ES3009436T3 - Transglutaminase mediated high molecular weight hyaluronan hydrogels - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un proceso para la formación de un hidrogel de hialuronano, que comprende las etapas de a) proporcionar un conjugado peptídico donante de hialuronano y un conjugado peptídico aceptor de hialuronano, cada uno representado por la fórmula general (I), donde el 10 % de los grupos R1 se representan por la fórmula general (II), donde L es un grupo enlazador de 2 a 6 átomos y Pep es un péptido donante o aceptor de transglutaminasa, y el resto de los grupos R1 se representan por -COOH; b) añadir un polipéptido del factor XIII y un polipéptido de trombina, o un polipéptido del factor XIIIa. La invención se refiere además a composiciones e hidrogeles caracterizados por la química descrita. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Hidrogeles de ácido hialurónico de alto peso molecular mediados por transglutaminasa

[0001]El ácido hialurónico (AH) es un componente abundante de la matriz extracelular de los tejidos conectivos, epiteliales y del sistema nervioso central. En el cartílago, el AH junto con el agrecano y la proteína de enlace forman grandes estructuras de agregación con carga negativa que son importantes para las propiedades mecánicas del cartílago. En el sistema nervioso central, el AH es la columna vertebral de la matriz extracelular (MEC) del cerebro y la médula espinal. Además, la MEC sirve como plantilla para la presentación de morfógenos y factores de crecimiento, y las variaciones en su composición son reconocidas por receptores celulares especializados, proporcionando así una guía durante el desarrollo, la plasticidad y la regeneración neuronales. Se sabe que el AH regula en particular la inflamación, siendo los fragmentos de bajo peso molecular (PM) proinflamatorios y las cadenas de alto PM antiinflamatorias. El AH de alto PM incluso limita la cicatrización glial después de un daño cerebral y una lesión de la médula espinal (LME). También es un componente importante para mantener las células madre neuronalesin vitroein vivo.

[0002]El AH se ha convertido en una herramienta popular para la ingeniería de cartílago y tejido neural. Los métodos estándar para formar geles de AH son AH tiolado (AH-SH) reticulado con PEG acrilado por adición de Michael, AH metacrilado (AH-MA) fotorreticulado con un iniciador de radicales y AH reticulado con dihidrazida adípica (DHA) (AH-DHA). Estos esquemas de reticulación tienen inconvenientes importantes, que han limitado su aplicación. Los geles de AH formados por adición de Michael son sistemas inyectables. A pH fisiológico se gelifican lentamente, lo que dificulta su manipulación y hace improbable su traducción clínica. Por ejemplo, los investigadores necesitaron 25 minutos de reacción previa antes de inyectar dichos geles en el cerebro (Liang et al. Biomaterials, vol. 34, n.° 22, pp. 5521-5529, 2013). A pH alto, donde la reacción avanza rápidamente, la viabilidad celular se ve afectada. El AH tiolado también se oxida fácilmente a disulfuros, con una pérdida significativa en cuestión de horas cuando se encuentra en solución a pH fisiológico. Esto se vuelve particularmente problemático con AH-SH de alto peso molecular (más de 1 MDa), ya que tiende a oxidarse hasta el punto de formar una esponja insoluble, incluso cuando se almacena congelado o en forma seca. Esto ha llevado a la mayoría de los usuarios de AH-SH a trabajar con AH de bajo peso molecular, típicamente alrededor de 100 kDa (Zheng Shu et al. Biomaterials, vol. 25, no. 7-8, pp. 1339-1348, marzo de 2004). Por el contrario, la fotorreticulación de A h-MA con un iniciador de radicales tiene la ventaja de estar basada en reactivos con mayor estabilidad y gelificación muy rápida, pero la necesidad de exposición a la luz significa que dichos geles no son inyectables. Además, los radicales libres son muy perjudiciales para la viabilidad celular. Por ejemplo, se ha descubierto que las células progenitoras neuronales no sobreviven más de 90 s durante la exposición a rayos UV en presencia de Irgacure 2959 (Seidlits et al. Biomaterials, vol.

31, n.° 14, pp. 3930-40, mayo de 2010), lo que ha motivado la adición de un paso de pre-reticulación antes de mezclar las células para la encapsulación. Por último, la reticulación de AH con DHA solo se puede efectuar en condiciones duras no compatibles con la encapsulación de células, en particular neuronas, o la gelificación in situ (pH 3,5 - 5 y activación de ácido carboxílico con una carbodiimida). Esto hace que este método sea incompatible con la gelificación in situ y/o la encapsulación celular.

[0003]Recientemente, Ranga et al. (Biomacromolecules 2016, 10.1021/acs.biomac.5b01587) introdujeron un derivado de AH reticulable con FXIIIa, que se basa en AH de bajo peso molecular co-reticulado con polietilenglicol (PEG). Este gel se caracteriza por la falta de estabilidad en concentraciones inferiores al 1 % (p/v).

[0004]El documento WO0016818 describe métodos de reticulación de hidrogel de AH. La transglutaminasa se utiliza para unir AH a PEG o 3,3'-ditiobis(sulfo-succinimidil-propionato) (DTSSP).

[0005]El objetivo de la presente invención es superar las deficiencias mencionadas en el estado de la técnica. Este objetivo se logra mediante el objeto de las reivindicaciones independientes.

[0006]La presente invención proporciona por primera vez un gel de hialuronano de alto peso molecular (HA-TG) que se reticula utilizando una actividad específica de transglutaminasa (TG), en particular la del factor XIII de coagulación sanguínea activado (FXIIIa). Este gel de AH-TG es inyectable y tiene una velocidad de gelificación ajustable en función de la cantidad de enzima añadida. La cinética de formación del gel se puede reducir a <40 s, incluso a <30 s, lo que lo hace muy atractivo para aplicaciones exigentes en las que puede producirse sangrado y movimiento. Debido al reconocimiento específico de los péptidos sustrato de FXIIIa por la enzima, la reticulación está completamente libre de sustancias químicas tóxicas. El FXIIIa también es capaz de reticular covalentemente la fibrina, su función nativa, lo que da la posibilidad de co-reticular dichos derivados de AH con fibrin(ógeno) y también garantiza una buena adhesión tisular. Además, el AH modificado es químicamente inerte, ya que está modificado con péptidos que no son susceptibles a la oxidación, hidrólisis o adición intramolecular de Michael, a diferencia de los derivados de tiol o (met)acrilato. Esto garantiza una estabilidad muy alta (no se observa ningún cambio en las mediciones reológicas después de varios meses en solución a pH fisiológico o después de más de un año en forma seca congelada). Finalmente, es posible trabajar directamente con a H de alto peso molecular (1-2 MDa) sin riesgo de reticulación espontánea durante el almacenamiento. Este método de reticulación se utilizó recientemente para reticular geles de PEG (Ehrbar et al., Biomaterials, vol. 28, no. 26, pp. 3856-66, sep. 2007) utilizados en aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos. Los hidrogeles reticulados enzimáticamente se han aplicado ampliamente para la administración de fármacos y la encapsulación celular, aunque los sistemas enzimáticos más extendidos tienen una bioortogonalidad menor (por ejemplo, la HRP-tiramina requiere peróxido de hidrógeno, que puede ser oxidante e inflamatorio para las células, la lisil oxidasa crea aldehídos, que son reactivos con los grupos amino presentes en la superficie de la mayoría de las proteínas y, por lo tanto, de las células, y la mayoría del trabajo de transglutaminasa utiliza transglutaminasas bacterianas menos específicas y más inmunogénicas) (Teixeira et al., Biomaterials, vol. 33, no. 5, pp. 1281-90, marzo de 2012).

Términos y definiciones

[0007]El hialuronano (también denominado hialuronato o ácido hialurónico) es un glicosaminoglicano que se encuentra de forma natural en el cuerpo humano. Su estructura es la de un polímero de una unidad repetida que consiste en una fracción de ácido D-glucurónico y una fracción de Na-acetilglucosamina en enlaces p-1,3 y p-1,4 alternados. La fórmula general del hialuronato es

[0008]El peso molecular de la unidad repetida es 379 g/mol. El hialuronano en el cuerpo puede superar las 2500 unidades repetidas (n) por molécula.

[0009]El término polipéptido del factor XIII (factor Laki Lorand, factor estabilizador de fibrina) en el contexto de la presente especificación se relaciona con el factor XIII, una transglutaminasa presente en humanos, que es un heterotetrámero de dos subunidades catalíticas A (UniProt No. P00488) y dos subunidades transportadoras B (UniProt No. P05160), o con un equivalente funcional del mismo.

[0010]El término polipéptido de trombina en el contexto de la presente especificación se relaciona con un factor(fibrinogenasa, trombosa, factor II de coagulación sanguínea activado, factor IIa de coagulación sanguínea, factor lia)que activa el factor XIII en la cascada de coagulación humana (UniProt No. P00734), o un equivalente funcional del mismo.

[0011]El término transglutaminasa en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a una enzima que cataliza la formación de un enlace isopeptídico entre un grupo amina libre en la cadena lateral de un residuo de lisina comprendido en un péptido aceptor de transglutaminasa y el grupo acilo en la cadena lateral de un residuo de glutamina comprendido en un péptido donante de transglutaminasa. Ejemplos de transglutaminasas humanas son la transglutaminasa de queratinocitos (Uniprot P22735), la transglutaminasa tisular (UniProt P21980), la transglutaminasa epidérmica y la transglutaminasa de próstata.

[0012]El término péptido donante de transglutaminasa en el contexto de la presente especificación se refiere a una secuencia peptídica que reacciona de manera eficiente con un péptido aceptor de transglutaminasa en presencia de una enzima transglutaminasa particular. Es necesario seleccionar el donante y el aceptor para la transglutaminasa particular. Para muchas transglutaminasas, se conocen secuencias donadoras y aceptoras. Los métodos para determinar las secuencias del sustrato de la transglutaminasa (donante y aceptora) son conocidos en la técnica (Keresztessy et al., Protein Science 2006, Vol 15(11), 2466-2480).

[0013]El término célula condrógena en el contexto de la presente especificación se relaciona con una célula madre parcialmente diferenciada hacia el linaje del cartílago.

[0014]El término condrocito en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a una célula de cartílago madura, en particular una célula de cartílago madura de origen articular, auricular, nasal, costal, menisco, núcleo pulposo o disco, utilizada a partir de una fuente autóloga o alogénica. Las células condroprogenitoras de estos tejidos y del pericondrio pueden denominarse de manera similar células condroprogenitoras, al igual que las células madre de la médula ósea, el cartílago, la grasa y la sangre.

[0015]El término célula condrógena en el contexto de la presente especificación se utiliza como un término genérico que abarca condrocitos y células condroprogenitoras y se relaciona específicamente con células capaces de producir cartílago, definidas por los marcadores colágeno tipo II y agrecano, que se detectan mediante métodos clásicos de expresión genética o análisis de deposición de proteínas conocidos por el técnico experto.

[0016]Las secuencias de aminoácidos se dan desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo. Las letras mayúsculas para las posiciones de secuencia se refieren a los L-aminoácidos en el código de una letra (Stryer, Biochemistry, 3.a ed., pág. 21).

[0017]El término alquilo C1-C4 en el contexto de la presente invención significa un hidrocarburo lineal o ramificado saturado que tiene 1, 2, 3 o 4 átomos de carbono, en donde en ciertas formas de realización un enlace carbono-carbono puede estar insaturado y/o una fracción CH2 puede estar intercambiada por oxígeno (puente éter) o nitrógeno (NH o NR siendo R metilo, etilo o propilo; puente amino). Ejemplos no limitantes para un alquilo C1-C4 son metilo, etilo, propilo, prop-2-enilo, n-butilo, 2-metilpropilo, tere-butilo, but-3-enilo, prop-2-inilo y but-3-inilo. En ciertas formas de realización, un alquilo C1-C4 es una fracción metilo, etilo, propilo o butilo.

[0018]El término alquilo C1-C5 en el contexto de la presente invención significa un hidrocarburo lineal o ramificado saturado que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 átomos de carbono, en donde un enlace carbono-carbono puede estar insaturado y una porción CH2 puede estar intercambiada por oxígeno (puente éter) o nitrógeno (puente amino). Los ejemplos no limitantes para un alquilo C1-C5 incluyen los ejemplos dados para alquilo C1-C4 anteriormente, y adicionalmente 3-metilbut-2-enilo, 2-metilbut-3-enilo, 3-metilbut-3-enilo, n-pentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo y pent-4-inilo.

[0019]El términoalquilo Cn no sustituidoen el sentido más estricto se refiere a la fracción -CnH2n- si se utiliza como un puente entre fracciones de la molécula, o -CnH2n+1 si se utiliza en el contexto de una fracción terminal.

[0020]Según un primer aspecto, la invención proporciona un proceso para formar un hidrogel de hialuronano. Este proceso comprende los pasos de

a. Proporcionar una solución acuosa de un primer conjugado de péptido de hialuronano, que comprende péptidos donantes de transglutaminasa (TG) y un segundo conjugado de péptido de hialuronano, que comprende péptidos aceptores de transglutaminasa. Los péptidos donantes de TG y aceptores de TG están presentes en cantidades aproximadamente equimolares. Si se va a utilizar una transglutaminasa derivada del factor XIII en la etapa de enlace covalente posterior, los péptidos donantes y aceptores deben ser sustratos adecuados del factor XIIIa. El primer conjugado de péptido hialuronano y dicho segundo conjugado de péptido hialuronano están representados cada uno por una fórmula general I,

en la que del 5 % al 20 %, particularmente del 8 al 12 %, más particularmente aproximadamente el 10 % de las fracciones R1 están representadas por una fórmula general II,

en la que

- L es una fracción de enlace que tiene una masa molecular de <150 g/mol, caracterizada por una fórmula NH-Alk o O-Alk o NH-NH-CO-Alk, siendo Alk un alquilo no sustituido de C1, C2, C3, C4 o C5 o un alquilo amino y/o hidroxisustituido de C2, C3, C4 o C5, particularmente L es -N-NHCO-(CH2)2-, y

- Pep es un péptido donante de transglutaminasa o un péptido aceptor de transglutaminasa, respectivamente, y el resto de las fracciones R1 están representadas por -COOH,

en la que

- una secuencia de péptido donante de transglutaminasa es o comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 01 a SEQ ID 14;

- una secuencia de péptido aceptor de transglutaminasa es o comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 15 a SEQ ID 29.

b. Añadir una transglutaminasa capaz de unir covalentemente dichos péptidos donantes de transglutaminasa a péptidos aceptores de transglutaminasa, particularmente

i. un polipéptido del factor XIII y un polipéptido de trombina, o

ii. un polipéptido del factor XIIIa

a dicha solución acuosa.

[0021]En ciertas formas de realización, el enlazador L en (II) contiene 5 átomos en la cadena. Ejemplos no limitantes de un enlazador de 5 átomos incluyen -O(CH2)4-, -NH(CH2)4-, -OCH2CO(CH2)2-, -OCH2CHOH(CH2)2- y -OCH2(CHOH)2CH2-

[0022]En ciertas formas de realización, el enlazador L en (II) contiene 6 átomos en la cadena. Ejemplos no limitantes de un enlazador de 5 átomos incluyen -O(CH2)a-, -NH(CH2)a-, -O(CH2)2O(CH2)2-, -O(CH2)2CO(CH2)2-, -O(CH2)2CHOH(CH2)2-y -OCH2(CHOH)2CH2)2-.

[0023]En ciertas formas de realización, el enlazador L en (II) contiene 4 átomos en la cadena. Ejemplos no limitantes de un enlazador de 4 átomos incluyen -O(CH2)3-, -NH(CH2)3-, -OCH2COCH2- y -OCH2CHOHCH2-.

[0024]En ciertas formas de realización, R1 de la fórmula (I) es:

[0025]En ciertas formas de realización, la solución del primer y segundo polipéptido de hialuronano comprende un tampón adaptado para llevar el gel a la misma concentración osmótica que el entorno en el que se va a utilizar. Las diferencias significativas en la concentración osmótica del gel resultante y el medio acuoso circundante pueden provocar la hinchazón o contracción del gel, en particular si la concentración osmótica del medio circundante es inferior a 0,02 mol/L.

[0026]En ciertas formas de realización, la concentración de la suma del primer conjugado de péptido hialuronano y el segundo conjugado de péptido hialuronano se caracteriza en la primera columna de la siguiente tabla, y el hialuronano se caracteriza por una masa molecular media (MMM) como se especifica en la segunda columna de la siguiente tabla:

[0027]En ciertas formas de realización, el proceso de la invención proporciona hidrogeles de hialuronano modificados con heparina (o modificados con sulfato de heparán). Los geles resultantes son de particular utilidad para el tratamiento quirúrgico de un solo paso de lesiones de cartílago. Para tales usos, es ventajoso incluir un factor de crecimiento condrogénico (particularmente seleccionado entre el factor de crecimiento transformante beta 1, 2 o 3, el factor de crecimiento similar a la insulina 1 y los factores de crecimiento de fibroblastos 1, 2, 9 o 18) para apoyar la proliferación y la deposición de matriz por las células. Dichos factores de crecimiento pueden estar comprendidos dentro de los hidrogeles de hialuronano de la invención. Los inventores observaron una liberación explosiva del factor de crecimiento TGF-b1 de los geles de hialuronano que no contienen heparina o sulfato de heparán, lo que indica que los geles de AH puro no retienen factores de crecimiento, por lo que ofrecen una cinética de liberación desfavorable para aplicaciones que requieren la incorporación de factores de crecimiento.

