ES3025508T3 - Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof - Google Patents

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ES3025508T3
ES3025508T3 ES21856995T ES21856995T ES3025508T3 ES 3025508 T3 ES3025508 T3 ES 3025508T3 ES 21856995 T ES21856995 T ES 21856995T ES 21856995 T ES21856995 T ES 21856995T ES 3025508 T3 ES3025508 T3 ES 3025508T3
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Andrew J Murphy
John Mcwhirter
Vera Voronina
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Abstract

Se describen aquí polipéptidos de inmunoglobulina modificados por anclaje, en los que el anclaje los fija a un receptor de interés. Estos polipéptidos se caracterizan generalmente en el extremo N-terminal mediante un anclaje, por ejemplo, la porción de unión al receptor de un ligando que se une a un receptor. Animales no humanos modificados genéticamente con segmentos de inmunoglobulina recombinante que codifican los polipéptidos de inmunoglobulina modificados por anclaje son capaces de producirlos. También se proporcionan estos animales no humanos, junto con métodos y composiciones para su producción y uso. También se proporcionan métodos para producir inmunoglobulinas modificadas por anclaje a partir de animales no humanos, así como inmunoglobulinas modificadas por anclaje generadas a partir de ellos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ácidos nucleicos que codifican anticuerpos modificados por anclaje y usos de los mismos
Antecedentes
Los productos de anticuerpos monoclonales han revolucionado la industria biofarmacéutica y logrado avances significativos en el tratamiento de varias enfermedades. A pesar de estos avances y del conocimiento adquirido por el uso de anticuerpos monoclonales para uso terapéutico, persisten enfermedades vinculadas a dianas a las que es difícil que los anticuerpos monoclonales se unan y/o accedan, lo que destaca la necesidad de diferentes enfoques para crear tratamientos eficaces.
Sumario de las enseñanzas técnicas
En el presente documento se divulga el reconocimiento de que es deseable genomodificar animales no humanos como sistemas in vivo mejorados para identificar y desarrollar nuevos tratamientos basados en anticuerpos y, en algunas realizaciones, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y/o fragmentos de los mismos), que se pueden utilizar para el tratamiento de una variedad de enfermedades. Los ácidos nucleicos, animales no humanos, métodos y polipéptidos divulgados en el presente documento se refieren a inmunoglobulinas modificadas por anclaje. Un anclaje, como se describe en el presente documento, comprende generalmente la parte de unión al receptor de un polipéptido no inmunoglobulina que se une a un receptor afín. Los anclajes añadidos a la inmunoglobulina ayudan a aumentar la afinidad de la inmunoglobulina por el receptor asociado al anclaje, mejorando así las propiedades de unión de la inmunoglobulina. En el presente documento se describen moléculas de ácido nucleico que codifican inmunoglobulinas modificadas por anclaje y/o que pueden utilizarse para modificar animales no humanos de manera que los animales no humanos puedan producir inmunoglobulinas modificadas por anclaje de novo.
Puede codificarse una inmunoglobulina modificada por anclaje descrita en el presente documento, al menos en parte, mediante un segmento de región variable (V), por ejemplo, una región variable de cadena pesada (V<h>) de inmunoglobulina (Ig) o una región variable de cadena ligera (V<l>) de Ig, modificado para codificar el anclaje entre y en unión operativa con: una secuencia líder de Ig y las secuencias marco (FR) y de región determinante de la complementariedad (CDR) de un segmento V de la estirpe germinal.
En consecuencia, también se describen moléculas de ácido nucleico, incluidos vectores de direccionamiento y genomas de animales no humanos, que comprenden el segmento V de Ig modificado no reordenado o reordenado. También se describen genomas de animales no humanos, células animales no humanas y animales no humanos que comprenden las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento.
Sumario de la invención
La invención se define por las reivindicaciones independientes. En las reivindicaciones dependientes se definen aspectos adicionales y aspectos preferidos. Cualquiera de los aspectos, realizaciones y ejemplos de la presente divulgación que no están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención y se proporcionan únicamente con fines ilustrativos.
Una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención comprende un segmento variable (V) de inmunoglobulina (Ig) modificado que codifica un polipéptido Ig modificado por anclaje, en donde el segmento V de Ig modificado comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el anclaje entre una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de Ig y una secuencia de ácido nucleico que codifica la región marco (FR) 1, la región determinante de la complementariedad (CDR)1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 de un segmento V de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo, en donde el polipéptido Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa: (i) el péptido señal de Ig, (ii) el anclaje y (iii) la F<r>1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento V de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo, en donde el anclaje comprende una parte de unión al receptor de un polipéptido no inmunoglobulina de interés que se une a un receptor afín y, opcionalmente, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante carece de cualquier otro segmento V. Las moléculas de ácido nucleico recombinante descritas en el presente documento también pueden comprender uno o más segmentos de diversidad (D) de Ig (no) reordenados, uno o más segmentos de unión (J) de Ig (no) reordenados y/o uno o más genes de la región constante (C) de Ig.
En algunas realizaciones, el péptido señal de Ig es el péptido señal de Ig del segmento V de Ig de la estirpe germinal, o una variante del mismo. En algunas realizaciones, el péptido señal de Ig comprende la secuencia MDWTWRFLFVVAAATGVQS (SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, el anclaje comprende un enlazador que une la parte de unión al receptor de un polipéptido no inmunoglobulina de interés a la FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento V de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo. En algunas realizaciones del enlazador, el enlazador comprende la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 5)
En algunas realizaciones, el segmento V de Ig de la estirpe germinal, o una variante del mismo, es un segmento variable de cadena pesada (V<h>) de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo, por ejemplo, es un segmento V de Ig de la estirpe germinal humana (h) o una variante del mismo, por ejemplo, un segmento V<h>1-2 de la estirpe germinal humana (h), un segmento I<i>V<h>1-3 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>1-8 de la estirpe germinal, un segmento Ii V<h>1-18 de la estirpe germinal, un segmento Ii V<h>1-24 de la estirpe germinal, un segmento Ii V<h>1-45 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>1-46 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>1-58 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>1-69 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>2-5 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>2-26 de la estirpe germinal, un segmento Ii V<h>2-70 de la estirpe germinal, un segmento Ii V<h>3-7 de la estirpe germinal, un segmento Ii V<h>3-9 de la estirpe germinal, un segmento Ii V<h>3-11 de la estirpe germinal, un segmento Ii V<h>3-13 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-15 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-16 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-20 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-21 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-23 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-30 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-30-3 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-30-5 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-33 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-35 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-38 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-43 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-48 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-49 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-53 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-64 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-66 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-72 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-73 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-74 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-4 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-28 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-30-1 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-30-2 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-30-4 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-31 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-34 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-39 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-59 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-61 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>5-51 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>6-1 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>7-4-1 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>7-81 de la estirpe germinal o variantes de los mismos. En algunas realizaciones, el segmento V de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo es un segmento Ii V<h>1-69 de la estirpe germinal o una variante del mismo. En algunas realizaciones, la variante es una variante alélica.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender un locus de la región variable de cadena pesada, por ejemplo, puede comprender en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento V<h>de Ig modificado, (II) uno o una pluralidad de segmentos de diversidad de cadena pesada (D<h>) de Ig y (III) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena pesada (J<h>) de Ig. En algunas realizaciones, el uno o una pluralidad de segmentos D<h>de Ig de (II) comprende uno, una pluralidad de o todos los segmentos D<h>de Ig humanos, y/o el uno o una pluralidad de segmentos J<h>de Ig de (III) comprende uno, una pluralidad o todos los segmentos J<h>de Ig humanos. En algunas realizaciones, el uno o una pluralidad de segmentos D<h>de Ig de (II) y el uno o una pluralidad de segmentos génicos J<h>de Ig de (III) se recombinan y forman una secuencia reordenada D<h>/J<h>de Ig de manera que la molécula de ácido nucleico recombinante comprende en unión operativa y de 5' a 3': el segmento génico V<h>de Ig modificado y la secuencia D<h>/J<h>e Ig reordenada.
En algunas realizaciones, el segmento génico V<h>de Ig modificado y la secuencia D<h>/J<h>de Ig reordenada se recombinan y forman una secuencia V<h>/D<h>/J<h>de Ig reordenada que codifica un dominio variable de cadena pesada de Ig modificado por anclaje, en donde el dominio variable de cadena pesada de Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa: (i) el péptido señal de Ig, (ii) el anclaje y (iii) la FR1, la región determinante de la complementariedad (CDR) 1, F<r>2, CDR2,<f>R3, CDR3 y FR4 codificadas por una secuencia V<h>/D<h>/J<h>de Ig reordenada.
En algunas realizaciones, el segmento V<h>de Ig modificado es un segmento génico V<h>de Ig modificado no reordenado.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante divulgada en el presente documento comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada (C<h>) de Ig, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica una C<h>de Ig se encuentra cadena abajo de y operativamente unida a (I) el segmento V<h>de Ig modificado, (II) el uno o una pluralidad de segmentos D<h>de Ig y (III) el uno o una pluralidad de segmentos J<h>de Ig. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica una C<h>de Ig comprende un gen ¡gg que codifica un isotipo de IgM, un gen IgS que codifica un isotipo de IgD, un gen IgY que codifica un isotipo de IgG, un gen ¡ga que codifica un isotipo de IgA y/o un gen ¡ge que codifica un isotipo de IgE. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de Ig modificada por anclaje, en donde la cadena pesada de Ig modificada por anclaje comprende en unión operativa: (i) el péptido señal de Ig, (ii) el anclaje, (iii) un dominio variable de cadena pesada de Ig que comprende FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 codificadas por una secuencia V<h>/D<h>/J<h>de Ig reordenada, y (iv) una C<h>de Ig. En algunas realizaciones, la C<h>de Ig es una C<h>de Ig no humana, por ejemplo, una C<h>de Ig de roedor, por ejemplo, una C<h>de Ig de rata o una C<h>de Ig de ratón.
En algunas realizaciones, el segmento V de Ig de la estirpe germinal, o una variante del mismo, es un segmento variable de cadena ligera (V<l>) de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender un locus de la región variable de cadena ligera, por ejemplo, puede comprender en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento V<l>de Ig modificado y (II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera (J<l>) de Ig.
En algunas realizaciones, el segmento V<l>de Ig modificado y el uno o una pluralidad de segmentos J<l>de Ig se recombinan y forman una secuencia V<l>/J<l>de Ig reordenada que codifica un dominio variable de cadena ligera de Ig modificado por anclaje, en donde el dominio variable de cadena ligera de Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa: (i) el péptido señal de Ig, (ii) el anclaje y (iii) la FR1, CDR1, FR2, CDR2, F<r>3, CDR3 y FR4 codificadas por la secuencia V<l>/J<l>de Ig reordenada.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender un locus de la región variable de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera (C<l>) de Ig, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica una C<l>de Ig se encuentra cadena abajo de y operativamente unida a: (I) el segmento V<l>de Ig modificado y (II) el uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera (J<l>) de Ig. En algunas realizaciones, la cadena ligera de Ig modificada por anclaje comprende en unión operativa: (i) el péptido señal de Ig, (ii) el anclaje, (iii) un dominio variable de cadena ligera de Ig que comprende FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 codificadas por una secuencia V<l>/J<l>de Ig reordenada, y (iv) una C<l>de Ig. En algunas realizaciones, la C<l>de Ig es una C<l>de Ig no humana, por ejemplo, una C<l>de Ig de roedor, por ejemplo, una C<l>de Ig de rata o una C<l>de Ig de ratón.
En algunas realizaciones del locus de la región variable de cadena ligera, el segmento V<l>de Ig de la estirpe germinal, o una variante del mismo, es un segmento variable de cadena ligera kappa (Vk) de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo. En consecuencia, en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento V<k>de Ig modificado y (II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera kappa (Jk) de Ig. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento Vk de Ig modificado, (II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera kappa (Jk) de Ig y (III) una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera kappa (C<k>) de Ig.
En algunas realizaciones del locus de la región variable de cadena ligera, el segmento V<l>de Ig de la estirpe germinal, o una variante del mismo, es un segmento variable de cadena ligera lambda (VA) de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo. En consecuencia, en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento VA de Ig modificado y (II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera lambda (JA) de Ig. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento VA de Ig modificado, (II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera lambda (JA) de Ig, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera lambda (CA) de Ig.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende la secuencia establecida como SEQ ID NO: 8 o una variante degenerada de la misma, o la secuencia establecida como SEQ ID NO: 10 o una variante degenerada de la misma.
También se describen vectores de direccionamiento, células animales no humanas (por ejemplo, células hospedadoras, células madre embrionarias, etc.)y animales no humanos que comprenden las moléculas de ácido nucleico.
También se describen vectores de direccionamiento que comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante de la invención. En algunas realizaciones de vectores de direccionamiento de la invención, el vector de direccionamiento comprende además brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena pesada de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, el locus de la cadena pesada de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante cadena arriba de y en unión operativa con una C<h>de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano es un locus de la cadena pesada de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de segmentos génicos V<h>, D<h>y/o J<h>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento V<h>no humano en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a uno o más segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos D<h>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<h>no humanos menos uno o todos los segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos D<h>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, el locus de la cadena pesada de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena pesada de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena pesada de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, el locus de la cadena pesada de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena pesada de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano es un la locus de la cadena pesada de Ig de roedor endógeno en un roedor o célula de roedor (por ejemplo, una célula madre embrionaria de roedor) y/o en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<h>, D<h>y/o J<h>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, y opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a uno o más segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos génicos D<h>no humanos, todos los segmentos génicos J<h>no humanos y uno o más genes de C<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, el brazo de homología en 5' comprende una secuencia establecida como SEQ ID NO: 11 y/o el brazo de homología en 3' comprende una secuencia establecida como SEQ ID NO: 12.
En algunas realizaciones de vectores de direccionamiento de la invención, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, el locus de la cadena ligera de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante cadena arriba de y en unión operativa con una C<l>de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano es un locus de la cadena ligera de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<l>y/o J<l>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento V<l>no humano en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos V<l>no humanos y todos los segmentos J<l>no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<l>no humanos y todos los segmentos JH no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, el locus de la cadena ligera de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig. En algunas realizaciones, el vector de direccionamiento descrito en el presente documento comprende una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, el locus de la cadena ligera de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano es un locus de la cadena ligera de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<l>y/o J<l>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, y opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos V<l>no humanos, todos los segmentos génicos J<l>no humanos y el gen de C<l>no humano en el locus de la cadena ligera Ig no humano.
En algunas realizaciones de vectores de direccionamiento, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, el locus de la cadena ligera k de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante cadena arriba de una Ck de Ig no humana en el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano y en unión operativa con ella, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera k de Ig no humano es un locus de la cadena ligera k de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera k de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<k>y/o J<k>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento Vk no humano en el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos Vk no humanos y todos los segmentos Jk no humanos en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<k>no humanos y todos los segmentos J<k>no humanos en el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, el locus de la cadena ligera k de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera k de Ig no humana en el locus de la cadena ligera k de Ig. En algunas realizaciones de vectores de direccionamiento, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera k de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera k de Ig no humana en el locus de la cadena ligera k de Ig, opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos Vk no humanos, todos los segmentos génicos Jk no humanos y el gen de Ck no humano en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano.
En algunas realizaciones de vectores de direccionamiento, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera A de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante cadena arriba de una CA de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano y en unión operativa con ella, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera A de Ig no humano es un locus de la cadena ligera A de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera A de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos VA y/o JA de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento VA no humano en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos VA no humanos y todos los segmentos JA no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos VA no humanos y todos los segmentos JA no humanos en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera A de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig. En algunas realizaciones, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante como se describe en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera A de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera A de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos VA no humanos, todos los segmentos génicos JA no humanos y el gen de CA no humano en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano.
También se describen en el presente documento genomas de animales no humanos que comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante y/o el vector de orientación descritos en el presente documento. En algunos aspectos genómicos de animales no humanos, el genoma del animal no humano comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento en un locus de Ig endógeno del genoma del animal no humano, por ejemplo, el genoma del animal no humano comprende el vector de direccionamiento descrito en el presente documento, en donde el vector de direccionamiento comprende brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen al locus de Ig endógeno. En algunos aspectos, el genoma de un animal no humano es el de un roedor. En algunos aspectos, el genoma de un animal no humano es el de una rata. En algunos aspectos, el genoma de un animal no humano es el genoma de un ratón.
En el presente documento también se describe un animal no humano o una célula animal no humana que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, el vector de direccionamiento y/o un genoma de animal no humano como se describe en el presente documento. La invención proporciona una célula de roedor o de animal no humano que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante o el vector de direccionamiento de la invención. En algunas realizaciones de animales no humanos, un animal no humano como se describe en el presente documento que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, el vector de direccionamiento o el genoma animal no humano como se describe en el presente documento en su estirpe germinal, por ejemplo, en una célula germinal, por ejemplo, es capaz de pasar la molécula de ácido nucleico recombinante, el vector de direccionamiento y/o un genoma animal no humano como se describe en el presente documento a su descendencia.
También se describen los métodos de utilización de las moléculas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, vectores de direccionamiento, como se describen en el presente documento in vitro para hacer una célula no humana, un embrión no humano y/o animales no humanos. De acuerdo con la invención, un método in vitro de modificación de una célula aislada comprende introducir en la célula aislada la molécula de ácido nucleico recombinante como se describe en el presente documento, por ejemplo, mediante la puesta en contacto de la célula con el vector de direccionamiento como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones del método, la célula es una célula hospedadora. En algunas realizaciones del método, la célula es una célula madre embrionaria (ES, del inglés embryonic stem). En algunas realizaciones, la célula como se describe en el presente documento o elaborada de acuerdo con un método descrito en el presente documento es una célula de roedor, por ejemplo, en donde la célula de roedor es una célula de rata o una célula de ratón.
También se describen los métodos de utilización de las moléculas de ácido nucleico, las células no humanas y/o los animales no humanos como se describe en el presente documento para elaborar proteínas de unión a antígenos modificadas por anclaje. También se describen embriones de animales no humanos y animales no humanos que pueden comprender y/o desarrollarse (por ejemplo, generarse) a partir de una célula madre embrionaria como se describe en el presente documento. De acuerdo con la invención, los embriones de animales no humanos o los animales no humanos son roedores. Dichos embriones o animales no humanos pueden desarrollarse mediante un método que comprenda la implantación de la célula ES como se describe en el presente documento en un embrión, y/o la implantación de un embrión que comprenda la célula ES en un hospedador adecuado y el mantenimiento del hospedador en condiciones adecuadas durante el desarrollo de la célula ES o del embrión en una progenie viable.
En algunos animales no humanos descritos en el presente documento (por ejemplo, en donde un animal no humano comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, el vector de direccionamiento y/o genoma como se describe en el presente documento y/o se genera de acuerdo con un método como se describe en el presente documento), un animal no humano comprende en comparación con un animal no humano de control: (a) un número comparable de linfocitos B maduros en el bazo, (b) un número comparable de linfocitos B positivos para<k>en el bazo, (c) un número comparable de linfocitos B positivos para A en el bazo, (d) un nivel comparable de IgG sérica y/o (e) un nivel comparable de IgM sérica. En algunas realizaciones, un animal no humano como se describe en el presente documento es capaz de generar una respuesta inmunitaria comparable a la de un animal no humano de control. En algunas realizaciones, un animal no humano como se describe en el presente documento comprende una pluralidad de proteínas de unión a antígeno que comprenden cada una un anclaje y/o proceden de la molécula de ácido nucleico recombinante, vector de direccionamiento y/o animal no humano como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un animal no humano como se describe en el presente documento comprende además el receptor afín de un polipéptido no inmunoglobulina de interés, la parte de unión al receptor de cuyo polipéptido no inmunoglobulina de interés sirve de anclaje. En algunas realizaciones de animales no humanos, un animal no humano como se describe en el presente documento comprende una pluralidad de proteínas de unión a antígeno que se unen cada una específicamente al receptor afín del polipéptido no inmunoglobulina de interés, la parte de unión al receptor de cuyo polipéptido no inmunoglobulina de interés sirve de anclaje.
Como se describe en el presente documento, un polipéptido no inmunoglobulina de interés (cuya parte de unión al receptor del polipéptido no inmunoglobulina de interés sirve como anclaje) puede comprender un péptido natriurético auricular (ANP, del inglés atrial natriuretic peptide). En algunas realizaciones, la cola carboxiterminal de ANP (por ejemplo, NSFRY (SEQ ID NO: 3)) puede servir de anclaje para un receptor afín. En algunas realizaciones, el receptor afín comprende un receptor de péptido natriurético (NPR, del inglés natriuretic peptide receptor), por ejemplo, NPR3, o parte del mismo.
En algunas realizaciones de animales no humanos, en donde el animal no humano como se describe en el presente documento se inmuniza con el receptor afín (opcionalmente, en donde el receptor afín comprende un receptor de péptido natriurético (NPR), por ejemplo, NPR3) del polipéptido no inmunoglobulina de interés (por ejemplo, ANP) del que la parte de unión al receptor (por ejemplo, NSFRY (SEQ ID NO: 3)) sirve de anclaje como se describe en el presente documento, un animal no humano como se describe en el presente documento comprende además una pluralidad de proteínas de unión a antígeno que se unen al receptor afín, cada una de las cuales comprende una KD inferior a 1 * 109 y/o una t1^ superior a 30 minutos. En algunas realizaciones, al menos un 15 % de la pluralidad de proteínas de unión a antígeno son capaces de bloquear y/o bloquean la unión del receptor afín al polipéptido no inmunoglobulina de interés. En algunas realizaciones, más de un 50 % de la pluralidad de proteínas de unión a antígeno se unen al receptor afín expresado en una superficie celular.
De acuerdo con la invención, el animal no humano es un roedor. En algunas realizaciones de animales no humanos descritas en el presente documento, el animal no humano es una rata. En algunas realizaciones de no humanos, el animal no humano es un ratón.
También se describen las proteínas de unión a antígeno modificadas por anclaje codificadas por las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento o elaboradas por los animales no humanos descritos en el presente documento. La invención proporciona un polipéptido Ig modificado por anclaje codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante de la invención, el vector de direccionamiento de la invención, la célula animal no humana de la invención, expresados por el animal no humano de la invención, expresados por el animal no humano o la célula animal no humana elaborada de acuerdo con el método de la invención, o elaborada de acuerdo con el método de producción de una proteína de unión a antígeno de la invención, en donde el polipéptido Ig modificado por anclaje comprende una secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 3 en su extremo N, opcionalmente, en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje, en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo, o en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje y la masa de cada proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo.
La invención proporciona un método para producir una proteína de unión a antígeno u obtener un ácido nucleico que la codifique, comprendiendo el método (i) inmunizar un animal no humano de la invención o elaborar de acuerdo con un método de elaboración de un animal no humano de la invención con un antígeno (por ejemplo, el receptor afín de un polipéptido no inmunoglobulina de interés, en donde la parte de unión al receptor del polipéptido no inmunoglobulina de interés sirve como anclaje), y (ii) permitir que el animal no humano produzca una respuesta inmunitaria contra el antígeno que incluye un anticuerpo, o ácido nucleico que lo codifica, que se une al antígeno. Algunas realizaciones comprenden además la recuperación de la proteína de unión a antígeno, o del ácido nucleico que la codifica, del animal no humano o de una célula animal no humana, por ejemplo, un linfocitos B, y opcionalmente fusionar el linfocitos B con una célula de mieloma para formar un hibridoma. Algunas realizaciones comprenden además clonar el ácido nucleico recuperado en una construcción de expresión y, opcionalmente, expresar la construcción de expresión en una célula hospedadora. En algunas realizaciones de clonación, el método comprende además la clonación del ácido nucleico recuperado, en donde el ácido nucleico recuperado codifica un dominio variable de Ig dentro del marco de lectura con una secuencia de codificación de región constante de Ig humana. En el presente documento también se describen linfocitos B, hibridomas fusionados con los linfocitos B o las células hospedadoras que expresan los ácidos nucleicos recuperados de linfocitos B. En algunas realizaciones, la masa de cada proteína de unión al antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje. En algunas realizaciones, la masa de cada proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo. En algunas realizaciones, la masa de cada proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje y la masa de cada proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo.
En el presente documento también se describen polipéptidos Ig modificados por anclaje que están (a) codificados por la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento, un vector de direccionamiento descrito en el presente documento o un genoma de animal no humano descrito en el presente documento, (b) expresados por un animal no humano o una célula animal no humana descrita en el presente documento, (c) expresados por el animal no humano o la célula animal no humana elaborada de acuerdo con un método descrito en el presente documento y/o (d) producidos por cualquier método descrito en el presente documento.
Otras características, objetos y ventajas de los animales no humanos, células, ácidos nucleicos y composiciones divulgadas en el presente documento son evidentes en la descripción detallada de ciertas realizaciones que siguen. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica determinadas realizaciones, se proporciona solamente a modo de ilustración, no de limitación.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos incluidos en el presente documento, que están compuestos por las siguientes figuras, son solamente para fines de ilustración y no de limitación.
En la figura 1 se muestra una ilustración, no a escala, de una realización ilustrativa no limitante de un segmento génico V<h>modificado con ANP útil como ADN donante para la modificación con Cas9/GA. También se muestran los sitios de reconocimiento de restricción (Xhol, Mrel, EcoRI, AvrII y Mrel) y el gen de resistencia a la espectinomicina (SPEC). En esta realización no limitante, el segmento génico V<h>1-69 humano se modifica con la secuencia que codifica la cola carboxiterminal (NSFRY; SEQ ID NO: 3) de la proteína natriurética auricular (ANP) para formar ADN donante que comprende un segmento génico V<h>1-69 modificado con ANP. En general, las formas sin relleno representan secuencias humanas, las formas rellenas representan secuencias murinas y las punteadas secuencias no humanas y no murinas.
En la figura 2 se muestra un ejemplo no limitante de un donante de ADN (establecido como la SEQ ID NO: 10) utilizado para modificar el gen de V<h>1-69 en el clon BAC VI504. Se muestran las siguientes características:
-una secuencia de ADN de sentido que incluye
(a) los últimos 7 codones del péptido señal bipartito (véase la flecha partida marcada como "péptido señal") codificados por un segmento V<h>1-69 de la estirpe germinal humana; una secuencia de nucleótidos que codifica la totalidad del polipéptido señal se establece como la SEQ ID NO: 6; y la secuencia de aminoácidos de la totalidad del polipéptido señal se establece como la SEQ ID NO: 7,
(b) el segmento V<h>1-69 de Ig de la estirpe germinal, incluido el exón 1, intrón 1 y exón 2 (véanse las flechas de división etiquetadas como "V<h>" inmediatamente encima de la secuencia de ADN)
(c) el intrón 1 del segmento V<h>1-69 de Ig de la estirpe germinal ("intrón"),
(d) la secuencia de nucleótidos que codifica una cola carboxiterminal del péptido natriurético auricular (ANP) (SEQ ID NO: 3) y un enlazador G4S (SEQ ID NO: 5),
(e) la parte del segmento V<h>1-69 de la estirpe germinal que codifica FR1, CDR1 (cuadro con motivos), FR2, CDR2 (cuadro con motivos), FR3 y CDR3 (cuadro con motivos), y la secuencia de aminoácidos de la misma (véanse las flechas divididas marcadas IgHV1-69), y
(e) la secuencia señal de recombinación de 23-meros (división RS-23),
-una traducción conceptual del segmento V<h>1-69 modificado con ANP que incluye la secuencia líder (marcado como ANP-G4S-V<h>1-69),
-los sitios de unión del ARNcr utilizados para cortar VI504 con Cas9 in vitro (marcados como 5' V<h>1-69 Cas9 y PAM),
- los solapamientos en 5' y 3' utilizados para el ensamblaje de Gibson del donante con VI504 (líneas negras con flechas marcadas como "solapamiento de V<h>1-69 en 5" y solapamiento de V<h>1-69 en 3', respectivamente), y - sitios de enzimas de restricción indicados con cuadros rayados en diagonal debajo de las secuencias: sitios EcoRI y AvrII utilizados para ligar un casete de resistencia a la espectinomicina en los donantes, sitios Xhol utilizados para eliminar el donante de la cadena principal del vector pUC y sitios Mrel utilizados para eliminar el casete Spec del BAC modificado antes de la reparación sin fisuras mediante ensamblaje de Gibson mediado por oligonucleótidos de unión.
En la figura 3 se muestra una ilustración, no a escala, de un ejemplo no limitante de inserción del segmento V<h>1-69 modificado con ANP en el clon BAC VI504 de acuerdo con el ejemplo 1 para crear un vector de direccionamiento VI748. En general, las formas sin relleno representan secuencias humanas (por ejemplo, los triángulos sin relleno representan el segmento V<h>1-69 humano, los segmentos D<h>humanos y los segmentos J<h>humanos), las formas rellenas representan secuencias murinas (por ejemplo, un triángulo relleno representa un segmento VH murino endógeno (sin marcar), las flechas rellenas representan los genes murinos Adam6a "a" y Adam6b "b", un óvalo relleno que representa un potenciador de Ig y una flecha rellena representa un gen ¡gg murino de "IgM"), y las formas punteadas representan secuencias no humanas y no murinas (por ejemplo, un gen de resistencia al cloranfenicol "CM", sitios de reconocimiento de recombinasas específicas "sitios Frt", un gen de resistencia a la higromicina "HYG" y un gen de resistencia a la espectinomicina "SPEC").
En la figura 4 se muestra una ilustración, no a escala, de un ejemplo no limitante de inserción del vector de direccionamiento en un locus de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina en el genoma de células ES de ratón mediante electroporación. Después de la electroporación, esta realización ilustrativa no limitante conserva un segmento V<h>endógeno representado como un triángulo relleno cadena arriba del gen Adam6a ("a"). En general, las formas sin relleno representan secuencias humanas (por ejemplo, los triángulos sin relleno representan el segmento V<h>1-69 humano, los segmentos D<h>humanos y los segmentos J<h>humanos), las formas rellenas representan secuencias murinas (por ejemplo, un triángulo relleno representa un segmento VH murino endógeno (sin marcar), las flechas rellenas representan los genes murinos Adam6a "a" y Adam6b "b", un óvalo relleno que representa un potenciador de Ig y una flecha rellena representa un gen ¡gg murino de "IgM"), y las formas punteadas representan secuencias no humanas y no murinas (por ejemplo, un gen de resistencia al cloranfenicol "CM", sitios de reconocimiento de recombinasas específicas "sitios Frt", un gen de resistencia a la higromicina "HYG" y un gen de resistencia a la espectinomicina "SPEC")
En las figuras 5A a 5 F se muestran los resultados, en relación con una realización no limitante de la invención, gráficos que comparan poblaciones de esplenocitos de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 con ratones VELOCIMMUNE® de control. Lasfiguras 5A y Bproporcionan (A) el número total de células por bazo (eje de ordenadas), el número de células CD19+/bazo (eje de ordenadas) o (B) el porcentaje de linfocitos (células CD19+) por bazo (eje de ordenadas) de ratones modificados con el segmento V<h>1-69 modificado con ANP (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control con loci de Ig humanizados (control). Lasfiguras 5C y 5Dproporcionan (C) el número total de linfocitos B maduros (CD19+IgDhiIgMint) y linfocitos B de transición (CD19+IgDintIgMhi) por bazo (eje de ordenadas) o (D)el porcentaje de linfocitos B maduros (CD19+IgDhiIgMint) y linfocitos B de transición (CD19+IgDintIgMhi) por bazo (eje de ordenadas) de ratones modificados con el segmento V<h>1-69 modificado con ANP (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control que comprenden loci de Ig humanizados (control). En lasfiguras 5E y Fse muestra (E) el número total de células CD19+kappa+ y células CD19+lambda+ por bazo (eje de ordenadas) o (F) el porcentaje de células CD19+K+ y células CD19+A+ por bazo (eje de ordenadas) de ratones modificados con el segmento V<h>1-69 modificado con ANP (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control que comprende loci de Ig humanizados (control).
En las figuras 6A a 6F se muestran los resultados, en relación con una realización no limitante de la invención, gráficos que comparan poblaciones de células de médula ósea aisladas de fémures de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 con ratones VELOCIMMUNE® de control. Lasfiguras 6A y Bproporcionan (A) el número total de células por fémur (eje de ordenadas) y el número de linfocitos B CD19+ por fémur (eje de ordenadas) o (B) el porcentaje de linfocitos (células CD19+ ) por fémur (eje de ordenadas) de ratones modificados con el segmento V<h>1-69 modificado con ANP (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control que comprenden loci de Ig humanizados (control). Lasfiguras 6C y Dproporcionan (C) el número total de prolinfocitos B CD43+ckit+ por fémur (eje de ordenadas) y el número de prelinfocitos B CD43xkit por fémur (eje de ordenadas) o (D) el porcentaje de prolinfocitos B CD43+ckit+ o prelinfocitos B CD43'ckit' por fémur de ratones modificados con el segmento V<h>1-69 modificado con ANP (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control que comprende loci de Ig humanizados (control). Lasfiguras 6E y Fproporcionan (E) el número total de linfocitos B inmaduros y linfocitos B maduros por fémur (eje de ordenadas) o (F) el porcentaje de linfocitos B inmaduros y linfocitos B maduros por fémur (eje de ordenadas) de ratones modificados con el segmento V<h>1-69 modificado con ANP (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control que comprenden loci de Ig humanizados (control).
En la figura 7 se muestran los resultados, en relación con una realización no limitante de la invención, de los niveles de IgG en suero de animales modificados con ANP-V<h>1-69 con animales de control VELOCIMMUNE® analizados mediante análisis de transferencia Western.
