JP7326246B2

JP7326246B2 - 待機手術を受ける、重度のフォンヴィレブランド病を患う患者の、組換えｖｗｆの投与による治療法

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Publication number: JP7326246B2
Application number: JP2020500622A
Authority: JP
Inventors: ミランダチャップマン; ブルースイーウェンスタイン; ベッティーナプロダー
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2038-07-09
Also published as: EP3648787B1; CA3069256A1; KR102788331B1; FI3648787T3; JP2020526527A; US20190091298A1; JP2023085513A; US20240009279A1; US20220168397A1; RU2020105681A3; EP4494697A3; EP3648787A1; KR20200037251A; RU2766118C2; RU2020105681A; US12622950B2; WO2019010496A1; DK3648787T3; EP4494697A2; CO2020001314A2

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月１７日出願の米国仮特許出願第６２／５４６，９９９号、及び２０１７年７月７日出願の米国仮特許出願第６２／５３０，０２４号に対する優先権を主張するものであり、これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明の背景
フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）などの凝固系疾患は、一般に、凝固カスケードの欠損から生じる。フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）は、フォンヴィレブランド因子の欠損により引き起こされる疾患の群を指す。フォンヴィレブランド因子は、血小板が一緒に凝集し、血管壁に張り付くのを助け、これは正常な血液凝固に必要なものである。

フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）は、推定有病率が１％である最も一般的な出血性疾患（ＶｅｙｒａｄｉｅｒＡ，ｅｔａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）．２０１６，９５（１１）：ｅ３０３８（非特許文献１））。しかしながら、より軽度の型の疾患を除き、実際に治療を必要とする患者は約１０，０００人に１人のみである。これらの凝固障害のための現在の治療には、正常な凝固因子を含む薬学的調製物を使用する補充療法が含まれる。

ＶＷＦは、サイズが約５００～２０，０００ｋＤの範囲である一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。ＶＷＦのｃＤＮＡの全長がクローニングされており、プロポリペプチドは、全長プレプロＶＷＦのアミノ酸残基２３～７６４に対応する（Ｅｉｋｅｎｂｏｏｍｅｔａｌ（１９９５）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ１，７７９０（非特許文献２））。ＶＷＦの多量体形態は、ジスルフィド結合により一緒に連結した２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットで構成される。ＶＷＦは、損傷した血管壁の内皮下層への初期血小板粘着を媒介し、より大きい多量体は、増強した止血活性を呈する。多量体化されたＶＷＦは、ＶＷＦのＡ１ドメインにおける相互作用をとおして血小板表面糖タンパク質Ｇｐ１ｂαに結合し、血小板粘着を促進する。ＶＷＦ上の他の部位は、血管壁への結合を媒介する。こうして、ＶＷＦは、剪断応力が高い条件下での血小板粘着及び一次止血に不可欠である、血小板と血管壁との間の橋を形成する。通常、内皮細胞は、より大きい重合形態のＶＷＦを分泌し、分子量がより低いＶＷＦの形態は、タンパク質分解的切断から生じる。分子量がなみはずれて大きい多量体は、内皮細胞のバイベル・パラーデ小体内に貯蔵され、トロンビン及びヒスタミンなどのアゴニストにより刺激されると放出される。

ＶＷＤを患う患者には、特に大手術における長期の止血の必要性を考慮して、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）補充による治療が推奨される（ＭａｎｎｕｃｃｉＰＭａｎｄＦｒａｎｃｈｉｎｉＭ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，２０１７，２３（２）：１８２－１８７（非特許文献３）；ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ．ＮａｔｉｏｎａｌＨｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄＢｌｏｏｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ．ＴｈｅＤｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄＤｉｓｅａｓｅＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．０８－５８３２；Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００７（非特許文献４））。血漿由来ＶＷＦ治療薬は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を含有し、繰り返しの投薬によりＦＶＩＩＩが蓄積する可能性がある。ＶＯＮＶＥＮＤＩ（フォンヴィレブランド因子［組換え］、Ｓｈｉｒｅ，ＷｅｓｔｌａｋｅＶｉｌｌａｇｅ，ＣＡ）は、最初であり唯一の組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）濃縮物である（ＴｕｒｅｃｅｋＰＬ，ｅｔａｌ．Ｈａｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ．２００９；２９（ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ３２－３８（非特許文献５）、ＭａｎｎｕｃｃｉＰＭ，ｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１３；１２２（５）：６４８－６５７（非特許文献６）、ＧｉｌｌＪＣ，ｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１５；１２６（１７）：２０３８－２０４６（非特許文献７））。

ＶｅｙｒａｄｉｅｒＡ，ｅｔａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）．２０１６，９５（１１）：ｅ３０３８Ｅｉｋｅｎｂｏｏｍｅｔａｌ（１９９５）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ１，７７９０ＭａｎｎｕｃｃｉＰＭａｎｄＦｒａｎｃｈｉｎｉＭ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，２０１７，２３（２）：１８２－１８７ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ．ＮａｔｉｏｎａｌＨｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄＢｌｏｏｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ．ＴｈｅＤｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄＤｉｓｅａｓｅＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．０８－５８３２；Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００７ＴｕｒｅｃｅｋＰＬ，ｅｔａｌ．Ｈａｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ．２００９；２９（ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ３２－３８ＭａｎｎｕｃｃｉＰＭ，ｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１３；１２２（５）：６４８－６５７ＧｉｌｌＪＣ，ｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１５；１２６（１７）：２０３８－２０４６

本発明は、２０～６０ＩＵ／ｋｇの組換えフォンヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を、外科手術の１２時間～２４時間、例えば、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、１２時間～２４時間、１４時間～２４時間、１６時間～２４時間、１８時間～２４時間、または２０時間～２４時間前に、患者に投与すること、ならびに第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を外科手術の前にｒＶＷＦとともに投与しないことによる、重度のフォンヴィレブランド病を患う患者のための前処置の方法を提供する。いくつかの実施形態では、前処置の方法は、対象に、５～９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦを手術の１時間前に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記の前処置を伴ってまたは伴わずに、対象に７０～２００ＩＵのｒＶＷＦが手術の後に投与される。いくつかの場合、外科手術は、大手術、小手術、または口腔手術からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、対象に、３５～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが大外科手術の１２時間～２４時間前に投与される。他の実施形態では、対象に、１５～９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが大外科手術の１時間前に投与される。別の実施形態では、対象に、１５０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが大外科手術の後に投与される。いくつかの例では、大外科手術を受ける対象に、２２０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量が投与される。いくつかの例では、外科手術が大外科手術であるとき、前処置は、ほぼ等しい少なくとも２用量のｒＶＷＦを外科手術の前に投与することを含む。「ほぼ等しい」とは、本明細書で使用される場合、濃度が互いの１～１５％、２～１４％、３～１３％、４～１２％、５～１１％、６～１０％、７～９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％以内である用量を指す。

いくつかの実施形態では、対象に、５０～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが小外科手術の１２時間～２４時間前に投与される。他の実施形態では、対象に、５～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが小手術の１時間前に投与される。別の実施形態では、対象に、７０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが小外科手術の後に投与される。いくつかの例では、小外科手術を受ける対象に、１００～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量が投与される。いくつかの例では、外科手術が小外科手術であるとき、前処置は、外科手術の前に少なくとも２用量のｒＶＷＦを投与することを含み、第１の用量は、第２の用量より多い。

いくつかの実施形態では、対象に、２０～４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが口腔外科手術の１２時間～２４時間前に投与される。他の実施形態では、対象に、２０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが口腔外科手術の１時間前に投与される。別の実施形態では、対象に、１０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが口腔外科手術中に投与される。別の実施形態では、対象に、７０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが口腔外科手術の後に投与される。いくつかの例では、口腔外科手術を受ける対象に、７０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量が投与される。いくつかの例では、外科手術が口腔外科手術であるとき、前処置は、ほぼ等しい少なくとも２用量のｒＶＷＦを外科手術の前に投与することを含む。

本発明の他の目的、利点、及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

試験患者における全体の止血有効性（主要評価項目）を示す。試験患者における止血有効性（副次的な評価項目）を示す。ベースライン人口統計及び臨床特性を示す。ＶＷＦ：ＲＣｏのＰＫパラメータ（ｎ＝１１）を示す。図５Ａは、ＶＷＤを患う全患者（ｎ＝１１）における、ｒＶＷＦ５０±５ＩＵｒＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇに応答した、平均のＶＷＦ：ＲＣｏレベル及び内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを、ＰＫデータを分析して示す。図５Ｂは、３型ＶＷＤを患う患者のサブセット（ｎ＝５）における、ｒＶＷＦ５０±５ＩＵｒＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇに応答した、平均のＶＷＦ：ＲＣｏレベル及び内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを、ＰＫデータを分析して示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。ＶＷＦ核酸及びアミノ酸配列を示す。

発明の詳細な説明
序論
本発明は、第ＶＩＩＩ因子を外科手術の前にｒＶＷＦとともに投与することなく、組換えフォンヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を患者に４５～６０ＩＧ／ｋｇのｒＶＷＦで投与することによる、重度のフォンヴィレブランド病を患う患者の前処置を、手術の前に行うための方法を提供する。いくつかの場合、外科手術は、大手術、小手術、または口腔手術からなる群から選択される。

ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１２／１７１０３１号の開示は、すべての目的について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「（その）ｔｈｅ」は、文脈が別に指示しない限り複数の言及を含む。よって、例えば、「抗体（ａｎａｎｔｉｂｏｄｙ）」への言及は、複数のそのような抗体を含み、「宿主細胞（ａｈｏｓｔｃｅｌｌ）」への言及は、当業者に既知である１つ以上の宿主細胞及びその同等物への言及などを含む。特許請求の範囲が任意の要素を除外するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、本記載は、特許請求の範囲の要素の列挙に関して「単に」、「のみ」などの排他的な専門用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基準として役立つことが意図される。

本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。それは、言うまでもなく、そのような実施形態は変化し得るからである。本明細書に使用される専門用語は特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定するよう意図されないことも理解されたい。

「プレプロペプチドＶＷＦ」、「プレプロＶＷＦ」、または「プロＶＷＦ」は、約２２個のアミノ酸残基のシグナルペプチド、約７４１個のアミノ酸残基のＶＷＦプロペプチド、及び約２０５０個のアミノ酸残基の成熟ＶＷＦサブユニットを含む、非成熟ＶＷＦポリペプチドを指す。プロＶＷＦサブユニットは、小胞体におけるそれらのカルボキシル末端付近のジスルフィド結合をとおして二量体化して、テイル-トゥ-テイル二量体を形成し、これがその後ゴルジに輸送される。ゴルジでは、追加のヘッド-トゥ-ヘッドジスルフィド結合がサブユニットのアミノ末端付近で形成され、その結果、多量体が形成される。プロセシングプロテアーゼフューリンを介してＶＷＦプロペプチドのタンパク質分解的切断が生じることで、成熟ＶＷＦ／ＶＷＦ－ＰＰ複合体が産生される。「ｒ」がＶＷＦ名の前に含まれる場合、これは組換え版を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を対象とする。

「ＶＷＦ複合体」または「成熟ＶＷＦ／ＶＷＦ－ＰＰ複合体」という用語は、成熟ＶＷＦサブユニット及びＶＷＦプロペプチドを含む、共有結合によらずに連結したヘテロ二量体構造を指す。ＶＷＦ複合体は、プレプロペプチドＶＷＦのプロペプチド部分と成熟ＶＷＦ部分との間のフューリン切断の産物として生成され得る。「ｒ」がＶＷＦ名の前に含まれる場合、これは組換え版を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）を対象とする。本明細書で使用される場合、「ｒＶＷＦ」は、組換えＶＷＦを指す。

本明細書で使用される場合、「ｒＦＶＩＩＩ」は組換えＦＶＩＩＩを指す。

「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターを参照して使用されるとき、その細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然核酸もしくはタンパク質の改変により修飾されていること、あるいはその細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。このため、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内に見られない遺伝子を発現するか、または異常に発現された、過少発現された、もしくは全く発現されない天然の遺伝子を発現する。

本明細書で使用される場合、「組換えＶＷＦ」には、組換えＤＮＡ技術により得られたＶＷＦが含まれる。ある特定の実施形態では、本発明のＶＷＦタンパク質は、構築物、例えば、組換えＶＷＦの産生方法に関して参照により本明細書に組み込まれる、１９８６年１０月２３日に公開されたＷＯ１９８６／０６０９６、及び１９９０年７月２３日に出願された米国特許出願第０７／５５９，５０９号において行われているように調製されたものを含み得る。本発明中のＶＷＦは、単量体形態及び多量体形態を含む、あらゆる可能性のある形態を含むことができる。本発明は、組み合わせて使用されるＶＷＦの異なる形態を包含することも理解されたい。例えば、本発明のＶＷＦは、異なる多量体、異なる誘導体、ならびに生物学的に活性な誘導体及び生物学的に活性でない誘導体の両方を含んでもよい。

本発明との関連において、組換えＶＷＦは、例えば、霊長類、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、齧歯類、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコなどの哺乳動物に由来する、ＶＷＦファミリーの任意のメンバー、及びそれらの生物学的に活性な誘導体を含む。活性を有する突然変異及び変異型ＶＷＦタンパク質も含まれ、ＶＷＦタンパク質の機能的断片及び融合タンパク質も同様である。さらに、本発明のＶＷＦは、精製、検出、またはそれらの両方を促進する標識をさらに含んでもよい。本明細書に記載のＶＷＦは、さらに、治療部分、またはインビトロもしくはインビボでの撮像に好適な部分により修飾されてもよい。

本明細書で使用される場合、「血漿由来ＶＷＦ（ｐｄＶＷＦ）」には、少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子のインビボ安定化、例えば結合の特性を有する哺乳動物から得られる成熟ＶＷＦを含む、タンパク質のすべての形態が含まれる。

「極めて多量体であるＶＷＦ」または「高分子量ＶＷＦ」は、少なくとも１０サブユニット、または１２、１４、もしくは１６サブユニットから、約２０、２２、２４、２６サブユニット、またはそれ以上を含むＶＷＦを指す。「サブユニット」という用語は、ＶＷＦの単量体を指す。当該技術分野で知られているように、重合してより高次の多量体を形成するのは、通常、ＶＷＦの二量体である（ここに、全体が参照により、すべての目的について、特にＶＷＦの多量体分析に関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、Ｔｕｒｅｃｅｋｅｔａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２０１０，３６（５）：５１０－５２１を参照されたい）。

本明細書で使用される場合、「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」は、患者にとって内因性であるか、血漿に由来するか、または組換えＤＮＡ技法の使用により産生されるかにかかわらず、第ＶＩＩＩ因子のすべての修飾形態を含めて、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の典型的な特徴を有する任意の形態の第ＶＩＩＩ因子分子を指す。第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、単一遺伝子産物から生じるポリペプチドの不均一な分布として、天然に及び治療用調製物に存在する（例えば、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：２９７９－２９８３（１９８６）を参照されたい）。第ＶＩＩＩ因子を含有する治療調製物の市販の例には、ＨＥＭＯＦＩＬＭ、ＡＤＶＡＴＥ、及びＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（ＢａｘｔｅｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能）の商品名で販売されているものが含まれる。

本明細書で使用される場合、「血漿ＦＶＩＩＩ活性」及び「インビボＦＶＩＩＩ活性」は同義に使用される。標準的なアッセイを使用して測定されるインビボＦＶＩＩＩ活性は、内因性ＦＶＩＩＩ活性であっても、治療用に投与されたＦＶＩＩＩ（組換えまたは血漿由来）の活性であってもよく、あるいは内因性ＦＶＩＩＩ活性及び投与されたＦＶＩＩＩ活性の両方であってもよい。同様に、「血漿ＦＶＩＩＩ」は、内因性ＦＶＩＩＩまたは投与された組換えもしくは血漿由来ＦＶＩＩＩを指す。

本明細書で使用される場合、「フォンヴィレブランド病」は、フォンヴィレブランド因子の欠損により引き起こされる疾患の群を指す。フォンヴィレブランド因子は、血小板が一緒に凝集し、血管壁に張り付くのを助け、これは正常な血液凝固に必要なものである。本明細書でさらに詳述されるように、フォンヴィレブランド病の型はいくつか存在し、これには、１型、２Ａ型、２Ｂ型、２Ｍ型、及び３型が含まれる。

「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、天然の状態で見られる場合に通常付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミド電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使用して決定される。ＶＷＦは、調製物に存在する優勢種であり、実質的に精製される。「精製された」という用語は、一部の実施形態では、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中で本質的に１つのバンドを生むことを示す。他の実施形態では、これは、核酸またはタンパク質が、少なくとも５０％純粋より好ましくは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上純粋であることを意味する。「精製する」または「精製」は、他の実施形態では、少なくとも１つの汚染物質を、精製される組成物から除去することを意味する。この意味では、精製は、精製された化合物が、均一、例えば１００％純粋であることを必ずしも求めない。

本明細書で使用される場合、「投与」（及びすべての文法上の相当語）には、対象への、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、坐薬としての投与、局所接触、腹腔内、病巣内、もしくは鼻腔内投与、または徐放性デバイス、例えば小型浸透圧ポンプの埋め込みが含まれる。投与は、非経口経路及び経粘膜経路（例えば、口腔内経路、鼻腔内経路、膣内経路、直腸内経路、または経皮経路）を含む任意の経路によるものである。非経口投与には、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与、及び頭蓋内投与が含まれる。他の送達様式には、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれるが、これらに限定されない。

「治療有効量または用量」または「治療に十分な量または用量」または「有効なまたは十分な量または用量」という用語は、投与目的である治療効果を生む用量を指す。例えば、血友病の治療に有用な薬物の治療有効量は、血友病に伴う１つ以上の症状を予防または緩和することができる量であり得る。正確な用量は、治療目的に左右され、当業者により、既知の技法を使用して確認されることになる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，ＴｈｅＡｒｔ，ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、Ｐｉｃｋａｒ，ＤｏｓａｇｅＣａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。

本明細書で使用される場合、「患者」及び「対象」という用語は、同義に使用され、疾患を有するかまたは疾患に罹患する可能性を有する哺乳動物（好ましくはヒト）を指す。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、指定された値の±１０％のおよその範囲を示す。例えば、「約２０％」という言葉は、１８～２２％の範囲を包含する。

本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、崩壊している物質の量（または試料または患者からのクリアランス）が半分に減少するまでにかかる期間を指す。

Ｉ．組換えフォンヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）
本発明は、外科手術、例えば非限定的に、大手術、小手術、または口腔手術を受ける、重度のＶＷＤを患う対象の前処置のために、フォンヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含む組成物を利用する。

ある特定の実施形態では、本発明のＶＷＦタンパク質は、構築物、例えば、組換えＶＷＦの産生方法に関して参照により本明細書に組み込まれる、１９８６年１０月２３日に公開されたＷＯ１９８６／０６０９６、及び１９９０年７月２３日に出願された米国特許出願第０７／５５９，５０９号において行われているように調製されたものを含んでもよい。本発明に有用なＶＷＦは、単量体及び多量体形態を含めて、あらゆる可能性のある形態を含む。１つの特に有用なＶＷＦの形態は、少なくとも２つのＶＷＦのホモ多量体である。ＶＷＦタンパク質は、生物学的に活性な誘導体であってもよく、あるいはＦＶＩＩＩのための安定化剤としてのみ使用される場合、ＶＷＦは、生物学的に活性でない形態であってもよい。本発明は、組み合わせて使用されるＶＷＦの異なる形態を包含することも理解されたい。例えば、本発明に有用な組成物は、異なる多量体、異なる誘導体、ならびに生物学的に活性な誘導体及び生物学的に活性でない誘導体の両方を含んでもよい。

一次止血において、ＶＷＦは、血小板と、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの特定の成分との間の橋として働く。このプロセスにおけるＶＷＦの生物活性は、種々のインビトロアッセイによって測定することができる（Ｔｕｒｅｃｅｋｅｔａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２８：１４９－１６０，２００２）。リストセチン補因子アッセイは、ＶＷＦの存在下で抗生物質リストセチンにより誘導される新鮮なまたはホルマリン固定した血小板の凝集に基づく。

血小板凝集の程度は、ＶＷＦ濃度に依存し、比濁法により、例えば、血小板凝集計の使用により測定することができる（Ｗｅｉｓｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２７０８－２７１６，１９７３、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅｅｔａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．３４：３０６－３０８，１９７５）。第２の方法は、ＥＬＩＳＡ技術に基づくコラーゲン結合アッセイである（ＢｒｏｗｎｅｔＢｏｓａｋ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．４３：３０３－３１１，１９８６、Ｆａｖａｌｏｒｏ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８３：１２７－１３５，２０００）。マイクロタイタープレートをＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンでコーティングする。次に、ＶＷＦをコラーゲン表面に結合させ、続いて酵素標識したポリクローナル抗体を用いて検出する。最後のステップは基質反応であり、これは、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて測光法によりモニタリングできる。本明細書で提供されるように、本発明のＶＷＦの特異的リストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）は、概して、インビトロアッセイを使用して測定したＶＷＦのｍＵ／μｇを単位として記載される。

ｐｄＶＷＦと比べた本発明のｒＶＷＦ組成物の利点は、ｒＶＷＦがｐｄＶＷＦよりも高い比活性を呈することである。いくつかの実施形態では、本発明のｒＶＷＦは、比活性が、少なくとも約２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３２．５、３５、３７．５、４０、４２．５、４５、４７．５、５０、５２．５、５５、５７．５、６０、６２．５、６５、６７．５、７０、７２．５、７５、７７．５、８０、８２．５、８５、８７．５、９０、９２．５、９５、９７．５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０ｍＵ／μｇ、またはそれ以上である。

本発明のｒＶＷＦは、約１０～約４０のサブユニットを含んで、極めて多量体である。さらなる実施形態では、本発明の方法を使用して産生された多量体ｒＶＷＦは、約１０～３０、１２～２８、１４～２６、１６～２４、１８～２２、２０～２１のサブユニットを含む。さらなる実施形態では、ｒＶＷＦは、二量体から、４０を超えるサブユニットの多量体（１０００万ダルトン超）の多量体まで、様々なサイズの多量体で存在する。最も大きい多量体は、血小板受容体と傷害部の内皮下マトリックス部位との両方と相互作用することができる複数の結合部位を提供し、最も止血活性があるＶＷＦの形態である。ＡＤＡＭＴＳ１３の適用により、超大型のｒＶＷＦ多量体は経時的に切断されるが、産生中（一般に細胞培養における発現による）、本発明のｒＶＷＦ組成物は、概してＡＤＡＭＴＳ１３に曝露せず、その極めて多量体である構造を保持する。

