ES3003258T3 - Stable polymorphic form of 6-fluoro-9-methyl-9h-b-carboline and uses thereof - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una forma polimórfica cristalina estable de 6-fluoro-9-metil-9H-β-carbolina de fórmula (I), a un método para la preparación de dicha forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-β-carbolina, y a una composición farmacéutica que comprende dicha forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-β-carbolina. Además, la presente invención se refiere al uso de dicha forma polimórfica cristalina estable y al uso de la composición farmacéutica que comprende dicha forma polimórfica cristalina estable en el tratamiento y/o profilaxis de daño auditivo, vértigo o trastornos vestibulares. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Forma polimórfica estable de 6-fluoro-9-metil-9fr-p-carbolina y usos de la misma

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una forma polimórfica cristalina estable de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de fórmula (I), a un método de preparación de dicha forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina, y a una composición farmacéutica que comprende dicha forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina. Además, la presente invención se refiere al uso de dicha forma polimórfica cristalina estable y al uso de la composición farmacéutica que comprende dicha forma polimórfica cristalina estable en el tratamiento y/o profilaxis de daños auditivos, vértigo o trastornos vestibulares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El polimorfismo es la capacidad de una sustancia química de existir en más de una forma cristalina distinta con diferentes disposiciones de las moléculas en la red cristalina. Aunque los polimorfos de la misma especie son químicamente idénticos, cada polimorfo tiene sus propias combinaciones únicas de propiedades químicas, mecánicas, térmicas y físicas. La variación de las propiedades fisicoquímicas de las distintas formas cristalinas hace que el polimorfismo sea un problema potencialmente importante para las empresas farmacéuticas (Erdemiret al.; Curr. Opin. Drug Discov. Dev.2007, 746-755). Las dificultades e inconsistencias encontradas en el desempeño y desarrollo del producto pueden atribuirse al polimorfismo, y dentro de la industria farmacéutica es un acuerdo común que el polimorfismo sea un aspecto crucial a considerar cuando se desarrollan nuevos candidatos a medicamentos. Los ingredientes farmacéuticos activos (API) se suministran con frecuencia en estado sólido a los pacientes, ya que las formas sólidas ofrecen comodidad, estabilidad física y química, facilidad de manipulación del producto y bajos costos de fabricación. Dado que cada forma sólida presenta propiedades fisicoquímicas únicas, entender y controlar las propiedades en estado sólido de un API es extremadamente importante en el proceso de desarrollo de un medicamento. La producción involuntaria del polimorfo equivocado en la etapa de cristalización puede dar lugar a formas de dosificación farmacéuticas que no son efectivas a una dosis designada en la forma de aplicación dada o que tienen el potencial de volverse tóxicas. Por estas razones, las agencias reguladoras exigen a las empresas farmacéuticas que controlen el proceso de cristalización para que continuamente se produzca el polimorfo deseado y han fomentado la aplicación de tecnologías analíticas de proceso al desarrollo del proceso de cristalización.

La recristalización a partir de una solución puede concebirse como un proceso de autoensamblaje en el que moléculas organizadas al azar y disueltas en un disolvente sobresaturado o en una mezcla de disolventes se unen para formar un arreglo molecular tridimensional ordenado con un patrón de repetición periódica. La cristalización es vital para muchos procesos que ocurren en la naturaleza y en la fabricación de una amplia gama de materiales. La calidad de un producto cristalino suele juzgarse en función de cuatro criterios principales: el tamaño del cristal, la pureza, la morfología y la estructura del cristal. El control de la morfología del cristal es esencial en muchas aplicaciones ya que el hábito de las partículas puede tener un gran impacto en los procesos posteriores a la cristalización. Para el desarrollo de un API, es vital producir un polimorfo específico para asegurar la biodisponibilidad y la estabilidad de un fármaco en la forma de dosificación farmacéutica final.

La solicitud de patente alemana (DE 10 2007 009264 A1) divulga 9-alquil-p-carbolinas que, debido a su efecto neuroprotector, pueden utilizarse para la terapia y/o profilaxis de trastornos del movimiento y/o enfermedades neurológicas como, por ejemplo, el Alzheimer o el Parkinson.

La solicitud de patente estadounidense US 2004/038970 A1 divulga el uso de 2,3,4,9-tetrahidro-1H-p-carbolinas sustituidas en posición 3 como agentes activos en el tratamiento de diversas indicaciones médicas, incluido el tinnitus. Sin embargo, el patrón de sustitución de este grupo de p-carbolinas difiere estructuralmente de forma considerable del patrón de sustitución de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina.

La solicitud internacional de patente (WO 2011/079841 A1) divulga p-carbolinas, preferentemente 9-alquil-p-carbolinas, el método de preparación de las mismas, y la composición farmacéutica que contiene dichas p-carbolinas. Además, esta solicitud PCT se refiere al uso de dichas p-carbolinas para la profilaxis y el tratamiento de la pérdida de audición, el tinnitus, los choques acústicos, el vértigo y los trastornos del equilibrio.

La solicitud internacional de patente (WO 2015/044434 A2) divulga las fluoro-9-metil-p-carbolinas, incluyendo la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina, el método de preparación de las mismas y las composiciones farmacéuticas que contienen las fluoro-9-metil-p-carbolinas. Además, esta solicitud PCT divulga el uso médico de las fluoro-9-metil-p-carbolinas para el tratamiento de enfermedades agudas y crónicas del oído y daños auditivos, mareos y trastornos del equilibrio.

Sin embargo, la solicitud internacional de patente (WO 2015/044434 A2) divulga la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina y no describe ninguna forma cristalina o polimórfica de la misma.

El objetivo de la presente invención es proporcionar una forma polimórfica cristalina estable de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina especialmente como ingrediente activo para la preparación de composiciones farmacéuticas, y proporcionar tales composiciones farmacéuticas estables que comprenden dicha forma polimórfica cristalina estable de 6-fluoro-9-metil-pcarbolina así como usos de la misma y un método para la preparación de tal forma polimórfica estable.

Este objetivo de la presente invención se resuelve mediante las enseñanzas de las reivindicaciones independientes. Otras características ventajosas, aspectos y detalles de la invención son evidentes a partir de las reivindicaciones dependientes, la descripción, las figuras y los ejemplos de la presente solicitud.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se proporcionan en primer lugar varias formas polimórficas cristalinas específicas de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina, también denominada en el presente documento 6-FMc , y también se divulgan características técnicas de las mismas. Sin embargo, sorprendentemente, sólo una de estas formas polimórficas cristalinas específicas es suficientemente estable y, por tanto, adecuada para la preparación de composiciones farmacéuticas. Todas las demás formas polimórficas no pueden utilizarse para formulaciones farmacéuticas debido a su inestabilidad.

El compuesto 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) existe en al menos cuatro formas polimórficas denominadas polimorfos A, B, C y T. En la práctica, el 6-FMC se aplica en forma de suspensión para alcanzar concentraciones terapéuticas en el tejido objetivo. Es vital producir un polimorfo específico para asegurar la biodisponibilidad y la estabilidad del fármaco en la forma de dosificación farmacéutica terminada. Por ello, se caracterizan las propiedades químicas, mecánicas, térmicas y físicas de cada polimorfo tanto en forma de polvo, así como parte de la formulación. Se encontraron diferencias notables entre los polimorfos. Los puntos de fusión difieren y la recristalización dio lugar a formas ortorrómbicas en el caso del polimorfo A y a formas monoclínicas en el caso del polimorfo B. Los espectros de difractometría de rayos X de polvos eran claramente diferentes, así como los espectros de ssRMN y de espectroscopia infrarroja. Los polimorfos C y T fueron difíciles de aislar en forma pura debido a su rápida descomposición, por lo que fue difícil obtener espectros limpios de estos polimorfos. Las investigaciones sobre la estabilidad de los polimorfos revelaron que las formas polimórficas A, C y T no son adecuadas para la fabricación de una formulación farmacéutica, mientras que el polimorfo A no es estable, pero puede convertirse en el polimorfo B bajo las condiciones aquí divulgadas. Sorprendentemente, la forma polimórfica B fue el único polimorfo que es suficientemente estable y adecuado para la preparación de una formulación farmacéutica que contiene partículas de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina cristalina de la forma polimórfica B. Las formas polimórficas A, C y T ni siquiera son suficientemente estables en condiciones normales de almacenamiento para formulaciones farmacéuticas a temperatura ambiente, de modo que las formas polimórficas A, C y T de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina no pueden utilizarse como principio activo cristalino en formulaciones farmacéuticas para el tratamiento del oído interno. Tales formulaciones farmacéuticas son preferentemente formulaciones liposomales, pomadas, suspensiones, geles y emulsiones, en donde la forma polimórfica B de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina está presente en forma cristalina o micronizada, preferentemente como micropartículas o nanopartículas.

Así, se realizaron varias pruebas de estabilidad con la forma polimórfica B de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina y se demuestra en la presente invención que el polimorfo B es muy estable y la forma perfecta para las formulaciones farmacéuticas previstas. Solamente bajo condiciones drásticas como las que se describen aquí, el polimorfo B se puede convertir en el polimorfo A. La conversión del polimorfo B en el polimorfo A puede lograrse mediante la extracción con dióxido de carbono supercrítico, así como mediante la sublimación al vacío, mientras que la conversión espontánea del polimorfo A en el B se produce en la formulación inmediatamente después de la mezcla. Nunca se ha observado el proceso inverso. Además, el tercer polimorfo C y el cuarto polimorfo T se descomponen incluso durante la fabricación de una formulación farmacéutica. No se ha podido detectar ninguna conversión del polimorfo B en el polimorfo C o en el polimorfo T, ni siquiera en condiciones tan drásticas como la exposición al dióxido de carbono supercrítico o la sublimación al vacío o el calentamiento extremo.

Por lo tanto, la presente solicitud se dirige a la forma polimórfica B de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina como la única forma polimórfica estable de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina que es adecuada para la preparación de las formulaciones farmacéuticas como se divulgan en la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Por consiguiente, la presente invención se refiere a la forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de la fórmula (I)

en donde la forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina (denominada en el presente documento como polimorfo B o forma polimórfica B) tiene el patrón de difracción de rayos X de polvos que comprende valores de ángulo 2-theta de 11.3, 17.1, 17.6, 18.0, 22.5, 23.2 y 29.4 grados con una desviación ± 0.2 grados.

Preferentemente, esta forma polimórfica B cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina tiene el patrón de difracción de rayos X de polvos que comprende valores de ángulo 2-theta de 11.3, 14.1, 17.1, 17.6, 18.0, 19.0, 20.3, 20.6, 22.5, 23.2, 24.3, 25.8, y 29.4 grados con una desviación ± 0.2 grados. Más concretamente, cada valor indicado tiene una desviación de ± 0.2 grados y puede escribirse como sigue 11.3 ± 0.2 grado, 14.1 ± 0.2 grado, 17.1 ± 0.2 grado, 17.6 ± 0.2 grado, 18.0 ± 0.2 grado, 19.0 ± 0.2 grado, 20.3 ± 0.2 grado, 20.6 ± 0.2 grado, 22.5 ± 0.2 grado, 23.2 ± 0.2 grado, 24.3 ± 0.2 grado, 25.8 ± 0.2 grado, y 29.4 ± 0.2 grado. Preferentemente la desviación es sólo ± 0.15 grados y más preferentemente sólo ± 0.1 grado.

