ES3027565T3 - Tcr and peptides - Google Patents

Abstract

TCR Y PÉPTIDOS Un receptor de células T (TCR), que se une a un péptido de la proteína del tumor de Wilms 1 (WT1) cuando lo presenta un complejo principal de histocompatibilidad (MHC). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

TCR y péptidos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a receptores de células T (TCR, por sus siglas en inglés) que se unen a péptidos derivados de la proteína 1 del tumor de Wilms (WT1, por sus siglas en inglés) cuando son presentados por un complejo mayor de histocompatibilidad. A este respecto, la presente invención se refiere a regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) que reconocen específicamente péptidos WT1.

Antecedentes de la invención

La terapia génica con receptores de células T (TCR) se basa en la transferencia genética de genes TCR de alta validez específicos de tumores a linfocitos T, lo que permite dirigirse específicamente a los antígenos tumorales deseados y dar lugar a una terapia menos tóxica y más específica y efectiva. Este enfoque ha resultado prometedor en ensayos clínicos. Uno de los principales obstáculos que limitan la explotación de la terapia génica con TCR para el tratamiento clínico de los cánceres es la falta de células T tumorales específicas y de los TCR correspondientes. Así pues, la escasa disponibilidad de TCR específicos de tumores sigue siendo un problema abierto que limita la amplia explotación de los enfoques inmunoterapéuticos basados en TCR.

La mayoría de los antígenos asociados a tumores (TAA, por sus siglas en inglés) son antígenos propios, así que las células T específicas para tales moléculas se destruyen o se anergizan debido a la tolerancia central y periférica. A pesar de ello, se ha observado la presencia natural de linfocitos T tumor específicos en donantes y pacientes sanos, particularmente en pacientes afectados por neoplasias malignas hematológicas, después de un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (allo-HSCT) en el que las frecuencias de linfocitos tumor específicos se han correlacionado con la regresión de la enfermedad (Kapp, M.et al. Bone Marrow Transplantation43,399 410 (2009); y Tyler, E.M.et al. Blood121,308-317 (2013)).

La elección de un antígeno tumoral como objetivo de los enfoques inmunoterapéuticos sigue siendo objeto de debate. Los TAA ideales se expresan en gran medida en las células tumorales, mientras que su expresión en el tejido sano es mínima.

La proteína 1 del tumor de Wilms 1 (WT1) es una proteína intracelular que codifica un factor de transcripción de dedo de zinc que desempeña un papel importante en el crecimiento y la diferenciación celular (Yang, L.et al. Leukemia21, 868-876 (2007)). WT1 se expresa ampliamente en diversos tumores hematológicos y sólidos, mientras que muestra una expresión limitante en varios tejidos sanos (por ejemplo, gónadas, útero, riñón, mesotelio, células progenitoras en diferentes tejidos). Pruebas recientes sugieren un papel de WT1 en la leucemogénesis y la tumorigénesis.

Varios ensayos clínicos en curso se basan en la generación de respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) después de la vacunación con péptidos WT1. Sin embargo, a pesar del reconocimiento de que WT1 es útil para la inmunoterapia, un pequeño número de epítopos de WT1, que están restringidos a un número limitado de alelos HLA (por sus siglas en inglés), se usan actualmente con fines de vacunación (Di Stasi, A.et al. Front. Immunol.(2015)). Uno de tales epítopos es el epítopo WT1 126-134 (RMFPNAPYL; SEQ ID NO: 255), que es presentado por el MHC (por sus siglas en inglés) codificado por el alelo HLA-A*0201 (es decir, el epítopo es HLA-A*0201 restringido).

US 2014/212888 se refiere a un método para proliferar y cultivar un CTL específico de péptidos WT1 en condiciones de dilución limitante. Usando este método, se obtuvieron CTL capaces de reconocer tanto un estado en el que un péptido específico WT1 de tipo silvestre es presentado por HLA-A*24:02 como un estado en el que un péptido específico WT1 mutante es presentado por HLA-A*24:02. WO 2016/161273 se refiere a métodos para identificar receptores de células T que se unen específicamente a un objetivo antigénico particular y pueden usarse como terapéuticos contra enfermedades.

Los epítopos restringidos HLA-A*0201 y los TCR correspondientes son de interés, ya que el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) con el haplotipo HLA-A*0201 se expresa en la gran mayoría (60 %) de la población caucásica. Por consiguiente, los TCR que se dirigen a epítopos WT1 restringidos por HLA-A*0201 son particularmente ventajosos, ya que una inmunoterapia que use tales TCR puede aplicarse ampliamente.

El epítopo WT1 126-134 se ha estudiado ampliamente en varios ensayos, solo o en combinación con antígenos tumorales adicionales. Sin embargo, informes recientes han puesto de manifiesto una gran preocupación en relación con el proceso de este epítopo en particular, que puede perjudicar su uso con fines de inmunoterapia. En particular, el epítopo WT1 126-134 es procesado más eficientemente por el inmunoproteasoma en comparación con los proteasomas estándar (Jaigirdar, A.et al. J Immunother.39(3):105-16 (2016)), lo que conduce a un reconocimiento deficiente de muchas líneas celulares tumorales HLA-A*0201 o células leucémicas primarias que expresan endógenamente WT1.

Así, sigue siendo necesario encontrar nuevos epítopos de WT1, particularmente los presentados por MHC con haplotipos HLA prevalentes (por ejemplo, HLA-A*0201).

Un epítopo restringido HLA-A*0201 procesado de forma natural que se ha identificado es WT137-45, que tiene la secuencia de aminoácidos VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157, ver por ejemplo, Smithgallet al2001;Blood98 (11 Parte 1): 121a). Sin embargo, se han descrito pocas secuencias de aminoácidos de TCR, particularmente secuencias CDR, específicas para esta secuencia peptídica (Schmitt, T.M.et al.(2017)Nat Biotechnol35: 1188 1195).

Por consiguiente, sigue habiendo necesidad de nuevos epítopos de WT 1, particularmente los restringidos a alelos HLA comunes, y necesidad de nuevos TCR capaces de unirse a epítopos de WT 1.

Breve descripción de la invención

Hemos identificado nuevos TCR que se unen a los péptidos WT 1 cuando son presentados por un MHC. Además, hemos determinado las secuencias de aminoácidos de los TCR, incluidas las secuencias de aminoácidos de sus regiones CDR, que son responsables de la especificidad de unión para WT 1. Por consiguiente, hemos demostrado que las células T que expresan TCR de acuerdo con la presente invención se dirigen específicamente a las células que sobreexpresan la proteína WT1 y las eliminan. Además, se ha demostrado que los TCR de la presente divulgación están restringidos a MHC codificados por alelos HLA de clase 1 y 2 comunes en la población caucásica, tales como HLA-A*0201 y HLA-B*3501 o HLA-B*3502.

En un aspecto, la invención proporciona un receptor de células T (TCR), que se une a un péptido de la proteína 1 del tumor de Wilms (WT1) cuando es presentado por un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), en donde el TCR comprende las siguientes secuenciasCd R:CDR1a - KALYS (SEQ ID NO: 1), CDR2a - LLKGGEQ (SEQ ID NO: 2), CDR3a - CGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3), CDR1p - SGHDY (SEQ ID NO: 6), CDR2p - FNNNVP (SEQ ID NO: 7), y CDR3p - CASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8), y en donde el TCR está restringido a HLA-A*0201.

En una realización, el TCR comprende un dominio variable de cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de identidad de secuencia dentro del mismo; y un dominio variable de cadena p que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de identidad de secuencia dentro del mismo.

En una realización, el TCR comprende una cadena a con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de identidad de secuencia dentro del mismo; y una cadena p que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 y variantes de las SEQ ID NO: 10 y 11 que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia dentro del mismo.

En una realización, la presente invención proporciona un TCR de la presente invención que comprende una cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 257 o una variante de la misma que tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, preferiblemente al menos 75 %, de identidad de secuencia dentro del mismo; y una cadena p que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 259 o una variante de la misma que tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, preferiblemente al menos 75 %, de identidad de secuencia dentro del mismo.

Un TCR de la presente invención puede unirse a un péptido WT1 que comprende la secuencia de aminoácidos APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117).

Un TCR de la presente invención puede comprender una región constante murinizada.

En una realización, el TCR de la invención es un TCR soluble.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica la cadena a de un receptor de células T (TCR) de la presente invención, y la cadena p de un TCR de la presente invención.

En una realización, el polinucleótido aislado codifica la cadena a enlazada a la cadena p. En una realización, el polinucleótido aislado codifica una o más secuencias de ARNip de interferencia corta (ARNip) y/o uno o más agentes capaces de reducir o prevenir la expresión de uno o más genes TCR endógenos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención. En una realización, el vector comprende un polinucleótido que codifica una o más cadenasc D3,CD8, un gen suicida y/o un marcador seleccionable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula aislada que comprende un TCR de la presente invención, un polinucleótido de la presente invención, o un vector de la presente invención.

En una realización, la célula comprende además un vector que codifica una o más cadenas CD3, CD8, un gen suicida y/o un marcador seleccionable.

En una realización, la célula es una célula T, un linfocito o una célula madre, tal como células madre hematopoyéticas o células madre pluripotentes inducidas (iPS, por sus siglas en inglés). La célula T, el linfocito o la célula madre pueden seleccionarse del grupo que consiste en células CD4, células CD8, células Th0, células Tc0, células Th1, células Tc1, células Th2, células Tc2, células Th17, células Th22, células T gamma/delta, células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés), células asesinas naturales T (NKT), células T doblemente negativas, células T ingenuas, células T madre con memoria, células T con memoria central, células T efectoras con memoria, células T efectoras, células madre hematopoyéticas y células madre pluripotentes.

En una realización, la célula es una célula T que ha sido aislada de un sujeto.

En una realización, se interrumpe un gen endógeno que codifica una cadena TCR a y/o un gen endógeno que codifica una cadena TCR p en la célula, preferiblemente de modo tal que el gen endógeno que codifica una cadena TCR a y/o el gen endógeno que codifica una cadena TCR p no se expresa. En una realización, el gen endógeno que codifica una cadena TCR a y/o el gen endógeno que codifica una cadena TCR p se interrumpe por la inserción de un casete de expresión que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un t Cr de la presente invención. En una realización, se interrumpen uno o más genes endógenos que codifican un MHC en la célula, preferiblemente en donde la célula es una célula T universal no alorreactiva. En una realización, se interrumpe un gen endógeno involucrado en la persistencia, expansión, actividad, resistencia a señales de agotamiento/senescencia/inhibitorias, capacidad de localización, u otras funciones de células T en la célula, preferiblemente en donde el gen endógeno involucrado en la persistencia, expansión, actividad, resistencia a señales de agotamiento/senescencia/inhibitorias, capacidad de localización u otras funciones de las células T se selecciona del grupo que consiste enPD1, TIM3, LAG3, 2B4, KLRG1, TGFbR, CD160yCTLA4;(por sus siglas en inglés, respectivamente). En una realización, el gen endógeno involucrado en la persistencia, expansión, actividad, resistencia a señales de agotamiento/senescencia/inhibitorias, capacidad de localización u otras funciones de las células T se interrumpe por la integración de un casete de expresión, en donde el casete de expresión comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un TCR de la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de una célula, que comprende el paso de introducir un vector de la invención en una célulain vitrooex vivo,por ejemplo, por transfección o transducción.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de una célula, que comprende el paso de transducir una célulain vitrooex vivo,con uno o más vectores de la presente invención.

En una realización, la célula a transducir con uno o más vectores se selecciona del grupo que consiste en células T, linfocitos o células madre, tales como células madre hematopoyéticas o células madre pluripotentes inducidas (iPS), opcionalmente la célula T, el linfocito o la célula madre puede seleccionarse del grupo que consiste en células CD4, células CD8, Células Th0, células Tc0, células Th1, células Tc1, células Th2, células Tc2, células Th17, células Th22, células T gamma/delta, células asesinas naturales (NK), células asesinas naturales T (NKT), células T doble negativas, células T ingenuas, células T madre con memoria, células T con memoria central, células T efectoras con memoria, células T efectoras, células madre hematopoyéticas y células madre pluripotentes.

En una realización, el método comprende el paso de edición de células T, que comprende interrumpir un gen endógeno, por ejemplo, un gen endógeno que codifica una cadena TCR a y/o un gen endógeno que codifica una cadena TCR p con una nucleasa artificial, preferiblemente en donde la nucleasa artificial se selecciona del grupo que consiste en nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN) y el sistema CRISPR/Cas; (por sus siglas en inglés, respectivamente).

En una realización, el método comprende el paso de edición de células T, que comprende interrumpir un gen endógeno que codifica una cadena TCR a y/o un gen endógeno que codifica una cadena TCR p con una nucleasa artificial, preferiblemente en donde la nucleasa artificial se selecciona del grupo que consiste en nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN) y el sistema CRISPR/Cas.

En una realización, el método comprende el paso de integración dirigida de un casete de expresión en el gen endógeno que codifica el gen de la cadena a del TCR y/o el gen endógeno que codifica la cadena p del TCR interrumpido por la nucleasa artificial, en donde el casete de expresión comprende un polinucleótido que codifica un TCR de la presente invención o una secuencia polinucleotídica de la presente invención.

En una realización, el método comprende el paso de interrumpir uno o más genes endógenos que codifican un MHC, preferiblemente en donde la célula preparada por el método es una célula T universal no alorreactiva.

En una realización, el método comprende el paso de interrumpir uno o más genes MHC endógenos, preferiblemente en donde la célula preparada por el método es una célula T universal no alorreactiva.

En una realización, el método comprende el paso de interrumpir uno o más genes endógenos para modificar la persistencia, expansión, actividad, resistencia a señales de agotamiento/senescencia/inhibitorias, capacidad de localización, u otras funciones de células T, preferiblemente en donde el método comprende el paso de integración dirigida de un casete de expresión en un gen endógeno involucrado en la persistencia, expansión, actividad, resistencia a señales de agotamiento/senescencia/inhibitorias, capacidad de localización, u otras funciones de células T alteradas por una nucleasa artificial, en donde el casete de expresión comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un TCR de la presente invención, preferiblemente en donde el gen endógeno se selecciona del grupo que consiste enPD1, TIM3, LAG3, 2B4, KLRG1, TGFbR, CD160yCTLA4.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula de la presente invención o una célula preparada por un método de la presente invención para usar en transferencia de células adoptivas, preferiblemente transferencia de células T adoptivas, opcionalmente la transferencia de células T adoptivas puede ser transferencia de células T adoptivas alogénicas, transferencia de células T universales no alogénicas, o transferencia de células T adoptivas autólogas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un TCR de la presente invención, un polinucleótido aislado de la presente invención, un vector de la presente invención, una célula de la presente invención, una célula preparada por un método de la presente invención, o una molécula quimérica de la presente invención para usar en terapia, opcionalmente en el tratamiento y/o prevención de una neoplasia maligna hematológica o un tumor sólido, en donde la neoplasia maligna hematológica se selecciona del grupo que consiste en leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés), leucemia mieloide crónica (CML, por sus siglas en inglés), leucemia linfoblástica, síndromes mielodisplásicos, linfoma, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin y linfoma de Hodgkin; y en donde el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de colon, colangiocarcinoma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cánceres de cabeza y cuello, sarcoma sinovial, angiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de tiroides, cáncer de endometrio, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de próstata, cáncer renal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer urotelial, cáncer biliar, glioblastoma, mesotelioma, cáncer de cuello uterino y cáncer colorrectal.

En una realización preferida, la terapia es para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda (AML).

En otra realización preferida, la terapia es para el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (CML).

