RS63070B1 - Kompozicije i postupci za upotrebu u lečenju homocistinurije - Google Patents

Kompozicije i postupci za upotrebu u lečenju homocistinurije

Info

Publication number
RS63070B1
RS63070B1 RS20220308A RSP20220308A RS63070B1 RS 63070 B1 RS63070 B1 RS 63070B1 RS 20220308 A RS20220308 A RS 20220308A RS P20220308 A RSP20220308 A RS P20220308A RS 63070 B1 RS63070 B1 RS 63070B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
htcbs
peg
pegylated
dose
mice
Prior art date
Application number
RS20220308A
Other languages
English (en)
Inventor
Jan P Kraus
Tomas Majtan
Erez Bublil
Original Assignee
Univ Colorado Regents
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US14/935,690 external-priority patent/US9675678B2/en
Application filed by Univ Colorado Regents filed Critical Univ Colorado Regents
Publication of RS63070B1 publication Critical patent/RS63070B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/205—Amine addition salts of organic acids; Inner quaternary ammonium salts, e.g. betaine, carnitine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/385—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having two or more sulfur atoms in the same ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01022—Cystathionine beta-synthase (4.2.1.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNE REFERENCE KOJE UPUĆUJU NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava se poziva na U.S. Application No.14/935,690, podnetu 9. novembra 2015. godine.
LISTA SEKVENCI
[0002] Ova prijava je podneta zajedno sa listom sekvenci u elektronskom formatu. Datoteka liste sekvenci, pod nazivom 2016-11-08_lista sekvenci_2089.1003PCT2.txt, je napravljena 8. novembra 2016. godine i njena veličina iznosi 26.2 kilobita.
OBLAST PRONALASKA
[0003] Ovo otkrivanje se generalno odnosi na enzimsku zamensku terapiju (ERT) upotrebom humane cistationinske b-sintaze (CBS), ili njene modifikovane verzije (npr., humana skraćena CBS (htCBS) ili njena varijanta),da bi se značajno smanjile koncentracije homocisteina (Hey) u serumu, i da bi se povratili nivoi nishodnih metabolita kao što su cistationin i cistein. Dalje, ERT sa CBS, htCBS ili njegova modifikovana verzija, kao što je htCBS mutant C15S, može da se koristi za lečenje bolesti kao što su homocistinurija i poremećaji homocisteinske remetilacije.
POZADINA PRONALASKA
[0004] Cistationinska b-sintaza (CBS) je prvi enzim na putu transsulfuracije, koji katalizuje kondenzaciju serina i homocisteina (Hey) u cistationin, koji se zatim hidrolizuje do cisteina putem cistationin gamalyasc (CGL). U biologiji sistema, robusnost biološkog sistema je definisana kao njegova mogućnost da ispravno funkcioniše u slučaju poremećaja, a redundancija elemenata u sistemu je jedan od mehanizama kojima se postiže robusnost (Kitano, H.2004, Nature Reviews Genetics, 5:826-837).
Međutim, čini se da sistemu biološke transsulfuracije u velikoj meri nedostaju komponente redundancije, što ovaj sistem čini sklonim ka mutacionim poremećajima. Na primer, CBS enzim je jedina komponenta koja može da preradi homocistein u cistationin. Ograničena redundancija sistema delimično postoji u obliku homocisteina, pri čemu prvi metabolit koji se uliva u put, može alternativno da se pretvori u metionin kroz put remetilacije, čime se olakšava homocisteinski teret. Pored toga, cistein, nishodni proizvod, može da se dobije direktno putem ishrane. Bez obzira na to, ovi putevi su ograničeni u svojim mogućnostima održavanja normalnih nivoa metabolita, a nedostatak CBS funkcije ima štetne posledice za humane pacijente ukoliko se ne leči. Inaktivacija CBS dovodi do homocistinurije sa nedostatkom cistationinske b-sintaze (CBSDH), čiji je uobičajeni naziv klasična homocistinurija.
[0005] Postoje ograničene terapijske opcije za lečenje CBSDH, a trenutne opcije za lečenje smanjuju homocistein ali nemaju tendenciju da normalizuju cistationin (Cth) ili cistein (Cys) i samim tim ove opcije lečenja mogu biti neadekvatne za obezbeđivanje opcija robusnog i efikasnog lečenja. Stoga, ostaje potreba u tehnici za efikasnijim strategijama lečenja pojedinaca sa homocistinurijom.
[0006] Ovaj pronalazak se bavi ovom potrebom putem obezbeđivanja kompozicije za upotrebu u lečenju CBSDH.
KRATAK SADRŽAJ
[0007] Ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske beta sintaze (htCBS) za upotrebu u postupku lečenja homocistinurije kod humanog subjekta, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje kompozicije subjektu, pri čemu je izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan i obuhvata mutaciju cisteina na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3 u serin, i pri čemu se izolovani mutantni polipeptid htCBS daje u dozi između 0.33 i oko 10 mg/kg najmanje jednom nedeljno tokom najmanje šest nedelja.
[0008] Ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske beta sintaze (htCBS) za upotrebu u terapeutskom postupku povećanja cistationina i/ili cisteina kod humanog subjekta sa nedostatkom CBS, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje kompozicije subjektu, pri čemu je pomenuti izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan i obuhvata mutaciju cisteina na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3 u serin, i daje se u dozi između 0.33 i oko 10 mg/kg najmanje jednom nedeljno tokom najmanje šest nedelja.
[0009] Ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske beta sintaze (htCBS) za upotrebu u terapeutskom postupku smanjivanja homocisteina, metionina, i/ili S-adenozil homocisteina kod humanog subjekta sa nedostatkom CBS, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje kompozicije subjektu, pri čemu je pomenuti izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan i obuhvata mutaciju cisteina na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3 u serin, i daje se u dozi između 0.33 i 10 mg/kg najmanje jednom nedeljno tokom najmanje šest nedelja.
[0010] Ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske beta sintaze (htCBS) za upotrebu u postupku lečenja oštećenja parenhima, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje kompozicije humanom subjektu, pri čemu je pomenuti izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan i obuhvata mutaciju cisteina na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3 u serin, i pri čemu se izolovani mutantni polipeptid htCBS daje u dozi između 0.33 i 10 mg/kg najmanje jednom dnevno tokom najmanje šest nedelja.
[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske B sintaze (htCBS) koja obuhvata mutaciju cisteina na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3 u serin za upotrebu u postupku lečenja najmanje jedne bolesti, poremećaja, ili stanja izabranog iz grupe koju čine osteoporoza, ili poremećaj vezivnog tkiva koji pogađa očni sistem, pri čemu taj postupak obuhvata davanje kompozicije humanom subjektu, pri čemu je pomenuti izolovani polipeptidni mutant htCBS PEGilovan sa ME-200GS PEG molekulom; pri čemu kompozicija se daje u dozi izabranoj iz opsega od 0.33 mg/kg do oko 10 mg/kg najmanje jednom nedeljno tokom najmanje šest nedelja.
[0012] Dalji aspekti ovog pronalaska su dati u patentnim zahtevima.
[0013] Ovde su otkrivene kompozicije pogodne za enzimsku zamensku terapiju koja obuhvata humanu skraćenu cistationinsku beta sintazu (htCBS) i njene varijante koje takođe mogu biti PEGilovane. htCBS kompozicija može da se koristi za snižavanje nivoa homocisteina i podizanje nivoa nishodnih metabolita, cistationina i cisteina, može da se koristi za lečenje stanja i bolesti kao što je homocistinurija (npr., CBSDH) i poremećaji remetilacije homocisteina, a takođe može da se koristi za poboljšanje patologije jetre.
[0014] Ovde su otkriveni postupci za lečenje homocistinurije kod subjekta davanjem subjektu kompozicije koja obuhvata izolovanu htCBS ili mutantni polipeptid htCBS . htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu biti PEGilovani sa PEG-om male ili velike molekulske mase. htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu biti PEGilovani sa PEG molekulima koji imaju razne geometrije i različite hemije za konjugaciju. htCBS ili mutantni polipeptidi htCBS mogu da se daju u dozi između 0.01 i 10 mg/kg i mogu da se daju najmanje jednom nedeljno. htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu da se daju u dozi između 5 i 7.5 mg/kg i mogu da se daju najmanje dva puta nedeljno. Dalje, htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu da se daju zajedno sa betainom, ili drugim poznatim CBSDH terapijama.
[0015] Ovde su otkriveni postupci za povećanje količine metabolita ka što su, ali bez ograničenja na, cistationin i cistein, kod subjekta davanjem subjektu kompozicija koja obuhvata htCBS ili mutantni polipeptid htCBS . htCBS ili mutantni polipeptid htCBS može biti PEGilovan sa PEG-om male ili velike molekulske mase. htCBS ili mutantni polipeptidi htCBS mogu da se daju u dozi između 0.01 i 10 mg/kg mogu da se daju najmanje jednom nedeljno. htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu da se daju u dozi između 5 i 7.5 mg/kg i mogu da se daju najmanje dva puta nedeljno. Dalje, htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu zajedno da se daju sa betainom. Količina cistationina može da se poveća do 0.005-0.35 µM. Količina cisteina može da se poveća do iznad 140 µM (npr., između 200 µM do 400 µM)
[0016] Ovde su otkriveni postupci za smanjenje količine metabolita kao što je, ali bez ograničenja na, homocistein, metionin S-adenozil homocistein, i S-adenozil metionin kod subjekta davanjem subjektu kompozicije koja obuhvata htCBS ili mutantni polipeptid htCBS. htCBS ili mutantni polipeptid htCBS može biti PEGilovan sa PEG-om male ili velike molekulske mase. htCBS ili mutantni polipeptidi htCBS mogu da se daju u dozi između 0.01 i 10 mg/kg. Na primer, doza je oko 0.4 mg/kg. htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu da se daju u dozi između 5 i 7.5 mg/kg i mogu da se daju najmanje dva puta nedeljno. Dalje, htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu da se daju zajedno sa betainom. Količina homocisteina može da se smanji do manje od 100 µM (npr., oko 10 µM). Količina metionina može da se smanji do manje od 50 µM (npr., oko 30 µM). Količina S-adenozil homocisteina može da se smanji do manje od 0.14 µM (npr., oko 0.015 µM)
[0017] Ovde su otkriveni postupci za lečenje bolesti jetre kod subjekta davanjem subjektu kompozicije koja obuhvata htCBS ili mutantni polipeptid htCBS. htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu biti PEGilovani PEG-om male ili velike molekulske mase. htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu da se daju u dozi između 0.01 i 10 mg/kg i mogu da se daju najmanje jednom nedeljno. Na primer, doza je oko 0.4 mg/kg. htCBS ili mutantni polipeptid htCBS mogu da se daju u dozi između 5 i 7.5 mg/kg i mogu da se daju najmanje dva puta nedeljno.
[0018] Ovde je otkriven postupak lečenja homocistinurije kod subjekta, pri čemu postupak uključuje faze davanja subjektu kompozicije koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske beta sintaze (htCBS) koja obuhvata mutaciju na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3, tako da je izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan sa molekulom ME-200GS PEG.
[0019] U nekim slučajevima, mutacija predstavlja supstituciju serina za cistein (C15S). U nekim slučajevima, subjekat je čovek. U nekim slučajevima, kompozicija se daje u dozi izabranoj iz opsega od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg. Na primer, doza je oko 0.4 mg/kg.
[0020] U nekim slučajevima, bolest, poremećaj, ili stanje je izabrano iz grupe koju čine osteoporoza, alopecija, istanjivanje kose, ili očni defekti, pri čemu taj postupak obuhvata davanje subjektu kompozicije koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske beta sintaze (htCBS) koja obuhvata mutaciju na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3, pri čemu je pomenuti izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan sa ME-200GS PEG molekulom.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0021]
FIG.1A-1B prikazuju zadržavanje enzima u plazmi i in vivo. FIG.1A prikazuje da se retenciono vreme enzima u plazmi održava čime se ukazuje na to ja brzi gubitak dejstva in vivo rezultat klirensa. FIG.
1B prikazuje da je retenciono vreme enzima in vivo pojačano za PEGilovanom htCBS. Miš #1 i Miš #2 na FIG.1B su takođe opisani kao na FIG.1B u International Patent Publication No. WO2014120770. FIG.2 prikazuje da ponovljeno davanje nePEGilovane htCBS ne dovodi do promena u nivoima homocisteina ili cisteina kod HO miševa.
FIG.3 prikazuje tok vremena PEGilacije sa izabranim linearnim 20kDa PEG molekulom označenim kao ME200MAB.
FIG.4A-4D prikazuju da dugoročna ponovljena injekcija PEGilovane htCBS značajno utiče na nivoe homocisteina, cistationina i cisteina plazmi i tkivu.
FIG.5A-5H ilustruju da mutant PEGilovane htCBS (takođe označen kao PEGC15S) i PEGilovana htCBS sprečavaju agregaciju proteina, obrazuju uglavnom dimere i ispoljavaju reproducibilan obrazac PEGilacije. FIG.5A je takođe opisan kao FIG.5A u International Patent Publication No. WO2014120770.
FIG.5B je takođe opisan kao FIG.5B u International Patent Publication No. WO20141207.
FIG.5C je takođe opisan kao FIG.5C u International Patent Publication No. WO2014120770.
FIG.5F je takođe opisan kao FIG.6A u International Patent Publication No. WO2014120770.
FIG.5G je takođe opisan kao deo FIG.7A i FIG.7B u International Patent Publication
No. WO2014120770.
FIG.5H je takođe opisan kao FIG.6C u International Patent Publication No. WO2014120770, pri čemu je njen sadržaj ovde uključen u svojoj celosti.
FIG.6A-6C prikazuju efekat mutanta PEGilovane htCBS (takođe označen kao PEGC15S) na homocisteinu i njegovim metabolitima nakon 1, 4 i 24 sata posle injekcije.
FIG.7A-7B prikazuju da lečenje mutantom PEGilovane htCBS (takođe označenim kao PEGC15S) i betainom sinergijski smanjuje i održava nivoe homocisteina niskim kod HO miševa i njihov efekat na nivoe cistationina.
FIG.8A-8B prikazuju da davanje mutanta PEGilovane htCBS a (takođe označenog kao PEGC15S) spašava potpuni CBS nokaut miševa od rane letalnosti i poboljšava patologiju jetre.
FIG.9A-9B prikazuju profile različitih PEGilovanih vrsta za C15S PEGilovan sa PEG molekulom maleimida (ME-200MA0B ili ME-400MA) ili PEG molekulom (ME-200GS) ili NHS estrom.
FIG.10A-10E prikazuju specifično dejstvo i nivoe metabolita u plazmi i CBS dejstvo nakon jedne subkutane (SC) injekcije 20NHS PEG-btCBS C15S (htCBS C15S PEGilovana sa ME-200GS PEG) ili 400MA PEG-htCBS C15S (htCBS C15S PEGilovana sa ME-400MA PEG) date HO miševima.
FIG.11A-11C prikazuju promene u stopama preživljavanja i nivoe metabolita kod KO miševa nakon davanja C15S PEGilovanog ili sa ME-200GS, ME-200MA0B ili ME-400MA.
FIG.12A-12F prikazuje potpuno sprečavanje i odlaganje početka facijalne alopecije u grupama 1278T -/- homozigotnih miševa kojima je kontinuirano davan C15S PEGilovan ili sa ME-200MA0B, ME-400MA ili ME-200GS.
FIG.13A-13B prikazuje poboljšanu ogoljenost jetre kod 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih KO miševa u poređenju sa PBS-lečenim KO miševima i zdravom kontrolom.
FIG.14A-14B prikazuju uzorke jetre na FIG.13A-13B kao što je primećeno elektronskom mikroskopijom.
FIG.15A-15D prikazuje efekte kontinuiranog davanja 2()NHS PEG-htCBS C15S kod HO miševa na CBS dejstvo i metabolite sumporne aminokiseline u plazmi pomoću različitih modela ALZET<®>osmotskih pumpi.
F1G.16A-16G prikazuju rezultate ispitivanja dvostruke energetske rentgenske apsorptiometrije (DEXA ili DXA) kontinuiranog dugoročnog davanja 20NHS PEG-htCBS C15S kod KO miševa.
FIG.17A-17F prikazuju rezultate dvostruke energetske rentgenske apsorptiometrije (DEXA ili DXA) kontinuiranog dugoročnog davanja 20NHS PEG-htCBS C15S kod I278T miševa.
FIG.18A-18B prikazuju koncentracije izabranih metabolita jetre analiziranih pomoću NMR metabolomike kod 1278T miševa nakon kontinuiranog dugoročnog davanja 20NHS PEG-htCBS C15S i u poređenju sa zdravim heterozigotnim i obolelim homozigotnim kontrolama.
FIG.19A-19E prikazuju efekte davanja 20NHS PEG-htCBS C15S na očne defekte kod I278T miševa. FIG.20A-20D prikazuju nivoe metabolita u plazmi kod I278T miševa koji su lečeni sa 20NHS PEG-htCBS i održavaju se ili na redovnoj dijeti ili na dijeti sa ograničenim unosom metabolita.
FIG.21A-21B prikazuju specifično dejstvo 20NHS-htCBS C15S kod mužjaka i ženki pacova nakon IV ili SC bolus doze od 4 (IV), 8 (SC), i 24 (SC) mg/kg. FIG.21C prikazuje specifično dejstvo 20NHS PEG-htCBS C15S nakon inicijalne injekcije i pri normalnim nivoima za pojedinačne Sprague Dawley pacove divljeg tipa koji primaju ukupno 9 injekcija u dozi od 8 mg/kg.
FIG.22A-22B prikazuju koncentraciju Cth u plazmi i specifično dejstvo 20NHS PEG-htCBS C15S kod cinomolgus majmuna (Macaca facicularis) nakon jedne IV ili SC injekcije u dozi od 2 ili 6 mg/kg. FIG.23A-23B specifično dejstvo i nivoe cistationina (Cth) u plazmi kod cinomolgus majmuna divljeg tipa (Macaca fascicularis) nakon višestrukih SC primena doze od 1,3, ili 10 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S.
FIG.24A-24G prikazuje rezultate alometrijskog skaliranja kako bi se procenila efikasna doza 20NHS PEG-htCBS kod ljudi bazirana na rezultatima za modele miševa, pacova, i majmuna.
DETALJAN OPIS
[0022] Ovde su otkrivene kompozicije i postupci za lečenje homocistinurije sa nedostatkom cistationinske b-sintaze (CBSDH). Kao neograničavajući primer, CBSDH može biti lečen zamenom enzima CBS ili njegovom varijantom.
[0023] Inaktivacija CBS rezultata dovodi do homocistinurije sa nedostatkom cistationinske b-sintaze (CBSDH), koja se češće naziva klasična homocistinurija. CBSDH je autozomalni recesivni poremećaj okarakterisan značajno povišenim nivoima ukupnog homocisteina (tHcy) i metionina, i u velikoj meri sniženih koncentracija cistationina i cisteina; to je najuobičajeniji nedostatak aminokiselina koje sadrže sumpor. Ukoliko se ne tretira, CBSDH dovodi do bolesti, poremećaja i/ili stanja kod raznih različitih sistema organa i ozbiljnih fenotipskih promena. Neograničavajući primeri ogoljenosti, poremećaja i/ili stanja od CBSDH uključuju mentalnu retardaciju, psihijatrijske poremećaje, probleme sa centralnim nervnim sistemom uključujući napade, kardiovaskularnu bolest sa predispozicijom za tromboembolijske komplikacije koje dovode do velike stope mortaliteta kod nelečenih i delimično lečenih pojedinaca, i opseg poremećaja vezivnog tkiva koji pogađaju očni sistem (npr., progresivna miopija i dislokacija sočiva, ectopia lends), i skeletni sistem (npr., marfanoid habitus, osteoporoza, skolioza, fina svetla i lomljiva kosa, tanka koža).
[0024] Postoji funkcionalna trihotomija u prirodi patogenih mutacija povezanih sa CBSDH. Jedna grupa mutacija je klasifikovana kao "ona koja reaguje na piridoksam," gde se funkcija CBS enzima može delimično obnoviti terapijom visokim dozama vitamina B6. Ovo lečenje može biti efektivno, ali ne ublažava uvek patološke događaje kod ovih pojedinaca, a neki od ovih događaja se javljaju čak i kod ovih pojedinaca tokom vremena. U kliničkom okruženju "koji reaguje na Vitamin B6" je definisan kao 20% relativnog pada kod Hey koji se javlja 24 sata nakon što je pojedincu data oralna doza od 100-500mg B6, što znači da pojedinac koji reaguje na B6 i dalje može da ima abnormalno visoke nivoe homocisteina. Druga grupa funkcionalnih mutacija je predstavljena "C-terminalnim CBS mutantima" kojima ne dostaje mogućnost reagovanja na post-translacionu ushodnu regulaciju S-adenozilmetioninom. Pojedincima sa ovom klasom mutacija obično nedostaju fenotipovi mentalne retardacije i aspekti vezivnih tkiva. Ova klasa je detektovana nakon merenja nivoa Hcy u plazmi nakon idiopatskog trombotičnog događaja pre 40 godina života (Maclean et al..2002. Hum. Mutal.19:6-41-55). Konačna grupa CBSDH mutacija je "klasična homocistinurija," koja predstavlja najozbiljniji oblik ove bolesti. Za ove dve druge grupe pojedinaca terapija vitaminom B6u izolaciji efektivno ne snižava Hey nivoe u serumu. Ove mutacione grupe prikazuju fenotipske razlike, ali mogu slično da se tretiraju.
[0025] Najčešća mutirana CBS alela je 833T>C (I278T), koja je povezana sa homocistinurijom koja odgovara na piridoksin. Samim tim, pojedinci koji reaguju na B6računaju na približno polovinu populacije pacijenata sa homocistinuirijom (Barber and Spaeth, 1969; Mudd ct al., 1985). Od ovih pojedinaca koji reaguju na B6, međutim, mnogi samo delimično reaguju, a u kombinaciji sa pojedincima koji ne reaguju na B6, javlja se potreba za dodatnim terapijskim opcijama. Na žalost, takve terapijske opcije su trenutno ograničene na smanjenje unosa metionina praćenjem striktne dijete sa malim unosom proteina sa dodatkom cisteina (sada suštinskim) i smanjenjem koncentracije homocisteina upotrebom betaina (N,N,N-trimetilglicin), pri čemu je davalac metila u mogućnosti da re-metiliše homocistein nazad u metionin. Stoga, enzimska zamenska terapija (ERT) koja koristi CBS (npr. ovde opisana PEGilovana htCBS) može biti najbolja terapija i za pacijente koji delimično reaguju na B6i za one koji ne reaguju na istu.
[0026] Kao rezultat CBS disfunkcije, nivoi homocisteina (Hey) su dramatično izmenjeni kod CBSDH pacijenata. Kod zdravih pojedinaca, ukupni nivoi Hey su u opsegu od ~5-15 µM (Stabler et al, 2002, Metabolism, 51:981-988), pri čemu je 98% u obliku disulfida ili su proteinski vezani. Samo 2% tHcy postoji u obliku slobodnog (nevezanog za protein) smanjenog homocisteina, koji može da služi kao supstrat za CBS (Mansoor et al, 1992, Anal. Biochem.200:218.229; Mudd et al., 2000, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.20:1704-1706). Ova ravnoteža je dramatično izmenjena kod pacijenata sa CBSDH, sa slobodnim smanjenim homocisteinom koji dostiže 10-25% tHcy vrednosti koje su primećene kod ovih pacijenata (do ~400µM) (Mansoor et al., 1993, Metabolism, 42:1481-1485).
[0027] Viši nivoi tHcy (npr., veći 54 puta od nivoa divljeg tipa) takođe mogu da uzrokuju ogoljenosti, poremećaje i/ili stanja kao što su, ali bez ograničenja na, facijalna alopecija kod miševa, osteoporoza i smanjenje srednjeg preživljavanja. Kao neograničavajući primer, modeli miševa koji su imali najmanje 54 puta više tHcy u poređenju sa divljim tipom koji je demonstriran kod nekoliko bolesti, poremećaja i/ili stanja, uključujući facijalnu alopeciju, osteoporozu i smanjenje srednjeg preživljavanja. Međutim nisu primećeni takvi znaci kod miševa koji su imali nivoe tHcy oko 30 puta veće od normalnih vrednosti i samim tim povećanje homocisteina može biti samo patogeno samo iznad nivoa donjeg praga (Gupta et al., 2009, FASEB J.23:883-893). U multicentričnom ispitivanju praćenja CBSDH kod ljudi, zaključeno je da mada razne kombinacije lečenja nisu uspele da očuvaju normalne nivoe homocisteina kod pacijenata sa CBSDH, a da su B6neresponderi nastavili da ispoljavaju nivoe homocisteina 3-5 veće od gornje granice kod normalne populacije, rizik od tromboembolizma kod ovih pacijenata je značajno smanjen (Yap et al., 2001, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol 21, 2080-2085). Sve ukupno, ovi podaci ukazuju da, da bi se poboljšala klinička manifestacija CBSDH, nepotpuno smanjenje tHcy, ukoliko je ispod donjeg praga, može biti dovoljno da se bolest leči.
[0028] Dok dijeta sa malim unosom metionina može biti efikasna u uspostavljanju i održavanju nekih metaboličkih kontrolnih nivoa homocisteina kod pacijenata, njegov efekat može bit zaustavljen nedostatkom dijetetske usklađenosti naročito kod pacijenata kod kojih je dijagnoza kasnije uspostavljena, što dovodi do istovremenog povećanja homocisteina praćenog razvojem simptoma, posebno kod dece (Walter el al., 1998, Eur. J. Pediatr, 157 Suppl 2, S71-76). Nedostatak dijetetske usklađenosti uzrokuje povećan Hey u serumu, ponovno javljanje komplikacija u vaskularnom i vezivnom tkivu uključujući fatalne i obeshrabrujuće događaje, i rizik od ozbiljnih neželjenih dejstava kao što je cerebralni edem (od prekomerne koncentracije Met-a u serumu) ili ozbiljnija pothranjenost (od nedostatka suštinskih aminokiselina). Najefikasnija terapeutska strategija je da se poveća dejstvo enzima, kao što je očigledno kada se piridoksin primenjuje kod homocistinurije koja reaguje na vitamin B6. Ova strategija nije moguća za pojedince koji ne reaguju na vitamin B6usled statSAD mutacija. Betainc može da pomogne u postizanju metaboličke kontrole kod manje usklađenih pacijenata i njegova kombinacija sa dijetom može da predstavlja najbolje dostupno lečenje. Međutim, trenutne terapije za pacijente koji ne reaguju na B6ne povećavaju suplementaciju cistationinom, a suplementacija cisteinom može biti opravdana za održavanje pravilnih nivoa. Povećano dejstvo enzima kod ovih pojedinaca samim tim može da zavisi od isporuke egzogenog enzima, tj. enzimske zamenske terapije (ERT).
[0029] Značajni dokazi ukazuju na moguću funkciju za cistationin nezavisan od svoje uloge intermedijera u transsulfuraciji. Pozitivna uloga za cistationin je predložena ispitivanjima određenog transgenskog mišjeg modela homocistinurije sa nedostatkom CBS. U ovom modelu klasične homocistinurije, mišji chs gene je inaktivisan i preživljava na ekspresiji niskog nivoa humanog CBS transgena pod kontrolom humanog CBS promotera; samim tim, označen je kao "samo za ljude" (HO). HO miš ispoljava ozbiljna povećanja i nivoa u plazmi i u tkivu Hey, metionina, S-adenozilmetionina, i S-adcnosil homocisteina i istovremeno smanjenje hepatičkih nivoa cisteina u plazmi. Međutim, nasuprot prethodnim CBS nokaut modelima klasične homocistinurije (takođe poznatim kao CBS nokaut miševi (KO) koji pate od ozbiljnog zaostatka u rastu i hepatopatije i većina umire tokom tri nedelje nakon rođenja, čak i dok su majke na betainu (Maclean et al., 2010b. Mol. Genet. Metab.101, 153-162)), koji pate od ozbiljnog zaostatka u rastu i hepatopatije, dovode do hepatičke steatoze, fibroze, i neonatalne smrti tri nedelje nakon rođenja čak i ako su majke na betainu, HO miševi ispoljavaju blagu hepatopatiju i približno 90% HO miševa živi najmanje 6 meseci (Maclean et al., 2012, J. Biol. Chem.287, 31994-32005.). Određivanja krvarenja iz repa ukazuju da su HO miševi u hiperkoagulativnom škrljicu koji je značajno poboljšan lečenjem betainom na način koji rekapitulira bolest kao što se javlja kod ljudi (Maclean et al., 2010b. Mol. Genet. Metab.101, 153-162; čiji je sadržaj u vidu reference ovde inkorporisan u celosti). HO miševi imaju visoke nivoe tHcy, ali pate samo od manjih posledica. Razlike u nivoima metabolita ova dva mišja modela su male ili ne postoje, izuzev nivoa cistationina, koji je zanačajno povišen kod HO miševa (~10 µM) u odnosu na KO (~ 1 µM). Samim tim se došlo do zaključka da cistationin može imati efekte protiv sakupljanja masti u jetri i bubrezima, povrede tkiva i smrti apoptotičnih ćelija indukovanih produženim stresom endoplazmatskog retikuluma.
[0030] Cistationin može da ispoljava zaštitne efekte kod mišjeg modela povrede jetre indukovane acetaminofenom time što cistein služi kao prolek. Upotreba CGL koji inaktivira jedinjenje D.1-2-amino-4-etilpropiolske kiseline u eksperimentima kako bi se indukovala hipercistationemija blokiranjem konverzije cistationina u cistein kuplovan sa praćenjem da cistationin ispoljava značajne zaštitne efekte kod 23 ćelije koje ne mogu da pretvore jedinjenje u cistein, čime se ukazuje da primećeni zaštitni efekti nisu rezultat toga što cistationin deluje kao prekursor za sintezu cisteina.
[0031] Cistationin može biti važan za normalno funkcionisanje mozga. Moguće je da se cistationin specifično akumulira u mozgu normalnog sisara da bi služio kao agens za citoprotekciju i da prekid njegove sinteze može da doprinese mentalnoj retardaciji kod homocistinurije povećavanjem osetljivosti neuronskih tkiva na toksični insult povišenog Hey i/ili njegovih derivata (Maclean et al., 2012, J. Biol, Chem.287, 31994-32005). Postoje značajne regionalne razlike u koncentracijama cistationina u mozgu, i veća je koncentracija u beloj nego sivoj stvari, čime se ukazuje na moguću ulogu u mijelinaciji.
Cistationin je pronađen u višim nivoima u okcipitalnim režnjevima mozga ljudi i majmuna nego u celom mozgu nižih životinjskih vrsta, a ukazano je na to da je uloga cistationina važnija u mozgu primata nego u mozgu glodara (Volpe and Lasier, 1972, Biol. Neonate 20.385-403;
[0032] Brojni neposredni dokazi idu u prilog mogućim fiziološkim ulogama ili za cistationin ili njegov derivat. U mozgu i centralnom nervnom sistemu primata (CNS), javlja se disbalans između nivoa relativnog dejstva CBS i CGL što dovodi do akumulacije cistationina. Slično tome, tokom razvoja embriona, CBS je eksprimirana u više tkiva kao što su srce i pluća koji ne ekprimiraju CBS koja može da se detektuje u tkivima odraslih. Opseg podataka ukazuje na to da CGL nije eksprimiran tokom ranog razvoja sisara. U uzorcima ljudske jetre na primer, CGL dejstvo je detektovano samo u postnatalnom tkivu dok dejstvo u fetalnom, prevremenom i terminskom neonatalnom tkivu jetre suštinski ne može da se detektuje. Sve zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da u određenim fazama razvoja i u nervnim tkivima odraslih, CBS se eksprimira konkretno za proizvodnju cistationina različitog od njegove uloge intermedijera u sintezi cisteina (Maclean et al., 2012, J. Biol. Chem .287,31994-32005). Uzevši u obzir da se rigorozna kontrola nad cistationin γ-liazom (CGL) i ekspresijom CBS javlja tokom razvoja sisara, ova opažanja se spajaju kako bi se ukazalo na moguću zaštitnu ulogu cistationina pored toga što predstavlja prekursor cisteina.
[0033] Biosintezu cisteina iz cistationina katalizuje CGL. Cistationin je prisutan unutar ćelija, i veruje se da ne postoji kao protein plazme. Shodno tome, veruje se da cistationin proizveden nakon injekcije ovde opisanog PEGilovanog humanog skraćenog (htCBS) enzima može takođe da posluži kao intracelularni supstrat za CGL. Pored toga, moguće je da smanjeni nivoi tHcy mogu da spreče stvaranje cisteinhomocisteinskih adukata (koji se mogu brzo očistiti u urinu), čime se stvaraju viši nivoi slobodnog cisteina u plazmi (Gupta et al., 2014, FASEB J.28:781-790).
CBS ENZIM
[0034] CBS gen se nalazi na ljudskom hromozomu 21 na q22.3 (Skovby el al., Hum. Genet.65:291-294 (1984); Munke et al., Am. J. Hum. Genet.42:550-559 (1988)). Sekvenca nukleinske kiseline koji kodira humanu CBS i aminokiselinska sekvenca koju kodira, su dostupne putem GenBank pristupnog br.
L19501, a ove sekvence su takođe otkrivene u U.S. Patent No.5,523,225, koji je ovdje uključen kao referenca u celosti. Sekvenca nukleinske kiseline genomske DNK koji kodira CBS takođe je javno dostupna putem baza podataka sekvenci kao što je GenBank i na internet stranici Univerziteta Kolorado iz Denvera (Kraus Laboratory).
[0035] Bez želje za vezivanjem za teoriju, protein kodiran CBS genom deluje kao homotetramer da bi katalizovao konverziju homocisteina u cistationin, pri čemu je to prva faza u putu transsulfuracije.
Kodirani protein alosterički je aktiviran S-adenozil-metioninom i koristi piridoksalfosfat kao zajednički faktor. Za ovaj gen je pronađeno više alternativno splajsovanih varijanti transkripta.
[0036] CBS upravlja neusmerenim protokom sumpora od metionina do cisteina dejstvujući na preseku puteva transmetilacije, transsulfuracije i remetilacije. On katalizuje reakciju β-zamenske reakcije u kojoj se serin kondenzuje s homocisteinom tako da je zavisan od piridoksalnog 5'-fosfata (PLP), kako bi nastao cistationin (Miles and Kraus, 2004, J. Biol. Chem.279:29871-29874).
[0037] Cistationin se zatim može pretvoriti u cistein pomoću gama lijaze cistationina (CGL). Stoga je pravilna funkcija CBS enzima kritična za regulaciju metabolizma cisteina i metionina (Mudd et al.,2001, "Disorders of Transsulfuration." In the Metabolic and molecular bases of inherited disease. C.R. Scriver, A.L. Beudet, W.S. Sly, V. D., C. B., K.K. W., i V. B., eds. (New York: McGraw-Hill), pp.2007-2056), i samim tim, kompromitovano dejstvo CBS ili njegov nedostatak, dovodi do biohemijskih i kliničkih manifestacija hemocistinurije sa nedostatkom CBS (CBSDH).
[0038] Inaktivacija CBS-a dovodi do homocistinurije s nedostatkom cistationinske beta-sintaze (CBSDH), koja se češće naziva klasična homocistinurija. Klasičnu homocistinuriju prvi su opisali Carson i Neill u 1962 (Carson and Neill, 1962. Arch. Dis. Child 37:505-513; čiji je sadržaj ovde uključen kao referenca u celosti) i priznata je kao najčešća urođena greška metabolizma sumpornih aminokiselina. Osnovni uzrok homocisunurije, nedostatak enzima cistationinske β-sintaze (CBS), otkriven je ubrzo nakon toga (Mudd et al., 1964, Science 143:1443-1445).
[0039] Misens mutacije predstavljaju najčešći uzrok nedostatka cistationinske β-sintaze (CBS). Mnoge od ovih mutacija dovode do pogrešno savijenih proteina, koji nemaju biološku funkciju. Prisustvo hemijskih pratilaca (npr., kao što su etanol, dimetilsulfoksid, ili trimetilatinoični-N-oksid) ponekad može da ublaži ili čak obnovi savijanje proteina i dejstvo mutantnih proteina. Osam CBS mutantnih enzima (P49L, P78R, A114V, R125Q, E176K, P422L, 1435T, i S466L) je prečišćeno i okarakterisano, i mogli bi da ih spasu hemijski pratioci poboljšavanjem savijanja proteina. Tetramerni mutantni enzimi koji su u potpunosti zasićeni hemom su imali ista ili veća konkretna dejstva od CBS divljeg tipa. Merenja termalne stabilnosti su pokazala da su prečišćeni mutanti jednako ili više termostabilni od CBS divljeg tipa. Odgovor na stimulaciju S-adenozil-L-metioninom ili termalnom aktivacijom je varirao. Nedostatak odgovora R125Q i E176K na oba stimulansa je ukazivao da njihove specifične konformacije nisu bile sposobne da postignu aktivirano stanje. Povišeni nivoi molekulskih pratilaca u sirovim ekstraktima, naročito DnaJ, su ukazivali na prilično indirektan efekat hemijskih pratilaca na savijanje CBS mutanata (Majtan, et al.,2010, J. Biol. Chem.285(21): 15866-15873.
[0040] Opseg pogrešnog savijanja 27 CBS mutacija prethodno ispitanih kod E. coli su ispitane na sposobnost pratilaca da spasu konformaciju ovih mutacija u uslovima koji više dozvoljavaju preklapanje CHO-K1 ćelija sisara. Ekspresija mutacija u ćelijama sisara je povećala srednje dejstvo 16 puta, a količinu tetramera 3.2 puta u poređenju sa ekspresijom u bakterijama. Nakon toga, ispitani su odgovori sedam izabranih mutacija na tri jedinjenja sa dejstvom poput pratioca. Aminooksisirćetna kiselina i 4-fenilbutirinska kiselina su pokazale slab efekat. Nasuprot tome, arginat heme je suštinski povećao stvaranje mutantnih CBS tetramera proteina (do šest puta) i smanjio katalitičko dejstvo (do devet puta) pet od sedam mutacija (p.A114V, p.K102N, p.R125Q, p.R266K, i p.R369C). Najveći efekat arginata heme je primećen za mutaciju p.R125Q, koja ne reaguje na in vivo lečenje vitaminom B6. Štaviše, reagovanje hema p.R125Q mutacije je potvrđeno u fibroblastima deriviranim od pacijenta homozigotnog za ovu genetsku varijantu. Na osnovu ovih podataka, različita grupa CBS mutacija koje reaguju na hem je predložena i predviđa se da će hemski džep biti važan cilj za dizajniranje novih terapija za homocistinuriju (Melenovska, el al., 2014, J. Inherit. Metab. Dis.38(2)).
[0041] Biohemijski, CBSDH je okarakterisana izuzetno povišenim nivoima homocisteina, metionina i S-adenozil-homocisteina u krvi (takođe poznatim kao "SAH" ili "AdoHcy"), koji su praćeni niskim nivoima cisteina i cistationina. Neke od kliničkih manifestacija nelečene homocistinurije uključuju tromboembolizam, probleme sa vezivnim tkivom kao što su dislociranje optičkih sočiva, marfanoidne karakteristike i osteoporoza, kognitivno oštećenje i duge znake (Kraus, J., i Kozich, V. (2001). " Cystathionine beta-synthase and its deficiency." In Homocysteine in health and disease. J.D. Carmel R, ed. (New York: Cambridge University Press), pp.223-243; Mudd et al., 2001, "Disorders of Transsulfuration."In the Metabolic and molecular bases of inherited disease. C.R. Scriver, A.L. Beudet, W.S. Sly, V. D., C. B., K.K. W., i V. B., eds. (New York: McGraw-Hill), pp.2007-2056).
