ES3027988T3 - Methods and materials for assessing allelic imbalance - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan métodos y sistemas para detectar el desequilibrio alélico mediante secuenciación de ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y materiales para evaluar el desequilibrio alélico
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Campo de la invención
La invención se refiere, en general, al diagnóstico molecular, y particularmente a un método y un sistema para detectar desequilibrios alélicos en muestras de pacientes.
Antecedentes de la invención
En general, una comparación de secuencias presentes en el mismo locus en cada cromosoma (cada cromosoma autosómico para machos) de un par de cromosomas puede revelar si ese locus particular es homocigoto o heterocigoto dentro del genoma de una célula. Los locus polimórficos dentro del genoma humano son generalmente heterocigotos dentro de un individuo, ya que ese individuo recibe típicamente una copia del padre biológico y una copia de la madre biológica. En algunos casos, un locus polimórfico o una cadena de locus polimórficos dentro de un individuo son homocigóticos como resultado de heredar copias idénticas de ambos padres biológicos. En otros casos, la homocigosidad resulta de una pérdida de heterocigosidad (LOH, por sus siglas en inglés) de la estirpe germinal. S. Jacobs et al., ([15-03-2007]Cáncer Research,vol. 67, n ° 6, páginas 2544-2551) describen un análisis integrado del genotipo, la pérdida de heterocigosidad (LOH) y el número de copias para el ADN derivado de tejidos FFPE usando micromatrices de oligonucleótidos que contienen más de 500K polimorfismos de un solo nucleótido. Kissel et al., ([2009]Cáncer Biomark.
5(3): 143-158) desvelan un conjunto de marcadores para detectar pérdida de heterocigosidad (LOH) que comprende 43 SNP que se enriquecen a partir de una muestra genómica a través de una etapa de PCR de dos etapas y después se secuencian.
Debido a que la información de LOH y número de copias puede ser clínicamente útil, existe la necesidad de métodos mejorados para identificar locus y regiones de LOH en muestras.
Breve sumario de la invención
El análisis del número de copias (incluyendo desequilibrio alélico y LOH) de tejidos tumorales se ha realizado tradicionalmente usando matrices de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés). La calidad de los datos es, a menudo, altamente variable y, de manera especial para muestras de FFPE, tiende a ser mala. Los autores han desarrollado un método de análisis del número de copias del genoma completo que produce datos de alta calidad a partir de todos los tipos de muestras que se basa en la captura en solución de fragmentos de ADN que abarcan locus diana (por ejemplo, SNP), seguido de secuenciación paralela para identificar y cuantificar los alelos. Los datos resultantes permiten LOH de alta calidad y análisis del número de copias de la muestra.
Por consiguiente, en un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar el estado de desequilibrio alélico en una pluralidad de locus genómicos en una muestra tumoral de un paciente con cáncer que comprende las etapas de enriquecer una muestra de ADN genómico para moléculas de ADN que comprendan cada una un locus de interés, en donde el enriquecimiento se realiza mediante un método de captura en disolución o soporte sólido; secuenciar dichas moléculas de ADN para determinar el genotipo en cada uno de dichos locus, en donde para la secuenciación se usa una plataforma paralela de alto rendimiento; y determinar para cada locus si hay desequilibrio alélico.
También se desvela, pero no forma parte de la invención, un método para detectar el estado de LOH en una pluralidad de locus genómicos en una muestra tumoral de un paciente con cáncer que comprende las etapas de enriquecer una muestra de ADN genómico para moléculas de ADN que comprendan cada una un locus de interés; secuenciar dichas moléculas de ADN para determinar el genotipo en cada uno de dichos locus; y determinar para cada locus homocigótico si es homocigótico debido a LOH.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque los métodos y los materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y los materiales adecuados se describen a continuación.
Otros rasgos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que representa las cantidades de alelos de células de cáncer de mama de un paciente con cáncer de mama a lo largo del cromosoma 1, como se determina usando una matriz de SNP. La región cromosómica entre las flechas es una región LOH que tiene aproximadamente 103 Mb de longitud.
La Figura 2 es un gráfico que representa las cantidades de alelos de las células de cáncer de mama para el mismo paciente con cáncer de mama que en la Figura 1 a lo largo del cromosoma 1, como se determina usando secuenciación de alto rendimiento. La región cromosómica entre las flechas es una región LOH que tiene aproximadamente 103 Mb de longitud.
La Figura 3 es un diagrama de un ejemplo de un dispositivo de computadora y un dispositivo de computadora móvil que se pueden usar para implementar las técnicas descritas en el presente documento.
Descripción detallada de la invención
Sorprendentemente, se ha descubierto que la determinación del desequilibrio alélico (por ejemplo, número de copias anormal, LOH) en muestras embebidas en parafina y fijadas en formalina («FFPE», por sus siglas en inglés) usando secuenciación de regiones genómicas que comprenden locus de interés (por ejemplo, SNP) genera datos de calidad muy superiores en comparación con el número de copias y los datos de desequilibrio alélico generados usando micromatrices. Esta invención permite el análisis del número de copias (por ejemplo, del desequilibrio alélico) a gran escala (por ejemplo, del genoma completo) de muestras de diversa calidad. En particular, permite que se produzcan datos de alta calidad a partir de ADN derivado de FFPE. Las plataformas actuales basadas en matrices no pueden producir datos de suficiente calidad a partir de este tipo de muestra.