Descripción de los dibujos

Figura 1. Gráficos que muestran los resultados de la expansión in vitro de células T funcionales específicas de WT-1 a partir de sangre periférica de diez donantes sanos

Las células mononucleares de sangre periférica de diez donantes sanos (HD, por sus siglas en inglés) fueron estimuladas con péptidos de 15-mero WT1 conjuntos y solapados por 26-30 horas, enriquecidas para células CD137+, y expandidas por 9-19 días. Las células T expandidas se volvieron a estimular por 6 horas con células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) autólogas cargadas con un conjunto de péptidos no relacionados o con un conjunto de péptidos WT1. Adicionalmente, se incluyeron en el escenario experimental controles negativos (células T no estimuladas) y positivos (células T cultivadas en presencia de PMA y lonomicina) (no se muestra). Los gráficos de puntos indican los resultados de la tinción intracelular para la producción de IFN<y>y la exposición de CD107a en la superficie celular. Después de varias reestimulaciones con APC autólogas cargadas con un conjunto de péptidos WT1, se probó la especificidad de las células T mediante tinción intracelular, como se ha descrito previamente. Los resultados mostraron un enriquecimiento de células T específicas de WT1 en el compartimento de células T CD8 para HD1(a), HD3(c), HD4(d), HD5(e), HD6(f), HD7(g)y HD10(j)y en el compartimento de células T CD4 para HD2(b), HD8(h)y HD9(i). WT1, tumor de Wilms 1; PMA, forbol 12-miristato 13-acetato; IFN<y>, interferón-Y; S, estimulación; (por sus siglas en inglés, respectivamente).

Figura 2. Cuadrícula y gráficos que muestran la identificación de péptidos inmunogénicos WT1 por una estrategia de cuadrícula de mapeo

Los epítopos reconocidos por las células T sensibilizadasin vitropor estimulaciones repetidas con el conjunto de péptidos WT 1 solapados se identificaron por tinción intracelular. En particular, se valoró el porcentaje de células T específicas que respondían a la cuadrícula de mapeo de subconjuntos de pentadecapéptidos WT1 cargados en APC. Adicionalmente, se incluyeron controles negativos (células T no estimuladas y células T cocultivadas con APC cargadas con un conjunto de péptidos no relacionados) y positivos (células T cultivadas en presencia de PMA y lonomicina) en el escenario experimental (las condiciones de células T no estimuladas y PMA/lono no se muestran).(a)Cuadrícula de deconvolución que indica el porcentaje de células T que expresanIFNyy CD107a después del cocultivo con APC cargadas con los diferentes subconjuntos (denotados SP1-24). Los valores deIFNyy CD107a en negrita denotan subconjuntos que contienen el epítopo WT1 reconocido por las células T. Se presentan gráficos de puntos representativos relativos al cocultivo de las células T con APC cargadas con los subconjuntos sensibles y que indican la expresión deIFNyy CD107a. Se observaron respuestas dominantes para: subconjuntos 4, 5, 16 en HD1(b), HD3(d), HD6(g), HD7(h), HD10(k); subconjuntos 6, 16, 17, 20, 23 en HD2(c); subconjuntos 4, 5, 6, 14, 18, 21 en HD4(e); subconjuntos 5, 11, 12, 21, 22 en HD5(f); subconjuntos 12, 14 para HD8(i); subconjuntos 5,13,21 para HD9(j). Para HD7, también observamos un aumento de la secreción deIFNyy de la expresión de CD107a en respuesta a los subconjuntos 7, 8, 20, aunque en porcentajes inferiores en comparación con la respuesta observada con los subconjuntos 4, 5, 16. SP, subconjuntos; WT1, tumor de Wilms 1; APC, células presentadoras de antígeno; PMA, forbol 12-miristato 13-acetato;IFNy,interferón-y.

Figura 3. Especificidad epitópica de las células T específicas de WT1 generadas por sensibilización con los péptidos conjuntos

Para validar los péptidos inmunogénicos WT1, las células T expandidas de cada HD se cocultivaron por 6 horas en presencia de APC cargadas con los péptidos identificados después de la deconvolución de la cuadrícula de mapeo y con al menos un péptido no relacionado como control negativo. Adicionalmente, se incluyeron en el escenario experimental controles negativos (células T no estimuladas) y positivos (células T cultivadas en presencia de PMA y lonomicina) (no se muestra). Los gráficos de puntos muestran para cada HD los resultados de la tinción intracelular paraIFNyy/o CD107a de superficie. Se observó un enriquecimiento de células CD107a y/oIFNypositivas respectivamente para las células T cocultivadas con los péptidos 40 y 41 para HD1(a)y no para los péptidos 42 y 43 (péptidos no relacionados); los péptidos 54, 77, 90 para HD2(b)y no para los péptidos 42 y 138 (péptidos no relacionados); el péptidoVLDFAPPg A(SEQ ID NO: 157, VLD, que es un nonámero del péptido representado por la SEQ ID NO: 117 (denominado “11-mero” en la Figura 3c)) para HD3(c)y baja respuesta con los péptidos PVLDFAPPG (SEQ ID NO: 158, PVL, que es otro nonámero del péptido representado por la SEQ ID NO: 117) y LDFAPPGAS (SEQ ID NO: 159, LDF, que es un nonámero del péptido representado por la SEQ ID NO: 116, descrito previamente como un péptido inmunogénico (Doubrovina, E.et al.(2012)Blood120: 1633 1646)); péptidos 17, 18, 99, 100 para HD4(d, e)y no para los péptidos no relacionados (15, 16, 63-66, 101, 102 y 132); péptido 101 para HD5(f)y no para los péptidos no relacionados (63, 107, 108, 113, 119 y 120); péptido VLDFAPPGA(Se QID NO: 157,VlD,que es un nonámero del péptido representado por las EqID NO: 117 (denominado “11-mero” en la Figura 3c)) para HD6(g)y el péptido PVLDFAPPG (SEQ ID NO: 158, PVL, que es otro nonámero del péptido representado por la SEQiDNO: 117) y no para el péptido LDFAPPGAS (SEQiDNO: 159, LDF, que es un nonámero del péptido representado por la SEQ ID NO: 116, descrito previamente como un péptido inmunogénico (Doubrovina, E.et al.(2012)Blood120: 1633-1646)); péptidos 101, 125, 137 para HD9(h); péptido VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157,VlD,que es un nonámero del péptido representado por la SEQ IDNo :

117 (denominado “11-mero” en la Figura 3c)) para HD10(i)y no para el péptido no relacionado. Para HD7 y HD8, debido a una aptitud reducida de las células T, no fue posible realizar pruebas funcionales para verificar el péptido predicho por la deconvolución de la cuadrícula de mapeo, es decir, los péptidos 40, 41, 91, 92 para HD7 y el péptido 24 para HD8.

Para determinar la restricción de HLA de los epítopos WT1 identificados para las células T HD4, HD5 y HD10, se secuenció el ADN del donante para determinar la tipificación de HLA. Posteriormente, las células T específicas de WT1 se cocultivaron con diferentes líneas celulares EBV-BLCL presentadoras de antígeno, cada una de las cuales albergaba un alelo HLA específico de interés que se identificó mediante secuenciación del ADN HD4, HD5 o HD10. Las células EBV-BLCL fueron pulsadas con el péptido 17 para HD4, el péptido 101 para HD5 y el péptido VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) o con un péptido de control no relacionado. Después del cocultivo por 6 horas, observamos una respuesta sustancial aWt 1por parte de las células T específicas de WT1 que habían sido cocultivadas con células EBV-BLCL que expresaban el alelo HLA-B*3502 y pulsadas con el péptido 17 para HD4(j), células EBV-BLCL que expresan el alelo HLA-B*3501 y pulsadas con el péptido 101 para HD5(k)y células EBV-BLCL que expresan el alelo HLA-A*0201 y pulsadas con el péptido VLDFAPPGA(Se QIDn O:157) para HD10(I).(m)Tabla que muestra los péptidos reconocidos por las células T expandidas a partir de HD1-HD10. Para HD3, HD6 y HD10, se muestra el nonámero específico que se superpone a los péptidos 40 y 41 y que provoca una respuesta inmunitaria. Tumor de Wilms 1; APC, células presentadoras de antígeno; PMA, 2; forbol 12-miristato 13-acetato;IFNy,interferón-Y; S, estimulación.

Figura 4. Gráficos y diagramas que muestran que las células T expandidas de HD1, HD3 y HD4 reconocen un epítopo WT1 procesado de forma natural

(a)Gráfico que representa la expresión de CD107 por células T CD8+ expandidas a partir de HD1 después de cocultivo con células T2 pulsadas con el conjunto WT1, células K562 modificadas genéticamente para expresar el alelo HLA-A*0201 y sobreexpresar la proteína WT1, o células T2 pulsadas con el conjunto MelanA/MART1 (por sus siglas en inglés) de control inespecífico como control negativo.

(b)Gráfico que representa los resultados de los experimentos para determinar la capacidad de las células T expandidas HD3 para dirigirse a las células que expresan WT1. Los resultados se representan como un índice de eliminación, que se calcula como el número total de células objetivo todavía presentes después del cocultivo con las células T específicas de WT1 dividido por el número total de células objetivo solas. Las células T HD3 se cocultivaron con células T2 pulsadas con el subconjunto 16 (SP16) que contiene el péptido inmunogénico que provoca la respuesta inmunitaria; células T2 pulsadas con el conjunto MelanA/MART1 (MelanA) como control negativo; células K562 de tipo silvestre (K562) o modificadas genéticamente para expresar tanto el alelo HLA-A*0201 como para sobreexpresar la proteína WT1 (K562 A2+WT1+).

(c)Gráficos que representan los resultados de experimentos para determinar la capacidad de las células T WT1 específicas de HD4 para eliminar células objetivo. Las células T HD4 se cocultivaron con blastos primarios CD33+ cosechados de un paciente con HLA-B*3502 en una relación de 10:1 o, como control, con células leucémicas de un paciente que no albergaba el alelo HLA-B*3502. Después de 3 días de cocultivo, los resultados indican una eliminación casi completa de los blastos CD33+ HLA-B*3502 cuando se siembran con células T específicas de WT1 (células CD3+). E, efector; T, objetivo (por sus siglas en inglés, respectivamente).

Figura 5. Gráfico que muestra los resultados del perfil Vp de las células T específicas de WT1

Las células T específicas de WT1 generadas a partir de las diferentes HD después de varias estimulaciones con el conjunto de WT1 se tiñeron con el kit de inmunoperfil Vp para determinar la clonalidad de la población. En particular, la expresión de los genes variables (V) de la cadena p se determinó por análisis de FACS (por sus siglas en inglés). Los resultados indican la expresión de un gen Vp altamente dominante en HD1 (TRBV12-3;12-4), HD2 (TRBV11-2), HD3 (TRBV4-3) HD5 (TRBV20-1) mientras que para HD4, HD6, HD10 no se detectó un claro enriquecimiento de un Vp definido. HD4 SP14 indica las células T estimuladas con el subgrupo 14, que contiene los péptidos 17-18, que provocan la respuesta inmunitaria más elevada; HD4 SP18+21 indica las células T estimuladas con los subgrupos 18 y 21, que contienen los péptidos 63-64-65-66 y 99-100-101-102, respectivamente, que provocan una respuesta inmunitaria mínima, como se muestra en la Figura 3. Para HD7, HD8 y HD9, no fue posible realizar el análisis Vp inmunoperfil debido a una aptitud celular reducida.

Figura 6. Gráficos que muestran los resultados de la secuenciación del TCR de las células T específicas de WT1 enriquecidas a lo largo del tiempo

Las células generadas a partir de cada donante sano incluido en el entorno experimental se caracterizaron por secuenciación del TCR ap después de varias estimulaciones con el conjunto de WT1. Los resultados de la secuenciación indicaron la presencia de clonotipos predominantes para HD1(a), HD2(b)y HD3(c), HD4(d), HD5(e), HD6(f), HD7(g), HD8(h), HD9(i), HD10(j). Los gráficos de barras representan las diez secuencias de aminoácidos CDR3 más predominantes identificadas en cada punto temporal (por ejemplo, S9 corresponde a los resultados de secuenciación obtenidos después de la 9° ronda de estimulación). Para cada barra, partiendo del eje X, el segmento inferior representa la secuencia CDR más predominante. Las nueve secuencias siguientes más predominantes se apilan sobre el segmento inferior y se ordenan por frecuencia decreciente en sentido ascendente. Las secuencias restantes se conjuntan en el segmento superior. WT1, tumor de Wilms 1; CDR3, región determinante de complementariedad 3; S, estimulación.

Figura 7. Actividad funcional de linfocitos T modificados genéticamente

Las células T aisladas de PBMC (por sus siglas en inglés) de individuos sanos fueron transducidas con un vector lentiviral bidireccional que codifica para la cadena a y la cadena p de TCR aislados de HD1 y HD3. Como control transducimos células T con un TCR previamente publicado que reconoce el WT1 126-134 (RMFPNAPYL; SEQ ID NO: 255) cuando lo presenta el alelo HLA-A*0201. Los linfocitos T de transferencia (TR, por sus siglas en inglés) se cocultivaron por 3 días con(a)células T2 pulsadas o no con el péptido WT1 126-134 o con el péptido VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) (relación efector:objetivo = 1:1);(b)células K562 de tipo silvestre (K562) o modificadas genéticamente para expresar el alelo HLA-A*0201 (relación efector:objetivo = 1:1);(c)3 blastos primarios de AML diferentes seleccionados en función de la expresión del alelo HLA-A*0201 y del antígeno WT1 (relación efector:objetivo = 5:1). Para el cocultivo con las líneas celulares T2 y K562, incluimos células T no transducidas como control. Los resultados indicaron la capacidad de cada TCR para reconocer el péptido objetivo cuando lo presenta el alelo HLA-A*0201 (Figura 7a) y el mayor potencial de las células T transducidas por el TCR de HD1 para mediar en una eliminación específica y casi completa de las células K562 portadoras del alelo HLA*A0201 en comparación con las células T HD3-TR. Cabe destacar que no se observó una destrucción sustancial de células objetivo en el cocultivo de células K562 HLA*A0201 con células T WT1 126-134 TR (Figura 7b). Estos resultados fueron confirmados además por el resultado del experimento de cocultivo realizado usando como células objetivo blastos primarios de AML derivados de 3 pacientes diferentes de AML (blastos pAML1: WT1-/HLA-A*0201+; blastos pAML2 y pAML3: WT1+/HLA-A*0201+). En este escenario experimental, cada población individual de células T se clasificó con dextrámeros específicos, antes del cocultivo con objetivos, para enriquecer la pureza de las células efectoras. Observamos una mayor eliminación de los dos blastos de pAML que albergaban el alelo HLA-A*0201 después del cocultivo con células T HD1 TR, mientras que solamente los blastos de pAML3 fueron reconocidos por las células T HD3 y WT1 126-134. UT, no transducido; pAML, leucemia mieloide aguda primaria; TR, transferencia; Dx, dextrámero; (por sus siglas en inglés, respectivamente).

Descripción detallada de la invención

Los términos “comprender”, “comprende” y “comprendido por”, como se usan en la presente, son sinónimos de “incluir” o “incluye”; o “contener” o “contiene”, y son inclusivos o abiertos y no excluyen miembros, elementos o pasos adicionales no repetidos. Los términos “comprender”, “comprende” y “comprendido por” también incluyen el término “consiste en”.

Receptor de células T

Durante el procesamiento de los antígenos, éstos se degradan en el interior de las células y posteriormente son transportados a la superficie celular por las moléculas del Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Las células T son capaces de reconocer este complejo péptido:MHC en la superficie de la célula que presenta el antígeno. Existen dos clases diferentes de moléculas MHC: MHC I y MHC II, cada clase transporta péptidos de diferentes compartimentos celulares a la superficie celular.

Un receptor de células T (TCR) es una molécula que se encuentra en la superficie de las células T y que se encarga de reconocer antígenos unidos a moléculas del MHC. El heterodímerot Crnatural está formado por una cadena alfa (a) y beta (p) en aproximadamente 95 % de las células T, mientras que aproximadamente 5 % de las células T tienen TCR formados por cadenas gamma(y)y delta (5).

La unión de un TCR con el antígeno y el MHC resulta en la activación del linfocito T en el que se expresa el TCR a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores y moléculas accesorias especializadas.

Cada cadena de un TCR natural pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y posee un dominio N-terminal de inmunoglobulina (Ig)-variable (V), un dominio Ig-constante (C), una región transmembrana/membrana celular y una corta cola citoplasmática en el extremo C-terminal.

El dominio variable tanto de la cadena a del TCR como de la cadena p tiene tres regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR). Una cadena TCR a o p, por ejemplo, comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 en orden amino a carboxilo terminal. En general, lac DR3es la principal responsable del reconocimiento del antígeno procesado, aunque también se ha demostrado que la CDR1 de la cadena alfa interactúa con la parte N-terminal del péptido antigénico, mientras que la CDR1 de la cadena beta lo hace con la parte C-terminal del péptido. Se cree que CDR2 reconoce la molécula de MHC.

