ES3021707T3 - A method for producing a decellularized tissue scaffold - Google Patents

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Grace Stevenson
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Tissue Regenix Ltd
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Abstract

La invención se refiere a un método para producir un andamio tisular descelularizado. También se refiere a un andamio tisular producido mediante dicho método. En particular, andamios tisulares porcinos. El método comprende niveles reducidos de detergente aniónico y evita el uso de inhibidores de proteasas de origen animal para producir un andamio tisular con propiedades favorables. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Un método para producir un andamio tisular descelularizado
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para producir un andamio tisular descelularizado.
Antecedentes
Los injertos de tejido blando de origen animal o humano se usan en una variedad de procedimientos médicos para reparar o reemplazar quirúrgicamente el tejido blando. Por ejemplo, tales injertos pueden usarse para reparar o reconstruir tejido en la reparación de hernias, el prolapso de órganos pélvicos o la reconstrucción de ligamentos.
Para que el tejido humano (aloinjerto) o el tejido animal (xenoinjerto) se use como un andamio tisular seguro y efectivo, es necesario garantizar que el injerto esté libre de bacterias y virus, esté descelularizado y esté libre de ADN para evitar el rechazo del injerto, y conserve las propiedades funcionales del tejido nativo del que se deriva, que incluyen las propiedades biomecánicas y la capacidad de funcionar como una matriz extracelular (ECM).
Se conoce en la técnica que el uso de detergentes aniónicos tales como dodecil sulfato de sodio (SDS) además de uno o más inhibidores de proteasas es altamente efectivo para descelular el tejido blando al tiempo que se mantiene su estructura de ECM para crear un andamio biológico efectivo (documento EP1392372B1). Sin embargo, el SDS, incluso a concentraciones relativamente bajas, es altamente citotóxico, lo que puede provocar el fracaso en la biocompatibilidad del injerto debido a que los residuos del detergente se conservan en el injerto. Adicionalmente, ciertos inhibidores de proteasas, tales como la aprotinina, a menudo son de origen animal, lo que se asocia con el riesgo de exponer al injerto receptor a enfermedades zoonóticas (por ejemplo, encefalopatías espongiformes transmisibles, que incluyen la encefalopatía espongiforme bovina), lo que es inaceptable en el contexto de los productos médicos.
Un problema adicional con los métodos de procesamiento actuales es la eliminación efectiva de virus de los injertos mismos, cuando se usa tejido no humano. Es importante garantizar que el injerto biológicamente sea seguro mediante la reducción de patógenos zoonóticos potenciales (por ejemplo, virus parvo porcino (PPV) y retrovirus endógenos porcinos (PERV)) a niveles seguros. Por esta razón, el tejido animal debe exponerse a un proceso de desinfección/esterilización que ha demostrado reducir la zoonosis hasta 6 log. Sin embargo, una reducción de esta magnitud no se logra típicamente mediante métodos de esterilización tradicionales, por ejemplo, la irradiación gamma a una dosis de 25 kGy.
La presente invención tiene como objetivo proporcionar un método mejorado para producir un andamio tisular descelularizado que supere o mejore parcialmente los problemas asociados con los métodos conocidos en la técnica.
En términos de la técnica anterior, el documento de Stapleton Thomas W. y otros: "Development and Characterization of an Acellular Porcine Medial Meniscus for Use in Tissue Engineering", TISSUE ENGINEERING PART A, vol. 14, núm. 4, 1 de abril de 2008 (01-04-2008), páginas 505-518, ISSN: 1937-3341, DOI: 10.1089/tea.2007.0233, describe el desarrollo y la caracterización de un material acelular, en donde los meniscos porcinos frescos se descelularizaron al exponer el tejido a ciclos de congelación-descongelación, incubación en tampón tris hipotónico, dodecil sulfato de sodio al 0,1 % (p/v) en tampón hipotónico más inhibidores de proteasas, nucleasas, tampón hipertónico seguido de desinfección mediante el uso de ácido peracético al 0,1 % (v/v) y lavado final en solución salina tamponada con fosfato.
El documento US 2010/152852 A1 describe la preparación de tejido meniscal donante que comprende las etapas de:
(i) ultrasonido del tejido en una solución tamponada;
(ii) congelar y descongelar el tejido;
(iii) incubar el tejido en una solución hipotónica;
(iv) incubar el tejido en una solución hipotónica que comprende un detergente aniónico;
(v) repetir las etapas (iii) y (iv);
(vi) incubar el tejido en una solución que comprende al menos una enzima nucleasa; y
(vii) lavar el tejido con un agente oxidante.
El documento US 2003/087428 A1 describe un proceso para preparar un injerto de tejido blando acelular para la implantación, que comprende extraer una muestra de tejido blando dentro de una solución tamponada hipotónica ligeramente alcalina de una endonucleasa que comprende un detergente no iónico para producir tejido extraído, tratar opcionalmente el tejido con una solución salina tamponada hipertónica, tratar con una solución salina tamponada hipotónica de dodecil sulfato de sodio, tratar opcionalmente el tejido con una solución salina tamponada hipertónica, lavar con agua ultrapura seguido de una solución de agua de dióxido de cloro, y almacenar un injerto de tejido blando acelular en una solución de almacenamiento que comprende solución salina isotónica, dióxido de cloro o isopropanol al 70 %.
El documento US 2018/361023 A1 describe partículas que comprenden omento descelularizado, en donde la descelularización se lleva a cabo mediante: (a) exponer el omento a una solución hipotónica; (b) deshidratar el omento siguiendo la etapa (a); (c) extraer grasa del omento deshidratado mediante el uso de agentes de extracción polares y no polares siguiendo la etapa (b); (d) rehidratar el omento deshidratado siguiendo la etapa (c); y (e) extraer células del omento rehidratado siguiendo la etapa (d).
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un método para producir un andamio tisular descelularizado, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante en donde el agente deslipidizante es un solvente polar;
• incubar el tejido con un detergente aniónico;
• incubar el tejido al menos una vez con una solución hipotónica y al menos una vez con una solución hipertónica, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado; en donde el tejido de partida se selecciona del grupo que consiste en: piel, menisco, tendón, ligamento, cartílago, músculo y vaso sanguíneo.
El tema de la presente descripción denominado como aquel que 'se apreciará', que es 'por ejemplo' o como que se 'describe en la presente descripción' puede no ser necesariamente parte de la invención reivindicada como tal, que se define por las reivindicaciones, pero se considera útil para comprender o interpretar la invención.
Se apreciará que las etapas del método no necesitan llevarse a cabo en el orden proporcionado anteriormente. Adicionalmente, o alternativamente, dos o más de las etapas pueden combinarse en una sola etapa. Simplemente a manera de ejemplo, la etapa de incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico e incubar el tejido con un detergente aniónico puede combinarse en una sola etapa. Secuencias ilustrativas de las etapas se proporcionan en otra parte de la presente descripción.
También se apreciará que múltiples etapas de cada incubación pueden comprenderse dentro del método. Por ejemplo, el método puede comprender múltiples etapas de incubación del tejido con un agente deslipidizante.
En una modalidad, el solvente polar es acetona. En una modalidad, la concentración del agente deslipidizante es de aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % (v/v).
En una modalidad, el detergente aniónico es dodecil sulfato de sodio (SDS) o desoxicolato de sodio, y/o la concentración del detergente aniónico (por ejemplo, SDS o desoxicolato de sodio) es igual o menor que 0,2 % (p/v).
En una modalidad, la solución hipotónica comprende tris al 0,1 %/EDTA al 0,1 %, y/o el tejido se incuba con una solución hipotónica durante entre 30 minutos a 100 horas, preferentemente durante entre 10 horas a 100 horas, preferentemente durante entre 20 horas a 80 horas.
En una modalidad, la solución hipertónica comprende tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 8-9 %, y/o el tejido se incuba con una solución hipertónica durante entre 1 hora a 48 horas, preferentemente durante entre 4 horas a 30 horas, preferentemente durante entre 8 horas a 24 horas.
En una modalidad, el método no comprende un inhibidor de enzimas proteasas de origen animal.
Se apreciará que el método puede no comprender un inhibidor de enzimas proteasas. Se apreciará que el método puede comprender un inhibidor de proteasa de origen no animal. Se apreciará que el método puede comprender un inhibidor de metaloproteasas de origen no animal. Adecuadamente, el inhibidor de proteasas de origen no animal puede ser EDTA. Adecuadamente, el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal puede estar a una concentración de aproximadamente 0,1 % (p/v).
Se apreciará que el método puede comprender además una o más etapas de enjuague del tejido, adecuadamente después de cada etapa de lisis celular.
En una modalidad, el método comprende además una o más etapas de enjuagar el tejido, preferentemente en donde el método comprende una etapa de enjuagar el tejido después de cada etapa de: incubación con una solución hipotónica, incubación con una solución hipertónica, y someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación.
Se apreciará que el método puede no comprender una enzima alfa galactosidasa.
Se apreciará que la eliminación del ADN se habilitará mediante el uso de un agente de eliminación del ADN que puede seleccionarse del grupo que consiste en una enzima endonucleasa u otros tratamientos que descomponen el ADN para permitir la elución del tejido.
En una modalidad, el agente de eliminación de ADN es una enzima endonucleasa, preferentemente la enzima endonucleasa es humana o bacteriana, preferentemente la endonucleasa se selecciona del grupo que consiste en DNasa tipo I, DNasa tipo II, ADN tipo III, RNasa o cualquier combinación de dos o más de estas, preferentemente la enzima endonucleasa está en una concentración de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 U/ml, preferentemente 5 U/ml.
Se apreciará que la enzima endonucleasa puede ser una endonucleasa derivada de bacterias, tal como una endonucleasa de Seratia marcescens modificada genéticamente que puede seleccionarse de cualquier endonucleasa disponible comercialmente tal como Benzonase®.
En una modalidad, el método comprende además la etapa de incubar el tejido con un agente antimicrobiano, preferentemente el agente antimicrobiano es un agente oxidante, preferentemente el agente oxidante es ácido peracético. Se apreciará que el ácido peracético puede estar a una concentración de aproximadamente 500 a aproximadamente 10000 ppm.
En una modalidad, el agente antimicrobiano está a una concentración de aproximadamente 0,05 % a 1 %.
En una modalidad, el método comprende además la etapa de someter el tejido a radiación ionizante, preferentemente la radiación ionizante es a una dosis de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 kGy, preferentemente aproximadamente 25 kGy.
Se apreciará que el método puede tomar entre 3 días a 14 días, adecuadamente entre 3 días a 12 días, adecuadamente entre 3 días a 10 días, adecuadamente entre 3 días a 7 días, adecuadamente entre 5 días a 14 días, adecuadamente entre 5 días a 12 días, adecuadamente entre 5 días a 10 días, adecuadamente entre 5 días a 7 días.
En la presente descripción se describe además un andamio tisular descelularizado producido mediante un método descrito en la presente descripción.
Como se describe en la presente descripción, el andamio tisular descelularizado puede estar sustancialmente libre de residuos de detergente aniónico (tal como SDS).
Como se describe en la presente descripción, el andamio tisular descelularizado puede estar sustancialmente libre de inhibidores de enzimas proteasas, adecuadamente libre de inhibidores de enzimas proteasas de origen animal.
