ES2995333T3 - Phosphorylcholine conjugates and uses thereof - Google Patents

Phosphorylcholine conjugates and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
ES2995333T3
ES2995333T3 ES14749245T ES14749245T ES2995333T3 ES 2995333 T3 ES2995333 T3 ES 2995333T3 ES 14749245 T ES14749245 T ES 14749245T ES 14749245 T ES14749245 T ES 14749245T ES 2995333 T3 ES2995333 T3 ES 2995333T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
carrier
autoimmune disease
disease
tuftsin
mice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14749245T
Other languages
English (en)
Inventor
Yehuda Shoenfeld
Miriam Blank
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tpcera Ltd
Original Assignee
Tpcera Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tpcera Ltd filed Critical Tpcera Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2995333T3 publication Critical patent/ES2995333T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/683—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols
    • A61K31/685—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols one of the hydroxy compounds having nitrogen atoms, e.g. phosphatidylserine, lecithin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/091—Esters of phosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La presente invención proporciona conjugados de fosforilcolina (PC) y composiciones farmacéuticas, en particular vacunas que los comprenden, para la prevención o el tratamiento de enfermedades autoinmunes. En particular, los conjugados de PC de la presente invención son eficaces para prevenir o tratar enfermedades autoinmunes asociadas con inflamación patológica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de fosforilcolina y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a agentes basados en fosforilcolina y composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos para la prevención y el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, particularmente enfermedades autoinmunitarias asociadas con inflamación patológica.
Antecedentes de la invención
En los países occidentales se ha demostrado una fuerte correlación entre la mejora del saneamiento y el aumento significativo de la prevalencia de síndromes autoinmunitarios y autoinflamatorios. Más aún, se informó una correlación entre la presencia de gusanos parásitos (helmintos) en ciertas áreas geográficas y la protección contra enfermedades atópicas, autoinmunitarias y autoinflamatorias. Estos estudios condujeron a la “hipótesis de la higiene”, que postula que el reciente aumento de la incidencia de enfermedades autoinmunitarias en el occidente refleja una ausencia de un cebado adecuado de la respuesta inmunitaria por parte de agentes infecciosos, que incluyen los gusanos parásitos, durante la infancia.
Durante las últimas décadas, muchos estudios informaron que la infección con helmintos parásitos, o el tratamiento sistémico con extractos de helmintos, puede reducir la inflamación asociada con enfermedades autoinmunitarias, tales como la esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide (RA), diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) y la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD).
Aunque dichos estudios fueron exitosos, el uso de patógenos potenciales como agentes terapéuticos ha planteado problemas éticos y de seguridad. Por lo tanto, se ha invertido un esfuerzo considerable en la identificación y caracterización de las moléculas derivadas de responsables de su inmunomodulación.
La molécula inmunomoduladora derivada de nematodos más definida en la actualidad es ES - 62. ES - 62 es una glicoproteína tetramérica (subunidades de 62 kDa) que tiene fracciones de fosforilcolina (PC) adheridas a través de un glicano de tipoN.
Se ha propuesto que la actividad inmunomoduladora de ES - 62 se atribuye a la presencia de las fracciones de PC. Se encontró un apoyo adicional para la actividad inmunomoduladora de PC en otros nematodos parásitos comoAscaris suumque expresan solo la fracción inmunomoduladora de PC.
La Patente de Estados Unidos No. 5,455,032 divulga composiciones útiles para inducir inmunoprotección contra infecciones por organismos patógenos que contienen antígenos de fosfocolina, que incluyenStreptococcus pneumoniaey otros microorganismos que tienen un componente de antígeno de fosfocolina en sus membranas o cápsides. Además, se divulgan vacunas y métodos para inducir la inmunoprotección contra la infección por estos organismos patógenos.
La Patente de Estados Unidos No. 7,067,480 divulga el uso de una glicoproteína que contiene fosforilcolina, particularmente ES - 62, en el tratamiento o profilaxis de enfermedades autoinmunitarias asociadas con inflamación anormal tales como la artritis reumatoide. Hartnett et al. (2008;Ann Rheum Dis;67:518 - 523) describe la función antiinflamatoria de la ES - 62 en la artritis.
La Patente de Estados Unidos No. 8,012,483 divulga un método para identificar sujetos con riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares isquémicas al determinar la presencia de anticuerpos, particularmente anticuerpos IgM, contra la fosforilcolina y divulga además composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado de fosforilcolina, o un anticuerpo con especificidad a un conjugado de fosforilcolina para inmunógenos activos o pasivos en el tratamiento o la prevención de aterosclerosis.
La Solicitud de Patente de Estados Unidos, Publicación No. 2010/0303721, divulga un método para tratar una respuesta inmunitaria excesiva que incluye una respuesta aberrante/mejorada de Th1 con una preparación de parásitos helmínticos. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo 1, lupus eritematoso, sarcoidosis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, rinitis alérgica, pólipos de colon/cáncer de colon y asma.
Sigue siendo necesario desarrollar moléculas pequeñas como inmunógenos seguros y estables, con efectos secundarios adversos mínimos, para tratar enfermedades autoinmunitarias, en particular las enfermedades asociadas con inflamación anormal.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen composiciones de vacunas que comprenden conjugados de fosforilcolina (PC) y usos de los mismos para el tratamiento y/o prevención de enfermedades y trastornos autoinmunitarios, tales como la artritis reumatoide, lupus, esclerosis múltiple y enfermedad inflamatoria intestinal.
La presente invención se basa en parte en el inesperado descubrimiento de que los conjugados PC, tales como PC -tuftsina, exhiben un efecto inhibidor sobre el desarrollo y la progresión del lupus eritematoso sistémico (SLE)in vivo.Otro hallazgo inesperado en el que se basa la presente invención, es que la Pc - tuftsina mejora,in vivo,el desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un conjugado de fosforilcolina que comprende al menos un derivado de fosforilcolina seleccionado del grupo que consiste en: 4 - aminofenilfosfocolina, 4 -diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 - Yodofenil) - dodecilfosfocolina ligada a al menos un portador de tetrapéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
De acuerdo con las reivindicaciones, el al menos un portador es tuftsina.
De acuerdo con algunas realizaciones el conjugado de fosforilcolina comprende un derivado de fosforilcolina ligada al portador.
De acuerdo con algunas realizaciones el conjugado de fosforilcolina comprende una pluralidad de derivados de fosforilcolina ligada al portador.
De acuerdo con algunas realizaciones el conjugado de fosforilcolina comprende una pluralidad de portadores ligados a un derivado de fosforilcolina.
De acuerdo con algunas realizaciones el derivado de fosforilcolina y el portador se separan por un espaciador.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fosforilcolina que comprende al menos un derivado de fosforilcolina seleccionado del grupo que consiste en: 4 -aminofenilfosfocolina, 4 - diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 - Yodofenil) - dodecilfosfocolina ligada a al menos un portador de tetrapéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
De acuerdo con algunas realizaciones dicha composición farmacéutica es una vacuna. De acuerdo con algunas realizaciones dicha composición farmacéutica comprende además un adyuvante. De acuerdo con algunas realizaciones el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en emulsiones agua en aceite, emulsiones de aceite en agua y liposomas.
De acuerdo con algunas realizaciones la presente invención proporciona una composición de vacuna para uso en un método para tratar una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto una composición de vacuna que comprende un conjugado de fosforilcolina que comprende al menos un derivado de fosforilcolina seleccionado del grupo que consiste en: 4 - aminofenilfosfocolina, 4 -diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 - Yodofenil) dodecilfosfocolina ligada a al menos un portador de tetrapéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, modulando de esta manera la respuesta inmunitaria de dicho sujeto hacia un fenotipo antiinflamatorio.
De acuerdo con algunas realizaciones dicho tratamiento comprende al menos uno de prevenir el inicio de dicha enfermedad autoinmunitaria, atenuar el progreso de dicha enfermedad autoinmunitaria e inhibir la progresión de dicha enfermedad autoinmunitaria.
De acuerdo con algunas realizaciones dicho sujeto tiene un alto riesgo de desarrollar dicha enfermedad autoinmunitaria. De acuerdo con algunas realizaciones la enfermedad autoinmunitaria se asocia con inflamación anormal. De acuerdo con algunas realizaciones la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, lupus, esclerosis múltiple, pénfigo vulgar, síndrome antifosfolípido, psoriasis, hepatitis autoinmunitaria, sarcoidosis, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis, enfermedad de Crohn y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
De acuerdo con algunas realizaciones, la composición de la vacuna para uso se administra en una ruta de administración seleccionada del grupo que consiste en intravenosa, intramuscular, oral, sublingual, intramucosa, intraperitoneal, nasal, subcutánea, tópica, intradérmica o transdérmica.
De acuerdo con algunas realizaciones el sujeto es un mamífero. De acuerdo con algunas realizaciones el sujeto es humano.
De acuerdo con algunas realizaciones la enfermedad autoinmunitaria es lupus. De acuerdo con la invención, el portador es tuftsina. De acuerdo con la invención, el conjugado de fosforilcolina comprende fosforilcolina - tuftsina.
De acuerdo con algunas realizaciones la enfermedad autoinmunitaria es colitis. De acuerdo con la invención, el portador es tuftsina. De acuerdo con la invención, el conjugado de fosforilcolina es fosforilcolina - tuftsina.
De acuerdo con algunas realizaciones la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide. De acuerdo con la invención, el portador es tuftsina,. De acuerdo con la invención, el conjugado de PC comprende fosforilcolina - tuftsina. De acuerdo con algunas realizaciones la presente invención proporciona un uso de una composición de vacuna que comprende un conjugado de fosforilcolina que comprende al menos un derivado de fosforilcolina seleccionado del grupo que consiste en: 4 - aminofenilfosfocolina, 4 - diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 -Yodofenil) - dodecilfosfocolina ligada a al menos un portador de tetrapéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 muestra el nivel de anticuerpos anti - PC (en unidades de densidad óptica, O.D., a 405 nm) en los sueros de ratones NZBxNZW/F1 (“ratones con lupus”) tratados con PC - O A (cuadrado; * = p < 0.001), MPC (triángulo; p > 0.05) o PBS (control; diamante).