Un dominio constante de un TCR puede consistir en secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma un puente disulfuro, estableciendo un enlace entre las dos cadenas.

Una cadena a de un TCR de la presente invención puede tener un dominio constante codificado por un gen TRAC (por sus siglas en inglés). A continuación se muestra un ejemplo de secuencia de aminoácidos de un dominio constante de cadena a codificado por un gen TRAC:

IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAV

AWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLL

KVAGFNLLMTLRLWSS

(SEQ ID NO: 128)

Un TCR de la presente invención puede comprender una cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 128 o una variante de la misma que tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia dentro del mismo, preferiblemente al menos 75 % de identidad de secuencia dentro del mismo.

Una cadena p de un TCR de la presente invención puede tener un dominio constante codificado por un gen TRBC1 o TRBC2 (por sus siglas en inglés). A continuación se muestra un ejemplo de secuencia de aminoácidos de un dominio constante de cadena p codificado por un gen TRBC1:

DLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPL

KEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA

WGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF

(SEQ ID NO: 129)

A continuación se muestra un ejemplo de secuencia de aminoácidos de un dominio constante de cadena p codificado por un gen TRBC2:

DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPL

KEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA

WGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG

(SEQ ID NO: 130)

Un TCR de la presente invención puede comprender una cadena p que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, o variantes de la SEQ ID NO: 129 y 130 que tienen al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia dentro del mismo, preferiblemente al menos 75 % de identidad de secuencia dentro del mismo.

El TCR de la presente invención puede tener uno o más residuos de cisteína adicionales en cada una de las cadenas a y p tal que el TCR puede comprender dos o más puentes disulfuro en los dominios constantes.

La estructura permite que el TCR se asocie con otras moléculas como la CD3, que posee tres cadenas distintas (Y, 5 y £) en los mamíferos y la cadena Z. Estas moléculas accesorias tienen regiones transmembranales cargadas negativamente y son vitales para propagar la señal del TCR a la célula. Las cadenas CD3 y Z, junto con el TCR, forman lo que se conoce como el complejo receptor de células T.

La señal del complejo de células T se potencia por la unión simultánea de las moléculas MHC por un correceptor específico. Para las células T auxiliares, este correceptor es el CD4 (específico para el MHC de clase II), mientras que para las células T citotóxicas, este correceptor es el CD8 (específico para el MHC de clase I). El correceptor permite un acoplamiento prolongado entre la célula presentadora de antígeno y la célula T y recluta moléculas esenciales (por ejemplo, LCK, por sus siglas en inglés) dentro de la célula involucradas en la señalización del linfocito T activado.

Por consiguiente, como se usa en la presente, el término “receptor de células T” (TCR) se refiere a la molécula capaz de reconocer un péptido cuando lo presenta una molécula del MHC. La molécula puede ser un heterodímero de dos cadenas a y p (u opcionalmente<y>y 5) o puede ser un constructo de TCR de cadena única. Un TCR de la presente invención puede ser un TCR soluble, por ejemplo, omitiendo o alterando uno o más dominios constantes. Un TCR de la presente invención puede comprender un dominio constante.

El TCR de la presente invención puede ser un TCR híbrido que comprende secuencias derivadas de más de una especie. Por ejemplo, sorprendentemente se ha descubierto que los TCR murinos se expresan más eficientemente en las células T humanas que los TCR humanos. El TCR puede por lo tanto comprender una región variable humana y secuencias murinas dentro de una región constante.

Una desventaja de este enfoque es que las secuencias constantes murinas pueden desencadenar una respuesta inmunitaria que provoque el rechazo de las células T transferidas. Sin embargo, los regímenes de acondicionamiento usados para preparar a los pacientes para la terapia adoptiva de células T pueden resultar en una inmunosupresión suficiente para permitir el injerto de células T que expresen secuencias murinas.

Regiones determinantes de complementariedad (CDR)

La porción del TCR que establece la mayoría de los contactos con el péptido antigénico unido al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) es la región determinante de complementariedad 3 (CDR3), que es única para cada clon de células T. La región CDR3 se genera a partir de eventos de reordenación somática que tienen lugar en el timo y que implican a genes no contiguos pertenecientes a los genes variable (V), de diversidad (D, para las cadenas p y 5) y de unión (J). Asimismo, los nucleótidos aleatorios insertados/eliminados en loslocide reordenación de cada gen de la cadena TCR aumentan enormemente la diversidad de la secuencia CDR3, que es muy variable. Así, la frecuencia de una secuencia CDR3 específica en una muestra biológica indica la abundancia de una población específica de células T. La gran diversidad del repertorio de TCR en seres humanos sanos proporciona un amplio rango de protección frente a una gran variedad de antígenos extraños presentados por moléculas MHC en la superficie de las células presentadoras de antígenos. A este respecto, cabe señalar que teóricamente se pueden generar hasta 1015 TCR diferentes en el timo.

La diversidad del receptor de células T se centra en la CDR3 y esta región es la principal responsable del reconocimiento del antígeno.

Un TCR puede comprender CDR que comprenden o consisten en un par CDR3a y un par CDR3p descritos a continuación.

Como se usa en la presente, el término “proteína” incluye moléculas polipeptídicas de cadena simple, así como complejos polipeptídicos múltiples en los que los polipéptidos constituyentes individuales están enlazados por medios covalentes o no covalentes. Como se usa en la presente, el término “polipéptido” se refiere a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y están unidos por uniones peptídicas o puentes disulfuro.

Variantes, derivados, análogos, homólogos y fragmentos

Además de las proteínas y polinucleótidos específicos mencionados en la presente, la presente invención también abarca el uso de variantes, derivados, análogos, homólogos y fragmentos de los mismos.

En el contexto de la presente invención, una variante de cualquier secuencia dada es una secuencia en la que la secuencia específica de residuos (ya sean residuos de aminoácidos o de ácidos nucleicos) se ha modificado de modo tal que el polipéptido o polinucleótido en cuestión conserva sustancialmente al menos una de sus funciones endógenas. Se puede obtener una secuencia variante por adición, deleción, sustitución, modificación, reemplazo y/o variación de al menos un residuo presente en la proteína que se presenta de manera natural.

Una secuencia de aminoácidos variante de la presente invención que tiene hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos puede tener, por ejemplo, una, dos o tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos.

El término “derivado” como se usa en la presente, en relación con las proteínas o polipéptidos de la presente invención incluye cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de y/o adición de uno (o más) residuos de aminoácidos de o a la secuencia siempre que la proteína o polipéptido resultante conserve sustancialmente al menos una de sus funciones endógenas.

El término “análogo”, como se usa en la presente, en relación con polipéptidos o polinucleótidos incluye cualquier mimético, es decir, un compuesto químico que posee al menos una de las funciones endógenas de los polipéptidos o polinucleótidos a los que imita.

Las proteínas usadas en la presente invención también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y resultan en una proteína funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos deliberadas se pueden realizar con base en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se retiene la función endógena. Por ejemplo, los aminoácidos negativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos positivamente cargados incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos principales polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina.

Una sustitución puede involucrar la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido similar (una sustitución conservativa). Un aminoácido similar es aquel que tiene un resto de cadena lateral con propiedades afines conjuntas, por ejemplo, como se muestra a continuación:

(i) cadenas laterales básicas: lisina (K), arginina (R), histidina (H);

(ii) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E);

(iii) cadenas laterales polares sin carga: asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T) y tirosina (Y);

(iv) cadenas laterales no polares: glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), metionina (M), triptófano (W) y cisteína (C).

Cualquier cambio en los aminoácidos debe mantener la capacidad del TCR para unirse al péptido WT1 presentado por las moléculas MHC.

Las secuencias variantes pueden incluir sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos. La variación puede concentrarse en una o más regiones, tales como las regiones constantes, el enlazador o las regiones marco de las cadenas a o p, o pueden estar repartidas por toda la molécula del TCR.

Pueden hacerse sustituciones, adiciones o deleciones conservadoras, por ejemplo, de acuerdo con la Tabla que se muestra a continuación. Los aminoácidos del mismo bloque de la segunda columna y preferiblemente de la misma línea de la tercera columna pueden sustituirse entre sí:

La presente invención también abarca la sustitución homóloga (sustitución y reemplazo se usan ambos en la presente para referirse al intercambio de un residuo de aminoácido existente por un residuo alternativo), por ejemplo, sustitución similar tal como básica por básica, ácida por ácida, polar por polar, etc. También puede producirse una sustitución no homóloga, por ejemplo, de un tipo de residuo a otro o, alternativamente, la inclusión de aminoácidos no naturales, tales como la ornitina.

El término “variante” como se usa en la presente puede significar una entidad que tiene cierta homología con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre o la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre. El término “homología” puede equipararse a “identidad”.

Una secuencia variante puede incluir una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 50 %, 55 %, 65 %, 75 %, 85 % o 90 % idéntica, preferiblemente al menos 95 %, al menos 97 %, o al menos 99 % idéntica a la secuencia objeto. Típicamente, las variantes comprenderán los mismos sitios activos, etc. que la secuencia de aminoácidos en cuestión. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

Una secuencia variante puede incluir una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 65 %, 75 %, 85 % o 90 % idéntica, preferiblemente al menos 95 %, al menos 97 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia objeto. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud, en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

Preferiblemente, la referencia a una secuencia que tiene un porcentaje de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO detallados en la presente se refiere a una secuencia que tiene el porcentaje de identidad indicado en toda la longitud de la SEQ ID NO a la que se hace referencia.

Las comparaciones de identidad pueden realizarse a ojo o, más usualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles en el mercado pueden calcular el porcentaje de homología o identidad entre dos o más secuencias.

El porcentaje de homología puede calcularse sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra y cada aminoácido de una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente de la otra secuencia, residuo a residuo. Esto se denomina alineamiento “sin huecos”. Típicamente son alineamientos que se realizan sobre un número relativamente corto de residuos.

Aunque se trata de un método muy sencillo y coherente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o deleción en la secuencia de nucleótidos puede hacer que los codones siguientes queden fuera del alineamiento, resultando así potencialmente en una gran reducción del porcentaje de homología cuando se realiza un alineamiento global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta las posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente el puntaje global de homología. Esto se consigue insertando “huecos” en el alineamiento de secuencias para intentar maximizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan “penalizaciones por huecos” a cada hueco que se produce en el alineamiento, de modo que, para un mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencias con el menor número posible de huecos, que refleje un mayor parentesco entre las dos secuencias comparadas, obtendrá una puntuación más alto que uno con muchos huecos. Típicamente son usados “costes de hueco afines” que cobran un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalización menor por cada residuo subsecuente en el hueco. Este es el sistema de puntaje de huecos más comúnmente usado. Las penalizaciones por huecos elevadas producirán, por supuesto, alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por huecos. Sin embargo, es preferible usar los valores por defecto cuando se usa tal software para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, al usar el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización por hueco por defecto para las secuencias de aminoácidos es de -12 para un hueco y de -4 para cada extensión.

El cálculo del porcentaje máximo de homología requiere, por lo tanto, en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones por huecos. Un programa informático adecuado para llevar a cabo tal alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereuxet al.(1984)Nucleic Acids Res.12: 387). Los ejemplos de otros programas informáticos que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (ver Ausubelet al.(1999)ibid-Cap. 18), FASTA (Atschulet al.(1990)J. Mol. Biol.403-410) y el conjunto de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas offline y online (ver Ausubelet al.(1999)ibid,páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, es preferible usar el programa GCG Bestfit. También existe otra herramienta, denominada BLAST 2 Sequences, para comparar secuencias de proteínas y nucleótidos (verFEMS Microbiol. Lett.(1999) 174: 247-50;FEMS Microbiol. Lett.(1999) 177: 187-8).

Aunque el porcentaje final de homología puede medirse en términos de identidad, el propio proceso de alineamiento típicamente no se basa en una comparación de pares de todo o nada. En su lugar, se suele usar una matriz de puntuación de similitud escalada que asigna puntuaciones a cada comparación por pares basada en la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de tal matriz comúnmente usada es la matriz BLOSUM62 -la matriz por defecto para la suite de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente usan los valores públicos por defecto o una tabla de comparación de símbolos personalizada si se suministra (ver el manual de usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, es preferible usar los valores públicos por defecto del paquete<g>C<g>, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el porcentaje de homología, preferiblemente el porcentaje de identidad de secuencia. El programa lo hace típicamente como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Los “fragmentos” también son variantes y el término típicamente se refiere a una región seleccionada del polipéptido o polinucleótido que es de interés funcionalmente o, por ejemplo, en un ensayo. Un “fragmento” se refiere así a una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos que es una porción de un polipéptido o polinucleótido de longitud completa.

Tales variantes pueden prepararse usando técnicas estándar de ADN recombinante tales como la mutagénesis dirigida al sitio. Cuando se vayan a realizar inserciones, se podrá fabricar ADN sintético que codifique la inserción junto con regiones flanqueantes 5' y 3' correspondientes a la secuencia natural a ambos lados del sitio de inserción. Las regiones flanqueantes contendrán sitios de restricción convenientes correspondientes a sitios de la secuencia natural, de modo que la secuencia pueda cortarse con la(s) enzima(s) adecuada(s) y el ADN sintético ligarse al corte. Posteriormente, el ADN se expresa de acuerdo con la invención para producir la proteína codificada. Estos métodos son solamente ilustrativos de las numerosas técnicas estándar conocidas en la técnica para la manipulación de secuencias de ADN y también se pueden usar otras técnicas conocidas.

Moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)

Típicamente, los TCR se unen a los péptidos como parte del complejo péptido:MHC.

La molécula MHC puede ser una molécula MHC de clase I o II. El complejo puede estar en la superficie de una célula presentadora de antígeno, tal como una célula dendrítica o una célula B, o cualquier otra célula, incluidas las células cancerosas, o puede inmovilizarse, por ejemplo, mediante recubrimiento sobre una esfera o una placa.

El sistema de antígenos leucocitarios humanos (HLA) es el nombre del complejo génico que codifica el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en humanos e incluye los antígenos HLA de clase I (A, B y C) y los antígenos HLA de clase II (DP, DQ y DR). Los alelos HLA A, B y C presentan péptidos derivados principalmente de proteínas intracelulares, por ejemplo, proteínas expresadas dentro de la célula. Esto es particularmente importante, ya que WT1 es una proteína intracelular.

Durante el desarrollo de las células Tin vivo,éstas se someten a un paso de selección positiva para garantizar el reconocimiento de los MHC propios, seguido de un paso negativo para eliminar las células T que se unen con demasiada fuerza a los MHC que presentan antígenos propios. En consecuencia, ciertas células T y los TCR que expresan solamente reconocerán los péptidos presentados por ciertos tipos de moléculas MHC, es decir, los codificados por alelos HLA particulares. Esto se conoce como restricción de HLA.

Un alelo HLA de interés es el HLA-A*0201, que se expresa en la gran mayoría (> 50 %) de la población caucásica. Por consiguiente, los TCR que se unen a péptidos WT1 presentados por MHC codificados por HLA-A*0201 (es decir, están restringidos por HLA-A*0201) son ventajosos, ya que una inmunoterapia que use tales TCR será adecuada para tratar a una gran proporción de la población caucásica.

Otros alelos HLA-A de interés son HLA-A*0101, HLA-A*2402 y HLA-A*0301.

Los alelos HLA-B ampliamente expresados de interés son HLA-B*3501, HLA-B*0702 y HLA-B*3502.

En una realización, un TCR de la presente invención restringido a HLA-A*0201 se une a un péptido WT1 que comprende la secuencia de aminoácidos APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) o una variante de la misma con hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos.

Otro alelo HLA de interés ampliamente expresado es el HLA-B*3501.

Otro alelo HLA de interés ampliamente expresado es el HLA-B*3502.

Hemos demostrado que las células T que expresan TCR que se unen a péptidos WT1 que comprenden una secuencia de aminoácidos de EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123) son capaces de eliminar selectivamente las células cancerosas (AML) que expresan el alelo HLA-B*3502 - ver el Ejemplo 4 y la Figura 4c.

