ES3027618T3

ES3027618T3 - Thymohydroquinone for use in treating hyperglycemia

Info

Publication number: ES3027618T3
Application number: ES18897769T
Authority: ES
Inventors: Muhammed Majeed; Kalyanam Nagabhushanam; Lakshmi Mundkur
Original assignee: Sami Sabinsa Group Ltd
Current assignee: Sami Sabinsa Group Ltd
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2025-06-16
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: EP3732294A1; EP3731833A1; ZA202004532B; ZA202004531B; CA3087042A1; KR102577863B1; EA202091205A1; AU2018397667B2; WO2019133587A1; CN111542313B; CN111542313A; PL3732294T3; US20190192447A1; BR112020012949A2; EP3731833B1; US10881623B2; US20190192448A1; EP3732294B1; EA202091184A1; ES3063931T3

Abstract

Se describe un método para el manejo terapéutico de la hiperglucemia en mamíferos mediante composiciones que contienen timohidroquinona. Más específicamente, la invención describe composiciones que contienen timohidroquinona para inhibir la actividad de la enzima α-glucosidasa y aumentar la captación celular de glucosa por las células de mamíferos. También se describen aquí los efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antiglicación de la timohidroquinona. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Timohidroquinona para uso en el tratamiento de la hiperglucemia

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la gestión terapéutica de la hiperglucemia en mamíferos.

Descripción del estado de la técnica

La hiperglucemia es una condición en donde los niveles de glucosa en sangre permanecen elevados. La hiperglucemia crónica, si no se trata, puede causar complicaciones secundarias que conducen al desarrollo de muchas enfermedades, como diabetes, obesidad, hiperlipoproteinemia, hiperlipidemia, complicaciones cardiovasculares, cáncer, aterosclerosis, trastornos neurodegenerativos, alergia, inflamación y osteoporosis. El aumento de los niveles de glucosa en sangre incrementa la producción de especies reactivas de oxígeno/nitrógeno y de citocinas proinflamatorias, provocando así estrés oxidativo e inflamación. Los niveles elevados de glucosa aumentan adicionalmente la glicosilación no enzimática de las proteínas y otras biomoléculas (glicosilación), lo que conduce a la producción de productos finales de glicosilación avanzada (AGE) que, según los informes, son la causa principal del envejecimiento celular. Los AGE también ejemplifican la cascada inflamatoria celular que conduce al deterioro progresivo y a la apoptosis.

Los fármacos que se administran actualmente (por ejemplo, metformina) son eficaces para controlar los niveles de glucosa en sangre. La ingesta continuada de estos fármacos sintéticos provoca muchos efectos secundarios que incluyen hepatotoxicidad y nefrotoxicidad. Por lo tanto, se justifica una molécula natural de origen vegetal más segura y eficaz para controlar los niveles de glucosa en sangre.

Los métodos de tratamiento que se emplean actualmente en la gestión de la hiperglucemia incluyen la administración de inhibidores contra las enzimas clave que regulan la descomposición de los carbohidratos y el aumento de la captación de glucosa. En este aspecto, los inhibidores de la glucosidasa son de especial importancia (Kim et al., Isolation and characterization of a-glucosidase inhibitor from the fungus Ganoderma lucidum. Journal of Microbiology, 2013;42:223-227). La a-glucosidasa, es esencial para la degradación del glucógeno a glucosa. Actúa sobre las moléculas de hidratos de carbono complejos para producir unidades de monosacáridos que se absorben fácilmente en el torrente sanguíneo. La inhibición de la a-glucosidasa provoca la reducción de la liberación de glucosa en el torrente sanguíneo, disminuyendo así la condición hiperglucémica.

