ES3017796T3 - Il-17f-specific capture agents and methods of using - Google Patents

Abstract

La presente solicitud proporciona agentes de captura de IL-17F estables basados en péptidos y métodos para su uso como agentes de detección. La solicitud también proporciona métodos para la fabricación de agentes de captura de IL-17F. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes de captura específicos de la IL-17F y métodos de uso

Antecedentes

La interleucina-17 humana (la IL-17A) es una citocina proinflamatoria secretada por células T activadas. La IL-17A es un objetivo validado para el tratamiento de la psoriasis en placas grave. Hay seis citocinas homodiméricas diferentes (la IL-17A-F) y el heterodímero la IL-17A/F en la familia de citocinas<i>L-17. La IL-17F es el homólogo más cercano a la IL-17A y es 50 % idéntico en secuencia. La IL-17A y la IL-17F se secretan como homodímeros unidos por disulfuro (32-38 kDa) y como heterodímero covalente la IL-17A/F (40-45 kDa). Al igual que la IL-17A, la IL-17F activa células inmunes y no inmunes para inducir mediadores proinflamatorios. Estos mediadores pueden inducir el reclutamiento de neutrófilos en focos inflamatorios, promover la destrucción local de tejidos, inducir la neovascularización en tumores, potenciar la osteoclastogénesis y proteger de la infección por patógenos, lo que se traduce en el desarrollo de enfermedades y la protección del huésped.

La IL-17A es una diana validada para el tratamiento de la psoriasis en placas grave. El enfoque actual consiste en bloquear la interacción de la IL-17a con su receptor en la superficie celular neutralizando la IL-17A circulante. Esto se realiza principalmente a través de anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos.

Los miembros de la familia de citocinas IL-17 median sus efectos a través de la unión a la familia de receptores IL-17, de la cual hay cinco miembros relacionados (la IL-17RA-IL-17RE). Tanto la IL-17A como la IL-17F se unen como homodímeros o heterodímeros al complejo receptor heterodimérico formado entre la IL-17RA y la IL-17RC. Si bien la actividad de la IL-17F parece estar relacionada con la de la IL-17A, la potencia difiere, lo que es consistente con las diferencias en las afinidades de unión del receptor.

Debido a su papel en la inmunidad y las enfermedades inmunomediadas, la IL-17A y la IL-17F se han convertido en un área de interés en el desarrollo de fármacos terapéuticos. La abundancia natural muy baja de la IL-17A y la IL-17A/F circulantes ha sido un desafío para la detección de estos biomarcadores mediante inmunoensayos sándwich tradicionales. La detección altamente sensible de los niveles circulantes de cada homodímero (IL17A, la IL-17F), así como del heterodímero la IL-17A/F, sería informativa para comprender la participación de cada citocina a lo largo de la enfermedad y el tratamiento.

El documento US 2011/263515 se refiere a agentes de captura y divulga agentes de captura multiligando que comprenden dos o más ligandos.

Millward et al. (Química de clic in situ: desde el descubrimiento de moléculas pequeñas hasta anticuerpos sintéticos) se refiere a la química iterativa de péptidos por clic in situ (IPISC) y divulga avances recientes en el diseño de ligandos mediante IPISC y enfoques afines. Coppock et al. (Agentes de captura de proteínas basados en péptidos con alta afinidad, selectividad y estabilidad como reemplazos de anticuerpos en ensayos de biodetección) se relaciona con agentes de captura de proteínas basados en péptidos y divulga un agente de captura catalizado por proteínas en desarrollo.

El documento US 2015/132314 se relaciona con anticuerpos anti-IL-17F y divulga anticuerpos monoclonales completamente humanos que reconocen la IL-17F pero no reconocen la IL-17A.

El documento US 2006/153839 se refiere a una molécula biespecífica y divulga una molécula biespecífica que comprende una primera fracción de unión de reconocimiento que se une a un receptor tipo Cab reticulado mediante un enlazador de poli(etilenglicol) ("PEG") con una o más segundas fracciones de unión de reconocimiento que se unen a una molécula.

Zhang et al. (Estructura y función de las citocinas de la familia de la interleucina-17) se relaciona con las citocinas de la familia de la interleucina-17 y revela el avance en la comprensión de la estructura y función de las citocinas de la familia IL-17.

Sumario

La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona exclusivamente con fines informativos.

La presente divulgación se refiere a agentes de captura sintetizados químicamente (llamados agentes de captura catalizados por proteínas o agentes PCC) que están diseñados para unirse para detectar interleucina 17F (la IL-17F), métodos para producir dichos agentes de captura utilizando química de clicin situiterativa, métodos para utilizar dichos agentes de captura para detectar la IL-17F y ensayos que emplean dichos métodos.

En un aspecto, se proporciona en el presente documento un agente de captura sintético estable que se une específicamente a la IL-17F. El agente de captura comprende dos ligandos unidos por un enlazador. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una composición que comprende uno o más agentes de captura sintéticos, como se describe en el presente documento, que se unen específicamente a la IL-17F. Según ciertas realizaciones, el agente de captura se une a la IL-17F con una mayor afinidad que la IL-17A. Según ciertas realizaciones, el agente de captura se une a la IL-17F con al menos 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100 o 1.000 veces más afinidad que la IL-17A.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un agente de captura sintético estable que se une específicamente a la IL-17F, en donde el agente de captura comprende un primer ligando que tiene afinidad por un primer epítopo en la IL-17F, un segundo ligando que tiene afinidad por un segundo epítopo en la IL-17F y un conector que conecta covalentemente el primer ligando al segundo ligando. En particular, el primer ligando se une al primer epítopo (o una versión sintética del mismo) de forma aislada y el segundo ligando se une al segundo epítopo (o una versión sintética del mismo) de forma aislada. En el agente de captura, el primer ligando y el segundo ligando se unen cooperativamente al primer y segundo epítopos de IL-17F, respectivamente.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para detectar la IL-17F en una muestra biológica, que comprende la etapa de poner en contacto la muestra biológica con uno o más agentes de captura descritos aquí.

Ligando de anclaje

El agente de captura comprende dos ligandos que se unen específicamente a la IL-17F en dos epítopos distintos. Estos ligandos de anclaje (a veces denominados en el presente documento simplemente "ligandos") pueden entonces unirse entre sí mediante un enlazador que proporciona una mayor afinidad por la IL-17F. Hay un primer ligando y un segundo ligando que se unen a un primer epítopo y un segundo epítopo, respectivamente.

El primer epítopo comprende la secuencia de aminoácidos de FFQKPES (SEQ ID NO:1) o FFQKPESCPPVPGG (s Eq ID NO:2). En ciertas realizaciones, el primer epítopo tiene entre 7 y 20 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, el primer epítopo tiene entre 7 y 13 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, el primer epítopo tiene como máximo 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos de longitud.

El segundo epítopo comprende la secuencia de aminoácidos de NENQRVS (SEQ ID NO:3) o GIINENQRVS (SEQ ID NO:4). En ciertas realizaciones, el primer epítopo tiene entre 7 y 20 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, el primer epítopo tiene entre 7 y 10 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, el primer epítopo tiene como máximo 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos de longitud.

El primer ligando comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre FYKTH (SEQ ID NO:5), FYKQH (SEQ ID NO:6), FYLTH (SEQ ID NO:7), FYLQH (SEQ ID NO:8), RRATS (SEQ ID NO:9) y RRAQS (SEQ ID NO:10). Según ciertas realizaciones, el primer ligando comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre RRATS (SEQ ID NO: 9) y RRAq S (SEQ ID NO: 10). El primer ligando es cíclico. En ciertas realizaciones, el primer ligando comprende un residuo 1,4-sustituido-1,2,3-triazol (Tz4) o un residuo 1,5-sustituido-1,2,3-triazol (Tz5).

El segundo ligando comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre KYGEV (SEQ ID NO:11), LYGEV (SEQ ID NO:12), VHKSG (SEQ ID NO:13), VHLSG (SEQ ID NO:14), QKHGP (SEQ ID NO:15), TKHGP (SEQ ID NO:16), QLHGP (SEQ ID NO:17), TLHGP (SEQ ID NO:18), YDLQR (SEQ ID NO:19), YDLTR (SEQ ID NO:20), YDKQR (SEQ ID NO:21), YDKTR (SEQ ID NO:22), KKGWP (SEQ ID NO:23), KLGWP (SEQ ID NO:24), LKGWP (SEQ ID NO:25), LLGWP (SEQ ID NO:26), RSYNL (SEQ ID NO:27), y RSYNK (SEQ ID NO:28). Según ciertas realizaciones, el primer ligando comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre TKHGP (SEQ ID NO: 16), QKHGP (SEQ ID NO: 15), KKGWP (SEQ ID NO: 23) y RSYNK (SEQ ID NO: 28). El primer ligando es cíclico. En ciertas realizaciones, el primer ligando comprende un residuo 1,4-sustituido-1,2,3-triazol (Tz4) o un residuo 1,5-sustituido-1,2,3-triazol (Tz5).

Según ciertas realizaciones, el primer ligando comprende la secuencia RRATS (SEQ ID NO: 9) y el segundo ligando comprende la secuencia QKHGP (SEQ ID NO: 15). En otras realizaciones, el primer ligando comprende la secuencia RRATS (SEQ ID NO: 9) y el segundo ligando comprende la secuencia RSYNK (SEQ ID NO: 28). En otras realizaciones, el primer y segundo ligando son cíclicos y comprenden un residuo Tz4.

Enlazador

El agente de captura comprende además un enlazador que une tanto al primer como al segundo ligando. Según ciertas realizaciones, la longitud del enlazador corresponde a la distancia entre el primer epítopo y el segundo epítopo. La longitud del enlazador debe ser al menos la distancia entre el primer y el segundo epítopo. En ciertas realizaciones, el enlazador es más largo que la distancia entre el primer y el segundo epítopos. Según ciertas realizaciones, el enlazador es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % más largo que la distancia entre el primer y el segundo epítopos.

El enlazador tiene una longitud de ~8,8 A a ~26,4 A o ~7 A a ~15 A. En ciertas realizaciones, la longitud del enlazador es ~15 A.

En otras realizaciones, el enlazador comprende una o más unidades repetidas de etilenglicol. En algunas realizaciones, el enlazador es PEG<1>, PEG<2>, PEG<3>, PEG<4>o PEG<5>. En otras realizaciones, el enlazador comprende un péptido. En otras realizaciones, el enlazador comprende un aminoácido. En una realización particular, el enlazador es glicina. En otras realizaciones, el enlazador comprende una fracción de alquileno, en donde la fracción de alquileno está opcionalmente sustituida con una o más fracciones proporcionadas en el presente documento.

Enlace triazol

En una realización del agente de captura, el ligando de anclaje y el ligando secundario están unidos a través de un residuo 1,4-sustituido-1,2,3-triazol (Tz4). En otra realización, el ligando secundario y el ligando terciario están unidos entre sí a través de un residuo de 1,2,3-triazol sustituido en 1,4 (Tz4). En otra realización más, el ligando terciario y el ligando cuaternario están unidos a través de un residuo 1,4-sustituido-1,2,3-triazol (Tz4). En otra realización más, el ligando de anclaje y el ligando secundario están unidos a través de un residuo 1,4-sustituido-1.2.3- triazol, y el ligando secundario y el ligando terciario están unidos a través de un residuo 1,4-sustituido-1,2,3-triazol. En otra realización más, el ligando ancla y el ligando secundario están unidos mediante un residuo 1,4-sustituido-1,2,3-triazol, el ligando secundario y el ligando terciario están unidos mediante un residuo 1,4-sustituido-1.2.3- triazol y el ligando terciario y el ligando cuarternario están unidos mediante un residuo 1,4-sustituido-1,2,3-triazol.

Agentes de captura

Según ciertas realizaciones, el agente de captura tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:

Según ciertas realizaciones, el agente de captura tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:

y

Propiedades

En ciertas realizaciones, los agentes de captura de IL-17F proporcionados en el presente documento son estables a través de una amplia gama de temperaturas, valores de pH, tiempos de almacenamiento, condiciones de almacenamiento y condiciones de reacción, y en ciertas realizaciones los agentes de captura son más estables que un anticuerpo o biológico comparable. En ciertas realizaciones, los agentes de captura son estables en el almacenamiento como un polvo liofilizado. En ciertas realizaciones, los agentes de captura son estables en almacenamiento a una temperatura de aproximadamente -80 °C a aproximadamente 60 °C. En ciertas realizaciones, los agentes de captura son estables a temperatura ambiente. En ciertas realizaciones, los agentes de captura son estables en suero humano durante al menos 24 horas. En ciertas realizaciones, los agentes de captura son estables a un pH en el rango de aproximadamente 3 a aproximadamente 12. En ciertas realizaciones, los agentes de captura son estables en forma de polvo durante dos meses a una temperatura de aproximadamente 60 °C.

Etiquetas detectables

En algunas realizaciones, el agente de captura está marcado con una etiqueta seleccionada del grupo que consiste en biotina, cobre-DOTA, biotina-PEG3, aminooxiacetato, 19FB, 18FB y FITC-PEG3. En otras realizaciones, el agente de captura está marcado con la fracción detectable que consiste en 64Cu DOTA, 68Ga DOTA, 18F, 64Cu, 68Ga, 89Zr, 124I, 86Y, 94mTc, 110mIn, 11C y 76Br. En otras realizaciones, la etiqueta es una etiqueta fluorescente. En una realización particular, la etiqueta detectable es 18F.

Procedimientos y usos

Como se utilizan en el presente documento, los términos "agente de captura de la invención", o "agentes de captura de la invención" se refieren a agentes de captura catalizados por proteínas sintéticas que se unen a la IL-17F, como se describe en el presente documento.

También se proporciona un método para detectar la IL-17F en un sujeto, que comprende la etapa de poner en contacto una muestra biológica del sujeto con uno o más agentes de captura de la invención. También se proporciona el uso de uno o más agentes de captura de la invención para la detección de la IL-17F en un sujeto. También se proporciona un método para detectar IL-17F en una muestra biológica utilizando un inmunoensayo, en donde el inmunoensayo utiliza un agente de captura como se describe en el presente documento, y en donde dicho agente de captura reemplaza a un anticuerpo o su equivalente en el inmunoensayo. En ciertas realizaciones, se proporcionan métodos para identificar, detectar, cuantificar o separar la IL-17F en una muestra biológica utilizando los agentes de captura como se describe en el presente documento. En una realización del método, el inmunoensayo se selecciona del grupo de Western blot, ensayo pull-down, dot blot y ELISA.

También se proporciona un método para detectar la presencia de la IL-17F en un sujeto humano o mamífero, comprendiendo el método las etapas de:

a) administrar a una muestra biológica del sujeto uno o más agentes de captura de la invención, en donde cada agente de captura está unido a una fracción detectable; y

b) detectar la fracción ligada a cada agente de captura en el sujeto; en donde la detección de la fracción indica la presencia de la IL-17F en el sujeto.

También se proporciona en el presente documento un método para detectar la IL-17F en una muestra que comprende:

a) exponer la muestra a uno o más agentes de captura de la invención, en donde cada agente de captura está unido a una fracción detectable;

b) la unión de la IL-17F en la muestra biológica a un agente de captura y

b) detectar la fracción ligada a cada agente de captura en el sustrato; en donde la detección de la fracción en el sustrato detecta la IL-17F en la muestra.

Kits

En ciertas realizaciones se proporcionan en el presente documento kits que comprenden uno o más agentes de captura de la invención. En ciertas realizaciones, estos kits se pueden utilizar para identificar, detectar, cuantificar y/o separar la IL-17F, y en ciertas realizaciones los kits se pueden utilizar en el diagnóstico y/o estadificación de una afección asociada con la presencia de la IL-17F. En ciertas realizaciones, un kit como se proporciona en el presente documento comprende: (a) un sustrato que comprende un adsorbente sobre él, en donde el adsorbente es adecuado para unirse a la IL-17F, y (b) una solución de lavado o instrucciones para preparar una solución de lavado, en donde la combinación del adsorbente y la solución de lavado permite la detección de la IL-17F. En otras realizaciones, los kits proporcionados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de una afección asociada con la presencia de la IL-17F.

En ciertas realizaciones, un kit puede comprender además instrucciones para parámetros operativos adecuados en forma de una etiqueta o un inserto separado. Por ejemplo, el kit puede tener instrucciones estándar que informen al consumidor/usuario del kit cómo lavar la sonda después de que una muestra de plasma u otra muestra de tejido entre en contacto con la sonda.

En ciertas realizaciones, un kit comprende (a) uno o más agentes de captura que se unen específicamente a la IL-17F; y (b) un reactivo de detección. Dichos kits pueden prepararse a partir de los materiales descritos en el presente documento.

Los kits proporcionados en el presente documento pueden comprender opcionalmente una información estándar o de control, y/o una cantidad de control de material, de modo que la muestra de ensayo pueda compararse con la información estándar de control y/o la cantidad de control para determinar si la cantidad de ensayo de IL-17F detectada en una muestra es una cantidad coherente con el diagnóstico de una afección particular.

Síntesis de agentes de captura

Se proporcionan en el presente documento métodos para elaborar (es decir, sintetizar) agentes de captura específicos de la IL-17F de la invención. En una realización, el método comprende las etapas de:

a. seleccionar un primer ligando que se una a un primer epítopo en la proteína objetivo,

b. seleccionar un segundo ligando que se una a un segundo epítopo en la proteína objetivo,

c. seleccionar un enlazador que tenga una longitud que permita al enlazador unirse tanto al primer ligando como al segundo ligando cuando tanto el primer ligando como el segundo ligando se unen específicamente al primer epítopo y al segundo epítopo, respectivamente, y

d. unir el enlazador al primer y segundo ligando, produciendo así el agente de captura sintético que se une específicamente a la proteína objetivo.

En ciertas realizaciones, los ligandos se identifican utilizando las siguientes etapas:

1) una limpieza previa para eliminar los aglutinantes inespecíficos,

2) un cribado de productos para identificar los éxitos resultantes de la química clicin situbasada en epítopos,

3) un cribado de dianas contra la proteína IL-17F marcada con His, y

4) otro cribado de dianas frente a la proteína IL-17F marcada con His en suero humano al 2 % (v/v) para identificar péptidos cuya unión a IL-17F no se vea alterada por las proteínas séricas.

En ciertas realizaciones, el primer epítopo y el segundo epítopo están de ~4,4 A a ~26,4 A, de ~8,8 A a ~26,4 A o de ~7 A a ~15 A o ~15 A de distancia entre sí. En algunas realizaciones, el enlazador es más largo que la distancia entre el primer y el segundo epítopo. Opcionalmente, el enlazador es 10-50 %, 5-25 % o 1-10 % más largo que la distancia entre el primer y el segundo epítopo.

En ciertas realizaciones, el agente de captura tiene una afinidad de unión a la proteína diana mayor que cualquiera de los ligandos. En algunas realizaciones, el agente de captura tiene una afinidad de unión que es al menos el 50, 75 o 90 % de la afinidad de unión de un aglutinante cooperativo completo. En otras realizaciones, el agente de captura tiene una afinidad de unión que es al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % de la afinidad de unión de un aglutinante cooperativo completo.

En ciertas realizaciones, la proteína diana es un epítopo sintético, en donde el epítopo sintético comprende al menos una secuencia de 20 aminoácidos de una proteína de longitud completa, en donde al menos un aminoácido del epítopo sintético comprende un grupo azida o acetileno. En algunas realizaciones, el epítopo sintético es una secuencia de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos de una proteína de longitud completa. En algunas realizaciones, al menos dos aminoácidos del epítopo sintético comprenden un grupo azida o acetileno. En otras realizaciones, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos del epítopo sintético comprenden un grupo azida o acetileno.

Según ciertas realizaciones, la proteína de longitud completa es una proteína natural. Según otras realizaciones, la proteína natural es IL-17.

Según ciertas realizaciones, el agente de captura une el epítopo sintético y la proteína de longitud completa con una afinidad de unión que es al menos el 50 % de la afinidad de unión de un aglutinante cooperativo completo. Según ciertas realizaciones, el agente de captura se une al epítopo sintético y a la proteína de longitud completa con una afinidad de unión que es al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % de la afinidad de unión de un aglutinante cooperativo completo.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1: Epítopos derivados de la proteína la IL-17F. Fig. 1A.Las diferencias de secuencia N-terminal se producen en las proteínas maduras que discriminan la IL-17F (SEQ ID NO:38) de la IL-17A (SEQ ID NO:37). Esta región de singularidad corresponde a Arg-31 a Thr-79 en la IL-17F.Fig. 1B.Secuencia del fragmento epítopo 1 diseñado que contiene un asidero de ensayo biotina-PEG3 y un asidero de clic de azida estratégicamente sustituido (C48Az4; Az4 = L-azidolisina), (Biotina-PEG3-FFQKPES(SEQ ID NO:1) [Az4]PPVPGGS) (SEQ ID NO:32).Fig.