En una realización, cuando un TCR de la presente invención se une a un péptido WT1 que comprende una secuencia de aminoácidos de APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) o una variante del mismo con hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, el TCR está restringido a HLA-A*0201.

Proteína del tumor de Wilms 1 (WT1)

La proteína 1 del tumor de Wilms 1 (WT1) es una proteína intracelular que codifica un factor de transcripción de dedo de zinc que desempeña un papel importante en el crecimiento y la diferenciación celular (Yang, L.et al. Leukemia21, 868-876 (2007)). Se expresa ampliamente en una variedad de tumores hematológicos y sólidos, mientras que muestra una expresión limitante en otros tejidos (gónadas, útero, riñón, mesotelio, células progenitoras en diferentes tejidos). Pruebas recientes sugieren que WT1 desempeña un papel en la leucemogénesis y la tumorigénesis.

WT1 tiene varias isoformas, algunas de las cuales resultan en empalmes alternativos de los transcritos de ARNm que codifican WT1. La secuencia completa de aminoácidos de una isoforma WT1 se publicó anteriormente (Gessler, M.et al. Nature;343(6260):774-778; (1990)). Esta isoforma particular consiste en 575 aminoácidos e incluye unos primeros 126 aminoácidos en el terminal N que faltan en el exón 5+ y en las isoformas KTS+ de WT1.

Un ejemplo de proteína WT1 tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la entrada UniProt J3KNN9. Otro ejemplo de proteína WT1 tiene la secuencia de aminoácidos que se indica a continuación:

SRQRPHPGALRNPTACPLPHFPPSLPPTHSPTHPPRAGTAAQAPGPRRLLAAILDFLLLQDPASTCVP

EPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAERLQGRRSRGASGSEPQQMGSDVRDLNA

LLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSW

GGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRN

QGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQA

LLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILC

GAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGE

KPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRW

PSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL

(SEQ ID NO: 131)

Péptidos WT1

Como se usa en la presente, el término péptido se refiere a una pluralidad de residuos de aminoácidos enlazados por uniones peptídicas. Según se define en la presente, un péptido puede tener menos de 30, menos de 25, menos de 20, menos de 19, menos de 18, menos de 17, menos de 16, menos de 15, menos de 14, menos de 13, menos de 12, menos de 11, menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6 o menos de 5 residuos de aminoácidos. Preferiblemente, un péptido tiene una longitud de entre 5 y 20 aminoácidos, más preferiblemente, un péptido tiene una longitud de entre 8 y 15 residuos de aminoácidos.

Los TCR de la presente invención se unen a un péptido WT 1 cuando es presentado por un MHC. Como se usa en la presente, se entiende por péptido WT1 un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una proteína WT1.

Por ejemplo, un péptido WT1 puede comprender al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, o al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos de proteína WT1.

El péptido WT1 puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) o una variante de la misma con hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Los ejemplos de péptidos WT1 que comprenden la secuencia de aminoácidos son AAQWAPVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 115) y APVLDFAPPGASAYG (SEQ ID NO: 116).

Otros péptidos WT1 pueden comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118), EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119), SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120), y variantes de las SEQ ID NO: 118-120 cada una con hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos.

Otros péptidos WT 1 pueden comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en EPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 123), YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126), y variantes de las SEQ ID NO: 123 y 126, cada una con hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Los péptidos WT1 de ejemplo pueden tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en TCVPEPASQHTLRSG (SEQ ID NO: 121), EPASQHTLRSGPGCL (SEQ ID NO: 122), HSTGYESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 124) y YESDNHTTPILCGAQ (SEQ ID NO: 125).

Otros péptidos WT1 pueden comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127) o una variante de la misma con hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos.

Otros péptidos WT 1 pueden comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250) o una variante de la misma con hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Los péptidos WT1 de ejemplo pueden tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en CMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 248) y NQMNLGATLKGVAAG (SEQ ID NO: 249).

Otros péptidos WT1 pueden comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251) o una variante de la misma con hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos.

Otros péptidos WT 1 pueden comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252), KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253), PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254), y variantes de las SEQ ID NO: 252, 253 y 254, cada una con hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos.

En algunas realizaciones, para los péptidos WT1 que se unen a moléculas MHC codificadas por el alelo HLA-A*0201 puede preferirse que los aminoácidos en la posición 2 del péptido (es decir, el segundo aminoácido a partir del N-terminal) sean leucina o metionina, aunque también pueden ser preferibles isoleucina, valina, alanina y treonina. También puede preferirse que el aminoácido en la posición 9 o 10 sea valina, leucina o isoleucina, aunque también pueden ser preferibles la alanina, la metionina y la treonina. Los motivos de unión al MHC preferidos de otros alelos HLA se divulgan en Celiset al (Molecular Immunology,Vol. 31, 8, diciembre de 1994, páginas 1423 a 1430).

Puede haber varios usos de los péptidos WT1 descritos en la presente. Por ejemplo, los péptidos WT1 descritos en la presente pueden administrarse a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano. La administración de los péptidos WT1 puede provocar una respuesta inmunitaria contra las células que expresan o sobreexpresan la proteína WT1, es decir, los péptidos WT1 son péptidos WT1 inmunogénicos.

Los péptidos WT1 descritos en la presente, por ejemplo, los péptidos WT1 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en EpASQHTLRSG (SEQ iD NO: 123) y YESDNHTTPIL (SEQ ID NO: 126), NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 127), QCLSAFTVHFSGQFT (SEQ ID NO: 118), EDPMGQQGSLGEQQY (SEQ ID NO: 119), SQLECMTWNQMNLGA (SEQ ID NO: 120), APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117), NQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 250), DPGGIWAKLGAAEAS (SEQ ID NO: 251), NHTTPILCGAQYRIH (SEQ ID NO: 252), KRHQRRHTGVKPFQC (SEQ ID NO: 253) PSCQKKFARSDELVR (SEQ ID NO: 254) y sus variantes, cada una con hasta tres sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, pueden usarse para buscar y/o identificar nuevas secuencias de TCR que se unan a células WT 1. Por ejemplo, las células T2 pueden ser pulsadas con un péptido WT1 divulgado en la presente e incubadas con una población de células T aislada de un donante. En este enfoque, la expresión de citocinas, por ejemplo, CD107a e IFN<y>, puede ser indicativa de células T que reconocen los péptidos WT 1.

Secuencias de TCR

Hemos determinado las secuencias de aminoácidos de los TCR que se unen a los péptidos WT1 descritos en la presente. En particular, hemos determinado las secuencias de aminoácidos de las CDR del TCR, que son importantes para el reconocimiento y la unión del péptido WT1.

En la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de secuencias de aminoácidos del TCR identificadas por los inventores.

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Reducción de las alteraciones y mejora de la expresión del TCR El TCR de la invención puede expresarse en una célula T para alterar la especificidad de antígeno de la célula T. Las células T transducidas por TCR pueden expresar al menos dos cadenas TCR alfa y dos cadenas TCR beta. Mientras que las cadenas TCR alfa/beta endógenas forman un receptor que es autotolerante, las cadenas TCR alfa/beta introducidas forman un receptor con especificidad definida para el antígeno objetivo dado.

Sin embargo, la terapia génica con TCR requiere una expresión suficiente de los TCR transferidos. El TCR transferido podría diluirse por la presencia del TCR endógeno, resultando en una expresión subóptima del TCR específico del tumor. Asimismo, pueden producirse desajustes entre las cadenas endógenas y las introducidas para formar nuevos receptores, que podrían mostrar especificidades inesperadas para los autoantígenos y causar daños autoinmunes cuando se transfieren a los pacientes.

De ahí que se hayan explorado varias estrategias para reducir el riesgo de desajuste entre las cadenas de TCR endógenas y las introducidas. Las mutaciones de la interfase alfa/beta del TCR son una de las estrategias que se emplean actualmente para reducir el emparejamiento erróneo no deseado. Por ejemplo, la introducción de una cisteína en los dominios constantes de las cadenas alfa y beta permite la formación de un puente disulfuro y potencia el emparejamiento de las cadenas introducidas, al tiempo que reduce el emparejamiento erróneo con las cadenas de tipo silvestre.

Por consiguiente, los TCR pueden comprender una o más mutaciones en la interfase cadena a/cadena p, tal que cuando la cadena a y la cadena p se expresan en una célula T, se reduce la frecuencia de falta de apareamiento entre dichas cadenas y las cadenas a y p del TCR endógeno. La una o más mutaciones pueden introducir un residuo de cisteína en el dominio de región constante de cada una de la cadena a y la cadena p, en donde los residuos de cisteína son capaces de formar un puente disulfuro entre la cadena a y la cadena p.

Otra estrategia para reducir la falta de apareamiento se basa en la introducción de secuencias polinucleotídicas que codifican ARNip, añadidas a los genes que codifican para las cadenas a y/o p del TCR específico del tumor, y diseñadas para limitar la expresión de los genes endógenos del TCR (Okamoto S.Cáncer research69, 9003 9011, 2009).

Por consiguiente, el vector o polinucleótido que codifica los TCR de la presente invención puede comprender uno o más ARNip u otros agentes destinados a limitar o anular la expresión de los genes TCR endógenos.

También es posible combinar nucleasas artificiales, tales como nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) o sistemas CRISPR/Cas, diseñadas para dirigirse a las regiones constantes de los genes endógenos, por ejemplo, los genes del TCR (TRAC y, o TRBC), para obtener la interrupción permanente de los genes endógenos de la cadena alfa y/o beta del TCR, permitiendo así la expresión completa del TCR específico del tumor y reduciendo o anulando así el riesgo de alteración del TCR. Este proceso, conocido como la edición del gen TCR demostró ser superior a la transferencia del gen TCRin vitroein vivo(Provasi E., Genovese P.,Nature MedicineMay; 18(5):807-15; 2012).

Por consiguiente, los TCR de la presente invención pueden usarse para editar la especificidad de las células T mediante la disrupción del TCR y la adición genética del TCR específico del tumor.

Además, la tecnología de edición del genoma permite la integración dirigida de un casete de expresión, que comprende un polinucleótido que codifica un TCR de la presente invención, y opcionalmente una o más regiones promotoras y/u otras secuencias de control de la expresión, en un gen endógeno alterado por las nucleasas artificiales (Lombardo A.,Nature biotechnology25, 1298-1306; 2007).

Por consiguiente, los TCR de la presente invención pueden usarse para editar la especificidad de las células T por la integración dirigida de un polinucleótido que codifica un TCR de la presente invención en una región genómica. La integración puede ser objetivo de una nucleasa artificial.

Otra estrategia desarrollada para aumentar la expresión del TCR transferido y reducir el desajuste del TCR consiste en la “murinización”, que sustituye las regiones constantes a y p del TCR humano (por ejemplo, las regiones TRAC, TRBC1 y TRBC2) por sus homólogas murinas. La murinización de las regiones constantes del TCR se describe, por ejemplo, en Sommermeyer y UckertJ Immunol;2010 (184:6223-6231). Por consiguiente, los TCR de la presente invención pueden murinizarse.

Polinucleótido aislado

La presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un receptor TCR de la invención.

El polinucleótido aislado puede ser de hebra doble o hebra única, y puede ser ARN o ADN.

Un experto entenderá que numerosos polinucleótidos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que el experto puede, usando técnicas rutinarias, hacer sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos que no afecten a la secuencia polipeptídica codificada por los polinucleótidos de la invención para reflejar el uso de codones de cualquier organismo hospedero particular en el que se vayan a expresar los polipéptidos de la invención.

Los polinucleótidos descritos en la presente pueden modificarse por cualquier método disponible en la técnica. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo para potenciar la actividadin vivoo la vida útil de los polinucleótidos de la invención.

Los polinucleótidos tales como los polinucleótidos de ADN pueden producirse de forma recombinante, sintética o por cualquier medio disponible para los expertos en la técnica. También pueden clonarse por técnicas estándar.

Los polinucleótidos más largos se producirán generalmente usando medios recombinantes, por ejemplo, usando técnicas de clonación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Esto involucrará fabricar un par de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanqueen la secuencia de direccionamiento que se desea clonar, poner los cebadores en contacto con ARNm o ADNc obtenidos de una célula animal o humana, realizar una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que produzcan la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción con un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores pueden estar diseñados para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados, de modo que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector adecuado.

En la Tabla 2 se proporcionan ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican TCR identificados por los inventores.

Tabla 2

Las secuencias variantes pueden tener adiciones, deleciones o sustituciones de una o más bases. Si la variación implica adición(es) o deleción(es), pueden producirse de tres en tres o estar equilibradas (es decir, una adición por cada deleción), de modo que la variación no provoque un desplazamiento de marco de lectura para la traducción del resto de la secuencia.

Algunas o todas las variaciones pueden ser “silenciosas” en el sentido de que no afectan a la secuencia de la proteína codificada debido a la degeneración del código genético.

Algunas o todas las variaciones pueden producir sustituciones, adiciones o deleciones conservadoras de aminoácidos, como se ha explicado anteriormente. La variación puede concentrarse en una o más regiones, tales como las que codifican las regiones constantes, el enlazador o las regiones marco de las cadenas a o p, o pueden estar repartidas por toda la molécula.

La secuencia variante debe conservar la capacidad de codificar total o parcialmente una secuencia de aminoácidos del TCR que se una a un péptido WT1.

Optimización de codones

Los polinucleótidos usados en la presente invención pueden tener una optimización de codones. La optimización de codones se ha descrito anteriormente en WO 1999/41397 y WO 2001/79518. Las diferentes células difieren en el uso de codones particulares. Este sesgo de codones corresponde a un sesgo en la abundancia relativa de ARNt particulares en el tipo de célula. Alterando los codones de la secuencia para que coincidan con la abundancia relativa de los ARNt correspondientes, es posible aumentar la expresión. Del mismo modo, es posible disminuir la expresión eligiendo deliberadamente codones para los que se sabe que los ARNt correspondientes son raros en el tipo celular particular. Así, se dispone de un grado adicional de control traslacional.

Muchos virus, incluido el HIV (por sus siglas en inglés) y otros lentivirus, usan un gran número de codones raros y, cambiándolos para que correspondan a codones de mamíferos comúnmente usados, se puede lograr una mayor expresión de los componentes de empaquetamiento en células productoras de mamíferos. Las tablas de uso de codones son conocidas en la técnica para células de mamíferos, así como para una variedad de otros organismos.

La optimización de codones también puede involucrar la eliminación de motivos de inestabilidad del ARNm y sitios de empalme crípticos.

Vector

La presente invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido descrito en la presente.

Un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. De acuerdo con la presente invención, y a modo de ejemplo, algunos vectores usados en técnicas de ácido nucleico recombinante permiten transferir entidades, tales como un segmento de ácido nucleico (por ejemplo, un segmento heterólogo de ADN, tal como un segmento heterólogo de ADNc), a una célula objetivo. El vector puede servir para mantener el ácido nucleico heterólogo (ADN o ARN) dentro de la célula, facilitar la replicación del vector que comprende un segmento de ácido nucleico o facilitar la expresión de la proteína codificada por un segmento de ácido nucleico. Los vectores pueden ser no virales o virales. Los ejemplos de vectores usados en técnicas de recombinación de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cromosomas, cromosomas artificiales y virus. El vector puede ser de cadena única o de cadena doble. Puede ser lineal y, opcionalmente, el vector comprende uno o más brazos de homología. El vector también puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico desnudo (por ejemplo, ADN). En su forma más simple, el vector puede ser en sí mismo un nucleótido de interés.

Los vectores usados en la invención pueden ser, por ejemplo, vectores plasmídicos o virales y pueden incluir un promotor para la expresión de un polinucleótido y, opcionalmente, un regulador del promotor.

Los vectores que comprenden polinucleótidos usados en la invención pueden introducirse en células usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, tales como transformación, transfección y transducción. Varias técnicas son conocidas en la técnica, por ejemplo, la transducción con vectores virales recombinantes, tales como los retrovirales, lentivirales, adenovirales, virales adenoasociados, baculovirales y vectores virales del herpes simple, los vectores de Sleeping Beauty (por su nombre en inglés); la inyección directa de ácidos nucleicos y la transformación biolística.