一実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるｒＶＷＦ組成物は、オリゴマーの９５％が６サブユニット～２０サブユニットを有することを特徴とするｒＶＷＦオリゴマーの分布を有する。他の実施形態では、ｒＶＷＦ組成物は、オリゴマーの９５％が、すべての目的について全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２／１７１０３１号の表２に見られる変種４５８～６４１から選択されるサブユニットの範囲を有することを特徴とする、ｒＶＷＦオリゴマーの分布を有する。

一実施形態では、ｒＶＷＦ組成物は、特定のより高次のｒＶＷＦ多量体またはより大きい多量体で存在するｒＶＷＦ分子の割合（％）に従って特徴付けることができる。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるｒＶＷＦ組成物中のｒＶＷＦ分子の少なくとも２０％が、少なくとも１０サブユニットのオリゴマー複合体で存在する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるｒＶＷＦ組成物中のｒＶＷＦ分子の少なくとも２０％が、少なくとも１２サブユニットのオリゴマー複合体で存在する。さらに他の実施形態では、本明細書で提供される方法で使用されるｒＶＷＦ組成物は、すべての目的について全体が参照により本明細書に組み込まれる表３～表５に見られる変種１３４～４５７のうちのいずれか１つに従い、特定のより高次のｒＶＷＦ多量体またはより大きい多量体（例えば、少なくともＹサブユニットの多量体）で存在するｒＶＷＦ分子を最低限の割合（％）で有する（例えば、少なくともＸ％を有する）。

上記に従って、対象に投与されるｒＶＷＦ組成物（ＦＶＩＩＩの有無にかかわらず）は、一般に、高分子量（ＨＭＷ）ｒＶＷＦ多量体をかなりの割合（％）で含む。さらなる実施形態では、ＨＭＷｒＶＷＦ多量体組成物は、少なくとも１０％～８０％のｒＶＷＦ十量体またはより高次の多量体を含む。さらなる実施形態では、組成物は、約１０～９５％、２０～９０％、３０～８５％、４０～８０％、５０～７５％、６０～７０％の十量体またはより高次の多量体を含む。さらなる実施形態では、ＨＭＷｒＶＷＦ多量体組成物は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の十量体またはより高次の多量体を含む。

ｒＶＷＦ多量体の数及び割合（％）の評定は、電気泳動を使用する方法、及びＶＷＦ多量体をサイズにより分離するサイズ排除クロマトグラフィー法が含まれるがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の方法を使用して実施することができ、これは、例えばＣｕｍｍｉｎｇらによって考察されているとおりである（全体が参照により、すべての目的について、特にＶＷＦ多量体の評定に関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、ＪＣｌｉｎＰａｔｈｏｌ．１９９３Ｍａｙ；４６（５）：４７０－４７３）。そのような教示は、ＶＷＦに対する放射性標識された抗体を用いてゲルを免疫ブロットした後に化学発光を検出する免疫ブロット技法（ウエスタンブロットなど）をさらに含んでもよい（例えば、全体が参照により、すべての目的について、特にＶＷＦ多量体の評定に関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、Ｗｅｎｅｔａｌ．，（１９９３），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．，７：３１７－３２３を参照されたい）。ＶＷＦのさらなるアッセイには、ＶＷＦ：抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦ：リストセチン補因子（ＶＷＦ：ＲＣｏｆ）、及びＶＷＦ：コラーゲン結合活性アッセイ（ＶＷＦ：ＣＢＡ）が含まれ、これらはフォンヴィレブランド病の診断及び分類に使用されることが多い。（例えば、全体が参照により、すべての目的について、特にＶＷＦのアッセイに関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、Ｆａｖａｌｏｒｏｅｔａｌ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９７，２９（４）：３４１－４５６を参照されたい）。

さらなる実施形態では、本発明のより高次のｒＶＷＦ多量体は、投与から約１～約９０時間の間、安定である。なおさらなる実施形態では、より高次のｒＶＷＦ多量体は、投与から約５～８０、１０～７０、１５～６０、２０～５０、２５～４０、３０～３５時間の間、安定である。またさらなる実施形態では、より高次のｒＶＷＦ多量体は、投与から少なくとも３、６、１２、１８、２４、３６、４８、７２時間の間、安定である。ある特定の実施形態では、ｒＶＷＦ多量体の安定性は、インビトロで評定される。

一実施形態では、本明細書で提供される組成物及び方法で使用されるより高次のｒＶＷＦ多量体は、半減期が投与から少なくとも１２時間である。別の実施形態では、より高次のｒＶＷＦ多量体は、半減期が投与から少なくとも２４時間である。さらに他の実施形態では、より高次のｒＶＷＦ多量体は、半減期が、すべての目的について全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２／１７１０３１号の表６に見られる変種６４２～１０４５から選択される。

特定の態様において、本発明に従い使用されるｒＶＷＦ（組換えまたは血漿由来）は、いずれのコンジュゲーション、翻訳後または共有結合修飾によっても修飾されない。特定の実施形態では、本発明のｒＶＷＦは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリシアル酸、ヒドロキシルエチルデンプン、ポリ炭水化物部分などを非限定的に含む水溶性重合体によって修飾されない。

他の態様において、本発明に従い使用されるｒＶＷＦ（組換えまたは血漿由来）は、ＮまたはＣ末端残基の修飾と、例えば、遊離スルフヒドリル基、一級アミン、及びヒドロキシル基での選択された側鎖の修飾とを含む、コンジュゲーション、翻訳後修飾、または共有結合修飾をとおして修飾される。一実施形態では、水溶性重合体は、リジン基または他の一級アミンによりタンパク質に（直接、またはリンカーを介して）連結する。一実施形態では、本発明のｒＶＷＦタンパク質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリシアル酸、ヒドロキシルエチルデンプン、ポリ炭水化物部分などを非限定的に含む水溶性重合体のコンジュゲーションによって修飾されてもよい。

ｒＶＷＦ及び／またはＦＶＩＩＩの修飾に使用され得る水溶性重合体は、直線状または分岐構造が含まれる。コンジュゲートされた重合体は、本発明の凝固タンパク質に直接結合してもよく、あるいは代替的に連結部分をとおして結合してもよい。水溶性重合体とのタンパク質コンジュゲーションの非限定的な例は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、及び同第４，１７９，３３７号、ならびにＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉａｎｄＤａｖｉｓ”ＥｎｚｙｍｅｓａｓＤｒｕｇｓ，”ＨｏｌｃｅｎｂｅｒｇａｎｄＲｏｂｅｒｔｓ，Ｅｄｓ．，ｐｐ．３６７３８３，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８１）、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎＧ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２ｎｄＥｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．２００８に見ることができる。

タンパク質コンジュゲーションは、当該技術分野において周知のいくつかの技法により行われてもよく、例えば、ＨｅｒｍａｎｓｏｎＧ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２ｎｄＥｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．２００８を参照されたい。例には、凝固タンパク質または水溶性重合体部分のいずれかの一方にあるカルボキシル基ともう一方のアミン基との間のペプチド結合、または一方のカルボキシル基ともう一方のヒドロキシル基との間のエステル連結をとおした連結が含まれる。本発明の凝固タンパク質が水溶性重合体化合物にコンジュゲートされ得る別の連結は、過ヨウ素酸酸化による重合体の非還元末端に形成されたアルデヒド基と反応する重合体部分上の遊離アミノ基間の、シッフ塩基を介したものである（ＪｅｎｎｉｎｇｓａｎｄＬｕｇｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８１；１２７：１０１１－８、ＦｅｍａｎｄｅｓａｎｄＧｒｅｇｏｎｒａｄｉｓ，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ．１９９７；１３４１；２６－３４）。生成されたシッフ塩基を、ＮａＣＮＢＨ_３を用いた特異的還元により安定させて、二級アミンを形成することができる。代替的な手法は、先立つ酸化後にＮＨ_４Ｃｌｌを用いて還元的アミノ化を行うことによる重合体上の末端遊離アミノ基の生成である。２つのアミノ基または２つのヒドロキシル基を連結させるために、二機能性試薬を使用することができる。例えば、アミノ基を含有する重合体をＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩／Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）のような試薬を用いて、凝固タンパク質のアミノ基にカップリングすることができる。加えて、Ｓｕｌｆｏ－ＥＭＣＳ（Ｎ－ε－マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル／Ｐｉｅｒｃｅ）のようなヘテロ二機能性架橋試薬を使用して、例えば、アミン基及びチオール基を連結させることができる。他の実施形態では、アルデヒド反応基、例えば、ＰＥＧアルコキシドとブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール、ＰＥＧとＤＭＳＯ及び無水酢酸、ならびにＰＥ．Ｇ塩化物と４－ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、スクシンイミジル活性エステル、活性化ジチオ炭酸ＰＥ．Ｇ、２，４，５－トリクロロフェニルクロロギ酸、及びＰ－ニトロフェニルクロロギ酸活性化ＰＥＧを、凝固タンパク質のコンジュゲーションに使用してもよい。

いくつかの態様において、本発明の方法で使用されるｒＶＷＦは、フューリンを用いてインビトロで成熟させたものである。さらなる実施形態では、フューリンは組換えフューリンである。

さらなる態様において、本発明の方法で使用されるｒＶＷＦは、当該技術分野で既知の方法を使用して、哺乳動物細胞培養物中の発現により産生される。特定の実施形態では、哺乳動物培養物はＣＨＯ細胞を含む。例示的な実施形態では、本発明のｒＶＷＦは、ＣＨＯ細胞発現系から単離されたｒＶＷＦタンパク質を含む。さらなる実施形態では、プロペプチド除去は、プロＶＷＦのフューリンへの曝露をとおしてインビトロで媒介され、なおさらなる実施形態では、プロペプチド除去に使用されるフューリンは組換えフューリンである。またさらなる実施形態では、完全グリコシル化／ＡＢＯ血液型グリカンは存在しない。

またさらなる実施形態では、好適な真核生物宿主系中の発現による本発明の方法及び組成物で使用されるｒＶＷＦ。真核生物細胞の例には、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ－Ｈｅｐ、及びＨｅｐＧ２などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｓ２細胞、及びＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞、ならびに酵母細胞、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＶＷＦは、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞などにおいて発現させることができる。例えば、ヒト細胞株、ハムスター細胞株、またはマウス細胞株中である。ひとつの特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ細胞株である。典型的には、哺乳動物細胞、例えば、連続細胞株由来のＣＨＯ細胞を使用して、本発明のＶＷＦを発現させることができる。

ある特定の実施形態では、ＶＷＦをコードする配列を含む核酸配列は、ベクターであり得る。ベクターは、ウイルスによって送達され得るか、またはプラスミドであり得る。タンパク質をコードする核酸配列は、特定の遺伝子またはその生物学的に機能的な部分であり得る。一実施形態では、タンパク質は、少なくとも、ＶＷＦの生物学的に活性な部分である。多種多様なベクターをＶＷＦの発現に使用することができ、これらは真核生物発現ベクターから選択され得る。真核生物発現のためのベクターの例としては、（ｉ）酵母中の発現には、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などといったプロモーターを使用する、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなどのベクター、（ｉｉ）昆虫細胞中の発現には、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどといったプロモーターを使用する、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどといったベクター、ならびに（ｉｉｉ）哺乳動物細胞中の発現には、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、及びβ－アクチンなどのプロモーターを使用する、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどといったベクター、及びワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどといったウイルス系に由来するベクターが挙げられる。

本発明のいくつかの実施形態では、核酸配列は、タンパク質の制御された発現に好適な他の配列、例えば、プロモーター配列、エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位、ポリリンカー、制限部位、ポリＡ配列、タンパク質プロセシング配列、選択マーカー、及び当業者には一般に既知である同様のものをさらに含む。

ある特定の実施形態では、本発明の細胞培養方法には、微小担体の使用が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、実施形態の細胞培養は、高い細胞密度及びタンパク質発現を達成するための大量特化細胞表面積に好適な条件下、大型バイオリアクター中で行うことができる。そのような成長条件をもたらすためのひとつの手段は、撹拌槽型バイオリアクター中の細胞培養に微小担体を使用することである。微小担体上の細胞成長の概念は、ｖａｎＷｅｚｅｌによって最初に説明され（ｖａｎＷｅｚｅｌ，Ａ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２１６：６４－５（１９６７））、細胞が、成長培地中に懸濁した小型の固体粒子の表面に付着することを可能にするものである。これらの方法により、高い表面積対体積率が得られ、その結果、効率的な養分利用が可能となる。さらに、真核生物細胞株中の分泌タンパク質の発現に対しては、表面積対体積率の増加により、分泌レベルがより高くなり、その結果、培養物の上清中のタンパク質収率がより高くなる。最後に、これらの方法により、真核生物発現培養の大規模化が容易になる。

ＶＷＦを発現する細胞は、細胞培養物の成長中に、球形または多孔質微小担体に結合し得る。微小担体は、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチン、及びセルロースに基づく微小担体、ならびにＢｕｔｌｅｒ（１９８８．Ｉｎ：Ｓｐｉｅｒ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２８３－３０３）。細胞を球形微小担体上のバイオマスに成長させ、細胞が最終発酵槽バイオマスに達したとき、かつ多孔質微小担体上で発現するタンパク質の産生の前に、細胞を継代培養すること（逆もまた同様）も可能である。好適な球形微小担体には、滑面微小担体、例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）１、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）２、及びＣｙｔｏｄｅ（商標）３（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ならびにマクロ多孔質微小担体、例えば、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商標）１、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商標）２、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（商標）１、及びＣｙｔｏｌｉｎｅ（商標）２（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）が含まれ得る。

ある特定の実施形態では、ｒＶＷＦは、高分子量ｒＶＷＦを産生する細胞培地で培養された細胞中で発現される。「細胞培養溶液」、「細胞培地（単数または複数）」、及び「細胞培養上清」という用語は、当該技術分野で一般に周知である細胞培養プロセスの態様を指す。本発明との関連において、細胞培養溶液には、細胞培地及び細胞培養上清が含まれ得る。細胞培地は、任意選択でサプリメントと一緒に細胞培養溶液に外部から添加され、ＶＷＦを発現する細胞の培養のための養分及び他の成分を提供する。細胞培養上清は、細胞培地からの養分及び他の成分、ならびに培養中に細胞から放出、代謝、及び／または分泌された産物を含む、細胞培養溶液を指す。さらなる実施形態では、培地は、動物性タンパク質を含まず、化学的に定義されたものであり得る。動物性タンパク質を含まず、化学的に定義された培地を調製する方法は、当該技術分野、例えば、ともに、すべての目的について、特に細胞培地に関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、米国第２００８／０００９０４０号及び米国第２００７／０２１２７７０号において既知である。「タンパク質を含まない」及び関連用語は、成長中にタンパク質を自然に落とす、培養中の細胞に対して外来であるかまたは培養中の細胞以外の源に由来するタンパク質を指す。別の実施形態では、培地はポリペプチドを含まない。別の実施形態では、培地は血清を含まない。別の実施形態では、培地は動物性タンパク質を含まない。別の実施形態では、培地は動物性成分を含まない。別の実施形態では、培地は、タンパク質、例えば、ウシ胎仔血清などの血清由来の動物性タンパク質を含有する。別の実施形態では、培地には、組換えタンパク質が外から添加される。別の実施形態では、タンパク質は、認定されている病原体を含まない動物に由来する。「化学的に定義された」という用語は、本明細書で使用される場合、培地が、例えば、動物性成分、臓器、腺、植物、または酵母の抽出物などの定義されていない、いかなるサプリメントも含まないことを意味するものとする。したがって、化学的に定義された培地の各成分は、正確に定義される。好ましい実施形態では、培地は、動物性成分を含まず、かつタンパク質を含まない。

さらなる実施形態では、哺乳動物細胞培養からの精製の後で、ｒＦＶＩＩＩは、投与前に再構成される。なおさらなる実施形態では、ｒＶＷＦは、再構成の前または後にフューリンで処理される。さらなる実施形態では、フューリンは組換えフューリンである。なおさらなる実施形態では、本発明のｒＶＷＦは、ＡＤＡＭＴＳ１３に曝露されず、その結果、超大型（即ち、１０以上のサブユニットを含む）が本発明のｒＶＷＦ組成物に存在するようになる。

特定の態様において、本発明の方法で使用されるｒＶＷＦは、緩衝液、糖、及び／または糖アルコール（トレハロース及びマンニトールを非限定的に含む）、安定化剤（グリシンなど）、及び界面活性剤（ポリソルベート８０など）を含有する製剤に含まれる。さらなる実施形態では、ｒＦＶＩＩＩを含有する製剤について、製剤は、ナトリウム、ヒスチジン、カルシウム、及びグルタチオンをさらに含んでもよい。

一態様において、ｒＶＷＦを含む製剤は、投与前に凍結乾燥される。凍結乾燥は、当該技術分野で一般的な技法を使用して行われ、開発される組成物に対して最適化されるべきである（Ｔａｎｇｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．２１：１９１－２００．（２００４）、及びＣｈａｎｇｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．１３：２４３－９（１９９６）］。

薬学的製剤を調製する方法には、次のステップのうちの１つ以上が含まれ得る：凍結乾燥の前に本明細書に記載の安定化剤を該混合物に添加するステップ、凍結乾燥の前に、各々本明細書に記載されている、増量剤、浸透圧調節剤、及び界面活性剤から選択される少なくとも１つの薬剤を該混合物に添加するステップ。凍結乾燥した製剤は、一態様では、少なくとも、緩衝液、増量剤、及び安定化剤のうちの１つ以上で構成される。この態様において、界面活性剤の利用は、凍結乾燥ステップ中または再構成中の凝集が問題となる場合に、評価及び選択される。適切な緩衝剤を含めて、凍結乾燥中、製剤をｐＨの安定領域に維持する。

凍結乾燥した物質の標準的な再構成の実施は、ある量の純水または注射用滅菌水（ＷＦＩ）（典型的には、凍結乾燥中に除去した体積に等しい）を戻し入れることであるが、非経口投与用医薬品の製造には抗生物質の希釈溶液が使用される場合がある［Ｃｈｅｎ，ＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＰｈａｒｍａｃｙ，１８：１３１１－１３５４（１９９２）］。したがって、本発明の凍結乾燥した組換えＶＷＦ組成物に希釈液を添加するステップを含む、再構成された組換えＶＷＦ組成物を調製するための方法が提供される。

凍結乾燥した物質は、水溶液として再構成されてもよい。様々な水性担体、例えば、注射用滅菌水、複数回投与用途のための保存剤を含む水、または適量の界面活性剤を含む水（例えば、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性化合物を含有する水性懸濁液）。様々な態様において、そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、非限定的に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、及びアカシアガムであり、分散または湿潤剤は、自然発生のホスファチド、例えば、非限定的に、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えば、非限定的に、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えば、非限定的に、ヘプタデカエチレン－オキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの、エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物、例えば、非限定的に、ポリエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルである。様々な態様において、水性懸濁液は、１つ以上の保存剤、例えば、非限定的に、エチル、またはｎ－プロピル、ｐ－ヒドロキシ安息香酸も含有する。

ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、シリンジまたは他の貯蔵容器の使用を伴う投与のための液体製剤である。さらなる実施形態では、これらの液体製剤は、水溶液として再構成される本明細書に記載の凍結乾燥した物質から製造される。

さらなる態様において、本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含む。「薬学的に」または「薬理学的に」許容されるという表現は、以下に記載のように、安定であり、凝集及び切断産物などタンパク質分解を阻害し、加えて、当該技術分野で周知の経路を使用して投与されるときにアレルギー反応または他の有害反応を生むことがない分子実体及び組成物を指す。「薬学的に許容される担体」には、上で開示された薬剤を含めて、ありとあらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌薬剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。

ＩＩ．組換えＶＷＦの産生
本発明の遊離成熟組換えフォンヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）は、組換えによって産生させることができる。当業者には、組換えタンパク質を宿主細胞中で発現させるための有用な方法が認識される。いくつかの例では、本方法には、ｒＶＷＦをコードする核酸配列をＣＨＯ細胞などの宿主細胞中で発現させること、及び得られた宿主細胞をある特定の条件下で培養して、ｒＶＷＦ、プレプロＶＷＦ、プロＶＷＦなどを産生させることが含まれる。

ある特定の実施形態では、ＶＷＦをコードする配列を含む核酸配列は、発現ベクターであり得る。ベクターは、ウイルスによって送達され得るか、またはプラスミドであり得る。タンパク質をコードする核酸配列は、特定の遺伝子またはその生物学的に機能的な部分であり得る。一実施形態では、タンパク質は、少なくとも、ＶＷＦの生物学的に活性な部分である。核酸配列は、タンパク質の制御された発現に好適な他の配列、例えば、プロモーター配列、エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位、ポリリンカー、制限部位、ポリＡ配列、タンパク質プロセシング配列、選択マーカー、及び当業者には一般に既知である同様のものをさらに含み得る。

多種多様なベクターをＶＷＦの発現に使用することができ、これらは真核生物発現ベクターから選択され得る。真核生物発現のためのベクターの例としては、（ｉ）酵母中の発現には、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などといったプロモーターを使用する、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなどのベクター、（ｉｉ）昆虫細胞中の発現には、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどといったプロモーターを使用する、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどといったベクター、ならびに（ｉｉｉ）哺乳動物細胞中の発現には、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、及びβ－アクチンなどのプロモーターを使用する、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどといったベクター、及びワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどといったウイルス系に由来するベクターが挙げられる。

さらなる態様において、本発明の方法で使用されるｒＶＷＦは、当該技術分野で既知の方法を使用して、哺乳動物細胞培養物中の発現により産生される。特定の実施形態では、哺乳動物培養物はＣＨＯ細胞を含む。さらなる実施形態では、ｒＶＷＦは、同じ培養中で組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）と同時発現される。そのような実施形態では、ｒＶＷＦ及びｒＦＶＩＩＩは、当該技術分野で既知の方法を使用して、一緒に精製（同時精製）されるかまたは別々に精製される。他の実施形態では、ｒＶＷＦは、ｒＦＶＩＩＩを含有しない培養中で発現される。

いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、好適な真核生物宿主系から発現及び単離される。真核生物細胞の例には、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ－Ｈｅｐ、及びＨｅｐＧ２などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｓ２細胞、及びＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞、ならびに酵母細胞、例えば、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセス細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＶＷＦは、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞などにおいて発現させることができる。例えば、ヒト細胞株、ハムスター細胞株、またはマウス細胞株中である。ひとつの特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ細胞株である。典型的には、哺乳動物細胞、例えば、連続細胞株由来のＣＨＯ細胞を使用して、本発明のＶＷＦを発現させることができる。ある特定の場合、ＶＷＦタンパク質は、ＣＨＯ細胞発現系から発現及び単離される。

ＶＷＦは、細胞培養系中で、または当該技術分野で認識されている任意の細胞培養法に従って産生させることができる。いくつかの実施形態では、細胞培養は、高い細胞密度及びタンパク質発現を達成するための大量特化細胞表面積に好適な条件下、大型バイオリアクター中で行うことができる。そのような成長条件をもたらすためのひとつの手段は、撹拌槽型バイオリアクター中の細胞培養に微小担体を使用することである。微小担体上の細胞成長の概念は、ｖａｎＷｅｚｅｌによって最初に説明され（ｖａｎＷｅｚｅｌ，Ａ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９６７，２１６：６４－５）、細胞が、成長培地中に懸濁した小型の固体粒子の表面に付着することを可能にするものである。これらの方法により、高い表面積対体積率が得られ、その結果、効率的な養分利用が可能となる。さらに、真核生物細胞株中の分泌タンパク質の発現に対しては、表面積対体積率の増加により、分泌レベルがより高くなり、その結果、培養物の上清中のタンパク質収率がより高くなる。最後に、これらの方法により、真核生物発現培養の大規模化が容易になる。

さらなる実施形態では、ＶＷＦプロペプチドは、プロＶＷＦのフューリンへの曝露をとおしてインビトロで非成熟ＶＷＦから切断される。いくつかの実施形態では、プロペプチド切断に使用されるフューリンは、組換えフューリンである。

ある特定の実施形態では、ｒＶＷＦは、高分子量ｒＶＷＦを産生する細胞培地で培養された細胞中で発現される。「細胞培養溶液」、「細胞培地（単数または複数）」、及び「細胞培養上清」という用語は、当該技術分野で一般に周知である細胞培養プロセスの態様を指す。本発明との関連において、細胞培養溶液には、細胞培地及び細胞培養上清が含まれ得る。細胞培地は、任意選択でサプリメントと一緒に細胞培養溶液に外部から添加され、ＶＷＦを発現する細胞の培養のための養分及び他の成分を提供する。細胞培養上清は、細胞培地からの養分及び他の成分、ならびに培養中に細胞から放出、代謝、及び／または分泌された産物を含む、細胞培養溶液を指す。さらなる実施形態では、培地は、動物性タンパク質を含まず、化学的に定義されたものであり得る。動物性タンパク質を含まず、化学的に定義された培地を調製する方法は、当該技術分野、例えば、ともに、すべての目的について、特に細胞培地に関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、米国第２００６／００９４１０４号、米国第２００７／０２１２７７０号、及び米国第２００８／０００９０４０号において既知である。「タンパク質を含まない」及び関連用語は、成長中にタンパク質を自然に落とす、培養中の細胞に対して外来であるかまたは培養中の細胞以外の源に由来するタンパク質を指す。別の実施形態では、培地はポリペプチドを含まない。別の実施形態では、培地は血清を含まない。別の実施形態では、培地は動物性タンパク質を含まない。別の実施形態では、培地は動物性成分を含まない。別の実施形態では、培地は、タンパク質、例えば、ウシ胎仔血清などの血清由来の動物性タンパク質を含有する。別の実施形態では、培地には、組換えタンパク質が外から添加される。別の実施形態では、タンパク質は、認定されている病原体を含まない動物に由来する。「化学的に定義された」という用語は、本明細書で使用される場合、培地が、例えば、動物性成分、臓器、腺、植物、または酵母の抽出物などの定義されていない、いかなるサプリメントも含まないことを意味するものとする。したがって、化学的に定義された培地の各成分は、正確に定義される。好ましい実施形態では、培地は、動物性成分を含まず、かつタンパク質を含まない。

ある特定の実施形態では、ＶＷＦを発現する細胞の培養は、少なくとも約７日、もしくは少なくとも約１４日、２１日、２８日、または少なくとも約５週、６週、７週、または少なくとも約２か月、もしくは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８か月、またはそれ以上の間、維持され得る。組換えＶＷＦタンパク質の産生のために細胞培養が維持される細胞密度は、タンパク質発現に使用される培養条件及び培地に依存することになる。当業者であれば、ＶＷＦを産生する細胞培養のための最適な細胞密度を容易に決定することができるであろう。一実施形態では、培養は、約０．５×１０^６～４×１０^７細胞／ｍｌの細胞密度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約１．０×１０^６～約１．０×１０^７細胞／ｍｌの濃度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約１．０×１０^６～約４．０×１０^６細胞／ｍｌの濃度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約１．０×１０^６～約４．０×１０^６細胞／ｍｌの濃度で長期間維持される。さらに他の実施形態では、細胞密度は、約２．０×１０^６～約４．０×１０^６、または約１．０×１０^６～約２．５×１０^６、または約１．５×１０^６～約３．５×１０^６、または任意の他の類似した範囲の濃度で長期間維持されてもよい。細胞培養中で適切な時間が経過した後、ｒＶＷＦは、当該技術分野で既知の方法を使用して発現系から単離され得る。

特定の実施形態では、ｒＶＷＦを産生させるための連続細胞培養の細胞密度は、２．５×１０^６細胞／ｍｌを超えない濃度で長期間維持される。他の特定の実施形態では、細胞密度は、２．０×１０^６細胞／ｍｌ、１．５×１０^６細胞／ｍｌ、１．０×１０^６細胞／ｍｌ、０．５×１０^６細胞／ｍｌ、またはそれ以下を超えない濃度で維持される。一実施形態では、細胞密度は、１．５×１０^６細胞／ｍｌ～２．５×１０^６細胞／ｍｌで維持される。

上記の細胞培養のひとつの実施形態では、細胞培養溶液は、銅を含む培地サプリメントを含む。そのような細胞培養溶液は、例えば、全体が参照により、すべての目的について、特に組換えＶＷＦの産生のための細胞培養方法及び組成物に関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８５２，８８８号、及び米国特許第９，４０９，９７１号に記載されている。

プレプロＶＷＦのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示され、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５５２（ホモサピエンスフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）ｍＲＮＡ）及びＮＰ＿０００５４３で入手可能である。成熟ＶＷＦタンパク質に対応するアミノ酸配列は、配列番号３（全長プレプロＶＷＦアミノ酸配列のアミノ酸配列７６４～２８１３に対応する）に示される。いくつかの実施形態では、ＶＷＦは、配列番号３の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％の同一性を呈する。いくつかの実施形態では、本発明のｒＶＷＦは、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を呈する。例えば、米国特許第８，５９７，９１０号、米国特許公開第２０１６／０１２９０９０号、及び図６を参照されたい。

有用なｒＶＷＦの一形態は、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子のインビボ安定化、例えば結合の特性を少なくとも有し、任意選択で薬理学的に許容されるグリコシル化パターンを有する。その特定の例には、Ａ２ドメインを含まないためにタンパク質分解に耐性であるＶＷＦ（Ｌａｎｋｈｏｆｅｔａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１００８－１０１３，１９９７）と、糖タンパク質ｌｂ結合ドメインならびにコラーゲン及びヘパリンのための結合部位を含む、Ｖａｌ４４９～Ａｓｎ７３０由来のＶＷＦ断片（Ｐｉｅｔｕｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４：１３３９－１３４７，１９８９）。ＶＷＦが少なくとも１つのＦＶＩＩＩ分子を安定化する能力の決定は、一態様において、当該技術分野で既知の方法に従い、ＶＷＦ欠損哺乳動物中で行われる。

本発明のｒＶＷＦは、当該技術分野で既知の任意の方法により産生させることができる。ひとつの特定の例は、組換えＶＷＦの産生方法に関して参照により本明細書に組み込まれる、１９８６年１０月２３日に公開された国際公開第ＷＯ８６／０６０９６号、１９９０年７月２３日に出願された米国特許出願第０７／５５９，５０９号で開示されている。よって、（ｉ）遺伝子操作による、例えば、ＲＮＡの逆転写及び／またはＤＮＡの増幅を介した、組換えＤＮＡの産生、（ｉｉ）トランスフェクションによる、例えば、電気穿孔またはマイクロインジェクションを介した、組換えＤＮＡの原核生物または真核生物細胞への導入、（ｉｉｉ）例えば連続式またはバッチ式による、形質転換細胞の培養、（ｉｖ）例えば構成的なまたは誘導時のＶＷＦの発現、ならびに（ｖ）例えば培地からのまたは形質転換細胞の採取によるＶＷＦの単離、その結果としての（ｖｉ）例えばアニオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーを介した、生成されたｒＶＷＦの取得のための方法が、当該技術分野で知られている。組換えＶＷは、一態様において、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法を使用して、形質転換宿主細胞中で作製される。例えば、ポリペプチドをコードする配列は、好適な制限酵素を使用してＤＮＡから切除され得る。代替的に、ＤＮＡ分子は、別の態様において、ホスホロアミデート法などの化学合成技法を使用して合成される。また、なお別の態様では、これらの技法の組み合わせが使用される。

本発明はまた、適切な宿主において本発明のポリペプチドをコードするベクターを提供する。ベクターは、適切な発現制御配列に作動可能に連結したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドがベクターに挿入される前または挿入された後のいずれかにこの作動可能な連結をもたらす方法は、よく知られている。発現制御配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが含まれる。中にポリヌクレオチドを有する得られたベクターを使用して、適切な宿主の形質転換を行う。この形質転換は、当該技術分野で周知の方法を使用して実行されてもよい。

本発明の実施には、多数の利用可能な周知の宿主細胞のうちのいずれかが使用される。特定の宿主の選択は、いくつかの当該技術分野で認識されている要因により決定され、これらの要因には、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドの毒性、形質転換率、ペプチド回収の容易性、発現特性、生体安全性、及び費用が含まれる。必ずしもすべての宿主細胞が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効であるわけではないという理解のもとに、これらの要因のバランスを取ることが必要である。これらの一般的なガイドライン内で、有用な微生物宿主細胞には、細菌、酵母及び他の菌類、昆虫、植物、哺乳動物（ヒトを含む）培養細胞、または当該技術分野で既知の他の宿主が挙げられるが、これらに限定されない。

形質転換宿主細胞は、所望の化合物が発現するように従来の発酵条件下で培養される。そのような発酵条件は当該技術分野で周知である。最後に、ポリペプチドは、当該技術分野で周知の方法により培地または宿主細胞自体から精製される。

本発明の化合物の発現に利用される宿主細胞に応じて、炭水化物（オリゴ糖）基が、タンパク質中のグリコシル化部位であることが分かっている部位に任意選択で結合する。一般に、配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る）の一部である場合、Ｏ連結オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合する一方、Ｎ連結オリゴ糖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合する。Ｘは、好ましくは、プロリンを数えずに１９個の天然に存在するアミノ酸のうちの１つである。各種類に見られるＮ連結及びＯ連結オリゴ糖及び糖残基の構造は異なる。Ｎ連結オリゴ糖及びＯ連結オリゴ糖両方に共通して見られる糖のひとつの種類は、Ｎ－アセチルアセチルノイラミン酸（シアル酸として言及される）である。シアル酸は、通常、Ｎ連結オリゴ糖及びＯ連結オリゴ糖両方の末端残基であり、その負電荷を理由に、一態様において、酸性をグリコシル化化合物に付与する。そのような部位（複数可）は、本発明の化合物のリンカーに組み込まれてもよく、好ましくは、（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳動物細胞中の）ポリペプチド化合物の組換え産生中に細胞によりグリコシル化される。他の態様において、そのような部位は、当該技術分野で既知の合成または半合成手順によりグリコシル化される。

いくつかの実施形態では、シアル化（シアリル化としても言及される）は、本明細書に記載の精製手順（アニオン交換、カチオン交換、サイズ排除、及び／または免疫親和性法を含む）の一環として、カラム上で行われ得る。いくつかの実施形態では、シアリル化により、ｒＶＷＤの安定性が、シアリル化を受けていないｒＶＷＦと比較して増加する。いくつかの実施形態では、シアリル化により、血液循環中のｒＶＷＤの安定性が、シアリル化を受けていないｒＶＷＦと比較して（例えば、対象への投与後に）増加する。いくつかの実施形態では、唾液分泌されたｒＶＷＦの増加した安定性は、シアリル化を受けていないｒＶＷＦと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加を生じる。いくつかの実施形態では、シアリル化により、ｒＶＷＦの半減期が、シアリル化を受けていないｒＶＷＦと比較して増加する。いくつかの実施形態では、シアリル化により、血液循環中のｒＶＷＤの半減期が、シアリル化を受けていないｒＶＷＦと比較して（例えば、対象への投与後に）増加する。いくつかの実施形態では、シアリル化されたｒＶＷＦの増加した半減期は、シアリル化を受けていないｒＶＷＦと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加を生じる。いくつかの実施形態では、シアリル化されたｒＶＷＦの増加した半減期により、シアリル化を受けていないｒＶＷＦと比較して（例えば、対象への投与後に）１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、またはそれ以上、血液循環中で安定であるｒＶＷＦが得られる。いくつかの実施形態では、シアリル化により、２，３シアリル化及び／または２，６シアリル化の数が増加する。いくつかの実施形態では、シアリル化は、追加の緩衝ステップとして２，３シアリルトランスフェラーゼ及び／または２，６シアリルトランスフェラーゼとＣＭＰ－ＮＡＮＡ（シチジン－５′－モノホスホ－Ｎ－アセチルノイラミン酸ナトリウム塩）を添加することにより増大する。いくつかの実施形態では、シアリル化は、追加の緩衝ステップとして２，３シアリルトランスフェラーゼとＣＭＰ－ＮＡＮＡ（シチジン－５′－モノホスホ－Ｎ－アセチルノイラミン酸ナトリウム塩）を添加することにより増大する。いくつかの実施形態では、２，３シアリル化は、追加の緩衝ステップとして２，３シアリルトランスフェラーゼとＣＭＰ－ＮＡＮＡ（シチジン－５′－モノホスホ－Ｎ－アセチルノイラミン酸ナトリウム塩）を添加することにより増大する。

いくつかの実施形態では、２，６シアリル化は、追加の緩衝ステップとして２，６シアリルトランスフェラーゼとＣＭＰ－ＮＡＮＡ（シチジン－５′－モノホスホ－Ｎ－アセチルノイラミン酸ナトリウム塩）を添加することにより増大する。いくつかの実施形態では、２，３シアリル化及び／または２，６シアリル化は、追加の緩衝ステップとして２，３シアリルトランスフェラーゼ及び／または２，６シアリルトランスフェラーゼとＣＭＰ－ＮＡＮＡ（シチジン－５′－モノホスホ－Ｎ－アセチルノイラミン酸ナトリウム塩）を添加することにより増大する。いくつかの実施形態では、ＣＭＰ－ＮＡＮＡは、修飾されたシアル酸を無電位位置に移動させるように、化学修飾または酵素修飾される。いくつかの実施形態では、シアリル化は、ｒＶＷＦを樹脂上にロードすること、本明細書に記載の１つ以上の緩衝液で洗浄して、不要な不純物を枯渇させること、追加のシアリル化を可能にする濃度でシアリルトランスフェラーゼ及びＣＭＰ－ＮＡＮＡを含有する１つ以上の緩衝液を適用すること、ならびに１つ以上の緩衝液で洗浄して、過剰なシアリル化試薬を枯渇させること、ならびに増強したｒＶＷＦ（例えば、シアリル化が増加したｒＶＷＦ）を１つ以上の緩衝液で溶出することによって実行される。いくつかの実施形態では、シアリル化プロセスは、本明細書に記載のように、カチオン交換法、アニオン交換法、サイズ排除法、または免疫親和性精製法の一環として実行される。

代替的に、化合物は、例えば固相合成技法を使用する合成方法により作製される。好適な技法は当該技術分野で周知であり、これには、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５－６１（ＫａｔｓｏｙａｎｎｉｓａｎｄＰａｎａｙｏｔｉｓｅｄｓ．）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９、Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４－４１４、ＳｔｅｗａｒｔａｎｄＹｏｕｎｇ（１９６９）、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、米国特許第３，９４１，７６３号、Ｆｉｎｎｅｔａｌ．（１９７６），ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄｅｄ．）２：１０５－２５３、及びＥｒｉｃｋｓｏｎｅｔａｌ．（１９７６），ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄｅｄ．）２：２５７－５２７’に記載されているものが含まれる。固相合成は、費用効率の良い小ペプチド作製方法であるので、個々のペプチドを作製する好ましい技法である。

ＶＷＦの断片、変異型、及び類似体は、当該技術分野で周知の方法に従って産生させることができる。ポリペプチドの断片は、非限定的に、酵素切断（例えば、トリプシン、キモトリプシン）を使用して、また組換え手段を使用して、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を生成することで調製することができる。多量体化ドメインまたは当該技術分野で既知の任意の他の同定可能なＶＷＦドメインなど、特定の活性を有するタンパク質の領域を含むポリペプチド断片を作製してもよい。

ポリペプチド類似体の作製方法もよく知られている。ポリペプチドのアミノ酸配列類似体は、置換型、挿入型、付加型、または欠失型類似体であり得る。ポリペプチドの断片を含む欠失型類似体には、機能または免疫原性活性に不可欠でない天然タンパク質の１つ以上の残基が欠如している。挿入型類似体には、例えば、ポリペプチド中の非末端点でのアミノ酸（複数可）の付加が伴う。この類似体は、例えば、非限定的に、免疫反応性エピトープまたは単純に単個の残基の挿入を含んでもよい。ポリペプチドの断片を含む付加型類似体は、タンパク質の末端の片方または両方での１つ以上のアミノ酸の付加を含み、例えば、融合タンパク質を含む。前述の類似体の組み合わせも企図される。

置換型類似体は、典型的には、タンパク質内の１つ以上の部位において野生型の１つのアミノ酸を別のアミノ酸に交換し、ポリペプチドの１つ以上の特性を、他の機能または特性を完全に損失することなく修飾するよう設計されてもよい。一態様において、置換は保存的置換である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸配列を、側鎖または類似した化学特性を有するアミノ酸で置換することである。保存的置換を作製するための類似したアミノ酸には、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）、塩基性側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、極性アミン側鎖（グルタミン、アスパラギン）、疎水性脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）、芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、小側鎖（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）、または脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、トレオニン）を有するものが含まれる。

一態様において、類似体は、それらが由来する組換えＶＷＦと実質的に相同または実質的に同一である。類似体には、野生型ポリペプチドの生物活性のうちの少なくとも一部、例えば血液凝固活性を保持するものが含まれる。

企図されるポリペプチド変異型には、ユビキチン化、ポリシアル化（またはポリシアリル化）を含むグリコシル化、治療剤または診断剤へのコンジュゲーション、標識化、ペグ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などの共有重合体結合、非加水分解性結合の導入、及びヒトタンパク質中で通常発生しないオルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入または置換などの技法により化学修飾されたポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。変異型は、本発明の非修飾分子と同じまたは本質的に同じ結合特性を保持する。そのような化学修飾には、薬剤のＶＷＦポリペプチドへの直接的または間接的な（例えば、リンカーを介した）結合が含まれてもよい。間接的結合の場合、リンカーが加水分解性であることも加水分解性でないことも企図される。

ペグ化ポリペプチド類似体の調製は、一態様では、（ａ）ポリペプチドを、結合構築物ポリペプチドが１つ以上のＰＥＧ基に結合した状態となる条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させるステップと、（ｂ）反応産物（複数可）を得るステップとを含む。一般に、アシル化反応のための最適な反応条件は、既知のパラメータ及び所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きいほど、ポリペグ化産物の割合（％）は高くなる。いくつかの実施形態では、結合構築物は、Ｎ末端に単個のＰＥＧ部分を有する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を血液凝固因子に結合させて、例えば、インビボの半減期をより長くしてもよい。ＰＥＧ基は、任意の簡便な分子量のものであってもよく、直線状または分岐である。ＰＥＧの平均分子量は、約２キロダルトン（「ｋＤ」）～約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、または約５ｋＤａ～約１０ｋＤａの範囲である。ある特定の態様では、ＰＥＧ基は、血液凝固因子上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）への、ＰＥＧ部分上の天然のもしくは操作された反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）をとおしたアシル化もしくは還元的アルキル化を介して、または当該技術分野で既知の任意の他の技法により、血液凝固因子に結合する。

ポリシアリル化ポリペプチドを調製するための方法は、米国特許公開第２００６０１６０９４８号、ＦｅｒｎａｎｄｅｓｅｔＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３４１：２６－３４，１９９７、及びＳａｅｎｋｏｅｔａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ１２：４２－５１，２００６に記載されている。簡潔に述べると、０．１ＭのＮａＩＯ_４を含有するコロミン酸（ＣＡ）の溶液を室温の暗所で撹拌して、ＣＡを酸化させる。活性化したＣＡ溶液を、例えばｐＨ７．２の０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液に対して、暗所で透析し、この溶液をｒＶＷＦ溶液に添加して、室温の暗所で１８時間、緩徐に振盪しながらインキュベートする。遊離試薬を、任意選択で、例えば限外濾過／透析濾過によりｒＶＷＦ－ポリシアル酸コンジュゲートから単離する。ｒＶＷＦのポリシアル酸とのコンジュゲーションは、グルタルアルデヒドを架橋試薬として使用して達成する（Ｍｉｇｎｅａｕｌｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３７：７９０－７９６，２００４）。