1C.Secuencia del fragmento Epítopo 2 diseñado que contiene un control de ensayo de biotina-PEG3 y un asidero de clic de azida estratégicamente sustituido (I62Az4), (Biotin-PEG3-GI[Az4]NENQRVS) (SEQ ID NO:33).

FIG. 2: Caracterización in vitro de macrociclos desarrollados contra el epítopo 1 de la IL-17F. Fig. 2A.Las pruebas ELISA tipo sandwich para la proteína IL-17F humana frente a Cy(RRATS) (SEQ ID NO:9) y Cy(RRAQS) (SEQ ID NO:10) modificados con PEG3-biotina arrojan valores EC<50>de 66 a 52 nM. Un anticuerpo monoclonal biotinilado ensayado de forma similar (TA319597, Origene) muestra una afinidad de unión similar.FIG. 2B.Los ELISA puntuales para las proteínas la IL-17F y la IL-17A humanas contra los dos ligandos peptídicos macrocíclicos, Cy(RRATS) modificado con PEG3-biotina (SEQ ID NO:9) y Cy(RRAQS) (SEQ ID NO:10), demuestran una unión preferencial a la IL-17F.FIG. 2C.Espectro de masas de Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9)-PEG3-biotina.FIG.

2D.Espectro de masas de Cy(RRAQS) (SEQ ID NO:10)-PEG3-biotina.

FIG.3: Orientación de la unión del macrociclo al epítopo 1 de la IL-17F. FIG 3A.Los epítopos IL-17F marcados con His se sintetizaron para que contuvieran una codificación estratégica de las secuencias N-terminal o C-terminal a la ubicación del asidero de clic (C48S). 1) SEQ ID NO:39, 2) SEQ ID NO:40, 3) SEQ ID NO:41. Los residuos desordenados se muestran en cursiva.FIG. 3B.Los ELISA puntuales para los epítopos de IL-17F marcados con His contra los dos ligandos peptídicos macrocíclicos, Cy(RRATS) (Se Q ID NO:9) y Cy(RRAQS) (SEQ ID NO: 10) modificados con PEG3-biotina, demuestran una unión preferente a la secuencia FFQKPES (SEQ ID NO: 1).

FIG. 4: Caracterización in vitro de macrociclos desarrollados contra el epítopo 2 de IL-17F. FIG. 4A.Las pruebas ELISA tipo sandwich para la proteína IL-17F humana frente a Cy(QKHGP) (SEQ ID NO: 15), Cy(TKHGP) (SEQ ID NO: 16), Cy(KKGWP) (SEQ ID NO:23) y Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) modificados con PEGa-biotina arrojan valores EC<50>de 72 a 15 nM.FIG. 4B.Los ELISA puntuales para las proteínas IL-17F e IL-17A humanas frente a los cuatro ligandos peptídicos macrocíclicos, Cy(QKHGP) modificado con PEG3-biotina (SEQ ID NO: 15), Cy(TKHGP) (SEQ ID NO:16), Cy(KKGWP) (SEQ ID NO:23), y Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28), demuestran una unión preferente a la IL-17F.FIG. 4C.Los ELISA puntuales para las proteínas IL-17F e IL-17A humanas frente a los ligandos peptídicos macrocíclicos, RRATS (SEQ ID NO:9), RSYNK (SEQ ID NO:28), (QKHGP) (SEQ ID NO: 15), demuestran una unión preferente a la IL-17F o la IL-17A.

FIG. 5: Representaciones estructurales en 3-D del homodímero de IL-17F.Se superponen las secuencias de los epítopos1-2 de la IL-17F y macrociclos representativos dirigidos al epítopo (Tz = triazol). Las distancias (A) medidas entre los dos epítopos se muestran con líneas discontinuas.FIG. 5A.En la proteína monomérica IL-17F, la distancia entre la secuencia FFQKPES (SEQ ID NO: 1) (en IL-17F epítopo 1) y IL-17F epítopo 2, NENQRVS (SEQ ID NO:3) es de ~15 A. Utilizando un enlazador cuya longitud sea similar a la distancia entre los dos sitios de unión en la proteína, se puede sintetizar un biligando que contenga macrociclos dirigidos a cada uno de los dos epítopos de IL-17F.FIG. 5B.En la proteína IL-17F homodimérica, la distancia entre la secuencia FFQKPES (SEQ ID NO: 1) (en IL-17F epítopo 1) de un monómero y IL-17F epítopo 2, NENQRVS (SEQ ID NO:3) del otro monómero es de ~7 Á. Utilizando un enlazador cuya longitud sea similar a la distancia entre los dos sitios de unión que unen el dímero proteico, se puede sintetizar otro biligando que contenga macrociclos dirigidos a cada uno de los dos epítopos de IL-17F. Identificación PDB ID: 1JPY.

FIG. 6: Estructuras de candidatos a biligandos cooperativos con enlaces que oscilan entre 4,4 y 26,4 A para unir los dos macrociclos. FIG. 6A.Biotina-PEG3-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9)-Gly-Cy(QKHGP)(SEQ ID NO: 15) (Gly = 4,4 Á).FIG. 6B.Biotina-PEG3-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9)-PEG<1>-Cy(QKHGP)(SEQ ID NO: 15) (PEGi = 8,8 Á).FIG. 6C.Biotina-PEG3-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9)-PEG<2>-Cy(QKHGP)(SEQ ID NO: 15) (PEG<2>= 13,2 Á).FIG. 6D.Biotina-PEG3-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9)-PEG<3>-Cy(QKHGP)(SEQ ID NO: 15) (PEG<3>= 17,6 Á).FIG.

6E.Biotina-PEG3-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9)-PEG<4>-Cy(QKHGP)(SEQ ID NO:15) (PEG<4>= 22 Á).FIG. 6F.Biotina-PEG3-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9)-PEG<5>-Cy(QKHGP)(SEQ ID NO:15) (PEGs = 26,4 Á).

FIG. 7: Punto de partida para el desarrollo de un conjunto de aglutinantes de PCC contra un objetivo proteico.El objetivo inicial es identificar uno o más PCC que se unan a un epítopo en la proteína objetivo(12),y uno o más PCC diferentes que se unan a un segundo epítopo(13).También pueden ser útiles otros PCC que se unan a un tercer, cuarto, etc. epítopo. El método PCC dirigido a epítopos enseña que esto puede lograrse mediante el cribado de bibliotecas de péptidos contra epítopos sintéticos (SynEps)(14,15).Un SynEp es un polipéptido que tiene la secuencia del epítopo diana natural, excepto que una posición contiene un aminoácido artificial que presenta un grupo químico azida o acetileno(16),llamado asidero de clic. La SynEp se modifica además para contener un asidero de ensayo, como un grupo biotina, en el extremo N o C-terminal(17).El procedimiento de selección se ha descrito previamente (Das, S. et al., Un enfoque sintético general para diseñar ligandos de péptidos macrocíclicos dirigidos a epítopos. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2015). Mediante este procedimiento, se identifica al menos un enlace peptídico único para cada uno de al menos dos epítopos de la diana. Estos aglutinantes peptídicos se validan mediante la realización de ensayos de unión contra el objetivo proteico completo(11)así como contra los SynEps. Para estos ensayos de unión, las SynEps se preparan con el residuo natural en lugar del asidero de click(16).Idealmente, las diferentes regiones de la proteína diana a las que se unen los distintos ligandos estarán relativamente próximas (unos pocos nanómetros o menos) en la estructura terciaria de la proteína. Incluso para un único SynEp, un cribado puede producir PCC que se unen a dos sitios diferentes.

FIG. 8: PCC que se une a dos sitios diferentes.La región que representa el epítopo de interés(12)se resalta sobre un fondo más oscuro de la proteína completa(11).El residuo de aminoácido que se sustituyó por un asidero de clic en la estructura SynEp se indica con una estrella(22).Durante las etapas de cribado de SynEp, pueden identificarse PCC que se unen al lado N-terminal del epítopo (23) o al lado C-terminal (24).

FIG. 9: Estimación de la longitud óptima del enlazador.Se muestra un primer PCC(31)que se une al lado N de un epítopo(12)y un segundo PCC(32)que se une al lado C de un segundo epítopo(13). El análisis de esta disposición de enlace, junto con la estructura de la proteína a partir de, por ejemplo, el banco de datos de proteínas permite estimar la longitud de un enlace optimizado(33).na estimación de este tipo puede reducir la elección de los enlaces candidatos a un número muy pequeño. Un ejemplo podría ser utilizar dicha estimación de longitud para seleccionar uno o dos oligómeros de polietilenglicol de longitud marcada para su ensayo. El mejor enlazador(34)es el que acerca la afinidad del biligando a la de un enlazador totalmente cooperativo.

FIG. 10: la IL-17F y la IL-17A son homólogos cercanos.Alineación de la IL-17F (SEQ ID NO:38) y la IL-17A (SEQ ID NO:37). Los residuos sombreados en verde son idénticos, los amarillos son homólogos y los no resaltados son únicos.

FIG. 11: Generación de ligandos para la IL-17F y la IL-17A.Se generaron ligandos de anclaje contra la IL-17F utilizando dos epítopos y contra la IL-17A utilizando un epítopo.

FIG. 12: Diseño de un biligando PCC optimizado contra IL-17F explotando la cooperatividad. FIG.

12A.Dibujo de la IL-17F de longitud completa. Los PCC se desarrollaron contra los epítopos denominados L1 y L2.FIG.12b .Vista ampliada de IL-17F mostrando la región objetivo. Se estima que la distancia entre los puntos químicamente accesibles en los PCC es de 15Á.FIG. 12C.Demostración de que un enlazador con una longitud cercana a 15 Á (PEG<3>) produce el mejor aglutinante (por aproximadamente 10 veces). Los biligandos tienen la forma Biotina-PEG3-Cy(RSYNK)(SEQ ID NO:28)-PEG<x>-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9) (x = 1 a 5).FIG. 12D.Gráfico que muestra que un enlazador con una longitud cercana a 15 Á(PEG<3>)produce el mejor aglutinante (por aproximadamente 10 veces).

FIG. 13: Estructuras de biligandos con enlaces PEG que van desde 8,8 a 26,4 A para unir los dos macrociclos. FIG. 13A.Biotina-PEG3-Cy(RSYNK)(SEQ ID NO:28)-PEG<1>-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9) (PEG<1>= 8,8 Á).FIG. 13B.Biotina-PEG3-Cy(RSYNK)(SEQ ID NO:28)-PEG<2>-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9) (PEG<2>= 13,2 Á).FIG.

13C.Biotina-PEG3-Cy(RSYNK)(SEQ ID NO:28)-PEG<3>-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9) (PEG<3>= 17,6 Á).FIG.

13D.Biotina-PEG3-Cy(RSYNK)(SEQ ID NO:28)-PEG<4>-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9) (PEG<4>= 22 Á).FIG.

13E.Biotina-PEG3-Cy(RSYNK)(SEQ ID NO:28)-PEG<5>-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9) (PEG<5>= 26,4 Á).

FIG. 14: Proteína-2 rica en histidina de Plasmodium falciparum (Pf.HRP-2).Se muestra el mapa de secuencia de Pf.HRP-2 (SEQ ID NO:42).

FIG. 15: Estructura y datos de EC50 del dímero YKYYR(SEQ ID NO:29).

FIG. 16: Biligando cy(YKYYR)(SEQ ID NO:29)-enlazador-cy(GWNVDL)(SEQ ID NO:30)con enlazador desarrollado mediante cribado de bibliotecas.

Descripción detallada

A menos que el contexto requiera lo contrario, a lo largo de la presente especificación y reivindicaciones, la palabra "comprender" y variaciones de la misma, tales como, "comprende" y "que comprende" deben interpretarse en un sentido abierto e inclusivo, es decir como "que incluye, pero no se limita a".

La referencia a lo largo de esta especificación a "una realización" o "una realización" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrito en relación con la realización está incluido en al menos una realización de la presente invención. Por lo tanto, las apariciones de las frases "en una realización" o "en una realización" en varios lugares a lo largo de esta especificación no se refieren necesariamente a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.

Definiciones

"Amino" se refiere al radical -NH<2>.

"Ciano" se refiere al radical -CN.

"Hidroxi" o "hidroxilo" se refiere al radical -OH.

"Imino" se refiere al sustituyente =NH.

"Nitro" se refiere al radical -NO<2>.

"Oxo" se refiere al sustituyente =O.

"Tioxo" se refiere al sustituyente =S.

"Alquilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada, recta o ramificada, compuesta únicamente por átomos de carbono e hidrógeno, saturada o insaturada (es decir, que contiene uno o más enlaces dobles y/o triples), con uno a doce átomos de carbono (alquilo C<1>-C<12>), preferiblemente de uno a ocho átomos de carbono (alquilo C<1>-C<8>) o de uno a seis átomos de carbono (alquilo C<1>-C<6>), y que está unido al resto de la molécula por un enlace simple, por ejemplo metilo, etilo, n propilo, 1 metiletilo (isopropilo), n butilo, n pentilo, 1,1 dimetiletilo (t-butilo), 3 metilhexilo, 2 metilhexilo, etenilo, prop-1-enilo, but-1-enilo, pent-1-enilo, penta 1,4 dienilo, etileno, propinilo, butileno, pentinilo, hexinilo y similares. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido.

"Alquileno" o "cadena de alquileno" se refiere a una cadena de hidrocarburos divalentes, recta o ramificada, que une el resto de la molécula a un grupo radical, formado únicamente por carbono e hidrógeno, saturado o insaturado (es decir, que contiene uno o más enlaces dobles y/o triples), y que tiene de uno a doce átomos de carbono, por ejemplo, metileno, etileno, propileno, n-butileno, etenileno, propenileno, n-butenileno, propinileno, n-butileno y similares. La cadena de alquileno está unida al resto de la molécula mediante un enlace simple o doble y al grupo radical mediante un enlace simple o doble. Los puntos de unión de la cadena de alquileno al resto de la molécula y al grupo radical pueden ser a través de uno o dos carbonos cualesquiera dentro de la cadena. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, una cadena de alquileno puede estar opcionalmente sustituida.

"Alcoxi" se refiere a un radical de la fórmula -ORa donde Ra es un radical alquilo como se definió anteriormente que contiene de uno a doce átomos de carbono. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo alcoxi puede estar opcionalmente sustituido.

"Aminocarbonilo" se refiere a un radical de la fórmula -C(=O)NRaRa, donde cada Ra es independientemente H, alquilo o una fracción de enlace.

"a-amino carbonilo" se refiere a un radical de la fórmula -C(=O)CRb(NRaRa), donde cada Ra es independientemente H, alquilo o una fracción de enlace y Rb es H o alquilo. En algunas realizaciones, un alfa amino carbonilo forma parte de una fracción cíclica (por ejemplo, un péptido) donde el carbonilo está dentro del anillo y el amino (NRaRa) es exocíclico. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un alfa aminocarbonilo es útil para la degradación de Edman de péptidos cíclicos.

a-amino carbonilo" se refiere a un radical de la fórmula -C(=O)CRb(N(C=O)RaRa), donde cada Ra es independientemente H, alquilo o una fracción de enlace y Rb es H o alquilo. En algunas realizaciones, un alfa amino carbonilo forma parte de una fracción cíclica (por ejemplo, un péptido) donde el carbonilo está dentro del anillo y el amino (N(C=O)RaRa) es exocíclico.

"Alquilamino" se refiere a un radical de la fórmula -NHRa o -NRaRa donde cada Ra es, independientemente, un radical alquilo como se ha definido anteriormente que contiene de uno a doce átomos de carbono. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo alquilamino puede estar opcionalmente sustituido.

"Tioalquilo" se refiere a un radical de la fórmula -SRa donde Ra es un radical alquilo como se ha definido anteriormente que contiene de uno a doce átomos de carbono. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo tioalquilo puede estar opcionalmente sustituido.

"Arilo" se refiere a un radical del sistema de anillos de hidrocarburos que comprende hidrógeno, de 6 a 18 átomos de carbono y al menos un anillo aromático. Para los fines de esta invención, el radical arilo puede ser un sistema de anillo monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas de anillos fusionados o puenteados. Los radicales arilo incluyen, entre otros, los derivados del aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, fluoranteno, fluoreno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, fenaleno, fenantreno, pleiadeno, pireno y trifenileno. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, el término "arilo" o el prefijo "ar-" (como en "aralquilo") pretende incluir radicales arilo que están opcionalmente sustituidos.

"Aralquilo" se refiere a un radical de la fórmula -Rb-Rc donde Rb es una cadena de alquileno como se definió anteriormente y Rc es uno o más radicales arilo como se definió anteriormente, por ejemplo, bencilo, difenilmetilo y similares. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo aralquilo puede estar opcionalmente sustituido.

"Cicloalquilo" o "anillo carbocíclico" se refiere a un radical hidrocarbonado monocíclico o policíclico no aromático estable formado únicamente por átomos de carbono e hidrógeno, que puede incluir sistemas de anillos fusionados o en puente, que tiene de tres a quince átomos de carbono, preferentemente de tres a diez átomos de carbono, y que está saturado o insaturado y unido al resto de la molécula por un enlace simple. Los radicales monocíclicos incluyen, por ejemplo, el ciclopropilo, el ciclobutilo, el ciclopentilo, el ciclohexilo, el cicloheptilo y el ciclooctilo. Los radicales policíclicos incluyen, por ejemplo, adamantilo, norbornilo, decalinilo, 7,7 dimetil biciclo[2.2.1]heptanilo y similares. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo cicloalquilo puede estar opcionalmente sustituido.

"Cicloalquilalquilo" se refiere a un radical de la fórmula -RbRd donde Rbes una cadena de alquileno como se definió anteriormente y Rd es un radical cicloalquilo como se definió anteriormente. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo cicloalquilalquilo puede estar opcionalmente sustituido.

"Fusionado" se refiere a cualquier estructura de anillo descrita en el presente documento que se fusione a una estructura de anillo existente en los compuestos de la invención. Cuando el anillo fusionado es un anillo heterociclilo o un anillo heteroarilo, cualquier átomo de carbono de la estructura de anillo existente que pase a formar parte del anillo heterociclilo fusionado o del anillo heteroarilo fusionado puede sustituirse por un átomo de nitrógeno.

"Halo" o “halógeno” se refiere a bromo, cloro, fluoro o yodo.

"Haloalquilo" se refiere a un radical alquilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido por uno o más radicales halo, como se ha definido anteriormente, por ejemplo, trifluorometilo, difluorometilo, triclorometilo, 2,2,2 trifluoroetilo, 1,2 difluoroetilo, 3 bromo 2 fluoropropilo, 1,2 dibromoetilo, y similares. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo haloalquilo puede estar opcionalmente sustituido.

"Heterociclo" o "heterociclilo" se refiere a un radical de anillo no aromático estable de 3 a 18 miembros que consta de dos a doce átomos de carbono y de uno a seis heteroátomos seleccionados del grupo formado por nitrógeno, oxígeno y azufre. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, el radical heterociclilo puede ser un sistema de anillos monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas de anillos fusionados o puenteados; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre del radical heterociclilo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado; y el radical heterociclilo puede estar parcial o totalmente saturado. Ejemplos de tales radicales heterociclilo incluyen, pero no se limitan a, dioxolanilo, tienil[1,3]ditianilo, decahidroisoquinolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, octahidroindolilo, octahidroisoindolilo, 2 oxopiperazinilo, 2 oxopiperidinilo, 2 oxopirrolidinilo, oxazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, 4 piperidonilo, pirrolidinilo, pirazolidinilo, quinuclidinilo, tiazolidinilo, tetrahidrofurilo, tritianilo, tetrahidropiranilo, tiomorfolinilo, tiamorfolinilo, 1 oxotiomorfolinilo y 1,1 dioxotiomorfolinilo. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido.

"N-heterociclilo" se refiere a un radical heterociclilo como se ha definido anteriormente que contiene al menos un nitrógeno y en el que el punto de unión del radical heterociclilo al resto de la molécula es a través de un átomo de nitrógeno en el radical heterociclilo. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo N-heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido.

"Heterociclilalquilo" se refiere a un radical de la fórmula -RbRe donde Rb es una cadena de alquileno como se ha definido anteriormente y Re es un radical heterociclilo como se ha definido anteriormente, y si el heterociclilo es un heterociclilo que contiene nitrógeno, el heterociclilo puede estar unido al radical alquilo en el átomo de nitrógeno. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo heterocicloalquilo puede estar opcionalmente sustituido.