En una modalidad, la forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina (polimorfo B) está en una forma monoclínica que tiene un grupo espacial de p2-i/c, en donde una molécula de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina está en una celda unitaria asimétrica que tiene una dimensión de celda unitaria de a = 3.85 ± 0.1 A, b = 17.32 ± 0.1 A, c = 13.77 ± 0.1 A, a = 90 ± 3°, p = 91 ± 3° y y = 90 ± 3°.

En una modalidad, el espectro de 13C-RMN en estado sólido de dicha forma polimórfica cristalina (polimorfo B) de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina comprende picos a 28.6, 107.3, 110.2, 111.6, 112.8, 116.6, 121.5, 126.2, 138.0, 155.5, 156.1, 156.7, 157.1, 157.2, 157.7, 158.1, y 158.4 ppm con una desviación ± 1 ppm como se muestra en la Figura 8B. Así, comprende picos a 28.6 ± 1 ppm, 107.3 ± 1 ppm, 110.2 ± 1 ppm, 111.6 ± 1 ppm, 112.8 ± 1 ppm, 116.6 ± 1 ppm, 121.5 ± 1 ppm, 126.2 ± 1 ppm, 138.0 ± 1 ppm, 155.5 ± 1 ppm, 156.1 ± 1 ppm, 156.7 ± 1 ppm, 157.1 ± 1 ppm, 157.2 ± 1 ppm, 157.7 ± 1 ppm, 158.1 ± 1 ppm, y 158.4 ± 1 ppm. Preferentemente, la desviación es de solo ± 0.5 ppm y, más preferentemente de solo ± 0.2 ppm.

En una modalidad, la forma polimórfica B cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de acuerdo con la invención tiene un punto de fusión de 123 ± 1°C.

Más preferentemente, el espectro de IR de dicha forma polimórfica B cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina comprende picos a 803.27, 819.54, 852.30, 864.13, 893.22, 1024.99, 1126.71, 1148.77, 1183.98, 1272.31, 1283.82, 1333.10, 1362.06, 1426.98, 1448.53, 1481.82, 1554.80, y 1578.94 cirr1 con una desviación de ±5 cm-1. Preferentemente, la desviación es de sólo ± 4 c irr1 y, más preferentemente, de sólo ± 3 c irr1.

Más preferentemente, el espectro de IR de dicha forma polimórfica cristalina comprende picos en 426.62, 524.31, 558.12, 604.22, 636.09, 704.73, 729.05, 742.59, 803.27, 819.54, 852.30, 864.13, 893.22, 1024.99, 1126.71, 1148.77, 1183.98, 1272.31, 1283.82, 1333.10, 1362.06, 1426.98, 1448.53, 1481.82, 1554.80 y 1578.94 cm'1 con una desviación de ±5 cmA

En la presente solicitud, se ha identificado otra forma polimórfica cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina (en lo sucesivo, polimorfo A, no formando parte de la invención) como se muestra en la Figura 1A. Sin embargo, esta forma polimórfica no es suficientemente estable y se divulga aquí como ejemplo de referencia, pero no forma parte de la presente invención. La forma polimórfica cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina (polimorfo A) se caracterizó completamente, mientras que las formas polimórficas C y T (no formando parte de la invención) son tan inestables que incluso la caracterización completa apenas fue posible. Esta forma polimórfica A cristalina está en forma ortorrómbica y tiene un grupo espacial de p2-i2-i21, una molécula de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina en una celda unitaria y una dimensión de celda unitaria de a = 5.90 ± 0.1 A, b = 10.35 ± 0.1 A, c = 15.46 ± 0.1 A, a = 90 ± 3°, p = 90 ± 3° y<y>= 90 ± 3°.

La estructura cristalina del polimorfo A (no formando parte de la invención) (Fig. 3A) se caracterizó con cierto detalle mediante cristalografía de rayos X. Este polimorfo cristaliza de forma ortorrómbica dentro de un grupo espacial p2-i2-i21. Las dimensiones de la celda unitaria sona= 5.8986 (1) A, alpha = 90°;b= 10.3506 (3) A, beta = 90°;c= 15.4572 (5) A, gamma = 90°. Como se muestra en la Fig. 2A), las moléculas de 6-FMC se encuentran en capas multidimensionales de moléculas en apilamiento pi y moléculas en apilamiento T ortogonales. También muestra claramente que no hay hidratos, solvatos o contraiones a la sal presentes en la estructura.

La figura de la fórmula confirmó la identidad del compuesto tal y como se había divulgado.

Dicha forma polimórfica A (no formando parte de la invención) tiene el patrón de difracción de rayos X de polvos que comprende valores de ángulo 2-theta de 11.9, 13.8, 16.5, 20.0, 23.8, 24.0, 25.6, 26.2, 26.7, y 28.1 grados con una desviación ± 0.2 grados. Son especialmente distintivas las señales que comprenden valores de ángulo 2-theta de 11.9, 16.5, 26.7 y 28.1.

Los puntos de fusión se midieron en un aparato de punto de fusión Büchi M565 de capilar abierto. A 100°C la velocidad de calentamiento se redujo a 1 centígrado por minuto para determinar el punto de fusión con mayor precisión. El punto de fusión no corregido resultó ser de ~125°C /-2°C. El punto de fusión se confirmó mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). Las curvas de calentamiento y enfriamiento se registraron mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC; Netzsch DSC 204 F1) (Fig. 5A). El punto de fusión fue confirmado por el calentamiento DSC. La curva de enfriamiento mostró un amplio rango entre 65°C y 45°C (Fig. 6A).

El espectro 13C-RMN en estado sólido de dicha forma polimórfica cristalina comprende picos a 28.6, 103, 111, 113, 114, 118, 124, 130, 133, 135 y 155-158 ppm (muchos picos C-F) con una desviación ± 1 ppm. (Figura 8A). La figura 8A muestra la ssRMN del polimorfo A, y la figura 8B muestra la ssRMN del polimorfo B (forma polimórfica de la invención) de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina. Estos espectros demuestran claras diferencias entre los dos polimorfos A y B.

Estabilidad del polimorfo B inventivo en comparación con otras formas cristalinas

El grado de conversión depende generalmente de la estabilidad relativa de los polimorfos, de las barreras cinéticas para la conversión de fase y de la tensión aplicada. No obstante, la conversión de fase no suele ser motivo de gran preocupación, siempre que la conversión se produzca de forma consistente, como parte de un proceso de fabricación validado en donde las variables críticas del proceso de fabricación se conozcan y controlen bien.

La forma polimórfica termodinámicamente más estable de una sustancia farmacéutica se elige a menudo durante el desarrollo, basándose en el mínimo potencial de conversión a otra forma polimórfica y en su mayor estabilidad química.

En la presente solicitud, se prueba la estabilidad del polimorfo inventivo y reivindicada de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina (polimorfo B) y se compara con otros polimorfos de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina (polimorfos A, C y T) como referencia.

Se intentó convertir el polimorfo inventivo de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina (polimorfo B) en otra forma polimórfica (como el polimorfo A) bajo diversas condiciones térmicas como se describe en el Ejemplo 3.

La forma polimórfica cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina (polimorfo B) se disolvió en un disolvente orgánico y dicha mezcla se calentó. Como se ha descrito en el Ejemplo 3, no se consiguió convertir completamente la forma polimórfica cristalina (polimorfo B) en otra forma (en este caso el polimorfo A).

La estabilidad térmica de la forma polimórfica inventiva en comparación con otra forma polimórfica es inesperada y técnicamente ventajosa, en particular, para el proceso y regulación farmacéutico. Los resultados de la búsqueda indican que a temperatura ambiente e incluso por debajo de la temperatura ambiente la forma polimórfica A se convierte parcial o totalmente en una forma térmicamente más estable que es la forma polimórfica B. Esta conversión puede acelerarse elevando la temperatura. Esta inestabilidad térmica de la forma polimórfica A es una desventaja que hace que este polimorfo no sea adecuado para fines farmacéuticos.

La conversión completa de la forma polimórfica inventiva (polimorfo B) en el polimorfo A sólo podría lograrse bajo condiciones drásticas, por ejemplo, en CO<2>supercrítico como se describe en el ejemplo 4. El cilindro del aparato en el que se ha introducido el CO<2>supercrítico se cargó con el polimorfo B (Fig. 9 A) y se calentó a 60°C y a una presión de 35 kPa. El tiempo fue de 2.5 horas durante las cuales el API se disolvió completamente en el CO<2>supercrítico. El espectro del producto final se muestra en la Figura 9B. Es bastante evidente que se produjo una conversión del polimorfo B en el polimorfo A. El polvo era blanco (Fig. 9C). Sin embargo, es claro que tales condiciones no se aplican durante la preparación de las formulaciones farmacéuticas de interés. Además, el hecho de que el polimorfo B sólo pueda convertirse en otra forma polimórfica bajo condiciones extremas demuestra que el polimorfo B es absolutamente estable en las condiciones a las cuales se fabrican, almacenan y aplican las formulaciones farmacéuticas de interés.

Se han aplicado diversas condiciones de disolución/cristalización para intentar convertir el polimorfo B en el polimorfo A. Como se ha mencionado anteriormente, sólo con procedimientos sofisticados el polimorfo B pudo convertirse completamente en el polimorfo A (Ejemplo 4). Las formas polimórficas de una sustancia farmacéutica pueden sufrir una conversión de fase cuando se exponen a una serie de procesos de fabricación, como el secado, la molienda, la micronización, la granulación húmeda, el secado por aspersión y la compactación. La exposición a condiciones ambientales como la humedad y la temperatura también puede inducir la conversión del polimorfo. Por lo tanto, el polimorfo A es inestable y, por lo tanto, no es adecuado para los procesos farmacéuticos, mientras que el polimorfo B

fue estable en todas estas condiciones, incluyendo el secado, la molienda, la micronización, la granulación húmeda, el secado por aspersión y la compactación.

En contraste al polimorfo A, la forma cristalina inventiva (polimorfo B) es muy estable y, por tanto, no se produce ninguna conversión cuando se expone a una serie de procesos de fabricación y formulación. Esta es una ventaja técnica inesperada.

La tercera forma polimórfica de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina, el polimorfo C, se obtuvo tras la recristalización del polimorfo B en una mezcla ternaria de disolventes de heptano, etanol y agua, como se describe en el Ejemplo 7 y se muestra en la Figura 15. El polimorfo C obtenido fue muy inestable en condiciones estándar y después de un par de semanas a temperatura ambiente, humedad relativa del 40% al 60% y presión atmosférica el polimorfo C se convirtió completamente en el polimorfo B.