Los sistemas de administración no virales incluyen, pero no se limitan a, métodos de transfección de ADN. Aquí, la transfección incluye un proceso que usa un vector no viral para administrar un gen a una célula objetivo. Los métodos típicos de transfección incluyen la electroporación, la biolística del ADN, la transfección mediada por lípidos, la transfección mediada por ADN compactado, los liposomas, los inmunoliposomas, la lipofectina, la transfección mediada por agentes catiónicos, los anfifilos faciales catiónicos (CFA, por sus siglas en inglés)(Nature Biotechnology1996 14; 556) y combinaciones de los mismos.

El término “transfección” debe entenderse que abarca el suministro de polinucleótidos a las células tanto por vía viral como no viral.

Además, la invención puede emplear protocolos de selección de objetivos genéticos, por ejemplo, el suministro de agentes modificadores del ADN.

El término “vector” incluye un vector de expresión, es decir, un constructo capaz de expresiónin vivooin vitro/ex vivo.La expresión puede estar controlada por una secuencia del vector o, por ejemplo, en el caso de la inserción en un lugar objetivo, la expresión puede estar controlada por una secuencia objetivo. Un vector puede estar integrado o anclado al ADN de la célula.

Los sistemas de suministro vírico incluyen, pero no se limitan a, un vector adenoviral, un vector adenoasociado viral (AAV, por sus siglas en inglés), un vector viral de herpes, un vector retroviral, un vector lentiviral y un vector baculoviral.

Los retrovirus son virus ARN con un ciclo vital diferente al de los virus líticos. En este sentido, un retrovirus es una entidad infecciosa que se replica a través de un intermediario de ADN. Cuando un retrovirus infecta una célula, su genoma es convertido en forma de ADN por una enzima transcriptasa inversa. La copia de ADN sirve como molde para la producción de nuevos genomas de ARN y proteínas codificadas viralmente necesarias para el ensamblaje de partículas virales infecciosas.

Existen muchos retrovirus, por ejemplo, el virus de la leucemia murina (MLV), el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), el virus del tumor mamario de ratón (MMTV), el virus del sarcoma de Rous (RSV), el virus del sarcoma de Fujinami (FuSV), el virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV), Virus del osteosarcoma murino FBR (FBR MSV), virus del sarcoma murino Moloney (Mo-MSV), virus de la leucemia murina Abelson (A-MLV), virus de la mielocitomatosis aviar-29 (MC29) y virus de la eritroblastosis aviar (AEV), así como todos los demás retrovirus, incluidos los lentivirus; (por sus siglas en inglés, respectivamente).

Puede encontrarse una lista detallada de retrovirus en Coffinet al(“Retroviruses” 1997Cold Spring Harbour Laboratory PressEds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763).

Los lentivirus también pertenecen a la familia de los retrovirus, pero pueden infectar tanto a células en división como a células sin división (Lewiset al(1992)EMBO J.3053-3058).

El vector puede ser capaz de transferir una secuencia de nucleótidos que codifica un TCR específico de WT1 descrito en la presente a una célula, tal como una célula T, de modo tal que la célula exprese el TCR específico de WT1. Preferiblemente, el vector será capaz de mantener un alto nivel de expresión en las células T, de modo que el TCR introducido pueda competir con éxito con el TCR endógeno por un número limitado de moléculas CD3.

Aumentar el suministro de moléculas CD3 puede aumentar la expresión de TCR, por ejemplo, en una célula que ha sido modificada para expresar los TCR de la presente invención. Por consiguiente, el vector de la presente invención puede comprender además uno o más genes que codifican CD3-gamma, CD3-delta, CD3-epsilon y/o CD3-zeta. En una realización, el vector de la presente invención comprende un gen que codifica CD3-zeta. El vector puede comprender un gen que codifique CD8. El vector puede codificar un marcador seleccionable o un gen suicida, para aumentar el perfil de seguridad de la célula modificada por ingeniería genética, por ejemplo, una célula de la presente invención, o una célula que ha sido modificada para expresar los TCR de la presente invención (Bonini,Science1997, Ciceri, BoniniLancet Oncol.2009, Oliveiraet al., STM2015). Los genes comprendidos en el vector de la presente invención pueden estar enlazados por secuencias de autocicatrización, tal como la secuencia de autocicatrización 2A.

Alternativamente, uno o más vectores separados que codifican un gen CD3 pueden proporcionarse para cotransferencia a una célula simultáneamente, secuencialmente o por separado con uno o más vectores de la presente invención, por ejemplo, uno o más vectores que codifican TCR de la presente invención.

Célula

La presente invención se refiere a una célula que comprende un polinucleótido o un vector de acuerdo con la presente invención.

La célula puede ser una célula T, un linfocito o una célula madre. La célula T, el linfocito o la célula madre pueden seleccionarse del grupo que consiste en células CD4, células CD8, células T ingenuas, células T madre con memoria, células T con memoria central, células T doble negativas, células T efectoras con memoria, células T efectoras, células Th0, células Tc0, células Th1, células Tc1, células Th2, células Tc2, células Th17, células Th22, células T gamma/delta, células asesinas naturales (NK), células asesinas naturales T (NKT), células madre hematopoyéticas y células madre pluripotentes.

El tipo de célula puede seleccionarse para proporcionar una persistenciain vivodeseable y ventajosa y para proporcionar funciones y características deseables y ventajosas a las células de la presente invención.

La célula puede haber sido aislada de un sujeto.

La célula de la presente invención puede proporcionarse para usarla en transferencia celular adoptiva. Como se usa en la presente, el término “transferencia celular adoptiva” se refiere a la administración de una población celular a un paciente. Típicamente son células T aisladas de un sujeto y posteriormente modificadas genéticamente y cultivadasin vitropara expresar un TCR de la presente invención antes de ser administradas al paciente.

La transferencia celular adoptiva puede ser alogénica o autóloga.

Por “transferencia celular autóloga” debe entenderse que la población inicial de células (que posteriormente se transducen según un método de la invención, o se transducen con un vector según la presente invención) se obtiene del mismo sujeto al que se administra la población de células T transducidas. La transferencia autóloga es ventajosa, ya que evita los problemas asociados a la incompatibilidad inmunológica y está disponible para los sujetos independientemente de la disponibilidad de un donante genéticamente compatible.

Por “transferencia celular alogénica” debe entenderse que la población inicial de células (que posteriormente se transducen según un método de la invención, o se transducen con un vector según la presente invención) se obtiene de un sujeto diferente de aquel al que se administra la población celular transducida. Preferiblemente, el donante será genéticamente compatible con el sujeto al que se administran las células para minimizar el riesgo de incompatibilidad inmunológica. Alternativamente, el donante puede tener un apareamiento erróneo y no estar emparentado con el paciente.

Las dosis adecuadas de poblaciones celulares transducidas son tales como para ser terapéutica y/o profilácticamente efectivas. La dosis a administrar puede depender del sujeto y de la condición a tratar, y puede ser determinada fácilmente por una persona experta.

La célula puede derivarse de una célula T aislada de un sujeto. La célula T puede formar parte de una población celular mixta aislada del sujeto, tal como una población de linfocitos de sangre periférica (PBL, por sus siglas en inglés). Las células T de la población de PBL pueden activarse por métodos conocidos en la técnica, tales como usar anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 o microesferas de tamaño celular conjugadas con anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28.

La célula T puede ser una célula T auxiliar CD4+ o una célula T citotóxica CD8+. La célula puede encontrarse en una población mixta de células T auxiliares CD4+ y células T citotóxicas CD8+. La activación policlonal, por ejemplo, usando anticuerpos anti-CD3 opcionalmente en combinación con anticuerpos anti-CD28, desencadenará la proliferación de células T CD4+ y CD8+.

La célula puede aislarse del sujeto al que se va a transferir adoptivamente la célula modificada genéticamente. A este respecto, la célula puede fabricarse aislando una célula T de un sujeto, activando opcionalmente la célula T, transfiriendo el gen TCR a la célulaex vivo.Posteriormente, la inmunoterapia del sujeto puede llevarse a cabo por la transferencia adoptiva de las células transducidas por el TCR. Como se usa en la presente, este proceso se refiere a la transferencia autóloga de células T, es decir, las células transducidas por el TCR se administran al mismo sujeto del que proceden originalmente las células T.

Alternativamente, la célula T puede aislarse de un sujeto diferente, tal como si fuera alogénica. La célula T puede aislarse de un sujeto donante. Por ejemplo, si el sujeto se somete a un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (Allo-HSCT) o a un trasplante de órganos sólidos o a un trasplante de células o a una terapia con células madre, la célula puede proceder del donante, del que proceden los órganos, tejidos o células. El donante y el sujeto en tratamiento pueden ser hermanos.

Alternativamente, la célula puede ser, o derivarse de, una célula madre, tal como una célula madre hematopoyética (HSC, por sus siglas en inglés). La transferencia genética a las MHC no conduce a la expresión del<t>C<r>en la superficie celular, ya que las células madre no expresan moléculas CD3. Sin embargo, cuando las células madre se diferencian en precursores linfoides que migran al timo, el inicio de la expresión de CD3 conduce a la expresión superficial del TCR introducido en los timocitos.

Una ventaja de este enfoque es que las células T maduras, una vez producidas, sólo expresan el TCR introducido y pocas o ninguna cadena TCR endógena, porque la expresión de las cadenas TCR introducidas suprime el reordenamiento de los segmentos génicos TCR endógenos para formar genes TCR alfa y beta funcionales. Otra ventaja es que las células madre modificadas genéticamente son una fuente continua de células T maduras con la especificidad antigénica deseada. La célula puede ser por lo tanto una célula madre modificada genéticamente, preferiblemente una célula madre hematopoyética modificada genéticamente, que, al diferenciarse, produce una célula T que expresa un TCR de la invención.

Pueden usarse otros enfoques conocidos en la técnica para reducir, limitar, prevenir, silenciar o derogar la experimentación de genes endógenos en las células de la presente invención o en las células preparadas por los métodos de la presente invención.

Como se usa en la presente, el término “interrupción” se refiere a reducir, limitar, prevenir, silenciar o anular la expresión de un gen. El experto en la técnica puede usar cualquier método conocido en la técnica para interrumpir un gen endógeno, por ejemplo, cualquier método adecuado para la edición del genoma, el silenciamiento de genes, el atenuamiento de genes o la inactivación de genes.

Por ejemplo, se puede interrumpir un gen endógeno con una nucleasa artificial. Una nucleasa artificial es, por ejemplo, una enzima de restricción artificial diseñada para dirigirse selectivamente a una secuencia polinucleotídica específica (por ejemplo, que codifica un gen de interés) e inducir una rotura de hebra doble en dicha secuencia polinucleotídica. Típicamente, la rotura de hebra doble (DSB, por sus siglas en inglés) se reparará mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés) propensa a errores, por lo que resultará en la formación de una secuencia polinucleotídica no funcional, que puede ser incapaz de expresar un gen endógeno.

En algunas realizaciones, la nucleasa artificial se selecciona del grupo que consiste en nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) y CRISPR/Cas (por ejemplo, CRISPR/Cas9).

Los métodos de preparación de una célula (por ejemplo, una célula T) de la presente invención pueden comprender el paso de integración dirigida de un casete de expresión en un gen endógeno (por ejemplo, un gen de cadena a del TCR endógeno y/o un gen de cadena p del TCR endógeno). Como se usa en la presente, el término casete de expresión se refiere a una secuencia polinucleotídica (por ejemplo, una secuencia polinucleotídica de ADN) que comprende una o más secuencias polinucleotídicas que codifican uno o más genes de interés tal que dichos genes de interés son capaces de expresión. Las secuencias endógenas pueden facilitar la expresión a partir del casete de expresión, y/o las secuencias de control de la transcripción dentro del casete de expresión pueden facilitar la expresión. Por ejemplo, el casete de expresión puede comprender una secuencia polinucleotídica de la presente invención, o una secuencia polinucleotídica que codifica un TCR de la presente invención, operablemente enlazada a una secuencia de control de expresión, por ejemplo, un promotor o una secuencia potenciadora. El uno o más genes de interés pueden estar situados entre uno o más conjuntos de sitios de restricción. De manera adecuada, los sitios de restricción pueden facilitar la integración del casete de expresión en, por ejemplo, un vector, un plásmido o ADN genómico (por ejemplo, ADN genómico de la célula hospedera).

Por ejemplo, un casete de expresión de la presente invención puede transferirse de una primera secuencia polinucleotídica, por ejemplo, en un vector, a otra “cortando”, por ejemplo, extirpando, el casete de expresión usando una o más enzimas de restricción adecuadas y “pegando”, por ejemplo, integrando, el casete de expresión en una segunda secuencia polinucleotídica.

El casete de expresión puede comprender un polinucleótido de la presente invención. El casete de expresión puede comprender un polinucleótido que codifica uno o más TCR de la presente invención. El casete de expresión puede incluir además un gen de resistencia a los antibióticos u otro gen marcador seleccionable que permita identificar las células que han integrado con éxito el casete de expresión en su ADN. Las secuencias polinucleotídicas comprendidas en el casete de expresión pueden estar operablemente enlazadas a secuencias de control de la expresión, por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora adecuada. El experto en la técnica podrá seleccionar secuencias de control de expresión adecuadas.

La presente invención también contempla una célula que expresa un TCR de la presente invención, que ha sido diseñada para interrumpir uno o más genes MHC endógenos. La alteración de un gen MHC endógeno puede reducir o prevenir la expresión del MHC en la superficie celular modificada. Por consiguiente, tal célula modificada con expresión reducida o nula del MHC tendrá una capacidad limitante o nula de presentar antígenos en su superficie celular. Tal célula es particularmente ventajosa para la transferencia celular adoptiva ya que la célula no será alorreactiva, por ejemplo, la célula no presentará antígenos que podrían ser reconocidos por el sistema inmunológico de un sujeto que recibe la célula transferida adoptivamente. Como resultado, la célula transferida no será reconocida como “no propia” y se puede evitar una reacción inmunológica adversa a la célula. Tal célula se denomina “célula universal”, ya que es adecuada para la transferencia adoptiva a una variedad de hospederos diferentes, independientemente del tipo de HLA.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para preparar una célula T universal no alorreactiva, que expresa un TCR de la presente invención. La presente invención proporciona además una célula T universal no alorreactiva que expresa un TCR de la presente invención.

La presente invención contempla además células que han sido modificadas por ingeniería para alterar uno más genes endógenos con el fin de modificar la célula para potenciar propiedades, características o funciones ventajosas de la célula y/o reducir propiedades, características o funciones indeseables. Por ejemplo, al alterar una célula endógena se puede modificar la persistencia, expansión, actividad, resistencia a señales de agotamiento/senescencia/inhibitorias, capacidad de localización u otras funciones celulares. Usado en este contexto, el término “modificar” se refiere a un cambio en una o más características en relación con una célula equivalente no modificada, por ejemplo, una célula en la que no se ha interrumpido un gen endógeno. Por ejemplo, el cambio puede consistir en aumentar, potenciar o introducir una característica o función de la célula en relación con una célula equivalente no modificada. Alternativamente, el cambio puede ser una disminución, supresión o abrogación de una característica o función de la célula en relación con una célula equivalente no modificada.

Los polinucleótidos y vectores de la presente invención pueden transferirse a subconjuntos específicos de células T, incluyendo CD4 y/o CD8, ingenuas, células T madre con memoria, memoria central, memoria efectoras o células efectoras, o en otros subconjuntos celulares tal como para promover una persistencia y funcionalidadin vivodiferentes en las células de la presente invención.

Los polinucleótidos y vectores de la presente invención también pueden transferirse a subconjuntos de células T tales como ingenuas, células madre T de memoria, células centrales de memoria, células efectoras de memoria, efectores.

Los polinucleótidos y vectores de la presente invención también pueden transferirse a subconjuntos de células T con diferentes polarizaciones, tales como Th0/Tc0, Th1/Tc1, Th2/Tc2, Th17, Th22 u otras, dependiendo de la citocina de base más apropiada para dirigirse a un tipo de tumor particular.

Asimismo, los polinucleótidos y vectores de la presente invención que codifican las regiones antígeno específicas de los TCR de la presente invención pueden transferirse en otros subconjuntos celulares, incluyendo células T gamma/delta, células NK, células NKT, células madre hematopoyéticas u otras células, con el fin de obtener el efecto terapéutico.

