ES3025190T3 - Biological conjugates having an photogenerated acidic or basic releasable detection moiety on top of biological tissues - Google Patents

Biological conjugates having an photogenerated acidic or basic releasable detection moiety on top of biological tissues Download PDF

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Abstract

La invención se refiere a un método para detectar una fracción diana en una muestra de especímenes biológicos mediante los pasos a) proporcionar al menos un conjugado con la fórmula general (I) X n - P - Y m , donde X es una fracción de detección, P un espaciador degradable ácido o básico e Y una fracción de reconocimiento de antígeno u oligonucleótido y n, m son números enteros entre 1 y 100 y donde X e Y están unidos covalentemente a P, b) unir el conjugado a la fracción diana a través de la fracción de reconocimiento de antígeno u oligonucleótido Y, marcando así la fracción diana c) detectar la fracción diana marcada con el conjugado detectando la fracción detectora X d) proporcionar al menos un precursor que es capaz de liberar un ácido o una base cuando se proporciona con radiación en donde el ácido o la base es capaz de escindir Pe) activar el precursor proporcionando radiación, liberando así el ácido o la base capaz de escindir P f) degradar el espaciador P con el ácido o la base liberados, escindiendo así la fracción de detección X de la fracción de detección conjugada.a) la fracción de detección X de la fracción de detección conjugada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados biológicos que tienen un resto de detección liberable ácido o básico fotogenerado sobre de tejidos biológicos
Antecedentes
La presente invención se refiere a un proceso para la detección o identificación de restos diana o células diana o a partir de una muestra celular marcando los restos diana o células diana con un conjugado que tiene un resto de detección y un resto de reconocimiento de antígeno u oligonucleótido unido a través de un espaciador degradable por ácidos o bases, en donde el ácido, o base, usado para degradar el espaciador se proporciona en forma de un precursor fotoactivable espacialmente.
Después de detectar los restos diana, el precursor se activa o se fotoescinde mediante radiación y el ácido, o base, para degradar el espaciador se libera, eliminando de este modo al menos el resto de detección del resto diana marcado.
Antecedentes
Desde hace mucho tiempo se sabe cómo detectar células usando conjugados que comprenden un resto fluorescente y un resto de reconocimiento de antígeno. Además, se han desarrollado conjugados a partir de los cuales se puede eliminar el resto fluorescente, permitiendo de este modo la re-tinción de las células que a su vez permite detectar múltiples restos diana.
También se sabe que los oligonucleótidos marcados fluorescentemente pueden usarse para detectar una secuencia diana y el resto fluorescente puede escindirse más tarde para realizar un conjunto múltiple posterior de hibridación y detección para aumentar la potencia de decodificación o detección. Gargey Yagnik et al: Journal of the American Society for Mass Spectrometry (2021) vol. 32, no. 4, páginas 977-988 describe la obtención de imágenes por MALDI-MS inmunohistoquímica altamente multiplexada de biomarcadores en tejidos.
Compendio
Sorprendentemente, se encontró que los conjugados compuestos de un resto de unión a antígeno unido a través de un espaciador degradable por ácidos o bases a un resto de detección pueden degradarse activando o fotoescindiendo un precursor de un ácido o una base. Después de la liberación, el espécimen biológico puede someterse nuevamente al mismo conjugado o a un conjugado diferente sin interferencia del marcador anterior. Por lo tanto, el objeto de la invención es un método para detectar un resto diana en una muestra de especímenes biológicos que consiste en
a) proporcionar al menos un conjugado con la fórmula general (I) X<n n>- P - Y<m>, siendo X un resto de detección, P un espaciador degradable por ácidos o bases e Y un resto de reconocimiento de antígeno u oligonucleótido y n, m son números enteros entre 1 y 100 y en donde X e Y están unidos covalentemente a P, b) unir el conjugado al resto diana a través del resto Y de reconocimiento de antígeno u oligonucleótido, marcando de este modo el resto diana,
c) detectar el resto diana marcado con el conjugado detectando el resto X de detección,
d) proporcionar al menos un precursor que es capaz de liberar un ácido o una base cuando se le proporciona radiación, en donde el ácido o base es capaz de escindir P,
e) activar el precursor proporcionando radiación, liberando de este modo el ácido o base capaz de escindir P, y
f) degradar el espaciador P con el ácido o base liberados, escindiendo de este modo el resto X de detección del resto de detección conjugado.