Al disolver la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina en agua ácida y valorar la solución a pH 12, apareció una cuarta forma polimórfica de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina, el polimorfo B, como forma polimórfica menos estable de la 6-fluoro-9-metil-pcarbolina. Ya después de un par de días en condiciones estándar (temperatura ambiente, humedad relativa del 40% al 60% y presión atmosférica) no se pudo detectar el polimorfo T. Esta rápida desaparición del polimorfo T hizo que la caracterización completa fuera bastante difícil. Sin embargo, se puede afirmar que ninguno de los polimorfos C y T es un hidrato o una forma de sal. El aislamiento de dicho polimorfo T fracasó. Al almacenar el polimorfo A en un medio acuoso, se observa la conversión en el polimorfo B y las señales del polimorfo T. Al menos los valores 2-theta característicos del polimorfo T pudieron determinarse mediante la sustracción de las señales pertenecientes al polimorfo B a partir de un difractograma mixto. En la figura 16 se muestra el patrón característico de la difracción de rayos X de polvos. Todos estos hallazgos enfatizan claramente que el polimorfo B representa el polimorfo más estable de 6-FMC y que es realmente el único polimorfo adecuado para la fabricación de las formulaciones farmacéuticas deseadas.

Micronización y estabilidad del polimorfo en una formulación a base de poloxámeros:

En una serie de experimentos, se ha analizado la estabilidad del polimorfo. Los polimorfos A y B micronizados (< 20jm ) se añadieron a un tampón de fosfato que contenía un tensoactivo no iónico como formulación de vehículo. Después de 30 horas, se extrajeron alícuotas, se lavaron, se secaron y se prepararon para la medición de la identidad del polimorfo mediante difractometría de rayos X de polvos (XRPD). El análisis XRPD demostró que, en la muestra inicialmente elaborada con el polimorfo A, se produjo una conversión del polimorfo del 60% al polimorfo B durante esas 30 horas (Fig. 10). 48 horas después de la preparación, el análisis XRPD dio como resultado una conversión del 100% de la forma polimórfica A a la B. Estos datos demuestran que el polimorfo B inventivo es el estado cristalino estable en la formulación. El análisis de consistencia realizado en una muestra elaborada inicialmente con el polimorfo B inventivo en intervalos regulares durante varios meses demostró que no hay conversión del polimorfo (Fig. 12).

En una modalidad, la forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina tiene un tamaño de partícula del cristal de < 200 |jm, de manera preferida < 175 jm , más preferido < 150 jm , aún más preferido < 125 jm , aún más preferido < 100 jm , aún más preferido < 75 jm , y aún más preferido < 50 jm . Más preferido, dicha forma polimórfica cristalina tiene un tamaño de partícula del cristal de < 20 jm .

Eficacia in vivo

La presente solicitud demuestra que la forma polimórfica B de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) tiene un impacto en la eficaciain vivo,como se indica en el Ejemplo 9. Los resultados se muestran en las Figuras 13 y 14.

Se ha investigado el efecto de una administración intratimpánica del polimorfo A de 6-FMC (0.12mg) preparado en fresco (menos de 24 horas antes de su uso) sobre el Desplazamiento del Umbral Permanente en cobayos (Fig. 13). El desplazamiento del umbral permanente (PTS) se define como la diferencia entre el umbral auditivo postraumático medido el día 14 y el umbral auditivo de referencia (basal) medido el día -3.

Además, en la figura 14 se presenta el efecto de una administración intratimpánica del polimorfo B de 6-FMC (0.12 mg) preparada al menos 48 horas antes de su uso, sobre el PTS en cobayos.

Utilizando un modelo de pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL) en cobayos, el solicitante investigó la eficacia de una única aplicación intratimpánica de 6-FMC en el tratamiento de la pérdida auditiva. Se observó que los animales tratados con el polimorfo A de 6-FMC presentan una mejora moderada en la recuperación del PTS. En comparación con los animales tratados con el vehículo, el tratamiento con el polimorfo A demostró una recuperación de 10-18 dBs del PTS a 16 kHz (Fig. 13). Sin embargo, para el uso clínico se necesitaría un efecto más fuerte.

Sorprendentemente, durante el desarrollo adicional se observó una clara mejora de la eficacia de los animales tratados con 6-FMC, en comparación con los experimentos anteriores (Fig.14).

Inesperadamente, se produjo una mejora mucho mayor del PTS en todas las frecuencias investigadas. El nivel de mejora aumentó de aproximadamente 10-18 dB como se ve en la figura 13, a 23-39 dB como se ve en la figura 14. Esta mejora de 30 dB y más, como se observa en la forma polimórfica B, es la más significativa desde el punto de vista clínico, ya que la audición se expresa de forma logarítmica (decibelios). En los seres humanos, una pérdida auditiva de 18 dB apenas puede ser percibida por el individuo, mientras que una pérdida auditiva de 30 dB dificulta la comunicación, en particular si se produce simultáneamente un ruido de fondo. Sorprendentemente algunas frecuencias (por ejemplo 4 y 8kHz, Fig. 14) de los animales tratados con la forma polimórfica B de 6-FMC demostraron un PTS cercano a cero.

Esta fuerte recuperación es muy importante, porque aclara la posibilidad de que un tratamiento con el polimorfo B de 6-FMC pueda conducir a una recuperación completa de la audición tras una pérdida auditiva inducida por ruido.

Para investigar cuál era la causa subyacente de los datos de eficacia mejorada, el solicitante realizó un análisis exhaustivo de los procedimientos experimentales y demostró que la mejora de la eficacia dependía de la preparación de la formulación del fármaco. Inicialmente, siempre se utilizó la formulación recién preparada inmediatamente después de la preparación que contenía el polimorfo A. Sin embargo, en los experimentos que demostraron una mayor eficacia, la formulación se preparó por adelantado y se almacenó durante al menos 48 horas antes de su uso. El análisis posterior de la formulación demostró que la formulación que se preparó inicialmente con la forma polimórfica A, se convirtió totalmente en la forma polimórfica B, parcialmente al 60% en 30h (Fig. 10) y totalmente ya después de 48h como se muestra en la Figura 11. En conjunto, estos datos muestran que la identidad de la forma polimórfica de 6-FMC presente en la formulación desempeña un papel muy importante. Además, el solicitante demostró que la formulación con la forma polimórfica B conduce a una mejora significativa de los datos de eficaciain vivoen el modelo de NIHL en cobayos, en comparación con la formulación con la forma polimórfica A.

Método de preparación de la forma polimórfica cristalina

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la preparación de la forma polimórfica cristalina inventiva de 6-fluoro-9H-metil-p-carbolina, que comprende los siguientes pasos:

A1) Proporcionar la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de la fórmula (I)

B1) disolver la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina en una mezcla de un disolvente polar y un disolvente no polar; o disolver primeramente la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina en un disolvente polar y añadir un disolvente no polar a la solución resultante de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina en el disolvente polar, en donde el disolvente polar es diclorometano, acetona, isopropanol, o una mezcla de los mismos, o una mezcla con agua y el disolvente no polar es metil ferf-butiléter, n-heptano, ciclohexano, o una mezcla de los mismos y la proporción del disolvente polar y el disolvente no polar está en un intervalo de 1:2 a 1:10;

C1) calentar la solución o la suspensión de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina hasta una temperatura en el intervalo entre 40° C y 100° C;

D1) agitar la solución resultante durante al menos 10 minutos a la misma temperatura

E1) enfriar la solución resultante hasta una temperatura en el intervalo entre -10° C a 30° C para obtener la forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de acuerdo con la reivindicación 1; y

F1) separar la forma polimórfica B cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de la fórmula (I)

Hay que destacar que todos los intentos iniciales para preparar una forma cristalina de 6-FMC dieron como resultado la forma polimórfica A. La forma polimórfica A se obtuvo por cristalización a partir de disolventes orgánicos apróticos no polares o ligeramente polares como el tolueno, el ciclohexano o el heptano. Por lo tanto, inicialmente los inventores consideraron que la forma polimórfica A era la forma polimórfica estable, porque esta forma polimórfica A siempre se obtenía tras la recristalización a partir de n-heptano. La identificación de la forma polimórfica B como la forma mucho más estable y mucho más activa fue un resultado sorprendente.

Tras comprobar que la forma polimórfica B es farmacológicamente muy potente y químicamente muy estable, se desarrolló el procedimiento de síntesis anterior que da lugar selectivamente a la forma polimórfica B.

La forma polimórfica B cristalina separada de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina tiene el patrón de difracción de rayos X de polvos que comprende valores de ángulo 2-theta de 11.3, 17.1, 17.6, 18.0, 22.5, 23.2, y 29.4 grados con una desviación ± 0.2 grados como se ha divulgado anteriormente.

Preferentemente, la forma polimórfica B cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina tiene el patrón de difracción de rayos X de polvos que comprende valores de ángulo 2-theta de 11.3, 14.1, 17.1, 17.6, 18.0, 19.0, 20.3, 20.6, 22.5, 23.2, 24.3, 25.8, y 29.4 grados con una desviación ± 0.2 grados como se ha divulgado anteriormente.

También preferentemente, la forma polimórfica cristalina inventiva de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina (polimorfo B) está en una forma monoclínica que tiene un grupo espacial de p2-ic, en donde una molécula de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina está en una celda unitaria asimétrica que tiene una dimensión de celda unitaria de a = 3.85 ± 0.1 A, b = 17.32 ± 0.1 A, c = 13.77 ± 0.1 A, a = 90 ± 3°, p = 91 ± 3° y y = 90 ± 3° como se ha descrito anteriormente.

Más preferido, el espectro 13C-RMN en estado sólido de dicha forma polimórfica cristalina (polimorfo B) de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina comprende picos a 28.6, 107.3, 110.2, 111.6, 112.8, 116.6, 121.5, 126.2, 138.0, 155.5, 156.1, 156.7, 157.1, 157.2, 157.7, 158.1, y 158.4 ppm con una desviación ± 1 ppm como se muestra en la Figura 8B.

De forma más preferida, la forma polimórfica B cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina tiene un punto de fusión de 123 ± 1°C como se ha descrito anteriormente.

Todavía más preferido, el espectro IR de dicha forma polimórfica B cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina comprende picos a 803.27, 819.54, 852.30, 864.13, 893.22, 1024.99, 1126.71, 1148.77, 1183.98, 1272.31, 1283.82, 1333.10, 1362.06, 1426.98, 1448.53, 1481.82, 1554.80, y 1578.94 cm'1 con una desviación de ±5 cmA Más preferentemente, el espectro IR de dicha forma polimórfica B cristalina comprende picos en 426.62, 524.31, 558.12, 604.22, 636.09, 704.73, 729.05, 742.59, 803.27, 819.54, 852.30, 864.13, 893.22, 1024.99, 1126.71, 1148.77, 1183.98, 1272.31, 1283.82, 1333.10, 1362.06, 1426.98, 1448.53, 1481.82, 1554.80, y 1578.94 cm‘1 con una desviación de ±5 cm‘ 1 como se ha descrito anteriormente.

Preferentemente, en la etapa B1) la concentración de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina en la mezcla de disolventes orgánicos está en el intervalo de 50 mM a 200 mM, preferentemente de 50 mM a 150 mM, más preferentemente de 80 mM a 120 mM.

