RS66859B1

RS66859B1 - Polipeptidi koji regrutuju t-ćelije na bazi tcr-alfa/beta reaktivnosti

Info

Publication number: RS66859B1
Application number: RS20250538A
Authority: RS
Inventors: Annelies Roobrouck; Hoorick Diane Van; João Vieira
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2016-05-13
Publication date: 2025-06-30
Also published as: ES3031002T3; AU2024200553A1; WO2016180969A1; HRP20250651T1; SI3611192T1; SI3294768T1; AU2021232753A1; AU2021232753B2; EP4524163A3; PT3294768T; EP3611192B1; US20190112392A1; PT3611192T; HUE071467T2; AU2019236588B2; AU2016259792A1; EP3294768A1; EP3611192A3; AU2016259792B2; CA2985698A1

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak obezbeđuje multispecifične polipeptide koji regrutuju T-ćelije i koji vežu konstantni domen TCR na T-ćeliji i barem jedan antigen na ciljanoj ćeliji kako je definisano sa zahtevima.

POZADINA

[0002] Rak naplaćuje enormne cene u ljudskim životima širom sveta. Trenutno je to vodeći uzrok smrti ljudi, odmah nakon srčanih bolesti i kapi. Razni tipovi raka presudno doprinose morbiditetu i mortalitetu širom sveta, sa približno 14 miliona novih slučajeva i 8.2 miliona smrti usled raka samo tokom 2012. godine. Očekuje se da broj novih slučajeva poraste za oko 70% tokom sledeće 2 dekade (izvor: WHO Cancer). Ukupan ekonomski uticaj preuranjenih smrti i nesposobnosti usled rak širom sveta je iznosio oko 900 milijardi dolara tokom 2008., predstavljajući 1.5% od svetskog bruto domaćeg proizvoda.

[0003] Postojeći režimi za tretman čvrstih tumora tipično uključuju kombinovanje nekoliko hemoterapija i radioterapija nakon hirurškog zahvata. Tokom 40 godina kliničkog iskustva je ostvaren mali progres, posebno u naprednim fazama raka.

[0004] Hitno su potrebne nove terapije protiv raka.

[0005] Terapija uz pomoć antitela je trenutno važan deo medicinskog pristupa za borbu protiv raznih bolesti, a posebno protiv raka. Nekoliko godina unazad, monoklonska antitela su uspostavljena kao ključan terapeutski pristup protiv brojnih bolesti. Sve trenutno odobrene terapije sa antitelima se oslanjaju na monospecifičnim monoklonskim antitelima (mAb). Sve do danas, najveći broj meta mAb zahteva agonistički ili antagonistički pristup. Dok ciljanje površinskih antigena može da posreduje antitumorskoj aktivnosti preko induciranja apoptoze, najveći deo aktivnosti na bazi mAb protiv hematoloških maligniteta se oslanja na Fcposredovanu efektorsku funkciju poput citotoksičnosti zavisne o komplementu (CDC) i antitelo-zavisne ćelija-posredovane citotoksičnosti (ADCC).

[0006] Imunoterapija se pojavila kao pristup istraživanja raka koji brzo napreduje. Imunoterapija predstavlja usmeravanje sistema telesnog imuno-nadgledanja, a naročito T-ćelija, prema tumorskim ćelijama.

[0007] Citotoksične T-ćelije (CTL) su T-limfociti koji ubijaju tumorske ćelije, ćelije koje su inficirane (naročito sa virusima), ili ćelije koje su oštećene na neki drugi način. T-limfociti (ili T-ćelije) eksprimiraju receptor T-ćelija ili TCR-molekul i CD3-receptor na ćelijskoj površini. αβ-TCR-CD3 kompleks (ili "TCR-kompleks") je sastavljen od šest različitih tipova I pojedinačnih transmembranskih belančevina koje se protežu kroz membranu: TCRα i TCRβ lanci koji formiraju TCR-heterodimer koji je odgovoran za prepoznavanje liganda, i nekovalentno spojeni CD3γ, CD3δ, CD3ε i ζ lanci, koji nose motive citoplazmatske sekvence koje se fosforilišu nakon aktivisanja receptora i regrutuju broj signalnih komponenta (Call et al. 2004, Molecular Immunology 40: 1295-1305).

[0008] Oba lanca, α i β, receptora T-ćelija se sastoje od konstantnog domena i varijabilnog domena. Fiziološki, αβ lanci iz receptora T-ćelija prepoznaju peptidni MHC-kompleks pa se grupiraju nakon aktivisanja CD3 lanaca. Ovi CD3 lanci posledično transdukuju signal za aktivisanje u intraćelijski okoliš.

[0009] Uzimajući u obzir potencijal prirodnih citotoksičnih T-limfocita (CTL) da posreduju ćelijskoj lizi, istraživane su brojne strategije sa ciljem regrutiranja imuno-ćelija kako bi posredovale ubijanju tumorskih ćelija. Budući da T-limfociti ne mogu da eksprimiraju Fcreceptore, pomenute ne mogu da budu regrutovane na mesto tumora uz pomoć Fc-repa antitumorskih monoklonskih antitela. Kao alternativa, T-ćelije pacijenta su bile modifikovane sa sekundarnim TCR-ima poznate specifičnosti prema definisanom tumorskom antigenu. Ovaj adaptivan ćelijski transfer je po prirodi visoko personalizovan i vrlo zahtevan zahvat. Međutim, glavni problem terapija uz pomoć T-ćelija ostaje veliki broj imuno-izlaznih mehanizama (immune escape mechanisms) za koje se zna da se javljaju kod pacijenata koji boluju od raka (Nagorsen et al.2012, Pharmacology & Therapeutics 136: 334-342).

[0010] Umesto da se izazivaju specifični odgovori T-ćelija, koji se oslanjaju na to da li tumorske ćelije eksprimiraju MHC-molekule, ali i na prisutnost, generisanje, transport i izlaganje specifičnih peptidnih antigena, najnovija istraživanja su nastojala kombinovati prednosti imunoterapija sa terapijama sa antitelima tako da su uključene sve T-ćelije pacijenta oslanjajući se na poliklonalnost uz pomoć tehnologija na bazi rekombinantnog antitela: "bispecifična antitela".

[0011] Bispecifična antitela se konstruišu tako da poseduju jednu ruku uz pomoć koje prepoznaju tumorski deo (ruka koja veže metu) dok drugom svojom rukom prepoznaju specifično prepoznaju antigen iz T-ćelije (ruka koja veže efektor), najčešće CD3. Uz pomoć istovremenog vezanja obiju ruku na njihove odgovarajuće antigene, T-limfociti su usmereni prema i aktivirani na tumorskoj ćeliji gde ispoljavaju svoju citolitičku funkciju.

[0012] Koncept primene bispecifičnih antitela sa ciljem aktivisanja T-ćelija protiv tumorskih ćelija je opisan pre više od 20 godina, ali problemi proizvodnje i klinički neuspesi su doveli do stagnacije ovakvih istraživanja. Razvijena su bispecifična antitela manjeg formata, koja lakše prodiru u tkiva i tumore u odnosu na konvencionalna antitela. Osim toga, manji format je bolji za stvaranje citolitičkih sinapsa, koje ubijaju ciljane ćelije. Smatralo se da će bispecifična antitela manjeg formata biti lakše proizvesti uz to da će biti manje imunogena u odnosu na konvencionalna antitela. Međutim, manji bispecifični BiTE-molekuli, koji se sastoje od dva pojedinačna lanac varijabilnih fragmenata (scFv) spojenih uz pomoć peptidnog linkera od 5 amino-kiselina, pokazala su smanjenu stabilnost (scFv su agregirala), niske ekspresione titre i slabu rastvorljivost. Štaviše, prva klinička ispitivanja Blinatumomab-a (BiTE-molekul), koji prepoznaje CD3-lance, su zaustavljena zbog štetnih neurološki efekata, sindroma oslobađanja citokina i infekcija sa jedne strane i izostanka objektivnih kliničkih odgovora ili robusnih znakova biološke aktivnost sa druge. Osim problema efikasnosti, BiTE se moraju stalno davati infuzijom – verovatno zbog nedostatka Fc-domena – koje onemogućava pacijentovu prijemčivost. Isti problem se javlja i kod DART (dual afinitet retargeting molecules koji su razvijeni od strane MacroGenics), pri čemu je teški lanac varijabilnog domena iz jednog antitela (Ab) spojen na laki lanac varijabilnog domena drugog Ab. MacroGenics sada pokušava rešiti pomenuti problem tako da fuzioniše Fc-domen na svoje DART-ove sledeće generacije, koje čini molekul ne samo većim, već takođe uzrokuje probleme u proizvodnji i uvođenju drugih Fc-funkcija. Veći format Fc je očekivano da pokazuje bolji PK, ali ponovo uvodi rizik od aktivnosti izvan mete. (Garber 2014, Nature Reviews 13: 799-801)

[0013] Tako, i dalje ostaje potreba za razvijanjem alternativih bispecifičnih formata.

SAŽETAK PRONALASKA

[0014] Ovaj pronalazak rešava pomenuti problem tako šta obezbeđuje multispecifične polipeptide koji sadrže prvi i barem jedan dodatan imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), pri čemu pomenuti prvi ISV poseduje visoki afinitet za/ili može da se veže na konstantni domen receptora iz T-ćelija (TCR); pri čemu barem jedan drugi ISV poseduje visoki afinitet za/ili se veže na antigen koji je prisutan na ciljanoj ćeliji, kao šta je definisano u zahtevima. U jednom naročitom aspektu, vezanje prvog ISV aktiviše inherentni citolitički potencijal na T-ćeliji usmeren protiv ciljane ćelije nezavisno o MHC.

[0015] Tako, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid ("polipeptid prema pronalasku") koji sadrži prvi i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), gde

• pomenuti prvi ISV poseduje visoki afinitet za/veže se na konstantni domen receptora iz T-ćelija (TCR) koji je prisutan na T-ćelijama;

• pomenuti drugi ISV poseduje visoki afinitet za/veže se na prvi antigen na ciljanoj ćeliji; pri čemu pomenuti prvi antigen je različit od pomenutog TCR; i

pri čemu pomenuta ciljana ćelija je različita od pomenute T-ćelije,

pri čemu se navedeni prvi ISV u suštini sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno), gde:

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID Br.s: 119-123, 125-127, 129, 132 i 133; i

(b) aminokiselinske sekvence koje se razlikuju za 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 123; i/ili

(ii) CDR2 je izabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID Br.s: 134-141, 143-144, 146-156, 159-163; i

(d) aminokiselinske sekvence koje se razlikuju za 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 153; i/ili

(iii) CDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID Br.s: 164-166, 169-171, 173-174; i

(f) aminokiselinske sekvence koje imaju 3, 2 ili 1 aminokiselinske razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 170.

[0016] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, gde navedeni polipeptid usmerava T ćeliju ka ciljnoj ćeliji.

[0017] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid indukuje aktivisanje T-ćelija.

[0018] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuto aktivisanje T-ćelija je nezavisno o MHC-prepoznavanju.

[0019] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuto aktivisanje T-ćelija zavisi o prezentiranju T-ćeliji pomenutog polipeptida vezanog na pomenuti prvi antigen u ciljanoj ćeliji.

[0020] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuto aktivisanje T-ćelija uzrokuje jedan ili više ćelijskih odgovora pomenute T-ćelije, pri čemu pomenuti ćelijski odgovor je izabran iz grupe koja obuhvata proliferaciju, diferencijaciju, sekreciju citokina, oslobađanje citotoksičnog efektor-molekula, citotoksičnu aktivnost, ekspresiju aktivacionih markera i preusmerenu lizu ciljanih ćelija.

[0021] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuto aktivisanje T-ćelija uzrokuje inhibiciju aktivnosti pomenute ciljane ćelije za više od oko 10%, naročito 20%, 30%, ili 40% ili još bolje za više od 50%, naročito više od 60%, poput 70%, 80%, ili čak više od 90%, kao na primer 100%.

[0022] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV veže konstantni domen receptora α iz T-ćelija (TCR-α) (SEQ ID Br.: 348) i/ili konstantni domen receptora β iz T-ćelija (TCR-β) (SEQ ID Br.: 349), ili polimorfne varijante njihovih izoforma.

[0023] Alternativno, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV veže konstantni domen receptora α iz T-ćelija (TCR-α) (SEQ ID Br.: 484) i/ili konstantni domen receptora β iz T-ćelija (TCR-β) (SEQ ID Br.: 485), ili polimorfne varijante njihovih izoforma.

[0024] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid i/ili prvi ISV poseduje konstantu stope vezanja (Kon) na pomenuti TCR koja je izabrana iz grupe koja obuhvata vrednosti od barem oko 10<2>M<-1>s<-1>, oko 10<3>M<-1>s<-1>, oko 10<4>M<-1>s<-1>, oko 10<5>M<-1>s<-1>, oko 10<6>M<-1>s<-1>, 10<7>M<-1>s<-1>, oko 10<8>M<-1>s<-1>, oko 10<9>M<-1>s<-1>, i oko 10<10>M<-1>s<-1>, kao šta je preferirano izmereno uz pomoć površinske plazmonske rezonance ili BLI.

[0025] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid i/ili prvi ISV ima konstantnu stope otpuštanja (Koff) sa pomenutog TCR koja je izabrana iz grupe koja obuhvata vrednosti od najviše oko 10<-3>s<-1>, oko 10<-4>s<-1>, oko 10<-5>s<-1>, oko 10<-6>s<-1>, oko 10<-7>s<-1>, oko 10<-8>s<-1>, oko 10<-9>s<-1>, i oko 10<-10>s<-1>, kao šta je preferirano izmereno uz pomoć površinske plazmonske rezonance ili BLI.

[0026] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV veže pomenuti TCR sa vrednosti EC50od između 100 nM i 1 pM, poput prosečne vrednosti EC50od 100 nM ili manje, a još bolje prosečne vrednosti EC50od 90 nM ili manje, poput manje od 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak još i manje, poput manje od 4, 3, 2, ili 1 nM ili još i manje, poput manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 pM, ili još i manje, poput manje od 4 pM, kao šta je preferirano izmereno uz pomoć protočne citometrije.

[0027] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV veže pomenuti TCR sa prosečnom KD-vrednosti od između 100 nM i 10 pM, poput prosečne KD-vrednosti od 90 nM ili manje, čak još bolje sa prosečnom KD-vrednosti od 80 nM ili manje, poput manje od 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili još manje, poput manje od 4, 3, 2, ili 1 nM, poput manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 pM, ili čak još i manje, poput manje od 10 pM. Preferirano, pomenuti KD je određen primenom Kinexa, BLI ili SPR, na primer određen je uz pomoć Proteona.

[0028] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, u kom se pomenuti prvi ISV u suštini sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), u kojima:

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(a) SEQ ID Br.: 123; i

(b) aminokiselinske sekvence koje imaju 1, 2 ili 3 razlike u aminokiselinima sa SEQ ID Br.: 123, pri čemu

o na poziciji 2 D je promenjeno u A, S, E ili G;

o na poziciji 4 H je promenjeno u Y;

o na poziciji 5 K je promenjeno u L;

o na poziciji 6 I je promenjeno u L;

o na poziciji 8 F je promenjeno u I ili V; i/ili

o na poziciji 10 G je promenjeno u S.

[0029] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, u kom se navedeni prvi ISV u suštini sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno), u kojima je CDR2 izabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID Br.: 153; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2, 3 ili 4 razlike u aminokiselinama sa SEQ ID Br.: 153, pri čemu

o na poziciji 1 H je promenjen u T ili R;

o na poziciji 3 S je promenjen u T ili A;

o na poziciji 5 G je promenjen u S ili A;

o na poziciji 7 Q je promenjen u D, E, T, A ili V;

o na poziciji 8 T je promenjen u A ili V; i/ili

o na poziciji 9 D je promenjeno u A, Q, N, V ili S.

[0030] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, u kom se navedeni prvi ISV u suštini sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno), u kojima je CDR3 izabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID Br.: 170; i

(b) aminokiselinske sekvence koje imaju 1, 2 ili 3 razlike u aminokiselinima sa SEQ ID Br.: 170, pri čemu

o na poziciji 1 F je promenjeno u Y, L ili G;

o na poziciji 4 I je promenjeno u L;

o na poziciji 5 Y je promenjeno u W; i/ili

o na poziciji 8 D je promenjeno u N ili S.

[0031] Poželjno je da polipeptid koji sadrži jedan ili više CDR-ova sa razlikom od 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline vezuje TCR sa približno istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptida koji sadrži CDR-ove bez razlike od 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline, pri čemu je navedeni afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0032] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, u kom se navedeni prvi ISV u suštini sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno), u kojima

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID Br.: 123; i

o na poziciji 2 D je promenjeno u A, S, E ili G;

o na poziciji 4 H je promenjeno u Y;

o na poziciji 5 K je promenjeno u L;

o na poziciji 6 I je promenjeno u L;

o na poziciji 8 F je promenjeno u I ili V; i/ili

o na poziciji 10, G je promenjen u S,

pod uslovom da polipeptid koji sadrži CDR1 sa razlikom od 3, 2 ili 1 aminokiseline vezuje TCR sa približno istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptida koji sadrži CDR1 bez razlike od 3, 2 ili 1 aminokiseline, pri čemu je navedeni afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom;

2. i u kojima

(ii) CDR2 je izabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID Br.: 153; i

(b) aminokiselinske sekvence koje imaju 1, 2, 3 ili 4 razlike u aminokiselinama sa SEQ ID Br.: 153, pri čemu

o na poziciji 1, H je promenjen u T ili R;

o na poziciji 3, S je promenjen u T ili A;

o na poziciji 5, G je promenjen u S ili A;

o na poziciji 7, Q je promenjen u D, E, T, A ili V;

o na poziciji 8, T je promenjen u A ili V; i/ili

o na poziciji 9, D je promenjen u A, Q, N, V ili S,

pod uslovom da polipeptid koji sadrži CDR2 sa razlikom od 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline vezuje TCR sa približno istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptida koji sadrži CDR2 bez razlike od 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline, pri čemu je navedeni afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i pri čemu

(iii) CDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID Br.: 170; i

(b) aminokiselinske sekvence koje imaju 1, 2 ili 3 razlike u aminokiselinama sa SEQ ID Br.: 170, pri čemu

o na poziciji 1, F je promenjen u Y, L ili G;

o na poziciji 4, I je promenjeno u L;

o na poziciji 5, Y je promenjeno u W; i/ili

o na poziciji 8, D je promenjeno u N ili S,

pod uslovom da se polipeptid koji sadrži CDR3 sa razlikom od 3, 2 ili 1 aminokiseline vezuje za TCR sa približno istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptida koji sadrži CDR3 bez razlike od 3, 2 ili 1 aminokiseline, pri čemu je navedeni afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0033] U ovom pronalasku, navedeni prvi ISV u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno), u kojima:

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID Br.s: 119-123, 125-127, 129, 132 i 133; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju za 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 123; i/ili

(ii) CDR2 je izabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID Br.s: 134-141, 143-144, 146-156, 159-163; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju za 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 153; i/ili

(iii) CDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID Br.: 164-166, 169-171, 173-174; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju za 3, 2 ili 1 aminokiselinu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 170.

[0034] U daljem aspektu, ovaj pronalazak pruža polipeptid kako je definisano u zahtevima, u kome se navedeni prvi ISV u suštini sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno), u kojima:

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID Br.s: 119-123, 125-127, 129, 132 i 133; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju za 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 123,

pod uslovom da polipeptid koji sadrži CDR1 sa razlikom od 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline vezuje TCR sa približno istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptida koji sadrži CDR1 bez razlike od 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline, pri čemu je navedeni afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(ii) CDR2 je izabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID Br.: 134-141, 143-144, 146-156, 159-163; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju za 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 153,

pod uslovom da polipeptid koji sadrži CDR2 sa razlikom od 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline vezuje TCR sa približno istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptida koji sadrži CDR2 bez razlike od 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline, pri čemu je navedeni afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) CDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID Br.: 164-166, 169-171, 173-174; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju za 3, 2 ili 1 aminokiseline u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 170,

pod uslovom da polipeptid koji sadrži CDR3 sa razlikom od 3, 2 ili 1 aminokiseline vezuje TCR sa približno istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptida koji sadrži CDR3 bez razlike od 3, 2 ili 1 aminokiseline, pri čemu je navedeni afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0035] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, u kojem se pomenuti prvi ISV u suštini sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 123, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 153, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 170.

[0036] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, u kojem je pomenuti prvi ISV izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID Br.: 1-104.

[0037] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, u kojem pomenuti prvi ISV unakrsno-blokira vezanje na konstantni domen receptora iz T-ćelije (TCR) sa barem jednim od polipeptida iz SEQ ID Br.: 1-104.

[0038] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, u kojem pomenuti prvi ISV je unakrsno-blokiran i ne može da se veže na konstantni domen receptora iz T-ćelija (TCR) uz pomoć barem jednog od polipeptida iz SEQ ID Br.: 1-104.

[0039] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, koji dodatno sadrži treći ISV, koji poseduje visoki afinitet za/koji se veže na drugi antigen na ciljanoj ćeliji, pri čemu pomenuti drugi antigen je različit od pomenutog prvog antigena.

[0040] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti prvi antigen na ciljanoj ćeliji je tumorski antigen, preferirano antigen povezan sa tumorom (tumour associated antigen, TAA).

[0041] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti drugi antigen na ciljanoj ćeliji je tumorski antigen, preferirano antigen povezan sa tumorom (TAA).

[0042] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti prvi antigen i pomenuti drugi antigen su prisutni na istoj ciljanoj ćeliji.

[0043] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti prvi antigen i pomenuti drugi antigen su prisutni na različitim ciljanim ćelijama.