Existen muchas moléculas inhibidoras de la a-glucosidasa de origen vegetal que se discuten en el estado de la técnica que se indica a countinuación:

1. Thilagam et al., a-Glucosidase and a-Amylase Inhibitory Activity of Senna surattensis, Journal of Acupuncture and Meridian Studies, 2013; 6(1):24-30

2. Poongunran et al., a-Glucosidase and a-Amylase Inhibitory Activities of Nine Sri Lankan Antidiabetic Plants, British Journal of Pharmaceutical Research, 2015;7(5): 365-374.

3. Kim et al., Isolation and characterization of a-glucosidase inhibitor from the fungus Ganoderma lucidum. Journal of Microbiology, 2013;42:223-227.

Sin embargo, se necesita una molécula de origen vegetal que inhiba eficazmente la a-glucosidasa y aumente la captación de glucosa para el tratamiento eficaz de la hiperglucemia.

LaNigella sativaes bien conocida por sus numerosas propiedades terapéuticas en los sistemas de medicina ayruvédica, siddha y unani. Se ha informado de que la planta contiene muchas moléculas activas como timoquinona, timohidroquinona, ditimoquinona, p-cimeno, carvacrol, 4-terpineol, t-anetol, sesquiterpeno longifoleno, a-pineno, timol, a hederina y hederagenina (Ahmad et al., A review on therapeutic potential of Nigella sativa: A miracle herb, Asian Pac J Trop Biomed. 2013; 3(5): 337-352), responsables de los efectos beneficiosos de la planta. Algunos de los efectos terapéuticos de laNigellia sativase enumeran en los siguientes documentos del estado de la técnica:

1. Alimohammadi et al., Protective and antidiabetic effects of extract from Nigella sativa on blood glucose concentrations against streptozotocin (STZ)-induced diabetic in rats: an experimental study with histopathological evaluation, Diagn Pathol. 2013; 8: 137.

2. Sultana et al., Nigella sativa: Monograph, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2015; 4(4): 103-106.

3. Randhwa and Alghamdi, Anticancer activity of Nigella sativa (black seed) - a review, Am J Chin Med.

2011;39(6):1075-91.

4. Mahmood et al., Nigella Sativa as an Antiglycating Agent for Human Serum Albumin, International Journal of Scientific research, 2013;2(4):25-27

5. Sobhi et al., Effect of lipid extracts of Nigella sativa L. seeds on the liver ATP reduction and alpha-glucosidase inhibition, Pak J Pharm Sci., 2016;29(1):111-117.

6. Awasthi S, Understanding the mechanism of antidiabetic activity and efficacy of functional foods against advanced glycation end products: Nigella sativa and Moringa oleífera, Planta Med, 2013; 79 - PN8.

7. Razavi b M, Hosseinzadeh H. A review of the effects of Nigella sativa L. and its constituent, thymoquinone, in metabolic syndrome. J Endocrinol Invest. Nov 2014;37(11):1031-40. El documento revisa el papel de los extractos y aceites deN. sativaen diferentes componentes del síndrome metabólico y los factores de riesgo de enfermedades cardiovasculares, incluyendo la hipertensión arterial, la obesidad, la dislipidemia y la glucemia elevada.

8. Meddah B. et al. Nigella sativa inhibits intestinal glucose absorption and improves glucose tolerance in rats. J Ethnopharmacol. 30 Ene 2009;121(3):419-24. El documento demuestra que el extracto acuoso deNigella sativainhibe directamente la absorción intestinal electrogénica de glucosain vitroy valida el uso tradicional de las semillas deNigella sativacontra la diabetes.

9. Hawsawi ZA, Ali BA, Bamosa AO. Effect of Nigella sativa (Black Seed) and thymoquinone on blood glucose in albino rats. Ann Saudi Med. Mayo-Jul 2001;21(3-4):242-4. El documento describe experimentos en donde se administran semillas deN. sativapor vía oral a ratas normales en un pienso. Las ratas alimentadas con su pienso durante 7 días muestran una reducción significativa de la glucosa en sangre.