[0042] Početni pokušaji lečenja homocistinurije koristili su ograničenja u ishrani kako bi se smanjio unos metionina, čime se izbegavalo nakupljanje toksičnog homocisteina (Komrower et al., 1966, Arch. Dis. Child 41:666-671). Kasnije je otkriveno da suplementacija s prekursorom zajedničkog faktora PLP, piridoksinom (vitaminom B5), ublažava kliničke manifestacije kod nešto manje od polovine pacijenata, a deo njih su samo delimični responderi (Barber and Spaeth, 1969. J. Pediatr.75:463-478; Mudd el al., 1985, Am. J. Hum. Genet.37:1-31). "B6responderi" bi trebalo da uzimaju dodatni vitamin B6do kraja života. U mnogim slučajevima, čak i pacijenti koji u potpunosti reaguju na B6zahtevaju blažu dijetu sa ograničenim unosom proteina kako bi mogli da postignu metaboličku kontrolu (Picker, J.D., and Levy, H.L. (2004). Homocystinuria Caused by Cystathionine Beta-Synthase Deficiency. In GeneReviews, R.A. Pagon, M.P. Adam, T.D. Bird, C.R. Dolan, C.T. Fong. and K. Stephens, eds. (Seattle (WA): University of Washington, Seattle). Preostali podskup, oni koji nisu odreagovali, su podvrgnuti izuzetno ograničenoj dijeti, sa kojim se mnogi pacijenti slabo uklapaju (Walter et at., 1998, Eur. J. Pediatr.157 Suppl 2, S71-76). Dijeta je kombinovana sa mešavinom aminokiselina obogaćenih sa metioninom i cisteinom zajedno sa betainom, koji mogu da služe kao davaoci metila za enzim betain-homocistein metiltransferaze (BHMT) da bi se proizveo dimetilglicink i metionin iz homocisteina (Finkelstein, 1990. J. Nutr. Blochem.
1:228-237). Glutation je sintetisan iz cisteina, i samim tim dodavanje cisteina može biti važno za smanjenje oksidativnog stresa. Većina pacijenata je takođe lečena trimetilglicinom, i normalnom dozom dodatka folne kiseline. Ovo poboljšava metaboličku kontrolu snižavanjem homocisteinskih nivao, u odnosu na striktnu dijetu.
[0043] Betain (N,N,N-trimetilglicin) se koristi za smanjenje koncentracije homocisteina promovisanjem pretvaranja homocisteina ponovo u metionin, tj., povećanje fluksa putem ponovne metilacije nezavisno od derivata folata (koji je uglavnom aktivan u jetri i u bubrezima). Mali deo ponovo formiranog metionina se zatim postepeno uklanja inkorporisanjem u protein tela. Metionin koji je pretvoren u protein je pretvoren u S-adenozil-metionin koji se nastavlja kako bi se ponovo obrazovao homocistein. Betain je samim tim najefikasniji ako je količina metionina koji bi trebalo da se ukloni mala. Stoga lečenje uključuje i betain i dijetu sa malim unosom metionina. Kod klasične homocistinurije, nivo metionina u plazmi obično raste iznad normalnog opsega od 30 mikromolova/L a koncentracije bi trebalo da se prate jer se mogu postići potencijalno toksični nivoi (više od 400 mikromolova/L).
[0044] Dugo se tražila alternativna strategija lečenja za CBSDH da bi se osobama koje ne reaguju na B6i osobama koje delimično reaguju obezbedila terapija koja poboljšava metaboličke abnormalnosti, smanjuje akumuliranje toksičnog homocisteina u krvotoku, i povećava nivoe cistationina i cisteina. Takve metaboličke promene mogu da obrnu, ili odlože početak CBSDH simptoma, i omoguće grupi obolelih pojedinaca da uživaju u neograničenoj ili blago ograničenoj dijeti i da značajno poboljšaju svoj kvalitet života. Da bi se ove beneficije obezbedile, terapija mora da poboljša jezgro nedostatka koji je u osnovi ovog stanja, naime aberantne nivoe CBS i/ili funkciju. Shodno tome, sistemsko uvođenje CBS-a, u obliku enzimske zamenske terapije (ERT), bi trebalo da bude id koristi za pacijente obolele od homocistinurije.
[0045] Bez vezivanja za teoriju, veruje se da značajno smanjenje ekstracelularnog homocisteina usled primene CBS stvara koncentracioni gradijent koji pokreće fluks homocisteina od intra- u ekstracelularne prostore, gde ga primenjeni enzim dalje obrađuje, i samim tim ekstracelularni CBS može da služi kao homocisteinski "odvod."
[0046] Struktura i način aktivacije nativne humane CBS koji postoji kao tetramer, koji je sastavljen od četiri identična monomera mogu biti teški za upotrebu u obliku ERT. Ovaj oblik enzima ima veliku tendenciju ka agregaciji, koja predstavlja veliko ograničenje za napore prečišćavanja (Kraus and Rosenberg, 1983, Arch. Biochem. Biophys.222:44-52). Pored toga, aktivacija CBS zahteva vezivanje S-adenozil-metionina (SAM) za C-terminalni rep, kako bi se olakšala autoinhibicija koju enzim vrši svojim C-terminalnim regulatornim regionom.
[0047] Skraćena rekombinantna humana CBS (htCBS) je otkrivena (SEQ ID NO: 3) tamo gde je C-terminalni regulatorni region uklonjen. htCBS može biti mutiran gde je cistein na aminokiselinskom položaju 15 promenjen u serin (htCBS mutant ili C15S) (SEQ ID NO: 13).
[0048] U nekim slučajevima PEGilovana htCBS ili mutantni enzim PEGilovane htCBS je poboljšao farmakokinetička i farmakodinamička svojstva enzima in vivo. Terapeutski proteini, za razliku od malih molekula, su dobijeni parenteralnim putevima, a na efikasnost lečenja u velikoj meri može da utiče njihova apsorpcija, raspodela, metabolizam i izlučivanje ("ADME") (Vugmeyster et al., 2012, World Journal of Biologicali Chemistry 3:73-92; čiji je sadržaj, kao referenca, ovde inkorporisan u svojoj celosti). Jedinjenja velike molekulske mase, kao što su enzimi, imaju ograničenu sposobnost prodiranja u tkiva, i samim tim su uglavnom prisutna u plazmi dok se ne uklone iz krvotoka bar jednim mehanizmom.
[0049] U nekim slučajevima, primena htCBS ili htCBS mutant za ERT održava visoko dejstvo u plazmi tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da isporuči stabilan i značajan efekat na metabolizam sumporne aminokiseline. Pojačavanje ERT efikasnosti može da zahteva dodatne modifikacije na proteinu, kako bi s povećalo retenciono vreme in vivo. Ovo može da se postigne PEGilacijom, dodavanjem grupa poli-etilen-glikola (PEG) na površinu proteina, da bi se produžilo retenciono vreme kod subjekta. Za PEGilaciju je zaključeno da svodi na minimum proteolizu, imuni odgovor i antigenost, dok povećava stabilnost i veličinu proteina, i smanjuje renalno izlučivanje (Kang et al., 2009, Expert opinion on emerging drugs 14:363-380;
[0050] Biosintezu cisteina iz cistationina katalizuje samo CGL. Cistationin je samo prisutan unutar ćelija, i dokumenti ne postoji kao proteini u plazmi. Shodno tome, veruje se da cistationin proizveden nakon injekcije ovde opisanih PEGilovane htCBS ili enzima mutanta PEGilovane htCBS, takođe može da služi kao intracelularni supstrat za CGL. Pored toga, a bez međusobnog isključivanja, takođe je moguće da sniženi nivoi tHcy takođe mogu da spreče stvaranje adukata cisteina-homocisteina (koji brzinski mogu da se očiste u urinu), čime se stvaraju viši nivoi slobodnog cisteina u plazmi, kao što je prethodno ukazano na to (Gupta et al., 2014, FASEB J.28, 781-790). Normalizovanje nivoa cisteina bez dodataka cisteina predstavlja drugu potencijalnu prednost trenutno opisanog htCBS i htCBS mutanta u ERT.
[0051] U nekim slučajevima, normalizacija nivoa cisteina može da se prati nakon primene PEGilovane htCBS ili enzima mutanta PEGilovane htCBS. Pored promene u nivoima metabolita, drugi pozitivan efekat primene htCBS ili htCBS mutanta može da se predvidi kao značajan uticaj na bolest jetre i preživljavanje obolelih CBSDH pacijenata.
POSTUPCI UPOTREBE PEGILOVANE ktCBS
[0052] U nekim slučajevima, ovde opisana kompozicija i postupci mogu da se koriste za lečenje CBSDH. Postoje tri grupe patogenih mutacija povezanih sa CBSDH, (1) mutacije koje reaguju na piridoksin, (2) C-terminalni CBS mutant i (3) klasična homocistinurija.
[0053] U jednom načinu ostvarivanja, zamena htCBS i htCBS enzima mutanta može da se koristi za lečenje CBSDH. htCBS i htCBS mutant enzim mogu biti PEGilovani ovde opisanim postupkom poznatim u nauci. Kao neograničavajući primer, PEG može biti male molekulske mase (npr., 2 kDa) PEG ili razgranati PEG velike molekulske mase sa četiri kraka (npr., 40 kDa). Na primer, htCBS ili mutantni polipeptid htCBS je PEGilovan sa jednim od sledećih PEG molekula: ME-200MA0B, ME-400MA, ME-050GS, GL4-400MA, i ME-200GS. Na primer, htCBS ili mutantni polipeptid htCBS PEG konjugat predstavlja 20NHS PEG-htCBS C15S konjugat.
[0054] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS i postupci upotrebe PEGilovane htCBS ili mutanta PEGilovane htCBS a ovde opisani mogu da se koriste za lečenje subjekata sa mutacijama koji reaguju na piridioksin. PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS može da se koristi sam ili u kombinaciji sa trenutnim terapijama (npr., vitaminom B6 ili betainom) da bi se lečili subjekti sa mutacijama koje reaguju na piridioksin. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste kako bi se ublažili ili smanjili patološki događaji kod subjekata sa mutacijama koje ne reaguju na piridoksin. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za lečenje subjekta sa mutacijama koje reaguju na piridoksin koji je delimičan responeder na terapiju vitaminom B6. Kao drugi neograničavajući primer, PEGilovana btCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za lečenje subjekta sa mutacijama koje reaguju na piridoksin koji nije reagovao na terapiju vitaminom B6.
[0055] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS i postupci upotrebe ovde opisane PEGilovane htCBS ili mutanta PEGilovane htCBS a mogu da se koriste za lečenje subjekata sa C-terminalnim CBS mutacijama. PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste sami ili u kombinaciji sa trenutnim terapijama (npr., vitaminom B6 ili betainom) za lečenje subjekata sa C-terminalnim CBS mutacijama. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za snižavanje Hcy nivoa u serumu kod subjekata sa C-terminalnim CBS mutacijama. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za lečenje subjekta sa C-terminalnim CBS mutacijama koji delimično reaguju na terapiju vitaminom B6. Kao još jedan neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za lečenje subjekta sa C-terminalnim CBS mutacijama koji ne reaguje na terapiju vitaminom B6.
[0056] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS i postupci upotrebe ovde opisane PEGilovane htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za lečenje subjekata sa klasičnom homocistinurijom. PEGilovana htCBS ili Mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste sami ili u kombinaciji sa trenutnim terapijama (npr.. vitaminom B6 ili betainom) za lečenje subjekata sa klasičnom homocistinurijom. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za smanjenje nivoa Hcy u serumu kod subjekata sa klasičnom homocistinurijom. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za lečenje subjekta sa klasičnom homocistinurijom koji delimično reaguje na terapiju vitaminom B6. Kao još jedan neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za lečenje subjekta sa klasičnom homocistinurijom koji ne revondira na terapiju vitaminom B6. U određenim slučajevima, subjekat je čovek, pacov, miš, i nehumani primat. U određenim slučajevima, 20NHS PEG-htCBS C15S se koristi za lečenje najmanje jedne bolesti, poremećaja, stanja, ili kliničkog simptoma izabranog iz grupe koju čine osteoporoza, istanjivanje kose, ili očni defekti.
[0057] Ovde opisane kompozicije i postupci mogu da se koriste da se smanji simptom, bolest ili poremećaj povezan sa CBSDH. Ovaj simptom, bolest ili poremećaj može biti u sistemu organa ili ozbiljna fenotipska promena. Neograničavajući primeri bolesti, poremećaja i/ili stanja od CBSDH uključuju mentalnu retardaciju, psihijatrijske poremećaje, probleme sa centralnim nervnim sistemom, uključujući napade, kardiovaskularnu bolest sa predispozicijom ka tromboembolijskim komplikacijama koje dovode do veće stope mortaliteta kod nelečenih i delimično lečenih pojedinaca, i opseg poremećaja vezivnih tkiva koji pogađa očni sistem (npr., progresivne miopije i obezbojavanja sočiva, ectopia lentis), i skeletni sistem (npr., marfanoid habitus, osteoporoza, skolioza, fina svetla kosa i lomljiva, tanka koža).
[0058] Ovde opisane kompozicije i postupci mogu da se koriste za lečenje bolesti, poremećaja i/ili stanja kao što je, ali bez ograničenja na, tromboembolizam, problemi sa vezivnim tkivima kao što je dislokacija optičkih sočiva, karakteristike marfanoida, osteoporoza, i kognitivno oštećenje.
[0059] Ovde opisana PEGilovana htCBS ili mutantni enzim PEGilovane htCBS mogu da smanje efekte i/ili da leče bolest jetre. Ta bolest jetre može biti kod subjekta sa CBSDH. Lečenje i/ili smanjenje efekata bolesti jetre samim tim može da poveća stopu preživljavanja pacijenata sa CBSDH. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za smanjenje oštećenja parenhima jetre.
[0060] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za povećanje cistationina i za lečenje ili smanjenje efekata bolesti jetre ili povrede.
[0061] Ovde opisane kompozicije i postupci (npr. enzimska zamenska terapija (ERT)) koje koriste PEGilovanu htCBS ili mutantni enzim PEGilovane htCBS mogu da poboljšaju manifestacije bolesti I metaboličke abnormalnosti koje karakterišu homocistinuriju. U nekim slučajevima, PEGilovana htCBS ili mutantni enzim PEGilovane htCBS modulira toksične metabolite tokom najmanje 24 sata, najmanje 48 sati, ili najmanje 72 sata. Pored načina ostvarivanja, PEGilovana htCBS ili mutantni enzim PEGilovane htCBS poboljšava manifestacije bolesti tokom najmanje 3 meseca, 6 meseci, 12 meseci, ili 24 meseca.
[0062] U nekim slučajevima, ERT koji koristi PEGilovanu htCBS ili mutantni enzim PEGilovane htCBS nudi efikasnu terapiju za pacijente sa CBSDH kako bi se omogućilo sprečavanje i lečenje i/ili poboljšanje simptoma homocistinurije, i ublažavanje potrebe za održavanjem takve dijete koja striktno isključuje proteine. Alternativno, subjektu se daje PEGilovana htCBS C15S, i subjekat je na dijeti koja isključuje protein ili na dijeti koja je sa ograničenim unosom metionina.
[0063] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za povećanje cistationina i za lečenje efekata mentalne retardacije kod subjekata sa homocistinurijom. Količina cistationina može da se poveća u regionu ili oblasti mozga kao što je, ali bez ograničenja na, siva masa potiljačnih režnjeva i bela masa.
[0064] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za povećanje osetljivosti nervnih tkiva u mozgu subjekata sa homocistinurijom. Količina cistationina može da se poveća u regionu ili oblasti mozga kao što je, ali bez ograničenja na, siva masa potiljačnih režnjeva i bela masa.
[0065] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za produženje života subjekta sa CBSDH.
[0066] U nekim slučajevima, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS se koristi kao deo CBS enzimske zamenske terapije (ERT) za lečenje homocistinurije. Primena PEGilovane htCBS ili mutanta htCBS može nužno zahtevati uvođenje enzima koji je u deficitu u njegov prirodni intracelularni odeljak [0067] U načinu ostvarivanja, primena PEGilovane htCBS ili mutanta PEGilovane htCBS smanjuje nivoe homocisteina za 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 52% 55%, 60%, 65%, 67%, 69%, 70%, 74%, 75%, 76%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95% ili za više od 95%. Kao neograničavajući primer, smanjenje homocisteina može predstavljati smanjenje od oko 69%. Kao neograničavajući primer, smanjenje homocisteina može biti smanjenje od oko 67%. Kao neograničavajući primer, smanjenje homocisteina može biti smanjenje od oko 52%. Kao neograničavajući primer, smanjenje homocisteina može biti smanjenje od oko 33%.
[0068] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS može da se primenjuje pre, posle ili istovremeno sa tradicionalnim lečenjem betainom. Kombinovana terapija može da dovede do sinergističkih efekata na nivoe homocisteina.
[0069] Primena PEGilovane htCBS ili mutanta PEGilovane htCBS subjektu može da izmeni ekstra- i intracelularnu ravnotežu sumpornih aminokiselina.
[0070] Izmena ekstra- i intracelularne ravnoteže može biti smanjenje homocisteina kao što je, ali bez ograničenja na, smanjenje od oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 52% 55%, 60%, 65%, 67%, 69%, 70%, 74%, 75%, 76%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95% ili za više od 95%. Kao neograničavajući primer, smanjenje homocisteina u plazmi može biti smanjenje od oko 75%.
[0071] Izmena ekstra- i intracelularne ravnoteže može biti povećanje cistationina kao što je, ali bez ograničenja na, povećanje od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 1120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%, 510%, 520%, 530%, 540%, 550%, 560%, 570%, 580%, 590%, 600%, 610%, 620%, 630%, 640%, 650%, 660%, 670%, 680%, 690%, 700%, 710%, 720%, 730%, 740%, 750%, 760%, 770%, 780%, 790%, 800%, 810%, 820%, 830%, 840%, 850%, 860%, 870%, 880%, 890%, 900%, 910%, 920%, 930% 940%, 950%, 960%, 970%, 980%, 990%, 1000% ili za više od 1000%. Kao neograničavajući primer, povećanje cistationina može biti oko 900%.
[0072] Izmena ekstra- i intracelularne ravnoteže može biti normalizacija koncentracije cisteina koja se odražava na poboljšanje histopatoloških promena u jetri i povećano preživljavanje.
[0073] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za smanjenje nivoa tHcy kod subjekta sa CBSDH. Nivoi tHcy mogu da se smanje do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2021, 22, 23, 24, 15, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 1-5, 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 2-5, 2-10, 2-20, 2-30, 2-40, 2-50, 3-5, 3-10, 3-20, 3-30, 3-40, 3-50, 4-6, 4-10, 4-20, 4-30, 4-40, 4-50, 5-7, 5-10, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 6-8, 6-10, 6-20, 6-30, 6-40, 6-50, 7-10, 7-20, 7-30, 7-40, 7-50, 8-10, 8-20, 8-30, 8-40, 8-50, 9-10, 9-20, 9-30, 9-40, 9-50, 10-20, 10-30, 10-40, 10-50, 20-30, 20-40, 20-50, 30-40, 30-50 ili 40-50 puta u odnosu na nivo divljeg tipa. Kao neograničavajući primer, tHCY nivo je smanjen do oko 30 puta u odnosu na nivo divljeg tipa. Kao neograničavajući primer, nivo tHCY je smanjen do oko 3-5 puta u odnosu na nivo divljeg tipa.
[0074] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za snižavanje tHcv nivoa a smim tim za lečenje ili smanjenje efekata bolesti, poremećaja i/ili stanja povezanih sa visokim nivoima tHCY (npr., većim 54 puta od nivoa divljeg tipa). Neograničavajući primeri, bolesti, poremećaj i/ili stanja povezana sa visokim nivoima tHCY uključuju facijalnu alopeciju, osteoporozu, dislokaciju očnih sočiva, i smanjenje srednje vrednosti preživljavanja.
[0075] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS ovde opisani mogu da se koriste da se normalizuju nivoi cisteina bez dodatka cisteina.
[0076] U jednom načinu ostvarivanja, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS ovde opisani mogu da se koriste u kombinaciji sa betainom kako bi se smanjile koncentracije homocisteina kod subjekta. Homocistein može biti smanjen oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 52% 55%, 60%, 65%, 67%, 69%, 70%, 74%, 75%, 76%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95% ili za više od 95% kod subjekta upotrebom kombinovane terapije. Kao neograničavajući primer, homocistein može biti smanjen 77%. Kao neograničavajući primer, homocistein može biti smanjen 76%. Kao neograničavajući primer, homocistein može biti smanjen 74%. Kao neograničavajući primer, homocistein može biti smanjen 40%.
[0077] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS ovde opisani mogu da se koriste za uzrokovanje promene kao što je povećanje i/ili smanjenje nivoa metabolita.
[0078] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS ovde opisani mogu da se koriste za uzrokovanje promene kao što je povećanje nivoa metabolita. Kao neograničavajući primer, metabolit može biti cistationin i cistein koji može biti povećan 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 52% 55%, 60%, 65%, 67%, 69%, 70%, 74%, 75%, 76%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 1120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%, 510%, 520%, 530%, 540%, 550%, 560%, 570%, 580%, 590%, 600%, 610%, 620%, 630%, 640%, 650%, 660%, 670%, 680%, 690%, 700%, 710%, 720%, 730%, 740%, 750%, 760%, 770%, 780%, 790%, 800%, 810%, 820%, 830%, 840%, 850%, 860%, 870%, 880%, 890%, 900%, 910%, 920%, 930%, 940%, 950%, 960%, 970%, 980%, 990%, 1000% ili za više od 1000%. Kao neograničavajući primer, količina cistationina može biti povećana do iznad 0,008.0.01, 0.015, 0.020, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, ili 0.35 µM ili cistationin može da se poveća do između 0.05 i 0.35 µM. Kao još jedan neograničavajući primer, količina cisteina može biti povećana do iznad 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400 ili cistein može da se poveća do između 200 µM i 400 µM.
[0079] Ovde opisana PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za uzrokovanje promene kao što je smanjenje nivoa metabolita. Kao neograničavajući primer, metabolit može biti homocistein, metionin i S-adenozil homocistein koji može biti smanjen za 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 52% 55%, 60%, 65%, 67%, 69%, 70%, 74%, 75%, 76%, 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili 100%. Kao neograničavajući primer, količina homocisteina može biti smanjena do oko 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ili 1 µM. Kao neograničavajući primer, količina metionina može biti smanjena do oko 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ili 1 µM. Kao još jedan neograničavajući primer, količina S-adenozil homocisteina je smanjena da bi bila oko 0.15, 0.14, 0.13, 0.12, 0.11, 0.10, 0.095, 0.04, 0.085, 0.08, 0.075, 0.07, 0.065, 0.06, 0.055, 0.05, 0.045, 0.04, 0.035, 0.03, 0.025, 0.02, 0.015, 0.01, 0.009, 0.008, 0.007, 0.006, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001 ili manje od 0.001 µM.
[0080] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS ovde opisani mogu da se koriste za smanjenje nivoa homocisteina, metionin, S-adenozil-metionina i S-adenozil-homocisteina kod subjekta.
[0081] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se koriste za povećanje nivoa cisteina i cistationina kod subjekta.
[0082] Ovde je otkriven postupak za rekombinantnu proizvodnju i prečišćavanje humane cistationinske sintaze. Taj postupak uključuje fazu kloniranja sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani CBS enzim ili njegovu skraćenu ili mutiranu varijantu u ekspresioni vektor. Kao neograničavajući primer, enzim i postupak mogu biti kao što je definisano u International publication WO2014120770, a konkretno kao u SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, i SEQ ID NO: 16.
PRIMENA I DOZIRANJE
[0083] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS subjektu može da se daje parenteralno.
[0084] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se daju subjektu subkutano (SC), intravenski (IV) ili intraperitonealnom (IP) injekcijom. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS može da se daje subjektu subkutano. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS može da se daje subjektu intravenski. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS može da se daje subjektu intraperitonealno. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS može da se daje subjektu putem osmotske pumpe.
[0085] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS može da se daje subjektu najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1415, 16, 17, 18, 19, 20 ili za više od 20 puta.
[0086] Davanje PEGilovane htCBS ili mutanta PEGilovane htCBS može da se ponavlja svakog minuta, 2 minuta, 3 minuta, 4 minuta, 5 minuta, šest 6, 7 minuta, 8 minuta, 9 minuta, 10 minuta, 15 minuta, 20 minuta, 25 minuta, 30 minuta, 35 minuta, 40 minuta, 45 minuta, 50 minuta, 55 minuta, na sat, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati, 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, dnevno, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, nedeljno, na dve nedelje, 3 nedelje, mesečno, 2 meseca, kvartalno, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, godišnje, 13 meseci, 14 meseci, 15 meseci, 16 meseci, 17 meseci, ili 18 meseci.
[0087] Davanje PEGilovane htCBS ili mutanta PEGilovane htCBS može biti serija doza koje predstavljaju minute, sate, dane ili nedelje razmaka. Broj doza u seriji može biti 2, 3, 4, 5 ili 6. Kao neograničavajući primer, subjektu se daju 3 doze sa 24 sata razmaka. Kao još jedan neograničavajući primer, subjektu se daje 5 doza sa 12 sati razmaka.
[0088] Davanje PEGilovane htCBS ili mutanta PEGilovane htCBS može da usledi nakon raspooreda doziranja serije doza koje ima razmak između prve serije i druge serije doza. Razmak između doza može biti 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati, 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, mesec, 2 meseca, kvartalno, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci, 13 meseci, 14 meseci, 15 meseci, 16 meseci, 17 meseci, ili 18 meseci. Broj doza u seriji može biti 2, 3, 4, 5 ili 6. Kao neograničavajući primer, subjektu može da se da prva serija od 5 doza sa 12 sati razmaka a zatim 14 dana nakon prve doze, subjektu se daje leka serija od 5 doza sa 12 sati razmaka. Kao još jedan neograničavajući primer, subjektu se daju dve serije doza tokom perioda od 8 nedelja gde prva serija predstavlja jednu dozu dva puta nedeljno tokom dve nedelje a leka serija doza predstavlja tri puta nedeljno tokom 6 nedelja.
[0089] U jednom načinu ostvarivanja, PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS može da se daje najmanje jednom nakon što je subjektu dat betain. Vreme između davanja betaina i PEGilovane htCBS može biti 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati.19 sati, 20 sati, 21 sati, 22 sati, 23 sati, dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, mesec, 2 meseca, kvartalno, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci, 13 meseca, 14 meseca, 15 meseca, 16 meseci, 17 meseci, ili 18 meseci. Kao neograničavajući primer, PEGilovana htCBS može da se daje 14 dana nakon što je subjektu dat betain. Kao još jedan neograničavajući primer, subjektu mogu da se daju dve doze nakon što je subjekat primio betain. PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS može da se daje 14 i 15 dana nakon davanja betaina.
[0090] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS može da se daje u kombinaciji sa betainom.
Kombinacija može da se daje najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više od 15 puta.
[0091] PEGilovana htCBS ili mutant PEGilovane htCBS mogu da se daju u kombinaciji sa betainom subjektu nakon što je subjekat inicijalno primao betain. Vreme između kombinovane terapije i originalnog davanja betaina može biti 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati, 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, mesec, 2 meseca, kvartalno, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci, 13 meseci, 14 meseci, 15 meseci, 16 meseci, 17 meseca, ili 18 meseca. Kao neograničavajući primer, kombinacija može da se daje 14 dana nakon što je subjektu prvi put dat betain. Kao još jedan neograničavajući primer, subjekat može da se daje u dve doze nakon što je subjekat prvi primio betain. Kombinacija može da se daje 14 i 15 dana nakon davanja betaina.
[0092] Doza PEGilovane htCBS ili mutanta PEGilovane htCBS koja se daje subjektu može biti između 5 i 8 mg/kg kao što je 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 7.5 mg/kg ili 8 mg/kg. U određenim slučajevima, ta doza je izabrana iz opsega od oko 2 mg/kg do oko 24 mg/kg. Na primer, doza je oko 2 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 10 mg/kg,ili oko 24 mg/kg. U određenim slučajevima, doza je izabrana iz opsega od oko 0.01 do oko 10 mg/kg. Na primer, doza je oko 0.4 mg/kg. U određenim slučajevima, PEGilovana htCBS ili PEGilovan mutantni polipeptid htCBS se daje subjektu koji je na dijeti sa ograničenim unosom metionina. Alternativno, PEGilovana htCBS ili mutantni polipeptid PEGilovane htCBS se daje subjektu koji nije na dijeti sa ogrnaičenim unosom metionina.
[0093] PEGilovana htCBS ili mutantni polipeptid PEGilovane htCBS može istovremeno da se daje sa drugim terapeutskim agensom za lečenje CBSDH. Kako se ovde koristi, "koji se daje u isto vreme" znači davanje dve ili više komponenti. Ove komponente za istovremeno davanje uključuju, ali bez ograničenja na PEGilovanu htCBS, mutant PEGilovane htCBS, betain ili vitamin B6. Istovremeno davanje se odnosi na davanje dve ili više komponenti simultano ili sa vremenskim razmakom između davanja kao što je I sekunda, 5 sekundi, 10 sekundi, 15 sekundi, 30 sekundi, 45 sekundi, 1 minut, 2 minuta, 3 minuta, 4 minuta, 5 minuta, 6 minuta, 7 minuta, 8 minuta, 9 minuta.10 minuta, 11 minuta, 12 minuta, 13 minuta, 14 minuta, 15 minuta, 16 minuta, 17 minuta, 18 minuta, 19 minuta, 20 minuta, 21 minuta, 22 minuta, 23 minuta, 24 minuta, 25 minuta, 26 minuta, 27 minuta, 28 minuta, 29 minuta, 30 minuta, 31 minuta, 32 minuta, 33 minuta, 34 minuta, 35 minuta, 36 minuta, 37 minuta, 38 minuta, 39 minuta, 40 minuta, 41 minuta, 42 minuta, 43 minuta, 44 minuta, 45 minuta, 46 minuta, 47 minuta, 48 minuta, 49 minuta, 50 minuta, 51 minuta, 52 minuta, 53 minuta, 54 minuta, 55 minuta, 56 minuta, 57 minuta, 58 minuta, 59 minuta, 1 sat, 1.5 sati, 2 sata, 2.5 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 11 sati, 12 sati, 13 sati, 14 sati, 15 sati, 16 sati, 17 sati, 18 sati, 19 sati, 20 sati, 21 sat, 22 sata, 23 sata, 1 dan, 1.5 dan, 2 dana, ili za više od 3 dana.
DEFINICIJE
[0094] Kako se koriste u ovoj specifikaciji, oblici za jedninu "neki," "jedan," i "taj" uključuju i referente u množini osim ukoliko kontekst ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pozivanje na "polimer" uključuje jedan polimer kao i dva ili više istih ili različitih polimera, pozivanje na "ekscipijens" uključuje jedan ekscipijens kao i dva ili više istih ili različitih ekscipijenasa, i njima sličnih.
[0095] Gde je opseg vrednosti dat, predviđeno je da je svaka vrednost koja pada između gornje i donje granice tog opsega i bilo koja leka navedena ili vrednost koja spada u navedeni opseg obuhvaćena ovim otkrivanjem i konkretno otkrivena. Na primer, ako je naveden opseg od 1 µm do 8 µm, predviđeno je da su 2 µm, 3 µm, 4 µm, 5 µm, 6 µm, i 7 µm takođe eksplicitno otkrivenim kao i opseg vrednosti veći od ili jednak 1 µm i opseg vrednosti manji od ili jednak 8 µm.
[0096] "Kodirajuća sekvenca" se odnosi na onaj deo nukleinske kiseline (npr., gen) koji kodira (i) mRNK koja se prevodi u aminokiselinsku sekvencu proteina; ili (ii) funkcionalnu MRNK, kao što je interferentna RNK ili antisens molekul.
[0097] "Rekombinantna," kada se koristi uz pozivanje na, npr., ćeliju, nukleinsku kiselinu, polipeptid, ekspresionu kasetu ili vektor, se odnosi na materijal, ili materijal koji odgovara prirodnom ili nativnom obliku materijala, koji je modifikovan uvođenjem nove grupe ili promenom postojeće grupe, ili je identičan ali proizveden ili dobijen od sintetičkih materijala. Na primer, rekombinantne ćelije eksprimiraju gene koji nisu pronađeni unutar nativnog (nerekombinantnog) oblika ćelije (tj., "egzogenih nukleinskih kiselina") ili eksprimiraju nativne gene koji su na drugi način eksprimirani na različitom nivou, obično nedovoljno eksprimirani ili nisu eksprimirani uopšte.
[0098] Rekombinantne tehnike mogu da uključuju, npr., upotrebu rekombinantne nukleinske kiseline koa što je cDNK koji kodira protein ili antisens sekvencu, za umetanje u ekspresioni sistem, kao što je ekspresioni vektor; dobijeni konstukt se uvodi u ćeliju, i ćelija eksprimira nukleinsku kiselinu, i protein, ukoliko je to moguće. Rekombinantne tehnike takođe obuhvataju ligaciju nukleinskih kiselina u kodirajuće ili promoterske sekvence od različitih izvora u ekspresionu kasetu ili vektor za ekspresiju fuzionog proteina, konstitutivnu ekspresiju proteina, ili inducibilnu ekspresiju proteina.
[0099] Pojmovi "subjekat", "pojedinac" ili "pacijent" se ovde naizmenično koriste i odnose se na kičmenjaka, poželjno sisara. Sisari uključuju, ali bez ograničenja na, ljude.
[0100] "Povezan" se odnosi na podudarnost sa razvojem ili manifestacijom bolesti, stanjem ili fenotipom. Povezanost može biti usled, ali bez ograničenja na, gena odgovornih za održavanje funkcija čija promena može da obezbedi osnov za razne bolesti i stanja, one koja su deo puta koji je uključen u konkretnu bolest, stanje ili fenotip i koja indirektno doprinose manifestaciji bolesti, stanja ili fenotipa.
[0101] "Fiziološki uslovi" ili "fiziološko rešenje" se odnosi na vodeno okruženje jonske jačine, pH, i temperature suštinski slične stanjima kod intaktnih ćelija sisara ili u prostoru tkiva ili organa živog sisara. Obično, fiziološka stanja obuhvataju vodeno rešenje sa oko 150 mM NaCl, pH 6.5-7.6, temperaturom od približno 22-37 stepeni C. Generalno, fiziološki uslovi su pogodni za stanja vezivanja za intermolekulsku povezanost bioloških makromolekula. Na primer, fiziološki uslovi 150 mM NaCl, pH 7.4, na 37 stepeni C su generalno pogodni.
[0102] "Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač" se odnosi na ekscipijens koji opciono može biti uključen u kompozicije ovog pronalaska i koji ne uzrokuje značajne neželjene toksikološke efekte po pacijenta. Na primer, u ovom primeru, odnosi se na ekscipijens koji se može uneti u telo subjekta sisara zajedno sa aktivnim jedinjenjem (ovde PEGilovana htCBS) bez značajnih toksikoloških efekata po subjekta.
[0103] Pojam "ekscipijens" ili "vehikulum" kako se ovde koristi označava bilo koju supstancu, koja sama po sebi nije terapeutski agens, koja se koristi kao nosač za isporuku terapeutskog agensa i pogodna je za davanje subjektu, npr. sisaru ili se dodaje farmaceutskoj kompoziciji kako bi se poboljšalo rukovanje ili svojstva čuvanja ili da bi se omogućilo ili olakšalo formiranje dozne jedinice kompozicije u diskretni oblik kao što je kapsula ili tableta pogodna za oralno davanje. Ekscipijensi i vehikulumi uključuju takve materijale poznate u tehnici, npr., bilo koji tečni gel, rastvarač, tečni razblaživač, solubilizator, ili njima slične, koji je netoksičan i koji ne stupa u interakciju sa drugim komponentama kompozicije na štetan način. Davanje može da znači oralno davanje, inhalaciju, enteralnu primenu, davanje sa hranom ili inokulaciju intravenskom injekcijom. Ekscipijensi mogu da uključuju standardne farmaceutske ekscipijense, a takođe mogu da uključuju bilo koje komponente koje mogu da se koriste za pripremu hrane i pića za ljude i/ili životinje, formulacija hrane ili mamaca ili druge hrane.
[0104] "Permeant," "lek," ili "farmakološki aktivni agens" ili bilo koji drugi sličan pojam označava bilo koji hemijski ili biološki materijal ili jedinjenje, uključujući peptid, pogodne za primenu postupcima prethodno poznatim u tehnici i/ili postupcima otkrivenim u ovom otkrivanju, koji indukuje željeni biološki ili farmakološki efekat, koji može da uključuje, ali bez ograničenja na (1) imanje profilaktičkog efekta na organizam i sprečavanjem neželjenog biološkog efekta kao što je sprečavanje infekcije, (2) ublažavanje stanja uzrokovanog bolešću, na primer, ublažavanje bola ili upale uzrokovane rezultatom bolesti, i/ili (3) ublažavanje, smanjenje, ili potpuno eliminisanje bolesti iz organizma. Efekat može biti lokalni, kao što je obezbeđivanje lokalnog anestetskog efekta ili može biti sistemski. Ovo otkrivanje nije namenjeno za nove permeante ili nove klase aktivnih agenasa. Pre je ograničeno na način isporuke agenasa ili permeanata koji postoje u stanju tehnike ili koji kasnije mogu biti utvrđeni kao aktivni agensi i koji su pogodni za isporuku prema ovom otkrivanju.