La FIG. 2 muestra la progresión de la proteinuria en ratones con lupus tratados con PC - OVA (cuadrado), MPC (triángulo) o PBS (control; diamante) como porcentaje de niveles de proteínas de al menos 100 mg/dl (p < 0.02) en la orina.
Las FIGS. 3A- 3B muestran secciones renales de ratones con lupus tratados con PC - OVA sondeados con anticuerpos específicos IgG - FITC Fc anti - ratón (A) teñidos con ácido Peryódico - Schiff (PAS; B)
Las FIGS. 4A - 4B muestran secciones renales de ratones con lupus tratados con MPC sondeados con anticuerpos específicos IgG - FITC Fc anti - ratón (A) teñidos con ácido Peryódico - Schiff (PAS; B).
Las FIGS. 5A - 5C muestran secciones renales de ratones con lupus de control tratados con PBS sondeados con anticuerpos específicos IgG - FITC Fc anti - ratón (A) teñidos con ácido Peryódico - Schiff (PAS; B - C).
La FIG. 6 es un gráfico de Kaplan - Meier que demuestra la supervivencia de ratones con lupus tratados con PC - OVA (triángulo; * = p < 0.01), MPC (cuadrado; p < 0.04) o PBS (control; diamante).
La FIG. 7 muestra el porcentaje de ratones con lupus con proteinuria (nivel de proteína por encima de 100 mg/dl) tratados con PC - tuftsina (TPC) o PBS (control), p < 0.02.
Las FIGS. 8A - 8B muestran secciones de riñón teñidas con PAS de ratones con lupus tratados con PBS (control; A) o PC - tuftsina (B).
Las FIGS. 9A- 9B muestran secciones de riñón de ratones con lupus tratados con PBS (control; A) o PC - tuftsina (B) sondeados con anticuerpos específicos IgG - FITC Fc anti - ratón.
La FIG. 10 muestra los niveles relativos de expresión de ARNm de la citocina antiinflamatoria TGFp(p < 0.001) y la citocina proinflamatoria IFN<y>(p < 0.03; en relación con p - actina) en los esplenocitos de ratones con lupus tratados con PC - tuftsina (TPC) o<p>BS.
La FIG. 11 muestra el nivel de proteínas (en unidades de pg/ml) de las citocinas antiinflamatorias TGFp e I L - 10 y las citocinas proinflamatorias IFN<y>e IL -17 en los esplenocitos de ratones con lupus tratados con PC - tuftsina (TPC) o PBS (control). * = p < 0.001, ** = p < 0.02.
La FIG. 12 muestra el análisis FACS de los niveles de células reguladoras T (Tregs - CD4+, CD25+, FOXP3+) en ratones con lupus tratados con PC - tuftsina (TPC; p < 0.02), fosforilcolina (PC; p < 0.01), tuftsina (T; p < 0.01) o PBS (p < 0.01).
Las FIGS. 13A-13D muestran la progresión a lo largo del tiempo en función de la actividad diaria de la enfermedad (DAI; A; p < 0.02), sangrado rectal (B; p < 0.001), pérdida de peso (en relación con t = 0; C; p < 0.001) y supervivencia (D) en ratones sometidos a la inducción de enfermedad inflamatoria intestinal por DSS (“ratones con iBd ”) tras el tratamiento con PC - tuftsina (círculo vacío) y PBS (círculo sólido).
Las FIGS. 14A- 14B muestran el análisis de cólones (A) y la longitud del colon (B; p < 0.02) en ratones con IBD después del tratamiento con PC - tuftsina (TPC) o PBS.
Las FIGS.15A- 15G muestran secciones de colon teñidas con H&E de ratones con IBD tratados con PBS (control; A, E) o PC - tuftsina (B, F) en comparación con una sección de colon de un ratón no sometido a inducción de IBD por DSS (C, G).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas, que incluyen composiciones de vacunas, que comprenden al menos un conjugado de fosforilcolina (PC) como se define en las reivindicaciones. Las composiciones farmacéuticas de la invención exhiben una actividad inmunomoduladora. De acuerdo con algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas son para tratar, mejorar el progreso y prevenir la aparición de enfermedades autoinmunitarias. De acuerdo con algunas realizaciones, los conjugados de PC de la presente invención se producen sintéticamente para garantizar la estabilidad y reproducibilidad de estos compuestos, al tiempo que mantienen o incluso mejoran su actividad. De acuerdo con algunas realizaciones, los conjugados de Pc son útiles como estimuladores del sistema inmunitario de un sujeto hacia el fenotipo Th2.
Como se utilizan en el presente documento, los términos “inmunomodulación”, “actividad de inmunomodulación”, “actividad inmunomoduladora” o “modulación de la respuesta inmunitaria” con referencia a los conjugados de PC de la presente invención se refieren a la capacidad de los conjugados para provocar al menos uno de los: reducir la capacidad de los linfocitos (tanto B - como T - ) para proliferar en respuesta al antígeno; inducir la generación de células T y/o B reguladoras (supresoras); y afectar a los macrófagos y a las funciones de las células dendríticas. Afectar las funciones de los macrófagos y las células dendríticas incluye, pero no se limita a, estimular la eliminación de las células apoptóticas e inducir células dendríticas tolerogénicas; inhibir la capacidad de los macrófagos para producir citocinas proinflamatorias tales como IL - 12, TNF - a e IL-6; modular la maduración de las células dendríticas para provocar preferentemente respuestas similares a Th2; e inducir a las células del bazo para producir la citocina antiinflamatoria, IL - 10, y sesgar las respuestas de anticuerpos en una dirección Th2/antiinflamatoria. La actividad inmunomoduladora de los conjugados de PC también se puede denominar en el presente documento actividad como “antiinflamatoria”.
El término “conjugado de fosforilcolina (PC)”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una fracción de fosforilcolina ligada a un portador, opcionalmente a través de un espaciador. El elemento estructural fosforilcolina puede comprender un derivado de la fosforilcolina.
Como se utiliza en el presente documento, el término “derivado de fosforilcolina” incluye los siguientes: 4 -aminofenilfosfocolina, 4 - diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 - Yodofenil)dodecilfosfocolina, entre otros. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
El portador puede ser inmunogénico o no inmunogénico.
Como se utiliza en el presente documento, el término “portador inmunogénico” se refiere a una variedad de moléculas o sustancias que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria contra la molécula de PC.
La PC se expresa por un diverso rango de organismos. En la bacteria Gram - positiva,Streptococcus pneumonía,la PC se adhiere directamente a los residuos de azúcar, generalmente considerados como N - acetilgalactosamina. La PC también se ha detectado en un amplio rango de bacterias Gram - positivas, tales comoClostridium, Lactococcus, Bacillusy la bacteria Gram - negativaHaemophilus influenzae.Los organismos eucariotas en los que se ha detectado PC incluyen muchos agentes causantes de enfermedades importantes, tales como los protozoosLeishmania majoryTrypanosoma cruzi;un amplio rango de hongos; el trematodoSchistosoma mansoni;la teniaDiphyllobothrium latum;varios nematodos gastrointestinales y todas las especies de nemátodo filarial. En los humanos, las PC aparecen en la valva interna de una membrana celular y se exponen al sistema inmunitario por las células apoptóticas.
El término “portador no inmunogénico”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una variedad de moléculas o sustancias que no provocan una respuesta inmunitaria.
De acuerdo con la invención, el conjugado de PC es PC -tuftsina.
Como se utiliza en el presente documento, el término “tuftsina” se refiere a un tetrapéptido (treonina - lisina - prolina -arginina, TKPR; SEQ ID NO: 17). La tuftsina se puede sintetizar químicamente o aislar del bazo por escisión enzimática del dominio Fc de la cadena pesada de IgG. La tuftsina es conocida por su actividad estimulante de la fagocitosis y el aumento de la capacidad de presentación de antígenos de los macrófagosin vitroein vivo.De acuerdo con algunas realizaciones, la tuftsina se puede considerar como un adyuvante. Se debe entender que la tuftsina se refiere a tuftsina y derivados de la misma, que incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: treonina - lisina - prolina TKP; TKPXaa; SEQ ID NO: 18), treonina - lisina - prolina - prolina - arginina (TKPPR; SEQ ID NO: 19), serina - lisina - prolina - arginina (SKPR; SEQ ID NO: 20), treonina - arginina - prolina - arginina (TRPR; SEQ ID NO: 21) y serina - lisina - prolina - lisina (SKPK; SEQ ID NO: 22) entre otros.
Ejemplos del efecto de los helmintos parásitos en las enfermedades autoinmunitarias incluyen un estudio en pacientes con colitis ulcerosa activa y enfermedad de Crohn tratados mediante la ingestión de huevos vivos de helmintos de cerdoTrichuris suis.En este estudio, la enfermedad remitió después del consumo de los huevos. Además, empleando modelos autoinmunitario experimentales, se logró una mejoría de la actividad de la enfermedad mediante la administración de helmintos o derivados de helmintos. Además, los estudios con ratones diabéticos no obesos (NOD) mostraron que la inoculación conTrichinella spiralis, Heligmosomoides polygyrusoSchistosoma mansoni,utilizando antígeno de huevo o antígeno de gusano, redujo notablemente la tasa de diabetes mellitus tipo I experimental (T1DM) y suprimió la infiltración linfoide en los islotes del páncreas. Más aún, se logró una mejoría de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) con el tratamiento con helmintos; las infecciones por gusanosSchistosomeprevinieron la colitis, desplazando la respuesta inmunitaria hacia el fenotipo Th2; y las ratas infectadas porSyphacia oblevatadesarrollaron artritis menos grave que las ratas no infectadas. También se encontró que el extracto de los nematodosAscaris suum, Schistosoma mansoniyAcanthocheilonema viteaereduce la gravedad de la artritis inducida por colágeno (CIA) en ratones.