Como se describe en la presente descripción, el andamio tisular descelularizado puede estar sustancialmente libre de proteína galactosa-alfa-1,3-galactosa (también conocida como alfa-gal).
Como se describe en la presente descripción, el andamio tisular puede ser un andamio tisular complejo. Adecuadamente, el andamio tisular complejo puede ser un andamio tisular de menisco (por ejemplo, un andamio tisular de menisco porcino), un andamio tisular dérmico (por ejemplo, un andamio tisular dérmico porcino) o un andamio tisular tendinoso (por ejemplo, un andamio tisular tendinoso porcino).
Excepto donde el contexto lo requiera de cualquier otra manera, las consideraciones expuestas en esta descripción deben considerarse aplicables al método y al andamio descritos en la presente descripción.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta descripción, las palabras “comprende” y “contiene” y variaciones de estas significan “que incluyen, pero no se limitan a”, y no pretenden (y no lo hacen) excluir otros restos, aditivos, componentes, enteros o etapas.
A través de toda la descripción y las reivindicaciones de esta descripción, el singular abarca el plural, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, se entiende que la descripción contempla la pluralidad, así como también los singulares, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera.
Los elementos, números enteros, características, compuestos, restos o grupos químicos descritos junto con un aspecto, modalidad, parte o ejemplo particular de la descripción deben entenderse aplicables a cualquier otro aspecto, modalidad, parte o ejemplo descrito en la presente descripción a menos que sean incompatibles con el mismo.
Breve descripción de las figuras
La descripción se describe además en la presente en lo adelante con referencia a las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1 muestra una imagen de un andamio tisular descelularizado producido mediante un método descrito en la presente descripción. Puede verse que se ha conservado la histoarquitectura del material. A es un andamio de menisco descelularizado. B es un andamio dérmico descelularizado. C es una vista alternativa del andamio dérmico descelularizado de la Figura 1B.
Descripción detallada
La presente descripción se basa en el desarrollo por parte de los inventores de un nuevo método para preparar andamios biológicos con varias ventajas sobre los métodos anteriores.
Específicamente, los inventores han descubierto que al incluir al menos una etapa optimizada de incubación con una solución hipertónica e incubación con una solución hipotónica, y/o al menos una etapa optimizada de congelación/descongelación del tejido, es posible reducir significativamente la concentración de detergente aniónico requerido para obtener un andamio tisular descelularizado.
Los detergentes aniónicos, tales como SDS, son altamente citotóxicos y dejan residuos de procesamiento en el andamio tisular que pueden ser citotóxicos y, por lo tanto, afectar negativamente la biocompatibilidad del andamio, incluso después de que se haya lavado el SDS. Los inventores han descubierto que es posible reducir la concentración de detergente aniónico (tal como SDS) usado, de manera que el andamio tisular puede estar sustancialmente libre de residuos de procesamiento, para mejorar de esta manera la biocompatibilidad del andamio, mediante la modificación y optimización de otras etapas en el proceso de descelularización.
Una ventaja adicional del método descrito en la presente descripción es que ya no requiere el uso de un inhibidor de enzimas proteasas de origen animal como se usa comúnmente en la técnica. Esto es beneficioso, ya que muchos métodos usan inhibidores de proteasas de origen animal, tales como aprotinina, que es de origen bovino y está asociado con un riesgo de transmisión de enfermedades zoonóticas. Los inventores han descubierto que la adición de etapas de enjuague después de la lisis celular puede eliminar suficientemente las proteasas presentes en el tejido descelularizado, y además que la reducción del tiempo de procesamiento durante cada etapa de la lisis celular puede reducir los efectos de las proteasas que se liberan de las células. Esto significa que ya no se requiere el uso de un inhibidor de enzimas proteasas de origen animal. Al tiempo que reduce el riesgo de transmisión de enfermedades zoonóticas, esto también aumenta la eficiencia del proceso.
Adicionalmente, el método descrito en la presente descripción también se encontró que reduce significativamente la cantidad de proteína galactosa-alfa-1,3-galactosa (también conocida como alfa-gal) presente en el tejido descelularizado. Esto es ventajoso ya que la proteína alfa-gal puede provocar una respuesta inmunitaria en el sujeto. En los métodos del estado de la técnica, la eliminación de alfa-gal generalmente requería una etapa adicional de tratar el tejido con la enzima alfa galactosidasa, que degrada la alfa gal. Los inventores han descubierto que en el presente método, esta etapa no es necesaria para eliminar sustancialmente todo la alfa-gal del andamio. El método descrito en la presente descripción hace que el andamio esté sustancialmente libre de alfa-gal.
Etapas del método
La presente descripción se refiere a un método para producir un andamio tisular descelularizado, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
• incubar el tejido con un detergente aniónico;
• incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
Como se menciona en otra parte de la presente descripción, las etapas del método no tienen que llevarse a cabo en el orden proporcionado anteriormente.
Adecuadamente, el método puede comprender en algunos casos una etapa de incubación del tejido con un inhibidor de enzimas proteasas. Adecuadamente, un inhibidor de proteasas de origen no animal.
La etapa de incubar el tejido con un agente deslipidizante se lleva a cabo antes de la etapa de incubar el tejido con un detergente aniónico, la etapa de incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación, y la etapa de incubar el tejido con un inhibidor de enzimas proteasas e incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN.
Adecuadamente, la etapa de incubar el tejido con un agente aniónico puede llevarse a cabo después de la etapa de incubar el tejido con un agente deslipidizante.
Adecuadamente, la etapa de incubar el tejido con un agente aniónico puede llevarse a cabo antes de la etapa de incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN.
Adecuadamente, la etapa de incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN puede llevarse a cabo después de la etapa de incubación con un agente aniónico.
Otras variaciones en el orden de las etapas del método serán conocidas para los expertos en la técnica. Dos o más de las etapas del método pueden combinarse en una sola etapa.
Adecuadamente, la etapa de incubar el tejido con un detergente aniónico puede combinarse con la etapa de incubar el tejido con un tampón hipotónico.
Otras formas en las que dos o más etapas del método pueden combinarse serán evidentes para los expertos.
Andamio tisular
El término “andamio tisular”, como se usa en la presente, se refiere a un soporte estructural biológico diseñado para imitar la matriz extracelular natural. Adecuadamente, el andamio tisular puede facilitar la unión, migración, proliferación y/o la organización tridimensional de las células que crecen en el mismo.
El andamio tisular descelularizado puede producirse mediante el método a partir de tejido obtenido de un sujeto humano o animal, o cadáver humano o animal. En el contexto de la presente descripción, el tejido obtenido de un sujeto humano o animal usado para fabricar el andamio tisular descelularizado puede denominarse “un tejido de partida” o “un tejido”.
El tejido de partida se selecciona del grupo que consiste en piel (o parte de la piel tal como la dermis), menisco, tendón, ligamento, cartílago, músculo, vaso sanguíneo y un órgano (tal como un corazón, riñón, hígado, etc.). Adecuadamente, como se describe en la presente descripción, el tejido de partida puede ser piel o menisco o tendón. Simplemente a manera de ejemplo, el tejido de partida puede ser la dermis, tal como la dermis porcina, o el tejido de partida puede ser el menisco porcino o el tendón porcino.
Adecuadamente, el animal del que se obtiene el tejido de partida puede ser, por ejemplo, un cerdo, un primate no humano, una vaca, una oveja o un caballo.
En el contexto de la presente descripción, el término “descelularizado” significa que el andamio está sustancialmente libre de componentes celulares (tales como membranas celulares, ácidos nucleicos, lípidos, sustancias similares a lípidos y componentes citoplasmáticos). Sin embargo, se apreciará que un andamio descelularizado conservará una matriz extracelular (ECM).
La frase “matriz extracelular (ECM)” como se usa en la presente, se refiere a una red de materiales producidos y secretados por las células del tejido en el espacio y/o medio extracelular circundante y que típicamente junto con las células del tejido imparten al tejido sus propiedades mecánicas y estructurales. Generalmente, la ECM incluye elementos fibrosos (particularmente colágeno, elastina o reticulina), polipéptidos de adhesión celular (tales como fibronectina, laminina y glicoproteínas adhesivas) y moléculas de relleno de espacio (tales como glucosaminoglicanos (GAG), proteoglicanos).
Por “sustancialmente libre de” material celular, se entiende que el andamio está sustancialmente libre de componentes celulares y/o sustancialmente libre de ácidos nucleicos.
La estructura puede determinarse como sustancialmente libre de componentes celulares mediante microscopía mediante el uso de tinción con hematoxilina y eosina. Adecuadamente, el andamio está al menos 80 % desprovisto de componentes celulares que aparecen naturalmente en el tejido de partida a partir del cual se produce el andamio. Adecuadamente, el andamio puede estar al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 % o más desprovisto de componentes celulares.
El andamio puede determinarse como sustancialmente libre de material celular al medir la cantidad restante de ácido nucleico en el andamio después del procesamiento. Adecuadamente, el andamio también está sustancialmente libre de ácidos nucleicos, como se define en la presente descripción. Adecuadamente, el ADN puede eliminarse suficientemente del andamio si la cantidad de ADN es menos de aproximadamente 50 ng/mg. Adecuadamente, si el ADN es menos de aproximadamente 50 ng/mg, el andamio está sustancialmente libre de material celular. Adecuadamente, la cantidad de ADN es menos de aproximadamente 50 ng/mg del peso en seco del andamio.
Por lo tanto, adecuadamente, el andamio está sustancialmente libre de material celular cuando: (i) está al menos 80 % desprovisto de componentes celulares, como se definió anteriormente, o (ii) el contenido de ADN es menos de aproximadamente 50 ng/mg.
Adecuadamente, el andamio está sustancialmente libre de material celular cuando: (i) está al menos 80 % desprovisto de componentes celulares, como se definió anteriormente, y (ii) el contenido de ADN es menos de aproximadamente 50 ng/mg.
El grado de descelularización puede determinarse histoquímicamente, por ejemplo, mediante la tinción del tejido con hematoxilina y eosina mediante el uso de técnicas estándar que visualizan las membranas celulares y los núcleos. La tinción inmunohistoquímica es otra forma en la que puede determinarse el grado de descelularización. La tinción inmunohistoquímica puede visualizar marcadores específicos de células tales como actina de músculo liso y antígenos de compatibilidad tisular, cuya ausencia es una indicación de la descelularización. Otro método en el que puede determinarse el grado de descelularización es la cuantificación de ADN. La cantidad de ADN igual o menor a 50 n/mg puede usarse como indicador de la descelularización. Otros métodos adecuados para evaluar la descelularización serán conocidos para los expertos en la técnica.
Adecuadamente, el andamio tisular descelularizado puede estar sustancialmente libre de alfa-gal. En este contexto, “sustancialmente libre” significa que la cantidad de alfa-gal en el andamio está dentro de los niveles clínicamente aceptables. Adecuadamente, el andamio puede comprender 20 % o menos, 19 % o menos, 18 % o menos, 17 % o menos, 16 % o menos, 15 % o menos, 14 % o menos, 13 % o menos, 12 % o menos, 11 % o menos, 10 % o menos, 9 % o menos, 8 % o menos, 7 % o menos, 6 % o menos, 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos, 1 % o menos de alfa-gal en comparación con la cantidad de alfa-gal de origen natural en el tejido de partida a partir del cual se produce el andamio. Los expertos en la técnica conocerán los métodos para determinar la cantidad de alfa-gal. Simplemente a manera de ejemplo, la alfa-gal puede medirse mediante la realización de un ELISA mediante el uso de kits disponibles comercialmente, tales como el disponible de MyBioSource.