La activación del precursor puede conseguirse por fotoescisión del precursor en al menos dos subunidades en donde al menos una de las subunidades es un ácido y/o una base.
Preferiblemente, mediante degradación ácida o básica del espaciador P, el resto Y de reconocimiento de antígeno u oligonucleótido se escinde del resto de detección.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1 a 4 muestran ejemplos de unidades para el espaciador P degradable por ácidos o bases. La figura 2 se toma de G. Lerche et al., Bioorg. 20 (2021) 571 -582)
Descripción detallada
El término "escindir el resto X de detección del conjugado" significa que el enlace entre X y P se anula y el resto X de detección puede eliminarse de la diana, por ejemplo, mediante disociación o lavado.
Opcionalmente, el resto Y de reconocimiento de antígeno también se elimina de la diana anulando el enlace entre X y P.
El proceso de la invención puede realizarse en una o más secuencias de las etapas a) a g). Después de cada secuencia, el resto de detección y opcionalmente el resto de reconocimiento de antígeno se liberan (eliminan) del resto diana. Especialmente cuando los especímenes biológicos son células vivas que se procesarán o analizarán adicionalmente, el método de la invención tiene la ventaja de proporcionar células sin marcar.
Después y/o antes de cada etapa a) - g), se puede realizar una etapa de lavado para eliminar material no deseado como conjugados no unidos o restos de detección liberados de la muestra.
Resto diana
El resto diana que se va a detectar con el método de la invención puede estar en cualquier espécimen biológico, tal como cortes de tejidos, agregados celulares, células en suspensión o células adherentes. Las células pueden estar vivas o muertas. Preferiblemente, los restos diana son antígenos expresados intracelularmente o extracelularmente en especímenes biológicos tales como animales enteros, órganos, cortes de tejidos, agregados celulares, o células individuales de invertebrados, (por ejemplo, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster), vertebrados (por ejemplo,Danio rerio(Hamilton, 1822),Xenopus laevis,(Daudin 1802)) y mamíferos (por ejemplo,Mus musculus,Linnaeus, 1758,Homo sapiens,Linneaeus, 1758)).
Resto de detección
El resto X de detección del conjugado puede ser cualquier resto que posea una propiedad o función que pueda usarse para fines de detección como los seleccionados del grupo que consiste en resto cromóforo, resto fluorescente, resto fosforescente, resto luminiscente, resto absorbente de luz, resto radiactivo y resto marcador de masa de isótopo de metal de transición.
Los restos fluorescentes adecuados son los conocidos en la técnica de las tecnologías de inmunofluorescencia, por ejemplo, citometría de flujo o microscopía de fluorescencia. En estas realizaciones de la invención, el resto diana marcado con el conjugado se detecta excitando el resto X de detección y detectando la emisión resultante (fotoluminiscencia). En esta realización, el resto X de detección es preferiblemente un resto fluorescente.
Los restos fluorescentes útiles pueden estar basados en proteínas, tales como ficobiliproteínas, poliméricos, tales como polifluorenos, colorantes de moléculas orgánicas pequeñas, tales como xantenos, como fluoresceína, o rodaminas, cianinas, oxazinas, cumarinas, acridinas, oxadiazoles, pirenos, pirrometenos, o complejos metalorgánicos, tales como complejos de Ru, Eu, Pt. Además de entidades de molécula única, también pueden usarse como restos fluorescentes agrupaciones de proteínas fluorescentes o colorantes de moléculas orgánicas pequeñas, así como nanopartículas, tales como puntos cuánticos, nanopartículas de conversión ascendente, nanopartículas de oro, nanopartículas de polímero teñidas.
Otro grupo de restos de detección fotoluminiscentes son restos fosforescentes con emisión de luz retardada en el tiempo después de la excitación. Los restos fosforescentes incluyen complejos metaloorgánicos, tales como complejos de Pd, Pt, Tb, Eu, o nanopartículas con pigmentos fosforescentes incorporados tales como SrAl2O4 dopado con lantánido.