[0044] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti TAA su nezavisno izabrani iz grupe koja obuhvata hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP), receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), belančevinu za aktivisanje fibroblasta (FAP), MART-1, karcinoembrionski antigen (CEA), gp100, MAGE-1, HER-2, Lewis<Y>-antigene, CD123, CD44, CLL-1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3, CD25, PRIVESAK-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, GD2, GD3, CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD147, receptore faktora rasta uključujući ErbB3 i ErbB4, citokinske receptore uključujući gama lanac receptora interleukin-2 (CD132 antigen), alfa lanac receptora interleukin-10 (IL-10R-A), beta lanac receptora interleukin-10 (IL-10R-B), beta-1 lanac receptora interleukin-12 (IL-12R-beta1), beta-2 lanac receptora interleukin-12 (beta-2 receptora IL-12), alfa-1 lanac receptora interleukin-13 (IL-13R-alfa-1) (CD213a1 antigen), alfa-2 lanac receptora interleukin-13 (belančevina koja veže interleukin-13), receptor interleukin-17 (receptor IL-17), receptor interleukin-17B (receptor IL-17B), prekursor receptora interleukin 21 (IL-21R), tip I receptora interleukin-1 (IL-1R-1) (CD121a); tip II receptora interleukin-1 (IL-1R-beta) (CDw121b), belančevinu antagonist receptoru interleukin-1 (IL-1ra), alfa lanac receptora interleukin-2 (CD25-antigen), beta lanac receptora interleukin-2 (CD122-antigen), alfa lanac receptora interleukin-3 (IL-3R-alfa) (CD123-antigen), CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosijalin), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, klaudin 6, klaudin 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nektin-4, SLITRK6, mezotelin, folatni receptor, tkivni faktor, aksl, glipikan-3, CA9, kripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, peptidni receptor oslobađanja gastrina, PAP, CEACAM5, CEACAM6, CXCR7, N-kaderin, FXYD2 gama a, CD21, CD133, Na/K-ATPazu, mIgM (IgM vezan na membranu), mIgA (IgA vezan na membranu), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6, DcR3 i CAIX, uključujući slične polimorfne varijante i izoforme.

[0045] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti TAA je CD20 (UniProt 11836), HER2 (Uniprot P04626), EGFR, CEA, i njihove polimorfne varijante ili izoforme.

[0046] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti prvi antigen i pomenuti drugi antigen su izabrani iz grupe koja obuhvata:

▪ EGFR kao prvi antigen i CEA kao drugi antigen;

▪ CD19 kao prvi antigen i CD20 kao drugi antigen;

▪ CD19 kao prvi antigen i CD22 kao drugi antigen;

▪ CD123 kao prvi antigen i Tim-3 kao drugi antigen;

▪ CD123 kao prvi antigen i CD69 kao drugi antigen.

[0047] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, koji dodatno sadrži deo koji se vezuje za proteine seruma.

[0048] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti ostatak koji veže serumsku belančevinu veže serumski albumin.

[0049] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti ostatak koji veže serumsku belančevinu je ISV koji veže serumski albumin.

[0050] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu se pomenuti ISV, koji veže serumski albumin, u suštini sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), gde CDR1 je SFGMS (SEQ ID Br.: 481), CDR2 je SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID Br.: 482), a CDR3 je GGSLSR (SEQ ID Br.: 475), CDR koji je određen na osnovu Kabat-ove definicije; i/ili gde CDR1 je GFTFSSFGMS (SEQ ID Br.: 472) ili GFTFRSFGMS (SEQ ID Br.: 473), CDR2 je SISGSGSDTL (SEQ ID Br.: 474), a CDR3 je GGSLSR (SEQ ID Br.: 475), CDR određen prema metodologiji autora Kontermann 2010.

[0051] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu je pomenuti ISV, koji veže serumski albumin, izabran iz grupe koja obuhvata Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG i Alb82-GGG (SEQ ID Br.: 400 do 412).

[0052] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti ISV-i su međusobno direktno spojeni ili su spojeni preko nekog linkera.

[0053] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu su pomenuti prvi ISV i/ili pomenuti drugi ISV i/ili možda pomenuti treći ISV i/ili možda pomenuti ISV, koji veže serumski albumin, su spojeni preko nekog linkera.

[0054] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu je pomenuti linker izabran iz grupe koja obuhvata linkere poput 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS i 35GS (SEQ ID Br.: 376 do 385).

[0055] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti ostatak za vezanje serumske belančevine nije antitelo na bazi polipeptida.

[0056] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, koji dodatno sadrži PEG.

[0057] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti ISV je nanotelo, VHH, humanizovani VHH, ili kamilski VH(tj. sekvenca koja je primenjena da sliči kamilskoj).

[0058] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid, pri čemu pomenuti prvi ISV je izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID Br.: 1 do 104.

[0059] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV je izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID Br.: 1 do 104, i pri čemu pomenuti drugi ISV je izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID Br.: 350-358.

[0060] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid koji je izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID Br.: 292, 295-296, 299-300, 303, 306-343, 387-388, 390, 414, 417-418, 421-422, 425, 428-464, 467-468, 470-471 i 486-487.

[0061] Drugi ISV može biti polipeptid koji specifično vezuje karcinoembrionski antigen (CEA) i sadrži ili u suštini se sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), u kojem:

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(a) SEQ ID Br.: 361 (GDTYGSYWMG); ili

(b) amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu iz SEQ ID Br.: 361, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR1 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CEA sa približno istim ili većim afinitet u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR1 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pri čemu pomenuti afinitet je izmeren uz pomoć površinske plazmonske rezonance; i/ili

(i) CDR2 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(c) SEQ ID Br.: 363 (AINRGGGYTV); ili

(d) amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu iz SEQ ID Br.: 363, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR2 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CEA sa približno istim ili većim afinitet u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR2 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pri čemu pomenuti afinitet je izmeren uz pomoć površinske plazmonske rezonance; i/ili

(ii) CDR3 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(e) SEQ ID Br.: 365 (SGVLGGLHEDWFNY); ili

(f) amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu iz SEQ ID Br.: 365, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR3 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CEA sa približno istim ili većim afinitet u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR3 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pro čemu pomenuti afinitet je izmeren uz pomoć površinske plazmonske rezonance.

[0062] Drugi ISV može da bude polipeptid, u kojem je CDR1 predstavljen sa SEQ ID Br.: 361, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 363, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 365.

[0063] Drugi ISV može da bude polipeptid koji specifično veže CD20 i sadrži ili u suštini se sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), u kojem:

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(a) SEQ ID Br.: 362 (GGTFSSYTMG); ili

(b) amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu iz SEQ ID Br.: 362, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR1 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CD20 sa približno jednakim ili većim afinitetom u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR1 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pod uslovom da pomenuti afinitet je izmeren primenom površinske plazmonske rezonance; i/ili (ii) CDR2 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(c) SEQ ID Br.: 364 (EVRWGGVTT); ili

(d) amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu iz SEQ ID Br.: 364, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR2 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CD20 sa približno jednakim ili većim afinitetom u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR2 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pod uslovom da pomenuti afinitet je izmeren primenom površinske plazmonske rezonance; i/ili (iii)CDR3 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(e) SEQ ID Br.: 366 (VRQMYMTVVPDY); ili

(f) amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu iz SEQ ID Br.: 366, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR3 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CD20 sa približno jednakim ili većim afinitetom u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR3 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pod uslovom da pomenuti afinitet je izmeren primenom površinske plazmonske rezonance.

[0064] Drugi ISV može da bude polipeptid, u kojem CDR1 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 362, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 364, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 366.

[0065] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid kao šta je definisano sa zahtevima.

[0066] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu ili sekvencu nukleinske kiseline kao šta je definisano sa zahtevima.

[0067] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju-domaćina koja je transformisana ili transfektovana sa nukleinskom kiselinom ili sekvencom nukleinske kiseline kao šta je definisano sa zahtevima ili sa vektorom kao šta je definisano sa zahtevima.

[0068] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju polipeptida kao šta je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti proces obuhvata uzgajanje ćelije-domaćina kao šta je definisano sa zahtevima u uslovima koji omogućavaju ekspresiju polipeptida kao šta je definisano sa zahtevima i obnavljanje proizvedenog polipeptida iz ćelijske kulture.

[0069] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompozicija koji sadrži polipeptid kao šta je definisano sa zahtevima, ili, polipeptid proizveden u skladu sa procesom kao šta je definisano sa zahtevima.

[0070] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kao šta je definisano sa zahtevima, ili je proizveden u skladu sa procesom kao šta je definisan sa zahtevima, a koji je namenjen tretiranju subjekta u potrebi.

[0071] Samo u ilustrativne svrhe, ovo otkriće obezbeđuje postupak za dostavu profilaktičkog ili terapeutskog polipeptida u specifičnu lokaciju, tkivo ili tip ćelije u telu, pri čemu pomenuti postupak obuhvata korake za administriranje nekom subjektu polipeptida koji je ovde opisan, ili je proizveden u skladu sa procesom koji je ovde opisan.

[0072] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kao šta je definisan sa zahtevima, ili koji je proizveden u skladu sa procesom kao šta je definisan sa zahtevima, a koji je namenjen prevenciji, tretmanu ili ublažavanju neke bolesti koja je izabrana iz grupe koja obuhvata proliferativnu bolest, upalnu bolest, infektivnu bolest i autoimunu bolest.

[0073] Samo u ilustrativne svrhe, ovo otkriće obezbeđuje postupak za prevenciju, tretman ili ublažavanje neke bolesti koja je izabrana iz grupe koja obuhvata proliferativne bolesti, upalne bolesti, infektivne bolesti i autoimune bolesti, pri čemu pomenuti postupak obuhvata korak administriranja nekom subjektu u potrebi polipeptida koji je ovde opisan, ili je proizveden u skladu sa procesom koji je ovde opisan.

[0074] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kao šta je definisan sa zahtevima namenjen za upotrebu u postupku za prevenciju, tretman ili ublažavanje proliferativne bolesti, pri čemu pomenuta proliferativna bolest je rak.

[0075] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kao šta je definisan sa zahtevima namenjen za upotrebu u postupku za prevenciju, tretman ili ublažavanje raka, pri čemu je pomenuti rak izabran iz grupe koja obuhvata razne tipove karcinoma, glioma, mezotelioma, melanoma, limfoma, leukemija, adenokarcinoma: rak dojke, raj jajnika, rak vrata materice, glioblastoma, multiplih mijeloma (uključujući monoklonsku gamopatiju neodređenog značaja, asimptomatski i simptomatski mijelom), rak prostate, i Burkitt-ov limfom, rak glave i vrata, rak debelog creva, kolorektalni rak, ne-sitnoćelijski rak pluća, sitnoćelijski rak pluća, rak jednjaka, rak želuca, rak pankreasa, hepatobilijarni rak, rak žučne kese, rak tankog creva, rak rektuma, rak bubrega, rak bešike, rak prostate, rak penisa, rak uretre, rak testisa, raj vagine, rak mokraćnog sistema, rak štitaste žlezde, rak paraštitaste žlezde, rak nadbubrežne žlezde, endokrini rak pankreasa, karcinoidni rak, rak kostiju, rak kože, razne retinoblastome, Hodgkin-ov limfom, ne-Hodgkin-ov limfom, Kaposi-ev sarkom, multicentrična Castleman-ovu bolest ili primarni efuzijski limfom usled AIDS-a, razne neuroektodermalne tumore, rabdomiosarkom; kao i bilo koju metastazu bilo kojeg od malopre pomenutih tipova raka, kao i indukcije koje nisu tumorske poput nazalne polipoze.

[0076] U daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid kao šta je definisan sa zahtevima namenjen za primenu u postupku za prevenciju, tretman ili ublažavanje neke od bolesti koje su ovde opisane, pri čemu pomenuti tretman je kombinovani tretman.

OBJAŠNJENJE SLIKA

[0077]

Slika 1: Procena ekspresije ljudskog TCR/CD3 i ljudskog CD3 na transfektovanim ćelijskim linijama CHO, HEK293 i Llana uz primenu 100 nM α/β antitela protiv ljudskog TCR (klon BW242/412) (crno) i 100 nM antitela protiv ljudskog CD3 (klon OKT-3) (sivo). MCF-vrednost (srednja kanalna fluorescencija) je prikazana za svaku ćelijsku liniju. X-os prikazuje ćelijski tip i transfektovane gene; CD3 označava transfekciju sa CD3-kompleksom (epsilon, delta, gama i zeta lanci), huTCR označava transfekciju sa TCR-α/β lancima, pri čemu se korišćeni varijabilni domen nalazi u zagradama.

Slika 2: Procena kvaliteta rastvorljivih rekombinantnih α/β-TCR belančevina iz majmuna makaki rakojeda (Macaca fascicularis) primenom antitela (klon R73) protiv TCR-α/β iz neljudskih primata/pacova; antitela protiv ljudskih TCR-α/β (ispunjeni krugovi) i irelevantnog nanotela protiv lizozima iz jajeta (cAblys) (prazni krugovi). OD-vrednost je prikazana u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slike 3A i 3B: Dozno-zavisno vezanje monovalentnog nanotela protiv TCR na ljudski TCR/CD3 koji je eksprimiran u ćelijama CHO-K1 (Slika 3A) i u primarim ljudskim T-ćelijama (Slika 3B). MCF-vrednost (srednja kanalna fluorescencija) je prikazana u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 4: Dozno-zavisno vezanje monovalentnog nanotela protiv TCR na ljudski TCR(2IAN)/CD3 iz ćelijske linije HEK293H (zatvoreni krug), na ljudski CD3 iz ćelijske linije HEK293H (unakrsno) i na referentnu ćelijsku liniju HEK293H (otvoreni krugovi). MCF-vrednost (srednja kanalna fluorescencija) je prikazana u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 5: Dozno-zavisno vezanje monovalentnog nanotela protiv TCR (ispunjeni krugovi) i irelevantnog nanotela (otvoreni krugovi) na rastvorljivu rekombinantnu ljudsku TCR-α/β(2XN9)-zipper belančevinu. OD kod 450 nm je prikazan u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slike 6A i 6B: Kinetička analiza interakcije T01700055A02 (Slika 6A) i T01700056G05 (Slika 6B) i rastvorljive rekombinantne ljudske TCR-α/β (2XN9)-zipper belančevine primenom BioSloj-interferometrije (BioLayer Interferometry) na instrumentu Octet RED384. Koncentracije nanesenog analita su bile: 1000, 333, 111, 37, 12.3, 4.1 i 1.4 nM. Langmuirpodešavanja su uvedena u podatke označene sa crnim linijama, dok su senzorgrami predstavljeni uz pomoć sivih linija.

Slike 7A i 7B: Podaci aktivisanja (T-ćelije) monovalentnog nanotela protiv TCR spojenog na kuglice (Slika 7A). Podaci aktivisanja (T-ćelije) monovalentnog nanotela protiv TCR prisutnog u rastvoru (Slika 7B). Aktivisanje je izmereno uz pomoć praćenja povećane regulacije CD69 u primarnim ljudskim T-ćelijama. MCF-vrednost (srednja kanalna fluorescencija) je predstavljena za svako nanotelo.

Slika 8: Vezanje serijskih razblaživanja multispecifičnih polipeptida CD20xTCR (puna linija) i TCRxCD20 (isprekidana linija) na ljudski TCR/CD3 eksprimiran u CHO-K1-ćelijama (A), primarnim ljudskim T-ćelijama (B) i Ramos-ovim ćelijama (C). MCF-vrednost (srednja kanalna fluorescencija) je prikazana u odnosu na koncentraciju polipeptida.

Slike 9A i 9B: Dozno-zavisni efekt ubijanja nakon vezanja bispecifičnih polipeptida CD20xTCR (puna linija) i TCRxCD20 (isprekidana linija) uz pomoć ogleda (na bazi protočne citometrije) ubijanja Ramos-ovih B-ćelija posredovanog uz pomoć ljudskih T-ćelija. Procenat (%) mrtvih ćelija (% TOPRO-pozitivnih ćelija) je prikazan u odnosu na koncentraciju pomenutih polipeptida (Slika 9A). Dozno-zavisni efekt ubijanja nakon vezanja bispecifičnih polipeptida CD20xTCR (puna linija) uz pomoć ogleda (na bazi protočne citometrije) ubijanja Ramos-ovih B-ćelija posredovanog uz pomoć ljudskih T-ćelija. Procenat (%) mrtvih ćelija (% TOPRO-pozitivnih ćelija) je prikazan u odnosu na koncentraciju polipeptida (Slika 9B).

Slika 10: Dozno-zavisno vezanje nanotela protiv CD20 na ljudskim CD20 Ramos-ovim (otvoreni simboli) i Raji (ispunjeni simboli) ćelijama. MCF-vrednost (srednja kanalna fluorescencija) je prikazan u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slike 11A i 11B: Dozno-zavisni efekt ubijanja nakon vezanja bispecifičnih polipeptida CD20xTCR (puna linija) i TCRxCD20 (isprekidana linija) uz pomoć ogleda xCELLigence uz korišćenje CHO-K1-ćelija transfektovanih sa ljudskim CD20 (Slika 11A). Dozno-zavisni efekt ubijanja uz pomoć T017000055 primenom ogleda xCELLigence uz korišćenje CHO-K1-ćelija transfektovanih sa ljudskim CD20 (puna linija, ispunjeni simbol) i CHO-K1 parentalne ćelijske linije (otvoreni krugovi) sa ciljem da se ilustruje TAA (CD20) zavisno ubijanje (Slika 11B). Ćelijski indeks (CI) je prikazan u odnosu na koncentraciju polipeptida.

Slika 12: Dozno-zavisni efekt ubijanja uz pomoć polipeptida CD20xTCR primenom 5GS-linkera (otvoreni kvadrati), 9GS-linkera (otvoreni krugovi) i 35GS-linkera (ispunjeni simboli) primenom ogleda za ubijanje na bazi xCELLigence uz korišćenje CHO-K1 ljudskih TCR(2XN9)/CD3-ćelija. Ćelijski indeks (CI) je prikazan u odnosu na koncentraciju polipeptida.

Slike 13A i 13B: Dozno-zavisni efekat ubijanja uz pomoć T017000055 (Slika 13A) i T017000076 (Slika 13B) primenom ogleda za ubijanje (na bazi protočne citometrije) Ramosovih B-ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija uz korišćenje različitih omera efektor (E) : meta (T) (omer E:T=10:1 – ispunjeni krugovi, omer E:T=5:1 – otvoreni kvadrati, omer E:T=2:1 – ispunjeni trougaonici i omer E:T=1:1 – otvoreni dijamanti). Ćelijska smrt (% TOPRO-pozitivnih ćelija) je prikazana u odnosu na koncentraciju polipeptida.

Slika 14: Vremensko-zavisna citolitička aktivnost polipeptidnog vezanja CD20/TCR uz pomoć ogleda za ubijanje xCELLigence posredovano prečišćenim primarnim ljudskim T-ćelijama uz korišćenje CHO-K1 ljudskih CD20 ciljnih ćelija. Specifična liza je prikazana u odnosu na koncentraciju konstrukta. Različite krivulje predstavljaju analizu vremena nakon dodavanja T-ćelija.

Slike 15A-15C: Vezanje serijskog razblaživanja polipeptida sa produženim polu-životom na ljudski TCR/CD3 eksprimiran u CHO-K1-ćelijama (Slika 15A), primarnim ljudskim T-ćelijama (Slika 15B) i Ramos-ovim ćelijama (Slika 15C). MCF-vrednost (srednja kanalna fluorescencija) je prikazana u odnosu na koncentraciju polipeptida.

Slike 16A-16D: Dozno-zavisni efekat ubijanja vezanjem multispecifičnih polipeptida CD20xTCR upoređeno sa vezanjem polipeptida CD20xTCRxALB11 primenom ogleda ubijanja (na bazi protočne citometrije) Ramos-ovih B-ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija (Slika 16A, Slika 16C). Dozo-zavisni efekat ubijanja vezanjem polipeptida CD20xTCRxALB11 u odsutnosti ili prisutnosti 30 µM HSA u ogledu ubijanja (na bazi protočne citometrije) Ramos-ovih B-ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija (Slika 16B, Slika 16D). Procenat (%) ćelijske smrti (% TOPRO-pozitivnih ćelija) je prikazan u odnosu na koncentraciju polipeptida.

Slika 17: Vezanje 100 nM monovalentnog nanotela protiv HER2 (5F07) u ćelijskim linijama SKBR3, MCF-7 i MDA-MB-468 primenom protočne citometrije sa ciljem da se procene nivoi ekspresije HER2. MCF-vrednost (srednja kanalna fluorescencija) je prikazana za svaku ćelijsku liniju.

Slike 18A-18C: Dozno-zavisni efekat ubijanja vezanjem multispecifičnih polipeptida TCRxHER2 (isprekidana linija) i vezanjem multispecifičnih polipeptida HER2xTCR (puna linija) u ogledu xCELLigence primenom ubijanja posredstvom ljudskih T-ćelija uz korišćenje SKBR-3-ćelija (Slika 18A), MCF-7-ćelija (Slika 18B) i MDA-MB-468-ćelija (Slika 18C). Podaci su analizirani nakon 18 h. Ćelijski indeks (CI) je prikazan u odnosu na koncentraciju polipeptida.

Slika 19: Dozno-zavisna proizvodnja INF-γ u ljudskim T-ćelijama nakon inkubacije HER2-pozitivnih ćelija sa multispecifičnim TCRxHER2 veznim polipeptidima (isprekidana linija) i multispecifičnim HER2xTCR veznim polipeptidima (puna linija) primenom ogleda na bazi xCELLigence. Podaci su analizirani nakon inkubacije od 72 h. OD je prikazan u odnosu na koncentraciju polipeptida.

Slika 20: Dozno-zavisni efekat ubijanja vezanjem multispecifičnih polipeptida CD20xTCR (puna linija) i TCRxCD20 (isprekidana linija) primenom ogleda za ubijanje (protočna citometrija) Ramos-ovih B-ćelija posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda. Procenat (%) mrtvih ćelija (% TOPRO-pozitivnih ćelija) je prikazan u odnosu na koncentraciju polipeptida.

