ES2322891T3

ES2322891T3 - Descelularizacion de matrices.

Info

Publication number: ES2322891T3
Application number: ES02735577T
Authority: ES
Inventors: John Fisher; Catherine Booth; Eileen Ingham
Original assignee: University of Leeds
Current assignee: University of Leeds
Priority date: 2001-05-24
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2009-07-01
Anticipated expiration: 2022-05-20
Also published as: CA2447847A1; WO2002096476A1; ATE424224T1; CA2447847C; EP1392372B1; GB0112586D0; EP1392372A1; DE60231395D1; US7354749B2; AU2002310589B2; US20040157206A1; GB2375771A

Abstract

Método de preparación de material biológico para implantación que comprende las etapas de: (i) incubar el material biológico con una disolución tampón a un pH ligeramente alcalino que incluye cantidades activas de un inhibidor proteolítico; (ii) incubar el material biológico con un detergente aniónico a un pH ligeramente alcalino a una concentración que es suficiente para efectuar la descelularización pero que mantiene la histoarquitectura del material biológico; (iii) lavar el material biológico con una disolución tampón a un pH ligeramente alcalino tanto con como sin cantidades activas de inhibidores proteolíticos; (iv) incubar el material biológico con una o más enzimas seleccionadas del grupo que comprende ADNasa tipo I, ADNasa tipo II y/o ARNasa, y opcionalmente; (v) colocar el material biológico en un medio crioprotector, estando el método caracterizado porque comprende una etapa de incubación con un único detergente.

Description

Descelularización de matrices.

La presente invención se refiere a un método de preparación de matrices o biomateriales modificados mediante ingeniería de tejidos para implantación, y en particular a un método de mejora de la descelularización de matrices o biomateriales modificados mediante ingeniería de tejidos antes de la implantación.

Antecedentes de la invención

Se conoce una gran variedad de implantes corporales para usos médicos tales como prótesis de sustitución vascular, recubrimientos y apósitos cutáneos, y para otros fines. El material de implante puede ser tejidos corporales o sintéticos de la misma especie o de otras especies distintas de la especie a la que se le va a implantar. Cuando van a implantarse estructuras y tejidos corporales, pueden usarse directamente del donante pero en muchos casos, se prefiere tener algún medio de conservación del tejido del implante para su uso posterior. Actualmente hay diversas técnicas de conservación disponibles que incluyen crioconservación y fijación química con agentes de reticulación tales como glutaraldehído, poli(glicidil éter) y carbodiimida. Con el fin de preparar el tejido de implante para su uso posterior, es deseable descelularizar el tejido antes de su almacenamiento mientras que se minimiza cualquier daño a la estructura física de la propia matriz tisular. Esta descelularización puede ser importante en la mejora de la biocompatibilidad y la reducción de la reacción inmunológica en el injerto de tejido.

De la técnica anterior se conoce el uso de detergentes aniónicos tales como dodecilsulfato de sodio (SDS) para la extracción de componentes celulares. La extracción con SDS se describió por primera vez en el documento US4323358 como un método de prevención o retraso de la calcificación de una bioprótesis valvular cardiaca de Hancock fijada con glutaraldehído, denominándose el método "tratamiento T6 de Hancock". En este método, el tejido fijado se pone en contacto con SDS para retardar la calcificación. Sin embargo, se han notificado limitaciones serias del método (Bodnar E et al, Thorac. Cardiovasc. Surgeon. 1985 34: 82-85; Courtman D W et al, J Biomed Mater Res. 1994 28: 655-666; Wilson G J et al. ASAIO Trans 1990 36: M340-343). Todos estos investigadores notifican que el SDS tiene un efecto perjudicial sobre la matriz extracelular (MEC) de la válvula cardiaca y en particular sobre los componentes de fibras de colágeno y elastina.

Con el fin de mitigar los efectos del SDS sobre la MEC, el documento US4776853 describe el uso de un pretratamiento previo con otros detergentes no iónicos, tal como Triton X-100 de modo que el SDS se emplea sólo como segundo detergente en un programa de descelularización con detergente de múltiples fases.