Agente deslipidizante
En el método descrito en la presente descripción, el tejido de partida se incuba con un agente deslipidizante. El término “agente deslipidizante” como se usa en la presente, se refiere a un agente que elimina lípidos y/o sustancias similares a lípidos del tejido de partida de manera que el tejido de partida esté sustancialmente libre de lípidos y/o sustancias similares a lípidos. Los lípidos y/o sustancias similares a lípidos pueden incluir, pero no se limitan a, lípidos complejos, lípidos simples, triglicéridos, ácidos grasos, glicerofosfolípidos (fosfolípidos), grasas verdaderas tales como ésteres de ácidos grasos, glicerol, cerebrósidos, ceras y esteroides tales como colesterol y ergosterol. Los lípidos y/o sustancias similares a lípidos pueden derivarse del propio tejido de partida.
En el contexto de un agente deslipidizante, por “sustancialmente libre de”, se entiende que el tejido está al menos 80 % desprovisto de lípidos y/o sustancias similares a lípidos presentes en el tejido antes de la incubación con el agente deslipidizante. Adecuadamente, el tejido puede estar al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 % o más desprovisto de lípidos y/o sustancias similares a lípidos en comparación con el tejido de partida.
Los lípidos y/o sustancias similares a lípidos pueden ser insolubles en agua y, por lo tanto, afectar a tratamientos subsecuentes a base de agua tales como lavados. Adecuadamente, los lípidos y/o sustancias similares a lípidos pueden ser solubles en un solvente polar. En consecuencia, como se describe en la presente descripción, el agente deslipidizante es un solvente polar. El término "solvente polar" como se usa en la presente, se refiere a un solvente que interactúa con otros compuestos a través de interacciones ácido-base, enlaces de hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo y/o por interacciones dipolo-inducidas.
Adecuadamente, el solvente polar puede seleccionarse del grupo que consiste en acetona, alcohol isopropílico, metanol, etanol, acetato de etilo o una mezcla de dos o más de estos. Más adecuadamente, el solvente polar puede ser acetona.
Adecuadamente, el solvente polar puede estar a una concentración de aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % v/v. En un ejemplo, el solvente polar está a una concentración de aproximadamente 99 % v/v.
Se apreciará que en el método, el tejido puede incubarse con un agente deslipidizante durante un período de tiempo suficiente para eliminar lípidos y/o sustancias similares a lípidos del tejido. Adecuadamente, hasta que se eliminen los lípidos y/o sustancias similares a lípidos deseados, dejando el tejido sustancialmente libre de dichos lípidos y/o sustancias similares a lípidos.
Adecuadamente, el período de incubación con un agente deslipidizante puede ser de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 horas, adecuadamente de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas.
Adecuadamente, el período de incubación con un agente deslipidizante puede ser de aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 24 horas o más. Adecuadamente, el período de incubación puede ser de aproximadamente 2 a 3 horas.
En un ejemplo, el agente deslipidizante es acetona a una concentración de aproximadamente 99 % v/v. En tal ejemplo, el período de incubación es de aproximadamente 2-3 horas.
En un ejemplo, el período de incubación es de aproximadamente 2 horas.
En un ejemplo, el período de incubación es de aproximadamente 3 horas.
En un ejemplo, puede haber más de una etapa de incubación del tejido con un agente deslipidizante. En un ejemplo, puede haber más de un período de incubación con un agente deslipidizante. En algunos casos, puede haber dos períodos de incubación con un agente deslipidizante. Adecuadamente, cada período de incubación puede ser una longitud total de tiempo diferente y puede comprender bloques de tiempo diferentes.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 2-3 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v);
• incubar el tejido con un detergente aniónico;
• incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
El término “incubación” o “incubando” como se usa en la presente, se refiere a poner en contacto el tejido con un agente relevante (el agente relevante es un agente deslipidizante, detergente aniónico, solución hipotónica, solución hipertónica, inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal, agente de eliminación de ADN o agente antimicrobiano). En el contexto de la presente descripción, el período de incubación se refiere a la cantidad total de tiempo que el tejido entra en contacto con (es decir, se incuba con) el agente relevante.
El período de incubación puede ser un bloque continuo de tiempo igual al período de incubación total, o una pluralidad de bloques de tiempo que combinados igualan el período de incubación total. Simplemente a manera de ejemplo, en el contexto de la incubación con acetona, el período de incubación puede comprenderse de un bloque continuo de tiempo, o por ejemplo, tres bloques de tiempo.
El experto apreciará que entre los bloques de tiempo puede haber un período de descanso. Adecuadamente, el tejido puede descansar entre los bloques de tiempo. Adecuadamente, la solución relevante puede reemplazarse entre uno o más bloques de tiempo, por ejemplo, para que el tejido se incube con una solución relevante fresca. Por ejemplo, el período de incubación con un agente deslipidizante puede ser de 2 horas que comprenden tres bloques de tiempo de 40 minutos, en donde entre cada bloque de tiempo el agente deslipidizante se reemplaza.
En un ejemplo, el período de incubación con un agente deslipidizante es de 2 horas que comprende tres bloques de tiempo de 40 minutos.
En un ejemplo, el período de incubación con un agente deslipidizante es de 3 horas que comprende tres bloques de tiempo de 1 hora.
En un ejemplo, el período de incubación con un agente deslipidizante es de 33 horas que comprende dos bloques de tiempo de 1 hora y un bloque extendido de 31 horas de tiempo.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 3 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v), y en donde la incubación se comprende de tres bloques de tiempo de 1 hora;
• incubar el tejido con un detergente aniónico;
• incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 2 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v), y en donde la incubación se comprende de tres bloques de tiempo de 40 minutos;
• incubar el tejido con un detergente aniónico;
• incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un ejemplo, el método comprende solo una etapa de incubación de un tejido de partida con un agente deslipidizante. En un ejemplo, la etapa es de aproximadamente 2 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v), y en donde la incubación se comprende de tres bloques de tiempo de 40 minutos. En otro ejemplo, el método comprende dos etapas de incubación de un tejido de partida con un agente deslipidizante. En un ejemplo, la primera etapa puede ser durante aproximadamente 33 horas y la segunda etapa durante aproximadamente 3 horas, en donde la primera etapa comprende dos bloques de tiempo de 1 hora y un bloque de tiempo de 31 horas, y en donde la segunda etapa comprende tres bloques de tiempo de 1 hora.
Detergente aniónico
El método comprende la etapa de incubar el tejido en un detergente aniónico.
Adecuadamente, la incubación con un detergente aniónico puede realizarse antes o después de la incubación con un agente deslipidizante. Más adecuadamente, esta etapa puede realizarse después de la incubación con un agente deslipidizante.
El término “detergente aniónico” como se usa en la presente, se refiere a un surfactante que tiene un extremo hidrófilo cargado negativamente. El detergente aniónico puede alterar las membranas y desnaturalizar las proteínas al romper las interacciones proteína-proteína.
Adecuadamente, el detergente aniónico puede seleccionarse del grupo que consiste en dodecil sulfato de sodio (SDS), desoxicolato de sodio, laurato de sodio, estearato de sodio, sulfosuccinato de dioctilo de sodio, N-lauroil sarcosinato de sodio anfótero y mezcla de dos o más de estos. Más adecuadamente, el detergente aniónico se selecciona del grupo que consiste en: SDS, desoxicolato de sodio, alquilbenceno sulfonatos, alquil sulfonatos, alquil sulfonatos, alquil sulfatos, sales de ácidos grasos fluorinados, siliconas, sulfatos de alcoholes grasos, sulfatos de éter de alcoholes grasos de polioxietileno, a-olefina sulfonato, éter de fosfatos de alcoholes grasos de polioxietileno, alquil alcohol amida, acetamida de ácido alquilsulfónico, sales de sulfonato de alquil succinato, alquilbenceno sulfonatos de aminoalcohol, naftenatos, sulfonato de alquilfenol y monolaurato de polioxietileno. En un ejemplo, el detergente aniónico es SDS.
Adecuadamente, el detergente aniónico (por ejemplo, SDS o desoxicolato de sodio) puede estar en una concentración de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 0,1 % (p/v), de aproximadamente 0,002 % a aproximadamente 0,018 % (p/v), de aproximadamente 0,004 % a aproximadamente 0,016 % (p/v), de aproximadamente 0,006 % a aproximadamente 0,014 % (p/v), o de aproximadamente 0,008 a aproximadamente 0,012%(p/v).
Adecuadamente, el detergente aniónico (por ejemplo, SDS o desoxicolato de sodio) puede estar a una concentración de aproximadamente 0,2 % o menos (p/v), aproximadamente 0,18 % o menos (p/v), aproximadamente 0,16 % o menos (p/v), aproximadamente 0,14 % o menos (p/v), aproximadamente 0,12 % o menos (p/v), aproximadamente 0,1 % o menos (p/v), aproximadamente 0,08 % o menos (p/v), aproximadamente 0,06 % o menos (p/v), aproximadamente 0,04 % o menos (p/v), aproximadamente 0,02 % o menos (p/v), aproximadamente 0,01 % o menos (p/v), aproximadamente 0,008 % o menos (p/v), aproximadamente 0,006 % o menos (p/v), aproximadamente 0,004 % o menos (p/v), aproximadamente 0,002 % o menos (p/v), o aproximadamente 0,001 % o menos (p/v).
En un ejemplo, el detergente aniónico (por ejemplo, SDS o desoxicolato de sodio) está a una concentración de aproximadamente 0,01 % (p/v).
En un ejemplo, el detergente aniónico (por ejemplo, SDS o desoxicolato de sodio) está a una concentración de aproximadamente 0,1 % (p/v).
El detergente aniónico puede diluirse para lograr la concentración deseada en cualquier solución adecuada. La solución puede ser hipotónica, isotónica o hipertónica. Más adecuadamente, la solución puede ser hipotónica.