[0028]En estas formas de realización, la solución acuosa de la etapa a. comprende adicionalmente heparina o sulfato de heparán, particularmente en una concentración de 0,05 % a 0,5 % (p/v con respecto al gel). En otras formas de realización particulares, la cantidad de heparina o sulfato de heparán es de 2,5 % a 15 %, más particularmente de 5 %-10 % (m/m) con respecto a la cantidad de hialuronano comprendida en el gel.

[0029]Tanto la adición de heparina como la adición de sulfato de heparán proporcionarán ventajas para los usos de acuerdo con la invención que se analizan en el presente documento. Los inventores emplearon sal sódica de heparina de mucosa intestinal porcina (que también es la fuente de productos de heparina de grado clínico). Como no está fraccionada, el peso molecular de las cadenas es heterogéneo. Para aplicaciones clínicas, se prefiere una heparina de grado GMP, en particular el producto de bajo peso molecular.

[0030] En ciertas formas de realización, la heparina o el sulfato de heparán comprenden péptidos donantes y/o aceptores de transglutaminasa unidos covalentemente. La química empleada para unir los péptidos puede ser esencialmente la misma que el proceso descrito en este documento en detalle para modificar el hialuronano. En ciertas formas de realización, del 10 % al 20 %, particularmente ca. 15 %, de los grupos de ácido carboxílico presentes en la heparina o el sulfato de heparán se modifican covalentemente. En ciertas formas de realización más particulares, las fracciones de ácido carboxílico se modifican covalentemente para contener una modificación descrita por la fórmula general (II) como se establece anteriormente [en la que el carbono que se muestra a la izquierda es el carbono carboxílico comprendido dentro de la cadena principal de glicosaminoglicano], con L y Pep teniendo el siguiente significado:

L es una fracción de enlace que tiene una masa molecular de <150 g/mol, particularmente un enlace que consiste en 2, 3, 4, 5 o 6 C, N y/o átomos de O en la cadena de enlace (más átomos de hidrógeno H según corresponda para saturar la estructura), más particularmente L es NH-Alk o O-Alk o NH-NH-CO-Alk con Alk siendo un alquilo no sustituido de Ci, C2, C3, C4 o C5 o un alquilo sustituido con amino y/o hidroxi de C2, C3, C4 o C5, incluso más particularmente L es -N-NHCO-(CH2)2-, y Pep es un péptido donador de transglutaminasa o un péptido aceptor de transglutaminasa, respectivamente, y el resto de las fracciones R1 están representadas por -COOH.

[0031] En ciertas formas de realización, la masa molecular de dicha heparina o sulfato de heparán varía de 1 kg/mol a 100 kg/mol. En ciertas formas de realización, la masa molecular de dicha heparina o sulfato de heparán varía de 4 kg/mol a 60 kg/mol. En ciertas formas de realización, la masa molecular de dicha heparina o sulfato de heparán varía de 15.000 g/mol a 50.000 g/mol.

[0032] La heparina es un polisacárido de uso clínico y sus propiedades de unión por afinidad con el factor de crecimiento, en particular en el caso de TGF-b1, hacen que la adición de heparina al gel sea una característica interesante. Los inventores descubrieron que la adición covalente de heparina a los geles de AH que se muestran en este documento permite una liberación más lenta y sostenida de TGF-b1, mejorando posteriormente la condrogénesis en los geles de AH-TG.

[0033] En ciertas formas de realización, se emplean de 1 a 50 U/ml del polipéptido del factor XIII (FXIII), particularmente de 5 a 40 U/ml, más particularmente de 10 a 30 U/ml de FXIII, incluso más particularmente de 15 a 25 U/ml de FXIII. En ciertas formas de realización, se emplean de 0,1 a 100 U/ml del polipéptido de trombina, particularmente de 1 a 20 U/ml, más particularmente 12,5 U/ml.

[0034] En ciertas formas de realización, se emplea FXIIIa preactivado a una actividad de 1 a 50 U/ml, particularmente de 5 a 20 U/ml. 5 a 20 U/ml son las concentraciones de enzima que dan como resultado una velocidad de gelificación (del orden de 1 min) de particular utilidad en aplicaciones quirúrgicas, dependiendo de la cantidad de polímero utilizado (menos AH requiere más enzima para llegar a la misma velocidad de gelificación).

[0035] Según una alternativa de este primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para formar un hidrogel de hialuronano caracterizado por una cinética de gelificación de segundo orden. Este procedimiento comprende los pasos de:

a. proporcionar una solución acuosa de un primer conjugado peptídico de hialuronano que comprende péptidos donantes de transglutaminasa y un segundo conjugado peptídico de hialuronano que comprende péptidos aceptores de transglutaminasa (en cantidades aproximadamente equimolares de péptidos donantes y aceptores, respectivamente),

b. añadir un polipéptido de trombina a dicha solución acuosa y permitir el equilibrio de la mezcla resultante;

c. posteriormente, añadir un polipéptido de factor XIII inactivado.

[0036] El calcio, que actúa como cofactor tanto para FXIIIa como para trombina, es un cofactor esencial para las enzimas empleadas en los métodos de la invención. En ciertas formas de realización preferidas, el proceso se realiza a una concentración de calcio de aproximadamente 50 mM. El intervalo útil de concentración de calcio es de al menos 1 a 100 mM, y puede extenderse a 0,1 a 300 mM con cierto impacto en la velocidad de reacción. El pH también es importante: los inventores utilizaron un pH de 7,6, pero se espera que la reacción funcione a valores de pH de 6 a 9.

[0037] En ciertas formas de realización, la mezcla de conjugado de péptido hialuronano (conjugado de péptido aceptor y donante) se equilibra con polipéptido FXIII y se añade trombina. En ciertas formas de realización, la mezcla de conjugado de péptido hialuronano (conjugado de péptido aceptor y donante) se equilibra con trombina y se añade polipéptido FXIII. En ciertas formas de realización, el calcio está presente desde el principio; en ciertas otras formas de realización, la reacción se inicia añadiendo calcio.

[0038] Los inventores han descubierto que equilibrar la mezcla de conjugado de péptido hialuronano con trombina y luego agregar FXIII no activado proporciona una cinética ideal, particularmente para las aplicaciones quirúrgicas contempladas en este documento: ~2 min de inicio y -10-15 min para alcanzar la rigidez máxima.

[0039] En ciertas formas de realización, el proceso según este primer aspecto de la invención se lleva a cabo a una concentración de

a. 0,1 a 100 U/ml, particularmente 1 a 20 U/ml, más particularmente 12,5 U/ml de polipéptido de trombina; y

b. 1 a 50 U/ml, particularmente 5 a 40 U/ml, más particularmente 15 a 25 U/ml de polipéptido de factor XIII.

[0040] En ciertas formas de realización, el proceso según este primer aspecto de la invención se lleva a cabo a una concentración de conjugado peptídico, refiriéndose por lo tanto a la suma del primer conjugado peptídico hialuronano y el segundo conjugado peptídico hialuronano con respecto al volumen total del gel acuoso, de 0,25 % (p/v) a 5 % (p/v), particularmente de 0,75 % a 0,95 % o de 0,5 % a 3 %, 0,5 % a 2 %, o 0,5 % a 1,5 %.

[0041] El experto en la materia comprenderá que existen en la naturaleza muchas otras parejas de precursor de transglutaminasa y factor activador que podrían adaptarse favorablemente para poner en práctica la presente invención al menos con respecto a algunas de las aplicaciones potenciales de los geles proporcionados en el presente documento. La transglutaminasa tisular humana en su forma oxidada y la tiorredoxina constituirían otro ejemplo de dicha pareja. Las transglutaminasas bacterianas se utilizan ampliamente en la industria alimentaria. Un ejemplo no limitativo es la combinación de TG de Streptomyces mobaraensis (EC 2.3.2.13; nombre de entrada de SwissProt TGL_STRSS, número de acceso P81453) y la endoproteasa TAMEP (metaloproteasa activadora de transglutaminasa, nombre de entrada de SwissProt TAMP_STRMB, número de acceso p 83543).

[0042] Sin embargo, el factor XIII parece proporcionar con diferencia la transglutaminasa más interesante para aplicaciones de ingeniería de tejidos clínicos, porque es el único TG humano ya disponible en calidad farmacéutica en grandes cantidades.

[0043] Un segundo aspecto de la invención se refiere a un proceso para la modificación de un polímero de hialuronano caracterizado por un peso molecular medio igual o mayor que (>) 250 kg/mol. El polímero de hialuronano está compuesto por n dímeros de fracciones de ácido D-glucurónico y fracciones de DN-acetilglucosamina. Las fracciones de ácido D-glucurónico tienen fracciones de ácido carboxílico reactivo. El proceso comprende los pasos de:

a. tiolación de 5% a 20%, particularmente 8-12%, más particularmente aproximadamente 10% de dichas fracciones de ácido carboxílico reactivo para producir hialuronano parcialmente tiolado;

b. hacer reaccionar dicho hialuronano parcialmente tiolado con divinilsulfona para producir vinilsulfonahialuronano;

c. haciendo reaccionar dicha vinilsulfona-hialuronano con un péptido que comprende una fracción de cisteína, en donde dicho péptido comprende una secuencia seleccionada entre una secuencia de péptido donante de transglutaminasa y una secuencia de péptido aceptor de transglutaminasa.

[0044] En ciertas formas de realización de este proceso de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, la tiolación se efectúa:

a. haciendo reaccionar dicho polímero de hialuronano con 3,3'-ditiobis(dihidrazida propanoica), particularmente en presencia de una alquilcarbodiimida a pH 4 a 5,5; seguido de

b. haciendo reaccionar el producto del paso a particularmente sin tratamiento adicional con un agente reductor seleccionado entre TCEP (tris-2-(carboxietil)fosfina), DTT (ditiotreitol) y betamercaptoetanol, para producir el hialuronano parcialmente tiolado.

[0045] Una alternativa de este aspecto de la invención se refiere a un proceso para la modificación de un polímero de heparina o sulfato de heparán. La heparina y el sulfato de heparán comprenden fracciones de ácido D-glucurónico y fracciones de ácido L-idurónico, ambas con fracciones de ácido carboxílico reactivas. Estas fracciones de ácido carboxílico se pueden modificar mediante el mismo proceso que se describe en los párrafos anteriores:

a. tiolación de 1 % a 25 %, particularmente 5-20 o 8-12 %, más particularmente aproximadamente 15 % de dichas fracciones de ácido carboxílico reactivas para producir heparina o sulfato de heparán parcialmente tiolados;

b. reacción de dicho hialuronano parcialmente tiolado con divinilsulfona para producir vinilsulfona-heparina o -sulfato de heparán;

c. haciendo reaccionar dicha vinilsulfona-heparina o -heparán sulfato con un péptido que comprende una fracción de cisteína, en donde dicho péptido comprende una secuencia seleccionada entre una secuencia de péptido donante de transglutaminasa y una secuencia de péptido aceptor de transglutaminasa.

[0046]En ciertas formas de realización, la tiolación se efectúa:

a. haciendo reaccionar el polímero de heparina o sulfato de heparán con 3,3'-ditiobis(dihidrazida propanoica), particularmente en presencia de una alquilcarbodiimida; seguido de

b. haciendo reaccionar el producto del paso a. (particularmente sin tratamiento adicional) con un agente reductor seleccionado entre TCEP (tris-2-(carboxietil)fosfina), DTT (ditiotreitol) y betamercaptoetanol, para producir la heparina o sulfato de -heparán parcialmente tiolado.

[0047]En cualquier procedimiento proporcionado en el presente documento (primer y segundo aspecto), el hialuronano y/o el primer conjugado peptídico de hialuronano y/o el segundo conjugado peptídico de hialuronano se caracterizan por un peso molecular medio igual o superior a (>) 250 kg/mol. En ciertos aspectos, este peso molecular supera los 500 kg/mol, o incluso los 1000 kg/mol (1 MDa). Ciertos aspectos hacen uso de hialuronano o conjugado peptídico de hialuronano caracterizado por una masa molecular media de entre 1000 kg/mol y 4000 kg/mol, incluso más particularmente entre 1000 kg/mol y 2000 kg/mol.

[0048]Como alternativa, la masa molecular del hialuronano y/o de los conjugados de péptidos de hialuronano proporcionados en el presente documento se caracteriza por el número n de la unidad base de disacárido de hialuronano. En ciertas formas de realización, n es >2,500. En ciertas formas de realización, n está entre 2,500 y 10,000, particularmente entre 2,500 y 5,000.

[0049]Estos altos pesos moleculares distinguen los procesos y geles proporcionados en este documento de los conocidos en la técnica, que se han obtenido con derivados de hialuronano que tienen una masa molecular media claramente inferior. Esta diferencia conduce a ventajas significativas tanto en la fabricación, como en la manipulación y en la aplicación de los geles proporcionados en este documento. Estas cualidades ventajosas incluyen la estabilidad del tamaño y la cinética de formación del gel.

[0050]Cuando se utiliza un valor de peso molecular en este documento, se debe interpretar como determinado por dispersión de luz multiángulo (MALS) en serie después de la cromatografía de permeación en gel (GPC), también conocida como cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (como se describe en Mendichi y Schieroni, Bioconjug Chem. 2002 Nov-Dic;13(6):1253-8). Los polímeros (incluidos los polisacáridos como AH y heparina) son típicamente polidispersos, y los pesos moleculares se refieren al peso molecular promedio ponderado (también llamado masa molecular promedio en masa o peso molecular medio) del polímero polidisperso (Mw) determinado como se indica en este documento.

[0051]El experto en la materia conoce métodos alternativos adicionales para determinar el peso molecular de un polímero que pueden emplearse en casos en los que el método MALS utilizado generalmente como referencia en el presente documento no proporciona resultados. Si el método MALS no es aplicable, el peso molecular proporcionado en el presente documento se considerará determinado por el primero de los siguientes métodos que sea aplicable:

- comparación con estándares de peso molecular del mismo polímero utilizando

omediciones de viscosidad en un reómetro,

oun viscosímetro en línea en un GPC,

odispersión de luz dinámica (DLS) o

omedición del tiempo de retención en GPC;

- dispersión de luz estática independiente;

- dispersión de luz de ángulo bajo (LALS) independiente o acoplada a GPC.

[0052]En cualquier proceso proporcionado en este documento (primer y segundo aspecto), la secuencia de péptido donante de transglutaminasa se selecciona de la siguiente manera:

De manera más general, un donante de lisina (péptido donante TG) se puede caracterizar como un grupo químico pequeño (menos de 3 kDa) que contiene una amina primaria así como un tiol (siendo el tiol el grupo que experimenta la adición de Michael a la fracción de divinilsulfona). Particularmente adecuados son los péptidos donantes de transglutaminasa de 1 a 30 aminoácidos de longitud que contienen una K (lisina) y una C (cisteína). Más específicamente, los péptidos que contienen una cisteína y la secuencia XKG donde X es un aminoácido hidrófobo tal como L (leucina), I (isoleucina), V (valina), F (fenilalanina), Y (tirosina), W (triptófano) o DOPA (3,4-dihidroxi-L-fenilalanina) y/o G es glicina, son buenos sustratos para FXIIIa; Más particularmente aún, esto es cierto para los péptidos que contienen la secuencia amino-terminal Ac-XKG, donde Ac- es un grupo acetilato. Ejemplos específicos de péptidos donantes ejemplares son péptidos que comprenden, o esencialmente son/consisten en, las secuencias Ac-FKGGERCG-NH2 (SEQ ID NO 01), Ac-FKGGC-NH2 (SEQ ID NO 02), Ac-FKGGERCG (SEQ ID NO 03), Ac FKGGC (SEQ ID NO 04), Ac-LKGGC (SEQ ID NO 05), Ac-DOPA-KG-C (SEQ ID NO 06), Ac-FKGG-GPQGIWGQ-ERCG-NH2 (SEQ ID NO 07), Ac-FKGG-GPQGIAGQ-ERCG-NH2 (SEQ ID NO 08), Ac-FKGG-GPQGIWGQ-C (SEQ ID NO 09), Ac-FKGG-GPQGIAGQ-C (SEQ ID NO 10), Ac-FKG-C-NH2 (SEQ ID NO 11), Ac-FKG-C (SEQ ID NO 12), Ac-LKG-C-NH2 (SEQ ID NO 13), Ac-LKG-C (SEQ ID NO 14).