Un problema adicional asociado con la descelularización del implante de tejido es minimizar la degradación de la MEC durante el procedimiento. Se conoce el uso de inhibidores de proteasas para prevenir tal degradación durante la incubación con un detergente no iónico en la primera fase del programa de descelularización con detergente de múltiples fases y también su uso para prevenir que las proteasas que se producen de manera natural ataquen los colágenos. Hay diversas proteasas diferentes que se encuentran dentro de la matriz tisular, o bien en asociación directa con las propias células o bien unidas dentro de la MEC. Una de las familias más grandes de proteasas, las metaloproteasas de la matriz (MPM), tiene una amplia gama de especificidades de sustrato incluyendo colágeno, laminina, fibronectina y elastina. Otra familia importante de proteasas degradantes de la matriz son los activadores del plasminógeno, que genera la proteasa de amplia especificidad plasmina a partir del abundante zimógeno plasminógeno. Además de la actividad proteolítica, la plasmina tiene la capacidad adicional de activar miembros de la familia de las MMP. Sin embargo, la mayoría de los inhibidores de proteasas son inherentemente tóxicos, lo que es indeseable si la matriz va a sembrarse con células vivas e implantarse en un ser humano o animal. Además, algunos de los inhibidores de proteasas usados hasta el momento, por ejemplo el PMSF, son extremadamente estables en disolución, teniendo una semivida inferior a 1 hora, y dado que la descelularización es un procedimiento largo es decir de varios días, esto limita la elección de los inhibidores que tienen una semivida suficiente.

Un método que pudiera simplificar el procedimiento de descelularización mientras que minimiza el daño a la MEC ofrecería una ventaja significativa con respecto a las prácticas actuales.

Exposición de la invención

En su aspecto más amplio, la presente invención proporciona un método de descelularización de una matriz tisular usando un detergente aniónico a una concentración suficiente para efectuar la descelularización pero a una concentración que mantiene la histoarquitectura de la MEC, usándose el único detergente aniónico junto con inhibidores de proteasas.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un método de preparación de material biológico para implantación que comprende las etapas de:

(i): incubar el material biológico con una disolución tampón a un pH ligeramente alcalino que incluye cantidades activas de un inhibidor proteolítico;

(ii): incubar el material biológico con un detergente aniónico a un pH ligeramente alcalino a una concentración que es suficiente para efectuar la descelularización pero que mantiene la histoarquitectura del material biológico;

(iii): lavar el material biológico con una disolución tampón a un pH ligeramente alcalino tanto con como sin cantidades activas de inhibidores proteolíticos;

(iv): incubar el material biológico con una o más enzimas seleccionadas del grupo que comprende ADNasa tipo I, ADNasa tipo II y/o ARNasa, y opcionalmente;

(v): colocar el material biológico en un medio crioprotector,

estando el método caracterizado porque comprende una etapa de incubación con un único detergente.

Preferiblemente, el método no incluye ninguna etapa adicional de incubación con detergente.

La referencia en el presente documento a la descelularización pretende incluir la eliminación de membranas celulares, ácidos nucleicos, lípidos, componentes citoplasmáticos y quedarse con una MEC que tiene como componentes principales colágenos y elastinas.

Preferiblemente, la disolución tampón es hipotónica o isotónica. Se apreciará que cada una puede usarse o bien como el único tampón o bien en combinación en diferentes fases del método y que el uso de un tampón hipotónico o isotónico no pretende limitar el alcance de la presente solicitud.

El método puede incluir la etapa adicional de crioconservar el material biológico en un criógeno tal como nitrógeno líquido hasta que se requiere.

Preferiblemente, los inhibidores proteolíticos son ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y aprotinina.

Se ha encontrado que la aprotinina es particularmente eficaz como inhibidor proteolítico y de particular utilidad debido a su baja toxicidad, estabilidad en disolución a diferentes pH y estabilidad a una variedad de diferentes temperaturas.

Normalmente, el EDTA se usa en un intervalo de concentración de 1 a 100 mM o del 0,01-1,0% (p/v) y normalmente a 10 mM o el 0,1% y la aprotinina en un intervalo de concentración de 1-100 UIC y normalmente a 10 UIC.

Preferiblemente, las condiciones ligeramente alcalinas de la etapa (i) están en el intervalo de pH de más de 7,0 y hasta pH 10,0, y más preferiblemente están a pH 8,0.

Preferiblemente, el periodo de incubación de la etapa (i) del método es de entre 8 y 20 horas y más preferiblemente es de 14 horas.

