ES2994256T3 - Compositions and methods for treatment of homocystinuria - Google Patents

Compositions and methods for treatment of homocystinuria Download PDF

Info

Publication number
ES2994256T3
ES2994256T3 ES21204193T ES21204193T ES2994256T3 ES 2994256 T3 ES2994256 T3 ES 2994256T3 ES 21204193 T ES21204193 T ES 21204193T ES 21204193 T ES21204193 T ES 21204193T ES 2994256 T3 ES2994256 T3 ES 2994256T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
htcbs
peg
mice
levels
hours
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES21204193T
Other languages
English (en)
Inventor
Jan P Kraus
Tomas Majtan
Erez Bublil
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Colorado System
University of Colorado Colorado Springs
Original Assignee
University of Colorado System
University of Colorado Colorado Springs
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US14/935,690 external-priority patent/US9675678B2/en
Application filed by University of Colorado System, University of Colorado Colorado Springs filed Critical University of Colorado System
Application granted granted Critical
Publication of ES2994256T3 publication Critical patent/ES2994256T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/205—Amine addition salts of organic acids; Inner quaternary ammonium salts, e.g. betaine, carnitine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/385—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having two or more sulfur atoms in the same ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01022—Cystathionine beta-synthase (4.2.1.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para la terapia de reemplazo enzimático utilizando cistationina beta sintasa humana modificada (CBS) en el tratamiento de la homocistinuria y enfermedades y trastornos relacionados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para el tratamiento de la homocistinuria
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, a la terapia de reposición enzimática (TRE) que usa CBS truncada humana (htCBS) con mutación C15S para reducir significativamente las concentraciones de homocisteína (Hcy) en suero y restablecer los niveles de sus metabolitos posteriores, tales como la cistationina y la cisteína. Además, se usa la TRE con htCBS con mutación C15S para el tratamiento de la homocistinuria.
Antecedentes de la invención
La cistationina beta-sintasa (CBS) es la primera enzima en la ruta de transulfuración, que cataliza la condensación de serina y homocisteína (Hcy) para dar cistationina, que luego se hidroliza para dar cisteína mediante la cistationina gamma-liasa (CGL). En biología de sistemas, la robustez de un sistema biológico se define como su capacidad para funcionar correctamente frente a perturbaciones, y la redundancia de elementos en el sistema es uno de los mecanismos por los cuales se logra tal robustez (Kitano, H. 2004, Nature Reviews Genetics, 5:826-837). Sin embargo, parece que el sistema biológico de transulfuración carece en gran medida de redundancia de componentes, lo que hace que este sistema sea propenso a perturbaciones mutacionales. Por ejemplo, la enzima CBS es el único componente que puede transformar la homocisteína en cistationina. Existe en parte una redundancia limitada del sistema, ya que la homocisteína, el primer metabolito que se canaliza hacia la ruta, puede convertirse alternativamente en metionina a través de la ruta de remetilación, aliviando de ese modo la carga de homocisteína. Además, la cisteína, un producto posterior, puede obtenerse directamente de la dieta. Sin embargo, estas rutas tienen una capacidad limitada para mantener niveles normales de metabolitos, y la falta de función de CBS tiene consecuencias perjudiciales para los pacientes humanos si no se trata. La inactivación de CBS da como resultado homocistinuria deficiente en cistationina beta-sintasa (CBSDH), más comúnmente conocida como homocistinuria clásica.
Existen opciones terapéuticas limitadas para tratar la CBSDH, y las opciones de tratamiento actuales reducen la homocisteína pero no tienden a normalizar la cistationina (Cth) ni la cisteína (Cys) y, por tanto, estas opciones de tratamiento pueden ser inadecuadas para brindar opciones de tratamiento robustas y eficaces. Por tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de estrategias de tratamiento más eficaces para individuos con homocistinuria.
La presente invención aborda esta necesidad proporcionando composiciones y métodos de uso de estas composiciones para el tratamiento de CBSDH.
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones.
La presente divulgación proporciona una composición que comprende un polipéptido mutante de cistationina beta sintasa truncada humana (htCBS) aislado conjugado con un resto de PEG, en la que el polipéptido mutante de htCBS aislado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 con un cambio de una cisteína en la posición de aminoácido correspondiente a 15 de SEQ ID NO: 3 a una serina y que carece del primer residuo de metionina N-terminal correspondiente a SEQ ID NO: 3, y está pegilado con ME-200GS; para su uso en un método de tratamiento de la homocistinuria en un sujeto humano, en la que el polipéptido mutante de htCBS pegilado se administra al menos una vez a la semana durante al menos seis semanas en una dosis de entre 0,33 y 10 mg/kg.
Se proporcionan aspectos adicionales de la invención en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, el polipéptido mutante de htCBS puede administrarse a una dosis de entre 5 y 7,5 mg/kg y puede administrarse al menos dos veces a la semana. Además, la htCBS o el polipéptido mutante de htCBS puede coadministrarse con betaína u otras terapias de CBSDH conocidas.
La cantidad de un metabolito tal como, pero sin limitarse a, cistationina y cisteína, en un sujeto puede aumentarse después de la administración. La cantidad de cisteína puede aumentarse hasta 0,005-0,35 |iM. La cantidad de cisteína puede aumentarse hasta por encima de 140 |iM (por ejemplo, entre 200 |iM y 400 |iM).
La cantidad de un metabolito tal como, pero sin limitarse a, homocisteína, metionina, S-adenosil homocisteína y S-adenosil metionina, en un sujeto puede disminuirse después de la administración. La cantidad de homocisteína puede disminuirse hasta menos de 100 |iM (por ejemplo, aproximadamente 10 |iM). La cantidad de metionina puede disminuirse hasta menos de 50 |iM (por ejemplo, aproximadamente 30 |iM). La cantidad de S-adenosil homocisteína puede disminuirse hasta menos de 0,14 |iM (por ejemplo, aproximadamente 0,015 |iM).
Puede tratarse una enfermedad hepática en un sujeto después de la administración.
En algunas realizaciones, la composición se administra en una dosis de aproximadamente 0,4 mg/kg.
Pueden tratarse la osteoporosis, la alopecia, el debilitamiento del cabello o defectos oculares después de la administración.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A-1B muestran la retención enzimática en plasma ein vivo.La figura 1A muestra que se mantiene el tiempo de retención enzimática en plasma, lo que sugiere que la rápida pérdida de actividadin vivoes el resultado del aclaramiento. La figura 1B muestra que se aumenta el tiempo de retención enzimáticain vivopara htCBS pegilada. El ratón n.° 1 y el ratón n.° 2 en la figura 1B también se describen como la figura 1B en la publicación de patente internacional n.° WO2014120770.
La figura 2 muestra que la administración repetida de htCBS no pegilada no produce cambios en los niveles de homocisteína o cistationina en ratones HO.
La figura 3 muestra un transcurso temporal de la pegilación con la molécula de PEG de 20 kDa lineal seleccionada denominada ME200MAB.
Las figuras 4A-4D muestran que la inyección repetida a largo plazo de htCBS pegilada afecta significativamente a los niveles de homocisteína, cistationina y cisteína en plasma y tejido.
Las figuras 5A-5H ilustran que el mutante de htCBS pegilado (también denominado PEGC15S) y la htCBS pegilada evitan la agregación de proteínas, forman principalmente dímeros y presentan un patrón de pegilación reproducible.
La figura 5A también se describe como la figura 5A en la publicación de patente internacional n.° WO2014120770. La figura 5B también se describe como la figura 5B en la publicación de patente internacional n.° WO2014120770. La figura 5C también se describe como figura 5C en la publicación de patente internacional n.° WO2014120770. La figura 5F también se describe como figura 6A en la publicación de patente internacional n.° WO2014120770. La figura 5G también se describe como parte de la figura 7A y la figura 7B en la publicación de patente internacional n. WO2014120770. La figura 5H también se describe como la figura 6C en la publicación de patente internacional n.° WO2014120770.
Las figuras 6A-6C muestran el efecto del mutante de htCBS pegilado (también denominado PEGC15S) sobre la homocisteína y sus metabolitos 1, 4 y 24 horas tras la inyección.
Las figuras 7A-7B muestran que el tratamiento con mutante de htCBS pegilado (también denominado PEGC15S) y betaína reduce y mantiene sinérgicamente niveles bajos de homocisteína en ratones HO y su efecto sobre los niveles de cistationina.
Las figuras 8A-8B muestran que la administración del mutante de htCBS pegilado (también denominado PEGC15S) rescata a los ratones con inactivación completa de CBS de la mortalidad prematura y mejora la patología hepática.
Las figuras 9A-9B muestran los perfiles de diferentes especies pegiladas para C15S pegilado con una molécula de maleimida-PEG (ME-200MA0B o ME-400MA) o una molécula de éster NHS-PEG (ME-200GS).
Las figuras 10A-10E muestran la actividad específica y los niveles de metabolitos en plasma y la actividad de CBS después de una única inyección subcutánea (s.c.) de 20NHS PEG-htCBS C15S (htCBS C15S pegilada con PEG ME-200GS) o 400MA PEG-htCBS C15S (htCBS C15S pegilada con PEG ME-400MA) a ratones HO.
Las figuras 11A-11C muestran los cambios en las tasas de supervivencia y los niveles de metabolitos en ratones KO después de la administración de C15S pegilado con ME-200GS, ME-200MA0B o ME-400MA.
Las figuras 12A-12E muestran la prevención completa y el retraso de la aparición de alopecia facial en grupos de ratones homocigóticos I278T -/- a los que se les administró continuamente C15S pegilado con ME-200MA0B, ME-400MA o ME-200GS.
Las figuras 13A-13B muestran una hepatopatía mejorada en ratones KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S en comparación con ratones KO tratados con PBS y un control sano.
Las figuras 14A-14B muestran las muestras de hígado de las figuras 13A-13B tal como se observa mediante microscopía electrónica.
Las figuras 15A-15D muestran los efectos de la administración continua de 20NHS PEG-htCBS C15S a ratones HO
sobre la actividad de CBS y los metabolitos de aminoácidos azufrados en plasma usando diferentes modelos de bombas osmóticas ALZET®.
Las figuras 16A-16G muestran los resultados del estudio de absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA o DXA) de la administración continua a largo plazo de 20NHS PEG-htCBS C15S a ratones KO.
Las figuras 17A-17F muestran los resultados del estudio de absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA o DXA) de la administración continua a largo plazo de 20NHS PEG-htCBS C15S a ratones I278T.
Las figuras 18A-18B muestran las concentraciones de metabolitos hepáticos seleccionados analizados usando metabolómica por RMN en ratones I278T después de la administración continua a largo plazo de 20NHS PEG-htCBS C15S y en comparación con controles heterocigóticos sanos y homocigóticos afectados.
Las figuras 19A-19E muestran los efectos de la administración de 20NHS PEG-htCBS C15S sobre defectos oculares en ratones I278T.
Las figuras 20A-20D muestran los niveles de metabolitos en plasma en ratones I278T que se tratan con 20NHS PEG-htCBS y se mantienen con una dieta normal o una dieta restringida en metabolitos.
Las figuras 21A-21B muestran la actividad específica de 20NHS-htCBS C15S en ratas macho y hembra después de una dosis en bolo i.v. o s.c. de 4 (i.v.), 8 (s.c.) y 24 (s.c.) mg/kg. La figura 21C muestra la actividad específica de 20NHS PEG-htCBS C15S después de la inyección inicial y en niveles en estado estacionario para ratas Sprague Dawley de tipo natural individuales que recibieron un total de 9 inyecciones a una dosis de 8 mg/kg.
Las figuras 22A-22B muestran la concentración de Cth en plasma y la actividad específica de 20NHS PEG-htCBS C15S en macacos cangrejeros(Macaca fascicularis)de tipo natural después de una única inyección i.v. o s.c. de una dosis de 2 ó 6 mg/kg.
Las figuras 23A-23B muestran la actividad específica y los niveles de cistationina (Cth) en plasma en macacos cangrejeros(Macaca fascicularis)de tipo natural después de múltiples administraciones s.c. de una dosis de 1, 3 ó 10 mg/kg de 20NHS PEG-htCBS C15S.
Las figuras 24A-24G muestran los resultados de la escala alométrica para estimar una dosis eficaz de 20NHS PEG-htCBS en humanos basándose en los resultados de los modelos de ratón, rata y mono en el presente documento.
Descripción detallada
En el presente documento se proporcionan composiciones para su uso en el tratamiento de la homocistinuria deficiente en cistationina beta-sintasa (Cb Sd H).
La inactivación de CBS da como resultado homocistinuria deficiente en cistationina beta-sintasa (CBSDH), más comúnmente conocida como homocistinuria clásica. La CBSDH es un trastorno autosómico recesivo caracterizado por niveles plasmáticos de homocisteína (tHcy) y metionina total muy elevados y concentraciones muy reducidas de cistationina y cisteína; es el defecto de aminoácidos azufrados más común. Si no se trata, la CBSDH da como resultado enfermedades, trastornos y/o estados en una variedad de diferentes aparatos y sistemas y cambios fenotípicos graves. Los ejemplos no limitativos de enfermedades, trastornos y/o estados a partir de la CBSDH incluyen retraso mental, trastornos psiquiátricos, problemas del sistema nervioso central incluyendo convulsiones, enfermedades cardiovasculares con predisposición a complicaciones tromboembólicas que dan como resultado una alta tasa de mortalidad en individuos no tratados y parcialmente tratados, y una variedad de trastornos del tejido conjuntivo que afectan al sistema visual (por ejemplo, miopía progresiva y luxación del cristalino, ectopia del cristalino) y al sistema esquelético (por ejemplo, hábito marfanoide, osteoporosis, escoliosis, pelo rubio fino y piel fina y quebradiza).
Existe una tricotomía funcional en la naturaleza de las mutaciones patógenas asociadas a CBSDH. Un grupo de mutaciones se clasifica como “sensible a piridoxina”, cuando la función de la enzima CBS puede restablecerse parcialmente mediante terapia con dosis altas de vitamina B6. Este tratamiento puede ser eficaz, pero no siempre mitiga los acontecimientos patológicos en estos individuos, y algunos de los acontecimientos se producen incluso en estos individuos con el tiempo. En un entorno clínico, “sensible a vitamina B6” se define como una caída relativa del 20% en Hcy que se produce 24 horas después de que a un individuo se le administre una dosis oral de 100-500 mg de vitamina B6, lo que significa que un individuo sensible a vitamina B6 todavía puede tener niveles de homocisteína anómalamente altos. El segundo grupo de mutaciones funcionales está representado por los “mutantes de CBS C-terminales”, que son defectuosos en su capacidad para responder a la regulación por incremento posterior a la traducción por S-adenosilmetionina. Los individuos con esta clase de mutaciones habitualmente carecen de los aspectos de retraso mental y tejido conjuntivo del fenotipo. Esta clase se detecta después de la medición de los niveles de Hcy en plasma después de un acontecimiento trombótico idiopático antes de los 40 años (Macleanet al.,2002. Hum. Mutat. 19:641-55). El último grupo de mutaciones de CBSDH es la “homocistinuria clásica”, que representa la forma más grave de la enfermedad. Para estos dos últimos grupos de individuos, la terapia con vitamina B6 en aislamiento no reduce eficazmente los niveles de Hcy en suero. Estos grupos mutacionales pueden mostrar distinciones fenotípicas, pero pueden tratarse de manera similar.
El alelo de CBS mutado más común es 833T>C (I278T), que se asocia con homocistinuria sensible a piridoxina. Por tanto, los individuos sensibles a vitamina B6 representan aproximadamente la mitad de la población de pacientes con homocistinuria (Barber y Spaeth, 1969; Muddet al.,1985). De estos individuos sensibles a vitamina Be, sin embargo, muchos son sólo pacientes que responden parcialmente, y en combinación con los individuos no sensibles a vitamina Be, surge la necesidad de opciones terapéuticas adicionales. Desafortunadamente, en la actualidad, tales opciones terapéuticas se limitan a reducir la ingesta de metionina siguiendo una dieta estricta baja en proteínas complementada con cisteína (ahora esencial) y disminuyendo la concentración de homocisteína mediante el uso de betaína (N,N,N-trimetilglicina), un donador de metilo capaz de remetilar la homocisteína para dar de nuevo metionina. Por tanto, la terapia de reposición enzimática (TRE) que usa CBS (por ejemplo, htCBS mutante pegilada descrita en el presente documento) puede ser la mejor terapia tanto para pacientes parcialmente sensibles a vitamina B6 como para aquellos no sensibles a vitamina Be.
Como resultado de la disfunción de CBS, los niveles de homocisteína (Hcy) se alteran drásticamente en pacientes con CBSDH. En individuos sanos, los niveles de Hcy total están en el intervalo de ~5-15 |iM (Stableret al.,2002, Metabolism, 51:981-988), el 98% de la cual está en forma de disulfuros o está unida a proteínas. Sólo el 2% de la tHcy existe como homocisteína reducida libre (no unida a proteínas), que puede servir como sustrato para CBS (Mansooret al.,1992, Anal. Biochem. 200:218-229; Muddet al.,2000, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20:1704-1706). Este equilibrio se altera drásticamente en pacientes con CBSDH, alcanzando la homocisteína reducida libre el 10-25% de los valores de tHcy que se observan en estos pacientes (hasta ~400 |iM) (Mansooret al.,1993, Metabolism, 42:1481-1485).
Niveles más altos de tHcy (por ejemplo, superiores a 54 veces los niveles de tipo natural) también pueden provocar enfermedades, trastornos y/o estados tales como, pero sin limitarse a, alopecia facial en ratones, osteoporosis y reducción de la supervivencia media. Como ejemplo no limitativo, los ratones modelo que tenían al menos 54 veces más tHcy en comparación con el tipo natural demostraron varias enfermedades, trastornos y/o estados, incluyendo alopecia facial, osteoporosis y reducción de la supervivencia media. Sin embargo, no se observaron tales signos en ratones que tenían niveles de tHcy de aproximadamente 30 veces los valores normales y, por tanto, la elevación de homocisteína sólo puede ser patógena por encima de un nivel umbral (Guptaet al.,2009,<f>A<s>EB J. 23: 883-893). En un estudio observacional multicéntrico de CBSDH en humanos, se encontró que, aunque diversas combinaciones de tratamientos no lograron restablecer los niveles normales de homocisteína en pacientes con CBSDH, y los pacientes que no respondieron a vitamina B6 continuaron presentando niveles de homocisteína 3-5 veces más altos que el límite superior en la población normal, el riesgo de tromboembolia en estos pacientes se redujo significativamente (Yapet al.,2001, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol 21, 2080-2085). En conjunto, estos datos indican que para mejorar la manifestación clínica de CBSDH, una reducción incompleta de tHcy, si está por debajo de un nivel umbral, puede ser suficiente para tratar la enfermedad.
Si bien una dieta baja en metionina puede ser eficaz para establecer y mantener cierto control metabólico de los niveles de homocisteína en los pacientes, su efecto puede verse obstaculizado por la falta de cumplimiento de la dieta, especialmente en pacientes con diagnóstico tardío, lo que da como resultado un aumento concomitante de homocisteína acompañado por el desarrollo de síntomas, especialmente en niños (Walteret al.,1998, Eur. J. Pediatr, 157, supl. 2, S71-76). El incumplimiento de la dieta provoca un aumento de Hcy en suero, la reaparición de complicaciones en el tejido vascular y conjuntivo, incluyendo acontecimientos mortales e incapacitantes, y riesgo de efectos secundarios graves tales como edema cerebral (por una concentración excesiva de Met en suero) o desnutrición grave (por falta de aminoácidos esenciales). La estrategia terapéutica más eficaz es aumentar la actividad enzimática, tal como resulta evidente cuando se administra piridoxina a homocistinuria sensible a vitamina B6. Esta estrategia no es posible para individuos no sensibles a vitamina B6 debido al estado de la mutación. La betaína puede ayudar a lograr un control metabólico en pacientes menos cumplidores y su combinación con la dieta puede representar el mejor tratamiento disponible. Sin embargo, las terapias actuales para pacientes que no responden a vitamina B6 no aumentan la cistationina, y la complementación con cisteína puede estar justificada para mantener niveles apropiados. Por tanto, el aumento de la actividad enzimática en estos individuos puede depender de la administración de enzimas exógenas, es decir, terapia de reposición enzimática (TRE).
Evidencias considerables sugieren una posible función para la cistationina independientemente de su papel como producto intermedio en la transulfuración. Los estudios de un modelo de ratón transgénico particular de homocistinuria deficiente en CBS han sugerido un papel positivo para la cistationina. En este modelo de homocistinuria clásica, el gencbsen el ratón se inactiva y sobrevive con un bajo nivel de expresión del transgén de CBS humana bajo el control del promotor de CBS humana; por tanto, se ha designado como “sólo humano” (HO). El ratón HO presenta graves elevaciones en los niveles de Hcy, metionina, S-adenosilmetionina y S-adenosil homocisteína en plasma y tejido y una disminución concomitante en los niveles de cisteína en plasma e hígado. Sin embargo, a diferencia de los modelos inactivación de CBS anteriores de homocistinuria clásica (también conocidos como ratones con inactivación de CBS (KO), que padecen un grave retraso del crecimiento y hepatopatía y la mayoría muere en el plazo de las tres semanas posteriores al nacimiento, incluso cuando las madres toman betaína (Macleanet al.,2010b. Mol. Genet. Metab. 101, 153-162)), que padecen un grave retraso del crecimiento y hepatopatía, incurren en esteatosis hepática, fibrosis y muerte neonatal en el plazo de las tres semanas posteriores al nacimiento, incluso cuando las madres reciben tratamiento con betaína, los ratones HO presentan una hepatopatía leve y aproximadamente el 90% de los ratones HO viven durante al menos 6 meses (Macleanet al.,2012, J. Biol. Chem. 287, 31994-32005). Las determinaciones de hemorragia de la cola indican que los ratones HO se encuentran en un estado hipercoagulativo que mejora significativamente mediante el tratamiento con betaína de una manera que recapitula la enfermedad tal como se produce en humanos (Macleanet al.,2010b. Mol. Genet. Metab. 101, 153-162). Los ratones HO tienen altos niveles de tHcy, pero sólo padecen consecuencias menores. Existe poca o ninguna diferencia en los niveles de metabolitos entre estos dos modelos murinos, excepto el nivel de cistationina, que es significativamente elevado en ratones HO (~10 |iM) en comparación con los KO (~1 |iM). Por tanto, se ha sugerido que la cistationina puede ejercer efectos protectores contra la acumulación de lípidos hepáticos y renales, la lesión tisular y la muerte celular apoptótica inducida por el estrés prolongado del retículo endoplásmico.
La cistationina puede ejercer efectos protectores en un modelo de ratón de lesión hepática inducida por paracetamol, sirviendo como un profármaco de cisteína. El uso del compuesto inactivador de CGL, ácido D,L-2-amino-4-pentinoico, en experimentos para inducir hipercistationemia mediante el bloqueo de la conversión de cistationina en cisteína, junto con la observación de que la cistationina ejerce efectos protectores significativos en células a23 que son incapaces de convertir este compuesto en cisteína, indican que los efectos protectores observados no son el resultado de que la cistationina actúe como precursor en la síntesis de cisteína.
La cistationina puede ser importante para el funcionamiento normal del cerebro. Es posible que la cistationina se acumule específicamente en el cerebro normal de mamíferos para servir como citoprotector y que la abolición de su síntesis pueda contribuir al retraso mental en la homocistinuria al aumentar la sensibilidad de los tejidos nerviosos al ataque tóxico de la Hcy elevada y/o derivados de la misma (Macleanet al.,2012, J. Biol, Chem. 287, 31994-32005). Existen diferencias regionales considerables en las concentraciones de cistationina dentro del cerebro, y existe una mayor concentración en la materia blanca que en la materia gris, lo que sugiere un posible papel en la mielinización. La cistationina se ha encontrado en niveles más altos en los lóbulos occipitales de cerebros humanos y de monos que en todo el cerebro de especies animales inferiores, y se ha sugerido que el papel de la cistationina es más importante en el cerebro de primates que en el de roedores (Volpe y Laster, 1972, Biol. Neonate 20,385-403).
Varias líneas indirectas de evidencias respaldan los posibles papeles fisiológicos de la cistationina o un derivado de la misma. En el cerebro y el sistema nervioso central (SNC) de los primates, parece haber un desequilibrio entre los niveles relativos de actividad de CBS y CGL que conducen a una acumulación de cistationina. De manera similar, durante el desarrollo embrionario, la<c>B<s>se expresa en múltiples tejidos, tales como el corazón y los pulmones, que no expresan CBS detectable en tejidos adultos. Una variedad de datos indica que la CGL no se expresa durante el desarrollo temprano de los mamíferos. En muestras de hígado humano, por ejemplo, la actividad de CGL sólo se detecta en tejido posnatal, mientras que la actividad en tejido hepático fetal, prematuro y neonatal a término es esencialmente indetectable. En conjunto, estos resultados indican que en determinadas etapas de desarrollo y en tejidos nerviosos adultos, la CBS se expresa específicamente para la producción de cistationina distinta de su papel como producto intermedio en la síntesis de cisteína (Macleanet al.,2012, J. Biol. Chem. 287,31994-32005). Junto con el conocimiento de que se produce un control riguroso sobre la expresión de cistationina y-liasa (CGL) y CBS durante el desarrollo de los mamíferos, estas observaciones se unen para sugerir un posible papel protector de la cistationina además de ser un precursor de cisteína.
La biosíntesis de cisteína a partir de cistationina se cataliza por CGL. La cistationina está presente dentro de las células y se cree que no existe como proteína plasmática. Por consiguiente, se cree que la cistationina producida tras la inyección de la enzima mutante de htCBS pegilada descrita en el presente documento también puede servir como sustrato intracelular para la CGL. Además, puede ser posible que los niveles reducidos de tHcy impidan la formación de aductos de cisteína-homocisteína (que pueden aclararse rápidamente en la orina), generando niveles más altos de cisteína libre en plasma (Guptaet al.,2014, FASEB J. 28:781-790).
A continuación en el presente documento, se describirán más completamente diversos aspectos de la presente invención.
LA ENZIMA CBS
El gen CBS reside en el cromosoma humano 21 en q22.3 (Skovbyet al.,Hum. Genet. 65:291-294 (1984); Munkeet al.,Am. J. Hum. Genet. 42:550-559 (1988)). La secuencia de ácido nucleico que codifica para la CBS humana y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma están disponibles a través del número de registro L19501 de GenBank, y estas secuencias también se divulgan en la patente estadounidense n.° 5.523.225. La secuencia de ácido nucleico del ADN genómico que codifica para CBS también está disponible de manera pública a través de bases de datos de secuencias tales como GenBank y en la página web de la Universidad de Colorado-Denver (Laboratorio de Kraus).
Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría, la proteína codificada por el gen CBS actúa como un homotetrámero para catalizar la conversión de homocisteína en cistationina, la primera etapa en la ruta de transulfuración. La proteína codificada se activa alostéricamente por S-adenosil-metionina y usa piridoxal fosfato como cofactor. Se han encontrado múltiples variantes de transcripción sometidas a corte y empalme alternativo para este gen.
La CBS rige el flujo unidireccional de azufre de la metionina a la cisteína al funcionar en la intersección de las rutas de transmetilación, transulfuración y remetilación. Cataliza una reacción de reemplazo p en la que la serina se condensa con la homocisteína de manera dependiente del piridoxal-5'-fosfato (PLP), para formar cistationina (Miles y Kraus, 2004, J. Biol. Chem. 279:29871-29874). La cistationina puede convertirse en cisteína mediante la cistationina gamma liasa (CGL). Por tanto, una función apropiada de la enzima CBS es fundamental tanto para la regulación del metabolismo de la cisteína como de la metionina (Muddet al.,2001, “Disorders of Transsulfuration” en The metabolic and molecular bases of inherited disease. C.R. Scriver, A.L. Beudet, W.S. Sly, V.D., C.B., K.K. W. and V.B., eds. (Nueva York: McGraw-Hill), págs. 2007-2056) y, por consiguiente, una actividad de CBS comprometida o la falta de la misma conduce a las manifestaciones bioquímicas y clínicas de homocistinuria deficiente en CBS (CBSDH).
La inactivación de CBS da como resultado homocistinuria deficiente en cistationina beta-sintasa (CBSDH), más comúnmente conocida como homocistinuria clásica. La homocistinuria clásica fue descrita por primera vez por Carson y Neill en 1962 (Carson y Neill, 1962. Arch. Dis. Child 37:505-513) y se reconoce como el error congénito más común del metabolismo de los aminoácidos azufrados. La causa subyacente de la homocisunuria, una deficiencia de la enzima cistationina p-sintasa (CBS), se descubrió poco después (Muddet al.,1964, Science 143:1443-1445).
Las mutaciones de aminoácido representan la causa más común de deficiencia de cistationina p-sintasa (CBS). Muchas de estas mutaciones dan como resultado proteínas con plegamiento erróneo, que carecen de función biológica. La presencia de chaperonas químicas (por ejemplo, tales como etanol, dimetilsulfóxido o N-óxido de trimetilamina) a veces pueden aliviar o incluso restablecer el plegamiento de la proteína y la actividad de proteínas mutantes. Se purificaron y caracterizaron ocho enzimas mutantes de CBS (P49L, P78R, A114V, R125Q, E176K, P422L, I435T y S466L), y pudieron rescatarse con chaperonas químicas al mejorar su plegamiento de proteína. Las enzimas mutantes tetraméricas completamente saturadas con hemo tenían actividades específicas iguales o superiores que la CBS de tipo natural. Las mediciones de estabilidad térmica demostraron que los mutantes purificados son igual o más termoestables que la CBS de tipo natural. La respuesta a la estimulación con S-adenosil-L-metionina o a la activación térmica varió. La falta de respuesta de R125Q y E176K a ambos estímulos indicó que sus conformaciones específicas no pudieron alcanzar el estado activado. Los niveles aumentados de chaperonas moleculares en extractos en bruto, particularmente DnaJ, indicaron un efecto bastante indirecto de las chaperonas químicas sobre el plegamiento de mutantes de CBS (Majtan,et al.,2010, J. Biol. Chem. 285(21): 15866-15873).
