ES2992120T3 - Un dispositivo de electroporación dérmica mínimamente invasivo - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo para electroporar y administrar uno o más antígenos y a un método para electroporar y administrar uno o más antígenos a células de tejidos epidérmicos utilizando el dispositivo. El dispositivo comprende una carcasa, una pluralidad de conjuntos de electrodos que sobresalen de la carcasa, incluyendo cada conjunto de electrodos al menos un electrodo, un generador de pulsos acoplado eléctricamente a los electrodos, un microcontrolador programable acoplado eléctricamente al generador de pulsos y una fuente de energía eléctrica acoplada al generador de pulsos y al microcontrolador. Los conjuntos de electrodos definen sitios separados espacialmente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un dispositivo de electroporación dérmica mínimamente invasivo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un dispositivo de electroporación que es capaz de suministrar una o más vacunas de plásmidos simultáneamente en sitios espacialmente separados de una manera tolerable.

Antecedentes

Un obstáculo importante para la vacunación eficaz a través de plásmidos antigénicos es la necesidad de que la vacuna de ADN se suministre intracelularmente. El suministro de ADN desnudo a través de una inyección intramuscular estándar es notoriamente ineficaz fuera de los modelos de roedores. Históricamente, esto ha provocado una incapacidad para lograr respuestas inmunes robustas en grandes mamíferos y seres humanos. Se han desarrollado varias estrategias para mejorar la expresión de las vacunas basadas en el ADN, tales como la optimización de codones, la optimización del RNA, la adición de secuencias líder y el desarrollo de secuencias consenso optimizadas. Estas estrategias de optimización pueden conducir a respuestas inmunes cruzadas mejoradas. La adición de adyuvantes moleculares basados en genes suministrados es otra área en la que se produce con frecuencia un aumento de las respuestas inmunes resultantes. A pesar de las mejoras en el diseño de vectores y el uso de adyuvantes moleculares, sigue existiendo una clara necesidad de un procedimiento eficaz de administración de vacunas de ADN que resulte en una expresión de alto nivel del plásmido en el tipo de célula deseado del tejido deseado, más comúnmente, músculo, tumor o piel.

El suministro de fármacos en el tejido dérmico (intradérmico) es un procedimiento atractivo en un entorno clínico por varias razones. La piel es el órgano más grande del cuerpo humano, el más accesible, y fácil de monitorear, además de ser altamente inmunocompetente. Sin embargo, la función de barrera impermeable de la piel ha sido un obstáculo importante para el suministro transdérmico eficaz de fármacos.

La piel humana comprende un área aproximada de 2 m2 y un grosor medio de alrededor de 2,5 mm, lo que la convierte en el órgano más grande del cuerpo humano. Convencionalmente, la piel tiene dos grandes tipos de tejido, la epidermis y la dermis. La epidermis es un epitelio estratificado que se queratina continuamente. La capa más externa de la piel es el estrato córneo (SC) y funciona como barrera primaria. El SC es una capa de 15-30 células gruesas de corneocitos no viables, pero bioquímicamente activos. Los otros tres estratos de la epidermis (S. granulosum, S. spinosum, S. basale) contienen queratinocitos en diferentes etapas de diferenciación, así como células inmunes de Langerhans y células dendríticas dérmicas.

Los procedimientos físicos y químicos para el suministro transdérmico de fármacos y el suministro de genes han sido detallados por grupos de todo el mundo. La iontoforesis, el suministro de lípidos y la pistola de genes son tales ejemplos. Un procedimiento físico para aumentar temporalmente la permeabilidad de la piel es la electroporación (“EP”). La electroporación implica la aplicación de breves impulsos eléctricos que dan lugar a la creación de vías acuosas dentro de las membranas de doble capa lipídicas de las células de mamíferos. Esto permite el paso de grandes moléculas, incluido el ADN, a través de la membrana celular, la cual de otro modo sería menos permeable. Por lo tanto, la electroporación aumenta la absorción o el grado en el cual los fármacos y el ADN se suministran a su tejido objetivo.

Aunque el mecanismo preciso por el cual la electroporación permite la transformación celular no se ha dilucidado, un modelo teórico propuesto implica un evento de poración debido a la desestabilización de la membrana, seguido del movimiento electroforético de moléculas cargadas hacia el interior de la célula. Para que se produzca la electroporación, la formación de poros requiere que se logre un umbral de energía y el movimiento producido por el efecto electroforético depende tanto del campo eléctrico como de la longitud del impulso.

En el caso de las vacunas de ADN, se ha demostrado que la electroporación mejora cuantitativamente las respuestas inmunes, aumenta la amplitud de esas respuestas inmunes y mejora la eficacia de la dosis. Más recientemente, la plataforma DNA-EP se ha traducido con éxito en el ámbito clínico humano y ha demostrado respuestas inmunes significativamente mejoradas en varios estudios de vacunas. Por lo tanto, se ha desarrollado la necesidad de un dispositivo de electroporación dérmica que se considere tolerable, fácil de usar y fácilmente susceptible de producción en masa, a la vez que se logran altas tasas de transfección que resulten en respuestas inmunes robustas.

Aunque una serie de dispositivos intramusculares han entrado ahora con éxito en ensayos clínicos, el procedimiento se considera generalmente invasivo y doloroso. Para que se considere apta para la vacunación masiva, especialmente en un entorno pediátrico, se necesita una solución para un procedimiento de electroporación más tolerable. En consecuencia, es deseable un dispositivo de electroporación dérmica eficaz que sea capaz de suministrar una vacuna de ADN multiagente de manera tolerable. Los documentos CN 101563132, WO 2006/054150, US 2001/023330 y US 2007/185432 se refieren a dispositivos de electroporación.

Sumario de la invención

La presente divulgación está dirigida a un dispositivo para la electroporación y el suministro de uno o más antígenos. El dispositivo comprende una carcasa, una pluralidad de conjuntos de electrodos que sobresalen de la carcasa, incluyendo cada conjunto de electrodos al menos un electrodo, un generador de impulsos acoplado eléctricamente a los electrodos, un microcontrolador programable acoplado eléctricamente al generador de impulsos, y una fuente de energía eléctrica acoplada al generador de impulsos y al microcontrolador. Los conjuntos de electrodos definen sitios espacialmente separados. Los electrodos están configurados para suministrar un impulso de electroporación a las células de los tejidos epidérmicos. El microcontrolador está configurado para ajustar los parámetros del impulso de electroporación de cada conjunto de electrodos de manera independiente.

La presente descripción también se dirige a un procedimiento de electroporación y suministro de uno o más antígenos a células de tejidos epidérmicos utilizando el dispositivo descrito en la presente memoria. En algunas realizaciones, los antígenos generalmente incluyen plásmidos de vacunas de ADN, péptidos, moléculas pequeñas, y combinaciones de estos. El procedimiento comprende la administración de uno o más antígenos a las células de los tejidos epidérmicos, el contacto de los tejidos epidérmicos con los electrodos y el suministro de los impulsos de electroporación.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1(A), 1(B), y 1(C) son vistas en perspectiva de un dispositivo mínimamente invasivo (MID) para EP de acuerdo con una realización.

La Figura 2 es una ilustración esquemática de un sistema eléctrico de la realización de las Figuras 1(A), 1(B), y 1(C).

Las Figuras 3(A), 3(B), y 3(C) son vistas en perspectiva de un MID para EP de acuerdo con otra realización.

La Figura 4 es una ilustración esquemática de un sistema eléctrico de la realización de las Figuras 3(A), 3(B), y 3(C).

Las Figuras 5(A), 5(B), y 5(C) son micrografías fluorescentes de la expresión de proteína verde fluorescente (GFP) después de la inyección y electroporación de plásmidos utilizando un MID con (A) electrodos de acero inoxidable o (B) electrodos de oro o con (C) sólo inyección y sin electroporación como control. Se calculó la intensidad de los píxeles GFP (D).

Las Figuras 6(A) y 6(B) son vistas de un MID para EP como (A) una vista lateral de una pieza de mano con electrodos de un conjunto espaciado de 1 mm (parte superior) y de un conjunto espaciado de 1,5 mm (parte inferior), y como (B) un primer plano de la cara de un conjunto espaciado de 1 mm que muestra los 25 electrodos de aguja.

Las Figuras 7(A), 7(B), y 7(C) son micrografías fluorescentes de la expresión de GFP después de la inyección y electroporación de plásmidos utilizando un MID con un espaciado de electrodos de 1,5 mm o un espaciado de electrodos de 1 mm y (A) electrodos de acero inoxidable o (B) electrodos de oro. Se utilizó como control un conjunto con inyección únicamente y sin electroporación. Se calculó la intensidad de los píxeles GFP (C).