Adecuadamente, la solución puede seleccionarse del grupo que consiste en tampón tris, tampón tris/EDTA (tris al 0,1 %/EDTA al 0,1 %), clorhidrato de tris[hidroxilmetil]-aminometano (Tris-HCl, 10-100 mM), ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazinetanosulfónico (HEPES, 10-100 mM), una solución diluida de PBS (tal como una solución que contiene 0,2 gramos de KCl, 0,2 gramos de KH2PO4, 8 gramos de NaCl, o una solución que contiene 2,16 gramos de Na2HPO4*7H2O en 1000 ml de H2O, y una solución diluida de solución salina normal (por ejemplo, que contiene NaCl al 0,9 %). ;;En un ejemplo, la solución es un tampón tris hipotónico. ;;Adecuadamente, el período de incubación con el detergente aniónico (por ejemplo, SDS o desoxicolato de sodio) es durante un tiempo suficiente para lograr la lisis celular en el tejido. Adecuadamente, esto puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 horas, adecuadamente de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 horas. ;;Adecuadamente, el período de incubación con el detergente aniónico puede ser de aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 45 horas, aproximadamente 50 horas, aproximadamente 55 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 65 horas, aproximadamente 70 horas, aproximadamente 75 horas, aproximadamente 80 horas, aproximadamente 85 horas, aproximadamente 90 horas, aproximadamente 95 horas, aproximadamente 100 horas o más. ;;Se apreciará que el período de incubación con un detergente aniónico puede depender del tipo de tejido de partida usado y/o el propio detergente. Simplemente a manera de ejemplo, la dermis porcina puede incubarse con un detergente aniónico (tal como SDS) durante aproximadamente 21 o 24 horas, mientras que el menisco porcino puede incubarse con un detergente aniónico (tal como SDS) durante aproximadamente 80 horas, mientras que el tendón porcino puede incubarse con un detergente aniónico durante aproximadamente 48 horas. El experto es capaz de determinar la longitud óptima de incubación con un detergente aniónico, adecuadamente mediante la determinación de si se ha producido la lisis celular en el tejido, esto puede determinarse mediante el uso de microscopía, por ejemplo. ;;En un ejemplo, el método comprende las etapas de: ;;• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 2-3 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v); ;• incubar el tejido con un detergente aniónico, en donde el detergente aniónico es SDS al 0,01 % (p/v); • incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e ;• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado. ;En un ejemplo, el tejido se incuba con detergente aniónico SDS al 0,01 % durante 21 o 24 horas. En un ejemplo, el tejido se incuba con detergente aniónico SDS al 0,01 % durante 80 horas que comprende cuatro bloques de tiempo de 20 horas. ;;En un ejemplo, el método comprende dos etapas de incubación del tejido con detergente aniónico SDS al 0,1 %. En un ejemplo, cada etapa es de aproximadamente 24 horas. ;;En un ejemplo, el método comprende las etapas de: ;;• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 3 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v), y en donde la incubación se comprende de tres bloques de tiempo de 1 hora; ;• incubar el tejido con un detergente aniónico durante aproximadamente 24 horas, en donde el detergente aniónico es SDS al 0,01 % (p/v); ;• incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e ;• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado. ;;En un ejemplo, el método comprende las etapas de: ;;• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 2 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v), y en donde la incubación se comprende de tres bloques de tiempo de 40 minutos; ;• incubar el tejido con un detergente aniónico durante aproximadamente 80 horas, en donde el detergente aniónico es SDS al 0,01 % (p/v), y en donde la incubación se comprende de cuatro bloques de tiempo de 20 horas; ;• incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e ;• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado. ;;Soluciones hipotónicas e hipertónicas ;;El método incluye la etapa de incubar el tejido al menos una vez con una solución hipotónica y al menos una vez con una solución hipertónica, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación. Adecuadamente, estas etapas actúan para lisar las células presentes en el tejido. ;;Adecuadamente, incubar el tejido al menos una vez con una solución hipotónica y al menos una vez con una solución hipertónica logra un efecto similar a someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; ambas etapas actúan para lisar las células. Adecuadamente, puede usarse cualquiera de las etapas, o ambas en combinación. Adecuadamente, por lo tanto, el método puede comprender incubar el tejido al menos una vez con una solución hipotónica y al menos una vez con una solución hipertónica, o adecuadamente el método puede comprender someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación. Alternativamente, el método puede comprender incubar el tejido al menos una vez con una solución hipotónica y al menos una vez con una solución hipertónica, y someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación. ;;Por “ciclo de congelación/descongelación” se entiende que el tejido se congela (por ejemplo, al colocarlo en nitrógeno líquido, o en un congelador a -80 °C o -20 °C) seguido de descongelación (por ejemplo, a 2-8 °C o 34 °C o 37 °C o a temperatura ambiente). ;;Adecuadamente, el tejido puede someterse a múltiples ciclos de congelación/descongelación. Adecuadamente, el tejido puede someterse a entre uno y cinco ciclos de congelación/descongelación. En un ejemplo, el tejido se somete a dos o tres ciclos de congelación/descongelación. ;;El término “solución hipotónica” se refiere a una solución que tiene una concentración de solutos que es menor que la concentración de solutos dentro de una célula tisular. El término “solución hipertónica” se refiere a una solución que tiene una concentración de solutos que es mayor que la concentración de solutos dentro de una célula tisular. ;;Simplemente a manera de ejemplo, se puede seleccionar una solución hipotónica del grupo que consiste en un tampón de tris/EDTA (tris al 0,1 %/e Dt A al 0,1 %), clorhidrato de tris[hidroxilmetil]-aminometano (Tris-HCl, 10-100 mM), ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazinetanosulfónico (HEPES, 10-100 mM), una solución diluida de PBS (tal como una solución que contiene 0,2 gramos de KCl, 0,2 gramos de KH2PO4, 8 gramos de NaCl, o una solución que contiene 2,16 gramos de Na2HPO4*7H2O en 1000 ml de H2O, y una solución diluida de solución salina normal (por ejemplo, que contiene NaCl al 0,9 %). Otras soluciones hipotónicas serán bien conocidas para los expertos en la técnica.
En un ejemplo, la solución hipotónica es de tris al 0,1 %/EDTA al 0,1 %.
El período de incubación con una solución hipotónica puede ser de aproximadamente 30 minutos a 100 horas, adecuadamente de 10 horas a aproximadamente 100 horas, o de aproximadamente 20 horas a 80 horas.
Adecuadamente, el período de incubación con una solución hipotónica puede ser de aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 5 horas, 10 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 45 horas, aproximadamente 50 horas, aproximadamente 55 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 65 horas, aproximadamente 70 horas, aproximadamente 75 horas, aproximadamente 80 horas, aproximadamente 85 horas, aproximadamente 90 horas, aproximadamente 95 horas, aproximadamente 100 horas o más.
Se apreciará que el período de incubación con una solución hipotónica puede depender del tipo de tejido de partida usado y/o de la propia solución hipotónica. Por ejemplo, una solución que es más hipotónica puede requerir un período de incubación más corto que una solución que es menos hipotónica. Simplemente a manera de ejemplo, la dermis porcina puede incubarse en una solución hipotónica durante aproximadamente 21-24 horas, mientras que el menisco porcino puede incubarse con una solución hipotónica durante aproximadamente 40 minutos, mientras que el tendón porcino puede incubarse con una solución hipotónica durante hasta 24 horas, adecuadamente en algunos casos durante 1-4 horas, y en algunos casos durante 24 horas. Un experto puede determinar un tiempo de incubación adecuado, al evaluar cuándo se descelulariza el tejido mediante el uso de los métodos descritos anteriormente, por ejemplo.
Como se mencionó en otra parte de la presente descripción, el detergente aniónico puede diluirse a la concentración deseada en una solución hipotónica. En tal caso, la etapa de incubar el tejido con un detergente aniónico y la etapa de incubar el tejido al menos una vez con una solución hipotónica pueden combinarse en una sola etapa.
En un ejemplo, por lo tanto, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
• incubar el tejido con un detergente aniónico y una solución hipotónica;
• incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
El método comprende la etapa de incubar al menos una vez el tejido con una solución hipotónica. Adecuadamente, el tejido puede incubarse una vez, dos veces, tres veces o más con una solución hipotónica. En un ejemplo, el tejido puede incubarse dos veces con una solución hipotónica. En un ejemplo, el tejido puede incubarse seis veces con una solución hipotónica.
Adecuadamente, cuando el tejido se incuba dos o múltiples veces con una solución hipotónica, una de las incubaciones puede combinarse con la etapa de incubación del tejido con un detergente aniónico. Esto puede lograrse mediante la dilución del detergente aniónico a una concentración deseada en un agente hipotónico. Adecuadamente, la segunda incubación con una solución hipotónica puede realizarse antes o después de la incubación con un detergente aniónico.
En un ejemplo, por lo tanto, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
• incubar el tejido con un detergente aniónico y una primera solución hipotónica;
• incubar el tejido al menos una vez con una segunda solución hipotónica y al menos una con una solución hipertónica, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
Adecuadamente, cuando la incubación con una solución hipotónica se realiza antes de la etapa de incubación con un detergente aniónico, puede realizarse antes o después de la etapa de incubación con un agente deslipidizante. Más adecuadamente, cuando la etapa de incubación con una solución hipotónica se realiza antes de la etapa de incubación con un detergente aniónico, puede realizarse después de la etapa de incubación con un agente deslipidizante. La etapa de incubar el tejido en una solución hipotónica puede realizarse antes o después de someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación. Adecuadamente, la etapa de incubar el tejido en una solución hipotónica puede realizarse antes de someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación. La etapa de incubar el tejido con una solución hipotónica puede seguirse por la etapa de incubar el tejido con una solución hipertónica. La incubación con una solución hipertónica puede ser directamente después de la incubación con una solución hipotónica. Alternativamente, la incubación con una solución hipertónica puede ser después de que el tejido se ha sometido a al menos un ciclo de congelación/descongelación.
Adecuadamente, en un caso donde la incubación con una solución hipotónica se realiza antes de la etapa de incubación con un detergente aniónico, el método puede comprender las etapas de:
incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
incubar el tejido con una primera solución hipotónica;
someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación;
incubar el tejido con una primera solución hipertónica;
incubar el tejido con un detergente aniónico y, opcionalmente, una segunda solución hipotónica; incubar el tejido con una segunda solución hipertónica; e
incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
Adecuadamente, cuando la incubación con una solución hipotónica se realiza después de la incubación con un detergente aniónico, también puede realizarse después de la incubación del tejido con un agente deslipidizante y/o la incubación con una solución hipertónica. En tal caso, el método puede comprender las etapas de:
incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
incubar el tejido con un detergente aniónico;
incubar el tejido con una solución hipertónica;
incubar el tejido con una solución hipotónica; e
incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
Adecuadamente, la primera y la segunda soluciones pueden ser la misma solución o soluciones diferentes. Adecuadamente, la primera y la segunda soluciones de cualquiera de los componentes del proceso se seleccionan de los componentes descritos en la presente descripción. Lo mismo se aplica a cualquier número de soluciones del mismo componente, por ejemplo, pueden usarse la tercera y la cuarta soluciones hipertónicas, adecuadamente estas pueden ser todas la misma solución o soluciones diferentes seleccionadas de las descritas en la presente descripción.
En un ejemplo, el método puede comprender seis etapas de incubación del tejido con tratamiento hipotónico. Adecuadamente, las dos primeras etapas comprenden la incubación con una solución hipotónica durante un período de 1-4 horas. Adecuadamente, la tercera, cuarta, quinta y sexta etapas comprenden la incubación con una solución hipotónica durante un período de 24 horas. Adecuadamente, al menos una de las etapas tercera, cuarta, quinta y sexta comprende un detergente aniónico. Adecuadamente, la primera y la segunda etapas pueden ser cada una anteriores a un ciclo de congelación/descongelación.
En un ejemplo, el método puede comprender dos etapas de incubación del tejido con tratamiento hipotónico. Adecuadamente, ambas etapas son durante un período de aproximadamente 21 horas. Adecuadamente, al menos una de las etapas comprende un detergente aniónico.