[0053] En cualquier proceso proporcionado en este documento (primer y segundo aspecto), la secuencia del péptido aceptor de transglutaminasa se selecciona de la siguiente manera:

De manera más general, un aceptor de glutamina (péptido aceptor de TG) se puede caracterizar como un grupo químico pequeño (menos de 3 kDa) que contiene una amida terminal así como un tiol (siendo el tiol el grupo que experimenta la adición de Michael a la fracción de divinilsulfona). Particularmente adecuados son los péptidos aceptores de transglutaminasa de 1 a 30 aminoácidos de longitud que contienen una Q (glutamina) y una C (cisteína). Más específicamente, los péptidos que contienen una cisteína y una secuencia seleccionada entre QQ, QL, QE y una C son buenos sustratos para FXIIIa; incluso más particularmente, esto es cierto para los péptidos que contienen la secuencia NQEQVSPL (SEQ ID NO 15), QQLG (SEQ ID NO 16) o GQLKHLEQQEG (SEQ ID NO 17) y una cisteína. Ejemplos específicos de péptidos aceptores ejemplares son péptidos que comprenden, o esencialmente son/consisten en, las secuencias x-NQEQVSPLC-y (SEQ ID NO 18), x-NQEQVSPL-ERCG-y (SEQ ID NO 19), x-NQEQVSPL-GPQGIWGQ-ERCG-y (SEQ ID NO 20), x-NQEQVSPL-GGG-ERCG-y (SEQ ID NO 21), x-NQEQVSPL-DRCG-y (SEQ ID NO 22), Ac-GQQQLGC-NH2 (SEQ ID NO 23), x-GQQQLG-ERCG-y (SEQ ID NO 24), x-GQQQLG-DRCG-y (SEQ ID NO 25), x-GQQQLGC-y (SEQ ID NO 26), x-GQLKHLEQQEG-Cy (SEQ ID NO 27), x-GQLKHLEQQEG-ERCG-y (SEQ ID NO 28), xGQLKHLEQQEG-DRCG-y (SEQ ID NO 29) con x siendo N-acetilo o H en el extremo N, e y siendo NH2- o H- en el extremo C.

[0054] Otro (tercer) aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende/consiste esencialmente en un polímero de hialuronano de fórmula general I,

en donde del 5 % al 20 %, particularmente del 8-12 %, más particularmente aproximadamente el 10 % de las fracciones R1 están representadas por una fórmula general II,

en donde

- L es una fracción enlazadora que tiene una masa molecular de <150 g/mol caracterizada por una fórmula NH-Alk o O-Alk o NH-NHCO-Alk, siendo Alk un alquilo C1 a C5, particularmente L es -N-NHCO-(CH2)2-, y

- Pep es un péptido donante de transglutaminasa o un péptido aceptor de transglutaminasa, respectivamente, y el resto de fracciones R1 están representadas por COOH,

en donde

a. la secuencia del péptido donante de transglutaminasa es o comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 01 a SEQ ID 14;

b. La secuencia del péptido aceptor de transglutaminasa es o comprende una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO 15 a SEQ ID 29.

[0055]Cualquier péptido donador y/o aceptor como se definió anteriormente se puede emplear en la práctica de la invención como se define por cualquiera de los aspectos o formas de realización de la misma enumerados anteriormente o a continuación.

[0056]Una alternativa de este tercer aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende o consiste esencialmente en hialuronano de alto peso molecular modificado por

i. tiolación de 5 % a 20 %, particularmente 8-12 %, 10 % de funciones COOH comprendidas en el hialuronano

ii. adición de Michael de divinil sulfona sobre fracciones de tiol introducidas en el paso i.,

iii. adición de Michael de péptidos que contienen cisteína a fracciones de vinilo introducidas en el paso ii.

[0057]En ciertas formas de realización, la composición se caracteriza por un peso molecular medio igual o mayor que (>) 250 kg/mol, > 500 kg/mol, particularmente mayor que 1000 kg/mol (1MDa); más particularmente entre 1.000.000 g/mol y 4.000. 000 g/mol, incluso más particularmente entre 1.000.000 g/mol y 2.000.000 g/mol.

[0058]Alternativamente, la composición puede caracterizarse con respecto a su peso molecular medio por el número n de la unidad base de disacárido de hialuronano en la cadena de polímero (véase la fórmula I). En ciertas formas de realización, n es >2,500. En ciertas formas de realización, n está entre 2,500 y 10,000, particularmente entre 2,500 y 5.000.

[0059]En ciertas formas de realización, la concentración de la suma del primer conjugado de péptido hialuronano y el segundo conjugado de péptido hialuronano se caracteriza en la primera columna de la siguiente tabla, y el hialuronano se caracteriza por una masa molecular media (MMM) como se especifica en la segunda columna de la siguiente tabla:

[0060] En ciertas formas de realización, la composición según este tercer aspecto de la invención, o cualquiera de las formas de realización contempladas en la misma, comprende además un poliazúcar sulfatado, particularmente un poliazúcar sulfatado seleccionado entre sulfato de alginato, sulfato de hialuronano, sulfato de condroitina, sulfatos de fucano (oligómeros de alfa-L-fucopiranosa unidos en 1->3 con un cierto grado de sustitución de sulfato en las posiciones 2 y 4, véase el documento US 6720419 B2 y los documentos citados en el mismo, todos los cuales se incorporan como referencia en el presente documento), carragenanos, ulvanos (xilorhamnoglucuronano sulfatado), heparina y sulfato de heparina, en particular en una proporción de 1 % a 20 % (m/m), más particularmente en una proporción de 2,5 % a 15 % (m/m), incluso más particularmente en una proporción de 5% a 10% (m/m) con respecto a la masa del polímero de hialuronano. La heparina o el sulfato de heparina pueden estar unidos covalentemente al gel de AH o como una adición libremente difundible. Se prefiere la heparina o el sulfato de heparina unidos covalentemente.

[0061] En ciertas formas de realización, la heparina o el sulfato de heparán comprenden péptidos donantes y/o aceptores de transglutaminasa unidos covalentemente, particularmente en donde entre el 10 % y el 20 % de los grupos de ácido carboxílico presentes en dicha heparina o sulfato de heparán están modificados covalentemente, más particularmente modificados covalentemente para contener una modificación descrita por la fórmula general (II) como se establece anteriormente [en donde el carbono que se muestra a la izquierda es el carbono carboxílico comprendido dentro de la cadena principal de glucosaminoglicano], teniendo L, S y Pep el significado indicado anteriormente.

[0062] En ciertas formas de realización, la composición según este tercer aspecto de la invención, o cualquiera de las formas de realización contempladas en la misma, se caracteriza porque comprende un péptido donante de transglutaminasa que comprende o consiste esencialmente en una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO 01 a SEQ ID NO 14.

[0063] En ciertas formas de realización, la composición según este tercer aspecto de la invención, o cualquiera de las formas de realización contempladas en la misma, se caracteriza porque comprende un péptido aceptor de transglutaminasa que comprende o consiste esencialmente en una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO 15 a SEQ ID NO 29.

[0064]En ciertas formas de realización, la composición según este tercer aspecto de la invención, o cualquiera de las formas de realización contempladas en la misma, se caracteriza porque comprende un polímero de hialuronano como se especificó anteriormente, que comprende un péptido aceptor de transglutaminasa que comprende o consiste esencialmente en una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO 15 a SEQ ID NO 29, y un polímero de hialuronano como se especificó anteriormente, que comprende un péptido aceptor de transglutaminasa que comprende o consiste esencialmente en una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO 15 a SEQ ID NO 29, en donde los péptidos donador y aceptor están presentes en cantidades molares aproximadamente iguales.

[0065]En ciertas formas de realización, la composición según este tercer aspecto de la invención, o cualquiera de las formas de realización contempladas en la misma, se caracteriza porque comprende un polímero de hialuronano que comprende péptidos donantes de transglutaminasa y un polímero de hialuronano que comprende péptidos aceptores de transglutaminasa, en donde los péptidos donantes y aceptores están presentes en una cantidad molar aproximadamente igual, y la composición comprende además un polipéptido del factor XIII y/o un polipéptido de trombina.

[0066]Una presentación preferida para ese tipo de composiciones es aquella en la que los dos polímeros de hialuronano distintos y (una o dos) enzima(s) se separan en dos o tres stocks en cualquiera de las combinaciones, lo que impide el inicio de la reacción de reticulación del gel antes de su mezcla. Ejemplos no exhaustivos de dichas permutaciones son: AH-TG/Lys y polipéptido de trombina en un stock, AH-TG/Gln y polipéptido FXIII en el otro stock, AH-TG/Lys y AH-TG/Gln en un stock y polipéptido FXIII activado en el otro stock, AH-TG/Lys, AH-TG/Gln y polipéptido de trombina en un stock, polipéptido FXIII en el otro stock, AH-TG/Lys y AH-TG/Gln en un stock, polipéptido FXIII en otro stock, polipéptido de trombina en un tercer stock. Las soluciones madre de polímeros y enzimas pueden estar en solución líquida, en solución congelada o en forma liofilizada. Para facilitar su uso, las soluciones madre pueden cargarse en una jeringa de doble cuerpo equipada con un mezclador estático o con agujas convergentes para que la mezcla se produzca durante la administración. También pueden combinarse con jeringas de un solo cuerpo o micropipetas y mezclarse previamente de forma manual o dejar que se mezclen in situ por difusión.

[0067]En ciertas formas de realización, la composición según este aspecto de la invención se proporciona en forma seca.

[0068]En ciertas formas de realización, la composición según este tercer aspecto de la invención, o cualquiera de las formas de realización contempladas en la misma, se caracteriza porque comprende un polímero de hialuronano que comprende péptidos donantes de transglutaminasa y un polímero de hialuronano que comprende péptidos aceptores de transglutaminasa, en donde los péptidos donantes y aceptores están presentes en una cantidad molar aproximadamente igual, y la composición comprende además un polipéptido de trombina, pero ningún polipéptido de factor XIII, ni calcio.

[0069]En ciertas formas de realización, la composición según este tercer aspecto de la invención, o cualquiera de las formas de realización contempladas en la misma, comprende un polímero de hialuronano que comprende péptidos donantes de transglutaminasa y un polímero de hialuronano que comprende péptidos aceptores de transglutaminasa. La composición comprende además trombina para dar como resultado una relación de trombina con respecto al polímero de AH total (la suma de ambos polímeros de AH) de entre 300 U de trombina por gramo de polímero de AH (lo que conduce a una actividad de 3 U/ml para un gel al 1 % y 9 U/ml para un gel al 3 %) y 1500 U por gramo de polímero de AH (lo que conduce a una actividad de 15 U/ml para un gel al 1 % y 45 U/ml para un gel al 3%). Particularmente útiles para aplicaciones quirúrgicas son las composiciones que comprenden aproximadamente de 1000 a 1500 U de trombina por gramo de polímero de AH (lo que conduce a concentraciones de 10 a 15 U por ml en un gel al 1 %).

[0070]Otro aspecto de la invención se refiere a un hidrogel de hialuronano que comprende hialuronano reticulado con transglutaminasa y agua, obtenido mediante un procedimiento según el primer aspecto de la invención, o cualquiera de sus formas de realización específicas.

[0071]Alternativamente, este aspecto de la invención puede enmarcarse de manera similar como proporcionar un hidrogel de hialuronano obtenido mediante la reticulación de un polímero de hialuronano modificado por el proceso de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, o mediante la reticulación de una composición como se proporciona aquí.

[0072]En ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano comprende de 0,25 % a 0,99 % de hialuronano reticulado en agua (p/v), particularmente de 0,25 % a 0,75 % (p/v), o de 0,4 % a 0,6 % (p/v), particularmente ca. 0,5 % (p/v).

[0073]En ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano comprende entre un 0,5 % y un 4 % de hialuronano reticulado en agua (p/v), particularmente entre un 1 % y un 2 % (p/v).

[0074]En ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano comprende adicionalmente entre un 0,01 % y un 0,5 % (p/v) de heparina o sulfato de heparán reticulado con el hialuronano, particularmente entre un 0,05 % y un 0,2 % (p/v).

[0075]En ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano, particularmente el hidrogel que comprende adicionalmente heparina o sulfato de heparina, comprende un factor de crecimiento seleccionado entre el factor de crecimiento transformante beta 1 ,2 o 3, el factor de crecimiento similar a la insulina 1 y los factores de crecimiento de fibroblastos 1, 2, 9 o 18. En ciertas formas de realización seleccionadas del mismo, la concentración de dicho factor de crecimiento es de 1 a 1000 ng/ml, particularmente de 10 a 100 ng/ml. Este notable rango de posible concentración de factor de crecimiento se explica por el hecho de que se ha descubierto que los factores de crecimiento son bioactivos incluso a concentraciones muy bajas en el rango de 1 ng/ml, por lo que, aunque las concentraciones empleadas en los ejemplos son mucho más altas, los inventores esperan que el gel que comprende el factor de crecimiento muestre cualidades ventajosas incluso a concentraciones mucho más bajas.

[0076]En ciertas formas de realización seleccionadas de la misma, la concentración de dicho factor de crecimiento está entre 10 ng/ml y 3000 ng/ml. En ciertas formas de realización, el gel comprende un factor de crecimiento seleccionado entre el factor de crecimiento transformante beta 1, 2 o 3 a una concentración de entre 10 ng/ml y 100 ng/ml. En ciertas formas de realización, el gel comprende un factor de crecimiento seleccionado entre el factor de crecimiento transformante beta 1, 2 o 3 a una concentración de entre 1500 ng/ml y 2500 ng/ml.

[0077]En ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano comprende se caracteriza por un tamaño de poro de entre 0,1 pm y 1 pm, particularmente entre 0,2 y 0,8 pm.

[0078]El tamaño de poro de la formulación AH-TG utilizada preferentemente para cultivos neuronales se evaluó con imágenes confocales, utilizando una pequeña cantidad (~50 pmol/L) de TG/Gln-Fluoresceína co-reticulada con el polímero como indicador fluorescente. Para ciertas formas de realización, se pudieron visualizar poros en el rango de 0,2 a 0,8 pm. Imágenes confocales de plano único de un hidrogel AH-TG al 0,5 % (p/v) marcado con fluorescencia con TG/Gln-Fluoresceína. Se pueden distinguir poros en el rango de 0,2 a 0,8 pm.

[0079]En ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano se caracteriza por una fuerza de adhesión, medida mediante un ensayo de empuje, de más de 0,5 kPa, en particular de 1 a 10 kPa, más particularmente alrededor de 2 kPa cuando se mide la adhesión a una superficie de cartílago.

[0080]En ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano se caracteriza por su fuerza de adhesión, medida mediante un ensayo de expulsión, de más de 5 kPa, en particular aproximadamente 6 kPa cuando se mide la adhesión a una superficie de cartílago tratada con condroitinasa. El ensayo de expulsión se describe en el Ejemplo 1. El cartílago tratado con condroitinasa se prepara de acuerdo con Hunziker Kapfinger (1998) J Bone Joint Surg Br 80:144-150.

[0081]En ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano se caracteriza por un cambio de dimensión (hinchazón o contracción), medido comparando los diámetros de los discos de gel después de la gelificación y después de una hinchazón adicional en un tampón acuoso isotónico durante 3 días, de menos del 20 % en promedio, en particular menos del 10 % en promedio, más particularmente menos del 4 %. En ciertas formas de realización, el cambio de dimensión se determina en promedio con una desviación estándar de menos del 10 %, donde el tampón acuoso es una solución acuosa que se aproxima a las condiciones fisiológicas, incluyendo, entre otras, solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato, medios de cultivo celular, suero sanguíneo o líquido sinovial.

[0082]Según ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano según se proporciona en el presente documento comprende adicionalmente células condrógenas según se define en que dichas células expresan colágeno 2 y agrecano, o son capaces de dar progenie que expresa colágeno 2 y agrecano, particularmente condrocitos, condroprogenitores, células madre mesenquimales o células madre adiposas.

[0083]Según ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano según se proporciona en el presente documento comprende adicionalmente neuronas, células neuronales y/o células neuroprogenitoras (particularmente células madre pluripotentes primarias o inducidas, o células madre embrionarias o células progenitoras neuronales, neuronas y/o oligodendrocitos y/o monocultivo o cocultivo de astrocitos. En ciertas formas de realización dichas células se derivan de especies que incluyen, pero no se limitan a, primates, roedores, aves; más particularmente neuronas primarias de ratón o rata y neuronas humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas). Condiciones especialmente favorables para la inclusión y el cultivo de células se obtienen mediante geles que tienen una concentración de conjugado de hialuronano-péptido en solución acuosa de 0,25 a 1,5 % (p/v), particularmente de 0,35 a 1 % (p/v), más particularmente de -0,5 % (p/v).

[0084]En ciertas formas de realización, la densidad celular de dichos geles celulares incrustados es de 0,1 a 100 millones de células/ml, particularmente de 0,5 a 50 millones de células/ml, más particularmente de 1 a 15 millones de células/ml.

[0085]En ciertas formas de realización, el hidrogel de hialuronano proporcionado en el presente documento comprende además partículas y/o fibras derivadas del cartílago. En ciertas formas de realización, dichas partículas consisten en, o comprenden, partículas de tejido. En ciertas formas de realización, dichas partículas consisten en, o comprenden, partículas de cartílago. En ciertas formas de realización, dichas partículas consisten en, o comprenden, partículas que consisten en tejido de cartílago liofilizado. En ciertas formas de realización, dichas partículas consisten en, o comprenden, tejido de cartílago humano. En ciertas formas de realización preferidas, dichas partículas consisten en, o comprenden, tejido de cartílago autólogo. En ciertas formas de realización preferidas, las partículas pueden ser productos clínicos de matriz micronizada que incluyen partículas de BioCartilage, Amniofix, Alloderm-Cymetra, Cook Biotech Small Intestial Muscosa (SIS). En ciertas formas de realización preferidas, las partículas pueden ser hidroxiapatita o fosfato de calcio.

