ES3004108T3

ES3004108T3 - Treatment of patients with severe von willebrand disease undergoing elective surgery by administration of recombinant vwf

Info

Publication number: ES3004108T3
Application number: ES18746457T
Authority: ES
Inventors: Miranda Chapman; Bruce Ewenstein; Bettina Ploder
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2025-03-11
Anticipated expiration: 2038-07-09
Also published as: EP3648787B1; CA3069256A1; KR102788331B1; FI3648787T3; JP2020526527A; US20190091298A1; JP2023085513A; US20240009279A1; US20220168397A1; RU2020105681A3; EP4494697A3; EP3648787A1; KR20200037251A; RU2766118C2; RU2020105681A; US12622950B2; WO2019010496A1; JP7326246B2; DK3648787T3; EP4494697A2

Abstract

La presente invención se refiere a un método para pretratar a un sujeto con enfermedad de von Willebrand grave antes de un procedimiento quirúrgico que comprende administrar al sujeto una dosis que varía de aproximadamente 20 UI/kg a aproximadamente 60 UI/kg de rVWF entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 24 horas antes del procedimiento quirúrgico, y en donde el Factor VIII no se administra con el rVWF antes del procedimiento quirúrgico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de pacientes con enfermedad grave de von Willebrand que se someten a cirugía electiva mediante administración de VWF recombinante

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional de EE . UU. n.° 62/546,999, presentada el 17 de agosto de 2017, y la solicitud de patente provisional de EE . UU. n.° 62/530,024, presentada el 7 de julio de 2017.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades de la coagulación, tales como la enfermedad de von Willebrand (VWD), generalmente son resultado de una deficiencia en la cascada de la coagulación. La enfermedad de von Willebrand (VWD) se refiere al grupo de enfermedades causadas por una deficiencia del factor de von Willebrand. El factor von Willebrand ayuda a que las plaquetas sanguíneas se agreguen entre s í y se adhieran a la pared de los vasos sanguíneos, lo cual es necesario para la coagulación sanguínea normal.

La enfermedad de von Willebrand (VWD) es el trastorno hemorrágico hereditario más común, con una tasa de prevalencia estimada del 1% (Veyradier A, et al.,Medicine(Baltimore). 2016, 95(11):e3038). Sin embargo, excluyendo las formas más leves de la enfermedad, sólo aproximadamente 1/10.000 pacientes realmente requieren tratamiento. El tratamiento actual de estas coagulopatías incluye una terapia sustitutiva utilizando preparaciones farmacéuticas que comprenden el factor de coagulación normal.

El VWF es una glicoproteína que circula en el plasma como una serie de multímeros cuyo tamaño varía de aproximadamente 500 a 20.000 kD. Se ha clonado la longitud completa del ADNc del VWF; el propolipéptido corresponde a los restos de aminoácidos 23 a 764 del prepro-VWF de longitud completa (Eikenboom et al (1995)Haemophilia1, 77 90). Las formas multiméricas del VWF están compuestas por subunidades polipeptídicas de 250 kD unidas entre sí por enlaces disulfuro. El VWF media la adhesión plaquetaria inicial al subendotelio de la pared del vaso dañado, presentando los multímeros más grandes actividad hemostática mejorada. El VWF multimerizado se une a la glicoproteína de la superficie plaquetaria Gp1ba, a través de una interacción en el dominio A1 del VWF, facilitando la adhesión plaquetaria. Otros sitios del VWF median la unión a la pared de los vasos sanguíneos. De esta forma, el VWF forma un puente entre la plaqueta y la pared del vaso que es esencial para la adhesión plaquetaria y la hemostasia primaria en condiciones de tensión de cizallamiento alto. Normalmente, las células endoteliales secretan formas poliméricas grandes de VWF y las formas de VWF que tienen un peso molecular más bajo surgen de la escisión proteolítica. Los multímeros de masas moleculares excepcionalmente grandes se almacenan en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células endoteliales y son liberados tras la estimulación por agonistas tales como la trombina y la histamina.

Para los pacientes con VWD, se recomienda que sean tratados con reemplazo del factor de von Willebrand (VWF) dada la necesidad de hemostasia prolongada, particularmente en cirugía mayor (Mannucci PM y Franchini M.,Haemophilia,2017, 23(2): 182-187; Institutos Nacionales de Salud. Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre. The Diagnosis, Evaluation, and Management of von Willebrand Publicación del NIH n.° 08-5832; diciembre de 2007). Las terapias con VWF derivado del plasma contienen factor VIII (FVIII) y tienen el potencial de acumulación de FVIII con dosis repetidas. VONVENDI® (factor von Willebrand [recombinante], Shire, Westlake Village, CA) es el primer y único concentrado de VWF recombinante (rVWF) (Turecek PL, et al.Hamostaseologie.2009;29(suppl 1):532-38; Mannucci PM, et al.Blood,2013;122(5):648-657; Gill JC , et al.Blood,2015;126(17):2038-2046). El documento EP 1593 390 se refiere a un tratamiento con vWF derivado de plasma y no describe la presente pauta posológica específica.

Breve compendio de la invención

La presente invención proporciona factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para usar en métodos de pretratamiento para un paciente con enfermedad de von Willebrand grave antes de un procedimiento quirúrgico administrando 20-60 UI/kg de factor de von Willebrand recombinante (rVWF) al paciente entre 12 horas y 24 horas, p. ej., 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 12 horas y 24 horas, 14 horas y 24 horas, 16 y 24 horas, 18 horas y 24 horas, o 20 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico, y sin administrar factor VIII (FVIII) con el rVWF antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, el rvWF para usar en el método de pretratamiento comprende además administrar al sujeto 5-90 UI/kg de rVWF 1 hora antes de la cirugía. En algunas realizaciones, se administran al sujeto 70-200 UI de rVWF después de la cirugía, con o sin el pretratamiento descrito anteriormente. En algunos casos, el procedimiento quirúrgico se selecciona de un grupo que consiste en cirugía mayor, cirugía menor y cirugía oral.

En algunas realizaciones, se administran al sujeto 35-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de un procedimiento quirúrgico mayor. En otras realizaciones, se administran al sujeto 15-90 ILT/kg de rVWF 1 hora antes de un procedimiento quirúrgico mayor. En otra realización, se administran al sujeto 150-220 UI/kg de rVWF después de un procedimiento quirúrgico mayor. En algunos casos, se administra al sujeto sometido a un procedimiento quirúrgico mayor una dosis total de 220-320 UI/kg. En algunos casos, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor y el pretratamiento comprende la administración de al menos dos dosis aproximadamente iguales de rVWF antes del procedimiento quirúrgico. Por "aproximadamente igual" como se utiliza en el presente documento se hace referencia a dosis que tienen concentraciones dentro de 1-15%, 2-14%, 3-13%, 4-12%, 5-11%, 6-10%, 7-9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% entre sí.

En algunas realizaciones, se administran al sujeto 50-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de un procedimiento quirúrgico menor. En otras realizaciones, se administra al sujeto 5-50 ILT/kg de rVWF 1 hora antes de una cirugía menor. En otra realización, se administran al sujeto 70-150 UI/kg de rVWF después de un procedimiento quirúrgico menor. En algunos casos, se administra al sujeto que se somete a un procedimiento quirúrgico menor una dosis total de 100-220 UI/kg. En algunos casos, cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor, el pretratamiento comprende la administración de al menos dos dosis de rVWF antes del procedimiento quirúrgico, en donde la primera dosis es mayor que la segunda dosis.

En algunas realizaciones, se administran al sujeto 20-40 ILT/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de un procedimiento quirúrgico oral. En otras realizaciones, se administran al sujeto 20-50 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico oral. En otra realización, se administran al sujeto 10-50 UI/kg de rVWF durante el procedimiento quirúrgico oral. En otra realización, se administran al sujeto 70-150 UI/kg de rVWF después de un procedimiento quirúrgico oral. En algunos casos, se administra al sujeto sometido a un procedimiento quirúrgico oral una dosis total de 70-190 UI/kg. En algunos casos, cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral y el pretratamiento comprende la administración de al menos dos dosis aproximadamente iguales de rVWF antes del procedimiento quirúrgico.

Otros objetos, ventajas y realizaciones de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra la eficiencia hemostática general (criterio de valoración principal) en los pacientes del estudio.

La FIG. 2 muestra la eficiencia hemostática (criterio de valoración secundario) en los pacientes del estudio.

La FIG. 3 muestra datos demográficos y características clínicas iniciales.

La FIG. 4 muestra los parámetros PK para VW F:RCo (n=11).

La FIG. 5A y la FIG. 5B muestran los niveles medios de VWF:RCo y FVIII:C endógeno en respuesta a rVWF 50±5 UI de rVWF:RCo/kg en todos los pacientes con VWD con datos PK analizados (n = 11) (FIG. 5A) y el subconjunto de pacientes con VWD tipo 3 (n = 5) (FIG . 5B).

La FIG. 6 muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del VWF.

Descripción detallada de la invención

Introducción

La presente invención proporciona rvWF para usar en métodos para el pretratamiento de un paciente con enfermedad de von Willebrand grave antes de cirugía mediante la administración al paciente de factor de von Willebrand recombinante (rVWF) 45-60 IG/kg de rVWF sin administrar factor VIII con el rVWF antes del procedimiento quirúrgico. En algunos casos, el procedimiento quirúrgico se selecciona de un grupo que consiste en cirugía mayor, cirugía menor y cirugía oral.

Definiciones

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un”, “una" y "el”, “la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo" incluye una pluralidad de dichos anticuerpos y la referencia a "una célula hospedante" incluye la referencia a una o más células hospedantes y equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Se observa además que las reivindicaciones pueden ser redactadas para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva tal como "únicamente", "solamente" y similares en relación con la enumeración de elementos de las reivindicaciones o el uso de una limitación "negativa".

Antes de describir la invención en más detalle, se debe comprender que esta invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que estas evidentemente pueden variar. También debe comprenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene solo el fin de describir realizaciones particulares y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

El término "pre-propéptido de VWF", "prepro-VWF" o "pro-VWF" se refiere a un polipéptido de VWF no maduro que comprende un péptido señal de aproximadamente 22 restos de aminoácidos, un propéptido de VWF de aproximadamente 741 restos de aminoácidos y una subunidad de VWF madura de aproximadamente 2050 restos de aminoácidos. Las subunidades de pro-VWF pueden dimerizarse por medio de enlaces disulfuro cerca de sus extremos carboxilo en el retículo endoplásmico para formar dímeros cola-cola que luego son transportados al Golgi. En el Golgi, se forman enlaces disulfuro cabeza-cabeza adicionales cerca de los extremos amino de las subunidades, formándose así multímeros. La escisión proteolítica del propéptido de VWF se produce a través de la proteasa furina de procesamiento, produciendo así un complejo VWF/VWF-PP maduro. Cuando se incluye "r" antes de la designación del VWF, esto se refiere a la versión recombinante. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se aplican al VWF recombinante (rVWF).

La expresión "complejo de VWF" o "complejo mat-VWF/VWF-PP" se refiere a una estructura heterodímera unida no covalentemente que comprende una subunidad de VWF madura y un propéptido de VWF. El complejo de VWF se puede generar como un producto de la escisión de furina entre la parte de propéptido y la parte de VWF madura del pre-propéptido de VWF. Cuando se incluye "r" antes de la designación del VWF, esto se refiere a la versión recombinante. En algunas realizaciones, el rvWF para el uso descrito en el presente documento se aplica al VWF recombinante (rVWF). Como se utiliza en el presente documento, "rVWF" se refiere a VWF recombinante.

Como se utiliza en el presente documento, "rFVIII" se refiere a FVIII recombinante.

El término "recombinante" cuando se usa con referencia, p. ej., a una célula, o ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector ha sido modificado mediante la introducción de una proteína o ácido nucleico heterólogo, o la alteración de una proteína o ácido nucleico nativo, o que la célula deriva de una célula modificada de este modo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otro modo se expresan de forma anormal, subexpresan o no se expresan en absoluto.

Como se utiliza en el presente documento, "VWF recombinante" incluye VWF obtenido mediante tecnología de ADN recombinante. En ciertas realizaciones, las proteínas de VWF para el uso de la invención pueden comprender una construcción, por ejemplo, preparada como en la publicación internacional WO 1986/06096 publicada el 23 de octubre de 1986 y solicitud de patente de EE . UU. N.° de Ser. 07/559,509, presentada el 23 de julio de 1990, a nombre de Ginsburg et al. El VWF para el uso de la presente invención puede incluir todas las formas potenciales, incluidas las formas monoméricas y multiméricas. También debe entenderse que el uso de la presente invención abarca diferentes formas de VWF que se pueden utilizar en combinación. Por ejemplo, el VWF para el uso de la presente invención puede incluir diferentes multímeros, diferentes derivados y tanto derivados biológicamente activos como derivados no biológicamente activos.

En el contexto del uso de la presente invención, el VWF recombinante abarca cualquier miembro de la familia VWF de, por ejemplo, un mamífero tal como un primate, ser humano, mono, conejo, cerdo, roedor, ratón, rata, hámster, jerbo, cánido, felino y derivados biológicamente activos de los mismos. También se incluyen las proteínas de VWF mutantes y variantes que tienen actividad, así como fragmentos funcionales y proteínas de fusión de las proteínas de VWF. Además, el VWF para el uso de la invención puede comprender además marcadores que faciliten la purificación, detección o ambas. El VWF descrito en el presente documento puede modificarse además con una fracción terapéutica o una fracción adecuada para la obtención de imágenes in vitro o in vivo.

Como se utiliza en el presente documento, "VWF derivado de plasma (pdVWF)" incluye todas las formas de la proteína que se encuentran en la sangre, incluido el VWF maduro obtenido de un mamífero que tiene la propiedad de estabilizar in vivo, p. ej., unirse, a al menos una molécula de FVIII.

La expresión "VWF altamente multimérico" o "VWF de alto peso molecular" se refiere al VWF que comprende al menos 10 subunidades, o 12, 14 o 16 subunidades, hasta aproximadamente 20, 22, 24 o 26 subunidades o más. El término "subunidad" se refiere a un monómero de VWF. Como se sabe en la técnica, generalmente son los dímeros de VWF los que polimerizan para formar los multímeros de orden mayor (véase Turecek et al., Semin.Thromb. Hemost.2010, 36(5): 510-521.

Como se utiliza en el presente documento, el término "factor VIII" o "FVIM" se refiere a cualquier forma de molécula de factor VIII con las características típicas del factor VIII de coagulación sanguínea, ya sea endógeno de un paciente, derivado del plasma sanguíneo o producido mediante el uso de técnicas de ADN recombinante, e incluyendo todas las formas modificadas del factor VIII. El factor VIII (FVIII) existe de forma natural y en preparaciones terapéuticas como una distribución heterogénea de polipéptidos que surgen de un único producto genético (véase, p. ej., Andersson et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,83:2979-2983 (1986)). Los ejemplos comercialmente disponibles de preparaciones terapéuticas que contienen Factor VIII incluyen las vendidas bajo los nombres comerciales de HEMOFIL M, ADVATE y RECOMBINATE (disponibles de Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Ill., EE . UU.).

Como se utiliza en el presente documento, "actividad del FVIII plasmático" y "actividad in vivo del FVIII" se utilizan indistintamente. La actividad del FVIII in vivo medida mediante ensayos convencionales puede ser la actividad del FVIII endógeno, la actividad de un FVIII administrado terapéuticamente (recombinante o derivado del plasma) o la actividad del FVIII tanto endógeno como administrado. De manera similar, "FVIII plasmático" se refiere al FVIII endógeno o al FVIII recombinante o derivado del plasma administrado.

Como se utiliza en el presente documento, "enfermedad de von Willebrand" se refiere al grupo de enfermedades causadas por una deficiencia del factor de von Willebrand. El factor von Willebrand ayuda a que las plaquetas sanguíneas se agreguen entre sí y se adhieran a la pared de los vasos sanguíneos, lo cual es necesario para la coagulación sanguínea normal. Como se describe con más detalle en el presente documento, existen varios tipos de enfermedad de Von Willebrand, que incluyen los tipos 1, 2A, 2B, 2M y 3.

Los términos “aislado”, “purificado” o “biológicamente puro” se refieren a un material que carece sustancial o esencialmente de los componentes que normalmente lo acompañan tal como se encuentra en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad se determinan normalmente usando técnicas de química analítica tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto rendimiento. El VWF que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificado. El término “purificado” en algunas realizaciones indica que un ácido nucleico o proteína dan lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. En otras realizaciones, significa que el ácido nucleico o la proteína es al menos 50% puro, más preferiblemente al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más puro. “Purificar” o “purificación”, en otras realizaciones, significa separar al menos un contaminante de la composición que se va a purificar. En este sentido, la purificación no requiere que el compuesto purificado sea homogéneo, p. ej., 100% puro.

Como se utiliza en el presente documento, "administrar" (y todos los equivalentes gramaticales) incluye administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea, administración oral, administración como un supositorio, contacto tópico, administración intraperitoneal, intralesional o intranasal, o la implantación de un dispositivo de liberación lenta, p. ej., una minibomba osmótica, a un sujeto. La administración es por cualquier vía, incluida la parenteral y transmucosa (p. ej., oral, nasal, vaginal, rectal o transdérmica). La administración parenteral incluye, p. ej., la administración intravenosa, intramuscular, intraarteriolar, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular e intracraneal. Otros modos de administración incluyen, pero no se limitan al uso de formulaciones liposomales, infusión intravenosa, parches transdérmicos, etc.

Las expresiones "cantidad o dosis terapéuticamente efectiva" o "cantidad o dosis terapéuticamente suficiente" o "cantidad o dosis efectiva o suficiente" se refieren a una dosis que produce efectos terapéuticos para los cuales se administra. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco útil para tratar la hemofilia puede ser la cantidad que es capaz de prevenir o aliviar uno o más síntomas asociados con la hemofilia. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento y podrá ser determinada por un experto en la técnica usando técnicas conocidas (véase, p. ej., Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a Edición, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams y Wilkins).

Como se utilizan en el presente documento, los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente y se refieren a un mamífero (preferiblemente ser humano) que tiene una enfermedad o tiene el potencial de contraer una enfermedad.

Como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" indica un intervalo aproximado de más o menos 10% a partir de un valor especificado. Por ejemplo, la expresión "aproximadamente 20%" abarca un intervalo de 18-22%.

Como se utiliza en el presente documento, el término "semivida" se refiere al período de tiempo que tarda la cantidad de una sustancia que se está descomponiendo (o aclaramiento de una muestra o de un paciente) en disminuir a la mitad.

I. Factor de von Willebrand recombinante (rVWF)

La presente invención utiliza composiciones que comprenden el factor de von Willebrand (rVWF) para el pretratamiento de sujetos con VWD grave que se someten a un procedimiento quirúrgico, tal como, pero no limitado a, cirugía mayor, cirugía menor o cirugía oral como se define además en las reivindicaciones.

En ciertas realizaciones, las proteínas de VWF para el uso de la invención pueden comprender una construcción, por ejemplo, preparada como en la publicación internacional WO 1986/06096 publicada el 23 de octubre de 1986 y solicitud de patente de EE .<u>U. N.° Ser. 07/559,509, presentada el 23 de julio de 1990, a nombre de Ginsburg et al. El<v>W<f>útil para la presente invención incluye todas las formas potenciales, incluidas las formas monoméricas y multiméricas. Una forma particularmente útil de VWF son los homomultímeros de al menos dos VWF. Las proteínas de VWF pueden ser un derivado biológicamente activo o, cuando se utilizan únicamente como estabilizante del FVIII, el VWF puede ser de una forma no biológicamente activa. También debe entenderse que la presente invención abarca diferentes formas de VWF para utilizar en combinación. Por ejemplo, una composición útil para la presente invención puede incluir diferentes multímeros, diferentes derivados y tanto derivados biológicamente activos como derivados no biológicamente activos.

En la hemostasia primaria, el VWF sirve como un puente entre las plaquetas y componentes específicos de la matriz extracelular, tales como el colágeno. La actividad biológica del VWF en este proceso se puede medir mediante diferentes ensayos in vitro (Turecek et al.,Semin. Thromb. Hemost.28: 149-160, 2002). El ensayo del cofactor ristocetina se basa en la aglutinación de plaquetas de nueva aportación o fijadas con formalina inducida por el antibiótico ristocetina en presencia de VWF.

El grado de aglutinación plaquetaria depende de la concentración de VWF y se puede medir mediante el método turbidimétrico, p. ej. mediante el uso de un agregómetro (Weiss et al.,J . Clin. Invest.52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al.,Thromb. Diath. Haemorrh.34: 306-308, 1975). El segundo método es el ensayo de unión de colágeno, que se basa en la tecnología ELISA (Brown et Bosak,Thromb. Res.43: 303-311, 1986; Favaloro,Thromb. Haemost.83: 127-135, 2000). Una placa de microtitulación está recubierta con colágeno tipo I o III. Luego, el VWF se une a la superficie del colágeno y posteriormente se detecta con un anticuerpo policlonal marcado con enzima. La última etapa es la reacción del sustrato, que se puede vigilar fotométricamente con un lector de ELISA. Como se proporciona en el presente documento, la actividad específica del cofactor de ristocetina del VWF (VW F:RCo) para el uso de la presente invención se describe generalmente en términos de mU/pg de VWF, medido utilizando ensayos in vitro.

Una ventaja de las composiciones de rVWF para el uso de la presente invención frente al pdVWF es que el rVWF presenta una actividad específica más alta que el pdVWF. En algunas realizaciones, el rVWF para el uso de la invención tiene una actividad específica de al menos aproximadamente 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60, 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80, 82,5, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 o más mU//pg.

El rVWF para el uso de la presente invención es altamente multimérico comprendiendo de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 subunidades. En otras realizaciones, el rVWF multimérico producido utilizando métodos de la presente memoria descriptiva comprende aproximadamente 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 subunidades. En otras realizaciones, el rVWF está presente en multímeros que varían en tamaño de dímeros a multímeros de más de 40 subunidades (>10 millones de Daltons). Los multímeros más grandes proporcionan múltiples sitios de unión que pueden interaccionar tanto con los receptores plaquetarios como con los sitios de lesión de la matriz subendotelial, y son la forma hemostáticamente más activa del VWF. La aplicación de ADAMTS13 escindirá los multímeros rVWF ultragrandes con el tiempo, pero durante la producción (generalmente a través de la expresión en cultivo celular), las composiciones de rVWF para el uso de la presente invención generalmente no están expuestas a ADAMTS13 y conservan su estructura altamente multimérica.

En una realización, una composición de rVWF como se usa en el presente documento tiene una distribución de oligómeros de rVWF caracterizada por que el 95% de los oligómeros tienen entre 6 subunidades y 20 subunidades. En otras realizaciones, la composición de rVWF tiene una distribución de oligómeros de rVWF caracterizada por que el 95% de los oligómeros tienen un intervalo de subunidades seleccionadas de variaciones de 458 a 641 que se encuentran en la Tabla 2 de la publicación internacional WO 2012/171031.

