ES3001509T3 - Stabilized liquid and lyophilized adamts13 formulations - Google Patents

Stabilized liquid and lyophilized adamts13 formulations Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a formulaciones de ADAMTS13 con propiedades mejoradas o deseables. Como tal, la invención proporciona formulaciones líquidas y liofilizadas de ADAMTS13 que son adecuadas para la administración farmacéutica. Entre otros aspectos, la presente invención también proporciona métodos para tratar diversas enfermedades y afecciones relacionadas con la disfunción del VWF y/o ADAMTS13 en un sujeto. También se proporcionan en el presente documento kits que comprenden formulaciones de ADAMTS13 útiles para el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Formulaciones de ADAMTS13 líquidas y liofilizadas estabilizadas
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 61/244,353, presentada el 21 de septiembre de 2009, que se incorpora expresamente en esta memoria en su totalidad a todos los efectos.
Declaración respecto a los derechos sobre las invenciones realizadas con investigación o desarrollo patrocinado por el gobierno
No aplicable
Referencia a una "lista de secuencias", una tabla o un apéndice de lista de programa informático presentado en un disco compacto
No aplicable
Antecedentes de la invención
Las proteínas ADAMTS (una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina de tipo I) son una familia de metaloproteinasas que contienen varios dominios conservados, incluyendo un dominio catalítico dependiente de cinc, un dominio rico en cisteína, un dominio similar a desintegrina y al menos una y, en la mayoría de los casos, múltiples repeticiones de trombospondina de tipo I (para una revisión, véase Nicholsonet al.,BMC Evol Biol. 2005 Feb 4; 5(1): 11). Estas proteínas, que están relacionadas evolutivamente con las familias de ADAM y MMP de metaloproteinasas (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb; 7(1): 25-31), son enzimas secretadas que se han ligado a varias enfermedades y afecciones, incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Ene; 41(1): 4-14), trastornos del tejido conjuntivo, cánceres, inflamación (Nicholsonet al.)y malaria grave porPlasmodium falciparum(Larkinet al.,PLoS Pathog. 2009 Mar; 5(3): e1000349). Debido a estas asociaciones, las enzimas ADAMTS se han reconocido como dianas terapéuticas potenciales para varias patologías (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol.
2006 Feb; 7(1): 25-31).
Un miembro de la familia de ADAMTS, ADAMTS13, escinde el factor de Von Willebrand (vWF) entre los residuos Tyr 1605 y Met 1606. La pérdida de la actividad de ADAMTS13 se ha ligado a varias afecciones, tales como TTP (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Ene; 41(1): 4-14), inflamación aguda y crónica (Chauhanet al.,J Exp Med. 2008 Sep 1; 205(9): 2065-74), y más recientemente, malaria grave porPlasmodium falciparum(Larkinet al.,PLoS Pathog. 2009 Mar; S(3): e1000349).
La púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) es un trastorno caracterizado por microangiopatía trombótica, trombocitopenia y trombosis microvascular que puede provocar diversos grados de isquemia e infarto de tejidos. Clínicamente, los pacientes con TTP se diagnostican por síntomas tales como trombocitopenia, esquistocitos (fragmentos de eritrocitos) y niveles elevados de lactato deshidrogenasa (Moake J L. Thrombotic microangiopathies. N Engl J Med. 2002; 347: 589-600; Moake J L. von Willebrand factor, ADAMTS-13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. Semin Hematol. 2004; 41: 4-14; Sadler J E, Moake J L, Miyata T, George J N. Recent advances in thrombotic thrombocytopenic purpura. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program).
2004: 407-423; Sadler J E. New concepts in von Willebrand disease. Annu Rev Med. 2005; 56:173-191).
En 1982, Moakeet al.encontraron multímeros de factor de Von Willebrand inusualmente grandes (UL-vWF) en el plasma de pacientes con TTP recurrente crónica (Moake J L, Rudy CK, T roll J H, Weinstein M J, Colannino NM, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII: von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307: 1432-1435). El vínculo entre UL-vWF y TTP ganó apoyo con hallazgos independientes de Furlanet al.y Tsai y Lian de que la mayoría de los pacientes que padecen TTP tienen deficiencia de una metaloproteasa plasmática, ahora conocida como ADAMTS13, que escinde vWF (Furlan M, Robles R, Solenthaler M, Wassmer M, Sandoz P, Laemmle B. Deficient activity of von Willebrand factor-cleaving protease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 1997; 89: 3097-3103; Tsai H M, Sussman, I I, Ginsburg D, Lankhof H, Sixma J J, Nagel R L. Proteolytic cleavage of recombinant type 2A von Willebrand factor mutants R834W and R834Q: inhibition by doxycycline and by monoclonal antibody VP-1. Blood. 1997; 89: 1954-1962; Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339: 1585-1594).
La proteasa ADAMTS13 es una proteína glucosilada de 190 kDa producida predominantemente por el hígado (Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413: 488-494; Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, Chung D. Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood. 2001; 98: 1662-1666; Zheng X, Chung D, Takayama T K, Majerus E M, Sadler J E, Fujikawa K. Structure of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13), a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura. J Biol Chem. 2001; 276: 41059-41063; Soejima K, Mimura N, Hiroshima M, Maeda H, Hamamoto T, Nakagaki T, Nozaki C. A novel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood: possibly, the von Willebrand factor-cleaving protease; J Biochem (Tokio).
2001; 130: 475-480; Gerritsen H E, Robles R, Lammle B, Furlan M. Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease. Blood. 2001; 98: 1654-1661).
Se ha demostrado que las mutaciones en el gen ADAMTS13 provocan TTP (Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413: 488 494). La TTP idiopática, a menudo provocada por autoanticuerpos que inhiben la actividad de ADAMTS-13, es un trastorno más común que sucede en adultos y niños mayores y puede reaparecer a intervalos regulares en un 11-36 % de los pacientes (Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339: 1585-1594; FurlanM, Lammle B. Deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease in familial and acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Baillieres Clin Haematol. 1998; 11: 509-514).
Los autoanticuerpos no neutralizantes también podrían inhibir la actividad de ADAMTS al inducir su eliminación de la circulación (Scheiflinger F, Knobl P, Trattner B, Plaimauer B, Mohr G, Dockal M, Dorner F, Rieger M. Nonneutralizing IgM and IgG antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS-13) in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 2003; 102: 3241-3243). La actividad plasmática de ADAMTS13 en adultos sanos varía de un 50 % a un 178 % (Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126: 1430-1433). En la mayoría de los pacientes con TTP familiar o adquirida, la actividad plasmática de ADAMTS13 está ausente o es menos de un 5 % de lo normal. Sin tratamiento, la tasa de mortalidad supera un 90 %, pero el tratamiento con plasma ha reducido la mortalidad hasta aproximadamente un 20 % (Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126: 1430-1433).
El vWF sintetizado en megacariocitos y células endoteliales se almacena en gránulos de plaquetas y cuerpos de Weibel-Palade, respectivamente, como vWF ultragrande (UL-vWF) (Moake J L, Rudy CK, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII: von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307: 1432-1435; Wagner D D, Olmsted J B, Marder V J. Immunolocalization of von Willebrand protein in Weibel-Palade bodies of human endothelial cells. J Cell Biol. 1982; 95: 355-360; Wagner D D, Bonfanti R. von Willebrand factor and the endothelium. Mayo Clin Proc. 1991; 66: 621-627; Sporn L A, Marder V J, Wagner D D. von Willebrand factor released from Weibel-Palade bodies binds more avidly to extracellular matrix than that secreted constitutively. Blood. 1987; 69: 1531 -1534; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158: 980-985; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Multimeric composition of endothelial cell-derived von Willebrand factor. Blood.
1989; 73: 2074-2076). Una vez secretados por las células endoteliales, estos multímeros de UL-vWF se escinden por ADAMTS13 en la circulación en una serie de multímeros más pequeños en sitios de escisión específicos dentro de la molécula de vWF (Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Endothelial cellderived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158: 980-985; Dent J A, Galbusera M, Ruggeri Z M. Heterogeneity of plasma von Willebrand factor multimers resulting from proteolysis of the constituent subunit. J Clin Invest. 1991; 88: 774-782; Furlan M, Robles R, Affolter D, Meyer D, Baillod P, Lammle B. Triplet structure of von Willebrand factor reflects proteolytic degradation of high molecular weight multimers. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 7503-7507).
ADAMTS13 se escinde en el enlace Tyr842-Met843 en el dominio central A2 de la subunidad vWF madura y requiere cinc o calcio para su actividad (Dent J A, Berkowitz S D, Ware J, Kasper C K, Ruggeri Z M. Identification of a cleavage site directing the immunochemical detection of molecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87: 6306-6310). vWF existe en forma de "ovillo de hilo" y filamentosa como se observa por microscopia electrónica (Slayter H, Loscalzo J, Bockenstedt P, Handin R I. Native conformation of human von Willebrand protein. Analysis by electron microscopy and quasi-elastic light scattering. J Biol. Chem. 1985; 260: 8559-8563). Además, la microscopia de fuerza atómica confirma que vWF existe en una conformación globular en condiciones estáticas y en un estado filamentoso desplegado después de exposición a esfuerzo de cizallamiento (Siedlecki C A, Lestini B J, Kottke-Marchant K K, Eppell S J, Wilson D L, Marchant R E. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 1996; 88: 2939-2950). Esto también podría ocurririn vivocuando un extremo del filamento de vWF está anclado a una superficie.
Los trombos de los pacientes con TTP consisten en poca fibrina y principalmente en vWF y plaquetas, lo que sugiere que la agregación plaquetaria mediada por vWF es una causa de trombosis (Asada Y, Sumiyoshi A, Hayashi T, Suzumiya J, Kaketani K. Immunohistochemistry of vascular lesion in thrombotic thrombocytopenic purpura, with special reference to factor VIII related antigen. Thromb Res. 1985; 38: 469-479). Los pacientes con TTP recurrente tienen multímeros ultragrandes en el plasma. Los multímeros de UL-vWF se acumulan con el tiempo porque la persistencia del inhibidor (Ab anti-ADAMTS13) disminuye la actividad de ADAMTS13. Los multímeros de UL-vWF son hiperactivos y se despliegan como resultado del esfuerzo de cizallamiento que provoca la agregación plaquetaria, lo que da como resultado trombosis intravascular (Tsai H M. Von Willebrand factor, ADAMTS13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. J Mol Med. 2002; 80: 639-647; Tsai H M. Deficiency of ADAMTS-13 in thrombotic and thrombocytopenic purpura. J Thromb Haemost. 2003; 1: 2038 2040; discusión 2040-2035).
Se cree que la presencia de multímeros de UL-vWF hiperreactivos en el plasma debido a la deficiencia de ADAMTS13 podría estar asociada con un riesgo aumentado de trombosis arterial ligada a arteriopatía coronaria.
Por consiguiente, hay una necesidad en la técnica de formulaciones farmacéuticas de proteínas ADAMTS13 adecuadas para el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones asociadas con la disfunción de ADAMTS13 y VWF. La presente invención proporciona, entre otros aspectos, formulaciones de ADAMTS13 adecuadas para administración farmacéutica, así como métodos para tratar a sujetos con enfermedades o afecciones asociadas con disfunción de ADAMTS13 y VWF.
Breve compendio de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona formulaciones para el uso reivindicado de ADAMTS13 (A13) adecuadas para administración farmacéutica. Ventajosamente, en algunas realizaciones, la invención proporciona formulaciones de A13 que pueden almacenarse durante periodos prolongados de tiempo sin perder actividad ni agregarse demasiado. En determinadas realizaciones, las formulaciones de la invención pueden almacenarse durante al menos 6 meses a temperaturas de hasta al menos aproximadamente 37 °C.
En un aspecto, la presente invención proporciona una formulación estabilizada de ADAMTS13 para el uso reivindicado (A13) que comprende (a) de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0.
En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona una formulación liofilizada estabilizada de ADAMTS13 para el uso reivindicado (A13), en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0.
En un aspecto de la invención, se proporcionan formulaciones de ADAMTS13 recombinante (rA13) adecuadas para administración farmacéutica para el uso reivindicado. En algunas realizaciones, las formulaciones proporcionadas en esta memoria tienen altas actividades específicas y son estables en almacenamiento durante periodos prolongados de tiempo.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan formulaciones para el uso reivindicado que tienen una dimerización o agregación reducida de A13 y rA13. En determinadas realizaciones, las formulaciones proporcionadas en esta memoria retardan la formación de dímeros y la agregación de A13 y rA13 cuando se almacenan durante periodos prolongados de tiempo. En algunas modalidades, estas formulaciones son adecuadas para administración farmacéutica.
Se describe un método de tratamiento o prevención de un trastorno asociado con la formación y/o presencia de uno o más trombos y un método para desintegrar uno o más trombos en un paciente que lo necesita. Ejemplos de trastornos asociados con la formación y/o presencia de uno o más trombos son púrpura trombocitopénica trombótica hereditaria (TTP), TTP adquirida, trombosis arterial, infarto agudo de miocardio (AMI), apoplejía, septicemia y coagulación intravascular diseminada (DIC). En una realización, los métodos de tratamiento o prevención incluyen la administración de una formulación de A13 o rA13 proporcionada en esta memoria.
En otro aspecto, se describen métodos de tratamiento o prevención de un infarto en un paciente que lo necesita. En determinadas realizaciones, se proporcionan métodos para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con un infarto, incluyendo, sin limitación, infarto de miocardio (ataque cardiaco), embolia pulmonar, acontecimientos cerebrovasculares tales como apoplejía, arteriopatía oclusiva periférica (tal como gangrena), síndrome antifosfolipídico, septicemia, arteritis de gigantocitos (GCA), hernia y vólvulo. En una realización, los métodos de tratamiento o prevención incluyen la administración de una formulación de A13 o rA13 proporcionada en esta memoria.
En un aspecto, se describen métodos para formular A13 o rA13 con alta estabilidad y/o altas actividades específicas. En determinadas realizaciones, los métodos son útiles para formular soluciones y liofilizados que pueden almacenarse durante periodos prolongados de tiempo a temperaturas de hasta al menos aproximadamente 37 °C sin perder las actividades específicas elevadas deseables para administración farmacéutica.
En otro aspecto, en esta memoria se describen kits para la administración farmacéutica de A13 o rA13. Los kits de la invención, en determinadas realizaciones, pueden comprender formulaciones líquidas o liofilizadas que pueden almacenarse durante periodos prolongados de tiempo.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80, a un pH de 7,0 con 20 mM de un agente tamponante seleccionado de (1) histidina, (2) tampón fosfato o (3) citrato de sodio. Las soluciones se almacenaron a 4 °C o 37 °C durante hasta 6 meses. (a ) La actividad FRETS-VWF73 y (B) la concentración de proteína ADAMTS13 medida por ELISA se determinaron en los puntos temporales indicados.
Figura 2.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80, a un pH de 7,0 con 20 mM de un agente tamponante seleccionado de (1) histidina, (2) tampón fosfato o (3) citrato de sodio y se liofilizó. Las formulaciones liofilizadas se almacenaron a 4 °C o 37 °C durante hasta 6 meses. Las formulaciones de ADAMTS13 se reconstituyeron con agua aséptica y se determinaron (A) la actividad FRETS-VWF73 y (B) la concentración de proteína ADAMTS13 medida por<e>L<i>SA en los puntos temporales indicados.
Figura 3.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80, a un pH de 7,0 con 20 mM de un agente tamponante seleccionado de (1) histidina, (2) tampón fosfato o (3) citrato de sodio y las muestras se cargaron directamente en una columna de filtración en gel Superose 6 o se liofilizaron y reconstituyeron con agua aséptica antes de la carga. Luego, las formulaciones de ADAMTS13 se analizaron mediante filtración en gel.
Figura 4.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80 e histidina 20 mM a pH 7,0. Las soluciones se almacenaron a(A)4 °C o(B)37 °C durante hasta 6 meses. Luego, las formulaciones de ADAMTS13 se analizaron mediante filtración en gel en los puntos temporales indicados.
Figura 5.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80 e histidina 20 mM a pH 7,0 y luego se liofilizó. Las formulaciones liofilizadas luego se almacenaron a(A)4 °C o(B)37 °C durante hasta 6 meses. Las formulaciones de ADAMTS13 se reconstituyeron en agua aséptica en los puntos temporales indicados y se analizaron mediante filtración en gel.
Figura 6.Se formuló ADAMTS13 recombinante en un tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80 e histidina 20 mM a pH 7,0 y luego se almacenó(A)en solución o(B)liofilizado a 4 °C o 37 °C durante hasta 6 meses. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyeron en agua aséptica y las muestras almacenadas en solución y las formulaciones liofilizadas se caracterizaron mediante análisis de dispersión de luz dinámica.
Figura 7.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80 y tampón fosfato de sodio 20 mM a pH 7,0 y luego se almacenó(A)en solución o(B)liofilizado a 4 °C o 37 °C durante hasta 6 meses. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyeron en agua aséptica y las muestras almacenadas en solución y las formulaciones liofilizadas se caracterizaron mediante análisis de dispersión de luz dinámica.
Figura 8.Se formuló ADAMTS13 recombinante en un tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80 y tampón fosfato de sodio 20 mM a pH 7,0 y luego se almacenó(A)en solución o(B)liofilizado a 4 °C o 37 °C durante hasta 6 meses. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyeron en agua aséptica y las muestras almacenadas en solución y las formulaciones liofilizadas se caracterizaron mediante análisis de dispersión de luz dinámica.
Figura 9.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80 e histidina 20 mM a pH 7,0 y luego se liofilizó. Las muestras liofilizadas se almacenaron a 4 °C o 37 °C durante 3 meses y luego se reconstituyeron en agua aséptica. Luego, las muestras de ADAMTS13 se caracterizaron mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier y los resultados se compararon con una muestra recién formulada y liofilizada.
Figura 10.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80, a un pH de 7,0 con 20 mM de un agente tamponante seleccionado de (1) histidina, (2) tampón fosfato o (3) citrato de sodio. Las soluciones se almacenaron a 4 °C o 37 °C durante 6 meses. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyeron con agua aséptica y se determinó la pureza de todas las muestras mediante análisis de HPLC en fase inversa.
Figura 11.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80, a un pH de 7,0 con 20 mM de un agente tamponante seleccionado de (1) histidina, (2) tampón fosfato o (3) citrato de sodio. Las muestras de las formulaciones en solución también se liofilizaron y reconstituyeron con agua aséptica. Las formulaciones en solución y liofilizadas reconstituidas se caracterizaron mediante análisis de calorimetría diferencial de barrido.
Figura 12.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80, a un pH de 7,0 con 20 mM de un agente tamponante seleccionado de (1) histidina, (2) tampón fosfato o (3) citrato de sodio. El diámetro promedio z del ADAMTS13 en las formulaciones se caracterizó mediante análisis de dispersión de luz dinámica.
Figura 13.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 0 %-2 % de sacarosa, un 0 %-3 % de manitol, calcio 0 mM-2 mM, un 0,05 % de polisorbato 80 e histidina 20 mM a pH 7,0 y se analizó mediante filtración en gel. La cromatografía completa se muestra en el panel(A),una sección ampliada del pico del dímero se muestra en el panel(B).
Figura 14.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM e histidina 20 mM a pH 5,5, 6,5, 7,5, 8,5 y 9,5. Las formulaciones se almacenaron a 4 °C o 40 °C durante 24 horas. Luego se determinaron la actividad FRETS-VWF73 y la concentración de proteína ADAMTS13 medida por ELISA, para las formulaciones al pH indicado.
Figura 15.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80 e histidina 20 mM a pH 7,0 con (12B y D) y sin (12A y C) CaCl2 2 mM. Las formulaciones líquidas se almacenaron a 25 °C (12A y B) o 37 °C (12C y D) durante tres semanas. La estabilidad enzimática se midió mediante ensayo de FRETS-VWF73 en los puntos temporales indicados.