[0086]En ciertas formas de realización, las partículas y/o fibras están hechas de un polímero sintético, particularmente un polímero seleccionado del grupo que consiste en polímeros, o polímeros derivados de, polietilenglicol, polipropilenglicol, poloxámeros formadores de gel F108, F127, F68, F88, polioxazolinas, polietilenimina, alcohol polivinílico, acetato de polivinilo, polimetilviniléter-co-anhídrido maleico, polilactida, poli-N-isopropilacrilamida, ácido poliglicólico, polimetilmetacrilato, poliacrilamida, ácido poliacrílico y polialilamina o copolímeros de estos o copolímeros en bloque de estos.

[0087]En ciertas formas de realización, las partículas y/o fibras comprenden o están compuestas predominantemente o exclusivamente de tejido picado. En ciertas formas de realización, el tejido picado se deriva de tejido seleccionado del grupo que consiste en cartílago auricular, cartílago nasal, núcleo pulposo, menisco, tráquea, cartílago nasal, cartílago costal, cartílago articular, líquido sinovial, humor vítreo, cerebro, médula espinal, músculo, tejidos conectivos, submucosa del intestino delgado e hígado. En ciertas formas de realización, el tejido picado está en el intervalo de 5 pm - 50 pm, 50 - 200 pm y 200 - 1000 pm o una combinación de estos.

[0088]En ciertas formas de realización, las partículas pueden contener células vivas.

[0089]En ciertas formas de realización, las células se cultivan ex vivo en los hidrogeles de AH de la invención, para su posterior implantación en un sitio adecuado en el cuerpo.

[0090]En ciertas otras formas de realización, los hidrogeles de AH de la invención se utilizan junto con células en una formulación en la que la composición precursora de gel se mezcla con las células y se inyecta en el paciente antes de la formación del gel, de modo que las células se incrustan en el gelin situ.Sorprendentemente, los inventores han descubierto que los hidrogeles de AH que tienen una concentración de AH de 0,5 % a 2 % (p/v) permiten que las células condrogénicas se propaguen, proliferen y depositen una matriz homogénea con el resultado de que la rigidez de los geles puede ir desde ~1 kPa hasta >100 kPa después de la implantación. Esto contrasta con los geles de AH conocidos en la técnica, en los que las células no se propaguen, proliferan poco o nada y depositan un anillo de matriz pericelular que no da lugar a ningún aumento significativo de la rigidez.

[0091]Los geles proporcionados en este documento se distinguen de los geles conocidos en la técnica por sus propiedades útiles e inusuales. En particular, los hidrogeles de AH proporcionados en el presente documento se pueden ajustar para que no se hinchen ni se encojan para concentraciones que oscilan al menos entre el 1 y el 3 %. Esta cualidad también se denomina en el presente documento estabilidad de forma y se muestra en la figura de caracterización mecánica del Ejemplo 1 (sin pérdida de masa y sin cambio en la relación de hinchamiento). Esta propiedad es importante, por ejemplo, cuando el hidrogel se utiliza in vivo, por ejemplo, en el tratamiento de un defecto de cartílago, porque ayudará a que el gel permanezca en su lugar.

[0092]En ciertas formas de realización del hidrogel proporcionado en este documento, la relación de los diámetros de los discos de gel antes y después del hinchamiento en PBS durante 3 días fue de 0,99+/-0,10 para geles al 3 % (DE n=8), 1+/-0,025 para geles al 2 % (DE n=3) y 1,03+/-0,05 para geles al 1 % (DE n=3).

[0093]Sin querer limitarse a la teoría, los inventores creen que el enlazador definitivamente juega un papel en esta estabilidad de forma, como se explica con más detalle a continuación en la sección 2.3 del Ejemplo 1.

[0094]En un aspecto, la invención proporciona un nuevo hidrogel inyectable según se define en las reivindicaciones, con propiedades ideales para procedimientos de reparación de cartílago en un solo paso. Se han propuesto muchos geles que soportan condrocitos en cultivos 3D, y los estándares de oro in vitro son la agarosa y el alginato, pero dado que estos geles no se adhieren a la superficie del cartílago, la fibrina sigue siendo casi siempre la opción en un entorno quirúrgico, a pesar de tener una vida útil muy corta y promover la formación de cicatrices en lugar de la regeneración hialina del cartílago.

[0095]El Ejemplo 1 a continuación muestra un ejemplo de los hidrogeles de hialuronano reticulados con transglutaminasa (AH-TG) proporcionados en este documento, que son simultáneamente inyectables, mitogénicos, condroinductores y fuertemente adhesivos al cartílago nativo. Los condroprogenitores humanos están encapsulados en geles de AH-TG y su crecimiento y condrogénesis se pueden ajustar en función del contenido de macrómeros. Sorprendentemente, dentro de los geles más blandos al 1 % (~ 1 kPa), los condroprogenitores proliferan y depositan matriz extracelular hasta un punto en el que los hidrogeles alcanzan un módulo (~0,3 MPa) que se aproxima al del cartílago nativo (~1,14 MPa) en 3 semanas. Los hidrogeles de AH-TG son completamente biocompatibles y proporcionan una excelente imitación de la matriz extracelular del cartílago nativo, siendo reconocidos por múltiples tipos de células. Utilizados en combinación con células condroprogenitoras humanas disponibles comercialmente, los hidrogeles AH-TG sientan las bases para un tratamiento basado en células para lesiones de cartílago que es mínimamente invasivo, altamente reproducible y logra la integración con el tejido circundante.

[0096]En comparación con el gel publicado por Ranga et al. (ibid.), la formulación de la presente invención forma geles estables hasta <0,25 % (p/v), lo que es importante para cultivos de neuronas, que necesitan una matriz extremadamente blanda pero estable, y aplicaciones en cirugía ortopédica. Los geles de la invención son típicamente estables en cuanto a forma (no se hinchan ni se encogen) en un rango que abarca al menos entre el 1 y el 3 % (p/v), lo que es una propiedad rara e importante para la regeneración del cartílago, para que los geles no se deslaminen o "salten" (se abulten o se disloquen) después de formarse en un defecto de rodilla.

Ventajas en aplicaciones neuronales:

[0097]Los inventores en el presente documento demuestran por primera vez que los geles de AH encapsularon neuronas que eran altamente viables, extendieron rápidamente las neuritas en 3D, especificaron axones y dendritas, formaron sinapsis activas y mostraron una actividad de picos estable y coordinada a largo plazo.

[0098]Los geles de AH de alto peso molecular reticulados con transglutaminasa (TG) de hidrogeles tienen ventajas significativas para la ingeniería de tejidos neurales en comparación con los geles de AH anteriores. Debido a su inercia química en ausencia de FXIIIa, el material se puede almacenar a largo plazo, es estable en solución y no muestra citotoxicidad. La gelificación es significativamente más respetuosa con las células que los geles conocidos en la técnica, debido a la especificidad de la enzima. La velocidad de gelificación se puede ajustar ajustando la cantidad de FXIIIa añadida, y se puede hacer que sea inferior a 40 segundos. Los geles son inyectables y se unen covalentemente al fibrinógeno y la fibrina, dos componentes bioactivos comunes en la ingeniería de tejidosin vitro,así como a las proteínas presentesin vivo,lo que permite que los geles se unan covalentemente a defectos cerebrales o de la médula espinal. Estas propiedades químicas y bioactivas óptimas de los geles AH-TG permitieron la formación de cultivos neuronales tridimensionales de un rendimiento sin precedentes, mostrando un rápido crecimiento de neuritas, especiación axonal y dendrítica, fuerte conectividad sináptica en redes tridimensionales y una actividad eléctrica coordinada de rápida ocurrencia y larga duración.

[0099]Siempre que se exponen en el presente documento alternativas para características separables individuales tales como, por ejemplo, una concentración de gel, una secuencia aceptora o donante o un tipo de célula como "formas de realización", se debe entender que dichas alternativas se pueden combinar libremente para formar formas de realización discretas de la invención divulgada en el presente documento.

[0100]La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y figuras, de los cuales se pueden extraer otras formas de realización y ventajas. Estos ejemplos tienen como objetivo ilustrar la invención pero no limitar su alcance.

Breve descripción de las figuras

[0101]

La figura 1 muestra esquemas conceptuales del mecanismo de gelificación del hialuronano (AH) reticulado por transglutaminasa (TG). Los residuos de lisina y glutamina que están reticulados covalentemente por el TG FXIIIa están resaltados a la izquierda, y el enlace amida resultante de la conjugación se muestra a la derecha. Las cadenas de AH aparecen en negro, los péptidos en rojo con cadenas laterales reactivas mostradas explícitamente, y el espaciador/adaptador entre los péptidos y el AH está en violeta. También se representan células condroprogenitoras humanas encapsuladas (hCC) y la adhesión al tejido del cartílago. Las secuencias mostradas son SEQ ID NO 7 y 19.

La figura 2 muestra la síntesis química de los precursores de AH-TG. Las condiciones de reacción son 1/ EDC, MES pH 4,1 a 4,5, DTPHY y luego TCEP, 2/ DVS, TEOA pH 8, 3/ Péptido, TEOA pH 8. Las secuencias mostradas son SEQ ID N<o>7, 1 y 19.

La figura 3 muestra las propiedades materiales de los geles correspondientes al Ejemplo 1. (A) Curvas de gelificación representativas como se ha monitoreado por reometría que muestra la acumulación de los módulos de almacenamiento G' y pérdida G" para varias concentraciones de AH-TG. Nótese la rápida gelificación y equilibrio hasta una meseta. (B) Valores del módulo de almacenamiento final (tomados a los 30 min), que muestran el rango de rigidez utilizado en este estudio y la ausencia de influencia de la adición de secuencia sensible a MMP. (C) Cambio en el diámetro de los geles después de 4 días de hinchamiento en PBS. La línea de puntos indica que no hay cambios. (D) Relación de hinchamiento (peso húmedo/seco de los geles) después de 4 días de hinchamiento en PBS. La línea de puntos indica los valores esperados para que no haya pérdida de masa ni cambio de volumen. Barras de error: DE con n=8 (para C y D al 3 %) o n=3 (el resto).

La figura 4 muestra un ejemplo de un gel según el Ejemplo 1 y su adhesión al cartílago. (A) Biopsias de cartílago pegadas con una capa de gel. (B) Configuración del ensayo de expulsión para determinación de la fuerza de unión. (C) Fuerza de unión de geles AH-TG en comparación con alginato y fibrina. (*) p<0,05. Barras de error: SEM n=6.

La figura 5 muestra la morfología celular y de colágeno de geles hechos de acuerdo con el Ejemplo 1 visualizados con marcadores no específicos. (A) Imágenes en vivo multifotónicas, con adquisición simultánea de calceína (citoplasma de células vivas, verde), yoduro de propidio (YP, núcleos de células muertas, rojo) y generación de segundo armónico (SHG, colágeno ensamblado, azul). Todas las condiciones son altamente viables, mientras que las células se extienden, proliferan y depositan una matriz de colágeno densa solo en geles HATG blandos. Las imágenes están a ~60 pm de profundidad debajo de la superficie de los geles. (B) Citoesqueleto de actina (faloidina, rojo) y núcleos (DAPI, azul) fotografiados en el centro de los geles a partir de criosecciones fijadas. Esto resalta que la propagación y proliferación de condroprogenitores humanos en geles AH-TG blandos no son meramente un efecto superficial. (A+B) Las imágenes corresponden a los 21 días posteriores a la encapsulación. Barras de escala: 80 pm.

La figura 6 muestra la producción de cartílago por parte de los hCC encapsulados, como se observa en (A) la expresión génica 21 días después de la encapsulación, normalizada a la expresión el día de la encapsulación, y (B) la deposición de proteínas de la matriz. Cada imagen corresponde a un corte vertical que cubre el gel desde abajo hasta arriba alrededor de su centro. El colágeno 1, el colágeno 2 y el DAPI se adquirieron en la misma sección. Barras de escala: 400 pm.

La figura 7 muestra la evolución de las propiedades mecánicas con la deposición de la matriz por parte de los hCC entre 2 y 21 días después de la encapsulación. Se encontró que el cartílago hialino bovino tenía un módulo de compresión de 106 Pa en las mismas condiciones de medición. Barras de error: DE de n=3 (D2) y n=6 (D21).

La figura 8 muestra la síntesis de los derivados de AH elaborados en el Ejemplo 2. En los péptidos TG, las cisteínas que proporcionan tioles para la conjugación sobre AH-VS están en negrita y la lisina y la glutamina acopladas covalentemente entre sí en sus cadenas laterales por FXIIIa están subrayadas. El sitio de escisión de MMP está marcado con una flecha. Las secuencias mostradas son s Eq ID NO 19 y 7.

La figura 9 muestra los resultados de las mediciones mecánicas de geles realizados de acuerdo con el Ejemplo 2. (A) Perfiles de gelificación para diferentes concentraciones de AH-TG monitoreados por reometría y (B) Valores del módulo de almacenamiento después de 30 min (meseta), que muestra geles de fibrina e híbridos AH-fibrina. La línea discontinua en el gel híbrido AH-fibrina muestra el módulo esperado si no hubiera co-entrecruzamiento o interacciones entre las redes de AH y fibrina. La concentración de enzima se ajustó para mantener una velocidad de gelificación similar para todas las condiciones, respectivamente en U/ml: FXIIIa 10 para AH-TG 0,25 %, FXIIIa 7,5 para AH-TG 0,5 %, FXIII 20 y trombina 12,5 para AH-<t>G 3 %, FXIIIa 7,5 y trombina 0,5 para fibrina y fibrina+AH-TG. Barras de error: DE de 3 a 4 réplicas. (C) Demostración de la adhesión del gel al tejido de la médula espinal de ratón ex vivo. El tejido cuelga de una pinza visible en la parte superior y el segmento fluorescente del medio es el gel.

La figura 10 muestra los espectros de RMN del material de partida AH de los geles según el Ejemplo 2 y los derivados de sustrato VS y TG. Nótese la presencia de protones de vinilo entre 6 y 7 ppm en AH-VS, y su desaparición completa después de la conjugación del péptido, mostrando una sustitución completa. El N-acetilato de la cadena principal de AH (Ac) se utiliza como referencia interna para cuantificar los grados de sustitución con VS. (*) agua (**) acetona (***) tampón TEOA.

La figura 11 muestra los resultados de mediciones mecánicas adicionales de los geles según el Ejemplo 2. (A) Respuesta de frecuencia de un gel de AH-TG al 0,5 % después de hincharse libremente durante 3 días en PBS. Barras de error: DE n=3. (B) Influencia de la concentración de enzima en la velocidad de gelificación de geles de AH-TG al 0,5%. (C) Comparación de la curva de gelificación de AH-TG al 1 % para una solución fresca frente a una solución que se ha conservado durante 2 meses mostrando estabilidad en solución. (D) Comparación de la curva de gelificación de AH-TG al 0,5% para un derivado de AH recién sintetizado frente a uno mantenido congelado en forma seca durante 1 año mostrando estabilidad en almacenamiento.

La figura 12 muestra la morfología de las neuronas (A) como se ve con la tinción de calceína de todo el espacio intracelular y la tinción de yoduro de propidio de los núcleos de células muertas y (B) como se ve con la tinción del citoesqueleto. D2, D5 y D21 se refieren al número de días que las neuronas pasan después de la encapsulación en los geles. Observe el tremendo aumento en la densidad de neuritas con el tiempo a medida que se realizan proyecciones de intensidad máxima (MIP) sobre un espesor reducido en puntos de tiempo posteriores. Los primeros planos enfatizan los conos de crecimiento axonal y dendrítico, así como los botones sinápticos llenos de actina que brotan de las dendritas llenas de microtúbulos en puntos de tiempo posteriores.

La figura 13 muestra la especiación axonal y dendrítica. (A) El marcador de dendrita madura MAP-2 comienza a expresarse en los cuerpos celulares y las neuritas proximales en D5, y se expresa fuertemente en toda la longitud de un subconjunto de neuritas en D21. El marcador neuronal embrionario hIII-tubulina está presente en todas las neuritas. (B) El marcador axonal Tau1 ya está segregado en algunas neuritas que, por lo tanto, son axones en D2. Para D5, muchos axones atraviesan el gel y para D21 hay demasiados restos positivos para Tau1 esparcidos por el gel para distinguir los axones. El neurofilamento marcador de neuronas comienza a expresarse fuertemente en unas pocas neuronas en D5 y está fuertemente presente en un subconjunto de neuritas de la mayoría de las neuronas en D21 (todas las neuronas tienen alguna tinción débil en todos los puntos temporales). Todas las imágenes son MIP de 50 pm.

La figura 14 muestra la formación de sinapsis y la actividad de picos coordinada. (A) Hay una malla densa de densidades presinápticas potenciales marcadas por Sinaptotagmina (B) las densidades sinápticas están densamente empaquetadas en la superficie de los cuerpos celulares y las dendritas (C) Hay una malla igualmente densa de densidades postsinápticas potenciales marcadas por PSD-95 (D) Las densidades pre y postsinápticas a menudo se encuentran en estrecha aposición entre sí, lo que muestra que hay muchas sinapsis presentes. (E) Neuronas transfectadas con el reportero de calcio codificado genéticamente GCaMp (F) Medición del nivel de calcio en las neuronas de (E) con microscopía confocal de alta velocidad. Todas las neuronas en el campo de visión disparan de manera completamente sincrónica, lo que confirma una fuerte conectividad sináptica. (AD) están en D21 y (EF) en D10.