De acuerdo con algunas realizaciones, la presente invención proporciona un conjugado de fosforilcolina (PC) que comprende al menos un derivado de fosforilcolina seleccionado del grupo que consiste en: 4 - aminofenilfosfocolina, 4 - diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 - Yodofenil) - dodecilfosfocolina ligada a al menos un portador de tetrapéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
De acuerdo con algunas realizaciones, el conjugado de fosforilcolina comprende un derivado de PC ligado a un portador.
De acuerdo con otras realizaciones, el conjugado de fosforilcolina comprende una pluralidad de derivados de PC ligados al portador.
De acuerdo con otras realizaciones, el conjugado de fosforilcolina comprende una pluralidad de portadores ligados a único derivado de PC.
De acuerdo con algunas realizaciones, el conjugado de fosforilcolina es el que consiste en al menos un derivado de PC y al menos un portador.
De acuerdo con realizaciones adicionales, el derivado de fosforilcolina y el portador se separan por un espaciador. El término “espaciador”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un elemento de conexión o de conexión puente entre un portador y la fracción de PC, normalmente ligada por métodos químicos o medios biológicos a la misma. Ejemplos no limitantes de espaciadores incluyen: aminoácidos, péptidos, polipéptidos, proteínas, hidrocarburos y polímeros, entre otros. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
De acuerdo con algunas realizaciones, el conjugado de PC comprende PC y un portador, ligados entre sí.
Como se utiliza en el presente documento, el término “ligado” se refiere a adherido, conectado, unido a, en asociación con y acoplado a, entre otros.
De acuerdo con algunas realizaciones, la PC y el portador están ligados a través de un enlace covalente.
De acuerdo con realizaciones adicionales, los conjugados de PC sintéticos de la presente invención se pueden sintetizar como se describe en la sección de Ejemplos a continuación.
De acuerdo con algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de fosforilcolina que comprende al menos un derivado de PC seleccionado del grupo que consiste en: 4 - aminofenilfosfocolina, 4 - diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 - Yodofenil) -dodecilfosfocolina ligada a al menos un portador de tetrapéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 y además que comprenden portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. De acuerdo con otras realizaciones, la composición farmacéutica está en la forma de solución, suspensión, comprimidos, comprimidos masticables, cápsulas, jarabes, aerosoles intranasales, supositorios, parches transdérmicos, entre otros tipos de composiciones farmacéuticas. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
De acuerdo con otras realizaciones, la composición farmacéutica es una formulación de acción prolongada, liberación controlada, liberación prolongada o liberación lenta. Cada posibilidad es una realización separada de la invención. De acuerdo con realizaciones adicionales, la composición farmacéutica es una vacuna. El término “vacuna”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un producto cuya administración está destinada a provocar una respuesta inmunitaria capaz de prevenir y/o disminuir la gravedad de una o más enfermedades o trastornos autoinmunitarios y la inflamación, entre otras enfermedades y trastornos. Cada posibilidad es una realización separada de la invención. De acuerdo con realizaciones adicionales, la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende al menos un conjugado de PC, como se define en las reivindicaciones. La vacuna es eficaz para prevenir, tratar o reducir la progresión de una enfermedad autoinmunitaria. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
Los conjugados de PC de la invención se pueden administrar profilácticamente como vacunas. Las vacunas de la invención contienen como ingrediente activo al menos un conjugado de fosforilcolina, como se define en las reivindicaciones, y un portador. Los portadores útiles farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como la albúmina sérica humana, toxoide tetánico, poliaminoácidos tales como el ácido poli(D - lisina:D - glutámico), gripe, proteína central del virus de la hepatitis B y la vacuna recombinante contra el virus de la hepatitis B. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
Las vacunas también pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (aceptable) como agua, solución salina tamponada con fosfato o solución salina, y además pueden incluir un adyuvante. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
De acuerdo con algunas realizaciones, la vacuna comprende además un adyuvante. El término “adyuvante”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un agente farmacológico y/o inmunológico que modifica el efecto de otros agentes y, específicamente, mejora la respuesta inmunitaria a un antígeno. Los adyuvantes pueden ser productos químicos inorgánicos u orgánicos, macromoléculas o células enteras de ciertas bacterias. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
De acuerdo con algunas realizaciones, el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, liposomas, adyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio y alumbre, entre otros. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para uso en una variedad de sistemas de suministro de fármacos como se detalla a continuación. Los portadores farmacéuticos aceptables adecuados para uso en la presente invención se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985).
De acuerdo con realizaciones adicionales, la presente invención proporciona una composición de vacuna para uso en un método para tratar una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto una composición de vacuna que comprende al menos un conjugado de PC en el que el conjugado de PC comprende al menos un derivado de PC seleccionado del grupo que consiste en: 4 - aminofenilfosfocolina, 4 -diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 - Yodofenil) - dodecilfosfocolina ligada a al menos un portador de tetrapéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, modulando de esta manera la respuesta inmunitaria de dicho sujeto hacia un fenotipo antiinflamatorio. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
De acuerdo con algunas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de una composición de vacuna que comprende un conjugado de fosforilcolina que comprende al menos una fracción de PC o un derivado de la misma seleccionado del grupo que consiste en: 4 - aminofenilfosfocolina, 4 - diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 - Yodofenil) - dodecilfosfocolina y al menos un portador de tetrapéptido que consiste en la SEQ ID NO: 17 para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
Como se utilizan en el presente documento, los términos “tratar” o “tratamiento” son intercambiables y se refieren a uno cualquiera o más de prevenir el inicio de una enfermedad autoinmunitaria, atenuar el progreso de dicha enfermedad autoinmunitaria e inhibir la progresión de una enfermedad autoinmunitaria, entre otros.
De acuerdo con algunas realizaciones, el sujeto en necesidad del mismo es un mamífero. De acuerdo con algunas realizaciones, el sujeto en necesidad del mismo es humano.
De acuerdo con algunas realizaciones, la composición de la vacuna es para uso en un método de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria que puede comprender las etapas de (i) determinar el riesgo de un sujeto para una enfermedad autoinmunitaria; (ii) seleccionar un sujeto que tiene el riesgo de dicha enfermedad; y (iii) tratar dicho sujeto que tiene el riesgo con el conjugado de PC de la invención.
De acuerdo con realizaciones adicionales, la enfermedad autoinmunitaria se asocia con una inflamación anormal. De acuerdo con realizaciones adicionales, la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, lupus, esclerosis múltiple, trastornos autoinmunitarios de la piel que incluyen pénfigo vulgar y psoriasis, síndrome antifosfolípido, hepatitis autoinmunitaria, sarcoidosis, colitis, enfermedad inflamatoria intestinal, que incluye la enfermedad de Crohn y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.
El lupus, o lupus eritematoso, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una categoría para una colección de enfermedades autoinmunitarias sistémicas. Los síntomas de estas enfermedades pueden afectar a muchos sistemas corporales diferentes, que incluyen articulaciones, piel, riñones, células sanguíneas, corazón y los pulmones. Hasta la fecha se conocen cuatro tipos principales de lupus: lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso discoide, lupus eritematoso inducido por fármacos y lupus eritematoso neonatal. De estos, el lupus eritematoso sistémico es la forma más común y grave de lupus. La respuesta inmunitaria anormal permite la producción sostenida de autoanticuerpos patógenos y complejos inmunitarios que causan daños en los distintos tejidos y sistemas. La respuesta inmunitaria anormal probablemente depende de la interacción de múltiples factores hereditarios y ambientales.
De acuerdo con algunas realizaciones, la composición de vacuna es para uso en un método para tratar lupus en el que el portador del conjugado de PC es tuftsina.
De acuerdo con algunas realizaciones, la composición de vacuna es para uso en un método para tratar lupus en el que el conjugado de PC es PC - tuftsina.
Los términos “artritis reumatoide” y “RA”, como se utilizan en el presente documento, son intercambiables y se refieren a una enfermedad crónica que presenta sinovitis inflamatoria persistente, que normalmente involucra articulaciones periféricas en una distribución simétrica. Esta inflamación puede provocar erosiones óseas, daños en el cartílago y destrucción de las articulaciones. Es una afección que afecta a aproximadamente el 1 % de la población. La prevalencia aumenta con la edad, y las mujeres se ven afectadas con mayor frecuencia que los hombres. La propagación de la RA es un evento inmunológicamente mediado por células Th1 CD4+.
De acuerdo con algunas realizaciones, la composición de vacuna es para uso en un método para tratar artritis reumatoide en el que el portador del conjugado de PC es tuftsina.
De acuerdo con algunas realizaciones, la composición de vacuna es para uso en un método para tratar artritis reumatoide en el que el conjugado de PC es PC - tuftsina.
Los términos “esclerosis múltiple” y “MS”, como se utilizan en el presente documento, son intercambiables y normalmente se refieren a un trastorno inflamatorio crónico recurrente y multifocal del sistema nervioso central que conduce a la desmielinización focal y la cicatrización del cerebro. Es una enfermedad frecuente que afecta a unos 350,000 estadounidenses, que se manifiesta durante la adultez temprana y media. La MS es una enfermedad autoinmunitaria mediada, al menos en parte, por células Th1. Las lesiones de la MS se asemejan a las inducidas por respuestas de hipersensibilidad retardadas que contienen células T y macrófagos activados. La encefalomielitis autoinmunitaria experimental, también llamada Encefalomielitis Alérgica Experimental (EAE), es un modelo animal de inflamación cerebral. Es una enfermedad inflamatoria desmielinizante del sistema nervioso central (SNC). Se utiliza principalmente con roedores y se ha estudiado ampliamente como modelo animal de las enfermedades desmielinizantes del SNC humano, que incluyen las enfermedades de esclerosis múltiple y la encefalomielitis aguda diseminada (ADEM). La EAE es también el prototipo de la enfermedad autoinmunitaria mediada por células T en general.