[0105] Pojam "oko," naročito u odnosu na datu količini, obuhvata devijacije plus ili minus pet procenata.
[0106] "Opcioni" ili "opciono" znači da naknadno željena okolnost može ili neće biti prisutna ili se neće javiti, tako da opis uključuje slučajeve gde je ta okolnost prisutna ili se javlja i slučajeve gde nije prisutna i ne javlja se.
[0107] "Suštinski odsutna" ili "koja suštinski ne sadrži" određenu karakteristiku ili entitet znači gotovo ukupno ili potpuno odsustvo karakteristike ili entiteta. Na primer, za subjekat kojem se daje PEGilovana htCBS, suštinska odsutnost neželjenog dejstava koje može da se primeti znači da je takav neželjeni efekat ili ne može da se detektuje, ili se javlja samo u zanemarljivoj količini, npr., u opsegu ili učestalosti koja je smanjena za oko 50% ili više u odnosu ili na učestalost ili intenzitet istog neželjenog efekta primećenog kod nelečenog pacijenta.
[0108] Pojmovi "farmakološki efektivna količina" ili "terapeutski efektivna količina" kako se odnose na ovu kompoziciju se odnose na netoksičnu, ali dovoljnu količinu aktivnog agensa (ili kompozicije koja sadrži taj aktivni agens) da bi se obezbedio željeni nivo u krvotoku ili na mestu dejstva (npr. intracelularno) kod subjekta koji se leči, i/ili da bi se obezbedio fiziološki, biofizički, biohemijski, farmakološki ili terapeutski odgovor, kao što je poboljšanje manifestacija homocistinurije. Tačna potrebna količina će zavisiti od subjekta do subjekta, i zavisiće od brojnih faktora, kao što je aktivni agens, dejstvo kompozicije, sredstvo za isporuku koje se koristi, fizičke karakteristike kompozicije, predviđena upotreba za pacijente (tj., broj doza koje se primenjuju svaki dan), kao i razmatranja pacijenta, kao što je vrsta, uzrast, i opšte stanje subjekta, ozbiljnost stanja koje se tretira, dodatni lekovi koej subjekat uzima, način davanja, i tome slično. Ove faktore i razmatranja stručnjak lako može da odredi na osnovu ovde obezbeđenih informacija. Odgovarajuću "efektivnu" količinu u bilo kom pojedinačnom slučaju stručnjak može da odredi rutinskim eksperimentom, na osnovu ovde obezbeđenih informacija.
[0109] Pojam "biološki dejstvo" se odnosi na bilo koje biološko dejstvo koje stručnjaci obično pripisuju nukleinskoj kiselini ili proteinu. Primeri bioloških dejstava predstavljaju enzimsko dejstvo, mogućnost za dimerizovanjem, savijanjem ili vezivanjem za drugi protein ili molekul nukleinske kiseline, itd.
[0110] Pojam "nukleinska kiselina" može biti u obliku RNK ili u obliku DNK, i uključuju mesendžer RNK, sintetičku RNK i DNK, cDNK, i genomsku DNK. DNK može biti dvostruko razgranata ili jednostruka, ako jednostruka može da bude kodirajući krak ili nekodirajući (anti-sens, complementarni) krak.
[0111] Kako se ovde koristi, "varijanta" je nukleinska kiselina, protein ili polipeptid koji nije identičan sa, ali ima značajnu homolognost (na primer, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence) dužinom cele sekvence nukleinske kiseline divljeg tipa ili aminokiselinske sekvence, kao što je prikazano kroz primere sekvenci u javnim bazama podataka o sekvencama, kao što je GenBank. Kako se ovde koristi, "protein, polipeptid ili njegovi peptidni fragmenti označavaju protein pune dužine ili njegov deo sa aminokiselinskom sekvencom koja u dužini obično ima najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselina, mada se i dipeptidi, tripeptidi i tetrapeptidi takođe uzimaju u razmatranje i obuhvaćeni su ovim otkrivanjem.
[0112] Kako se ovde koristi, "mutant" predstavlja mutirani protein dizajniran ili konstruisan tako da izmeni svojstva ili funkcije koje se odnose na glikosilaciju, stabilizaciju proteina i/ili vezivanje liganda.
[0113] Kako se ovde koristi, pojmovi "nativan" ili "divljeg tipa" u odnosu na datu ćeliju, polipeptid, nukleinsku kiselinu, obeležje fenotipa, se odnosi na oblik u kojem se obično pronalazi u prirodi.
[0114] Kako se ovde koristi, pojmovi "protein," "polipeptid," "oligopeptid" i "peptid" imaju svoje konvencionalno značenje I koriste se naizmenično da bi se označio polimer od najmanje dve aminokiseline kovalentno povezane amidnom vezom, nevezano za dužinu ili post-translacionu modifikaciju (npr., glikosilacija, fosforilacija, lipidacija, miristilacija, ubikvitinacija, itd.). Dalje, ovde opisani polipeptidi nisu ograničeni na konkretnu dužinu. U ovu definiciju su uključeni D- i L-aminokiseline, i mešavine D- i L-aminokiselina. Ovaj pojam se takođe ne odnosi na ili isključuje postekspresione modifikacije polipeptida, na primer, glikosilacije, acetilacije, fosforilacije i njima slične, kao I druge modifikacije poznate u tehnici, i one koje se javljaju prirodno i one koje se ne javljaju. Polipeptid može biti ceo protein, ili njegova podsekvenca. Polipeptidi takođe mogu da se odnose na aminokiselinske sekvence koje obuhvataju epitope, tj., antigenske determinante suštinski odgovorne za imunogenska svojsta polipeptida i koji mogu da pobude imuni odgovor.
[0115] "Položaj koji odgovara" se odnosi na položaj od značaja (tj., broj baze ili broj ostatka) u molekulu ili proteinu nukleinske kiseline u odnosu na položaj u drugom referentnom molekulu ili proteinu nukleinske kiseline. Odgovarajući položaji mogu biti određeni poređenjem i poravnanjem sekvenci kako bi se maksimalno uvećao broj uparenih nukleotida ili ostataka, na primer, tako da je identitet između sekvenci veći od 90%, veći od 95%, veći od 96%, veći od 97%, veći od 98% ili veći od 99%. Položaju od značaja se zatim dodeljuje broj u referentnom molekulu nukleinske kiseline. Na primer, ukoliko se u genu X javi određeni polimorfizam na nukleotidu 2073 iz SEQ ID No. X, radi identifikovanja odgovarajućeg nukleotidau drugom alelu ili izolatu, te sekvence se poravnjavaju a zatim se identifikuje položaj koji je u ravni sa 2073. Pošto razne alele mogu biti različitih dužina, položaj koji označava 2073 možda neće biti nukleotid 2073, već je umesto toga položaj koji "odgovara" položaju u referentnoj sekvenci
[0116] "Procenat identiteta sekvence" i "homologija procenta" se ovde naizmenično koriste da bi se označila poređenja među polinukleotidima i polipeptidima, i određuju se poređenjem dve optimalno poravnane sekvence preko komparativnog prozora, pri čemu deo polinukleotidne ili polipeptidne sekvence u komparativnom prozoru može da obuhvata dodatke ili delecije (tj., praznine) u odnosu na referentnu sekvencu (koja ne obuhvata dodatke ili delecije) za optimalno poravnanje te dve sekvence. Procenat može da se izračuna određivanjem broja položaja na kojima se javljaju identična baza nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak u obe sekvence da bi se dobio broj sparenih položaja, čime se broj uparenih položaja deli sa ukupnim brojem položaja u komparativnom prozoru I množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identiteta sekvenci. Alternativno, procenat može da se izračuna određivanjem broja položaja na kojima se baza identične nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak javljaju kod obe sekvence ili baza nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak je poravnan sa prazninom kako bi se dobio određeni broj uparenih položaja, pri čemu se broj uparenih položaja deli sa ukupnim brojem položaja u komparativnom prozoru i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identiteta sekvenci. Stručnjaci će ceniti ta postoji mnogo utvrđenih algoritama koji su dostupni za poravnanje dve sekvence. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može da se izvede, npr., algoritmom lokalne homologije Smith & Waterman, Adv. Appl. Math.2:482 (1981), algoritmom poravnanja homologije Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.48:443 (1970), pretragom ta postupak sličnosti od Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. SAD 85:2444 (1988), kompjuterizovanim primenama ovih algoritama (GAP, BESTF17, FASTA, i TFASTA u GCG Wisconsin Software Package), ili vizuelnim inspektovanjem (videti generalno. Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, zajedničko ulaganje Greene Publishing Associates, Inc. i John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)). Primeri algoritama koji su pogodni za određivanje procentualnog identiteta sekvenci i sličnosti sekvenci su BLAST i BLAST 2.0 algoritmi, koji su opisani u Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215; 403-410 i Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res.3389-3402, tim redom. Softver za izvođenje BLAST analiza je javno dostupan putem sajta National Center for Biotechnology Information. Ovaj algoritam uključuje prve identifikacione parove sekvenci visokog skora (HSP) identifikovanjem kratkih reči dužine W u kveri sekvenci, koja ili odgovara ili zadovoljava neki pozitivno ocenjen najniži skor T kada je u ravni sa rečju iste dužine u sekvenci iz baze podataka. T se odnosi na, najniži skor susedne reči (Altschul et al. supra). Ovi inicijalni susedni pokušaji reči dejstvuju kao "seme" za započinjanje pretraga da bi se pronašli duži HSP koji ih zadrže. Pokušaji reči su zatim produženi u oba smera duž svake sekvence dokle god može da se postigne skor kumulativnog poravnanja. Kumulativni skorovi su izračunati pomoću, za nukleotidne sekvence, parametara M (nagradni skor za par uparenih ostataka; uvek >0) i N (kazneni skor za neuparene ostatke; uvek <0). Za aminokiselinske sekvence, matrica za dodeljivanje skora se koristi da bi se izračunao kumulativni skor. Produženje pogodaka reči u svakom smeru se zaustavlja kada: skor kumulativnog poravnanja otpada za količinu X od svoje maksimalne postignute vrednosti; kumulativni skor ide do nule ili ispod, usled akumulacije jednog ili više poravnanja ostataka sa negativnim skorom; ili se postiže kraj bilo koje sekvence. Parametri BLAST algoritma W, T, i X određuju osetljivost i brzinu poravnanja. BLASTN program (za nukleotidne sekvence) koristi kao početne vrednosti dužinu reči (W) od 11, očekivanje (E) od 10, M=5, N=4, i poređenje oba standarda. Za aminokiselinske sekvence, BLASTP program koristi kao početne vrednosti dužinu reči (W) od 3, očekivanje (E) od 10, i BLOSUM62 matricu za postizanje skora (videti Henikoff & Henikoff, Proc. Nail. Acad. Sci. SAD 89:10915 (1989)).
[0117] Dok su gorepomenuti algoritmi i programi pogodni za određivanje poravnanja sekvenci i % identiteta sekvence, u svrhe ovog otkrivanja, određivanje % identiteta sekvenci će se obično izvoditi upotrebom BESTFIT ili GAP programa u paketu GCG Wisconsin Software (Accelrys, Madison WI), pomoću obezbeđenih početnih parametara.
[0118] Pojam "NH2 terminalne modifikacije" može da se koristi da bi se označili ovde opisani peptidi. Terminus peptidnih jedinjenja ovog pronalaska koji odgovara amino amino terminusu, ukoliko je prisutan, može biti u "slobodnom" obliku (npr., H2N-), ili alternativno može biti aciklovan sa grupom formule R<2>C(O)- ili R<2>S(O)2-, pri čemu R<2>je kao što je prethodno definisano. U nekim slučajevima R<2>je izabrano iz grupe koju čine (C1-C6) alkil, (C5-C10) aril, (C6-C16) arilalkil, 5-10-člani heteroaril ili 6- 16-člani heteroarilalkil.
[0119] U drugom slučaju amino terminus može biti "blokiran" blokirajućom grupom dizjaniranom da dodeli jedinjenju specifična svojstva, kao što je mala antigenost. Neograničavajući primeri takvih blokirajućih grupa uključuju polimere polialkilenoksida kao što su polietilenglikol (PEG). Razni polimeri korisni za dodeljivanje jedinjenja a određenije peptida i proteina, konkretnih svojstava su poznati u tehnici, kao što su hemije pogodne za pričvršćivanje takvih polimera na jedinjenja. Konkretni neograničavajući primeri mogu da se pronađu u U.S. Patent No.
5,643,575; 5,730,990; 5,902,588; 5,919,455; 6,113,906; 6,153,655; i 6.177,087.
[0120] Pojam "modifikacije karboksi terminusa" mogu da se koriste vezano za ovde opisane peptide. Terminus peptidnih jedinjenja koji odgovara C-terminusu, ukoliko je prisutan, može biti u obliku nederivatizirane karboksilne grupe, ili kao slobodna kiselina ili kao so, kao što je so natrijuma, kalijuma, magnezijuma ili druge soli neorganskog ili organskog jona, ili može biti u obliku derivatizovanog karboksila, kao što je estar, tioestar ili amid. Takvi derivatizovani oblici jedinjenja mogu da se pripreme reagovanjem jedinjenja sa karboksilnim terminusom sa odgovarajućim alkoholom, tiolom ili aminom. Pogodni alkoholi, tioli ili amini uključuju, primera radi a bez ograničenja, alkohole formule R<2>OH, tiole formule R<2>SH i amine formule R<2>NH2, R<2>R<2>NH ili NH3, gde je svako R<2>nezavisno od drugih, kao što je prethodno definisano.
[0121] Pojam "L ili D oblik aminokiseline" može da se koristi u vezi sa ovde opisanim peptidom. Kao što će to stručnjaci prepoznati, razni X" ostaci koji obuhvataju jedinjenja ovog pronalaska mogu biti ili u L- ili D-konfiguraciji oko svojih Cα.ugljenikaa. U nekim slučajevima, svi Cαugljenici određenog jedinjenja su u istoj konfiguraciji. U nekim slučajevima, jedinjenja obuhvataju konkretne hiralite oko jednog ili više Cαugljenika i/ili uključuju nepeptidne veze na specifičnim lokacijama kako bi se jedinjenju dodelila specifična svojstva. Na primer, dobro je poznato da su peptidi sastavljeni delimično ili u celosti od D-aminokiselinskog luka otporniji na proteaze u odnosu na njihove odgovarajuće L-peptidne parove. Stoga, u nekim slučajevima, jedinjenja predstavljaju peptide sastavljene u celosti ili delimično od Daminokiselina. Alternativno, jedinjenja dobre stabilnosti naspram proteaza mogu da uključuju peptidne analoge uključujući peptidne veze obrnutog polariteta na specifičnim položajima. Na primer, jedinjenja koja imaju stabilnost nastpram proteaza poput triptika uključuju peptidne analoge koji imaju peptidne veze obrnutog polariteta pre svakog L-Arg ili L-Lys ostatka; jedinjenja koja imaju stabilnost naspram proteaza poput himotripsina uključuju peptidne analoge koji imaju peptidne veze obrnutog polariteta pre svakog malog I srednjeg-šestog L-alifatičkog ostatka ili L-nepolarnog ostatka. U drugom slučaju, jedinjenja koja imaju stabilnost u odnosu na proteaze uključuju peptidne analoge sastavljene u celosti od peptidnih veza obrnutog polariteta.
[0122] Kako se ovde koristi, pojam "dugoročna primena" se odnosi na primenu enzima CBS, htCBS, ili htCBS mutanta (npr., sa C 15S mutacijom) konjugovanog na PEG grupu tokom vremenskog perioda od 6 nedelja ili duže.
[0123] Kako se ovde koristi, pojam "kontinuirano davanje" se odnosi na ponovljeno davanje enzima CBS, htCBS, ili htCBS mutanta (npr., sa C15S mutacijom) konjugovanog na PEG grupu tokom ispitivanja putem SC injekcije ili implantirane osmotske pumpe.
[0124] Kako se ovde koristi, pojam "I278T', "I278T' homozigotni", ili "I278T -/homozigotni" miševi se odnosi na mišji model kod kojeg je endogeni mišji cbs gen nokautiran i humani transgen CBS koji ima najuobičajeniju mutaciju u CBS alelu, 833T>C (1278T), koja je povezana sa homocistinurijom, umetnut kao cDNK klon pod kontrolom cink-inducibilnog promotera na plazmidu integrisanom u mišji genom.
PRIMERI
[0125] Sledeći primeri lučni ilustrativne prirode i ni na koji način nisu predviđeni da budu ograničavajući.
Primer 1. Eksperimentalni postupci
A. Konstrukcija sekvenciono optimizovane, skraćene humane CBS u PET29A(+) vektoru
[0126] Kao što je prethodno opisano u International Publication No. WO2014120770, kodirajuća sekvenca pune dužine (551 aa) humane CBS je optimizovana za bakterijsku ekspresiju i klonirana u pUC57 vektor nakon digestije sa EcoRV restrikcionim enzimom, putem GenScript SAD Inc (NJ, SAD). CBS sekvenca je zatim amplifikovana PCR-om pomoću prajmera A1 i A2 da bi se generisala sekvenca koja kodira skraćeni enzim (aa I-413). Proizvod PCR je zatim digestiran sa restrikcionim enzimima Ncol i Xhol, i povezan u pET-28a(+) vektor koji je digestiran istim enzimima. Kloniranje u optimalno Ncol mesto pET-28a(+) dovodi do mutacije G u C u odnosu na CBS sekvencu divljeg tipa. Komplet za mutagenezu usmerenu na mesto (Stratagene. CA, SAD) koji koristi prajmere B1 i B2, se koristi kako bi ponovo regenerisao sekvencu divljeg tipa (htCBS). Ista strategija je korišćena za generisanje C15S mutanta (mutacija T u A; htCBSC15) upotrebom prajmera C1 i C2. Sve sekvence su verifikovane sekvencioniranjem. Ekspresiju skraćene CBS kontroliše ushodni T7 promoter u pET-28a(+) vektoru, koji zahteva transformaciju u DE3 bakterije i indukciju putem IPTG. Tabela 1 opisuje prajmere i njihove idnetifikatrore sekvenci.
B. Ekspresija i prečišćavanje
[0127] pET-28a(+) vektor, koji sakriva sekvencu koja kodira za skraćenu humanu CBS, je transformisan u DE3 bakterije, tj., E.Coli BL-21 (DE3) ili HMS174(DE3), i bakterije iz klonova rezistentnih na kanamicin su uzgajane u 5 ml Luria-Bertani (LB) pofloge, sa 30 µg/ml kanamicin, tokom noći na 37°C na rotacionoj mućkalici pri 275 O/M. Jedan ml kulture koja je stajala preko noći je dodat u 100 ml podloge Terrific Broth (TB) sa 30 ug/ml kanamicina i uzgajana je tokom noći, zatim je 10 ml toga dodato u 1 litar TB podloge koja sadrži 0.001% tiamin-HCl pH 8.0, 0.0025% piridoksin-HCl pH 8.0, 0.3 mM δ-ALA pH 8.0, 150 µM gvožđe-hlorida, 30 ug/ml kanamicina. Kultura je zatim uzgajana na 30°C na rotacionoj mućkalici pri 275 O/M dok OD600ne postigne vrednost od ∼0.6-0.7,a ekspresija proteina nije indukovana dodavanjem 1 mM IPTG. Fermentacija je zatim nastavljena dodatnih 16 sati. Ćelije su sakupljene 10-minutnom, 6000 RCF centrifugacijom na 4°C, oprane ledenim 0.9% NaCl, ponovo centrifugirane kako je gore opisano, i zamrznute na -80°C. Zatim su dodata 4.45 ml pufera lize (20 mM NaH2PO4, pH=7.2, 40 mM NaCl, 0.1 mM PLP) po 1 gramu peleta u ćelijski pelet i drugi je homogenizovan u Dounce homogenizatoru i teriran lizozomom (2 mg/ml final), inkubiran tokom 1 sata na 4°C na platformi koja se ljulja, sonikovan kako bi se smanjio viskozitet, i centrifugiran na 53000 RCF. Supernatant, koji obuhvata rastvorljivu frakciju se zatim čuva na -80°C. Lizat je obrađen putem višefaznog hromatografskog postupka. Sam postupak se sastoji od kolone za hvatanje anjonske razmene (DEAE Sepharose-FF), praćene kolonom za afinitet. Ovim se postiže čistoća od približno 90%. Konačna čistoća od > 99% se postiže upotrebom jedne ili dve faze hromatografije poliranja. Konačni eluat iz kolone je dijafiltriran u PBS.
C. Ispitivanje dejstva enzima
[0128] CBS dejstvo je određeno ispitivanjem radioizotopa sa C<14>-obeleženim serinom kao supstratom. Deset µl (ukupno 490 ng) čistog htCBS u puferu za razblaženje (0.1 M Tris-HCl pH=8.6, 1 mM DTT, 10 µM PLP, 0.5 mg/ml BSA) ili 10 µl plazme je dodato u 85 µl reakcione mešavine koja sadrži 0.1 M Tris-HCl pH=8.6, 10 mM L-serina, 0.5 mM PLP, 0.5 mg/ml BSA i 0.3 µCi (za čist enzim) ili 0.45 µCi (za plazmu) L-[C<H>(U)]-serina. Uzorci su inkubirani 5 minuta na 37°C i reakcija je započeta dodavanjem 5 µl 0.2 M Hey (10 mM konačna koncentracija). Nakon 30 minuta inkubacije na 37°C, 20 µl alikvota mešavine za ispitivanje se nanosi na papir 3 CHR Whatman (NJ, SAD). Početak ispitivanja i uzorkovanje dobijene mešavine su se poremetili tako da je vreme svake reakcije bilo 30 minuta. Silazna papirna hromatografija je korišćena za izolovanje radioaktivnog proizvoda (Cth) iz obeleženog supstrata (Ser). C<14>-cistationin formiran u reakciji je odvojen od C<14>-serina tokom noći silaznom papirnom hromatografijom u 2-propanol/mravlja kiselina/H2O (75: 5.7: 18.9 v/v). Radioaktivnost u oblasti cistationina markera (detektovanog bojenjem trake sa markerom ninhidrinom) je određena rezanjem hromatograma u trake koje se uranjaju u 5 ml Opti-fluor scintilacionog koktela (PerkinElmer, MA, SAD) i broje se u brojaču za scintilaciju Beckman LS-3801. Uzorak enzim vatre je korišćen kao slepa proba radi praćenja radioaktivnosti pozadine koja se zatim oduzima od svakog uzorka. Za čist enzim, vrednosti specifičnog dejstva su izražene kao jedinice enzima (količina enzima koji prozvodi 1 µmol cistationina/sat) po mg CBS, a za uzorke plazme kao jedinice po µl plazme. U ispitivanjima farmakokinetike (PK), ovo je označeno kao: mU/µl plazme.
D. Ispitivanje dejstva u gelu
[0129] Uzorci proteina su razdvojeni pomoću Nativan Page (Bio-Rad, CA, SAD). Gel je zatim inkubiran 15-30 minuta u rastvoru za bojenje (100 mM Tris-HCl pH=8, 20 mM L-ciszien, 50 mM 2-merkaptoetanol.0.1 mM PLP i 0.2 olovonitrat). Reakcija je zaustavljena uranjanjem gela u 7% sirćetnu kiselinu.
E. Određivanje koncentracija metabolita
[0130] Metaboliti u plazmi, homocistein, cistationin i cistein su određeni masenom spektrometrijom tečne hromatografije sa stabilnim razblaženjem izotopa kao što je prethodno opisano u (Allen et a/., 1993, Metabolism, 42: 1448-1460). Merenja ukupnog homocisteina nevezanog za protein i drugih aminotiola kao i aminokiselina u tkivu su izvedena kao što je opisano u (Maclean et al., 2010b. Mol. Genet. Metab.101, 153-162). Metaboliti su određeni masenom spektrometrijom tečne hromatografije sa stabilnim razblaženjem izotopa.
F. PEGilacija
[0131] Molekuli polietilenglikola su nabavljeni od NOF korporacije (Tokio, Japan). PEGilacija je izvedena prema uputstvima proizvođača. Na primer, kuplovanje PEG derivata maleimida sa SH grupama htCBS (5 mg/ml) je izvedeno u 100 mM fosfatnom puferu pH=6.5 tokom noći na 4°C . Molarni odnos između PEG molekula i CBS proteina je bio 10:1 ili 5:1.
[0132] Alternativno, PEGilacija je postignuta konjugacijom 20kDa NHS-estra PEG (ME-200GS) sa htCBS C15S (skraćeni humani CBS sa C15S mutacijom). Protokol u nastavku daje opis postupka PEGilacije.
[0133]Hromatografski prečišćen htCBS C15S je pufer razmenjen i formulisan u 100mM puferu natriujmfosfata pH 7.2 i koncentrovan do najmanje 10 mg/ml. Alikvot enzima se čuva na -80°C, i otapa se na 37/42°C u vodenom kupatilu uz povremeno mešanje. Alikvot enzima je centrifugiran kako bi se uklonila nastala pena, ukoliko se stvorila, i čuva se na ledu dok je potrebno.
[0134] Molarni odnos PEGilacije je bio 1:10 (po htCBS C 15S podjedinici), koji se prevodi u 431 mg ME-200GS na 100 mg htCBS C15S. Izračunata količina proteina, vode, i 2x pufer (potrebno samo ako je koncentracija enzima veća od 10 mg/ml) su pomešani u sterilnoj falkon epruveti od 50 ml koj ne sadrži endotoksin. Na primer, za PEGilaciju 200 mg htCBS C15S od 20 mg/ml je bilo potrebno 10 ml proteina, 12 ml sterilne vode, i 10 ml 100mM Na-P pH7.2 pufera. Epruveta je ukupno sadržavala zapreminu od 32 ml i čuvana je na ledu. U odvojenoj epruveti, 862 mg ME-200GS PEG je rastvoreno u sterilnoj vodi ili DMSO mešanjem, mešanjem u voneksu ili opciono zagrevanjem na 37/42°C u vodenom kupatilu na kratko. PEG se brzo rastvorio u bistrom, izuzetno viskoznom rastvoru. Razblaženi enzim je prenesen u epruvetu koja sadrži rastvoreni PEG brzo ili presipanjem ili pipetiranjem. Epruveta je čvrsto zatvorena i odmah izmeđana u vorteksu 10-15 sekundi da bi se napravila homogena mešavina. Epruveta je inkubirana na sobnoj temperaturi na platformi koja se ljulja tokom 4-6 sati ili na 4°C tokom noći.
G. Čuvanje enzima
[0135] PEGilovani C15S htCBS je formulisan upotrebom PBS pH7.4 i koncentrovan do približno najmanje 5 mg/ml, i obično do koncentracije između 10 i 25 mg/ml. Enzim se čuva na -80°C u (1.2 ml) alikvotima. Za svaki dozirajući dan, svež rastvor enzima za jednokratnu upotrebu je pripremljen razblaživanjem u PBS do konačne koncentracije 1 mg/ml. Bilo koji rastvor koji ostaje nakon završetka doziranja se odbacuje.
H. Postupci sa životinjama
[0136] Svi postupci sa životinjama su odobreni od strane Univerziteta Kolorado u Denveru IACUC, koji je AAALAC akreditovana institucija (#00235), osigurana usluga javnog zdravlja (#A 3269-01) i licencirana od strane USDA (#84-R-0059). C576BL/6J i CBS nokaut (KO) miševi su dobijeni iz Jackson laboratorije (ME, SAD). Prethodno su napravljeni samo humani (HO)miševi (Maclean et al., 2010b. Mol. Genet. Metab. 101, 153-162) u laboratoriji. Životinje se održavaju na standarnoj ekstrudiranoj dijeti 2918 (Harlan, CA, SAD) sa neograničenim pristupu hrani i vodi.
[0137] Reprezentativni mladunci su rutinski analizirani zbog homozignotosti. Lanceta za jednokratnu upotrebu za submandibularno krvarenje je korišćena za uzimanje krvi u Capiject T-MLHG litijumheparinske (12.5 IJ) epruvete sa gelom (Terumo Medical Corporation, NJ, SAD). Epruvete su zatim centrifugirane na 1200G tokom 10 min, nakon čega je usledilo sakupljanje plazme u epruvete od 1.5 ml i čuvanje na -80°C.
[0138] Genotipovanje: reprezentativni mladunsi su rutinski analizirani zbog homozignosti qPCR. Biopsije repova su urađene pomoću kompleta DNeasy Blood i Tissue kit (Qiagen, Hilden, Nemačka). Kvalitet DNK je praćen pomoću NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, DE, SAD). Dvadeset uzoraka ng DNK je provučeno na pleksu u triplikatu pomoću glavne mešavine za ekspresiju gena (artikal #4369016) Applied Biosystem's (CA, SAD). Amplifikacija je izvedena na Applied Biosystem's 7500 Fast Instrument pomoću postupka standardne krive. Applied Biosystems' Tert (artikal #4458366) ili Tfrc (artikal #4458368) referenta ispitivanja istog broja su korišćena kao homozigotni kalibrator jedne kopije. Ispitivanje Applied Biosystem Mr00299300 je korišćeno da bi se detektovao Neo gen.
[0139] Pacovi Sprague Dawley divljeg tipa su smešteni u kavezima i održavaju se u uslovima neograničenog pristupa hrani i vodi.
[0140] Cinomolgus majmuni divljeg tipa (Macaca fascicularis) su smešteni u polno odvojene obore sa neograničenim pristupom hrani i vodi. Dvanaestočasovni ciklusi dana/mraka, temperatura, i vlažnost se kontinuirano prate i kontrolišu. Svakodnevno je obezbeđivano dodatno obogaćivanje sredine u smislu prirodnih zvučnih pozadinskih zvukova i vizuelno u smislu video snimaka prirode. Svi majmuni su pregledani zbog opšteg zdravlja pre ispitivanja.
1. Uzimanje uzoraka
[0141] Nakon injekcije PEGilovanim oblikom htCBS, kao što je 20NHS PEG-htCBS C15S, krv je uzeta u raznim vremenskim tačkama u Capiject T-MLHG litijum-heparinske epruvete (12.5 IJ) sa gelom (Terumo Medical Corporation, NJ, SAD) iz submandibularne vene svesnih ispitivanja na životinjama pomoću lanceta za jednokratnu upotrebu dizajniranih za submandibularno uzorkovanje. Plazma je uzeta iz uzoraka krvi nakon centrifuge na 1200G tokom 10 minuta i čuva se na -80°C u epruvetama od 1.5 mL.
J. Farmakokinetika
[0142] Farmakokinetički (PK) parametri su izračunati pomoću modela uklanjanja nekompartmentalne krive koji rastavlja krivu u seriju eksponencijalnih pojmova koji odgovaraju apsorpciji, raspodeli i fazama eliminacije koji se javljaju tokom vremena enzima u krvi. Pristup uklanjanja krive podrazumeva da faze dislokacije leka prate očiglednu kinetiku prvog reda, što je dokazano linearnošću terminalnog dela polulogaritamskog dijagrama. Ova izračunavanja su rađena pomoću programa za modelovanje PK Solutions 2.0 (Summit Solutions, Montrose, CO) pomoću srednjeg dejstva enzima u plazmi za svako rutinsko davanje. Bioraspoloživost je izračunata podeloma površine ispod krive (AUC) za SC ili IP načinom putem AUC uočene posle IV primene.
K. Priprema uzoraka za mapiranje NHS PEGilacije
[0143] Svaki uzorak (300 µg), uključujući ne-PEGilovanu CBS kontrolu, je razblažen HPLC vodom (ThermoFisher) do 80 µL. Uzorak je zatim izmešan u proporciji 1:1 (v/v) sa 0.24 M CAPS puferom (Sigma) pH 11.5, i inkubiran na 37°C tokom 22 sata kako bi se uklonili PEG. De-PEGilovan uzorak je prenesen u Amicon Ultra 30K Centrifugal filter (Millipore), i dodato je 320 µL 8M gvanidin HCI rastvora (Sigma). Filter se zavrti na 13,000 o/m tokom 10 minuta. Ovaj postupak se ponavlja dva puta kako bi se uzorci puferom dva puta razmenili u 8M gvanidin HCI i uklonio preostali slobodni PEG.
[0144] Uzorak je kombinovan sa 1M Tris HCl (pH 7.5) do konačne koncentracije od 100 mM Tris. Uzorak je smanjen sa 10 mM DTT (Sigma) na 56 °C tokom 45 minuta i ohlađen. Jodoacetamid je dodat konačnoj koncentraciji od 30 mM i uzorci su inkubirani u mraku na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Uzorak je zatim razblažen sa 50 mM Tris (pH 7.5) rastvorom da bi se postigla koncentracija gvanidina od 1 M. Redukovani/alkilovani uzorci su korišćeni za digestiju Asp-N endopeptidaze.
[0145] Dva µg Asp-N su dodata u 100 µg redukovanog i alkilovanog uzorka (enzim: proteinski odnos = 1:50 (w:w)). Digestija je izvedena tokom noći na 37°C.
L. Priprema uzoraka za histopatološku analizu
[0146] PBS-ubrizgani ili PEGilovani htCBS konjugatom, kao što je 20NHS PEG-htCBS C15S, lečeni KO miševi su žrtvovani 17-19. dana i uzorci jetre su obrađeni zbog histološke analize optičkom mikroskopijom. Histološka procena je izvedena na slepo. Jetre su uklonjene i fikisrane tokom 24 sata sa 4% paraformaldehidom u PBS (pH 7.4). Blokovi tkiva za histologiju su odrezani, dehidrirani serijom etanola, zatim acetona, mešavine acetona i ksilena, i ksilena, zatim su ugrađeni u parafin. Paralelno, mali blokovi tkiva (oko 4 mm × 2 mm) fiksirani sa paraformaldehidom su brzo zamrznuti u petrolnom etru, ohlađeni suvim ledom, i čuvaju se na -50°C zbog detekcije apolarnih lipida. Parafinski preseci debljine 4 µm su deparafinizovani u ksilenu i rehidrirani sa etanolom (96%, 70%, 60%) posle faze izopropilnog alkohola. Preseci tkiva su obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) da bi se procenile histopatološke promene. Bojenje Masson trihromom je izvedeno zbog detekcije fibroze. Steatoza je verifikovana pomoću Oil Red O bojenja zbog detekcije apolarnih lipida u fiksno zamrznutim presecima debljine 10 µm i isečeni sa Leica Cryomicrotome (CM 1850). Preseci su pregledani i fotografisani sa Nikon light mikroskopom (E800) opremljenim sa Olympus digitalnom kamerom (DP70).
[0147] Za elektronski mikroskop, jedna trećina svake od jetri je obrađena za elektronski mikroskop isecanjem na parčad debljine 1-2 mm i uronjena post-fiksaciono u 3% glutaraldehid. Uzorci su nakon toga umešani u Epon-Araldite mešavinu, dvostruko obojeni, i ispitani pomoću JEOL 1200 elektronskog mikroskopa pri uvećanju od 3000x.
M. Dvostruka energetska rentgenska apsorptiometrija (DEXA)
[0148] A PIXImusII DEXA skener (GE Lunar Medical Systems) specifično dizajniran za skeniranje malih životinja kao što su miševi je korišćen za DEXA analizu. Ova mašina je omogućila brzo i efikasno određivanje kompozicije tela (masa bez tkiva, puna masa, i gustina kostiju) miša pre postupaka terminalne ekstrakcije tkiva. Miševi su izgladnjivani 4 sata pre DEXA merenja kako bi se uklonila hrana iz gastrointestinalnog trakta. Miševi su zatim anestezirani pomoću IP bolus injekcije od 60 mg/kg ketamina i 15 mg/kg ksilazina i smešteni u stalak DEXA mašine. Nakon završenog merenja (3∼5 minuta), miševi su uklonjeni iz DEXA mašine i korišćeni su u terminalnim postupcima, kao što su ekstrakcije tkiva.
N. Preprime utoraka očiju radi praćenja pod mikroskopom
[0149] Miševi su podvrgnuti perfuzionoj fiksaciji sa 4% paraformaldehidom u 1× PBS pH 7.4 (4% PFA) da bi se sačuvali zidovi očne jabučice. Oči su pažljivo hirurški uklonjene, uronjene u 4% PFA i pažljivo je napravljen mali otvor u zadnjem delu očne jabučice ispod optičkog nerva kako bi se omogućilo da fiksativ prodre u unutrašnjost oka i fiksira strukture tokom noći na 4°C. Uzorci su oprani 3 puta pomoću filtriranog 1× PBS pH 7.4. Nakon pranja, posteriorni deo očne jabučice je pažljivo seciran do nivoa cilijarnog epiteliuma kako bi se izložila cilijarna zonula. Uzorak je stavljen u 8% BSA blokirajući rastvor tokom 2 sata uz mešanje. Nakon blokiranja, MAGP1 antitela (Sigma) razblažena 1:50 u 4% BSA su dodata u uzorak i čuvaju se na 4°C tokom noći. Sledećeg dana, uzorak je opran 6 puta pomoću 1× PBS pH 7.4, i Alexa 488 sekundarna antitela (1:200, Invitrogen) su dodata uzorku i inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi uz mešanje. Uzorak je opran 6 puta i kontraobojen metil zelenom (nuklearno bojenje) tokom 15 minuta.
[0150] Rastvor koji sadrži 4% agaroze se zagreva, sipa u poklopljenu staklenu pertri posudu, i ostavi se da se stvrdne na sobnoj temperaturi. Stvrdnuti gek skuži kao komora za slike za to oko. Mali otvor je napravljen kako bi gel služio kao sigurna komora oka. Da bi se pratila cilijarna zonula, komora je napunjena sa 1× PBS, i obojeni uzorak oka se stavi u otvor sa posteriornom površinom sočiva koja dodiruje sloj gela.3-dimenzionalne slike se prave pomoću invertovanog LSM 510 konfokalnog mikroskopa pri uvećanju od 10× i zumu od 0.7×.
Primer 2. htCBS retenciono vreme
A. Nemodifikovana htCBS ispoljava kratko retenciono vreme u cirkulaciji
[0151] Farmakokinetička svojstva farmakološki aktivne supstance koja se daje u cirkulaciju su u velikoj meri pogođena prirodnim mehanizmima ADME. Brz klirens ubrzanog molekula u velikoj meri može da utiče na efikasnost lečenja i samim tim duža vremena eliminacije u cirkulaciju su poželjna. Što može da se prevede u manje učestalo davanje ili manje doze koje za uzvrat svode neželjena dejstva na minimum. Da bi se odredila farmakokinetika htCBS u cirkulaciji plazme, pojedinačna doza od 5 mg/kg je ubrizgana subkutano (SC), intravenski (IV) ili intraperitonealno (IP) C57BL/6J miševima. Davanje htCBS IV ili IP putem je ispoljilo najviše vrednosti specifičnog dejstva tokom prva 4 sata posle injekcije (primećeni najviši nivoi u plazmi do 123 i 76 mU/µL, tim redom; tabela 2 prikazuje vrednosti površine ispod krive (AUC)). Farmakokinetički parametri izračunati iz uzoraka plazme (tabela 2) pokazuju da je poluživot eliminacije za htCBS 2.7 sati, čime se ukazuje da grubo nakon 6 vremena eliminacije (manje od 20 sati) nivoi htCBS bi trebalo da mogu da se detektuju.
[0152] Bioraspoloživost htCBS je iznosila 50% za SC puteve primene čime se ukazuje da SC isporuka može biti klinička opcija za ovaj terapeutski pristup. Sporije vreme poluživota za SC i IP (tabela 2) može da se objasni fazom spore apsorpcije koja se javlja tokom faze eliminacije čime se produžava srednje vreme rezidentnosti i očigledan poluživot, mada za ovu svrhu mnogo duži poluživot je bio poželjan i samim tim ispitani su PEGilovani derivati htCBS.
[0153] Brzi pad htCBS dejstva in vivo može da se pripiše olakšanom klirensu iz cirkulacije i takođe može da se pripiše gubitku enzimskog dejstva, kada se htCBS uvede u okruženje u cirkulaciji. Da bi se ovo drugo rešilo, htCBS je inkubirana in vitro u mišjoj plazmi divljeg tipa ili HO miševa na 37°C do 96 sati, sa dejstvom izmerenim na svaka 24 sata. Kao što je prikazano na FIG.1A, nije zabeleženo značajno dejstvo do72 sata inkubacije u plazmi bilo kog mišjeg modela. Blagi 25% gubitak dejstva je zabeležen nakon 96 sati inkubacije. Dalje, kao što je prikazano na FIG.1B, western blot (WB) analize plazme iz životinja koje su primile injekciju SC, su otkrile da količina htCBS opada kao funkcija vremena, pa stoga klirens predstavlja brzi gubitak htCBS dejstva u cirkulaciji, pre nego gubitak dejstva u plazmi.
B. PEGilacija htCBS pojačava poluživot u plazmi in vivo
[0154] Da bi se odredio uticaj PEG molekula na farmakokinetiku CBS, htCBS je PEGilovana linearnim PEG-om male molekulske mase (2 kDa), i razgranatim PEG-om (označenim sa ME020MA i GL4-400MA, redom) sa četiri kraka velike molekulske mase (40 kDa). Kao što je prikazano na tabeli 3, PEGilacija nije uticala na specifično dejstvo enzima. Tabala 3 prikazuje rezultate Coomasaie-obejnog SDS-PAGE PEGilovane i nePEGilovane htCBS sa odgovarajućim vrednostima specifičnog dejstva koje prikazuju da PEGilacija ne utiče na dejstvo enzima. Miševima je SC ubrizgana kao što je opisano na A (n=4-5), sa ME200MA- ili GL4-400MA-PEGilovanom htCBS u odnosu na nePEGilovanu htCBS.
[0155] Doza od 5 mg/kg telesne mase (BW) PEGilovane htCBS (PEGhtCBS) se daje C57BL/6J miševima SC i IV putem, a CBS dejstvo se prati u različitim vremenskim tačkama. Dva eksperimentalna kraka (n=5 svako) su korišćena za svaki način primene injekcije. Krv je uzeta nakon injekcije iz grupe 1 na 0, 1, 8 i 24 sata i iz grupe 2 na 1, 4, 10, i 48 sati.
