ES3009593T3

ES3009593T3 - Nonalcoholic fatty liver disease (nafld) and nonalcoholic steatohepatitis (nash) biomarkers and uses thereof

Info

Publication number: ES3009593T3
Application number: ES17705281T
Authority: ES
Inventors: Stuart Field
Original assignee: Somalogic Operating Co Inc
Current assignee: Somalogic Operating Co Inc
Priority date: 2016-02-08
Filing date: 2017-02-07
Publication date: 2025-03-27
Anticipated expiration: 2037-02-07
Also published as: EP3414575C0; BR112018014842A2; BR112018014842A8; US20210215711A1; WO2017139254A1; EP4513191A3; US20240094222A1; US12510550B2; EP3414575B1; CN116008563B; KR20180105156A; EP4513191A2; MX2018009170A; KR102687249B1; CN116008563A; CN108603887A; CN108603887B; EP3414575A1

Abstract

Se proporcionan métodos, composiciones y kits para determinar si un sujeto padece enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), y más específicamente, una o más de las siguientes afecciones asociadas: esteatosis, inflamación lobulillar, balonización hepatocítica y fibrosis. También se proporcionan métodos, composiciones y kits para determinar si un sujeto padece esteatosis no alcohólica. También se proporcionan métodos, composiciones y kits para determinar si un sujeto padece esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcadores de enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) y esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y usos de los mismos

Campo de la invención

La presente solicitud se refiere en general a la detección de biomarcadores y a la caracterización de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), por ejemplo, para identificar sujetos con esteatosis y esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). En diversas realizaciones, la invención se refiere a uno o más biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits para caracterizar la EHGNA y la EHNA en un individuo.

Antecedentes

La siguiente descripción proporciona un sumario de información y no es una admisión que cualquier información proporcionada o publicaciones a las que se hace referencia en el presente documento sea técnica anterior de la presente solicitud.

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) se define como la presencia de esteatosis hepática, con o sin inflamación y fibrosis, en ausencia de antecedentes de alcohol. La EHGNA se subdivide en hígado graso no alcohólico (HGNA) y esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). En el HGNA, la esteatosis hepática está presente sin evidencia de inflamación significativa, mientras que en la EHNA, la esteatosis hepática se asocia a una inflamación hepática que puede ser histológicamente indistinguible de la esteatohepatitis alcohólica.

La EHGNA se ha convertido en una epidemia mundial y es la principal causa de enfermedad hepática en Norteamérica, como consecuencia del rápido aumento de la prevalencia de la obesidad. Sin embargo, los datos poblacionales precisos sobre la incidencia del HGNA y la EHNA son escasos, en parte porque el diagnóstico requiere documentación histopatológica. Los principales factores de riesgo de la EHGNA son la obesidad central, la diabetes mellitus de tipo 2, los niveles elevados de triglicéridos (grasas) en la sangre y la hipertensión arterial. En los Estados Unidos, la EHGN<a>está presente en el 20-40 % de la población y la EHNA en aproximadamente el 25 % de la población obesa. Entre el 10 % y el 29 % de los pacientes con EHNA desarrollan cirrosis y el 4 %-27 % de ellos desarrollan cáncer hepático.

La mayoría de las personas con EHNA no presentan síntomas. Algunos pueden tener dolor en el cuadrante superior derecho, hepatomegalia o síntomas inespecíficos tales como molestias abdominales, debilidad, fatiga o malestar. Un médico o enfermero puede sospechar la presencia de EHNA a partir de los resultados de los análisis de sangre rutinarios. En la EHGN<a>, las enzimas hepáticas aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) con frecuencia están elevadas.

El método de referencia actual para confirmar la EHNA es una evaluación histológica de la biopsia hepática, que es cara, invasiva y puede provocar dolor, hemorragia o incluso la muerte.

Sería muy deseable disponer de un análisis de sangre sencillo que permitiera identificar y distinguir las diversas fases tanto de la EHGNA como de la EHNA (y reducir de este modo la necesidad de biopsia hepática). Williamset al.,2015.J Biol Chem.,290(101:6546-6557 establece una función para la señalización de integrina en la facilitación de la acción de la insulina hepática promoviendo al mismo tiempo la acumulación de lípidos en ratones expuestos a una dieta con alto contenido de grasa. Neiiariet al.,2001,J Pathol.,195(4):473-481 investiga la función de la regulación positiva de las integrinas en la enfermedad hepática crónica y su relación con la inflamación y la fibrosis en la hepatitis C crónica, Wrucket al.,2015,Sci Data,2:150068 explora la etapa de esteatosis temprana de la EHGNA con el objetivo de identificar los mecanismos moleculares que subyacen a la etiología de la EHGNA. El documento WO 2014/150198 A2 proporciona métodos, composiciones y kits para determinar si un sujeto tiene la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA). Tokushigeet al.,2013,J Gastroenterol,48(121:1392-1400 proporciona biomarcadores potenciales de la gravedad de la fibrosis en la enfermedad del hígado graso no alcohólico. Moylanet al.,2013.Hepatology,59(2):471:482 desvela que los perfiles de expresión génica hepática diferencian los pacientes presintomáticos con hígado graso no alcohólico leve frente a grave.

Sumario

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En las realizaciones reivindicadas, se proporcionan métodos para determinar si un sujeto tiene la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA). En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención existen métodos para identificar sujetos con esteatosis y métodos de determinación de la gravedad de la esteatosis.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención existen métodos para determinar si un sujeto tiene esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y métodos para identificar sujetos con EHNA. En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención existen métodos para distinguir sujetos con EHNA de sujetos con esteatosis y métodos para determinar la gravedad de la EHNA.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el método del presente documento sirve para determinar si un sujeto tiene la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que comprende formar un panel de biomarcadores con N proteínas biomarcadoras de entre las proteínas biomarcadoras enumeradas en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, y detectar el nivel de cada una de las N proteínas biomarcadoras del panel en una muestra del sujeto, en donde N es al menos 5. En algunas realizaciones, N es de 5 a 10, o N es de 6 a 10, o N es de 7 a 10, o N es de 8 a 10, o N es de 9 a 10, o N es al menos 6, o N es al menos 7, o N es al menos 8, o N es al menos 9. En algunas realizaciones, N es 5, o N es 6, o N es 7, o N es 8, o N es 9, o N es 10.

En las realizaciones reivindicadas, se proporciona un método para determinar si un sujeto tiene la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que comprende detectar el nivel de ITGA1/ITGB1 en una muestra del sujeto, en donde un nivel de ITGA1/ITGB1 que es superior a un nivel de control indica que el sujeto tiene EHGNA, y en donde detectar el nivel de ITGA1/IGTB1 comprende la detección de ITGA1 y/o ITGB1, y/o un complejo de ITGA1 e ITGB1. En algunas realizaciones, se proporciona un método para determinar si un sujeto tiene la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que comprende detectar el nivel de HSP90AA1/HSP90AB1 en una muestra del sujeto, en donde un nivel de HSP90AA1/HSP90AB1 que es superior a un nivel de control indica que el sujeto tiene EHGNA. En algunas realizaciones, se proporciona un método para determinar si un sujeto tiene la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que comprende detectar los niveles de ITGA1/ITGB1 y HSP90AA1/HSP90AB1 en una muestra del sujeto, en donde un nivel de ITGA1/ITGB1 y/o un nivel de HSP90AA1/HSP90AB1 que es superior a un nivel de control indica que el sujeto tiene EHGNA. En las realizaciones reivindicadas, el método comprende además detectar el nivel de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete biomarcadores seleccionados de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR y THBS2, en una muestra del sujeto, en donde un nivel de al menos un biomarcador seleccionado de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR y THBS2 que es superior a un nivel de control del biomarcador respectivo, indica que el sujeto tiene EHGNA. En algunas realizaciones, el método comprende detectar los niveles de ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, COLEC11 y THBS2. En algunas realizaciones, el método comprende determinar el nivel de AST en el sujeto, en donde un nivel elevado de AST indica que el sujeto tiene EHGNA.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el método del presente documento sirve para determinar si un sujeto tiene la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que comprende detectar el nivel de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez u once biomarcadores seleccionados de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y THBS2, en una muestra del sujeto, en donde un nivel de al menos un biomarcador seleccionado de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y THBS2 que es superior a un nivel de control del biomarcador respectivo, indica que el sujeto tiene EHGNA. En las realizaciones reivindicadas, el método comprende detectar el nivel de ITGA1/ITGB1, o tanto de HSP90AA1/HSP90AB1 como de ITGA1/ITGB1.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el método del presente documento sirve para determinar si un sujeto tiene esteatosis, que comprende proporcionar un panel de biomarcadores que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o siete biomarcadores seleccionados de ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 y CSF 1R; detectar el nivel de los biomarcadores en una muestra del sujeto para proporcionar valores de biomarcadores que correspondan a los biomarcadores del panel de biomarcadores con el fin de determinar si el sujeto tiene esteatosis o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga esteatosis.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el método del presente documento sirve para determinar si un sujeto tiene esteatosis, que comprende detectar al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o siete biomarcadores seleccionados de ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 y CSF1R, en una muestra del sujeto con el fin de determinar si el sujeto tiene esteatosis o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga esteatosis.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el método del presente documento sirve para determinar si un sujeto tiene inflamación lobular, que comprende proporcionar un panel de biomarcadores que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho biomarcadores seleccionados de ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B y POR; detectar el nivel de los biomarcadores en una muestra del sujeto para proporcionar valores de biomarcadores que correspondan a los biomarcadores del panel de biomarcadores con el fin de determinar si el sujeto tiene inflamación lobular o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga inflamación lobular.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el método del presente documento sirve para determinar si un sujeto tiene inflamación lobular, que comprende detectar al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho biomarcadores seleccionados de ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B y POR, en una muestra del sujeto con el fin de determinar si el sujeto tiene inflamación lobular o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga inflamación lobular.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el método descrito en el presente documento sirve para determinar si un sujeto tiene balonización de hepatocitos, que comprende proporcionar un panel de biomarcadores que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho biomarcadores seleccionados de ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP y HSP90AA1/HSP90AB1; detectar el nivel de los biomarcadores en una muestra del sujeto para proporcionar valores de biomarcadores que correspondan a los biomarcadores del panel de biomarcadores con el fin de determinar si el sujeto tiene balonización de hepatocitos o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga balonización de hepatocitos.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el método descrito en el presente documento sirve para determinar si un sujeto tiene balonización de hepatocitos, que comprende detectar al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho biomarcadores seleccionados de ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP y HSP90AA1/HSP90AB 1, en una muestra del sujeto con el fin de determinar si el sujeto tiene balonización de hepatocitos o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga balonización de hepatocitos.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el método del presente documento sirve para determinar si un sujeto tiene fibrosis, que comprende proporcionar un panel de biomarcadores que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece o catorce biomarcadores seleccionados de C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y DCN; detectar el nivel de los biomarcadores en una muestra del sujeto para proporcionar valores de biomarcadores que correspondan a los biomarcadores del panel de biomarcadores con el fin de determinar si el sujeto tiene fibrosis o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga fibrosis.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el método del presente documento sirve para determinar si un sujeto tiene fibrosis, que comprende detectar al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece o catorce biomarcadores seleccionados de C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y DCN, en una muestra del sujeto con el fin de determinar si el sujeto tiene fibrosis o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga fibrosis.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el sujeto está en riesgo de desarrollar esteatosis, inflamación lobular, balonización de hepatocitos y/o fibrosis.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el sujeto puede estar en riesgo de desarrollar la EHGNA. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el sujeto puede estar en riesgo de desarrollar esteatosis. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el sujeto puede estar en riesgo de desarrollar el HGNA. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el sujeto puede tener una comorbilidad de la EHGNA seleccionada de obesidad, obesidad abdominal, síndrome metabólico, enfermedades cardiovasculares y diabetes. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el sujeto puede ser obeso.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, al menos un biomarcador puede ser un biomarcador proteico. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, cada biomarcador puede ser un biomarcador proteico. En algunas realizaciones, un método comprende poner en contacto biomarcadores de la muestra del sujeto con un conjunto de reactivos de captura de biomarcadores, en donde cada reactivo de captura de biomarcadores del conjunto de reactivos de captura de biomarcadores se une específicamente a un biomarcador diferente que se está detectando. En algunas realizaciones, cada reactivo de captura de biomarcadores es un anticuerpo o un aptámero. En algunas realizaciones, cada reactivo de captura de biomarcadores es un aptámero. En algunas realizaciones, al menos un aptámero es un aptámero de velocidad de disociación baja. En algunas realizaciones, al menos un aptámero de velocidad de disociación baja comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 nucleótidos con modificaciones. En algunas realizaciones, cada aptámero de velocidad de disociación baja se une a su proteína diana con una velocidad de disociación (ty2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > l2o minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos o > 240 minutos.

En las realizaciones revindicadas descritas en el presente documento, la muestra se selecciona de una muestra de sangre, una muestra de suero o una muestra de plasma.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, si el sujeto tiene EHGNA o EHNA, al sujeto se le puede recomendar una pauta seleccionada de pérdida de peso, control de azúcar en sangre y evitación del alcohol. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, si el sujeto tiene EHGNA o EHNA, al sujeto se le puede recomendar la cirugía de derivación gástrica. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, si el sujeto tiene EHGNA o EHNA, al sujeto se le puede prescribir al menos un agente terapéutico seleccionado de pioglitazona, vitamina E y metformina.

En algunas realizaciones, un método descrito en el presente documento tiene el fin de determinar una prima de seguro médico o una prima de seguro de vida. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar una prima de seguro médico o una prima de seguro de vida. En algunas realizaciones, un método descrito en el presente documento comprende además usar la información resultante del método para predecir y/o gestionar la utilización de recursos médicos.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, se proporcionan kits. En algunas realizaciones, un kit comprende al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez u once aptámeros que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y THBS2.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, un kit comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o siete aptámeros que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada de ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB 1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 y CSF1R.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, un kit comprende al menos uno al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho aptámeros seleccionados que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada de ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, Ky NU, FCGR3B y POR.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, se proporciona un kit, en donde el kit comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho aptámeros seleccionados que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada de ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP y HSP90AA1/HSP90AB1.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, un kit comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece o catorce aptámeros seleccionados que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada de C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y DCN. En cualquiera de las realizaciones del presente documento, cada aptámero se une a una proteína diana diferente.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, al menos un aptámero puede ser un aptámero de velocidad de disociación baja. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, cada aptámero puede ser un aptámero de velocidad de disociación baja. En algunas realizaciones, al menos un aptámero de velocidad de disociación baja comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 nucleótidos con modificaciones hidrófobas.

En algunas realizaciones, cada aptámero de velocidad de disociación baja se une a su proteína diana con una velocidad de disociación (ty2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > l2o minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos o > 240 minutos.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, se proporcionan composiciones. En algunas de dichas realizaciones, una composición comprende proteínas de una muestra de un sujeto y al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez u once aptámeros que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y THBS2.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, una composición comprende proteínas de una muestra de un sujeto y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o siete aptámeros que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada de ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 y CSF1R.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición que comprende proteínas de una muestra de un sujeto y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho aptámeros seleccionados que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada de ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B y POR.

En algunas realizaciones, cada aptámero se une a una proteína diana diferente.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición que comprende proteínas de una muestra de un sujeto y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho aptámeros seleccionados que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada de ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP y HSP90AA1/HSP90AB1.

En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición que comprende proteínas de una muestra de un sujeto y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece o catorce aptámeros seleccionados que se unen específicamente a una proteína diana seleccionada de C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y DCN.

En algunas realizaciones, cada aptámero se une específicamente a una proteína diana diferente.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, al menos un aptámero puede ser un aptámero de velocidad de disociación baja. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, cada aptámero puede ser un aptámero de velocidad de disociación baja. En algunas realizaciones, al menos un aptámero de velocidad de disociación baja comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 nucleótidos con modificaciones hidrófobas. En algunas realizaciones, cada aptámero de velocidad de disociación baja se une a su proteína diana con una velocidad de disociación (ty2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > l2o minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos o > 240 minutos.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, cada biomarcador puede ser un biomarcador proteico. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el método puede comprender poner contacto biomarcadores de la muestra del sujeto con un conjunto de reactivos de captura de biomarcadores, en donde cada reactivo de captura de biomarcadores del conjunto de reactivos de captura de biomarcadores se une específicamente a un biomarcador que se está detectando. En algunas realizaciones, cada reactivo de captura de biomarcadores del conjunto de reactivos de captura de biomarcadores se une específicamente a un biomarcador diferente que se está detectando. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, cada reactivo de captura de biomarcadores puede ser un anticuerpo o un aptámero. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, cada reactivo de captura de biomarcadores puede ser un aptámero. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, al menos un aptámero puede ser un aptámero de velocidad de disociación baja. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, al menos un aptámero de velocidad de disociación baja puede comprender al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 nucleótidos con modificaciones. En algunas realizaciones, las modificaciones son modificaciones hidrófobas. En algunas realizaciones, las modificaciones son modificaciones de base hidrófoba. En algunas realizaciones, una o más de las modificaciones pueden seleccionarse de las modificaciones que se muestran en la Figura 11. En algunas realizaciones, cada aptámero de velocidad de disociación baja se une a su proteína diana con una velocidad de disociación (ty2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos o > 240 minutos.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, la muestra se selecciona de una muestra de sangre, una muestra de suero o una muestra de plasma.

En cualquiera de las realizaciones, descritas en el presente documento pero no de acuerdo con la presente invención, la muestra en una composición puede ser una muestra de sangre. En algunas realizaciones, la muestra de sangre se selecciona de una muestra de suero y una muestra de plasma.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, un kit o composición puede comprender al menos un aptámero que sea un aptámero de velocidad de disociación baja. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, cada aptámero de un kit o de una composición puede ser un aptámero de velocidad de disociación baja. En algunas realizaciones, al menos un aptámero de velocidad de disociación baja comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 nucleótidos con modificaciones. En algunas realizaciones, al menos un nucleótido con una modificación es un nucleótido con una modificación de base hidrófoba. En algunas realizaciones, cada nucleótido con una modificación es un nucleótido con una modificación de base hidrófoba. En algunas realizaciones, cada modificación de base hidrófoba se selecciona independientemente de la modificación de la Figura 11. En algunas realizaciones, cada aptámero de velocidad de disociación baja en un kit se une a su proteína diana con una velocidad de disociación (ty2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos o > 240 minutos.

Breve descripción de los dibujos

LaFIG. 1muestra las vías de selección de estabilidad del clasificador de esteatosis, como se describe en el Ejemplo 2.

LaFIG. 2muestra una curva ROC de un clasificador de nueve biomarcadores para la esteatosis, como se describe en el Ejemplo 2.

LaFIG.3muestra el voto por clase para el clasificador de bosque aleatorio de nueve marcadores para la esteatosis, como se describe en el Ejemplo 2.

LaFIG. 4muestra las funciones de distribución acumulativa para cada uno de los biomarcadores en el clasificador de nueve marcadores para la esteatosis, como se describe en el Ejemplo 2.

LaFIG. 5muestra las vías de selección de estabilidad del clasificador de EHNA (fibrosis), como se describe en el Ejemplo 2.

LaFIG. 6muestra una curva ROC de un clasificador de cuatro biomarcadores para la EHNA (fibrosis), como se describe en el Ejemplo 2.

LaFIG. 7muestra gráficos de cajas para el clasificador de cuatro marcadores para la EHNA (fibrosis) en cada uno de los grupos de sujetos, como se describe en el Ejemplo 2.

LaFIG. 8muestra las funciones de distribución acumulativa para cada uno de los biomarcadores en el clasificador de cuatro marcadores para la EHNA (fibrosis), como se describe en el Ejemplo 2.

LaFIG. 9ilustra un sistema informático de ejemplo no limitante para su uso con diversos métodos implementados por ordenador que se describen en el presente documento.

LaFIG. 10ilustra un ensayo de aptámeros de ejemplo no limitante que puede usarse para detectar uno o más biomarcadores en una muestra biológica.

LaFIG. 11muestra determinadas pirimidinas modificadas de ejemplo que pueden incorporarse en aptámeros, tales como aptámeros de velocidad de disociación baja.

LaFIG. 12muestra gráficos de cajas para el clasificador de 8 marcadores para la esteatosis en cada uno de los grupos de sujetos, como se describe en el Ejemplo 5.

LaFIG. 13muestra gráficos de cajas para el clasificador de 8 marcadores para la fibrosis en cada uno de los grupos de sujetos, como se describe en el Ejemplo 5.

LaFIG. 14muestra las funciones de distribución acumulativa para cada uno de los biomarcadores en el clasificador de cuatro marcadores para la EHNA (fibrosis), como se describe en el Ejemplo 5.

LaFIG. 15muestra gráficos de cajas para el clasificador de 8 marcadores para la esteatosis para las muestras con enmascaramiento después del desenmascaramiento, de acuerdo con su grupo de muestra real, como se describe en el Ejemplo 6.

LaFIG. 16muestra curvas ROC para el rendimiento del clasificador de esteatosis de 8 marcadores para el conjunto de descubrimiento y para el conjunto de validación con enmascaramiento, como se describe en el Ejemplo 6. LaFIG. 17muestra gráficos de cajas para el clasificador de 8 marcadores para la fibrosis para las muestras con enmascaramiento después del desenmascaramiento, de acuerdo con su grupo de muestra real, como se describe en el Ejemplo 6.

LaFIG. 18muestra curvas ROC para el rendimiento del clasificador de fibrosis de 8 marcadores para el conjunto de descubrimiento y para dos conjuntos de validación con enmascaramiento, como se describe en el Ejemplo 6. LasFIG. 19AyBmuestran las distribuciones de sensibilidad y especificidad de 2500 iteraciones bootstrap del conjunto de verificación de retención del 20 %, usando (A) el clasificador de esteatosis de 8 marcadores y (B) el clasificador de fibrosis de 8 marcadores, como se describe en el Ejemplo 6.

LaFIG. 20muestra gráficos de cajas para el clasificador de esteatosis de 8 marcadores en cada una de las muestras pediátricas de acuerdo con su grupo de muestra real, como se describe en el Ejemplo 7.

LaFIG. 21muestra la distribución de las puntuaciones histológicas y NAS de la biopsia hepática basal, como se describe en el Ejemplo 8.

LaFIG. 22muestra gráficos de cajas para los 6 biomarcadores principales para la esteatosis, como se describe en el Ejemplo 8.

LaFIG. 23muestra gráficos de cajas para los 6 biomarcadores principales para la inflamación lobular, como se describe en el Ejemplo 8.

LaFIG. 24muestra gráficos de cajas para los 6 biomarcadores principales para la balonización de hepatocitos, como se describe en el Ejemplo 8.

LaFIG. 25muestra gráficos de cajas para los 6 biomarcadores principales para la fibrosis, como se describe en el Ejemplo 8.

FIG. 26muestra gráficos de cajas para los 6 biomarcadores principales para la puntuación NAS, como se describe en el Ejemplo 8.

LaFIG. 27muestra gráficos de cajas para los 6 biomarcadores principales para el diagnóstico de EHNA, como se describe en el Ejemplo 8.

LaFIG. 28muestra un diagrama de Venn de biomarcadores proteicos significativos por categoría histológica y diagnóstico de EHNA.

LaFIG. 29muestra la selección e características para la esteatosis.

LaFIG. 30muestra selección e características para la inflamación lobular.

LaFIG. 31muestra la selección e características para la balonización de hepatocitos. LaFIG. 32muestra la selección de características para la fibrosis.

LasFIG. 33A y 33Bmuestran funciones de densidad de probabilidad (escaladas por el tamaño de la muestra) de los datos de entrenamiento utilizados para ajustar el modelo bayesiano ingenuo para la Proteína 1 (33A) y la Proteína 2 (33B). Las curvas están coloreadas por clase y las mediciones de proteínas para la Muestra 1 (x = 3,79301, 2,59934) se representan por la línea vertical discontinua. Esto indica gráficamente que es más probable que la Muestra 1 proceda de la distribución de control.

LasFIG. 34A y 34bmuestran gráficos bivariantes de los datos de entrenamiento utilizados para ajustar el modelo bayesiano ingenuo de dos marcadores de proteínas. Las líneas discontinuas son las medias específicas de clase de los parámetros del modelo, los puntos se indican por clase (los círculos sólidos son de control, los círculos punteados son de enfermedad) y el límite de decisión bayesiano no lineal que refleja el límite de p = 0,5 se representa por la curva. La "x" verde representa las coordenadas de las Muestras 1-5.

Descripción detallada

Aunque la invención se describirá junto con determinadas realizaciones representativas, se entenderá que la invención se define por las reivindicaciones y no se limita a estas realizaciones.

Un experto en la materia reconocerá que en la práctica de la presente invención pueden usarse muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. La presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el significado comprendido habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque pueden usarse cualesquier métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica de la invención, en el presente documento se describen determinados métodos, dispositivos y materiales.

Como se usan en la presente solicitud, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen el plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa, y pueden usarse indistintamente con "al menos uno" y "uno o más". Por lo tanto, la referencia a "un aptámero" incluye mezclas de aptámeros, la referencia a "una sonda" incluye mezclas de sondas y similares.

Como se usan en el presente documento, los términos y expresiones "comprende", "que comprende/n", "incluye", "que incluye/n", "contiene", "que contiene/n", y cualquier variación de los mismos, tienen por objeto cubrir una inclusión no exclusiva, de manera que un proceso, método, producto definido por su proceso o composición de la materia que comprende, incluye o contiene un elemento o lista de elementos puede incluir otros elementos no enumerados expresamente.

La presente solicitud incluye biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits para determinar si un sujeto tiene EHGNA. La presente solicitud también incluye biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits para determinar si un sujeto tiene EHNA. En algunas realizaciones, se proporcionan biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits para determinar si un sujeto con EHGNA tiene EHNA.

Como se usa en el presente documento, la expresión "ITGA1/ITGB1" se usa para referirse a ITGA1 y/o ITGB1 y/o al complejo de ITGA1 e ITGB 1. Por lo tanto, si un método comprende detectar el biomarcador "ITGA1/ITGB1", el método puede comprender detectar ITGA1, ITGB1, tanto ITGA1 como ITGB 1, y/o el complejo de ITGA1 e ITGB 1. Un reactivo de captura de biomarcadores que se une específicamente a ITGA1/ITGB1 puede unirse a ITGA1 y/o ITGB1 y/o tanto a ITGA1 como a ITGB1 y/o al complejo de |T<g>A 1 e ITGB1.