"Heteroarilo" se refiere a un radical de sistema de anillo de 5 a 14 miembros que comprende átomos de hidrógeno, de uno a trece átomos de carbono, de uno a seis heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre, y al menos un anillo aromático. A efectos de la presente invención, el radical heteroarilo puede ser un sistema de anillos monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas de anillos fusionados o puenteados; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre del radical heteroarilo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, azepinilo, acridinilo, bencimidazolilo, benzotiazolilo, benzindolilo, benzodioxolilo, benzofuranoilo, benzooxazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzo[b][1,4]dioxepinilo, 1,4 benzodioxanilo, benzoonaftofuranoilo, benzoxazolilo, benzodioxolilo, benzodioxinilo, benzopiranilo, benzopiranonilo, benzofuranoilo, benzofuranoonilo, benzotienilo (benzotiofenilo), benzotriazolilo, benzo[4,6]imidazo[1,2 a]piridinilo, carbazolilo, cinolinilo, dibenzofuranoilo, dibenzotiofenilo, furanilo, furanonilo, isotiazolilo, imidazolilo, indazolilo, indolilo, indazolilo, isoindolilo, indolinilo, isoindolinilo, isoquinolilo, indolizinilo, isoxazolilo, naftiridinilo, oxadiazolilo, 2 oxoazepinilo, oxazolilo, oxiranilo, 1 -oxidopiridinilo, 1 oxopirimidinilo, 1 -oxidopirazinilo, 1 -oxidopiridazinilo, 1-fenil 1H pirrolilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, pteridinilo, purinilo, pirrolilo, pirazolilo, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, quinolinilo, quinuclidinilo, isoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tiazolilo, tiadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, triazinilo y tiofenilo (es decir, tienilo). A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido.

"N-heterociclilo" se refiere a un radical heteroarilo como el definido anteriormente que contiene al menos un nitrógeno y en el que el punto de unión del radical heteroarilo al resto de la molécula es a través de un átomo de nitrógeno en el radical heteroarilo. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo N-heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido.

"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical de la fórmula -RbRf donde Rb es una cadena de alquileno como se ha definido anteriormente y Rf es un radical heteroarilo como se ha definido anteriormente. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo heteroarilalquilo puede estar opcionalmente sustituido.

El término "sustituido" utilizado aquí significa cualquiera de los grupos anteriores (p. ej, alquilo, alquileno, alcoxi, alquilamino, aminocarbonilo, a-aminocarbonilo, a-amidocarbonilo, tioalquilo, arilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, haloalquilo, heterociclilo, N-heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo, N-heteroarilo y/o heteroarilalquilo) en los que al menos un átomo de hidrógeno se sustituye por un enlace a un átomo distinto del hidrógeno, como, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos: un átomo de halógeno como F, Cl, Br e I; un átomo de oxígeno en grupos como grupos hidroxilo, grupos alcoxi y grupos éster; un átomo de azufre en grupos como grupos tiol, grupos tioalquilo, grupos sulfona, grupos sulfonilo y grupos sulfóxido; un átomo de nitrógeno en grupos tales como aminas, amidas, alquilaminas, dialquilaminas, arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, N-óxidos, imidas y enaminas; un átomo de silicio en grupos tales como grupos trialquilosililo, dialquilosililo, alquildialosililo y trilosililo; y otros heteroátomos en otros grupos diversos. "Sustituido" también se refiere a cualquiera de los grupos anteriores en los que uno o más átomos de hidrógeno se sustituyen por un enlace de orden superior (por ejemplo, un enlace doble o triple) con un heteroátomo, como el oxígeno en los grupos oxo, carbonilo, carboxilo y éster; y el nitrógeno en grupos como iminas, oximas, hidrazonas y nitrilos. Por ejemplo, "sustituido" incluye cualquiera de los grupos anteriores en los que uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan con -NRgRh, -NRgC(=O)Rh, -NRgC(=O)NRgRh, -NRgC(=O)ORh, -NRgSO2Rh, -OC(=O) NRgRh, -ORg, -SRg, -SORg, -SO2Rg, -OSO2Rg, -SO2ORg, =NSO2Rg, y -SO<2>NRgRh. "Sustituido" también significa cualquiera de los grupos anteriores en los que uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan con -C(=O)Rg, -C(=O)ORg, -C(=O)NRgRh, -CH<2>SO<2>Rg, -CH<2>SO<2>NRgRh. En lo anterior, Rg y Rh son iguales o diferentes e independientemente hidrógeno, alquilo, alcoxi, alquilamino, tioalquilo, arilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, haloalquilo, heterociclilo, N-heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo, N-heteroarilo y/o heteroarilalquilo. "Sustituido" significa además cualquiera de los grupos anteriores en los que uno o más átomos de hidrógeno se sustituyen por un enlace a un grupo amino, ciano, hidroxilo, imino, nitro, oxo, tioxo, halo, alquilo, alcoxi, alquilamino, tioalquilo, arilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, haloalquilo, heterociclilo, N-heterociclilo, heterociclalquilo, heteroarilo, N-heteroarilo y/o heteroarilalquilo. Además, cada uno de los sustituyentes anteriores también puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los sustituyentes anteriores.

"Profármaco" pretende indicar un compuesto que puede convertirse en condiciones fisiológicas o por solvólisis en

un compuesto biológicamente activo de la invención (es decir, un agente de captura descrito). Así, el término "profármaco" se refiere a un precursor metabólico de un compuesto de la invención que es farmacéuticamente aceptable. Un profármaco puede ser inactivo cuando se administra a un sujeto que lo necesita, pero se convierte

in vivo en un compuesto activo de la invención. Los profármacos normalmente se transforman rápidamente in vivo

para producir el compuesto original de la invención, por ejemplo, mediante hidrólisis en sangre. El compuesto profármaco ofrece a menudo ventajas de solubilidad, compatibilidad tisular o liberación retardada en un organismo

mamífero (véase, Bundgard, H., Design of Prodrugs (1985), pp. 79, 2124 (Elsevier, Amsterdam)). Se proporciona

una descripción exhaustiva en Higuchi, T., et al., A.C.S. Symposium Series, Vol. 14, y en Bioreversible Carriers in

Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association y Pergamon Press, 1987.

El término "profármaco" también incluye cualquier portador unido covalentemente, que libera el compuesto activo

de la invención in vivo cuando dicho profármaco se administra a un sujeto mamífero. Los profármacos de un compuesto de la invención pueden prepararse modificando grupos funcionales presentes en el compuesto de la

invención de tal manera que las modificaciones se escindan, ya sea en manipulación rutinaria o in vivo, al compuesto padre de la invención. Los profármacos incluyen compuestos de la invención en los que un grupo

hidroxi, amino o mercapto está unido a cualquier grupo que, cuando el profármaco del compuesto de la invención

se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxi libre, amino libre o mercapto libre, respectivamente. Ejemplos de profármacos incluyen, pero no se limitan a, derivados acetato, formiato y benzoato

de alcohol o derivados amida de grupos funcionales amina en los compuestos de la invención y similares.

La invención divulgada en el presente documento también pretende abarcar todos los agentes de captura farmacéuticamente aceptables divulgados que están marcados isotópicamente por tener uno o más átomos reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número de masa diferente. Los ejemplos de isótopos

que se pueden incorporar en los compuestos descritos incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno,

oxígeno, fósforo, fluoro y cloro, como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, respectivamente. Estos compuestos radiomarcados podrían ser útiles para ayudar a determinar o medir la eficacia

de los compuestos, caracterizando, por ejemplo, el lugar o el modo de acción, o la afinidad de unión al lugar de

acción farmacológicamente importante. Ciertos agentes de captura revelados marcados isotópicamente, por

ejemplo, los que incorporan un isótopo radiactivo, son útiles en estudios de distribución tisular de fármacos y/o

sustratos. Los isótopos radioactivos de tritio, es decir, 3H, y carbono 14, es decir, 14C, son particularmente útiles

con dicho fin debido a su facilidad de incorporación y los métodos sencillos de detección.

La sustitución con isótopos más pesados, tales como deuterio, es decir, 2H, pueden ofrecer ciertas ventajas terapéuticas derivadas de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, un aumento de la semivida in vivo o una

reducción de las necesidades de dosificación, por lo que pueden ser preferibles en algunas circunstancias.

La sustitución con isótopos que emiten positrones, tales como 11C, 18F, 15O y 13N, puede resultar útil en estudios

de topografía de emisión de positrones (PET) para evaluar la ocupación del receptor sustrato. Los agentes de

captura marcados isotópicamente pueden prepararse generalmente mediante técnicas convencionales conocidas

por los expertos en la materia o mediante procesos análogos a los descritos en las Preparaciones y Ejemplos que

se exponen a continuación, utilizando un reactivo adecuado marcado isotópicamente en lugar del reactivo no

marcado empleado anteriormente.

La invención divulgada en el presente documento también pretende abarcar los productos metabólicos in vivo de

los agentes de captura divulgados. Tales productos pueden resultar, por ejemplo, de la oxidación, reducción, hidrólisis, amidación, esterificación y similares del compuesto administrado, principalmente debido a procesos enzimáticos. En consecuencia, la invención incluye compuestos producidos por un proceso que comprende la administración de un compuesto de esta invención a un mamífero durante un período de tiempo suficiente para

producir un producto metabólico del mismo. Tales productos se identifican típicamente administrando un compuesto radiomarcado de la invención en una dosis detectable a un animal, como rata, ratón, cobaya, mono o

humano, dejando tiempo suficiente para que se produzca el metabolismo y aislando sus productos de conversión

de la orina, sangre u otras muestras biológicas.

"Mamífero" incluye a los seres humanos y tanto a los animales domésticos, como los animales de laboratorio y los

animales de compañía (por ejemplo, gatos, perros, cerdos, vacas, ovejas, cabras, caballos, conejos), como a los

animales no domésticos, como los animales salvajes y similares.

“Opcional” u “opcionalmente” significan que el suceso o las circunstancias descritas posteriormente pueden producirse o no, y que la descripción incluye casos en los que se produce dicho suceso o circunstancia y casos

en los que no. Por ejemplo, "arilo opcionalmente sustituido" significa que el radical arilo puede o no estar sustituido

y que la descripción incluye tanto radicales arilo sustituidos como radicales arilo que no tienen sustitución.

Un "portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye, sin limitación, cualquier adyuvante, portador, excipiente, deslizante, agente edulcorante, diluyente, conservante, tinte/colorante, potenciador del sabor, tensioactivo, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, estabilizador, agente isotónico, disolvente o emulsionante que haya sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos como aceptable para su uso en seres humanos o animales domésticos.

"Sal farmacéuticamente aceptable" incluye sales de adición de ácidos y bases.

"Sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia biológica y las propiedades de las bases libres, que no son indeseables desde el punto de vista biológico o de otro tipo, y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, pero no limitados a, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como, pero no limitados a, ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido alcanforico, ácido alcanfor-10-sulfónico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido carbónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclámico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glucoheptónico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutámico, ácido glutárico, ácido 2-oxo-glutárico, ácido glicerofosfórico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido isobutírico, ácido láctico, ácido lactobiónico, ácido láurico, ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido múcico, ácido naftaleno-1,5-disulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido 1 -hidroxi-2-naftóico, ácido nicotínico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamóico, ácido propiónico, ácido piroglutámico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tiociánico, ácido p-toluenosulfónico, ácido trifluoroacético, ácido undecilénico y similares.

"Sal de adición de base farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia biológica y las propiedades de los ácidos libres, que no son biológicamente o de otro modo indeseables. Estas sales se preparan a partir de la adición de una base inorgánica o una base orgánica al ácido libre. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen, entre otras, las sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Las sales inorgánicas preferidas son las de amonio, sodio, potasio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, entre otras, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, incluidas las aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, como amoníaco, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, dietanolamina, etanolamina, deanol, 2 dimetilaminoetanol, 2 dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, benetamina, benzatina, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, trietanolamina, trometamina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina y similares. Las bases orgánicas particularmente preferidas son la isopropilamina, la dietilamina, la etanolamina, la trimetilamina, la diciclohexilamina, la colina y la cafeína.

Los compuestos (agentes de captura) de la invención, o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden contener uno o más centros asimétricos y, por lo tanto, pueden dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R) o (S) o, como (D) o (L) para los aminoácidos. La presente invención pretende incluir todos los isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras. Los isómeros ópticamente activos (+) y ( ), (R) y (S) , o (D) y (L) pueden prepararse utilizando sintrones quirales o reactivos quirales, o resolverse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, cromatografía y cristalización fraccionada. Las técnicas convencionales para la preparación/aislamiento de enantiómeros individuales incluyen la síntesis quiral a partir de un precursor ópticamente puro adecuado o la resolución del racemato (o el racemato de una sal o derivado) utilizando, por ejemplo, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) quiral. Cuando los compuestos descritos en el presente documento contienen dobles enlaces olefínicos u otros centros de asimetría geométrica, y a menos que se especifique lo contrario, se pretende que los compuestos incluyan isómeros geométricos tanto E como Z. Asimismo, se pretende incluir todas las formas tautoméricas. Los (D)-aminoácidos (también denominados D-aminoácidos) se denominan aquí en minúsculas (por ejemplo, la D-valina se denomina "v"), mientras que los (L)-aminoácidos (también denominados aquí L-aminoácidos) se denominan en mayúsculas (por ejemplo, la L-valina o valina se denomina "V"). La glicina no es quiral y se conoce como "G".

Un "estereoisómero" se refiere a un compuesto formado por los mismos átomos unidos por los mismos enlaces pero que tienen diferentes estructuras tridimensionales, que no son intercambiables. La presente invención contempla varios estereoisómeros y mezclas de los mismos e incluye "enantiómeros", que se refiere a dos estereoisómeros cuyas moléculas son imágenes especulares no superponibles entre sí.

Un "tautómero" se refiere a un desplazamiento de protones de un átomo de una molécula a otro átomo de la misma molécula. La presente invención incluye tautómeros de cualquiera de dichos compuestos.

A menudo, las cristalizaciones producen un solvato del compuesto de la invención. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "solvato" se refiere a un agregado que comprende una o más moléculas de un compuesto de la invención con una o más moléculas de disolvente. El disolvente puede ser agua, en cuyo caso el solvato puede ser un hidrato. Alternativamente, el disolvente puede ser un disolvente orgánico. Así, los compuestos de la presente invención pueden existir como un hidrato, incluyendo un monohidrato, dihidrato, hemihidrato, sesquihidrato, trihidrato, tetrahidrato y similares, así como las correspondientes formas solvatadas. El compuesto de la invención puede ser un verdadero solvato, mientras que en otros casos, el compuesto de la invención puede simplemente retener agua adventicia o ser una mezcla de agua más algún disolvente adventicio.

El término "agente de captura" como se utiliza en el presente documento se refiere a una composición que comprende dos o más moléculas de unión a la diana y que se une específicamente a una proteína diana a través de dichas moléculas de unión a la diana. Cada fracción de unión al objetivo exhibe afinidad de unión por la proteína objetivo, ya sea individualmente o en combinación con otras fracciones de unión al objetivo. En ciertas realizaciones, cada fracción de unión al objetivo se une a la proteína objetivo a través de una o más interacciones no covalentes, que incluyen, por ejemplo, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas e interacciones de van der Waals. Un agente de captura puede comprender una o más moléculas orgánicas, incluyendo por ejemplo polipéptidos, péptidos, polinucleótidos y otras moléculas no poliméricas. En algunos aspectos, un agente de captura es un agente de captura catalizado por proteínas (PCC).

El término "epítopo" como se utiliza en el presente documento se refiere a una superficie molecular distinta de una proteína (por ejemplo, la IL-17F). Normalmente, el epítopo es un polipéptido y puede actuar por sí solo como una secuencia finita de 10 a 40 aminoácidos.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a una secuencia de aminoácidos que comprende un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales y a los polímeros de aminoácidos no naturales.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de forma similar a los aminoácidos naturales, y a sus isómeros. Los aminoácidos naturales son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos modificados posteriormente, por ejemplo, la hidroxiprolina, el carboxiglutamato, la O-fosfoserina y sus isómeros. El término "análogos de aminoácidos" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metilsulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (p. ej., norleucina) o estructuras principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. El término "miméticos de aminoácidos" se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de forma similar a un aminoácido natural. Se hace referencia a los aminoácidos en la presente ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por sus símbolos de una letra recomendados por la Biochemical Nomenclature Commission (Comisión de Nomenclatura Bioquímica) IUPAC-IUB.

El término "aminoácido no natural", como se utiliza en el presente documento se refiere a un aminoácido que es diferente de los veinte aminoácidos naturales (alanina, arginina, glicina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, serina, treonina, histidina, lisina, metionina, prolina, valina, isoleucina, leucina, tirosina, triptófano, fenilalanina) en la funcionalidad de su cadena lateral. El aminoácido no natural puede ser un análogo cercano de uno de los veinte aminoácidos naturales, o puede introducir una funcionalidad y una química completamente nuevas, siempre que la hidrofobicidad del aminoácido no natural sea equivalente o superior a la del aminoácido natural. El aminoácido no natural puede sustituir a un aminoácido existente en una proteína (sustitución) o ser una adición a la secuencia de tipo salvaje (inserción). La incorporación de aminoácidos no naturales puede realizarse mediante métodos químicos conocidos, como la síntesis peptídica en fase sólida o la ligadura química nativa, o mediante métodos biológicos.

Los términos "unión específica", "unión selectiva", "se une selectivamente" o "se une específicamente" utilizados en el presente documento se refieren a la unión del agente de captura a un epítopo de un antígeno predeterminado. Normalmente, el agente de captura se une con una afinidad (K<d>) de aproximadamente menos de 10-7 M, como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menor.

El término "K<d>" como se utiliza en el presente documento se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una determinada interacción agente de captura-antígeno. Por lo general, los agentes de captura de la invención se unen a IL-17 con una constante de equilibrio de disociación (K<d>) de menos de aproximadamente 10'6 M,10'7 M, tal como menos de aproximadamente 10'8 M,10'9 M o 10'1° M o incluso menor, por ejemplo, como se determina utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento Biacore utilizando el antígeno como ligando y el agente de captura como analito, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad correspondiente a una K<d>que es al menos diez veces menor, por ejemplo al menos 100 veces menor, por ejemplo al menos 1.000 veces menor, por ejemplo al menos 10.000 veces menor, por ejemplo al menos 100.000 veces menor que su afinidad de unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o de un antígeno estrechamente relacionado. La cantidad con la que la afinidad es menor depende de la K<d>del agente de captura, de modo que cuando la K<d>del agente de captura es muy baja (es decir, el agente de captura es altamente específico), entonces la cantidad con la que la afinidad por el antígeno es menor que la afinidad por un antígeno no específico puede ser al menos 10.000 veces.

El término "kd" (s-1) como se utiliza en el presente documento se refiere a la constante de velocidad de disociación de una determinada interacción agente de captura-antígeno. Dicho valor también se denomina valor de koff.

El término "ka" (M-1 x s-1), como se utiliza en el presente documento se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción de ligando-receptor particular.

El término "K<d>" (M), como se utiliza en el presente documento se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de ligando-receptor particular.

El término "K<a>" (M-1) como se utiliza en el presente documento se refiere a la constante de equilibrio de asociación de una interacción particular de agente de captura-antígeno y se obtiene dividiendo la ka por la kd.

Una "composición farmacéutica" se refiere a una formulación de un compuesto de la invención y un medio generalmente aceptado en la técnica para la administración del compuesto biológicamente activo a mamíferos, por ejemplo, seres humanos. Tal medio incluye todos los portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables para el mismo.

El término "condición" como se utiliza en el presente documento se refiere generalmente a una enfermedad, un evento o un cambio en el estado de salud. Un cambio en el estado de salud puede estar asociado a una enfermedad o acontecimiento concreto, en cuyo caso el cambio puede producirse simultáneamente o antes de la enfermedad o acontecimiento. En los casos en que el cambio en el estado de salud se produce antes de una enfermedad o acontecimiento, el cambio en el estado de salud puede servir como predictor de la enfermedad o acontecimiento. Por ejemplo, un cambio en el estado de salud puede ser una alteración en el nivel de expresión de un gen concreto asociado a una enfermedad o acontecimiento. Alternativamente, un cambio en el estado de salud puede no estar asociado a una enfermedad o acontecimiento concreto.

Las referencias a métodos de tratamiento en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnóstico.