Figura 16. (A) Se cargó ADAMTS13 recombinante en una columna de filtración en gel Superose 6 GL equilibrada con un tampón que contenía Na2HPO420 mM (pH 7,5) y NaCl 500 mM, y las especies moleculares se separaron por tamaño y forma. Se crearon tres combinaciones de elución correspondientes a A13 agregado (combinación 1), A13 dimérico (combinación 2) y A13 monomérico (combinación 3). Luego se determinó la actividad FRETS-VWF73 de cada combinación.(B)El estado oligomérico y la polidispersidad de las fracciones combinadas se evaluaron adicionalmente mediante análisis de dispersión de luz dinámica.
Figura 17.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80, histidina 20 mM a pH 7,0 y NaCl a(A)0 mM,(B)30 mM,(C)60 mM,(D)90 mM,(E)120 mM o(F)150 mM. Luego, las composiciones de ADAMTS13 formuladas se liofilizaron y se inspeccionaron visualmente para determinar el aspecto del liofilizado resultante.
Figura 18.Los liofilizados de ADAMTS13 recombinante producidos a partir de formulaciones que contenían NaCl de 0 a 150 mM se reconstituyeron en agua. Los estados de agregación de las proteínas ADAMTS13 reconstituidas se determinaron mediante análisis de filtración en gel.
Figura 19.Se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía un 0,05 % de polisorbato 80, histidina 20 mM a pH 7,0, sacarosa a una concentración de 5 mM a 20 mM y NaCl a una concentración de 0 a 150 mM. La actividad de la proteína ADAMTS13 en cada formulación se determinó mediante ensayo de FRETS-VWF73.
Figura 20.Se liofilizaron tampones con alto contenido salino y bajo contenido salino. El tampón con alto contenido salino(A)contenía histidina 20 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80 y CaCl22 mM, mientras que el tampón con bajo contenido salino(B)contenía histidina 20 mM (pH 7,0), NaCl 30 mM, un 1 % de sacarosa, un 3 % de manitol, un 0,05 % de polisorbato 80 y CaCl22 mM. Luego, las dos formulaciones se liofilizaron en condiciones convencionales y los liofilizados resultantes se inspeccionaron visualmente.
Figura 21.El estado multimérico de ADAMTS13 recombinante aislado por cromatografía de intercambio catiónico(A)antes y(B)después de la filtración en gel se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna Superóse 6 GL.
Figura 22.El estado multimérico de ADAMTS13 recombinante aislado por cromatografía de intercambio catiónico(A)antes y(B)después de la filtración en gel se analizó mediante dispersión de luz dinámica.Figura 23.Protocolo (A) convencional y(B)ampliado para la liofilización de formulaciones de rADAMTS13.
Figura 24.Comparación de liofilizados de rADAMTS13 producidos por liofilización de(A)formulaciones de rA13 1 a 4 usando un protocolo de liofilización convencional,(B)formulaciones de rA13 1 a 4 usando un protocolo de liofilización ampliado,(C)formulaciones de rA13 5 a 8 usando un protocolo de liofilización convencional y(D)formulaciones de rA13 5 a 8 usando un protocolo de liofilización ampliado. Las formulaciones y protocolos de liofilización usados para la generación de estos datos se pueden encontrar en el ejemplo 12.
Figura 24.Los liofilizados de ADAMTS13 recombinante producidos a partir de formulaciones que contenían(A)NaCl 30 mM o(B)NaCl 60 mM, según protocolos de liofilización convencionales (A LYO) o ampliados (B LYO), se reconstituyeron en agua. Los estados de agregación de las proteínas ADAMTS13 reconstituidas se determinaron mediante análisis de dispersión de luz dinámica.
Figura 25.El estado oligomérico y la polidispersidad de las composiciones de ADAMTS13 formuladas con(A)NaCl 30 mM o(B)NaCl 60 mM se evaluaron mediante análisis de dispersión de luz dinámica después de la liofilización con un protocolo convencional o ampliado.
Figura 26.Estructura de dominios de la proteasa ADAMTS13 que escinde el factor de Von Willebrand (VWF) humano. El polipéptido ADAMTS13 precursor consiste en un péptido señal (S), un propéptido (P), seguido de los elementos estructurales del polipéptido maduro que comprende un dominio de metaloproteasa catalítica, un dominio similar a desintegrina, un motivo de trombospondina de tipo 1 (TSP1), un dominio rico en cisteína y espaciador, 7 repeticiones TSP1 adicionales y 2 dominios CUB. Diez sitios potenciales de N-glucosilación están marcados con círculos rellenos.
Figura 27.Diámetros hidrodinámicos de composiciones de ADAMTS13 formuladas con diferentes agentes tamponantes determinados por análisis de dispersión de luz dinámica (DLS).
Figura 28.Influencia de la tensión de cizallamiento en ADAMTS13 humano recombinante determinada por análisis de dispersión de luz dinámica (DLS).
Figura 29.Estabilidad de congelación y descongelación de ADAMTS13 humano recombinante determinada por la actividad FRETS.
Figura 30.Estabilidad de congelación y descongelación de ADAMTS13 humano recombinante determinada por análisis de dispersión de luz dinámica (DLS).
Figura 31.Fotoestabilidad de ADAMTS13 humano recombinante liofilizado determinada por SE-HPLC.Figura 32.Fotoestabilidad de ADAMTS13 humano recombinante líquido y liofilizado determinada por análisis de dispersión dinámica de luz (DLS).
Figura 33.Fotoestabilidad de ADAMTS13 humano recombinante líquido y liofilizado determinada por la actividad FRETS.
Figura 34.Influencia del calcio y el cinc en la actividad FRETS de ADAMTS13 humano recombinante.
Figura 35.Influencia del contenido de sal y glúcidos en el estado oligomérico de la formulación liofilizada de ADAMTS13 humano recombinante determinada por SE-HPLC. El contenido de glúcidos de cada formulación debe presentarse en g/l, en lugar de concentraciones molares (por ejemplo, 20 mM = 20 g/l).
Figura 36.Liofilizados producidos por liofilización de ADAMTS13 humano recombinante formulado según la tabla 15.
Figura 37.Análisis de dispersión de luz dinámica (DLS) del estado oligomérico de ADAMTS13 humano recombinante liofilizado con un programa de liofilización convencional de 3 días, almacenado durante 6 meses a(panel superior)4 °C;(panel central)30 °C; y(panel inferior)40 °C.
Figura 38.Análisis de dispersión de luz dinámica (DLS) del estado oligomérico de ADAMTS13 humano recombinante liofilizado con un programa de liofilización ampliado de 10 días, almacenado durante 6 meses a(panel superior)4 °C;(panel central)30 °C; y(panel inferior)40 °C.
Figura 39.Análisis de dispersión de luz dinámica (DLS) del estado oligomérico de ADAMTS13 humano recombinante formulado a diferentes concentraciones de proteína después de almacenamiento a 4 °C, 30 °C y 40 °C.
Descripción detallada de la invención
I. Introducción
ADAMTS13 es una metaloproteasa plasmática que escinde multímeros del factor de Von Willebrand (VWF) y regula por disminución su actividad en la agregación plaquetaria. La púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) es una enfermedad grave asociada con el factor de Von Willebrand (VWF) inusualmente grande, hiperactivo hemostáticamente y una deficiencia grave de ADAMTS-13. Se ha desarrollado un candidato de producto de ADAMTS13 recombinante como tratamiento de sustitución de proteína recombinante para el tratamiento de la TTP provocada por deficiencia de ADAMTS13 (Plaimauer y Scheiflinger, Semin Hematol. 2004 Ene; 41(1): 24 33; Plaimauer Bet al.,F. Blood. 2002 Nov 15; 100(10): 3626-32. Publicación electrónica de 2002 Jul 12; y Bruno Ket al.,J Thromb Haemost. 2005 May; 3(5): 1064-73).
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de formulaciones líquidas y liofilizadas de proteínas ADAMTS purificadas con estabilidad aumentada que cumplen los requisitos establecidos por la Conferencia Internacional sobre Armonización de Requisitos Técnicos de Productos Farmacéuticos para Uso en Humanos (ICH Guideline, PHARMACEUTICAL DEVELOPMENT Q8(R2), 2005).
La actividad hemostática de VWF es muy dependiente del tamaño de los multímeros. La metaloproteasa plasmática ADAMTS13 es la proteasa principal identificada que regula fisiológicamente el tamaño multimérico de VWF. ADAMTS13 se escinde entre Tyr 1605 y Met 1606 en el dominio A2 de VWF produciendo fragmentos de escisión típicos de 176 kDa y 140 kDa y multímeros de VWF más pequeños que se encuentran en la circulación. El gen ADAMTS13 humano contiene 29 exones y abarca aproximadamente 37 kb en el cromosoma 9q34. El transcrito de 4,7 kb se sintetiza predominantemente en células estrelladas hepáticas, pero también en células del endotelio vascular y plaquetas, y codifica un producto de traducción primario de 1427 residuos aminoacídicos. El polipéptido ADA<m>TS13 precursor consiste en un péptido señal y un propéptido que termina en el extremo C en un sitio potencial de furina para la escisión, seguido de la secuencia de la proteasa madura que escinde VWF. El polipéptido ADAMTS13 maduro (1353 residuos aminoacídicos) comprende los elementos estructurales característicos de todos los miembros de la familia de ADAMTS: un dominio de metaloproteasa similar a reprolisina, un dominio similar a desintegrina, una repetición central de trombospondina de tipo 1 (TSP1), un dominio rico en cisteína que alberga un motivo RGD posiblemente importante para las interacciones de la integrina y un dominio espaciador, seguido después de ello de una combinación única de 7 repeticiones TSP1 consecutivas (TSP1/n.° 2-8) y dos dominios<c>U<b>(figura 26).
El ADAMTS13 maduro tiene una masa molecular calculada de aproximadamente 145 kDa, mientras que el ADAMTS13 derivado de plasma purificado tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 180 kDa, probablemente debido a modificaciones postraduccionales que consisten en las secuencias de consenso actuales para 10 sitios potenciales de N-glucosilación, y varios sitios de O-glucosilación y un sitio de C-manosilación en las repeticiones TSP1. La actividad proteolítica de VWF de ADAMTS13 es muy dependiente de cationes divalentes. El motivo del sitio activo en el dominio de metaloproteasa contiene el motivo HEXXHXXGXXHD altamente conservado con tres residuos de histidina que coordinan un ion Zn2+ catalítico y un sitio de unión de calcio previsto que se propone que se coordina por Glu 83, Asp 173, Cys 281 y Asp 284. Los papeles funcionales de los dominios de ADAMTS13 se han estudiado principalmente usando sistemas de ensayoin vitro,que muestran que las regiones aminoterminales desde la metaloproteasa hasta el dominio espaciador son cruciales para la escisión de VWF. Las repeticiones TSP1 carboxiterminales y los dominios c U<b>parecen ser importantes para el reconocimiento del sustrato VWF y la unión a posibles receptores de superficie como CD36 en células endoteliales.
Un resultado importante del desarrollo de formulaciones de proteínas es la identificación de vías de inactivación y vías de agregación o degradación de la proteína respectiva. Se observó una inactivación completa dependiente del tiempo de la proteína ADAMTS13 humana recombinante en una semana a 40 °C en formulación líquida mediante ensayo de la actividad FRETS. Como se describe en esta memoria, se descubrió que esta inactivación podía reducirse en presencia de Ca2+ 2 mM. A 25 °C, la actividad FRETS no disminuyó más en presencia de Ca2+. A 4 °C, las formulaciones líquidas de la actividad de ADAMTS13 se mantuvieron estables durante 24 semanas en ausencia de Ca2+.
Además, se encontró que en formulaciones liofilizadas idénticas solo se produjo una inactivación leve o nula cuando la formulación se almacenó a 40 °C en ausencia de Ca2+. La adición de Ca2+ 2 mM o 4 mM no influyó en la estabilidad a 40 °C.
Por consiguiente, los autores de la invención han descubierto que la agregación dependiente del tiempo de las proteínas ADAMTS13 en una formulación líquida (por ejemplo, almacenada a 40 °C) es un contribuyente importante a la degradación y/o pérdida de actividad enzimática. Es importante destacar que, como se proporciona por presente invención, esta agregación se puede reducir sustancialmente mediante liofilización y/o mediante la adición de Ca2+ a formulaciones líquidas. Además, se ha descubierto que la adición de un tensioactivo no iónico (por ejemplo, Tween 80 al 0,05 %) reduce la formación de agregados de ADAMTS13 en formulaciones liofilizadas. Además, se encontró que la presencia de uno o más glúcidos y/o alditoles estabiliza significativamente ADAMTS13 durante la liofilización y ayuda en la formación de un liofilizado mejorado.
II. Definiciones
Como se usa en esta memoria, "ADAMTS13" o "A13" se refieren a una metaloproteasa de la familia de ADAMTS (una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina de tipo I) que escinde el factor de Von Willebrand (vWF) entre los residuos Tyr 1605 y Met 1606. En el contexto de la presente invención, una proteína ADAMTS13 abarca cualquier proteína ADAMTS13, por ejemplo, ADAMTS13 de un mamífero tal como un primate, ser humano (NP_620594), mono, conejo, cerdo, bovino (XP_610784), roedor, ratón (NP_001001322), rata (XP_342396), hámster, jerbo, cánido, félido, rana (NP_001083331), pollo (XP_415435), y derivados biológicamente activos de los mismos. También se incluyen proteínas ADAMTS13 mutantes y variantes que tienen actividad, así como fragmentos funcionales y proteínas de fusión de las proteínas ADAMTS13. Además, las proteínas ADAMTS13 de la invención pueden comprender además marcas que faciliten la purificación, la detección o ambas. Las proteínas ADAMTS13 descritas en esta memoria pueden modificarse además con un resto terapéutico o un resto adecuada para la obtención de imágenesin vitrooin vivo.
Las proteínas ADAMTS13 humanas incluyen, sin limitación, polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos del número de acceso de GenBank NP_620594 o un polipéptido procesado de la misma, por ejemplo, un polipéptido en que se ha eliminado el péptido señal (aminoácidos 1 a 29) y/o el propéptido (aminoácidos 30-74). Se conocen en la técnica muchas variantes naturales de ADAMTS13 humano, y están incluidas por las formulaciones de la presente invención, de las que algunas incluyen mutaciones seleccionadas de R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, P475S, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, E740K, A900V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V y R1336W. Además, las proteínas ADAMTS13 incluyen proteínas naturales y recombinantes que se han mutado, por ejemplo, por una o más mutaciones conservadoras en un aminoácido no esencial. Preferiblemente, los aminoácidos esenciales para la actividad enzimática de ADAMTS13 no se mutarán. Estos incluyen, por ejemplo, residuos que se sabe o presupone que son esenciales para la unión de metales, tales como los residuos 83, 173, 224, 228, 234, 281 y 284, y residuos encontrados en el sitio activo de la enzima, por ejemplo, el residuo 225. De manera similar, en el contexto de la presente invención, las proteínas ADAMTS13 incluyen isoformas alternativas, por ejemplo, isoformas que carecen de los aminoácidos 275 a 305 y/o 1135 a 1190 de la proteína humana de longitud completa.
Como se usa en esta memoria, la expresión "derivado biológicamente activo" se refiere a cualquier polipéptido con sustancialmente la misma función biológica que ADAMTS13. Las secuencias polipeptídicas de los derivados biológicamente activos pueden comprender eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos cuya ausencia, presencia y/o sustitución, respectivamente, no tiene ningún impacto negativo sustancial sobre la actividad biológica del polipéptido. La actividad biológica de dichos polipéptidos puede medirse, por ejemplo, por la reducción o retardo de la adhesión plaquetaria al endotelio, la reducción o retardo de la agregación plaquetaria, la reducción o retardo de la formación de cadenas plaquetarias, la reducción o retardo de la formación de trombos, la reducción o retardo del crecimiento de trombos, la reducción o retardo de la oclusión de los vasos, la escisión proteolítica de vWF, la desintegración de trombos, o por escisión de un sustrato peptídico, por ejemplo, un péptido FRETS-VWF73 (Kokameet al.,Br J Haematol. 2005 Abr; 129(1): 93-100) o variante del mismo.
Asimismo, las proteínas ADAMTS13 pueden modificarse aún más, por ejemplo, mediante modificaciones postraduccionales (por ejemplo, glucosilación en uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos humanos 142, 146, 552, 579, 614, 667, 707, 828, 1235, 1354 o cualquier otro sitio de modificación natural o manipulado) o mediante modificación química o enzimáticaex vivo,incluyendo, sin limitación, glucosilación, modificación mediante polímero soluble en agua (por ejemplo, PEGilación, sialilación, HESilación, etc.), marcaje y similares.
Como se usa en esta memoria, "una unidad de actividad de ADAMTS13" se define como la cantidad de actividad en 1 ml de plasma humano normal combinado, independientemente del ensayo que se use. Por ejemplo, una unidad de actividad FRETS-VWF73 de ADAMTS13 es la cantidad de actividad necesaria para escindir la misma cantidad de sustrato FRETS-VWF73 (Kokameet al.,Br J Haematol. 2005 Abr; 129(1):93-100) que la que se escinde por un ml de plasma humano normal combinado.
Como se usan en esta memoria, las expresiones "ADAMTS13" y "derivado biológicamente activo", respectivamente, también incluyen polipéptidos obtenidos mediante tecnología de ADN recombinante. El ADAMTS13 recombinante ("rADAMTS13"), por ejemplo, el ADAMTS13 humano recombinante ("r-hu-ADAMTS13"), puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Un ejemplo específico se describe en el documento WO 02/42441 que se incorpora en esta memoria por referencia con respecto al método de producción de ADAMTS13 recombinante. Esto puede incluir cualquier método conocido en la técnica para (i) la producción de ADN recombinante por genomanipulación, por ejemplo, mediante retrotranscripción de ARN y/o amplificación de ADN, (ii) introducción de ADN recombinante en células procariotas o eucariotas por transfección, es decir, mediante electroporación o microinyección, (iii) cultivo de dichas células transformadas, por ejemplo, de manera continua o discontinua, (iv) expresión de ADAMTS13, por ejemplo, de forma constitutiva o tras inducción, y (v) aislamiento de dicho ADAMTS13, por ejemplo, del medio de cultivo o recogiendo las células transformadas, para (vi) obtener ADAMTS13 recombinante sustancialmente purificado, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de afinidad. La expresión "derivado biológicamente activo" incluye también moléculas quiméricas tales como, por ejemplo, ADAMTS13 (o un derivado biológicamente activo del mismo) en combinación con Ig, para mejorar las propiedades biológicas/farmacológicas tales como, por ejemplo, la semivida de ADAMTS13 en el sistema circulatorio de un mamífero, particularmente un ser humano. La Ig también podría tener el sitio de unión a un receptor de Fc opcionalmente mutado.
Como se usa en esta memoria, el término "trombo" se refiere a un coágulo de sangre, especialmente un coágulo de sangre que comprende plaquetas, un microtrombo y/o un émbolo. Dicho trombo puede unirse o no a un vaso sanguíneo arterial o venoso, y puede bloquear parcial o totalmente el flujo sanguíneo en un vaso sanguíneo arterial o venoso.
Como se usan en esta memoria, las expresiones "vitamina B3", "nicotinamida", "niacinamida", "niacina" y "ácido nicotínico" pueden usarse indistintamente para referirse a cualquier miembro de la familia B3 de vitaminas.
Como se usa en esta memoria, una "cantidad o dosis terapéuticamente eficaz" o "cantidad o dosis suficiente" se refiere a una dosis que produce efectos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento y será verificable por un experto en la técnica usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a edición, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
Como se usa en esta memoria, una "concentración fisiológica" de sal se refiere a una concentración de sal entre aproximadamente 100 mM y aproximadamente 200 mM de una sal farmacéuticamente aceptable. Ejemplos no limitantes de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, cloruro de sodio y potasio, acetato de sodio y potasio, citrato de sodio y potasio, fosfato de sodio y potasio.