La figura 15 muestra los resultados de una caracterización de la actividad de disparo con bloqueadores farmacológicos que confirma que los picos de calcio están asociados con la actividad eléctrica neuronal y la excitación glutamatérgica. Cada línea muestra el nivel de calcio en un cuerpo celular diferente a partir de imágenes del reportero fluorescente, y las flechas indican cambios en los medios, con incubaciones de 30 min a 1 h cuando se agrega un inhibidor y hasta toda la noche para los pasos de lavado.

La figura 16 muestra A) Módulo elástico de geles de AH con y sin CDC en el día 0 y 21. B) Aumento del plegamiento del ADN después de 3 semanas en geles sin partículas (AH), geles con CDC en medios con TGF (AH-CDC+TGF), medios sin TGF (HADCC-TGF) y geles con CDC cargado y medios sin TGF.

La figura 17 muestra el perfil de liberación de TGF-b1 de geles AH-TG (línea azul) y AH-TG 0,1 % Heparina-TG/Gln (línea naranja).

La figura 18 muestra la histología de los andamiajes de gel (duplicados) producidos con y sin heparina-TG/Gln. Los paneles muestran el contenido de glicosaminoglicanos (tinción con Azul Alcian), Colágeno II (verde) y Colágeno I (rojo). Barra de escala: 500 pm.

La figura 19 muestra A) La fuerza de unión de los andamios de gel AH-TG sin células el día de la reticulación (día 0), después de 6 semanas de cultivo in vitro y después de 6 semanas de cultivo in vivo en un modelo de ratón subcutáneo. B) La fuerza de unión de los andamios AH-TG con hCC el día de la reticulación (día 0), después de 3 semanas de cultivo in vitro (preimplantación) y después de 6 semanas adicionales in vivo en un modelo de ratón subcutáneo. Los datos se dan tanto para el cultivo in vitro en condiciones normóxicas (21 % de oxígeno) como en condiciones hipóxicas (3 % de oxígeno). C) El diámetro de los andamios de gel durante el tiempo del cultivo in vivo: 1, 3,5 y 6 semanas después de la implantación. Los resultados se expresan como porcentaje del diámetro en la implantación.

La figura 20 muestra la histología de los andamios de gel producidos sin (A) y con (B) partículas de cartílago. Los andamios se tiñeron para la producción de GAG con tinción de azul alcián. Barra de escala: 20 pm.

Ejemplos

Ejemplo 1: Hidrogeles de hialuronano reticulados con factor XIII para ingeniería de tejidos de cartílago

2.1. Diseño de materiales

[0102]Para diseñar un hidrogel adaptado para inyección durante la cirugía artroscópica y apoyar la reparación del cartílago, se tomaron dos decisiones iniciales críticas sobre la estructura principal del polímero y la estrategia de reticulación.

[0103]Los dos polímeros principales de gran tamaño del cartílago son el AH y el colágeno 2. El colágeno 2 está protegido del sistema inmunitario in vivo, por lo que las inyecciones de colágeno 2 soluble presentan un alto riesgo de desencadenar la producción de anticuerpos que, en última instancia, darían lugar a una inflamación dramática del cartílago. En cambio, el AH es un material de andamiaje ideal para la ingeniería de tejidos del cartílago. Es un componente no inmunogénico clave de la matriz extracelular del cartílago, donde cumple funciones tanto de señalización como estructurales, esta última implicando la unión de monómeros de agrecano en grandes agregados importantes para soportar la carga. Utilizamos AH de grado farmacéutico de 1 a 1,8 MDa, uno de los pesos moleculares más altos del mercado, para beneficiarnos también de las propiedades positivas del AH de alto peso molecular.

[0104]Para impartir sensibilidad al FXIIIa al AH, sustituimos el polímero con un espaciador seguido de péptidos que son específicamente reconocidos y ligados covalentemente por la enzima. Uno de los péptidos está donando la lisina reactiva (TG/Lys) y el otro la glutamina reactiva (TG/Gln). El AH sustituido con TG/Gln y TG/Lys se sintetiza por separado, y luego se combina en cantidades equimolares junto con la enzima para desencadenar la gelificación, que se puede hacer directamente en defectos de cartílago y con células encapsuladas, como se ilustra en la figura 1. El material de partida de AH, así como el FXIII y la trombina utilizados, son todos productos clínicos generalizados, lo que hace improbable que el derivado de gel cree una respuesta inmune, y la gelificación rápida y suave hace que el material sea particularmente adaptado a la inyección in situ, lo que es óptimo para la traducción clínica.

2.2. Síntesis química

[0105]La conjugación directa de péptidos sobre AH es posible pero tiene varias desventajas. En primer lugar, los péptidos donantes de lisina pueden reaccionar de manera descontrolada a través de la amina de la cadena lateral y la amina terminal. En segundo lugar, la conjugación de ácidos carboxílicos con aminas mediada por EDC en condiciones acuosas tiene solo rendimientos moderados, lo que es problemático para reactivos costosos como los péptidos. Y lo más importante, incluso después de una cuidadosa purificación por cromatografía líquida de alta presión (HpLC), los péptidos contienen una cantidad desconocida de sales residuales y ácido trifluoroacético (TFA), lo que significa que lograr tasas de sustitución precisas y reproducibles con diferentes lotes de péptidos es muy difícil.

[0106]Por lo tanto, optamos por diseñar un nuevo procedimiento de tres pasos en el que cada reacción es eficiente, no tiene productos secundarios y se lleva a cabo hasta su finalización. Esto garantiza una excelente reproducibilidad de la tasa de sustitución independientemente del operador y de los lotes de materias primas, y también garantiza que casi no se desperdicie ningún péptido, lo que hace que el procedimiento sea rentable.

[0107]En resumen (Fig. 2), primero se tioló AH usando activación de EDC y conjugación con hidrazida de un compuesto que contiene ditiol, seguido de reducción del ditiol con TCEP para producir AH-SH. La conjugación mediada por EDC es crítica ya que define la tasa de sustitución y, por lo tanto, el comportamiento de gelificación posterior y las propiedades mecánicas del gel. El uso de un tampón en lugar del seguimiento manual del pH más común garantiza una intervención humana mínima y, por lo tanto, una gran reproducibilidad. A continuación, se agregó un gran exceso de divinil sulfona, para intercambiar con una adición de Michael la funcionalidad tiol a vinil sulfonas (VS), produciendo AH-VS. Finalmente, los péptidos que contienen un casete de cisteína se hicieron reaccionar sobre el AH-VS, utilizando nuevamente la eficiencia de la adición de Michael de tioles sobre VS. En cada paso, la diálisis fue el método de elección para la eliminación de los tampones y las moléculas pequeñas que no reaccionaron, porque es muy eficiente con polímeros y garantiza que no haya estrés en las cadenas de Ah de alto peso molecular, preservando el peso molecular. Una de las principales motivaciones para optar por pasar de AH-SH y AH-VS a AH-TG fue que los tioles se oxidan fácilmente y, según nuestra experiencia, muy poca oxidación fue suficiente para formar una esponja reticulada cuando se trabaja con AH de peso molecular muy alto. Esto complica el almacenamiento a largo plazo de AH-SH, especialmente si se neutraliza. También afecta negativamente a la reproducibilidad, ya que las soluciones de AH-SH de peso molecular alto en un tampón a pH 7,4 sufren una oxidación significativa incluso durante las pocas horas de un solo experimento. El AH-VS de peso molecular alto, a pesar de su estabilidad relativamente buena en solución, tiene problemas de almacenamiento similares porque difícilmente se resuspende de la forma congelada o liofilizada, probablemente debido a las interacciones hidrófobas que ocurren rápidamente, así como a las adiciones lentas de hidroxilos de AH o aminas desacetiladas en los vinilos mientras está en estado sólido. Por todas estas razones, se utilizaron AH-SH y AH-VS inmediatamente en el siguiente paso. Por el contrario, los derivados de AH-TG tuvieron una estabilidad perfecta en solución, en forma congelada y en seca, como se verificó por reometría (no se encontró ningún cambio en la curva de gelificación después de que el polímero había pasado >2 meses en solución salina tamponada con Tris (NaCl 150 mM, CaCl2 50 mM, TRIS 50 mM, equilibrado a pH 7,6) a 4 °C, o más de un año en forma congelada seca, figura 11C-D). En este procedimiento, apuntamos (a través de la cantidad de reactivos en el primer paso) una tasa de sustitución del 10 %, confirmada por RMN de protones en el AH-VS en D2O (picos de VS entre 6 y 7 ppm versus pico de acetilato de la cadena principal de AH a 1,9 ppm, figura 10). La sustitución completa del AH-VS con péptidos se confirmó por la desaparición completa de los picos de VS.

[0108]Para elaborar geles con sensibilidad a MMP, se elaboró una versión de AH-TG que incorporó una secuencia escindible por MMP dentro del péptido TG/Lys.

[0109]Como la función nativa de FXIIIa es reticular los coágulos de fibrina entre sí y con proteínas asociadas, se espera que se puedan formar copolímeros de fibrina y AH-TG, como se muestra en la figura 9B. La rigidez de un gel que contiene fibrina y AH es mayor que la suma de la rigidez de los geles de fibrina o AH solos, lo que muestra que se están produciendo interacciones sinérgicas.

2.3. Caracterización mecánica

[0110]El comportamiento de gelificación se caracterizó por reometría (Fig. 3A-B). En lugar de preactivar FXIII con trombina como se hizo en la literatura de PEG, razonamos que la activación in situ de FXIII daría una cinética de gelificación más interesante: de esta manera, se puede utilizar una cantidad bastante alta de FXIII, para un equilibrio muy rápido hasta una meseta después de la activación, y la velocidad de gelificación inicial se puede ajustar con la cantidad de trombina, para tener el inicio de la gelificación exactamente en el tiempo deseado (esto puede verse como un método de reticulación que tiene una cinética de segundo orden en función del tiempo en lugar de la progresión lineal habitual). También significa que se pueden utilizar las mismas concentraciones de enzima para cualquier contenido de macrómero, lo que produce siempre un tiempo de inicio de gelificación similar. Elegimos utilizar 20 U/ml de FXIII y 12,5 U/ml de trombina para obtener el inicio de la gelificación alrededor de 1 minuto y el equilibrio hasta una meseta en 10 a 15 minutos.

[0111]Las soluciones precursoras de macrómeros de 1 a 3 % dieron módulos de almacenamiento que oscilaban entre ~ 0,3 y 2 kPa, que abarcan un rango de rigidez típicamente apropiado para encapsular células que todavía están en un estado proliferativo y no completamente diferenciado. Aún se pudieron formar geles estables hasta al menos 0,25 % (p/v), pero la alta viscosidad de las soluciones a más de 3 % hace que la manipulación de precursores más concentrados sea difícil. AH-TG que incluye la secuencia sensible a MMP tenía propiedades mecánicas idénticas.

[0112]La medición del diámetro del gel y las proporciones de hinchamiento (masa seca sobre masa húmeda) mostraron que los geles no sufrieron ningún cambio dimensional o pérdida de polímero en comparación con los geles fundidos D0 después de la incubación en PBS durante 4 días (Fig. 3C-D). El contenido de polímero estable durante 4 días demuestra que esencialmente todas las cadenas de AH estaban reticuladas, algo que se esperaba para un procedimiento de reticulación tan eficiente que utiliza un polímero de peso molecular tan alto. Sin embargo, la falta de hinchamiento o contracción fue un hallazgo notable ya que indica un equilibrio perfecto de atracción y repulsión entre las cadenas que permitió que los geles mantuvieran su tamaño en cada concentración examinada. Es probable que cada parte de la cadena de polímero desempeñe un papel en la estabilidad de forma auspiciosa, con la carga negativa del AH contribuyendo a la repulsión, los péptidos contribuyendo a las cargas positivas y los espaciadores a la hidrofobicidad. Esto contrasta con la mayoría de los sistemas de hidrogel donde las interacciones cadena-cadena y cadena-disolvente conducen a una contracción o hinchamiento significativo del gel. En estos casos, el cambio de forma dependiente de la concentración y del tiempo, que es impredecible, puede hacer que las construcciones de ingeniería tisular se deslaminen o se salgan (se disloquen, se abulten) de su sitio de implantación.

2.4 Adhesión a explantos de cartílago

[0113]La adhesión a explantos de cartílago se estudió con pruebas de empuje de cilindros de geles hechos en anillos de 4 mm de cartílago bovino (Fig. 4). La adhesión se comparó con la fibrina, un pegamento y sellador quirúrgico común y el alginato, que es el hidrogel más común para el cultivo de condrocitos en 3D, pero no es adhesivo (Kuo y Ma, Biomaterials 2001, 22, 511; Drury y Mooney, Biomaterials 2003, 24, 4337). Se encontró que el AH-TG era significativamente más adhesivo al cartílago que el pegamento de fibrina, que era en sí mismo más adhesivo que el alginato (prueba t de Student p<0,05). Cuando la superficie del cartílago se trató con condroitinasa, para eliminar los polisacáridos y exponer la parte proteica de la matriz del cartílago, que es lo que media la adhesión en los tres casos, se encontró que la fuerza de adhesión aumentó aproximadamente 2, 3 y 6 veces para la fibrina, AH-TG y alginato respectivamente. El alginato y la fibrina se estaban volviendo comparables, pero AH-TG todavía se pegaba ~3 veces más fuerte que los controles, alcanzando una fuerza de adhesión de más de 6 kPa.

2.5. Formación de cartílago a partir de ECP encapsuladas

[0114]Finalmente, los hCC se encapsularon en los hidrogeles para estudiar su potencial para apoyar la condrogénesis y la formación efectiva de tejido de cartílago. El resultado se analizó después de 3 semanas en cultivo (D21), y los geles de alginato, al ser un estándar en el campo, se utilizaron como referencia.

[0115]Los ensayos de células vivas/muertas mostraron una viabilidad cercana al 100% en todas las condiciones (Fig. 5A), pero la morfología celular observada a partir de la tinción con calceína (célula completa) y actina (Fig. 5B) dependía en gran medida de la concentración de polímero. Las células se extendieron y proliferaron para llenar casi todo el espacio en los geles más blandos, mientras que solo formaron pequeños grupos sin extenderse en los geles más fuertes. La generación del segundo armónico (SHG) a 60 micrones de profundidad desde la superficie se recopiló simultáneamente con la fluorescencia de calceína/YP. Esto proporcionó una manera de verificar la producción general de colágeno de una manera no específica del tipo directamente en las células vivas. Los geles blandos se destacaron claramente del resto por estar completamente llenos de una red densa de colágeno, mientras que las otras condiciones solo mostraron la deposición de colágeno en una capa delgada alrededor de los grupos de células. El colágeno apareció fibrilar en la misma superficie del gel, lo cual es común en el colágeno 1 en tales construcciones de cartílago diseñadas, pero más homogéneo dentro del gel, aunque se deposita en forma de células diseminadas.

[0116]A continuación, investigamos la deposición de la matriz a nivel de genes y proteínas con qPCR normalizada a D0 e inmunofluorescencia, respectivamente. En todas las condiciones, la expresión del gen del colágeno 2 aumentó al menos 104 veces, mientras que la regulación positiva del colágeno 1 fue inferior a 10 veces, lo que indica una buena inducción de la condrogénesis en todas las condiciones. La alta expresión del colágeno 2 también se tradujo al nivel de proteínas: los geles blandos se rellenaron completamente con una matriz de colágeno 2, mientras que los geles más rígidos solo tenían una deposición de colágeno 2 delgada y más compacta alrededor de los grupos de células, que recuerda a lo que se vio en SHG. La relación colágeno 2/colágeno 1 fue mayor en los geles más rígidos, lo que se esperaba ya que estas células tenían una morfología celular más redonda. El agrecano se reguló positivamente en el orden de 10 veces en todas las condiciones, nuevamente con una mayor expresión en los geles más rígidos. La deposición de agrecano fue particularmente fuerte en la superficie de los geles de AH.

[0117]El patrón de deposición de proteínas dependía en gran medida de la profundidad, lo que se puede atribuir al hecho de que los hidrogeles se cultivaron en moldes cilíndricos de PDMS unidos a cubreobjetos. Las tinciones muestran claramente que un mejor acceso a nutrientes/factores de crecimiento/oxígeno en la superficie beneficia en gran medida la producción de proteínas.

[0118]Finalmente, se evaluó el parámetro más importante para las aplicaciones clínicas, la evolución de las propiedades mecánicas a lo largo del tiempo. Si bien se descubrió que los geles rígidos al 3 % mantienen esencialmente su rigidez durante el período de cultivo de 3 semanas, los geles blandos al 1 % mostraron un tremendo aumento de la rigidez desde un módulo de compresión inicial de ~1 kPa hasta un valor final cercano a 0,3 MPa. Se descubrió que el cartílago nativo medido en las mismas condiciones era de ~1 MPa, lo que es coherente con los valores publicados en la literatura. Es particularmente digno de mención que la rigidez de los geles blandos alcanzó el orden de magnitud del cartílago nativo en un período de tiempo clínicamente relevante.