Los términos "tratar", "tratamiento" o "tratamiento", como se utilizan en el presente documento, se refieren generalmente a prevenir una afección o acontecimiento, ralentizar el inicio o la tasa de desarrollo de una afección o retrasar la aparición de un acontecimiento, reducir el riesgo de desarrollar una afección o experimentar un acontecimiento, prevenir o retrasar el desarrollo de síntomas asociados con una afección o acontecimiento, reducir o poner fin a los síntomas asociados con una afección o acontecimiento, generar una regresión completa o parcial de una afección, disminuir la gravedad de una afección o acontecimiento, o alguna combinación de los mismos.

Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de captura divulgado puede variar según factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del agente de captura para provocar una respuesta deseada en el individuo.

El término "estable", como se utiliza en el presente documento con respecto a un agente de captura catalizado por proteínas o a una formulación farmacéutica del mismo, se refiere a que el agente o la formulación conservan su integridad estructural y funcional durante un periodo de tiempo suficiente para ser utilizados en los métodos descritos en el presente documento.

El término "sintético", como se utiliza en el presente documento con respecto a un agente de captura catalizado por proteínas o a un agente de captura, se refiere a que el agente de captura se ha generado por medios químicos y no biológicos.

A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencias que aquí se facilitan se refieren al valor obtenido mediante el conjunto de programas BLAST 2.0 utilizando los parámetros por defecto (Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402).

Como comprenderán los expertos en la materia, las búsquedas BLAST suponen que las proteínas pueden modelarse como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias, que pueden ser tractos homopoliméricos, repeticiones de período corto o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Estas regiones de baja complejidad pueden alinearse entre proteínas no relacionadas aunque otras regiones de la proteína sean totalmente disímiles. Se pueden emplear varios programas de filtrado de baja complejidad para reducir estos alineamientos de baja complejidad. Por ejemplo, el SEG (Wooten y Federhen, (1993) Comput. Chem. 17:149-63) y XNU (Claverie and States, (1993) Comput. Chem. 17:191-201) los filtros de baja complejidad pueden emplearse solos o combinados.

Como se utiliza en el presente documento, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido incluye la referencia a los residuos de las dos secuencias, que son los mismos cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia en una ventana de comparación especificada. Cuando se utiliza un porcentaje de identidad secuencial en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras, donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias, que difieren por tales sustituciones conservativas, tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Normalmente, esto implica puntuar una sustitución conservadora como una discordancia parcial en lugar de total, aumentando así el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una puntuación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una puntuación de cero, una sustitución conservadora recibe una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, según el algoritmo de Meyers and Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17, e.g., tal como se aplica en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., USA).

Como se utiliza en el presente documento, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado comparando dos secuencias alineadas óptimamente a lo largo de una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Se calcula el porcentaje mediante la determinación del número de posiciones en las que la base de ácido nucleico o residuo de aminoácido aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, la división del número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y la multiplicación del resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

El término "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntica" de secuencias polinucleotídicas significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene entre 50-100 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 50 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 60 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 90 % y más preferiblemente al menos 95 %, comparada con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineamiento descritos utilizando parámetros estándar. Un experto reconocerá que estos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares. A estos efectos, por identidad sustancial de secuencias de aminoácidos se entiende normalmente una identidad de secuencia de entre 55-100 %, preferiblemente al menos 55 %, preferiblemente al menos 60 %, más preferiblemente al menos 70 %, 80 %, 90 % y lo más preferiblemente al menos 95 %.

En ciertas realizaciones, el término "IL-17F", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la IL-17F humana. En algunas realizaciones, la IL-17 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a ella.

1 MTVKTLHGPAMVKYLLLSIL GLAFLSEAAA RKIPKVGHTF FQKPESCPPV PGG3MKLDIG

61 IINENQRVSM SRNIESRSTS PWNYTVTWDP NRYPSEWQA QCRNLGCINA QGKEDISMNS

<121 VPIQQETLW RRKHQGC3VS FQLEKVLVTV GCTCVTPVIH RVQ>(SEQIDNO:31)

En otras realizaciones, la IL-17F es una proteína codificada por el gen representado por el número de identificación del gen Entrez 112744.

Desarrollo de agentes de captura de la IL-17F

Los anticuerpos son actualmente el agente de detección por defecto para su uso en plataformas de diagnóstico. Sin embargo, los anticuerpos presentan varios inconvenientes, como su elevado coste, escasa estabilidad y, en muchos casos, falta de caracterización adecuada y alta especificidad. El reemplazo ideal para su uso en ensayos de diagnóstico debe ser sintético, estable a una variedad de condiciones térmicas y químicas y mostrar alta afinidad y especificidad para el objetivo de interés.

Un anticuerpo monoclonal de alta calidad posee una afinidad nanomolar baja y una especificidad de objetivo alta. Curiosamente, los análisis estructurales y genéticos de la superficie de reconocimiento del antígeno han demostrado que la mayor parte de la diversidad molecular de los bucles variables está contenida en un único bucle altamente variable (CDR-H3). En los seres humanos, este bucle tiene un tamaño que oscila entre 1 y 35 residuos (15 de media), puede adoptar una amplia gama de conformaciones estructurales y es responsable de la mayoría de las interacciones con el antígeno. Los otros cinco bucles son mucho menos diversos y solo adoptan un número reducido de conformaciones. Esto sugiere que un péptido "ancla" cuidadosamente seleccionado puede dominar el modo y la fuerza de la interacción entre un agente de captura y su proteína diana. También sugiere que otros componentes peptídicos, aunque solo aportan contribuciones modestas a la energía total de interacción, pueden proporcionar importantes características de andamiaje y elementos de especificidad.

La química de clic in situ es una técnica en la que una pequeña molécula inhibidora enzimática se separa en dos moléculas, cada una de las cuales se expande en una pequeña biblioteca: una con funcionalidades acetilénicas y otra con grupos azida. A continuación, la propia enzima ensambla el inhibidor "más adecuado" a partir de estos componentes de la biblioteca promoviendo selectivamente la cicloadición 1,3-dipolar entre los grupos acetileno y azida para formar un enlace triazol (la reacción "clic"). La proteína desempeña efectivamente el papel de una variante extremadamente selectiva del catalizador Cu(I) que se utiliza habitualmente para tales acoplamientos. La enzima promueve la reacción de clic solo entre aquellos componentes de la biblioteca que se unen a la proteína en la orientación correcta. El inhibidor resultante puede exhibir características de afinidad muy superiores a las del inhibidor inicial que formó la base de las dos bibliotecas.

La química de clic secuencial in situ amplía el concepto de química de clic in situ para permitir el descubrimiento de agentes de captura multiligando (ver: USSN 20100009896). Este proceso se utilizó anteriormente para producir un agente de captura triligando contra la proteína modelo anhidrasa carbónica II (CAII). La química secuencial de clic in situ tiene varias ventajas. En primer lugar, la información estructural sobre la proteína diana se sustituye por la capacidad de muestrear un espacio químico muy amplio para identificar los componentes ligandos del agente de captura. Por ejemplo, se puede identificar un ligando inicial comparando la proteína con una gran biblioteca de péptidos de una perla y un compuesto (OBOC) (>106 elementos), en la que los péptidos pueden estar compuestos de aminoácidos naturales, no naturales y/o artificiales. A continuación, el ligando de anclaje resultante se utiliza en un cribado de clic in situ, de nuevo utilizando una gran biblioteca OBOC, para identificar un ligando biligando. Una segunda ventaja es que el proceso puede repetirse, de modo que el biligando se utiliza como ancla para identificar un triligando, y así sucesivamente. El agente de captura final puede ampliarse mediante procesos químicos relativamente sencillos y en gran medida automatizados, y puede desarrollarse con una etiqueta, como un grupo de biotina, como parte intrínseca de su estructura. Este enfoque permite explorar arquitecturas de agentes de captura ramificadas, cíclicas y lineales. Aunque se han descrito muchas estrategias para el ensamblaje multiligando dirigido a proteínas, la mayoría requieren información estructural detallada sobre la diana para guiar la estrategia de cribado, y la mayoría (como el enfoque clic in situ original), están optimizadas para bibliotecas de moléculas pequeñas de baja diversidad.

La presente realización generaliza aún más la aplicación de clic in situ para encontrar ingenuamente un ligando de anclaje utilizando clic in situ. En enfoques anteriores, era necesario un aglutinante conocido para iniciar el ligando. Este método proporciona un mecanismo para encontrar un ligando de anclaje de novo.

Como se describe en el presente documento, se utilizó un enfoque iterativo de química de clic in situ para sintetizar un agente de captura biligando que se une específicamente a la IL-17F. Este enfoque de química de clic in situ comprendió dos etapas. En primer lugar, se encontraron dos ligandos "ancla" que se unían a la IL-17F en sitios distintos pero relativamente próximos. En segundo lugar, se encontró un enlazador de tamaño adecuado que unía los dos ligandos produciendo un agente de captura con mayor afinidad por la IL-17F.

Se encontró que los agentes de captura generados por los métodos divulgados en el presente documento muestran afinidad de unión por la IL-17F. Se demostró que los agentes de captura funcionan como agentes de captura y detección en ensayos ELISA e inmunoprecipitan eficazmente la IL-17F.

Agentes de captura de la IL-17F

En el presente documento se proporciona un agente de captura sintético estable que se une específicamente a IL-17F, en el que el agente de captura comprende dos o más ligandos "ancla" (también denominados simplemente "ligandos" en el presente documento) y un enlazador, y en el que los ligandos se unen selectivamente a IL-17F.

En ciertas realizaciones, un ligando comprende uno o más polipéptidos o péptidos. En algunas de estas realizaciones, una fracción de unión a diana comprende uno o más péptidos que comprenden D-aminoácidos, L-aminoácidos y/o aminoácidos sustituidos con grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en alquilo sustituido y no sustituido, azido sustituido y no sustituido, alquino sustituido y no sustituido, biotinilo sustituido y no sustituido, azioalquilo sustituido y no sustituido, polietilenglicolilo sustituido y no sustituido, y 1,2,3-triazol sustituido y no sustituido.

Los ligandos están unidos entre sí ba través de un enlace covalente mediante un enlazador. En algunas de estas realizaciones, el ligando y el enlazador están unidos entre sí mediante un enlace amida o un enlace 1,4disustituido-1,2,3-triazol como se muestra a continuación:

enlace 1,4-disustituido-1,2,3-triazol.

En aquellas realizaciones en las que los ligandos y el enlazador están unidos entre sí a través de un enlace 1,4-disustituido-1,2,3-triazol, el enlace 1,4-disustituido-1,2,3-triazol puede formarse mediante una Cicloadición Azida/Alquino Catalizada por Cu (CuAAC).

En ciertas realizaciones, los ligandos y el enlazador están unidos entre sí por un enlace Tz4 que tiene la siguiente estructura:

En ciertas realizaciones, los ligandos y el enlazador están unidos entre sí por un enlace Tz5 que tiene la siguiente estructura:

En aquellas realizaciones en las que uno o más de los ligandos y el enlazador están unidos entre sí mediante enlaces amida, el enlace amida puede formarse mediante el acoplamiento de un grupo ácido carboxílico y un grupo amina en presencia de un agente de acoplamiento (por ejemplo, 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HATU), N-hidroxi-7-aza-benzotriazol (HOAt), o diisopropiletilamina (DIEA) en DMF).

En ciertas realizaciones, los agentes de captura proporcionados en el presente documento son estables a través de una gama de condiciones de reacción y/o tiempos de almacenamiento. Un agente de captura que es "estable", tal y como se utiliza aquí, mantiene la capacidad de unirse específicamente a una proteína diana. En ciertas realizaciones, los agentes de captura aquí proporcionados son más estables que un anticuerpo que se une a la misma proteína diana en una o más condiciones de reacción y/o almacenamiento. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los agentes de captura aquí proporcionados son más resistentes a la degradación proteolítica que un anticuerpo que se une a la misma proteína diana.

En determinadas realizaciones, los agentes de captura aquí proporcionados tienen una vida útil superior a seis meses, lo que significa que son estables en almacenamiento durante más de seis meses. En algunas de estas realizaciones, los agentes de captura tienen una vida útil de un año o más, dos años o más, o más de tres años. En algunas de estas realizaciones, los agentes de captura se almacenan en forma de polvo liofilizado. En ciertas realizaciones, los agentes de captura aquí proporcionados tienen una vida útil más larga que un anticuerpo que se une a la misma proteína diana.

En ciertas realizaciones, los agentes de captura proporcionados en el presente documento son estables a temperaturas que oscilan entre -80° y 120° C aproximadamente. En algunas de estas realizaciones, los agentes de captura son estables dentro de un intervalo de temperaturas de -80° a -40° C; -40° a -20° C; -20° a 0° C; 0° a 20° C; 20° a 40° C; 40° a 60° C; 60° a 80° C; y/o 80° a 120° C. En ciertas realizaciones, los agentes de captura proporcionados en el presente documento son estables en un intervalo de temperaturas más amplio que un anticuerpo que se une a la misma proteína diana, y/o permanecen estables a una temperatura específica durante un periodo de tiempo más largo que un anticuerpo que se une a la misma proteína diana.

En determinadas realizaciones, los agentes de captura proporcionados en el presente documento son estables en un intervalo de pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 8,0. En ciertas realizaciones, el rango es de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0. En ciertas realizaciones, el rango es de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0.

En ciertas realizaciones, los agentes de captura aquí proporcionados son estables en suero humano durante más de 12 horas. En algunas de estas realizaciones, los agentes de captura son estables en suero humano durante más de 18 horas, más de 24 horas, más de 36 horas o más de 48 horas. En ciertas realizaciones, los agentes de captura proporcionados en el presente documento son estables durante un período de tiempo más largo en el suero humano que un anticuerpo que se une a la misma proteína diana. En ciertas realizaciones, los agentes de captura son estables en forma de polvo durante dos meses a una temperatura de unos 60° C.

En ciertas realizaciones, los agentes de captura proporcionados en el presente documento pueden comprender una o más etiquetas de detección, incluyendo, por ejemplo, biotina, ácido cobre-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (cobre-DOTA), 64Cu DOTA, 68Ga DOTA, 18F, 64Cu, 68Ga, 89Zr, 124I, 86Y, 94mTc, 110mIn, 11C, 76Br, 1231,131I, 67Ga, 111In y 99mTc, u otros productos radiomarcados que pueden incluir emisores gamma, emisores de protones, emisores de positrones, tritio o etiquetas cubiertas detectables por otros métodos (es decir, gadolinio), entre otros. En una realización particular, la etiqueta de detección es 18F. En ciertas realizaciones, los agentes de captura pueden modificarse para usarse como agentes de formación de imágenes. Los agentes de imagen pueden utilizarse como agentes de diagnóstico.

En ciertas realizaciones, los agentes de captura proporcionados en el presente documento pueden modificarse para obtener una actividad química o biológica deseada. Ejemplos de actividades químicas o biológicas deseadas incluyen, sin limitación, la mejora de la solubilidad, estabilidad, biodisponibilidad, detectabilidad o reactividad. Ejemplos de modificaciones específicas que pueden introducirse en un agente de captura incluyen, entre otros, la ciclación del agente de captura mediante la formación de un enlace disulfuro; la modificación del agente de captura con otros grupos funcionales o moléculas. Del mismo modo, un agente de captura puede sintetizarse para unirse a epítopos no canónicos o no biológicos de las proteínas, aumentando así su versatilidad. En ciertas realizaciones, el agente de captura puede modificarse modificando los bloques de síntesis de las moléculas de unión a la diana antes de la reacción de acoplamiento.

Métodos de elaboración y selección de agentes de captura

En ciertas realizaciones, se proporcionan métodos de cribado de moléculas de unión a dianas y/o de fabricación de agentes de captura que comprenden estas moléculas de unión a dianas. También se pueden encontrar métodos para seleccionar fracciones de unión al objetivo y/o preparar agentes de captura que comprendan estas fracciones de unión al objetivo en las Publicaciones Internacionales N.° WO 2012/106671, WO 2013/033561, WO 2013/009869 y WO 2014/074907.

Dos ligandos identificados por separado que se unen a dos regiones diferentes de la misma proteína (la diana) se unen químicamente para formar un biligando. Al optimizar un enlazador de los dos ligandos, el biligando formado por los ligandos y el enlazador puede exhibir una afinidad de unión que es muy superior a la de cualquiera de los ligandos individuales. Este efecto de unión reforzada se denomina cooperatividad de unión. Para un aglutinante cooperativo ideal, las energías de enlace termodinámico de los ligandos individuales al objetivo se sumarán para producir la energía de enlace del biligando enlazado. Esto significa que la constante de afinidad de unión (K<d>) del biligando enlazado será el producto de la afinidad de unión de los ligandos individuales (es decir, K<d>= K<d>1 x K<d>2, donde los subíndices 1 y 2 se refieren a los dos ligandos). En la práctica, rara vez, o nunca, se consigue la plena vinculación cooperativa. Así, la comparación de las propiedades de un biligando ligado con las de un ligando totalmente cooperativo proporciona una medida del grado óptimo de ligación de los dos ligandos.

Si el objetivo proteico tiene una estructura terciaria (plegada) conocida y bien definida, entonces los aspectos clave de este método de selección involucran estrategias para identificar ligandos que se unan a regiones preferidas de la proteína, seguidos de enfoques para identificar un enlazador optimizado. Si la proteína no tiene una estructura terciaria bien definida, la divulgación describe estrategias diseñadas para lograr aún una medida significativa de unión cooperativa de un biligando.

La Figura 7 describe el punto de partida para desarrollar un conjunto de aglutinantes de PCC contra un objetivo proteico (11). El objetivo inicial es identificar uno o más PCC que se unan a un epítopo en la proteína objetivo (12), y uno o más PCC diferentes que se unan a un segundo epítopo (13). También pueden ser útiles otros PCC que se unan a un tercer, cuarto, etc. epítopo. El método PCC dirigido a epítopos enseña que esto puede lograrse mediante el cribado de bibliotecas de péptidos frente a epítopos sintéticos (SynEps) como los que se muestran en la Fig. 7 (14,15). Un SynEp es un polipéptido que tiene la secuencia del epítopo diana natural, excepto que una posición contiene un aminoácido artificial que presenta un grupo químico azida o acetileno (16), denominado asidero de clic. La SynEp se modifica además para contener un asidero de ensayo, como un grupo biotina, en el extremo N o C (17). El procedimiento de cribado puede realizarse mediante cualquier procedimiento descrito en el presente documento o conocido en la técnica. Mediante el cribado, se identifica al menos un enlace peptídico único para cada uno de al menos dos epítopos de la diana. Estos péptidos se validan mediante ensayos de unión a la proteína diana completa (11) y a las SynEps. Para estos ensayos de unión, las SynEps se preparan con el residuo natural en lugar del asidero de clic (16).

Idealmente, las diferentes regiones de la proteína diana a las que se unen los distintos ligandos estarán relativamente próximas (unos pocos nanómetros o menos) en la estructura terciaria de la proteína. Incluso para un único SynEp, un cribado puede producir PCC que se unen a dos sitios diferentes. En la Figura 8, la región que representa el epítopo de interés (12) aparece resaltada sobre un fondo más tenue de la proteína completa (11). El residuo de aminoácido que se sustituyó por un asidero de clic en la estructura SynEp se indica con una estrella (22) . Durante las etapas de cribado de SynEp, pueden identificarse PCC que se unen al lado N-terminal del epítopo (23) o al lado C-terminal (24).

Una vez que se identifican los PCC a los que se dirige el epítopo, existen varios métodos para seleccionar un enlazador.

En una primera realización, si se conoce la estructura plegada de la proteína, y si los PCC se unen a esa estructura plegada, entonces se puede usar esa información, más el conocimiento de qué PCC se unen a qué epítopos, para estimar una longitud de enlace óptima. Esto se ilustra en la Figura 9. Esta figura muestra un PCC (31) que se une al lado N de un epítopo (12) y un segundo PCC (32) que se une al lado C de un segundo epítopo (13). El análisis de esta disposición de unión, junto con la estructura de la proteína a partir, por ejemplo, de la Protein Database, permite estimar la longitud de un enlazador optimizado (33). Una estimación de este tipo puede reducir la elección de los enlaces candidatos a un número muy pequeño. Un ejemplo podría ser utilizar dicha estimación de longitud para seleccionar uno o dos oligómeros de polietilenglicol de longitud similar para su ensayo. El mejor enlazador (34) es el que aproxima la afinidad del biligando a la de un enlazador totalmente cooperativo.