En una realización, una composición de rVWF se puede caracterizar según el porcentaje de moléculas de rVWF que están presentes en un multímero de rVWF de orden superior particular o un multímero más grande. Por ejemplo, en una realización, al menos el 20% de las moléculas de rVWF en una composición de rVWF utilizada en los métodos descritos en el presente documento están presentes en un complejo oligomérico de al menos 10 subunidades. En otra realización, al menos el 20% de las moléculas de rVWF en una composición de rVWF utilizada como se describe en el presente documento están presentes en un complejo oligomérico de al menos 12 subunidades. En otras realizaciones más, una composición de rVWF utilizada como se proporciona en el presente documento tiene un porcentaje mínimo (p. ej., tiene al menos X% ) de moléculas de rVWF presentes en un multímero de rVWF de orden superior particular o multímero más grande (p. ej., un multímero de al menos Y subunidades) según una cualquiera de las variaciones 134 a 457 que se encuentran en la Tabla 3 a la Tabla 5.

De acuerdo con lo anterior, la composición de rVWF administrada al sujeto (con o sin FVIII) generalmente comprende un porcentaje significativo de multímeros de rVWF de alto peso molecular (HMW). En otras realizaciones, la composición de multímeros de rVWF de HMW comprende al menos 10%-80% de decámeros de rVWF o multímeros de orden superior. En otras realizaciones, la composición comprende aproximadamente 10-95%, 20-90%, 30-85%, 40-80%, 50-75%, 60-70% de decámeros o multímeros de orden superior. En otras realizaciones, la composición de multímeros de rVWF de HMW comprende al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de decámeros o multímeros de orden superior.

La evaluación del número y porcentaje de multímeros de rVWF se puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, métodos que utilizan electroforesis y cromatografía de exclusión por tamaño para separar los multímeros de VWF por tamaños, por ejemplo como comentan Cumming et al,( J Clin Pathol.mayo de 1993; 46(5): 470-473. Estas técnicas pueden incluir además técnicas de inmunotransferencia (tales como transferencia Western), en las que se lleva a cabo la inmunotransferencia en gel con un anticuerpo radiomarcado contra VWF seguido de detección quimioluminiscente (véase por ejemplo Wen et al., (1993),J . Clin. Lab. Anal.,7: 317-323. Otros ensayos para el VWF incluyen el ensayo de actividad de unión VWF:Antígeno (VWF:Ag), VWF:Cofactor de ristocetina (VWF:RCof) y VWF:colágeno (VW F:CBA), que se utilizan a menudo para el diagnóstico y la clasificación de la enfermedad de Von Willebrand. (véase por ejemplo Favaloro et al.,Pathology,1997, 29(4): 341-456.

En otras realizaciones, los multímeros de rVWF de orden superior para el uso de la invención son estables durante aproximadamente 1 a aproximadamente 90 horas después de la administración. En otras realizaciones más, los multímeros de rVWF de orden superior son estables durante aproximadamente 5-80, 10-70, 15-60, 20-50, 25-40, 30-35 horas después de la administración. En otras realizaciones más, los multímeros de rVWF de orden superior son estables durante al menos 3, 6 , 12, 18, 24, 36, 48, 72 horas después de la administración. En ciertas realizaciones, la estabilidad de los multímeros de rVWF se evalúa in vitro.

En una realización, los multímeros de rVWF de orden superior utilizados en las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento tienen una semivida de al menos 12 horas después de la administración. En otra realización, los multímeros de rVWF de orden superior tienen una semivida de al menos 24 horas después de la administración. En otras realizaciones más, los multímeros de rVWF de orden superior tienen una semivida seleccionada de variaciones de 642 a 1045 que se encuentran en la Tabla 6 de la publicación internacional WO 2012/171031.

En aspectos específicos, los rVWF (recombinantes o derivados del plasma) utilizados según la presente invención no se modifican con ninguna modificación de conjugación, postraducción o covalente. En realizaciones particulares, el rVWF para el uso de la presente invención no está modificado con un polímero soluble en agua, incluyendo, sin limitación, un polietilenglicol (PEG), un polipropilenglicol, un polioxialquileno, un poli(ácido siálico), hidroxietil-almidón, una fracción de policarbohidrato y similares.

En otros aspectos, el rVWF (recombinante o derivado de plasma) utilizado de acuerdo con la presente invención se modifica por medio de conjugación, modificación postraduccional o modificación covalente, incluyendo modificaciones de los restos N o C-terminales, así como modificaciones de cadenas laterales seleccionadas, por ejemplo, en grupos sulfhidrilo libres, aminas primarias y grupos hidroxilo. En una realización, un polímero soluble en agua está unido a la proteína (directamente o a través de un conector) mediante un grupo lisina u otra amina primaria. En una realización, las proteínas de rVWF para el uso de la presente invención pueden estar modificadas por conjugación con un polímero soluble en agua, incluyendo, sin limitación, un polietilenglicol (PEG), un polipropilenglicol, un polioxialquileno, un poli(ácido siálico), hidroxietilalmidón, una fracción de policarbohidrato y similares.

Los polímeros solubles en agua que pueden usarse para modificar el rVWF y/o FVIII incluyen estructuras lineales y ramificadas. Los polímeros conjugados pueden unirse directamente a las proteínas de coagulación para el uso de la invención, o alternativamente pueden unirse a través de una fracción de enlace. Se pueden encontrar ejemplos no limitantes de conjugación de proteínas con polímeros solubles en agua en las patentes de EE . UU. N.° 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 y 4,179,337, así como en Abuchowski y Davis "Enzymes as Drugs," Holcenberg and Roberts, Eds., págs. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981), y Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2.a Ed., Academic Press, Inc. 2008.

La conjugación de proteínas se puede llevar a cabo mediante una serie de técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo, véase Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2.a Ed., Academic Press, Inc. 2008. Los ejemplos incluyen la unión a través del enlace peptídico entre un grupo carboxilo en una de las fracciones de proteína de coagulación o polímero soluble en agua y un grupo amina de la otra, o una unión éster entre un grupo carboxilo de una y un grupo hidroxilo de la otra. Otra unión mediante la cual una proteína de coagulación para el uso de la invención podría conjugarse con un compuesto polimérico soluble en agua es a través de una base de Schiff, entre un grupo amino libre en la fracción polimérica que se hace reaccionar con un grupo aldehído formado en el extremo no reductor del polímero por oxidación con peryodato (Jennings y Lugowski,J . Immunol.1981; 127:1011-8; Femandes y Gregonradis,Biochim Biophys Acta.1997; 1341; 26-34). La base de Schiff generada se puede estabilizar mediante reducción específica con NaCNBH3 para formar una amina secundaria. Un enfoque alternativo es la generación de grupos amino libres terminales en el polímero mediante aminación reductora con NH4Cl después de una oxidación previa. Se pueden utilizar reactivos bifuncionales para unir dos grupos amino o dos hidroxilo. Por ejemplo, un polímero que contiene un grupo amino se puede acoplar con un grupo amino de la proteína de coagulación con reactivos como BS3 (suberato de bis(sulfosuccinimidilo)/Pierce, Rockford, III.). Además, se pueden utilizar reactivos de reticulación heterobifuncionales como Sulfo-EMCS éster (N-.epsilon.-Maleimidocaproiloxi)sulfosuccinimida/Pierce), por ejemplo, para unir grupos amina y tiol. En otras realizaciones, se pueden utilizar un grupo reactivo de aldehído, tal como alcóxido de PEG más acetal dietílico de bromoacetaldehído; PEG más DMSO y anhídrido acético, y cloruro de PEG más el fenóxido de 4-hidroxibenzaldehído, ésteres activos de succinimidilo, ditiocarbonato activado P E G ., cloroformiato de 2,4,5-triclorofenilo y cloroformiato de P-nitrofenilo activado P E G ., en la conjugación de una proteína de coagulación.

En algunos aspectos, el rVWF para el uso de la presente invención ha sido madurado in vitro con furina. En otras realizaciones, la furina es furina recombinante.

En otros aspectos, el rVWF para el uso de la presente invención se produce por expresión en un cultivo de células de mamíferos utilizando métodos conocidos en la técnica. En realizaciones particulares, el cultivo de mamíferos comprende células CHO. En una realización de ejemplo, el rVWF para el uso de la invención comprende proteína de rVWF aislada de un sistema de expresión de células CHO. En una realización adicional, la eliminación del propéptido es mediada in vitro a través de la exposición del pro-VWF a la furina, en otra realización más, la furina utilizada para la eliminación del propéptido es furina recombinante. En otra realización más, los glicanos del grupo sanguíneo ABO/totalmente glicosilados están ausentes.

En otras realizaciones adicionales, el rVWF se utiliza para la presente invención mediante expresión en un sistema hospedante eucariota adecuado. Los ejemplos de células eucariotas incluyen, sin limitación, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, B<h>K, SK-Hep y HepG2; células de insecto, p. ej., células SF9, células SF21, células S2 y células High Five; y células de levadura, p. ej., células de Saccharomyces o Schizosaccharomyces. En una realización, el VWF se puede expresar en células de levadura, células de insecto, células aviares, células de mamífero y similares. Por ejemplo, en una línea celular humana, una línea celular de hámster o una línea celular murina. En una realización particular, la línea celular es una línea celular CHO, BHK o HEK. Normalmente, se pueden utilizar células de mamífero, p. ej., célula CHO de una línea celular continua, para expresar el VWF para el uso de la presente invención.

En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el VWF puede ser un vector. El vector puede ser suministrado por un virus o puede ser un plásmido. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína puede ser un gen específico o una parte biológicamente funcional del mismo. En una realización, la proteína es al menos una parte biológicamente activa del VWF. Se puede utilizar una amplia variedad de vectores para la expresión del VWF y se pueden seleccionar de vectores de expresión eucariotas. Ejemplos de vectores para expresión eucariota incluyen: (i) para expresión en levadura, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, utilizando promotores tales como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc.; (ii) para expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., utilizando promotores tales como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adeno-asociados, virus del herpes, retrovirus, etc., utilizando promotores tales como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, y p-actina.

En algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico comprende además otras secuencias adecuadas para una expresión controlada de una proteína tales como secuencias promotoras, potenciadores, cajas TATA, sitios de inicio de la transcripción, policonectores, sitios de restricción, secuencias poli-A, secuencias de procesamiento de proteínas, marcadores de selección y similares que son generalmente conocidos por un experto en la técnica.

En ciertas realizaciones, los métodos de cultivo celular de la memoria descriptiva pueden comprender el uso de un microportador. En algunas realizaciones, los cultivos celulares de las realizaciones se pueden realizar en biorreactores grandes en condiciones adecuadas para proporcionar superficies específicas de cultivo de alto volumen para lograr altas densidades celulares y expresión de proteínas. Un medio para proporcionar dichas condiciones de crecimiento es utilizar microportadores para el cultivo celular en biorreactores de tanque agitado. El concepto de crecimiento celular en microportadores fue descrito por primera vez por van Wezel (van Wezel, A .L.,Nature216:64-5 (1967)) y permite la adhesión de células a la superficie de pequeñas partículas sólidas suspendidas en el medio de crecimiento. Estos métodos proporcionan altas relaciones superficie-volumen y por lo tanto permiten una utilización eficiente de los nutrientes. Además, para la expresión de proteínas secretadas en líneas celulares eucariotas, la mayor relación superficie-volumen permite mayores niveles de secreción y, por lo tanto, mayores rendimientos de proteínas en el líquido sobrenadante del cultivo. Finalmente, estos métodos permiten aumentar fácilmente la escala de los cultivos de expresión eucariotas.

Las células que expresan VWF pueden unirse a un microportador esférico o poroso durante el crecimiento del cultivo celular. El microportador puede ser un microportador seleccionado del grupo de microportadores basados en dextrano, colágeno, plástico, gelatina y celulosa y otros como se describe en Butler (1988. En: Spier & Griffiths,Animal Cell Biotechnology3:283-303). También es posible cultivar las células hasta una biomasa en microportadores esféricos y subcultivar las células cuando hayan alcanzado la biomasa final del fermentador y antes de la producción de la proteína expresada en un microportador poroso o viceversa. Los microportadores esféricos adecuados pueden incluir microportadores de superficie lisa, tales como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 y Cytode™ 3 (G E Healthcare) y microportadores macroporosos tales como Cytopore™1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 y Cytoline™ 2 (G E Healthcare).

En ciertas realizaciones, el rVWF se expresa en células cultivadas en medios de cultivo celular que producen rVWF de alto peso molecular. Las expresiones "solución de cultivo celular", "medio o medios de cultivo celular" y "líquido sobrenadante de cultivo celular" se refieren a aspectos de los procedimientos de cultivo celular generalmente bien conocidos en la técnica. En el contexto de la presente invención, una solución de cultivo celular puede incluir medios de cultivo celular y líquido sobrenadante de cultivo celular. Los medios de cultivo celular se añaden externamente a la solución de cultivo celular, opcionalmente junto con complementos, para proporcionar nutrientes y otros componentes para cultivar las células que expresan VWF. El líquido sobrenadante de cultivo celular se refiere a una solución de cultivo celular que comprende los nutrientes y otros componentes del medio de cultivo celular, así como los productos liberados, metabolizados y/o excretados de las células durante el cultivo. En otras realizaciones, los medios pueden estar exentos de proteínas animales y definidos químicamente. Se conocen en la técnica métodos para preparar medios de cultivo exentos de proteínas animales y definidos químicamente, por ejemplo en los documentos US 2008/0009040 y US 2007/0212770. "Exento de proteínas" y expresiones relacionadas se refieren a proteínas que provienen de una fuente exógena o distinta a las células del cultivo, que liberan proteínas de forma natural durante el crecimiento. En otra realización, el medio de cultivo está exento de polipéptidos. En otra realización, el medio de cultivo está exento de suero. En otra realización, el medio de cultivo está exento de proteínas animales. En otra realización, el medio de cultivo está exento de componentes animales. En otra realización, el medio de cultivo contiene proteína, p. ej., proteína animal de suero, tal como suero bovino fetal. En otra realización, el cultivo tiene proteínas recombinantes añadidas de forma exógena. En otra realización, las proteínas son de un animal certificado exento de patógenos. La expresión "químicamente definido" como se utiliza en el presente documento significa que el medio no comprende ningún complemento indefinido, tal como, por ejemplo, extractos de componentes animales, órganos, glándulas, plantas o levaduras. Por consiguiente, cada componente de un medio químicamente definido queda definido con precisión. En una realización preferida, los medios están exentos de componentes animales y exentos de proteínas.

En otras realizaciones, posteriormente a la purificación a partir de un cultivo de células de mamífero, el rFVIII se reconstituye antes de la administración. En otras realizaciones más, el rVWF se trata con furina antes o después de la reconstitución. En otras realizaciones, la furina es furina recombinante. En otras realizaciones más, el rVWF para el uso de la invención no se expone a ADAMTS13, con el resultado de que están presentes formas ultragrandes (es decir, que comprenden 10 o más subunidades) en las composiciones de rVWF para el uso de la invención.

En aspectos específicos, el rVWF utilizado en la presente invención está contenido en una formulación que contiene un tampón, un azúcar y/o un alcohol de azúcar (incluyendo sin limitación trehalosa y manitol), un estabilizante (tal como glicina) y un tensioactivo (tal como polisorbato 80). En otras realizaciones, para formulaciones que contienen rFVIII, la formulación puede incluir además sodio, histidina, calcio y glutatión.

En un aspecto, las formulaciones que comprenden rVWF se liofilizan antes de la administración. La liofilización se lleva a cabo utilizando técnicas comunes en la técnica y debe optimizarse para la composición que se está desarrollando [Tang et al.,Pharm Res.21:191-200. (2004) y Chang et al.,Pharm Res.13:243-9 (1996)].

Los métodos para preparar formulaciones farmacéuticas pueden incluir una o más de las siguientes etapas: añadir un agente estabilizante como se describe en el presente documento a dicha mezcla antes de liofilizar, añadir al menos un agente seleccionado de un agente de carga, un agente regulador de la osmolaridad y un tensioactivo, cada uno de los cuales como se describe en el presente documento, a dicha mezcla antes de liofilizar. Una formulación liofilizada está, en un aspecto, compuesta al menos por uno o más de un tampón, un agente de carga y un estabilizante. En este aspecto, se evalúa la utilidad de un tensioactivo y se selecciona en los casos en que la agregación durante la etapa de liofilización o durante la reconstitución se convierte en un problema. Se incluye un agente de tamponamiento apropiado para mantener la formulación dentro de zonas estables de pH durante la liofilización.

La práctica de reconstitución convencional para el material liofilizado es volver a añadir un volumen de agua pura o agua estéril para inyección (WFI) (típicamente equivalente al volumen retirado durante la liofilización), aunque a veces se usan soluciones diluidas de agentes antibacterianos en la producción de productos farmacéuticos para administración parenteral [Chen,Drug Development and Industrial Pharmacy,18:1311-1354 (1992)]. Por consiguiente, se proporcionan métodos para la preparación de composiciones de VWF recombinante reconstituidas que comprenden la etapa de añadir un diluyente a una composición de VWF recombinante liofilizada para el uso de la invención.

El material liofilizado puede reconstituirse como una solución acuosa. Una variedad de vehículos acuosos, p. ej., agua estéril para inyección, agua con conservantes para uso en dosis múltiples o agua con cantidades apropiadas de tensioactivos (por ejemplo, una suspensión acuosa que contiene el compuesto activo en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas). En varios aspectos, dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo y sin limitación, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; los agentes dispersantes o humectantes son un fosfátido de origen natural, por ejemplo y sin limitación, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo y sin limitación, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo y sin limitación, heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de sorbitol polioxietilénico, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo y sin limitación, monooleato de sorbitán polietilénico. En diversos aspectos, las suspensiones acuosas también contienen uno o más conservantes, por ejemplo y sin limitación, phidroxibenzoato de etilo o n-propilo.

En ciertas realizaciones, las composiciones para el uso de la presente invención son formulaciones líquidas para administración con el uso de una jeringa u otro recipiente de almacenamiento. En otras realizaciones, estas formulaciones líquidas se producen a partir del material liofilizado descrito en el presente documento reconstituido como una solución acuosa.

En un aspecto adicional, las composiciones para el uso de la invención comprenden además uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Las frases "farmacéuticamente" o "farmacológicamente" aceptable se refieren a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhiben la degradación de proteínas tales como productos de agregación y escisión, y además no producen reacciones alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran utilizando vías bien conocidas en la técnica, como se describe a continuación. Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares clínicamente útiles, incluidos los agentes descritos anteriormente.

II. Producción de VWF recombinante

El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) maduro libre para el uso de la presente invención se puede producir de forma recombinante. Un experto en la materia reconoce métodos útiles para expresar una proteína recombinante en una célula hospedante. En algunos casos, el método incluye expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica el rVWF en una célula hospedante, tal como una célula CHO, y cultivar la célula hospedante resultante en determinadas condiciones para producir rVWF, prepro-VWF, pro-VWF y similares.

En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el VWF puede ser un vector de expresión. El vector puede ser suministrado por un virus o puede ser un plásmido. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína puede ser un gen específico o una parte biológicamente funcional del mismo. En una realización, la proteína es al menos una parte biológicamente activa del VWF. La secuencia de ácido nucleico puede comprender además otras secuencias adecuadas para una expresión controlada de una proteína, tales como secuencias promotoras, potenciadores, cajas TATA, sitios de iniciación de la transcripción, policonectores, sitios de restricción, secuencias poli-A, secuencias de procesamiento de proteínas, marcadores de selección y similares, que son generalmente conocidos por un experto en la técnica.

Se puede utilizar una amplia variedad de vectores para la expresión del VWF y se pueden seleccionar de vectores de expresión eucariotas. Ejemplos de vectores para expresión en eucariotas incluyen: (i) para expresión en levadura, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, utilizando promotores tales como AOX1,<g>A p , GAL1, AUG1, etc.; (ii) para expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., utilizando promotores tales como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBpV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adeno-asociados, virus del herpes, retrovirus, etc., utilizando promotores tales como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV y p-actina.

En algunos aspectos, el rVWF para el uso de la presente invención se produce por expresión en un cultivo de células de mamíferos utilizando métodos conocidos en la técnica. En realizaciones particulares, el cultivo de mamífero comprende células CHO. En otras realizaciones, el rVWF se coexpresa con el factor VIII recombinante (rFVIII) en el mismo cultivo. En dichas realizaciones, el rVWF y el rFVIII se purifican juntos (copurificados) o por separado utilizando métodos conocidos en la técnica. En otras realizaciones, el rVWF se expresa en un cultivo que no contiene rFVIII.

En algunas realizaciones, el rVWF se expresa y se aísla de un sistema hospedante eucariota adecuado. Los ejemplos de células eucariotas incluyen, sin limitación, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep y HepG2; células de insecto, p. ej., células SF9, células SF21, células S2 y células High Five; y células de levadura, p. ej., células de Saccharomyces o Schizosaccharomyces. En una realización, el VWF se puede expresar en células de levadura, células de insecto, células aviares, células de mamífero y similares. Por ejemplo, en una línea celular humana, una línea celular de hámster o una línea celular murina. En una realización particular, la línea celular es una línea celular CHO, BHK o HEK. Normalmente, se pueden utilizar células de mamífero, p. ej., célula CHO de una línea celular continua, para expresar el VWF para el uso de la presente invención. En ciertos casos, la proteína VWF se expresa y se aísla de un sistema de expresión de células CHO.

El VWF se puede producir en un sistema de cultivo celular o de acuerdo con cualquier método de cultivo celular reconocido por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, los cultivos celulares se pueden realizar en biorreactores grandes en condiciones adecuadas para proporcionar superficies específicas de cultivovolumen grandes para lograr altas densidades celulares y expresión de proteínas. Un medio para proporcionar dichas condiciones de crecimiento es utilizar microportadores para el cultivo celular en biorreactores de tanque agitado. El concepto de crecimiento celular en microportadores fue descrito por primera vez por van Wezel (van Wezel, A .L.,Nature,1967, 216:64-5) y permite la adhesión de células a la superficie de pequeñas partículas sólidas suspendidas en el medio de crecimiento. Estos métodos proporcionan altas relaciones superficie-volumen y por lo tanto permiten una utilización eficiente de los nutrientes. Además, para la expresión de proteínas secretadas en líneas celulares eucariotas, la mayor relación superficie-volumen permite mayores niveles de secreción y, por lo tanto, mayores rendimientos de proteínas en el líquido sobrenadante del cultivo. Finalmente, estos métodos permiten aumentar fácilmente la escala de los cultivos de expresión eucariotas.

Las células que expresan VWF pueden unirse a un microportador esférico o poroso durante el crecimiento del cultivo celular. El microportador puede ser un microportador seleccionado del grupo de microportadores basados en dextrano, colágeno, plástico, gelatina y celulosa y otros como se describe en Butler (1988. En: Spier y Griffiths,Animal Cell Biotechnology3:283-303). También es posible cultivar las células hasta una biomasa en microportadores esféricos y subcultivar las células cuando hayan alcanzado la biomasa final del fermentador y antes de la producción de la proteína expresada en un microportador poroso o viceversa. Los microportadores esféricos adecuados pueden incluir microportadores de superficie lisa, tales como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 y Cytodex™ 3 (G E Healthcare) y microportadores macroporosos tales como Cytopore™1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 y Cytoline™ 2 (G E Healthcare).