La presente invención proporciona además un método de preparación de una célula, que comprende el paso de transducir una célulain vitrooex vivocon un vector de la presente invención. En la técnica se conocen diversos métodos para la transducción de una célula con un vector (ver, por ejemplo, Sambrooket al).

La presente invención también proporciona un método de producción de una célula T que expresa un TCR de la invención induciendo la diferenciación de una célula madre que comprende un polinucleótido o un vector de la presente invención.

Una población de células puede purificarse selectivamente de células que presenten un fenotipo o característica específicos, y de otras células que no presenten ese fenotipo o característica, o que los presenten en menor grado. Por ejemplo, una población de células que expresa un marcador específico (por ejemplo, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD152, CXCR3 o CCR4) puede purificarse a partir de una población inicial de células. Alternativa o adicionalmente, puede purificarse una población de células que no exprese otro marcador.

Por “enriquecimiento” de una población de células para un cierto tipo de células debe entenderse que se aumenta la concentración de ese tipo de células dentro de la población. La concentración de otros tipos de células puede reducirse concomitantemente.

La purificación o el enriquecimiento pueden resultar en una población de células sustancialmente puras de otros tipos de células.

La purificación o el enriquecimiento de una población de células que expresan un marcador específico (por ejemplo, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD152,<c>X<c>R3 o CCR4) puede conseguirse usando un agente que se una a ese marcador, preferiblemente de forma sustancialmente específica para ese marcador. Un agente que se une a un marcador celular puede ser un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que se une a CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD152, CXCR3 o CCR4.

El término “anticuerpo” se refiere a anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpos capaces de unirse a un objetivo seleccionado, e incluye Fv, scFv, F(ab') y F(ab')<2>(por sus siglas en inglés, respectivamente), anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos genotecnológicos, incluidos anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados, y anticuerpos seleccionados artificialmente producidos por despliegue en fagos o técnicas alternativas.

Además, en la invención también se pueden usar alternativas a los anticuerpos clásicos, por ejemplo, “avicuerpos”, “avímeros”, “anticalinas”, “nanocuerpos” y “DARPinas”.

Los agentes que se unen a marcadores específicos pueden etiquetarse para que sean identificables usando cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica. El agente puede estar etiquetado intrínsecamente o puede modificarse conjugando una etiqueta dentro del mismo. Por “conjugar” se entiende que el agente y la etiqueta están operablemente unidos. Esto significa que el agente y la etiqueta están enlazados de modo tal que ambos pueden desempeñar su funcionalidad (por ejemplo, unirse a un marcador, permitir la identificación fluorescente o permitir la separación cuando se colocan en un campo magnético) sustancialmente sin obstáculos. Los métodos adecuados de conjugación son bien conocidos en la técnica y serían fácilmente identificables por el experto.

Una etiqueta puede permitir, por ejemplo, purificar de su entorno el agente marcado y cualquier célula a la que esté unido (por ejemplo, el agente puede estar marcado con una esfera magnética o una etiqueta de afinidad, tal como la avidina), detectarlo o ambas cosas. Los marcadores detectables adecuados para usar como etiqueta incluyen fluoróforos (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes, cereza, cian y naranja) y etiquetas peptídicas (por ejemplo, etiquetas His, etiquetas Myc, etiquetas FLAG y etiquetas HA).

En la técnica se conocen varias técnicas para separar una población de células que expresan un marcador específico. Entre ellas se incluyen las tecnologías de separación basadas en microesferas magnéticas (por ejemplo, la separación basada en microesferas magnéticas de circuito cerrado), la citometría de flujo, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), la purificación con etiquetas de afinidad (por ejemplo, usando columnas o microesferas de afinidad, tales como columnas de biotina para separar agentes marcados con avidina) y las técnicas basadas en la microscopía.

También puede ser posible realizar la separación usando una combinación de diferentes técnicas, tal como un paso de separación basado en microesferas magnéticas seguido de la clasificación de la población resultante de células para uno o más marcadores adicionales (positivos o negativos) por citometría de flujo.

La separación de grados clínicos puede realizarse, por ejemplo, usando el sistema CliniMACS® (Miltenyi). Se trata de un ejemplo de tecnología de separación en circuito cerrado basada en esferas magnéticas.

También se prevé usar propiedades de exclusión de tintes (por ejemplo, población lateral o etiquetado con rodamina) o actividad enzimática (por ejemplo, actividad ALDH) para enriquecer las MHC.

Moléculas quiméricas

En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula quimérica que comprende un TCR de la presente invención, un TCR codificado por un polinucleótido de la presente invención conjugado con un sustrato no celular. La conjugación puede ser covalente o no covalente.

El sustrato no celular puede ser una nanopartícula, un exosoma o cualquier sustrato no celular conocido en la técnica.

La molécula quimérica de la presente invención puede ser soluble.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula quimérica que comprende un TCR de la presente invención, un TCR codificado por un polinucleótido de la presente invención conjugado con una toxina o un anticuerpo.

La toxina o el anticuerpo pueden ser citotóxicos. La toxina puede ser una molécula o compuesto citotóxico, por ejemplo, una molécula o compuesto radiactivo. La porción TCR de la molécula quimérica puede conferir la capacidad de reconocer células que expresen la proteína o los péptidos WT1. Así, la molécula quimérica puede reconocer específicamente y/o unirse a las células tumorales que expresan WT1. Por consiguiente, las moléculas quiméricas de la presente invención pueden proporcionar un suministro dirigido a WT1 de toxinas citotóxicas, anticuerpos y/o compuestos.

Enfermedades relacionadas con WT1

WT1 se expresa ampliamente en diversos tumores hematológicos y sólidos, mientras que muestra una expresión limitante en varios tejidos sanos (por ejemplo, gónadas, útero, riñón, mesotelio, células progenitoras en diferentes tejidos). Los presentes inventores han identificado y determinado las secuencias de aminoácidos de los TCR que reconocen los péptidos WT1. Asimismo, han demostrado que las células T que expresan TCR de acuerdo con la presente invención se dirigen y eliminan células que presentan el péptido WT 1 o sobreexpresan la proteína WT 1.

Además, se proporciona en la presente invención un TCR de la presente invención, un polinucleótido aislado de la presente invención, un vector de la presente invención, una célula de acuerdo con la presente invención, o una célula preparada por el método de la presente invención para usar en terapia, opcionalmente en el tratamiento y/o prevención de una neoplasia maligna hematológica o un tumor sólido, en donde la neoplasia maligna hematológica se selecciona del grupo que consiste en leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfoblástica, síndromes mielodisplásicos, linfoma, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin y linfoma de Hodgkin; y en donde el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de colon, colangiocarcinoma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cánceres de cabeza y cuello, sarcoma sinovial, angiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de tiroides, cáncer de endometrio, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de próstata, cáncer renal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer urotelial, cáncer biliar, glioblastoma, mesotelioma, cáncer de cuello uterino y cáncer colorrectal.

El término “prevenir” está contemplado para referirse a evitar, retrasar, impedir o dificultar la contracción de la enfermedad. El tratamiento puede, por ejemplo, prevenir o reducir la probabilidad de desarrollar o contraer una enfermedad asociada a la expresión de WT1.

“Tratar”, como se usa en la presente, se refiere al cuidado de un sujeto enfermo, con el fin de mejorar, curar o reducir los síntomas de la enfermedad, o con el fin de reducir, detener o retrasar la progresión de la enfermedad.

El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto humano puede ser un niño. Por ejemplo, el niño puede tener menos de 10 años, menos de 9 años, menos de 8 años, menos de 7 años, menos de 6 años, menos de 5 años, menos de 4 años, menos de 3 años o menos de 2 años. El sujeto humano puede ser un bebé.

Se puede haber determinado previamente que el sujeto necesita un TCR, un polinucleótido aislado, un vector o una célula de la presente invención, o una célula preparada por el método de la presente invención sobre la base de la expresión de WT1. Por ejemplo, el sujeto puede tener una población celular que muestre una expresión aumentada de WT1 en relación con una población celular de control sana. Se pueden usar diversas técnicas conocidas en la técnica para determinar la expresión de WT1 - por ejemplo, se puede usar RT-PCR cuantitativa para determinar la cantidad de transcrito de ARN de WT1, que es indicativo de la expresión de proteína WT1. El experto en la técnica también apreciará que la expresión de la proteína WT1 puede determinarse realizando inmunotransferencia tipo Western usando anticuerpos comercialmente disponibles específicos para WT1.

El sujeto también puede haber sido identificado previamente como portador de una alteración (por ejemplo, mutación o deleción) en un gen WT1. Tal alteración puede ser hereditaria. Así, la enfermedad asociada a la expresión de WT1 puede ser una enfermedad hereditaria. Los ejemplos de enfermedades hereditarias asociadas a la expresión de WT1 incluyen, pero no se limitan a, el síndrome WAGR (tumor de Wilms-aniridia-malformación genitourinaria-retraso), el síndrome de Denys-Drash (DDS), el síndrome de Frasier (FS), el síndrome de anomalías genitourinarias (anomalías del aparato reproductor y urinario); (por sus siglas en inglés, respectivamente).

Los sujetos con enfermedades hereditarias asociadas a la expresión de WT1 pueden tener un mayor riesgo de desarrollar un trastorno proliferativo (por ejemplo, un cáncer).

La enfermedad asociada a la expresión de WT1 puede ser un trastorno proliferativo.

El trastorno proliferativo puede ser una neoplasia maligna hematológica o un tumor sólido. La neoplasia maligna hematológica puede seleccionarse del grupo que consiste en leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfoblástica, síndromes mielodisplásicos, linfoma, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin y linfoma de Hodgkin.

El tumor sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de colon, colangiocarcinoma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cánceres de cabeza y cuello, sarcoma sinovial, angiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de tiroides, cáncer de endometrio, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de próstata, cáncer renal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer urotelial, cáncer biliar, glioblastoma, mesotelioma, cáncer de cuello uterino y cáncer colorrectal.

La enfermedad asociada con la expresión de WT1 puede seleccionarse de un grupo que consiste en leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfoblástica, síndromes mielodisplásicos, linfoma, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin y linfoma Hodgkin, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de colon, colangiocarcinoma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cánceres de cabeza y cuello, sarcoma sinovial, angiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de tiroides, cáncer de endometrio, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de próstata, cáncer renal, sarcoma de partes blandas, cáncer urotelial, cáncer biliar, glioblastoma, mesotelioma, cáncer de cuello uterino y cáncer colorrectal.

Composición farmacéutica

Los TCR de la presente invención, los polinucleótidos de la presente invención, los vectores de la presente invención, las células de la presente invención, las células preparadas por los métodos de la presente invención y las moléculas quiméricas de la presente invención pueden formularse para su administración a sujetos con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los portadores y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotónicas, por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato, y potencialmente contienen albúmina de suero humano.

La manipulación de los productos de terapia celular se realiza preferiblemente de conformidad con las normas internacionales FACT-JACIE para terapia celular.

Método de tratamiento

El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede ser un animal no humano.

El sujeto puede tener una enfermedad asociada a la expresión de WT1. El sujeto puede estar en riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a la expresión de WT1. Se puede haber determinado previamente que el sujeto tiene riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a la expresión de WT1. El sujeto puede tener un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a WT1.

El aumento del riesgo puede haberse determinado por una examinación genética y/o revisando los antecedentes familiares del sujeto. El sujeto puede expresar marcadores genéticos indicativos de un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a la expresión de WT1.

Convenientemente, una persona experta en la técnica será consciente de los factores de riesgo genéticos (por ejemplo, marcadores genéticos) asociados con un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con WT 1. El experto puede usar cualquier método o técnica adecuados conocidos en la técnica para determinar si el sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar una enfermedad asociada con la expresión de WT1.

El sujeto puede haber recibido previamente tratamiento para una enfermedad asociada a la expresión de WT1. El sujeto puede estar en remisión. El sujeto puede ser resistente a la quimioterapia. El sujeto puede ser resistente a una terapia anti-WT 1.

La terapia puede comprender el paso de administrar una quimioterapia al sujeto. La quimioterapia puede administrarse al sujeto simultáneamente, secuencialmente o por separado con el TCR de la presente invención, el polinucleótido aislado de la presente invención, el vector de la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, la célula preparada por el método de la presente invención, o la molécula quimérica de la presente invención.

Los tratamientos tanto humanos como veterinarios están dentro del alcance de la presente invención.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, histología, inmunología, oncología, que están dentro de las capacidades de una persona con conocimientos ordinarios en la técnica. Estas técnicas se explican en la literatura.

Ver, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2° edición,Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M.et al.(1995 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Cap. 9, 13 y 16,John Wiley & Sons;Roe, B., Crabtree, J. y Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques,John Wiley & Sons;Polak, J.M. y McGee, J.O'D. (1990)In situHybridization: Principles and Practice,Oxford University Press;Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,IRL Press;y Lilley, D.M. y Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Press.

A continuación se describirán diversos atributos y realizaciones preferentes de la presente invención por ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Generación de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de WT1 funcionales a partir de donantes sanos (HD)

Con el fin de identificar nuevos TCR específicos para epítopos de WT1 restringidos a diferentes alelos HLA, estimulamos células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de diez HD diferentes con un conjunto de pentadecapéptidos (15-mero) con un solapamiento de 11 aminoácidos que abarcaban la secuencia completa de la proteína WT1 (ver Materiales y métodos). El diseño de este péptido garantiza la estimulación óptima de las células T CD4+ y CD8+.

Después de 26-30 horas de estimulación, enriquecimos las células T que expresaban CD137. CD137 es una molécula regulada positivamente por el receptor de células T y se ha demostrado previamente que es un marcador fiable para la rápida identificación, aislamiento y expansiónin vitrode células T de memoria e ingenuas CD4+ y CD8+ específicas de antígeno. La fracción CD137 negativa fue posteriormente agotada de la fracción CD3, irradiada a 30 Gy y usada como células presentadoras de antígeno (APC) para la fracción CD137+. Las células CD137+ seleccionadas se expandieronin vitropor ~9 días y se volvieron a estimular con APC autólogas representadas por células CD3 agotadas o por linfocitos B autólogos inmortalizados cargados con el conjunto de péptidos cada 7-14 días. Este procedimiento resultó en el enriquecimiento de los linfocitos T WT1 específicos, como muestran los resultados citofluorimétricos presentados en la Figura 1 (a-j). La caracterización funcional de las células T se realizó en diferentes momentos. Más en detalle, las células T se cocultivaron con APC autólogas cargadas con el conjunto de péptidos y, después de 6 horas de cocultivo, se identificó la expresión de CD107a e IFN<y>en la población de células T por tinción intracelular. La expresión de CD107a después del encuentro con el antígeno indica degranulación inducida por el antígeno y potencial lítico.

Como control negativo, las células se estimularon con un conjunto de péptidos no relacionados. La estimulación de control resultó en una secreción mínima de IFN<y>y CD107a por parte de las células T derivadas de cada donante sano.

Ejemplo 2 - Mapeo de epítopos de WT1 que provocan una respuesta de células T

Para identificar el epítopo de WT1 reconocido por las células T, se cuantificó la secreción de IFN<y>después de 6 horas de cocultivoin vitrode las células T estimuladas/enriquecidas con WT1 con APC autólogas cargadas con subconjuntos de péptidos, cada uno de los cuales contenía hasta 12 péptidos de acuerdo con una cuadrícula de mapeo. La cuadrícula de mapeo consiste en 24 subconjuntos y cada péptido está contenido de forma única en dos subconjuntos que se cruzan (Doubrovina, E.et al. Blood120, 1633-1646 (2012)). Los resultados se resumen en la Figura 2a.

El análisis de FACS mostró una expresión sustancial de IFN<y>y CD107a por parte de las células T derivadas de HD1-, HD3-, HD6-, HD7-, HD10 después de la estimulación con los subconjuntos 4, 5 y 16 (Figura 2b, d, g, h, k). Se observó una expresión sustancial de IFN<y>en las células T derivadas de HD2 estimuladas por los subconjuntos 6, 16, 17 y 20 (Figura 2c), mientras que los subconjuntos 4, 5, 6 14, 18 y 21 estimularon la expresión de IFNy y CD107a en las células T derivadas de HD4 (Figura 2e) y los subconjuntos 5, 11, 12, 21 y 22 estimularon la expresión de IFN<y>en HD5 (Figura 2f). Para HD7, observamos adicionalmente un aumento de la expresión de IFN<y>y CD107a, aunque a un nivel menor comparado con el observado con los subconjuntos 4, 5 y 16, después de la estimulación con los subconjuntos 7, 8, 20 (Figura 2h). Asimismo, observamos un aumento de la expresión de IFN<y>y CD107a después de la estimulación de células T derivadas de HD8 con los subconjuntos 12 y 14 (Figura 2i) y de células T derivadas de HD9 con los subconjuntos 5,13, 21 (Figura 2j).