En las figuras 8A y B se muestran los resultados, en relación con una realización no limitante de la invención, de la concentración (|jg/ml; eje de ordenadas) de (A) IgG de ratón (m) en suero o (B) mIgM en suero aislada de animales modificados con ANP-V<h>1-69 (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control que comprenden loci de Ig humanizados (control).
En la figura 9 se muestran los resultados, en relación con una realización no limitante de la invención, gráficos que comparan las respuestas inmunitarias (valores de anticuerpos; eje de ordenadas) en ratones modificados con a NP-V<h>1-69 (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control que comprende loci de Ig humanizados (control) en antígenos proteicos. De los sueros analizados, 3 muestras de suero procedían de hemorragias después del tercer refuerzo y 1 después del quinto refuerzo en ratones modificados con ANP-V<h>1-69. Para ratones VELOCIMMUNE® de control, 2 muestras de suero procedían de hemorragias posteriores al sexto refuerzo, mientras que 1 era después del noveno refuerzo.
En la figura 10 se muestran los resultados, en relación con una realización no limitante de la invención, gráficos que comparan las respuestas inmunitarias (valores de anticuerpos; eje de ordenadas) en ratones modificados con ANP-V<h>1-69 (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control que comprende loci de Ig humanizados (control) en antígenos proteicos. De los sueros analizados, 3 muestras de suero procedían de hemorragias después del tercer refuerzo y 1 después del quinto refuerzo en ratones modificados con ANP-V<h>1-69. Para ratones VELOCIMMUNE® de control, 2 muestras de suero procedían de hemorragias posteriores al sexto refuerzo, mientras que 1 era después del noveno refuerzo.
En la figura 11 se muestran los resultados, en relación con una realización no limitante de la invención, gráficos que comparan los valores K<d>(eje de ordenadas) de la unión de hNPR3-MMH a anticuerpos monoclonales (AcM) NPR3 aislados de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control que comprenden loci de Ig humanizados (control) en antígenos proteicos a 25 °C utilizando el diagrama de cajas y bigotes.
Figura 12: muestras los resultados, en relación con una realización no limitante de la invención, gráficos que comparan los valores t1^ (eje de ordenadas) de la unión de hNPR3-MMH a anticuerpos monoclonales (AcM) NPR3 aislados de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 (ANP) o animales VELOCIMMUNE® de control que comprenden loci de Ig humanizados (control) en antígenos proteicos a 25 °C utilizando el diagrama de cajas y bigotes.
Definiciones
El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones adjuntas al presente documento y no está limitado por realizaciones particulares descritas en el presente documento; los expertos en la materia, que lean la presente divulgación, serán conscientes de diversas modificaciones que pueden ser equivalentes a tales realizaciones descritas, o bien dentro del alcance de las reivindicaciones. En general, la terminología es de acuerdo con su significado entendido en la materia, a menos que se indique claramente lo contrario. Las definiciones explícitas de determinados términos se proporcionan en el presente documento y a continuación; los significados de estos y otros términos en casos particulares a lo largo de esta memoria descriptiva resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir del contexto. A lo largo de la memoria descriptiva se exponen definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos.
El uso de términos ordinales tales como "primero/a", "segundo/a", "tercero/a", etc., en las reivindicaciones para modificar un elemento de una reivindicación no denota por sí mismo ninguna prioridad, precedencia u orden de un elemento de la reivindicación sobre otro o el orden temporal en el que se realizan los actos de un método, sino que se usan simplemente como marcadores para distinguir un elemento de una reivindicación que tiene un determinado nombre de otro elemento que tiene el mismo nombre (salvo por el uso del término ordinal) para distinguir los elementos de la reivindicación.
Los artículos "un" y "uno/a" en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse que incluyen los referentes en plural. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son de otro modo relevantes para un producto o un proceso dado a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo a partir del contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplean en, o son de otro modo relevantes, para un producto o proceso dado. La invención incluye también realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son de otro modo relevantes, para un producto o proceso dado. Es más, debe entenderse que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones enumeradas se introduce en otra reivindicación dependiente de la misma reivindicación base (o, según corresponda, cualquier otra reivindicación) a menos que se indique lo contrario o a menos que sea evidente para un experto en la materia que surja una contradicción o incoherencia. Cuando los elementos se presentan como listas, (por ejemplo, en el grupo Markush o en un formato similar) debe entenderse que también se divulga cada subgrupo de los elementos, y que pueden eliminarse cualquier elemento o elementos del grupo. Debe entenderse que, en general, cuando la invención o aspectos de la invención, se refiere, o refieren, a comprender elementos particulares, características, etc., las realizaciones de la invención, o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente en, dichos elementos, características, etc. Por motivos de simplicidad, estas realizaciones no se han expuesto específicamente en todos los casos en el presente documento con tantas palabras. También debe entenderse que cualquier realización o aspecto de la invención puede excluirse explícitamente de las reivindicaciones, independientemente de si la exclusión específica se menciona en la memoria descriptiva.
Como se usa en la presente solicitud, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Todos los números utilizados en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretenden cubrir cualquier fluctuación normal, por ejemplo, /- 5 %, apreciada por un experto habitual en la materia pertinente.
A dm in istración: se refiere a la administración de una composición a un sujeto o sistema (por ejemplo, a una célula, órgano, tejido, organismo o componente relevante o conjunto de componentes de los mismos). Aquellos expertos habituales en la materia apreciarán que la vía de administración puede variar dependiendo, por ejemplo, del sujeto o sistema al que se administra la composición, de la naturaleza de la composición, del fin de la administración, etc.
Por ejemplo, en algunos aspectos, la administración a un sujeto animal (por ejemplo, a un ser humano o un roedor) puede ser bronquial (incluyendo por instilación bronquial), yugal, entérica, intradérmica, intraarterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, mucosa, nasal, oral, rectal, subcutánea, sublingual, tópica, traqueal (incluyendo por instilación intratraqueal), transdérmica, vaginal y/o vítrea. En algunos aspectos, la administración puede implicar una dosificación intermitente. En algunos aspectos, la administración puede implicar una dosificación continua (por ejemplo, perfusión) durante al menos un período de tiempo seleccionado. En algunos aspectos, un anticuerpo producido por un animal no humano divulgado en el presente documento puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano o un roedor). En algunos aspectos, una composición farmacéutica incluye un anticuerpo producido por un animal no humano divulgado en el presente documento. En algunos aspectos, una composición farmacéutica puede incluir un tampón, un diluyente, un excipiente o cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo producido por un animal no humano divulgado en el presente documento se puede incluir en un recipiente para almacenamiento o administración, por ejemplo, un frasco, una jeringa (por ejemplo, una jeringa i.v.) o una bolsa (por ejemplo, una bolsa i.v.).
A fin idad: se refiere a la fuerza de la interacción entre una proteína de unión a antígeno y su compañero de unión, por ejemplo, entre un anticuerpo y un epítopo específico. Un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo tiene normalmente una K<d>con respecto a su epítopo diana de aproximadamente 10-9 M o inferior (por ejemplo, aproximadamente 1 * 10-9 M, 1 * 10-10 M, 1 * 10-11 M o aproximadamente 1 * 10-12 M). La K<d>se puede medir mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™; inmunoensayo enzimático (ELISA) u otros métodos conocidos.
A nticuerpo: se refiere a una proteína de unión a antígeno inmunoglobulina. Un anticuerpo tetramérico comprende cuatro cadenas polipeptídicas de inmunoglobulina (Ig), por ejemplo, dos cadenas pesadas (H) de Ig y dos cadenas ligeras (L) de Ig interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende un dominio variable de cadena pesada de Ig y una región o dominio constante de cadena pesada (C<h>) de Ig. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, C<h>1, C<h>2 y C<h>3. Cada cadena ligera de Ig comprende un dominio variable de cadena ligera de Ig y una región constante de cadena ligera (C<l>) de Ig.
El dominio variable de cadena pesada de Ig y el dominio variable de cadena ligera de Ig pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, del inglés complementarity determining regions), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, del inglés framework regions). Cada uno de los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de Ig comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo N al extremo C en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (las CDR de cadena pesada pueden abreviarse como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de cadena ligera pueden abreviarse como<l>C<d>R1,<l>C<d>R2 y LCDR3).
Proteína de unión a antígeno se refiere a las inmunoglobulinas, anticuerpo, anticuerpos, proteína de unión y similares, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), intracuerpos, minicuerpos, diacuerpos y anticuerpos antiidiotípicos (anti-id), y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. Los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" también se refieren a diacuerpos covalentes, tales como aquellos divulgados en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. 20070004909, e Ig-DARTS, tales como aquellos divulgados en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. 20090060910.
Biológicam ente activo : se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, in vitro o in vivo (p. ej., en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando está presente en un organismo, tiene un efecto biológico dentro de ese organismo, se considera biológicamente activo.
En aspectos particulares donde una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una parte de esa proteína o polipéptido que confiere al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se denomina normalmente parte "biológicamente activa".
A fín : se refiere a dos biomoléculas que suelen interactuar (por ejemplo, un receptor y su ligando).
Comparable: se refiere a dos o más agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etc., que pueden no ser idénticos entre sí, pero que son lo suficientemente similares para permitir la comparación entre ellos, de manera que se puedan extraer conclusiones razonablemente basándose en las diferencias o similitudes observadas. Los expertos habituales en la materia entenderán, en el contexto, qué grado de identidad se requiere en cualquier circunstancia dada para dos o más de estos agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etc. para considerarlos comparables.
Conservadora: se refiere a una sustitución conservadora de aminoácidos, es decir, una sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R de la cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de un polipéptido no inmunoglobulina de interés para unirse a su receptor afín. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: cadenas laterales alifáticas, tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas laterales de hidroxilo alifáticas, tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida, tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas, tales como fenilalanina, tirosina y triptófano; cadenas laterales básicas, tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y cadenas laterales que contienen azufre, tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/arginina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato y asparagina/glutamina.
En algunos aspectos, una sustitución de aminoácidos conservadora puede ser una sustitución de cualquier resto natural en una proteína con alanina, como se usa, por ejemplo, en la mutagénesis por barrido de alanina. En algunos aspectos, se realiza una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz logarítmica de probabilidades PAM250 divulgada en Gonnet, G. H. et al., 1992, Science 256:1443-1445. En algunos aspectos, una sustitución es una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz logarítmica de probabilidades PAM250.
C ontrol: se refiere al significado entendido en la materia de un "control" que es un patrón con el que se comparan los resultados. Normalmente, los controles se usan para aumentar la integridad en los experimentos mediante el aislamiento de variables con el fin de llegar a una conclusión sobre dichas variables. En algunos aspectos, un control es una reacción o ensayo que se realiza simultáneamente con una reacción de ensayo o ensayo para proporcionar un elemento de comparación. Un "controf puede referirse a un "animal de control" . Un "animal de control" puede tener una modificación como se describe en el presente documento, una modificación que es diferente a como se describe en el presente documento, o ninguna modificación (es decir, un animal de tipo silvestre). En un experimento, se aplica un "ensayo" (es decir, una variable que se está ensayando). En un segundo experimento, el "control", la variable que se somete a ensayo no se aplica. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.
En algunos aspectos, un control es un control histórico (es decir, de una prueba o ensayo realizado previamente, o una cantidad o resultado que se conoce previamente). En algunos aspectos, un control es o comprende un registro impreso o guardado de otro modo.
Variante degenerada de una molécula de ácido nucleico de referencia codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la codificada por el ácido nucleico de referencia y tiene una secuencia de ácido nucleico sustancialmente idéntica a la molécula de ácido nucleico de referencia pero con diferencias debidas a la degeneración del código genético.
A lteración, se refiere al resultado de un evento de recombinación homóloga con una molécula de ADN (por ejemplo, con una secuencia homóloga endógena tal como un gen o locus génico).
En algunos aspectos, una alteración puede lograr o representar una inserción, supresión, sustitución, reemplazo, mutación de aminoácido o un cambio de marco de una o más secuencias de ADN o cualquier combinación de los mismos. Las inserciones pueden incluir la inserción de genes completos, fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto al de la secuencia endógena (por ejemplo, una secuencia heteróloga), o secuencias codificantes procedentes o aisladas de un gen particular de interés. En algunos aspectos, una alteración puede aumentar la expresión y/o la actividad de un gen o producto génico (por ejemplo, de una proteína codificada por un gen). En algunos aspectos, una alteración puede disminuir la expresión y/o actividad de un gen o producto génico. En algunos aspectos, una alteración puede alterar la secuencia de un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunos aspectos, una alteración puede alterar la secuencia de un cromosoma o la posición de un cromosoma en un genoma. En algunos aspectos, una alteración puede truncar o fragmentar un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunos aspectos, una alteración puede extender un gen o un producto génico codificado. En algunos de tales aspectos, una alteración puede lograr el ensamblaje de una proteína de fusión. En algunos aspectos, una alteración puede afectar al nivel, pero no a la actividad, de un gen o producto génico. En algunos aspectos, una alteración puede afectar a la actividad, pero no al nivel, de un gen o producto génico. En algunos aspectos, una alteración puede no tener un efecto significativo en el nivel de un gen o producto génico. En algunos aspectos, una alteración puede no tener un efecto significativo en la actividad de un gen o producto génico. En algunos aspectos, una alteración puede no tener un efecto significativo ni en el nivel o ni en la actividad de un gen o producto génico. En algunos aspectos, un efecto significativo puede medirse mediante, por ejemplo, pero sin limitación, una prueba de la t de Student.
Locus endógeno o gen endógeno: se refiere a un locus genético encontrado en un organismo (o célula) parental o de referencia antes de la introducción de una alteración, interrupción, supresión, inserción, modificación, sustitución o reemplazo como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, un locus endógeno comprende una secuencia, en su totalidad o en parte, que se encuentra en la naturaleza. En algunas realizaciones, el locus endógeno es un locus de tipo silvestre. En algunas realizaciones, un organismo de referencia es un organismo de tipo silvestre. En algunas realizaciones, un organismo de referencia es un organismo genomodificado. En algunas realizaciones, un organismo de referencia es un organismo criado en laboratorio (ya sea de tipo silvestre o genomodificado).
P rom otor endógeno: se refiere a un promotor que está asociado de forma natural, por ejemplo, en un organismo de tipo silvestre, con un gen o locus genético endógeno.
G enom odificado: se refiere, en general, al aspecto de haber sido manipulado por la mano del hombre. Como es una práctica común y lo entienden los expertos en la materia, la descendencia de un polinucleótido o célula genomodificados se denominan normalmente "genomodificado" a pesar de que la manipulación real se realizó en una entidad anterior. Es más, como apreciarán los expertos en la materia, está disponible una diversidad de metodologías a través de las cuales se puede lograr la "genomodificación" como se describe en el presente documento. Un polinucleótido puede considerarse que está "genomodificado" cuando dos o más secuencias que no están unidas entre sí en ese orden en la naturaleza se manipulan por la mano del hombre para unirse directamente entre sí en el polinucleótido genomodificado. En algunos aspectos, un polinucleótido genomodificado puede comprender una secuencia reguladora, que se encuentra en la naturaleza en unión operativa con una primera secuencia codificante pero no en unión operativa con una segunda secuencia codificante, unida por la mano del hombre de modo que está unida operativamente con la segunda secuencia codificante. Como alternativa, o de manera adicional, en algunos aspectos, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico que codifica cada una elementos o dominios polipeptídicos que en la naturaleza no están unidos entre sí pueden unirse entre sí en un único polinucleótido genomodificado. Comparativamente, en algunos aspectos, una célula u organismo puede considerarse que está "genomodificado" si se ha manipulado de manera que se altere su información genética (por ejemplo, se ha introducido nuevo material genético que no estaba previamente presente, o se ha alterado o eliminado material genético previamente presente).
En algunos aspectos, la "genomodificación" puede implicar la selección o el diseño (por ejemplo, de secuencias de ácido nucleico, secuencias polipeptídicas, células, tejidos y/u organismos) mediante el uso de sistemas informáticos programados para realizar análisis o comparación, o de otro modo para analizar, recomendar y/o seleccionar secuencias, alteraciones, etc.). Como alternativa, o de manera adicional, en algunos aspectos, "genomodificar" puede implicar el uso de metodologías de síntesis química y/o tecnologías de ácidos nucleicos recombinantes in vitro, tales como, por ejemplo, por ejemplo, amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa), hibridación, mutación, transformación, transfección, etc. y/o cualquiera de una diversidad de metodologías de emparejamiento controlado. Como apreciarán los expertos en la materia, una diversidad de tales técnicas establecidas (por ejemplo, para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos y el cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección, etc.) se conocen bien en la materia y se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y/o analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook e ta l., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Gen: se refiere a una secuencia de ADN en un cromosoma que codifica un producto (por ejemplo, un producto de ARN y/o un producto polipeptídico). Con fines de claridad, el término "gen" generalmente se refiere a una parte de un ácido nucleico que codifica un polipéptido; el término puede incluir opcionalmente secuencias reguladoras, como resultará evidente a partir del contexto para los expertos habituales en la materia. Esta definición no pretende excluir la aplicación del término "gen" a las unidades de expresión que no codifican proteínas, sino más bien aclarar que, en la mayoría de los casos, el término como se usa en el presente documento se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido.
En algunos aspectos, un gen incluye una secuencia codificante (es decir, una secuencia que codifica un producto particular). En algunos aspectos, un gen incluye una secuencia no codificante. En algunos aspectos, un gen puede incluir tanto una secuencia codificante (por ejemplo, exónica) como no codificante (por ejemplo, intrónica). En algunos aspectos, un gen puede incluir una o más secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) y/o secuencias intrónicas que, por ejemplo, pueden controlar o afectar a uno o más aspectos de la expresión génica (por ejemplo, expresión específica del tipo de célula, la expresión inducible, etc.).
Los dominios variables de los receptores de antígenos de inmunoglobulinas, por ejemplo, anticuerpos, se codifican en conjuntos de segm entos génicos, también denominados en el presente documento "segmentos" que se sitúan secuencialmente a lo largo del cromosoma y sufren recombinación somática para formar un exón de dominio variable completo. La configuración de los segmentos génicos humanos que se heredan, por ejemplo, la configuración en línea germinal de los segmentos génicos humanos, por ejemplo, el orden de los segmentos génicos humanos en el genoma de la estirpe germinal (por ejemplo, el genoma transmitido a la siguiente generación) de un ser humano, se puede encontrar en Lefranc, M. P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), que también muestra segmentos génicos funcionales y pseudogenes que se encuentran en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina humana en configuración en línea germinal. Los segmentos génicos se clasifican como segmentos génicos variables (V) (cada uno de los cuales también puede denominarse individualmente segmento V), segmentos génicos de diversidad (D) (cada uno de los cuales también puede denominarse individualmente segmento D) o segmentos génicos de unión (J) (cada uno de los cuales también puede denominarse individualmente segmento J). Existen múltiples copias de cada tipo de segmento genético en el ADN de la estirpe germinal, pero sólo se expresa una para cada tipo de cadena receptora en un linfocito receptor
Una serie de eventos de recombinación, que implican varios componentes genéticos, sirve para ensamblar inmunoglobulinas a partir de la disposición ordenada de segmentos génicos (por ejemplo, V, D y J). Se sabe que este ensamblaje de segmentos génicos es impreciso y, por lo tanto, la diversidad de inmunoglobulinas se logra mediante la combinación de diferentes segmentos génicos y la formación de uniones exclusivas a través de unión imprecisa. Se genera mayor diversidad a través de un proceso conocido como hipermutación somática en el que la secuencia de la región variable de las inmunoglobulinas se altera para aumentar la afinidad y la especificidad por el antígeno. La referencia a un segmento génico de Ig en el presente documento, por ejemplo, un segmento V de Ig, incluye variantes del segmento V de Ig de la estirpe germinal. Una variante de un segmento de Ig de la estirpe germinal, por ejemplo, un segmento V de Ig de la estirpe germinal incluye una variante polimórfica, por ejemplo, alélica, del mismo, una variante somáticamente hipermutada del mismo, una variante recombinada del mismo y una variante degenerada del mismo.
Polimorfismos de secuencia de la región codificante de un segmento de Ig, por ejemplo, las secuencias de las variantes alélicas de un segmento de Ig de la estirpe germinal, se describen en Pallares, N. et al. (1998) Exp. Clin. Immunogenet., 15, 8-18; Barbie, V. y Lefranc, M. P. (1998) Exp. Clin. Immunogenet., 15, 171-183; Martinez, C. y Lefranc, M. P. (1998) Exp. Clin. Immunogenet., 15, 184-193; Pallares, N. et al. (1999) Exp. Clin. Immunogenet., 16, 36-60 (1999) y Ruiz, M. et al. (1999) Exp. Clin. Immunogenet., 16, 173-184. La representación de los segmentos alélicos de Ig de la estirpe germinal también puede encontrarse en dos formatos en la web mundial (www) en imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/#B, que muestra las alineaciones de todas las secuencias conocidas asignadas a los diferentes alelos, por comparación con el alelo*01, e imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/#C, que proporciona descripciones de las mutaciones de nucleótidos y los correspondientes cambios de aminoácidos de los diferentes alelos, en comparación con el alelo*01. Véase también la patente EP n.° 3 128009.
Un segmento V de Ig puede considerarse una variante recombinada o somáticamente hipermutada de un segmento V de Ig de la estirpe germinal si comprende, para una cualquiera o más de las siguientes regiones: FR1, FR2 y/o FR3, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de secuencia de ácido nucleico con el segmento de la estirpe germinal, o codifica un aminoácido que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por el segmento V de Ig de la estirpe germinal.
En algunas realizaciones, un segmento V de Ig puede considerarse una variante recombinada o somáticamente hipermutada de un segmento V de Ig de la estirpe germinal si comprende, para una cualquiera o más de las siguientes regiones: FR1, FR2 y/o FR3, entre el 80 % y el 99 % de homología de secuencia de ácido nucleico con el segmento de la estirpe germinal. En algunas realizaciones, un segmento V de Ig puede considerarse una variante recombinada o somáticamente hipermutada de un segmento V de Ig de la estirpe germinal si comprende, para una cualquiera o más de las siguientes regiones: FR1, FR2 y/o FR3, entre el 85 % y el 99 % de homología de secuencia de ácido nucleico con el segmento de la estirpe germinal. En algunas realizaciones, un segmento V de Ig puede considerarse una variante recombinada o somáticamente hipermutada de un segmento V de Ig de la estirpe germinal si comprende, para una cualquiera o más de las siguientes regiones: FR1, FR2 y/o FR3, entre el 90 % y el 99 % de homología de secuencia de ácido nucleico con el segmento de la estirpe germinal. En algunas realizaciones, un segmento V de Ig puede considerarse una variante recombinada o somáticamente hipermutada de un segmento V de Ig de la estirpe germinal si comprende, para una cualquiera o más de las siguientes regiones: FR1, FR2 y/o FR3, entre el 95 % y el 99 % de homología de secuencia de ácido nucleico con el segmento de la estirpe germinal.
Un segmento V de Ig puede considerarse una variante recombinada o somáticamente hipermutada de un segmento V de Ig de la estirpe germinal si codifica, para una cualquiera o más de las siguientes regiones: FR1, FR2 y/o FR3, un aminoácido que tenga entre el 80 % y el 99 % de homología de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por el segmento V de Ig de la estirpe germinal. Un segmento V de Ig puede considerarse una variante recombinada o somáticamente hipermutada de un segmento V de Ig de la estirpe germinal si codifica, para una cualquiera o más de las siguientes regiones: FR1, FR2 y/o FR3, un aminoácido que tenga entre el 85 % y el 99 % de homología de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por el segmento V de Ig de la estirpe germinal. Un segmento V de Ig puede considerarse una variante recombinada o somáticamente hipermutada de un segmento V de Ig de la estirpe germinal si codifica, para una cualquiera o más de las siguientes regiones: FR1, FR2 y/o FR3, un aminoácido que tenga entre el 90 % y el 99 % de homología de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por el segmento V de Ig de la estirpe germinal. Un segmento V de Ig puede considerarse una variante recombinada o somáticamente hipermutada de un segmento V de Ig de la estirpe germinal si codifica, para una cualquiera o más de las siguientes regiones: FR1, FR2 y/o FR3, un aminoácido que tenga entre el 95 % y el 99 % de homología de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos codificada por el segmento V de Ig de la estirpe germinal.
La molécula de inmunoglobulina es un polipéptido en forma de Y compuesto por dos cadenas pesadas idénticas y dos ligeras idénticas, cada una de las cuales tiene dos componentes estructurales: un dominio variable y un dominio constante. Son los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras que se forman por el ensamblaje de segmentos génicos, mientras que los dominios constantes se fusionan con dominios variables a través del corte y empalme de ARN. Aunque el mecanismo de ensamblaje (o unión) de los segmentos génicos es similar para las cadenas ligeras y pesadas, solamente se requiere un evento de unión para cadenas ligeras (es decir, V a J) mientras que se requieren dos para cadenas pesadas (es decir, D a J y V a DJ).
En general, un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina está codificado por el exón de dominio variable formado por la recombinación somática de un segmento génico variable de cadena pesada (V<h>) de inmunoglobulina (también denominado segmento V<h>) recombinado con un segmento génico de diversidad de cadena pesada (D<h>) de inmunoglobulina (también denominado segmento D<h>) y un segmento génico de unión de cadena pesada J<h>de inmunoglobulina (también denominado segmento J<h>). Un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina está codificado generalmente por un exón de dominio variable formado por la recombinación somática de un segmento génico variable de cadena ligera (V<l>) de inmunoglobulina (también denominado segmento V<l>) con un segmento génico de unión de cadena ligera (J<l>) de inmunoglobulina (también denominado segmento J<l>).
El ensamblaje de segmentos génicos para regiones variables de cadena ligera y pesada (denominado respectivamente recombinación VDJ y recombinación VJ) está guiado por secuencias de ADN no codificantes conservadas que flanquean cada segmento génico, denominadas secuencias señal de recombinación (RSS, del inglés recombination signal sequences), que aseguran reordenamientos del ADN en ubicaciones precisas en relación con secuencias codificantes V, D y J (véase, por ejemplo, Ramsden, D. A. et al., 1994, Nuc. Acids Res. 22(10): 1785-96). Cada RSS consiste en un bloque conservado de siete nucleótidos (heptámero) que es contiguo a una secuencia codificante (por ejemplo, un segmento V, D o J) seguido de un espaciador (ya sea de 12 pb o de 23 pb) y un segundo bloque conservado de nueve nucleótidos (nonámero). Aunque se tolera una divergencia de secuencia considerable en el espaciador de 12 pb o 23 pb entre individuos, la longitud de estas secuencias normalmente no varía. La recombinación entre segmentos génicos de inmunoglobulina sigue una regla comúnmente conocida como la regla 12/23, en la que los segmentos génicos flanqueados por una RSS con un espaciador de 12 pb (o 12 meros) normalmente se unen a un segmento génico flanqueado por un espaciador de 23 pb (o 23 meros; véase, por ejemplo, Hiom, K. y M. Gellert, 1998, Mol. Cell. 1(7): 1011-9).
A menos que se indique lo contrario o a menos que sea evidente para un experto habitual en la materia que surgiría una contradicción o incoherencia, se supone que un segmento génico sin reordenar sin referencia a una RSS comprende las dos RSS con las que el segmento génico está asociado de forma natural, por ejemplo, flanqueado por, unido operativamente a, etc. En algunas realizaciones, un segmento génico sin reordenar en el presente documento puede comprender un segmento génico en su configuración de la estirpe germinal (por ejemplo, de tipo silvestre), por ejemplo, un segmento génico V<h>de la estirpe germinal y un segmento génico J<h>de la estirpe germinal están flanqueados cada uno en ambos lados por una RSS de 23 meros. En cambio, un segmento génico D<h>de la estirpe germinal, por ejemplo, un segmento génico D<h>sin reordenar, está flanqueado a cada lado por una RSS de 12 meros.
De esta manera, un segmento génico sin reordenar también puede referirse a un segmento génico en su configuración en línea germinal, incluyendo cualquier RSS asociada con dicha configuración en línea germinal. Así mismo, una pluralidad de segmentos génicos en su configuración en línea germinal generalmente se refiere a que no solo cada segmento génico individual está en su configuración de estirpe germinal (por ejemplo, sin reordenar), sino también el orden y/o ubicación de los segmentos génicos funcionales. Véase, por ejemplo, Lefranc, M. P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), para la configuración en línea germinal de los segmentos génicos V, D y J humanos.
Cada segmento V comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal o líder (L) de Ig unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y parte de la CDR3 de un dominio variable de inmunoglobulina. Cada segmento génico D contribuye a la CDR3 de un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina. Cada segmento génico J también contribuye a la CDR3 y la FR4 de un dominio variable de inmunoglobulina. Las posiciones de los aminoácidos de las FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 se basan en una numeración única descrita en Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55-77 y también pueden consultarse en www.imgt.org.
H eterólogo: se refiere a un agente o entidad de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipéptido, gen o producto génico presente en una célula u organismo en particular, el término aclara que el polipéptido relevante o fragmento del mismo, gen o fragmento del mismo, o producto génico o fragmento del mismo: (1) se genomodificó por la mano del hombre; (2) se introdujo en la célula u organismo (o un precursor de los mismos) a través de la mano del hombre (por ejemplo, mediante ingeniería genética); y/o (3) no se produce de forma natural ni está presente en la célula u organismo relevante (por ejemplo, el tipo de célula o tipo de organismo relevante). Otro ejemplo incluye un polipéptido o fragmento del mismo, gen o fragmento del mismo, o producto génico o fragmento del mismo que normalmente está presente en una célula u organismo natural en particular, pero que se ha modificado, por ejemplo, por mutación o colocación bajo el control de asociados no naturales y, en algunos aspectos, elementos reguladores no endógenos (por ejemplo, un promotor).
Célula hospedadora: se refiere a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico o proteína heterólogos (por ejemplo, exógenos). Los expertos tras la lectura de la presente divulgación comprenderán que dichos términos se refieren no solo a la célula en cuestión en particular, sino que también se utilizan para referirse a la descendencia de dicha célula. Debido a que en generaciones sucesivas pueden producirse determinadas modificaciones debido a mutaciones o a influencias ambientales, dicha descendencia puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero siguen estando incluidas dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora".
En algunos aspectos, una célula hospedadora es o comprende una célula procariota o eucariota. En algunos aspectos, una célula hospedadora es o comprende una célula de mamífero. En general, una célula hospedadora es cualquier célula que sea adecuada para recibir y/o producir un ácido nucleico o proteína heterólogo, independientemente del Reino de vida al que esté designada la célula. Las células ilustrativas incluyen las de procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterias (por ejemplo, cepas de Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células micobacterianas, células fúngicas, células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica, etc.), células vegetales, células de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insecto infectadas por baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células animales no humanas, células humanas o fusiones de células, tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas.
En algunos aspectos, la célula es una célula humana, de mono, simio, hámster, rata o ratón. En algunos aspectos, la célula es eucariota y se selecciona entre las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de la retina, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-O, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral y una estirpe celular procedente de una célula mencionada anteriormente. En algunos aspectos, la célula comprende uno o más genes víricos, por ejemplo, una célula de la retina que expresa un gen vírico (p. ej., una célula PER.C6®). En algunos aspectos, una célula hospedadora es o comprende una célula aislada. En algunos aspectos, una célula hospedadora forma parte de un tejido. En algunos aspectos, una célula hospedadora forma parte de un organismo.
Hum anizada/o: se refiere a una molécula (por ejemplo, un ácido nucleico, una proteína, etc.) que no era de origen humano y para la que una parte se ha sustituido con una parte correspondiente de una molécula humana correspondiente de tal manera que la molécula modificada (por ejemplo, humanizada) conserva su función biológica y/o mantiene la estructura que realiza la función biológica conservada. Por el contrario, "humano" y similares abarca moléculas que tienen solamente un origen humano, por ejemplo, nucleótidos humanos o proteínas que comprenden únicamente secuencias de nucleótidos y aminoácidos humanos, respectivamente. El término "humano o humanizado" se utiliza para reflejar que la molécula humana o humanizada puede ser (a) una molécula humana o (b) una molécula humanizada.
Identidad: en relación con una comparación de secuencias, se refiere a la identidad como se determina por una serie de algoritmos diferentes conocidos en la materia que se pueden utilizar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos.
En algunos aspectos, las identidades como se describen en el presente documento se determinan usando una alineación ClustalW v. 1.83 (lenta) empleando una penalización por hueco abierto de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,1, y usando una matriz de similitud de Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
Inm unoglobulina se refiere a una clase de polipéptidos, y ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, que están presentes en el suero o se expresan en los linfocitos B del sistema inmunitario, que funcionan como anticuerpos, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno.
Un po lipéptido no inm unoglobulina se refiere a ligandos, por ejemplo, polipéptidos, que se unen a un receptor afín. Los pares de polipéptidos no inmunoglobulina:receptores afines ilustrativos y bien conocidos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, aquellos polipéptidos no inmunoglobulina que se unen a receptores acoplados a proteínas G (GPCR, del inglés G-protein coupled receptors) afines. Los GPCR ilustrativos incluyen, pero sin limitación, receptores de quimiocinas, receptores de glucagón (por ejemplo, GLPEGLPIR), receptores de calcitonina, receptores de melanocortina. Estos y otros GPCR afines, incluidos los polipéptidos no inmunoglobulina que se unen a los mismos, se conocen bien en la materia. Véase, por ejemplo, Wu et al. (2017) J. Mol. Biol. 429:2726-45. Otros pares no limitantes e ilustrativos de polipéptidos no inmunoglobulina (ligando):receptores afines incluyen
a. ligandos que se unen a receptores tirosina quinasas afines, por ejemplo, ligandos tales como, pero sin limitación, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), insulina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), etc. b. pares de receptores DLL:Notch,
c. pares de receptores B7:CD28/C<l>TA4/PD1,
d. pares de receptores semaforina:plexina,
e. pares PCSK9/LDLR,
f. pares HLA:LILR,
g. pares HLA:KIR,
h. pares RGD-ligando:integrina,
i. pares amilina:CALCR/RAMP, por ejemplo, RAMP1/2/3
j. pares de péptidos natriuréticos (por ejemplo, ANP, BNP, CNP, etc.):receptores de péptidos natriuréticos (NPR, NPR3, etc.), etc.