La Figura 8 muestra gráficos de corriente y resistencia para MIDs con un espaciado de electrodos de 1,5 mm o 1 mm. La composición de electrodos era de oro o de acero inoxidable (SS).

La Figura 9 muestra gráficos de corriente e impedancia para MIDs con un espaciado de electrodos de 1,5 mm o 1 mm a 5 o 15 voltios.

La Figura 10(A) muestra micrografías fluorescentes de la expresión de GFP después de la inyección y electroporación de plásmidos utilizando un MID con un espaciado de electrodos de 1,5 mm o 1 mm a 5 o 15 voltios. Se calculó la intensidad de los píxeles GFP (B).

La Figura 11(A) muestra micrografías fluorescentes de la expresión de GFP después de la inyección y electroporación de diferentes concentraciones (0,5, 0,25, y 0,1 mg/ml) de plásmido utilizando un MID con un espaciado de electrodos de 1,5 mm o un espaciado de electrodos de 1 mm a 15 voltios. Se calculó la intensidad de los píxeles GFP (B).

Las Figuras 12(A), 12(B), y 12(C) son micrografías fluorescentes de la tinción de linfocitos después de la inyección y electroporación de plásmidos utilizando un MID. La Figura 12(A) es una biopsia de piel en un animal no tratado con un aumento de 20x. La Figura 12(B) es una biopsia de piel de un animal tratado con plásmido de expresión de GFP con un aumento de 20x. La Figura 12(C) es la muestra de la Figura 12(B) pero con un aumento de 40x.

La Figura 13(A) es una vista en perspectiva de un MID para EP de acuerdo con una realización, la Figura 13(B) es una fotografía de un MID con un conjunto de 4x4 y un espaciado de 1,5 mm, la Figura 13(C) es una fotografía de un MID con un conjunto de 5x5 y un espaciado de 1,0 mm, y la Figura 13(D) es una fotografía que muestra una comparación lado a lado de los MIDs de las Figuras 13(B) y 13(C).

La Figura 14 es una micrografía fluorescente que muestra la expresión de GFP después de una administración intradérmica de un plásmido de gen informador y EP con los MIDs de doble cabezal de la Figura 13(B), comparada con la expresión de GFP después de la inyección intradérmica sola (sin EP).

Descripción detallada

La presente invención se dirige a un dispositivo de electroporación que puede proporcionar un suministro intradérmico heterogéneo de antígenos a un mamífero. Uno o más antígenos pueden ser suministrados simultáneamente en sitios espacialmente separados de forma tolerable a través de un dispositivo mínimamente invasivo (MID) que tiene una pluralidad de conjuntos de electrodos. Los conjuntos de electrodos están configurados para variar el impulso de electroporación de un conjunto a otro. Por ejemplo, cada conjunto de electrodos puede activarse o controlarse de manera independiente y selectivamente. Por lo tanto, el MID permite un suministro heterogéneo de antígenos. La electroporación dérmica a través de este MID refleja un procedimiento clínicamente aceptable para suministrar eficazmente vacunas en la piel de un sujeto. Este dispositivo permite suministrar simultáneamente múltiples vacunas en múltiples formas (ácido nucleico, proteína, moléculas pequeñas, o una combinación de estas), a la vez que se eliminan posibles problemas de interferencia inmune resultantes del suministro conjunto de múltiples antígenos. También permite la capacidad de suministrar dosis más altas de un único antígeno durante un único tratamiento.

1. Definiciones

Se debe entender que la terminología utilizada en la presente memoria tiene como fin describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende ser limitativa. Como se utiliza en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario.

Para la citación de intervalos numéricos en la presente memoria, se contempla explícitamente cada número intermedio con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan explícitamente los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

El término “electroporación” como se utiliza en la presente memoria, se refiere al uso de un impulso de campo eléctrico transmembrana para inducir vías microscópicas (poros) en una biomembrana; la presencia de los poros permite que biomoléculas tales como plásmidos, oligonucleótidos, siRNA, fármacos, iones, y agua pasen temporalmente de un lado de la membrana celular al otro.

El término “mínimamente invasivo”, tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una penetración limitada por los electrodos de aguja del dispositivo de EP proporcionado, y puede incluir electrodos no invasivos (o agujas no penetrantes). Preferentemente, la penetración es de tal grado que penetra a través del estrato córneo, y preferentemente entra en la capa de tejido vivo más externa, el estrato granuloso, pero no penetra la capa basal. La profundidad de penetración preferentemente no excede de 0,1 mm, y en algunas realizaciones la profundidad de penetración oscila de aproximadamente 0,01 mm a aproximadamente 0,04 mm para atravesar el estrato córneo. Esto puede lograrse utilizando un electrodo que tenga el extremo de trocar rectificado para proporcionar una punta afilada que permita la penetración a través del estrato córneo, pero evita una penetración más profunda.

Los términos “tolerable” y “casi indoloro” se utilizan indistintamente en la presente memoria, y cuando se refieren al EP, significan un nivel sustancialmente menor de dolor asociado con el EP que con los dispositivos de EP típicamente disponibles. Más específicamente, un EP tolerable o casi indoloro es el resultado de la combinación del uso del dispositivo descrito en la presente memoria, evitando el EP del músculo, junto con el suministro de campos eléctricos bajos a las capas epidérmicas entre el estrato córneo y las capas basales. Preferentemente, los campos eléctricos comprenderán niveles de tensión bajos, por ejemplo, de 0,01 V a 70 V, o de 1 V a 15 V. Cuando se mide utilizando una escala analógica visual, los sujetos que experimentan EP con el dispositivo descrito en la presente memoria de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente memoria experimentan niveles de dolor que están dentro del 20 % (de la escala completa) de su puntuación libre de dolor o sin dolor, o, por ejemplo, dentro de 2 puntos, con 0 -10 de escala completa, y preferentemente dentro del 10 % de su puntuación sin dolor.

El término “evita sustancialmente el daño” se utiliza en la presente memoria para referirse a una cantidad de energía que es suministrada por los dispositivos descritos a las células objetivo para electroporar dichas células y causar un daño mínimo perceptible a las mismas células. Preferentemente, no hay daño ni alteración histológica macroscópica perceptible en dichas células.

2. Dispositivo mínimamente invasivo

La presente invención está dirigida a un dispositivo mínimamente invasivo (MID) que tiene una pluralidad de conjuntos de electrodos que están configuradas para variar el impulso de electroporación de conjunto a conjunto. LasFiguras 1(A), 1(B),y1(C)divulgan un MID100que tiene una pluralidad de conjuntos de electrodos para la electroporación y el suministro de uno o más antígenos. El MID100comprende una carcasa102que tiene una porción104de punta, una pluralidad de conjuntos106,108de electrodos, acoplados a la porción104de punta, incluyendo cada conjunto106,108de electrodos, electrodos110dispuestos en un patrón cuadrado de 4*4. En algunas realizaciones, una o ambas porciones104de punta y los electrodos110pueden separarse del resto del MID100, por ejemplo, para esterilizarlos después de su uso, de modo que las partes separadas puedan utilizarse de nuevo. Alternativamente, una o ambas de la porción104de punta y los electrodos110pueden ser de un solo uso.

Los conjuntos106,108de electrodos definen sitios espacialmente separados. Aunque lasFiguras 1(A), 1(B),y1(C)ilustran el MID100como incluyendo dos conjuntos106,108de electrodos, en otras realizaciones el MID100puede incluir más de dos conjuntos de electrodos, por ejemplo, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, o diez o más conjuntos de electrodos.