En una segunda realización, si no se conoce la estructura plegada de la proteína, o si la proteína simplemente no tiene una estructura plegada bien definida, entonces se utiliza tanta información como esté disponible para determinar la composición de una biblioteca de moléculas de enlace candidatas. Luego se examina esa biblioteca para identificar el mejor enlazador.

En una tercera realización, si no se conoce la estructura plegada de la proteína o si la proteína simplemente no tiene una estructura plegada bien definida, entonces, utilizando el conocimiento que existe sobre la proteína, simplemente se selecciona un enlazador para anexar los dos PCC. Incluso si no se identifica de esta manera un ligante optimizado y totalmente cooperativo, el biligando vinculado casi con certeza superará a cualquiera de los dos monoligandos debido a los efectos de cooperatividad.

In vitro

Para la detección de la IL-17F en solución, un agente de captura de la invención se puede marcar de forma detectable, luego ponerse en contacto con la solución y después se puede detectar la formación de un complejo entre el agente de captura y el objetivo de la IL-17F. Por ejemplo, un agente de captura marcado con fluorescencia puede utilizarse para ensayos de detección de IL-17F in vitro, en los que el agente de captura se añade a una solución que se va a analizar para IL-17F en condiciones que permitan que se produzca la unión. El complejo entre el agente de captura marcado con fluorescencia y el objetivo la IL-17F se puede detectar y cuantificar, por ejemplo, midiendo la mayor polarización de fluorescencia que surge del péptido unido al complejo en relación con la del péptido libre.

Como alternativa, puede utilizarse un ensayo "ELISA" de tipo sándwich, en el que un agente de captura se inmoviliza en un soporte sólido, como un tubo o pocillo de plástico, luego la solución sospechosa de contener IL-17F se pone en contacto con la fracción de unión inmovilizada, se lavan los materiales no de unión y se detecta el polipéptido complejo utilizando un reactivo de detección adecuado para reconocer la IL-17F.

Para la detección o purificación de la IL-17F soluble a partir de una solución, los agentes de captura de la invención se pueden inmovilizar sobre un sustrato sólido tal como un soporte cromatográfico u otro material de matriz, luego el aglutinante inmovilizado se puede cargar o poner en contacto con la solución en condiciones adecuadas para la formación de un complejo agente de captura/IL-17F. La porción no vinculante de la solución se puede eliminar y el complejo se puede detectar, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-IL-17F, o un anticuerpo anti-polipéptido de unión, o la IL-17F se puede liberar de la fracción de unión en condiciones de elución apropiadas.

Diagnóstico por imágenes in vivo

Un uso particularmente preferido para los agentes de captura de la invención es para crear imágenes visualmente legibles de IL-17F o células que expresan IL-17F en un fluido biológico, como, por ejemplo, en suero humano. Los agentes de captura de IL-17F descritos en el presente documento se pueden convertir en reactivos de imágenes mediante la conjugación de los agentes de captura con una etiqueta apropiada para la detección diagnóstica. Preferiblemente, un agente de captura que muestre una especificidad mucho mayor para la IL-17F que para otras proteínas séricas se conjuga o une a una etiqueta apropiada para la metodología de detección que se vaya a emplear. Por ejemplo, el agente de captura puede conjugarse con o sin un enlazador con un quelato paramagnético adecuado para la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), con una etiqueta radiactiva adecuada para la formación de imágenes por rayos X, tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) o gammagrafía (incluido un quelante para un metal radiactivo), con un agente de contraste de ultrasonidos (por ejemplo, una microburbuja estabilizada, un microbalón o lo que se ha denominado un "liposoma" relleno de gas adecuado para la detección por ultrasonidos) o con un colorante de formación de imágenes ópticas.

En otra realización, en lugar de etiquetar directamente un agente de captura con una etiqueta detectable o un constructo radioterapéutico, uno o más péptidos o constructos de la invención se pueden conjugar con, por ejemplo, avidina, biotina o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se unirá a la etiqueta detectable o al radioterapéutico.

A. Resonancia magnética

Los agentes de captura de la IL-17F descritos en el presente documento se pueden conjugar ventajosamente con un quelato de metal paramagnético para formar un agente de contraste para su uso en MRI.

Los iones metálicos paramagnéticos preferidos tienen números atómicos 21 -29, 42, 44 o 57-83. Esto incluye iones de la serie de metales de transición o de los lantánidos que tienen uno, y más preferiblemente cinco o más, electrones desapareados y un momento magnético de al menos 1,7 magnetones de Bohr. Los metales paramagnéticos preferidos incluyen, pero no se limitan a, cromo (III), manganeso (II), manganeso (III), hierro (II), hierro (III), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), praseodimio (III), neodimio (III), samario (III), gadolinio (III), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), europio (III) e iterbio (III), cromo (III), hierro (III) y gadolinio (III). El catión trivalente, Gd3+, es particularmente preferido para los agentes de contraste de MRI, debido a su alta relaxividad y baja toxicidad, con la ventaja adicional de que existe solo en un estado de oxidación biológicamente accesible, lo que minimiza la metabolización no deseada del metal por parte del paciente. Otro metal útil es el Cr3+, que es relativamente barato. Los quelatos de Gd(III) se utilizan en aplicaciones clínicas y radiológicas de MR desde 1988, y aproximadamente el 30 % de los exámenes de MRI emplean actualmente un agente de contraste basado en gadolinio.

El quelante de metal paramagnético es una molécula que tiene uno o más grupos polares que actúan como ligando para, y complejo con, un metal paramagnético. Los quelantes adecuados son conocidos en la técnica e incluyen ácidos con grupos de ácido metileno fosfónico, grupos de ácido metileno carbohidroxamina, grupos carboxietilideno o grupos carboximetileno. Algunos ejemplos de quelantes son, entre otros, el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), el ácido 1,4,7,10-tetraazaciclo-tetradecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), el 1 -sustituido 1,4,7,-tricarboximetil-1,4,7,10-teraazaciclododecano (DO3A), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacético (TETA). Otros ligandos quelantes son el etileno bis-(2-hidroxi-fenilglicina) (EHPG) y sus derivados, incluidos el 5-CI-EHPG, el 5-Br-EHPG, el 5-Me-EHPG, el 5-t-Bu-EHPG y el 5-sec-Bu-EHPG; ácido benzodietilentriaminopentaacético (benzo-DTPA) y sus derivados, incluidos dibenzo-DTPA, fenil-DTPA, difenil-DTPA, bencil-DTPA y dibencil-DTPA ácido bis-2 (hidroxibencil)-etilenodiaminodiacético (HBED) y sus derivados; la clase de compuestos macrocíclicos que contienen al menos 3 átomos de carbono, más preferentemente al menos 6, y al menos dos heteroátomos (0 y/o N), que pueden consistir en un anillo, o dos o tres anillos unidos entre sí en los elementos del anillo hetero, por ej. g., benzo-DOTA, dibenzo-DOTA y benzo-NOTA, donde NOTA es ácido 1,4,7-triazaciclononano N,N',N"-triacético, benzo-TETA, benzo-DOTm A, donde DOTMA es 1,4,7,10-tetraaciclotetradecano-1,4,7,10-tetra(ácido metil tetraacético), y benzo-TETMA, donde TETMA es 1,4,8,11-tetraaciclotetradecano-1,4,8,11-(ácido metil tetraacético); derivados del ácido 1,3-propileno-diaminetetraacético (PDTA) y del ácido trietilentetraaminohexaacético (TTNA); derivados del 1,5,10-N,N',N"-tris(2,3-dihidroxibenzoil)-tricatecolato (LICAM); y del 1,3,5-N,N',N"-tris(2,3-dihidroxibenzoil)aminometilbenceno (MECAM). Un quelante preferido para usar en la presente invención es DTPA, y se prefiere particularmente el uso de DO3A. Ejemplos de quelantes representativos y grupos quelantes contemplados por la presente invención se describen en los documentos WO 98/18496, WO 86/06605, WO 91/03200, WO 95/28179, WO 96/23526, WO 97/36619, WO 98/46612, WO 99/17809, y la patente de EE. UU N.° 4,899,755, la patente de EE. UU N.° 5,474,756, la patente de EE. UU N.° 5,846,519 y la patente de EE. UU N.° 6,143,274.

De acuerdo con la presente invención, el quelante del agente de contraste de MRI está acoplado al agente de captura de la IL-17F. La posición del quelato debe seleccionarse de manera que no interfiera con la afinidad de

unión o la especificidad del agente de captura de la IL-17F. El quelato también puede adherirse en cualquier parte

del agente de captura.

En general, el agente de captura de IL-17F puede estar unido directa o covalentemente al quelante metálico (u

otra etiqueta detectable), o puede estar acoplado o conjugado al quelante metálico mediante un enlazador, que

puede ser, sin limitación, enlaces amida, urea, acetal, cetal, éster doble, carbonilo, carbamato, tiourea, sulfona,

tioéster, éster, éter, disulfuro, lactona, imina, fosforilo o fosfodiéster; cadenas alquílicas saturadas o insaturadas sustituidas o no sustituidas; cadenas de aminoácidos lineales, ramificadas o cíclicas de un solo aminoácido o de diferentes aminoácidos (por ejemplo g., extensiones del N- o C-terminal de la fracción de unión a IL-17F); cadenas

de polietilenglicoles (PEG), polioxietileno o polivinilpiridina derivatizadas o infra-ivatizadas; cadenas de poliamida sustituidas o no sustituidas; cadenas de poliaminas, poliéster, polietilenimina, poliacrilato, poli(alcohol vinílico), poliglicerol u oligosacáridos (por ej, dextrano); copolímeros en bloque alternos; ácidos malónico, succínico, glutárico, adípico y pimélico; ácido caproico; diaminas y dialcoholes simples; cualquiera de los otros enlaces aquí descritos; o cualquier otro enlazador polimérico simple conocido en la técnica (véase, por ejemplo, los documentos WO 98/18497 y WO 98/18496). Preferiblemente, el peso molecular del enlazador se puede controlar estrictamente. Los pesos moleculares pueden variar en tamaño desde menos de 100 a más de 1.000.

Preferiblemente, el peso molecular del enlazador es menor que 100. Además, puede ser deseable utilizar un enlazador que sea biodegradable in vivo para proporcionar rutas de excreción eficientes para los reactivos de imágenes de la presente invención. Dependiendo de su ubicación dentro del enlazador, dichas funcionalidades biodegradables pueden incluir funcionalidades éster, éster doble, amida, fosfoéster, éter, acetal y cetal.

En general, se pueden utilizar métodos conocidos para acoplar el quelato de metal y el agente de captura de la IL-17F utilizando dichos enlaces (WO 95/28967, WO 98/18496, WO 98/18497 y discusión allí incluida). La fracción

de unión a la IL-17F puede unirse a través de un extremo N o C mediante un enlace amida, por ejemplo, a un nitrógeno del esqueleto de coordinación metálico de un quelato metálico o a un brazo de acetato del propio quelato metálico. La presente divulgación contempla la unión del quelato en cualquier posición, siempre que el quelato metálico conserve la capacidad de unir fuertemente el metal para minimizar la toxicidad.

Los reactivos de contraste de MRI preparados de acuerdo con la presente divulgación pueden utilizarse de la

misma manera que los reactivos de contraste de MRI convencionales. Se pueden preferir determinadas técnicas

de MR y secuencias de pulsos para mejorar el contraste del sitio con la sangre y los tejidos de fondo. Estas técnicas

incluyen (pero no se limitan a), por ejemplo, secuencias de angiografía de sangre negra que buscan oscurecer la

sangre, como secuencias de eco de espín rápido (Alexander, A. et al., 1998. Magn. Reson. Med., 40: 298-310) y secuencias de eco de gradiente alteradas por el flujo (Edelman, R. et al., 1990. Radiology, 177: 45-50). Estos métodos también incluyen técnicas independientes del flujo que aumentan la diferencia de contraste, como las secuencias preparadas con inversión-recuperación o con saturación-recuperación que aumentarán el contraste

entre el tejido que expresa IL-17F y los tejidos de fondo. Finalmente, las preparaciones de transferencia de magnetización también pueden mejorar el contraste con estos agentes (Goodrich, K. et al., 1996. Invest. Radia,

31: 323-32).

El reactivo marcado se administra al paciente en forma de composición inyectable. El método de administración

del agente de contraste de MRI es preferiblemente parenteral, es decir, intravenoso, intraarterial, intratecal, intersticial o intracavitario. Para obtener imágenes de tejidos que expresan la IL-17F, como tumores, se prefiere la administración intravenosa o intraarterial. Para la MRI, se contempla que el sujeto reciba una dosis de agente de contraste suficiente para realzar la señal de MR en el sitio de expresión de IL-17F en al menos un 10 %. Tras la inyección con el agente de captura de IL-17F que contiene el reactivo de MRI, se explora al paciente en la máquina

de MRI para determinar la ubicación de cualquier sitio de expresión de IL-17F. En entornos terapéuticos, tras la identificación de un sitio de expresión de la IL-17F (por ejemplo, líquido o tejido), se puede administrar inmediatamente un agente anticanceroso (por ejemplo, inhibidores de la IL-17F), si es necesario, y se puede escanear posteriormente al paciente para visualizar la carga viral.

B. Imágenes nucleares (imágenes con radionúdidos) y radioterapia

Los agentes de captura de IL-17F de la invención pueden conjugarse con un reportero de radionúclido apropiado

para gammagrafía, SPECT o PET y/o con un radionúclido apropiado para radioterapia. Las construcciones en las

que los agentes de captura de IL-17F se conjugan tanto con un quelante para un radionucleido útil para el diagnóstico por imagen como con un quelante útil para la radioterapia están dentro del alcance de la invención.

Para su uso como agente PET, un agente de captura descrito se puede complejar con uno de los diversos iones metálicos emisores de positrones, tales como 51Mn, 52Fe, 60Cu, 68Ga, 72As, 94mTc, o 110In. Las fracciones de unión

de la invención también se pueden marcar mediante halogenación utilizando radionucleidos tales como 18F, 124I,

125I, 1311,123I, 77Br, y 76Br. Los radionucleidos metálicos preferidos para gammagrafía o radioterapia incluyen 99mTc,

51Cr, 67Ga, 68Ga , 47Sc, 51Cr, 167Tm, 141Ce, 111In, 168Yb, 175Yb, 140La, 90Y, 88Y, 153Sm, 166Ho, 165Dy, 166Dy, 62Cu, 64Cu,

67Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 214Bi, 105Rh, 109Pd, 117mSn, 149Pm, 161Tb, 177Lu, 199Au. La elección del metal se determinará en función de la aplicación terapéutica o diagnóstica deseada. Por ejemplo, para fines de diagnóstico, los radionucleidos preferidos incluyen 64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc, y 111In. Para fines terapéuticos, los radionucleidos preferidos incluyen 64Cu, 90Y, 195Rh, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 161Tb, 166Tb, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Ln, 186/188Re, y 199Au. 99mTc es útil para aplicaciones de diagnóstico debido a su bajo costo, disponibilidad, propiedades de imagen y alta actividad específica. Las propiedades nucleares y radiactivas del 99mTc hacen de este isótopo un agente ideal para la obtención de imágenes gammagráficas. Este isótopo tiene una energía de fotón único de 140 keV y una semivida radiactiva de unas 6 horas, y se puede obtener fácilmente de un generador de 99Mo-99mTc. 18F, 4-[18F]fluorobenzaldehído (18FB), Al[18F]-NOTA 68Ga-DOTA y 68Ga-NOTA son radionucleidos típicos para la conjugación con agentes de captura de IL-17F para el diagnóstico por imagen.

Los radionucleidos metálicos pueden ser quelados, por ejemplo, mediante quelantes lineales, macrocíclicos, de terpiridina y N<3>S, N<2>S<2>o N4(véase también, la patente de EE. UU N.° 5,367,080, la patente de EE. UU N.° 5,364,613, la patente de EE. UU N.° 5,021,556, la patente de EE. UU N.° 5,075,099, la patente de EE. UU N.° 5,886,142), y otros quelantes conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, HYNIC, DTPA, EDTA, DOTA,<d>03A, TE<t>A, NOTA y quelantes de bisamino bistiol (B<a>T) (véase tambiénPatente de EE. UU. N.° 5,720,934). Por ejemplo, los quelantes N.sub.4 se describen en la patente de EE. UU N.° 6,143,274; la patente de EE. UU N.° 6,093,382; la patente de EE. UU N.° 5,608,110; la patente de EE. UU N.° 5,665,329; la patente de EE. UU N.° 5,656,254; y la patente de EE. UU N.° 5,688,487. Ciertos quelantes de N.sub.35 se describen en los documentos WO 95/03280, WO 95/06633, WO 96/03427 y en la patente de EE. UU N.° 5,662,885; la patente de EE. UU N.° 5,976,495; y la patente de EE. UU N.° 5,780,006. El quelante también puede incluir derivados del ligando quelante mercapto-acetil-acetil-glicil-glicina (MAG3), que contiene sistemas N<3>S y N<2>S<2>tales como MAMA (monoamidemonoamineditiols), DADS (N<2>S diamineditiols), CODADS y similares. Estos sistemas de ligandos y una variedad de otros se describen, por ejemplo, en Liu, S, y Edwards, D., 1999. Chem. Rev., 99:2235-2268, y las referencias correspondientes.

El quelante también puede incluir complejos que contengan átomos de ligando que no estén donados al metal en un conjunto tetradentado. Estos incluyen los aductos de ácido borónico de dioximas de tecnecio y renio, tales como los descritos en la patente de EE. UU N.° 5,183,653; la patente de EE. UU N.° 5,387,409; y la patente de EE. UU N.° 5,118,797.

Los quelantes se pueden unir covalentemente directamente al agente de captura de la IL-17F a través de un enlazador, como se describió anteriormente, y luego se pueden marcar directamente con el metal radiactivo de elección (véase, los documentos WO 98/52618, la patente de EE. UU N.° 5,879,658, y la patente de EE. UU N.° 5,849,261).

Los agentes de captura de IL-17F que comprenden 18F, 4-[18F]fluorobenzaldehído (18FB), Al[18F]-NOTA, 68Ga-DOTA y 68Ga-NOTA son de interés preferente para el diagnóstico por imagen. Los complejos de tecnecio radiactivo también son útiles para el diagnóstico por imagen, y los complejos de renio radiactivo son especialmente útiles para la radioterapia. Al formar un complejo de tecnecio radiactivo con los reactivos de esta invención, el complejo de tecnecio, preferiblemente una sal de pertecnetato de 99mTc, se hace reaccionar con el reactivo en presencia de un agente reductor. Los agentes reductores preferidos son los iones ditionito, estañoso y ferroso; el agente reductor más preferido es el cloruro estañoso. Los medios para preparar tales complejos se proporcionan convenientemente en forma de kit que comprende un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo de la invención a etiquetar y una cantidad suficiente de agente reductor para etiquetar el reactivo con99mTc. Alternativamente, el complejo puede formarse haciendo reaccionar un péptido de esta invención conjugado con un quelante apropiado con un complejo lábil preformado de tecnecio y otro compuesto conocido como ligando de transferencia. Este proceso se denomina intercambio de ligandos y es bien conocido por los expertos en la materia. El complejo lábil se puede formar utilizando ligandos de transferencia tales como tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo. Entre las sales de pertecnetato de 99mTc útiles con la presente invención se incluyen las sales de metales alcalinos tales como la sal de sodio, o sales de amonio o sales de amonio de alquilo inferior.

Preparación de los complejos de la invención presente donde el metal es radioactivo rhenium puede ser cumplido utilizando rhenium empezando materiales en el estado de oxidación 5 o 7. Ejemplos de compuestos en los que el renio está en el estado Re(VII) son NH4ReO4 o KReO4. Re(V) está disponible como, por ejemplo, [ReOCU](NBu4), [ReOCl4](AsPh4), ReOCb(PPh3)2 y como ReO<2>(piridina)4+, donde Ph es fenilo y Bu es n-butilo. También se pueden utilizar otros reactivos de renio capaces de formar un complejo de renio.

Los agentes de imagen PET, SPECT o gammagrafía marcados radiactivamente proporcionados por la presente invención se incluyen con una cantidad adecuada de radiactividad. Generalmente, la dosis unitaria a administrar tiene una radiactividad de aproximadamente 0,01 mCi a aproximadamente 100 mCi, preferiblemente de 1 mCi a 20 mCi. La solución a inyectar en dosis unitaria es de aproximadamente 0,01 mL a aproximadamente 10 mL. Generalmente se prefiere formar complejos radiactivos en soluciones que contengan radiactividad en concentraciones de aproximadamente 0,01 mCi a 100 mCi por ml.