Slika 21: Dozno-zavisni efekat ubijanja vezanjem bispecifičnih polipeptida CD20xTCR (puna linija) i TCRxCD20 (isprekidana linija) primenom ogleda na bazi xCELLigence gdje je praćeno ubijanje CHO-K1 CD20-ljudskih ćelija posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda. CI je prikazan u odnosu na koncentraciju polipeptida.

Slika 22: Dozno-zavisno vezanje monovalentnog nanotela protiv TCR (ispunjeni krugovi) i irelevantnog nanotela (otvoreni krugovi) na rastvorljivu rekombinantnu TCR-α/β-zipper belančevinu iz makaki rakojeda. OD kod 450 nm je prikazan u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slike 23A i 23B: Kinetička analiza interakcije T0170055A02 (Slika 23A) i T0170056G05 (Slika 23B) i rastvorljive rekombinantne TCR-α/β-zipper belančevine iz makaki rakojeda primenom BioSloj-inferometrije na instrumentu Octet RED384. Koncentracije nanesenog analita su bile: 1000, 333, 111, 37, 12.3, 4.1 i 1.4 nM. Langmuir-podešeni kinetički podaci su prikazani sa crnim linijama, dok su senzorgrami prikazani sa sivim linijama.

Slike 24A i 24B: Dozno-zavisni efekat ubijanja uz pomoć T017000076 (CD20xTCR vezni multispecifični konstrukt) naspram T017000093 (CD20xTCRxALB11 vezni konstrukt) primenom ogleda (protočna citometrija) ubijanja Ramos-ovih B-ćelija posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda (Slika 24A). Dozo-zavisno ubijanje uz pomoć T017000093 u prisutnosti 30 µM HSA u ogledu za ubijanje (protočna citometrija) Ramos-vih B-ćelija posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda (Slika 24B). Procenat (%) ćelijske smrti (% TOPRO-pozitivnih ćelija) je prikazan u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 25: Dozno-zavisni efekat ubijanja vezanjem multispecifičnog konstrukta CD20xTCR naspram vezanja konstrukta CD20xTCRxALB11 i naspram vezanja konstrukta CD20xTCRxALB11 u prisutnosti 30 µM HSA u ogledu na bazi xCELLigence gde se prati ubijanje CHO-K1 ljudski ćelija transfektovanih sa CD20 posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda. Ćelijski indeks (CI) je prikazan u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 26: Dozno-zavisni efekat ubijanja vezanjem multispecifičnih polipeptida TCRxHER2 (isprekidana linija) i vezanjem multispecifičnih polipeptida HER2xTCR (puna linija) primenom ogleda xCELLigence gde se prati ubijanje ćelija HER2-pozitivnog SKBR-3-tumora posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda. Podaci su analizirani nakon inkubacije od 40 h. Ćelijski indeks (CI) je prikazan u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 27: Dizajn studije za Ramos-ov model kao šta je opisano u Primeru 19. Ramos-ove ćelije su bile intravenozno injektirane u miševe tokom dana 1 (D1). PBMC su injektirani intraperitonealno u životinje tokom dana 3 (D3). Miševi su tretirani od D3 do dana 7 (D7) uz pomoć T017000083 (TCR/CD20) i to IV jednom dnevno tokom 5 dana (Q1Dx5) ili sa T017000088 (irelevantni multispecifični polipeptid) IV Q1Dx5.

Slika 28: Apsolutni Ramos-ov broj B-ćelija na logaritamskoj skali u koštanoj srži (Slika 28A) i slezini (Slika 28B). Apsolutni PBMC-izvedeni broj B-ćelija na logaritamskoj skali u koštanoj srži (Slika 28C) i slezini (Slika 28D). Prikazani su rezultati individualnih životinja. Broj B-ćelija je prikazan kao funkcija različitih tretiranih grupa. Otvoreni krugovi na vrhu grafikona pokazuju koje aktivne doze su bile statistički značajno različite od irelevantnog polipeptida (T017000088) na bazi F-testova uz pomoć ANOVA-analize izmešanih efekata. Svi efekti u slezini su statistički značajni na 5% nivou značaja. Primetno, vrednost na Y-osi od 0.001 označava da nema ćelija za brojiti.

Slika 29: Dizajn studije za PBMC-model trošenja (tj. smanjivanja broja; depletion model) B-ćelija kao šta je opisan u Primeru 20. PBMC su životinjama injektirani intraperitonealno tokom dana 3 (D3). Miševi su tretirani od D3 do dana 7 (D7) sa T017000083 (TCR/CD20) i to IV jednom dnevno tokom 5 dana (Q1Dx5) ili sa T017000088 (irelevantni polipeptid) IV Q1Dx5.

Slika 30: Apsolutni broj PBMC-izvedenih B-ćelija na logaritamskoj skali. Prikazani su rezultati za pojedinačne životinje. Broj B-ćelija je prikazan kao funkcija različitih tretiranih grupa. Primetno, vrednost na Y-osi od 0.001 označava da nema ćelija za brojiti.

Slike 31A i 31B: Određivanje nivoa ekspresije EGFR (Slika 31A; uz pomoć antitela protiv EGFR; Santa Cruz, sc-120 PE) ili CEACAM5 (Slika 31B; uz pomoć antitela protiv CEACAM; Sino Biological, 11077-MM02-P) u ćelijskim linijama HER14, Hela, LoVo i LS174-T uz pomoć protočne citometrije. MCF-vrednost (srednja kanalna fluorescencija) je prikazana za svaku ćelijsku liniju.

Slika 32: Dozno-zavisno vezanje monovalentnog nanotela i multispecifičnih polipeptida na HER14-ćelije (A), LS174T-ćelije (B), primarne ljudske T-ćelije (C) i LoVo-ćelije (D). Intenzitet srednje kanalne fluorescencije je prikazan u odnosu na koncentraciju.

Slika 33: Određivanje nivoa ekspresije EGFR i CEACAM5 u ćelijskim linijama HER14, LoVo i LS174T uz pomoć 100 nM nanotela EGFR i CEACAM primenom protočne citometrije. MFI-vrednost (srednji intenzitet fluorescencije; mean fluorescence intensity) je prikazana za svaku ćelijsku liniju.

Slika 34: Dozno-zavisno preusmereno ubijanje ciljanih linija LoVo(A, B), LST174T (C, D) i HER14 (E) uz pomoć multispecifičnim polipeptidima posredstvom ljudskih efektorskih T-ćelija primenom ogleda xCELLigence uz korišćenje omera efektor : meta od 15. Nakon inkubacije od 30 h – 40 h (A, C) i 50 h – 60 h (B, D, E), CI je prikazan u odnosu na koncentraciju multispecifičnih polipeptida. (T017000107 = krug, T017000109 = kvadrat, T017000110 = trougaonik).

Slika 35: Dizajn studije in vivo Ramos-ovog modela koji je korišćen u Primeru 26. Ramos-ove ćelije su injektirane intravenozno u miševe tokom dana 1 (D1). PBMC su životinjama injektirani intraperitonealno tokom dana 3 (D3). Miševi su tretirani od D3 do dana 7 (D7) sa T017000088, T017000106, T017000083, T017000104 ili T017000105.

Slika 36: Apsolutni broj Ramos-ovih B-ćelija na logaritamskoj skali u koštanoj srži (A) i u slezini (B). Prikazani su rezultati za pojedinačne životinje. Broj Ramos-ovih B-ćelija je prikazan kao funkcija različitih tretiranih grupa. Zvezde na vrhu grafikona pokazuju koje aktivne doze su statistički značajno različite od kontrolnog nanotela (T017000088 ili T017000106) na bazi F-testova ANOVA-analize izmešanih efekata. Svi efekti su bili statistički značajni na 5% nivou značaja.

Slika 37: Apsolutni broj PBMC-izvedenih B-ćelija na logaritamskoj skali u koštanoj srži (A) i slezini (B). Prikazani su rezultati za pojedinačne životinje. Broj PBMC-izvedenih B-ćelija je prikazan kao funkcija različitih tretiranih grupa. Zvezde na vrhu grafikona pokazuju koje aktivne doze su statistički značajno različite u odnosu na kontrolno nanotelo (T017000088 ili T017000106) na bazi F-testova ANOVA-analize izmešanih efekata. Svi efekti su bili statistički značajni na nivou 5%-značaja.

Slika 38: Dozno-zavisno preusmereno ubijanje ciljanih SKBR3-ćelija uz pomoć T017000102 posredstvom ljudskih efektorskih T-ćelija izolovanih iz donora 932 (A), ljudskih CD4+ T-ćelija izolovanih iz donora 941 (B) i ljudskih CD8+ T-ćelija izolovanih iz donora 941 (C) primenom xCELLigence ogleda uz korišćenje omera efektor : meta od 15. Nakon inkubacije od 40 h, CI je prikazan u odnosu na koncentraciju multispecifičnog polipeptida.

Slika 39: Dozno-zavisno aktivisanje ljudskih efektorskih T-ćelija izolovanih iz donora 932 (A, D), ljudskih CD4+ T-ćelija izolovanih iz donora 941 (B, E) i ljudskih CD8+ T-ćelija izolovanih iz donora 941 (C, F) uz pomoć T017000102 u ogledu preusmerenog ubijanja ciljanih SKBR3-ćelija. Aktivisanje je izmereno praćenjem pozitivne regulacije CD69 (A, B, C) i CD25 (D, E, F). Intenzitet srednje fluorescencije (MFI) je prikazan u odnosu na koncentraciju.

Slika 40: Dozno-zavisna proizvodnja citokina uz pomoć ljudskih efektorskih T-ćelija izolovanih iz donora 932(A, D), ljudskih CD4+ T-ćelija izolovanih iz donora 941 (B, E) i ljudskih CD8+ T-ćelija izolovanih iz donora 941 (C, F) uz pomoć T017000102 u ogledu preusmerenog ubijanja ciljnih SKBR3-ćelija. Proizvodnja ljudskog INF-γ (A, B, C) i ljudskog IL-6 (D, E, F) je izmerena nakon 72 h inkubacije. Izmerena koncentracija ljudskog INF-γ i ljudskog IL-6 (u pg/ml) je prikazana u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 41: Dozno-zavisno vezanje HLE-konstrukta T017000108 na HER14-ćelije (A), LS174T-ćelije (B), primarne ljudske T-ćelije (C) i LoVo-ćelije (D). Intenzitet srednje fluorescencije (MFI) je prikazan u odnosu na koncentraciju.

Slika 42: Dozno-zavisno preusmereno ubijanje ciljanih LS174T-ćelija uz pomoć T017000107 (puna linija) i T017000108 (isprekidana linija) posredstvom ljudskih efektorskih T-ćelija primenom ogleda xCELLigence uz korišćenje omera efektor : meta od 15. Nakon inkubacije od 48 h, CI je prikazan u odnosu na koncentraciju multispecifičnih polipeptida.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0078] Ovi pronalazači su shvatili da formati koji spajaju T-ćelije i tumorske ćelije sa ciljem indukovanja imuno-odgovora treba da zadovolje razne i često suprotstavljene zahteve. Pomenuti format treba da bude široko primenjiv. Naročito, pomenuti format treba preferirano da bude koristan kod širokog spektra pacijenata i preferirano takođe usmeren protiv širokog raspona tumora. Pomenuti format treba preferirano da bude bezbedan i usmeren samo protiv ciljanih ćelija. Osim toga, format treba preferirano da bude dovoljno malen da lako penetrira u tkiva i tumore, dok sa druge strane format ne sme da bude zahtevan za pacijenta. Na primer, pomenuti format treba da ima produženi polu-život, tako da nakon intravenozne administracije ne bude odmah odstranjen preko bubrežnog sustava. Međutim, produženje polu-života preferirano ne sme da olakša promašaj mete niti da uzrokuje nus-pojave ili da ograniči penetraciju u tkiva i tumore. Dodatno, bilo je prepoznato da tumorske ćelije često stvaraju izlazne mehanizme (escape mechanisms) uz pomoć negativne regulacije ciljanih antigena tokom terapije. Prema tome, u daljnjoj preferiranoj verziji, pomenuti format treba istovremeno da cilja više antigena.

[0079] Ovaj pronalazak ostvaruje baren jedan od pomenutih zahteva.

[0080] Naročito, pretpostavljalo se da će imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni (ISV) u načelu biti idealni kandidati, upravo zbog toga šta su dovoljno mali da lako penetriraju u (tumorsko) tkivo, a mogu da se kombinuju sa drugim ISV kao građevni blokovi. Sledeće, ISV usmereni protiv konstantnih TCR-domena treba da pokazuju široku mogućnost primene. Suprotno varijabilnim TCR-domenima, pomenuti konstantni TCR-domeni pokazuju manje varijacija u sekvenci, pa posledično mogu da budu korisni kod širokog raspona pacijenata.

[0081] Neočekivano, ispostavilo se da je iznimno teško generisanje ISV uz pomoć imunizovanja lama protiv konstantnih domena iz TCR. Ili nije dobiven značajan imunoodgovor, ili su generisani ISV bili usmereni protiv varijabilnih TCR-domena. Jedino uz pomoć rigoroznog imunizovanja i postupaka pretrage uz korišćenje različitih ćelija i sekvenca za imunizovanje i poticanje (boosting) kao i uz korišćenje različitih screening-belančevina, ovi pronalazači su ispeli da izoluju ISV protiv konstantnih TCR-domena. Mada su identifikovana samo tri klastera oslobođenih ISV, pomenuti ISV su posedovali neočekivan raspon naprednih karakteristika. Prvo, pomenuti ISV su neočekivano široko primenjivi, tj. pomenuti TCR-ISV su bili sposobni da vežu T-ćelije iz različitih donora uz visoki afinitet. Formatirani kao multispecifični polipeptidi, pomenuti TCR-ISV omogućuju ubijanje tumorski ćelija sa različitom tumorskim antigenima. Tako, pomenuti TCR-ISV mogu da se koriste protiv velikog broja tumora. Osim toga, pomenuti multispecifični polipeptidi koji sadrži pomenute TCR-ISV ostaju aktivni kada su vezani na albuminu. Ovo doprinosi favorizovanom PK-profilu i prijemčivosti pacijenta uz minimalne nus-pojave. Polipeptidi iz ovoga pronalaska pokazuju svoje efekte samo kada su vezani istovremeno na T-ćeliju i na ciljanu ćeliju, koje ukazuje na njihovu bezbednost.

[0082] Ovi pronalazači su smatrali da istovremeno ciljanje više antigena smanjuje verovatnost pojave tumorskih escape-varijanata, zbog čega je strategija primene terapeutski aktivisanih T-ćelija poboljšana. Obezbeđeni su multispecifični polipeptidi koji obuhvataju TCR-ISV kako je definisano zahtevima spojene na imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene protiv različitih ciljanih antigena i/ili različitih epitopa iz nekog naročitog antigen (biparatopično).

[0083] Imunoglobulinske sekvence, poput antitela i iz njih izvedenih fragmenata koji vežu antigen (na primer, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni ili ISV) se koriste za specifično ciljanje njihovih odgovarajućih antigena za istraživačke svrhe ili u terapeutskoj primeni. Generisanje imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena poput na primer, VHH ili nanotela može da podrazumeva imunizovanje neke eksperimentalne životinje poput lama, konstrukciju biblioteka faga iz imuno-tkiva, selekciju faga koji prikazuje antigen kojeg vežu imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni i pretraživanje pomenutih domena i njihovih izmenjenih konstrukata kako bi se otkrile željene specifičnosti (WO 94/04678). Alternativno, slični imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni poput na primer, dAb mogu da se generišu uz pomoć selektiranja faga koji prikazuju antigen kojeg vežu imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni direktno iz naivnih ili sintetskih biblioteka i naknadno pretraživanje pomenutih domena i njihovih izmenjenih konstrukata sa ciljem otkrivanja željenih specifičnosti (Ward et al., Nature, 1989, 341: 544-546; Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; kao i, na primer, dokumenti WO 06/030220, WO 06/003388 i druge objavljene patentne aplikacije od Domantis Ltd.). Na žalost, upotreba monoklonskih i/ili izrazito izmenjenih antitela takođe donosi rizik visokih troškova, a može da rezultuje suboptimalnoj penetraciji u tumor u odnosu na druge strategije.

[0084] Ovaj pronalazak obezbeđuje multispecifične polipeptide kako je definisano zahtevima koji specifično vežu receptor T-ćelije (TCR), uz neočekivani raspon naprednih karakteristika. Prvo, pomenuti polipeptidi su jednostavni za proizvodnju. Štaviše, pomenuti ISV su neočekivano široko primenjivi, tj. ovi TCR-ISV su sposobni da se vežu na T-ćelije iz različitih donora uz visoki afinitet. Formatirani kao multispecifični polipeptidi, ovi TCR-ISV omogućavaju ubijanje tumorskih ćelija sa različitim tumorski antigenima. Osim toga, ubijanje nije primećeno kada polipeptidi nisu bili vezani istovremeno na T-ćelije i na ciljane ćelije koje naglašava bezbednost polipeptida iz ovoga pronalaska. Tako, ovi TCR-ISV mogu da se koriste protiv širokog raspona tumora. Štaviše, ovi TCR-ISV mogu da se smatraju bezbednima. Osim toga, multispecifični polipeptidi koji sadrže pomenute TCR-ISV ostaju aktivni kada su vezani na albumin. Ovo treba da doprinese ostvarivanju poželjnog PK-profila i prijemčivosti pacijenta, uz minimalne nus-pojave.

[0085] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano zahtevima koji sadrži prvi i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), pri čemu pomenuti prvi ISV ima visoki afinitet za/veže se na konstantni domen iz receptora T-ćelija (TCR), a drugi ISV ima visoki afinitet za/veže se na antigen na nekoj ćeliji (ciljanoj ćeliji), a preferirano tumorskoj ćeliji. Antigen je preferirano specifičan za pomenutu ciljanu ćeliju, poput na primer nekog tumorskog antigena (TAA). Multispecifični polipeptid iz ovog pronalaska usmerava T-ćeliju prema ciljanoj ćeliji, na primer prema nekoj tumorskoj ćeliji i indukuje aktivisanje T-ćelije sa ciljem da pomenuta T-ćelija inhibira ili ubije pomenutu ciljanu ćeliju, na primer neku tumorsku ćeliju.

Definicije:

[0086]

a) Osim ako je drugačije navedeno, svi termini koji se ovde koriste imaju svoja uobičajena značenja, koja su poznata stručnjaku. Kao referenca mogu da se koriste, na primer, standardi priručnici iz paragrafa a) na str.46 u dokumentu WO 08/020079.

b) Termin "imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen", koji je sinonim sa "pojedinačni varijabilni domen" i "ISV", definiše molekule koje sadrže mesto za vezanje antigena, ili je pomenuto formirano sa pojedinačnim imunoglobulinskim domenom. To odvaja imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene od "konvencionalnih" imunoglobulina ili njihovih fragmenata (poput, scFv, itd.), pri čemu dva imunoglobulinska domena, a naročito dva varijabilna domena, reaguju kako bi formirali mesto za vezanje antigena. Tipično, kod konvencionalnih imunoglobulina, varijabilni domen iz teškog lanca (VH) i varijabilni domen ili lakog lanca (VL) reaguju kako bi formirali mesto za vezanje antigena. U tom slučaju, regioni koji određuju komplementarnost (CDR) iz oba VH i VL lanca doprinose mestu za vezanje antigena, tj. ukupni 6 CDR-a je uključeno u formiranju mesta za vezanje antigena. Suprotno, mesto za vezanje u imunoglobulinskom pojedinačnom varijabilnom domenu nastaje uz pomoć pojedinačnog VH- ili VL-domena. Tako, mesto za vezanje antigena iz imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena nastaje uz pomoć ne više od tri CDR-a.

Termini "imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen", "pojedinačni varijabilni domen", i "ISV", tako, ne obuhvaćaju konvencionalne imunoglobuline ili njihove fragmente koji zahtevaju interakciju barem dva varijabilna domena za formiranje mesta za vezanje antigena. Međutim, ovi termini ne obuhvataju fragmente iz konvencionalnih imunoglobulina pri čemu pomenuto mesto za vezanje antigena nastaje preko pojedinačnog varijabilnog domena.