En una realización adicional, el propéptido de VWF se escinde del VWF no maduro in vitro por medio de la exposición del pro-VWF a furina. En algunas realizaciones, la furina utilizada para la escisión del propéptido es furina recombinante.

En ciertas realizaciones, el rVWF se expresa en células cultivadas en medios de cultivo celular que producen rVWF de alto peso molecular. Las expresiones "solución de cultivo celular", "medio o medios de cultivo celular" y "líquido sobrenadante de cultivo celular" se refieren a aspectos de los procedimientos de cultivo celular generalmente bien conocidos en la técnica. En el contexto de la presente invención, una solución de cultivo celular puede incluir medios de cultivo celular y líquido sobrenadante de cultivo celular. Los medios de cultivo celular se añaden externamente a la solución de cultivo celular, opcionalmente junto con complementos, para proporcionar nutrientes y otros componentes para cultivar las células que expresan VWF. El líquido sobrenadante de cultivo celular se refiere a una solución de cultivo celular que comprende los nutrientes y otros componentes del medio de cultivo celular, así como los productos liberados, metabolizados y/o excretados de las células durante el cultivo. En otras realizaciones, los medios pueden estar exentos de proteínas animales y definidos químicamente. Se conocen en la técnica métodos para preparar medios de cultivo exentos de proteínas animales y definidos químicamente, por ejemplo en los documentos US 2006/0094104, US 2007/0212770 y US 2008/0009040. "Exento de proteínas" y términos relacionados se refieren a proteínas que provienen de una fuente exógena o distinta a las células del cultivo, que liberan proteínas de forma natural durante el crecimiento. En otra realización, el medio de cultivo está exento de polipéptidos. En otra realización, el medio de cultivo está exento de suero. En otra realización, el medio de cultivo está exento de proteínas animales. En otra realización, el medio de cultivo está exento de componentes animales. En otra realización, el medio de cultivo contiene proteína, p. ej., proteína animal de suero, tal como suero bovino fetal. En otra realización, el cultivo tiene proteínas recombinantes añadidas de forma exógena. En otra realización, las proteínas son de un animal certificado exento de patógenos. La expresión "químicamente definido" como se utiliza en el presente documento significa que el medio no comprende ningún complemento indefinido, tal como, por ejemplo, extractos de componentes animales, órganos, glándulas, plantas o levaduras. Por consiguiente, cada componente de un medio químicamente definido queda definido con precisión. En una realización preferida, los medios están exentos de componentes animales y exentos de proteínas.

En ciertas realizaciones, el cultivo de células que expresan VWF se puede mantener durante al menos aproximadamente 7 días, o al menos aproximadamente 14 días, 21 días, 28 días, o al menos aproximadamente 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, o al menos aproximadamente 2 meses, o 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o más. La densidad celular en la que se mantiene un cultivo celular para la producción de una proteína de VWF recombinante dependerá de las condiciones de cultivo y del medio utilizado para la expresión de la proteína. Un experto en la técnica podrá determinar fácilmente la densidad celular óptima para un cultivo celular que produce un VWF. En una realización, el cultivo se mantiene a una densidad celular de entre aproximadamente 0,5*106 y 4*107 células/ml durante un período de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente 1,0* 106 y aproximadamente 1,0*107 células/ml durante un período de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente 1,0* 106 y aproximadamente 4,0*106 células/ml durante un período de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente 1,0*106 y aproximadamente 4,0*106 células/ml durante un período de tiempo prolongado. En otras realizaciones más, la densidad celular se puede mantener a una concentración entre aproximadamente 2,0*106 y aproximadamente 4,0*106, o entre aproximadamente 1,0*106 y aproximadamente 2,5*106, o entre aproximadamente 1,5*106 y aproximadamente 3,5*106, o cualquier otro intervalo similar, durante un período de tiempo prolongado. Después de un tiempo apropiado en cultivo celular, el rVWF se puede aislar del sistema de expresión utilizando métodos conocidos en la técnica.

En una realización específica, la densidad celular del cultivo celular continuo para la producción de rVWF se mantiene a una concentración de no más de 2,5*106 células/ml durante un período prolongado. En otras realizaciones específicas, la densidad celular se mantiene a no más de 2,0*106 células/ml, 1,5*106 células/ml, 1,0*106 células/ml, 0,5*106 células/ml o menos. En una realización, la densidad celular se mantiene entre 1,5*106 células/ml y 2,5*106 células/ml.

En una realización de los cultivos celulares descritos anteriormente, la solución de cultivo celular comprende un complemento de medio que comprende cobre. Dichas soluciones de cultivo celular se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.° 8,852,888 y la patente de EE.UU. n.° 9,409,971.

Las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de prepro-VWF se exponen en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, y están disponibles en los números de acceso de GenBank NM_000552 (ARNm del factor von Willebrand (VWF) de Homo sapiens) y NP_000543, respectivamente. La secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína de VWF madura se expone en la SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los aminoácidos 764-2813 de la secuencia de aminoácidos prepro-VWF de longitud completa). En algunas realizaciones, el VWF presenta al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el rVWF para el uso de la invención presenta al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 100% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 3. Véase, por ejemplo, patente de EE . UU. N.° 8,597,910,<publicación de patente de EE . UU. N.° 2016/0129090, así como la>F<i>G.<6.>

Una forma de rVWF útil tiene al menos la propiedad de estabilización in vivo, p. ej., por unión, de al menos una molécula de factor VIII (FVIII) y tiene opcionalmente un patrón de glicosilación que es farmacológicamente aceptable. Ejemplos específicos de esto incluyen VWF sin el dominio A2, por lo tanto resistente a la proteólisis (Lankhof et al.,Thromb. Haemost.77: 1008-1013, 1997), y un fragmento de VWF de Val 449 a Asn 730 que incluye el dominio de unión a la glicoproteína lb y sitios de unión para colágeno y heparina (Pietu et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun.164: 1339-1347, 1989). La determinación de la capacidad de un VWF para estabilizar al menos una molécula de FVIII se lleva a cabo, en un aspecto, en mamíferos deficientes en VWF según métodos conocidos en el estado de la técnica.

El rVWF para el uso de la presente invención se puede producir por cualquier método conocido en la técnica. Un ejemplo específico se describe en la publicación internacional WO86/06096 publicada el 23 de octubre de 1986 y solicitud de patente de EE . UU. N.° 07/559,509, presentada el 23 de julio de 1990. Por lo tanto, en la técnica se conocen métodos para (i) la producción de ADN recombinante por ingeniería genética, p. ej., mediante transcripción inversa de ARN y/o amplificación de ADN, (ii) introducción de ADN recombinante en células procariotas o eucariotas por transfección, p. ej. mediante electroporación o microinyección, (iii) cultivo de las células transformadas, p. ej. de manera continua o discontinua, (iv) expresión de VWF, p. ej. de manera constitutiva o por inducción, y (v) aislamiento del VWF, p. ej. del medio de cultivo o recolectando las células transformadas, con el fin de (vi) obtener el rVWF purificado, p. ej. mediante cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de afinidad. En un aspecto, un VWF recombinante se produce en células hospedantes transformadas utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias que codifican el polipéptido podrían escindirse del ADN utilizando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de ADN se sintetiza, en otro aspecto, utilizando técnicas de síntesis química, tales como el método del fosforamidato. Además, en otro aspecto más, se utiliza una combinación de estas técnicas.

La memoria descriptiva también proporciona vectores que codifican polipéptidos para el uso de la invención, en un hospedante apropiado. El vector comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido unido operativamente a secuencias de control de expresión apropiadas. Los métodos para efectuar esta unión operativa, ya sea antes o después de insertar el polinucleótido en el vector, son bien conocidos. Las secuencias de control de expresión incluyen promotores, activadores, potenciadores, operadores, sitios de unión ribosómica, señales de inicio, señales de parada, señales de caperuza, señales de poliadenilación y otras señales implicadas en el control de la transcripción o traducción. El vector resultante que tiene el polinucleótido en el mismo se utiliza para transformar un hospedante apropiado. Esta transformación puede realizarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

En la práctica de esta invención se utiliza cualquiera de un gran número de células hospedantes disponibles y bien conocidas. La selección de un hospedante particular depende de una serie de factores reconocidos por la técnica, que incluyen, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión elegido, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, la velocidad de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la bioseguridad y los costes. Se debe lograr un equilibrio de estos factores teniendo en cuenta que no todas las células hospedante son igualmente eficaces para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estas pautas generales, las células hospedantes microbianas útiles incluyen, sin limitación, bacterias, levaduras y otros hongos, células de insecto, planta, mamífero (incluidas humanas) en cultivo u otros hospedantes conocidos en la técnica.

Las células hospedantes transformadas se cultivan en condiciones de fermentación convencionales para que se expresen los compuestos deseados. Dichas condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Finalmente, los polipéptidos se purifican de medios de cultivo o de las propias células hospedantes por métodos bien conocidos en la técnica.

Dependiendo de la célula hospedante utilizada para expresar un compuesto para el uso de la invención, los grupos de carbohidratos (oligosacáridos) se unen opcionalmente a sitios que se sabe que son sitios de glicosilación en proteínas. Generalmente, los oligosacáridos unidos por O se unen a restos de serina (Ser) o treonina (Thr), mientras que los oligosacáridos unidos por N se unen a restos de asparagina (Asn) cuando son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferiblemente uno de los 19 aminoácidos naturales sin contar la prolina. Las estructuras de oligosacáridos unidos por N y unidos por O y los restos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en oligosacáridos tanto unidos por N como unidos por O es el ácido N-acetilneuramínico (denominado ácido siálico). El ácido siálico normalmente es el resto terminal de oligosacáridos tanto unidos por N como unidos por O y, en virtud de su carga negativa, en un aspecto, confiere propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Dicho(s) sitio(s) pueden incorporarse en el conector de los compuestos para el uso de esta invención y son preferiblemente glicosilados por una célula durante la producción recombinante de los compuestos polipeptídicos (p. ej., en células de mamíferos tales como CHO, BHK, COS). En otros aspectos, dichos sitios se glicosilan mediante procedimientos sintéticos o semisintéticos conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, la sialización (también denominada sialilación) se puede realizar en la columna como parte de los procedimientos de purificación descritos en el presente documento (incluidos los métodos de intercambio aniónico, intercambio catiónico, exclusión por tamaño y/o inmunoafinidad). En algunas realizaciones, la sialilación da como resultado una mayor estabilidad del rVWF en comparación con el rVWF que no ha sufrido sialilación. En algunas realizaciones, la sialilación da como resultado una mayor estabilidad del rVWF en la circulación sanguínea (por ejemplo, después de la administración a un sujeto) en comparación con el rVWF que no ha sufrido sialilación. En algunas realizaciones, la mayor estabilidad del rVWF sialivado da como resultado un aumento de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en comparación con el rVWF que no ha sufrido sialilación. En algunas realizaciones, la sialilación da como resultado una mayor semivida del rVWF en comparación con el rVWF que no ha sufrido sialilación. En algunas realizaciones, la sialilación da como resultado una mayor semivida del rVWF en la circulación sanguínea (por ejemplo, después de la administración a un sujeto) en comparación con el rVWF que no ha sufrido sialilación. En algunas realizaciones, la mayor semivida del rVWF sialilado da como resultado un aumento de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en comparación con el rVWF que no ha sufrido sialilación. En algunas realizaciones, la mayor semivida del rVWF sialilado da como resultado un rVWF que es estable durante 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas o más en la circulación sanguínea (por ejemplo, después de la administración a un sujeto) en comparación con el rVWF que no ha sufrido sialilación. En algunas realizaciones, la sialilación aumenta el número de sialilación 2,3 y/o sialilación 2,6. En algunas realizaciones, la sialilación se aumenta mediante la adición de 2,3 sialiltransferasa y/o 2,6 sialiltransferasa y CMP-NANA (sal sódica del ácido citidina-5-monofosfo-N-acetilneuramínico) como una etapa de tampón adicional. En algunas realizaciones, la sialilación se aumenta mediante la adición de 2,3 sialiltransferasa y CMP-NANA (sal sódica del ácido citidina-5/-monofosfo-N-acetilneuramínico) como una etapa de tampón adicional. En algunas realizaciones, la sialilación 2,3 se aumenta mediante la adición de 2,3 sialiltransferasa y CMP-NANA (sal sódica del ácido citidina-5-monofosfo-N-acetilneuramínico) como una etapa de tampón adicional.

En algunas realizaciones, la sialilación 2,6 se aumenta mediante la adición de 2,6 sialiltransferasa CMP-NANA (sal sódica del ácido citidina-5/-monofosfo-N-acetilneuramínico) como una etapa de tampón adicional. En algunas realizaciones, la sialilación 2,3 y/o sialilación 2,6 se aumentan mediante la adición de 2,3 sialiltransferasa y/o 2,6 sialiltransferasa y CMP-NANA (sal sódica del ácido citidina-5/-monofosfo-N-acetilneuramínico) como una etapa de tampón adicional. En algunas realizaciones, la CMP-NANA está química o enzimáticamente modificada para transferir ácido siálico modificado a la posición libre potencial. En algunas realizaciones, la sialilación se lleva a cabo cargando rVWF en la resina, lavando con uno o más tampones como se describe en el presente documento para eliminar impurezas no deseadas, aplicando uno o más tampones que contienen sialiltransferasa y CMP-NANA en condiciones que permiten la sialilación adicional, y lavando con uno o más tampones para eliminar el exceso de reactivos de sialilación, y eluyendo con uno o más tampones el rVWF mejorado (p. ej., el rVWF con mayor sialilación). En algunas realizaciones, el procedimiento de sialilación se realiza como parte de un método de intercambio de cationes, un método de intercambio de aniones, un método de exclusión por tamaño o un método de purificación por inmunoafinidad, como se describe en el presente documento.

Alternativamente, los compuestos se preparan por métodos sintéticos utilizando, por ejemplo, técnicas de síntesis en fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en la técnica, e incluyen las descritas en Merrifield (1973),Chem. Polypeptides,págs. 335-61 (Katsoyannis y Panayotis eds.); Merrifield (1963),J . Am. Chem. Soc.85: 2149; Davis et al. (1985),Biochem. Intl.10: 394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; patente de EE . UU. N.° 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3.a ed.) 2: 105-253; y Erickson et al. (1976), The Proteins (3.a ed.) 2: 257-527 '. La síntesis en fase sólida es la técnica preferida para preparar péptidos individuales, ya que es el método más rentable para preparar péptidos pequeños.

Los fragmentos, variantes y análogos del VWF se pueden producir de acuerdo con métodos que son bien conocidos en la técnica. Los fragmentos de un polipéptido se pueden preparar utilizando, sin limitación, escisión enzimática (p. ej., tripsina, quimotripsina) y también utilizando medios recombinantes para generar fragmentos de polipéptido que tengan una secuencia de aminoácidos específica. Se pueden generar fragmentos de polipéptidos que comprendan una región de la proteína que tenga una actividad particular, tal como un dominio de multimerización o cualquier otro dominio de VWF identificable conocido en la técnica.

También son bien conocidos los métodos para preparar análogos de polipéptidos. Los análogos de secuencia de aminoácidos de un polipéptido pueden ser análogos de sustitución, inserción, adición o deleción. Los análogos de deleción, incluidos los fragmentos de un polipéptido, carecen de uno o más restos de la proteína nativa que no son esenciales para la función o la actividad inmunogénica. Los análogos de inserción implican la adición de, p. ej., aminoácido(s) en un punto no terminal en el polipéptido. Este análogo puede incluir, por ejemplo y sin limitación, la inserción de un epítopo inmunorreactivo o simplemente un único resto. Los análogos de adición, incluidos los fragmentos de un polipéptido, incluyen la adición de uno o más aminoácidos en uno o ambos extremos de una proteína e incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión. También se contemplan combinaciones de los análogos antes mencionados.

Los análogos de sustitución típicamente intercambian un aminoácido del tipo natural por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y pueden estar diseñados para modular una o más propiedades del polipéptido sin la pérdida completa de otras funciones o propiedades. En un aspecto, las sustituciones son sustituciones conservadoras. La "sustitución de aminoácido conservadora" es la sustitución de un aminoácido por un aminoácido que tiene una cadena lateral o un carácter químico similar. Los aminoácidos similares para hacer sustituciones conservadoras incluyen los que tienen una cadena lateral ácida (ácido glutámico, ácido aspártico); una cadena lateral básica (arginina, lisina, histidina); una cadena lateral de amida polar (glutamina, asparagina); una cadena lateral alifática hidrófoba (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); una cadena lateral aromática (fenilalanina, triptófano, tirosina); una cadena lateral pequeña (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); o una cadena lateral de hidroxilo alifática (serina, treonina).

En un aspecto, los análogos son sustancialmente homólogos o sustancialmente idénticos al VWF recombinante del que se derivan. Los análogos incluyen los que conservan al menos parte de la actividad biológica del polipéptido de tipo natural, p. ej., la actividad de coagulación sanguínea.

Las variantes de polipéptidos contempladas incluyen, sin limitación, polipéptidos modificados químicamente mediante técnicas tales como ubiquitinación, glicosilación, incluyendo polisialación (o polisialilación), conjugación con agentes terapéuticos o de diagnóstico, marcado, unión de polímero covalente tal como pegilación (derivatización con polietilenglicol), introducción de enlaces no hidrolizables e inserción o sustitución por síntesis química de aminoácidos tales como ornitina, que normalmente no se encuentran en las proteínas humanas. Las variantes conservan las mismas o esencialmente las mismas propiedades de unión de las moléculas no modificadas para el uso de la invención. Dicha modificación química puede incluir la unión directa o indirecta (p. ej., a través de un conector) de un agente al polipéptido de VWF. En el caso de unión indirecta, se contempla que el conector pueda ser hidrolizable o no hidrolizable.

La preparación de análogos de polipéptidos pegilados comprenderá en un aspecto las etapas de (a) hacer reaccionar el polipéptido con polietilenglicol (tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG ) en condiciones mediante las cuales el polipéptido de la construcción de unión se une a uno o más grupos PEG , y (b) obtener el o los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinan basándose en los parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la relación PEG:proteína, mayor será el porcentaje de producto polipegilado. En algunas realizaciones, la construcción de unión tiene una única fracción de PEG en el extremo N. El polietilenglicol (PEG ) se puede unir al factor de coagulación sanguínea para, por ejemplo, proporcionar una semivida más larga in vivo. El grupo PEG puede tener cualquier peso molecular conveniente y ser lineal o ramificado. El peso molecular medio del PEG varía de aproximadamente 2 kiloDalton ("kD") a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa. En ciertos aspectos, los grupos PEG se unen al factor de coagulación sanguínea por medio de acilación o alquilación reductora por un grupo reactivo natural o modificado en la fracción de PEG (p. ej., un grupo aldehído, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo en el factor de coagulación sanguínea (p. ej., un grupo aldehído, amino o éster) o mediante cualquier otra técnica conocida en la técnica.

Los métodos para preparar el polipéptido polisialilado se describen en la publicación de patente de Estados Unidos 20060160948, Fernandes et Gregoriadis;Biochim. Biophys. Acta1341: 26-34, 1997, y Saenko et al.,Haemophilia12:42-51, 2006. Brevemente, una solución de ácido colomínico (CA) que contiene NaIO40,1 M se agita en la oscuridad a temperatura ambiente para oxidar el CA. La solución de CA activada se dializa, p. ej., contra un tampón de fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,2, en la oscuridad y esta solución se añade a una solución de rVWF y se incuba durante 18 h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación suave. Los reactivos libres se pueden separar opcionalmente del conjugado de rVWF-ácido polisiálico mediante, por ejemplo, ultrafiltración/diafiltración. La conjugación del rVWF con ácido polisiálico se logra utilizando glutaraldehído como reactivo de reticulación (Migneault et al.,Biotechniques37: 790-796, 2004).

También se contempla en otro aspecto que los polipéptidos prepro-VWF y pro-VWF proporcionarán un beneficio terapéutico en las formulaciones para el uso en la presente invención. Por ejemplo, la patente de EE . UU., N.° 7,005,502 describe una preparación farmacéutica que comprende cantidades sustanciales de pro-VWF que induce la generación de trombina in vitro. Además de fragmentos, variantes u otros análogos biológicamente activos recombinantes del VWF maduro de origen natural, la presente invención contempla el uso de fragmentos, variantes o análogos biológicamente activos recombinantes de los polipéptidos prepro-VWF (expuesto en la SEQ ID NO: 2) o pro-VWF (restos de aminoácidos 23 a 764 de s E q ID NO: 2) en las formulaciones descritas en el presente documento.

Un trabajador experto puede generar fácilmente polinucleótidos que codifican fragmentos, variantes y análogos para codificar fragmentos, variantes o análogos biológicamente activos de la molécula natural que tienen la misma actividad biológica o una actividad biológica similar a la de la molécula natural. En varios aspectos, estos polinucleótidos se preparan utilizando técnicas de PCR, digestión/ligación de moléculas codificantes de ADN y similares. Por lo tanto, un experto en la técnica podrá generar cambios de una sola base en la cadena de a Dn para dar como resultado un codón alterado y una mutación de sentido alterado, utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a la mutagénesis específica del sitio. Como se utiliza en el presente documento, la frase "condiciones de hibridación moderadamente restrictivas" significa, por ejemplo, hibridación a 42°C en formamida al 50% y lavado a 60°C en 0,1 * SSC , SDS al 0,1%. Los expertos en la técnica entienden que la variación de estas condiciones ocurre en función de la longitud y el contenido de bases de nucleótidos G e de las secuencias que se van a hibridar. Las fórmulas convencionales en la técnica son apropiadas para determinar las condiciones de hibridación exactas. Véase Sambrook et al., 9.47-9.51 en Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

A. Multímeros del VWF

La evaluación del número y porcentaje de multímeros de rVWF se puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, métodos que utilizan electroforesis y cromatografía de exclusión por tamaño para separar los multímeros de VWF por tamaños, por ejemplo como comentan Cumming et al.,(J Clin Pathol.mayo de 1993; 46(5): 470-473. Estas técnicas pueden incluir además técnicas de inmunotransferencia (tales como transferencia Western), en las que se lleva a cabo la inmunotransferencia en gel con un anticuerpo radiomarcado contra VWF seguido de detección quimioluminiscente (véase, por ejemplo, Wen et al.,J . Clin. Lab. Anal.,1993, 7: 317-323. Otros ensayos para el VWF incluyen el ensayo de actividad de unión VWF:Antígeno (VWF:Ag), VWF:Cofactor de ristocetina (VWF:RCof) y VWF:colágeno (VW F:CBA), que se utilizan a menudo para el diagnóstico y la clasificación de la enfermedad de Von Willebrand (véase, por ejemplo, Favaloro et al.,Pathology,1997, 29(4): 341-456; Sadler, JE ,Annu Rev Biochem,1998, 67:395-424; y Turecek et al.,Semin Thromb Hemost,2010, 36:510-521. En algunas realizaciones, el rVWF obtenido utilizando los métodos presentes incluye cualquier patrón de multímeros presente en la muestra de carga del rVWF. En algunas realizaciones, el rVWF obtenido utilizando los métodos presentes incluye patrones de multímeros que se producen fisiológicamente, así como patrones de multímeros de VWF ultragrandes.

b. Ensayos de VWF

En la hemostasia primaria, el VWF sirve como un puente entre las plaquetas y componentes específicos de la matriz extracelular, tales como el colágeno. La actividad biológica del VWF en este proceso se puede medir mediante diferentes ensayos in vitro (Turecek et al.,Semin Thromb Hemost,2010, 36: 510-521).