En otra realización de la invención, la diana marcada con el conjugado se detecta sin excitación previa por irradiación. En esta realización, el resto de detección puede ser un marcador radiactivo. Pueden estar en forma de marcaje con radioisótopos intercambiando isótopos no radiactivos por sus homólogos radiactivos, tales como tritio, 32P, 35S o 14C, o introducir marcadores unidos covalentemente, tales como 125I, que está unido a tirosina, 18F dentro de fluorodesoxiglucosa, o complejos metalorgánicos, es decir, 99Tc-DTPA.
En otra realización, el resto de detección es capaz de provocar quimioluminiscencia, es decir, marcador de peroxidasa de rábano picante en presencia de luminol.
En otra realización de la invención, la diana marcada con el conjugado no se detecta por emisión de radiación, sino por absorción de radiación UV, luz visible o NIR. Los restos de detección absorbentes de luz adecuados son colorantes absorbentes de luz sin emisión de fluorescencia, tales como colorantes inhibidores de la fluorescencia de moléculas orgánicas pequeñas como N-aril rodaminas, colorantes azoicos y estilbenos.
En otra realización, los restos X de detección absorbentes de luz pueden irradiarse mediante luz láser pulsada, generando una señal fotoacústica.
En otra realización de la invención, la diana marcada con el conjugado se detecta por detección espectrométrica de masas de un isótopo de metal de transición. Los marcadores de etiqueta de masa de isótopo de metal de transición pueden introducirse como complejos metaloorgánicos unidos covalentemente o componente de nanopartícula. En la técnica se conocen etiquetas isotópicas de lantánidos y elementos de transición tardíos adyacentes.
El resto X de detección puede estar acoplado de forma covalente o no covalente al espaciador P. Los métodos para la conjugación covalente o no covalente son conocidos por los expertos en la técnica. En el caso de un enlace covalente entre el resto X de detección y el espaciador P, es posible una reacción directa de un grupo activado en el resto de detección o en el espaciador P con un grupo funcional en el espaciador P o bien en el resto X de detección o bien a través de una molécula enlazadora heterobifuncional, que se hace reaccionar en primer lugar con uno de ellos y se hace reaccionar en segundo lugar con el otro compañero de fijación.
Por ejemplo, un gran número de compuestos heterobifuncionales están disponibles para unirse a entidades. Las entidades ilustrativas incluyen: azidobenzoil hidrazida, N-[4-(p-azidosalicilamino)butil]-3'-[2'-piridilditio]propionamida), suberato de bis-sulfosuccinimidilo, dimetiladipimidato, disuccinimidiltartrato, éster de N-y-maleimidobutiriloxisuccinimida, N-hidroxi sulfosuccinimidil-4-azidobenzoato, [4-azidofenil]-1,3'-ditiopropionato de N-succinimidilo, [4-yodoacetil]aminobenzoato de N-succinimidilo, glutaraldehído, ésteres de succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)polietilenglicol] (NHS-PEG-MAL) y 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo. Un grupo de unión preferido es éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (SPDP) o éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1 -carboxílico (SMCC) con un grupo sulfhidrilo reactivo en el resto de detección y un grupo amino reactivo en el espaciador P.
Una unión casi-covalente del resto X de detección al espaciador P puede lograrse con sistemas de unión que proporcionan una constante de disociación de < 10-9 M, por ejemplo, interacción de unión biotina-avidina.
Espaciador P degradable por ácidos o bases
Los espaciadores P degradables por ácidos o bases adecuados pueden comprender unidades funcionales escindibles ácidas o básicas seleccionadas del grupo que consiste en acetales, silil ésteres, hidrazina, imina, ésteres, fosforamidita, hidrazina, vinil éter, tritilo, aconitrilo, oxicarbonilo, parametoxibencilo, cetal, policetal, ortoésteres, ácido tiomalémico, en un enlazador con alquilo, polietilenglicol, polisacáridos, proteínas, péptidos, depsipéptidos, poliésteres, segmentos de ácidos nucleicos y derivados de los mismos.
La radiación utilizada para activar o fotoescindir el precursor depende de la naturaleza química del precursor, pero normalmente está en el intervalo de 200 a 800 nm.