Termin "imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen" ili "ISV" uključuje (bez ograničenja) domene za vezanje antigena ili fragmente poput VHH-domena ili VH- ili VL-domena. Termini molekuli za vezanje antigena ili belančevine za vezanje antigena su sinonimi i, takođe, uključuju termin nanotelo. Pomenuti imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni mogu da budu sekvence lakog lanca varijabilnog domena (na primer, VL-sekvenca), ili sekvence teškog lanca varijabilnog domena (na primer, VH-sekvenca); a specifičnije, pomenuti mogu da budu sekvence teškog lanca varijabilnog domena koje su izvedene iz konvencionalnog četiri-lančanog antitela ili sekvence teškog lanca varijabilnog domena koje su izvedene iz teškog lanca antitela. Prema tome, pomenuti imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni mogu da budu domeni antitela, ili imunoglobulinske sekvence koje su prikladne za primenu kao domeni antitela, pojedinačni domeni antitela, ili imunoglobulinske sekvence koje su prikladne za primenu kao pojedinačni domeni antitela, "dAb", ili imunoglobulinske sekvence koje su prikladne za primenu kao dAb, ili nanotela, uključujući, ali bez ograničenja, VHH-sekvence, humanizovane VHH-sekvence ili VH-sekvence slične kamilskima. Ovaj pronalazak koristi imunoglobulinske sekvence različitog porekla, koje sadrže sekvence iz miša, pacova, zeca, magarca, ljudi i kamilske imunoglobulinske sekvence. Pomenuti imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen uključuje potpuno ljudske, humanizovane, drugačije optimizovane sekvence ili himerne imunoglobulinske sekvence. Pomenuti imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen i struktura nekog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena mogu da se posmatraju – ali bez ograničenja – kao da se sastoje od četiri okvirna regiona (regioni okvira) ili "FR", koji su u stanju tehnike i ovde označeni kao "Okvirni region 1" ili "FR1"; "Okvirni region 2" ili "FR2"; "Okvirni region 3" ili "FR3"; i "Okvirni region 4" ili "FR4"; pri čemu su pomenuti okvirni regioni isprekidani sa tri regiona koja određuju komplementarnost ili "CDR", a koji su u stanju tehnike označeni kao "Region 1 za određivanje komplementarnosti" ili "CDR1"; "Region 2 za određivanje komplementarnosti" ili "CDR2"; i "Region 3 za određivanje komplementarnosti" ili "CDR3". Treba da se primeti da termini nanotelo ili nanotela su registrovani zaštitni znaci od Ablynx N.V. pa prema, takođe, tome mogu da se označe kao nanotelo ili nanotela.

c) Osim ako je drugačije navedeno, termini "imunoglobulinska sekvenca", "sekvenca", "nukleotidna sekvenca" i "nukleinska kiselina" su opisani u paragrafu b) na str. 46 iz dokumenta WO 08/020079.

d) Osim ako je drugačije navedeno, svi postupci, koraci, tehnike i manipulacije koje nisu specifično opisane u detaljima mogu da se provedu i bile su provedene na način koji je poznat per se, kao šta je poznato stručnjacima. Referentna literatura, na primer, predstavljaju standardni priručnici i opšte stanje tehnike, koje je opisano ovde, ali i u referencama koje su tamo citirane; kao i, na primer, u sledećim preglednim člancima: Presta 2006 (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6):640-656), Levin & Weiss 2006 (Mol. Biosyst. 2(1):49-57), Irving et al.2005 (J. Immunol. Methods 248(1-2):31-45), Schmitz et al. 2000 (Placenta 21 Suppl. A: S106-112, Gonzales et al. 2005 (Tumour Biol.

26(1):31-43), koje opisuju tehnike manipuliranja belančevina, poput afinitetnog sazrevanja i drugih tehnika za poboljšavanje specifičnosti i drugih poželjnih karakteristika belančevina poput raznih imunoglobulina.

e) Amino-kiselinski ostaci su označeni u skladu sa standardnim kodom od tri slova ili jednog slova za amino-kiselinu. Referenca je Tabela A-2 na str. 48 iz Internacionalne aplikacije WO 08/020079 od Ablynx N.V. pod naslovom Immunoglobulin single variable domains directed against IL-6R and polypeptides comprising the istoj for the treatment of diseases and disorders associated with II-6 mediated signalling.

f) Radi mogućnosti upoređivanja dve ili više nukleotidnih sekvenca, procenat sekvencne identičnosti između prve nukleotidne sekvence i druge nukleotidne sekvence može da se izračuna ili odredi kao šta je opisano u paragrafu e) na str. 49 iz dokumenta WO 08/020079, poput deljenja [broja nukleotida u prvoj nukleotidnoj sekvenci koji su identični sa nukleotidima na odgovarajućim pozicijama u drugoj nukleotidnoj sekvenci] sa [ukupnim brojem nukleotida u prvoj nukleotidnoj sekvenci] i množenja sa [100%], pri čemu se svaka delecija, insercija, supstitucija ili adicija nekog nukleotida u drugoj nukleotidnoj sekvenci – u odnosu na prvu nukleotidnu sekvencu – smatra kao razlika pojedinačnog nukleotida (pozicije); ili uz korišćenje nekog prikladnog računarnog algoritma ili tehnike, koje su takođe opisane u paragrafu e) na str. 49 iz dokumenta WO 08/020079.

g) Za potrebe mogućnosti upoređivanja dva ili više imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena ili drugih amino-kiselinskih sekvenca poput, na primer, polipeptida iz ovoga pronalazak itd., procenat sekvencne identičnosti između prve amino-kiselinske sekvence i druge amino-kiselinske sekvence (takođe ovde označena kao aminokiselinska identičnost) može da se izračuna ili odredi kao šta je opisano u paragrafu f) na str. 49 i 50 iz dokumenta WO 08/020079, poput deljenja [broja amino-kiselinskih ostataka u prvoj amino-kiselinskoj sekvenci koji su identični sa amino-kiselinskim ostacima na odgovarajućim pozicijama u drugoj amino-kiselinskoj sekvenci] sa [ukupnim brojem amino-kiselinskih ostataka u prvoj amino-kiselinskoj sekvenci] i množenjem sa [100%], pri čemu se svaka delecija, insercija, supstitucija ili adicija nekog amino-kiselinskog ostatka u drugoj amino-kiselinskoj sekvenci – u odnosu na prvu amino-kiselinsku sekvencu – smatra razlikom pojedinačnog amino-kiselinskog ostatka (pozicije), tj., kao "amino-kiselinska razlika" kao šta je ovde definisano; ili uz korišćenje prikladnog računarnog algoritma ili tehnike, koji su opisani u paragrafu f) na str.49 i 50 iz dokumenta WO 08/020079.

Takođe, kod određivanja stepena sekvencne identičnost između dva imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena, stručnjak može da uzme u obzir takozvane "konzervativne" amino-kiselinske supstitucije, kao šta je opisano na str.50 iz dokumenta WO 08/020079.

Bilo koja amino-kiselinska supstitucija unesena u ovde opisane polipeptide može takođe da se bazira na analizi frekvencija amino-kiselinskih varijacija između homolognih belančevina iz različitih vrsta koje je opisano od strane autora Schulz et al. 1978 (Principles of Protein Structure, Springer-Verlag), na analizama potencijala koji formiraju strukture koje su razvijene od strane autora Chou & Fasman 1975 (Biochemistry 13: 211) i 1978 (Adv. Enzymol. 47: 45-149), i na analizi obrazaca hidrofobnosti belančevina koje su razvijene od strane autora Eisenberg et al.1984 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144), Kyte & Doolittle 1981 (J Molec. Biol. 157: 105-132), i Goldman et al. 1986 (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353). Informacije o primarnoj, sekundarnoj i tercijarnoj strukturi nanotela su navedene u ovom opisu, a opšte stanje tehnike je ovde takođe citirano. Takođe, za tu svrhu, kristalna struktura VHH-domena od lame je, na primer, opisana od strane autora Desmyter et al. 1996 (Nature Structural Biology, 3: 803), Spinelli et al. 1996 (Natural Structural Biology 3: 752-757), i Decanniere et al. 1999 (Structure, 7: 361). Daljna informacija oko nekih aminokiselinskih ostataka koji u konvencionalnim VH-domenima formiraju VH/VLinterfejs i potencijalnim camelizing-supstitucijama na ovim pozicijama mogu da se pronađu u prijašnjem stanju tehnike koje je citirano iznad.

h) Imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni i sekvence nukleinskih kiselina se smatra da su potpuno isti ako poseduju 100% sekvencne identičnosti (kao šta je definisano ovde) preko cele njihove dužine.

i) Kada se upoređuju dva imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena, termin amino-kiselinska razlika se odnosi na neku inserciju, deleciju ili supstituciju nekog pojedinačnog amino-kiselinskog ostatka u nekoj poziciji prve sekvence, a u odnosu na drugu sekvencu; pri čemu se podrazumeva da dva imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena mogu da sadrže jednu, dve ili više takvih amino-kiselinskih razlika. j) Kada se navodi da nukleotidna sekvenca ili amino-kiselinska sekvenca "obuhvata" drugu nukleotidnu sekvencu ili amino-kiselinsku sekvencu ili da "u suštini se sastoji od duge nukleotidne sekvence ili amino-kiselinske sekvence", tada je značenje objašnjeno u paragrafu i) na str. 51-52 iz dokumenta WO 08/020079.

k) Termin "u suštini izolovano iz" znači kao šta je objašnjeno u paragrafu j) na str.52 i 53 iz dokumenta WO 08/020079.

l) Termini "domen" i "vezni domen" imaju značenja koja su dana u paragrafu k) na str.53 iz dokumenta WO 08/020079.

m) Termini "antigeni determinant" i "epitop", koji su ovde sinonimi, imaju značenje iz paragrafa l) na str.53 iz dokumenta WO 08/020079.

n) Kao šta je dalje opisano u paragrafu m) na str. 53 iz dokumenta WO 08/020079, neka amino-kiselinska sekvenca (poput antitela, polipeptida iz ovog pronalaska, ili opšte neke belančevine, peptida ili neki njihov fragment koji mogu da vežu antigen) koja (specifično) veže, ima afinitet za i/ili specifičnost ka nekom specifičnom antigenom determinantu, epitopu, antigenu ili belančevini (ili barem jednom njegovom delu, fragmentu ili epitopu), tada se navodi da je pomenuta protiv ili usmerena protiv pomenutog antigenog determinanta, epitopa, antigena ili belančevine.

o) Termin specifičnost se odnosi na broj različitih tipova antigena ili antigenih determinanata na koje može da se veže neki naročiti molekul koji veže antigen ili belančevina koja veže antigen (poput ISV, nanotela ili polipeptida iz ovog pronalaska). Pomenuta specifičnost belančevine koja veže antigen može da se odredi na bazi afiniteta i/ili aviditeta.

[0087] Pomenuti afinitet, predstavljen kao ravnotežna konstantna za disocijaciju nekog antigena sa neke belančevine koja veže antigen (KDili KD), je mera za veznu jačinu između nekog antigenog determinanta, tj. mete, i nekog mesta za vezanje antigena na belančevini za vezanje antigena, tj. ISV ili nanotelo: čim je vrednost KDmanja, jača je vezna jačina između antigenog determinanta i molekula za vezanje antigena (alternativno, afinitet može takođe da se izrazi kao afinitetna konstantna (KA), koja je 1/KD). Kao šta je poznato stručnjacima (na primer na bazi daljnjeg opisa u ovoj aplikaciji), afinitet može da se odredi na način koji je poznat per se, u zavisnosti o specifičnom antigenu od interesa.

[0088] Aviditet je afinitet nekog polipeptida, tj. ligand može da se veže preko dva (ili više) farmakofora (ISV) pri čemu višestruke interakcije stvaraju sinergiju koja jača "prividni" afinitet. Aviditet je mera jačine vezanja između polipeptida iz ovog pronalaska i relevantnog antigena. Polipeptid iz ovog pronalaska može da se veže preko svoja dva (ili više) građevna bloka, poput ISV ili nanotela, na najmanje dve mete, tokom čega višestruke interakcije – na primer prvi građevni blok, ISV ili nanotelo, se veže na prvu metu, a drugi građevni blok, ISV ili nanotelo, se veže na drugu metu – stvaraju sinergiju koja pojačava "prividni" afinitet. Aviditet se odnosi na afinitet između antigenog determinanta i mesta koje veže antigen na molekulu za vezanje antigena i broja relevantnih mesta za vezanje koja su prisutna na molekulima za vezanje antigena. Na primer, i bez ograničenja, polipeptidi koji sadrže dva ili više građevna bloka, poput ISV ili nanotela koji su usmereni protiv različitih meta u ćeliji mogu da se (i uobičajeno će se) vezati sa visokim aviditetom na svaki od pojedinačnih monomera ili pojedinačnih građevnih blokova, poput, na primer, monovalentnih ISV ili nanotela, koji se sastoje od polipeptida iz ovoga pronalaska.

[0089] Bilo koja KD-vrednost veća od 10<-4>mol/L (ili bilo koja KA-vrednost manja od 10<4>M<-1>) L/mol se, opšte uzeto, smatra da ukazuje na ne-specifično vezanje.

[0090] Polipeptidi iz ovoga pronalaska sadrže prvi i drugi ISV, npr. prvo i drugo nanotelo. Preferirano, afinitet svakog ISV, na primer, npr. nanotela, se određuje pojedinačno. Drugim rečima, afinitet se određuje za monovalentni ISV ili nanotelo, nezavisno o aviditetnih efekata usled prisutnosti drugog ISV ili nanotela, koji može, ali ne mora da bude prisutan. Afinitet monovalentnog ISV ili nanotela, može da se odredi pomenutom monovalentnom ISV ili nanotelu, per se, tj. kada pomenuti monovalentni ISV ili nanotelo, nije deo polipeptida iz ovog pronalaska. Alternativno ili dodatno, afinitet monovalentnog ISV ili nanotela, može da se odredi prema jednoj meti dok je druga meta odsutna.

[0091] Vezanje belančevine koja prepoznaje antigen na neki antigen ili antigeni determinant može da se odredi na bilo koji prikladan način koji je poznat per se, uključujući, na primer, Scatchard-analizu i/ili oglede kompetetivnog vezanja, poput radioimuno-ogleda (RIA), encimskih imuno-ogleda (EIA) i ogleda sandwich-kompeticije, a njihove različite varijante su poznate stanju tehnike per se; kao i uz pomoć drugih tehnika koje su ovde pomenute.

[0092] Pomenuta konstanta disocijacije može da bude stvarna ili prividna konstantna disocijacije, kao šta je poznato stručnjaku. Postupci za određivanje konstante disocijacije su poznati stručnjaku, i, na primer, uključuju ovde pomenute tehnike. U tom smislu, podrazumeva se da možda neće biti moguće da se izmere konstante disocijacije veće od 10<-4>mol/L ili 10<-3>mol/L (na primer, of 10<-2>mol/L). Opciono, kao šta je takođe poznato stručnjaku, pomenute (stvarna ili prividna) konstante disocijacije mogu da se izračunaju na bazi (stvarna ili prividna) konstanti asocijacije (KA), uz pomoć jednačine [KD= 1/KA].

[0093] Afinitet se odnosi na jačinu ili stabilnost molekularnih interakcija. Afinitet je obično predstavljen sa KD, ili konstanta disocijacije, koja ima svoje jedinice tj. mol/L (ili M). Afinitet takođe može da se izrazi kao konstanta asocijacije, KA, koja je jednaka 1/KDi ima svoje jedinice, (mol/L)<-1>(ili M<-1>). U ovoj specifikaciji, stabilnost interakcija između dva molekula (poput amino-kiselinske sekvence, nanotela ili polipeptida iz ovog pronalaska i njihovih predviđenih meta) uglavnom se izražava kao KD-vrednost njihovih interakcija; pri čemu se podrazumeva da je stručnjaku poznato da u skladu sa jednačinom KA= 1/KD, specifikovanje jačine molekularnih interakcija preko njihovih KD-vrednosti takođe može da se koristi sa ciljem da se izračuna odgovarajuća KA-vrednost. Ova KD-vrednost karakteriše jačinu molekularne interakcije takođe i u termodinamičkom smislu jer je povezana sa slobodnom energijom (DG) vezanja preko dobro poznate jednačine DG=RT.ln(KD) (ekvivalentno sa DG=-RT.ln(KA)), gde R je gasna konstantna, T je apsolutna temperatura, a In se odnosi na prirodni logaritam.

[0094] KDza biološke interakcije koje imaju značenje (na primer, specifične su) se tipično kreće u rasponu od 10<-10>M (0.1 nM) do 10<-5>M (10000 nM). Jača interakcija znači niži KD.

[0095] KDmože takođe da se izrazi kao omer konstante disocijacijske stope nekog kompleksa, označena kao koff, u odnos na stopu njegove asocijacije, označene kao kon(tako da KD= koff/kon, a KA= kon/koff). Pomenuta off-stopa, koff, ima svoje jedinice, s<-1>(gde s je jedinica SI-sistema za sekund). Pomenuta on-stopa, kon, ima svoje jedinice, M<-1>s<-1>. on-stopa može da varira između 10<2>M<-1>s<-1>do oko 10<7>M<-1>s<-1>, približavajući se konstantni asocijacijske stope kod ograničene difuzije za biomolekularne interakcije. off-stopa se odnosi na polu-život neke molekularne interakcije preko jednačine t1/2=ln(2)/koff. off-stopa može da varira između 10<-6>s<-1>(blizu ireverzibilnog kompleks sa t1/2od više dana) do 1s<-1>(t1/2= 0.69 s).

[0096] Afinitet molekularne interakcije između dva molekula može da se izmereni uz pomoć različitih tehnika koje su poznate per se, poput dobro poznate biosenzorske tehnike površinske plazmonske rezonance (SPR) (vidi, na primer, Ober et al.2001, Intern. Immunology, 13: 1551-1559). Termin "površinska plazmonska rezonanca", kao šta se ovde koristi, se odnosi na optički fenomen koji omogućava analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu uz pomoć detektovanja promena u koncentracijama belančevina u biosenzornoj matrici, gde je jedan molekul imobiliziran na biosenzornom čipu, a drugi molekul prelazi preko imobiliziranog molekula u uslovima protoka pri čemu se mere kon, koff, ali i određuje vrednost KD(ili KA). Ovo, na primer, može da se ostvari primenom dobro-poznatog BIAcore<®>sistema (BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Svedska i Piscataway, NJ). Za daljni opis vidi Jonsson et al. 1993 (Ann. Biol. Clin.51: 19-26), Jonsson et al. 1991 (Biotechniques 11: 620-627), Johnsson, et al.1995 (J. Mol. Recognit. 8: 125-131), i Johnnson, et al.1991 (Anal. Biochem. 198: 268-277).

[0097] Druga dobro-poznata biosenzorna tehnika koja određuje afinitete biomolekularnih interakcija je interferometrija bio-sloja (BLI) (vidi, na primer, Abdiche et al. 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217). Termin "interferometrija bio-sloja" ili "BLI", kao šta se ovde koristi, se odnosi na optičku tehniku bez oznaka koja analizuje obrazac interferencije svetla koje je reflektovano sa dve površine: interni referentni sloj (referentna zraka) i sloj imobilizirane belančevine na biosenzornom vrhu (signalna zraka). Promena broja molekula vezanih na pomenuti vrh biosenzora uzrokuje pomak interferencijskog obrasca, koji je poznat kao pomak talasne dužine (nm), a njegova magnituda je direktna mera broja molekula vezanih na površinu biosenzornog vrha. Budući da pomenute interakcije mogu da budu izmerene u realnom vremenu, mogu da se odrede stope asocijacije i disocijacije i afiniteti. BLI može, na primer, da se provede uz korišćenje dobro-poznatih Octet<®>sistema (ForteBio, odjel Pall Life Sciences, Menlo Park, SAD).

[0098] Alternativno, afiniteti mogu da se izmere uz pomoć Kinetic Exclusion Assay (KinExA) (vidi, na primer, Drake et al. 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43), uz korišćenje platforme KinExA<®>(Sapidyne Instruments Inc, Boise, SAD). Termin "KinExA", kao šta se ovde koristi, se odnosi na postupak na bazi rastvora koji meri pravi afinitet i kinetike ravnotežnog vezanja ne-modifikovanih molekula. Ekvilibrirani rastvori kompleksa antitelo/antigen se propuštaju kroz kolonu sa kuglicama koje su prekrivene sa antigenom (ili antitelom), koje omogućava da se slobodno antitelo (ili antigen) veže na prekriveni molekul. Detektovanje tako ulovljenog antitela (ili antigena) se ostvaruje uz pomoć fluorescentno označenom belančevinom koja veže antitelo (ili antigen).

[0099] Takođe, stručnjaku je poznato da izmerena KDmože da odgovara prividnoj KDako je proces merenja na neki način pod uticajem intrinzičnog veznog afiniteta navedenog molekula, na primer, preko artefakata koji se tiču preliva biosenzora jedne od molekula. Takođe, prividna KDmože da bude izmeren ako jedan molekul sadrži više od jednog mesta prepoznavanja drugog molekula. U takvoj situaciji, izmereni afinitet može da bude pod uticajem aviditeta interakcija između dva pomenuta molekula.

[0100] Drugi pristup koji može da se koristi sa ciljem da se proceni afinitet je procedura 2-step ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) od autora Friguet et al. 1985 (J. Imunol. Methods, 77: 305-19). Ovaj postupak uspostavlja ravnotežu vezanja u fazi rastvora gde se izvodi merenje i na taj način izbegava moguće artefakte koji se tiču adsorpcije jednog od molekula na podlogu poput plastike.

[0101] Međutim, tačno merenje KDmože da bude veoma zahtevan postupak, a kao posledica često se određuju prividne KD-vrednosti sa ciljem da se proceni vezna jačina dva molekula. Podrazumeva se da sve dok se sva merenja odvijaju na ujednačen način (na primer, uz nepromenljive uslove merenja), prividne KD-mere mogu da se koriste kao aproksimacija pravog KDpa tako, u ovom dokumentu, KDi prividna KDtreba da se tretiraju sa jednakom važnosti i relevantnosti.

[0102] Konačno, podrazumeva se da u mnogim situacijama iskusni istraživač može da donese odluku da je prikladno da se odredi vezni afinitet prema nekom referentnom molekulu. Na primer, sa ciljem da se proceni vezna jačina između molekula A i B, istraživač može da koristi, na primer, neki referentni molekul C za kojeg se zna da se veže na B i da je prikladno označen sa fluoroforom ili kromoforom ili sa nekim drugim hemijskim ostatkom, poput biotina radi jednostavnijeg detektovanja uz pomoć ELISA ili FACS (Fluorescent activated cell sorting) ili drugim formatom (fluorofor za detektovanje fluorescencije, kromofor za jednostavno detektovanje absorpcije, biotin za detektovanje ELISA posredovane streptavidinom). Tipično, ovaj referentni molekul C se održava u fiksnoj koncentraciji, a koncentracija A varira za određenu koncentraciju ili količinu B. Kao rezultat se dobija IC50-vrednost koja odgovara koncentraciji A kod koje je izmereni signal za C u odsutnosti A prepolovljen. Pod uslovom da su poznati KD ref, KDreferentnog molekula, kao i ukupna koncentracija crefreferentnog molekula, prividna KDza interakciju A-B može da se odredi primenom sledeće formule: KD= IC50/(1+cref/ KD ref). Treba da se primeti da ako cref<< KD ref, tada je KD≈ IC50. Pod uslovom da se merenje IC50provede na konzistentan način (na primer, uz održavanje creffiksnim) za veznike koji se upoređuju, jačina ili stabilnost molekularne interakcije može da se proceni preko IC50pri čemu se ova mera smatra ekvivalentnom sa KDili sa prividnom KDkroz ceo ovaj tekst.