El término “colitis”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una o más de las siguientes enfermedades y trastornos: enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis de derivación, enfermedad de Behcet y colitis indeterminada, entre otras.
Si bien la causa de la IBD sigue sin determinarse, se presume que es el resultado de la desregulación de la mucosa intestinal del sistema inmunitario. Las células inflamatorias de la mucosa normalmente tienen un efecto protector contra los contenidos luminales. Esta inflamación crónica altamente efectiva está estrictamente controlada para limitar la lesión del tejido. La IBD puede ser el resultado de respuestas inmunitarias inapropiadamente vigorosas a factores luminales. La enfermedad de Crohn (CD) parece ser una inflamación de tipo Th demasiado vigorosa que produce IFN<y>y TNFa. La incidencia de la enfermedad de Crohn en las sociedades industrializadas ha aumentado desde la década de 1950 hasta mediados de la década de 1980, y ahora es de aproximadamente 1 a 8 casos por cada 100,000 personas por año. Esto sugiere que cambios desconocidos en nuestro entorno han afectado la frecuencia de la enfermedad de Crohn. La naturaleza de la colitis ulcerosa (UC) está menos definida.
Se presentan varios modelos animales de inflamación intestinal crónica. De hecho, los ratones con supresiones genéticas modificadas genéticamente pueden desarrollar una inflamación intestinal crónica similar a la<i>B<d>. Estos incluyen ratones mutantes que portan supresiones dirigidas para los genes IL - 2, IL -10 y MHC clase II o TCR, entre otros. Se mostró en algunos modelos animales que un sistema inmunitario desregulado puede mediar en sí mismo la lesión intestinal. La inflamación de mucosa en varios modelos animales generan grandes cantidades de IFN<y>y TNFa, lo que sugiere que la producción excesiva de citocinas de tipo Th1 es un mecanismo común que subyace a la patogénesis de la enfermedad. También, el bloqueo de los circuitos Th1 previene la inflamación. La CD es una respuesta Th1. Por lo tanto, estos modelos pueden tener implicaciones directas en la inmunopatología de este proceso de enfermedad humana.
De acuerdo con algunas realizaciones, la composición de vacuna es para uso en un método para tratar colitis en el que el portador del conjugado de PC es tuftsina.
De acuerdo con algunas realizaciones, la composición de vacuna es para uso en un método para tratar colitis en el que el conjugado de PC es PC - tuftsina.
De acuerdo con algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es un trastorno autoinmunitario de la piel. Hay muchos tipos diferentes de trastornos autoinmunitarios relacionados con la piel, que incluyen esclerodermia, psoriasis, dermatomiositis, epidermólisis ampollosa y penfigoide ampolloso. El pénfigo vulgar es una enfermedad crónica de la piel con ampollas con lesiones cutáneas que rara vez son pruriginosas, pero que a menudo son dolorosas. La enfermedad es causada por anticuerpos dirigidos contra la desmogleína 1 y la desmogleína 3 lo que resulta en la pérdida de cohesión entre los queratinocitos en la epidermis. Se caracteriza por extensas ampollas flácidas y erosiones mucocutáneas. La psoriasis se produce cuando el sistema inmunitario confunde las células de la piel con un patógeno y envía señales defectuosas que aceleran el ciclo de crecimiento de las células de la piel. El trastorno es una afección crónica recurrente que varía en gravedad, desde parches localizados en el minar hasta una cobertura corporal completa. Las uñas de las manos y de los pies se ven afectadas con frecuencia (distrofia ungueal psoriásica) y se pueden observar como un síntoma aislado. La psoriasis también puede causar inflamación de las articulaciones, lo que se conoce como artritis psoriásica.
De acuerdo con otras realizaciones, la composición de la vacuna para uso se administra en una ruta de administración seleccionada del grupo que consiste en intravenosa, intramuscular, oral, sublingual, intramucosa, intraperitoneal, nasal, subcutánea, tópica e intradérmica o transdérmica. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.
Por lo tanto, la invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden una solución de los agentes descritos anteriormente disueltos o suspendidos en un portador aceptable, tal como un portador acuoso. Se puede utilizar una variedad de portadores acuosos farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0.4 %, ácido hialurónico glicina al 0.3 % y similares. Estas composiciones se pueden esterilizar por técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas, o se pueden filtrar estérilmente. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para uso tal cual, o liofilizar, la preparación liofilizada se combina con una solución estéril para administración. Las composiciones pueden contener sustancias portadoras farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes ajustadores y amortiguadores del pH, agentes ajustadores de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. Cada posibilidad es una realización separada de la invención.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en estado sólido. Para las composiciones de sólido, se pueden utilizar portadores convencionales no tóxicos farmacéuticamente aceptables que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral en las que el excipiente es sólido, se presentan, por ejemplo, como formulaciones de dosis unitarias tales como bolos, cápsulas o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del conjugado de PC de la invención como compuesto activo. Un comprimido se puede fabricar por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos en forma comprimida se pueden preparar al comprimir en una máquina adecuada el compuesto activo en forma de flujo libre, tal como polvo o gránulos, mezclado opcionalmente con un aglutinante, lubricante, diluyentes inertes, agente lubricante, agente tensioactivo o agente dispersante. Las comprimidos moldeados se pueden elaborar al moldear el compuesto activo con diluyentes líquidos inertes. Los comprimidos pueden estar recubiertos opcionalmente y, si no están recubiertos, se pueden ranurar opcionalmente. Las cápsulas se pueden preparar al llenar las cubiertas de las cápsulas con un compuesto activo, ya sea solo o mezclado con uno o más ingredientes accesorios, y luego sellarlas de la manera habitual. Los sellos son análogos a las cápsulas, en los que un compuesto activo junto con cualquier ingrediente(s) accesorio(s) se sella en un sobre de papel de arroz. Un compuesto activo también se puede formular como gránulos dispersables, que se pueden, por ejemplo, suspender en agua antes de la administración o rociar sobre los alimentos. Los gránulos se pueden envasar, por ejemplo, en una bolsita.
Para la administración de aerosoles, las composiciones farmacéuticas de la invención se suministran, por ejemplo, en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y, opcionalmente, un propulsor como portadores farmacéuticamente aceptables. El tensioactivo debe, por supuesto, no ser tóxico y preferiblemente soluble en el propulsor. Representativos de dichos agentes son los ésteres o ésteres parciales de los ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Cada posibilidad es una realización separada de la invención. Se pueden emplear ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. También se puede incluir un portador, según se desee, como con, por ejemplo, lecitina para el suministro intranasal.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en forma de liposoma. Los liposomas proporcionan otro sistema de suministro para el suministro y presentación de las moléculas inmunomoduladoras de la invención. Los liposomas son vesículas bicapa compuestas de fosfolípidos y otros esteroles que rodean un centro normalmente acuoso donde se puede encapsular el conjugado de PC u otros productos. La estructura del liposoma es muy versátil, con muchos tipos que van desde tamaños nanométricos hasta micrómetros, desde aproximadamente 25 nm hasta aproximadamente 500 pm. Se ha encontrado que los liposomas son eficaces para suministrar agentes terapéuticos a las superficies de dermis y de mucosas. Los liposomas se pueden modificar aún más para suministro dirigido, por ejemplo, mediante la incorporación de anticuerpos específicos en la membrana superficial. El tiempo promedio de supervivencia o la vida media de la estructura intacta del liposoma se puede prolongar con la inclusión de ciertos polímeros, tales como el polietilenglicol, lo que permite una liberación prolongadain vivo.Los liposomas pueden ser unilamelares o multilaminares.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en forma de micropartículas y nanopartículas. Las micropartículas y nanopartículas emplean pequeñas esferas biodegradables que actúan como depósitos para el suministro de vacunas. La principal ventaja que poseen las microesferas poliméricas sobre otros adyuvantes que afectan al depósito es que son extremadamente seguras y han sido aprobadas por la Administración de Alimentos y Fármacos de los EE. UU. para uso en medicina humana como suturas adecuadas y para uso como suministro de fármacos biodegradables. Las tasas de hidrólisis de copolímeros están muy bien caracterizadas, lo que a su vez permite la fabricación de micropartículas con liberación sostenida de los inmunomoduladores durante períodos prolongados de tiempo.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por vía parenteral como micropartículas. Las micropartículas provocan una inmunidad duradera, especialmente si incorporan características de liberación prolongada. La tasa de liberación se puede modular por la mezcla de polímeros y sus pesos moleculares relativos, que se hidrolizarán durante períodos de tiempo variables. Sin querer limitarse a la teoría, la formulación de partículas de diferentes tamaños (de 1 pm a 200 pm) también puede contribuir a respuestas inmunológicas duraderas, ya que las partículas grandes se deben descomponer en partículas más pequeñas para que estén disponibles para la absorción de macrófagos. De esta manera, se podría desarrollar una vacuna de una sola inyección al integrar varios tamaños de partículas, prolongando de esta manera la presentación conjugada de PC.
Las composiciones de vacunas que contienen los conjugados de PC de la invención se administran a un paciente para provocar la modulación de la respuesta inmunitaria del sujeto hacia la actividad antiinflamatoria como se define en el presente documento. Una cantidad suficiente para lograr la actividad terapéutica deseada se define como una “dosis efectiva inmunomoduladora”. Las cantidades efectivas para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición del conjugado de PC, la forma de administración, el peso y el estado general de salud del paciente, así como del criterio del médico prescriptor.
Los conjugados de PC de la presente invención se pueden utilizar en una vacuna farmacéutica que comprende los conjugados de PC y los portadores farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones son adecuadas para una sola administración o para una serie de administraciones (esquemas de vacunación). Cuando se proporcionan en serie, las inoculaciones posteriores a la administración inicial se suministran para reforzar la respuesta inmunitaria y, normalmente, se denominan inoculaciones de refuerzo.