Un par ligando:receptor puede incluir proteasas e inhibidores.
In v itro : se refiere a eventos que se producen en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo pluricelular.
In vivo: se refiere a eventos que se producen en un organismo pluricelular, tal como un ser humano y un animal no humano. En el contexto de sistemas basados en células, la expresión puede usarse para referirse a eventos que se producen en una célula viva (al contrario que, por ejemplo, sistemas in vitro).
A islado: se refiere a una sustancia y/o entidad (1) que se ha separado de al menos algunos de los componentes a los que estaba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) que se ha diseñado, producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente 10 o más de los distintos componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunos aspectos, los agentes aislados son al menos aproximadamente un 80 % o más puros. Una sustancia es "pura" si carece sustancialmente de otros componentes. En algunos aspectos, como entenderán los expertos en la materia, una sustancia todavía puede considerarse "aislada" o incluso "pura", después de haberse combinado con otros componentes determinados tales como, por ejemplo, uno o más portadores o excipientes (por ejemplo, tampón, disolvente, agua, etc.); en dichos aspectos, el porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir dichos portadores o excipientes.
Por poner solo un ejemplo, en algunos aspectos, un polímero biológico, tal como un polipéptido o polinucleótido, que se produce en la naturaleza se considera "aislado" cuando: (a) en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociado con alguno o con todos los componentes que lo acompañan en su estado natural en la naturaleza; (b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie de la especie que lo produce en la naturaleza; o (c) se expresa por o está asociado de otro modo con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Por tanto, por ejemplo, en algunos aspectos, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del que lo produce en la naturaleza se considera un polipéptido "aislado". Como alternativa, o de manera adicional, en algunos aspectos, un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación puede considerarse un polipéptido "aislado" en la medida en que se haya separado de otros componentes: a) con los que está asociado en la naturaleza; y/o b) con los que estaba asociado cuando se produjo inicialmente.
Secuencia líd e r o péptido señal: se refiere a un péptido señal o líder (L) de inmunoglobulina que guía una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina a través del retículo endoplásmico y que posteriormente se escinde de la cadena pesada o ligera antes del ensamblaje del anticuerpo final. También puede referirse a la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal o líder. Cada segmento génico V comprende una secuencia líder codificada por el exón 1 y el exón 2 del segmento (véase, por ejemplo, la figura 2) que se encuentra inmediatamente cadena arriba de la secuencia del exón 2 que codifica FR1, c DR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento V de Ig de la estirpe germinal. Las secuencias señal o líder de Ig son bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55-77 y también pueden consultarse en la web mundial (www) con la dirección imgt.org. Véase también Lefranc y Lefranc (2020) Biomedicines 8(9): 1-117.
A nim al no hum ano: se refiere a cualquier organismo vertebrado que no es un ser humano. Un animal no humano puede ser un ciclóstomo, un pez óseo, un pez cartilaginoso (por ejemplo, un tiburón o una raya), un anfibio, un reptil, un mamífero y un ave. En algunos aspectos, un mamífero no humano puede ser un primate, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, una vaca o un roedor. En algunos aspectos, un animal no humano puede ser una rata o un ratón.
Á cido nucleico en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o se puede incorporar a una cadena oligonucleotídica y generalmente es intercambiable con una molécula de ácido nucleico, secuencia de ácido nucleico, molécula de nucleótidos, molécula de nucleótidos, cuyos términos también son intercambiables entre sí.
En algunos aspectos, un "ácido nucleico" es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena oligonucleotídica a través de un enlace fosfodiéster. Como quedará claro por el contexto, en algunos aspectos, "ácido nucleico" se refiere a restos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos); en algunos aspectos, "ácido nucleico" se refiere a una cadena oligonucleotídica que comprende restos de ácido nucleico individuales. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" es o comprende ARN; en algunos aspectos, un "ácido nucleico" es o comprende ADN. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" es, comprende o consiste en uno o más restos de ácido nucleico naturales. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" es, comprende o consiste en uno o más análogos de ácido nucleico. En algunos aspectos, un análogo de ácido nucleico difiere de un "ácido nucleico" en el sentido de que no utiliza una cadena principal fosfodiéster. Por ejemplo, en algunos aspectos, un "ácido nucleico" es, comprende o consiste en uno o más "ácidos nucleicos peptídicos", que se conocen en la materia y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la cadena principal, se consideran dentro del alcance de la presente invención. Como alternativa, o de manera adicional, en algunos aspectos, un "ácido nucleico" tiene uno o más enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidita en lugar de enlaces fosfodiéster. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" es, comprende o consiste en uno o más nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina). En algunos aspectos, un "ácido nucleico" es, comprende o consiste en uno o más análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5 propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas y combinaciones de las mismas). En algunos aspectos, un "ácido nucleico" comprende uno o más azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa, ribosa, 2-desoxirribosa, arabinosa y hexosa) en comparación con los de los ácidos nucleicos naturales. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico funcional, tal como un ARN o una proteína. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento polipeptídico (por ejemplo, un péptido). En algunos aspectos, un "ácido nucleico" incluye uno o más intrones. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" incluye uno o más exones. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" incluye una o más secuencias codificantes. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" se prepara mediante uno o más de aislamiento de una fuente natural, síntesis enzimática por polimerización basada en una plantilla complementaria (in vivo o in vitro), reproducción en una célula o sistema recombinante y síntesis química. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" tiene al menos 3 o más restos de longitud. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" es monocatenario; en algunos aspectos, un ácido nucleico" es bicatenario. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido o fragmento del mismo. En algunos aspectos, un "ácido nucleico" tiene actividad enzimática.
Unido operativam ente: se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista.
En otros aspectos, la unión operativa no requiere contigüidad. Por ejemplo, los segmentos génicos de región variable sin reordenar "unidos operativamente" entre sí son capaces de reordenarse para formar un gen de región variable reordenado, cuyos segmentos génicos de región variable sin reordenar pueden no ser necesariamente contiguos entre sí. Los segmentos génicos de región variable sin reordenar unidos operativamente entre sí y a un gen de región constante contiguo son capaces de reordenarse para formar un gen de región variable reordenado que se expresa junto con el gen de región constante como una cadena polipeptídica de una proteína de unión a antígeno. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se une de manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen tanto las secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés como las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés.
La expresión "secuencia de control de la expresión", se refiere a secuencias polinucleotídicas, que son necesarias para afectar a la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las que están unidas. Las "secuencias de control de expresión" incluyen: secuencias de inicio de la transcripción, de terminación, promotoras y potenciadoras adecuadas; señales de procesamiento del ARN eficaces, tales como las señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencia de consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador. Por ejemplo, en procariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión ribosómica y una secuencia de terminación de la transcripción, mientras que en eucariotas normalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" se pretende que incluya componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión.
C ondiciones fis io lóg icas: tiene su significado entendido en la materia que hace referencia a las condiciones en las que las células u organismos viven y/o se reproducen. En algunos aspectos, la expresión se refiere a las condiciones del medio externo o interno que pueden producirse en la naturaleza para un organismo o sistema celular. En algunos aspectos, las condiciones fisiológicas son aquellas condiciones presentes en el cuerpo de un animal humano o no humano, especialmente las condiciones presentes en y/o dentro de un sitio quirúrgico. Las condiciones fisiológicas normalmente incluyen, por ejemplo, un intervalo de temperatura de 20 a 40 °C, presión atmosférica de 1, pH de 6 a 8, concentración de glucosa de 1 a 20 mM, concentración de oxígeno a niveles atmosféricos y gravedad tal como se encuentra en la tierra. En algunos aspectos, las condiciones en un laboratorio se manipulan y/o mantienen en condiciones fisiológicas. En algunos aspectos, las condiciones fisiológicas se encuentran en un organismo (por ejemplo, un animal no humano).
P olipéptido: se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos.
En algunos aspectos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que se produce en la naturaleza. En algunos aspectos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que no se produce en la naturaleza. En algunos aspectos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que contiene partes que se producen en la naturaleza por separado unas de otras (es decir, de dos o más organismos diferentes, por ejemplo, partes humanas y no humanas). En algunos aspectos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que está genomodificada en el sentido de diseñada y/o producida mediante la acción de la mano del hombre. En algunos aspectos, un polipéptido puede comprender o consistir en una pluralidad de fragmentos, cada uno de los cuales se encuentra en el mismo polipéptido precursor en una disposición espacial diferente entre sí que la que se encuentra en el polipéptido de interés (por ejemplo, los fragmentos que están directamente unidos en el precursor pueden estar separados espacialmente en el polipéptido de interés o viceversa, y/o los fragmentos pueden estar presentes en un orden diferente en el polipéptido de interés que en el precursor), de modo que el polipéptido de interés sea un derivado de su polipéptido precursor.
Recom binante: se refiere a ácidos nucleicos y/o polipéptidos diseñados, genomodificados, preparados, expresados, creados o aislados mediante medios recombinantes, tales como polipéptidos expresados mediante un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, polipéptidos aislados de una biblioteca combinatoria de polipéptidos humanos recombinante (Hoogenboom H. R., 1997 TIB Tech. 15:62-70; Hoogenboom H. y Chames P., 2000, Immunology Today 21:371-378; Azzazy H. y Highsmith W. E., 2002, Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V y Larrick J. W., 2002, BioTechniques 29:128-145) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulinas humanas (véase, por ejemplo, Taylor, L. D., et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Little M. et al., 2000, Immunology Today 21:364-370; Kellermann S. A. y Green L. L., 2002, Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Murphy, A. J., et al., 2014, Proc. Nath Acad. Sci. U.S. A. 111(14):5153-5158) o polipéptidos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique cortar y empalmar elementos de secuencia seleccionados entre sí.
En algunos aspectos, uno o más de dichos elementos de secuencia seleccionados se encuentran en la naturaleza. En algunos aspectos, uno o más de dichos elementos de secuencia seleccionados están diseñados in silico. En algunos aspectos, uno o más de dichos elementos de secuencia seleccionados son el resultado de mutagénesis (por ejemplo, in vivo o in vitro) de un elemento de secuencia conocido, por ejemplo, de una fuente natural o sintética. Por ejemplo, en algunos aspectos, un polipéptido recombinante comprende secuencias que se encuentran en el genoma (o polipéptido) de un organismo fuente de interés (por ejemplo, ser humano, ratón, etc.). En algunos aspectos, un polipéptido recombinante comprende secuencias que se producen en la naturaleza por separado (es decir, de dos o más organismos diferentes, por ejemplo, partes humana y no humana) en dos organismos diferentes (por ejemplo, un organismo humano y uno no humano). En algunos aspectos, un polipéptido recombinante tiene una secuencia de aminoácidos que fue el resultado de mutagénesis (por ejemplo, in vitro o in vivo, por ejemplo, en un animal no humano), de modo que las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos recombinantes son secuencias que, mientras se originan de y se relacionan con secuencias polipeptídicas, pueden no existir de forma natural dentro del genoma de un animal no humano in vivo.
Referencia: se refiere a un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor convencional o de control contra el cual un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés se compara. Una "referencia" o "control" puede referirse a un "animal de referencia" o "animal de control". Un "animal de referencia" puede tener una modificación como se describe en el presente documento, una modificación que es diferente a la descrita en el presente documento o ninguna modificación (es decir, un animal de tipo silvestre). Normalmente, como comprenderían los expertos en la materia, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se determina o se caracteriza en condiciones comparables a las usadas para determinar o caracterizar el agente, animal (por ejemplo, un mamífero), cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés.
En algunos aspectos, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se ensaya y/o se determina de manera sustancialmente simultánea con la prueba o determinación de un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunos aspectos, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia es una referencia anterior, opcionalmente incorporada en un medio tangible. En algunos aspectos, una referencia puede referirse a un control. "Control VELOCIMMUNE®" y similares, por ejemplo, "control VELOCIMMUNE®", o "control" como animal de referencia se refiere a un ratón VELOCIMMUNE® que comprende loci de región variable pesada y kappa humanizados, donde los ratones son capaces de reproducirse. Estos ratones de control VELOCIMMUNE® se describen de forma general en Macdonald et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 y la información complementaria.
Recom binación som ática: se refiere a la recombinación de los segmentos génicos V<h>, D<h>y J<h>en un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina o la recombinación de los segmentos génicos V<l>y J<l>en un locus de la cadena ligera de inmunoglobulina. La recombinación somática se produce antes del contacto con el antígeno y durante el desarrollo de los linfocitos B en la médula ósea. En un locus de la cadena pesada, un D<h>y un J<h>se recombinan aleatoriamente con la eliminación de todo el ADN intermedio en un proceso denominado unión D-J. A continuación, un segmento aleatorio V<h>se recombina con el segmento reordenado D<h>J<h>. La recombinación en un locus de la cadena ligera de inmunoglobulina se produce de forma similar. Un segmento génico V<l>y un segmento génico J<l>se combinan y recombinan durante un proceso denominado unión V-J, con eliminación de todo el ADN entre ellos.
Sustancialm ente: se refiere a la condición cualitativa de mostrar la extensión o el grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en la materia biológica comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, llegan a completarse y/o transcurren hasta completarse o consiguen o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se utiliza para capturar la posible carencia de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
Hom ología sustancial: se refiere a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la materia, generalmente se considera que dos secuencias son "sustancialmente homologas" si contienen restos homólogos en las posiciones correspondientes. Los restos homólogos pueden ser restos idénticos. Como alternativa, los restos homólogos pueden ser restos no idénticos con características estructurales y/o funcionales apropiadamente similares. Por ejemplo, como es bien conocido por los expertos en la materia, determinados aminoácidos se clasifican normalmente como aminoácidos "hidrófobos" o "hidrófilos", y/o que tienen cadenas laterales "polares" o "no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo con frecuencia puede considerarse una sustitución "homóloga". Las categorizaciones habituales de aminoácidos se resumen a continuación:
Alanina Ala A No polar Neutro 1,8
Arginina Arg R Polar Positivo -4,5
Asparagina Asn N Polar Neutro -3,5
Ácido aspártico Asp D Polar Negativo -3,5
Cisteína Cys C No polar Neutro 2,5
Ácido glutámico Glu E Polar Negativo -3,5
Glutamina Gln Q Polar Neutro -3,5
Glicina Gly G No polar Neutro -0,4
Histidina His H Polar Positivo -3,2
Isoleucina Ile I No polar Neutro 4,5
Leucina Leu L No polar Neutro 3,8
Lisina Lys K Polar Positivo -3,9
Metionina Met M No polar Neutro 1,9
Fenilalanina Phe F No polar Neutro 2,8
Prolina Pro P No polar Neutro -1,6
Serina Ser S Polar Neutro -0,8
Treonina Thr T Polar Neutro -0,7
Triptófano Trp W No polar Neutro -0,9
Tirosina Tyr Y Polar Neutro -1,3
Valina Val V No polar Neutro 4,2
Aminoácidos ambiguos 3 letras 1 letra
Asparagina o ácido aspártico Asx B
Glutamina o ácido glutámico Glx Z
Leucina o isoleucina Xle J
Aminoácido no especificado o desconocido Xaa X
Como se conoce bien en la materia, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse usando cualquiera de una diversidad de algoritmos, incluidos los disponibles en programas informáticos comerciales, tales como BLASTN para secuencias nucleotídicas, y BLASTP, BLAST con espacios y PS1-BLAST para secuencias de aminoácidos. Se describen programas ilustrativos de este tipo en Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403410; Altschul, S. F. et al., 1996, Methods in Enzymol. 266:460-80; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A. D. y B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Además de identificar secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente normalmente proporcionan una indicación del grado de homología.
En algunos aspectos, se considera que dos secuencias son sustancialmente homólogas si al menos un 95 % o más de sus restos correspondientes son homólogos en un tramo relevante de restos. En algunos aspectos, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunos aspectos, el tramo relevante es de al menos 9 o más restos. En algunos aspectos, el tramo relevante incluye restos contiguos a lo largo de una secuencia completa. En algunos aspectos, el tramo relevante incluye restos discontinuos a lo largo de una secuencia completa, por ejemplo, restos no contiguos reunidos por la conformación plegada de un polipéptido o una parte del mismo. En algunos aspectos, el tramo relevante es de al menos 10 o más restos.
Identidad sustancia l: se refiere a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la materia, generalmente se considera que dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si contienen restos idénticos en las posiciones correspondientes. Como se conoce bien en la materia, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse usando cualquiera de una diversidad de algoritmos, incluidos los disponibles en programas informáticos comerciales, tales como BLASTN para secuencias nucleotídicas, y BLASTP, BLAST con espacios y PS1-BLAST para secuencias de aminoácidos. Se describen programas ilustrativos de este tipo en Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S. F. et al., 1996, Methods in Enzymol.
266:460-80; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A. D. y B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente normalmente proporcionan una indicación del grado de identidad.
En algunos aspectos, se considera que dos secuencias son sustancialmente idénticas si al menos un 95 % o más de sus restos correspondientes son idénticos en un tramo relevante de restos. En algunos aspectos, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunos aspectos, el tramo relevante es de al menos 10 o más restos.
Vector de direccionam iento o construcción de direccionam iento: se refiere a una molécula polinucleotídica que comprende una región de direccionamiento. Una región de direccionamiento comprende una secuencia idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia de una célula, tejido o animal diana y prevé la integración de la construcción de direccionamiento en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal mediante recombinación homóloga. También se incluyen regiones de direccionamiento que se dirigen usando sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio (por ejemplo, sitios loxP o Frt).
En algunos aspectos, una construcción de direccionamiento como se describe en el presente documento comprende además una secuencia de un ácido nucleico o gen de interés particular, un marcador seleccionable, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de ácidos nucleicos que permiten la recombinación mediada por la adición exógena de proteínas que ayudan en o facilitan la recombinación que implica dichas secuencias. En algunos aspectos, una construcción de direccionamiento como se describe en el presente documento comprende además un gen de interés en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés es un gen heterólogo que codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por una secuencia endógena. En algunos aspectos, una construcción de direccionamiento como se describe en el presente documento comprende además un gen humanizado de interés, en su totalidad o en parte, en donde el gen humanizado de interés codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de un polipéptido codificado por una secuencia endógena. En algunos aspectos, una construcción de direccionamiento (o vector de direccionamiento) puede comprender una secuencia de un ácido nucleico manipulada por la mano del hombre. Por ejemplo, en algunos aspectos, se puede construir una construcción de direccionamiento (o vector de direccionamiento) para que contenga un polinucleótido genomodificado o recombinante que contenga dos o más secuencias que no están unidas entre sí en ese orden en la naturaleza, pero que sean manipuladas por la mano del hombre para unirse directamente entre sí en el polinucleótido genomodificado o recombinante.
Transgén o construcción transgénica: se refiere a una secuencia de un ácido nucleico (que codifica, por ejemplo, un polipéptido de interés, en su totalidad o en parte) que se ha introducido en una célula por la mano del hombre, tal como por los métodos descritos en el presente documento. Un transgén puede ser parcial o totalmente heterólogo, es decir, exógeno, al animal o célula transgénicos en donde se introduce. Un transgén puede incluir una o más secuencias reguladoras de la transcripción y cualquier otro ácido nucleico, tal como intrones o promotores, que puede ser necesario para la expresión de una secuencia de un ácido nucleico seleccionada. Un transgén puede incluir uno o más marcadores seleccionables que permiten la selección posterior de la descendencia (por ejemplo, células) que han incorporado el transgén.
A nim al transgénico, anim al transgénico no hum ano o Tg+: se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier animal no humano de origen no natural en el que una o más de las células del animal no humano contienen un ácido nucleico y/o un gen heterólogos que codifica un polipéptido de interés, en su totalidad o en parte.
En algunos aspectos, se introduce una secuencia de un ácido nucleico y/o gen heterólogos en la célula, directa o indirectamente mediante introducción en una célula precursora, mediante manipulación genética deliberada, tal como por microinyección o por infección con un virus recombinante. La expresión manipulación genética no incluye las técnicas clásicas de reproducción, sino que está dirigido a la introducción de moléculas de ADN recombinante. Esta molécula puede estar integrada dentro de un cromosoma, o puede ser un ADN que se replica extracromosómicamente. La expresión "Tg+" incluye animales que son heterocigotos u homocigotos para un ácido nucleico y/o gen heterólogo, y/o animales que tienen copias únicas o múltiples de un ácido nucleico y/o gen heterólogo.
Vector de direccionam iento: se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar un ácido nucleico de interés al que está asociado, en particular para la inserción dirigida del ácido nucleico de interés en otra molécula de ácido nucleico, por ejemplo, plásmido donante, genoma de animales no humanos, etc.
En algún aspecto, los vectores son capaces de realizar la replicación y/o expresión extracromosómica de los ácidos nucleicos a los que están unidos en una célula hospedadora, tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en el presente documento "vectores de expresión" o "construcciones".
Tipo silvestre : tiene su significado entendido en la materia que se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad tal como se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto "normal" (en contraste con mutante, enfermo, genomodificado, alterado, etc.). Los expertos en la materia apreciarán que los genes y polipéptidos de tipo silvestre con frecuencia existen en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).
Otras características, objetivos y ventajas de la presente invención son evidentes en la descripción detallada de algunas realizaciones a continuación. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona solamente a modo de ilustración, no de limitación.
Descripción detallada
Aunque los tratamientos basados en anticuerpos son muy prometedoras para el tratamiento de varias enfermedades, el desarrollo de agentes anticuerpos especialmente eficaces que se unan a dianas resistentes al tratamiento sigue siendo un reto. En el presente documento se describen inmunoglobulinas (Ig) modificadas por anclaje y segmentos V de Ig modificados que las codifican, donde el anclaje comprende al menos la parte de unión al receptor de un ligando (por ejemplo, un polipéptido no inmunoglobulina) que se une a un receptor afín. Los animales que comprenden los segmentos V de Ig modificados pueden generar un repertorio diverso de inmunoglobulinas modificadas por anclaje en respuesta a la inmunización con un receptor afín al anclaje.
Sin pretender quedar ligados a teoría alguna, se cree que el anclaje actúa para aumentar la afinidad de un anticuerpo creado de novo en un animal en respuesta a la provocación antigénica con el receptor afín, por ejemplo, mediante la unión al receptor afín simultáneamente con un anticuerpo que se une específicamente al receptor afín y/o permitiendo la maduración por afinidad de aquellos anticuerpos que normalmente no se expandirían, sin el anclaje, en respuesta a una provocación antigénica con el receptor afín. En consecuencia, el diverso repertorio de inmunoglobulinas producidas por animales no humanos divulgado en el presente documento puede comprender inmunoglobulinas modificadas por anclaje que se unen al receptor afín con afinidad elevada, aumentando así la población de inmunoglobulinas a partir de las cuales puede descubrirse un candidato principal contra la diana previamente resistente al tratamiento.
M oléculas de ácidos nucleicos, inc lu idos los vectores de direccionam iento y los genom as animales, etc.
Puede codificarse una inmunoglobulina modificada por anclaje descrita en el presente documento, al menos en parte, mediante un segmento de región variable (V), por ejemplo, una región variable de cadena pesada (V<h>) de inmunoglobulina (Ig) o una región variable de cadena ligera (V<l>) de Ig, modificado para codificar el anclaje entre y en unión operativa con: una secuencia líder de Ig y las secuencias marco (FR) y de región determinante de la complementariedad (CDR) de un segmento V de Ig de la estirpe germinal. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los péptidos señal de la inmunoglobulina (Ig) y las secuencias de ácido nucleico de los segmentos V de la estirpe germinal, por ejemplo, segmentos V de la estirpe germinal humana, se conocen bien en la materia, como las secuencias de aminoácidos así codificadas. Véase, por ejemplo, Lefranc, M. P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) y el sitio web que se encuentra en la red mundial (www) en la dirección imgt.org.
Una molécula de ácido nucleico, incluidos los vectores diana, y los genomas animales descritos en el presente documento pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifique cualquier péptido señal de Ig de un segmento V de la estirpe germinal. En algunas realizaciones, un segmento V de Ig modificado comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de un primer segmento V de Ig de la estirpe germinal, una secuencia de ácido nucleico que codifica un anclaje y un ácido nucleico que codifica la región marco (FR) 1, la región determinante de la complementariedad (CDR)1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 de un segundo segmento V de Ig de la estirpe germinal, en donde el primer segmento V de Ig de la estirpe germinal y el segundo segmento V de Ig de la estirpe germinal son segmentos V de Ig de la estirpe germinal diferentes. En algunas realizaciones, un segmento V de Ig modificado comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de un primer segmento V de Ig de la estirpe germinal, una secuencia de ácido nucleico que codifica un anclaje y un ácido nucleico que codifica la región marco (FR) 1, la región determinante de la complementariedad (CDR)1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 de un segundo segmento V de Ig de la estirpe germinal, en donde el primer segmento V de Ig de la estirpe germinal y el segundo segmento V de Ig de la estirpe germinal son el mismo segmento V de Ig de la estirpe germinal. En algunas realizaciones, el péptido señal de Ig comprende la secuencia MDWTWRFLFVVAAATGVQS (SEQ ID NO: 7).
Las secuencias de aminoácidos de los segmentos V de la estirpe germinal humana (h) (por ejemplo, los segmentos de la cadena pesada variable de la estirpe germinal humana (hVH o MGVh), los segmentos variables kappa de la estirpe germinal humana (hVK o hIGKV) y los segmentos variables lambda de la estirpe germinal humana (hVA o hIGLV)) y los segmentos V de la estirpe germinal murina (m) (por ejemplo, segmentos de cadena pesada variable de la estirpe germinal de ratón (mVH oitiIGV<h>), los segmentos variables kappa de la estirpe germinal de ratón (mVK o mIGKV) y los segmentos variables lambda de la estirpe germinal de ratón (mVA o mIGLV)) pueden encontrarse en las direcciones de Internet (www) imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/SequenceLogos/human/ e imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/SequenceLogos/mouse/.
En algunas realizaciones, el segmento V de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo (por ejemplo, que codifica FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 de un segmento V de Ig modificado como se describe en el presente documento) es un segmento V de Ig de la estirpe germinal humana (h) o una variante del mismo, por ejemplo, un segmento Vh1-2 de la estirpe germinal humana (h), un segmento hVHl-3 de la estirpe germinal, un segmento Ii Vh1-8 de la estirpe germinal, un segmento hVHl-18 de la estirpe germinal, un segmento hVHl-24 de la estirpe germinal, un segmento hVH1-45 de la estirpe germinal, un segmento hVH1-46 de la estirpe germinal, un segmento hVH1-58 de la estirpe germinal, un segmento hVHl-69 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>2-5 de la estirpe germinal, un segmento hVH2-26 de la estirpe germinal, un segmento hVH2-70 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-7 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-9 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-11 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-13 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-15 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-16 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-20 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-21 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-23 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-30 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-30-3 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-30-5 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-33 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-35 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-38 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-43 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-48 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-49 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-53 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-64 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-66 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-72 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-73 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-74 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-4 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-28 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-30-1 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-30-2 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-30-4 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-31 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-34 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-39 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-59 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-61 de la estirpe germinal, un segmento hVH5-51 de la estirpe germinal, un segmento hVH6-1 de la estirpe germinal, un segmento hVH7-4-1 de la estirpe germinal, un segmento hVH7-81 de la estirpe germinal o variantes de los mismos. En algunas realizaciones, el segmento V de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo es un segmento hVH1-69 de la estirpe germinal o una variante del mismo.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende únicamente el segmento hVH de Ig modificado, por ejemplo, no comprende segmentos hVH adicionales ni variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende además, además del segmento hVH de Ig modificado, segmentos hVH adicionales, por ejemplo, uno de, más de uno de, o cada uno de, Vh1-2, hVHl-3, hVHl-8, hVHl-18, hVHl-24, hVHl-45, hVHl-46, hVHl-58, hVHl-69, hVH2-5, hVH2-26, hVH2-70, hVH3-7, hVH3-9, hVH3-11, hVH3-13, hVH3-15, hVH3-16, hVH3-20, hVH3-21, hVH3-23, hVH3-30, hVH3-30-3, hVH3-30-5, hVH3-33, hVH3-35, hVH3-38, hVH3-43, hVH3-48, hVH3-49, hVH3-53, hVH3-64, hVH3-66, hVH3-72, hVH3-73, hVH3-74, hVH4-4, hVH4-28, hVH4-30-1, hVH4-30-2, hVH4-30-4, hVH4-31, hVH4-34, hVH4-39, hVH4-59, hVH4-61, Ii Vh5-51, hVH6-1, hVH7-4-1, I<i>V<h>7-81 y variantes de los mismos. En algunas realizaciones que comprenden más de uno de, o cada uno de, los segmentos Vh1-2, hVHl-3, hVHl-8, hVHl-18, hVHl-24, hVHl-45, hVHl-46, hVHl-58, hVHl-69, hVH2-5, hVH2-26, hVH2-70, hVH3-7, hVH3-9, hVH3-11, hVH3-13, hVH3-15, hVH3-16, hVH3-20, hVH3-21, hVH3-23, hVH3-30, hVH3-30-3, hVH3-30-5, hVH3-33, hVH3-35, hVH3-38, hVH3-43, hVH3-48, hVH3-49, hVH3-53, hVH3-64, hVH3-66, hVH3-72, hVH3-73, hVH3-74, hVH4-4, hVH4-28, hVH4-30-1, hVH4-30-2, hVH4-30-4, hVH4-31, hVH4-34, hVH4-39, hVH4-59, hVH4-61, hVH5-51, hVH6-1, hVH7-4-1 y hVH7-81, los segmentos hVH están en configuración en línea germinal.
En algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento (por ejemplo, un vector de direccionamiento, un genoma animal no humano, etc.) puede comprender una región variable de cadena pesada de Ig, por ejemplo, puede comprender además del segmento V modificado por anclaje, segmentos génicos Vh, Dh y/o Jh (des)reordenados adicionales y, en algunos aspectos, segmentos génicos hVH, hDH y/o hJhH (des)reordenados adicionales. En algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un vector de direccionamiento, un genoma animal no humano, etc.) como se describe en el presente documento comprende un solo segmento hVH (des)reordenado, uno o más segmentos hDH (des)reordenados y uno o más segmentos hJH (des)reordenados, en donde el único segmento hVH (des)reordenado es un segmento hVH modificado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anclaje como se describe en el presente documento.
En algunos aspectos, el ácido nucleico recombinante (por ejemplo, un vector de direccionamiento, un genoma animal no humano, etc.) como se describe en el presente documento comprende uno o más segmentos D<h>humanos, por ejemplo, uno de, más de uno de, o cada uno de, Ii D<h>1-1, Ii D<h>1-7, Ii D<h>1-14, Ii D<h>1-20, Ii D<h>1-26, Ii D<h>2-2, Ii D<h>2-8, Ii D<h>2-15, hDH2-21, hDH3-3, Ii D<h>3-9, Ii D<h>3-10, Ii D<h>3-16, Ii D<h>3-22, Ii D<h>4-4, Ii D<h>4-11, Ii D<h>4-17, Ii D<h>4-23, Ii D<h>5-5, Ii D<h>5-12, hDH5-18, hDH5-24, Ii D<h>6-6, hDH6-13, hDH6-19, hDH6-25, Ii D<h>7-27 y variantes de los mismos. En algunos aspectos que comprenden más de uno de, o cada uno de, los Ii D<h>1-1, Ii D<h>1-7, Ii D<h>1-14, Ii D<h>1-20, hDH1-26, Ii D<h>2-2, hDH2-8, hDH2-15, hDH2-21, hDH3-3, Ii D<h>3-9, hDH3-10, hDH3-16, hDH3-22, hDH4-4, Ii D<h>4-11, hDH4-17, hDH4-23, hDH5-5, Ii D<h>5-12, hDH5-18, hDH5-24, hDH6-6, hDH6-13, Ii D<h>6-19, hDH6-25 y hDH7-27, los segmentos hDH están en configuración en línea germinal.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, un vector de direccionamiento, un genoma animal no humano, etc.) como se describe en el presente documento comprende uno o más segmentos J<h>humanos, por ejemplo, uno de, más de uno de, o cada uno de, W<h>1, W<h>2, M<h>3, M<h>4, M<h>5, M<h>6 y variantes de los mismos. En algunos aspectos que comprenden más de uno de, o cada uno de, los segmentos M<h>1, M<h>2, M<h>3, W<h>4, M<h>5, y M<h>6, los segmentos hJH están en configuración en línea germinal.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, un vector de direccionamiento, un genoma animal no humano, etc.) como se describe en el presente documento puede comprender un locus de región variable de cadena pesada, por ejemplo, puede comprender en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento V<h>de Ig modificado, (II) uno o una pluralidad de segmentos de diversidad de cadena pesada (D<h>) de Ig y (III) uno o una pluralidad de todos los segmentos de unión de cadena pesada (J<h>) de Ig. En algunas realizaciones, el uno o una pluralidad de segmentos D<h>de Ig de (II) comprende uno, una pluralidad de o todos los segmentos D<h>de Ig humanos, y/o el uno o una pluralidad de segmentos J<h>de Ig de (III) comprende uno, una pluralidad o todos los segmentos J<h>de Ig humanos. En algunas realizaciones, el uno o una pluralidad de segmentos D<h>de Ig de (II) y el uno o una pluralidad de segmentos génicos J<h>de Ig de (III) se recombinan y forman una secuencia reordenada D<h>/J<h>de Ig de manera que la molécula de ácido nucleico recombinante comprende en unión operativa y de 5' a 3': el segmento génico V<h>de Ig modificado y la secuencia D<h>/J<h>e Ig reordenada.