[0156] Kao što je prikazano na FIG.1B (donji panel) za GL4-400MA PEGhtCBS, dejstvo u plazmi je značajno produženo za PEGilovani protein u odnosu na nePEGilovani par. Kao što je prikazano na tabeli 4, poluživot je porastao sa 2.7 sati za nePEGilovanu htCBS na 16.7 i 30.4 sati sa ME020MA i GL4-400MA PEGilacijom, redom.
[0157] Ovo znači da bi vreme izlaganja nakon pojedinačne doze bilo 5 do 10 puta duže od PEGilovanih oblika. Pored toga, bioraspoloživost nakon SC davanja je bila u opsegu od 50 do 80% čime se ukazuje da će SC način primene biti razuman za klinička ispitivanja.
Primer 3. Davanje htCBS i nivoi homocisteina, cistationina i cisteina u serumu.
[0158] Krajnji cilj za upotrebu htCBS za CBSDH je da se smanji toksično opterećenje tHcy, kako bi se povećali nivoi cistationina i cisteina. Za ove promene se očekuje da spreče, uspore ili odlože početak CBSDH simptoma. Istraživanja homocistinurije su, međutim, usporena nedostatkom pogodnog životinjskog modela. Miševi koji lučni potpuni nokaut za mišji gen umiru tokom 2-3 nedelje nakon rođenja. HO (samo za ljude) miševi su različiti od drugih nokaut miševa zato što, pored toga što im je mišji antigen nokautiran, eksprimiraju niske nivoe humanog gena koji omogućava njihovo preživljavanje do odraslog doba (Maclean et al., 2010b, Mol. Genet. Metab.101, 153-162). HO miševi ispoljavaju ozbiljne poraste Hey, metionina, S-adenozilmetionina, i S-adenozilhomocisteina i prisutni su sa istovremenim opadanjem nivoa cisteina u plazmi i jetri. Shodno tome, ovi miševi ispoljavaju karakteristike koje u nekoliko aspekata, rekapituliraju bolest onako kako se ista javlja kod ljudi.
A. Primena htCBS ne poboljšava koncentracije tHcy i cistationina
[0159] HO miševi kojima je davana nePEGilovana htCBS u dozi od 5mg/kg tokom 5 uzastopnih dana 1. i 3. nedelje (10 dana između setova lečenja) nisu pokazali pormenu u nivoima homocisteina u serumu. FIG.2 prikazuje srednje nivoe homocisteina i cistationina kod HO miševa. Ovaj nedostatak metaboličke modulacije nePEGilovane htCBS dalje potvrđuje neophodnost modifikovanja htCBS kovalentnim pričvršćivanjem molekula polietilenglikola.
[0160] Nekoliko različitih hemija PEG-ova su opisani u International Publication No. WO2014120770, (videti tabelu 5) i podaci ukazuju da CBS PEGilovana sa manje od 20 kDa PEG-ova pokazuje više od brzog gubitka dejstva u plazmi, od CBS sa PEG-ovima veće molekulske mase. Iz tog razloga, linearni 20 kDa PEG označen sa ME200MA0B je izabran za dalje analize. FIG.3 predstavlja Coomasaie-obojen SDS-PAGE koji prikazuje vremenski tok htCBS PEGilacije sa ME200MA0B. Reakcija PEGilacije je započeta dodavanjem PEG-a, i uzorci su izvučeni iz epruveta u naznačenim vremenskim tačkama radi analize.
B. Ponovljena primena PEGhtCBS poboljšava koncentracije tHcy i cistationina i vraća normalne nivoe cisteina.
[0161] Dugoročni efekat PEGhtCBS primene se prati pomoću HO miševa. PEGhtCBS enzim se daje 8 HO miševa u dozi od 7.5 mg/kg, dva puta nedeljeno (ponedeljak i četvrtak) tokom prve dve nedelje, a zatim tri puta nedeljno (ponedeljak, sreda i petak) tokom 6 nedelja. Uzorci krvi se uzimaju 24 sata (utorak) i 72 sata (ponedeljak) nakon injekcije (FIG.4A-4C). Na FIG.4A je prikazano da se tHcy u plazmi smanjuje sa 212 µM na vremenskoj 0 do proseka u opsegu od 62-103 µM 24 sata nakon injekcija, i bila je u opsegu od 141-189 µM 72 sata posle prošlonedeljne injekcije. Od 28. dana pa na dalje, vrednosti 72 sata nakon injekcije su značajno niže od vrednosti vremenske 0 (P≤ 0.02). Na nivoe cistationina i cisteina se takođe pozitivno uticalo. Cistationin je porastao sa 6 µM na najviše 30 µM a cistein je konstantno bio iznad 200 µM 24 sata posle injekcije (FIG.4C). Zanimljivo je da su od 24. dana, fluktuacije koncentracije cisteina bile mnogo manje izražene u odnosu na prve tri nedelje lečenja. Pored analize nivoa metabolita u plazmi, uzorci tkiva jetre, bubrega i mozga od ubrizganih miševa su analizirani takođe da bi se odredili i nivoi homocisteina koji nije vezan za protein (slobodni i oblici povezani disulfidom). Kao što je prikazano na FIG.4D, kod dugoročno ubrizganih životinja, smanjenje od 44%, 63% i 47% je određeno za tkivo jetre, bubrega, i mozga , tim redom. Stoga, dugoročno ponavljana injekcija PEGhtCBS značajno utiče na nivoe homocisteina, cistationina i cisteina u plazmi.
Primer 4. htCBS mutant (C15S) prikazuje poželjne obrasce agregacije i PEGilacije
A. C15S mutirana htCBS ne ispoljava agregaciju i obrazac uniformne PEGilacije
[0162] Iako je prethodno prijavljeno da je htCBS enzim manje sklon agregaciji u odnosu na protein punog lanca (Frank et al., 2006, Biochemistry 45:11021-11029), on i dalje obrazuje tetramere i veće agregate. Ovo može da stimuliše odbrambene mehanizme i da dovede do npr. amiloidne depozicije (D'Souza et al., 2014, "Amyloid: the international journal of experimental and clinical investigation. The official journal of the International Society of Amyloidosis" 21:71-75), ali takođe i da utiče na prečišćavanje, rukovanje, i konzistentnost. FIG.5A (prethodno otkrivena kao Fig.5A iz WO2014120770, prikazuje Coomasaie-obojen nativan-PAGE koji prikazuje da su različite šarže htCBS ispoljile različite odnose dimera/tetramera, sa različitim stepenima većih agregata. FIG.5B (prethodno otkrivena kao Fig. 5B iz WO2014120770, predstavlja ispitivanje dejstva u gelu, je pokazala da ovi agregati ispoljavaju CBS dejstvo. FlG.5C (prethodno otkrivena kao Fig.5C iz WO2014120770, prikazuje da agregacija uzrokuje nekonzistentne proizvode PEGilacije. PEGilacija je dovela do dve različite trake, pod pretpostavkom da reflektuju različite stepene PEGilacije budući da agregacija može da dejstvuje tako da zamračuje dostupna mesta za PEGilaciju. Shodno tome, usled izraženije agregacije šarže 28 (FIG.5A) njena PEGilacija je dovela do izraženije manje trake, tj. manje PEGilovane,na SDS-PAGE (FIG.5C), dok je PEGilacija šarže 112, koja je obuhvatala i tetramere i dimere (FIG.5A), dovela do izraženije gornje trake u odnosu an šaržu 28 (FIG.5C). FIG.5D prikazuje Coomasaie-obejen nativni gel, koji ukazuje da je inkubacija obe enzimske šarže sa redukcionim agensom tris(2-karboksietil)fosfinom (TCEP) pretvorila većinu tetramera i većih agregata u dimerni oblik. Ovi podaci ukazuju da agregacijom upravljaju cisteini izloženi na površini htCBS. Stoga, za TCEP lečenje se veruje da takođe dovodi do šire PEGilacije, budući da se više dimera stvara od oblika veće molekulske mase, čime es otvara put izlaganju dodatnih mesta za PEGilaciju na površini htCBS. Zapravo, kao što je prikazano na FIG.5E odnos između gornje/donje trake PEGilacije na Coomasaie-obojenom SDS-PAGE znalajno skreće prema gornjoj tracij nakon lečenja TCEP lečenje u odnosu na PEGilaciju u odsustvu TCEP. Shodno tome, za htCBS agregaciju se veruje da njom upravlja najmanje delimično stvaranje intramolekulskih disulfidnih mostova. Stoga, C15 je mutiran u serin, čime se stvara C15S htCBS mutant; za C15 je prethodno pokazano da je najreaktivniji cistein na površini CBS (Frank et al., 2006, Biochemistry 45:11021-11029). FIG.5F (prethodno otkrivena kao Fig 6A iz WO2014120770, prikazuje Coomasaie-pbojeni nativni gel, pri čemu su za htCBS primećene dve glavne trake (dimeri i tetrameri), dok C15S htCBS mutant ispoljava jednu traku, na koju, kako je očekivano, ne utiče lečenje sa TCEP. Ovom zapažanju dalje ide u prilog HPLC ekskluziona hromatografija prema veličini (HPLC-SEC). Pripreme CBS su razdvojene na Yarra SEC-3000, 300<∗>7.8 mm koloni za isključivanje po veličini (Phenomenex, CA, SAD). Kolona je kalibrisana i radi u 100 mM natrijumfosfatu pH-6.8, pri brzini protoka od 1 ml/min na sobnoj temperaturi. HPLC-SEC analiza, FIG.5G (prethodno otkrivena kao deo FIG.7A i FIG.7B iz WO2014120770, čiji je sadržaj, kao referenca, ovde inkorporisan u svojoj celosti), prikazuje razlike u htCBS C 15S (Fig.5G, levi panel) i odnosa htCBS dimer/tetramer (FIG.5G, desni panel). Pojedinačni pik za dimerni C15S htCBS mutant je klutirao na 8.62 min dok je glavni pik za htCBS eluirao na 7.9 min, što odgovara tetrameru. Fig.4H prikazuje Coomasaie-obojeni SDS-PAGE gel koji prikazuje reproduktivnost htCBS C15S PEGilacije između različitih šarži i poređenja sa htCBS. Odsustvo agregata u C15S htCBS je dovelo do konzistentnijeg obrasca PEGilacije između različitih šarži sa gotovo isključivo jednom PEGilovanom trakom koja se pojavljuje na SDS-PAGE. Direktno poređnje između PEGhtCBS i PEGC15S i in vivo i in vitro nije pokazalo razliku u učinku.
[0163] Efekat PEGC15S na metabolite je takođe ispitan 1, 4 i 24 sata posle injekcije (FIG.6A-FiG.6C). Izmereni su nivoi tHey (FIG.6A), cistationina (FIG.6B), i cisteina (FIG.6C) kod HO miševa kojima je ubrizgano 7.5 mg/kg PEGC15S ili PBS (n=5) 1.4 i 24 sata posle injekcije. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ±SEM i svaka vremenska tačka se poredi među dve grupe pomoću neuparenog Studentovog testa t testa<∗>p=0.05,<∗∗>p≤0.01, i<∗∗∗>p≤0.001. Efekat na tHey i cistein je primećen samo 24 sata posle injekcije (FIG.6A i FIG.6C), međutim značajan porast kod cistationina je već primećen 1 i 4 sata posle injekcije (FIG.6B).
Primer 5. PEGC15S i betain funkcionišu svaergistički in vivo
[0164] Da bi se procenio efekat betaina i kombinovane terapije, terapije betainom, PEGC15S, i kombinacijom betain+PEGC15S su izvedene i upoređeni su metaboliti puta transsulfuracije.
[0165] Grupe koje su primale betain i betain+PEGC15S su ispitane sa 2% betainom u pijaćoj vodi tokom 18 dana eksperimenta, a drugoj grupi je 14. i 15. dana ubrizgano 7.5mg/kg PEGC15S. Grupa lečena samo PEGC15S je držana na regularnoj vodi i ubrizgavana je takođe 14. i 15. dana. Kao što je prikazano na FIG.
7A, 14 dana lečenja betainom je dovelo do 29% i 32% smanjenja tHey za grupe lečene betainom. Grupa lečena samo betainom je održavala ove nivoe tHey do 18. dana. Injekcija PEGC15S na pozadini betaina je dovela do izraženijeg smanjejna 74%, 77%, 76% i 40%, 15., 16., 17. i 18. dana, tim redom. Lečenje samo sa PEGC15S je dovelo do smanjenja 69%, 67%, 52% i 33% 15., 16., 17. i 18. dana, tim redom.
Prema ovim podacima, injekcija PEGC15S sa ili bez lečenja betainom je daleko superiornija od lečenja samo betainom. Pored toga, kombinacija betain+PEGC15S je bila superiornija u odnosu na lečenje samo sa PEGC15S. Kao što je prikazano na FIG.7B, razlika između ove dve grupe je postala statistički značajna 48 sati posle druge injekcije (17. dana). Samim tim, kombinacija PEGC15S sa betainom omogućava održavanje nižih nivoa tHey tokom produženog vremenskog perioda.
[0166] Lečenje samo betainom nije dovelo do povećanja cistationina tokom 18 dana eksperimenta. Naprotiv, povećanje je primećeno za dve grupe koje su lečene sa PEGC15S (sa ili bez betaina). Zanimljivo je da je kombinacija PEGC15S sa betainom, koja je dovela do povećanja počevši od 16. dana pa na dalje, bila značajno manja nego u grupi koja je bila na terpaiji samo sa PEGC15S. Ovo je zbog činjenice da je lečenje samo sa PEGC15S takođe kanalisalo homocistein u kondenzaciju sa serinom da bi se obrazovao cistationin. Kombinacija sa betainom kanališe neke od dostupnog homocisteina putem remetilacije da bi se proizveo metionin, a samim tim manje homocisteina može biti dostupno za pretvaranje PEGC15S u cistationin.
Primer 6. PEGC15S spašava KO miševe od rane smrti i poboljšava bolest jetre
A. Smanjenje rane smrti
[0167] Većina kompletnih CBS-nokaut miševa (KOs) umire u roku od 2-3 nedelje nakon rođenja. Grafički je prikazana Kaplan-Mejerova kriva preživljavanja KO miševa kojima je dva puta nedeljeno ubrizgavan PEGC115S nasuprot miševa kojima je ubrizgavan PBS. Miševi su održavani na vodi betaina do 21. dana, i ispitana je mogućnost ubrizganog enzima da spašava KO mladunce. KO mladuncima je dva puta nedeljno ubrizgavan PEGC15S ili PBS. Svi miševi su na betainu u pijaćoj vodi do 21. dana (dana odvikavanja). Kao što je prikazano na FIG.8A, 21. dana, samo 18% miševa je preživelo u grupi kojoj je ubrizgavan PBS nasuprot 93% onih kojima je ubrizgavan enzim. Nijedna životinja kojoj je ubrizgavan PBS nije preživela do 24. dana, dok je 86% preživljavanja zabeleženo za grupu kojoj je ubrizgavan enzim. Od 24. dana pa na dalje, brojevi životinja kojima je ubrizgavan enzim su počeli da opadaju takođe, sa 45% preživljavanja 29. dana i 33%, 35. dana, mada je primećeno da upotreba različitog PEG molekula i dozni režim u velikoj meri utiču na rezultate kao što je prikazano u dodatnim primerima u nastavku (npr., FIG.11A i 11C). B. Bolest jetre
[0168] Prethodno je pokazano da KO miševi pate od ozbiljnog oštećenja jetre (Maclean et al., 2010a, Mol. Genet. Metab 101, 163-171; Watanabe et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sct. U. S. A.92:1585-1589).
Produženo preživljavanje KO miševa, samim tim može biti u korelaciji sa poboljšanjem bolesti jetre nakon CBS lečenja. Shodno tome, urađene su histološke analize rezova na jetri od životinja kojima je ubrizgavan PEGC 15S tokom 35 dana. Životinje su žrtvovane 36. dana a uzorci jetre su obrađeni zbog histološke analize optičkom mikroskopijom. Životinje kojima je ubrizgavan PBS nisu preživele do 35. dana, ali su uzorci od jetre dve životinje uzeti neposredno nakon smrti i obrađeni. Eksperimenti su izvedeni na slepo. Jetre su uklonjene i fiksirane tokom 24 sata sa 4% paraformaldehidom u PBS (pH 7.4). Izrezani su blokovi tkiva za histologiju, dehidrirani serijama etanola praćenih acetonom, mešavinom acetona i ksilena a zatim uklopljenih u parafin. Paralelno, mali blokovi tkiva (oko 4mm x 2mm) fiksirani paraformaldehidom su brzo zamrznuti u etru petrola ohlađenom sa suvim ledom, i čuvaju se na - 50°C radi detekcije apolarnih lipida. Parafinske sekcije debljine 4 µm su deparafinizovane u kislinu i nakon faze izopropil alkohola rehidriranog etanolom (96%, 70%, 60%). Sekcije tkiva su obojene hematoksilinom i eozinom (H&E) da bi se procenile histopatološke promene. Masaon bojenje trihromom je izvedeno zbog detekcije fibroze. Steatoza je verifikovana pomoću bojenjem Oil Red O radi detekcije apolarnih lipida u fiksiranim-zamrznutim presecima, debljine 10µm i isečeni pomoću Leica Cryomicrotome (CM 1850). Ovi preseci su pregledani i fotografisani Nikon light mikroskopom (E800) koji je opremljena sa Olympus digitalnom kamerom (DP70).
[0169] FIG.8B prikazuje histologiju jetre dva KO miša kojima je ubrizgan PEGC15S žrtvovana 35. dana nasuprot jetri od dve KO životinje kojima je ubrizgavan PB koje su uginule 17. i 24. dana (mrlje hematoksilina i eozina). Prikazi manjeg uvećanja parenhima jetre (FIG.8B, lecw kolonw) prikazuju umerene promene sa blago nepravilnim pločama jetrenih ćelija i blagu do umerenu steatozu kod PEGC15S-ubrizganih KO-1 i KO-2 kod kojih su prisutne masivne zonalne nekroze hepatocita (FIG.8B, KO-3, obeležene vrhovima strelica) i difuzna steatoza sa višestruko dispergovanim nekrozama (FIG.8B KO-4, nekroze obeležene vrhovima strelica) kod PBS-ubrizganih KO. Boja specifična za apolarne lipide u citoplazmi hepatocita je prikazana u umecima. Veća uvećanja (desne kolone) pokazuju prisustvo učestalih mitoza (obeleženih strelicama i prikazanih detaljno u umecima) i uvećanih polimorfnih jezgara sa izraženim jezgrima kod PEGC15S-ubrizganih KO. Veća uvećanja parenhima jetre kod PBS-ubrizganih KO pokazuju konfluentne hepatocelularne nekroze sa sporadičnom zapaljenskom infiltracijom (FIG.8B, KO-3, obeleženom vrhovima strelice) ili višestruko dispergovanim nekrozama praćenim izraženom resorptivnom zapaljenskom reakcijom (FIG.8B, KO-4, obeleženom vrhovima strelice). Preostali parenhim jetre pokazuje mikro i makrovezikularnu steatozu kod PBS-ubrizganih KO. (PT=portalni trakt, CV = centralna vena).
[0170] PBS-ubrizgane životinje su razvile ozbiljnu hepatopatiju koju karakteriše izražena mikrovezikularna do makrovezikularna steatoza i značajna smrt hepatocita, sa minimalno ili bez fibroze. Višestruke mono ili oligo nekroze hepatocita dispergovane po režnju jetre praćene izraženom zapaljenskom resorptivnom reakcijom su pronađene kod jedne životinje, dok su u drugoj prevladavale masivne konfluentne nekroze hepatocita uglavnom u periportalnim zonama sa sporadičnim infiltratom.
Znaci regeneracije parenhima jetre su bili minimalni kod obe životinje. Te dve PEGC115S-ubrizgane životinje su pokazale promene u jetri uz manje znake oštećenja parenhima ali bez izražene regeneracije pa ih je ispitivač tačno prepoznao kao one koje su primale terapiju. Promene koje ukazuju na regeneraciju parenhima jetre (blago nepravilan oblik režnja jetre, bazofilna citolazma hepatocita, učestale mitoze i bijezgreni hepatociti, nuklearna pleomorfija i uvećanje sa izraženim jezgrima) su bili najuočljiviji znaci. Celokupna morfologija je konzistentna sa povišenom proliferacijom, transkripcijom i translacijom u hepatocitima. Pored toga, retke fokalne nekroze hepatocita i blaga steatoza nukrovezikularnog tipa su detektovane a fibroza je bila minimalna.
Primer 7. Biohemijska karakterizacija 20NHS PEG-htCBS C15S
[0171] Biohemijske karakteristike 20NHS PEG-htCBS C15S su određene pre ispitivanja efekata in vivo primene molekula.
A. N-lerminalno sekvencioniranje i intaktna masena analiza
[0172] Pet šarži nemodifikovane htCBS C15S je analizirano pomoću N-terminalnog sekvencioniranja. Dobijene sekvence su bile identične za sve šarže, i upoređenju sa referentnom sekvencom, svima im je nedostajao početni nedostatak metionina. Za N-tenminus iz htCBS C15S je primećeno da je PSETP, a ne MPSETP kao što je pronađeno u sekvenci divljeg tipa CBS.
[0173] Intaktna masa određena dekonvulisanim masenim spektrima htCBS C15S potvrdila je rezultate od N-terminalnog sekvencioniranja identifikovanjem samo jednog glavnog pika na 45290 Da u pet šarži. Ova vrednost odgovara molekulskoj masi htCBS C15S monomera bez N-teminalnog metionina (teoretska molekulska masa 45289.7 Da).
[0174] Poravnanje sekvenci je dalje izvedeno softverom Geneious 9.1.5 (Free Version), pomoću Geneious tipa za poravnanje "Global alignment with end gaps" i Cost Matrix Blosum62 radi poređenja proteinskih sekvenci htCBS C15S kod ljudi, pacova, majmuna, i miševa. Rezultati su potvrdili da N-terminus 20NHS PEG-htCBS C15S predstavlja PSETP a ne MPSETP kako je pronađeno u sekvenci divljeg tipa skraćenog CBS kod ljudi, majmuna, pacova, i miševa. Za htCBS C15S je primećeno da dele 96% identiteta sekvence, uključujući 1 prazninu (na početku kodona), sa skraćenom CBS kod majmuna. Sledeće razlike između sekvenci su primećene kod htCBS C15S koji se ovde koristi i kod skraćene CBS majmuna na osnosvu UniProtKB/Swiss-Prot; Q58H57. Položaj aminokiseline (na osnovu poravnanja sekvenci) 18 R→L (htCBS C15S kako se ovde koristi→skraćena sekvenca kod majmuna), položaj 25 K→Q, položaj 32 S→L, položaj 34 E→G, položaj 69 A→V, položaj 71 A→E, položaj 90 V→1, položaj 133 D→A, položaj 157 A→T, položaj 242 Q-+R, položaj 354 V→M, i položaj 403 T→V.
[0175] Za htCBS C15S je primećeno da deli 84% identiteta sekvence, uključujući 5 praznina (kod sekvence pacova), sa skraćenom CBS kod pacova. Sledeće razlike između sekvenci su primećene iz htCBS C15S koja se ovde koristi i skraćene CBS kod pacova na osnovu UniProtKB/Swiss-Prot: P32232. Položaj aminokiseline (na osnovu poravnanja sekvenci) 4 E→G (htCBS C15S koja se ovde koristi→skraćenia sekvenca pacova), položaj 6 P→S. položaj 8 A→C, položaj 10 V→D, položaj 12 P→S,položaj 13 T→A, položaj 15 S→C, položaji 17-24 HRSGPHSA→QDLEVQPE, položaj 26 S→Q, položaj 32-34 SPE→ASG, položaj 38-42 AKEPL→R--V, položaj 45 R→S, položaj 48 A→T, položaji 60-62 ASE→MAD, položaj 66 H→Y, položaj 69 A→V, položaj 71 A→T, položaj 82 K→R, položaj 86 D→N, položaj 94 K→R, položaj 96 G→S, položaj 98-99 KF→NA, položaj 133 D→A, položaj 161 R→K, položaj 175 S→M, položaj 235 T→D, položaj 238 D→E, položaj 248 L→V, positon 255 V→A, položaj 276 R→K, položaj 300 T→A, položaj 318 T→A, položaj 322 K→R, položaj 329-331 EEA→DDS, položaj 333 T→A, položaj 340 i 350 A→S, položaj 353-354 TV→AM, položaj 365 Q→K, položaj 383 T→S, položaj 389 R→K, položaj 397 L→M položaj 401 D→-, položaj 403-404 TE→SV, i položaj 406 K→R.
[0176] Za htCBS C15S je primećeno da deli 84% identiteta sekvence, uključujući 5 praznina (kod mišje sekvence), sa skraćenom CBS kod pacova. Sledeće razlike između sekvenci su primećene od htCBS C15S koja se ovde koristi i skraćene mišje CBS na osnovu UniPnotKB/Swiss-Prot: Q91W9. Položaj aminokiseline (na osnovu poravnanja sekvenci) 4 E→G (htCBS C15S koja se ovde koristi→skraćena mišja sekvenca) položaj 6 P→S, položaj 8 A→C, položaj 10 V→D, položaji 12-13 PT→SA, položaji 15-21 SPHRSGP→GFQHLDM, položaj 24 A→E, položaj 26-27 GS→RQ, položaji 32-34 SPE→PSG, položaji 37-42 EAKEPL→DR---V, položaj 48 A→T, položaji 59-62 PASE→AMAD, položaj 66 H→Y, položaji 69-71 APA→VLT, položaj 82 K→R, položaj 86 D→N, položaj 96 G→S, položaj 98-99 KF→NA, položaj 133 D→A, položaj 161 R→K, položaj 175 S→M, položaj 235 T→D, položaj 238 D→E, položaj 255 V→A, položaj 276 R→K, položaj 300 T→A, položaj 318 T→A, položaji 330-331 EA→DS, položaj 333 T→A, položaj 350 A→S, položaj 353-354 TV→AM, položaj 383 T→S, položaj 389 R→K, položaj 397 L→M, položaj 401 D→4-, položaj 403-404 TE→SV, položaj 406 K→R, i položaj 411 H→R.
[0177] Gornji rezultati prikazuju da sekvence pacova i miševa dele mnoge od istih razlika u poređenju sa htCBS C15S PEGilovanom sa 20NHS PEG-htCBS C15S koja se koristi u ovim primerima. Skraćena sekvenca kod majmuna je delila najveću sličnost sa sekvencom 20NHS PEG-htCBS C15S.
B. Mapiranje PEGC15S PEGilacijom NHS estra
[0178] Mesta PEGilacije tri serije 20NMS PEG-htCBS C15S su mapirana; RC-6-67A (6.3 mglml), RC-6-67B (6.7 mg/ml), i RC-8-14 (3.8 mg/ml). Uzorci su de-PEGilovani u alkalima, redukovani i alkilovani, digestirani sa Asp-N endopeptidazom i analizirani putem LC/UV/MS.
[0179] Hromatografija na obrnutim fazama je izvedena za količinu injekcije od 33 µg u mobilnoj fazi A od 0.1% TFA (ThermoFisher) u vodi i mobilnoj fazi B od 0.1% TFA (ThermoFisher) u acetoniurilu (Burdick and Jackson) sa XBridge BEH130 C183.5 µm, 4.6 × 150 mm kolona (Waters) na temperaturi kolone od 60 °C.
Tabela 6 prikazuje gradijent tečne hromatografije velike performanse (HPLC).
[0180] ESl-QTOF maseni spektometar (Agilent, model 6538) je podešen na visoku rezoluciju 4GH2i način rada pozitivnog jona sa opsegom MS Scanod 330 do 3200 m/z pre LC/UV/MS pomoću Agilent mešavine za podešavanje kalibracije. Voltaže su podešene na sledeći način: fragmentor -250 V, lopatica -65 V, i oktopol RF voltaža 750 V. Temperatura gasa je bila 350°C. sve mase su kalibrisane do unutar ≠ 1ppm pre nego što je ispitivanje moglo da se nastavi. Kalibracija dinamičke masene ose je takođe korišćena kroz sve LC/MS/MS eksperimente kontinuiranom infuzijom referentnog standarda. Korišćeni su joni zaključane mase: 922.009798.
[0181] Protein C15S nePEGilovane htCBS je obrađen paralelno kao kontrola. Primećeno je da peptidna mapa pokriva 97.8% aminokiselinske ekvence za svaki od četiri uzorka, uključujući svih 30 lizinskih ostataka. Za dvanaest peptida je identifikovano da su PEGilovani na osnovu masenih dodavanja 1-2 PEG veznika, a procenjuje se da je obim PEGilacije u opsegu od 4.5 do 5.S PEGs/CBS podjedinica za ove tri serije.
[0182] Uzorci su prvo dePEGilovani u uslovima (pH 11.5, 37 °C 22 sati) optimizovanim u analizi zauzetosti mesta za PEGilaciju PEGilovane htCBS C15S putem LC/MS/MS. Nakon de-PEGilacije, na prethodno pegilovanim mestima su ostavljeni veznici formule: C5H6O3(monoizotopna molekulska masa od 114.0317 Da), koji mogu da se identifikuju peptidnim mapiranjem. DePEGilovan uzorak je redukovan, alkilisan, digestiran sa Asp-N endopeptidazom i analiziran putem LC/UV/MS kako je prethodno opisano.
[0183] Opseg PEGilacije je procenjen pomoću sledećeg izračunavanja: # PEGova po peptidu (rasprostranjenost(1<∗>veznik) 2 x rasprostranjenost(2<∗>veznik))/(rasprostranjenost(bez veznika) rasprostranjenost(1<∗>veznik) rasprostranjenost(2<∗>veznik)). Tabela 7 obezbeđuje LC/UV/MS rezultate.
[0184] Lizini 25, 30, 211, 247.271, i 405-406 su nedvosmisleno identifikovani kao PEGilovani u nekoj meri u sve tri šarže 20NHS PEG-htCBS C15S. Svaka od tih grupa lizina 72 i 75; 82 i 83; 94, 97-98, i 102; 322 i 325; i 394 i 398 su unutar istog peptida, a ovde datom analizom nije moglo da se odredi koji lizin je PEGilovan u kojoj meri.
[0185] Neka cepanja peptida koja nisu specifična za Asp-N endopeptidazu (N-terminal Asp i Glu) su takođe praćena, na primer 107 A-K 119 i 333 A-K 348, koja mogu da se pripišu baznoj hidrolizi proteina tokom dePEGilacije. Značajan procenat deamidacije je primećen za neke peptide, koji takođe mogu da se pripišu alkalinskim uslovima koji se koriste za reakciju dePEGilacije.
Primer 8. Biohemijska karakterizacija PEGilacije maleimida
[0186] SDS-PAGE i nativan PAGE gel su izvedeni da bi se uporedila reproduktivnost obrazaca PEGilacije za htCBS konjugovanog u ME-400MA i ME-200GS. Rezultati su pokazali varijabilan odnos između diskretnih PEG-CBS vrsta i pokazali su nepotpunu PEGilaciju kada se koriste molekuli PEG maleimida ME-400MA. Varijabilni obimi PEGilacije za NHS estar PEG ME-200GS su napravili "razmaz" velike molekulske mase nerazdvojivih PEGilovanih vrsta na SDS-PAGE (FIG.9A) i nativnim PAGE gelovima (FIG.
9B).
[0187] Za razliku od PEGilacije htCBS C15S sa ME-200GS, PEGilacija htCBS C15S sa ME-400MA je praćena i utvrđeno je obezbeđuje tri definisane vrste kada se razdvaja na nativnom PAGE (FIG.9B). Za najtežu vrstu je primećeno da koeluira sa drugom vrstom u htCBS C15S PEGilovanoj sa ME-200GS. Tačan identitet najteže vrste nije bio određen zbog relativno male količine vrste u poređenju sa drugim vrstama i nedostatkom razdvajanja koje je sprečeno detaljnom farmakodinamičkom (PD) karakterizacijom. Za drugu vrstu je identifikovano da nosi 1 PEG pričvršćen za svaku podjedinicu u nativnom dimeru, koji je poznat pod drugim nazivom kao homoPEGilovana vrsta. Za najlakšu PEGilovanu vrstu je primećeno da nosi samo 1 PEG po dimeru, koja je takođe poznata kao heteroPEGilovana ili hemiPEGilovana vrsta.
A. Mapiranje PEGC15S PEGilacijom maleimida
[0188] Prva faza peptidnog mapiranja bilo je uzimanje u obzir svakog peptida koji sadrži cistein u dva uzorka htCBS C15S PEGilovana sa ME-400MA: RC-6-13 POOL1 i RC-6-13 POOL2. RC-6-13 POOL1 (BSL uzorak# 1127) predstavlja homoPEGilovanu vrstu (najverovatnije PEGilovanu na istom ostatku). RC-6-13 POOL2 (BSL uzorak# 1128) predstavlja hemiPEGilovanu vrstu, stoga je na SDS-PAGE primećeno da je tu gotovo jednaka proporcija PEGilovanih i nemodifikovanih traka. Ovaj primer je odredio lokaciju pričvršćivanja ME-400MA, kada je najpristupačniji cistein (C15) zamenjen serinom.
[0189] Lys-C digestija je izvedena na referentnom proteinu (UnPEG RC-6-09 DIAFILTRATE) i simultano na dva PEGilovana proteina (RC-6-13 POOL1/ RC-6-13 POOL2). Osam peptida koji sadrže cistein su identifikovani sa redukovane/alkilisane LC/MS mape peptida. Sedam peptida koji sadrže cistein je obezbedilo slične relativne rasprostranjenosti u sva tri uzorka kao što je prikazano na tabeli 8 u nastavku, čime se ukazuje da je za 7 peptida cisteina malo verovatno da su PEGilovani.
[0190] Za samo jedan peptid koji sadrži cistein je primećeno da je značajno smanjio relativnu rasprostranjenost u svakom od dva PEGilovana uzorka. Tabela 8 obezbeđuje relativnu rasprostranjenost nePEGilovanih peptida u svakom uzorku.
[0191] Za peptid 272-322 je primećeno da sadrži dva cisteinska ostatka. PEGilovani ostaci su primećeni na Cys272 i/ili Cys275 koji je na Lys-C peptidu 272-322. Da bi se dalje napravila razlika da li su Cys272 i/ili Cys275 PEGilovani, ta dva ostatka su razdvojena na različite peptide, referentne (UnPEG RC-6-09 DIAFILTRATE) i ta dva PEGilovana proteina (RC-6-13 POOL1/ RC-6-13 POOL2) su lečena reagensom 2-Nitro-5-tio-cijanobenzoične kiseline (NTCB). Zazo što NTCB cepa N-terminalno na slobodne cisteinske ostatke, PEGilovan cistein ne obrazuje cijanilisan kranji proizvod i samim tim se blokira cepanje.
[0192] Sedam peptida koji sadrže cistein su identifikovani sa NTCB lečene C8 LC-MS peptidne mape. Kako je efikasnost hemijske digestije bila relativno mala u poređenju sa digestijom enzima, ciljani pikovi peptida su svi bili mali na hromatogramu, a primećene su neželjene reakcije (rezultati nisu prikazani). Pikovi peptida koji se odnose cistein su locirani i kvantifikovani su pomoću ručne pretrage jona. U poređenju sa referentnim proteinom samo jedan peptid koji sadrži cistein je pokazao značajno smanjenje kod uzorka RC-6-13 POOL1. Peptid, identifikovan kao ostaci 244-271, označava da je mesto 272 blokirano, čime se snižava prinos za 244-271 peptid. Dva peptida koja sadrže cistein su pokazala smanjenje relativne rasprostranjenosti za RC-6-13-POOL2 uzorak; međutim, odnos je blizu ova dva.
Moguće je da su oba cisteina uključena u PEGilaciju ili da je rasprostranjenost pika previše niska da bi se izveo čvrst zaključak. Rezultazi u tabeli 9 obezbeđuju dokaze da se PEGilacija nalazi na Cys272, mada Cys275 nije u potpunosti isključen kao lokacija PEGilacije.
Primer 9. Farmakokinetika i farmakodinamika 400MA PEG-htCBS C15S i 20NHS PEG-htCBS C15S kod HO miševa
[0193] Ovaj primer karakteriše i upoređuje svojstva farmakokinetike (PK) i farmakodinamike (PD) htCBS C15S PEGilovane ili sa 20 kDa linearnim NHS estrom-aktiviranim PEG (ME-200GS) ili 40 kDa linearnim maleimidom-aktiviranim PEG (ME-400MA). Svaki od PEGC15S je prečišćen na DEAE sefarozi i puferi su razmenjeni pomoću filtracije tangencijalnim protokom (TFF) na BioMax<®>100 kertridž u 1x sterilnom PBS.
[0194] htCBS C15S modifikovana sa ME-400MA (400MA PEG-htCBS C15S) je koncentrovana do 7mg/ml. HomoPEGilovana htCBS C15S modifikovana sa ME-400MA (pik 1) je koncentrovana do 4.3 mg/ml, a hemi/heteroPEGilovana htCBS C15S modifikovana sa ME-400MA (pik 2) je koncentrovana do 5.1 mg/ml. htCBS C15S modifikovana sa ME-200GS (20NHS PEG-htCBS C15S) je koncentrovana do 6 mg/ml.
[0195] Za 20NHS PEG-htCBS C15S, HO miševima je davana SQ doza od 5, 10 ili 15 mg/kg doza ili im se davana IV doza od 10 mg/kg. Za 400MA-htCBS C15S, HO miševi su primali pojedinačnu dozu od 10 mg/kg ili SC ili IV jednog od tri oblika: (i) mešavina svih vrsta, gde nije pokušavano razdvajanje pojedinačnih oblika (mešavina), (ii) homoPEGilovana vrsta (pik 1), i (iii) hetero/hemiPEGilovanih vrsta (pik 2).
[0196] I mužjaci i ženke HO miševa su korišćeni u ovom primeru, i u svakoj grupi su bila 3 do 4 miša. Dve grupe miševa označene kao "A" i "B" su korišćene za svaki način davanja kako bi se zapremina krvi uzeta od svakog miša svela na minimum. Za SC davanje, krv je uzimana u grupi A na 0.5, 3, 24, i 72 sata posle injekcije i u grupi B na 1, 6, 48, i 96 sati posle injekcije. Za IV davanje, krv je uzeta od grupe A na 0.25, 1, 6, i 48 sati posle injekcije i t-injekcije i od grupe B na 0.5, 3, 24, i 72 sata posle injekcije.
A. Farmakokinetika
[0197] PK parametri izračunati iz krive vreme-dejstvo su prikazani u tabeli 10 za ME-200GS konjugat i u tabeli 11 za ME-400MA konjugat. Polulogaritamski dijagrami su bili linearni za intravenske grupe i samim tim je potvrđeno da su svi oblici htCBS C 15S enzima očišćeni iz plazme kinetikom prvog reda (podaci nisu prikazani).
[0198] Bioraspoloživost je izračunata deljenjem površine ispod krive (AUC) za SC ili IP način putem AUC primećene nakon IV davanja. Tabela 10 obezbeđuje PK parametre nakon IV i SC davanja 20NHS PEG-htCBS C15S.
[0199] Ovo ukazuje da je vrednost modelovana za 10 mg/kg dozi sa vremenskim intervalom između doza od 48 sati i poluživotom od 17.5 sati.
[0200] Za 20NHS PEG-htCBS C15S, površina ispod krive je bila 3062, 4788 i 5754 za doze od 5, 10, i 15 mg/kg, tim redom. Frakcija htCBS C15S enzima koja je dostigla sistemsku cirkulaciju nakon ekstravaskularnog (SC) doziranja je bila 82.6% u grupama sa dozom 5 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S SC ali je opala do 64.6% i 51.6% u grupama sa dozama od 10 i 15 mg/kg. Samim tim, povećanje je bilo manje nego dozno proporcionalno što se i odražava u proporciji porasta kod AUC, cmaks, i bioraspoloživosti. Ove rezultate verovatno objašnjava blagi pad ukupne apsorpcije 20NHS PEG-htCBS C15S sa rastućom dozom.
[0201] Poluživot eliminacije u IV doznoj grupu je bio 48 sati što znači da se polovina koncentracije leka u plazmi čisti svakih 48 sati. Podaci su bili u potpunosti linearni kada se grafički prikaže kao koncentracija sa vremenom na logaritamskoj skali sa korelacionim koeficijentima >0.98 što ukazuje da je ovo bliska procena poluživota eliminacije za 20NHS PEChtCBS C15S. Poluživot, određivanja u SC doznim grupama su bili varijabilni, i bili su u opsegu od 17.5 do 137 sati. Ove procene su dovedene u sumnju sporom dvofaznom fazom apsorpcije/raspodele. Izračunato je da jepProsečno vreme cirkulisanja pojedinačnog molekula enzima (MRT) u opsegu između 44 i 194 sati za 20NHS PEG-htCBS C 15S.
[0202] Vreme potrebno da bi se postiglo stabilno stanje (konstantni pikovi i konstantne najniže vrednosti) je modelovano od 10 mg/kg SC skupa podataka pod pretpostavkom da dozni interval iznosi 48 sati a da je poluživot 17.5 sati. Vreme potrebno za postizanje apsolutnog stabilnog stanja je procenjeno da iznosi 343 sata (tj. nakon oko 7 SC injekcija svaka 2 dana), ali promene u pikovima i najnižim koncentracijama u plazmi su bile veoma blizu nivoa stabilnog stanja za 144 sati. U stabilnom stanju, pik i najniža koncentracija su simulisani da iznose 162 i 85 mU/µL nakon doze od 10 mg/kg koja se daje SC jednom dnevno svaka dva dana. Međutim, veoma slični nivoi su postignuti 144 sati posle injekcija tj. posle 3 SC davanja PEGilovanog enzima svaka 2 dana.
[0203] Nivoi plazme 400MA PEG-htCBS C15S za pik 1 koji predstavlja PEGilovanu vrstu (2 PEG grupe po htCBSdimeru), pik 2 koji predstavlja hemiPEGilovanu vrstu (pojedinačna PEG grupa po htCBS C15S dimeru) su upoređeni na FIG.10A. Ova mešavina je predstavljena kao tamna linija sa kvadratićima koji označavaju tačke sakupljanja. Pik 1 je predstavljen isprekidanom linijom sa kružićima koji označavaju tačke sakupljanja, a pik 2 je predstavljen isprekidanom linijom sa rombićima koji označavaju tačke sakupljanja.
[0204] Tabela 11 obezbeđuje PK parametre izračunate nakon SC i IV davanje 10 mg/kg 400MA PEG-htCBS C 15S.
[0205] Primećeno je da bioraspoloživost izračunata za mešanu 400MA PEG-htCBS C15S iznosi 55.2%. Tmaksje vreme cmaks(nivo početnog pika u plazmi). Poluživot eliminacije je izračunat i iznosi 39 sati iz IV skupa podataka. PK parametri nisu bili dramatično različiti od pojedinačne PEGilovane vrste označene kao pik 1 (hemiPEGilovan) i pik 2 (homoPEGilovan).
B. Poređenje ME-200GS i ME-400MA PEGilovanih oblika htCBS C15S
[0206] Za PK parametre nije primećeno da se primetno razlikuju za dva PEGilovana ovde upoređena oblika htCBS C15S (ME-200GS i ME-400MA). Specifično dejstvo u odnosu na vremenske krive za 10 mg/kg IV i SC doze svakog enzima su takođe primećene da su slične kao što je prikazano na FIG.10B. Dejstva nakon IV doziranja su prikazana kao tamne linije, a nakon SC doziranja su prikazane kao isprekidane linije. Kružići (IV) i trouglovi (SC) predstavljaju vremena sakupljanja za miševe kojima se daje 20NHS PEG-htCBS C15S, a rombići (IV) i kvadratići (SC) predstavljaju vremena sakupljanja za miševe kojima se daje 400MA-htCBS C 15S.
[0207] Međutim, profili metabolita prikazani na FIG.10C koji prikazuju 20NHS PEG-htCBS C15S su bili efikasniji u smislu normalizovanja nivoa homocisteina u plazmi (kružići) i cisteina (kvadratići) nakon pojedinačne SC doze 10 mg/kg. Nivoi cistationina, predstavljeni trouglovima na grafikonu na FIG.10C, nisu bili značajno različiti između dva konjugata. Generalno, odgovori prate nivoe u plazmi izmerene ispitivanjem dejstva.
[0208] Za odgovor za 20NHS PEG-htCBS C15S je primećeno da se javlja brže i primećeno je da je više produžen u odnosu na odgovor do 400MA PEG-htCBS C15S. Za oba PEGilovana enzima je primećeno da poboljšavaju nivoe Hey i Cys u plazmi do grubo istog opsega tokom 6 sati nakon SC davanja, a za nivoe Hey u plazmi je je primećeno da su ostali sniženi do 72 sata nakon davanja 20NHS PEG-htCBS C 15S u poređenju sa postepenom normalizacijom od 24 sata i ukupni povratak na nivoe pre injekcije na 72 sata nakon davanja 400MA PEG-htCBS C 15S. Sličan obrazac odražavaju nivoi Cys u plazmi za oba PEGilovana enzima.