10. Ivankovic S. et al. The antitumor activity of thymoquinone and thymohydroquinone in vitro and in vivo. Exp Oncol. Sep 2006;28(3):220-4. El documento revela la actividad antitumoral de la timoquinona (TQ) y la timohidroquinona (THQ)in vitroein vivo.

11. Gawali, N. et al. (2017), [P1-091]: NEUROPROTECTIVE EFFECT OF THYMOHYDROQUINONE IN LIPOPOLYSACCHARIDE-INDUCED NEUROINFLAMMATION AND COGNITIVE IMPAIRMENT IN MICE. Alzheimer's & Dementia, 13: P273-P274. El documento divulga que la timohidroquinona administrada por vía intraperitoneal a ratones tiene un efecto neuroprotector.

La mayoría de los efectos biológicos notificados de laNigella sativacorresponden al extracto entero o específicamente a la timoquinona. No se dispone de informes sobre los efectos biológicos de la timohidroquinona con respecto al tratamiento de la hiperglucemia. Aunque la timohidroquinona es la forma reducida de la timoquiona, es diferente tanto estructural como funcionalmente.

Es el objeto principal de la invención divulgar un método para la inhibición de la actividad de la a-Glucosidasa utilizando una composición que comprende timohidroquinona.

Es otro objeto de la invención dar a conocer un método para aumentar la captación de glucosa por células de mamífero mediante la administración de una composición que comprende timohidroquinona.

Otro objeto de la invención es dar a conocer la timohidroquinona para su uso en el tratamiento terapéutico de la hiperglucemia en mamíferos.

La presente invención resuelve los objetivos mencionados y proporciona otras ventajas relacionadas.

Breve descripción de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Esta memoria descriptiva divulga composiciones que comprenden timohidroquinona. Específicamente, la memoria descriptiva divulga composiciones que contienen timohidroquinona para inhibir la actividad de la enzima a-glucosidasa. La memoria descriptiva también divulga el uso de composiciones que contienen timohidroquinona para aumentar la captación celular de glucosa por las células de mamíferos. Más específicamente, la memoria descriptiva divulga un método para el manejo terapéutico de la hiperglucemia en mamíferos utilizando composiciones que contienen timohidroquinona. Los efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antiglicación de la timohidroquinona también se divulgan en la presente.

Las características y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción más detallada, tomada conjuntamente con los dibujos adjuntos, que ilustran, a modo de ejemplo, el principio de la invención.

Breve descripción de las dibujos

LasFig. 1a y 1bmuestran la representación gráfica de la actividad inhibidora de la a-glucosidasa de la timoquinona (TQ), la timohidroquinona (THQ) y la composición de timohidroquinona.

LaFig. 2es una representación gráfica que muestra el porcentaje de captación de glucosa por los adipocitos y los miocitos tratados con timoquinona (TQ), timohidroquinona (THQ) y composición de timohidroquinona.

LaFig. 3muestra los histogramas representativos de la captación de glucosa por células de mamífero tratadas con insulina(3a),timoquinona (TQ)(3b),timohidroquinona (THQ)(3c) y composición de timohidroquinona(3d).Las células no tratadas sirven como grupo de control(3e),

LaFig. 4muestra la representación gráfica de la actividad de atrapamiento de DPPH de la timoquinona (TQ)(4a),la timohidroquinona (THQ)(4b)y la composición de timohidroquinona(4c).

LaFig. 5muestra la representación gráfica de las composiciones de la actividad de atrapamiento del DPPH y de la actividad de inhibición de la glucosidasa con porcentajes crecientes de timohidroquinona. El aumento del contenido de timohidroquinona se correlacionó directamente con el aumento de la actividad biológica.

LaFig. 6muestra la representación gráfica de las composiciones de la actividad de atrapamiento del DPPH y de la actividad de inhibición de la glucosidasa con porcentajes crecientes de timoquinona. El aumento del contenido de timoquinona se correlacionó inversamente con el aumento de la actividad biológica.