Como se usa en la presente, el término “solución hipertónica” se refiere a una solución que tiene una mayor concentración de solutos que la concentración de solutos dentro de una célula.
Simplemente a manera de ejemplo, una solución hipertónica puede seleccionarse de, por ejemplo, solución de tris/cloruro de sodio (tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 8-9 %), soluciones de azúcar, soluciones de sal, dextrosa al 5 % (azúcar) y cloruro de sodio al 0,45 %, dextrosa al 5 % y cloruro de sodio al 0,9 %, y dextrosa al 10 % en agua. En un ejemplo, la solución hipertónica es una solución de tris al 0,6 %/cloruro de sodio al 8 9 %.
En un ejemplo, la solución hipertónica es una solución de tris/cloruro de sodio (tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 8,2 %.
Adecuadamente, el período de incubación con la solución hipertónica puede ser de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, de aproximadamente 4 horas a 30 horas, de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 24 horas.
Adecuadamente, el período de incubación con la solución hipertónica puede ser durante aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 42 horas, aproximadamente 44 horas, aproximadamente 46 horas, aproximadamente 48 horas o más.
Se apreciará que el período de incubación con una solución hipertónica puede depender del tipo de tejido de partida usado y/o la solución hipertónica. Simplemente a manera de ejemplo, la dermis porcina puede incubarse con una solución hipertónica durante aproximadamente 21-24 horas, mientras que el menisco porcino puede incubarse con una solución hipertónica durante aproximadamente 8 horas, mientras que el tendón porcino puede incubarse con una solución hipertónica durante aproximadamente 18 horas. El experto es capaz de determinar un tiempo de incubación adecuado mediante experimentación de rutina con el tejido en cuestión.
En un ejemplo, el período de incubación con solución hipertónica de tris/cloruro de sodio (tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 8,2 %) es de 21-24 horas.
En un ejemplo, el período de incubación con solución hipertónica de tris/cloruro de sodio (tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 9 %) es de 8 horas. En un ejemplo, el método comprende dos períodos de incubación con solución hipertónica de tris/cloruro de sodio (tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 9 %), cada uno durante 8 horas.
En un ejemplo, el período de incubación con solución hipertónica de tris/cloruro de sodio (tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 8,2 %) es de aproximadamente 18 horas.
Adecuadamente, el método comprende incubar el tejido al menos una vez con una solución hipertónica. Adecuadamente, el método comprende incubar el tejido una vez, dos veces, tres veces o más con la solución hipertónica. Más adecuadamente, el método puede comprender incubar el tejido una o dos veces con una solución hipertónica. En un ejemplo, el método comprende incubar el tejido una vez con una solución hipertónica.
En un ejemplo donde el tejido se incuba una vez con una solución hipertónica, la etapa de incubación del tejido con una solución hipertónica puede llevarse a cabo después de la incubación con un detergente aniónico (con o sin una solución hipotónica).
En un caso donde el tejido se incuba dos veces con una solución hipertónica, la etapa de incubar el tejido con una solución hipertónica puede llevarse a cabo una vez antes de la incubación con un detergente aniónico (con o sin una solución hipotónica) y una vez después de la incubación con un detergente aniónico (con o sin una solución hipotónica).
En un ejemplo, el método comprende:
incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
incubar el tejido con un detergente aniónico y una primera solución hipotónica;
incubar el tejido con una solución hipertónica;
incubar el tejido con una segunda solución hipotónica; e
incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un ejemplo, el método comprende:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
• incubar el tejido con un detergente aniónico y una primera solución hipotónica durante 24 horas, en donde la primera solución hipotónica comprende solución de tris al 0,1 %/EDTA al 0,1 %;
• incubar el tejido con una solución hipertónica durante 24 horas, en donde la solución hipertónica comprende tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 8-9 %;
• incubar el tejido con una segunda solución hipotónica durante 24 horas, en donde la segunda solución hipotónica comprende solución de tris al 0,1 %/EDTA al 0,1 %; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un ejemplo, el método comprende:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
• incubar el tejido con una primera solución hipertónica;
• incubar el tejido con un detergente aniónico y una solución hipotónica;
• incubar el tejido con una segunda solución hipertónica; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un ejemplo, el método comprende:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
• incubar el tejido con una primera solución hipertónica durante hasta 8 horas, en donde la primera solución hipertónica comprende una solución de tris al 0,6 %/cloruro de sodio al 9 %;
• incubar el tejido con un detergente aniónico y una solución hipotónica durante 4 bloques de 20 horas, en donde la solución hipotónica comprende solución de tris al 0,1 %/EDTA al 0,1 %;
• incubar el tejido con una segunda solución hipertónica durante hasta 8 horas, en donde la segunda solución hipertónica comprende tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 8-9 %; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un ejemplo, el método comprende:
incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
incubar el tejido con una primera solución hipotónica;
someter el tejido a uno o más ciclos de congelación/descongelación;
incubar el tejido con una primera solución hipertónica;
incubar el tejido con un detergente aniónico y una segunda solución hipotónica;
incubar el tejido con una segunda solución hipertónica; e
incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un ejemplo, el método comprende:
incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
incubar el tejido con una primera solución hipotónica en donde la primera solución hipotónica comprende solución de tris al 0,1 %/EDTA al 0,1 %;
someter el tejido a tres ciclos de congelación/descongelación;
incubar el tejido con una primera solución hipertónica durante hasta 8 horas, en donde la primera solución hipertónica comprende tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 8-9 %;
incubar el tejido con un detergente aniónico y una segunda solución hipotónica durante 4 bloques de 20 horas, en donde la segunda solución hipotónica comprende solución de tris al 0,1 %/EDTA al 0,1 %; incubar el tejido con una segunda solución hipertónica durante hasta 8 horas, en donde la segunda solución hipertónica comprende tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 8-9 %; e
incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
Inhibidor de enzimas proteasas
Adecuadamente, el método puede no comprender un inhibidor de enzimas proteasas, especialmente no un inhibidor de enzimas proteasas de origen animal. Por lo tanto, adecuadamente, el proceso puede no comprender una etapa de incubación del tejido con un inhibidor de enzimas proteasas.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
• incubar el tejido con un detergente aniónico;
• incubar el tejido al menos una vez con una solución hipotónica y al menos una vez con una solución hipertónica, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado,
en donde el método no comprende un inhibidor de proteasas de origen animal.
Sin embargo, aunque no se requiere necesariamente, el método puede comprender una etapa de incubación del tejido con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal. El término “ inhibidor de enzimas proteasas” como se usa en la presente, se refiere a un agente que inhibe la actividad proteolítica de las enzimas proteasas. El término “de origen no animal” significa que el inhibidor de proteasas no es un inhibidor obtenido de una fuente animal, y no se produce naturalmente en los animales.
Adecuadamente, el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal puede ser un inhibidor de metaloproteasas. Seleccionado adecuadamente de cualquier agente quelante. Adecuadamente, un agente quelante actúa como un inhibidor de proteasas y evita la degradación del tejido. Adecuadamente, el inhibidor de proteasas de origen no animal se selecciona del grupo que consiste en EDTA, NTA, ATMP, EDTMP y HEDP, por ejemplo. En un ejemplo, el inhibidor de proteasas de origen no animal es EDTA.
Adecuadamente, el inhibidor de enzima proteasas de origen no animal se usa a una concentración de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 0,5 %, o de aproximadamente 0,75 % a aproximadamente 0,25 %.
Adecuadamente, el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal se usa a una concentración de aproximadamente 1 %, aproximadamente 0,75 %, aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,25 %, aproximadamente 0,1 %, aproximadamente 0,05 % o aproximadamente 0,01 %. En un ejemplo, el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal se usa a una concentración de aproximadamente 0,1 %.
En un ejemplo, el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal es EDTA a una concentración de aproximadamente 0,1 %.
Se apreciará que la etapa de incubar el tejido con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal puede llevarse a cabo antes de la etapa de incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, o después de la etapa de incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN.
Adecuadamente, la etapa de incubar el tejido con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal puede combinarse con la etapa de incubar el tejido con un agente hipotónico.
Adecuadamente, la etapa de incubar el tejido con una solución hipotónica puede combinarse con la etapa de incubar el tejido con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal. Adecuadamente, la incubación combinada del tejido en una solución hipotónica y un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal se lleva a cabo después de la incubación con un agente deslipidizante, un detergente aniónico (con o sin agente hipotónico) y una solución hipertónica.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 2-3 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v);
• incubar el tejido con un detergente aniónico, en donde el detergente aniónico es SDS al 0,01 % (p/v); • incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal, en donde el inhibidor de proteasas es EDTA al 0,1 %, e incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, para obtener de esta manera un andamio tisular descelularizado.
Adecuadamente, el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal puede diluirse a la concentración deseada en cualquier solución adecuada. Simplemente a manera de ejemplo, el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal (por ejemplo, EDTA) puede diluirse en solución salina tamponada con fosfato, o en una solución tampón hipotónica (tris al 0,1 %).
Se apreciará que cuando el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal (por ejemplo, EDTA) se diluye en una solución hipotónica, la etapa de incubar el tejido con una solución hipotónica y un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal puede combinarse en una etapa. A manera de ejemplo, en tal caso, el método comprende las etapas de:
incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
incubar el tejido con un detergente aniónico;
incubar el tejido con una solución hipertónica;
incubar el tejido con una solución hipotónica; e
incubar el tejido con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal y una segunda solución hipotónica, en donde el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal es EDTA; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un caso donde el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal no se diluye en una solución hipotónica, el método puede comprender las siguientes etapas:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
• incubar el tejido con una primera solución hipotónica;
someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación;
incubar el tejido con una primera solución hipertónica;
incubar el tejido con un detergente aniónico;
incubar el tejido con una segunda solución hipertónica;
incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN; e
incubar el tejido con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal, en donde el inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal es EDTA; de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
Opcionalmente, el detergente aniónico también puede comprender una solución hipotónica.
Adecuadamente, el período de incubación con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal (tal como EDTA) es suficiente para inhibir las proteasas en el tejido, adecuadamente esto puede ser de aproximadamente 0,5 horas a 48 horas, o de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas.
Adecuadamente, el período de incubación con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal puede ser de aproximadamente 0,5 horas, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 42 horas o 48 horas, o más.
Se apreciará que el período de incubación con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal puede depender del tipo de tejido de partida usado y/o del propio inhibidor. Simplemente a manera de ejemplo, la dermis porcina puede incubarse durante aproximadamente 24 horas con un inhibidor tal como EDTA, mientras que el menisco porcino puede incubarse durante aproximadamente 3 horas con un inhibidor tal como EDTA. El experto es capaz de determinar un tiempo de incubación adecuado mediante experimentación de rutina con el tejido en cuestión.
En un ejemplo, el período de incubación con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal EDTA al 0,1 % es de 24 horas.
En un ejemplo, el período de incubación con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal EDTA al 0,1 % es de 3 horas.
Los inventores han descubierto sorprendentemente que el método puede producir un andamio tisular descelularizado incluso cuando no se usa un inhibidor de enzimas proteasas, adecuadamente incluso cuando solo se usan inhibidores de proteasas de origen no animal. La aprotinina es un inhibidor de enzimas proteasas de origen animal, específicamente un inhibidor de la tripsina pancreática bovina. Debido a su origen bovino, puede transmitir enfermedades zoonóticas. Adecuadamente, el método no usa o comprende necesariamente un inhibidor de proteasas de origen animal. Adecuadamente, el método no usa o comprende necesariamente aprotinina.