[0119]Los geles intermedios al 2 % tenían valores entre estos dos extremos, y los geles de alginato eran demasiado inestables para ser medidos en D0 y solo alcanzaron 10 kPa en D21. Es importante señalar que, si bien los geles de alginato experimentaron una contracción y un cambio de forma significativos, todos los geles a H-TG tenían una forma y un tamaño casi perfectamente estables durante el tiempo de cultivo. Estos resultados de rigidez se correlacionan fuertemente con la deposición de colágeno como se ve por SHG que solo muestra la matriz ensamblada, mientras que la expresión génica no fue el mejor predictor del resultado físico.

[0120]Todos los experimentos celulares se realizaron también con geles AH-TG sensibles a MMP, y ninguna de las caracterizaciones mostró una diferencia significativa entre los geles sensibles e insensibles a MMP (datos que se muestran en el suplemento). Estos resultados sugieren que el aumento del coste y el riesgo de degradación prematura del gel cuando se utilizan secuencias de MMP no está justificado, y que el uso de AH-TG sin secuencias de MMP es la mejor opción para la ingeniería de tejidos de cartílago.

[0121]Los condroprogenitores humanos encapsulados en los geles mostraron una proliferación ajustable y una buena deposición de la matriz del cartílago, transformando los geles en tejido similar al cartílago en tres semanas. Sorprendentemente, los geles más blandos al 1 % mostraron un tremendo aumento de la rigidez durante el tiempo de cultivo, alcanzando una rigidez del mismo orden de magnitud que el cartílago nativo.

2.6 Estabilidad y condrogénesis de AH-TG en un modelo de ratón subcutáneo

[0122]Los andamios de gel de AH-TG, reticulados en anillos de 4 mm de cartílago bovino, se implantaron por vía subcutánea en ratones desnudos durante 6 semanas. Después de este tiempo, la fuerza de unión de las construcciones fue comparable a la fuerza de unión inicial, así como a la fuerza de unión de las construcciones cultivadas in vitro durante el mismo tiempo (Fig. 20A).

[0123]Los hCC se encapsularon en geles AH-TG y se cultivaron durante 3 semanas en condiciones normóxicas o hipóxicas en anillos de cartílago bovino. Después de este tiempo, los constructos se implantaron por vía subcutánea en ratones desnudos durante 6 semanas. Las resistencias de unión en el momento de la implantación fueron respectivamente 60 y 40 veces mayores (es decir, 80 kPa y 52 kPa) en comparación con el valor inicial. Cuando los animales se sacrificaron para el análisis de los andamiajes, los geles estaban intactos y no provocaron ninguna reacción negativa visible. La resistencia de unión de los constructos alcanzó 300 kPa y 150 kPa para el precultivo en normoxia e hipoxia respectivamente (Fig. 20B). La evaluación histológica mostró que los constructos no se vascularizaron ni se infiltraron con células huésped. Además, los constructos pudieron preservar la matriz extracelular producida in vitro. Los constructos con y sin anillos de cartílago mantuvieron su forma y dimensiones durante su tiempo in vivo como lo confirmó la ecografía (Fig. 20C).

2.7 Geles de AH que contienen heparina

[0124]En primer lugar, los resultados histológicos muestran que la liberación repentina de TGF-b1 de los andamios de AH-TG que no contienen heparina o sulfato de heparán es menos que idealmente suficiente para la condrogénesis (véase la figura 17). Como se puede observar en la figura 18, la tinción de azul alcián es muy tenue y probablemente se debe a la presencia de grupos de ácido carboxílico en la estructura principal de hialuronano. Casi no hay colágeno II y el colágeno I aparece en los bordes del andamio. Uno de los duplicados se encogió.

[0125]Sin embargo, cuando la heparina-TG/Gln se entrecruzó con la cadena principal de AH-TG, el factor de crecimiento pudo promover de manera eficiente la secreción de glicosaminoglicanos y colágeno II. La tinción muestra un contenido incluso mayor de colágeno II en comparación con los andamios cultivados en un medio que contenía 10 ng/ml de TGF-b1. Es de gran interés que la adición de heparina también condujo a una disminución drástica de la producción de colágeno I por las células, lo que indica que hay retención de un fenotipo de cartílago. Cabe destacar que el andamio cultivado en ausencia total de factor de crecimiento condujo a la muerte celular y los geles eran demasiado blandos para analizarlos más a fondo.

4. Sección experimental

[0126]Todos los productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich y los reactivos de cultivo celular de ThermoFisher Scientific a menos que se indique lo contrario.

Síntesis de AH-SH:

[0127]Se disolvieron 400 mg (1 mmol de la unidad de repetición de disacárido) de sal sódica de AH (Lifecore Biomedical, 1,01-1,8 MDa) y 23,8 mg (0,1 mmol) de 3,3'-ditiobis(dihidrazida propanoica) (DTPHY, Frontier Scientific) en una solución de MES 150 mM con agitación suave ocasional (pH final 4,1). A continuación, se disolvieron 38,4 mg (0,2 mmol) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, Fluka) en 1 ml de agua desionizada y se añadieron gota a gota con agitación. Se detuvo la agitación y se dejó que la reacción continuara durante la noche. El pH aumentó hacia ~4,5 durante el curso de la reacción, y el tampón MES impidió que aumentara más. A continuación, se disolvieron 143,33 mg (0,5 mmol) de TCEP-HCl (Fluorochem) en 500 pl de agua y se añadieron, la solución se homogeneizó agitando y se dejó que la reducción se llevara a cabo durante la noche en un matraz cerrado en reposo. Por último, se añadió 1 g (17 mmol) de NaCl a la solución y la mezcla se dializó frente a agua ultrapura equilibrada a pH 4,5 con HCl diluido, con 4 cambios de agua durante 24 h, para obtener una solución de sal sódica de AH-SH pura.

Síntesis de AH-VS:

[0128]La solución de AH-SH recuperada de la diálisis anterior se añadió gota a gota a una solución de 1 ml (10 mmol) de divinil sulfona (DVS) en 40 ml de tampón de trietanolamina (TEOA), 300 mM, pH 8,0. La reacción se dejó actuar durante 2 horas a temperatura ambiente, luego se añadió 1 g de NaCl y la solución se dializó contra agua ultrapura para obtener AH sustituido con sulfona de vinilo puro (AH-VS).

[0129]La tasa de sustitución se midió comparando los picos a 6,75 ppm (vinilsulfonas) y 1,75 ppm (N-acetilos de AH) de RMN de protones en D2O y se encontró que era el 10 % de los ácidos carboxílicos en AH.

[0130]El AH-VS es estable durante períodos prolongados de tiempo en solución (al menos semanas), pero difícilmente se resuspende si se congela o liofiliza, probablemente debido a interacciones hidrofóbicas. Por lo tanto, procedimos directamente con el siguiente paso (si es necesario el almacenamiento en forma seca, la liofilización en presencia de >20 mM de NaCl produce un polvo que se puede resuspender fácilmente).

AH-TG/Lys y AH-TG/Gln:

[0131]El AH-VS se dividió en dos partes iguales. Una mitad se sustituyó con un péptido sustrato de FXIIIa que proporciona un residuo de glutamina reactivo (TG/Gln: NQEQVSPL-ERCG (SEQ ID NO 19)) y la otra mitad con el péptido que proporciona la lisina reactiva (TG/Lys: FKGG-ERCG (SEQ ID NO 01)). Para una versión sensible a la metaloproteinasa de matriz (MMP) de los geles, se utilizó en su lugar un donante de lisina con una secuencia sensible a MMP (Ehrbaret al., Biomaterials, vol. 28, no. 26, pp. 3856-66, sep. 2007) (MMP-TG/Lys: FKGG-GPQGIWGQ-ERCG (SEQ ID NO 07)). Los péptidos (Anawa) contenían -40 % de sal que se tuvo en cuenta en los cálculos de molaridad. Para la conjugación, se añadieron 10 ml de tampón TEOA 300 mM, pH 8,0 a cada porción de AH-VS, las soluciones se desoxigenaron burbujeando con gas nitrógeno y, finalmente, los péptidos se añadieron en un exceso de 1,3 sobre el VS. Las soluciones se homogeneizaron rápidamente, los matraces se sellaron y las reacciones se dejaron proceder durante la noche sin agitación. Finalmente, se disolvieron 2 g de NaCl en cada matraz y los productos se dializaron frente a agua ultrapura. Los componentes AH-TG puros resultantes se esterilizaron mediante filtración de 0,4 mm, se dividieron en alícuotas y se liofilizaron en condiciones estériles.

Formación de gel AH-TG:

[0132]Se resuspendieron alícuotas de AH-TG/Lys y AH-TG/Gln al 1,2 o 3 % (p/v) en TBS filtrado estéril (NaCl 150 mM, CaCl250 mM, TRIS 50 mM, equilibrado a pH 7,6). A continuación, las dos soluciones se combinaron en un volumen igual para formar la solución madre de polímero AH-TG. Para desencadenar la gelificación de 60 ml de solución AH-TG, se añadieron 1,5 ml de solución de trombina (Baxter, 500 U/ml) seguido de 6 ml de solución de FXIII (Fibrogammin, CSL Behring, 200 U/ml). La gelificación se produjo en aproximadamente 1 minuto, lo que dejó tiempo suficiente para transferir el precursor líquido.

[0133]Formación de gel de alginato: Se colocó alginato (Novamatrix) al 0,33 % (p/v) (que coincide con la rigidez de los geles AH-TG al 3 %) en NaCl 150 mM en moldes cilíndricos de PDMS de 4 mm de diámetro y 1 mm de altura sobre cubreobjetos, y se gelificó en ~500 ml de solución de CaCl2 100 mM durante 1 h, difundido a través de una membrana prehumedecida. A continuación, se retiraron la membrana y el calcio y se cubrió el gel con medio de cultivo.

Modificación de la heparina

[0134]Para que se reticulara covalentemente con la cadena principal de AH-TG, los inventores modificaron la heparina (Sigma, H3393) injertando péptidos donantes de glutamina (abreviados como Gln) a los grupos carboxílicos de la heparina, utilizando exactamente el mismo protocolo que se muestra anteriormente para el hialuronano. El grado de sustitución fue del 15 %.

ELISA

[0135]Para cada estudio de condición, se prepararon 3 geles de 30 pl. Brevemente, se mezclaron 50 pl de AH-TG al 4 % (en solución de glucosa tamponada con Tris, TBG, que consiste en glucosa 100 mM, Tris 50 mM, cloruro de calcio 50 mM, pH equilibrado a 7,6) con 50 pl de Heparina-TG/Gln al 0,2 %, junto con 0,1 pl de una solución madre de TGF-b1 (10 pg/ml, lo que conduce a una cantidad final en los geles de 1 ng). La gelificación se obtuvo mediante la adición de 2,5 pl de trombina 500 U/ml y 5 pl de factor XIII 200 U/ml y los geles se mantuvieron a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, se transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 ml y se añadieron 200 pl de sobrenadante (PBS, BSA al 1 %). Entre cada toma, los tubos se mantuvieron a 37°C. Se utilizó un kit ELISA (R&D Systems, DY240-05) según el protocolo del fabricante para determinar la concentración de TGF-b1 en el sobrenadante.

Preparación de los geles con células y condiciones de cultivo

[0136]Se encapsularon células humanas (375 millones por 25 pl de estructura) en AH-TG solo, AH-TG con TGF-b1 o AH-TG con heparina-TG/Gln y TGF-b1. Se utilizó TGF-b1 a una concentración de 2 pg/ml.

• AH-TG

[0137]Se mezclaron suavemente 250 |jl de AH-TG al 2%en tampón TBG sin calcio con 3,75 millones de células y se desencadenó la reticulación mediante la adición de 6,25 j l de trombina 500 U/ml, 12,5 j l de factor XIII 200 U/ml y 2,5 j l de una solución de cloruro de calcio 5 M. Se vertieron 8 geles de 25 j l en moldes de PDMS, de los cuales 2 se cultivaron durante 3 semanas en medios condrogénicos completos que contenían 10 ng/ml de TGF-b1 y 2 se cultivaron con medios de control (DMEM 31966 1 % ITS, 40 jg/m l de Lprolina y 50 jg/m l de ácido ascórbico, sin factor de crecimiento añadido). Los medios se cambiaron cada dos días.

• AH-TG con TGF-b1

[0138]Se añadieron 30 j l de AH-TG al 4% en tampón TBG sin calcio, que contenía 100 ng de TGF-b1 (obtenido mezclando 18 j l de AH-TG al 6,7 % con 12 j l de una solución madre de TGF-b1 a 10 mg/ml), a 30 j l de tampón TBG sin calcio. Después de mezclar suavemente con 900.000 células (para obtener una concentración celular final de 15 millones de células/ml), se desencadenó la gelificación mediante la adición de 1,5 j l de trombina 500 U/ml, 3 j l de factor XIII 200 U/ml junto con 3 j l de una solución de cloruro de calcio 1M. Se produjeron 2 geles de 25 j l en moldes de silicona en forma de disco de 4 mm de diámetro. Los andamios se cultivaron en medios de control durante 3 semanas, el medio se cambió cada dos días.

• AH-TG+Heparina-TG/Gln+TGF-b1

[0139]Se añadieron 30 j l de AH-TG al 4% en tampón TBG sin calcio, que contenía 100 ng de TGF-b1 (obtenido mezclando 18 j l de AH-TG al 6,7 % con 12 j l de una solución madre de TGF-1 a 10 mg/ml), a 30 j l de Heparina-TG/Gln al 0,2 % en tampón TBG sin calcio. Después de mezclar suavemente con 900.000 hCC (para obtener una concentración celular final de 15 millones de células/ml), se desencadenó la gelificación mediante la adición de 1,5 j l de Trombina 500 U/ml, 3 j l de factor XIII 200 U/ml junto con 3 j l de una solución de cloruro de calcio 1M. Se produjeron 2 geles de 25 j l en moldes de silicona en forma de disco de 4 mm de diámetro. Los andamios se cultivaron en medios de control durante 3 semanas, el medio se cambió cada dos días.

Histología

[0140]Después de 3 semanas en cultivo, los geles se recolectaron, se fijaron con paraformaldehído al 4 % en PBS, se lavaron en PBS y se sumergieron en sacarosa al 10 % (en PBS) durante 1 h, seguido de sacarosa al 30 % (en PBS) durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, los geles se mantuvieron durante 2 horas en un compuesto de temperatura de corte óptima (O.C.T) a temperatura ambiente antes de congelarlos instantáneamente, mediante inmersión en metanol que contenía hielo seco. Los constructos se cortaron en un criostato (5 jm de espesor) y los portaobjetos se secaron y se mantuvieron a -20 °C. Se realizaron tinciones con azul alcián e inmunotinciones de colágeno I y II.

Resultados

Liberación del factor de crecimiento

[0141]La adición covalente de heparina-TG/Gln a los hidrogeles AH-TG permitió la retención eficiente del factor de crecimiento en el andamiaje y permitió una liberación sostenida y lenta de TGF-b1 (Fig. 17). Esto permitió una producción mejorada de matriz de cartílago por células condrogénicas sin ningún suministro adicional de factores de crecimiento a través del medio de cultivo (Fig. 18), como sería el caso in vivo.

Mediciones

Todos los valores de medición proporcionados en este documento corresponden a los siguientes métodos, cuando corresponda, a menos que se indique lo contrario

Mediciones de módulos de corte:

[0142]Después de agregar el FXIII y la trombina, el precursor de gel se cargó rápidamente en un reómetro Anton Paar MCR 301 equipado con una geometría de placa-placa de 20 mm y piso de metal, precalentado a 37 °C y con cámara humidificada. La sonda se bajó rápidamente a la posición de medición (0,1 a 0,2 mm, monitoreando el precursor de gel formando un anillo alrededor de la geometría mientras se baja la sonda para asegurar que el espacio de medición se llena con precisión). A continuación, se controló la gelificación a 1 Hz con una tensión del 4 %, que se encontraba dentro del rango viscoelástico lineal de los geles.

Mediciones del módulo de compresión:

[0143]Los geles se dejaron hinchar durante al menos 2 días en PBS y se probaron bajo compresión no confinada utilizando un analizador de textura TA.XTplus (Stable Microsystems) con una célula de carga de 500 g. Las muestras se comprimieron hasta una deformación final del 10 % a una velocidad de 0,01 mm/s. El módulo de compresión E informado es la pendiente del rango lineal inicial de la curva de tensión-deformación.

Mediciones de la resistencia de adhesión:

[0144]Se recogieron muestras de cartílago articular bovino con un espesor de 1-2 mm de las articulaciones de las rodillas de terneros de 3-6 meses de edad. Se prepararon anillos de cartílago de 8 mm de diámetro exterior y 4 mm de diámetro interior utilizando punzones de biopsia y se lavaron en PBS. A continuación, los explantos se dividieron aleatoriamente en dos grupos: un grupo se dejó en PBS mientras que el otro se incubó durante 15 minutos a 37 °C en 1 U/ml de condroitinasa ABC seguido de 3 lavados con PBS. La digestión con condroitinasa da como resultado una digestión de aproximadamente 50 mm de GAG, como se confirmó mediante tinción con azul alcián. Se inyectaron geles AH-TG en el hueco circular de los explantos de cartílago y se dejaron gelificar durante 20 minutos a 37 °C en una cámara humidificada. Para evitar fugas, los explantos se colocaron sobre una superficie recubierta de parafilm. Se realizaron pruebas de expulsión a una velocidad de 0,5 mm/s con una varilla de 3 mm. La resistencia de la unión se calculó como la fuerza máxima dividida por el área del orificio perforado interior.