Como se usa en esta memoria, una "concentración subfisiológica" de sal se refiere a una concentración de sal de menos de aproximadamente 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable. En realizaciones preferidas, una concentración subfisiológica de sal es de menos de aproximadamente 80 mM de una sal farmacéutica. En otra realización preferida, una concentración subfisiológica de sal es de menos de aproximadamente 60 mM de una sal farmacéutica.
Como se usa en esta memoria, el término "aproximadamente" indica un intervalo aproximado de más o menos un 10 % de un valor especificado. Por ejemplo, la expresión "aproximadamente un 20 %" abarca un intervalo de un 18-22 %. Como se usa en esta memoria, "aproximadamente" también incluye la cantidad exacta. Por tanto, "aproximadamente un 20 %" significa "aproximadamente un 20 %" y también "un 20 %".
Como se usa en esta memoria, "almacenamiento" significa que una formulación no se administra inmediatamente a un sujeto una vez preparada, sino que se mantiene durante un periodo de tiempo en condiciones particulares (por ejemplo, temperatura particular, etc.) antes de su uso. Por ejemplo, una formulación líquida o liofilizada se puede mantener durante días, semanas, meses o años, antes de su administración a un sujeto, a temperaturas variadas, tal como refrigerada (de 0 °C a 10 °C) o a temperatura ambiente (por ejemplo, temperatura de hasta 32 °C).
Como se usa en esta memoria, la expresión "medio químicamente definido" se refiere a un medio de crecimiento sintético en que se conocen la identidad y concentración de todos los componentes. Los medios químicamente definidos no contienen extractos de bacterias, levaduras, animales o plantas, aunque pueden incluir o no componentes individuales derivados de plantas o animales (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, etc.). Ejemplos no limitantes de medios químicamente definidos disponibles comercialmente incluyen diversos medios EX-CELL® (SAFC Biosciences, Inc), diversos medios Eagle modificados de Dulbecco (DME) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), mezcla de nutrientes de Ham (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), y similares. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medios de cultivo químicamente definidos, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 6,171,825 y 6,936,441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 2008/0009040 y 2007/0212770.
Como se usa en esta memoria, la expresión "medio de cultivo son oligopéptidos" se refiere a un medio son proteínas que no comprende oligopéptidos, tales como, por ejemplo, oligopéptidos derivados de un hidrolizado de proteínas. En una realización, el medio no comprende oligopéptidos que tengan veinte o más aminoácidos. En una realización de la presente invención, el medio no comprende oligopéptidos que tengan quince o más aminoácidos. En otra realización de la invención, el medio no comprende oligopéptidos que tengan diez o más aminoácidos. En una realización, el medio no comprende oligopéptidos que tengan siete o más aminoácidos. En otra realización, el medio no comprende oligopéptidos que tengan cinco o más aminoácidos. En otra realización más, el medio no comprende oligopéptidos que tengan tres o más aminoácidos. Según una realización adicional de la presente invención, el medio no comprende oligopéptidos que tengan dos o más aminoácidos. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medio de cultivo sin oligopéptidos, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 6,171,825 y 6,936,441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 2008/0009040 y 2007/0212770.
Como se usa en esta memoria, la expresión "medio de cultivo sin suero" se refiere a un medio de cultivo que no está complementado con un suero animal. Aunque a menudo los medios sin suero son medios químicamente definidos, los medios sin suero pueden complementarse con proteínas o fracciones de proteínas animales o vegetales concretas. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medio de cultivo sin suero, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 6,171,825 y 6,936,441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 2008/0009040 y 2007/0212770.
Como se usa en esta memoria, la expresión "medio de cultivo sin proteínas animales" se refiere a un medio de cultivo que no está complementado con suero, proteínas o fracciones de proteínas animales. Aunque a menudo los medios de cultivo sin proteínas animales son medios químicamente definidos, los medios de cultivo sin proteínas animales pueden contener hidrolizados de plantas o levaduras. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medio de cultivo sin proteínas animales, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 6,171,825 y 6 ,936 ,441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 2008/0009040 y 2007/0212770.
Un "vector de expresión" es una construcción de ácido nucleico, generada de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico específicos que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula hospedadora. El vector de expresión puede ser formar parte de un plásmido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico a transcribir unido de forma funcional a un promotor.
El término "heterólogo", cuando se usa con referencia a partes de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, con dos o más secuencias de genes no relacionados para generar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región de codificación de otra fuente. De forma similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).
Un "promotor" se define como una serie de secuencias de control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Como se usa en esta memoria, un promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cercanas al sitio de inicio de la transcripción, tales como, en el caso de un promotor de polimerasa de tipo II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales, que pueden estar ubicados hasta a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo en regulación ambiental y del desarrollo. La expresión "unido de forma funcional" se refiere a una vinculación funcional entre una secuencia de control de la expresión de ácido nucleico (tal como un promotor, o serie de sitios de unión del factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
III. Composiciones y formulación de ADAMTS13
En un aspecto, la presente invención proporciona formulaciones estabilizadas para el uso reivindicado de las proteínas ADAMTS13 (A13) y rADAMTS13 (rA13). En una realización, las formulaciones de la invención son estables cuando se almacenan a temperaturas de hasta al menos aproximadamente 40 °C durante al menos aproximadamente 6 meses. En otras realizaciones, las formulaciones proporcionadas en esta memoria conservan una actividad significativa de ADAMTS13 cuando se almacenan durante periodos prolongados de tiempo. En otras realizaciones más, las formulaciones de la invención reducen o retardan la dimerización, oligomerización y/o agregación de una proteína ADAMTS13.
En una realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 para el uso reivindicado, que comprenden una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz de una proteína ADAMTS13, una concentración subfisiológica a fisiológica de una sal farmacéuticamente aceptable, una concentración estabilizadora de uno o más glúcidos y/o alditoles, un tensioactivo no iónico, un agente tamponante que proporciona un pH neutro a la formulación y, opcionalmente, una sal de calcio y/o cinc. En general, las formulaciones de A13 estabilizadas proporcionadas en esta memoria son adecuadas para administración farmacéutica. En una realización preferida, la proteína A13 es ADAMTS13 humana o un derivado o fragmento biológicamente activo de la misma.
En determinadas realizaciones, las formulaciones de ADAMTS13 son formulaciones líquidas. En otras realizaciones, las formulaciones de ADAMTS13 son formulaciones liofilizadas que se liofilizan a partir de una formulación líquida como se proporciona en esta memoria.
En determinadas realizaciones de las formulaciones proporcionadas en esta memoria, la proteína ADAMTS13 es una ADAMTS13 humana (hA13) o una ADAMTS13 humana recombinante (rhA13), o un derivado o fragmento biológicamente activo de la misma. En una realización, la secuencia de aminoácidos de hA13 es la del número de acceso de GenBank NP_620594. En otra realización, la secuencia de aminoácidos de hA13 comprende los aminoácidos 75 a 1427 de NP_620594, una variante natural o conservadora de la misma, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
En determinadas realizaciones, ADAMTS13 se proporciona en una dosis terapéuticamente eficaz entre aproximadamente 0,05 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml. En otras realizaciones, ADAMTS13 está presente en una concentración entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml. En otras realizaciones más, ADAMTS13 está presente en una concentración entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 5 mg/ml. En otra realización, ADAMTS13 está presente en una concentración entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 2 mg/ml. En otras realizaciones más, ADAMTS13 puede estar presente a aproximadamente 0,01 mg/ml, o a aproximadamente 0,02 mg/ml, 0,03 mg/ml, 0,04 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,07 mg/ml, 0,08 mg/ml, 0,09 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,1 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,3 mg/ml, 1,4 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1,6 mg/ml, 1,7 mg/ml, 1,8 mg/ml, 1,9 mg/ml, 2,0 mg/ml, 2,5 mg/ml, 3,0 mg/ml, 3,5 mg/ml, 4,0 mg/ml, 4,5 mg/ml, 5,0 mg/ml, 5,5 mg/ml, 6,0 mg/ml, 6,5 mg/ml, 7,0 mg/ml, 7,5 mg/ml, 8,0 mg/ml, 8,5 mg/ml, 9,0 mg/ml, 9,5 mg/ml, 10,0 mg/ml o una concentración más alta. En una realización, la concentración de una formulación de ADAMTS13 relativamente pura puede determinarse por espectroscopia (es decir, proteína total medida a A280) u otra determinación en masa (por ejemplo, ensayo de Bradford, tinción con plata, peso de un polvo liofilizado, etc.). En otras realizaciones, la concentración de ADAMTS13 puede determinarse por ensayo ELISA de ADAMTS13 (por ejemplo, mg/ml de antígeno).
En otras realizaciones más, la concentración de ADAMTS13 en una formulación proporcionada por la presente invención puede expresarse como un nivel de actividad enzimática. Por ejemplo, en una realización, una formulación de ADAMTS13 puede contener entre aproximadamente 10 unidades de actividad FRETS-VWF73 y aproximadamente 10000 unidades de actividad FRETS-VWF73 u otra unidad enzimática de A13 adecuada (UI). En otras realizaciones, la formulación puede contener entre aproximadamente 20 unidades de actividad FRETS-VWF73 (U<f v 73>) y aproximadamente 8000 unidades de actividad FRETS-VWF73, o entre aproximadamente 30 UFV73 y aproximadamente 6000 UFV73, o entre aproximadamente 40 UFV73 y aproximadamente 4000 U<f v 73>, o entre aproximadamente 50 U<f v 73>y aproximadamente 3000 U<f v 73>, o entre aproximadamente 75 U<f v 73>y aproximadamente 2500 U<f v 73>, o entre aproximadamente 100 U<f v 73>y aproximadamente 2000 U<f v 73>, o entre aproximadamente 200 U<f v 73>y aproximadamente 1500 U<f v 73>, o entre aproximadamente otros intervalos dentro de los mismos. En una realización preferida, una formulación de ADAMTS13 proporcionada en esta memoria contiene entre aproximadamente 150 y aproximadamente 600 U<f v 73>. En determinadas realizaciones, una formulación contiene aproximadamente 10 unidades de actividad FRETS-VWF73, o aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 10000 o más unidades de actividad FRETS-VWF73.
De manera similar, en determinadas realizaciones, la concentración de ADAMTS13 puede expresarse como una actividad enzimática por unidad de volumen, por ejemplo, unidades enzimáticas A13 por ml (UI/ml). Por ejemplo, en una realización, una formulación de<a>D<a m>TS13 puede contener entre aproximadamente 10 UI/ml y aproximadamente 10000 UI/ml. En otras realizaciones, la formulación puede contener entre aproximadamente 20 UI/ml y aproximadamente 8000 UI/ml, o entre aproximadamente 30 UI/ml y aproximadamente 6000 UI/ml, o entre aproximadamente 40 UI/ml y aproximadamente 4000 UI/ml, o entre aproximadamente 50 UI/ml y aproximadamente 3000 UI/ml, o entre aproximadamente 75 UI/ml y aproximadamente 2500 Ul/ml, o entre aproximadamente 100 Ul/ml y aproximadamente 2000 Ul/ml, o entre aproximadamente 200 UI/ml y aproximadamente 1500 UI/ml, o entre aproximadamente otros intervalos dentro de los mismos. En una realización preferida, una formulación de ADAMTS13 proporcionada en esta memoria contiene entre aproximadamente 150 UI/ml y aproximadamente 600 UI/ml. En otra realización preferida, una formulación de ADAMTS13 proporcionada en esta memoria contiene entre aproximadamente 100 UI/ml y aproximadamente 1000 UI/ml. En determinadas realizaciones, una formulación contiene aproximadamente 10 UI/ml, o aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 10000 o más UI/ml.
En determinadas realizaciones, las formulaciones de ADAMTS13 estabilizadas proporcionadas por la presente invención contendrán una concentración de sal de subfisiológica a fisiológica, por ejemplo.
En otras realizaciones, una formulación de ADAMTS13 contendrá aproximadamente 0 mM, o aproximadamente 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, o más de una sal farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la sal es cloruro de sodio o potasio.
Ventajosamente, se ha encontrado que las formulaciones de ADAMTS13 que contienen una concentración subfisiológica de una sal farmacéuticamente aceptable forman liofilizados compactos con superficies lisas. Además, se ha encontrado que las formulaciones liofilizadas con bajo contenido salino de proteínas ADAMTS13 reducen la agregación de proteínas en comparación con formulaciones preparadas con concentraciones fisiológicas de sal. Por consiguiente, en una realización preferida, la presente invención proporciona formulaciones con bajo contenido salino de ADAMTS13 que contienen una concentración subfisiológica de una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, menos de aproximadamente 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable. En una realización, una formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino proporcionada en esta memoria contiene menos de aproximadamente 100 mM de una sal farmacéutica. En una realización preferida, una formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino proporcionada en esta memoria contiene menos de aproximadamente 80 mM de una sal farmacéutica. En otra realización preferida, una formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino proporcionada en esta memoria contiene menos de aproximadamente 60 mM de una sal farmacéutica (es decir, entre aproximadamente 0 mM y aproximadamente 60 mM de sal). En otra realización preferida, una formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino contendrá entre aproximadamente 30 mM y aproximadamente 60 mM de una sal farmacéuticamente aceptable. En otras realizaciones más, una formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino contendrá aproximadamente 0 mM, o aproximadamente 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM de una sal farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, una formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino es una formulación liofilizada. En una realización preferida, la sal es cloruro de sodio o potasio.
También se ha descubierto que la inclusión de niveles moderados (es decir, entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 %) de uno o más glúcidos y/o alditoles ayuda en la preparación de liofilizados compactos con superficies lisas y ayuda a estabilizar ADAMTS13 tras la liofilización. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 que contienen entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de uno o más glúcidos y/o alditoles. Puede usarse cualquier glúcido, tal como mono-, di- o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, incluyendo, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, dextrano, trehalosa, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietil almidón y carboximetilcelulosa. En una realización particular, se usa sacarosa o trehalosa como aditivo glucídico. Los alditoles se definen como un hidrocarburo que tiene entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8 átomos de carbono y un grupo hidroxilo. Ejemplos no limitantes de alditoles que pueden usarse en las formulaciones de ADAMTS13 proporcionadas en esta memoria incluyen manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una realización, se usa manitol como aditivo de alditol. En una realización preferida, una formulación de ADAMTS13 contiene tanto un aditivo glucídico como uno de alditol.
Los glúcidos o alditoles puede usarse de forma individual o en combinación. En algunas realizaciones, el glúcido, el alditol o la combinación de los mismos estarán presentes en la formulación en una concentración entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 7 %. En una realización, el contenido de glúcido y/o alditol de la formulación estará entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 %. En determinadas realizaciones, el glúcido, el alditol o la combinación de los mismos estará presente en una concentración entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 5 %. En una realización preferida, el glúcido, el alditol o la combinación de los mismos estará presente en una concentración entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 %. En otra realización preferida, el glúcido, el alditol o la combinación de los mismos estará presente en una concentración entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 %. En determinadas realizaciones, la concentración final puede ser de aproximadamente un 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2.5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 5,5 %, 6,0 %, 6,5 % o 7,0 % de glúcido, alditol o una combinación de los mismos. En realizaciones particulares, una formulación proporcionada en esta memoria puede comprender un glúcido en una concentración de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 5,0 % y un alditol en una concentración de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 5,0 %. Puede usarse cualquier combinación de concentraciones de glúcido y alditol, por ejemplo, un glúcido presente en una concentración de aproximadamente un 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 5,5 %, 6,0 %, 6,5 % o 7,0 % y un alditol presente en una concentración de aproximadamente un 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3.5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 5,5 %, 6,0 %, 6,5 % o 7,0 %.
Ventajosamente, también se descubrió que la inclusión de un tensioactivo no iónico reduce sustancialmente la agregación de las formulaciones de ADAMTS13. Por consiguiente, en una realización, se proporcionan formulaciones de ADAMTS13 que contienen una concentración estabilizadora de un detergente no iónico. Los tensioactivos no iónicos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las formulaciones de la presente invención son conocidos en la técnica de la ciencia farmacéutica e incluyen, sin limitación, polisorbato 80 (Tween 80), polisorbato 20 (Tween 20) y diversos poloxámeros o plurónicos, incluyendo Pluronic F-68 y BRIJ 35, o mezclas de los mismos. En una realización preferida, el tensioactivo no iónico usado en las presentes formulaciones farmacéuticas es polisorbato 80. En determinadas realizaciones, puede usarse un tensioactivo en una formulación proporcionada en esta memoria en una concentración entre aproximadamente un 0,001 % y aproximadamente un 0,2 %. En una realización preferida, el tensioactivo se usa en una concentración entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 %. En otra realización preferida, el tensioactivo se usa en una concentración de aproximadamente un 0,05 %. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la formulación puede incluir un tensioactivo no iónico en una concentración de aproximadamente un 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08 %, 0,09 %, 0,1 %, 0,125 %, 0,15 %, 0,175 %, 0,2 % y similares.
Además, se encontró que las formulaciones de ADAMTS13 se estabilizaron cuando se formularon a un pH neutro entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, se proporcionan formulaciones de ADAMTS13 que contienen un agente tamponante adecuado para mantener la formulación a un pH neutro. Los agentes tamponantes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, tampones fosfato, histidina, citrato de sodio, HEPES, Tris, bicina, glicina, N-glicilglicina, acetato de sodio, carbonato de sodio, glicilglicina, lisina, arginina, fosfato de sodio y mezclas de los mismos. En realizaciones preferidas, el tampón se selecciona de histidina, tampón fosfato, HEPES y citrato de sodio. En una realización preferida, el tampón es histidina o HEPES. En una realización específica, el tampón es histidina. En otra realización específica, el tampón es HEPES. En una realización, el pH de las formulaciones proporcionadas en esta memoria está entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 9,0. En determinadas realizaciones, el pH de la formulación es aproximadamente 6,5 o aproximadamente 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 o 9,0. En una realización preferida, el pH de la formulación de A13 está entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0. En una realización más preferida, el pH de la formulación de A13 está entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. En una realización particular, el pH de la formulación de A13 es aproximadamente 7,0. En otra realización particular, el pH de la formulación de A13 es 7,0 ± 0,2.
También se demuestra en esta memoria que la inclusión de calcio estabiliza aún más las formulaciones de ADAMTS13. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, se proporcionan formulaciones de ADAMTS13 estabilizadas que contienen entre aproximadamente 0,5 mM y aproximadamente 20 mM de calcio (por ejemplo, cloruro de calcio). Puede usarse cualquier sal de calcio farmacéuticamente aceptable en las formulaciones proporcionadas en esta memoria. Ejemplos no limitantes de sal de calcio que se pueden usarse incluyen, por ejemplo, CaCb, CaCO3, Ca(C6HnO7)2, Ca3(PO4)2, Ca(C1sH35O2)2 y similares. En una realización, el calcio está presente en una formulación de ADAMTS13 de la invención en una concentración de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 10 mM. En otra realización, el calcio está presente en una formulación de ADAMTS13 en una concentración entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 5 mM. En una realización preferida, el calcio está presente en una formulación de ADAMTS13 en una concentración de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 4 mM. En determinadas realizaciones, la concentración de calcio es aproximadamente 0,5 mM, o aproximadamente 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM o 20 mM. En una realización particular, la concentración de calcio es aproximadamente 2 mM. En otra realización preferida, la concentración de calcio es aproximadamente 3 mM. En otra realización preferida más, la concentración de calcio es aproximadamente 4 mM.