El ensayo de VWF:cofactor de ristocetina (VWF:RCof) se basa en la aglutinación de plaquetas de nueva aportación o fijadas con formalina inducida por el antibiótico ristocetina en presencia de VWF. El grado de aglutinación de plaquetas depende de la concentración de VWF y se puede medir mediante el método turbidimétrico, p. ej. usando un agregómetro (Weiss et al.,J . Clin. Invest.,1973, 52: 2708-2716; Macfarlane et al.,Thromb. Diath. Haemorrh.,1975, 34: 306-308). Como se proporciona en el presente documento, la actividad específica del cofactor de ristocetina del VWF (VW F:RCo) para el uso de la presente invención se describe generalmente en términos de mU/pg de VWF, medido utilizando ensayos in vitro.

En algunas realizaciones, el rVWF purificado de acuerdo con los métodos de la presente memoria descriptiva tiene una actividad específica de al menos aproximadamente 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60, 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80, 82,5, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 o más mU/pg. En algunas realizaciones, el rVWF utilizado en los métodos descritos en el presente documento tiene una actividad específica de 20 mU/pg a 150 mU/pg. En algunas realizaciones, el rVWF tiene una actividad específica de 30 mU/pg a 120 mU/pg. En algunas realizaciones, el rVWF tiene una actividad específica de 40 mU/pg a 90 mU/pg. En algunas realizaciones, el rVWF tiene una actividad específica seleccionada de variaciones 1 a 133 que se encuentran en la Tabla 3, a continuación.

Tabla 3. Realizaciones de ejemplo para la actividad específica del rVWF encontrada en las composiciones y utilizada en los métodos proporcionados en el presente documento.

El rVWF para el uso de la presente invención es altamente multimérico comprendiendo de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 subunidades. En otras realizaciones, el rVWF multimérico producido utilizando métodos de la presente memoria descriptiva comprende aproximadamente 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 subunidades. En algunas realizaciones, el rVWF está presente en multímeros que varían en tamaño de dímeros a multímeros de más de 40 subunidades (>10 millones de Daltons). Los multímeros más grandes proporcionan múltiples sitios de unión que pueden interaccionar tanto con los receptores plaquetarios como con los sitios de lesión de la matriz subendotelial, y son la forma hemostáticamente más activa del VWF. En algunas realizaciones, el rVWF para el uso de la presente invención comprende multímeros ultragrandes (ULM). En general, se considera que los multímeros altos y ultragrandes son los más eficaces desde el punto de vista hemostático (véase, por ejemplo, Turecek, P.,Hamostaseologie,(Vol. 37): Suplemento 1, páginas S15-S25 (2017)). En algunas realizaciones, el rVWF está entre 500 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, se puede obtener cualquier patrón de multímeros deseado utilizando los métodos descritos. En algunas realizaciones, cuando se emplean métodos de intercambio aniónico y/o de intercambio catiónico, el pH, la conductividad y/o la concentración de contraiones de los tampones en una o más etapas de lavado o los tampones de gradiente se pueden manipular para obtener el patrón de multímeros deseado. En algunas realizaciones, se emplean entonces métodos de cromatografía de exclusión por tamaño y se pueden emplear criterios de recolección para obtener el patrón de multímeros deseado. En algunas realizaciones, el patrón de multímeros descrito comprende multímeros ultragrandes. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen al menos de 10.000 kDa, al menos 11.000 kDa, al menos 12.000 kDa, al menos 13.000 kDa, al menos 14.000 kDa, al menos 15.000 kDa, al menos 16.000 kDa, al menos 17.000 kDa, al menos 18.000 kDa, al menos 19.000 kDa, al menos 20.000 kDa. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen entre aproximadamente 10.000 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen entre aproximadamente 11.000 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen entre aproximadamente 12.000 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen entre aproximadamente 13.000 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen entre aproximadamente 14.000 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen entre aproximadamente 15.000 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen entre aproximadamente 16.000 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen entre aproximadamente 17.000 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen entre aproximadamente 18.000 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, los multímeros ultragrandes tienen entre aproximadamente 19.000 kDa y 20.000 kDa. En algunas realizaciones, el rVWF obtenido utilizando los métodos presentes incluye cualquier patrón de multímeros presente en la muestra de carga del rVWF. En algunas realizaciones, el rVWF obtenido utilizando los métodos presentes incluye patrones de multímeros que se producen fisiológicamente, así como patrones de multímeros de VWF ultragrandes.

En algunas realizaciones, la composición de rVWF preparada mediante el método de purificación descrito en el presente documento tiene una distribución de oligómeros de rVWF caracterizada por que el 95% de los oligómeros tienen entre 6 subunidades y 20 subunidades. En algunas realizaciones, la composición de rVWF tiene una distribución de oligómeros de rVWF caracterizada por que el 95% de los oligómeros tienen un intervalo de subunidades seleccionadas de variaciones 458 a 641 que se encuentran en la Tabla 4.

Tabla 4. Realizaciones de ejemplo para la distribución de oligómeros de rVWF encontrados en las composiciones y utilizados en los métodos proporcionados en el presente documento.

En algunas realizaciones, la composición de rVWF preparada mediante los métodos proporcionados en el presente documento se puede caracterizar de acuerdo con el porcentaje de moléculas de rVWF que están presentes en un multímero de rVWF de orden superior particular o un multímero más grande. Por ejemplo, en una realización, al menos el 20% de las moléculas de rVWF en una composición de rVWF utilizada en los métodos descritos en el presente documento están presentes en un complejo oligomérico de al menos 10 subunidades. En otra realización, al menos 20% de las moléculas de rVWF en una composición de rVWF utilizada en los métodos descritos en el presente documento están presentes en un complejo oligomérico de al menos 12 subunidades. En otras realizaciones más, una composición de rVWF utilizada en los métodos proporcionados en el presente documento tiene un porcentaje mínimo (p. ej., tiene al menos X% ) de moléculas de rVWF presentes en un multímero de rVWF de orden superior particular o multímero más grande (p. ej., un multímero de al menos Y subunidades) según una cualquiera de las variaciones 134 a 457 que se encuentran en la Tabla 5 a la Tabla 7.

Tabla 5. Realizaciones de ejemplo para el porcentaje de moléculas de rVWF que están presentes en un multímero de rVWF de orden superior particular o multímero mayor encontrado en las composiciones y usado en los métodos proporcionados en el presente documento.

Var. = Variación

Tabla 6. Realizaciones de ejemplo para el porcentaje de moléculas de rVWF que están presentes en un multímero de rVWF de orden superior particular o multímero mayor encontrado en las composiciones y usado en los métodos proporcionados en el presente documento.

Var. = Variación

Tabla 7. Realizaciones de ejemplo para el porcentaje de moléculas de rVWF que están presentes en un multímero de rVWF de orden superior particular o multímero mayor encontrado en las composiciones y usado en los métodos proporcionados en el presente documento.

Var. = Variación

De acuerdo con lo anterior, el rVWF comprende un porcentaje significativo de multímeros de rVWF de alto peso molecular (HMW). En otras realizaciones, la composición de multímeros de rVWF de HMW comprende al menos 10%-80% de decámeros de rVWF o multímeros de orden superior. En otras realizaciones, la composición comprende aproximadamente 10-95%, 20-90%, 30-85%, 40-80%, 50-75%, 60-70% de decámeros o multímeros de orden superior. En otras realizaciones, la composición de multímeros de rVWF de HMW comprende al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de decámeros o multímeros de orden superior.

La evaluación del número y porcentaje de multímeros de rVWF se puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, métodos que utilizan electroforesis y cromatografía de exclusión por tamaño para separar los multímeros de rVWF por tamaños, por ejemplo como comentan Cumming et al,( J Clin Pathol.mayo de 1993; 46(5): 470-473. Estas técnicas pueden incluir además técnicas de inmunotransferencia (tales como transferencia Western), en las que se lleva a cabo la inmunotransferencia en gel con un anticuerpo radiomarcado contra VWF seguido de detección quimioluminiscente (véase por ejemplo Wen et al., (1993),J . Clin. Lab. Anal.,7: 317-323. Otros ensayos para el VWF incluyen el ensayo de actividad de unión VWF:Antígeno (VWF:Ag), VWF:Cofactor de ristocetina (VWF:RCof) y VWF:colágeno (VW F:CBA), que se utilizan a menudo para el diagnóstico y la clasificación de la enfermedad de Von Willebrand. (véase por ejemplo Favaloro et al.,Pathology,1997, 29(4): 341-456.

En algunas realizaciones, la relación de la actividad procoagulante del rFVIII (UI rFVIII:C) a la actividad del cofactor de ristocetina del rVWF (UI rVWF:RCo) para el rVWF preparado según los métodos de la presente memoria descriptiva está entre 3:1 y 1:5. En otras realizaciones, la relación está entre 2:1 y 1:4. En otras realizaciones más, la relación está entre 5:2 y 1:4. En otras realizaciones, la relación está entre 3:2 y 1:3. En otras realizaciones más, la relación es aproximadamente 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 2:3, 2:4, 2:5, 3:1, 3:2, 3:4 o 3:5. En otras realizaciones, la relación está entre 1:1 y 1:2. En otras realizaciones más, la relación es 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 o 2:1. En ciertas realizaciones, la relación de la actividad procoagulante del rFVIII (UI rFVIII:C) a la actividad del cofactor de ristocetina del rVWF (UI rVWF:RCo) en una composición útil para un método descrito en el presente documento se selecciona de las variaciones 1988 a 2140 que se encuentran en la Tabla 8.

Tabla 8. Realizaciones de ejemplo para la relación de la actividad procoagulante del rFVIII (UI rFVIII:C) a la actividad del cofactor ristocetina del rVWF (UI rVWF:RCo) en composiciones y utilizadas en los métodos proporcionados en el presente documento.

En otras realizaciones, los multímeros de rVWF de orden superior para el uso de la invención son estables durante aproximadamente 1 a aproximadamente 90 horas después de la administración. En otras realizaciones más, los multímeros de rVWF de orden superior son estables durante aproximadamente 5-80, 10-70, 15-60, 20-50, 25-40, 30-35 horas después de la administración. En otras realizaciones más, los multímeros de rVWF de orden superior son estables durante al menos 3, 6 , 12, 18, 24, 36, 48 y 72 horas después de la administración. En ciertas realizaciones, la estabilidad de los multímeros de rVWF se evalúain vitro.

En una realización, los multímeros de rVWF de orden superior utilizados en las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento tienen una semivida de al menos 12 horas después de la administración. En otra realización, los multímeros de rVWF de orden superior tienen una semivida de al menos 24 horas después de la administración. En otras realizaciones más, los multímeros de rVWF de orden superior tienen una semivida seleccionada de variaciones 642 a 1045 que se encuentran en la Tabla 9.

Tabla 9. Realizaciones de ejemplo para la semivida de multímeros de rVWF de orden superior encontrados en las composiciones preparadas mediante los métodos proporcionados en el presente documento.

En algunas realizaciones, el pro-VWF y/o el rVWF purificado según la presente memoria descriptiva no se modifica con ninguna modificación de conjugación, de postraducción o covalente. En realizaciones particulares, el pro-VWF y/o el rVWF purificado para el uso de la presente invención no está modificado con un polímero soluble en agua, incluyendo, sin limitación, un polietilenglicol (PEG), un polipropilenglicol, un polioxialquileno, un poli(ácido siálico), hidroxietil-almidón, una fracción de policarbohidrato y similares.

En algunas realizaciones, el pro-VWF y/o el rVWF purificado según la presente memoria descriptiva se modifican por medio de conjugación, modificación postraduccional o modificación covalente, incluidas modificaciones de los restos N- o C-terminales, así como modificaciones de cadenas laterales seleccionadas, por ejemplo, en grupos sulfhidrilo libres, aminas primarias y grupos hidroxilo. En una realización, un polímero soluble en agua está unido a la proteína (directamente o a través de un conector) mediante un grupo lisina u otra amina primaria. En algunas realizaciones, el pro-VWF y/o el rVWF purificado para el uso de la presente invención pueden estar modificadas por conjugación con un polímero soluble en agua, incluyendo, sin limitación, un polietilenglicol (PEG), un polipropilenglicol, un polioxialquileno, un poli(ácido siálico), hidroxietilalmidón, una fracción de policarbohidrato y similares.

Los polímeros solubles en agua que pueden usarse para modificar el pro-VWF y/o el rVWF purificado incluyen estructuras lineales y ramificadas. Los polímeros conjugados pueden unirse directamente a las proteínas de coagulación para el uso de la invención, o alternativamente pueden unirse a través de una fracción de enlace. Se pueden encontrar ejemplos no limitantes de conjugación de proteínas con polímeros solubles en agua en las patentes de EE . UU. N.° 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 y 4,179,337, así como en Abuchowski y Davis "Enzymes as Drugs," Holcenberg y Roberts, Eds., págs. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981), y Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2.a Ed., Academic Press, Inc. 2008.

La conjugación de proteínas se puede llevar a cabo mediante una serie de técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo, véase Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2.a Ed., Academic Press, Inc. 2008. Los ejemplos incluyen la unión a través del enlace peptídico entre un grupo carboxilo en una de las fracciones de proteína de coagulación o polímero soluble en agua y un grupo amina de la otra, o una unión éster entre un grupo carboxilo de una y un grupo hidroxilo de la otra. Otra unión mediante la cual una proteína de coagulación para el uso de la invención podría conjugarse con un compuesto polimérico soluble en agua es a través de una base de Schiff, entre un grupo amino libre en la fracción polimérica que se hace reaccionar con un grupo aldehído formado en el extremo no reductor del polímero por oxidación con peryodato (Jennings y Lugowski,J . Immunol.1981; 127:1011-8; Femandes y Gregonradis,Biochim Biophys Acta.1997; 1341; 26-34). La base de Schiff generada se puede estabilizar mediante reducción específica con NaCNBH3 para formar una amina secundaria. Un enfoque alternativo es la generación de grupos amino libres terminales en el polímero mediante aminación reductora con NH4Cl después de una oxidación previa. Se pueden utilizar reactivos bifuncionales para unir dos grupos amino o dos hidroxilo. Por ejemplo, un polímero que contiene un grupo amino se puede acoplar con un grupo amino de la proteína de coagulación con reactivos como BS3 (suberato de bis(sulfosuccinimidilo)/Pierce, Rockford, III.). Además, se pueden utilizar reactivos de reticulación heterobifuncionales como Sulfo-EMCS éster de (N-£-Maleimidocaproiloxi)sulfosuccinimida/Pierce), por ejemplo, para unir grupos amina y tiol. En otras realizaciones, se pueden utilizar un grupo reactivo de aldehído, tal como alcóxido de PEG más acetal dietílico de bromoacetaldehído; PEG más DMSO y anhídrido acético, y cloruro de PEG más el fenóxido de 4-hidroxibenzaldehído, ésteres activos de succinimidilo, ditiocarbonato activado PE .G ., cloroformiato de 2,4,5-triclorofenilo y cloroformiato de P-nitrofenilo activado PE .G ., en la conjugación de una proteína de coagulación.

Otro método para medir la actividad biológica del VWF es el ensayo de unión de colágeno, que se basa en la tecnología ELISA (Brown y Bosak,Thromb. Res.,1986, 43:303-311; Favaloro,Thromb. Haemost.,2000, 83 127-135). Una placa de microtitulación está recubierta con colágeno tipo I o III. Luego, el VWF se une a la superficie del colágeno y posteriormente se detecta con un anticuerpo policlonal marcado con enzima. La última etapa es la reacción de un sustrato, que se puede vigilar fotométricamente con un lector de ELISA.

Los ensayos inmunológicos de los factores de von Willebrand (VWF:Ag) son inmunoensayos que miden la concentración de la proteína de VWF en plasma. No dan ninguna indicación sobre la función del VWF. Existen varios métodos para medir VWF:Ag y estos incluyen tanto el ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA ) como los inmunoensayos de látex automatizados (LIA). Muchos laboratorios utilizan ahora un inmunoensayo de látex totalmente automatizado. Históricamente, los laboratorios utilizaban una variedad de técnicas, incluido el electroinmunoensayo Laurell "Laurell Rockets", pero hoy en día rara vez se utilizan en la mayoría de los laboratorios.

III. Kits

Como un aspecto adicional que no es parte de la invención, la memoria descriptiva incluye kits que comprenden una o más composiciones liofilizadas envasadas de una manera que facilita su uso para la administración a sujetos. En una realización, dicho kit incluye la formulación farmacéutica descrita en el presente documento (p. ej., una composición que comprende una proteína o péptido terapéutico), envasada en un envase tal como un frasco o recipiente sellado, con una etiqueta fijada al envase o incluida en el paquete que describe el uso del compuesto o composición en la práctica del método. En una realización, la formulación farmacéutica se envasa en el envase de tal manera que la cantidad de espacio de cabeza en el envase (p. ej., la cantidad de aire entre la formulación líquida y la parte superior del envase) es muy pequeña. Preferiblemente, la cantidad de espacio de cabeza es insignificante (p. ej., casi nada). En una realización, el kit contiene un primer envase que tiene una composición de proteína o péptido terapéutico y un segundo envase que tiene una solución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición. En un aspecto, la formulación farmacéutica está envasada en forma de dosificación unitaria. El kit puede incluir además un dispositivo adecuado para administrar la formulación farmacéutica según una vía de administración específica. Preferiblemente, el kit contiene una etiqueta que describe el uso de las formulaciones farmacéuticas.

IV. rVWF para métodos de pretratamiento de sujetos con VWD que se someten a cirugía

Una de las ventajas de administrar el rVWF a sujetos con VWD grave como pretratamiento para la cirugía es que la mayor actividad específica del rVWF en comparación con el pdVWF permite flexibilidad en la cantidad de rVWF administrado y el número de veces que se le vuelve a administrar una dosis al sujeto. Como se apreciará y como se comenta con más detalle en el presente documento, el FVIII coadministrado puede ser recombinante o derivado del plasma.

Se llevan a cabo administraciones únicas o múltiples de rVWF y los niveles y el patrón de dosis los selecciona el médico tratante. Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosis adecuada depende del tipo de enfermedad que se va a tratar (p. ej., enfermedad de von Willebrand), la gravedad y el curso de la enfermedad, si el fármaco se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al fármaco, y la discreción del médico tratante

En algunos aspectos, el rVWF se administra antes de un procedimiento quirúrgico a un sujeto en un intervalo de 20-60 UI/kg, p. ej., 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 44 , 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 20-60, 35-70, 20-40, 35-60, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60 o 50-55 UI/kg. En algunas realizaciones, el rVWF se administra entre 12 horas y 24 horas, p. ej., 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 12 horas y 24 horas, 14 horas y 24 horas, 16 y 24 horas, 18 horas y 24 horas, o 20 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico. En algunos aspectos, no se administra factor VIII (FVIII) con el rVWF antes del procedimiento quirúrgico.

En algunas realizaciones, se administra rVWF al sujeto en un intervalo de 5-90 UI/kg, p. ej., 5-90, 5-50, 10-90, 15-90, 20-90, 30-90, 40-90, 50-90, 60-90, 70-90, 80-90, 5-80, 10-70, 20-60, 30-50, 35-60, 5-50, 5-40, 5-30. 5 20, 10-90, 10-50 o 20-40 UI/kg 1 hora antes de la cirugía. En otras realizaciones, el rVWF se administra en una dosis de 70-200 UI/kg, p. ej., 70-200, 80-200-, 90-200, 100-200, 110-200, 120-200, 130-200, 130-200, 140 200, 150-200, 160-200, 170-200, 180-200, 190-200, 70-170, 80-180, 60-160, 50-150, 40-140, 30, 130, 20-120, 10-110, 70-100 o 70-90 UI/kg después de la cirugía. En algunos casos, el procedimiento quirúrgico se selecciona de un grupo que consiste en cirugía mayor, cirugía menor y cirugía oral.

En algunas realizaciones, se administran al sujeto 35-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de cirugía mayor. En otras realizaciones, se administran al sujeto 15-90 UI/kg de rVWF 1 hora antes de cirugía mayor. En otra realización, se administran al sujeto 150-220 UI/kg de rVWF después de cirugía mayor. En algunos casos, se administra al sujeto que se somete a cirugía mayor una dosis total de 220-320 UI/kg.

En algunas realizaciones, se administran al sujeto 50-60 Ul/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de cirugía menor. En otras realizaciones, se administran al sujeto 5-50 UI/kg de rVWF 1 hora antes de cirugía menor. En otra realización, se administran al sujeto 70-150 UI/kg de rVWF después de cirugía menor. En algunos casos, se administra al sujeto que se somete a cirugía menor una dosis total de 100-220 UI/kg.

En algunas realizaciones, se administran al sujeto 20-40 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de cirugía oral. En otras realizaciones, se administran al sujeto 20-50 UI/kg de rVWF 1 hora antes de cirugía oral. En otra realización, se administran al sujeto 10-50 UI/kg de rVWF durante la cirugía oral. En otra realización, se administran al sujeto 20-50 UI/kg de rVWF después de cirugía oral. En algunos casos, se administra al sujeto que se somete a cirugía oral una dosis total de 70-190 UI/kg.

Las composiciones de rVWF pueden estar contenidas en formulaciones farmacéuticas, como se describe en el presente documento. Dichas formulaciones pueden administrarse por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral, mediante pulverización por inhalación, vía vaginal, rectal o mediante inyección intracraneal. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal o técnicas de infusión. También se contempla la administración por vía intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o implantación quirúrgica en un sitio particular. Generalmente, las composiciones están esencialmente exentas de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser dañinas para el receptor.

En un aspecto, las formulaciones para el uso de la invención se administran mediante un bolo inicial seguido de una infusión continua para mantener niveles circulantes terapéuticos del medicamento. Como otro ejemplo, el compuesto de la invención se administra como una dosis de una sola vez. Los expertos en la técnica optimizarán fácilmente las dosis y las pautas de administración eficaces determinados por la buena práctica médica y la afección clínica del paciente individual. La vía de administración puede ser, pero no se limita a, administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. La frecuencia de la dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y la vía de administración. La formulación farmacéutica óptima la determina un experto en la técnica dependiendo de la vía de administración y dosis deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 páginas 1435-1712. Dichas formulaciones influyen en el estado físico, estabilidad, tasa de liberación in vivo y la tasa de depuración in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la vía de administración, se calcula una dosis adecuada según el peso corporal, la superficie específica del cuerpo o el tamaño del órgano. Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar mediante el uso de ensayos establecidos para determinar los niveles en sangre de las dosificaciones junto con datos de respuesta a la dosis apropiados. El régimen de dosificación final lo determina el médico tratante, considerando varios factores que modifican la acción de los fármacos, p. ej., la actividad específica del fármaco, la gravedad del daño y la capacidad de respuesta del paciente, la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, hora de administración y otros factores clínicos. A modo de ejemplo, una dosis típica de un VWF recombinante para el uso de la presente invención es de aproximadamente 50 UI/kg, equivalente a 500 |jg/kg. A medida que se llevan a cabo estudios, surgirá información adicional con respecto a los niveles de dosificación adecuados y la duración del tratamiento para varias enfermedades y afecciones.