Después de realizar la etapa C1), la suspensión de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina también se convierte en la solución resultante como se menciona en la etapa D1).

Preferentemente, en la etapa C1) la solución o la suspensión de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina se calienta a una temperatura comprendida en el intervalo entre 40° C y 60° C.

Preferentemente, durante la etapa D1) o después de la etapa D1) de los métodos mencionados anteriormente, se realiza la siguiente etapa D2):

D2) concentrar la mezcla de la solución o suspensión resultante mediante la evaporación de los disolventes, preferentemente al vacío.

Opcionalmente, en la etapa E1) después de enfriar la solución resultante, se puede realizar el siguiente paso:

E2) sembrar la forma polimórfica B cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina.

Los diversos métodos de preparación se describen en los Ejemplos 1 y 2 en detalle.

En algunas modalidades, en la etapa A) de los métodos descritos anteriormente, la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de la fórmula (I) está en una forma polimórfica A cristalina, en donde, dicha forma polimórfica tiene el patrón de difracción de rayos X de polvos que comprende valores de ángulo 2-theta de 11.9, 16.5, 26.7, y 28.1 grados con una desviación ± 0.2 grados o alternativamente 11.9, 13.8, 16.5, 20.0, 23.8, 24.0, 25.6, 26.2, 26.7, y 28.1 grados con una desviación ± 0.2 grados.

Composición farmacéutica y uso médico

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un uso médico de la forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-pcarbolina (forma polimórfica B) de acuerdo con la invención, en donde la forma polimórfica cristalina inventiva de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina tiene el patrón de difracción de rayos X de polvos que comprende valores de ángulo 2-theta de 11.3, 17.1, 17.6, 18.0, 22.5, 23.2, y 29.4 grados con una desviación de ± 0.2 grados.

Preferentemente, dicha forma polimórfica B cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina tiene el patrón de difracción de rayos X de polvos que comprende valores de ángulo 2-theta de 11.3, 14.1, 17.1, 17.6, 18.0, 19.0, 20.3, 20.6, 22.5, 23.2, 24.3, 25.8, 28.4 y 29.4 grados con una desviación ± 0.2 grados como se ha descrito anteriormente.

También se prefiere que dicha forma polimórfica cristalina esté en una forma monoclínica que tenga un grupo espacial de p2-i/c, en donde una molécula de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina esté en una celda unitaria asimétrica que tenga una dimensión de celda unitaria de a = 3.85 ± 0.1 A, b = 17.32 ± 0.1 A, c = 13.77 ± 0.1 A, a = 90 ± 3°, p = 91 ± 3° y y = 90 ± 3° como se ha descrito anteriormente.

Más preferentemente, el espectro 13C-RMN en estado sólido de dicha forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina comprende picos a 28.6, 107.3, 110.2, 111.6, 112.8, 116.6, 121.5, 126.2, 138.0, 155.5, 156.1, 156.7, 157.1, 157.2, 157.7, 158.1, y 158.4 ppm con una desviación ± 1 ppm como se muestra en la Figura 8B como se ha descrito anteriormente.

Aún más preferido, dicha forma polimórfica B cristalina de la formulación farmacéutica tiene un punto de fusión de 123 ± 1° C.

Aún más preferido, el espectro IR de dicha forma polimórfica B cristalina de la formulación farmacéutica comprende picos a 803.27, 819.54, 852.30, 864.13, 893.22, 1024.99, 1126.71, 1148.77, 1183.98, 1272.31, 1283.82, 1333.10, 1362.06, 1426.98, 1448.53, 1481.82, 1554.80, y 1578.94 cm'1 con una desviación ± 5 cmA

En una modalidad, dicha forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (forma polimórfica B) de acuerdo con la invención es útil para el tratamiento y/o profilaxis de daños auditivos, vértigo o trastornos vestibulares.

Preferentemente, dicha forma polimórfica B cristalina de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina descrita anteriormente es útil para el tratamiento y/o profilaxis de la lesión auditiva, el vértigo o el trastorno vestibular, en donde la lesión auditiva, el vértigo o los trastornos vestibulares se seleccionan del grupo que consiste de la enfermedad de Meniére, la pérdida auditiva neurosensorial repentina, la pérdida auditiva inducida por ruido, la pérdida de audición relacionada con la edad, las enfermedades autoinmunes del oído, el tinnitus, los traumatismos acústicos, los traumatismos por explosión, la sordera laberíntica, la presbiacusia, los traumatismos durante la implantación de prótesis del oído interno (traumatismo de inserción), el vértigo debido a enfermedades del oído interno y los daños auditivos debido a los antibióticos y citostáticos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la composición farmacéutica que comprende la forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina (forma polimórfica B) anteriormente mencionada junto con al menos un portador, excipiente, disolvente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, dicha composición farmacéutica es útil para el tratamiento y/o profilaxis del daño auditivo, el vértigo o el trastorno vestibular.

Preferentemente, dicha composición farmacéutica es útil para el tratamiento y/o profilaxis del daño auditivo, el vértigo o el trastorno vestibular, en donde el daño auditivo, el vértigo o el trastorno vestibular se selecciona del grupo que consiste de la enfermedad de Meniére, la pérdida auditiva neurosensorial repentina, la pérdida auditiva inducida por ruido, la pérdida de audición relacionada con la edad, las enfermedades autoinmunes del oído, el tinnitus, los traumatismos acústicos, los traumatismos por explosión, la sordera laberíntica, la presbiacusia, los traumatismos

durante la implantación de prótesis del oído interno (traumatismo de inserción), el vértigo debido a enfermedades del oído interno y los daños auditivos debido a los antibióticos y citostáticos.

La forma polimórfica B de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina anteriormente mencionada o las composiciones farmacéuticas anteriormente mencionadas que comprenden la forma polimórfica B de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina pueden prepararse y administrarse en forma de sistemas de aplicación transdérmica (emplasto, película), gotas, píldoras, grageas, geles, hidrogeles, ungüentos, jarabes, granulados, supositorios (úvulas), emulsiones, dispersiones, microformulaciones, nanoformulaciones, liposomas, soluciones, jugos, suspensiones, soluciones para infusión o soluciones para inyección. Se prefieren las composiciones farmacéuticas en forma de liposomas, ungüentos, suspensiones, geles y emulsiones. Son especialmente preferidas las formulaciones en forma de hidrogel.

Tales composiciones son, entre otras cosas, adecuadas para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, mucocutánea, rectal, transdérmica, tópica, bucal, intradérmica, intragastral, intracutánea, intranasal, intrabucal, percutánea, intratimpánica o sublingual. Se prefiere especialmente la administración o inyección en el oído medio, así como la administración tópica a través del tímpano.

Como portador farmacéuticamente aceptable puede utilizarse, por ejemplo, lactosa, almidón, sorbitol, sacarosa, celulosa, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, talco, manitol, alcohol etílico y similares. Tanto los polvos como las tabletas pueden comprender de 5 a 95 % en peso de dicho portador.

Las formulaciones líquidas comprenden soluciones, suspensiones, aerosoles y emulsiones. Por ejemplo, soluciones inyectables basadas en agua o en agua-propilenglicol para inyecciones parenterales. Para la preparación de supositorios se utilizan preferentemente ceras de bajo punto de fusión, ésteres de ácidos grasos y glicéridos.

Las composiciones farmacéuticas comprenden además geles y otros portadores viscosos de fármacos que son biodegradables o no degradables biológicamente, acuosos o no acuosos o basados en microesferas.

Preferentemente, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención está formulada para una administración tópica y/o local. Los portadores adecuados para una administración otogénica, por ejemplo, para una administración en el oído (medio), son sustancias orgánicas e inorgánicas que son farmacéuticamente aceptables y que no reaccionan con el compuesto cristalino de acuerdo con la invención y/o sus agentes activos adicionales, por ejemplo sal de cocina, alcoholes, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, alquilglicoles, polietilenglicoles, triacetato de glicerina, gelatina, hidratos de carbono como la lactosa o el almidón, carbonato de magnesio (magnesia, tiza), estearato (ceras), talco y petrolato (vaselina). Las composiciones descritas pueden esterilizarse y/o pueden contener adyuvantes como lubricantes, conservadores como el tiomersal (por ejemplo, 50% en peso), estabilizadores y/o humectantes, emulsionantes, sales para afectar la presión osmótica, sustancias tampón, colorantes y/o aromas. Estas composiciones también pueden contener uno o varios agentes activos adicionales, si es necesario. Las composiciones otogénicas y/o audiológicas según la invención pueden comprender diferentes compuestos y/o sustancias, por ejemplo, otras sustancias bioactivas como antibióticos, agentes activos antiinflamatorios como esteroides, corticoides, analgésicos, antipirinas, benzocaínas, procaínas.

Las composiciones de acuerdo con la presente invención para la administración tópica pueden contener otros compuestos y/o sustancias farmacéuticamente aceptables. En una modalidad preferida de la presente invención se selecciona un excipiente tópico que no amplifica la liberación de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina cristalina, y del posible agente activo o agentes activos adicionales hacia el sistema circulatorio sanguíneo o al sistema nervioso central, cuando se administra al oído, en el oído medio o en el canal auditivo. Las posibles sustancias portadoras contienen ácidos hidrocarbónicos, adsorbentes sin agua como el petrolato hidrofílico (vaselina) y la lanolina sin agua (es decir, Aquaphor®) y medios basados en emulsiones agua-aceite como la lanolina y elCold Cream.Más preferidas son las sustancias portadoras que son esencialmente no excluyentes y que contienen generalmente sustancias portadoras, que son solubles en agua, así como las sustancias basadas en emulsiones de aceite en agua (cremas o ungüentos hidrofílicos) y las sustancias con una base soluble en agua como las sustancias portadoras basadas en polietilenglicol y las soluciones acuosas que fueron gelificadas con varias sustancias como metilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1:

A)cristales del polimorfo A (como referencia)

B)cristales del polimorfo B. Las estructuras cristalinas de los polimorfos A y B se obtuvieron por recristalización en heptano y en una mezcla de MTBE y acetona o DCM respectivamente.

Figura 2:

A)Red molecular del polimorfo A (como referencia) de 6-FMC en un solo cristal (izquierda) y la respectiva estructura química (derecha) calculada por difractometría.

B)Red molecular del polimorfo B de 6-FMC en un solo cristal (izquierda) y la respectiva estructura química (derecha) calculada por difractometría.

Figura 3:

A)Difracción de rayos X de polvos (XRPD) del polimorfo A (como referencia).

B)Difracción de rayos X de polvos (XRPD) del polimorfo B.

C)Una superposición de las firmas de XRPD, calculadas mediante el uso de Mercury® basado en la estructura de rayos X del polimorfo B y la estructura medida del polimorfo B.

Figura 4:

A)Espectro infrarrojo (IR) del polimorfo A (como referencia).

B)Espectro infrarrojo (IR) del polimorfo B.

Figura 5:

A)Curva de fusión por DSC del polimorfo A (como referencia).