別の態様では、プレプロＶＷＦ及びプロＶＷＦポリペプチドが本発明の製剤中で治療的有用性を提供することも企図される。例えば、米国特許第７，００５，５０２号は、インビトロでトロンビン生成を誘導する、相当量のプロＶＷＦを含む薬学的調製物を記載している。組換えの天然に存在する成熟ＶＷＦの生物学的に活性な断片、変異型、または他の類似体に加えて、本発明は、プレプロＶＷＦ（配列番号２に示される）またはプロＶＷＦポリペプチド（配列番号２のアミノ酸残基２３～７６４）の組換えの生物学的に活性な断片、変異型、または類似体を、本明細書に記載の製剤において使用することを企図する。

断片、変異型、及び類似体をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在する分子と同じまたは類似した生物活性を有する天然に存在する分子の生物学的に活性な断片、変異型、または類似体をコードするように、当業者によって容易に生成され得る。様々な態様において、これらのポリヌクレオチドは、ＰＣＲ技法、ＤＮＡコード分子の消化／ライゲーションなどを使用して調製される。よって、当業者であれば、部位特異的変異生成を含むがこれに限定されない当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、ＤＮＡ鎖中に単一塩基変化を生成し、改変されたコドン及びミスセンス変異を生じさせることができる。本明細書で使用される場合、「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という表現は、例えば、５０％のホルムアミド中、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１倍のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６０℃での洗浄を意味する。これらの条件は、ハイブリダイゼーションを受ける配列の長さ及びＧＣヌクレオチド塩基含有量に基づいて変動することが、当業者には理解される。当該技術分野で標準とされる処方が、正確なハイブリダイゼーション条件を決定するのに適切である。Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，９．４７－９．５１ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）を参照されたい。

Ａ．ＶＷＦ多量体
ｒＶＷＦ多量体の数及び割合（％）の評定は、電気泳動を使用する方法、及びＶＷＦ多量体をサイズにより分離するサイズ排除クロマトグラフィー法が含まれるがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の方法を使用して実施することができ、これは、例えばＣｕｍｍｉｎｇらによって考察されているとおりである（全体が参照により、すべての目的について、特にＶＷＦ多量体の評定に関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、ＪＣｌｉｎＰａｔｈｏｌ．，１９９３Ｍａｙ；４６（５）：４７０－４７３）。そのような教示は、ＶＷＦに対する放射性標識された抗体を用いてゲルを免疫ブロットした後に化学発光を検出する免疫ブロット技法（ウエスタンブロットなど）をさらに含んでもよい（例えば、全体が参照により、すべての目的について、特にＶＷＦ多量体の評定に関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、Ｗｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．，１９９３，７：３１７－３２３を参照されたい）。ＶＷＦのさらなるアッセイには、ＶＷＦ：抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦ：リストセチン補因子（ＶＷＦ：ＲＣｏｆ）、及びＶＷＦ：コラーゲン結合活性アッセイ（ＶＷＦ：ＣＢＡ）が含まれ、これらはフォンヴィレブランド病の診断及び分類に使用されることが多い（例えば、全体が参照により、すべての目的について、特にＶＷＦのアッセイに関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、Ｆａｖａｌｏｒｏｅｔａｌ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９７，２９（４）：３４１－４５６、Ｓａｄｌｅｒ，ＪＥ，ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ，１９９８，６７：３９５－４２４、及びＴｕｒｅｃｅｋｅｔａｌ．，ＳｅｍｉｎＴｈｒｏｍｂＨｅｍｏｓｔ，２０１０，３６：５１０－５２１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本方法を使用して得られるｒＶＷＦは、ｒＶＷＦのローディング試料に存在する任意の多量体パターンを含む。いくつかの実施形態では、本方法を使用して得られるｒＶＷＦは、生理学的に生じる多量体パターン及び超大型ＶＷＦ多量体パターンを含む。

ｂ．ＶＷＦアッセイ
一次止血において、ＶＷＦは、血小板と、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの特定の成分との間の橋として働く。このプロセスにおけるＶＷＦの生物活性は、種々のインビトロアッセイによって測定することができる（Ｔｕｒｅｃｅｋｅｔａｌ．，ＳｅｍｉｎＴｈｒｏｍｂＨｅｍｏｓｔ，２０１０，３６：５１０－５２１）。

ＶＷＦ：リストセチン補因子（ＶＷＦ：ＲＣｏｆ）アッセイは、ＶＷＦの存在下で抗生物質リストセチンにより誘導される、新鮮なまたはホルマリン固定した血小板の凝集に基づく。血小板凝集の程度は、ＶＷＦ濃度に依存し、比濁法により、例えば、血小板凝集計の使用により測定することができる（Ｗｅｉｓｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９７３，５２：２７０８－２７１６、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅｅｔａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．，１９７５，３４：３０６－３０８）。本明細書で提供されるように、本発明のＶＷＦの特異的リストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）は、概して、インビトロアッセイを使用して測定したＶＷＦのｍＵ／μｇを単位として記載される。

いくつかの実施形態では、本発明の方法に従い精製されたｒＶＷＦは、比活性が、少なくとも約２０、２２．５、２５、２７，５、３０、３２．５、３５、３７．５、４０、４２．５、４５、４７．５、５０、５２．５、５５、５７．５、６０、６２．５、６５、６７．５、７０、７２．５、７５、７７．５、８０、８２．５、８５、８７．５、９０、９２．５、９５、９７．５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０ｍＵ／μｇ、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるｒＶＷＦは、比活性が２０ｍＵ／μｇ～１５０ｍＵ／μｇである。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、比活性が３０ｍＵ／μｇ～１２０ｍＵ／μｇである。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、比活性が４０ｍＵ／μｇ～９０ｍＵ／μｇである。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦの比活性は、以下の表３に見られる変種１～１３３から選択される。

（表３）本明細書で提供される組成物中に見られ、本方法で使用されるｒＶＷＦの比活性の例示的な実施形態

Ｖａｒ．＝変種

本発明のｒＶＷＦは、約１０～約４０のサブユニットを含んで、極めて多量体である。さらなる実施形態では、本発明の方法を使用して産生された多量体ｒＶＷＦは、約１０～３０、１２～２８、１４～２６、１６～２４、１８～２２、２０～２１のサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、二量体から、４０を超えるサブユニットの多量体（１０００万ダルトン超）の多量体まで、様々なサイズの多量体で存在する。最も大きい多量体は、血小板受容体と傷害部の内皮下マトリックス部位との両方と相互作用することができる複数の結合部位を提供し、最も止血活性があるＶＷＦの形態である。いくつかの実施形態では、本発明のｒＶＷＦは、超大型多量体（ＵＬＭ）を含む。一般に、高多量体及び超大型多量体は、止血に関して最も有効であるとされている（例えば、Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｐ．，Ｈａｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ，（Ｖｏｌ．３７）：Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１，ｐａｇｅｓＳ１５－Ｓ２５（２０１７）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、５００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、いずれの所望の多量体パターンも、記載の方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態では、アニオン交換及び／またはカチオン交換方法を用いる場合、１つ以上の洗浄ステップ（複数可）中の緩衝液または勾配緩衝液のｐＨ、伝導性、及び／または対イオン濃度を操作して、所望の多量体パターンを得ることができる。いくつかの実施形態では、次にサイズ排除クロマトグラフィー法を用い、収集基準を用いて、所望の多量体パターンを得ることができる。いくつかの実施形態では、記載の多量体パターンは、超大型多量体を含む。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、少なくとも１０，０００ｋＤａ、少なくとも１１，０００ｋＤａ、少なくとも１２，０００ｋＤａ、少なくとも１３，０００ｋＤａ、少なくとも１４，０００ｋＤａ、少なくとも１５，０００ｋＤａ、少なくとも１６，０００ｋＤａ、少なくとも１７，０００ｋＤａ、少なくとも１８，０００ｋＤａ、少なくとも１９，０００ｋＤａ、少なくとも２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１０，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１１，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１２，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１４，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１５，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１６，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１７，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１８，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、超大型多量体は、約１９，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、本方法を使用して得られるｒＶＷＦは、ｒＶＷＦのローディング試料に存在する任意の多量体パターンを含む。いくつかの実施形態では、本方法を使用して得られるｒＶＷＦは、生理学的に生じる多量体パターン及び超大型ＶＷＦ多量体パターンを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法により調製されるｒＶＷＦ組成物は、オリゴマーの９５％が６サブユニット～２０サブユニットを有することを特徴とするｒＶＷＦオリゴマーの分布を有する。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ組成物は、オリゴマーの９５％が、表４に見られる変種４５８～６４１から選択されるサブユニットの範囲を有することを特徴とする、ｒＶＷＦオリゴマーの分布を有する。

（表４）本明細書で提供される組成物中に見られ、本方法で使用されるｒＶＷＦオリゴマーの分布の例示的な実施形態

Ｖａｒ．＝変種

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法により調製されるｒＶＷＦ組成物は、特定のより高次のｒＶＷＦ多量体またはより大きい多量体で存在するｒＶＷＦ分子の割合（％）に従って特徴付けることができる。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるｒＶＷＦ組成物中のｒＶＷＦ分子の少なくとも２０％が、少なくとも１０サブユニットのオリゴマー複合体で存在する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるｒＶＷＦ組成物中のｒＶＷＦ分子の少なくとも２０％が、少なくとも１２サブユニットのオリゴマー複合体で存在する。さらに他の実施形態では、さらに他の実施形態では、本明細書で提供される方法で使用されるｒＶＷＦ組成物は、表５～表７に見られる変種１３４～４５７のうちのいずれか１つに従い、特定のより高次のｒＶＷＦ多量体またはより大きい多量体（例えば、少なくともＹサブユニットの多量体）で存在するｒＶＷＦ分子を最低限の割合（％）で有する（例えば、少なくともＸ％を有する）。

（表５）本明細書で提供される組成物中に見られ、本方法で使用される特定のより高次のｒＶＷＦ多量体またはより大きい多量体で存在するｒＶＷＦ分子の割合（％）の例示的な実施形態

Ｖａｒ．＝変種

（表６）本明細書で提供される組成物中に見られ、本方法で使用される特定のより高次のｒＶＷＦ多量体またはより大きい多量体で存在するｒＶＷＦ分子の割合（％）の例示的な実施形態

Ｖａｒ．＝変種

（表７）本明細書で提供される組成物中に見られ、本方法で使用される特定のより高次のｒＶＷＦ多量体またはより大きい多量体で存在するｒＶＷＦ分子の割合（％）の例示的な実施形態

Ｖａｒ．＝変種

上記に従って、ｒＶＷＦは、高分子量（ＨＭＷ）ｒＶＷＦ多量体をかなりの割合（％）で含む。さらなる実施形態では、ＨＭＷｒＶＷＦ多量体組成物は、少なくとも１０％～８０％のｒＶＷＦ十量体またはより高次の多量体を含む。さらなる実施形態では、組成物は、約１０～９５％、２０～９０％、３０～８５％、４０～８０％、５０～７５％、６０～７０％の十量体またはより高次の多量体を含む。さらなる実施形態では、ＨＭＷｒＶＷＦ多量体組成物は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の十量体またはより高次の多量体を含む。

ｒＶＷＦ多量体の数及び割合（％）の評定は、電気泳動を使用する方法、及びｒＶＷＦ多量体をサイズにより分離するサイズ排除クロマトグラフィー法が含まれるがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の方法を使用して実施することができ、これは、例えばＣｕｍｍｉｎｇらによって考察されているとおりである（全体が参照により、すべての目的について、特にｒＶＷＦ多量体の評定に関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、ＪＣｌｉｎＰａｔｈｏｌ．１９９３Ｍａｙ；４６（５）：４７０－４７３）。そのような教示は、ＶＷＦに対する放射性標識された抗体を用いてゲルを免疫ブロットした後に化学発光を検出する免疫ブロット技法（ウエスタンブロットなど）をさらに含んでもよい（例えば、全体が参照により、すべての目的について、特にＶＷＦ多量体の評定に関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、Ｗｅｎｅｔａｌ．，（１９９３），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．，７：３１７－３２３を参照されたい）。ＶＷＦのさらなるアッセイには、ＶＷＦ：抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦ：リストセチン補因子（ＶＷＦ：ＲＣｏｆ）、及びＶＷＦ：コラーゲン結合活性アッセイ（ＶＷＦ：ＣＢＡ）が含まれ、これらはフォンヴィレブランド病の診断及び分類に使用されることが多い。（例えば、全体が参照により、すべての目的について、特にＶＷＦのアッセイに関するすべての教示について本明細書に組み込まれる、Ｆａｖａｌｏｒｏｅｔａｌ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９７，２９（４）：３４１－４５６を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って調製されたｒＶＷＦについてのｒＦＶＩＩＩ凝結促進活性（ＩＵｒＦＶＩＩＩ：Ｃ）対ｒＶＷＦリストセチン補因子活性（ＩＵｒＶＷＦ：ＲＣｏ）の比は、３：１～１：５である。さらなる実施形態では、この比は、２：１～１：４である。なおさらなる実施形態では、この比は、５：２～１：４である。さらなる実施形態では、この比は、３：２～１：３である。なおさらなる実施形態では、この比は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、２：１、２：３、２：４、２：５、３：１、３：２、３：４、または３：５である。さらなる実施形態では、この比は、１：１～１：２である。またさらなる実施形態では、この比は、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、または２：１である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に有用な組成物中のｒＦＶＩＩＩ凝固促進活性（ＩＵｒＦＶＩＩＩ：Ｃ）対ｒＶＷＦリストセチン補因子活性（ＩＵｒＶＷＦ：ＲＣｏ）の比は、表８に見られる変種１９８８～２１４０から選択される。

（表８）本明細書で提供される組成物中の及び本方法で使用されるｒＦＶＩＩＩ凝固促進活性（ＩＵｒＦＶＩＩＩ：Ｃ）対ｒＶＷＦリストセチン補因子活性（ＩＵｒＶＷＦ：ＲＣｏ）の比についての例示的な実施形態

Ｖａｒ．＝変種

一実施形態では、本明細書で提供される組成物及び方法で使用されるより高次のｒＶＷＦ多量体は、半減期が投与から少なくとも１２時間である。別の実施形態では、より高次のｒＶＷＦ多量体は、半減期が投与から少なくとも２４時間である。さらに他の実施形態では、より高次のｒＶＷＦ多量体は、半減期が、表９に見られる変種６４２～１０４５から選択される。

（表９）本明細書で提供される方法により調製される組成物に見られる、より高次のｒＶＷＦ多量体の半減期の例示的な実施形態

Ｖａｒ．＝変種

いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたプロＶＷＦ及び／または精製ｒＶＷＦは、いずれのコンジュゲーション、翻訳後または共有結合修飾によっても修飾されない。特定の実施形態では、本発明のプロＶＷＦ及び／または精製ｒＶＷＦは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリシアル酸、ヒドロキシルエチルデンプン、ポリ炭水化物部分などを非限定的に含む水溶性重合体を用いて修飾されない。

いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたプロＶＷＦ及び／または精製ｒＶＷＦは、ＮまたはＣ末端残基の修飾と、例えば、遊離スルフヒドリル基、一級アミン、及びヒドロキシル基での選択された側鎖の修飾とを含む、コンジュゲーション、翻訳後修飾、または共有結合修飾をとおして修飾される。一実施形態では、水溶性重合体は、リジン基または他の一級アミンによりタンパク質に（直接、またはリンカーを介して）連結する。いくつかの実施形態では、本発明のプロＶＷＦ及び／または精製ｒＶＷＦは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリシアル酸、ヒドロキシルエチルデンプン、ポリ炭水化物部分などを非限定的に含む水溶性重合体のコンジュゲーションにより修飾されてもよい。

プロＶＷＦ及び／または精製ｒＶＷＦの修飾に使用されてもよい水溶性重合体は、直線的構造及び分岐構造を含む。コンジュゲートされた重合体は、本発明の凝固タンパク質に直接結合してもよく、あるいは代替的に連結部分をとおして結合してもよい。水溶性重合体とのタンパク質コンジュゲーションの非限定的な例は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、及び同第４，１７９，３３７号、ならびにＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉａｎｄＤａｖｉｓ“ＥｎｚｙｍｅｓａｓＤｒｕｇｓ，”ＨｏｌｃｅｎｂｅｒｇａｎｄＲｏｂｅｒｔｓ，Ｅｄｓ．，ｐｐ．３６７３８３，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８１）、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎＧ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２ｎｄＥｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．２００８に見ることができる。

ＶＷＦの生物活性を測定するための別の方法は、ＥＬＩＳＡ技術に基づくコラーゲン結合アッセイである（ＢｒｏｗｎａｎｄＢｏｓａｋ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１９８６，４３：３０３－３１１、Ｆａｖａｌｏｒｏ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２０００，８３１２７－１３５）。マイクロタイタープレートをＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンでコーティングする。次に、ＶＷＦをコラーゲン表面に結合させ、続いて酵素標識したポリクローナル抗体を用いて検出する。最後のステップは基質反応であり、これは、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて測光法によりモニタリングできる。

フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ：Ａｇ）の免疫学的アッセイは、血漿中のＶＷＦタンパク質の濃度を測定する免疫アッセイである。これらは、ＶＷＦ機能に関する兆候は示さない。ＶＷＦ：Ａｇを測定するためのいくつかの方法が存在し、これらには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または自動ラテックス免疫アッセイ（ＬＩＡ）の両方が含まれる。現在では多くの研究所が全自動ラテックス免疫アッセイを使用する。過去には、研究所は、Ｌａｕｒｅｌｌ電気免疫アッセイ「ＬａｕｒｅｌｌＲｏｃｋｅｔｓ」を含む様々な技法を使用していたが、これらは、今日では大部分の研究所でほとんど使用されない。

ＩＩＩ．キット
追加の態様として、本発明には、対象への投与を目的としたそれらの使用を促進する様式でパッケージされた１つ以上の凍結乾燥した組成物を含むキットが含まれる。一実施形態では、そのようなキットには、密封ボトルまたは容器などの入れ物の中にパッケージされた本明細書に記載の薬学的製剤（例えば、治療用タンパク質またはペプチドを含む組成物）が含まれ、本方法の実施における化合物または組成物の使用を説明するラベルが入れ物に貼付されているか、またはパッケージに含まれている。一実施形態では、薬学的製剤は、入れ物の上部空間の量（例えば、液体製剤と容器の上部との間の空気量）が極めて少なくなるように入れ物にパッケージされる。好ましくは、上部空間の量はごくわずかである（例えば、ないに等しい）。一実施形態では、キットには、治療用タンパク質またはペプチド組成物を含む第１の入れ物と、組成物のため生理学的に許容される再構成溶液を有する第２の入れ物とが含まれる。一態様において、薬学的製剤は、単位剤形でパッケージされる。キットには、特定の投与経路に従う薬学的製剤の投与に好適なデバイスがさらに含まれてもよい。好ましくは、キットには、薬学的製剤の使用を説明するラベルが含まれる。

ＩＶ．手術を受けるＶＷＤを患う対象に前処置を行う方法のためのｒＶＷＦ
手術の前処置を行うために重度のＶＷＤを患う患者にｒＶＷＦを投与することの利点のひとつは、ｐｄＶＷＦと比較してより高いｒＶＷＦの比活性により、投与されるｒＶＷＦの量及び対象への再投与の回数において融通がきくようになることである。理解されるように、また本明細書でさらに詳細に考察されるように、同時投与されるＦＶＩＩＩは、組換えであっても血漿由来であってもよい。

ｒＶＷＦの単回または複数回投与が、治療にあたる医師により選択された用量レベル及びパターンで行われる。疾患の予防または治療に関して、適切な投薬量は、治療すべき疾患の種類（例えばフォンヴィレブランド病）、疾患の重症度及び経過、薬物が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の病歴及び薬物への反応、ならびに主治医の裁量に依存することになる。

いくつかの態様において、ｒＶＷＦは、２０～６０ＩＵ／ｋｇの範囲、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、２０～６０、３５～７０、２０～４０、３５～６０、４５～６０、４５～５５、４５～５０、５０～６０、５５～６０、または５０～５５ＩＵ／ｋｇで、外科手術前に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、外科手術の１２時間～２４時間、例えば、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、１２時間～２４時間、１４時間～２４時間、１６～２４時間、１８時間～２４時間、または２０時間～２４時間前に投与される。いくつかの態様において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、外科手術の前にｒＶＷＦと共に投与されない。

いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、５～９０ＩＵ／ｋｇの範囲、例えば、５～９０、５～５０、１０～９０、１５～９０、２０～９０、３０～９０、４０～９０、５０～９０、６０～９０、７０～９０、８０～９０、５～８０、１０～７０、２０～６０、３０～５０、３５～６０、５～５０、５～４０、５～３０．５～２０、１０～９０、１０～５０、または２０～４０ＩＵ／ｋｇで手術の１時間前に対象に投与される。他の実施形態では、ｒＶＷＦは、７０～２００ＩＵ／ｋｇ、例えば、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００、１１０～２００、１２０～２００、１３０～２００、１３０～２００、１４０～２００、１５０～２００、１６０～２００、１７０～２００、１８０～２００、１９０～２００、７０～１７０、８０～１８０、６０～１６０、５０～１５０、４０～１４０、３０、１３０、２０～１２０、１０～１１０、７０～１００、または７０～９０ＩＵ／ｋｇの用量で手術後に投与される。いくつかの場合、外科手術は、大手術、小手術、または口腔手術からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、対象に、３５～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが大手術の１２時間～２４時間前に投与される。他の実施形態では、対象に、１５～９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが大手術の１時間前に投与される。別の実施形態では、対象に、１５０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが大手術の後に投与される。いくつかの例では、大手術を受ける対象に、２２０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量が投与される。

いくつかの実施形態では、対象に、５０～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが小手術の１２時間～２４時間前に投与される。他の実施形態では、対象に、５～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが小手術の１時間前に投与される。別の実施形態では、対象に、７０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが小手術の後に投与される。いくつかの例では、小手術を受ける対象に、１００～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量が投与される。

いくつかの実施形態では、対象に、２０～４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが口腔手術の１２時間～２４時間前に投与される。他の実施形態では、対象に、２０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが口腔手術の１時間前に投与される。別の実施形態では、対象に、１０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが口腔手術中に投与される。別の実施形態では、対象に、２０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが口腔手術の後に投与される。いくつかの例では、口腔手術を受ける対象に、７０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量が投与される。