De manera similar, se ha descubierto que, en determinadas condiciones, la inclusión de cinc estabiliza aún más una formulación de ADAMTS13 proporcionada en esta memoria. Por ejemplo, la figura 34 muestra que la inclusión de cinco entre aproximadamente 2 pM y aproximadamente 10 pM estabilizó aún más las formulaciones de ADAMTS13 que contenían calcio. Puede usarse cualquier sal de cinc farmacéuticamente aceptable en las formulaciones proporcionadas en esta memoria. Ejemplos no limitantes de sal de cinc que pueden usarse incluyen, por ejemplo, ZnSÜ4-7H2O, ZnSÜ3-2H2O, Zn3(PO4)2 y (C6H5O7)2Zn3-2H2O y similares. En una realización, se usa ZnSO4 en las formulaciones de ADAMTS13 proporcionadas en esta memoria. En algunas realizaciones, el cinc está presente en una formulación de AdA m TS13 de la invención en una concentración de aproximadamente 0,5 pM a aproximadamente 20,0 pM. En una realización preferida, el cinc se incluye en una formulación de ADAMTS13 en una concentración entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 10,0 pM. En determinadas realizaciones, la concentración de cinc es aproximadamente 0,5 pM, o aproximadamente 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM o 10 pM.
En algunas realizaciones, las formulaciones de ADAMTS13 proporcionadas en esta memoria pueden comprender además uno o más excipientes, vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Además, las formulaciones proporcionadas en esta memoria pueden comprender además otros agentes farmacéuticos, vehículos, adyuvantes, diluyentes, potenciadores de la penetración en tejidos, solubilizantes y similares. Los expertos en la técnica conocen métodos para preparar composiciones y formulaciones para administración farmacéutica (véase, por ejemplo, REMINGTON'S pHARMACEUTICAL SCIENCES, 18.a ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)).
En una realización, las formulaciones de ADAMTS13 proporcionadas en esta memoria tendrán una tonicidad en un intervalo entre aproximadamente 200 mOsmol/l y aproximadamente 400 mOsmol/l, o en un intervalo entre aproximadamente 250 y aproximadamente 350 mOsmol/l. En determinadas realizaciones, una formulación de ADAMTS13 proporcionada en esta memoria tendrá una tonicidad, por ejemplo, de aproximadamente 200 mOsmol/l, o de aproximadamente 210 mOsmol/l, 220 mOsmol/l, 230 mOsmol/l, 240 mOsmol/l, 250 mOsmol/l, 260 mOsmol/l, 270 mOsmol/l, 280 mOsmol/l, 290 mOsmol/l, 300 mOsmol/l, 310 mOsmol/l, 320 mOsmol/l, 330 mOsmol/l, 340 mOsmol/l, 350 mOsmol/l, 360 mOsmol/l, 370 mOsmol/l, 380 mOsmol/l, 390 mOsmol/l o 400 mOsmol/l.
Ejemplos de agentes de tonicidad que pueden usarse en las formulaciones proporcionadas en esta memoria incluyen, sin limitación, cloruro de sodio, dextrosa, sacarosa, xilitol, fructosa, glicerol, sorbitol, manitol, trehalosa, cloruro de potasio, manosa, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, otras sales inorgánicas, otros glúcidos, otros alditoles y combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, una formulación de ADAMTS13 puede comprender al menos un agente de tonicidad, o al menos dos, tres, cuatro, cinco o más agentes de tonicidad.
Las formulaciones de ADAMTS13 proporcionadas en esta memoria pueden formularse para administración mediante métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como infusión en embolada o continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracefalorraquídea, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. En determinadas realizaciones, las formulaciones de ADAMTS13 proporcionadas en esta memoria pueden administrarse de forma sistémica o local. La administración sistémica incluye, sin limitación: vías de administración oral, subdérmica, intraperitoneal, subcutánea, transnasal, sublingual o rectal. La administración local incluye, sin limitación: vías de administración tópica, subcutánea, intramuscular e intraperitoneal.
En un aspecto de la invención, se proporciona una composición de proteína ADAMTS13 monomérica. En determinadas realizaciones, la composición de proteína ADAMTS13 monomérica está sustancialmente exenta de ADAMTS13 agregada, ADAMTS13 dimérica o ADAMTS13 tanto agregada como dimérica. En algunas realizaciones, la composición monomérica tiene una actividad específica mayor que una composición similar que contiene proteína ADAMTS13 agregada y/o dimérica. En una realización particular, la composición de ADAMTS13 monomérica se produce mediante un método que comprende filtración en gel o cromatografía de exclusión por tamaño. En una realización particular, la proteína ADAMTS13 es una ADAMTS13 humana (hA13) o ADAMTS13 humana recombinante (rhA13), o un derivado o fragmento biológicamente activo de la misma.
En otro aspecto, se proporcionan formulaciones de composiciones de ADAMTS13 monomérica. En una realización, la formulación es una formulación farmacéuticamente aceptable de la proteína ADAMTS13 monomérica. En determinadas realizaciones, la formulación está sustancialmente exenta de ADAMTS13 agregada, ADAMTS13 dimérica o ADAMTS13 tanto agregada como dimérica. En algunas realizaciones, las formulaciones de ADAMTS13 monomérica tienen una actividad específica mayor que las formulaciones similares que contienen proteína ADAMTS13 agregada y/o dimérica. En una realización particular, la formulación de ADAMTS13 monomérica se produce mediante un método que comprende filtración en gel o cromatografía de exclusión por tamaño. En una realización particular, la proteína ADAMTS13 en la formulación es una ADAMTS13 humana (hA13) o ADAMTS13 humana recombinante (rhA13), o un derivado o fragmento biológicamente activo de la misma. En determinadas realizaciones, la proteína ADAMTS13 monomérica se formula según una formulación proporcionada en esta memoria.
En una realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 para el uso reivindicado, que comprenden de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 10,0 mg/ml de proteína ADAMTS13, menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable, un glúcido y/o alditol, un tensioactivo no iónico y un agente tamponante. En determinadas realizaciones, las formulaciones pueden comprender además calcio y/o cinc. En otras realizaciones, la formulación puede estar tamponada a un pH entre aproximadamente 6,5 y 9,0. En determinadas modalidades, las formulaciones de A13 son adecuadas para administración oral.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación estabilizada de ADAMTS13 para el uso reivindicado, que comprende: de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio.
En una realización, se proporciona una formulación de ADAMTS13 estabilizada para el uso reivindicado, que comprende de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5 que contiene entre aproximadamente 50 unidades por ml y aproximadamente 1000 unidades por ml de actividad de ADAMTS13. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio.
En otra realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 1 mM a 10 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 4 mM de calcio. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio.
En otra realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. En determinadas realizaciones, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol. En una realización particular, la mezcla de sacarosa y manitol consiste en aproximadamente un 1 % de sacarosa y aproximadamente un 3 % de manitol. En determinadas realizaciones, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM de calcio, preferiblemente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 4 mM de calcio. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio.
En otra realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; entre aproximadamente un 0,01 % y un 0,1 % de un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. En determinadas realizaciones, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68, BRIJ 35 y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol. En una realización particular, el tensioactivo es polisorbato 80. En determinadas realizaciones, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM de calcio, preferiblemente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 4 mM de calcio. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio.
En otra realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5, en donde el agente tamponante es histidina o HEPES. En determinadas realizaciones, el agente tamponante está presente en una concentración entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM, preferiblemente entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM. En otra realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2. En determinadas realizaciones, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM de calcio, preferiblemente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 4 mM de calcio. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio.
En otra realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. En determinadas realizaciones, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 20 pM de cinc. En determinadas realizaciones, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM de calcio, preferiblemente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 4 mM de calcio. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio.
En una realización preferida, la presente invención proporciona una formulación de ADAMTS13 estabilizada para el uso reivindicado, que comprende de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; de 0 a 60 mM de NaCl; de 2 mM a 4 mM de calcio; de un 2 % a un 4 % de manitol; de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2). En determinadas realizaciones, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 20 pM de cinc.
En otra realización, se proporcionan formulaciones de ADAMTS13 con bajo contenido salino estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de aproximadamente 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH aproximadamente entre 6,5 y 7,5. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio. En una realización preferida, la formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino es una formulación liofilizada.
En una realización, se proporciona una formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino estabilizada para el uso reivindicado, que comprende de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de aproximadamente 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5 que contiene entre aproximadamente 50 unidades por ml y aproximadamente 1000 unidades por ml de actividad de ADAMTS13. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio. En una realización preferida, la formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino es una formulación liofilizada.
En otra realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 con bajo contenido salino estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de aproximadamente 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 1 mM a 10 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 4 mM de calcio. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio. En una realización preferida, la formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino es una formulación liofilizada.
En otra realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 con bajo contenido salino estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de aproximadamente 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. En determinadas realizaciones, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol. En una realización particular, la mezcla de sacarosa y manitol consiste en aproximadamente un 1 % de sacarosa y aproximadamente un 3 % de manitol. En determinadas realizaciones, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM de calcio, preferiblemente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 4 mM de calcio. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio. En una realización preferida, la formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino es una formulación liofilizada.
En otra realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 con bajo contenido salino estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de aproximadamente 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; entre aproximadamente un 0,01 % y un 0,1 % de un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. En determinadas realizaciones, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68, BRU 35 y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol. En una realización particular, el tensioactivo es polisorbato 80. En determinadas realizaciones, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM de calcio, preferiblemente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 4 mM de calcio. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio. En una realización preferida, la formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino es una formulación liofilizada.
En otra realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 con bajo contenido salino estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de aproximadamente 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5, en donde el agente tamponante es histidina o HEPES. En determinadas realizaciones, el agente tamponante está presente en una concentración entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM, preferiblemente entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM. En otra realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2. En determinadas realizaciones, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM de calcio, preferiblemente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 4 mM de calcio. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio. En una realización preferida, la formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino es una formulación liofilizada.
En otra realización, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 con bajo contenido salino estabilizadas para el uso reivindicado, que comprenden de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de aproximadamente 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; de 0,5 mM a 20 mM de calcio; un glúcido y/o alditol; un tensioactivo no iónico; y un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5. En determinadas realizaciones, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 20 pM de cinc. En determinadas realizaciones, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM de calcio, preferiblemente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 4 mM de calcio. En una realización preferida, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio o cloruro de potasio. En una realización preferida, la formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino es una formulación liofilizada.
En una realización preferida, la presente invención proporciona una formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino estabilizada para el uso reivindicado, que comprende de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; menos de aproximadamente 100 mM de NaCl; de 2 mM a 4 mM de calcio; de un 2 % a un 4 % de manitol; de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2). En determinadas realizaciones, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 20 pM de cinc. En una realización preferida, la formulación de ADAMTS13 con bajo contenido salino es una formulación liofilizada.
En una realización, la presente invención proporciona una formulación estabilizada de ADAMTS13 (A13) para el uso reivindicado, que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación estabilizada de ADAMTS13 (A13) que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) menos de 100 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
En una realización, la presente invención proporciona una formulación con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13) para el uso reivindicado, que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o<h>E<p>ES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13) para el uso reivindicado, que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 60 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
En una realización relacionada, la presente invención proporciona una formulación liofilizada estabilizada de ADAMTS13 (A13) para el uso reivindicado, en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada para el uso reivindicado, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación liofilizada estabilizada de ADAMTS13 (A13) para el uso reivindicado, en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) menos de 100 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
En una realización relacionada, la presente invención proporciona una formulación liofilizada con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13) para el uso reivindicado, en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación liofilizada con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13) para el uso reivindicado, en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 60 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
IV. Estabilidad de las formulaciones de ADAMTS13
En determinadas realizaciones, las formulaciones de ADAMTS13 proporcionadas en esta memoria pueden ser estables durante un periodo prolongado de tiempo cuando se almacenan a una determinada temperatura, por ejemplo, a aproximadamente -80 °C, -20 °C, 4 °C, 18 °C, temperatura ambiente, 25 °C, 30 °C, 35 °C, 37 °C, 40 °C o mayor. En algunas realizaciones, un periodo prolongado de tiempo es de al menos aproximadamente una semana. En otras realizaciones, un periodo prolongado de tiempo puede comprender al menos aproximadamente 2 semanas, o al menos aproximadamente 3 semanas, o al menos aproximadamente 1 mes, o al menos aproximadamente 2 meses, o al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16 o 18 meses. En otras realizaciones más, las formulaciones de la invención pueden ser estables durante al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5 o más años.
En determinadas realizaciones de la invención, la estabilidad puede medirse mediante una o más propiedades biofísicas y/o enzimáticas de la proteína A13 o rA13 en la formulación. Ejemplos no limitantes de propiedades que pueden usarse para evaluar la estabilidad incluyen la actividad enzimática, la actividad específica, el grado de mono- o polidispersidad de la proteína, el grado de dimerización, oligomerización o agregación de la proteína y el grado de desplegamiento de la proteína.
Un experto en la técnica conocerá fácilmente otras medidas de estabilidad que pueden emplearse para evaluar la estabilidad de una formulación de ADAMTS13, incluyendo, sin limitación, filtración en gel, dispersión de luz dinámica o estática, ultracentrifugación analítica, rp-HPLC, cromatografía de intercambio iónico, espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier, calorimetría, calorimetría diferencial de barrido, espectroscopia de RMN, espectrometría de masas, dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAX), electroforesis en gel de poliacrilamida y similares.
En una realización, la presente invención proporciona formulaciones de A13 o rA13 para el uso reivindicado, que conservan al menos aproximadamente un 50 % de la actividad total de ADAMTS13 después de almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo. En otras realizaciones, se proporciona una formulación que conserva al menos aproximadamente un 60 %, o al menos aproximadamente un 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de la actividad total de ADAMTS13 después de almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo.
En otra realización, se proporcionan formulaciones que mantienen al menos aproximadamente un 50 % de la actividad específica de ADAMTS13 después de almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo. En otras realizaciones, se proporciona una formulación que conserva al menos aproximadamente un 60 %, o al menos aproximadamente un 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de la actividad específica de ADAMTS13 después de almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo.
En otras realizaciones, las formulaciones de la invención poseerán una actividad específica de al menos aproximadamente 600 U de actividad FRETS-VWF73 por mg de proteína ADAMTS13 después de almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo. En otras realizaciones, una formulación proporcionada en esta memoria tendrá al menos aproximadamente 700 U/mg de A13, o al menos aproximadamente 800 U/mg, 900 U/mg, 1000 U/mg, 1100 U/mg, 1200 U/mg, 1300 U/mg, 1400 U/mg, 1500 U/mg o mayor actividad específica después de almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo.
En una realización, una formulación de A13 proporcionada en esta memoria tendrá una polidispersidad, determinada por análisis de dispersión de luz dinámica, de menos de aproximadamente un 50 % después de almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo. En otras realizaciones, una formulación de A13 tendrá una polidispersidad de menos de aproximadamente un 45 %, o de menos de aproximadamente un 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % de polidispersidad, medida por análisis de dispersión de luz dinámica después de almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo.
En otra realización de la invención, una formulación de A13 proporcionada en esta memoria tendrá una población de proteína A13 que consiste en al menos aproximadamente un 50 % de monómeros de A13 después de almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo. En otras realizaciones, una formulación puede tener al menos aproximadamente un 60 % de monómeros de A13, o al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un porcentaje mayor de monómeros de A13.
V. Expresión y purificación de ADAMTS13
En determinadas realizaciones, una proteína ADAMTS13 usada en las formulaciones proporcionadas en esta memoria puede expresarse, producirse o purificarse según un método descrito previamente, por ejemplo, en los documentos US 6,926,894, US 2005/0266528, US 2007/0015703, la solicitud de patente de Estados Unidos n.° de serie 12/437,384, la solicitud de patente de Estados Unidos n.° de serie 12/847,999 y el documento WO 2002/42441, que se incorporan todos por la presente por referencia en su totalidad a todos los efectos.
A. Células hospedadoras y vectores
Las proteínas ADAMTS recombinantes pueden producirse mediante expresión en cualquier sistema hospedador procariota o eucariota adecuado. Ejemplos de células eucariotas incluyen, sin limitación, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep y HepG2; células de insecto, por ejemplo, células SF9, células SF21, células S2 y células High Five; y células de levadura, por ejemplo, células deSaccharomycesoSchizosaccharomyces.En una realización, las proteínas ADAMTs pueden expresarse en células bacterianas, células de levadura, células de insecto, células de ave, células de mamífero y similares. Por ejemplo, en una línea celular humana, una línea celular de hámster o una línea celular murina. En una realización particular, la línea celular es una línea celular CHO, BHK o HEK. En una realización preferida, la línea celular es una línea celular CHO.
En una realización, las células pueden ser cualquier célula de mamífero que pueda cultivarse, preferiblemente en un proceso de fabricación (es decir, al menos 1 litro), para producir una proteína ADAMTS deseada tal como ADAMTS13. Ejemplos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Grahamet al.,J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR, tal como el subclón DUKX-B11 (CHO, Uriaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervicouterino humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Matheret al.,Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y la línea de hepatoma humano (Hep G2). Preferiblemente, la línea celular es una línea celular de roedor, especialmente una línea celular de hámster tal como CHO o BHK.
Puede usarse una amplia variedad de vectores para la expresión de una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) y puede seleccionarse de vectores de expresión eucariotas y procariotas. En determinadas realizaciones, se contempla un vector plasmídico para su uso en la expresión de una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13). En general, se usan vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicón y control derivadas de especies compatibles con la célula hospedadora en relación con estos hospedadores. El vector puede portar un sitio de replicación, así como secuencias de marcado que pueden proporcionar selección fenotípica en células transformadas. El plásmido comprenderá una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) unida de forma funcional a una o más secuencias de control, por ejemplo, un promotor.
Un método preferido de preparación de clones de células CHO estables que expresan una proteína ADAMTS recombinante es como sigue. Una línea celular CHO deficiente en DHFR, DUKX-B 11, se transfecta con un vector de expresión de DHFR para la expresión de la proteína recombinante relevante, esencialmente como se describe en la patente de Estados Unidos número 5,250,421 (Kaufmanet al.,Genetics Institute, Inc.). La selección se lleva a cabo mediante el crecimiento en medios sin hipoxantina/timidina (HT) y la amplificación de la región relevante que codifica la expresión de la proteína ADAMTS recombinante y el gen DHFR se logra mediante la propagación de las células en concentraciones crecientes de metotrexato. Cuando sea apropiado, las líneas celulares CHO pueden adaptarse para el crecimiento en medio sin suero y/o proteínas, esencialmente como se describe en el documento US 6,100,061 (Reiteret al.,Immuno Aktiengesellschaft).
En otra realización preferida, las células HEK293 estables se preparan transfectándolas con una construcción que contiene un marcador de selección por higromicina y seleccionando transformantes por resistencia al antibiótico.
La capacidad de determinados virus de infectar células o entrar en las células mediante endocitosis mediada por receptor, y de integrarse en el genoma de la célula hospedadora y expresar genes víricos de manera estable y eficaz los ha convertido en candidatos atractivos para la transferencia de ácidos nucleicos exógenos a las células (por ejemplo, células de mamífero). Por consiguiente, en determinadas realizaciones, se usa un vector vírico para introducir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en una célula hospedadora para su expresión. El plásmido vírico comprenderá una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) unida de forma funcional a una o más secuencias de control, por ejemplo, un promotor. Alternativamente, el vector vírico puede no contener una secuencia de control y, en cambio, dependerá de una secuencia de control dentro de la célula hospedadora para dirigir la expresión de la proteína ADAMTS. Ejemplos no limitantes de vectores víricos que pueden usarse para administrar un ácido nucleico incluyen vectores adenovíricos, vectores AAV y vectores retrovíricos.
En una realización, un vector de expresión adenovírico incluye aquellas construcciones que contienen secuencias de adenovirus suficientes para sustentar el empaquetamiento de la construcción y para expresar en última instancia una construcción de ADAMTS que se ha clonado en el mismo. Los vectores adenovíricos permiten la introducción de secuencias exógenas de hasta 7 kb (Grunhauset al.,Seminar in Virology, 200(2): 535-546, 1992)).