Se ha sometido a prueba el grado de plegamiento erróneo de 27 mutaciones de CBS sometidas a prueba previamente enE. colipara determinar la capacidad de las chaperonas para rescatar la conformación de estas mutaciones en las condiciones más permisivas de plegamiento de las células CHO-K1 de mamífero. La expresión de mutaciones en células de mamífero aumentó la mediana de actividad en 16 veces y la cantidad de tetrámeros en 3,2 veces en comparación con la expresión en bacterias. Posteriormente, se sometieron a prueba las respuestas de siete mutaciones seleccionadas a tres compuestos con actividad similar a la de las chaperonas. El ácido aminooxiacético y el ácido 4-fenilbutírico presentaron sólo un efecto débil. Por el contrario, el hemo-arginato aumentó sustancialmente la formación de tetrámeros de proteína CBS mutantes (hasta seis veces) y rescató la actividad catalítica (hasta nueve veces) de cinco de las siete mutaciones (p.A114V, p.K102N, p.R125Q, p.R266K y p.R369C). El mayor efecto del hemo-arginato se observó para la mutación p.R125Q, que no es sensible al tratamientoin vivocon vitamina B6. Además, la sensibilidad a hemo de la mutación p.R125Q se confirmó en fibroblastos derivados de un paciente homocigótico para esta variante genética. Basándose en estos datos, se propuso un grupo distinto de mutaciones de CBS sensibles a hemo y se predijo que la bolsa de hemo de CBS sería una diana importante para el diseño de nuevas terapias para la homocistinuria (Melenovska,et al.,2014, J. Inherit. Metab. Dis. 38(2)).
Bioquímicamente, la CBSDH se caracteriza por niveles sanguíneos de homocisteína, metionina y S-adenosilhomocisteína (también conocida como “SAH” o “AdoHcy”) muy elevados, acompañados de niveles bajos de cisteína y cistationina. Algunas de las manifestaciones clínicas de la homocistinuria no tratada incluyen tromboembolia, problemas del tejido conjuntivo tales como luxación del cristalino, características marfanoides y osteoporosis, deterioro cognitivo y otros signos (Kraus, J. y Kozich, V. (2001). “Cystathionine beta-synthase and its deficiency” en Homocysteine in health and disease. J.D. Carmel R, ed. (Nueva York: Cambridge University Press), págs. 223-243; Muddet al.,2001, “Disorders of Transsulfuration” en The metabolic and molecular bases of inherited disease. C.R. Scriver, A.L. Beudet, W.S. Sly, V.D., C.B., K.K. W. and V.B., eds. (Nueva York: McGraw-Hill), págs. 2007-2056).
Los intentos iniciales para tratar la homocistinuria emplearon restricciones de la dieta para disminuir la ingesta de metionina, evitando de ese modo la acumulación de la homocisteína tóxica (Komroweret al.,1966, Arch. Dis. Child 41:666-671). Más tarde se descubrió que la complementación con el precursor del cofactor PLP, la piridoxina (vitamina B6), alivia las manifestaciones clínicas en poco menos de la mitad de los pacientes, y un subconjunto de estos responde sólo parcialmente (Barber y Spaeth, 1969. J. Pediatr. 75:463-478; Muddet al.,1985, Am. J. Hum. Genet.
37:1-31). Los “pacientes que responden a vitamina B6” necesitan tomar complementos de vitamina B6 durante el resto de sus vidas. En muchos casos, incluso los pacientes completamente sensibles a vitamina B6 requieren una dieta restringida en proteínas más suave para poder lograr un control metabólico (Picker, J.D. y Levy, H.L. (2004). Homocystinuria Caused by Cystathionine Beta-Synthase Deficiency en GeneReviews, R.A. Pagon, M.P. Adam, T.D. Bird, C.R. Dolan, C.T. Fong, and K. Stephens, eds. (Seattle (WA): Universidad de Washington, Seattle). El subconjunto restante, los pacientes que no responden, están sujetos a una dieta extremadamente limitada, con la que muchos pacientes no cumplen bien (Walteret al.,1998, Eur. J. Pediatr. 157, supl. 2, S71-76). La dieta se combina con una mezcla de aminoácidos enriquecida en cisteína y libre de metionina junto con betaína, que puede servir como donador de metilo para la enzima betaína-homocisteína metiltransferasa (BHMT) para producir dimetilglicina y metionina a partir de homocisteína (Finkelstein, 1990. J. Nutr. Biochem. 1:228-237). El glutatión se sintetiza a partir de la cisteína y, por tanto, la adición de cisteína puede ser importante para reducir el estrés oxidativo. La mayoría de los pacientes también reciben tratamiento con trimetilglicina y una dosis normal de complemento de ácido fólico. Esto mejora el control metabólico al disminuir los niveles de homocisteína, junto con la dieta estricta.
La betaína (N,N,N-trimetilglicina) se usa para reducir las concentraciones de homocisteína al fomentar la conversión de homocisteína de nuevo en metionina, es decir, aumentando el flujo a través de la ruta de remetilación independiente de los derivados de folato (que es principalmente activo en el hígado y en los riñones). Luego, una pequeña porción de la metionina reformada se elimina gradualmente mediante su incorporación a la proteína corporal. La metionina que no se convierte en proteína se convierte en S-adenosil-metionina que vuelve a formar homocisteína. Por tanto, la betaína es más eficaz si la cantidad de metionina que va a eliminarse es pequeña. Por tanto, el tratamiento incluye tanto betaína como una dieta baja en metionina. En la homocistinuria clásica, el nivel de metionina en plasma generalmente aumenta por encima del intervalo normal de 30 micromoles/l y las concentraciones deben monitorizarse ya que pueden alcanzarse niveles potencialmente tóxicos (más de 400 micromoles/l).
Durante mucho tiempo se ha buscado una estrategia de tratamiento alternativa para la CBSDH para proporcionar a los pacientes que no responden y a los que responden parcialmente a vitamina B6 una terapia que mejore las anomalías metabólicas, reduzca la acumulación de homocisteína tóxica en la circulación y aumente los niveles de cistationina y cisteína. Tales cambios metabólicos pueden revertir o retrasar la aparición de los síntomas de CBSDH y permiten que este grupo de individuos afectados disfrute de una dieta sin restricciones o sólo levemente restringida y mejore significativamente su calidad de vida. Para proporcionar estos beneficios, una terapia debe mejorar la deficiencia central que subyace a este estado, es decir, los niveles y/o la función aberrantes de CBS. Por consiguiente, la introducción sistémica de CBS, en forma de terapia de reposición enzimática (TRE), debería ser beneficiosa para los pacientes con homocistinuria.
Sin pretender limitarse a ninguna teoría, se cree que una disminución significativa de la homocisteína extracelular debido a la administración de CBS genera un gradiente de concentración, desencadenando un flujo de homocisteína desde los espacios intracelulares hasta los extracelulares, donde la enzima administrada puede procesarla adicionalmente y, por tanto, la CBS extracelular puede servir como un “sumidero” de homocisteína.
La estructura y el modo de activación de la CBS humana nativa, que existe como un tetrámero que se compone de cuatro monómeros idénticos, puede ser difícil de usar como TRE. Esta forma de la enzima tiene una alta tendencia a la agregación, lo que plantea una limitación importante en los esfuerzos de purificación (Kraus y Rosenberg, 1983, Arch. Biochem. Biophys. 222:44-52). Además, la activación de CBS requiere la unión de S-adenosil-metionina (SAM) a la cola C-terminal, con el fin de aliviar la autoinhibición ejercida sobre la enzima por su región reguladora C-terminal.
Se proporciona una CBS humana truncada (htCBS) recombinante (SEQ ID NO: 3) en la que se ha eliminado la región reguladora C-terminal. La htCBS está mutada, en la que la cisteína en la posición de aminoácido 15 se ha cambiado a serina (mutante de htCBS o C15S) (SEQ ID NO: 13). El polipéptido mutante de htCBS carece del primer residuo de metionina N-terminal correspondiente a SEQ ID NO: 3.
En una realización, la enzima mutante de htCBS pegilada mejoró las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la enzimain vivo.Las proteínas terapéuticas, a diferencia de las moléculas pequeñas, se administran por vía parenteral, y la eficacia del tratamiento puede verse muy afectada por su absorción, distribución, metabolismo y excreción (“ADMe ”) (Vugmeysteret al.,2012, World Journal of Biological Chemistry 3:73-92). Los compuestos de alto peso molecular, tales como las enzimas, tienen una capacidad de penetración tisular limitada y, por tanto, están presentes principalmente en el plasma hasta que se eliminan de la circulación mediante al menos un mecanismo.
En una realización, la administración de mutante de htCBS para la TRE mantiene una alta actividad en plasma durante un periodo de tiempo suficiente para generar un efecto constante y significativo sobre el metabolismo de los aminoácidos azufrados. Mejorar la eficacia de la TRE puede requerir modificaciones adicionales en la proteína con el fin de aumentar el tiempo de retenciónin vivo.La pegilación, la adición de restos de polietilenglicol (PEG) sobre la superficie de la proteína, prolonga el tiempo de retención en un sujeto. Se descubrió que la pegilación minimiza la proteólisis, la respuesta inmunitaria y la antigenicidad, al tiempo que aumenta la estabilidad y el tamaño de las proteínas y reduce la excreción renal (Kanget al.,2009, Expert opinion on emerging drugs 14:363-380).
La biosíntesis de cisteína a partir de cistationina se cataliza únicamente por CGL. La cistationina sólo está presente dentro de las células y no existe como proteína plasmática. Por consiguiente, se cree que la cistationina producida tras la inyección de la enzima mutante de htCBS pegilada descrita en el presente documento también puede servir como sustrato intracelular para CGL. Además, y no mutuamente excluyentes, también es posible que niveles reducidos de tHcy impidan la formación de aductos de cisteína-homocisteína (que pueden aclararse rápidamente en la orina), generando niveles más altos de cisteína libre en plasma, tal como se sugirió recientemente (Guptaet al.,2014, FASEB J. 28, 781-790). La normalización de los niveles de cisteína sin complementación con cisteína es otra posible ventaja del mutante de htCBS descrito en el presente documento en la TRE.
En una realización, puede observarse la normalización de los niveles de cisteína después de la administración de la enzima mutante de htCBS pegilada. Además de un cambio en los niveles de metabolitos, puede predecirse que otro efecto positivo de la administración de mutante de htCBS tendrá un impacto significativo en la hepatopatía y la supervivencia de los pacientes con CBSDH afectados.
htCBS PEGILADA PARA SU USO EN TERAPIA
Existen tres grupos de mutaciones patógenas asociadas a CBSDH, (1) mutaciones sensibles a piridoxina, (2) mutantes de CBS C-terminales y (3) homocistinuria clásica.
La enzima mutante de htCBS puede pegilarse mediante un método conocido en la técnica o descrito en el presente documento. El polipéptido mutante de htCBS está pegilado con ME-200GS. Por ejemplo, el conjugado de polipéptido mutante de htCBS con PEG es un conjugado 20n Hs PEG-htCBS C15S.
En una realización, pueden tratarse sujetos con mutaciones sensibles a piridoxina. El mutante de htCBS pegilado puede usarse solo o en combinación con las terapias actuales (por ejemplo, vitamina B6 o betaína) para tratar a sujetos con mutaciones sensibles a piridoxina. Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para mitigar o reducir acontecimientos patológicos en sujetos con mutaciones sensibles a piridoxina. Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para tratar a un sujeto con mutaciones sensibles a piridoxina que responde parcialmente a la terapia con vitamina Be. Como otro ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para tratar a un sujeto con mutaciones sensibles a piridoxina que no responde a la terapia con vitamina Be.
En una realización, pueden tratarse sujetos con mutaciones de CBS C-terminales. El mutante de htCBS pegilado puede usarse solo o en combinación con las terapias actuales (por ejemplo, vitamina Be o betaína) para tratar a sujetos con mutaciones de CBS C-terminales. Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para reducir los niveles de Hcy en suero en sujetos con mutaciones de CBS C-terminales. Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para tratar a un sujeto con mutaciones de CBS C-terminales que responde parcialmente a la terapia con vitamina Be. Como otro ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para tratar a un sujeto con mutaciones de CBS C-terminales que no responde a la terapia con vitamina Be.
En una realización, pueden tratarse sujetos con homocistinuria clásica. El mutante de htCBS pegilado puede usarse solo o en combinación con las terapias actuales (por ejemplo, vitamina Be o betaína) para tratar a sujetos con homocistinuria clásica. Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para reducir los niveles de Hcy en suero en sujetos con homocistinuria clásica. Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para tratar a un sujeto con homocistinuria clásica que responde parcialmente a la terapia con vitamina Be. Como otro ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para tratar a un sujeto con homocistinuria clásica que no responde a la terapia con vitamina Be.
En una realización, las composiciones descritas en el presente documento pueden reducir un síntoma, una enfermedad o un trastorno asociado a CBSDH. El síntoma, la enfermedad o el trastorno puede estar en aparatos y sistemas o ser un cambio fenotípico grave. Los ejemplos no limitativos de enfermedades, trastornos y/o estados a partir de la CBSDH incluyen retraso mental, trastornos psiquiátricos, problemas del sistema nervioso central incluyendo convulsiones, enfermedades cardiovasculares con predisposición a complicaciones tromboembólicas que dan como resultado una alta tasa de mortalidad en individuos no tratados y parcialmente tratados, y una variedad de trastornos del tejido conjuntivo que afectan al sistema visual (por ejemplo, miopía progresiva y luxación del cristalino, ectopia del cristalino) al y sistema esquelético (por ejemplo, hábito marfanoide, osteoporosis, escoliosis, pelo rubio fino y piel fina y quebradiza).
En una realización, las composiciones descritas en el presente documento pueden tratar una enfermedad, un trastorno y/o un estado tal como, pero sin limitarse a, tromboembolia, problemas del tejido conjuntivo tales como luxación del cristalino, características marfanoides, osteoporosis y deterioro cognitivo.
En una realización, la enzima mutante de htCBS pegilada descrita en el presente documento puede reducir los efectos y/o tratar la hepatopatía. La hepatopatía puede estar en un sujeto con CBSDH. Por tanto, el tratamiento y/o la reducción de los efectos de la hepatopatía pueden aumentar la tasa de supervivencia de los pacientes con CBSDH. Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede reducir el daño al parénquima hepático.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede aumentar la cistationina y tratar o reducir los efectos de la hepatopatía o lesión hepática.
En una realización, las composiciones pueden mejorar las manifestaciones de la enfermedad y las anomalías metabólicas que caracterizan a la homocistinuria. En algunas realizaciones, la enzima mutante de htCBS pegilada modula los metabolitos tóxicos durante al menos 24 horas, al menos 48 horas o al menos 72 horas. En realizaciones adicionales, la enzima mutante de htCBS pegilada mejora las manifestaciones de la enfermedad durante al menos 3 meses, 6 meses, 12 meses o 24 meses.
En una realización, la TRE que usa la enzima mutante de htCBS pegilada ofrece una terapia eficaz para los pacientes con CBSDH para permitir la prevención y el tratamiento y/o la mejora de los síntomas de la homocistinuria y aliviar la necesidad de mantener una dieta tan estricta que excluye proteínas. Alternativamente, a un sujeto se le administra htCBS C15S pegilada, y el sujeto sigue una dieta que excluye proteínas o restringida en Met.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para aumentar la cistationina y tratar o reducir los efectos del retraso mental en sujetos con homocistinuria. La cantidad de cistationina puede aumentarse en una región o zona del cerebro tal como, pero sin limitarse a, la sustancia gris y la sustancia blanca de los lóbulos occipitales.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para aumentar la sensibilidad de los tejidos nerviosos en el cerebro de sujetos con homocistinuria. La cantidad de cistationina puede aumentarse en una región o zona del cerebro tal como, pero sin limitarse a, la sustancia gris y la sustancia blanca de los lóbulos occipitales.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede usarse para prolongar la vida de un sujeto con CBSDH.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado se usa como parte de la terapia de reposición enzimática (TRE) de CBS para el tratamiento de la homocistinuria. La administración de mutante de htCBS pegilado puede no requerir la introducción de la enzima deficiente en su compartimento intracelular natural.
En una realización, la administración de mutante de htCBS pegilado disminuye los niveles de homocisteína en un 5%, un 10%, un 15%, un 20%, un 25%, un 30%, un 33%, un 35%, un 40%, un 45%, un 50%, un 52%, un 55%, un 60%, un 65%, un 67%, un 69%, un 70%, un 74%, un 75%, un 76%, un 77%, un 80%, un 85%, un 90%, un 95% o más de un 95%. Como ejemplo no limitativo, la disminución de homocisteína puede ser una disminución de aproximadamente el 69%. Como ejemplo no limitativo, la disminución de homocisteína puede ser una disminución de aproximadamente el 67%. Como ejemplo no limitativo, la disminución de homocisteína puede ser una disminución de aproximadamente el 52%. Como ejemplo no limitativo, la disminución de homocisteína puede ser una disminución de aproximadamente el 33%.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse antes, después o de manera concomitante al tratamiento tradicional con betaína. La terapia de combinación puede dar como resultado efectos sinérgicos sobre los niveles de homocisteína.
En una realización, la administración de mutante de htCBS pegilado a un sujeto puede alterar el equilibrio extracelular e intracelular de los aminoácidos azufrados.
En una realización, la alteración del equilibrio extracelular e intracelular puede ser una disminución de la homocisteína en plasma tal como, pero sin limitarse a, una disminución de aproximadamente el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 33%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 52%, el 55%, el 60%, el 65%, el 67%, el 69%, el 70%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o más del 95%. Como ejemplo no limitativo, la disminución de homocisteína en plasma puede ser una disminución de aproximadamente el 75%.
En una realización, la alteración del equilibrio extracelular e intracelular puede ser un aumento de la cistationina tal como, pero sin limitarse a, un aumento de aproximadamente el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 100%, el 110%, el 1120%, el 130%, el 140%, el 150%, el 160%, el 170%, el 180%, el 190%, el 200%, el 210%, el 220%, el 230%, el 240%, el 250%, el 260%, el 270%, el 280%, el 290%, el 300%, el 310%, el 320%, el 330%, el 340%, el 350%, el 360%, el 370%, el 380%, el 390%, el 400%, el 410%, el 420%, el 430%, el 440%, el 450%, el 460%, el 470%, el 480%, el 490%, el 500%, el 510%, el 520%, el 530%, el 540%, el 550%, el 560%, el 570%, el 580%, el 590%, el 600%, el 610%, el 620%, el 630%, el 640%, el 650%, el 660%, el 670%, el 680%, el 690%, el 700%, el 710%, el 720%, el 730%, el 740%, el 750%, el 760%, el 770%, el 780%, el 790%, el 800%, el 810%, el 820%, el 830%, el 840%, el 850%, el 860%, el 870%, el 880%, el 890%, el 900%, el 910%, el 920%, el 930%, el 940%, el 950%, el 960%, el 970%, el 980%, el 990%, el 1000% o más del 1000%. Como ejemplo no limitativo, el aumento de cistationina puede ser de aproximadamente el 900%.
En una realización, la alteración del equilibrio extracelular e intracelular puede ser la normalización de las concentraciones de cisteína que se refleja en la mejora de los cambios histopatológicos en el hígado y en el aumento de la supervivencia.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede reducir los niveles de tHcy en un sujeto con CBSDH. Los niveles de tHcy pueden reducirse hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 1-5, 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 2-5, 2-10, 2-20, 2-30, 2-40, 2-50, 3-5, 3-10, 3-20, 3-30, 3-40, 3-50, 4-6, 4-10, 4-20, 4- 30, 4-40, 4-50, 5-7, 5-10, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 6-8, 6-10, 6-20, 6-30, 6-40, 6-50, 7-10, 7-20, 7-30, 7-40, 7-50, 8-10, 8-20, 8-30, 8-40, 8-50, 9-10, 9-20, 9-30, 9-40, 9-50, 10-20, 10-30, 10-40, 10-50, 20-30, 20-40, 20-50, 30-40, 30-50 ó 40-50 veces el nivel de tipo natural. Como ejemplo no limitativo, el nivel de tHcy se reduce hasta aproximadamente 30 veces el nivel de tipo natural. Como ejemplo no limitativo, el nivel de tHcy se reduce hasta aproximadamente 3-5 veces el nivel de tipo natural.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede reducir los niveles de tHcy y, por tanto, tratar o reducir los efectos de enfermedades, trastornos y/o estados asociados con niveles altos de tHcy (por ejemplo, superior a 54 veces el nivel de tipo natural). Los ejemplos no limitativos de enfermedades, trastornos y/o estados asociados con niveles altos de tHcy incluyen alopecia facial, osteoporosis, luxación del cristalino y reducción de la supervivencia media.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado descrito en el presente documento puede normalizar los niveles de cisteína sin complementación con cisteína.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado descrito en el presente documento puede usarse en combinación con betaína para reducir las concentraciones de homocisteína en un sujeto. La homocisteína puede reducirse aproximadamente un 5%, un 10%, un 15%, un 20%, un 25%, un 30%, un 33%, un 35%, un 40%, un 45%, un 50%, un 52%, un 55%, un 60%, un 65%, un 67%, un 69%, un 70%, un 74%, un 75%, un 76%, un 77%, un 80%, un 85%, un 90%, un 95% o más de un 95% en un sujeto usando la terapia de combinación. Como ejemplo no limitativo, la homocisteína puede reducirse un 77%. Como ejemplo no limitativo, la homocisteína puede reducirse un 76%. Como ejemplo no limitativo, la homocisteína puede reducirse un 74%. Como ejemplo no limitativo, la homocisteína puede reducirse un 40%.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado descrito en el presente documento puede provocar un cambio tal como un aumento y/o una disminución de los niveles de metabolitos.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado descrito en el presente documento puede provocar un cambio tal como un aumento de los niveles de metabolitos. Como ejemplo no limitativo, el metabolito puede ser cistationina y cisteína, que pueden aumentarse en un 5%, un 10%, un 15%, un 20%, un 25%, un 30%, un 33%, un 35%, un 40%, un 45%, un 50%, un 52%, un 55%, un 60%, un 65%, un 67%, un 69%, un 70%, un 74%, un 75%, un 76%, un 77%, un 80%, un 85%, un 90%, un 95%, un 100%, un 110%, un 1120%, un 130%, un 140%, un 150%, un 160%, un 170%, un 180%, un 190%, un 200%, un 210%, un 220%, un 230%, un 240%, un 250%, un 260%, un 270%, un 280%, un 290%, un 300%, un 310%, un 320%, un 330%, un 340%, un 350%, un 360%, un 370%, un 380%, un 390%, un 400%, un 410%, un 420%, un 430%, un 440%, un 450%, un 460%, un 470%, un 480%, un 490%, un 500%, un 510%, un 520%, un 530%, un 540%, un 550%, un 560%, un 570%, un 580%, un 590%, un 600%, un 610%, un 620%, un 630%, un 640%, un 650%, un 660%, un 670%, un 680%, un 690%, un 700%, un 710%, un 720%, un 730%, un 740%, un 750%, un 760%, un 770%, un 780%, un 790%, un 800%, un 810%, un 820%, un 830%, un 840%, un 850%, un 860%, un 870%, un 880%, un 890%, un 900%, un 910%, un 920%, un 930%, un 940%, un 950%, un 960%, un 970%, un 980%, un 990%, un 1000% o más de un 1000%. Como ejemplo no limitativo, la cantidad de cistationina puede aumentarse hasta por encima de 0,008, 0,01, 0,015, 0,020, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3 ó 0,35 |im o la cistationina puede aumentarse hasta entre 0,05 y 0,35 |iM. Como otro ejemplo no limitativo, la cantidad de cisteína puede aumentarse hasta por encima de 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400 o la cisteína puede aumentarse hasta entre 200 |iM y 400 |iM.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado descrito en el presente documento puede provocar un cambio tal como una disminución de los niveles de metabolitos. Como ejemplo no limitativo, el metabolito puede ser homocisteína, metionina y S-adenosil homocisteína, que pueden disminuir en un 5%, un 10%, un 15%, un 20%, un 25%, un 30%, un 33%, un 35%, un 40%, un 45%, un 50%, un 52%, un 55%, un 60%, un 65%, un 67%, un 69%, un 70%, un 74%, un 75%, un 76%, un 77%, un 80%, un 85%, un 90%, un 95%, un 99% o un 100%. Como ejemplo no limitativo, la cantidad de homocisteína puede reducirse hasta aproximadamente 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ó 1 |iM. Como ejemplo no limitativo, la cantidad de metionina puede reducirse hasta aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ó 1 |iM. Como otro ejemplo no limitativo, la cantidad de S-adenosil homocisteína se reduce hasta aproximadamente 0,15, 0,14, 0,13, 0,12, 0,11, 0,10, 0,095, 0,09, 0,085, 0,08, 0,075, 0,07, 0,065, 0,06, 0,055, 0,05, 0,045, 0,04, 0,035, 0,03, 0,025, 0,02, 0,015, 0,01, 0,009, 0,008, 0,007, 0,006, 0,005, 0,004, 0,003, 0,002, 0,001 o menos de 0,001 |iM.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado descrito en el presente documento puede reducir los niveles de homocisteína, metionina, S-adenosil-metionina y S-adenosil-homocisteína en un sujeto.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede aumentar los niveles de cisteína y cistationina en un sujeto.
El mutante de htCBS puede producirse usando un método para producir de manera recombinante y purificar una cistationina sintasa humana. El método incluye la etapa de clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima CBS humana o una variante truncada o mutada de la misma en un vector de expresión. Como ejemplo no limitativo, el método puede ser tal como se expone en la publicación internacional WO2014120770.
ADMINISTRACIÓN Y DOSIFICACIÓN
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse a un sujeto mediante administración parenteral.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse a un sujeto mediante inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.). Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse a un sujeto mediante administración subcutánea. Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse a un sujeto mediante administración intravenosa. Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse a un sujeto mediante administración intraperitoneal. Como ejemplo no limitativo, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse a un sujeto mediante una bomba osmótica.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse a un sujeto al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de 20 veces.
En una realización, la administración de mutante de htCBS pegilado puede repetirse cada minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 35 minutos, 40 minutos, 45 minutos, 50 minutos, 55 minutos, cada hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, cada día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, cada semana, 2 semanas, 3 semanas, cada mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses o 18 meses.
En una realización, la administración de mutante de htCBS pegilado puede ser una serie de dosis con un intervalo de minutos, horas, días o semanas. El número de dosis en una serie puede ser de 2, 3, 4, 5 ó 6. Como ejemplo no limitativo, a un sujeto se le administran 3 dosis con un intervalo de 24 horas. Como otro ejemplo no limitativo, a un sujeto se le administran 5 dosis con un intervalo de 12 horas.
En una realización, la administración de mutante de htCBS pegilado puede seguir una pauta posológica de una serie de dosis que tiene un intervalo entre la primera serie y la segunda serie de dosis. El intervalo entre las dosis puede ser de 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses o 18 meses. El número de dosis en una serie puede ser de 2, 3, 4, 5 ó 6. Como ejemplo no limitativo, a un sujeto puede administrársele una primera serie de 5 dosis con un intervalo de 12 horas y luego, 14 días después de la primera dosis, se le administra una segunda serie de 5 dosis con un intervalo de 12 horas. Como otro ejemplo no limitativo, a un sujeto se le administran dos series de dosis durante un periodo de 8 semanas, donde la primera serie es una dosis dos veces a la semana durante dos semanas y la segunda serie de dosis es tres veces a la semana durante 6 semanas.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse al menos una vez después de que a un sujeto se le haya administrado betaína. El tiempo entre la administración de betaína y la htCBS pegilada puede ser de 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses o 18 meses. Como ejemplo no limitativo, la htCBS pegilada puede administrarse 14 días después de que al sujeto se le haya administrado betaína. Como otro ejemplo no limitativo, a un sujeto pueden administrársele dos dosis después de que se le haya administrado betaína. El mutante de htCBS pegilado puede administrarse 14 y 15 días después de la administración de betaína.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse en combinación con betaína a un sujeto. La combinación puede administrarse al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más de 15 veces.
En una realización, el mutante de htCBS pegilado puede administrarse en combinación con betaína a un sujeto después de que el sujeto haya recibido inicialmente betaína. El tiempo entre el tratamiento combinado y la administración original de betaína puede ser de 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, o 18 meses. Como ejemplo no limitativo, la combinación puede administrarse 14 días después de que se haya administrado betaína por primera vez al sujeto. Como otro ejemplo no limitativo, a un sujeto pueden administrársele dos dosis después de que al sujeto se le haya administrado por primera vez betaína. La combinación puede administrarse 14 y 15 días después de la administración de betaína.
En una realización, la dosis de mutante de htCBS pegilado administrada a un sujeto puede estar entre 5 y 8 mg/kg, tal como 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 7,5 mg/kg u 8 mg/kg. En determinadas realizaciones, la dosis se selecciona del intervalo de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 24 mg/kg. Por ejemplo, la dosis es de aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 24 mg/kg. En determinadas realizaciones, la dosis se selecciona del intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg. Por ejemplo, la dosis es de aproximadamente 0,4 mg/kg. En determinadas realizaciones, el polipéptido mutante de htCBS pegilado se administra a un sujeto que sigue una dieta restringida en metionina. Alternativamente, el polipéptido mutante de htCBS pegilado se administra a un sujeto que no sigue una dieta restringida en metionina.
En una realización, el polipéptido mutante de htCBS pegilado puede coadministrarse con otro agente terapéuti tratar la CBSDH. Tal como se usa en el presente documento, “coadministrado” significa la administración de dos o más componentes. Estos componentes para la coadministración incluyen, pero no se limitan a, betaína o vitamina Be. La coadministración se refiere a la administración de dos o más componentes simultáneamente o con un lapso de tiempo entre la administración tal como 1 segundo, 5 segundos, l0 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 11 minutos, 12 minutos, 13 minutos, 14 minutos, 15 minutos, 16 minutos, 17 minutos, 18 minutos, 19 minutos, 20 minutos, 21 minutos, 22 minutos, 23 minutos, 24 minutos, 25 minutos, 26 minutos, 27 minutos, 28 minutos, 29 minutos, 30 minutos, 31 minutos, 32 minutos, 33 minutos, 34 minutos, 35 minutos, 36 minutos, 37 minutos, 38 minutos, 39 minutos, 40 minutos, 41 minutos, 42 minutos, 43 minutos, 44 minutos, 45 minutos, 46 minutos, 47 minutos, 48 minutos, 49 minutos, 50 minutos, 51 minutos, 52 minutos, 53 minutos, 54 minutos, 55 minutos, 56 minutos, 57 minutos, 58 minutos, 59 minutos, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 1 día, 1,5 días, 2 días o más de 3 días.