En algunas realizaciones, el segmento génico V<h>de Ig y la secuencia reordenada D<h>/J<h>de Ig se recombinan y forman una secuencia reordenada V<h>/D<h>/J<h>de Ig que codifica un dominio variable de cadena pesada de Ig modificado por anclaje, en donde el dominio variable de cadena pesada de Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa: (i) el péptido señal de Ig, (ii) el anclaje y (iii) la FR1, la región determinante de la complementariedad (CDR) 1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 codificadas por la secuencia reordenada V<h>/D<h>/J<h>de Ig.
En algunas realizaciones, el segmento V<h>de Ig modificado es un segmento génico V<h>de Ig modificado no reordenado.
En algunos aspectos, un ácido nucleico recombinante (e g., un vector de direccionamiento, un genoma animal no humano, etc.) como se describe en el presente documento comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada (C<h>) de Ig, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica una C<h>de Ig se encuentra cadena abajo de y operativamente unida a (I) el segmento V<h>de Ig modificado, (II) el uno o una pluralidad de segmentos D<h>de Ig y (III) el uno o una pluralidad de segmentos J<h>de Ig. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica una C<h>de Ig comprende un gen igg que codifica un isotipo de IgM, un gen ig5 que codifica un isotipo de IgD, un gen igY que codifica un isotipo de IgG, un gen iga que codifica un isotipo de IgA y/o un gen ige que codifica un isotipo de IgE. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de Ig modificada por anclaje, en donde la cadena pesada de Ig modificada por anclaje comprende en unión operativa: (i) el péptido señal de Ig, (ii) el anclaje, (iii) un dominio variable de cadena pesada de Ig que comprende FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 codificadas por una secuencia V<h>/D<h>/J<h>de Ig reordenada, y (iv) una C<h>de Ig. En algunas realizaciones, la C<h>de Ig es una C<h>de Ig no humana, por ejemplo, una C<h>de Ig de roedor, por ejemplo, una C<h>de Ig de rata o una C<h>de Ig de ratón.
En algunas realizaciones, el segmento V de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo (por ejemplo, que codifica FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 de un segmento V de Ig modificado como se describe en el presente documento) es un segmento de cadena ligera variable (V<l>) de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender un locus de la región variable de cadena ligera, por ejemplo, puede comprender en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento V<l>de Ig modificado y (II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera (J<l>) de Ig. En algunas realizaciones, el segmento V<l>de Ig modificado y uno o una pluralidad de segmentos J<l>de Ig se recombinan y forman una secuencia reordenada V<l>/J<l>de Ig que codifica un dominio variable de cadena ligera de Ig modificado por anclaje, en donde el dominio variable de cadena ligera de Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa: (i) el péptido señal de Ig, (ii) el anclaje y (iii) la FR1, CDR1, FR2, CDR2, f R3, CDr 3 y Fr 4 codificadas por la secuencia V<l>/J<l>de Ig reordenada. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender un locus de la región variable de cadena ligera y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera (C<l>) de Ig, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica una C<l>de Ig se encuentra cadena abajo de y operativamente unida a: (I) el segmento V<l>de Ig modificado y (II) el uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera (J<l>) de Ig. En algunas realizaciones, la cadena ligera de Ig modificada por anclaje comprende en unión operativa: (i) el péptido señal de Ig, (ii) el anclaje, (iii) un dominio variable de cadena ligera de Ig que comprende FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 codificados por una secuencia reordenada V<l>/J<l>de Ig, y (iv) una C<l>de Ig. En algunas realizaciones, la C<l>de Ig es una C<l>de Ig no humana, por ejemplo, una C<l>de Ig de roedor, por ejemplo, una C<l>de Ig de rata o una C<l>de Ig de ratón.
En algunas realizaciones, el segmento V de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo (por ejemplo, que codifica FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 de un segmento V de Ig modificado como se describe en el presente documento) es un segmento variable de cadena ligera kappa (Vk) de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo, por ejemplo, un segmento V<k>humano, por ejemplo, es un segmento hVKl-5, un segmento hVKl-6, un segmento hVKl-8, un segmento hVKlD-8, un segmento hVKl-9, un segmento hVKl-12, un segmento hVKlD-12, un segmento hVKl-13, un segmento hVKlD-13, un segmento hVKl-16, un segmento hVKlD-16, un segmento hVKl-17, un segmento hVKlD-17, un segmento hVKl-27, un segmento hVKl-33, un segmento hVKlD-33, un segmento hVK1-37, un segmento hVKlD-37, un segmento hVKl-39, un hVKlD-39, un segmento hVKl-NL1, un segmento hVKlD-42, un segmento hVKlD-43, un segmento hVK2-4, un segmento hVK2-18, un segmento hVK2D-18, un segmento hVK2-24, un segmento hVk2D-24, un segmento hVk2-28, un segmento hVk2D-28, un segmento hVk2-29, un segmento hVk2D-29, un segmento hVk2-30, un segmento hVk2D-30, un segmento hVk2-40, un segmento hVk2D-40, un segmento hVK2D-26, un segmento hVK3-7, un segmento hVK3D-7, un segmento hVK3-11, un segmento hVK3D-11, un segmento hVK3-15, un segmento hVK3D-15, un segmento hVK3-20, un segmento hVK3D-20, un segmento hVK4-1, un segmento hVK5-2, un segmento hVK6-21, un segmento hVK6D-21, un segmento hVK6D-41, un segmento hVK7-3 y variantes de los mismos. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende además, además del segmento hVk de Ig modificado, segmentos hVk adicionales, por ejemplo, uno de, más de uno de, o cada uno de un segmento hVKlD-8, un segmento hVKl-9, un segmento hVKl-l2, un segmento hVKlD-12, un segmento hVKl-13, un segmento hVKlD-13, un segmento hVKl-16, un segmento hVKlD-16, un segmento hVK1-17, un segmento hVK1D-17, un segmento hVK1-27, un segmento hVK1-33, un segmento hVK1D-33, un segmento hVK1-37, un segmento hVK1D-37, un segmento hVK1-39, un hVK1D-39, un segmento hVK1-NL1, un segmento hVK1D-42, un segmento hVK1D-43, un segmento hVK2-4, un segmento hVK2-18, un segmento hVK2D-18, un segmento hVK2-24, un segmento hVK2D-24, un segmento hVK2-28, un segmento hVK2D-28, un segmento hVK2-29, un segmento hVK2D-29, un segmento hVK2-30, un segmento hVK2D-30, un segmento hVK2-40, un segmento hVK2D-40, un segmento hVK2D-26, un segmento hVK3-7, un segmento hVK3D-7, un segmento hVK3-11, un segmento hVK3D-11, un segmento hVK3-15, un segmento hVK3D-15, un segmento hVK3-20, un segmento hVK3D-20, un segmento hVK4-1, un segmento hVK5-2, un segmento hVK6-21 y un segmento hVK6D-21. En algunas realizaciones que comprenden más de uno de, o cada uno de, un segmento hVK1D-8, un segmento hVK1-9, un segmento hVK1-12, un segmento hVK1D-12, un segmento hVK1-13, un segmento hVK1D-13, un segmento hVK1-16, un segmento hVK1D-16, un segmento hVK1-17, un segmento hVK1D-17, un segmento hVK1-27, un segmento hVK1-33, un segmento hVK1D-33, un segmento hVK1-37, un segmento hVK1D-37, un segmento hVK1-39, un hVK1D-39, un segmento hVK1-NL1, un segmento hVK1D-42, un segmento hVK1D-43, un segmento hVK2-4, un segmento hVK2-18, un segmento hVK2D-18, un segmento hVK2-24, un segmento hVK2D-24, un segmento hVK2-28, un segmento hVK2D-28, un segmento hVK2-29, un segmento hVK2D-29, un segmento hVK2-30, un segmento hVK2D-30, un segmento hVK2-40, un segmento hVK2D-40, un segmento hVK2D-26, un segmento hVK3-7, un segmento hVK3D-7, un segmento hVK3-11, un segmento hVK3D-11, un segmento hVK3-15, un segmento hVK3D-15, un segmento hVK3-20, un segmento hVK3D-20, un segmento hVK4-1, un segmento hVK5-2, un segmento hVK6-21 y un segmento hVK6D-21, los segmentos hVK están en configuración en línea germinal.
En algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento (por ejemplo, un vector de direccionamiento, un genoma animal no humano, etc.) puede comprender una región variable de cadena ligera K de Ig, por ejemplo, puede comprender además del segmento hVK modificado por anclaje, segmentos Jk adicionales (des)reordenados y, en algunos aspectos, segmentos génicos hJK (des)reordenados adicionales. En consecuencia, en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento Vk de Ig modificado y (II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera kappa J<k>de Ig. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, un vector de direccionamiento, un genoma animal no humano, etc.) como se describe en el presente documento comprende uno o más segmentos J<k>humanos, por ejemplo, uno de, más de uno de, o cada uno de, hJK1, hJK2, hJK3, hJK4, hJK5 y variantes de los mismos. En algunas realizaciones que comprenden más de uno de, o cada uno de, los segmentos hJK1, hJK2, hJK3, hJK4, hJK5, los segmentos hJK están en configuración en línea germinal.
De manera adicional, en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento V<k>de Ig modificado y (II) una o una pluralidad de uniones de cadena ligera kappa (Jk) de Ig y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera kappa (Ck) de Ig.
En algunas realizaciones, el segmento V de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo (por ejemplo, que codifica FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 de un segmento V de Ig modificado como se describe en el presente documento) es un segmento variable de cadena ligera lambda (VA) de Ig germinal o una variante del mismo, por ejemplo, un segmento VA humano, por ejemplo, un segmento hVA1-36, un segmento hVA1-40, un segmento hVA1-41, un segmento hVA1-44, un segmento hVA1-47, un segmento hVA1-50, un segmento hVA1-51, un segmento hVA1-62, un segmento hVA2-5, un segmento hVA2-8, un segmento hVA2-11, un segmento hVA2-14, un segmento hVA2-18, un segmento hVA2-23, un segmento hVA2-33, un segmento hVA2-34, un segmento hVA3-1, un segmento hVA3-9, un segmento hVA3-10, un segmento hVA3-12, un segmento hVA3-13, un segmento hVA3-16, un segmento hVA3-19, un segmento hVA3-21, un segmento hVA3-22, un segmento hVA3-25, un segmento hVA3-27, un segmento hVA3-31, un segmento hVA3-32, un segmento hVA4-3, un segmento hVA4-60, un segmento hVA4-69, un segmento hVA5-37, un segmento hVA5-39, un segmento hVA5-45, un segmento hVA5-48, un segmento hVA5-52, un segmento hVA6-57, un segmento hVA7-43, un segmento hVA7-46, un segmento hVA8-61, un segmento hVA9-49, un segmento hVA10-54, un segmento hVA11-55 y variantes de los mismos. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende además, además del segmento hVA de Ig modificado, segmentos hVA adicionales, por ejemplo, uno de, más de uno de, o cada uno de un segmento hVA1-36, un segmento hVA1-40, un segmento hVA1-41, un segmento hVA1-44, un segmento hVA1-47, un segmento hVA1-50, un segmento hVA1-51, un segmento hVA1-62, un segmento hVA2-5, un segmento hVA2-8, un segmento hVA2-11, un segmento hVA2-14, un segmento hVA2-18, un segmento hVA2-23, un segmento hVA2-33, un segmento hVA2-34, un segmento hVA3-1, un segmento hVA3-9, un segmento hVA3-10, un segmento hVA3-12, un segmento hVA3-13, un segmento hVA3-16, un segmento hVA3-19, un segmento hVA3-21, un segmento hVA3-22, un segmento hVA3-25, un segmento hVA3-27, un segmento hVA3-31, un segmento hVA3-32, un segmento hVA4-3, un segmento hVA4-60, un segmento hVA4-69, un segmento hVA5-37, un segmento hVA5-39, un segmento hVA5-45, un segmento hVA5-48, un segmento hVA5-52, un segmento hVA6-57, un segmento hVA7-43, un segmento hVA7-46, un segmento hVA8-61, un segmento hVA9-49, un segmento hVA10-54 y un segmento hVA11-55. En algunas realizaciones que comprenden más de uno de, o cada uno de, un segmento hVAl-36, un segmento hVA1-40, un segmento hVA1-41, un segmento hVA1-44, un segmento hVA1-47, un segmento hVA1-50, un segmento hVA1-51, un segmento hVA1-62, un segmento hVA2-5, un segmento hVA2-8, un segmento hVA2-11, un segmento hVA2-14, un segmento hVA2-18, un segmento hVA2-23, un segmento hVA2-33, un segmento hVA2-34, un segmento hVA3-1, un segmento hVA3-9, un segmento hVA3-10, un segmento hVA3-12, un segmento hVA3-13, un segmento hVA3-16, un segmento hVA3-19, un segmento hVA3-21, un segmento hVA3-22, un segmento hVA3-25, un segmento hVA3-27, un segmento hVA3-31, un segmento hVA3-32, un segmento hVA4-3, un segmento hVA4-60, un segmento hVA4-69, un segmento hVA5-37, un segmento hVA5-39, un segmento hVA5-45, un segmento hVA5-48, un segmento hVA5-52, un segmento hVA6-57, un segmento hVA7-43, un segmento hVA7-46, un segmento hVA8-61, un segmento hVA9-49, un segmento hVA10-54, un segmento hVA11-55, los segmentos hVA están en configuración en línea germinal.
En algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento (por ejemplo, un vector de direccionamiento, un genoma animal no humano, etc.) puede comprender una región variable de cadena ligera A de Ig, por ejemplo, puede comprender además del segmento hVA modificado por anclaje, segmentos JA adicionales (des)reordenados y, en algunos aspectos, segmentos génicos hJA (des)reordenados adicionales. En consecuencia, en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento VA de Ig modificado y (II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera kappa JA de Ig. En algunos aspectos, el ácido nucleico recombinante (por ejemplo, un vector de direccionamiento, un genoma animal no humano, etc.) como se describe en el presente documento comprende uno o más segmentos JA humanos, por ejemplo, uno de, más de uno de, o cada uno de, los segmentos hJAl, hJA2, hJA3, hJA4, hJA5, hJA6, hJA7 y variantes de los mismos. En algunas realizaciones que comprenden más de uno de, o cada uno de, los segmentos hJA1, hJA2, hJA3, hJA4, hJA5, hJA6, hJA7, los segmentos hJA están en configuración en línea germinal. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende en unión operativa y de 5' a 3': (I) el segmento VA de Ig modificado, (II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera lambda (JA) de Ig, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera lambda (CA) de Ig.
Anclajes
Como se describe en el presente documento, los anclajes comprenden ligandos (o partes de los mismos) que se unen a receptores afines. En consecuencia, como se describe en el presente documento, un anclaje puede comprender un polipéptido no inmunoglobulina, por ejemplo, una parte de unión al receptor del polipéptido no inmunoglobulina. Las modificaciones por anclaje descritas en el presente documento pueden ser útiles para aumentar la afinidad de las proteínas de unión a antígenos, por ejemplo, anticuerpos, a receptores resistentes al tratamiento.
Los pares de polipéptidos no inmunoglobulina:receptores afines ilustrativos y bien conocidos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, aquellos polipéptidos no inmunoglobulina que se unen a receptores acoplados a proteínas G (GPCR, del inglés G-protein coupled receptors) afines. Los GPCR ilustrativos incluyen, pero sin limitación, receptores de quimiocinas, receptores de glucagón (por ejemplo, GLPEGLP1R), receptores de calcitonina, receptores de melanocortina. Estos y otros GPCR afines, incluidos los polipéptidos no inmunoglobulina que se unen a los mismos, se conocen bien en la materia. Véase, por ejemplo, Wu et al. (2017) J. Mol. Biol. 429:2726-45. Otros pares no limitantes e ilustrativos de polipéptidos no inmunoglobulina (ligando):receptores afines incluyen
a. ligandos que se unen a receptores tirosina quinasas afines, por ejemplo, ligandos tales como, pero sin limitación, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), insulina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), etc. b. pares de receptores DLL:Notch,
c. pares de receptores B7:CD28/C<l>TA4/PD1,
d. pares de receptores de semaforimplexina,
e. pares PCSK9/LDLR,
f. pares HLA:LILR,
g. pares HLA:KIR,
h. pares RGD-ligando:integrina,
i. pares de péptidos natriuréticos (por ejemplo, ANP, BNP, CNP, etc.):receptores de péptidos natriuréticos (NPR, NPR3, etc.), etc.
Un par ligando:receptor puede incluir proteasas e inhibidores.
En algunas realizaciones, el anclaje comprende un péptido natriurético (NP), por ejemplo, una parte de unión al receptor de una NP. Los NP comprenden al menos ocho péptidos de aminoácidos estructuralmente relacionados, almacenados como tres prohormonas diferentes: prohormona del péptido natriurético auricular (ANP), prohormona del péptido natriurético de tipo B (BNP) y prohormona del péptido natriurético de tipo C (CNP). El péptido natriurético de dendroaspis, un péptido natriurético de tipo D (DNP), se ha descubierto recientemente, cuya función en el ser humano sigue sin estar clara.
La prohormona ANP (proANP) es un polipéptido de 126 aminoácidos que se expresa principalmente en los cardiomiocitos y da lugar a varios péptidos con propiedades hipotensoras, propiedades natriuréticas, propiedades diuréticas y/o propiedades kaliuréticas. Estos péptidos procedentes de la prohormona ANP se identifican por sus secuencias de aminoácidos que comienzan en el extremo aminoterminal de la prohormona ANP: por ejemplo, proANP 1-30 comprende un NP de acción prolongada, proANP 31-67 comprende un dilatador de vasos, proANP 79-98 comprende un péptido kaliurético y los aminoácidos 99-126 (también denominada ANP), entre otros. Dentro del riñón, proANP se procesa de forma diferente, lo que da lugar a la adición de cuatro aminoácidos adicionales al extremo N, por ejemplo, proANP 95-126 (también denominada urodilatina).
La prohormona BNP (proBNP) es un polipéptido de 108 aminoácidos, que también se expresa principalmente en los cardiomiocitos. La prohormona BNP se procesa en el corazón humano para formar BNP (por ejemplo, los aminoácidos 77-108 de su prohormona de 108 aminoácidos), y NT-proBNP (por ejemplo, los aminoácidos 1-76, que circulan en los seres humanos. BNP es un biomarcador fiable de la dilatación ventricular. Pandit et al. (2011) Ind. J. Endocrino!. Metab. 15(4) S345-53.
A diferencia de ANP y BNP, CNP se expresa principalmente en las células endoteliales y epiteliales renales. Se han identificado dos moléculas CNP en la circulación. También, aunque CNP parece carecer de función natriurética, es probable que CNP actúe como regulador del tono vascular y del crecimiento de forma paracrina o autocrina, y existen indicios de que puede desempeñar un papel en el crecimiento óseo.
Las NP ejercen sus funciones biológicas mediante la unión específica a receptores de la superficie celular. Se han identificado tres receptores específicos en tejidos de mamíferos: dos receptores acoplados a la guanililciclasa (GC-A y GC-B, también denominados receptores de NP (NPR)-A y NPR-B, respectivamente). NPR-A y NPR-B actúan a través de la activación de la cascada de señalización dependiente de GMPc. En cambio, el tercer receptor de tipo C (también denominado NPR-C) no está acoplado a la guanililciclasa y parece estar implicado principalmente en el aclaramiento de las NP. Los tres receptores se unen ANP, BNP y CNP con afinidades diferentes. El orden de selectividad del ligando para GC-A es ANP > BNP >> CNP, para GC-B es CNP >> ANP > BNP, y para NPR-C es ANP > CNP > BNP. Jaubert et al. (1999) PNAS 96(18) 10278-283.
Los receptores de NP pueden ser dianas útiles para el tratamiento de la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, mientras que ANP y BNP tienen importantes propiedades diuréticas, natriuréticas e hipotensoras, CNP puede desempeñar un papel en el crecimiento óseo. De esta manera, todo direccionamiento de los receptores de Np basada en anticuerpos debe tener en cuenta las afinidades de unión diferenciales de los receptores a las NP.
En algunas realizaciones, el anclaje comprende la secuencia ANP o una parte de la misma. Una secuencia de ácido nucleico que codifica ANP humana se establece como el número de registro de NCBI NM_006172.4 y la SEQ ID NO: 1 en el presente documento. Una secuencia de aminoácidos de ANP humana se establece como el número de registro de NCBI NP_006163 y la SEQ ID NO: 2 en el presente documento. En algunas realizaciones, el anclaje descrito en el presente documento comprende la parte de unión al receptor de ANP, por ejemplo, la cola carboxiterminal de ANP. En algunas realizaciones, la parte de unión al receptor de ANP comprende la secuencia de aminoácidos NSFRY (SEQ ID NO: 3).
Enlazadores
En algunas realizaciones, el anclaje comprende un enlazador que une la parte de unión al receptor de un polipéptido no inmunoglobulina de interés a la FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento V de Ig de la estirpe germinal o una variante del mismo. En algunas realizaciones, el enlazador puede tener un aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador puede tener dos aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador puede tener tres aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador puede tener cuatro aminoácidos de longitud, por ejemplo, el enlazador puede comprender la secuencia GLSG (SEQ ID NO: 13). En algunas realizaciones, el enlazador puede tener cinco aminoácidos de longitud, por ejemplo, puede comprender la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 5). I En algunas realizaciones, el enlazador puede tener seis aminoácidos de longitud, por ejemplo, puede comprender una secuencia de GLSGSG (SEQ ID NO: 14). En algunas realizaciones, el enlazador puede tener siete aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender una secuencia de GLSGLSGS (SEQ ID NO: 15). En algunas realizaciones, el enlazador puede tener nueve aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador puede tener diez aminoácidos de longitud, por ejemplo, puede comprender una secuencia de GLSGLSGLSG (SEQ<i>D NO: 16) o GLSGGSGLSG (SEQ ID NO: 17). En algunas realizaciones, el primer y el segundo enlazador son idénticos en longitud, y tienen cada uno más de diez aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento comprende la secuencia establecida como SEQ ID NO: 8 o una variante degenerada de la misma, o la secuencia establecida como SEQ ID NO: 10 o una variante degenerada de la misma.
Vectores de direccionamiento
Además se describen vectores de direccionamiento para emplearse en los métodos para la producción de los animales no humanos, células, tejidos o embriones genéticamente modificados proporcionados en el presente documento.
En un aspecto, se describe un vector de direccionamiento que comprende un ácido nucleico de inserción, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V de Ig modificado como se describe en el presente documento, flanqueado por brazos de homología en 5' y 3' que pueden sufrir recombinación homóloga con un locus de interés, por ejemplo, un locus de región variable de cadena pesada o ligera de Ig. Los vectores de direccionamiento y los ejemplos de los componentes de los vectores de direccionamiento (es decir, ácidos nucleicos insertos, polinucleótidos de interés, casetes de expresión, etc.) se describen a continuación en detalle en el presente documento.
Un brazo de homología y un sitio diana (es decir, región genómica afín) son "complemento" o son "complementarios" entre sí cuando las dos regiones comparten un nivel suficiente de identidad de secuencia entre sí para actuar como sustratos para una reacción de recombinación homóloga. Por "homología" se quiere decir secuencias de ADN que son o bien idénticas o comparten identidad de secuencia con una secuencia correspondiente o "complementaria". La identidad de secuencia entre una secuencia diana dada y el brazo de homología correspondiente que se encuentra en un vector de direccionamiento puede ser cualquier grado de identidad de secuencia que permita que se produzca la recombinación homóloga. Por ejemplo, la cantidad de identidad de secuencia compartida por el brazo de homología del vector de direccionamiento (o un fragmento del mismo) y el sitio diana (o un fragmento del mismo) puede ser de al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, de manera que las secuencias experimenten una recombinación homóloga. Así mismo, una región complementaria de homología entre el brazo de homología y el sitio diana complementario puede ser de cualquier longitud que sea suficiente para promover la recombinación homóloga en el sitio de reconocimiento sometido a escisión. Por ejemplo, un brazo de homología dado y/o sitio diana complementario puede comprender regiones complementarias de homología que tienen al menos 5-10 kb, 5-15 kb, 10-20 kb, 20-30 kb, 30-40 kb, 40-50 kb, 50-60 kb, 60-70 kb, 70-80 kb, 80-90 kb, 90 100 kb, 100-110 kb, 110-120 kb, 120-130 kb, 130-140 kb, 140-150 kb, 150-160 kb, 160-170 kb, 170-180 kb, 180 190 kb, 190-200 kb, 200 kb a 300 kb de longitud o más (tal como se describe en los vectores descritos en otras partes en el presente documento) de modo que el brazo de homología tenga suficiente homología para experimentar recombinación homóloga con los correspondientes sitios diana dentro del genoma de la célula. Para facilitar la referencia los brazos de homología se refieren en el presente documento como un brazo de homología en 5' y uno en 3'. Esta terminología se refiere a la posición relativa de los brazos de homología respecto a un ácido nucleico inserto dentro del vector de direccionamiento.
Por lo tanto, los brazos de homología del vector de direccionamiento están diseñados para ser complementarios a un sitio diana con el locus dirigido. Por tanto, los brazos de homología pueden ser complementarios a un locus que es natural de la célula, o alternativamente pueden ser complementarios a una región de un segmento heterólogo o exógeno de ADN que se integró en el genoma de la célula, incluidos, pero sin limitación, transgenes, casetes de expresión, o regiones heterólogas o exógenas de ADN genómico. Como alternativa, los brazos de homología del vector de direccionamiento pueden ser complementarios a una región de un cromosoma artificial humano o cualquier otra región genómica genomodificada contenida en una célula hospedadora apropiada. Aun adicionalmente, los brazos de homología de un vector de direccionamiento pueden ser complementarios o proceder de una región de una genoteca de BAC, una genoteca de cósmidos o una genoteca de fagos PI. Por tanto, en aspectos específicos, los brazos de homología del vector de direccionamiento son complementarios a un locus genómico de eucariota, no de ser humano, mamífero, mamífero no humano, ser humano, roedor, ratón o rata que sea natural, heterólogo o exógeno de una célula dada. En un aspecto, los brazos de homología proceden de un ADN sintético.
En algunas realizaciones de vectores de direccionamiento, el vector de direccionamiento comprende además brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena pesada de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, el locus de la cadena pesada de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<h>de Ig modificado y, opcionalmente, segmentos D<h>y/o J<h>de Ig) cadena arriba de y en unión operativa con una C<h>de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano es un locus de la cadena pesada de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de segmentos génicos V<h>, D<h>y/o J<h>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento V<h>no humano en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a uno o más segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos D<h>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos VH no humanos menos uno o todos los segmentos VH no humanos, todos los segmentos D<h>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, el locus de la cadena pesada de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena pesada de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano.
En algunas realizaciones, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena pesada de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, el locus de la cadena pesada de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<h>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) D<h>de Ig), segmento(s) J<h>de Ig y/o gen(es) de C<h>de Ig) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena pesada de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano es un la locus de la cadena pesada de Ig de roedor endógeno en un roedor o célula de roedor (por ejemplo, una célula madre embrionaria de roedor) y/o en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<h>, D<h>y/o J<h>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, y opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a uno o más segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos génicos D<h>no humanos, todos los segmentos génicos JH no humanos y uno o más genes de CH no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano.
En algunas realizaciones, el brazo de homología en 5' comprende una secuencia establecida como SEQ ID NO: 12 y/o el brazo de homología en 3' comprende una secuencia establecida como SEQ ID NO: 13.
En algunas realizaciones de vectores de direccionamiento, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, el locus de la cadena ligera de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<l>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) J<l>de Ig como se describe en el presente documento) cadena arriba de y en unión operativa con una C<l>de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano es un locus de la cadena ligera de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<l>y/o J<l>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento V<l>no humano en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos V<l>no humanos y todos los segmentos J<l>no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<l>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, el locus de la cadena ligera de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig.
En algunas realizaciones, el vector de direccionamiento descrito en el presente documento comprende una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, el locus de la cadena ligera de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<l>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) J<l>de Ig y/o un gen de C<l>de Ig como se describe en el presente documento) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano es un locus de la cadena ligera de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<l>y/o J<l>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, y opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos V<l>no humanos, todos los segmentos génicos J<l>no humanos y el gen de C<l>no humano en el locus de la cadena ligera de Ig no humano.
En algunas realizaciones de vectores de direccionamiento, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera k de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, el locus de la cadena ligera de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<k>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) J<k>de Ig como se describe en el presente documento) cadena arriba de y en unión operativa con una Ck de Ig no humana en el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano es un locus de la cadena ligera k de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera k de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<k>y/o J<k>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento Vk no humano en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos V<k>no humanos y todos los segmentos Jk no humanos en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos Vk no humanos y todos los segmentos Jk no humanos en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, el locus de la cadena ligera k de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera k de Ig no humana en el locus de la cadena ligera k de Ig.
En algunas realizaciones de vectores de direccionamiento, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera k de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<k>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) J<k>de Ig y/o un gen de C<k>de Ig como se describe en el presente documento) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera k de Ig no humana en el locus de la cadena ligera k de Ig, opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos V<k>no humanos, todos los segmentos génicos J<k>no humanos y el gen de Ck no humano en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano.
En algunas realizaciones de vectores de direccionamiento, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera A de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento VA de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) JA de Ig) cadena arriba de y en unión operativa con una CA de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera A de Ig no humano es un locus de la cadena ligera A de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera A de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos VA y/o JA de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento VA no humano en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos VA no humanos y todos los segmentos JA no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos VA no humanos y todos los segmentos JA no humanos en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera A de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig.
En algunas realizaciones, el vector de direccionamiento comprende la molécula de ácido nucleico recombinante como se describe en el presente documento y brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera A de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento VA de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) JA de Ig y/o un gen de CA de Ig como se describe en el presente documento) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera A de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos VA no humanos, todos los segmentos génicos JA no humanos y el gen de CA no humano en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano.
En algunas realizaciones, el vector de direccionamiento como se describe en el presente documento puede comprender además una secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias diana de recombinación específicas de sitio. Se reconoce que cualquier región o polinucleótido individual de interés dentro del vector de direccionamiento también puede estar flanqueado por dichos sitios. La recombinasa específica de sitio puede introducirse en la célula por cualquier medio, incluida la introducción del polipéptido de recombinasa en la célula o mediante introducción de un polinucleótido que codifica la recombinasa específica de sitio en la célula hospedadora. El polinucleótido que codifica la recombinasa específica de sitio puede estar ubicado dentro del vector de direccionamiento o dentro de un polinucleótido separado. La recombinasa específica de sitio puede unirse operativamente a un promotor activo en la célula incluyendo, por ejemplo, un promotor inducible, un promotor que es endógeno a la célula, un promotor que es heterólogo a la célula, un promotor específico de célula, un promotor específico de tejido o un promotor específico del estado de desarrollo. Las secuencias diana de recombinación específica de sitio, que pueden flanquear la secuencia nucleotídica o cualquier polinucleótido de interés en el vector de direccionamiento pueden incluir, pero sin limitación, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, los sitios de recombinación específicos flanquean un polinucleótido que codifica un marcador de selección dentro del vector de direccionamiento. En dichos casos, tras la integración del vector de direccionamiento en el locus diana, se pueden eliminar las secuencias nucleotídicas entre los sitios de recombinación específicos.
En algunas realizaciones, el vector de direccionamiento descrito en el presente documento comprende un marcador de selección, que puede estar contenido en un casete de selección. Dichos marcadores de selección incluyen, pero sin limitación, neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (puror), blasticidina S desaminasa (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferasa (gpt), o timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-k), o una combinación de los mismos. En una realización, el polinucleótido que codifica el marcador de selección está unido operativamente a un promotor activo en la célula. En una realización, el polinucleótido que codifica el marcador de selección está flanqueado con secuencias diana de recombinación específica de sitio.
Genomas de animales no humanos
También se describen en el presente documento genomas de animales no humanos que comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante y/o el vector de orientación descritos en el presente documento. En algunos aspectos genómicos de animales no humanos, el genoma del animal no humano comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento en un locus de Ig endógeno del genoma del animal no humano, por ejemplo, el genoma del animal no humano comprende el vector de direccionamiento descrito en el presente documento, en donde el vector de direccionamiento comprende brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen al locus de Ig endógeno. En algunos aspectos, el genoma de un animal no humano es el de un roedor. En algunos aspectos, el genoma de un animal no humano es el de una rata. En algunos aspectos, el genoma de un animal no humano es el genoma de un ratón.
En aspectos del genoma de animales no humanos, el genoma comprende un locus de la cadena pesada de Ig no humano que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<h>de Ig modificado y, opcionalmente, segmentos D<h>de Ig y/o J<h>de Ig) cadena arriba de y en unión operativa con una C<h>de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano es un locus de la cadena pesada de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de segmentos génicos V<h>, D<h>y/o J<h>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento V<h>no humano en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a uno o más segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos D<h>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<h>no humanos menos uno o todos los segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos D<h>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante está en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena pesada de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano.
En algunos aspectos, el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<h>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) D<h>de Ig), segmento(s) J<h>de Ig y/o gen(es) de C<h>de Ig) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena pesada de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano es un la locus de la cadena pesada de Ig de roedor endógeno en un roedor o célula de roedor (por ejemplo, una célula madre embrionaria de roedor) y/o en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de segmentos génicos V<h>, D<h>y/o J<h>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, y opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a uno o más segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos génicos D<h>no humanos, todos los segmentos génicos J<h>no humanos y uno o más genes de CH no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano.