Como se usa en el presente documento, la expresión "HSP90AA1/HSP90AB1" se usa para referirse a HSP90AA1 y/o HSP90AB1. Por lo tanto, si un método comprende detectar el biomarcador "HSP90AA1/HSP90AB1", el método puede comprender detectar HSP90AA1, HSP90AB1 o tanto HSP90AA1 como HSP90AB1. Un reactivo de captura de biomarcadores que se une específicamente a HSP90AA1/HSP90AB1 puede unirse a HSP90AA1 y/o HSP90AB1 y/o ambos HSP90AA1 y HSP90AB1.

En algunas realizaciones, se proporcionan uno o más biomarcadores que pueden usarse solos o en diversas combinaciones para determinar si un sujeto tiene EHGNA. Como se describe con detalle a continuación, las realizaciones de ejemplo incluyen los biomarcadores proporcionados en la Tabla 15 y la Tabla 16, con o sin uno o más biomarcadores proporcionados en las Tablas 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9.

Los biomarcadores se identificaron usando un ensayo múltiple basado en aptámeros. La Tabla 3 enumera nueve biomarcadores que son útiles para distinguir muestras obtenidas de individuos obesos normales de muestras de individuos con EHGNA. La Tabla 4 enumera cuatro biomarcadores que son útiles para distinguir las muestras obtenidas de individuos con esteatosis de las muestras de individuos con EHNA en fases 2, 3 y 4. La Tabla 8 enumera ocho biomarcadores que son útiles para distinguir muestras obtenidas de individuos obesos normales de muestras de individuos con EHGNA. La Tabla 9 enumera ocho biomarcadores que son útiles para distinguir las muestras obtenidas de individuos con esteatosis de las muestras de individuos con EHNA en fases 2, 3 y 4. En las Tablas 6 y 7 se enumeran biomarcadores adicionales que pueden usarse en cualquier combinación entre sí y/o con los biomarcadores de las Tablas 3, 4, 8 y/o 9. En algunas realizaciones, un subconjunto de biomarcadores de las Tablas 3, 4, 6, 7, 8 y 9 se combinan en un panel que se muestra en la Tabla 5.

La Tabla 15 y la Tabla 16 enumeran biomarcadores que son útiles para caracterizar la gradación histológica de la EHNA. En algunas realizaciones, uno o más biomarcadores de la Tabla 15 y/o la Tabla 16 se proporcionan para su uso solos o en diversas combinaciones para determinar si un sujeto tiene esteatosis o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga EHNA. En algunas realizaciones, uno o más biomarcadores de la Tabla 15 y/o de la Tabla 16 son útiles para determinar si un sujeto tiene esteatosis, inflamación lobular, balonización de hepatocitos y/o fibrosis. En algunas realizaciones, uno o más biomarcadores de la Tabla 15 y/o la Tabla 16 son útiles para determinar la probabilidad de que el sujeto tenga esteatosis, inflamación lobular, balonización de hepatocitos y/o fibrosis. En algunas realizaciones, uno o más de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16 son útiles solos o en diversas combinaciones para determinar si un sujeto tiene EHNA en cualquier fase. En algunas realizaciones, uno o más de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16 pueden combinarse con uno más biomarcadores seleccionados de las Tablas 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9 para formar un panel.

En algunas realizaciones, uno o más de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y la Tabla 16 son útiles para identificar sujetos en riesgo de desarrollar EHNA. En algunas realizaciones, uno o más de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16 son útiles para identificar sujetos en riesgo de desarrollar esteatosis, inflamación lobular, balonización de hepatocitos y/o fibrosis. En algunas realizaciones, se proporcionan uno o más biomarcadores que pueden usarse solos o en diversas combinaciones para determinar si un sujeto tiene esteatosis. En algunas realizaciones, el sujeto es obeso. Uno o más de los biomarcadores de la Tabla 15 y/o la Tabla 16 pueden usarse en combinación con uno o más biomarcadores de la Tabla 3 y/o la Tabla 4 y/o la Tabla 6 y/o la Tabla 7 y/o la Tabla 8 y/o la Tabla 9 en un método descrito en el presente documento.

En algunas realizaciones, se proporcionan uno o más biomarcadores que pueden usarse solos o en diversas combinaciones para determinar si un sujeto tiene EHNA en cualquier fase. En algunas realizaciones, se proporcionan uno o más biomarcadores para su uso solos o en diversas combinaciones para determinar si un sujeto tiene EHNA en fase 2, 3 o 4. En algunas realizaciones, ya se sabe que el sujeto tiene esteatosis. Como se describe con detalle a continuación, las realizaciones de ejemplo incluyen los biomarcadores proporcionados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, que se identificaron usando un ensayo múltiple basado en aptámeros. En algunas realizaciones, el número y la identidad de los biomarcadores de un panel se seleccionan basándose en la sensibilidad y la especificidad para la combinación concreta de valores de biomarcadores. Los términos "sensibilidad" y "especificidad" se usan en el presente documento con respecto a la capacidad de clasificar correctamente a un individuo, basándose en uno o más niveles de biomarcadores detectados en una muestra biológica, como que tiene la enfermedad o que no tiene la enfermedad. En algunas realizaciones, los términos "sensibilidad" y "especificidad" pueden usarse en el presente documento con respecto a la capacidad de clasificar correctamente a un individuo, basándose en uno o más niveles de biomarcadores detectados en una muestra biológica, como que tiene esteatosis o que no tiene esteatosis. En dichas realizaciones, "sensibilidad" indica el rendimiento del biomarcador o biomarcadores con respecto a clasificar correctamente individuos con esteatosis. "Especificidad" indica el rendimiento del biomarcador o biomarcadores con respecto a clasificar correctamente individuos que no tienen esteatosis. Por ejemplo, una especificidad del 85 % y una sensibilidad del 90 % para un panel de biomarcadores utilizado para someter a ensayo un conjunto de muestras de control (tales como muestras de individuos sanos o sujetos que se sabe que no tienen esteatosis) y muestras de ensayo (tales como muestras de individuos con esteatosis) indica que el 85 % de las muestras de control se clasificaron correctamente como muestras de control mediante el panel, y el 90 % de las muestras de ensayo se clasificaron correctamente como muestras de ensayo mediante el panel.

En algunas realizaciones, los términos "sensibilidad" y "especificidad" pueden usarse en el presente documento con respecto a la capacidad de clasificar correctamente a un individuo, basándose en uno o más niveles de biomarcadores detectados en una muestra biológica, como que tiene EHNA (o EHNA en fase 2, 3 o 4) o que tiene esteatosis. "Sensibilidad" indica el rendimiento del biomarcador o biomarcadores con respecto a clasificar correctamente individuos con EHNA (o EHNA en fase 2, 3 o 4). "Especificidad" indica el rendimiento del biomarcador o biomarcadores con respecto a clasificar correctamente individuos que no tienen EHNA (o no tienen EHNA en fase 2, 3 o 4). Por ejemplo, una especificidad del 85 % y una sensibilidad del 90 % para un panel de biomarcadores utilizado para someter a ensayo un conjunto de muestras de control (tales como muestras de individuos con esteatosis) y muestras de ensayo (tales como muestras de individuos con EHNA, o EHNA en fase 2, 3 o 4) indica que el 85 % de las muestras de control se clasificaron correctamente como muestras de control mediante el panel, y el 90 % de las muestras de ensayo se clasificaron correctamente como muestras de ensayo mediante el panel.

En algunas realizaciones, el rendimiento global de un panel de uno o más biomarcadores se representa por el valor del área bajo la curva (ABC). El valor del ABC se obtiene a partir de la curva característica operativa del receptor (ROC), que se ejemplifican en el presente documento. La curva ROC es el gráfico de la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) de un ensayo frente a la tasa de falsos positivos (1-especificidad) del ensayo. La expresión "área bajo la curva" o "ABC" se refiere al área bajo la curva de una curva característica operativa del receptor (ROC), ambos bien conocidos en la técnica. Las medidas del ABC son útiles para comparar la precisión de un clasificador en todo el intervalo de datos. Los clasificadores con un ABC mayor tienen una capacidad mayor para clasificar correctamente incógnitas entre dos grupos de interés (por ejemplo, individuos normales e individuos con EHGNA, o individuos con esteatosis e individuos con EHNA). Las curvas ROC son útiles para representar gráficamente el rendimiento de una característica particular (por ejemplo, cualquiera de los biomarcadores descritos en el presente documento y/o cualquier elemento de información biomédica adicional) para distinguir entre dos poblaciones. Normalmente, los datos de características de toda la población se clasifican en orden ascendente basándose en el valor de una única característica. Después, para cada valor de esa característica, se calculan las tasas de verdaderos positivos y falsos positivos de los datos. La tasa de verdaderos positivos se determina mediante el recuento del número de casos por encima del valor de esa característica y después dividiendo por el número total de casos. La tasa de falsos positivos se determina mediante el recuento del número de controles por encima del valor de esa característica y después dividiendo por el número total de controles. Aunque esta definición se refiere a escenarios en los que una característica se eleva en los casos en comparación con los controles, esta definición también se aplica a escenarios en los que una característica es inferior en los casos en comparación con los controles (en dicho escenario, se contarían las muestras por debajo del valor de esa característica). Se pueden generar curvas ROC para una sola característica, así como para otros resultados individuales, por ejemplo, una combinación de dos o más características se puede combinar matemáticamente (por ejemplo, sumar, restar, multiplicar, etc.) para proporcionar un valor de suma único, y este valor de suma único puede trazarse gráficamente en una curva ROC. Adicionalmente, cualquier combinación de múltiples características, en la que la combinación deriva de un único valor de salida, puede representarse gráficamente en una curva ROC.

En algunas realizaciones, un método comprende detectar el nivel de al menos un biomarcador enumerado en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, con o sin al menos un biomarcador enumerado en las Tablas 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9 en una muestra de un sujeto para determinar si un sujeto tiene EHGNA. En algunas de dichas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra o una porción de la muestra del sujeto con al menos un reactivo de captura, en donde cada reactivo de captura se une específicamente a un biomarcador cuyos niveles se están detectando. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra, o proteínas de la muestra, con al menos un aptámero, en donde cada aptámero se une específicamente a un biomarcador cuyos niveles se están detectando.

En algunas realizaciones, un método comprende determinar si un sujeto tiene la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que comprende formar un panel de biomarcadores con N proteínas biomarcadoras de entre las proteínas biomarcadoras enumeradas en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, y detectar el nivel de cada una de las N proteínas biomarcadoras del panel en una muestra del sujeto, en donde N es al menos 5. En algunas realizaciones, N es de 5 a 10, o N es de 6 a 10, o N es de 7 a 10, o N es de 8 a 10, o N es de 9 a 10, o N es al menos 6, o N es al menos 7, o N es al menos 8, o N es al menos 9, o N es 5, o N es 6, o N es 7, o N es 8, o N es 9, o N es 10. En algunas realizaciones, un método comprende detectar el nivel de al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez seleccionados de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y THBS2 para determinar si un sujeto tiene EHGNA.

En las realizaciones reivindicadas, el método comprende detectar el nivel de ITGA1/ITGB1 en una muestra del sujeto, en donde un nivel de ITGA1/ITGB1 que es superior a un nivel de control indica que el sujeto tiene EHGNA.

En algunas realizaciones, un método comprende detectar el nivel de HSP90AA1/HSP90AB1 en una muestra del sujeto, en donde un nivel de HSP90AA1/HSP90AB1 que es superior a un nivel de control indica que el sujeto tiene EHGNA.

En algunas realizaciones, un método comprende detectar los niveles de ITGA1/ITGB 1 y HSP90AA1/HSP90AB1 en una muestra del sujeto, en donde un nivel de ITGA1/ITGB1 y/o un nivel de HSP90AA1/HSP90AB 1 que es superior a un nivel de control indica que el sujeto tiene EHGNA.

En algunas realizaciones, el método comprende además detectar el nivel de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete biomarcadores seleccionados de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR y THBS2, en una muestra del sujeto, en donde un nivel de al menos un biomarcador seleccionado de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR y THBS2 que es superior a un nivel de control del biomarcador respectivo, indica que el sujeto tiene EHGNA. En algunas realizaciones, el método comprende detectar los niveles de ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, COLEC11 y THBS2. En algunas realizaciones, un método comprende determinar el nivel de AST en el sujeto, en donde un nivel elevado de AST indica que el sujeto tiene EHGNA.

En otra realización, un método comprende detectar el nivel de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez biomarcadores seleccionados de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y THBS2, en una muestra del sujeto, en donde un nivel de al menos un biomarcador seleccionado de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y THBS2 que es superior a un nivel de control del biomarcador respectivo, indica que el sujeto tiene EHGNA. En algunas realizaciones, un método comprende HSP90AA1/HSP90AB1 o ITGA1/ITGB1, o ambos HSP90AA1/HSP90AB1 e ITGA1/ITGB1.

En algunas realizaciones, el método comprende determinar si un sujeto tiene esteatosis, inflamación lobular, balonización de hepatocitos y/o fibrosis. En algunas realizaciones, la esteatosis es esteatosis leve, moderada o grave. En algunas realizaciones, el método comprende determinar si un sujeto tiene esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). En algunas realizaciones, el método comprende determinar si el sujeto tiene EHNA, tal como EHNA en fase 1, 2, 3 o 4. En algunas realizaciones, el sujeto está en riesgo de desarrollar EHGNA. En algunas realizaciones, el sujeto está en riesgo de desarrollar EHNA. En algunas realizaciones, el sujeto está en riesgo de desarrollar esteatosis, inflamación lobular, balonización de hepatocitos y/o fibrosis. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto obeso. En algunas realizaciones, el método comprende determinar si el sujeto tiene esteatosis y/o determinar si la esteatosis es leve, moderada o grave.

En algunas realizaciones, se proporciona un método de detección de esteatosis, que comprende proporcionar un panel de biomarcadores que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o seis biomarcadores seleccionados de ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 y CSF1R; detectar el nivel de los biomarcadores en una muestra del sujeto para proporcionar valores de biomarcadores que correspondan a los biomarcadores del panel de biomarcadores con el fin de determinar si el sujeto tiene esteatosis o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga esteatosis.

En algunas realizaciones, el método comprende detectar el nivel de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o seis biomarcadores seleccionados de ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 y CSF1R, en una muestra del sujeto con el fin de determinar si el sujeto tiene esteatosis o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga esteatosis. En algunas realizaciones, el panel de biomarcadores comprende ACY1, KNYU y al menos uno, al menos dos, al menos tres o cuatro marcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1 y CSF1R. En algunas realizaciones, el método comprende detectar ACY1, KNYU y al menos uno, al menos dos, al menos tres o cuatro marcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1 y CSF1R. En algunas realizaciones, el método comprende detectar al menos un biomarcador seleccionado entre ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 y CSF1R.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para determinar si el sujeto tiene inflamación lobular, comprende proporcionar un panel de biomarcadores que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho biomarcadores seleccionados de ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B y POR; detectar el nivel de los biomarcadores en una muestra del sujeto para proporcionar valores de biomarcadores que correspondan a los biomarcadores del panel de biomarcadores con el fin de determinar si el sujeto tiene inflamación lobular o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga inflamación lobular. En algunas realizaciones, el método comprende detectar un panel de biomarcadores que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho biomarcadores seleccionados de ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B y POR, en una muestra del sujeto con el fin de determinar si el sujeto tiene inflamación lobular o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga inflamación lobular. En algunas realizaciones, el panel de biomarcadores comprende ACY1, THBS2, COLEC11 y al menos uno o dos biomarcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1 y POR. En algunas realizaciones, el método comprende detectar ACY1, THBS2, COLEC11 y al menos uno o dos biomarcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1 y POR. En algunas realizaciones, el método comprende detectar ITGA1/ITGB1.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para determinar si el sujeto tiene balonización de hepatocitos, que comprende proporcionar un panel de biomarcadores que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho biomarcadores seleccionados de ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP y HSP90AA1/HSP90AB1; detectar el nivel de los biomarcadores en una muestra del sujeto para proporcionar valores de biomarcadores que correspondan a los biomarcadores del panel de biomarcadores con el fin de determinar si el sujeto tiene balonización de hepatocitos o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga balonización de hepatocitos. En algunas realizaciones, el método comprende detectar un panel de biomarcadores que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho biomarcadores seleccionados de ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP y HSP90AA1/HSP90AB1, en una muestra del sujeto con el fin de determinar si el sujeto tiene balonización de hepatocitos o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga balonización de hepatocitos. En algunas realizaciones, el panel de biomarcadores comprende ACY1, COLEC11, THBS2 y al menos uno o dos biomarcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1 y HSP90AA1/HSP90AB1. En algunas realizaciones, el método comprende detectar ACY1, COLEC11, THBS2 y al menos uno o dos biomarcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1 y HSP90AA1/HSP90AB1.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para determinar si el sujeto tiene fibrosis, que comprende proporcionar un panel de biomarcadores que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece o catorce biomarcadores seleccionados de C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y DCN; detectar el nivel de los biomarcadores en una muestra del sujeto para proporcionar valores de biomarcadores que correspondan a los biomarcadores del panel de biomarcadores con el fin de determinar si el sujeto tiene fibrosis o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga fibrosis. En algunas realizaciones, el panel de biomarcadores comprende detectar al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece o catorce biomarcadores seleccionados de C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y DCN, en una muestra del sujeto con el fin de determinar si el sujeto tiene fibrosis o determinar la probabilidad de que el sujeto tenga fibrosis. En algunas realizaciones, el método comprende detectar un panel de biomarcadores que comprende C7, COLEC11, THBS2 y al menos uno, al menos dos o tres biomarcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 y DCN. En algunas realizaciones, el método comprende detectar C7, COLEC11, THBS2 y al menos uno, al menos dos o tres biomarcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 y DCN.

En algunas realizaciones, un método comprende detectar el nivel de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez biomarcadores seleccionados de los biomarcadores en la Tabla 15 y la Tabla 16. En algunas realizaciones, un nivel de un biomarcador en la Tabla 15 o la Tabla 16 que es superior a un nivel de control del biomarcador respectivo indica que el sujeto tiene EHGNA.

Los biomarcadores identificados en el presente documento proporcionan una serie de opciones para subconjuntos o paneles de biomarcadores que pueden usarse para identificar eficazmente la EHGNA. Los biomarcadores identificados en el presente documento proporcionan una serie de opciones para subconjuntos o paneles de biomarcadores que pueden usarse para identificar eficazmente la esteatosis, inflamación lobular, balonización de hepatocitos y/o fibrosis. Los biomarcadores identificados en el presente documento proporcionan una serie de opciones para subconjuntos o paneles de biomarcadores que pueden usarse para identificar eficazmente la EHNA. Los biomarcadores identificados en el presente documento proporcionan una serie de opciones para subconjuntos o paneles de biomarcadores que pueden usarse para identificar eficazmente la EHNA en fase 1, 2, 3 y 4. La selección del número adecuado de dichos biomarcadores puede depender de la combinación específica de biomarcadores elegida. Además, en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, excepto cuando se indique explícitamente, un panel de biomarcadores puede comprender biomarcadores adicionales no mostrados en las Tablas 3, 4, 6, 7, 8, 9 o 15.

En algunas realizaciones, un método comprende detectar el nivel de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez biomarcadores seleccionados de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y THBS2 en una muestra del sujeto, en donde un nivel de al menos un biomarcador indica que el sujeto tiene EHGNA.

En algunas realizaciones, un método comprende detectar el nivel de al menos un biomarcador enumerado en las Tablas 3, 4, 6, 7, 8, 9 y/o 15 en una muestra de un sujeto para determinar si un sujeto tiene EHNA o EHNA en fase 2, 3 o 4. En algunas de dichas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra o una porción de la muestra del sujeto con al menos un reactivo de captura, en donde cada reactivo de captura se une específicamente a un biomarcador cuyos niveles se están detectando. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra, o proteínas de la muestra, con al menos un aptámero, en donde cada aptámero se une específicamente a un biomarcador cuyos niveles se están detectando.

Los biomarcadores identificados en el presente documento proporcionan una serie de opciones para subconjuntos o paneles de biomarcadores que pueden usarse para identificar eficazmente la EHNA, o la EHNA en fase 2, 3 o 4. La selección del número adecuado de dichos biomarcadores puede depender de la combinación específica de biomarcadores elegida. Además, en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, excepto cuando se indique explícitamente, un panel de biomarcadores puede comprender biomarcadores adicionales no mostrados en las Tablas 3, 4, 6, 7, 8, 9 o 15.

Como se usa en el presente documento, "enfermedad del hígado graso no alcohólico" o "EHGNA" se refiere a una afección en la que se deposita grasa en el hígado (esteatosis hepática), con o sin inflamación y fibrosis, en ausencia de consumo excesivo de alcohol.

Como se usan en el presente documento, "esteatosis" y "esteatosis no alcohólica" se usan indistintamente, e incluyen la esteatosis leve, moderada y grave, sin inflamación ni fibrosis, en ausencia de consumo excesivo de alcohol. La Tabla 1 muestra una clasificación de ejemplo de la esteatosis leve, moderada y grave.

Como se usa en el presente documento, "esteatohepatitis no alcohólica" o "EHNA" se refiere a la EHGNA en la que hay inflamación y/o fibrosis en el hígado. La EHNA puede dividirse en cuatro fases. Se describen métodos de ejemplo de determinación de la fase de la EHNA, por ejemplo, en Kleineret al.,2005,Hepatology,41(6):1313-1321 y Bruntet al.,2007,Modern Pathol.,20: S40-S48. La Tabla 1 muestra una clasificación de ejemplo de la EHNA en fases 1,2, 3 y 4.

Como se usa en el presente documento, "obeso" con referencia a un sujeto se refiere a un sujeto con un IMC de 30 o más.

"Muestra biológica", "muestra" y "muestra de ensayo" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a cualquier material, fluido biológico, tejido o célula obtenido o derivado de otro modo de un individuo. Esto incluye sangre (incluyendo sangre entera, leucocitos, células mononucleares de sangre periférica, capa leucoplaquetaria, plasma y suero), esputo, lágrimas, mucosidad, lavados nasales, aspirados nasales, orina, saliva, lavados peritoneales, ascitis, líquido quístico, fluido glandular, líquido linfático, aspirado bronquial, líquido sinovial, aspirado articular, secreciones de órganos, células, un extracto celular y fluido cerebroespinal. Esto también incluye fracciones experimentalmente separadas de todos los anteriores. Por ejemplo, una muestra de sangre puede fraccionarse en suero, plasma o en fracciones que contienen determinados tipos de células sanguíneas, tales como glóbulos rojos o glóbulos blancos (leucocitos). En algunas realizaciones, una muestra puede ser una combinación de muestras de un individuo, tal como una combinación de una muestra de tejido y de fluido. La expresión "muestra biológica" también incluye materiales que contienen material sólido homogeneizado, tal como de una muestra de heces, una muestra tisular o una biopsia tisular, por ejemplo. La expresión "muestra biológica" también incluye materiales derivados de un cultivo tisular o un cultivo celular. Puede emplearse cualquier método adecuado para obtener una muestra biológica; los métodos de ejemplo incluyen, por ejemplo, flebotomía, hisopado (por ejemplo, hisopado bucal) y un procedimiento de biopsia de aspirado con agua fija. Los tejidos de ejemplo susceptibles de aspiración con agua fina incluyen ganglio linfático, pulmón, tiroides, mama, páncreas e hígado. También pueden recogerse muestras, por ejemplo, mediante microdisección (por ejemplo, microdisección de captura láser (MCL) o microdisección láser (MDL)), lavado de vejiga, frotis (por ejemplo, un frotis de PAP) o lavado ductal. Una "muestra biológica" obtenida o derivada de un individuo incluye cualquier muestra de este tipo que se ha procesado de cualquier manera adecuada después de haber sido obtenida a partir del individuo.

Además, en algunas realizaciones, una muestra biológica puede obtenerse tomando muestras biológicas de varios individuos y agrupándolas, o agrupando una alícuota de la muestra biológica de cada individuo. La muestra agrupada puede tratarse como se describe en el presente documento para una muestra de un único individuo, y, por ejemplo, si se establece un mal pronóstico en la muestra agrupada, entonces se puede volver a someter a ensayo cada muestra biológica individual para determinar qué individuo o individuos tienen esteatosis y/o EHNA.

"Diana", "molécula diana" y "analito" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a cualquier molécula de interés que pueda estar presente en una muestra biológica. Una "molécula de interés" incluye cualquier variación minoritaria de una molécula particular, tal como, en el caso de una proteína, por ejemplo, variaciones minoritarias en la secuencia de aminoácidos, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje, que no altera sustancialmente la identidad de la molécula. Una "molécula diana", "diana" o "analito" se refiere a un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula o estructura multimolecular. "Moléculas diana", "dianas" y "analitos" se refieren a más de un tipo o especie de molécula o estructura multimolecular. Las moléculas diana de ejemplo incluyen proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos, polisacáridos, glucoproteínas, hormonas, receptores, antígenos, anticuerpos, aficuerpos, miméticos de anticuerpos, virus, patógenos, sustancias tóxicas, sustratos, metabolitos, análogos de estado de transición, cofactores, inhibidores, fármacos, colorantes, nutrientes, factores de crecimiento, células, tejidos y cualquier fragmento o porción de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, una molécula diana es una proteína, en cuyo caso la molécula diana puede denominarse "proteína diana".

Como se usa en el presente documento, un "agente de captura" o "reactivo de captura" se refiere a una molécula que es capaz de unirse específicamente a un biomarcador. Un "reactivo de captura de proteínas diana" se refiere a una molécula que es capaz de unirse específicamente a una proteína diana. Los reactivos de captura de ejemplo no limitantes incluyen aptámeros, anticuerpos, adnectinas, anquirinas, otros miméticos de anticuerpos y otros armazones de proteínas, autoanticuerpos, quimeras, moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, lectinas, receptores de unión a ligando, polímeros improntados, avímeros, peptidomiméticos, receptores de hormonas, receptores de citocinas, receptores sintéticos y modificaciones y fragmentos de cualquiera de los reactivos de captura mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, un reactivo de captura se selecciona de un aptámero y un anticuerpo.

El término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos de longitud completa de cualquier especie y a fragmentos y derivados de dichos anticuerpos, incluyendo fragmentos Fab, fragmentos F(ab')<2>, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fv y fragmentos Fv monocatenarios. El término "anticuerpo" también se refiere a anticuerpos derivados sintéticamente, tales como anticuerpos y fragmentos derivados de la presentación de fagos, aficuerpos, nanocuerpos, etc.