Descripción de las modalidades más preferidas

En una modalidad más preferida, la invención da a conocer un método de inhibición de la enzima glucosidasa, en donde dicho método comprende los siguientes pasos:

i) Poner en contacto la enzima glucosidasa con un sustrato paranitrofenil-a-d-glucopiranósido;

ii) Incubar con una dosis eficaz de timohidroquinona o una composición que comprenda timohidroquinona en condiciones óptimas;

iii) Leer el cambio en la absorbancia mediante métodos espectrofotométricos y fluorimétricos

iv) Comparar la absorbancia con un blanco de control y determinar el porcentaje de inhibición enzimática (IC50) por la timohidroquinona o una composición que comprende timohidroquinona mediante la fórmula:

% de inhibición = [(absorbancia del control - absorbancia del inhibidor)/absorbancia del control] * 100.

En una modalidad relacionada, la composición comprende de 0,1 % - 5% en peso de timoquinona, de 0,01% - 10% en peso de timohidroquinona, de 20% - 95% en peso de ácidos grasos, de 0,001% - 3% en peso de a-hederina o hederagenina, de 0,1% - 4,0% en peso de agente estabilizador y de 0,2% - 2% en peso de potenciador de la biodisponibilidad. En otra modalidad relacionada, el agente estabilizador se selecciona del grupo que comprende ácido rosmarínico, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, metabisulfito de sodio, galato de propilo, cisteína, ácido ascórbico y tocoferoles. En otra modalidad relacionada, el potenciador de la biodisponibilidad se selecciona del grupo que comprende piperina, quercetina, extracto de ajo, extracto de jengibre y naringina.

En otra modalidad más preferida, la invención da a conocer un método para aumentar la captación de glucosa por células de mamífero, en donde dicho método comprende los pasos de poner en contacto células de mamífero con dosis efectivas de timohidroquinona o una composición que comprenda timohidroquinona, para aumentar la captación de glucosa por las células. En una modalidad relacionada, la composición comprende de 0,1% - 5% en peso de timoquinona, de 0,01% - 10% en peso de timohidroquinona, de 20% - 95% en peso de ácidos grasos, de 0,001% - 3% en peso de a-hederina o hederagenina, de 0,1% - 4,0% en peso de agente estabilizador y de 0,2% -2% en peso de potenciador de la biodisponibilidad. En otra modalidad relacionada, el agente estabilizador se selecciona del grupo que comprende ácido rosmarínico, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, metabisulfito de sodio, galato de propilo, cisteína, ácido ascórbico y tocoferoles. En otra modalidad relacionada, el potenciador de la biodisponibilidad se selecciona del grupo que comprende piperina, quercetina, extracto de ajo, extracto de jengibre y naringina. En otra modalidad relacionada, las células de mamífero son células humanas.

En otra modalidad preferida, la invención da a conocer la timohidroquinona para su uso en el tratamiento terapéutico de la hiperglucemia en un mamífero con el fin de lograr una reducción de los niveles de glucosa en la sangre. En una modalidad relacionada, la gestión de la hiperglucemia se consigue disminuyendo la absorción de glucosa mediante la inhibición de la enzima glucosidasa, aumentando la captación celular de glucosa, reduciendo los radicales libres, reduciendo la inflamación y disminuyendo la glicosilación. En otra modalidad relacionada, el mamífero es un humano. En otra modalidad relacionada, la timohidroquinona está comprendida en una composición formulada de timohidroquinona y excipientes, adyuvantes, diluyentes o portadores farmacéuticamente/nutracéuticamente aceptables y administrada por vía oral en forma de comprimidos, cápsulas, geles blandos, jarabes, gomitas, polvos, suspensiones, emulsiones, masticables, caramelos o comestibles.

Las modalidades más preferidas anteriormente mencionadas que incorporan las características técnicas y los efectos técnicos de la presente invención se explican a través de ejemplos ilustrativos en la presente.