Adecuadamente, el método puede comprender además una o más etapas de enjuague para ayudar a eliminar las proteasas liberadas de las células lisadas dentro del tejido.
Por lo tanto, adecuadamente, puede tener lugar una etapa de enjuague después de incubar el tejido con una solución hipotónica, después de incubar el tejido con una solución hipertónica y/o después de someter el tejido a un ciclo de congelación/descongelación.
Adecuadamente, el método comprende una etapa de enjuague después de cada etapa de lisis celular.
Por lo tanto, adecuadamente, tiene lugar una etapa de enjuague después de incubar el tejido con una solución hipotónica, y después de incubar el tejido con una solución hipertónica, y después de someter el tejido a un ciclo de congelación/descongelación. Por lo tanto, adecuadamente, el método puede comprender múltiples etapas de enjuague. Adecuadamente, cada etapa de enjuague puede comprender uno o más enjuagues del tejido. Adecuadamente, cada etapa de enjuague comprende al menos tres enjuagues del tejido.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
• incubar el tejido con un detergente aniónico;
• incubar el tejido al menos una vez con una solución hipotónica y al menos una vez con una solución hipertónica, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación;
• enjuagar el tejido; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
incubar el tejido con un detergente aniónico;
incubar el tejido con una solución hipotónica;
enjuagar el tejido;
incubar el tejido con una solución hipertónica;
enjuagar el tejido; e
incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
incubar el tejido con un detergente aniónico;
incubar el tejido con una solución hipotónica;
enjuagar el tejido;
incubar el tejido con una solución hipertónica;
enjuagar el tejido;
someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación;
enjuagar el tejido; e
incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
El enjuague adecuado del tejido comprende enjuagar el tejido con una solución de enjuague. Adecuadamente, la solución de enjuague es una solución isotónica. Adecuadamente, la solución de enjuague es una solución salina.
Adecuadamente en cada caso que comprende una o más etapas de enjuague, el método no comprende un inhibidor de enzimas proteasas.
En algunos ejemplos, el método puede comprender una etapa de incubación del tejido con una enzima proteasa o proteinasa. Adecuadamente, una enzima proteasa o proteinasa de origen animal. En un ejemplo, con una enzima tripsina, adecuadamente una enzima tripsina derivada de cerdo. En un ejemplo, la incubación del tejido con enzima proteasa o proteinasa es durante un período de aproximadamente 72 horas.
Agente de eliminación de ADN
El método comprende la etapa de incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN. El término “agente de eliminación de ADN” como se usa en la presente, se refiere a un agente que desnaturaliza y/o escinde el ADN.
Adecuadamente, el agente de eliminación de ADN puede seleccionarse del grupo que consiste en una enzima endonucleasa, ácida o alcalina, por ejemplo.
Adecuadamente, la enzima endonucleasa puede ser una endonucleasa humana. Adecuadamente, la enzima endonucleasa puede seleccionarse del grupo que consiste en DNasa tipo I, DNasa tipo II, ADN tipo III, RNasa o cualquier combinación de dos o más de estas. Alternativamente, la enzima endonucleasa puede ser una endonucleasa derivada de bacterias, o una combinación de endonucleasa humana y derivada de bacterias en cualquier combinación de dos o más de estas. Adecuadamente, la endonucleasa puede ser una DNasa I. Adecuadamente, la enzima endonucleasa puede ser una endonucleasa derivada de bacterias, tal como una endonucleasa de Seratia marcescens modificada genéticamente que puede seleccionarse de cualquier endonucleasa disponible comercialmente tal como Benzonase®.
Adecuadamente, la enzima endonucleasa puede estar en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,5 a 50 U/ml. En un ejemplo, la enzima endonucleasa está a una concentración de aproximadamente 5 U/ml.
Adecuadamente, la endonucleasa puede estar presente en un tampón de reacción. Adecuadamente, el tampón de reacción puede comprender Tris y cloruro de magnesio hexahidratado. Adecuadamente, el tampón de reacción puede comprender Tris al 0,6 % y cloruro de magnesio hexahidratado al 0,2 %.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 2-3 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v);
• incubar el tejido con un detergente aniónico, en donde el detergente aniónico es SDS al 0,01 % (p/v); • incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN en donde el agente de eliminación de ADN es 5 U/ml de DNasa I, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
Adecuadamente, el período de incubación con un agente de eliminación de ADN es durante un tiempo suficiente para eliminar el ADN a un nivel de menos de 50 ng/mg. Adecuadamente, esto puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, adecuadamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 horas. Adecuadamente, el período de incubación con un agente de eliminación de ADN puede ser durante aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas o más.
Se apreciará que el período de incubación con un agente de eliminación de ADN puede depender del tipo de tejido de partida usado y/o del propio agente. Simplemente a manera de ejemplo, la dermis porcina puede incubarse durante aproximadamente 3 horas con un agente de eliminación de ADN tal como una endonucleasa, mientras que el menisco porcino puede incubarse durante aproximadamente 22 horas con un agente de eliminación de ADN tal como una endonucleasa, mientras que el tendón porcino puede incubarse durante aproximadamente 6 horas. El ADN puede eliminarse suficientemente del tejido si la cantidad de ADN es menos de aproximadamente 50 ng/mg. El experto apreciará que la eliminación de ADN del tejido puede optimizarse a través de experimentos de rutina que implican diferentes concentraciones y/o tiempos de incubación con un agente de eliminación de ADN.
En un ejemplo, el período de incubación con el agente de eliminación de ADN 5 U/ml de endonucleasa es de 3 horas.
En un ejemplo, el período de incubación con el agente de eliminación de ADN 5 U/ml de endonucleasa es de 22 horas, que comprende dos bloques de tiempo de 2 horas y un bloque de tiempo de 18 horas.
En un ejemplo, el período de incubación con el agente de eliminación de ADN 5U/ml de endonucleasa es de 6 horas, que comprende tres bloques de tiempo de 2 horas.
En un ejemplo, el agente de eliminación de ADN es Benzonase®. La etapa de incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN puede realizarse antes o después de la etapa de incubar el tejido con un inhibidor de enzimas proteasas de origen no animal, si está presente.
Agente antimicrobiano
El método puede comprender además la etapa de incubar el tejido en un agente antimicrobiano. Esta etapa puede ser particularmente beneficiosa en el contexto de un método para producir un andamio tisular descelularizado a partir de un tejido de partida no humano, ya que estos tejidos están asociados con el riesgo de transmisión de enfermedades zoonóticas.
El término “agente antimicrobiano” como se usa en la presente, se refiere a cualquier compuesto natural, sintético o semisintético que tiene actividad antibacteriana, antifúngica, antiviral y/o antiparasitaria. En el contexto de la presente descripción, tal actividad puede incluir disminuir el número de bacterias, hongos, virus y/o parásitos vivos en el tejido de partida y/o andamio tisular, y/o disminuir la posibilidad de contaminación e infección posterior del receptor del andamio tisular tras su usoin vivo.La disminución del número de microorganismos vivos puede lograrse limitando, evitando y/o inhibiendo el crecimiento de los microorganismos, y/o la destrucción de los microorganismos.
Adecuadamente, el agente antimicrobiano puede ser un agente oxidante. El término “agente oxidante” como se usa en la presente, se refiere a un agente que es capaz de oxidar una membrana celular de un microorganismo, lo que da como resultado la lisis y muerte de la célula del microorganismo.
Adecuadamente, el agente oxidante puede ser ácido peracético (PAA). Adecuadamente, el PAA puede estar a una concentración de aproximadamente 500 a aproximadamente 10000 ppm. Adecuadamente, el PAA puede estar a una concentración de aproximadamente 500 ppm a 1500 ppm. En un ejemplo, el PAA está a una concentración de 1000 ppm, escrita de cualquier otra manera como 0,1 %.
Adecuadamente, el agente oxidante (por ejemplo, PAA) puede tener un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. Más adecuadamente, el agente oxidante (por ejemplo, PAA) puede tener un pH de aproximadamente 7.
Adecuadamente el agente oxidante puede estar presente en un tampón, adecuadamente, por ejemplo, en un tampón PBS.
Se apreciará que el agente antimicrobiano puede comprender un solo agente antimicrobiano o dos o más agentes antimicrobianos. Por ejemplo, el agente antimicrobiano puede comprender dos agentes antimicrobianos.
En un caso donde el agente antimicrobiano comprende dos o más agentes antimicrobianos, al menos uno de los agentes puede ser un agente oxidante suave (por ejemplo, PAA). Adecuadamente, en un caso donde el agente antimicrobiano comprende dos o más agentes antimicrobianos, al menos uno de los agentes puede ser un agente oxidante suave (por ejemplo, PAA) y al menos uno de los agentes puede ser un antibiótico.
Adecuadamente, el antibiótico puede seleccionarse del grupo que consiste de penicilina estreptomicina, estreptomicina, ampicilina, actinomicina D, carbenicilina, cefotaxima, fosmidomicina, gentamicina, kanamicina, neomicina y polimixina B.
En el método, el tejido puede incubarse con un agente antimicrobiano (tal como un agente oxidante suave, por ejemplo, PAA) durante un tiempo suficiente hasta que el tejido esté esencialmente libre de microorganismos vivos. Adecuadamente, la incubación puede ser de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 24 horas, adecuadamente de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 12 horas, adecuadamente de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 6 horas, adecuadamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas.
Más adecuadamente, la incubación con un agente antimicrobiano (tal como un agente oxidante, por ejemplo, PAA) puede ser durante aproximadamente 1 hora. En este contexto, “esencialmente libre de” significa que el tejido está al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 %, o más desprovisto de microorganismos que existen en el tejido antes de la incubación con un agente antimicrobiano. El experto es capaz de determinar el tiempo de incubación apropiado para eliminar microorganismos del tejido, por ejemplo, mediante experimentación de rutina.
En un ejemplo, la incubación con un agente antimicrobiano de PAA al 0,1 % es de 1 hora o aproximadamente 3 horas.
La etapa de incubación con un agente antimicrobiano puede realizarse al menos una, dos, tres o más veces. Adecuadamente, la etapa de incubación con un agente antimicrobiano puede realizarse una o dos veces. Simplemente a manera de ejemplo, la incubación con un agente antimicrobiano (tal como un agente oxidante, por ejemplo, PAA) puede realizarse antes de la incubación con un agente deslipidizante y/o después de la incubación con un inhibidor de enzimas proteasas o un agente de eliminación de ADN. Adecuadamente, la incubación con PAA puede ser directamente antes del empaque del andamio tisular descelularizado. Adicionalmente, puede realizarse un incubación adicional con un agente antimicrobiano después de una etapa de someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
• incubar opcionalmente un tejido de partida con un agente antimicrobiano;
• incubar el tejido con un agente deslipidizante;
• incubar el tejido con un detergente aniónico;
• incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación;
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN; e
• incubar el tejido con un agente antimicrobiano, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En otro ejemplo, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 2-3 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v);
• incubar el tejido con un detergente aniónico, en donde el detergente aniónico es SDS al 0,01 % (p/v); • incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación;
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN en donde el agente de eliminación de ADN es 5 U/ml de DNasa I; e
• incubar el tejido con un agente antimicrobiano, en donde el agente antimicrobiano es PAA al 0,1 %, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado.