Cuando una programación de vacunación requiere dos o más dosificaciones separadas, es necesario considerar los intervalos entre dosis. El intervalo entre dos dosis sucesivas puede ser el mismo o puede cambiar a lo largo del programa. De acuerdo con ciertas realizaciones, la programación de inmunización comprende además la reexposición del sujeto a la vacuna que comprende el conjugado de PC de la presente invención (dosis de refuerzo). Como es sabido por los expertos en la técnica, existe una variedad de combinaciones y subcombinaciones posibles de las diversas condiciones preferidas de temporización de la primera administración, el intervalo más corto, el intervalo más grande y el número total de administraciones (en términos absolutos, o dentro de un período establecido). Se debe entender que todas estas combinaciones y subcombinaciones están dentro de las enseñanzas de la presente invención.
Aunque no forma parte de la presente invención, también se describe en el presente documento un kit para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria que comprende uno o más recipientes llenos de la composición de vacuna que comprende un conjugado de fosforicolina que comprende al menos una fracción de PC o un derivado de la misma y al menos un portador seleccionado del grupo que consiste en un polímero, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, un péptido, un polipéptido y un lípido. Opcionalmente, asociado con dicho(s) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma descrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyo aviso refleja la aprobación por parte de la agencia de fabricación, uso o venta para la administración a humanos.
Aunque no forma parte de la presente invención, también se describe en el presente documento un kit para el tratamiento de una enfermedad o trastorno autoinmunitario, el kit comprende un primer recipiente que comprende un conjugado de fosforicolina que comprende al menos una fracción de PC o un derivado de la misma y al menos un portador seleccionado del grupo que consiste en un polímero, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, un péptido, un polipéptido y un lípido; un segundo recipiente que comprenda portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables; y, opcionalmente, un tercer recipiente compuesto por un adyuvante. El kit podrá comprender, además, un protocolo para la preparación de una vacuna a partir de los contenidos de dicho primer y segundo recipiente y, opcionalmente, también del contenido de dicho tercer recipiente.
Los conjugados de PC de la invención son útiles en vacunas y en protocolos de inmunización para la prevención, tratamiento y progresión de enfermedades autoinmunitarias, particularmente enfermedades inflamatorias.
De acuerdo con algunas realizaciones, los conjugados de PC de la presente invención, cuando se administran a un mamífero, provocan la actividad de inmunomodulación del mamífero. Una variedad de modelos conocidos por los expertos en la materia pueden utilizarse para establecer la capacidad de inmunomodulación de los conjugados de la invención. Los cultivos celulares se pueden utilizar para probar el efecto de los conjugados de PC sobre la proliferación celular, el perfil de citocinas, el desarrollo de células dendríticas tolerogénicas y el desarrollo de células T reguladoras. Por ejemplo, se pueden utilizar kits comerciales para el seguimiento de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias, que incluyen, pero no se limitan a, IL -1 , IL - 2, IFN<y>, IL - 4, IL -10, IL -15, IL -17 y TNFa. Los modelos animales, tal como son conocidos por un experto en la técnica y como se ejemplifica a continuación, se pueden utilizar para probar la actividad de los conjugados de PC de la invención en el tratamiento, prevención o reducción de la progresión de enfermedades autoinmunitarias.
De acuerdo con algunas realizaciones, la capacidad de inmunomodulación de los conjugados de PC de la presente invención se ejemplifica a continuación en modelos animales de enfermedades autoinmunitarias, que incluyen artritis inducida por colágeno (CIA), colitis y lupus eritematoso sistémico (SLE).
Los ejemplos a continuación se presentan en detalle para ilustrar más plenamente algunas realizaciones de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: El efecto de los conjugados de PC en el desarrollo del lupus eritematoso sistémico (SLE) (solo como referencia)
Los fosfolípidos no son inmunogénicos. Por lo tanto, la fosforilcolina (PC) se utiliza comúnmente como conjugado para diferentes portadores. Los portadores pueden servir como adyuvantes. Se utilizaron los siguientes conjugados de PC: PC - Ovoalbúmina (PC - OVA) y 2 - metacriloiloxietil - PC (<m>P<c>).
PC - OVA se adquirió de Biosearch Technologies, Inc.
En MPC, la PC aparece como una fracción en los helmintos. Específicamente, MPC es la fracción de PC en un núcleo de polímero (2 - metacriloiloxietilo) definido como MPC. MPC se adquirió de NOF Inc.
Se estudió el potencial de los conjugados de PC para inmunomodular el lupus en ratones NZBxNZW/F1 que desarrollan lupus en un contexto genético.
Ratones: se obtuvieron ratones hembra NZBxNZW/F1 de Harlan Olac y se suministraron por el Jackson Laboratory (Bar Harbar, EE. UU.) a la edad de 8 - 10 semanas. Los ratones se mantuvieron en las instalaciones de animales de Sheba, en el Sheba Medical Center, Israel. Todos los animales fueron atendidos según lo aprobado por el Comité de Revisión Ética del Ministerio de Salud y Ciencias de Israel.
La manifestación serológica y clínica de la nefritis lúpica en ratones NZBxNZW/F1 se evaluó como se describió anteriormente (Shoenfeld Y et al., Int Immunol. 2002, 14(11): 1303 - 1311). En resumen, los anticuerpos específicos para PC se midieron mediante ELISA como se describe a continuación. Los anticuerpos específicos para el ADNdc se detectaron mediante ELISA, como se describió anteriormente (Shoenfeld et al., 2002,ibid).La proteinuria se midió mediante una prueba semicuantitativa estándar utilizando un kit Albustix (Bayer Diagnostic). Los depósitos de inmunocomplejos renales (ICD) se determinaron como se describió anteriormente (Shoenfeld et al., 2002,ibid).La intensidad del ICD se clasificó de la siguiente manera: 0, sin ICD; 1, baja intensidad; 2, intensidad moderada; y 3, alta intensidad de ICD. El análisis de ICD ser realizó por dos sujetos que desconocían si cada ratón era un ratón de tratamiento o un ratón de control.
Los resultados demuestran el efecto inhibidor de los tratamientos con PC - OVA y MPC en el desarrollo de nefritis lúpica en ratones con lupus NZBxNZW/F1. El efecto inhibidor se manifestó por proteinuria pospuesta y disminución de los depósitos de complejos inmunitarios en la membrana basal glomerular. Los resultados se basan en el tratamiento en una estadio temprano de la enfermedad a partir de la semana 8 de edad. PC - OVA, MPC o PBS se proporcionaron 3 veces por semana 3 pg/0.1 ml por ratón por vía subcutánea, n =20 por grupo. Los ratones se sangraron cada 2 semanas para medición de los anticuerpos específicos de PC y ADNdc. La proteinuria se evaluó cada 2 semanas.
El tratamiento con conjugado de PC - OVA (Fig. 1, cuadrados) fue inmunogénico y los ratones desarrollaron títulos elevados de anticuerpos anti - PC (p < 0.001) en comparación con el grupo tratado con PBS (Fig. 1, diamantes) y MPC (Fig. 1, triángulos), mientras que el MPC (poli PC en núcleo polimérico) no fue inmunogénico y no causó generación de anticuerpos anti - PC (p > 0.05). Los datos de los anticuerpos anti - PC se presentan con una dilución de sueros de 1:400. Los resultados se dan como O.D. a 405 nm. La presencia de anticuerpos específicos de PC en los sueros de ratones se detectó mediante ELISA a PC - KLH (PC - Hemocianina de lapa californiana), donde la unión a KLH sirvió como una referencia de control. No se observó ninguna respuesta a KLH. PC - OVA y MPC no tuvieron ningún efecto sobre la generación de anticuerpos anti - ADNdc en todos los puntos de tiempo (datos no mostrados).
No se documentó ningún efecto del tratamiento con PC - OVA y MPC en la generación de anticuerpos anti - ADNdc, como se ilustra en la Figura 1.
La proteinuria (definida como al menos 100 mg/dl de proteína en la orina) en ratones con lupus tratados con PC - OVA (Fig. 2, cuadrado) o MPC (Fig. 2, triángulo) se pospuso significativamente (p < 0.02) en comparación con el tratamiento con PBS (Fig. 2, diamante) a las 30 a 33 semanas de edad.
Se analizaron secciones de riñón de ratones con lupus tratados con PC - OVA (Figs. 3A - 3B), MPC (Figs. 4A - 4B) y PBS (Figs. 5A- 5C) para glomerulonefritis. Se aplicaron dos procedimientos de tinción (i) tinción histológica (PAS); y (ii) tinción inmunohistológica de depósitos de complejos inmunitarios en el mesangio del riñón utilizando conjugado Fc - FITC anti - ratón. Como se ilustra en las Figuras 5A- 5C, los ratones tratados con PBS mostraron glomerulonefritis grave (estadio VI) ejemplificada por fuertes depósitos de inmunocomplejos (5A), glomerulonefritis proliferativa difusa (5B) y glomerulonefritis necrotizante en forma de media luna (5C). Sin embargo, en el mismo punto de tiempo de las 34 semanas, los ratones con lupus tratados con MPC (Figs. 4A - 4B) y PC - OVA (Figs. 3A - 3<b>), exhibieron solo un estadio temprano (estadio II) de glomerulonefritis.
Un análisis de Kaplan - Meier indica que el tiempo de supervivencia de los ratones con lupus tratados con PC - OVA (Fig. 6, triángulo) fue significativamente mayor (Fig. 6 * = p < 0.01) en comparación con los ratones tratados con PBS (Fig. 6, diamante). El tiempo de supervivencia de los ratones tratados con MPC (Fig. 6, cuadrado) mostró solo tendencia a la significación (p < 0.04).
Ejemplo 2: El efecto de la PC -tuftsina en el desarrollo de proteinuria in vivo
Los fosfolípidos no son inmunogénicos, por lo tanto, la PC se conjugó con PC - tuftsina, que puede servir como adyuvante.