Ejemplo 1:Inhibición de la glucosidasa

Para la inhibición de la glucosidasa, se disolvió a-glucosidasa (Código G5003; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en una disolución amortiguadora de fosfato de potasio 67 mM, pH 6,8, con un contenido de 8 que contenía 0,2% de albúmina sérica bovina (Sigma-Aldrich) y 0,02% de azida de sodio (Sigma-Aldrich), que se utilizó como fuente enzimática. Se utilizó paranitrofenil-a-d-glucopiranósido (Sigma-Aldrich) como sustrato. La timoquinona, la timohidroquinona y la composición que contiene timohidroquinona se pesaron preparadas a una concentración de 63, 125, 250 y 500 |jg/ml y se enrasaron con volúmenes iguales de agua destilada. Se incubaron 50 |jl de dicha composición durante 5 min con 50 j l de fuente enzimática (0,15 U/ml). Tras la incubación, se añadieron 50 j l de sustrato (1,25 mM) y se siguió incubando durante 20 min a temperatura ambiente. Antes y después de la adición de sustrato, se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de microplacas (BMG FLUOstar OPTIMA Microplate Reader). Se obtuvo el aumento de la absorbancia al añadir el sustrato. Cada prueba se llevó a cabo tres veces y la media de absorción se utilizó para calcular el porcentaje de inhibición de la a-glucosidasa. La acarbosa se utilizó como control positivo con diversas concentraciones. Las actividades inhibitorias de concentraciones variables de dicha composición se expresaron como 100 menos la diferencia de absorbancia (%) de dicha composición en relación con el cambio de absorbancia del control negativo (es decir, el agua utilizada como disolución de prueba). Las mediciones se realizaron por triplicado y se determinó el valor IC50 (es decir, la concentración de dicha composición que da lugar a una inhibición del 50% de la actividad máxima).

La timohidroquinona (IC5071,9 |jg/ml) y la composición que comprende timohidroquinona (IC50 150,9 |jg/ml) mostraron una inhibición eficaz de la a-glucosidasa en comparación con la timoquinona (IC50407,6 jg/m l) (Fig 1a y ib).

Ejemplo 2:Aumento de la captación de glucosa

Los mioblastos de la línea celular de músculo esquelético C2C12 (obtenidos de ATCC) se mantuvieron en DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino a 37°C con un 5% de CO2. Se sembraron 20,000 células por pozo en una placa de 24 pozos. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 80-90%, se indujo la diferenciación sustituyendo el medio de crecimiento por DMEM con un 1% de suero de caballo. Los experimentos se llevaron a cabo en miotubos C2C12 completamente diferenciados tras 4-5 días en medio de diferenciación. A continuación, las células se trataron con BSA al 0,5% en un medio bajo en glucosa durante 16 horas y se lavaron con disolución amortiguadora de fosfato Krebs-Ringer fría sin glucosa. A continuación, las células se trataron con diferentes concentraciones no citotóxicas de muestras en medio DMEM bajo en glucosa con o sin insulina a una concentración de 0,1 jM durante 30 minutos a 37°C. A continuación, las células se lavaron con PBS frío y se tiñeron con 5 jM de un análogo fluorescente de la D-glucosa 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino]-2-deoxi-D-glucosa (2-NBDG) durante 15 minutos en la oscuridad, seguido de la detección por citometría de flujo de la fluorescencia producida por las células.

La timohidroquinona y la composición que comprende timohidroquinona mostraron una mayor captación de glucosa en los adipocitos y las células musculares en comparación con la timoquinona(Fig. 2a y 2b).

Ejemplo 3:Actividad antioxidante de la timohidroquinona

La propiedad antioxidante de la timohidroquinona se valoró mediante la actividad de atrapamiento del DPPH.