En un ejemplo, el método puede comprender dos etapas de incubación con un agente antimicrobiano. Adecuadamente, en donde el agente antimicrobiano es PAA al 0,1 %. Adecuadamente, la primera etapa comprende incubar con el agente antimicrobiano durante un período de aproximadamente 1 hora. Adecuadamente, la segunda etapa comprende incubar con el agente antimicrobiano durante un período de aproximadamente 3 horas.
Radiación ionizante
Los tejidos animales generalmente deben exponerse a un proceso de desinfección/esterilización que ha demostrado reducir la zoonosis en 6 log. Sin embargo, una reducción de esta magnitud no se logra típicamente mediante métodos de esterilización tradicionales, por ejemplo, la irradiación gamma a una dosis de 25 kGy. Los inventores han descubierto sorprendentemente que tal nivel de esterilización puede lograrse mediante el uso de radiación ionizante. En consecuencia, el método puede comprender además la etapa de someter el andamio biológico descelularizado a radiación ionizante. Adecuadamente, la radiación ionizante puede ser de aproximadamente 15 kGy a aproximadamente 50 kGy. Adecuadamente, la radiación ionizante puede ser de aproximadamente 18 kGy a 25 kGy, adecuadamente la radiación ionizante puede ser entre 25 kGy a 27,5 kGy.
Adecuadamente, la radiación ionizante puede realizarse antes o después de que el tejido se ha empaquetado. Adecuadamente, la radiación ionizante puede realizarse después de que el tejido se ha empaquetado.
Adecuadamente, la radiación ionizante puede realizarse con o sin hielo seco.
En un ejemplo, el método comprende las etapas de:
incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
incubar el tejido con un detergente aniónico;
incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación;
incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN;
incubar el tejido con un agente antimicrobiano para obtener de esta manera un andamio tisular descelularizado;
empaquetar opcionalmente el andamio; y
someter el andamio a radiación ionizante.
En otro ejemplo, el método comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 2-3 horas, en donde el agente deslipidizante es acetona al 99 % (v/v);
• incubar el tejido con un detergente aniónico, en donde el detergente aniónico es SDS al 0,01 % (p/v); • incubar el tejido al menos una vez con un tampón hipotónico y al menos una vez con un tampón hipertónico, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación;
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN en donde el agente de eliminación de ADN es 5 U/ml de DNasa I;
• incubar el tejido con un agente antimicrobiano, en donde el agente antimicrobiano es PAA al 0,1 %, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado;
• empaquetar opcionalmente el andamio; y
• someter el andamio a radiación ionizante de aproximadamente 18 kGy a 25 kGy, adecuadamente de 25 kGy a 27,5 kGy.
El experto apreciará que entre cada una de las etapas de incubación del método el tejido puede enjuagarse o lavarse al menos una vez. Adecuadamente, el tejido puede enjuagarse o lavarse al menos dos o tres veces entre cada una de las etapas de incubación. Simplemente a manera de ejemplo, el enjuague o lavado puede ser con solución salina. Alternativamente, el enjuague o lavado puede ser con un tampón, por ejemplo, un tampón de lavado o un tampón bien conocido tal como PBS. Adecuadamente, la solución salina puede comprender una solución de cloruro de sodio al 0,9 %. Adecuadamente, el tampón de lavado puede comprender EDTA al 0,1 % y solución salina tamponada con fosfato al 0,1 %. Adecuadamente, el PBS puede comprender una solución salina tamponada con fosfato al 0,1 %.
Ejemplos particulares del método
En un ejemplo, el método puede adaptarse para un andamio tisular tendinoso porcino. Adecuadamente, en donde el tejido de partida es tendón porcino.
En un ejemplo, el método comprende:
(a) incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante;
(b) incubar el tejido con una solución hipotónica;
(c) someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación;
(d) incubar el tejido con un agente antimicrobiano;
(e) incubar el tejido con una solución hipotónica;
(f) incubar el tejido con un detergente aniónico;
(g) incubar el tejido con una solución hipotónica;
(h) incubar el tejido con un detergente aniónico;
(i) incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN;
(j) incubar el tejido con una solución hipertónica;
(k) incubar el tejido con un agente antimicrobiano.
En un ejemplo, el agente deslipidizante es acetona, adecuadamente acetona al 99 % (v/v). En un ejemplo, la etapa (a) comprende incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 2 horas. En un ejemplo, la etapa (a) comprende incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante tres rondas, adecuadamente cada ronda que comprende aproximadamente 40 minutos.
En un ejemplo, la solución hipotónica es un tampón tris hipotónico que comprende Tris al 0,1 % y EDTA al 0,1 %. En un ejemplo, la etapa (b) comprende incubar el tejido con una solución hipotónica durante aproximadamente 1-4 horas. En un ejemplo, la etapa (e) comprende incubar el tejido con una solución hipotónica durante aproximadamente 24 horas. En un ejemplo, la etapa (g) comprende incubar el tejido con una solución hipotónica durante aproximadamente 24 horas.
En un ejemplo, el método comprende dos ciclos de congelación/descongelación. Adecuadamente, cada ciclo se realiza en una solución hipotónica.
En un ejemplo, el método puede comprender una etapa de almacenamiento del tejido. Adecuadamente, el tejido puede almacenarse después de congelarse. Adecuadamente, esto puede tener lugar al final del método, o a la mitad del método, adecuadamente a la mitad de la etapa (c). Adecuadamente, la etapa de almacenamiento puede ser durante un período de hasta 12 meses.
En un ejemplo, el agente antimicrobiano es PAA, adecuadamente PAA al 0,1 %. En un ejemplo, la etapa (d) comprende incubar el tejido con un agente antimicrobiano durante aproximadamente 1 hora. En una etapa ilustrativa (k) comprende incubar el tejido con un agente antimicrobiano durante aproximadamente 3 horas.
En un ejemplo, el detergente aniónico es SDS, adecuadamente, SDS al 0,1 % (p/v). En un ejemplo, el SDS está presente en una solución hipotónica, adecuadamente en un tampón Tris. En una etapa ilustrativa (f) comprende incubar el tejido con un detergente aniónico durante aproximadamente 24 horas. En una etapa ilustrativa (h) comprende incubar el tejido con un detergente aniónico durante aproximadamente 24 horas.
En un ejemplo, el agente de eliminación de ADN es 5 U/ml de Benzonase® en tampón, el tampón puede comprender Tris al 0,6 % y cloruro de magnesio hexahidratado al 0,2 %. En una etapa ilustrativa (i) comprende incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN durante aproximadamente 6 horas. En una etapa ilustrativa (i) comprende incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN durante tres rondas, adecuadamente cada ronda que comprende aproximadamente 2 horas.
En un ejemplo, la solución hipertónica es Tris al 0,6 % y cloruro de sodio al 8,2 %. En un ejemplo, la etapa (j) comprende incubar el tejido con una solución hipertónica durante aproximadamente 18 horas.
En un ejemplo, una o más etapas de lavado están presentes en el método como se describió anteriormente. En un ejemplo, una etapa de lavado puede estar presente entre las etapas (a) y (b), entre las etapas (h) y (i), entre las etapas (i) y (j), entre las etapas (j) y (k), y/o después de la etapa (k). En un ejemplo, las etapas de lavado entre las etapas (a) y (b), entre las etapas (h) y (i), y después de la etapa (k) son con solución salina. En un ejemplo, la etapa de lavado entre las etapas (i) y (j) es con un tampón de lavado. En un ejemplo, la etapa de lavado entre las etapas (j) y (k) es con PBS.
Adecuadamente la mayoría de las etapas del método se realizan a alrededor de 37 °C. Sin embargo, adecuadamente la etapa (a) y la etapa (b) se realizan entre 18-30 °C.
Adecuadamente, el método comprende además una etapa de esterilización terminal como se describe en otra parte en la presente descripción.
En otro ejemplo, el método puede adaptarse para un andamio tisular dérmico porcino. Adecuadamente, en donde el tejido de partida es dermis porcina.
En un ejemplo, el método comprende:
(a) incubar un tejido de partida con un agente antimicrobiano;
(b) incubar el tejido con un agente deslipidizante;
(c) incubar el tejido con una proteinasa;
(d) incubar el tejido con un agente deslipidizante;
(e) incubar el tejido con un detergente aniónico;
(f) incubar el tejido con una solución hipertónica;
(g) incubar el tejido con una solución hipotónica;
(h) incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN;
(i) incubar el tejido con un agente antimicrobiano.
En un ejemplo, el agente antimicrobiano es PAA, adecuadamente PAA al 0,1 %. En un ejemplo, la etapa (a) comprende incubar el tejido con un agente antimicrobiano durante aproximadamente 1 hora. En una etapa ilustrativa (i) comprende incubar el tejido con un agente antimicrobiano durante aproximadamente 3 horas.
En un ejemplo, el agente deslipidizante es acetona, adecuadamente acetona al 99 % (v/v). En un ejemplo, la etapa (b) comprende incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 33 horas. En un ejemplo, la etapa (b) comprende incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante tres rondas, adecuadamente una primera y segunda ronda de aproximadamente 1 hora, y una tercera ronda de aproximadamente 31 horas. En un ejemplo, la etapa (d) comprende incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante aproximadamente 3 horas. En un ejemplo, la etapa (d) comprende incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante durante tres rondas, adecuadamente cada ronda que comprende aproximadamente 1 hora.
En un ejemplo, la proteinasa es una proteinasa natural. En un ejemplo, la proteinasa es tripsina, adecuadamente tripsina al 0,2 % derivada de cerdo en tampón, el tampón puede comprender Tris al 0,6 % y cloruro de magnesio hexahidratado al 0,2 %. En un ejemplo, la etapa (c) comprende incubar el tejido con una proteinasa durante aproximadamente 72 horas.
En un ejemplo, el detergente aniónico es SDS, adecuadamente, SDS al 0,01 % (p/v). En un ejemplo, el SDS está presente en una solución hipotónica, adecuadamente en un tampón Tris. En una etapa ilustrativa (e) comprende incubar el tejido con un detergente aniónico durante aproximadamente 21 horas.
En un ejemplo, la solución hipertónica es Tris al 0,6 % y cloruro de sodio al 8,2 %. En un ejemplo, la etapa (f) comprende incubar el tejido con una solución hipertónica durante aproximadamente 21 horas.
En un ejemplo, la solución hipotónica es Tris al 0,1 % y EDTA al 0,1 %. En un ejemplo, la etapa (g) comprende incubar el tejido con una solución hipotónica durante aproximadamente 21 horas.
En un ejemplo, el método puede comprender además una etapa de despojar el tejido. Adecuadamente esta etapa puede tener lugar entre las etapas (c) y (d). Adecuadamente, el despojado puede tardar hasta 8 horas. Adecuadamente, al menos una etapa de lavado está presente antes y después de la etapa de despojado.