DEFINICIONES
Tal como se usa en esta memoria descriptiva, las formas en singular “un/o”, “una” y “el/la” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un “polímero” incluye un único polímero así como dos o más polímeros iguales o diferentes, la referencia a un “excipiente” incluye un único excipiente así como dos o más excipientes iguales o diferentes, y similares.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se pretende que cada valor intermedio entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido se incluya en la divulgación y se divulgue específicamente. Por ejemplo, si se establece un intervalo de 1 |im a 8 |im, se pretende que también se divulguen explícitamente 2 |im, 3 |im, 4 |im, 5 |im, 6 |im y 7 |im, así como el intervalo de valores mayor o igual a 1 |im y el intervalo de valores menor o igual a 8 |im.
“Secuencia codificante” se refiere a esa porción de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen) que codifica para (i) un ARNm que se traduce en una secuencia de aminoácidos de una proteína; o (ii) un ARN funcional, tal como un ARN de interferencia, o una molécula antisentido.
“Recombinante”, cuando se usa con referencia a, por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, un polipéptido, un casete de expresión o un vector, se refiere a un material, o a un material correspondiente a la forma natural o nativa del material, que se ha modificado mediante la introducción de un nuevo resto o alteración de un resto existente, o es idéntico al mismo pero producido o derivado de materiales sintéticos. Por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula (por ejemplo, “ácidos nucleicos exógenos”) o expresan genes nativos que de otro modo se expresan a un nivel diferente, normalmente, subexpresados o no expresados en absoluto.
Las técnicas recombinantes pueden incluir, por ejemplo, el uso de un ácido nucleico recombinante tal como un ADNc que codifica para una proteína o una secuencia antisentido, para la inserción en un sistema de expresión, tal como un vector de expresión; el constructo resultante se introduce en una célula y la célula expresa el ácido nucleico, y la proteína, si es apropiado. Las técnicas recombinantes también abarcan la unión de ácidos nucleicos a secuencias codificantes o promotoras de diferentes fuentes en un vector o casete de expresión para la expresión de una proteína de fusión, la expresión constitutiva de una proteína o la expresión inducible de una proteína.
Los términos “sujeto”, “individuo” o “paciente” se usan en el presente documento de manera intercambiable y se refieren a un humano.
“Asociado” se refiere a la coincidencia con el desarrollo o la manifestación de una enfermedad, un estado o un fenotipo. La asociación puede deberse a, pero no se limita a, genes responsables de las funciones de mantenimiento cuya alteración puede proporcionar la base para una variedad de enfermedades y estados, aquellos que forman parte de una ruta que está implicada en una enfermedad, un estado o un fenotipo específico y aquellos que contribuyen indirectamente a la manifestación de una enfermedad, un estado o un fenotipo.
“Condiciones fisiológicas” o “disolución fisiológica” se refiere a un entorno acuoso que tiene una fuerza iónica, un pH y una temperatura sustancialmente similares a las condiciones en una célula de mamífero intacta o en un espacio tisular u órgano de un mamífero vivo. Normalmente, las condiciones fisiológicas comprenden una disolución acuosa que tiene NaCl aproximadamente 150 mM, pH 6,5-7,6 y una temperatura de aproximadamente 22-37°C. Generalmente, las condiciones fisiológicas son condiciones de unión adecuadas para la asociación intermolecular de macromoléculas biológicas. Por ejemplo, las condiciones fisiológicas de NaCl 150 mM, pH 7,4, a 37°C son generalmente adecuadas.
“Excipiente o portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un excipiente que puede incluirse opcionalmente en las composiciones de la invención y que no provoca efectos toxicológicos adversos significativos para el paciente. En particular, en el presente caso, se refiere a un excipiente que puede incorporarse al cuerpo del sujeto en asociación con un compuesto activo (en este caso, htCBS pegilada) sin efectos toxicológicos adversos significativos para el sujeto.
El término “excipiente” o “vehículo”, tal como se usa en el presente documento, significa cualquier sustancia, que no es en sí misma un agente terapéutico, usada como portador para la administración de un agente terapéutico y adecuada para la administración a un sujeto, por ejemplo, un mamífero, o añadida a una composición farmacéutica para mejorar sus propiedades de manipulación o almacenamiento o para permitir o facilitar la formación de una dosis unitaria de la composición en un artículo discreto tal como una cápsula o un comprimido adecuado para la administración oral. Los excipientes y vehículos incluyen cualquiera de tales materiales conocidos en la técnica, por ejemplo, cualquier líquido, gel, disolvente, diluyente líquido, solubilizador o similar, que no sea tóxico y que no interaccione con otros componentes de la composición de manera perjudicial. La administración puede significar administración oral, inhalación, administración entérica, alimentación o inoculación mediante inyección intravenosa. Los excipientes pueden incluir excipientes farmacéuticos convencionales y también pueden incluir cualquier componente que pueda usarse para preparar alimentos y bebidas para consumo humano y/o animal, formulaciones de piensos o cebos u otros productos alimenticios.
“Permeante”, “fármaco” o “agente farmacológicamente activo”, o cualquier otro término similar, significa cualquier material o compuesto químico o biológico, incluyendo péptidos, adecuado para la administración mediante los métodos previamente conocidos en la técnica y/o mediante los métodos enseñados en la presente divulgación, que induce un efecto biológico o farmacológico deseado, que puede incluir, pero no se limita a ( i) tener un efecto profiláctico sobre el organismo y prevenir un efecto biológico no deseado tal como prevenir una infección, (2) aliviar un estado provocado por una enfermedad, por ejemplo, aliviar el dolor o la inflamación provocados como resultado de la enfermedad, y/o (3) aliviar, reducir o eliminar completamente la enfermedad del organismo. El efecto puede ser local, tal como proporcionar un efecto anestésico local, o puede ser sistémico. Esta divulgación no se refiere a nuevos permeantes ni a nuevas clases de agentes activos. Más bien, se limita al modo de administración de agentes o permeantes que existen en el estado de la técnica o que pueden establecerse posteriormente como agentes activos y que son adecuados para su administración según la presente divulgación.
Se pretende que el término “aproximadamente”, particularmente en referencia a una cantidad dada, abarque desviaciones de más o menos el cinco por ciento.
“Opcional” u “opcionalmente” significa que la circunstancia descrita posteriormente puede producirse o estar presente, o no, de modo que la descripción incluye casos en los que la circunstancia está presente o se produce y casos en los que no está presente o no se produce.
“Sustancialmente ausente” o “sustancialmente libre” de una determinada característica o entidad significa que la característica o entidad está casi total o completamente ausente. Por ejemplo, para un sujeto al que se le administró htCBS pegilada, la ausencia sustancial de un efecto secundario observable significa que dicho efecto secundario no es detectable o se produce sólo en un grado insignificante, por ejemplo, en un grado o una frecuencia que se reduce en aproximadamente un 50% o más en comparación con la frecuencia o intensidad del mismo efecto secundario observado en un paciente no tratado.
Los términos “cantidad farmacológicamente eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” en relación con la presente composición se refieren a una cantidad no tóxica pero suficiente del agente activo (o la composición que contiene el agente activo) para proporcionar el nivel deseado en el torrente sanguíneo o en el sitio de acción (por ejemplo, intracelularmente) en el sujeto que va a tratarse, y/o para proporcionar una respuesta fisiológica, biofísica, bioquímica, farmacológica o terapéutica deseada, tal como la mejora de las manifestaciones de homocistinuria. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro y dependerá de numerosos factores, tales como el agente activo, la actividad de la composición, el dispositivo de administración empleado, las características físicas de la composición, el uso previsto por el paciente (es decir, el número de dosis administradas al día), así como las consideraciones del paciente, tales como la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad del estado que está tratándose, los medicamentos adicionales que toma el sujeto, el modo de administración, y similares. Estos factores y consideraciones puede determinarlos fácilmente un experto en la técnica, basándose en la información proporcionada en el presente documento. Una cantidad “eficaz” apropiada en cualquier caso individual puede determinarla un experto habitual en la técnica usando experimentación de rutina, basándose en la información proporcionada en el presente documento.
El término “actividad biológica” se refiere a cualquier actividad biológica normalmente atribuida a un ácido nucleico o a una proteína por parte de los expertos en la técnica. Ejemplos de actividades biológicas son la actividad enzimática, la capacidad de dimerizar, plegar o unir otra proteína o molécula de ácido nucleico, etc.
El término “ácido nucleico” puede estar en forma de ARN o en forma de ADN e incluir ARN mensajero, ARN y ADN sintéticos, ADNc y ADN genómico. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido, complementaria).
Tal como se usa en el presente documento, una “variante” es un ácido nucleico, una proteína o un polipéptido que no es idéntico a, pero tiene una homología significativa (por ejemplo, una identidad de secuencia del 80%, del 85%, del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98% o del 99%) con toda la longitud de la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de tipo natural, tal como se muestra a modo de ejemplo mediante secuencias en las bases de datos de secuencias públicas, tales como GenBank. Tal como se usa en el presente documento, “proteína, polipéptido o fragmento peptídico de los mismos” significa la proteína de longitud completa o una porción de la misma que tiene una secuencia de aminoácidos normalmente de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos de longitud, aunque la presente divulgación también contempla y abarca dipéptidos, tripéptidos y tetrapéptidos.
Tal como se usa en el presente documento, un “mutante” es una proteína mutada diseñada o modificada por ingeniería para alterar propiedades o funciones relacionadas con la glicosilación, la estabilización de proteínas y/o la unión de ligandos.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “nativo” o “de tipo natural” en relación con una célula, un polipéptido, un ácido nucleico, un rasgo o un fenotipo dado, se refiere a la forma en la que se encuentra normalmente en la naturaleza.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “proteína”, “polipéptido”, “oligopéptido” y “péptido” tienen su significado convencional y se usan de manera intercambiable para indicar un polímero de al menos dos aminoácidos unidos covalentemente por un enlace amida, independientemente de la longitud o modificación posterior a la traducción (por ejemplo, glicosilación, fosforilación, lipidación, miristilación, ubicuitinación, etc). Además, los polipéptidos descritos en el presente documento no se limitan a una longitud específica. Incluidos dentro de esta definición están los D- y L-aminoácidos, y las mezclas de D- y L-aminoácidos. Este término tampoco se refiere ni excluye modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto naturales como no naturales. Un polipéptido puede ser una proteína completa o una subsecuencia de la misma. Los polipéptidos también pueden referirse a subsecuencias de aminoácidos que comprenden epítopos, es decir, determinantes antigénicos sustancialmente responsables de las propiedades inmunogénicas de un polipéptido y que son capaces de provocar una respuesta inmunitaria.
“Posición correspondiente a” se refiere a una posición de interés (es decir, número de base o número de residuo) en una molécula de ácido nucleico o proteína en relación con la posición en otra molécula de ácido nucleico o proteína de referencia. Las posiciones correspondientes pueden determinarse comparando y alineando secuencias para maximizar el número de nucleótidos o residuos coincidentes, por ejemplo, de modo que la identidad entre las secuencias sea superior al 90%, superior al 95%, superior al 96%, superior al 97%, superior al 98% o superior al 99%. Luego, a la posición de interés se le da el número asignado en la molécula de ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, si un polimorfismo particular en el gen X se produce en el nucleótido 2073 de SEQ ID NO: X, para identificar el nucleótido correspondiente en otro alelo o aislado, se alinean las secuencias y luego se identifica la posición que se alinea con 2073. Dado que diversos alelos pueden tener diferentes longitudes, la posición que designa a 2073 puede no ser el nucleótido 2073, sino que está en una posición que “corresponde” a la posición en la secuencia de referencia.
“Porcentaje de identidad de secuencia” y “porcentaje de homología” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a comparaciones entre polinucleótidos y polipéptidos, y se determinan comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en la que la porción de la secuencia de polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje puede calcularse determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Alternativamente, el porcentaje puede calcularse determinando el número de posiciones en las que se encuentra la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias, o se alinea una base de ácido nucleico o un residuo de aminoácido con un hueco para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Los expertos en la técnica aprecian que hay muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias. Puede realizarse una alineación óptima de las secuencias para la comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software GCG Wisconsin), o mediante inspección visual (véase, en general, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelet al.,eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplemento de 1995) (Ausubel)). Ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschulet al.(1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410 y Altschulet al.(1977) Nucleic Acids Res. 3389-3402, respectivamente. El software para realizar el análisis con BLAST está disponible de manera pública a través del sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencias de puntuación alta (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que o bien coinciden o bien satisfacen alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de palabras próximas (Altschulet al.citado anteriormente). Estos aciertos iniciales de palabras próximas actúan como “semillas” para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que los contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde puede aumentarse la puntuación de alineación acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada disminuye en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
Si bien todos los algoritmos y programas mencionados anteriormente son adecuados para la determinación del alineamiento de secuencias y del % de identidad de secuencia, para los fines de la divulgación en el presente documento, la determinación del % de identidad de secuencia normalmente se realizará usando los programas BESTFIT o GAP en el paquete de software GCG Wisconsin (Accelrys, Madison WI), usando los parámetros por defecto proporcionados.
El término “modificaciones del extremo NH2-terminal” puede usarse para referirse a los péptidos descritos en el presente documento. El extremo terminal de los compuestos peptídicos de la invención correspondiente al extremo amino-terminal, si está presente, puede estar en forma “libre” (por ejemplo, H2N-), o alternativamente puede estar acilado con un grupo de fórmula R2C(O)- o R2S(O)2-, en las que R2 es tal como se definió anteriormente. En una realización, R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroarilo de 5-10 miembros o heteroarilalquilo de 6-16 miembros.
En otra realización, el extremo amino-terminal puede “bloquearse” con un grupo bloqueante diseñado para impartir al compuesto propiedades específicas, tales como una baja antigenicidad. Los ejemplos no limitativos de tales grupos bloqueantes incluyen polímeros de poli(óxido de alquileno) tales como polietilenglicol (PEG). Se conocen en la técnica una variedad de polímeros útiles para impartir a los compuestos, y en particular péptidos y proteínas, propiedades específicas, ya que son químicas adecuadas para unir tales polímeros a los compuestos. Pueden encontrarse ejemplos específicos no limitativos en las patentes estadounidenses n.os 5.643.575; 5.730.990; 5.902.588; 5.919.455; 6.113.906; 6.153.655; y 6.177.087.
El término “modificaciones del extremo carboxilo-terminal” puede usarse en relación con los péptidos descritos en el presente documento. El extremo terminal de los compuestos peptídicos correspondiente al extremo C-terminal, si está presente, puede estar en forma de un grupo carboxilo no derivatizado, o bien como ácido libre o bien como sal, tal como una sal de sodio, potasio, calcio, magnesio u otra sal de un ion inorgánico u orgánico, o puede estar en forma de un carboxilo derivatizado, tal como un éster, un tioéster o una amida. Tales formas derivatizadas de los compuestos pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto que tiene un extremo carboxilo-terminal con un alcohol, un tiol o una amina apropiados. Los alcoholes, los tioles o las aminas adecuados incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, alcoholes de fórmula R2OH, tioles de fórmula R2SH y aminas de fórmula R2NH2, R2R2NH o NH3, en las que cada R2 es, independientemente de los demás, tal como se definió anteriormente.
El término “aminoácidos en forma L o D” puede usarse en relación con el péptido descrito en el presente documento. Tal como reconocerán los expertos en la técnica, los diversos residuos X” que comprenden los compuestos de la invención pueden estar o bien en la configuración L o bien en la configuración D con respecto a sus carbonos Ca. En una realización, todos los carbonosCade un compuesto particular están en la misma configuración. En algunas realizaciones de la invención, los compuestos comprenden quiralidades específicas sobre uno o más carbonosCay/o incluyen enlaces no peptídicos en ubicaciones específicas para impartir al compuesto propiedades específicas. Por ejemplo, se sabe bien que los péptidos que se componen en su totalidad o en parte de D-aminoácidos son más resistentes a las proteasas que sus equivalentes de L-péptidos correspondientes. Por tanto, en una realización, los compuestos son péptidos que se componen total o parcialmente de D-aminoácidos. Alternativamente, los compuestos que tienen buena estabilidad frente a las proteasas pueden incluir análogos peptídicos que incluyen enlaces peptídicos de polaridad inversa en posiciones específicas. Por ejemplo, los compuestos que tienen estabilidad frente a las proteasas de tipo tríptico incluyen análogos peptídicos que tienen enlaces peptídicos de polaridad inversa antes de cada residuo L-Arg o L-Lys; los compuestos que tienen estabilidad frente a las proteasas de tipo quimotripsina incluyen análogos peptídicos que tienen enlaces peptídicos de polaridad inversa antes de cada L-residuo alifático o L-residuo no polar de tamaño pequeño o medio. En otra realización, los compuestos que tienen estabilidad frente a las proteasas incluyen análogos peptídicos que se componen totalmente de enlaces peptídicos de polaridad inversa. Otras realizaciones que tienen estabilidad frente a las proteasas resultarán evidentes para los expertos en la técnica. En el presente documento se describen realizaciones especificas adicionales de los compuestos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “administración a largo plazo” se refiere a la administración del mutante de htCBS conjugado con un resto de PEG durante un periodo de tiempo de 6 semanas o más.
Tal como se usa en el presente documento, el término “administración continua” se refiere a la administración repetida del mutante de htCBS conjugado con un resto de PEG durante el transcurso de un estudio mediante inyección s.c. o una bomba osmótica implantada.
Tal como se usa en el presente documento, el término ratones “I278T”, “homocigóticos I278T” u “homocigóticos I278T -/-” se refiere a un modelo de ratón en el que el gencbsde ratón endógeno se ha inactivado y se ha insertado un transgén de CBS humana que tiene la mutación más común en el alelo de CBS, 833T>C (I278T), que está asociada a la homocistinuria, tal como un clon de ADNc bajo el control del promotor inducible por zinc en un plásmido integrado en el genoma de ratón.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos son de naturaleza ilustrativa y de ningún modo pretenden ser limitativos.
Ejemplo 1. Procedimientos experimentales
A. Construcción de CBS humana truncada y de secuencia optimizada en el vector PET29A(+)
Tal como se describió previamente en la publicación internacional n.° WO2014120770, se optimizó la secuencia codificante de CBS humana de longitud completa (551 aa) para la expresión bacteriana y se clonó en el vector pUC57 después de la digestión con la enzima de restricción EcoRV, por GenScript USA Inc (NJ, EE.UU.). Luego se amplificó la secuencia de CBS mediante PCR usando los cebadores A1 y A2 para generar una secuencia que codifica para la enzima truncada (aa 1-413). Luego se digirió el producto de PCR con las enzimas de restricción Ncol y Xhol y se ligó al vector pET-28a(+) que se digirió con las mismas enzimas. La clonación en el sitio Ncol óptimo de pET-28a(+) da como resultado una mutación de G a C en comparación con la secuencia de tipo natural de CBS. Se usó un kit de mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene, CA, EE.UU.) usando los cebadores B1 y B2 para regenerar la secuencia de tipo natural (htCBS). Se usó la misma estrategia para generar el mutante C15S (mutación T a A; htCBSC15) usando los cebadores C1 y C2. Se verificaron todas las secuencias mediante secuenciación. La expresión de CBS truncada está controlada por un promotor T7 aguas arriba en el vector pET-28a(+), que requiere la transformación en bacterias DE3 y la inducción por IPTG. La tabla 1 describe los cebadores y su identificador de secuencia.
Tabla 1. Cebadores
B. Expresión y purificación
Se transformó el vector pET-28a(+), que albergaba la secuencia que codifica para la CBS humana truncada, en bacterias DE3, es decir,E. coliBL-21 (DE3) o HMS174 (DE3) y se hicieron crecer bacterias de clones resistentes a kanamicina en 5 ml de medio Luria-Bertani (LB), con kanamicina 30 |ig/ml, durante la noche a 37°C en un agitador rotatorio a 275 rpm. Se añadió un ml del cultivo de la noche a 100 ml de medio Terrific Broth (TB) con kanamicina 30 ug/ml y se hizo crecer durante la noche. Luego se añadieron 10 ml a 1 litro de medio TB que contenía el 0,001% de tiamina-HCl pH 8,0, el 0,0025% de piridoxina-HCl pH 8,0, 8-ALA 0,3 mM pH 8,0, cloruro férrico 150 |iM, kanamicina 30 ug/ml. Luego se hizo crecer el cultivo a 30°C en un agitador rotatorio a 275 rpm hasta que la DO600 alcanzó el valor de ~0,6-0,7 y se indujo la expresión de proteínas mediante la adición de IPTG 1 mM. Se continuó la fermentación durante 16 horas adicionales. Se recogieron las células mediante centrifugación a RCF 6000 durante 10 minutos a 4°C, se lavó con NaCl al 0,9% helado, volvió a centrifugarse como antes y se congeló a -80°C. Luego se añadieron al sedimento celular 4,45 ml de tampón de lisis (NaH2PO420 mM, pH = 7,2, NaCl 40 mM, PLP 0,1 mM) por 1 gramo de sedimento y se homogeneizó este último en un homogeneizador Dounce y se trató con lisozima (2 mg/ml final), se incubó durante 1 hora a 4°C en una plataforma oscilante, se sometió a sonicación para reducir la viscosidad y se centrifugó a RCF 53000. A continuación, se almacenó el sobrenadante, que comprendía la fracción soluble, a -80°C. Se procesó el lisado a través de un procedimiento cromatográfico de múltiples etapas. El procedimiento principal consiste en una columna de captura de intercambio aniónico (DEAE Sepharose-FF), seguida de una columna de afinidad. Esto alcanza una pureza de aproximadamente el 90%. Se logra la pureza final de > 99% mediante el uso de una o dos etapas de cromatografía de pulido. Se sometió a diafiltración el eluato final de la columna en PBS.
C. Ensayo de actividad enzimática
Se determinó la actividad de CBS mediante un ensayo de radioisótopos con serina marcada con C14 como sustrato. Se añadieron diez |il (490 ng totales) de htCBS pura en tampón de dilución (Tris-HCl 0,1 M pH=8,6, DTT 1 mM, PLP 10 |iM, BSA 0,5 mg/ml) o 10 |il de plasma a 85 |il de mezcla de reacción que contenía Tris-HCl 0,1 M pH=8,6, L-serina 10 mM, PLP 0,5 mM, BSA 0,5 mg/ml y 0,3 |iCi (para enzima pura) o 0,45 |iCi (para plasma) de L-[C14(U)]-serina. Se incubaron las muestras durante 5 min a 37°C y se inició la reacción mediante la adición de 5 |il de Hcy 0,2 M (concentración final de 10 mM). Tras 30 min de incubación a 37°C, se aplicó una alícuota de 20 |il de la mezcla de ensayo sobre un papel Whatman CHR de calidad 3 (NJ, EE.UU.). Se escalonaron la iniciación del ensayo y la toma de muestras de la mezcla resultante de modo que cada tiempo de reacción fuera de 30 minutos. Se usó cromatografía en papel descendente para aislar el producto radiactivo (Cth) a partir de un sustrato marcado (Ser). Se separó la C14-cistationina formada en la reacción de la C14-serina mediante cromatografía en papel descendente durante la noche en 2-propanol/ácido fórm ico/^O (75:5,7:18,9 v/v). Se determinó la radiactividad en el área del marcador cistationina (detectada mediante la tinción del marcador con ninhidrina) cortando el cromatograma en tiras que se sumergieron en 5 ml de cóctel de centelleo Opti-fluor (PerkinElmer, MA, EE.UU.) y se contó en un contador de centelleo Beckman LS-3801. Se usó una muestra libre de enzimas como blanco para monitorizar la radiactividad de fondo que luego se restó de cada muestra. Para la enzima pura, se expresan los valores de actividad específica como unidades de enzima (la cantidad de enzima que produce 1 |imol de cistationina/hora) por mg de CBS, y para muestras de plasma, como unidades por |il de plasma. En los estudios farmacocinéticos (PK), esto se ha denominado: mU/|il de plasma.
D. Ensayo de actividad en gel
Se separaron muestras de proteínas usando Page nativo (Bio-Rad, CA, EE.UU.). Luego se incubó el gel durante 15 30 minutos en una disolución de tinción (Tris-HCl 100 mM pH=8, L-cisteína 20 mM, 2-mercaptoetanol 50 mM, PLP 0,1 mM y nitrato de plomo 0,2 mM). Se detuvo la reacción sumergiendo el gel en ácido acético al 7%.
E. Determinación de las concentraciones de metabolitos
Se determinaron los metabolitos homocisteína, cistationina y cisteína en plasma mediante cromatografía de líquidosespectrometría de masas de dilución de isótopos estables tal como se describió previamente en (Allenet al.,1993, Metabolism, 42: 1448-1460). Se realizaron mediciones de homocisteína total no unida a proteínas y otros aminotioles, así como de aminoácidos en tejido, tal como se describe en (Macleanet al.,2010b. Mol. Genet. Metab. 101, 153-162). Se determinaron los metabolitos mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de dilución de isótopos estables.
F. Pegilación
Se adquirieron moléculas de polietilenglicol de NOF Corporation (Tokio, Japón). Se llevó a cabo la pegilación según las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, se llevó a cabo el acoplamiento de derivados de maleimida-PEG a los grupos SH de htCBS (5 mg/ml) en un tampón fosfato 100 mM pH = 6,5 durante la noche a 4°C. La razón molar entre las moléculas de PEG y la proteína CBS fue de 10:1 ó 5:1.
Alternativamente, se logró la pegilación mediante la conjugación de éster NHS-PEG de 20 kDa (ME-200GS) con htCBS C15S (CBS humana truncada que tiene una mutación C15S). El siguiente protocolo explica resumidamente el procedimiento de pegilación.
Se sometió a intercambio de tampón la htCBS C15S purificada cromatográficamente y se formuló en tampón fosfato de sodio 100 mM pH 7,2 y se concentró hasta al menos 10 mg/ml. Se almacenó la alícuota de enzima a -80°C y se descongeló en un baño de agua a 37/42°C con mezclado ocasional. Se centrifugó la alícuota de enzima para retirar la espuma generada, si la hubiera, y se mantuvo en hielo hasta que se necesitó.
La razón molar de pegilación fue de 1:10 (por subunidad de htCBS C15S), lo que se traduce en 431 mg de ME-200GS por 100 mg de htCBS C15S. Se mezclaron la cantidad calculada de proteína, agua y tampón 2x (necesario sólo si la concentración de enzima era superior a 10 mg/ml) en un tubo Falcon estéril de 50 ml libre de endotoxinas. Por ejemplo, la pegilación de 200 mg de htCBS C15S de 20 mg/ml requirió 10 ml de la proteína, 12 ml de agua estéril y 10 ml de tampón Na-P 100 mM pH 7,2. El tubo contenía un volumen total de 32 ml y se mantuvo en hielo. En un tubo distinto, se disolvieron 862 mg de PEG ME-200GS en agua estéril o DMSO mezclando, agitando con vórtex o con calentamiento opcional en un baño de agua a 37/42°C durante un breve periodo de tiempo. Se disolvió rápidamente el PEG en una disolución transparente y altamente viscosa. Se transfirió rápidamente la enzima diluida al tubo que contenía PEG disuelto o bien mediante vertido o bien mediante pipeteo. Se cerró herméticamente el tubo y se agitó con vórtex inmediatamente durante 10-15 segundos para generar una mezcla homogénea. Se incubó el tubo a TA en una plataforma oscilante durante 4-6 horas o a 4°C durante la noche.
G. Almacenamiento de enzimas
Se formuló htCBS C15S pegilada usando PBS pH 7,4 y se concentró hasta aproximadamente al menos 5 mg/ml, y normalmente hasta una concentración de entre 10 y 25 mg/ml. Se almacenó la enzima a -80°C en alícuotas (1,2 ml). Para cada día de dosificación, se preparó una disolución nueva de enzima de un solo uso mediante dilución en PBS hasta una concentración final de 1 mg/ml. Se descartó cualquier disolución restante al finalizar la dosificación.
H.Procedimientos con animales
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por la Universidad de Colorado-Denver IACUC, que es una institución acreditada por AAALAC (n.° 00235), con garantía de servicio de salud pública (n.° A 3269-01) y con licencia del USDA (n.° 84-R-0059). Se obtuvieron ratones C576BL/6J y con inactivación de CBS (KO) del Laboratorio Jackson (ME, EE.UU.). Previamente se generaron ratones sólo humanos (HO) (Macleanet al.,2010b. Mol. Genet. Metab. 101, 153-162) en el laboratorio. Se mantuvieron los animales con la dieta convencional extruida 2918 (Harlan, CA, EE.UU.) con acceso ilimitado a alimento y agua.
Se analizaron rutinariamente crías representativas en cuanto a homocigosidad. Se usó una lanceta de un solo uso para sangrado submandibular para la recogida de sangre en tubos de heparina de litio Capiject T-MLHG (12,5 UI) con gel (Terumo Medical Corporation, NJ, EE.UU.). Luego se centrifugaron los tubos a 1200 g durante 10 min, seguido de la recogida de plasma en tubos de 1,5 ml y almacenamiento a -80°C.
Genotipado: se analizaron rutinariamente crías representativas en cuanto a homocigosidad mediante qPCR. Se generaron biopsias de la cola con el kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania). Se monitorizó la calidad del ADN mediante el aparato NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, DE, EE.UU.). Se procesaron de manera simple muestras de veinte ng de ADN por triplicado usando la mezcla maestra de expresión génica de Applied Biosystems (CA, EE.UU.) (artículo n.° 4369016). Se realizó la amplificación en el instrumento 7500 Fast de Applied Biosystems usando el método de la curva de calibración. Se usaron ensayos de referencia del número de copias Tert (artículo n.° 4458366) o Tfrc (artículo n.° 4458368) de Applied Biosystems como calibrador homocigótico de una copia. Se usó el ensayo Mr00299300 de Applied Biosystems para detectar el gen Neo.
Se alojaron ratas Sprague Dawley de tipo natural en jaulas y se mantuvieron en condiciones convencionales con acceso ilimitado a alimento y agua.
Se alojaron macacos cangrejeros(Macaca fascicularis)de tipo natural en corrales separados por sexo con acceso ilimitado a comida y agua. Se monitorizaron y controlaron continuamente los ciclos de luz/oscuridad de doce horas, la temperatura y la humedad. Se proporcionó diariamente enriquecimiento ambiental adicional en forma de sonidos de fondo auditivos naturales y enriquecimiento por video de naturaleza visual. Se examinaron todos los monos para determinar su salud general antes del estudio.