El aumento crónico de los niveles de azúcar en la sangre conduce a la formación de especies reactivas del oxígeno. Las especies reactivas de oxígeno (ROS), incluyendo los radicales superóxido, hidroxilo, peroxilo y alcoxi, son atrapadas por los antioxidantes celulares y permanecen en equilibrio. Estos daños inducidos por r Os provocan irritación cutánea, inflamación, envejecimiento, cáncer y muchas otras enfermedades. el método de atrapamiento de radicales libres a, a-difenil-p-picrilhidrazilo (DPPH) es una de las primeras aproximaciones para evaluar el potencial antioxidante de un compuesto.

Procedimiento

El DPPH es un radical libre estable en disolución metanólica con una absorbancia a 520 nm. Si los radicales libres son atrapados por una molécula antioxidante, la disolución resultante tiene una apariencia amarilla. La capacidad de donación de átomos de hidrógeno o electrones del metabolito extracelular se midió mediante el blanqueo de la disolución de metanol DPPH de color púrpura.

La timoquinona, la timohidroquinona y la composición que comprende timohidroquiona se prepararon en concentraciones variables. Para el ensayo de atrapamiento de radicales DPPH, se mezclaron 20 j l de material de prueba con 180 j l de DPPH en metanol en una placa de 96 pocillos siguiendo el método descrito anteriormente (Clarke et al., 2013). La placa se mantuvo en la oscuridad durante 15 minutos, tras lo cual se midió la absorbancia de la disolución a 540 nm utilizando un lector de microplacas (TECAN Ltd, Mannedorf, Suiza). Los blancos (DMSO, metanol) y el estándar (disolución de Trolox en DMSO) se registraron simultáneamente. Los extractos se examinaron con concentraciones variables para establecer la concentración de inhibición (IC50, la concentración que reduce la absorbancia del DPPH en un 50%).

La actividad de atrapamiento de radicales libres se calculó del siguiente modo,

(B-C) - (S-C)

% de actividad de atrapamiento = ------------------------X 100

(B-C)

Donde,

B = Absorbancia de la disolución de referencia (OD de DPPH)

C = Absorbancia de la disolución de referencia en blanco (OD de sólo metanol)

S = Absorbancia de la disolución de prueba

C = Absorbancia del blanco de la disolución de prueba

La timohidroquinona es un potente antioxidante con una IC50 de 1,78 |jg/ml (Fig. 4b). La composición que incluía timohidroquinona también mostró un excelente potencial antioxidante con una IC50 de 540,1 jg/m l(Fig. 4c), que es mucho más eficaz que la timoquinona(Fig. 4a).

Ejemplo 4:Actividad antiinflamatoria de timohidroquinona

La hiperglucemia crónica aumenta la inflamación celular al incrementar la producción de citocinas proinflamatorias como el TNF-a. Se probó la actividad antiinflamatoria de la timoquinona, la timohidroquinona y una composición que comprende timohidroquinona mediante la valoración de su actividad inhibidora del TNF-a.

Células: Los THPI-monocitos humanos adquiridos a la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y mantenidos en cultivo en una monocapa en medio del Rosewell Park Memorial Institute (RPMI Life technologies, CA, EE. UU.) suplementado con un 10% (v/v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS; GIBCO/Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 unidades/mL de penicilina y 100 jg/m L de estreptomicina (Life technologies) a 37°C en un incubador humidificado con un 5% de CO2.

Reactivos y disoluciones amortiguadoras: Lipopolisacárido (LPS, Sigma chemicals, EE. UU.), disolución salina amortiguada con fosfato, RPMI, FBS

Kit ELISA: Kit ELISA para TNF humano, Krishgen Biosciences, EE. UU

Procedimiento

Se examinó la actividad antiinflamatoria utilizando la línea celular de monocitos/macrófagos humanos; los THP-monocitos responden a los lipopolisacáridos (LPS) secretando citocinas proinflamatorias. El factor de necrosis tumoral (TNF-a) es una de las principales citocinas que desencadenan una cascada de reacciones inflamatorias. La concentración de TNF-a se midió mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La reducción de la concentración de TNF-a indica una actividad antiinflamatoria del compuesto.