Como se usa en el presente documento, "marcador" y "biomarcador" se usan indistintamente para referirse a una molécula diana que indica o es un signo de un proceso normal o anormal en un individuo o de una enfermedad u otra afección en un individuo. Más específicamente, un "marcador" o "biomarcador" es un parámetro anatómico, fisiológico, bioquímico o molecular asociado a la presencia de un estado o proceso fisiológico específico, ya sea normal o anormal, y, si es anormal, ya sea crónico o agudo. Los biomarcadores pueden detectarse y medirse mediante una diversidad de métodos, incluyendo ensayos de laboratorio y formación de imágenes médicas. En algunas realizaciones, un biomarcador es una proteína diana.

Como se usan en el presente documento, "nivel del biomarcador" y "nivel" se refieren a una medición que se realiza usando cualquier método analítico para detectar el biomarcador en una muestra biológica y que indica la presencia, ausencia, cantidad o concentración absoluta, cantidad o concentración relativa, título, un nivel, un nivel de expresión, una relación de niveles medidos, o similares, de, para o correspondiente al biomarcador en la muestra biológica. La naturaleza exacta del "nivel" depende del diseño específico y de los componentes del método analítico particular empleado para detectar el biomarcador.

Un "nivel de control" de una molécula diana se refiere al nivel de la molécula diana en el mismo tipo de muestra de un individuo que no tiene la enfermedad o afección, o de un individuo que no se sospecha que tenga la enfermedad o afección. No es necesario determinar un "nivel de control" de una molécula diana cada vez que se realicen los presentes métodos, y puede ser un nivel determinado previamente que se use como referencia o umbral para determinar si el nivel en una muestra particular es superior o inferior a un nivel normal. En algunas realizaciones, un nivel de control en un método descrito en el presente documento es el nivel que se ha observado en uno o más sujetos sin EHGNA. En algunas realizaciones, un nivel de control en un método descrito en el presente documento es el nivel que se ha observado en uno o más sujetos con EHGNA, pero no EHNA. En algunas realizaciones, un nivel de control en un método descrito en el presente documento es el nivel promedio o medio, opcionalmente más o menos una variación estadística, que se ha observado en una pluralidad de sujetos normales, o sujetos con EHGNA, pero no EHNA.

Como se usan en el presente documento, "individuo" y "sujeto" se usan indistintamente para referirse a un sujeto de ensayo o paciente. El individuo puede ser un mamífero o un no mamífero. En diversas realizaciones, el individuo es un mamífero. Un individuo mamífero puede ser un ser humano o no humano. En diversas realizaciones, el individuo es un ser humano. Un individuo sano o normal es un individuo en el que la enfermedad o afección de interés (tal como la EHNA) no es detectable mediante métodos de diagnóstico convencionales.

"Diagnosticar", "diagnosticando", "diagnóstico", y variaciones de los mismos, se refieren a la detección, determinación o reconocimiento del estado de salud o afección de un individuo basándose en uno o más signos, síntomas, datos u otra información relativa a ese individuo. El estado de salud de un individuo puede diagnosticarse como sano/normal (es decir, un diagnóstico de la ausencia de una enfermedad o afección) o diagnosticarse como enfermo/anormal (es decir, un diagnóstico de la presencia, o una evaluación de las características, de una enfermedad o afección). Los términos "diagnosticar", "diagnosticando", "diagnóstico", etc., abarcan, con respecto a una enfermedad o afección particular, la detección inicial de la enfermedad; la caracterización o clasificación de la enfermedad; la detección de la progresión, la remisión o la recurrencia de la enfermedad; y la detección de la respuesta de la enfermedad después de la administración de un tratamiento o terapia al individuo. El diagnóstico de la EHGNA incluye distinguir individuos que tienen EHGNA de los individuos que no. El diagnóstico de la EHNA incluye distinguir individuos que tienen EHNA de los individuos que tienen esteatosis en el hígado, pero no EHNA, y de individuos sin enfermedad hepática.

"Pronosticar", "pronosticando", "pronóstico" y variaciones de los mismos se refieren a la predicción del curso futuro de una enfermedad o afección en un individuo que tiene la enfermedad o afección (por ejemplo, predecir la supervivencia del paciente), y dichos términos abarcan la evaluación de la respuesta de la enfermedad después de la administración de un tratamiento o terapia al individuo.

"Evaluar", "evaluando", "evaluación" y variaciones de los mismos abarcan tanto "diagnosticar" como "pronosticar" y también comprenden determinaciones o predicciones sobre el curso futuro de una enfermedad o afección en un individuo que no tiene la enfermedad, así como determinaciones o predicciones relativas a la probabilidad de que una enfermedad o afección reaparezca en un individuo que aparentemente se ha curado de la enfermedad. El término "evaluar" también abarca la valoración de la respuesta de un individuo a una terapia, tal como, por ejemplo, predecir si es probable que un individuo responda favorablemente a un agente terapéutico o si es improbable que responda a un agente terapéutico (o si experimentará efectos secundarios tóxicos u otros efectos secundarios indeseables, por ejemplo), seleccionar un agente terapéutico para su administración a un individuo, o controlar o determinar la respuesta de un individuo a una terapia que se le ha administrado al individuo. Por lo tanto, "evaluar" la EHGNA puede incluir, por ejemplo, cualquiera de los siguientes: pronosticar el curso futuro de la EHGNA en un individuo; predecir si la EHGNA progresará a EHNA; predecir si una fase particular de EHNA progresará a una fase superior de EHNA; etc.

Como se usa en el presente documento, "detectar" o "determinar" con respecto a un nivel de biomarcador incluye el uso tanto del instrumento utilizado para observar y registrar una señal correspondiente a un nivel de biomarcador como del material o materiales necesarios para generar dicha señal. En diversas realizaciones, el nivel se detecta usando cualquier método adecuado, incluyendo fluorescencia, quimioluminiscencia, resonancia de plasmón superficial, ondas acústicas superficiales, espectrometría de masas, espectroscopía infrarroja, espectroscopia Raman, microscopía de fuerza atómica, microscopía de barrido en túnel, métodos de detección electroquímica, resonancia magnética nuclear, puntos cuánticos y similares.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto con EHGNA" se refiere a un sujeto al que se le ha diagnosticado EHGNA. En algunas realizaciones, la EHGNA se sospecha durante un chequeo rutinario, control del síndrome metabólico y la obesidad, o control de posibles efectos secundarios de fármacos (por ejemplo, agentes reductores del colesterol o esteroides). En algún caso, las enzimas hepáticas tales como AST y ALT son elevadas. En algunas realizaciones, se diagnostica a un sujeto después de la formación de imágenes abdominales o torácicas, ecografía hepática o formación de imágenes por resonancia magnética. En algunas realizaciones, otras afecciones tales como el consumo excesivo de alcohol, la hepatitis C y la enfermedad de Wilson se han descartado antes de un diagnóstico de EHGNA. En algunas realizaciones, un sujeto se ha diagnosticado después de una biopsia hepática.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto con esteatosis" y un "sujeto con esteatosis no alcohólica" se usan indistintamente, y se refieren a un sujeto al que se le ha diagnosticado esteatosis. En algunas realizaciones, la esteatosis se diagnostica mediante un método descrito anteriormente para la EHGNA en general.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto con EHNA" se refiere a un sujeto al que se le ha diagnosticado EHNA. En algunas realizaciones, la EHNA se diagnostica mediante un método descrito anteriormente para la EHGNA en general. En algunas realizaciones, se diagnostica fibrosis avanzada en un paciente con EHGNA, por ejemplo, de acuerdo con Gambino R,et al. Annals of Medicine2011;43(8):617-49.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto en riesgo de desarrollar EHGNA" se refiere a un sujeto con una o más comorbilidades de la EHGNA, tales como obesidad, obesidad abdominal, síndrome metabólico, enfermedades cardiovasculares y diabetes.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto en riesgo de desarrollar esteatosis" se refiere a un sujeto al que no se le ha diagnosticado que tenga esteatosis, pero que tiene una o más comorbilidades de la EHGNA, tales como obesidad, obesidad abdominal, síndrome metabólico, enfermedades cardiovasculares y diabetes.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto en riesgo de desarrollar EHNA" se refiere a un sujeto con esteatosis que sigue teniendo una o más comorbilidades de la EHGNA, tales como obesidad, obesidad abdominal, síndrome metabólico, enfermedades cardiovasculares y diabetes.

"Soporte sólido" se refiere en el presente documento a cualquier sustrato que tiene una superficie a la que pueden unirse moléculas, directa o indirectamente, a través de enlaces covalentes o no covalentes. Un "soporte sólido" puede tener una diversidad de formatos físicos, que puede incluir, por ejemplo, una membrana; un chip (por ejemplo, un chip de proteínas); un portaobjetos (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio o un cubreobjetos); una columna; una partícula hueca, sólida, semisólida, que contiene poros o cavidades, tal como, por ejemplo, una perla; un gel; una fibra, incluyendo un material de fibra óptica; una matriz; y un receptáculo de muestras. Los receptáculos de muestra de ejemplo incluyen pocillos de muestra, tubos, capilares, viales y cualquier otro recipiente, surco o hendidura capaz de contener una muestra. Un receptáculo de muestras puede estar contenido en una plataforma multimuestras, tal como una placa de microtitulación, portaobjetos, dispositivo de microfluidos y similares. Un soporte puede estar compuesto por un material natural o sintético, un material orgánico o inorgánico. La composición del soporte sólido sobre el que se unen los reactivos de captura depende generalmente del método de unión (por ejemplo, unión covalente). Otros receptáculos de ejemplo incluyen microgotas y emulsiones aceite/agua microfluidas controladas o a granel dentro de las cuales pueden realizarse ensayos y manipulaciones relacionadas. Los soportes sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales a base de sílice, vidrio funcionalizado, silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, membranas, nailon, fibras naturales (tales como, por ejemplo, seda, lana y algodón), polímeros y similares. El material que compone el soporte sólido puede incluir grupos reactivos tales como, por ejemplo, grupos carboxi, amino o hidroxilo, que se usan para la unión de los reactivos de captura. Los soportes sólidos poliméricos pueden incluir, por ejemplo, poliestireno, tetraftalato de polietilenglicol, acetato de polivinilo, cloruro de polivinilo, polivinilpirrolidona, poliacrilonitrilo, metacrilato de polimetilo, politetrafluoroetileno, caucho de butilo, caucho de estireno-butadieno, caucho natural, polietileno, polipropileno, (poli)tetrafluoroetileno, (poli)fluoruro de vinilideno, policarbonato y polimetilpenteno. Las partículas sólidas de soporte adecuadas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, partículas codificadas, tales como las partículas codificadas de tipo Luminex®, partículas magnéticas y partículas de vidrio.

Usos de ejemplo de los biomarcadores

En diversas realizaciones ilustrativas, se proporcionan métodos para determinar si un sujeto tiene EHGNA. En diversas realizaciones, se proporciona un método para determinar si un sujeto tiene EHGNA, que comprende formar un panel de biomarcadores con N proteínas biomarcadoras de entre las proteínas biomarcadoras enumeradas en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, y detectar el nivel de cada una de las N proteínas biomarcadoras del panel en una muestra del sujeto, en donde N es al menos 5. En diversas realizaciones, se proporciona un método para determinar si un sujeto tiene EHGNA, que comprende detectar el nivel de al menos un biomarcador enumerado en la Tabla 15 y/o la Tabla 16 en una muestra de un sujeto para determinar si un sujeto tiene HGNA.

En diversas realizaciones, se proporcionan métodos para determinar si un sujeto tiene esteatosis, que puede ser esteatosis leve, moderada o grave. En diversas realizaciones, se proporcionan métodos para determinar si un sujeto tiene EHNA, que puede ser EHNA en fase 1,2, 3 o 4, o que puede ser EHNA en fase 2, 3 o 4. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para determinar si un sujeto con esteatosis tiene EHNA, que puede ser EHNA en fase 1, 2, 3 o 4, o que puede ser EHNA en fase 2, 3 o 4. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para caracterizar la fase histológica de la EHNA. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para determinar si un sujeto tiene esteatosis, inflamación lobular, balonización de hepatocitos y/o fibrosis. Los métodos comprenden detectar uno o más niveles de biomarcadores correspondientes a uno o más biomarcadores que están presentes en la circulación de un individuo, tal como en suero o plasma, mediante cualquier número de métodos analíticos, incluyendo cualquiera de los métodos analíticos descritos en el presente documento. Estos biomarcadores, por ejemplo, están presentes a niveles diferentes en individuos con EHGNA en comparación con individuos normales (en donde los individuos normales pueden ser individuos obesos). En algunas realizaciones, los biomarcadores están presentes a niveles diferentes en individuos con EHNA (tal como EHNA en fase 1,2, 3 o 4, o EHNA en fase 2, 3 o 4) en comparación con individuos normales (en donde los individuos normales pueden ser individuos obesos). En algunas realizaciones, los biomarcadores están presentes a diferentes niveles en individuos con EHNA (tal como EHNA en fase 1, 2, 3 o 4, o EHNA en fase 2, 3 o 4) en comparación con sujetos con esteatosis, que puede ser esteatosis leve, moderada o grave.

En algunas realizaciones, los biomarcadores están presentes a niveles diferentes en individuos con esteatosis en comparación con individuos normales (en donde los individuos normales pueden ser individuos obesos). En algunas realizaciones, los biomarcadores están presentes a niveles diferentes en individuos con inflamación lobular en comparación con individuos normales (en donde los individuos normales pueden ser individuos obesos). En algunas realizaciones, los biomarcadores están presentes a niveles diferentes en individuos con balonización de hepatocitos en comparación con individuos normales (en donde los individuos normales pueden ser individuos obesos). En algunas realizaciones, los biomarcadores están presentes a niveles diferentes en individuos con fibrosis en comparación con individuos normales (en donde los individuos normales pueden ser individuos obesos).

Puede usarse la detección de los niveles diferenciales de un biomarcador en un individuo, por ejemplo, para permitir la determinación de si un individuo tiene EHGNA (que puede ser esteatosis o EHNA), o si un individuo con esteatosis ha desarrollado EHNA. En algunas realizaciones, cualquiera de los biomarcadores descritos en el presente documento puede usarse para controlar individuos (tales como individuos obesos) para el desarrollo de EHGNA, o para controlar individuos con esteatosis para el desarrollo de EHNA.

Como ejemplo de la manera en que cualquiera de los biomarcadores descritos en el presente documento puede usarse para determinar si un sujeto tiene EHGNA, los niveles de uno o más de los biomarcadores descritos en un individuo al que no se le ha diagnosticado EHGNA, pero tiene una o más comorbilidades de la EHGNA, pueden indicar que el individuo ha desarrollado EHGNA en una fase más temprana de lo que se determinaría usando un ensayo invasivo, tal como la biopsia hepática. Debido a que los presentes métodos no son invasivos, pueden usarse para controlar individuos en riesgo de desarrollar EHGNA (tales como, por ejemplo, individuos obesos). Al detectar la EHGNA en una fase más temprana, la intervención médica puede ser más eficaz. Dicha intervención médica puede incluir, pero sin limitación, pérdida de peso, control de azúcar en sangre y evitación del alcohol. En algunas realizaciones, pueden usarse agentes terapéuticos, tales como pioglitazona, vitamina E y/o metformina. Véase, por ejemplo, Sanyalet al.,2010,NEJM,362: 1675-1685. En algunos casos, dicha intervención precoz puede retrasar o prevenir la insuficiencia hepática y la necesidad de un trasplante de hígado.

De manera similar, como un ejemplo adicional de la forma en que los biomarcadores descritos en el presente documento pueden usarse para determinar si un sujeto que tiene esteatosis está desarrollando EHNA, los niveles de uno o más de los biomarcadores descritos en un individuo con esteatosis pueden indicar que el individuo está desarrollando EHNA. Debido a que los presentes métodos no son invasivos, los individuos con esteatosis pueden controlarse para detectar el desarrollo de EHNA. Al detectar la EHNA en una fase más temprana, la intervención médica puede ser más eficaz. Dicha intervención médica puede incluir, pero sin limitación, pérdida de peso, control de azúcar en sangre y evitación del alcohol. En algunas realizaciones, pueden usarse agentes terapéuticos, tales como pioglitazona, vitamina E y/o metformina. Véase, por ejemplo, Sanyalet al.,2010,NEJM,362: 1675-1685. En algunos casos, dicha intervención precoz puede retrasar o prevenir la insuficiencia hepática y la necesidad de un trasplante de hígado.

Además, en algunas realizaciones, un nivel de expresión diferencial de uno o más de los biomarcadores en un individuo a lo largo del tiempo puede ser indicativo de la respuesta del individuo a una pauta terapéutica particular. En algunas realizaciones, los cambios en la expresión de uno o más de los biomarcadores durante el control de seguimiento pueden indicar que una terapia particular es eficaz o pueden sugerir que la pauta terapéutica debe alterarse de alguna manera, por ejemplo, controlando más agresivamente el azúcar en sangre, persiguiendo más agresivamente la pérdida de peso, etc. En algunas realizaciones, un nivel de expresión constante de uno o más de los biomarcadores en un individuo a lo largo del tiempo puede ser indicativo de que la esteatosis de un individuo no está empeorando, o no se está convirtiendo en EHNA.

Además de someter a ensayo los niveles de biomarcadores como ensayo diagnóstico independiente, los niveles de biomarcadores también pueden realizarse junto con la determinación de polimorfismos de nucleótido único (SNP, por sus siglas en inglés) u otras lesiones o variabilidad genéticas que sean indicativas de un mayor riesgo de susceptibilidad a la enfermedad. (Véase, por ejemplo, Amoset al., Nature Genetics40, 616-622 (2009)).

Además de someter a ensayo los niveles de biomarcadores como ensayo diagnóstico independiente, los niveles de biomarcadores también pueden realizarse junto con otros métodos de cribado de EHGNA, tales como la detección de un agrandamiento del hígado, ensayos de sangre (por ejemplo, para detectar elevaciones de determinadas enzimas hepáticas, tales como ALT y/o AST), ecografía abdominal y biopsia hepática. En algunos casos, los métodos que usan los biomarcadores descritos en el presente documento pueden facilitar la justificación médica y económica de la implementación de tratamientos más agresivos para la EHGNA o la EHNA, cribados de seguimiento más frecuentes, etc. Los biomarcadores también pueden usarse para iniciar el tratamiento en individuos en riesgo de desarrollar EHGNA, pero a los que no se les ha diagnosticado esteatosis, si el ensayo diagnóstico indica que es probable que desarrollen la enfermedad.

Además de someter a ensayo los niveles de biomarcadores junto con otros métodos de diagnóstico de EHGNA, la información relativa a los biomarcadores también puede evaluarse junto con otros tipos de datos, en particular los datos que indican el riesgo de EHGNA de un individuo. Estos diversos datos pueden evaluarse mediante métodos automatizados, tales como un programa informático/software, que pueden incorporarse a un ordenador u otro aparato/dispositivo.

Detección y determinación de biomarcadores y niveles de biomarcadores

Un nivel de biomarcador para los biomarcadores descritos en el presente documento puede detectarse usando cualquiera de una variedad de métodos analíticos conocidos. En una realización, un nivel de biomarcador se detecta usando un reactivo de captura. En diversas realizaciones, el reactivo de captura puede exponerse al biomarcador en solución o puede exponerse al biomarcador mientras el reactivo de captura está inmovilizado en un soporte sólido. En otras realizaciones, el reactivo de captura contiene una característica que es reactiva con una característica secundaria en un soporte sólido. En estas realizaciones, el reactivo de captura puede exponerse al biomarcador en solución y, después, la característica del reactivo de captura puede usarse junto con la característica secundaria del soporte sólido para inmovilizar el biomarcador en el soporte sólido. El reactivo de captura se selecciona basándose en el tipo de análisis que se ha de realizar. Los reactivos de captura incluyen, pero sin limitación, aptámeros, anticuerpos, adnectinas, anquirinas, otros miméticos de anticuerpos y otros armazones de proteínas, autoanticuerpos, quimeras, moléculas pequeñas, fragmentos F(ab')<2>, fragmentos de anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fv, fragmentos Fv monocatenarios, ácidos nucleicos, lectinas, receptores de unión a ligando, aficuerpos, nanocuerpos, polímeros improntados, avímeros, peptidomiméticos, receptores de hormonas, receptores de citocinas y receptores sintéticos, así como modificaciones y fragmentos de éstos.

En algunas realizaciones, un nivel de biomarcador se detecta usando un complejo biomarcador/reactivo de captura.

En algunas realizaciones, el nivel de biomarcador deriva del complejo biomarcador/reactivo de captura y se detecta indirectamente, tal como, por ejemplo, como resultado de una reacción que es posterior a la interacción biomarcador/reactivo de captura, pero que depende de la formación del complejo biomarcador/reactivo de captura.

En algunas realizaciones, el nivel de biomarcador se detecta directamente a partir del biomarcador en una muestra biológica.

En algunas realizaciones, los biomarcadores se detectan usando un formato multiplexado que permite la detección simultánea de dos o más biomarcadores en una muestra biológica. En algunas realizaciones del formato multiplexado, se inmovilizan reactivos de captura, directa o indirectamente, de manera covalente o no covalente, en ubicaciones discretos sobre un soporte sólido. En algunas realizaciones, un formato multiplexado usa soportes sólidos discretos en los que cada soporte sólido tiene un reactivo de captura único asociado a ese soporte sólido, tal como, por ejemplo, puntos cuánticos. En algunas realizaciones, se usa un dispositivo individual para la detección de cada uno de los múltiples biomarcadores que han de detectarse en una muestra biológica. Los dispositivos individuales pueden configurarse para permitir el procesamiento simultáneo de cada biomarcador de la muestra biológica. Por ejemplo, puede usarse una placa de microtitulación de forma que cada pocillo de la placa se use para analizar uno o más de los múltiples biomarcadores que han de detectarse en una muestra biológica.

En una o más de las realizaciones anteriores, puede usarse un marcador fluorescente para marcar un componente del complejo biomarcador/reactivo de captura para permitir la detección del nivel de biomarcador. En diversas realizaciones, el marcador fluorescente puede conjugarse con un reactivo de captura específico de cualquiera de los biomarcadores descritos en el presente documento mediante técnicas conocidas, y después el marcador fluorescente puede usarse para detectar el nivel de biomarcador correspondiente. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen quelatos de tierras raras, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, aloficocianina, PBXL-3, Qdot 605, Lisamina, ficoeritrina, Rojo Texas y otros de dichos compuestos.

En algunas realizaciones, el marcador fluorescente es una molécula de colorante fluorescente. En algunas realizaciones, la molécula de colorante fluorescente incluye al menos un sistema de anillos de indolio sustituido en el que el sustituyente en el carbono 3 del anillo de indolio contiene un grupo químicamente reactivo o una sustancia conjugada. En algunas realizaciones, la molécula de colorante incluye una molécula AlexFluor, tal como, por ejemplo, AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, AlexaFluor 647, AlexaFluor 680 o AlexaFluor 700. En algunas realizaciones, la molécula de colorante incluye un primer tipo y un segundo tipo de molécula de colorante, tal como, por ejemplo, dos moléculas de AlexaFluor diferentes. En algunas realizaciones, la molécula de colorante incluye un primer tipo y un segundo tipo de molécula de colorante, y las dos moléculas de colorante tienen espectros de emisión diferentes.

La fluorescencia puede medirse con una diversidad de instrumentos compatibles con una amplia gama de formatos de ensayo. Por ejemplo, se han diseñado espectrofluorímetros para analizar placas de microtitulación, portaobjetos de microscopio, matrices impresas, cubetas, etc. VéasePrincipies of Fluorescence Spectroscopy,de J.R. Lakowicz, Springer Science Business Media, Inc., 2004. VéaseBioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications; Philip E. Stanley y Larry J. Kricka editores, World Scientific Publishing Company, Enero de 2002.

En una o más realizaciones, opcionalmente, puede usarse un marcador de quimioluminiscencia para marcar un componente del complejo biomarcador/captura para permitir la detección de un nivel de biomarcador. Los materiales quimioluminiscentes adecuados incluyen cualquiera de cloruro de oxalilo, Rodamina 6G, Ru(bipy)<3>2+, TMAE (tetraquis(dimetilamino)etileno), Pirogalol (1,2,3-trihidroxibenceno), Lucigenina, peroxioxalatos, Oxalatos de arilo, Ésteres de acridinio, dioxetanos y otros.

En algunas realizaciones, el método de detección incluye una combinación enzima/sustrato que genera una señal detectable que corresponde al nivel de biomarcador. En general, la enzima cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse usando diversas técnicas, incluyendo espectrofotometría, fluorescencia y quimioluminiscencia. Las enzimas adecuadas incluyen, por ejemplo, luciferasas, luciferina, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, uricasa, xantina oxidasa, lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares.

En algunas realizaciones, el método de detección puede ser una combinación de fluorescencia, quimioluminiscencia, radionúclidos o combinaciones enzima/sustrato que generan una señal medible. En algunas realizaciones, la señalización multimodal podría tener características únicas y ventajosas en los formatos de ensayo de biomarcadores.

En algunas realizaciones, los niveles de biomarcadores descritos en el presente documento pueden detectarse usando cualquier método analítico, incluyendo, ensayos uniplexados de aptámeros, ensayos multiplexados de aptámeros, inmunoensayos uniplexados o multiplexados, perfiles de expresión de ARNm, perfiles de expresión de miARN, análisis espectrométrico de masas, métodos histológicos/citológicos, etc., como se analiza a continuación.

Determinación de los niveles de biomarcadores usando ensayos basados en aptámeros

Los ensayos dirigidos a la detección y cuantificación de moléculas fisiológicamente significativas en muestras biológicas y de otro tipo son herramientas importantes en la investigación científica y en el ámbito sanitario. Una clase de dichos ensayos implica el uso de una micromatriz que incluye uno o más aptámeros inmovilizados en un soporte sólido. Cada uno de los aptámeros es capaz de unirse a una molécula diana de manera muy específica y con una afinidad muy elevada. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 5.475.096 titulada "Ligandos de ácidos nucleicos"; véase también, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 6.242.246, la Patente de los EE. UU. N.° 6.458.543 y la Patente de los EE. U<u>. N.° 6.503.715, cada una de las cuales se titula "Biochip de diagnóstico de ligandos de ácidos nucleicos". Una vez que la micromatriz entra en contacto con una muestra, los aptámeros se unen a sus respectivas moléculas diana presentes en la muestra y de este modo permiten determinar un nivel de biomarcador correspondiente a un biomarcador.