B)Curva de fusión por DSC del polimorfo B.

Figura 6:

A)Curva de enfriamiento por DSC del polimorfo A (como referencia).

B)Curva de enfriamiento por DSC del polimorfo B

Figura 7:

A)Análisis termo gravimétrico del polimorfo A (como referencia)

B)Análisis termo gravimétrico del polimorfo B

Figura 8: Resonancia magnética nuclear en estado sólido (ssRMN)

A)13C ssRMN del polimorfo A (como referencia)

b ) 13C ssRMN del polimorfo B

Figura 9: Dióxido de carbono supercrítico

A)Espectro del polimorfo antes de introducirlo en el aparato (polimorfo B; innovación del fluido supercrítico ExtrateX).

B)Espectro del polimorfo después de tratar el polimorfo B con dióxido de carbono supercrítico (produce el polimorfo A).

C)Precipitado tras la exposición de 6-FMC al dióxido de carbono supercrítico

El cilindro del aparato en el que se había introducido el CO<2>supercrítico se cargó con el polimorfo B (Fig. 9.A) y se calentó a 60° C y a una presión de 35MPa. El tiempo fue de 2.5 horas durante las cuales el API se disolvió completamente en el CO<2>supercrítico. El espectro del producto final se muestra en la Figura 9.B. Es evidente que se produjo una transformación del polimorfo B en el polimorfo A. El polvo era blanco (Fig. 9C).

Figura 10: Difracción de rayos X de polvos (XRPD) de la forma polimórfica A en una formulación basada en poloxámero después de 30 horas muestra la conversión del 60% de la forma polimórfica A introducida inicialmente en la forma polimórfica B inventiva.

Figura 11: Después de 48h en la formulación, a partir de la forma polimórfica A inventiva inicialmente introducida se produce una conversión del 100% a la forma polimórfica B.

Figura 12: Después de 30h en la formulación, a partir del polimorfo B inventivo inicialmente introducido no se produce ninguna conversión.

Figura 13: El efecto de una administración intratimpánica del polimorfo A de 6-FMC (0.12mg) sobre el PTS en cobayos.

Figura 14: Efecto de una única administración intratimpánica del polimorfo B de 6-FMC (0.12mg) sobre el PTS en cobayos.

Figura 15: Difracción de rayos X de polvos (XRPD) del polimorfo C (como referencia).

Figura 16: Difracción de rayos X de polvos (XRPD) de los polimorfos B+T.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la materia deberían apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas que se divulgan y seguir obteniendo un resultado similar o parecido sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención.

Otras modificaciones y modalidades alternativas de diversos aspectos de la invención serán evidentes para los expertos en la materia a la vista de esta descripción. Por consiguiente, esta descripción debe interpretarse únicamente como ilustrativa y tiene por objeto enseñar a los expertos en la materia la manera general de llevar a cabo la invención. Debe entenderse que las formas de la invención mostradas y descritas aquí deben tomarse como ejemplos de modalidades. Los elementos y materiales pueden sustituirse por los ilustrados y descritos en este documento, las partes y los procesos pueden ser invertidos, y ciertas características de la invención pueden utilizarse de forma independiente, todo como sería evidente para un experto en la materia después de tener el beneficio de esta descripción de la invención.

EJEMPLOS

Procedimientos Generales

1. RMN de estado sólido (ss-RMN)

La ss-RMN se midió a t.a. con un Bruker Advance III HD, 400MHz ssMAS (estado sólido con giro en ángulo mágico (solid state Magic Angle Spinning)) con un rotor de 4mm y una velocidad de giro de 12.5 kHz y una frecuencia de transmisión de 100 MHz. La muestra se llenó en seco en el rotor de 4 mm y se midió a temperatura ambiente.

2. XRPD

La XRPD se midió en un capilar abierto con un STOE Modell Stadi, Detector:

Mythen Dectris (monocromador de haz de Cu-K-a) de 2 a 50 de 2-theta.

Basándose en los datos cristalográficos, se calcularon las respectivas XRPD con el programa de análisis Mercury® y se compararon con las XRPD determinadas experimentalmente.

Preparación de la muestra: Las muestras secas (aproximadamente 20 mg) se molieron cuidadosamente en un mortero y en un capilar de vidrio de 0.5 mm, que se cierra mediante una fusión cuidadosa.

Colección de datos: La XRPD se midió a temperatura ambiente con un STOE Modell StudyP, Detector: Mythen Dectris 1K utilizando radiación CuKal (1.540598 A) en geometría de transmisión, un generador de rayos X de foco fino largo de Cu y un monocromador curvo de Germanio. Las muestras se midieron de 2 a 50 en 2-theta con el modo Debye-Scherrer Scan. La precisión de las posiciones de los picos se define como /- 0.2 grados en dos theta debido a diferencias experimentales como la preparación de la muestra y la densidad de empaquetamiento del capilar.

3. IR

El IR se midió en condiciones estándar con una unidad Jasco ATR Diamond (Golden Gate). En primer lugar, se mide el fondo sin muestra. A continuación, se coloca una cantidad visible de la muestra en la unidad ATR de diamante y se atornilla. Las muestras se midieron con 16 escaneos en un intervalo de 4000 -400 cm-1. El fondo se resta del barrido real para obtener el espectro IR de la muestra.

Ejemplo 1-1: preparación de la forma polimórfica cristalina (polimorfo A como forma polimórfica de referencia) de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC)

Método A:

La 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) se suspende en n-heptano (50 mL por g) y la suspensión se calienta a reflujo. La solución resultante se deja enfriar lentamente hasta t.a. y se deja reposar toda la noche. El sólido precipitado se filtra, se lava con n-heptano y se seca. La forma polimórfica A de 6-FMC se obtiene como agujas de color amarillo-marrón pálido con un rendimiento del 88%.

El documento WO2015044434 describe un método sintético de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) y la 6-FMC se obtiene como producto crudo en forma de cristales de color amarillo mostaza. Dichos cristales están en la forma polimórfica A de la presente invención. El análisis elemental de dichos cristales muestra pequeñas cantidades de impurezas, como agua y disolvente, y dichas impurezas pueden causar un punto de fusión deprimido en comparación con la forma polimórfica A altamente purificada obtenida en la presente solicitud, que aparece como cristales blancos.

Método B:

1. "Recristalización de última generación".Bajo agitación magnética, se calentó a reflujo una suspensión de 5 gramos de polimorfo B en 200 mL de n-heptano recién destilado. Se tuvo cuidado de que la fuente de calor (baño de aceite) no superara el nivel de disolvente en el matraz de fondo redondo de 500 mL. Como los cristales se disolvieron completamente en 200 mL, sólo se añadieron 20 mL más en lugar de la cantidad calculada de 290 mL. Tras 5 minutos de reflujo, se retiró la fuente de calor y se dejó de agitar. La solución se mantuvo alejada de la agitación externa o del enfriamiento para permitir un crecimiento lento de los cristales de alta pureza.

Tras 12h de cristalización a temperatura ambiente, los cristales se eliminaron por filtración al vacío, aspirando hasta lo más seco posible (mover la torta de filtración perdida con una espátula de plástico). El producto semiseco se transfirió a un matraz y se secó durante 2h a 2.5Pa a temperatura ambiente. El rendimiento en seco fue de 4.52 g (90.4%).

Esta muestra se analizó con difracción de rayos X y se comparó con el material de partida, que también se volvió a analizar para confirmar los espectros obtenidos.

La XRPD del producto de recristalización muestra que los cristales son principalmente el "polimorfo A", pero también hay un ~20% del polimorfo B; probablemente porque se utilizó una menor cantidad de heptano para la recristalización. Las XRPDs antes y después de la recristalización se muestran en una superposición. Para eliminar el polimorfo B restante, el lote se sometió a un nuevo proceso de recristalización (véase la parte 3).

2. Recristalización en condiciones difíciles(temperatura demasiado alta, matraz demasiado grande y fuente de calor a 1 cm por encima del nivel del disolvente). El equipo se utilizó como en el primer experimento. Se pusieron a reflujo 3.6 g en 120 mL de n-heptano en un matraz de 500 mL. La solución parecía clara, pero por encima del nivel del disolvente, se formaban cristales continuamente durante el proceso de calentamiento y ocasionalmente eran devueltos a la mezcla por el goteo del heptano hirviendo.

Esta mezcla (con algunos cristales preformados) se enfrió y rápidamente se formaron cristales en la solución (debido a los cristales ya presentes). Una vez completada la cristalización, los cristales formados en los frascos se veían como si hubiera puntos negros y manchas marrones.

3. Segunda recristalización: En un matraz de 250 mL, una suspensión de 3.9 g en 225 mL de heptano se sometió a reflujo (bloque de calefacción metálico) y la solución clara resultante se mantuvo a reflujo durante 10 min, antes de retirar la fuente de calor. La reacción se dejó enfriar y, a medida que aparecían los primeros cristales, la solución se agitó ocasionalmente para evitar la formación de cristales grandes. Después de dejar reposar durante 3h, los cristales esponjosos se eliminaron por filtración, se lavaron con 15 mL de n-heptano, se secaron por aspiración, se recogieron en un matraz más pequeño y se secaron durante la noche en un liofilizador a t.a. con 100Pa. Los cristales resultantes parecen más esponjosos y voluminosos que los de la primera recristalización. La XRPD muestra exclusivamente el polimorfo A.

En un experimento separado se registró la XRPD del polimorfo B como polvo seco y en un capilar empapado con nheptano para evaluar la influencia del heptano libre presente durante la medición. Esto es importante para asegurarse de que ninguna de las señales detectadas del "polimorfo de heptano" son artefactos debido al heptano residual incluido. Se confirmó que el heptano adicional no influye en las XRPD registradas.

A) Cristalografía de polvo de rayos X

La difractometría de rayos X de polvos se considera actualmente como el método definitivo para detectar el polimorfismo. Además, la demostración de una estructura no equivalente por difracción de rayos X de monocristal corroboraría las estructuras polimórficas.

La estructura cristalina delpolimorfo A(Fig. 1A) se caracterizó con cierto detalle mediante cristalografía de rayos X. Este polimorfo cristaliza de forma ortorrómbica dentro de un grupo espacial p2-i2-i21. Las dimensiones de la celda unitaria sona= 5.8986 (1) A, alpha = 90°;b= 10.3506 (3) A, beta = 90°;c= 15.4572 (5) A, gamma = 90°. Como se muestra en la Figura 2A, las moléculas de 6-FMC se encuentran en capas multidimensionales de moléculas en apilamiento pi y moléculas en apilamiento T ortogonales. También muestra claramente que no hay hidratos, solvatos o contraiones a la sal presentes en la estructura.