[0209] Nije primećeno da povećano doziranje značajno poboljšava PD profil bilo kog oblika CBS što ukazuje da se maksimalna efikasnost ovog enzima ne rukovodi samo njegovim nivoima koncentracije u plazmi, već da na to utiču faktori kao što je kinetika enzima, dosupnost supstrata, i koncentracija.
[0210] Za 20NHS PEG-htCBS C15S je primećeno da obezbeđuje najpovoljniji profil nakon SC primene u poređenju sa 400MA PEG-htCBS C15S. Konkretno, poluživot u cirkulaciji je bio 47 sati za 20NHS PEG-htCBS C15S u poređenju sa 39 sati (tj.20% duži poluživot) za 400MA PEG-htCBS C15S, a bioraspoloživost nakon SC primene jednake količine (10 mg/kg) je bila 64.6% za 20NHS PEG-htCBS C15S u poređenju sa 55.2% za mešavinu (tj.17% bolja raspoloživost).
C. Poređenje različitih doza 20NHS PEG-htCBS C15S
[0211] Za PD odgovor je generalno primećeno da se javlja u direktnoj proporcionalnosti sa najvišim nivoima u plazmi i smanjuje se proporcionalno sa poluživotom. Međutim, veza sa dozom kod odogovora pika je primećena da prilazi maksimalnim nivoima na 5 mg/kg tako da su te doze od 10 ili 15 mg/kg dovele do malog povećanja efikasnosti pika kao što je određeno i nivoima homocisteina i cistationina kao što je prikazano na FIG.10D. Talasasti obrazac eliminacije je primećen u svakoj od faza eliminacija koja je bila ista na svakoj krivi, tako da dejstvo plazme postignuto tokom 48 sati a zatim oporavljeno (ili je bilo slično) na 72 sta, da bi samo opalo na 96 sati. Ovaj obrazac neuobičajene eliminacije nakon SC doziranja htCBS C15S moguće može biti usled čišćenja dvofazne apsorpcije koju čine rana brza i sporija kasna faza apsorpcije.
[0212] Povećano doziranje 20NHS PEG-htCBS C15S je primećeno da pokazuje grubo dvostruko veće CBS dejstvo u plazmi za dozu od 10 mg/kg u poređenju sa 5 mg/kg, ali nije bilo linearno za veću dozu od 15 mg/kg, što je prikazano na FIG.10E. Postoji uočljiva razlika između PD odgovora 10 i 15 mg/kg doznih grupa za svaki metabolit. Zapravo, za mnoge vremenske tačke u grupi koja je primala veću dozu je primećeno da proizvode odgovor koji ide ispod onog u grupi koja je primala dozu od 5 mg/kg. Ove razlike se ne računaju za nižu bioraspoloživost (smanjena apsorpcija po dozi jedinice) primećenu kod rastućih doza od 20NHS PEG-htCBS C15S. Kao zaključak, za pojedinačnu doza između 5 i 10 mg/kg je primećeno da proizvodi odgovor maksimalne efikasnosti kod HO mišjeg modela.
Primer 10. Farmakodinamika PEGC15S tokom dugoročne primene kod HO miševa
[0213] Ovaj primer ocenjuje i poredi farmakodinamičku efikasnost i potencijalne imunogene odgovore dugoročno egzogeno primenjivane htCBS C15S PEGilovane ili sa ME-200MA0B, ME-200GS, GL4-400MA, ME-400MA, ili ME-050GS kod HO miševa. Kada su humani proteini konstruisani u mišji genom i eksprimirani kod neonatalnih životinja, kao što je to slučaj za HO miša, imuni odgovori će najverovatnije imati kliničku relevantnost za humani odgovor. Videti, Guidance for Industry, Immunogenic assessment of therapeutic protein products, CEBR (August 2014). HO miševi eksprimiraju male količine proteina humane CBS i vrlo verovatno su sličniji humanim pacijentima u smislu njihovog adaptivnog imunog odgovora na PEG htCBS enzime od potpunih nokaut miševa ili miševa divljeg tipa.
[0214] U jednom skupu eksperimenata, procenjena je htCBS C15S PEGilovana ili sa ME-200MA0B, ME-200GS, GL4-400MA, ili ME-400MA. Šest grupa HO miševa je korišćeno da se izvedu ova ispitivanja: dve grupe su primale 200MA0B PEG-htCBS C15S (grupe 1 i 3), jedna grupa je primala 20NHS PEG-htCBS C 15S (grupa 4), jedna grupa je primala GL4-400MA PEG-htCBS C15S (grupa 5), a dve grupe su primale 400MA PEG-htCBS C15S (grupa 6 i 7). I mužjaci i ženke HO miševa su korišćeni (ukupno n=6 do 8 miševa po grupi) u ovim ispitivanjima.
[0215] Za grupu 1, miševi su primali 2 kruga od po 5 dana subkutanih injekcija 200MA0B PEG-htCBS C15S 1., 2., 3., 4., i 5. dana (1. nedelja) i 15., 16., 17., 18., i 19. dana (3. nedelja). Doza za ovaj eksperiment je bila 5 mg/kg/dnevno. Kontrolna grupa koja je primala slani rastvor (2. grupa) je bila uključena u ovaj eksperiment. Sve druge grupe su primale 3 kruga od po 5 dana subkutanih injekcija 1., 2., 3., 4., i 5. dana (1. nedelja); 15., 16., 17., 18., i 19. dana (3. nedelja);i 29., 30., 31., 32. i 33. dana (5. nedelja). Doza za ove eksperimente je bila 7.5 mg/kg/dnevno.
[0216] U odvojenom skupu eksperimenata, procenjena je htCBS C15S PEGilovana sa ME-200MA0B ili ME050GS. Dve grupe mužjaka i ženki HO miševa (1M/5F) su primale 3 kruga 5 dana subkutanih injekcija ili 200MA0B PEG-htCBS C15S (grupa 8) ili 050GS PEG-htCBS (grupa 9) 1., 2., 3., 4., i 5. dana (1. nedelja); 15., 16., 17., 18., i 19. dana (3. nedelja); i 29., 30., 31., 32. i 33. dana (5. nedelja). Ta doza je bila 7.5 mg/kg/dnevno.
[0217] U svim skupovima eksperimenata, svaki ciklus doziranja od 5 dana je praćen 10-dnevnim periodom "bez primene leka". Krv je uzorkovana submandibularnom lancetom ponedeljkom, sredom, i petkom tokom nedelje doziranja (1, 3, i 5) i prvog dana (ponedeljak) svakog 10-dnevnog perioda bez primene leka. Svi postupci uzorkovanja krvi i subkutane injekcije su izvedeni u 3 P.M. da bi se izbegli artefakti usled svakodnevnih varijacija. Na dan kada se izvodi i uzorkovanje krvi i kada se daje injekcija, krv je uzorkovana pre primene enzima.
[0218] Farmakodinamički odgovor kod HO miševa na svaki konjugat PEGilovane htCBS C15S je ocenjen za svaki krug kvantifikovanja nivoa metabolita homocisteina, cistationina, i cisteina u plazmi, koji su povezani sa putem transsulfuracije, na osnovnoj liniji i posle lečenja. Kvantifikacija je izvedena masenom spektrometrijom tečne hromatografije razblaživanjem stabilnog izotopa (LC/MS) kao što je opisano u primeru 1. Maksimalna procentualna promena homocisteina, cistationina, i cisteina je izračunata u odnosu na vrednosti na osnovnoj liniji za svaku nedelju doziranja.
[0219] ME-200MA0B;: Tri nezavisna ispitivanja su izvedena sa 200MA0B PEG-htCBS C15S (grupe 1, 3 i 8). U 1. grupi, nivoi Hcy u plazmi su primećeni da su pali za 68% u odnosu na nivoe osnovne linije tokom prve nedelje doziranja, ali je primećeno da su pali za 24% u odnosu na nivoe na osnovnoj liniji tokom druge serije 200MA0B PEG-htCBS C15S injekcija tokom 3. nedelje sa 10-dnevnim periodom bez primene leka u međuvremenu (tabela 12). Na sličan pad efikasnosti je ukazivala i atenuisana procena i Cth i Cys nivoa tokom druge runde injekcija (tabela 13 i tabela 14). Drugo ispitivanje (3. grupa) je izvedeno da bi se odredilo da li je atenuisana efikasnost primećena sa različitim skupom naivnih HO miševa. Primećeno je da su ukupni Hcy nivoi u 3. grupi pali do 82% ispod osnovne linije tokom prvog kruga injekcija. Tokom drugog i trećeg kruga injekcija tokom 3. nedelje i 5. nedelje, za nivoe Hey je primećeno da padaju do samo 57% i 50% vrednosti osnovne linije, tim redom. Slično tome, za dodatnu seriju 200MA0B PEG-htCBS C15S koja je primenjivana grupi 8 je primećeno da snižava nivoe Hey u plazmi za 80% u odnosu na nivoe na osnovnoj liniji u odnosu na nivoe na osnovnoj liniji tokom prve nedelje doziranja, ali samo za 61% vrednosti osnovne linije tokom 3. nedelje doziranja. Tokom 5. nedelje doziranja, za nivoe Hcy u plazmi je primećeno da padaju na 50% od vrednosti osnovne linije (tabela12). Na sličan pad efikasnosti su ukazivale atenuisane procene Cys nivoa tokom 3. nedelje i 5. nedelje davanja injekcija (tabela 13 I tabela 14), u odnosu na 1. nedelju. Sličan trend atenuisane efikasnosti je primećen u 1., 3., i 8. grupi, iako je za jačinu atenuisanog odgoovra primećeno da je dramatičnija u 1. grupi u odnosu na 3. i 8. grupu. Sličan trend atenuisane efikasnosti je primećen u 1., 3., i 8. grupi, iako je za jačinu atenuisanog odgovora primećeno da je dramatičnija u 1. grupi u odnosu na 3. i 8. grupu.
[0220] ME-200GS: Uočeno je da primena 20NHS PEG-htCBS C15S u eksperimentalnoj grupi 4 smanjuje nivoe Hcy u plazmi za 77% u odnosu na nivoe osnovne linije u prvoj nedelji doziranja, 70% tokom treće nedelje doziranja, i 66% tokom pete nedelje doziranja (tabela 12). Slično opadanje efikasnosti je prikazano atenuisanim povećanjima Cth i Cys nivoa tokom treće i pete nedelje doziranja (tabela 13 i tabela 14) u odnosu na 1. nedelju. Međutim, za 20NHS PEG-htCBS C15S, opadanje fikasnosti je primećeno 3. nedelje i 5. nedelje doziranja je najmanje moglo da se poredi sa drugim PEG htCBS C15S konjugatima i statistički nije značajno.
[0221] GLA-400MA: Primena GL4-400MA-htCBS C15S u 5 grupi je dovela do prosečnog pada od 75% u nivoima Hcy u plazmi u odnosu na nivoe osnovne linije u prvoj nedelji doziranja, ali samo 41% tokom treće nedelje doziranja i 34% tokom 5. nedelje doziranja (tabela 12). Slično opadanje efikasnosti je prikazano atenuisanim povećanjem Cth i Cys nivoa tokom 3. nedelje i 5. nedelje doziranja (tabela 13 i tabela 14) u odnosu na 1. nedelju.
[0222] ME-400MA: Dva nezavisna eksperimenta su izvedena sa 400MA PEG-htCBS C15S (6. i 7. grupa). U grupi 6, procentualno smanjenje Hcy nivoa je primećeno da iznosi 73% u poređenju sa nivoima osnovne linije u 1. nedelji, a nakon toga je opalo do 65% i 59% tokom 3. nedelje i 5. nedelje doziranja tim redom. Jačina pada efikasnosti je bila dramatičnija u 7. grupi kao što je prikazano atenuisanim smanjenjima Hcy nivoa tokom tri kruga doziranja (tabela 12). Slični trendovi atenuisane efikasnoti su primećeni u promenama Cth i Cys nivoa za 6. grupu i 7. grupu (tabela 13 i tabela 14).
[0223] ME-050GS: Uočeno je da primena 050GS PEG-htCBS C15S u 9. grupi snižava nivoe Hey u plazmi za 75% u odnosu na nivoe osnovne linije u 1. nedelji doziranja, ali snižava za 59% u odnosu na nivoe osnovne linije tokom 3. nedelje doziranja. Tokom 5. nedelje doziranja, za nivoe Hey u plazmi je uočeno da opadaju do 42% nivoa osnovne linije (tabela 12). Sličan pad efikasnosti je prikazan atenuisanim povišenjima nivoa Cth i Cys tokom 3. i 5. nedelje doziranja (tabela 13 i tabela 14) u odnosu na 1. nedelju.
[0224] Tabela 12, tabela 13, i tabela 14 predstavljaju procentualne promene nivoa metabolita homocisteina, cistationina, i cisteina u plazmi nakon svakog kruga subkutanih injekcija različitih oblika PEGilovane htCBS C15S. U ovim tabelama, vrednosti osnovne linije su predstavljene kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) u µM, a promene su predstavljene kao srednja maksimalna procentualna promena sa osnovne linije za svaki 5-dnevni ciklus doziranj a (nedelje 1, 3 i 5). n.d. znači "nije određen". Tabela 12 obezbeđuje procentualnu promenu ukupnog homociestina nakon dugoročnog lečenja sa PEGC15S.
[0225] Tabela 13 obezbeđuje procentualnu promenu cistationina nakon dugoročnog lečenja sa
PEGC15S.
[0226] Tabela 14 obezbeđuje procentualnu promenu cisteina nakon dugoročnog lečenja sa PEGC15S.
[0227] Rezultati ovih ispitivanja pokazuju smanjenje nivoa Hcy u plazmi u skladu sa povećanjem Cth i Cys u plazmi u svim grupama, čime se ukazuje na normalizaciju metabolita kao odgovora na lečenje sa PEG-C15S. U svim grupama, maksimalna efikasnost je primećena tokom prve nedelje doziranja. Za Hcy nivoe je uočeno da značajno opadaju (oko 68% do oko 82%) ispod osnovne linije za sve eksperimentalne grupe, kao što je prikazano na tabeli 12. Procenat povećanja pika Cth i Cys je takođe bio maksimalan tokom 1. nedelje, kao što je prikazano na tabeli 13 i tabeli 14. Jačina farmakodinamičkog odgovora je opala tokom naknadnih ciklusa injekcija PEG-C15S tokom 3. nedelje do 5. nedelje. Sveukupno, najveći i najtrajniji farmakodinamički odgovor je uočen za 20NHS PEG-htCBS C15S.
[0228] Atenuisana efikasnost je uočena tokom drugog kruga doziranja PEGilovane htCBS C15S koja se daje tokom 3. nedelje doziranja za sve ispitivane konjugate sa izuzetkom 20NHS PEG-htCBS C15S. Dalje opadanje efikasnosti je primećeno tokom trećeg ciklusa doziranja izvedenog tokom 5. nedelje u odnosu na 3. nedelju. Iako se stvaranje antitela ne meri direktno u ovim ispitivanjima, ovaj usporeni pad efikasnosti nakon ponovljenog davanja predstavlja klasičnu indikaciju adaptivnog imuniteta. Samim tim, verovatno objašnjenje za atenuaciju je bio imuni odgovor usmerena na htCBS C15S PEGilovanu sa ME-200MA0B, MA-400ME, GL4-400MA, ili ME-050GS.
[0229] Od ispitanih konjugata, uočeno je da 20NHS PEG-htCBS C15S ima najrobusniju dugoročnu efikasnost. ME-200GS hipotetički može efikasnije da maskira imunogenske epitope na htCBS C15S u odnosu na druge PEG-ove. Samim tim, za 20NHS PEG-htCBS C15S oblik je uočeno da je najpotentniji i najmanje imunogeni oblik raznih ispitanih PEGilovanih htCBS C15S konjugata.
Primer 11. htCBS C15S PEGilovana sa ME-200MA0B, ME-400MA, ili ME-200GS spašava KO miševe od rane smrti
[0230] Ispitivanje preživljavanja je izvedeno kod KO mišjeg modela ovde opisanog radi poređenja efikasnosti sa raznim PEGilovanim htCBS C15S konjugatima.
A. Preživljavanje KO mladunaca do 21/35 dana
[0231] Kaplan-Mejerova kriva preživljavanja je grafički prikazana za KO miševe kojima je tri puta nedeljno ubrizgavano 7.5 mg/kg htCBS C15S PEGilovane sa ME-200MA0B (n=24), ME-400MA (n-31=13F + 18M), ili ME-200GS (n=28=14F 14M), a grupa KO miševa (a=44) kojoj je ubrizgavan PBS kao kontrola. Dojilje su bile na betainskoj vodi, i nakon ablaktacije, mladunci (21. dana) su stavljeni na regularnu vodu bez betaina. Ispitivana je mogućnost ubrizganog enzima da spasava KO mladunce.
[0232] Kao što je prikazano na FIG.11A, 21. dana, samo oko 20% miševa je preživelo u grupi u koja je primala injekcije PBS u odnosu na do oko 92% onih koji su primali injekcije 200MA0B PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200MA) i oko 97% onih koji su primali injekcije 400MA PEG-htCBS C15 (C15S/400MA) ili 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/200GS).
B. Nivoi metabolita nakon vikenda bez primee leka (najmanje koncentracije) i 24 sata nakon poslednje injekcije (pik)
[0233] Nivoi metabolita kod preživljavanja KO miševa starosti od oko 4-5 nedelja su izmereni nakon vikenda bez primene leka (najniže koncentracije) i 24 sata nakon poslednje injekcije (pika) pomoću eksperimentalnog postupka u primeru 1.
[0234] Izmereni nivoi su upoređeni sa nivoima kod slično lečenih zdravih KO /legla kao što je prikazano na FIG.11B. Nivoi Hcy u plazmi kod 400MA PEG-htCBS C15S-lečenih KO miševa su u opsegu 256±8 µM 72 sata nakon doze (ME-400MA) (stubac skroz levo za svaki metabolit) do 145±6 µM 24 sata nakon doze (ME-400MA 24h) (stubac koji je drugi sa leve strane za svaki metabolit). Nivoi Hcy u plazmi kod 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih miševa su bili u opsegu 179±10 µM na 72 sata posle doze (ME-200GS) (treći stubac sa leve strane) do 96±8 µM 24 sati posle doze (ME-200GS 24h) (stubac četvrti sa leve strane). Samim tim, maksimalan odgovor za oba konjugata htCBS C15S je uočen 24 sata posle doze i uočeno je da opada 72 sata posle doze. Uočeno je da lečenje bilo kojim konjugatom značajno (p<0.001) smanjuje nivoe toksičnog Hcy u plazmi za oko pola. Naprotiv, uočeno je da su nivoi homocisteina u plazmi kod lečenih zdravih heterozigotnih legla oko 5 µM u obe vremenske tačke.
[0235] Za nivoe Cth je uočeno da su u opsegu od 57 i 77 µM kod KO miševa lečenih konjugatima htCBS C15S. Ovi nivoi u plazmi su grubo 12-struko veći od onih uočenih kod nelečenih heterozigotnih miševa. Uočeno je da je razlika između pika i najnižih nivoa Cth u plazmi mala, što je dokaz da farmakodinamički efekat enzima u odnosu na nivoe cistationine može da traje ispod 72 sata i/ili Cth se može sporije čistiti iz plazme u poređenju sa drugim metabolitima gde su uočene veće razlike. Uočeno je da su nivoi Cys u plazmi 72 sata posle doze i kod 400MA PEG-htCBS C15S-lečenih i kod 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih KO miševa značajno (p<0.001) sniženi na 83±4 i 106±6 µM u poređenju sa zdravim heterozigotnim leglima (151±6), tim redom. Za nivoe Cys u plazmi je uočeno da se povećavaju kod lečenih miševa 24 sata posle doze za oba konjugata što ukazuje na delimičnu normalizaciju cirkulisanja metabolita sumpora. Za nivoe Cys u plazmi je uočeno da se povećavaju 157±624 sati posle-400MA PEG-htCBS C15S primene i do 176±6 µM 24 sati posle-20NHS PEG-htCBS C15S primene. Nivoi metionina u plazmi su bili blago povišeni kod KO miševa u poređenju sa zdravim heterozigotnim kontrolama i nisu se menjali značajno između najnižih koncentracija i nivoa pikova.
C. Životni ciklus nakon inicijalnog ili kontinuiranog lečenja
[0236] Nakon početnih 35 dana (5 nedelja) dugog lečenje da bi se sprečila neonatalna letalnost KO miševa, pri čemu su KO miševi lečeni sa 20NHS PEG-htCBS C15S podeljeni u dve grupe. Jedna grupa (5W) je prestala da dobija bilo kakvu terapiju izuzev te početne, dok je druga grupa (CONT) nastavila sa istim režimom do uzrasta od 120 dana (7.5 mg/kg, SC, 3x nedeljno).
[0237] Uočeno je preživljavanje ovih grupa KO mladunaca do 4 meseca starosti i grafički je prikazano na FIG.11C. Svi KO miševi kojima je kontinirano davana 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS) su preživeli najmanje 119 dana kao što je prikazano na FIG.11C. Završetak lečenja nakon početnih 35 dana je doveo do oko 85% preživljavanja u uzrastu od 119 dana.
D. Ukupna masa i dobitak mase CBS-lečenih KO miševa u odnosu na /- zdrave miševe
[0238] Ukupna masa i količina dobijene mase KO miševa (mužjaci n=16 i ženke n=11) kojima je tri puta nedeljno primenjivana 20NHS PEG-htCBS C15S u dozi od 7.5 mg/kg su određeni i upoređeni sa slično lečenim /- zdravim leglima (mužjaci n=14 i ženke n=13). Ukupna masa i dobijena masa su izmerene kod miševa nakon ablaktakcije od 21. dana do 36. dana.
[0239] Za heterozigotne mužjake miševa je primećeno da imaju najveću ukupnu masu od 23-35. dana koja je u opsegu od oko 10.5 g do oko 18 g, mada su 20NHS PEG-htCBS C15S-lečeni KO mužjaci imali najveću ukupnu masu 21. dana (oko 10 g).20NHS PEG-htCBS C15S-lečene ženke KO miševa su imale najnižu ukupnu masu nakon 23. dana koja je u opsegu od oko 10 g do oko 14 g.
[0240] Zdrave ženke miševa (n=14) su takođe imale najveću količinu dobijene mase počevši od 23. dana koja je u opsegu od 2 g do oko 9.5 g. Količina dobijene mase kod 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih KO mužjaka miševa (n=16) i 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih KO ženki miševa (n=11) je bila značajno niža od količine dobijene mase za obe kontrolne grupe.
Primer 12. PEGilovana htCBS C15S odlaže, sprečava, i usporava facijalnu alopeciju kod mišjeg modela 1278T
[0241] Za I278T -/- homozigotni mišji model homocistinurije je uočeno da ispoljava osobine specifičnog fenotipa kao što su facijalna alopecija pored uobičajenog profila metabolita, za razliku od drugih mišjih modela sa homocistinurijom. Facijalna alopecija je definisana kao gubitak dlaka sa lica i glave. Početak facijalne alopecije je oko 90 dana (W12), obično se u potpunosti razvija oko 120 dana starosti (W17).
[0242] Facijalna alopecija je hipotetički povezana sa homocistinurijom i odnosnim metaboličkim profilom; stoga, primena enzimske zamenske terapije (ERT; PEG-CBS) bi trebalo da spase ovaj fenotip usporavanjem napretka, sprečavanjem/odlaganjem početka, i/ili usporavanjem već uzrokovanog oštećenja.
A. Odlaganje početka facijalne alopecije
[0243] Miševi starosti 3W koji ne pokazuju bilo koje znake facijalne alopecije su bili podeljeni u 2 grupe. Prva grupa (n=3 mužjaka) je primala injekcije od 7.5 mg/kg tri puta nedeljno sa 200MA0B PEG-htCBS C15S tokom perioda od 6 nedelja. Fizički izgled je zabeležen pre eksperimenta i praćen je na nedeljnom nivou, zatim na dve nedelje nakon režima primanja injekcija od 6W. Provereni su nivoi metabolita pre eksperimenta i 24 sata nakon poslednje injekcije, tj. nakon režima primanja injekcija od 6W.
[0244] Uočeno je da je primena 200MA0B PEG-htCBS C15S tokom perioda od 6 ndelja od uzrasta od 3W dovela do odlaganja facijalne alopecije na FIG.12A. Uočeno je da se I278T oboleli (-/-) ili zdravi (+/-) miševi ne razlikuju u tom uzrastu, a -/- miševi nisu imali znake facijalnog gubitka dlaka. Nije uočeno da nelečeni I278T /- zdravi heterozigotni miševi pate od gubitka facijalnih dlaka na 19W i nešto blagog gubitka dlaka na 34W, za razliku od nelečenih I278T -/- obolelih homozigotnih miševa, za koje je uočeno da imaju u potpunosti razvijenu facijalnu alopeciju do 38W. Obično, facijalna alopecija postaje očigledna na 12W i u potpunosti je razvijena do uzrasta od 17W.
[0245] Uočeno je da primena 200MA0B PEG-htCBS C15S tokom 6 nedelja (uzrast miševa tokom primanja injekcija je bio 4W-10W) odlaže početak alopecije za oko isto vreme kao trajanje lečenja (6 nedelja) kao što su demonstrirali I278T -/- oboleli homozigotni miševi za koje je uočeno da ne pokazuju znake gubitka facijalnih dlaka u uzrastu od 4M a samo početne znake u uzrastu od 7M. Svi rezultati obezbeđuju dokaz da je primena 200MA0B PEG-htCBS C15S tokom 6 nedelja odložila početak facijalne alopecije kod I278T miševa.
B. Ukupna prevencija razvijanja facijalne alopecije
[0246] Druga grupa (n = 3; 2 mužjaci, 1 ženka) je kontinuirano primala injekcije od 7.5 mg/kg 200MA0B PEG-htCBS C15S koje se subkutano daju od 3W do 41 nedelje starosti. Masa je inicijalno praćena na nedeljnom nivou. Fizički izgled je praćen pre eksperimenta i prati se nedeljno ili dvonedeljno nakon početnog režima od 6W. Nivoi metabolita se proveravaju pre eksperimenta i 24 sata posle poslednje injekcije inicijalnog režima davanja injekcija od 6W a zatim je to bilo na nedeljnom ili dvonedeljnom nivou.
[0247] Primećeno je da kontinuirano davanje 200MA0B PEG-htCBS C15S I278T -/homozigotnim miševima u potpunosti sprečava početak i razvoj facijalne alopecije kod miševa primećenih u uzrastu od W19, W24, W31, i W35 kao što je prikazano na FIG.12B. fizički izgledi tako lečenih miševa liče na one koji se uobičajeno primećuju kod zdravih 1278T /heterozigotnih miševa, i značajno se razlikuju od gizičkog izgleda i nelečenih 1278T-/- kontrola i 1278T -/- homozigotnih u uzrastu od W36 i starijim lečenim tokom periodaa od samo 6 nedelja.
[0248] Merenja metabolita na FIG.12C pokazuju da je kontinuirano davanje 200MA0B PEG-htCBS C15S dovelo do značajnog smanjenja nivoa Hcy u odnosu na nivoe pre lečenja (oko 300 µM) i stabilizcije na nivoima od oko 100 µM ukupnog Hcy (srednja linija). Cys nivoi (gornja linija) su normalizovani sa lečenjem (od oko 130 µM do oko 240 µM) i održavani sve vreme na nivoima od oko 230 µM.
C Usporavanje/normalizacija fenotipa kada se facijalna alopecija u potpunosti razvije
[0249] 1278T miševi, koji su bili najmanje stari 120D (W17) i koji su imali vidljivu, u potpunosti razvijenu facijalnu alopeciju, su podeljeni u 2 grupe. Grupa A (n=6; 3 mužjaka i 3 ženke) je primala injekcije 3 puta nedeljno sa 400MA PEG-htCBS C15S, a grupa B (n = 4; 2 mužjaka, 2 ženke) je primala injekcije 3 puta nedeljno sa 20NHS PEG-htCBS C15S do navršene oko 1 godine. Nivoi metabolita su određeni pre početka lečenja i mereni tokom ispitivanja 24 sata nakon injekcije, a masa i fizički izgled se inicijalno prate na nedeljnom nivou, a kasnije na dve nedelje.
[0250] Za usporavanje facijalne alopecije kod 1278T -/- homozigotnih miševa (drugačije poznatih kao normalizacija fenotipa), započeto je lečenje miševa koji već u potpunosti eksprimiraju fenotip facijalne alopecije. Uzrast životinja na početku ispitivanja je bio u opsegu od W24 do W28, što je ispod uobičajenog uzrasta za početak alopecije (120D ili W17).
[0251] Kontinuirana primena ili PEG-CBS konjugata 3 puta nedeljno je značajno poboljšala facijalnu alopeciju kao što je prikazano na FIG.12D, čak i ako se u potpunosti ne normalizuje u odnosu na nelečene neobolele I278T /- heterozigotne kontrole. Za 20NHS PEG-htCBS C15S je uočeno da ima bolji učinak od 400MA PPEG-htCBS C15S zato što sve životinje lečene sa 20NHS PEG-htCBS C15S su reagovale na lečenje (4 od 4), dok je samo 5 od 6 životinja odreagovalo na lečenje sa 400MA PEG-htCBS C15S. Pored toga, subjekativno praćenje obezbeđuje debljinu i sjaj krzna miševa kod onih kod kojih je primenjivan 20NHS PEG-htCBS C15S.
[0252] Dalje, merenja metabolita na FIG.12E pokazuju da, dok su oba PEG-CBS molekula bila efikasna, za 20NHS PEG-htCBS C15S (grupa B) je uočeno da snižava nivoe Hey i da povećava nivoe Cys više suštinski od 400MA PEG-htCBS C15S (grupa A).
D. Zaključci
[0253] 1 Primena PEG-CBS nevezano od PEG grupe je dovela do poboljšanja facijalne alopecije, koja je osobina fenotipa karakteristična za nelečene 1278T -/homozigotne miševe kao što je prethodno pomenuto. Primena ERT tokom 6 nedelja je dovela do odlaganja nastanka facijalne alopecije.
Kontinuirana ERT primena kod miševa pre nastanka facijalne alopecije je u potpunosti sprečila njen razvoj i takve životinje se nisu razlikovale od neobolelih zdravih I278T /- heterozigotnih miševa.
Kontinuirana ERT primena kod miševa sa već razvijenom facijalnom alopecijom je dovela do značajnog poboljšanja njihovog fizičkog izgleda. U svim slučajevima, pozitivan efekat na facijalnu alopeciju je bio praćen ili uzrokovan najmanje delimičnom (Hcy) ili potpunom (Cys) normalizacijom nivoa metabolita u plazmi.
Primer 13.20NHS PEG-htCBS C15S poboljšava bolest jetre kod KO miševa
[0254] Histološka analiza je izvedena za seciranja jetre kod KO miševa kojima je subkutano (SC) ubrizgano 7.5 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S ili PBS tri puta nedeljno od uzrasta od 2 dana i eutanazirani u uzrastu od 17-19 dana i upoređeni sa jetrama istog uzrasta /- zdravih kontrolnih miševa.
A. Svetlosna mikroskopija
[0255] Životinje su žrtvovane 17-19. dana i uzorci jetre su obrađeni zbog histoliške analize optičkom mikroskopijom. Za parenhim jetre PBS-ubrizganih KO miševa, kao što je prikazano na FIG.13A, je uočeno da ima blago nepravilan oblik režnjeva jetre sa umerenom do ozbiljno steatozom, fokalne hepatocelularne nekroze, i resorptivnom zapaljenskom reakcijom, što je označeno strelicom. Za parenhim jetre zdravih heterozigotnih miševa i 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih KO miševa, takođe prikazan na FIG.13A, je uočeno da imaju pravilan oblik jetre i minimalnu anziokariozu.
[0256] Veći detalj koji se dobija većim uvećanjem identičnog seciranja jetre prikazani na FIG.13A su prikazani na FIG.13B sa umecima koji prikazuju Oil Red O bojenja za lipide. Za PBS-ubrizgane KO miševe je uočeno da imaju mikro- i makrovezikularnu steatozu, anizokariozu, fokalne nekroze hepatocita, i resorptivnu zapaljensku reakciju. Ove karakteristike su istaknute strelicama. Za parenhim jetre 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih KO miševa je uočeno da imaju minimalnu anizokariozu, kao što je dokazano jezgrima 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih KO i zdravih heterozigotnih miševa pri čemu i jedni i drugi imaju regularnu veličinu i regularan oblik finog hromatina i neugledna jezgra. Diskretne lipidne kapljice primećene kod citoplazme hepatocita lečenih i zdravih miševa mogu da se detektuju pomoću Oil Red O mrlje (videti umetke na FIG.13B).
B. Elektronska mikroskopija
[0257] Tkivo jetre od zdravog heterozigotnog (+/-) miša, PBS-lečenog KO miša, i 400MA PEG-htCBS C15S-lečenog KO miša je takođe praćeno elektronskom mikroskopijom pri uvećanju od 3000x. Slike slikane elektronskom mikroskopijom su prikazane na FIG.14A. Na FIG.14A, crne strelice označavaju grubi endoplazmatski retikulum (ER), a bele strelice označavaju mitohondriju (MT). Crni gornji delovi strelica označavaju citosolni glikogen, a dvostruke crne zvezdice označavaju jezgra. Bele zvezdice označavaju lipidne kapljice.
[0258] Kod /- miša je uočeno da ima binukleisan hepatocit sa normalnom citoplazmatskom kompozicijom i jezgrima sa normalnom morfologijom. Za cisterne grubog ER je primećeno da su tanke i uredno organizovane, a za MT je primećeno da ima normlanu veličinu i oblik. Za jezgra je uočeno da su pravilna i normohromatska sa neupadljivim jezgrima.
[0259] Za PBS-lečeni KO miš je primećeno da ima steatozu, povišen broj citoplazmatskih organela, nepravilno hiperhromatsko jezgro hepatocita. Za citoplazmu je primećeno da je bogata organelama i da sadrži brojne lipidne kapljice (bele zvezdice) edematoznu MT. Za jezgro je primećeno da ima grub hromatin, nepravilan izgled, i izraženo jezgro.
[0260] Za 400MA PEG-htCBS C15S-lečenog miša je primećeno da ima normalnu citoplazmatsku kompoziciju u hepatocitu i pravilno normohromatsko jezgro. Kao /miš, za cisterne ER je primećeno da su tanke i pravilno organizovane, pri čemu je MT normalnog oblika i veličine, a jezgro izgleda normalno sa finim hromatinom.
[0261] Slike sa elektronske mikroskopije pri uvećanju od 8000x potvrđuju ove nalaze detaljnije, kao što je prikazano na FIG.14B. Na FIG.14B. crne strelice označavaju endoplazmatski retikulum (ER), a bele strelice označavaju mitohondrije (MT). Crne zvezdice označavaju citosolni glikogen. Za 400MA PEG-htCBS C15S-lečene i /- miševe je primečeno da imaju tanke i normalno organizovane grube ER cisterne i regularan MT. Za PBS-lečenog KO miša je primećeno da je bogat cisternama i vezikulama. Za cisterne ER je primećeno da su bogate cisternama i vezikulama. Za ER cisterne je primećeno da imaju varijabilno rastuće širine. Za MT je primećeno da su pleiomorfni i natečeni sa neorganizovanim kristama.
C. Poređenje nivoa metabolita u plazmi i tkiva kod KO miševa, u uzrastu od 18-19 dana
[0262] Metaboliti u plazmi i tkivu su izmereni u grupama miševa divljeg tipa (kontrolnim), kod nelečenih homozigotnih -/- obolelih KO miševa, i 400MA PEG-htCBS C15S-lečenih KO miševa. Lečena grupa je primala subkutane injekcije 400MA PEG-htCBS C15S 3 puta nedeljno u dozi od 7.5 mg/kg od uzrasta od 2 dana. Plazma i tkiva su uzimani 24 sata nakon poslednje injekcije. Tabela 15 prikazuje nivoe Hcy, Cys, Cth, i MEt u plazmi.
[0263] Tabela 16 prikazuje nivoe Hcy,Cys, Cth, i MEt u jetrenom tkivu.
[0264] Tabela 17 prikazuje nivoe Hcy,Cys, Cth, i MEt u bubrežnom tkivu.
[0265] Tabela 18 prikazuje nivoe Cys, Cth, i MEt u moždanom tkivu.
Tabela 18. Nivoi metabolita u moždanom tkivu [nmol/g+SEM]
Primer 14. Efekti kontinuiranog davanja 20NHS PEG-htCBS C15S pomoću ALZET<®>osmotske pumpe kod HO miševa
[0266] ALZET<®>osmotske pumpe obezbeđuje stabilnu, kontrolisanu isporuku 20NHS PEG-htCBS C15S tokom produženog vremenskog perioda kod svežih i naivnih HO miševa. htCBS C15S PEGilovana sa ME-200GS se primenjuje upotrebom četiri različita modela mikro-osmatskih ALZET<®>pumpi, koja se kontinuirano raspodeljuje po zapremini enzima po satu umesto ponovljenih subkutanih injekcija: model 1002 (0.25 µl/h), model 2002 (0.5 µl/h), model 2004 (0.25 µl/h), i model 2006 (0.15 µl/h).
[0267] Za ublažavanje bola, pre- i postoperativno, životinjama se daje TYLENOL<®>(2 mg/ml) u bocama za vodu ad libitum tokom 48 sati pre i posle hirurške intervencije za implantaciju ALZET<®>pumpe. Pored toga, životinje su primale 5 mg/kg karprofena subkutano svaka 24 sata, i tokom 48 sati postoperativno. Za anesteziju tokom hirurške intervencije, 5% izoflurana je primenjeno inhalacijom i održavano je na 2-3% tokom hirurške intervencije. Dok su miševi anestezirani, svaki od njih je dobio medicinsku ALZET<®>osmotsku pumpu implantiranu u sterilnim uslovima u biološki bezbednom ormaru. Pumpe su implantirane subkutano u opuštene površine kože na ventralnoj strani vrata. Pre implantiranja pumpe, miševi su obrijani a površina kože im je pripremljena sa BETADINE<®>. Implantacija pumpe je zahtevala mali hirurški rez (5 mm) je urađen sa sterilnim makazama. Rez je zatvoren klipovima za rane, koji su uklonjeni nakon 1 nedelje kada se koža u potpunosti zaleči. Uzorci krvi su uzeti nakon 1, 3, 6, 9, 12, 15, 19, i 20 dana za pumpe model 1002 i 2002. Modeli 2004 i 2006 pumpe su bili hirurški uklonjeni na kraju označenog životnog veka pumpe (4 i 6 nedelja za model 2004 i 2006, tim redom). Uzimanje uzoraka krvi je samim tim prilagođeno za svaku pumpu: 1, 3, 5, 12, 19, 26, 31, 32, 33, i 36 dana za model 2004 eksplantiran 30. i 1.dana ispitivanja, 3., 5., 12., 19., 26., 33., 40., 45., 46., 47. i 50. dana za model 2006 eksplantiran 44. dana. Uzorci plazme su korišćeni za određivanje CBS dejstva u plazmi i merenje Hey, Cth, i Cys nivoa.
[0268] Enzim primenjen za modele 1002 i 2002 je bio 20NHS PEG-htCBS C15S u koncentraciji od 21 µg/µl i sa specifičnim dejstvom 673.9+13.2 U/mg. U ovim eksperimentima, model 1002 je imao brzinu pumpanja od 0.25±0.01 µl/h tokom perioda od 14 dana, a srednja vrednos zapremine punjenja je bila 110.7±6.5 µl. Brzina davanja enzima je bila 5.25 µg/h enzima, koja je ekvivalentna 126 µg/dan ili oko 3.5 U/h što je jednakno 85 U/dnevno.
[0269] Model 2002 je imao srednju brzinu pumpanja od 0.48±0.02 µl/h za period od 14 dana, a srednja zapremina punjenja je bila 207±7 µl. Brzina davanja je bila 0.5 µg/h enzima, što je ekvivalentno 252 µg/dan ili oko 7 U/h što je jednako 168 U/dan.
[0270] FIG.15A predstavlja grafikon na kojem su upoređeni nivoi Hcy i Cys u plazmi između HO miševa sa implantiranim ili modelom 1002 ili modelom 2002 ALZET<®>osmotske pumpe. Praćeno je preklapanje nivoa metabolita u plazmi obe grupe. FIG.15B predstavlja grafikon na kojem je upoređeno specifično dejstvo 20NHS PEG-htCBS C15S u plazmi nakon kontinuiranog davanja ili sa modelom 1002 ili modelom 2002 ALZET<®>osmotske pumpe. Primećeno je da je CBS dejstvo u plazmi HO miševa kod kojih su implantirane pumpe modela 2002 grubo udvostručeno u poređenju sa miševima kojima je implantiran model 1002. Međutim, dvostruka količina CBS dejstva u plazmi miševa kod kojih je implantirana pumpa modela 2002 je dovela do sličnog poboljšanja metabolita u plazmi kao što je bilo postignuto kod miševa kod kojih je implantirana pumpa Modela 1002 i koji su grubo imali pola CBS dejstva u plazmi u poređenju sa grupom modela 2002.
[0271] Enzim koji je primenjen za Modele 2004 i 2006 je bila ME-200GS PEGilovana htCBS C15S u koncentraciji od 18 µg/µl i koja je imala specifično dejstvo od 623.2+16.4 U/mg. Model 2004 je imao srednju brzinu pumpanja od 0.23+0.01 µl/h za period od 28 dana a srednja zapremina punjenja je bila 237.7+4.6 µl. Brzina davanja enzima je bila 4.5 µg/h enzima, što je ekvivalentno sa 108 µg/dan ili oko 2.8 U/h što je ekvivalentno sa 67 U/dan. Model 2004 ALZET<®>osmotske pumpe je eksplantiran na 30 dana.
[0272] Model 2006 je imao srednju brzinu pumpanja od 0.154-0.01 µl/h tokom perioda od 42 dana, a srednja zapremina punjenja je bila 237,2+3.0 µl. Brzina davanja enzima je bila 2.7 µg/h enzima, što je ekvivalentno 65 µg/dan ili oko 1.7 U/h što je ekvivalentno 40 U/dan. Model 2006 ALZET<®>osmotske pumpe je eksplantiran na 44 dana.
[0273] FIG.15C i FIG.15D prikazuju grafikone na kojima su upoređeni nivoi metabolita i CBS dejstvo, tim redom, u plazmi miševa koji su primali 20NHS PEG-htCBS C15S ili model 2004 ili model 2006 ALZET<®>osmotskih pumpi. Uprkos što model 2004 koji raspodeljuje 67% više enzima od Modela 2006 pumpe, pri čemu je kod obe grupe miševa uočeno da imaju slične profile metabolita u plazmi. Za nivoe Hey u plazmi je primećeno da suštinski smanjuju 20NHS PEG-htCBS C15S-lečene miševe, a opet primećen je samo umereni porast Cys nivoa u plazmi.
Primer 15. Dugoročno kontinuirano davanje 20 NHS PEG-htCBS C15S sprečava osteoporozu kod KO i I278T miševa
[0274] Analizirani su efekti dugoročnog kontinuiranog davanja 20NHS PEG-htCBS C15S kod KO i I278T miševa pomoću dvostruke energetske rentgenske apsorptiometrije (DEXA) pomoću protokola iz primera 1.
A. Mineralizacija kostiju i telesna kompozicija kod KO miševa