En aspectos del genoma de animales no humanos, el genoma comprende un locus de la cadena ligera de Ig no humano que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<l>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) J<l>de Ig como se describe en el presente documento) cadena arriba de y en unión operativa con una C<l>de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano es un locus de la cadena ligera de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<l>y/o J<l>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento V<l>no humano en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos V<l>no humanos y todos los segmentos J<l>no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<l>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante está en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig.
En aspectos del genoma de animales no humanos, el locus de la cadena ligera de Ig comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<l>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) J<l>de Ig y/o un gen de C<l>de Ig como se describe en el presente documento) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano es un locus de la cadena ligera de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de segmentos génicos V<l>y/o J<l>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, y opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos V<l>no humanos, todos los segmentos génicos J<l>no humanos y el gen de CL no humano en el locus de la cadena ligera de Ig no humano.
En aspectos del genoma de animales no humanos, el genoma comprende un locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento Vk de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) Jk de Ig como se describe en el presente documento) cadena arriba de y en unión operativa con una C<k>de Ig no humana en el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano es un locus de la cadena ligera k de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera k de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<k>y/o J<k>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento Vk no humano en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos V<k>no humanos y todos los segmentos Jk no humanos en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<k>no humanos y todos los segmentos Jk no humanos en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante está en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera<k>de Ig no humana en el locus de la cadena ligera<k>de Ig.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento Vk de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) Jk de Ig y/o un gen de C<k>de Ig como se describe en el presente documento) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera<k>de Ig no humana en el locus de la cadena ligera<k>de Ig, opcionalmente, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos Vk no humanos, todos los segmentos génicos Jk no humanos y el gen de Ck no humano en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano.
En aspectos del genoma de animales no humanos, el genoma comprende un locus de la cadena ligera A de Ig no humano que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento VA de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) JA de Ig) cadena arriba de y en unión operativa con una CA de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera A de Ig no humano es un locus de la cadena ligera A de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera A de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos VA y/o JA de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento VA no humano en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos VA no humanos y todos los segmentos JA no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunos aspectos, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos VA no humanos y todos los segmentos JA no humanos en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante está en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera A de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig.
En algunos aspectos genómicos de animales no humanos, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento VA de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) JA de Ig y/o un gen de CA de Ig como se describe en el presente documento) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera A de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos VA no humanos, todos los segmentos génicos JA no humanos y el gen de CA no humano en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano.
Células anim ales no humanas, anim ales no hum anos y m étodos de elaboración de los m ism os
Animales no humanos y células animales no humanas
Se describen animales no humanos y células animales no humanas que expresan inmunoglobulinas modificadas por anclaje, por ejemplo, de loci de Ig modificados para comprender la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento que comprende un segmento V de Ig modificado, por ejemplo, una región variable de cadena pesada (V<h>) de Ig o una región variable de cadena ligera (V<l>) de Ig, modificado para codificar el anclaje entre y en unión operativa con: una secuencia líder de Ig, y las secuencias marco (FR) y de región determinante de la complementariedad (CDR) de un segmento V de la estirpe germinal. Por tanto, se describen animales no humanos, embriones, células que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinante, construcciones de direccionamiento y/o genomas animales descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones de animales no humanos o células animales no humanas, el animal o la célula no humanos comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento (que comprende un segmento V de Ig modificado, por ejemplo, una región variable de cadena pesada (V<h>) de Ig o una región variable de cadena ligera (V<l>) de Ig, modificado para codificar el anclaje entre y en unión operativa con: una secuencia líder de Ig, y las secuencias marco (FR) y de región determinante de la complementariedad (CDR) de un segmento V de la estirpe germinal) ubicada aleatoriamente en el genoma del animal. En algunas realizaciones, el animal no humano comprende la molécula de ácido nucleico recombinante descrita en el presente documento (que comprende un segmento V de Ig modificado, por ejemplo, una región variable de cadena pesada (V<h>) de Ig o una región variable de cadena ligera (V<l>) de Ig, modificado para codificar el anclaje entre y en unión operativa con: una secuencia líder de Ig, y las secuencias marco (FR) y de región determinante de la complementariedad (CDR) de un segmento V de la estirpe germinal) en un locus de Ig endógeno del animal no humano, por ejemplo, el animal no humano comprende el vector de direccionamiento descrito en el presente documento, en donde el vector de direccionamiento comprende brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen al locus de Ig endógeno. De acuerdo con la invención, el animal no humano es un roedor. En algunas realizaciones, la célula animal no humana es una célula de roedor. En algunas realizaciones, el animal no humano es una rata. En algunas realizaciones, la célula animal no humana es una célula de rata. En algunas realizaciones, el animal no humano es un ratón. En algunas realizaciones, la célula animal no humana es una célula de ratón.
En realizaciones, los animales no humanos o la célula animal no humana comprende un locus de la cadena pesada de Ig no humano que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<h>de Ig modificado y, opcionalmente, segmentos D<h>de Ig y/o J<h>de Ig) cadena arriba de y en unión operativa con una C<h>de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano es un locus de la cadena pesada de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de segmentos génicos V<h>, D<h>y/o J<h>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento V<h>no humano en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a uno o más segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos D<h>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<h>no humanos menos uno o todos los segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos D<h>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante está en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena pesada de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano.
En algunas realizaciones, el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<h>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) D<h>de Ig), segmento(s) J<h>de Ig y/o gen(es) de C<h>de Ig) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena pesada de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano es un la locus de la cadena pesada de Ig de roedor endógeno en un roedor o célula de roedor (por ejemplo, una célula madre embrionaria de roedor) y/o en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de segmentos génicos V<h>, D<h>y/o J<h>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, y opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a uno o más segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos génicos D<h>no humanos, todos los segmentos génicos J<h>no humanos y uno o más genes de CH no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano.
En algunas realizaciones, los animales no humanos o la célula animal no humana comprende un locus de la cadena ligera de Ig no humano que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<l>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) J<l>de Ig como se describe en el presente documento) cadena arriba de y en unión operativa con una C<l>de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano es un locus de la cadena ligera de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<l>y/o J<l>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento V<l>no humano en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos V<l>no humanos y todos los segmentos J<l>no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<l>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante está en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig.
En algunas realizaciones, el locus de la cadena ligera de Ig comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<l>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) J<l>de Ig y/o un gen de C<l>de Ig como se describe en el presente documento) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano es un locus de la cadena ligera de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de segmentos génicos V<l>y/o J<l>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, y opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos V<l>no humanos, todos los segmentos génicos J<l>no humanos y el gen de C<l>no humano en el locus de la cadena ligera de Ig no humano.
En algunas realizaciones, los animales no humanos o la célula animal no humana comprende un locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<k>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) J<k>de Ig como se describe en el presente documento) cadena arriba de y en unión operativa con una Ck de Ig no humana en el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano es un locus de la cadena ligera<k>de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos V<k>y/o J<k>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento Vk no humano en el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos Vk no humanos y todos los segmentos Jk no humanos en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<k>no humanos y todos los segmentos J<k>no humanos en el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante está en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera k de Ig no humana en el locus de la cadena ligera k de Ig.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V<k>de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) J<k>de Ig y/o un gen de Ck de Ig como se describe en el presente documento) está en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera k de Ig no humana en el locus de la cadena ligera k de Ig, opcionalmente, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos V<k>no humanos, todos los segmentos génicos J<k>no humanos y el gen de Ck no humano en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano.
En algunas realizaciones, los animales no humanos o la célula animal no humana comprende un locus de la cadena ligera A de Ig no humano que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento VA de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) JA de Ig) cadena arriba de y en unión operativa con una CA de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera A de Ig no humano es un locus de la cadena ligera A de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera A de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos génicos VA y/o JA de Ig endógenos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento VA no humano en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos VA no humanos y todos los segmentos JA no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano. En algunas realizaciones, tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos VA no humanos y todos los segmentos JA no humanos en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante está en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera A de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig.
En algunas realizaciones, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento VA de Ig modificado y, opcionalmente, segmento(s) JA de Ig y/o un gen de CA de Ig como se describe en el presente documento) en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera A de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos VA no humanos, todos los segmentos génicos JA no humanos y el gen de CA no humano en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano.
Métodos de elaboración de animales no humanos o células animales no humanas
También se describen los métodos de utilización de las moléculas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, vectores de direccionamiento, como se describe en el presente documento para elaborar una célula no humana in vitro, un embrión no humano y/o animales no humanos. En algunas realizaciones, un método in vitro de modificación de una célula aislada comprende introducir en la célula aislada una molécula de ácido nucleico recombinante como se describe en el presente documento, por ejemplo, mediante la puesta en contacto de la célula con el vector de direccionamiento como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones del método, la célula es una célula hospedadora. En algunas realizaciones del método, la célula es una célula madre embrionaria (ES, del inglés embryonic stem). En algunas realizaciones, la célula como se describe en el presente documento o elaborada de acuerdo con un método descrito en el presente documento es una célula de roedor, por ejemplo, en donde la célula de roedor es una célula de rata o una célula de ratón.
También se describen los métodos de utilización de las moléculas de ácido nucleico, las células no humanas y/o los animales no humanos como se describe en el presente documento para elaborar proteínas de unión a antígenos modificadas por anclaje. También se describen embriones de animales no humanos y animales no humanos que pueden comprender y/o desarrollarse (por ejemplo, generarse) a partir de una célula madre embrionaria como se describe en el presente documento. Dichos embriones o animales no humanos pueden desarrollarse mediante un método que comprenda la implantación de la célula ES como se describe en el presente documento en un embrión, y/o la implantación de un embrión que comprenda la célula ES en un hospedador adecuado y el mantenimiento del hospedador en condiciones adecuadas durante el desarrollo de la célula ES o del embrión en una progenie viable.
Como se describe en el presente documento, el vector de direccionamiento puede utilizarse para dirigir un locus de Ig que tenga una región variable de inmunoglobulina humana o humanizada. Los loci de inmunoglobulina que comprenden segmentos génicos de región variable humana se conocen en la materia y pueden encontrarse, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.633.425; 5.770.429; 5.814.318; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584; 6.998.514; 7.795.494; 7.910.798; 8.232.449; 8.502.018; 8.697.940; 8.703.485; 8.754.287; 8.791.323; 8.809.051; 8.907.157; 9.035.128; 9.145.588; 9.206.263; 9.447.177; 9.551.124; 9.580.491 y 9.475.559, así como en las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 20100146647, 20110195454, 20130167256, 20130219535, 20130326647, 20130096287, y 2015/0113668 y en las publicaciones PCT n.° WO2007117410, WO2008151081, WO2009157771, W02010039900, WO2011004192, WO2011123708 y WO2014093908.
En algunas realizaciones, los animales no humanos divulgados en el presente documento comprenden transgenes exógenos de inmunoglobulina totalmente humana que comprenden un segmento V de Ig modificado como se describe en el presente documento, que son capaces de reordenarse en linfocitos B precursores en ratones (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). En estas realizaciones, pueden insertarse (aleatoriamente) transgenes de inmunoglobulina totalmente humanos que comprenden el segmento V de Ig modificado descrito en el presente documento y también pueden inactivarse genes de inmunoglobulina endógenos (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg et al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143) por ejemplo, en donde los loci endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina y de la cadena ligera<k>están inactivados, por ejemplo, mediante la eliminación dirigida de partes pequeñas pero fundamentales de cada locus endógeno, seguido de la introducción de locus de genes de inmunoglobulina humana como transgenes grandes integrados aleatoriamente o minicromosomas (Tomizuka et al., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727).
En algunas realizaciones, los loci de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina humanos o humanizados que comprenden el segmento V de Ig modificado descrito en el presente documento se encuentran en loci de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina endógenos, respectivamente. Se ha demostrado que la sustitución de incluso un solo segmento génico V<h>endógeno con un segmento génico V<h>humano puede dar como resultado una respuesta inmunitaria que comprende un dominio variable de inmunoglobulina humanizada. Véase, por ejemplo, Tien et al. (2016) Cell 166:1471-84.
Se ha descrito previamente un método para una gran sustitución genética in situ de los loci de genes variables de inmunoglobulina de la estirpe germinal de ratón por loci de genes variables de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana mientras se mantiene la capacidad de los ratones para generar descendencia. Véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.596.541 y 8.697.940. De manera específica, se describe la sustitución precisa de seis megabases de los loci de gen variable de inmunoglobulina tanto de cadena pesada como de cadena ligera k del ratón con sus homólogos humanos mientras se conservan inalteradas las regiones constantes de ratón. Como resultado, se han creado ratones que tienen una sustitución precisa de todo su repertorio variable de inmunoglobulina de la estirpe germinal con secuencias variables de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana equivalentes, mientras mantiene las regiones constantes de ratón. Las regiones variables humanas están unidas a regiones constantes de ratón para formar loci de inmunoglobulina humanos-ratón quiméricos que se reordenan y expresan a niveles fisiológicamente apropiados. Los anticuerpos expresados son "quimeras inversas", es decir, comprenden secuencias de regiones variables humanas y secuencias de regiones constantes de ratón.
En algunos aspectos, los ratones que tienen regiones variables de inmunoglobulina humanizados que expresan anticuerpos que tienen regiones variables humanas o humanizadas y regiones constantes de ratón se denominan ratones VELOCIMMUNE®. Los ratones VELOCIMMUNE® humanizados presentan un sistema inmunitario humoral completamente funcional que es esencialmente indistinguible del de los ratones de tipo silvestre. Muestran poblaciones de células normales en todas las etapas del desarrollo de los linfocitos B. Presentan una morfología de órganos linfoides normal. Las secuencias de anticuerpos de ratones VELOCIMMUNE® presentan un reordenamiento V(D)J normal y frecuencias de hipermutación somática normales. Las poblaciones de anticuerpos en estos ratones reflejan distribuciones de isotipo que son el resultado del cambio de clase normal (por ejemplo, cambio de isotipo cis normal). La inmunización de ratones VELOCIMMUNE® da como resultado respuestas inmunitarias humorales fuertes que generan repertorios de anticuerpos diversos y grandes que tienen dominios variables de inmunoglobulina humana adecuados para su uso como candidatos terapéuticos. Esta plataforma proporciona una fuente abundante de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana naturalmente maduradas por afinidad para producir anticuerpos y otras proteínas de unión a antígeno farmacéuticamente aceptables. Es la sustitución precisa de las secuencias variables de inmunoglobulina de ratón con secuencias variables de inmunoglobulina humana de tal manera que las secuencias variables de inmunoglobulina humana se unan operativamente con una o más secuencias génicas endógenas de región constante no humanas de una manera quimérica inversa la que permite producir ratones VELOCIMMUNE®.
Los ratones modificados de forma quimérica inversa incluyen, pero sin limitación, ratones modificados para comprender en un locus de inmunoglobulina endógeno una región variable humana(izada) (por ejemplo, que comprenda (D), J y uno o más segmentos génicos V humanos) unida operativamente a una región constante endógena, por ejemplo,
(a) en un locus endógeno de cadena pesada:
(i) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar en unión operativa con una región constante de cadena pesada endógena, en donde la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar comprende una pluralidad de segmentos génicos V<h>de región variable de cadena pesada humana sin reordenar (por ejemplo, todos los segmentos génicos V<h>humanos sin reordenar funcionales), uno o más segmentos génicos D<h>de cadena pesada de inmunoglobulina sin reordenar y uno o más segmentos génicos J<h>de cadena pesada de inmunoglobulina sin reordenar,
opcionalmente en donde el uno o más segmentos génicos D<h>de cadena pesada de inmunoglobulina sin reordenar y uno o más segmentos génicos J<h>de cadena pesada de inmunoglobulina sin reordenar son uno o más segmentos génicos D<h>de cadena pesada de inmunoglobulina humana sin reordenar (por ejemplo, todos los segmentos génicos D<h>humanos funcionales) y/o uno o más segmentos génicos J<h>de cadena pesada de inmunoglobulina humana sin reordenar (por ejemplo, todos los segmentos génicos J<h>humanos funcionales);
(ii) una región variable de cadena pesada humana o humanizada sin reordenar restringida en unión operativa con una región constante de cadena pesada endógena, en donde la región variable de cadena pesada humana o humanizada restringida sin reordenar consiste esencialmente en un único segmento génico V<h>de región variable de cadena pesada humana sin reordenar unido operativamente con uno o más segmentos génicos D<h>de cadena pesada de inmunoglobulina sin reordenar y uno o más segmentos génicos JH de cadena pesada de inmunoglobulina sin reordenar, opcionalmente en donde el uno o más segmentos génicos D<h>de cadena pesada de inmunoglobulina sin reordenar y uno o más segmentos génicos JH de cadena pesada de inmunoglobulina sin reordenar son uno o segmentos génicos D<h>de cadena pesada de inmunoglobulina humana sin reordenar y uno o más segmentos génicos J<h>de cadena pesada de inmunoglobulina humana sin reordenar, respectivamente; (iii) una región variable de cadena pesada humana o humanizada sin reordenar modificada con histidina en unión operativa con una región constante de cadena pesada endógena, en donde la región variable de cadena pesada humana o humanizada sin reordenar modificada con histidina comprende una secuencia génica variable de cadena pesada de inmunoglobulina sin reordenar que comprende en una secuencia codificante de la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) una sustitución de al menos un codón que no es de histidina con un codón de histidina o una inserción de al menos un codón de histidina; o
(iv) una secuencia codificante de inmunoglobulina solamente de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada humana o humanizada sin reordenar en unión operativa con una región constante de cadena pesada endógena, en donde la región constante de cadena pesada endógena comprende (1) un gen de IgM endógeno inalterado que codifica un isotipo de IgM que se asocia con la cadena ligera y (2) un gen no de IgM, por ejemplo, un gen de IgG, que carece de una secuencia que codifique un dominio C<h>1 funcional, en donde el gen no de IgM codifica un isotipo no de IgM que carece de un dominio C<h>1 capaz de asociarse covalentemente con un dominio constante de cadena ligera;
y/o
(b) en un locus endógeno de cadena ligera:
(i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena, en donde la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar comprende una pluralidad de segmentos génicos V<l>de región variable de cadena ligera humana sin reordenar (por ejemplo, todos los segmentos génicos V<l>humanos sin reordenar funcionales) y uno o más segmentos génicos J<l>de cadena ligera de inmunoglobulina sin reordenar, opcionalmente en donde el uno o más segmentos génicos J<l>de cadena ligera de inmunoglobulina sin reordenar son uno o más segmentos génicos J<l>de cadena ligera de inmunoglobulina humana sin reordenar (por ejemplo, todos los segmentos génicos J<l>humanos funcionales),
opcionalmente en donde el locus endógeno de la cadena ligera de inmunoglobulina es un locus endógeno de la cadena ligera kappa (k) de inmunoglobulina, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar comprende segmentos génicos de<k>variable (V<k>) y<k>de unión (J<k>) humanos y en donde la región constante de cadena ligera endógena es una secuencia de región constante de cadena k endógena y/o en donde el locus endógeno de la cadena ligera de inmunoglobulina es una cadena ligera lambda (A) de inmunoglobulina endógena, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar comprende los segmentos génicos de A variable (VA) y A de unión (JA) humanos y la región constante de cadena ligera endógena es una secuencia de región constante de cadena A endógena, opcionalmente en donde el locus de la cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno comprende (a) uno o más segmentos génicos VA humanos, (b) uno o más segmentos génicos JA humanos y (c) uno o más segmentos génicos CA humanos, en donde (a) y (b) están operativamente unidos a (c) y un segmento génico (CA) constante de cadena ligera de inmunoglobulina de roedor, y en donde el locus de la cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno comprende, además: uno o más potenciadores de cadena ligera A (EA) de inmunoglobulina de roedor y uno o más potenciadores de cadena ligera A (EA) de inmunoglobulina humanos, que comprenden opcionalmente tres EA humanos;
(ii) una secuencia codificante de cadena ligera común que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera humana o humanizada reordenada en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena, en donde la secuencia de región variable de cadena ligera humana o humanizada reordenada comprende un segmento génico de región variable de cadena ligera V<l>humana reordenado con un segmento génico de cadena ligera JL de inmunoglobulina;
(iii) una región variable de cadena ligera humana o humanizada sin reordenar restringida en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena, en donde la región variable de cadena ligera humana o humanizada sin reordenar restringida comprende no más de dos segmentos génicos (V<l>) variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana sin reordenar unidos operativamente a uno o más segmentos génicos (J<l>) de cadena ligera de inmunoglobulina humana sin reordenar;
(iv) una región variable de cadena ligera humana o humanizada sin reordenar modificada con histidina en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena, en donde la región variable de cadena ligera humana o humanizada sin reordenar modificada con histidina comprende una secuencia génica variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar que comprende en una secuencia codificante de la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) una sustitución de al menos un codón que no es de histidina con un codón de histidina o una inserción de al menos un codón de histidina; o
(v) una región variable de cadena ligera humana o humanizada reordenada modificada con histidina en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena, en donde la región variable de cadena ligera humana o humanizada reordenada modificada con histidina comprende una secuencia génica variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada reordenada que comprende en una secuencia codificante de la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) una sustitución de al menos un codón que no es de histidina con un codón de histidina o una inserción de al menos un codón de histidina,
opcionalmente en donde el ratón comprende además
(i) un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada que comprende un gen de ADAM6 funcional de manera que el ratón presenta la fertilidad de tipo silvestre del animal no humano; y/o
(ii) un gen exógeno de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) para una mayor diversidad de receptores de antígenos, opcionalmente, de modo que al menos un 10 % de los genes de la región variable reordenados comprendan adiciones que no sean de plantilla,
habiéndose descrito dichos ratones previamente. Véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 8.697.940, 8.754.287, 9.204.624, 9.334.334, 9.801.362, 9.332.742; y 9.516.868; las publicaciones de patente de EE. UU. 20110195454, 20120021409, 20120192300, 20130045492; 20150289489; 20180125043; 20180244804; las publicaciones de PCT n.° WO2019/113065, WO2017210586 y WO2011163314; Lee et al. (2014) Nature Biotechnology 32:356.
Un artesano experto reconocerá fácilmente que cualquier ratón o células de ratón (por ejemplo, células ES de ratón modificadas de manera quimérica inversa pueden modificarse para comprender un segmento V de Ig modificado como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, en el presente documento se describe un animal no humano modificado genéticamente cuyo genoma, por ejemplo, genoma de la estirpe germinal, comprende:
un locus endógeno de inmunoglobulina que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un segmento génico hVH modificado de la invención, un segmento génico D<h>humano y un segmento génico J<h>humano, en donde la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina está unida operativamente a una región constante, y/o
un locus de la cadena endógeno que comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un segmento V<l>modificado de la invención y un segmento génico J<l>humano, en donde la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina está unida operativamente a una región constante.
En algunos aspectos, un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, una rata o un ratón, comprende en su genoma una sustitución de uno o más segmentos V<h>, D<h>y J<h>endógenos en un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina endógeno con uno o más segmentos V<h>, D<h>y J<h>humanos, en donde el uno o más segmentos V<h>, D<h>y J<h>humanos comprenden un segmento génico V<h>humano modificado como se describe en el presente documento y están unidos operativamente a un gen de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno; y opcionalmente un segmento V<l>humano y J<l>humano sin reordenar o reordenados unidos operativamente a un gen de región constante de cadena ligera (C<l>) de inmunoglobulina no humano, por ejemplo, de roedor, por ejemplo, de un ratón o rata, o humana, por ejemplo, en un locus de la cadena ligera no human endógeno.
En determinados aspectos, los animales no humanos modificados genéticamente comprenden en su genoma, por ejemplo, genoma de la estirpe germinal, un locus de inmunoglobulina (exógeno o endógeno) que contiene una región variable de inmunoglobulina que comprende uno o más segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina humanos sin reordenar que incluyen un segmento génico V de Ig modificado como se describe en el presente documento y una región constante de inmunoglobulina que comprende un gen de región constante de inmunoglobulina y en el que uno o más segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina humanos sin reordenar están unidos operativamente al gen de región constante de inmunoglobulina.
En general, un locus de inmunoglobulina modificado genéticamente comprende una región variable de inmunoglobulina (que comprende segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina) unida operativamente a una región constante de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el locus de inmunoglobulina modificado genéticamente comprende uno o más segmentos génicos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanos sin reordenar, incluido un segmento genético V<h>de Ig modificado como se describe en el presente documento, unido operativamente a un gen de región constante de cadena pesada. En algunas realizaciones, el locus de inmunoglobulina modificado genéticamente comprende segmentos génicos de región variable k de inmunoglobulina humanos no reordenados, incluido un segmento génico V<k>de Ig modificado como se describe en el presente documento, unido operativamente a un gen de región constante de cadena<k>. En algunas realizaciones, el locus de inmunoglobulina modificado genéticamente comprende segmentos génicos de región variable A de inmunoglobulina humanos no reordenados, incluido un segmento génico VA de Ig modificado como se describe en el presente documento, unido operativamente a un gen de región constante de cadena k. En algunas realizaciones, el locus de inmunoglobulina modificado genéticamente comprende segmentos génicos de región variable A de inmunoglobulina humanos no reordenados, incluido un segmento génico VA de Ig modificado como se describe en el presente documento, unido operativamente a un gen de región constante de cadena A.
En determinadas realizaciones, el animal no humano comprende en un locus de la cadena pesada endógeno una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada no reordenada que comprende un segmento génico V<h>de Ig modificado como se describe en el presente documento en unión operativa con una región constante de cadena pesada endógena, en donde la región variable de inmunoglobulina contiene uno o más segmentos génicos de región variable de cadena pesada de Ig humanos sin reordenar. En algunas realizaciones, el uno o más segmentos génicos de región variable de Ig humanos no reordenados comprende un segmento génico V<h>de Ig modificado como se describe en el presente documento, uno o más segmentos de diversidad de cadena pesada (D<h>) de inmunoglobulina, y uno o más segmentos de unión de cadena pesada (J<h>) de inmunoglobulina (opcionalmente uno o más segmentos J<h>humanos no reordenados). En algunas realizaciones, el segmento génico V<h>de Ig modificado como se describe en el presente documento es el único segmento V<h>de Ig presente en la región variable de la cadena pesada. En algunas realizaciones, los segmentos génicos de Ig humanos sin reordenar incluyen todos los segmentos génicos D<h>humanos funcionales. En algunas realizaciones, los segmentos génicos de Ig humanos sin reordenar incluyen todos los segmentos génicos J<h>humanos funcionales. Se proporcionan regiones variables ilustrativas que comprenden segmentos génicos de cadena pesada de Ig, por ejemplo, en Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 e información complementaria.
En algunos aspectos, los animales no humanos proporcionados en el presente documento comprenden en un locus endógeno de la cadena pesada una región variable de cadena pesada humana o humanizada sin reordenar restringida en unión operativa con una región constante de cadena pesada endógena que comprende al menos un gen de IgM no humano, en donde la región variable de cadena pesada humana o humanizada no reordenada restringida se caracteriza por un único segmento génico V<h>humano (por ejemplo, un único segmento génico V<h>de Ig modificado como se describe en el presente documento), una pluralidad de segmentos génicos D<h>(por ejemplo, segmentos génicos D<h>humanos) y una pluralidad de segmentos génicos J<h>(por ejemplo, segmentos génicos J<h>humanos), en donde el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina restringido es capaz de reordenarse y formar una pluralidad de reordenamientos distintos, en donde cada reordenamiento procede del único segmento génico V<h>humano, uno de los segmentos D<h>y uno de los segmentos J<h>y en donde cada reordenamiento codifica un dominio variable de cadena pesada diferente (por ejemplo, como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.° 20130096287). En algunas realizaciones, el único segmento génico V<h>humano modificado es V<h>1-2 o V<h>1-69.
En determinadas realizaciones, un animal no humano comprende en un locus endógeno de la cadena ligera una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada no reordenada, incluido un segmento V<l>de Ig modificado como se describe en el presente documento, en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena. En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar contiene segmentos génicos de región variable k de Ig humana sin reordenar. En algunas realizaciones, la región variable de inmunoglobulina humana o humanizada no reordenada comprende uno o una pluralidad de segmentos Vk humanos no reordenados, que puede incluir un segmento Vk de Ig modificado como se describe en el presente documento, y uno o más segmentos Jk humanos no reordenados. En algunas realizaciones, los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina humanos sin reordenar comprenden todos los segmentos Jk humanos. En algunas realizaciones, los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina comprenden cuatro segmentos V<k>funcionales y todos los segmentos J<k>humanos. En algunas realizaciones, los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina comprenden 16 segmentos Vk funcionales y todos los segmentos Jk humanos (por ejemplo, todos los segmentos Vk y segmentos Jk humanos funcionales). En algunas realizaciones, los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina humanos sin reordenar comprenden la totalidad de los segmentos V<k>humanos y todos los segmentos Jk humanos. Se proporcionan regiones variables ilustrativas que comprenden segmentos génicos<k>de Ig, por ejemplo, en Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 e información complementaria.
En algunos aspectos, una región variable de cadena ligera humana o humanizada sin reordenar restringida en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena se caracteriza por que la región variable de cadena ligera humana o humanizada sin reordenar comprende no más de dos segmentos génicos V<l>humanos y una pluralidad de segmentos génicos J<l>(por ejemplo, ratones de doble cadena ligera o DLC, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 9.796.788), uno de los no más de dos segmentos génicos V<l>humanos puede ser un segmento V<l>de Ig modificado como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, los segmentos génicos V<l>son segmentos génicos V<k>. En algunos aspectos, los segmentos génicos V<l>son segmentos génicos VA. En algunos aspectos, los segmentos génicos Vk son IGKV3-20 e IGKV1-39. En algunos aspectos, un animal no humano comprende exactamente dos segmentos génicos Vk humanos sin reordenar y cinco segmentos génicos Jk humanos sin reordenar unidos operativamente a una región constante de cadena ligera de ratón en los loci endógenos de la cadena ligera k del ratón, opcionalmente en donde los dos segmentos génicos Vk humanos sin reordenar exactamente son un segmento génico Vk1-39 humano y un segmento génico Vk3-20 humano, en donde los cinco segmentos génicos Jk humanos sin reordenar son un segmento génico Jk1 humano, un segmento génico Jk2 humano, un segmento génico Jk3 humano, un segmento génico Jk4 humano y un segmento génico Jk5 humano, en donde los segmentos génicos de cadena ligera kappa humanos sin reordenar son capaces de reordenar y codificar dominios variables humanos de un anticuerpo, y opcionalmente además en donde el animal no humano no comprende un segmento génico Vk endógeno que es capaz de reordenarse para formar una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina.
En determinadas realizaciones, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena contiene segmentos génicos de región variable de IgA humana sin reordenar, incluido un segmento de A de Ig modificado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina humanos sin reordenar comprenden una pluralidad de segmentos VA humanos y uno o más segmentos JA humanos. En alguna realización, los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina humanos sin reordenar comprenden uno o más segmentos VA humanos, uno o más segmentos JA humanos y una o más secuencias de región constante CA humanas. En algunas realizaciones, los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina humanos sin reordenar comprenden todos los segmentos VA humanos. En algunas realizaciones, los segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina humanos sin reordenar comprenden todos los segmentos JA humanos. Se proporcionan regiones variables ilustrativas que comprenden segmentos génicos A de Ig, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 9.035.128 y 6.998.514. En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena comprende (a) uno o más segmentos génicos VA humanos, (b) uno o más segmentos génicos JA humanos y (c) uno o más segmentos génicos CA humanos, en donde (a) y (b) están unidos operativamente a (c) y un segmento génico CA de roedor, y en donde el locus endógeno de la cadena ligera A de inmunoglobulina comprende, además: uno o más potenciadores de cadena ligera A (EA) de inmunoglobulina de roedor y uno o más potenciadores de cadena ligera A (EA) de inmunoglobulina humanos, que comprende opcionalmente tres EA humanos.
En determinados aspectos, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena comprende segmentos génicos de región variable A de Ig humanos sin reordenar, por ejemplo, un segmento A de Ig modificado como se describe en el presente documento, unido operativamente a un gen de Ck endógeno (por ejemplo, de roedor, por ejemplo, rata o ratón) de tal manera que el animal no humano exprese una cadena ligera de inmunoglobulina que comprenda una secuencia de dominio variable A humana procedente de los segmentos génicos VA y JA fusionada con un dominio constante<k>endógeno, véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 9.226.484.
En algunos aspectos, un locus de la cadena ligera<k>de inmunoglobulina humanizado, por ejemplo, un locus<k>endógeno de inmunoglobulina humanizado, comprende uno o más segmentos génicos VA humanos (por ejemplo, un segmento VA humano modificado como se describe en el presente documento) y uno o más segmentos génicos JA humanos cadena arriba de (por ejemplo, unidos operativamente a) un gen de CA, por ejemplo, que puede sustituir a un gen de C<k>endógeno. En algunos aspectos, un gen de CA es un gen de CA de roedor (por ejemplo, rata o ratón). En algunos aspectos, un gen de CA es un gen CA1 de ratón. En algunos aspectos, el gen de CA comprende uno o más genes de CA humanos. En algunos aspectos, los uno o más segmentos génicos JA humanos y uno o más genes de CA de dicho locus de la cadena ligera k de inmunoglobulina humanizado están presentes en agrupaciones JA-CA. En algunos aspectos, un roedor modificado genéticamente (por ejemplo, una rata o un ratón) es homocigoto para dicho locus de la cadena ligera<k>de inmunoglobulina humanizado. En algunos aspectos, un roedor modificado genéticamente (por ejemplo, una rata o un ratón) es heterocigoto para dicho locus de la cadena ligera k de inmunoglobulina humanizado. En algunos aspectos, un roedor modificado genéticamente (por ejemplo, una rata o un ratón), que comprende dicho locus de la cadena ligera k de inmunoglobulina humanizado, produce un anticuerpo que comprende, entre otras, cadenas ligeras A, donde cada cadena ligera A comprende un dominio variable de cadena ligera A humano unido operativamente a un dominio constante de cadena ligera A humano, por ejemplo, en respuesta a la estimulación del antígeno.