Preferiblemente, el detergente aniónico es dodecilsulfato de sodio (SDS) o desoxicolato de sodio.

Preferiblemente, se usa SDS a una concentración igual o inferior al 0,1% (p/v), e igual o superior al 0,03% (p/v).

La referencia en el presente documento al término % (p/v) se refiere al porcentaje en peso (gramos) por volumen unitario (100 ml), por tanto el 0,1% p/v es equivalente a 0,1 g disueltos en 100 ml.

Los métodos de la técnica anterior en los que se ha sugerido el SDS para la descelularización usan concentraciones de SDS iguales o superiores al 1% (p/v) con el fin de efectuar la descelularización. Se ha encontrado que el uso de detergentes aniónicos a esta concentración da como resultado la desestabilización de las interacciones proteicas y/o solubilización, conduciendo así a la degradación de las proteínas de la MEC. Ha sido el conocimiento imperante que el SDS no sería eficaz por debajo de una concentración del 1% (p/v). Sin embargo, los resultados han mostrado sorprendentemente, que una concentración del 0,1% o inferior es eficaz para la descelularización cuando se realiza en presencia de inhibidores de proteasas y que no hay daño a la MEC.

Estudios adicionales usando un segundo detergente no iónico tal como Triton X-100, n-hexil-\beta-D-glucopiranósido, TWEEN 20 y MEGA 10 y el detergente zwitteriónico CHAPS no mostraron ningún efecto sobre la descelularización producida por una baja concentración de SDS solo. Los resultados mostraron que el uso de un segundo detergente no tenía ningún efecto significativo sobre la descelularización de válvulas cardiacas porcinas incluso tras un periodo de 72 h. Por tanto, la presente invención es particularmente ventajosa porque se ha demostrado que no existe ninguna necesidad de un segundo detergente no iónico. Por consiguiente, la presente invención ha obviado la necesidad de un procedimiento con detergente de múltiples fases.

Preferiblemente, se usa desoxicolato de sodio a una concentración igual o inferior al 2,0% (p/v) e igual o superior al 0,5% (p/v).

Preferiblemente, el periodo de incubación de la etapa (ii) del método es de entre 20 y 28 horas y más preferiblemente es de 24 horas.

Preferiblemente, las condiciones ligeramente alcalinas de la etapa (ii) están en el intervalo de pH de más de 7,0 y hasta pH 10,0, y más preferiblemente están a pH 8,0.

Preferiblemente, la etapa de lavado (iii) del método implica múltiples lavados, normalmente X3 lavados con solución salina tamponada con Tris (preferiblemente NaCl 0,15 M, Tris 0,05 M en agua destilada) que contiene inhibidores de proteasas (EDTA al 0,1% y aprotinina 10 UIC/ml), y además, múltiples lavados, normalmente X3 lavados con solución salina tamponada con Tris sin los inhibidores de proteasas.

Preferiblemente, las condiciones ligeramente alcalinas de la etapa (iii) están en el intervalo de pH de más de 7,0 y hasta pH 10,0, y más preferiblemente están a pH 8,0.

Preferiblemente, la etapa de incubación (iv) del método es de 4-6 horas a 37ºC.

La ADNasa tipo I, ADNasa tipo II o ARNasa se emplean como disoluciones de fuerza iónica baja en una cantidad eficaz para eliminar los ácidos nucleicos y proporcionar una matriz tisular de inmunogenicidad limitada. Por consiguiente, cualquier otro agente que pueda realizar la misma función está incluido dentro del alcance de la presente invención.

Preferiblemente, se usa ADNasa I en un intervalo de concentración de 5,0-100 \mug/ml y normalmente a 20 \mug/ml y ARNasa A en un intervalo de concentración de 0,1-10 \mug/ml y normalmente a 1 \mug/ml.

Preferiblemente, se prepara el tejido biológico en la etapa (v) del método para su almacenamiento mediante colocación en un crioprotector, tal como y sin limitación, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene el 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) y el 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un implante de tejido que comprende MEC de la que se han eliminado las membranas celulares, los ácidos nucleicos y otros componentes citoplasmáticos, habiéndose producido el implante de tejido mediante el método de la presente invención.