PC - Tuftsina: Tuftsina es un tetrapéptido (treonina - lisina - prolina - arginina, TKPR; SEQ ID NO: 17). En modelos autoinmunitarios tales como EAE y lupus tuvo un efecto inhibidor sobre la progresión de la enfermedad (Dagan S et al., J Biol Response Mod. 1987, 6(6):625 - 636). La PC conjugada con tuftsina se sintetiza en base a la química de Michaelson. El derivado de PC, 4 - aminofenilfosforilcolina, utilizado para la construcción del conjugado, se adquirió de Biosearch Technologies.
El efecto de la PC - tuftsina sobre la proteinuria se determinó en un modelo de ratón para lupus, específicamente, ratones hembra NZBXW/F1 que desarrollan lupus en un contexto genético. Los niveles de proteinuria se midieron utilizando Multistix (Bayer Diagnostics). Este tipo de medición se utiliza normalmente en la clínica para evaluar la manifestación de la nefritis lúpica. La nefritis lúpica es una inflamación del riñón causada por el lupus eritematoso sistémico (SLE).
Los ratones, a partir de las 14 semanas de edad, recibieron por vía subcutánea PC - tuftsina a una concentración de 50 jg/0.1 ml por ratón (tratamiento; n = 10) o PBS (control; n = 10), tres veces por semana. La proteinuria se definió como tener un nivel de proteína superior a 100 mg/dl en la orina.
Los resultados demuestran el efecto inhibidor del tratamiento con PC - tuftsina sobre el desarrollo de glomerulonefritis. Como se muestra en la Figura 7, se exhibió una atenuación significativa (p < 0.02) en proteinuria en el grupo de ratones tratados con PC - tuftsina (TPC) en comparación con el grupo control, es decir, ratones que recibieron solo el portador (PBS).
Ejemplo 3: El efecto de la PC - tuftsina sobre la morfología de los riñones in vivo
El efecto de la PC - tuftsina sobre la morfología de los riñones se determinó en un modelo de ratón con lupus como en el Ejemplo 2. La sección de riñón obtenida de riñones de ratones sacrificados después de los tratamientos que se incorporaron en parafina. Se utilizó la tinción de PAS para detectar la patología de la nefritis. La tinción con inmunofluorescencia se utilizó para detectar depósitos de complejos inmunitarios. Este último se implementó al incubar las secciones incorporadas en parafina con IgG anti - ratón conjugada con FITC. La evaluación fue realizada por un patólogo.
Los ratones, a partir de las 14 semanas de edad, recibieron por vía subcutánea PC - tuftsina a una concentración de 50 |jg/0.1 ml por ratón (tratamiento; n = 10) o PBS (control; n = 10), tres veces por semana.
Los resultados demuestran un efecto inhibidor significativo de la PC - tuftsina sobre el desarrollo de glomerulonefritis. Específicamente, como se ilustra en las Figuras 8A - 8B, los ratones tratados con PC - tuftsina no mostraron ninguna patología de nefritis, se ejemplifica un glomérulo normal (Figura 8B; x60). Mientras que el grupo control, es decir, ratones que recibieron solo el portador (PBS), presentó una glomerulonefritis grave, fuerte destrucción de los glomérulos, así como infiltración de linfocitos (Figura 8A; x60).
Como se muestra en las Figuras 9A- 9B, en ratones con lupus tratados con PC - tuftsina, se exhibieron depósitos de inmunocomplejos muy leves en los glomérulos (Figura 9B; x40) en comparación con el grupo control (PBS), que presenta depósitos severos de inmunocomplejos (Figura 9A; x20).
Ejemplo 4: El efecto de la PC - tuftsina en el sistema inmunitario in vivo
El efecto de la PC - tuftsina en el sistema inmunitario se determinó en el modelo de ratón con lupus como en el Ejemplo 2. Se midieron los análisis de citocinas y el perfil de células T reguladoras; este tipo de estudios se utilizan normalmente en la clínica para evaluar la manifestación de la nefritis lúpica.
Los ratones, a partir de las 14 semanas de edad, recibieron por vía subcutánea PC - tuftsina a una concentración de 50 jg/0.1 ml por ratón (tratamiento; n = 10) o PBS (control; n = 10), tres veces por semana. En los estudios de citoquinas, los niveles relativos de expresión de ARNm de la citocina proinflamatoria IFN<y>y la citocina antiinflamatoria TGFp se analizaron mediante RT - PCR en tiempo real utilizando LightCycler (Roche). El ARN total se aisló de los esplenocitos y se transcribió de forma inversa en ADNc mediante al utilizar Transcriptasa Inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (Promega). El ADNc resultante se sometió a RT - PCR en tiempo real en presencia de cebadores específicos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla 1). El volumen de reacción de 20 |jl contenía MgCh tres mM, mezcla LightCycler HotStart DNA SYBR Green 1 (Roche), pares de cebadores específicos y cinco microlitros de ADNc. La expresión relativa de IFNy y TGFp se normalizó a niveles de p - actina.
Tabla 1 - Cebadores RT - PCR (directo e inverso respectivamente)
Los resultados demuestran que la PC - tuftsina (TPC) ejerce un efecto inhibidor significativo sobre el desarrollo de glomerulonefritis. Como se muestra en la Figura 10, la expresión del ARNm relativa de los esplenocitos de la citocina antiinflamatoria TGFp en ratones tratados con PC - tuftsina mejoró significativamente en comparación con el ARNm de TGFp derivado de los ratones tratados con PBS (p < 0.001). Por el contrario, el nivel relativo de expresión de ARNm de IFN<y>de citocinas proinflamatorias en ratones tratados con PC - tuftsina (TPC) se redujo significativamente, es decir, mejoró en comparación con el ARNm de IFN<y>del grupo de control PBS (p < 0.03). Los resultados indican que la PC -tuftsina inhibió el desarrollo de la inflamación asociada con la nefritis.
El nivel de proteína de los esplenocitos de las citocinas antiinflamatorias TGFp e IL - 10 y las citocinas proinflamatorias IFNy e IL - 17 se cuantificaron por DuoSet (R&D Systems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se recolectaron bazos de ratones tratados con PC - tuftsina o PBS, se aislaron los esplenocitos (5x106/ml) y se incubaron durante 72 horas y posteriormente se evaluaron los contenidos de citocinas secretadas.
Los resultados demuestran un efecto inhibidor significativo ejercido por PC - tuftsina sobre el desarrollo de glomerulonefritis. Como se muestra en la Figura 11, los ratones tratados con PC - tuftsina (TPC) exhibieron un aumento de 5.1 y 4.8 en los niveles de proteínas de citocinas antiinflamatorias, TGFp e IL -10, respectivamente, en comparación con el tratamiento con PBS (p < 0.001). Al mismo tiempo, las concentraciones de citocinas proinflamatorias IFNy e IL - 17 en ratones tratados con PC - tuftsina (TPC) se redujeron en 5.2 y 2.7 veces, respectivamente, en comparación con el grupo de control (p < 0.001, p < 0.02, respectivamente). Estos resultados indican además que el tratamiento con PC -tuftsina da como resultado una inhibición significativa de las citocinas proinflamatorias y la expresión mejorada de citocinas antiinflamatorias, lo que reduce, e incluso previene, la aparición de nefritis.
Finalmente, se realizó un ensayo de perfil de células reguladoras T (Tregs) en esplenocitos aislados incubados con los siguientes anticuerpos: anti - CD4+FITC, anti - CD25+APC y anti - FOXP3+PE (eBioscience) y se analizó mediante FACS. Puertas de dispersión frontal y lateral se ajustaron para incluir todas las células y excluir los residuos (Becton Dickinson). Las células se comprimieron en células CD4+ y, para la tinción intracelular, las células se incubaron con una solución de fijación, se lavaron y se resuspendieron en una solución de permeabilización (Serotec). Se utilizó como referencia el control de isotipos.
También en este caso, los resultados demuestran un efecto inhibidor significativo del tratamiento con PC - tuftsina sobre el desarrollo de glomerulonefritis. Como se muestra en la Figura 12, los ratones tratados con PC-tuftsina (TPC) presentaron una mejora del 18±2 por ciento en el nivel de expresión de Tregs, CD4+CD25+ FOXP3+ (p < 0.02), mientras que con los ratones tratados con PBS se observó un aumento de solo 4±0.6 por ciento (p < 0.01). En particular, la fosforilcolina (PC) o la tuftsina (T) no causaron ninguna elevación significativa en el nivel de Tregs, (p < 0.01). Más aún, la cantidad relativa de Tregs obtenida con PC - tuftsina es mayor que la suma de las Tregs relativas obtenidas de cada uno de las PC y tuftsina. Por lo tanto, el PC - tuftsina exhibe un efecto terapéutico sinérgico.
Ejemplo 5: El efecto de la tuftsina de PC en el desarrollo de la colitis in vivo
El efecto de la PC - tuftsina en el desarrollo de la colitis se determinó en un modelo de ratón sometido a inducción de colitis aguda mediante tratamiento con sulfato de dextrano de sodio (DSS). Específicamente, se llevó a cabo la inducción de colitis en ratones macho C57BL/6 (“ratones de colitis”) al suplementar el agua de bebida (2.5 % p/v) durante cinco días con DSS (mol. wt. 36,000 - 50,000).
Dos grupos de ratones fueron alimentados diariamente por ingestión oral utilizando una aguja de alimentación, con PC - tuftsina a una concentración de 500 pg/0.1 ml por ratón (tratamiento; n = 10), o PBS (control; n = 10). Estos compuestos se proporcionaron durante 11 días, comenzando dos días antes de la administración de DSS. Un tercer grupo de ratones (n = 10) no fueron inducidos con colitis, es decir, no recibieron DSS, ni ningún tratamiento. Todos los grupos de ratones tenían un peso corporal promedio idéntico (27 - 29 gr).