En otra realización, puede usarse un virus adenoasociado (AAV) para introducir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en una célula hospedadora para su expresión. Los sistemas AAV se han descrito previamente y en general son bien conocidos en la técnica (Kelleher y Vos, Biotechniques, 17(6): 1110-7, 1994; Cottenet al.,Proc Natl Acad Sci USA, 89(13): 6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3): 141-64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158: 97-129, 1992). Los detalles relativos a la generación y el uso de vectores rAAV se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 5,139,941 y 4,797,368, cada una de ellas incorporada en esta memoria por referencia en su totalidad a todos los efectos.
En una realización, puede usarse un vector de expresión retrovírico para introducir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en una célula hospedadora para su expresión. Estos sistemas se han descrito previamente y en general son bien conocidos en la técnica (Mannet al.,Cell, 33: 153-159, 1983; Nicolas y Rubinstein, En: Vectors: A survey of molecular cloning vectores and their uses, Rodríguez y Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pág. 494-513, 1988; Temin, En: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nueva York: Plenum Press, pág. 149-188, 1986). En una realización específica, el vector retrovírico es un vector lentivírico (véase, por ejemplo, Naldiniet al.,Science, 272(5259): 263-267, 1996; Zuffereyet al.,Nat Biotechnol, 15(9): 871-875, 1997; Blomeret al.,J Virol., 71(9): 6641-6649, 1997; patentes de Estados Unidos n.° 6,013,516 y 5,994,136).
Ejemplos no limitantes de vectores para expresión procariota incluyen plásmidos tales como pRSET, pET, pBAD, etc., en donde los promotores usados en los vectores de expresión procariota incluyen lac, trc, trp, recA, araBAD, etc. Ejemplos de vectores para expresión eucariota incluyen: (i) para expresión en levadura, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, que usan promotores tales como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc.; (ii) para expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., que usan promotores tales como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas víricos tales como virus de la variolovacuna, virus adenoasociados, virus del herpes, retrovirus, etc., que usan promotores tales como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV y p-actina.
En determinadas realizaciones, la expresión en cultivo celular de ADAMTS13 puede comprender el uso de un microportador. La presente invención proporciona, entre otros aspectos, métodos de expresión de proteína ADAMTS a gran escala. En algunas realizaciones, los cultivos celulares de las realizaciones pueden realizarse en biorreactores grandes en condiciones adecuadas para proporcionar áreas superficiales de cultivo específicas de alto volumen para lograr altas densidades celulares y expresión de proteínas. Un medio para proporcionar dichas condiciones de crecimiento es usar microportadores para cultivo celular en biorreactores de tanque agitado. En otra realización, estos requisitos de crecimiento se cumplen mediante el uso de un cultivo celular en suspensión.
B. Métodos de cultivo
En determinadas realizaciones, la expresión de ADAMTS13 puede comprender el uso de un sistema de cultivo celular manejado en un modo de funcionamiento discontinuo o continuo. Por ejemplo, cuando se usan cultivos celulares discontinuos, pueden manejarse en modo de un solo lote, lote alimentado o lote repetido. Asimismo, los cultivos celulares continuos pueden manejarse en modo, por ejemplo, de perfusión, turbidostato o quimiostato. El cultivo celular discontinuo y continuo se puede realizar en condiciones de suspensión o de adherencia. Cuando se maneja en condiciones de suspensión, las células quedarán suspendidas libremente y mezcladas dentro del medio de cultivo. Alternativamente, en condiciones de adherencia, las células se unirán a una fase sólida, por ejemplo, un microportador, un microportador poroso, un portador de disco, un cartucho cerámico, una fibra hueca, una lámina plana, una matriz de gel y similares.
Un cultivo discontinuo es típicamente un cultivo celular a gran escala en que un inóculo celular se cultiva hasta una densidad máxima en un tanque o fermentador, y se recoge y procesa como un solo lote. Un cultivo de lote alimentado es típicamente un cultivo discontinuo al que se le suministran nutrientes frescos (por ejemplo, sustratos limitantes del crecimiento) o aditivos (por ejemplo, precursores de productos). La solución de alimentación suele estar muy concentrada para evitar la dilución del biorreactor. En un cultivo de lote repetido, las células se colocan en un medio de cultivo y se cultivan hasta una densidad celular deseada. Para evitar la aparición de una fase de declive y muerte celular, el cultivo entonces se diluye con medio de crecimiento completo antes de que las células alcancen su concentración máxima. La cantidad y frecuencia de dilución varían ampliamente y dependen de las características de crecimiento de la línea celular y de la conveniencia del proceso de cultivo. El proceso puede repetirse tantas veces como sea necesario y, a menos que se descarten las células y el medio en subcultivo, el volumen del cultivo aumentará gradualmente a medida que se realice cada dilución. El volumen creciente puede controlarse teniendo un reactor de tamaño suficiente para permitir diluciones dentro del recipiente o dividiendo el cultivo diluido en varios recipientes. El fundamento de este tipo de cultivo es mantener las células en un estado de crecimiento exponencial. El subcultivo en serie se caracteriza porque el volumen de cultivo siembre está aumentando gradualmente, puede haber múltiples recogidas, las células siguen creciendo y el proceso puede continuar durante el tiempo que se desee. En determinadas realizaciones, una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) puede recuperarse después de recoger el sobrenadante de un cultivo discontinuo.
Un cultivo continuo puede ser un cultivo en suspensión al que se suministran continuamente nutrientes mediante la entrada de medio fresco, en donde el volumen de cultivo se mantiene habitualmente constante mediante la retirada concomitante del medio usado. En los métodos de quimiostato y turbidostato, el medio extraído contiene células. Por tanto, las células que quedan en el recipiente de cultivo celular deben crecer para mantener un estado estable. En el método de quimiostato, la tasa de crecimiento típicamente se controla controlando la tasa de dilución, es decir, la velocidad a la que se añade medio fresco. La tasa de crecimiento de las células en el cultivo puede controlarse, por ejemplo, a una tasa de crecimiento submáxima, mediante la alteración de la tasa de dilución. Por el contrario, en el método de turbidostato, la tasa de dilución se establece para permitir la máxima tasa de crecimiento que las células pueden conseguir en las condiciones de funcionamiento dadas, tales como el pH y la temperatura.
En un cultivo de perfusión, el medio extraído está empobrecido de células, que quedan retenidas en el recipiente de cultivo, por ejemplo, mediante filtración o mediante métodos centrífugos que dan lugar a la reintroducción de las células en el cultivo. Sin embargo, típicamente las membranas usadas para filtración no retienen el 100 % de las células, por lo que una parte se retira cuando se extrae el medio. Puede que no sea crucial realizar cultivos de perfusión a tasas de crecimiento muy altas, ya que la mayoría de las células quedan retenidas en el recipiente de cultivo.
El sistema de reactor de tanque agitado puede usarse para cultivos celulares discontinuos y continuos manejados en modo de suspensión o adherente. En general, el sistema de reactor de tanque agitado puede manejarse como cualquier reactor de tanque agitado convencional con cualquier tipo de agitador, tal como un Rushton, de hidropala, de paletas inclinadas o marino.
C. Medios de cultivo
ADAMTS13 puede expresarse en medios de cultivo que estén exentos de proteínas añadidas de forma exógena. "Medio de cultivo sin proteínas" y expresiones relacionadas se refieren a un medio de cultivo que carece de proteínas que provienen de una fuente exógena o distinta a las células del cultivo, que desprenden de forma natural proteínas durante el crecimiento. En una realización, una proteína ADAMTS13 puede expresarse en un medio que está exento de proteínas añadidas de forma exógena (es decir, sin proteínas) y está complementado con cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, el medio de cultivo sin proteínas contiene una poliamina. Por ejemplo, en una concentración de al menos 2 mg/l, o de o aproximadamente entre 2 mg/l y 30 mg/l, o de o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realización específica, la poliamina es putrescina. Se muestran medios de cultivo sin proteínas ejemplares en las patentes de Estados Unidos números 6,171,825 y 6,936,441, el documento WO 2007/077217, las publicaciones de solicitud de patentes de Estados Unidos números 2008/0009040 y 2007/0212770, y la solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 12/847,999, cuyas descripciones se incorporan en esta memoria por referencia en su totalidad a todos los efectos.
Se conocen en la técnica métodos de preparación de medios de cultivo sin proteínas animales y químicamente definidos, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 6,171,825 y 6,936,441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 2008/0009040 y 2007/0212770, cuyas descripciones se incorporan en esta memoria por referencia en su totalidad a todos los efectos. En una realización, el medio de cultivo usado para expresar una proteína ADAMTS13 es un medio sin proteínas o sin oligopéptidos animales. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo puede ser químicamente definido. En determinadas realizaciones, los medios de cultivo pueden contener al menos una poliamina en una concentración de aproximadamente 0,5 mg/l a aproximadamente 10 mg/l.
La proteína ADAMTS13 también puede expresarse en medios de cultivo que estén exentos de oligopéptidos añadidos de forma exógena. En una realización, ADAMTS13 se expresa en un medio de cultivo que está exento de oligopéptidos añadidos de forma exógena (es decir, sin polipéptidos) y está complementado con cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, el medio de cultivo sin oligopéptidos contiene una poliamina. Por ejemplo, en una concentración de al menos 2 mg/l, o de o aproximadamente entre 2 mg/l y 30 mg/l, o de o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realización específica, la poliamina es putrescina. Se muestran medios de cultivo sin oligopéptidos ejemplares en las patentes de Estados Unidos números 6,171,825 y 6,936,441, el documento WO 2007/077217, las publicaciones de solicitud de patentes de Estados Unidos números 2008/0009040 y 2007/0212770, y la solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 12/847,999.
La proteína ADAMTS13 también puede expresarse en medios de cultivo que estén exentos de suero. En una realización, ADAMTS13 se expresa en un medio de cultivo que está exento de suero añadido de forma exógena (es decir, sin suero) y está complementado con cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, el medio de cultivo sin suero contiene una poliamina. Por ejemplo, en una concentración de al menos 2 mg/l, o de o aproximadamente entre 2 mg/l y 30 mg/l, o de o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realización específica, la poliamina es putrescina. Se muestran medios de cultivo sin suero ejemplares en las patentes de Estados Unidos números 6,171,825 y 6,936,441, el documento WO 2007/077217, las publicaciones de solicitud de patentes de Estados Unidos números 2008/0009040 y 2007/0212770, y la solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 12/847,999.
La proteína ADAMTS13 también puede expresarse en medios de cultivo que estén exentos de proteínas animales. En una realización, ADAMTS13 se expresa en un medio de cultivo que está exento de proteínas y polipéptidos animales añadidos de forma exógena (es decir, sin proteínas animales) y está complementado con cinc, calcio y/o nicotinamida (vitamina B3). En determinadas realizaciones, el medio de cultivo sin proteínas animales contiene una poliamina. Por ejemplo, en una concentración de al menos 2 mg/l, o de o aproximadamente entre 2 mg/l y 30 mg/l, o de o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l. En una realización específica, la poliamina es putrescina. Se muestran medios de cultivo sin proteínas animales ejemplares en las patentes de Estados Unidos números 6,171,825 y 6,936,441, el documento WO 2007/077217, las publicaciones de solicitud de patentes de Estados Unidos números 2008/0009040 y 2007/0212770, y la solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 12/847,999.
Las proteínas ADAMTS13 también pueden expresarse en medios de cultivo complementados con calcio, cinc y/o vitamina B3 adicionales, como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° de serie 12/847,999, cuya divulgación se incorpora en esta memoria por referencia en su totalidad a todos los efectos. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio sin proteínas animales, sin oligopéptidos o químicamente definido. En determinadas realizaciones, el medio sin proteínas animales o sin oligopéptidos se prepara como se muestra en las patentes de Estados Unidos números 6,171,825 y 6,936,441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 2008/0009040 y 2007/0212770, y se complementa con calcio, cinc y/o vitamina B3 adicionales. En una realización específica, el medio de cultivo químicamente definido puede ser similar a un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), que se ha complementado con calcio, cinc y/o vitamina B3 adicionales, para aumentar la actividad específica de una proteína ADAMTS expresada en una célula cultivada en el medio. En otras realizaciones más, el medio de cultivo está exento de componentes animales. En otra realización, el medio de cultivo contiene proteína, por ejemplo, proteína animal de suero, tal como suero bovino fetal. En otra realización, el cultivo tiene proteínas recombinantes añadidas de forma exógena. En otra realización, las proteínas proceden de un animal certificado como libre de patógenos.
D. Purificación ADAMTS13
Los métodos para la purificación de ADAMTS13 natural a partir de plasma combinado son bien conocidos en la técnica. Asimismo, los métodos para la expresión y purificación de ADAMTS13 recombinante también son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la expresión recombinante y purificación se muestran por Plaimauer y Scheiflinger, Semin Hematol. 2004 Ene; 41(1): 24-33; Plaimauer Bet al.,F. Blood. 2002 Nov 15; 100(10): 3626 32. Publicación electrónica de 2002 Jul 12; Bruno Ket al.,J Thromb Haemost. 2005 May; 3(5): 1064-73, y la solicitud de patente de Estados Unidos n.° de serie 12/847,999.
Además, la presente descripción proporciona métodos adicionales para la purificación de ADAMTS13 recombinante. En una realización, ADAMTS13 recombinante se expresa en células CHO recombinantes y se purifica del medio acondicionado resultante mediante cromatografía de intercambio catiónico en POROS HS. Para eliminar ADAMTS13 dimérico, monomérico y/o agregado indeseable, la composición entonces se somete a filtración en gel de exclusión por tamaño. Las composiciones de ADAMTS13 en general también se someterán a al menos uno, preferiblemente dos, etapas de eliminación o inactivación vírica.
En determinadas realizaciones, los métodos proporcionados en esta memoria para la preparación de una formulación de ADAMTS13 incluirán además al menos una etapa de inactivación o eliminación vírica. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionados en esta memoria incluirán al menos dos o al menos tres etapas de inactivación o eliminación vírica. Ejemplos no limitantes de etapas de inactivación o eliminación vírica que pueden emplearse con los métodos proporcionados en esta memoria incluyen tratamiento con detergente disolvente (Horowitzet al.,Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Supl. 3): S21-S28 y Kreilet al.,Transfusion 2003 (43): 1023-1028), nanofiltración (Hamamotoet al.,Vox Sang 1989 (56)230-236 y Yuasaet al.,J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)): 2021-2024). En una realización preferida, la presente invención proporciona métodos para la preparación de una formulación de ADAMTS13 que comprende tratamiento con detergente disolvente y nanofiltración.
En una realización, se proporciona un método para proporcionar una formulación de proteína ADAMTS13 víricamente segura, comprendiendo el método las etapas de (a) cultivar una célula que alberga un ácido nucleico que codifica una proteína ADAMTS13 en un medio de cultivo; (b) recuperar una parte del sobrenadante del medio de cultivo que contiene la proteína ADAMTS13; (c) enriquecer la proteína ADAMTS13 con una etapa cromatográfica; (d) realizar al menos un etapa de inactivación o eliminación vírica; y (e) formular la composición de ADAMTS13 enriquecida según una formulación proporcionada en esta memoria, proporcionando de este modo una formulación de ADAMTS13 víricamente segura. En una realización, el medio de cultivo contiene cinc, calcio y, opcionalmente, nicotinamida (vitamina B3). En una realización preferida, la etapa de cultivar una célula comprende un cultivo continuo (por ejemplo, cultivo de perfusión o quimiostático). En otra realización preferida, el cultivo se mantiene a una temperatura entre 34 °C y 37 °C. En otra realización preferida más, el cultivo se mantiene a un pH entre 6,9 y 7,2. En una realización, la etapa de eliminación vírica es nanofiltración.
En una realización, se describe un método para fabricar una formulación de ADAMTS13 estabilizada, comprendiendo el método las etapas de: (a) expresar una proteína ADAMTS13, o un derivado biológicamente activo de la misma, en una célula cultivada en un medio que comprende cinc en una concentración de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 12 pM y calcio en una concentración de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1,5 mM; (b) purificar la proteína ADAMTS13; y (c) preparar una formulación según una cualquiera de las formulaciones proporcionadas en esta memoria.
En una realización, se describe un método para fabricar una formulación de ADAMTS13 estabilizada, comprendiendo el método las etapas de: (i) expresar una proteína ADAMTS13, o un derivado biológicamente activo de la misma, en una célula cultivada en un medio que comprende cinc en una concentración de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 12 pM y calcio en una concentración de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1,5 mM; (ii) purificar la proteína ADAMTS13; y (iii) preparar una formulación que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 200 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación estabilizada para el uso reivindicado de ADAMTS13 (A13), que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) menos de 100 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
En una realización, se describe un método para fabricar una formulación de ADAMTS13 estabilizada, comprendiendo el método las etapas de: (i) expresar una proteína ADAMTS13, o un derivado biológicamente activo de la misma, en una célula cultivada en un medio que comprende cinc en una concentración de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 12 pM y calcio en una concentración de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1,5 mM; (ii) purificar la proteína ADAMTS13; y (iii) preparar una formulación que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o<h>E<p>ES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7.5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13) para el uso reivindicado, que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 60 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
En una realización, se describe un método para fabricar una formulación de ADAMTS13 estabilizada, comprendiendo el método las etapas de: (i) expresar una proteína ADAMTS13, o un derivado biológicamente activo de la misma, en una célula cultivada en un medio que comprende cinc en una concentración de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 12 pM y calcio en una concentración de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1,5 mM; (ii) purificar la proteína ADAMTS13; y (iii) preparar una formulación que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 200 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7.5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación liofilizada estabilizada de ADAMTS13 (A13) para el uso reivindicado, en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) menos de 100 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
En una realización, la presente invención proporciona un método para fabricar una formulación de ADAMTS13 estabilizada, comprendiendo el método las etapas de: (i) expresar una proteína ADAMTS13, o un derivado biológicamente activo de la misma, en una célula cultivada en un medio que comprende cinc en una concentración de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 12 pM y calcio en una concentración de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1,5 mM; (ii) purificar la proteína ADAMTS13; y (iii) preparar una formulación que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación liofilizada con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13), en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 60 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
1. Tratamiento con disolvente y detergente (S/D)
Para inactivar diversos contaminantes víricos que puedan estar presentes en una formulación de ADAMTS13, una o más soluciones intermedias de ADAMTS13 pueden someterse a un tratamiento con detergente disolvente (S/D). Los métodos para el tratamiento con detergente de soluciones son bien conocidos en la técnica (para su recapitulación, véase, Pelletier JPet al.,Best Pract Res Clin Haematol. 2006; 19(1): 205-42. En general, puede usarse cualquier tratamiento convencional con S/D junto con los métodos proporcionados en esta memoria. A continuación se proporciona, por ejemplo, un protocolo ejemplar para un tratamiento con S/D.
En una realización, se añade Triton X-100, Tween-20 y tri(n-butil)fosfato (TNBP) a una solución intermedia de ADAMTS13 en concentraciones finales de o aproximadamente un 1,0 %, 0,3 % y 0,3 %, respectivamente. Entonces se agita la mezcla a una temperatura de o aproximadamente entre 18 °C y 25 °C durante al menos una hora.
2. Nanofiltración y ultra/diafiltración
Para reducir la carga vírica de una formulación de proteína ADAMTS13 proporcionada en esta memoria, la formulación, o una composición intermedia, puede nanofiltrarse usando un dispositivo de nanofiltración adecuado. En determinadas realizaciones, el dispositivo de nanofiltración tendrá un tamaño medio de poro de o aproximadamente entre de 15 nm y 200 nm. Ejemplos de nanofiltros adecuados para este uso incluyen, sin limitación, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP®, Viresolve NFR® (Millipore), Planova® 15N, 20N, 35N y 75N (Planova). En una realización específica, el nanofiltro puede tener un tamaño medio de poro de o aproximadamente entre 15 y 72 nm, o de o aproximadamente entre 19 y 35 nm, o de o aproximadamente 15 nm, 19 nm, 20 nm, 35 nm o 72 nm. En una realización preferida, el nanofiltro tendrá un tamaño medio de poro de o aproximadamente 19 nm, 20 nm o 35 nm, tal como un filtro Asahi PLANOVA® 20N o PLANOVA® 35n o equivalente del mismo.