[0145]Protocolo de aislamiento y expansión de hCC:se recolectaron y aislaron hCC como lo describen Darwiche et al. (Darwiche 2012). Brevemente, se tomó y trituró una biopsia de tejido de la epífisis cubital proximal de un donante de 14 semanas de gestación. Los hCC crecieron a partir de los trozos de tejido. Las células se cultivaron durante hasta 2 semanas en DMEM (cat. 41966) que contenía 10 % v/v de FBS, 2 mM de L-glutamina y 10 mg/ml de gentamicina. Las células se almacenaron en nitrógeno líquido y se expandieron hasta el paso 3 antes de la encapsulación.

[0146]Encapsulación de hCC en geles:Las células se tripsinizaron y se resuspendieron a 15 x 106 células/ml en la solución AH-TG, luego se desencadenó la gelificación como se describió anteriormente. Los geles se vertieron rápidamente en moldes cilíndricos de PDMS esterilizados con UV de 4 mm de diámetro (SYLGARD 184, Corning) adheridos a cubreobjetos de 10 mm. Se dejó que los geles se reticularan durante 15 minutos a 37 °C antes de agregar medio condrogénico (DMEM (cat. 31966) suplementado con 10 ng/ml de factor de crecimiento transformante p3 (TGF-p3, Peprotech), 100 nM de dexametasona, 50 pg/ml de L-ascorbato-2-fosfato, 40 pg/ml de prolina, 0,5% de penicilinaestreptomicina y 1 % de premezcla ITS+ (Corning)). Los geles se incubaron en una cámara humidificada controlada (37 °C, 5 % (vol/vol) de CO2) durante 3 semanas y el medio de cultivo se reemplazó dos veces por semana.

[0147]Imágenes en vivo:Los geles se incubaron durante 1 h en un medio suplementado con 2 pM de calceína AM y 6,6 pg/ml de yoduro de propidio (YP), se lavaron con medio fresco y se obtuvieron imágenes en un microscopio multifotón Leica SP8 (objetivo de inmersión en agua de 25x, irradiación Mai Tai a 900 nm) con recolección simultánea de la generación del segundo armónico (SHG) y fluorescencia. Las imágenes presentadas se tomaron a 60 a 70 pm de la superficie de la muestra, ya que la señal se deterioró a mayores profundidades.

[0148]Inmunohistoquímica:Los geles se fijaron en formaldehído al 4 % durante 45 minutos, se incorporaron en O.C.T (Tissue-Tek O.C.T Compound Blue, Sysmex) y se almacenaron a -80 °C. Se cortaron secciones de 5 pm de espesor utilizando un criostato (CryoStar NX70, Thermo Scientific). La tinción de colágeno 1 y 2 se realizó después de 30 minutos de digestión con hialuronidasa al 0,2 % (p/v) a 37 °C y 1 hora de bloqueo con BSA al 5 % en PBS con anticolágeno 1 de ratón diluido 1:200 (Abcam #ab6308) y anticolágeno 2 de conejo diluido 1:200 (Rockland 600-401-104). La tinción de proteoglicanos se realizó después de reducir el tejido con 10 mM de ditiotreitol en TBS pH 7,4 durante 2 horas a 37 °C y alquilar con 40 mM de yodoacetamida en PBS durante 2 horas a 37 °C. A continuación, las secciones se digirieron con 0,02 U/ml de condroitinasa ABC durante 40 minutos a 37 °C y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con BSA al 5 % antes de incubarlas con el anticuerpo primario (Hybridoma 12/21/1-C-6). Todos los anticuerpos primarios se diluyeron en BSA al 1 % (p/v) en PBS y se incubaron durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos secundarios Alexa Fluor 594 Cabra Anti-Ratón IgG (Invitrogen, A11005), Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Conejo Alexa 488 (Invitrogen A11008) y Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón (Invitrogen A11029) se utilizaron en una dilución de 1:200 en BSA al 1 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, los portaobjetos se incubaron durante 10 minutos con el colorante nuclear DAPI (Molecular Probes, Invitrogen) antes de montarlos con el medio de montaje VectaMount AQ (Vector Laboratories).

[0149]Extracción de ARN y PCR:Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido y se trituraron utilizando morteros para pellets (Thomas Scientific). El ARN total se preparó utilizando el kit NucleoSpin miRNA (Macherey-Nagel) y la concentración se determinó con un lector de microplacas Synergy H1 (BioTek Instruments). El ARN con una relación de absorbancia a 260/280 nm entre 1,9 y 2,1 se utilizó para el análisis de PCR. La mezcla maestra Fast SYBR Green (Applied Biosystems) se utilizó para realizar la amplificación por PCR con cebador directo e inverso de 150 nM. Todos los cebadores (véase la Tabla 1) se diseñaron a través de las uniones exón-exón utilizando la herramienta de diseño de PCR en tiempo real de Integrated DNA Technologies (http://eu.idtdna.com/Scitools/Applications/RealTimePCR/Default.asp) para evitar la amplificación del ADN genómico. Todos los datos procedían de 3 réplicas independientes y se analizaron utilizando el método 2-AACt) y se normalizaron frente al gen de referencia RPL13a (Studer et al. Tissue Eng Part C Methods. 2012 Oct;18(10):761-71) con muestras del día 0 elegidas como referencia.

ARNm N.° de adhesión BP_________ Secuencia de cebador (5'-3')

hRPL13aNM_012423 100 DIR AAGTACCAGGCAGTGACAG (SEQ ID NO 030)

INV CCTGTTTCCGTAGCCTCATG (SEQ ID NO 031)

hCol1a1NM_000088 83 DIR CAGCCGCTTCACCTACAGC (SEQ ID NO 032)

INV TTTTGTATTCAATCACTGTCGCC (SEQ ID NO 033)hCol2a1NM_001844 92 DIR GGAATTCGGTGTGGACATAGG (SEQ ID NO 034)

INV ACTTGGGTCCTTTGGGTTTG (SEQ ID NO 035)hCol10a1NM_000493 108 DIR ATTCCTAGTGGCTCCAATGTG (SEQ ID NO 036)

INV GCCTACCTCCATATGCATTTT (SEQ ID NO 037)

hACANNM_001135.3 98 DIR GAATGGGAACCAGCCTATACC (SEQ ID NO 038)

INV TCTGTACTTTCCTCTGTTGCTG (SEQ ID NO 039)

[0150]Implantación subcutánea in vivo:Los andamios se prepararon como se describió anteriormente con y sin hCC, con y sin explantos de cartílago. Los constructos se implantaron después de 3 semanas de precultivo en el bolsillo subcutáneo de ratones desnudos NU/NU (inmunodeficientes) (hembras de 2-3 meses de edad, Charles River). Los estudios en animales se realizaron de conformidad con las pautas éticas (número de solicitud ZH189/2014). Los ratones fueron anestesiados en una caja de plexiglás con isoflurano al 4,5 % seguido de isoflurano al 2 % aplicado a través de una máscara nasal durante la cirugía. Se cortaron dos incisiones, cada una lateral a la línea media dorsal, a nivel de la articulación de la cadera y los constructos se colocaron subcutáneamente. La incisión se cerró con grapas quirúrgicas, que se retiraron después de 1 semana. Después de 6 semanas, los animales fueron sacrificados mediante asfixia con CO2, los explantos se fijaron durante 2 horas en paraformaldehído al 1 % y se procesaron para histología y pruebas mecánicas como se describió anteriormente. Los animales fueron escaneados periódicamente con un sistema de imágenes Vevo LAZR para adquirir imágenes de ultrasonido de los constructos. Durante la exploración, los animales fueron anestesiados con isoflurano al 4,5 % y la anestesia se mantuvo con isoflurano al 1,5 %.

Ejemplo 2: Hidrogeles de hialuronano que favorecen la formación in vitro de redes neuronales3D

Introducción

[0151]El hialuronano es la columna vertebral de la matriz extracelular del cerebro, donde tiene múltiples funciones estructurales y de señalización. Las cadenas largas de hialuronano (>1 MDa) están unidas por proteoglicanos de sulfato de condroitina como el agrecano, que a su vez están reticulados por tenascinas. El cerebro no tiene una red de colágeno 2 interpenetrante, lo que hace que el hialuronano sea un componente aún más esencial de la matriz cerebral y la opción más obvia para imitar la matriz extracelular natural de las neuronas.

[0152]Las neuronas se encuentran entre las células más frágiles del cuerpo y, por lo tanto, el uso de una química de reticulación que esté absolutamente libre de sustancias químicas reactivas estresantes es una gran ventaja al encapsularlas en un hidrogel, con el fin de preservar una alta viabilidad. Para esto, la reticulación FXIIIa es particularmente adecuada: la enzima reticula selectivamente los péptidos unidos a AH-TG y ninguno de los componentes del gel puede reaccionar de forma cruzada con las células.

[0153]Además, las neuronas prosperan en matrices muy blandas (~ 100 Pa) y la forma más natural de lograr una rigidez tan baja de una manera estable y confiable es reticular polímeros de alto peso molecular con una baja densidad de reticulación. Por estas razones, el hialuronano de alto peso molecular con baja sustitución del péptido del sustrato de transglutaminasa descrito para el ejemplo del cartílago (AH-TG) es perfectamente adecuado. Los geles se pueden hacer para que coincidan con la rigidez adecuada para el tejido neuronal reduciendo el porcentaje de AH-TG a -0,5 % (p/v), sin sacrificar la estabilidad.

Resultados y discusión

Encapsulación de neuronas: viabilidad y morfología

[0154]Como se ve en la Figura 9A, la gelificación se puede ajustar para que ocurra dentro del primer minuto después de la mezcla y administración de la muestra, y la rigidez de 10 a 2000 Pa es fácilmente accesible con variaciones de la concentración de AH-TG. Los experimentos piloto de encapsulación de neuronas demostraron que los geles al 0,25 % tendían a ser demasiado blandos para manipularlos fácilmente sin dañarlos, mientras que los geles al 1 % reducían el crecimiento de las neuritas. Por lo tanto, realizamos el estudio de cultivo de neuronas en 3D con 0,5 % de AH-TG (la mitad de AH-TG/Lys y la otra mitad de AH-TG/Gln). Estos geles no parecieron degradarse, ni se hincharon ni encogieron notablemente durante períodos de cultivo que, por lo general, duran entre 1 y 2 meses.

[0155]La inercia en ausencia de FXIIIa tuvo como consecuencia esperada que los reactivos AH-TG no tuvieran citotoxicidad alguna y que las neuronas disociadas pudieran encapsularse sin pérdida de viabilidad. En geles al 0,5 % (p/v), la viabilidad era de alrededor del 90 % justo antes de la encapsulación (D0) y se encontró que era del 85±5 % en D2 y del 81±7% en D5 (DE n=9). Los geles no mostraron signos de degradación en ningún momento y los cultivos estables pudieron mantenerse durante más de 2 meses.

[0156]Se observó una rápida extensión de las neuritas desde los primeros días y, para el D21, los geles se llenaron con una densa malla de neuritas, formando extensas redes 3D (nótese el espesor reducido de MIP y las densidades de neuritas aumentadas en la figura 12A desde el D2 hasta el D21). Los conos de crecimiento grandes con muchos filipodios exploratorios llenos de actina en la punta de los axones llenos de microtúbulos, así como conos de crecimiento dendríticos más pequeños y simples, recordaban lo que se observain vivo(Fig. 12B, primeros planos a-b). Las neuritas también estaban cubiertas con muchos filamentos pequeños llenos de actina en el D2, que podrían ser puntos de iniciación de ramificaciones. Para el D5, parecían mayormente lisos. Posteriormente, comenzaron a verse brotes llenos de actina que recordaban a espinas dendríticas en algunas neuritas en D5, y se volvieron omnipresentes en D21 (claramente visibles en los primeros planos b-c-d de la figura 12A D2-D21 y la figura 12B).

[0157]Los marcadores axónicos y dendríticos específicos aparecieron al mismo tiempo que las características morfológicas asociadas con los axones y las dendritas: los axones positivos para Tau1 ya eran visibles en D2, y el marcador dendrítico MAP-2 comenzó a expresarse en los cuerpos celulares y las dendritas proximales en D5, y se expresó fuertemente y se localizó en toda la longitud de un subconjunto de neuritas en D21 (Fig. 13). La tubulina pIII tiñe todas las neuritas de estas neuronas embrionarias, como se esperaba, mientras que los neurofilamentos se expresaron fuertemente solo después de 21 días, y solo en un subconjunto de neuritas.

Actividad de picos

[0158]El reportero de calcio codificado genéticamente GCaMP se utilizó para monitorear la actividad de picos de las neuronas. Los picos fuertes y completamente sincrónicos ya eran visibles en D10 (Fig. 14 EF). De acuerdo con esto, se encontró una gran densidad de terminales presinápticas potenciales llenas de sinaptotagmina y terminales postsinápticas potenciales llenas de PSD-95 asociadas a cuerpos celulares y neuritas (Fig. 14 a B) y en muchos casos asociadas entre sí (C-D), para formar sinapsis.

[0159]Como las ondas de calcio pueden estar presentes en otros tipos de células además de las neuronas y tener otras causas además de los picos eléctricos, confirmamos que los picos eran de hecho actividad eléctrica neuronal mediante el bloqueo con el bloqueador específico del canal de sodio dependiente del voltaje Tetrodotoxina (TTX). Además, los inhibidores específicos de la transmisión glutamatérgica CPP y CNQX también bloquearon la actividad de picos, lo que demuestra que la excitación neuronal se basa en la excitación glutamatérgica estándar, como se podría esperar de las neuronas corticales (Fig. 15). La actividad siempre se recuperó después del lavado durante la noche, lo que demuestra que ninguno de los compuestos se utilizó en una dosis tóxica.

[0160]La facilidad con la que las neuronas en cultivos 3D en estos geles pueden ser monitoreadas con reporteros fluorescentes junto con el hecho de que las pruebas farmacológicas con moléculas pequeñas pueden realizarse simplemente dejando que las moléculas se difundan durante 1 hora a través de los geles hace que estos geles sean particularmente adecuados para estudios de neurobiología o farmacología en cultivos 3D.

[0161]Se debe hacer una nota adicional de que también se encontró que estos geles AH-TG se adhieren al tejido de la médula espinal del ratón (Fig. 9C), que es una propiedad importante para la traducción in vivo de nuestros resultados in vitro: por ejemplo, para llenar un quiste en la médula espinal con una matriz permisiva axonal, o para administrar células en el cerebro con una matriz de soporte.

Conclusión

[0162]Los nuevos hidrogeles AH-TG descritos aquí se reticulan con la actividad de transglutaminasa específica de FXIIIa y presentan un conjunto ideal de propiedades para la ingeniería de tejidos neuronales, incluyendo estabilidad química, reticulación específica con velocidad de gelificación y rigidez ajustables de forma independiente, citocompatibilidad con encapsulación de neuronas disociadas (la prueba de citocompatibilidad más exigente), inyectabilidad, reticulación covalente a fibrina y otras proteínas, y la posibilidad de degradar enzimáticamente los geles para biorresorción o recuperación celular. Estos geles se basan adicionalmente en AH de alto peso molecular, que tiene importantes propiedades neuroprotectoras, antifibróticas y antiinflamatorias. Además, el AH es la columna vertebral de la matriz extracelular del cerebro, por lo que las neuronas reciben un gel que imita su entorno natural. Todas estas propiedades permitieron cultivos neuronales en 3D de un rendimiento sin precedentes, con un rápido crecimiento de las neuritas, una polarización neuronal adecuada, una actividad eléctrica de rápida aparición y duradera con una fuerte conectividad sináptica. Por lo tanto, estos geles están perfectamente posicionados para llevar los estudios neurobiológicos y farmacológicos basados en células a la tercera dimensión. También son prometedores para su traducción a aplicaciones en lesiones cerebrales o de la médula espinal, algo que requerirá una mayor investigaciónin vivo.

Materiales y métodos

[0163]Todos los reactivos se utilizaron con la mayor pureza disponible a menos que se indique lo contrario.

Síntesis de AH-SH, síntesis de AH-VS, conjugación de péptidos:

[0164]Véase la sección experimental del Ejemplo 1.

Preactivación de FXIII

[0165]FXIII (Fibrogammin, CSL Behring) se resuspendió a 200 U/ml en agua, se dividió en alícuotas de 100 ul y se almacenó a -80 °C. Para la activación, se añadieron 3,2 |jl de trombina (de Tissucol, Baxter) a 50 U/ml y 2 |jl de CaCl2 100 mM a una alícuota, y se incubó durante 15 min a 37 °C. El FXIII activado (FXIIIa) se almacenó en alícuotas de 10 j l a -80 °C hasta el día de su uso.