Precursor
Los precursores adecuados comprenden unidades funcionales seleccionadas del grupo que consiste en sales de diazonio, perhalometiltriazinas, halobisfenilo, o-nitrobenzaldehído, sulfonatos, ésteres de imidilsulfonilo, sales de diarilyodonio, sales de sulfonio, diazosulfonato, diarilsulfonas, 1,2-diazocetonas, 2-diazo 1-oxo 5 sulfonilo, 2-diazo 1-oxo 4 sulfonilo, diazometil cetona, ácido de diazoMeldrum, derivados de arilazida, benzocarbonatos, carbamatos, carbonatos de dimetoxibenzoiinilo, carbamatos de dimetoxibenzoiinilo, carbonatos de o-nitrobenciloxi, carbamatos de o-nitrobenciloxi, nitrobenceno sulpenilo, o-nitroanilinas, carbamato de nitrobencilo, carbamatos de 3',5'-dimetoxibenzoína.
Resto Y de reconocimiento de antígeno
La expresión "resto Y de reconocimiento de antígeno" se refiere a cualquier tipo de anticuerpo, anticuerpo fragmentado o derivados de anticuerpo fragmentados, dirigidos contra los restos diana expresados en los especímenes biológicos, como antígenos expresados intracelularmente o extracelularmente en células. La expresión se refiere a anticuerpos completamente intactos, anticuerpos fragmentados o derivados de anticuerpos fragmentados, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, sdAb, scFv, di-scFv, nanocuerpos. Tales derivados fragmentados de anticuerpos pueden sintetizarse mediante procedimientos recombinantes que incluyen conjugados covalentes y no covalentes que contienen este tipo de moléculas. Otros ejemplos de restos de reconocimiento de antígeno son complejos de péptido/MHC que se dirigen a moléculas de TCR, moléculas receptoras de adhesión celular, receptores para moléculas coestimuladoras, moléculas de unión artificiales modificadas por ingeniería genética, por ejemplo, péptidos o aptámeros que se dirigen, por ejemplo, a moléculas de la superficie celular.
El "resto Y de reconocimiento de antígeno" también puede comprender oligonucleótidos que reconocen restos diana apropiados de los especímenes biológicos, como otros nucleótidos. Preferiblemente, los oligonucleótidos comprenden 10-200 nucleótidos.
El conjugado usado en el método de la invención puede comprender hasta 100, preferiblemente 1-20 restos Y de reconocimiento de antígeno. La interacción del resto de reconocimiento de antígeno con el antígeno diana puede ser de alta o baja afinidad. Las interacciones de unión de un único resto de reconocimiento de antígeno de baja afinidad son demasiado bajas para proporcionar un enlace estable con el antígeno. Los restos de reconocimiento de antígeno de baja afinidad pueden multimerizarse mediante conjugación con el espaciador P enzimáticamente degradable para proporcionar alta avidez. Cuando el espaciador P se escinde enzimáticamente en la etapa g), los restos de reconocimiento de antígeno de baja afinidad se monomerizarán, lo que da como resultado una eliminación completa del resto X de detección, el espaciador P y el resto Y de reconocimiento de antígeno (Fig. 3b). Los restos de reconocimiento de antígeno de alta afinidad proporcionan un enlace estable que da como resultado una eliminación del resto X de detección y el espaciador P durante la etapa g).
Preferiblemente, la expresión "resto Y de reconocimiento de antígeno" se refiere a un anticuerpo dirigido contra el antígeno expresado intracelularmente por los especímenes biológicos (células diana), como IL2, FoxP3, CD154 o extracelular, como CD3, CD14, C<d>4, CD8, CD25, CD34, CD56 y CD133.
Los restos Y de reconocimiento de antígeno, especialmente anticuerpos, pueden acoplarse al espaciador P a través de grupos amino o sulfhidrilo de cadena lateral. En algunos casos, la cadena lateral glucosídica del anticuerpo puede oxidarse mediante peryodato dando como resultado grupos funcionales aldehído.
El resto Y de reconocimiento de antígeno puede estar acoplado covalente o no covalentemente al espaciador P. Los métodos para la conjugación covalente o no covalente son conocidos por los expertos en la técnica y los mismos que se mencionan para la conjugación del resto X de detección.