Posteriormente a la nanofiltración, el filtrado opcionalmente puede concentrarse mediante ultrafiltración y/o la composición de tampón puede ajustarse mediante diafiltración. En determinadas realizaciones, la ultrafiltración se lleva a cabo en un casete con un tamiz de canal abierto y la membrana de ultrafiltración tiene un límite de peso molecular nominal (NMWCO) de menos de o aproximadamente 175 kDa o menos de o aproximadamente 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 o menos kDa. En una realización preferida, la membrana de ultrafiltración tiene un NMWCO de no más de 30 kDa. En otra realización preferida, la membrana de ultrafiltración tiene un NMWCO de no más de 30 kDa.
3. Liofilización y tratamiento térmico
En otras realizaciones más, la actividad vírica de una formulación de ADAMTS13 liofilizada, que puede haberse sometido previamente a otras etapas de inactivación o eliminación vírica tales como nanofiltración, puede reducirse aún más mediante tratamiento térmico de la composición liofilizada. Los tratamientos térmicos para la inactivación de cargas víricas en factores sanguíneos son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase, Piszkiewiczet al.,Thromb Res. 1987 Jul 15; 47(2): 235-41; Piszkiewiczet al.,Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989; (56): 44-54; Epstein y Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar; 114(3): 335-40).
VI. Administración y métodos de tratamiento
Las formulaciones pueden administrarse para tratamientos terapéuticos o profilácticos. En general, para aplicaciones terapéuticas, las formulaciones se administran a un sujeto con una enfermedad o afección asociada con disfunción de ADAMTS13 o VWF o que lo necesita de otro modo, en una "dosis terapéuticamente eficaz". Las formulaciones y cantidades eficaces para estos usos dependerán de la gravedad de la enfermedad o afección y del estado general de salud del paciente. Puede administrarse una sola administración o múltiples administraciones de las formulaciones dependiendo de la dosis y la frecuencia requeridas y toleradas por el paciente.
Un "paciente" o "sujeto" a los efectos de la presente invención incluye tanto seres humanos como otros animales, particularmente mamíferos. Por tanto, las composiciones, formulaciones y métodos pueden se aplicables tanto al tratamiento de seres humanos como en aplicaciones veterinarias. En una realización particular, el paciente es un mamífero y, en una realización, es un ser humano. Pueden usarse otros tratamientos y terapias conocidos para afecciones asociadas con la disfunción de ADAMTS13 o VWF en combinación con las formulaciones y métodos proporcionados por la invención. Se describen
métodos de preparación de una formulación de rA13 estabilizada que tenga altas actividades específicas. En una realización, el método comprende las etapas de expresar una proteína ADAMTS13, o un derivado biológicamente activo de la misma, en una célula cultivada en un medio que comprende cinc en una concentración de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 12 pM y calcio en una concentración de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1,5 mM, purificar la proteína A13 y preparar una formulación como se describe anteriormente. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo se complementa además con vitamina B3 en una concentración de aproximadamente 1 mg/l a aproximadamente 20 mg/l.
Se describen métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad o afección asociada con una disfunción de ADAMTS13 o VWF. Se describen métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad o afección asociada con la formación y/o presencia de uno o más trombos. Se describen métodos de desintegración de uno o más trombos en un sujeto que lo necesita. Se describen métodos de tratamiento o prevención de un infarto en un sujeto que lo necesita. En general, los métodos comprenden administrar una formulación de ADAMTS13 que se proporciona en esta memoria a un sujeto que la necesita.
Ejemplos no limitantes de trastornos asociados con la formación y/o presencia de uno o más trombos son púrpura trombocitopénica trombótica hereditaria (TTP), TTP adquirida, trombosis arterial, infarto agudo de miocardio (AMI), apoplejía, septicemia y coagulación intravascular diseminada (DIC).
Ejemplos no limitantes de trastornos asociados con un infarto incluyen, sin limitación, infarto de miocardio (ataque cardiaco), embolia pulmonar, acontecimientos cerebrovasculares tales como apoplejía, arteriopatía oclusiva periférica (tal como gangrena), síndrome antifosfolipídico, septicemia, arteritis de gigantocitos (GCA), hernia y vólvulo.
A. Tratamiento y profilaxis para la disfunción de ADAMTS13 y vWF Se describe
un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con una disfunción de ADAMTS13 o VWF, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 según una cualquiera de las formulaciones proporcionadas en esta memoria.
Se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con una disfunción de ADAMTS13 o VWF, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 200 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación estabilizada de ADAMTS13 (A13) que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 200 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
Se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con una disfunción de ADAMTS13 o VWF, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o<h>E<p>ES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13) que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 60 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
Se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con una disfunción de ADAMTS13 o VWF, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 200 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación liofilizada estabilizada de ADAMTS13 (A13), en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 200 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
Se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con una disfunción de ADAMTS13 o VWF, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación liofilizada con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13), en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 60 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
B. Tratamiento y profilaxis de enfermedades y afecciones trombóticas
Se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección con la formación y/o presencia de un trombo, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 según una cualquiera de las formulaciones proporcionadas en esta memoria.
Se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con la formación y/o presencia de un trombo, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de Ad a Mt S13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 200 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación estabilizada de ADAMTS13 (A13) que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 200 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
Se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con la formación y/o presencia de un trombo, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de A<d a>M<t>S13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o<h>E<p>ES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13) que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 60 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
Se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con la formación y/o presencia de un trombo, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 200 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación liofilizada estabilizada de ADAMTS13 (A13) para el uso reivindicado, en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 200 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
Se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con la formación y/o presencia de un trombo, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de Ad a Mt S13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADAMTS13; (b) de 0 mM a 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación liofilizada con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13), en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 60 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
C. Tratamiento y profilaxis de un infarto
Se describe un método para tratar o prevenir un infarto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 según una cualquiera de las formulaciones proporcionadas en esta memoria.
Se describe un método para tratar o prevenir un infarto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADa Mt S13; (b) de 0 mM a 200 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación estabilizada de ADAMTS13 (A13) que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 200 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
Se describe un método para tratar o prevenir un infarto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de AD<a>M<t>S13; (b) de 0 mM a 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o h Ep ES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13) que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 60 mM de NaCI; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
Se describe un método para tratar o prevenir un infarto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de ADa Mt S13; (b) de 0 mM a 200 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico. En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación liofilizada estabilizada de ADAMTS13 (A13), en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 200 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
Se describe un método para tratar o prevenir un infarto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una formulación de ADAMTS13 que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 (es decir, actividad FRETS-vWF73) por mg de AD<a>M<t>S13; (b) de 0 mM a 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable; (c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio; (d) un glúcido y/o alditol; (e) un tensioactivo no iónico; y (f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 200 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 400 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 600 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización más preferida, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 800 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En otra realización preferida más, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende al menos 1000 unidades de actividad de A13 por mg de ADAMTS13. En una realización, la formulación estabilizada de ADAMTS13 comprende entre aproximadamente 100 unidades y aproximadamente 2000 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10,0 mM de calcio. En una realización preferida, la formulación contiene entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mM de calcio.
En otra realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 6 % de un glúcido y/o alditol. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 5 % de un glúcido y/o alditol. En una realización específica, la formulación comprende aproximadamente un 4 % de un glúcido y/o alditol. En una realización, el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos. En una realización preferida, el glúcido y/o alditol es una mezcla de sacarosa y manitol.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente un 0,01 % y aproximadamente un 0,1 % de un tensioactivo no iónico. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente un 0,05 % de un tensioactivo no iónico.
En una realización, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35. En una realización preferida, el tensioactivo es polisorbato 80.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM de un agente tamponante. En una realización preferida, la formulación comprende entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM de un agente tamponante. En otra realización, el agente tamponante es histidina o HEPES. En una realización preferida, el agente tamponante es histidina. En una realización, el pH de la formulación está entre aproximadamente 6,5 y 7,5. En una realización preferida, el pH de la formulación es 7,0 ± 0,2.
En una realización de la formulación de A13 liofilizada con bajo contenido salino estabilizada, la formulación comprende además entre aproximadamente 0,5 pM y 20 pM de cinc.
En una realización específica, la presente invención proporciona una formulación liofilizada con bajo contenido salino estabilizada de ADAMTS13 (A13), en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida que comprende (a) al menos 100 unidades de actividad de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) de 0 a 60 mM de NaCl; (c) de 2 mM a 4 mM de calcio; (d) de un 2 % a un 4 % de manitol; (e) de un 0,5 % a un 2 % de sacarosa; (f) de un 0,025 a un 0,1 % de polisorbato 80; y (g) de 10 mM a 50 mM de histidina (pH 7,0 ± 0,2).
VII. Kits de ADAMTS13
Se describen kits que se proporcionan para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la disfunción de ADAMTS13 o VWF. En una realización, el kit comprende una formulación de A13 o rA13, como se proporciona anteriormente. En algunas realizaciones, los kits proporcionados en esta memoria pueden contener una o más dosis de una formulación líquida o liofilizada que se proporciona en esta memoria. Cuando los kits comprenden una formulación de A13 o rA13 liofilizada, en general los kits también contendrán un líquido adecuado para la reconstitución de la formulación líquida, por ejemplo, agua aséptica o un tampón farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, los kits pueden comprender una formulación de ADAMTS13 preenvasada en una jeringa para administración por un profesional de la salud o para uso doméstico.
Se describe un kit proporcionado que comprende entre aproximadamente 10 unidades de actividad FRETS-VWF73 y aproximadamente 10000 unidades de actividad FRETS-VWF73. En otras realizaciones, el kit puede proporcionar, por ejemplo, entre aproximadamente 20 unidades de actividad FRETS-VWF73 (U<f v 73>) y aproximadamente 8000 unidades de actividad FRETS-VWF73, o entre aproximadamente 30 U<f v 73>y aproximadamente 6000 U<f v 73>, o entre aproximadamente 40 U<f v 73>y aproximadamente 4000 U<f v 73>, o entre aproximadamente 50 U<f v 73>y aproximadamente 3000 U<f v 73>, o entre aproximadamente 75 U<f v 73>y aproximadamente 2500 U<f v 73>, o entre aproximadamente 100 U<f v 73>y aproximadamente 2000 U<f v 73>, o entre aproximadamente 200 U<f v 73>y aproximadamente 1500 U<f v 73>, o entre aproximadamente otros intervalos dentro de los mismos. En determinadas realizaciones, un kit puede proporcionar aproximadamente 10 unidades de actividad FRETS-VWF73, o aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 10000 o más unidades de actividad FRETS-VWF73.
En determinadas realizaciones, el kit será para una sola administración o dosis de ADAMTS13. En otras realizaciones, el kit puede contener múltiples dosis de ADAMTS13 para su administración. En una realización, el kit puede comprender una formulación de ADAMTS13 preenvasada en una jeringa para administración por un profesional de la salud o para uso doméstico.
VIII. Ejemplos
A. Ejemplo 1: Expresión de ADAMTS13 recombinante (rA13)
Se cultivó un cultivo celular en quimiostato de la línea celular CHO recombinante n.° 640-2 que expresa ADAMTS13 humana, en un medio BACD-A13 químicamente definido complementado con cinc y vitamina B3 adicionales. El cultivo de 10 l se mantuvo durante 53 días y se supervisó la producción y actividad de la proteína rA13 a lo largo del tiempo.
Las células CHO recombinantes que expresan ADAMTS13 humana se adaptaron a un medio patentado químicamente definido (medio BCS). Se descongeló un DWCB y se preparó un inóculo celular en medio BCS. Las células propagadas a partir del clon de expresión de rA13 n.° 640-2 se transfirieron a un biorreactor de 10 l con impulsores de tipo Rushton y se cultivaron en cultivos de lote repetido con medio BACD-A13 patentado a un pH controlado en línea de 7,15-7,20 a 37 °C con una concentración de oxígeno disuelto de un 20 % de saturación de aire. Después de que 2 cultivos discontinuos se desarrollaran hasta el volumen de trabajo final de 10 l, el biorreactor se cambió a alimentación de medio continua el día 5 y se hizo funcionar durante 48 días adicionales en modo de quimiostato.
Se tomaron muestras del sobrenadante de los biorreactores semanalmente y se analizaron para la producción de proteína rA13 mediante ELISA y la actividad de rA13 mediante ensayo FRETS-VWF73. Los recuentos de células se determinaron mediante tecnología Nucleocounter. Se midieron las tasas de dilución y se usaron para calcular las tasas de crecimiento y las productividades volumétricas.
En condiciones de cultivo continuo usando medio BACD-A13 químicamente definido complementado con cinc y nicotinamida a una concentración final de 1,432 mg/l de ZnSO47H2O y 7,02 mg/l de nicotinamida, se consiguieron altos niveles de producción de proteína rA13, entre 0,9 y 1,3 mg/l/d, y actividades específicas, entre aproximadamente 800 y 1100 mü/pg de rA13 (tabla 1). De forma destacable, las productividades volumétricas y específicas celulares aumentaron con el tiempo en el cultivo a largo plazo, probablemente debido a las tasas crecientes de crecimiento y dilución a lo largo del tiempo. La alta actividad específica de rA13 expresada al menos pudo mantenerse a un nivel alto y constante durante al menos las 7 semanas en que el cultivo se desarrolló en condiciones quimiostáticas. De hecho, la actividad específica de rA13 producida en el cultivo realmente aumentó de aproximadamente 800 mü/pg de A13 en la semana 2 a aproximadamente 1100 mü/pg de A13 en la semana 7.
Tabla 1. Datos de fermentación para el experimento discontinuo CP_07/18_M07: hA13 CHO clon n.° 985/1 985 DWCB n.° 01.
B. Ejemplo 2: Formulación de ADAMTS13 recombinante (rA13) purificada
ADAMTS13 recombinante se expresó en células CHO recombinantes y se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico. La rA13 purificada tenía una concentración final de aproximadamente 750 pg/ml con una actividad específica de aproximadamente 850 mü/pg. La rA13 se formuló en un tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80, a un pH de 7,0 con 20 mM de un agente tamponante seleccionado de (1) histidina, (2) tampón fosfato o (3) citrato de sodio. Luego las muestras se dividieron en partes iguales y la mitad de ellas se liofilizaron.
Las muestras liofilizadas se reconstituyeron con agua aséptica hasta un volumen final igual al de la formulación preliofilizada. Luego se caracterizó una sola alícuota de cada formulación líquida y liofilizada mediante filtración en gel cargando la muestra en una columna Superóse 6 GL (GE Healthcare). Como se puede observar en la figura 3, todas las formulaciones dieron como resultado muestras de ADAMTS13 que se desarrollaban como un único pico correspondiente a la proteína rA13 monomérica por filtración en gel.
C. Ejemplo 3: Caracterización de la retención de actividad de formulaciones de rA13 almacenadas a 4 °C y 37 °C
Muestras de rA13 formuladas y divididas en alícuotas como en el ejemplo 2 se almacenaron a 4 °C o 37 °C durante hasta 6 meses. Las formulaciones en solución se analizaron para determinar la concentración de proteína rA13, determinada por ELISA, y la actividad de rA13 mediante ensayo FRETS-VWF73 a las 0, 1,2, 3, 12 y 24 semanas (figura 1). Las muestras liofilizadas se reconstituyeron con agua aséptica hasta un volumen final igual al de la formulación preliofilizada y se analizaron de manera similar a las 0, 2, 4, 8, 12 y 24 semanas (figura 2).
Las formulaciones líquidas de rA13 almacenadas a 4 °C no mostraron pérdida ni en el contenido de antígeno, es decir, la concentración de proteína, ni en la actividad FRETS-VWF73 en puntos temporales de hasta 6 meses. Como se ve en la figura 1, este fue el caso para las tres formulaciones, tamponadas con histidina, fosfato y citrato de sodio, respectivamente. Por el contrario, las formulaciones líquidas, tamponadas con histidina o citrato de sodio, presentaron una pérdida casi completa de actividad después de una semana a 37 °C (figura 1A; ^ = histidina, □ = citrato de sodio). Esta pérdida de actividad estuvo acompañada de un aumento en el contenido de antígeno en una semana para estas muestras, lo que sugiere que las proteínas rA13 se estaban desnaturalizando. La formulación líquida con histidina de rA13 presentó un contenido de antígeno drásticamente reducido a los 3 y 6 meses, lo que sugiere que la proteína se estaba degradando. De forma destacable, la rA13 líquida formulada con tampón fosfato mostró una actividad significativa a las tres semanas cuando se almacenó a 37 °C (figura 1A; ° = tampón fosfato). De forma coherente, el contenido de antígeno de esta formulación aumentó a una tasa más lenta, lo que sugiere que la desnaturalización de rA13 se retarda cuando se formula con tampón fosfato.
Las formulaciones liofilizadas de rA13 parecieron ser estables durante al menos 6 meses cuando se almacenaron a 4 °C o 37 °C (figura 2). La rA13 liofilizada formulada con tampón fosfato presentó una pérdida gradual de actividad (un 30 % a los 6 meses) cuando se almacenó a 37 °C, pero no a 4 °C, sin embargo, esta pérdida de actividad no estuvo acompañada de un aumento en la disponibilidad del antígeno por ELISA (figura 2; o = tampón fosfato). Ninguna otra formulación liofilizada mostró una pérdida de actividad o un aumento en la disponibilidad del antígeno cuando se almacenó a 4 °C o 37 °C.
D. Ejemplo 4: Estabilidad conformacional de rA13 en formulaciones almacenadas a 4 °C y 37 °C
Muestras de rA13 formuladas y divididas en alícuotas como en el ejemplo 2 se almacenaron a 4 °C o 37 °C durante hasta 6 meses. Las conformaciones globales de rA13 formulada y almacenada en solución y estado liofilizado se caracterizaron mediante filtración en gel en los puntos temporales descritos en el ejemplo 3. Se muestran los resultados de los experimentos de filtración en gel realizados con rA13 formulada con histidina a las 0, 1, 2, 3 y 24 semanas para las formulaciones líquidas (figura 4) y a las 0, 2, 4, 8, 12 y 24 semanas para las formulaciones liofilizadas (figura 5).
Las formulaciones líquidas con histidina, almacenadas a 4 °C durante hasta 6 meses, se desarrollaron principalmente como un monómero sobre filtración en gel (figura 4A), lo que sugiere que la proteína es muy estable en solución a 4 °C. Este resultado es coherente con los descritos en el ejemplo 3, que mostró que el rA13 formulada con histidina y almacenada en solución a 4 °C durante hasta 6 meses no perdió ninguna actividad FRETS-VWF73. Por el contrario, rA13 formulada con histidina y almacenada a 37 °C, se desarrolló como una especie de orden superior/parcial o totalmente desnaturalizada, como lo indican los volúmenes de elución/tiempos de retención reducidos (figura 4B). Coherente con los resultados observados en el ejemplo 3, A13 formulada en histidina almacenada a 37 °C durante 6 meses pareció estar mayoritariamente degradada.
Se repitieron los experimentos de filtración en gel para cada formulación, almacenada a 4 °C y 37 °C, y se integraron las áreas relativas bajo los picos eluidos para determinar las poblaciones relativas de monómero de rA13 (3), dímero de rA13 (2) y rA13 agregada/desnaturalizada (1) en las formulaciones. Los resultados de los experimentos de filtración en gel realizados en las tres formulaciones liofilizadas almacenadas a 4 °C y 37 °C durante seis meses se presentan en la tabla 2. Las muestras liofilizadas se reconstituyeron con agua aséptica hasta un volumen final igual al de la formulación preliofilizada antes del análisis mediante filtración en gel.
Tabla 2. Área relativa bajo la curva (ABC) para filtraciones en gel de formulaciones liofilizadas de ADAMTS13 reconstituidas.