En resumen, las realizaciones preferidas de la presente invención proporcionan un método de descelularización de una matriz celular que da como resultado efectos perjudiciales no significativos en las proteínas de la MEC y la posterior histoarquitectura de la válvula aórtica, tal como se evalúa mediante técnicas tanto histológicas como biomecánicas y en el que se usa un único detergente aniónico tal como SDS o desoxicolato de sodio a una concentración suficiente para provocar la descelularización;

\bullet: como detergente de fase única;

\bullet: a concentraciones bajas que efectúan la descelularización mientras que mantienen la MEC en un buen estado;

\bullet: en combinación con los inhibidores de proteasas EDTA (como inhibidor de las MPM) y aprotinina (inhibidor de la familia de la serina de activadores del plasminógeno);

\bullet: durante un periodo de aproximadamente 24 horas.

Según un aspecto aún adicional de la invención, se proporciona un producto que comprende una combinación de un detergente aniónico a una concentración descrita anteriormente en el presente documento y un inhibidor proteolítico tal como se describió anteriormente en el presente documento y que incluye opcionalmente un conjunto de instrucciones para el uso del mismo en el método de la presente invención.

Alternativamente, el producto que lo comprende puede comprender concentrados para su dilución y uso en un método.

La presente invención se describirá ahora sólo a modo de ejemplo con referencia a las figuras siguientes en las que:

la figura 1A ilustra una sección transversal de una valva de válvula cardiaca tratada con disolución de SDS al 0,05% a 10 aumentos;

la figura 1B ilustra la figura 1A a 40 aumentos;

la figura 2A ilustra una sección transversal de una valva de válvula cardiaca tratada con una disolución de SDS al 0,02% a 10 aumentos;

la figura 2B ilustra la figura 2A a 40 aumentos;

la figura 3A ilustra una fotomicrografía a 400 aumentos de tendón rotuliano porcino fresco teñido con hematoxilina y eosina, y;

la figura 3B ilustra una fotomicrografía a 400 aumentos de tendón rotuliano porcino tras el tratamiento de descelularización según la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Con referencia a las figuras 1A y 1B, se muestra una sección transversal de una valva de válvula cardiaca tratada con concentraciones de SDS al 0,03%. Se observó una descelularización total de la valva a esta concentración. Sin embargo, a concentraciones inferiores al 0,05% (figuras 2A y 2B), se encontró que la matriz había retenido células completas o fragmentos de células. La sección transversal de una valva de válvula cardiaca tratada con SDS al 0,02% es por tanto una concentración inferior a la que no se produce la descelularización. Puede observarse que los fragmentos de células y las células completas se han retenido en la matriz (pigmento azul/negro). Siguiendo el método de la presente invención, también pueden descelularizarse satisfactoriamente tendones rotulianos (figura 3B).

Ejemplo 1 - Válvulas aórticas porcinas

Se obtuvieron corazones porcinos de un matadero local en el plazo de 2 horas tras la matanza y se transportaron en hielo al laboratorio. A su llegada al laboratorio, se disecaron las raíces de la válvula aórtica del corazón y se lavaron en solución de transporte (solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), aprotinina 10 UIC/ml, penicilina 10 u/ml, estreptomicina 100 \mug/ml, nistatina 100 U/ml, HEPES 10 mM pH 7,6). Se incubaron las válvulas aórticas durante la noche (14 horas) en tampón Tris hipotónico (Tris 10 mM pH 8, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,1% (p/v), 10 UIC de aprotinina en agua destilada AD).

Posteriormente, se incubaron las válvulas aórticas durante 24 horas con agitación a temperatura ambiente en dodecilsulfato de sodio (SDS) (al 0,05%-0,1%) (p/v) o desoxicolato de sodio al 0,5% en tampón Tris hipotónico. Entonces se lavaron (X3) con solución salina tamponada con Tris (NaCl 0,15 M, Tris 0,05 M, pH 7,6 en AD) que contenía inhibidores de proteasas (EDTA al 0,1% p/v y aprotinina 10 UIC/ml). Entonces se sometieron a un lavado adicional (X3) con solución salina tamponada con Tris (TBS) sin inhibidores de proteasas.

Entonces se incubaron las válvulas aórticas durante 4-6 horas a 37ºC con ADNasa I (20 \mug/ml) y ARNasa A (1 \mug/ml). Tras esto, se lavaron (X3) en TBS que contenía inhibidores de proteasas. Finalmente, en preparación para su almacenamiento se colocaron en un crioprotector [medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10% (v/v) y dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% (v/v) y se crioconservaron en nitrógeno líquido hasta que se requirieron para implantación.