En algunas realizaciones, cada conjunto106,108puede incluir un conjunto de 4*4 de electrodos110que tienen una longitud respectiva de 0,1 mm, 0,2 mm, 0,3 mm, 0,4 mm, 0,5 mm, 1,0 mm, 1,5 mm, 2,0 mm, 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm, 4,5 mm, 5 mm, 6,0 mm, 7,0 mm, 8,0 mm, 9,0 mm, o 10,0 mm. Aunque en la realización ilustrada cada conjunto106,108incluye un conjunto de 4*4 de electrodos110, es decir, 16 electrodos110, en otras realizaciones, cada uno de los conjuntos106,108pueden incluir respectivamente otros números y/o patrones de electrodos110. Por ejemplo, cada uno de los conjuntos106,108puede incluir respectivamente electrodos110dispuestos en un patrón de 1*1, 1*2, 1*3, 1*4, 1*5, 1*6, 1*7, 1*8, 1*9, 1*10, 2 *1 ,2*2 , 2*3 2*4, 2*5, 2*6, 2*7, 2*8, 2*9, 2*10, 3*1, 3*2, 3*3, 3*4, 3*5, 3*6, 3*7, 3*8, 3*9, 3*10, 4 *1 ,4*2 , 4*3, 4*4, 4*5, 4*6, 4*7, 4*8, 4*9, 4*10, 5*1, 5*2, 5*3, 5*4, 5*5, 5*6, 5*7, 5*8, 5*9, 5*10, 6*1, 6*2, 6*3, 6*4, 6*5, 6*6, 6*7, 6*8, 6*9, 6*10, 7*1, 7*2, 7*3, 7*4, 7*5, 7*6, 7*7, 7*8, 7*9, 7*10, 8*1, 8*2, 8*3, 8*4, 8*5, 8*6, 8*7, 8*8, 8*9, 8*10, 9*1, 9*2, 9*3, 9*4, 9*5, 9*6, 9*7, 9*8, 9*9, 9*10, 10*1, 10*2, 10*3, 10*4, 10*5, 10*6, 10*7, 10*8, 10*9, 10*10, o múltiplos de 11-100 y cualquier combinación de estos. Los patrones pueden disponerse en diversas formas, tales como cuadrados, triángulos, rectángulos, paralelogramos, círculos o cualquier otra forma geométrica. Los electrodos110en forma de aguja pueden ser de oro, platino, titanio, acero inoxidable, aluminio, o cualquier otro metal conductor. Los electrodos pueden estar recubiertos o chapados con un metal tal como oro, cobre, platino, plata, o cualquier otro metal conductor.

En algunas realizaciones, cada electrodo110tiene forma de aguja. Es decir, cada uno de los electrodos110incluye un árbol 112 y un extremo114cónico que penetra en el tejido o trocar. Aunque laFigura 2(B)ilustra los electrodos110como generalmente cilindricos, en otras realizaciones, al menos uno de los electrodos110puede asumir cualquier forma geométrica, incluyendo, pero no limitado a, una forma semicilíndrica, una forma poliédrica regular, y una forma poliédrica irregular, derivados de estos, y combinaciones de estos. El extremo114que penetra en el tejido puede facilitar que los electrodos110penetren a través del estrato córneo y alcancen el estrato granuloso. En algunas realizaciones, el extremo114que penetra en el tejido permite que el electrodo110penetre a través del estrato córneo, pero evita la penetración profunda. Con este fin, el extremo114que penetra en el tejido puede tener una longitud de aproximadamente 0,1 mm o menos, o de aproximadamente 0,01 mm a aproximadamente 0,04 mm.

Los electrodos110ilustrados están configurados para suministrar un impulso de electroporación a las células de los tejidos epidérmicos. En algunas realizaciones, los impulsos de electroporación están asociados a un campo eléctrico que evita sustancialmente el daño en las células de los tejidos epidérmicos. En otras realizaciones, los impulsos de electroporación se asocian a un potencial eléctrico que es casi indoloro medido por una escala analógica visual. La escala analógica visual es básicamente una línea horizontal de100mm de longitud en la cual 0 mm indica ausencia de dolor y100mm indica el peor dolor. Casi indoloro es una puntuación utilizando la escala analógica visual que produce una puntuación media de aproximadamente 20 mm o menos (dentro de un intervalo de confianza del 95 %), y preferentemente de 10 mm o menos (dentro de un intervalo de confianza del 95 %).

En algunas realizaciones, los electrodos110adyacentes están espaciados entre sí a una distancia de no más de aproximadamente 1,5 mm. En otras realizaciones, los electrodos110adyacentes están espaciados entre sí a una distancia de no más de aproximadamente 1,0 mm. Una distancia más corta entre los electrodos110significa que los electrodos110están empaquetados de una manera más compacta, lo cual puede aumentar la eficacia del MID100y por lo tanto puede ser deseable. En algunas realizaciones, cada electrodo110puede estar espaciado de cada electrodo110adyacente a una distancia de 150 mm o menos, de100mm a 1,0 mm, de 50 mm a 1,0 mm, de 40 mm a 1,0 mm, de 30 mm a 1,0 mm, de 20 mm a 1,0 mm, de 10 mm a 1,0 mm, de 5,0 mm a 2,0 mm, de 5,0 mm a 1,0 mm, aproximadamente 2,0 mm, aproximadamente 1,5 mm, o aproximadamente 1,0 mm.

Con referencia también a laFigura 2, los generadores116,118de impulsos están eléctricamente acoplados a los respectivos conjuntos106,108de electrodos. En algunas realizaciones, al menos uno de los generadores116,118de impulsos puede ser el generador de impulsos Elgen 1000 (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA) (no se muestra). En otras realizaciones, sin embargo, el impulso de electroporación puede generarse utilizando otros mecanismos adecuados. En la realización ilustrada, un microcontrolador120programable está acoplado eléctricamente a los generadores116,118de impulsos. En respuesta a una condición/señal de entrada, el microcontrolador120es capaz de ajustar los parámetros EP de cada conjunto106,108de electrodos independientemente, dependiendo de los requisitos de uso o preferencias para cada conjunto106,108de electrodos. Por lo tanto, el microcontrolador120está configurado para variar el impulso de electroporación de conjunto a conjunto. Por ejemplo, la tensión del impulso, la corriente, la duración, y la cantidad de los impulsos eléctricos aplicados pueden variar de un conjunto a otro para variar los julios por cm3 aplicados en cada sitio de inyección. En algunas realizaciones, el microcontrolador120está configurado para suministrar los impulsos de electroporación sustancialmente de manera simultánea. En la realización ilustrada, cada conjunto106,108de electrodos se acciona con un generador116,118de impulsos respectivo. El MID100también incluye una fuente122de energía eléctrica acoplada a los generadores116,118de impulsos y al microcontrolador120para proporcionar energía eléctrica. En la realización ilustrada, la fuente122de energía eléctrica es un suministro de alta y baja tensión, aunque se pueden utilizar en su lugar otras fuentes de energía que realizan la misma función que la fuente122de energía eléctrica divulgada en la presente memoria.

En algunas realizaciones, el impulso de electroporación de cada conjunto106,108de electrodos se asocia con un potencial eléctrico de 0,01 V a 70 V, 0,01 V a 50 V, 0,01 V a 40 V, 0.01 V a 30 V, 0,01 V a 20 V, 0,01 V a 15 V, 0,1 V a 70 V, 0,1 V a 50 V, 0,1 V a 40 V, 0,1 V a 30 V, 0,1 V a 20 V, 0,1 V a 15 V, 1 V a 30 V, 1 V a 20 V, 1 V a 15 V, 15 V a 30 V, o 15 V a 30 V. En otras realizaciones, el potencial eléctrico es preferentemente bajo de modo que el EP sea tolerable o casi indoloro según lo medido mediante una escala analógica visual, pero suficientemente alto de modo que efectúe la transfección de las células en los tejidos epidérmicos. Por ejemplo, el potencial eléctrico puede ser de 5 V, 10 V, 15 V o, en algunas realizaciones, 20 V, cuando los electrodos110adyacentes del MID100están espaciados entre sí entre 1,0 mm y 2,0 mm.

En algunas realizaciones, cada impulso de electroporación de cada conjunto106,108de electrodos está asociado con una corriente eléctrica de 0,1 mA a 100 mA, 0,2 mA a 100 mA, 0.5 mA a 100 mA, 1 mA a 100 mA, 1 mA a 80 mA, 1 mA a 60 mA, 1 mA a 50 mA, 1 mA a 40 mA, 1 mA a 30 mA, 10 mA a 50 mA, 10 mA a 40 mA, 10 mA a 30 mA, 10 mA a 20 mA, o 10 mA a 15 mA, o aproximadamente 10 mA, o en algunas realizaciones aproximadamente 20 mA. Al igual que el potencial eléctrico, la corriente eléctrica es preferentemente baja de modo que el EP sea tolerable o casi indoloro según lo medido mediante una escala analógica visual, pero suficientemente alta de modo que efectúe la transfección de las células en los tejidos epidérmicos.