Se estimularon 1X105 células THP-1 con 100 ng de lipopolisacarida (LPS, 0,1jg/mL) para inducir la secreción de TNF-a. Las células fueron pretratadas con diferentes concentraciones de materiales de prueba (timoquinona, timohidroquinona y una composición que comprende timohidroquinona) antes del tratamiento con LpS. Los sobrenadantes celulares se recolectaron 24 horas después del tratamiento y secretaron TNF-a estimado mediante ELISA de citocinas según lo descrito por el fabricante. Las células no estimuladas se utilizaron como control negativo. El límite de detección fue <1 pg/mL.

Resultados

Los resultados indicaron que la timohidroquinona inhibió el TNF-a (Tabla 1), lo que indica una actividad antiinflamatoria significativa sin afectar a la viabilidad celular.

Tabla 1: Actividad antiinflamatoria de timohidro uinona

Ejemplo 5:Actividad antiglicación de la timohidroquinona

Los productos finales de glicación avanzada (AGE) se generan mediante la formación no enzimática de aductos entre los grupos amino de las proteínas (predominantemente lisina y arginina) y los grupos carbonilo del azúcar reductor, también conocida como reacción de Maillard. En las primeras etapas, los azúcares reductores reaccionan con grupos amino libres para formar un compuesto de aldimina inestable que sufre un reordenamiento molecular para formar un producto de glicación temprana estable conocido como producto de Amadori. En las etapas posteriores, el proceso de glicación a través de reacciones de oxidación, deshidratación y ciclado forma los productos finales de glicación avanzada, también conocidos como AGE. Se sabe que diversas estructuras de los AGE, tales como N£-(carboximetil)-lisina (CML), pirralina, pentosidina, están asociadas a trastornos degenerativos, tales como el envejecimiento, la diabetes, la aterosclerosis la enfermedad de Alzheimer y la insuficiencia renal.

Se sabe que las pentosidinas se acumulan en los pacientes diabéticos y las vesperlisinas se encuentran en la cataractogénesis y la retinopatía diabética. Los agentes capaces de prevenir la glicación pueden utilizarse eficazmente para contrarrestar las complicaciones secundarias asociadas a la hiperglucemia. Se probaron los efectos antiglicación de la timoquinona y la timohidroquinona.

Los AGE pueden ser tanto de naturaleza fluorescente como no fluorescente. Normalmente, los AGE del tipo de la vesperlisina tienen una excitación a 370 nm y una emisión a 440 nm, mientras que los AGE del tipo de la pentosidina tienen una excitación a 335 nm y una emisión a 385 nm. El principio se basa en que el azúcar ribosa y la albúmina sérica bovina se mezclan en una relación específica y se incuban durante 24 horas. Los AGE tipo vesperlisina formados por la reacción se estimaron por el aumento de fluorescencia detectado en Ex/Em a 390/460 nm, y las pentosidinas se detectaron en Ex/Em a 320/405 nm

Materiales

Ribosa, albúmina sérica bovina, placas de microtitulación negras de 96 pozos

Ribosa - Método BSA: Se añadieron 10 |jl de diversas concentraciones de muestras a 40 |jl de BSA (albúmina sérica bovina, cepa de 25 mg/ml) y 50 j l de D-Ribosa (cepa de 150 mg/ml) por pozo de microplaca negra de 96 pozos y se incubaron durante 24 h a 37 °C. La BSA se tomó como el control. Los AGE (productos finales de glicación avanzada) formados se detectaron mediante la fluorescencia a Ex/Em a 390/460 nm para AGE vesperlisina y a Ex/Em a 320/405 nm para AGE pentosidina.

Resultados

La inhibición de los AGE vesperlisina y pentosidina por la timoquinona y la timohidroquinona se tabula en la Tabla 2.

T l 2: P r n inhi i i n l A E r l im hi r in n

Los resultados indicaron que la timohidroquinona es una molécula biológicamente más potente y presenta una mayor actividad biológica en comparación con la timoquinona.