[0275] Gustina minerala u kostima (BMD) i sadržaj minerala u kostima (BMC) su analizirani pomoću DEXA za tri grupe miševa: /- zdrave heterozigotne kontrole (n=4M+6F), obolele KO kontrole (n=5M+13F), i 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS)-lečene KO miševe (n=6M+15F).20NHS PEG-htCBS CISS-lečenim miševima je davano 7.5 mg/kg subkutano (SC) tri puta nedeljno od 2. dana do oko 5 meseci. Svi -/- KO miševi su lečeni tokom početnih 5W (uzrasta od 2 do 35 dana) da bi se sprečila neonatalna letalnost.
[0276] FIG.16A, FIG.16B, FIG.16C, FIG.16D. i FIG.16E predstavljaju grafikone na kojima je upoređena BMD (g/cm<2>), BMC (g), ukupna masa (g), telesna masa bez masnog tkiva (g), i sadržaj masti (%), tim redom, među tri grupe miševa. Tabela 19 obezbeđuje P-vrednosti koje se koriste za određivanje značaja za razlike u lečenoj grupi u poređenju sa dve kontrolne grupe.
[0277] P-vrednost od 0.05 je podešena kao donja granica kako bi se odredio značaj. Lečena grupa je imala značajno veći BMD od obe kontrolne grupe. Lečena grupa je takođe imala značajno veću BMC, ukupnu masu, telesnu masu bez masnog tkiva, i sadržaj masti od nokaut kontrole. Samim tim, lečenje KO miševa sa 20NHS PEG-htCBS C15S je u potpunosti sprečavalo duboku osteoporozu i poboljšavalo je telesnu kompoziciju (ukupna masa, telesna masa bez masnog tkiva i sadržaj masti).
B. Metaboliti u plazmi kod KO miševa
[0278] Kod 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih KO miševa, nivoi Hcy,Cth, i Cys u plazmi su mereni na dve nedelje tokom trajanja ispitivanja i prikazani su na FIG.16F. Uzorak krvi je prvo uzet 41. dana (ne predstavlja istinsku vremensku nulu, pre nego nivoe metabolita 72 sata nakon injekcije), zatim na početku 45. dana, uzorak je uziman svake dve nedelje. Primećeno je da se nivo Hcy (srednja linija) smanjivao sa oko 180 µM 45. dana do oko 90 µM 45. dana i ostajao je stabilan na ovim nivoima tokom ispitivanja. Nivo Cys (gornja linija) normalizovan lečenjem sa manje od 100 µM, 45. dana do oko 200 µM, 45. dana i trajao je tokom trajanja ispitivanja. Nivo Cth (donja linija) je oscilirao oko 50 µM tokom trajanja ispitivanja.
[0279] Metaboliti u plazmi su određeni upotrebom istih miševa/grupa kako je prethodno opisano. Krajnji nivoi metabolita Hey, Cth, Cys, i MEt su određeni 24 sata nakon poslednje injekcije 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenim KO miševima (desni stubac za svaki metabolit) i upoređeni sa nelečenim zdravim /-(levi stubac) i obolelim -/- KO miševima (srednji stubac), kao što je prikazano na FIG.16G. Tabela 20 obezbeđuje P-vrednosti korišćene da bi se odredio značaj za razlike u nivoima metabolita u lečenoj grupi u poređenju sa dve kontrolne grupe.
[0280] P-vrednost 0.01 je podešena kao donja granica da bi se odredio značaj. Primećeno je da nivoi Hey značajno opadaju, primećeno je da Cth nivoi značajno rastu, a Cys nivoi su normalizovani kod KO miševa koji primaju 20NHS PEG-htCBS C15S u poređenju sa nelečenim KO miševima. Primećeno je da su nivoi meta blago povišeni kod nelečenih KO miševa, ali ne značajno različiti među grupama.
[0281] Stoga, primećeno je da kontinuirano dugoročno davanje 20NHS PEG-htCBS C15S KO miševima može značajno da poboljša nivoe Hey, Cth, i Cys u plazmi u odnosu na nelečene -/- KO miševe. Nivoi Cys u plazmi su bili normalizovani (tj. ne značajno različiti od) do vrednosti zdravih /- miševa. Primećeno je da su podaci o metabolitima u korelaciji sa određenim fenotipom pomoću DEXA.
C. Mineralizacija kostiju i telesna kompozicija kod I278T miševa
[0282] Gustina minerala u kostima metabolita (BMD) i sadržaj minerala u kostima (BMC) su analizirani pomoću DEXA za tri grupe I278T miševa: /- zdrave heterozigotne kontrole (n=10M+11F), - /- obolele homozigotne 1278T kontrole (n=6M+8F), i 20NHS PEG-htCBS C15S-lečeni I278T miševi (n=6M+6F). 20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS)-lečeni I278T miševi su primali 7.5 mg/kg subkutano (SC) 3 puta nedeljno od uzrasta od 6 meseci do uzrasta od 13 meseci. FIG.17A, FIG.17B, FIG.17C, FIG.17D, i FIG.17E predstavljaju grafikone u poređenju sa BMD (g/cm<2>), BMC (g), ukupnom masom (g), telesnom masom bez masnog tkiva (g), i sadržajem masti (%), tim redom, među tri grupe miševa. Tabela 21 obezbeđuje P-vrednosti koje se koriste za određivanje značaja razlika u lečenoj grupi u odnosu na kontrolne grupe.
[0283] P-vrednost od 0.05 je podešena kao donja granica da bi se odredio značaj. Svi parametri određeni pomoću DEXA značajno smanjili kod obolelih I278T miševa u poređenju sa heterozigotnim miševima. Lečenje I278T miševa sa 20NHS PEG-htCBS C15S je dovela do značajne korelacije svih parametara izuzev količine telesne mase bez masnog tkiva u poređenju sa nelečenim I278T miševima. Zapravo, primećeno je da vrednosti mineralizacije kostiju (BMD) ne mogu da se razlikuju između zdrvih heterozigotnih kontrola i 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih I278T miševa. Samim tim, lečenje I278T miševa sa 20NHS PEG-htCBS C15S je takođe sprečavalo duboku osteoporozu i poboljšavalo telesnu kompoziciju (ukupnu masu, telesnu masu bez masnog tkiva i sadržaj masti).
D. Metaboliti u plazmi kod I278T miševa
[0284] Metaboliti u plazmi su određeni kod istih miševa/grupa kako je prethodno opisano i međusobno upoređeni. Nivoi metabolita Hey, Cth, Cys, i MEt u plazmi su prikazani na FIG.17F. Levi stubac predstavlja nivo metabolita za /- zdrave kontrole, a srednji stubac predstavlja nivo metabolita za -/-obolele kontrole. Nivoi svakog metabolita kod 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih miševa su predstavljeni desnim stupcem. Tabela 22 prikazuje P-vrednosti koje se koriste da bi se odredio značaj zbog razlika u nivoima metabolita u plazmi među /- zdravim kontrolama, -/- obolelim kontrolama, i 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenim I278T miševima.
[0285] P-vrednost 0.01 je bila podešena kao donje granica da bi se odredila značajnost. Za Hey nivoe je primećeno da značajno opadaju, a za Cth nivoe je primećeno da značajno rastu, a Cys nivoi su se značajno poboljšali, ali nisu bili normalizovani kod I278T miševa koji su primali 20NHS PEG-htCBS C15S u odnosu na nelečene obolele I278T kontrole. Nivoi met-a su bili blago povišeni kod nelečenih obolelih I278T miševa i načajno normalizovani do nivoa /- heterozigotnih miševa kod I278T miševa nakon lečenja.
[0286] Ovi rezultati su slični rezultatima u DEXA ispitivanju sa KO miševima, osim što normalizacija Cys nivoa do /- nivoa nije bila uočena kod lečene I278T grupe. Stoga, kontinuirana dugoročna 20NHS PEG-htCBS C15S primena kod I278T miševa je značajno poboljšala nivoe Hey, Cth, Cys, kao i nivo meta-a u plazmi u poređenju sa nelečenim -/homozigotnm obolelim miševima. Za ove podatke o metabolitima je primećeno da potvrđuju fenotip ocenjen putem DEXA.
[0287] Stoga, dugoročno kontinuirano davanje 20NHS PEG-htCBS C15S sprečava osteoporozu i poboljšava kompoziciju kod KO i kod I278T modela miševa, i efikasno poboljšavana nivoe metabolita povezane sa homocistinurijom.
Primer 16. Kontinuirana dugoročna primena 200MA0B PEG-htCBS C15S poboljšava funkciju i metabolizam jetre, smanjuje zapaljenje, i normalizuje lipide u plazmi kod I278T miševa
[0288] Za primenu 200MA0B PEG-htCBS C15S kod 1278T miševa je primećeno da poboljšava metabolizam glukoze u jetri, status redoksa, i potencijal metilacije kao i metabolizam lipida. Za funkciju jetre je primećeno da je nezahvaćena, a za zapaljenske citokine i Iipide u plazmi je primećeno da se normalizuju lečenjem.
A. Efekti dugoročne primene 200MA0B PEG-htCBS C15S na funkciju jetre i metabolizam lipida kod I278T miševa
[0289] Biomarkeri u plazm isu izmereni kod I278T miševa nakon dugoročnog lečenja sa 200MA0B PEG-htCBS C15S da bi se analizirala funckija jetre, zapaljenje, i nivoi lipida u plazmi. Tri grupe 1278T miševa su analizirane: /- zdravi heterozigotni kontrolni (n=3), -/oboleli homozigotni kontrolni (n=3), i 200MA0B PEG-htCBS C15S-lečeni I278T miševi (n=3).200MA0B PEG-htCBS C15S-tMatirani miševi su primali 7.5 mg/kg subkutano (SC) 3 puta nedeljeno od uzrasta od 6 meseci do 13 meseci. Dejstva enzima alanina aminotransferaze (ALT), aspartat aminotransferaze (AST), i alkalin fosfataze (ALP); koncentracije citokina IL-12 (p40), IL-12 (p20), IL-13, G-CSF, MCP-1, i TNF-α; i koncentracije lipida u plazmi (ukupno, HDL i LDL holesteroli, i trigliceridi) su izmereni u plazmi (nisu prikazani rezultati). Za funkciju jetre je primećeno da nije obolela jer su dejstva AST, ALT i ALP u plazmi bila unutar referentnog opsega. Za zapljenske citokine, naročito IL-12 (p40) i IL-13, je bilo primećeno da su povišeni kod netretirtanih I278T miševa i normalizovani kod lečene grupe. Panel lipida u plazmi prikazuje da su nelečeni I278T miševi imali značajno više ukupne, HDL i LDL holesterole, a u isto vreme suštinski snižene trigliceride u odnosu na zdrave /kontrole. Profil lipida je u celosti normalizovan kod 200MA0B PEC-htCBS C15S-lečenih I278T miševa.
B. Efekti dugoročne primene 200MA0B PEG-htCBS C15S na metabolizam jetre kod I278T miševa [0290] Pored goreopisanih biomarkera, metabolomike nuklearne magnetne rezonance (NMR) je izvedena kako bi se analiziralo tkivo jetre istih miševa da bi se ispitao efekat dugoročnog lečenja sa 200MA0B PEG-htCBS C15S na I278T miševe. Metaboliti iz tkiva jetre su ekstrahovani u hidrofilne i lipofilne rastvarače i kvantifikovane odvojeno pomoću NMR.
[0291] Koncentracije glikogena, glukoze, glutationa (GSH), ukupnog glutationa, i MEtil-grupe kod hidrofilne frakcije su prikazani na FIG.18A. Levi stubac predstavlja koncentracije kod /- zdravih kontrola, a srednji stubac predstavlja koncentracije kod -/obolelih kontrola. Koncentracije kod 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih miševa su predstavljeni na desnom stupcu. Za hidrofobne frakcije, ukupne nezasićene masne kiseline (UFA), polinezasićene masne kiseline (PUFA), t-masne kiseline, (CH2)nlipide, i ukupni lipidi su prikazani na FIG.18B. Levi stubac predstavlja koncentracije kod /- zdravih kontrola, I srednji stubac predstavlja koncentracije kod -/- obolelih kontrola. Koncentracije kod 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih miševa su predstavljeni desnim stubcem. Primećeno je da primena 200MA0B PEG-htCBS C15S kod I278T miševa poboljšava metabolizam glukoze u jetri, status redoksa, i potencijal metilacije kao i metabolizam lipida.
Primer 17. Dugoročno lečenje sa 20NHS PEG-htCBS C15S poboljšava očni defekti kod I278-T miševa [0292] Promene u nivoima metabolita u plazmi su izmereni kod I278T (+/-) zdravih heterozigotnih kontrolnih miševa, nelečenih -/- obolelih homozigotnih kontrolnih miševa, i 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih -/- homozigotnih I278T miševa.20NHS PEG-htCBS C15S (C15S/ME-200GS)-lečeni miševi su primali 7.3 mg/kg subkutano (SC) 3 puta nedeljno od uzrasta 2 dana do uzrasta od 4 meseca. Promene nivoa metabolita u plazmi od 6 nedelja do 4 meseca su prikazani na FIG.19A. Nivoi izmereni počevši od 72 sata nakon injekcije budući da su miševi bili na terapiji od uzrasta od 2 dana.
[0293] Kao što je bilo očekivano, nelečena homozigotna I278T kontrola je imala značajno povišen Hey nivo i snižen Cys nivo u poređenju sa zdravim heterozigotnim kontrolama kao što je prikazano na FIG.
19A. Hey nivo kod nelečenih homozigotnih I278T miševa je flukturiao oko 400 µM do 440 µM tokom ispitivanja, što predstavlja dokaz kontinuirane akumulacije Hey usled nedostatka funkcionalne CBS. Kod 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih I278T miševa, Hey nivo se smanjio od 230 µM do oko 70 µM i ovaj nivo je održavan tokom ostatka ispitivanja. Pored toga, dejstvo 20NHS PEG-htCBS C15S je dovelo do akumulacije Cth u plazmi do oko 50 µM tokom ispitivanja i što je još važnije do normalizacije Cys nivoa u plazmi do oko 230 µM, koji se održavao tokom ispitivanja.
[0294] Oči od I278T miševa su analizirane i poređene unutar tri grupe. Zdrava heterozigotna kontrola i nelečena -/- obolela I278T kontrola su upoređene na FIG.198 i FIG.19C. tim redom, pri čemu je kod nelečene homozigotne kontrole primećeno da ima manja i tanja zonularna vlakna, koja su se završila na ekvatoru sočiva tik iznad meridionalnih redova i nisu rasla na posteriornoj površini sočiva. U uzorcima 20NHS PEG-htCBS C15S-lečenih miševa prikazanih na FIG.19D i FIG.19E, primećeno je obogaćenje gustine zonularnih vlakana i znaci "ponovnog rasta" zonularnih vlakana na pozadinskoj površini sočiva. Ove primedbe su dokaz da je dugoročno lečenje sa 20NHS PEG-htCBS C15S imalo pozitivan efekat na očne defekte kod I278T homozigotnih miševa.
Primer 18. Kombinacija davanja 20NHS PEG-htCBS C15S i dijete sa ograničenim unosom Met-a normalizuje Hcy nivoe kod I278T miševa
[0295] Ispitivanje dijete je izvedeno kod I278T miševa i analizirani su. Metaboliti u plazmi kod miševa starosti od 10 nedelja: /- I278T (kontrola), -/- I278T (negativna kontrola), i -/- miševa lečenih sa 20NHS PEG-htPBS (OT-58). Svaka grupa je dalje podeljena u dve podgrupe: jedna na redovnoj ishrani (8.2 g/kg Met TD.01084 dijeta cinkova voda) (REG) i jedna na dijeti sa ograničenim unosom metionina (0.5 g/kg Met TD.110591 dijeta betainska voda) (MRD). Lečenje je započeto u uzrastu od W5.
[0296] FIG.20A prikazuje nivo Hey u 6 grupa. Visoki nivoi Hey (356 µM, koji je konzistentan sa eksperimentima iznad upotrebom I278T miševa) su primećeni kod -/-miševa na REG dijeti. Za nivo Hey je primećeno da je suštinski niži (51 µM) u lečenoj grupi na REG dijeti. Relativno visok nivo Hey (41 µM) je takođe primećen kod - /- miševa na MRD dijeti, koji je normalizovan OT-58 lečenjem (2 µM u odnosu na 4 µM kod /- na MRD).
[0297] FIG.20B prikazuje nivoe Cth kod 6 grupa. Visok nivo Cth je primećen kod -/- OT-58-lečenih miševa na obe dijete, 113 µM za REG u odnosu na 10 µM za MRD dijetu, a nivo je bio viši kod miševa na REG dijeti usled dostupnosti supstrata. Sličan trend između REG u odnosu na MRD dijetu je primećen za preostale grupe, koji je dokaz da visoki nivoi Cth (određenije kod -/- na REG) nastaju od dijete 1.
[0298] FIG.20C prikazuje nivoe Cys kod 6 grupa. Za Cys nivoe je primećeno da suštinski sniženi samo kod -/- miševa na REG dijeti, dok je za MRD dijetu i/ili OT-58 lečenje primećeno da normalizuju nivoe Cys u plazmi.
[0299] FIG.20D prikazuje nivoe met-a kod 6 grupa. Za nivoe met-a u plazmi je primećeno da su visoki (1313 µM) kod -/- miševa na REG dijeti, koji prethodno nisu primećeni kod I278T miševa na standardnoj dijeti. Takav visoki Hesh nivo met-a je prethodno primećen samo kod D17-19 nelečenih CBS KO miševa. Visoki nivoi met-a kod -/- I278T miševa na REG dijeti koji su primali PBS injekcije su verovatno bili rezultat visokog sadržaja met-a kod REG dijete koja se koristi kao kontrolna dijeta u ovom eksperimentu u odnosu na STD dijetu koju obezbeđuje ustanova za životinje.
[0300] Ipak, OT-58 lečenje kod -/- miševa na REG dijeti je primećeno da snižava nivo met-a (201 µM na 66 µM) suštinski, mada nije normalizovalo nivoe. Primećeno je da nivoi met-a kod miševa na MRD dijeti mogu da budu normalni ili niži nego kod normalnih koji prikazuju samo blagi efekat od lečenja.
[0301] Samim tim, primećeno je da kombinacija dijete sa ograničenim unosom met-a i primena 20NHS PEG-htCBS C15S normalizuju nivoe metabolita kod I278T miševa. Istovremena primena 20NHS PEGhtCBS C15S (OT-58) sa nerestriktivnom (ne samo olakšanom) dijetom kod subjekata sa homocistinurijom je dovela do smanjenja Hey na 50 µM.
Primer 19: Farmakokinetika 20NHS PEG-htCBS C15S kod pacova
A. Farmakokinetika pojedinačne doze
[0302] Da bi se ocenila farmakokinetika 20NHS PEG-htCBS C15S kod pacova, pacovima Sprague Dawley divljeg tipa je ubrizgana pojedinačna doza 20NHS PEG-htCBS C15S intravaskularnim (IV) ili subkutanim (SC) putevima. Tri odvojene pojedinačne doze PK ispitivanja su kombinovane upotrebom identičnog ili veoma sličnog dizajna ispitivanja kao što je prikazano u tabeli 23. Dizajn trećeg (ponovljene doze) PK ispitivanja (grupe 7-9) je podešen da bi se omogućila ekstrakcija podataka nakon prve doze i samim tim njihova kombinacija sa PK ispitivanjem pojedinačne doze (grupe 1-6). Plazma je sakupljena u naznačenim vremenima kako je navedeno u tabeli 23 i analizirana zbog CBS dejstva postupcima detaljno opisanim u primeru 1.
[0303] Specifično dejstvo 20NHS PEG-htCBS C15S kod mužjaka i ženki pacova nakon pojedinačne IV ili SC bolus doze od 4 (IV), 8 (SC), i 24 mg/kg (SC) je prikazano na FIG.21A i FIG.21B. Rezultati primene 20NHS PEG-htCBS C15S putem IV injekcije pacovima mužjaka i ženki su bili gotovo u slojevima. Međutim, suštinske razlike su primećene između mužjaka i ženki pacova nakon jedne primene 8 ili 24 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S, SC putem. PK parametri za oba i IV i SC put kod mužjaka i ženki izračunatih na osnovu rezultata na FIG.21A (4 mg/kg IV) i FIG.21B (8 mg/kg i 24 mg/kg SC) su prikazani u tabeli 24. Bioraspoloživost 20NHS PEG-htCBS C15S od SC kod pacova je izuzetno zavisila od pola pri čemu su mužjaci apsorbovali manje (19-21%) od ženki (oko 36%), i bioraspoloživost je bila suštinski niža kod pacova u poređenju sa onim što je primećeno kod HO miševa (52-83%).
B. Farmakokinetika ponovljene doze
[0304] Da bi se dalje procenili pacovi kao vrsta za izvođenje dugoročnih ispitivanja toksičnosti, farmakokinetika 20NHS PEG-htCBS C15S je određena u tri grupe Sprague Dawley pacova koji su primali ukupno 9 SC injekcija svakih 48 sati ili 4 mg/kg (mala), 8 mg/kg (srednja), ili 24 mg/kg (visoka) 20NHS PEG-htCBS C15S. Dizajn ispitivanja je prikazan u tabeli 23. Eksperiment je izveden u trajanju od 24 dana. Plazma je sakupljena i analizirana radi CBS dejstva pomoću postupaka detaljno opisanih u primeru 1.
[0305] Specifična dejstva CBS za ponovljenu dozu PK ispitivanja grafički prikazana tokom vremena su data u vidu primera na srednjoj dozi od 8 mg/kg kao što je prikazano na FIG.21C (slični fenomeni su prikazani za male (4mg/kg) kao i za velike doze (24 mg/kg grupe). Strelice označavaju injekciju. Nije primećena akumulacija CBS dejstva u plazmi, a suštinski pad pika CBS dejstva u plazmi je primećen nakon prvih 6 injekcija. Ova neočekivana nemogućnost pacova da postignu predviđene nivoe stabilnog stanja CBS dejstva u plazmi je primećena da je dublja kod mužjaka nego kod ženki, najverovatnije usled njihove smanjene bioraspoloživosti (videti gornju pojedinačnu dozu PK podataka). Suštinska atenuacija CBS dejstva kod naknadnih primena 20NHS PEG-htCBS C15S je bila vrlo verovatno usled imunološkog odgovora, koji je bio dokaz da pacovi nisu pogodna vrsta za dugoročna ispitivanja toksičnosti.
Primer 20. Farmakokinetika i farmakodinamika 20NHS PEG-htCBS C15S kod majmuna
[0306] Da bi se procenio nehumani model primata za dugoročna ispitivanja toksičnosti i ocenila efikasna doza kod ljudi putem alometrijskog skaliranja, izvedena su farmakokinetička i farmakodinamička ispitivanja 20NHS PEG-htCBS C15S kod cinomolgus majmuna divljeg tipa (Macaca fascicularis).
A. Farmakokinetika i farmakodinamika pojedinačne doze 20NHS PEG-htCBS C15S kod majmuna [0307] Za PK ispitivanje pojedinačne doze, tri eksperimentalne grupe od 4 (n:::2M+2F) majmuna su korišćene da bi se izveli eksperimenti. Prva grupa je primala 2 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S putem IV injekcije. Krv je uzimana na 0, 0.083, 0.16,0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 72, 120, i 192 sati posle IV injekcije. Druga i treća grupa su primale ili 2 mg/kg ili 6 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S putem SC injekcije. Krv je uzimana na 0, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 192,240, i 336 sati posle SC injekcije. Sakupljena plazma je analizirana zbog CBS dejstva i nivoi metabolita(homocistein, cistationin i cistein) su određeni postupcima opisanim u primeru 1.
[0308] Krive specifičnog dejstva CBS tokom vremena kod majmuna posle primanja pojedinačne doze od 2 mg/kg dose IV primene ili doze od 2 mg/kg ili 6 mg/kg SC primene 20NHS PEG-htCBS C15S su prikazane na FIG.22A. Izračunati PK parametri za obe i IV i SC primenu nakon pojedinačne injekcije su ukratko prikazani u tabeli 25. Bioraspoloživost 20NHS PEG-htCBS C15S kod majmuna je izračunata kod majmuna da iznosi približno 80%, što je gotovo identično bioraspoloživosti kod HO miševa kojima je data SC doza od 5 mg/kg (83%). Za poluživot eliminacije 2ONHS PEG-hiCBS C15S iz plazme kod majmuna je izračunato da iznosi 67 sati na osnovu IV skupa podataka i 73 sata na osnovu SC skupa podataka. Izračunato je da Cmaksiznosi 40.8 mU/µL, pri SC dozi od 2 mg/kg i 114.9 mU/µL pri SC dozi od 6 mg/kg.
[0309] U tabeli 25 su navedeni PK parametri dobijeni iz eksperimenata sa pojedinačnom dozom izvedenih sa 20NHS PEG-htCBS C15S kod majmuna.
[0310] Pošto su ubrizgani majmunu bili zdravi, divljeg tipa i prirodno su imali niske nivoe Hey (3-5 µM u poređenju sa 150-500 µM kod homocistinurije mišjih modela), efekat farmakodinamike nakon pojedinačne IV ili SC doze od 20NHS PEG-htCBS C15S nije bio očekivan. Nisu primećene značajne promene nivoa Hey i Cys u plazmi kod ubrizganih majmuna. Međutim, značajni vrhovi Cth8 su primećeni u plazmi nakon IV primene, i 8 i 48 sati posle SC primene u odnosu na početne nivoe, što je predstavljalo dokaz PD efekta čak i kod neobolelih zdravih majmuna (FIG.22B). Vrhovi Cth u nivoima plazme su verovatno poticali od primene 20NHS PEG-htCBS C15S zato što je CBS jedini enzim poznat da obrazuje Cth. Pored toga, CBS enzim normalno ne cirkuliše i funkcioniše u plazmi. Za Cth obrazovan u plazmi datim 20NHS PEG-htCBS C 15S je primećeno da se čisti sporije od Cys ili Hey. Stoga, metaboliti, određenije Cth, su dalje praćeni u višedoznom ispitivanju da bi se odredilo da li je primećeni PD efekat bio izraženiji ili dozno zavisan.
B. Farmakokinetika ponovljene doze i farmakodinamika 20NHS; PEG-htCBS C15S kod majmuna [0311] Eksperimenti sa ponovljenim dozama su izvedeni, pri čemu su tri grupe od 4 majmuna (1M+1F kod glavne podgrupe i 1M+1F kod podgrupa za oporavak) primale ukupno 6 uzastopnih SC doza svaka 72 sata ili 1 mg/kg (mala), 3 mg/kg (srednja), ili 10 mg/kg (visoka) 20NHS PEG-htCBS C15S. Krv je uzimana od majmuna u tri glavne podgrupe na 0, 32, 72, 104, 144, 176, 216, 248, 288, 320, 360, 392, i 408 sati nakon prve injekcije, dok su životinje u podgrupama za oporavak krvarile u dodatnim vremenskim tačkama od 432, 456, 480, 528, i 696 sati nakon prve injekcije. Plazma je uzimana i analizirana zbog CBS dejstva i nivoa sumporne aminokiseline (homocistein, cistationin, cistein, lantionin, i homolantionin) pomoću postupaka opisanih u primeru 1.
[0312] Krive specifičnog dejstva 20NHS PEG-htCBS C 15S tokom vremena za male (I mg/kg), srednje (3 mg/kg) i visoke (10 mg/kg) dozne grupe nakon 6 uzastopnih SC injekcija svaka 3 danasu prikazani na FIG.
23A. Subkutana primena 20NHS PEG-htCBS C15S kod cinomolgus majmuna je dovela do predvidivih i dozno-zavisnih nivoa CBS dejstva u plazmi nakon 6 doza datih svaka 3 dana tokom 16 dana. Nasuprot rezultata PK ispitivanja ponovljene doze kod pacova, nije detektovana atenuacija CBS dejstva nakon ponovljenih davanja 20NHS PEG-htCBS C15S majmunima divljeg tipa. Svaka naknadna primena enzima je dovela do potpuno predvidive akumulacije CBS dejstva u plazmi I suštinski je dostigla nivoe stabilnog stanja nakon prve tri doze. Za dalje doziranje je primećeno da održava stabilno stanje, pri čemu je brzina eliminacije ekvivalentna brzini apsorpcije što dovodi do konstantnog pika i najnižih nivoa u plazmi. Srednja najviša koncentracija plazme u stabilnom stanju (cmaks-) je bila normalizovana za doze koje su u opsegu od 36 do 39 mU/µl a najniži nivoi u plazmi su bili normalizovani u stabilnom stanju (cmin-) koji su u opsegu od 23 do 28 mU/µl. Za brzinu eliminacije 20NHS PEG-htCBS C15S je primećeno da je log-linearna čime se potvrđuje kinetika prvog reda tako da potrebno vreme za smanjenje polovine aktivnosti 20NHS PEG-htCBS C15S u plazmi bilo konstanto (podaci nisu prikazani). Za poluživot eliminacije je procenjeno kod životinja za oporavak nakon poslednje doze 16. dana i bilo je između 49 i 64 sata, tj., slično poluživotu kod majmuna nakon pojedinačne SC doze 20NHS PEG-htCBS C15S (73 sati), koje je predstavljalo dokaz da višestruke doze nisu menjale brzinu eliminacije.
[0313] Nivoi cistationina u plazmi, biomarker za koji je zaključeno da je pokazatelj dejstva 20NHS PEG-htCBS C15S čak i kod neobolelih zdravih majmuna (videti podatke o pojedinačnoj dozi kod majmuna). Rezultati kod majmuna koji su primali 6 injekcija 72 sata osim malih (1 mg/kg), srednjih (3 mg/kg), I visokih (10 mg/kg) doza su prikazani na FIG.23B. Ti nivoi Cth su bili u korelaciji sa pikovima i najnižim nivoima 20NHS PEG-htCBS C15S dejstvo u plazmi i primećeno je takođe da su dozno-zavisni. Nije bilo jasnih razlika između doznih grupa za homocistein i cistein (podaci nisu prikazani).
[0314] Pored cistationina tioetra proizvedenog putem CBS, dva tioetra lantionina i homolantionina, koji su izabrani kao surogat markeri vodoniksulfida, su izmereni u uzorcima plazme majmuna iz ispitivanja ponovljene doze u odabranim vremenskim tačkama. Sumporvodonik je nov i važan signalni molekul u mnogim fiziološkim procesima i samim tim je u velikoj meri ispitan u novije vreme za terapeutske primene.
[0315] Tabela 26 predstavlja nivoe cistationina, lantionina, i homolantionina u plazmi kod majmuna divljeg tipa nakon ponovljenog davanja 20NHS PEG-htCBS C 15S u različitim dozama SC putem.
Prijavljeni su nivoi metabolita na 0 sati (pre doze), 176 sati i 392 sati nakon prve injekcije. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) u µM (n=4).
[0316] Ponovljeno davanje 20NHS PEG-htCBS C15S majmunima divljeg tipa je primećeno da je povećalo nivoe cistationina i lantionina u plazmi, ali nivoi homolantionina nisu bili značajno pogođeni. Za povećanje cistationina i lantionina je primećeno da je direktno proporcionalno dozi, i primećeno je da je dozna zavisnost izraženija za lantionin od cistationina.
C. Ispitivanje LC/MS/MS C15S dejstva
[0317] Bioanalitički postupak razvijen pomoću LC/MS/MS za određivanje cistationina M+4 kao proizvoda CBS dejstva upotrebom cistationina M+8 (<13>C2D6) kao internog standarda je bio razvijen i validiran i za uzorke od majmuna i čoveka i samim tim može da se koristi za određivanje CBS dejstva u uzorcima od farmakokinetičkih i toksikoloških ispitivanja kao kliničkih ispitivanja. Ispitivanje enzima je suštinski izvedeno kao što je opisano u primeru 1 uz sledeće modifikacije, deuterisano D, L-homocistein M+4 je korišćeno kako bi se inicirala reakcija sa neobeleženim L-serinom u reakcionoj mešavini. Nakon inkubacije od 30 min na 37°C, enzimska reakcija je zaustavljena zakišeljavanjem pomoću 6N HCl i obeleženi proizvod reakcije (cistationin M+4) je ekstrahovan pomoću EZ:faast kompleta (Phenomenex, SAD). Ukratko, 50 µl uzorka (kalibracioni standard, QC uzorak ili enzimska reakcija) je pomešana u epruveti na ledu i zaštićena od svetlosti sa 100µl internog standardnog rastvora (cistationin M+8, 0.25 ng/µl) i 250 µl vode. Ta mešavina je ekstrahovana sa MCX kolonama sa kertridžom (Waters). Eluirana podloga (6N aonijak u metanolu) je uparena do suva na 45°C. Suvi ostatak je rastvoren u podlozi eluenta EZ:faast kompleta, derivatiziran i tečno-tečno ekstrahovan prema protokolu proizvođača kompleta. Ekstrakcija čvrste faze je automatizovana sa pločama za ekstrakciju kako bi se povećala propusnost i uštedelo vreme. Koncentracije cistationina M+4 koje mogu da se izmere su primećene nevezano za poreklo enzima (htCBS C15S ili C15S/ME-200GS prisutnog u uzorcima plazme ili kontrolama ili tragovima endogene majmunske/humane CBS u uzorcima plazme). Dosta pažnje je posvećeno opsegu kalibracije budući da su dobijena određivanja bila u većem delu kvalifikovanog koncentracionog opsega (5.00 do 1500 nM).
[0318] Tabele 12-14 u nastavku prikazuju poređenje C15S/ME-200GS specifičnog dejstva određenog putem LC/MS/MS pomoću D,L-homocisteina M+4 kao supstrata i radiometrijskim ispitivanjem pomoću L-[<13>C-U]-serina kao supstrata. Specifično dejstvo enzima je prisutno u mU/µl. "n.d." znači "nije određen". Tabela 27 prikazuje poređenje C15S/ME-200GS specifičnih aktivnosti u skupu uzoraka plazme od cinomolgus majmuna kojem je IV ubrizgana pojedinačna doza od 2 mg/kg.
[0319] Tabela 28 prikazuje poređenje C15S/ME-200GS specifičnih dejstava u skupu uzoraka plazme od cinomolgus majmuna kojem je SC ubrizgana pojedinačna doza od 2 mg/kg.
[0320] Tabela 29 prikazuje poređenje C15S/ME-200GS specifičnih dejstava u skupu uzoraka plazme od cinomolgus majmuna kojem je SC ubrizgana pojedinačna doza od 6 mg/kg (odnosi se na primer 20).
Primer 21. Ekstrapolacija PK/PD podataka sa životinja na ljude
[0321] U većini slučajeva, nivoi leka u plazmi potrebni da bi se dobio farmakodinamički odgovor su različiti u samoj vrsti usled varijacija sekvence specifične za vrst kod receptora ili cilja enzima. Na primer, antitelo protiv humanog proteina može da ima veoma različit afinitet za mišji i humani ciljani protein usled razlika u vrsti kod sekvence ciljanog proteina, u slučaju 20NHS PEG-htCBS C15S, biološki cilj je aminokiselina, Hey, koja je identična u samoj vrsti. Dalje, raspodela leka u ciljanom tkivu može da varira u samoj vrsti i možda se ne može lako predvideti nivoima leka u plazmi usled biološke raspodele specifične za vrstu. Međutim, "ciljano tkivo" za 20NHS PEG/C15S je plazma koja daje visok stepen sigurnosti predviđanju ekstrapoliranih humanih vrednosti od poređenja unutar vrste farmakokinetičkih parametara u plazmi.
[0322] Ova ispitivanja su izvedena kod miševa pomoću SC doze od 7.5 mg/kg, a ispitivanja odgovora na dozu su pokazala da doza od 5 mg/kg maksimalno povećava efikasnsot u smislu modulisanja nivoa biomarkera u plazmi: Hey, Cth i Cys. Upotrebom doze od 5 mg/kg i ispravljanjem razlike u telesnoj površini između ljudi (70 kg) i miševa (0.025 kg), za dozu od 0.4 mg/kg je procenjeno da je efikasna humana ekvivalentna doza (HED). U ovoj dozi, pik nivoi u plazmi su bili 50 mU/µl kod miševa sa AUC od 3060 mU-h/mL. Pošto je supstrat za 20NHS PEG-htCBS C15S dejstvo (Hey i serin) bio isti u vrsti a mesto dejstva je bio sam pul krvi, ovi parametri obezbeđuju tačnu procenu ciljanih nivoa u plazm iljudi potrebnih za efikasnost u 20NHS PEG-htCBS kliničkom ispitivanju.
[0323] Farmakokinetička ispitivanja su izvedena kod mišjih životinjskih modela CBSDH. Normalni pacovi Sprague Dawley , i normalni cinomolgus majmuni posle ili pojedinačne ili više Sc injekcija na raznim doznim nivoima. Pored toga, farmakokinetička ispitivanja pojedinačne doze su izvedena kod sve 3 vrste nakon IV primene 20NHS PEG-htCBS C15S da bi se procenila bioraspoloživost kod sve 3 vrste nakon SC primene. Sažetak farmakokinetičkih parametara bioraspoloživosti (F%) korigovanih za dozu kod modela miša, pacova, i majmuna nakon SC primene su prikazani u tabeli.
[0324] Prema ovim rezultatima, 20NHS PEG-htCBS C15S je polako apsorbovan u krvotoku nakon SC primene kod sve 3 vrste. Poluživot apsorpcije je bio sličan u vrsti u opsegu između 5 i 12 sati kod miševa, između 10 i 16 sati kod pacova, i između 8 i 10 sati kod majmuna posle pojedinačne SC injekcije, što je dovelo do Tmaksvrednosti koja je bila u opsegu između 24 sata i 48 sati kod jedne životinje. Poluživot eliminacije (T1/2) je bio 20 sati kod miševa, 44.5 sati kod pacova, i 73 sati kod majmuna. Procenat 20NHS PEG-htCBS C15S apsorbovane u krvi nakon SC primene (F%) je bio >80% kod oba modela miša (5 mg/kg doza) i majmuna (u dozama od 1, 3 ili 10 mg/kg). Međutim, procenat 20NHS PEG-htCBS C15S apsorbovan u krvi je bio samo 20% kod mužjaka pacova i 36% ženki pacova. U tabeli 30, AUC/doza i Cmaks/doza kod pacova su bile korigovane do 80% bioraspoloživosti (parentetske vrednosti u tabeli 30) kako bi se omogućila poređenja unutar vrste na istom F%.
[0325] Poređenja unutar vrste su izvedena na osnovu skaliranja površine tela pod pretpostavkom da je bioraspoloživost 80% kod sve 3 vrste (miš, pacov i majmun) da bi se odredilo da li je linearna korelacija postojala između loga telesne mase i loga raznih PK parametara (AUC/doza, Cmaks po dozi i T1/2).
Linearna korelacija kod ovih parametara je označavala da su farmakokinetički parametri za 20NHS PEG-htCBS C15S skalirani do površine tela, i da su samim tim humane vrednosti verovatno predvidive.
Linearne korelacije omogućavaju predviđanja kliničke doze i doznog režima iz kliničklih ispitivanja.
[0326] Linearna korelacija je primećena za farmakokinetičke parametre AUC, Cmaks i T1/2u vrsti za 20NHS PEG-htCBS C15S. Kao što je prikazano na FIG.24A (AUC/doza), FIG.24B (Cmaks/doza), i FIG.24C (T1/2), odlična linearna korelacija je primećena između loga telesne mase i svake vrste u odnosu na njihove pridružene PK parametre korigovane za tu dozu. Ekstrapoliranjem loga telesne mase za ljude (70 kg) za svaki parametar su za humane subjekte su izračunate AUC/doza, Cmaks/doza, i T1/2. Predvidive humane vrednosti su obezbeđene u tabeli 30.
[0327] Ekstrapolirani/predviđeni poluživot kod ljudi je bio oko 175 sati ili 7.3 dana. Za predviđenu efikasnu dozu kod ljudi je izračunato (5 mg/kg) alometrijskim skaliranjem da iznosi 0.4 mg/kg kod čoveka od 70 kg. Pomoću predviđene humane Cmaksod 34 mU/µL (po mg/kg) i opsega Tmaksod 48 do 72 sata, hipotetikčka kriva je konstruisana za PK krivu pojedinačne doze kod ljudi, koja je prikazana na FIG.24D. E odsečak je bio 43.079 mg/µL, a poluživot je bio 176.737 sati. Podaci od miševa i majmuna su takođe prikazani u komparativne svrhe na FIG.24D. Tabela 31 obezbeđuje ekstrapolirane koncentracije procenje za ljude.
[0328] Od PK parametara izvedenih iz FIG.24D, PK kriva višestrukih doza je modelovana tako da obuhvata kinetiku prvog reda kod ljudi, koja je prikazana na FIG.24E.
A. PK kriva hipotetičke ponovljene doze kod ljudi
[0329] FIG.24F prikazuje predviđene PK vrednosti za 20NHS PF4-htCBS C15S kod ljudi pri SC dozi od 1 mg/kg koja se daje jednom nedeljno tokom pristupa nivoa u plazmi u stabilnom stanju i predviđene pik i najniže nivoe u stabilnom stanju (svetlo siva). FIG.24G prikazuje predviđene PK vrednosti za 20NHS PEG-htCBS C15S kod ljudi u SC dozi od 1 mg/kg koja se daje dva puta nedeljno tokom pristupa nivoima u plazmi u stabilnom stanju i predviđene pik i najniže nivoe kod ljudi u ovom doznom intervalu (svetlo siva). Tabela 32 upoređuje predviđene pik i najniže nivoe 20NHS PEG-htCBS C15S u plazmi kod ljudi pri SC dozama od 0,33, 0.66, i 1 mg/kg koje se daju jednom nedeljno i dva puta nedeljno (pod pretpostavkom da je bioraspoloživost kod ljudi 80%).
[0330] Iz ovih računanja, doza od 0.66 mg/kg 20NHS PEG-htCBS C15S koja se daje SC humanim pacijentima jednom nedeljno je predviđena da dovede do nivoa u plazmi koji su u opsegu između 31 i 45 mU/µL u stabilnom stanju. Slično tome, za dozu od 0.33 koja se daje dva puta nedeljno se predviđa da dovede do nivoa u plazmi koji su u opsegu između 35 i 41 mU/µL u stabilnom stanju (nakon oko 8 doza). Ova predviđanja podrazumevaju subkutanu bioraspoloživost od 80% kao što je primećeno i kod miševa i kod majmuna. Za ove doze od 20NHS PEG-htCBS C15S se očekuje da proizvedu najviše i najniže nivoe u plazmi u efikasnom opsegu za nivoe u plazmi slične onima kod miševa (najviše vrednosti 50 mU/µL).
Pored toga, ove doze odgovaraju humanoj efikasnoj dozi predviđenoj na osnovu ispitivanja kod miševa samih od 0.4 mg/kg. Linearna korelacija telesne mase i PK parametara kroz pretklinkičke vrste, je omogućila alometrijsko skaliranje (skaliranje telesne površine) kako bi se predvideli PK parametri AUC, Cmaks i poluživot eliminacije kod ljudi poređenjem vrednosti po vrstama.
[0331] Za oba postupka predviđanja efikasne doze kod ljudi (direktno na osnovu podataka o miševima i alometrijskog skaliranja kroz 3 vrste) je primećeno da odgovaraju u smislu predviđanja efikasne doze (HED). Samim tim, pod pretpostavkom da je bioraspoloživost 80%, predložena doza od 0.33 mg/kg koja se primenjuje dva puta dnevno ili 0.66 mg/kg koja se primenjuje jednom nedeljno će verovatno predstavljati efikasne doze u kliničkim ispitivanjima kod ljudi.

