strip for lateral flow assays
WO2008061243A2 (en) 2006-11-16 2008-05-22 Novavax, Inc. Respiratory syncytial virus-virus like particle (vlps)
EP1933140B1 (en) 2006-12-11 2011-08-17 AraGen Biotechnology Co. Ltd. Antibody detection method involving an oligonucleotide enhanced collodial gold signal
WO2010129302A1 (en) * 2009-04-28 2010-11-11 Innovative Laboratory Technologies, Inc. Lateral-flow immuno-chromatographic assay devices
US20120220051A1 (en) * 2009-07-08 2012-08-30 Anp Technologies, Inc. Immunogenicity Assay
CN102906278A (zh) 2010-01-11 2013-01-30 比奥根艾迪克Ma公司 用于jc病毒抗体的测定
DK2715352T3 (da) 2011-05-31 2019-05-20 Biogen Ma Inc Fremgangsmåde til vurdering af risiko for pml

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