Como se usa en el presente documento, un "aptámero" se refiere a un ácido nucleico que tiene una afinidad de unión específica por una molécula diana. Se reconoce que las interacciones de afinidad son una cuestión de grado; sin embargo, dentro de este contexto, la "afinidad de unión específica" de un aptámero por su diana significa que el aptámero se une a su diana normalmente con un grado mucho más alto de afinidad que si se une a otros componentes en una muestra de ensayo. Un "aptámero" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos particular. Un aptámero puede incluir cualquier número adecuado de nucleótidos, incluyendo cualquier número de nucleótidos modificados químicamente. "Aptámeros" se refiere a más de uno de dichos conjuntos de moléculas. Diferentes aptámeros pueden tener el mismo o diferente número de nucleótidos. Los aptámeros pueden ser ADN o ARN o ácidos nucleicos modificados químicamente y pueden ser monocatenarios, bicatenarios o contener regiones bicatenarias, y pueden incluir estructuras ordenadas superiores. Un aptámero también puede ser un fotoaptámero, en el que se incluye un grupo funcional fotorreactivo o químicamente reactivo en el aptámero para permitir su unión covalente a su diana correspondiente. Cualquiera de los métodos de aptámeros desvelados en el presente documento puede incluir el uso de dos o más aptámeros que se unen específicamente a la misma molécula diana. Como se describe adicionalmente a continuación, un aptámero puede incluir un marcador. Si un aptámero incluye un marcador, no es necesario que todas las copias del aptámero tengan el mismo marcador. Es más, si diferentes aptámeros incluyen cada uno un marcador, estos aptámeros diferentes pueden tener el mismo marcador o un marcador diferente.

Un aptámero puede identificarse usando cualquier método conocido, incluyendo el proceso SELEX. Una vez identificado, un aptámero puede prepararse o sintetizarse de acuerdo con cualquier método conocido, incluyendo los métodos de síntesis química y los métodos de síntesis enzimática.

Los términos "SELEX" y "proceso SELEX" se usan indistintamente en el presente documento para referirse, normalmente, a una combinación de (1) la selección de aptámeros que interactúan con una molécula diana de una manera deseable, por ejemplo, unión con alta afinidad a una proteína, con (2) la amplificación de esos ácidos nucleicos seleccionados. El proceso SELEX puede usarse para identificar aptámeros con alta afinidad por una diana o un biomarcador específicos.

Generalmente, SELEX incluye preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos, unir la mezcla candidata a la molécula diana deseada para formar un complejo de afinidad, separar los complejos de afinidad de los ácidos nucleicos candidatos no unidos, separar y aislar el ácido nucleico del complejo de afinidad, purificar el ácido nucleico e identificar una secuencia de aptámero específica. El proceso puede incluir múltiples ciclos para perfeccionar adicionalmente la afinidad del aptámero seleccionado. El proceso puede incluir fases de amplificación en uno o más puntos en el proceso. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 5.475.096, titulada "Ligandos de ácidos nucleicos". El proceso SELEX puede usarse para generar un aptámero que se une covalentemente a su diana, así como un aptámero que se une no covalentemente a su diana. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 5.705.337 titulada "Evolución sistemática de ligandos de ácidos nucleicos mediante enriquecimiento exponencial: Chemi-SELEX".

El proceso SELEX puede usarse para identificar aptámeros de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas en el aptámero, tales como, por ejemplo, características de suministro mejoradas o estabilidadin vivomejorada. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen sustituciones químicas en las posiciones de base y/o ribosa y/o fosfato. Se describen aptámeros identificados con el proceso SELEX que contienen nucleótidos modificados en la Patente de los EE. UU. N.° 5.660.985, titulada "Ligandos de ácidos nucleicos de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados", que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones 5' y 2' de pirimidinas. La Patente de los EE. UU. N.° 5.580.737, véase anteriormente, describe aptámeros altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'- NH2), 2'-fluoro (2'-F) y/o 2'-O-metilo (2'-OMe). Véase también, la publicación de Solicitud de Patente de los EE. UU. N.° 2009/0098549, titulada "SELEX y PHOTOSELEX", que describe bibliotecas de ácidos nucleicos que tienen propiedades químicas y físicas expandidas y su uso en SELEX y photoSELEX.

También puede usarse SELEX para identificar aptámeros que tienen características de tasa de disociación deseables. Véase la Publicación de los EE. UU. N.° 2009/0004667, titulada "Método para generar aptámeros con velocidades de disociación mejoradas", que describe métodos SELEX mejorados para generar aptámeros que pueden unirse a moléculas diana. Se describen métodos para producir aptámeros y fotoaptámeros que tienen tasas de disociación más lentas con respecto a sus respectivas moléculas diana. Los métodos implican poner en contacto la mezcla candidata con la molécula diana, permitir que ocurra la formación de complejos ácido nucleico-diana y realizar un proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta en donde los complejos ácido nucleico-diana con tasas de disociación rápidas se disociarán y no se reformarán, mientras que los complejos con tasa de disociación lenta permanecerán intactos. Adicionalmente, los métodos incluyen el uso de nucleótidos modificados en la producción de mezclas de ácidos nucleicos candidatos para generar aptámeros o con rendimiento de tasa de disociación mejorada. Los nucleótidos modificados de ejemplo no limitantes incluyen, por ejemplo, las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 11. En algunas realizaciones, un aptámero comprende al menos un nucleótido con una modificación, tal como una modificación de base. En algunas realizaciones, un aptámero comprende al menos un nucleótido con una modificación hidrófoba, tal como una modificación de base hidrófoba, permitiendo contactos hidrófobos con una proteína diana. Dichos contactos hidrófobos, en algunas realizaciones, contribuyen a una mayor afinidad y/o una tasa de disociación más lenta de unión por el aptámero. En la Figura 11 se muestran nucleótidos de ejemplo no limitantes con modificaciones hidrófobas. En algunas realizaciones, un aptámero comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 nucleótidos con modificaciones hidrófobas, donde cada modificación hidrófoba puede ser igual o diferente de las demás. En algunas realizaciones, al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 modificaciones hidrófobas en un aptámero pueden seleccionarse independientemente de las modificaciones hidrófobas mostradas en la Figura 11.

En algunas realizaciones, un aptámero de velocidad de disociación baja (incluyendo aptámeros que comprenden al menos un nucleótido con una modificación hidrófoba) tiene una velocidad de disociación (ty2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos o > 240 minutos.

En algunas realizaciones, un ensayo emplea aptámeros que incluyen grupo funcionales fotorreactivos que permiten que los aptámeros se unan covalentemente o "fotorreticulen" sus moléculas diana. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE. U<u>. N.° 6.544.776 titulada "Biochip de diagnóstico de ligandos de ácidos nucleicos". Estos aptámeros fotorreactivos también se denominan fotoaptámeros. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 5.763.177, la Patente de los EE. UU. N.° 6.001.577 y la Patente de los EE. UU. N.° 6.291.184, cada una de las cuales se titula "Evolución sistemática de ligandos de ácidos nucleicos mediante enriquecimiento exponencial: Fotoselección de ligandos de ácidos nucleicos y solución SELEX"; véase también, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 6.458.539, titulada "Fotoselección de ligandos de ácidos nucleicos". Después de poner la micromatriz en contacto con la muestra y de que los fotoaptámeros hayan tenido la oportunidad de unirse a sus moléculas diana, los fotoaptámeros se fotoactivan y el soporte sólido se lava para retirar cualquier molécula no específicamente unida. Pueden usarse condiciones de lavado duras, puesto que las moléculas diana que están unidas a los fotoaptámeros no se retiran generalmente, debido a los enlaces covalentes creados por el grupo o grupos funcionales fotoactivados sobre los fotoaptámeros. De esta manera, el ensayo permite detectar un nivel de biomarcador correspondiente a un biomarcador en la muestra de ensayo.

En algunos formatos de ensayo, los aptámeros se inmovilizan sobre el soporte sólido antes de ponerlos en contacto con la muestra. En determinadas circunstancias, sin embargo, la inmovilización de los aptámeros antes del contacto con la muestra puede no proporcionar un ensayo óptimo. Por ejemplo, la preinmovilización de los aptámeros puede dar como resultado una mezcla ineficaz de los aptámeros con las moléculas diana sobre la superficie del soporte sólido, conduciendo, quizás, a tiempos de reacción largos y, por lo tanto, a períodos de incubación prolongados para permitir una unión eficiente de los aptámeros a sus moléculas diana. Además, cuando se emplean fotoaptámeros en el ensayo y dependiendo del material utilizado como soporte sólido, el soporte sólido puede tender a dispersar o absorber la luz utilizada para efectuar la formación de enlaces covalentes entre los fotoaptámeros y sus moléculas diana. Es más, dependiendo del método empleado, la detección de moléculas diana unidas a sus aptámeros puede estar sometida a la imprecisión, puesto que la superficie del soporte sólido puede exponerse también y estar afectada por cualquier agente de marcaje que se use. Por último, la inmovilización de los aptámeros en el soporte sólido implica generalmente una etapa de preparación de los aptámeros (es decir, la inmovilización) antes de la exposición de los aptámeros a la muestra, y esta etapa de preparación puede afectar a la actividad o funcionalidad de los aptámeros.

Se han descrito ensayos de aptámeros que permiten a un aptámero capturar su diana en solución y a continuación emplear etapas de separación que están designadas para retirar componentes específicos de la mezcla de aptámerodiana antes de su detección (véase la Publicación de los EE. UU. 2009/0042206, titulada "Análisis multiplexados de muestras de ensayo"). Los métodos de ensayo de aptámeros descritos permiten la detección y cuantificación de una diana de ácido no nucleico (por ejemplo, una diana proteica) en una muestra de ensayo detectando y cuantificando un ácido nucleico (es decir, un aptámero). Los métodos descritos crean un sustituto de ácido nucleico (es decir, el aptámero) para detectar y cuantificar una diana de ácido no nucleico, permitiendo, de este modo, la amplia diversidad de tecnologías de ácido nucleico, incluyendo la amplificación, que ha de aplicarse a un intervalo más amplio de dianas deseadas, incluyendo dianas proteicas.

Pueden construirse aptámeros para facilitar la separación de los componentes de ensayo de un complejo de biomarcador de aptámero (o complejo covalente de biomarcador de fotoaptámero) y permitir el aislamiento del aptámero para su detección y/o cuantificación. En una realización, estas construcciones pueden incluir un elemento escindible o liberable dentro de la secuencia del aptámero. En otras realizaciones, pueden introducirse funciones adicionales en el aptámero, por ejemplo, un componente marcable o detectable, un componente espaciador o un marcador de unión específica o un elemento de inmovilización. Por ejemplo, el aptámero puede incluir un marcador conectado al aptámero a través de una fracción escindible, un marcador, un componente espaciador que separa el marcador y el resto escindible. En una realización, un elemento escindible es un enlazador fotoescindible. El enlazador fotoescindible puede unirse a un resto de biotina y a una sección espaciadora, puede incluir un grupo NHS para la derivatización de aminas, y puede usarse para introducir un grupo biotina en un aptámero, permitiendo de este modo la liberación del aptámero posteriormente en un método de ensayo.

Los ensayos homogéneos, realizados con todos los componentes de ensayo en solución, no requieren la separación de la muestra y los reactivos antes de la detección de la señal. Estos métodos son rápidos y fáciles de usar. Estos métodos generan una señal basada en un reactivo de captura o unión molecular que reacciona con su diana específica. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, los reactivos de captura molecular comprenden un aptámero o un anticuerpo o similar y la diana específica puede ser un biomarcador mostrado en la Tabla 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9.

En algunas realizaciones, un método para la generación de señales aprovecha el cambio de señal de anisotropía debido a la interacción de un reactivo de captura marcado con fluoróforo con su diana biomarcadora específica. Cuando la captura marcada reacciona con su diana, el aumento del peso molecular provoca que el movimiento de rotación del fluoróforo unido al complejo sea mucho más lento, lo que cambia el valor de la anisotropía. Mediante el control del cambio de anisotropía, pueden usarse eventos de unión para medir cuantitativamente los biomarcadores en soluciones. Otros métodos incluyen ensayos de polarización de fluorescencia, métodos de baliza molecular, inactivación de fluorescencia resuelta en el tiempo, quimioluminiscencia, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia y similares.

Un ensayo de aptámeros en solución que puede usarse para detectar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica incluye lo siguiente: (a) preparar una mezcla poniendo en contacto la muestra biológica con un aptámero que incluye un primer marcador y tiene una afinidad específica por el biomarcador, en donde se forma un complejo de afinidad de aptámero cuando el biomarcador está presente en la muestra; (b) exponer la mezcla a un primer soporte sólido que incluye un primer elemento de captura y permitir que el primer marcador se asocie al primer elemento de captura; (c) eliminar los componentes de la mezcla no asociados al primer soporte sólido; (d) unión de un segundo marcador al componente biomarcador del complejo de afinidad de aptámero; (e) liberar el complejo de afinidad de aptámero del primer soporte sólido; (f) exponer el complejo de afinidad de aptámero liberado a un segundo soporte sólido que incluye un segundo elemento de captura y permitir que el segundo marcador se asocia al segundo elemento de captura; (g) eliminar cualquier aptámero no complejado de la mezcla separando el aptámero no complejado del complejo de afinidad de aptámero; (h) eluir el aptámero del soporte sólido; y (i) detectar el biomarcador detectando el componente aptámero del complejo de afinidad de aptámero.

En el Ejemplo 7 se describe un método de ejemplo no limitante de detección de biomarcadores en una muestra biológica usando aptámeros. Véase también Kraemeret al., PLoS One6(10): e26332.

Determinación de los niveles de biomarcadores usando inmunoensayos

Los métodos de inmunoensayo se basan en la reacción de un anticuerpo con su diana o analito correspondiente y pueden detectar el analito en una muestra dependiendo del formato de ensayo específico. Para mejorar la especificidad y la sensibilidad de un método de ensayo basado en la inmunorreactividad, los anticuerpos monoclonales y los fragmentos de los mismos se usan con frecuencia debido a su reconocimiento de epítopo específico. También se han utilizado anticuerpos policlonales con éxito en diversos inmunoensayos debido a su mayor afinidad por la diana en comparación con los anticuerpos monoclonales. Los inmunoensayos se han diseñado para su uso con una amplia gama de matrices de muestras biológicas. Los formatos de inmunoensayo se han diseñado para proporcionar resultados cualitativos, semicuantitativos y cuantitativos.

Los resultados cuantitativos se generan a través del uso de una curva patrón creada con concentraciones conocidas del analito específico que ha de detectarse. La respuesta o señal de una muestra desconocida se representa gráficamente sobre la curva patrón, y se establece una cantidad o nivel correspondiente a la diana en la muestra desconocida.

Se han diseñado numerosos formatos de inmunoensayo. El ELISA o el EIA pueden ser cuantitativos para la detección de un analito. Este método se basa en la unión de un marcador al analito o al anticuerpo y el componente del marcador incluye, ya sea directa o indirectamente, una enzima. Los ensayos ELISA pueden tener un formato para la detección directa, indirecta, competitiva o en sándwich del analito. Otros métodos se basan en marcadores tales como, por ejemplo, radioisótopos (I125) o fluorescencia. Las técnicas adicionales incluyen, por ejemplo, aglutinación, nefelometría, turbidimetría, transferencia Western, inmunoprecipitación, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, citometría de flujo, ensayos Luminex y otros (véaseImmunoAssay: A Practical Guide,editado por Brian Law, publicado por Taylor & Francis, Ltd., edición de 2005).

Los formatos de ensayo ilustrativos incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo, fluorescentes, quimioluminiscencia y transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) o inmunoensayos de FRET resuelta en el tiempo (TR-FRET). Los ejemplos de procedimientos para detectar biomarcadores incluyen la inmunoprecipitación de biomarcadores seguida de métodos cuantitativos que permiten discriminar el tamaño y el nivel de péptidos, tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar, electrocromatografía planar y similares.

Los métodos de detección y/o cuantificación de un marcador detectable o de un material generador de señales dependen de la naturaleza del marcador. Los productos de reacciones catalizadas por enzimas adecuadas (cuando el marcador detectable es una enzima; véase anteriormente) pueden ser, sin limitación, fluorescentes, luminiscentes o radiactivos o pueden absorber luz visible o ultravioleta. Los ejemplos de detectores adecuados para detectar dichos marcadores detectables incluyen, sin limitación, película de rayos X, contadores de radiactividad, contadores de centelleo, espectrofotómetros, colorímetros, fluorómetros, luminómetros y densitómetros.

Cualquiera de los métodos de detección puede realizarse en cualquier formato que permita cualesquier preparación, procesamiento y análisis adecuados de las reacciones. Este puede ser, por ejemplo, en placas de ensayo de múltiples pocillos (por ejemplo, 96 pocillos o 386 pocillos) o usando cualquier matriz o micromatriz adecuada. Las soluciones madre para diversos agentes pueden fabricarse manual o automáticamente, y todas las operaciones posteriores de pipeteo, dilución, mezcla, distribución, lavado, incubación, lectura de muestras, recopilación de datos y análisis pueden realizarse automáticamente uando software de análisis, robótica e instrumentación de detección disponibles en el mercado y capaces de detectar un marcador detectable.

Determinación de los niveles de biomarcadores usando perfiles de expresión génica

La medición de ARNm en una muestra biológica puede usarse, en algunas realizaciones, como sustituto para la detección del nivel de la proteína correspondiente en la muestra biológica. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un biomarcador o panel de biomarcadores descrito en el presente documento que puede detectarse mediante la detección de ARN adecuado.

En algunas realizaciones, los niveles de expresión de ARNm se miden mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-PCR seguida de qPCR). La RT-PCR se utiliza para crear un ADNc a partir del ARNm. El ADNc puede usarse en un ensayo de qPCR para producir fluorescencia a medida que progresa el proceso de amplificación del ADN. En comparación con una curva patrón, la qPCR puede producir una medición absoluta, tal como el número de copias de ARNm por célula. Se han utilizado transferencias Northern, micromatrices, ensayos Invader y RT-PCR combinada con electroforesis capilar para medir los niveles de expresión del ARNm en una muestra. VéaseGene Expression Profiling: Methods and Protocols,Richard A. Shimkets, editor, Humana Press,Detección de biomarcadores usando tecnologías de formación de imágenes moleculares in vivo

En algunas realizaciones, un biomarcador descrito en el presente documento puede usarse en ensayos de formación de imágenes moleculares. Por ejemplo, un agente de formación de imágenes puede acoplarse a un reactivo de captura, que puede usarse para detectar el biomarcadorin vivo.

Las tecnologías de formación de imágenesin vivoproporcionan métodos no invasivos para determinar el estado de una enfermedad particular en el cuerpo de un individuo. Por ejemplo, partes enteras del cuerpo o incluso el cuerpo entero, pueden verse como una imagen tridimensional, proporcionando de este modo valiosa información sobre la morfología y las estructuras del organismo. Dichas tecnologías pueden combinarse con la detección de los biomarcadores descritos en el presente documento para proporcionar información relativa al biomarcadorin vivo.

El uso de tecnologías de formación de imágenes molecularesin vivose está ampliando debido a diversos avances en tecnología. Estos avances incluyen el desarrollo de nuevos agentes o marcadores de contraste, tales como radiomarcadores y/o marcadores fluorescentes, que pueden proporcionar señales fuertes dentro del cuerpo; y el desarrollo de nuevas y potentes tecnologías de formación de imágenes, que pueden detectar y analizar estas señales desde el exterior del cuerpo, con sensibilidad y precisión suficientes para proporcionar información útil. El agente de contraste puede visualizarse en un sistema de formación de imágenes adecuado, proporcionando de este modo una imagen de la porción o porciones del cuerpo en las que se encuentra el agente de contraste. El agente de contraste puede estar unido o asociado a un reactivo de captura, tal como un aptámero o un anticuerpo, por ejemplo, y/o con un péptido o proteína, o un oligonucleótido (por ejemplo, para la detección de la expresión génica), o un complejo que contenga cualquiera de ellos con una o más macromoléculas y/u otras formas en forma de partícula.

El agente de contraste también puede presentar un átomo radiactivo útil para la formación de imágenes. Los átomos radiactivos adecuados incluyen el tecnecio-99m o el yodo-123 para estudios centellográficos. Otros restos fácilmente detectables incluyen, por ejemplo, marcadores de espín para la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) tales como, por ejemplo, yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Dichos marcadores son bien conocidos en la técnica y podrían seleccionarse fácilmente por alguien con conocimientos ordinarios en la materia.

Las técnicas formación de imágenes convencionales incluyen, pero sin limitación, formación de imágenes por resonancia magnética, exploración por tomografía computarizada, tomografía de emisión de positrones (TEP), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y similares. Para la formación de imágenesin vivode diagnóstico, el tipo de instrumento de detección disponible es un factor importante al seleccionar un agente de contraste dado, tal como un radionúclido determinado y el biomarcador concreto al que se dirige (proteína, ARNm y similares). El radionúclido elegido normalmente tiene un tipo de desintegración detectable por un tipo determinado de instrumento. Además, al seleccionar un radionúclido para el diagnósticoin vivo,su semivida debe ser lo suficientemente larga como para permitir la detección en el momento de máxima captación por el tejido diana, pero lo suficientemente corta como para minimizar la radiación nociva del hospedador.

Las técnicas de imagen de ejemplo incluyen, pero sin limitación, PET y SPECT, que son técnicas de imagen en las que se administra un radionúclido sintética o localmente a un individuo. La captación posterior de la radiosonda se mide a lo largo del tiempo y se usa para obtener información sobre el tejido objetivo y el biomarcador. Debido a las emisiones de alta energía (rayos gamma) de los isótopos específicos empleados y a la sensibilidad y sofisticación de los instrumentos utilizados para detectarlos, la distribución bidimensional de la radiactividad puede inferirse desde el exterior del cuerpo.

Los núclidos emisores de positrones habitualmente utilizados en PET incluyen, por ejemplo, carbono-11, nitrógeno-13, oxígeno-15 y flúor-18. En la SPECT se usan isótopos que decaen por captura de electrones y/o emisión gamma e incluyen, por ejemplo, yodo-123 y tecnecio-99m. Un método de ejemplo para marcar aminoácidos con tecnecio-99m es la reducción del ion pertecnetato en presencia de un precursor quelante para formar el complejo lábil tecnecio-99mprecursor, que, a su vez, reacciona con el grupo de unión metálico de un péptido quimiotáctico modificado bifuncionalmente para formar un conjugado tecnecio-99m-péptido quimiotáctico.

Con frecuencia se usan anticuerpos para dichos métodos de diagnóstico de formación de imágenesin vivo.La preparación y el uso de anticuerpos para el diagnósticoin vivose conocen bien en la técnica. De manera similar, pueden usarse aptámeros para dichos métodos de diagnóstico por formación de imágenesin vivo.Por ejemplo, un aptámero que se usó para identificar un biomarcador particular descrito en el presente documento puede marcarse adecuadamente e inyectarse en un individuo para detectar el biomarcadorin vivo.El marcador utilizado se seleccionará de acuerdo con la modalidad de formación de imágenes que han de usarse, como se ha descrito anteriormente. Los agentes de formación de imágenes dirigidos por aptámeros podrían tener características únicas y ventajosas en relación con la penetración tisular, distribución tisular, cinética, eliminación, potencia y selectividad en comparación con otros agentes de formación de imágenes.

Dichas técnicas también pueden realizarse opcionalmente con oligonucleótidos marcados, por ejemplo, para la detección de la expresión génica a través de formación de imágenes con oligonucleótidos antisentido. Estos métodos se usan para la hibridaciónin situ,por ejemplo, con moléculas fluorescentes o radionúclidos como marcador. Otros métodos para la detección de la expresión génica incluyen, por ejemplo, la detección de la actividad de un gen indicador.

Otro tipo general de tecnología de formación de imágenes es la formación de imágenes ópticas, en la que las señales fluorescentes dentro del sujeto son detectadas por un dispositivo óptico externo al sujeto. Estas señales pueden deberse a la fluorescencia real y/o a la bioluminiscencia. Las mejoras en la sensibilidad de los dispositivos de detección óptica han aumentado la utilidad de la formación de imágenes ópticas para los ensayos de diagnósticoin vivo.

Para una revisión de otras técnicas, véase N. Blow,Nature Methods,6, 465-469, 2009.

Determinación de biomarcadores usando métodos histológicos/citológicos

En algunas realizaciones, los biomarcadores descritos en el presente documento pueden detectarse en una diversidad de muestras de tejido mediante métodos histológicos o citológicos. Por ejemplo, para la histología pueden usarse biopsias endo y transbronquiales, aspirados con aguja fina, agujas de corte y biopsias de núcleo. Para la citología puede usarse lavado y cepillado bronquial, aspiración pleural y esputo. Cualquiera de los biomarcadores identificados en el presente documento puede usarse para teñir una muestra de ensayo como indicador de enfermedad.

En algunas realizaciones, uno o más reactivos de captura específicos del biomarcador o biomarcadores correspondientes se usan en una evaluación citológica de una muestra y pueden incluir uno o más de los siguientes: recoger una muestra celular, fijar la muestra celular, deshidratar, aclarar, inmovilizar la muestra celular en un portaobjetos de microscopio, permeabilizar la muestra celular, tratamiento para la recuperación de analitos, tinción, destinción, lavado, bloqueo y reacción con uno o más reactivos de captura en una solución tamponada. En otra realización, la muestra celular se produce a partir de un bloque celular.

En algunas realizaciones, en una evaluación histológica de una muestra de tejido se usan uno o más reactivos de captura específicos de los biomarcadores correspondientes y pueden incluir uno o más de los siguientes: recoger una muestra de ensayo de tejido, fijar la muestra de tejido, deshidratar, aclarar, inmovilizar la muestra de tejido en un portaobjetos de microscopio, permeabilizar la muestra de tejido, tratar para la recuperación, la tinción, la destinción, el lavado, el bloqueo, la rehidratación y la reacción de analitos con uno o más reactivos de captura en una solución tamponada. En otra realización, la fijación y la deshidratación se reemplazan por la congelación.

En otra realización, el uno o más aptámeros específicos para el biomarcador o biomarcadores correspondientes se hacen reaccionar con la muestra histológica o citológica y pueden servir como el ácido nucleico diana en un método de amplificación de ácido nucleico. Los métodos adecuados de amplificación de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, PCR, q-beta replicasa, amplificación de círculo rodante, desplazamiento de cadena, amplificación dependiente de helicasa, amplificación isotérmica mediada por bucle, reacción en cadena de la ligasa y amplificación de círculo rodante asistida por restricción y circularización.

En una realización, el uno o más reactivos de captura específicos para los biomarcadores correspondientes para su uso en la evaluación histológica o citológica se mezclan en una solución tamponada que puede incluir cualquiera de los siguientes: materiales de bloqueo, competidores, detergentes, estabilizantes, ácido nucleico portador, materiales polianiónicos, etc.

Un "protocolo citológico" generalmente incluye la recogida de muestras, la fijación de muestras, la inmovilización de muestras y la tinción. La "preparación celular" puede incluir varias etapas de procesamiento después de la recogida de muestras, incluyendo el uso de uno o más aptámeros para la tinción de las células preparadas.