Por consiguiente, en un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar el estado de desequilibrio alélico en una pluralidad de locus genómicos en una muestra tumoral de un paciente con cáncer que comprende las etapas de enriquecer una muestra de ADN genómico para moléculas de ADN que comprendan cada una un locus de interés, en donde el enriquecimiento se realiza mediante un método de captura en disolución o soporte sólido; secuenciar dichas moléculas de ADN para determinar el genotipo en cada uno de dichos locus, en donde en la secuenciación se usa una plataforma paralela de alto rendimiento; y determinar para cada locus si hay desequilibrio alélico. «Locus», como se usa en el presente documento, tiene su significado habitual en la técnica. Como se usa en el presente documento, «región» significa una pluralidad de locus sustancialmente adyacentes. A menos que se indique lo contrario o a menos que el contexto indique claramente lo contrario, las declaraciones hechas sobre un locus generalmente se aplicarán a una región.
Como se usa en el presente documento, «desequilibrio alélico» significa cualquier caso en el que el número de copias somáticas difiere del número de copias de la estirpe germinal en un locus o región genómica. En algunas realizaciones, el desequilibrio alélico se expresa en términos de proporción de copia principal («MCP, por sus siglas en inglés»). La proporción de copias principales y MCP, como se usa en el presente documento, significan la relación del número de copias de alelos principales al número de copias de alelos principales minoritarios, como sigue:
MCP = [número de copias del alelo principal] / ([número de copias de alelo principal] [número de copias de alelo minoritario])
En algunas realizaciones, un locus o una región muestra desequilibrio alélico si la MCP en dicho locus o dicha región es 0.51,0.52, 0.53, 0.54, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95 o 1.
Un ejemplo de desequilibrio alélico es la pérdida de heterocigosidad («LOH»), en la que un locus es heterocigoto en la estirpe germinal, pero homocigoto en el tejido somático. En este sentido, la homocigosidad puede incluir pérdida homocigótica (es decir, deleción) del locus en tejido somático. Los diferentes tipos de LOH y desequilibrio alélico posibles se examinan con más detalle a continuación.
Por tanto, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para detectar el estado de LOH en una pluralidad de locus genómicos en una muestra tumoral de un paciente con cáncer que comprende enriquecer una muestra de ADN genómico para moléculas de ADN que comprendan cada una un locus de interés; secuenciar dichas moléculas de ADN para determinar el genotipo en cada uno de dichos locus; y determinar para cada locus homocigótico si es homocigótico debido a LOH.
De acuerdo con la presente invención, se pueden usar técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos para identificar locus y/o regiones con desequilibrio alélico. Por ejemplo, el ADN genómico de una muestra celular (por ejemplo, una muestra de células cancerosas) puede extraerse y fragmentarse. Se puede usar cualquier método apropiado para extraer y fragmentar ácido nucleico genómico incluyendo, sin limitación, equipos comerciales tales como QIAamp DNA Mini (Qiagen), MagNA Pure DNA Isolation (Roche Applied Science) y GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep (Sigma-Aldrich). Una vez extraído y fragmentado, se puede hacer secuenciación dirigida o no dirigida para determinar los genotipos de la muestra en los locus de interés. Por ejemplo, puede hacerse secuenciación de genoma completo, transcriptoma completo o exoma completo para determinar genotipos a millones o incluso miles de millones de pares de bases (es decir, los pares de bases pueden ser «locus» que van a evaluarse).
En algunos casos, la secuenciación dirigida de locus polimórficos conocidos (por ejemplo, SNP y secuencias<circundantes) puede hacerse como una alternativa al análisis de micromatrices. Por ejemplo, el a>D<n genómico>puede enriquecerse para aquellos fragmentos que contienen un locus (por ejemplo, ubicación de SNP) que van a analizarse usando equipos diseñados para este fin (por ejemplo, Agilent SureSelect, Illumina TruSeq Capture, Nimblegen SeqCap EZ Choice, Raindance Thunderstorm<™>). Por ejemplo, el ADN genómico que contiene los locus que se van a analizar se puede hibridar con fragmentos de ARN de captura biotinilados para formar complejos de ARN biotinilado / ADN genómico. Alternativamente, se pueden utilizar sondas de captura de ADN que resulten en la formación de híbridos de ADN biotinilado / ADN genómico. Pueden usarse perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina y una fuerza magnética para separar los complejos de ARN / ADN genómico biotinilados de aquellos fragmentos de ADN genómico no presentes dentro de un complejo de ARN / ADN genómico biotinilado. Los complejos de ARN / ADN genómico biotinilados obtenidos pueden tratarse para eliminar el ARN capturado de las perlas magnéticas, dejando de ese modo fragmentos de ADN genómico intactos que contienen un locus que va a analizarse. Estos fragmentos de ADN genómico intactos que contienen los locus que se van a analizar se pueden amplificar usando, por ejemplo, técnicas de PCR. Alternativamente, se puede emplear una reacción de PCR múltiple para enriquecer los locus de interés. Los cebadores de PCR pueden diseñarse para flanquear los locus de interés y puede ejecutarse una reacción de PCR para amplificar secuencias que comprendan dichos locus.
Los fragmentos de ADN genómico enriquecidos pueden secuenciarse usando cualquier técnica de secuenciación. Más allá de la secuenciación de Sanger, numerosas máquinas y estrategias de secuenciación adecuadas son bien conocidas en la técnica, incluyendo, entre otras, las desarrolladas por Illumina (el analizador de genoma; Bennett et al., (2005)Pharmacogenomics,6: 373-382; HiSeq; MiSeq); de Applied Biosystems, Inc. (el secuenciador SOLiD<™>; solid.appliedbiosystems.com); de Roche (por ejemplo, el<secuenciador 454>G<s FLX™ ; Margulies et al., (2005) Nature, 437: 376-380; las Patentes de>E<e>.<UU. números>6,274,320; 6,258,568; 6,210,891); por Helicos Biosciences (Heliscope<™>system, véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente de EE. UU. número 2007/0070349); por Oxford Nanopore (por ejemplo, GridION<™>y MinION<™>, véase, por ejemplo, la Solicitud Internacional número PCT/GB2009/001690, publicación número WO/2010/004273); y por otros.
Los resultados de la secuenciación de los fragmentos de ADN genómico pueden usarse para identificar locus que tengan desequilibrio alélico. En algunos casos, se puede realizar un análisis del estado de desequilibrio alélico de los locus a lo largo de una longitud de un cromosoma para determinar la longitud de las regiones de desequilibrio alélico. Por ejemplo, un tramo de ubicaciones de SNP que están separadas (por ejemplo, separadas entre aproximadamente 25 kb y aproximadamente 100 kb) a lo largo de un cromosoma puede evaluarse mediante secuenciación, y los resultados de la secuenciación se usan para determinar no solo la presencia de una región de desequilibrio alélico (por ejemplo, homocigosidad somática) a lo largo de un cromosoma, sino también la longitud de esa región de desequilibrio. Los resultados de la secuenciación obtenidos se pueden usar para generar un gráfico en que se representen gráficamente las cantidades de alelos a lo largo de un cromosoma. La cantidad de alelos, d<i>, para el SNP i puede calcularse a partir del número ajustado de sondas capturadas para dos alelos (A<i>y B<i>): d<i>=. A<i>/ (A<i>+ B<i>). Un ejemplo de tal gráfico se presenta en la Figura 2.
Una vez que se ha determinado el genotipo de una muestra (por ejemplo, homocigosidad) para una pluralidad de locus (por ejemplo, SNP), pueden usarse técnicas comunes para identificar locus y regiones de desequilibrio alélico debido a cambio somático (por ejemplo, LOH). Una forma de determinar si el desequilibrio se debe a un cambio somático es comparar el genotipo somático con la estirpe germinal. Por ejemplo, el genotipo para una pluralidad de locus (por ejemplo, SNP) puede determinarse tanto en una muestra de estirpe germinal (por ejemplo, sangre) como en una muestra somática (por ejemplo, tumor). Los genotipos para cada muestra pueden compararse (típicamente de manera computacional) para determinar dónde es el genoma de la célula de la estirpe germinal, por ejemplo, heterocigoto y el genoma de la célula somática es, por ejemplo, homocigoto. Tales locus son locus LOH y las regiones de tales locus son regiones LOH.
También se pueden usar técnicas computacionales para determinar si el desequilibrio alélico es somático (por ejemplo, debido a LOH). Tales técnicas son particularmente útiles cuando una muestra de estirpe germinal no está disponible para análisis y comparación. Por ejemplo, pueden usarse algoritmos tales como los descritos en otra parte para detectar regiones de desequilibrio alélico usando información de matrices de SNP (Nanya et al.,Cáncer Res.,65: 6071-6079 (2005)). Típicamente, estos algoritmos no tienen en cuenta explícitamente la contaminación de muestras tumorales con tejido benigno. Véase la Solicitud Internacional número PCT/US2011/026098 para Abkevich et al.; Goransson et al., PLoS One (2009) 4(6): e6057. Esta contaminación es, a menudo, lo suficientemente alta como para que la detección de regiones de desequilibrio alélico sea un reto. Los métodos analíticos mejorados de acuerdo con la presente invención para identificar desequilibrios alélicos, incluso a pesar de la contaminación, incluyen los incorporados en productos desoftwarede computadora como se describe a continuación.
Lo siguiente es un ejemplo. Si la relación observada (por ejemplo, MCP) de las señales de dos alelos, A y B, es de dos a uno, hay dos posibilidades. La primera posibilidad es que las células cancerosas tengan LOH con deleción del alelo B en una muestra con una contaminación del 50 % con células normales. La segunda posibilidad es que no haya LOH, pero que el alelo A se duplique en una muestra sin contaminación con células normales. Un algoritmo puede implementarse como un programa de computadora como se describe en el presente documento para reconstruir regiones LOH basándose en datos de genotipo (por ejemplo, genotipo SNP). Un punto del algoritmo es reconstruir primero los números de copias específicas de alelo (ASCN, por sus siglas en inglés) en cada locus (por ejemplo, SNP). Los ASCN son el número de copias de alelos paternos y maternos. Una región LOH se determina después como un tramo de SNP, siendo cero uno de los ASCN (paterno o materno). El algoritmo puede basarse en maximizar una función de probabilidad y puede ser de manera conceptual similar a un algoritmo descrito previamente diseñado para reconstruir el número de copias total (en lugar de ASCN) en cada locus (por ejemplo, SNP). Véase la Solicitud Internacional número PCT/US2011/026098 (Publicación número WO/2011/106541). La función de probabilidad puede maximizarse sobre el ASCN de todos los locus, nivel de contaminación con tejido benigno, número total de copias promediado sobre todo el genoma y nivel de ruido específico de la muestra. Los datos de entrada para el algoritmo pueden incluir (1) intensidades de señal normalizadas específicas de la muestra para ambos alelos de cada locus y (2) colecciones de parámetros específicos del ensayo (específicos para diferentes matrices de SNP y para enfoque basado en secuencias) definidos basándose en el análisis de un gran número de muestras con perfiles de ASCN conocidos, o consistir en ellas.
En algunos casos, se puede usar un proceso de selección para seleccionar locus (por ejemplo, locus de SNP) que se vayan a evaluar usando un ensayo configurado para identificar locus con desequilibrio alélico (por ejemplo, ensayos basados en matrices de SNP y ensayos basados en secuenciación). Por ejemplo, puede seleccionarse cualquier ubicación de SNP humano para su inclusión en un ensayo basado en matrices de SNP o un ensayo basado en secuenciación configurado para identificar locus con desequilibrio alélico dentro del genoma de las células. En algunos casos, se pueden evaluar 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 millones o más locus (por ejemplo, ubicaciones de SNP) presentes dentro del genoma humano para identificar aquellos locus que (a) no están presentes en el cromosoma Y, (b) no son locus mitocondriales, (c) tienen una frecuencia alélica minoritaria de al menos aproximadamente el 5 % en la población de interés (por ejemplo, caucásicos), (d) tienen una frecuencia alélica minoritaria de al menos aproximadamente el 1 % en tres poblaciones distintas de la población de interés (por ejemplo, china, japonesa y yoruba) y/o (e) no tienen una desviación significativa del equilibrio de Hardy-Weinberg en ninguna de estas poblaciones. En algunos casos, se pueden seleccionar más de 100000, 150 000 o 200 000 locus humanos que cumplan los criterios (a) a (e). De los criterios de cumplimiento de los locus humanos (a) a (e), se puede seleccionar un grupo de locus (por ejemplo, los locus superiores 2500, 5000, 7500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 75000, 100000, 150000 o 200000) de tal manera que los locus tengan un alto grado de frecuencia de alelos en la población de interés, cubran el genoma humano de una manera separada y algo uniforme (por ejemplo, al menos un locus de interés cada aproximadamente 5 kb, 10 kb, 25 kb, 50 kb, 75 kb, 100 kb, 150 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb o más), y no estén en desequilibrio de ligamiento con otro locus seleccionado en cualquiera de las poblaciones usadas para análisis. En algunos casos, se pueden seleccionar aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 mil o más locus cumpliendo cada uno de estos criterios e incluirse en un ensayo configurado para identificar regiones de desequilibrio alélico a través de un genoma humano. Por ejemplo, se pueden seleccionar entre aproximadamente 70000 y aproximadamente 90000 (por ejemplo, aproximadamente 80000) SNP para el análisis con un ensayo basado en matrices de SNP, y se pueden seleccionar entre aproximadamente 45000 y aproximadamente 55000 (por ejemplo, aproximadamente 54000) SNP para el análisis con un ensayo basado en secuenciación.
Por consiguiente, en un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar el estado de desequilibrio alélico en una pluralidad de locus genómicos en una muestra de un paciente que comprende las etapas de enriquecer una muestra de ADN genómico para moléculas de ADN que comprendan cada una un locus de interés; secuenciar dichas moléculas de ADN para determinar el genotipo en cada uno de tales locus; y determinar para cada locus si tiene desequilibrio alélico.
También se desvela, pero no forma parte de la invención, un método para detectar el estado de LOH en una pluralidad de locus genómicos en una muestra de un paciente que comprende las etapas de enriquecer una muestra de ADN genómico para moléculas de ADN que comprenden cada una un locus de interés; secuenciar dichas moléculas de ADN para determinar el genotipo en cada uno de dichos locus; y determinar para cada locus homocigótico si es homocigótico debido a LOH.
También se desvela, pero no forma parte de la invención, un método para detectar el estado del número de copias en una pluralidad de locus genómicos en una muestra de un paciente que comprende las etapas de enriquecer una muestra de ADN genómico para moléculas de ADN que comprendan cada una un locus de interés; secuenciar dichas moléculas de ADN; y cuantificar cada alelo en cada uno de dichos locus para determinar su número de copias.
En algunas realizaciones, se evalúan al menos 10, 50, 100, 1000, 10000, 50000, 55000, 75000, 100000, 150000, 200 000, 300 000, 400 000, 500 000, 750 000, 1 000 000, 2 000 000 o más locus. En algunas realizaciones, estos locus están separados uniformemente a lo largo del genoma. Como se usa en el presente documento, los locus están «separados uniformemente a lo largo del genoma» cuando la diferencia porcentual entre la distancia<AB>entre dos locus A y B cualesquiera y la distancia<CD>entre dos locus C y D cualesquiera (es decir, 100* (distancia<AB>- distancia<CD>) / distancia<AB>o 100* (distancia<AB>- distancia<CD>) / distancia<CD>) es menor o igual que el 50 %, el 40 %, el 30 %, el 20 %, el 15 %, el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o el 1 %. Tal diferencia porcentual se denomina en el presente documento «espaciado genómico» de locus. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de tejido FFPE. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra tumoral del paciente.
Otro aspecto de la invención proporciona un sistema para determinar el estado de desequilibrio alélico en una pluralidad de locus en una muestra que comprende un analizador de muestras para (1) enriquecer una muestra de ADN genómico para moléculas de ADN que comprendan cada una un locus de interés y (2) secuenciar dichas moléculas de ADN para producir una pluralidad de señales cuantitativas alrededor de cada uno de tales locus; y un programa de computadora para analizar dicha pluralidad de señales cuantitativas para determinar si cada uno de tales locus tiene desequilibrio alélico.
También se desvela, pero no forma parte de la invención, un sistema para determinar el estado de LOH en una pluralidad de locus en una muestra que comprende un analizador de muestras para (1) enriquecer una muestra de ADN genómico para moléculas de ADN que comprendan cada una un locus de interés y (2) secuenciar dichas moléculas de ADN para producir una pluralidad de señales cuantitativas alrededor de cada uno de dichos locus; un programa de computadora para analizar dicha pluralidad de señales cuantitativas para determinar si cada uno de dichos locus es homocigoto en la muestra; y un programa de computadora para determinar para cada locus homocigoto si es homocigoto debido a LOH.
También se desvela, pero no forma parte de la invención, un sistema para detectar el estado del número de copias en una pluralidad de locus genómicos en una muestra de un paciente que comprende un analizador de muestras para (1) enriquecer una muestra de ADN genómico para moléculas de ADN que comprendan cada una un locus de interés y (2) secuenciar dichas moléculas de ADN para producir una pluralidad de señales cuantitativas alrededor de cada uno de dichos locus; y un programa de computadora para analizar dicha pluralidad de señales cuantitativas para cuantificar cada alelo en cada uno de dichos locus para determinar su número de copias.
En algunas realizaciones de los sistemas de la invención, un analizador de muestras enriquece la muestra en ADN de interés y secuencia ese ADN. En otras realizaciones, dos o más analizadores de muestras realizan estas funciones. En algunas realizaciones, un programa desoftwareanaliza la pluralidad de señales cuantitativas para determinar si cada locus es homocigoto en la muestra y también determina para cada locus homocigoto si es homocigoto debido a LOH.
La Figura 3 es un diagrama de un ejemplo de un dispositivo 1400 de computadora y un dispositivo 1450 de computadora móvil que pueden usarse con las técnicas descritas en el presente documento. El dispositivo 1400 de computadora representa diversas formas de computadoras digitales, tales como computadoras portátiles, computadoras de escritorio, estaciones de trabajo, asistentes digitales personales, servidores, servidores blade, ordenadores centrales y otras computadoras apropiadas. El dispositivo 1450 de computadora representa diversas formas de dispositivos móviles, tales como asistentes digitales personales, teléfonos celulares, teléfonos inteligentes y otros dispositivos de computadora similares. Los componentes mostrados aquí, sus conexiones y vinculaciones, y sus funciones, son solamente ejemplares, y no limitan las implementaciones de las invenciones descritas y/o reivindicadas en este documento.
El dispositivo 1400 de computadora incluye un procesador 1402, una memoria 1404, un dispositivo 1406 de almacenamiento, una interfaz 1408 de alta velocidad que se conecta a la memoria 1404 y puertos 1410 de expansión de alta velocidad y una interfaz 1415 de baja velocidad que se conecta al bus 1414 de baja velocidad y al dispositivo 1406 de almacenamiento. Cada uno de los componentes 1402, 1404, 1406, 1408, 1410 y 1415, están interconectados usando diversos buses, y pueden montarse en una placa base común o de otras maneras según sea apropiado. El procesador 1402 puede procesar instrucciones para llevarlas a cabo dentro del dispositivo 1400 de computadora, incluyendo instrucciones almacenadas en la memoria 1404 o en el dispositivo 1406 de almacenamiento para visualizar información gráfica para una GUI en un dispositivo de entrada/salida externo, tal como la pantalla 1416 acoplada a la interfaz 1408 de alta velocidad. En otras implementaciones, se pueden usar múltiples procesadores y/o múltiples buses, según sea apropiado, junto con múltiples memorias y tipos de memoria. También, pueden conectarse múltiples dispositivos 1400 de computadora, proporcionando cada dispositivo porciones de las operaciones necesarias (por ejemplo, como un banco de servidores, un grupo de servidores blade o un sistema multiprocesador).
La memoria 1404 almacena información dentro del dispositivo 1400 de computadora. En una implementación, la memoria 1404 es una unidad o unidades de memoria volátil. En otra implementación, la memoria 1404 es una unidad o unidades de memoria no volátil. La memoria 1404 también puede ser otra forma de medio legible por computadora, tal como un disco magnético u óptico.
El dispositivo 1406 de almacenamiento puede proporcionar almacenamiento masivo para el dispositivo 1400 de computadora. En una implementación, el dispositivo 1406 de almacenamiento puede ser o puede contener un medio legible por computadora, tal como un dispositivo de disquete, un dispositivo de disco duro, un dispositivo de disco óptico o un dispositivo de cinta, una memoriaflashu otro dispositivo de memoria de estado sólido similar, o una matriz de dispositivos, incluyendo dispositivos en una red de área de almacenamiento u otras configuraciones. Un producto de programa de computadora puede estar incorporado de manera tangible en un soporte de información. El producto de programa de computadora también puede contener instrucciones que, cuando se lleven a cabo, realicen uno o más métodos, tales como los descritos en el presente documento. El portador de información es un medio legible por computadora o máquina, tal como la memoria 1404, el dispositivo 1406 de almacenamiento, la memoria en el procesador 1402 o una señal propagada.
El controlador 1408 de alta velocidad gestiona las operaciones intensivas de ancho de banda para el dispositivo 1400 de computadora, mientras que el controlador 1415 de baja velocidad gestiona las operaciones intensivas de ancho de banda más bajas. Tal asignación de funciones es solamente ejemplar. En una implementación, el controlador 1408 de alta velocidad está acoplado a la memoria 1404, la pantalla 1416 (por ejemplo, a través de un procesador gráfico o acelerador) y a los puertos 1410 de expansión de alta velocidad, que pueden aceptar diversas tarjetas de expansión (no mostradas). En la implementación, el controlador 1415 de baja velocidad está acoplado al dispositivo 1406 de almacenamiento y al puerto 1414 de expansión de baja velocidad. El puerto de expansión de baja velocidad, que puede incluir varios puertos de comunicación (por ejemplo, USB, Bluetooth, Ethernet o Ethernet inalámbrica) puede acoplarse a uno o más dispositivos de entrada/salida, tales como un teclado, un dispositivo apuntador, un escáner, un lector óptico, un detector de señal fluorescente o un dispositivo de red tal como un conmutador o enrutador, por ejemplo, a través de un adaptador de red.
El dispositivo 1400 de computadora puede implementarse en varias formas diferentes, como se muestra en la figura. Por ejemplo, puede implementarse como un servidor 1420 estándar, o múltiples veces en un grupo de tales servidores. También puede implementarse como parte de un sistema 1424 de servidor de bastidor. Es más, puede implementarse en una computadora personal tal como una computadora 1422 portátil. Alternativamente, los componentes del dispositivo 1400 de computadora pueden combinarse con otros componentes en un dispositivo móvil (no mostrado), tal como el dispositivo 1450. Cada uno de tales dispositivos puede contener uno o más de los dispositivos 1400, 1450 de computadora, y todo un sistema puede estar compuesto por múltiples dispositivos 1400, 1450 de computadora que se comuniquen entre sí.
El dispositivo 1450 de computadora incluye un procesador 1452, una memoria 1464, un dispositivo de entrada/salida tal como una pantalla 1454, una interfaz 1466 de comunicación y un transceptor 1468, entre otros componentes (por ejemplo, un escáner, un lector óptico, un detector de señal fluorescente). El dispositivo 1450 también puede estar provisto de un dispositivo de almacenamiento, tal como un microaccionamiento u otro dispositivo, para proporcionar almacenamiento adicional. Cada uno de los componentes 1450, 1452, 1464, 1454, 1466 y 1468 están interconectados usando varios buses, y varios de los componentes pueden montarse en una placa base común o de otras maneras según sea apropiado.
El procesador 1452 puede llevar a cabo instrucciones dentro del dispositivo 1450 de computadora, incluyendo instrucciones almacenadas en la memoria 1464. El procesador puede implementarse como una colección de chips que incluyen procesadores analógicos y digitales separados y múltiples. El procesador puede proporcionar, por ejemplo, coordinación de los otros componentes del dispositivo 1450, tal como control de interfaces de usuario, aplicaciones ejecutadas por el dispositivo 1450 y comunicación inalámbrica por el dispositivo 1450.
El procesador 1452 puede comunicarse con un usuario a través de la interfaz 1458 de control y la interfaz 1456 de visualización acoplada a una pantalla 1454. La pantalla 1454 puede ser, por ejemplo, una pantalla TFT LCD (pantalla de cristal líquido de transistor de película delgada) o una pantalla OLED (diodo emisor de luz orgánica), u otra tecnología de visualización apropiada. La interfaz 1456 de visualización puede comprender circuitos apropiados para accionar la pantalla 1454 para presentar información gráfica y de otro tipo a un usuario. La interfaz 1458 de control puede recibir comandos de un usuario y convertirlos para su presentación al procesador 1452. Es más, puede proporcionarse una interfaz 1462 externa en comunicación con el procesador 1452, para permitir la comunicación de área cercana del dispositivo 1450 con otros dispositivos. La interfaz 1462 externa puede proporcionar, por ejemplo, comunicación por cable en algunas implementaciones, o comunicación inalámbrica en otras implementaciones, y también se pueden usar múltiples interfaces.
La memoria 1464 almacena información dentro del dispositivo 1450 de computadora. La memoria 1464 puede implementarse como uno o más de un medio o medios legibles por computadora, una unidad o unidades de memoria volátil o una unidad o unidades de memoria no volátil. La memoria 1474 de expansión también puede proporcionarse y conectarse al dispositivo 1450 a través de la interfaz 1472 de expansión, que puede incluir, por ejemplo, una interfaz de tarjeta SIMM (módulo de memoria de línea única). Tal memoria 1474 de expansión puede proporcionar espacio de almacenamiento extra para el dispositivo 1450 o también puede almacenar aplicaciones u otra información para el dispositivo 1450. Por ejemplo, la memoria 1474 de expansión puede incluir instrucciones para efectuar o complementar los procesos descritos en el presente documento y puede incluir también información segura. Por tanto, por ejemplo, la memoria 1474 de expansión puede proporcionarse como un módulo de seguridad para el dispositivo 1450 y puede programarse con instrucciones que permitan el uso seguro del dispositivo 1450. Es más, se pueden proporcionar aplicaciones seguras a través de las tarjetas SIMM, junto con información adicional, tal como poner información de identificación en la tarjeta SIMM de una manera no pirateable.
La memoria puede incluir, por ejemplo, memoriaflashy/o memoria NVRAM, como se examina a continuación. En una implementación, se incorpora un producto de programa de computadora de manera tangible en un soporte de información. El producto de programa de computadora contiene instrucciones que, cuando se llevan a cabo, realizan uno o más métodos, tales como los descritos en el presente documento. El portador de información es un medio legible por computadora o máquina, tal como la memoria 1464, la memoria 1474 de expansión, la memoria en el procesador 1452, o una señal propagada que puede recibirse, por ejemplo, a través del transceptor 1468 o la interfaz 1462 externa.
El dispositivo 1450 puede comunicarse de forma inalámbrica a través de la interfaz 1466 de comunicación, que puede incluir circuitos de procesamiento de señales digitales cuando sea necesario. La interfaz 1466 de comunicación puede proporcionar comunicaciones bajo diversos modos o protocolos, tales como llamadas de voz GSM, SMS, EMS o mensajes MMS, CDMA, TDMA, PDC, WCDMA, CDMA2000 o GPRS, entre otros. Tal comunicación puede ocurrir, por ejemplo, a través del transceptor 1468 de radiofrecuencia. Es más, puede ocurrir una comunicación de corto alcance, tal como usando un Bluetooth, WiFi u otro transceptor de este tipo (no mostrado). Es más, el módulo 1470 receptor GPS (Sistema de Posicionamiento Global, por sus siglas en inglés) puede proporcionar datos inalámbricos adicionales asociados con la navegación y la ubicación al dispositivo 1450, que pueden usarse según sea apropiado por aplicaciones que se ejecutan en el dispositivo 1450.
El dispositivo 1450 también puede comunicarse de forma audible usando el códec 1460 de audio, que puede recibir información hablada de un usuario y convertirla en información digital que se pueda usar. El códec 1460 de audio puede generar asimismo sonido audible para un usuario, tal como a través de un altavoz, por ejemplo, en un auricular del dispositivo 1450. Tal sonido puede incluir sonido de llamadas telefónicas de voz, puede incluir sonido grabado (por ejemplo, mensajes de voz, archivos musicales, etc.) y también puede incluir sonido generado por aplicaciones que operan en el dispositivo 1450.
El dispositivo 1450 de computadora puede implementarse en varias formas diferentes, como se muestra en la figura. Por ejemplo, puede implementarse como un teléfono 1480 celular. También puede implementarse como parte de un teléfono 1482 inteligente, un asistente digital personal u otro dispositivo móvil similar.