Tabla 1. Longitudes de enlace (A) y ángulos (°C) de la forma polimórfica A

m ) - c ( 4 > 1.3 710 (15 ) H ( l ) - C ( l l ) 1.3795 (16 )

N ( l ) - C ( l> 1.3 818 (16 ) N < 1 )-C (12 ) 1.4 536 (17 )

N (2 )-C (10 ) 1.3342 (18 ) N ( 2 ) - C ( 9 ) 1.3535 (17 )

C ( l ) - C ( 2 ) 1.3960 (18 ) C ( l ) - C ( 6 ) 1.4179 (18 )

C ( 2 ) - C ( 3 ) 1.3877 (19 ) C (2) - H (2) 0.9 46 ( 19 )

C ( 3 ) - C ( 4 ) 1.388 ( 2 ) C ( 3 ) - H ( 3 ) 0.9 95 ( 18 )

C (4 ) -C { 5 ) 1.3739 (18 ) C ( 5 ) - C ( 6 ) 1.3991 (17 )

C ( 5 ) - H ( 5 ) 0.9 81 ( 17 ) C ( 6 ) - C ( 7 ) 1.4404 (17 )

C ( 7 ) -C ( 8 ) 1.3985 (16 ) C ( 7 ) - C ( l l ) 1.4104 (17 )

C ( 8 ) - C ( 9 ) 1 .3850 (17 ) C ( 8 ) - H (8) 0. 964 ( 18 )

C ( 9 ) - H ( 9 ) 0.9 57 ( 18 ) C ( 10 ) - C ( l l ) 1.3987 (18 )

C (10 ) - H ( 10 ) 0.9 98 ( 17 ) C (12) -K (12A ) 0. 97 ( 2 )

C ( 12 ) - H( 12B) 1.0 0 ( 2 ) C (12) -H (120 0. 97 ( 2 )

C ( l l ) - N ( l > - C ( l ) 108 .03 (11 ) C ( l l ) - N ( l ) - C ( 12 ) 126.04 (11 )

C ( l ) - N ( 1 ) - C ( 12) 125 .63 (12 ) C ( 10 ) - N ( 2 ) - C ( 9 ) 11 8.71 (11 )

N ( l ) - C ( l ) - C (2) 128.84 (12 ) N ( l ) - C ( l ) - C ( 6 ) 109.53 (11 )

C ( 2 ) - C ( l ) - C ( 6 ) 121 .63 (12 ) C ( 3 ) - C ( 2 ) - C ( l ) 117 .68 (13 )

C (3) - C ( 2 ) -H (2) 120.9 (10 ) C ( l ) - C ( 2 ) - H ( 2 ) 121.3 (10 )

C ( 2 ) - C ( 3 ) - C ( 4 ) 119.6 3 (12 ) C ( 2 ) - C ( 3 ) - H (3) 120.0 (11)

C ( 4 ) - C ( 3 ) - H (3) 120.4 (10 ) F ( l ) - C (4) - C (5) 1 18.23 (12 )F(l)- C ( 4 ) -C(3) 117.30 (12 ) C ( 5 ) - C ( 4 ) - C (3) 124 .47 (12 )

C ( 4 ) - C ( 5 ) - C ( 6 ) 116.4 4 (12 ) C ( 4 ) - C ( 5 ) -H(5) 121.1(10)

C ( 6 ) - C ( 5 ) - H ( 5 ) 122.4 (10 ) C ( 5 ) - C ( 6 ) - C ( l ) 120.1 3 (12 )

C ( 5 ) - C ( 6 ) - C (7) 133.6 7 (12 ) C ( l ) - C ( 6 ) - C ( 7 ) 106.1 9 (11 )

C ( 8 ) - C ( 7 ) - C ( l l ) 1 18.17 (11 ) C ( 8 ) - C ( 7 ) - C (6) 135 .41 (12 )

C ( l l ) - C ( 7 ) - C ( 6 ) 106 .41 (10 ) C ( 9 ) - C ( 8 ) - C (7) 117 .43 (12 )

C ( 9 ) - C ( 8 ) - H (8) 118.8 (11 ) C (7) -C (8) -H (8) 123.7 (11 )

N ( 2 ) - C ( 9 ) - C (8) 124.4 4 (12 ) N ( 2 ) - C ( 9 > - H (9) 115.8 (10 )

C ( 8 ) - C ( 9 ) - H ( 9 ) 119.7 (10 ) N ( 2 ) - C ( 10 ) - C ( l l ) 120.89 (12 )

N ( 2 ) - C ( 10 ) - H (10) 116. 3 ( 9 ) C ( l l ) - C ( 10 ) - H ( 10 ) 122 .7 (10 )

N ( l > - C ( l l ) - C ( 10 ) 129.79 (12 ) N ( l ) - C ( l l ) - C ( 7 ) 109.83 (11 )

C ( 10 ) - C ( l l ) - C (7) 120 .36 (11 ) N ( l ) - C ( 12 ) -1 (128 ) 110.0(12)

N ( l ) - C ( 12 ) - H ( 12B) 110.9 (12 ) H (12A ) -C (12 ) -H (12 B ) 104.3 (17 )

N ( l ) - C ( 12 ) -K(12C) 110.3 (13 ) H (12A ) -C (12 ) -H (12C) 114.7 (18 )

K( 12B ) -C ( 12 ) - H ( 12C) 106 .5 (18 )

B) Datos de X-RPD

La difracción de rayos X de polvos del polimorfo A tiene señales características en 2-theta

Tabla 2. Valores de 2-Theta del polimorfo A cristalino (Fig. 3A)

C) ssRMN del Polimorfo A (Fig. 8A)

28.7, 103.6, 111.9, 113.4, 114.6, 114.8, 118.9, 125.4, 131.0, 134.0, 135.8, 155.5, 155.7, 156.4, 156.6, 157.6, 158.2, y 159.3 ppm

D) FT-IR del polimorfo A (Fig. 4A)

422.64, 446.61, 523.52, 557.49, 604.03, 635.82, 702.67, 743.66, 802.11, 813.34, 848.24, 893.14, 1023.95, 1069.75, 1152.14, 1183.22, 1275.15, 1363.80, 1427.67, 1450.25, 1480.13, 1560.90, y 1582.19 cm-1.

Ejemplo 1-2: preparación de la forma polimórfica cristalina (polimorfo B) de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) de acuerdo con la presente invención

Método A (isopropanol : n-heptano = 1:5):

Se suspende 1 g de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) en una mezcla de isopropanol y n-heptano y se calienta la suspensión a reflujo. La solución resultante se enfría y los sólidos precipitados se filtran, se lavan con n-heptano y se secan. La forma polimórfica B de 6-FMC se obtiene como polvo amarillo-marrón pálido con un rendimiento del 77%.

Método B (diclorometano : n-heptano = 1:4):

Se disuelven 2 g de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) en 6 mL de DCM y se añaden 24 mL de n-heptano a la solución. Los sólidos precipitados se filtran, se lavan con n-heptano y se secan. La forma polimórfica B de 6-FMC se obtiene como polvo amarillo-marrón pálido con un rendimiento del 62%.

Método C (Diclorometano : MTBE = 1:9.4):

Se disuelven 400 mg de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) en 1.6 mL de DCM y se añaden 15 mL de MTBE a la solución. La suspensión resultante se concentra por medio de un evaporador rotatorio a 40°C bajo 65kPa hasta obtener una solución clara. Después de 2 minutos, se detiene la evaporación, se enfría la solución y se filtra la suspensión resultante. La forma polimórfica B cristalina áspera de 6-FMC se obtiene como sólido marrón pálido y se seca. Rendimiento = 75%.

Método D (Acetona : MTBE = 1:2.8):

Se disuelven 400 mg de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) en 3.6 mL de acetona y se añaden 10 mL de MTBE a la solución. La solución resultante se concentra por medio de un evaporador rotatorio a 40°C bajo 45kPa hasta obtener una solución clara. Tras 7 minutos, la suspensión resultante se enfría y se filtra. La forma polimórfica B cristalina áspera de 6-FMC se obtiene como sólido marrón pálido y se seca. Rendimiento = 61%.

Método E (precipitación de la base libre con agua)

Se disuelven 200 mg de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) en 3.2 mL de DMSO. La solución clara se precipita en 40 mL de agua destilada y el precipitado formado se centrifuga. El sobrenadante se desecha y el precipitado se lava 3 veces con agua destilada para eliminar el DMSO residual. (Proceso de agitación en vortex - centrifugado). Después del último paso de lavado, los sólidos blancos brillantes se congelan en nitrógeno líquido, se liofilizan y representan el polimorfo B puro.

Método F (precipitación de la base libre con NaOH)

Se agita una suspensión acuosa de 200 mg de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC) y se añade HCl a pH 2. Durante la formación de la sal, se obtiene una solución clara y amarilla. Para asegurar la ausencia de sólidos, se filtra a través de un filtro de jeringa de 0.45|jm. La solución se agita de nuevo y se basifica con NaOH a pH 12. Durante la adición, se observa una espesa precipitación blanca de la base libre y se centrifuga. El sobrenadante se decanta y el sólido se lava a fondo mediante el tratamiento repetido con agua destilada, agitación en vortex y procesos de centrifugación (4x). Tras el último lavado, el sólido se congela en nitrógeno líquido y se liofiliza. Rendimiento: 85% del polimorfo B puro.

A) Cristalografía de rayos X

La estructura cristalina del polimorfo B (Fig. 1B) se caracterizó también con cierto detalle mediante cristalografía de rayos X. Este polimorfo cristaliza en forma monoclínica dentro de un grupo espacial p2ic. Las dimensiones de la celda unitaria son a = 3.8456 (2) A, alfa = 90°; b = 17.3249 (8) A, beta = 91.069 (3)°; c = 13.7709 (7) A, gamma = 90°. Como se muestra en la Fig. 2B), las moléculas de 6-FMC se encuentran en capas ordenadas de bandas en zig-zag. También muestra claramente que no hay hidratos, solvatos o contraiones a la sal presentes en la estructura. El análisis reveló la ausencia de cualquier disolvente. La imagen de la fórmula confirmó la identidad del compuesto tal y como se reclama.