I. Recogida de muestras
Después de la inyección con una forma pegilada de htCBS, tal como 20NHS PEG-htCBS C15S, se recogió sangre en diversos puntos de tiempo en tubos de heparina de litio Capiject T-MLHG (12,5 UI) con gel (Terumo Medical Corporation, NJ, EE.UU.) de la vena submandibular de los animales de estudio conscientes usando una lanceta desechable diseñada para muestreo submandibular. Se recogió plasma de las muestras de sangre después de centrifugar a 1200 g durante 10 minutos y se almacenó a -80°C en tubos de 1,5 ml.
J. Farmacocinética
Se calcularon los parámetros farmacocinéticos (PK) usando un modelo de separación de curvas no compartimental que resuelve una curva en una serie de términos exponenciales correspondientes a las fases de absorción, distribución y eliminación que se producen durante el transcurso del tiempo de la enzima en la sangre. El enfoque de extracción de curvas supone que las fases de disposición del fármaco siguen una cinética aparente de primer orden, que se demuestra por la linealidad en la parte terminal de un gráfico semilogarítmico. Se realizaron estos cálculos usando un programa de modelado denominado PK Solutions 2.0 (Summit Solutions, Montrose, CO) usando la actividad enzimática plasmática media para cada vía de administración. Se calculó la biodisponibilidad dividiendo el área bajo la curva (AUC) para la vía s.c. o i.p. entre el AUC observada después de la administración i.v.
K. Preparación de muestras para el mapeo de pegilación con NHS
Se diluyó cada muestra (300 |ig), incluido el control de CBS no pegilada, con agua para HPLC (ThermoFisher) hasta 80 |il. Luego se mezcló la muestra 1:1 (v/v) con tampón CAPS 0,24 M (Sigma) pH 11,5 y se incubó a 37°C durante 22 horas para retirar los PEG. Se transfirió la muestra despegilada a un filtro de centrífuga Amicon Ultra 30K (Millipore) y se añadieron 320 |il de disolución de HCl de guanidina 8 M (Sigma). Se centrifugó el filtro a 13.000 rpm durante 10 minutos. Se repitió dos veces este procedimiento para intercambiar el tampón de las muestras a HCl de guanidina 8 M y retirar el PEG libre residual.
Se combinó la muestra con Tris-HCl 1 M (pH 7,5) hasta una concentración final de Tris 100 mM. Se redujo la muestra con DTT 10 mM (Sigma) a 56°C durante 45 minutos y se enfrió. Se añadió yodoacetamida hasta una concentración final de 30 mM y se incubaron las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se diluyó la muestra con una disolución de Tris 50 mM (pH 7,5) hasta alcanzar una concentración de guanidina de 1 M. Se usaron las muestras reducidas/alquiladas para la digestión con endopeptidasa Asp-N.
Se añadieron 2 |ig de Asp-N a 100 |ig de la muestra reducida y alquilada (razón enzima:proteína = 1:50 (p:p)). Se llevó a cabo la digestión durante la noche a 37°C.
L. Preparación de muestras para análisis histopatológico
Se sacrificaron los ratones KO inyectados con PBS o tratados con el conjugado de htCBS pegilada, tal como 20NHS PEG-htCBS C15S, los días 17-19 y se procesaron las muestras de hígado para análisis histológico mediante microscopía óptica. La evaluación histológica se llevó a cabo con enmascaramiento. Se extrajeron los hígados y se fijaron durante 24 horas con paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,4). Se recortaron bloques de tejido para histología, se deshidrataron con una serie de etanol seguido de acetona, mezcla de acetona-xileno y xileno, y luego se incrustaron en parafina. Paralelamente, se congelaron rápidamente pequeños bloques de tejido (de aproximadamente 4 mm * 2 mm) fijados con paraformaldehído en éter de petróleo enfriado con hielo seco y se almacenaron a -50°C para la detección de lípidos apolares. Se desparafinizaron cortes de parafina de 4 |im de grosor en xileno y después de la etapa de alcohol isopropílico se rehidrataron con etanol (96%, 70%, 60%). Se tiñeron los cortes de tejido con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar los cambios histopatológicos. Se realizó la tinción tricrómica de Masson para la detección de fibrosis. Se verificó la esteatosis usando tinción con Oil Red O para la detección de lípidos apolares en cortes fijados congelados de 10 |im de grosor y cortados con un criomicrotomo Leica (CM 1850). Se visualizaron y fotografiaron los cortes con un microscopio óptico Nikon (E800) equipado con una cámara digital Olympus (DP70).
Para la microscopía electrónica, se procesó un tercio de cada uno de los hígados para microscopía electrónica cortándolo en rodajas de 1-2 mm de grosor y sumergiendo después de la fijación en glutaraldehído al 3%. Posteriormente, se incrustaron las muestras en una mezcla de Epon-Araldite, se tiñeron dos veces y se examinaron con un microscopio electrónico JEOL 1200 con un aumento de 3000x.
M. Absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA)
Se usó para el análisis de DEXA un escáner PlXImuslI DEXA (GE Lunar Medical Systems) diseñado específicamente para escanear animales pequeños tales como ratones. Esta máquina permitió la determinación rápida y eficaz de la composición corporal (masa magra, masa grasa y densidad ósea) de un ratón antes de los procedimientos de extracción de tejido terminal. Se mantuvieron los ratones en ayunas durante 4 horas antes de la medición por DEXA para retirar los alimentos del tracto gastrointestinal. Luego se anestesiaron los ratones mediante inyección en bolo i.p. de 60 mg/kg de ketamina y 15 mg/kg de xilazina y se colocaron en una bandeja en la máquina de DEXA. Después de realizar la medición (3~5 minutos), se retiraron los ratones de la máquina de DEXA y se usaron en procedimientos terminales, tales como extracciones de tejido.
N. Preparación de muestras oculares para observación al microscopio
Se sometieron los ratones a fijación por perfusión con paraformaldehído al 4% en 1x PBS pH 7,4 (PFA al 4%) para preservar las paredes del globo ocular. Se extrajeron los ojos quirúrgicamente con cuidado, se sumergieron en PFA al 4% y se hizo un pequeño orificio con cuidado en el globo posterior del ojo justo debajo del nervio óptico para permitir que el fijador penetre al interior del ojo y fije las estructuras durante la noche a 4°C. Se lavaron las muestras 3 veces usando 1x PBS filtrado pH 7,4. Después del lavado, se diseccionó cuidadosamente el globo posterior del ojo hasta el nivel del epitelio ciliar para exponer la zónula ciliar. Se colocó la muestra en una disolución bloqueante de BSA al 8% durante 2 horas con agitación. Después del bloqueo, se le añadieron a la muestra anticuerpos MAGP1 (Sigma) diluidos 1:50 en BSA al 4% y se almacenaron a 4°C durante la noche. Al día siguiente, se lavó la muestra 6 veces con 1x PBS pH 7,4, se añadieron anticuerpos secundarios Alexa 488 (1:200, Invitrogen) a la muestra y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Se lavó la muestra 6 veces y se sometió a contratinción con verde de metilo (tinción nuclear) durante 15 minutos.
Se calentó una disolución que contenía agarosa al 4%, se vertió en una placa de Petri de vidrio con tapa y se dejó solidificar a temperatura ambiente. El gel solidificado sirvió como cámara de obtención de imágenes para el ojo. Se hizo un pequeño orificio en el gel para que sirviera como cámara segura para el ojo. Para observar la zónula ciliar, se llenó la cámara con 1x PBS y se colocó la muestra del ojo teñida en el orificio con la superficie posterior de la lente tocando el lecho de gel. Se generaron imágenes tridimensionales usando un microscopio confocal invertido LSM 510 con un aumento de 10x y un zoom de 0,7x.
Ejemplo 2. Tiempo de retención de htCBS
A. La htCBS no modificada presenta un tiempo de retención corto en circulación
Las propiedades farmacocinéticas de una sustancia farmacológicamente activa que se administra a la circulación se ven muy afectadas por los mecanismos naturales de ADME. El aclaramiento rápido de la molécula inyectada puede tener un gran impacto en la eficacia del tratamiento y, por tanto, se desean semividas de circulación más prolongadas, lo que puede traducirse en administraciones menos frecuentes o menores dosis que, a su vez, minimizan los efectos secundarios. Para determinar la farmacocinética de htCBS en circulación plasmática, se inyectó una dosis única de 5 mg/kg por vía subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.) a ratones C57BL/6J. La administración de htCBS por vía i.v. o i.p. presentó los valores de actividad específica más altos durante las primeras 4 horas posteriores a la inyección (niveles plasmáticos máximos observados de hasta 123 y 76 mU/|il, respectivamente; la tabla 2 muestra los valores del área bajo la curva (AUC)). Los parámetros farmacocinéticos calculados a partir de muestras de plasma (tabla 2) muestran que la semivida de htCBS era de 2,7 horas, lo que sugiere que después de aproximadamente 6 semividas (menos de 20 horas), los niveles de htCBS deberían ser indetectables.
La biodisponibilidad de htCBS fue del 50% para las vías s.c., lo que sugiere que la administración s.c. puede ser una opción clínica para este enfoque terapéutico. Las semividas aparentes más lentas para la administración s.c. e i.p. (tabla 2) pueden explicarse por una fase de absorción lenta que se produce durante la fase de eliminación, prolongando de ese modo el tiempo de residencia medio y la semivida aparente; sin embargo, para el presente propósito era deseable una semivida mucho más prolongada y, por tanto, se sometieron a prueba los derivados pegilados de htCBS.
Tabla 2. Parámetros farmacocinéticos
La rápida disminución de la actividad de htCBSin vivopuede atribuirse a un aclaramiento facilitado de la circulación y también puede atribuirse a la pérdida de actividad enzimática de htCBS una vez que se introduce en el medio en circulación. Para someter a prueba esto último, se incubó htCBSin vitroen plasma de ratón de ratones de tipo natural o HO a 37°C durante hasta 96 horas, midiendo la actividad cada 24 horas. Tal como se muestra en la figura 1A, no se registró ninguna pérdida significativa de actividad durante hasta 72 horas de incubación en el plasma de ninguno de los modelos de ratón. Se registró una modesta pérdida de actividad del 25% después de 96 horas de incubación. Además, tal como se muestra en la figura 1B, los análisis de inmunotransferencia de tipo Western (WB) del plasma de los animales inyectados por vía s.c. revelaron que la cantidad de htCBS disminuye en función del tiempo, por tanto, el aclaramiento explica la rápida pérdida de actividad de htCBS en circulación, en lugar de la pérdida de actividad en el plasma.
B. La pegilación de htCBS mejora la semivida plasmática in vivo
Con el fin de determinar el impacto de las moléculas de PEG en la farmacocinética de CBS, se pegiló htCBS con un PEG lineal de bajo peso molecular (2 kDa) y con un PEG ramificado de cuatro ramas de alto peso molecular (40 kDa) (designados como ME020MA y GL4-400MA, respectivamente). Tal como se muestra en la tabla 3, la pegilación no afectó a la actividad específica de la enzima. La tabla 3 muestra los resultados de la SDS-PAGE con tinción de Coomassie de htCBS pegilada y no pegilada con los correspondientes valores de actividad específica que muestran que la pegilación no influye en la actividad de la enzima. A los ratones se les inyectó por vía s.c. tal como se describe en A (n=4-5), con htCBS pegilada con ME200MA o GL4-400MA en comparación con htCBS no pegilada.
Tabla 3. Actividad
Se administró una dosis de 5 mg/kg de peso corporal (PC) de htCBS pegilada (PEG-htCBS) a ratones C57BL/6J por vía s.c. e i.v., y se monitorizó la actividad de CBS en diferentes puntos de tiempo. Se usaron dos ramas experimentales (n=5 cada uno) para cada vía de inyección. Se extrajo sangre tras la inyección del grupo 1 a las 0, 1, 8 y 24 horas y del grupo 2 a las 1, 4, 10 y 48 horas.
Tal como se muestra en la figura 1B (panel inferior) para GL4-400MA PEG-htCBS, la actividad en plasma se prolongó significativamente para la proteína pegilada en comparación con el equivalente no pegilado. Tal como se muestra en la tabla 4, la semivida aumentó desde 2,7 horas para la htCBS no pegilada hasta 16,7 y 30,4 horas con la pegilación con ME020MA y GL4-400MA, respectivamente.
Tabla 4. Resultados de modelación farmacocinética
Esto significa que el tiempo de exposición después de una dosis única sería de 5 a 10 veces mayor para las formas pegiladas. Además, la biodisponibilidad después de la administración s.c. osciló desde el 50 hasta el 80%, lo que sugiere que la vía s.c. sería razonable para los estudios clínicos.
Ejemplo 3. Administración de htCBS y niveles séricos de homocisteína, cistationina y cisteína.
El objetivo final del uso de htCBS para CBSDH es reducir la carga tóxica de tHcy para elevar los niveles de cistationina y cisteína. Se espera que estos cambios prevengan, reviertan o retrasen la aparición de los síntomas de CBSDH. Sin embargo, la investigación de la homocistinuria se ha visto obstaculizada durante mucho tiempo por la falta de un modelo animal adecuado. Los ratones con inactivación completa para el gen de ratón mueren en el plazo de las 2-3 semanas posteriores al nacimiento. Los ratones HO (sólo humanos) se diferencian de otros ratones con inactivación génica porque, además de tener el gen de ratón inactivado, expresan niveles bajos del gen humano que les permite sobrevivir hasta la edad adulta (Macleanet al.,2010b, Mol. Genet. Metab. 101, 153-162). Los ratones HO presentan elevaciones graves de Hcy, metionina, S-adenosilmetionina y S-adenosilhomocisteína y presentan una disminución concomitante en los niveles plasmáticos y hepáticos de cisteína. Por consiguiente, estos ratones presentan características que, en varios aspectos, recapitulan la enfermedad tal como se produce en humanos.
A. La administración de htCBS no mejora las concentraciones de tHcy y cistationina
Los ratones HO a los que se les administró htCBS no pegilada a 5 mg/kg durante 5 días consecutivos en las semanas 1 y 3 (10 días entre conjuntos de tratamientos) no demostraron cambios en los niveles séricos de homocisteína. La figura 2 muestra los niveles medios de homocisteína y cistationina en ratones HO. Esta falta de modulación metabólica por la htCBS no pegilada confirma además la necesidad de modificar la htCBS mediante la unión covalente de moléculas de polietilenglicol.
Se sometieron a prueba varias químicas diferentes de PEG tal como se describe en la publicación internacional n.° WO2014120770 (véase la tabla 5), y los datos indican que la CBS que está pegilada con PEG de menos de 20 kDa demuestra una pérdida de actividad más rápida en plasma que la CBS con PEG de mayor peso molecular. Por ese motivo, se eligió el PEG lineal de 20 kDa designado como ME200MA0B para análisis posteriores. La figura 3 presenta una SDS-PAGE con tinción de Coomassie que muestra el transcurso temporal de la pegilación de htCBS con ME200MA0B. La reacción de pegilación se inició mediante la adición del PEG, y las muestras se retiraron del tubo en los puntos de tiempo indicados para su análisis.
Tabla 5. Evaluación de la química de PEG
B. La administración repetida de PEG-htCBS mejora las concentraciones de tHcy y cistationina y restablece los niveles normales de cisterna.
Se monitorizó el efecto a largo plazo de la administración de PEG-htCBS usando ratones HO. Se administró la enzima PEG-htCBS a 8 ratones HO a una dosis de 7,5 mg/kg, dos veces a la semana (lunes y jueves) durante las dos primeras semanas y luego tres veces a la semana (lunes, miércoles y viernes) durante 6 semanas. Se extrajeron muestras de sangre 24 horas (martes) y 72 horas (lunes) tras la inyección (figuras 4A-4C). La figura 4A muestra que la tHcy en plasma se redujo desde 212 |iM en el tiempo 0 hasta un promedio en el intervalo de 62-103 |iM 24 horas después de las inyecciones, y estuvo en un intervalo de 141-189 |iM 72 horas después de la última inyección semanal. A partir del día 28, los valores a las 72 horas tras las inyecciones fueron significativamente más bajos que el valor a tiempo 0 (P<0,02). Los niveles de cistationina y cisteína también se vieron influidos positivamente. La cistationina aumentó desde 6 |iM hasta 30 |iM y la cisteína estuvo constantemente por encima de 200 |iM 24 horas tras la inyección (figura 4C). Curiosamente, a partir del día 24, las fluctuaciones en la concentración de cistationina fueron mucho menos pronunciadas en comparación con las primeras tres semanas de tratamiento. Además del análisis de los niveles de metabolitos en plasma, también se analizaron muestras de tejido hepático, renal y cerebral de los ratones inyectados para determinar los niveles de homocisteína no unida a proteínas (formas libres y unidas por disulfuro). Tal como se muestra en la figura 4D, en animales inyectados a largo plazo, se demostró una reducción del 44%, el 63% y el 47% en tejidos hepáticos, renales y cerebrales, respectivamente. Por tanto, la inyección repetida a largo plazo de PEG-htCBS afecta significativamente a los niveles plasmáticos de homocisteína, cistationina y cisteína.
Ejemplo 4. El mutante de htCBS (C15S) muestra patrones preferenciales de agregación y pegilación
A. La htCBS con mutación C15S no presenta patrón de agregación y presenta un patrón de pegilación uniforme
Aunque se notificó anteriormente que la enzima htCBS es menos propensa a la agregación en comparación con la proteína de longitud completa (Franket al.,2006, Biochemistry 45:11021-11029), todavía forma tetrámeros y agregados superiores. Esto puede estimular los mecanismos inmunológicos defensivos y conducir a, por ejemplo, depósito de amiloide (D'Souzaet al.,2014, “Amyloid: the international journal of experimental and clinical investigation. The official journal of the International Society of Amyloidosis” 21: 71-75), pero también afectan a la purificación, la manipulación y la consistencia. La figura 5A (previamente divulgada como figura 5A del documento WO2014120770, representa una PAGE nativa con tinción de Coomassie que muestra que diferentes lotes de htCBS presentaron diferentes razones de dímero/tetrámero, con grados variables de agregados superiores. La figura 5B (previamente divulgada como figura 5B del documento WO2014120770, es un ensayo de actividad en gel que demostró que estos agregados presentan actividad de CBS. La figura 5C (previamente divulgada como figura 5C del documento WO2014120770, muestra que la agregación provoca productos de pegilación no consistentes. La pegilación dio como resultado dos bandas distintas, lo que presumiblemente refleja grados variables de pegilación, ya que la agregación puede actuar para obstaculizar los sitios de pegilación disponibles. Por consiguiente, debido a una agregación más pronunciada del lote 28 (figura 5A), su pegilación dio como resultado una banda inferior más pronunciada, es decir, menos pegilada, en SDS-PAGE (figura 5C), mientras que la pegilación del lote 112, compuesto por tetrámeros y dímeros (figura 5A), dio como resultado una banda superior más pronunciada en comparación con el lote 28 (figura 5C). La figura 5D muestra un gel nativo con tinción de Coomassie, que indica que la incubación de ambos lotes de enzimas con el agente reductor tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) convirtió gran parte de los tetrámeros y agregados superiores en una forma dimérica. Estos datos implican que la agregación está impulsada por cisteínas expuestas en la superficie de htCBS. Por tanto, se creía que el tratamiento con TCEP también daba como resultado una pegilación más extensa, ya que se generaban más dímeros a partir de formas de mayor PM, dando lugar a la exposición de sitios de pegilación adicionales en la superficie de htCBS. De hecho, tal como se muestra en la figura 5E, la razón entre las bandas de pegilación superior/inferior en una SDS-PAGE con tinción de Coomassie se desplaza significativamente hacia la banda superior tras el tratamiento con TCEP en comparación con la pegilación en ausencia de TCEP. Por consiguiente, se cree que la agregación de htCBS está impulsada, al menos parcialmente, por la formación de puentes disulfuro intramoleculares. Por tanto, C15 se mutó a serina, generando el mutante de htCBS C15S; se demostró previamente que C15 es la cisteína más reactiva en la superficie de CBS (Franket al.,2006, Biochemistry 45:11021-11029). La figura 5F (previamente divulgada como figura 6<a>del documento WO2014120770, representa un gel nativo con tinción de Coomassie, en el que se observan dos bandas principales (dímeros y tetrámeros) para htCBS, mientras que el mutante de htCBS C15S muestra una única banda que, tal como se esperaba, no se ve afectada por el tratamiento con TCEP. Esta observación se confirmó además mediante HPLC-cromatografía de exclusión molecular (HPLC-SEC). Se separaron las preparaciones de CBS en un aparato Yarra SEC-3000, columna de exclusión molecular de 300*7,8 mm (Phenomenex, CA, EE.UU.). La columna se equilibró y se hizo funcionar en fosfato de sodio 100 mM pH=6,8, a una velocidad de flujo de 1 ml/min a temperatura ambiente. El análisis de HPLC-SEC, figura 5G (anteriormente divulgada como parte de la figura 7A y la figura 7B del WO2014120770), muestra las diferencias en htCBS C15S (figura 5G, panel izquierdo) y la razón de dímero/tetrámero de htCBS (figura 5G, panel derecho). El pico único para el mutante de htCBS C15S dimérico eluyó a los 8,62 min, mientras que el pico principal para htCBS eluyó a los 7,9 min, que corresponde a un tetrámero. La figura 4H muestra un gel de SDS-PAGE con tinción de Coomassie que muestra la reproducibilidad de la pegilación de htCBS C15S entre diferentes lotes y la comparación con htCBS. La ausencia de agregados en htCBS C15S dio como resultado un patrón de pegilación más consistente entre los diferentes lotes con casi exclusivamente una banda pegilada que aparece en SDS-PAGE. La comparación directa entre PEG-htCBS y PEGC15S tantoin vivocomoin vitrono mostró ninguna diferencia en el rendimiento.
El efecto de PEGC15S sobre los metabolitos también se sometió a prueba 1,4 y 24 horas tras la inyección (figura 6A-figura 6C). Se midieron los niveles de tHcy (figura 6A), cistationina (figura 6B) y cisteína (figura 6C) en ratones HO inyectados con 7,5 mg/kg de PEGC15S o PBS (n=5) 1, 4 y 24 horas tras la inyección. Los datos se presentan como media ± EEM y cada punto de tiempo se compara entre los dos grupos usando la prueba de la t de Student para datos no emparejados. *p=0,05, **p<0,01 y ***p<0,001. El efecto sobre tHcy y cisteína se observó sólo 24 horas tras la inyección (figura 6A y figura 6C), sin embargo, ya se observó un aumento significativo en la cistationina 1 y 4 horas tras la inyección (figura 6B).
Ejemplo 5. PEGC15S y betaína funcionan de manera sinérgicain vivo
Para evaluar el efecto de betaína y la terapia de combinación, se llevaron a cabo tratamientos con betaína, PEGC15S y una combinación de betaína+PEGC15S y se compararon los metabolitos de la ruta de transulfuración.
Los grupos de betaína y betaína+PEGC15S se trataron con betaína al 2% en el agua para beber durante los 18 días del experimento, y al último grupo se le inyectaron 7,5 mg/kg de PEGC15S los días 14 y 15. Se mantuvo el grupo de tratamiento único con PEGC15S en agua normal y también se inyectaron los días 14 y 15. Tal como se muestra en la figura 7A, 14 días de tratamiento con betaína dieron como resultado una disminución del 29% y del 32% en tHcy para los grupos tratados con betaína. El grupo de tratamiento único con betaína mantuvo estos niveles de tHcy hasta el día 18. La inyección de PEGC15S en el fondo de betaína dio como resultado una reducción más pronunciada del 74%, el 77%, el 76% y el 40% los días 15, 16, 17 y 18, respectivamente. El tratamiento con PEGC15S solo dio como resultado una reducción del 69%, el 67%, el 52% y el 33% los días 15, 16, 17 y 18, respectivamente. Según estos datos, la inyección de PEGC15S con o sin tratamiento con betaína es muy superior al tratamiento con betaína solo. Además, la combinación de betaína+PEGC15S fue superior al tratamiento con PEGC15S solo. Tal como se muestra en la figura 7B, la diferencia entre estos dos grupos se volvió estadísticamente significativa 48 horas tras la segunda inyección (día 17). Por tanto, la combinación de PEGC15S con betaína permite mantener niveles más bajos de tHcy durante un periodo de tiempo prolongado.
El tratamiento con betaína solo no dio como resultado un aumento de cistationina durante los 18 días del experimento. Por el contrario, se observó un aumento para los dos grupos que se trataron con PEGC15S (con o sin betaína). Curiosamente, la combinación de PEGC15S con betaína dio como resultado un aumento que, a partir del día 16 en adelante, fue significativamente menor que en el grupo que recibió la terapia única con PEGC15S. Esto se debe al hecho de que el tratamiento con PEGC15S solo canaliza la homocisteína hacia la condensación con serina para formar cistationina. La combinación con betaína canaliza parte de la homocisteína disponible a través de la ruta de remetilación para producir metionina y, por tanto, puede haber menos homocisteína disponible para que PEGC15S se convierta en cistationina.
Ejemplo 6. PEGC15S rescata a los ratones KO de la muerte prematura y mejora la hepatopatía
A. Reducción de la muerte prematura
La mayoría de los ratones con inactivación completa de CBS (KO) mueren en el plazo de las 2-3 semanas posteriores al nacimiento. Se representó gráficamente una curva de supervivencia de Kaplan Meyer de ratones KO inyectados dos veces a la semana con PEGC15S frente a ratones a los que se les inyectó PBS. Se mantuvieron los ratones en agua con betaína hasta el día 21 y se sometió a prueba la capacidad de la enzima inyectada para rescatar a las crías KO. A las crías KO se les inyectó PEGC15S o PBS dos veces a la semana. Todos los ratones recibieron betaína en el agua para beber hasta el día 21 (día del destete). Tal como se muestra en la figura 8A, el día 21, sólo el 18% de los ratones sobrevivieron en el grupo al que se le inyectó PBS frente al 93% de los que recibieron la inyección con la enzima. Ningún animal al que se le inyectó PBS sobrevivió hasta el día 24, mientras que se registró una supervivencia del 86% para el grupo al que se le inyectó enzima. Desde el día 24 en adelante, el número de animales a los que se les inyectó la enzima también comenzó a disminuir, con un 45% de supervivencia el día 29 y un 33% el día 35, aunque se observó que el uso de una molécula de PEG y una pauta posológica diferentes tuvo un gran impacto en estos resultados tal como se muestra en los ejemplos adicionales a continuación (por ejemplo, figura 11A y 11C).
B. Hepatopatía
Anteriormente se demostró que los ratones KO padecen daño hepático grave (Macleanet al.,2010a, Mol. Genet. Metab 101, 163-171; Watanabeet al.,1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:1585-1589). Por tanto, la supervivencia prolongada de los ratones KO puede estar correlacionada con la mejora de la hepatopatía después del tratamiento con CBS. Por consiguiente, se realizaron análisis histológicos de cortes de hígado de animales a los que se les inyectó PEGC15S durante 35 días. Se sacrificaron los animales el día 36 y se procesaron las muestras de hígado para el análisis histológico mediante microscopía óptica. Los animales inyectados con PBS no sobrevivieron hasta el día 35, pero se tomaron muestras de hígado de dos animales inmediatamente después de la muerte y se procesaron. Los experimentos se llevaron a cabo con enmascaramiento. Se extrajeron los hígados y se fijaron durante 24 horas con paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,4). Se recortaron bloques de tejido para histología, se deshidrataron con una serie de etanol seguido de acetona, mezcla de acetona-xileno y xileno y luego se incrustaron en parafina. Paralelamente, se congelaron rápidamente pequeños bloques de tejido (de aproximadamente 4 mm x 2 mm) fijados con paraformaldehído en éter de petróleo enfriado con hielo seco y se almacenaron a -50°C para la detección de lípidos apolares. Se desparafinizaron cortes de parafina de 4 |im de grosor en xileno y después de la etapa de alcohol isopropílico se rehidrataron con etanol (96%, 70%, 60%). Se tiñeron los cortes de tejido con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar los cambios histopatológicos. Se realizó la tinción tricrómica de Masson para la detección de fibrosis. Se verificó la esteatosis usando tinción con Oil Red O para la detección de lípidos apolares en cortes congelados fijados de 10 |im de grosor y cortados con un criomicrotomo Leica (CM 1850). Se visualizaron y fotografiaron los cortes en un microscopio óptico Nikon (E800) equipado con una cámara digital Olympus (DP70).
La figura 8B muestra la histología del hígado de dos ratones KO inyectados con PEGC15S sacrificados el día 35 frente a hígados de dos animales KO inyectados con PBS que murieron los días 17 y 24 (tinción con hematoxilina y eosina). Las vistas de menor aumento del parénquima hepático (figura 8B, columnas de la izquierda) muestran cambios moderados con placas de células hepáticas ligeramente irregulares y esteatosis de leve a moderada en KO-1 y KO-2 inyectados con PEGC15S que contrastan con necrosis zonales masivas de hepatocitos (figura 8B, KO-3, marcado con puntas de flecha) y esteatosis difusa con múltiples necrosis dispersas (figura 8B KO-4, necrosis marcadas con puntas de flecha) en KO inyectados con PBS. En los insertos se muestra una tinción específica para lípidos apolares en el citoplasma de hepatocitos. Las vistas de mayor aumento (columnas de la derecha) demuestran la presencia de mitosis frecuentes (marcadas con flechas y mostradas en detalle en los insertos) y núcleos polimorfos agrandados con nucléolos prominentes en KO inyectados con PEGC15S. Las vistas de mayor aumento del parénquima hepático en KO inyectados con PBS demuestran necrosis hepatocelulares confluentes con una escasa infiltración inflamatoria (figura 8B, KO-3, marcadas con puntas de flecha) o múltiples necrosis dispersas acompañadas de una reacción inflamatoria reabsortiva prominente (figura 8B, KO-4, marcado con puntas de flecha). El parénquima hepático restante muestra esteatosis microvesicular y macrovesicular en KO inyectados con PBS (PT = espacio porta, CV = vena central).