ｒＶＷＦの組成物は、本明細書に記載のように、薬学的製剤中に含めることができる。そのような製剤は、経口、局所、経皮、非経口、吸入スプレーにより、経腟、経直腸、または頭蓋内注射により投与することができる。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射、または注入技法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注射、及びまたは特定の部位での外科的移植による投与も企図される。一般に、組成物は、発熱物質、及びレシピエントに有害であり得る他の不純物を本質的に含まない。

一態様において、本発明の製剤は、薬物製品の治療的循環レベルを維持するために、最初はボーラスにより、続いて連続注入により投与される。別の例として、本発明の化合物は、一回限りの投薬として投与される。当業者であれば、良好な医療行為及び個々の患者の病態によって決定する有効な投薬量及び投与レジメンの最適化は容易であろう。投与経路は、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与により得るが、これらに限定されない。投薬頻度は、薬剤の薬物動態パラメータ及び投与経路に依存する。最適な薬学的製剤は、投与経路及び所望の投薬量に応じて当業者により決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄ．，１９９０，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２ｐａｇｅｓ１４３５－１７１２を参照されたい。この開示は、その全体が、すべての目的、特に薬学的製品についての製剤、投与経路、及び投薬量に関するすべての教示について、参照により本明細書に組み込まれる。そのような製剤は、投与される薬剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼす。投与経路に応じて、好適な用量は、体重、体表面積、または臓器サイズに従って計算される。適切な投薬量は、血中濃度投薬量を決定するための確立されているアッセイを、適切な用量応答データと組み合わせて使用することにより、確認され得る。最終投薬レジメンは、薬物の作用を変更する様々な要因、例えば、薬物の比活性、損傷の重症度及び患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別、及び食習慣、あらゆる感染の重症度、投与時間、ならびに他の臨床要因を考慮して、主治医により決定される。例として、本発明の組換えＶＷＦの典型的な用量は約５０ＩＵ／ｋｇであり、これは５００μｇ／ｋｇに相当する。試験の実施につれて、様々な疾患及び状態のための適切な投薬レベル及び治療期間に関するさらなる情報が明らかになるであろう。

本発明の実施には、別段に示されていない限り、当該技術分野の技能の内である、有機化学、重合体技術、分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技法及び記述が用いられ得る。そのような従来の技法には、重合体アレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、及び標識を使用するハイブリダイゼーションの検出が含まれる。本明細書の以下の実施例を参照することで、好適な技法の具体的な例解を得ることができる。しかしながら、言うまでもなく、他の同等である従来の手順も使用することができる。そのような従来の技法及び記述は、標準的な実習手引書、例えば、ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＳｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ），ＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｅｌｌｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（すべてＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓから）、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈＥｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ，ＨｉｇｈｌｙｓｔａｂｉｌｉｚｅｄＹｏｒｋ，Ｇａｉｔ，”ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ”１９８４，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＮｅｌｓｏｎａｎｄＣｏｘ（２０００），Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３ｒｄＥｄ．，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎＰｕｂ．，ＨｉｇｈｌｙｓｔａｂｉｌｉｚｅｄＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄＢｅｒｇｅｔａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈＥｄ．，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎＰｕｂ．，ＨｉｇｈｌｙｓｔａｂｉｌｉｚｅｄＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に見ることができ、これらのすべては、全目的について、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別に指示しない限り複数の言及を含むことに留意されたい。よって、例えば、「ポリメラーゼ（ａｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」は、１つの薬剤またはそのような薬剤の混合物を指し、「方法（ｔｈｅｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、当業者に既知である同等のステップ及び方法への言及などを含む。

他に特段の定めのない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で触れるすべての出版物は、これらの出版物に記載され、本明細書に記載の発明と関連して使用され得る、デバイス、組成物、製剤、及び方法を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。

値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、それはまた、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本発明内に包含される。記載範囲がその上限値及び下限値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される上限値及び下限値のいずれか一方または両方を除外する範囲も本発明に包含される。

以上の説明では、本発明のより完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が述べられている。しかしながら、本発明がこれらの具体的な詳細のうちの１つ以上を有さずに実施され得ることは、当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を不明瞭にすることを避けるために、周知の特徴及び当業者に周知の手順は説明されていない。

本発明は主に特定の実施形態を参照して説明されるが、本開示を読むことで、当業者には他の実施形態が明らかとなることも想定され、そのような実施形態は本発明の方法に含まれることが意図される。

ａ．凍結乾燥したＶＷＦ製剤
本方法はまた、本明細書で提供される治療方法で使用するためのｒＶＷＦの製剤を提供する。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦ組成物は、薬学的組成物の製造のために使用される。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、凍結乾燥した製剤に製剤化され得る。

いくつかの実施形態では、本発明のＶＷＦポリペプチドを含む製剤は、精製後、かつ対象への投与前に凍結乾燥される。凍結乾燥は、当該技術分野で一般的な技法を使用して行われ、開発される組成物に対して最適化されるべきである（Ｔａｎｇｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．２１：１９１－２００，（２００４）ａｎｄＣｈａｎｇｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．１３：２４３－９（１９９６））。

凍結乾燥サイクルは、一態様において、凍結、一次乾燥、及び二次乾燥の３つのステップで構成される（Ａ．Ｐ．Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，ＰｈｉｌＴｒａｎｓＲＳｏｃＬｏｎｄｏｎ，ＳｅｒＢ，Ｂｉｏｌ２７８：１６７（１９７７））。凍結ステップでは、溶液を冷却して、氷の形成を開始する。さらに、このステップには、増量剤の結晶化が含まれる。氷は、一次乾燥段階で昇華させ、この一次乾燥段階は、昇華を促進するために、真空を使用し、熱を導入して、チャンバ圧を、氷の蒸気圧を下回るように減少させることによって実施される。最後に、吸収されたまたは結合した水を、減少したチャンバ圧及び高い棚温度のもと、二次乾燥段階で除去する。このプロセスにより、凍結乾燥ケーキとして知られる物質が産生される。その後、ケーキを滅菌水または注射に好適な希釈液のいずれかにより再構成することができる。

凍結乾燥サイクルは、賦形剤の最終的な物理的状態を決定するだけでなく、再構成時間、外観、安定性、及び最終含水量などの他のパラメータにも影響を与える。凍結状態の組成物構造は、特定の温度で生じるいくつかの推移を受け（例えば、ガラス転移、湿潤、及び結晶化）、この構造を使用して、凍結乾燥プロセスを理解し最適化し得る。ガラス転移温度（Ｔｇ及び／またはＴｇ’）は、溶質の物理的状態に関する情報を提供することができ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定することができる。Ｔｇ及びＴｇ’は、凍結乾燥サイクルを設計する際に考慮に入れる必要がある重要なパラメータである。例えば、Ｔｇ’は、一次乾燥に重要である。さらに、乾燥状態では、ガラス転移温度により、最終製品の貯蔵温度に関する情報が得られる。

ｂ．薬学的製剤及び賦形剤一般
賦形剤は、薬物製品（例えば、タンパク質）の安定性及び送達を授けるまたは強化する添加物である。それらを含める理由にかかわらず、賦形剤は、製剤の不可欠な成分であり、したがって、安全であり、患者による忍容性が良好である必要がある。タンパク質薬物については、賦形剤の選択は、薬物の有効性及び免疫原性の両方に影響し得るため、特に重要である。よって、タンパク質製剤は、好適な安定性、安全性、及び市場性をもたらす賦形剤の適切な選択を伴って開発する必要がある。

凍結乾燥した製剤は、一態様では、少なくとも、緩衝液、増量剤、及び安定化剤のうちの１つ以上で構成される。この態様において、界面活性剤の利用は、凍結乾燥ステップ中または再構成中の凝集が問題となる場合に、評価及び選択される。適切な緩衝剤を含めて、凍結乾燥中、製剤をｐＨの安定領域に維持する。液体及び凍結乾燥タンパク質製剤について企図される賦形剤化合物の比較を表１０に提供する。

（表１）凍結乾燥タンパク質製剤の賦形剤化合物

タンパク質用製剤の開発における主な課題は、製品を、製造、輸送、及び貯蔵のストレスに対して安定させることである。製剤賦形剤の役割は、これらのストレスに対する安定化を提供することである。賦形剤は、高濃度タンパク質製剤の粘度を低下させることで、それらの輸送を可能にし、患者の利便性を向上させるためにも用いられる。一般に、賦形剤は、それらが様々な化学的及び物理的ストレスに対してタンパク質を安定させる機序に基づいて分類することができる。一部の賦形剤は、特定のストレスの影響を緩和するため、または特定のタンパク質の特別な感受性を調節するために使用される。他の賦形剤は、タンパク質の物理的安定性及び共有結合安定性に対するより一般的な影響を有する。本明細書に記載の賦形剤は、それらの化学型またはそれらの製剤における機能的役割のいずれかによって編成される。安定化手段の簡単な説明が、各賦形剤種の考察時に提供される。

本明細書で提供される教示及び指導を所与として、当業者であれば、バイオ医薬品（例えば、タンパク質）の安定性の保持を促進する本発明のバイオ医薬製剤を得るために任意の特定の製剤に含めることができる賦形剤の量または範囲を理解するであろう。例えば、本発明のバイオ医薬製剤に含めることができる塩の量及び種類は、最終溶液の所望の浸透圧（例えば、等張性、低張性、または高張性）、ならびに製剤に含める他の成分の量及び浸透圧に基づいて選択される。

例として、約５％のソルビトールを含めることで、等張性を得ることができる一方、約９％のスクロース賦形剤が、等張性を得るために必要とされる。本発明のバイオ医薬製剤内に含めることができる１つ以上の賦形剤の量及び濃度範囲の選択は、塩、ポリオール、及び糖類を参照して上で例示されている。しかしながら、当業者であれば、本明細書に記載され、特定の賦形剤を参照してさらに例示された考察は、例えば、塩、アミノ酸、他の等張化剤、界面活性剤、安定化剤、増量剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、酸化防止剤、金属イオン、キレート剤、及び／または保存剤を含む、すべての種類及び組み合わせの賦形剤に等しく適用可能であることを理解するであろう。

さらに、特定の賦形剤がモル濃度で報告される場合、当業者は、溶液の相当するパーセント（％）ｗ／ｖ（例えば、（溶液試料中の物質のグラム／溶液１ｍＬ）×１００％）も企図されることを認識するであろう。

言うまでなく、当業者は、本明細書に記載の賦形剤の濃度が、特定の製剤中で相互依存性を共有することを理解するであろう。例として、例えばタンパク質濃度が高い場合、または例えば安定化剤濃度が高い場合には、増量剤の濃度を下げてもよい。加えて、増量剤を含まない特定の製剤の等張性を維持するために、安定化剤の濃度を適宜調整し得る（例えば、「等張化する」量の安定化剤を使用し得る）ことが、当業者には認識され得る。一般的な賦形剤は、当該技術分野で既知であり、Ｐｏｗｅｌｌｅｔａｌ．，ＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓｆｉｒＰａｒｅｎｔｅｒａｌＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９８），ＰＤＡＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５２：２３８－３１１に見ることができる。

ｃ．薬学的緩衝液及び緩衝剤
薬理学的に活性なタンパク質製剤の安定性は、通常、狭いｐＨ範囲で最大となることが観察される。この最適な安定性のｐＨ範囲は、製剤化前の試験中の早い時期に特定する必要がある。加速的安定性試験及び熱量測定スクリーニング試験などのいくつかのアプローチが、この試みに有用である（ＲｅｍｍｅｌｅＲ．Ｌ．Ｊｒ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８（１６）：５２４１－７（１９９９））。一度製剤を仕上げると、タンパク質を製造し、その貯蔵寿命にわたって維持する必要がある。よって、製剤のｐＨを制御するために、ほぼ常に緩衝剤が用いられる。

緩衝種の緩衝能は、ｐＫａに等しいｐＨで最大であり、ｐＨがこの値から離れて上昇または低下するにつれて減少する。緩衝能の９０パーセントは、そのｐＫａの１ｐＨ単位内に存在する。緩衝能はまた、緩衝剤濃度の上昇と比例して増加する。

緩衝剤の選択時、いくつかの要因を考慮する必要がある。まず初めに、緩衝種及びその濃度を、そのｐＫａ及び所望の製剤ｐＨに基づいて定義しなければならない。緩衝剤がタンパク質及び他の製剤賦形剤と適合し、いずれの分解反応にも触媒作用を及ぼさないことを確実にすることも等しく重要である。考慮すべき第３の重要な側面は、投与時に緩衝液が誘導し得る刺痛及び刺激感である。例えば、クエン酸塩は、注射の際に刺痛を生じさせることが知られている（ＬａｕｒｓｅｎＴ，ｅｔａｌ．，ＢａｓｉｃＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ．，９８（２）：２１８－２１（２００６））。刺痛及び刺激の可能性は、投与時に製剤が血液中に急速に希釈されていくＩＶ経路により投与される場合よりも比較的長い時間、薬物溶液がその部位に留まる皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）経路を介して投与される薬物について、より大きい。直接ＩＶ注入により投与される製剤については、緩衝剤（及び任意の他の製剤成分）の全量をモニタリングする必要がある。患者において心血管系への影響を引き起こし得るリン酸カリウム緩衝液の形態で投与されるカリウムイオンは、特に注意しなければならない（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ－ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＪＣ，ｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．，７３（２）：２８３－９０（２００６））。

凍結乾燥した製剤のための緩衝剤は、さらなる考慮を必要とする。リン酸ナトリウムなどの一部の緩衝剤は、凍結中にタンパク質非晶相から結晶化することで、ｐＨが変化し得る。酢酸塩及びイミダゾールなどの他の一般的な緩衝剤は、凍結乾燥プロセス中に昇華または蒸発することにより、凍結乾燥中または再構成後に製剤のｐＨを変化させ得る。

組成物に存在する緩衝系は、生理学的に適合するように、また薬学的製剤の所望のｐＨを維持するように選択される。一実施形態では、溶液のｐＨは、ｐＨ２．０～ｐＨ１２．０である。例えば、溶液のｐＨは、２．０、２．３、２．５、２．７、３．０、３．３、３．５、３．７、４．０、４．３、４．５、４．７、５．０、５．３、５．５、５．７、６．０、６．３、６．５、６．７、７．０、７．３、７．５、７．７、８．０、８．３、８．５、８．７、９．０、９．３、９．５、９．７、１０．０、１０．３、１０．５、１０．７、１１．０、１１．３、１１．５、１１．７、または１２．０であってもよい。

ｐＨ緩衝化合物は、製剤のｐＨを所定のレベルに維持するのに好適な任意の量で存在してもよい。一実施形態では、ｐＨ緩衝濃度は、０．１ｍＭ～５００ｍＭ（１Ｍ）である。例えば、ｐＨ緩衝剤は、少なくとも０．１、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、または５００ｍＭであることが企図される。

本明細書に示される製剤の緩衝に使用される例示的なｐＨ緩衝剤には、有機酸、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリス、ＨＥＰＥＳ、及びアミノ酸またはアミノ酸の混合物、例えば、非限定的に、ヒスチジン及びグリシンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、緩衝剤はクエン酸塩である。

ｄ．薬学的安定化剤及び増量剤
本薬学的製剤の一態様において、貯蔵により誘導される凝集及び化学分解を防止または低減するために、安定化剤（または安定化剤の組み合わせ）が添加される。再構成の際に溶液が霞んでいるまたは混濁している場合、タンパク質が沈殿または少なくとも凝集しているということである。「安定化剤」という用語は、水性状態で、凝集、または化学分解（例えば、自己分解、脱アミド化、酸化など）を含む物理的分解を防止することができる賦形剤を意味する。企図される安定化剤には、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、アルギニンＨＣＬ、ポリ－ヒドロキシ化合物、例えば、デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、シクロデキストリン、Ｎ－メチルピロリデン、セルロース、及びヒアルロン酸などの多糖類、塩化ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ７４：２２５，（１９９１））。本製剤中、安定化剤は、約０．１、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、７００、９００、または１０００ｍＭの濃度で組み込まれる。本発明の一実施形態では、マンニトール及びトレハロースが安定化剤として使用される。

所望の場合、製剤には、適量の増量剤及び浸透圧調節剤も含まれる。増量剤には、例えば、非限定的に、マンニトール、グリシン、スクロース、重合体、例えば、デキストラン、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ラクトース、ソルビトール、トレハロース、またはキシリトールが含まれる。一実施形態では、増量剤はマンニトールである。増量剤は、約０．１、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、７００、９００、または１０００ｍＭの濃度で組み込まれる。

ｅ．薬学的界面活性剤
タンパク質は、表面と相互作用する傾向が強く、それにより、気液、ウイルス液体、液液（シリコーン油）界面で吸収及び変性が起きやすい。この分解経路は、タンパク質濃度に反比例して依存し、可溶性及び不溶性タンパク質凝集体の形成または表面への吸収による溶液からのタンパク質の喪失のいずれかを生じさせることが観察されている。容器表面吸収に加えて、表面誘起分解は、製品の配送及び処理中に受けるような物理的撹拌によって悪化する。

界面活性剤は、表面誘起分解を防止するために、タンパク質製剤中で一般に使用される。界面活性剤は、界面位置についてタンパク質に勝つ能力を有する両親媒性分子である。界面活性剤分子の疎水性部分は、界面位置（例えば、気／液）を占有する一方、分子の親水性部分は、バルク溶媒に向けて配向されたままである。十分な濃度（典型的には洗剤の臨界ミセル濃度あたり）で、界面活性剤分子の表面層は、タンパク質分子の界面での吸収を防止する働きをする。それにより、表面誘起分解が最小限に抑えられる。本明細書で企図される界面活性剤には、非限定的に、ソルビタンポリエトキシレートの脂肪酸エステル、例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０が含まれる。これら２つは、疎水性特性を分子に付与する脂肪族鎖の長さが異なるだけである（それぞれＣ－１２及びＣ－１８）。したがって、ポリソルベート８０は、ポリソルベート２０よりも、界面活性が高く、臨界ミセル濃度が低い。

界面活性剤はまた、タンパク質の熱力学的立体配座安定性にも影響し得る。ここでも再び、所与の界面活性賦形剤の影響は、タンパク質に固有となる。例えば、ポリソルベートは、一部のタンパク質の安定性を減少させ、他のタンパク質の安定性を増大させることが示されている。タンパク質の界面活性剤による不安定化は、部分的にまたは完全に折り畳まれていないタンパク質状態との特異的結合に関与し得る洗剤分子の疎水性尾部の観点から、理論的に説明することができる。これらの種類の相互作用により、配座平衡において、より展開したタンパク質状態に向かった変化が生じ得る（例えば、結合するポリソルベートを補完してタンパク質分子の疎水性部分の曝露を増加させる）。あるいは、タンパク質の天然状態がいくらかの疎水性表面を呈する場合、天然状態への界面活性剤の結合により、その配座が安定し得る。

ポリソルベートの別の側面は、それらが本質的に酸化的分解の影響を受けやすいことである。多くの場合、原材料として、これらは十分な量の過酸化物を含有し、タンパク質残基側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こす。安定化剤の添加に起因する酸化的損傷の可能性は、最小有効濃度の賦形剤を製剤中で使用するべきである点を強調する。界面活性剤については、所与のタンパク質の有効濃度は、安定化の機序に依存することになる。

界面活性剤は、凍結及び乾燥中の表面関連の凝集現象を防止するためにも、適量で添加される（Ｃｈａｎｇ，Ｂ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：１３２５，（１９９６））。このため、例示的な界面活性剤には、非限定的に、天然に存在するアミノ酸に由来する界面活性剤を含む、アニオン性、カチオン性、非イオン性、双性イオン性、及び両性界面活性剤が含まれる。アニオン性界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、及びジオクチルスルホン酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、１－オクタンスルホン酸ナトリウム塩、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、及びグリコデオキシコール酸ナトリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。カチオン性界面活性剤には、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム一水和物、及び臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムが含まれるが、これらに限定されない。双性イオン性界面活性剤には、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３－１０、及びＳＢ３－１２が含まれるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤には、ジギトニン、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、ＴＷＥＥＮ－２０、及びＴＷＥＥＮ－８０が含まれるが、これらに限定されない。界面活性剤には、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、４０、５０、及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５、及び８０、大豆レシチン、ならびに他のリン脂質、例えば、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及び（ジオレイルホスファチジルグリセロール）ＤＯＰＧ；スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースも含まれるが、これらに限定されない。したがって、これらの界面活性剤を含む組成物を、個々に、または異なる比での混合物としてのいずれかで含む組成物がさらに提供される。本発明の一実施形態では、界面活性剤はＴＷＥＥＮ－８０である。本製剤中、界面活性剤は、約０．０１～約０．５ｇ／Ｌの濃度で組み込まれる。提供される製剤中、界面活性剤濃度は、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０ｇ／Ｌである。

ｆ．薬学的塩
多くの場合、タンパク質の可溶性、物理的安定性、及び等張性に重要であり得る、製剤のイオン強度を増加させるために、塩が添加される。塩は、様々な方法でタンパク質の物理的安定性に影響し得る。イオンは、タンパク質の表面上で荷電残基に結合することにより、タンパク質の天然状態を安定させることができる。代替的に、塩は、タンパク質骨格に沿ったペプチド基に結合することにより（－ＣＯＮＨ－）、変性状態を安定させることができる。塩はまた、タンパク質分子内の残基間の反発静電相互作用を遮断することにより、タンパク質の天然配座を安定させることができる。タンパク質製剤中の塩はまた、タンパク質の凝集及び不溶性につながり得るタンパク質分子間の求引静電相互作用を遮断することができる。提供される製剤中、塩濃度は、０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、８０、１００、１２０、１５０、２００、３００、及び５００ｍＭの間である。