Tabla 3. Longitudes de enlace (A) y ángulos (°C) de la forma polimórfica B

r u > - c < 4 > 1. 360 ( 8 )N ( l ) - C ( l l ) 1. 376 ( 9 )

N ( l ) - C ( l )1.38 4 ( 9 )N ( l ) - C ( 12 ) 1 .457 ( 8 )

N ( 2 ) - C ( 9 >1.342 ( 10 )N ( 2 ) - C ( 10 ) 1.34 4 ( 10 )

C ( l ) - C (2)1.398 ( 10 )C ( l ) - C ( 6 ) 1.4 08 ( 10 )

<C( 2 ) - C U )>1.3 88 ( 11 )C ( 2 ) -H(2A) 0.9500

C ( 3 ) - C ( 4 ) 1. 384 ( 11 )C (3 ) -K ( 3 A ) 0 .9500

C ( 4 ) - C ( 5 )1. 355 ( 10 )C ( 5 ) - C (6) 1.401 ( 10 )

C (5) -H (SA )0. 9500C ( 6 ) -C (7 ) 1.4 33 ( 10 )

C ( 7 ) - C (8) 1. 384 ( 10 )C ( 7 ) - C (11) 1 .413 ( 9 )

C ( 8 ) - C ( 9 ) 1.3 93 ( 10 )C ( 8 ) - H ( 8A) 0.9500

C( 9 ) -H (9 A) 0.9500C ( 10 ) - C ( l l ) 1.3 95 ( 10 )

C U 0 ) -HUOA) 0.95 00C (12 ) -K (12A ) 0.9800

C (12) -H U 2B) 0.98 00C (12 ) -H (12C ) 0.9800

C U 1 ) - N U ) - C ( l )10 8.3 ( 5 )126. 1 ( 6 )

C ( l ) - N U ) -C (12) 125.6 ( 6 )117 .9 ( 6 )

H ( 1 ) - C U ) - C ( 2 ) 128 .2 ( 6 )109. 5 ( 6 )

C (2) - C U ) -C (6 )122 .4 ( 7 )116. 5 ( 7 )

C (3) - C ( 2 ) -H(2A) 121. 8121.8

C (4) -C (3) -C (2) 1 20.7 ( 7 )119.6

C ( 2 ) - C ( 3 ) -H(3A) 119.6118 .5 ( 7 )

C ( 5 ) - C ( 4 ) - C ( 3 ) 12 3.6 ( 7 )117. 9 ( 7 )

C ( 4 ) - C ( 5 ) - C ( 6 ) 117 .5 ( 7 )121.2

C ( 6 ) - C ( 5 ) - H ( 5 A ) 121.2119. 4 ( 6 )

C ( 5 ) - C ( 6 ) -C<7) 13 4.4 ( 7 )106. 3 ( 6 )

C (8) - C (7) - C U 1 )118.0 ( 6 )1 35.1 ( 6 )

C U 1 ) -C (7) -C(6) 106.9 ( 6 )1 17.6 ( 7 )

C (7) -C (8) -H (8A)121.2121.2

N ( 2 ) - C ( 9 ) - C (8) 125. 0 ( 7 )117.5

C ( 8 ) - C ( 9 ) - H ( 9 A ) 117.5121.1 ( 7 )

N ( 2 ) - C ( 10 ) - H ( 10 A ) 119.4119.4

N U ) - C ( l l ) - C U O ) 130. 5 ( 7 )1 09.1 ( 6 )

C ( 10 ) - C ( l l ) - C ( 7 ) 12 0.4 ( 7 )109.5

N U ) -C (12 ) - HU 2B ) 109.5109.5

N ( l ) - C U 2 ) -HU2C) 109.5 109.5

K ( 12 B ) - C ( 12 ) - H ( 12 C ) 109.5

B) XRPD

El patrón de XRPD calculado del polimorfo B y el patrón de XRPD medido del polimorfo B se muestran en la Figura 3B y como una superposición en la Figura 3C. A pesar de una ligera variación en los valores absolutos de 2-theta, los patrones son relativamente casi idénticos entre sí.

Tabla 4. Valores 2-Theta del polimorfo B cristalino (Fig. 3B)

C) ssRMN del Polimorfo B(Fig. 8B)

28.6, 107.3, 110.2, 111.6, 112.8, 116.6, 121.5, 126.2, 138.0, 155.5, 156.1, 156.7, 157.1, 157.2, 157.7. 158.1, y 158.4 ppm

D) FT-IR del Polimorfo B(Fig. 4B)

426.62, 524.31, 558.12, 604.22, 636.09, 704.73, 729.05, 742.59, 803.27, 819.54, 852.30, 864.13, 893.22, 1024.99, 1126.71, 1148.77, 1183.98, 1272.31, 1283.82, 1333.10, 1362.06, 1426.98, 1448.53, 1481.82, 1554.80, y 1578.94 cm-1.

Ejemplo 2: Medición de los puntos de fusión y DSC de las formas polimórficas cristalinas

Los polvos de los polimorfos de 6-FMC se calentaron bajo agitación mientras que el calentamiento se desaceleró a temperaturas superiores a 100° C (1 centígrado por minuto). La muestra del polimorfo A se fundió a ~125° C. Las curvas de calentamiento y enfriamiento se registraron mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC; Netzsch DSC 204 F1) (Fig. 5A). El punto de fusión fue confirmado por el calentamiento DSC. La curva de enfriamiento mostró un amplio rango entre 65 y 45° C (Fig. 6A).

La muestra del polimorfo B se fundió a ~123° C. El análisis de la curva de calentamiento de DSC demostró una fase de transición, caracterizada por una pequeña desaceleración del proceso de fusión (Fig. 5B). Durante el proceso de enfriamiento del polimorfo B, la curva mostró una transición bifásica en un intervalo de temperatura de 45-75° C (Fig. 6B). Esto refleja la degradación del polimorfo B. El análisis de difractometría reveló que la conversión del polimorfo B en el polimorfo A se correlacionó con la duración del estado de fusión hasta una conversión completa. La sublimación al vacío produjo una conversión completa en el polimorfo A.

Ejemplo 3: Conversión del polimorfo bajo diversas condiciones térmicas (polimorfo B a polimorfo A)

3-1: El polimorfo B de 6-FMC se disolvió en n-heptano, la suspensión se calentó (100° C) durante 1:45 h bajo agitación. A continuación, la suspensión se enfrió y se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. El precipitado se filtró, se lavó con n-heptano y se secó al aire. El espectro XRPD resultante no reveló la conversión en la forma A.

3-2: El polimorfo B de 6-FMC se diluyó en tolueno y se calentó hasta 95° C y se enfrió hasta temperatura ambiente. El precipitado se filtró, se lavó con tolueno y se secó en una corriente de aire. El espectro XRPD indicó cierta presencia del polimorfo A, pero este experimento no fue reproducible, por lo que se supone que también en estas condiciones no se produce ninguna conversión del polimorfo B en el polimorfo A.

3-3: Una suspensión del polimorfo B de 6-FMC se diluyó en n-heptano y se calentó hasta 110° C. Se mantuvo durante 5 horas y 18 minutos en un matraz en condiciones de reflujo, seguido de un enfriamiento suave hasta la temperatura ambiente, y se agitó durante 16 horas. El precipitado se filtró, se lavó con heptano y se secó al aire. La XRPD demostró que el polimorfo B no había cambiado.

3-4: Una suspensión del polimorfo B de 6-FMC se diluyó en n-heptano y se calentó a 108° C hasta que la sustancia se diluyó completamente. Se añadieron cristales semilla del polimorfo A a la solución que se enfrió suavemente hasta la temperatura ambiente. El precipitado se filtró, se lavó con n-heptano y se secó al aire. La XRPD demostró que el polimorfo B no había cambiado.

Ejemplo 4: Conversión de polimorfos utilizando CO<2>supercrítico (polimorfo B a polimorfo A)

La extracción/conversión de polimorfos con CO<2>supercrítico se realizó con 500 mg de polimorfo B crudo y blanquecino en un sistema ExtrateX de expansión rápida de una solución supercrítica (REES). El recipiente de extracción se calentó a 60° C con una presión de 350 bar. La boquilla era un capilar de acero inoxidable de 5 cm de longitud y un diámetro interior de 0.25 mm a 70° C. El recipiente de expansión se calentó a 40° C a 1-5Mpa. Tiempo de equilibrio: 2.5h; tiempo de pulverización: 15min. Después del proceso, el polimorfo A se obtiene como un polvo blanco brillante.

El cilindro del aparato en el que se había introducido el CO<2>supercrítico se cargó con el polimorfo B (Fig. 9A) y se calentó a 60° C y a una presión de 35MPa. El tiempo fue de 2.5 horas durante las cuales el API se disolvió completamente en el CO<2>supercrítico. El espectro del producto final se muestra en la Figura 9B. Es bastante evidente que se produjo una transformación del polimorfo B en el polimorfo A. El polvo era blanco (Fig. 9C).

Ejemplo 5: Propiedades de los polimorfos de 6-FMC en forma de polvo (experimentos de fusión y enfriamiento)

Los polvos de los polimorfos de 6-FMC se calentaron bajo agitación mientras que el calentamiento se desaceleró a temperaturas superiores a 100° C (1 centígrado por minuto). La muestra del polimorfo A se fundió a ~125° C. Las curvas de calentamiento y enfriamiento se registraron mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC; Netzsch DSC 204 F1) (Fig. 5A). El punto de fusión fue confirmado por el calentamiento DSC. La curva de enfriamiento mostró un amplio rango entre 65 y 45° C (Fig. 6A).

La muestra del polimorfo B se fundió a ~123° C. El análisis de la curva de calentamiento de DSC demostró una fase de transición, caracterizada por una pequeña desaceleración del proceso de fusión (Fig. 5B). Durante el proceso de enfriamiento del polimorfo B, la curva mostró una transición bifásica en un intervalo de temperatura de 45-75° C (Fig. 6B). Esto refleja la degradación del polimorfo B. El análisis de difractometría reveló que la conversión del polimorfo B en el polimorfo A se correlacionó con la duración del estado de fusión hasta una conversión completa. La sublimación al vacío a 1-2 kPa produjo una conversión completa en cristales blancos del polimorfo A.

Ejemplo 6: Protocolo de extracción de 6-FMC de la formulación a base de poloxámero (Prueba de estabilidad de los polimorfos A y B en una formulación)

Se enfriaron 2 mL de la formulación a base de poloxámero con 12mg/ml de 6-FMC a 4° C, se agitó en vortex y se transfirió a un vial Eppendorf de 2 mL. El vial enfriado se centrifugó durante 2 minutos con una centrífuga de mesa, la solución polimérica sobrenadante se retiró con una pipeta y se desechó. El 6-FMC restante se resuspendió y se agitó en vórtex con 1.5 mL de agua milli-Q helada y se centrifugó como se ha descrito anteriormente. El agua sobrenadante se eliminó de nuevo con una pipeta y el procedimiento de lavado se repite 3 veces (en total 4 lavados). Nota: Mantener la solución fría para facilitar el proceso de centrifugación. Después del último lavado, el 6-FMC de color blanco restante se enfría con nitrógeno líquido y se liofiliza durante la noche a 100Pa a temperatura ambiente.

Después de 30 horas en la formulación, el 60% de la forma polimórfica A se convierte en la forma polimórfica B (véase la Fig. 10). Si se mantiene la formulación durante 48 horas o más, se produce una conversión del 100% de la forma polimórfica A en la forma polimórfica B, como se muestra en la figura 11.

Ejemplo 7: Preparación de la tercera forma polimórfica cristalina (polimorfo C) de 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC)

Se disolvieron 818mg de 6-FMC (polimorfo B) en 5mL de etanol y 500|jL de agua. A continuación, se añadieron 50mL de heptano, lo que dio lugar a la separación de fases. A pesar de la separación de fases, se utilizó el evaporador rotatorio a 40° C y 14kPa. Se separó una película de aceite en la pared del pistón, que de repente se volvió firme. Esta sustancia sólida cristalina se analizó demostrando únicamente el polimorfo B.

Se añadieron otros 20 mL de heptano al producto de la reacción y se calentó en condiciones de reflujo (temperatura de aproximadamente 100° C) durante 5 min a presión normal hasta que la solución tuvo un aspecto claro. La solución se enfrió durante la noche, mientras se agitaba, hasta temperatura ambiente. En la pared del pistón se formaron grumos más oscuros, mientras que en el fondo del pistón se formó una pulpa cristalina homogénea. La pulpa cristalina homogénea consistió en el polimorfo C.