En algunas realizaciones, la región variable de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina humanos sin reordenar también incluye secuencias intergénicas de región variable de inmunoglobulina humanas. En algunas realizaciones, la región variable de inmunoglobulina incluye secuencias intergénicas de región variable de Ig no humanas (por ejemplo, de roedor, rata, ratón). En algunas realizaciones, la secuencia intergénica es de origen de especies endógenas.
En algunas realizaciones, la región variable de inmunoglobulina es una región variable ligera reordenada (una región variable de cadena ligera universal). En algunas realizaciones, el gen de región variable de cadena ligera de Ig reordenado es un gen de región variable de cadena ligera de Ig reordenado humano. Se proporcionan regiones variables de cadena ligera de Ig reordenadas ilustrativas en, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.°: 9.969.814; 10.130.181, y 10.143.186 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 20120021409, 20120192300, 20130045492, 20130185821, 20130302836 y 20150313193. En algunos aspectos, el organismo no humano (organismo de "cadena ligera universal") que comprende una región variable de cadena ligera universal se usa para producir anticuerpos biespecíficos. En algunos aspectos, una secuencia codificante de cadena ligera común comprende una única secuencia Vk/Jk de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada unida operativamente a una región constante de cadena ligera endógena. En algunos aspectos, la secuencia Vk/Jk de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única se modifica de tal manera que la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única codifica el anclaje como se describe en el presente documento unido operativamente a la cadena ligera universal. En algunos aspectos, la secuencia Vk/Jk de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única es (i) una secuencia V<k>1-39/J<k>5 humana que comprende un segmento génico V<k>1-39 humano fusionado con un segmento génico Jk5 humano, o (ii) una secuencia Vk3-20/Jk1 humana que comprende un segmento génico Vk320 humano fusionado con un segmento génico J<k>1 humano.
En algunos aspectos, la región variable de inmunoglobulina es una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera y/o de cadena pesada que incluye inserciones y/o sustituciones de codones de histidina diseñados para introducir propiedades de unión dependientes del pH a los anticuerpos generados en dicho organismo no humano. En algunos de dichos aspectos, los codones de histidina se insertan y/o se reemplazan en las secuencias de ácido nucleico que codifican CDR3. Varios de estos loci de inmunoglobulina ligeros y/o pesados se proporcionan en las patentes de EE. UU. n.° 9.301.510; 9.334.334; y 9.801.362 y en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 20140013456. En algunos aspectos, la región variable de cadena ligera humana o humanizada reordenada modificada con histidina en unión operativa con una región constante de cadena ligera endógena comprende una única secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que comprende secuencias de segmentos Vk y Jk humanos, opcionalmente en donde la secuencia del segmento Vk procede de un segmento génico Vk1-39 o Vk3-20 humano, y en donde la secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón que no es de histidina de la secuencia del segmento Vk con un codón de histidina que se expresa en una posición seleccionada del grupo que consiste en 105, 106, 107, 108, 109, 111 y una combinación de los mismos (de acuerdo con la numeración IMGT). En algunos aspectos, la región variable de cadena pesada humana o humanizada sin reordenar modificada con histidina en unión operativa con una región constante de cadena pesada endógena comprende una secuencia génica variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada sin reordenar que comprende en una secuencia codificante de la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) (por ejemplo, en un segmento génico V<h>(humano) modificado como se describe en el presente documento) una sustitución de al menos un codón que no es de histidina con un codón de histidina o una inserción de al menos un codón de histidina. En algunos aspectos, la secuencia génica variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada no reordenada comprende segmentos génicos V<h>humanos no reordenados (por ejemplo, un segmento V<h>modificado (humano) como se describe en el presente documento), D<h>humanos no reordenados o D<h>sintéticos, y J<h>humanos no reordenados, opcionalmente, en donde el segmento V<h>humano no reordenado (por ejemplo, el segmento V<h>humano modificado como se describe en el presente documento) comprende la sustitución de al menos un codón no histidina por un codón histidina o una inserción de al menos un codón histidina. En algunos aspectos, la región variable de cadena ligera humana o humanizada sin reordenar modificada con histidina en unión operativa con una región constante de cadena pesada endógena comprende segmentos génicos V<l>sin reordenar y J<l>sin reordenar. En algunos aspectos, la región variable de cadena ligera humana o humanizada sin reordenar modificada con histidina comprende no más de dos segmentos génicos V<l>(por ejemplo, no más de dos segmentos génicos V<k>) humanos sin reordenar y uno o más J<l>(por ejemplo, J<k>) humanos sin reordenar, en donde cada uno de los no más de dos segmentos génicos V<l>humanos comprenden en una secuencia codificante de CDR3 una sustitución de al menos un codón que no es de histidina por un codón de histidina o una inserción de al menos un codón de histidina. En algunos aspectos, los no más de dos segmentos génicos V<k>humanos sin reordenar son los segmentos génicos V<k>1-39 y V<k>3-20 humanos, cada uno de los cuales comprende una o más sustituciones de un codón que no es de histidina con un codón de histidina, y en donde los segmentos génicos V<k>y J<k>humanos son capaces de reordenarse y los segmentos génicos V<k>y J<k>humanos codifican un dominio variable de cadena ligera humana que comprende una o más histidinas en una posición seleccionada del grupo que consiste en 105, 106, 107, 108, 109, 111 (de acuerdo con la numeración IGMT), y un combinación de los mismos, en donde la una o más histidinas proceden de una o más sustituciones.
En algunas realizaciones, la región constante de inmunoglobulina comprende un gen de región constante de cadena pesada. En algunas realizaciones, el gen de región constante de cadena pesada es un gen de región constante de cadena pesada humana. En algunas realizaciones, el gen de región constante de cadena pesada es de origen de especie endógena. En algunas realizaciones, el gen de región constante de cadena pesada es un gen de región constante de ratón o un gen de región constante de rata. En algunas realizaciones, el gen de región constante es una mezcla de secuencia humana y no humana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el gen de región constante codifica una región C<h>1 humana y una región C<h>2 y/o C<h>3 no humana (por ejemplo, origen de especies endógenas, ratón, rata). En algunas realizaciones, el gen de región constante de cadena pesada es un gen de región constante C|j, C5, C<y>(C<y>1, C<y>2, C<y>3, C<y>4), Ca o C<e>. En algunas realizaciones, el gen de región constante es un gen de región constante endógeno. En algunas realizaciones, el gen de región constante codifica una región C<h>1 mutada de tal manera que el animal no humano exprese solo anticuerpos de cadena pesada (véanse, por ejemplo, la patente de EE. u U. n.° 8.754.287, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2015/0289489). En algunas realizaciones, por ejemplo, donde el objetivo es generar cadenas pesadas para producir anticuerpos biespecíficos (por ejemplo, en organismos de cadena ligera universal o doble), los dominios Fc de las cadenas pesadas comprenden modificaciones para facilitar la formación de heterodímeros de cadena pesada y/o para inhibir la formación de homodímeros de cadena pesada. Dichas modificaciones se proporcionan, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.731.168; 5.807.706; 5.821.333; 7.642.228 y 8.679.785 y en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2013/0195849.
En algunas realizaciones, la región constante de inmunoglobulina comprende un gen de región constante de cadena ligera. En algunas realizaciones, el gen de región constante de cadena ligera es un gen de región constante k. En algunas realizaciones, el gen de región constante de cadena ligera es un gen de región constante A. En algunas realizaciones, el gen de región constante de cadena ligera es de origen de especie endógena. En algunas realizaciones, el gen de región constante de cadena ligera es un gen de región constante de ratón o un gen de región constante de rata. En algunas realizaciones, el gen de región constante de cadena ligera es una mezcla de secuencia humana y no humana.
En algunas realizaciones, la región variable de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos de región variable humanos y el gen de región constante de inmunoglobulina al que se unen operativamente los segmentos génicos de región variable están situados en un locus de inmunoglobulina endógeno. En algunas realizaciones, el locus de inmunoglobulina endógeno es un locus de la cadena pesada endógeno. En algunas realizaciones, el locus de inmunoglobulina endógeno es un locus k endógeno. En algunas realizaciones, el locus de inmunoglobulina endógeno es un locus A endógeno. En algunas realizaciones, el gen de región constante al que se unen operativamente los segmentos génicos de región variable humanos es un gen de región constante endógeno.
En algunas realizaciones, uno o más de los loci endógenos de inmunoglobulina o una parte de uno o más loci endógenos (por ejemplo, una región variable y/o una región constante) en el genoma del animal no humano proporcionado en el presente documento se inactivan. Los loci del gen de región variable de inmunoglobulina endógenos y partes de los mismos pueden inactivarse mediante cualquier método conocido en la materia, incluidos, pero sin limitación, la eliminación del locus o una parte del mismo del genoma del organismo, la sustitución de un locus o una parte del mismo con una secuencia de ácido nucleico diferente, la inversión de una parte del locus y/o el desplazamiento de una parte del locus a otra posición en el genoma del organismo no humano. En algunas realizaciones, la inactivación del locus es solamente una inactivación parcial. En algunas realizaciones, la región variable del locus se inactiva, pero la región constante permanece funcional (por ejemplo, porque está unida operativamente a segmentos génicos de región variable no endógenos).
En algunas realizaciones, el animal no humano modificado genéticamente incluye un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina endógeno inactivado. En algunas realizaciones, el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina endógeno o una parte del mismo se inactiva por eliminación, reemplazo, desplazamiento y/o inversión de al menos parte de la región variable endógena del locus de la cadena pesada endógeno. En algunas realizaciones, la al menos parte de la región variable del locus de la cadena pesada endógeno que se elimina, se reemplaza, se desplaza y/o se invierte comprende los segmentos J de la región variable. En algunas realizaciones, el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina endógeno o una porción del mismo se inactiva por eliminación, reemplazo, desplazamiento y/o inversión de al menos parte de la región constante endógena del locus de la cadena pesada endógeno. En algunas realizaciones, la al menos parte de la región constante del locus de la cadena pesada endógeno que se elimina, se reemplaza, se desplaza y/o se invierte comprende el gen de O|j de la región constante endógena.
En algunas realizaciones, el animal no humano modificado genéticamente incluye un locus de la cadena<k>de inmunoglobulina endógeno inactivado. En algunas realizaciones, el locus de la cadena<k>de inmunoglobulina endógeno o una parte del mismo se inactiva por eliminación, reemplazo, desplazamiento y/o inversión de al menos parte de la región variable endógena del locus de la cadena<k>endógeno. En algunas realizaciones, la al menos parte de la región variable del locus de la cadena<k>endógeno que se elimina, se reemplaza, se desplaza y/o se invierte comprende los segmentos J de la región variable. En algunas realizaciones, el locus de la cadena k de inmunoglobulina endógeno o parte del mismo se inactiva por eliminación, reemplazo, desplazamiento y/o inversión de al menos parte de la región constante endógena del locus de la cadena<k>endógeno. En algunas realizaciones, la al menos parte de la región constante del locus de la cadena k endógeno que se elimina, se reemplaza, se desplaza y/o se invierte comprende el gen de C<k>de la región constante endógena.
En algunas realizaciones, el animal no humano modificado genéticamente incluye un locus de la cadena A de inmunoglobulina endógeno inactivado. En algunas realizaciones, el locus de la cadena A de inmunoglobulina endógeno o una parte del mismo se inactiva por eliminación, reemplazo, desplazamiento y/o inversión de al menos parte de una región variable endógena del locus de la cadena A endógeno. En algunas realizaciones, la al menos parte de al menos un grupo de genes V-J-C en el locus de la cadena A endógeno se elimina, se reemplaza, se desplaza y/o se invierte. En algunas realizaciones, el locus de la cadena A de inmunoglobulina endógeno o parte del mismo se inactiva por eliminación, reemplazo, desplazamiento y/o inversión de al menos parte de una región constante endógena del locus de la cadena A endógeno. En algunas realizaciones, la al menos parte de la región constante del locus de la cadena A endógeno que se elimina, se reemplaza, se desplaza y/o se invierte comprende un gen de C de la región constante endógena.
En varias realizaciones, las modificaciones del locus de inmunoglobulina no afectan a la fertilidad del animal no humano. En algunas realizaciones, el locus de la cadena pesada comprende un gen funcional, por ejemplo, un gen ADAM6a endógeno, un gen ADAM6b, o ambos, y la modificación genética no afecta la expresión y/o función del gen ADAM6a endógeno, el gen ADAM6b, o ambos. En algunas realizaciones, el genoma del animal no humano modificado genéticamente comprende además un gen funcional localizado ectópicamente, por ejemplo, el gen ADAM6a endógeno, el gen ADAM6b, o ambos. Los animales no humanos ilustrativos que expresan ADAM6a y/o ADAM6b exógenos se describen en las patentes de EE. UU. n.° 8.642.835 y 8.697.940.
En algunas realizaciones, el animal no humano modificado genéticamente comprende además y expresa una desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) exógena para una mayor diversidad de receptores de antígenos. En la publicación PCT WO 2017210586 se describen animales no humanos ilustrativos que expresan TdT exógena.
En algunas realizaciones, un elemento de control transcripcional incluye un elemento de control transcripcional RAG1, un elemento de control transcripcional RAG2, un elemento de control transcripcional de cadena pesada de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera k de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera 1 de inmunoglobulina, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el genoma de un animal no humano proporcionado comprende además uno o más genes de cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina humanos (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8.502.018; la patente de EE. UU. n.° 8.642.835; la patente de EE. UU. n.° 8.697.940; la patente de EE. UU. n.°: 8791323; y las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2013/0096287 A1 y 2018/0125043 A1; y la publicación del PCT n.° WO2019/113065). Como alternativa, la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento V de Ig modificado, como se describe en el presente documento, puede introducirse en una célula madre embrionaria de una cepa modificada diferente, tal como, por ejemplo, una cepa VELOCIMMUNE® (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8.502.018 y la patente de EE. UU. n.° 8.642.835). En algunas realizaciones, los animales no humanos descritos en el presente documento pueden prepararse mediante la introducción del vector de direccionamiento como se describe en el presente documento, en una célula de una cepa modificada. Por poner solo un ejemplo, el vector de direccionamiento descrito en el presente documento puede introducirse en un animal no humano, como se describe en las patentes de EE. UU. n.° 8.642.835 y 8.697.940, expresando dicho animal no humano anticuerpos que tienen regiones variables completamente humanas y regiones constantes de ratón. En algunas realizaciones, los animales no humanos, como se describen en el presente documento, se preparan para comprender además genes de inmunoglobulina humanos (genes de región variable y/o constante). En algunas realizaciones, los animales no humanos como se describen en el presente documento comprenden un segmento V de Ig modificado como se describe en el presente documento, y material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, seres humanos), en donde el material genético codifica, en su totalidad o en parte, una o más regiones variables de cadena pesada y/o ligera humanas.
Los animales no humanos como se describen en el presente documento se pueden preparar como se describe anteriormente, o mediante métodos conocidos en la materia, para que comprendan genes humanos o humanizados adicionales, a menudo en función del uso previsto del animal no humano. Se puede introducir material genético de dichos genes humanos o humanizados adicionales mediante la alteración adicional del genoma de las células (por ejemplo, células madre embrionarias) que tienen las modificaciones genéticas como se ha descrito anteriormente o mediante técnicas de reproducción (que no forman parte de la invención) conocidas en la materia con otras cepas modificadas genéticamente según se desee.
Por ejemplo, como se describe en el presente documento, los animales no humanos que comprenden un segmento V de Ig modificado como se describe en el presente documento pueden comprender además (por ejemplo, a través de cruzamientos o estrategias de direccionamiento de múltiples genes) una o más modificaciones como se describe en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2011-0195454 A1, 2012-0021409 A1, 2012-0192300 A1, 2013-0045492 A1, 2013-0185821 A1, 2013-0198880 A1, 2013-0302836 A1, 2015-0059009 A1; publicaciones de solicitud de patente internacional n.° WO 2011/097603, WO 2012/148873, WO 2013/134263, WO 2013/184761, WO 2014/160179, WO 2014/160202.
Un animal no humano fundador transgénico puede identificarse basándose en la presencia de un segmento V de Ig modificado en su genoma y/o en la expresión de anticuerpos modificados por anclaje que comprenden aminoácidos correspondientes a una parte de unión al receptor de un polipéptido no inmunoglobulina que se une a un receptor afín. Un animal no humano transgénico fundador puede utilizarse entonces para criar (no forma parte de la invención) animales no humanos adicionales portadores del segmento V de Ig modificado, creando así una serie de animales no humanos portadores cada uno de una o más copias de un segmento V de Ig modificado. Así mismo, los animales transgénicos no humanos portadores de un segmento V de Ig modificado pueden criarse además (no forma parte de la invención) con otros animales no humanos transgénicos portadores de otros transgenes (por ejemplo, genes de inmunoglobulina humana) según se desee.
También pueden producirse animales no humanos transgénicos para que contengan sistemas seleccionados que permitan la expresión regulada o dirigida del transgén. Los sistemas ilustrativos incluyen el sistema de recombinasa Cre/loxP del bacteriófago P1 (véase, por ejemplo, Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236) y el sistema de recombinasa FLP/Frt de S. cerevisiae (O'Gorman, S. et al., 1991, Science 251:1351-1355). Dichos animales pueden proporcionarse mediante la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo, al aparear dos animales transgénicos, uno que contiene un transgén que comprende una modificación seleccionada (por ejemplo, un segmento V de Ig modificado) y el otro que contiene un transgén que codifica una recombinasa (por ejemplo, una recombinasa Cre).
Aunque las realizaciones que emplean un segmento V de Ig modificado en un ratón (es decir, un ratón con un segmento V<h>humano modificado, segmentos génicos D<h>y J<h>, estando la totalidad de los mismos unidos operativamente con uno o más genes de región constante de cadena pesada murina) se analizan ampliamente en el presente documento, también se describen otros animales no humanos que comprenden un segmento V de Ig modificado. Dichos animales no humanos incluyen cualquiera de los que pueden modificarse genéticamente para expresar inmunoglobulinas modificadas por anclaje como se describe en el presente documento, incluidos, por ejemplo, mamíferos, por ejemplo, ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primate (por ejemplo, tití común, macaco), etc. De acuerdo con la invención, el animal no humano es un roedor. Por ejemplo, para los animales no humanos cuyas células ES modificables genéticamente adecuadas no estén fácilmente disponibles, se emplean otros métodos para producir un animal no humano que comprenda la modificación genética. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, modificar un genoma de células no ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) para transferir el genoma modificado genéticamente a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito desnucleado, y gestar la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en las condiciones adecuadas para formar un embrión.
Los métodos para modificar un genoma de animal no humano (por ejemplo, un cerdo, vaca, roedor, pollo, etc.) incluyen, por ejemplo, emplear una nucleasa de dedos de cinc (ZFN), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN) o una proteína Cas (es decir, un sistema CRISPR/Cas) para modificar un genoma para incluir un segmento V de Ig modificado como se describe en el presente documento. Se puede encontrar orientación sobre métodos para modificar el genoma de la estirpe germinal de un animal no humano en, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de los EE. UU. n.° 2015-0376628 A1, US 2016-0145646 A1 y US 2016-0177339 A1.
En algunos aspectos, un animal no humano, como se describe en el presente documento, es un mamífero. En algunos aspectos, un animal no humano, como se describe en el presente documento, es un mamífero pequeño, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. Un animal genéticamente modificado de la invención es un roedor. En algunas realizaciones, un roedor como se describe en el presente documento se selecciona de un ratón, una rata y un hámster. En algunas realizaciones, un roedor como se describe en el presente documento se selecciona de la superfamilia Muroidea. En algunas realizaciones, un animal genéticamente modificado como se describe en el presente documento es de una familia seleccionada entre Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratones), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del nuevo mundo, campañoles), Muridae (ratones y ratas verdaderos, jerbos, ratones espinosos, ratas crestadas), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de roca, ratas con cola, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirón espinoso) y Spalacidae (por ejemplo, topos, ratas de bambú y zokors). En algunas realizaciones, un roedor genéticamente modificado como se describe en el presente documento se selecciona de un ratón o rata auténticos (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso y una rata con cresta. En algunas realizaciones, un ratón genéticamente modificado como se describe en el presente documento es de un miembro de la familia Muridae. En alguna realización, un animal no humano, como se describe en el presente documento, es un roedor. En algunas realizaciones, un roedor como se describe en el presente documento se selecciona de un ratón y una rata. En algunas realizaciones, un animal no humano, como se describe en el presente documento, es un ratón.
En algunas realizaciones, un animal no humano como se describe en el presente documento es un roedor que es un ratón de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/01a. En algunas realizaciones, un ratón de la presente invención es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129Sl/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, por ejemplo, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). En algunas realizaciones, un ratón modificado genéticamente como se describe en el presente documento es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, un ratón como se describe en el presente documento es una mezcla de cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, una cepa 129 de la mezcla como se describe en el presente documento es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En algunas realizaciones, un ratón como se describe en el presente documento es una cepa BALB, por ejemplo, cepa BALB/c. En algunas realizaciones, un ratón como se describe en el presente documento es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.
En algunas realizaciones, un animal no humano como se describe en el presente documento es una rata. En algunas realizaciones, una rata como se describe en el presente documento se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6 y Dark Agouti. En algunas realizaciones, una cepa de rata como se describe en el presente documento es una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.
M étodos de producción de inm unoglobulinas m odificadas p o r anclaje e inm unoglobulinas m odificadas p o r anclaje
Se han creado varias tecnologías in vitro e in vivo para la producción de agentes terapéuticos basados en anticuerpos. En particular, las tecnologías in vivo han presentado la producción de animales transgénicos (es decir, roedores) que contienen genes de inmunoglobulina humanos, ya sea incorporados al azar en el genoma del animal (por ejemplo, véase la patente de EE. UU. n.° 5.569.825) o colocados de manera precisa en un locus endógeno de inmunoglobulina en unión operativa con regiones constantes de inmunoglobulina endógenas del animal (véase, por ejemplo, las patentes EE. UU. n.° 8.502.018; 8.642.835; 8.697.940; y 8.791.323). Ambos enfoques han sido productivos en la producción de candidatos terapéuticos de anticuerpos prometedores para su uso en seres humanos. Además, ambos enfoques tienen la ventaja sobre los enfoques in vitro de que los candidatos a anticuerpos se eligen de repertorios de anticuerpos generados in vivo, que incluye la selección por afinidad y especificidad por el antígeno dentro del medio interno del sistema inmunitario del hospedador. De esta manera, los anticuerpos se unen al antígeno presentado de manera natural (dentro de epítopos y superficies biológicas relevantes) en lugar de entornos artificiales o predicciones in silico que pueden acompañar a las tecnologías in vitro. A pesar de los fuertes repertorios de anticuerpos producidos a partir de tecnologías in vivo, los anticuerpos contra complejos (por ejemplo, virus, polipéptidos de canal) o antígenos citoplasmáticos sigue siendo difícil. Además, la generación de anticuerpos contra polipéptidos que compartan un alto grado de identidad de secuencia entre especies (por ejemplo, seres humanos y ratones) sigue siendo un reto debido a la tolerancia inmunitaria.
Por tanto, la presente invención, entre otras cosas, se basa en el reconocimiento de que la construcción de un sistema in vivo caracterizado por la producción de anticuerpos que tienen un anclaje para ayudar a amarrar la inmunoglobulina a un antígeno de interés (por ejemplo, el receptor afín del anclaje) y aumentar la afinidad del mismo al antígeno, ya sea contribuyendo a la avidez de la molécula a través de su propia afinidad por su receptor afín y/o permitiendo la hipermutación somática de un repertorio más amplio de inmunoglobulinas capaces de reconocer el receptor afín.
Se pueden emplear animales no humanos para elaborar un anticuerpo humano, donde el anticuerpo humano comprende dominios variables procedentes de una o más secuencias de ácidos nucleicos de región variable codificadas por material genético de una célula de un animal no humano como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un animal no humano proporcionado se inmuniza con un antígeno de interés (por ejemplo, un receptor que es afín al anclaje) en condiciones y durante un tiempo suficientes para que el animal no humano desarrolle una respuesta inmunitaria a dicho antígeno de interés. Los anticuerpos se aíslan del animal no humano (o una o más células, por ejemplo, uno o más linfocitos B) y se caracterizan usando varios ensayos que miden, por ejemplo, la afinidad, especificidad, cartografiado de epítopos, capacidad para bloquear la interacción ligando-receptor, activación del receptor de inhibición, etc. En algunas realizaciones, los anticuerpos producidos por los animales no humanos proporcionados comprenden uno o más dominios variables humanos que proceden de una o más secuencias de nucleótidos de región variable humanas aisladas del animal no humano.
Los animales no humanos como se describen en el presente documento proporcionan un sistema in vivo mejorado y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células) para producir anticuerpos humanos que son útiles para una variedad de ensayos. En algunos aspectos, los animales no humanos proporcionados se utilizan para desarrollar tratamientos dirigidos a uno o varios receptores de un par receptor ligando, como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, los animales no humanos proporcionados se utilizan para identificar, cribar y/o desarrollar productos terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos, etc.) que se unen a uno o más polipéptidos receptores acoplados a proteínas G (GPCR). En algunos aspectos, los animales no humanos proporcionados se utilizan para cribar y desarrollar candidatos terapéuticos (por ejemplo, anticuerpos, etc.) que bloquean la actividad de una o más tirosina quinasas receptoras, uno o más polipéptidos GPCR humanos, uno o más receptores Notch, uno o más de CD28, CTLA4 y PD1, un receptor de plexina, un LDLR, un LILR, un KIR, una integrina o un NPR, por ejemplo, NPR3. En algunos aspectos, los animales no humanos proporcionados se utilizan para determinar el perfil de unión de antagonistas y/o agonistas de uno o más polipéptidos GPCR humanos, uno o más receptores Notch, uno o más de CD28, CTLA4 y PD1, un receptor de plexina, un LDLR, un LILR, un KIR, una integrina o un NPR, por ejemplo, NPR3. En algunos aspectos, los animales no humanos proporcionados se utilizan para determinar el epítopo o epítopos de uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos que se unen a uno o más polipéptidos GPCR humanos, uno o más receptores Notch, uno o más de CD28, CTLA4 y PD1, un receptor de plexina, un LDLR, un LILR, un KIR, una integrina o un NPR, por ejemplo, NPR3.
En algunos aspectos, los animales no humanos proporcionados se utilizan para determinar los perfiles farmacocinéticos de los anticuerpos. En algunos aspectos, uno o más de los animales no humanos proporcionados y uno o más de los animales no humanos de control o de referencia se exponen cada uno a uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos a diversas dosis (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg o 50 mg/kg o más). Los anticuerpos terapéuticos candidatos pueden dosificarse mediante cualquier vía de administración deseada, incluyendo las vías de administración parenteral y no parenteral. Las vías parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras vías de inyección. Las vías no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, yugal, vaginal, ocular. La administración también puede ser por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares) y/o inyección intravenosa, por ejemplo, utilizando una bolsa de líquido intravenoso. La sangre se aísla de animales no humanos (humanizados y de control) en varios puntos temporales (por ejemplo, 0 h, 6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días o hasta 30 o más días). Se pueden realizar diversos ensayos para determinar los perfiles farmacocinéticos de los anticuerpos terapéuticos candidatos administrados usando muestras obtenidas de animales no humanos como se describe en el presente documento, incluyendo, pero sin limitación, IgG total, respuesta de anticuerpos antiterapéuticos, aglutinación, etc.
En algunos aspectos, los animales no humanos proporcionados expresan anticuerpos, por tanto, las células, estirpes celulares y cultivos celulares se pueden generar para que sirvan como fuente de anticuerpos para su uso en ensayos de unión y funcionales, por ejemplo, para analizar la unión o función de un antagonista o agonista, particularmente cuando el antagonista o agonista es específico para una secuencia polipeptídica o epítopo humanos o, como alternativa, específico para una secuencia polipeptídica o un epítopo humanos que funciona en la interacción (unión) ligando-receptor. En algunos aspectos, los epítopos unidos por anticuerpos terapéuticos candidatos o ARNip se pueden determinar usando células aisladas de los animales no humanos proporcionados.
En algunas realizaciones, las células de los animales no humanos proporcionados se pueden aislar y utilizar de forma ad hoc, o se pueden mantener en cultivo durante muchas generaciones. En algunas realizaciones, las células de un animal no humano proporcionado se inmortalizan (por ejemplo, mediante el uso de un virus) y se mantienen en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie).
En algunas realizaciones, los animales no humanos como se describen en el presente documento proporcionan un sistema in vivo para la generación de variantes de anticuerpos que se unen a un antígeno diana humano. Dichas variantes incluyen anticuerpos que tienen una funcionalidad, especificidad y baja reactividad cruzada deseadas a un epítopo común compartido por dos o más antígenos diana humanos. En algunas realizaciones, los animales no humanos proporcionados se emplean para generar grupos de anticuerpos para generar una serie de variantes de anticuerpos que se exploran para determinar una funcionalidad deseada o mejorada.
En algunas realizaciones, los animales no humanos como se describen en el presente documento proporcionan un sistema in vivo para generar bibliotecas de anticuerpos. Dichas bibliotecas proporcionan una fuente de secuencias de región variable de cadena ligera y pesada que pueden injertarse en diferentes regiones Fc en función de una función efectora deseada y/o usarse como fuente para la maduración por afinidad de la secuencia de región variable usando técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, PCR propensa a errores, etc.).
Kits
La presente divulgación se refiere además a un envase o kit que comprende uno o más recipientes llenos de al menos un animal no humano, célula no humana, fragmento de ADN y/o vector de direccionamiento como se describe en el presente documento. Los kits pueden usarse en cualquier método aplicable (por ejemplo, un método de investigación). Opcionalmente, asociado a tal(es) recipiente(s), puede haber un aviso en la forma prescrita por un organismo estatal que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyo aviso refleja (a) la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para la administración a seres humanos, (b) instrucciones de uso, o ambos o un contrato que rige la transferencia de materiales y/o productos biológicos (por ejemplo, un animal no humano o una célula no humana como se describe en el presente documento) entre dos o más entidades.
Otras características de realizaciones descritas resultarán evidentes en el curso de las siguientes descripciones de realizaciones ilustrativas, que se dan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de las mismas.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la materia cómo preparar y usar los métodos y composiciones divulgados en el presente documento. A menos que se indique de otro modo, la temperatura se indica en grados Celsius y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.
Ejem plo 1. C onstrucción de una región variable de inm unoglobulina que com prende un segm ento génico de región variable de inm unoglobulina m odificado con ANP
Este ejemplo no limitante ilustra la construcción de un vector de direccionamiento para la integración de un segmento génico de región variable (V) de inmunoglobulina (Ig) modificado por anclaje en una región variable de inmunoglobulina de un locus de inmunoglobulina. Como se describe a continuación, la secuencia codificante de la cola carboxiterminal del ANP se coloca en unión operativa con un segmento génico V de Ig, cuyo segmento V de Ig modificado puede colocarse en unión operativa con segmentos génicos de unión (J) de Ig y, si procede, segmentos génicos de diversidad (D) de Ig, de modo que tras la recombinación V(D)J, se expresan anticuerpos que comprenden colas carboxiterminal del ANP en el extremo N de una cadena polipeptídica de inmunoglobulina.
Mediante la tecnología VELOCIGENE® se creó un vector de direccionamiento que contenía un segmento génico V<h>modificado con ANP para su inserción en una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.586.251 y Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21 (6):652-659) y técnicas de biología molecular conocidas en la materia. En lasfiguras 1 y 2se expone una estrategia ilustrativa no limitante para construir un vector de direccionamiento usando secuencias que codifican la cola carboxiterminal del ANP.
Un fragmento de ADN donante que comprende la cola carboxiterminal del ANP insertada en el segmento génico V<h>1-69 de la estirpe germinal a través de una secuencia que codifica un enlazador peptídico se fabricó mediante síntesis de ADN de novo (Blue Heron Biotech, Bothell, WA). En lafigura 1se muestra el fragmento donante "p466090" ANP-V<h>1-69 Cas9. Se ligó un casete de resistencia a la espectinomicina "SPEC" en los sitios EcoRI y AvrII del plásmido donante p46609 para obtener el plásmido p46685(Figura 1). En laFigura 2se muestra una ilustración más detallada del plásmido donante p46609 resultante.
El fragmento donante se utilizó para modificar el clon BAC VI504 (MAID6211). Véase lafigura 2. El clon BAC VI504 comprende, de 5' a 3', un brazo de homología de ratón de ~20 kb en 5', un fragmento 1-Ceul-Ascl de ~15 kb que contiene el gen Adam6a "a" de ratón, un casete Frt-Ub-Hyg-Frt y el gen Adam6b "b" de ratón, un fragmento Asc1-AsiSI de ~9 kb que contiene el gen de V<h>1-69 de la estirpe germinal humana, un fragmento de ~60 kb que contiene los genes de D<h>y J<h>humanos y un brazo de homología de ratón de ~8 kb en 3' que contiene el potenciador intrónico de IgH de ratón (óvalo relleno), la región de cambio de IgM y parte del gen de IgM de ratón(Figura 3).
En la etapa 1, VI504 se digirió in vitro con Cas9 complejado con una mezcla de dos ARNg que cortan en 5' y 3' del gen de V<h>1-69 de la estirpe germinal humana. Los extremos 3' y 5' resultantes tienen solapamientos de 60 pb con los extremos de p46685. A continuación, los fragmentos Xhol de p46685 se ensamblaron con VI504 (MAID6211) mediante ensamblaje Gibson para obtener VI738. En la etapa 2, VI738 se digirió con Mrel para eliminar el casete de resistencia a la espectinomicina. A continuación, el BAC se reparó mediante ensamblaje de Gibson mediado por oligonucleótidos de unión, dejando una unión sin costuras (AMrel) para formar los LTVEC finales VI748 (MAID6833). El LTVEC era idéntico al VI504 excepto por la inserción de los codones ANP-G4S en VI748.