En algunas realizaciones, el impulso de electroporación de cada conjunto106,108de electrodos está asociado con una duración de 5 ms a 250 ms, 10 ms a 250 ms, 20 ms a 250 ms, 40 ms a 250 ms, 60 ms, a 250 ms, 80 ms a 250 ms, 100 ms a 250 ms, 20 ms a 150 ms, 40 ms a 150 ms, 60 ms a 150 ms, 80 ms a 150 ms, 100 ms a 150 ms, 100 ms a 140 ms, 100 ms a 130 ms, 100 ms a 120 ms, 100 ms a 110 ms, o aproximadamente 100 ms. En algunas realizaciones, la duración es preferentemente corta para que el EP sea tolerable o casi indoloro según lo medido mediante una escala analógica visual, pero suficientemente larga de modo que efectúe la transfección de las células en los tejidos epidérmicos.

En algunas realizaciones, el microcontrolador120está configurado para ajustar una cantidad respectiva de impulsos de electroporación para cada conjunto106,108de electrodos independientemente, y el número de impulsos eléctricos puede ser 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, o 100 o más. Aumentando la cantidad de impulsos de electroporación y reduciendo la energía por impulso, también se puede reducir la cantidad de dolor percibido o experimentado por un sujeto en comparación con menos impulsos a mayor energía. Preferentemente, se utiliza un menor número de impulsos, lo cual no reduce la respuesta inmune que se genera, ya que da como resultado menos dolor experimentado por el sujeto. Además, el uso de menos energía por impulso reduce el dolor y mejora la tolerabilidad. En algunas realizaciones, la cantidad de impulsos de electroporación es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, y más preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 3. En algunas realizaciones, se utilizan se utilizan 3 impulsos.

En algunas realizaciones, los conjuntos106,108de electrodos están espaciados entre sí al menos por una distancia para evitar sustancialmente la interferencia de los dos antígenos suministrados por los dos conjuntos106,108cuando se suministran los impulsos de electroporación. Se ha observado la interferencia de plásmidos en una serie de antígenos cuando se suministran secuencialmente en el mismo sitio en la piel. Aunque no se desee estar vinculado por una teoría particular, esto podría deberse a interferencias tanto a nivel transcripcional (posible competencia en el promotor, etc.) como a nivel traslacional (mal plegamiento o dimerización a nivel de proteínas). El MID100que tiene una pluralidad de conjuntos106,108de electrodos espaciados podría eliminar este efecto de interferencia, el cual puede afectar negativamente a la respuesta inmune resultante. Además, el MID100, que tiene una pluralidad de guías106,108de electrodos, podría eliminar la necesidad de dos tratamientos separados, permitiendo que un sujeto tratado experimente un solo incidente de tratamiento, reduciendo así el dolor que se experimenta.

En algunas realizaciones, el MID100incluye interruptores (no se muestran) acoplados eléctricamente a cada conjunto106,108de electrodos para activar selectivamente cada conjunto106,108de electrodos. Por ejemplo, el MID100puede activarse mediante un pedal o un botón de activación, o cualquier otro activador conectado a un circuito eléctrico.

LasFiguras 3y4ilustran un MID200que incluye un generador202de impulsos de acuerdo con otra realización. Esta realización emplea gran parte de la misma estructura y tiene muchas de las mismas propiedades que la realización del MID100descrita anteriormente en conexión con lasFiguras 1(A)-1(C). En consecuencia, la siguiente descripción se centra en la estructura y las características que son diferentes de la realización descrita anteriormente en conexión con lasFiguras 1(A)-1(C). La estructura y las características de la realización que se muestra en las Figuras 3 y 4 que corresponden a la estructura y características de la realización de lasFiguras 1(A)-1(C)se designan de aquí en adelante con números de referencia similares.

En esta realización, el generador202de impulsos está alimentado por una batería204. En la realización ilustrada, la batería204está dentro de la carcasa102. Por lo tanto, el MID200puede ser portátil. La batería204puede ser una batería de iones de litio, hidruro de metal de níquel, ácido de plomo, o cadmio de níquel.

Con referencia a la Figura 4, el generador202de impulsos es un conductor de alta y baja tensión. El generador202de impulsos en esta realización acciona ambos conjuntos106,108de electrodos. Un microcontrolador206está acoplado eléctricamente al generador202de impulsos. El microcontrolador206es capaz de ajustar los parámetros de electroporación de cada conjunto106,108de electrodos independientemente, por ejemplo, en respuesta a una condición/señal de entrada. El generador202de impulsos puede generar impulsos con parámetros EP ajustados por el microcontrolador206y, en cooperación con la batería204, amplificar los impulsos generados según sea necesario.

3. Procedimiento de electroporación y suministro de uno o más antígenos

En un aspecto, el MID100,200que tiene una pluralidad de conjuntos106,108de electrodos descritos en la presente memoria se puede utilizar en un procedimiento de electroporación y suministro de uno o más antígenos, como se discute más adelante, a través de la piel, órganos, u otras partes del cuerpo de un sujeto. Es decir, los MID100,200pueden utilizarse para aplicar un impulso de campo eléctrico transmembrana que induce vías microscópicas (poros) en una biomembrana, permitiendo el suministro de uno o más antígenos de un lado a otro de la membrana celular. El procedimiento puede comprender las etapas de suministrar el antígeno a las células de los tejidos epidérmicos, poner en contacto los tejidos epidérmicos con los electrodos, y suministrar un impulso de electroporación para generar una respuesta inmune. El procedimiento puede comprender además el suministro simultáneo de antígeno a las células y el suministro de un impulso de electroporación para generar una respuesta inmune.

• Administración del antígeno a las células de los tejidos epidérmicos

Primero se inyecta intradérmicamente una pluralidad de antígenos en lugares espacialmente separados. En algunas realizaciones, el antígeno se suministra por vía intradérmica al tejido objetivo utilizando la técnica de Mantoux, por ejemplo, utilizando una aguja de inyección de calibre 29.

• Contacto de los tejidos epidérmicos con los electrodos

A continuación, los tejidos epidérmicos se penetran con al menos un electrodo110a una profundidad de aproximadamente 0,1 mm o menos, o de aproximadamente 0,01 mm a aproximadamente 0,04 mm. Los sitios de inyección y los sitios de penetración de tejido están preferentemente colocalizados. En algunos ejemplos, para facilitar la colocalización o el centrado de los sitios de inyección y los sitios de penetración de tejido, se pueden marcar o hacer indentaciones en los tejidos epidérmicos antes de la inyección intradérmica.

• Suministro de un impulso de electroporación

Una vez penetrados los tejidos epidérmicos, estos últimos se ponen en contacto con los electrodos110y se suministra un impulso de electroporación. En algunas realizaciones, los impulsos de electroporación se asocian a un campo eléctrico que evita sustancialmente dañar las células de los tejidos epidérmicos. En otras realizaciones, los impulsos de electroporación se asocian a un potencial eléctrico que es casi indoloro medido por una escala analógica visual. Por ejemplo, los impulsos de electroporación están asociados a un potencial eléctrico de aproximadamente 1 voltios a aproximadamente 30 voltios, o preferentemente de aproximadamente 15 voltios a aproximadamente 20 voltios, una corriente eléctrica de aproximadamente 1 mA a aproximadamente 50 mA, o preferentemente de aproximadamente 10 mA a aproximadamente 15 mA, y una duración que oscila entre aproximadamente 80 ms y aproximadamente 150 ms, o preferentemente100ms, o una combinación de estos. Estos impulsos pueden ser suministrados en serie, preferentemente de 1 a 10 impulsos, y más preferentemente de 1 a 3 impulsos.

Un inconveniente del suministro intradérmico convencional es la limitación del volumen que se puede suministrar a la piel. Para una inyección con una sola aguja, en general no se pueden suministrar volúmenes mayores que 100-150 pl directamente en la piel debido a problemas con la delaminación dérmica. Dado que el antígeno sólo puede producirse en concentraciones no superiores a 10mg/ml, la limitación de volumen puede restringir la dosis resultante.

En algunas realizaciones, los MID100,200pueden suministrar preferentemente dosis más altas de una única vacuna. El uso del MID100,200evita la limitación del volumen de inyección única de 100-150 pl. En algunas realizaciones, se pueden suministrar dosis significativamente más altas simultáneamente con un único tratamiento sin ninguna molestia añadida para el paciente. La capacidad de suministrar dosis más altas podría tener efectos positivos significativos en las respuestas inmunes resultantes para vacunas específicas. El uso de un dispositivo multicabezal también tiene el beneficio añadido de dirigirse directamente a más células que un dispositivo de único conjunto. Un mayor número de células transfectadas con un antígeno podría dar como resultado respuestas inmunes mejoradas a través de una mayor presentación a las células presentadoras de antígeno.