La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales y descripciones de química orgánica, tecnología de polímeros, biología molecular (incluidas técnicas recombinantes), biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Dichas técnicas convencionales incluyen síntesis de matrices de polímeros, hibridación, ligación y detección de hibridación utilizando un marcador. Se pueden obtener ilustraciones específicas de técnicas adecuadas por referencia al ejemplo que aparece a continuación. Sin embargo, por supuesto también se pueden utilizar otros procedimientos convencionales equivalentes. Dichas técnicas y descripciones convencionales se pueden encontrar en manuales de laboratorio convencionales tales como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, y Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todos de Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4.a Ed.) Freeman, Highly stabilized York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson y Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3.a Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y. y Berg et al. (2002) Biochemistry, 5.a Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y.

Obsérvese que como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un(una)" y "el(la)" incluye referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una polimerasa" se refiere a un agente o mezclas de dichos agentes, y la referencia a "el método" incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

Obsérvese que como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un(una)" y "el(la)" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una polimerasa" se refiere a un agente o mezclas de dichos agentes, y la referencia a "el método" incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior y el inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, queda comprendido dentro de la invención. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos de forma independiente en los intervalos más pequeños que también están comprendidos dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, también están incluidos en la invención los intervalos que excluyen cualquiera de ambos de los límites incluidos.

En la descripción anterior, se exponen numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión más completa de la presente invención. Sin embargo, será evidente para el experto en la técnica que la presente invención se puede poner en práctica sin uno o más de estos detalles específicos. En otros casos, no se han descrito características y procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica para evitar ensombrecer la invención.

Aunque la presente invención se describe principalmente con referencia a realizaciones específicas, también se prevé que otras realizaciones se harán evidentes para los expertos en la técnica al leer la presente descripción, y se pretende que dichas realizaciones estén contenidas dentro del presente método de la invención.

a. Formulaciones de VWF liofilizadas

El presente método también proporciona formulaciones de rVWF para usar en los métodos de tratamiento proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición de rVWF se utiliza para la producción de una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, el rVWF se puede formular en una formulación liofilizada.

En algunas realizaciones, las formulaciones que comprenden un polipéptido de VWF para el uso de la invención se liofilizan después de purificación y antes de la administración a un sujeto. La liofilización se lleva a cabo utilizando técnicas comunes en la técnica y debe optimizarse para la composición que se está desarrollando (Tang et al.,Pharm Res.21:191-200, (2004) y Chang et al.,Pharm Res.13:243-9 (1996)).

Un ciclo de liofilización se compone, en un aspecto, de tres etapas: congelación, secado primario y secado secundario (A. P. Mackenzie,Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol278:167 (1977)). En la etapa de congelación, la solución se enfría para iniciar la formación de hielo. Además, esta etapa induce la cristalización del agente de carga. El hielo se sublima en la etapa de secado primario, que se lleva a cabo reduciendo la presión de la cámara por debajo de la presión de vapor del hielo, utilizando vacío e introduciendo calor para promover la sublimación. Finalmente, el agua adsorbida o unida se elimina en la etapa de secado secundario a una presión de la cámara reducida y a una temperatura de anaquel elevada. El procedimiento produce un material conocido como torta liofilizada. Posteriormente, la torta se puede reconstituir con agua estéril o diluyente adecuado para inyección.

El ciclo de liofilización no sólo determina el estado físico final de los excipientes sino que también afecta a otros parámetros tales como el tiempo de reconstitución, apariencia, estabilidad y contenido de humedad final. La estructura de la composición en estado congelado pasa por varias transiciones (p. ej., transiciones vítreas, humectaciones y cristalizaciones) que ocurren a temperaturas específicas y la estructura puede usarse para comprender y optimizar el procedimiento de liofilización. La temperatura de transición vítrea (Tg y/o Tg') puede proporcionar información sobre el estado físico de un soluto y puede determinarse mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). Tg y Tg' son un parámetro importante que debe tenerse en cuenta al diseñar el ciclo de liofilización. Por ejemplo, Tg' es importante para el secado primario. Además, en estado seco, la temperatura de transición vítrea proporciona información sobre la temperatura de almacenamiento del producto final.

b. Formulaciones farmacéuticas y excipientes en general

Los excipientes son aditivos que imparten o mejoran la estabilidad y la administración de un medicamento (p. ej., proteína). Independientemente del motivo de su inclusión, los excipientes son un componente integral de una formulación y, por lo tanto, deben ser seguros y bien tolerados por los pacientes. En el caso de los fármacos de proteínas, la elección de los excipientes es particularmente importante porque pueden afectar tanto a la eficacia como a la inmunogenicidad del fármaco. Por lo tanto, es necesario desarrollar formulaciones de proteínas con una selección adecuada de excipientes que proporcionen estabilidad, seguridad y comercialización adecuadas.

Una formulación liofilizada está, en un aspecto, compuesta al menos por uno o más de un tampón, un agente de carga y un estabilizante. En este aspecto, se evalúa la utilidad de un tensioactivo y se selecciona en los casos en que la agregación durante la etapa de liofilización o durante la reconstitución se convierte en un problema. Se incluye un agente de tamponamiento apropiado para mantener la formulación dentro de zonas estables de pH durante la liofilización. En la Tabla 10 se proporciona una comparación de los componentes excipientes contemplados para las formulaciones de proteínas líquidas y liofilizadas.

Tabla 1: Componentes excipientes de formulaciones de proteína liofilizadas

El principal desafío en el desarrollo de formulaciones para proteínas es estabilizar el producto frente a las tensiones de la fabricación, envío y almacenamiento. El papel de los excipientes de formulación es proporcionar estabilización frente a estas tensiones. También se pueden emplear excipientes para reducir la viscosidad de formulaciones de proteínas de alta concentración con el fin de permitir su administración y mejorar la comodidad del paciente. En general, los excipientes pueden clasificarse en función de los mecanismos mediante los cuales estabilizan las proteínas frente a diversas tensiones químicas y físicas. Algunos excipientes se utilizan para aliviar los efectos de una tensión específica o para regular una susceptibilidad particular de una proteína específica. Otros excipientes tienen efectos más generales sobre las estabilidades física y covalente de las proteínas. Los excipientes descritos en el presente documento están organizados ya sea por su tipo químico o por su papel funcional en las formulaciones. Se proporcionan breves descripciones de los modos de estabilización cuando se comenta cada tipo de excipiente.

Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica sabrán qué cantidad o intervalo de excipiente se puede incluir en cualquier formulación particular para lograr una formulación biofarmacéutica para el uso de la invención que promueva la retención en la estabilidad del producto biofarmacéutico (p. ej., una proteína). Por ejemplo, la cantidad y el tipo de una sal que se van a incluir en una formulación biofarmacéutica para el uso de la invención se selecciona en función de la osmolalidad deseada (p. ej., isotónica, hipotónica o hipertónica) de la solución final, así como de las cantidades y la osmolalidad de otros componentes que se incluirán en la formulación.

A modo de ejemplo, la inclusión de aproximadamente 5% de sorbitol puede lograr isotonicidad, mientras que se necesita aproximadamente 9% de un excipiente de sacarosa para lograr isotonicidad. La selección de la cantidad o intervalo de concentraciones de uno o más excipientes que pueden incluirse dentro de una formulación biofarmacéutica para el uso de la invención se ha ilustrado anteriormente con referencia a sales, polioles y azúcares. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que las consideraciones descritas en el presente documento e ilustradas además por referencia a excipientes específicos son igualmente aplicables a todos los tipos y combinaciones de excipientes, incluidos, por ejemplo, sales, aminoácidos, otros agentes de tonicidad, tensioactivos, estabilizantes, agentes de carga, crioprotectores, lioprotectores, antioxidantes, iones metálicos, agentes quelantes y/o conservantes.

Además, cuando se da un excipiente particular en concentración molar, los expertos en la técnica reconocerán que también se contempla el porcentaje equivalente (%) en p/v (p. ej. (gramos de sustancia en una muestra de solución/ml de solución) X 100%) de solución.

Por supuesto, un experto en la técnica reconocería que las concentraciones de los excipientes descritos en el presente documento comparten una interdependencia dentro de una formulación particular. A modo de ejemplo, la concentración de un agente de carga se puede reducir cuando, p. ej., hay una alta concentración de proteína o cuando, p. ej., hay una alta concentración de agente estabilizante. Además, un experto en la técnica reconocería que, con el fin de mantener la isotonicidad de una formulación particular en la que no hay agente de carga, la concentración de un agente estabilizante se ajustaría en consecuencia (p. ej., se utilizaría una cantidad "tonificante" de estabilizante). Los excipientes comunes son conocidos en la técnica y se pueden encontrar en Powell et al., Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDAJ . Pharm. Sci. Technology,52:238-311.

c. Tampones y agentes de tamponamiento farmacéuticos

Generalmente se observa que la estabilidad de una formulación de proteína farmacológicamente activa es máxima en un intervalo de pH estrecho. Este intervalo de pH de estabilidad óptima debe identificarse temprano durante los estudios de preformulación. Varios enfoques, tales como los estudios de estabilidad acelerada y los estudios de barrido calorimétrico, son útiles en este cometido (Remmele R .L. Jr., et al.,Biochemistry,38(16): 5241-7 (1999)). Una vez finalizada una formulación, la proteína debe fabricarse y mantenerse durante toda su vida útil. Por lo tanto, casi siempre se emplean agentes de tamponamiento para controlar el pH en la formulación.

La capacidad de tampón de las especies de tamponamiento es máxima a un pH igual al pKa y disminuye a medida que el pH aumenta o disminuye alejándose de este valor. El noventa por ciento de la capacidad de tamponamiento existe dentro de una unidad de pH de su pKa. La capacidad de tampón también aumenta proporcionalmente al aumentar la concentración del tampón.

Hay varios factores que deben tenerse en cuenta al elegir un tampón. En primer lugar, es necesario definir la especie de tampón y su concentración basado en su pKa y del pH de la formulación deseado. Igualmente importante es garantizar que el tampón sea compatible con la proteína y otros excipientes de la formulación y que no catalice ninguna reacción de degradación. Un tercer aspecto importante a tener en cuenta es la sensación de picazón e irritación que puede inducir el tampón tras administrarlo. Por ejemplo, se sabe que el citrato causa picazón tras la inyección (Laursen T, et al.,Basic Clin Pharmacol Toxicol.,98(2): 218-21 (2006)). El potencial de picazón e irritación es mayor para los fármacos que se administran por vía subcutánea (SC) o intramuscular (IM), donde la solución del fármaco permanece en el sitio durante un período de tiempo relativamente más largo que cuando se administra por vía IV, donde la formulación se diluye rápidamente en la sangre tras la administración. Para formulaciones que se administran por infusión IV directa, es necesario controlar la cantidad total de tampón (y cualquier otro componente de la formulación). Hay que tener especial cuidado con los iones de potasio administrados en forma de tampón de fosfato de potasio, que pueden inducir efectos cardiovasculares en un paciente (Hollander-Rodriguez JC , et al.,Am. Fam. Physician.,73(2): 283-90 (2006)).

Los tampones para formulaciones liofilizadas necesitan consideración adicional. Algunos tampones, como el fosfato de sodio, pueden cristalizar fuera de la fase amorfa de la proteína durante la congelación, lo que produce cambios en el pH. Otros tampones comunes, tales como el acetato y el imidazol, pueden sublimar o evaporarse durante el proceso de liofilización, cambiando el pH de la formulación durante la liofilización o después de la reconstitución.

El sistema de tampón presente en las composiciones se selecciona para que sea fisiológicamente compatible y para mantener un pH deseado de la formulación farmacéutica. En una realización, el pH de la solución está entre pH 2,0 y pH 12,0. Por ejemplo, el pH de la solución puede ser 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4,3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, 10,0, 10,3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7 o 12,0.

El compuesto de tamponamiento de pH puede estar presente en cualquier cantidad adecuada para mantener el pH de la formulación a un nivel predeterminado. En una realización, la concentración para tamponamiento del pH es entre 0,1 mM y 500 mM (1 M). Por ejemplo, se contempla que el agente de tamponamiento del pH sea al menos 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 o 500 mM.

Los agentes de tamponamiento del pH de ejemplo utilizados para tamponar la formulación como se expone en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, ácidos orgánicos, glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato, citrato, Tris, H EpES y aminoácidos o mezclas de aminoácidos, incluyendo, pero no limitados a, aspartato, histidina y glicina. En una realización del uso de la presente invención, el agente de tamponamiento es citrato.

d. Estabilizantes y agentes de carga farmacéuticos

En un aspecto de las presentes formulaciones farmacéuticas, se añade un estabilizante (o una combinación de estabilizantes) para prevenir o reducir la agregación y la degradación química inducidas por el almacenamiento. Una solución poco clara o turbia tras la reconstitución indica que la proteína ha precipitado o al menos se ha agregado. El término "estabilizante" significa un excipiente capaz de prevenir la agregación o degradación física, incluida la degradación química (por ejemplo, autólisis, desamidación, oxidación, etc.) en estado acuoso. Los estabilizantes contemplados incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa, manitol, sorbitol, glicina, arginina-HCl, compuestos polihidroxílicos, incluidos polisacáridos tales como dextrano, almidón, hidroxietilalmidón, ciclodextrinas, N-metilpirrolideno, celulosa y ácido hialurónico, cloruro de sodio, (Carpenter et al.,Develop. Biol. Standard74:225, (1991)). En las presentes formulaciones, el estabilizante se incorpora en una concentración de aproximadamente 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 o 1000 mM. En una realización del uso de la presente invención, se utilizan manitol y trehalosa como agentes estabilizantes.

Si se desea, las formulaciones también incluyen cantidades apropiadas de agentes de carga y reguladores de osmolalidad. Los agentes de carga incluyen, por ejemplo y sin limitación, manitol, glicina, sacarosa, polímeros tales como dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, lactosa, sorbitol, trehalosa o xilitol. En una realización, el agente de carga es manitol. El agente de carga se incorpora en una concentración de aproximadamente 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 o 1000 mM.

e. Tensioactivos farmacéuticos

Las proteínas tienen una alta propensión a interaccionar con superficies, lo que las hace susceptibles a la adsorción y desnaturalización en interfases aire-líquido, vial-líquido y líquido-líquido (aceite de silicona). Se ha observado que esta ruta de degradación depende inversamente de la concentración de proteínas y da como resultado la formación de agregados de proteínas solubles e insolubles o la pérdida de proteínas de la solución a través de la adsorción a las superficies. Además de la adsorción en la superficie del envase, la degradación inducida por la superficie es agravada por la agitación física, como la que se experimentaría durante el envío y la manipulación del producto.

Los tensioactivos se utilizan comúnmente en formulaciones de proteínas para prevenir la degradación inducida por la superficie. Los tensioactivos son moléculas anfipáticas con la capacidad de competir con las proteínas por posiciones interfaciales. Las partes hidrófobas de las moléculas de tensioactivo ocupan posiciones interfaciales (p. ej., aire/líquido), mientras que las partes hidrófilas de las moléculas permanecen orientadas hacia el disolvente en masa. En concentraciones suficientes (normalmente aproximadamente a la concentración micelar crítica del detergente), una capa superficial de moléculas de tensioactivo sirve para evitar que las moléculas de proteína se adsorban en la interfase. De esta manera, se minimiza la degradación inducida por la superficie. Los tensioactivos contemplados en el presente documento incluyen, sin limitación, ésteres de ácidos grasos de sorbitán polietoxilados, p. ej., polisorbato 20 y polisorbato 80. Ambos difieren únicamente en la longitud de la cadena alifática que imparte carácter hidrófobo a las moléculas, C-12 y C-18, respectivamente. Por consiguiente, el polisorbato-80 es más tensioactivo y tiene una concentración micelar crítica más baja que el polisorbato-20.

Los detergentes también pueden afectar a la estabilidad conformacional termodinámica de las proteínas. También aquí, los efectos de un excipiente detergente determinado serán específicos de la proteína. Por ejemplo, se ha mostrado que los polisorbatos reducen la estabilidad de algunas proteínas y aumentan la estabilidad de otras. La desestabilización de proteínas por detergentes se puede racionalizar en términos de las colas hidrófobas de las moléculas de detergente que pueden participar en una unión específica con estados de la proteína parcial o totalmente desplegados. Este tipo de interacciones podrían producir un cambio en el equilibrio conformacional hacia estados de la proteína más expandidos (p. ej., aumentando la exposición de las partes hidrófobas de la molécula de proteína complementario a la unión del polisorbato). Alternativamente, si el estado nativo de la proteína presenta algunas superficies hidrófobas, la unión del detergente al estado nativo puede estabilizar esa conformación.

Otro aspecto de los polisorbatos es que son inherentemente susceptibles a la degradación oxidativa. A menudo, como materias primas, contienen cantidades suficientes de peróxidos para producir la oxidación de las cadenas laterales de los restos de las proteínas, especialmente la metionina. El potencial de daño oxidativo que surge de la adición de estabilizantes enfatiza el punto de que se deben utilizar las concentraciones efectivas más bajas de excipientes en las formulaciones. Para los tensioactivos, la concentración efectiva para una proteína determinada dependerá del mecanismo de estabilización.

También se añaden tensioactivos en cantidades apropiadas para evitar el fenómeno de agregación relacionado con la superficie durante la congelación y secado (Chang, B,J . Pharm. Sci.85:1325, (1996)). Por lo tanto, los tensioactivos de ejemplo incluyen, sin limitación, tensioactivos aniónicos, catiónicos, no iónicos, de ion híbrido y anfóteros, incluidos los tensioactivos derivados de aminoácidos naturales. Los tensioactivos aniónicos incluyen, pero no se limitan a, lauril-sulfato de sodio, dioctil-sulfosuccinato de sodio y dioctil-sulfonato de sodio, ácido quenodesoxicólico, sal sódica de N-lauroilsarcosina, dodecil-sulfato de litio, sal sódica del ácido 1-octanosulfónico, hidrato de colato de sodio, desoxicolato de sodio y sal sódica del ácido glicodesoxicólico. Los tensioactivos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, cloruro de cetilpiridinio monohidrato y bromuro de hexadeciltrimetilamonio. Los tensioactivos de ion híbrido incluyen, pero no se limitan a, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 y SB3-12. Los tensioactivos no iónicos incluyen, pero no se limitan a, digitonina, Triton X-100, Triton X-114,<t>W<e>EN-20 y TWEEN-80. Los tensioactivos también incluyen, pero no se limitan a, lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 10, 40, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, lecitina de soja y otros fosfolípidos tales como dioleilfosfatidilcolina (DOPC), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y (dioleilfosfatidilglicerol) DOPG; éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Por lo tanto, se proporcionan además composiciones que comprenden estos tensioactivos, ya sea individualmente o como una mezcla en diferentes relaciones. En una realización del uso de la presente invención, el tensioactivo es TWEEN-80. En las presentes formulaciones, el tensioactivo se incorpora en una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 g/l. En las formulaciones proporcionadas, la concentración de tensioactivo es de 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 g/l.

f. Sales farmacéuticas

A menudo se añaden sales para aumentar la fuerza iónica de la formulación, lo que puede ser importante para la solubilidad de las proteínas, la estabilidad física y la isotonicidad. Las sales pueden afectar a la estabilidad física de las proteínas de diversas maneras. Los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas uniéndose a los restos cargados en la superficie de la proteína. Alternativamente, las sales pueden estabilizar el estado desnaturalizado uniéndose a grupos peptídicos a lo largo de la cadena principal de la proteína (-CONH-). Las sales también pueden estabilizar la conformación nativa de la proteína al proteger las interacciones electrostáticas repulsivas entre restos dentro de una molécula de proteína. Las sales en las formulaciones de proteínas también pueden proteger las interacciones electrostáticas atractivas entre las moléculas de proteínas que pueden conducir a la agregación e insolubilidad de las proteínas. En las formulaciones proporcionadas, la concentración de sal está entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 y 500 mM.

g. Otros componentes excipientes comunes: aminoácidos farmacéuticos

Los aminoácidos han encontrado un uso versátil en formulaciones de proteínas como tampones, agentes de carga, estabilizantes y antioxidantes. Por lo tanto, en un aspecto, se emplean histidina y ácido glutámico para el tamponamiento de formulaciones de proteínas en el intervalo de pH de 5,5 - 6,5 y 4,0 - 5,5 respectivamente. El grupo imidazol de la histidina tiene un pKa = 6,0 y el grupo carboxilo de la cadena lateral del ácido glutámico tiene un pKa de 4,3, lo que hace que estos aminoácidos sean adecuados para el tamponamiento en sus respectivos intervalos de pH. El ácido glutámico es especialmente útil en dichos casos. La histidina se encuentra comúnmente en las formulaciones de proteínas comercializadas y este aminoácido proporciona una alternativa al citrato, un tampón que se sabe que produce picazón tras inyección. Curiosamente, también se ha informado que la histidina tiene un efecto estabilizante con respecto a la agregación cuando se usa en altas concentraciones tanto en presentaciones líquidas como liofilizadas (Chen B, et al.,Pharm Res.,20(12): 1952 60 (2003)). Otros también observaron que la histidina reduce la viscosidad de una formulación con alta concentración de proteínas. Sin embargo, en el mismo estudio, los autores observaron un aumento de la agregación y la decoloración en las formulaciones que contenían histidina durante los estudios de congelacióndescongelación del anticuerpo en recipientes de acero inoxidable. Otra nota de precaución con la histidina es que sufre fotooxidación en presencia de iones metálicos (Tomita M, et al.,Biochemistry,8(12): 5149-60 (1969)). El uso de metionina como un antioxidante en formulaciones parece prometedor; se ha observado que es eficaz contra una serie de estreses oxidativos (Lam XM, et al.,J Pharm ScL,86(11): 1250-5 (1997)).

En varios aspectos, se proporcionan formulaciones que incluyen uno o más de los aminoácidos glicina, prolina, serina, arginina y alanina y se ha mostrado que estabilizan las proteínas por el mecanismo de exclusión preferencial. La glicina también es un agente de carga comúnmente utilizado en formulaciones liofilizadas. Se ha mostrado que la arginina es un agente eficaz para inhibir la agregación y se ha utilizado en formulaciones tanto líquidas como liofilizadas.