Las dosis típicas de un agente de captura de la IL-17F marcado con radionúclido según la invención proporcionan 10-20 mCi. Tras la inyección de los agentes de captura de IL-17F marcados con radionucleidos en el paciente, se utiliza una cámara gamma calibrada para la energía de rayos gamma del nucleido incorporado en el agente de imagen para obtener imágenes de las zonas de captación del agente y cuantificar la cantidad de radiactividad presente en el lugar. La obtención de imágenes del sitio in vivo se puede realizar en cuestión de minutos. Sin embargo, la obtención de imágenes puede realizarse, si se desea, horas o incluso más tiempo después de que se inyecta el péptido radiomarcado en un paciente. En la mayoría de los casos, una cantidad suficiente de la dosis administrada se acumulará en la zona que se va a fotografiar en aproximadamente 0,1 de una hora para permitir la toma de escintifotos.

Los expertos en la materia conocen los programas de dosis adecuados para los compuestos radioterapéuticos de la presente invención. Los compuestos pueden administrarse utilizando muchos métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, una única o múltiples inyecciones IV o IP, utilizando una cantidad de radiactividad que sea suficiente para causar daño o ablación del tejido objetivo que expresa IL-17F, pero no tanto como para causar un daño sustancial al tejido no objetivo (tejido normal). La cantidad y la dosis requeridas son diferentes para los distintos constructos, en función de la energía y la semivida del isótopo utilizado, el grado de captación y eliminación del agente del organismo y la masa del tejido que expresa IL-17F. En general, las dosis pueden variar desde una dosis única de unos 30-50 mCi hasta una dosis acumulativa de hasta unos 3 Ci

Las composiciones radioterapéuticas de la invención pueden incluir tampones fisiológicamente aceptables, y pueden requerir estabilizadores de radiación para prevenir el daño radiolítico al compuesto antes de la inyección. Los expertos en la materia conocen estabilizadores de radiación y pueden incluir, por ejemplo, ácido paraaminobenzoico, ácido ascórbico, ácido gentístico y similares.

Un kit de un solo vial o de varios viales que contiene todos los componentes necesarios para preparar los complejos de esta invención, excepto el radionúclido, es una parte integral de esta invención.

Un kit de un solo vial contiene preferiblemente un ligando quelante, una fuente de sal estannosa u otro agente reductor farmacéuticamente aceptable, y está tamponado adecuadamente con un ácido o base farmacéuticamente aceptable para ajustar el pH a un valor de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. La cantidad y el tipo de agente reductor utilizado dependería de la naturaleza del complejo de intercambio que se va a formar. Las condiciones adecuadas son bien conocidas por los expertos en la materia. Se prefiere que el contenido del kit esté en forma liofilizada. Un kit de vial único de este tipo puede contener opcionalmente ligandos lábiles o de intercambio tales como glucoheptonato, gluconato, manitol, malato, ácido cítrico o tartárico y también puede contener modificadores de reacción tales como ácido dietilentriamino-pentaacético (DPTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), o ciclodextrina .alfa., .beta., o .gamma. que sirven para mejorar la pureza radioquímica y la estabilidad del producto final. El kit también puede contener estabilizadores, agentes de carga como manitol, que están diseñados para ayudar en el proceso de liofilización, y otros aditivos conocidos por los expertos en la materia.

Un kit multi-vial contiene preferiblemente los mismos componentes generales pero emplea más de un vial para reconstituir el radiofármaco. Por ejemplo, un vial puede contener todos los ingredientes necesarios para formar un complejo Tc(V) lábil al añadir pertecnetato (por ejemplo, la fuente de estaño u otro agente reductor). En este vial se añade pertecnetato y, tras esperar un tiempo adecuado, el contenido de este vial se añade a un segundo vial que contiene el ligando, así como tampones adecuados para ajustar el pH a su valor óptimo. Después de un tiempo de reacción de aproximadamente 5 a 60 minutos, se forman los complejos de la presente invención. Es ventajoso que el contenido de ambos viales de este kit multivial esté liofilizado. Como en el caso anterior, los modificadores de reacción, ligandos de intercambio, estabilizadores, agentes de carga, etc. pueden estar presentes en uno o ambos viales.

También se proporciona en el presente documento un método para incorporar un grupo protésico radiomarcado con 18F en un agente de captura de la IL-17F. En una realización, el 4-[18F]fluorobenzaldehído (18FB) se conjuga con un agente de captura que lleva una fracción aminooxi, lo que da como resultado la formación de oxima. En otra realización, el [18F]fluorobenzaldehído se conjuga con un agente de captura que lleva una fracción de hidrazida de acilo, lo que da como resultado un aducto de hidrazona. El 4-fluorobenzaldehído se puede preparar en forma de18F mediante el desplazamiento de un grupo saliente, utilizando un ion de 18F, mediante métodos conocidos.

Los agentes de captura marcados con 18F también se pueden preparar a partir de agentes de captura que poseen fracciones de tiosemicarbazida en condiciones que promueven la formación de una tiosemicarbozona, o mediante el uso de un complejo de adición de bisulfito de aldehído marcado con 18F.

Los métodos anteriores son especialmente adecuados para el marcaje de agentes de captura, por ejemplo, los agentes de captura descritos en el presente documento, que pueden modificarse durante la síntesis para contener una fracción nucleófila de hidroxilamina, tiosemicarbazida o hidrazina (o acilhidrazida) que puede utilizarse para reaccionar con el aldehído marcado. Los métodos se pueden utilizar para cualquier agente de captura que pueda acomodar una fracción nucleofílica adecuada. Típicamente, la fracción nucleófila se añade al extremo N-terminal del péptido, pero el experto reconocerá que el nucleófilo también puede unirse a una cadena lateral de aminoácidos o al extremo C-terminal del péptido. Se proporcionan métodos para sintetizar una secuencia peptídica radiomarcada en la que se hace reaccionar 4-[18F]fluorobenzaldehído con una secuencia peptídica que comprende una hidroxilamina, una tiosemicarbazona o un grupo hidrazina (o acilhidrazida), formando así las oximas, tiosemicarbazonas o hidrazonas correspondientes, respectivamente. El 4-[18F]fluorobenzaldehído normalmente se genera in situ mediante la descomposición catalizada por ácido del complejo de adición de 4-[18F]fluorobenzaldehído y bisulfito de sodio. El uso del complejo de adición de bisulfito mejora la velocidad de purificación, ya que a diferencia del aldehído, el complejo puede concentrarse hasta desecarse. La formación del complejo también es reversible en condiciones ácidas y básicas. En particular, cuando el complejo se pone en contacto con un péptido que contiene una hidroxilamina, una tiosemicarbazida o un grupo hidrazina (o acilhidrazida) en medio ácido, el 4-[18F]fluorobenzaldehído libre reactivo se consume a medida que se forma in situ, dando como resultado la secuencia de péptido radiomarcado con 18F correspondiente.

En los casos en que los enlaces oxima, tiosemicarbazona o hidrazona presentan inestabilidad in vivo, se puede emplear una etapa de reducción adicional para reducir el doble enlace que conecta el péptido al sustrato que contiene 18F. El enlace peptídico reducido correspondiente mejoraría la estabilidad. Un experto en la materia apreciaría la variedad de métodos disponibles para llevar a cabo dicha etapa de reducción. También se pueden utilizar las etapas de aminación reductora descritos en Wilson et al., Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals, XXVIII (10), 1189-1199, 1990 para formar una base de Schiff que involucra un péptido y 4-[18F]fluorobenzaldehído y reducir directamente la base de Schiff utilizando agentes reductores como cianoborohidruro de sodio.

El 4-[18F]fluorobenzaldehído se puede preparar como se describe en Wilson et al., Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals, Xx V i II (10), 1189-1199, 1990; Iwata et al., Applied radiation and isotopes, 52, 87-92, 2000; Poethko et al., The Journal of Nuclear Medicine, 45, 892-902, 2004; y Schottelius et al., Clinical Cancer Research, 10, 3593-3606, 2004. El Na18F en agua puede añadirse a una mezcla de criptofijo y K.sub.2CO.sub.3. Puede añadirse acetonitrilo anhidro y la solución se evapora en un bloque calefactor bajo una corriente de argón. Pueden añadirse porciones adicionales de acetonitrilo y evaporarse para secar completamente la muestra. El triflato de 4-trimetilamonio-benzaldehído puede disolverse en DMSO y añadirse al F-18 seco. Luego la solución puede calentarse en el bloque calefactor. La solución puede enfriarse brevemente, diluirse con agua y filtrarse a través de un Waters®. Cartucho de extracción Oasis HLB LP. El cartucho se puede lavar con una proporción de agua:acetonitrilo y agua de 9:1 para eliminar el 18F no unido y el triflato de 4-trimetilamoniobenzaldehído sin reaccionar. Luego, el 4-[18F]fluorobenzaldehído puede eluirse del cartucho con metanol en fracciones.

Aplicaciones terapéuticas

En el presente documento se proporcionan métodos de uso de los agentes de captura de IL-17F divulgados en el presente documento para detectar IL-17F en una muestra biológica. En ciertas realizaciones, estos métodos utilizan un inmunoensayo, en el que el agente de captura sustituye a un anticuerpo o su equivalente. En ciertas realizaciones, el inmunoensayo puede ser un Western blot, un ensayo pull-down, un dot blot o un ELISA.

Una muestra biológica para su uso en los métodos aquí previstos puede seleccionarse del grupo formado por órganos, tejidos, fluidos corporales y células. Cuando la muestra biológica es un fluido corporal, el fluido puede seleccionarse del grupo formado por sangre, suero, plasma, orina, esputo, saliva, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secreciones cutáneas, secreciones respiratorias, secreciones intestinales, secreciones del tracto genitourinario, lágrimas y leche. Los órganos incluyen, por ejemplo las glándulas suprarrenales, la vejiga, los huesos, el cerebro, los senos, el cuello uterino, el esófago, los ojos, la vesícula biliar, los genitales, el corazón, los riñones, el intestino grueso, el hígado, los pulmones, los ganglios linfáticos, los ovarios, el páncreas, la hipófisis, la próstata, las glándulas salivales, los músculos esqueléticos, la piel, el intestino delgado, la médula espinal, el bazo, el estómago, el timo, la tráquea, la tiroides, los testículos, los uréteres y la uretra. Los tejidos incluyen, por ejemplo, tejidos epiteliales, conectivos, nerviosos y musculares.

En ciertas realizaciones del presente documento se proporcionan métodos de uso de los agentes de captura de IL-17F divulgados en el presente documento para diagnosticar y/o clasificar (por ejemplo, estadificar) una afección asociada con la expresión de IL-17F. En algunas de estas realizaciones, los métodos comprenden (a) obtener una muestra biológica de un sujeto; (b) medir la presencia o ausencia de IL-17F en la muestra con el agente de captura de IL-17F; (c) comparar los niveles de IL-17F con un intervalo de control predeterminado para IL-17F; y (d) diagnosticar una afección asociada con la expresión de IL-17F basándose en la diferencia entre los niveles de IL-17F en la muestra biológica y el control predeterminado.

En otras realizaciones, los agentes de captura de IL-17F divulgados en el presente documento se utilizan como una terapéutica dirigida específica del mutante. En ciertos aspectos de esta realización, el agente de captura de IL-17F se administra solo sin administrar ADN, un radiofármaco u otro agente activo.

Los agentes de captura de IL-17F de la invención también pueden utilizarse para dirigir material genético a células que expresan IL-17F. El material genético puede incluir ácidos nucleicos, como ARN o ADN, de origen natural o sintético, incluidos ARN y ADN recombinantes y ARN y ADN antisentido. Los tipos de material genético que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, genes transportados en vectores de expresión como plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales de levadura (YAC) y virus defectuosos o "ayudantes", ácidos nucleicos antigénicos, ARN y ADN de cadena simple y doble y análogos de los mismos, como oligodeoxinudeótidos de fosforotioato y fosforoditioato. Además, el material genético puede combinarse, por ejemplo, con lípidos, proteínas u otros polímeros. Los vehículos de entrega de material genético pueden incluir, por ejemplo, una partícula de virus, un vector retroviral u otro vector de terapia génica, un liposoma, un complejo de lípidos (especialmente lípidos catiónicos) y material genético, un complejo de derivados de dextrano y material genético, etc.

En una realización, los agentes de captura de la invención se utilizan en terapia génica. En esta realización, el material genético, o uno o más vehículos de administración que contengan material genético pueden conjugarse con uno o más agentes de captura de IL-17F de la presente divulgación y administrarse a un paciente.

Los agentes terapéuticos y los agentes de captura de IL-17F aquí divulgados pueden enlazarse o fusionarse de formas conocidas, opcionalmente utilizando el mismo tipo de enlaces discutidos en otras partes de esta solicitud. Los enlaces preferidos serán cadenas alquílicas sustituidas o no sustituidas, cadenas de aminoácidos, cadenas de polietilenglicol y otros enlaces poliméricos simples conocidos en la técnica. Más preferiblemente, si el agente terapéutico es en sí mismo una proteína, para la que se conoce la secuencia de ADN codificante, la proteína terapéutica y el polipéptido de unión a IL-17F pueden coexpresarse a partir del mismo gen sintético, creado mediante técnicas de ADN recombinante, como se ha descrito anteriormente. La secuencia de codificación del polipéptido de unión a IL-17F puede fusionarse en el marco con la de la proteína terapéutica, de manera que el péptido se exprese en el amino o carboxi-terminal de la proteína terapéutica, o en un lugar entre los terminales, si se determina que dicha colocación no destruiría la función biológica requerida de la proteína terapéutica o del polipéptido de unión a IL-17F. Una ventaja particular de este enfoque general es que es posible la concatamerización de múltiples agentes de captura de IL-17F dispuestos en tándem, aumentando así el número y la concentración de sitios de unión de IL-17F asociados a cada proteína terapéutica. De esta manera, aumenta la avidez de unión de la IL-17F, lo que se esperaría que mejorara la eficacia de la proteína de fusión terapéutica recombinante.

Ejemplos

Ejemplo 1. Diseño del epítopo la IL-17F

Se examinaron las secuencias primarias de la IL-17F y la IL-17A para entender dónde hay regiones de identidad o similitud, y dónde hay diferencias. Para crear ligandos peptídicos macrocíclicos que puedan discriminar eficazmente la IL-17F de la IL-17A, se prestó atención a aquellas secuencias que son exclusivas de las dos proteínas. Las diferencias de secuencia que diferencian la IL-17F de la IL-17A se encuentran en la región N-terminal de las proteínas maduras. En la IL-17F, esta región de singularidad corresponde a Arg-31 a Thr-79 (Figura 1A).

Se sintetizaron químicamente dos epítopos polipeptídicos y se explotaron como dianas para generar ligandos peptídicos macrocíclicos específicos contra la IL-17F. Los epítopos se diseñaron con un asidero de ensayo de biotina-PEG3 y un asidero de clic de azida estratégicamente sustituida (Az4 = L-azidolisina). El lugar de sustitución del asidero de clic en cada epítopo se determinó examinando la estructura de la proteína e identificando un aminoácido (a) cuya cadena lateral esté expuesta a la superficie y no interactúe con otros átomos de la proteína, y (b) que sea químicamente similar al Az4. El epítopo 1 de la IL-17F (Phe-40 a Ser-54) está ubicado muy cerca del extremo N de la IL-17F y se sustituye por Az4 en una ubicación central (Cys-48). El epítopo 2 de la IL-17F (Gly-60 a Ser-69) se encuentra después del epítopo 1 en la secuencia primaria y se sustituye con Az4 en Ile-62. Las secuencias del Epítopo 1 y del Epítopo 2 se muestran en la Figura 1B y C.

Ejemplo 2. Detección de anclajes de macrociclo contra el epítopo 1 de la IL-17F

Se realizaron pruebas de detección utilizando una biblioteca OBOC ciclada con triazol de la forma H<2>N-Pra-Cy(XXXXX)-Met-TG (SEQ ID NO:34), donde TG = resina TentaGel® S NH<2>(S 30902, Rapp Polymere), X = uno de los diecisiete L-aminoácidos (sin Cys, Met e Ile), Pra = L-propargilglicina y Cy( ) = ciclización de triazol a través de residuos flanqueantes de Pra y Az4. Se identificaron macrociclos frente al fragmento epítopo 1 de IL-17F mediante un proceso de cribado en cuatro etapas: 1) un predespeje para eliminar ligantes inespecíficos, 2) un cribado de productos para identificar los éxitos resultantes de la química de clicin situcon epítopo, 3) un cribado de dianas frente a la proteína IL-17F marcada con His, y 4) otro cribado de dianas frente a la proteína IL-17F marcada con His en suero humano al 2% (v/v) para identificar los péptidos cuya unión a IL-17F no se ve alterada por las proteínas séricas.

Pre-aclaración.Las perlas de biblioteca hinchadas (500 mg) se bloquearon durante la noche con tampón de bloqueo (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% (p/v) BsA y 0,05% (v/v) Tween-20, pH 7,6) a 4 °C y, a continuación, se lavaron con tampón de bloqueo tres veces. Se añadió a las perlas una dilución 1:10.000 de estreptavidinafosfatasa alcalina (V559C, Promega) en 5 mL de tampón de bloqueo y se incubó con agitación suave a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, las perlas se lavaron con 3 * 3 mL de TBS (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) (1 minuto cada una), 3 * 3 mL de tampón de lavado de glicina 0,1 M, pH 2,8, 3 * 3 mL de TBS y, por último, 3 * 3 mL de tampón de fosfatasa alcalina (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCb, pH 9) (5 min cada una).

La unión se visualizó incubando las perlas en presencia de sustrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitroazul de tetrazolio (BCIP/NBT) (S3771, Promega) durante 25 minutos. Las perlas púrpuras indicaban ligantes de fondo, se retiraron con una pipeta y se desecharon. Las perlas transparentes restantes se recogieron y decoloraron con clorhidrato de guanidina 7,5 M pH 2,0 durante 30 min, se lavaron diez veces con agua y se incubaron en 1-metil-2-pirrolidinona (NMP) durante toda la noche para decolorar.

Pantalla de productos con IL-17F Epítopo I .Las perlas restantes del prelavado se lavaron con agua diez veces y con TBS tres veces. A continuación, las perlas se incubaron con 3 mL de 100 pM de fragmento del epítopo 1 de la IL-17F (Biotin-PEGa-FFQKPES(SEQ ID NO:1) [Az4]PPVPGGS)(SEQ ID NO:32) en TBS durante 1,5 h a temperatura ambiente para permitir que se produjera una reacción de clicin situ.Las perlas se lavaron con TBS diez veces y luego se incubaron con clorhidrato de guanidina 7,5 M, pH 2,0 durante 1 hora para eliminar todo el epítopo la IL-17F no unido covalentemente a las perlas. Estas perlas se lavaron con TBS diez veces y se volvieron a bloquear con tampón de bloqueo durante 2 h. Se añadió una dilución 1:10.000 de estreptavidina-fosfatasa alcalina en 5 mL de tampón de bloqueo durante 1 h para detectar la presencia del epítopo IL-17F adherido a las perlas. A continuación, las perlas se lavaron con 3 * 3 mL de TBS (1 minuto cada una), 3 * 3 mL de tampón de lavado de glicina 0,1 M y pH 2,8, 3 * 3 mL de TBS y, por último, 3 * 3 mL de tampón de fosfatasa alcalina (pH 9) (5 minutos cada una). A continuación, las perlas se revelaron con BCIP/NBT durante 25 min, como se indica en el preaclarado. Se seleccionaron con pipeta y se guardaron las perlas hit púrpuras conjugadas con epítopos. Estos resultados (25en total: 5 de color violeta oscuro, 20 de color violeta medio a claro)se trataron con clorhidrato de guanidina 7,5 M pH 2,0 durante 30 min para eliminar la estreptavidina adherida, se lavaron diez veces con agua y se incubaron en NMP durante toda la noche para decolorar.