Determinación de los niveles de biomarcadores usando métodos de espectrometría de masas

Puede usarse una diversidad de configuraciones de espectrómetros de masas para detectar los niveles de biomarcadores. Existen varios tipos de espectrómetros de masas o pueden producirse con diversas configuraciones. En general, un espectrómetro de masas tiene los siguientes componentes principales: una entrada de muestra, una fuente de iones, un analizador de masas, un detector, un sistema de vacío, un sistema de control de instrumentos y un sistema de datos. La diferencia en la entrada de muestra, la fuente de iones y el analizador de masas definen generalmente el tipo de instrumento y sus capacidades. Por ejemplo, una entrada puede ser una fuente de cromatografía líquida de columna capilar o puede ser una sonda directa o una fase tales como las utilizadas en la desorción láser asistida por matriz. Son fuentes de iones comunes, por ejemplo, electronebulización, incluyendo la nanopulverización y la micropulverización o la desorción láser asistida por matriz. Los analizadores de masas comunes incluyen un filtro de masas de cuadrupolo, un analizador de masas de trampa de iones y un analizador de masas de tiempo de vuelo. Se conocen bien métodos de espectrometría de masas adicionales en la técnica (véase Burlingameet al. Anal. Chem.70:647 R-716R (1998); Kinter y Sherman, Nueva York (2000)).

Los biomarcadores de proteínas y los niveles de biomarcadores pueden detectarse y medirse mediante cualquiera de los métodos siguientes: espectrometría de masas con ionización por electronebulización (ESI-MS), ESI-MS/M<s>, ESI-MS/(MS)n, espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF - MS), espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser potenciada en superficie (SELDI-TOF-MS), desorción/ionización sobre silicio (DIOS), espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS), tiempo de vuelo de cuadrupolo (Q-TOF), tecnología de tiempo de vuelo en tándem (TOF/TOF), denominada ultraflex III<t>O<f>/TOF, espectrometría de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)N, espectrometría de masas por fotoionización a presión atmosférica (APPI-MS), APPI-MS/MS y APPI-(MS)N, espectrometría de masas de cuadrupolo, espectrometría de masas por transformada de Fourier (FTMS), espectrometría de masas cuantitativa y espectrometría de masas con trampa de iones.

Se usan estrategias de preparación de muestras para marcar y enriquecer las muestras antes de la caracterización por espectroscopia de masas de los biomarcadores proteínicos y la determinación de los niveles de biomarcadores. Los métodos de marcaje incluyen, pero sin limitación, el marcaje isobárico para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) y el marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC). Los reactivos de captura utilizados para enriquecer selectivamente las muestras en busca de proteínas candidatas a biomarcadores antes del análisis espectroscópico de masas incluyen, pero sin limitación, aptámeros, anticuerpos, sondas de ácido nucleico, quimeras, moléculas pequeñas, un fragmento F(ab')<2>, un fragmento de anticuerpo monocatenario, un fragmento Fv, un fragmento Fv de cadena simple, un ácido nucleico, una lectina, un receptor de ligando, aficuerpos, nanocuerpos, anquirinas, anticuerpos de dominio, armazones alternativos de anticuerpos (por ejemplo, diacuerpos, etc.) polímeros improntados, avímeros, peptidomiméticos, peptoides, ácidos nucleicos peptídicos, ácido nucleico treósico, un receptor hormonal, un receptor de citocinas, y receptores sintéticos, así como modificaciones y fragmentos de éstos.

Los ensayos anteriores permiten la detección de niveles de biomarcadores que son útiles en los métodos descritos en el presente documento, donde los métodos comprenden detectar, en una muestra biológica de un individuo, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho o al menos nueve biomarcadores seleccionados de los biomarcadores de las Tablas 3, 4, 6, 7, 8 y 9. En diversas realizaciones, los métodos comprenden detectar los niveles de uno o más biomarcadores seleccionados de cualquiera de los grupos de biomarcadores descritos en el presente documento, tales como los paneles que se muestran en la Tabla 5 y los subconjuntos de biomarcadores que se muestran en las Tablas 3, 4, 6, 7, 8 y 9. Por lo tanto, mientras que algunos de los biomarcadores descritos pueden ser útiles por sí solos para detectar la EHGNA y/o la EHNA, también se describen en el presente documento métodos para la agrupación de múltiples biomarcadores y subconjuntos de los biomarcadores para formar paneles de dos o más biomarcadores. De acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, los niveles de biomarcadores pueden detectarse y clasificarse individualmente o pueden detectarse y clasificarse colectivamente, como, por ejemplo, en un formato de ensayo múltiple.

Clasificación de biomarcadores y cálculo de puntuaciones de enfermedad

En algunas realizaciones, un "distintivo" de biomarcadores para un ensayo diagnóstico determinado contiene un conjunto de biomarcadores, teniendo cada biomarcador niveles característicos en las poblaciones de interés. Los niveles característicos, en algunas realizaciones, pueden referirse a la media o el promedio de los niveles de biomarcadores para los individuos de un grupo particular. En algunas realizaciones, puede usarse un método de diagnóstico descrito en el presente documento para asignar una muestra desconocida de un individuo a uno de dos grupos, EHGNA o normal. En algunas realizaciones, puede usarse un método de diagnóstico descrito en el presente documento para asignar una muestra desconocida de un individuo a uno de dos grupos, EHNA o EHGNA. En algunas realizaciones, el método de diagnóstico descrito en el presente documento puede usarse para asignar una muestra desconocida de un individuo a uno de tres grupos: normal, EHGNA sin EHNA y EHNA.

La asignación de una muestra a uno de dos o más grupos se conoce como clasificación, y el procedimiento utilizado para realizar esta asignación se conoce como clasificador o método de clasificación. Los métodos de clasificación también pueden denominarse métodos de puntuación. Existen muchos métodos de clasificación que pueden usarse para construir un clasificador de diagnóstico a partir de un conjunto de niveles de biomarcadores. En algunos casos, los métodos de clasificación se realizan usando técnicas de aprendizaje supervisado en las que se recoge un conjunto de datos con muestras obtenidas de individuos pertenecientes a dos (o más, para estados de clasificación múltiple) grupos distintos que se desea distinguir. Puesto que la clase (grupo o población) a la que pertenece cada muestra se conoce de antemano para cada muestra, el método de clasificación puede entrenarse para proporcionar la respuesta de clasificación deseada. También es posible usar técnicas de aprendizaje no supervisado para producir un clasificador de diagnóstico.

Los enfoques habituales para desarrollar clasificadores de diagnóstico incluyen árboles de decisión; embolsado refuerzo bosques; aprendizaje basado en la inferencia de reglas; Ventanas Parzen; modelos lineales; logístico; métodos de redes neuronales; agrupación no supervisada; K-medias; jerárquico ascendente/descendente; aprendizaje semisupervisado; métodos prototípicos; vecino más cercano; estimación de la densidad de núcleo; máquinas de vectores de apoyo; modelos ocultos de Markov; aprendizaje Boltzmann; y los clasificadores pueden combinarse de forma simple o de manera que se minimicen determinadas funciones objetivo. Para una revisión, véase, por ejemplo, Clasificación de patrones, R.O. Duda,et al.,editores, John Wiley & Sons, 2.a edición, 2001; véase también,The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction,T. Hastie,et al.,editores, Springer Science+Business Media, LLC, 2.a edición, 2009.

Para producir un clasificador usando técnicas de aprendizaje supervisado, se obtiene un conjunto de muestras denominadas datos de entrenamiento. En el contexto de ensayos diagnósticos, los datos de entrenamiento incluyen muestras de los distintos grupos (clases) a los que posteriormente se asignarán las muestras desconocidas. Por ejemplo, las muestras recogidas de individuos de una población de control y de individuos de una población con una enfermedad particular pueden constituir datos de entrenamiento para desarrollar un clasificador que pueda clasificar muestras desconocidas (o, más en particular, los individuos de los que se obtuvieron las muestras) como que tienen la enfermedad o que están libres de la enfermedad. El desarrollo del clasificador a partir de los datos de entrenamiento se conoce como entrenamiento del clasificador. Los detalles específicos sobre el entrenamiento del clasificador dependen de la naturaleza de la técnica de aprendizaje supervisado. El entrenamiento de un clasificador bayesiano ingenuo es un ejemplo de este tipo de técnica de aprendizaje supervisado (véase, por ejemplo,Pattern Classification,R.O. Duda,et al.,editores, John Wiley & Sons, 2.a edición, 2001; véase también,The Elements of Statistical Learning -Data Mining, Inference, and Prediction,T. Hastie,et al.,editores, Springer Science+Business Media, LLC, 2.a edición, 2009). Se describe el entrenamiento de un clasificador bayesiano ingenuo, por ejemplo, en las Publicaciones de los EE. UU. N.°: 2012/0101002 y 2012/0077695.

Puesto que normalmente hay muchos más niveles potenciales de biomarcadores que muestras en un conjunto de entrenamiento, hay que tener cuidado para evitar un ajuste excesivo. El sobreajuste se produce cuando un modelo estadístico describe un error aleatorio o ruido en lugar de la relación subyacente. El sobreajuste puede evitarse de varias maneras, incluyendo, por ejemplo, limitando el número de biomarcadores utilizados en el desarrollo del clasificador, asumiendo que las respuestas de los biomarcadores son independientes entre sí, limitando la complejidad del modelo estadístico subyacente empleado y garantizando que el modelo estadístico subyacente se ajusta a los datos.

Un ejemplo ilustrativo del desarrollo de un ensayo de diagnóstico usando un conjunto de biomarcadores incluye la aplicación de un clasificador bayesiano ingenuo, un clasificador probabilístico simple basado en el teorema de Bayes con tratamiento independiente estricto de los biomarcadores. Cada biomarcador se describe mediante una función de densidad de probabilidad (pdf, por sus siglas en inglés) dependiente de la clase para los valores de UFR medidos o los valores de log UFR (unidades de fluorescencia relativa) en cada clase. Se supone que las pdf conjuntas para el conjunto de biomarcadores de una clase son el producto de las pdf individuales dependientes de la clase para cada biomarcador. Entrenar un clasificador bayesiano ingenuo en este contexto equivale a asignar parámetros ("parametrización") para caracterizar las PDF dependientes de clase. Puede usarse cualquier modelo subyacente para las pdf dependientes de clase, pero, en general, el modelo debería ajustarse a los datos observados en el conjunto de entrenamiento.

El rendimiento del clasificador bayesiano ingenuo depende del número y la calidad de los biomarcadores utilizados para construir y entrenar el clasificador. Un único biomarcador se comportará de acuerdo con su distancia KS (Kolmogorov-Smirnov). La adición de biomarcadores posteriores con buenas distancias KS (>0,3, por ejemplo), en general, mejorará el rendimiento de la clasificación si los biomarcadores añadidos posteriormente son independientes del primer biomarcador. Usando la sensibilidad más la especificidad como puntuación de clasificación, pueden generarse muchos clasificadores de alta puntuación con una variación de un algoritmo codicioso. (Un algoritmo codicioso es cualquier algoritmo que sigue la metaheurística de resolución de problemas de hacer la elección localmente óptima en cada fase con la esperanza de encontrar el óptimo global).

Otra forma de representar el rendimiento de un clasificador es a través de una característica operativa del receptor (ROC), o simplemente una curva ROC o un gráfico ROC. El ROC es un gráfico de la sensibilidad o tasa de verdaderos positivos, frente a la tasa de falsos positivos (1 - especificidad o 1 - tasa de verdaderos negativos), para un sistema clasificador binario a medida que varía su umbral de discriminación. El ROC también puede representarse de forma equivalente representando gráficamente la fracción de verdaderos positivos de los positivos (TPR = tasa de verdaderos positivos) frente a la fracción de falsos positivos de los negativos (FPR = tasa de falsos positivos). También se conoce como curva característica operativa relativa, porque se trata de una comparación de dos características de funcionamiento (TPR y FPR) a medida que cambia el criterio. El área bajo la curva ROC (ABC) se usa habitualmente como medida resumida de la precisión diagnóstica. Puede tomar valores de 0,0 a 1,0. El ABC tiene una importante propiedad estadística: el ABC de un clasificador equivale a la probabilidad de que el clasificador clasifique una instancia positiva elegida al azar más alto que una instancia negativa elegida al azar (Fawcett T, 2006.An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters.27: 861-874). Esto equivale al ensayo de rangos de Wilcoxon (Hanley, J.A., McNeil, B.J., 1982.The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve. Radiology143, 29-36.).

En realizaciones de ejemplo se usa cualquier número de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, con o sin uno o más biomarcadores de las Tablas 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9, en diversas combinaciones para producir ensayos de diagnóstico que permitan identificar individuos con EHGNA. Los biomarcadores enumerados en las Tablas 3, 4, 6, 7, 8, 9, 15 y 16 pueden combinarse de muchas maneras para producir clasificadores. En algunas realizaciones, los paneles de biomarcadores se componen de diferentes conjuntos de biomarcadores dependiendo de un criterio de rendimiento diagnóstico específico que se selecciona. Por ejemplo, determinadas combinaciones de biomarcadores pueden producir ensayos que son más sensibles (o más específicos) que otras combinaciones. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con EHGNA se selecciona de los paneles de la Tabla 5.

En realizaciones de ejemplo se usa cualquier número de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, con o sin uno o más biomarcadores de las Tablas 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9, en diversas combinaciones para producir ensayos de diagnóstico que permitan identificar individuos con esteatosis. Los biomarcadores enumerados en las Tablas 3, 4, 6, 7, 8, 9, 15 y 16 pueden combinarse de muchas maneras para producir clasificadores. En algunas realizaciones, los paneles de biomarcadores se componen de diferentes conjuntos de biomarcadores dependiendo de un criterio de rendimiento diagnóstico específico que se selecciona. Por ejemplo, determinadas combinaciones de biomarcadores pueden producir ensayos que son más sensibles (o más específicos) que otras combinaciones. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con esteatosis se selecciona de los paneles de la Tabla 5. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con esteatosis comprende los biomarcadores de la Tabla 3. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con esteatosis comprende los biomarcadores de la Tabla 8. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con esteatosis comprende al menos cinco biomarcadores de la Tabla 15. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con esteatosis comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o cinco biomarcadores de la Tabla 16.

En realizaciones de ejemplo se usa cualquier número de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, con o sin uno o más biomarcadores adicionales, en diversas combinaciones para producir ensayos de diagnóstico que permitan identificar individuos con inflamación lobular. En algunas realizaciones, los paneles de biomarcadores se componen de diferentes conjuntos de biomarcadores dependiendo de un criterio de rendimiento diagnóstico específico que se selecciona. Por ejemplo, determinadas combinaciones de biomarcadores pueden producir ensayos que son más sensibles (o más específicos) que otras combinaciones. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con inflamación lobular comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho biomarcadores seleccionados de ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B y POR. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con inflamación lobular comprende ACY1, THBS2, COLEC11 y al menos uno o dos biomarcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1 y POR.

En realizaciones de ejemplo se usa cualquier número de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, con o sin uno o más biomarcadores adicionales, en diversas combinaciones para producir ensayos de diagnóstico que permitan identificar individuos con balonización de hepatocitos. En algunas realizaciones, los paneles de biomarcadores se componen de diferentes conjuntos de biomarcadores dependiendo de un criterio de rendimiento diagnóstico específico que se selecciona. Por ejemplo, determinadas combinaciones de biomarcadores pueden producir ensayos que son más sensibles (o más específicos) que otras combinaciones. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con balonización de hepatocitos comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete u ocho biomarcadores seleccionados de ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP y HSP90AA1/HSP90AB1. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con balonización de hepatocitos comprende ACY1, COLEC11, THBS2 y al menos uno o dos biomarcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1 y HSP90AA1/HSP90AB1.

En realizaciones de ejemplo se usa cualquier número de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, con o sin uno o más biomarcadores adicionales, en diversas combinaciones para producir ensayos de diagnóstico que permitan identificar individuos con fibrosis. En algunas realizaciones, los paneles de biomarcadores se componen de diferentes conjuntos de biomarcadores dependiendo de un criterio de rendimiento diagnóstico específico que se selecciona. Por ejemplo, determinadas combinaciones de biomarcadores pueden producir ensayos que son más sensibles (o más específicos) que otras combinaciones. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con fibrosis comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece o catorce biomarcadores seleccionados de C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 y DCN. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con fibrosis comprende C7, COLEC11, THBS2 y al menos uno, al menos dos o tres biomarcadores adicionales seleccionados de ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 y DCN.

En realizaciones de ejemplo se usa cualquier número de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, con o sin uno o más biomarcadores adicionales, en diversas combinaciones para producir ensayos de diagnóstico que permitan identificar individuos con EHNA. Los biomarcadores enumerados en las Tablas 3, 4, 6, 7, 8, 9, 15 y 16 pueden combinarse de muchas maneras para producir clasificadores. En algunas realizaciones, los paneles de biomarcadores se componen de diferentes conjuntos de biomarcadores dependiendo de un criterio de rendimiento diagnóstico específico que se selecciona. Por ejemplo, determinadas combinaciones de biomarcadores pueden producir ensayos que son más sensibles (o más específicos) que otras combinaciones. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con EHNA comprende N proteínas biomarcadoras de las proteínas biomarcadoras enumeradas en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, en donde N es al menos 5.

En realizaciones de ejemplo se usa cualquier número de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, con o sin uno o más biomarcadores adicionales, en diversas combinaciones para producir ensayos de diagnóstico que permitan identificar individuos con EHGNA, esteatosis y/o EHNA. Los biomarcadores enumerados en las Tablas 3, 4, 6, 7, 8, 9, 15 y 16 pueden combinarse de muchas maneras para producir clasificadores. En algunas realizaciones, los paneles de biomarcadores se componen de diferentes conjuntos de biomarcadores dependiendo de un criterio de rendimiento diagnóstico específico que se selecciona. Por ejemplo, determinadas combinaciones de biomarcadores pueden producir ensayos que son más sensibles (o más específicos) que otras combinaciones. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con EHGNA, esteatosis y/o EHNA se selecciona de los paneles de la Tabla 5. En algunas realizaciones, un panel de biomarcadores para identificar individuos con EHGNA, esteatosis y/o EHNA comprende N proteínas biomarcadoras de las proteínas biomarcadoras enumeradas en la Tabla 15 y/o la Tabla 16, en donde N es al menos 5.

En algunas realizaciones, una vez que se define un panel para incluir un conjunto particular de biomarcadores de la Tabla 15 y/o la Tabla 16, con o sin uno o más biomarcadores adicionales, y se construye un clasificador a partir de un conjunto de datos de entrenamiento, los parámetros de ensayo de diagnóstico están completos. En algunas realizaciones, una muestra biológica se somete a uno o más ensayos para producir los niveles cuantitativos de biomarcadores pertinentes utilizados para la clasificación. Los niveles de biomarcadores medidos se usan como entrada para el método de clasificación que produce una clasificación y una puntuación opcional para la muestra que refleja la confianza de la asignación de clase.

En algunas realizaciones, una muestra biológica se diluye opcionalmente y se ejecuta en un ensayo de aptámeros multiplexado, y los datos se evalúan de la siguiente manera. En primer lugar, los datos del ensayo se normalizan y calibran opcionalmente, y los niveles de biomarcadores resultantes se usan como entrada para un esquema de clasificación bayesiano. En segundo lugar, la relación log-verosimilitud se calcula para cada biomarcador medido individualmente y después se suma para producir una puntuación de clasificación final, que también se denomina puntuación de diagnóstico. Se puede notificar la asignación resultante, así como de la puntuación de clasificación global. En algunas realizaciones, los factores de riesgo log-verosimilitud individuales calculados para cada nivel de biomarcador también pueden notificarse.

Kits

Cualquier combinación de los biomarcadores descritos en el presente documento puede detectarse usando un kit adecuado, tal como para su uso en la realización de los métodos desvelados en el presente documento. Adicionalmente, cualquier kit puede contener uno o más marcadores detectables como se describen en el presente documento, tales como un resto fluorescente, etc.

En algunas realizaciones, un kit incluye (a) uno o más reactivos de captura (tales como, por ejemplo, al menos un aptámero o anticuerpo) para detectar uno o más biomarcadores en una muestra biológica, y opcionalmente (b) uno o más productos de software o programas informáticos para predecir si el individuo del que se obtuvo la muestra biológica tiene EHGNA, esteatosis y/o EHNA (tal como EH<n>A en fase 1, 2, 3 o 4, o EH<n>A en fase 2, 3 o 4). Como alternativa, en lugar de uno o más productos de programas informáticos, pueden proporcionarse una o más instrucciones para que un ser humano realice manualmente las etapas anteriores.

En algunas realizaciones, un kit comprende un soporte sólido, un reactivo de captura y un material generador de señales. El kit también puede incluir instrucciones para usar los dispositivos y reactivos, manipular la muestra y analizar los datos. Además, el kit puede usarse con un sistema informático o software para analizar y notificar el resultado del análisis de la muestra biológica.

Los kits también pueden contener uno o más reactivos (por ejemplo, tampones de solubilización, detergentes, lavados o tampones) para procesar una muestra biológica. Cualquiera de los kits descritos en el presente documento también puede incluir, por ejemplo, tampones, agentes de bloqueo, materiales de matriz de espectrometría de masas, agentes de captura de anticuerpos, muestras de control positivas, muestras de control negativas, software e información tal como protocolos, orientación y datos de referencia.

En algunas realizaciones, para el análisis de EHGNA y/o EHNA se proporcionan kits, en donde los kits comprenden cebadores de PCR para uno o más biomarcadores descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un kit puede incluir además instrucciones de uso y correlación de los biomarcadores con el pronóstico de EHGNA y/o EHNA. En algunas realizaciones, un kit puede incluir una matriz de ADN que contenga el complemento de uno o más de los biomarcadores descritos en el presente documento, reactivos y/o enzimas para amplificar o aislar el ADN de muestra. Los kits pueden incluir reactivos para PCR en tiempo real, por ejemplo, sondas y/o cebadores TaqMan, y enzimas.

Por ejemplo, un kit puede comprender (a) reactivos que comprendan al menos un reactivo de captura para determinar el nivel de uno o más biomarcadores en una muestra de ensayo, y opcionalmente (b) uno o más algoritmos o programas informáticos para realizar las etapas de comparación de la cantidad de cada biomarcador cuantificado en la muestra de ensayo con uno o más puntos de corte predeterminados. En algunas realizaciones, un algoritmo o programa informático asigna una puntuación a cada biomarcador cuantificado basándose en dicha comparación y, en algunas realizaciones, combina las puntuaciones asignadas a cada biomarcador cuantificado para obtener una puntuación total. Además, en algunas realizaciones, un algoritmo o programa informático compara la puntuación total con una puntuación predeterminada, y usa la comparación para determinar si el individuo tiene EHGNA, esteatosis y/o EHNA. Como alternativa, en lugar de uno o más algoritmos o programas informáticos, pueden proporcionarse una o más instrucciones para que un ser humano realice manualmente las etapas anteriores.

Métodos informáticos y software

Una vez seleccionado un biomarcador o un panel de biomarcadores, un método para evaluar la EHGNA en un individuo puede comprender lo siguiente: 1) recoger u obtener de otro modo una muestra biológica; 2) realizar un método analítico para detectar y medir el biomarcador o biomarcadores del panel en la muestra biológica; y 3) notificar los resultados de los niveles de biomarcadores. En algunas realizaciones, los resultados de los niveles de biomarcadores se comunican de forma cualitativa en lugar de cuantitativa, tal como, por ejemplo, un diagnóstico propuesto ("EHGNA", "esteatosis", "EHNA", "EHNA en fase 2, 3 o 4", etc.) o simplemente un resultado positivo/negativo en el que se definen "positivo" y "negativo". En algunas realizaciones, un método para evaluar la EHGNA en un individuo puede comprender lo siguiente: 1) recoger u obtener de otro modo una muestra biológica; 2) realizar un método analítico para detectar y medir el biomarcador o biomarcadores del panel en la muestra biológica; 3) realizar cualquier normalización o estandarización de los datos; 4) calcular el nivel de cada biomarcador; y 5) notificar los resultados de los niveles de biomarcadores. En algunas realizaciones, los niveles de biomarcadores se combinan de algún modo y se notifica un único valor para los niveles de biomarcadores combinados. En este enfoque, en algunas realizaciones, el valor notificado puede ser un único número determinado a partir de la suma de todos los cálculos de biomarcadores que se compara con un valor umbral preestablecido que es una indicación de la presencia o ausencia de enfermedad. O la puntuación de diagnóstico puede ser una serie de barras que representan cada una un valor de biomarcador y el patrón de las respuestas puede compararse con un patrón preestablecido para determinar la presencia o ausencia de enfermedad.

Al menos algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento pueden implementarse con el uso de un ordenador. Un ejemplo de un sistema informático 100 se muestra en la Figura 9. Con referencia a la Figura 9, el sistema 100 se muestra compuesto por elementos de hardware que están acoplados eléctricamente a través del bus 108, incluyendo un procesador 101, dispositivo de entrada 102, dispositivo de salida 103, dispositivo de almacenamiento 104, lector 105a de medios de almacenamiento legibles por ordenador, aceleración de procesamiento 107 del sistema de comunicaciones 106 (por ejemplo, procesadores DSP o de propósito especial) y memoria 109. El lector 105a de medios de almacenamiento legibles por ordenador se acopla además al medio 105b de almacenamiento legible por ordenador, representando la combinación de manera integral los dispositivos de almacenamiento remotos, locales, fijos y/o extraíbles, además de los medios de almacenamiento, la memoria, etc., para contener de manera temporal y/o más permanente la información legible por ordenador, que puede incluir el dispositivo de almacenamiento 104, la memoria 109 y/o cualquier otro recurso accesible del sistema 100. El sistema 100 también comprende elementos de software (mostrados como ubicados actualmente dentro de la memoria de trabajo 191) que incluyen un sistema operativo 192 y otro código 193, tal como programas, datos y similares.

Con respecto a la Figura 9, el sistema 100 tiene una gran flexibilidad y capacidad de configuración. Por lo tanto, por ejemplo, podría utilizarse una única arquitectura para implementar uno o más servidores que pueden configurarse adicionalmente de acuerdo con protocolos deseables actualmente, variaciones de protocolo, extensiones, etc. Sin embargo, será evidente para los expertos en la materia que las realizaciones pueden usarse de acuerdo con requisitos de aplicación más específicos. Por ejemplo, podrían implementarse uno o más elementos del sistema como subelementos dentro de un componente del sistema 100 (por ejemplo, dentro del sistema de comunicaciones 106). También puede utilizarse hardware personalizado y/o implementar determinados elementos en el hardware, software o ambos. Además, aunque puede emplearse la conexión a otros dispositivos informáticos, tales como dispositivos de entrada/salida de red (no mostrados), ha de entenderse que también podría utilizarse conexión por cable, inalámbrica, módem y/u otra conexión o conexiones a otros dispositivos informáticos.