En las formulaciones proporcionadas, la concentración de aminoácido está entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 y 500 mM. En una realización del uso de la presente invención, el aminoácido es glicina.

h. Otros componentes excipientes comunes: antioxidantes farmacéuticos

La oxidación de restos de las proteínas procede de varias fuentes diferentes. Más allá de la adición de antioxidantes específicos, la prevención del daño oxidativo a las proteínas implica el control cuidadoso de una serie de factores durante todo el procedimiento de fabricación y el almacenamiento del producto, tales como el oxígeno atmosférico, temperatura, exposición a la luz y contaminación química. Por lo tanto, la invención contempla el uso de antioxidantes farmacéuticos que incluyen, sin limitación, agentes reductores, depuradores de oxígeno/radicales libres o agentes quelantes. Los antioxidantes en las formulaciones de proteínas terapéuticas son, en un aspecto, solubles en agua y permanecen activos durante toda la vida útil del producto. Los agentes reductores y depuradores de oxígeno/radicales libres funcionan eliminando las especies de oxígeno activo en solución. Los agentes quelantes como el EDTA son eficaces al unirse a los contaminantes metálicos residuales que promueven la formación de radicales libres. Por ejemplo, se utilizó EDTA en la formulación líquida del factor de crecimiento de fibroblastos ácido para inhibir la oxidación catalizada por iones metálicos de los restos cisteína.

Además de la eficacia de varios excipientes para prevenir la oxidación de proteínas, es preocupante el potencial de los propios antioxidantes para inducir otros cambios covalentes o físicos en la proteína. Por ejemplo, los agentes reductores pueden producir la rotura de enlaces disulfuro intramoleculares, lo que puede conducir al cambio de sitio de disulfuros. Se ha mostrado que, en presencia de iones de metales de transición, el ácido ascórbico y el EDTA promueven la oxidación de metionina en una serie de proteínas y péptidos (Akers MJ y Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. En: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editores. Pharmaceutical Science. Taylor y Francis, Reino Unido (1999)); Fransson JR , /.Pharm. Sci.86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al.,Pharm Res.,21(12): 2377-83 (2004)). Se ha informado que el tiosulfato de sodio reduce los niveles de oxidación de metionina inducida por luz y temperatura en rhuMab HER2; sin embargo, en este estudio también se informó de la formación de un aducto de tiosulfato-proteína (Lam XM, Yang JY , et al.,J Pharm Sci.86(11): 1250-5 (1997)). La selección de un antioxidante apropiado se hace según los estreses y sensibilidades específicos de la proteína. Los antioxidantes contemplados en ciertos aspectos incluyen, sin limitación, agentes reductores y depuradores de oxígeno/radicales libres, EDTA y tiosulfato de sodio.

i. Otros componentes excipientes comunes: iones de metales farmacéuticos

En general, los iones de metales de transición no son deseados en las formulaciones de proteínas porque pueden catalizar reacciones de degradación física y química en las proteínas. Sin embargo, se incluyen iones de metales específicos en las formulaciones cuando son cofactores de proteínas y en formulaciones de proteínas en suspensión donde forman complejos de coordinación (p. ej., suspensión de zinc de insulina). Recientemente, se ha propuesto el uso de iones de magnesio (10 - 120 mM) para inhibir la isomerización del ácido aspártico a ácido isoaspártico (WO 2004039337).

Dos ejemplos donde los iones de metales confieren estabilidad o mayor actividad en las proteínas son la desoxirribonucleasa humana (rhDNasa, Pulmozyme®) y el factor VIII. En el caso de la rhDNasa, los iones Ca+2 (hasta 100 mM) aumentaron la estabilidad de la enzima a través de un sitio de unión específico (Chen B, et al., /Pharm Sci.,88(4): 477-82 (1999)). De hecho, la eliminación de iones de calcio de la solución con EGTA producía un aumento de la desamidación y la agregación. Sin embargo, este efecto se observó sólo con iones Ca+2; se observó que otros cationes divalentes Mg+2, Mn+2 y Zn+2 desestabilizaban la rhDNasa. Se observaron efectos similares en el factor VIII. Los iones Ca+2 y Sr+2 estabilizaban la proteína mientras que otros como Mg+2, Mn+2 y Zn+2, Cu+2 y Fe+2 desestabilizaban la enzima (Fatouros, A., et al.,Int. J . Pharm., 155,121-131 (1997). En un estudio separado con el factor VIII, se observó un aumento significativo en la tasa de agregación en presencia de iones Al+3 (Derrick TS, et al., /.Pharm. Sci.,93(10): 2549-57 (2004)). Los autores señalan que otros excipientes, como las sales tampón, a menudo están contaminados con iones Al+3 e ilustran la necesidad de utilizar excipientes de calidad adecuada en productos formulados.

j. Otros componentes excipientes comunes: conservantes farmacéuticos

Los conservantes son necesarios cuando se desarrollan formulaciones parenterales de multiuso que implican más de una extracción del mismo envase. Su función principal es inhibir el crecimiento microbiano y garantizar la esterilidad del producto durante toda la vida útil o el período de uso del medicamento. Los conservantes comúnmente utilizados incluyen, sin limitación, alcohol bencílico, fenol y m-cresol. Si bien los conservantes tienen una larga historia de uso, el desarrollo de formulaciones de proteínas que incluyan conservantes puede ser un desafío. Los conservantes casi siempre tienen un efecto desestabilizante (agregación) sobre las proteínas, y esto se ha convertido en un factor importante que limita su uso en formulaciones de proteínas multidosis (Roy S, et al.,J Pharm ScL,94(2): 382-96 (2005)).

Hasta la fecha, la mayoría de los fármacos de proteínas se han formulado para un solo uso. Sin embargo, cuando son posibles las formulaciones multidosis, tienen la ventaja adicional de permitir la conveniencia del paciente y mayor comercialización. Un buen ejemplo es el de la hormona de crecimiento humana (hGH), donde el desarrollo de formulaciones conservadas ha llevado a la comercialización de presentaciones en forma de pluma de inyección de usos múltiples más convenientes. Actualmente se encuentran disponibles en el mercado al menos cuatro de dichos dispositivos de pluma que contienen formulaciones conservadas de hGH. Norditropin® (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (líquido, Genentech) y Genotropin (liofilizado - cartucho de doble cámara, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol, mientras que Somatrope® (Eli Lilly) está formulado con m-cresol.

Se deben considerar varios aspectos durante el desarrollo de la formulación de formas farmacéuticas conservadas. Se debe optimizar la concentración efectiva de conservante en el medicamento. Esto requiere ensayar un conservante determinado en la forma farmacéutica con intervalos de concentración que confieran eficacia antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la proteína. Por ejemplo, se evaluaron con éxito tres conservantes en el desarrollo de una formulación líquida para el receptor de interleucina-1 (tipo I), utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC). Los conservantes se clasificaron según su impacto en la estabilidad en concentraciones comúnmente utilizadas en productos comercializados (Remmele RL Jr., et al.,Pharm Res.,15(2): 200-8 (1998)).

El desarrollo de formulaciones líquidas que contienen conservantes es más desafiante que el de las formulaciones liofilizadas. Los productos liofilizados se pueden liofilizar sin el conservante y reconstituir con un diluyente que contenga conservante en el momento de su uso. Esto acorta el tiempo durante el cual un conservante está en contacto con la proteína, minimizando significativamente los riesgos de estabilidad asociados. Con formulaciones líquidas, la eficacia y estabilidad del conservante deben mantenerse durante toda la vida útil del producto (18 - 24 meses). Un punto importante a tener en cuenta es que la eficacia del conservante debe demostrarse en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes excipientes.

Algunos conservantes pueden producir reacciones en el sitio de inyección, lo cual es otro factor que hay que considerar cuando se elige un conservante. En ensayos clínicos que se centraron en la evaluación de conservantes y tampones en Norditropin, se observó que la percepción del dolor era menor en las formulaciones que contenían fenol y alcohol bencílico en comparación con una formulación que contenía mcresol (Kappelgaard A.M.,Horm Res.62 Suppl 3:98-103 (2004)). Es interesante que, entre los conservantes comúnmente utilizados, el alcohol bencílico posee propiedades anestésicas (Minogue SC y Sun DA.,AnesthAnalg.,100(3): 683-6 (2005)). En varios aspectos, el uso de conservantes proporciona un beneficio que supera cualquier efecto secundario.

k. Métodos de preparación de formulaciones farmacéuticas

La presente memoria descriptiva contempla además métodos para la preparación de formulaciones farmacéuticas, aunque éstos no son parte de la invención.

Los presentes métodos comprenden además una o más de las siguientes etapas: añadir un agente estabilizante como se describe en el presente documento a dicha mezcla antes de liofilizar, añadir al menos un agente seleccionado de un agente de carga, un agente regulador de la osmolalidad y un tensioactivo, cada uno de los cuales como se describe en el presente documento, a dicha mezcla antes de liofilizar.

La práctica de reconstitución convencional para el material liofilizado es volver a añadir un volumen de agua pura o agua estéril para inyección (WFI) (típicamente equivalente al volumen retirado durante la liofilización), aunque a veces se usan soluciones diluidas de agentes antibacterianos en la producción de productos farmacéuticos para administración parenteral (Chen,Drug Development and Industrial Pharmacy,18:1311-1354 (1992)). Por consiguiente, se proporcionan métodos para la preparación de composiciones de rVWF reconstituidas que comprenden la etapa de añadir un diluyente a una composición de rVWF liofilizada para el uso de la invención.

l. Formulación de rVWF de ejemplo para administración

En algunas realizaciones, los métodos presentes proporcionan una formulación mejorada que permite un producto final con alta potencia (alta concentración de rVWF y estabilidad mejorada a largo plazo) con el fin de reducir el volumen para el tratamiento (100 UI/ml a 10.000 UI/ml). En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 100 UI/ml a 10.000 UI/ml. En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 500 UI/ml a 10.000 UI/ml. En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 1000 UI/ml a 10.000 UI/ml. En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 2000 UI/ml a 10.000 UI/ml. En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 3000 UI/ml a 10.000 UI/ml. En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 4000 UI/ml a 10.000 UI/ml. En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 5000 UI/ml a 10.000 UI/ml. En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 6000 UI/ml a 10.000 UI/ml. En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 7000 UI/ml a 10.000 UI/ml. En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 8000 UI/ml a 10.000 UI/ml. En algunas realizaciones, la concentración de rVWF en la formulación para administración es de aproximadamente 9000 UI/ml a 10.000 UI/ml.

En algunas realizaciones, la formulación para administración comprende uno o más compuestos de ion híbrido, incluidos, por ejemplo, aminoácidos como histidina, glicina, arginina. En algunas realizaciones, la formulación para administración comprende un componente con característica anfipática que tiene un mínimo de un grupo hidrófobo y uno hidrófilo, incluyendo por ejemplo polisorbato 80, octilpiranósido, dipéptidos y/o péptidos anfipáticos. En algunas realizaciones, la formulación para administración comprende un azúcar no reductor o alcohol de azúcar o disacáridos, incluidos, por ejemplo, sorbitol, manitol, sacarosa o trehalosa. En algunas realizaciones, la formulación para administración comprende una sal soluble en agua no tóxica, que incluye, por ejemplo, cloruro de sodio, que da como resultado una osmolalidad fisiológica. En algunas realizaciones, la formulación para administración comprende un pH en un intervalo de 6,0 a 8,0. En algunas realizaciones, la formulación para administración comprende un pH de aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5 o aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, la formulación para administración comprende uno o más cationes bivalentes que estabilizan el rVWF, incluyendo, por ejemplo, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la formulación para administración comprende glicina de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, histidina de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, cloruro de sodio de aproximadamente cero a aproximadamente 300 mM (p. ej., menos de 300 mM de sodio), polisorbato 20 (o polisorbato 80) de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,05% y sacarosa de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 20% (p/p) con un pH de aproximadamente 7,0 y que tiene una osmolaridad fisiológica en el momento de la administración.

En algunas realizaciones, la formulación para administración se puede liofilizar. En algunas realizaciones, la formulación para administración es estable y puede almacenarse en estado líquido a de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C, así como de aproximadamente 18°C a aproximadamente 25°C. En algunas realizaciones, la formulación para administración es estable y puede almacenarse en estado líquido a de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C. En algunas realizaciones, la formulación para administración es estable y puede almacenarse en estado líquido a de aproximadamente 18°C a aproximadamente 25°C.

m. Administración/dosificación

Para administrar composiciones a seres humanos o animales de ensayo, en un aspecto, las composiciones comprenden uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Las frases "farmacéuticamente" o "farmacológicamente" aceptable se refieren a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhiben la degradación de proteínas tales como productos de agregación y escisión, y además no producen reacciones alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran utilizando vías bien conocidas en la técnica, como se describe a continuación. Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares clínicamente útiles, incluidos los agentes descritos anteriormente.

Las formulaciones farmacéuticas se administran por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral, mediante pulverización por inhalación, vía vaginal, rectal o mediante inyección intracraneal. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal o técnicas de infusión. También se contempla la administración por vía intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, y/o intrapulmonar en un sitio particular. Generalmente, las composiciones están esencialmente exentas de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser dañinas para el receptor.

Según el uso de la presente invención, el rVWF se administra en ausencia del Factor VIII (FVIII). En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, el rVWF se administra antes del procedimiento quirúrgico, como se comenta en el presente documento. En algunas realizaciones, el rVWF se administra al menos 12 horas, al menos 13 horas, al menos 14 horas, al menos 15 horas, al menos 16 horas, al menos 17 horas, al menos 18 horas, al menos 19 horas, al menos 20 horas, al menos 21 horas, al menos 22 horas, al menos 23 horas o al menos 24 horas antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administran 35-60 UI/kg de rVWF al menos 12 horas, al menos 13 horas, al menos 14 horas, al menos 15 horas, al menos 16 horas, al menos 17 horas, al menos 18 horas, al menos 19 horas, al menos 20 horas, al menos 21 horas, al menos 22 horas, al menos 23 horas o al menos 24 horas antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran 50-60 UI/kg de rVWF al menos 12 horas, al menos 13 horas, al menos 14 horas, al menos 15 horas, al menos 16 horas, al menos 17 horas, al menos 18 horas, al menos 19 horas, al menos 20 horas, al menos 21 horas, al menos 22 horas, al menos 23 horas o al menos 24 horas antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran 20-40 UI/kg de rVWF al menos 12 horas, al menos 13 horas, al menos 14 horas, al menos 15 horas, al menos 16 horas, al menos 17 horas, al menos 18 horas, al menos 19 horas, al menos 20 horas, al menos 21 horas, al menos 22 horas, al menos 23 horas o al menos 24 horas antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 50-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran 50-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 55-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 50-55 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 50 UI/kg, aproximadamente 52 UI/kg, aproximadamente 54 UI/kg, aproximadamente 56 UI/kg, aproximadamente 58 UI/kg o aproximadamente 60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 35-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 35-55 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 40-60 Ul/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 45-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 50-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 35 UI/kg, aproximadamente 40 UI/kg, aproximadamente 45 UI/kg, aproximadamente 50 UI/kg, aproximadamente 55 UI/kg o aproximadamente 60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administra aproximadamente 20-40 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, aproximadamente 20 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, aproximadamente 25 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, aproximadamente 30 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, aproximadamente 35 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, aproximadamente 40 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, el método comprende una segunda etapa de pretratamiento de administrar rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 5-50 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 5 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 10 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 15 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 20 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 25 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 35 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 40 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 45 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 50 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 15-90 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 15 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 20 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 25 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 35 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 40 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 45 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 50 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 55 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 60 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 65 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 70 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 75 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 80 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 85 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 90 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 20-50 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 25-50 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30-50 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 25-40 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 40 50 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 20 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 25 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 35 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 40 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 45 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 50 UI/kg de rVWF 1 hora antes del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, el método comprende la administración de rVWF durante el procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 10-50 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 20-50 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30-50 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 40 50 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 20-40 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30-40 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran 10 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 15 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 20 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 25 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 35 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 40 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 45 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 50 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 70-220 Ul/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 90-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 110-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 120-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 140-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 150-200 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 160-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 180-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 180-200 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 180-190 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 190-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 190-210 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 200-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 210-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 80 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 90 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 110 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 120 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 130 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 140 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 160 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 170 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 180 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 190 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 200 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 210 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 70-150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 80-150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 90-150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100-150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 110-150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 120-150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 130-150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100-140 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 90-140 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 140-150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 70 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 80 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 90 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 100 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 110 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 120 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 130 Ul/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 140 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor, el pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis de rVWF antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor, el pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis de rVWF antes del procedimiento quirúrgico, en donde la primera dosis es mayor que la segunda dosis. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 150-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 160-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 170-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 180-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 180-210 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 190-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 190-210 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 200-220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 150 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 160 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 170 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 180 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 190 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 200 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 210 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 220 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor, el pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis aproximadamente iguales de rVWF antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 20-50 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 25-50 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30-50 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 25 40 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30-40 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 40-50 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 45-50 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 20 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 25 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 30 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 35 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 40 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 45 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 50 UI/kg de rVWF después del procedimiento quirúrgico cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral y el pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis aproximadamente iguales de rVWF antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 100-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 110-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 120-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 130-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 140-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 150-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 160-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 170-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 180-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 190-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 180-210 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 190-210 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 200-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 210-220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 100 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 110 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 120 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 130 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 140 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 150 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 160 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 170 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 180 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 200 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 210 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 220-320 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 230-320 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 240-320 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 250-320 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 260-320 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 270-320 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 280-320 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 280-310 Ul/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 290-310 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 290-320 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 300-320 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 300-310 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 220 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 230 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 240 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 250 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 260 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 270 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 280 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 290 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 300 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 310 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 320 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 70-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 80-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de 9 aproximadamente 90-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 100-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 110-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 120-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 130-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 140-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 150-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 160-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 170-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 180-190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 70 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 80 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 90 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 100 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 110 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 120 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 130 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 140 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 150 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 160 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 170 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 180 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, se administra una dosis total de aproximadamente 190 UI/kg de rVWF cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

En algunas realizaciones, cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor, el pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis aproximadamente iguales de rVWF antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, la dosificación es una dosificación como la indicada anteriormente. En algunas realizaciones, no se administra FVIII. En algunas realizaciones, cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor, el pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis de rVWF antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, cuando el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor, el pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis de rVWF antes del procedimiento quirúrgico, en donde la primera dosis es mayor que la segunda dosis. En algunas realizaciones, la dosificación es una dosificación como la indicada anteriormente. En algunas realizaciones, no se administra FVIII. En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral y el pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis aproximadamente iguales de rVWF antes del procedimiento quirúrgico. En algunas realizaciones, la dosificación es una dosificación como la indicada anteriormente. En algunas realizaciones, no se administra FVIII.

Generalmente, la VWD tipo 1 se indica por la relación VWF:RCo <30 UI/dl, VWF:Ag <30 UI/dl, FVIII bajo o normal y VWF:RCo/VWF:Ag >0,5-0,7 UI/dl. La VWD tipo 2A se indica por la relación VW F:RCo <30 UI/dl, VWF:Ag <30-200 UI/dl, FVIII bajo o normal y VWF:RCo/VWF:Ag <0,5-0,7 UI/dl. La VWD tipo 2B se indica por la relación VW F:RCo <30-200 UI/dl, VWF:Ag <30 UI/dl, FVIII bajo o normal y VWF:RCo/VWF:Ag <0,5-0,7 UI/dl. La VWD tipo 2M se indica por la relación VWF:RCo <30 UI/dl, VWF:Ag <30-200 UI/dl, FVIII bajo o normal y VWF:RCo/VWF:Ag <0,5-0,7 UI/dl. La VWD tipo 2N se indica por la relación VW F:RCo 30-2000 UI/dl, VWF:Ag 30-200 UI/dl, FVIII muy bajo y VWF:RCo/VWF:Ag >0,5-0,7 UI/dl. La VWD tipo 3 se indica por la relación VW F:RCo <3 UI/dl, VWF:Ag <3 UI/dl, FVIII extremadamente bajo (<10 UI/dl) y la VW F: RC o/VWF: Ag no es aplicable. Lo normal se indica con la relación VWF:RCo 50-200 UI/dl, VWF:Ag 50-200 UI/dl, FVIII normal y VWF:RCo/VWF:Ag >0,5-0,7 UI/dl. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene VWD tipo 3. En algunas realizaciones, el sujeto tiene VWD tipo 1 grave. En algunas realizaciones, el sujeto tiene VWD tipo 2 grave.

V. Procedimientos quirúrgicos

El procedimiento quirúrgico según el uso de la presente invención puede ser un procedimiento quirúrgico mayor o un procedimiento quirúrgico menor.

Generalmente, la cirugía mayor incluye cualquier procedimiento quirúrgico invasivo en el que se realiza una resección más extensa, p. ej., se entra en una cavidad corporal, se extraen órganos o se altera la anatomía normal. Generalmente, si se abre una barrera mesenquimal (por ejemplo, cavidad pleural, peritoneo, meninges), la cirugía se considera mayor. En algunas realizaciones, una cirugía mayor es aquella en la que se espera una pérdida de sangre mayor de 500 ml, cambios significativos de fluidos y, típicamente, al menos una noche en el hospital. Los procedimientos quirúrgicos mayores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, cirugías bariátricas/derivación gástrica, miotomía septal, pancreatectomía, reparación de disección aórtica torácica, esofagectomía, cistectomía de vejiga, revascularización coronaria, cirugía de osteomielitis espinal, restauración ventricular quirúrgica, craneotomía, cirugía laparoscópica (excepto colecistectomía y ligadura de trompas), resección abierta de órganos, reemplazos de articulaciones grandes, mastectomía con reconstrucción y/o cirugía de columna, torácica, vascular y/o intracraneal. Otros ejemplos de cirugías mayores incluyen, pero no se limitan a, osteotomía maxilar o mandibular, laringectomía, resección de masas grandes benignas o malignas y/o disección de ganglios linfáticos que requieren una noche de hospitalización (con o sin cirugía reconstructiva), mastectomía con reconstrucción tisular inmediata (con o sin biopsia de ganglios linfáticos o disección axilar), reparación o resección laparoscópica o abierta (de, por ejemplo, estómago, intestino delgado, colon, hígado, páncreas, bazo, glándulas suprarrenales o hígado), colecistectomía abierta, reparaciones de hernias ventrales, epigástricas o incisionales grandes, resección o ablación histeroscópica, histerectomía y/o cirugía anexial, laparoscopia para endometriosis extensa, cirugía del suelo pélvico abdominal o transvaginal, cirugía intracraneal, laminectomía y/o fusión espinal, reemplazo de rodilla, reemplazo de cadera, reemplazo de hombro, reemplazo de articulación del codo, extracción o revisión de material de implante por infección o fallo, amputación, laminectomía y/o fusión espinal, reconstrucción con colgajo libre (cirugía plástica), paniculectomía, mediastinoscopia, resección pulmonar, resección de esófago, resección de masa mediastínica (toracoscópica o abierta), reparación de hernia hiatal (toracoscópica o abierta), resección de tumor de vejiga (transuretral o abierta), tumor de próstata (transuretral o abierta), resección de riñón (laparoscópica o abierta), resección ureteral (laparoscópica o abierta), resección de testículo (transescrotal o abdominal), amputación, cirugía de derivación arterial periférica, reparación de aneurisma aórtico (endovascular o abierta) y/o endarterectomía carotídea.