Detección de objetivos con proteína la IL-17F marcada con His.Los éxitos de producto se lavaron con agua diez veces y se almacenaron en TBS a 4 °C. Estas 25 perlas se transfirieron a un filtro de tubo de centrífuga Corning® 8162 Costar® Spin-X® (membrana de acetato de celulosa) y se incubaron con tampón de bloqueo durante 3 h a temperatura ambiente. Las perlas se enjuagaron tres veces con tampón de bloqueo y luego se incubaron con 150 nM de proteína la IL-17F marcada con His de longitud completa (ab167911, Abcam) en tampón de bloqueo (preparación: 0,5 pL de proteína la IL-17F marcada con His en 200 pL de tampón de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de bloqueo y luego se incubaron con 500 pL de anticuerpo 1:10.000 Anti-6X His tag® [HIS-1] (conjugado con fosfatasa alcalina) (ab49746, Abcam) en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron posteriormente con 3 * 500 pL de tampón de bloqueo, 3 * 500 pL de TBS y, a continuación, 3 * 500 pL de tampón de fosfatasa alcalina (pH 9) (centrifugando a 7.000 rpm durante 30 segundos después de cada lavado). A continuación, las perlas se revelaron con BCIP/NBT durante 10 minutos. Se seleccionaron con pipeta y se guardaron las perlas de color púrpura unidas a la proteína IL-17F.20 perlas eran de color púrpura, lo que indicaba la unión tanto al epítopo IL-17 como a la proteína, mientras que 5 eran transparentes, lo que indicaba que no se unían a la proteína IL-17F.Las 20 dianas se trataron con clorhidrato de guanidina 7,5 M pH 2,0 durante 30 min para eliminar las proteínas unidas, se lavaron diez veces con agua y se incubaron en NMP durante toda la noche para decolorarlas.

Ensayo de diana con proteína IL-17F marcada con His en suero humano al 2 % (v/v)Los blancos se lavaron con agua diez veces. Estas 20 perlas se incubaron con tampón de bloqueo durante 7 h en un filtro de tubo de centrífuga Corning® 8162 Costar®Spin-X ® (membrana de acetato de celulosa). Las perlas se enjuagaron tres veces con tampón de bloqueo y luego se incubaron con 150 nM de proteína IL-17F marcada con His de longitud completa (ab167911, Abcam) en tampón de bloqueo que contenía un 2 % (v/v) de suero humano (HS-30, Omega Scientific) durante 1 h a temperatura ambiente (preparación: 1,25 pL de proteína IL-17F marcada con His 10 pL de suero filtrado 490 pL de tampón de bloqueo). Nota: Antes de la prueba, se eliminaron las partículas del suero mediante centrifugación (7.000 rpm, 30 segundos) utilizando un filtro de tubo Corning® 8162 Costar® Spin-X®. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de bloqueo y luego se incubaron con 500 pL de anticuerpo 1:10.000 Anti-6X His tag® [HIS-1] (conjugado con fosfatasa alcalina) (ab49746, Abcam) en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron posteriormente con 3 * 500 pL de tampón de bloqueo, 3 * 500 pL de TBS y, a continuación, 3 * 500 pL de tampón de fosfatasa alcalina (pH 9) (centrifugando a 7.000 rpm durante 30 segundos después de cada lavado). A continuación, las perlas se revelaron con BCIP/NBT durante 10 minutos. Se seleccionaron con una pipeta las perlas de color púrpura y se guardaron.Los 2 resultados cuya unión a la proteína la IL-17F no fue alterada por las proteínas séricasse trataron con clorhidrato de guanidina 7,5 M pH 2,0 durante 30 min para eliminar las proteínas unidas, se lavaron diez veces con agua y se incubaron en<n>M<p>durante toda la noche para decolorar. Finalmente, los 2 hits se lavaron con agua diez veces para prepararlos para el análisis de secuenciación.

La secuenciación se realizó a través de degradación de Edman en un sistema de 2 cartuchos Applied Biosystems Procise® cLC en el Laboratorio de Microanálisis de Proteínas/Péptidos en Caltech. El secuenciador Edman no pudo distinguir entre1) los residuos K (lisina) y L (leucina),y2)los residuos Q (glutamina) y T (treonina).Losresultados de la secuenciación se muestran en la Tabla 1, incluidas las variantes K/L y Q/T.

Tabla 1: Secuencias de péptidos macrocíclicos identificados contra el epítopo 1 de la IL-17F

Estos péptidos candidatos se volvieron a sintetizar en una resina escindible, se purificaron mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna C18 (Phenomenex Luna, 5|jm, 250 x 10 mm) y se comprobó su afinidad y especificidad frente a la proteína IL-17F mediante ELISA.

Datos de síntesis de los epítopos 1 de IL-17F

Cy(FYKTH)(SEQ ID NO:5)-PEG3-biotona. MALDI-MS (m/z): calculado para C<65>H<97>N<17>O<14>S (M+H) 1372,71; encontrado 1374,24.

Cy(FYKQH)(SEQ ID NO:6)-PEG3-biotona MALDI-MS (m/z): calculado para C<66>H<98>N<18>O<14>S (M+H) 1399,72; encontrado 1401,36.

Cy(FYLTH)(SEQ ID NO:7)-PEG3-biotona MALDI-MS (m/z): calculado para C<65>H<96>N<416>O<14>S (M+H) 1357,70; encontrado 1360,15.

Cy(FYLQH)(SEQ ID NO:8)-PEG3-biotona MALDI-MS (m/z): calculado para C<66>H<97>N<17>O<14>S (M+H) 1384,71; encontrado 1386,24.

Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9)-PEG3-biotona MALDI-MS (m/z): calculado para C<53>H<94>N<20>O<14>S (M+H) 1269,70; encontrado 1269,91 (Figura 2C).

Cy(RRAQS)(SEQ ID NO:10)-PEG<3>-biotona MALDI-MS (m/z): calculado para C<54>H<95>N<21>O<14>S (M+H) 1295,71; encontrado 1296,19 (Figura<2>d<).>

Ejemplo 3. Ensayosinvitrocon ligandos dirigidos al epítopo 1 de la IL-17F

Sandwich ELISA.Se recubrió una placa negra de 96 pocillos de NeutrAvidin Coated High Binding Capacity (15510, Pierce) con 2 pM de ligando peptídico macrocíclico en TBS (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) durante 2 h a temperatura ambiente. Como control, se cubrió con anti-IL17F monoclonal biotinilado (TA319597, Origene) a 4 pg/mL en TBS. La placa se aspiró y luego se lavó con TBS (5 x) y tampón de lavado (0,05 % (v/v) Tween-20 en PBS, 1 x). La proteína IL-17F marcada con His de longitud completa (ab167911, Abcam) se diluyó en serie en tampón de lavado (de 800 a 0 nM) y se incubó en los micropocillos designados durante 90 min a temperatura ambiente. Los micropocillos se aspiraron y posteriormente se lavaron con tampón de lavado (10 x). Para detectar la proteína IL-17F unida, se preparó un anticuerpo Anti-6X His tag® [HIS-1] conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (ab49746, Abcam) a una dilución de 1:10.000 y se añadió a los micropocillos durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se aspiró y se lavó con tampón de lavado (5 x). Se utilizó el sistema de sustrato fluorescente AttoPhos® AP (S1000, Promega) para desarrollar los micropocillos. Utilizando una longitud de onda de excitación de 430 nm, se registró la emisión fluorescente a 535 nm con el fotómetro DTX880 de Beckman Coulter. Las curvas de valoración se ajustaron utilizando un programa de ajuste de curvas de regresión de cuatro parámetros (Origin 8.5) para determinar los valores EC<50>.

Los resultados se muestran en la Figura 2A. Se probó la afinidad de unión de Cy(RRATS) modificado con PEG<3>-biotina (SEQ ID NO:9) y Cy(RRAQS) (SEQ ID NO:10) en un formato ELISA. Para estos ensayos, se capturó una serie de diluciones de la proteína la IL-17F marcada con His de longitud completa utilizando los ligandos peptídicos macrocíclicos inmovilizados en una placa recubierta con NeutrAvidin. Cy (RRATS) (SEQ ID NO:9) y Cy(RRAQS) (SEQ ID NO:10) exhibieron valores de EC<50>de 66 ± 9 nM y 52 ± 5 nM, respectivamente, para la proteína la IL-17F humana. Un anti-IL17F monoclonal biotinilado ensayado de forma similar muestra una afinidad de unión similar.

ELISA puntual (la IL-17F vs. ensayo de selectividad de IL-17A).Se recubrió una placa negra de 96 pocillos de NeutrAvidin Coated High Binding Capacity (15510, Pierce) con 2 pM de ligando peptídico macrocíclico en TBS (pH 7,6) durante 2 h a temperatura ambiente. La placa se aspiró y luego se lavó con TBS (5 x) y tampón de lavado (0,05 % (v/v) Tween-20 en PBS, 1 x). Las proteínas IL-17F (ab167911, Abcam) e IL-17A (ab166882, Abcam) marcadas con His de longitud completa se prepararon a 200 y 50 nM en tampón de lavado y se incubaron en los micropocillos designados durante 90 min a temperatura ambiente. Los micropocillos se aspiraron y posteriormente se lavaron con tampón de lavado (10 x). Para detectar las proteínas IL-17F e IL-17A unidas, se preparó el anticuerpo anti-6X His tag® conjugado con fosfatasa alcalina (AP) [HIS-1] (ab49746, Abcam) a una dilución de 1:10.000 y se agregó a los micropocillos durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se aspiró y se lavó con tampón de lavado (5 x). Se utilizó el sistema de sustrato fluorescente AttoPhos® AP (S1000, Promega) para desarrollar los micropocillos. Utilizando una longitud de onda de excitación de 430 nm, se registró la emisión fluorescente a 535 nm con el fotómetro DTX880 de Beckman Coulter.

Los resultados se muestran en la Figura 2B. La selectividad de Cy(RRATS) (SEQ ID NO:9) y Cy(RRAQS) (SEQ ID NO:10) modificados con PEG3-biotina se probó en un formato ELISA. Para estos ensayos, las proteínas IL-17F e IL-17A marcadas con His de longitud completa se capturaron utilizando los ligandos peptídicos macrocíclicos inmovilizados en una placa recubierta de NeutrAvidina. Tanto Cy(RRATS) (SEQ ID NO:9) como Cy(RRAQS) (SEQ ID NO:10) mostraron una selectividad de 2:1 para IL-17F en el intervalo de concentración de 200-50 nM. Estos resultados confirman la naturaleza selectiva de la estrategia de focalización de epítopos.

Ensayo para determinar la orientación de la unión del macrociclo al epítopo 1 de la IL-17F.Se recubrió una placa negra de 96 pocillos de NeutrAvidin Coated High Binding Capacity (15510, Pierce) con 2 pM de ligando peptídico macrocíclico en TBS (pH 7,6) durante 2 h a temperatura ambiente. Como control, se cubrió con anti-IL17F monoclonal biotinilado (TA319597, Origene) a 4 pg/mL en TBS. La placa se aspiró y luego se lavó con TBS (5 x) y tampón de lavado (0,05 % (v/v) Tween-20 en PBS, 1 x). Se prepararon epítopos de IL-17F marcados con His sintetizados químicamente a 2 pM en tampón de lavado y se incubaron en los micropocillos designados durante 90 min a temperatura ambiente. Como control se añadió tampón de lavado sin epítopo. Los micropocillos se aspiraron y posteriormente se lavaron con tampón de lavado ( l0 *). Para detectar los epítopos de IL-17F unidos, se preparó un anticuerpo Anti-6X His tag® [HIS-1] conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (ab49746, Abcam) en dilución 1:10.000 y se añadió a los micropocillos durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se aspiró y se lavó con tampón de lavado (5 *). Se utilizó el sistema de sustrato fluorescente AttoPhos® AP (S1000, Promega) para desarrollar los micropocillos. Utilizando una longitud de onda de excitación de 430 nm, se registró la emisión fluorescente a 535 nm con el fotómetro DTX880 de Beckman Coulter. Los datos se muestran después de restar el fondo sin epítopo.

Los resultados se muestran en la Figura 3. Para este experimento, el epítopo 1 IL-17F se resintetizó con un asidero de ensayo His6 y una sustitución C48S en lugar de un asidero de clic. Se sintetizaron dos epítopos adicionales de IL-17F etiquetados con His que contenían codificación estratégica de las secuencias N-terminal o C-terminal a C48S. Se realizaron ELISA puntuales para los tres epítopos de IL-17F marcados con His frente a los ligandos peptídicos macrocíclicos inmovilizados. Para Cy(RRATS) modificado con PEG3-biotina (SEQ ID NO:9) y Cy(RRAQS) (SEQ ID NO:10), se obtuvieron señales ELISA positivas para el epítopo 1 la IL-17F marcado con His (C48S) y el epítopo revuelto C-terminal al asidero de clic (barras negras y rojas). La unión se destruyó cuando el epítopo se codificó N-terminal al asidero de clic (barras azules). Por lo tanto, los ligandos peptídicos macrocíclicos muestran una unión preferencial a la secuencia FFQKPES (SEQ ID NO: 1) dentro del epítopo 1 de la IL-17F (C48S). Por otra parte, el anticuerpo monoclonal biotinilado anti-IL17F no mostró una unión apreciable a los epítopos la IL-17F marcados con His, ya que se generó contra un inmunógeno proteico.

En resumen, los resultados de las Figuras 2-3 confirman que la estrategia de selección de epítopos produjo ligandos peptídicos macrocíclicos de afinidad inferior a 100 nM que reconocen selectivamente los epítopos de IL-17F, así como la proteína completa.

Ejemplo 4. Cribado del anclaje macrociclo contra el epítopo 2 IL-17F.

Se realizaron pruebas de detección de manera similar para identificar el fragmento del epítopo 2 de la IL-17F (biotina-PEG3-GI[Az4]NENQRVS) (SEQ ID NO: 33) utilizando la biblioteca OBOC ciclada con triazol de la forma H<2>N-Pra-Cy(XXxXx)-Met-TG (SEQ ID NO: 34). Los macrociclos se identificaron frente al fragmento epítopo 2 de IL-17F mediante el proceso de cribado en cuatro etapas mencionado anteriormente: 1) un predespeje para eliminar ligantes inespecíficos, 2) un cribado de productos para identificar los éxitos resultantes de la química clicin situdel epítopo, 3) un cribado de dianas frente a la proteína IL-17F marcada con His, y 4) cribados de dianas adicionales frente a la proteína IL-17F marcada con His en suero humano al 1%-5% (v/v) para identificar los péptidos cuya unión a IL-17F no se ve alterada por las proteínas séricas.

Pantalla de productos con IL-17F epítopo 2.La selección del producto se realizó con 3 mL de 100 pM del fragmento del epítopo 2 de la IL-17F (Biotina-PEGa-GI[Az4]NENQRVS) (SEQ ID NO:33) en TBS durante 1,5 h a temperatura ambiente para permitir que se produjera una reacción de clicin situ.Las perlas se lavaron con TBS diez veces y luego se incubaron con clorhidrato de guanidina 7,5 M, pH 2,0 durante 1 hora para eliminar todo el epítopo la IL-17F no unido covalentemente a las perlas. Estas perlas se lavaron con TBS diez veces y se volvieron a bloquear con tampón de bloqueo durante 2 h. Se añadió una dilución 1:10.000 de estreptavidina-fosfatasa alcalina en 5 mL de tampón de bloqueo durante 1 h para detectar la presencia del epítopo IL-17F adherido a las perlas. A continuación, las perlas se lavaron con 3 * 3 mL de TBS (1 minuto cada una), 3 * 3 mL de tampón de lavado de glicina 0,1 M y pH 2,8, 3 * 3 mL de TBS y, por último, 3 * 3 mL de tampón de fosfatasa alcalina (pH 9) (5 minutos cada una). A continuación, las perlas se revelaron con BCIP/NBT durante 25 min, como se indica en el preaclarado. Se seleccionaron con pipeta y se guardaron las perlas hit púrpuras conjugadas con epítopos. Estos resultados(98 en total: 50 púrpura oscuro, 48 púrpura medio a claro)se trataron con clorhidrato de guanidina 7,5 M pH 2,0 durante 30 minutos para eliminar la estreptavidina adherida, se lavaron diez veces con agua y se incubaron en NMP durante la noche para decolorarlos.

Detección de objetivos con proteína la IL-17F marcada con His.Los éxitos de producto se lavaron con agua diez veces y se almacenaron en TBS a 4 °C. Estas 98 perlas se transfirieron a un filtro de tubo de centrífuga Corning® 8162 Costar® Spin-X® (membrana de acetato de celulosa) y se incubaron con tampón de bloqueo durante 3 h a temperatura ambiente. Las perlas se enjuagaron tres veces con tampón de bloqueo y luego se incubaron con 150 nM de proteína la IL-17F marcada con His de longitud completa (ab167911, Abcam) en tampón de bloqueo (preparación: 0,5 pL de proteína la IL-17F marcada con His en 200 pL de tampón de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de bloqueo y luego se incubaron con 500 pL de anticuerpo 1:10.000 Anti-6X His tag® [HIS-1] (conjugado con fosfatasa alcalina) (ab49746, Abcam) en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron posteriormente con 3 * 500 pL de tampón de bloqueo, 3 * 500 pL de TBS y, a continuación, 3 * 500 pL de tampón de fosfatasa alcalina (pH 9) (centrifugando a 7000 rpm durante 30 segundos después de cada lavado). A continuación, las perlas se revelaron con BCIP/NBT durante 10 minutos. Se seleccionaron con pipeta y se guardaron las perlas de color púrpura unidas a la proteína IL-17F.53 perlas eran de color púrpura, lo que indicaba la unión tanto al epítopo IL-17 como a la proteína, mientras que 40 eran transparentes, lo que indicaba que no se unían a la proteína IL-17F.Las 53 dianas se trataron con clorhidrato de guanidina 7,5 M pH 2,0 durante 30 min para eliminar las proteínas unidas, se lavaron diez veces con agua y se incubaron en NMP durante toda la noche para decolorarlas.

Ensayo de diana con proteína IL-17F marcada con His en suero humano al 1% (v/v).Los blancos se lavaron con agua diez veces. Estas 53 perlas se incubaron con tampón de bloqueo durante 7 h en un filtro de tubo de centrífuga Corning® 8162 Costar®Spin-X ® (membrana de acetato de celulosa). Las perlas se enjuagaron tres veces con tampón de bloqueo y luego se incubaron con 150 nM de proteína IL-17F marcada con His de longitud completa (ab167911, Abcam) en tampón de bloqueo que contenía 1 % (v/v) de suero humano (HS-30, Omega Scientific) durante 1 h a temperatura ambiente (preparación: 1,25 pL de proteína IL-17F marcada con His 5 pL de suero filtrado 495 pL de tampón de bloqueo). Nota: Antes de la prueba, se eliminaron las partículas del suero mediante centrifugación (7.000 rpm, 30 segundos) utilizando un filtro de tubo Corning® 8162 Costar® Spin-X®. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de bloqueo y luego se incubaron con 500 pL de anticuerpo 1:10.000 Anti-6X His tag® [HIS-1 ] (conjugado con fosfatasa alcalina) (ab49746, Abcam) en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron posteriormente con 3 * 500 pL de tampón de bloqueo, 3 * 500 pL de TBS y, a continuación, 3 * 500 pL de tampón de fosfatasa alcalina (pH 9) (centrifugando a 7.000 rpm durante 30 segundos después de cada lavado). A continuación, las perlas se revelaron con BCIP/NBT durante 10 minutos. Se seleccionaron con una pipeta las perlas de color púrpura y se guardaron. Las23 respuestas positivas cuya unión a la IL -17Fproteína no se vio alterada p o r las proteínasséricas se trataron con clorhidrato de guanidina 7,5 M pH 2,0 durante 30 min para eliminar las proteínas unidas, se lavaron diez veces con agua y se incubaron en NMP durante toda la noche para decolorarlas.

Detección selectiva con proteína la IL-17F marcada con His en suero humano al 5 % (v/v) para refinar el número de resultados.Las 23 perlas se lavaron con agua diez veces y después se incubaron con tampón de bloqueo durante 7 h en un filtro de tubo decentrífuga Corning® 8162 Costar® Spin-X® (membrana de acetato de celulosa). Las perlas se enjuagaron tres veces con tampón de bloqueo y luego se incubaron con 150 nM de proteína IL-17F marcada con His de longitud completa (ab167911, Abcam) en tampón de bloqueo que contenía 5 % (v/v) de suero humano (HS-30, Omega Scientific) durante 1 h a temperatura ambiente (preparación: 1,25 pL de proteína IL-17F marcada con His 25 pL de suero filtrado 475 pL de tampón de bloqueo). Nota: Antes de la prueba, se eliminaron las partículas del suero mediante centrifugación (7.000 rpm, 30 segundos) utilizando un filtro de tubo Corning® 8162 Costar® Spin-X®. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de bloqueo y luego se incubaron con 500 pL de anticuerpo 1:10.000 Anti-6X His tag® [HIS-1] (conjugado con fosfatasa alcalina) (ab49746, Abcam) en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron posteriormente con 3 * 500 pL de tampón de bloqueo, 3 * 500 pL de TBS y, a continuación, 3 * 500 pL de tampón de fosfatasa alcalina (pH 9) (centrifugando a 7.000 rpm durante 30 segundos después de cada lavado). A continuación, las perlas se revelaron con BCIP/NBT durante 10 minutos. Se seleccionaron con una pipeta las perlas de color púrpura y se guardaron. Los6 resultados cuya unión a la pro te ína la IL -17F no fue alterada p o r las prote ínas séricasse trataron con clorhidrato de guanidina 7,5 M pH 2,0 durante 30 min para eliminar las proteínas unidas, se lavaron diez veces con agua y se incubaron en NMP durante toda la noche para decolorar. Finalmente, los 6 hits se lavaron con agua diez veces para prepararlos para el análisis de secuenciación.