[0103] p) Polu-život neke amino-kiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida može, uopšteno, da bude definisan kao šta je opisano u paragrafu o) na str. 57 iz dokumenta WO 08/020079 i, kao šta je tamo pomenuto, se odnosi na vreme koje je potrebno da se serumska koncentracija pomenute amino-kiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida smanji za 50% u uslovima in vivo, na primer usled degradacije sekvence ili jedinjenja i/ili izbacivanje ili sekvestracije pomenute sekvence ili jedinjenja uz pomoć prirodnih mehanizama. Pomenuti in vivo polu-život neke amino-kiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida može da se odredi na način koji je poznat per se, poput farmakokinetičke analize. Prikladne tehnike su poznate stručnjaku iz ove tehničke oblasti, a, na primer, uopšteno, mogu da budu takve kako šta je opisano u paragrafu o) na str.57 iz dokumenta WO 08/020079. Kao šta je takođe pomenuto u paragrafu o) na str.57 iz dokumenta WO 08/020079, pomenuti polu-život može da se izrazi uz pomoć parametara poput t1/2-alfa, t1/2-beta i površine ispod krivulje (area under the curve, AUC). Referenca je, na primer, Eksperimentalni Deo ispod, kao i standardni priručnici, poput onog od autora Kenneth et al.1996 (Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists) i autora Peters et al. 1996 (Pharmacokinete analysis: A Practical Approach). Referenca su takođe i autori Gibaldi & Perron 1982 (Pharmacokinetics, Dekker M, 2. rev. izdanje). Termini "povećanje polu-života" ili "povećani polu-život" su definisani u paragrafu o) na str. 57 iz dokumenta WO 08/020079, a naročito se odnose na povećanje t1/2-beta, sa ili bez povećanja t1/2-alfa i/ili AUC ili oba.

[0104] q) Šta se tiče mete ili antigena, termin "mesto interakcije" na meti ili antigenu označava mesto, epitop, antigeni determinant, deo, domen ili niz amino-kiselinskih ostataka u meti ili antigenu koji predstavljaju mesto vezanja liganda, receptora ili drugog vezanog partnera, katalitičko mesto, mesto cepanja, mesto za alosteričku interakciju, mesto koje je uključeno u multimerizaciju (poput homomerizacija ili heterodimerizacija) istoj mete ili antigena; ili bilo koje drugo mesto, epitop, antigeni determinant, deo, domen ili niz amino-kiselinskih ostataka u pomenutoj meti ili antigenu koji su uključeni u biološkoj akciji ili mehanizmu istoj mete ili antigena. Uopšteno, "mesto interakcije" može da bude bilo koje mesto, epitop, antigeni determinant, deo, domen ili niz amino-kiselinskih ostataka u meti ili antigenu gde može da se veže amino-kiselinska sekvenca ili polipeptid iz ovoga pronalaska, pri čemu dolazi do moduliranja pomenute mete ili antigena (i/ili bilo kojeg puta, interakcije, signaliziranja, biološkog mehanizma ili biološkog efekta u koje su uključeni pomenuta meta ili antigen).

[0105] r) Imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ili polipeptid se smatra da je "specifičan za" prvu metu ili antigen u odnosu na drugu metu ili antigen kada se na prvi antigen veže sa afinitetom/aviditetom (kao šta je iznad opisano, i prikladno izraženo kao KD-vrednost, KA-vrednost, Koff-stopa i/ili Kon-stopa) koji je barem 10-puta, poput barem 100-puta, a preferirano barem 1000-puta, i do 10.000-puta ili više bolji od afiniteta uz pomoć kojeg se pomenuta amino-kiselinska sekvenca ili polipeptid veže na drugu metu ili polipeptid. Na primer, prvi antigen može da se veže na metu ili antigen sa KD-vrednosti koja je barem 10-puta manja, poput barem 100-puta manja, a preferirano barem 1000-puta manja, poput 10.000-puta manja ili čak manja od toga, nego KDuz pomoć koje se pomenuta amino-kiselinska sekvenca ili polipeptid veže na drugu metu ili polipeptid. Preferirano, kada je neki imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ili polipeptid "specifičan za" prvu metu ili antigen u odnosu na neku drugu metu ili antigen, tada se kaže da je usmeren protiv (kao šta je ovde definisano) pomenute prve mete ili antigena, ali nije usmeren protiv pomenute druge mete ili antigena.

[0106] s) Termini "unakrsni blok", "unakrsno-blokiran" i "unakrsno-blokiranje" su sinonimi koji označavaju sposobnost nekog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptida da interferiše sa vezanjem prirodnog liganda na svoj(e) receptor(e). Obim sa kojim je neki imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ili polipeptid sposoban da interferiše sa vezanjem drugog jedinjenja, poput prirodnog liganda, na njegovu metu pa prema tome može da se kaže da pomenuti stvara unakrsni blok, može da se odredi primenom ogleda za kompeticijsko vezanje. Jedan naročito prikladan kvantitativan ogled za unakrsno-blokiranje primenjuje pristup na bazi FACS-a ili ELISA-e ili Alfascreen sa ciljem merenja kompeticije između označenog (na primer, sa His-priveskom ili biotinilovan) imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptida i nekog drugog vezanog agensa koji se takmiče za vezanje na istu metu. Eksperimentalni deo uopšteno opisuje prikladne oglede na bazi FACS-a, ELISA-e ili Alfascreen-zamene uz pomoć kojih se određuje da li neki vezani molekul unakrsno-blokira ili je sposoban za unakrsno-blokiranje nekog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptida. Podrazumeva se da pomenuti ogled može da se koristi sa bilo kojim od imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena ili drugim vezanim agensima koji su ovde opisani. Tako, opšte uzeto, unakrsno-blokiranje aminokiselinske sekvenca ili drugog vezanog agensa je, na primer, takvo koje omogućava vezanje na metu u formatu malopre opisanog ogleda za unakrsno-blokiranje tako da, tokom ogleda i u prisutnosti druge amino-kiselinske sekvence ili drugog vezanog agensa, snimljena zamena imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptida iznosi između 60% i 100% (na primer, u formatu kompeticijskog ogleda na bazi ELISA/Alfascreen-a) ili između 80% do 100% (na primer, u formatu kompeticijskog ogleda na bazi FACS-a) od maksimalne teoretski-očekivane zamene (na primer, zamena sa hladnim (na primer, ne-označenim) imunoglobulinskim pojedinačnim varijabilnim domenom ili polipeptidom koji treba da bude unakrsno-blokiran) uz pomoć potencijalnog agensa za unakrsno-blokiranje koji se testira i koji je prisutan u količini od 0.01 mM ili manje (agens za unakrsno-blokiranje može da bude drugo konvencionalno monoklonsko antitelo poput IgG, fragmenti klasično monovalentnog antitela (Fab, scFv) i izmenjene varijante (na primer, diatela, triatela, minitela, VHH, dAb, VH, VL)).

[0107] t) Amino-kiselinska sekvenca poput, na primer, nekog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptida u skladu sa ovim pronalaskom se kaže da je "VHH1-tip imunoglobulisnkog pojedinačnog varijabilnog domena" ili "VHH-tip 1 sekvenca", ako pomenuti VHH1-tip imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ili VHH-tip 1 sekvenca poseduje 85% identičnost (uz korišćenje VHH1-konsenzus sekvence kao querysekvenca uz primenu blast-algoritma koji je podešen standardno, tj., koristi bodovnu matricu blosom62) sa VHH1-konsenzus sekvencom (QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSD GSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA) (SEQ ID Br.: 483), i obavezno sadrži cistein na poziciji 50, tj., C50 (uz primenu Kabat-numerisanja).

[0108] u) Amino-kiselinska sekvenca poput, na primer, nekog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptida se kaže da je "unakrsno-reaktivna" prema dva različita antigena ili antigena determinanta (poput serumskog albumina iz dve različite vrste sisara, poput ljudskog serumskog albumina i serumskog albumina iz makaki rakojeda) samo ukoliko je istovremeno specifična za (kao šta je ovde definisano) oba pomenuta različita antigena ili antigene determinante.

[0109] v) Kao šta je dodatno opisano u paragrafu q) na str. 58 i 59 iz dokumenta WO 08/020079, amino-kiselinski ostaci nekog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena su numerisani u skladu sa opštim numerisanjem VH-domena koje su opisali autori Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, publikacija br. 91), kao šta je primenjeno na VHH-domene iz kamila (Camelidae) u članku autora Riechmann & Muyldermans, 2000 (J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195; vidi, na primer, Sliku 2 ove publikacije). Podrazumeva se da – kao šta je poznato stanju tehnike u vezi sa VH-domenima i VHH-domenima – ukupan broj amino-kiselinskih ostataka u svakom CDR može da varira i da ne odgovara sa ukupnim brojem amino-kiselinskih ostataka navedenih u Kabat-numerisanju (odnosno, jedna ili više pozicija u skladu sa Kabatnumerisanjem ne moraju da budu popunjene u aktualnoj sekvenci, ili sama aktualna sekvenca može da sadrži više amino-kiselinskih ostataka od broja koji je predviđen Kabatnumerisanjem). To znači da, uopšteno, numerisanje po Kabat-u može, ali ne mora da odgovara aktualnom numerisanju amino-kiselinskih ostataka u aktualnoj sekvenci. Ukupan broj aminokiselinskih ostataka u VH-domenu i VHH-domenu uobičajeno se kreće u rasponu od 110 do 120, često između 112 i 115. Podrazumeva se da manje i veće sekvence takođe mogu da budu prikladne za ostvarivanje ovde opisanih ciljeva.

[0110] Određivanje CDR-regiona može takođe da se provede u skladu sa različitim postupcima. Kod određivanja CDR-a prema Kabatu, FR1 nekog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 1-30, CDR1 iz imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 31-35, FR2 iz imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena obuhvata amino-kiseline na pozicijama 36-49, CDR2 iz imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 50-65, FR3 iz imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 66-94, CDR3 iz imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 95-102, a FR4 iz imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 103-113.

[0111] U ovoj prijavi, međutim, osim ako je drugačije navedeno, CDR-sekvence se određuju prema autorima Kontermann & Dübel (Ur. 2010, Antibody Engineering, vol. 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, poglavlje 3, str. 33-51). U skladu sa tim postupkom, FR1 obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 1-25, CDR1 obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 26-35, FR2 obuhvata amino-kiseline na pozicijama 36-49, CDR2 obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 50-58, FR3 obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 59-94, CDR3 obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 95-102, a FR4 obuhvata amino-kiselinske ostatke na pozicijama 103-113.

[0112] w) Slike, sekvence i Eksperimentalni deo/Primeri služe samo radi dodatnog ilustrovanja pronalaska i ne treba da se interpretiraju kao da ograničavaju okvire ovoga pronalaska i/ili njegove pridodane zahteve na bilo koji način, osim ako je ovde eksplicitno navedeno drugačije.

[0113] x) Pola maksimalno inhibitorne koncentracije (IC50) je mera sposobnosti jedinjenja da inhibira neku biološku ili biohemijsku funkciju, na primer, neki farmakološki efekt. Ova kvantitativna mera označava koliko je potrebno ISV ili nanotela (inhibitora) da se neki biološki proces (ili komponenta nekog procesa, tj. neki encim, ćelija, ćelijski receptor, hemotaksa, anaplazija, metastaza, invazivnost, itd) inhibira na pola. Drugim rečima, to je pola od maksimalne (50%) inhibitorne koncentracije (IC) neke supstancije (50% IC, ili IC50). Pomenuta IC50nekog leka može da se odredi uz pomoć konstruiranja krivulje odgovora na dozu i ispitivanja efekta različitih koncentracija antagonista poput ISV ili nanotela na aktivnost reverznog agonista. IC50-vrednosti mogu da se izračunaju za neki antagonist poput ISV ili nanotela uz pomoć određivanja koncentracije koja je potrebna da se inhibira pola maksimalnog biološkog odgovora agonista.

[0114] Termin pola maksimalno efektivne koncentracije (EC50) se odnosi na koncentraciju jedinjenja koja indukuje odgovor koji se nalazi na pola-puta između osnovne i maksimalne linije nakon specifikovanog vremenskog izlaganja. U ovom kontekstu se koristi kao mera potencijala nekog polipeptida, ISV-a ili nanotela. Pomenuti EC50graduirane krivulje doznog odgovora predstavlja koncentraciju jedinjenja kod koje je primećeno 50% njegovog maksimalnog efekta. Koncentracija se preferirano izražava u molarnim jedinicama.

[0115] U biološkim sistemima, male promene u koncentraciji liganda tipično rezultuju brzim promenama odgovora, koje daje sigmoidnu funkciju. Tačka nagiba kod koje povećani odgovor usled povećane koncentracije liganda počinje da slabi je EC50. Ovo može da se odredi matematički uz pomoć deriviranja best-fit linije. U većini slučajeva je oslanjanje na grafikonu prihvatljivo. U slučaju kada je u delu sa primerima obezbeđen EC50, the eksperimenti su bili dizajnirani da reflektuju KD šta je više moguće tačnije. Drugim rečima, EC50-vrednosti mogu tada da se smatraju KD-vrednostima. Termin "prosečni KD" se odnosi na prosečnu KD-vrednost koja je dobivena u barem 1, ali preferirano više od 1, poput barem 2 eksperimenta. Termin "prosečno" se odnosi na matematički termin "prosečno" (suma podataka podeljenih sa brojem klasa).

[0116] Takođe je povezan sa IC50koje je mera inhibicije jedinjenja (50% inhibicija). Kod ogleda kompeticije vezanja i ogleda sa funkcionalnim antagonistom, IC50je najčešća sumarna mera krive doznog odgovora. Kod ogleda agonist/stimulator najčešća sumarna mera je EC50.

[0117] y) Podrazumeva se da, kao šta se ovde koristi, forme jednine takođe uključuju i množinu osim ako iz konteksta jasno proizlazi suprotno. Tako, na primer, referenca "reagens" uključuje jedan ili više takvih različitih reagensa, a referenca "postupak" uključuje ekvivalentne korake i postupke koji su poznati stručnjacima i koji mogu da budu modifikovani ili zamenjeni sa ovde opisanim postupcima.

[0118] Osim ako je drugačije navedeno, termin "barem" ispred serije elemenata podrazumeva da se odnosi na svaki element iz serije.

[0119] Termin "i/ili" gde god se ovde koristi ima značenje "i", "ili" i "sve ostale kombinacije elemenata koji povezuju pomenuti termin".

[0120] Termin "oko" ili "približno", kao šta se ovde koristi, označava unutar 20%, preferirano unutar 15%, bolje unutar 10%, a najbolje unutar 5% neke vrednosti ili raspona.

[0121] Kroz celu ovu specifikaciju i u zahtevima na kraju, osim ako kontekst zahteva suprotno, reč "obuhvata", i varijacije poput "sadrži" i "koji sadrži", se podrazumeva da obuhvataju navedeni celi broj ili korak ili grupu celih brojeva ili koraka, ali istovremeno ne isključuje bilo koji drugi celi broj ili korak ili grupu celih brojeva ili koraka. Kada se ovde kositi, termin "koji sadrži" može da se zameni sa terminom "sadržavajući" ili "uključujući", a ponekad i sa terminom "ima".

[0122] Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisan sa zahtevima koji sadrži barem jedan prvi i barem jedan dodatan imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), pri čemu pomenuti barem jedan prvi ISV ima visoki afinitet za/veže konstantni domen receptora T-ćelije (TCR), a pomenuti barem jedan dodatni ISV ima visoki afinitet za/veže neki antigen na ciljanoj ćeliji.

[0123] Tipično, multispecifični polipeptidi iz ovog pronalaska kombinuju visoki afinitet prepoznavanja antigena na ciljanoj ćeliji sa aktivisanjem T-ćelija, koje rezultuje aktivisanjem koje je nezavisno o prirodnoj specifičnosti T-ćelija. Modus delovanja vezanih molekula koji istovremeno vežu neki molekul na ćelijskoj površini ciljane ćelije, poput tumorskog antigena, i TCR iz T-ćelije je obično poznat. Dovođenje T-ćelije blizu ciljane ćelije, tj., uključivanje pomenute T-ćelije i klasteriranje na TCR-kompleksu rezultuje ubijanjem ciljane ćelije od strane T-ćelije. Sa ovim pronalaskom, ovaj proces može biti iskorišćen sa ciljem medicinskog delovanja protiv neke proliferativne bolesti, upalne bolesti, infektivne bolesti i autoimune bolesti. Uopšteno, T-ćelije su opremljene sa granulama koje sadrže smrtonosnu kombinacijom belančevina koje formiraju pore, poznate kao perforini, i proteaze koje indukuju ćelijsku smrt, poznate kao grancimi. Preferirano, ove belančevine se dostavljaju u ciljane ćelije preko citolitičke sinapse koja se formira kada se T-ćelije nalaze blizu ciljane ćelije koja treba da se uništi. Normalno, blizina između neke T-ćelije i neke ciljane ćelije se ostvaruje tako da se T-ćelija veže na MHC/peptidni kompleks preko receptora T-ćelija. Polipeptidi iz ovoga pronalaska dovode T-ćeliju blizinu ciljane ćelije i bez interakcije receptor na T-ćeliji/MHC.

[0124] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid, kako je definisan sa zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid usmerava T-ćelije prema ciljanoj ćeliji.

[0125] Uz pomoć jedne svoje ruke (prvi ISV), pomenuti multispecifični polipeptid ostvaruje visoki afinitet za/veže se na konstantni domen TCR-podjedinice, proteinska komponenta kompleksa za prenos signala u T-ćelijama koji se nalazi na površini ćelija. Sa drugom svojom rukom (drugi ISV i/ili treći ISV, itd.), pomenuti multispecifični polipeptid prepoznaje, ima visoki afinitet za/veže antigen(e) na ciljanim ćelijama. Preferirano, aktivisanje T-ćelija nastupa samo kada su multispecifični polipeptidi prezentirani T-ćelijama preko površine ciljanih ćelija. Antigenska zavisnost ciljanih ćelija rezultuje u preferirani bezbednosni profil tokom aktivisanja. U jednoj izvedbi, pomenuti multispecifični polipeptidi privremeno povezuju T-ćelije i ciljane ćelije. Preferirano, pomenuti multispecifični polipeptid može da potakne mirujuće poliklonske T-ćelije, poput CD4<+>i/ili CD8<+>T-ćelije, na aktivisanje visoko potentne preusmerene lize ciljanih ćelija. Preferirano, T-ćelija je usmerena na sledeću ciljanu ćeliju nakon lize prve ciljane ćelije.

[0126] Belančevine i polipeptidi koji sadrže ili u suštini se sastoje od dva ili više imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena (poput barem dva imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena iz ovoga pronalaska) ovde se označavaju kao "multivalentne" belančevine ili polipeptidi ili kao "multivalentni konstrukti". Neki ne-ograničavajući primeri takvih multivalentnih konstrukata su opisani u nastavku teksta. Polipeptidi iz ovoga pronalaska su "multivalentni", tj. takvi koji sadrže dva ili više građevna bloka ili ISV-a od kojih su barem prvi građevni blok, ISV ili nanotelo, i drugi građevni blok, ISV ili nanotelo, međusobno različiti i usmereni protiv različitih meta, poput antigena ili antigenih determinanata. Polipeptidi iz ovoga pronalaska koji sadrže barem dva ISV ili nanotela kako je definisano sa zahtevima, u kojima je barem jedan ISV ili nanotelo, usmeren protiv konstantnog domena TCR i barem jedan ISV ili nanotelo, usmeren protiv drugog antigena (tj., protiv druge mete koja je različita od prve mete, poput, na primer, TAA, kao CD20 ili HER2), ovde se takođe nazivaju "multispecifičnim" polipeptidima iz ovoga pronalaska, a ISV ili nanotela, prisutni u takvim polipeptidima ovde se takođe smatraju "multivalentnim formatima" ili "multispecifičnim formatima". Tako, na primer, neki "bispecifični" polipeptid iz ovoga pronalaska je polipeptid koji obuhvata barem jedan ISV ili nanotelo, koji je usmeren protiv TCR i barem jedan dodatni ISV ili nanotelo, koji je usmeren protiv druge mete (tj., usmeren protiv druge mete koja je različita od pomenute prve mete, poput, na primer, TAA, kao CD20 ili HER2), dok neki "trispecifični" polipeptid iz ovoga pronalaska je neki polipeptid koji sadrži barem jedan ISV ili nanotelo, koji je usmeren protiv TCR, drugi ISV ili nanotelo, koji je usmeren protiv druge mete koja je različita od pomenute prve mete (na primer, TAA, kao CD20 ili HER2) i barem jedan dodatni građevni blok, ISV ili nanotelo, koji je usmeren protiv trećeg antigena (tj., takvog koji je različit od pomenute prve i pomenute druge mete, kao na primer neki drugi TAA); itd. Kao šta jasno proizlazi iz opisa, ovaj pronalazak nije ograničen na bispecifične polipeptide, u smislu da neki multispecifični polipeptid iz ovoga pronalaska može da sadrži barem jedan ISV ili nanotelo, protiv konstantnog domena TCR-a, i drugi ISV ili nanotelo, protiv druge mete u bilo koji broj građevnih blokova, ISV ili nanotela, usmerenih protiv jedne ili više meta, koje mogu da budu iste ili različite od pomenute prve i/ili druge mete. Pomenuti građevni blokovi, ISV ili nanotela, mogu opciono da budu spojeni preko linkerskih sekvenca.

[0127] Termini bispecifični polipeptid, bispecifični format, bispecifični konstrukt, bispecifični konstrukt nanotela, bispecifično i bispecifično antitelo se ovde koriste kao sinonimi.