En un ejemplo, el método puede comprender además una etapa de contención, adecuadamente en donde el tejido se mantiene en solución salina. Adecuadamente, la etapa de contención puede tener lugar antes de la etapa final (i). Adecuadamente, la etapa de contención puede ser de hasta 72 horas.
En un ejemplo, el agente de eliminación de ADN es 5 U/ml de Benzonase® en tampón, el tampón puede comprender Tris al 0,6 % y cloruro de magnesio hexahidratado al 0,2 %. En una etapa ilustrativa (h) comprende incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN durante aproximadamente 3 horas.
En un ejemplo, una o más etapas de lavado están presentes en el método como se describió anteriormente. En un ejemplo, una etapa de lavado puede estar presente entre las etapas (a) y (b), entre las etapas (b) y (c), entre las etapas (c) y (d), entre las etapas (d) y (e), entre las etapas (g) y (h), entre las etapas (h) y (i), y/o después de la etapa (i). En un ejemplo, las etapas de lavado son con solución salina.
Adecuadamente, la mayoría de las etapas del método se realizan a alrededor de 14 °C. Sin embargo, adecuadamente las etapas (a) y (i) se realizan a aproximadamente 27 °C. Sin embargo, adecuadamente las etapas (b) y (d) se realizan a aproximadamente 21,5 °C.
Adecuadamente, el método comprende además una etapa de esterilización terminal como se describe en otra parte en la presente descripción.
Andamio tisular descelularizado
En la presente descripción se describe además un andamio tisular descelularizado producido mediante un método como se describe en la presente descripción.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que el método elimina los residuos de detergente aniónico (tal como SDS) del tejido. Sin desear limitarse a esta hipótesis, los inventores creen que la eliminación de residuos de detergente aniónico es posible debido a la optimización de las condiciones del proceso usadas en otras etapas del método, en particular las condiciones del proceso usadas en los incubaciones con una solución hipertónica e hipotónica y/o el ciclo de congelación/descongelación. En consecuencia, el andamio tisular descelularizado descrito en la presente descripción está sustancialmente libre de residuos de detergente aniónico (tal como SDS). Por ‘sustancialmente libre' se entiende que el andamio tisular está al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o hasta 100 % libre de residuos de procesamiento de detergentes aniónicos. Adecuadamente, en virtud del método descrito en la presente descripción, el andamio tisular descrito en la presente descripción comprende menos residuo de detergente aniónico que los andamios producidos en la técnica.
En consecuencia, el andamio tisular descelularizado descrito en la presente descripción está sustancialmente libre de proteína galactosa-alfa-1,3-galactosa (también conocida como alfa-gal). Por ‘sustancialmente libre' se entiende que el andamio tisular puede comprender 20 % o menos, 19 % o menos, 18 % o menos, 17 % o menos, 16 % o menos, 15 % o menos, 14 % o menos, 13 % o menos, 12 % o menos, 11 % o menos, 10 % o menos, 9 % o menos, 8 % o menos, 7 % o menos, 6 % o menos, 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos, 1 % o menos de alfa-gal en comparación con la cantidad de alfa-gal de origen natural en el tejido de partida a partir del cual se produce el andamio. Adecuadamente, en virtud del método descrito en la presente descripción, el andamio tisular descrito en la presente descripción comprende menos residuo de proteína alfagal que los andamios producidos en la técnica.
Adecuadamente, el andamio tisular es un andamio tisular complejo. En un ejemplo, el andamio tisular complejo es un andamio tisular de menisco.
Ejemplos
Ejemplo 1: Dermis porcina
Pre-tratamiento: La dermis porcina se diseccionó y se cortó a 1-2 mm de grosor.
El tejido se lavó en ácido peracético (PAA) al 0,1 % durante 1 hora seguido de lavarlo con solución salina. El tejido se lavó con acetona al 99 % (v/v) tres veces durante 1 hora, seguido de tres lavados con solución salina para eliminar la acetona.
Después, el tejido se incubó en tripsina al 0,2 % durante 72 horas para permitir el despojado manual, seguido de tres lavados adicionales con solución salina y tres lavados con acetona.
Descelularización: El tejido se lavó en SDS al 0,01 % en tampón tris hipotónico durante hasta 24 horas seguido de un lavado con solución hipertónica de tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 9 % durante 24 horas y un lavado adicional de tampón hipotónico (tris al 0,1 %/EDTA al 0,1 %) durante 24 horas.
El ADN se eliminó con un lavado de 5000 U/l de endonucleasa durante 3 horas seguido de tres lavados en solución salina.
El tejido se cortó a medida antes de la inactivación viral en PAA al 0,1 %, empaque final y esterilización terminal a 25 kGy.
Para demostrar la descelularización efectiva, el tejido se probó para detectar residuos de ADN mediante el uso del kit de sangre y tejido de Qiagen DNAeasy y el sistema NanoQuant y también se tiñó con hematoxilina y eosina (Figura 1). Se demostró un contenido de ADN promedio de 16 ng/mg. Se reconoce <50 ng/mg como el estándar para la descelularización.
Ejemplo 2: Menisco porcino
Pre-tratamiento: El menisco porcino se diseccionó y se cortó a 7-8 mm de grosor.
El tejido se lavó tres veces en acetona al 99%(v/v) durante 40 minutos cada uno, seguido de tres lavados en solución salina para eliminar la acetona.
Después, el tejido se lavó en un tampón tris hipotónico durante 40 minutos y se sometió a tres ciclos de congelación/descongelación. El tejido se congeló a -80 °C.
Descelularización: El tejido se descongeló y se lavó en ácido peracético (PAA) al 0,1 % durante 1 hora. Después, el tejido se lavó en una solución hipertónica de tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 9 % durante hasta 8 horas seguido de incubación en SDS al 0,01 % en tampón tris hipotónico durante hasta 20 horas x 4 veces seguido de un lavado en solución hipertónica de tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 9 % durante hasta 8 horas. Después, el tejido se lavó en solución salina durante 40 minutos x 3 veces. El ADN se eliminó con un lavado de 5000 U/l de endonucleasa durante 2 horas x 2 veces, seguido de una incubación con endonucleasa de 18 horas seguido de tres lavados en solución salina.
Los residuos de procesamiento se eliminaron del tejido mediante la incubación del tejido en una solución de EDTA al 0,01 %/solución salina tamponada con fosfato al 0,1 % durante hasta 3 horas seguido de siete lavados en solución salina y tres lavados de solución salina tamponada con fosfato durante 40 minutos.
El tejido se lavó en PAA al 0,1 % para garantizar la inactivación viral seguido de tres lavados en solución salina y un lavado final en solución salina durante 90 horas antes del empaque final y la esterilización terminal a 25 kGy.
Para demostrar la descelularización efectiva, el tejido se probó para detectar residuos de ADN mediante el uso del kit de sangre y tejido de Qiagen DNAeasy y el sistema NanoQuant y también se tiñó con hematoxilina y eosina. Se demostró un contenido promedio de ADN de 14 ng/mg, mientras que se reconoce <50 ng/mg como el estándar para la descelularización.
La Figura 1 muestra que la descelularización se ha logrado al tiempo que se mantiene la histoarquitectura del material. La Figura 1A muestra un andamio de menisco descelularizado. La Figura 1B muestra un andamio dérmico descelularizado. En ambos casos, se ha conservado la histoarquitectura del tejido. La Figura 1C es otra vista del andamio de la Figura 1B.
Datos experimentales
1. Caracterización de alfa-gal de la dermis porcina
El a-gal (a-gal) se cuantificó mediante el uso del kit de ELISA a-gal de MyBioSource (MBS262885). El tejido descelularizado mediante el método del ejemplo 1 se homogenizó primero mediante el uso de un mezclador de alto cizallamiento con extracción y tratamiento mediante el uso del método estándar del kit de ELISA de a gal. Después de la extracción, la a-gal se cuantificó mediante la medición de la absorbancia de la muestra a 450 nm.
Tabla 1
Como puede verse en los resultados de la Tabla 1, el método descrito en la presente descripción redujo significativamente la cantidad de alfa-gal en el andamio tisular.
2. Comparación del método descrito en la presente descripción con el método descrito en el documento EP1392372B1
La citotoxicidad de un tejido descelularizado de acuerdo con el documento EP1392372B1, y un tejido descelularizado de acuerdo con el ejemplo 2 en la presente descripción, se evaluó mediante el uso de ISO 10993-5 (método de extracción).
Tabla 2
Como puede verse en los datos de la Tabla 2, el método descrito en la presente descripción como se llevó a cabo en el ejemplo 2 (V2) es mejor para eliminar el contenido de ADN y mejor para eliminar los residuos de SDS citotóxicos que el método del estado de la técnica.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un andamio tisular descelularizado, el método que comprende las etapas de:
• incubar un tejido de partida con un agente deslipidizante en donde el agente deslipidizante es un solvente polar;
• incubar el tejido con un detergente aniónico;
• incubar el tejido al menos una vez con una solución hipotónica y al menos una vez con una solución hipertónica, y/o someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación; e
• incubar el tejido con un agente de eliminación de ADN, de esta manera se obtiene un andamio tisular descelularizado; en donde el tejido de partida se selecciona del grupo que consiste en: piel, menisco, tendón, ligamento, cartílago, músculo y vaso sanguíneo.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el solvente polar es acetona.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración del agente deslipidizante es de aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % (v/v).
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el detergente aniónico es dodecil sulfato de sodio (SDS) o desoxicolato de sodio, y/o en donde la concentración del detergente aniónico es igual o menor que 0,2 % (p/v).
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución hipotónica comprende tris al 0,1 %/EDTA al 0,1 %, y/o en donde el tejido se incuba con una solución hipotónica durante entre 30 minutos a 100 horas, preferentemente durante entre 10 horas a 100 horas, preferentemente durante entre 20 horas a 80 horas.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución hipertónica comprende tris al 0,6 %/solución de cloruro de sodio al 8-9 %, y/o en donde el tejido se incuba con una solución hipertónica durante entre 1 hora a 48 horas, preferentemente durante entre 4 horas a 30 horas, preferentemente durante entre 8 horas a 24 horas.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método no comprende un inhibidor de proteasas de origen animal.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además una o más etapas de enjuagar el tejido, preferentemente en donde el método comprende una etapa de enjuagar el tejido después de cada etapa de: incubación con una solución hipotónica, incubación con una solución hipertónica, y someter el tejido a al menos un ciclo de congelación/descongelación.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente de eliminación de ADN es una enzima endonucleasa, preferentemente en donde la enzima endonucleasa es humana o bacteriana, preferentemente en donde la enzima endonucleasa se selecciona del grupo que consiste en DNasa tipo I, DNasa tipo II, ADN tipo III, RNasa o cualquier combinación de dos o más de estas, preferentemente en donde la enzima endonucleasa está en una concentración de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 U/ml, preferentemente 5 U/ml.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además la etapa de incubar el tejido con un agente antimicrobiano, preferentemente en donde el agente antimicrobiano es un agente oxidante, preferentemente en donde el agente oxidante es un ácido peracético.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el agente antimicrobiano está en una concentración de aproximadamente 0,05 % (p/v) a 1 % (p/v).
12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de someter el tejido a radiación ionizante, preferentemente en donde la radiación ionizante es a una dosis de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 kGy, preferentemente aproximadamente 25 kGy.
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