Los animales inyectados con PBS desarrollaron hepatopatía grave caracterizada por esteatosis microvesicular a macrovesicular pronunciada y muerte significativa de hepatocitos, con fibrosis mínima o nula. En un animal se encontraron múltiples necrosis monocelulares u oligocelulares de hepatocitos dispersos por todo el lóbulo hepático acompañadas de una reacción inflamatoria reabsortiva prominente, mientras que en el otro animal predominaron las necrosis confluentes masivas de hepatocitos principalmente en las zonas periportales con un escaso infiltrado inflamatorio. Los signos de regeneración del parénquima hepático fueron mínimos en ambos animales. Los dos animales a los que se les inyectó PEGC15S mostraron cambios moderados en el hígado con signos menores de daño al parénquima pero con una regeneración prominente, y el examinador reconoció correctamente que recibían terapia. Los cambios indicativos de regeneración del parénquima hepático (arquitectura ligeramente irregular del lóbulo hepático, citoplasma basófilo de los hepatocitos, mitosis frecuentes y hepatocitos binucleados, polimorfismo nuclear y agrandamiento con nucléolos prominentes) fueron la característica más llamativa. La morfología general fue consistente con una mayor proliferación, transcripción y traducción en los hepatocitos. Además, se detectaron raras necrosis focales de hepatocitos y esteatosis leve de tipo microvesicular y la fibrosis fue mínima.
Ejemplo 7. Caracterización bioquímica de 20NHS PEG-htCBS C15S
Se determinaron las características bioquímicas de 20NHS PEG-htCBS C15S antes de los estudios sobre los efectos de la administraciónin vivode la molécula.
A. Secuenciación N-terminal y análisis de masa intacta
Se analizaron cinco lotes de htCBS C15S sin modificar mediante secuenciación N-terminal. Las secuencias obtenidas fueron idénticas para todos los lotes y, en comparación con la secuencia de referencia, todas carecían del residuo de metionina inicial. Se observó que el extremo N-terminal de htCBS C15S era PSETP y no MPSETP tal como se encuentra en la secuencia de la CBS de tipo natural.
La masa intacta determinada por los espectros de masas deconvolucionados de htCBS C15S corroboró los resultados de la secuenciación N-terminal al identificar sólo un pico principal a 45290 Da en los cinco lotes. Este valor coincide con la masa molecular del monómero de htCBS C15S sin la metionina N-terminal (peso molecular teórico de 45289,7 Da).
Se llevó a cabo además la alineación de secuencias con el software Geneious 9.1.5 (versión gratuita), usando el tipo de alineación de Geneious “Alineación global con huecos finales” y una matriz de costes Blosum62 para comparar las secuencias de proteínas de htCBS C15S en humanos, ratas, monos y ratones Los resultados confirmaron que el extremo N-terminal de 20NHS PEG-htCBS C15S es PSETP y no MPSETP tal como se encuentra en la secuencia de la CBS truncada de tipo natural en humanos, monos, ratas y ratones. Se observó que la htCBS C15S compartía una identidad de secuencia del 96%, incluyendo 1 hueco (en el codón de inicio), con la CBS de mono truncada. Se observaron las siguientes diferencias entre las secuencias en la htCBS C15S usada en el presente documento y la CBS de mono truncada basándose en UniProtKB/Swiss-Prot; Q58H57. Posición de aminoácidos (basándose en la alineación de las secuencias) 18 R s L (htCBS C15S usada en el presente documentos-secuencia de mono truncada), posición 25 KsQ , posición 32 S sL , posición 34 EsG , posición 69 A sV , posición 71 A sE , posición 90 V s |, posición 133 D sA , posición 157 A s T , posición 242 Q sR , posición 354 V s M y posición 403 T sV .
Se observó que la htCBS C15S compartía una identidad de secuencia del 84%, incluyendo 5 huecos (en la secuencia de rata), con la CBS de rata truncada. Se observaron las siguientes diferencias entre las secuencias de la htCBS C15S usada en el presente documento y la CBS de rata truncada basándose en UniProtKB/Swiss-Prot: P32232. Posición de aminoácidos (basándose en el alineamiento de secuencias) 4 E sG (htCBS C15S usada en el presente documentossecuencia de rata truncada), posición 6 P sS , posición 8 A sC , posición 10 V sD , posición 12 P sS , posición 13 T sA , posición 15 S sC , posiciones 17-24 HRSGPHSAsQDLEVQPE, posición 26 S sQ , posiciones 32 34 SPEsASG, posiciones 38-42 A<k>E<p>L<s>R—V, posición 45 R sS , posición 48 A s T , posiciones 60-62 ASEsMAD, posición 66 H sY , posición 69 A sV , posición 71 A sT , posición 82 K sR , posición 86 D sN , posición 94 KsR , posición 96 G sS , posiciones 98-99 KFsNA, posición 133 D sA , posición 161 R sK , posición 175 S sM , posición 235 T sD , posición 238 D sE , posición 248 LsV , posición 255 V sA , posición 276 R sK , posición 300 T sA , posición 318 T sA , posición 322 K sR , posiciones 329-331 EEAsDDS, posición 333 T sA , posiciones 340 y 350 A sS , posiciones 353-354 TVsAM , posición 365 Q sK , posición 383 T sS , posición 389 R sK , posición 397 L sM posición 401 D s-, posiciones 403-404 TE sS V y posición 406 KsR .
Se observó que la htCBS C15S compartía una identidad de secuencia del 84%, incluyendo 5 huecos (en la secuencia de ratón), con la CBS de rata truncada. Se observaron las siguientes diferencias entre las secuencias de la htCBS C15S usada en el presente documento y la CBS de ratón truncada basándose en UniProtKB/Swiss-Prot: Q91W9. Posición de aminoácidos (basándose en la alineación de secuencias) 4 E s G (htCBS C15S usada en el presente documentossecuencia de ratón truncada), posición 6 P sS , posición 8 A sC , posición 10 V sD , posiciones 12-13 PTsSA, posiciones 15-21 SPHRSGPs g FQh LDM, posición 24 A sE , posiciones 26-27 GSsRQ, posiciones 32-34 SPEsPSG, posiciones 37-42 EAKEPLsDR---V, posición 48 A sT , posiciones 59-62 PASEsAMAD, posición 66 H sY , posiciones 69-71 APAsVLT, posición 82 KsR , posición 86 D sN , posición 96 G sS , posiciones 98-99 KFsNA, posición 133 D sA, posición 161 R sK , posición 175 S sM , posición 235 T sD , posición 238 D sE , posición 255 V sA , posición 276 R sK , posición 300 T sA , posición 318 T sA , posiciones 330-331 EAsDS, posición 333 T sA , posición 350 A sS , posiciones 353-354 TVsAM , posición 383 T sS , posición 389 R sK , posición 397 LsM , posición 401 D s -, posiciones 403-404 TEsSV, posición 406 K s R y posición 411 H sR .
Los resultados anteriores muestran que las secuencias de rata y ratón comparten muchas de las mismas diferencias en comparación con la htCBS C15S pegilada con 20NHS PEG-htCBS C15s usada en los ejemplos en el presente documento. La secuencia de mono truncada compartía la mayor similitud con la secuencia de 20NHS PEG-htCBS C15S.
B. Mapeo de pegilación con éster NHS de PEGC15S
Se mapearon los sitios de pegilación de tres lotes de 20NHS PEG-htCBS C15S; RC-6-67A (6,3 mg/ml), RC-6-67B (6,7 mg/ml) y RC-8-14 (3,8 mg/ml). Se despegilaron las muestras en álcali, se sometieron a reducción y alquilación, se digirieron con endopeptidasa Asp-N y se analizaron mediante CL/UV/EM.
Se realizó una cromatografía de fase inversa para una cantidad de inyección de 33 |ig en una fase móvil A de TFA al 0,1% (ThermoFisher) en agua y una fase móvil B de TFA al 0,1% (ThermoFisher) en acetonitrilo (Burdick and Jackson) con una columna XBridge BEH130 C18 de 3,5 |im, 4,6 * 150 mm (Waters) a una temperatura de columna de 60°C. La tabla 6 muestra el gradiente para la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).
Tabla 6. Gradiente de HPLC
Se configuró el espectrómetro de masas ESl-QTOF (Agilent, modelo 6538) a alta resolución de 4 GHz y modo de iones positivos que tenía un intervalo de barrido de EM de 330 a 3200 m/z antes de CL/UV/EM usando la mezcla de ajuste de calibración de Agilent. Se configuraron las tensiones de la siguiente manera: fragmentador -250 V, laberinto(skimmer)-65 V y tensión RF octopolar 750 V. La temperatura del gas era de 350°C. Se calibraron todas las masas dentro de ± 1 ppm antes de poder continuar con la prueba. La calibración del eje de masa dinámica también se empleó en todos los experimentos de CL/EM/EM mediante infusión continua de un patrón de referencia. Se emplearon iones de masa de bloqueo: 922.009798.
Se procesó una proteína htCBS C15S no pegilada en paralelo como control. Se observó que el mapa de péptidos cubría el 97,8% de la secuencia de aminoácidos para cada una de las cuatro muestras, incluyendo los 30 residuos de lisina. Se identificaron doce péptidos que se habían pegilado en función de las adiciones de masa de 1-2 grupos de unión de PEG, y se estimó que el grado de pegilación estaba en el intervalo de 4,5 a 5,5 PEG/subunidad de CBS para estos tres lotes.
En primer lugar, se despegilaron las muestras en condiciones optimizadas (pH 11,5, 37°C, 22 horas) en el análisis de ocupación del sitio de pegilación de htCBS C15S pegilada mediante CL/EM/EM. Después de la despegilación, los sitios anteriormente pegilados quedan con un grupo de unión que tiene la fórmula: C5H6O3 (peso molecular monoisotópico de 114,0317 Da), que puede identificarse mediante mapeo de péptidos. Se redujo la muestra despegilada, se sometió a alquilación, se digirió con endopeptidasa Asp-N y se analizó mediante CL/uV/EM tal como se describió anteriormente.
Se estimó el grado de pegilación usando el siguiente cálculo: n.° de PEG por péptido = (abundancia(1*grupo de unión) 2 x abundancia(2*grupo de unión))/(abundancia(sin grupo de unión) abundancia(1*grupo de unión) abundancia(2*grupo de unión)). La tabla 7 proporciona los resultados de CL/UV/EM.
Tabla 7. Grado de pegilación en las tres muestras medidas por PEG/péptido estimado
Se identificaron inequívocamente las lisinas 25, 30, 211, 247, 271 y 405-406 como pegiladas hasta cierta medida en los tres lotes de 20NHS PEG-htCBS C15S. Cada uno de los grupos de lisinas 72 y 75; 82 y 83; 94, 97-98 y 102; 322 y 325; y 394 y 398 estaban dentro del mismo péptido, y el análisis del presente documento no pudo determinar qué lisina estaba pegilada en qué medida.
También se observaron algunas escisiones peptídicas no específicas de la endopeptidasa Asp-N (extremo N-terminal de Asp y Glu), por ejemplo, 107 A-K 119 y 333 A-K 348, que pueden atribuirse a la hidrólisis básica de la proteína durante la despegilación. Se observó un porcentaje significativo de desamidación para algunos péptidos, lo que también puede atribuirse a las condiciones alcalinas usadas para la reacción de despegilación.
Ejemplo 8. Caracterización bioquímica de la pegilación con maleimida
Se realizaron SDS-PAGE y gel de PAGE nativa para comparar la reproducibilidad de los patrones de pegilación para htCBS conjugada con ME-400MA y ME-200GS. Los resultados mostraron una razón variable entre las especies distintas de PEG-CBS y mostraron una pegilación incompleta cuando se usaron las moléculas de maleimida-PEG de ME-400MA. Grados variables de pegilación para el éster NHS PEG ME-200GS generaron una “mancha” de alto peso molecular de especies pegiladas inseparables en SDS-PAGE (figura 9A) y geles de PAGE nativa (figura 9B).
A diferencia de la pegilación de htCBS C15S con ME-200GS, se observó que la pegilación de htCBS C15S con ME-400MA producía tres especies definidas cuando se separaban en PAGE nativa (figura 9B). Se observó que la especie más pesada coeluía con la segunda especie en htCBS C15S pegilada con ME-200GS. No se determinó la identidad exacta de la especie más pesada porque la cantidad relativamente pequeña de esta especie en comparación con las demás especies y la falta de separación impidieron una caracterización farmacodinámica (PD) detallada. Se identificó que la segunda especie portaba 1 PEG unido a cada subunidad en el dímero nativo, también conocida como especie homopegilada. Se ha observado que la especie pegilada más ligera porta sólo 1 PEG por dímero, también conocida como especie heteropegilada o hemipegilada.
A. Mapeo de pegilación con maleimida de PEGC15S
La primera etapa del mapeo de péptidos fue contabilizar cada péptido que contenía cisteína en dos muestras de htCBS C15S pegilada con ME-400MA: RC-6-13 POOL1 y RC-6-13 POOL2. RC-6-13 POOL1 (muestra de BSL n.°1127) representa la especie homopegilada (lo más probablemente pegilada en el mismo residuo). RC-6-13 POOL2 (muestra de BSL n.° 1128) representa la especie hemipegilada, por lo que en SDS-PAGE se observó que había aproximadamente la misma proporción de bandas pegiladas y no modificadas. Este ejemplo determinó la ubicación de unión de un ME-400MA, cuando la cisteína más accesible (C15) se reemplaza por serina.
Se realizó una digestión con Lys-C sobre la proteína de referencia (UnPEG RC-6-09 DIAFILTRATE) y simultáneamente sobre las dos proteínas pegiladas (RC-6-13 POOL1/RC-6-13 POOL2). Se identificaron ocho péptidos que contenían cisteína a partir de un mapa de péptidos reducidos/alquilados mediante CL/EM. Siete péptidos que contenían cisteína produjeron abundancias relativas similares en las tres muestras, tal como se muestra en la tabla 8 a continuación, lo que indica que es poco probable que estos 7 péptidos de cisteína se hayan pegilado.
Se observó que sólo un péptido que contenía cisteína tenía una abundancia relativa significativamente reducida en cada una de las dos muestras pegiladas. La tabla 8 proporciona las abundancias relativas de péptidos no pegilados en cada muestra.
Tabla 8. Abundancia relativa de péptidos Lys-C que contienen Cys no pegilados
Se observó que el péptido 272-322 contenía dos residuos de cisteína. Se observaron residuos pegilados en Cys272 y/o Cys275 que residían en el péptido Lys-C 272-322. Para diferenciar aún más si Cys272 y/o Cys275 están pegilados, se separaron los dos residuos en péptidos diferentes, se trataron la referencia (UnPEG RC-6-09 DIAFILTRATE) y las dos proteínas pegiladas (RC-6-13<p>O<o>L1/RC-6-13 POOL2) con el reactivo ácido 2-nitro-5-tio-cianobenzoico (NTCB). Debido a que el NTCB escinde de manera N-terminal para liberar residuos de cisteína, la cisteína pegilada no forma el producto final cianilado y, por tanto, bloquea la escisión.
Se identificaron siete péptidos que contenían cisteína a partir del mapa de péptidos C8 tratados con NTCB mediante CL-EM. Como la eficiencia de la digestión química fue relativamente baja en comparación con la digestión enzimática, los valores máximos del péptido diana fueron pequeños en el cromatograma, y también se observaron reacciones secundarias (resultados no mostrados). Los valores máximos de péptidos relacionados con la cisteína se localizaron y cuantificaron mediante búsqueda de iones manual. En comparación con la proteína de referencia, sólo un péptido que contenía cisteína mostró una disminución significativa en la muestra RC-6-13 POOL1. El péptido, identificado como los residuos 244-271, significa que el sitio 272 estaba bloqueado, lo que redujo el rendimiento del péptido 244 271. Dos péptidos que contenían cisteína mostraron una disminución de la abundancia relativa para la muestra RC-6-13 POOL2; sin embargo, la razón es cercana entre estos dos. Es posible que ambas cisteínas estén implicadas en la pegilación o que la abundancia máxima sea demasiado baja como para extraer una conclusión sólida. Los resultados en la tabla 9 demuestran que la pegilación reside en Cys272, aunque Cys275 no se descartó completamente como ubicación de la pegilación.
Tabla 9. Comparación de la pegilación de Cys272 y Cys275
Ejemplo 9. Farmacocinética y farmacodinamia de 400MA PEG-htCBS C15S y 20NHS PEG-htCBS C15S en ratones HO
Este ejemplo caracteriza y compara las propiedades farmacocinéticas (PK) y farmacodinámicas (PD) de htCBS C15S pegilada con PEG activado con éster NHS lineal de 20 kDa (ME-200GS) o PEG activado con maleimida lineal de 40 kDa (ME-400MA). Cada uno de los PEGC15S se purificó en DEAE Sepharose y se sometió a intercambio de tampón mediante filtración de flujo tangencial (TFF) en un cartucho BioMax® 100 en 1x PBS estéril.
Se concentró la htCBS C15S modificada con ME-400MA (400MA PEG-htCBS C15S) hasta 7 mg/ml. Se concentró la htCBS C15S homopegilada modificada con ME-400MA (valor máximo 1) hasta 4,3 mg/ml y se concentró la htCBS C15S hemi/heteropegilada modificada con ME-400MA (valor máximo 2) hasta 5,1 mg/ml. Se concentró la htCBS C15S modificada con ME-200GS (20NHS PEG-htCBS C15S) hasta 6 mg/ml.
Para 20NHS PEG-htCBS C15S, a los ratones HO se les administró por vía s.c. una dosis de 5, 10 ó 15 mg/kg de o se les administró por vía i.v. una dosis de 10 mg/kg. Para 400MA-htCBS C15S, los ratones HO recibieron una dosis única de 10 mg/kg por vía o bien s.c. o bien i.v. de una de las tres formas: (i) una mezcla de todas las especies, donde no se ha intentado la separación de las formas individuales (mezcla), (ii) una especie homopegilada (valor máximo 1) y (iii) una especie hetero/hemipegilada (valor máximo 2).
En este ejemplo se usaron ratones HO tanto machos como hembras, y cada grupo contenía de 3 a 4 ratones. Se usaron dos grupos de ratones denominados “A” y “B” para cada vía de administración para minimizar el volumen de sangre extraído de cualquier ratón. Para la administración s.c., se extrajo sangre del grupo A a las 0,5, 3, 24 y 72 horas tras la inyección y del grupo B a las 1, 6, 48 y 96 horas tras la inyección. Para la administración i.v., se extrajo sangre del grupo A a las 0,25, 1,6 y 48 horas tras la inyección y del grupo B a las 0,5, 3, 24 y 72 horas tras la inyección.
A. Farmacocinética
Los parámetros PK calculados a partir de las curvas de tiempo-actividad se describen en la tabla 10 para el conjugado ME-200GS y en la tabla 11 para el conjugado ME-400MA. Los gráficos semilogarítmicos fueron lineales para los grupos intravenosos y, por tanto, confirmaron que todas las formas de la enzima htCBS C15S se aclararon del plasma mediante una cinética de primer orden (datos no mostrados).
La biodisponibilidad se calculó dividiendo el área bajo la curva (AUC) para la vía s.c. o i.p. entre el AUC observada después de la administración i.v. La tabla 10 proporciona los parámetros PK después de la administración i.v. y s.c. de 20NHS PEG-htCBS C15S.
Tabla 10. Parámetros PK para los experimentos realizados con 20NHS PEG-htCBS C15S
El * indica que el valor se modeló para una dosis de 10 mg/kg con un intervalo de dosificación de 48 horas y una semivida de 17,5 horas.
Para 20NHS PEG-htCBS C15S, el área bajo la curva fue de 3062, 4788 y 5754 para las dosis de 5, 10 y 15 mg/kg, respectivamente. La fracción de la enzima htCBS C15S que alcanzó la circulación sistémica después de la dosificación extravascular (s.c.) fue del 82,6% en el grupo de dosis s.c. de 5 mg/kg de 20NHS PEG-htCBS C15S, pero disminuyó hasta el 64,6% y el 51,6% en los grupos de dosis de 10 y 15 mg/kg. Por tanto, el aumento fue menor que la dosis proporcional, que se refleja en la proporción de aumento del AUC, la cmáx y la biodisponibilidad. Estos resultados se explican probablemente por una ligera disminución en la absorción total de 20NHS PEG-htCBS C15S al aumentar la dosis.
La semivida de eliminación en el grupo de dosis i.v. fue de 48 horas, lo que significa que se aclarará la mitad de la concentración del fármaco en el plasma cada 48 horas. Los datos fueron completamente lineales cuando se representaron como concentración frente al tiempo en una escala logarítmica con coeficientes de correlación >0,98, lo que sugiere que esta es una estimación cercana de la semivida de eliminación para 20NHS PEG-htCBS C15S. Las determinaciones de la semivida en los grupos de dosis s.c. fueron variables y oscilaron entre 17,5 y 137 horas. Estas estimaciones se basan en una fase de absorción/distribución bifásica lenta. Se calculó que el tiempo de circulación promedio (MRT) de una única molécula de enzima oscilaba entre 44 y 194 horas para 20NHS PEG-htCBS C15S.
El tiempo para alcanzar el estado estacionario (niveles máximos y mínimos constantes) se modeló a partir del conjunto de datos s.c. de 10 mg/kg suponiendo un intervalo de dosificación de 48 horas y una semivida de 17,5 horas. Se estimó que el tiempo para alcanzar el estado estacionario absoluto era de 343 horas (es decir, después de unas 7 inyecciones s.c. cada 2 días), pero los cambios en los niveles plasmáticos máximos y mínimos estuvieron muy cerca de los niveles estacionarios a las 144 horas. En el estado estacionario, se simuló que los niveles máximo y mínimo eran de 162 y 85 mUfel después de una dosis de 10 mg/kg administrada por vía s.c. una vez cada dos días. Sin embargo, se alcanzaron niveles muy similares 144 horas tras la inyección, es decir, después de 3 administraciones s.c. de la enzima pegilada cada 2 días.
Los niveles en plasma de 400MA PEG-htCBS C15S para el máximo 1 que representa a la especie homopegilada (2 restos de PEG por dímero de htCBS) y para el máximo 2 que representa a la especie hemipegilada (un único resto PEG por dímero de htCBS C15S) se compararon en la figura 10 A. La mezcla se representa como una línea continua con cuadrados que indican los puntos de recogida. El máximo 1 está representado por una línea discontinua con círculos que indican los puntos de recogida y el máximo 2 está representado por una línea discontinua con rombos que indican los puntos de recogida.
La tabla 11 proporciona los parámetros PK calculados después de la administración s.c. e i.v. de 10 mg/kg de 400MA PEG-htCBS C15S.
Tabla 11. Parámetros PK para los experimentos realizados con 400MA PEG-htCBS C15S
________
Se observó que la biodisponibilidad calculada para 400MA PEG-htCBS C15S mixto era del 55,2%. El Tmáx es el tiempo de la cmáx (nivel plasmático máximo inicial). Se calculó que la semivida de eliminación era de 39 horas a partir del conjunto de datos i.v. Los parámetros PK no fueron drásticamente diferentes para las especies pegiladas individuales designadas como valor máximo 1 (hemipegilada) y valor máximo 2 (homopegilada).
B. Comparación de las formas de htCBS C15S pegiladas con ME-200GS y ME-400MA
No se observó que los parámetros PK fueran perceptiblemente diferentes para las dos formas pegiladas de htCBS C15S (ME-200GS y ME-400MA) comparadas en este caso. También se observó que las curvas de actividad específica frente al tiempo para las dosis i.v. y s.c. de 10 mg/kg de cada enzima eran similares, tal como se muestra en la figura 10B. Las actividades después de la dosificación i.v. se muestran como líneas continuas y las de después de la dosificación s.c. se muestran como líneas discontinuas. Los círculos (i.v.) y los triángulos (s.c.) representan tiempos de recogida para ratones a los que se les administró 20NHS PEG-htCBS C15S, y los rombos (i.v.) y los cuadrados (s.c.) representan tiempos de recogida para ratones a los que se les administró 400MA-htCBS C15S.
Sin embargo, los perfiles de metabolitos representados en la figura 10C muestra que 20NHS PEG-htCBS C15S fue más eficaz en cuando a la normalización de los niveles plasmáticos de homocisteína (círculos) y cisteína (cuadrados) después de una dosis única s.c. de 10 mg/kg. Los niveles de cistationina, representados por los triángulos en el gráfico de la figura 10C, no fueron significativamente diferentes entre los dos conjugados. Generalmente, las respuestas siguen los niveles plasmáticos medidos mediante el ensayo de actividad.
Se observó que la respuesta a 20NHS PEG-htCBS C15S se producía más rápidamente y que era más prolongada en comparación con la respuesta a 400MA PEG-htCBS C15S. Se observó que ambas enzimas pegiladas mejoraron los niveles plasmáticos de Hcy y Cys aproximadamente en la misma medida durante 6 horas después de la administración s.c., y se observó que los niveles plasmáticos de Hcy permanecieron disminuidos hasta 72 horas después de la administración de 20NHS PEG-htCBS C15S en comparación con la normalización gradual a partir de las 24 horas y el retorno total a los niveles previos a la inyección a las 72 horas tras la administración de 400MA PEG-htCBS C15S. Los niveles plasmáticos de Cys reflejaron un patrón similar para ambas enzimas pegiladas.
No se observó que el aumento de la dosificación mejorara significativamente el perfil PD de ninguna de las formas de CBS, lo que sugiere que la eficacia máxima de la enzima no se rige únicamente por sus concentraciones plasmáticas, sino que también está influenciada por factores tales como la cinética de la enzima, la disponibilidad de sustrato y la concentración.
Se observó que 20NHS PEG-htCBS C15S proporcionaba el perfil más favorable después de la administración s.c. en comparación con 400MA PEG-htCBS C15S. Específicamente, la semivida en circulación fue de 47 horas para 20NHS PEG-htCBS C15S en comparación con 39 horas (es decir, un 20% más de semivida) para 400MA PEG-htCBS C15S, y la biodisponibilidad después de la administración s.c. de la misma cantidad (10 mg/kg) fue del 64,6% para 20NHS PEG-htCBS C15S en comparación con el 55,2% para una mezcla (es decir, una biodisponibilidad el 17% mejor).
C. Comparación de diferentes dosis de 20NHS PEG-htCBS C15S
En general, se observó que la respuesta PD se producía en proporción directa a los niveles plasmáticos máximos y disminuía proporcionalmente con la semivida. Sin embargo, se observó que la relación de la dosis en las respuestas máximas se aproximaba a los niveles máximos a 5 mg/kg, de modo que las dosis de 10 ó 15 mg/kg dieron como resultado un pequeño aumento en la eficacia máxima determinada por los niveles de homocisteína y cistationina, tal como se muestra en la figura 10D. Se observó un patrón ondulado de eliminación en cada una de las fases de eliminación que era el mismo en cada curva, de modo que la actividad plasmática alcanzaba un mínimo a las 48 horas y luego se recuperaba (o era similar) a las 72 horas, sólo para volver a disminuir a las 96 horas Este patrón de eliminación inusual observado después de la dosificación s.c. de htCBS C15S puede deberse posiblemente al aclaramiento de la fase de absorción bifásica que consiste en una fase de absorción temprana rápida y tardía más lenta.
Se observó que una dosificación mayor de 20NHS PEG-htCBS C15S mostraba aproximadamente el doble de actividad de CBS en plasma para la dosis de 10 mg/kg en comparación con 5 mg/kg, pero no fue lineal para la mayor dosis de 15 mg/kg, que se muestra en la figura 10E. Hay una diferencia notable entre las respuestas PD de los grupos de dosis de 10 y 15 mg/kg para cada metabolito. De hecho, se observó que muchos de los puntos de tiempo en el grupo de mayor dosis produjeron una respuesta que tendía a disminuir por debajo de la del grupo de dosis de 5 mg/kg. Estas diferencias no se explicaron por la menor biodisponibilidad (disminución de la absorción por dosis unitaria) observada con dosis crecientes de 20NHS PEG-htCBS C15S. En conclusión, se observó que una dosis única de entre 5 y 10 mg/kg producía una respuesta de eficacia máxima en el modelo de ratón HO.
Ejemplo 10. Farmacodinamia de PEGC15S durante la administración a largo plazo en ratones HO
Este ejemplo evalúa y compara la eficacia farmacodinámica y las posibles respuestas inmunogénicas de htCBS C15S administrada exógenamente a largo plazo pegilada con ME-200MA0B, ME-200GS, GL4-400MA, ME-400MA o ME-050GS a ratones HO. Cuando las proteínas humanas se modifican por ingeniería en el genoma de ratón y se expresan en animales neonatos, como es el caso del ratón HO, es más probable que las respuestas inmunitarias tengan relevancia clínica para la respuesta humana. Véase, Guía para la industria, Evaluación inmunogénica de productos proteicos terapéuticos, CEBR (agosto de 2014). Los ratones HO expresan pequeñas cantidades de la proteína CBS humana y es probable que sean más similares a los pacientes humanos en cuanto a su respuesta inmunitaria adaptativa a las enzimas htCBS pegiladas que los ratones de tipo natural o con inactivación completa.
En un conjunto de experimentos, se evaluó htCBS C15S pegilada con ME-200MA0B, ME-200GS, GL4-400MA o ME-400MA. Se usaron seis grupos de ratones HO para realizar estos estudios: dos grupos recibieron 200MA0B PEG-htCBS C15S (grupos 1 y 3), un grupo recibió 20Nh S PEG-htCBS C15S (grupo 4), un grupo recibió GL4-400MA PEG-htCBS C15S (grupo 5) y dos grupos recibieron 400MA PEG-htCBS C15S (grupos 6 y 7). En estos estudios se usaron ratones HO tanto machos como hembras (n total = de 6 a 8 ratones por grupo).
Para el grupo 1, los ratones recibieron 2 tandas de 5 inyecciones subcutáneas diarias de 200MA0B PEG-htCBS C15S los días 1, 2, 3, 4 y 5 (semana 1) y los días 15, 16, 17, 18 y 19 (semana 3). La dosis para este experimento fue de 5 mg/kg/día. En este experimento se incluyó un grupo de control de solución salina (grupo 2). Todos los demás grupos recibieron 3 tandas de 5 inyecciones subcutáneas diarias los días 1, 2, 3, 4 y 5 (semana 1); los días 15, 16, 17, 18 y 19 (semana 3); y los días 29, 30, 31, 32 y 33 (semana 5). La dosis para estos experimentos fue de 7,5 mg/kg/día.
En un conjunto independiente de experimentos, se evaluó htCBS C15S pegilada con ME-200MA0B o ME-050GS. Dos grupos de ratones HO machos y hembras (1M/5H) recibieron 3 tandas de 5 inyecciones subcutáneas diarias de 200MA0B PEG-htCBS C15S (grupo 8) o ME-050GS PEG-htCBS C15S (grupo 9) los días 1, 2, 3, 4 y 5 (semana 1); los días 15, 16, 17, 18 y 19 (semana 3); y los días 29, 30, 31, 32 y 33 (semana 5). La dosis fue de 7,5 mg/kg/día.