El método de la invención es especialmente útil para la detección y/o aislamiento de tipos celulares específicos a partir de mezclas complejas y puede comprender más de una secuencia secuencial o paralela de las etapas a) - g). El método puede usar una variedad de combinaciones de conjugados. Por ejemplo, un conjugado puede comprender anticuerpos específicos para dos epítopos diferentes, como dos anticuerpos anti-CD34 diferentes. Diferentes antígenos pueden abordarse con diferentes conjugados que comprenden diferentes anticuerpos, por ejemplo, anti-CD4 y anti-CD8 para la diferenciación entre dos poblaciones de células T distintas o anti-CD4 y anti-CD25 para la determinación de diferentes subpoblaciones celulares como células T reguladoras.
La cantidad de ácido debe ser suficiente para degradar sustancialmente el espaciador en el período de tiempo deseado. Normalmente, la señal de detección se reduce al menos aproximadamente 80%, más normalmente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%. Las condiciones para la liberación pueden optimizarse empíricamente en términos de temperatura, pH, presencia de cofactores metálicos, agentes reductores, etc. La degradación se completará habitualmente en al menos aproximadamente 15 minutos, más habitualmente al menos aproximadamente 10 minutos, y habitualmente no será más de aproximadamente 30 minutos.
Realizaciones del método
En primer lugar, se puede proporcionar más de un precursor, en donde los diferentes precursores se activan o se fotoescinden mediante radiación de diferentes longitudes de onda.
En segundo lugar, el conjugado se proporciona a una superficie de un espécimen biológico y la radiación para activar el precursor se aplica a regiones definidas espacialmente del espécimen biológico. Obviamente, la degradación del espaciador P se restringe a las regiones definidas espacialmente del espécimen biológico solamente.
En tercer lugar, la muestra de especímenes biológicos tiene un primer pH y después de activar el precursor proporcionando radiación, al menos una parte de la muestra de especímenes biológicos tiene un segundo pH; en donde la diferencia del primer y segundo pH es al menos -0,5, preferiblemente al menos -1,0, más preferiblemente al menos -2,0. Sin embargo, el intervalo de pH no debe exceder de 4 a 10.
En cuarto lugar, la radiación para activar el precursor se aplica a al menos una región definida espacialmente del espécimen biológico, en donde antes de proporcionar radiación, la al menos una región definida espacialmente tiene un primer pH y después de activar el precursor proporcionando radiación, la al menos una región definida espacialmente tiene un segundo pH; en donde la diferencia del primer y segundo pH es al menos -0,5, preferiblemente al menos -1,0, más preferiblemente al menos -2,0. Sin embargo, el intervalo de pH no debe exceder de 4 a 10.
Métodos de detección celular
El método y equipo para detectar la diana marcada con el conjugado X<n>- P - Y<m>se determina por el resto X de detección.
En una variante de la invención, el resto X de detección es un resto fluorescente. Las dianas marcadas con fluorocromo-conjugado se detectan excitando el resto fluorescente X y analizando la señal de fluorescencia resultante. La longitud de onda de la excitación se selecciona normalmente según el máximo de absorción del resto fluorescente X y se proporciona mediante fuentes de LÁSER o LED como se conoce en la técnica. Si se usan varios restos X de detección diferentes para la detección de múltiples colores/parámetros, debe tenerse cuidado de seleccionar restos fluorescentes que no tengan espectros de absorción superpuestos, al menos que no se solapen con máximos de absorción. En el caso de restos fluorescentes como resto de detección, las dianas pueden detectarse, por ejemplo, bajo un microscopio de fluorescencia, en un citómetro de flujo, un espectrofluorómetro o un escáner de fluorescencia. La luz emitida por quimioluminiscencia puede detectarse mediante instrumentación similar omitiendo la excitación.
Los restos de detección radiactivos se detectan a través de la radiación emitida por los isótopos radiactivos. La instrumentación adecuada para la detección de radiación radiactiva incluye, por ejemplo, contadores de centelleo. En el caso de la emisión beta, la microscopía electrónica también se puede usar para la detección.
Los restos de etiqueta de masa de isótopo de metal de transición se detectan mediante métodos espectrométricos de masas tales como ICP-MS, que se integra en instrumentación de citometría de masa.