La evaluación del desarrollo de la colitis se realizó mediante el control del peso corporal, sangrado rectal, consistencia de heces y supervivencia cada dos días. El sangrado intestinal fue seguido por una prueba de hemocultivo y la observación de signos de sangrado en el ano o sangrado macroscópico. El índice diario de actividad de enfermedad (DAI) se calculó al calificar en una escala de cero a cuatro los siguientes parámetros: cambio de peso (0, < 1 %; 1, 1 - 5 %; 2, 5 - 10 %; 3, 10 - 15 %; y 4, >15 %), hemorragia intestinal (0, negativo; 4, positivo) y consistencia de heces (0, normal; 2, heces blandas; 4, diarrea). A continuación, se dividieron las puntuaciones combinadas por tres para obtener el índice final de actividad de la enfermedad. Diez días después de la inducción de la enfermedad, se sacrificaron ratones y se recolectó el intestino grueso y se evaluó la longitud del colon y el daño colónico microscópico. Para la puntuación microscópica, las porciones proximal, medial y distal del colon y el ciego se fijaron en formalina tamponada con fosfato al 10%. Las secciones incorporadas en parafina se tiñeron con H&E. El grado de daño histológico e inflamación fue clasificado de forma ciega por un patólogo experto.
Los resultados demuestran un efecto de mejora de la PC - tuftsina en el desarrollo de la colitis inducida por DSS. Como se muestra en la Figura 13A, la puntuación del DAI de los ratones con colitis tratados con PC - tuftsina (círculo vacío) fue de alrededor de 0.9 (p < 0.02) el último día del experimento, el día 8, que fue significativamente más baja que el DAI del grupo de control (PBS, círculo sólido). Este último aumentó gradualmente con el tiempo alcanzando el valor de 2.6 después de 5 días.
Además, como se ilustra en las Figuras 13B - 13C, los ratones tratados con PC - tuftsina (círculo vacío) exhibieron un sangrado rectal significativamente bajo (13B; p < 0.001) y pérdida de peso (13C; p < 0.001) en comparación con los ratones control (tratados con PBS, círculo sólido). Finalmente, como se ilustra en la Figura 13D, los ratones tratados con PC - tuftsina (círculo vacío) exhibieron una supervivencia significativamente mayor. Después de 5 días, se exhibió una disminución en la supervivencia con los ratones tratados con PBS (círculos sólidos), mientras que el 100 % de los ratones tratados con PC - tuftsina (círculo vacío) seguían vivos, incluso después del día 12.
Como se ejemplifica en las Figuras 14A-14B, la longitud del colon de los ratones tratados con PC - tuftsina (TPC) fue de ocho cm, en comparación con los ratones control (tratados con PBS), que se acortaron de ocho cm a cinco - seis cm (p < 0.02).
Finalmente, como se muestra en las Figuras 15A-15G, los análisis histológicos de la sección del colon de los cólones de todos los tres grupos de ratones revelaron que el tratamiento con PC - tuftsina (Figs. 15B; x20, 15F; x60) atenuó la destrucción del colon en comparación con los tratamientos de control, es decir, el tratamiento con PBS (Figs. 15A; x10, 15E; x40) y ratones sanos, es decir, ratones no sometidos a la inducción de colitis por DSS (Figs. 15C; x20, 15G; x60). No se observaron diferencias en la estructura de los epitelios del colon en ratones sanos (Figs. 15C, 15G) ni en ratones con colitis tratados con PC - tuftsina (Figs. 15B, 15F), mientras que en los ratones con colitis tratados con PBS se observó una fuerte infiltración de células y un alejamiento de las glándulas (Figs. 15A, 15E).
Ejemplo 6: El efecto de los conjugados de PC sobre la artritis inducida por colágeno (CIA) in vivo
Los estudios anteriores mostraron que el tratamiento con PC - OVA de ratones CIA, es decir, ratones con artritis inducida por colágeno, resultó en una mejora de la progresión de la inflamación asociada con un cambio de la respuesta Th1 a Th2. En el presente estudio se evalúa el efecto de la PC - tuftsina, PC - glicano y MPC en la progresión de la enfermedad en ratones machos DBA/1 con artritis inducida por colágeno.
Para obtener PC - Glicano, la PC o derivado de PC se adhiere directamente a una fracción de glicano, tal como Galp1 - 4[Fuca1 - 3]GlcNAc y a N - acetil glucosamina para formar PC - Galpl - 4[Fuca1 - 3]GlcNAc y PC - N - acetil glucosamina (PC - GlcNAc), respectivamente.
El tratamiento de un modelo animal para la artritis con los conjugados de PC de la invención se realiza de acuerdo con dos regímenes: (1) protocolo profiláctico (preventivo), con ratones con artritis inducida por colágeno (CIA) en los que los conjugados de PC se administran dos días antes de la inducción de la artritis mediante inyección de colágeno - II; los conjugados PC se administran a la edad de ocho semanas antes de que se detecte la manifestación clínica de artritis; (2) Protocolo terapéutico, donde los conjugados PC se administran cuando la enfermedad se encuentra en estado de progresión (por ejemplo, CIA a las 20 semanas de edad, que es similar al lupus a las 24 semanas de edad).
Los ratones machos DBA/1 reciben 50 |jg de colágeno tipo II (CII) en emulsión 1:1 con el adyuvante completo de Freund en la base de la cola. Los ratones se evalúan por dos observadores ciegos tres veces por semana, para detectar signos de artritis. La evaluación se basa en las siguientes puntuaciones severas: 0 = normal, 1 = eritema, 2 = eritema más hinchazón, 3 = extensión/pérdida de función y puntuación total = suma de cuatro extremidades. Para el protocolo profiláctico, los ratones se tratan con conjugados de PC, 3 jg/0.1 ml por ratón por vía subcutánea el día -2, el día 0 y el día 21. Para los estudios terapéuticos, los ratones se tratan tres veces por semana con conjugados de PC, 3 jg/0.1 ml de PBS por vía subcutánea durante 14 días a partir de 1 día después de que la CIA sea clínicamente detectable. Los ratones de control reciben el portador (PBS), o la fracción sola (por ejemplo, tuftsina, polímero 2 -metacriloiloxietilo y glicano) en puntos de tiempo similares a los utilizados para los conjugados de PC.
La proliferación se evalúa como sigue: Las células linfáticas drenantes (DLN) y los esplenocitos se cultivan a 2x106/ml durante 96 h en medio RPMI - 1640, suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10 %, L - glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 0.1 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 jg/m l de estreptomicina y 2 - ME 50 jM . Las células se marcan con éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE) y se cocultivan con o sin colágeno - II (50 jg/m l) durante 5 días. A continuación, se recolectan los linfocitos, se evalúa la proliferación mediante el método de dilución CFSE y citometría de flujo, y se presentan como MFI (intensidad de fluorescencia media).
El perfil de citocinas se evalúa de la siguiente manera: Los fluidos de cultivo de esplenocitos y células DLN después de la exposición a colágeno - II (50 jg/m l) o Concanavalina A (Con - A; 5 jg/m l) durante 48 h y 72 h respectivamente, se recolectan y almacenan a unos - 80 °C. El efecto de los conjugados de PC se examina siguiendo las citocinas seleccionadas Th1/Th2/Th17. Específicamente, el nivel de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias (IL -1 , IL - 2, IFNy, IL - 4, IL - 10, IL - 15, IL - 17 y TNFa) se monitoriza utilizando el kit de Citocinas de Ratón MI<l>L<i>PLEX MAP (Millipore) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en Luminex (Bio - plex®). El nivel de TGFp se monitoriza mediante el kit ELISA.
En base al perfil de citocinas, se eligen las citocinas seleccionadas para las mediciones del nivel de ARNm utilizando RT - PCR cuantitativa en tiempo real, como se detalla en el Ejemplo 4. Las muestras de ADNc se amplifican utilizando cebadores específicos (Tabla 1).
El nivel de expresión de autoanticuerpos en la sangre se evalúa de la siguiente manera: se toma sangre de los diferentes grupos de ratones en diferentes puntos de tiempo y los títulos de anti - colágeno - II y anti - PC en los sueros se siguen con ELISA. En resumen, las placas ELISA se recubren con colágeno - II (10 jg/ml), PC - KLH (10 jg/ml), glicano (10 jg/ml), tuftsina (10 jg/m l) o polímero 2 - metacriloiloxietilo (10 jg/m l) en PBS, durante la noche a 4 °C. Las placas bloqueadas con BSA (3 % en PBS) se exponen a diferentes diluciones de sueros (1:200 hasta 1:10,000) durante 2 h a temperatura ambiente. La unión se sondea con IgG o IgM anti - ratón conjugada con fosfatasa alcalina y sustrato apropiado. Los datos se leen a 405 nM ref. 600 nM. Los títulos de anticuerpos anti - CCP (péptido citrulinado cíclico) se determinan utilizando el anti - DIASTAT anti - CCP2 siguiendo las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones: los sueros de ratón se diluyen a 1:10 o 1:100 en el diluyente de la muestra, y el anticuerpo secundario se sustituye por IgG anti - ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina.
La histopatología de las patas de los ratones también se evalúa de la siguiente manera: la pata del ratón se fija en formalina tamponada neutra al 4 % (Sigma), se descalcifica, se corta y se tiñe con H&E o con Nuclear Fast Rubine -Aniline Blue - Orange G. Cuatro secciones coronales separadas por 80 jm se puntúan por dos observadores independientes, a baja potencia para la infiltración celular, exudación y pannus, y a baja (610) y alta potencia (6100) para la erosión ósea y la destrucción del cartílago. Se utiliza una escala graduada semicuantitativa de 0 a 3, de la siguiente manera: 0, sin cambios; 1, cambios leves; 2, cambios moderados; y 3, los cambios más severos observados en los experimentos. La destrucción del cartílago se determina como la pérdida de cartílago en relación con el área total del cartílago. Se determina una puntuación media para cada animal para cada parámetro, y la puntuación se promedia para determinar las medias del grupo.