[0128] Kao šta je jasno vidljivo iz ovog opisa, pomenuti imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni korišćeni u pronalasku mogu da se koriste kao "građevni blokovi" sa ciljem da se formiraju polipeptidi iz ovoga pronalaska, na primer, uz pomoć njihovog prikladnog kombinovanja sa drugim grupama, ostacima, ili veznim jedinicama, a sa ciljem da se formiraju jedinjenja ili konstrukti kao šta je ovde opisano (poput, ali bez ograničenja, bi-/tri-/tetra-/multivalentni i bi-/tri-/tetra-/multispecifični polipeptidi iz ovoga pronalaska) koji unutar jednog molekula spajaju jednu ili više poželjnih karakteristika ili bioloških funkcija.

[0129] Podrazumeva se da (kao šta je takođe pokazano u delu sa primerima) ISV koji veže TCR i ISV koji veže antigen na ciljanoj ćeliji mogu da budu orijentisani na bilo koji način u polipeptidu iz ovoga pronalaska. Naročito, u jednoj izvedbi, ISV koji veže TCR je postavljen N-terminalno, a ISV koji veže antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen C-terminalno. U drugoj izvedbi, ISV koji veže antigen na ciljanoj ćelija je postavljen N-terminalno, a ISV koji veže TCR je postavljen C-terminalno.

[0130] U jednom preferiranom aspektu, polipeptid iz ovoga pronalaska sadrži barem jedan prvi, barem jedan drugi i barem jedan treći imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), pri čemu pomenuti barem jedan prvi ISV ima visoki afinitet za/veže se na konstantni domen receptora T-ćelije (TCR); pomenuti barem jedan drugi ISV ima visoki afinitet za/veže se na prvi antigen na ciljanoj ćeliji, a pomenuti barem jedan treći ISV ima visoki afinitet za/veže se na drugi antigen na ciljanoj ćeliji, pri čemu pomenuti drugi antigen je različit od pomenutog prvog antigena. Pomenuti prvi antigen i pomenuti drugi antigen mogu da se nalaze na istoj ili u različitim ciljanim ćelijama.

[0131] Podrazumeva se da (kao šta je takođe pokazano u delu sa primerima) ISV koji veže TCR i ISV-i koji vežu pomenuti prvi i drugi antigen na ciljanoj ćeliji mogu da budu postavljeni u bilo kojem redosledu u polipeptidu iz ovoga pronalaska. Naročito, u jednoj izvedbi, pomenuti ISV koji veže TCR je postavljen N-terminalno, pomenuti ISV koji veže pomenuti prvi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen centralno, a pomenuti ISV koji veže pomenuti drugi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen C-terminalno. U drugoj izvedbi, pomenuti ISV koji veže TCR jer postavljen N-terminalno, pomenuti ISV koji veže pomenuti drugi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen centralno, a pomenuti ISV koji veže pomenuti prvi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen C-terminalno. U drugoj izvedbi, pomenuti ISV koji veže pomenuti prvi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen N-terminalno, pomenuti ISV koji veže pomenuti drugi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen centralno, a pomenuti ISV koji veže TCR je postavljen C-terminalno. U drugoj izvedba, pomenuti ISV koji veže pomenuti prvi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen N-terminalno, pomenuti ISV koji veže TCR je postavljen centralno, a pomenuti ISV koji veže pomenuti drugi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen C-terminalno. U drugoj izvedbi, pomenuti ISV koji veže pomenuti drugi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen N-terminalno, pomenuti ISV koji veže TCR je postavljen centralno, a pomenuti ISV koji veže pomenuti prvi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen C-terminalno. U drugoj izvedbi, pomenuti ISV koji veže pomenuti drugi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen N-terminalno, pomenuti ISV koji veže pomenuti prvi antigen na ciljanoj ćeliji je postavljen centralno, a pomenuti ISV koji veže TCR je postavljen C-terminalno.

[0132] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na polipeptide koji sadrže ili u suštini se sastoje od jednog ili više ISV ili polipeptida iz ovoga pronalaska, a opciono dodatno sadrže jedan ili više drugih grupa, ostataka, ili veznih jedinica. Kao šta je stručnjaku jasno iz ovog opisa, takve dodatne grupe, ostaci, vezne jedinice ili amino-kiselinske sekvence mogu, ali ne moraju, da donesu dodatne funkcionalnosti polipeptidu iz ovoga pronalaska (i/ili jedinjenju ili konstruktu u kojem je prisutan) i mogu, ali ne moraju, da modifikuju karakteristike polipeptida iz ovoga pronalaska.

[0133] Polipeptidi iz ovoga pronalaska mogu, uopšteno, da se pripreme primenom nekog postupka koji obuhvata barem jedan korak koji prikladno spaja dva ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena korišćenih u pronalasku sa jednom ili više drugih grupa, ostataka, ili veznih jedinica, opciono preko jednog ili više prikladnih linkera, a sa ciljem da se dobije jedinjenje, konstrukt ili polipeptid iz ovog pronalaska. Polipeptidi iz ovog pronalaska mogu takođe da se pripreme primenom nekog postupka koji, uopšteno, obuhvata barem korake koji obezbeđuju nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid iz ovog pronalaska, eksprimiranja pomenute nukleinske kiseline na neki prikladan način, i obnavljanja eksprimiranog polipeptida iz ovog pronalaska. Takvi postupci mogu da se provedu na način koji je poznat per se, koje je jasno stručnjaku, na primer na bazi ovde opisanih postupaka i tehnika.

[0134] Proces dizajniranja/izbora i/ili pripreme nekog polipeptida iz ovoga pronalaska, započinjući sa amino-kiselinskom sekvencom korišćenom u pronalasku, je ovde takođe označen kao "formatiranje" pomenute amino-kiselinske sekvence korišćene u pronalasku; a za amino-kiselinu iz ovoga pronalaska koja je deo jedinjenja, konstrukta ili polipeptida iz ovoga pronalaska se kaže da je "formatirana" ili da je "u formatu" pomenutog polipeptida iz ovog pronalaska. Primeri načina na koje neka amino-kiselinska sekvenca korišćena u pronalasku može da bude formatirana i primeri takvih formata stručnjaku će postati jasnima iz ovoga opisa; a takvi formatirani polipeptidi iz pronalaska formiraju dodatni aspekt ovoga pronalaska.

[0135] Na primer, takve dodatne grupe, ostaci, ili vezna jedinica mogu da budu jedan ili više dodatnih imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena, tako da pomenuto jedinjenje ili konstrukt predstavlja (fuzionu) belančevinu ili (fuzioni) polipeptid. U jednom preferiranom, ali ne-ograničavajućem aspektu, pomenuta jedna ili više drugih grupa, ostataka, ili veznih jedinica su imunoglobulinske sekvence. Još bolje, pomenuta jedna ili više drugih grupa, ostataka, ili veznih jedinica su izabrane iz grupe koja obuhvata domen antitela, imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene koji su prikladni za primenu kao domen antitela, pojedinačni domen antitela, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni (ISV) koji su prikladni za primenu kao pojedinačni domen antitela, "dAb", imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni koji su prikladni za primenu kao dAb, ili nanotela. Alternativno, takve grupe, ostaci, ili vezne jedinice mogu, na primer, da budu hemijske grupe, ostaci, koji sami za sebe mogu, ali ne moraju, da budu biološki i/ili farmakološki aktivni. Na primer, i bez ograničenja, takve grupe mogu da budu spojene na polipeptide iz ovoga pronalaska sa ciljem da se obezbedi "derivat" polipeptida iz ovog pronalaska, kao šta je ovde dalje opisano.

[0136] Takođe, unutar okvira ovoga pronalaska se nalaze jedinjenja ili konstrukti, koji obuhvataju ili u suštini se sastoje od jednog ili više derivata kao šta je ovde opisano, i opciono dodatno sadrže jednu ili više drugih grupa, ostataka, ili veznih jedinica, opciono spojenih preko jednog ili više linkera. Preferirano, pomenuta ili više drugih grupa, ostataka ili veznih jedinica predstavljaju imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni. Kod iznad opisanih jedinjenja ili konstrukata, pomenuti dva ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena korišćeni u pronalasku i jedna ili više grupa, ostataka, ili veznih jedinica mogu da budu spojeni direktno jedan na drugi i/ili preko jednog ili više prikladnih linkera ili spejsera. Na primer, kada pomenuta jedna ili više grupa, ostataka, ili vezanih jedinica predstavljaju imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene, pomenuti linkeri mogu takođe da budu imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni, tako da rezultujuće jedinjenje ili konstrukt predstavlja neku fuzionu belančevinu ili fuzioni polipeptid.

[0137] Polipeptidi iz pronalska obuhvataju barem dva ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena kako je definisano sa zahtevima. U nekim izvedbama, pomenuti polipeptidi u suštini se sastoje od dva ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena kako je definisano sa zahtevima. Polipeptid koji se "u suštini sastoji od" dva ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena, je neki polipeptid koji osim pomenuta dva ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena, ovde opisanih, ne sadrži dodatne imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene. Na primer, polipeptid koji se u suštini sastoji od dva imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena ne sadrži bilo kakve dodatne imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene. Međutim, podrazumeva se da polipeptid koji se u suštini sastoji od dva ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena može da uključuje dodatne funkcionalnosti, poput oznaka, toksina, jednog ili više linkera, veznu sekvencu, itd. Pomenute dodatne funkcionalnosti uključuju grupe na bazi amino-kiselina, ali i takve koje nisu na bazi amino-kiselina. U nekim izvedbama, polipeptidi se sastoje od dva ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena kako je definisano sa zahtevima. Podrazumeva se da termini "polipeptidni konstrukt" i "polipeptid" mogu da se koriste kao sinonimi (osim ako kontekst jasno ukazuje na suprotno).

[0138] U nekim izvedbama, pomenuti polipeptidi uključuju multivalentne ili multispecifične konstrukte koji sadrže imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene kako je definisano sa zahtevima. U nekim izvedbama, pomenuti polipeptidi obuhvataju skele na bazi antitela i skele koje nisu na bazi antitela. U nekim izvedbama, pomenuti polipeptidi sadrže ostatak za vezanje serumskih belančevina. U nekim izvedbama, pomenuti ostatak za vezanje serumskih belančevina je neki imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen. U nekim izvedbama, pomenuti imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen je nanotelo.

[0139] Podrazumeva se da redosled građevnih blokova, poput, na primer, prvog građevnog bloka, drugog građevnog bloka, trećeg građevnog bloka itd., na pomenutom polipeptidu (orijentacija) može da se izabere u skladu sa potrebama stručnjaka, kao i relativni afiniteti koji mogu da zavise o lokaciji ovih građevnih blokova u samom polipeptidu. Da li pomenuti polipeptid sadrži linker je pitanje izbora specifičnog dizajna. Međutim, neke orijentacije, sa ili bez linkera, mogu da obezbede preferirane vezne karakteristike dok druge orijentacije to ne mogu. Na primer, redosled prvog i drugog ISV u polipeptidu iz ovoga pronalaska može da bude (gledano sa N-terminusa prema C-terminusu): (i) prvi ISV (na primer, prvo nanotelo) -[linker] - drugi ISV (na primer, drugo nanotelo); ili (ii) drugi ISV (na primer, drugo nanotelo) - [linker] - prvi ISV (na primer, prvo nanotelo); (pri čemu linker je samo opcija). Ovim pronalaskom su obuhvaćene sve te orijentacije. Polipeptidi koji imaju orijentaciju građevnih blokova koja obezbeđuje poželjne (vezne) karakteristike mogu lako da se identifikuju rutinskim postupcima, na primer, onako kao šta je opisano u eksperimentalnom delu.

[0140] Pomenuti prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV) iz polipeptida iz ovoga pronalaska poseduje visoki afinitet za/veže se na konstantni domen receptora T-ćelije (TCR) koji je prisutan na T ćeliji.

[0141] Efektorska ćelija je neka ćelija koji sadrži TCR-kompleks, preferirano neka imunoćelija, poput T-ćelije, preferirano CD4<+>T-helper-ćelija (takođe poznata kao CD4-ćelija, T-helper-ćelija ili T4-ćelija), bolje neka citotoksična T-ćelija (takođe poznata kao TC-ćelija, CTL ili CD8<+>T-ćelije) ili prirodne T-ćelije ubice (NKT-ćelije). U nekim izvedbama, pomenuta ćelija je prisutna in vivo. U nekim izvedbama, pomenuta ćelija je prisutna in vitro. Pomenuta efektorska ćelija korišćena u pronalasku se odnosi naročito na ćelije sisara, preferirano na ćelije primata, a najbolje na ljudske ćelije.

[0142] Kao šta se ovde koriste, termini "TCR-kompleks" ili "αβ TCR-CD3-kompleks" se odnose na komplekse receptora T-ćelija koji se nalaze na površini T ćelije (vidi Kuhns et al.

2006, Immunity 24: 133-139). Pomenuti TCR-kompleks se sastoji od šest različitih tipova I pojedinačnih transmembranskih belančevina: TCRα- i TCRβ-lanci koji formiraju TCR-heterodimer koji je odgovoran za prepoznavanje liganda, i ne-kovalentno spojeni CD3γ-, CD3δ-, CD3ε- i ζ-lanci, koji sadrže motive citoplazmatske sekvence koji se fosforilišu nakon aktivisanja receptora i regrutuju veliki broj komponenta za signaliziranje. α- i β-lanci receptora T-ćelija se sastoje od konstantnog domena i varijabilnog domena. Sekvence konstantnih domena ljudskog CD3 i ljudskog TCR-α/β su opisane u Tabeli A-6 (SEQ ID Br.: 344-349; UniProt identifikatori: CD3 delta: P04234, CD3 gama: P09693, CD3 epsilon: P07766, CD3 zeta: P20963, TCR alfa: P01848 i TCR beta: u odnosu na P01850).

[0143] U jednoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV veže konstantni domen α-receptora T-ćelije (TCR-α) (SEQ ID Br.: 348) i/ili konstantni domen β-receptora T-ćelije (TCR-β) (SEQ ID Br.: 349), ili njihove polimorfne varijante ili izoforme.

[0144] Alternativno, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV veže konstantni domen α-receptora T-ćelije (TCR-α) (SEQ ID Br.: 484) i/ili konstantni domen β-receptora T-ćelije (TCR-β) (SEQ ID Br.: 485), ili njihove polimorfne varijante ili izoforme.

[0145] Izoforme su alternativne sekvence belančevina koje mogu da se generišu iz istog gena uvođenjem pojedinačnih ili kombinacijama bioloških događaja poput upotrebe alternativnog promotora, alternativnog splajsovanja, alternativne inicijacije i pomaka okvira na ribosomu, kao šta je već poznato stanju tehnike.

[0146] "Aktivisanje T-ćelija", kao šta se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više ćelijskih odgovor(a) T-ćelija, na primer, citotoksičnih T-ćelija, izabranih iz grupe koja obuhvata sledeće pojmove: proliferacija, diferencijacija, sekrecija citokina, oslobađanje citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksična aktivnost, ekspresija aktivacionih markera, i preusmerena ciljana liza ćelija.

Polipeptidi iz ovoga pronalaska mogu da potaknu aktivisanje T-ćelija. Prikladni ogledi za merenje procesa aktivisanja T-ćelija su poznati stanju tehnike koje je ovde opisano, na primer, kao šta je opisano u dokumentu WO 99/54440 od autora Schlereth et al. 2005 (Cancer Immunol. Immunother. 20: 1-12), ili kao šta je navedeno u primerima ili u tekstu ispod.

[0147] U jednoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid indukuje aktivisanje T-ćelija. Preferirano, polipeptid iz ovoga pronalaska indukuje aktivisanje T-ćelija samo kada je pomenuti drugi i/ili dodatni ISV vezan na neki antigen na ciljanoj ćeliji.

[0148] U jednoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuto aktivisanje T-ćelija zavisi o prezentiranju pomenutog polipeptida, koji je vezan na pomenuti prvi antigen na ciljanoj ćeliji, nekoj T-ćeliji.

[0149] Aktivisanje T-ćelija uz pomoć polipeptida iz ovoga pronalaska može da se prati pozitivnom regulacijom CD69, CD25 i raznih molekula ćelijske adhezije, de novo ekspresijom i/ili oslobađanjem citokina (na primer, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-4 i IL-10), pozitivnom regulacijom grancima i ekspresijom perforina, i/ili ćelijskom proliferacijom, membranskim izobličavanjem, aktivisanjem prokaspaza 3 i/ili 7, fragmentacijom nuklearne DNA i/ili cepanjem kaspaznog supstrata poli (ADPriboza) polimeraze. Preferirano, preusmerena liza ciljanih ćelija uz pomoć multispecifičnih polipeptida ne zavisi o specifičnosti receptora T-ćelija, prisutnosti MHC klase I i/ili β2 mikroglobulina, i/ili bilo kojeg ko-stimulatornog stimulisa.

[0150] U jednoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuto aktivisanje T-ćelija ne zavisi o prepoznavanju MHC.

[0151] Polipeptidi iz ovoga pronalaska pokazuju preusmerenu lizu in vitro sa prethodno nestimulisanim perifernim poliklonskim CD8<+>- i CD4<+>-pozitivnim T-ćelijama. Preusmerena liza ciljanih ćelija regrutovanjem T-ćelija uz pomoć polipeptida iz ovoga pronalaska uključuje formiranje citolitičke sinapse i dostavu perforina i grancima. Ćelijska liza uz pomoć T-ćelija je opisana ranije, na primer, od strane autora Atkinson & Bleackley 1995 (Crit. Rev. Immunol 15(3-4):359-384). Preferirano, uključene T-ćelije mogu da obavljaju serijsku lizu ciljanih ćelija, i nisu pod uticajem mehanizama za imuno-escape koji interferišu sa procesiranjem peptidnog antigena i prezentacijom, ili klonalne diferencijacije T-ćelija (vidi, na primer, dokument WO 2007/042261). In vitro, preusmerena liza je vidljiva kod niskih pikomolarnih koncentracija, koje sugeriše da veoma mali broj polipeptida iz ovoga pronalaska treba da bude vezan na ciljane ćelije kako bi se aktivisale T-ćelije. Kao šta je pokazano u primerima, niski omer efektor : meta može da ukazuje na serijsku lizu ciljnih ćelija. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na potentne polipeptide. Preferirano, polipeptid iz ovoga pronalaska posreduje ubijanju ciljanih ćelija, na primer, tumorskih ćelija, poput stimulisanja T-ćelija da formiraju pore i dostave pro-apoptotičke komponente iz granula citotoksičnih T-ćelija.

[0152] U jednoj izvedba, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuto aktivisanje T-ćelija uzrokuje jedan ili više ćelijskih odgovora pomenute T-ćelije, pri čemu pomenuti ćelijski odgovor je izabran iz grupa koja obuhvata proliferaciju, diferencijaciju, sekreciju citokina, oslobađanje citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksičnu aktivnost, ekspresiju markera za aktivisanje i preusmerenu lizu ciljane ćelije.

[0153] Kao šta se ovde koristi, termin "potencija" je mera biološke aktivnosti nekog agensa, poput nekog polipeptida, ISV ili nanotela. Potencija nekog agensa može da se odredi primenom bilo kojeg prikladnog postupka koji je poznat stanju tehnike, kao šta je, na primer, opisano u eksperimentalnom delu. Ogledi potencije na bazi ćelijske kulture su često preferirani format za određivanje biološke aktivnosti zbog toga jer mere fiziološki odgovor koji je potaknut agensom i mogu da daju rezultate unutar relativno kratkog vremenskog perioda. Mogu da se koriste razni tipovi ogleda na bazi ćelija, koji iskorišćavaju mehanizam delovanja produkta, uključujući, ali bez ograničenja, oglede proliferacije, oglede citotoksičnosti, oglede usmrćivanja ćelija, oglede sa reporter-genom, oglede vezanja na receptor na površini ćelije, i oglede koji mere indukciju/inhibiciju funkcionalno esencijalnih belančevina ili drugih signalnih molekula (poput fosforilisanih belančevina, encima, citokina, cAMP i sli.), model trošenja Ramos-ovih B-ćelija, ogled ubijanja tumorskih ćelija posredovanjem T-ćelija (na primer, kao šta je prikazano u delu sa primerima). Svu oni dobro poznati stanju tehnike. Rezultati ćelijskih ogleda potencijala mogu da se izraze kao "relativni potencijal" kao šta je određeno uporedbom multispecifičnog polipeptida iz ovog pronalaska sa odgovorom koji je dobiven sa odgovarajućim referentnim monovalentnim ISV, na primer, polipeptid koji sadrži samo jedan ISV ili jedno nanotelo, a opciono dodatno sadrži neko irelevantno nanotelo (vidi eksperimentalni deo).

[0154] U jednoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuto aktivisanje T-ćelija uzrokuje inhibiciju neke aktivnosti pomenute ciljane ćelije, poput usporavanja ili minimizovanja rasprostranjivanja pomenute ciljane ćelije, a sa ciljem da se inhibira ili uspori rast i/ili proliferacija ciljane ćelija, i/ili da se ubije ciljana ćelija (na primer, uzrokuje regresiju poremećaja i/ili simptoma) za više od oko 10%, poput 20%, 30%, ili 40% ili čak više od 50%, poput više od 60%, poput 70%, 80%, ili čak više od 90%, poput 100%.

[0155] Pomenuti prvi ISV, nanotelo ili VHH korišćeni u pronalasku imaju visoki afinitet za konstantni domen TCR. Pomenuti prvi ISV ili nanotelo korišćeni u pronalasku mogu, na primer, da budu usmereni protiv nekog antigenog determinanta, epitopa, dela, domena, podjedinice ili konformacije (gde je primenjivo) pomenute prve mete. Pomenuti prvi ISV, na primer, prvo nanotelo ili VHH, je preferirano izabrano da ima visoki afinitet za svoju metu per se, bez obzira na uticaj bilo kakvog aviditetnog efekta.