En algunas realizaciones, el procedimiento divulgado puede administrarse a un sujeto tal como un mamífero. El mamífero puede ser un humano, un mono, un perro, un gato, un ganado, un cobaya, un ratón, o una rata El ganado puede ser, por ejemplo, bovino, porcino, ovino o vacuno.

4. Antígeno

La presente divulgación también está dirigida a procedimientos de suministro de al menos un antígeno utilizando el MID100,200que tiene una pluralidad de conjuntos106,108de electrodos, como se ha discutido anteriormente. El procedimiento puede dirigirse al suministro de dos o más antígenos o una combinación de estos utilizando el suministro heterogéneo mediante el MID100,200. En determinadas realizaciones, los MID100,200descritos en la presente memoria pueden utilizarse para mejorar el suministro de un antígeno. Tal y como se utiliza en la presente memoria, “antígeno” se refiere a cualquier sustancia u organismo que provoca una respuesta inmune (produce inmunidad) cuando se introduce en el cuerpo.

En algunas realizaciones, el antígeno puede derivarse de un agente infeccioso o un autoantígeno, por ejemplo, un antígeno de cáncer de próstata tal como el antígeno prostático específico (PSA) o el antígeno de membrana prostático específico (PSMA). El antígeno particular utilizado no es crítico. Los antígenos son conocidos en la técnica y pueden incorporarse para su uso en los procedimientos y composiciones proporcionados en la presente memoria utilizando cualquier procedimiento común. Se pueden encontrar listas no limitativas de antígenos adecuados para su uso en los diversos aspectos y realizaciones descritos en la presente memoria en la bibliografía, por ejemplo, BioCarb Chemicals Catalogue; y The Jordan Report: Desarrollo Acelerado de Vacunas 1995 NIH, Bethesda, Md., 1995. Los antígenos pueden incluir, pero no se limitan a, ácidos nucleicos, péptidos, moléculas pequeñas, quimioterapéuticos, inmunoterapéuticos, o combinaciones de estos. Un antígeno puede incluir un inmunógeno.

En algunas realizaciones, el antígeno comprende un ácido nucleico. Ácido nucleico se refiere a un compuesto polinucleotídico, el cual incluye oligonucleótidos, que comprenden nucleósidos o análogos de nucleósidos que tienen bases heterocíclicas nitrogenadas o análogos de bases, unidos covalentemente por enlaces fosfodiéster estándar u otras conexiones. Los ácidos nucleicos pueden incluir ARN, ADN, polímeros quiméricos de ADN-ARN, o análogos de estos. El ADN puede ser un plásmido que exprese un antígeno concreto de interés. Por ejemplo, el plásmido puede ser una construcción de influenza SynCon (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell PA).

En algunas realizaciones, el antígeno comprende un péptido. Los péptidos incluyen cualquier secuencia de aminoácidos. Los péptidos pueden ser sintéticos o aislados de una fuente natural. El péptido puede ser una proteína. El péptido puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

En algunas realizaciones, el antígeno comprende una molécula pequeña. Las moléculas pequeñas incluyen compuestos orgánicos e inorgánicos.

En algunas realizaciones, el antígeno comprende un agente quimioterapéutico. Los quimioterapéuticos pueden incluir fármacos citotóxicos o citostáticos tales como, por ejemplo, metotrexato (ametopterina), doxorrubicina (adrimicina), daunorrubicina, citosinarabinosida, etopósido, 5-fluorouracilo, melfalán, clorambucilo y otras mostazas nitrogenadas (por ejemplo, ciclofosfamida), cisplatino, vindesina (y otros alcaloides de la vinca), mitomicina, bleomicina, purotionina (oligopéptido de harina de cebada), macromomicina. Derivados de 1,4-benzoquinona y trenimon.

En algunas realizaciones, el antígeno incluye una citocina. La citocina se refiere a una sustancia secretada por las células del sistema inmune que transportan señales localmente entre las células. Las citocinas incluyen proteínas, péptidos, y glicoproteínas. Las citocinas incluyen, pero no se limitan a, los interferones, las quimiocinas, el TGF-p, el TNF-a, y las interleucinas. Entre las interleucinas se encuentran la IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 y la IL-36. Las citocinas pueden derivarse de una fuente humana o de una fuente no humana transgénica que exprese un gen humano.

Los antígenos pueden incluir, entre otros, antígenos microbianos como antígenos parasitarios, antígenos víricos, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos cancerígenos, fármacos aditivos de antígenos de vacunas como derivados de la cocaína y la nicotina, bacterias atenuadas o muertas, virus atenuados o muertos, antígenos autoinmunes o antígenos proteicos no estructurales, o cualquier combinación de estos. En algunas realizaciones, el antígeno comprende al menos un antígeno de gripe, autoinmune, cocaína o cáncer.

En algunas realizaciones, un antígeno comprende cualquier antígeno derivado de polisacáridos de superficie bacteriana el cual pueda utilizarse en vacunas basadas en carbohidratos. Las bacterias expresan típicamente carbohidratos en la superficie celular como parte de glicoproteínas, glicoplípidos, cadenas laterales O-específicas de lipopolisacáridos, polisacáridos capsulares y similares. Ejemplos no limitantes de cepas bacterianas adecuadas incluyen Streptococcus pneumonia, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenza, Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Salmonella spp., Shigella spp. y estreptococos del grupo B. En algunas realizaciones, cualquier epítopo de carbohidrato bacteriano conocido (por ejemplo, los descritos en Sanders, et al. Pediatría. Resolución 1995, 37, 812 819; Bartoloni, et al. Vacuna 1995, 13, 463-470; Pirofski, et al., Infect. Inmunitaria. 1995, 63, 2906-2911); la Patente de los Estados Unidos Número 6,413,935; y la Publicación Internacional Número WO 93/21948) puede utilizarse como antígeno en las composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria.

Algunas realizaciones proporcionan un antígeno que comprende un antígeno viral. Los ejemplos no limitantes de antígenos virales se incluyen los derivados del VIH (por ejemplo, gp120, nef, tat, pol), la influenza, y el virus del Nilo Occidental (WNV). En algunas realizaciones, el antígeno puede comprender virus enteros muertos o virus atenuados.

Algunos aspectos proporcionan un antígeno fúngico. Ejemplos no limitantes de antígenos fúngicos incluyen los derivados de Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Coccidoides spp., Histoplasma spp., y Aspergillus spp.

Algunas realizaciones proporcionan un antígeno derivado de un parásito. Ejemplos no limitantes de antígenos parasitarios incluyen los derivados de Plasmodium spp., Trypanosoma spp., Schistosoma spp., Leishmania spp. y similares.

En algunas realizaciones, el antígeno comprende un epítopo de carbohidrato. Los ejemplos no limitantes de epítopos de carbohidratos que pueden utilizarse en los aspectos y realizaciones descritos en la presente memoria incluyen: Gala1,4Galp (para vacunas bacterianas); GalNAca (para vacunas contra el cáncer); Manp1,2(Manp)nManp-(para vacunas fúngicas útiles contra, por ejemplo, C. albicans), donde n es cualquier número entero, incluido cero; GalNAcp1,4(NeuAca2,3)Galp1,4Glcp-O-ceramida (para vacunas contra el cáncer); Gala1,2(Tyva1,3)Mana1,4Rhaa1,3Gala1,2-(Tya1,3)Mana4Rha- y Gala1,2(Abea1,3)Mana1,4Rhaa1,3Gala1,2(Abea1,3) Mana1,4Rhaa1,3Gala1,2(Abea1,3)Mana1,4Rha (ambas útiles contra, por ejemplo, Salmonella spp.). La descripción de otros epítopos de carbohidratos ejemplares como antígenos o inmunógenos y la síntesis de estos se describen con más detalle en la Patente de los Estados Unidos Número 6,413,935.