Pico n.° Inicio de liof. Liof. 6 m 4 °C Liof. 6 m 37 °C
Liof His (1)
Coherente con los resultados observados en el ejemplo 3, las formulaciones de rA13 liofilizadas no presentaron ningún aumento en la cantidad de dímero o especies agregadas/desnaturalizadas después de almacenamiento a 4 °C durante al menos 6 meses. De manera similar, rA13 formulada y liofilizada con histidina o citrato de sodio mostró solo niveles menores de dimerización cuando se almacenó a 37 °C durante al menos 6 meses. Además, no hubo indicios de que alguna de estas formulaciones provocara niveles aumentados de agregación y/o desnaturalización. Por el contrario, rA13 formulada y liofilizada con tampón fosfato presentó niveles significativos de dimerización y agregación y/o desnaturalización, cuando se almacenó a 37 °C durante al menos 6 meses.
E. Ejemplo 5: Caracterización biofísica de formulaciones de rA13 almacenadas a 4 °C y 37 °C
Muestras de rA13 formuladas y divididas en alícuotas como en el ejemplo 2 se almacenaron a 4 °C o 37 °C durante hasta 6 meses. Como medida de la estabilidad conformacional de la proteína rA13 formulada como se describe anteriormente, se determinaron los radios de Stokes mediante dispersión de luz dinámica para las formulaciones de rA13 en solución (A) y liofilizada (B) con histidina (figura 6), tampón fosfato (figura 7) y citrato de sodio (figura 8), en cada uno de los puntos temporales indicados.
Además, las tasas de recuento derivadas para cada una de las formulaciones líquidas, antes del almacenamiento, se determinaron mediante dispersión de luz dinámica. Como se puede ver en la figura 12, existe una discontinuidad en el cambio de los radios de Stokes y, por tanto, en la estabilidad de rA13, por encima de aproximadamente 35 °C para las formulaciones en histidina y citrato de sodio, y por encima de aproximadamente 40 °C para la formulación en fosfato. Además, aunque la formulación en fosfato tiene un radio de Stokes más grande que las formulaciones en histidina o citrato de sodio a temperaturas por debajo de aproximadamente 37 °C, la formulación en fosfato parece ser ligeramente más estable a temperaturas entre aproximadamente 40 °C y 50 °C.
Las muestras liofilizadas formuladas con histidina se almacenaron a 4 °C o 37 °C durante 3 meses y luego se reconstituyeron en agua aséptica. Para caracterizar si se produjeron o no cambios conformacionales locales o globales en rA13 reconstituida, se realizó espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier para las muestras almacenadas a 4 °C y 37 °C durante 3 meses, y se compararon con A13 recién formulada y liofilizada. Como se puede ver en la figura 9, los espectros de absorbancia de las tres muestras se superponen casi perfectamente, lo que sugiere que no se producen transiciones conformacionales en rA13 almacenada como una formulación liofilizada en histidina a 4 °C o 37 °C durante 3 meses.
Las formulaciones de rA13 almacenadas a 4 °C o 37 °C durante 6 meses también se caracterizaron mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa (rp-HPLC). La rp-HPLC permite la separación de moléculas de proteína estrechamente relacionadas y, por tanto, en muchos casos puede diferenciar entre versiones modificadas del mismo polipéptido, por ejemplo, modificado en carga, parcialmente degradado o parcialmente desplegado. Como se puede ver en la figura 10, todas las formulaciones de rA13 parecen ser estables durante al menos 6 meses a 4 °C, coherente con varios resultados observados anteriormente.
Las muestras de rA13 formuladas como en el ejemplo 2 se analizaron a continuación mediante calorimetría diferencial de barrido para caracterizar aún más la estabilidad de la proteína rA13 en las diversas formulaciones. La naturaleza bimodal de la curva de capacidad térmica generada en la figura 11 sugiere que dos dominios de la proteína pueden desplegarse por separado, y que la primera transición de desplegamiento se produce a una temperatura entre aproximadamente 54 °C y 55 °C. Las temperaturas de desplegamiento de rA13 son similares para las diversas formulaciones. Sin embargo, la entalpía de transición aumentada, como lo indica el área más grande debajo de la endoterma, para la formulación en fosfato y, en menor medida, para la formulación en citrato, sugiere formulaciones ligeramente estabilizadas de A13.
F. Ejemplo 6: Caracterización de la formación de dímeros en formulaciones de rA13
Para determinar el efecto de los agentes estabilizantes sobre el estado oligomérico de rA13 en solución, se formuló rA13 en histidina 20 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM y un 0,05 % de polisorbato 80 con diferentes combinaciones de sacarosa (de un 0 % a un 2 %), manitol (de un 0 % a un 3 %) y calcio (de 0 mM o 2 mM). Las diversas formulaciones se analizaron luego mediante filtración en gel sobre una columna Sepharose 6 GL (GE Healthcare). Como se ve en la figura 13, diversas combinaciones de agentes estabilizantes pudieron reducir la cantidad de formación de dímero de A13 en aproximadamente un 50 %. Los porcentajes de agregados, dímeros/oligos y monómeros para cada formulación se proporcionan en la tabla 14.
Tabla 14. Formulaciones usadas para determinar el efecto de diversos agentes tamponantes de la formulación de ADAMTS13.
G. Ejemplo 7: Efecto del pH en la estabilidad de la formulación de ADAMTS13
Para determinar el efecto del pH sobre la estabilidad de rA13 en solución, rA13 se dializó en tampón que contenía histidina 20 mM y NaCl 150 mM, se ajustó a un intervalo de pH entre 5,5 y 9,5 y se almacenó a 4 °C o 40 °C durante 24 horas. La estabilidad se midió mediante la concentración de antígeno rA13, determinada mediante ELISA, y la actividad de rA13 mediante ensayo FRETS-VWF73, a las 24 horas. Como se ve en la tabla 3 y la figura 14, rADAMTS13 es relativamente estable durante 24 horas a 4 °C cuando se formula en una solución que tiene un pH entre 5,5 y 9,5.
Tabla 3. Estabilidad de ADAMTS13 en formulación líquida cuando se almacena a 4 °C durante 24 horas.
Tabla 4. Estabilidad de ADAMTS13 en formulación líquida cuando se almacena a 40 °C durante 24 horas.
H. Ejemplo 8: Efecto de niveles bajos de CaCl2 sobre la estabilidad de la formulación de ADAMTS13
Para determinar el efecto de niveles bajos de CaCl2 sobre la estabilidad de rA13 en solución, rA13 se formuló en tampón que contenía NaCl 150 mM, un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80 e histidina 20 mM a pH 7,0 con (12B y D) y sin (12A y C) de CaCl22 mM. Las formulaciones líquidas se almacenaron a 25 °C o 37 °C durante tres semanas. Luego se evaluó la estabilidad de la formulación determinando la actividad relativa FRETS-VWF73 a las 0, 1, 2 y 3 semanas. Como se puede ver en la figura 15, la adición de CaCl2 2 mM estabilizó las formulaciones de rADAMTS13 líquidas almacenadas tanto a 25 °C como a 37 °C, en grados variables. En particular, la adición de niveles bajos de CaCl2 a las formulaciones líquidas de rADAMTS13 almacenadas a 25 °C confirió aproximadamente un 95 % de estabilidad de la actividad enzimática durante tres semanas, en comparación con una pérdida de actividad de un 80 % observada en las formulaciones sin CaCl2.
I. Ejemplo 9: Actividad FRETS-VWF73 de especies oligoméricas de ADAMTS13 recombinante
Para determinar la actividad enzimática de las diferentes especies oligoméricas de la proteína ADAMTS13 aisladas durante la purificación, se cargó rA13 en una columna de filtración en gel Superose 6 GL equilibrada con un tampón que contenía Na2HPO420 mM (pH 7,5) y NaCl 500 mM. Luego se separaron las especies moleculares de ADAMTS13 por tamaño y forma. Las fracciones que eluyeron de la columna se combinaron según su estado oligomérico aparente, por ejemplo, A13 agregada (grupo 1), A13 dimérica (grupo 2) y A13 monomérica (grupo 3) (figura 16A). Se obtuvo una confirmación adicional del estado oligomérico de ADAMTS13 determinando el radio de Stokes promedio de la proteína en cada combinación mediante dispersión de luz dinámica (figura 16B).
Luego se determinó la actividad enzimática de cada combinación mediante ensayo FRETS-VWF73. Como se puede ver en la figura 16, la actividad volumétrica de las especies de A13 agregadas fue de aproximadamente 218 mU/ml, la actividad de A13 dimérica fue de aproximadamente 1,435 U/ml y la actividad de A13 monomérica fue de aproximadamente 97,905 U/ml. Después de normalizar las actividades para el volumen de las combinaciones, más de un 99 % de la actividad total se encuentra en la combinación de elución correspondiente a la proteína monomérica. Cuando las actividades se normalizador luego para la cantidad total de proteína, puede observarse que la combinación de proteína monomérica tiene una actividad específica más alta que la combinación de proteína dimérica y la combinación de proteína agregada.
J. Ejemplo 10: Efecto de la concentración de NaCl sobre la liofilización de formulaciones de ADAMTS13
Para determinar el efecto de la concentración de NaCl sobre la producción de liofilizados, se formuló ADAMTS13 recombinante en tampón que contenía un 2 % de sacarosa, un 0,05 % de polisorbato 80 e histidina 20 mM (pH 7,0) con cantidades variables de NaCl (de 0 a 150 mM). Luego, las formulaciones de ADAMTS13 se liofilizaron en condiciones convencionales y se inspeccionaron visualmente para verificar la calidad de los liofilizados resultantes (figura 17). Los liofilizados producidos a partir de formulaciones de ADAMTS13 que contenían concentraciones salinas más bajas (de 0 a 60 mM; figuras 17A-C) tenían estructuras compactas con superficies lisas, mientras que los liofilizados producidos a partir de formulaciones con alto contenido salino (NaCl 120 mM y 150 mM; figuras 17E y F) eran porosos y no compactos, con un aspecto similar a una cuerda o agrietado. Las formulaciones de ADAMTS13 que contenían niveles intermedios de NaCl (90 mM; figura 17D) eran parcialmente compactas con una superficie semiporosa o similar a un cráter.
Un liofilizado poroso y no compacto indica fusión durante el proceso de liofilización. En general, se usan altas concentraciones de sal para disminuir la temperatura de derrumbe (o temperatura vítrea) que puede provocar la fusión parcial del material congelado durante el proceso de secado principal. Esto puede tener un impacto negativo en los niveles de agregación de proteína y/o la recuperación de la actividad enzimática. Por lo tanto, un buen aspecto del liofilizado en general se correlaciona con una mejor recuperación de la actividad y menos agregación de la respectiva proteína formulada. Ventajosamente, la presente invención proporciona formulaciones de ADAMTS13 que permiten la producción de liofilizados de alta calidad. En determinadas realizaciones, las formulaciones innovadoras proporcionadas en esta memoria permiten formulaciones con bajo contenido salino de ADAMTS13, que son particularmente estables durante la liofilización, lo que da como resultado la formación de liofilizados de alta calidad.
Una preocupación con el uso de formulaciones de proteína con bajo contenido salino es que puede producirse una agregación de proteína aumentada. Para determinar si este era el caso de las formulaciones de ADAMTS13 con bajo contenido salino, los liofilizados producidos anteriormente se reconstituyeron en agua desionizada y los estados de agregación de las proteínas ADAMTS13 reconstituidas se analizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Como se puede ver en la figura 18, la concentración de sal de las formulaciones liofilizadas no tuvo efecto sobre el estado de agregación de la proteína ADAMTS13 reconstituida (compárese NaCl 0 mM con NaCl 150 mM).
Para validar aún más el uso de formulaciones de ADAMTS13 con bajo contenido salino, se determinó la actividad FRETS-VWF73 de diversas formulaciones que varían de 0 a 150 mM de NaCl. Como se puede ver en la figura 19, la concentración de sal, así como la concentración de sacarosa, de las formulaciones de ADAMTS13 no influyeron en la actividad de la proteína ADAMTS13 recombinante. Estos resultados sugieren que las formulaciones con bajo contenido salino (es decir, de 0 a 100 mM de NaCl) de proteínas ADAMTS13 recombinantes líquidas y liofilizadas son adecuadas para uso farmacéutico.
K. Ejemplo 11: Formulación liofilizada de ADAMTS13 en tampones con alto contenido salino y bajo contenido salino
Para comparar formulaciones liofilizadas de ADAMTS13 recombinante, se prepararon formulaciones con alto contenido salino (NaCl 150 mM) y bajo contenido salino (NaCl 30 mM). Tanto la formulación con alto contenido salino como la de bajo contenido salino contenían histidina 20 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM, un 0,05 % de polisorbato 80 y CaCb 2 mM. La formulación con alto contenido salino contenía además un 2 % de sacarosa y NaCl 150 mM, mientras que la formulación con bajo contenido salino contenía además un 1 % de sacarosa, un 3 % de manitol y NaCl 30 mM. Luego, ambas formulaciones se liofilizaron en condiciones convencionales. El liofilizado resultante producido a partir de la formulación de ADAMTS13 con alto contenido salino no era compacto, no uniforme, grumoso y poroso (figura 20A), mientras que el liofilizado producido a partir de la formulación ADAMTS13 con bajo contenido salino era compacto, bastante uniforme y tenía una superficie lisa (figura 20B). Estos resultados sugieren que las formulaciones con bajo contenido salino de ADAMTS13 liofilizada son muy adecuadas para uso farmacéutico.
L. Ejemplo 12: Purificación de rADAMTS13 para formulaciones liofilizadas
En una realización, ADAMTS13 recombinante se expresó en células CHO recombinantes y se purificó del medio acondicionado resultante mediante cromatografía de intercambio catiónico en POROS HS. Las fracciones recogidas de rADAMTS13 eluidas de la columna HS se analizaron luego mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna Superose 6 GL: TC10/30, para la dimerización y agregación antes y después de la filtración en gel, mediante cromatografía de exclusión por tamaño (figuras 21A y B, respectivamente) y dispersión de luz dinámica (figuras 22A y B, respectivamente). Como se puede ver en la figura 21A, casi un 20 % de la rADAMTS13 total en las fracciones eluidas de HS, antes de la filtración en gel, se encontraba en estados diméricos, monoméricos o agregados indeseables. Por el contrario, casi todo la rADAMTS13 combinada de la etapa de filtración en gel es monomérica (figura 21B). De manera similar, el radio hidrodinámico promedio de rADAMTS13 eluida de HS (aproximadamente 20,5 nm; figura 22A) fue casi el doble del de rADAMTS recuperada después de cromatografía de exclusión por tamaño (aproximadamente 12-13 nm; figura 22B).
M. Ejemplo 13: Comparación de protocolos convencionales y ampliados para la liofilización de formulaciones de rADAMTS13
Para comparar la liofilización de formulaciones de rADAMTS13 que contienen concentraciones variables bajas de sal (NaCl 30 mM y 60 mM), calcio (CaCl2 2 mM y 4 mM) y glúcido (un 1 % de sacarosa y un 1 % de trehalosa), se purificó rADAMTS13 mediante cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de exclusión por tamaño, como anteriormente, y se formuló en histidina 20 mM, un 3 % de manitol, un 0,05 % de polisorbato 80, con las ocho combinaciones de sal, calcio y glúcido dadas anteriormente. Todos los viales tenían la misma concentración de ADAMTS13 (190 pig/ml de antígeno). Las formulaciones de rA131 a 8 (tablas 5 y 6) luego se liofilizaron usando un protocolo de liofilización convencional (3 días; figura 23A) o ampliado (11 días; figura 23B). Después de la liofilización, se inspeccionaron visualmente los liofilizados para las cualidades deseables (figura 24).
Tabla 5. Formulaciones de rADAMTS13 liofilizadas usadas en el protocolo de liofilización convencional.
Tabla 6. Formulaciones de rADAMTS13 liofilizadas usadas en el protocolo de MofiMzación ampliado.
Para determinar el estado multimérico de ADAMTS13 en cada una de las formulaciones, la proteína liofilizada se reconstituyó en agua desionizada y se analizó mediante dispersión de luz dinámica. Como se puede ver en la figura 25, las formulaciones liofilizadas preparadas usando protocolos de liofilización tanto convencionales como ampliados, produjeron moléculas de ADAMTS13 principalmente monoméricas (pico a aproximadamente 12-13 nm) después de la reconstitución. Aunque el pico de ADAMTS13 correspondiente a la proteína agregada (entre 100 y 110 nm) parece ser aproximadamente la mitad de alto que el pico de monómero, un experto en la técnica reconocerá que el eje de ordenadas mide la intensidad, en lugar de la masa total y, por tanto, el gráfico exagera enormemente el porcentaje de especies de ADAMTS13 que están agregadas. También se observa que las formulaciones preparadas con protocolos de liofilización ampliados (líneas discontinuas) contienen menos ADAMTS13 agregada que las formulaciones preparadas con protocolos de liofilización convencionales (líneas continuas), después de la reconstitución en agua desionizada.
Para evaluar la estabilidad de rADAMTS13 liofilizada en cada una de las formulaciones presentadas anteriormente, los liofilizados producidos mediante los protocolos convencionales y ampliados se usaron para preparar una serie de viales para almacenamiento a diversas temperaturas durante hasta 36 meses. Como se describe en la tabla 7, se prepararon viales que contenían 5 mg o 10 mg de rADAMTS13 liofilizada para almacenamiento a 2 - 8 °C (es decir, en condiciones de refrigeración convencionales), 30 °C (temperatura ambiente) y 40 °C. Todos los viales se ensayaron mediante FTIR, SE-HPLC y DLS. También se ensayó la actividad FRETS y el antígeno ADAMTS13 para todas las muestras. Las formulaciones de ADAMTS13 liofilizadas pueden analizarse luego para la actividad FRETS-VWF73 y la estabilidad de antígeno, como se describe anteriormente, en los puntos temporales indicados para determinar la estabilidad de la proteína en las diversas formulaciones liofilizadas. Las tablas 8 y 9 proporcionan los resultados de los ensayos de actividad FRETS-VWF73 de formulaciones de ADAMTS13 reconstituidas generadas por los protocolos de liofilización convencionales y ampliados, respectivamente. De manera similar, la recuperación de antígeno se da en las tablas 10 y 11, para muestras generadas con los protocolos de liofilización convencionales y ampliados, respectivamente.
Tabla 7. Configuración experimental para ensayar la estabilidad de formulaciones de ADAMTS13 liofilizadas. La configuración corresponde a liofilizaciones tanto de tipo A como de tipo B.
Tabla 8. Actividad FRETS-VWF73 en formulaciones de ADAMTS13 liofilizadas preparadas mediante protocolos de liofilización convencionales.
Tabla 9. Actividad FRETS-VWF73 en formulaciones de ADAMTS13 liofilizadas preparadas mediante protocolos de liofilización ampliados.
Tabla 10. Recuperación de antígeno A13 en formulaciones de ADAMTS13 liofilizadas preparadas mediante protocolos de liofilización convencionales.
Tabla 11. Recuperación de antígeno A13 en formulaciones de ADAMTS13 liofilizadas preparadas mediante protocolos de liofilización ampliados.
Las tablas 17 y 18 resumen los resultados de FTIR de los diferentes programas de MofiMzación para las formulaciones de rADAMTS022-1. Ni el tiempo ni la temperatura tuvieron una influencia importante en las estructuras secundarias. Además, el programa de liofilización no cambió los elementos estructurales, aparte de la aparente disminución de hélice alfa a 40 °C para el programa convencional A, lo que no se observó para el programa de liofilización más largo B.
Tabla 17. Estructura secundaria de la formulación de rADAMTS13 liofilizada 22-1A evaluada por FTIR.
Tabla 18. Estructura secundaria de la formulación de rADAMTS13 liofilizada 22-1A evaluada por FTIR.