La evaluación reguladora de T se lleva a cabo de la siguiente manera: Las Tregs CD4+CD25+ se pueden inducir durante la infección por helmintos. Las células de esplenocitos y DLN de ratones en las que se atenúa la progresión de CIA luego de tratamiento con conjugados de PC y se analizan aún más para la producción de citocinas Th1/Th2/Th17 y el fenotipo regulador T CD4+CD25+ Foxp3+ (Tregs). La medición de los niveles de Tregs se realiza mediante FACS utilizando el Kit de Aislamiento de Células T Reguladoras CD4+CD25+ de selección negativa de perlas magnéticas. El kit contiene un cóctel de anticuerpos conjugados con biotina específicos del linaje contra CDS (Ly-2), CD11b (Mac -1), CD45R (B220), CD49b (DX5), T e r -119 y Microperlas anti - Biotina para la depleción de linfocitos T no CD4+, así como Microperlas CD25 - PE y anti - PE para la posterior selección positiva de células T reguladores CD4+CD25+. Las células se analizan mediante citometría de flujo. El nivel de ARNm de Foxp3 también se analiza mediante RT -PCR en tiempo real, como se describió anteriormente, para las citocinas. El cebador utilizado incluye los enumerados en la Tabla 1 anterior, entre otros.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que comprende al menos un derivado de fosforilcolina seleccionado del grupo que consiste en: 4 -aminofenilfosfocolina, 4 - diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 - Yodofenil) - dodecilfosfocolina ligada a al menos un portador de tetrapéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el derivado de fosforilcolina y el al menos un portador de tetrapéptido se separan por un espaciador.
3. El conjugado de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho derivado de fosforilcolina se une covalentemente a dicho al menos un portador de tetrapéptido a través de un espaciador de aminoácidos.
4. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado que comprende al menos un derivado de fosforilcolina seleccionado del grupo que consiste en: 4 - aminofenilfosfocolina, 4 - diazoniofenilfosforilcolina, 4 - nitrofenilfosfocolina y 12 - (3 - Yodofenil) - dodecilfosfocolina ligada a al menos un portador de tetrapéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, y que comprende además un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en la que el derivado de fosforilcolina y el al menos un portador de tetrapéptido se separan por un espaciador.
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 4 o 5, en la que dicho derivado de fosforilcolina se une covalentemente a dicho al menos un portador de tetrapéptido a través de un espaciador de aminoácidos.
7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que dicha composición farmacéutica es una vacuna.
8. La vacuna de la reivindicación 7, que comprende además un adyuvante.
9. La vacuna de la reivindicación 8, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en emulsiones agua en aceite, emulsiones de aceite en agua y liposomas.
10. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, para uso en un método para tratar una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto en necesidad del mismo.
11. La composición de vacuna para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el tratamiento comprende al menos uno de prevenir el inicio de dicha enfermedad autoinmunitaria, atenuar el progreso de dicha enfermedad autoinmunitaria e inhibir la progresión de dicha enfermedad autoinmunitaria; o en la que dicho sujeto tiene un alto riesgo de desarrollar dicha enfermedad autoinmunitaria.
12. La composición de vacuna para uso de acuerdo con la reivindicación 10 o 11, en la que la enfermedad autoinmunitaria se asocia con inflamación anormal; o en la que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, lupus, esclerosis múltiple, pénfigo vulgar, síndrome antifosfolípido, psoriasis, hepatitis autoinmunitaria, sarcoidosis, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis, enfermedad de Crohn y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
13. La composición de vacuna para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que la enfermedad autoinmunitaria es lupus.
14. La composición de vacuna para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que la enfermedad autoinmunitaria es colitis.
15. La composición de vacuna para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide.
ES14749245T 2013-02-05 2014-02-05 Phosphorylcholine conjugates and uses thereof Active ES2995333T3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361760668P 2013-02-05 2013-02-05
PCT/IL2014/050124 WO2014122646A1 (en) 2013-02-05 2014-02-05 Phosphorylcholine conjugates and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2995333T3 true ES2995333T3 (en) 2025-02-10

Family

ID=51299287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14749245T Active ES2995333T3 (en) 2013-02-05 2014-02-05 Phosphorylcholine conjugates and uses thereof

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9987372B2 (es)
EP (1) EP2953978B1 (es)
CN (1) CN105102485B (es)
AU (1) AU2014213631B2 (es)
ES (1) ES2995333T3 (es)
HU (1) HUE069662T2 (es)
WO (1) WO2014122646A1 (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2995333T3 (en) 2013-02-05 2025-02-10 Tpcera Ltd Phosphorylcholine conjugates and uses thereof
US10046021B2 (en) 2013-02-05 2018-08-14 Tpcera Ltd. Phosphorylcholine conjugates and uses thereof
WO2017094014A1 (en) * 2015-12-01 2017-06-08 Tpcera Ltd. Phosphorylcholine conjugates and uses thereof
GB201603296D0 (en) 2016-02-25 2016-04-13 Ucl Business Plc Chemotactic,drug-containing polymersomes
GB201604553D0 (en) 2016-03-17 2016-05-04 Ucl Business Plc Fumarate polymersomes
AU2018360406A1 (en) * 2017-11-02 2020-05-21 Tarsier Pharma Ltd Phosphorylcholine-tuftsin conjugate for treating ocular inflammation
GB201806095D0 (en) 2018-04-13 2018-05-30 Ucl Business Plc Metabolisable pH sensitive polymersomes
WO2020144467A1 (en) 2019-01-07 2020-07-16 Ucl Business Ltd Polymersomes functionalised with multiple ligands
IL312988A (en) * 2021-11-21 2024-07-01 Tarsier Pharma Ltd Liquid compositions comprising a phosphorylcholine-tuftsin conjugate
GB2622559A (en) * 2022-05-10 2024-03-27 Johan Frostegaard Compositions, methods and uses

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5455032A (en) 1993-07-29 1995-10-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Use of phosphocholine hapten conjugates in vaccines
US6551574B2 (en) 1995-06-07 2003-04-22 Rhomed Incorporated Tuftsin metallopeptide analogs and uses thereof
US9192633B2 (en) 1997-12-31 2015-11-24 University Of Iowa Research Foundation Use of parasitic biological agents for disease prevention and control
GB0122731D0 (en) 2001-09-20 2001-11-14 Univ Strathclyde Anti-inflammatory agent
US20050118655A1 (en) 2003-11-17 2005-06-02 University Of Iowa Research Foundation Use of parasitic biological agents for diseases prevention and control
DE602005023428D1 (de) 2004-04-15 2010-10-21 Athera Biotechnologies Ab Verfahren zur Feststellung der Gefahren von ischemischen Herzgefässerkrankungen mit PhosphorylcholinKonjugaten
CA2472818A1 (en) * 2004-06-30 2005-12-30 Institut Pasteur Carbohydrate-phosphorylcholine conjugate molecules and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications
US7408075B1 (en) * 2005-03-23 2008-08-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Synthesis of phosphocholine ester derivatives and conjugates thereof
EP2097119A4 (en) 2006-11-21 2012-10-17 Abbott Lab USE OF A TERPOLYMER OF TETRAFLUOROETHYLENE, HEXAFLUORPROPYLENE AND VINYLIDENE FLUORIDE IN MEDICAMENTAL COATINGS
CA2699100A1 (en) 2007-09-11 2009-04-02 Dorian Bevec Use of a peptide as a therapeutic agent
DK2260873T3 (da) * 2009-06-08 2019-09-16 Biocompatibles Uk Ltd Pcylering af proteiner
ES2995333T3 (en) 2013-02-05 2025-02-10 Tpcera Ltd Phosphorylcholine conjugates and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2953978C0 (en) 2024-10-23
EP2953978A1 (en) 2015-12-16
CA2915537A1 (en) 2014-08-14
US9987372B2 (en) 2018-06-05
WO2014122646A1 (en) 2014-08-14
AU2014213631A1 (en) 2015-09-10
CN105102485B (zh) 2019-04-19
AU2014213631B2 (en) 2018-03-08
EP2953978B1 (en) 2024-10-23
US20160193350A1 (en) 2016-07-07
EP2953978A4 (en) 2016-12-28
HUE069662T2 (hu) 2025-04-28
CN105102485A (zh) 2015-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2995333T3 (en) Phosphorylcholine conjugates and uses thereof
JP2023015158A (ja) ＩＬ‐１５とＩＬ‐１５Ｒαとの複合体及びその使用
ES2897635T3 (es) Métodos y composiciones para modular el sistema inmunológico con la arginasa I
Mawardi et al. Chronic graft‐versus‐host disease: Current management paradigm and future perspectives
KR20140100422A (ko) 백신 조성물
US12350308B2 (en) Phosphorylcholine conjugates and uses thereof
CN112074298B (zh) Langerin+细胞靶向
CA2840941A1 (en) Wt1 peptide cancer vaccine composition for transdermal administration
US11065330B2 (en) Induction of antigen-specific tolerance by peripheral phagocytosis
JP7216965B2 (ja) Ｓ１００ａ９を標的とする免疫原性組成物
Yang et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8+ T cell immune activity and inhibiting tumor progression
CN110290805A (zh) 通用流感疫苗组合物
CN107847439A (zh) 用于舌下施用的吡喃葡萄糖基脂质a和过敏原制剂
WO2017094014A1 (en) Phosphorylcholine conjugates and uses thereof
BE1023966B1 (fr) Utilisation d’adjuvants pour la prévention et/ou le traitement des maladies auto-immunes
CA2840997A1 (en) Vaccine composition for transdermal administration
CA2915537C (en) Phosphorylcholine conjugates and uses thereof
WO2016039620A2 (en) Respiratory syncytial virus virosomes
Cao et al. Suppression of autoimmune arthritis and neuroinflammation via an amino acid-conjugated butyrate prodrug with enhanced oral bioavailability
EP3189851A1 (en) Vaccine pharmaceutical composition for suppressing apoptosis of ctl or inhibiting suppression of induction of ctl
JP2022537920A (ja) 改良されたワクチン製剤
Gloudemans et al. The Mucosal Adjuvant Cholera Toxin B Instructs Non-Mucosal
PT1701730E (pt) Método e vacina compreendendo copolímero 1 para tratamento de distúrbios psiquiátricos