ｇ．他の一般的な賦形剤成分：薬学的アミノ酸
アミノ酸は、緩衝剤、増量剤、安定化剤、及び酸化防止剤としてタンパク質製剤中で多目的な使用が見い出されている。このため、一態様では、それぞれ、５．５～６．５及び４．０～５．５のｐＨ範囲でタンパク質製剤を緩衝するために、ヒスチジン及びグルタミン酸が用いられる。ヒスチジンのイミダゾール基は、ｐＫａが６．０であり、グルタミン酸側鎖のカルボキシル基は、ｐＫａが４．３であるため、これらのアミノ酸は、対応するｐＨ範囲における緩衝に好適となる。そのような場合、グルタミン酸が特に有用である。ヒスチジンは、市販のタンパク質製剤に一般的に見られ、このアミノ酸は、注射時に刺痛を伴うことが知られる緩衝剤であるクエン酸塩の代替となる。興味深いことに、ヒスチジンも、液体及び凍結乾燥両方の体裁で、高濃度で液体使用されると、凝集に関して安定化効果を有することが報告されている（ＣｈｅｎＢ，ｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．，２０（１２）：１９５２－６０（２００３））。ヒスチジンはまた、タンパク質濃度が高い製剤の粘度を低下させることが、他の者により観察された。しかしながら、同じ研究において、著者は、ステンレス鋼製容器中での抗体の凍結解凍研究中にヒスチジン含有製剤における凝集及び変色が増加したことを観察した。ヒスチジンの他の注意点は、ヒスチジンが金属イオンの存在下で光酸化を受けることである（ＴｏｍｉｔａＭ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８（１２）：５１４９－６０（１９６９））。メチオニンを製剤中で酸化防止剤として使用することは有望であるように見受けられ、いくつかの酸化ストレスに対して効果的であることが観察されている（ＬａｍＸＭ，ｅｔａｌ．，ＪＰｈａｒｍＳｃＬ，８６（１１）：１２５０－５（１９９７））。

様々な態様において、アミノ酸のグリシン、プロリン、セリン、アルギニン、及びアラニンのうちの１つ以上を含む製剤が提供され、これらは、選択的な除外の機序によりタンパク質を安定させることが示されている。グリシンは、凍結乾燥製剤中で一般的に使用される増量剤でもある。アルギニンは、凝集の阻害に効果的であることが示されており、液体及び凍結乾燥両方の製剤に中で使用されている。

提供される製剤中、アミノ酸濃度は、０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、８０、１００、１２０、１５０、２００、３００、及び５００ｍＭの間である。本発明の一実施形態では、このアミノ酸はグリシンである。

ｈ．他の一般的な賦形剤成分：薬学的酸化防止剤
タンパク質残基の酸化は、いくつかの異なる発生源から生じる。特定の酸化防止剤を添加することの他に、酸化性のタンパク質損傷の防止には、製品の製造プロセス及び貯蔵にわたって、大気酸素、温度、光曝露、及び化学的汚染などのいくつかの要因を慎重に制御することが伴う。したがって、本発明は、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤、またはキレート剤を非限定的に含む、薬学的酸化防止剤の使用を企図する。治療用タンパク質製剤中の酸化防止剤は、一態様において、水溶性であり、製品貯蔵寿命にわたって活性なままである。還元剤及び酸素／フリーラジカル捕捉剤は、溶液中の活性酸素種を除去することによって作用する。ＥＤＴＡなどのキレート剤は、フリーラジカル形成を促進する微量金属汚染物質と結合することにより有効となる。例えば、ＥＤＴＡは、酸性線維芽細胞成長因子の液体製剤中で利用されて、金属イオンが触媒するシステイン残基の酸化を阻害した。

様々な賦形剤のタンパク質酸化を防止する有効性に加えて、酸化防止剤自体がタンパク質に対して他の共有結合的または物理的変化を誘導する可能性が懸念される。例えば、還元剤により、ジスルフィドシャフリングにつながり得る分子内ジスルフィド結合の分断が生じ得る。遷移金属イオンの存在下で、アスコルビン酸及びＥＤＴＡが、いくつかのタンパク質及びペプチド中でメチオニン酸化を促進することが示されている（ＡｋｅｒｓＭＪ，ａｎｄＤｅｆｅｌｉｐｐｉｓＭＲ．ＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓａｓＰａｒｅｎｔｅｒａｌＳｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ．ＳｖｅｎＦｒｏｋｊａｅｒ，ＬａｒｓＨｏｖｇａａｒｄ，ｅｄｉｔｏｒｓ．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ．ＴａｙｌｏｒａｎｄＦｒａｎｃｉｓ，ＵＫ（１９９９））、ＦｒａｎｓｓｏｎＪ．Ｒ．，／．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６（９）：４０４６－１０５０（１９９７）、ＹｉｎＪ，ｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．，２１（１２）：２３７７－８３（２００４））。チオ硫酸ナトリウムは、ｒｈｕＭａｂＨＥＲ２において光及び温度により誘導されるメチオニン酸化のレベルを低下させることが報告されているが、チオ硫酸－タンパク質付加物の形成もこの研究において報告された（ＬａｍＸＭ，ＹａｎｇＪＹ，ｅｔａｌ．，ＪＰｈａｒｍＳｃｉ．８６（１１）：１２５０－５（１９９７））。タンパク質の特定のストレス及び感受性に従い、適切な酸化防止剤を選択する。ある特定の態様において企図される酸化防止剤には、還元剤及び酸素／フリーラジカル捕捉剤、ＥＤＴＡ、及びチオ硫酸ナトリウムが非限定的に含まれる。

ｉ．他の一般的な賦形剤成分：薬学的金属イオン
一般に、遷移金属イオンは、タンパク質中で物理的及び化学的分解を触媒し得るので、タンパク質製剤においては望まれない。しかしながら、特定の金属イオンは、それらがタンパク質に対する補因子である製剤、及びそれらが配位錯体を形成するタンパク質の懸濁製剤（例えば、インスリンの亜鉛懸濁液）に含められる。近年では、アスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために、マグネシウムイオン（１０～１２０ｍＭ）の使用が提案されている（国際公開第ＷＯ２００４０３９３３７号）。

金属イオンがタンパク質中で安定性または増大した活性を付与する２つの例は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼ（ｒｈＤＮａｓｅ、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））及び第ＶＩＩＩ因子である。ｒｈＤＮａｓｅの場合、Ｃａ^＋２イオン（最大１００ｍＭ）により、特定の結合部位をとおして酵素の安定性が増加した（ＣｈｅｎＢ，ｅｔａｌ．，／ＰｈａｒｍＳｃｉ．，８８（４）：４７７－８２（１９９９））。実に、ＥＧＴＡを用いて溶液からカルシウムイオンを除去することで、脱アミド化及び凝集の増大が生じた。しかしながら、この効果は、Ｃａ^＋２イオンによってのみ観察され、他の二価カチオンであるＭｇ^＋２、Ｍｎ^＋２、及びＺｎ^＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定にしたことが観察された。類似の効果が第ＶＩＩＩ因子でも観察された。Ｃａ^＋２及びＳｒ^＋２イオンはタンパク質を安定させたが、Ｍｇ^＋２、Ｍｎ^＋２、及びＺｎ^＋２、Ｃｕ^＋２及びＦｅ^＋２などの他のものは、酵素を不安定にした（Ｆａｔｏｕｒｏｓ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１５５，１２１－１３１（１９９７）。第ＶＩＩＩ因子を用いた別個の研究では、Ａｌ^＋３イオンの存在下で凝集率の著しい増加が観察された（ＤｅｒｒｉｃｋＴＳ，ｅｔａｌ．，／．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９３（１０）：２５４９－５７（２００４））。著者は、緩衝塩のような他の賦形剤が、多くの場合にＡｌ^＋３イオンで汚染されていることを注記しており、製剤化した製品中で適切な量の賦形剤を使用する必要性を示している。

ｊ．他の一般的な賦形剤成分：薬学的保存剤
保存剤は、同じ容器から１回超取り出すことを伴う複数回使用の非経口製剤を開発する際に必要となる。これらの主な機能は、微生物増殖を阻害し、薬物製品の貯蔵寿命または使用期間にわたって製品の滅菌状態を確実にすることである。一般的に使用される保存剤には、ベンジルアルコール、フェノール、及びｍ－クレゾールが非限定的に含まれる。保存剤は長年使用されているものの、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は困難であり得る。保存剤は、ほぼ必ずタンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有し、このことが、それらの複数回投与タンパク質製剤中での使用を制限する主因となっている（ＲｏｙＳ，ｅｔａｌ．，ＪＰｈａｒｍＳｃＬ，９４（２）：３８２－９６（２００５））。

今日まで、ほとんどのタンパク質薬物は、単回使用のみのために製剤化されてきた。しかしながら、複数回投与製剤が可能であると、これらは、患者の便宜性、及び市場性の増大を可能にする追加の利点を有する。良い例は、保存剤入り製剤の開発によって、より簡便な複数回使用注射ペンの体裁が商用化された、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の例である。ｈＧＨの保存剤入り製剤を含む少なくとも４つのそのようなペン型デバイスが、現在市販されている。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（登録商標）（液体、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）、ＮｕｔｒｏｐｉｎＡＱ（登録商標）（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥－デュアルチャンバカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）はフェノールを含む一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）（ＥｌｉＬｉｌｌｙ）はｍ－クレゾールと共に製剤化される。

保存剤入り剤形の製剤開発中には、いくつかの局面を検討する必要がある。薬物製品中の効果的な保存剤濃度を最適化しなければならない。これには、剤形中の所与の保存剤を、タンパク質安定性を障害することなく抗微生物有効性を付与する濃度範囲で試験することが必要となる。例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、インターロイキン－１受容体（Ｉ型）のための液体製剤の開発において、３つの保存剤がスクリーニングを通過した。保存剤は、市販製品で一般的に使用される濃度での安定性に与えるその影響に基づいて、順位決定された（ＲｅｍｍｅｌｅＲＬＪｒ．，ｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．，１５（２）：２００－８（１９９８））。

保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥製品は、保存剤なしで凍結乾燥させ、使用時に、希釈剤を含有する保存剤を用いて再構成することができる。これにより、保存剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、関連する安定性リスクが大幅に最小化される。液体製剤では、保存剤の有効性及び安定性は、製品貯蔵寿命全体（約１８～２４か月）にかけて維持されなければならない。注記すべき重要な点は、保存剤の有効性が、活性薬物及びすべての賦形剤成分を含有する最終製剤中で示される必要があることである。

一部の保存剤は、注射部位反応を引き起こし得、これは保存剤の選択時に考慮が必要な別の要因である。ノルディトロピン中の保存剤及び緩衝液の評価に焦点を当てた臨床試験では、フェノール及びベンジルアルコールを含有する製剤において、ｍ－クレゾールを含有する製剤と比較して低い疼痛知覚が観察された（ＫａｐｐｅｌｇａａｒｄＡ．Ｍ．，ＨｏｒｍＲｅｓ．６２Ｓｕｐｐｌ３：９８－１０３（２００４））。興味深いことに、一般的に使用される保存剤の中でも、ベンジルアルコールは麻酔特性を有する（ＭｉｎｏｇｕｅＳＣ，ａｎｄＳｕｎＤＡ．，ＡｎｅｓｔｈＡｎａｌｇ．，１００（３）：６８３－６（２００５））。様々な態様において、保存剤の使用により、いずれの副作用にも勝る利益が得られる。

ｋ．薬学的製剤の調製方法
本発明は、さらに、薬学的製剤の調製方法を企図する。

本方法には、次のステップのうちの１つ以上がさらに含まれる：凍結乾燥の前に本明細書に記載の安定化剤を該混合物に添加するステップ、凍結乾燥の前に、各々本明細書に記載されている、増量剤、浸透圧調節剤、及び界面活性剤から選択される少なくとも１つの薬剤を該混合物に添加するステップ。

凍結乾燥した物質の標準的な再構成の実施は、ある量の純水または注射用滅菌水（ＷＦＩ）（典型的には、凍結乾燥中に除去した体積に等しい）を戻し入れることであるが、非経口投与用医薬品の製造には抗生物質の希釈溶液が使用される場合がある（Ｃｈｅｎ，ＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＰｈａｒｍａｃｙ，１８：１３１１－１３５４（１９９２））。したがって、本発明の凍結乾燥したｒＶＷＦ組成物に希釈液を添加するステップを含む、再構成されたｒＶＷＦ組成物を調製するための方法が提供される。

凍結乾燥した物質は、水溶液として再構成されてもよい。様々な水性担体、例えば、注射用滅菌水、複数回投与用途のための保存剤を含む水、または適量の界面活性剤を含む水（例えば、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性化合物を含有する水性懸濁液）。様々な態様において、そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、非限定的に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、及びアカシアガムであり、分散または湿潤剤は、自然発生のホスファチド、例えば、非限定的に、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えば、非限定的に、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えば、非限定的に、ヘプタデカエチル－エンオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの、エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物、例えば、非限定的に、ポリエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルである。様々な態様において、水性懸濁液は、１つ以上の保存剤、例えば、非限定的に、エチル、またはｎ－プロピル、ｐ－ヒドロキシ安息香酸も含有する。

ｌ．投与のための例示的なｒＶＷＦ製剤
いくつかの実施形態では、本方法は、治療の量を低減する（１００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌ）ために、高い効力（高いｒＶＷＦ濃度及び増強された長期安定性）を有する最終製品を可能にする増強された製剤を提供する。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約１００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約５００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約１０００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約２０００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約３０００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約４０００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約５０００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約６０００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約７０００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約８０００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、投与用の製剤中のｒＶＷＦ濃度は、約９０００ＩＵ／ｍｌ～１００００ＩＵ／ｍｌである。

いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、例えば、ヒスチジン、グリシン、アルギニンのようなアミノ酸を含む、１つ以上の双性イオン性化合物を含む。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、例えば、ポリソルベート８０、オクチルピラノシド、ジペプチド、及び／または両親媒性ペプチドを含む、最低で１つの疎水性基と１つの親水性基とを有する両親媒性特性を持つ成分を含む。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、例えば、ソルビトール、マンニトール、スクロース、またはトレハロースを含む、非還元糖または糖アルコールまたは二糖類を含む。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、生理学的浸透圧をもたらす、例えば塩化ナトリウムを含む無毒性水溶性塩を含む。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、ｐＨが、６．０～８．０の範囲である。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、ｐＨが、約６．０、約６．５、約７、約７．５、または約８．０である。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、及び／またはそれらの組み合わせを含む、ｒＶＷＦを安定させる１つ以上の二価カチオンを含む。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、投与の時点で生理学的浸透圧を有し、約７．０のｐＨで、約１ｍＭ～約５０ｍＭのグリシン、約１ｍＭ～約５０ｍＭのヒスチジン、約０～約３００ｍＭの塩化ナトリウム（例えば、３００ｍＭ未満のナトリウム）、約０．０１％～約０．０５％のポリソルベート２０（またはポリソルベート８０）、及び約０．５％～約２０％（ｗ／ｗ）のスクロースを含む。

いくつかの実施形態では、投与用の製剤は凍結乾燥することができる。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、安定であり、２℃～約８℃、及び約１８℃～約２５℃で、液体状態で貯蔵することができる。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、安定であり、約２℃～約８℃で、液体状態で貯蔵することができる。いくつかの実施形態では、投与用の製剤は、安定であり、約１８℃～約２５℃で、液体状態で貯蔵することができる。

ｍ．投与／投薬
組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、一態様において、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に」または「薬理学的に」許容されるという表現は、以下に記載のように、安定であり、凝集及び切断産物などタンパク質分解を阻害し、加えて、当該技術分野で周知の経路を使用して投与されるときにアレルギー反応または他の有害反応を生むことがない分子実体及び組成物を指す。「薬学的に許容される担体」には、上で開示された薬剤を含めて、ありとあらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌薬剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。

薬学的製剤は、経口、局所、経皮、非経口、吸入スプレーにより、経腟、経直腸、または頭蓋内注射により投与することができる。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射、または注入技法を含む。特定の部位での静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、及び／または肺内注射による投与も企図される。一般に、組成物は、発熱物質、及びレシピエントに有害であり得る他の不純物を本質的に含まない。

本発明に従い、ｒＶＷＦは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の非存在下で投与される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、本明細書で考察されるように、外科手術の前に投与される。いくつかの実施形態では、ｒＶＷＦは、外科手術の少なくとも１２時間前、少なくとも１３時間前、少なくとも１４時間前、少なくとも１５時間前、少なくとも１６時間前、少なくとも１７時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも１９時間前、少なくとも２０時間前、少なくとも２１時間前、少なくとも２２時間前、少なくとも２３時間前、または少なくとも２４時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術は小外科手術である。いくつかの実施形態では、外科手術は大外科手術である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、３５～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが、外科手術の少なくとも１２時間前、少なくとも１３時間前、少なくとも１４時間前、少なくとも１５時間前、少なくとも１６時間前、少なくとも１７時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも１９時間前、少なくとも２０時間前、少なくとも２１時間前、少なくとも２２時間前、少なくとも２３時間前、または少なくとも２４時間に投与される。いくつかの実施形態では、５０～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが、外科手術の少なくとも１２時間前、少なくとも１３時間前、少なくとも１４時間前、少なくとも１５時間前、少なくとも１６時間前、少なくとも１７時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも１９時間前、少なくとも２０時間前、少なくとも２１時間前、少なくとも２２時間前、少なくとも２３時間前、または少なくとも２４時間に投与される。いくつかの実施形態では、２０～４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが、外科手術の少なくとも１２時間前、少なくとも１３時間前、少なくとも１４時間前、少なくとも１５時間前、少なくとも１６時間前、少なくとも１７時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも１９時間前、少なくとも２０時間前、少なくとも２１時間前、少なくとも２２時間前、少なくとも２３時間前、または少なくとも２４時間に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術は大外科手術である。いくつかの実施形態では、外科手術は小外科手術である。いくつかの実施形態では、外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、約５０～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１２時間～２４時間前に投与される。いくつかの実施形態では、５０～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、外科手術は小外科手術である。いくつかの実施形態では、約５５～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、外科手術は小外科手術である。いくつかの実施形態では、約５０～５５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、外科手術は小外科手術である。いくつかの実施形態では、約５０ＩＵ／ｋｇ、約５２ＩＵ／ｋｇ、約５４ＩＵ／ｋｇ、約５６ＩＵ／ｋｇ、約５８ＩＵ／ｋｇ、または約６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが、外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、外科手術は小外科手術である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、約３５～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１２時間～２４時間前に投与される。いくつかの実施形態では、約３５～５５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、外科手術は大外科手術である。いくつかの実施形態では、約３０～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、外科手術は大外科手術である。いくつかの実施形態では、約４０～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、外科手術は大外科手術である。いくつかの実施形態では、約４５～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、外科手術は大外科手術である。いくつかの実施形態では、約５０～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、外科手術は大外科手術である。いくつかの実施形態では、約３５ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇ、約４５ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ、約５５ＩＵ／ｋｇ、または約６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが、外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、外科手術は大外科手術である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、該外科手術の１２時間～２４時間前の約２０～４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、該外科手術の１２時間～２４時間前の約２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、該外科手術の１２時間～２４時間前の約２５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、該外科手術の１２時間～２４時間前の約３０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、該外科手術の１２時間～２４時間前の約３５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、該外科手術の１２時間～２４時間前の約４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、本方法は、外科手術の１時間前にｒＶＷＦを投与する第２の治療前ステップを含む。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約５～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約２５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約３０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約３５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約４５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１５～９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約３０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約３５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約４５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約５５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約６５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約７０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約７５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約８０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約８５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約２０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約２５～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約３０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約２５～４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約４０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約２５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約３０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約３５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約４５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の１時間前に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、本方法は、外科手術中のｒＶＷＦの投与を含む。いくつかの実施形態では、約１０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約２０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約３０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約４０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約２０～４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約３０～４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、１０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約１５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約２５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約３０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約３５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約４５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、約５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが該外科手術中に投与され、該外科手術は口腔外科手術である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、約７０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約９０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１１０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１２０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１４０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１５０～２００ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１６０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１８０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１８０～２００ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１８０～１９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１９０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１９０～２１０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約２００～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約２１０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約８０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１００ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１１０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１３０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１７０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１８０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約１９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約２００ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約２１０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、約２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約７０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約８０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約９０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１００～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１１０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１２０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１３０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１００～１４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約９０～１４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１４０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約７０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約８０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１００ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１１０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１３０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、前処置は、外科手術の前に少なくとも２用量のｒＶＷＦを投与することを含む。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、前処置は、外科手術の前に少なくとも２用量のｒＶＷＦを投与することを含み、第１の用量は、第２の用量より多い。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１５０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１６０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１７０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１８０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１８０～２１０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１９０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１９０～２１０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２００～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１７０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１８０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約１９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２００ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２１０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、前処置は、ほぼ等しい少なくとも２用量のｒＶＷＦを外科手術の前に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約２０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約２５～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約３０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約２５～４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約３０～４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約４０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約４５～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約２５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約３０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約３５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約４５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが外科手術の後に投与される。いくつかの実施形態では、外科手術は口腔外科手術であり、前処置は、ほぼ等しい少なくとも２用量のｒＶＷＦを外科手術の前に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１００～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１１０～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１２０～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１３０～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１４０～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１５０～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１６０～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１７０～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１８０～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１９０～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１８０～２１０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１９０～２１０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約２００～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約２１０～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１００ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１１０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１３０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１４０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１５０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１６０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１７０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１８０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約２００ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約２１０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、約２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２２０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２３０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２４０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２５０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２６０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２７０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２８０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２８０～３１０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２９０～３１０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２９０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約３００～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約３００～３１０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２３０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２４０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２５０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２６０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２７０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２８０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約２９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約３００ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約３１０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、約３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約７０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約８０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約９０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１００～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１１０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１２０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１３０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１４０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１５０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１６０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１７０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１８０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約７０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約８０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１００ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１１０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１３０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１４０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１５０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１６０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１７０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１８０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、外科手術が口腔外科手術であるとき、約１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

いくつかの実施形態では、外科手術が大外科手術であるとき、前処置は、ほぼ等しい少なくとも２用量のｒＶＷＦを外科手術の前に投与することを含む。いくつかの実施形態では、投薬量は、上に列挙した投薬量である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、前処置は、外科手術の前に少なくとも２用量のｒＶＷＦを投与することを含む。いくつかの実施形態では、外科手術が小外科手術であるとき、前処置は、外科手術の前に少なくとも２用量のｒＶＷＦを投与することを含み、第１の用量は、第２の用量より多い。いくつかの実施形態では、投薬量は、上に列挙した投薬量である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。いくつかの実施形態では、外科手術は口腔外科手術であり、前処置は、ほぼ等しい少なくとも２用量のｒＶＷＦを外科手術の前に投与することを含む。いくつかの実施形態では、投薬量は、上に列挙した投薬量である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは投与されない。