Ejemplo 2 - Tendones rotulianos porcinos

Se disecaron tendones rotulianos porcinos y entonces se lavaron en PBS. Se incubaron los tendones durante la noche (24 horas) en tampón Tris hipotónico (Tris 10 mM, pH 8, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,1%, 10 UIC de aprotinina en agua destilada (AD)]. Posteriormente, se incubaron los tendones durante 24 horas más con agitación a temperatura ambiente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,03-0,1% p/v o desoxicolato de sodio al 0,5% en tampón Tris hipotónico. Entonces se lavaron (X3) con PBS que contenía inhibidores de proteasas (EDTA al 0,1% y aprotinina 10 UIC/ml).

Con referencia a la figura 3A, se muestra una fotomicrografía de tendón rotuliano porcino fresco, teñido con hematoxilina y eosina (x400). La figura 3B muestra una fotomicrografía de tendón rotuliano porcino tras el tratamiento de descelularización tal como se describió anteriormente y también teñido con hematoxilina y eosina (x400). Resulta evidente a partir de la comparación de las figuras que se ha conseguido la descelularización mientras que se mantiene la histoarquitectura del material.

Claims

1. Método de preparación de material biológico para implantación que comprende las etapas de:

(v): colocar el material biológico en un medio crioprotector, estando el método caracterizado porque comprende una etapa de incubación con un único detergente.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el tampón es hipotónico y/o isotónico.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye además la etapa de crioconservar el material biológico en un criógeno tal como nitrógeno líquido hasta que se requiere para su uso.

4. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el inhibidor proteolítico es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y aprotinina.

5. Método según la reivindicación 4, en el que se usa el EDTA a una concentración en la región de 1 a 100 mM o del 0,01-1,0% (p/v).

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que se usa EDTA a una concentración de 10 mM o del 0,1% (p/v).

7. Método según la reivindicación 4, en el que se usa aprotinina en un intervalo de concentración de 1-100 UIC.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 7, en el que se usan 10 UIC de aprotinina.

9. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las condiciones ligeramente alcalinas de la etapa (i) están en el intervalo de pH de más de 7,0 y hasta pH 10,0.

10. Método según la reivindicación 9, en el que el pH es 8,0.

11. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el periodo de incubación de la etapa (i) es de entre 8 y 20 horas.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el periodo de incubación es de 14 horas.

13. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el detergente aniónico es dodecilsulfato de sodio (SDS) o desoxicolato de sodio.

14. Método según la reivindicación 13, en el que se usa SDS a una concentración igual o inferior al 0,1% (p/v) e igual o superior al 0,03% (p/v).

15. Método según la reivindicación 13, en el que se usa desoxicolato de sodio a una concentración igual o inferior al 2,0% (p/v) e igual o superior al 0,5% (p/v).

16. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el periodo de incubación de la etapa (ii) es de entre 20 y 28 horas.

17. Método según la reivindicación 16, en el que el periodo de incubación es de 24 horas.

18. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las condiciones alcalinas de la etapa (ii) están en la región del intervalo de pH de más de 7,0 y hasta pH 10,0.

19. Método según la reivindicación 18, en el que el pH es de 8,0.

20. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de lavado (iii) comprende múltiples lavados con solución salina tamponada con Tris que contiene inhibidores de proteasa y múltiples lavados con solución salina tamponada con Tris sin los inhibidores de proteasas.

21. Método según la reivindicación 20, en el que el tampón es NaCl 0,15 M, Tris 0,05 M en agua destilada con o sin EDTA y aprotinina.

22. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las condiciones alcalinas de la etapa (iii) están en la región del intervalo de pH de más de 7,0 y hasta pH 10,0.

23. Método según la reivindicación 22, en el que el pH es de 8,0.

24. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la incubación de la etapa (iv) es durante 4-6 horas a 37ºC.

25. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que se usa ADNasa I a una concentración en el intervalo de 5-100 \mug/ml y ARNasa a una concentración en el intervalo de 0,1-10 \mug/ml.

26. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el material biológico se prepara en la etapa (v) para su almacenamiento mediante colocación en un crioprotector que comprende medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene entre el 10-20% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) y el 5-15% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).