Otros ejemplos de antígenos incluyen, pero no se limita a, los que producen una respuesta inmune o antigénica frente a las siguientes enfermedades y agentes causantes de enfermedades: ántrax; adenovirus; Bordetella pertussus; botulismo; rinotraqueítis bovina; Branhamella catarrhalis; hepatitis canina; moquillo canino; clamidia; cólera; coccidiomicosis; viruela vacuna; citomegalovirus; citomegalovirus; fiebre del dengue; toxoplasmosis del dengue; difteria; encefalitis; Escherichia colienterotoxigénica; Virus de Epstein Barr; Encefalitis equina; Anemia infecciosa equina; Influenza equina; Neumonía equina; Rinovirus equino; Leucemia felina; Flavivirus; Globulina; Haemophilus influenza tipo b; Haemophilus influenzae; Haemophilus pertussis; Helicobacter pylori; Hemophilus spp.; hepatitis; hepatitis A; hepatitis B; hepatitis C; virus del herpes; VIH; virus VIH-1; virus VlH-2; HTLV; influenza; encefalitis japonesa; Klebsiellae spp. Legionella pneumophila; leishmania; lepra; enfermedad de Lyme; inmunógeno del paludismo; sarampión; meningitis; meningococo; polisacárido meningocócico del grupo A, polisacárido meningocócico del grupo C; parotiditis; virus de la parotiditis; micobacterias; Mycobacterium tuberculosis; Neisseria spp; Neisseria gonorrhoeae; Neisseria meningitidis; lengua azul ovina; encefalitis ovina; papiloma; parainfluenza; paramixovirus; paramixovirus; tos ferina; peste; Pneumococcus spp. pneumocystis carinii; Neumonía; Poliovirus; Proteus species; Pseudomonas aeruginosa; Rabia; Virus respiratorio sincitial; Rotavirus; Rubéola; Salmonella; Esquistosomiasis; Shigella; Virus de la inmunodeficiencia simia; Viruela; Staphylococcus aureus; Staphylococcus spp. streptococcus pneumoniae; Streptococcus pyogenes; Streptococcus spp.; gripe porcina; tétanos; Treponema pallidum; fiebre tifoidea; Vaccinia; virus varicela-zóster; y Vibrio cholerae. Los antígenos o inmunógenos pueden incluir diversos toxoides, antígenos víricos y/o antígenos bacterianos, tales como los antígenos empleados comúnmente en las siguientes vacunas: vacuna contra la varicela; vacunas contra la difteria, el tétanos y la tos ferina; vacuna contra el haemophilus influenzae tipo b (Hib); vacuna contra la hepatitis A; vacuna contra la hepatitis B; vacuna contra la influenza; vacunas contra el sarampión, las paperas, y la rubéola (MMR); vacuna neumocócica; vacunas contra la poliomielitis; vacuna contra el rotavirus; vacunas contra el ántrax; y vacuna contra el tétanos y la difteria (Td) (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos número 6,309,633).

En algunas realizaciones, los antígenos pueden incluir cualquier tipo de antígeno asociado con el cáncer tales como, por ejemplo, antígenos asociados a tumores (TSAs) (incluyendo antígenos asociados con leucemias y linfomas) tales como el antígeno carcinoembrionario, fosfatasa ácida prostática, PSA, PSMA, y similares, y antígenos que están asociados con agentes que pueden causar cáncer (por ejemplo, virus tumorigénicos tales como, por ejemplo, adenovirus, VHB, VHC, HTLV, virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi, VPH (Gardasil), y similares).

Los antígenos pueden incluir combinaciones de antígenos tales como combinaciones de péptidos, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, y similares. Los antígenos pueden incluir glicoproteínas, glicolípidos, glicoproteínas, lipoproteínas, lipopolisacáridos, y similares.

Los antígenos que se utilizan para llevar a cabo los procedimientos EP divulgados incluyen aquellos que se derivatizan o modifican de alguna manera, tales como por ejemplo conjugando o acoplando uno o más grupos adicionales a los mismos para mejorar la función o lograr funciones adicionales tales como la focalización o el suministro mejorado de estos, incluyendo técnicas conocidas en la técnica tales como, por ejemplo, las descritas en la Patente de los Estados Unidos número 6,493,402 a Pizzo et al. (complejos de a-2 macroglobulina); la Patente de los Estados Unidos número 6,309,633; la Patente los Estados Unidos número 6,207,157; y la Patente de los Estados Unidos número 5,908,629.

Los ejemplos ilustrativos del MID100,200y el procedimiento de uso del MID100,200se describen con mayor detalle más adelante.

Ejemplos

Ejemplo 1 Efecto de composición de electrodo en la eficacia de transfección

Para abordar el efecto del material de electrodo en la localización de gen informador, se comparó la eficacia de transfección para dos dispositivos mínimamente invasivos (MID) con diferentes composiciones de electrodos (oro y acero inoxidable). Esta comparación tuvo como objetivo evaluar si se podía utilizar una alternativa más económica (acero inoxidable) a los electrodos de oro, a la vez que se mantiene la eficacia de transfección. La composición de electrodos se comprobó con facilidad, debido a que los electrodos chapados en oro se retiraron fácilmente de sus casquillos y se sustituyeron por electrodos de acero inoxidable del mismo calibre y longitud. Esto produjo un cabezal de electrodo idéntico que sólo se diferenciaba en la composición de electrodo.

El esquema experimental se detalla en la Tabla 1.

Tabla 1

Se completó una serie de estudios de localización de la expresión in vivo. Todos los experimentos in vivo se llevaron a cabo en cobayas Hartley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), los cuales se consideran un modelo excelente para aplicaciones dermatológicas. Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo los protocolos institucionales de IACUC. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Departamento de Defensa de los Estados Unidos (DoD) 3216.1“Use of Laboratory Animals in DoD Programs”,9 CFR partes 1-4 “Regulaciones de Bienestar Animal”, Publicación de la Academia Nacional de Ciencias“Guide for the Care & Use of Laboratory Animal’,en su versión modificada, y las normas del Departamento de Agricultura que implementan la Ley de Bienestar Animal (7 U.S.C. 2131-2159), así como otras leyes y reglamentos federales y estatales aplicables e instrucciones de DoD. Todos los tratamientos con animales se llevaron a cabo bajo anestesia.

Se inyectó intradérmicamente un plásmido que expresaba el gen GFP informador (0,5, 1, y 2 mg/ml) en la piel de cobayas. Inmediatamente después de la inyección, se realizó una electroporación en la piel en el sitio de la inyección utilizando un dispositivo MID con electrodos de oro o de acero inoxidable. Los animales fueron sacrificados tres días después del tratamiento. Se extirpó la piel y se visualizó bajo un microscopio fluorescente. Se tomaron fotografías de alta resolución y posteriormente se analizó la intensidad de los píxeles utilizando un software estándar (Adobe Photoshop CS5). El nivel de expresión se calculó a través del recuento de píxeles de áreas de tratamiento predefinidas. Se estableció una “región cerrada” de contacto de electrodos para el análisis de píxeles bajo el supuesto de que la transfección sólo se produce donde se aplica el campo eléctrico y que este último sólo se forma donde los electrodos están en contacto directo con la piel. La distancia entre el primer y el cuarto electrodo del dispositivo MID era de 4,5 mm. Por lo tanto, se utilizó la “herramienta de regla” de Adobe Photoshop CS5 para aislar una región de 4,5 mm2, la cual se definió con una longitud de aproximadamente 95 píxeles. Adobe Photoshop CS5 reconoció intensidades de píxeles que oscilaban entre 0-255 (más oscuro-más brillante) en tres canales diferentes (Rojo, Verde y Azul). Dado que la señal positiva de GFP predominaría en el canal verde, el análisis de píxeles se restringió a este canal. La versión CS5 de Adobe Photoshop fue capaz de calcular automáticamente la intensidad media y mediana de los píxeles de la región seleccionada. Dado que la distribución de la intensidad de los píxeles no era simétrica en la mayoría de los casos, se consideró que la mediana ofrecía una mejor representación de la tendencia central para el histograma. Para garantizar resultados precisos, se analizaron los datos agrupados de múltiples lugares de tratamiento en múltiples animales.

Los resultados se muestran en laFigura 5. Los resultados también se compararon con la expresión de GFP después de la inyección intradérmica sin electroporación posterior. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de oro y de acero inoxidable (valor P < 0,05 entre ambos grupos de tratamiento y el control de sólo inyección ID). Los resultados indicaron que el electrodo de acero inoxidable, más económico, era tan eficaz como el electrodo de oro para provocar la expresión del gen informador.