Posteriormente, las células T derivadas de HD se estimularon por 6 horas con APC pulsadas con los pentadecapéptidos únicos compartidos por los subconjuntos que provocaban la respuesta inmunitaria más alta y con al menos un 15-mero no relacionado. El análisis de FACS indicó un aumento de la expresión de CD107a y/o IFN<y>para los péptidos 40 y 41 en las células T HD1 (Figura 3a), los péptidos 54, 77, 90 para las células T HD2 (Figura 3b), el péptido VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157; que es un nonámero del péptido representado por la SEQ ID NO: 117) para las células T HD3 (Figura 3c), los péptidos 17, 18, 99, 100 para HD4 (Figura 3d, e), el péptido 101 para h D5 (Figura 3f), el péptido VLDFAPPGA (s Eq ID NO: 157; que es un nonámero del péptido representado por la SEQ ID NO: 117) para las células T HD6 (Figura 3g), los péptidos 101, 125 y 137 para las células T HD9 (Figura 3h), el péptido VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157; que es un nonámero del péptido representado por la SEQ ID NO: 117) para las células T HD10 (Figura 3i). De este modo, se identificaron las secuencias inmunogénicas dominantes. No se observaron respuestas inmunitarias relevantes (es decir, aumento de la expresión de CD107a y/o IFN<y>) después del cocultivo con péptidos de control no relacionados. En el caso de HD7 y HD8, debido a la reducida aptitud celular, no fue posible realizar experimentos de cultivo para identificar los péptidos inmunogénicos. Aun así, pudimos predecir el péptido reconocido por la deconvolución de la cuadrícula de mapeo. Identificamos la secuencia solapada de los péptidos 41 y 42 (originados en SP4, 5, 16) y la secuencia solapada de los péptidos 91 y 92 (originados en SP7, 8, 20) para HD7 y el péptido 24 para HD8.

Para determinar la restricción de HLA del péptido inmunogénico WT1 reconocido por las células T expandidas a partir de HD4, HD5 y HD10, las células T de éstas se cocultivaron por 6 horas con un panel de diferentes células EBV-BLCL objetivo, cada una de las cuales expresaba un alelo HLA-A o HLA-B diferente que había sido pulsado con un péptido relevante (péptido 17 para Hd 4; péptido 101 para HD5; péptido VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) para HD10) o un péptido de control no relacionado. Los resultados de este experimento mostraron que el péptido 17 es presentado por el alelo HLA-B*3502 y es reconocido por las células T derivadas de HD4 (Figura 3j), el péptido 101 es presentado por el alelo HLA-B*3501 y es reconocido por las células T derivadas de HD5 (Figura 3k); el péptido VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) es presentado por el HLA-A*0201 y es reconocido por las células T derivadas de HD10 (Figura 3I).

Las secuencias de los péptidos WT1 reconocidos por las células T específicas de WT1 expandidas a partir de HD1-HD10 se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3

Ejemplo 3 - Las células T específicas de WT1 eliminan selectivamente las células que expresan WT1

Para determinar la restricción de HLA de las células T específicas de WT1 y su capacidad para eliminar las células que expresan WT1, las células T se cocultivaron con diferentes células objetivo.

Células T derivadas de HD1

Conscientes de que HD1 alberga el alelo HLA-A*0201, cocultivamos células T específicas de WT1 enriquecidas con diferentes células objetivo: Células T2 pulsadas con el conjunto de péptidos solapados que comprende los péptidos 40 y 41 (ver Tabla 3); células T2 pulsadas con el conjunto MelanA/MART1 como control negativo (conjunto T2 MelanA/MART1); o células K562 modificadas genéticamente para expresar tanto el alelo HLA-A*0201 como para sobreexpresar la proteína WT1 (K562 HLA-A*0201 WT1).

Después de 6 horas de cocultivo, se determinó la expresión de CD107a por FACS. Los resultados para HD1 indican la expresión de CD107a en > 60 % de las células T CD8+ después del cocultivo con células T2 pulsadas con el conjunto WT 1 (Figura 4a). Similarmente, el cocultivo de células T específicas de WT 1 con células<k>562 modificadas genéticamente (que expresan el alelo HLA-A*0201 y la proteína WT1) resultó en la expresión de CD107a por > 60 % de las células T CD8+ (Figura 4a).

Por el contrario, la expresión de CD107a por las células T CD8+ cocultivadas con células T2 pulsadas con el conjunto MelanA/MART 1 de control negativo fue mínima (Figura 4a).

Estos resultados demuestran que las células T aisladas derivadas de HD1 reconocen específicamente el péptido WT1 que comprende la secuencia APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) cuando son presentadas por moléculas MHC codificadas por el alelo HLA-A*0201. Asimismo, los resultados muestran que las células T derivadas de HD1 son capaces de dirigirse específicamente a las células que sobreexpresan la proteína WT 1. Por consiguiente, estos datos experimentales demuestran que los TCR expresados por las células T derivadas de HD1 se unen específicamente a los péptidos que comprenden el APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) y que tales TCR están restringidos a HLA-A*0201

Células T derivadas de HD3

Conscientes de que HD3 alberga el alelo HLA-A*0201, cocultivamos células T específicas de WT1 enriquecidas con diferentes células objetivo: Células T2 pulsadas con el subconjunto 16, que se determinó previamente que contenía el péptido inmunogénico que provocaba la respuesta inmunitaria (T2-SP16); células T2 pulsadas con el conjunto MelanA/MART1 como control negativo (T2-MelanA); células K562 de tipo silvestre (K562) como control negativo; o células K562 modificadas genéticamente para expresar tanto el alelo HLA-A*0201 como para sobreexpresar la proteína WT1 (K562 A2+WT1+).

Después de 4 días de cocultivo, la capacidad de las células T derivadas de HD3 para eliminar las células objetivo se expresó como índice de eliminación, calculado como el número total de células objetivo que seguían presentes después del cocultivo con las células T específicas de WT1 dividido por el número total de células objetivo solas.

Los resultados demuestran la capacidad de las células T específicas de WT1 para eliminar las células objetivo que expresan el epítopo WT1 específico identificado (Figura 4b). En particular, las células T derivadas de HD3 eliminaron aproximadamente 95 % de las células T2 pulsadas con péptidos WT1 que comprendían APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117) (subconjunto 16; SP16). Asimismo, las células T derivadas de HD3 eliminaron aproximadamente 78 % de las células K562 que expresaban moléculas MHC codificadas por el alelo HLA-A*0201 y sobreexpresaban la proteína WT 1. Por el contrario, las células T derivadas de HD3 no eliminaron ninguna de las células T2 impulsadas por el conjunto MelanA/MART1 de control negativo. Similarmente, la eliminación de células K562 de tipo silvestre de control fue mínima (Figura 4b).

Estos resultados demuestran que las células T aisladas derivadas de HD3 reconocen específicamente el péptido WT1 que comprende la secuencia de aminoácidos APVLDFAPPGA (SEQ ID NO: 117). Asimismo, los resultados muestran que las células T derivadas de HD3 son capaces de dirigirse específicamente a las células que sobreexpresan la proteína WT1 y eliminarlas por la presentación de péptidos por el MHC codificado en h LA-A*0201. Por consiguiente, estos datos experimentales demuestran la especificidad del péptido WT1 para los TCR expresados por las células T derivadas de HD3 y que los TCR derivados de HD3 están restringidos a HLA-A*0201.

Células T derivadas de HD4

La capacidad de las células T derivadas de HD4 para eliminar células objetivo se valoró por el cocultivo de las células T con blastos leucémicos primarios (células CD33+) aislados de un paciente con leucemia mieloide aguda (AML) que se seleccionó en función de la alta expresión del antígeno WT1 y la tipificación de HLA (HLA-B*3502). Como control negativo, las células T derivadas de HD4 se cocultivaron con blastos leucémicos de un paciente con AML que no expresaba el alelo HLA-B*3502.

Después de tres días de cocultivo a una relación efector/objetivo de 10 a 1, el análisis de FACS mostró la eliminación casi completa de los blastos leucémicos (CD33+) cosechados del paciente con AML que expresaba el alelo HLA-B*3502 después del cocultivo con células T HD4 WT1 específicas (células CD3+) (Figura 4c, panel superior). De hecho, solamente 0,54 % de la población celular total restante era positiva para la expresión de CD33.

Por el contrario, no se observó eliminación de células CD33+ después del cocultivo de células T específicas de WT1 con blastos de AML de control no relacionados (Figura 4c, panel inferior). De hecho, en la muestra de control, 7,9 % de la población celular total fue positiva para la expresión de CD33 después del cocultivo con las células T específicas de WT1 derivadas de HD4.

Es importante destacar que estos resultados demuestran la capacidad de las células T WT 1 específicas derivadas de HD4 para dirigirse específicamente y eliminar blastos leucémicos (células cancerosas de AML) que sobreexpresan WT 1 y MHC codificado por el HLA-B*3502. Así, los TCR derivados de HD4 son capaces de dirigirse específicamente a células cancerosas y eliminarlas de forma restringida por HLA-B*3502.

Ejemplo 4 - Inmunoperfil de secuencias Vp para células T específicas de WT1

Para identificar mejor los TCR involucrados en el reconocimiento antigénico por las células T específicas de WT1 de HD1-6 y 10 (para HD7, HD8 y HD9, no fue posible realizar el análisis de inmunoperfil Vp debido a una aptitud celular reducida), realizamos primero un análisis de FACS multiparamétrico para determinar cuantitativamente el repertorio TCR Vp. Así, para determinar la clonalidad de las células T específicas de WT1 expandidas, usamos el kit de repertorio lO Test Beta Mark TCR V beta de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Este kit permite detectar la expresión de 24 genes V beta diferentes en ocho tubos individuales. En particular, se garantiza una cobertura de 75 % del repertorio completo de V beta usando este enfoque. Los resultados de la tinción FACS indicaron la gran prevalencia de una Vp específica para HD1, HD2, HD3, HD5 - ver la Figura 5. Para HD4, HD6 y HD10, no fue posible una determinación exhaustiva de la Vp predominante, probablemente debido a la limitación intrínseca del kit, que incluye anticuerpos que cubren 75 % de las proteínas Vp existentes.

Ejemplo 5 - Secuenciación de alto rendimiento de cadenas TCR a y p aisladas de células T específicas de WT1

Se recolectaron células T específicas de WT1 en diferentes puntos temporales a lo largo del marco temporal del cocultivo y se extrajo su ARN usando el kit de extracción de ARN Arcturus Pico Pure. Las secuencias CDR3 de las células T específicas de WT1 se amplificaron usando un enfoque RACE (por sus siglas en inglés) modificado en el que se incluyó una captura magnética después de la síntesis del ADNc para aumentar la especificidad de la reacción y eliminar los moldes no deseados (Ruggieroet al. Nat. Commun.6, 8081 (2015)). Las muestras se secuenciaron usando un secuenciador Illumina MiSeq y los clonotipos CDR3 se identificaron usando el software MiXTCR (Bolotin, DAet al. Nature Methods12, 380-381 (2015)) Además, las CDR1, CDR2 y CDR3 se determinaron adicionalmente usando la herramienta IMGT V-quest (Brochet, X.et al., Nucl. Acids Res.36, W503-508 (2008). PMID: 18503082; Giudicelli, V., Brochet, X., Lefranc, M.-P.,Cold Spring Harb Protoc.2011 Jun 1 ;2011 (6). pii: pdb.prot5633. doi: 10.1101/pdb.prot5633. PMID: 21632778 Resumen también en el cuaderno IMGT con generosa aportación del protocolo de Cold Spring Harb (CSH)).

Los resultados de la secuenciación demostraron el predominio creciente de un clonotipo CDR3 específico en la población de células T específica de WT1 a lo largo del tiempo para ambas cadenas TCR en HD1-10. Los genotipos predominantes de las cadenas a y p y las secuencias CDR3 se muestran en la Figura 6.

Además, se determinaron las secuencias de aminoácidos de longitud completa de las cadenas a y p de los TCR derivados de HD1-10 (ver la Tabla 1). También se determinaron las secuencias nucleotídicas correspondientes -ver la Tabla 2.

Ejemplo<6>- Validación funcional de los TCR recién identificados

Las secuencias de TCR a y p aisladas de HD1 y HD3 y que reconocen el VLDFAPPGA de WT1 (SEQ ID NO: 157) cuando es presentado por el alelo HLA-A*0201 se clonaron en un vector lentiviral bajo el control de un promotor bidireccional para promover la expresión robusta y coordinada de ambas cadenas del TCR en linfocitos transducidos. Se transdujeron células T de un individuo sano con el vector viral que codifica el TCR HD1 o el TCR HD3. Como control, también transdujimos células con el TCR WT1 126-134. Las células T transducidas se validaron funcionalmente por cocultivo con diferentes células objetivo representadas por las células T2 pulsadas con uno de los 2 péptidos reconocidos (VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) para los TCR HD1 y HD3; RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255) para el TCR WT1 126-134) (Figura 7a), células K562 de tipo silvestre o modificadas para expresar el alelo HLA-A*0201 (Figura 7b), blastos primarios de AML derivados de 3 pacientes de AML y seleccionados de acuerdo con la expresión del alelo HLA-A*0201 y la expresión de WT1 (Figura 7c). Después de 3 días de cocultivo observamos la capacidad de cada población de células T transducidas para reconocer específicamente el péptido objetivo cuando se presenta por el alelo HLA-A*0201 (Figura 7a) y el mayor potencial de las células T HD1 para mediar en una eliminación casi completa de las células K562 manipuladas. La mayor potencia del TCR HD1 en el reconocimiento del antígeno objetivo se confirmó además por los resultados del cocultivo con blastos de pAML. Aquí, observamos una mayor eliminación de ambos blastos de pAML que albergan el alelo HLA-A*0201 después del cocultivo con células T HD1 TR en comparación con las condiciones en las que se usaron linfocitos T HD3 TR y WT1 126-134 TR como células efectoras.

Materiales y métodos

La secuencia de la proteína WT1 publicada anteriormente por Gessleret al.(Gessler, M.et al.(1990)Nature343: 774-778) se usó para diseñar los péptidos usados para la estimulación y aislamiento de células T WT1 específicas. Esta secuencia contiene 575 aminoácidos e incluye los primeros 126 aminoácidos del N-terminal que faltan en la isoforma (exón 5+, KTS+) de WT1. Diseñamos 141 pentadecapéptidos que abarcaban toda la secuencia de la proteína WT 1, cada uno de los cuales se solapaba con el siguiente en 11 aminoácidos.

Los péptidos fueron sintetizados por PRIMM de acuerdo con las especificaciones de secuencia validada, 70 % de pureza, esterilidad y ausencia de endotoxina. Estos péptidos se mezclaron en cantidades iguales en el conjunto WT1 a una concentración de 1 |jg/mL por péptido. Además, se generaron 24 subconjuntos, cada uno de los cuales contenía hasta 12 péptidos (4,17 jg/mL/por péptido) de acuerdo con una matriz de mapeo específica para que cada péptido se incluyera en solamente dos subconjuntos solapados, como se muestra en la Tabla 4 (ver la estrategia de la matriz de mapeo en Doubrovina, E.et al. Blood120, 1633-1646 (2012)).

Tabla 4

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica

Se obtuvo sangre periférica de diez donantes sanos del Hospital San Raffaele previo consentimiento informado. Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque.