[0156] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV veže konstantni domen receptora T-ćelije (TCR) sa prosečnom KD-vrednosti od između 100 nM i 10 pM, poput prosečne KD-vrednosti od 90 nM ili manje, čak još bolje prosečnom KD-vrednosti od 80 nM ili manje, poput manje od 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak manje, poput manje od 4, 3, 2, ili 1 nM, poput manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 pM, ili još manje, poput manje od 10 pM. Preferirano, pomenuti KD se određuje primenom Kinexa, BLI ili SPR, na primer, kao šta se određuje od strane Proteon-a. Na primer, pomenuti KD se određuje kao šta je opisano u delu sa primerima.

[0157] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV ima visoki afinitet kada je izmeren kao monovalent. Preferirano, pomenuti prosečni KD je izmeren primenom površinske plazmonske rezonance (SPR) na rekombinantnoj belančevini.

[0158] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid ima disocijacijsku konstantu (KD) prema (ili za vezanje) pomenutom TCR izabranu iz grupe koja obuhvata: najviše oko 10<-5>M, najviše oko 10<-6>M, najviše oko 10<-7>M, najviše oko 10<-8>M, najviše oko 10<-9>M, najviše oko 10<-10>M, najviše oko 10<-11>M, i najviše oko 10<-12>M, preferirano kao šta je izmereno primenom površinske plazmonske rezonance.

[0159] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV veže pomenuti TCR sa EC50-vrednost od između 100 nM i 1 pM, poput prosečne EC50-vrednosti od 100 nM ili manje, još bolje prosečne EC50-vrednosti od 90 nM ili manje, poput manje od 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak manje, poput manje od 4, 3, 2, ili 1 nM ili još manje, poput manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 pM, ili čak još manje, poput manje od 4 pM.

[0160] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti prosečni KD se određuje uz pomoć FACS, Biacore, ELISA uz korišćenje monovalentnog prvog ISV, poput nanotela, ili polipeptida koji sadrži monovalentni prvi ISV, poput nanotela, na primer pomenuti EC50se određuje kao šta je opisano u delu sa primerima.

[0161] U primerima je pokazano da KD dobro korelira sa EC50.

[0162] U jednoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid ima konstantnu stope asocijacije (Kon) prema (ili za vezanje) pomenutom/g TCR koja je izabrana iz grupe koja obuhvata: barem oko 10<2>M<-1>s<-1>, barem oko 10<3>M<-1>s<-1>, barem oko 10<4>M<-1>s<-1>, barem oko 10<5>M<-1>s<-1>, barem oko 10<6>M<-1>s<-1>, 10<7>M<-1>s<-1>, barem oko 10<8>M<-1>s<-1>, barem oko 10<9>M<-1>s<- 1>, i barem oko 10<10>M<-1>s<-1>, kao šta je preferirano izmereno primenom površinske plazmonske rezonance ili kao šta je navedeno u delu sa primerima.

[0163] U jednoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid ima konstantnu stope disocijacije (Koff) prema (ili za vezanje) pomenutom/g TCR koja je izabrana iz grupe koja obuhvata: najviše oko 10<-3>s<-1>, najviše oko 10<-4>s<-1>, najviše oko 10<-5>s<-1>, najviše oko 10<-6>s<-1>, najviše oko 10<-7>s<-1>, najviše oko 10-<8>s<-1>, najviše oko 10<-9>s<-1>, i najviše oko 10<-10>s<-1>, kao šta je preferirano izmereno primenom površinske plazmonske rezonance ili kao šta je navedeno u delu sa primerima.

[0164] Predviđene su modifikacije amino-kiselinskih sekvenca ovde opisanih vezanih molekula, ISV, ili polipeptida. Na primer, može da bude poželjno da se poboljša vezani afinitet i/ili neke druge biološke karakteristike antitela ili ISV. Varijante amino-kiselinske sekvence veznih molekula, ISV, ili polipeptida se pripremaju uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u nukleinske kiseline pomenutih veznih molekula, ISV, ili polipeptida, ili primenom peptidne sinteze.

[0165] Takve modifikacije uključuju, na primer, delecije, i/ili insercije, i/ili supstitucije ostataka unutar amino-kiselinskih sekvenca pomenutih veznih molekula, ISV ili polipeptida. Bilo koja kombinacija delecija, insercija, i supstitucija se provodi tako da bude prisutna u finalnom konstruktu, pod uslovom da pomenuti finalni konstrukt poseduje poželjne karakteristike. Promene amino-kiselina takođe mogu da izmene post-translacione procese veznih molekula, poput na primer menjanja broja ili pozicije mesta za glikozilaciju. Preferirano, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 amino-kiselina može da bude supstituisano u CDR, dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 25 amino-kiselina može da bude supstituisano u regionima okvira (FR), pod uslovom da (i) CDR1 prvog ISV može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 123; i/ili (ii) CDR2 prvog ISV može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 153; i/ili (iii) CDR3 prvog ISV može imati samo 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 170.). Ove supstitucije su preferirano konzervativne supstitucije kao šta je ovde opisano. Dodatno ili alternativno, 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 amino-kiselina može da bude ugrađeno ili izrezano u svakom CDR (naravno, zavisno o njihovoj dužini), dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 25 amino-kiselina može da bude ugrađeno ili izrezano u svakom FR, pod uslovom da (i) CDR1 prvog ISV može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.123; i/ili (ii) CDR2 prvog ISV može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.

153; i/ili (iii) CDR3 prvog ISV može imati samo 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.170.

[0166] Korisni postupak za identifikovanje određenih ostataka ili regiona u veznim molekulima, ISV ili polipeptidima, koji se nalaze na preferiranom lokacijama za mutagenezu se naziva "alanine scanning mutagenesis" kao šta je opisano od strane autora Cunningham & Wells 1989 (Science 244: 1081-1085). U toj metodi, neki ostatak ili grupa u ciljanim ostacima unutar veznog molekula je/su identifikovan(i) (na primer, promenjeni ostaci poput Arg, Asp, His, Lys, i Glu) i zamenjen sa prirodnom ili negativno nabijenom amino-kiselinom (najbolje, alanin ili polialanin) sa ciljem da se utiče na interakciju tih amino-kiselina sa epitopom. Lokacije ovih amino-kiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost prema supstitucijama su tada rafinirane uvođenjem dodatnih ili drugih varijanata u, ili za, pomenuta mesta supstitucije. Tako, dok je mesto za uvođenje neke varijacije u amino-kiselinsku sekvencu predodređeno, priroda mutacije per se ne mora da bude predodređena. Na primer, sa ciljem da se analizira uticaj neke mutacije u nekom mestu, provodi se postupak ala scanning ili se provodi nasumična mutageneza u ciljanom kodonu ili regionu, a eksprimirane varijante veznog molekula se ispituju sa ciljem da se pronađe poželjna aktivnost.

[0167] Preferirano, insercije u amino-kiselinsku sekvencu uključuju amino- i/ili karboksilterminalne fuzije u rasponu dužina od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ostataka u polipeptidima koji sadrže stotinu ili više ostataka.

[0168] Drugi tip varijanata su supstitucije amino-kiselina. Ove varijante preferirano obuhvataju barem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 amino-kiselinskih ostataka u vezanom molekulu, ISV ili poliptidu koji su zamenjeni sa drugim ostacima, pod uslovom da (i) CDR1 prvog ISV može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.123; i/ili (ii) CDR2 prvog ISV može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.153; i/ili (iii) CDR3 prvog ISV može imati samo 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.170. Mesta od najvećeg interesa za supstitucijsku mutagenezu uključuju CDR, a naročito hipervarijabilne regione, ali promene FR su takođe predviđene. Na primer, ako CDR-sekvenca obuhvata 6 amino-kiselina, predviđena je supstitucija jedne, dve ili tri od pomenutih aminokiselina. Slično, ako CDR-sekvenca obuhvata 15 amino-kiselina, predviđena je supstitucija jedne, dve, tri, četiri, pet ili šest od pomenutih amino-kiselina.

[0169] Uopšteno, ako su amino-kiseline supstituisane u jednom ili više ili u svim CDR, preferirano je da tako dobivena "supstituisana" sekvenca bude izmenjena barem 60%, bolje 65%, još bolje 70%, naročito dobro 75%, još bolje 80% ili čak više od 90% u odnosu na "originalnu" CDR-sekvencu, uz uslov da (i) CDR1 prvog ISV može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.123; i/ili (ii) CDR2 prvog ISV može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br.153; i/ili (iii) CDR3 prvog ISV može imati samo 3, 2 ili 1 aminokiselinu različitu u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br. 170. To označava da stepen identičnosti CDR sa "supstituisanom" sekvencom zavisi o njegovoj dužini. Na primer, CDR koji sadrži 5 amino-kiselina je preferirano 80% identičan sa svojom supstituisanom sekvencom kako bi se mogla supstituisati barem jedna amino-kiselina. Prema tome, CDR veznih molekula mogu imati različite stepene identičnosti sa svojim supstituisanim sekvencama, na primer, CDR1 može da ima 80%, dok CDR3 može da ima 90% identičnost.

[0170] Preferirane supstitucije (ili zamene) su konzervativne supstitucije. Međutim, bilo koja supstitucija (uključujući ne-konzervativnu supstituciju ili jednu ili više iz liste "primernih supstitucija" navedenih u Tabeli B-1 ispod) može da se primeni sve dok polipeptid zadržava svoju sposobnost da se veže na konstantni domen receptora T-ćelija (TCR) koji se nalazi na površini T-ćelija preko prvog ISV i na prvi antigen na površini ciljane ćelije preko drugog ISV i/ili njegovi CDR mogu da dele identičnost sa tako supstituisanom sekvencom (barem 60%, bolje 65%, još bolje 70%, naročito dobro 75%, čak još bolje 80% identičnosti sa "originalnom" CDR-sekvencom).

[0171] Konzervativne supstitucije su navedene u Tabeli B-1 ispod.

[0172] Kao šta je navedeno malopre, samo nakon postupaka rigoroznog imunizovanja i pretrage i selekcije ovi su pronalazači mogli da identifikuju vezanje ISV na konstantne domene TCR. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptide koji sadrže prvi ISV koji je izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID Br.: 1-118 (Tabela A-4). Dodatna analiza sekvenca je pokazala da je svo vezanje ISV na TCR obuhvatalo veoma sličan CDR3. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid u skladu sa ovom pronalaskom u kojem pomenuti prvi ISV u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4) i 3 regiona za određivanje komplementarnosti (CDR1 do CDR3), u kojima CDR3 ima amino-kiselinsku sekvencu X1SR X2X3PYX4Y, u kojoj X1je F, Y, G, L ili K, X2je I ili L, X3je Y ili W, a X4je D, N ili S.

[0173] Dodatna analiza sekvenca je otkrila da postoji samo ograničeni broj sekvencnih varijacija u CDR (Primer 4.2 i Tabele A-1 to A-3).

Tabela B-1: Supstitucije amino-kiselina

[0174] Prema tome, u polipeptidu prema pronalasku, pomenuti prvi ISV u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), u kojima:

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(a) SEQ ID Br.119-123, 125-127, 129, 132 i 133; i

(b) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu iz SEQ ID Br.: 123; i/ili

(ii) CDR2 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(c) SEQ ID Br.134-141, 143-144, 146-156, 159-163; i

(d) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu iz SEQ ID Br.: 153; i/ili

(iii) CDR3 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(e) SEQ ID Br.164-166, 169-171, 173-174; i

(f) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu iz SEQ ID Br.: 170.

[0175] Dodatne preferirane CDR-sekvence su prikazane u Tabeli A-4.

[0176] Uopšteno, preferirane su kombinacije CDR-a koje su navedene u Tabeli A-4 (tj. one pomenute u istoj liniji u Tabeli A-4). Tako, opšte uzeto, preferirano je da, kada CDR u nekom ISV je CDR-sekvenca koja je pomenuta u Tabeli A-4 ili prikladno izabrana iz grupe koja obuhvata CDR-sekvence koje sadrže 4, 3, 2 ili samo 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na CDR-sekvencu koja je navedena u Tabeli A-4, tada barem jedan, a preferirano oba druga CDR-a su prikladno izabrana iz CDR-sekvenca koje pripadaju istoj kombinaciji u Tabeli A-4 (tj. koje su pomenute u istoj liniji u Tabeli A-4) ili su prikladno izabrane iz grupe koja obuhvata CDR-sekvence koje sadrže 4, 3, 2 ili samo 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na CDR-sekvencu(e) koje pripadaju istoj kombinaciji.

[0177] Analiza sekvenca nastalih veznika je dodatno dovela do identifikovanja 3 različita klastera. Ovde su prikazane odgovarajuće poredbe (vidi Tabelu A-1, Tabelu A-2 i Tabelu A-3). Klasteriranje je provedeno na bazi sličnosti i razlika sekvenca CDR2 i CDR3. Klaster A je naj-prominentniji i sadrži 104 klonova (SEQ ID Br.: 1-104), klaster B obuhvata 11 klonova (SEQ ID Br.: 105-115), a klaster C je predstavljen sa samo 3 klona (SEQ ID Br.: 116-118). Klasteriranje na bazi strukturnih sličnosti i razlika u amino-kiselinskoj sekvenci je prevedeno u funkcionalne sličnosti i razlike kao šta je prikazano u primerima. Predstavnici svih klastera su izolovani na bazi visokog afiniteta vezanja konstantnog domena TCR (Primeri 3 & 4) i na bazi aktivisanja ljudskih T-ćelija (Primer 4.2). Opšte uzeto, predstavnici klastera A su pokazali najbolje EC50-vrednosti. Osim toga, predstavnici klastera A su unakrsno-reaktivni sa konstantnim domenom TCR iz makaki rakojeda (Primer 18). Mada predstavnici klastera C imaju nešto manje EC50-vrednosti od predstavnika klastera B, predstavnici klastera C još uvek imaju niže IC50-vrednosti u ogledu protočne citometrije na bazi ubijanja Ramos-ovih ćelija posredstvom T-ćelija (Primer 10).

[0178] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, u kojem pomenuti prvi ISV u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), u kojima CDR1 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(a) SEQ ID Br.: 123; i

(b) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 1, 2, 3 ili 4 amino-kiselinske razlike u odnosu na SEQ ID Br.: 123, pri čemu

o na poziciji 2, D je zamenjen sa A, S, E ili G;

o na poziciji 4, H je zamenjen sa Y;

o na poziciji 5, K je zamenjen sa L;

o na poziciji 6, I je zamenjen sa L;

o na poziciji 8, F je zamenjen sa I ili V; i/ili

o na poziciji 10, G je zamenjen sa S.

[0179] Prema tom, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, u kojem pomenuti prvi ISV u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), u kojem CDR2 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(a) SEQ ID Br.: 153; i

(b) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 1, 2, 3 ili 4 amino-kiselinske razlike u odnosu na SEQ ID Br.153, pri čemu

o na poziciji 1, H je zamenjen sa T ili R;

o na poziciji 3, S je zamenjen sa T ili A;

o na poziciji 5, G je zamenjen sa S ili A;

o na poziciji 7, Q je zamenjen sa D, E, T, A ili V;

o na poziciji 8, T je zamenjen sa A ili V; i/ili

o na poziciji 9, D je zamenjen sa A, Q, N, V ili S.

[0180] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, u kojem pomenuti prvi ISV u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), u kojima CDR3 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(a) SEQ ID Br.: 170; i

(b) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 1, 2, 3 ili 4 amino-kiselinske razlike u odnosu na SEQ ID Br.: 170, pri čemu

o na poziciji 1, F je zamenjen sa Y, L ili G;

o na poziciji 4, I je zamenjen sa L;

o na poziciji 5, Y je zamenjen sa W; i/ili

o na poziciji 8, D je zamenjen sa N ili S.

[0181] U jednoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, u kojem pomenuti prvi ISV u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno), gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID Br. 123, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID Br. 153, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID Br.170.

[0182] Drugi imunoglobulinski jednostruki varijabilni domen (ISV) polipeptida pronalaska ima visok afinitet za/vezuje se za antigen na ciljnoj ćeliji, poželjno ćeliji raka. „Ciljna ćelija“, kako se ovde pominje, je ćelija koja prezentuje određeni antigen na svojoj površini. U poželjnom aspektu, „ciljna ćelija“ je ćelija raka.

[0183] Membrana (takođe nazvana plazma-membrana ili fosfolipidni dvosloj) okružuje citoplazmu ćelije, i predstavlja spoljnu granicu ćelije, tj. membrana je površina ćelije. Tako, membrana odvaja i štiti ćeliju od okoline, a najčešće je načinjena od dvostrukog sloja fosfolipida. Unutar membrane se nalaze brojni molekuli belančevina, poput kanala, pumpa i ćelijskih receptora. Budući da je takva membrana fluidna, molekuli belančevina mogu da ulaze u unutrašnjost membrane. Termin "antigen na ciljanoj ćeliji", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki molekul koji je izložen na površini ćelije. U najvećem broju slučajeva, ovaj molekul je lociran u ili na plazma-membrani ćelija tako da barem jedan deo ovog molekula ostaje pristupačan sa spoljne strane ćelije u tercijarnoj formi. Ne-ograničavajući primer za nekog molekula na površini ćelije, koji je lociran u plazma-membrani, je neka transmembranska belančevina koja sadrži, u svojoj tercijarnoj konformaciji, regione hidrofilnosti i regione hidrofobnosti. Tako, barem jedan hidrofoban region dozvoljava pomenutom molekulu na površini ćelije da bude uklopljen, ili ugrađen u hidrofobnoj plazma-membrani ćelije dok pomenuti hidrofilni regioni strče sa svake strane plazma-membrane u citoplazmu odnosu prema ekstraćelijskom prostoru.

[0184] Pomenuti antigen može da bude bilo koja meta na nekoj ćeliji, na primer, neki tumorski antigen. U preferiranoj izvedbi, pomenuti antigen je specifičan za pomenutu ciljanu ćeliju, na primer, tumorska ćelija, poput antigena koji je povezan sa tumorskog (TAA) na pomenutoj tumorskoj ćeliji.

[0185] Termin "tumorski antigen", kao šta se ovde koristi, može da obuhvata one antigene koji su predstavljeni na tumorskim ćelijama. Ovi antigeni mogu da budu izloženi na ćelijskoj površini uz pomoć nekog ekstraćelijskog dela, koji je često kombinovan sa transmembranskim i citoplazmatskim delom molekula. Ovi antigeni ponekad mogu da budu izloženi samo na tumorskim ćelijama, a nikada na normalnim ili zdravim ćelijama. Tumorski antigeni mogu ekskluzivno da budu eksprimirani u tumorskim ćelijama ili mogu da predstavljaju neku tumorspecifičnu mutaciju upoređeno sa normalnim ćelijama. U tom slučaju se nazivaju tumorspecifični antigeni. Međutim, to nije opšti slučaj. Češće se radi o slučaju kada su isti antigeni izloženi i na tumorskim ćelijama i na normalnim ćelijama, a tada se nazivaju "antigeni povezani sa tumorom (TAA)". Ovi antigeni povezani sa tumorom mogu da budu prekomerno eksprimirani u tumorskim ćelijama ako se uporedi sa normalnim ćelijama ili su bolje pristupačni za vezanje antitela u tumorskim ćelijama zbog manje-kompaktne strukture tumorskog tkiva ako se uporedi sa normalnim tkivom. TAA su preferirano antigeni koji se eksprimiraju u ćelijama pojedinačnih tumora, ali u normalnim ćelijama se preferirano ne eksprimiraju. Često, TAA su antigeni koji su normalno eksprimirani u ćelijama samo u određenim tačkama razvoja (poput tokom fetalnog razvoja), a u starijem organizmu oni su manje eksprimirani, ili su antigeni koji se ne eksprimiraju u normalnim tkivima ili ćelijama nekog organa koji nakon tumorogeneze mogu da eksprimiraju pomenuti antigen.

[0186] U jednoj izvedbi, pomenuti prvi antigen na ciljanoj ćeliji je tumorski antigen, preferirano antigen povezan sa tumorom (TAA).

[0187] U jednoj izvedbi, pomenuti drugi antigen na ciljanoj ćeliji je tumorski antigen, preferirano antigen povezan sa tumorom (TAA).

[0188] U jednoj izvedbi, pomenuti antigen je prisutan značajno češće u tumorskim ćelijama ako se uporedi sa normalnim ćelijama. Pomenuti antigen na ciljanoj ćeliji je preferirano antigen povezan sa tumorom (TAA). Preferirani TAA uključuju MART-1, karcinoembrionski antigen ("CEA"), gp100, MAGE-1, HER-2, CD20, Lewis<Y>-ove antigene, hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP), receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), belančevinu za aktivisanje fibroblasta (FAP), CD19 i CD33.

[0189] Antigeni sa ćelijske površine koji su preferirano eksprimirani u AML LSC u odnosu na normalne hematopoetske matične ćelije, a tako preferirano TAA, uključuju CD123, CD44, CLL-1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3 i CD25.

[0190] Drugi antigeni povezani sa tumorom koji su prikladni kao antigen na ciljanoj ćeliji za vezanje sa pomenutim drugim ISV unutar polipeptida iz ovoga pronalaska uključuju: TAG-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, glikolipide poput GD2 i GD3.