Claims (15)

  1. Patentni zahtevi 1. Kompozicija koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske beta sintaze (htCBS) za upotrebu u postupku lečenja homocistinurije kod humanog subjekta, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje kompozicije subjektu, pri čemu je izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan i obuhvata mutaciju cisteina na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3 u serin, i pri čemu se izolovani mutantni polipeptid htCBS daje u dozi između 0.33 i oko 10 mg/kg najmanje jednom nedeljno tokom najmanje šest nedelja.
  2. 2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu: (a) izolovani mutantni polipeptid htCBS je PEGilovan sa najmanje jednim izabranim iz grupe koju čine: ME-200GS, ME-200MA0B, ME-400MA, GL4-400MA, i ME-050GS; (b) PEG predstavlja linearni PEG male molekulske mase; (c) PEG predstavlja razgranati PEG sa četiri kraka velike molekulske mase; (d) doza predstavlja količinu izabranu iz grupe koju čine: 0.33, 0.66, oko 1, oko 2, i oko 5 mg/kg; (e) doza je oko 0.4 mg/kg; (f) izolovani mutantni polipeptid htCBS se daje zajedno sa betainom; (g) betain se daje pre izolovanog mutantnog polipeptida htCBS ; ili (h) mutantni polipeptid htCBS se daje najmanje dva puta nedeljno.
  3. 3. Kompozicija koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske beta sintaze (htCBS) za upotrebu u terapeutskom postupku povećanja cistationina i/ili cisteina kod humanog subjekta sa nedostatkom CBS, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje kompozicije subjektu, pri čemu je pomenuti izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan i obuhvata mutaciju cisteina na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3 u serin, i daje se u dozi između 0.33 i oko 10 mg/kg najmanje jednom nedeljno tokom najmanje šest nedelja.
  4. 4. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 3, pri čemu: (a) izolovani mutantni polipeptid htCBS je PEGilovan sa najmanje jednim izabranim iz grupe koju čine: ME-200GS, ME-200MA0B, ME-400MA, GL4-400MA, i ME-050GS; (b) mutantni polipeptid htCBS se daje najmanje dva puta nedeljno; (c) PEG predstavlja linearni PEG male molekulske mase; (d) PEG predstavlja razgranati PEG sa četiri kraka velike molekulske mase; (e) doza predstavlja količinu izabranu iz grupe koju čine: 0.33, 0.66, oko 1, oko 2, i oko 5 mg/kg; (f) doza je oko 0.4 mg/kg; (g) količina cistationina je povećana do iznad 0.008 µM; (h) izolovani mutantni polipeptid htCBS se daje zajedno sa betainom; ili (i) betain se daje pre davanja izolovanog mutantnog polipeptida htCBS.
  5. 5. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 4, opcija pod (g), pri čemu: (i) količina cistationina je povećana do između 0.005-0.35 µM; (ii) količina cisteina je povećana do iznad 140 µM; ili (iii) količina cisteina je povećana do između 200 µM do 400 µM.
  6. 6. Kompozicija koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske beta sintaze (htCBS) za upotrebu u terapeutskom postupku smanjivanja homocisteina, metionina, i/ili S-adenozil homocisteina kod humanog subjekta sa nedostatkom CBS, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje kompozicije subjektu, pri čemu je pomenuti izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan i obuhvata mutaciju cisteina na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3 u serin, i daje se u dozi između 0.33 i 10 mg/kg najmanje jednom nedeljno tokom najmanje šest nedelja.
  7. 7. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 6, pri čemu: (a) PEG predstavlja linearni PEG male molekulske mase; (b) PEG predstavlja razgranati PEG sa četiri kraka velike molekulske mase; (c) doza predstavlja količinu izabranu iz grupe koju čine: 0.33, 0.66, oko 1, oko 2, i oko 5 mg/kg; (d) doza je oko 0.4 mg/kg; (e) količina homocisteina je manja od 100 µM; (f) izolovana htCBS se daje zajedno sa betainom; ili (g) betain se daje pre izolovanog mutantnog polipeptida htCBS .
  8. 8. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 7, opcija pod (e), pri čemu je količina homocisteina oko 10 µM.
  9. 9. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 7 opcija pod (e), pri čemu je količina metionina manja od 50 µM; pri čemu, opciono: (i) količina metionina je oko 30 µM; ili (ii) količina S-adenozil homocisteina je smanjena do manje od 0.14 µM, poželjno, količina S-adenozil homocisteina je smanjena do oko 0.015 µM.
  10. 10. Kompozicija koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske beta sintaze (htCBS) za upotrebu u postupku lečenja oštećenja parenhima jetre, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje kompozicije humanom subjektu, pri čemu je pomenuti izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan i obuhvata mutaciju cisteina na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3 u serin, i pri čemu se izolovani mutantni polipeptid htCBS daje u dozi između 0.33 i 10 mg/kg najmanje jednom dnevno tokom najmanje šest nedelja.
  11. 11. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu: (a) PEG predstavlja linearni PEG male molekulske mase; (b) PEG predstavlja razgranati PEG sa četiri kraka velike molekulske mase; (c) doza predstavlja količinu izabranu iz grupe koju čine: 0.33, 0.66, oko 1, oko 2, i oko 5 mg/kg; (d) doza je oko 0.4 mg/kg; ili (e) oštećenje parenhima jetre je smanjeno.
  12. 12. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je pomenuti izolovani mutantni polipeptid htCBS PEGilovan sa ME-200GS PEG molekulom.
  13. 13. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 12, pri čemu se ta kompozicija daje u dozi izabranoj iz grupe koju čine: 0.33, 0.66, oko 1, oko 2, i oko 5 mg/kg.
  14. 14. Kompozicija koja obuhvata izolovani mutantni polipeptid humane skraćene cistationinske B sintaze (htCBS) koji obuhvata mutaciju cisteina na aminokiselinskom položaju 15 iz SEQ ID NO: 3 u serin za upotrebu u postupku lečenja najmanje jedne bolesti, poremećaja, ili stanja izabranog iz grupe koju čine osteoporoza, ili poremećaj vezivnog tkiva koji pogađa očni sistem, pri čemu taj postupak obuhvata davanje kompozicije humanom subjektu, pri čemu je pomenuti izolovani polipeptidni mutant htCBS PEGilovan sa ME-200GS PEG molekulom; pri čemu se ta kompozicija daje u dozi izabranoj iz opsega od 0.33 mg/kg do oko 10 mg/kg najmanje jednom nedeljno tokom najmanje šest nedelja.
  15. 15. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu subjekat nije na dijeti sa ograničenim unosom metionina; ili je subjekat na dijeti sa ograničenim unosom metioninina.
RS20220308A 2015-11-09 2016-11-09 Kompozicije i postupci za upotrebu u lečenju homocistinurije RS63070B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/935,690 US9675678B2 (en) 2013-01-29 2015-11-09 Compositions and methods for treatment of homocystinuria
PCT/US2016/061050 WO2017083327A1 (en) 2015-11-09 2016-11-09 Compositions and methods for treatment of homocystinuria
EP16864878.0A EP3373922B1 (en) 2015-11-09 2016-11-09 Compositions and methods for use in the treatment of homocystinuria