一般に、１型ＶＷＤは、３０ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：ＲＣｏ、３０ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：Ａｇ、低いまたは正常なＦＶＩＩＩ、及び０．５～０．７ＩＵ／ｄＬ超のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比によって表される。２Ａ型ＶＷＤは、３０ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：ＲＣｏ、３０～２００ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：Ａｇ、低いまたは正常なＦＶＩＩＩ、及び０．５～０．７ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比によって表される。２Ｂ型ＶＷＤは、３０～２００ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：ＲＣｏ、３０ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：Ａｇ、低いまたは正常なＦＶＩＩＩ、及び通常は０．５～０．７ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比によって表される。２Ｍ型ＶＷＤは、３０ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：ＲＣｏ、３０～２００ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：Ａｇ、低いまたは正常なＦＶＩＩＩ、及び０．５～０．７ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比によって表される。２Ｎ型ＶＷＤは、３０～２０００ＩＵ／ｄＬのＶＷＦ：ＲＣｏ、３０～２００ＩＵ／ｄＬのＶＷＦ：Ａｇ、非常に低いＦＶＩＩＩ、及び０．５～０．７ＩＵ／ｄＬ超のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比によって表される。３型ＶＷＤは、３ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：ＲＣｏ、３ＩＵ／ｄＬ未満のＶＷＦ：Ａｇ、極度に低い（１０ＩＵ／ｄＬ未満の）ＦＶＩＩＩによって表され、ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比は適用されない。正常は、５０～２００ＩＵ／ｄＬのＶＷＦ：ＲＣｏ、５０～２００ＩＵ／ｄＬのＶＷＦ：Ａｇ、正常なＦＶＩＩＩ、及び０．５～０．７ＩＵ／ｄＬ超のＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ：Ａｇ比によって表される。いくつかの実施形態では、対象は３型ＶＷＤを有する。いくつかの実施形態では、対象は重度の１型ＶＷＤを有する。いくつかの実施形態では、対象は重度の２型ＶＷＤを有する。

Ｖ．外科手術
本発明の方法に従う外科手術は、大外科手術または小外科手術であり得る。

一般に、大手術には、より広範な切除、例えば、体腔への進入、臓器の除去、または通常の生体構造の改変が行われる、いずれかの侵襲的術式が含まれる。一般に、間充織バリア（例えば、胸腔、腹膜、髄膜）が開かれる場合、手術は大手術とみなされる。いくつかの実施形態では、大手術は、５００ｍＬ超の血液の損失、大量の体液移行、及び典型的には少なくとも一晩の入院が見込まれるものである。例示的な大外科手術には、肥満手術／胃バイパス、中隔心筋切除術、膵切除術、胸部大動脈解離修復、食道切除術、膀胱摘出、冠動脈血行再建術、脊椎骨髄炎手術、外科的心室修復、頭蓋骨切除術、腹腔鏡手術（胆嚢摘出術及び卵管結紮術を除く）、器官の開腹切除、大関節置換術、再建を伴う乳房切除、ならびに／または脊椎、胸部、血管、及び／もしくは頭蓋内手術が含まれるが、これらに限定されない。大手術のさらなる例には、上顎もしくは下顎骨切り術、喉頭切除術、一晩の入院を要する大型の良性もしくは悪性塊の切除術及び／またはリンパ節郭清（再建手術の有無を問わず）、即時組織再建を伴う乳房切除（リンパ節生検または腋窩切開の有無を問わず）、腹腔鏡下もしくは回復修復術もしくは切除（例えば、胃、小腸、結腸、肝臓、膵臓、脾臓、副腎、または肝臓）、開腹胆嚢摘出術、大型の瘢痕、上腹部、もしくは腹壁ヘルニア修復術、子宮鏡下切除もしくはアブレーション、子宮摘出術及び／もしくは付属器手術、広範な子宮内膜症の腹腔鏡検査、腹部もしくは経膣の骨盤底手術、頭蓋内手術、脊椎椎弓切除述及び／もしくは固定術、膝関節置換術、股関節置換術、肩関節置換術、肘関節置換術、金属物除去または感染もしくは不具合のための補正、切断術、脊椎椎弓切除術及び／もしくは固定術、遊離皮弁再建（整形外科）、脂肪層切除、縦隔鏡検査、肺切除術、食道切除術、縦隔腫瘤切除術（胸腔鏡下または開腹）、裂孔ヘルニア修復（胸腔鏡下または開腹）、膀胱腫瘍切除術（経尿道的または開腹）、前立腺腫瘍（経尿道的または開腹）、腎臓切除の切除術（腹腔鏡下または開腹）、尿管切除術（腹腔鏡下または開腹）、精巣の切除術（経陰嚢的または腹部）、切断術、末梢動脈バイパス手術、大動脈瘤修復術（血管内または開腹）、ならびに／あるいは頸動脈内膜剥離術が含まれるが、これらに限定されない。

小手術は、皮膚または粘膜及び結合組織のみが切除される任意の侵襲的術式、例えば、カテーテル挿入のための血管切開、皮下組織へのポンプの埋め込みである。小外科手術には、典型的には、全身麻酔を使用せずにまたは呼吸補助を必要とせずに外来環境で安全に行うことができる任意の手順が含まれる。いくつかの実施形態では、小手術は、５００ｍＬ未満の血液の損失、最小量の体液移行が見込まれ、典型的には外来で行われるものである（日帰り手術／同日退院）。そのような外来外科手術には、白内障手術、再建なしの乳房手術、腹腔鏡下胆嚢摘出術及び卵管結紮、ならびにほとんどの皮膚手技、表面的手技、内視鏡下手技、及び関節鏡下手技が含まれ得るが、これらに限定されない。小手術のさらなる例には、抜歯、扁桃摘出術、アデノイド切除術、鼻中隔形成術、鼻甲介切除術、鼻形成術、咽頭生検、喉頭生検、レーザーもしくは他の手段による小規模な切除術、中耳手術、乳様突起削開術、蝸牛移植、内視鏡下副鼻腔手術、良性及び悪性塊の小規模な切除術（外来として行われるもの、すなわち、下顎隆起、上腕裂嚢胞、小型の舌癌）、甲状腺摘出術、乳腺腫瘤摘出術（リンパ節生検または腋窩切開の有無にかかわらず）、乳房切除（リンパ節生検または腋窩切開の有無にかかわらず）、鼠径ヘルニア修復術（腹腔鏡下または開腹アプローチ）、臍ヘルニア修復術（腹腔鏡下または開腹アプローチ）、腹腔鏡下胆嚢摘出術、痔核切除術、拡張術、掻爬術、診断用子宮鏡検査法、腹腔鏡検査、サーマルバルーンによる子宮内膜アブレーション、卵管結紮術、腹腔鏡検査－限られた子宮内膜症、経膣テープ挿入、椎間板切除術、白内障摘出術、大部分の眼科学的処置、関節鏡視下手術（ＡＣＬ修復術を含む）、通常の金属物除去（感染のためではないもの）、腱手術、腱膜瘤切除術、椎間板切除術、手根管開放術、デュピュイトラン拘縮解放、腱大手術、腱小手術、小規模な回転皮弁及び皮膚移植、基底細胞切除術、脂肪腫切除、乳房縮小及び良性乳房疾患のための他の手術、美容乳房手術、気管支鏡検査法、膀胱鏡検査、尿管鏡検査、結石のためのレノスコピー（ｒｅｎｏｓｃｏｐｙ）、狭窄のためのレノスコピー、生検のためのレノスコピー、睾丸瘤切除術、精索静脈瘤切除術、精管切除術、包皮環状切除術、ならびに／または静脈瘤切除術が含まれるが、これらに限定されない。

口腔外科手術には、例えば抜歯を含む様々な歯科手術及び口腔手術が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、外科手術は大外科手術である。いくつかの実施形態では、外科手術は小外科手術である。いくつかの実施形態では、外科手術は口腔外科手術である。

実施例１：ＲＶＷＦの止血有効性及び安全性
この試験では、ＡＤＶＡＴＥ（抗血友病因子［組換え］）、ＢａｘａｌｔａＵＳＩｎｃ．，ＷｅｓｔｌａｋｅＶｉｌｌａｇｅ，ＣＡ（ｒＦＶＩＩＩ）を用いる場合と用いない場合とで、待機手術を受ける重度のＶＷＤを患う患者におけるｒＶＷＦの止血有効性及び安全性を評価した。

方法
待機手術を受ける予定である重度のＶＷＤを有した１８歳以上の患者における１０か国１４施設での第３相非盲検非対照非無作為化試験（ＮＣＴ０２２８３２６８）。患者を手術後１４日間にわたってモニタリングした。

処置
手術の１２～２４時間前に、ｒＶＷＦ４０～６０ＩＵ／ｋｇｒＶＷＦ：ＲＣｏを静脈内投与して、内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを３０ＩＵ／ｄＬ以上（小／口腔手術）または６０ＩＵ／ｄＬ以上（大手術）に増加させた。ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを、手術開始前３時間以内に評定した。目標ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルが達成された場合、手術の１時間前にｒＶＷＦを単独で投与して、表２に示すピークレベルを達成した。目標ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルが達成された場合、手術の１時間前にｒＶＷＦを単独で投与して、表２に示すピークレベルを達成した。術中及び術後の投薬を、薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）結果に従って目標トラフレベルを維持するように個別化し、止血チャレンジの強度及び期間も同様にした。

（表２）ＶＷＦ：ＲＣｏ及びＦＶＩＩＩ：Ｃの目標レベル：
術中及び術後の過剰出血を防止するための推奨

ＢＷ＝体重、ＦＶＩＩＩ：Ｃ＝第ＶＩＩＩ因子活性、ＩＲ＝段階的回収率、ｒＶＷＦ＝組換えフォンヴィレブランド因子、ＶＷＦ：ＲＣｏ＝フォンヴィレブランド因子リストセチン補因子活性。
^＊推奨されるＦＶＩＩＩ：Ｃ目標ピーク血漿レベルを得るために、追加のｒＦＶＩＩＩが必要とされてもよい。
†手術前１時間以内に投与。
‡ＩＲが入手可能でない場合、ＩＵ／ｋｇあたり２．０ＩＵ／ｄＬのＩＲと仮定する。
ΔＶＷＦ：ＲＣｏ＝目標ピーク血漿ＶＷＦ：ＲＣｏ－ベースライン血漿ＶＷＦ：ＲＣｏ。

評定
全体止血有効性（主要評価項目）を、最後の周術期注入から２４時間の時点または試験完了時のいずれか早い方で、治験責任医師が評定した（表３）。術中止血有効性は、術中の実際の血液損失対予測血液損失とともに、執刀医が評定した（表３）。安全性評価には、有害事象（ＡＥ）、ならびにｒＶＷＦ、ｒＦＶＩＩＩ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）タンパク質、マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、及びｒフューリンに対する抗体が含まれた。

（表３）全体^＊及び術中†止血有効性格付けスケール

ｒＦＶＩＩＩ＝組換え第ＶＩＩＩ因子、ｒＶＷＦ＝組換えフォンヴィレブランド因子。
＊治験責任医師が評定する。
†執刀医が評定する。

統計
記述的分析には、ＣｌｏｐｐｅｒＰｅａｒｓｏｎ検定を使用して「優良／良好」と格付けされた止血有効性を有する患者の数についての、点推定値及び９０％ＣＩが含まれた。ＰＫ／ＰＤ及び安全性は、記述統計を使用して要約した。

結果
患者

（表４）ベースライン人口統計及び臨床特性

ＢＭＩ＝体格指数、ＦＶＩＩＩ：Ｃ＝第ＶＩＩＩ因子活性、ＶＷＤ＝フォンヴィレブランド病、ＶＷＦ：ＲＣｏ＝フォンヴィレブランド因子リストセチン補因子活性。

全体止血有効性を、１５人すべての患者について「優良」または「良好」として格付けした（９０％ＣＩ：８１．９～１００．０）（図１）。

有効性
全体止血有効性を、１５人すべての患者について「優良」または「良好」として格付けした（９０％ＣＩ：８１．９～１００．０）（図１）。

術中止血有効性を、１５人すべての患者について「優良」または「良好」として格付けした（９０％ＣＩ：８１．９～１００．０）（図２）。３型ＶＷＤを患う８人の患者のなかで、全体及び術中止血有効性は、ともに、７人の患者について「優良」及び１人の患者について「良好」と格付けした。予測血液損失と比べた平均±ＳＤ術中実血液損失は、７０％±４５％であり、１３人の患者について「優良」及び２人の患者について「良好」と格付けした。

曝露
手術出血を防止または治療するために、患者に合計１０４回のｒＶＷＦ注入を行い、ｒＶＷＦの全体手術用量中央値は２２０．４ＩＵ／ｋｇであった（範囲、６３．８～６４８．４ＩＵ／ｋｇ）（表４）。９３回（８９．４％）のｒＶＷＦ単独の注入：１５回（手術の１２～２４時間前）、１２回（手術の１時間前）、及び６６回（術後）。１１回（１０．６％）のｒＦＶＩＩＩを伴うｒＶＷＦの注入：３回（手術の１時間前）、１回（術中）、７回（術後）。５人の患者に、１１回のｒＦＶＩＩＩを伴うｒＶＷＦの注入を行い、７回のｒＦＶＩＩＩを伴うｒＶＷＦの術後注入のうちの６回は１人の患者に行った。

大手術を受ける１０人の患者のうち、７人（７０％）にはｒＦＶＩＩＩ同時投与は必要とされなかった。

（表５）全ｒＶＷＦ曝露の中央値及び手術分類

ｒＶＷＦ＝組換えフォンヴィレブランド因子。
＊術前準備注入、術前初期ローディング用量、術前補充ローディング用量、術中用量、及び術後用量の合計回数。

安全性
６人の患者が、１２件の治療中に発生したＡＥを報告し、そのいずれも治療に関係があるとはみなされなかった。患者は重篤なＡＥ（憩室炎及び深部静脈血栓［ＤＶＴ］、各々１人の患者に生じた）を有し、いずれの事象も因子代置治療に関係があるとはみなされなかった。

重篤なＤＶＴは術後８日目に生じた（最初、術後４日目に重篤でないＤＶＴとして報告された）。この事象は、無症候性であり、慣例の複式スキャンの後に観察された。この事象は、ｒＶＷＦに関係している可能性が低く、ｒＦＶＩＩＩまたは試験手技とは関係がないと評定し、原因としては、患者の大手術（全人工股関節置換術）及び現行の肥満の病歴と因果関係があった。ＦＶＩＩＩ：Ｃの術後レベルは、１５０ＩＵ／ｄＬを超過することは決してなかった。この事象を理由に大静脈フィルタを設置し、その後、事象は後遺症なく消散した。重篤なアレルギー反応なし；ｒＦＶＩＩＩ、ＣＨＯタンパク質、マウスＩｇＧ、またはｒフューリンに対する中和抗体。

人工膝関節置換術の大手術中に濃厚赤血球の術中輸血を受けたＶＷＤ３型を患う１人の患者が、術後７日目にＶＷＦに対する結合性抗体について試験で陽性を示した。

ＰＫ分析を受けた患者（ｎ＝１１）についてのＶＷＦ：ＲＣｏのＰＫパラメータを図４に示す。ＶＷＦ：ＲＣｏ、ＶＷＦ：Ａｇ、及びＶＷＦコラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢ）の濃度中央値は、３０分までにピークレベルに達し、注入後７２時間かけて徐々に減退した（図４）。

ｒＶＷＦ単独の投与により、注入から６～１２時間後、内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルが大幅かつ急速に安定し、評定したすべての患者（ｎ＝１１、図５Ａ）にわたって、また３型ＶＷＤを患う患者のサブセット（ｎ＝５、図５Ｂ）において、２４時間までにピークＦＶＩＩＩ：Ｃレベルが達成された。全体としては、患者は、注入後６時間までに６０ＩＵ／ｄＬ超の平均ＦＶＩＩＩ：Ｃを達成し（図５Ａ）、ベースラインＦＶＩＩＩ：Ｃがより高い患者（例えば、１型または２型ＶＷＤを患う患者）は、目標レベルをより迅速に達成することができた。ベースライン時に２ＩＵ／ｄＬ未満の平均ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを有したにもかかわらず、ｒＶＷＦ単独の投与で、３型ＶＷＤを患う患者は、目標のＶＷＦ：ＲＣｏ及びＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを迅速に達成でき、注入から１２時間後に６０ＩＵ／ｄＬ超のＦＶＩＩＩ：Ｃが達成された（図５Ｂ）。

結論
この手術試験では、１５人すべての患者について、全体及び術中止血有効性を「優良」または「良好」と格付けした。大手術については、全体止血有効性は、７人の患者で「優良」、３人の患者で「良好」であり、術中有効性は、８人の患者で「優良」、２人の患者で「良好」であった。術中及び術後の止血を達成した注入のほぼ９０％がｒＶＷＦ単独によるものであり、大手術の７０％がｒＶＷＦ単独により管理された。ｒＶＷＦは主要なＶＷＤ機能不全を標的にし、これにより、医師はＦＶＩＩＩ蓄積を懸念することなく最適な有効性の達成に集中できるようになる。これらのデータにより、大手術及び小手術におけるｒＶＷＦの安全かつ効果的な使用が支持される。

実施例２：手術を受ける重度のフォンヴィレブランド病を患う対象における組換えフォンヴィレブランド因子
この実施例では、手術を受ける、フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）を患う対象の治療を検査する試験からの試験結果を提供する。

評価基準：
主要評価基準：
治験責任医師（血友病医）が評定した全体止血有効性［タイムフレーム：最後の周術期注入から２４時間後、または１４日目（±２日）の来院終了時のいずれか早い方］。止血有効性を、優良－良好－中度－なしのスケールで格付けした。
・優良：ＡＤＶＡＴＥと併せたｒＶＷＦまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかったｒＶＷＦを用いて達成した術中及び術後の止血が、止血が正常な対象に行った外科手術の種類について予測されたものと同程度に良好またはそれよりも良好であった。
・良好：ＡＤＶＡＴＥと併せたｒＶＷＦまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかったｒＶＷＦを用いて達成した術中及び術後の止血が、止血が正常な対象に行った外科手術の種類について予測されたものとおおむね同程度に良好であった。
・中度：ＡＤＶＡＴＥと併せたｒＶＷＦまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかったｒＶＷＦを用いた術中及び術後の止血が、行った処置の種類について最適なものを明らかに下回ったが、ｒＶＷＦ濃度を変更する必要なく維持された。
・なし：適切な投薬にもかかわらず不十分な治療応答に起因した制御されない出血が参加者に認められ、ｒＶＷＦ濃度の変更が必要とされた。

副次的な評価基準：
＃１：執刀医が評定した術中の実血液損失対予測血液損失［タイムフレーム：０日目（手術完了時）］。予測血液損失は、参加者と性別、年齢、身長、及び併存疾患が同じである、止血が正常な個人を基に、執刀医が術前に推定した。実血液損失は、麻酔医の記録に準じ、手術中のスワブ、タオル、及び吸引へのものを含め、予測血液損失からなった。

＃２：予測血液損失と比べた術中の実血液損失［タイムフレーム：０日目（手術完了時）］。予測血液損失と比べた実血液損失は、［実血液損失（ｍＬ）］を［予測血液損失（ｍＬ）］で割ったものに１００を掛けて計算した。

＃３：執刀医が評定した術中の実血液損失対予測血液損失スコア［タイムフレーム：０日目（手術完了時）］
・止血有効性を、優良－良好－中度－なしのスケールで格付けした。
・優良：術中血液損失は、止血が正常な対象に行った手術の種類について予測された最大血液損失以下であった（１００％以下）。
・良好：術中血液損失は、止血が正常な対象に行った手術の種類についての最大予測血液損失より最大で５０％大きかった（１０１～１５０％）。
・中度：術中血液損失は、止血が正常な対象に行った手術の種類についての最大予測血液損失より５０％大きかった（１５０％超）。
・なし：凝固因子代替レジメンの変更が必要とされた、適切な投薬にもかかわらず不十分な治療応答に起因した制御されない出血。

＃４：執刀医が評定した術中止血有効性スコア［タイムフレーム：０日目（手術完了時）］
・止血有効性を、優良－良好－中度－なしのスケールで格付けした。
・優良：ＡＤＶＡＴＥと併せたｒＶＷＦまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかったｒＶＷＦを用いて達成した術中の止血は、止血が正常な対象に行った外科手術の種類について予測されたものと同程度に良好またはそれよりも良好であった。
・良好：ＡＤＶＡＴＥと併せたｒＶＷＦまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかったｒＶＷＦを用いて達成した術中の止血は、止血が正常な対象に行った外科手術の種類について予測されたものとおおむね同程度に良好であった。
・中度：ＡＤＶＡＴＥと併せたｒＶＷＦまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかったｒＶＷＦを用いた術中の止血は、行った処置の種類について最適なものを明らかに下回ったが、ｒＶＷＦ濃度を変更する必要なく維持された。
・なし：適切な投薬にもかかわらず不十分な治療応答に起因した制御されない出血が参加者に認められ、ｒＶＷＦ濃度の変更が必要とされた。

＃５：ＡＤＶＡＴＥと併せたｒＶＷＦまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかったｒＶＷＦの術中及び術後の重量調整日用量［タイムフレーム：毎日、手術日から術後１４日目（±２日）まで］

＃６：有害事象の発生［タイムフレーム：治験薬の最初の注入から試験完了まで（すなわち、手術から１４（±２）日後）まで］。治療に関係がある有害事象（ＴＥＡＥ）及び治療に関係がある重篤な有害事象（ＴＥＳＡＥ）を評価した。

＃７：血栓事象の発生［タイムフレーム：治験薬の最初の注入から試験完了まで（すなわち、手術から１４（±２）日後）まで］。血栓事象について、治療に関係がある有害事象（ＴＥＡＥ）及び治療に関係がある重篤な有害事象（ＴＥＳＡＥ）を評価した。

＃８：重篤なアレルギー反応（例えば、アナフィラキシー）の発生［タイムフレーム：治験薬の最初の注入から試験完了まで（すなわち、手術から１４（±２）日後）まで］。重篤なアレルギー反応について、治療に関係がある有害事象（ＴＥＡＥ）及び治療に関係がある重篤な有害事象（ＴＥＳＡＥ）を評価した。