La secuenciación se realizó mediante degradación de Edman. El secuenciador Edman no pudo distinguir entre 1)los residuos K (lisina) y L (leucina),y 2)los residuos Q (glutamina) y T (treonina).Los resultados de la secuenciación se muestran en la Tabla 2, incluidas las variantes K/L y Q/T.

Tabla 2: Secuencias de péptidos macrocíclicos identificados frente al epítopo 2 de la IL-17F

Estos péptidos candidatos se resintetizaron en una resina escindible, se purificaron mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna C18 y se probaron contra la proteína la IL-17F mediante ELISA.

Datos de síntesis de los Epítopos 2 de IL-17F

Cy(KYGEV)(SEQ ID NO:11)-PEG3-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<58>H<93>N<15>O<15>S (M+H) 1272,67; encontrado 1274,02.

Cy(LYGEV)(SEQ ID NO:12)-PEG3-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<58>H<92>N<14>O<13>S (M+H) 1257,66; encontrado 1259,13.

Cy(VHKSG)(SEQ ID NO:13)-PEG3-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<53>H<89>N<17>O<13>S (M+H) 1204,65; encontrado 1206,20.

Cy(VHLSG)(SEQ ID NO:14)-PEG3-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<53>H<88>N<16>O<13>S (M+H) 1189,64; encontrado 1191,11.

Cy(QKHGP)(SEQ ID NO:15)-PEG3-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<55>H<90>N<18>O<13>S (M+H) 1243,67; encontrado 1245,18.

Cy(TKHGP)(SEQ ID NO:16)-PEG<3>-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<54>H<89>N<17>O<13>S (M+H) 1216,65; encontrado 1218,25.

Cy(QLHGP)(SEQ ID NO:17)-PEG3-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<55>H<89>N<17>O<13>S (M+H) 1228,65; encontrado 1228,84.

Cy(TLHGP)(SEQ ID NO:18)-PEG3-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<54>H<88>N<16>O<13>S (M+H) 1201,64; encontrado 1201,73.

Cy(YDLQR)(SEQ ID NO:19)-PEG<3>-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<61>H<98>N<18>O<16>S (M+H) 1371,71; encontrado 1372,16.

Cy(YDLTR)(SEQ ID NO:20)-PEG3-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<60>H<97>N<17>O<16>S (M+H) 1344,70; encontrado 1345,13.

Cy(YDKQR)(SEQ ID NO:21)-PEG3-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<61>H<99>N<19>O<16>S (M+H) 1386,72; encontrado 1387,00.

Cy(YDKTR)(SEQ ID NO:22)-PEG3-biotina. MALDI-MS (m/z): calculado para C<60>H<98>N<18>O<16>S (M+H) 1359,71; encontrado 1359,94.

Biotina-PEG3-Cy(KKGWP) (SEQ ID NO: 23). MALDI-MS (m/z): calculado para C<59>H<91>N<17>O<13>S (M+H) 1278,67; encontrado 1278,83.

Biotina-PEG3-Cy(KLGWP)(SEQ ID NO:24). MALDI-MS (m/z): calculado para C<59>H<90>N<16>O<13>S (M+H) 1263,66; encontrado 1263,92.

Biotina-PEG3-Cy(LKGWP) (SEQ ID NO: 25). MALDI-MS (m/z): calculado para C<59>H<90>N<16>O<13>S (M+H) 1263,66; encontrado 1263,86.

Biotina-PEG3-Cy(LLGWP) (SEQ ID NO: 26). MALDI-MS (m/z): calculado para C<59>H<89>N<15>O<13>S (M+H) 1248,65; encontrado 1248,89.

Biotina-PEG3-Cy(RSYNL) (SEQ ID NO: 27). MALDI-MS (m/z): calculado para C<57>H<90>N<18>O<16>S (M+H) 1315,65; encontrado 1315,95.

Biotina-PEG3-Cy(RSYNK) (SEQ ID NO: 28). MALDI-MS (m/z): calculado para C<57>H<91>N<19>O<16>S (M+H) 1330,66; encontrado 1331,06.

Ejemplo 5. Ensayosinvitrocon ligandos dirigidos al epítopo 2 de la IL-17F

ELISA sándwich.Estos ensayos se realizaron utilizando el mismo protocolo que se utilizó para evaluar los ligandos específicos del epítopo 1 de la IL-17F.

Los resultados se muestran en la Figura 4A: La afinidad de unión de Cy(QKHGP) (SEQ ID NO:15), Cy(TKHGP) (SEQ ID NO:16), Cy(KKGWP) (SEQ ID NO:23) y Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) modificados con PEGa-biotina se probó en un formato ELISA. Para estos ensayos, se capturó una serie de diluciones de la proteína la IL-17F marcada con His de longitud completa utilizando los ligandos peptídicos macrocíclicos inmovilizados en una placa recubierta con NeutrAvidin. Cy(QKHGP) (SEQ ID NO: 15) y Cy(TKHGP) (SEQ ID NO: 16) exhibieron valores de EC<50>de 64 ± 10 nM y 72 ± 16 nM, respectivamente, para la proteína la IL-17F humana. Cy(KKGWP) (SEQ ID NO:23) y Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) exhibieron valores de EC<50>de 24 ± 3 nM y 15 ± 5 nM, respectivamente, para la proteína la IL-17F humana. Curiosamente, Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) supera la afinidad de unión del anti-IL17<f>monoclonal biotinilado ensayado de forma similar.

ELISA puntual (la IL-17F vs. ensayo de selectividad de IL-17A).Se recubrió una placa negra de 96 pocillos de NeutrAvidin Coated High Binding Capacity (15510, Pierce) con 2 pM de ligando peptídico macrocíclico en TBS (pH 7,6) durante 2 h a temperatura ambiente. Como control, se cubrió con anti-IL17F monoclonal biotinilado (TA319597, Origene) a 4 pg/mL en TBS. La placa se aspiró y luego se lavó con TBS (5 *) y tampón de lavado (0,05 % (v/v) Tween-2o en PBS, 1 *). Las proteínas IL-17F (ab167911, Abcam) e IL-17A (ab166882, Abcam) marcadas con His de longitud completa se prepararon a 100 nM en tampón de lavado y se incubaron en los micropocillos designados durante 90 min a temperatura ambiente. Los micropocillos se aspiraron y posteriormente se lavaron con tampón de lavado (10 *). Para detectar las proteínas IL-17F e IL-17A unidas, se preparó el anticuerpo anti-6X His tag® conjugado con fosfatasa alcalina (AP) [HIS-1] (ab49746, Abcam) a una dilución de 1:10.000 y se agregó a los micropocillos durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se aspiró y se lavó con tampón de lavado (5 *). Se utilizó el sistema de sustrato fluorescente AttoPhos® AP (S1000, Promega) para desarrollar los micropocillos. Utilizando una longitud de onda de excitación de 430 nm, se registró la emisión fluorescente a 535 nm con el fotómetro DTX880 de Beckman Coulter.

Los resultados se muestran en la Figura 4B. La selectividad de Cy(QKHGP) (SEQ ID NO:15), Cy(TKHGP) (SEQ ID NO:16), Cy(KKGWP) (SEQ ID NO:23) y Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) modificados con PEGa-biotina se probó en un formato ELISA. Para estos ensayos, las proteínas IL-17F e IL-17A marcadas con His de longitud completa se capturaron utilizando los ligandos peptídicos macrocíclicos inmovilizados en una placa recubierta de NeutrAvidina. Tanto Cy(KKGWP) (SEQ ID NO:23) como Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) mostraron una selectividad de 4:1 para IL-17F a 100 nM. Otros ligandos, incluidos Cy(QKHGP) (SEQ ID NO:15) y Cy(TKHGP) (SEQ ID NO:16), y los anti-IL17F monoclonales biotinilados muestran una selectividad aún mayor (casi absoluta) para la IL-17F. Una vez más, estos resultados confirman la naturaleza selectiva de la estrategia de selección de epítopos.

Ejemplo 6. Diseño de un ligador para unir covalentemente dos ligandos macrocíclicos

La estructura terciaria de la proteína IL-17F se explotó posteriormente como andamiaje para desarrollar un agente PCC biligando que presenta una verdadera unión cooperativa (rango de K<d>de < 1 nM). Se unieron covalentemente combinaciones de dos macrociclos para crear un agente PCC biligando que muestra una alta avidez por los dos epítopos.

En este proceso es importante el diseño de un enlazador adecuado para salvar la distancia entre los dos epítopos de la proteína. La estructura cristalina 3-D de IL-17F (PDB ID: 1JPY) se analizó en PyMOL (DeLano Scientific) para identificar las distancias entre el epítopo 1 de IL-17F y el epítopo 2 de IL-17F (Figura 5). En el epítopo 1 de la IL-17F, la atención se centró en la secuencia FFQKPES (SEQ ID NO:1) porque se determinó que los macrociclos Cy(RRATS) (SEQ ID NO:9) y Cy(RRAQS) (SEQ ID NO: 10) interactuaban preferentemente con esta región (Figura 3). La secuencia NENQRVS (SEQ ID NO:3) dentro del epítopo 2 de la IL-17F fue la región de unión supuesta para los macrociclos Cy(QKHGP) (SEQ ID NO: 15), Cy(TKHGP) (SEQ ID NO:16), Cy(KKGWP) (SEQ ID NO:23) y Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) debido a la ubicación N-terminal del asidero de clic. Dado que la IL-17F existe de forma nativa como homodímero, se midieron las distancias entre los dos epítopos dentro de uno y a través de ambos monómeros. En la proteína la IL-17F monomérica, la secuencia FFQKPEs (SEQ ID NO: 1) (en el epítopo 1 de la IL-17F) y el epítopo 2 de la IL-17F están separados por ~15 A. Por lo tanto, un enlace químico de ~15 A sería útil para unir covalentemente un macrociclo dirigido al epítopo 1 de la IL-17F y un macrociclo dirigido al epítopo 2 de la IL-17F. Los biligandos cooperativos resultantes serían útiles para la detección o el tratamiento de la IL-17F y el heterodímero la IL-17A/F. En la proteína IL-17F homodimérica, la secuencia FFQKPES (SEQ ID NO:1) (en el epítopo 1 de IL-17F) de un monómero y el epítopo 2 de IL-17F del otro monómero están separados por ~7 A. Así, un enlazador químico de ~7 A sería útil para unir covalentemente un macrociclo dirigido al Epítopo 1 de IL-17F y un macrociclo dirigido al Epítopo 2 de IL-17F. Los biligandos cooperativos resultantes serían útiles para la detección o el tratamiento de la IL-17F.

Ejemplo 7. Síntesis de candidatos a biligandos cooperativos

Los candidatos a biligandos cooperativos se sintetizaron con un enlazador de longitud variable que unía covalentemente un macrociclo del Epítopo 1 de IL-17F con un macrociclo del Epítopo 2 de IL-17F. El conector que conecta los dos macrociclos fue un único aminoácido pegilado (Fmoc-NH-PEGx-ácido propiónico; x = 1 a 5) o glicina (Gly). Se eligió un enlazador PEG porque está disponible en varias longitudes que unirían la distancia de 7 -15 A entre los dos epítopos de la proteína. También se espera que el PEG muestre propiedades anti incrustaciones biológicas.

Primero se generaron candidatos biligandos cooperativos a partir de Cy(RRATS) (SEQ ID NO:9) (dirigido al epítopo 1 de la IL-17F) y Cy(QKHGP) (SEQ ID NO: 15) (dirigido al epítopo 2 de la IL-17F). Se priorizó Cy(QKHGP) (SEQ ID NO:15) debido a su alta selectividad para la IL-17F. Las estructuras de los candidatos a biligando cooperativo Biotin-PEG<3>-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9)-PEG<x>-Cy(QKHGP)(SEQ ID NO:15) se muestran en la Figura 6. Los candidatos a biligando cooperativo también se generaron a partir de Cy(RRATS) (SEQ ID NO:9) (dirigido al epítopo 1 de la IL-17F) y Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) (dirigido al epítopo 2 de la IL-17F). Se priorizó Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) debido a su alta afinidad por la IL-17F.

Ejemplo 8. Interleucina 17F (IL17F): utilice la estructura cristalina y los datos del ensayo PCC para estimar la distancia entre los dos ligandos y seleccione el mejor enlazador a partir de esa información.

La Figura 10 muestra la similitud de secuencia de la IL-17F y la IL-17A. La Figura 11 muestra la generación de ligandos para la IL-17F y la IL-17A. Los PCC de biligando se crearon para la IL-17F que se unió a dos epítopos distintos, mientras que los PC de monoligando se crearon para la IL-17A. La Figura 12A proporciona la estructura completa de la IL-17<f>(PDB: 1JPY). A la izquierda del dibujo se muestran dos epítopos L1 y L2 dirigidos por PCC. Estos son dos epítopos que distinguen la IL-17F de la IL-17A. Obsérvese que estos epítopos no son adyacentes a la secuencia, sino que están próximos dentro de la estructura plegada de la proteína. La Figura 12B es una vista ampliada de la región diana de la proteína (a partir de la estructura cristalina), y se dibujan las ubicaciones de unión y las secuencias de dos ligandos macrocíclicos PCC diana del epítopo. Cada uno de los PCC exhibe valores de K<d>en el rango de 15 - 70 nM.

Los PCC Cy(RRATS) (SEQ ID NO:9) (dirigidos al epítopo 1 de la IL-17F) y Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) (dirigidos al epítopo 2 de la IL-17F) se construyeron con asideros químicos para su posterior elaboración. Cy(RSYNK) (SEQ ID NO:28) se priorizó en base a su alta afinidad por la IL-17F (K<d>= 15 nM). La distancia entre esos asideros químicos, cuando los PCC están unidos a la IL-17F, es de unos 15 A. Esto predice que un enlazador optimizado que conecte los dos PCC tendrá una longitud cercana a los 15 A. En la Figura 12<c>esa predicción se valida probando enlaces basados en oligómeros de polietilenglicol (PEG) de longitudes variables. Cuando los dos PCC se unen covalentemente entre sí utilizando el oligómero de PEG de longitud más cercana a 15 A, el biligando resultante Cy(RSYNK)(SEQ ID NO:28)-PEG<3>-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9) exhibe un valor de K<d>de 250 pM contra la IL-17F. Esto representa una mejora de >100 veces en afinidad en relación con los ligandos macrocíclicos PCC individuales. Los enlaces más cortos o largos producen afinidades biligando que, aunque mejoran con respecto a cualquiera de los monoligandos, son unas ~10 veces inferiores a las del enlazador óptimo.

Las estructuras de los candidatos a biligando Biotina-PEG<3>-Cy(RSYNK)(SEQ ID NO:28)-PEG<x>-Cy(RRATS)(SEQ ID NO:9) (x = 1 a 5) se muestran en la Figura 13.

Ejemplo 9. Enlace de los dos ligandos utilizando los mejores conocimientos disponibles, dando como resultado un biligando con afinidad mejorada respecto a los ligandos individuales.

Los ligandos biligandos a la IL-17F con enlaces más cortos (PEG<1>, PEG<2>) o más largos (PEG<4>, PEG<5>) que 15 A presentan valores de K<d>de 1 - 4 nM frente a la IL-17F. Estos valores representan una mejora de 5 a 25 veces en la afinidad en relación con los ligandos macrocíclicos de PCC individuales.

La Proteína-2 rica en histidina de Plasmodium falciparum (Pf.HRP-2) es una proteína no estructurada, pero tiene muchos epítopos que se repiten en toda la estructura. Se desarrolló una serie de PCC contra varios epítopos Pf.HRP-2. El mapa de secuencia de Pf. HRP-2 se proporciona en la Fig. 14.

El péptido cíclico Cy(YKYYR) (SEQ ID NO:29) se desarrolló contra el epítopo AHHAHHAAD (SEQ ID NO:35). Cy(YKYYR) (SEQ iD NO:29) exhibe una EC<50>de 220 nM. Debido a la cantidad de repeticiones de epítopos, se buscó un aglutinante cooperativo simplemente uniendo dos PCC Cy(YKYYR) (SEQ ID NO:29) junto con un enlazador de aproximadamente 1,5 nm de largo. El biligando enlazado resultante exhibió una EC<50>de 20 nM (Fig. 15).

El PCC cíclico con secuencia variable GWNVDL (SEQ ID NO:30) se desarrolló contra la secuencia C-terminal de Pf.HRP-2 (AHHATDAHHAAAHHEAATHCL) (SEQ ID NO:36) (EC<50>= 50 nM). Se desarrolló un conector entre este PCC y el YKYYR cíclico (SEQ ID NO: 29) (ver arriba; EC<50>= 220 nM) mediante el análisis de una biblioteca de 10.000 elementos de moléculas de conector de longitud variable. El biligando resultante exhibió una EC<50>de 540 pM, lo que representa una mejora de 100 veces sobre el mejor de los dos componentes del ligando (Figura 16).

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES 1. Un agente de captura sintético estable que se une específicamente a la IL-17F, en donde el agente de captura comprende un primer ligando con afinidad por un primer epítopo de la IL-17F, un segundo ligando con afinidad por un segundo epítopo de la IL-17F, y un enlazador que conecta covalentemente el primer ligando con el segundo ligando, en donde el primer epítopo comprende la secuencia de aminoácidos FFQKPES, en donde el segundo epítopo comprende la secuencia de aminoácidos NENQRVS, en donde el agente de captura es selectivo para la IL-17F frente a la IL-17A, en donde el primer ligando es cíclico, en donde el segundo ligando es cíclico, en donde la longitud del enlazador es de ~8,8 A a ~26,4 A o de ~7 A a ~15 A, en donde el primer ligando comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. FYKTH; b. FYKQH; c. FYLTH; d. FYLQH; e. RRATS; y f. RRAQS, y en donde el segundo ligando comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. KYGEV; b. LYGEV; c. VHKSG; d. VHLSG; e. QKHGP; f. TKHGP; g. QLHGP; h. TLHGP; i. YDLQR; j. YDLTR; k. YDKQR; l. YDKTR; m. KKGWP; n. KLGWP; o. LKGWP; p. LLGWP; q. RSYNL; y r. RSYNK.
2. 2. El agente de captura de la reivindicación 1, en donde el primer epítopo comprende la secuencia de aminoácidos FFQKPESCPPVPGG.
3. 3. El agente de captura de la reivindicación 1, en donde el segundo epítopo comprende la secuencia de aminoácidos GIINENQRVS.
4. 4. El agente de captura de la reivindicación 1, en donde el primer ligando comprende un residuo de 1,2,3-triazol sustituido en 1,4 (Tz4) o un residuo de 1,2,3-triazol sustituido en 1,5 (Tz5).
5. 5. El agente de captura de la reivindicación 1, en donde el segundo ligando comprende un residuo de 1,2,3-triazol sustituido en 1,4 (Tz4) o un residuo de 1,2,3-triazol sustituido en 1,5 (Tz5).
6. 6. El agente de captura de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el enlazador es divalente.
7. 7. El agente de captura de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el enlazador comprende una o más unidades repetidas de etilenglicol o en donde el enlazador comprende un péptido.
8. 8. El agente de captura de la reivindicación 1, en donde el primer ligando comprende la secuencia RRATS y el segundo ligando comprende la secuencia QKHGP o RSYNK.
9. 9. El agente de captura de la reivindicación 1, en donde el primer y el segundo ligando comprenden un residuo Tz4, y además opcionalmente en donde el enlazador es PEG<1>, PEG<2>, PEG<3>, PEG<4>o PEG<5>.
10. 10. El agente de captura de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente de captura está marcado con una fracción detectable, en donde la fracción detectable se selecciona del grupo que consiste en biotina, cobre-DOTA, biotina-PEG3, aminooxiacetato, 19FB, 18FB y FITC-PEG<3>, o en donde la fracción detectable se selecciona del grupo que consiste en 64Cu DOTA, 68Ga DOTA, 68Ga NOTA, 18F, Al18F NOTA, 64Cu, 61Ga, 89Zr, 124I, 86Y, 94mTc, 110mIn, 11C y 76Br.
11. 11. El agente de captura de la reivindicación 1, que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste en: a.

    b.

    c.