En un aspecto, el sistema puede comprender una base de datos que contenga características de biomarcadores característicos de EHGNA y/o EHNA. Los datos del biomarcador (o información del biomarcador) pueden utilizarse como entrada al ordenador para su uso como parte de un método implementado por ordenador. Los datos de biomarcadores pueden incluir los datos descritos en el presente documento.

En un aspecto, el sistema comprende además uno o más dispositivos para proporcionar datos de entrada a uno o más procesadores.

El sistema comprende además una memoria para almacenar un conjunto de datos de elementos de datos clasificados.

En otro aspecto, el dispositivo para proporcionar datos de entrada comprende un detector para detectar la característica del elemento de datos, por ejemplo, tal como un espectrómetro de masas o un lector de chips génicos.

El sistema adicionalmente puede comprender un sistema de gestión de bases de datos. Las peticiones o consultas de los usuarios pueden formatearse en un lenguaje adecuado que entienda el sistema de gestión de la base de datos, que procesa la consulta para extraer la información pertinente de la base de datos de conjuntos de entrenamiento.

El sistema puede conectarse a una red a la que están conectados un servidor de red y uno o más clientes. La red puede ser una red de área local (LAN) o una red de área amplia (WAN), como se sabe en la técnica. Preferentemente, el servidor incluye el hardware necesario para ejecutar productos de programas informáticos (por ejemplo, software) con el fin de acceder a los datos de la base de datos para procesar las solicitudes de los usuarios.

El sistema puede incluir un sistema operativo (por ejemplo, UNIX® o Linux) para ejecutar instrucciones de un sistema de gestión de bases de datos. En un aspecto, el sistema operativo puede funcionar en una red de comunicaciones global, tal como Internet, y utilizar un servidor de red de comunicaciones global para conectarse a una red de este tipo.

El sistema puede incluir uno o más dispositivos que comprendan una interfaz gráfica de visualización que comprenda elementos de interfaz tales como botones, menús desplegables, barras de desplazamiento, campos para introducir texto, y similares, como los que se encuentran habitualmente en las interfaces gráficas de usuario conocidas en la técnica. Las solicitudes introducidas en una interfaz de usuario pueden transmitirse a un programa de aplicación del sistema para que lo formatee y busque información pertinente en una o más de las bases de datos del sistema. Las peticiones o consultas introducidas por un usuario pueden construirse en cualquier lenguaje de base de datos adecuado.

La interfaz gráfica de usuario puede ser generada por un código de interfaz gráfica de usuario como parte del sistema operativo y puede usarse para introducir datos y/o mostrar los datos introducidos. El resultado de los datos procesados puede visualizarse en la interfaz, imprimirse en una impresora en comunicación con el sistema, guardarse en un dispositivo de memoria y/o transmitirse a través de la red o puede proporcionarse en forma de medio legible por ordenador.

El sistema puede estar en comunicación con un dispositivo de entrada para proporcionar datos relativos a elementos de datos al sistema (por ejemplo, valores de expresión). En un aspecto, el dispositivo de entrada puede incluir un sistema de perfiles de expresión génica que incluya, por ejemplo, un espectrómetro de masas, un chip génico o lector de matriz, y similares.

Los métodos y aparatos para analizar la información de biomarcadores de acuerdo con diversas realizaciones pueden implementarse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, usando un programa informático que funciona en un sistema informático. Un sistema informático convencional que comprende un procesador y una memoria de acceso aleatorio, tal como un servidor de aplicaciones accesible remotamente, servidor de red, ordenador personal o estación de trabajo. Los componentes adicionales del sistema informático pueden incluir dispositivos de memoria o sistemas de almacenamiento de información, tales como un sistema de almacenamiento masivo y una interfaz de usuario, por ejemplo, un monitor convencional, teclado y dispositivo de seguimiento. El sistema informático puede ser un sistema autónomo o formar parte de una red de ordenadores que incluya un servidor y una o más bases de datos.

El sistema de análisis de biomarcadores puede proporcionar funciones y operaciones para completar el análisis de datos, tales como la recopilación de datos, el procesamiento, el análisis, la notificación y/o el diagnóstico. Por ejemplo, en una realización, el sistema informático puede ejecutar el programa informático que puede recibir, almacenar, buscar, analizar y notificar la información relativa a los biomarcadores. El programa informático puede incluir múltiples módulos que realicen diversas funciones u operaciones, tales como un módulo de procesamiento para procesar los datos en bruto y generar datos suplementarios y un módulo de análisis para analizar los datos en bruto y los datos suplementarios con el fin de generar un estado y/o diagnóstico de la enfermedad. La identificación de la EHGNA, la esteatosis y/o la EHNA puede comprender la generación o recogida de cualquier otra información, incluyendo información biomédica adicional, sobre el estado del individuo en relación con la enfermedad, la determinación de si es conveniente realizar más ensayos o la evaluación de otro modo el estado de salud del individuo.

Algunas realizaciones descritas en el presente documento pueden implementarse para incluir un producto de programa informático. Un producto de programa de ordenador puede incluir un medio legible por ordenador que tenga código de programa legible por ordenador incorporado en el medio para hacer que un programa de aplicación se ejecute en un ordenador con una base de datos.

Como se usa en el presente documento, un "producto de programa de ordenador" se refiere a un conjunto organizado de instrucciones en forma de declaraciones en lenguaje natural o de programación que están contenidas en un soporte físico de cualquier naturaleza (por ejemplo, por escrito, electrónico, magnético, óptico o de otro tipo) y que pueden usarse con un ordenador u otro sistema automatizado de tratamiento de datos. Dichas declaraciones de lenguaje de programación, cuando son ejecutadas por un ordenador o un sistema de procesamiento de datos, provocan que el ordenador o el sistema de tratamiento de datos actúe de acuerdo con el contenido particular de las declaraciones. Los productos de programas informáticos incluyen, sin limitación: programas de código fuente y código objeto y/o bibliotecas de ensayos o datos integrados en un soporte legible por ordenador. Adicionalmente, el producto de programa informático que permite a un sistema informático o a un dispositivo de equipo de procesamiento de datos actuar de maneras preseleccionadas puede proporcionarse de varias formas, incluyendo, pero sin limitación, código fuente original, código de montaje, código objeto, lenguaje de máquina, versiones cifradas o comprimidas de lo anterior y de todos y cada uno de sus equivalentes.

En un aspecto, se proporciona un producto de programa informático para indicar si un individuo tiene EHGNA, si un individuo tiene esteatosis, y/o si un individuo tiene EHNA (tales como EHNA en fase 1, 2, 3 o 4, o EHNA en fase 2, 3 o 4). El producto de programa informático incluye un medio legible por ordenador que contiene código de programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema informático, el código de programa que comprende: código que recupera los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden niveles de biomarcadores que corresponden a uno o más de los biomarcadores descritos en el presente documento, y código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado de EHGNA, esteatosis y/o EHNA del individuo en función de los niveles del biomarcador.

Aunque se han descrito diversas realizaciones como métodos o aparatos, debe entenderse que las realizaciones pueden implementarse a través de código acoplado a un ordenador, por ejemplo, código residente en un ordenador o accesible por el ordenador. Por ejemplo, el software y las bases de datos podrían utilizarse para implementar muchos de los métodos analizados anteriormente. Por lo tanto, además de las realizaciones logradas mediante hardware, también se observa que estas realizaciones pueden lograrse a través del uso de un artículo de fabricación compuesto por un medio utilizable por ordenador que tiene un código de programa legible por ordenador incorporado en el mismo, lo que provoca la habilitación de las funciones desveladas en la presente descripción. Por lo tanto, se desea que las realizaciones también se consideren protegidas por esta patente en sus medios de código de programa. Adicionalmente, las realizaciones pueden incorporarse como código almacenado en una memoria legible por ordenador de prácticamente cualquier tipo, incluyendo, sin limitación, RAM, ROM, medios magnéticos, medios ópticos o medios magneto-ópticos. Incluso de forma más general, las realizaciones podrían implementarse en software, o en hardware, o en cualquier combinación de los mismos, incluyendo, pero sin limitación, software que se ejecuta en un procesador de propósito general, microcódigo, matrices lógicas programables (PLA, por sus siglas en inglés) o circuitos integrados específicos de aplicación (ASIC, por sus siglas en inglés).

También se prevé que las realizaciones puedan lograrse como señales informáticas incorporadas en una onda portadora, así como señales (por ejemplo, eléctricas y ópticas) propagadas a través de un medio de transmisión. Por lo tanto, los distintos tipos de información analizados anteriormente podrían formatearse en una estructura, tal como una estructura de datos, y transmitirse como una señal eléctrica a través de un medio de transmisión o almacenarse en un soporte legible por ordenador.

Métodos de tratamiento

En algunas realizaciones, después de una determinación de que un sujeto tiene EHGNA, esteatosis o EHNA, el sujeto se somete a una pauta terapéutica para retrasar o prevenir el empeoramiento de la enfermedad. Las pautas terapéuticas de ejemplo no limitantes para la EHGNA, la esteatosis y/o la EHNA incluyen pérdida de peso, control de azúcar en sangre y evitación del alcohol. En algunas realizaciones, un sujeto recibe un agente terapéutico, tal como pioglitazona, vitamina E y/o metformina. Véase, por ejemplo, Sanyalet al.,2010,NEJM,362: 1675-1685. En algunas realizaciones, un sujeto se somete a una operación de derivación gástrica (o similar), por ejemplo, con el fin de acelerar la pérdida de peso.

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de control de la EHGNA. En algunas realizaciones, los presentes métodos de determinación de si un sujeto tiene EHGNA se realizan en un tiempo 0. En algunas realizaciones, el método se realiza de nuevo en un tiempo 1 y, opcionalmente, un tiempo 2 y, opcionalmente, un tiempo 3, etc., con el fin de controlar la progresión de la EHGNA en el sujeto. En algunas realizaciones, se usan biomarcadores diferentes en diferentes puntos temporales, dependiendo del estado actual de la enfermedad del individuo y/o dependiendo de la velocidad a la que se cree o se predice que progrese la enfermedad.

Otros métodos

En algunas realizaciones, los biomarcadores y métodos descritos en el presente documento se usan para determinar una prima de seguro médico y/o una prima de seguro de vida. En algunas realizaciones, los resultados de los métodos descritos en el presente documento se usan para determinar una prima de seguro médico y/o una prima de seguro de vida. En algunos de dichos casos, una organización que proporciona seguros médicos o seguros de vida solicita u obtiene de otro modo información relativa al estado de e Hg Na o EHNA de un sujeto y usa dicha información para determinar una prima de seguro médico o de seguro de vida adecuada para el sujeto. En algunas realizaciones, el ensayo es solicitado, y pagado por, la organización que proporciona el seguro médico o el seguro de vida.

En algunas realizaciones, los biomarcadores y métodos descritos en el presente documento se usan para predecir y/o gestionar la utilización de recursos médicos. En algunas de dichas realizaciones, los métodos no se realizan con el fin de dicha predicción, sino que la información obtenida a partir del método se usa en dicha predicción y/o gestión de la utilización de los recursos médicos. Por ejemplo, un centro de ensayos u hospital puede reunir información a partir de los presentes métodos para muchos sujetos con el fin de predecir y/o gestionar la utilización de recursos médicos en un centro particular o en un área geográfica particular.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la solicitud como se define por las reivindicaciones adjuntas. Las técnicas de biología molecular rutinarias descritas en los siguientes ejemplos pueden realizarse como se describe en manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001).

Ejemplo 1. Sujetos de estudio de EHGNA

Las muestras utilizadas para identificar los biomarcadores procedían de Geisinger Health. Se recogieron muestras de suero y se realizaron biopsias hepáticas a 576 pacientes obesos antes de que se sometieran a cirugía bariátrica para perder peso.

Las muestras se recogieron en tubos de suero con tapón rojo y se procesaron según el protocolo; brevemente, se dejó coagular la muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente y, después, se centrifugó a 1300xg durante 10 minutos y se retiró la capa superior, que se almacenó a -80 °C. Las muestras se descongelaron una vez para hacer alícuotas y otra para el ensayo.

Con el fin de identificar biomarcadores que distinguen sujetos con EHGNA de sujetos obesos normales, y biomarcadores que distinguen sujetos con EHNA de sujetos con esteatosis en el hígado, los sujetos de estudio se dividieron en normales, tres niveles de esteatosis hepática (leve, moderada y grave) y cuatro fases de EHNA de acuerdo con los resultados de la biopsia hepática, usando el método de clasificación de Brunt (Bruntet al.,2007,Modern Pathol.,20: S40-S48). Los grupos se subclasificaron como se muestra en la Tabla 1.

T l 1: l ifi i n r i f EHNA

Datos demográficos de los sujetos

En la Tabla 2 se muestran determinadas características de los individuos de cada uno de los grupos analizados anteriormente.

T l ^ 2: D m r fi l

continuación

Como se muestra en la Tabla 2, se determinaron la edad, el índice de masa corporal y los niveles de LDL de los sujetos, y se encontró que estaban equilibrados en todos los grupos.

Ejemplo 2. Ensayo múltiple de aptámeros para la identificación de biomarcadores

La calidad de las muestras normales, con EHGNA y con EHNA en los grupos mencionados anteriormente se evaluó comparando las distribuciones de biomarcadores asociados a la manipulación de las muestras, tales como cizalla, lisis celular y activación del complemento en los casos y controles. La calidad de la muestra fue buena y no hubo sesgo de control de casos.

Se usó un ensayo múltiple de aptámeros para analizar las muestras y los controles con el fin de identificar biomarcadores predictivos de EHGNA y EHNA. El análisis multiplexado utilizado en este experimento incluyó aptámeros para detectar 1129 proteínas en sangre a partir de pequeños volúmenes de muestra (~65 pl de suero o plasma), con límites de detección bajos (mediana de 1 pM), ~7 log de intervalo dinámico y mediana de coeficiente de variación del ~5 %. Se describe el ensayo múltiple de aptámeros, por ejemplo, en Goldet al.(2010)Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS ONE5(12): e15004; y las Publicaciones de los EE. UU.: 2012/0101002 y 2012/0077695.

La Selección de Estabilidad toma muchos subconjuntos de la mitad de los datos y realiza la selección de biomarcadores usando el clasificador lazo, que es un modelo de regresión logística regularizada. Véase, por ejemplo, Meinshausenet al.,2010,J. Royal Statistical Soc: Series B (Statistical Methodology),72: 417-473. La vía de selección para un único biomarcador es la proporción de estos subconjuntos para los que ese biomarcador se seleccionó mediante el modelo lazo sobre un intervalo de lambda. Lambda es un parámetro de ajuste que determina cuántos biomarcadores selecciona el lazo. La probabilidad máxima de selección en un intervalo de valores lambda es la métrica definitiva utilizada para seleccionar un conjunto de biomarcadores.

Los biomarcadores candidatos se identificaron mediante selección de estabilidad, que después se usaron para generar el modelo clasificador de bosque aleatorio. Véase, por ejemplo, Shiet al., J. Comput. Graph. Stat.15(1): 118-138 (2006). Brevemente, un predictor de bosque aleatorio es un conjunto de predictores de árbol de clasificación individuales. Véase, por ejemplo, Breiman,Machine Learning,45(1): 5-32 (2001). Para cada observación, cada árbol individual vota por una clase y el bosque predice la clase que tiene la pluralidad de votos. El usuario especifica el número de variables seleccionadas aleatoriamente (mtry) en las que se buscará el mejor reparto en cada nodo. El índice de Gini se utiliza como criterio de reparto. Véase, por ejemplo, Breimanet al., Classification and Regression Trees,Chapman y Hall, Nueva York, 1984. Se cultiva el árbol más grande posible y no se poda. El nodo raíz de cada árbol del bosque contiene una muestra bootstrap de los datos originales como conjunto de entrenamiento. Las observaciones que no están en el conjunto de entrenamiento, aproximadamente 1/3 del conjunto de datos original, se denominan observaciones fuera de bolsa (OOB, por sus siglas en inglés). Puede llegarse a las predicciones de OOB de la siguiente manera: para un caso en los datos originales, predecir el resultado por pluralidad de votos incluyendo sólo aquellos árboles que no contenían el caso en su correspondiente muestra bootstrap. Al contrastar estas predicciones OOB con los resultados del conjunto de entrenamiento, se puede llegar a una estimación de la tasa de error de predicción, que se denomina tasa de error OOB.

El análisis univariante se realizó usando el ensayo no paramétrico de Kolmogorov-Smirnov (estadística KS), que cuantifica la distancia entre la función de distribución acumulativa de cada aptámero para dos distribuciones de referencia designadas caso (esteatosis leve, moderada y grave y/o EHNA 1-4) y control (obesos normales). El rendimiento del clasificador de bosque aleatorio depende del número y la calidad de los biomarcadores utilizados para construir y entrenar el clasificador. Un único biomarcador se comportará de acuerdo con su distancia KS y su valor de PCA (análisis de componentes principales, por sus siglas en inglés), como se ejemplifica en el presente documento. Si la métrica de rendimiento de un clasificador se define como la suma de la sensibilidad (fracción de verdaderos positivos, /T<p>) y la especificidad (uno menos la fracción de falsos positivos, 1 -fFp),un clasificador perfecto tendrá una puntuación de dos y un clasificador aleatorio, en promedio, tendrá una puntuación de uno. Usando la definición de la distancia KS, el valor x* que maximiza la diferencia en las funciones cdf (función de distribución acumulativa) puede encontrarse resolviendo

dKS c jcd fc ( x ) - c d f j ( x ) )Q

c■"ohraex

para x lo que lleva ap(x*|c)=p(x*|d),es decir, la distancia KS se produce donde se cruzan las pdf (funciones de densidad de probabilidad, por sus siglas en inglés) dependientes de clase. Sustituyendo este valor de x* en la expresión de la distancia KS se obtiene la siguiente definición de KS

KS = cdfc (x* ) - e d fj (x*)

] - / fp - / f n

la distancia KS es uno menos la fracción total de errores usando un ensayo con un corte en x*, esencialmente un clasificador bayesiano de analito único. Puesto que se define una puntuación desensibilidad+especificidad= 2 -fFP-fFN,combinando la definición anterior de la distancia KS se observa quesensibilidad+especificidad= 1KS.Se seleccionaron biomarcadores con una estadística intrínsecamente adecuada para construir clasificadores.

La adición de biomarcadores posteriores con buenas distancias KS (>0,3, por ejemplo), en general, mejorará el rendimiento de la clasificación si los biomarcadores añadidos posteriormente son independientes del primer biomarcador. Usando la sensibilidad más la especificidad como puntuación de clasificación, pueden generarse muchos clasificadores de alta puntuación.

A. Clasificador de esteatosis

Basándose en las clasificaciones de los sujetos, se asumió que todos los grupos de esteatosis, así como EHNA en fases 1-4, tienen grasa en las células hepáticas. Se desarrolló un clasificador (esteatosis o grasa en el hígado) comparando sujetos obesos normales con todos los sujetos con EHGNA.

Los marcadores elegidos mediante la selección de estabilidad (véase la Figura 1) se suministraron a un algoritmo de bosque aleatorio para generar un modelo. Se proporciona la curva ROC resultante (véase a continuación).

En la Figura 2 se muestra una curva ROC para un clasificador de nueve marcadores para EHGNA (esteatosis). El área bajo la curva (ABC) fue de 0,90 /- 0,03. La sensibilidad fue del 92 % y la especificidad del 63 %, con un límite de 0,5.

La puntuación de probabilidad, es decir, Prob(Esteatosis), del modelo de cada clasificador se representó gráficamente para cada individuo en todos los grupos para evaluar si podía usarse como modelo de gravedad/seguimiento además de la decisión binaria sobre la que se construyó (Figura 3). El gráfico muestra una clara discriminación entre ausencia de esteatosis y esteatosis, y el voto de probabilidad aumenta con el nivel de esteatosis. Los sujetos con EHNA en todas las fases presentan esteatosis grave.

La Figura 4 muestra las funciones de distribución acumulativa (FDA) para los 9 biomarcadores en el clasificador.

La Tabla 3 muestra los biomarcadores en el clasificador de 9 marcadores. La Tabla 3 también proporciona un nombre alternativo para determinados biomarcadores, el nombre del gen y el número de acceso UniProt para cada biomarcador, y si el biomarcador está presente a niveles más altos o más bajos en la población con EHGNA, en comparación con la población normal.

T l : l ifi r n v i m r r r ^ l EH NA

La Figura 3 muestra gráficos de cajas para el clasificador de nueve biomarcadores en cada uno de los grupos de sujetos (de izquierda a derecha: normal, esteatosis leve, esteatosis moderada, esteatosis grave, NASH1, NASH2, NASH3, NASH4). La línea negra dentro de cada recuadro representa la mediana (o percentil 50) de los puntos de datos, y el propio recuadro representa el intervalo intercuartílico (IQR), el área que abarca los puntos de datos desde el percentil 25 hasta el 75. Los bigotes se extienden para cubrir los puntos de datos dentro de 1,5 * IQR de la parte superior e inferior de la caja.

B. Clasificador de EHNA (Fibrosis)

Todos los sujetos con EHNA presentan alguna forma de inflamación y balonización asociada a la fibrosis. Por lo tanto, se compararon todos los grupos de esteatosis con la EHNA en fases 2, 3 y 4. Para garantizar la identificación de verdaderos biomarcadores de fibrosis, se excluyó el grupo de EHNA en fase 1.

Los marcadores elegidos mediante la selección de estabilidad (Figura 5) se suministraron a un algoritmo de bosque aleatorio para generar un modelo. A continuación se presenta la ROC resultante.

En la Figura 6 se muestra una curva ROC del clasificador de cuatro marcadores para EHNA en fase 2, 3 y 4 (fibrosis). El área bajo la curva (ABC) fue de 0,82 /- 0,07, con una sensibilidad del 62 % y una especificidad del 92 % con un valor de corte de 0,5.

La puntuación de probabilidad, es decir, Prob(Esteatosis), del modelo de cada clasificador se representó gráficamente para cada individuo en todos los grupos para evaluar si podía usarse como modelo de gravedad/seguimiento además de la decisión binaria sobre la que se construyó (Figura 7). El gráfico muestra una clara discriminación entre ausencia de esteatosis y esteatosis, y el voto de probabilidad aumenta con el nivel de esteatosis. Los sujetos con EHNA en todas las fases presentan esteatosis grave.

La Tabla 4 muestra los biomarcadores en el clasificador de 4 marcadores. La Tabla 4 también proporciona un nombre alternativo para determinados biomarcadores, el nombre del gen y el número de acceso UniProt para cada biomarcador, y si el biomarcador está presente en niveles más altos o más bajos en las poblaciones de EHNA 2, 3 y 4, en comparación con todas las poblaciones de EHGNA.

continuación

La Figura 7 muestra gráficos de cajas para el clasificador de cuatro biomarcadores en cada uno de los grupos de sujetos (de izquierda a derecha: normal, esteatosis leve, esteatosis moderada, esteatosis grave, NASH1, NASH2, NASH3, NASH4). La línea negra dentro de cada recuadro representa la mediana (o percentil 50) de los puntos de datos, y el propio recuadro representa el intervalo intercuartílico (IQR), el área que abarca los puntos de datos desde el percentil 25 hasta el 75. Los bigotes se extienden para cubrir los puntos de datos dentro de 1,5 * IQR de la parte superior e inferior de la caja.

La Figura 8 muestra las CDF de los 4 biomarcadores en el clasificador.

Ejemplo 3. Biomarcadores y clasificadores adicionales para EHGNA y/o EHNA

Usando el método de selección de estabilidad, se definieron clasificadores adicionales para distinguir diversos grupos de individuos. Los clasificadores (incluyendo los clasificadores analizados anteriormente) se muestran en la Tabla 5. Los marcadores de las comparaciones 2 y 5 se usaron para construir un clasificador de bosque aleatorio para la esteatosis (EHGNA) y la fibrosis (EHNA), como se ha analizado anteriormente.

Tabla 5. Clasificadores obtenidos usando selección de estabilidad

La comparación 1 de la Tabla 5 muestra un clasificador de 7 marcadores que distingue los sujetos de control de los de EHNA en fase 1 a 4 con una sensibilidad del 86,4 % y una especificidad del 82 %. La comparación 3 muestra un clasificador de 3 marcadores que distingue los sujetos de control frente a todas las esteatosis (leve, moderada y grave) con una sensibilidad del 76,6 % y una especificidad del 74,4 %.

Más información sobre los biomarcadores enumerados en la Tabla 5 que no están en las Tablas 3 y 4, anteriores, se muestra en la Tabla 6.

En la Tabla 7 se muestran los 25 biomarcadores principales según la distancia KS univariante para el grupo de control frente a EHNA en fases 1 a 4. Estos biomarcadores, y combinaciones de estos biomarcadores, puede usarse para separar a los sujetos de control (tales como los sujetos obesos) de los sujetos con EHNA y/o para separar a los sujetos de control de los sujetos con esteatosis.

T l 7: 2 i m r r rin i l

Ejemplo 4: Detección de biomarcadores de ejemplo usando aptámeros

Se describe un método de ejemplo de detección de uno o más biomarcadores en una muestra, por ejemplo, en Kraemeret al., PLoS One6(10): e26332, y se describe a continuación. Se describen tres métodos diferentes de cuantificación: hibridación basada en micromatrices, un método basado en perlas Luminex y qPCR.

Reactivos

HEPES, NaCl, KCl, EDTA, EGTA, MgCh y Tween-20 pueden adquirirse, por ejemplo, en Fisher Biosciences. La sal de sodio de sulfato de dextrano (DxSO4), peso molecular nominal 8000, puede adquirirse, por ejemplo, en AIC y se dializa contra agua desionizada durante al menos 20 horas con un intercambio. La ADN polimerasa KOD EX puede adquirirse, por ejemplo, en VWR. El cloruro de tetrametilamonio y CAPSO pueden adquirirse, por ejemplo, en Sigma-Aldrich y la estreptavidina-ficoeritrina (SAPE) puede adquirirse, por ejemplo, en Moss Inc. El clorhidrato de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilfluoruro (AEBSF) puede adquirirse, por ejemplo, en Gold Biotechnology. Las placas de 96 pocillos recubiertas de estreptavidina pueden adquirirse, por ejemplo, en Thermo Scientific (Placas recubiertas con estreptavidina Pierce HBC, transparente, 96 pocillos, número de producto 15500 o 15501). La NHS-PEO4-biotina puede adquirirse, por ejemplo, en Thermo Scientific (EZ-Link NHS-PEO4-Biotina, número de producto 21329), disuelta en DMSO anhidro, y puede almacenarse congelada en alícuotas de un solo uso. IL-8, MIP-4, Lipocalina-2, RANTES, MMP-7 y MMP-9 pueden adquirirse, por ejemplo, en R&D Systems. La resistina y MCP-1 pueden adquirirse, por ejemplo, en PeproTech, y tPA puede adquirirse, por ejemplo, en VWR.