＃９：フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に対する阻害性及び全結合性抗体、ならびに第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する阻害性抗体が生じた参加者の数［タイムフレーム：試験は、スクリーニング時、ＰＫ注入前、手術前、過剰な出血または説明のつかない出血の場合に手術後、術後７日目、及び試験終了来院時（すなわち、手術から１４（±２）日後）にわたって行った］。ＡＤＶＡＴＥと併せたまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかった組換えフォンヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）により、参加者を治療した。

＃１０：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）タンパク質、マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、または組換えフューリン（ｒフューリン）に対する抗体を生じた参加者の数［タイムフレーム：試験は、スクリーニング時、ＰＫ注入前、手術前、過剰な出血または説明のつかない出血の場合に手術後、術後７日目、及び試験終了来院時（すなわち、手術から１４（±２）日後）にわたって行った。］ＡＤＶＡＴＥと併せたまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかった組換えフォンヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）により、参加者を治療した。

＃１１：薬物動態：注入から０～７２時間後の血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０～７２時間／用量）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］この評定は、大手術を受ける対象のみに必須とした。対象に、手術の４２日前以内に５０±５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ：ＲＣｏの用量でＰＫ注入を施した。注入から０～７２時間後の血漿濃度／時間曲線下面積を、線形台形法則を使用して計算した。ＡＵＣ（０～７２ｈ）の計算のため、７２時間でのレベルを２つの最も近いサンプリング時点から線形内挿／外挿した。以下の分析物に対してＰＫ分析を行った：ＶＷＦリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）、ＶＷＦ抗原活性（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦコラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢ）、ＩＮＮＯＶＡＮＣＥＶＷＦＡｃアッセイ測定ＶＷＦ活性（ＶＷＦ：Ａｃ）、ＦＶＩＩＩ凝固活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）。

＃１２：薬物動態：時間０から無限大時間の血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０～∞／用量）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］この評定は、大手術を受ける対象のみに必須とした。対象に、手術の４２日前以内に５０±５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ：ＲＣｏの用量でＰＫ注入を施した。時間０から無限大時間の血漿濃度／時間曲線下面積及び時間０から無限大時間の一次モーメント曲線下面積は、時間０から最後の定量化可能な濃度の時間までのＡＵＣまたはＡＵＭＣに、それぞれＣｔ／λｚ及びＣｔ／λｚ（ｔ＋１／λｚ）として計算した尾部面積補正を足した合計として計算し、ここで、Ｃｔは、最後の定量可能な濃度であり、ｔは、最後の定量可能な濃度の時間であり、λｚは、終末相または動態速度定数であった。以下の分析物に対してＰＫ分析を行った：ＶＷＦリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）、ＶＷＦ抗原活性（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦコラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢ）、ＩＮＮＯＶＡＮＣＥＶＷＦＡｃアッセイ測定ＶＷＦ活性（ＶＷＦ：Ａｃ）、ＦＶＩＩＩ凝固活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）。

＃１３：薬物動態：平均滞留時間（ＭＲＴ）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］この評定は、大手術を受ける対象のみに必須とした。対象に、手術の４２日前以内に５０±５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ：ＲＣｏの用量でＰＫ注入を施した。平均滞留時間は、時間０から無限大時間の一次モーメント曲線下面積を時間０から無限大時間の曲線下面積で割り、Ｔ／２を引いたものとして計算し、ここで、Ｔは注入の期間であった。以下の分析物に対してＰＫ分析を行った：ＶＷＦリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）、ＶＷＦ抗原活性（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦコラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢ）、ＩＮＮＯＶＡＮＣＥＶＷＦＡｃアッセイ測定ＶＷＦ活性（ＶＷＦ：Ａｃ）。

＃１４：薬物動態：クリアランス（ＣＬ）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］この評定は、大手術を受ける対象のみに必須とした。対象に、手術の４２日前以内に５０±５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ：ＲＣｏの用量でＰＫ注入を施した。クリアランスは、用量（ＩＵ／ｋｇ）を時間０から無限大時間の曲線下面積で割ったものとして計算した。以下の分析物に対してＰＫ分析を行った：ＶＷＦリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）、ＶＷＦ抗原活性（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦコラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢ）、ＩＮＮＯＶＡＮＣＥＶＷＦＡｃアッセイ測定ＶＷＦ活性（ＶＷＦ：Ａｃ）。

＃１５：薬物動態：段階的回収率（ＩＲ）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］この評定は、大手術を受ける対象のみに必須とした。対象に、手術の４２日前以内に５０±５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ：ＲＣｏの用量でＰＫ注入を施した。段階的回収率は、（Ｃｍａｘ－Ｃ注入前）を用量（ＩＵ／ｋｇ）で割ったものとして計算し、ｋｇは投薬時の体重を指し、Ｃｍａｘは注入前の値に対する補正前の観察された最大濃度であった。以下の分析物に対してＰＫ分析を行った：ＶＷＦリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）、ＶＷＦ抗原活性（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦコラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢ）、ＩＮＮＯＶＡＮＣＥＶＷＦＡｃアッセイ測定ＶＷＦ活性（ＶＷＦ：Ａｃ）。

＃１６：薬物動態：排出相半減期（Ｔ１／２）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］この評定は、大手術を受ける対象のみに必須とする。対象に、手術の４２日前以内に５０±５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ：ＲＣｏの用量でＰＫ注入を施した。終末相または動態半減期（Ｔ１／２）は、ｌｎ２／λｚとして計算し、ここで、λｚは、少なくとも３つの定量化可能な濃度を使用してＷｉｎＮｏｎｌｉｎＮＣＡにおいて計算した終末相排出速度定数であった。以下の分析物に対してＰＫ分析を行った：ＶＷＦリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）、ＶＷＦ抗原活性（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦコラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢ）、ＩＮＮＯＶＡＮＣＥＶＷＦＡｃアッセイ測定ＶＷＦ活性（ＶＷＦ：Ａｃ）。

＃１７：薬物動態：定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］この評定は、大手術を受ける対象のみに必須とする。対象に、手術の４２日前以内に５０±５ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦ：ＲＣｏの用量でＰＫ注入を施した。Ｖｓｓは、クリアランスに平均滞留時間を掛けたものとして計算した。以下の分析物に対してＰＫ分析を行った：ＶＷＦリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）、ＶＷＦ抗原活性（ＶＷＦ：Ａｇ）、ＶＷＦコラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢ）、ＩＮＮＯＶＡＮＣＥＶＷＦＡｃアッセイ測定ＶＷＦ活性（ＶＷＦ：Ａｃ）。

適格性基準：
試験に適格とされる年齢：１８歳以上、試験に適格とされる性別：すべて

組み入れ基準：
以下に列挙する重度のフォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）と診断されていること、及び待機外科手術が計画されていること：
・１．１型（フォンヴィレブランド因子：リストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）が２０ＩＵ／ｄＬ未満）、または
・２．２Ａ型（多量体パターンにより確認）、２Ｂ型（表現型により診断）、２Ｎ型（ＦＶＩＩＩ：Ｃが１０％未満であり、遺伝子学が過去に確認されている）、２Ｍ型、または
・３．３型（フォンヴィレブランド因子抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）３ＩＵ／ｄＬ以下）

出血を制御するためにフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）濃縮物による代替療法を必要とした前歴があるＶＷＤ。

３型ＶＷＤ（ＶＷＦ抗原／ＶＷＦ：Ａｇが３ＩＵ／ｄＬ以下）の場合、参加者は、少なくとも２０日のＶＷＦ／ＦＶＩＩＩ凝固因子濃縮物（寒冷沈降物または新鮮な凍結血漿を含む）への曝露の医療歴を有すること。

１型または２型ＶＷＤの場合、参加者は、５日の曝露、またはＶＷＦ／ＦＶＩＩＩ凝固因子濃縮物（寒冷沈降物または新鮮な凍結血漿を含む）を必要とする過去の大手術の医療歴を有すること。

参加者は、少なくとも１８歳であったこと。

妊娠の可能性がある女性である場合、参加者は、陰性の妊娠検査を提示すること。

該当する場合、参加者は、試験期間中、適正な避妊方法の使用に同意すること。

参加者は、治験実施計画書の要件を遵守する意思があり、それが可能であること。

選択された除外基準：
偽性ＶＷＤまたは別の遺伝性もしくは後天性凝固障害（例えば、質的及び数的血小板障害または１．４超の上昇したプロトロンビン時間［ＰＴ］／国際標準比［ＩＮＲ］）であると診断されている。

スクリーニング時にＶＷＦ阻害剤の前歴または存在がある。

力価が０．４ＢＵ以上（ナイメゲン変法ベセスダアッセイにより）または０．６ＢＵ以上（ベセスダアッセイによる）である第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）阻害剤の前歴または存在がある。

マウスまたはハムスターのタンパク質などの、被験薬物の成分のいずれかに対する過感受性が分かっている。

季節性アレルギー性鼻炎／結膜炎、軽度の喘息、食物アレルギー、または動物アレルギーを除く免疫障害の病歴を有する。

血栓塞栓事象の病歴を有する。

ＣＤ４絶対数が２００／ｍｍ^３未満のＨＩＶ陽性である。

血小板数が１００，０００／ｍＬ未満である。

次のうちのいずれかから明らかな重大な肝臓疾患と診断されている参加者：正常な上限の５倍である血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、低アルブミン血症、門脈高血圧（例えば、他の理由では説明できない脾腫の存在、食道静脈瘤の前歴）、または小児ＢもしくはＣと分類された肝硬変。

クレアチニンレベルが２．５ｍｇ／ｄＬ以上の腎臓疾患と診断されている。

インフォームドコンセントに署名する前３０日以内に、局所治療（例えば、軟膏、鼻腔用スプレー）を除く免疫調節薬による治療を受けたことがある参加者。

インフォームドコンセント取得時に妊娠中または授乳中であった参加者。

登録前３０日以内にＡＤＶＡＴＥと併せたもしくはＡＤＶＡＴＥと併せなかったｒＶＷＦ以外の治験薬（ＩＰ）、または治験医療機器が関与する別の臨床試験に参加しているか、あるいは本試験の経過中にＩＰまたは治験デバイスが関与する別の臨床試験に参加する予定があった参加者。しかしながら、ｒＶＷＦ予防試験（０７１３０１）に参加している適格患者は登録してもよい。

進行性の致死的疾患を有する及び／または寿命が３か月未満である。

結果：
登録は、１０か国（米国、オーストラリア、台湾、ドイツ、ロシア、スペイン、ウクライナ、英国、イタリア、トルコ）、１４か所の施設で実施した。

（表６）報告群

（表６）参加者：試験全体

（表７）ベースライン測定

主要評価項目：評価項目＃１

（表８）評価基準
１．主要項目：治験責任医師（血友病医）が評定した全体止血有効性［タイムフレーム：最後の周術期注入の２４時間後または１４日目（±２日）の来院の終了時のいずれか早い方］。

（表９）主要評価項目＃１

集団説明評価項目＃１
大手術、小手術、及び口腔手術を受ける参加者の数と、フォンヴィレブランド１型、２Ａ型、２Ｂ型、２Ｍ型、及び３型を患う参加者の数とを合計すると、分析した参加者の全体数となる。治験薬を服用し、少なくとも１回の止血評定を受けるすべての参加者を含む完全分析データセットを分析に使用した。

（表１０）報告群評価項目＃１

（表１１）測定値評価項目＃１

副次的な評価項目：評価項目＃２
２．副次項目：執刀医が評定した術中の実血液損失対予測血液損失［タイムフレーム：０日目（手術完了時）］

（表１２）主要評価項目＃２

集団説明評価項目＃２
予測血液損失について、１人の参加者（大手術報告群に含まれた）の予測血液損失が収集されなかったため、分析した参加者の数は１４人であった。治験薬を服用し、少なくとも１回の止血評定を受けたすべての参加者を含む完全分析データセットを分析に使用した。

（表１３）報告群評価項目＃２

（表２６）測定値評価項目＃２

［１］１人の参加者しか分析しなかったため、標準偏差は有り得ない。
執刀医が評定した術中の実血液損失対予測血液損失に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃３
３．副次項目：予測血液損失と比べた術中の実血液損失［タイムフレーム：０日目（手術完了時）］

（表１４）評価項目＃３

集団説明評価項目＃３
３人の参加者の実血液損失及び予測血液損失がゼロであり、１人の参加者の予測血液損失が収集されなかったため、分析した参加者の数は１１人であった。したがって、「予測血液損失と比べた実血液損失」を計算することができなかった。この評価項目の分析には、完全分析データセットを使用した。

（表１５）報告群評価項目＃３

（表１６）測定値

［１］１人の参加者しか分析しなかったため、標準偏差は有り得ない。
予測血液損失と比べた術中の実血液損失に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃４
４．副次項目：執刀医が評定した術中の実血液損失対予測血液損失スコア［タイムフレーム：０日目（手術完了時）］

（表１７）評価項目＃４

（表１８）集団説明評価項目＃４

（表１９）報告群評価項目＃４

（表２０）測定値評価項目＃４

執刀医が評定した術中の実血液損失対予測血液損失スコアに関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃５
５．副次項目：執刀医が評定した術中止血有効性スコア［タイムフレーム：０日目（手術完了時）］

（表２１）評価項目＃５

（表２２）集団説明評価項目＃５

（表２３）報告群評価項目＃５

（表２４）測定値評価項目＃５

執刀医が評定した術中止血有効性スコアに関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃６
６．副次項目：ＡＤＶＡＴＥと併せたｒＶＷＦまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかったｒＶＷＦの術中及び術後の重量調整日用量［タイムフレーム：毎日、手術日から術後１４日目（±２日）まで］

（表２５）評価項目＃６

（表２５）集団説明評価項目＃６

（表４０）報告群評価項目＃６

（表２６）：測定値評価項目＃６

ＡＤＶＡＴＥと併せたｒＶＷＦまたはＡＤＶＡＴＥと併せなかったｒＶＷＦの術中及び術後の重量調整日用量に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃７
７．副次項目：有害事象の発生［タイムフレーム：治験薬の最初の注入から試験完了まで（すなわち、手術から１４（±２）日後）まで］。

（表２７）評価項目＃７

（表２８）集団説明評価項目＃７

（表２９）報告群評価項目＃７

（表３０）測定値

有害事象の発生に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃８
８．副次項目：血栓事象の発生［タイムフレーム：治験薬の最初の注入から試験完了まで（すなわち、手術から１４（±２）日後）まで］

（表３１）評価項目＃８

（表３２）集団説明評価項目＃８

（表３３）報告群

（表３４）測定値評価項目＃８

血栓事象の発生に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃９
９．副次項目：重篤なアレルギー反応（例えば、アナフィラキシー）の発生［タイムフレーム：治験薬の最初の注入から試験完了まで（すなわち、手術から１４（±２）日後）まで］

（表３５）評価項目＃９

（表３６）集団説明評価項目＃９

（表３７）報告群評価項目＃９

（表３８）測定値評価項目＃９

重篤なアレルギー反応（例えば、アナフィラキシー）の発生に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃１０
１０．副次項目：フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に対する阻害性及び全結合性抗体、ならびに第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する阻害性抗体が生じた参加者の数［タイムフレーム：試験は、スクリーニング時、ＰＫ注入前、手術前、過剰な出血または説明のつかない出血の場合に手術後、術後７日目、及び試験終了来院時（すなわち、手術から１４（±２）日後）にわたって行った。］

（表３９）集団説明評価項目＃１０

（表４０）集団説明評価項目＃１０

（表４１）報告群評価項目＃１０

（表５５）測定値評価項目＃１０

フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に対する阻害性及び全結合性抗体、ならびに第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に対する阻害性抗体が生じた参加者の数に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃１１
１１．副次項目：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）タンパク質、マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、または組換えフューリン（ｒフューリン）に対する抗体を生じた参加者の数［タイムフレーム：試験は、スクリーニング時、ＰＫ注入前、手術前、過剰な出血または説明のつかない出血の場合に手術後、術後７日目、及び試験終了来院時（すなわち、手術から１４（±２）日後）にわたって行った。］

（表４２）評価項目＃１１

（表４３）集団説明評価項目＃１１

（表４４）報告群評価項目＃１１

（表５９）測定値評価項目＃１１

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）タンパク質、マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、または組換えフューリン（ｒフューリン）に対する抗体を生じた参加者の数に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃１２
１２．副次項目：薬物動態：注入から０～７２時間後の血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０～７２時間／用量）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］

（表４５）評価項目＃１２

（表４６）集団説明評価項目＃１２

（表４７）報告群評価項目＃１２

（表４８）測定値評価項目＃１２

薬物動態：注入から０～７２時間後の血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０～７２時間／用量）に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃１３
１３．副次項目：薬物動態：時間０から無限大時間の血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０～∞／用量）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］

（表４９）評価項目＃１３

（表５０）集団説明評価項目＃１３

（表５１）報告群評価項目＃１３

（表５２）測定値

薬物動態：時間０から無限大時間の血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０～∞／用量）に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃１４
１４．副次項目：薬物動態：平均滞留時間（ＭＲＴ）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］

（表５３）評価項目＃１４

（表５４）集団説明評価項目＃１４

（表５５）報告群評価項目＃１４

（表５６）測定値

薬物動態：平均滞留時間（ＭＲＴ）に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃１５
１５．副次項目：薬物動態：クリアランス（ＣＬ）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］

（表５７）評価項目＃１５

（表５８）集団説明評価項目＃１５

（表５９）報告群評価項目＃１５

（表６０）測定値

薬物動態：クリアランス（ＣＬ）に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃１６
１６．副次項目：薬物動態：段階的回収率（ＩＲ）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］

（表６１）評価項目＃１６

（表７７）集団説明評価項目＃１６

（表６２）報告群評価項目＃１６

（表６３）測定値評価項目＃１６

薬物動態：段階的回収率（ＩＲ）に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃１７
１７．副次項目：薬物動態：排出相半減期（Ｔ１／２）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］

（表６４）評価項目＃１７

（表６５）集団説明評価項目＃１７

（表６６）報告群評価項目＃１７

測定値

薬物動態：排出相半減期（Ｔ１／２）に関する統計分析は提供せず。

副次的な評価項目：評価項目＃１８
１８．副次項目：薬物動態：定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）［タイムフレーム：ＰＫ測定は、注入の３０分前以内、ならびに注入から３０（±５）分後、６０（±５）分後、６（±１）時間後、１２（±１）時間後、２４（±２）時間後、４８（±２）時間後、及び７２（±２）時間後に行った。］

（表６７）評価項目＃１８

（表６８）集団説明評価項目＃１８

（表６９）報告群評価項目＃１８

測定値評価項目＃１８

薬物動態：定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）に関する統計分析は提供せず。

上に示した実施例は、本発明の組成物、システム、及び方法の実施形態を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に付与するために提供されており、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。当業者には明らかである本発明を実行するための上記した様式の修正は、以下の特許請求の範囲の内であることが意図される。本明細書で言及するすべての特許及び刊行物は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。本開示で引用されるすべての参考文献は、各参考文献全体が個別に参照により組み込まれているのと同程度に、参照により組み込まれる。

すべての見出し及び節の名称は、明確化及び参照目的のみで使用されるものであり、いかようにも限定するものとして解釈すべきでない。例えば、当業者であれば、本明細書に記載の発明の主旨及び範囲に従い、適宜、異なる見出し及び節からの様々な態様を組み合わせることの有用性を理解するであろう。

本明細書で引用されるすべての参考文献は、ここに、個々の刊行物または特許もしくは特許出願の各々が、すべての目的でそれらの全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、その全体が参照により、またすべての目的で、本明細書に組み込まれる。

当業者には明らかとなるように、本出願の多くの修正及び改変を、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことがきできる。本明細書に記載の具体的な実施形態及び実施例は、例として提供されるにすぎず、本出願は、添付の特許請求の範囲の条項、及び特許出願の範囲が権限を有する同等物の全範囲によってのみ制限される。

Claims

外科手術前に、重度のフォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）を患う対象の前処置を行うための組成物であって、前記前処置が、組換えフォンヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を前記外科手術の１２時間～２４時間前に前記対象に投与することを含み、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）が、前記外科手術前に前記ＶＷＦとともに投与されず、前記組成物が、２０～６０ＩＵ／ｋｇの組換えフォンヴィレブランド因子（ｒＶＷＦ）を含み、かつ、前記ｒＶＷＦが、少なくとも１０サブユニットを含む極めて多量体であるｒＶＷＦを含む、前記組成物。
前記前処置が、５～９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦを前記外科手術の１時間前に前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
ＦＶＩＩＩが前記外科手術の後に投与されない、請求項１に記載の組成物。
前記外科手術が、大手術、小手術、及び口腔手術からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、５０～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、前記外科手術が小外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、３５～６０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、前記外科手術が大外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、２０～４０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術の１２時間～２４時間前に投与され、前記外科手術が口腔外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、５～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術の１時間前に投与され、前記外科手術が小外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、１５～９０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術の１時間前に投与され、前記外科手術が大外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、２０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術の１時間前に投与され、前記外科手術が口腔外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、１０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術中に投与され、前記外科手術が口腔外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、７０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術の後に投与される、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、７０～１５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術の後に投与され、前記外科手術が小外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、１５０～２２０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術の後に投与され、前記外科手術が大外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、２０～５０ＩＵ／ｋｇのｒＶＷＦが前記外科手術の後に投与され、前記外科手術が口腔外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、１００～２２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与され、前記外科手術が小外科手術である、請求項１に記載の組成物
前記対象に、２２０～３２０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与され、前記外科手術が大外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記対象に、７０～１９０ＩＵ／ｋｇの総用量のｒＶＷＦが投与され、前記外科手術が口腔外科手術である、請求項１に記載の組成物。
前記外科手術が大外科手術であり、前記前処置が、ほぼ等しい少なくとも２用量のｒＶＷＦを前記外科手術の前に投与することを含む、請求項１に記載の組成物。
前記外科手術が小外科手術であり、前記前処置が、前記外科手術の前に少なくとも２用量のｒＶＷＦを投与することを含み、第１の用量が、第２の用量より多い、請求項１に記載の組成物。
前記外科手術が口腔外科手術であり、前記前処置が、ほぼ等しい少なくとも２用量のｒＶＷＦを前記外科手術の前に投与することを含む、請求項１に記載の組成物。