Formación de gel de AH-TG

[0166]Se resuspendieron alícuotas de AH-TG/Lys y AH-TG/Gln a la concentración deseada, es decir, 0,5 % (p/v) a menos que se indique lo contrario, en solución salina suplementada con 50 mM de TRIS y 50 mM de CaCl2, con pH equilibrado a 7,6 y esterilizada por filtración (denominada TBS). A continuación, se combinaron las dos soluciones en un volumen igual y se añadió a la pared del tubo la cantidad de enzima correspondiente a la velocidad de gelificación deseada, es decir, 3 j l de FXIIIa 200 U/ml para 80 j l de gel a menos que se indique lo contrario, y se incorporó rápidamente mediante agitación vorticial. La gelificación se produjo en 1-2 minutos y se dejó que continuara durante 20 minutos para garantizar que se alcanzara una meseta de rigidez antes de transferir al medio.

Reometría

[0167]Después de añadir el FXIIIa, el precursor de gel se cargó rápidamente en un reómetro Anton Paar MCR 301 equipado con una geometría de placa-placa de 20 mm y piso de metal, precalentado a 37 °C y con cámara humidificada. La sonda se bajó rápidamente a la posición de medición (100 a 200 jm , monitoreando el precursor de gel formando una corona alrededor de la geometría mientras se baja la sonda para asegurar que el espacio de medición se llena con precisión). A continuación, la gelificación se monitoreó a 1 Hz con una tensión del 4 %.

[0168]Los geles de fibrina de control se prepararon añadiendo FXIIIa y trombina a 7,5 y 0,5 U/ml respectivamente a partir de soluciones concentradas en una solución de fibrinógeno al 0,5 % (p/v) en TBS. Los híbridos AH-fibrina se prepararon añadiendo la misma cantidad de enzima en una solución de fibrinógeno que contenía además 0,5 % (p/v) de AH-TG.

[0169]Para las mediciones después del hinchamiento, se prepararon geles de AH-TG al 0,5 % (p/v) en moldes de teflón de 1,4 mm de espesor, se dejaron gelificar durante 20 min a 37 °C con una atmósfera humidificada, se recogieron y se sumergieron en PBS pH 7,4 durante 3 días. A continuación, los geles se cargaron en el reómetro equipado con una geometría de placa-placa de 10 mm, se comprimieron en un 10 % para asegurar la adhesión a la superficie, se recortaron y se midieron con un barrido de frecuencia a una tensión del 4 %.

Cultivos de neuronas

[0170]Se diseccionaron y disociaron las cortezas de embriones de rata Wistar E17 como se describió anteriormente. Brevemente, las cortezas se incubaron durante 15 minutos a 37 °C en PBS suplementado con 1 mg/ml de BSA, 10 mM de glucosa, 0,5 jg/m l de ADNasa (Sigma, D-5025) y 0,5 mg/ml de papaína (Sigma, P-4762), y se lavaron con medio de bloqueo compuesto por DMEM 10 % de FBS. Se resuspendieron en 2 ml de medio de bloqueo y se disociaron por trituración utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego. Las células disociadas se resuspendieron en un medio de crecimiento sin suero, compuesto por Neurobasal B27 (Gibco 21103-049 y 17504-044) suplementado con 1x Glutamax y Penicilina/Estreptomicina, y se sembraron durante la noche en matraces recubiertos con poliL-lisina (50 ug/ml en tampón de borato, pH 8,4, incubados a 37 °C durante 1 h). Al día siguiente, las neuronas sembradas se lavaron primero con TrypLE express durante 5 min, para desprender las células no viables débilmente adherentes y los restos celulares. A continuación, las células sanas restantes se desprendieron con tripsina/EDTA (Gibco 12605-010 y 25200-072). Después de la adición de dos volúmenes de medio de bloqueo, las células se centrifugaron y se resuspendieron en un medio de crecimiento sin suero, y se contaron.

[0171]Para la encapsulación, las neuronas se sedimentaron y se resuspendieron a 10e6 células/ml en la mezcla AH-TG/Lys-Gln. Después de la adición del FXIIIa, el precursor del gel se vertió en moldes de PDMS caseros de 4 mm de diámetro/1 mm de altura preadheridos sobre cubreobjetos y se mantuvieron en placas de 24 pocillos. Después de 20 minutos de gelificación a 37 °C en una atmósfera humidificada, se añadió 1 ml de medio sin suero a los geles. Después de 2-3 semanas, se reemplazó la mitad del medio una vez a la semana.

Ensayos de células vivas-muertas

[0172]Los geles se incubaron 1 h en un medio suplementado con calceína AM 2 jM y yoduro de propidio 6,6 jg/ml, se transfirieron a un medio fresco para lavar y se tomaron imágenes en un multifotón Leica SP8 de 465 x 465 x 200 mm. Las células vivas y muertas se contaron manualmente en la proyección de intensidad máxima (MIP) (típicamente ~400 células/imagen). Los experimentos se reprodujeron por triplicado con 3 camadas diferentes (n=9).

Inmunocitoquímica e imágenes

[0173]Los anticuerpos primarios fueron: pIII-tubulina (Sigma T5076, 1:500), neurofilamento (Sigma N4142, 1:150), sinaptotagmina (DSHB, 8 |jg/ml), MAP-2 (Sigma M3696, 1:200), PSD-95 (Abcam ab18258, 1:400). Los anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 y 594 (Invitrogen A11005, A11008, A10680, A11015) se usaron a 1:200.

[0174]Adaptamos protocolos de inmunocitoquímica estándar para teñir y obtener imágenes directamente de los geles completos. Las muestras se fijaron y permeabilizaron durante 1 h a 4 °C en formalina al 10 % con Triton X-100 al 0,1 %, se bloquearon durante la noche con BSA al 5 % en PBS y se lavaron con PBS (dos veces durante 1 h, una vez durante la noche). A continuación, se incubaron en anticuerpo primario (durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave, dilución con BSA al 3 % en PBS), se lavaron con PBS, se incubaron durante la noche en anticuerpo secundario, se lavaron con PBS, se tiñeron con DAPI 0,3 jM en PBS durante 1 h y, finalmente, se lavaron con PBS.

[0175]La obtención de imágenes de muestras inmunoteñidas se realizó en un microscopio multifotón Leica SP8 con un objetivo de agua de 20x/0,95 NA, excitando típicamente a 710 nm y 1100 nm utilizando láseres fs MaiTai Deepsee e Insight Deepsee respectivamente (Spectra Physics). Las pilas resultantes se editaron en Fiji para aplicar un MIP y ajustar la visualización de color (brillo/contraste/gamma). Cuando había ruido de sal y pimienta, se aplicó un filtrado de mediana sobre < 2 px.

Obtención de imágenes de actividad de picos

[0176]El reportero de calcio intracelular codificado genéticamente GCaMP se administró con un virus adenoasociado añadido directamente al precursor de gel a una concentración optimizada. A continuación, se obtuvieron imágenes de la actividad de picos en un microscopio confocal Leica SP8 a 8 fotogramas/s (Fig. 14) o en un microscopio de campo amplio Zeiss Observer con incubación de CO2 a 2,5 fotogramas/s (Fig. 15).

[0177]Para confirmar que las ondas de calcio estaban efectivamente asociadas con picos eléctricos neuronales y transmisión glutamatérgica, se añadieron los siguientes inhibidores selectivos al medio y se dejaron difundir en los geles durante 1 h: Tetrodotoxina 500 nM (Acros Organics, antagonista del canal de sodio dependiente de voltaje), CPP 10 mM (Sigma, antagonista del receptor de glutamato NMDA), CNQX 20 jM (Sigma, antagonista del receptor de glutamato AMPA/kainato).

Ejemplo 3: Partículas de cartílago descelularizadas en un hidrogel reticulable in situ

[0178]En este ejemplo presentamos un andamiaje con potencial bioactivo para la reparación del cartílago que consiste en un hidrogel de hialuronano (AH) modificado reticulable enzimáticamente y partículas de cartílago descelularizadas (CDC). Partículas descelularizadas con un protocolo propio de laboratorio y partículas comerciales BioCartilage® (Arthrex, Naples, FL, EE. UU.) se cargaron con un factor de crecimiento condrogénico y se mezclaron con AH para formar hidrogeles estables, inyectables y reticulables in situ (AH-CDC). Cuando se sembraron con células condroprogenitoras humanas (hCC), los geles estimularon la proliferación celular y la síntesis de matriz cartilaginosa en un grado mayor en comparación con los geles de AH sin partículas cuando se cultivaron en presencia de un factor de crecimiento.

[0179] MÉTODOS:Se extrajo cartílago articular bovino de cóndilos de terneros, se molió en cromatografía y se descelularizó con un protocolo de dos pasos. Las partículas de CDC y BioCartilage® se cargaron con factor de crecimiento transformante beta-3 (TGFp-3) y se mezclaron con un hidrogel AH-T<g>al 1 % (p/v) como se muestra en los Ejemplos 1 o 2 junto con 15 millones de hCC/ml. Se añadió el factor XIII como se muestra en los Ejemplos 1 y 2, y después de la activación con trombina y Ca2+ se inició la reticulación. Los geles se cultivaron en medios con o sin TGFp-3 (10 ng/mL) durante 3 semanas para ensayos bioquímicos, análisis histológico y pruebas mecánicas. Los medios de cultivo se analizaron con ELISA para determinar la liberación de TGFp-3.

[0180] RESULTADOS:Después del cultivo, el AH-CDC exhibió un módulo elástico significativamente más alto medido en pruebas de compresión que los geles de AH sin partículas. Los geles aumentaron respectivamente de 1,04 y 1,61 kPa a 126 y 45 kPa(Fig. 16)debido a la deposición de la matriz.

[0181]Se investigó la proliferación celular mediante un ensayo Picogreen. Todos los geles AH-CDC mostraron aumentos de hasta 5 veces en el ADN después de 3 semanas, mientras que los geles sin partículas mostraron un aumento de hasta 3 veces en el ADN.

[0182]El análisis histológico confirmó la deposición de GAG y colágeno II en geles cultivados en presencia de TGFp-3 (medio o CDC cargado). No se observaron diferencias entre las partículas de CDC bovinas y BioCartilage®.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para formar un hidrogel de hialuronano, que comprende los pasos de a. proporcionar una solución acuosa que comprende i. un primer conjugado de péptido de hialuronano que comprende péptidos donantes de transglutaminasa y ii. un segundo conjugado de péptido de hialuronano que comprende péptidos aceptores de transglutaminasa, en donde dicho primer conjugado de péptido de hialuronano y dicho segundo conjugado de péptido de hialuronano están representados cada uno por una fórmula general I,

   en donde del 5% al 20%, particularmente del 8 al 12%, más particularmente aproximadamente el 10 % de las fracciones R1 están representadas por una fórmula general II,

   en donde - L es NH-Alk o O-Alk o NH-NH-CO-Alk con Alk siendo un alquilo C1 a C5, y - Pep es un péptido donante de transglutaminasa o un péptido aceptor de transglutaminasa, respectivamente, y el resto de las fracciones R1 están representadas por -COOH. b. añadir una transglutaminasa capaz de unir covalentemente dichos péptidos donantes de transglutaminasa a péptidos aceptores de transglutaminasa a dicha solución acuosa, en donde la concentración de la suma de dicho primer conjugado de péptido hialuronano y dicho segundo conjugado de péptido hialuronano es de 0,25 % (p/v) a 5 % (p/v) y en donde dicho hialuronano se caracteriza por un peso molecular medio igual o mayor que (>) 250 kg/mol, y en donde a. la secuencia de péptido donante de transglutaminasa es o comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 01 a SEQ ID 14; b. la secuencia de péptido aceptor de transglutaminasa es o comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 15 a SEQ ID 29.
2. 2. Procedimiento para formar un hidrogel de hialuronano según la reivindicación 1, que comprende los pasos de añadir un polipéptido de trombina a dicha solución acuosa y permitir el equilibrio de la mezcla resultante; posteriormente, añadir un polipéptido de factor XIII.
3. 3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que L es -N-NHCO-(CH2)2-.
4. 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solución acuosa de la etapa a. comprende adicionalmente heparina o sulfato de heparán en una concentración de 0,05 % a 0,5 % (p/v con respecto al gel), y en el que la heparina o sulfato de heparán comprende péptidos donantes y/o aceptores de transglutaminasa unidos covalentemente, en el que entre el 10 % y el 20 % de los grupos de ácido carboxílico presentes en dicha heparina o sulfato de heparán están modificados covalentemente para contener una modificación descrita por la fórmula general (II) como se ha expuesto anteriormente, teniendo L, S y Pep el significado indicado anteriormente.
5. 5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de la suma de dicho primer conjugado de péptido hialuronano y dicho segundo conjugado de péptido hialuronanose caracteriza enla primera columna de la siguiente tabla, y dicho hialuronanose caracteriza poruna masa molecular media (MMM) como se especifica en la segunda columna de la siguiente tabla:
6. 6. Procedimiento para la modificación de un polímero de hialuronano,caracterizado porquedicho polímero de hialuronano tiene un peso molecular medio igual o superior a (>) 250 kg/mol y está compuesto por n dímeros de fracciones de ácido D-glucurónico y fracciones de D-N-acetilglucosamina, y en el que dichas fracciones de ácido D-glucurónico tienen fracciones de ácido carboxílico reactivas, y dicho procedimiento comprende los pasos de: a. tiolación de 5 % a 20 % de dichas fracciones de ácido carboxílico reactivas para producir hialuronano parcialmente tiolado; b. hacer reaccionar dicho hialuronano parcialmente tiolado con divinilsulfona para producir vinilsulfonahialuronano; c. hacer reaccionar dicho vinilsulfona-hialuronano con un péptido que comprende una fracción de cisteína, en el que dicho péptido comprende una secuencia seleccionada entre una secuencia de péptido donante de transglutaminasa y una secuencia de péptido aceptor de transglutaminasa.
7. 7. Procedimiento para la modificación de un polímero de heparina o sulfato de heparán, en el que dicho polímero de heparina o sulfato de heparán comprende fracciones de ácido D-glucurónico y fracciones de ácido L-idurónico, cada una de las cuales contiene fracciones de ácido carboxílico reactivas, y dicho procedimiento comprende los pasos de: a. tiolación de 5% a 20%, particularmente 8-12%, más particularmente aproximadamente 10% de dichas fracciones de ácido carboxílico reactivas para producir heparina o sulfato de heparán parcialmente tiolado; b. hacer reaccionar dicho hialuronano parcialmente tiolado con divinilsulfona para producir vinilsulfona-heparina o vinilsulfona-heparán sulfato; c. hacer reaccionar dicha vinilsulfona-heparina o -heparán sulfato con un péptido que comprende una fracción de cisteína, en el que dicho péptido comprende una secuencia seleccionada de una secuencia de péptido donante de transglutaminasa y una secuencia de péptido aceptor de transglutaminasa, en el que a. la secuencia del péptido donante de transglutaminasa es o comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 01 a SEQ ID 14; b. la secuencia del péptido aceptor de transglutaminasa es o comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 15 a SEQ ID 29.
8. 8. Composición que comprende o consiste esencialmente en un polímero de hialuronano de fórmula general I,

   en donde entre el 5 % y el 20 % de las fracciones R1 están representadas por una fórmula general II,

   en donde - L es NH-Alk o O-Alk o NH-NH-CO-Alk, siendo Alk un alquilo Ci a C5, y - Pep es un péptido donante de transglutaminasa o un péptido aceptor de transglutaminasa, respectivamente, y el resto de las fracciones R1 están representadas por COO<h>, en donde a. la secuencia del péptido donante de transglutaminasa es o comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 01 a SEQ ID 14; b. la secuencia del péptido aceptor de transglutaminasa es o comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 15 a SEQ ID 29.
9. 9. Hidrogel de hialuronano que comprende hialuronano reticulado con transglutaminasa y agua, obtenido - mediante un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o - mediante reticulación de un hialuronano obtenido mediante un proceso según la reivindicación 6 , o - mediante reticulación de una composición según la reivindicación 8, en el que el hidrogel comprende entre un 0,25 % y un 0,75 % de hialuronano reticulado en agua (p/v) o en el que el hidrogel comprende entre un 0,5 % y un 4 % de hialuronano reticulado en agua (p/v).
10. 10. Hidrogel de hialuronano según la reivindicación 9, en el que a) la concentración del hialuronano reticulado en agua se caracteriza en la primera columna de la siguiente tabla, y b) el hialuronano empleado para obtener dicho hidrogel se caracteriza por una masa molecular media (MMM) como se especifica en la segunda columna de la siguiente tabla:
11. 11. Hidrogel de hialuronano según las reivindicaciones 9 o 10,caracterizado porun tamaño de poro de 0,1 pm a 1,0 pm.
12. 12. Hidrogel de hialuronano según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho hidrogelse caracteriza poruna fuerza de adhesión, medida mediante ensayo de expulsión, a. de más de 0,5 kPa cuando se mide la adhesión a una superficie de cartílago; y/o b. de más de 4 kPa cuando se mide la adhesión a una superficie de cartílago tratada con condroitinasa.
13. 13. Hidrogel de hialuronano según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12,caracterizado porun cambio de dimensión (hinchazón o contracción), medido comparando los diámetros de los discos de gel después de la gelificación y después de un hinchamiento adicional en un tampón acuoso isotónico durante 3 días, de menos del 10 % en promedio.
14. 14. Hidrogel de hialuronano según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende adicionalmente condrocitos, condroprogenitores, células madre mesenquimales o células madre adiposas.
15. 15. Hidrogel de hialuronano según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que dicho hidrogel comprende neuronas, células neuronales y/o células neuroprogenitoras.