Ácidos nucleicos

Pueden adquirirse oligodesoxinucleótidos convencionales (incluyendo los sustituidos con amina y biotina), por ejemplo, de Integrated DNA Technologies (IDT). Z-Block es un oligodesoxinucleótido monocatenario de secuencia 5'-(AC-BnBn)7-AC-3', donde Bn indica un resto de desoxiuridina sustituida con bencilo. El bloque Z puede sintetizarse usando la química convencional de fosforamidita. Los reactivos de captura de aptámeros también pueden sintetizarse mediante química de fosforamidita convencional, y pueden purificarse, por ejemplo, en una columna PRP-3 de 21,5*75 mm, funcionando a 80 °C en un sistema Waters Autopurification 2767 (o en un sistema semiautomatizado de la serie Waters 600), usando, por ejemplo, un calentador timberline TL-600 o TL-150 y un gradiente de bicarbonato de trietilamonio (TEAB)/ACN para eluir el producto. La detección se realiza a 260 nm y las fracciones se recogen a través del pico principal antes de agrupar las mejores fracciones.

Tampones

El tampón SB 18 se compone de HEPES 40 mM, NaCl 101 mM, KCl 5 mM, MgCl25 mM y Tween 20 al 0,05 % (v/v) ajustado a pH 7,5 con NaOH. El tampón SB17 es SB18 complementado con EDTA trisódico 1 mM. El tampón PB1 se compone de HEPES 10 mM, NaCl 101 mM, KCl 5 mM, MgCl2 5 mM, EDTA trisódico 1 mM y Tween -20 al 0,05 % (v/v) ajustado a pH 7,5 con NaOH. El tampón de elución CAPSO consiste en CAPSO 100 mM pH 10,0 y NaCl 1 M. El tampón de neutralización contiene HEPES 500 mM, HCl 500 mM y Tween-20 al 0,05 % (v/v). El tampón de hibridación de Agilent es una formulación patentada que se suministra como parte de un kit (Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit). El Tampón de lavado 1 de Agilent es una formulación patentada (Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1, Agilent). El Tampón de lavado 2 de Agilent es una formulación patentada (Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2, Agilent). La solución de hibridación TMAC consiste en cloruro de tetrametilamonio 4,5 M, EDTA trisódico 6 mM, Tris-HCl 75 mM (pH 8,0) y Sarkosyl al 0,15 % (v/v). El tampón KOD (10 veces concentrado) consiste en Tris-HCl 1200 mM, MgSO4 15 mM, KCl 100 mM, (NH4)2SO460 mM, Triton-X 100 al 1 % v/v y BSA al 1 mg/ml.

Preparación de la muestra

Se descongela suero (almacenado a -80 °C en alícuotas de 100 pl) en un baño de agua a 25 °C durante 10 minutos, y después se almacena en hielo antes de la dilución de la muestra. Las muestras se mezclan mediante un vórtice suave durante 8 segundos. Se prepara una solución de muestra de suero al 6% por dilución en 0,94* SB17 complementada con MgCl20,6 mM, Eg TA trisódico 1 mM, AEBSF 0,8 mM y Z-Block 2 pM. Una porción de la solución madre de suero al 6% se diluye 10 veces en SB17 para crear una solución madre de suero al 0,6%. Se usan poblaciones del 6 % y del 0,6 %, en algunas realizaciones, para detectar analitos de alta y baja abundancia, respectivamente.

Reactivo de captura (aptámero) y preparación de la placa de estreptavidina

Los aptámeros se agrupan en 2 mezclas de acuerdo con la abundancia relativa de sus analitos afines (o biomarcadores). Las concentraciones madre son de 4 nM para cada aptámero y la concentración final de cada aptámero es de 0,5 nM. Las mezclas madre de aptámeros se diluyen 4 veces en tampón SB 17, se calientan a 95 °C durante 5 minutos y se enfrían a 37 °C durante 15 minutos antes de su uso. Este ciclo de desnaturalizaciónrenaturalización tiene por objeto normalizar las distribuciones de conformadores de aptámeros y garantizar de este modo una actividad reproducible de los aptámeros a pesar de las historias variables. Las placas de estreptavidina se lavan dos veces con 150 pl de tampón<p>B1 antes de su uso.

Equilibrado y captura de placas

Las mezclas de aptámeros 2* enfriadas por calor (55 |jl) se combinan con un volumen igual de diluciones de suero al 6 % o al 0,6 %, produciendo mezclas de equilibrio que contienen suero al 3 % y al 0,3 %. Las placas se sellan con un tapete de sellado de silicona (Axymat Silicone sealing mat, VWR) y se incuban durante 1,5 h a 37 °C. Después, las mezclas de equilibrio se transfieren a los pocillos de una placa de estreptavidina de 96 pocillos lavada y se incuban en un termomezclador Eppendorf a 37 °C, con agitación a 800 rpm, durante dos horas.

Ensayo manual

A menos que se especifique otra cosa, el líquido se retira por vertido, seguido de dos golpecitos sobre capas de papel de cocina. Los volúmenes de lavado son de 150 j l y todas las incubaciones por agitación se realizan en un termomezclador Eppendorf a 25 °C, 800 rpm. Las mezclas de equilibrio se eliminan mediante pipeteo y las placas se lavan dos veces durante 1 minuto con tampón PB1 complementado con sulfato de dextrano 1 mM y biotina 500 jM , después 4 veces durante 15 segundos con el tampón PB1. Se añade una solución recién preparada de NHS-PEO4-biotina 1 mM en tampón PB1 (150 jl/pocillo) y las placas se incuban durante 5 minutos con agitación. La solución de NHS-biotina se retira y las placas se lavan 3 veces con tampón PB1 complementado con glicina 20 mM y 3 veces con tampón PB1. Después, se añaden 85 j l de tampón PB1 complementado con DxSO4 1 mM a cada pocillo y se irradian las placas bajo una lámpara UV BlackRay (longitud de onda nominal de 365 nm) a una distancia de 5 cm durante 20 minutos con agitación. Las muestras se transfieren a una nueva placa recubierta de estreptavidina lavada, o a un pocillo no utilizado de la placa de estreptavidina lavada existente, combinando mezclas de dilución de muestra alta y baja en un único pocillo. Las muestras se incuban a temperatura ambiente con agitación durante 10 minutos. El material no adsorbido se retira y las placas se lavan 8 veces durante 15 segundos cada una con tampón PB1 complementado con glicerol al 30 %. Después, las placas se lavan una vez con tampón PB1. Los aptámeros se eluyen durante 5 minutos a temperatura ambiente con 100 j l de tampón de elución CAPSO. Se transfieren 90 j l del eluido a una placa HybAid de 96 pocillos y se añaden 10 j l de tampón de neutralización.

Ensayo semiautomatizado

Las placas de estreptavidina con mezclas de equilibrio adsorbidas se colocan en la cubierta de un lavador de placas BioTek EL406, que está programado para realizar las siguientes etapas: el material no adsorbido se elimina por aspiración y los pocillos se lavan 4 veces con 300 j l de tampón PB1 complementado con sulfato de dextrano 1 mM y biotina 500 jM . Después, los pocillos se lavan 3 veces con 300 j l de tampón PB1. Se añaden 150 j l de una solución recién preparada (a partir de una solución madre de DMSO 100 mM) de NHS-PEO4-biotina 1 mM en tampón PB1. Las placas se incuban durante 5 minutos con agitación. Se aspira el líquido y se lavan los pocillos 8 veces con 300 j l de tampón PB1 complementado con glicina 10 mM. Se añaden 100 j l de tampón PB1 complementado con sulfato de dextrano 1 mM. Después de estas etapas automatizadas, las placas se retiran del lavador de placas y se colocan en un termoagitador montado bajo una fuente de luz UV (BlackRay, longitud de onda nominal de 365 nm) a una distancia de 5 cm durante 20 minutos. El termoagitador se ajusta a 800 rpm y 25 °C. Después de 20 minutos de irradiación, las muestras se transfieren manualmente a una nueva placa de estreptavidina lavada (o a un pocillo no utilizado de la placa lavada existente). Las mezclas de reacción de alta abundancia (3 % de suero 3 % de mezcla de aptámeros) y de baja abundancia (0,3 % de suero 0,3 % de mezcla de aptámeros) se combinan en un único pocillo en este punto. Esta placa "Catch-2" se coloca en la cubierta del lavador de placas BioTek EL406, que está programado para realizar las siguientes etapas: la placa se incuba durante 10 minutos con agitación. Se aspira el líquido y se lavan los pocillos 21 veces con 300 j l de tampón PB1 complementado con glicerol al 30 %. Los pocillos se lavan 5 veces con 300 j l de tampón PB1 y se aspira el último lavado. Se añaden 100 j l de tampón de elución CAPSO y se eluyen los aptámeros durante 5 minutos con agitación. Siguiendo estas etapas automatizadas, después la placa se retira de la cubierta del lavador de placas y se transfieren manualmente alícuotas de 90 j l de las muestras a los pocillos de una placa HybAid de 96 pocillos que contiene 10 j l de tampón de neutralización.

Hibridación en micromatrices Agilent 8*15k personalizadas

Se transfieren 24 j l del eluido neutralizado a una nueva placa de 96 pocillos y se añaden a cada pocillo 6 j l de 10* Agilent Block (Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit, Gran volumen, Agilent 5188-5380), que contiene un conjunto de controles de hibridación compuesto por 10 aptámeros Cy3. Se añaden 30 j l de tampón de hibridación Agilent 2* a cada muestra y se mezclan. Se pipetean manualmente 40 j l de la solución de hibridación resultante en cada "pocillo" del portaobjetos con junta de hibridación (Hybridization Gasket Slide, formato de 8 micromatrices por portaobjetos, Agilent). Se colocan portaobjetos de micromatrices Agilent personalizados, con 10 sondas por matriz complementarias a la región aleatoria de 40 nucleótidos de cada aptámero con un enlazador 20* dT, en los portaobjetos de sello de acuerdo con el protocolo del fabricante. El conjunto (Hybridization Chamber Kit - SureHybenabled, Agilent) se sujeta y se incuba durante 19 horas a 60 °C mientras se gira a 20 rpm.

Lavado posterior a la hibridación

Se colocan aproximadamente 400 ml de Tampón de lavado 1 de Agilent en cada una de las dos placas de tinción de vidrio separadas. Los portaobjetos (no más de dos a la vez) se desmontan y separan mientras se sumergen en el Tampón de lavado 1, después se transfieren a una gradilla de portaobjetos en una segunda cubeta de tinción que también contiene Tampón de lavado 1. Los portaobjetos se incuban durante 5 minutos más en Tampón de lavado 1 con agitación. Los portaobjetos se transfieren al Tampón de lavado 2 preequilibrado a 37 °C y se incuban durante 5 minutos con agitación. Los portaobjetos se transfieren a una cuarta cubeta de tinción que contiene acetonitrilo y se incuban durante 5 minutos con agitación.

Formación de imágenes de micromatrices

Los portaobjetos de micromatrices se visualizan con un sistema de barrido de micromatrices Agilent G2565CA, usando el canal Cy3 a una resolución de 5 pm con un ajuste de PMT del 100 % y la opción XRD activada a 0,05. Las imágenes TIFF resultantes se procesan usando el software de extracción de características Agilent versión 10.5.1.1 con el protocolo GE1_105_Dec08. Los datos primarios de Agilent están disponibles como Información complementaria (Figura S6).

Diseño de sonda Luminex

Las sondas inmovilizadas en perlas tienen 40 desoxinucleótidos complementarios al extremo 3' de la región aleatoria de 40 nucleótidos del aptámero diana. La región complementaria del aptámero se acopla a las microesferas Luminex mediante un enlazador de hexaetilenglicol (HEG) que porta un extremo amino 5'. Los desoxioligonucleótidos de detección biotinilados comprenden 17-21 desoxinucleótidos complementarios a la región 5' del cebador de los aptámeros diana. Las moléculas de biotina se añaden a los extremos 3' de los oligos de detección.

Acoplamiento de sondas a microesferas Luminex

Las sondas se acoplan a las microesferas Luminex Microplex siguiendo esencialmente las instrucciones del fabricante, pero con las siguientes modificaciones: las cantidades de oligonucleótidos aminoterminales son de 0,08 nMol por 2,5*106 microesferas, y la segunda adición de EDC es de 5 pl a 10 mg/ml. Las reacciones de acoplamiento se realizan en un Eppendorf ThermoShaker a 25 °C y 600 rpm.

Hibridación de microesferas

Las soluciones madre de microesferas (unas 40000 microesferas/pl) se agitan en vórtice y se someten a ultrasonidos en un limpiador ultrasónico Health Sonics (Modelo: T1,9C) durante 60 segundos para suspender las microesferas. Las microesferas en suspensión se diluyen hasta 2000 microesferas por reacción en soluciones de hibridación de 1,5 * TMAC y se mezclan mediante vórtice y ultrasonidos. Se transfieren 33 pl por reacción de la mezcla de microesferas a una placa HybAid de 96 pocillos. Se añaden a cada reacción 7 pl de oligonucleótido de detección biotinilado 15 nM en tampón TE 1* y se mezclan. Se añaden 10 pl de muestra de ensayo neutralizada y la placa se sella con un tapón de silicona. La placa se incuba primero a 96 °C durante 5 minutos y después a 50 °C sin agitación durante toda la noche en un horno de hibridación convencional. Una placa filtrante (Dura pore, Millipore número de pieza MSBVN1250, tamaño de poro de 1,2 pm) se humedece previamente con 75 pl de solución de hibridación 1* TMAC complementada con BSA al 0,5 % (p/v). Todo el volumen de muestra de la reacción de hibridación se transfiere a la placa de filtro. La placa de hibridación se aclara con 75 pl de solución de hibridación TMAC 1* que contiene BSA al 0,5 % y el material restante se transfiere a la placa de filtro. Las muestras se filtran a vacío lento, con 150 pl de tampón evacuados durante aproximadamente 8 segundos. La placa de filtro se lava una vez con 75 pl de solución de hibridación 1* TMAC que contiene BSA al 0,5 % y las microesferas de la placa de filtro se resuspenden en 75 pl de solución de hibridación 1* TMAC que contiene BSA al 0,5 %. La placa de filtro se protege de la luz y se incuba en un Eppendorf Thermalmixer R durante 5 minutos a 1000 rpm. Después, la placa filtrante se lava una vez con 75 pl de solución de hibridación TMAC 1* que contiene BSA al 0,5 %. 75 pl de ficoeritrina estreptavidina 10 pg/ml (SAPE-100, MOSS, Inc.) en solución de hibridación 1* TMAC y se incuba en el Eppendorf Thermalmixer R a 25 °C a 1000 rpm durante 60 minutos. La placa de filtro se lava dos veces con 75 pl de solución de hibridación 1* TMAC que contiene BSA al 0,5 % y las microesferas de la placa de filtro se resuspenden en 75 pl de solución de hibridación 1* TMAC que contiene BSA al 0,5 %. Después, la placa de filtro se incuba protegida de la luz en un Eppendorf Thermalmixer R durante 5 minutos, 1000 rpm. Después, la placa filtrante se lava una vez con 75 pl de solución de hibridación TMAC 1* que contiene BSA al 0,5 %. Las microesferas se resuspenden en 75 pl de solución de hibridación TMAC 1* complementada con BSA al 0,5 %, y se analizan en un instrumento Luminex 100 que ejecuta el software XPonent 3.0. Se cuentan al menos 100 microesferas por tipo de microesfera, con una calibración alta del PMT y un ajuste del discriminador de dobletes de 7500 a 18000.

Lectura de QPCR

Las curvas patrón para qPCR se preparan en agua con un rango de 108 a 102 copias con diluciones 10 veces mayores y un control sin placa. Las muestras de ensayo neutralizadas se diluyen 40 veces en diH2O. La mezcla maestra de qPCR se prepara a una concentración final de 2* (2* tampón KOD, mezcla de dNTP 400 pM, mezcla de cebadores directo e inverso 400 nM, 2* SYBR Green I y 0,5 U KOD EX). Se añaden 10 pl de la mezcla maestra 2* qPCR a 10 pl de muestra de ensayo diluida. La qPCR se realiza en un BioRad MylQ iCycler con 2 minutos a 96 °C seguidos de 40 ciclos de 96 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 30 segundos.

Ejemplo 5. Análisis adicionales de EHGNA y EHNA

Los datos del ensayo múltiple de aptámeros descrito en el Ejemplo 2 para las muestras descritas en el Ejemplo 1 se sometieron a un nuevo análisis, usando un modelo de regresión logística.

La Selección de Estabilidad toma muchos subconjuntos de la mitad de los datos y realiza la selección de biomarcadores usando el clasificador lazo, que es un modelo de regresión logística regularizada. Véase, por ejemplo, Meinshausenet al.,2010,J. Royal Statistical Soc: Series B (Statistical Methodology),72: 417-473. La vía de selección para un único biomarcador es la proporción de estos subconjuntos para los que ese biomarcador se seleccionó mediante el modelo lazo sobre un intervalo de lambda. Lambda es un parámetro de ajuste, que determina cuántos biomarcadores selecciona el lazo. La probabilidad máxima de selección en un intervalo de valores lambda es la métrica definitiva utilizada para seleccionar un conjunto de biomarcadores.

C. Clasificador de esteatosis

Basándose en las clasificaciones de los sujetos, se asumió que todos los grupos de esteatosis, así como EHNA en fases 1-4, tienen grasa en las células hepáticas. Se desarrolló un clasificador (esteatosis o grasa en el hígado) comparando sujetos obesos normales con todos los sujetos con EHGNA y NASH.

Los marcadores se ajustaron con modelos de regresión logística para generar clasificadores.

La Tabla 8 muestra los biomarcadores en el clasificador de esteatosis de 8 marcadores (EHGNA). La Tabla 8 también muestra los coeficientes de regresión logística para el modelo y el intervalo de confianza del 95 % para la estimación del coeficiente. El clasificador de 8 marcadores contiene todos los marcadores del clasificador de 9 marcadores mostrado en la Tabla 3, excepto por PLAT.

T l : l ifi r h i m r r r l EH NA

La Figura 12 muestra gráficos de cajas para el clasificador de 8 marcadores para cada conjunto de sujetos con esteatosis y EHNA. La línea negra dentro de cada recuadro representa la mediana (o percentil 50) de los puntos de datos, y el propio recuadro representa el intervalo intercuartílico (IQR), el área que abarca los puntos de datos desde el percentil 25 hasta el 75. Los bigotes se extienden para cubrir los puntos de datos dentro de 1,5 * IQR de la parte superior e inferior de la caja. El gráfico muestra una clara discriminación entre ausencia de esteatosis y esteatosis, y el voto de probabilidad aumenta con el nivel de esteatosis. Los sujetos con EHNA en todas las fases presentan esteatosis grave.

D. Clasificador de EHNA (Fibrosis)

Todos los sujetos con EHNA presentan alguna forma de inflamación y balonización asociada a la fibrosis. Para este análisis, se compararon los grupos de esteatosis leve y moderada con EHNA en fases 2, 3 y 4. Para garantizar la identificación de verdaderos biomarcadores de fibrosis, se excluyó el grupo de EHNA en fase 1. Los sujetos con esteatosis grave se omitieron en este análisis porque el muestreo de la biopsia en esos sujetos podría haber pasado por alto algo de fibrosis.

Los marcadores se ajustaron con modelos de regresión logística para generar clasificadores para generar un modelo.

La Tabla 9 muestra los biomarcadores en el clasificador de 8 marcadores de fibrosis (EHNA). La Tabla 9 también muestra los coeficientes de regresión logística para el modelo y el intervalo de confianza del 95 % para la estimación del coeficiente. El clasificador de 8 marcadores contiene todos los marcadores del clasificador de 4 marcadores mostrado en la Tabla 4, más cuatro marcadores adicionales.

Tabla 9: Clasificador de ocho biomarcadores para EHNA en fases 2, 3 y 4 frente a la esteatosis de leve a moderada

EHGNA

La Figura 13 muestra gráficos de cajas para el clasificador de fibrosis de 8 biomarcadores en cada uno de los grupos de sujetos (de izquierda a derecha: normal, esteatosis leve, esteatosis moderada, esteatosis grave, NASH1, NASH2, NASH3, NASH4). La línea negra dentro de cada recuadro representa la mediana (o percentil 50) de los puntos de datos, y el propio recuadro representa el intervalo intercuartílico (IQR), el área que abarca los puntos de datos desde el percentil 25 hasta el 75. Los bigotes se extienden para cubrir los puntos de datos dentro de 1,5 * IQR de la parte superior e inferior de la caja.

Los cuatro biomarcadores adicionales en el clasificador de fibrosis de la Tabla 9 se muestran en la Tabla 10, junto con nombres alternativos, los nombres de los genes y el número de acceso UniProt de cada biomarcador.

Tabla 10: Biomarcadores adicionales en el clasificador de 8 biomarcadores de fibrosis

La Figura 14 muestra las funciones de distribución acumulativa para los cuatro marcadores adicionales en el clasificador de ocho marcadores para la fibrosis.

Ejemplo 6. Desenmascaramiento de muestras con enmascaramiento

Como se muestra en la Tabla 2, se enmascaró un conjunto de muestras en cada uno de control, esteatosis leve, esteatosis moderada, esteatosis grave, EHNA en fase 1 y EHNA en fase 2. La probabilidad de que cada una de las muestras con enmascaramiento procediera de un sujeto con esteatosis se determinó usando el clasificador de 8 marcadores que se muestra en la Tabla 8. La Figura 15 muestra gráficos de cajas para las muestras con enmascaramiento después del desenmascaramiento, de acuerdo con su grupo de muestra real.

La Figura 16 muestra el rendimiento del clasificador de esteatosis de 8 marcadores para el conjunto de descubrimiento y para el conjunto de validación con enmascaramiento. La curva superior es la curva ROC para el conjunto de descubrimiento, que tiene un área bajo la curva (ABC) de 0,927 ± 0,03 y una sensibilidad del 92,8 % y una especificidad del 73,3 % con un valor de corte de 0,5. La curva inferior es la curva ROC para el conjunto de validación con enmascaramiento, con un ABC de 0,889 ± 0,06 y una sensibilidad del 88 % y una especificidad del 65,8 % con un valor de corte de 0,5.

La Tabla 10 muestra el rendimiento del clasificador de esteatosis de 8 marcadores para el conjunto de validación con enmascaramiento para identificar un sujeto como positivo o negativo para la esteatosis.

Tabla 10: Rendimiento del clasificador de esteatosis de 8 marcadores para el conjunto de validación con enmascaramiento

La probabilidad de que cada una de las muestras con enmascaramiento procediera de un sujeto con fibrosis se determinó usando el clasificador de 8 marcadores que se muestra en la Tabla 9. La Figura 17 muestra gráficos de cajas para las muestras con enmascaramiento después del desenmascaramiento, de acuerdo con su grupo de muestra real.

La Figura 18 muestra el rendimiento del clasificador de fibrosis de 8 marcadores para el conjunto de descubrimiento y para dos conjuntos de validación con enmascaramiento diferentes. El segundo conjunto de validación incluye el primer conjunto de validación más el grupo normal (individuos negativos para la enfermedad). Debido a que el modelo no se entrenó con el grupo normal, es ingenuo para esas muestras, que pueden revelar falsos positivos. La curva superior (roja) es la curva ROC para el conjunto de descubrimiento (control (esteatosis leve+moderada) frente a EHNA grados 2, 3 y 4), que tiene un área bajo la curva (ABC) de 0,929 ± 0,04 y una sensibilidad del 78,8 % y una especificidad del 89,9 % con un valor de corte de 0,5. La curva central (azul) es la curva ROC del primer conjunto de validación con enmascaramiento, que tiene un ABC de 0,885 ± 0,11 y una sensibilidad del 66,7 % y una especificidad del 84,6 % con un valor de corte de 0,5. La curva inferior (cian) es la curva ROC del segundo conjunto de validación con enmascaramiento, que tiene un ABC de 0,891 ± 0,08 y una sensibilidad del 66,7 % y una especificidad del 89,5 % con un valor de corte de 0,5.

Las Tablas 11 y 12 muestran el rendimiento del clasificador de fibrosis de 8 marcadores para los dos conjuntos de validación con enmascaramiento para identificar sujetos como positivos o negativos para fibrosis.

Tabla 11: Rendimiento del clasificador de fibrosis de 8 marcadores para el primer conjunto de validación con enmascaramiento

Tabla 12: Rendimiento del clasificador de fibrosis de 8 marcadores para el segundo conjunto de validación con enmascaramiento

La Figura 19 muestra las distribuciones de sensibilidad y especificidad de 2500 iteraciones bootstrap del conjunto de verificación de retención del 20 %, usando (A) el clasificador de esteatosis de 8 marcadores y (B) el clasificador de fibrosis de 8 marcadores. Se muestran los intervalos de confianza empíricos del 95 %, así como las estimaciones de entrenamiento y validación, ambos dentro de los intervalos de confianza del 95 %.

Ejemplo 7. Rendimiento del clasificador en sujetos pediátricos

Se obtuvieron 90 muestras de suero de niños del Departamento de Gastroenterología y Nutrición Pediátricas del Colegio Médico de Wisconsin. Los sujetos que aportaron muestras se clasificaron en cuatro grupos: controles no obesos (N = 45), obesos con ensayos de función hepática normales (N = 20), obesos con ensayos de función hepática elevados (N = 7) y sujetos diagnosticados de EHNA (N = 18). Las muestras se analizaron usando el clasificador de esteatosis de 8 marcadores que se muestra en la Tabla 8 y el clasificador de fibrosis de 8 marcadores que se muestra en la Tabla 9.

La probabilidad de que cada una de las muestras pediátricas procediera de un sujeto con esteatosis se determinó usando el clasificador de 8 marcadores que se muestra en la Tabla 8. La Figura 20 muestra gráficos de cajas para las muestras pediátricas de acuerdo con su grupo de muestra real. El clasificador de esteatosis identificó con precisión los sujetos pediátricos con EHNA.

A diferencia del clasificador de esteatosis, el clasificador de fibrosis de 8 marcadores no identificó eficazmente los sujetos pediátricos con fibrosis en este experimento. (No se muestran los datos).