Ejemplo 2 Efecto del espaciado de electrodos en la eficacia de transfección

Para evaluar el efecto del espaciado de electrodos en la eficacia de transfección y la localización del gen informador, se creó una placa de circuito espaciada 1 mm y se ajustó en la carcasa de pieza de cabezal y se comparó con un MID similar con una placa de circuito espaciada 1,5 mm. Para garantizar que el área de tratamiento de superficie siguiera siendo la misma entre las dos piezas de mano en los diferentes espaciados, se añadió una fila adicional de electrodos a la placa de circuito espaciada 1 mm. Por lo tanto, se comparó una pieza de mano espaciada 1,5 mm con filas de electrodos de 4x4 (16 electrodos) con una pieza de mano espaciada 1 mm con filas de electrodos de 5x5 (25 electrodos). Por lo tanto, cada pieza de mano tenía un área de superficie de tratamiento de aproximadamente de 4 4,5 mm2. LaFigura 6Amuestra una fotografía de ambas piezas de mano desde una perspectiva lateral. La pieza de mano superior es el espaciado de 1 mm, y la pieza de mano inferior es el espaciado de 1,5 mm. LaFigura 6Bmuestra una vista en primer plano de la cara de la pieza de mano de 1 mm.

Se completó una serie de estudios de localización de la expresión in vivo, como se describe en el Ejemplo 1. De manera específica, después de una inyección intradérmica de una dosis conocida (0,5, 1, y 2 mg/ml) de ADN plasmídico que expresaba el gen GFP informador en la piel de cobayas, se utilizó el dispositivo prototipo de 1 mm o 1,5 mm para electroporar casi inmediatamente, dentro de los 10 segundos siguientes a la inyección, la burbuja de inyección resultante. Los electrodos eran de composición de oro o de acero inoxidable. Los animales fueron sacrificados tres días después del tratamiento. Se extirpó la piel y se visualizó bajo un microscopio fluorescente. Se tomaron fotografías de alta resolución y posteriormente se analizó la intensidad de los píxeles utilizando un software estándar (Adobe Photoshop CS5). El nivel de expresión se calculó a través del recuento de píxeles de áreas de tratamiento predefinidas. Para garantizar resultados precisos, se analizaron los datos agrupados de múltiples lugares de tratamiento en múltiples animales. La expresión de GFP se monitorizó durante diferentes periodos de tiempo (12, 24, y 48 horas) para permitir la evaluación de la cinética de expresión.

El esquema experimental se detalla en la Tabla 2.

Tabla 2

Los resultados se muestran en laFigura 7. Se muestran los resultados de 6 tratamientos para cada condición. Los resultados también se compararon con la expresión de GFP después de la inyección intradérmica sin electroporación posterior. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los resultados para el dispositivo con la placa de circuito espaciada 1,5 mm y la placa de circuito espaciada 1 mm (valor P < 0,05 entre los grupos de tratamiento y el control de sólo inyección ID). Los resultados son representativos de múltiples experimentos y demostraron que se logró una transfección exitosa y robusta con un dispositivo de electroporación mínimamente invasivo (MID EP) utilizando un espaciado de electrodos de 1,5 mm o 1 mm.

Estos resultados sugieren que el espaciado de electrodos no afecta a la expresión de GFP en la piel ya que no se observó ninguna diferencia visible (determinada a simple vista y cuantificable a través del recuento de píxeles) entre los dos espaciados de electrodos. Por lo tanto, la electroporación con MID EP que utilizó un espaciado de electrodos de 1,5 mm o 1 mm dio como resultado una expresión robusta del gen informador.

Ejemplo 3

Efecto del espaciado de electrodos sobre la corriente

Un dispositivo como el descrito en la presente memoria puede tener la capacidad de capturar y almacenar todos los parámetros eléctricos en tiempo real a medida que ocurren durante cada impulso de electroporación. Se completó una serie de estudios de localización de la expresión in vivo, como se describe en el Ejemplo 1, para examinar la corriente y la tensión para la electroporación con dispositivos de diferente espaciado y composición de electrodos. Mientras la tensión aplicada permanecía constante (15 voltios), se examinaba la impedancia (resistencia) y la corriente suministrada para cada tratamiento para cada espaciado de electrodos y cada composición de electrodos.

LaFigura 8muestra tanto la impedancia resultante (resistencia en Ohmios) como la Corriente (en miliamperios).

La corriente fue aproximadamente tres veces mayor en la pieza de mano de 1 mm (media de 85 mA) en comparación con la pieza de mano de 1,5 mm (media de 23 mA), aunque la tensión aplicado fue la misma en todas las condiciones. El aumento de la corriente en la pieza de mano de 1,5 mm dio como resultado una gran reducción (aproximadamente el 75 %) de la impedancia del tejido. Desde la perspectiva de la producción de un dispositivo dérmico tolerable, el aumento de la corriente puede ser problemático al causar más dolor o sensación al paciente. El aumento de la corriente puede causar más dolor o sensación en un paciente y, por lo tanto, el aumento de la corriente puede ser problemático para producir un dispositivo dérmico tolerable. Estos resultados sugieren que, si bien el espaciado de electrodos no parece influir en la expresión de GFP resultante, el espaciado o la presencia de electrodos adicionales puede influir en el flujo de corriente y, por lo tanto, en la impedancia del tejido.

Para abordar aún más el problema del aumento de la corriente, se investigó si la tensión aplicada podría reducirse en un tercio (a 5 voltios) y aun así dar como resultado una corriente de 10-20 mA. Los electrodos eran de acero inoxidable. Los resultados se muestran en laFigura 9. Los resultados sugirieron que los electrodos adicionales, y no el espaciado real de electrodos, afectaban a la corriente resultante.

Para evaluar si una tensión reducida afectaba a la eficacia de transfección, se suministró intradérmicamente a la piel de cobaya un plásmido de ADN que expresaba el gen GFP informador e inmediatamente después se procedió a la electroporación utilizando un dispositivo MID con un espaciado de electrodos de 1,5 mm (4x4) o un espaciado de electrodos de 1 mm (4x4 o 5x5) a 15 o 5 voltios. Los animales fueron sacrificados tres días después del tratamiento. Se extirpó la piel y se visualizó bajo un microscopio fluorescente. Se tomaron fotografías de alta resolución y posteriormente se analizó la intensidad de los píxeles utilizando un software estándar (Adobe Photoshop CS5).

Los resultados se muestran en laFigura 10. Estos resultados sugieren que la tensión de entrada puede reducirse en piezas de mano de electrodos más grandes, a la vez que se mantiene la eficacia de transfección. Por lo tanto, los resultados sugirieron que se puede lograr una transfección robusta con un conjunto más grande a la vez que se mantiene los parámetros de baja tensión y sin dolor. Es probable que, en un dispositivo clínico humano, se necesiten al menos 25 electrodos para mantener una cobertura óptima dependiendo de los requisitos o preferencias de uso, por ejemplo, el volumen de inyección.

Ejemplo 4

Efecto de concentración de plásmido en la eficacia de transfección

Se examinó el efecto de concentraciones más bajas de plásmido que expresa el gen GFP informador en la eficacia de transfección con dispositivos de diferente composición y espaciado de electrodos.

Se completó una serie de estudios de localización de la expresión in vivo, como se describe en el Ejemplo 1. Se inyectó intradérmicamente un plásmido que expresaba el gen GFP informador (0,5, 0,25, y 0,1 mg/ml) en la piel de cobayas e inmediatamente después se procedió a la electroporación utilizando un dispositivo MID con electrodos de oro o de acero inoxidable y electrodos espaciados 1 mm- (5x5) o 1,5 mm- (4x4) a 15 voltios. Los animales fueron sacrificados tres días después del tratamiento. Se extirpó la piel y se visualizó bajo un microscopio fluorescente. Se tomaron fotografías de alta resolución y posteriormente se analizó la intensidad de los píxeles utilizando un software estándar (Adobe Photoshop CS5). El nivel de expresión se calculó a través del recuento de píxeles de áreas de tratamiento predefinidas. Para garantizar resultados precisos, se analizaron los datos agrupados de múltiples lugares de tratamiento en múltiples animales.

Los resultados se muestran en laFigura 11. También se observó la expresión de GFP después de la inyección de ID sola (sin EP), pero se detectó una expresión mínima (datos que no se muestran). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el espaciado o la composición de electrodos en ninguna de las concentraciones del plásmido que expresa el gen GFP informador.