En todos los conjuntos de experimentos, a cada ciclo de dosificación de 5 días le siguió un “periodo de reposo farmacológico” de 10 días. Se tomaron muestras de sangre con una lanceta submandibular los lunes, miércoles y viernes de las semanas de dosificación (1, 3 y 5) y el primer día (lunes) de cada periodo de reposo farmacológico de 10 días. Todos los procedimientos de toma de muestras de sangre e inyecciones subcutáneas se realizaron a las 3 p.m. para evitar artefactos debido a las variaciones diurnas. En los días en los que se realizaron tanto la toma de muestras de sangre como la inyección, el procedimiento de toma de muestras de sangre se llevó a cabo antes de la administración de la enzima.
La respuesta farmacodinámica en ratones HO a cada conjugado de htCBS C15S pegilada se evaluó para cada tanda de dosificación mediante la cuantificación de los niveles plasmáticos de los metabolitos homocisteína, cistationina y cisteína, que están asociados con la ruta de transulfuración, al inicio y después del tratamiento. La cuantificación se realizó mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL/EM) de dilución de isótopos estables tal como se describe en el ejemplo 1. El cambio porcentual máximo de homocisteína, cistationina y cisteína se calculó en comparación con los valores de referencia para cada semana de dosis.
ME-200MA0B:se realizaron tres estudios independientes con 200MA0B PEG-htCBS C15S (grupos 1, 3 y 8). En el grupo 1, se observó que los niveles plasmáticos de Hcy disminuyeron un 68% en comparación con los niveles iniciales durante la primera semana de dosificación, pero se observó que disminuyeron sólo un 24% en comparación con los niveles iniciales durante la segunda serie de inyecciones de 200MA0B PEG-htCBS C15S durante la semana 3 con un periodo de reposo farmacológico de 10 días entremedias (tabla 12). Se sugirió una disminución similar en la eficacia por la elevación atenuada de los niveles de Cth y Cys durante la segunda tanda de inyecciones (tabla 13 y tabla 14). Se realizó un segundo estudio (grupo 3) para determinar si se observaba una eficacia atenuada con un conjunto diferente de ratones HO sin tratamiento previo. Se observó que los niveles totales de Hcy en el grupo 3 disminuyeron hasta un 82% por debajo del nivel inicial durante el primer ciclo de inyecciones. Durante los ciclos segundo y tercero de inyecciones durante la semana 3 y la semana 5, se observó que los niveles de Hcy disminuyeron hasta sólo el 57% y el 50% de los valores iniciales, respectivamente. De manera similar, se observó que el lote adicional de 200MA0B PEG-htCBS C15S administrado al grupo 8 disminuyó los niveles plasmáticos de Hcy en un 80% en comparación con los niveles iniciales en la primera semana de dosificación, pero sólo en un 61% de los valores de referencia durante la semana 3 de dosificación. Durante la semana 5 de dosificación, se observó que los niveles plasmáticos de Hcy disminuyeron hasta un 50% de los valores iniciales (tabla 12). Se sugirió una disminución similar en la eficacia por las elevaciones atenuadas de los niveles de Cys durante las inyecciones de la semana 3 y la semana 5 (tabla 13 y tabla 14), en comparación con la semana 1. Se observó una tendencia similar de eficacia atenuada en los grupos 1, 3 y 8, aunque se observó que la magnitud de la respuesta atenuada era más drástica en el grupo 1 en comparación con los grupos 3 y 8.
ME-200GS: se observó que la administración de 20NHS PEG-htCBS C15S en el grupo experimental 4 disminuyó los niveles plasmáticos de Hcy en un 77% en comparación con los niveles iniciales en la primera semana de dosificación, un 70% durante la tercera semana de dosificación y un 66% durante la quinta semana de dosificación (tabla 12). Se mostró una disminución similar en la eficacia por elevaciones atenuadas de los niveles de Cth y Cys durante las semanas tercera y quinta de dosificación (tabla 13 y tabla 14) en comparación con la semana 1. Sin embargo, para 20NHS PEG-htCBS C15S, la disminución en la eficacia observada en la semana 3 y la semana 5 de dosificación fue la más baja en comparación con los otros conjugados de PEG-htCBS C15S y no fue estadísticamente significativa.
GL4-400MA:la administración de GL4-400MA-htCBS C15S en el grupo 5 dio como resultado una disminución promedio del 75% en los niveles plasmáticos de Hcy en comparación con los niveles iniciales en la primera semana de dosificación, pero sólo un 41% durante la tercera semana de dosificación y un 34% durante la semana 5 de dosificación (tabla 12). Se mostró una disminución similar en la eficacia por la elevación atenuada de los niveles de Cth y Cys durante la semana 3 y la semana 5 de dosificación (tabla 13 y tabla 14) en comparación con la semana 1.
ME-400MA:se realizaron dos experimentos independientes con 400MA PEG-htCBS C15S (grupos 6 y 7). En el grupo 6, se observó que el porcentaje de disminución de los niveles de Hcy era del 73% en comparación con los niveles iniciales en la semana 1 y, posteriormente, disminuyó hasta el 65% y el 59% durante la semana 3 y la semana 5 de dosificación, respectivamente. La magnitud de la disminución en la eficacia fue más drástica en el grupo 7, tal como se muestra por las disminuciones atenuadas de los niveles de Hcy durante las tres tandas de dosificación (tabla 12). Se observaron tendencias similares de eficacia atenuada en los cambios de los niveles de Cth y Cys para el grupo 6 y el grupo 7 (tabla 13 y tabla 14).
ME-050GS:se observó que la administración de 050GS PEG-htCBS C15S en el grupo 9 disminuyó los niveles plasmáticos de Hcy en un 75% en comparación con los niveles iniciales en la semana 1 de dosificación, pero sólo disminuyó en un 59% de los niveles iniciales durante la semana 3 de dosificación. Durante la semana 5 de dosificación, se observó que los niveles plasmáticos de Hcy disminuyeron hasta el 42% de los niveles iniciales (tabla 12). Se mostró una disminución similar en la eficacia por elevaciones atenuadas de los niveles de Cth y Cys durante las semanas 3 y 5 de dosificación (tabla 13 y tabla 14) en comparación con la semana 1.
La tabla 12, la tabla 13 y la tabla 14 presentan los cambios porcentuales en los niveles plasmáticos de los metabolitos homocisteína, cistationina y cisteína después de cada tanda de inyecciones subcutáneas de diferentes formas de htCBS C15S pegilada. En estas tablas, los valores iniciales se presentan como media ± error estándar de la media (EEM) en |iM, y los cambios se presentan como el cambio porcentual máximo medio con respecto al nivel inicial para cada ciclo de dosificación de 5 días (semanas 1, 3 y 5). n.d. significa “no determinado”. La tabla 12 proporciona el cambio porcentual en la homocisteína total después del tratamiento a largo plazo con PEGC15S.
Tabla 12. Cambio en los niveles de Hcy total después del tratamiento con PEGC15S en ratones HO
La tabla 13 proporciona el cambio porcentual en la cistationina después del tratamiento a largo plazo con PEGC15S.
Tabla 13. Cambio en los niveles de cistationina después del tratamiento con PEGC15S en ratones HO
La tabla 14 proporciona el cambio porcentual en la cisteína después del tratamiento a largo plazo con PEGC15S.
Tabla 14. Cambio en los niveles de cisteína después del tratamiento con PEGC15S en ratones HO
Los resultados de estos estudios muestran una disminución en los niveles plasmáticos de Hcy junto con un aumento de Cth y Cys en plasma en todos los grupos, lo que sugiere una normalización de los metabolitos en respuesta al tratamiento con PEG-C15S. En todos los grupos, la eficacia máxima se observó durante la primera semana de dosificación. Se observó que los niveles de Hcy disminuyeron significativamente (de aproximadamente el 68% a aproximadamente el 82%) por debajo del nivel inicial para todos los grupos experimentales, tal como se muestra en la tabla 12. El aumento porcentual máximo en los niveles de Cth y Cys también fue máximo durante la semana 1, tal como se muestra en la tabla 13 y tabla 14. La magnitud de la respuesta farmacodinámica disminuyó durante los ciclos posteriores de inyección de PEG-C15S durante la semana 3 y más adelante en la semana 5. En general, la respuesta farmacodinámica más alta y duradera se observó para 20NHS PEG-htCBS C15S.
Se observó una eficacia atenuada durante la segunda tanda de dosificación de htCBS C15S pegilada administrada durante la semana 3 de dosificación para todos los conjugados estudiados con la excepción de 20NHS PEG-htCBS C15S. Se observó una disminución adicional en la eficacia durante el tercer ciclo de dosificación realizado durante la semana 5 en comparación con la semana 3. Aunque la formación de anticuerpos no se midió directamente en estos estudios, esta lenta disminución en la eficacia después de la administración repetida es una indicación clásica de inmunidad adaptativa. Por tanto, la explicación probable de la atenuación fue una respuesta inmunitaria dirigida a htCBS C15S pegilada con ME-200MA0B, MA-400ME, GL4-400MA o ME-050GS.
De los conjugados sometidos a prueba, se observó que 20NHS PEG-htCBS C15S tenía la eficacia más robusta y duradera. Se plantea la hipótesis de que ME-200GS puede enmascarar de manera más eficiente los epítopos inmunogénicos en htCBS C15S en comparación con los otros PEG. Por tanto, se observó que la forma 20NHS PEG-htCBS C15S era la forma más potente y menos inmunogénica de los diversos conjugados de htCBS C15S pegilada sometidos a prueba.
Ejemplo 11. El htCBS C15S pegilada con ME-200MA0B. ME-400MA o ME-200GS rescata a los ratones KO de una muerte prematura
Se realizó un estudio de supervivencia en el modelo de ratón KO descrito en el presente documento para comparar la eficacia de varios diversos conjugados de htCBS C15S.
A. Supervivencia de crías KO hasta el día 21/35
Se representó gráficamente una curva de supervivencia de Kaplan Meyer de ratones KO inyectados tres veces a la semana con 7,5 mg/kg de htCBS C15S pegilada con ME-200MA0B (n=24), ME-400MA (n=31 = 13H 18M) o ME-200GS (n=28= 14H 14M), y un grupo de ratones KO (n=44) a los que se les inyectó PBS como control. Las madres lactantes se mantuvieron con agua con betaína y, después del destete, las crías (día 21) recibieron agua regular sin betaína. Se sometió a prueba la capacidad de la enzima inyectada para rescatar a las crías KO.
Tal como se muestra en la figura 11A, el día 21, sólo aproximadamente el 20% de los ratones sobrevivieron en el grupo al que se le inyectó PBS, a diferencia de aproximadamente el 92% de a los que se les inyectó 200MA0B PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200MA) y aproximadamente el 97% de a los que se les inyectó 400Ma PEG-htCBS C15S (C15S/400MA) o 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/200GS).
B. Niveles de metabolitos después de un reposo farmacológico de fin de semana (mínimo) y 24 horas después de la última inyección (valor máximo)
Los niveles de metabolitos en ratones KO supervivientes a una edad de aproximadamente 4-5 semanas se midieron después de un reposo farmacológico de fin de semana (mínimo) y 24 horas después de la última inyección (valor máximo) usando el procedimiento experimental del ejemplo 1.
Los niveles medidos se compararon con los niveles en compañeros de camada KO /- sanos tratados de manera similar tal como se muestra en la figura 11B. Los niveles plasmáticos de Hcy en ratones KO tratados con 400MA PEG-htCBS C15S oscilaron entre 256±8 |iM 72 horas después de la dosis (ME-400MA) (barra en el extremo izquierdo para cada metabolito) y 145±6 |iM 24 horas tras la dosis (ME-400MA 24 h) (segunda barra desde la izquierda para cada metabolito). Los niveles plasmáticos de Hcy en ratones KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S oscilaron entre 179±10 |iM 72 horas tras la dosis (ME-200GS) (tercera barra desde la izquierda) y 96±8 |iM 24 horas tras dosis (ME-200GS 24 h) (cuarta barra desde la izquierda). Por tanto, la respuesta máxima para ambos conjugados de htCBS C15S se observó 24 horas tras la dosis, y se observó que disminuyó 72 horas tras la dosis. Se observó que el tratamiento con cualquiera de los conjugados disminuyó significativamente (p<0,001) los niveles plasmáticos de la Hcy tóxica hasta aproximadamente la mitad. Por el contrario, se observó que los niveles plasmáticos de homocisteína en los compañeros de camada heterocigóticos sanos tratados eran de aproximadamente 5 |iM en ambos puntos de tiempo.
Se observaron niveles de Cth dentro del intervalo de 57 y 77 |iM en ratones KO tratados con conjugados de htCBS C15S pegilada. Estos niveles plasmáticos fueron aproximadamente 12 veces más altos que los observados en los ratones heterocigóticos no tratados. Se observó que la diferencia entre los niveles plasmáticos máximo y mínimo de Cth era pequeña, lo que demuestra que el efecto farmacodinámico de la enzima sobre los niveles de cistationina puede persistir más allá de las 72 horas y/o que la Cth puede aclararse más lentamente del plasma en comparación con los otros metabolitos, en los que se observaron mayores diferencias. Se observó que los niveles plasmáticos de Cys 72 horas tras la dosis en ratones KO tratados con 400MA PEG-htCBS C15S y 20NHS PEG-htCBS C15S disminuyeron significativamente (p<0,001) hasta 83±4 y 106±6 |iM en comparación con compañeros de camada heterocigóticos sanos (151±6), respectivamente. Se observó que los niveles plasmáticos de Cys aumentaron en ratones KO tratados 24 horas tras la dosis para ambos conjugados, lo que indica una normalización parcial de los metabolitos azufrados circulantes. Se observó que los niveles plasmáticos de Cys aumentaron hasta 157±624 horas tras la administración de 400MA PEG-htCBS C15S y hasta 176±6 |iM 24 horas tras la administración de 20NHS PEG-htCBS C15S. Los niveles plasmáticos de metionina estaban ligeramente elevados en los ratones KO en comparación con los controles heterocigóticos sanos y no cambiaron significativamente entre los niveles mínimo y máximo.
C. Esperanza de vida después de un tratamiento inicial o continuo
Después de un tratamiento largo inicial de 35 días (5 semanas) para prevenir la mortalidad neonatal de los ratones KO, se dividieron en dos grupos los ratones KO tratados con 20NHs PEG-htCBS C15S. Un grupo (5S) dejó de recibir cualquier tratamiento además del inicial, mientras que el otro grupo (CONT) continuó con la misma pauta hasta los 120 días de edad (7,5 mg/kg, s.c., 3 veces a la semana).
Se observó la supervivencia de estos grupos de crías KO durante hasta 4 meses y se representó gráficamente en la figura 11C. Todos los ratones KO a los que se les administró continuamente 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS) sobrevivieron al menos 119 días tal como se muestra en la figura 11C. La finalización del tratamiento después de los 35 días iniciales dio como resultado una supervivencia de aproximadamente el 85% a los 119 días de edad.
D. Peso total y aumento de peso de ratones KO tratados con CBS frente aratones sanos +/
Se determinó el peso total y la cantidad de aumento de peso de los ratones KO (n = 16 machos y n = 11 hembras) a los que se les administró 20NHS PEG-htCBS C15S tres veces a la semana a una dosis de 7,5 mg/kg y se comparó con compañeros de camada sanos /- tratados de manera similar (n=14 machos y n=13 hembras). Se midieron el peso total y el aumento de peso en los ratones después del destete desde el día 21 hasta el día 36.
Se observó que los ratones macho heterocigóticos tenían el mayor peso total entre los días 23 y 35, que oscilaba entre aproximadamente 10,5 g y aproximadamente 18 g, aunque los ratones macho KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S tenían el peso total más alto el día 21 (aproximadamente 10 g). Los ratones hembra KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S tenían el peso total más bajo después del día 23, que oscilaba entre aproximadamente 10 g y aproximadamente 14 g.
Los ratones macho sanos (n=14) también tuvieron la mayor cantidad de aumento de peso a partir del día 23, que oscilaba entre aproximadamente de 2 g y aproximadamente de 9,5 g. La cantidad de aumento de peso en los ratones macho KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S (n=16) y los ratones hembra KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S (n=11) fue significativamente menor que la cantidad de aumento de peso para ambos grupos de control.
Ejemplo 12. La htCBS C15S pegilada retrasa, previene y revierte la alopecia facial en un modelo de ratón I278T
Se observó que el modelo de ratón homocigótico I278T -/- de homocistinuria presentaba rasgos fenotípicos específicos, tales como alopecia facial, además del perfil típico de metabolito, a diferencia de otros modelos de ratón con homocistinuria. La alopecia facial se define como la pérdida del pelo de la cara y la cabeza. La aparición de la alopecia facial es aproximadamente a los 90 días (S12), normalmente desarrollada por completo aproximadamente a los 120 días de edad (S17).
Se plantea la hipótesis de que la alopecia facial está relacionada con la homocistinuria y el perfil metabólico relacionado; por tanto, la administración de terapia de reposición enzimática (TRE; PEG-CBS) debería rescatar este fenotipo al ralentizar el avance, prevenir/retrasar la aparición y/o revertir el daño ya causado.
A. Retraso de la aparición de la alopecia facial
Se dividieron en 2 grupos los ratones de 3S de edad que no mostraban ningún signo de alopecia facial. Al primer grupo (n=3 machos) se le inyectó 7,5 mg/kg tres veces a la semana de 200MA0B PEG-htCBS C15S durante un periodo de 6 semanas. El aspecto físico se registró antes del experimento y se monitorizó semanalmente, luego quincenalmente después de la pauta de inyección de 6S. Los niveles de metabolitos se comprobaron antes del experimento y 24 horas después de la última inyección, es decir, después de la pauta de inyección de 6S.
Se observó que la administración de 200MA0B PEG-htCBS C15S durante un periodo de 6 semanas a partir de las 3S de edad retrasaba la aparición de alopecia facial en la figura 12A. Se observó que los ratones I278T afectados (-/-) o sanos (+/-) no podían distinguirse a esa edad, y los ratones -/- no tenían signos de pérdida de pelo facial. No se observó que los ratones heterocigóticos sanos I278T /- no tratados padecieran pérdida de pelo facial a las 19S y sólo una leve pérdida del pelo a las 34S, a diferencia de los ratones homocigóticos afectados I278T -/- no tratados, que se observó que tenían una alopecia facial completamente desarrollada a las 38S. Normalmente, la alopecia facial se vuelve evidente a las 12S y se desarrolla por completo a las 17S.
Se observó que la administración de 200MA0B PEG-htCBS C15S durante 6 semanas (la edad de los ratones durante la inyección fue de 4S-10S) retrasó la aparición de la alopecia durante aproximadamente el mismo tiempo que la duración del tratamiento (6 semanas), tal como se demuestra por los ratones homocigóticos afectados I278T -/-, que se observó que no mostraban signos de pérdida de pelo facial a los 4M de edad y sólo mostraban signos iniciales a los 7M de edad. Estos resultados demuestran que la administración de 200MA0B PEG-htCBS C15S durante 6 semanas retrasó la aparición de la alopecia facial en ratones I278T.
B.Prevención total del desarrollo de la alopecia facial
Al segundo grupo (n=3; 2 machos, 1 hembra) se le inyectó continuamente 7,5 mg/kg de 200MA0B PEG-htCBS C15S administrado por vía subcutánea desde las 3S de edad hasta las 41 semanas de edad. El peso se monitorizó al principio semanalmente. El aspecto físico se registró antes del experimento y se monitorizó semanal o quincenalmente después de la pauta de inyección de 6S inicial. Los niveles de metabolitos se comprobaron antes del experimento y 24 horas después de la última inyección de la pauta de inyección de 6S inicial y luego se siguieron semanal o quincenalmente.
Se observó que la administración continua de 200MA0B PEG-htCBS C15S a ratones homocigóticos I278T -/- prevenía por completo la aparición y el desarrollo de alopecia facial en ratones observados a las 19S, 24S, 31S y 35S de edad tal como se muestra en la figura 12B. El aspecto físico de tales ratones tratados se parece al observado normalmente en los ratones heterocigóticos I278T /- sanos y difiere significativamente del aspecto físico tanto de los controles I278T -/- no tratados como de los homocigóticos I278T -/- a las 36S de edad y mayores tratados durante un periodo de sólo 6 semanas.
Las mediciones de metabolitos en la figura 12C muestran que la administración continua de 200MA0B PEG-htCBS C15S dio como resultado una disminución significativa de los niveles de Hcy en comparación con los niveles antes del tratamiento (aproximadamente 300 |iM) y la estabilización en niveles de aproximadamente de 100 |iM de Hcy total (línea central). Los niveles de Cys (línea superior) se normalizaron con el tratamiento (desde aproximadamente 130 |iM hasta aproximadamente 240 |iM) y se mantuvieron durante todo el tiempo en niveles de aproximadamente 230 |iM.
C. Reversión/normalización del fenotipo una vez que la alopecia facial se ha desarrollado por completo
Se dividieron en 2 grupos los ratones I278T, que tenían al menos 120D (17S) de edad y tenían alopecia facial completamente desarrollada y visible. Al grupo A (n=6; 3 machos y 3 hembras) se le inyectó 3 veces a la semana 400Ma PEG-htCBS C15S, y al grupo B (n=4; 2 machos, 2 hembras) se le inyectó 3 veces a la semana 20NHS PEG-htCBS C15S hasta una edad de aproximadamente 1 año. Los niveles de metabolitos se determinaron antes del inicio del tratamiento y se midieron durante el estudio 24 horas después de la inyección, y el peso y el aspecto físico se monitorizaron al principio semanalmente y luego quincenalmente.
Para la reversión de la alopecia facial en ratones homocigóticos I278T -/- (también conocida como normalización del fenotipo), se inició el tratamiento de ratones que ya expresaban completamente el fenotipo de alopecia facial. La edad de los animales al comienzo del estudio oscilaba entre 24S y 28S de edad, que está más allá de la edad típica de aparición de la alopecia (120D o 17S).
La administración continua de cualquiera de los conjugados de PEG-CBS durante 3 veces a la semana mejoró significativamente la alopecia facial tal como se muestra en la figura 12D, aunque no la normalizó completamente en comparación con los controles heterocigóticos I278T /- no afectados no tratados. Se observó que 20NHS PEG-htCBS C15S funcionaba mejor que 400MA PEG-htCBS C15S porque todos los animales tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S respondieron al tratamiento (4 de 4), mientras que sólo 5 de 6 animales respondieron al tratamiento con 400MA PEG-htCBS C15S. Además, una observación subjetiva de los ratones proporciona que el espesor y el brillo del pelaje de los ratones era mejor para aquellos a los que se les administró 20NHS PEG-htCBS C15S.
Además, las mediciones de metabolitos en la figura 12E muestran que, aunque ambas moléculas de PEG-CBS eran eficaces, se observó que 20NHS PEG-htCBS C15S (grupo B) disminuyó los niveles de Hcy y aumentó los niveles de Cys más sustancialmente que 400MA PEG-htCBS C15S (grupo A).
D. Conclusiones
La administración de PEG-CBS independientemente del resto PEG dio como resultado una mejora de la alopecia facial, que es un rasgo fenotípico típico de los ratones homocigóticos I278T -/- no tratados, tal como se mencionó anteriormente. La administración de TRE durante 6 semanas dio como resultado un retraso en la aparición de la alopecia facial. La administración continua de TRE a los ratones antes de la aparición de la alopecia facial previno por completo su desarrollo, y tales animales no podían distinguirse de los ratones heterocigóticos I278T /- sanos no afectados. La administración continua de TRE a los ratones con alopecia facial ya completamente desarrollada dio como resultado una mejora significativa de su aspecto físico. En todos los casos, el efecto positivo sobre la alopecia facial estuvo acompañado o fue provocado por la normalización al menos parcial (Hcy) o total (Cys) de los niveles de metabolitos en plasma.
Ejemplo 13. La 20NHS PEG-htCBS C15S mejora la hepatopatía en ratones KO
El análisis histológico se realizó para cortes de hígado de ratones KO a los que se les había inyectado por vía subcutánea (s.c.) 7,5 mg/kg de 20NHS PEG-htCBS C15S o PBS tres veces a la semana desde los 2 días de edad y que se sacrificaron a los 17-19 días de edad, y se compararon con los hígados de ratones de control sanos /- de la misma edad.
A. Microscopía óptica
Se sacrificaron los animales el día 17-19 y se procesaron las muestras de hígado para el análisis histológico mediante microscopía óptica. Se observó que el parénquima hepático de los ratones KO inyectados con PBS, tal como se muestra en la figura 13A, tenía una arquitectura ligeramente irregular de los lobulillos hepáticos con esteatosis de moderada a grave, necrosis hepatocelular focal y reacción inflamatoria reabsortiva, que se indica con la flecha. Se observó que el parénquima hepático de los ratones KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S y los ratones heterocigóticos sanos, también mostrado en la figura 13A, tenía una arquitectura hepática regular y anisocariosis mínima.
En la figura 13B se muestra el mayor detalle proporcionado por una mayor ampliación del mismo corte de hígado mostrado en la figura 13A, con insertos que muestran la tinción con Oil Red O para lípidos. Se observó que los ratones KO inyectados con PBS tenían esteatosis microvesicular y macrovesicular, anisocariosis, necrosis focal de hepatocitos y una reacción inflamatoria reabsortiva. Estas características están señaladas por las flechas. Se observó que el parénquima hepático de los ratones KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S tenía una anisocariosis mínima, tal como se demuestra por los núcleos de los ratones KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S y los ratones heterocigóticos sanos, ambos de tamaño y forma regulares con cromatina fina y nucléolos poco visibles. Las distintas gotitas de lípido observadas en el citoplasma de los hepatocitos de los ratones sanos y tratados pudieron detectarse usando tinción con Oil Red O (véanse los insertos en la figura 13B).
B. Microscopía electrónica
También se observó el tejido hepático de un ratón heterocigótico (+/-) sano, un ratón KO tratado con PBS y un ratón KO tratado con 400MA PEG-htCBS C15S mediante microscopía electrónica con un aumento de 3000x. Las imágenes de microscopía electrónica capturadas se muestran en la figura 14A. En la figura 14A, las flechas negras indican el retículo endoplásmico (RE) rugoso y las flechas blancas indican las mitocondrias (MT). Los asteriscos negros indican glicógeno citosólico y los asteriscos negros dobles indican los núcleos. Los asteriscos blancos indican gotitas de lípido.
Se observó que el ratón /- tenía un hepatocito binucleado con una composición de citoplasma normal y núcleos con morfología normal. Se observó que las cisternas del RE rugoso eran delgadas y estaban organizadas regularmente, y se observó que las MT tenían un tamaño y una forma normales. Se observó que los núcleos eran regulares y normocromáticos con nucléolos poco visibles.
Se observó que el ratón KO tratado con PBS tenía esteatosis, un mayor número de orgánulos citoplásmicos y un núcleo hipercromático irregular del hepatocito. Se observó que el citoplasma era rico en orgánulos y contenía numerosas gotitas de lípido (asteriscos blancos) y MT edematosas. Se observó que el núcleo tenía cromatina gruesa, un contorno irregular y un nucléolo prominente.
Se observó que el ratón tratado con 400MA PEG-htCBS C15S tenía una composición de citoplasma normal en el hepatocito y un núcleo normocromático regular. Al igual que el ratón /-, se observó que las cisternas del RE eran delgadas y estaban organizadas regularmente, las MT tenían un tamaño y una forma normales, y el núcleo parecía normal con cromatina fina.
Las imágenes de microscopía electrónica con un aumento de 8000x confirman estos hallazgos con mayor detalle, tal como se muestra en la figura 14B. En la figura 14B. las flechas negras indican el retículo endoplásmico (RE) y las flechas blancas indican las mitocondrias (MT). Los asteriscos negros indican glicógeno citosólico. Se observó que los ratones tratados con 400MA PEG-htCBS C15S y los ratones /- tenían cisternas del RE rugoso delgadas y normalmente organizadas y MT regulares. Se observó que el ratón KO tratado con PBS era rico en cisternas y vesículas. Se observó que las cisternas del RE presentaban anchuras que aumentaban de forma variable. Se observó que las MT eran polimorfas y estaban hinchadas con crestas desorganizadas.
C. Comparación de niveles de metabolitos en plasma y tejidos en ratones KO a los 18-19 días de edad
Los metabolitos en plasma y tejido se midieron en los grupos de ratones de tipo natural (control), ratones KO afectados homocigóticos -/- no tratados y ratones KO tratados con 400MA PEG-htCBS C15S. Al grupo tratado se le administraron inyecciones subcutáneas de 400MA PEG-htCBS C15S 3 veces a la semana a una dosis de 7,5 mg/kg desde los 2 días de edad. El plasma y los tejidos se recogieron 24 horas después de la última inyección. La tabla 15 muestra los niveles de Hcy, Cys, Cth y Met en plasma.
Tabla 15. Niveles de metabolitos en plasma [pM ± EEM]
La tabla 16 muestra los niveles de Hcy, Cys, Cth y Met en tejido hepático.
Tabla 16. Niveles de metabolitos en tejido hepático [nmol/g ± EEM]
La tabla 17 muestra los niveles de Hcy, Cys, Cth y Met en tejido renal.
Tabla 17. Niveles de metabolitos en tejido renal [nmol/g ± EEM]
La tabla 18 muestra los niveles de Hcy, Cys, Cth y Met en tejido cerebral.
Tabla 18. Niveles de metabolitos en tejido cerebral [nmol/g ± EEM]
Ejemplo 14. Efectos de la administración continua de 20NHS PEG-htCBS C15S usando una bomba osmótica ALZET® en ratones HO
Las bombas osmóticas ALZET® proporcionan una administración constante y controlada de 20NHS PEG-htCBS C15S durante un periodo de tiempo prolongado en ratones HO nuevos y sin tratamiento previo. La htCBS C15S pegilada con ME-200GS se administró usando cuatro modelos diferentes de bombas microosmóticas ALZET®, que dispensan continuamente un volumen de enzima por hora en lugar de inyecciones subcutáneas repetidas: modelo 1002 (0,25 |il/h), modelo 2002 (0,5 pl/h), modelo 2004 (0,25 pl/h) y modelo 2006 (0,15 pl/h).