Células B inmortalizadas

Se aislaron células B autólogas a partir de PBMC de donantes sanos usando las microesferas CD19 (Miltenyi Biotech). Las células se transdujeron con un vector lentiviral que albergaba el transgén BCL-6/BCL-XL (Kwakkenbos, M. J.et al. Nat. Med.16, 123 (2009)) y el pseudotipo H/F (Lévy, C.et al. Molecular Therapy209, 1699-1712, (2012)) y se cultivaron en IMDM suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS), penicilinaestreptomicina y 10 ng/mL de IL-21 (Miltenyi Biotech). Las células B se reestimularon cada 5 días por cocultivo con fibroblastos de células L de ratón irradiados (50 Gy) que expresaban CD40L (3T3-CD40L) a una relación células B:3T3-CD40L de 10:1.

Líneas celulares

Cultivamos las líneas celulares T2 y K562 en RPMI 1640 (GIBCO-BRL) suplementado con penicilina, estreptomicina, glutamina y 10 % de FBS (BioWhittaker).

Células leucémicas

Las células primarias de AML se obtuvieron del biobanco de leucemia del Hospital San Raffaele (OSR) y se seleccionaron en función de la expresión de WT1 por PCR cuantitativa y de la tipificación de HLA. Todos los EBV-BLCL y las células leucémicas primarias fueron tipificados para los alelos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR y HLA-DQ a alta resolución en el laboratorio HLA de la OSR.

Citometría de flujo

Usamos anticuerpos conjugados con FITC-, PE-, PerCP-, APC-, PE-Cicromo 7-, APC-Cicromo 7-, Pacific Blue y Brillant Violet dirigidos a CD3, CD4, CD8, CD107a, IFNy, TNFa, CD33, CD117, CD34, CD14, V021.3, Vp8, V07.2 y HLA-A2 humanos. WT1 VLDFAPPGA marcado con fluorescencia APC (SEQ ID NO: 157) y WT1 RMFPNAPYL marcado con fluorescencia PE (SEQ ID NO: 255) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron con los anticuerpos por 15 minutos a 4 °C y se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato que contenía 1 % de FBS. Las muestras se pasaron por un citómetro de flujo Canto II (BD Biosciences) con clasificador celular activado por fluorescencia (FACS), y los datos se analizaron con el software Flow Jo (Tree star Inc). Para la evaluación intracelular de la secreción de citocinas y la expresión de marcadores de degranulación, se usó el juego de amortiguadores Fix/Perm (Biolegend) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Estimulación, aislamiento y expansión de células T específicas de WT1

Las PBMC recién aisladas se resuspendieron en X-VIVO suplementado con 5 % de suero AB humano, 2 mM de glutamina y 1 |jg/mL de anticuerpo monoclonal CD28, se sembraron a una densidad de 107 células/mL y se estimularon con el conjunto de péptidos solapados WT1, cada péptido presente a una concentración de 1 jg/mL.

Las células T específicas de antígeno se aislaron después de 26-30 horas por la expresión de CD137. Más específicamente, las células se tiñeron con el anticuerpo CD137 conjugado con PE y se clasificaron usando microesferas anti-PE (Miltenyi Biotech). La fracción CD137- fue agotada de las células CD3 usando microesferas CD3 (Miltenyi Biotech), irradiada 30 Gy y usada como APC cargada con péptidos en un cocultivo con la fracción CD137+ a una relación de 100:1 cuando fue posible o al menos 20:1 y una densidad final de 5 * 106 células/mL. Se usó como medio X-VIVO suplementado con 5 % de suero AB humano, 5 ng/mL de IL-7, 5 ng/mL de IL-15 y 10 ng/mL de IL-21. Los medios, incluidas las citocinas, se sustituían cada 2-3 días.

Reestimulación de células T específicas de antígeno expandidas

Las células se reestimularon cada 7-14 días con APC autólogas impulsadas por WT1 (células PBMC CD3 agotadas; células B inmortalizadas). En las reestimulaciones iniciales, las células se lavaron 2 días antes y se sembraron en medio libre de citocinas. Las APC fueron irradiadas con 30 Gy, pulsadas con el conjunto de péptidos durante la noche y cocultivadas con células efectoras en X-VIVO suplementado con 5 % de suero AB humano, 1 jg/m L de anticuerpo monoclonal CD28 e IL-7 (5 ng/mL), IL-15 (5 ng/mL), IL-21 (10 ng/mL).

Valoración de la respuesta de las células T

El porcentaje de células T que respondieron al conjunto de péptidos WT1 se midió realizando un cocultivo de 6 horas de las células efectoras con APC autólogas (relación de al menos 1:1) pulsadas con el antígeno deseado (conjunto de péptidos WT1, subconjuntos WT1, péptidos individuales WT1, conjunto de péptidos no relacionados como control). Los cocultivos se sembraron en X-VIVO suplementado con 5 % de suero AB humano y complementado con el anticuerpo monoclonal CD28 (1 jg/mL), Golgi Stop (BD) y anticuerpo CD107a-FITC para la valoración de la degranulación. Posteriormente, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron intracelularmente para determinar el porcentaje de células CD3+CD8+ o CD3+CD4+ que expresaban IFNy y CD107a.

Mapeo de péptidos inmunogénicos

Las células T estimuladas con el conjunto WT1 se sembraron en pozos diferentes y se cocultivaron con APC autólogas cargadas con uno de cada uno de los subconjuntos WT1 en una relación de al menos 1:1. Las respuestas de las células T a cada subgrupo se midieron como se ha descrito previamente por análisis de FACS. La deconvolución de la cuadrícula de mapeo fue esencial para determinar qué péptidos compartidos provocaban una respuesta de células T. Una vez determinados los péptidos inmunogénicos, las células T se volvieron a estimular con APC cargadas con los péptidos individuales para confirmar su inmunogenicidad.

Evaluación de la capacidad de las células T para reconocer células que expresan WT1

La especificidad WT1 y la capacidad restringida HLA de las células T para reconocer células objetivo se midieron con diferentes procedimientos experimentales. Para las células T derivadas de HD1, la secreción de CD107a se determinó por análisis de FACS después de 6 horas de cocultivo con las células objetivo; para las células T derivadas de HD3, el índice de eliminación se calculó como el número total de células objetivo aún presentes después de 4 días de cocultivo con las células T específicas de WT 1 dividido por el número total de células objetivo solas; para las células T derivadas de HD4, se valoró por análisis citofluorimétrico el porcentaje de células objetivo CD33+ (células primarias de AML que albergaban los alelos HLA de interés y, como control, de células primarias de AML que no albergaban el alelo HLA específico) aún presentes después de 3 días de cocultivo con células T CD3+ específicas de WT 1.

Valoración de la clonalidad de células T

Para determinar la clonalidad de las células T específicas de WT1 expandidas, se usó el kit IO Test Beta Mark TCR V beta repertoire de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Secuenciación del repertorio de TCR

Se recogieron células T específicas de WT1 en diferentes puntos temporales a lo largo del marco temporal del cocultivo y se extrajo ARN usando el kit de extracción de ARN Arcturus Pico Pure. Las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR) 3 de las células T específicas de WT1 se amplificaron usando un método RACE modificado (Ruggiero, E.et al. Nat. Commun.6,8081 (2015)). Las muestras se secuenciaron usando un secuenciador IlluminaMiSeq y los clonotipos CDR3 se identificaron usando el software MiXCR (Bolotin, DAet al. Nature Methods12, 380-381 (2015)).

Vectores lentivirales

Los genes de las cadenas a y p del TCR aislados de HD1 y HD3 fueron optimizados por codones, modificados en cisteína y clonados en un vector lentiviral (LV) bajo un promotor bidireccional. Las secuencias de aminoácidos (aa) y nucleótidos (nt) fueron:

Los LV fueron empaquetados por un constructo de tercera generación competente en integrasa y pseudotipados por la envoltura del virus de la estomatitis vesicular (VSV, por sus siglas en inglés). Como control, incluimos el LV que codifica para un TCR WT1 126-134 que reconoce el péptido RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255).

Transducciones vectoriales

Para la transducción con el vector lentiviral WT1-TCR, se activaron linfocitos T aislados de un individuo sano y se clasificaron usando esferas magnéticas conjugadas con anticuerpos contra CD3 y CD28 (ClinExVivo CD3/CD28; Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante, y se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM, por sus siglas en inglés) (GIBCO-BRL) suplementado con penicilina, estreptomicina, 10 % de FBS (por sus siglas en inglés) y 5 ngm L-1 de cada IL-7 e IL-15 (PeproTech). Para la transducción, se sembraron linfocitos T a 2,5 x<1 0 6>célulasmL-1 y se infectaron con el LV por 24 h. Después, las células T se cultivaron a 106 célulasmL-1 y se expandieron. La eficiencia de la transducción se determinó midiendo el porcentaje de células T CD3 que expresaban los dextrámeros específicos. Las células se clasificaron usando APC o dextrámero HLA-A*0201 marcado con fluorescencia PE específico para el VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) o RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 255) (Immudex) usando microesferas anti-APC o anti-PE (Miltenyi Biotec) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ensayos funcionales

La capacidad de las células T transferidas con TCR HD1, HD3 y WT1 126-134 para reconocer células objetivo que expresan WT1 se midió en cocultivo con (a) células T2 pulsadas con el péptido WT1 126-134 o con el péptido VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 157) (relación efector:objetivo = 1:1); (b) células K562 de tipo silvestre (K562) o modificadas genéticamente para expresar el alelo HLA-A*0201 (relación efector:objetivo = 1:1); (c) 3 blastos primarios de AML diferentes seleccionados en función de la expresión del alelo HLA-A*0201 y del antígeno WT1 (relación efector: objetivo = 5:1). Para el cocultivo con las líneas celulares T2 y K562, incluimos células T no transducidas como control. Después de 3 días de cultivo, se valoró el porcentaje de células objetivo por un análisis citofluorimétrico. El índice de eliminación se calculó del siguiente modo: 1-(número total de células objetivo aún presentes después de 3 días de cocultivo con las células T específicas de WT1/número total de células objetivo solas).

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de células T (TCR), que se une a un péptido de la proteína 1 del tumor de Wilms (WT1) cuando es presentado por un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), en donde el TCR comprende las siguientes secuencias CDR:

CDR1a - KALYS (SEQ ID NO: 1),

CDR2a - LLKGGEQ (SEQ ID NO: 2),

CDR3a - CGTAWINDYKLSF (SEQ ID NO: 3),

CDR1p - SGHDY (SEQ ID NO: 6),

CDR2p - FNNNVP (SEQ ID NO: 7), y

CDR3p - CASRKTGGYSNQPQHF (SEQ ID NO: 8),

y en donde el TCR está restringido a HLA-A*0201.

2. Un TCR de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un dominio variable de cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de identidad de secuencia dentro del mismo; y un dominio variable de cadena p que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de identidad de secuencia dentro del mismo.

3. Un TCR de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de identidad de secuencia dentro del mismo; y una cadena p que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y variantes de las SEQ ID NO: 10 y 11 que tienen al menos 75 % de identidad de secuencia dentro del mismo.

4. Un TCR de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende una región constante murinizada.

5. Un TCR de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el TCR es un TCR soluble.

6. Un polinucleótido aislado que codifica la cadena a de un receptor de células T (TCR) de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, y la cadena p de un TCR de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, opcionalmente en donde el polinucleótido codifica la cadena a enlazada a la cadena p.

7. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 6, que codifica uno o más ARNip de interferencia corta (ARNip) u otros agentes capaces de reducir o prevenir la expresión de uno o más genes TCR endógenos.

8. Un vector, que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, que opcionalmente comprende además un polinucleótido que codifica una o más cadenas CD3, CD8, un gen suicida y/o un marcador seleccionable.

9. Una célula aislada que comprende un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 o un vector de acuerdo con la reivindicación 8, opcionalmente en donde la célula comprende además un vector que codifica una o más cadenas CD3, CD8, un gen suicida y/o un marcador seleccionable, opcionalmente en donde la célula es una célula T, un linfocito o una célula madre, opcionalmente en donde la célula T, el linfocito o la célula madre se selecciona del grupo que consiste en células CD4, Células CD8, células T ingenuas, células T madre con memoria, células T con memoria central, células T doble negativas, células T efectoras con memoria, células T efectoras, células Th0, células Tc0, células Th1, células Tc1, células Th2, células Tc2, células Th17, células Th22, células T gamma/delta, células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), células madre hematopoyéticas y células madre pluripotentes, además opcionalmente en donde la célula es una célula T que ha sido aislada de un sujeto.

10. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, en donde un gen endógeno que codifica una cadena TCR a y/o un gen endógeno que codifica una cadena TCR p está interrumpido, preferiblemente tal como que el gen endógeno que codifica una cadena TCR a y/o el gen endógeno que codifica una cadena TCR p no se expresa, opcionalmente, en donde el gen endógeno que codifica una cadena TCR a y/o el gen endógeno que codifica una cadena TCR p se interrumpe mediante la inserción de un casete de expresión que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

11. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, en donde uno o más genes endógenos que codifican un MHC están alterados.

12. Una célula de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde un gen endógeno involucrado en la persistencia, expansión, actividad, resistencia a señales de agotamiento/senescencia/inhibitorias, capacidad de localización, u otras funciones de las células T está alterado, preferiblemente en donde el gen endógeno involucrado en la persistencia, expansión, actividad, resistencia a señales de agotamiento/senescencia/inhibitorias, capacidad de localización, u otras funciones de las células T se selecciona del grupo que consiste enPD1, TIM3, LAG3, 2B4, KLRG1, TGFbR, CD160yCTLA4.

13. Un método de preparación de una célula, que comprende el paso de introducir un vector de acuerdo con la reivindicación 8 en una célulain vitrooex vivo,por ejemplo, por transfección o transducción.

14. Un método de preparación de una célula de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende el paso de edición de células T, que comprende interrumpir un gen endógeno que codifica una cadena TCR a y/o un gen endógeno que codifica una cadena TCR p con una nucleasa artificial, preferiblemente en donde la nucleasa artificial se selecciona del grupo que consiste en nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN) y sistemas CRISPR/Cas, opcionalmente en donde el método comprende el paso de integración dirigida de un casete de expresión en el gen endógeno que codifica la cadena a del TCR y/o el gen endógeno que codifica la cadena p del TCR alterado por la nucleasa artificial, en donde el casete de expresión comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

15. Un método para preparar una célula de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, que comprende el paso de interrumpir uno o más genes endógenos que codifican un MHC, preferiblemente en donde la célula preparada por el método es una célula T universal no alorreactiva y/o en donde el método comprende el paso de interrumpir uno o más genes endógenos para modificar la persistencia, expansión, actividad, resistencia a señales de agotamiento/senescencia/inhibitorias, capacidad de localización, u otras funciones de la célula T, preferiblemente en donde el método comprende el paso de integración dirigida de un casete de expresión en un gen endógeno involucrado en la persistencia, expansión, actividad, resistencia a señales de agotamiento/senescencia/inhibitorias, capacidad de localización, u otras funciones de las células T alteradas por una nucleasa artificial, en donde el casete de expresión comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, preferiblemente en donde el gen endógeno se selecciona del grupo que consiste enPD1, TIM3, LAG3, 2B4, KLRG1, TGFbR, CD160yCTLA4.

16. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12 o una célula preparada por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15 para usar en transferencia celular adoptiva, preferiblemente transferencia celular T adoptiva, opcionalmente en donde la transferencia celular T adoptiva es transferencia celular T adoptiva alogénica, transferencia celular T adoptiva autóloga, o transferencia celular T adoptiva universal no alogénica.

17. Una molécula quimérica que comprende un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, conjugado con un sustrato no celular, una toxina y/o un anticuerpo, opcionalmente en donde el sustrato no celular se selecciona del grupo que consiste en nanopartículas, exosomas y otros sustratos no celulares.

18. Un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, un vector de acuerdo con la reivindicación 8, una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, una célula preparada por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 15, o una molécula quimérica de acuerdo con la reivindicación 17 para su uso en terapia, opcionalmente en el tratamiento y/o prevención de una neoplasia maligna hematológica o un tumor sólido, en donde la neoplasia maligna hematológica se selecciona del grupo que consiste en leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfoblástica, síndromes mielodisplásicos, linfoma, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin y linfoma de Hodgkin; y en donde el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de colon, colangiocarcinoma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cánceres de cabeza y cuello, sarcoma sinovial, angiosarcoma, osteosarcoma, cáncer de tiroides, cáncer de endometrio, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de próstata, cáncer renal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer urotelial, cáncer biliar, glioblastoma, mesotelioma, cáncer de cuello uterino y cáncer colorrectal.