El estado oligomérico de ADAMTS13 en las formulaciones liofilizadas 1A y 1B se analizó mediante dispersión de luz dinámica durante el transcurso de 6 meses de almacenamiento a 4 °C, 30 °C y 40 °C. Como se ve en las figuras 37 y 38, se observaron niveles de agregados más altos en las muestras preparadas con el programa de liofilización ampliado. Sin embargo, los niveles de agregación no aumentaron sustancialmente durante el tiempo de almacenamiento.
De manera similar, la HPLC de exclusión por tamaño no mostró cambios importantes entre los diferentes programas de liofilización para las formulaciones de rADAMTS022 después de 6 meses (datos no mostrados). El análisis muestra que no se indujeron agregados después de almacenamiento a 4 °C, 30 °C y 40 °C durante el transcurso de 3 meses.
N. Ejemplo 14: Expresión y purificación de ADAMTS13 humana recombinante
ADAMTS-13 recombinante se genera mediante un clon de célula de ovario de hámster chino (CHO) recombinante en un proceso de fermentación en un cultivo en suspensión. El medio de crecimiento, desarrollado por Baxter, está exento de sustancias de origen humano o animal y de proteínas recombinantes. Se pueden encontrar ejemplos de este tipo de medios de crecimiento útiles para la expresión de ADAMTS13, por ejemplo, en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° de serie 12/847,999. El proceso de fabricación utiliza un método de cultivo celular continuo (quimiostato). El proceso de purificación comienza con una etapa inicial de eliminación de células mediante filtración. El producto sin células de hasta 4 días posteriores se combina para producir un lote posterior. Las recolecciones combinadas, filtradas se concentran mediante ultra/diafiltración y luego se someten a una etapa de inactivación vírica con detergente disolvente. La purificación adicional incluye una etapa de captura cromatográfica (intercambio aniónico), una etapa de nanofiltración (segunda etapa de reducción vírica), una etapa de cromatografía negativa (hidroxiapatita) seguida de una cromatografía en modo mixto (Capto MMC) y una etapa final de concentración cromatográfica y preformulación (intercambio catiónico). La sustancia farmacológica a granel (BDS) preformulada se congela a -60 °C en un congelador con temperatura controlada.
O. Ejemplo 15: Ensayo FRETS-VWF73 para la actividad de ADAMTS13
La actividad proteolítica de ADAMTS13 se midió frente a un sustrato que extingue la fluorescencia (FRETS-VWF73, Peptides Institute, Inc; Osaka, Japón) según la descripción del ensayo del fabricante. En resumen, las muestras de rADAMTS13 se diluyeron (en un volumen total de 100 pl) en tampón que contenía Bis-Tris 5 mM, CaCl225 mM y un 0,005 % de Tween20 y se transfirieron a una placa de microvaloración negra. Las muestras se midieron frente a una curva de referencia de muestras de plasma humano diluido (de 80 a 5 mU/ml de plasma). La reacción se inició añadiendo el sustrato (100 pl, FRETS-VWF73; concentración final de 2 pM) y se midió la fluorescencia cada dos minutos durante 45 minutos en un espectrofotómetro de fluorescencia con lex = 360 nm y lem = 460 a 30 °C (FLx800, Bio Tek). Los resultados de actividad se leyeron de una curva de referencia de plasma humano. Los datos se expresan como unidad/ml. El plasma humano normal se consideró 1 unidad/ml.
P. Ejemplo 16: ELISA de antígeno ADAMTS13
Las muestras que contienen ADAMTS13 se analizan en un ensayo ELISA usando IgG policlonal de conejo dirigida contra ADAMTS13 humana tanto como captura como en su forma marcada como anticuerpo de detección. El antígeno ADAMTS13 presente en la muestra se captura por el anticuerpo específico de ADAMTS13 recubierto en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Las muestras se diluyeron en tampón (Tris 250 mM, NaCl 350 mM, un 0,5 % de BSA, un 0,1 % de Tween 20) y se transfirieron a los pocillos de microvaloración recubiertos. El antígeno ADAMTS13 unido se detecta con IgG de conejo anti-ADAMTS13 conjugado con HRP usando TMB como sustrato (Thermo Art: n.° 34021). La absorbancia se midió en un espectrofotómetro (TECAN SpectraFluorPlus, Tecan Sales Austria, Groding, Austria) a 1 = 450 nm. Las concentraciones de antígeno ADAMTS13 (expresadas en pg/ml) se calcularon a partir de un patrón de referencia usando diluciones que variaban de 250 a 7,81 ng/ml de ADAMTS13 recombinante que se purificó de recolecciones de cultivo de células HEK293 transfectadas de forma estable.
Q. Ejemplo 17: Análisis de ADAMTS13 mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC)
La SE-HPLC se realizó usando un purificador AKTA "serie 900" (GE Healthcare). El sistema estaba equipado con una columna Superose 12 GL (GE Healthcare, TC10/30) que se hizo funcionar a un caudal constante de 0,3 ml por minuto a temperatura ambiente. Como tampón de migración se usó Tris 20 mM, acetato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 7,4. La muestra se centrifugó (centrífuga 5415C, Eppendorf, Viena, Austria) durante 5 min a 10000 rpm y se aplicaron automáticamente 100 pl mediante un tomamuestras automático. La absorbancia del efluente de la columna se midió continuamente a 280 nm.
R. Ejemplo 18: Análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) de ADAMTS13
La dispersión de luz dinámica (DLS) se realizó usando un Malvern Nano Zetasizer ZS (Malvern Instruments Ltd Enigma Business Park, Grovewood Road, Malvern, Worcestershire, Reino Unido WR14 1XZ) y un Haake Rheostress 1 (Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Alemania) equipado con un cono de 60 mm de diámetro/ángulo de 0,5° para mediciones de viscosidad del tampón.
Todas las muestras se centrifugaron (centrífuga 5415C, Eppendorf, Viena, Austria) durante 5 minutos a 10000 rpm para determinar el diámetro hidrodinámico de una proteína. Se llenaron 60 pl de muestra en una microcubeta desechable ZEN0040 y se determinó la viscosidad del tampón mediante Rheostress 1. Este parámetro se usa para analizar el tamaño eficaz de las proteínas mediante DLS. La temperatura de funcionamiento fue de 25 °C con un tiempo de equilibrado de 2 minutos. El ángulo de las proteínas se estableció en 173° de retrodispersión para medir el tamaño y se realizaron 3 desarrollos por muestra para promediar los resultados.
Las muestras se midieron mediante el modo de temperatura creciente para supervisar la influencia de la temperatura sobre una proteína. El procedimiento de medición fue similar a una medición de tamaño normal, excepto por las diferentes temperaturas con un valor creciente de 1 °C/min desde 15 °C hasta 80 °C y un tiempo de equilibrado de 2 min. Se usó una cubeta de vidrio de bajo volumen DTS2145 para estas rampas de temperatura.
S. Ejemplo 19: Análisis de ADAMTS13 mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)
La espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier se realizó usando el espectroscopio FTIR TENSOR 27 (Bruker Optik GmbH, 76275 Ettlingen, Alemania) equipado con una cubeta BioATR II que funciona en modo de reflexión total atenuada. Esta configuración del instrumento puede usarse para analizar la conformación de formulaciones de proteína.
Durante una temperatura de funcionamiento de 20 °C, se llenaron 20 pl de agua en la cubeta y se midieron para la exploración de fondo. Después de ello, se llenaron 20 pl de tampón en la cubeta y se midieron frente a la exploración de fondo, para restar el agua del tampón. Este procedimiento se repitió con tampón como exploración de fondo para medir la muestra (intervalo de medición de frecuencia: 4000 - 650 cmr1). Se generó un interferograma y se tradujo en un espectro de transmisión. Se corrigieron diferentes espectros para el mismo desplazamiento y se normalizaron a la misma concentración de proteína. Además, la estructura secundaria (% de hélice a,%de lámina p) de la proteína se calculó mediante el programa informático de evaluación (OPUS 6.0 / Bruker) que contenía una base de datos de ~40 proteínas de estructura secundaria conocida.
T. Ejemplo 20: Análisis por fotoirradiación de la estabilidad de ADAMTS13
El ensayo de fotoestabilidad se realizó usando la cámara de fotoestabilidad Atlas Suntest CPS+ (Chicago, Illinois, EE. UU.), según SOP VN-09-45058TB. El CPS+ supervisa y controla la irradiancia, la temperatura del patrón negro y la temperatura del aire de la cámara. La fotoestabilidad se ensayó en la misma formulación que se usó para los experimentos de cizallamiento y congelación-descongelación (tabla 12). Las muestras y los controles se ensayaron mediante DLS y SE-HPLC. Los resultados se muestran en la figura 31 y la figura 32. Ambas formulaciones (líquida y liofilizada) mostraron los mismos resultados por SE-HPLC. El pico de monómero de ADAMTS13 disminuyó y el pico de dímero aumentó con el tiempo de irradiación. El diámetro hidrodinámico de la formulación líquida y liofilizada también aumentó ligeramente con el tiempo (figura 32). La formulación liofilizada irradiada durante 10 h (según lo recomendado por ICH Q1B) no mostró ninguna diferencia con el control protegido de la luz. La actividad FRETS supervisada durante la fotoirradiación disminuyó rápidamente en formulaciones líquidas, pero menos en formulaciones liofilizadas, como se muestra en la figura 33. Incluso después de una dosis de fotoirradiación cuatro veces mayor, según lo recomendado por la directriz ICH Q1B que corresponde a 4,8 millones de lux horas, permaneció más de un 50 % de la actividad FRETS.
Los viales de "control" se envolvieron en papel de aluminio para eliminar la exposición a la luz y se colocaron en la cámara de fotoestabilidad junto con las muestras de ensayo. Todas las muestras se colocaron horizontalmente. Un tiempo de irradiación de 10 h correspondió a entre 1,2 y 1,8 millones de lux h y 765 W/m2 de luz UV. Las muestras se retiraron de la cámara de fotoestabilidad después de 10 h y se midieron el espectro (190-800 nm) y el valor de pH.
U. Ejemplo 21: Análisis por tensión mecánica de la estabilidad de ADAMTS13
Se aplicó esfuerzo de cizallamiento con un Haake Rheostress1 (Thermo Electron Karlsruhe GmbH, Karlsruhe, Alemania) usando un cono con un diámetro de 60 mm y un ángulo de 0,5°. La temperatura se estableció en 25.0 °C.
En resumen, ADAMTS13 humana recombinante, preparada como se describe anteriormente, se formuló como en la tabla 12. Se aplicaron 500 pl de muestra de ADAMTS13 por desarrollo y se sometieron a esfuerzo a 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500 y 600 rpm durante 15 min. Luego, la muestra se transfirió a un vial Eppendorf. Se aplicaron mediciones DLS para supervisar el posible desplegamiento o agregación parcial inducido por esfuerzo de cizallamiento. Como se muestra en la figura 28, se formaron agregados a un esfuerzo de cizallamiento de 200 rpm.
Tabla 12. Formulación usada para el análisis por tensión mecánica de la estabilidad de ADAMTS13.
V. Ejemplo 22: Efectos de diversos agentes tamponantes en las formulaciones de ADAMTS13
Para determinar el efecto que tenían diversos tampones sobre la estabilidad y la conformación de las formulaciones de ADAMTS13, ADAMTS13 humana recombinante, expresada y purificado como se describe anteriormente, se dializó frente a diferentes tampones (tabla 13) y se analizó mediante dispersión de luz dinámica (DLS) para identificar las preferencias de tampón básicas de ADAMTS13. Como se puede ver en la figura 27, los diámetros hidrodinámicos más pequeños de ADAMTS13 se encontraron cuando la proteína se formuló en tampones de histidina o HEPES.
Tabla 13. Formulaciones usadas para determinar el efecto de diversos agentes tamponantes de la formulación de ADAMTS13.
W. Ejemplo 23: Análisis por congelación y descongelación de la estabilidad de ADAMTS13
La misma formulación (tabla 12) usada para los experimentos de esfuerzo de cizallamiento se usó de nuevo para investigar el comportamiento de la proteína durante el esfuerzo de congelación y descongelación. Se eligieron dos condiciones de congelación y descongelación -20 °C/TA y -80 °C/+37 °C. La figura 29 resume los resultados de las mediciones de actividad FRETS. Todas las muestras son estables dentro del intervalo de variación del ensayo (desviación típica relativa de un 25 %). No se observó pérdida de actividad FRETS incluso después de un ciclo de congelación y descongelación de 5 veces. La estabilidad de BAX930 en esta formulación líquida está confirmada por los resultados de las mediciones DLS y SE-HPLC. No se observó ningún aumento en la intensidad de los picos de agregación (entre 100 y 1000 nm) por DLS independientemente de las condiciones de congelación y descongelación (figura 30). De manera similar, la SE-HPLC no mostró un aumento del nivel de agregación después de ciclos repetidos de congelación y descongelación a -80 °C/+37 °C, pero sí cierto aumento a -20 °C/TA (datos no mostrados).
X. Ejemplo 24: Efecto del calcio y el cinc sobre la actividad FRETS de ADAMTS13
ADAMTS13 humana recombinante, preparada como se describe anteriormente, se trató con EDTA 10 mM y luego se dializó frente a tampón que contenía histidina 20 mM y NaCl 190 mM (pH 7,5). Después de la diálisis, se añadieron nuevamente CaCl2 y ZnCb a las formulaciones en diferentes concentraciones. Luego se ensayó la actividad de formulaciones de ADAMTS13 que contenían diferentes concentraciones de calcio y cinc para la actividad FRET como se describe anteriormente. Como se puede ver en la figura 34, niveles crecientes de calcio aumentaron la recuperación de la actividad FRETS. Se consiguió una actividad casi máxima con la inclusión de CaCb 4 mM, tanto en presencia como en ausencia de cinc. En concentraciones intermedias de calcio (2 mM y 4 mM), la adición de cinc proporcionó un aumento moderado en la actividad FRETS.
Y. Ejemplo 25: Influencia de la concentración de sal y glúcido sobre la agregación en formulaciones de ADAMTS13 liofilizadas
Para investigar más a fondo el efecto que tienen las concentraciones de sal y glúcido en las formulaciones liofilizadas de ADAMTS13, se determinó el estado oligomérico de varias formulaciones liofilizadas después de la reconstitución con agua desionizada. En resumen, ADAMTS13 humana recombinante se produjo como se describe anteriormente. Luego, las muestras de proteína se formularon con histidina 20 mM (pH 7,0), cloruro de calcio 2 mM y un 0,05 % de polisorbato 80 con los niveles de cloruro de sodio y sacarosa dados en la tabla 15. Luego, las formulaciones se liofilizaron, como se describe anteriormente, y se reconstituyeron con agua desionizada. Luego se determinaron las características oligoméricas mediante análisis por SE-HPLC, cuyos resultados se muestran en la tabla 15 y la figura 35. Como se puede ver en formulaciones que contienen bajas concentraciones de glúcido, los altos niveles de sal (150 mM) aumentan la agregación de ADAMTS13 y reducen el contenido monomérico de la formulación.
Tabla 15. Influencia de la concentración de sal y glúcido en la agregación en formulaciones de ADAMTS13 liofilizadas medida mediante el área de pico de SE-HPLC.
Lote NaCl Sacarosa Osmolaridad Aqreqado Dímero/oligómero Monómero [mM] ___ [g/l]___ [mOsmol] ____[%]___ _______ [%]_______ ____ [%]____
La misma formulación mostrada en la tabla 15 se usó luego para evaluar la calidad del liofilizado producido después de la liofilización de las formulaciones de ADAMTS13. Como se resume en la tabla 16 y se muestra en la figura 36, la presencia de altas concentraciones de cloruro de sodio (150 mM) no produjo liofilizado. Por el contrario, los mejores liofilizados se obtuvieron con formulaciones que contenían entre 0 mM y 60 mM de cloruro de sodio en presencia de un 2 % de sacarosa.
Tabla 16. Calidad del liofilizado producido para diversas formulaciones de ADAMTS13 humana
recombinante.
Z. Ejemplo 26: Ensayo de tensión térmica a largo plazo
Para caracterizar aún más la estabilidad de las formulaciones liofilizadas de ADAMTS13, se inició un segundo ensayo de tensión a largo plazo. Para este ensayo, se formuló ADAMTS13 humana recombinante en tres concentraciones finales de proteína según la tabla 19. Se incluyó un segundo glúcido (manitol) en la formulación, ya que se descubrió que estabilizaba la proteína durante la liofilización y proporcionaba un liofilizado compacto con una superficie lisa. Todas las muestras de ensayo de tensión se caracterizaron mediante DLS (figura 39), SE-HPLC (tabla 20) y FTIR. También se midieron la actividad FRETS (tabla 21) y ELISA de antígeno A13 (tabla 22) a lo largo del tiempo para todas las formulaciones.
Tabla 19. Formulación de rADAMTS13 en tampón Tris para ensayos de tensión (rADAMTS025)
________________________________
Tabla 20. Influencia de alta concentración de ADAMTS13 sobre el nivel de agregado determinado por SE-HPLC (rADAMTS025).
Tabla 21. Actividad FRETS-VWF73 en formulaciones de ADAMTS13 liofilizadas.
Tabla 22. Recuperación de antígeno A13 en formulaciones de ADAMTS13 liofilizadas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación estabilizada de ADAMTS13 para su uso en un método de tratamiento o prevención de púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) hereditaria o adquirida o apoplejía, en donde dicho método comprende la administración de la formulación de ADAMTS13 estabilizada, en donde dicha formulación comprende menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable.
2. Formulación para su uso según la reivindicación 1, que comprende entre 10 UI/ml y 10000 UI/ml de actividad de ADAMTS13.
3. Formulación para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde la sal es cloruro de sodio o cloruro de potasio.
4. La formulación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende
(a) entre 0,5 mM y 20 mM de calcio;
(b) entre 2,0 mM y 5,0 mM de calcio; o
(c) entre 2,0 mM y 4,0 mM de calcio.
5. La formulación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un glúcido y/o alditol, opcionalmente entre un 2 % y un 6 % de un glúcido y/o alditol.
6. La formulación para su uso según la reivindicación 5, en donde el glúcido y/o alditol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y una combinación de los mismos.
7. La formulación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende un tensioactivo no iónico, opcionalmente entre un 0,01 % y un 0,1 % de un tensioactivo no iónico y/u opcionalmente en donde el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F-68 y BRIJ 35.
8. La formulación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un agente tamponante adecuado para mantener la formulación a un pH neutro.
9. La formulación para su uso según la reivindicación 8, en donde el agente tamponante es histidina o HEPES.
10. La formulación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el pH de la formulación está entre 6,5 y 9,0, opcionalmente entre 6,5 y 7,5.
11. La formulación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende ADAMTS13 en una concentración de 0,01 mg/ml o mayor.
12. La formulación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además de 0,5 pM a 20,0 pM de cinc.
13. La formulación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la formulación de ADAMTS13 estabilizada comprende:
(A)
(a) de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13;
(b) menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable;
(c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio;
(d) un glúcido y/o alditol;
(e) un tensioactivo no iónico; y
(f) un agente tamponante para mantener un pH entre 6,0 y 8,0, o
(B)
(a) de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13;
(b) menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable;
(c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio;
(d) un glúcido y/o alditol;
(e) entre aproximadamente un 0,01 % y un 0,1 % de un tensioactivo no iónico; y
(f) un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5, o (C)
(a) de 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13;
(b) menos de 100 mM de una sal farmacéuticamente aceptable;
(c) de 0,5 mM a 20 mM de calcio;
(d) un glúcido y/o alditol;
(e) un tensioactivo no iónico; y
(f) un agente tamponante para mantener un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5, en donde el agente tamponante es histidina o HEPES.
14. Una formulación liofilizada de ADAMTS13 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la formulación se liofiliza a partir de una formulación líquida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. La formulación para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la proteína ADAMTS13 es ADAMTS13 humana o ADAMTS13 humana recombinante.
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