Para el alivio del dolor, antes y después de la operación, a los animales también se les administró TYLENOL® (2 mg/ml) en frascos de agua a voluntad durante 48 horas antes y después de la cirugía para la implantación de la bomba ALZET®. Además, los animales recibieron 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea cada 24 horas y durante las 48 horas posteriores a la operación. Para la anestesia durante la cirugía, se administró isoflurano al 5% por inhalación y se mantuvo al 2-3% durante la cirugía. Mientras los ratones estaban anestesiados, cada uno de ellos recibió una bomba osmótica ALZET® de calidad médica implantada en condiciones estériles en una vitrina de seguridad biológica. Las bombas se implantaron por vía subcutánea en la zona de piel suelta en el lado ventral del cuello. Antes de implantar la bomba, se afeitó a los ratones y se preparó la zona de la piel con BETADINE®. La implantación de la bomba requirió una pequeña incisión quirúrgica (5 mm) realizada con tijeras estériles. La incisión se cerró con grapas de sutura, que se retiraron después de 1 semana cuando la piel había cicatrizado por completo. Se tomaron muestras de sangre a los 1, 3, 6, 9, 12, 15, 19 y 20 días para los modelos de bomba 1002 y 2002. Los modelos de bomba 2004 y 2006 se retiraron quirúrgicamente al final del ciclo de vida designado de la bomba (4 y 6 semanas para los modelos 2004 y 2006, respectivamente). Por tanto, la recolección de muestras de sangre se ajustó para cada bomba: 1, 3, 5, 12, 19, 26, 31, 32, 33 y 36 días para el modelo 2004 explantado el día 30 del estudio y 1, 3, 5, 12, 19, 26, 33, 40, 45, 46, 47 y 50 días para el modelo 2006 explantado el día 44 del estudio. Se usaron muestras de plasma para determinar la actividad de CBS en plasma y medir los niveles de Hcy, Cth y Cys.
La enzima administrada para los modelos 1002 y 2002 fue 20NHS PEG-htCBS C15S a una concentración de 21 pg/pl y con una actividad específica de 673,9±13,2 U/mg. En estos experimentos, el modelo 1002 tenía una tasa de bombeo media de 0,25±0,01 |il/h durante un periodo de 14 días y el volumen de llenado medio era de 110,7±6,5 |il. La tasa de administración de la enzima fue de 5,25 |ig/h de la enzima, lo que equivale a 126 |ig/día, o aproximadamente 3,5 U/h, lo que equivale a 85 U/día.
El modelo 2002 tuvo una tasa de bombeo media de 0,48±0,02 |il/h durante un periodo de 14 días y el volumen de llenado medio fue de 207±7 |il. La tasa de administración fue de 0,5 |ig/h de la enzima, lo que equivale a 252 |ig/día, o aproximadamente 7 U/h, lo que equivale a 168 U/día.
La figura 15A es un gráfico que compara los niveles plasmáticos de Hcy y Cys entre ratones HO implantados con un modelo 1002 o modelo 2002 de bomba osmótica ALZET®. Se observó una superposición de los niveles de metabolitos en el plasma de ambos grupos. La figura 15B es un gráfico que compara la actividad específica del 20NHS PEG-htCBS C15S en plasma después de la administración continua con un modelo 1002 o modelo 2002 de bomba osmótica ALZET®. Se observó que la actividad de CBS en el plasma de los ratones HO implantados con el modelo 2002 de bomba se duplicó prácticamente, en comparación con los ratones implantados con el modelo 1002. Sin embargo, el doble de la actividad de CBS en el plasma de los ratones implantados con el modelo 2002 de bomba dio como resultado una mejora similar de metabolitos plasmáticos tal como se logró en ratones implantados con el modelo 1002 de bomba y que tenían prácticamente la mitad de la actividad de CBS en plasma en comparación con el grupo de modelo 2002.
La enzima administrada para los modelos 2004 y 2006 fue ME-200GS PEG-htCBS C15S a una concentración de 18 |ig/|il y con una actividad específica de 623,2±16,4 U/mg. El modelo 2004 tenía una tasa de bombeo media de 0,23±0,01 |il/h durante un periodo de 28 días y el volumen de llenado medio era de 237,7±4,6 |il. La tasa de administración de la enzima fue de 4,5 |ig/h de la enzima, lo que equivale a 108 |ig/día, o aproximadamente 2,8 U/h, lo que equivale a 67 U/día. Se explantó el modelo 2004 de bomba osmótica ALZET® a los 30 días.
El modelo 2006 tenía una tasa de bombeo media de 0,15±0,01 |il/h durante un periodo de 42 días y el volumen de llenado medio era de 237,2±3,0 |il. La tasa de administración de la enzima fue de 2,7 |ig/h de la enzima, lo que equivale a 65 |ig/día, o aproximadamente 1,7 U/h, lo que equivale a 40 U/día. Se explantó el modelo 2006 de bomba osmótica ALZET® a los 44 días.
La figura 15C y la figura 15D muestran gráficos que comparan los niveles de metabolitos y la actividad de CBS, respectivamente, en el plasma de ratones a los que se les administró 20NHS PEG-htCBS C15S con el modelo 2004 o el modelo 2006 de bomba osmótica ALZET®. A pesar de que el modelo 2004 dispensa un 67% más de enzima que el modelo 2006 de bomba, se observó que ambos grupos de ratones tenían perfiles de metabolitos en plasma similares. Se observó que los niveles plasmáticos de Hcy se redujeron sustancialmente en los ratones tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S, aunque sólo hubo un modesto aumento en los niveles plasmáticos de Cys.
Ejemplo 15. La administración continua a largo plazo de 20NHS PEG-htCBS C15S previene la osteoporosis en ratones KO e I278T
Se analizaron los efectos de la administración continua a largo plazo de 20NHS PEG-htCBS C15S en ratones KO e I278T usando absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA) usando el protocolo del ejemplo 1.
A. Mineralización ósea y composición corporal en ratones KO
Se analizaron la densidad mineral ósea (DMO) y el contenido mineral óseo (CMO) mediante DEXA para tres grupos de ratones: controles heterocigóticos sanos /- (n=4M+6H), controles KO afectados (n=5M+13H) y ratones KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS) (n=6M+15H). A los ratones tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S se les administró 7,5 mg/kg por vía subcutánea (s.c.) tres veces a la semana desde el día 2 hasta aproximadamente los 5 meses. Todos los ratones KO -/- se trataron durante las 5 semanas iniciales (desde los 2 hasta los 35 días de edad) para prevenir la mortalidad neonatal.
La figura 16A, la figura 16B, la figura 16C, la figura 16D y la figura 16E son gráficos que comparan la DMO (g/cm2), el CMO (g), la masa total (g), la masa magra (g) y el contenido de grasa (%), respectivamente, entre los tres grupos de ratones. La tabla 19 proporciona los valores de P usados para determinar la significación de las diferencias en el grupo tratado en comparación con los dos grupos de control.
Tabla 19. Valores de P para los parámetros determinados mediante DEXA en ratones KO
Se estableció un valor de P de 0,05 como umbral para determinar la significación. El grupo tratado tenía una DMO significativamente mayor que ambos grupos de control. El grupo tratado también tenía un CMO, una masa total, una masa magra y un contenido de grasa significativamente más altos que el control con inactivación completa. Por tanto, el tratamiento de ratones KO con 20NHS PEG-htCBS C15S previno por completo la osteoporosis profunda y mejoró la composición corporal (masa total, masa magra y contenido de grasa).
B. Metabolitos plasmáticos en ratones KO
En ratones KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S, se midieron los niveles plasmáticos de Hcy, Cth y Cys quincenalmente durante el transcurso del estudio y se muestran en la figura 16F. Inicialmente, se tomó una muestra de sangre el día 41 (no representa un verdadero tiempo cero, sino los niveles de metabolitos 72 horas después de la inyección), luego, a partir del día 45, se tomó una muestra cada dos semanas. Se observó que el nivel de Hcy (línea central) disminuyó desde aproximadamente 180 |iM el día 45 hasta aproximadamente 90 |iM el día 45 y se mantuvo constante en esos niveles durante todo el estudio. El nivel de Cys (línea superior) se normalizó con el tratamiento desde menos de 100 |iM el día 45 hasta aproximadamente 200 |iM el día 45 y se mantuvo durante el transcurso del estudio. El nivel de Cth (línea inferior) osciló alrededor de 50 |iM durante toda la duración del estudio.
Los metabolitos plasmáticos se determinaron usando los mismos ratones/grupos que se describieron anteriormente. Los niveles de punto final de los metabolitos Hcy, Cth, Cys y Met se determinaron 24 horas después de la última inyección a los ratones KO tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S (barra derecha para cada metabolito) y se compararon con ratones KO afectados -/- (barra central) y sanos /- no tratados (barra izquierda), tal como se muestra en la figura 16G. La tabla 20 proporciona los valores de P usados para determinar la significación de las diferencias en los niveles de metabolitos en el grupo tratado en comparación con los dos grupos de control.
Tabla 20. Valores de P para los cambios en los niveles de metabolitos en ratones KO
Se estableció un valor de P de 0,01 como umbral para determinar la significación. Se observó que los niveles de Hcy disminuyeron significativamente, los niveles de Cth aumentaron significativamente y los niveles de Cys se normalizaron en ratones KO que recibieron 20NHS PEG-htCBS C15S en comparación con los ratones KO no tratados. Se observó que los niveles de Met estaban ligeramente elevados en ratones KO no tratados, pero no eran significativamente diferentes entre los grupos.
Por tanto, se observó que la administración continua a largo plazo de 20NHS PEG-htCBS C15S a ratones KO mejoraba significativamente los niveles plasmáticos de Hcy, Cth y Cys en comparación con los ratones KO -/- no tratados. Los niveles plasmáticos de Cys se normalizaron (es decir, no fueron significativamente diferentes) a los valores de ratones sanos /-. Se observó que los datos de metabolitos se correlacionaban con el fenotipo determinado por DEXA.
C. Mineralización ósea y composición corporal en ratones I278T
Se analizaron la densidad mineral ósea (DMO) y el contenido mineral óseo (CMO) mediante DEXA para tres grupos de ratones I278T: controles heterocigóticos sanos /- (n=10M+11H), controles I278T homocigóticos afectados - /-(n=6M+8H) y ratones I278T tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S (n=6M+6H). A los ratones I278T tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS) se les administró 7,5 mg/kg por vía subcutánea (s.c.) 3 veces a la semana desde los 6 meses hasta los 13 meses de edad. La figura 17A, la figura 17B, la figura 17C, la figura 17D y la figura 17E son gráficos que comparan la DMO (g/cm2), el CMO (g), la masa total (g), la masa magra (g) y el contenido de grasa (%), respectivamente, entre los tres grupos de ratones. La tabla 21 proporciona los valores de P usados para determinar la significación de las diferencias en el grupo tratado en comparación con los grupos de control.
Tabla 21. Valores de P para los parámetros determinados mediante DEXA en ratones I278T
Se estableció un valor de P de 0,05 como umbral para determinar la significación. Todos los parámetros determinados por DEXA se redujeron significativamente en los ratones I278T afectados en comparación con los ratones heterocigóticos sanos. El tratamiento de ratones I278T con 20NHS PEG-htCBS C15S dio como resultado una corrección significativa de todos los parámetros excepto la cantidad de masa magra en comparación con los ratones I278T no tratados. De hecho, se observó que los valores de mineralización ósea (DMO) no podían distinguirse entre los controles heterocigóticos sanos y los ratones I278T tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S. Por tanto, el tratamiento de ratones I278T con 20NHS PEG-htCBS C15S también previno la osteoporosis profunda y mejoró la composición corporal (masa total, masa magra y contenido de grasa).
D. Metabolitos plasmáticos en ratones I278T
Los metabolitos plasmáticos se determinaron en los mismos ratones/grupos que se describieron anteriormente y se compararon entre sí. Los niveles plasmáticos de los metabolitos Hcy, Cth, Cys y Met se muestran en la figura 17F. La barra izquierda representa el nivel de metabolito para los controles sanos /- y la barra central representa el nivel de metabolito para los controles afectados -/-. Los niveles de cada metabolito en ratones tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S están representados por la barra derecha. La tabla 22 muestra los valores de P usados para determinar la significación de las diferencias en los niveles de metabolitos en plasma entre los controles sanos /-, los controles afectados -/- y los ratones I278T tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S.
Tabla 22. Valores de P de los cambios en los metabolitos en plasma
Se estableció un valor de P de 0,01 como umbral para determinar la significación. Se observó que los niveles de Hcy disminuyeron significativamente, los niveles de Cth aumentaron significativamente y los niveles de Cys mejoraron significativamente, pero no se normalizaron, en ratones I278T que recibieron 20NHS PEG-htCBS C15S en comparación con los controles I278T afectados no tratados. Los niveles de Met estaban ligeramente elevados en ratones I278T afectados no tratados y se normalizaron significativamente a niveles de ratones heterocigóticos /- en ratones I278T después del tratamiento.
Estos resultados son similares a los resultados del estudio mediante DEXA con ratones KO, excepto que no se observó la normalización de los niveles de Cys a niveles /- en el grupo de I278T tratado. Por tanto, la administración continua a largo plazo de 20NHS PEG-htCBS C15S a ratones I278T mejoró significativamente los niveles plasmáticos de Hcy, Cth, Cys y Met en comparación con los ratones afectados homocigóticos -/- no tratados. Se observaron estos datos de metabolitos para corroborar el fenotipo evaluado por DEXA.
Por tanto, la administración continua a largo plazo de 20NHS PEG-htCBS C15S previene la osteoporosis y mejora la composición corporal en modelos de ratón KO e I278T, y es eficaz para mejorar los niveles de metabolitos que están asociados con la homocistinuria.
Ejemplo 16. La administración continua a largo plazo de 200MA0B PEG-htCBS C15S mejora el metabolismo y la función del hígado, reduce la inflamación y normaliza los lípidos plasmáticos en ratones I278T
Se observó que la administración de 200MA0B PEG-htCBS C15S a ratones I278T mejoraba el metabolismo hepático de la glucosa, el estado redox y el potencial de metilación, así como el metabolismo de los lípidos. Se observó que la función hepática no se vio afectada, y se observó que las citocinas inflamatorias y los lípidos plasmáticos se normalizaron con el tratamiento.
A. Efectos de la administración a largo plazo de 200MA0B PEG-htCBS C15S sobre la función hepática y el metabolismo de los lípidos en ratones I278T
Los biomarcadores plasmáticos se midieron en ratones I278T después de un tratamiento a largo plazo con 200MA0B PEG-htCBS C15S para analizar la función hepática, la inflamación y los niveles de lípidos en plasma. Se analizaron tres grupos de ratones I278T: control heterocigótico sano /- (n=3), control homocigótico afectado -/- (n=3) y ratones I278T tratados con 200MA0B PEG-htCBS C15S (n=3). A los ratones tratados con 200MA0B PEG-htCBS C15S se les administró 7,5 mg/kg por vía subcutánea (s.c.) 3 veces a la semana desde los 6 meses hasta los 13 meses de edad. Las actividades enzimáticas de la alanina aminotransferasa (ALT), la aspartato aminotransferasa (AST) y la fosfatasa alcalina (ALP); las concentraciones de citocinas IL-12 (p40), IL-12 (p20), IL-13, G-CSF, MCP-1 y TNF-a; y las concentraciones de lípidos en plasma (colesterol total, HDL y LDL, y triglicéridos) se midieron en plasma (resultados no mostrados). Se observó que la función hepática no se vio afectada ya que las actividades de AST, ALT y ALP en plasma estaban dentro del intervalo de referencia. Se observó que las citocinas inflamatorias, particularmente IL-12 (p40) e IL-13, estaban elevadas en ratones I278T no tratados y se normalizaron con el grupo tratado. El grupo de lípidos en plasma mostró que los ratones I278T no tratados tienen colesterol total, HDL y LDL significativamente más altos, mientras que los triglicéridos disminuyen sustancialmente en comparación con los controles sanos /-. El perfil de lípidos se normalizó por completo en ratones I278T tratados con 200MA0B PEG-htCBS C15S.
B. Efectos de la administración a largo plazo de 200MA0B PEG-htCBS C15S sobre el metabolismo hepático en ratones I278T
Además de los biomarcadores descritos anteriormente, se realizó metabolómica por resonancia magnética nuclear (RMN) para analizar el tejido hepático de los mismos ratones para investigar el efecto del tratamiento a largo plazo con 200MA0B PEG-htCBS C15s en ratones I278T. Los metabolitos de los tejidos hepáticos se extrajeron en disolventes hidrófilos y lipófilos y se cuantificaron por separado mediante RMN.
Las concentraciones de glicógeno, glucosa, glutatión (GSH), glutatión total y grupos metilo en la fracción hidrófila se muestran en la figura 18A. La barra izquierda representa las concentraciones en controles sanos /- y la barra central representa las concentraciones en controles afectados -/-. Las concentraciones en ratones tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S están representadas por la barra derecha. Para la fracción hidrófoba, los ácidos grasos insaturados (AGI) totales, los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI), los ácidos grasos t, los lípidos (CH2)n y los lípidos totales se muestran en la figura 18B. La barra izquierda representa las concentraciones en controles sanos /- y la barra central representa las concentraciones en controles afectados -/-. Las concentraciones en ratones tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S están representadas por la barra derecha. Se observó que la administración de 200MA0B PEG-htCBS C15S a ratones I278T mejora el metabolismo hepático de la glucosa, el estado redox y el potencial de metilación, así como el metabolismo de los lípidos.
Ejemplo 17. El tratamiento a largo plazo con 20NHS PEG-htCBS C15S mejora los defectos oculares en ratones I278T
Los cambios en los niveles de metabolitos en plasma se midieron en ratones de control heterocigóticos sanos (+/-) I278T, ratones de control homocigóticos afectados -/- no tratados y ratones I278T homocigóticos -/- tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S. A los ratones tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS) se les administró 7,5 mg/kg por vía subcutánea (s.c.) 3 veces a la semana desde los 2 días hasta los 4 meses de edad. Los cambios en los niveles de metabolitos en plasma desde las 6 semanas hasta los 4 meses se muestran en la figura 19A. Los niveles se midieron a partir de las 72 horas después de la inyección cuando los ratones estaban en tratamiento desde los 2 días de edad.
Tal como se esperaba, el control I278T homocigótico no tratado tenía un nivel de Hcy significativamente elevado y un nivel de Cys reducido en comparación con los controles heterocigóticos sanos tal como se muestra en la figura 19A. El nivel de Hcy en los ratones I278T homocigóticos no tratados fluctuó entre aproximadamente 400 |iM y 440 |iM durante el estudio, lo que demuestra una acumulación continua de Hcy debido a la falta de CBS funcional. En los ratones I278T tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S, el nivel de Hcy disminuyó desde 230 |iM hasta aproximadamente 70 |iM y mantuvo este nivel durante el resto del estudio. Además, la actividad de 20NHS PEG-htCBS C15S dio como resultado una acumulación de Cth en plasma de aproximadamente 50 |iM durante todo el estudio y, lo que es más importante, la normalización de los niveles de Cys en plasma a aproximadamente de 230 |iM, que se mantuvo durante todo el estudio.
Los ojos de los ratones I278T se analizaron y compararon entre los tres grupos. El control heterocigótico sano y el control I278T afectado -/- no tratado se comparan en la figura 19B y la figura 19C, respectivamente, se observó que el control homocigótico no tratado tenía menos fibras zonulares y más delgadas, que terminaban en el ecuador del cristalino justo por encima de las filas meridionales y no crecían en la superficie posterior del cristalino. En las muestras de los ratones tratados con 20NHS PEG-htCBS C15S que se muestran en la figura 19D y la figura 19E, se observó un enriquecimiento de la densidad de las fibras zonulares y signos de “recrecimiento” de las fibras zonulares sobre la superficie posterior de la lente. Estas observaciones demuestran que el tratamiento a largo plazo con 20NHS PEG-htCBS C15S tuvo un efecto positivo sobre los defectos oculares en los ratones homocigóticos I278T.
Ejemplo 18. La combinación de la administración de 20NHS PEG-htCBS C15S y una dieta restringida en Met normaliza los niveles de Hcy en ratones I278T
Se realizó un estudio de dieta en ratones I278T y se analizaron. Metabolitos plasmáticos de ratones de 10 semanas de edad: I278T /- (control), I278T -/- (control negativo) y ratones -/-tratados con 20NHS PEG-htCBS (OT-58). Cada grupo se dividió en subgrupos: uno sigue una dieta regular (dieta de 8,2 g/kg de Met TD.01084 agua con zinc) (REG) y otro sigue una dieta restringida en metionina (dieta de 0,5 g/kg de Met TD.110591 agua con betaína) (MRD). El tratamiento se inició a las 5S de edad.
La figura 20A muestra los niveles de Hcy entre los 6 grupos. Se observó un alto nivel de Hcy (356 |iM, lo que es compatible con los experimentos anteriores usando ratones I278T) en ratones -/- que siguen una dieta REG. Se observó que el nivel de Hcy era sustancialmente más bajo (51 |iM) en el grupo tratado que sigue la dieta REG. También se observó un nivel relativamente alto de Hcy (41 |iM) en ratones -/- que siguen una dieta MRD, que se normalizó con el tratamiento con OT-58 (2 |iM frente a 4 |iM en /- que siguen una dieta MRD).
La figura 20B muestra los niveles de Cth entre los 6 grupos. Se observó un alto nivel de Cth en los ratones tratados con OT-58 -/- que siguen ambas dietas, 113 pM para la dieta REG frente a 10 pM para la dieta MRD, y el nivel fue mayor en los ratones que siguen una dieta REG debido a la disponibilidad de sustrato. Se observó una tendencia similar entre las dietas REG y MRD para los grupos restantes, lo que demuestra que los altos niveles de Cth (particularmente en -/- que siguen una dieta REG) resultan de la dieta.
La figura 20C muestra los niveles de Cys entre los 6 grupos. Se observó que los niveles de Cys disminuyeron sustancialmente sólo en ratones -/- que siguen una dieta r Eg , mientras que se observó que una dieta MRD y/o un tratamiento con OT-58 normalizaban los niveles plasmáticos de Cys.
La figura 20D muestra los niveles de Met entre los 6 grupos. Se observó que los niveles plasmáticos de Met eran altos (1313 |iM) en ratones -/- que siguen una dieta REG, lo que no se había observado previamente en ratones I278T que siguen una dieta convencional. Un nivel tan alto de Met sólo se había observado previamente en ratones KO no tratados con CBS D17-19. Los altos niveles de Met en ratones I278T -/- que siguen una dieta REG que recibieron inyecciones de PBS probablemente fueron el resultado de un contenido más alto de Met en la dieta REG usada como dieta de control en este experimento en comparación con la dieta CONV proporcionada por las instalaciones para animales.
Sin embargo, se observó que el tratamiento con OT-58 en ratones -/- que siguen una dieta REG disminuyó el nivel de Met (de 201 pM a 66 pM) sustancialmente, aunque no normalizó los niveles. Se observó que los niveles de Met en ratones que siguen una dieta MRD eran normales o más bajos de lo normal, mostrando sólo un ligero efecto del tratamiento.
Por tanto, se observó que la combinación de una dieta restringida en Met y la administración de 20NHS PEG-htCBS C15S normalizaba los niveles de metabolitos en ratones I278T. La coadministración de 20NHS PEG-htCBS C15S (OT-58) con una dieta no restringida (no sólo atenuada) en sujetos con homocistinuria dio como resultado una reducción de Hcy hasta 50 pM.
Ejemplo 19: Farmacocinética de 20NHS PEG-htCBS C15S en ratas
A. Farmacocinética de dosis única
Con el fin de evaluar la farmacocinética de 20NHS PEG-htCBS C15S en ratas, se les inyectó a ratas Sprague Dawley de tipo natural una dosis única de 20NHS PEG-htCBS C15S por vía intravascular (i.v.) o subcutánea (s.c.). Se combinaron tres estudios PK de dosis única independientes usando un diseño de estudio idéntico o muy similar al mostrado en la tabla 23. Se ajustó el diseño de un tercer estudio PK (de dosis repetida) (grupos 7-9) para permitir la extracción de datos después de la primera dosis y, por tanto, su combinación con un estudio PK de dosis única (grupos 1-6). El plasma se recogió en los tiempos designados que se enumeran en la tabla 23 y se analizó para determinar la actividad de CBS usando los métodos detallados en el ejemplo 1.
Tabla 23. Diseño de estudios PK de dosis única (grupos 1-6) y dosis repetida (grupos 7-9) en ratas Sprague Dawley usando 20NHS PEG-htCBS C15S
La actividad específica de 20NHS PEG-htCBS C15S en ratas macho y hembra después de una dosis única en bolo i.v. o s.c. de 4 (i.v.), 8 (s.c.) y 24 (s.c.) mg/kg se muestra en la figura 21A y la figura 21B. Los resultados de la administración de 20NHS PEG-htCBS C15S mediante inyección i.v. a ratas macho y hembra fueron casi superponibles. Sin embargo, se observaron diferencias sustanciales entre machos y hembras después de una única administración de 8 ó 24 mg/kg de 20NHS PEG-htCBS C15S por vía s.c. Los parámetros PK para las vías i.v. y s.c. en machos y hembras calculados a partir de los resultados de la figura 21A (4 mg/kg i.v.) y la figura 21B (8 mg/kg y 24 mg/kg s.c.) se muestran en la tabla 24. La biodisponibilidad de 20NHS PEG-htCBS C15S s.c. en ratas fue fuertemente dependiente del sexo, absorbiendo los machos menos (19-21%) que las hembras (aproximadamente el 36%), y la biodisponibilidad fue sustancialmente menor en ratas en comparación con la observada en ratones HO (52-83%).
Tabla 24. Parámetros PK de 20NHS PEG-htCBS C15S en ratas Sprague Dawley
B.Farmacocinética de dosis repetida
Para evaluar adicionalmente a las ratas como especie para realizar estudios de toxicidad a largo plazo, se determinó la farmacocinética de 20NHS PEG-htCBS C15S en tres grupos de ratas Sprague Dawley que recibieron un total de 9 inyecciones s.c. cada 48 horas de 4 mg/kg (baja), 8 mg/kg (media) o 24 mg/kg (alta) de 20NHS PEG-htCBS C15S. El diseño del estudio se describe en la tabla 23. El experimento se llevó a cabo durante 24 días. Se recogió plasma y se analizó la actividad de CBS usando los métodos detallados en el ejemplo 1.
Las actividades específicas de CBS para el estudio PK de dosis repetida representadas a lo largo del tiempo se muestran a modo de ejemplo en una dosis media de 8 mg/kg tal como se muestra en la figura 21C (se observaron fenómenos similares para grupos de dosis baja (4 mg/kg) y alta (24 mg/kg). Las flechas indican una inyección. No se observó acumulación de actividad de CBS en plasma, y se observó una disminución sustancial en las actividades máximas de CBS después de las primeras 6 inyecciones. Se observó que esta incapacidad inesperada de las ratas para alcanzar los niveles en estado estacionario predichos de la actividad de CBS en plasma era más profunda en los machos que en las hembras, muy probablemente debido a su menor biodisponibilidad (véanse los datos PK de dosis única anteriores). La atenuación sustancial de la actividad de CBS en las administraciones de 20NHS PEG-htCBS C15S posteriores se debió probablemente a una respuesta inmunitaria, lo que demostró que las ratas no son una especie adecuada para estudios de toxicidad a largo plazo.
Ejemplo 20. Farmacocinética y farmacodinamia de 20NHS PEG-htCBS C15S en monos
Para evaluar un modelo de primate no humano para estudios de toxicidad a largo plazo y estimar la dosis eficaz en humanos a través de escalas alométricas, se realizaron estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos de 20NHS PEG-htCBS C15S en macacos cangrejeros(Macaca fascicularis)de tipo natural.
A. Farmacocinética y farmacodinamia de dosis única de 20NHS PEG-htCBS C15S en mono
Para el estudio PK de dosis única, se usaron tres grupos experimentales de 4 (n=2M+2H) monos cada uno para realizar los experimentos. El primer grupo recibió 2 mg/kg de 20NHS PEG-htCBS C15S mediante inyección i.v. Se extrajo sangre a las 0, 0,083, 0,16, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 72, 120 y 192 horas tras la inyección i.v. Los grupos segundo y tercero recibieron 2 mg/kg o 6 mg/kg de 20NHS PEG-htCBS C15S mediante inyección s.c. Se extrajo sangre a las 0, 1,2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 192, 240 y 336 horas tras la inyección s.c. Se analizó el plasma recogido para determinar la actividad de CBS y se determinaron los niveles de metabolitos de aminoácidos azufrados (homocisteína, cistationina y cisteína) usando los métodos descritos en el ejemplo 1.
Las curvas de actividad específica de CBS a lo largo del tiempo en monos después de recibir una dosis única de 2 mg/kg mediante administración i.v. o una dosis de 2 mg/kg o 6 mg/kg mediante administración s.c. de 20NHS PEG-htCBS C15S se muestran en la figura 22A. Los parámetros PK calculados tanto para la administración i.v. como para la administración s.c. después de una única inyección se resumen en la tabla 25. Se calculó que la biodisponibilidad de 20NHS PEG-htCBS C15S en monos era de aproximadamente el 80%, que es casi idéntica a la biodisponibilidad en ratones HO a los que se les administró una dosis s.c. de 5 mg/kg (83%). Se calculó que la semivida de eliminación de 20NHS PEG-htCBS C15S del plasma en monos se calculó era de 67 horas a partir del conjunto de datos i.v. y de 73 horas a partir del conjunto de datos s.c. Se calculó que la Cmáx era de 40,8 mU/|il a una dosis s.c. de 2 mg/kg y de 114,9 mU/|il a una dosis s.c. de 6 mg/kg.
La tabla 25 enumera los parámetros PK obtenidos a partir de experimentos de dosis única realizados con 20NHS PEG-htCBS C15S en monos.