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63070B1 true RS63070B1 (sr) 2022-04-29

Family

ID=58696136

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220308A RS63070B1 (sr) 2015-11-09 2016-11-09 Kompozicije i postupci za upotrebu u lečenju homocistinurije
RS20241229A RS66106B1 (sr) 2015-11-09 2016-11-09 Kompozicije i postupci za lečenje homocistinurije

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241229A RS66106B1 (sr) 2015-11-09 2016-11-09 Kompozicije i postupci za lečenje homocistinurije

Country Status (25)

Country Link
US (3) US11077175B2 (sr)
EP (3) EP3998067B1 (sr)
JP (2) JP7009364B2 (sr)
KR (1) KR102819396B1 (sr)
CN (2) CN115920016A (sr)
AU (2) AU2016354030B2 (sr)
BR (1) BR112018007768A2 (sr)
CY (1) CY1125113T1 (sr)
DK (2) DK3998067T3 (sr)
ES (2) ES2909914T3 (sr)
FI (1) FI3998067T3 (sr)
HR (2) HRP20241491T1 (sr)
HU (2) HUE058749T2 (sr)
IL (2) IL302198A (sr)
LT (2) LT3998067T (sr)
MX (1) MX2018005312A (sr)
NZ (1) NZ741552A (sr)
PL (2) PL3373922T3 (sr)
PT (2) PT3998067T (sr)
RS (2) RS63070B1 (sr)
SG (1) SG10201912972SA (sr)
SI (2) SI3373922T1 (sr)
SM (2) SMT202200151T1 (sr)
WO (1) WO2017083327A1 (sr)
ZA (1) ZA201802376B (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9675678B2 (en) 2013-01-29 2017-06-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for treatment of homocystinuria
FI3998067T3 (fi) 2015-11-09 2024-10-31 Univ Colorado Regents Koostumukset ja menetelmät homokystinurian hoitoon
IL269544B2 (en) 2017-04-17 2025-01-01 Univ Colorado Regents Streamlining enzyme replacement therapy for the treatment of high homocysteine
ES3058596T3 (en) * 2019-06-26 2026-03-11 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Pegylated cystathionine beta synthase for enzyme therapy for treatment of homocystinuria
CA3152379A1 (en) * 2019-09-03 2021-03-11 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Cystathionine beta-synthase enzyme therapy for treatment of elevated homocysteine levels

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS555429A (en) * 1978-06-23 1980-01-16 Nissan Motor Co Ltd Pressure regulator for fuel injection type gasoline engine
JPS5576559A (en) 1978-12-01 1980-06-09 Chiyou Lsi Gijutsu Kenkyu Kumiai Electron beam fine adjusting device
US5656425A (en) 1993-08-17 1997-08-12 Regents Of The University Of Colorado Screening for mutations by expressing cDNA segments
US5523225A (en) 1993-09-13 1996-06-04 Regents Of The University Of Colorado DNA sequence encoding human cystathionine β-synthase
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5635375A (en) 1995-01-09 1997-06-03 Regents Of The University Of Colorado Method of increasing the yield and heme saturation of cystathione β-synthase
CA2217696A1 (en) 1995-04-25 1996-10-31 Oridigm Corporation S-adenosyl methionine regulation of metabolic pathways and its use in diagnosis and therapy
US5705151A (en) 1995-05-18 1998-01-06 National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine Gene therapy for T cell regulation
US6153655A (en) 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
EE05214B1 (et) 1998-04-28 2009-10-15 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Polool-IFN- β konjugaat, selle valmistamismeetod ja farmatseutiline kompositsioon
US6174696B1 (en) 1999-11-12 2001-01-16 Genzyme Corporation Method for the determination of homocysteine
WO2001002600A2 (en) 1999-07-06 2001-01-11 General Atomics Detection of analytes using attenuated enzymes
US6653062B1 (en) 2000-07-26 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Preservation and storage medium for biological materials
US20030091543A1 (en) 2001-10-26 2003-05-15 Klein Matthew B. Therapeutic cell preparation grafts and methods of use thereof
AU2003251550A1 (en) 2002-06-17 2003-12-31 The Regents Of The University Of Colorado HUMAN CYSTATHIONINE Beta-SYNTHASE VARIANTS AND METHODS OF PRODU CTION THEREOF
GB0216001D0 (en) 2002-07-10 2002-08-21 Nat Blood Authority Process and composition
EP1396537A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-10 Avidis SA Treatment of elevated plasma homocysteine
CN1863551A (zh) 2003-07-31 2006-11-15 抗癌公司 用于提高在体内的效力的PLP和PEG－rMETase的用途
CN1552905A (zh) 2003-12-18 2004-12-08 中国农业科学院茶叶研究所 一类茶树胱硫醚-γ-合成酶特异表达序列标签及其生物芯片
US8500720B2 (en) 2005-05-09 2013-08-06 Medtronic, Inc Method and apparatus for treatment of cardiac disorders
US20070010492A1 (en) 2005-07-11 2007-01-11 Generale Robert J Composition and method for reducing homocysteine caused by drugs containing methyl compounds
EP1878739A1 (en) 2006-07-14 2008-01-16 LEK Pharmaceuticals D.D. One step IMAC (MCAC) purification of proteins
JP6041454B2 (ja) * 2007-03-15 2016-12-07 株式会社 Ｄｎａセキュリティー研究所 Ｄｎａ含有インク組成物
JP5074146B2 (ja) 2007-03-30 2012-11-14 オリンパス株式会社 カプセル型医療装置
CN101322840A (zh) 2008-05-28 2008-12-17 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 一种人胱硫醚β-合成酶重组蛋白及应用
BR112012004546A8 (pt) 2009-08-29 2017-12-05 Abbott Lab Terapêutica por proteínas ligantes dll4-ligantes
CA2788689C (en) 2010-02-04 2019-07-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Engineered enzymes with methionine-gamma-lyase enzymes and pharmacological preparations thereof
EA201370008A1 (ru) 2010-07-01 2013-06-28 Айсис Инновэйшн Лимитид Лечение когнитивных нарушений
US9034318B2 (en) 2011-08-30 2015-05-19 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Chemically modified cystathionine beta-synthase enzyme for treatment of homocystinuria
US9243239B2 (en) 2012-03-26 2016-01-26 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Purification of cystathionine beta-synthase
US9675678B2 (en) 2013-01-29 2017-06-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for treatment of homocystinuria
WO2015033279A1 (en) * 2013-09-04 2015-03-12 Mahesh Kandula Compositions and methods for the treatment of homocystinuria
US11123436B2 (en) 2015-07-24 2021-09-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method of preparing physiologically active polypeptide conjugate
FI3998067T3 (fi) 2015-11-09 2024-10-31 Univ Colorado Regents Koostumukset ja menetelmät homokystinurian hoitoon
IL269544B2 (en) 2017-04-17 2025-01-01 Univ Colorado Regents Streamlining enzyme replacement therapy for the treatment of high homocysteine
JP7002314B2 (ja) * 2017-12-13 2022-02-10 株式会社ブリヂストン 空気入りタイヤ
ES3058596T3 (en) 2019-06-26 2026-03-11 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Pegylated cystathionine beta synthase for enzyme therapy for treatment of homocystinuria
CA3152379A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Travere Therapeutics Switzerland Gmbh Cystathionine beta-synthase enzyme therapy for treatment of elevated homocysteine levels

Also Published As

Publication number Publication date
ES2909914T3 (es) 2022-05-10
KR20180074703A (ko) 2018-07-03
IL302198A (en) 2023-06-01
BR112018007768A2 (pt) 2018-10-23
SI3998067T1 (sl) 2025-03-31
CN108472277A (zh) 2018-08-31
EP4487914A3 (en) 2025-03-26
CY1125113T1 (el) 2024-02-16
LT3998067T (lt) 2024-11-25
DK3998067T3 (da) 2024-10-28
US20240091325A1 (en) 2024-03-21
EP3373922A4 (en) 2019-05-15
US20200276282A1 (en) 2020-09-03
RS66106B1 (sr) 2024-11-29
IL258487A (en) 2018-05-31
AU2022287540B2 (en) 2025-02-27
SMT202400463T1 (it) 2025-01-14
PL3998067T3 (pl) 2025-01-07
HRP20241491T1 (hr) 2025-01-03
IL258487B1 (en) 2023-05-01
PT3373922T (pt) 2022-03-28
ZA201802376B (en) 2020-11-25
HUE058749T2 (hu) 2022-09-28
HK1258502A1 (en) 2019-11-15
IL258487B2 (en) 2023-09-01
FI3998067T3 (fi) 2024-10-31
EP4487914A2 (en) 2025-01-08
WO2017083327A1 (en) 2017-05-18
EP3998067A1 (en) 2022-05-18
AU2016354030A1 (en) 2018-05-10
SI3373922T1 (sl) 2022-05-31
SG10201912972SA (en) 2020-03-30
EP3373922A1 (en) 2018-09-19
SMT202200151T1 (it) 2022-05-12
KR102819396B1 (ko) 2025-06-12
AU2016354030B2 (en) 2022-09-15
JP2022050589A (ja) 2022-03-30
JP7009364B2 (ja) 2022-02-10
HUE068830T2 (hu) 2025-01-28
JP2018532763A (ja) 2018-11-08
MX2018005312A (es) 2018-08-15
LT3373922T (lt) 2022-04-11
US11771745B2 (en) 2023-10-03
US11077175B2 (en) 2021-08-03
DK3373922T3 (da) 2022-03-28
HRP20220407T1 (hr) 2022-05-27
NZ741552A (en) 2022-04-29
AU2022287540A1 (en) 2023-02-02
CN115920016A (zh) 2023-04-07
PL3373922T3 (pl) 2022-05-02
PT3998067T (pt) 2024-11-04
ES2994256T3 (en) 2025-01-21
JP7482914B2 (ja) 2024-05-14
US20220125896A1 (en) 2022-04-28
EP3998067B1 (en) 2024-09-11
US12194082B2 (en) 2025-01-14
CA3001625A1 (en) 2017-05-18
EP3373922B1 (en) 2022-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10653755B2 (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
JP7482914B2 (ja) ホモシスチン尿症の治療する組成物および方法
JP6976859B2 (ja) ＡｃｔＲＩＩリガンドトラップを用いたβ−サラセミアの治療
JP2023123565A (ja) 治療用組換えクロトータンパク質ならびにそれを含む組成物および方法
RU2770698C2 (ru) Способы лечения кальцификации тканей
EP4649961A2 (en) Methods and compositions for treating anemia using actriib ligand traps and mtor inhibitors
HK40072007A (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
HK40072007B (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
HK1258502B (en) Compositions and methods for treatment of homocystinuria
WO2018204603A1 (en) PROPIONYL-CoA CARBOXYLASE COMPOSITIONS AND USES THEREOF