El ensamblaje correcto de los fragmentos donantes descritos y la sustitución dirigida del segmento génico V<h>1-69 de la estirpe germinal (GL) del clon BAC VI504 por el segmento génico V<h>1-69 modificado por NP, tal como se describe en el presente documento, se confirmó mediante secuenciación y reacción en cadena de la polimerasa a lo largo de la construcción del vector de direccionamiento utilizando los cebadores expuestos en la tabla 1.
Tabla 1
continuación
Ejem plo 2. Generación de roedores que com prenden un segm ento génico V<h>m odificado con NP
Este ejemplo demuestra la producción de animales no humanos (por ejemplo, roedores) cuyo genoma comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que incluye un segmento génico V<h>modificado con NP, por ejemplo, un segmento génico V<h>que comprende una cola carboxiterminal del ANP.
El vector de direccionamiento VI748 se linealizó y electroporó en células madre embrionarias de ratón que tenían un genoma homocigótico para un locus de región variable de cadena pesada de Ig endógeno que comprendía una eliminación de todos los segmentos V<h>, D<h>y J<h>endógenos excepto para el segmento V<h>1-86 en 5' (1115KO), y para un locus de región variable de cadena ligera k de endógeno que comprendía una sustitución de todos los segmentos V<k>y J<k>endógenos con el repertorio completo de segmentos V<k>y J<k>humanos. En lafigura 4se representa el locus de la cadena pesada de Ig de la célula Es (con un acervo 50 % Balb, 25 % C57BL/6 y 25 % 129) utilizada para la electroporación de cada vector de direccionamiento. Después de la electroporación, las células electroporadas se cultivaron en medio de selección. Las colonias resistentes a fármacos se recogieron 10 días después de la electroporación y se cribaron mediante TAQMAN™ y cariotipificación para determinar el direccionamiento correcto como se ha descrito previamente (Valenzuela et al., citado anteriormente, Frendewey, D. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:295-307) utilizando un conjunto cebador/sonda que detectaba la integración adecuada del segmento génico V<h>1-69 modificado por anclaje.
Cebador directo: TGTGTCCTGTCCACAGGTG (SEQ ID NO: 34)
Sonda: CCAGTCCAACAGTTCCGGTACG (SEQ ID NO: 35)
Cebador inverso: CAGCTGGACCTGGCTACC (SEQ ID NO: 36)
El método VELOCIMOUSE® (DeChiara, T. M. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:285-294; DeChiara, T. M., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirou et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99), en el que se inyectaron células ES dirigidas en embriones Swiss Webster en estadio de 8 células sin compactar, para producir ratones sanos de generación F0 procedentes totalmente de células ES que sean heterocigotos para el segmento V<h>modificado por anclaje (ANP) y que expresen anticuerpos modificados por anclaje (ANP). Dichos ratones modificados se denominan en el presente documento ratones modificados ANP-V<h>1-69.
El casete de selección de fármacos puede eliminarse opcionalmente mediante la adición posterior de una recombinasa (por ejemplo, mediante tratamiento con Cre) o cruzándolos con una cepa de ratón eliminador de Cre (no forma parte de la invención) (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2009/114400) a fin de eliminar cualquier casete de selección con Iox introducido mediante la construcción de direccionamiento que no se elimina, por ejemplo, en la fase de célula ES o en el embrión. Opcionalmente, se conserva el casete de selección en los ratones.
Ejem plo 3. Fenotipado inm unitario de roedores m ediante análisis de citom etría de flu jo
Para determinar el fenotipo inmunitario de los ratones modificados con ANP-V<h>1-69, se analizaron linfocitos B de la médula ósea y esplénicos mediante citometría de flujo. Para este estudio, dos ratones de control VELOCIMMUNE® (véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 8.502.018; 8.642.835; 8.697.940) y tres ratones modificados con ANP-V<h>1-69 descritos en el ejemplo 2 se sacrificaron y se recogieron sus bazos y médula ósea. Se recogió médula ósea de los fémures mediante centrifugación a 8.000 rpm durante 2 minutos. Se disociaron los bazos para obtener suspensiones de células individuales. Los glóbulos rojos de las preparaciones del bazo y de la médula ósea se lisaron con tampón de lisis ACK, seguido de un lavado con DPBS que contenía FBS al 2 %. Las células aisladas (un total de 1 x 106) se incubaron con anti-CD16/CD32 de ratón (clon 2.4G2, BD) en hielo durante 10 minutos, seguido del marcaje con los grupos de anticuerpos descritos en la tabla 2 durante 30 minutos en hielo.
Tabla 2: Grupos de Ac utilizados para citometría de flujo
Después de la tinción, las células se lavaron y se fijaron en formaldehído al 2 %. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo BD LSRFortessa y se analizaron con el programa informático FlowJo. Los subconjuntos de células se identificaron mediante las siguientes estrategias. Maduración de la médula ósea: linfocitos B inmaduros (B220int IgM+), linfocitos B maduros (B220elevado IgM+), prolinfocitos B (IgM-B220int, c-KitintCD43elevado), prelinfocitos B (IgM-B220int, c-Kit-CD43int). Kappa/lambda de bazo y médula ósea: Linfocitos B (CD19+ CD3-), Linfocitos T (CD3+ CD19-), Linfocitos B IgK+ (CD19+ IgK+ IgL-), Linfocitos B IgL+ (CD19+ IgK-IgL+). Maduración del bazo: linfocitos B maduros (CD19+, B220+ CD93-), linfocitos B foliculares (CD19+, B220+ CD93-, CD21/35int IgMint/+), linfocitos B de la zona marginal (CD19+, B220+ CD93-, CD21/35+ IgM+), linfocitos B de transición (CD19+, B220+ CD93+), linfocitos B T1 (CD19+, B220+ CD93+, IgM+ CD23-), linfocitos B T2 (CD19+, B220+ CD93+, IgM+ CD23+) y linfocitos B T3 (CD19+, B220+ CD93+, IgMint CD23+).
Como se muestra en lasfiguras 5A a 5F, en el bazo, había niveles similares de linfocitos B en los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 en comparación con los ratones de control VELOCIMMUNE®. La frecuencia de linfocitos B maduros en los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 parece ser similar a la observada en los ratones de control VELOCIMMUNE®, sin embargo, hubo una ligera disminución de células inmaduras en los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 en comparación con los ratones de control VELOCIMMUNE®. En el bazo, las frecuencias de linfocitos B lambda y kappa positivos son similares en los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 en comparación con los ratones de control VELOCIMMUNE®.
Como se muestra en lasfiguras 6A a 6F, en la médula ósea, había niveles similares de linfocitos B en los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 en comparación con ratones de control VELOCIMMUNE®. En la médula ósea, había más prolinfocitos B y menos prelinfocitos B en los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 en comparación con los ratones de control VELOCIMMUNE®. Hay menos linfocitos B maduros y más inmaduros en la médula ósea de los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 en comparación con los ratones de control VELOCIMMUNE®.
Para determinar además el fenotipo inmunitario de los ratones modificados con ANP-V<h>1-69, se analizaron los niveles de IgG de ratón mediante transferencia de Western. Para el ensayo, se extrajo sangre de un subconjunto de ratones modificados con ANP-V<h>-1-69 y de ratones de control VELOCIMMUNE®. El suero se recogió en tubos separadores de suero (BD), se incubó durante 30 minutos y se separó de la sangre mediante centrifugación a 9000 fcr durante cinco minutos a 4 °C. Los sueros de ratón se diluyeron 1:25 en PBS y se pasaron por geles Novex Tris-Glicina al 4 20 % en condiciones no reductoras. Los geles se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de acuerdo con las especificaciones del fabricante (BioRad Trans-Blot Transfer System). A continuación, las transferencias se bloquearon durante una noche con leche desnatada al 10 % en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 al 0,05 % (TBST, Sigma). Las membranas de PVDF se incubaron con anti-IgG de ratón-HRP (Thermo/Pierce, n.° de cat. 31432) diluido 1:20.000 en leche descremada al 4 % en TBST durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, las transferencias se lavaron cinco veces durante cinco minutos por lavado y se revelaron posteriormente durante un minuto con el reactivo de detección por transferencia de western Amersham EC (GE Healthcare Life Sciences) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A continuación, se obtuvieron imágenes de las transferencias usando un sistema de documentación en gel de cámara CCD refrigerado ImageQuant LAS-4000 de GE Healthcare. Las imágenes se capturaron a intervalos de 15 segundos hasta que se capturaron 20 imágenes o las imágenes estuvieron completamente expuestas, lo que sucediese primero.
Como se muestra en lafigura 7, los niveles séricos de IgG eran comparables entre los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 y los ratones de control VELOCIMMUNE®, según las mediciones de transferencia de Western. Este resultado sugiere que los ratones ANP de diseño V tienen niveles normales de Ac en comparación con los ratones de control VELOCIMMUNE®.
Para determinar además el fenotipo inmunitario de los ratones modificados con ANP-V<h>1-69, se midieron los niveles de IgM e IgG séricos totales mediante ELISA. Para el ELISA, se cubrieron las placas con 1 pg/ml de IgM+IgG+IgA antirratón (clon Ac 102445, Abeam) durante toda la noche a 4 °C. A continuación, se lavaron las placas con DPBS con Tween-20 al 0,1 % y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en BSA al 1 % en DPBS. El suero de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 o de ratones de control VELOCIMMUNE® y el patrón IgM de ratón (Biolegend, n.° de cat. 401604) o el patrón IgG de ratón (Sigma, n.° de cat. 18765) se diluyeron en serie en BSA al 1 % en DPBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavaron en DPBS con Tween-20 al 0,1 % y se detectaron IgM o IgG utilizando anti-IgM de ratón-HRP (Southern Biotech, n.° de cat. 1021 05) o anti-IgG de ratón-HRP (Southern Biotech, n.° de cat. 1030-05). Se realizaron nuevos lavados y a continuación se añadió sustrato TMB (BD). Después de permitir el desarrollo del color, la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 1 N y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas SpectraMax. Se generaron gráficos convencionales en GraphPad Prism utilizando regresión no lineal (ajuste de curva, cuatro parámetros) de los patrones IgM o IgG y se cuantificaron los niveles séricos de IgM e IgG.
Como se muestra en lasfiguras 8A y 8B, los niveles séricos de IgG medidos mediante ELISA fueron comparables entre los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 y los ratones de control VELOCIMMUNE®. Los niveles séricos de IgM medidos mediante ELISA también fueron comparables entre los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 y los ratones de control VELOCIMMUNE®. Ambos resultados sugieren que los ratones ANP tienen niveles normales de Ac en comparación con los ratones de control VELOCIMMUNE®.
La retención del anclaje por los anticuerpos se verificó mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS). La inmunoglobulina aislada del suero de ratón mediante perlas magnéticas de proteína A (Thermo Scientific) se analizó en condiciones reductoras mediante gel SDS-PAGE para separar las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina se extirparon y digirieron con enzima Lys-C (Promega) durante la noche. Las sales se eliminaron de los digeridos con un C18 Ziptip (Millipore) siguiendo el protocolo del fabricante. Los péptidos se eluyeron de cada Ziptip en 2,5 pl de ACN al 70 %/TFA al 0,1 % que contenía 10 mg/ml de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) y se aplicaron directamente a un Bruker Anchorchip Target (Bruker Daltonics) mezclado con ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (Protea), que se disolvió en acetonitrilo al 70 % ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 %. Tras secar, cada diana se analizó mediante espectrometría de masas por ionización de desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) en Bruker Ultraflextreme MALDI MS (Bruker Daltonics) en modo reflextron-positivo.
MALD1-TOF MS sugiere que las inmunoglobulinas modificadas con ANP permanecen inalteradas en el suero de ratones modificados con a NP-V<h>-1-69 (datos no mostrados).
Ejem plo 4. Producción de anticuerpos en roedores que contienen segm entos génicos de región variable de inm unoglobulina genom odificados
Este ejemplo demuestra la producción de anticuerpos en un roedor cuyo genoma comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que incluye un segmento génico de región variable de inmunoglobulina como se describe en el presente documento. Los métodos descritos en este ejemplo y/o los métodos de inmunización bien conocidos en la materia, se pueden utilizar para inmunizar roedores que contienen un segmento génico de región variable de inmunoglobulina genomodificado como se describe en el presente documento con polipéptidos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, péptidos procedentes de un epítopo deseado), o una combinación de polipéptidos o fragmentos de los mismos, según se desee.
Brevemente, las cohortes de ratones que incluyen un segmento génico de región variable de inmunoglobulina genomodificado como se describe en el presente documento se estimulan con un antígeno de interés, por ejemplo, un receptor de un polipéptido no inmunoglobulina de interés que se une a un receptor afín, mediante métodos de inmunización conocidos en la materia. La respuesta inmunitaria del anticuerpo se controla mediante un inmunoensayo ELISA (es decir, valor en suero).
Inmunización
Se inmunizaron ratones de control VELOCIMMUNE® (n = 3) y modificados con ANP-V<h>1-69 (n=4) con un inmunógeno proteico compuesto por el dominio extracelular de NPR3 fusionado a un marcador mFc carboxiterminal (denominado NPR3 ecto-mFc humano) utilizando protocolos de inmunización convencionales. Se extrajo sangre de los ratones antes del inicio de la inmunización y después de los refuerzos con inmunógeno. Las últimas extracciones de sangre previas a la eutanasia de los ratones para el aislamiento de anticuerpos se sometieron a un análisis de valores en una proteína NPR3 humana (compuesta por el dominio extracelular de NPR3 fusionado a un marcador carboxiterminal de myc-myc-hexahistidina; denominada NPR3 ecto-MMH humana) y células que expresan NPR3 humana genomodificadas (células HEK293 genomodificadas para sobreexpresar NPR3 humana completa; denominadas células 293/hNPR3).
Determinación del valor antisuero
Los valores de los anticuerpos en suero contra NPR3 se determinaron mediante ELISA. Noventa y seis placas de microvaloración (Pierce) se recubrieron con antígeno NPR3 anti-MMH humano a 2 pg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Irvine Scientific) durante una noche a 4 °C. Las placas se lavaron con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 % (PBS-T, Sigma-Aldrich) y se bloquearon con 250 pl de seroalbúmina bovina al 0,5 % (BSA, Sigma-Aldrich) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS-T. Los antisueros preinmunitarios e inmunitarios se diluyeron tres veces en serie en BSA-PBS al 0,5 % y se añadieron a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas y se añadieron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano de caballo (HRP) anti-IgG-Fc de ratón (Jackson ImmunoResearch) en dilución 1:5000 a las placas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas y se revelaron utilizando TMB/H2O2 como sustrato mediante la incubación durante 15 a 20 minutos. La reacción se detuvo con ácido y las placas se leyeron en un espectrofotómetro (Victor, Perkin Elmer) a 450 nm. Los valores de los anticuerpos se calcularon mediante el programa informático Graphpad PRISM. El valor se definió como el factor de dilución del suero interpolado cuya señal de unión es 2 veces mayor que la de la base.
Valores de los anticuerpos en células
Los valores de los anticuerpos anti-NPR3 en células de genomodificadas se determinaron mediante la tecnología MULTI-ARRAY® de Meso Scale Discovery (MSD). Se recubrieron placas de electrodos de carbono de noventa y seis pocillos (de MSD) con 40.000 células por pocillo de células 293/hNPR3 o células HEK293 en PBS a 37 °C durante 1 hora. La solución de recubrimiento celular se decantó y las placas se bloquearon mediante incubación durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) con 150 pl de seroalbúmina bovina (BSA, Sigma-Aldrich) al 2 % en PBS, seguida de lavado con PBS. Los antisueros preinmunitarios e inmunitarios se diluyeron en serie tres veces en BSA-PBS al 1 % y se añadieron a las placas durante 1 h a temperatura ambiente seguido de lavado. A continuación, se añadió a las placas el anticuerpo secundario conjugado con rutenio IgG-Fc antirratón de cabra (Jackson ImmunoResearch y marcado con rutenio por la propia empresa) a 1 pg/ml y se incubó durante 1 hora a TA. El tampón de lectura 4X T sin tensioactivos de MSD se diluyó a 1X y se añadieron 150 pl a cada pocillo y se leyeron en el instrumento generador de imágenes SECTOR® de MSD. Los valores de los anticuerpos se calcularon mediante el programa informático Graphpad PRISM. El valor se definió como el factor de dilución del suero interpolado cuya señal de unión es 2 veces mayor que la de la base.
Resultados
Se determinaron las respuestas inmunitarias humorales en ratones de control VELOCIMMUNE® y modificados con ANP-V<h>1-69 utilizando proteína hNPR3 recombinante y células humanas genomodificadas que expresan NPR3 (HEK293/hNPR3) tras la inmunización con inmunógeno de ectoproteína NPR3. Los antisueros de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 (n = 4) mostraron una gama de valores elevados de anticuerpos sobre la proteína hNPR3.mmh con un valor promedio de 465.625 comparable a los valores promedio de 394.032 para la cepa de control VELOCIMMUNE® (n = 3)(Figura 9).Los valores promedio de anticuerpos de los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 en células que expresaban HEK293/hNPR3 y las células h Ek293 parentales fueron 268.763 y 3.948 respectivamente, lo que sugiere que los antisueros son específicos de NPR3. Se obtuvieron resultados similares para los ratones de control VELOCIMMUNE® con valores promedio de anticuerpos de 72.826 y 5.219 en células HEK293 que expresaban hNPR3 y células parentales HEK293 respectivamente(Figura 10). Estos resultados sugieren que los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 son capaces de generar una respuesta inmunitaria comparable a la de la cepa de ratones de control VELOCIMMUNE®.
Ejem plo 4. A islam iento de células que expresan y/o ácidos nucleicos que codifican anticuerpos producidos en roedores que contienen un segm ento génico de región variable de inm unoglobulina genom odificado
Cuando se consigue una respuesta inmunitaria deseada, los esplenocitos (y/u otro tejido linfático) se recogen y se fusionan con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas de células de hibridoma inmortales. Las líneas de células de hibridoma se exploran (p. ej., mediante un ensayo ELISA) y se seleccionan para identificar las líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos específicos de antígeno. Los hibridomas pueden caracterizarse adicionalmente por su afinidad de unión relativa e isotipo, según se desee. Mediante esta técnica se obtienen varios anticuerpos quiméricos específicos de antígeno (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de roedor).
El ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y las cadenas ligeras puede aislarse y unirse a isotipos deseables (regiones constantes) de la cadena pesada y cadena ligera para la preparación de anticuerpos completamente humanos. Dicho un anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Después, los anticuerpos completamente humanos se caracterizan por su afinidad de unión relativa y/o actividad neutralizante del antígeno de interés.
El ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno. Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de roedor y se caracterizan y seleccionan por características deseables, que incluyen afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de roedor se reemplazan por una región constante humana deseada para generar anticuerpos completamente humanos. Si bien la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable. Los anticuerpos específicos de antígeno también se aíslan directamente de linfocitos B antígeno positivos (de ratones inmunizados) sin fusión con células de mieloma, como se describe en, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.582.298. Con este método, se produjeron varios anticuerpos específicos de antígeno completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos).
De manera específica, los esplenocitos de ratones VELOCIMMUNE® inmunizados con NPR3 o ratones modificados con ANP-V<h>1-69 se tiñeron con el dominio extracelular NPR3 humano expresado con un marcador Fc humano carboxiterminal (hNPR3 ecto-hFc) y FITC-anti-mFc como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.582.298. Se aislaron linfocitos B individuales positivos para IgG y positivos para antígeno mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en pocillos separados de una placa de 384 pocillos. La RT-PCR de los genes de anticuerpos de estos linfocitos B se realizó de acuerdo con un método descrito por Wang y Stollar (Journal of Immunological Methods 2000; 244:217-225). Brevemente, los ADNc de cada linfocitos B se sintetizaron mediante una reacción de transcriptasa inversa (RT) (SUPERSCIPT™ III, Invitrogen). A continuación, cada producto de RT resultante se dividió y transfirió a dos pocillos correspondientes en placas de 384 pocillos separadas para la amplificación de las secuencias de cadena pesada y ligera. Un conjunto de los productos de RT resultantes se amplificó primero por PCR utilizando un cebador degenerado en 5' específico para la secuencia líder de región variable de cadena pesada de IgG humana y un cebador en 3' específico para la región constante de cadena pesada de ratón, para formar un amplicón. El amplicón se sometió a una segunda ronda de PCR utilizando un conjunto de cebadores degenerados en 5' específico para el marco 1 de la secuencia de región variable de cadena pesada de IgG humana o un cebador específico para el péptido ANP (sólo ratones ANP) y un conjunto de cebadores degenerados en 3' específico para el marco 4 de la secuencia de región variable de cadena pesada de IgG humana. El otro conjunto de los productos de RT resultantes se amplificó primero por PCR utilizando un conjunto de cebadores degenerado en 5' específicos para la secuencia líder de región variable de cadena ligera kappa humana y un cebador específico en 3' para la región constante de la cadena ligera kappa de ratón para formar un amplicón. Se realizó una segunda ronda de PCR en este amplicón utilizando un conjunto de cebadores degenerados en 5' específico para el marco 1 de la secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana y un conjunto de cebadores degenerados en 3' específico para el marco 4 de la secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana. Los productos de PCR de las cadenas pesada y ligera se clonaron en vectores de anticuerpos que contenían la región constante de cadena pesada de IgG1 humana y la región constante de cadena ligera kappa, respectivamente. Se produjeron anticuerpos hIgG1 recombinantes mediante transfección transitoria de células CHO K1 para su posterior cribado.
Ejem plo 5: Cribado p rim ario de sobrenadantes aislados de células CHO K1
Se caracterizaron las propiedades de unión de un grupo de anticuerpos monoclonales anti-NPR3 que contenían sobrenadantes recogidos de células transfectadas CHO K1, 146 de los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 y 65 de control VELOCIMMUNE®, a hNPR3-mmH y se determinaron los parámetros cinéticos de unión y la constante de unión de equilibrio mediante tecnología SPR.
La constante de disociación de equilibrio (K<d>) para la unión de NPR3 a diferentes anticuerpos monoclonales (AcM) de NPR3 y la velocidad de disociación a pH 6,0 se determinaron mediante un biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real utilizando un instrumento Biacore 4000. Todos los estudios de unión se realizaron en fosfato sódico 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM y tensioactivo Tween-20 (PBS-T) al 0,05 % v/v, preparado a pH 7,4 (PBS-T_pH 7,4) en tampón de funcionamiento a 25 °C. La superficie del chip sensor Biacore CM5 se derivatizó primero mediante acoplamiento de aminas con AcM de ratón específico anti-Fc humano (REGN2567) para capturar diferentes AcM de NPR3. Se inyectaron concentraciones únicas de 100 nM del ectodominio de NPR3 humano expresado con un marcador carboxiterminal myc-myc-6xHis (hNPR3-MMH) preparado en tampón de ejecución PBS-T_pH 7,4 sobre la superficie capturada por el AcM de NPR3 durante 90 s a un caudal de 30 pl/min y se controló su disociación en tampón de ejecución PBS-T_pH 7,4 durante 90 s. Después de la fase de disociación, se inyectó tampón PBS-T preparado a pH 6,0 (PBS-T_pH 6,0) durante 2 min. Al final de cada ciclo, la superficie capturada por el AcM de NPR3 se regeneró mediante una inyección de 12 segundos de ácido fosfórico 20 mM.
La velocidad de asociación (ka) y la velocidad de disociación (kd) se determinaron mediante el ajuste de los sensorgramas de unión en tiempo real a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa utilizando el programa informático de evaluación Biacore 4000, mientras que la disociación de hNPR3-MMH del AcM de NPR3 en PBS-T_pH 6,0 se determinó mediante el ajuste de la curva de disociación con el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. La constante de equilibrio de disociación de unión (K<d>) y la semivida disociativa (t1^ ) se calcularon a partir de las tasas cinéticas como:
kd 1 , , . , ln (2)
Kd(M) - , y t V 2 (mm)
60 x kd
También se calcularon los valores medios y medianos de K<d>y t1^ de los AcM de NPR3 aislados de ratones de control VELOCIMMUNE® y modificados con ANP-V<h>1-69, que se proporcionan en la tabla 3.
Los valores de K<d>y t1^ de los AcM de NPR3 aislados de ratones de control VELOCIMMUNE® y modificados con ANP-V<h>1-69 se compararon utilizando el diagrama de cajas y bigotes como se muestra en las figuras 11 y 12, respectivamente.
Los valores medios y medianos de K<d>y t1^ de los grupos de AcM de ratones modificados con ANP-V<h>-1-69 y de control VELOCIMMUNE® respectivamente se enumeran en la tabla 3, y la comparación de los valores de K<d>y t1^ se muestran en la figura 11 y la figura 12, respectivamente. Tanto los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 como los ratones de control VELOCIMMUNE® fueron capaces de generar anticuerpos en un amplio rango de afinidad, con el valor medio/mediano de K<d>más pequeño, y una t 1^ más larga, para los Ac procedentes de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 que para los procedentes de ratones de control VELOCIMMUNE®. Estos resultados sugieren que los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 pueden generar anticuerpos de alta afinidad en una población mayor que los ratones de control VELOCIMMUNE®.
Tabla 3: Mediana y media de los valores K<d>y t1^ de la unión de hNPR3-MMH a anticuerpos monoclonales (AcM) de NPR3 aislados de ratones de control VELOCIMMUNE® y modificados con ANP-V<h>1-69 a 25 °C
Luminex
Se realizaron ensayos de unión Luminex para determinar la unión de anticuerpos aislados de ratones inmunizados con NPR3 a un grupo de antígenos NPR3. Para este ensayo, los antígenos se acoplaron con aminas a microesferas Luminex. Las microesferas para proteínas acopladas a aminas se prepararon del siguiente modo: aproximadamente 10 millones de microesferas MicroPlex (MicroPLex Microspheres, Luminex, n.° de cat. LC10000-00) se resuspendieron mediante agitación en vórtex en 500 j l de NaPO4 0,1 M, pH 6,2 (tampón de activación) y a continuación se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. Las microesferas se resuspendieron en 160 j l de tampón de activación y los grupos carboxilato (-COOH) se activaron mediante la adición de 15 j l de 50 mg/ml de N-hidroxisuccinimida (NHS, Thermo Scientific, n.° de cat. 24525) seguido de la adición de 15 j l de 50 mg/ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC, ThermoScientific, n.° de cat. 22980) a 25 °C. Después de 10 minutos, el pH de la reacción se redujo a 5,0 con la adición de 500 j l de MES 50 mM pH 5,0, y las microesferas se agitaron en vórtex seguido de centrifugación para eliminar el sobrenadante. Las microesferas activadas se mezclaron inmediatamente con 500 j l de 25 jg/m l de los antígenos proteicos [dominio extracelular NPR3 humano expresado con un marcador Fc humano carboxiterminal (hNPR3 ecto-hFc) y dominio extracelular NPR3 humano expresado con un marcador Fc de ratón carboxiterminal complejado con ANP humano (hNPR3-ecto-mFc-hANP)] en MES 50 mM pH 5,0. Se utilizó una única región de perlas por proteína/anticuerpo acoplado. La mezcla microesferas-proteína se incubó durante dos horas a 25 °C. La reacción de acoplamiento se apagó mediante la adición de 50 j l de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 y las microesferas se agitaron vorticialmente, se centrifugaron y se lavaron tres veces con 800 pl de PBS que contenía Tween20 al 0,05 %, para eliminar las proteínas no acopladas y otros componentes de la reacción. Las microesferas se resuspendieron en PBS con BSA al 2 % y Na Azida al 0,05 % a 10 millones de microesferas/ml.
Las microesferas con proteínas acopladas a aminas se mezclaron a 2700 perlas/ml, a continuación, se sembraron 75 j l de microesferas por pocillo en una placa de fondo plano con filtro de 96 pocillos (Millipore, n.° de cat: MSBVN1250) y se mezclaron con 25 j l de sobrenadantes que contenían anticuerpos individuales anti-NPR3. Las muestras y las microesferas se incubaron durante dos horas a 25 °C y, a continuación, se lavaron dos veces con 200 j l de PBS con Tween 20 al 0,05 %. Para detectar los niveles de anticuerpos unidos a microesferas individuales, 100 j l de F(ab')2 antikappa humana de cabra conjugado con 2,5 jg/m l de R-ficoeritrina (Southern Biotech, n.° de cat.
2063-09) en<p>B<s>con BSA al 2 % y Na Azida al 0,05 % y, a continuación, se incubaron durante 30 minutos a 25 °C. Las muestras se lavaron dos veces con 200 j l de PBS con Tween 20 al 0,05 % y se resuspendieron en 150 j l de PBS con Tween 20 al 0,05 %. Las placas se leyeron en un instrumento Luminex FlexMap 3D con el programa informático Luminex xPonent versión 4.2.
Los anticuerpos que se unieron a hNPR3-ecto-hFc y hNPR3-ecto-mFc-hANP con señales de unión superiores a 1000, pero inferior a 5000 y superior a 5000 se muestran en la tabla 4. En total se analizaron 439 muestras: 236 muestras de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 y 203 muestras de ratones de control VELOCIMMUNE®. Las señales de unión se midieron como intensidad media de fluorescencia (IMF). Como se muestra en la tabla 4, hubo un mayor porcentaje de anticuerpos de los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 que se unieron a hNPR3 ecto-hFc y al complejo de hNPR3 ecto-mFc-hANP >5000 en el ensayo Luminex en comparación con los anticuerpos aislados de los ratones de control VELOCIMMUNE®.
Tabla 4: Número total de anticuerpos anti-NRP3 (porcentaje) unidos a hNPR3-ecto-hFc y hNPR3-ecto-mFc-hANP acoplados a aminas en el ensayo de unión Luminex.
Capacidad de bloqueo
Se desarrolló un ensayo de bloqueo basado en ELISA para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-NPR3 para bloquear la unión de NPR3 humano a ANP humano (hANP). En este ensayo, la proteína NPR3 humana recombinante, que comprende una parte del dominio extracelular NPR3 humano (aminoácidos Gly27-Ser482) fusionada a la parte Fc de la IgG2a de ratón en el extremo C de NPR3 (hNPR3-mFc, Seq ID o n.° de registro), se absorbió pasivamente a una concentración de 2 jg/m l en PBS en una placa de microvaloración de 96 pocillos durante toda la noche a 4 °C. Posteriormente se bloquearon los sitios de unión inespecíficos utilizando una solución al 0,5 % (p/v) de BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después se lavó la placa con PBS+ tween, sobrenadantes de anticuerpos anti-NPR3 a una dilución de 1:10 o se añadió 1 jg/m l de anticuerpo de control de isotipo IgG1 humano no unido. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y a continuación se añadió la hANP biotinilada recombinante (biotina-hANP; Phoenix Pharmaceuticals INC, Burlingame, CA) a una concentración final de 200 pM y se incubó durante 1 hora. La concentración de biotina-hANP se encontraba en el intervalo dinámico de la unión dependiente de la dosis de biotina-hANP a la hNPR3 recubierta con placa cerca del valor CE50. La placa se lavó y la biotina-hANP unida a la placa se detectó con 100 ng/ml de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) y se visualizó utilizando una solución de sustrato TMB (BD Biosciences, San Jose, CA) de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante. La absorbancia a 450 nm se midió en un lector de placas multimodo Victor™ (PerkinElmer™).
El porcentaje de bloqueo de los anticuerpos anti-NPR3 ensayados se calculó mediante la fórmula siguiente:
[Señal experimental(probado en anti- NPR3) - Señal de fondo(tampón)] \ ^ o
% de bloqueo = 100 —
[Señal máxima(biotina-hANP sola)
Los anticuerpos que bloquearon la unión de biotina-hANP a hNPR3 en más o igual al 50 % se clasificaron como bloqueantes.
Se evaluó la capacidad de los sobrenadantes de anticuerpos anti-NPR3 del ratones de control VELOCIMMUNE® y modificados con ANP-V<h>1-69 para bloquear la unión del ANP humano al NPR3 humano mediante un ensayo de bloqueo basado en ELISA. Como se observa en la tabla 5, se probaron 338 sobrenadantes de anticuerpos anti-NPR3 para bloquear la unión del ANP humano al NPR3 humano, donde 125 procedían de ratones de control VELOCIMMUNE® y 213 de ratones modificados con ANP-V<h>1-69. Ciento treinta y cuatro sobrenadantes de anticuerpos anti-NPR3 bloquearon la unión de hNPR3-mFc a biotina-hANP con un porcentaje de bloqueo mayor o igual al 50 %. De los 134 bloqueadores, 17 se aislaron de ratones de control VELOCIMMUNE® y 117 de ratones modificados con ANP-V<h>1-69, que fueron el 14 % y el 55 % del número de anticuerpos analizados de los ratones de control VELOCIMMUNE® y de los ratones modificados con ANP-V<h>1-69, respectivamente. De los 50 mejores bloqueadores, 7 procedían de ratones de control VELOCIMMUNE® y 43 de ratones modificados con ANP-V<h>1-69, que representan el 6 % y el 20 % del total de AcM probados de las dos cepas de ratones, respectivamente.
En este experimento, el anticuerpo de control de isotipo IgG1 humano mostró un porcentaje de bloqueo del 32 % y se clasificó como no bloqueante.
En conjunto, los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 produjeron más anticuerpos que se unieron a NPR3 con alta especificidad y bloquearon la unión de la proteína NPR3 recombinante a ANP humano que la de los ratones de control VELOCIMMUNE®.