Ejemplo 5

Eficacia de la electroporación analizada a nivel celular

Se analizaron inmunohistoquímicamente muestras de piel extraídas de animales tratados en los experimentos detallados en los Ejemplos anteriores. Después del tratamiento, la piel se extirpó post mortem (después de la muerte), se seccionó, y se montó en parafina. Las células que expresaban GFP se observaron y contaron utilizando un microscopio fluorescente de alta potencia (Olympus - BX51 TF). Se anotaron el número y la región (es decir, la capa de estratos en la epidermis) de las células que expresaban GFP. Las secciones histológicas también se contrateñían con una colección de anticuerpos disponibles comercialmente antes del montaje para permitir la identificación directa de los tipos de células transfectadas, tales como linfocitos IHC, queratinocitos (la mayoría de las células en la epidermis) y células de Langerhans (APC más comunes en la epidermis). Los anticuerpos también se utilizaron para observar el efecto de la electroporación en la infiltración de linfocitos.

Se logró una tinción robusta de queratinocitos en la epidermis. La región epidérmica en las secciones de piel estaba claramente definida. En general, los resultados sugieren que los electrodos adicionales impactan masivamente en el flujo de corriente y, por lo tanto, impactan la impedancia del tejido. Este aumento del flujo de corriente no pareció afectar a la expresión resultante del gen informador. Sin embargo, era evidente que la tensión podía reducirse en la pieza de mano de 5x5 1 mm a la vez que se lograban corrientes fuertes y una transfección robusta.

Para ver una tinción positiva para el anticuerpo específico de Langerhans en la piel, se extrajeron el bazo y los ganglios linfáticos de un animal sacrificado para utilizarlos como controles positivos para el anticuerpo. Se detectó una fuerte tinción de anticuerpos tanto en el bazo como en los ganglios linfáticos, pero no en la piel. Aunque no se quiera limitar a una teoría en particular, esto sugería que el anticuerpo estaba funcionando pero que la señal en la piel era demasiado débil para detectarla, o que no había células de Langerhans presentes en el tejido probado.

Los resultados adicionales se muestran en laFigura 12. Se observó que tanto la electroporación como la expresión de genes informadores dieron como resultado la infiltración de linfocitos en el área de tratamiento. La combinación de EP y expresión del gen informador dio como resultado la mayor infiltración. Aunque se observó la colocalización de la tinción de queratinocitos y la expresión del gen informador, la tinción no fue consistente. Sin embargo, se confirmó sistemáticamente la colocalización de la IHC de linfocitos y la expresión del gen informador.

Ejemplo 6

Dispositivo de doble cabezal

Se fabricó un dispositivo de doble cabezal que tenga dos conjuntos uno al lado de otro con una pequeña zona tampón. Los conjuntos se diseñaron para suministrar impulsos simultáneamente. Alternativamente, cada cabezal puede ser pulsado independientemente con modificaciones adicionales del equipo. Se crearon prototipos de carcasas de plástico y componentes eléctricos personalizados. Los dispositivos se muestran en laFigura 13.

Se completó una serie de estudios de localización de la expresión in vivo, como se describe en el Ejemplo 1. Se inyectó intradérmicamente un plásmido que expresa el gen GFP o RFP informador a una concentración de 1 mg/ml en la piel de cobaya. La inyección fue seguida inmediatamente por la electroporación utilizando el dispositivo de doble cabezal (con 16 electrodos de acero inoxidable en un conjunto de 4*4 y un espaciado de 1,5 mm, a 25 V). Los resultados se muestran en laFigura 14, la cual es una micrografía fluorescente que muestra la expresión de GFP seguida de una administración intradérmica de un plásmido de gen informador y EP con la MID100,200, comparada con la expresión de GFP después de la inyección intradérmica sola (sin EP). Los electrodos110de las MID100,200estaban espaciados entre sí por un espaciado de 1,5 mm. El animal fue sacrificado después del tratamiento y se le extirpó la piel y se visualizó con un microscopio de fluorescencia. La micrografía fluorescente confirma que múltiples plásmidos se suministraron simultáneamente en lugares separados espacialmente.

Ejemplo 7

Cinética de transfección

Se completará una serie de estudios de localización de la expresión in vivo, utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. De manera específica, seguido de una inyección intradérmica de una dosis conocida (0,5, 1 y 2 mg/ml) de ADN plasmídico que expresa el gen GFP informador en la piel de cobayas, se utilizará un dispositivo prototipo de 1 mm o 1,5 mm para electroporar inmediatamente la burbuja de inyección resultante. Los electrodos del MID serán de composición de oro o de acero inoxidable. Los animales serán sacrificados en diferentes momentos (12 horas, 24 horas, y 48 horas, 3 días) después del tratamiento. Se extirpará la piel y se visualizará bajo un microscopio fluorescente para cada momento. Se tomarán fotografías de alta resolución y posteriormente se analizará la intensidad de los píxeles utilizando un software estándar (Adobe Photoshop CS5). El nivel de expresión se calculará a través del recuento de píxeles de las áreas de tratamiento predefinidas. Para garantizar la precisión de los resultados, se analizarán los datos agrupados de múltiples lugares de tratamiento en múltiples animales. La expresión del GFP se comparará a lo largo de los diferentes periodos de tiempo para facilitar la evaluación de la cinética de expresión.

La invención se establece en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo (100, 200) para la electroporación y suministro de uno o más antígenos, comprendiendo el dispositivo: una carcasa (102) que tiene una porción (104) de punta distal;

una pluralidad de conjuntos (106, 108) de electrodos acoplados cada uno a la porción (104) de punta, en la que los conjuntos (106, 108) de electrodos sobresalen de la porción (104) de punta;

un generador (116, 118, 122) de impulsos acoplado eléctricamente a al menos un electrodo (110) de cada conjunto (106, 108) de electrodos;

un microcontrolador (120, 206) programable acoplado eléctricamente al generador (116, 118, 122) de impulsos, en el que cada electrodo (110) está configurado para suministrar un impulso de electroporación a las células de los tejidos epidérmicos; y

en el que el generador (116, 118, 122) de impulsos es alimentado por una batería (204) transportada dentro de la carcasa (102), en el que la batería (204) permite que el dispositivo (100, 200) sea portátil,

caracterizado porquelos conjunto (106, 108) de electrodos definen sitios espacialmente separados, cada conjunto (106, 108) de electrodos incluye una pluralidad de electrodos (110), y el microcontrolador (120, 206) está configurado para ajustar parámetros del impulso de electroporación de cada conjunto (106, 108) de electrodos independientemente, en el que el microcontrolador (120, 206) está configurado para ajustar una cantidad respectiva de impulsos de electroporación para cada conjunto (106, 108) de electrodos independientemente, y en el que la cantidad es de 1 a 10.

2. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la batería (204) es de un tipo de batería seleccionado a partir de un grupo que comprende iones de litio, hidruro metálico de níquel, plomo ácido, y níquel cadmio.

3. El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende además un botón de activación para activar el suministro del impulso de electroporación.

4. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que el impulso de electroporación está asociado a un potencial eléctrico, el microcontrolador (120, 206) está configurado para variar el potencial eléctrico de conjunto a conjunto, y en el que el microcontrolador (120, 206), en cooperación con la batería (204), puede amplificar el impulso de electroporación.

5. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que el impulso de electroporación está asociado con una corriente eléctrica, y en el que el microcontrolador (120, 206) está configurado para variar la corriente eléctrica de conjunto a conjunto.

6. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que el impulso de electroporación está asociado con una duración, y en el que el microcontrolador (120, 206) está configurado para variar la duración de conjunto a conjunto.

7. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que los conjunto (106, 108) de electrodos están espaciados entre sí al menos por una distancia de modo que se evite sustancialmente la interferencia de los antígenos cuando se suministran los impulsos de electroporación.

8. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de electrodos (110) en cada conjunto (106, 108) de electrodos están dispuestos en un patrón respectivo.

9. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que al menos un electrodo (110) de la pluralidad de electrodos (110) en cada conjunto (106, 108) de electrodos incluye un extremo (114) que penetra el tejido con una longitud de 0,1 mm o menos.

10. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que al menos un electrodo (110) de la pluralidad de electrodos (110) en cada conjunto (106, 108) incluye un extremo (114) que penetra el tejido con una longitud de 0,01 mm a 0,04 mm.

11. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que los impulsos de electroporación evitan sustancialmente el daño en las células de los tejidos epidérmicos.

12. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que los impulsos de electroporación están asociados con un potencial eléctrico que es de 0,01 V a 70 V, en el que el potencial eléctrico es casi indoloro medido por una escala analógica visual.

13. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que los electrodos (110) contiguos están espaciados entre sí a una distancia de no más que 1,5 mm, y opcionalmente a una distancia de no más que 1,0 mm.

14. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de electrodos (110) para cada conjunto (106, 108) de electrodos está configurada para suministrar los impulsos de electroporación sustancialmente de manera simultánea.