Uso del método
El método de la invención puede usarse para diversas aplicaciones en investigación, diagnóstico y terapia celular.
En una primera variante de la invención, se detectan especímenes biológicos como células con fines de recuento, es decir, para establecer la cantidad de células de una muestra que tiene un cierto conjunto de antígenos reconocidos por los restos de reconocimiento de antígeno del conjugado.
En una segunda variante, se detectan una o más poblaciones de especímenes biológicos de la muestra y se separan como células diana. Esta variante puede usarse para la purificación de células diana, por ejemplo, en investigación clínica, diagnóstico e inmunoterapia. En esta variante, se pueden realizar una o varias etapas de clasificación después de cualquiera de las etapas a) a g) y las etapas de lavado opcionales.
Son adecuados para tales separaciones especialmente los clasificadores de flujo, por ejemplo, sistemas clasificadores de células basados en FACS o MEMS, por ejemplo como se describe en los documentos EP14187215.0 o EP14187214.3.
En otra variante de la invención, se determina la localización de los restos diana como antígenos en los especímenes biológicos reconocidos por los restos de reconocimiento de antígeno del conjugado. Tales técnicas se conocen como "cartografía de ligandos multiepítopos", "citometría basada en chip" o "Multioymx" y se describen, por ejemplo, en los documentos EP 0810428, EP1181525, EP 1136822 o EP1224472. En esta tecnología, las células se inmovilizan y se ponen en contacto con anticuerpos acoplados a un resto fluorescente. Los anticuerpos son reconocidos por los antígenos respectivos en el espécimen biológico (por ejemplo, en una superficie celular) y después de eliminar el marcador no unido y excitar los restos fluorescentes, la localización del antígeno se detecta por la emisión de fluorescencia de los restos fluorescentes. En ciertas variantes, en lugar de anticuerpos acoplados a restos fluorescentes, pueden usarse anticuerpos acoplados a restos detectables para obtención de imágenes por MALDI o CyTOF. El experto en la técnica es consciente de cómo modificar la técnica basada en el resto fluorescente para trabajar con estos restos de detección.
La localización de los restos diana se logra mediante un dispositivo de formación de imágenes digitales con una resolución y sensibilidad suficientes para la longitud de onda de la radiación fluorescente. El dispositivo de formación de imágenes digitales puede usarse con o sin ampliación óptica, por ejemplo, con un microscopio de fluorescencia. Las imágenes resultantes se almacenan en un dispositivo de almacenamiento apropiado como un disco duro, por ejemplo, en formato RAW, TIF, JPEG o HDF5.
Para detectar diferentes antígenos, se pueden proporcionar diferentes conjugados de anticuerpo que tienen el mismo o diferente resto fluorescente o resto Y de reconocimiento de antígeno. Puesto que la detección paralela de la emisión de fluorescencia con diferentes longitudes de onda es limitada, los conjugados anticuerpofluorocromo se utilizan secuencialmente individualmente o en pequeños grupos (2-10) unos después de otros.
En otra variante más del método según la invención, los especímenes biológicos, especialmente las células en suspensión, del espécimen se inmovilizan atrapándolas en microcavidades o por adherencia.
En general, el método de la invención se puede realizar en varias variantes. Por ejemplo, el conjugado no reconocido por un resto diana puede eliminarse, por ejemplo, lavándolo con tampón antes de que se detecte el resto diana marcado con el conjugado.
En una variante de la invención, se proporcionan al menos dos conjugados simultáneamente o en secuencias de tinción posteriores, en donde cada resto Y de reconocimiento de antígeno reconoce diferentes antígenos. En una variante alternativa, se pueden proporcionar al menos dos conjugados a la muestra simultáneamente o en secuencias de tinción posteriores, en donde cada conjugado comprende un espaciador P degradable diferente que se escinde por diferentes enzimas. En ambos casos, los restos diana marcados pueden detectarse de manera simultánea o secuencial. La detección secuencial puede implicar la degradación simultánea de las moléculas espaciadoras P o la posterior degradación de las moléculas espaciadoras P con la eliminación (lavado) opcionalmente intermedia de los restos no unidos.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Método para detectar un resto diana en una muestra de especímenes biológicos que consiste en:
a) proporcionar al menos un conjugado con la fórmula general (I) X<n>- P - Y<m>, siendo X un resto de detección, P un espaciador degradable por ácidos o bases e Y un resto de reconocimiento de antígeno u oligonucleótido y n, m son números enteros entre 1 y 100 y en donde X e Y están unidos covalentemente a P,
b) unir el conjugado al resto diana a través del resto Y de reconocimiento de antígeno u oligonucleótido, marcando de este modo el resto diana,
c) detectar el resto diana marcado con el conjugado detectando el resto X de detección,
d) proporcionar al menos un precursor que es capaz de liberar un ácido o una base cuando se le proporciona radiación, en donde el ácido o base es capaz de escindir P,
e) activar el precursor proporcionando radiación, liberando de este modo el ácido o base capaz de escindir P, y
f) degradar el espaciador P con el ácido o base liberados, escindiendo de este modo el resto X de detección del resto de detección conjugado.
2. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el precursor se activa por fotoescisión en al menos dos subunidades, en donde al menos una de las subunidades es un ácido y/o una base.
3. Método según las reivindicaciones 1 o 2 caracterizado por que el espaciador P degradable por ácidos o bases, el resto Y de reconocimiento de antígeno u oligonucleótido se escinde del resto de detección.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por que el resto de detección se selecciona del grupo que consiste en resto cromóforo, resto fluorescente, resto fosforescente, resto luminiscente, resto absorbente de luz, resto radiactivo, metal de transición y resto marcador de masa isotópica.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el espaciador P degradable por ácidos o bases comprende unidades funcionales escindibles ácidas o básicas seleccionadas del grupo que consiste en acetales, silil ésteres, hidrazina, imina, ésteres, fosforamidita, hidrazina, vinil éter, tritilo, aconitrilo, oxicarbonilo, parametoxibencilo, cetal, policetal, ortoésteres, ácido tiomalémico, en un enlazador con alquilo, polietilenglicol, polisacáridos, proteínas, péptidos, depsipéptidos, poliésteres, segmentos de ácidos nucleicos y derivados de los mismos.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el resto Y de reconocimiento de antígeno es un anticuerpo, un anticuerpo fragmentado, un derivado de anticuerpo fragmentado, complejos de péptido/MHC que se dirigen a moléculas de TCR, moléculas receptoras de adhesión celular, receptores para moléculas coestimuladoras o moléculas de unión artificiales modificadas por ingeniería genética.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que el precursor comprende unidades funcionales seleccionadas del grupo que consiste en sales de diazonio, perhalometiltriazinas, halobisfenilo, o-nitrobenzaldehído, sulfonatos, ésteres de imidilsulfonilo, sales de diarilyodonio, sales de sulfonio, diazosulfonato, diarilsulfonas, 1,2-diazocetonas, 2-diazo 1-oxo 5 sulfonilo, 2-diazo 1-oxo 4 sulfonilo, diazometil cetona, ácido de diazoMeldrum, derivados de arilazida, benzocarbonatos, carbamatos, carbonatos de dimetoxibenzoiinilo, carbamatos de dimetoxibenzoiinilo, carbonatos de o-nitrobenciloxi, carbamatos de onitrobenciloxi, nitrobenceno sulpenilo, o-nitroanilinas, carbamato de nitrobencilo, carbamatos de 3',5'-dimetoxibenzoína.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que se proporciona más de un precursor, en donde los diferentes precursores se activan por radiación de diferentes longitudes de onda.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado por que la muestra de especímenes biológicos tiene un primer pH y después de activar el precursor proporcionando radiación, al menos una parte de la muestra de especímenes biológicos tiene un segundo pH; en donde la diferencia del primer y segundo pH es al menos -0,5.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que el conjugado se proporciona a una superficie de un espécimen biológico y la radiación para activar el precursor se aplica a regiones definidas espacialmente del espécimen biológico.
11. Método según la reivindicación 10, caracterizado por que la radiación para activar el precursor se aplica a al menos una región definida espacialmente del espécimen biológico, en donde antes de proporcionar radiación, la al menos una región definida espacialmente tiene un primer pH y, después de activar el precursor proporcionando radiación, la al menos una región definida espacialmente tiene un segundo pH; en donde la diferencia del primer y segundo pH es al menos -0,5.
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