Tabla 5. Sumario de los sobrenadantes de anticuerpos anti-NPR3 que bloquean la unión del ANP humano al NPR3-mFc humano.
La capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-NPR3 humano aislados de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 y de ratones de control VELOCIMMUNE® inmunizados con la proteína recombinante NPR3 para unirse a células que expresan NPR3 humano (hNPR3) se determinó mediante un ensayo basado en electroquimioluminiscencia (ECL).
Brevemente, las células HEK293 se genomodificaron para que expresaran NPR3 humano transfectándolas con el plásmido de expresión pLVXN.NPR3 resistente a la neomicina, que codifica NPR3 humano (aminoácidos M1-A541), UniProtKB - P17342). Las células HEK293 no transfectadas que no mostraron expresión detectable de NPR3 mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) con péptido natriurético auricular (ANP) comercial se incluyeron en el experimento como control de unión de fondo. Se incluyeron un anticuerpo IgG1 humano antialérgeno y un anticuerpo IgG2 de ratón antiidiotipo como controles de anticuerpos irrelevantes para la unión.
Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el siguiente procedimiento. Las células que expresaban NPR3 y las células parentales cultivadas en matraces se enjuagaron una vez en tampón 1xPBS sin Ca2+/Mg2+ y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C con Enzyme Free Cell Dissociation Solution para desprender las células. Los sedimentos celulares se lavaron una vez con 1xPBS con Ca2+/Mg2+ y se contaron con un contador celular CellometerTM Auto T4 (Nexcelom Bioscience, Lorenzo, MA). Se sembraron por separado aproximadamente 2,0 * 104 células HEK293/hNPR3 o HEK293 por pocillo en placas de electrodos de carbono de 96 pocillos (Meso Scale Discovery, Rockville, MD) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C para permitir la adhesión de las células. Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon mediante la incubación con BSA al 2 % (p/v) en 1xPBS con Ca2+/Mg2+ durante 1 hora a temperatura ambiente. A las células unidas en la placa, se añadieron sobrenadantes de anticuerpos anti-NPR3 a una dilución de 1:10 o 0,2 |jg/ml de anticuerpos de control, seguidos de 1 hora de incubación a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron las placas para eliminar los anticuerpos no unidos utilizando un lavador de placas AquaMax2000 con cabezal de lavado celular (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA). La IgG humana unida a la placa se detectó con un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana conjugado con SULFO-TAGTM específico para cadenas pesadas y ligeras (Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, PA) y la IgG de ratón unida a la placa (el anticuerpo comercial NPR3 y el anticuerpo de control del isotipo mlgG) se detectó con el anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón conjugado con SULFO-TAGTM específico para el fragmento Fcy (Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, PA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de los lavados, las placas se revelaron con tampón de lectura (Meso Scale Discovery, Rockville, MD) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante y las señales luminiscentes se registraron con un SECTOR Imager 600 (Meso Scale Discovery, Rockville, MD). Se calculó la proporción de señales de unión en las células HEK293/hNPR3 con respecto a las células HEK293 parentales y se comunicó como indicación de la especificidad de unión de los anticuerpos anti-NPR3. Los anticuerpos con una señal de unión en células HEK293/hNPR3 superior o igual a 200 ULR y una relación de unión superior o igual a 3 se clasificaron como aglutinantes específicos y los anticuerpos con una señal de unión inferior a 200 ULR o una relación de unión inferior a 3 se clasificaron como aglutinantes inespecíficos o no aglutinantes.
Resultados:
La capacidad del anticuerpo anti-NPR3 aislado del control VELOCIMMUNE® y de los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 para unirse específicamente a células HEK293 que expresan NPR3 se evaluó en un ensayo de unión basado en electroquimioluminiscencia.
Los resultados experimentales se muestran en la tabla 6. Se analizó la unión de un total de 338 anticuerpos anti-NPR3 en sobrenadantes brutos a células HEK293/hNPR3, de los cuales 125 anticuerpos se aislaron de ratones de control VELOCIMMUNE® y 213 anticuerpos de ratones modificados con ANP-V<h>1-69. Un total de 250 anticuerpos anti-NPR3, 62 de control VELOCIMMUNE® y 188 de ratones modificados con ANP-V<h>1-69, mostraron señales de unión superiores o iguales a 200 ULR en células HEK293/hNPR3 y relaciones de unión en HEK293/hNPR3 respecto a HEK293 parental superiores o iguales a 3, lo que sugiere que estos anticuerpos son capaces de unirse específicamente a NPR3. El cincuenta por ciento de los anticuerpos anti-NPR3 de ratones de control VELOCIMMUNE® y en comparación, el 88 % de los ratones modificados con ANP-V<h>1-69, fueron aglutinantes específicos de NPR3. De los 50 aglutinantes específicos principales, 6 anticuerpos eran de control VELOCIMMUNE® y 44 eran de ratones modificados con ANP-V<h>1-69, lo que sugiere que el 5 % de los sobrenadantes de anticuerpos anti-NPR3 procedentes de ratones de control VELOCIMMUNE® y el 21 % de los sobrenadantes de anticuerpos anti-NPR3 procedentes de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 eran aglutinantes principales.
En el experimento, el anticuerpo comercial anti-hNPR3-mIgG2, incluido como control positivo, se unió específicamente a las células HEK293/hNPR3, y tanto los controles de isotipo de IgG1 humana como de IgG2 de ratón no se unieron a las células HEK293/hNPR3, como cabía esperar.
En conjunto, los resultados de la unión utilizando células HEK293/hNPR3 sugieren que los ratones modificados con ANP-V<h>1-69 fueron capaces de generar anticuerpos que se unieron específicamente a las células que expresan hNPR3 y la abundancia de aglutinantes de alta eficacia puede ser mayor de los anticuerpos aislados de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 que de los ratones de control VELOCIMMUNE® normales.
Tabla 6: Sumario de la unión de sobrenadantes de anticuerpos anti-NPR3 a células genomodificadas para expresar NPR3 humano.
Anticuerpos purificados
Con el fin de evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-NPR3 procedentes de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 para unirse a NPR3, se estableció una estirpe celular genomodificada en células HEK293 (riñón embrionario humano 293, ATCC) que se transfectaron para expresar de forma estable NPR3 humano de longitud completa y posteriormente se seleccionaron para obtener una expresión elevada. La estirpe celular resultante se denominó HEK293/hNPR3 de tipo principal (A<c>L n.° 9752, Regeneron).
Para la evaluación de la unión por citometría de flujo, las células HEK293/hNPR3 tipo principal se extrajeron con tampón de disociación celular sin enzimas (Millipore, n.° cat. S-004-C), se lavaron una vez y se resuspendieron en tampón de tinción (IX PBS, sin calcio ni magnesio (Irvine Scientific, n.° cat. 9240) con suero fetal bovino filtrado al 2 % (Seradigm, n.° cat. 1500-500)) y se tiñeron con colorante verde de viabilidad fijable (Life Technologies, n.° cat. L23101) antes de lavarse de nuevo y colocarse en las placas de tinción de fondo en V (Axygen Scientific, n.° cat. P-96-450-V-C-S).
Los anticuerpos purificados aislados de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 y ratones de control VELOCIMMUNE®, un anticuerpo comercial (GeneTex, GTX84015) o anticuerpos de control de isotipo se diluyeron en serie en tampón de tinción 1:3 de 100 nM a 24,4 pM (con un pocillo adicional para tampón de tinción solo sin molécula de ensayo) y se añadieron a las células en la placa de tinción.
Después de una etapa adicional de lavado, las muestras se tiñeron con anticuerpos de detección secundarios marcados con Alexa Fluor®647 [antihumano (Jackson ImmunoResearch, n.° cat. 109-607-003) y antirratón (Jackson ImmunoResearch, n.° cat. 115-607-003)] antes de la fijación con tampón de fijación CytoFix (BD Biosciences, n.° cat.
554655). Todas las muestras se filtraron a través de placas de filtro de 96 pocillos (Pall, n.° cat. 8027) en placas de lectura de fondo en U (Corning, n.° cat. 3799) antes de pasarlas por el citómetro iQue PLUS y se midió la intensidad media de fluorescencia (IMF) de cada muestra. Los datos se agruparon en el programa informático iQue Forecyt® para calcular la media geométrica de cada muestra en el canal RL1-A y los resultados se analizaron posteriormente mediante un modelo de regresión no lineal (logístico de 4 parámetros) en el programa informático Prism® 8 para obtener los valores CE50. Las veces máximas de unión se calculó mediante la siguiente ecuación:
IMF,m ed ia g eo m étr ica de RL1-A
Veces de unión
IMF,m ed ia g eo m étr ica de RL 1-A ,contro l de an ticuerpo secundario solo
En esta ecuación, "IMFmedia geométrica de<rl>1-<a>" se refiere al valor máximo de la intensidad media de fluorescencia (IMF) en el canal RL1-A de las células teñidas con los anticuerpos purificados. "IMFmedia geométrica de RL1-A, control de anticuerpo secundario solo" se refiere al valor de IMF en el canal RL1-A de células teñidas únicamente con anticuerpo secundario de detección marcado con Alexa647.
Como se muestra en la tabla 7, 12 anticuerpos anti-NPR3 purificados aislados de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 expresados con el marcador ANP ("+ANP"), 12 anticuerpos anti-NPR3 purificados aislados de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 expresados sin el marcador ANP ("-ANP") y 8 anticuerpos anti-NPR3 purificados aislados de ratones de control VELOCIMMUNE® se sometieron a pruebas de unión específica a células HEK293/hNPR3 tipo principal mediante citometría de flujo. Once de los 12 anticuerpos anti-NPR3 purificados aislados de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 expresados con el marcador ANP mostraron una unión específica a células HEK293/hNPR3, con valores de veces de unión que variaban entre 21 y 1012 con respecto al control de anticuerpo de detección secundario solo y valores de CE50 que variaban de 7,7 nM a >10 nM. Los 10 de los 12 anticuerpos anti-NPR3 purificados aislados de ratones modificados con ANP-V<h>1-69 expresados sin el marcador ANP mostraron una unión específica a células HEK293/hNPR3, con valores de veces de unión que variaban de 132 a 819 con respecto al control de anticuerpo secundario de detección solo y valores de CE50 que variaban de 6,3 nM a >10 nM. Los 8 anticuerpos anti-NPR3 purificados aislados de ratones de control VELOCIMMUNE® mostraron una unión específica a las células HEK293/hNPR3, con valores de veces de unión que variaban entre 215 y 789 con respecto al control de anticuerpo de detección secundario solo y valores de CE50 que variaban de 2,4 nM a >10 nM. Los anticuerpos de control de isotipo no mostraron unión a las células HEK293/hNPR3 y un anticuerpo comercial anti-NPR3 se unió a HEK293/hNPR3 con una unión 22 veces superior al control de anticuerpo secundario de detección solo y una CE50 de 7,6 nM.
Tabla 7
EQUIVALENTES
La descripción y los dibujos anteriores son sólo a modo de ejemplo y la invención se describe en detalle mediante las reivindicaciones que siguen.
Los expertos en la materia apreciarán los estándares típicos de desviación o error atribuibles a los valores obtenidos en ensayos u otros procesos descritos en el presente documento.
En el presente documento se hace referencia a publicaciones, sitios web y otros materiales de referencia para describir los antecedentes de la invención y proporcionar detalles adicionales sobre su práctica.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento variable (V) de inmunoglobulina (Ig) modificada que codifica un polipéptido Ig modificado por anclaje,
en donde el segmento V de Ig modificado comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el anclaje entre una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de Ig y una secuencia de ácido nucleico que codifica la región marco (FR) 1, la región determinante de la complementariedad (CDR)1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 de un segmento V de Ig de la estirpe germinal, o una variante del mismo que se selecciona del grupo que consiste en una variante polimórfica del mismo, una variante somáticamente hipermutada del mismo, una variante recombinada del mismo y una variante degenerada del mismo,
en donde el polipéptido Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa:
(i) el péptido señal de Ig,
(ii) el anclaje y
(iii) la FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento V de Ig de la estirpe germinal o la variante del mismo,
en donde el anclaje comprende una parte de unión al receptor de un polipéptido no inmunoglobulina de interés que se une a un receptor afín, y
opcionalmente, en donde la molécula de ácido nucleico carece de otros segmentos V.
2. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en donde
(a) el péptido señal de Ig es el péptido señal de Ig del segmento V de Ig de la estirpe germinal, o una variante del mismo; y/o
(b) el segmento V de Ig de la estirpe germinal o la variante del mismo es un segmento variable de cadena pesada (V<h>) de Ig de la estirpe germinal o una variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo de modo que:
el segmento V de Ig modificado es un segmento V<h>de Ig modificado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el anclaje entre la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de Ig y una secuencia de ácido nucleico que codifica la región marco (FR)1, la región determinante de la complementariedad (CDR)1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento V<h>de Ig de la estirpe germinal o la variante del mismo, y
el polipéptido Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa:
(i) el péptido señal de Ig,
(ii) el anclaje y
(iii) la FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento V<h>de Ig de la estirpe germinal o la variante del mismo; y/o
(c) el segmento V de Ig de la estirpe germinal o variante del mismo es un segmento V<h>1-2 de la estirpe germinal humana (h), un segmento I<i>V<h>1-3 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>1-8 de la estirpe germinal, un segmento hVH1-18 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>1-24 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>1-45 de la estirpe germinal, un segmento hVH1-46 de la estirpe germinal, un segmento hVH1-58 de la estirpe germinal, un segmento hVH1-69 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>2-5 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>2-26 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>2-70 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-7 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-9 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-11 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-13 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-15 de la estirpe germinal, un segmento I<i>V<h>3-16 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-20 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-21 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-23 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-30 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-30-3 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-30-5 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-33 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-35 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-38 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-43 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-48 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-49 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-53 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-64 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-66 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-72 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-73 de la estirpe germinal, un segmento hVH3-74 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-4 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-28 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-30-1 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-30-2 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-30-4 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-31 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-34 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-39 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-59 de la estirpe germinal, un segmento hVH4-61 de la estirpe germinal, un segmento hVH5-51 de la estirpe germinal, un segmento hVH6-1 de la estirpe germinal, un segmento hVH7-4-1 de la estirpe germinal, un segmento hVH7-81 de la estirpe germinal; o una variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo; y/o
(d) el segmento V de Ig de la estirpe germinal o la variante del mismo es un segmento I<i>V<h>1-69 de la estirpe germinal, o una variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo, opcionalmente, en donde el péptido señal de Ig comprende la secuencia MDWTWRFLFVVAAATGVQS (SEQ ID NO: 7).
3. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 2, que comprende:
(A) en unión operativa y de 5' a 3':
(I) el segmento V<h>de Ig modificado,
(II) uno o una pluralidad de segmentos de diversidad de cadena pesada (D<h>) de Ig, y
(III) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena pesada (J<h>) de Ig,
opcionalmente en donde:
(a) el uno o una pluralidad de segmentos D<h>de Ig de (II) comprende uno, una pluralidad de o todos los segmentos D<h>de Ig humanos, y/o el uno o una pluralidad de segmentos J<h>de Ig de (III) comprende uno, una pluralidad de o todos los segmentos J<h>de Ig humanos; y/o
(b) (1) el uno o una pluralidad de segmentos D<h>de Ig de (II) y el uno o una pluralidad de segmentos J<h>de Ig de (III) se recombinan y forman una secuencia D<h>/J<h>de Ig reordenada de tal manera que la molécula de ácido nucleico recombinante comprende en unión operativa y de 5' a 3':
el segmento V<h>de Ig modificado, y
la secuencia D<h>/J<h>de Ig reordenada, además, opcionalmente, en donde el segmento V<h>de Ig modificado y la secuencia D<h>/J<h>de Ig reordenada se recombinan y forman una secuencia V<h>/D<h>/J<h>de Ig reordenada que codifica un dominio variable de cadena pesada de Ig modificado por anclaje,
en donde el dominio variable de cadena pesada de Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa: (1) el péptido señal de Ig,
(ii) el anclaje y
(iii) la FR1, la región determinante de la complementariedad (CDR)1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 codificadas por la secuencia V<h>/D<h>/J<h>de Ig reordenada; o
(2) el segmento V<h>de Ig modificado es un segmento V<h>de Ig modificado no reordenado; y/o
(c) en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de la cadena pesada (C<h>) de Ig,
en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la C<h>de Ig se encuentra cadena abajo de y operativamente unida a
(I) el segmento V<h>de Ig modificado,
(II) el uno o una pluralidad de segmentos D<h>de Ig, y
(III) el uno o una pluralidad de segmentos J<h>de Ig,
opcionalmente, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la C<h>de Ig comprende un gen ¡gg que codifica un isotipo de IgM, un gen ¡gS que codifica un isotipo de IgD, un gen ¡gY que codifica un isotipo de IgG, un gen ¡ga que codifica un isotipo de IgA y/o un gen ¡ge que codifica un isotipo de IgE; y/o
(B) una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de Ig modificada por anclaje, en donde la cadena pesada de Ig modificada por anclaje comprende en unión operativa:
(i) el péptido señal de Ig,
(ii) el anclaje,
(iii) un dominio variable de cadena pesada de Ig que comprende FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 codificadas por una secuencia V<h>/D<h>/J<h>de Ig reordenada, y
(iv) una C<h>de Ig, opcionalmente, en donde la C<h>de Ig es una C<h>de Ig no humana, opcionalmente, en donde la C<h>de Ig no humana es una C<h>de Ig de roedor, además, opcionalmente, en donde la C<h>de Ig no humana es una C<h>de Ig de rata o una C<h>de Ig de ratón.
4. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 2(a), en donde el segmento V de Ig de la estirpe germinal o la variante del mismo es un segmento variable de cadena ligera (V<l>) de Ig de la estirpe germinal o una variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo, de modo que
el segmento V de Ig modificado es un segmento V<l>de Ig modificado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el anclaje entre la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de Ig y una secuencia de ácido nucleico que codifica la región marco (FR)1, la región determinante de la complementariedad (CDR)1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento V<l>de Ig de la estirpe germinal o la variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo, y
el polipéptido Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa:
(i) el péptido señal de Ig,
(ii) el anclaje y
(iii) la FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento V<l>de Ig de la estirpe germinal o la variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo, opcionalmente en donde: (A) la molécula de ácido nucleico recombinante comprende en unión operativa y de 5' a 3':
(I) el segmento V<l>de Ig modificado, y
(II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera (J<l>) de Ig, opcionalmente además en donde (a) el segmento V<l>de Ig modificado y el uno o una pluralidad de segmentos J<l>de Ig se recombinan y forman una secuencia V<l>/J<l>de Ig reordenada que codifica un dominio variable de cadena ligera de Ig modificado por anclaje,
en donde el dominio variable de cadena ligera de Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa: (i) el péptido señal de Ig,
(ii) el anclaje y
(iii) la FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 codificadas por la secuencia V<l>/J<l>de Ig reordenada; y/o (b) la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera (C<l>) de Ig,
en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la C<l>de Ig se encuentra cadena abajo de y operativamente unida a:
(I) el segmento V<l>de Ig modificado y
(II) el uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera (J<l>) de Ig; y/o
(B) la molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de Ig modificada por anclaje, en donde la cadena ligera de Ig modificada por anclaje comprende en unión operativa:
(i) el péptido señal de Ig,
(ii) el anclaje,
(iii) un dominio variable de cadena ligera de Ig que comprende FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 codificadas por una secuencia V<l>/J<l>de Ig reordenada, y
(iv) una C<l>de Ig, opcionalmente, en donde la C<l>de Ig es una C<l>de Ig no humana, además, opcionalmente, en donde la C<l>de Ig no humana es una C<l>de Ig de roedor, o una C<l>de Ig de rata, o una C<l>de Ig de ratón; y/o (C) el segmento V<l>de Ig de la estirpe germinal o la variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada de mismo es:
(a) un segmento variable de cadena ligera kappa (Vk) de Ig de la estirpe germinal, o variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo, de modo que
el segmento V de Ig modificado es un segmento Vk de Ig modificado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el anclaje entre la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de Ig y la secuencia de ácido nucleico que codifica la región marco (FR)1, la región determinante de la complementariedad (CDR)1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento Vk de Ig de la estirpe germinal o la variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo, y
el polipéptido Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa:
(i) el péptido señal de Ig,
(ii) el anclaje y
(iii) la FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento Vk de Ig de la estirpe germinal o la variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo,
opcionalmente, en donde el ácido nucleico recombinante comprende en unión operativa y de 5' a 3':
(I) el segmento V<k>de Ig modificado, y
(II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera kappa (J<k>) de Ig,
además, opcionalmente, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera kappa (Ck) de Ig, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la Ck de Ig se encuentra cadena abajo de y operativamente unida a:
(I) el segmento V<k>de Ig modificado, y
(II) el uno o una pluralidad de segmentos Jk de Ig; o
(b) un segmento variable de cadena ligera lambda (VA) de Ig de la estirpe germinal o una variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo de modo que
el segmento V de Ig modificado es un segmento VA de Ig modificado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el anclaje entre la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de Ig y la secuencia de ácido nucleico que codifica la región marco (FR)1, la región determinante de la complementariedad (CDR)1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento VA de Ig de la estirpe germinal o la variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo, y
el polipéptido Ig modificado por anclaje comprende en unión operativa:
(i) el péptido señal de Ig,
(ii) el anclaje y
(iii) la FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento VA de Ig de la estirpe germinal o la variante polimórfica, somáticamente hipermutada, recombinada o degenerada del mismo,
opcionalmente, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende en unión operativa y de 5' a 3':
(I) el segmento VA de Ig modificado, y
(II) uno o una pluralidad de segmentos de unión de cadena ligera lambda (JA) de Ig,
además, opcionalmente, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera lambda (CA) de Ig, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la CA de Ig se encuentra cadena abajo de y operativamente unida a:
(I) el segmento VA de Ig modificado, y
(II) el uno o una pluralidad de segmentos JA de Ig.
5. La molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:
(a) el anclaje comprende un enlazador que une la parte de unión al receptor de un polipéptido no inmunoglobulina de interés a la FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y CDR3 del segmento V de Ig de la estirpe germinal o la variante del mismo, opcionalmente, en donde el enlazador comprende la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 5); y/o
(b) el anclaje comprende la parte de unión al receptor del péptido natriurético (NPR) de un péptido natriurético (NP), opcionalmente, en donde la parte de unión al NPR del NP comprende la cola carboxiterminal del NP, y/o el NP es péptido natriurético auricular (ANP); y/o
(c) el anclaje comprende la secuencia NSFRY (SEQ ID NO: 3); y/o
(d) la molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la secuencia establecida como la SEQ ID NO: 8 o una variante degenerada de la misma, la secuencia establecida como la SEQ ID NO: 10 o una variante degenerada de la misma, la secuencia establecida como la SEQ ID NO: 11 o una variante degenerada de la misma y la secuencia establecida como la SEQ ID NO: 12 o una variante degenerada de la misma.
6. Un vector de direccionamiento que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de:
(a) una cualquiera de las reivindicaciones 1-3(A)(c) y 5, en donde el vector de direccionamiento comprende además brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena pesada de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, el locus de la cadena pesada de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante cadena arriba de y en unión operativa con una C<h>de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano es un locus de la cadena pesada de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de segmentos V<h>, D<h>y/o J<h>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde:
(i) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento V<h>no humano en el locus de la cadena pesada de Ig no humano; y/o
(ii) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a uno o más segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos D<h>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano; y/o
(iii) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<h>no humanos menos uno o todos los segmentos VH no humanos, todos los segmentos DH no humanos y todos los segmentos JH no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano; y/o
(iv) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, el locus de la cadena pesada de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena pesada de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano; y/o
(v) el brazo de homología en 5' comprende una secuencia establecida como la SEQ ID NO: 11 y/o el brazo de homología en 3' comprende una secuencia establecida como la SEQ ID NO: 12; o
(b) una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5, en donde el vector de direccionamiento comprende además brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena pesada de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, el locus de la cadena pesada de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena pesada de Ig no humana en el locus de la cadena pesada de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano es un locus de la cadena pesada de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena pesada de Ig no humano comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de segmentos V<h>, D<h>y/o J<h>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena pesada de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a uno o más segmentos V<h>no humanos, todos los segmentos D<h>no humanos, todos los segmentos J<h>no humanos y uno o más genes de C<h>no humanos en el locus de la cadena pesada de Ig no humano; o
(c) una cualquiera de las reivindicaciones 1-2(a), 4 y 5, en donde el vector de direccionamiento comprende además brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, el locus de la cadena ligera de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante cadena arriba de y en unión operativa con una C<l>de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano es un locus de la cadena ligera de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos V<l>y/o J<l>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano,
(i) la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento V<l>no humano en el locus de la cadena ligera de Ig no humano; y/o
(ii) la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos V<l>no humanos y todos los segmentos J<l>no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano y/o
(iii) la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<l>no humanos y todos los segmentos J<h>no humanos en el locus de la cadena ligera de Ig no humano; y/o
(iv) el locus de la cadena ligera de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano; o
(d) una cualquiera de las reivindicaciones 1-2(a) y 4-5(c), en donde el vector de direccionamiento comprende además brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, el locus de la cadena ligera de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera de Ig no humana en el locus de la cadena ligera de Ig no humano, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano es un locus de la cadena ligera de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos V<l>y/o J<l>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos V<l>no humanos, todos los segmentos J<l>no humanos y el gen de C<l>no humano en el locus de la cadena ligera de Ig no humano; o
(e) una cualquiera de las reivindicaciones 1-2(a), 4 y 5, en donde el vector de direccionamiento comprende además brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera k de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, el locus de la cadena ligera k de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante cadena arriba de una Ck de Ig no humana en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano y en unión operativa con ella, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano es un locus de la cadena ligera<k>de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos V<k>y/o J<k>de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde
(i) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento Vk no humano en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano; y/o
(ii) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos Vk no humanos y todos los segmentos J<k>no humanos en el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano; y/o
(iii) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos V<k>no humanos y todos los segmentos Jk no humanos en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano; y/o
(iv) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, el locus de la cadena ligera k de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera<k>de Ig no humana en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano; o
(f) una cualquiera de las reivindicaciones 1-2(a) y 4, en donde el vector de direccionamiento comprende además brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera k de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera k de Ig no humana en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano, opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera<k>de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos Vk no humanos, todos los segmentos Jk no humanos y el gen de Ck no humano en el locus de la cadena ligera k de Ig no humano; o
(g) una cualquiera de las reivindicaciones 1-2(a), 4 y 5, en donde el vector de direccionamiento comprende además brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera A de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante cadena arriba de una CA de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano y en unión operativa con ella, opcionalmente, en donde el locus de la cadena ligera A de Ig no humano es un locus de la cadena ligera A de Ig de roedor endógeno y/o en donde el locus de la cadena ligera A de Ig no humano comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana o humanizada, una eliminación de los segmentos VA y/o JA de Ig endógenos, o una combinación de los mismos, opcionalmente en donde
(i) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye a un segmento VA no humano en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano; y/o
(ii) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye uno o más segmentos VA no humanos y todos los segmentos VA no humanos en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano; y/o
(iii) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye todos los segmentos VA no humanos y todos los segmentos JA no humanos en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano; y/o
(iv) tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera A de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano; o
(h) una cualquiera de las reivindicaciones 1-2(a), 4 y 5, en donde el vector de direccionamiento comprende además brazos de homología en 5' y 3' que se dirigen a un locus de la cadena ligera A de Ig no humano, de modo que tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, el locus de la cadena ligera A de Ig no humano diana comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en unión operativa con una secuencia reguladora de cadena ligera A de Ig no humana en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, opcionalmente en donde tras la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus de la cadena ligera A de Ig no humano, la molécula de ácido nucleico recombinante sustituye segmentos VA no humanos, todos los segmentos JA no humanos y el gen de CA no humano en el locus de la cadena ligera A de Ig no humano.
7. Una célula animal no humana que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o el vector de direccionamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6(a)-(h), opcionalmente en donde el animal no humano es un roedor, opcionalmente en donde el roedor es una rata o un ratón.
8. La célula animal no humana de la reivindicación 7, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante se encuentra en un locus de Ig endógeno del genoma del animal no humano.
9. La célula animal no humana de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde la célula animal no humana es una célula madre embrionaria (ES) de rata o una célula ES de ratón.
10. Un animal no humano que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el vector de direccionamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6(a)-(h) o la célula animal no humana de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el animal no humano es un roedor, opcionalmente en donde el roedor es una rata o un ratón.
11. El animal no humano de la reivindicación 10, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante, el vector de direccionamiento o la célula animal no humana se encuentra en la estirpe germinal del animal no humano.
12. Un método in vitro de modificación de una célula aislada que comprende introducir en la célula aislada la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
13. El método in vitro de la reivindicación 12, en donde
(a) la introducción comprende poner en contacto la célula con el vector de direccionamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6(a)-(h); y/o
(b) la célula es una célula hospedadora o una célula madre embrionaria (ES); y/o
(c) la célula es una célula de roedor, opcionalmente en donde la célula de roedor es una célula de rata o una célula de ratón.
14. Un embrión de animal no humano, o un animal no humano, generado a partir de la célula madre embrionaria de la reivindicación 9 o de la reivindicación 13(b), en donde el animal no humano es un roedor, opcionalmente en donde el roedor es una rata o un ratón.
15. Un método de elaboración de un animal no humano que comprende implantar la célula ES de la reivindicación 9 o de la reivindicación 13(b) o un embrión que comprende la célula ES en un hospedador adecuado y mantener al hospedador en condiciones adecuadas durante el desarrollo de la célula ES o del embrión en progenie viable, en donde el animal no humano es un roedor, opcionalmente en donde el roedor es una rata o un ratón.
16. El animal no humano de una cualquiera de las reivindicaciones 10-11 y 14 o el animal no humano elaborado de acuerdo con el método de la reivindicación 15, en donde
(A) el animal no humano comprende, en comparación con un animal no humano de control que no comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el vector de direccionamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6(a)-(h) o la célula animal no humana de la reivindicación 7 o la reivindicación 8:
(a) un número similar de linfocitos B maduros en el bazo,
(b) un número similar de linfocitos B positivos para kappa en el bazo,
(c) un número similar de linfocitos B positivos para lambda en el bazo,
(d) un nivel similar de IgG en suero y/o
(e) un nivel similar de IgM en suero; y/o
(B) el animal no humano:
(a) es capaz de generar una respuesta inmunitaria similar a la de un animal no humano de control que no comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el vector de direccionamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6(a)-(h) o la célula animal no humana de la reivindicación 7 o la reivindicación 8; y/o
(b) comprende una pluralidad de proteínas de unión a antígeno que comprenden cada una el polipéptido Ig modificado por anclaje, opcionalmente, en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje,
en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo, o
en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje y la masa de cada proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo; y/o
(c) comprende además un receptor afín del polipéptido no inmunoglobulina de interés; y/o
(d) comprende una pluralidad de proteínas de unión a antígeno que comprenden cada una el polipéptido Ig modificado por anclaje y se unen específicamente al receptor afín del polipéptido no inmunoglobulina de interés, opcionalmente, en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje,
en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo, o
en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje y la masa de cada proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo, opcionalmente en donde
(i) el receptor afín es un receptor de péptidos natriuréticos (NPR); y/o
(ii) cada una de la pluralidad de proteínas de unión a antígeno comprende un K<d>inferior a 1 * 109 y/o una t 1^ superior a 30 minutos; y/o
(iii) al menos un 15 % de la pluralidad de proteínas de unión a antígeno bloquean la unión del receptor afín al polipéptido no inmunoglobulina de interés; y/o (iv) más del 50 % de la pluralidad de proteínas de unión a antígeno se unen al receptor afín expresado en una superficie celular; y/o
(e) el animal no humano es un roedor, opcionalmente en donde el roedor es una rata o un ratón.
17. Un método para producir una proteína de unión a antígeno u obtener un ácido nucleico que la codifique, comprendiendo el método
inmunizar con un antígeno al animal no humano de una cualquiera de las reivindicaciones 10-11, 14 y 16 o al animal no humano elaborado de acuerdo con el método de la reivindicación 15,
permitiendo que el animal no humano produzca la proteína de unión a antígeno que comprende el polipéptido Ig modificado por anclaje, o el ácido nucleico que la codifica, que se une al antígeno, opcionalmente:
en donde la masa de la proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje, en donde la masa de la proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo, o
en donde la masa de la proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje y la masa de la proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo.
18. El método de la reivindicación 17, que comprende además la recuperación de la proteína de unión a antígeno, o del ácido nucleico que la codifica, del animal no humano o de una célula animal no humana del mismo, o recuperar la célula animal no humana, opcionalmente, en donde la célula animal no humana es un linfocito B.
19. La célula animal no humana recuperada de acuerdo con el método de la reivindicación 18, opcionalmente en donde la célula animal no humana es un linfocito B, opcionalmente en donde además el linfocito B es un linfocito B de ratón.
20. Una célula de hibridoma que comprende la célula animal no humana de la reivindicación 19 fusionada con una célula de mieloma.
21. Un polipéptido Ig modificado por anclaje codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el vector de direccionamiento de la reivindicación 6(a)-(h), la célula animal no humana de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, expresada por el animal no humano de una cualquiera de las reivindicaciones 10-11 y 16, expresada por el animal no humano o la célula animal no humana elaborada de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 12, 13(a), 13(b) y 15, o elaborada de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 17-18,
en donde el polipéptido Ig modificado por anclaje comprende una secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 3 en su extremo N, opcionalmente:
en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje,
en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo, o
en donde la masa de cada proteína de unión a antígeno confirma la presencia del polipéptido Ig modificado por anclaje y la masa de cada proteína de unión a antígeno se determina mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo.
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