Ejemplo 8. Descubrimiento de biomarcadores para el desarrollo de paneles de biomarcadores para la Esteatosis, Inflamación lobular, Balonización de hepatocitos y Fibrosis

Se analizó un total de 297 muestras de suero de adultos. Estas muestras proceden de tres cohortes de EHNA CRN: Base de datos de EHGNA (n = 81), ensayo PIVENS (n = 80) y DB2 (n = 136). Las recogidas de EHGNA y DB2 se crearon para estudiar la historia natural de la EHGNA y la EHNA. El ensayo PIVENS (Pioglitazona frente a vitamina E frente a placebo para el tratamiento de pacientes no diabéticos con esteatohepatitis no alcohólica) fue realizado por el CRN de EHNA para investigar los tratamientos en pacientes no diabéticos con EHNA. Todas las muestras se recogieron antes del tratamiento y los resultados de la biopsia hepática de referencia se obtuvieron en los 6 meses siguientes a la recogida del suero. La Tabla 13 y la Figura 21 muestran la distribución de la puntuación histológica y de actividad de la EHGNA (puntuaciones NAS) de la biopsia hepática basal. NAS es un sistema de puntuación histológica de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), descrito, por ejemplo, en Kleineret al., Hepatology41(6):1313-21 (2005). Se basa en cuatro categorías de afectación hepática, incluyendo esteatosis, inflamación lobular, balonización de hepatocitos y fibrosis. La esteatosis se puntúa de 0 a 3 y se basa en el porcentaje de superficie afectada por esteatosis. La inflamación lobular se puntúa de 0 a 3 y se basa en el número de focos por campo de 200x. La balonización de hepatocitos se puntúa de 0 a 2 y se basa en la prevalencia de hepatocitos balonizados (por ejemplo, ninguno, pocos o muchos). La fibrosis se puntúa de 0 a 4 y se basa en la extensión y la localización de la fibrosis, hasta la cirrosis (puntuación 4).

Tabla 13: Histolo ía de la bio sia he ática basal

Los niveles de biomarcadores se compararon con el diagnóstico de EHNA (Diagnóstico de EHNA) proporcionado por los investigadores del CRN de EHNA (campo nashdx en el diccionario de datos). Se registró un diagnóstico positivo de EHNA (código de diagnóstico = 2) en 123 participantes en el estudio. Estas muestras se compararon con 174 muestras de individuos sin EHGNA (código de diagnóstico 99, n = 31) o con EHGNA, sin EHNA (código de diagnóstico 0, n = 143).

Identificación de biomarcadores candidatos

Se aplicó el ensayo de Jonckheere-Terpstra (ensayo JT) para identificar biomarcadores candidatos de lol componentes histológicos individuales de la EHNA (esteatosis, inflamación lobular, balonización de hepatocitos y fibrosis), la puntuación de NAS y el Diagnóstico de EHNA. El ensayo JT es un ensayo no paramétrico basado en intervalos que puede usarse para determinar si existe una tendencia estadísticamente significativa entre una variable independiente ordinal (puntuación histológica de baja a alta) y una variable dependiente continua (medición de proteínas SOMAscan). Además de las mediciones proteómicas de SOMAscan, se incluyeron 20 variables clínicas continuas como biomarcadores potenciales en este análisis.

Después de corregir las comparaciones múltiples, el número de marcadores significativos (basado en un valor de p corregido de Bonferroni de < 0,01) varió de 27 a 132, dependiendo del componente histológico (Tabla 14). En las Figuras 22-27 se muestran gráficos de cajas para las 6 proteínas principales de cada categoría. La única variable clínica en los 6 biomarcadores principales es AST (rotulada ast.clín en las figuras).

Tabla 14: Número de prot ín i nifi iv m i n l n T rr ión por Bonferroni p <0,01

continuación

Como se muestra en la Figura 22, uno o más de los biomarcadores ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1 y CSF1R pueden usarse para determinar la probabilidad de que un sujeto tenga esteatosis. Como se muestra en la Figura 23, uno o más de los biomarcadores ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1 y POR pueden usarse para determinar la probabilidad de que un sujeto tenga inflamación lobular. En algunas realizaciones, también pueden considerarse los niveles clínicos de AST.

Como se muestra en la Figura 24, uno o más de los biomarcadores ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB 1 y HSP90AA1/HSP90AB 1 pueden usarse para determinar la probabilidad de que un sujeto tenga balonización de hepatocitos. En algunas realizaciones, también pueden considerarse los niveles clínicos de AST.

Como se muestra en la Figura 25, uno o más de los biomarcadores C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 y DCN pueden usarse para determinar la probabilidad de que un sujeto tenga fibrosis.

Las proteínas séricas mejor clasificadas se solapan en todas las categorías. La gravedad de la enfermedad en diferentes categorías histológicas puede estar relacionada. Por ejemplo, es probable que un paciente con una puntuación de balonización de hepatocitos de 2 también tenga fibrosis. Existen 10 proteínas únicas entre los 6 marcadores mejor clasificados por categoría histológica (Tabla 15).

Además de los biomarcadores enumerados en la Tabla 15, los niveles de AST clínicos formaban parte de los seis marcadores principales de inflamación lobular y balonización de hepatocitos. Los niveles clínicos de AST se determinan usando ensayos de sangre rutinarios conocidos en la técnica.

En la Figura 28 se muestra una visión más amplia de los marcadores séricos superpuestos y únicos, donde se comparan todas las proteínas significativas (p < 0,01 corregido por Bonferroni) de cada categoría. Este análisis demuestra que pueden construirse modelos que capten múltiples aspectos de la biología de la EHNA o que sean específicos de un componente.

Aunque los modelos piloto se construyeron a partir de muestras que representaban los extremos (por ejemplo, esteatosis 0 frente a 3, balonización 0 frente a 2 y fibrosis 0 frente a 3), las ABC de rendimiento validadas 10 veces (0,97 ± 0,02 y 0,94 ± 0,07) demuestran que el modelo funciona en todas las muestras.

Ejemplo 9. Desarrollo adicional de paneles de biomarcadores para la Esteatosis, Inflamación lobular, Balonización de hepatocitos y Fibrosis

El descubrimiento de biomarcadores comenzó con distancias KS univariantes que distinguían la enfermedad del control, seguidas de una selección de estabilidad y ensayos JT de comportamiento monotónico entre la gravedad de las fases de la enfermedad. A continuación se proporciona un resumen de cada una de las etapas de filtrado del análisis. Una vez que la lista final de candidatos se ha reducido al conjunto más parsimonioso de marcadores dentro de un error típico del "mejor" modelo (a través de la función de coste de la selección de características), el conjunto final de características se usó para ajustar un modelo para cada componente de la enfermedad hepática.

Brevemente, la reducción de la dimensionalidad y el filtrado de candidatos siguieron el proceso a continuación:

1)Análisis de KS:Distancias KS > 0,4 y TDF asociada a la distancia KS < 0,05 (5 %)O

2)Selección de estabilidad:analitos con una probabilidad de selección máxima (proporción de entradas en el modelo) superior a 0,45, 0,45, 0,5, 0,5 y 0,5 para cada una de esteatosis, inflamación lobular, balonización, fibrosis y NASHdx respectivamenteY

3)Análisis de JT:TDF asociada al ensayo de JT < 0,05 (5 %)

4)Analitos de control:se eliminaron analitos de control negativo tales como dianas HybControls, Spuriomers y NonHuman

5)Marcadores de sitio:los marcadores que distinguen las muestras de diferentes sitios o estudios se eliminaron de los posibles candidatos en cada lista de componentes

6)Estabilidad de espín:Se eliminaron los analitos con puntuación de estabilidad de espín (modelos bayesianos del experimento de manipulación de muestras) en el percentil 33 inferior (%il)

7)Reproducibilidad:se eliminaron los analitos que se determinó que tenían un coeficiente de varianza (%CV) superior al 15 % durante el estudio de reproducibilidad del ensayo de la versión 3

8)Distribución gaussiana:se realizó una inspección visual de la distribución dividida por grupo clínico (enfermedad frente a control) para la aproximación gaussiana y se eliminaron los analitos con estructuras de varianza no gaussianas, bimodales o muy diferentes entre los grupos clínicos.

Siguiendo el análisis anterior, se identificaron marcadores candidatos para cada componente de la enfermedad hepática. La Tabla 16 muestra los candidatos finales para cada categoría histológica identificada en este análisis adicional.

T l 1 : r i i n l r ín m r l ifi n rí hi l i

continuación

Los modelos finales se construyeron usando una combinación de selección de características usando un ABC y/o función de coste de sensibilidad especificidad y el conjunto mínimo de características que dieran como resultado un rendimiento similar (pico -1se). Las Figuras 29 a 32 muestran el progreso de búsqueda del algoritmo de selección de características. Usando el ABC como métrica de coste (es decir, de rendimiento), las características/biomarcadores se añaden secuencialmente de acuerdo con qué marcadoradicionalda como resultado el mayor aumento de rendimiento. Los puntos en los gráficos de cajas (izquierda) representan combinaciones específicas de ejecuciones/veces del algoritmo de búsqueda. El panel derecho muestra los mismos datos con intervalos de confianza del 95 % basados en el ABC medio por característica. El punto/caja roja representa el modelo con ABC máximo y el verde oscuro y claro representan 1 y 2 errores típicos desde el máximo, respectivamente. Un error típico desde el máximo se considera generalmente el modelo más parsimonioso (es decir, menos complejo) de "mejor" rendimiento.

Basándose en los resultados de selección de características, se seleccionaron los siguientes marcadores para los modelos para la condición respectiva.

• Esteatosis: ACY1

• Inflamación lobular: COLEC11, CSF1R

• Balonización de hepatocitos: ITGA1/ITGB1, COLEC11, SERPINC1, LGALS3BP

• Fibrosis: C7, THBS2, KYNU, SERPINA7.

Ejemplo 10. Modelo de EHNA en adultos de NIH

La especificación de los modelos bayesianos ingenuos se generó durante la fase de descubrimiento de los datos iniciales de los NIH para adultos en cada una de las siguientes condiciones de enfermedad: esteatosis, inflamación lobular, balonización y fibrosis. A continuación se muestran los parámetros completos del modelo bayesiano ingenuo junto con una descripción de cómo calcular las probabilidades posteriores normalizadas (y las predicciones de clase) dada una muestra desconocida con mediciones de analitos transformados con log-io(UFR) para cada característica.

Los modelos bayesianos ingenuos contienen parámetros2pk+ k, dondekes el número de clases,pes el número de características/proteínas; una media (p) y una desviación típica (a) para cada combinación proteína*clase, más el previo específico de clase, que se determinó por la prevalencia de clase de entrenamiento (es decir, unano informativaanterior). Los modelos bayesianos ingenuos suponen densidades gaussianas y se calculan mediante la función de densidad de probabilidad (PDF) dados los parámetros específicos de clase p y a:

Usando esta ecuación (1), una muestra desconocida con mediciones de proteínas transformadas (UFR) porplog-io(x =xi, ..., xp)y k = 2 clases (enfermedad y control), puede clasificarse mediante la ecuación (2):

Las probabilidades posteriores normalizadas (Pr) se obtuvieron calculando la proporción específica de cada clase en la densidad total, por ejemplo:

P(control|proteínas)

pr(control\proteínas) p (cont ro i|proteínas) P(enfermedad|proteínas)’

P(enfermedad \proteínas)

Pr(enfermedad\proteínas) =

P(control \proteínas) — P(enfermedad \protemas)

y la predicción de clase se realizó mediante un corte de decisión determinado de acuerdo con la distancia perpendicular máxima de la curva ROC a la línea unitaria.

La Tabla 17 muestra el mapeo entre los identificadores de genes y los nombres de proteínas utilizados en el análisis.

Modelo bayesiano ingenuo de esteatosis

C ía s i f ie a d o r bayos i.a no i ngonuo ro b u s to p a ra p ro d i c t.o ro s d is c r e to s

1.1 a na da :

ro b u s to .b a y o s ia n c irg o n u o -p ro d o te rm in a d o(xlo q .d a to s , y c o n ju n to de d a lo s$ R e sp u e s ta )

P ro b a b il id a d e s a p r i o r i :

c o n ju n to de d a to s$P osp ue s ta

c o n t r o l e s le a to s is

0 ,14315 0 ,85185

Densidades condicionales:

A C Y 1 ,3343.1.4

c o n t r o l mu 3 ,82550

es coa Los ismu 4 ,18191

c o n t r o l_ s ig m a 0 ,23774

o s te n to s is s ¡ q'iia 0 ,28751

Para clasificar una muestra desconocida con mediciones de UFR de proteínas:x i = logvo(ACY1.3343.1.4), se calculó lo siguiente:

0,85185

1 - ( * ! - (3,18191))2

P(control|x1) = expx 0,14815

^ 2 ^ (0 ,23774 )^ ^ V 2(0,23774)2

P(esteatosis|x1)

Pr(esíeaíosís) =

P(esteatosis|x1)+P(control|x1)

donde el umbral de decisión (corte) para la clase esteatosis esPr(esteatosis)> 0,86153.

Modelo de Bayes ingenuo de inflamación lobular

C las i f ¡ c a d o r b e y e s ja n o in g e n u a r o b u s to p a ra p r e d í c t o r e s d is c r e t o s

L la m a d a :

r o b u s to , b ayo s i a no i rg e n u o .p rc d o r .e rn r . nado y - c o n ju n to

P r o b a b i l id

c o n ju n to d

control

0,75421 0,24579

D e n s id a d e s c o n d ic io n a le s :

COLEGI1 4430 44.3 CSF1R.2638.12.2

control_mu 3,73339 2,71638

i n í ic u r t io b mu4,00075 2,33843

c o n t r o l_ s ig m a0,17571 0,10198

i n f l a n l o b s iq m a0,25238 0,09696

Para clasificar una muestra desconocida con mediciones de UFR de proteínas:x i =logio(COLEC11.4430.44.3), and X<2>= log10(CSF1R.2638.12.2), se calculó lo siguiente:

- ( x 1— (4,00075))2

P(infiam iob|x1,x2)<1>

expx

72^(0,25238)2 2(0,25238)2

1—(x843))2

exp<2>- (2,83

x 0,24579 72^(0,09696)2 2(0,09696)2

donde el umbral de decisión (corte) para la clase de inflamación lobular esPr(inflamlob) >0,22539.

Modelo bayesiano ingenuo de balonización

C-nsificador bayesi.anaingenuorobustopara predistores discretos :

T, I amada:

robusto.nayesiano.ingemio.predeterminado (x- :03 .dates, y conjunto de datos$Respuesta)

Probabilidades a priori:: ' ■conjuntodo datos^Respuestaccontrol ha.o.n¡7,ac;ión :■

i

0,67912 0,42088

Henalcadescortdiclonaers:

ITGAl. ITGBl.3503.4.2 C0LEC11.4430.44.3 SEftPIHCl.3344.80.4 LGALS33P.5000.52.1 control urn 3,01777 3,70799 4,720819 .3,05858 balonización mu 3,29517 3,95848 4,663504 3,'5268 c’Jütrol_sigEna 0,17479 0,15080 0,094592 0,13341 balonización si-qma. 0,27017 0,28850 0,087817 0 ,13401 :Para clasificar una muestra desconocida con mediciones de UFR de proteínas:x i= log10(ITGA1.ITGB1.3503.4.2), X<2>= logi0(COLEC11.4430.44.3), x3 = log10(SERPINC1.3344.60.4), andX4= log10(LGALS3BP.5000.52.1), se calculó lo siguiente:

—(x<4>- (3,05858))2\

7e x p l \ -)x 0,57912<2rc(0,13341)2' ” r V 2(0,13341)2>

P(balonización\ x1,...,x4)

Pr(balonización) = ■

P(balonización\x<4>, ...,x<4>)P(control\x<4>,...,x<4>)

donde el umbral de decisión (corte) para la clase de balonización esPr(balonización) >0,3151.

Modelo bayesiano ingenuo de fibrosis

Clasificador bayesiano ingenuo robusto para prediolores discretos

I I añada:

ro b u sta ; .b a y o s i a n o i n q e u i.o . p tredét.erm in a d o (x ~ I oq .d a t o s , y • e o n j u r t .o d o d a l o s

$ R o sp u o sL a )

P r o b a b i l i d a d e s a p r i o r i :

c o n j u n t o d e d a t o s S P e s p u e s t a

c o n tro l f ib r o s is

0 ,66002 0 ,33100

bons.i.dadosadíe;ionatos:

C 7.2888.49.2 T H E S 2.3339.3 o .1 KYNU.4659.64.2 3E R P IIÍA 7.2706.69.2c o n t .r o l_ m u .3 ,414743 3 ,0136 3 ,20911 4 ,731746f i b r o s i s_ m u3 ,504044 3 ,3116 3 ,45485 4 ,772775coütrol_sigm a0 ,089359 0,1.451 0 ,17464 0 , 050306f ib r o s i s s ig n a0 , 1.38501 0 ,2366 0 ,25642 0 , 056368 Para clasificar una muestra desconocida con mediciones de UFR de proteínas:x i= logio(C7.2888.49.2), X<2>= log1ü(THBS2.3339.33.1), x3 =lo g ^ K YNU.4559.64.2), andX4=logv3(SERPINA7.2706.69.2),se calculó lo siguiente:

P(fibrosis\x<4>,...,x<4>)

Pr(fibrosis)

P(fibrosis\x<4>, ...,x<4>)P(control\x<4>,...,x<4>)

donde el umbral de decisión (corte) para la clase de fibrosis esPr(fibrosis)> 0,31707.

Ejemplo 11. Clasificadores bayesiano ingenuo

El objetivo general es usar un marco de modelización probabilística para predecir la clase de una muestra desconocida. Dichos modelos matemáticos, o clasificadores, se basan en los datos de entrenamiento y se construyen (es decir, ajuste de modelo) con el fin de hacer predicciones de clase sobre la muestra desconocida. Con este fin, el Teorema de Bayes puede generalizarse a la forma:

Probabilidad posterior =Probabil idad(da tos)x A n ter ior

Evidencia(1)

y después se escriben en términos de probabilidades,

Piresultado | datos) =P(dat0S¡ resultaâ Kresultaao)(<2>)

donde el términoP(datos)es una constante normalizadora que es independiente del resultado, y con frecuencia se ignora si se desean posterioresrelativossobre posterioresabsolutos.La ecuación (2) se simplifica entonces a,

P(resultado|datos) x P(datos|resultado) x P(resultado)(3)

Bayes ingenuo en la práctica

Consideremos un ejemplo en el que las mediciones proteómicas, suponiendo que tienen distribuciones gaussianas (es decir, normales), se toman de un individuo y la probabilidad posterior de interés es si ese individuo pertenece a uno dekposibles resultados/clases. Por ejemplo, si hayk= 2 clases posibles, enfermedad o control (es decir, un clasificadorbinario),esto puede reescribirse como:

P(control|UFR de proteína) = P(UFR de proteina|control) x P(control), P(enfermedad | UFR de proteína) = P(UFR de proteina | enfermedad) x P(enfermedad),Si haypproteínas que ingenuamente se supone que son independientes, se pueden multiplicar sus probabilidades individuales para obtener una probabilidad acumulada. Para la enfermedad posterior esto proporciona:

P(control | UFR de proteínas) = P(prot1 | control) x P(prot2 | control) x... xP(protp | control) x = P(control),P(enfermedad | UFR s de proteína) = P(prot1|enfermedad) x P(prot2 | enfermedad) x... xP{jprotp|enfermedad) x = P(enfermedad),

Los modelos bayesianos ingenuos contienen parámetros2pk+ k, dondekes el número de clases,pes el número de características/proteínas; una media (|j) y una desviación típica (a) para cada combinación proteína x clase, más el previo específico de clase, que con frecuencia se determina por las proporciones de clase de entrenamiento (es decir, unano informativaanterior). Los modelos bayesianos ingenuos suponen densidades gaussianas y se calculan mediante la función de densidad de probabilidad (PDF) dados los parámetros específicos de clase j y a:

Para clasificar una muestra desconocida con mediciones de proteínas p(x = xi,...,xp)y k clases, calcular lo siguiente:

El resultado de la ecuación (5) en este Ejemplo proporciona unadensidadde probabilidad para cada clase, que no se restringe en el intervalo [0, 1]. Las probabilidades posteriores normalizadas (Pr) se obtienen calculando la proporción específica de cada clase de la densidad total,

Cálculo de ejemplo

Considerar un ejemplo de biomarcador/característica de clase k = 2 (enfermedad frente a control) yp = 2,con2pk k =10 parámetros:

Tabla 18: Un modelo bayesiano ingenuo de 2 marcadores/proteína. Subíndices para control/enfermedad.

Parámetros del modelo Control Enfermedad

Muestras de entrenamiento 224 73

Proteína 1(p.c, p.d)3,73389 4,00075

Proteína 1 (ád, ád) 0,17571 0,25238

Proteína 2((p.c,/id) 2,71638 2,83843

Proteína 2(8c,ád) 0,10198 0,09696

Tabla 19: 5 muestras desconocidas con 2 mediciones de proteínas (UFR) cada una (log<10>-transforma ____________________ Gaussiana).____________________

Muestra Prot1 Prot1 (/og<1>ü) Prot2 Prot2 (/og<1>ü)

1 6208,8 3,79301 397,5 2,59934

2 2917,2 3,46497 504,8 2,70312

3 5856,7 3,76765 526,3 2,72123

4 12510,8 4,09729 712,9 2,85303

5 11929,3 4,07661 697,8 2,84373

Para la Muestra 1 anterior, las densidades de probabilidad condicionales posteriores ingenuas de Bayes se calculan usando la ecuación (5) de este Ejemplo de la siguiente manera:

Densidad posterior de control:

P(control|x1= 3,79301,x2 = 2,59934) =P(x1= 3,793011control)x

P(x2= 2,59934 |control) x

P(control)

=P(xí= 3,793011v c= 3,73389, ffc = 0,17571) xP(x2= 2.59934 |vc= 2,71638,ac= 0,10198) x (224 /224 73))

= 2,14546x2,02464x0,75421

= 3,27613

Densidad posterior de la enfermedad:

P(enfermedad|x1= 3,79301,x2 = 2,59934) =P(x1= 3,793011enfermedad)x

P(x2= 2,59934 |enfermedad)xP(enfermedad)

=P(x1= 3,793011Va= 4,00075,ad= 0,25238) xP(x2= 2,59934 |Vd= 2,83843,ad= 0,09696) x ( 73 / 224 73))

= 1,1265 x 0,19677 x 0,24579

= 0,05448

Probabilidades posteriores normalizadas: A partir de la ecuación (6) de este Ejemplo, la proporción relativa de cada densidad es:

3,27613

Pr

v(control

||

) 0,05448^

3,„

2„

76„

1„

3= 0,

,98364

0,05448

Príenfermedad|x) = „ „ = 0,01636

y J| ) 0,05448 3,27613 ,

La Figura 33A/B representa las densidades de probabilidad específicas de clase (enfermedad frente a control) a partir de los datos de entrenamiento y la línea discontinua vertical muestra los valores de medición de la Muestra 1 para las proteínas 1 y 2, respectivamente. La Figura 34A/B muestra los gráficos bivariantes de las 2 proteínas, donde B muestrael límite de decisión entre enfermedad y control con las posiciones de las 5 muestras desconocidas identificadas con una X.

Tabla 20: Probabilidades posteriores normalizadas para 5 muestras desconocidas. La predicción de clase de enfermedad se basa en un corte de decisión de Pr(enfermedad) > 0,5 (véanse también las Fig. 34A-34B).

Muestra Pr(control) Pr(enfermedad) Predicción de clase

1 0,98364 0,01636 control

2 0,97012 0,02988 control

3 0,92891 0,07109 control

4 0,17962 0,82038 enfermedad

5 0,23105 0,76895 enfermedad

Las realizaciones y los ejemplos anteriores se ofrecen únicamente a título de ejemplo. Ninguna realización, ejemplo o elemento particular de una realización o ejemplo particular debe interpretarse como un elemento o característica crítico, requerido o esencial de cualquiera de las reivindicaciones. Pueden realizarse diversas alteraciones, modificaciones, pueden realizarse sustituciones y otras variaciones a las realizaciones desveladas sin apartarse del alcance de la presente solicitud, que se define en las reivindicaciones adjuntas. La memoria descriptiva, incluyendo las figuras y los ejemplos, ha de considerarse de manera ilustrativa, en lugar de una restrictiva, y todas dichas modificaciones y sustituciones tienen por objeto incluirse en el ámbito de la solicitud. Las etapas descritas en cualquiera de las reivindicaciones de método o proceso pueden ejecutarse en cualquier orden posible y no se limitan a un orden presentado en cualquiera de las realizaciones, los ejemplos o las reivindicaciones. Además, en cualquiera de los métodos anteriores, uno o más biomarcadores específicamente enumerados pueden excluirse específicamente como biomarcador individual o como biomarcador de cualquier panel.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar si un sujeto tiene la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que comprende detectar el nivel de ITGA1/ITGB1 en una muestra del sujeto, en donde un nivel de ITGA1/ITGB1 que es superior a un nivel de control indica que el sujeto tiene EHGNA, y en donde detectar el nivel de ITGA1/IGTB1 comprende la detección de ITGA1 y/o iTg B1, y/o un complejo de ITGA1 e ITGB1,

el método comprende además detectar el nivel de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete biomarcadores seleccionados de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR y THBS2, en una muestra del sujeto, en donde un nivel de al menos un biomarcador seleccionado de ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, kYn U, POR y THBS2 que es superior a un nivel de control del biomarcador respectivo, indica que el sujeto tiene EHGNA, y

en donde la muestra es una muestra de sangre, una muestra de suero o una muestra de plasma.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende detectar los niveles de ITGA1/ITGB1, ACY1, COLEC11 y THBS2 y detectar además el nivel de HSP90AA1/HSP90AB1.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además determinar el nivel de AST en el sujeto, en donde un nivel elevado de AST indica que el sujeto tiene EHGNA.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto está en riesgo de desarrollar EHGNA.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto es obeso.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde cada biomarcador es un biomarcador proteico.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende poner en contacto biomarcadores de la muestra del sujeto con un conjunto de reactivos de captura de biomarcadores, en donde cada reactivo de captura de biomarcadores del conjunto de reactivos de captura de biomarcadores se une específicamente a un biomarcador diferente que se está detectando.

8. El método de la reivindicación 7, en donde cada reactivo de captura de biomarcadores es un anticuerpo o un aptámero.

9. El método de la reivindicación 8, en donde cada reactivo de captura de biomarcadores es un aptámero.

10. El método de la reivindicación 9, en donde al menos un aptámero es un aptámero de velocidad de disociación baja que se une a su proteína diana con una velocidad de disociación (t1^ ) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos o > 240 minutos.