También se evaluaron los efectos biológicos de las composiciones con un porcentaje creciente de timohidroquinona. La Tabla 3 ofrece la lista de las composiciones con aumento del contenido de timohidroquinona.

Tabla 3: Com osiciones ue contienen timohidro uinona

El aumento del contenido de timohidroquinona en las composiciones se correlacionó con un mayor atrapamiento del DPPH y una mayor inhibición de la glucosidasa(Fig. 5)en comparación con la timoquinona, que no mostró correlación con la actividad biológica(Fig. 6).Por lo tanto, la timohidroquinona puede incorporarse eficazmente a formulaciones para el tratamiento eficaz de diversas enfermedades y trastornos incluyendo, pero sin limitarse a, hiperglucemia, diabetes, obesidad, hiperlipoproteinemia, hiperlipidemia, complicaciones cardiovasculares, cáncer, aterosclerosis, enfermedades neurodegenerativas, alergia, inflamación y osteoporosis.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de inhibición de la enzima glucosidasa, en donde dicho método comprende los siguientes pasos: i) Poner en contacto la enzima glucosidasa con un sustrato paranitrofenil-a-d-glucopiranósido;

iii) Leer el cambio en la absorbancia mediante métodos espectrofotométricos y fluorimétricos;

% de inhibición = [(absorbancia del control - absorbancia del inhibidor)/absorbancia del control] * 100, en donde el método no comprende un tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la composición que comprende timohidroquinona comprende de 0,1% - 5% en peso de timoquinona, de 0,01% - 10% en peso de timohidroquinona, de 20% - 95% en peso de ácidos grasos, de 0,001% - 3% en peso de a-hederina o hederagenina, de 0,1% - 4,0% en peso de agente estabilizador y de 0,2% - 2% en peso de potenciador de la biodisponibilidad.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el agente estabilizador se selecciona del grupo que comprende ácido rosmarínico, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, metabisulfito de sodio, galato de propilo, cisteína, ácido ascórbico y tocoferoles.

4. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el potenciador de la biodisponibilidad se selecciona del grupo que comprende piperina, quercetina, extracto de ajo, extracto de jengibre y naringina.

5. Un método para aumentar la captación de glucosa por células de mamífero, en donde dicho método comprende los pasos de poner en contacto células de mamífero con dosis efectivas de timohidroquinona o una composición que comprende timohidroquinona, para aumentar la captación de glucosa por las células, en donde el método no comprende un tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde la composición comprende de 0,1% - 5% en peso de timoquinona, de 0,01% - 10% en peso de timohidroquinona, de 20% - 95% en peso de ácidos grasos, de 0,001% - 3% en peso de a-hederina o hederagenina, de 0,1% - 4,0% en peso de agente estabilizador y de 0,2% - 2% en peso de potenciador de la biodisponibilidad.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde el agente estabilizador se selecciona del grupo que comprende ácido rosmarínico, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, metabisulfito de sodio, galato de propilo, cisteína, ácido ascórbico y tocoferoles.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde el potenciador de la biodisponibilidad se selecciona del grupo que comprende piperina, quercetina, extracto de ajo, extracto de jengibre y naringina.

9. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde las células de mamífero son células humanas.

10. Timohidroquinona para su uso en el tratamiento terapéutico de la hiperglucemia en un mamífero con el fin de lograr una reducción de los niveles de glucosa en la sangre.

11. La timohidroquinona para uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el mamífero es un ser humano.

12. Timohidroquinona para uso de conformidad con la reivindicación 10 u 11, en donde la timohidroquinona está comprendida en una composición formulada de timohidroquinona y excipientes, adyuvantes, diluyentes o portadores farmacéuticamente/nutracéuticamente aceptables y para administración oral en forma de comprimidos, cápsulas, geles blandos, jarabes, gomitas, polvos, suspensiones, emulsiones, masticables, caramelos o comestibles.