Tabla 25. Parámetros PK después de una única inyección i.v. y s.c. de 20NHS PEG-htCBS C15S a un macaco cangrejero
Puesto que los monos inyectados eran de tipo natural sanos y tenían niveles de Hcy naturalmente bajos (3-5 |iM en comparación con 150-500 |iM en modelos murinos de homocistinuria), se observó un efecto farmacodinámico después de una dosis única i.v. o s.c. de 20NHS PEG-htCBS C15S que no se esperaba. No se observaron cambios significativos en los niveles plasmáticos de Hcy y Cys en los monos inyectados. Sin embargo, se observaron picos significativos de Cth en plasma 8 horas después de la administración i.v. y 8 y 48 horas después de la administración s.c. en comparación con los niveles iniciales, lo que demostraba un efecto PD incluso en monos sanos no afectados (figura 22B). Los picos en los niveles plasmáticos de Cth se originaron probablemente por la administración de 20NHS PEG-htCBS C15S porque la CBS es la única enzima que se sabe que forma Cth. Además, la enzima CBS normalmente no circula ni funciona en el plasma. Se observó que la Cth formada en plasma mediante la administración de 20NHS PEG-htCBS C15S se aclaraba más lentamente que Cys o Hcy. Por tanto, los metabolitos, particularmente Cth, se monitorizaron adicionalmente en un estudio de dosis múltiple para determinar si el efecto PD observado era más pronunciado o dependiente de la dosis.
B. Farmacocinética y farmacodinamia de dosis repetida de 20NHS PEG-htCBS C15S en monos
Se realizaron experimentos de dosis repetida en los que tres grupos de 4 monos (1M+1H en el subgrupo principal y 1M+1H en el subgrupo de recuperación) recibieron un total de 6 dosis s.c. consecutivas cada 72 horas de 1 mg/kg (baja), 3 mg/kg (media) o 10 mg/kg (alta) de 20NHS PEG-htCBS C15S. Se extrajo sangre de los monos en los subgrupos principales a las 0, 32, 72, 104, 144, 176, 216, 248, 288, 320, 360, 392 y 408 horas tras la primera inyección, mientras que se extrajo sangre de los animales en los subgrupos de recuperación en momentos adicionales a las 432, 456, 480, 528 y 696 horas tras la primera inyección. Se recogió el plasma y se analizó para determinar la actividad de CBS y los niveles de aminoácidos azufrados (homocisteína, cistationina, cisteína, lantionina y homolantionina) usando los métodos descritos en el ejemplo 1.
Las curvas de actividad específica de 20NHS PEG-htCBS C15S a lo largo del tiempo para grupos de dosis baja (1 mg/kg), media (3 mg/kg) y alta (10 mg/kg) después de 6 inyecciones s.c. consecutivas cada 3 días se muestran en la figura 23A. La administración subcutánea de 20NHS PEG-htCBS C15S a macacos cangrejeros condujo a niveles plasmáticos predecibles y dependientes de la dosis de actividad de CBS después de 6 dosis administradas cada 3 días durante 16 días. A diferencia de los resultados del estudio PK de dosis repetida en ratas, no se detectó atenuación de la actividad de CBS después de administraciones repetidas de 20NHS PEG-htCBS C15S a monos de tipo natural. Cada administración subsiguiente de la enzima dio como resultado una acumulación completamente predecible de actividad de CBS en plasma y esencialmente alcanzó niveles en estado estacionario después de las tres primeras dosis. Se observó que la dosificación adicional mantenía el estado estacionario, en el que la tasa de eliminación era equivalente a la tasa de absorción, lo que conducía a niveles plasmáticos máximos y mínimos constantes. La concentración plasmática máxima media en estado estacionario (cmáx-EE) se normalizó para dosis que oscilaban entre 36 y 39 mU/|il y los niveles plasmáticos mínimos se normalizaron para dosis en estado estacionario (Cmín-EE) que oscilaban entre 23 y 28 mU/|il. Se observó que la tasa de eliminación de 20NHS PEG-htCBS C15S era semilogarítmica, confirmando de ese modo la cinética de primer orden, de modo que el tiempo necesario para que la actividad plasmática de 20NHS PEG-htCBS C15S disminuyera hasta la mitad era constante (datos no mostrados). Se estimó la semivida de eliminación en los animales en recuperación después de la última dosis el día 16 y era de 49 a 64 horas, es decir, similar a la semivida observada en monos después de una dosis única s.c. de 20NHS PEG-htCBS C15S (73 horas), lo que demostraba que las dosis múltiples no cambiaban la tasa de eliminación.
Se encontró que los niveles plasmáticos de cistationina, un biomarcador, eran indicativos de la actividad de 20NHS PEG-htCBS C15S incluso en monos sanos no afectados (véanse los datos de dosis única en monos). Los resultados en monos que recibieron 6 inyecciones con 72 horas de diferencia para dosis bajas (1 mg/kg), medias (3 mg/kg) y altas (10 mg/kg) se presentan en la figura 23B. Los niveles de Cth se correlacionaron bien con los máximos y mínimos de la actividad de 20NHS PEG-htCBS C15S en plasma y también se observó que eran dependientes de la dosis. No se observaron diferencias claras entre los grupos de dosis para homocisteína y cisteína (datos no mostrados).
Además del tioéter cistationina producido por CBS, se midieron dos tioéteres, lantionina y homolantionina, que se eligieron como marcadores sustitutos de la producción de sulfuro de hidrógeno, en muestras de plasma de mono del estudio de dosis repetida en puntos de tiempo seleccionados. El sulfuro de hidrógeno es una molécula de señalización emergente e importante en muchos procesos fisiológicos y, por tanto, se ha estudiado ampliamente en los últimos años para aplicaciones terapéuticas.
La tabla 26 presenta los niveles plasmáticos de cistationina, lantionina y homolantionina en monos de tipo natural después de la administración repetida de 20NHS PEG-htCBS C 15S a diferentes dosis por vía s.c. Se notifican los niveles de metabolitos a las 0 horas (antes de la dosis), 176 horas y 392 horas después de la primera inyección. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (EEM) en |iM (n=4).
Tabla 26. Niveles plasmáticos de los tioéteres cistationina, lantionina y homolantionina en monos después de la administración repetida de 20NHS PEG-htCBS C15S
Se observó que la administración repetida de 20NHS PEG-htCBS C15S a monos de tipo natural aumentaba los niveles plasmáticos de cistationina y lantionina, pero los niveles de homolantionina no se vieron afectados significativamente. Se observó que el aumento de cistationina y lantionina era directamente proporcional a la dosis, y se observó que la dependencia de la dosis era más prominente para la lantionina que para la cistationina.
C. Ensayo de actividad de C15S mediante CL/EM/EM
El método bioanalítico desarrollado mediante CL/EM/EM para la determinación de cistationina M+4 como producto de la actividad CBS usando cistationina M+8 (13C2D6) como patrón interno se ha desarrollado y validado para muestras de plasma tanto de mono como humano y, por tanto, puede usarse para determinar la actividad de CBS en muestras de estudios farmacocinéticos y toxicológicos, así como en ensayos clínicos. El ensayo enzimático se realizó esencialmente tal como se describe en el ejemplo 1 con las siguientes modificaciones. Se usó D,L-homocisteína M+4 deuterada para iniciar la reacción con L-serina no marcada en la mezcla de reacción. Después de 30 min de incubación a 37°C, se detuvo la reacción enzimática mediante acidificación con HCl 6 N y se extrajo el producto de reacción marcado (cistationina M+4) con el kit EZ:faast (Phenomenex, EE.UU.). En resumen, se mezclaron 50 |il de muestra (patrón de calibración, muestra QC o reacción enzimática) en un tubo sobre hielo y protegido de la luz con 100 |il de disolución de patrón interno (cistationina M+8, 0,25 ng/|il) y 250 |il de agua. Se extrajo la mezcla con columnas de cartuchos MCX (Waters). Se evaporó el medio eluido (amoniaco 6 N en metanol) hasta sequedad a 45°C. Se disolvió el residuo seco en el medio eluyente del kit EZ:faast, se derivatizó y se sometió a extracción líquido-líquido siguiendo el protocolo del fabricante del kit. Se automatizó la extracción en fase sólida con placas de extracción para aumentar el rendimiento y ahorrar tiempo. Se observaron concentraciones medibles de cistationina M+4 independientemente del origen de la enzima (htCBS C15S o C15S/ME-200GS presente en muestras de plasma o controles o trazas de CBS de mono/humana endógena en muestras de plasma). Se prestó mucha atención al intervalo de calibración puesto que las determinaciones realizadas estaban en la parte más alta del intervalo de concentración cualificado (de 5,00 a 1500 nM).
Las tablas 12-14 a continuación muestran la comparación de la actividad específica de C15S/ME-200GS determinada mediante CL/EM/EM usando D,L-homocisteína M+4 como sustrato y mediante ensayo radiométrico usando L-[13C-U]serina como sustrato. La actividad específica de la enzima se presenta en mU/|il. “n.d.” representa “no determinado”. La tabla 27 muestra la comparación de las actividades específicas de C15S/ME-200GS en un conjunto de muestras de plasma de macaco cangrejero al que se le inyectó por vía i.v. una dosis única de 2 mg/kg.
Tabla 27. Comparación de actividades específicas de C15S/ME-200GS determinadas mediante dos ensayos en muestras de plasma de mono después de una dosis única i.v. de 2 mg/kg
La tabla 28 muestra la comparación de las actividades específicas de C15S/ME-200GS en un conjunto de muestras de plasma de macaco cangrejero al que se le inyectó por vía s.c. una dosis única de 2 mg/kg.
Tabla 28. Comparación de actividades específicas de C15S/ME-200GS determinadas mediante dos ensayos en muestras de plasma de mono después de una dosis única s.c. de 2 mg/kg
La tabla 29 muestra la comparación de las actividades específicas de C15S/ME-200GS en un conjunto de muestras de plasma de macaco cangrejero al que se le inyectó por vía s.c. una dosis única de 6 mg/kg (se refiere al ejemplo 20).
Tabla 29. Comparación de actividades específicas de C15S/ME-200GS determinadas mediante dos ensayos en muestras de plasma de mono después de una dosis única s.c. de 6 mg/kg
Ejemplo 21. Extrapolación de datos PK/PD de animales a humanos
En la mayoría de los casos, los niveles plasmáticos de un fármaco necesarios para provocar una respuesta farmacodinámica son diferentes entre especies debido a las variaciones de secuencia específicas de especie en el receptor o la enzima diana. Por ejemplo, un anticuerpo contra una proteína humana puede tener una afinidad muy diferente por la proteína murina y humana diana debido a las diferencias de especie en la secuencia de la proteína diana. En el caso de 20NHS PEG-htCBS C15S, la diana biológica es el aminoácido Hcy, que es idéntico entre especies. Además, la distribución de un fármaco en el tejido diana puede variar entre especies y es posible que no pueda predecirse fácilmente por los niveles plasmáticos del fármaco debido a la biodistribución específica de especie. Sin embargo, el “tejido diana” para 20NHS PEG/C15S es el plasma, lo que otorga un alto grado de certeza a la predicción de valores extrapolados para humanos a partir de la comparación entre especies de los parámetros farmacocinéticos en plasma.
Los estudios del presente documento se realizaron en ratones usando una dosis s.c. de 7,5 mg/kg, y los estudios de dosis-respuesta demostraron que una dosis de 5 mg/kg maximizaba la eficacia en cuanto a modulación de los niveles plasmáticos de biomarcadores: Hcy, Cth y Cys. Usando una dosis de 5 mg/kg y corrigiendo la diferencia en el área de superficie corporal entre humanos (70 kg) y ratones (0,025 kg), se estimó que una dosis de 0,4 mg/kg era la dosis humana equivalente (DHE) eficaz. A esta dosis, los niveles plasmáticos máximos fueron de 50 mU/pl en ratones con una AUC de 3060 mU-h/ml. Puesto que el sustrato para la actividad de 20NHS PEG-htCBS C15S (Hcy y serina) fue el mismo entre especies y el sitio de acción fue la propia sangre, estos parámetros proporcionan una estimación precisa de los niveles plasmáticos humanos requeridos para la eficacia en un ensayo clínico de 20NHS PEG-htCBS.
Se realizaron estudios farmacocinéticos en modelos animales murinos de CBSDH, ratas Sprague Dawley normales y macacos cangrejeros normales después de inyecciones s.c. únicas o múltiples a varios niveles de dosis. Además, se realizaron estudios farmacocinéticos de dosis única en las 3 especies después de la administración i.v. de 20NHS PEG-htCBS C15S para evaluar la biodisponibilidad en las 3 especies después de la administración s.c. En la tabla 30 se proporciona un resumen de la biodisponibilidad de los parámetros farmacocinéticos (% de F) corregidos para la dosis en modelos de ratón, rata y mono después de la administración s.c.
Tabla 30. Parámetros PK para OT-58 (htCBS C15S ME-200GS) entre especies y valores predichos para humanos a partir de la escala de área de superficie corporal
El * indica que la AUC/dosis promedio en ratas se corrigió para el 80% de biodisponibilidad, lo que equivale a 1343 (mU-h/ml)/(mg/kg). El ** indica que la Cmáx/dosis promedio en ratas se corrigió para el 80% de biodisponibilidad, lo que equivale a 16,5 (mU/|il)/(mg/kg).
Según estos resultados, 20NHS PEG-htCBS C15S se absorbió lentamente en el torrente sanguíneo después de la administración s.c. en las 3 especies. La semivida de absorción fue similar entre especies, oscilando entre 5 y 12 horas en el ratón, entre 10 y 16 horas en la rata y entre 8 y 10 horas en el mono después de una única inyección s.c., lo que condujo a valores de Tmáx que oscilaban entre 24 horas y 48 horas en animales individuales. La semivida de eliminación (T1/2) fue de 20 horas en ratones, 44,5 horas en ratas y 73 horas en monos. El porcentaje de 20NHS PEG-htCBS C15S absorbido en la sangre después de la administración s.c. (% de F) fue >80% en modelos de ratón (dosis de 5 mg/kg) y mono (dosis de 1, 3 ó 10 mg/kg). Sin embargo, el porcentaje de 20NHS PEG-htCBS C15S absorbido en la sangre fue tan sólo del 20% en ratas macho y del 36% en ratas hembra. En la tabla 30, la AUC/dosis y la Cmáx/dosis en rata se corrigieron para el 80% de biodisponibilidad (valores entre paréntesis en la tabla 30) para permitir que se hicieran comparaciones entre especies con el mismo % de F.
Se realizaron comparaciones entre especies basadas en la escala del área de superficie corporal suponiendo una biodisponibilidad del 80% en las 3 especies (ratón, rata y mono) para determinar si existía una correlación lineal entre el logaritmo del peso corporal y el logaritmo de diversos parámetros farmacocinéticos (AUC/dosis, Cmáx/dosis y T1/2). Una correlación lineal en estos parámetros indicó que los parámetros farmacocinéticos para 20NHS PEG-htCBS C15S se escalaron al área de superficie corporal y, por tanto, probablemente serían predictivos de los valores en humanos. Las correlaciones lineales permiten hacer predicciones de la dosis clínica y la pauta posológica a partir de los datos preclínicos.
Se observó una correlación lineal para los parámetros farmacocinéticos AUC, Cmáx y T1/2 entre especies para 20NHS PEG-htCBS C15S. Tal como se muestra en la figura 24A (AUC/dosis), la figura 24B (Cmáx/dosis) y la figura 24C (T1/2), se observó una excelente correlación lineal entre el logaritmo del peso corporal de cada especie frente a sus parámetros farmacocinéticos asociados corregidos para la dosis. Al extrapolar al logaritmo del peso corporal para humanos (70 kg) para cada parámetro, AUC/dosis, Cmáx/dosis y T1/2, se calculó para sujetos humanos. Los valores predictivos en humanos se proporcionan en la tabla 30.
La semivida extrapolada/predicha en humanos fue de aproximadamente 175 horas o 7,3 días. Se calculó que la dosis eficaz predicha para humanos a partir de la dosis eficaz en ratones (5 mg/kg) mediante escala alométrica era de 0,4 mg/kg en un humano de 70 kg. Usando la Cmáx humana predicha de 34 mU/|il (por mg/kg) y un intervalo de Tmáx de 48 a 72 horas, se construyó una curva hipotética para una curva PK de dosis única en humanos, que se muestra en la figura 24D. La intersección E fue de 43,079 mg/|il y la semivida fue de 176,737 horas. Los datos de ratones y monos también se muestran con fines comparativos en la figura 24D. La tabla 31 proporciona las concentraciones extrapoladas estimadas para humanos.
Tabla 31. Concentraciones extrapoladas para humanos
A partir de los parámetros PK derivados de la figura 24D, se modeló una curva PK de dosis múltiple suponiendo una cinética de primer orden en humanos, que se muestra en la figura 24E.
A. Curva PK de dosis repetida hipotética en humanos
La figura 24F muestra los valores PK predichos para 20NHS PEG-htCBS C15S en humanos a una dosis s.c. de 1 mg/kg administrada una vez a la semana durante la aproximación a los niveles plasmáticos en estado estacionario y los niveles máximo y mínimo predichos en estado estacionario (gris claro). La figura 24G muestra los valores PK predichos para 20NHS PEG-htCBS C15S en humanos a una dosis s.c. de 1 mg/kg administrada dos veces a la semana durante la aproximación a los niveles plasmáticos en estado estacionario y los niveles máximo y mínimo predichos en humanos en este intervalo de dosificación (gris claro). La tabla 32 compara los niveles plasmáticos máximo y mínimo predichos de 20NHS PEG-htCBS C15S en humanos a dosis s.c. de 0,33, 0,66 y 1 mg/kg administradas una y dos veces a la semana (suponiendo una biodisponibilidad del 80% en humanos).
Tabla 32. Niveles plasmáticos predichos en humanos (suponiendo una biodisponibilidad del 80%)
A partir de estos cálculos, se predijo que una dosis de 0,66 mg/kg de 20NHS PEG-htCBS C15S administrada por vía s.c. a pacientes humanos una vez a la semana daría como resultado niveles plasmáticos que oscilarían entre 31 y 45 mU/|il en estado estacionario. De manera similar, se predijo que una dosis de 0,33 administrada dos veces a la semana daría como resultado niveles plasmáticos que oscilarían entre 35 y 41 mU/|il en estado estacionario (después de aproximadamente 8 dosis). Estas predicciones suponen una biodisponibilidad subcutánea del 80% tal como se observó tanto en ratones como en monos. También se espera que estas dosis de 20NHS PEG-htCBS C15S produzcan niveles plasmáticos máximos y mínimos en el intervalo eficaz para los niveles plasmáticos similares a los de los ratones (niveles máximos de 50 mU/|il). Además, estas dosis corresponden a la dosis eficaz humana predicha a partir de los estudios murinos solos de 0,4 mg/kg. La correlación lineal del peso corporal y los parámetros PK entre especies preclínicas permitió que la escala alométrica (escala del área de superficie corporal) predijera los parámetros PK AUC, Cmáx y semivida de eliminación en humanos al comparar los valores entre especies.
Se observó que ambos métodos de predicción de la dosis eficaz en humanos (directamente a partir de los datos de ratón y de la escala alométrica entre 3 especies) coincidían en cuanto a predicciones de dosis eficaces (DHE). Por tanto, suponiendo una biodisponibilidad del 80%, una dosis propuesta de 0,33 mg/kg administrada dos veces a la semana o de 0,66 mg/kg administrada una vez a la semana serán probablemente dosis eficaces en ensayos clínicos en humanos.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Composición que comprende un polipéptido mutante de cistationina beta sintasa truncada humana (htCBS) aislado conjugado con un resto de PEG, en la que el polipéptido mutante de htCBS aislado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 con un cambio de una cisteína en la posición de aminoácido correspondiente a 15 de SEQ ID NO: 3 a una serina y que carece del primer residuo de metionina N-terminal correspondiente a SEQ ID NO: 3, y está pegilado con ME-200GS;
para su uso en un método de tratamiento de la homocistinuria en un sujeto humano, en la que el polipéptido mutante de htCBS pegilado se administra al menos una vez a la semana durante al menos seis semanas en una dosis de entre 0,33 y 10 mg/kg.
2. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la dosis es una cantidad seleccionada del grupo que consiste en: 0,33, 0,5, aproximadamente 1, aproximadamente 2 y aproximadamente 5 mg/kg.
3. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la dosis es de aproximadamente 0,4 mg/kg.
4. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el polipéptido mutante de htCBS pegilado se administra al menos dos veces a la semana.
5. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el polipéptido mutante de htCBS pegilado se coadministra con betaína.
6. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que se administra betaína antes que el polipéptido mutante de htCBS pegilado.
ES21204193T 2015-11-09 2016-11-09 Compositions and methods for treatment of homocystinuria Active ES2994256T3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/935,690 US9675678B2 (en) 2013-01-29 2015-11-09 Compositions and methods for treatment of homocystinuria

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2994256T3 true ES2994256T3 (en) 2025-01-21

Family

ID=58696136

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16864878T Active ES2909914T3 (es) 2015-11-09 2016-11-09 Composiciones y métodos para su uso en el tratamiento de homocistinuria
ES21204193T Active ES2994256T3 (en) 2015-11-09 2016-11-09 Compositions and methods for treatment of homocystinuria

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16864878T Active ES2909914T3 (es) 2015-11-09 2016-11-09 Composiciones y métodos para su uso en el tratamiento de homocistinuria

Country Status (25)

Country Link
US (3) US11077175B2 (es)
EP (3) EP3998067B1 (es)
JP (2) JP7009364B2 (es)
KR (1) KR102819396B1 (es)
CN (2) CN115920016A (es)
AU (2) AU2016354030B2 (es)
BR (1) BR112018007768A2 (es)
CY (1) CY1125113T1 (es)
DK (2) DK3998067T3 (es)
ES (2) ES2909914T3 (es)
FI (1) FI3998067T3 (es)
HR (2) HRP20241491T1 (es)
HU (2) HUE058749T2 (es)
IL (2) IL302198A (es)
LT (2) LT3998067T (es)
MX (1) MX2018005312A (es)
NZ (1) NZ741552A (es)
PL (2) PL3373922T3 (es)
PT (2) PT3998067T (es)
RS (2) RS63070B1 (es)
SG (1) SG10201912972SA (es)
SI (2) SI3373922T1 (es)
SM (2) SMT202200151T1 (es)
WO (1) WO2017083327A1 (es)
ZA (1) ZA201802376B (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9675678B2 (en) 2013-01-29 2017-06-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for treatment of homocystinuria
FI3998067T3 (fi) 2015-11-09 2024-10-31 Univ Colorado Regents Koostumukset ja menetelmät homokystinurian hoitoon
IL269544B2 (en) 2017-04-17 2025-01-01 Univ Colorado Regents Streamlining enzyme replacement therapy for the treatment of high homocysteine
ES3058596T3 (en) * 2019-06-26 2026-03-11 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Pegylated cystathionine beta synthase for enzyme therapy for treatment of homocystinuria
CA3152379A1 (en) * 2019-09-03 2021-03-11 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Cystathionine beta-synthase enzyme therapy for treatment of elevated homocysteine levels

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS555429A (en) * 1978-06-23 1980-01-16 Nissan Motor Co Ltd Pressure regulator for fuel injection type gasoline engine
JPS5576559A (en) 1978-12-01 1980-06-09 Chiyou Lsi Gijutsu Kenkyu Kumiai Electron beam fine adjusting device
US5656425A (en) 1993-08-17 1997-08-12 Regents Of The University Of Colorado Screening for mutations by expressing cDNA segments
US5523225A (en) 1993-09-13 1996-06-04 Regents Of The University Of Colorado DNA sequence encoding human cystathionine β-synthase
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5635375A (en) 1995-01-09 1997-06-03 Regents Of The University Of Colorado Method of increasing the yield and heme saturation of cystathione β-synthase
CA2217696A1 (en) 1995-04-25 1996-10-31 Oridigm Corporation S-adenosyl methionine regulation of metabolic pathways and its use in diagnosis and therapy
US5705151A (en) 1995-05-18 1998-01-06 National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine Gene therapy for T cell regulation
US6153655A (en) 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
EE05214B1 (et) 1998-04-28 2009-10-15 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Polool-IFN- β konjugaat, selle valmistamismeetod ja farmatseutiline kompositsioon
US6174696B1 (en) 1999-11-12 2001-01-16 Genzyme Corporation Method for the determination of homocysteine
WO2001002600A2 (en) 1999-07-06 2001-01-11 General Atomics Detection of analytes using attenuated enzymes
US6653062B1 (en) 2000-07-26 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Preservation and storage medium for biological materials
US20030091543A1 (en) 2001-10-26 2003-05-15 Klein Matthew B. Therapeutic cell preparation grafts and methods of use thereof
AU2003251550A1 (en) 2002-06-17 2003-12-31 The Regents Of The University Of Colorado HUMAN CYSTATHIONINE Beta-SYNTHASE VARIANTS AND METHODS OF PRODU CTION THEREOF
GB0216001D0 (en) 2002-07-10 2002-08-21 Nat Blood Authority Process and composition
EP1396537A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-10 Avidis SA Treatment of elevated plasma homocysteine
CN1863551A (zh) 2003-07-31 2006-11-15 抗癌公司 用于提高在体内的效力的PLP和PEG－rMETase的用途
CN1552905A (zh) 2003-12-18 2004-12-08 中国农业科学院茶叶研究所 一类茶树胱硫醚-γ-合成酶特异表达序列标签及其生物芯片
US8500720B2 (en) 2005-05-09 2013-08-06 Medtronic, Inc Method and apparatus for treatment of cardiac disorders
US20070010492A1 (en) 2005-07-11 2007-01-11 Generale Robert J Composition and method for reducing homocysteine caused by drugs containing methyl compounds
EP1878739A1 (en) 2006-07-14 2008-01-16 LEK Pharmaceuticals D.D. One step IMAC (MCAC) purification of proteins
JP6041454B2 (ja) * 2007-03-15 2016-12-07 株式会社 Ｄｎａセキュリティー研究所 Ｄｎａ含有インク組成物
JP5074146B2 (ja) 2007-03-30 2012-11-14 オリンパス株式会社 カプセル型医療装置
CN101322840A (zh) 2008-05-28 2008-12-17 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 一种人胱硫醚β-合成酶重组蛋白及应用
BR112012004546A8 (pt) 2009-08-29 2017-12-05 Abbott Lab Terapêutica por proteínas ligantes dll4-ligantes
CA2788689C (en) 2010-02-04 2019-07-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Engineered enzymes with methionine-gamma-lyase enzymes and pharmacological preparations thereof
EA201370008A1 (ru) 2010-07-01 2013-06-28 Айсис Инновэйшн Лимитид Лечение когнитивных нарушений
US9034318B2 (en) 2011-08-30 2015-05-19 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Chemically modified cystathionine beta-synthase enzyme for treatment of homocystinuria
US9243239B2 (en) 2012-03-26 2016-01-26 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Purification of cystathionine beta-synthase
US9675678B2 (en) 2013-01-29 2017-06-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for treatment of homocystinuria
WO2015033279A1 (en) * 2013-09-04 2015-03-12 Mahesh Kandula Compositions and methods for the treatment of homocystinuria
US11123436B2 (en) 2015-07-24 2021-09-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method of preparing physiologically active polypeptide conjugate
FI3998067T3 (fi) 2015-11-09 2024-10-31 Univ Colorado Regents Koostumukset ja menetelmät homokystinurian hoitoon
IL269544B2 (en) 2017-04-17 2025-01-01 Univ Colorado Regents Streamlining enzyme replacement therapy for the treatment of high homocysteine
JP7002314B2 (ja) * 2017-12-13 2022-02-10 株式会社ブリヂストン 空気入りタイヤ
ES3058596T3 (en) 2019-06-26 2026-03-11 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Pegylated cystathionine beta synthase for enzyme therapy for treatment of homocystinuria
CA3152379A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Cystathionine beta-synthase enzyme therapy for treatment of elevated homocysteine levels

Also Published As

Publication number Publication date
ES2909914T3 (es) 2022-05-10
KR20180074703A (ko) 2018-07-03
IL302198A (en) 2023-06-01
BR112018007768A2 (pt) 2018-10-23
SI3998067T1 (sl) 2025-03-31
CN108472277A (zh) 2018-08-31
EP4487914A3 (en) 2025-03-26
CY1125113T1 (el) 2024-02-16
LT3998067T (lt) 2024-11-25
DK3998067T3 (da) 2024-10-28
US20240091325A1 (en) 2024-03-21
EP3373922A4 (en) 2019-05-15
US20200276282A1 (en) 2020-09-03
RS66106B1 (sr) 2024-11-29
IL258487A (en) 2018-05-31
AU2022287540B2 (en) 2025-02-27
SMT202400463T1 (it) 2025-01-14
PL3998067T3 (pl) 2025-01-07
HRP20241491T1 (hr) 2025-01-03
IL258487B1 (en) 2023-05-01
PT3373922T (pt) 2022-03-28
ZA201802376B (en) 2020-11-25
HUE058749T2 (hu) 2022-09-28
HK1258502A1 (en) 2019-11-15
IL258487B2 (en) 2023-09-01
FI3998067T3 (fi) 2024-10-31
EP4487914A2 (en) 2025-01-08
WO2017083327A1 (en) 2017-05-18
EP3998067A1 (en) 2022-05-18
AU2016354030A1 (en) 2018-05-10
SI3373922T1 (sl) 2022-05-31
SG10201912972SA (en) 2020-03-30
EP3373922A1 (en) 2018-09-19
SMT202200151T1 (it) 2022-05-12
KR102819396B1 (ko) 2025-06-12
AU2016354030B2 (en) 2022-09-15
JP2022050589A (ja) 2022-03-30
JP7009364B2 (ja) 2022-02-10
HUE068830T2 (hu) 2025-01-28
JP2018532763A (ja) 2018-11-08
MX2018005312A (es) 2018-08-15
LT3373922T (lt) 2022-04-11
US11771745B2 (en) 2023-10-03
US11077175B2 (en) 2021-08-03
DK3373922T3 (da) 2022-03-28
HRP20220407T1 (hr) 2022-05-27
NZ741552A (en) 2022-04-29
AU2022287540A1 (en) 2023-02-02
CN115920016A (zh) 2023-04-07
PL3373922T3 (pl) 2022-05-02
PT3998067T (pt) 2024-11-04
RS63070B1 (sr) 2022-04-29
JP7482914B2 (ja) 2024-05-14
US20220125896A1 (en) 2022-04-28
EP3998067B1 (en) 2024-09-11
US12194082B2 (en) 2025-01-14
CA3001625A1 (en) 2017-05-18
EP3373922B1 (en) 2022-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10653755B2 (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
US12194082B2 (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
CN112574982B (zh) 用于治疗高胱氨酸尿症的胱硫醚β-合酶
US12042529B2 (en) Optimization of enzyme replacement therapy for treatment of homocystinuria
HK40072007A (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
EP3230308B1 (en) Methods for treating and preventing cardiomyopathy
HK40072007B (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
HK1258502B (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria