ES3031002T3 - T cell recruiting polypeptides based on tcr alpha/beta reactivity - Google Patents

T cell recruiting polypeptides based on tcr alpha/beta reactivity

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ES3031002T3
ES3031002T3 ES19186738T ES19186738T ES3031002T3 ES 3031002 T3 ES3031002 T3 ES 3031002T3 ES 19186738 T ES19186738 T ES 19186738T ES 19186738 T ES19186738 T ES 19186738T ES 3031002 T3 ES3031002 T3 ES 3031002T3
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Annelies Roobrouck
Hoorick Diane Van
João Vieira
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Ablynx NV
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Abstract

Se proporcionan polipéptidos de reclutamiento de células T que se unen al dominio constante del TCR en una célula T. Los polipéptidos se pueden utilizar en métodos para el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos que reclutan linfocitos T en función de la reactividad a TCT alfa/beta
Campo de la invención
La presente invención proporciona polipéptidos multiespecíficos de reclutamiento de linfocitos T que se unen al dominio constante de TCR en un linfocito T y al menos un antígeno en una célula diana como se define por las reivindicaciones.
Antecedentes
El cáncer supone grandes pérdidas humanas en todo el mundo. Hoy en día es la causa principal de muerte en el mundo, seguida de cardiopatías y apoplejía. Los cánceres figuran entre las causas principales de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, con aproximadamente 14 millones de nuevos casos y 8,2 millones de muertes relacionadas con el cáncer en 2012. Se espera que el número de nuevos casos aumente en aproximadamente un 70 % en las próximas 2 décadas (fuente: Cáncer - OMS). El impacto económico total de la muerte prematura y la discapacidad provocadas por el cáncer en todo el mundo fue de aproximadamente 900 mil millones de dólares en 2008, lo que representa un 1,5 % del producto interior bruto mundial.
Las pautas de tratamiento disponibles para tumores sólidos incluyen típicamente una combinación de quimioterapia con extirpación quirúrgica y radioterapia. En 40 años de experiencia clínica se han logrado pocos progresos, especialmente en estadios avanzados de cáncer.
Se esperan con impaciencia nuevos tratamientos para combatir el cáncer.
El tratamiento con anticuerpos es ahora una parte importante del armamento del médico para combatir enfermedades y especialmente el cáncer. Los anticuerpos monoclonales se han establecido como una estrategia terapéutica clave para una serie de enfermedades ya desde hace varios años. Todos los tratamientos con anticuerpos aprobados contemporáneos se basan en anticuerpos monoclonales monoespecíficos (mAb). Hasta hoy, la mayoría de las dianas de los mAb requieren una estrategia agonista o antagonista. Mientras que abordar los propios antígenos de superficie celular puede mediar la actividad antitumoral a través de la inducción de apoptosis, la mayor parte de la actividad basada en mAb contra neoplasias hemáticas depende de alguna de las funciones efectoras mediadas por Fc, tales como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC).
La inmunoterapia ha surgido como un área en rápido crecimiento de la investigación del cáncer. La inmunoterapia dirige el sistema de vigilancia inmunitaria del cuerpo y, en particular, los linfocitos T, a las células cancerosas.
Los linfocitos T citotóxicos (CTL) son linfocitos T que destruyen las células cancerosas, las células que están infectadas (particularmente con virus) o las células que están dañadas de otras maneras. Los linfocitos T expresan el receptor de linfocitos T o molécula TCR y el receptor de CD3 en la superficie celular. El complejo ap TCR-CD3 (o "complejo TCR") está compuesto por seis diferentes proteínas transmembranarias de un solo dominio de tipo I: las cadenas TCRa y TCRp que forman el heterodímero TCR responsable del reconocimiento de ligando, y las cadenas CD3y, CD3ó, CD3e y Z asociadas no covalentemente, que portan motivos de secuencia citoplasmática que se fosforilan tras la activación del receptor y reclutan un gran número de componentes de señalización (Callet al.2004, Molecular Immunology 40: 1295-1305).
Tanto las cadenas a como p del receptor de linfocitos T consisten en un dominio constante y un dominio variable. Fisiológicamente, las cadenas ap del receptor de linfocitos T reconocen el complejo de MHC cargado de péptido y se asocian tras el acoplamiento a las cadenas CD3. Estas cadenas CD3 posteriormente transducen la señal de acoplamiento al entorno intracelular.
Considerando el potencial de los linfocitos T citotóxicos (CTL) de origen natural para mediar la lisis celular, se han explorado varias estrategias para reclutar inmunocitos para mediar la destrucción de células tumorales. Dado que los linfocitos T carecen de la expresión de receptores de Fc, no se reclutan en un sitio tumoral a través de la cola Fc de un anticuerpo monoclonal antitumoral. Como alternativa, los linfocitos T del paciente se modificaron con un segundo TCR de especificidad conocida para un antígeno tumoral definido. Esta transferencia celular adoptiva es por naturaleza altamente personalizada y muy trabajosa. Sin embargo, el principal problema de los tratamientos con linfocitos T sigue siendo el gran número de mecanismos de escape inmunológico que se sabe que se producen en pacientes con cáncer (Nagorsenet al.2012, Pharmacology & Therapeutics 136: 334-342).
En lugar de provocar respuestas específicas de linfocitos T, que dependen de la expresión por parte de las células cancerosas de moléculas MHC y la presencia, generación, transporte y presentación de antígenos peptídicos específicos, los avances más recientes han intentado combinar las ventajas de la inmunoterapia con el tratamiento con anticuerpos mediante la participación de todos los linfocitos T de un paciente de una manera policlonal a través de tecnologías basadas en anticuerpos recombinantes: ''biespecíficos''.
Se han manipulado anticuerpos biespecíficos que tienen una parte de reconocimiento tumoral en un brazo (brazo de unión a la diana), mientras que el otro brazo de la molécula tiene especificidad por un antígeno de linfocitos T (brazo de unión al efector), principalmente CD3. A través de la unión simultánea de los dos brazos a sus respectivos antígenos, los linfocitos T se dirigen hacia y se activan en la célula tumoral, donde pueden ejercer su función citolítica.
El concepto de usar anticuerpos biespecíficos para activar linfocitos T contra células tumorales se describió hace más de 20 años, pero los problemas de fabricación y los fracasos clínicos llevaron el campo al estancamiento. Se desarrollaron biespecíficos en formato más pequeño, que penetran más fácilmente en tejidos y tumores que los anticuerpos convencionales. Además, el formato más pequeño es mejor para crear las sinapsis citolíticas, que destruyen la célula diana. Se pensó que los biespecíficos en formato más pequeño serían más fáciles de fabricar y menos inmunógenos que los anticuerpos convencionales. Sin embargo, las moléculas BiTE biespecíficas más pequeñas, que consisten en dos fragmentos variables monocatenarios (scFv) unidos por un conector peptídico de 5 aminoácidos, presentaban una falta de estabilidad (los scFv tienden a agregarse), bajos valores de expresión y poca solubilidad. Además, los primeros ensayos clínicos de Blinatumomab (una molécula BiTE), que reconoce cadenas CD3, se detuvieron prematuramente debido a acontecimientos adversos neurológicos, síndrome de liberación de citocinas e infecciones, por un lado, y la ausencia de respuestas clínicas objetivas o signos robustos de actividad biológica, por otro. Aparte de la eficacia, los BiTE deben infundirse continuamente, probablemente debido a la falta de un dominio Fc, que no contribuye al cumplimiento por parte del paciente. El mismo problema se aplica a las DART (moléculas de redirección de afinidad doble desarrolladas por MacroGenics), en que el dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo (Ab) está ligado con el dominio variable de la cadena ligera de otro Ab. MacroGenics ahora intenta resolver este problema fusionando un dominio Fc en sus DART de nueva generación, lo que hace que la molécula no solo sea más grande, sino que también provoca problemas de fabricación e importación de otras funciones del Fc. El formato más grande con Fc se espera que tenga una mejor PK, pero vuelve a introducir el riesgo de actividad inespecífica. (Garber 2014, Nature reviews 13: 799-801)
Por tanto, sigue existiendo una necesidad de formatos biespecíficos alternativos.
Sumario de la invención
La invención resuelve este problema proporcionando polipéptidos multiespecíficos que comprenden un primer y al menos un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV) adicional, en donde dicho primer ISV tiene una alta afinidad por/se une a un dominio constante del receptor de linfocitos T (TCR); dicho al menos un segundo ISV tiene una alta afinidad por/se une a un antígeno presente en una célula diana, como se define por las reivindicaciones. En un aspecto particular, la unión del primer ISV activará el potencial citolítico inherente del linfocito T contra una célula diana independientemente de MHC.
Por tanto, la presente invención proporciona un polipéptido ("polipéptido de la invención) que comprende un primer y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), en donde
• dicho primer ISV tiene una alta afinidad por/se une al dominio contante del receptor de linfocitos T (TCR) presente en un linfocito T;
• dicho segundo ISV tiene alta afinidad por/se une a un primer antígeno en una célula diana;
en donde dicho primer antígeno es diferente de dicho TCR; y
en donde dicha célula diana es diferente de dicho linfocito T,
en donde dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que:
(i) CDR1 se elige del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 119-123, 125-127, 129, 132 and 133; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 123; y/o
(ii) CDR2 se elige del grupo que consiste en:
(c) SEQ ID NO: 134-141, 143-144, 146-156, 159-163 ; y
(d) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; y/o
(iii) CDR3 se elige del grupo que consiste en:
(e) SEQ ID NO: 164-166, 169-171, 173-174; y
(f) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho polipéptido dirige el linfocito T a la célula diana.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho polipéptido induce la activación de linfocitos T.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha activación de linfocitos T es independiente del reconocimiento de MHC.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha activación de linfocitos T depende de presentar dicho polipéptido unido a dicho primer antígeno en una célula diana a un linfocito T.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha activación de linfocitos T provoca una o más respuestas celulares de dichos linfocitos T, en donde dicha respuesta celular se selecciona del grupo que consiste en proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica, expresión de marcadores de activación y lisis redirigida de células diana.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha activación de linfocitos T provoca la inhibición de una actividad de dicha célula diana en más de aproximadamente un 10 %, tal como un 20 %, 30 % o 40 % o más de un 50 %, tal como más de un 60 %, tal como un 70 %, 80 % o incluso más de un 90 %, tal como un 100 %.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV se une al dominio constante de un receptor de linfocitos T a (TCR-a) (SEQ ID NO: 348) y/o el dominio constante del receptor de linfocitos T p (TCR-p) (SEQ ID NO: 349) o variantes polimórficas o isoformas del mismo.
Como alternativa, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV se une al dominio constante del receptor de linfocitos T a (TCR-a) SEQ ID NO: 484) y/o el dominio constante del receptor de linfocitos T p (TCR-p) (SEq ID NO: 485) o variantes polimórficas o isoformas del mismo.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho polipéptido y/o primer ISV tiene una constante de tasa de asociación (Kon) para la unión a dicho TCR seleccionada del grupo que consiste en al menos aproximadamente 102 M-1s-1, al menos aproximadamente 103 M-1s-1, al menos aproximadamente 104 M-1s-1, al menos aproximadamente 105 M-1s-1, al menos aproximadamente 106 M-1s-1, 107 M-1s-1, al menos aproximadamente 108 M-1s-1, al menos aproximadamente 109 M-1s-1 y al menos aproximadamente 1010 M-1s-1, preferiblemente medida por resonancia de plasmones superficiales o BLI.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho polipéptido y/o primer ISV tiene una constante de tasa de disociación (Koff) para la unión a dicho TCR seleccionada del grupo que consiste en como mucho aproximadamente 10-3 s-1, como mucho aproximadamente 10-4 s-1, como mucho aproximadamente 10-5 s-1, como mucho aproximadamente 10-6 s-1, como mucho aproximadamente 10-7 s-1, como mucho aproximadamente 10-8 s-1, como mucho aproximadamente 10-9 s-1 y como mucho aproximadamente 10-10 s-1 preferiblemente medida por resonancia de plasmones superficiales o BLI.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV se une a dicho TCR con un valor de CE50 entre 100 nM y 1 pM, tal como a un valor promedio de CE50 de 100 nM o menos, incluso más preferiblemente a un valor promedio de CE50 de 90 nM o menos, tal como menos de 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM o incluso menos, tales como menos de 4, 3, 2 o 1 nM o incluso menos, tal como menos de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 pM, o incluso menos, tal como menos de 4 pM, preferiblemente medido por citometría de flujo.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV se une a dicho TCR con un valor promedio de KD entre 100 nM y 10 pM, tal como a un valor promedio de KD de 90 nM o menos, incluso más preferiblemente a un valor promedio de KD de 80 nM o menos, tal como menos de 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM o incluso menos, tal como menos de 4, 3, 2 o 1 nM, tal como menos de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 pM, o incluso menos, tal como menos de 10 pM. Preferiblemente, la KD se determina por Kinexa, BLI o SPR, por ejemplo, como se determina por Proteon.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que CDR1 se elige del grupo que consiste en
(a) SEQ ID NO: 123; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen 1,2 o 3 diferencias de aminoácido con SEQ ID NO: 123, en donde - en la posición 2, D se ha cambiado a A, S, E o G;
- en la posición 4, H se ha cambiado a Y;
- en la posición 5, K se ha cambiado a L;
- en la posición 6, I se ha cambiado a L;
- en la posición 8, F se ha cambiado a I o V; y/o
- en la posición 10, G se ha cambiado a S.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que CDR2 se elige del grupo que consiste en
(a) SEQ ID NO: 153; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen 1, 2, 3 o 4 diferencias de aminoácido con SEQ ID NO: 153, en donde
- en la posición 1, H se ha cambiado a T o R;
- en la posición 3, S se ha cambiado a T o A;
- en la posición 5, G se ha cambiado a S o A;
- en la posición 7, Q se ha cambiado a D, E, T, A o V;
- en la posición 8, T se ha cambiado a A o V; y/o
- en la posición 9, D se ha cambiado a A, Q, N, V o S.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que CDR3 se elige del grupo que consiste en
(a) SEQ ID NO: 170; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen 1,2 o 3 diferencias de aminoácido con SEQ ID NO: 170, en donde
- en la posición 1, F se ha cambiado a Y, L o G;
- en la posición 4, I se ha cambiado a L;
- en la posición 5, Y se ha cambiado a W; y/o
- en la posición 8, D se ha cambiado a N o S.
Preferiblemente, el polipéptido que comprende la una o más CDR con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se une a TCR con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende las CDR sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que
(i) CDR1 se elige del grupo que consiste en
(a) SEQ ID NO: 123; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen 1,2 o 3 diferencias de aminoácido con SEQ ID NO: 123, en donde
- en la posición 2, D se ha cambiado a A, S, E o G;
- en la posición 4, H se ha cambiado a Y;
- en la posición 5, K se ha cambiado a L;
- en la posición 6, I se ha cambiado a L;
- en la posición 8, F se ha cambiado a I o V; y/o
- en la posición 10, G se ha cambiado a S,
con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR1 con diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a TCR con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR1 sin la diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales;
y en que
(ii) CDR2 se elige del grupo que consiste en
(a) SEQ ID NO: 153; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen 1, 2, 3 o 4 diferencias de aminoácido con SEQ ID NO:
153, en donde
- en la posición 1, H se ha cambiado a T o R;
- en la posición 3, S se ha cambiado a T o A;
- en la posición 5, G se ha cambiado a S o A;
- en la posición 7, Q se ha cambiado a D, E, T, A o V;
- en la posición 8, T se ha cambiado a A o V; y/o
- en la posición 9, D se ha cambiado a A, Q, N, V o S,
con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR2 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a TCR con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR2 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales; y en que
(iii) CDR3 se elige del grupo que consiste en
(a) SEQ ID NO: 170; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen 1, 2 o 3 diferencias de aminoácido con SEQ ID NO: 170, en donde
- en la posición 1, F se ha cambiado a Y, L o G;
- en la posición 4, I se ha cambiado a L;
- en la posición 5, Y se ha cambiado a W; y/o
- en la posición 8, D se ha cambiado a N o S,
con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR3 con diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a TCR con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR3 sin la diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales;
En la presente invención, dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que:
(i) CDR1 se elige del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 119-123, 125-127, 129, 132 y 133; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No : 123; y/o
(ii) CDR2 se elige del grupo que consiste en:
(c) SEQ ID NO: 134-141, 143-144, 146-156, 159-163; y
(d) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; y/o
(iii) CDR3 se elige del grupo que consiste en:
(e) SEQ ID NO: 164-166, 169-171, 173-174; y
(f) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que:
(i) CDR1 se elige del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 119-123, 125-127, 129, 132 y 133; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR1
con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a TCR con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR1 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales; y/o
(ii) CDR2 se elige del grupo que consiste en:
(c) SEQ ID NO: 134-141, 143-144, 146-156, 159-163; y
(d) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR2 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a TCR con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR2 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales; y/o
(iii) CDR3 se elige del grupo que consiste en:
(e) SEQ ID NO: 164-166, 169-171, 173-174; y
(f) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR3 con diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a TCR con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR3 sin la diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales;
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que: CDR1 está<representada por SEQ ID NO: 123, CDR2 está representada por SEQ ID n>O:<153, y CDR3 está representada por>SEQ ID NO: 170.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV se elige del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-104.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV bloquea de forma cruzada la unión al dominio constante del receptor de linfocitos T (TCR) por al menos uno de los polipéptidos con SEQ ID NO: 1 -104.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV tiene bloqueada de forma cruzada la unión al dominio constante del receptor de linfocitos T (TCR) por al menos uno de los polipéptidos con SEQ ID NO: 1 -104.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, que comprende además un tercer ISV, que tiene una alta afinidad por/se une a un segundo antígeno en una célula diana, en donde dicho segundo antígeno es diferente de dicho primer antígeno.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer antígeno en una célula diana es un antígeno tumoral, preferiblemente un antígeno asociado a tumor (TAA).
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho segundo antígeno en una célula diana es un antígeno tumoral, preferiblemente un antígeno asociado a tumor (TAA).
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno están presentes en las mismas células diana.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno están presentes en diferentes células diana.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dichos TAA se eligen independientemente del grupo que consiste en proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína de activación de fibroblastos (FAP), MART-1, antígeno carcinoembrionario (CEA), gp100, MAGE-1, HER-2, antígenos de LewisY, CD123, CD44, CLL-1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3, CD25, TAG-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, GD2, GD3, CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD147, receptores del factor de crecimiento que incluyen ErbB3 y ErbB4, receptores de citocinas que incluyen cadena gamma del receptor de interleucina-2 (antígeno CD132), cadena alfa del receptor de interleucina-10 (IL-10R-A), cadena beta del receptor de interleucina-10 (IL-10R-B), cadena beta-1 del receptor de interleucina-12 (IL-12R-beta1), cadena beta-2 del receptor de interleucina-12 (receptor beta-2 de IL-12), cadena alfa-1 del receptor de interleucina-13 (IL-13R-alfa-1) (antígeno CD213a1), cadena alfa-2 del receptor de interleucina-13 (proteína de unión a interleucina-13), receptor de interleucina-17 (receptor de IL-17), receptor de interleucina-17B (receptor de IL-17B), precursor del receptor de interleucina 21 (IL-21R), receptor de interleucina-1 de tipo I (IL-1R-1) (CD121a); receptor de interleucina-1 de tipo 11 (IL-1 R-beta) (CDw121b), proteína antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1 ra), cadena alfa del receptor de interleucina-2 (antígeno CD25); cadena beta del receptor de interleucina-2 (antígeno CD122), cadena alfa del receptor de interleucina-3 (IL-3R-alfa) (antígeno CD123), CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosialina), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, claudina 6 , claudina 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, c D56, MUC16 , EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nectina-4, SLITRK6 , mesotelina, receptor de folato, tromboplastina tisular, axl, glipicano-3, CA9, Cripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, receptor del péptido liberador de gastrina, PAP, CEACAM5, CEACAM6 , CXCR7, N-cadherina, FXYD2 gamma a, CD21, CD133, Na/K-ATPasa, mIgM (IgM unida a membrana), mlgA (IgA unida a membrana), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6 , DcR3 y c A iX, incluyendo variantes polimórficas relacionadas e isoformas.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho TAA es CD20 (UniProt 11836), He R2 (UniProt P04626), EGFR, CEA, variantes polimórficas o isoformas de los mismos.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno se eligen del grupo que consiste en:
- EGFR como primer antígeno y CEA como segundo antígeno;
- CD19 como primer antígeno y CD20 como segundo antígeno;
- CD19 como primer antígeno y CD22 como segundo antígeno;
- CD123 como primer antígeno y Tim-3 como segundo antígeno;
- CD123 como primer antígeno y CD69 como segundo antígeno.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, que comprende además un resto de unión a proteína sérica.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho resto de unión a proteína sérica se une a seroalbúmina.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho resto de unión a proteína sérica es un ISV que se une a seroalbúmina.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho ISV que se une a seroalbúmina consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que CDR1 es SFGMS (SEQ ID NO: 481), CDR2 es SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 482) y CDR3 es GGSLSR (SEQ ID NO: 475), estando las CDR determinadas de acuerdo con la definición de Kabat; y/o en que CDR1 es GFTFSSFGMS (SEQ ID NO: 472) o GFTFRSFGMS (SEQ ID NO: 473), CDR2 es SISGSGSDTL (SEQ ID NO: 474) y CDR3 es GGSLSR (SEQ ID n O: 475), estando las CDR determinadas de acuerdo con Kontermann 2010.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho ISV que se une a seroalbúmina se selecciona de Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG y Alb82-GGG (SEQ ID NO: 400 a 412).
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dichos ISV están ligados directamente entre sí o están ligados mediante un conector.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV y/o dicho segundo ISV y/o posiblemente dicho tercer ISV y/o posiblemente dicho ISV que se une a seroalbúmina están unidos mediante un conector.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho conector se elige del grupo que consiste en conectores de 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS y 35GS (SEQ ID NO: 376 a 385).
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho resto de unión a proteína sérica es un polipéptido no basado en anticuerpo.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, que comprende además PEG.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho ISV es un Nanobody, un V<hh>, un V<hh>humanizado o un V<h>camelizado.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones en donde dicho primer ISV se elige del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 104.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV se elige del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 104, y en donde dicho segundo ISV se elige del grupo que consiste en SEQ ID NO: 350-358.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones eligido del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 292, 295-296, 299-300, 303, 306-343, 387-388, 390, 414, 417-418, 421-422, 425, 428-464, 467-468, 470-471 and 486-487.
El segundo ISV puede ser un polipéptido que se une específicamente a antígeno carcinoembrionario (CEA) y que comprende o consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que:
(i) CDR1 se elige del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 361 (GDTYGSYWMG); o
(b) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR1 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CEA con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR1 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales; y/o
(ii) CDR2 se elige del grupo que consiste en:
(c) SEQ ID NO: 363 (AINRGGGYTV); o
(d) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 363, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR2 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CEA con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR2 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales; y/o
(iii) CDR3 se elige del grupo que consiste en:
(e) SEQ ID NO: 365 (SGVLGGLHEDWFNY); o
(f) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 365, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR3 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CEA con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR3 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales.
El segundo ISV puede ser un polipéptido, en que CDR1 está representada por SEQ ID NO: 361, CDR2 está representada por SEQ ID NO: 363, y CDR3 está representada por SEQ ID NO: 365.
El segundo ISV puede ser un polipéptido que se une específicamente a CD20 y que comprende o consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que:
(i) CDR1 se elige del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 362 (GGTFSSYTMG); o
(b) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 362, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR1 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CD20 con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR1 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales; y/o
(ii) CDR2 se elige del grupo que consiste en:
(c) SEQ ID NO: 364 (EVRWGGVTT); o
(d) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 364, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR2 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CD20 con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR2 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales; y/o
(iii) CDR3 se elige del grupo que consiste en:
(e) SEQ ID NO: 366 (VRQMYMTVVPDY); o
(f) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR3 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CD20 con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR3 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales.
El segundo ISV puede ser un polipéptido, en que CDR1 está representada por SEQ ID NO: 362, CDR2 está representada por SEQ ID NO: 364, y CDR3 está representada por SEQ ID NO: 366.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define por las reivindicaciones.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico como se define por las reivindicaciones.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula hospedadora transformada o transfectada con el ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico como se define por las reivindicaciones o con el vector como se define por las reivindicaciones.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un proceso para la producción del polipéptido como se define por las reivindicaciones, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula hospedadora como se define por las reivindicaciones en condiciones que permiten la expresión del polipéptido como se define por las reivindicaciones y recuperar el polipéptido producido del cultivo.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido como se define por las reivindicaciones, o el polipéptido producido de acuerdo con el proceso como se define por las reivindicaciones.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, o producido de acuerdo con el proceso como se define por las reivindicaciones, para su uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesita.
Con propósitos ilustrativos únicamente, la presente divulgación proporciona un método para administrar un polipéptido profiláctico o terapéutico a una ubicación específica, tejido o tipo celular en el cuerpo, comprendiendo el método las etapas de administrar a un sujeto un polipéptido como se describe en este documento, o producido de acuerdo con el proceso como se describe en este documento.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, o producido de acuerdo con el proceso como se define por las reivindicaciones, para su uso en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad proliferativa, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad infecciosa y una enfermedad autoinmunitaria.
Con propósitos ilustrativos únicamente, la presente divulgación proporciona un método para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad proliferativa, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad infecciosa y una enfermedad autoinmunitaria, que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita el polipéptido como se describe en este documento, o producido de acuerdo con un proceso como se describe en este documento.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones para su uso en o un método para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa, en donde dicha enfermedad proliferativa es cáncer.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones para su uso en o un método para la prevención, tratamiento o mejora de cáncer, en donde dicho cáncer se elige del grupo que consiste en carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas: cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervicouterino, glioblastoma, mieloma múltiple (incluyendo gammapatía monoclonal de alcance indeterminado, mieloma asintomático y sintomático), cáncer de próstata y linfoma de Burkitt, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer hepatobiliar, cáncer de vesícula biliar, cáncer de intestino delgado, cáncer rectal, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pene, cáncer de uretra, cáncer de testículo, cáncer de vagina, cáncer de útero, cáncer tiroideo, cáncer paratiroideo, cáncer suprarrenal, cáncer endocrino pancreático, cáncer carcinoide, cáncer de hueso, cáncer de piel, retinoblastomas, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castleman multicéntrica o linfoma de efusión primaria asociado al SIDA, tumores neuroectodérmicos, rabdomiosarcoma; así como cualquier metástasis de cualquiera de los cánceres anteriores, así como cualquier indicación no cancerosa, tal como poliposis nasal.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, para su uso en o un método para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad como se describe en este documento, en donde el tratamiento es una politerapia.
Leyendas de las figuras
Figura 1:Evaluación de la expresión de líneas celulares CHO, HEK293 y Llana transfectadas con TCR/CD3 humano y CD3 humana usando anticuerpo anti-TCR a/p humano (clon BW242/412) 100 nM (negro) y anticuerpo anti-CD3 humana (clon OKT-3) 100 nM (gris). El valor de MCF (fluorescencia media del canal) se representó para cada línea celular. El eje de abscisas representa el tipo de célula y los genes transfectados; CD3 indica transfección con el complejo CD3 (cadenas épsilon, delta, gamma y zeta), huTCR indica transfección con las cadenas a/p de TCR, en donde el dominio variable usado está entre paréntesis.
Figura 2:Evaluación de la calidad de las proteínas TCR a/p recombinantes solubles de macaco usando anticuerpo anti-TCRa/p de primate no humano/rata clon R73; anticuerpo anti-TCR a/p humano (círculos rellenos) y un Nanobody antilisozima de huevo irrelevante (cAblys) (círculos vacíos). Se representó el valor de DO frente a la concentración de Nanobody.
Figuras 3A y 3B: Unión dependiente de la dosis de Nanobodies monovalentes anti-TCR a TCR/CD3 humano expresado en células CHO-K1 (figura 3A) y a linfocitos T humanos primarios (figura 3B). El valor de MCF (fluorescencia media del canal) se representó frente a la concentración del Nanobody.
Figura 4:Unión dependiente de la dosis de Nanobodies monovalentes anti-TCR a la línea celular HEK293H de TCR(2IAL)/CD3 humano (círculo relleno), HEK293H de CD3 humana (cruz) y a la línea celular de referencia HEK293H (círculos vacíos). El valor de MCF (fluorescencia media del canal) se representó frente a la concentración del Nanobody.
Figura 5:Unión dependiente de la dosis de Nanobodies monovalentes anti-TCR (círculos rellenos) y de un Nanobody irrelevante (círculos vacíos) a la proteína soluble recombinante humana TCR a/p(2XN9)-cremallera. Se representó la DO a 405 nm frente a la concentración de Nanobody.
Figuras 6A y 6B:Análisis cinético de T01700055A02 (figura 6A) y T01700056G05 (figura 6B) sobre la interacción de la proteína soluble recombinante humana TCR a/p (2Xn9)-cremallera mediante interferometría de biocapa en un instrumento Octet RED384. Las concentraciones de analitos aplicadas fueron: 1000, 333, 111, 37, 12,3, 4,1 y 1,4 nM. Los ajustes de Langmuir a los datos cinéticos se indican con las líneas negras, mientras que los sensogramas se presentan con las líneas grises.
Figuras 7A y 7B:Datos de activación de linfocitos T de Nanobodies monovalentes anti-TCR acoplados a microesferas (figura 7A). Datos de activación de linfocitos T de Nanobodies monovalentes anti-TCR presentados en solución (figura 7B). La activación se midió supervisando la regulación por aumento de CD69 en linfocitos T humanos primarios. El valor de MCF (fluorescencia media del canal) se representó para cada Nanobody.
Figura 8:Unión de una serie de dilución de polipéptidos multiespecíficos CD20xCD3 (línea continua) y CD3xCD20 (línea de puntos) a TCR/CD3 humano expresado en células CHO-K1 (A), linfocitos T humanos primarios (B) y células Ramos (C). El valor de MCF (fluorescencia media del canal) se representó frente a la concentración de los polipéptidos.
Figuras 9A y 9B:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de polipéptidos biespecíficos de unión a CD20xTCR (línea continua) y de unión a TCRxCD20 (línea de puntos) en un ensayo de destrucción de linfocitos B de Ramos mediada por linfocitos T humanos basado en citometría de flujo. El % de muerte celular (% de células positivas para TOPRO) se representa gráficamente frente a la concentración de los polipéptidos (figura 9A). Efecto de destrucción dependiente de la dosis de polipéptidos biespecíficos de unión a CD20xTCR (línea continua) en un ensayo de destrucción de linfocitos B de Raji mediada por linfocitos T humanos basado en citometría de flujo. El % de muerte celular (% de células positivas para TOPRO) se representa frente a la concentración de los polipéptidos (figura 9B).
Figura 10:Unión dependiente de la dosis del Nanobody anti-CD20 en células Ramos (símbolos vacíos) y Raji (símbolos rellenos) de CD20 humana. El valor de MCF (fluorescencia media del canal) se representó frente a la concentración del Nanobody.
Figuras 11A y 11B:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de polipéptidos biespecíficos de unión a CD20xTCR (línea continua) y de unión a TCRxCD20 (línea de puntos) en el ensayo basado en xCELLigence usando células CHO-K1 transfectadas con CD20 humana. Efecto de destrucción dependiente de la dosis de T017000055 en el ensayo basado en xCELLigence usando células CHO-K1 transfectadas con CD20 humana (línea continua, símbolo relleno) y la línea celular precursora CHO-K1 (círculos vacíos) para ilustrar la destrucción dependiente de TAA (CD20) (figura 11B). Se representó el índice celular (IC) frente a la concentración de polipéptidos.
Figura 12:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de polipéptidos CD20 x TCR usando un conector 5GS (cuadrados vacíos), un conector 9GS (círculos vacíos) y un conector 35GS (símbolos rellenos) en un ensayo de destrucción basado en xCELLigence usando células CHO-K1 con TCR(2XN9)/CD3 humano. Se representó el índice celular (IC) frente a la concentración de polipéptidos.
Figuras 13A y 13B:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de T017000055 (figura 13A) y T017000076 (figura 13B) en un ensayo de destrucción de linfocitos B de Ramos mediada por linfocitos T basado en citometría de flujo usando diferentes relaciones de efector (E) a diana (T) (relación de E:T 10:1 - círculos rellenos, relación de E:T 5:1 - cuadrados vacíos, relación de E:T 2:1 - triángulos rellenos y relación de E:T 1:1 - rombos vacíos). El % de muerte celular (% de células positivas para TOPRO) se representó frente a la concentración de los polipéptidos.
Figura 14:Actividad citolítica dependiente del tiempo de polipépotidos de unión a CD20/TCR en el ensayo de destrucción mediada por linfocitos T humanos primarios purificados en xCELLigence usando células diana CHO-K1 de CD20 humana. El % de lisis específica se representó frente a la concentración de la construcción. Las diferentes curvas representan el tiempo de análisis después de la adición de los linfocitos T.
Figuras 15A-15C:Unión de una dilución en serie de polipéptidos con semivida prolongada a TCR/CD3 humano expresado en células CHO-K1 (figura 15A), linfocitos T humanos primarios (figura 15B) y células Ramos (figura 15C). El valor de MCF (fluorescencia media del canal) se representó frente a la concentración de los polipéptidos.
Figuras 16A-16D:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de polipéptidos multiespecíficos de unión a CD20xTCR frente a polipéptidos de unión a CD20xTCRxALB11 en un ensayo de destrucción de linfocitos B de Ramos mediada por linfocitos T humanas basado en citometría de flujo (figura 16A, figura 16C). Efecto de destrucción dependiente de la dosis de polipéptidos de unión a CD20xTCRxALB11 en ausencia o presencia de HSA 30 pM en un ensayo de destrucción de linfocitos B de Ramos mediada por linfocitos T humanos basado en citometría de flujo (figura 16B, figura 16D). El % de muerte celular (% de células positivas para TOPRO) se representó frente a la concentración de los polipéptidos.
Figura 17:Unión de Nanobody monovalente anti-HER2 100 nM (5F07) a líneas celulares SKBR3, MCF-7 y MDA-MB-468 en citometría de flujo para evaluar los niveles de expresión de HER2. El valor de MCF (fluorescencia media del canal) se representó para cada línea celular.
Figuras 18A-18C:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de polipéptidos multiespecíficos de unión a TCRxHER2 (línea de puntos) y polipéptidos multiespecíficos de unión a HER2xTCR (línea continua) en un ensayo de destrucción mediada por linfocitos T humanos basado en xCELLigence usando células SKBR-3 (figura 18A), células MCF-7 (figura 18B) y células MDA-MB-468 (figura 18C). Los datos se analizaron después de 18 h. Se representó el índice celular (IC) frente a la concentración de los polipéptidos.
Figura 19:Producción de INF-y dependiente de la dosis por linfocitos T humanos después de incubación de células positivas para HER2 con polipéptidos multiespecíficos de unión a TCRxHER2 (línea de puntos) y polipéptidos multiespecíficos de unión a HER2xTCR (línea continua) en un ensayo basado en xCELLigence. Los datos se analizaron después de incubación de 72 h. Se representó la DO frente a la concentración de los polipéptidos.
Figura 20:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de polipéptidos multiespecíficos de unión a CD20xTCR (línea continua) y de unión a TCRxCD20 (línea de puntos) en un ensayo de destrucción de linfocitos B de Ramos mediada por linfocitos T de macaco basado en citometría de flujo. El % de muerte celular (% de células positivas para TOPRO) se representó frente a la concentración de los polipéptidos.
Figura 21:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de polipéptidos biespecíficos de unión a CD20xTCR (línea continua) y de unión a TCRxCD20 (línea de puntos) en el ensayo de destrucción de CD20 humana en CHO-K1 mediada por linfocitos T de macaco basado en xCELLigence. Se representó el IC frente a la concentración de polipéptidos.
Figura 22:Unión dependiente de la dosis de Nanobodies monovalentes anti-TCR (círculos rellenos) y de un Nanobody irrelevante (círculos vacíos) a la proteína soluble recombinante de macaco TCR a/p-cremallera. Se representó la DO a 405 nm frente a la concentración de Nanobody.
Figuras 23A y 23B:Análisis cinético de T0170055A02 (figura 23A) y T0170056G05 (figura 23B) sobre la interacción de la proteína soluble recombinante TCRa/p-cremallera de macaco mediante interferometría de biocapa en un instrumento Octet RED384. Las concentraciones de analitos aplicadas fueron: 1000, 333, 111, 37, 12,3, 4,1 y 1,4 nM. Los ajustes de Langmuir a los datos cinéticos se indican con las líneas negras, mientras que los sensogramas se presentan con las líneas grises.
Figuras 24A y 24B:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de T017000076 (construcción multiespecífica de unión a CD20xTCR) frente a T017000093 (construcción de unión a CD20xTCRxALB11) en un ensayo de destrucción de linfocitos B mediada por linfocitos T de macaco basado en citometría de flujo (figura 24A). Destrucción dependiente de la dosis de T017000093 en presencia de HSA 30 pM en un ensayo de destrucción de linfocitos B de Ramos mediada por linfocitos T de macaco basado en citometría de flujo (figura 24B). El % de muerte celular (% de células positivas para TOPRO) se representó frente a la concentración de Nanobody.
Figura25:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de la construcción multiespecífica de unión a CD20xTCR frente a la construcción de unión a CD20xTCRxALB11 y frente a la construcción de unión a CD20xTCRxALB11 en presencia de HSA 30 pM en un ensayo basado en xCELLigence de células CHO-K1 transfectadas con CD20 humana mediado por linfocitos T de macaco. Se representó el índice celular (IC) frente a la concentración de Nanobody.
Figura 26:Efecto de destrucción dependiente de la dosis de polipéptidos multiespecíficos de unión a TCRxHER2 (línea de puntos) y polipéptidos multiespecíficos de unión a HER2xTCR (línea continua) en un ensayo de destrucción de tumores SKBR-3 positivos para HER2 mediada por linfocitos T de macaco basado en xCELLigence. Los datos se analizaron después de incubación de 40 h. Se representó el índice celular (IC) frente a la concentración de Nanobody.
Figura 27:Diseño del estudio para el modelo Ramos como se describe en el ejemplo 19. Se inyectaron células Ramos por vía intravenosa a ratones en el día 1 (D1). Se inyectaron PBMC por vía intraperitoneal a los animales en el día 3 (D3). Los ratones se trataron de D3 al día 7 (D7) con T017000083 (TCR/CD20) IV una vez al día durante 5 días (Q1 Dx5) o T017000088 (polipéptido multiespecífico irrelevante) IV Q1 Dx5.
Figura 28:Recuento absoluto de linfocitos B de Ramos en escala logarítmica en médula ósea (figura 28A) y bazo (figura 28B). Recuento absoluto de linfocitos B derivados de PBMC en escala logarítmica en médula ósea (figura 28C) y bazo (figura 28D). Se representan los resultados de animales individuales. Se muestra el número de linfocitos B en función de los diferentes grupos de tratamiento. Los círculos vacíos en la parte superior del gráfico muestran las dosis activas que fueron significativamente diferentes estadísticamente del polipéptido irrelevante (T017000088) en función de las pruebas F del análisis ANOVA de efectos mixtos. Todos los efectos en el bazo son estadísticamente significativos al nivel de significación del 5 %. En particular, el valor del eje de ordenadas de 0,001 significa que no se han contado células.
Figura 29:Diseño del estudio para el modelo de reducción de linfocitos B de PBMC como se describe en el ejemplo 20. Se inyectaron PBMC por vía intraperitoneal a los animales el día 3 (D3). Los ratones se trataron de D3 al día 7 (D7) con T017000083 (TCR/CD20) IV una vez al día durante 5 días (Q1Dx5) o T017000088 (polipéptido irrelevante) IV Q1 Dx5.
Figura 30:Recuento absoluto de linfocitos B derivados de PBMC en escala logarítmica. Se representan los resultados de animales individuales. Se muestra el número de linfocitos B en función de los diferentes grupos de tratamiento. En particular, un valor del eje de ordenadas de 0,001 significa que no se han contado células.
Figuras 31A y 31B:Determinación del nivel de expresión de EGFR (figura 31A; con anticuerpo anti-EGFR; Santa Cruz, sc-120 PE) o CEACAM5 (figura 31B; con anticuerpo anti-CEACAM; Sino Biological, 11077-MM02-P) en líneas celulares HER14, Hela, LoVo y LS174-T en citometría de flujo. El valor de MCF (fluorescencia media del canal) se representó para cada línea celular.
Figura 32:Unión dependiente de la dosis de los Nanobodies monovalentes y los polipéptidos multiespecíficos a HER14 (A), LS174T (B), linfocitos T humanos primarios (C) y células LoVo (D). La intensidad media de fluorescencia del canal se representó frente a la concentración.
Figura 33:Determinación de los niveles de expresión de EGFR y CEACAM5 de las líneas celulares HER14, LoVo y LS174T usando 100 nM de los Nanobodies contra EGFR y CEACAM en citometría de flujo. El valor de MFI (intensidad media de fluorescencia) se representó para cada línea celular.
Figura 34:Destrucción de células diana LoVo(A, B), LST174T (C, D) y HER14 (E) redirigida dependiente de la dosis de polipéptidos multiespecíficos por linfocitos T efectores humanos en el ensayo basado en xCELLigence usando una relación de efector a diana de 15. El IC después de un tiempo de incubación de 30 h-40 h (A, C) y 50 h-60 h (B, D, E) se representó frente a la concentración de los polipéptidos multiespecíficos. (T017000107 = círculo, T017000109 = cuadrado, T017000110 = triángulo).
Figura 35:Diseño del estudio del modelo Ramosin vivousado en el ejemplo 26. Se inyectaron células Ramos por vía intravenosa a ratones en el día 1 (D1). Se inyectaron PBMC por vía intraperitoneal a los animales el día 3 (D3). Los ratones se trataron de D3 al día 7 (D7) con T017000088, T017000106, T017000083, T017000104 o T017000105.
Figura 36:Recuento absoluto de linfocitos B de Ramos en escala logarítmica en médula ósea y bazo. Se representan los resultados de animales individuales. Se muestra el número de linfocitos B de Ramos en función de los diferentes grupos de tratamiento. Las estrellas en la parte superior del gráfico muestran las dosis activas que fueron significativamente diferentes estadísticamente del Nanobody de control (T017000088 o T017000106) en función de las pruebas F del análisis ANOVA de efectos mixtos. Todos los efectos son estadísticamente significativos al nivel de significación del 5 %.
Figura 37:Recuento absoluto de linfocitos B derivados de PBMC en escala logarítmica en médula ósea y bazo. Se representan los resultados de animales individuales. Se muestra el número de linfocitos B derivados de PBMC en función de los diferentes grupos de tratamiento. Las estrellas en la parte superior del gráfico muestran las dosis activas que fueron significativamente diferentes estadísticamente del Nanobody de control (T017000088 o T017000106) en función de las pruebas F del análisis ANOVA de efectos mixtos. Todos los efectos son estadísticamente significativos al nivel de significación del 5 %.
Figura 38:Destrucción de células diana SKBR3 redirigida dependiente de la dosis de T017000102 por linfocitos T efectores humanos aisladas del donador 932 (A), linfocitos T CD4+ humanos aislados del donador 941 (B) y linfocitos T CD8+ humanos aislados del donador 941 (C) en el ensayo basado en xCELLigence usando una relación de efector a diana de 15. El IC después de un tiempo de incubación de 40 h se representó frente a la concentración del polipéptido multiespecífico.
Figura 39:Activación de linfocitos T dependiente de la dosis de linfocitos T efectores humanos aislados del donador 932 (A, D), linfocitos T CD4+ humanos aislados del donador 941 (B, E) y linfocitos T CD8+ humanos aislados del donador 941 (C, F) por T017000102 en un entorno de destrucción de células diana SKBR3 redirigida. La activación se midió supervisando la regulación por aumento de CD69 (A, B, C) y de CD25 (D, E, F). La intensidad media de fluorescencia (MFI) se representó frente a la concentración.
Figura 40:Producción de citocinas dependiente de la dosis por linfocitos T efectores humanos aislados del donador 932 (A, D), linfocitos T CD4+ humanos aislados del donador 941 (B, E) y linfocitos T CD8+ humanos aislados del donador 941 (C, F) por T017000102 en un entorno de destrucción de células diana SKBR3 redirigido. La producción de INF-y humana (A, B, C) y de IL-6 humana (D, E, F) se midió después de 72 h de incubación. La concentración medida de INF-y e IL-6 humanas (en pg/ml) se representó frente a la concentración del Nanobody.
Figura 41:Unión dependiente de la dosis de la construcción HLE T017000108 a HER14 (A), LS174T (B), linfocitos T humanos primarios (C) y células LoVo (D). La intensidad media de fluorescencia (MFI) se representó frente a la concentración.
Figura 42:Destrucción de células diana LS174T redirigida dependiente de la dosis de T017000107 (línea continua) y T017000108 (línea de puntos) por linfocitos T efectores humanos en el ensayo basado en xCELLigence usando una relación de efector a diana de 15. El IC después de un tiempo de incubación de 48 h se representó frente a la concentración de los polipéptidos multiespecíficos.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la presente invención se dieron cuenta de que los formatos que ponen linfocitos T y células tumorales juntos para inducir una respuesta inmunitaria deben cumplir con diversos requisitos frecuentemente opuestos. El formato debe ser de aplicación general. En particular, el formato debe ser preferiblemente útil en una amplia gama de pacientes y preferiblemente también contra una amplia gama de tumores. El formato debe ser preferiblemente seguro y dirigirse únicamente a las celdas previstas. Además, el formato debe ser preferiblemente lo suficientemente pequeño como para penetrar fácilmente en tejidos y tumores, mientras que, por otro lado, el formato debe ser favorable para el paciente. Por ejemplo, el formato debe tener una semivida prolongada, de modo que el formato no se elimine instantáneamente tras la administración mediante aclaramiento renal. Sin embargo, la prolongación de la semivida preferiblemente no debe introducir actividad inespecífica ni efectos secundarios ni limitar la penetración en tejidos y tumores. Además, se reconoció que las células tumorales a menudo crean mecanismos de escape mediante la regulación por disminución de antígenos diana dentro de un tratamiento. Por consiguiente, en una versión preferida adicional, el formato debe dirigirse simultáneamente a múltiples antígenos.
La presente invención logra al menos uno de estos requisitos.
En particular, se planteó la hipótesis de que los dominios variables individuales de inmunoglobulina (ISV) serían, en principio, candidatos ideales, ya que son lo suficientemente pequeños para penetrar fácilmente en el tejido (tumor) y pueden combinarse con otros ISV como componentes básicos. A continuación, los ISV dirigidos contra los dominios constantes de TCR deben tener una amplia aplicabilidad. A diferencia de los dominios variables de TCR, estos dominios constantes de TCR presentan una menor variabilidad de secuencia y, en consecuencia, deben ser útiles en una amplia gama de pacientes.
Inesperadamente, resultó ser extremadamente difícil generar ISV mediante inmunización en llamas contra los dominios constantes de TCR. O bien no se montó ninguna respuesta inmunitaria significativa, o bien los ISV generados se dirigieron contra los dominios variables de TCR. Solo al implementar un método de inmunización y cribado rigurosamente llevado a cabo usando diferentes células y secuencias para la inmunización y el refuerzo, así como usando diferentes proteínas de cribado, los autores de la invención pudieron aislar ISV contra los dominios constantes de TCR. Aunque se identificaron solamente tres grupos de ISV relacionados, estos ISV tenían una gama inesperada de rasgos característicos ventajosos. En primer lugar, los ISV inesperadamente fueron ampliamente aplicables, es decir, los ISV contra TCR podían unirse a linfocitos T de diferentes donadores con alta afinidad. En formato de un polipéptido multiespecífico, los ISV contra TCR posibilitaron la destrucción de células tumorales con diferentes antígenos asociados a tumor. Por tanto, los ISV contra TCR pueden usarse contra una multitud de cánceres. Además, los polipéptidos multiespecíficos que comprenden los ISV contra TCR permanecieron activos cuando se unieron a albúmina. Esto contribuye a un perfil PK favorable y al cumplimiento por parte del paciente, al tiempo que se minimizan los efectos secundarios. Los polipéptidos de la invención solo mostraron efectos cuando se unieron tanto al linfocito T como a la célula diana, lo que es indicativo de su seguridad.
Se identificaron seis grupos de ISV relacionados, que tenían una gama inesperada de rasgos característicos ventajosos. En primer lugar, los ISV inesperadamente fueron ampliamente aplicables, es decir, los ISV contra CD3 podían unirse a linfocitos T de diferentes donadores con alta afinidad. En formato de un polipéptido multiespecífico, los ISV contra CD3 posibilitaron la destrucción de células tumorales con diferentes antígenos asociados a tumor. Por tanto, los ISV contra CD3 pueden usarse contra una multitud de cánceres. Además, los polipéptidos multiespecíficos que comprenden los ISV contra CD3 permanecieron activos cuando se unieron a albúmina. Esto contribuye a un perfil PK favorable y al cumplimiento por parte del paciente, al tiempo que se minimizan los efectos secundarios. Los polipéptidos de la invención solo mostraron efectos cuando se unieron tanto al linfocito T como a la célula diana, lo que es indicativo de su seguridad.
Los autores de la presente invención consideraron que abordar simultáneamente múltiples antígenos reduce la probabilidad de generar variantes de escape tumoral, por lo que se mejora la actividad terapéutica de la estrategia de acoplamiento de linfocitos T. Se proporcionan polipéptidos multiespecíficos que comprenden un ISV contra TCR como se define por las reivindicaciones, combinado con dominios variables individuales de inmunoglobulina contra diferentes antígenos diana y/o diferentes epítopos en un antígeno particular (biparatópico).
Las secuencias de inmunoglobulina, tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno derivados de los mismos (por ejemplo, dominios variables individuales de inmunoglobulina o ISV) se usan para abordar específicamente sus respectivos antígenos en investigación y aplicaciones terapéuticas. La generación de dominios variables individuales de inmunoglobulina, tales como, por ejemplo, VHH o Nanobodies, puede implicar la inmunización de un animal experimental tal como una llama, la construcción de colecciones de fagos a partir de tejido inmunitario, selección de fagos que presentan dominios variables individuales de inmunoglobulina de unión a antígeno y cribado de dichos dominios y construcciones manipuladas de los mismos para las especificidades deseadas (documento WO 94/04678). Como alternativa, pueden generarse dominios variables individuales de inmunoglobulina similares, tales como, por ejemplo, dAb, seleccionando fagos que presentan dominios variables individuales de inmunoglobulina de unión a antígeno directamente de colecciones no expuestas o sintéticas y cribado posterior de dichos dominios y construcciones manipuladas de los mismos para las especificidades deseadas (Wardetal.,Nature, 1989, 341: 544-546; Holtetal.,Trends Biotechnol., 2003, 21 (11):484-490; así como, por ejemplo, los documentos WO 06/030220, WO 06/003388 y otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd.). Desafortunadamente, el uso de anticuerpos monoclonales y/o fuertemente manipulados también conlleva un alto coste de fabricación y puede provocar una penetración tumoral subóptima en comparación con otras estrategias.
La presente invención proporciona polipéptidos multiespecíficos como se definen por las reivindicaciones que se unen específicamente al receptor de linfocitos T (TCR), con una gama inesperada de rasgos característicos ventajosos. En primer lugar, los polipéptidos son fáciles de fabricar. Además, los ISV inesperadamente son ampliamente aplicables, es decir, los ISV contra TCR podían unirse a linfocitos T de diferentes donadores con alta afinidad. En formato de un polipéptido multiespecífico, los ISV contra TCR posibilitaron la destrucción de células tumorales con diferentes antígenos asociados a tumor. Por el contrario, no se observó destrucción cuando los polipéptidos no se unieron a linfocitos T y la célula diana, lo que subraya la seguridad de los polipéptidos de la invención. Por tanto, los ISV contra TCR pueden usarse contra una multitud de cánceres. Además, los ISV contra TCR pueden considerarse seguros. Además, los polipéptidos multiespecíficos que comprenden los ISV contra TCR permanecieron activos cuando se unieron a albúmina. Esto contribuirá a un perfil PK favorable y al cumplimiento por parte del paciente, al tiempo que se minimizan los efectos secundarios.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, que comprende un primer y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), en donde el primer ISV tiene una alta afinidad por/se une al dominio constante del receptor de linfocitos T (TCR) y el segundo ISV tiene una alta afinidad por/se une a un antígeno en una célula (célula diana), preferiblemente una célula tumoral. El antígeno es preferiblemente específico para dicha célula diana, tal como, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor (TAA). El polipéptido multiespecífico de la invención dirige el linfocito T a la célula, por ejemplo, una célula tumoral e induce la activación del linfocito T para permitir que dicho linfocito T inhiba o destruya dicha célula diana, por ejemplo, dicha célula tumoral.
Definiciones:
a) Salvo que indique o defina de otro modo, todos los términos usados tienen su significado habitual en la técnica, que estarán claros para los expertos en la materia. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales convencionales mencionados en el párrafo a) en la página 46 del documento WO 08/020079.
b) La expresión "dominio variable individual de inmunoglobulina", usado indistintamente con "dominio variable individual" e "ISV", define moléculas en donde el sitio de unión a antígeno está presente en, y se forma por, un solo dominio de inmunoglobulina. Esto diferencia los dominios variables inmunoglobulina individuales de inmunoglobulina de las inmunoglobulinas "convencionales" o sus fragmentos (tales como Fab, scFv, etc.), en donde dos dominios de inmunoglobulina, en particular dos dominios variables, interactúan para formar un sitio de unión a antígeno. Típicamente, en inmunoglobulinas convencionales, un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL) interactúan para formar un sitio de unión a antígeno. En este caso, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) tanto de VH como de VL contribuirán al sitio de unión a antígeno, es decir, un total de 6 CDR estarán implicadas en la formación del sitio de unión a antígeno. Por el contrario, el sitio de unión de un dominio variable individual de inmunoglobulina se forma mediante un solo dominio VH o VL. Por tanto, el sitio de unión a antígeno de un dominio variable individual de inmunoglobulina se forma mediante no más de tres CDR.
Por tanto, las expresiones "dominio variable individual de inmunoglobulina", "dominio variable individual" e "ISV" no comprenden inmunoglobulinas convencionales o sus fragmentos, que requieren la interacción de al menos dos dominios variables para la formación de un sitio de unión a antígeno. Sin embargo, estas expresiones comprenden fragmentos de inmunoglobulinas convencionales en donde el sitio de unión a antígeno se forma mediante un solo dominio variable.
La expresión "dominio variable individual de inmunoglobulina" o "ISV" incluye (sin limitación) dominios o fragmentos de unión a antígeno tales como dominios V<h h>o dominios V<h>o V<l>, respectivamente. Las expresiones moléculas de unión a antígeno o proteína de unión a antígeno se usan indistintamente e incluyen también el término Nanobodies. Los dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden ser secuencias del dominio variable de la cadena la ligera (por ejemplo, una secuencia V<l>) o secuencias del dominio variable de la cadena pesada (por ejemplo, una secuencia V<h>); más específicamente, pueden ser secuencias del dominio variable de la cadena pesada que derivan de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o secuencias del dominio variable de la cadena pesada que derivan de un anticuerpo de cadena pesada. Por consiguiente, los dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden ser anticuerpos de dominio, o secuencias de inmunoglobulina que son adecuadas para su uso como anticuerpos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, o secuencias de inmunoglobulina que son adecuadas para su uso como anticuerpos de un solo dominio, "dAb" o secuencias de inmunoglobulina que son adecuadas para su uso como dAb, o Nanobodies, incluyendo, aunque sin limitación, secuencias V<h h>, secuencias VHH humanizadas o secuencias VH camelizadas. La invención usa secuencias de inmunoglobulina de diferente origen, que comprenden secuencias de inmunoglobulina de ratón, rata, conejo, burro, ser humano y camélido. El dominio variable individual de inmunoglobulina incluye secuencias de inmunoglobulina completamente humanas, humanizadas, con secuencia optimizada de otro modo o quiméricas. Puede considerarse que el dominio variable individual de inmunoglobulina y la estructura de un dominio variable individual de inmunoglobulina comprenden, sin embargo, sin limitación a ello, cuatro regiones flanqueantes o "FR", que se denominan en la técnica y en este documento "región flanqueante 1" o "FR1"; "región flanqueante 2" o "FR2"; "región flanqueante 3" o "FR3"; y "región flanqueante 4" o "FR4", respectivamente; que son regiones flanqueantes interrumpidas por tres regiones determinantes de la complementariedad o "CDR", que se denominan en la técnica "región determinante de la complementariedad 1" o "CDR1"; "región determinante de la complementariedad 2" o "CDR2"; y "región determinante de la complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. Cabe señalar que los términos Nanobody o Nanobodies son marcas comerciales registradas de Ablynx N.V. y, por tanto, también pueden denominarse Nanobody o Nanobodies, respectivamente.
c) Salvo que se indique de otro modo, las expresiones "secuencia de inmunoglobulina", "secuencia", "secuencia de nucleótidos" y "ácido nucleico" son como se describen en el párrafo b) en la página 46 del documento WO 08/020079.
d) Salvo que se indique de otro modo, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle pueden realizarse y se han realizado de una manera conocidaper se,como quedará claro para los expertos en la materia. Por ejemplo, se hace referencia de nuevo a los manuales convencionales y a los antecedentes técnicos generales mencionados en este documento y a las referencias adicionales citadas en ellos; así como a, por ejemplo, las siguientes reseñas Presta 2006 (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6):640-656), Levin y Weiss 2006 (Mol. Biosyst. 2(1):49-57), Irvinget al.2005 (J. Immunol. Methods 248(1 -2):31 -45), Schmitzet al.
2000 (Placenta 21 Supl. A: S106-112, Gonzaleset al.2005 (Tumour Biol. 26(1 ):31 -43), que describen técnicas para manipulación de proteínas, tales como la maduración por afinidad y otras técnicas para mejorar la especificidad y otras propiedades deseadas de proteínas tales como inmunoglobulinas.
e) Los residuos aminoacídicos se indicarán de acuerdo con el código convencionales de tres letras o de una letra de los aminoácidos. Se hace referencia a la tabla A-2 en la página 48 de la solicitud internacional WO 08/020079 de Ablynx N.V. titulada"Immunoglobulin single variable domains directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with Il-6 mediated signalling”.
f) Con el propósito de comparar dos o más secuencias de nucleótidos, el porcentaje de"identidad de secuencia”entre una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos puede calcularse o determinarse como se describe en el párrafo e) en la página 49 del documento WO 08/020079, tal como dividiendo[el número de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de nucleótidos]por [elnúmero total de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos]y multiplicando por [700 %], en que cada eliminación, inserción, sustitución o adición de un nucleótido en la segunda secuencia de nucleótidos, en comparación con la primera secuencia de nucleótidos, se considera una diferencia en un solo nucleótido (posición); o usando un algoritmo informático o técnica adecuada, de nuevo como se describe en el párrafo e) en la página 49 del documento WO 08/020079.
g) Con el propósito de comparar dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina u otras secuencias de aminoácidos tales como, por ejemplo, los polipéptidos de la invención, etc., el porcentaje de"identidad de secuencia”entre una primera secuencia de aminoácidos y una segunda secuencia de aminoácidos (también denominada en este documento"identidad de aminoácidos”)puede calcularse o determinarse como se describe en el párrafo f) en las páginas 49 y 50 del documento WO 08/020079, tal como dividiendo[el número de residuos aminoacídicos en la primera secuencia de aminoácidos que son idénticos a los residuos aminoacídicos en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de aminoácidos]por[el número total de residuos aminoacídicos en la primera secuencia de aminoácidos]y multiplicando por [700 %], en que cada eliminación, inserción, sustitución o adición de un residuo aminoacídico en la segunda secuencia de aminoácidos, en comparación con la primera secuencia de aminoácidos, se considera una diferencia en un solo residuo aminoacídico (posición), es decir, una "diferencia aminoacídica" como se define en este documento; o usando un algoritmo informático o técnica adecuada, de nuevo como se describe en el párrafo f) en las páginas 49 y 50 del documento WO 08/020079).
Además, al determinar el grado de identidad de secuencia entre dos dominios variables individuales de inmunoglobulina, el experto en la materia puede tener en cuenta las denominadas sustituciones aminoacídicas "conservativas", como se describe en la página 50 del documento WO 08/020079.
Cualquier sustitución aminoacídica aplicada a los polipéptidos descritos en este documento también puede basarse en el análisis de las frecuencias de variaciones aminoacídicas entre proteínas homólogas de diferentes especies, desarrollado por Schulzet al.1978 (Principles of Protein Structure, Springer-Verlag), sobre los análisis de los potenciales de formación de estructuras desarrollados por Chou y Fasman 1975 (Biochemistry 13: 211) y 1978 (Adv. Enzymol. 47: 45-149), y sobre el análisis de patrones de hidrofobia en proteínas desarrollado por Eisenberget al.1984 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144), Kyte y Doolittle 1981 (J Molec. Biol. 157: 105-132), y Goldmanet al.1986 (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353). La información sobre la estructura primaria, secundaria y terciaria de Nanobodies se proporciona en la descripción de este documento y en los antecedentes técnicos generales citados anteriormente. Además, para este propósito, se da la estructura cristalina de un dominio V<h h>de una llama, por ejemplo, por Desmyteret al.1996 (Nature Structural Biology, 3: 803), Spinelliet al.1996 (Natural Structural Biology 3: 752-757), y Decanniereet al.1999 (Structure, 7: 361). En la técnica anterior citada anteriormente se puede encontrar información adicional sobre algunos de los residuos aminoacídicos que, en dominios V<h>convencionales, forman la superficie de contacto de V<h>/V<l>, y posibles sustituciones para camelizado en estas posiciones.
h) Se dice que los dominios variables individuales de inmunoglobulina y las secuencias de ácido nucleico son"exactamente iguales"si tienen una identidad de secuencia de un 100 % (como se define en este documento) sobre toda su longitud.
i) Al comparar dos dominios variables individuales de inmunoglobulina, la expresión"diferencia de aminoácido"se refiere a una inserción, eliminación o sustitución de un solo residuo aminoacídico en una posición de la primera secuencia, en comparación con la segunda secuencia; entendiéndose que dos dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden contener una, dos o más de dichas diferencias de aminoácido.
j) Cuando se dice que una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos "comprende" otra secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente, o que "consiste esencialmente en" otra secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, esto tiene el significado dado en el párrafo i) en las páginas 51-52 del documento WO 08/020079.
k) La expresión "en forma esencialmente aislada" tiene el significado dado en el párrafo j) en las páginas 52 y 53 del documento WO 08/020079.
l) Las expresiones "dominio" y "dominio de unión" tienen los significados dados en el párrafo k) en la página 53 del documento WO 08/020079.
m) Las expresiones "determinante antigénico" y "epítopo", que también pueden usarse indistintamente en este documento, tienen los significados dados en el párrafo l) en la página 53 del documento WO 08/020079.
n) Como se describe adicionalmente en el párrafo m) en la página 53 del documento WO 08/020079, una secuencia de aminoácidos (tal como un anticuerpo, un polipéptido de la invención o, en general, una proteína o polipéptido de unión a antígeno o un fragmento del mismo) que puede unirse (específicamente) a, que tenga afinidad por y/o que tenga especificidad por un determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína (o por al menos una parte, fragmento o epítopo de la misma) específica se dice que es"contra"o está"dirigido contra"dicho determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína.
o) El término"especificidad'se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos a los que puede unirse una molécula de unión a antígeno particular o proteína de unión a antígeno (tal como un ISV, Nanobody o un polipéptido de la invención). La especificidad de una proteína de unión a antígeno puede determinarse en función de la afinidad y/o la avidez.
La afinidad, representada por la constante en equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (K<d>o KD), es una medida de la fuerza de unión entre un determinante antigénico, es decir, la diana, y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno, es decir, el ISV o Nanobody: cuanto menor sea el valor de la K<d>, mayor será la fuerza de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión a antígeno (como alternativa, la afinidad también puede expresarse como la constante de afinidad (K<a>), que es 1/K<d>). Como estará claro para los expertos en la materia (por ejemplo, en función de la divulgación adicional en este documento), la afinidad puede determinarse de una manera conocidaper se,dependiendo del antígeno específico de interés.
La avidez es la afinidad del polipéptido, es decir, el ligando puede unirse mediante dos (o más) farmacóforos (ISV) en que las múltiples interacciones sinergizan para potenciar la afinidad "aparente". La avidez es la medida de la fuerza de unión entre el polipéptido de la invención y los antígenos pertinentes. El polipéptido de la invención puede unirse mediante sus dos (o más) componentes básicos, tales como ISV o Nanobodies, a las al menos dos dianas, en que las múltiples interacciones, por ejemplo, el primer componente básico, ISV o Nanobody que se une a la primera diana y el segundo componente básico, ISV o Nanobody que se une a la segunda diana, sinergizan para potenciar la afinidad "aparente". La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión a antígeno en la molécula de unión a antígeno como con el número de sitios de unión pertinentes presentes en las moléculas de unión a antígeno. Por ejemplo, y sin limitación, los polipéptidos que contienen dos o más componentes básicos, tales como ISV o Nanobodies dirigidos contra diferentes dianas en una célula pueden unirse (y habitualmente se unirán) con mayor avidez que cada uno de los monómeros individuales o componentes básicos individuales, tales como, por ejemplo, los ISV monovalentes o Nanobodies, comprendidos en los polipéptidos de la invención.
En general, se considera que cualquier valor de K<d>mayor de 10<-4>mol/litro (o cualquier valor de K<a>menor de 10<4>M<-1>) litros/mol indica unión no específica.
Los polipéptidos de la invención comprenden un primer y un segundo ISV, por ejemplo, un primer y un segundo Nanobody. Preferiblemente, la afinidad de cada ISV, por ejemplo, Nanobody, se determina individualmente. En otras palabras, la afinidad se determina por el ISV o Nanobody monovalente, independientemente de los efectos de avidez debidos al otro ISV o Nanobody, que podría estar presente o no. La afinidad para un ISV o Nanobody monovalente puede determinarse en el ISV o Nanobody monovalenteper se,es decir, cuando dicho ISV o Nanobody monovalente no está comprendido en el polipéptido de la invención. Como alternativa o adicionalmente, la afinidad para un ISV o Nanobody monovalente puede determinarse en una diana mientras la otra diana está ausente.
La unión de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse de cualquier manera adecuada conocidaper se,incluyendo, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competición intercalados, y las diferentes variantes de los mismos conocidasper seen la técnica; así como las otras técnicas mencionadas en este documento.
La constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente, como estará claro para los expertos en la materia. Los métodos para determinar la constante de disociación estarán claros para los expertos en la materia y, por ejemplo, incluyen las técnicas mencionadas en este documento. A este respecto, también estará claro que puede que no sea posible medir constantes de disociación de más de 10<-4>moles/litro o 10<-3>moles/litro (por ejemplo, de 10<-2>moles/litro). Opcionalmente, como también estará claro para los expertos en la materia, la constante de disociación (real o aparente) puede calcularse en función de la constante de asociación (real o aparente) (K<a>), mediante la relación [K<d>= 1/K<a>].
La afinidad indica la fuerza o estabilidad de una interacción molecular. La afinidad se da normalmente por la K<d>o constante de disociación, que tiene unidades de mol/litro (o M). La afinidad también puede expresarse como una constante de asociación, K<a>, que es igual a 1/K<d>y tiene unidades de (mol/litro)<-1>(o M<-1>). En la presente memoria descriptiva, la estabilidad de la interacción entre dos moléculas (tal como una secuencia de aminoácidos, Nanobody o polipéptido y su diana prevista) se expresará principalmente en términos del valor de K<d>de su interacción; estando claro para los expertos en la materia que, en vista de la relación K<a>= 1/K<d>, especificar la fuerza de la interacción molecular por su valor de K<d>también se puede usar para calcular el valor de K<a>correspondiente. El valor de K<d>caracteriza la fuerza de una interacción molecular también en un sentido termodinámico, ya que está relacionada con la energía libre (DG) de unión por la relación DG = RT.ln(K<D>) conocida (equivalentemente DG = -RT.ln(K<A>)), donde R es igual a la constante de los gases, T es igual a la temperatura absoluta y ln indica el logaritmo neperiano.
La K<d>para las interacciones biológicas que se consideran significativas (por ejemplo, específicas) están típicamente en el intervalo de 10<-10>M (0,1 nM) a 10<-5>M (10000 nM). Cuanto más fuerte es una interacción, menor es su K<d>.
La K<d>también puede expresarse como la relación de la constante de tasa de disociación de un complejo, indicada k<o ff>, con la tasa de su asociación, indicada k<on>(de modo que K<d>= k<off>/k<on>y K<a>= k<on>/k<off>). La tasa de disociación k<off>tiene unidades s<-1>(donde s es la notación unitaria del SI de segundo). La tasa de asociación k<on>tiene unidades M<-1>s<-1>. La tasa asociación puede variar entre 10<2>M<-1>s<-1>y aproximadamente 10<7>M<-1>s<-1>, que se aproxima a la constante de tasa de asociación limitada por difusión para interacciones biomoleculares. La tasa de disociación está relacionada con la semivida de una interacción molecular dada por la relación t<1/2>= ln(2)/k<o ff>. La tasa de disociación puede variar entre 10<-6>s<-1>(complejo casi irreversible con un t<1/2>de múltiples días) y 1 s<-1>(t<1/2>= 0,69 s).
La afinidad de una interacción molecular entre dos moléculas puede medirse mediante diferentes técnicas conocidasper se,tal como la conocida técnica de biosensor de resonancia de plasmones superficiales (SPR) (véase, por ejemplo, Oberetal.2001, Intern. Immunology, 13: 1551-1559). La expresión "resonancia de plasmones superficiales", como se usa en este documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas instantáneamente mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, cuando una molécula se inmoviliza en el chip biosensor y la otra molécula se pasa por la molécula inmovilizada en condiciones de flujo que producen mediciones de k<o n>, k<off>y, por<tanto, valores de>K<d (o>K<a>).<Esto se puede realizar, por ejemplo, usando el sistema BIAcore bien conocido (BIAcore>International AB, una empresa GE Healthcare, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, véanse Jonssonet al.1993 (Ann. Biol. Clin. 51: 19-26), Jonssonet al.1991 (Biotechniques 11: 620-627), Johnsson,et al.1995 (J. Mol. Recognit. 8: 125-131), y Johnnson,et al.1991 (Anal. Biochem. 198: 268-277).
Otra técnica de biosensores bien conocida para determinar afinidades de interacciones biomoleculares es la interferometría de biocapa (BLI) (véase, por ejemplo, Abdicheet al.2008, Anal. Biochem. 377: 209-217). La expresión "interferometría de biocapa" o "BLI", como se usa en este documento, se refiere a una técnica óptica sin marcadores que analiza el patrón de interferencia de la luz reflejada desde dos superficies: una capa de referencia interna (haz de referencia) y una capa de proteína inmovilizada en la punta del biosensor (haz de señal). Un cambio en el número de moléculas unidas a la punta del biosensor provoca un cambio en el patrón de interferencia, presentado como un cambio de longitud de onda (nm), cuya magnitud es una medida directa del número de moléculas unidas a la superficie de la punta del biosensor. Como las interacciones pueden medirse instantáneamente, pueden determinarse las velocidades de asociación y disociación y las afinidades. La BLI puede realizarse, por ejemplo, usando los bien conocidos sistemas Octet<®>(ForteBio, una división de Pall Life Sciences, Menlo Park, EE. UU.).
Como alternativa, las afinidades se pueden medir en el ensayo de exclusión cinética (KinExA) (véase, por ejemplo, Drakeet al.2004, Anal. Biochem., 328: 35-43), usando la plataforma KinExA® (Sapidyne Instruments Inc, Boise, EE. UU.). El término "KinExA", como se usa en este documento, se refiere a un método basado en solución para medir la verdadera afinidad de unión en equilibrio y la cinética de moléculas no modificadas. Las soluciones equilibradas de un complejo de anticuerpo/antígeno se pasan sobre una columna con microesferas prerrecubiertas con antígeno (o anticuerpo), lo que permite que el anticuerpo (o antígeno) libre se una a la molécula recubierta. La detección del anticuerpo (o antígeno) capturado de este modo se consigue con una proteína marcada fluorescentemente que se une al anticuerpo (o antígeno).
<También estará claro para los expertos en la materia que la>K<d medida puede corresponder a la>K<d aparente si el>proceso de medición influye de alguna manera en la afinidad de unión intrínseca de las moléculas implicadas, por ejemplo, por artefactos relacionados con el recubrimiento en el biosensor de una molécula. Además, se puede<medir una>K<d aparente si una molécula contiene más de un sitio de reconocimiento para la otra molécula. En dicha>situación, la afinidad medida puede verse afectada por la avidez de la interacción por las dos moléculas.
Otra estrategia que puede usarse para evaluar la afinidad es el procedimiento de ELISA (ensayo de inmunoadsorción enzimática) de 2 etapas de Friguetet al.1985 (J. Immunol. Methods, 77: 305-19). Este método establece una medición en equilibrio de unión en fase de solución y evita posibles artefactos relacionados con la adsorción de una de las moléculas en un soporte tal como plástico.
<Sin embargo, la medición exacta de>K<d puede ser bastante trabajosa y, como consecuencia, a menudo se determinan valores de>K<d aparentes para evaluar la fuerza de unión de dos moléculas. Cabe señalar que, siempre>que todas las mediciones se realicen de una manera coherente (por ejemplo, manteniendo las condiciones del<ensayo inalteradas), se pueden usar mediciones de>K<d aparentes como una aproximación de la>K<d verdadera y, por tanto, en el presente documento, la>K<d y la>K<d aparente deben tratarse con igual importancia o relevancia.>
Finalmente, cabe señalar que, en muchas situaciones, el científico experimentado puede juzgar que es conveniente determinar la afinidad de unión con respecto a alguna molécula de referencia. Por ejemplo, para evaluar la fuerza de unión entre moléculas A y B, se puede usar, por ejemplo, una molécula de referencia C que se sabe que se une a B y que está marcada adecuadamente con un grupo fluoróforo o cromóforo u otro resto químico, tal como biotina para una fácil detección en un ELISA o FACS (clasificación de células activadas fluorescentes) u otro formato (el fluoróforo para la detección de fluorescencia, el cromóforo para la detección de absorción de luz, la biotina para la detección de ELISA mediada por estreptavidina). Típicamente, la molécula de referencia C se mantiene a una concentración fija y la concentración de A se varía para una concentración o cantidad dada de B. Como resultado, se obtiene un valor de CI<50>correspondiente a la concentración de A en la<que la señal medida para C en ausencia de A se reduce a la mitad. Siempre que se conozca>K<d re f, la>K<d de la molécula de referencia, así como el de concentración total de la molécula de referencia c re f, la>K<d aparente para la interacción A-B se puede obtener de la siguiente fórmula:>K<d = CI5ü/(1+cref/>K<d re f). Obsérvese que, si c ref <<>K<d re f,>K<d = CI50. Siempre que la medición de la CI50 se realice de una manera coherente (por ejemplo, manteniendo la>c<ref>fija) para los ligandos que se comparan, la fuerza o estabilidad de una interacción molecular puede evaluarse<por la CI50 y esta medición se considera equivalente a>K<d o a>K<d aparente en todo este texto.>
p) La semivida de una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido puede definirse en general, como se describe en el párrafo o) en la página 57 del documento WO 08/020079 y como se menciona en el mismo se refiere al tiempo que tarda la concentración sérica de la secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido en reducirse en un 50 %,in vivo,por ejemplo, debido a la degradación de la secuencia o compuesto y/o a la eliminación o secuestro de la secuencia o compuesto por mecanismos naturales. La semividain vivode una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido puede determinarse de cualquier manera conocidaper se,tal como mediante análisis farmacocinético. Las técnicas adecuadas estarán claras para los expertos en la materia, y pueden ser, por ejemplo, en general como se describe en el párrafo o) en la página 57 del documento WO 08/020079. Como se menciona también en el párrafo o) en la página 57 del documento WO 08/020079, la semivida puede expresarse usando parámetros tales como t1 /2-alfa, t1/2-beta y el área bajo la curva (ABC). Se hace referencia, por ejemplo, a la parte experimental a continuación, así como a los manuales convencionales, tales como Kennethet al.1996 (Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists) y Peterset al.1996 (Pharmacokinete analysis: A Practical Approach). También se hace referencia a Gibaldi y Perron 1982 (Pharmacokinetics, Dekker M, 2.a edición rev.). Las expresiones "aumento en la semivida" o "semivida aumentada", son como se definen en el párrafo o) en la página 57 del documento WO 08/020079 y, en particular, se refieren a un aumento en t1/2-beta, con o sin un aumento en t1/2-alfa y/o el ABC o ambos.
q) Con respecto a una diana o antígeno, la expresión "sitio de interacción" en la diana o antígeno significa un sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o tramo de residuos aminoacídicos en la diana o antígeno que es un sitio para unirse a un ligando, receptor u otro compañero de unión, un sitio catalítico, un sitio de escisión, un sitio para interacción alostérica, un sitio implicado en multimerización (tal como homomerización o heterodimerización) de la diana o antígeno; o cualquier otro sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o tramo de residuos aminoacídicos en la diana o antígeno que esté implicado en una acción o mecanismo biológico de la diana o antígeno. Más en general, un "sitio de interacción" puede ser cualquier sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o tramo de residuos aminoacídicos en la diana o antígeno al que una secuencia de aminoácidos o polipéptido puede unirse de tal manera que se module la diana o antígeno (y/o cualquier vía, interacción, señalización, mecanismo biológico o efecto biológico en que esté implicada la diana o el antígeno).
r) Se dice que un dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido es"específico para"una primera diana o antígeno en comparación con una segunda diana o antígeno cuando se une al primer antígeno con una afinidad/avidez (como se describe anteriormente, y expresada adecuadamente como un valor de K<d>, valor de K<a>, tasa Koff y/o tasa Kon) que es al menos 10 veces, tal como al menos 100 veces y preferiblemente al menos 1000 veces, y hasta 10000 veces o más, mejor que la afinidad con que dicha secuencia de aminoácidos o polipéptido se une a la segunda diana o polipéptido. Por ejemplo, el primer antígeno puede unirse a la diana o antígeno con un valor de K<d>que es al menos 10 veces menor, tal como al menos 100 veces menor y preferiblemente al menos 1000 veces menor, tal como 10000 veces menor o incluso menor que eso, que la K<d>con que dicha secuencia de aminoácidos o polipéptido se une a la segunda diana o polipéptido. Preferiblemente, cuando un dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido es "específico para" una primera diana o antígeno en comparación con una segunda diana o antígeno, está dirigido contra (como se define en este documento) dicha primera diana o antígeno, pero no contra dicha segunda diana o antígeno.
s) Las expresiones"bloquea de forma cruzada", "bloqueado de forma cruzada"y"bloqueo cruzado"se usan indistintamente en este documento para indicar la capacidad de un dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido de interferir con la unión del ligando natural a su(s) receptor(es). La medida en que un dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido puede interferir con la unión de otro compuesto, tal como el ligando natural a su diana y, por lo tanto, si puede decirse que se bloquea de forma cruzada, puede determinarse utilizando ensayos de unión de competencia. Un ensayo de bloqueo cruzado cuantitativo particularmente adecuado usa una estrategia basada en FACS o ELISA o Alphascreen para medir la competencia entre el dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido marcado (por ejemplo, marcado con His o biotinilado) y el otro agente de unión en términos de su unión a la diana. La parte experimental describe en general ensayos adecuados basados en desplazamiento de FACS, ELISA o Alphascreen para determinar si una molécula de unión bloquea de forma cruzada o puede bloquear de forma cruzada un dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido. Se apreciará que el ensayo puede usarse con cualquiera de los dominios variables individuales de inmunoglobulina u otros agentes de unión descritos en este documento. Por tanto, en general, una secuencia de aminoácidos de bloqueo cruzado u otro agente de unión es, por ejemplo, una que se unirá a la diana en el ensayo de bloqueo cruzado anterior de modo que, durante el ensayo y en presencia de una segunda secuencia de aminoácidos u otro agente de unión, el desplazamiento registrado del dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido esté entre un 60 % y un 100 % (por ejemplo, en el ensayo de competencia basado en ELISA/Alphascreen) o entre un 80 % y un 100 % (por ejemplo, en un ensayo de competencia basado en FACS) del desplazamiento teórico máximo (por ejemplo, desplazamiento por dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido radioinactivo (por ejemplo, sin marcar) que tiene que bloquearse de forma cruzada) mediante el agente de bloqueo cruzado potencial a ensayar que está presente en una cantidad de 0,01 mM o menos (el agente de bloqueo cruzado puede ser otro anticuerpo monoclonal convencional tal como IgG, fragmentos de anticuerpo monovalente clásicos (Fab, scFv) y variantes manipuladas (por ejemplo, diacuerpos, triacuerpos, minicuerpos, VHH, dAb, VH, VL)).
t) Se dice que una secuencia de aminoácidos tal como, por ejemplo, un dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido es un"dominio variable individual de inmunoglobulina de tipo VHH1"o"secuencia de VHH de tipo1", si dicho dominio variable individual de inmunoglobulina de tipo VHH1 o secuencia de VHH de tipo 1 tiene una identidad de un 85 % (usando la secuencia consenso de VHH1 como la secuencia de consulta y usando el algoritmo blast con la configuración convencional, es decir, matriz de puntuación blosom62) con la secuencia consenso de VHH1 (QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSD GSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA) (SEQ ID NO: 483), y obligatoriamente tiene una cisteína en la posición 50, es decir, C50 (usando la numeración de Kabat).
u) Se dice que una secuencia de aminoácidos tal como, por ejemplo, un dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido es"reactivo de forma cruzada"para dos antígenos o determinantes antigénicos diferentes (tales como seroalbúmina de dos especies diferentes de mamífero, tales como seroalbúmina humana y seroalbúmina de macaco cangrejero) si es específico para (como se define en este documento) estos dos antígenos o determinantes antigénicos diferentes.
v) Como se describe adicionalmente en el párrafo q) en las páginas 58 y 59 del documento WO 08/020079, los residuos aminoacídicos de un dominio variable individual de inmunoglobulina se numeran de acuerdo con la numeración general para dominios V<h>dada por Kabatetal.("Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, publicación n.° 91), como se aplica a los dominios V<h h>de camélidos en el artículo de Riechmann y Muyldermans, 2000 (J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195; véase, por ejemplo, la figura 2 de esta publicación). Cabe señalar que, como es bien conocido en la técnica para dominios V<h>y para dominios VHH, el número total de residuos aminoacídicos en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de residuos aminoacídicos indicado por la numeración de Kabat (es decir, una o más posiciones de acuerdo con la numeración de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia real, o la secuencia real puede contener más residuos aminoacídicos que el número permitido por la numeración de Kabat). Esto significa que, en general, la numeración de acuerdo con Kabat puede corresponder o no a la numeración real de los residuos aminoacídicos en la secuencia real. El número total de residuos aminoacídicos en un dominio VH y un dominio VHH estará habitualmente en el intervalo de 110 a 120, a menudo entre 112 y 115. Sin embargo, cabe señalar que secuencias más pequeñas y más largas también pueden ser adecuadas para los propósitos descritos en este documento.
La determinación de regiones CDR también se puede hacer de acuerdo con diferentes métodos. En la determinación de CDR de acuerdo con Kabat, FR1 de un dominio variable individual de inmunoglobulina comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 1-30, CDR1 de un dominio variable individual de inmunoglobulina comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 31-35, FR2 de un dominio variable individual de inmunoglobulina comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un dominio variable individual de inmunoglobulina comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 50-65, FR3 de un dominio variable individual de inmunoglobulina comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 66-94, CDR3 de un dominio variable individual de inmunoglobulina comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 95 102, y FR4 de un dominio variable individual de inmunoglobulina comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 103-113.
En la presente solicitud, sin embargo, salvo que se indique de otro modo, las secuencias de CDR se determinaron de acuerdo con Kontermann y Dübel (Eds. 2010, Antibody Engineering, vol. 2, Springer Verlag Heidelberg Berlín, Martin, capítulo 3, pág. 33-51). De acuerdo con este método, FR1 comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 1-25, CDR1 comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 26-35, FR2 comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 50-58, FR3 comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 59-94, CDR3 comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 95-102, y FR4 comprende los residuos aminoacídicos en las posiciones 103-113.
w) Las figuras, lista de secuencias y la parte experimental/ejemplos se dan únicamente para ilustrar adicionalmente la invención y no deben interpretarse o entenderse como limitantes del alcance de la invención y/o de las reivindicaciones adjuntas de ninguna manera, salvo que se indique explícitamente de otro modo en este documento.
x) La concentración inhibitoria de la mitad del máximo (CI50) es una medida de la eficacia de un compuesto para inhibir una función biológica o bioquímica, por ejemplo, un efecto farmacológico. Esta medida cuantitativa indica la cantidad de ISV o Nanobody (inhibidor) que se necesita para inhibir un proceso biológico dado (o componente de un proceso, es decir, una enzima, célula, receptor celular, quimiotaxia, anaplasia, metástasis, invasividad, etc.) a la mitad. En otras palabras, es la concentración inhibitoria (CI) de la mitad del máximo (50 %) de una sustancia (CI del 50 % o CI50). La CI50 de un fármaco puede determinarse construyendo una curva de respuesta a la dosis y examinando el efecto de diferentes concentraciones de antagonista, tal como un ISV o Nanobody, sobre la inversión de la actividad agonista. Los valores de CI50 pueden calcularse para un antagonista dado tal como un ISV o Nanobody determinando la concentración necesaria para inhibir la mitad de la respuesta biológica máxima del agonista.
La expresión concentración eficaz de la mitad del máximo (CE50) se refiere a la concentración de un compuesto que induce una respuesta a mitad de camino entre el nivel basal y el máximo después de un tiempo de exposición específico. En el presente contexto, se usa como una medida de la potencia de un polipéptido, ISV o Nanobody. La CE50 de una curva de respuesta a la dosis graduada representa la concentración de un compuesto donde se observa un 50 % de su efecto máximo. La concentración se expresa preferiblemente en unidades molares.
En los sistemas biológicos, pequeños cambios en la concentración de ligando típicamente provocan cambios rápidos en la respuesta, siguiendo una función sigmoidea. El punto de inflexión en que el aumento en la respuesta con una concentración creciente de ligando comienza a ralentizarse es la CE50. Esto puede determinarse matemáticamente por derivación de la curva de mejor ajuste. Confiar en un gráfico para la estimación es conveniente en la mayoría de los casos. En caso de que la CE50 se proporcione en la sección de ejemplos, los experimentos se diseñaron para reflejar la KD lo más exacta posible. En otras palabras, los valores de CE50 pueden considerarse entonces como valores de KD. La expresión "KD promedio" se refiere al valor de KD promedio obtenido en al menos 1, pero preferiblemente más de 1, tal como al menos 2 experimentos. El término "promedio" se refiere al término matemático "promedio" (sumas de datos divididas por el número de elementos en los datos).
También está relacionado con la CI50, que es una medida de la inhibición de un compuesto (inhibición del 50 %). Para ensayos de unión de competencia y ensayos de antagonistas funcionales, la CI50 es la medida abreviada más común de la curva de respuesta a la dosis. Para ensayos de agonista/estimulador, la medida abreviada más común es la CE50.
y) Debe apreciarse que, como se usa en este documento, las formas singulares "un/o", "una" y "el/la", incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "un reactivo" incluye uno o más de dichos diferentes reactivos y una referencia "al método" incluye referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la materia, que podrían modificarse o sustituirse en el lugar de los métodos descritos en este documento.
Salvo que se indique de otro modo, debe entenderse que la expresión "al menos" que precede una serie de elementos, se refiere a cada elemento de la serie.
El término "y/o" dondequiera que se une en la presente memoria incluye el significado de "y", "o" y "todas y cada una de las otras combinaciones de los elementos conectados por dicho térmico".
El término "aproximadamente", como se usa en este documento, significa dentro de un 20 %, preferiblemente dentro de un 15 %, más preferiblemente dentro de un 10 % y mucho más preferiblemente dentro de un 5 % de un valor o intervalo dado.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, salvo que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implica la inclusión de un número entero o etapa indicada o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se usa en la presente memoria, la expresión "que comprende" puede sustituirse con la expresión "que contiene" o "que incluye" o a veces cuando se usa en este documento, con la expresión "que tiene".
La presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, que comprende al menos un primer y al menos un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV) adicional, en donde dicho al menos un primer ISV tiene una alta afinidad por/se une al dominio constante del receptor de linfocitos T (TCR) y dicho al menos un ISV adicional tiene una alta afinidad por/se une a un antígeno en una célula diana.
Típicamente, los polipéptidos multiespecíficos de la invención combinan reconocimiento de antígeno de alta afinidad en la célula diana con activación de linfocitos T, lo que provoca una activación que es independiente de la especificidad natural de los linfocitos T. El modo de acción de las moléculas de unión que se une tanto a una molécula de superficie celular en una célula diana, tal como un antígeno tumoral, como al TCR de linfocitos T es comúnmente conocido. Poner un linfocito T en estrecha proximidad a una célula diana, es decir, acoplar dicho linfocito T y agrupar el complejo TCR provoca la destrucción de la célula diana por el linfocito T. Mediante la presente invención, este proceso puede aprovecharse en la lucha contra las enfermedades proliferativas, las enfermedades inflamatorias, las enfermedades infecciosas y las enfermedades autoinmunitarias. En general, los linfocitos T están equipados con gránulos que contienen una combinación mortal de proteínas formadoras de poros, llamadas perforinas, y proteasas inductoras de muerte celular, llamadas granzimas. Preferiblemente, estas proteínas se suministran a las células diana a través de una sinapsis citolítica que se forma si los linfocitos T están en estrecha proximidad a una célula diana que está destinada a ser destruida. Normalmente, la estrecha proximidad entre un linfocito T y una célula diana se consigue mediante la unión de linfocitos T a un complejo de MHC/péptido usando su receptor de linfocitos T correspondiente. Los polipéptidos de la invención ponen un linfocito T en dicha estrecha proximidad a una célula diana en ausencia de interacción del receptor de linfocitos T/MHC.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho polipéptido dirige el linfocito T a la célula diana.
Con un brazo (primer ISV), el polipéptido multiespecífico tiene una alta afinidad por/se une al dominio constante de la subunidad de TCR, un componente proteínico del complejo transductor de señales del receptor de linfocitos T en linfocitos T. Con otro brazo (segundo ISV y/o tercer ISV, etc.), el polipéptido multiespecífico reconoce, tiene una alta afinidad por/se une a uno o más antígenos en las células diana. Preferiblemente, la activación de linfocitos T solo se observa cuando los polipéptidos multiespecíficos se presentan a linfocitos T en la superficie de las células diana. La dependencia de antígeno de las células diana para la activación provoca un perfil de seguridad favorable. En una realización, los polipéptidos multiespecíficos fijan transitoriamente linfocitos T y células diana. Preferiblemente, el polipéptido multiespecífico puede inducir la activación de linfocitos T policlonales en reposo, tales como linfocitos T CD4+ y/o CD8+, para una lisis redirigida altamente potente de células diana. Preferiblemente, el linfocito T se dirige a una siguiente célula diana después de la lisis de la primera célula diana.
Las proteínas y polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina (tales como al menos dos dominios variables individuales de inmunoglobulina usados en la invención) se denominarán en este documento proteínas o polipéptidos "multivalentes" o "construcciones multivalentes". Algunos ejemplos no limitantes de dichas construcciones multivalentes quedarán claros a partir de la descripción adicional de este documento. Los polipéptidos de la invención son "multivalentes", es decir, que comprenden dos o más componentes básicos o ISV, de los que al menos el primer componente básico, ISV o Nanobody y el segundo componente básico, ISV o Nanobody son diferentes, y están dirigidos contra diferentes dianas, tales como antígenos o determinantes antigénicos. Los polipéptidos de la invención que contienen al menos dos ISV o Nanobodies como se define por las reivindicaciones, en que al menos un ISV o Nanobody está dirigido contra el dominio constante de un TCR y al menos un ISV o Nanobody está dirigido contra un segundo antígeno (es decir, contra la segunda diana que es diferente de la primera diana, tal como, por ejemplo, un TAA, tal como CD20 o HER2), también se denominarán polipéptidos "multiespecíficos" de la invención, y los ISV o Nanobodies presentes en dichos polipéptidos también se denominarán en este documento en un "formato multivalente" o "formato multiespecífico". Por tanto, por ejemplo, un polipéptido "biespecífico" de la invención es un polipéptido que comprende al menos un ISV o Nanobody dirigido contra TCR y al menos un ISV o Nanobody adicional dirigido contra una segunda diana (es decir, dirigido contra una segunda diana diferente de dicha primera diana, tal como, por ejemplo, un TAA, por ejemplo, CD20 o HER2), mientras que un polipéptido "triespecífico" de la invención es un polipéptido que comprende al menos un ISV o Nanobody dirigido contra TCR, un segundo ISV o Nanobody dirigido contra una segunda diana diferente de dicha primera diana (por ejemplo, un TAA, por ejemplo, CD20 o HER2) y al menos un componente básico, ISV o Nanobody adicional dirigido contra un tercer antígeno (es decir, diferente tanto de la primera como de la segunda diana, tal como otro TAA); etc. Como estará claro por la descripción, la invención no se limita a polipéptidos biespecíficos, en el sentido de que un polipéptido multiespecífico de la invención puede comprender al menos un primer ISV o Nanobody contra el dominio constante del TCR, un segundo ISV o Nanobody contra una segunda diana y cualquier número de componentes básicos, ISV o Nanobodies dirigidos contra una o más dianas, que pueden ser iguales o diferentes de la primera y/o segunda diana, respectivamente. Los componentes básicos, ISV o Nanobodies se pueden ligar opcionalmente mediante secuencias conectoras.
Las expresiones polipéptido biespecífico, formato biespecífico, construcción biespecífica, construcción de Nanobody biespecífico, biespecífico y anticuerpo biespecífico se usan indistintamente en este documento.
Como estará claro por la descripción adicional anterior y en este documento, los dominios variables individuales de inmunoglobulina usados en la invención pueden usarse como "componentes básicos" para formar polipéptidos de la invención, por ejemplo, combinándolos adecuadamente con otros grupos, residuos, restos o unidades de unión, para formar compuestos o construcciones como se describen en este documento (tales como, sin limitaciones, los polipéptidos bi-/tri-/tetra-/multivalentes y bi-/tri-/tetra-/multiespecíficos de la invención descritos en este documento) que combinan dentro de una molécula una o más propiedades o funciones biológicas deseadas.
Se apreciará (como también se demuestra en la sección de ejemplos) que el ISV que se une a TCR y el ISV que se une al antígeno en una célula diana pueden colocarse en cualquier orden en el polipéptido de la invención. Más particularmente, en una realización, el ISV que se une a TCR se coloca hacia el extremo N y el ISV que se une al antígeno en una célula diana se coloca hacia el extremo C. En otra realización, el ISV que se une al antígeno en una célula diana se coloca hacia el extremo N y el ISV que se une a TCR se coloca hacia el extremo C.
En un aspecto preferido, el polipéptido de la invención comprende al menos un primer, al menos un segundo y al menos un tercer dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), en donde dicho al menos un primer ISV tiene una alta afinidad por/se une al dominio constante del receptor de linfocitos T (TCR); dicho al menos un segundo ISV tiene una alta afinidad por/se une a un primer antígeno en una célula diana, y dicho al menos un tercer ISV tiene una alta afinidad por/se une a un segundo antígeno en una célula diana, en donde dicho segundo antígeno es diferente de dicho primer antígeno. Dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno pueden estar en la misma célula diana o en diferentes.
Se apreciará (como también se demuestra en la sección de ejemplos) que el ISV que se une a TCR y los ISV que se unen al primer y segundo antígeno en una célula diana pueden colocarse en cualquier orden en el polipéptido de la invención. Más particularmente, en una realización, el ISV que se une a TCR se coloca en hacia el extremo N, el ISV que se une al primer antígeno en una célula diana se coloca de forma central y el ISV que se une al segundo antígeno en una célula diana se coloca hacia el extremo C. En otra realización, el ISV que se une a TCR se coloca hacia el extremo N, el ISV que se une al segundo antígeno en una célula diana se coloca de forma central y el ISV que se une al primer antígeno en una célula diana se coloca hacia el extremo C. En otra realización, el ISV que se une al primer antígeno en una célula diana se coloca hacia el extremo N, el ISV que se une al segundo antígeno en una célula diana se coloca de forma central y el ISV que se une a TCR se coloca hacia el extremo C. En otra realización, el ISV que se une al primer antígeno en una célula diana se coloca hacia el extremo N, el ISV que se une a TCR se coloca de forma central y el ISV que se une al segundo antígeno en una célula diana se coloca hacia el extremo C. En otra realización, el ISV que se une al segundo antígeno en una célula diana se coloca hacia el extremo N, el ISV que se une a TCR se coloca de forma central y el ISV que se une al primer antígeno en una célula diana se coloca hacia el extremo C. En otra realización, el ISV que se une al segundo antígeno en una célula diana se coloca hacia el extremo N, el ISV que se une al primer antígeno en una célula diana se coloca de forma central y el ISV que se une a TCR se coloca hacia el extremo C.
La invención se refiere además a polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más ISV o polipéptidos de la invención y, opcionalmente, comprenden además uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión diferentes. Como se quedará claro para los expertos en la materia a partir de la divulgación adicional en este documento, dichos grupos, residuos, restos, unidades de unión o secuencias de aminoácidos adicionales pueden proporcionar o no funcionalidad adicional al polipéptido de la invención (y/o al compuesto o construcción en que están presente) y pueden modificar o no las propiedades del polipéptido de la invención.
Los polipéptidos de la invención pueden prepararse en general mediante un método que comprende al menos una etapa de ligar adecuadamente los dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina usados en la invención al uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión adicionales, opcionalmente mediante uno o más conectores adecuados, para proporcionar el compuesto, construcción o polipéptido de la invención. Los polipéptidos de la invención también pueden prepararse mediante un método que comprende en general al menos las etapas de proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, expresar dicho ácido nucleico de una manera adecuada y recuperar el polipéptido expresado de la invención. Dichos métodos pueden realizarse de una manera conocidaper se,que estará clara para los expertos en la materia, por ejemplo, en función de los métodos y técnicas descritos adicionalmente en este documento.
El proceso de diseño/selección y/o preparación de un polipéptido de la invención, a partir de una secuencia de aminoácidos usada en la invención, también se denomina en este documento"dar formatoa" dicha secuencia de aminoácidos de la invención; y se dice que un aminoácido usado en la invención que forma parte de un polipéptido de la invención está"en formato de”o está”en el formato de”dicho polipéptido de la invención. Ejemplos de maneras en que a una secuencia de aminoácidos usada en la invención se le puede dar formato y ejemplos de dichos formatos estarán claros para los expertos en la materia en función de la divulgación de este documento; y dichos polipéptidos en formato de la invención forman un aspecto adicional de la invención.
Por ejemplo, dichos grupos, residuos, restos o unidades de unión adicionales pueden ser uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina adicionales, de modo que el compuesto o construcción sea una proteína (de fusión) o polipéptido (de fusión). En un aspecto preferido, pero no limitante, dicho uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión diferentes son secuencias de inmunoglobulina. Aún más preferiblemente, dichos uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión diferentes se eligen del grupo que consiste en anticuerpos de dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para uso como anticuerpo de dominio, anticuerpos de un solo dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina (ISV) que son adecuados para su uso como anticuerpo de un solo dominio, "dAb", dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para su uso como dAb o Nanobodies. Como alternativa, dichos grupos, residuos, restos o unidades de unión pueden ser, por ejemplo, grupos químicos, residuos, restos, que pueden o ser no por sí mismos biológicamente y/o farmacológicamente activos. Por ejemplo, y sin limitación, dichos grupos pueden ligarse a polipéptidos de la invención para proporcionar un "derivado" de un polipéptido de la invención, como se describe adicionalmente en este documento.
También dentro del alcance de la presente invención están compuestos o construcciones, que comprenden o consisten esencialmente en uno o más derivados como se describe en este documento, y opcionalmente comprenden además uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión diferentes, opcionalmente ligados mediante uno o más conectores. Preferiblemente, dicho uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión diferentes son dominios variables individuales de inmunoglobulina. En los compuestos o construcciones descritos anteriormente, los dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina usados en la invención y el uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión pueden estar ligados directamente entre sí y/o mediante uno o más conectores o espaciadores adecuados. Por ejemplo, cuando el uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión son dominios variables individuales de inmunoglobulina, los conectores también pueden ser dominios variables individuales de inmunoglobulina, de modo que el compuesto o construcción resultante sea una proteína de fusión o polipéptido de fusión.
Los polipéptidos de la invención comprenden al menos dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina como se define por las reivindicaciones. En algunas realizaciones, los polipéptidos consisten esencialmente en dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina como se define por las reivindicaciones. Un polipéptido que "consiste esencialmente en" dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina, es un polipéptido que, además de los dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina divulgados en este documento, no tiene dominios variables individuales de inmunoglobulina adicionales. Por ejemplo, un polipéptido que consiste esencialmente en dos dominios variables individuales de inmunoglobulina no incluye ningún dominio variable individual de inmunoglobulina adicional. Sin embargo, debe apreciarse que un polipéptido que consiste esencialmente en dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina puede incluir funcionalidades adicionales, tal como un marcador, una toxina, uno o más conectores, una secuencia de unión, etc. Estas funcionalidades adicionales incluyen grupos tanto basados en aminoácidos como no basados en aminoácidos. En algunas realizaciones, los polipéptidos consisten en dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina como se define por las reivindicaciones. Debe apreciarse que las expresiones "construcción de polipéptido" y "polipéptido" pueden usarse indistintamente en este documento (salvo que el contexto indique claramente otra cosa).
En algunas realizaciones, los polipéptidos incluyen construcciones multivalentes o multiespecíficas que comprenden dominios variables individuales de inmunoglobulina como se define por las reivindicaciones. En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden armazones basados en anticuerpo y armazones no basados en anticuerpo. En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden un resto proteínico de unión a suero. En algunas realizaciones, el resto proteínico de unión a suero es un dominio variable individual de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el dominio variable individual de inmunoglobulina es un Nanobody.
Se apreciará que el orden de los componentes básicos, tal como, por ejemplo, un primer componente básico, un segundo componente básico, un tercer componente básico, etc., en el polipéptido (orientación) se puede elegir de acuerdo con las necesidades del experto en la materia, así como las afinidades relativas que pueden depender de la ubicación de estos componentes básicos en el polipéptido. Que el polipéptido comprenda un conector, es una cuestión de elección de diseño. Sin embargo, algunas orientaciones, con o sin conectores, pueden proporcionar características de unión preferidas en comparación con otras orientaciones. Por ejemplo, el orden de un primer y un segundo ISV en el polipéptido de la invención puede ser (del extremo N al extremo C): (i) primer ISV (por ejemplo, un primer Nanobody) - [conector] - segundo ISV (por ejemplo, un segundo Nanobody); o (ii) segundo ISV (por ejemplo, un segundo Nanobody) - [conector] - primer ISV (por ejemplo, un primer Nanobody); (en donde el conector es opcional). Todas las orientaciones están incluidas por la invención. Los polipéptidos que contienen una orientación de componentes básicos que proporciona características (de unión) deseadas se pueden identificar fácilmente mediante cribado rutinario, por ejemplo, como se ejemplifica en la sección experimental.
El primer dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV) del polipéptido de la invención tiene una alta afinidad por/se une al dominio constante del receptor de linfocitos T (TCR) presente en un linfocito T.
Una célula efectora es una célula que comprende un complejo TCR, preferiblemente un inmunocito, tal como un linfocito T, preferiblemente un linfocito T auxiliar CD4+ (también conocido como linfocito CD4, linfocitos T auxiliar o linfocito T4), más preferiblemente un linfocito T citotóxico (también conocido como linfocito T<c>, linfocito T CTL o CD8+), linfocitos T citolíticos naturales (linfocitos NKT). En algunas realizaciones, la célula está presentein vivo.
En algunas realizaciones, la célula está presentein vitro.La célula efectora usada en la invención se refiere en particular a células de mamífero, preferiblemente a células de primate, e incluso más preferiblemente a células humanas.
Como se usa en este documento, las expresiones "complejo TCR" o "complejo ap TCR-CD3" se refieren al complejo del receptor de linfocitos T presentado en la superficie de linfocitos T (véase Kuhnset al.2006, Immunity 24:133-139). El complejo TCR está compuesto por seis diferentes proteínas transmembranarias de un solo dominio de tipo I: las cadenas TCRa y TCRp que forman el heterodímero TCR responsable del reconocimiento de ligando, y las cadenas CD3<y>, CD35, CD3s y Z asociadas no covalentemente, que portan motivos de secuencia citoplasmática que se fosforilan tras la activación del receptor y reclutan un gran número de componentes de señalización. Tanto las cadenas a como p del receptor de linfocitos T consisten en un dominio constante y un dominio variable. Las secuencias para CD3 humana y los dominios constantes de TCRa/p humanos se proporcionan en la tabla A-6 (SEQ iD NO: 344-349; véase los identificadores de UniProtKB: CD3 delta: P04234, CD3 gamma: P09693, CD3 épsilon: P07766, CD3 zeta: P20963, TCR alfa: P01848 y TCR beta: relacionado con P01850).
En una realización, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV se une al dominio constante del receptor de linfocitos T a (TCR-a) (SEQ ID NO: 348) y/o el dominio constante del receptor de linfocitos T p (TCR-p) (SEQ ID NO: 349) o variantes polimórficas o isoformas del mismo.
Como alternativa, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV se une al dominio constante de un receptor de linfocitos T a (TCR-a) (SEQ ID NO: 484) y/o el dominio constante del receptor de linfocitos T p (TCR-p) (SEQ ID NO: 485) o variantes polimórficas o isoformas del mismo.
Las isoformas son secuencias proteínicas alternativas que pueden generarse a partir del mismo gen mediante un solo acontecimiento biológico o mediante la combinación de acontecimientos biológicos, tales como el uso de promotores alternativos, empalme alternativo, inicio alternativo y desplazamiento del marco ribosómico, todo como se conoce en la técnica
La "activación de linfocitos T", como se usa en este documento, se refiere a una o más respuestas celulares de un linfocito T, por ejemplo, un linfocito T citotóxico, tal como seleccionas de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica, expresión de marcadores de activación y lisis redirigida de células diana. Los polipéptidos de la invención pueden inducir la activación de linfocitos T. Ensayos adecuados para medir la activación de linfocitos T son conocidos en la técnica descrita en este documento, por ejemplo, como se describe en el documento WO 99/54440 o por Schlerethet al.2005 (Cancer Immunol. Immunother. 20: 1-12), o como se ejemplifica en los ejemplos o a continuación.
En una realización, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho polipéptido induce la activación de linfocitos T. Preferiblemente, el polipéptido de la invención induce la activación de linfocitos T solo cuando dicho segundo ISV y/o ISV adicional se une a un antígeno en una célula diana.
En una realización, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha activación de linfocitos T depende de presentar dicho polipéptido unido a dicho primer antígeno en una célula diana a un linfocito T.
La activación de linfocitos T por los polipéptidos de la invención puede supervisarse mediante la regulación por aumento de CD69, CD25 y diversas moléculas de adhesión celular, expresiónde novoy/o liberación de citocinas (por ejemplo, IFN-y, TNF-a, IL-6, IL-2, IL-4 e IL-10), regulación por aumento de la expresión de granzima y perforina, y/o proliferación celular, vesiculación de la membrana, activación de procaspasas 3 y/o 7, fragmentación del ADN nuclear y/o escisión de poli (ADPribosa) polimerasa del sustrato caspasa. Preferiblemente, la lisis redirigida de células diana por polipéptidos multiespecíficos es independiente de la especificidad del receptor de linfocitos T, la presencia de MHC de clase I y/o microglobulina p2, y/o de cualquier estímulo coestimulador.
En una realización, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha activación de linfocitos T es independiente del reconocimiento de MHC.
Los polipéptidos de la invención muestran lisis redirigidain vitrocon linfocitos T policlonales periféricos CD8+ y CD4+ positivos no estimulados previamente. La lisis redirigida de células diana mediante el reclutamiento de linfocitos T por los polipéptidos de la invención implica la formación de sinapsis citolítica y el suministro de perforina y granzimas. Se ha descrito la lisis celular por linfocitos T, por ejemplo, por Atkinson y Bleackley 1995 (Crit. Rev. Immunol 15(3-4):359-384). Preferiblemente, los linfocitos T acoplados tienen capacidad de lisis de células diana en serie, y no se ven afectados por mecanismos de evasión inmunitaria que interfieran con el procesamiento o presentación de antígenos peptídicos, o diferenciación de linfocitos T clonales (véase, por ejemplo, el documento WO 2007/042261). Se observa lisis redirigidain vitroa concentraciones picomolares bajas, lo que sugiere que tienen que unirse cantidades muy bajas de polipéptidos de la invención a células diana para activar los linfocitos T. Como se demuestra en los ejemplos, la baja relación de efector a diana podría ser indicativa de lisis de células diana en serie. Por consiguiente, la presente invención se refiere a polipéptidos potentes. Preferiblemente, el polipéptido de la invención media la destrucción de células diana, por ejemplo, células cancerosas, tal como estimulando linfocitos T en la formación de poros y suministrando componentes proapoptóticos de gránulos de linfocitos T citotóxicos.
En una realización, la presente invención se refiere un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha activación de linfocitos T provoca una o más respuestas celulares de dichos linfocitos T, en donde dicha respuesta celular se selecciona del grupo que consiste en proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica, expresión de marcadores de activación y lisis redirigida de células diana.
Como se usa en este documento, el término "potencia" es una medida de la actividad biológica de un agente, tal como un polipéptido, ISV o Nanobody. La potencia de un agente puede determinarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, como se describe en la sección experimental. Los ensayos de potencia basados en cultivo celular son a menudo el formato preferido para determinar la actividad biológica, ya que miden la respuesta fisiológica provocada por el agente y pueden generar resultados en un periodo de tiempo relativamente corto. Pueden usarse diversos tipos de ensayos basados en células, basados en el mecanismo de acción del producto, que incluyen, aunque sin limitación, ensayos de proliferación, ensayos de citotoxicidad, ensayos de destrucción celular, ensayos de genes indicadores, ensayos de unión al receptor de superficie celular, y ensayos para medir la inducción/inhibición de proteínas funcionalmente esenciales u otras moléculas de señal (tales como proteínas fosforiladas, enzimas, citocinas, AMPc y similares), el modelo de reducción de linfocitos B de Ramos, ensayo de destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T (por ejemplo, como se expone en la sección de ejemplos), todos bien conocidos en la técnica Los resultados de los ensayos de potencia basados en células pueden expresarse como "potencia relativa", determinada mediante la comparación del polipéptido multiespecífico de la invención con la respuesta obtenida para el ISV monovalente de referencia correspondiente, por ejemplo, un polipéptido que comprende solo un ISV o un Nanobody, que comprende opcionalmente además un Nanobody irrelevante (véase la sección experimental).
En una realización, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha activación de linfocitos T provoca la inhibición de una actividad de dicha célula diana, tal como retardar o minimizar la propagación de la célula diana, inhibir o retardar el crecimiento y/o la proliferación de la célula diana, y/o destruir la célula diana (por ejemplo, provocar la regresión del trastorno y/o los síntomas) en más de aproximadamente un 10 %, tal como un 20 %, un 30 % o un 40 % o incluso más de un 50 %, tal como más de un 60 %, tal como un 70 %, un 80 %, o incluso más de un 90 %, tal como un 100 %.
El primer ISV, Nanobody o VHH usado en la invención tiene una alta afinidad por el dominio constante de TCR. El primer ISV o Nanobody de la invención puede estar dirigido, por ejemplo, contra un determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformación (cuando proceda) de dicha primera diana. El primer ISV, Nanobody o VHH, se elige preferiblemente por su alta afinidad por su dianaper se,sin tener en cuenta la influencia de cualquier efecto de avidez.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV se une al dominio constante del receptor de linfocitos T (TCR) con un valor promedio de KD entre 100 nM y 10 pM, tal como a un valor promedio de KD de 90 nM o menos, incluso más preferiblemente a un valor promedio de KD de 80 nM o menos, tal como menos de 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM o incluso menos, tal como menos de 4, 3, 2 o 1 nM, tal como menos de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 pM, o incluso menos, como menos de 10 pM. Preferiblemente, la KD se determina por KinExA, BLI o SPR, por ejemplo, como se determina por Proteon. Por ejemplo, dicha KD se determina como se expone en la sección de ejemplos.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV tiene una alta afinidad cuando se mide como monovalente. Preferiblemente, dicha KD promedio se mide por resonancia de plasmones superficiales (SPR) en proteína recombinante.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho polipéptido tiene una constante de disociación (K<d>) para (o para la unión a) dicho TCR seleccionada del grupo que consiste en: como mucho aproximadamente 10-5 M, como mucho aproximadamente 10-6 M, como mucho aproximadamente 10-7 M, como mucho aproximadamente 10-8 M, como mucho aproximadamente 10-9 M, como mucho aproximadamente 10-10 M, como mucho aproximadamente 10-11 M y como mucho aproximadamente 10-12 M, preferiblemente medida por resonancia de plasmones superficiales.
La presente invención también se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV se une a dicho TCR con un valor de CE50 entre 100 nM y 1 pM, tal como a un valor promedio de CE50 de 100 nM o menos, incluso más preferiblemente a un valor promedio de CE50 de 90 nM o menos, tal como menos de 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM o incluso menos, tales como menos de 4, 3, 2 o 1 nM o incluso menos, tal como menos de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 pM, o incluso menos, tal como menos de 4 pM.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha KD promedio se determina por FACS, Biacore, ELISA, en un primer ISV monovalente, tal como un Nanobody, o un polipéptido que comprende un primer ISV monovalente, tal como un Nanobody, por ejemplo, dicha CE50 se determina como se expone en la sección de ejemplos.
En los ejemplos se ha demostrado que la KD se correlaciona bien con la CE50.
En una realización, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho polipéptido tiene una constante de tasa de asociación (Kon) para (o para la unión a) dicho TCR seleccionada del grupo que consiste en al menos aproximadamente 102 M-1s-1, al menos aproximadamente 103 M-1s-1, al menos aproximadamente 104 M-1s-1, al menos aproximadamente 105 M-1s-1, al menos aproximadamente 106 M-1s-1, 107 M-1s-1, al menos aproximadamente 108 M-1s-1, al menos aproximadamente 109 M-1s-1 y al menos aproximadamente 1010 M-1s-1, preferiblemente medida por resonancia de plasmones superficiales o como se realiza en la sección de ejemplos.
En una realización, la presente invención proporciona un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho polipéptido tiene una constante de tasa de disociación (Koff) para (o para la unión a) dicho TCR seleccionada del grupo que consiste en como mucho aproximadamente 10-3 s-1, como mucho aproximadamente 10-4 s-1, como mucho aproximadamente 10-5 s-1, como mucho aproximadamente 10-6 s-1, como mucho aproximadamente 10-7 s-1, como mucho aproximadamente 10-8 s-1, como mucho aproximadamente 10-9 s-1 y como mucho aproximadamente 10-10 s-1 preferiblemente medida por resonancia de plasmones superficiales o como se realiza en la sección de ejemplos.
Se contemplan modificaciones de la secuencia de aminoácidos de las moléculas de unión, ISV o polipéptidos descritos en este documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo o ISV. Las variantes de secuencia de aminoácidos de las moléculas de unión, ISV o polipéptidos se preparan introduciendo cambios nucleotídicos apropiados en el ácido nucleico de las moléculas de unión, ISV o polipéptidos, o por síntesis peptídica.
Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de las moléculas de unión, ISV o polipéptidos. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos postraduccionales de las moléculas de unión, tal como cambiar el número o posición de los sitios de glucosilación. Preferiblemente, 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 aminoácidos pueden sustituirse en una CDR, mientras que 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos pueden sustituirse en las regiones flanqueantes (FR), con la condición de que (i) CDR1 del el primer ISV solo pueda tener diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; y/o (ii) CDR2 del primer ISV solo pueda tener diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; y/o (iii) CDR3 del primer ISV solo pueda tener diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170. Las sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas como se describe en este documento. Adicionalmente o como alternativa, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos pueden insertarse o eliminarse en cada una de las CDR (por supuesto, dependiendo de su longitud), mientras que 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos pueden insertarse o eliminarse en cada una de las FR, con la condición de que (i) CDR1 del primer ISV solo pueda tener diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; y/o (ii) CDR2 del primer ISV solo pueda tener diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153 y/o (iii) CDR3 del primer ISV solo pueda tener diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
Un método útil para la identificación de determinados residuos o regiones de las moléculas de unión, ISV o polipéptidos, que son ubicaciones preferidas para mutagénesis se denomina "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells 1989 (Science 244: 1081 -1085). Aquí, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) dentro de la molécula de unión se identifica y remplaza por un aminoácido neutro o cargado negativamente (mucho más preferiblemente alanina o polialanina) para influir en la interacción de los aminoácidos con el epítopo. Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo variantes adicionales u otras en, o por, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para introducir una secuencia de aminoácidos está predeterminada, la naturaleza de la mutaciónper seno tiene que predeterminarse. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se realiza mutagénesis por barrido de ala o aleatoria en un codón o región diana y las variantes expresadas de la molécula de unión se criban para la actividad deseada.
Preferiblemente, las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxiterminales que varían en longitud de 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 residuos a polipéptidos que contienen cien o más residuos.
Otro tipo de variante es una variante de sustitución aminoacídica. Estas variantes tienen preferiblemente al menos 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 residuos aminoacídicos en la molécula de unión, ISV o polipéptido remplazados por un residuo diferente, con la condición de que (i) CDR1 del primer ISV solo pueda tener una diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; y/o CDR2 del primer ISV solo pueda tener diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; y/o (iii) CDR3 del primer ISV solo pueda tener diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las CDR, en particular las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Por ejemplo, si una secuencia de CDR abarca 6 aminoácidos, se prevé que se sustituya uno, dos o tres de estos aminoácidos. Del mismo modo, si una secuencia de CDR abarca 15 aminoácidos, se prevé que uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de estos aminoácidos se sustituyan.
En general, si los aminoácidos se sustituyen en una o más o en todas las CDR, se prefiere que la secuencia "sustituida" así obtenida sea al menos un 60 %, más preferiblemente un 65 %, incluso más preferiblemente un 70 %, particularmente preferiblemente un 75 %, más particularmente preferiblemente un 80 % o incluso más de un 90 % idéntica a la secuencia de CDR "original", con la condición de que (i) CDR1 del primer ISV solo pueda tener diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; y/o (ii) CDR2 del primer ISV solo pueda tener diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; y/o (iii) CDR3 del primer ISV solo pueda tener diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170. Esto significa que depende de la longitud de la CDR el grado al que sea idéntica a la secuencia "sustituida". Por ejemplo, una CDR que tiene 5 aminoácidos es preferiblemente un 80 % idéntica a su secuencia sustituida para que tenga al menos un aminoácido sustituido. Por consiguiente, las CDR de la molécula de unión pueden tener diferentes grados de identidad con sus secuencias sustituidas, por ejemplo, CDR1 puede tener un 80 %, mientras que CDR3 puede tener un 90 %.
Las sustituciones (o remplazos) preferidas son sustituciones conservativas. Sin embargo, cualquier sustitución (incluyendo la sustitución no conservativa o una o más de las "sustituciones ejemplares" enumeradas en la tabla B-1 a continuación) se contempla siempre que el polipéptido conserve su capacidad de unirse al dominio constante del receptor de linfocitos T (TCR) presente en un linfocito T mediante el primer ISV y a un primer antígeno en una célula diana mediante el segundo ISV y/o sus CDR tengan una identidad con la secuencia así sustituida (al menos un 60 %, más preferiblemente un 65 %, incluso más preferiblemente un 70 %, particularmente preferiblemente un 75 %, más particularmente preferiblemente un 80 % idéntica a la secuencia de CDR "original").
Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla B-1 a continuación.
Como se indica anteriormente, solo después de métodos de inmunización cribado y selección rigurosos, los autores de la presente invención pudieron identificar ISV que se unen a los dominios constantes de TCR. Por consiguiente, la presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden un primer ISV elegido del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-118 (véase la tabla A-4). El análisis de secuencia demostró además que todos los ISV que se unen al TCR comprenden una CDR3 muy similar. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido de acuerdo con la invención en el que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que CDR3 tiene la secuencia de aminoácidos X<1>SR X<2>X<3>PYX<4>Y, en que X<1>es F, Y, G, L o K, X<2>es I o L, X<3>es Y o W, y X<4>es D, N o S.
El análisis de secuencias reveló además que solo hay un número limitado de variaciones de secuencia en las CDR (véase el ejemplo 4.2 y las tablas A-1 a A-3).
Tabla B-1: Sustituciones de aminoácidos
Por consiguiente, en el polipéptido de la invención, dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que:
(i) CDR1 se elige del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 119-123, 125-127, 129, 132 y 133; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; y/o
(ii) CDR2 se elige del grupo que consiste en:
(c) SEQ ID NO: 134-141, 143-144, 146-156, 159-163; y
(d) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; y/o
(iii) CDR3 se elige del grupo que consiste en:
(e) SEQ ID NO: 164-166, 169-171, 173-174; y
(f) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
En la tabla A-4 se representan otras secuencias de CDR preferidas.
En general, se prefieren las combinaciones de CDR enumeradas en la tabla A-4 (es decir, las mencionadas en la misma línea de la tabla A-4). Por tanto, en general se prefiere que, cuando una CDR en un ISV es una secuencia de CDR mencionada en la tabla A-4 o se elige adecuadamente del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 4, 3, 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con una secuencia de CDR enumerada en la tabla A-4, al menos una y preferiblemente ambas de las otras CDR se elijan adecuadamente de las secuencias de CDR que pertenecen a la misma combinación en la tabla A-4 (es decir, mencionadas en la misma línea en la tabla A-4) o se elijan adecuadamente del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 4, 3, 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia o secuencias de CDR que pertenecen a la misma combinación.
El análisis de secuencia de los ligandos resultantes provocó además la identificación de 3 grupos distintos. Se proporcionan alineaciones correspondientes (véase la tabla A-1, tabla A-2 y tabla A-3). La agrupación se basó en similitudes y diferencias de secuencia en CDR2 y CDR3. El grupo A es el más prominente, comprendiendo 104 clones (SEQ ID NO: 1-104), el grupo B comprende 11 clones (SEQ ID NO: 105-115) y el grupos C está representado únicamente por 3 clones (SEQ ID NO: 116-118). La agrupación basada en las similitudes y diferencias estructurales en la secuencia de aminoácidos se tradujo en similitudes y diferencias funcionales como se revela en los ejemplos. Los representantes de todos los grupos se aislaron en función de la alta afinidad de unión al dominio constante del TCR (ejemplos 3 y 4) y la activación de linfocitos T humanos (ejemplo 4.2). En general, los representantes del grupo A demostraron los mejores valores de CE50. Además, los representantes del grupo A tenían reactividad cruzada con el dominio constante de TCR de macaco (véase el ejemplo 18). Aunque los representantes del grupo C tuvieron valores de CE50 algo menos favorables que los representantes del grupo B, los representantes del grupo C tuvieron valores de CI50 más bajos en un ensayo de destrucción de Ramos mediada por linfocitos T basado en citometría de flujo (véase el ejemplo 10 ).
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que CDR1 se elige del grupo que consiste en
(a) SEQ ID NO: 123; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen 1,2, 3 o 4 diferencias de aminoácido con SEQ ID NO: 123, en donde
- en la posición 2, D se ha cambiado a A, S, E o G;
- en la posición 4, H se ha cambiado a Y;
- en la posición 5, K se ha cambiado a L;
- en la posición 6 , I se ha cambiado a L;
- en la posición 8 , F se ha cambiado a I o V; y/o
- en la posición 10, G se ha cambiado a S.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que CDR2 se elige del grupo que consiste en
(a) SEQ ID NO: 153; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen 1,2, 3 o 4 diferencias de aminoácido con SEQ ID NO: 153, en donde - en la posición 1, H se ha cambiado a T o R;
- en la posición 3, S se ha cambiado a T o A;
- en la posición 5, G se ha cambiado a S o A;
- en la posición 7, Q se ha cambiado a D, E, T, A o V;
- en la posición 8 , T se ha cambiado a A o V; y/o
- en la posición 9, D se ha cambiado a A, Q, N, V o S.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que CDR3 se elige del grupo que consiste en
(a) SEQ ID NO: 170; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen 1,2, 3 o 4 diferencias de aminoácido con SEQ ID NO: 170, en donde
- en la posición 1, F se ha cambiado a Y, L o G;
- en la posición 4, I se ha cambiado a L;
- en la posición 5, Y se ha cambiado a W; y/o
- en la posición 8 , D se ha cambiado a N o S.
En una realización, la invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en que dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que: CDR1 está representada por SEQ ID NO: 123, CDR2 está representada por SEQ ID NO: 153, y CDR3 está representada por<s>E<q>ID NO: 170.
El segundo dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV) del polipéptido de la invención tiene una alta afinidad por/se une a un antígeno en una célula diana, preferiblemente una célula cancerosa. Una "célula diana", como menciona en este documento, es una célula que presenta un antígeno particular en su superficie. En un aspecto preferido, la "célula diana" es una célula cancerosa.
La membrana (también llamada membrana plasmática o bicapa fosfolipídica) rodea el citoplasma de una célula, que es el límite exterior de la célula, es decir, la membrana es la superficie de la célula. Esta membrana sirve para separar y proteger una célula de su entorno circundante y está hecha principalmente de una doble capa de fosfolípidos. Incrustada dentro de esta membrana hay una diversidad de moléculas proteínicas, tales como canales, bombas y receptores celulares. Como la membrana es fluida, las moléculas proteínicas pueden viajar dentro de la membrana. La expresión "antígeno en una célula diana", como se usa en este documento, indica una molécula, que se presenta en la superficie de una célula. En la mayoría de los casos, esta molécula estará ubicada en o sobre la membrana plasmática de la célula de modo que al menos parte de esta molécula permanezca accesible desde fuera de la célula en forma terciaria. Un ejemplo no limitante de una molécula de superficie celular, que está ubicada en la membrana plasmática, es una proteína transmembranaria que comprende, en su conformación terciaria, regiones de hidrofilia e hidrofobia. Aquí, al menos una región hidrófoba permite que la molécula de superficie celular se incruste, o se inserte en la membrana plasmática hidrófoba de la célula, mientras que las regiones hidrófilas se extienden a ambos lados de la membrana plasmática en el citoplasma y el espacio extracelular, respectivamente.
Dicho antígeno puede ser cualquier diana en una célula, por ejemplo, un antígeno tumoral. En una realización preferida, dicho antígeno es específico para dicha célula diana, por ejemplo, célula cancerosa, tal como un antígeno asociado a tumor (TAA) en dicha célula cancerosa.
La expresión "antígeno tumoral", como se usa en este documento, puede entenderse como aquellos antígenos que se presentan en células tumorales. Estos antígenos se pueden presentar en la superficie celular con una parte extracelular, que a menudo se combina con una parte transmembranaria y citoplasmática de la molécula. A veces, estos antígenos pueden presentarse solo por células tumorales y nunca por una célula normal o sana. Los antígenos tumorales pueden expresarse exclusivamente en células tumorales o podrían representar una mutación específica de tumor en comparación con células normales. En este caso, se denominan antígenos específicos de tumor. Sin embargo, este no será el caso en general. Más comunes son los antígenos que se presentan por células tumorales y células normales, y se denominan "antígenos asociados a tumor (TAA)". Estos antígenos asociados a tumor pueden sobreexpresarse en células tumorales en comparación con células normales o son más accesibles para la unión a anticuerpos en células tumorales debido a la estructura menos compacta del tejido tumoral en comparación con el tejido normal. Los TAA son preferiblemente antígenos que se expresan en células de tumores particulares, pero que preferiblemente no se expresan en células normales. A menudo, los TAA son antígenos que normalmente se expresan en células solo en puntos particulares en el desarrollo de un organismo (tal como durante el desarrollo fetal) y que se están expresando inapropiadamente en el organismo en el presente punto de desarrollo, o son antígenos que no se expresan en tejidos o células normales de un órgano que ahora expresa el antígeno.
En una realización, dicho primer antígeno en una célula diana es un antígeno tumoral, preferiblemente un antígeno asociado a tumor (TAA).
En una realización, dicho segundo antígeno en una célula diana es un antígeno tumoral, preferiblemente un antígeno asociado a tumor (TAA).
En una realización, dicho antígeno está presente más abundantemente en una célula cancerosa que en una célula normal. El antígeno en una célula diana es preferiblemente un antígeno asociado a tumor (TAA). Los TAA preferidos incluyen MART-1, antígeno carcinoembrionario ("CEA"), gp100, MAGE-1, HER-2, CD20, antígenos de LewisY, proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína de activación de fibroblastos (FAP), CD19 y CD33.
Los antígenos de superficie celular que se expresan preferentemente en AML LSC en comparación con células madre hematopoyéticas normales y, por tanto, se prefieren como TAA, incluyen CD123, CD44, CLL-1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3 y CD25.
Otros antígenos asociados a tumor adecuados como antígeno en una célula diana para unirse por el segundo ISV dentro de los polipéptidos de la invención incluyen: TAG-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, glucolípidos tales como GD2 y GD3.
El TAA usado en la invención incluye también antígenos de diferenciación hematopoyéticos, es decir, glucoproteínas habitualmente asociadas con agrupaciones de grupos de diferenciación (CD), tales como CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD69 y CD147; receptores del factor de crecimiento, que incluyen HER2, ErbB3 y ErbB4; receptores de citocinas que incluyen cadena gamma del receptor de interleucina-2 (antígeno CD132), cadena alfa del receptor de interleucina-10 (IL-10R-A), cadena beta del receptor de interleucina-10 (IL-10R-B), cadena beta-1 del receptor de interleucina-12 (IL-12R-beta1), cadena beta-2 del receptor de interleucina-12 (receptor beta-2 de IL-12), cadena alfa-1 del receptor de interleucina-13 (IL-13R-alfa-1) (antígeno CD213a1), cadena alfa-2 del receptor de interleucina-13 (proteína de unión a interleucina-13), receptor de interleucina-17 (receptor de IL-17), receptor de interleucina-17B (receptor de IL-17B), precursor del receptor de interleucina 21 (IL-21R), receptor de interleucina-1 de tipo I (IL-1R-1) (CD121a), receptor de interleucina-1 de tipo II (IL-1 R-beta) (CDw121b), proteína antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1 ra), cadena alfa del receptor de interleucina-2 (antígeno CD25), cadena beta del receptor de interleucina-2 (antígeno CD122), cadena alfa del receptor de interleucina-3 (IL-3R-alfa) (antígeno CD123), así como otros, tales como CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R,<IgE, CD248 (endosialina), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2 ,>P<s>CA,<claudina 6 , claudina 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2 ,>c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nectina-4, SLITRK6 , mesotelina, receptor de folato, tromboplastina tisular, axl, glipicano-3, CA9, Cripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, receptor del péptido liberador de<gastrina, PAP, CEACAM5, CEACAM6 , CXCR7, N-cadherina, f>X<y>D2<gamma a, c>D21,<CD133, Na/K-ATPasa,>mlgM (IgM unida a membrana), mlgA (IgA unida a membrana), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6 , DcR3 y CAIX.
Por consiguientes, la presente invención se refiere un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho TAA se elige del grupo que consiste en proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína de activación de fibroblastos (FAP),<MART-1, antígeno carcinoembrionario ("CEA"), gp100, MAGE-1,>H<e>R-2,<antígenos de LewisY, CD123, CD44, CLL->1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3, CD25, TAG-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, GD2, GD3, CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD147; receptores del factor de crecimiento que incluyen ErbB3 y ErbB4; receptores de citocinas que incluyen cadena gamma del receptor de interleucina-2 (antígeno CD132), cadena alfa del receptor de interleucina-10 (IL-10R-A), cadena beta del receptor de interleucina-10 (IL-10R-B), cadena beta-1 del receptor de interleucina-12 (IL-12R-beta1), cadena beta-2 del receptor de interleucina-12 (receptor beta-2 de IL-12), cadena alfa-1 del receptor de interleucina-13 (IL-13R-alfa-1) (antígeno CD213a1), cadena alfa-2 del receptor de interleucina-13 (proteína de unión a interleucina-13), receptor de interleucina-17 (receptor de IL-17), receptor de interleucina-17B (receptor de IL-17B), precursor del receptor de interleucina 21 (IL-21R), receptor de interleucina-1 de tipo I (IL-1R-1) (CD121a), receptor de interleucina-1 de tipo II (IL-1R-beta) (CDw121b), proteína antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1 ra), cadena alfa del receptor de interleucina-2 (antígeno CD25), cadena beta del receptor de interleucina-2 (antígeno CD122), cadena alfa del receptor de interleucina-3 (IL-3R-alfa) (antígeno CD123), CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosialina), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, claudina 6 , claudina 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nectina-4, SLITRK6 , mesotelina, receptor de folato, tromboplastina tisular, axl, glipicano-3, CA9, Cripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, receptor del péptido liberador de gastrina, PAP, CEACAM5, CEACAM6 , CXCR7, N-cadherina, FXYD2 gamma a, CD21, CD133, Na/K-ATPasa, mlgM (IgM unida a membrana), mlgA (IgA unida a membrana), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6 , DcR3 y CAlX, y variantes polimórficas relacionadas e isoformas,<preferiblemente dicho>T<a>A<es CD20 (UniProt 11836), HER2 (UniProt P04626), EGFR o CEACAM, variantes>polimórficas y/o isoformas del mismo.
El segundo ISV, Nanobody o VHH usado en la invención tiene una alta afinidad por su antígeno. El segundo ISV o Nanobody usado en la invención puede estar dirigido, por ejemplo, contra un determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o conformación (cuando proceda) de dicho antígeno en una célula diana.
La célula diana usada en la invención se refiere en particular a células de mamífero, y preferiblemente a células de primate y aún más preferiblemente a células humanas. La célula diana es preferiblemente una célula hiperproliferativa tal como, por ejemplo, una célula cancerosa.
La presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho segundo ISV o adicional se une a un antígeno en una célula diana con un valor promedio de KD entre 100 nM y 10 pM, tal como a un valor promedio de KD de 90 nM o menos, incluso más preferiblemente a un valor promedio de KD de 80 nM o menos, tal como menos de 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM o incluso menos, tal como menos de 4, 3, 2 o 1 nM, tal como menos de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 pM, o incluso menos, tal como menos de 10 pM. Preferiblemente, la KD se determina por KinExA, BLI o SPR, por ejemplo, como se determina por Proteon.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho segundo ISV o adicional tiene una alta afinidad por su antígeno cuando se mide como monovalente.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha KD promedio se mide por resonancia de plasmones superficiales (SPR) y/o KinExA o Proteon, por ejemplo, en proteína recombinante, tal como se describe en la sección de ejemplos.
La presente invención también se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho segundo ISV o adicional se une a un antígeno en una célula diana con un valor de CE50 entre 100 nM y 1 pM, tal como a un valor promedio de CE50 de 100 nM o menos, incluso más preferiblemente a un valor promedio de CE50 de 90 nM o menos, tal como menos de 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM o incluso menos, tales como menos de 4, 3, 2 o 1 nM o incluso menos, tal como menos de 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 pM, o incluso menos, tal como menos de 4 pM.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicha CE50 promedio se determina por FACS, o ELISA, en un segundo ISV monovalente, tal como un Nanobody, o un polipéptido que comprende un segundo ISV monovalente, tal como un Nanobody.
En los ejemplos se ha demostrado que la KD se correlaciona bien con la CE50.
Abordar simultáneamente múltiples antígenos puede reducir la probabilidad de generar variantes de escape tumoral, por lo que se mejora la actividad terapéutica de la estrategia de acoplamiento de linfocitos T. La presente invención proporciona polipéptidos multiespecíficos como se define por las reivindicaciones, que comprenden un ISV contra TCR combinado con dominios variables individuales de inmunoglobulina contra diferentes antígenos (diana) (en una célula diana). A continuación se proporcionan combinaciones preferidas de primer y segundo antígeno (se apreciará que los ISV que unen dichos antígenos se pueden colocar en cualquier orden en el polipéptido de la invención):
Asimismo, abordar simultáneamente múltiples epítopos, determinantes antigénicos, partes, dominios, subunidades o conformaciones de una proteína o antígeno en una célula diana puede reducir la probabilidad de generar variantes de escape tumoral, por lo que se mejora la actividad terapéutica de la estrategia de acoplamiento de linfocitos T (véase el ejemplo 22). La presente invención proporciona polipéptidos como se definen por las reivindicaciones, que comprenden un ISV anti-TCR combinado con dominios variables individuales de inmunoglobulina contra diferentes epítopos, determinantes antigénicos, partes, dominios, subunidades o conformaciones de un antígeno en una célula diana (también denominados construcciones biparatópicas). A continuación se proporcionan combinaciones preferidas de primer y segundo ISV contra TAA (se apreciará que los ISV que unen dichos antígenos se pueden colocar en cualquier orden en el polipéptido de la invención):
Los polipéptidos y composiciones de la presente invención pueden ser para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y trastornos de la presente invención (en este documento también "enfermedades y trastornos de la presente invención") que incluyen, aunque sin limitación, cáncer. El término "cáncer" se refiere al estado patológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por proliferación o supervivencia celular desregulada. Ejemplos de cáncer incluyen, aunque sin limitación, carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas: cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervicouterino, glioblastoma, mieloma múltiple (incluyendo gammapatía monoclonal de alcance indeterminado, mieloma asintomático y sintomático), cáncer de próstata y linfoma de Burkitt, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer hepatobiliar, cáncer de vesícula biliar, cáncer de intestino delgado, cáncer rectal, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pene, cáncer de uretra, cáncer de testículo, cáncer de vagina, cáncer de útero, cáncer tiroideo, cáncer paratiroideo, cáncer suprarrenal, cáncer endocrino pancreático, cáncer carcinoide, cáncer de hueso, cáncer de piel, retinoblastomas, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castleman multicéntrica o linfoma de efusión primaria asociado al SIDA, tumores neuroectodérmicos, rabdomiosarcoma (véase, por ejemplo, Cancer, Principles and practice (DeVita,et al.eds 1997) para cánceres adicionales); así como cualquier metástasis de cualquiera de los cánceres anteriores, así como indicaciones no cancerosas, tales poliposis nasal, así como otros trastornos y enfermedades descritos en este documento.
Para una descripción general de los dominios variables individuales de inmunoglobulina, se hace referencia a la descripción adicional a continuación, así como a la técnica anterior citada en este documento. A este respecto, debe tenerse en cuenta, sin embargo, que esta descripción y la técnica anterior describen principalmente dominios variables individuales de inmunoglobulina de la denominada "clase V<h>3" (es decir, dominios variables individuales de inmunoglobulina con un alto grado de homología de secuencia con secuencias de la línea germinal humana de la clase V<h>3, tales como DP-47, DP-51 o DP-29). Sin embargo, cabe señalar que la invención en su sentido más amplio cubre en general cualquier tipo de dominio variables individual de inmunoglobulina y, por ejemplo, también cubre los dominios variables individuales de inmunoglobulina pertenecientes a la denominada "clase V<h>4" (es decir, dominios variables individuales de inmunoglobulina con un alto grado de homología de secuencia con secuencias de la línea germinal humana de la clase V<h>4, tales como DP-78), como se describe, por ejemplo, en el documento WO 07/118670.
En general, los dominios variables individuales de inmunoglobulina (en particular secuencias de V<h h>y dominios variables individuales de inmunoglobulina de secuencia optimizada) pueden caracterizarse en particular por la presencia de uno o más"residuos distintivos”(como se describe, por ejemplo, en la tabla B2) en una o más de las secuencias flanqueantes (de nuevo, como se describe adicionalmente en este documento).
Tabla B-2: Residuos distintivos en VHH
Las inmunoglobulinas usadas en la invención también pueden contener una extensión C terminal (X)n (en que n es de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5 (y preferiblemente 1 o 2, tal como 1); y cada X es un residuo aminoacídico (preferiblemente de origen natural) que se elige independientemente, y preferiblemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I)), para los que se hace referencia al documento WO 12/175741 y WO 15/060643.
De nuevo, dichos dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden obtenerse de cualquier manera adecuada y a partir de cualquier fuente adecuada, y pueden ser, por ejemplo, secuencias de V<h h>de origen natural (es decir, de una especie adecuada de camélido, por ejemplo, llama) o VH o VL sintéticos o semisintéticos (por ejemplo, de ser humano). Dichos dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden incluir VHH "humanizados" o "de secuencia optimizada" de otro modo, secuencias de inmunoglobulina "camelizadas" (y, en particular, secuencias de dominio variable de la cadena pesada camelizadas, es decir, VH camelizados), así como VH humanos, VL humanos, VHH de camélido que se han alterado por técnicas tales como maduración de afinidad (por ejemplo, partiendo de secuencias de inmunoglobulina sintéticas, aleatorias o de origen natural), injerto de CDR, revestimiento, combinación de fragmentos derivados de diferentes secuencias de inmunoglobulina, ensamblaje por PCR usando cebadores solapantes y técnicas similares para manipulación de secuencias de inmunoglobulina bien conocidas por los expertos en la materia; o cualquier combinación adecuada de cualquiera de las anteriores como se describe adicionalmente en este documento.
Como se menciona en este documento, una clase particularmente preferida de dominios variables individuales de inmunoglobulina usados en la invención comprende dominios variables individuales de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio V<h h>de origen natural, pero que se ha "humanizado", es decir, por remplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la secuencia de aminoácidos de dicha secuencia de V<h h>de origen natural (y, en particular, en las secuencias flanqueantes) por uno o más de los residuos aminoacídicos que se producen en la posición o posiciones correspondientes en un dominio V<h>de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano (por ejemplo, indicado anteriormente). Esto se puede realizar de una manera conocidaper se,que estará clara para los expertos en la materia, por ejemplo, en función de la descripción adicional en este documento y la técnica anterior sobre humanización mencionada en este documento. De nuevo, cabe señalar que dichos dominios variables individuales de inmunoglobulina humanizados usados en la invención se pueden obtener de cualquier manera adecuada conocidaper sey, por tanto, no se limitan estrictamente a polipéptidos que se han obtenido usando un polipéptido que comprende un dominio V<h h>de origen natural como material de partida.
Otra clase particularmente preferida de dominios variables individuales de inmunoglobulina usados en la invención comprende dominios variables individuales de inmunoglobulina con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio V<h>de origen natural, pero que se ha "camelizado", es decir, por remplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la secuencia de aminoácidos de un dominio V<h>de origen natural de un anticuerpo de 4 cadenas convencional por uno o más de los residuos aminoacídicos que se producen en la posición o posiciones correspondientes en un dominio V<h h>de un anticuerpo de cadena pesada. Esto se puede realizar de una manera conocidaper se,que estará clara para los expertos en la materia, por ejemplo, en función de la descripción en este documento. Dichas sustituciones de "camelizado" se insertan preferiblemente en posiciones aminoacídicas que se forman y/o están presentes en la superficie de contacto de VH-VL, y/o en los denominados residuos distintivos deCamelidaecomo se define en este documento (véase también, por ejemplo, el documento WO 94/04678 y Davies y Riechmann 1994 (FEBS letters 339: 285-290) y 1996 (Protein Engineering 9: 531-537)). Preferiblemente, la secuencia de V<h>que se usa como material de partida o punto de partida para generar o diseñar los dominios variables individuales de inmunoglobulina camelizados es preferiblemente una secuencia de V<h>de un mamífero, más preferiblemente la secuencia de V<h>de un ser humano, tal como una secuencia de V<h>3. Sin embargo, cabe señalar que dichos dominios variables individuales de inmunoglobulina camelizados usados en la invención se pueden obtener de cualquier manera adecuada conocidaper sey, por tanto, no se limitan estrictamente a polipéptidos que se han obtenido usando un polipéptido que comprende un dominio V<h>de origen natural como material de partida.
Por ejemplo, de nuevo como se describe adicionalmente en este documento, tanto la "humanización" como la "camelización" pueden realizarse proporcionando una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio V<h h>o dominio V<h>de origen natural, respectivamente, y luego cambiando, de una manera conocidaper se,uno o más codones en dicha secuencia de nucleótidos de tal manera que la nueva secuencia de nucleótidos codifique un dominio variable individual de inmunoglobulina "humanizado" o "camelizado" usado en la invención, respectivamente. Este ácido nucleico entonces puede expresarse de una manera conocidaper se,para proporcionar los dominios variables individuales de inmunoglobulina deseados usados en la invención. Como alternativa, en función de la secuencia de aminoácidos de un dominio V<h h>o dominio V<h>de origen natural, respectivamente, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables individuales de inmunoglobulina humanizados o camelizados deseados usados en la invención, respectivamente, puede diseñarse y luego sintetizarsede novousando técnicas para síntesis peptídica conocidasper se.Además, en función de la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de un dominio V<h h>o dominio V<h>de origen natural, respectivamente, una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios variables individuales de inmunoglobulina humanizados o camelizados deseados usados en la invención, respectivamente, puede diseñarse y luego sintetizarsede novousando técnicas para la síntesis de ácido nucleico conocidasper se,tras lo que el ácido nucleico obtenido de ese modo puede expresarse de una manera conocidaper se,para proporcionar los dominios variables individuales de inmunoglobulina deseados usados en la invención.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho ISV es un Nanobody, un V<h h>, un V<h h>humanizado o un V<h>camelizado.
En general, las proteínas o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en un solo componente básico, un solo dominio variable individual de inmunoglobulina o un solo Nanobody se denominarán en este documento proteínas o polipéptidos "monovalentes", "construcciones monovalentes", "componente básico monovalente", "dominio variable individual de inmunoglobulina monovalente" o "Nanobody monovalente", respectivamente.
El segundo ISV puede ser un polipéptido que se une específicamente al antígeno carcinoembrionario (CEA) y que comprende o consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que:
(i) CDR1 se elige del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 361 (GDTYGSYWMG); o
(b) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR1 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CEA con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR1 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales; y/o
(ii) CDR2 se elige del grupo que consiste en:
(c) SEQ ID NO: 363 (AINRGGGYTV); o
(d) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 363, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR2 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CEA con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR2 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales; y/o
(iii) CDR3 se elige del grupo que consiste en:
(e) SEQ ID NO: 365 (SGVLGGLHEDWFNY); o
(f) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 365, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR3 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CEA con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR3 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales.
En otro aspecto, el segundo ISV puede ser un polipéptido en que CDR1 está representada por SEQ ID NO: 361, CDR2 está representada por SEQ ID NO: 363, y CDR3 está representada por SEQ ID NO: 365. Polipéptido spreferidos incluyen SEQ ID NO: 353 y 354.
En un aspecto adicional, los segundos ISV pueden ser polipéptidos que bloquean de forma cruzada la unión a antígeno carcinoembrionario (CEA) por al menos uno de los ISV o polipéptidos con SEQ ID NO: 353 o 354.
En un aspecto adicional, los segundos ISV pueden ser polipéptidos que tiene bloqueada de forma cruzada la unión a antígeno carcinoembrionario (CEA) por al menos uno de los ISV o polipéptidos con SEQ ID NO: 353 o 354.
El segundo ISV puede ser un polipéptido que se une específicamente a CD20 y que comprende o consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que:
(i) CDR1 se elige del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 362 (GGTFSSYTMG); o
(b) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 362, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR1 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CD20 con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR1 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales;
y/o
(ii) CDR2 se elige del grupo que consiste en:
(c) SEQ ID NO: 364 (EVRWGGVTT); o
(d) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 364, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR2 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CD20 con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR2 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales;
y/o
(iii) CDR3 se elige del grupo que consiste en:
(e) SEQ ID NO: 366 (VRQMYMTVVPDY); o
(f) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 366, con la condición de que el polipéptido que comprende la CDR3 con diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) se una a CD20 con aproximadamente la misma afinidad o mayor en comparación con la unión por el polipéptido que comprende la CDR3 sin la diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), estando dicha afinidad medida por resonancia de plasmones superficiales.
En otro aspecto, el segundo ISV puede ser un polipéptido en que CDR1 está representada por SEQ ID NO: 362, CDR2 está representada por SEQ ID NO: 364, y CDR3 está representada por SEQ ID NO: 366. Un polipéptido preferido incluye SEQ ID N<o>: 357.
En un aspecto adicional, los segundos ISV pueden ser polipéptidos que bloquean de forma cruzada la unión a CD20 por el ISV o polipéptido con SEQ ID NO: 357.
En un aspecto adicional, los segundos ISV pueden ser polipéptidos que tienen bloqueada de forma cruzada la unión a CD20 por el ISV o polipéptido con<s>E<q>ID NO: 357.
La invención se refiere además a compuestos o construcciones y, en particular, a proteínas o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más ISV o polipéptidos de la invención y, opcionalmente, comprenden además uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión diferentes. Como se quedará claro para los expertos en la materia a partir de la divulgación adicional en este documento, dichos grupos, residuos, restos, unidades de unión o secuencias de aminoácidos adicionales pueden proporcionar o no funcionalidad adicional al polipéptido de la invención (y/o al compuesto o construcción en que están presente) y pueden modificar o no las propiedades del polipéptido de la invención.
En un aspecto específico, pero no limitante de la invención, que se describirá adicionalmente en este documento, los polipéptidos de la invención pueden tener una semivida aumentada en suero (como se describe adicionalmente en este documento) en comparación con el dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido del que se han obtenido. Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede estar ligado (químicamente o de otro modo) a uno o más grupos o restos que prolongan la semivida (tal como PEG), para proporcionar un derivado del polipéptido de la invención con una semivida aumentada.
En un aspecto específico de la invención, un polipéptido de la invención puede tener una semivida aumentada, en comparación con el polipéptido correspondiente de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de dichos polipéptidos quedarán claros para los expertos en la materia en función de la divulgación adicional en este documento y, por ejemplo, comprenderán polipéptidos de la invención que se han modificado químicamente para aumentar la semivida de los mismos (por ejemplo, mediante pegilación); polipéptidos de la invención que comprenden al menos un sitio de unión adicional para unirse a una proteína sérica (tal como seroalbúmina); o polipéptidos de la invención que comprenden al menos un ISV o polipéptido de la invención que está ligado a al menos un resto (y, en particular, al menos una secuencia de aminoácidos) que aumenta la semivida del polipéptido de la invención. Ejemplos de polipéptidos de la invención que comprenden dichos restos o dominios variables individuales de inmunoglobulina que prolongan la semivida quedarán claros para los expertos en la materia en función de la divulgación adicional en este documento; y, por ejemplo, incluyen, sin limitación, polipéptidos en que el uno o más polipéptidos de la invención están adecuadamente ligados a una o más proteínas séricas o fragmentos de las mismas (tales como seroalbúmina (humana) o fragmentos adecuados de la misma) o a una o más unidades de unión que pueden unirse a proteínas séricas (tales como, por ejemplo, anticuerpos de dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para su uso como anticuerpo de dominio, anticuerpos de un solo dominio, dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para su uso como anticuerpo de un solo dominio, "dAb", dominios variables individuales de inmunoglobulina que son adecuados para su uso como dAb, o Nanobodies que pueden unirse a proteínas séricas tales como seroalbúmina (tal como seroalbúmina humana), inmunoglobulinas séricas tales como IgG, o transferrina; se hace referencia a la descripción adicional y referencias mencionadas en este documento); ISV o polipéptidos en que un ISV o polipéptido de la invención está ligado a una parte Fc (tal como un Fc humano) o una parte o fragmento adecuado del mismo; o polipéptidos en que el uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina o polipéptidos de la invención están ligados adecuadamente a una o más proteínas pequeñas o péptidos que pueden unirse a proteínas séricas, tales como, sin limitación, las proteínas y péptidos descritos en los documentos WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489, WO 08/068280, WO 09/127691 y WO 11/095545.
En general, los polipéptidos de la invención con semivida aumentada preferiblemente tienen una semivida que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo, al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la semivida del ISV o polipéptido correspondiente de la invenciónper se.Por ejemplo, los polipéptidos de la invención con semivida aumentada pueden tener una semivida, por ejemplo, en seres humanos que está aumentada en más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con el ISV o polipéptido correspondiente de la invenciónper se.
En un aspecto preferido, pero no limitante de la invención, dichos polipéptidos de la invención tienen una semivida en suero, por ejemplo, en seres humanos, que está aumentada en más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con el polipéptido correspondiente de la invenciónper se.
En otro aspecto preferido, pero no limitante de la invención, dichos polipéptidos de la invención presentan una semivida en suero en seres humanos de al menos aproximadamente 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden tener una semivida de al menos 5 días (tal como aproximadamente 5 a 10 días), preferiblemente al menos 9 días (tal como aproximadamente 9 a 14 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 10 días (tal como aproximadamente 10 a 15 días), o al menos aproximadamente 11 días (tal como aproximadamente 11 a 16 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 12 días (tal como aproximadamente 12 a 18 días o más) o más de 14 días (tal como aproximadamente 14 a 19 días).
En la presente invención se demostró que la inclusión de una unidad de unión dirigida a albúmina en la construcción tal cual no tuvo un impacto esencial en la potencia o eficacia obtenida. Aunque se observó una pérdida menor de eficacia/potencia en presencia de HSA, los polipéptidos multiespecíficos de unión a TCR de semivida prolongada seguían siendo potentes en la destrucción de células tumorales. Se ha demostrado que la administración de fármacos basada en albúmina es útil para lograr un tratamiento mejorado contra el cáncer, en gran parte debido a su diana pasiva hacia el tumor mediante el efecto de permeabilidad y retención potenciado y la demanda aumentada de albúmina por las células tumorales como fuente de energía y aminoácidos. Sin embargo, la albúmina carece no solo del mecanismo activo para superar la barrera de la membrana celular, sino también de la capacidad de penetrar en tejidos tumorales (Qianqian Guoet al.2013 Polym. Chem., 4; 4584-4587).
En un aspecto particularmente preferido, pero no limitante de la invención, la invención proporciona un polipéptido de la invención que comprende un primer y un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV); y que comprende además uno o más (preferiblemente uno) dominios variables individuales de inmunoglobulina de unión a albúmina en suero como se describe en este documento, por ejemplo, el dominio variable individual de inmunoglobulina de unión a seroalbúmina denominado Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG (tabla B-3).
Tabla B-3: Dominios variables individuales de inmunoglobulina para su uso en HLE de los ISV y polipéptidos de la invención
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, que comprende además un resto de unión a proteína sérica.
La presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho resto de unión a proteína sérica se une a seroalbúmina.
La presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho resto de unión a proteína sérica es un dominio variable individual de inmunoglobulina que se une a seroalbúmina.
La presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho ISV que se une a seroalbúmina consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que CDR1 es SFGMS (SEQ ID NO: 481), CDR2 es SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 482), y en que CDR3 es GGSLSR (SEQ ID NO: 475), estando las CDR determinadas de acuerdo con la definición de Kabat; y/o en que CDR1 es GFTFSSFGMS (SEQ ID NO: 472) o GFTFRSFGMS (SEQ ID NO: 473), CDR2 es SISGSGSDTL (SEQ ID NO: 474) y CDR3 es GGSLSR (SEQ ID<n>O: 475), estando las CDR determinadas de acuerdo con Kontermann 2010.
La presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho ISV que se une a seroalbúmina comprende Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG (tabla B3).
En los polipéptidos de la invención, los dos o más componentes básicos, ISV o Nanobodies y el opcionalmente uno o más polipéptidos, uno o más grupos, fármacos, agentes, residuos, restos o unidades de unión diferentes pueden estar ligados directamente entre sí (como se describe, por ejemplo, en el documento WO 99/23221) y/o pueden estar ligados entre sí mediante uno o más espaciadores o conectores adecuados, o cualquier combinación de los mismos.
Los espaciadores o conectores adecuados para su uso en polipéptidos multivalentes y multiespecíficos estarán claros para los expertos en la materia, y en general pueden ser cualquier conector o espaciador usado en la técnica para ligar secuencias de aminoácidos. Preferiblemente, dicho conector o espaciador es adecuado para su uso en la construcción de proteínas o polipéptidos que están destinados a uso farmacéutico.
Algunos espaciadores particularmente preferidos incluyen los espaciadores y conectores que se usan en la técnica para ligar fragmentos de anticuerpo o dominios de anticuerpo. Estos incluyen los conectores mencionados en los antecedentes técnicos generales citada anteriormente, así como, por ejemplo, conectores que se usan en la técnica para construir diacuerpos o fragmentos scFv (a este respecto, sin embargo, cabe señalar que, mientras que en los diacuerpos y en los fragmentos scFv, la secuencia conectora usada debe tener una longitud, un grado de flexibilidad y otras propiedades que permitan que los dominios V<h>y V<l>pertinentes se unan para formar el sitio de unión a antígeno completo, no hay limitación particular en la longitud o la flexibilidad del conector usado en el polipéptido de la invención, ya que cada ISV o Nanobody por sí mismo forma un sitio de unión a antígeno completo).
Por ejemplo, un conector puede ser una secuencia de aminoácidos adecuada y, en particular, secuencias de aminoácidos entre 1 y 50, preferiblemente entre 1 y 30, tal como entre 1 y 10 residuos aminoacídicos. Algunos ejemplos preferidos de dichas secuencias de aminoácidos incluyen conectores de gly-ser, por ejemplo, del tipo (gly<x>ser<y>)<z>, tal como (por ejemplo, (gly4ser)3 o (gly3ser2)3, como se describe en el documento WO 99/42077 y los conectores GS30, GS15, GS9 y GS7 descritos en las solicitudes de Ablynx mencionadas en este documento (véanse, por ejemplo, los documentos WO 06/040153 y WO 06/122825), así como regiones similares a bisagra, tales como las regiones de bisagra de anticuerpos de cadena pesada de origen natural o secuencias similares (tales como las descritas en el documento WO 94/04678). Los conectores preferidos se representan en la tabla B-4.
Tabla B-4: Conectores
Algunos otros conectores particularmente preferidos son polialanina (tal como AAA), así como los conectores GS30 (SEQ ID NO: 85 en el documento WO 06/122825) y GS9 (SEQ ID NO: 84 en el documento WO 06/122825).
Otros conectores adecuados comprenden en general compuestos orgánicos o polímeros, en particular los adecuados para su uso en proteínas para uso farmacéutico. Por ejemplo, se han usado restos de poli(etilenglicol) para ligar dominios de anticuerpo, véase, por ejemplo, el documento WO 04/081026.
La longitud, el grado de flexibilidad y/u otras propiedades del conector o conectores usados (aunque no es crucial, como suele ser para conectores usados en fragmentos scFv) pueden influir en las propiedades del polipéptido final de la invención, incluyendo, aunque sin limitación, la afinidad, especificidad o avidez por TCR, o por uno o más de los otros antígenos. En función de la divulgación en este documento, los expertos en la materia podrán determinar el conector o conectores óptimos para su uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
Por ejemplo, en polipéptidos multivalentes de la invención, la longitud y flexibilidad del conector son preferiblemente tales que permiten que cada ISV o Nanobody usado en la invención presente en el polipéptido se una a su diana afín, por ejemplo, el determinante antigénico en cada una de las dianas. De nuevo, en función de la divulgación en este documento, los expertos en la materia podrán determinar el conector o conectores óptimos para su uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
El o los conectores usados pueden conferir una o más propiedades favorables o funcionalidad a los polipéptidos de la invención, y/o proporcionen uno o más sitios para la formación de derivados y/o para la unión de grupos funcionales (por ejemplo, como se describe en este documento para los derivados de los polipéptidos de la invención). Por ejemplo, los conectores que contienen uno o más residuos aminoacídicos cargados pueden proporcionar propiedades hidrófilas mejoradas, mientras que los conectores que forman o contienen epítopos o marcadores pequeños pueden usarse con propósitos de detección, identificación y/o purificación. De nuevo, en función de la divulgación en este documento, los expertos en la materia podrán determinar los conectores óptimos para su uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
Finalmente, cuando se usan dos o más conectores en los polipéptidos de la invención, estos conectores pueden ser iguales o diferentes. De nuevo, en función de la divulgación en este documento, los expertos en la materia podrán determinar los conectores óptimos para su uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos rutinarios limitados.
Habitualmente, para facilitar la expresión y la producción, un polipéptido de la invención será un polipéptido lineal. Sin embargo, la invención en su sentido más amplio no se limita a ello. Por ejemplo, cuando un polipéptido de la invención comprende tres o más componentes básicos, ISV o Nanobodies, es posible ligarlos mediante el uso de un conector con tres o más "brazos", estando cada "brazo" ligado a un componente básico, ISV o Nanobody, para proporcionar una construcción "en forma de estrella". También es posible, aunque habitualmente es menos preferido, usar construcciones circulares.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho primer ISV y dicho segundo ISV y posiblemente dicho tercer ISV y/o dicho ISV que se une a seroalbúmina están directamente ligados entre sí o están ligados mediante un conector.
La presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho conector se elige del grupo que consiste en conectores de 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS y 35GS.
La presente invención se refiere a un polipéptido como se define por las reivindicaciones, en donde dicho resto de unión a proteína sérica es un polipéptido no basado en anticuerpo (por ejemplo, PEG).
La invención también se refiere a métodos para preparar los polipéptidos como se definen por las reivindicaciones. Los ISV, polipéptidos y construcciones pueden prepararse de una manera conocidaper se,como estará claro para los expertos en la materia a partir de la descripción adicional en este documento. Por ejemplo, los ISV, polipéptidos y construcciones pueden prepararse de cualquier manera conocidaper separa la preparación de anticuerpos y, en particular, para la preparación de fragmentos de anticuerpo (incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos de (un solo) dominio y fragmentos scFv). Algunos métodos preferidos, pero no limitantes, para preparar los polipéptidos y construcciones incluyen los métodos y técnicas descritos en este documento.
El método para producir un ISV, polipéptido o construcción proteínica puede comprender las siguientes etapas:
- la expresión, en una célula hospedadora u organismo hospedador adecuado (una célula hospedadora como se reivindica también se denomina en este documento "hospedador de la invención") o en otro sistema de expresión adecuado de un ácido nucleico que codifica dicho ISV, polipéptido o construcción proteínica,
opcionalmente seguido de:
- aislamiento y/o purificación del ISV, polipéptido o construcción proteínica obtenida de ese modo.
En particular, dicho método puede comprender las etapas de:
- cultivo y/o mantenimiento de una célula hospedadora de la invención en condiciones que sean tales que dicha célula hospedadora de la invención exprese y/o produzca al menos un polipéptido o de la invención;
opcionalmente seguido de:
- aislamiento y/o purificación del polipéptido de la invención obtenido de ese modo.
Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención (también denominado"ácido nucleico de la invención"o"secuencia de nucleótidosde la invención").Un ácido nucleico de la invención puede estar en forma de ADN o ARN monocatenario o bicatenario, y está preferiblemente en forma de ADN bicatenario. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser ADN genómico, ADNc o ADN sintético (tal como ADN con un uso de codones que se ha adaptado específicamente para la expresión en la célula hospedadora u organismo hospedador previsto).
De acuerdo con una realización de la invención, el ácido nucleico de la invención está en forma esencialmente aislada, como se define en este documento. El ácido nucleico de la invención también puede estar en forma de, estar presente y/o formar parte de un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, cósmido o YAC, que de nuevo puede estar en forma esencialmente aislada.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse u obtenerse de una manera conocidaper se,en función de la información sobre los polipéptidos de la invención dada en este documento, y/o pueden aislarse de una fuente natural adecuada. Además, como quedará claro para los expertos en la materia, para preparar un ácido nucleico de la invención, también varias secuencias de nucleótidos, tales como al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable individual de inmunoglobulina usado en la invención y, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican uno o más conectores, se pueden ligar entre sí de una manera adecuada.
Las técnicas para generar los ácidos nucleicos de la invención estarán claras para los expertos en la materia y pueden incluir, por ejemplo, aunque sin limitación, síntesis automatizada de ADN; mutagénesis dirigida al sitio; combinación de dos o más secuencias de origen natural y/o sintéticas (o dos o más partes de las mismas), introducción de mutaciones que dan lugar a la expresión de un producto de expresión truncado; introducción de uno o más sitios de restricción (por ejemplo, para crear casetes y/o regiones que se puedan digerir y/o ligar fácilmente usando enzimas de restricción adecuadas), y/o la introducción de mutaciones por medio de una reacción de PCR usando uno o más cebadores "discrepantes". Estas y otras técnicas estarán claras para los expertos en la materia, y se hace referencia de nuevo a los manuales convencionales, tales como Sambrooket al.y Ausubelet al.,mencionados en este documento, así como los ejemplos a continuación.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en forma de, estar presente en y/o formar parte de una construcción genética, como estará claro para los expertos en la materia. Dichas construcciones genéticas comprenden en general al menos un ácido nucleico de la invención que está opcionalmente ligado a uno o más elementos de construcciones genéticas conocidosper se,tales como, por ejemplo, uno o más elementos reguladores adecuados (tales como uno o más promotores, potenciadores, terminadores, etc. adecuados) y los elementos adicionales de construcciones genéticas mencionados en este documento. Dichas construcciones genéticas que comprenden al menos un ácido nucleico de la invención también se denominarán en este documento"construcciones genéticas de la invención".
Las construcciones genéticas de la invención pueden ser ADN o ARN, y son preferiblemente ADN bicatenario. Las construcciones genéticas de la invención también pueden estar en una forma adecuada para la transformación de la célula hospedadora u organismo hospedador previsto, en una forma adecuada para la integración en el ADN genómico de la célula hospedadora prevista o en una forma adecuada para la replicación independiente, mantenimiento y/o herencia en el organismo hospedador previsto. Por ejemplo, las construcciones genéticas de la invención pueden estar en forma de un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, cósmido, YAC, un vector vírico o transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar la expresiónin vitroy/oin vivo(por ejemplo, en una célula hospedadora, organismo hospedador y/o sistema de expresión adecuado).
En una realización preferida, pero no limitante, una construcción genética de la invención comprende
a) al menos un ácido nucleico de la invención; conectado de forma funcional a
b) uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado;
y opcionalmente también
c) uno o más elementos adicionales de construcciones genéticas conocidosper se;
en que tienen las expresiones "elemento regulador", "promotor", "terminador" y "conectado de forma funcional" tienen
si significado habitual en la técnica (como se describe adicionalmente en este documento); y en que dichos "elementos adicionales" presentes en las construcciones genéticas pueden ser, por ejemplo, secuencias UTR 3' o 5', secuencias líderes, marcadores de selección, marcadores de expresión/genes indicadores y/o elementos que pueden facilitar o aumentar (la eficiencia de) la transformación o integración. Estos y otros elementos adecuados para dichas construcciones genéticas estarán claros para los expertos en la materia y pueden depender, por ejemplo, del tipo de construcción usado; la célula hospedadora u organismo hospedador previsto; la manera en que las secuencias de nucleótidos de la invención de interés van a expresarse (por ejemplo, mediante expresión constitutiva, transitoria o inducible); y/o la técnica de transformación a usar. Por ejemplo, las secuencias reguladoras, promotores y terminadores conocidosper separa la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (que incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos de (un solo) dominio y fragmentos scFv) pueden usarse de una manera esencialmente análoga.
Preferiblemente, en las construcciones genéticas de la invención, dicho al menos un ácido nucleico de la invención y dichos elementos reguladores, y opcionalmente dicho uno o más elementos adicionales, están "ligados de forma funcional" entre sí, por lo que en general se entiende que están en una relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor se considera "ligado de forma funcional" a una secuencia codificante si dicho promotor puede iniciar o controlar/regular de otro modo la transcripción y/o la expresión de una secuencia codificante (en que dicha secuencia codificante debe entenderse como "bajo el control de" dicho promotor). En general, cuando dos secuencias de nucleótidos están ligadas de forma funcional, estarán en la misma orientación y habitualmente también en el mismo marco de lectura. Habitualmente también serán esencialmente contiguas, aunque esto también puede no ser necesario.
Los ácidos nucleicos de la invención y/o las construcciones genéticas de la invención pueden usarse para transformar una célula hospedadora u organismo hospedador, es decir, para la expresión y/o producción del polipéptido de la invención. El hospedador es preferiblemente un hospedador no humano. Los hospedadores o células hospedadoras adecuadas estarán claras para los expertos en la materia, y pueden ser, por ejemplo, cualquier célula o línea celular fúngica, procariota o eucariota adecuada o cualquier organismo fúngico, procariota o eucariota adecuado, por ejemplo:
- una cepa bacteriana, que incluye, aunque sin limitación, cepas gramnegativas tales como cepas deEscherichia coli; deProteus,por ejemplo, deProteus mirabilis; dePseudomonas,por ejemplo, dePseudomonas fluorescens;y cepas grampositivas tales como cepas deBacillus,por ejemplo, deBacillus subtiliso deBacillus brevis;deStreptomyces,por ejemplo, deStreptomyces lividans;deStaphylococcus,por ejemplo, deStaphylococcus carnosus;y deLactococcus,por ejemplo, deLactococcus lactis;
- una célula fúngica, que incluye, aunque sin limitación, células de especies deTrichoderma,por ejemplo, deTrichoderma reesei;deNeurospora,por ejemplo, deNeurospora crassa;deSordaria,por ejemplo, deSordaria macrospora;deAspergillus,por ejemplo, deAspergillus nigero deAspergillus sojae;o de otros hongos filamentosos;
- una célula de levadura, que incluye, aunque sin limitación, células de especies deSaccharomyces,por ejemplo, deSaccharomyces cerevisiae;deSchizosaccharomyces,por ejemplo, deSchizosaccharomyces pombe;dePichia,por ejemplo, dePichia pastoriso dePichia methanolica;deHansenula,por ejemplo, deHansenula polymorpha;deKluyveromyces,por ejemplo, deKluyveromyces;deArxula,por ejemplo, deArxula adeninivorans;deYarrowia,por ejemplo, deYarrowia lipolytica;
- una célula o línea celular de anfibio, tal como oocitos deXenopus;
- una célula o línea celular derivada de insecto, tal como células/líneas celulares derivadas de lepidóptero, que incluyen, aunque sin limitación, células deSpodopteraSF9 y Sf21 o células/líneas celulares derivadas deDrosophila,tales como células Schneider y Kc;
- una planta o célula vegetal, por ejemplo, en plantas de tabaco; y/o
- una célula o línea celular de mamífero, por ejemplo, una célula o línea celular derivada de un ser humano, una célula o una línea celular de mamífero que incluye, aunque sin limitación, células CHO, células BHK (por ejemplo, células BHK-21) y células o líneas celulares humanas tales como células HeLa, COS (por<ejemplo,>C<o>S-<7) y PER.C6;>
así como todos los demás hospedadores o células hospedadoras conocidasper separa la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos de (un solo) dominio y fragmentos scFv), lo que estará claro para los expertos en la materia. También se hace referencia a los antecedentes técnicos generales citados anteriormente en este documento, así como, por ejemplo, a los documentos WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenkenet al.1998 (Res. Immunol. 149: 589-99); Riechmann y Muyldermans 1999 (J. Immunol. Met. 231: 25-38); van der Linden 2000 (J. Biotechnol. 80: 261-70); Joostenet al.2003 (Microb. Cell Fact. 2: 1); Joostenet al.2005 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92); y las referencias adicionales citadas en este documento.
Para la expresión de los ISV, polipéptidos o construcciones en una célula, también pueden expresarse como los denominados "intracuerpos", como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 94/02610, WO 95/22618 y US 7004940; WO 03/014960; en Cattaneo y Biocca 1997 (Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes y Springer-Verlag); y en Kontermann 2004 (Methods 34: 163-170).
De acuerdo con una realización preferida, pero no limitante de la invención, el polipéptido de la invención se produce en una célula bacteriana, en particular una célula bacteriana adecuada para producción farmacéutica a gran escala, tal como células de las cepas mencionadas anteriormente.
De acuerdo con otra realización preferida, pero no limitante de la invención, el polipéptido de la invención se produce en una célula de levadura, en particular una célula de levadura adecuada para producción farmacéutica a gran escala, tal como células de las especies mencionadas anteriormente.
De acuerdo con otra realización preferida más, pero no limitante de la invención, el polipéptido de la invención se producen en una célula de mamífero, en particular en una célula humana o en una célula de una línea celular humana, y más en particular en una célula humana o en una célula de una línea celular humana que es adecuada para producción farmacéutica a gran escala, tal como las líneas celulares mencionadas anteriormente en este documento.
Las técnicas adecuadas para transformar una célula hospedadora de la invención estarán claras para los expertos en la materia y pueden depender de la célula hospedadora prevista y de la construcción genética a usar. Se hace referencia de nuevo a los manuales y solicitudes de patente mencionados anteriormente.
Después de la transformación, se puede realizar una etapa para detectar y seleccionar aquellas células hospedadoras que se han transformado con éxito con la secuencia de nucleótidos/construcción genética de la invención. Esto puede ser, por ejemplo, una etapa de selección basada en un marcador de selección presente en la construcción genética de la invención o una etapa que implica la detección del polipéptido de la invención, por ejemplo, usando anticuerpos específicos.
La célula hospedadora transformada (que puede estar en forma de una línea celular estable) forma aspectos adicionales de la presente invención.
Preferiblemente, estas células hospedadoras son tales que expresan, o (al menos) pueden expresar (por ejemplo, en condiciones adecuadas), un polipéptido de la invención. La invención también incluye generaciones adicionales, descendencia y/o descendientes de la célula hospedadora de la invención, por ejemplo, obtenidos por división celular o por reproducción sexual o asexual.
Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora que expresa (o que, en circunstancias adecuadas, puede expresar) un polipéptido de la invención; y/o que contiene un ácido nucleico que codifica el mismo. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de dichos hospedadores o células hospedadoras pueden ser como se describe en general en los documentos WO 04/041867, WO 04/041865 o WO 09/068627. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden expresarse, producirse o fabricarse con ventaja en una cepa de levadura, tal como una cepa dePichia pastoris.También se hace referencia a los documentos WO 04/25591, WO 10/125187, WO 11/003622 y WO 12/056000, que también describen la expresión/producción enPichiay otros hospedadores/células hospedadoras de dominios variables individuales de inmunoglobulina y polipéptidos que comprenden los mismos.
Para producir/obtener la expresión de los polipéptidos de la invención, la célula hospedadora transformada en general puede conservarse, mantenerse y/o cultivarse en condiciones tales que se exprese/produzca el polipéptido (deseado) de la invención. Las condiciones adecuadas estarán claras para los expertos en la materia y habitualmente dependerán de la célula hospedadora usada, así como de los elementos reguladores que controlan la expresión de la secuencia de nucleótidos (relevante) de la invención. De nuevo, se hace referencia a los manuales y solicitudes de patente mencionados anteriormente en los párrafos sobre las construcciones genéticas de la invención.
En general, las condiciones adecuadas pueden incluir el uso de un medio adecuado, la presencia de una fuente adecuada de alimento y/o nutrientes adecuados, el uso de una temperatura adecuada y, opcionalmente la presencia de un factor o compuesto inductor adecuado (por ejemplo, cuando las secuencias de nucleótidos de la invención están bajo el control de un promotor inducible); todos ellos pueden seleccionarse por los expertos en la materia. De nuevo, en dichas condiciones, los polipéptidos de la invención pueden expresarse de una manera constitutiva, de una manera transitoria o solo cuando se inducen adecuadamente.
También estará claro para los expertos en la materia que el polipéptido de la invención puede (en primer lugar) generarse en una forma inmadura (como se menciona anteriormente), que luego puede someterse a modificación postraduccional, dependiendo de la célula hospedadora usada. Además, el polipéptido de la invención puede glucosilarse, de nuevo dependiendo de la célula hospedadora usada.
El polipéptido de la invención puede entonces aislarse de la célula hospedadora y/o del medio en que se cultivó dicha célula hospedadora, usando técnicas de aislamiento y/o purificación de proteínas conocidasper se,tales como técnicas de cromatografía (preparativa) y/o electroforesis, técnicas de precipitación diferencial, técnicas de afinidad (por ejemplo, usando una secuencia de aminoácidos escindible específica fusionada con el polipéptido o construcción de la invención) y/o técnicas inmunológicas preparativas (es decir, usando anticuerpos contra la secuencia de aminoácidos a aislar).
Las construcciones que comprende el polipéptido de la invención en general pueden prepararse mediante un método que comprende al menos la etapa de ligar adecuadamente los ISV o polipéptidos de la invención al uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión adicionales, opcionalmente mediante uno o más conectores adecuados, para proporcionar las construcciones. Los polipéptidos de la invención entonces pueden modificarse adicionalmente y, en particular, mediante modificación química y/o biológica (por ejemplo, enzimática) de uno o más de los residuos aminoacídicos que forman los polipéptidos de la invención, para obtener derivados de los polipéptidos de la invención.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención.
Los métodos para el tratamiento del organismo humano o animal por cirugía o terapia son tal como se describen en este documento con propósitos ilustrativos únicamente. En los métodos anteriores, los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse de cualquier manera adecuada, dependiendo de la formulación o composición farmacéutica específica a usar. Por tanto, los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse, por ejemplo, por vía oral, intraperitoneal (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, o mediante cualquier otra vía de administración que evite el tubo gastrointestinal), intranasal, transdérmica, tópica, mediante un supositorio, por inhalación, de nuevo dependiendo de la formulación o composición farmacéutica específica a usar. El profesional clínico podrá seleccionar una vía adecuada de administración y una formulación o composición farmacéutica adecuada a usar en dicha administración, dependiendo de la enfermedad o trastorno a prevenir o tratar y otros factores bien conocidos por el profesional clínico.
Como se usa en este documento, la expresión "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que pueda usarse en el tratamiento y/o control de un trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer o uno o más síntomas del mismo. En determinadas realizaciones, la expresión "agente terapéutico" se refiere a un polipéptido multiespecífico de la invención. Preferiblemente, un agente terapéutico es un agente que se sabe que es útil para, o se ha usado o se está usando actualmente para el tratamiento, prevención y/o control de un trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer o uno o más síntomas del mismo.
Como se usa en este documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" en el contexto del cáncer se refiere a la cantidad de un tratamiento solo, o en combinación con otros tratamientos, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento y/o control de cánceres. En un aspecto, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de un tratamiento suficiente para destruir, modificar, controlar o eliminar tejido canceroso primario, regional o metastásico. En otro aspecto, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de un tratamiento suficiente para reducir los síntomas de un cáncer. En otro aspecto, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de un tratamiento suficiente para retardar o minimizar la propagación del cáncer. En una realización específica, una cantidad terapéuticamente eficaz de un tratamiento es una cantidad de un tratamiento suficiente para inhibir el crecimiento o la proliferación de células cancerosas, destruir células cancerosas existentes (por ejemplo, provocar la regresión del cáncer) y/o prevenir la propagación de las células cancerosas a otros tejidos o zonas (por ejemplo, prevenir la metástasis). En otra realización específica, una cantidad terapéuticamente eficaz de un tratamiento es la cantidad de un tratamiento suficiente para inhibir el crecimiento de un tumor en al menos un 5 %, preferiblemente al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 %, medido por un método convencional conocido en la técnica. Usada en relación con una cantidad de un polipéptido multiespecífico de la invención, la expresión puede abarcar una cantidad que mejora el tratamiento global, reduce o evita efectos indeseados, o potencia la eficacia terapéutica de o sinergiza con otro tratamiento. En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de un tratamiento reduce o evita los efectos indeseados, o potencia la eficacia terapéutica de o sinergiza con otro tratamiento en al menos un 5 %, preferiblemente al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 % con respecto a un control (por ejemplo, un control negativo tal como solución salina tamponada con fosfato) en un ensayo conocido en la técnica o descrito en este documento.
Como se usa en este documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" en el contexto de un trastorno celular hiperproliferativo no canceroso se refiere a la cantidad de un tratamiento solo, o en combinación con otros tratamientos, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento y/o control de dicho trastorno. En un aspecto, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de un tratamiento suficiente para destruir, modificar, controlar o eliminar células afectadas por un trastorno celular hiperproliferativo no canceroso. En otro aspecto, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de un tratamiento suficiente para reducir los síntomas de un trastorno celular hiperproliferativo no canceroso. En otro aspecto, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de un tratamiento suficiente para retardar o minimizar la propagación del trastorno celular hiperproliferativo no canceroso. En una realización específica, una cantidad terapéuticamente eficaz de un tratamiento es una cantidad de un tratamiento suficiente para inhibir el crecimiento o la proliferación del trastorno celular hiperproliferativo no canceroso, destruir células hiperproliferativas no cancerosas existentes (por ejemplo, provocar la regresión del trastorno). En otra realización específica, una cantidad terapéuticamente eficaz de un tratamiento es la cantidad de un tratamiento suficiente para inhibir el crecimiento de las células hiperproliferativas no cancerosas en al menos un 5 %, preferiblemente al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 %, medido por un método convencional conocido en la técnica. Usada en relación con una cantidad de un polipéptido multiespecífico de la invención, la expresión puede abarcar una cantidad que mejora el tratamiento global, reduce o evita efectos indeseados, o potencia la eficacia terapéutica de o sinergiza con otro tratamiento. En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de un tratamiento reduce o evita los efectos indeseados, o potencia la eficacia terapéutica de o sinergiza con otro tratamiento en al menos un 5 %, preferiblemente al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 % con respecto a un control (por ejemplo, un control negativo tal como solución salina tamponada con fosfato) en un ensayo conocido en la técnica.
Como se usa en este documento, el término "tratamiento" se refiere a cualquier protocolo, método y/o agente que pueda usarse en el tratamiento, prevención y/o control de un trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer. En determinadas realizaciones, los términos "tratamientos" y "tratamiento" se refieren a un tratamiento biológico, tratamiento complementario y/u otros tratamientos útiles en el tratamiento, prevención y/o control de un trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer o uno o más síntomas del mismo conocidos por los expertos en la materia, tal como personal médico.
Como se usa en este documento, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" en el contexto de administrar uno o más tratamientos a un sujeto se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de un trastorno asociado con un trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer, y/o la mejora de uno o más síntomas del mismo resultante de la administración de uno o más tratamientos (que incluyen, aunque sin limitación, la administración de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos). En realizaciones específicas, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" en el contexto de administrar uno o más tratamientos a un sujeto se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de un trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer, se refiere a una reducción en las células cancerosas en al menos un 5 %, preferiblemente al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 % con respecto a un control (por ejemplo, un control negativo tal como solución salina tamponada con fosfato). En otras realizaciones, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" en el contexto de administrar uno o más tratamientos a un sujeto se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de un trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer, se refiere a ningún cambio en el número de células cancerosas, una reducción en el tiempo de hospitalización, una reducción en la mortalidad o un aumento en el tiempo de supervivencia del sujeto con cáncer.
Los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse de acuerdo con una pauta de tratamiento que es adecuada para prevenir y/o tratar el trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer, a prevenir o tratar. El profesional clínico en general podrá determinar una pauta de tratamiento adecuada, dependiendo de factores tales como el estadio del trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer, a tratar, la gravedad del trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer, a tratar y/o la gravedad de los síntomas del mismo, el polipéptido de la invención a usar, la vía específica de administración y la formulación o composición farmacéutica a usar, la edad, el sexo, el peso, la dieta, el estado general del paciente y factores similares bien conocidos por el profesional clínico.
En general, la pauta de tratamiento comprenderá la administración de uno o más polipéptidos de la invención, o de una o más composiciones que comprenden los mismos, en una o más cantidades o dosis farmacéuticamente eficaces. El profesional clínico puede determinar la cantidad o cantidades o dosis específicas a administrar, de nuevo en función de los factores citados anteriormente.
En general, para la prevención y/o tratamiento de un trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer, mencionado en este documento y dependiendo del tipo de trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer y el estadio de la enfermedad a tratar, la potencia del polipéptido de la invención a usar, la vía específica de administración y la formulación o composición farmacéutica específica usada, los polipéptidos en general se administrarán en una cantidad entre 1 gramo y 0,01 miligramos por kg de peso corporal al día, preferiblemente entre 0,1 gramos y 0,01 miligramos por kg de peso corporal al día, tal como aproximadamente 0,1, 1, 10, 100 o 1000 miligramos por kg de peso corporal al día, por ejemplo, de 0,1 mg por kg a 25 mg por kg de peso corporal del sujeto; de forma continua (por ejemplo, por infusión), como una dosis diaria única o como múltiples dosis divididas durante el día. En general, el profesional clínico podrá determinar una dosis diaria adecuada, dependiendo de los factores mencionados en este documento. También estará claro que, en casos específicos, el profesional clínico puede optar por desviarse de estas cantidades, por ejemplo, en función de los factores citados anteriormente y de su criterio pericial. En general, se puede obtener alguna orientación sobre las cantidades a administrar a partir de las cantidades habitualmente administradas para anticuerpos convencionales comparables o fragmentos de anticuerpo contra la misma diana administrados esencialmente por la misma vía, teniendo en cuenta, sin embargo, las diferencias en la afinidad/avidez, eficacia, biodistribución, semivida y factores similares bien conocidos por los expertos en la materia.
Habitualmente, en el método anterior, se usará un solo polipéptido de la invención, pero también pueden usarse dos o más polipéptidos de la invención en combinación.
Los polipéptidos de la invención también pueden usarse en combinación con uno o más compuestos o principios farmacéuticamente activos adicionales, es decir, como una pauta de tratamiento combinado, que puede dar lugar o no a un efecto sinérgico. De nuevo, el profesional clínico podrá seleccionar dichos compuestos o principios adicionales, así como una pauta de tratamiento combinado adecuado, en función de los factores citados anteriormente y su criterio pericial.
En particular, los polipéptidos de la invención pueden usarse en combinación con otros compuestos o principios farmacéuticamente activos que se usan o pueden usarse para la prevención y/o tratamiento del trastorno celular hiperproliferativo, por ejemplo, cáncer, enfermedad y/o trastorno citado en este documento, como resultado de lo cual puede obtenerse o no un efecto sinérgico. Ejemplos de dichos compuestos y principios, así como vías, métodos y formulaciones o composiciones farmacéuticas para administrarlos estarán claros para el profesional clínico.
Cuando se van a usar dos o más sustancias o principios como parte de una pauta de tratamiento combinado, pueden administrarse por la misma vía de administración o por diferentes vías de administración, esencialmente al mismo tiempo o en diferentes momentos (por ejemplo, esencialmente de forma simultánea, consecutivamente o según una pauta alternante). Cuando las sustancias o principios van a administrarse simultáneamente por la misma vía de administración, pueden administrarse como diferentes formulaciones o composiciones farmacéuticas o como parte de una formulación o composición farmacéutica combinada, como quedará claro para los expertos en la materia.
En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para la administración de dominios variables individuales de inmunoglobulina y construcciones polipeptídicas de los mismos que comprenden uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina, polipéptidos, compuestos y/o construcciones. En algunas realizaciones, el dominio variable individual de inmunoglobulina, polipéptido, compuesto y/o construcción se administra como una composición farmacéutica. La composición farmacéutica, además de los dominios variables individuales de inmunoglobulina y construcciones polipeptídicas de los mismos, incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se describe en detalle, las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden formularse especialmente para su administración en forma sólida o líquida, incluyendo las adaptadas para lo siguiente: administración oral, por ejemplo, pociones (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), comprimidos, por ejemplo, los dirigidos a absorción yugal, sublingual y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación en la lengua; administración parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril, o formulación de liberación mantenida; aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, pomada o un parche o aerosol de liberación controlada aplicado a la piel, pulmones o cavidad bucal; por ejemplo, por vía intravaginal o intrarrectal, como un óvulo vaginal, crema o espuma; por vía sublingual; por vía ocular; por vía transdérmica; o por vía nasal, pulmonar y a otras superficies mucosas.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en este documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, según el juicio médico razonable, adecuados para usar en contacto con los tejidos de los seres humanos y los animales sin provocar una toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivos, y acordes con una relación riesgo/beneficio razonable.
La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se usa en este documento, significa un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno líquido o sólido, un diluyente, un excipiente o un material disolvente encapsulante, implicado en el transporte del compuesto en cuestión desde un órgano o una parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de que debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no debe ser nocivo para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: glúcidos, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; tamponantes del pH tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua apirógena; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones de pH tamponado; poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y otras sustancias atóxicas compatibles, empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Las formulaciones de la divulgación incluyen las adecuadas para administración oral, nasal, tópica (que incluye yugal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar de manera conveniente en formas farmacéuticas unitarias y se pueden preparar por cualquier método conocido en el área farmacéutica. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, dominio variable individual de inmunoglobulina o construcciones polipeptídicas del mismo) que se puede combinar con un material de vehículo para producir una forma farmacéutica individual variará dependiendo del hospedador que se esté tratando y del modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una forma farmacéutica individual será en general la cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. En general, esta cantidad variará de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 99 % del ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 70 %, mucho más preferiblemente de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 30 %.
En determinadas realizaciones, una formulación comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste en ciclodextrinas, liposomas, formadores de micelas, por ejemplo, ácidos biliares, y vehículos poliméricos, por ejemplo, poliésteres y polianhídridos. En determinadas realizaciones, una formulación mencionada anteriormente hace que esté biodisponible por vía oral un dominio variable individual de inmunoglobulina o construcción polipeptídica.
Los métodos de preparación de estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de asociar un dominio variable individual de inmunoglobulina o construcción polipeptídica con el vehículo y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente un dominio variable individual de inmunoglobulina o construcción polipeptídica con vehículos líquidos, o vehículos sólidos divididos finamente, o ambos, y luego, si fueran necesario, dando forma al producto.
Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, sellos, píldoras, comprimidos, pastillas (usando una base con sabor, habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto), polvos, granulados, o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como grageas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga) y/o como enjuagues bucales y similares, conteniendo, cada una, una cantidad predeterminada de un dominio variable individual de inmunoglobulina de la invención como ingrediente activo. Un dominio variable individual de inmunoglobulina o polipéptido también puede administrarse como un bolo, electuario o pasta.
En formas farmacéuticas sólidas para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), el ingrediente activo se mezcla con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de los siguientes: rellenos o diluyentes, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; humectantes, tales como glicerol; agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato de sodio; agentes retardadores de la disolución, tales como parafina; aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerol y tensioactivos no iónicos; absorbentes, tales como caolín y arcilla bentonita; lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos; y colorantes. En el caso de las cápsulas, los comprimidos y las píldoras, las composiciones farmacéuticas pueden también contener tamponantes. También se pueden emplear composiciones sólidas de tipo similar como relleno en cápsulas de cubierta de gelatina blanda y dura usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Un comprimido se puede fabricar por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos fabricados por compresión pueden prepararse usando aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo, glicolato de almidón sódico o carboximetilcelulosa sódica reticulada), tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden prepararse en una máquina adecuada en que una mezcla del compuesto en polvo se humedece con un diluyente líquido inerte.
Los comprimidos y otras formas farmacéuticas sólidas de las composiciones farmacéuticas, tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, opcionalmente, se pueden ranurar o preparar con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en el área de la formulación farmacéutica. También se pueden formular de modo que proporcionen una liberación lenta o controlada del principio activo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Se pueden formular para liberación rápida, por ejemplo, liofilizadas. Se pueden esterilizar, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retenga bacterias, o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en agua estéril, o en algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente opacificantes y pueden ser de una composición tal que liberen únicamente el ingrediente o ingredientes activos, o los liberen, preferiblemente, en una determinada parte del tubo gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. Ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden usar comprenden sustancias poliméricas y ceras. El ingrediente activo también puede estar en forma microencapsulada, si corresponde, con uno o más de los excipientes descritos anteriormente.
Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires, farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes usados normalmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen de trigo, oliva, ricino y sésamo), glicerol, tetrahidrofurfurol, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos.
Aparte de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, aromatizantes y conservantes.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, ésteres polioxietilenados de sorbitol y sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas para administración rectal o vaginal se pueden presentar como un supositorio u óvulo vaginal, que se puede preparar mezclando un dominio variable individual de inmunoglobulina o construcción polipeptídica con uno o más excipientes o vehículos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera para supositorios o un salicilato y, que sea sólido a temperatura ambiente, pero líquido a la temperatura corporal y, por lo tanto, se fundirá en el recto o la cavidad vaginal y liberará el compuesto activo.
Las formulaciones adecuadas para administración vaginal también incluyen óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen vehículos tales como los que se conocen en la técnica como apropiados.
Las formas farmacéuticas para administración tópica o transdérmica de un dominio variable individual de inmunoglobulina o construcción polipetídica incluyen polvos, aerosoles, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo se puede mezclar en condiciones asépticas con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propulsor que pueda ser necesario.
Las pomadas, las pastas, las cremas y los geles pueden contener excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, vaselinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y aerosoles pueden contener excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los aerosoles pueden contener adicionalmente propulsores corrientes, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano.
Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar un suministro controlado de un dominio variable individual de inmunoglobulina o construcción polipeptídica al cuerpo. Disolver o dispersar el compuesto en el medio apropiado puede generar dichas formas farmacéuticas. También se pueden usar potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. Proporcionar una membrana de control de la velocidad o dispersar el compuesto en una matriz polimérica o gel puede controlar la tasa de dicho flujo.
También se contemplan las formulaciones oftálmicas, las pomadas, los polvos y las soluciones oculares como comprendidas por el alcance de esta divulgación.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral comprenden uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina o construcciones polipeptídicas en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener glúcidos, alcoholes, antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del destinatario pretendido o agentes de suspensión o espesantes.
Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados, que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas, incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos sobre los compuestos en cuestión, se puede garantizar incluyendo diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico y similares. También puede ser deseable incluir en las composiciones agentes isotónicos, tales como glúcidos, cloruro de sodio y similares. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede lograr mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
En algunos casos, para prolongar el efecto de un fármaco es deseable ralentizar la absorción del fármaco desde la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tenga baja solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución, que a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retardada de una forma del fármaco administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso.
Las formas inyectables de liberación lenta (prolongada) se preparan formando matrices de microencapsulación del compuesto en cuestión en polímeros biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la relación entre fármaco y polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). También se preparan formulaciones inyectables de liberación lenta por atrapamiento del fármaco en liposomas o microemulsiones, que son compatibles con los tejidos corporales.
El polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el vector o la célula hospedadora de la invención pueden proporcionarse como parte de kits que comprenden un polipéptido de la invención, una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector de la invención o una célula hospedadora de la invención. El kit puede comprender uno o varios viales que contienen la molécula de unión e instrucciones de uso. El kit también puede contener medios para administrar la molécula de unión de la presente invención, tales como una jeringuilla, una bomba, un infusor o similares.
La invención se describirá ahora adicionalmente mediante los siguientes aspectos, ejemplos y figuras preferidos, no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Material y métodos
1.1 Líneas celulares transfectadas con TCR1 a@/CD3
Se generaron líneas celulares transitorias y estables CHO-K1 (ATCC: CCL-61), HEK293H (Life Technologies 11631-017), Llana (fibroblastos de células del cordón umbilical de llama) con sobreexpresión recombinante de las 6 cadenas del complejo receptor de linfocitos T humano completo. Para esto, las secuencias codificantes de la cadena TCR alfa (a) y TCR beta (p) se clonaron en un vector derivado de pcDNA3.1, en dirección 3' de un promotor de CMV y se insertó una secuencia peptídica vírica similar a 2A entre ambas cadenas para inducir el salto ribosómico durante la traducción de la poliproteína. En el mismo vector, las secuencias codificantes de las cadenas épsilon, delta, gamma y zeta del complejo CD3 se clonaron en dirección 3' de un promotor de CMV adicional, también usando secuencias peptídicas víricas similares a 2A entre las respectivas cadenas. Además, se generó un clon estable de HEK293H con sobreexpresión recombinante de las 4 cadenas de la CD3 humana como se describe anteriormente usando un solo vector génico.
Las secuencias usadas para CD3 humana y los dominios constantes de TCRa/p humano se obtuvieron de UniProtKB (CD3 delta: P04234, CD3 gamma: P09693, CD3 épsilon: P07766, CD3 zeta: P20963, TCR a: P01848 y TCR p: P01850; SEQ ID NO: 344a349, respectivamente). Las secuencias de los dominios variables de TCRa/p humano se obtuvieron de secuencias de estructuras cristalinas (códigos PDB: 2IAN, 2XN9 y 3TOE) (dominios variables de TCR a humano derivados de 2IAN, 2XN9 y 3TOE con SEQ ID NO: 393 a 395, respectivamente; dominios variables de TCR p humano derivados de 2IAN, 2XN9 y 3TOE con SEQ ID NO: 476 a 478, respectivamente).
La expresión en la superficie celular del complejo receptor de linfocitos T humano se confirmó por citometría de flujo usando un anticuerpo de ratón IgG2b funcional anti-TCRa/p humano, clon BW242/412 (Miltenyi 130-098-219) y un anticuerpo de ratón IgG2a funcional anti-CD3 marcado con PE, clon OKT-3 (eBioscience 12-0037) (figura 1).
1.2 Proteínas solubles recombinantes TCR1 aip
Las proteínas TCR a/p solubles humanas y de macaco/macaco cangrejero se generaron de forma interna. Las secuencias de la parte extracelular del dominio constante de TCRa/p humano se obtuvieron de UniProtKB (TCR a: P01848 y TCR p: P01850; SEQ ID NO: 479 y 480, respectivamente). Los dominios variables de TCR a/p humano se obtuvieron de la secuencia de la estructura cristalina (código PDB: 2XN9, SEQ ID NO: 394 y 477, respectivamente para las cadenas a y p).
Las secuencias para la parte extracelular de los dominios constantes de TCR a/p de macaco/macaco cangrejero se obtuvieron de los archivos de GenBank EHH63463 y AEA41868 respectivamente (SEQ ID NO: 396 y 397). Las secuencias para los dominios variables de TCR a/p de macaco/macaco cangrejero se obtuvieron de AEA41865 y AEA41866 (SEQ ID NO: 398 y 399, respectivamente para las cadenas a y p).
Los dominios extracelulares de TCR a/p (2XN9) humano o de TCR a/p de macaco/macaco cangrejero se fusionaron con una secuencia codificante de la proteína de cremallera (O'Sheaet al.1993 Curr. Biol. 3(10): 658 667), se produjeron por células CHOK1SV (Lonza) usando el GS Gene Expression System<™>de Lonza y posteriormente se purificaron.
La calidad de las proteínas TCR a/p cremallera se evaluó en un ensayo de unión de ELISA. Las placas de ELISA Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) se recubrieron con 2 pg/ml de proteína soluble recombinante humana TCR a/p (2Xn9)-cremallera o proteína soluble recombinante de macaco TCR a/p-cremallera. Después de incubación durante la noche, las placas se lavaron y se bloquearon con PBS caseína al 1 % durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las placas se incubaron con diluciones en serie de un Nanobody funcional marcado con FLAG o el anticuerpo IgG de ratón funcional anti-TCRa/p de primate no humano/rata, clon R73 (eBioscience 16 5960) durante 1 h a temperatura ambiente mientras se agitaba, se lavaron de nuevo y se incubaron con anti-marca-HRP de ratón (Sigma, n.° A8592), respectivamente anticuerpo de conejo antirratón-HRP (Dako, n.° P0260). Después de 1 h, se añadió solución TMB One Solution (Promega n.° G7431). La reacción se detuvo con H<2>SO<4>2 M y se determinó la unión dependiente de la dosis midiendo la DO a 450 nm usando Tecan sunrise 4 (figura 2).
Ejemplo 2: Inmunización de llamas con TCRICD3, clonación de los repertorios de fragmentos de anticuerpo solo de cadena pesada y preparación de fagos
2.1 Inmunización
Se estableció generar anticuerpos solo de cadena pesada en camélidos (por ejemplo, llama y alpaca) contra las cadenas constantes a y/o p del receptor de linfocitos T (TCR). Aunque el complejo natural del receptor de linfocitos T consiste tanto en cadenas CD3 (gamma, delta, épsilon y zeta), así como en cadenas a y p de TCR, se planteó la hipótesis de que la ausencia de cadenas CD3 facilitaría el acceso a los dominios constantes de TCR. Especialmente porque las cadenas CD3 rodean lateralmente y limitan el acceso a los dominios constantes de las cadenas a y p de TCR. Contrariamente a nuestra experiencia con otras dianas, la obtención de una respuesta inmunitaria contra las cadenas a o p de TCR no fue tan sencilla como se esperaba.
En una estrategia final, tras la aprobación del Comité Ético (CRIA, LA1400575, Bélgica- EC2012#1), los autores de la invención intentaron un protocolo de inmunización complejo con ADN que codifica el complejo de linfocitos T. En resumen, se inmunizaron 3 llamas adicionales con un vector plasmídico pVAX1-TCR(2IAN)/CD3 humano (descrito en el ejemplo 1,2) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) y con un vector plasmídico pVAX1 -Tc R(2X9)/CD3 humano (descrito en el ejemplo 1,2), (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.) de acuerdo con protocolos convencionales. Dos llamas recibieron adicionalmente 1 inyección subcutánea de linfocitos T humanos primarios. Los linfocitos T humanos se recogieron de sangre de la capa leucoplaquetaria, de voluntarios sanos (banco de sangre de Gent) usando RosetteSep (StemCell Technologies, n.° 15061) seguido de enriquecimiento en Ficoll-Paque<™>PLUS (GE Healthcare n.° 17-1440-03) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se almacenaron en nitrógeno líquido. Después de descongelarlas, las células se lavaron y se volvieron a suspender en D-PBS de Gibco y se mantuvieron en hielo antes de la inyección.
2.2 Clonación de los repertorios de fragmentos de anticuerpo solo de cadena pesada y preparación de fagos
Por animal, se recogieron muestras de sangre después de la inyección de un tipo de antígeno de inmunización. A partir de estas muestras de sangre, se prepararon PBMC usando Ficoll-Hypaque de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE. UU.). Para cada llama inmunizada, se construyeron colecciones combinando el ARN total aislado de muestras originarias de un determinado subconjunto del programa de inmunización, es decir, después de un tipo de antígeno de inmunización.
En resumen, el repertorio de VHH amplificado con PCR se clonó mediante sitios de restricción específicos en un vector diseñado para facilitar la presentación en fagos de la colección de VHH. El vector se obtuvo de pUC119. En el marco con la secuencia codificante de VHH, el vector codifica una marca 3xFLAG e His6 C terminal. Los fagos se prepararon de acuerdo con protocolos convencionales (véanse, por ejemplo, los documentos WO 04/041865,<w>O 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858 y otras técnicas y solicitudes anteriores presentadas por Ablynx N.V. citadas en este documento).
Ejemplo 3: Selección de VHH específicos de TCR/CD3 mediante presentación en fagos
La gran mayoría de los VHH seleccionados estaban dirigidos contra las regiones variables de la cadena TCR a o TCR p. Por lo tanto, los autores de la invención tuvieron que idear diferentes estrategias de selección y contraselección.
En resumen, los repertorios de VHH obtenidos de todas las llamas y clonados como colección en fagos se usaron en diferentes estrategias de selección, aplicando una multiplicidad de condiciones de selección. Las selecciones usando líneas celulares transfectadas con TCR/CD3 humano con el mismo dominio variable que el usado durante la inmunización dieron como resultado únicamente ligandos de dominio variable. Por lo tanto, durante las selecciones se usaron herramientas que contenían un dominio variable diferente de TCRa/p (células transfectadas (descritas en el ejemplo 1.1), proteína soluble (descrita en el ejemplo 1.2) o linfocitos T primarios humanos (aislados como se describe en el ejemplo 2.1)) y demostraron ser cruciales para la identificación de ligandos de dominio constante. Las variables adicionales durante las selecciones incluyeron el método de presentación del antígeno (en solución cuando se usaban células o recubierto en placas cuando eran proteínas), la concentración de antígeno, el ortólogo usado (proteína TCR a/p recombinante humana o de macaco) y el número de rondas de selección. Todas las selecciones en fase sólida recubierta se hicieron en placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania).
Las selecciones se realizaron como sigue: Las preparaciones de antígeno TCRa/p-CD3 para los formatos de selección en fase sólida y en fase de solución se presentaron como se describe anteriormente en concentraciones múltiples. Después de 2 h de incubación con las colecciones de fagos, seguidas de un lavado exhaustivo, los fagos unidos se eluyeron con tripsina (1 mg/ml) durante 15 minutos. La actividad de la proteasa tripsina se neutralizó inmediatamente aplicando inhibidor de proteasa ABSF 0,8 mM. Como control, se realizaron selecciones sin antígeno en paralelo.
Los productos de los fagos se usaron para infectarE. colipara el análisis de clones de VHH individuales. Los extractos periplásmicos se prepararon de acuerdo con protocolos convencionales (véanse, por ejemplo, los documentos W o 03/035694, W o 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 y otras técnicas y solicitudes anteriores presentadas por Ablynx N.V. citadas en este documento).
Ejemplo 4: Cribado, análisis de secuencias y purificación
Cribado de Nanobodies de unión a TCR/CD3 en un ensayo de citometría de flujo
Los extractos periplásmicos se cribaron por la unión a TCR/CD3 expresado en las células usando células CHO-K1 o HEK293H transfectadas con TCR/CD3 humano y la línea celular de referencia respectiva CHO-K1 o HEK293H en una configuración de línea celular mixta. Con este fin, se marcó un gran lote de líneas celulares de referencia con PKH268 pM y se congelaron. Se mezclaron 5x104 células de referencia marcadas con PKH con 5x104 células diana y se incubaron con extractos periplásmicos durante 30 min a 4 °C, y se lavaron 3 veces. A continuación, las células se incubaron con 1 pg/ml de anticuerpo monoclonal ANTI-FLAG® M2 (Sigma-Aldrich, cat. n.° F1804) durante 30 min a 4 °C, se lavaron de nuevo y se incubaron durante 30 min a 4 °C con anticuerpo de cabra antirratón marcado con APC (Jackson Immunoresearch 115-135-164, 1:100). Las muestras se lavaron, se resuspendieron en tampón FACS (D-PBS de Gibco, con FBS al 10 % de Sigma y azida de sodio al 0,05 % de Merck) y luego se analizaron por medio de un BD FACSArray. En primer lugar, se seleccionó una población P1 que representaba más de un 80 % de la población celular total en función de la distribución FSC-SSC. En esta ventana de adquisición, se contaron 20000 células durante la adquisición. En función de la distribución PKH26-SSC, se seleccionó la población precursora marcada con PKH y la población diana sin marcar de TCR/CD3 humano. Para estas 2 poblaciones, se calculó el valor medio de APC.
4.2 Cribado de Nanobodies de unión a TCR/CD3 en un ensayo de activación de linfocitos T humanos
Después de varios intentos, resultó que la activación de linfocitos T humanos purificados por anticuerpos o Nanobodies según protocolos convencionales, es decir, recubiertos en una placa de 96 pocillos, no fue lo suficientemente sensible (datos no mostrados).
Para evaluar la actividad, se desarrolló un ensayo diferente, basado en una activación de linfocitos T acoplados a microesferas. En resumen, se recubrieron dynabeads de cabra anti-IgG de ratón (Life Technologies n.° 11033) con anticuerpos de ratón IgG antiFLAG (Sigma F1804), (15 pg/1E7 microesferas). Después de un periodo de incubación de 2 h a 4 °C, las microesferas se lavaron y se incubaron con 80 pl de extracto periplásmico durante 20 min a 4 °C mientras se agitaban. Los Nanobodies no acoplados se retiraron por lavado antes de añadir el complejo de microesferas junto con el anticuerpo soluble de ratón anti-CD28 (Pelicluster CD28 - Sanquin n.° M1650) a linfocitos T humanos primarios purificados (aislados como se describe en el ejemplo 2.1). Como condición de control, se usaron linfocitos T humanos no estimulados. En resumen, las dynabeads de cabra anti-IgG ratón acopladas a IgG de ratón antiFLAG se incubaron en 80 pl de extracto periplásmico que contenía Nanobodies irrelevantes. Después de la retirada de los Nanobodies no acoplados durante una etapa de lavado, se añadió el complejo de Nanobody irrelevante-microesfera a linfocitos T humanos primarios purificados.
Después de una incubación de 24 h a 37 °C y un 5 % de CO<2>, el estado de activación de los linfocitos T humanos se determinó midiendo el nivel de expresión de CD69 en citometría de flujo usando CD69PE monoclonal de ratón antihumano (BD Biosciences n.° 557050).
4.3 Análisis de secuencias de los Nanobodies obtenidos
Se secuenciaron Nanobodies que puntuaron positivos en el cribado de unión citométrica de flujo y el ensayo de activación de linfocitos T.
El análisis de secuencias demostró que todos los ISV anti-TCR comprendían una CDR3 muy similar. En particular, la CDR3 tiene la secuencia de aminoácidos X<1>SR X<2>X<3>PYX<4>Y, en que X<1>es F, Y, G, L o K, X<2>es I o L, X<3>es Y o W y X<4>es D, N o S.
El análisis de secuencias dio como resultado adicional la identificación de 3 grupos distintos. Se proporcionan alineaciones correspondientes (tabla A-1, tabla A-2, tabla A-3). La agrupación se basó en similitudes y diferencias de secuencia en CDR2 y CDR3. El grupo A es el más prominente, comprendiendo 104 clones (SEQ ID NO: 1-104), el grupo B comprende 11 clones (SEQ ID NO: 105-115) y el grupo C está representado únicamente por 3 clones (SEQ ID NO: 116-118).
Se determinó la variabilidad de secuencia de las CDR para los diferentes grupos. Para elgrupo A,se usó como referencia la secuencia de aminoácidos de las CDR del clon 56G05, con la que se compararon las CDR de todos los demás clones del grupo A. La variabilidad de secuencia frente a 56G05 se representa en las tablas a continuación.
en caso de que la posición 5 sea L, entonces la posición 6 es también L
Para elgrupo B,se usó como referencia la secuencia de aminoácidos de las CDR del clon 55C07, con la que se compararon las CDR de todos los demás clones del grupo B. La variabilidad de secuencia frente a 55C07 se representa en las tablas a continuación.
| varia c io n es |_____________________________________________________ D
Para elgrupo C,se usó como referencia la secuencia de aminoácidos de las CDR del clon 61G01, con la que se compararon las CDR de todos los demás clones del grupo C. La variabilidad de secuencia frente a 61G01 se representa en las tablas a continuación.
La agrupación se basó en la secuencia transmutada en diferencias funcionales (véaseinfra).
4.4 Purificación de Nanobodies monovalentes
Se seleccionaron Nanobodies representativos para cada grupo y se expresaron enE. coliTG1 como proteínas marcadas de forma triple con His6, FLAG. La expresión se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM y se dejó que continuara durante 4 horas a 37 °C. Después de rotar los cultivos celulares, se prepararon extractos periplásmicos por congelación-descongelación de los sedimentos. Estos extractos se usaron como material de partida y los Nanobodies se purificaron mediante IMAC y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
Los Nanobodies se purificaron hasta un 95 % de pureza evaluada mediante SDS-PAGE (datos no mostrados).
Ejemplo 5: Unión de Nanobodies anti-TCR a TCR/CD3 humano expresado en células CHO-K1 y a linfocitos T humanos primarios purificados
La unión de Nanobodies monovalentes anti-TCR purificados a TCR(2XN9)/CD3 humano expresado en células CHO-K1 y a linfocitos T humanos primarios purificados se evaluó en citometría de flujo como se explica en el ejemplo 4.1. Se aplicaron a las células series de dilución de los Nanobodies 55A02 (grupo A), 56G05 (grupo A), 68G05 (grupo B) y 61G01 (grupo C) partiendo de 1 pM.
Los resultados se muestran en la figura 3.
Los Nanobodies se unieron claramente a TCR/CD3 humano expresado en células CHO-K1. Los representantes del grupo A mostraron la mejor afinidad, seguidos del representante del grupo B y del representante del grupo C. Los Nanobodies se unieron a linfocitos T humanos primarios purificados, aunque con una potencia ligeramente menor en comparación con las células CHO-K1 de TCR (2XN9)/CD3 humano. Los representantes del grupo A mostraron la mejor afinidad para unirse a linfocitos T primarios humanos, en consonancia con los datos sobre CHO-K1 (2XN9)/CD3. Los valores de CE50 obtenidos de la curva de respuesta a dosis se representan en la tabla C-1.
Tabla C-1: CE50 (M) de Nanobodies monovalentes anti-TCR para la unión a células CHO-K1 con TCR (2XN9)/CD3 humano y para la unión a linfocitos T primarios purificados determinada en citometría de flujo.
Ejemplo 6: Determinación del epítopo de unión
Se evaluó la unión de los Nanobodies monovalentes anti-TCR purificados a TCR(2IAN)/CD3 humano expresado en células HEK293H y se comparó con la unión a células HEK293H transfectadas con CD3 humana en citometría de flujo, como se describe en el ejemplo 5. Se aplicaron a las células series de dilución de Nanobodies anti-TCR partiendo de 1 pM. La línea celular precursora HEK293H se incluyó como línea celular negativa para TCR/CD3. Los resultados se muestran en la figura 4.
Los Nanobodies se unieron claramente a TCR(2IAN)/CD3 humano expresado en HEK293H, pero no a las células HEK293H transfectadas solo con CD3 humana ni a la línea celular precursora HEK293H. Los valores de CE50 obtenidos de la curva de respuesta a dosis se representan en la tabla C-2.
Tabla C-2: CE50 (M) de Nanobodies monovalentes anti-TCR para la la unión de TCR(2IAN)/CD3 humano o CD3 humana expresada en HEK293H determinada en citometría de flujo.
En conclusión, los clones eran específicos para la unión a TCR a/p humano. No se observó ninguna unión a CD3 humana.
Ejemplo 7: Unión de Nanobodies anti-TCR a proteína TCR a/p humana recombinante soluble
7.1 Unión de Nanobodies anti-TCR a la proteína del receptor de linfocitos T humanos en ELISA
La unión de Nanobodies monovalentes contra TCR purificados a la proteína TCR a/p humana recombinante soluble se evaluó en ELISA (como se describe en el ejemplo 1.2) usando 2 pg/ml de proteína TCR a/p humana recombinante soluble recubierta directamente.
Los resultados se muestran en la figura 5. Los valores de CE50 obtenidos de la curva de respuesta a dosis se representan en la tabla C-3.
Tabla C-3: CE50 (M) de Nanobodies monovalentes anti-TCR para la unión a proteína TCR(2XN9) humana recombinante soluble, determinada en ELISA.
En conclusión, los clones representativos de todos los grupos se unen a la proteína TCR a/p humana recombinante soluble.
7.2 Unión de Nanobodies anti-TCR a la proteína del receptor de linfocitos T humanos en BLI
Las afinidades de unión se midieron usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). La proteína soluble recombinante humana TCR(2XN9)-cremallera se inmovilizó covalentemente en sensores reactivos a amina (ForteBio) mediante química de acoplamiento de NHS/EDC. Para el análisis cinético, los sensores se sumergieron primero en tampón de migración (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, p20 al 0,05 %, pH 7,4 de GE Healthcare Life Sciences) para determinar el ajuste del valor de referencia. Posteriormente, los sensores se sumergieron en pocillos que contenían diferentes concentraciones de Nanobodies purificados (intervalo entre 1,4 nM y 1 mM) para la etapa de asociación (180 s) y se transfirieron a pocillos que contenían tampón de migración para la etapa de disociación (15 min). Las constantes de afinidad (KD) se calcularon aplicando un modelo de interacción de 1:1 usando el programa informático de análisis de datos ForteBio.
Los resultados se representan en la figura 6. Las características de unión se enumeran en la tabla C-4.
Tabla C-4: Análisis cinético de Nanobodies monovalentes anti-TCR para la unión a proteína TCR(2XN9) humana recombinante soluble determinada con el instrumento Octet RED384.
En conclusión, la afinidad de unión para los representantes del grupo A determinada usando BLI en 2XN9 soluble humano mostró correlación con las afinidades determinadas en células CHO-K1 (2XN9)/CD3 en citometría de flujo (véase el ejemplo 5).
Ejemplo 8: Determinación de la capacidad de activación de linfocitos T humanos primarios purificados
La funcionalidad de los Nanobodies monovalentes anti-TCR purificados se evaluó en el ensayo de activación de linfocitos T humanos. Se recubrieron dynabeads de cabra anti-IgG de ratón (Life Technologies n.° 11033) con anticuerpos de ratón IgG antiFLAG (Sigma F1804), (15 pg/1E7 microesferas). Después de un periodo de incubación de 2 h a 4 °C, las microesferas se lavaron y se incubaron con una cantidad fija (1 pg) de Nanobody purificado marcado con FLAG durante 20 min a 4 °C mientras se agitaban. Los Nanobodies no acoplados se retiraron por lavado antes de añadir el complejo de microesferas junto con el anticuerpo soluble de ratón anti-CD28 (Pelicluster CD28 - Sanquin n.° M1650) a linfocitos T humanos primarios purificados aislados (aislados como se describe en el ejemplo 2.1) de distintos donadores sanos.
Además, se evaluó el efecto de la unión de TCR monovalente por los Nanobodies mediante la incubación del Nanobody con los linfocitos T humanos primarios purificados sin captura previa en dynabeads anti-IgG de ratón, en presencia de anticuerpo anti-CD28.
El estado de activación de los linfocitos T humanos primarios purificados se supervisó midiendo la expresión de CD69 en citometría de flujo usando CD69PE monoclonal de ratón antihumano (BD Biosciences n.° 557050 Biosciences) después de una incubación de 24 h a 37 °C y un 5 % de CO2 como se describe en el ejemplo 4.2.
En conclusión, los Nanobodies anti-TCR de todos los grupos mostraron una clara regulación por aumento de CD69 después de la captura en dynabeads anti-IgG de ratón. El Nanobody irrelevante no mostró ninguna regulación por aumento de CD69 (figura 7A). Además, ninguno de los Nanobodies presentados en solución pudo activar linfocitos T humanos primarios purificados, medidos por la expresión aumentada de CD69 (figura 7B).
Ejemplo 9: Unión de polipéptidos multiespecíficos de unión a TCR al complejo receptor de linfocitos T humanos expresado en células
Para demostrar que la redirección de linfocitos T acoplados a células tumorales es posible por los Nanobodies, se eligió el antígeno CD20 como diana tumoral ejemplar.
Se formatearon diferentes componentes básicos de unión a TCR (es decir, Nanobodies) en una construcción multiespecífica con un Nanobody dirigido a CD20 humana (véase la tabla C-5). Los Nanobodies contra efectores y tumor se ligaron genéticamente con un conector 35GS y posteriormente se expresaron en la levaduraPichiade acuerdo con protocolos convencionales (polipéptidos multiespecíficos).
Se generaron construcciones irrelevantes remplazando el Nanobody contra efector o tumor con un Nanobody antilisozima de huevo (cAblys) irrelevante (tabla C-5)
Tabla C-5: ID de muestra y descripción de construcciones multiespecíficas.
La unión de las construcciones multiespecíficas a TCR/CD3 humano expresado en células CHO-K1, linfocitos T humanos primarios purificados y células Ramos positivas para CD20 (ATCC: CRL-1596) se evaluó en citometría de flujo como se explica en el ejemplo 5. Los resultados se presentan en la figura 8.
Los valores de CE50 obtenidos de la curva de respuesta a dosis se representan en la tabla C-6.
Los datos indican una unión asimismo similar de los polipéptidos multiespecíficos TCRxCD20 en comparación con sus equivalentes monovalentes. Sin embargo, se detectó una unión reducida de los polipéptidos multiespecíficos CD20XTCR a células CHO-K1 con TCR(2XN9)/CD3 humano y a linfocitos T humanos primarios purificados en comparación con sus equivalentes monovalentes. En la línea celular Ramos positiva para CD20 humana, el polipéptido multiespecífico con CD20 en el extremo C mostró una unión reducida en comparación con los polipéptidos con CD20 en el extremo N.
Ejemplo 10: Caracterización funcional de polipéptidos multiespecíficos de unión a CD20xTCR en un ensayo de destrucción basado en citometría de flujo
Para evaluar si los polipéptidos multiespecíficos podían destruir células tumorales, se realizaron ensayos de citotoxicidad con linfocitos T humanos aislados como células efectoras.
Se aislaron linfocitos T humanos como se describe en el ejemplo 2.1. La calidad y pureza de los linfocitos T humanos purificados se comprobó con anticuerpos marcados con fluorescencia anti-CD3 (eBiosciences n.° 12 0037-73), anti-CD8 (BD Biosciences n.° 345775), anti-CD4 (BD Biosciences n.° 345771), anti-CD45RO (BD Biosciences n.° 555493), anti-CD45RA (BD Biosciences n.° 550855), anti-CD19 (BD Biosciences n.° 555413), anti-CD25 (BD Pharmigen n.° 557138) y anti-CD69 (BD Pharmigen n.° 557050) en un ensayo citométrico de flujo. Las células Ramos que expresan CD20 humana y las células Raji que expresan CD20 humana (ECACC: 85011429), marcadas con el tinte de membrana PKH-26 como se describe anteriormente, se usaron como células diana. Se coincubaron 2,5x105 células efectoras y 2,5x104 células diana en placas de fondo en V de 96 pocillos en una relación de efector frente a diana de 10:1. Para la medición de la lisis celular dependiente de la concentración, se añadieron diluciones en serie de polipéptidos multiespecíficos (tabla C-5) a las muestras y se incubaron durante 18 h en una atmósfera de un 5 % de CO2 a 37 °C. Después de la incubación, las células se sedimentaron mediante centrifugación y se lavaron con tampón FACS. Posteriormente, las células se resuspendieron en tampón FACS complementado con TOPRO3 5 nM (Molecular Probes cat. n.° T3605) para distinguir las células vivas de las muertas. Las células se analizaron usando un citómetro de flujo FACS Array (BD Biosciences). Por muestra, se adquirió un volumen total de muestra de 80 pl. Se estableció la ventana de adquisición en células positivas para PKH26, y dentro de esta población se determinaron las células positivas para TOPRO3.
Los polipéptidos multiespecíficos de unión a CD20xTCR mostraron una destrucción dependiente de la dosis de las células Ramos (figura 9A). T017000014 (grupo A, 20CD019C07-35GS-T0170028B01-FLAG3-HIS6) mostró una destrucción dependiente de la dosis tanto en células Ramos (figura 9A) como en células Raji (figura 9B), lo que confirma que el efecto citotóxico observado no estaba restringido a una sola línea celular tumoral. El nivel de expresión del antígeno tumoral CD20 se determinó para ambas líneas celulares (figura 10).
Los valores de CI50 y el % de lisis obtenidos de la curva de respuesta a la dosis se representan en la tabla C-7 (% de lisis = % de células muertas a 500 nM de Nanobody menos el % de células muertas del control sin Nanobody).
Estos resultados demuestran que los polipéptidos multiespecíficos de TCR pueden inducir la destrucción mediada por linfocitos T de líneas celulares positivas para diana tumoral. Cuando el Nanobody dirigido a diana o el Nanobody contra efector se remplazó por un Nanobody irrelevante, no se pudo observar efecto sobre la viabilidad de las células Ramos. No hubo una preferencia clara de la orientación entre los bloques de unión individuales en el polipéptido multiespecífico.
Ejemplo 11: Caracterización funcional de polipéptidos multiespecíficos de unión a CD20xTCR en un ensayo de destrucción basado en xCELLigence
Los polipéptidos multiespecíficos de unión a TCR también se ensayaron para determinar su toxicidad celular en células diana adherentes transfectadas con CD20 humana en presencia de linfocitos T efectores humanos utilizando una técnica basada en impedancia eléctrica instantánea. Aquí, se midieron las fluctuaciones en la impedancia inducidas por la adherencia de las células a la superficie de un electrodo. Los linfocitos T no son adherentes y, por lo tanto, no afectan a las mediciones de impedancia.
En resumen, la estación xCELLigence se colocó en una estufa de incubación de 37 °C en un 5 % de CO2. Se añadieron 50 pl de medio de ensayo a cada pocilio de una placa E-plate 96 (ACEA Biosciences; cat. n.° 05232 368 001) y se realizó una lectura en blanco sobre el sistema xCELLigence para medir la impedancia de fondo en ausencia de células. Posteriormente, se sembraron células CHO-K1 transfectadas con CD20 humana o células de referencia CHO-K1 (1x104) en las placas E-plate 96, y se añadieron 50 pl de una dilución en serie de polipéptido multiespecífico. Después de 30 min a TA, se añadieron 50 pl de linfocitos T humanos por pocillo (3x105) para tener una relación de efector a diana de 30:1. La placa se colocó en la estación xCELLigence y se midió la impedancia cada 15 min durante 3 días. Los datos se analizaron usando un punto temporal fijo indicado en los resultados.
Los valores de CI50 se representan en la tabla C-8.
Tabla C-8: CI50 (M) de los polipéptidos multiespecíficos en el ensayo de destrucción CD20 de CHO-K1 mediada por linfocitos T humanos basado en xCELLigence usando una relación de efector a diana de 30 a 1, analizada 44 h después de la siembra.
Los polipéptidos multiespecíficos mostraron una destrucción dependiente del antígeno tumoral. Los polipéptidos multiespecíficos no pudieron inducir la destrucción mediada por linfocitos T de las células de referencia CHO-K1, pero indujeron la destrucción mediada por linfocitos T humanos dependiente de la dosis de las células CHO-K1 transfectadas con CD20. En la figura 11 se muestra un ejemplo.
Estos resultados confirman el resultado obtenido en el ensayo de destrucción basado en citometría de flujo del ejemplo 10. Además, solo cuando el antígeno diana tumoral está presente se observó destrucción mediada por linfocitos T, lo que indica que los polipéptidos multiespecíficos son dependientes de forma crucial de su diana para la inducción de citotoxicidad.
Ejemplo 12: Evaluación de la longitud del conector de los polipéptidos multiespecíficos
Para evaluar el impacto de la longitud del conector usado en los polipéptidos multiespecíficos de unión a CD20/TCR sobre la capacidad citotóxica, se ligaron genéticamente los componentes básico efector y tumoral con un conector 5GS (SEQ ID NO: 376), 9GS (SEQ ID NO: 378) o 35GS (SEQ ID NO: 385) y posteriormente se expresaron enPichiade acuerdo con protocolos convencionales (véase la tabla C-9).
Tabla C-9: ID de la muestra y descripción de construcción multiespecífica para evaluar el impacto de la longitud del conector.
El impacto de la longitud del conector usado en los polipéptidos multiespecíficos de unión a CD20/TCR sobre la toxicidad celular inducida por linfocitos T efectores primarias humanos sobre las células diana adherentes CHO-K1 transfectadas con CD20 humana se evaluó usando una técnica basada en la impedancia eléctrica instantánea como se describe en el ejemplo 11.
Los resultados se resumen en la figura 12.
Todos los polipéptidos multiespecíficos, es decir, todas las longitudes de conector demostraron la destrucción celular específica. Inesperadamente, los polipéptidos multiespecíficos de TCR con el conector más largo (conector 35GS) mostraron la mejor potencia. En vista de estos resultados, se realizaron experimentos adicionales con polipéptidos multiespecíficos que comprenden el conector 35GS.
Ejemplo 13: Influencia de la relación de efector a diana sobre el efecto de destrucción de los polipéptidos multiespecíficos
Para evaluar el efecto de diferentes relaciones de efector a diana (E:T) sobre las propiedades de destrucción de los polipéptidos, se incubaron polipéptidos multiespecíficos de unión a CD20xTCR con 2,5x104células Ramos marcadas con PKH en presencia de, respectivamente, 2,5x105(E:T = 10:1), 1,25x105 (E:T = 5:1), 5x104 (E:T = 2:1) y 2,5x104 (E:T = 1:1) linfocitos T primarios humanos como se describe en el ejemplo 10.
Los resultados ejemplares se muestran en la figura 13. Los valores de CI50 se representan en la tabla C-10. Tabla C-10: CI50 (M) de los polipéptidos multiespecíficos en el ensayo de destrucción de Ramos mediada por linfocitos T basado en citometría de flujo usando diferentes relaciones de efector a diana.
Ambas construcciones pudieron destruir las células diana de CD20 humana a diferentes relaciones de E:T, incluso a una relación de 1:1, después de un tiempo de incubación de 18 h con poca diferencia en la potencia. Aunque hubo un impacto en la relación de E:T sobre el % de lisis, esto también se podría asociar al tiempo de incubación (véase a continuación).
Ejemplo 14: Actividad citolítica dependiente del tiempo de construcciones multiespecíficas de unión a CD20/TCR en el ensayo mediado por linfocitos T humanos primarios purificados en xCELLigencePara evaluar el impacto del tiempo de incubación en las propiedades de destrucción de las construcciones multiespecíficas de unión a CD20xTCR, se calculó la lisis específica de células diana para diferentes puntos temporales en xCELLigence. En resumen, la estación xCELLigence se colocó en una estufa de incubación de 37 °C en un 5 % de CO2. Se añadieron 50 gl de medio de ensayo a cada pocillo de una placa E-plate 96 (ACEA Biosciences; cat. n.° 05232368001) y se realizó una lectura en blanco sobre el sistema xCELLigence para medir la impedancia de fondo en ausencia de células. Posteriormente, se sembraron células CHO-K1 transfectadas con CD20 humana o de referencia CHO-K1 (1x104) en las placas E-plate 96. Después de 20 h, se añadieron 3x105 linfocitos T humanos primarios purificados (descritossupra)y construcciones multiespecíficas 100 nM o 1,5 nM, respectivamente. Se midió el índice celular (IC) cada 15 min durante 5 días. Usando el IC normalizado (el índice celular normalizado - ICN, se calcula dividiendo el valor del índice celular en un punto temporal particular por el valor del índice celular del punto de tiempo en que se añadieron los linfocitos T humanos primarios purificados), se calculó la lisis específica en diferentes puntos temporales de la condición con construcciones con respecto a la condición que no tenía construcción. (% de lisis específica = ((ICN<sin construcción>- ICN<con construcción>)/ICN<sin construcc ión>))x100.
Los resultados se representan en la figura 14.
Ya una hora después de la adición de los linfocitos T primarios humanos y la construcción multiespecífica, se puede observar un aumento de la lisis celular que claramente aumentó aún más con tiempos de incubación más largos. El efecto máximo fue claramente dependiente del tiempo de incubación, pero el valor de CI50 obtenido no cambió con tiempos de incubación aumentados. La construcción irrelevante no mostró ninguna destrucción de las células CHO-K1 transfectadas con CD20 humana.
Ejemplo 15: Exploración de la prolongación de la semivida (HLE)
Se planteó la hipótesis de que la HLE mediante unión a albúmina podría ser adecuada para cumplir con diversos requisitos, incluyendo (i) prolongación de la semivida (HLE) del resto; y (ii) eficacia del polipéptido multiespecífico. Preferiblemente, la función de HLE no alteraría la penetración de tumores y tejidos.
Alb11 (SEQ ID NO: 404), un Nanobody que se une a seroalbúmina humana (HSA) se ligó a los polipéptidos multiespecíficos CD20xTCR para aumentar la semividain vivode las moléculas con formato (documento WO 06/122787). Se generaron varios formatos basados en el componente básico dirigido a tumor CD20 en el extremo N, los componentes básicos de reclutamiento de TCRa/p en el centro y el Nanobody dirigido a albúmina en el extremo C, usando un conector 35GS y expresados como se indica anteriormente. En la tabla C-11 se muestra una descripción general de los formatos explorados.
Tabla C-11: ID de muestra y descripción de construcciones de HLE
Como la adición del Nanobody Alb11 podría influir en la afinidad o la potencia de la construcción y la unión de HSA al Nanobody Alb11 podría tener impacto sobre la afinidad o la potencia de las construcciones de semivida prolongada, se caracterizaron las construcciones de semivida prolongada para su unión a células CHO-K1 que sobreexpresan TCR y linfocitos T humanos primarios. Además, se evaluó la potencia en el ensayo de destrucción de linfocitos B de Ramos dependiente de linfocitos T funcionales en presencia y ausencia de HSA (descrito en 15.1 y 15.2 a continuación).
15.1 Impacto del componente básico Alb11 en las propiedades de unión
De forma análoga a los experimentos descritos en el ejemplo 5, se evaluó la unión de polipéptidos anti-TCR con semivida prolongada a células CHO-K1 de TCR(2XN9)/CD3 humano, linfocitos T humanos primarios y células Ramos en un ensayo citométrico de flujo en ausencia de HSA.
Los resultados se proporcionan en la figura 15. Los valores de CE50 obtenidos en este ensayo se enumeran en la tabla C-12.
La comparación de la construcción de HLE de CD20-35GS-TCR con las construcciones sin HLE mostró una unión similar en las tres líneas celulares ensayadas. Los datos presentados mostraron que el acoplamiento del componente básico Alb11 no influyó en las propiedades de unión.
15.2 Impacto de seroalbúmina humana sobre la potencia en ensayo de destrucción de linfocitos B mediada por linfocitos T humanos
Se evaluó la funcionalidad de los polipéptidos anti-TCR con semivida prolongada en el ensayo de destrucción de Ramos mediada por linfocitos T humanos como se describe en el ejemplo 10 en presencia y ausencia de HSA 30 pM, y se comparó con la funcionalidad de las construcciones multiespecíficas sin HLE.
Los resultados se representan en la figura 16. Los valores de CI50 obtenidos en este ensayo se enumeran en la tabla C-13.
Tabla C-13: CI50 (M) de y % de lisis por los polipéptidos HLE en el ensayo de destrucción de linfocitos B (Ramos) dependiente de linfocitos T para evaluar el efecto de la HLE.
Los resultados indican que la inclusión del Nanobody dirigido a albúmina en la construcción tal cual no tuvo un impacto esencial en la potencia o eficacia obtenida. Aunque se observó una pérdida menor de eficacia/potencia en presencia de HSA, los polipéptidos multiespecíficos de TCR de semivida prolongada seguían siendo potentes en la destrucción de células tumorales.
Ejemplo 16: Caracterización funcional de polipéptidos multiespecíficos en un ensayo de destrucción de tumor positivo a HER2 mediada por linfocitos T humanos basado en xCELLigence
Para evaluar la aplicabilidad general de los componentes básicos de TCR en la dirección de linfocitos T a células tumorales, los componentes básicos de TCR se combinaron con el componente básico que se une a un TAA diferente, en este caso un Nanobody que se une a HER2.
El componente básico anti-TCR se combinó con un Nanobody que se une al antígeno de tumor sólido HER2 en dos orientaciones (tabla C-14) y se caracterizó en el ensayo de destrucción de tumor positivo a HER2 mediada por linfocitos T humanos basado en xCELLigence como se describe en el ejemplo 11 usando dos líneas celulares que expresan HER2 (SKBR3 (ATCC: HTB-30), MCF-7 (ATCC: HTB-22)) y una línea celular de referencia negativa a h Er 2 (MDA-MB-468 (ATCC HTB-132)) como población de células diana. Los niveles de expresión de HER2 humano se confirmaron usando 100 nM del Nanobody monovalente anti-HER2 HER2005F07 (SEQ ID NO: 350) en citometría de flujo como se describe en el ejemplo 5. Los resultados se muestran en la figura 17.
Tabla C-14: ID de muestra y descripción de polipéptidos de unión a HER2/TCR.
En resumen, se sembraron SKBR3 (4x104 células/pocillo), MDA-MB-468 (4x104 células/pocillo) o MCF-7 (2x104 células/pocillo) en placas E-plate de 96 pocillos y se incubaron con 6x105 células o 3x105 linfocitos T primarios humanos (relación de efecto a diana de 15 a 1) en presencia o ausencia de las construcciones multiespecíficas y se siguieron a lo largo del tiempo. Los datos se analizaron después de 18 h y se muestran en la figura 18.
Los valores de CI50 obtenidos en este ensayo se enumeran en la tabla C-15.
Los datos indican destrucción específica de líneas celulares tumorales HER2 - positivas al dirigir los linfocitos T primarios humanos a las células tumorales mediante el Nanobody anti-TCR. Por tanto, los componentes básicos de unión TCR son ampliamente aplicables para dirigir linfocitos T citotóxicos a tumores. A pesar de la gran diferencia en la densidad del antígeno tumoral en las células SKBR3 y MCF-7, ambas se destruyeron de manera eficiente mediante la adición de construcciones de polipéptido multiespecífico.
Ejemplo 17: Efecto de los polipéptidos de unión a HER2/TCR sobre la liberación de IFN-y por linfocitos T humanos en el ensayo de destrucción de células tumorales positivas a HER2
Para evaluar adicionalmente la amplia aplicabilidad de los componentes básicos de unión a TCR, se supervisó la inducción de la liberación de citocinas durante el ensayo de destrucción de SKBR3 mediada por linfocitos T humanos basado en xCELLigence. La liberación de la citocina IFN-y se midió mediante ELISA. En resumen, las células SKBR3 se sembraron en placas de E-plate 96 en presencia de linfocitos T primarios humanos purificados con o sin polipéptidos multiespecíficos de unión a HER2/TCR o irrelevantes, como se describe en el ejemplo 16. A las 72 h después de la adición de los linfocitos T primarios humanos/polipéptidos a las placas E-plate, se midió la producción de IFN-y por los linfocitos T primarios humanos. Las placas de ELISA de 96 pocillos MaxiSorp (Nunc) se recubrieron con anticuerpo anti-IFN-y humano (BD Biosciences n.° 551221). Después de la incubación durante la noche, las placas se lavaron y se bloquearon con PBS BSA al 2 % durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las placas se incubaron con 100 gl de los sobrenadantes (diluidos en factor 2) y 1 gg/ml de anticuerpo biotinilado anti-IFN-y humano (BD Biosciences, n.° 554550) 2 h 30 min mientras se agitaban, se lavaron de nuevo y se incubaron con estreptavidina-HRP (DakoCytomation n.° P0397). Después de 30 min, se añadió solución TMB One Solution (Promega n.° G7431). La reacción se detuvo con H<2>SO<4>2 M y la producción de IFN-y dependiente de la dosis de polipéptido se determinó por medición de la DO a 405 nm usando Tecan sunrise 4.
Los resultados se muestran en la figura 19. Los valores de CE50 obtenidos en este ensayo se enumeran en la tabla C-16.
Los polipéptidos multiespecíficos de unión a HER2/TCR indujeron una producción dependiente de la dosis de la citocina IFN-y, lo que indica que los linfocitos T humanos se activaron solo en presencia del polipéptido relevante.
Ejemplo 18: Reactividad cruzada en macaco de Nanobodies anti-TCR
Se evaluó la reactividad cruzada de los componentes básicos de unión a TCR con TCR del macaco.
18.1 Caracterización funcional de los polipéptidos multiespecíficos en un ensayo de destrucción de tumor Ramos positivo a CD20 mediada por linfocitos T de macaco
En un primer experimento, se estableció un ensayo de destrucción por citometría de flujo, esencialmente como se describe en el ejemplo 10, usando 2,5x10<5>linfocitos T primarios de macaco (aislados usando el kit de aislamiento de linfocitos Pan T MACS n.° 130-091-993) como células efectoras y 2,5x10<4>células Ramos positivas a CD20 humana como células diana.
Los valores de CI50 y el % de lisis obtenidos de la curva de respuesta a dosis se representan en la tabla C-17. Los resultados se muestran en la figura 20.
Los polipéptidos multiespecíficos de unión a TCR que contenían un componente básico de unión a TCR perteneciente al grupo A mostraron destrucción dependiente de la dosis de las células Ramos usando linfocitos T de macaco.
18.2 Caracterización funcional de los polipéptidos multiespecíficos en un ensayo de destrucción de células CHO-K1 positivas a CD20 humana mediada por linfocitos T de macaco
Para evaluar adicionalmente la reactividad cruzada de los componentes básicos de unión a TCR en las construcciones multiespecíficas de unión a TCR/CD20, se usó el ensayo de destrucción basado en xCELLigence usando linfocitos T de macaco primarios purificados esencialmente como se describe en el ejemplo 11.
El ensayo usó una relación de efector a diana de 30 a 1, es decir, 3x10<5>linfocitos T de macaco efectores (aislados usando el kit de aislamiento de linfocitos Pan T MACS n.° 130-091-993) y 1x10<4>células diana CHO-K1 con CD20 humana.
Los valores de CI50 obtenidos en este ensayo se enumeran en la tabla C-18. Los resultados se resumen en la figura 21.
Puede concluirse que los polipéptidos multiespecíficos de unión a TCR que contienen un componente básico de unión a TCR perteneciente al grupo A mostraron destrucción dependiente de la dosis de las células CHO-K1 transfectadas con CD20 usando linfocitos T de macaco. Por tanto, los Nanobodies del grupo A reaccionan de forma cruzada con los linfocitos T de macaco primarios y pueden provocar una potente destrucción basada en estos linfocitos T de macaco.
18.3 Unión de Nanobodies anti-TCR a la proteína del receptor de linfocitos T de macaco (ELISA)
La unión de Nanobodies monovalentes anti-TCR purificados a la proteína TCR a/p de macaco recombinante soluble se evaluó en ELISA (como se describe en el ejemplo 1.2) usando 2 gg/ml de proteína TCR-a/p cremallera recombinante soluble recubierta directamente.
Los valores de CE50 obtenidos de la curva de respuesta a dosis se representan en la tabla C-19.
En la figura 22 se muestra un resultado ejemplar.
Tabla C-19: CE50 (M) de Nanobodies monovalentes anti-TCR para la unión a proteína TCR/CD3 de macaco recombinante soluble, determinada en ELISA.
Los resultados indican que los Nanobodies anti-TCR del grupo A y del grupo B se unen a la proteína TCR-a/p cremallera soluble recombinante de macaco.
18.4 Evaluación de la reactividad cruzada en macaco en interferometría de biocapa
Las afinidades de unión de los Nanobodies monovalentes anti-TCR se midieron usando interferometría de biocapa (BLI) en un instrumento Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.) esencialmente como se describe en el ejemplo 7.1 usando TCR a/p cremallera de macaco. Los resultados se representan en la figura 23, las características de unión de los Nanobodies anti-TCR se enumeran en la tabla C-20.
Tabla C-20: Características de unión de Nanobodies monovalentes anti-TCR determinadas en Octet usando proteína TCR-cremallera de macaco directamente recubierta.
Los Nanobodies del grupo A se unen a TCR a/p cremallera recombinante soluble de macaco con una afinidad 10 veces menor en comparación con TCR a/p cremallera recombinante soluble humano.
18.5 Caracterización funcional polipéptidos multiespecíficos de semivida prolongada en un ensayo de destrucción de tumor Ramos positivo a CD20 mediada por linfocitos T de macaco
De forma análoga a la configuración descrita en el ejemplo 18.1, se evaluaron los polipéptidos de unión a TCR de semivida prolongada en un ensayo de destrucción de Ramos mediada por linfocitos T de macaco.
Los valores de CI50 obtenidos en este ensayo se enumeran en la tabla C-21. Los resultados se representan en la figura 24.
Tabla C-21: CI50 de y % de lisis por polipéptidos multiespecíficos HLE en el ensayo de destrucción de linfocitos B (Ramos) dependiente de linfocitos T de macaco para evaluar el efecto de HLE.
Los polipéptidos multiespecíficos de unión a TCR con HLE prolongada que contienen un componente básico de unión a TCR perteneciente al grupo A mostraron destrucción dependiente de la dosis de las células de Ramos usando linfocitos T primarios purificados de macaco. La inclusión del ALB11 en la construcción tal cual no repercutió en la potencia (solapamiento del IC). Al añadir HSA, se observó un pequeño descenso de la eficacia, mientras que la potencia no se vio afectada.
18.6 Caracterización funcional de polipéptidos multiespecíficos de unión a CD20xTCR de semivida prolongada en un ensayo de destrucción de células tumorales positivas CHO-CD20 mediada por linfocitos T de macaco
Para confirmar los datos en el ensayo basado en citometría de flujo, se ensayaron las construcciones HLE en la destrucción de CHO-K1 con CD20 humana basada en xCELLigence usando linfocitos T de macaco primarios purificados como se describe en el ejemplo 11.
Los resultados se muestran en la figura 25. Los valores de CI50 obtenidos de la curva de respuesta a dosis se representan en la tabla C-22.
Tabla C-22: CI50 (M) de las construcciones multiespecíficas de unión a TCR/CD20 y HLE en el ensayo de destrucción de tumor CHO-K1 con CD20 humana mediada por linfocitos T de macaco para evaluar el efecto de ALB11 y HSA.
Los polipéptidos multiespecíficos de unión a TCR HLE mostraron destrucción dependiente de la dosis de células CHO-K1 transfectadas con CD20 humana usando linfocitos T de macaco, lo que confirma que ALB11 no tiene ningún impacto en la reactividad cruzada en macaco del componente básico de unión a TCR.
18.7 Caracterización funcional de polipéptidos multiespecíficos en un ensayo de destrucción de células tumorales Ramos positivas a HER2 mediada por linfocitos T de macaco
Los polipéptidos multiespecíficos se caracterizaron funcionalmente en un ensayo de destrucción de células tumorales positivas a HER2 mediada por linfocitos T de macaco. En resumen, los polipéptidos multiespecíficos de unión a TCR/HER2 se evaluaron en un ensayo de destrucción basado en xCELLigence esencialmente como se describe en el ejemplo 16, usando 6x105 linfocitos T de macaco como células efectoras y 4x104 SKBR3 como células diana (efector a diana de 30 a 1). Los datos se analizaron después de 18 h.
Los resultados se representan en la figura 26. Los valores de CI50 obtenidos en este ensayo se enumeran en la tabla C-23.
La reactividad cruzada en macaco del componente básico de unión a TCR se confirmó usando las construcciones multiespecíficas de unión a HER2/TCR.
Ejemplo 19: Demostración preliminar in vivo en un modelo de reducción de linfocitos B de Ramos
En este modelo de reducción de linfocitos B se inyectaron células Ramos (una línea celular de linfoma de Burkitt) y PBMC humanos, respectivamente, por vía intravenosa e intraperitoneal, en ratones NOG. Se evaluó la destrucción de linfocitos B de Ramos y linfocitos B derivados de PBMC mediante el reclutamiento mediado por Nanobody de linfocitos T presentes en la población de PBMC, que refleja el potencial de los polipéptidos multiespecíficos de activar linfocitos T mediante enlace directo de linfocitos T a través de TCR a linfocitos B diana a través de CD20, lo que provoca la destrucción de células diana.
Se evaluó la eficaciain vivodel polipéptido biespecífico T017000083 (unión a CD20xTCR) sobre la reducción de linfocitos B en un modelo de ratón NOG de Ramos y se comparó con el polipéptido multiespecífico irrelevante T017000088 (Nanobody irrelevante Nanobody de unión a TCR). El estudio demostró un efecto estadísticamente significativo en la médula ósea y el bazo sobre la reducción de linfocitos B de Ramos y sobre la reducción de linfocitos B derivados de PBMC en el bazo.
En detalle, la reducción de linfocitos B se evaluó en ratones, a los que se había inyectado por vía intravenosa 106 células Ramos en 200 gl de medio 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) en el día uno (D1). Esta inyección tuvo lugar 24 horas después de una irradiación corporal completa de los ratones con una fuente de y (1,44 Gy, 60 Co) (D0). Se inyectaron 107 PBMC (500 gl en P<b>S) en D3 (es decir, dos días después de la inyección de las células tumorales) después de la aleatorización de los ratones en grupos de 24 animales cada uno. El tratamiento comenzó en D3 una hora después de la inyección de PBMC y se repitió durante 5 días consecutivos en total hasta D7 (figura 27). Se ensayaron tres niveles de dosis de los polipéptidos de unión a TCR/CD20 (0,5 mg/kg, 5 mg/kg y 23 mg/kg).
[0429] En D20 o en D21, se sacrificaron los ratones y se recogieron el bazo y la médula ósea (fémur) para el análisis FACS (mCD45, hCD45, hCD19, hCD20, hCD10) para analizar y cuantificar la presencia de linfocitos B de Ramos (hCD19+ hCD20+ hCD45+ hCD45- hCD10+) y linfocitos B derivados de PBMC (hCD19+ hCD20+ hCD45+ mCD45- hCD10-).
Los resultados para la reducción de linfocitos B de Ramos se representan en la figura 28A y la figura 28B. Los ratones tratados con un polipéptido multiespecífico irrelevante se consideraron el grupo de control para los análisis. En la figura 28A se observó un patrón de respuesta a la dosis en la médula ósea para T017000083 (CD20/TCR) frente al polipéptido multiespecífico irrelevante para reducir el número de células Ramos. Los 2 niveles de dosis más altos para el polipéptido multiespecífico de unión a CD20/TCR fueron significativamente diferentes estadísticamente del polipéptido multiespecífico irrelevante. El análisis estadístico se ha realizado con pruebas de F del análisis ANOVA de efectos mixtos. Para el bazo, todos los niveles de dosis ensayados de T017000083 fueron significativamente diferentes estadísticamente del polipéptido multiespecífico irrelevante, como se representa en la figura 28B. El patrón de respuesta a la dosis en el bazo fue menos pronunciado, ya que todas las dosis estaban cercanas a o se estimaron en el efecto máximo y, por tanto, fueron muy similares.
Los resultados de la reducción de linfocitos B derivados de PBMC se representan en la figura 28C y en la figura 28D. En la médula ósea, se observó un patrón de respuesta a la dosis para T017000083, como se representa en la figura 28C. La diferencia estimada en el número de linfocitos B humanos para T017000083 frente al polipéptido multiespecífico irrelevante para los 2 niveles de dosis más altos fue significativamente diferente estadísticamente al nivel de significación del 5 %. En el bazo, los recuentos de linfocitos B fueron significativamente diferentes estadísticamente del grupo tratado con polipéptido multiespecífico irrelevante en todos los grupos tratados con T017000083, y esto a todos los niveles de dosis ensayados. El patrón de respuesta a la dosis fue menos pronunciado, ya que todas las dosis estaban cercanas a o se estimaron en el efecto máximo y, por tanto, fueron muy similares, aunque se observó un aumento de la diferencia estimada con el aumento de la dosis.
En conclusión, estos resultados demuestran que los polipéptidos multiespecíficos de CD20/TCR pueden disminuir significativamente los linfocitos B de Ramos y los linfocitos B derivados de PBMC en el bazo y los linfocitos B de Ramos en médula ósea en este modelo. Esto confirma la activación de linfocitos T inducida por polipéptido mediante enlace cruzado de linfocitos T a linfocitos B diana y la destrucción de estos últimos.
Ejemplo 20: Demostración preliminar in v iv o en un modelo de reducción de linfocitos B de PBMC
En este modelo de reducción de linfocitos B se inyectaron PBMC humanos por vía intraperitoneal en ratones NOG. Se evaluó la destrucción de linfocitos B derivados de PBMC mediante el reclutamiento mediado por polipéptidos de linfocitos T presentes en la población de PBMC, que refleja el potencial de los polipéptidos de la invención de activar linfocitos T mediante enlace directo de linfocitos T a través de TCR a linfocitos B diana a través de CD20, lo que provoca la destrucción de células diana.
Se evaluó la eficaciain vivodel polipéptido multiespecífico T017000083 (unión a CD20xTCR) sobre la reducción de linfocitos B en un modelo de ratón NOG de PBMC y se comparó con el polipéptido irrelevante T017000088. El estudio demostró un efecto claro sobre la reducción de linfocitos B derivados de PBMC en el bazo.
En detalle, la reducción de linfocitos B se evaluó en ratones, a los que se había inyectado por vía intraperitoneal 3x107 PBMC en 500 gl de PBS en el día tres (D3) después de una irradiación corporal completa de los ratones con una fuente de y (1,44 Gy, 60 Co) (D0) y aleatorización de los ratones en grupos de 12 animales cada uno. El tratamiento comenzó en D3 una hora después de la inyección de PBMC y se repitió durante 5 días consecutivos, en total hasta el día 7 (D7) (figura 29). Se ensayaron tres niveles de dosis del polipéptido de unión a CD20/TCR (0,5 mg/kg, 5 mg/kg y 23 mg/kg).
El día 18 (D18), se sacrificaron los ratones y se recogió el bazo para el análisis FACS (mCD45, hCD45, hCD19, hCD20) para analizar y cuantificar la presencia de linfocitos B humanos derivados de PBMC (hCD19+ hCD20+ hCD45+ MCD45-).
Los resultados para la reducción de linfocitos B derivados de PBMC se representan en la figura 30. En el bazo, los recuentos de linfocitos B fueron claramente diferentes del grupo tratado con polipéptido irrelevante en todos los grupos tratados con T017000083 y esto a todos los niveles de dosis ensayados. El patrón de respuesta a la dosis no fue pronunciado, ya que todas las dosis están cercanas a o se estimaron en el efecto máximo y, por tanto, fueron muy similares.
En conclusión, estos resultados demuestran que un polipéptido multiespecífico de unión a CD20/TCR puede disminuir significativamente los linfocitos B derivados de PBMC en el bazo en este modelo. Esto confirma la activación de linfocitos T inducida por polipéptido mediante enlace cruzado de linfocitos T a linfocitos B diana y la destrucción de estos últimos.
Ejemplo 21: Focalización de células tumorales con polipéptidos que se acoplan a linfocitos T multiespecíficos
La actividad terapéutica de la estrategia de acoplamiento de linfocitos T puede mejorarse mediante la focalización simultánea de múltiples antígenos asociados a tumor. A menudo, las células tumorales crean un mecanismo de escape mediante la regulación por disminución de antígenos diana dentro de un tratamiento. Es probable que abordar simultáneamente múltiples antígenos reduzca la probabilidad de generar variantes de escape tumoral. La afinidad individual de los Nanobodies dirigidos al tumor respectivo puede variarse de modo que se consiga la unión preferible a un solo marcador o la unión simultánea a ambos marcadores tumorales. Los antígenos presentes en diferentes poblaciones celulares pueden combinarse o incluso las proteínas solubles pueden abordarse en combinación con un antígeno asociado a tumor.
Como la plataforma Nanobody es idealmente adecuada para combinar diferentes especificidades en un formato multiespecífico, los Nanobodies anti-TCR usados en la invención se combinan en formatos que ilustran estos conceptos, es decir, con diferentes Nanobodies de unión a antígeno tumoral en un polipéptido multiespecífico.
Para el concepto de focalización de antígeno tumoral doble, un Nanobody reactivo hacia un primer antígeno tumoral (TA1, por ejemplo, CEA) se une a un segundo Nanobody con diferente especificidad (TA2, por ejemplo, EGFR), diferente de TA1, en combinación con un Nanobody reactivo a TCR. El orden específico de los componentes básicos se varía dentro del formato, así como las longitudes de conector aplicado entre los diferentes componentes básicos. Las combinaciones de TA1 y TA2 que se ensayan se representan en la tabla C-24.
Tabla C-24: Combinación de componentes básicos de unión a TCR, TA1, TA2 y Alb en polipéptidos multiespecíficos.
Para ensayar la prolongación de la semivida, se incluye un Nanobody de Alb también en los polipéptidos como se expone en la tabla C-24.
Para demostrar la destrucción específica, se usa un sistema de ensayo de cultivo celular mixto donde se coincuban células tumorales positivas a solo TA1 (por ejemplo, MC38-huCEA o MKN45) y positivas solo a TA2 (por ejemplo, Hela o Her14). El nivel de expresión de los respectivos antígenos tumorales se determinó en diferentes líneas celulares y se representa en la figura 31. Tras la adición de los polipéptidos de la invención, los linfocitos T humanos primarios y la albúmina si es necesario, se supervisa la citotoxicidad mediada por linfocitos T en función de una lectura citométrica. Se hace una comparación con respecto a células o formatos doblemente negativos que contienen uno o más Nanobodies irrelevantes.
Para verificar la destrucción específica, la destrucción inducida de células tumorales doblemente positivas (para TA1 y TA2, por ejemplo, LS174T o LoVo) se compara con la destrucción inducida de células tumorales positivas simples. Para esto, se usa un ensayo de citotoxicidad mediada por linfocitos T como se describe anteriormente con un solo tipo de células tumorales positivas para ambos marcadores (véase el ejemplo 19).
Ejemplo 22: Focalización de células tumorales con polipéptidos que se acoplan a linfocitos T multiespecíficos
Como se menciona anteriormente, la actividad terapéutica de la estrategia de acoplamiento de linfocitos T puede mejorarse mediante la focalización simultánea de múltiples antígenos asociados a tumor. No solo las células tumorales crean un mecanismo de escape mediante la regulación por disminución de antígenos diana dentro de un tratamiento, sino también por la introducción de mutaciones (puntuales). También en este caso, es probable que abordar simultáneamente múltiples epítopos en un antígeno reduzca la probabilidad de generar variantes de escape tumoral. Además, abordar múltiples epítopos en un solo antígeno puede aumentar la afinidad de unión (efecto de avidez).
Como la plataforma Nanobody es idealmente adecuada para combinar diferentes especificidades en un formato multivalente, los Nanobodies anti-TCR usados en la invención se combinan en formatos que ilustran estos conceptos, es decir, con diferentes Nanobodies de unión a antígeno tumoral en un polipéptido multiespecífico.
Para el concepto de focalización multivalente de antígenos tumorales, se enlazan dos Nanobodies reactivos hacia un antígeno (TA1 y TA2, respectivamente), seguidos de un Nanobody reactivo a TCR. El orden específico de los componentes básicos se varía dentro del formato, así como las longitudes de conector aplicado entre los diferentes componentes básicos. Las combinaciones de TA1 y TA2 que se ensayan se representan en la tabla C-25.
Tabla C-25: Combinación de componentes básicos de unión a TCR, TA1, TA2 y Alb en polipéptidos multiespecíficos.
Para ensayar la prolongación de la semivida, se incluye un Nanobody de unión a albúmina también en los polipéptidos como se expone en la tabla C-25.
La potencia y eficacia de estos formatos multivalentes se evalúa y se compara con los formatos biespecíficos respectivos en un ensayo de destrucción de células tumoralesin vitrocomparable al ensayo descrito en el ejemplo 10, pero con las líneas celulares relevantes (por ejemplo, Hela, Her14, Ls174T, SKBR3, MCF7). Además, la relación de efector-diana se varía de modo que se hace una estimación de si un polipéptido multivalente/multiespecífico tiene una eficacia más alta con relaciones de efector a diana más bajas.
Ejemplo 23: Unión de Nanobodies monovalentes y polipéptidos multiespecíficos a células en citometría de flujo
Como se describe anteriormente, la actividad terapéutica de la estrategia de acoplamiento de linfocitos T puede mejorarse mediante la focalización simultánea de múltiples antígenos asociados a tumor, ya que las células tumorales a menudo crean un mecanismo de escape mediante la regulación por disminución de los antígenos abordados dentro de un tratamiento. Es probable que abordar simultáneamente múltiples antígenos reduzca la generación de variantes de escape tumoral.
Para este concepto de focalización de antígeno tumoral doble, un Nanobody reactivo hacia un primer antígeno tumoral (EGFR) se ligó a un segundo Nanobody con diferente especificidad (CEACAM5), en combinación con un Nanobody reactivo a TCR. El orden específico de los componentes básicos se varió dentro del formato. Los Nanobodies contra efectores y tumor se ligaron genéticamente con el conector 35GS y posteriormente se expresaron en la levaduraPichiade acuerdo con protocolos convencionales. Se generaron construcciones irrelevantes remplazando el Nanobody contra tumor con un Nanobody antilisozima de huevo (cAblys) irrelevante (tabla C-26).
Tabla C-26: ID de muestra y descripción de polipéptidos multiespecíficos.
La unión dependiente de la dosis de los Nanobodies monovalentes y los polipéptidos multiespecíficos a líneas celulares cancerosas que expresan CEACAM5 y EGFR (LoVo; ATCC C<c>L-229 y LS174T; ECACC 87060401), una línea celular que expresa EGFR (HER14; NIH3T3 (ATCC CRL-1658) transfectada con EGFR), y a linfocitos T humanos primarios purificados (aislados como se describe en el ejemplo 2.1) se evaluó en citometría de flujo como se explica en el ejemplo 5. Los resultados se presentan en la figura 32.
El nivel de expresión de los antígenos tumorales respectivos en las diferentes células se determinó en citometría de flujo usando 100 nM de un Nanobody monovalente anti-EGFR (EGFR038G07) y un Nanobody monovalente anti-CEA, como se describe en el ejemplo 5. Los resultados se muestran en la figura 33.
Los valores de CE50 obtenidos de la curva de respuesta a dosis para la unión a células HER14 se representan en la tabla C-27. Los valores de CE50 obtenidos de la curva de respuesta a dosis para la unión a células LS174T y LoVo se representan en la tabla C-28.
Tabla C-27: CE50 (M) de Nanobodies monovalentes y polipéptidos multiespecíficos para la unión de células HER14 determinada en citometría de flujo.
Tabla C-28: CE50 (M) de Nanobodies monovalentes y polipéptidos multiespecíficos para la unión de células LoVo y LS174T determinada en citometría de flujo.
Los datos mostraron la unión del Nanobody monovalente de EGFR y de los polipéptidos multiespecíficos que contienen el componente básico de EGFR a las células HER14, que expresan solo EGFR. No se observó ninguna unión del Nanobody monovalente de CEACAM ni de los polipéptidos multiespecíficos que contenían solo el componente básico de anclaje tumoral CEACAM5. Todos los polipéptidos monovalentes y multiespecíficos mostraron unión a las líneas celulares LS174T y LoVo doblemente positivas a EGFR, CEACAM5, como era de esperar. También hubo unión de los polipéptidos multiespecíficos a los linfocitos T primarios humanos. Se observó un descenso de la afinidad de los polipéptidos multiespecíficos frente al componente básico de TCR monovalente debido a la posición C terminal del componente básico de TCR.
Ejemplo 24: Unión de Nanobodies monovalentes a EGFR humano y a la proteína CEACAM5 (SPR)
La afinidad de unión del Nanobody monovalente de EGFR purificado se evaluó mediante una determinación de la afinidad basada en resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento Biacore T100. Para ello, se inmovilizó hEGFR (Sino Biological, n.° 10001-H08H) en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina, usando química de EDC y NHS. Los Nanobodies purificados se inyectaron durante 2 minutos a diferentes concentraciones (entre 1,37 y 3000 nM) y se dejaron disociar durante 15 min a un caudal de 45 pl/min. Entre las inyecciones de muestra, las superficies se regeneraron con NaOH 50 mM. Se usó HBS-EP+ (tampón Hepes pH 7,4) como tampón de migración.
Las afinidades de unión del Nanobody monovalente de CEACAM5 purificado se evaluó mediante una determinación de la afinidad basada en SpR en un instrumento Biacore T100. Para ello, se inmovilizó hCEACAM-5 (R&D Systems, n.° 4128-CM) en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina, usando química de EDC y NHS. Los Nanobodies purificados se inyectaron durante 2 minutos a diferentes concentraciones (entre 0,31 y 2000 nM) y se dejaron disociar durante 15 min a un caudal de 45 pl/min. Entre las inyecciones de muestra, las superficies se regeneraron con glicina 10 mM pH 1,5. Se usó HBS-EP+ (tampón Hepes pH 7,4) como tampón de migración.
Las constantes cinéticas se calcularon a partir de los sensogramas usando el programa informático BlAEvaluation (interacción 1:1). Las constantes de afinidad (KD) se calcularon a partir de las constantes de tasa de asociación y disociación resultantes kon y koff, y se muestran en la tabla C-29.
Tabla C-29: Constante de afinidad de Nanobodies monovalentes para la unión de hEGFR y hCEACAM5, determinada en Biacore usando proteínas recubiertas directamente.
Ejemplo 25: Destrucción celular redirigida de polipéptidos multiespecíficos por linfocitos T efectores humanos en el ensayo basado en xCELLigence
Los polipéptidos multiespecíficos se caracterizaron funcionalmente en un ensayo de destrucción de células tumorales positivas a EGFR/CEACAM mediada por linfocitos T humanos. En resumen, las construcciones multiespecíficas se evaluaron en un ensayo de destrucción basado en xCELLigence esencialmente como se describe en el ejemplo 16, usando 6x105 linfocitos T humanos como células efectoras y 4x104 células LS174T (ECACC 87060401) o células LoVo (ATCC CCL-229) respectivamente como células diana (efector a diana de 15 a 1). Los datos se analizaron después de 30-40 h y después de 50-60 h.
Los resultados se representan en la figura 34. Los valores de CI50 obtenidos en este ensayo se enumeran en las tablas 30 y 31.
Tabla 30: CI50 (M) de los polipéptidos multiespecíficos en el ensayo de destrucción mediada por linfocitos T humanos basado en xCELLigence usando una relación de efector a diana de 15. Datos analizados después de 30-40 h.
Los datos sobre las células LoVo EGFR+/CEA+ mostraron una diferencia de ~28 veces en la potencia entre las construcciones solo de CEACAM5 y las multiespecíficas de EGFR-CEA y una diferencia de ~8 veces en la potencia entre las construcciones solo de EGFR y las construcciones multiespecíficas de EGFR-CEA. En las células LS174T EGFR+/CEA+, se observó una diferencia de ~7 veces en la potencia entre las construcciones solo de CEACAM5 y las multiespecíficas de EGFR-CEA y una diferencia de ~2 veces entre las construcciones solo de EGFR y las construcciones multiespecíficas de EGFR-CEA. Estos resultados mostraron que se obtenían potenciaciones de la potencia con construcciones multiespecíficas reactivas contra dos antígenos diferentes presentes en una célula.
Ejemplo 26: Reducción in v iv o de linfocitos B por polipéptidos de semivida prolongada (HLE) en un modelo de reducción de linfocitos B de Ramos
En este modelo de reducción de linfocitos B, se inyectaron células Ramos de linfoma de Burkitt y PBMC humanos respectivamente por vía intravenosa e intraperitoneal en ratones, tras lo que se evaluó la destrucción de linfocitos B de Ramos y linfocitos B derivados de PBMC mediante reclutamiento mediado por Nanobodies de linfocitos T presentes en la población de PBMC: es decir, el potencial de los Nanobodies, HLE y no HLE (NHLE), para activar las linfocitos T mediante la vinculación directa de los linfocitos T a través del TCR con los linfocitos B diana a través del CD20, lo que provoca la destrucción de las células dianas.
Los polipéptidos usados en este estudio se describen en la tabla 32:
Tabla 32: ID de muestra y descripción de polipéptidos multiespecíficos usados en estudioin vivo.
Se evaluó la eficaciain vivode un Nanobody biespecífico HLE, T017000104 (específico de TCR y CD20 acoplado a un componente básico dirigido a albúmina) en un modelo de ratón NOG de Ramos y se comparó con el Nanobody irrelevante T017000106. Se compararon el Nanobody de semivida prolongada (NHLE) T017000105 (específico de TCR y CD20) y T0107000083 (específico de TCR y CD20) con el Nanobody irrelevante NHLE TO17000088 (irrelevante y específico de TCR). El estudio demostró un efecto estadísticamente significativo en médula ósea y bazo sobre la reducción de linfocitos B derivados de PBMC para T017000104 y T017000105 en comparación con sus respectivos NB de control irrelevantes. Las células Ramos se redujeron significativamente en los ratones tratados con T017000104 y T017000105, tanto en el bazo como en la médula ósea.
En detalle, se evaluó la reducción de linfocitos B en los ratones, a los que se inyectó por vía intravenosa células Ramos en el día uno (D1) y por vía intraperitoneal PBMC en D3. Los ratones se trataron de D3 a D7 (figura 35).
Los tumores se indujeron mediante inyección intravenosa de 106 células Ramos en 200 pl de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (D1) 24 horas después de la irradiación corporal completa de los ratones con una fuente de y (1,44 Gy, 60 Co) (D0). Los PBMC se inyectaron en D3 (es decir, dos días después de la inyección de células tumorales) después de la aleatorización de los ratones en grupos de 12 animales cada uno (11 animales para el grupo 6) en función del peso corporal. Los animales recibieron una única inyección intraperitoneal (IP) de 107 PBMC (500 pl en PBS). El tratamiento comenzó en D3 una hora después de la inyección de PBMC y se repitió durante 5 días consecutivos en total para los grupos 1-4 y 6, mientras que el grupo 5 recibió solo dos inyecciones (D3 y D5).
En D20 o en D21, se sacrificaron los ratones y se recogieron el bazo y la médula ósea (fémur) para el análisis FACS (mCD45, hCD45, hCD19, hCD20, hCD10) y se analizó la presencia de linfocitos B de Ramos y linfocitos B derivados de PBMC.
Los resultados para la reducción de linfocitos B de Ramos se representan en la figura 36. Las artículos de ensayo T017000083 y T017000105, y T017000104 se compararon con sus respectivos grupos de control (grupos 1 y 2) en función de la presencia/ausencia de HLE. En la médula ósea, se observó una diferencia estadísticamente significativa en el número de linfocitos B de Ramos entre los Nanobodies de control y los Nanobodies NHLE T017000083 y T017000105 (figura 36A). En el bazo, la diferencia fue significativa solo para T017000105 (figura 36B). El Nanobody HLE T017000104 redujo significativamente las células Ramos en el bazo y la médula ósea independientemente de la frecuencia de dosificación aplicada (figuras 36A y B). El análisis estadístico se ha realizado con pruebas de F del análisis ANOVA de efectos mixtos.
Los resultados para la reducción de linfocitos B derivados de PBMC se representan en la figura 37. En la médula ósea, se observó una reducción en el recuento absoluto de linfocitos B en todos los grupos de tratamiento, en comparación con el Nanobody de control irrelevante y este efecto fue significativo para los Nanobodies T017000083 y T017000104 (figura 37A). En el bazo, el efecto fue más pronunciado y significativo para todos los grupos de tratamiento (figura 37B).
En conclusión, estos resultados demuestran que tanto el polipéptido anti-CD20/anti-TCR como el polipéptido HLE anti-CD20/anti-TCR pueden disminuir significativamente los linfocitos B de Ramos y los linfocitos B derivados de PBMC en el bazo y la médula ósea en este modelo de reducción de linfocitos B. Esto confirmó la activación de linfocitos T inducida por Nanobody mediante enlace cruzado de linfocitos T a linfocitos B diana y la destrucción de estos últimos.
Ejemplo 27: Función de los linfocitos T efectores CD4+ y CD8+ humanos en la activación de los linfocitos T
Para investigar la función de los linfocitos T humanos CD4+, respectivamente CD8+ en la destrucción redirigida, se realizó la focalización de células tumorales con polipéptidos que se acoplan a linfocitos T multiespecíficos usando subconjuntos de linfocitos T. En este caso, se usó la línea celular SKBR3 positiva a HER2y el Nanobody T017000102 (dirigido a HER2 y TCR).
27.1 Destrucción celular redirigida de polipéptidos multiespecíficos por linfocitos T CD4+ y CD8+ efectores humanos en el ensayo basado en xCELLigence
Se recogieron linfocitos T humanos como se describe en el ejemplo 2.1. Después de la descongelación, se aislaron linfocitos T CD4+, respectivamente CD8+ humanos usando el kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ (Miltenyi Biotec n.° 130-096-533), respectivamente CD8+ (Miltenyi Biotech n.° 130-096-495). Se sembraron células SKBR3 en placas E-plate de 96 pocillos (2x104 células/pocillo) y se incubaron con 3x105 linfocitos T efectores primarios humanos, linfocitos T CD4+ efectores primarios humanos o linfocitos T CD8+ efectores primarios humanos (relación de efector a diana de 15:1) en presencia o ausencia de construcciones multiespecíficas y se siguieron a lo largo del tiempo, como se describe en el ejemplo16. Los datos se analizaron después de 40 h.
Los resultados se muestran en la figura 38. Los valores de CI50 se representan en la tabla 33.
Tabla 33: CI50 (M) de los polipéptidos multiespecíficos en el ensayo de destrucción de SKBR3 mediada por linfocitos T humanos basado en xCELLigence usando una relación de efector a diana de 15 a 1.
Los datos mostraron destrucción específica dependiente de la dosis de líneas celulares tumorales positivas a HER2 al dirigir los linfocitos T primarios humanos, linfocitos T CD4+ humanos o CD8+ humanos a las células tumorales mediante el polipéptido TCR.
27.2 Efecto de polipéptidos de unión a HER2/TCR sobre la expresión de CD69 y CD25 en linfocitos T efectores humanos c D4+ y CD8+ en un ensayo de destrucción de células tumorales positivas a HER2
Se aislaron linfocitos T humanos primarios y subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ y se realizó un ensayo de destrucción de células tumorales positivas a HER2 redirigida usando células SKBR3 como se describe en el ejemplo 27.1. La activación de los linfocitos T se determinó midiendo la regulación por aumento de CD69 y CD25 después de 24 h y 72 h de incubación respectivamente en los linfocitos T primarios humanos y en las poblaciones de linfocitos T humanos CD4+ y CD8+. La expresión de CD69 y CD25 se midió en citometría de flujo, usando anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD69PE humano (BD Biosciences n.° 557050) y de ratón anti-CD25PE humano (BD Pharmigen n.° 557138), para la medición de CD69 y CD25 respectivamente.
Los resultados ejemplares se muestran en la figura 39.
Los datos mostraron una regulación por aumento dependiente de la dosis de CD69 y CD25 en linfocitos T primarios humanos, linfocitos T CD4+ humanos y CD8+ humanos.
27.3 Efecto de polipéptidos de unión a HER2/TCR sobre la liberación de IFN-y e IL-6 por linfocitos T efectores humanos c D4+ y CD8+ en un ensayo de destrucción de células tumorales positivas a HER2Se aislaron linfocitos T humanos primarios y subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ y se realizó un ensayo de destrucción de células tumorales positivas a HER2 redirigida usando células SKBR3 como se describe en el ejemplo 27.1. La liberación de la citocina IFN-y se midió por ELISA como se describe en el ejemplo 17 y la liberación de IL-6 se midió en ELISA usando el kit ELISA Quantikine de IL-6 humana (R&D Systems, n.° D6050) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los resultados ejemplares se muestran en la figura 40.
Los datos mostraron una liberación de IFN-y e IL-6 dependiente de la dosis por linfocitos T primarios humanos, linfocitos T CD4+ humanos y CD8+ humanos.
Ejemplo 28: Exploración de la prolongación de la semivida (HLE)
Se planteó la hipótesis de que la HLE mediante unión a albúmina podría ser adecuada para cumplir con diversos requisitos, incluyendo (i) prolongación de la semivida (HLE) del resto; y (ii) eficacia del polipéptido multiespecífico. Preferiblemente, la función de HLE no alteraría la penetración de tumores y tejidos.
Alb11 (SEQ ID NO: 404), un Nanobody que se une a seroalbúmina humana (HSA) se ligó al polipéptido multiespecífico de unión a EGFRxCEAxTCR para aumentar la semividain vivode la molécula con formato (documento WO 06/122787). Se generó un formato con el Nanobody dirigido a albúmina en el extremo C usando un conector 35GS y se expresó como se indica anteriormente. El formato explorado se muestra en la tabla 34. Tabla 34: ID de muestra y descripción del polipéptido HLE multiespecífico.
Como la adición del Nanobody Alb11 podría influir en la afinidad o la potencia de la construcción, se caracterizó el polipéptido multiespecífico de semivida prolongada por su unión a líneas celulares que expresan EGFR y CEA y a linfocitos T humanos primarios. Además, se evaluó la potencia en el ensayo de destrucción de LS174T dependiente de linfocitos T funcionales (descrito en 28.1 y 28.2 a continuación).
28.1 Impacto del componente básico Alb11 en las propiedades de unión
La unión dependiente de la dosis del polipéptido multiespecífico HLE a líneas celulares cancerosas que expresan CEACAM5 y EGFR (LS174T y LoVo), una línea celular que expresa EGFR (HER14; NIH3T3 transfectada con EGFR) y a linfocitos T humanos primarios purificados (aislados como se describe en el ejemplo 2.1) se evaluó en citometría de flujo como se explica en el ejemplo 5, en ausencia de HSA.
Los resultados se presentan en la figura 41. El valor de CE50 obtenido de la curva de respuesta a dosis para la unión a células HER14 se representa en la tabla 35. Los valores de CE50 obtenidos de las curvas de respuesta a dosis para la unión a células LS174T y LoVo se representan en la tabla 36.
Tabla 35: CE50 (M) de T017000108 para la unión a células HER14 determinada en citometría de flujo.
Tabla 36: CE50 (M) de T017000108 para la unión a LoVo y LS174T determinada en citometría de flujo.
La comparación de la construcción HLE con la construcción no HLE mostró unión similar a las tres líneas celulares ensayadas. Los datos presentados mostraron que el acoplamiento del componente básico Alb11 no influyó en las propiedades de unión.
28.2 Impacto del Nanobody Alb11 en la destrucción celular redirigida por linfocitos T electores humanos en el ensayo basado en xCELLigence
La funcionalidad del polipéptido multiespecífico de semivida prolongada se evaluó en ausencia de HSA en el ensayo de destrucción de LS174T mediada por linfocitos T humanos como se describe en el ejemplo 10 y se comparó con la funcionalidad de las construcciones multiespecíficas no HLE.
Los resultados se representan en la figura 42. Los valores de CI50 obtenidos se enumeran en la tabla 37.
Tabla 37: CI50 (M) de los polipéptidos multiespecíficos en el ensayo de destrucción mediada por linfocitos T humanos basado en xCELLigence usando una relación de efector a diana de 15. Los datos se analizaron después de 40-50 h.
Los resultados indican que la inclusión del Nanobody dirigido a albúmina en la construcción tal cual no tuvo un impacto esencial en la potencia o eficacia obtenida.
Tablas
Tabla A-1: Alineación de secuencias de ligandos del grupo A de TCR - parte 1
Tabla A-2: Alineación de secuencias de ligandos del grupo A de TCR - parte 1 continuación
79 90 100 110 Kabat # I ab 1 1a 1 SEQ ID NO 50 T017QPMPQ56GQ5 YLQMNSLKPEDTAVYFCPAFSP.IYPYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO 8 T0170PMP053D01 ....T.... ....v..,.G. .L. ..N...
SEQ ID NO 60 T0170PMP067D01 ...,T.... ....V* ,,.G. .L. ..N... ;SEQ ID NO 47 T0170PMP056F01 ....T.... ....V. ...G. .L. ..N... ;SEQ ID NO 76 T0170PMP069A06 ....TG.... ....V. .,.G. .L. ..N... ;SEQ ID NO 65 T0170PMP067F02 ....T.... ....V. .,.G. .L. ..N.....-Q.... SEQ ID NO 66 T0170PMP068C03 ....T.... ....V. ...G. .L. ..N......Q.... SEQ ID NO 26 T0170PMP055E05 ....T.... ..T..V..,.G. .L. ..N.....-Q..... SEQ ID NO 19 T0170PMP055C02 ....T..T......V. .,.G. .L. ..N......Q..... SEQ ID NO 61 T017QPMP067D06 ...,T.....,.G. ..N......0........ ;; ; SEQ ID NO 29 TO17OPMPO55F06 G. .L. ..N ;SEQ ID NO 1 TO170PMP027A05 G. .L. ..N ;SEQ ID NO 6 TO170PMPQ40C01 G. ,L. ..N ;SEQ ID NO 3 TO170PMP028F10 G. .L. ..N ;SEQ ID NO 5 TO170PMP029F08 G. .L. ..N ;SEQ ID NO 13 T0170PMP055A08 G. .L. ..N ;SEQ ID NO 32 TO17OPMPO55G09 G. .L. ..N SEQ ID NO 69 T0170PMP068D05 G. .L. ..N SEQ ID NO 75 TO170PMP068F08 G. .L. ..N SEQ ID NO 95 T0170PMP070F11 G. .L. ..N SEQ ID NO 87 TQ17QPMPQ69E11 L. .L. ..N ; SEQ ID NO 99 T0170PMP084B07 L..L...N SEQ ID NO 10 T0170PMP055A01 Y..... N ;SEQ ID NO 11 TO17OPMPO55A02 Y..... N ;SEQ ID NO 22 TO17OPMPO55D03. Y ..N. ;SEQ ID NO 24 T0170PMP055D10.Y..N. ;;Tabla A-3: Alineación de secuencias de ligandos del grupo A de TCR - parte 2 ; ;; Tabla A-4: Alineación de secuencias de ligandos del grupo A de TCR - parte 2 continuación ;;; ;; SEQ ID NO 50 T0170PMP056G05 YLQMNSLKPEDTAVYFCFAFSP.IYPYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO 71 T0170PMP068E01 ;SEQ ID NO 101 T0170PMP084E03 ..G, ..Y. .....N.. ;SEQ ID NO 102 T0170PMP084E05 ..Y. .....N.. ;SEQ ID NO 30 T0170PMP055F08 ..Y. ....,N.. ;SEQ ID NO 37 T0170PMP056C01 ..Y......N.. ;SEQ ID NO 49 T0170PMP056G02 ..Y......N.. ;SEQ ID NO 57 T0170PMP067A03 ..Y......N.. ;SEQ ID NO 59 T0170PMP067C09 ..Y......W.. ;SEQ ID NO 74 TQ17QPMPQ68F06 ..Y. .....N.. ;SEQ ID NO 82 T0170PMP069D02 ..Y. ....,N.. ;SEQ ID NO S3 T0170PMP070D07 ,A... ..Y. .....N.. ;SEQ ID NO 100 T0170PMP084C02 ..D... ..Y. .....N.. ;SEQ ID NO 55 T0170PMP061B04 ...A. ..Y......N.. ;SEQ ID NO 83 T0170PMP069D07 ,..A. ..Y......W.. ;SEQ ID NO 36 T0170PMP056B11 ..Y. .....N.. ;SEQ ID NO 104 T0170PMP084F10 ..Y. .....N.. ;SEQ ID NO 39 TO17OPMPO56C03 ..Y. .....N..---Q.... SEQ ID NO 80 T0170PMP069C04 ..Y. ....,N..---Q.... SEQ ID NO 44 TO17OPMPO56D02 ..Y......N..-P---Q.... SEQ ID NO 56 T0170PMP067A01 ..Y......N..---Q.... SEQ ID NO 58 T0170PMP067B06 ..Y......N..---Q.... SEQ ID NO 88 TO17OPMPO69F05 L. ..Y......W..---Q.... SEQ ID NO 103 TO17OPMPO84F04 ,..A. ..Y......N..---Q.... SEQ ID NO 21 T0170PMP055C10 H. ..Y. .....N..---Q.... SEQ ID NO S T0170PMP053E10 ..Y. ....,N..----Q..... SEQ ID NO 15 T0170PMP055B01 ..Y. .....N..---Q..... SEQ ID NO 79 T0170PMP069C01 ..Y. .....N..---Q..... SEQ ID NO 62 T0170PMP067D09 .L.N., ..Y. ....,N.. ;SEQ ID NO 63 T0170PMP067E03 .L.N., ..Y. ....,N.. ;SEQ ID NO 43 TO17OPMPO56D01 H. L. ,..G. .....N..---Q.... SEQ ID NO 64 T0170PMP067E06 L. ,..G. .....N..---Q..... SEQ ID NO 86 T0170PMP069E09 L. ..G......N..---Q..... SEQ ID NO 81 T0170PMP069C05 L. ,..G. .....S..---Q..... SEQ ID NO 90 T0170PMP070B08 ,.V, L. ,..G. ....,N.. ;SEQ ID NO 12 T0170PMP055A03 ..G... ---Q.... ;Tabla A-5: Alineación de secuencias de ligandos del grupo A de TCR - parte 3 ; ;; Tabla A-6: Alineación de secuencias de ligandos del grupo A de TCR - parte 3 continuación ;;79 90 100 110 Kabat # 1 ab i 1a i SEQ ID NO 50 TO17OPMPO56G05 YLQMNSLKPEDTAVYFCRAFSRIYPYDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO 41 TG17GPMPQ56CG7 ...G. .R. ;SEQ ID NO 92 T0170PMP070C09 .................. G................... SEQ ID NO 98 TO17OPMPO82B04 .................. G................... SEQ ID NO 33 TO17OPMPO56A02 ...G. ..w.... .Q.... SEQ ID NO 31TO17OPMPO55G05...n.<.O>.... SEQ ID NO 78 T0170PMP069B08 .................. G................... SEQ ID NO 20 T0170PMP055C06 ..N.... ...G. .Q.... SEQ ID NO 23 T0170PMP055D06 F. ..N.... ...G. ■Q..... SEQ ID NO 25 TO17OPMPO55E01 ...G. ..w.... .Q.... SEQ ID NO 27 TO17OPMPO55F02 ...G. ..w.... ;SEQ ID NO 38 TO17OPMPO56C02 ...G. ..w.... ,Q.... SEQ ID NO 97 TO17OPMPO70GQ6 ..,G. ..w.... .Q.... SEQ ID NO 89 TQ170PMP069G08 ...G. ..w.... ;SEQ ID NO 94 T0170PMP070E07 ...G...w.... ;SEQ ID NO 70 TO17OPMPO68D07 ...G. ..w.... ;SEQ ID NO 51 TO17OPMPO56G11 ,..G. .,w♦... ,Q.... SEQ ID NO 67 TO17OPMPO68C07 ...G. ..V7.... .Q.... SEQ ID NO 84 TO17OPMPO69E02 ...G. ..w.... ;SEQ ID NO 68 TO17OPMPO6SC11 ...G. ,Q.... SEQ ID NO 72 T0170PMP068E08 ....R.. ...G. ..w... . •Q..... SEQ ID NO 46 TO17OPMPO56E02 ...G. ..w.... ;SEQ ID NO 35 TO17OPMPO56A10 ,., R, , ,,,G, .Q.... SEQ ID NO 42 TQ17QPMP056C10 ,.. R, . ,,,G. ,Q.... SEQ ID NO 16 TO17OPMPO55B02 ....R.. ...G. ;SEQ ID NO 34 T0170PMP056A08 ....R.. ...G. ;SEQ ID NO 40 T0170PMP056C04 ....R.. ...G. .H. ;SEQ ID NO 53 T0170PMP057D06 ....R.. ...G. .Q.... SEQ ID NO 7 TO17OPMPO53A03 *.. R.. itlG.
SEQ ID NO 85 TO17OPMPO69E07 ,.G.R.. t..G.
SEQ ID NO 18 TO17OPMPO55B11 ... R.. ...G.
SEQ ID NO 48 TG17QPMPQ56F08 ,.. R, . ,t,G,
SEQ ID NO 91 T0170PMP070B09 ,.N.R.. t..G.
SEQ ID NO 73 TO17OPMPO68F04 ....R.. ...G. .Q.... SEQ ID NO 14 T0170PMP055A10 ....R.. ...G. .R. ■Q..... SEQ ID NO 17 TO17OPMPO55B03 ....R.. ...G. .Q.... SEQ ID NO 52 TO17OPMPO57B02 ..L. .H.G. .L...N. -Q....
Tabla A-7: Alineación de secuencias de ligandos del grupo B de TCR
Tabla A-8: Alineación de secuencias de ligandos del grupo C de TCR
��

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Polipéptido que comprende un primer y un segundo dominio variable individual (ISV) de inmunoglobulina, en donde
- dicho primer ISV tiene alta afinidad por/se une al dominio constante del receptor de linfocitos T (TCR) presente en un linfocito T;
- dicho segundo ISV tiene una alta afinidad por/se une a un primer antígeno en una célula diana;
en donde dicho primer antígeno es diferente de dicho TCR; y
en donde dicha célula diana es diferente de dicho linfocito T, en donde dicho primer ISV consiste esencialmente en 4 regiones flanqueantes (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en que:
(i) CDR1 se elige del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 119-123, 125-127, 129, 132 y 133; y
(b) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; y/o
(ii) CDR2 se elige del grupo que consiste en:
(c) SEQ ID NO: 134-141, 143-144, 146-156, 159-163; y
(d) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; y/o
(iii) CDR3 se elige del grupo que consiste en:
(e) SEQ ID NO: 164-166, 169-171, 173-174; y
(f) secuencias de aminoácidos que tienen diferencia de 3, 2 o 1 aminoácido(s) con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170.
2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un tercer ISV, que tiene una alta afinidad por/se une a un segundo antígeno en una célula diana, en donde dicho segundo antígeno es diferente de dicho primer antígeno.
3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho primer antígeno en una célula diana es un antígeno tumoral, preferiblemente un antígeno asociado a tumor (TAA).
4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde dicho segundo antígeno en una célula diana es un antígeno tumoral, preferiblemente un antígeno asociado a tumor (TAA).
5. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno están presentes en la misma célula diana.
6. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno están presentes en diferentes células diana.
7. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde dicho o dichos TAA se eligen independientemente del grupo que consiste en proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína de activación de fibroblastos (FAP),<MART-1, antígeno carcinoembrionario (CEA), gp100, MAGE-1, h>ER-2,<antígenos de LewisY, CD123, CD44, CLL->1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3, CD25, TAG-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, GD2, GD3, CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD147, receptores del factor de crecimiento que incluyen ErbB3 y ErbB4, receptores de citocinas que incluyen cadena gamma del receptor de interleucina-2 (antígeno CD132), cadena alfa del receptor de interleucina-10 (IL-10R-A), cadena beta del receptor de interleucina-10 (IL-10R-B), cadena beta-1 del receptor de interleucina-12 (IL-12R-beta1), cadena beta-2 del receptor de interleucina-12 (receptor beta-2 de IL-12), cadena alfa-1 del receptor de interleucina-13 (IL-13R-alfa-1) (antígeno CD213a1), cadena alfa-2 del receptor de interleucina-13 (proteína de unión a interleucina-13), receptor de interleucina-17 (receptor de IL-17), receptor de interleucina-17B (receptor de IL-17B), precursor del receptor de interleucina 21 (IL-21R), receptor de interleucina-1 de tipo I (IL-1R-1) (CD121a), receptor de interleucina-1 de tipo II (IL-1R-beta) (CDw121b), proteína antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1 ra), cadena alfa del receptor de interleucina-2 (antígeno CD25), cadena beta del receptor de interleucina-2 (antígeno CD122), cadena alfa del receptor de interleucina-3 (IL-3R-alfa) (antígeno CD123), CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosialina), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, claudina 6, claudina 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nectina-4, SLITRK6, mesotelina, receptor de folato, tromboplastina tisular, axl, glipicano-3, CA9, Cripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, receptor del péptido liberador de gastrina, PAP, CEACAM5, CEACAM6, CXCR7, N-cadherina, FXYD2 gamma a, CD21, CD133, Na/K-ATPasa, mIgM (IgM unida a membrana), mIgA (IgA unida a membrana), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6, DcR3 y CAlX y variantes polimórficas e isoformas relacionadas.
8. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en donde dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno se eligen del grupo que consiste en:
- EGFR como primer antígeno y CEA como segundo antígeno;
- CD19 como primer antígeno y CD20 como segundo antígeno;
- CD19 como primer antígeno y CD22 como segundo antígeno;
- CD123 como primer antígeno y Tim-3 como segundo antígeno; y
- CD123 como primer antígeno y CD69 como segundo antígeno.
9. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además un resto de unión a proteína sérica.
10. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho resto de unión a proteína sérica es un ISV que se une a seroalbúmina.
11. Un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un vector que comprende dicho ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico.
12. Una célula hospedadora transformada o transfectada con el ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico o con el vector como se define en la reivindicación 11.
13. Un proceso para la producción del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula hospedadora como se define en la reivindicación 12 en condiciones que permitan la expresión del polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y recuperar el polipéptido producido del cultivo.
14. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o el polipéptido producido de acuerdo con el proceso de la reivindicación 13.
15. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o producido de acuerdo con el proceso de la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesite.
16. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o producido de acuerdo con el proceso de la reivindicación 13, para su uso en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad proliferativa, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad infecciosa y una enfermedad autoinmunitaria.
17. El polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha enfermedad proliferativa es cáncer.
18. El polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicho cáncer se elige del grupo que consiste en carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas: cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervicouterino, glioblastoma, mieloma múltiple (incluyendo gammapatía monoclonal de alcance indeterminado, mieloma asintomático y sintomático), cáncer de próstata y linfoma de Burkitt, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer hepatobiliar, cáncer de vesícula biliar, cáncer de intestino delgado, cáncer rectal, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pene, cáncer de uretra, cáncer de testículo, cáncer de vagina, cáncer de útero, cáncer tiroideo, cáncer paratiroideo, cáncer suprarrenal, cáncer endocrino pancreático, cáncer carcinoide, cáncer de hueso, cáncer de piel, retinoblastomas, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castleman multicéntrica o linfoma de efusión primaria asociado al SIDA, tumores neuroectodérmicos, rabdomiosarcoma; así como cualquier metástasis de cualquiera de los cánceres anteriores.
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