La cirugía menor es cualquier procedimiento quirúrgico invasivo en el que solo se reseca la piel o las membranas mucosas y tejido conectivo, p. ej., un corte vascular para la colocación de catéter o implantación de bombas en el tejido subcutáneo. Un procedimiento quirúrgico menor generalmente incluye cualquier procedimiento que pueda realizarse de forma segura en un entorno ambulatorio, sin el uso de anestesia general ni la necesidad de asistencia respiratoria. En algunas realizaciones, una cirugía menor es aquella en la que hay una pérdida de sangre esperada de menos de 500 ml, cambios mínimos de líquidos y generalmente se realiza de forma ambulatoria (cirugía de día/alta el mismo día). Dichos procedimientos quirúrgicos ambulatorios pueden incluir, pero no se limitan a, cirugía de cataratas, cirugía de mama sin reconstrucción, colecistectomía laparoscópica y ligadura de trompas, y la mayoría de los procedimientos cutáneos, superficiales, endoscópicos y artroscópicos. Otros ejemplos de cirugías menores incluyen, pero no se limitan a, extracción de dientes, amigdalectomía, adenoidectomía, septoplastia, turbinectomía, rinoplastia, biopsia faríngea, biopsia laríngea, escisión menor por láser u otros medios, cirugía del oído medio, mastoidectomía, implantación coclear, cirugía endoscópica de los senos nasales, pequeñas resecciones de masas benignas y malignas (realizadas de forma ambulatoria; es decir, torus mandibulares, quistes de la hendidura braquial, cáncer de lengua pequeño), tiroidectomía, tumorectomía mamaria (con o sin biopsia de ganglios linfáticos o disección axilar), mastectomía (con o sin biopsia de ganglios linfáticos o disección axilar), reparación de hernia inguinal (abordaje laparoscópico o abierto), reparación de hernia umbilical (abordaje laparoscópico o abierto), colecistectomía laparoscópica, hemorroidectomía, dilatación, legrado, histeroscopia diagnóstica, laparoscopia, ablación endometrial con balón térmico, ligadura de trompas, laparoscopia - endometriosis limitada, inserción de cinta transvaginal, discectomía, extracción de cataratas, la mayoría de los procedimientos oftalmológicos, cirugía artroscópica (incluyendo reparación del ACL), extracción de material de implante de rutina (no por infección), cirugía de tendones, bunionectomía, discectomía, liberación del túnel carpiano, liberación de la contractura de Dupuytren, cirugía mayor de tendones, cirugía menor de tendones, pequeños colgajos rotacionales e injertos de piel, resección de carcinoma de células basales, escisión de lipoma, mamoplastia de reducción y otra cirugía para enfermedad mamaria benigna, cirugía mamaria cosmética, broncoscopia, cistoscopia, ureteroscopia, renoscopia para cálculos, renoscopia para estenosis, renoscopia para biopsia, escisión de hidrocele, escisión de varicocele, vasectomía, circuncisión y/o escisión de vena varicosa.

Los procedimientos quirúrgicos orales incluyen, pero no se limitan a, varios procedimientos dentales y cirugías orales, incluyendo, por ejemplo, extracciones de dientes.

En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor. En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor. En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral.

Ejemplos

Ejemplo 1: Eficacia hemostática y seguridad de rVWF

Este estudio evaluaba la eficacia hemostática y la seguridad de rVWF con o sin ADVATE (factor antihemofílico [recombinante]), Baxalta US Inc., Westlake Village, CA (rFVIII) en pacientes con VWD grave que se sometían a cirugía electiva.

Métodos

Estudio de fase 3, abierto, no controlado, no aleatorizado en 14 sitios en 10 países (NCT02283268) en pacientes >18 años de edad que tenían VWD grave y estaban programados para someterse a una cirugía electiva. Los pacientes se vigilaron durante 14 días después de la cirugía.

Tratamiento

12-24 h antes de la cirugía, se administró rVWF 40-60 Ul/kg rVWF:RCo por vía intravenosa para permitir que los niveles endógenos de FVIII:C aumentaran a >30 Ul/dl (cirugía menor/oral) o >60 Ul/dl (cirugía mayor). Los niveles de FVIII:C se evaluaron en el espacio de 3 h del inicio de la cirugía. Si se alcanzaban los niveles objetivo de FVIII:C, se administró rVWF solo 1 h antes de la cirugía para alcanzar los niveles máximos descritos en la Tabla 2. La dosificación intraoperatoria y posoperatoria se individualizó para mantener los niveles mínimos objetivo según los resultados farmacocinéticos (PK) y farmacodinámicos (PD), así como la intensidad y duración del desafío hemostático.

Tabla 2. Niveles objetivo de VW F:RCo y FVIII:C: recomendaciones para la prevención del sangrado excesivo durante y después de la cirugía

Tipo de Nivel plasmático máximo Nivel plasmático Cálculo de la dosis de rVWF (Ul cirugía objetivo de VW F:RCo (Ul/dl) máximo objetivo de de VW F:RCo requeridas)! FVIII:C* (Ul/dl)

Menor/Oral 50-60 40-50 AVW F:RCo * BW (kg)/lRJ

Mayor 100 80-100 AVW F:RCo * BW (kg)/lRJ BW=peso corporal; FVIN:C=actividad del factor VIII; IR=recuperación incremental;

rVWF=factor de von Willebrand recombinante; VWF:RCo=actividad del cofactor de ristocetina del factor de von Willebrand.

*Puede requerirse rFVIII adicional para alcanzar los niveles plasmáticos máximos objetivo de FVIII:C recomendados.

fS e administra en el espacio de 1 h antes de la cirugía.

fS i no se dispone de IR, suponer una IR de 2,0 Ul/dl por Ul/kg.

AVW F:RCo = VW F:RCo plasmático máximo objetivo - VWF:RCo plasmático inicial.

Evaluación

La eficacia hemostática general (resultado principal) fue evaluada por el investigador 24 horas después de la última infusión perioperatoria o al finalizar el estudio, lo que ocurriera primero (Tabla 3). El cirujano evaluó la eficacia hemostática intraoperatoria (Tabla 3), junto con la pérdida de sangre intraoperatoria real frente a la prevista. Las evaluaciones de seguridad incluyeron acontecimientos adversos (AE) y anticuerpos contra rVWF, rFVIII, proteínas de ovario de hámster chino (CHO), inmunoglobulina G murina (IgG) y rFurina.

Tabla 3. Escala de valoración de eficacia hemostática general* e intraoperatoriaf

Valoración Evaluación

Excelente La hemostasia lograda con rVWF con o sin rFVIII era tan buena o mejor que la esperada para el tipo de procedimiento quirúrgico realizado en un sujeto hemostáticamente normal.

Buena La hemostasia lograda con rVWF con o sin rFVIII era probablemente tan buena como la esperada para el tipo de procedimiento quirúrgico realizado en un sujeto hemostáticamente normal.

Moderada La hemostasia con rVWF con o sin rFVIII era claramente menos que óptima para el tipo de procedimiento realizado, pero se mantuvo sin necesidad de cambiar el concentrado de rVWF. Ninguna El paciente experimentó sangrado incontrolado que fue el resultado de una respuesta terapéutica inadecuada a pesar de la dosificación adecuada, necesitando un cambio de concentrado de rVWF.

rFVIII=factor VIII recombinante; rVWF=factor de von Willebrand recombinante.

*Evaluado por el investigador.

fEvaluado por el cirujano.

Estadística

Los análisis descriptivos incluían estimaciones puntuales e IC del 90% para el número de pacientes con eficacia hemostática valorada como "excelente/buena" utilizando una prueba de Clopper Pearson. La PK/PD y seguridad se resumieron usando estadísticos descriptivos.

Resultados

Pacientes

Tabla 4. Datos demográficos y características clínicas iniciales

Parámetro N=15

Sexo, n (%)

Hombre 7 (46,7) Mujer 8 (53,3)

Edad media (intervalo), años 40 (20-70) Parámetro N=15

Peso medio (intervalo), kg 73,5 (52,0-127,2) IMC mediano (intervalo), kg/m2 25,6 (17,1-38,0) Tipo de VWD, n (%)

1 3 (20,0)

2A 2 (13,3)

2B 1 (6,7)

2M 1 (6,7)

3 8 (53,3) Clasificación de la cirugía, n (%)

Mayor 10 (66,7) Menor 4 (26,7)

Oral 1 (6,7)

FVIII:C medio (DE), UI/dl

Todos los tipos de VWD (n=11) 20,6 (23,7) VWD tipo 3 (n=5) 1,8 (1,1)

VW F:RCo medio (DE), UI/dl

Todos los tipos de VWD (n=11) 9,7 (11,0)

VWD tipo 3 (n=5) <8 (0,0) IMC=índice de masa corporal; FVNI:C=actividad del factor VIII; VWD=enfermedad de von Willebrand; VWF:RCo=actividad del cofactor de ristocetina del factor de von Willebrand.

La eficacia hemostática general se valoró como "excelente" o "buena" para los 15 pacientes (IC del 90%: 81,9 100,0) (Figura 1).

Eficacia

La eficacia hemostática intraoperatoria se valoró como "excelente" o "buena" para los 15 pacientes (IC del 90%: 81,9-100,0) (Figura 2). Entre los 8 pacientes con VWD tipo 3, tanto la eficacia hemostática general como la intraoperatoria se valoraron como "excelente" para 7 pacientes y "buena" para 1 paciente. La pérdida de sangre intraoperatoria real media ± DE en relación con la pérdida de sangre prevista fue de 70% ± 45% y se valoró como "excelente" para 13 pacientes y "buena" para 2 pacientes.

Exposición

Los pacientes recibieron un total de 104 infusiones de rVWF para prevenir o tratar el sangrado quirúrgico; la dosis quirúrgica general media de rVWF fue de 220,4 UI/kg (intervalo, 63,8-648,4 UI/kg) (Tabla 4). 93 (89,4%) infusiones de rVWF solo: 15 (12-24 h antes de la cirugía), 12 (1 h antes de la cirugía) y 66 (de forma postoperatoria). 11 (10,6%) infusiones de rVWF con rFVIII: 3 (1 h antes de la cirugía), 1 (de forma intraoperatoria) y 7 (de forma postoperatoria). 5 pacientes recibieron las 11 infusiones de rVWF con rFVIII, y 6 de las 7 infusiones postoperatorias de rVWF con rFVIII fueron en 1 paciente.

De los 10 pacientes que se sometían a cirugía mayor, 7 (70%) no requirieron coadministración de rFVIII.

Tabla 5. Exposición al rVWF mediana general y por clasificación quirúrgica

Seguridad

6 pacientes informaron de 12 A E surgidos durante del tratamiento; ninguno se consideró relacionado con el tratamiento. pacientes tuvieron A E graves (diverticulitis y trombosis venosa profunda [DVP]; cada una ocurrió en 1 paciente); ninguno de los acontecimientos se consideró relacionado con el tratamiento de reemplazo de factor.

La DVP grave se produjo el día 8 después de la operación (inicialmente se informó como DVP no grave el día 4 después de la operación). El acontecimiento fue asintomático y se observó después de eco Doppler de rutina. El acontecimiento se evaluó como poco probable relacionado con rVWF y no relacionado con rFVIII o los procedimientos del estudio; causalmente asociado con la cirugía mayor del paciente (reemplazo total de cadera) y los antecedentes de obesidad en curso. Los niveles postoperatorios de FVIII:C nunca superaron 150 UI/dl. El acontecimiento produjo la colocación de un filtro cava y posteriormente se resolvió sin secuelas. Sin reacciones alérgicas graves; anticuerpos neutralizantes contra rFVIII, proteínas de CHO, IgG murina o rFurina.

Un paciente con VWD tipo 3 que recibió una transfusión intraoperatoria de glóbulos rojos empaquetados durante una cirugía mayor de reemplazo total de rodilla dio positivo para anticuerpos de unión a VWF el día 7 posoperatorio.

Los parámetros PK para VWF:RCo para los pacientes que se sometieron a análisis PK (n = 11) se muestran en la FIG. 4. Las concentraciones medias de VWF:RCo, VWF:Ag y actividad de unión al colágeno de VWF (VW F:CB) alcanzaron niveles máximos a los 30 min y disminuyeron gradualmente a lo largo de un período de 72 h después de la infusión (FIG. 4).

La administración de rVWF solo dio como resultado la estabilización rápida y sustancial de los niveles endógenos de FVIII:C 6-12 h después de infusión, con niveles máximos de FVIII:C alcanzados a las 24 h entre todos los pacientes evaluados (n = 11; FIG. 5A), así como en el subconjunto de pacientes con VWD tipo 3 (n = 5; FIG. 5B). En general, los pacientes alcanzaron FVIII:C medio >60 UI/dl a las 6 h posteriores a la infusión (FIG. 5A), y los pacientes con FVIII:C inicial más alto (p. ej., con VWD tipo 1 o tipo 2) pudieron alcanzar los niveles objetivo más rápidamente. A pesar de tener niveles medios de FVIII:C <2 UI/dl al inicio, la administración de rVWF solo permitió a los pacientes con VWD tipo 3 alcanzar los niveles objetivo de VWF:RCo y FVIII:C rápidamente, con FVIII:C >60 UI/dl alcanzado a las 12 h posteriores a la infusión (FIG. 5B).

Conclusiones

En este estudio quirúrgico, la eficacia hemostática general e intraoperatoria se valoró como "excelente" o "buena" para los 15 pacientes. Para cirugías mayores, la eficacia hemostática general fue "excelente" en 7 pacientes y "buena" en 3 pacientes, y la eficacia intraoperatoria fue "excelente" en 8 pacientes y "buena" en 2 pacientes. Casi el 90% de las infusiones para lograr la hemostasia intraoperatoria y posoperatoria fueron solo con rVWF; el 70% de las cirugías mayores se manejaron solo con rVWF. El rVWF se dirige a la disfunción primaria de la VWD y permite a los médicos centrarse en lograr una eficacia óptima sin preocuparse por la acumulación de FVIII. Estos datos respaldan el uso seguro y eficaz de rVWF en cirugías mayores y menores.

Ejemplo 2: Factor de von Willebrand recombinante en sujetos con enfermedad de von Willebrand grave que se someten a cirugía

Este ejemplo proporciona los resultados del estudio de un estudio que examinaba el tratamiento de sujetos con enfermedad de von Willebrand (VWD) grave que se sometían a cirugía.

Criterios de valoración:

Criterios principales de valoración:

Eficacia hemostática general según la evaluación del investigador (médico especialista en hemofilia) [Marco de tiempo: 24 horas después de la última infusión perioperatoria o en la visita de finalización del día 14 (± 2 días), lo que ocurra primero]. La eficacia hemostática se valoró en una escala de excelente - buena - moderada - ninguna.

• Excelente: La hemostasia intra y posoperatoria lograda con rVWF con o sin ADVATE era tan buena o mejor que la esperada para el tipo de procedimiento quirúrgico realizado en un sujeto hemostáticamente normal.

• Buena: La hemostasia intra y posoperatoria lograda con rVWF con o sin ADVATE era probablemente tan buena como la esperada para el tipo de procedimiento quirúrgico realizado en un sujeto hemostáticamente normal.

• Moderada: La hemostasia intra y posoperatoria lograda con rVWF con o sin ADVATE era claramente menos que óptima para el tipo de procedimiento realizado, pero se mantuvo sin necesidad de cambiar el concentrado de rVWF.

• Ninguna: El participante experimentó sangrado incontrolado que era el resultado de una respuesta terapéutica inadecuada a pesar de la dosificación adecuada, necesitando un cambio de concentrado de rVWF.

Criterios secundarios de valoración:

n.° 1: Pérdida de sangre intraoperatoria real frente a prevista según la evaluación del cirujano que opera [Marco de tiempo: Día 0 (al finalizar la cirugía)]. La pérdida de sangre prevista fue estimada preoperatoriamente por el cirujano que operaba basándose en un individuo hemostáticamente normal del mismo sexo, edad, estatura y comorbilidades que el participante. Se evaluó la pérdida de sangre real que consistía en la pérdida de sangre estimada, que incluía hisopos, toallas y succión durante el procedimiento, según el registro del anestesiólogo.

n.° 2: Pérdida de sangre intraoperatoria real respecto a la pérdida de sangre prevista [Marco de tiempo: Día 0 (al finalizar la cirugía)]. La pérdida de sangre real respecto a la pérdida de sangre prevista se calculó como [Pérdida de sangre real (ml)] dividida por [Pérdida de sangre prevista (ml) multiplicada por 100.

n.° 3: Puntuación de la pérdida de sangre intraoperatoria real frente a la prevista según la evaluación del cirujano que opera [Marco de tiempo: Día 0 (al finalizar la cirugía)].

• La eficacia hemostática se valoró en una escala de excelente - buena - moderada - ninguna.

• Excelente: La pérdida de sangre intraoperatoria era menor o igual a la pérdida de sangre máxima esperada para el tipo de procedimiento realizado en un sujeto hemostáticamente normal (< 100%).

• Buena: La pérdida de sangre intraoperatoria era hasta un 50% mayor que la pérdida de sangre máxima esperada para el tipo de procedimiento realizado en un sujeto hemostáticamente normal (101-150%). Moderada: La pérdida de sangre intraoperatoria era más de 50% de la pérdida de sangre máxima esperada para el tipo de procedimiento realizado en un sujeto hemostáticamente normal (>150%).

• Ninguna: Hemorragia no controlada que era el resultado de una respuesta terapéutica inadecuada a pesar de la dosificación adecuada, necesitando un cambio del régimen de reemplazo del factor de coagulación.

n.° 4: Puntuación de eficacia hemostática intraoperatoria según la evaluación del cirujano que opera [Marco de tiempo: Día 0 (al finalizar la cirugía)]

• Excelente: La hemostasia intraoperatoria lograda con rVWF con o sin ADVATE era tan buena o mejor que la esperada para el tipo de procedimiento quirúrgico realizado en un sujeto hemostáticamente normal.

• Buena: La hemostasia intraoperatoria lograda con rVWF con o sin ADVATE era probablemente tan buena como la esperada para el tipo de procedimiento quirúrgico realizado en un sujeto hemostáticamente normal.

• Moderada: La hemostasia intraoperatoria lograda con rVWF con o sin ADVATE era claramente menos que óptima para el tipo de procedimiento realizado, pero se mantuvo sin necesidad de cambiar el concentrado de rVWF.

n.° 5: Dosis diaria intra y posoperatoria ajustada por peso de rVWF con o sin ADVATE [Marco de tiempo: diariamente, desde el día de la cirugía hasta el día 14 posoperatorio (± 2 días)]

n.° 6 : Aparición de acontecimientos adversos [Marco de tiempo: desde la primera infusión del producto en investigación hasta la finalización del estudio (es decir, 14 (± 2) días después de la cirugía)]. Se evaluaron los acontecimientos adversos surgidos durante el tratamiento (TEA E) y los acontecimientos adversos graves surgidos durante el tratamiento (TESAE).

n.° 7: Aparición de acontecimientos trombóticos [Marco de tiempo: desde la primera infusión del producto en investigación hasta la finalización del estudio (es decir, 14 (± 2) días después de la cirugía)]. Se evaluaron los acontecimientos adversos surgidos durante el tratamiento (TEA E) y los acontecimientos adversos graves surgidos durante el tratamiento (TESAE).

n.° 8 : Aparición de reacciones alérgicas graves (p. ej., anafilaxis) [Marco de tiempo: desde la primera infusión del producto en investigación hasta la finalización del estudio (es decir, 14 (± 2) días después de la cirugía)]. Se evaluaron los acontecimientos adversos surgidos durante el tratamiento (TEA E) y los acontecimientos adversos graves surgidos durante el tratamiento (TESA E) para las reacciones alérgicas graves.

n.° 9: Número de participantes que desarrollaron anticuerpos inhibidores y de unión total contra el factor de von Willebrand (VWF) y anticuerpos inhibidores contra el factor VIII (FVIII) [Marco de tiempo: los ensayos se realizaron durante todo el estudio en la selección, antes de la infusión PK, antes de la cirugía, después de la cirugía en caso de sangrado excesivo o sangrado inexplicable, el día 7 posoperatorio y en la visita de finalización del estudio (es decir, 14 (± 2) días después de la cirugía)]. Los participantes se trataron con factor van Willebrand recombinante (rVWF) con o sin ADVATE.

n.° 10: Número de participantes que desarrollaron anticuerpos contra proteínas de ovario de hámster chino (CHO), inmunoglobulina G (IgG) de ratón o furina recombinante (rFurina) [Marco de tiempo: laos ensayos se realizaron durante todo el estudio en la selección, antes de la infusión PK, antes de la cirugía, después de la cirugía en caso de sangrado excesivo o sangrado inexplicable, el día 7 posoperatorio y en la visita de finalización del estudio (es decir, 14 (± 2) días después de la cirugía)]. Los participantes se trataron con factor de van Willebrand recombinante (rVWF) con o sin ADVATE.