La X-RPD de la forma polimórfica C se mide como se muestra en la Figura 15 y los picos característicos se resumen en la Tabla 5.

Tabla 5. Valores 2-Theta del polimorfo C

Ejemplo 8: Preparación de la cuarta forma polimórfica cristalina (polimorfo T) de la 6-fluoro-9-metil-p-carbolina (6-FMC)

Con HCl se acidificaron 250mg del polimorfo B de 6-FMC micronizado, seguido de sonicación a 40°C. La solución turbia se basificó con hidróxido de sodio hasta alcanzar un pH de 12, lo que provocó una precipitación fina y pulverulenta. El polvo se extendió sobre un pesafiltro para su secado al aire. La XRPD resultante reveló una mezcla de un nuevo polimorfo y el polimorfo B. El porcentaje era de ~50 a 50%. El nuevo polimorfo era claramente diferente de los polimorfos A, B y C y se le denominó polimorfo T.

Se llevó a cabo un análisis de RMN de la mezcla del polimorfo B/T, de la mezcla de los polimorfos B/T extrasecos y del polimorfo B puro para comprobar la presencia de agua. Ninguna de las muestras mostró más agua que la presente en el cloroformo deuterado. Por lo tanto, los análisis no revelaron ninguna evidencia de hidratos.

La X-RPD de la forma polimórfica T se mide como se muestra en la Figura 16 y los picos característicos se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6. Valores 2-Theta del polimorfo T obtenidos por sustracción de un espectro mixto del polimorfo B y T

Ejemplo 9: Eficacia in vivo de la forma polimórfica cristalina inventiva de 6-FMC - modelo de cobayo

Procedimientos generales:Todas las pruebasin vivode los estudios principales se llevaron a cabo en el bien establecido modelo de cobayo de NIHL. Se eligió el cobayo porque su anatomía es comparable tanto en estructura como en tamaño a la de los humanos. La función auditiva se evaluó mediante audiometría de respuesta evocada cerebral (BERA).

Métodos: Los cobayos adultos recibieron una inyección intratimpánica (i.t.) de 6-FMC formulada, ya sea, en un hidrogel termosensible o de hidrogel solo. Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia. Se utilizó la BERA para medir las respuestas auditivas del tronco cerebral (ABR) el día -3 y el día 14. Los estímulos auditivos eran tonos sinusales (10 ms de duración a 4, 8 y 16 kHz) en pasos de 5 dB de 0 a 90 dB. Estas mediciones se utilizaron para calcular el PTS. El trauma acústico se realizó el día 0 y consistió en una única banda continua (cuarto de octava centrado en 8kHz) a 118dB SPL durante 30 min. Los animales fueron tratados 1h después del final de la exposición acústica. La ventana redonda se visualizó con un microscopio quirúrgico a través de un pequeño orificio perforado en el hueso de la bulla del oído izquierdo. Se inyectaron 10pl de gel que contenía 6-FMC o vehículo utilizando una jeringa Hamilton y una bomba motorizada en la membrana de la ventana redonda (RWM) antes de cerrar el orificio con cemento dental.

Preparación de la formulación: se preparó previamente una solución basada en tensoactivos no iónicos, disolviendo una cantidad adecuada de tensoactivos no iónicos en agua o en tampón PBS y dejando que se mezclara durante una noche en condiciones de refrigeración. Una vez que el tensoactivo no iónico está completamente disuelto, se ajustan la osmolalidad y el pH si se desea. A continuación, la solución se filtra a través de un tamiz de 500 pm para eliminar las partículas de gel no disueltas. Esto concluye la composición del vehículo. La formulación que contiene el API (ingrediente farmacéutico activo) se prepara añadiendo 6-FMC micronizado (< 50pm) a una concentración de 12mg/mL. Para los experimentos presentados en la Figura 13, la formulación de 6-FMC se aplicó directamente después de ser preparada. Para los experimentos de la Figura 14, la formulación de 6-FMC se preparó al menos 48 horas antes de los experimentos con animales.

Resultados y discusión

Un tratamiento intratimpánico con 6-FMC en cualquiera de las formas polimórficas A o B dio lugar a una reducción sustancial de la NIHL (Fig. 13 y 14).

Administración del polimorfo A

En el caso de la forma polimórfica A se pudo conseguir un efecto moderado, en donde el PTS se redujo en un promedio de 7.7 dB (Fig. 13). En general, la exposición al ruido dio lugar a un PTS promedio de 22.3 dB en los controles tratados con vehículo y ésta se redujo en aproximadamente 7.7 dB hasta un cambio de umbral de 14.6 dB en los animales tratados con la forma polimórfica A del 6-FMC.

En el caso de la forma polimórfica B, este efecto fue considerablemente más fuerte y significativo en todas las frecuencias investigadas y dio lugar a una reducción terapéuticamente útil del PTS en al menos 23.6 dB hasta un notable 39.9 dB (Fig. 14). Es importante destacar que en algunas frecuencias el PTS se redujo a 0, lo que demuestra que el tratamiento con el polimorfo B de 6-FMC tiene el potencial de recuperación completa de la pérdida auditiva inducida por ruido. En general, la exposición al ruido dio lugar a un PTS promedio de 34.7dB en los controles tratados con el vehículo y esto se redujo significativamente en un promedio de 34.1 dB a un cambio de umbral de 0.6 dB en los animales tratados con la forma polimórfica B de la 6-FMC.

La comparación de los datos de eficacia de los estudios con animales en los que se utilizó la forma polimórfica A y B de la 6-FMC, demuestra que la forma polimórfica B tiene una eficacia muy superior sobre la forma polimórfica A. El uso de la forma polimórfica B conduce a una reducción promedio del PTS de 34.1 dB en comparación con una reducción promedio de 7.7 dB observada en los animales tratados con la forma polimórfica A. Además, se demostró que los animales tratados con la forma polimórfica B tienen la posibilidad de recuperarse completamente de la pérdida auditiva inducida por ruido, como se observa en la frecuencia de 4 y 8 kHz en la Figura 14, donde el PTS llegó a 0. En conjunto, los resultados de los estudiosin vivoutilizando el modelo de NIHL en cobayos, sugieren que una sola aplicación intratimpánica de la forma polimórfica B de 6-FMC conduce a una mejora significativa del PTS y tiene una eficacia superior a la forma polimórfica A.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Una forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de la fórmula (I)

   caracterizada porque la forma polimórfica cristalina tiene el patrón de difracción de rayos X de polvos medidos utilizando radiación CuKai que comprende valores de ángulo 2-theta de 11.3, 17.1, 17.6, 18.0, 22.5, 23.2 y 29.4 grados con una desviación ± 0.2 grados.
2. 2. La forma polimórfica cristalina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la forma polimórfica cristalina tiene el patrón de difracción de rayos X de polvos medidos utilizando radiación CuKa<1>, que comprende valores de ángulo 2-theta de 11.3, 14.1, 17.1, 17.6, 18.0, 19.0, 20.3, 20.6, 22.5, 23.2, 24.3, 25.8, y 29.4 grados con una desviación ± 0.2 grados.
3. 3. La forma polimórfica cristalina de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la forma polimórfica cristalina está en una forma monoclínica que tiene un grupo espacial de p2-i/c, en donde una molécula de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina está en una celda unitaria asimétrica que tiene una dimensión de celda unitaria de a = 3.85 ± 0.1 A, b = 17.32 ± 0.1 A, c = 13.77 ± 0.1 A, a = 90 ± 3°, p = 91 ± 3° y y = 90 ± 3°.
4. 4. La forma polimórfica cristalina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el espectro de 13C-RMN en estado sólido de dicha forma polimórfica cristalina comprende picos a 28.6, 107.3, 110.2, 111.6, 112.8, 116.6, 121.5, 126.2, 138.0, 155.5, 156.1, 156.7, 157.1, 157.2, 157.7, 158.1, y 158.4 ppm con una desviación de ± 1 ppm.
5. 5. La forma polimórfica cristalina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicha forma polimórfica cristalina tiene un punto de fusión de 123°C ± 1°C.
6. 6. La forma polimórfica cristalina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el tamaño de partícula de la forma polimórfica cristalina es < 200 pm.
7. 7. La forma polimórfica cristalina de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el tamaño de partícula de la forma polimórfica cristalina es < 20 pm.
8. 8. Una composición farmacéutica que comprende la forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 junto con al menos un portador, excipiente, disolvente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
9. 9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, en forma de liposomas, ungüentos, suspensiones, geles y emulsiones.
10. 10. Una forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8 o 9 para uso en el tratamiento y/o profilaxis de daños auditivos, vértigo o trastorno vestibular.
11. 11. La forma polimórfica cristalina para uso o la composición farmacéutica para uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el daño auditivo, el vértigo o los trastornos vestibulares se seleccionan del grupo que consiste de la enfermedad de Meniére, la pérdida auditiva neurosensorial repentina, la pérdida auditiva inducida por ruido, la pérdida de audición relacionada con la edad, las enfermedades autoinmunes del oído, el tinnitus, los traumatismos acústicos, los traumatismos por explosión, la sordera laberíntica, la presbiacusia, los traumatismos durante la implantación de prótesis del oído interno (traumatismo de inserción), el vértigo debido a enfermedades del oído interno y los daños auditivos debido a los antibióticos y citostáticos
12. 12. La forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina para uso o la composición farmacéutica para uso de conformidad con la reivindicación 10 u 11, en donde la forma polimórfica cristalina o la composición farmacéutica se administran por vía tópica y/o local.
13. 13. Un método para preparar la forma polimórfica cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 1 que comprende: A1) Proporcionar la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de la fórmula (I)

    B1) disolver la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina en una mezcla de un disolvente polar y un disolvente no polar; o disolver primeramente la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina en un disolvente polar y añadir un disolvente no polar a la solución resultante de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina en el disolvente polar, en donde el disolvente polar es diclorometano, acetona, isopropanol, o una mezcla de los mismos, o una mezcla con agua y el disolvente no polar es metil ferf-butiléter, n-heptano, ciclohexano, o una mezcla de los mismos y la proporción del disolvente polar y el disolvente no polar está en un intervalo de 1:2 a 1:10; C1) calentar la solución o la suspensión de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina hasta una temperatura en el intervalo entre 40° C y 100° C; D1) agitar la solución resultante durante al menos 10 minutos a la misma temperatura E1) enfriar la solución resultante hasta una temperatura en el intervalo entre -10° C a 30° C para obtener la forma polimórfica cristalina de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de acuerdo con la reivindicación 1; y F) separar la forma polimórfica B cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 1.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque en la etapa B1) una concentración de 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina en la mezcla del disolvente polar y el disolvente no polar está en el intervalo de 50 mM a 200 mM.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13 o 14, caracterizado porque después de la etapa E1) y antes de la etapa F) se realiza la siguiente etapa E2): E2) sembrar la forma polimórfica cristalina de la 6-fluoro-9-metil-9H-p-carbolina.