Diversas implementaciones de los sistemas y las técnicas descritas en el presente documento pueden materializarse en circuitos electrónicos digitales, circuitos integrados, ASIC especialmente diseñados (circuitos integrados específicos de la aplicación),hardwarede computadora,firmware, softwarey/o combinaciones de estos. Estas diversas implementaciones pueden incluir la implementación en uno o más programas de computadora que se puedan llevar a cabo y/o interpretar en un sistema programable que incluya al menos un procesador programable, que pueda ser de propósito especial o general, acoplado para recibir datos e instrucciones desde un sistema de almacenamiento, y para transmitir datos e instrucciones a un sistema de almacenamiento, al menos un dispositivo de entrada y al menos un dispositivo de salida.
Estos programas de computadora (también conocidos como programas,software,aplicaciones o código desoftware)incluyen instrucciones de máquina para un procesador programable, y pueden implementarse en un lenguaje de programación de procedimiento y/u orientado a objetos de alto nivel, y/o en lenguaje de ensamblaje/máquina. Como se usa en el presente documento, los términos «medio legible por máquina» y «medio legible por computadora» se refieren a cualquier producto, aparato y/o dispositivo de programa de computadora (por ejemplo, discos magnéticos, discos ópticos, memoria y dispositivos lógicos programables (PLD)) usados para proporcionar instrucciones y/o datos de máquina a un procesador programable, incluyendo un medio legible por máquina que recibe instrucciones de máquina como una señal legible por máquina. El término «señal legible por máquina» se refiere a cualquier señal usada para proporcionar instrucciones y/o datos de máquina a un procesador programable.
Para proporcionar interacción con un usuario, los sistemas y las técnicas descritas en el presente documento pueden implementarse en una computadora que tenga un dispositivo de visualización (por ejemplo, un monitor de CRT [tubo de rayos catódicos] o LCD [pantalla de cristal líquido]) para visualizar información para el usuario y un teclado y un dispositivo apuntador (por ejemplo, un ratón o una bola de seguimiento) mediante el cual el usuario puede proporcionar entrada a la computadora. Asimismo, se pueden usar otras clases de dispositivos para proporcionar interacción con un usuario; por ejemplo, la retroalimentación proporcionada al usuario puede ser cualquier forma de retroalimentación sensorial (por ejemplo, retroalimentación visual, retroalimentación auditiva o retroalimentación táctil); y la entrada del usuario se puede recibir en cualquier forma, incluyendo entrada acústica, de voz o táctil.
Los sistemas y las técnicas descritas en el presente documento pueden implementarse en un sistema de computadora que incluya un componente de extremo posterior (por ejemplo, como un servidor de datos), o que incluya un componente demiddleware(por ejemplo, un servidor de aplicaciones), o que incluya un componente de extremo frontal (por ejemplo, una computadora cliente que tenga una interfaz gráfica de usuario o un navegador web a través del cual un usuario pueda interactuar con una implementación de los sistemas y las técnicas descritas en el presente documento), o cualquier combinación de tales componentes de extremo posterior,middlewareo de extremo frontal. Los componentes del sistema pueden estar interconectados por cualquier forma o medio de comunicación de datos digitales (por ejemplo, una red de comunicación). Los ejemplos de redes de comunicación incluyen una red de área local («LAN»), una red de área amplia («WAN») e Internet.
El sistema de computadora puede incluir clientes y servidores. Un cliente y un servidor están generalmente alejados entre sí e interactúan típicamente a través de una red de comunicación. La asociación entre cliente y servidor surge en virtud de programas de computadora que se ejecutan en las respectivas computadoras y que tienen una asociación entre cliente y servidor.
En algunos casos, un sistema proporcionado en el presente documento puede configurarse para que incluya uno o más analizadores de muestras. Un analizador de muestras puede configurarse para producir una pluralidad de señales sobre el ADN genómico de una célula cancerosa. Por ejemplo, un analizador de muestras puede producir señales que puedan interpretarse de una manera que identifique el estado de desequilibrio alélico de locus a lo largo de un cromosoma. En algunos casos, un analizador de muestras puede configurarse para efectuar una o más etapas de un ensayo basado en secuenciación y puede configurarse para producir y/o capturar señales de tales ensayos. En algunos casos, un sistema de computadora proporcionado en el presente documento puede configurarse para que incluya un dispositivo de computadora. En tales casos, el dispositivo de computadora puede configurarse para recibir señales de un analizador de muestras.
El dispositivo de computadora puede incluir instrucciones ejecutables por computadora o un programa de computadora (por ejemplo,software)que contenga instrucciones ejecutables por computadora para efectuar uno o más de los métodos o las etapas descritas en el presente documento. En algunos casos, tales instrucciones ejecutables por computadora pueden dar instrucciones a un dispositivo de computadora para analizar señales de un analizador de muestras, de otro dispositivo de computadora o de un ensayo basado en secuenciación. El análisis de tales señales puede efectuarse para determinar genotipos, desequilibrio alélico en ciertos locus, regiones de desequilibrio alélico, el número de regiones de desequilibrio alélico, para determinar el tamaño de regiones de desequilibrio alélico, para determinar el número de regiones de desequilibrio alélico con un tamaño o intervalo de tamaños particular, o para determinar una combinación de estos elementos.
En algunos casos, un sistema proporcionado en el presente documento puede incluir instrucciones ejecutables por computadora o un programa de computadora (por ejemplo,software)que contenga instrucciones ejecutables por computadora para formatear una salida que proporcione una indicación sobre el número de copias, el desequilibrio alélico, LOH o una combinación de estos elementos.
En algunos casos, un sistema proporcionado en el presente documento puede incluir un dispositivo de procesamiento previo configurado para procesar una muestra (por ejemplo, células cancerosas) de manera que se pueda realizar un ensayo basado en secuenciación. Los ejemplos de dispositivos de procesamiento previo incluyen, sin limitación, dispositivos configurados para enriquecer las poblaciones celulares para células cancerosas en lugar de células no cancerosas, dispositivos configurados para lisar células y/o extraer ácido nucleico genómico y dispositivos configurados para enriquecer una muestra para fragmentos particulares de ADN genómico.
Ejemplos
En el proceso descrito en la presente memoria se utilizó un sistema de captura Agilent SureSelect seguido de secuenciación Illumina HiSeq, sin embargo, podría usarse cualquier método de captura en solución o en soporte sólido y plataforma de secuenciación paralela de alto rendimiento.
En el proceso de selección de diseño inicial se utilizaron los ~2.5 millones de SNP en la matriz de SNP Illumina Omni2.5. Esta lista de SNP se eligió porque actualmente es la mayor lista de SNP de los que hay información de genotipado disponible para múltiples grupos de población diferentes. Todas las 2448785 ubicaciones de SNP se introdujeron en el asistente de enriquecimiento de diana Agilent eArray Sure Select para lecturas largas de un solo extremo usando los ajustes por defecto. 1353 042 pasaron los criterios de selección y tenían los cebos diseñados.
Después, se seleccionaron 110 000 SNP con altas frecuencias alélicas minoritarias y que cubrían uniformemente el genoma. En la selección, se descartaron los SNP en desequilibrio de ligamiento fuerte y los SNP con desviación de Stong del equilibrio de Hardy-Weinberg.
Se construyeron dos diseños preliminares de bibliotecas que comprendían 55000 sondas, cada una dirigida a 55 000 localizaciones de SNP diferentes. La prueba se efectuó usando una muestra de ADN normal de alta calidad para comprobar la captura uniforme de ambos alelos de cada SNP. Es más, se capturaron 4 muestras de FFPE y se usaron para seleccionar las sondas que se comportaban más óptimamente. Se buscaron sondas que mostraran una captura robusta e incluso una profundidad de secuencia sin sobre- o subrepresentación de lecturas de secuencia en la biblioteca de secuenciación final.
El diseño de la biblioteca de sondas de captura final estaba comprendido por 55 000 sondas óptimas identificadas usando los diseños de captura preliminares.
Los resultados de la medición del número de copias y LOH usando la técnica de secuenciación anterior se muestran en la Figura 2 (mostrando la Figura 1 el análisis de micromatrices en tejido congelado fresco como comparación).

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un métodoin vitrode detección del estado de desequilibrio alélico del genoma completo en una pluralidad de locus genómicos de polimorfismo de nucleótido único (SNP) en una muestra embebida en parafina, fijada en formalina, que comprende:
enriquecer, de una muestra de tumor del paciente, ADN genómico para moléculas de ADN, comprendiendo cada molécula de ADN al menos un locus de la pluralidad de locus de SNP; en donde el enriquecimiento se realiza mediante un método de captura en solución o en soporte sólido; secuenciar las moléculas de ADN para determinar el genotipo en cada locus, en donde en la secuenciación se usa una plataforma paralela de alto rendimiento;
determinar, para cada locus, si el locus tiene desequilibrio alélico.
2. Uso de un sistema para determinar el estado de desequilibrio alélico del genoma completo en una pluralidad de locus genómicos de polimorfismo de nucleótido único (SNP) en una muestra embebida en parafina, fijada en formalina, que comprende:
un analizador de muestras para (1) enriquecer el ADN genómico de una muestra tumoral para moléculas de ADN, comprendiendo cada molécula un locus de interés, en donde el enriquecimiento se realiza mediante un método de captura en solución o en soporte sólido; y (2) secuenciar las moléculas de ADN para
producir una pluralidad de señales cuantitativas para cada locus, en donde en la secuenciación se usa una plataforma paralela de alto rendimiento;
un programa de computadora para analizar la pluralidad de señales cuantitativas para determinar el genotipo de cada uno de dichos locus en la muestra;
un programa de computadora para determinar para cada locus si el locus tiene desequilibrio alélico.
3. El método de la reivindicación 1 o el uso del sistema de la reivindicación 2, en donde la pluralidad de locus de SNP comprende al menos 1000 locus de SNP.
4. El método de la reivindicación 1 o el uso del sistema de la reivindicación 2, cuando la pluralidad de locus de SNP comprende al menos 10000 locus de SNP.
5. El método de la reivindicación 1 o el uso del sistema de la reivindicación 2, en donde los locus están espaciados uniformemente a lo largo del genoma.
6. El método de la reivindicación 1 o el uso del sistema de la reivindicación 2, en donde hay al menos un locus de SNP ubicado en promedio cada 1.2 Mb dentro de cada cromosoma dentro del genoma humano.
7. El método de la reivindicación 1 o el uso del sistema de la reivindicación 2, en donde hay al menos un locus de SNP ubicado en promedio cada 500 Kb dentro de cada cromosoma.
8. El método de la reivindicación 1 o el uso del sistema de la reivindicación 2, en donde se determina que un locus tiene desequilibrio alélico si la proporción de copia principal en el locus es 0.51 o mayor.
9. El método de la reivindicación 1 o el uso del sistema de la reivindicación 2, en donde el espaciado genómico de dicha pluralidad de locus genómicos es menor o igual que el 50 %.
10. El método de la reivindicación 1 o el uso del sistema de la reivindicación 2, en donde el espaciado genómico de dicha pluralidad de locus genómicos es menor o igual que el 30 %.
11. El método de la reivindicación 1 o el uso del sistema de la reivindicación 2, en donde el espaciado genómico de dicha pluralidad de locus genómicos es menor o igual que el 10 %.
12. El método de la reivindicación 1 o el uso del sistema de la reivindicación 2, en donde el desequilibrio alélico se detecta en un locus de polimorfismo de un solo nucleótido donde el locus tiene pérdida de heterocigosidad.
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