n.° 11: Farmacocinética: Área bajo la curva de concentración plasmática frente a tiempo de 0 a 72 horas después de infusión (AUC 0-72 h/dosis) [Marco de tiempo: las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas]. Esta evaluación solo era necesaria para los sujetos que se sometían a cirugía mayor. Los sujetos recibieron una infusión PK con una dosis de rVWF:RCo de 50±5 Ul/kg dentro de los 42 días previos a la cirugía. El área bajo la curva de concentración plasmática/tiempo de 0 a 72 horas después de la infusión se calculó utilizando la regla trapezoidal lineal. Para el cálculo del AUC(0-72 h), los niveles a las 72 horas se interpolaron/extrapolaron linealmente desde los 2 puntos de tiempo de muestreo más cercanos. Se realizó un análisis PK para los siguientes analitos: actividad del cofactor de ristocetina del VWF (VWF:RCo), actividad del antígeno del VWF (VWF:Ag), actividad de unión al colágeno del VWF (VW F:CB), actividad del VWF medida mediante el ensayo INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac), actividad de coagulación del FVIII (FVIII :C)

n.° 12: Farmacocinética: Área bajo la curva de concentración plasmática frente a tiempo desde tiempo 0 a infinito (AUC 0-~/dosis) [Marco de tiempo: las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas]. Esta evaluación solo era necesaria para los sujetos que se sometían a cirugía mayor. Los sujetos recibieron una infusión PK con una dosis de rVWF:RCo de 50±5 UI/kg dentro de los 42 días previos a la cirugía. El área bajo la curva de concentración plasmática/tiempo desde el tiempo 0 a infinito y el área bajo la curva del primer momento desde el tiempo 0 a infinito se calculó como la suma del AUC o AUMC desde el tiempo 0 hasta el tiempo de la última concentración cuantificable más una corrección del área de cola calculada como Ct/Az y Ct/Az(t+1/Az), respectivamente, donde Ct era la última concentración cuantificable, t era el tiempo de la última concentración cuantificable y Az era la constante de velocidad terminal o de disposición. Se realizó un análisis PK para los siguientes analitos: actividad del cofactor de ristocetina del VWF (VWF:RCo), actividad del antígeno del VWF (VWF:Ag), actividad de unión al colágeno del VWF (VW F:CB), actividad del VWF medida mediante el ensayo INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac), actividad de coagulación del FVIII (FVIII :C)

n.° 13: Farmacocinética: Tiempo medio de permanencia (MRT) [Marco de tiempo: Las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas]. Esta evaluación solo era necesaria para los sujetos que se sometían a una cirugía mayor. Los sujetos recibieron una infusión PK con una dosis de rVWF:RCo de 50±5 Ul/kg dentro de los 42 días previos a la cirugía. El tiempo de permanencia medio se calculó como el área bajo la curva del primer momento desde el tiempo 0 a infinito dividida por el área bajo la curva del tiempo 0 a infinito menos T/2, donde T era la duración de la infusión. Se realizó un análisis PK para los siguientes analitos: actividad del cofactor de ristocetina del VWF (VWF:RCo), actividad del antígeno del VWF (VWF:Ag), actividad de unión al colágeno del VWF (VW F:CB), actividad del VWF medida mediante el ensayo INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac)

n.° 14: Farmacocinética: Aclaramiento (CL) [Marco de tiempo: Las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas]. Esta evaluación solo era necesaria para los sujetos que se sometían a una cirugía mayor. Los sujetos recibieron una infusión PK con una dosis de rVWF:RCo de 50±5 Ul/kg dentro de los 42 días previos a la cirugía. El aclaramiento se calculó como la dosis (Ul/kg) dividida por el área bajo la curva de tiempo de 0 a infinito. Se realizó un análisis PK para los siguientes analitos: actividad del cofactor de ristocetina del VWF (VW F:RCo), actividad del antígeno del VWF (VWF:Ag), actividad de unión al colágeno del VWF (VW F:CB), actividad del VWF medida mediante el ensayo INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac)

n.° 15: Farmacocinética: Recuperación incremental (IR) [Marco de tiempo: Las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas]. Esta evaluación solo era necesaria para los sujetos que se sometían a una cirugía mayor. Los sujetos recibieron una infusión PK con una dosis de rVWF:RCo de 50±5 UI/kg dentro de los 42 días previos a la cirugía. La recuperación incremental se calculó como (Cmáx menos Cpreinfusión) dividido por la dosis (UI/kg), donde kg se refiere al peso corporal en el momento de la dosificación y Cmáx era la concentración máxima observada antes de la corrección de los valores previos a la infusión. Se realizó un análisis PK para los siguientes analitos: actividad del cofactor de ristocetina del VWF (VWF:RCo), actividad del antígeno del VWF (VWF:Ag), actividad de unión al colágeno del VWF (VW F:CB), actividad del VWF medida mediante el ensayo INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac)

n.° 16: Farmacocinética: Semivida de fase de eliminación (T1/2) [Marco de tiempo: Las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas]. Esta evaluación solo era necesaria para los sujetos que se sometían a una cirugía mayor. Los sujetos recibieron una infusión PK con una dosis de rVWF:RCo de 50±5 UI/kg dentro de los 42 días previos a la cirugía. La semivida terminal o de disposición (T1/2) se calculó como ln2/Az, donde Az era la constante de velocidad de eliminación terminal calculada en WinNonlin NCA utilizando al menos tres concentraciones cuantificables. Se realizó un análisis PK para los siguientes analitos: actividad del cofactor de ristocetina del VWF (VWF:RCo), actividad del antígeno del VWF (VWF:Ag), actividad de unión al colágeno del VWF (VW F:CB), actividad del VWF medida mediante el ensayo INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac)

n.° 17: Farmacocinética: Volumen de distribución en estado estacionario (Vss) [Marco de tiempo: Las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas]. Esta evaluación solo es necesaria para los sujetos que se someten a una cirugía mayor. Los sujetos recibieron una infusión PK con una dosis de rVWF:RCo de 50±5 UI/kg dentro de los 42 días previos a la cirugía. El Vss se calculó como el aclaramiento multiplicado por el tiempo de permanencia medio. Se realizó un análisis PK para los siguientes analitos: actividad del cofactor de ristocetina del VWF (VW F:RCo), actividad del antígeno del VWF (VWF:Ag), actividad de unión al colágeno del VWF (VW F:CB), actividad del VWF medida mediante el ensayo INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac)

Criterios de elegibilidad:

Edades elegibles para el estudio: 18 años y mayores; Sexos elegibles para el estudio: Todos

Criterios de inclusión:

Diagnóstico de enfermedad de von Willebrand (VWD) grave según se detalla a continuación y procedimiento quirúrgico electivo planificado:

• 1. Tipo 1 (factor de von Willebrand: actividad del cofactor de ristocetina (VW F:RCo) <20 UI/dl), o • 2. Tipo 2A (verificado por el patrón de multímeros), Tipo 2B (diagnosticado por genotipo), Tipo 2N (FVIII:C <10% y genética documentada históricamente), Tipo 2M, o

• 3. Tipo 3 (antígeno del factor von Willebrand (VWF:Ag) < 3 UI/dl)

VWD con antecedentes de requerir terapia de sustitución con concentrado de factor von Willebrand (VWF) para controlar el sangrado.

Si es VWD tipo 3 (antígeno de VWF/VWF:Ag < 3 UI/dl), el participante tiene historial médico de al menos 20 días de exposición a concentrados de factores de coagulación VWF/FVIII (incluido crioprecipitado o plasma fresco congelado).

Si es VWD tipo 1 o tipo 2, el participante tiene historial médico de 5 días de exposición o una cirugía mayor previa que requirió concentrados de factor de coagulación VWF/FVIII (incluido crioprecipitado o plasma fresco congelado).

El participante tenía al menos 18 años de edad.

Si es mujer en edad fértil, la participante presenta una prueba de embarazo negativa.

Si es aplicable, el participante acepta emplear medidas anticonceptivas adecuadas durante la duración del estudio.

El participante está dispuesto y es capaz de cumplir con los requisitos del protocolo.

Criterios de exclusión seleccionados:

Diagnóstico de pseudo VWD u otro trastorno de la coagulación hereditario o adquirido (p. ej., trastornos plaquetarios cualitativos y cuantitativos o tiempo de protrombina [PT] elevado / índice internacional normalizado [INR] > 1,4).

Historial o presencia de un inhibidor de VWF en la selección.

Historial o presencia de un inhibidor del factor VIII (FVIII) con un título > 0,4 BU (ensayo Bethesda modificado por Nijmegen) o > 0,6 BU (por ensayo Bethesda).

Hipersensibilidad conocida a cualquiera de los componentes de los fármacos del estudio, tales como proteínas de ratón o de hámster.

Historial médico de trastornos inmunológicos, excluyendo rinitis/conjuntivitis alérgica estacional, asma leve, alergias alimentarias o alergias a animales.

Historial médico de un acontecimiento tromboembólico.

VIH positivo con un recuento absoluto de CD4 < 200/mm3.

Recuento de plaquetas < 100.000/ml.

Diagnóstico de enfermedad hepática significativa, probado por, pero no limitados a, cualquiera de los siguientes: alanina aminotransferasa sérica (ALT) 5 veces el límite superior de lo normal; hipoalbuminemia; hipertensión de la vena porta (p. ej., presencia de esplenomegalia sin explicación, antecedentes de várices esofágicas) o cirrosis hepática clasificada como Child B o C.

Diagnóstico de enfermedad renal, con un nivel de creatinina sérica > 2,5 mg/dl.

El participante había sido tratado con un fármaco inmunomodulador, excluyendo el tratamiento tópico (p. ej., pomadas, pulverizadores nasales), dentro de los 30 días anteriores a la firma del consentimiento informado.

La participante estaba embarazada o en período de lactancia en el momento en que se obtuvo el contenido informado.

El participante había participado en otro estudio clínico que involucraba un producto en investigación (IP), distinto de rVWF con o sin ADVATE, o un dispositivo en investigación dentro de los 30 días anteriores a la inscripción o estaba programado para participar en otro estudio clínico que involucraba un IP o un dispositivo en investigación durante el curso de este estudio. Sin embargo, podrán inscribirse pacientes elegibles que participen en el Estudio de profilaxis del rVWF (071301).

Enfermedad mortal progresiva y/o expectativa de vida menor a 3 meses.

Resultados:

La inscripción se llevó a cabo en 14 sitios de estudio en 10 países (EE . UU., Australia, Taiwán, Alemania, Rusia, España, Ucrania, Reino Unido, Italia, Turquía).

Tabla 6 : Grupos de recogida de datos

Tabla 6 : Participante: Estudio general

Tabla 7: Medidas iniciales

Factor de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes analizados generales 15

[Unidades: Participantes]

Edad 40,0

[Unidades: Años]

Mediana (Intervalo completo) (20,0 a 70,0)

Sexo: Femenino, Masculino

[Unidades: Participantes]

Recuento de participantes

Mujer 8 53,3%

Hombre 7 46,7%

Criterio principal de valoración: Criterio de valoración n.° 1

Tabla 8 : Criterios de valoración

1. Principal: Eficacia hemostática general según la evaluación del investigador (médico especialista en hemofilia) [Marco de tiempo: 24 horas después de la última infusión perioperatoria o en la visita de finalización el día 14 (± 2 días), lo que ocurra primero].

T a b la 9: C r ite r io p r in c ip a l d e v a lo ra c ió n n .° 1

Descripción de la población Criterio de valoración n.° 1

El número de participantes con cirugía mayor, menor y oral y el número de participantes con Von Willebrand tipo 1 ,2A, 2B, 2M y 3 se suman para dar el número total de participantes analizados. Para el análisis se utilizó el conjunto completo de datos de análisis, que incluían todos los participantes que recibieron el producto en investigación y tienen al menos 1 evaluación hemostática.

Tabla 10: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 1

Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 2 2. Secundario: Pérdida de sangre intraoperatoria real frente a prevista según la evaluación del cirujano que opera [Marco de tiempo: Día 0 (al finalizar la cirugía)].

Tabla 12: Criterio principal de valoración n.° 2

Descripción de la población Criterio de valoración n.° 2

Para la pérdida de sangre prevista, el número de participantes analizados fue 14, ya que para un participante (incluido en el grupo de recogida de datos de cirugía mayor) no se recogió la pérdida de sangre prevista. Para el análisis se utilizó el conjunto completo de datos de análisis, que incluían todos los participantes que recibieron el producto en investigación y tuvieron al menos 1 evaluación hemostática.

Tabla 13: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 2

N o s e p ro p o rc io n ó a n á lis is e s ta d ís t ic o p a ra la p é rd id a d e s a n g re in tra o p e ra to r ia re a l f re n te a la p re v is ta s e g ú n la e v a lu a c ió n d e l c iru ja n o q u e o p e ra .

C r ite r io d e v a lo ra c ió n s e c u n d a r io : C r ite r io d e v a lo ra c ió n n .° 3

3. Secundario: Pérdida de sangre intraoperatoria real respecto a la pérdida de sangre prevista [Marco de tiempo: Día 0 (al finalizar la cirugía)].

Tabla 14: Criterio de valoración n.° 3

Descripción de la población Criterio de valoración n.° 3

El número de participantes analizados era 11, ya que para 3 participantes la pérdida de sangre real y prevista fue cero y para 1 participante no se recogió la pérdida de sangre prevista. Por lo tanto, no se pudo calcular la "pérdida de sangre real respecto a la pérdida de sangre prevista". Para el análisis de esta medida de criterio de valoración se utilizó el conjunto de datos de análisis completo.

Tabla 15: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 3

No se proporcionó análisis estadístico para la pérdida de sangre intraoperatoria real respecto a la pérdida de sangre prevista

C r ite r io d e v a lo ra c ió n s e c u n d a r io : C r ite r io d e v a lo ra c ió n n .° 4

4. Secundario: Puntuación de la pérdida de sangre intraoperatoria real frente a prevista según la evaluación del cirujano que opera [Marco de tiempo: Día 0 (al finalizar la cirugía)].

Tabla 17: Criterio de valoración n.° 4

Tabla 18: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 4

Tabla 19: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 4

N o s e p ro p o rc io n ó a n á lis is e s ta d ís t ic o p a ra la p u n tu a c ió n d e la p é rd id a d e s a n g re in tra o p e ra to r ia re a l f re n te a la p re v is ta s e g ú n la e v a lu a c ió n d e l c iru ja n o q u e o p e ra .

C r ite r io d e v a lo ra c ió n s e c u n d a r io : C r ite r io d e v a lo ra c ió n n .° 5

5. Secundario: Puntuación de eficacia hemostática intraoperatoria según la evaluación del cirujano que opera [Marco de tiempo: Día 0 (al finalizar la cirugía)]

Tabla 21: Criterio de valoración n.° 5

Tabla 22: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 5

Tabla 23: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 5

N o s e p ro p o rc io n ó a n á lis is e s ta d ís t ic o p a ra la p u n tu a c ió n d e e f ic a c ia h e m o s tá t ic a in tra o p e ra to r ia e v a lu a d a p o r e l c iru ja n o q u e o p e ra

C r ite r io d e v a lo ra c ió n s e c u n d a r io : C r ite r io d e v a lo ra c ió n n .° 6

6. Secundario: Dosis diaria intra y posoperatoria ajustada por peso de rVWF con o sin ADVATE [Marco de tiempo: diariamente, desde el día de la cirugía hasta el día 14 posoperatorio (± 2 días)]

Tabla 25: Criterio de valoración n.° 6

Tabla 25: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 6

Tabla 40: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 6

Tabla 26: Valores medidos Criterio de valoración n.° 6

No se proporcionó análisis estadístico para la dosis diaria ajustada por peso intra y posoperatoria de rVWF con o sin ADVATE

C r ite r io d e v a lo ra c ió n s e c u n d a r io : C r ite r io d e v a lo ra c ió n n .° 7

7. Secundario: Aparición de acontecimientos adversos [Marco de tiempo: desde la primera infusión del producto en investigación hasta la finalización del estudio (es decir, 14 (± 2) días después de la cirugía)].

Tabla 27: Criterio de valoración n.° 7

Tabla 28: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 7

Tabla 29: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 7

Tabla 30: Valores medidos

No se proporcionó análisis estadístico para la aparición de acontecimientos adversos

Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 8

8. Secundario: Aparición de acontecimientos trombóticos [Marco de tiempo: desde la primera infusión del producto en investigación hasta la finalización del estudio (es decir, 14 (± 2) días después de la cirugía)]. Tabla 31: Criterio de valoración n.° 8

Tabla 32: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 8

Tabla 33: Grupos de recogida de datos

Tabla 34: Valores medidos Criterio de valoración n.° 8

No se proporcionó análisis estadístico para la aparición de acontecimientos trombóticos

Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 9

9. Secundario: Aparición de reacciones alérgicas graves (p. ej., anafilaxia) [Marco de tiempo: desde la primera infusión del producto en investigación hasta la finalización del estudio (es decir, 14 (± 2) días después de la cirugía)].

Tabla 35: Criterio de valoración n.° 9

Tabla 36: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 9

Tabla 37: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 9

Tabla 38: Valores medidos Criterio de valoración n.° 9

No se proporcionó análisis estadístico para la aparición de reacciones alérgicas graves (p. ej., anafilaxia). Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 10

10. Secundario: Número de participantes que desarrollaron anticuerpos inhibidores y de unión total contra el factor de von Willebrand (VWF) y anticuerpos inhibidores contra el factor VIII (FVIII) [Marco de tiempo: los ensayos se realizaron durante todo el estudio en la selección, antes de la infusión PK, antes de la cirugía, después de la cirugía en caso de sangrado excesivo o sangrado inexplicable, el día 7 posoperatorio y en la visita de finalización del estudio (es decir, 14 (± 2) días después de la cirugía)].

Tabla 39: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 10

Tabla 40: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 10

Tabla 41: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 10

Tabla 55: Valores medidos Criterio de valoración n.° 10

No se proporcionó análisis estadístico para el número de participantes que desarrollaron anticuerpos inhibidores y de unión total contra el factor de von Willebrand (VWF) y anticuerpos inhibidores contra el factor VIII (FVIII)

Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 11

11. Secundario: Número de participantes que desarrollaron anticuerpos contra proteínas de ovario de hámster chino (CHO), inmunoglobulina G (IgG) de ratón o furina recombinante (rFurina) [Marco de tiempo: los ensayos se realizaron durante todo el estudio en la selección, antes de la infusión PK, antes de la cirugía, después de la cirugía en caso de sangrado excesivo o sangrado inexplicable, el día 7 posoperatorio y en la visita de finalización del estudio (es decir, 14 (± 2) días después de la cirugía)].

Tabla 42: Criterio de valoración n.° 11

Tabla 43: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 11

Tabla 44: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 11

Tabla 59: Valores medidos Criterio de valoración n.° 11

No se proporcionó análisis estadístico para el número de participantes que desarrollaron anticuerpos contra proteínas de ovario de hámster chino (CHO), inmunoglobulina G (IgG) de ratón o furina recombinante (rFurina) Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 12

12. Secundario: Farmacocinética: Área bajo la curva de concentración plasmática frente a tiempo de 0 a 72 horas después de infusión (AUC 0-72 h/dosis) [Marco de tiempo: las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas].

Tabla 45: Resultado n.° 12

Tabla 46: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 12

Tabla 47: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 12

Tabla 48: Valores medidos Criterio de valoración n.° 12

No se proporcionó análisis estadístico para la farmacocinética: Área bajo la curva de concentración plasmática frente a tiempo de 0 a 72 horas después de infusión (AUC 0-72 h/dosis)

Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 13

13. Secundario: Farmacocinética: Área bajo la curva de concentración plasmática frente a tiempo desde tiempo 0 a infinito (AUC 0-“ /dosis) [Marco de tiempo: las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas].

Tabla 49: Criterio de valoración n.° 13

Tabla 50: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 13

Tabla 51: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 13

Tabla 52: Valores medidos

No se proporcionó análisis estadístico para farmacocinética: área bajo la curva de concentración plasmática frente a tiempo desde tiempo 0 a infinito (AUC 0-~ /dosis)

Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 14

14. Secundario: Farmacocinética: Tiempo medio de permanencia (MRT) [Marco de tiempo: Las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas].

Tabla 53: Criterio de valoración n.° 14

Tabla 54: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 14

Tabla 55: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 14

Tabla 56: Valores medidos

No se proporcionó análisis estadístico para farmacocinética: tiempo medio de permanencia (MRT) Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 15

15. Secundario: Farmacocinética: Aclaramiento (CL) [Marco de tiempo: Las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas].

Tabla 57: Criterio de valoración n.° 15

Tabla 58: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 15

Tabla 59: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 15

Tabla 60: Valores medidos

No se proporciona análisis estadístico para farmacocinética: Aclaramiento (CL)

Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 16

16. Secundario: Farmacocinética: Recuperación incremental (IR) [Marco de tiempo: Las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas].

Tabla 61: Criterio de valoración n.° 16

Tabla 77: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 16

Tabla 62: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 16

Tabla 63: Valores medidos Criterio de valoración n.° 16

No se proporcionó análisis estadístico para farmacocinética: Recuperación incremental (IR)

Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 17

17. Secundario: Farmacocinética: Semivida de fase de eliminación (T1/2) [Marco de tiempo: Las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas].

Tabla 64: Criterio de valoración n.° 17

Tabla 65: Descripción de la población Criterio de valoración n.° 17

Tabla 66 : Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 17

No se proporciona análisis estadístico para la farmacocinética: Semivida de fase de eliminación (T1/2) Criterio de valoración secundario: Criterio de valoración n.° 18

18. Secundario: Farmacocinética: Volumen de distribución en estado estacionario (Vss) [Marco de tiempo: Las mediciones PK se hicieron dentro de los 30 minutos previos a la infusión y después de la infusión a los 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas y 72 (± 2) horas]. Tabla 67: Criterio de valoración n.° 18

Tabla 68 : Descripción de la población Criterio de valoración n.° 18

Tabla 69: Grupos de recogida de datos Criterio de valoración n.° 18

No se proporcionó análisis estadístico para farmacocinética: Volumen de distribución en estado estacionario (Vss)

Los ejemplos expuestos anteriormente se proporcionan para dar a los expertos en la técnica una descripción y divulgación completa de cómo hacer y utilizar las realizaciones de las composiciones para el uso de la presente invención y los sistemas y métodos descritos adicionalmente, y no pretenden limitar el alcance de lo que los autores de la invención consideran su invención. Las modificaciones de los modos descritos anteriormente para llevar a cabo la invención que sean obvias para los expertos en la técnica se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Todas las patentes y las publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva indican los niveles técnicos de los expertos en la técnica a la que pertenece la invención.

Todos los encabezados y designaciones de secciones se utilizan solo con fines de claridad y referencia y no deben considerarse limitantes de ningún modo. Por ejemplo, los expertos en la técnica apreciarán la utilidad de combinar varios aspectos de diferentes encabezados y secciones según sea apropiado de acuerdo con el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Se pueden realizar muchas modificaciones y variaciones de esta solicitud sin apartarse del alcance de las reivindicaciones, como será evidente para los expertos en la técnica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para usar en un método para el pretratamiento de un sujeto con enfermedad de von Willebrand (VWD) grave antes de un procedimiento quirúrgico, en donde dicho pretratamiento comprende administrar 20-60 UI/kg del rVWF a dicho sujeto entre 12 horas y 24 horas antes del procedimiento quirúrgico y en donde no se administra factor VIII (FVIII) con el VWF antes del procedimiento quirúrgico.

2. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde dicho pretratamiento comprende además administrar 5-90 UI/kg de rVWF a dicho sujeto 1 hora antes de dicho procedimiento quirúrgico.

3. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde no se administra FVIII después de dicho procedimiento quirúrgico.

4. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde dicho procedimiento quirúrgico se selecciona del grupo que consiste en cirugía mayor, cirugía menor y cirugía oral.

5. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde se administran a dicho sujeto 50-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor, o

en donde se administran a dicho sujeto 35-60 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor o en donde se administran a dicho sujeto 20-40 UI/kg de rVWF entre 12 horas y 24 horas antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral.

6. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde dicho pretratamiento comprende además administrar 5-50 UI/kg de rVWF a dicho sujeto 1 hora antes del procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor.

7. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde se administran además a dicho sujeto 15-90 UI/kg de rVWF 1 hora antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor.

8. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde se administran además a dicho sujeto 20-50 UI/kg de rVWF 1 hora antes de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral.

9. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde se administran a dicho sujeto 10-50 UI/kg de rVWF durante dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral.

10. Factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde se administran además a dicho sujeto 70-220 UI/kg de rVWF después de dicho procedimiento quirúrgico.

11. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde se administran además a dicho sujeto 70-150 UI/kg de rVWF después de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor o

en donde se administran además a dicho sujeto 150-220 UI/kg de rVWF después de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor, o

o

en donde se administran además a dicho sujeto 20-50 UI/kg de rVWF después de dicho procedimiento quirúrgico y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral.

12. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde se administra a dicho sujeto una dosis total de 100-220 UI/kg de rVWF y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor, o

en donde se administra a dicho sujeto una dosis total de 220-320 UI/kg de rVWF y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor, o

en donde se administra a dicho sujeto una dosis total de 70-190 Ul/kg de rVWF y dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral.

13. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico mayor y dicho pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis aproximadamente iguales de rVWF antes del procedimiento quirúrgico.

14. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico menor y dicho pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis de rVWF antes del procedimiento quirúrgico, en donde la primera dosis es mayor que la segunda dosis.

15. El factor de von Willebrand recombinante (rVWF) para el uso de la reivindicación 1, en donde dicho procedimiento quirúrgico es un procedimiento quirúrgico oral y dicho pretratamiento comprende administrar al menos dos dosis aproximadamente iguales de rVWF antes del procedimiento quirúrgico.