[0191] TAA iz ovoga pronalaska uključuju, takođe, antigene za hematopoetsku diferencijaciju, tj. gliko-belančevine koje su uobičajeno povezane su grupiranjem klaster-diferencijacije (CD), poput CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD69 i CD147; receptore faktora rasta, uključujući HER2, ErbB3 i ErbB4; citokinske receptore, uključujući gama lanac interleukin-2 receptora (CD132-antigen), alfa lanac interleukin-10 receptora (IL-10R-A), beta lanac interleukin-10 receptora (IL-10R-B), beta-1 lanac interleukin-12 receptora (IL-12R-beta1), beta-2 lanac interleukin-12 receptora (IL-12 receptor beta-2), alfa-1 lanac interleukin-13 receptora (IL-13R-alfa-1) (CD213a1-antigen), alfa-2 lanac interleukin-13 receptora (belančevina koja veže interleukin-13), interleukin-17 receptor (IL-17-receptor), interleukin-17B receptor (IL-17B-receptor), prekursor interleukin 21 receptora (IL-21R), tip I interleukin-1 receptora (IL-1R-1) (CD121a), tip II interleukin-1 receptora (IL-1R-beta) (CDw121b), belančevinu antagonist interleukin-1 receptoru (IL-1ra), alfa lanac interleukin-2 receptora (CD25-antigen), beta lanac interleukin-2 receptora (CD122-antigen), alfa lanac interleukin-3 receptora (IL-3R-alfa) (CD123-antigen); kao i druge, poput CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosijalin), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, klaudin 6, klaudin 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nektin-4, SLITRK6, mezotelin, folatni receptor, tkivni faktor, aksl, glipikan-3, CA9, kripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, peptidni receptor za oslobađanje gastrina, PAP, CEACAM5, CEACAM6, CXCR7, N-kaderin, FXYD2 gama a, CD21, CD133, Na/K-ATPazu, mlgM (IgM vezan na membranu), mlgA (IgA vezan na membranu), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6, DcR3 i CAIX.

[0192] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisan sa zahtevima, pri čemu pomenuti TAA je izabran iz grupe koja obuhvata hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP), receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), belančevinu za aktivisanje fibroblasta (FAP), MART-1, karcinoembrionski antigen ("CEA"), gp100, MAGE-1, HER-2, Lewis<Y>-ove antigene, CD123, CD44, CLL-1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3, CD25, PRIVESAK-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, GD2, GD3, CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD147; receptore faktora rasta, uključujući ErbB3 i ErbB4; citokinske receptore, uključujući gama lanac interleukin-2 receptora (CD132-antigen), alfa lanac interleukin-10 receptora (IL-10R-A), beta lanac interleukin-10 receptora (IL-10R-B), beta-1 lanac interleukin-12 receptora (IL-12R-beta1), beta-2 lanac interleukin-12 receptora (IL-12 receptor beta-2), alfa-1 lanac interleukin-13 receptora (IL-13R-alfa-1) (CD213a1-antigen), alfa-2 lanac interleukin-13 receptora (belančevina koja veže interleukin-13), interleukin-17 receptor (IL-17-receptor), interleukin-17B receptor (IL-17B-receptor), prekursor interleukin 21 receptora (IL-21R), tip I interleukin-1 receptora (IL-1R-1) (CD121a), tip II interleukin-1 receptora (IL-1R-beta) (CDw121b), belančevinu antagonist interleukin-1 receptora (IL-1ra), alfa lanac interleukin-2 receptora (CD25-antigen), beta lanac interleukin-2 receptora (CD122-antigen), alfa lanac interleukin-3 receptora (IL-3R-alfa) (CD123-antigen), CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosijalin), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, klaudin 6, klaudin 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, Nektin-4, SLITRK6, mezotelin, folatni receptor, tkivni faktor, aksl, glipikan-3, CA9, kripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, peptidni receptor za oslobađanje gastrina, PAP, CEACAM5, CEACAM6, CXCR7, N-kaderin, FXYD2 gama a, CD21, CD133, Na/K-ATPazu, mlgM (IgM vezan na membranu), mlgA (IgA vezan na membranu), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6, DcR3 i CAIX, i slične polimorfne varijante i izoforme, a preferirano pomenuti TAA je CD20 (UniProt 11836), HER2 (Uniprot P04626), EGFR, ili CEACAM, i njihove polimorfne varijante i/ili izoforme.

[0193] Pomenuti drugi ISV, nanotelo ili VHH korišćen u pronalasku ima visoki afinitet prema svojem antigenu. Drugi ISV ili nanotelo korišćeno u pronalasku može, na primer, da bude usmeren protiv neke antigene determinante, nekog epitopa, dela, domena, podjedinice ili konformacije (kada je primenjivo) u pomenutom antigenu na ciljanoj ćeliji.

[0194] Pomenuta ciljana ćelija korišćena u pronalasku se naročito odnosi na ćelije sisara, preferirano na ćelije primata, i čak još bolje na ljudske ćelije. Pomenuta ciljana ćelija je preferirano neka hiperproliferativna ćelija poput, na primer, neke tumorske ćelije.

[0195] Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu se pomenuti drugi ili dodatni ISV veže na antigen na ciljanoj ćeliji sa prosečnom KD-vrednosti od između 100 nM i 10 pM, poput prosečne KD-vrednosti od 90 nM ili manje, čak još bolje sa prosečnom KD-vrednosti od 80 nM ili manje, kao manje od 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak još manje, poput manje od 4, 3, 2, ili 1 nM, kao manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 pM, ili čak još manje, kao manje od 10 pM. Preferirano, pomenuti KD se određuje primenom Kinexa, BLI ili SPR, na primer kao šta je određeno uz pomoć Proteon.

[0196] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti drugi ili dodatni ISV ima visoki afinitet za svoj antigen kada je izmeren kao monovalent.

[0197] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti prosečni KD je izmeren primenom površinske plazmonske rezonance (SPR) i/ili KinExA ili Proteon, na primer na rekombinantnoj belančevini, kao šta je opisano u delu sa primerima.

[0198] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti drugi ili dodatni ISV veže antigen na ciljanoj ćelija sa EC50-vrednost od između 100 nM i 1 pM, poput prosečne EC50-vrednosti od 100 nM ili manje, čak još bolje sa prosečnom EC50-vrednosti od 90 nM ili manje, kao manje od 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak još manje, kao manje od 4, 3, 2, ili 1 nM ili još manje, poput manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 pM, ili čak još manje, poput manje od 4 pM.

[0199] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano sa zahtevima, pri čemu pomenuti prosečni EC50se određuje primenom FACS ili ELISA na monovalentnom drugom ISV, poput nanotela, ili na polipeptidu koji sadrži monovalentni drugi ISV, poput nanotela.

[0200] U primerima je pokazano da KD dobro korelira sa EC50.

[0201] Istovremeno ciljanje više antigena može da smanji verovatnoću generisanja tumorskih escape-varijanata zbog čega je strategija angažovanja terapeutskog aktivisanja T-ćelija poboljšana. Ovaj pronalazak obezbeđuje multispecifične polipeptide kako je definisano sa zahtevima, koji sadrže TCR-ISV kombinovane sa imunoglobulinskim pojedinačnim varijabilnim domenima protiv različitih (ciljanih) antigena (na ciljanoj ćeliji). Preferirane kombinacije prvog i drugog antigena su navedene ispod (podrazumeva se da ISV koji vežu pomenute antigene mogu da budu pozicionirani u bilo kojem redosledu u polipeptidu iz ovog pronalaska):

[0202] Slično, istovremeno ciljanje više epitopa, antigenih determinanata, delova, domena, podjedinica ili konformacija neke belančevine ili antigena na ciljanoj ćeliji može da smanji verovatnoću generisanja tumorskih escape-varijanata zbog čega je strategija angažovanja terapeutskog aktivisanja T-ćelija poboljšana (Primer 22). Ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptide kako je definisano sa zahtevima, koji sadrže ISV protiv TCR koji su kombinovani sa imunoglobulinskim pojedinačnim varijabilnim domenima protiv različitih epitopa, antigenih determinanata, delova, domena, podjedinica ili konformacija u nekom antigenu na ciljanoj ćeliji (takođe poznati kao biparatopni konstrukti). Preferirane kombinacije prvog i drugom TAA-ISV su predstavljene ispod (podrazumeva se da ISV koji vežu pomenute antigene mogu da budu pozicionirani u bilo kojem redosledu u polipeptidu iz ovog pronalaska):

[0203] Polipeptidi i kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da budu za korišćenje u prevenciji i/ili tretmanu bolesti i poremećaja navedenih u ovom pronalasku (ovde takođe "bolesti i poremećaji iz ovoga pronalaska") koje uključuje, ali bez ograničenja, rak. Termin "rak" se odnosi na patološko stanje kod sisara koje je tipično karakterizovano sa poremećajem ćelijske proliferacije ili preživljenja. Primeri za rak uključuju, ali bez ograničenja, karcinome, gliome, mezoteliome, melanome, limfome, leukemije, adenokarcinome: rak dojke, rak jajnika, rak vrata materice, glioblastom, multipli mijelom (uključujući monoklonsku gamopatiju neodređenog značaja, asimptomatski i simptomatski mijelom), rak prostate, i Burkitt-ov limfom, rak glave and vrata, rak debelog creva, kolorektalni rak, ne-sitnoćelijski rak pluća, sitnoćelijski rak pluća, rak jednjaka, rak želuca, rak pankreasa, hepatobilijarni rak, rak žučne kese, rak tankog creva, rak rektuma, rak bubrega, rak bešike, rak prostate, rak penisa, rak uretre, rak testisa, rak vagine, rak materice, rak štitaste žlezde, rak paraštitaste žlezde, rak nadbubrežne žlezde, endokrini rak pankreasa, karcinoidni rak, rak kosti, rak kože, razne retinoblastome, Hodgkin-ov limfom, ne-Hodgkin-ov limfom, Kaposi-ev sarkom, multicentričnu Castlemanovu bolest ili primarni efuzijski limfom povezan sa AIDS-om, neuroektodermalne tumore, rabdomiosarkom (vidi, na primer, Cancer, Principles and practice (DeVita et al., ur. 1997) za dodatne tipove tumora); kao i bilo koju metastazu bilo kojeg od malopre pomenutih tipova raka, a tako i ne-tumorske indikacije poput nazalne polipoze, kao i druge ovde opisane poremećaje i bolesti.

[0204] Za opšti opis imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena treba se pogledati opis u tekstu ispod, kao i ranije stanje tehnike koje je ovde citirano. U tom smislu, treba, međutim, da se primeti da ovaj opis i prijašnje stanje tehnike uglavnom opisuju imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene iz takozvane "VH3-klase" (tj., imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni sa visokim stepenom sekvencne homologije u odnosu na ljudske sekvence iz germinativne linije VH3-klase poput DP-47, DP-51 ili DP-29). Podrazumeva se da, međutim, ovaj pronalazak u svojem najširem smislu uopšteno obuhvata bilo koji tip imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena i, na primer, takođe, obuhvata imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene koji pripadaju takozvanoj "VH4-klasi" (tj., imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene sa visokim stepenom sekvencne homologije prema ljudskim sekvencama (iz germinativna-linija) VH4-klase poput DP-78), kao šta je, na primer, opisano u dokumentu WO 07/118670.

[0205] Uopšteno, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni (a naročito VHH-sekvence i sekvence optimizovanih imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena) mogu da, naročito, budu karakterizovani uz pomoć prisutnosti jednog ili više "ostataka-oznaka" (kao šta je opisano, na primer, u Tabeli B2) u jednoj ili više okvirnih sekvenca (ponovo, kao šta je dodatno ovde opisano).

Tabela B-2: Ostaci-oznake u VHH.

[0206] Imunoglobulini korišćeni u pronalasku mogu, takođe, da sadrže C-terminalnu ekstenziju (X)n (u kojoj n je 1 do 10, preferirano 1 do 5, poput 1, 2, 3, 4 ili 5 (a preferirano 1 ili 2, poput 1); a svaki X je (preferirano prirodan) amino-kiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, a preferirano nezavisno izabran iz grupe koja obuhvata alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izoleucin (I)), koje je opisano u dokumentima WO 12/175741 i WO 15/060643.

[0207] Ponovo, takvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni mogu da se izvedu na bilo koji prikladan način i iz bilo kojeg prikladnog izvora, i mogu, na primer, da budu prirodne VHH-sekvence (tj., iz prikladnih vrsta kamila, na primer, lame) ili sintetički ili polu-sintetički VHili VL(na primer, ljudski). Takvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni mogu da uključuju "humanizovane" ili na drugi način "optimizovane" VHH, "kamilske" imunoglobulinske sekvence (a, naročito, kamilske sekvence teškog lanca varijabilnog domena, tj., kamilski VH), kao i ljudski VH, ljudski VL, VHHiz kamila koji su promenjeni primenom tehnika poput afinitetnog sazrevanja (na primer, započinjući od sintetičkih, nasumičnih ili prirodnih imunoglobulinskih sekvenca), CDR-kalemljenja, „furniranja“, kombinovanja fragmenata izvedenih iz različitih imunoglobulinskih sekvenca, PCR-sklapanje uz korišćenje preklapajućih prajmera, i sličnih tehnika za konstrukciju imunoglobulinskih sekvenca koje su dobro poznate stručnjaku; ili bilo koja prikladna kombinacija bilo čega prethodnog kao šta je dodatno ovde opisano. Kao šta je ovde opisano, naročito preferirana klasa imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena korišćenih u pronalasku obuhvata imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene sa amino-kiselinskom sekvencom koja sadrži aminokiselinsku sekvencu sa prirodnim VHH-domenom, ali je bila "humanizovana", tj. uz pomoć zamene jednog ili više amino-kiselinskih ostataka u amino-kiselinskoj sekvenci pomenute prirodne VHH-sekvence (naročito u okvirnim sekvencama) sa jednim ili više amino-kiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućim pozicijama u VH-domenu iz konvencionalnog 4-lančanog ljudskog antitela (na primer, kao šta je navedeno iznad). Ovo može da se obezbedi na način koji je poznat per se, a koji je poznat stručnjaku, na primer na bazi daljnjeg opisa u ovom tekstu i na bazi prethodnog stanja tehnike o humanizovanju o kojem je ovde reč. Ponovo, podrazumeva se da tako humanizovani imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni korišćeni u pronalasku mogu da se dobiju na bilo koji prikladan način koji je poznat per se pa tako nisu strogo ograničeni na polipeptide koji su dobiveni primenom polipeptida koji sadrži prirodni VHH-domen kao početni materijal.

[0208] Druga naročito preferirana klasa imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena korišćenih u pronalasku obuhvata imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene sa aminokiselinskom sekvencom koja odgovara amino-kiselinskoj sekvenci prirodnog VH-domena, ali je bila "kamilska", tj. promenjena uz pomoć zamene jednog ili više amino-kiselinskih ostataka u amino-kiselinskoj sekvenci prirodnog VH-domena iz konvencionalnog 4-lančanog antitela sa jednim ili više amino-kiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućim pozicijama u VHH-domenu teškog lanca pomenutog antitela. Ovo može da se ostvari na način koji je poznat per se, koje je poznato stručnjaku, na primer na bazi ovog opisa. Takve camelizing-supstitucije su preferirano uvedene u amino-kiselinske pozicije koje formiraju i/ili su prisutne u VH-VL-interfejsu, i/ili u takozvanim ostacima-oznakama iz kamila, kao šta je ovde definisano (visi, takođe, na primer dokument WO 94/04678 i Davies & Riechmann 1994 (FEBS Letters 339: 285-290) i 1996 (Protein Engineering 9: 531-537)). Preferirano, VH-sekvenca koja se koristi kao početni materijal ili početna tačka za generisanje ili dezajniranje kamilskih imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena je preferirana VH-sekvenca nekog sisara, bolje ljudska VH-sekvenca, poput VH3-sekvence. Međutim, podrazumeva se da takvi kamilski imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni iz ovoga pronalaska mogu da se dobiju primenom bilo kojeg prikladnog načina koji je poznat per se pa tako nije strogu ograničen na polipeptide koji su bili dobiveni primenom polipeptida koji sadrži prirodni VH-domen kao početni materijal.

[0209] Na primer, ponovo, kao šta je ovde dodatno opisano, "humanizovanje" i "kamilizovanje" može da se provede obezbeđivanjem nukleotidne sekvence koja kodira neki prirodni VHH-domen ili VH-domen, a tada izmenom, na način koji je poznat per se, jednog ili više kodona u pomenutoj nukleotidnoj sekvenci tako da nova nukleotidna sekvenca kodira neki "humanizovani" ili "kamilski" imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen korišćen u pronalasku. Ova nukleinska kiselina može tada da se eksprimira na način koji je poznat per se, tako da se obezbede poželjni imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni korišćeni u pronalasku. Alternativno, na bazi amino-kiselinske sekvence prirodnog VHH-domena ili VH-domena, može da se dizajnira amino-kiselinska sekvenca poželjno humanizovanih ili kamilskih imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena korišćenih u pronalasku, a tada i da se sintetizuje de novo primenom tehnika za sintezu peptida koje su poznate per se. Takođe, na bazi amino-kiselinske sekvence ili nukleotidne sekvence prirodnog VHH-domena ili VH-domena, može da se dizajnira nukleotidna sekvenca koja kodira poželjno humanizovane ili kamilske imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene korišćene u pronalasku, a tada i da se sintetizuje de novo primenom tehnika za sintezu nukleinskih kiselina koje su poznate per se, nakon čega tako dobivena nukleinska-kiselina može da se eksprimira na način koji je poznat per se, a sa ciljem da se dobiju poželjni imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni korišćeni u pronalasku.

[0210] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti ISV je nanotelo, VHH, humanizovani VHH, ili VHsličan kamilskom.

[0211] Uopšteno, belančevine ili polipeptidi koji sadrže ili u suštini se sastoje od pojedinačnog građevnog bloka, pojedinačnog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili pojedinačnog nanotela ovde se nazivaju "monovalentne" belančevine ili polipeptidi, "monovalentni konstrukti", "monovalentan građevni blok", "monovalentni imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen", ili "monovalentno nanotelo", redom.

[0212] Drugi ISV može biti polipeptid koji specifično veže karcinoembrionski antigen (CEA) i koji sadrži ili u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), gde:

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(a) SEQ ID Br.: 361 (GDTYGSYWMG); ili

(b) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 361, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR1 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CEA sa približno jednakim ili većim afinitetom u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR1 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pri čemu pomenuti afinitet je izmereno primenom površinske plazmonske rezonance;

i/ili

(ii) CDR2 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(c) SEQ ID Br.: 363 (AINRGGGYTV); ili

(d) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 363, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR2 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CEA sa približno jednakim ili većim afinitetom u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR2 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pri čemu pomenuti afinitet je izmereno primenom površinske plazmonske rezonance;

i/ili

(ii) CDR3 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(e) SEQ ID Br.: 365 (SGVLGGLHEDWFNY); ili

(f) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 365, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR3 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CEA sa približno jednakim ili većim afinitetom u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR3 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinske razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren primenom površinske plazmonske rezonance.

[0213] U drugom aspektu, drugi ISV može biti polipeptid u kojem CDR1 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 361, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 363, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 365. Preferirani polipeptidi uključuju SEQ ID Br.: 353 i 354.

[0214] U daljnjem aspektu, drugi ISV mogu biti polipeptidi koji unakrsno-blokiraju vezanje na karcinoembrionski antigen (CEA) uz pomoć barem jednog ISV ili polipeptida izabranih iz SEQ ID Br.: 353 ili 354.

[0215] U daljnjem aspektu, drugi ISV mogu biti polipeptidi koji su unakrsno-blokirani i zbog toga ne mogu da se vežu na karcinoembrionski antigen (CEA) uz pomoć barem jednog ISV ili polipeptida izabranih iz SEQ ID Br.: 353 ili 354.

[0216] Drugi ISV može biti polipeptid koji specifično veže CD20 i koji sadrži ili u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), gde:

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(a) SEQ ID Br.: 362 (GGTFSSYTMG); ili

(b) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 362, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR1 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CD20 sa približno jednakim ili većim afinitetom u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR1 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pri čemu pomenuti afinitet je izmereno primenom površinske plazmonske rezonance;

i/ili

(ii) CDR2 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(c) SEQ ID Br.: 364 (EVRWGGVTT); ili

(d) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 364, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR2 sa 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinskom razlikom veže CD20 sa približno jednakim ili većim afinitetom u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR2 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pri čemu pomenuti afinitet je izmereno primenom površinske plazmonske rezonance;

i/ili

(iii) CDR3 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(e) SEQ ID Br.: 366 (VRQMYMTVVPDY); ili

(f) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 366, pod uslovom da pomenuti polipeptid koji sadrži CDR3 sa 4, 3, 2, ili amino-kiselinskom razlikom veže CD20 sa približno jednakim ili većim afinitetom u odnosu na vezanje sa polipeptidom koji sadrži CDR3 bez pomenute 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku, pri čemu pomenuti afinitet je izmereno primenom površinske plazmonske rezonance.

[0217] U drugom aspektu, drugi ISV može biti polipeptid u kojem CDR1 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 362, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 364, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID Br.: 366. Preferirani polipeptid uključuje SEQ ID Br.: 357.

[0218] U daljnjem aspektu, drugi ISV mogu biti polipeptidi koji unakrsno-blokiraju vezanje na CD20 uz pomoć ISV ili polipeptida izabranih iz SEQ ID Br.: 357.

[0219] U daljnjem aspektu, drugi ISV mogu biti polipeptidi koji su unakrsno-blokirani i zbog toga ne mogu da se vežu na CD20 uz pomoć ISV ili polipeptida izabranih iz SEQ ID Br.: 357.

[0220] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na jedinjenja ili na konstrukte, a naročito na belančevine ili polipeptide koji sadrže ili u suštini se sastoje od jednog ili više ISV ili polipeptida iz ovoga pronalaska, a opciono dalje sadrže jednu ili više drugih grupa, ostataka, ili vezanih jedinica. Kao šta stručnjak može da vidi iz daljnjeg opisa, takve dodatne grupe, ostaci, vezane jedinice ili amino-kiselinske sekvence mogu, ali ne moraju, da obezbede dodatnu funkcionalnost polipeptida iz ovoga pronalaska (i/ili jedinjenju ili konstruktu u kojem su prisutne) i mogu, ali ne moraju, da modifikuju karakteristike polipeptida iz ovoga pronalaska.

[0221] U jednom specifičnom, ali ne-ograničavajućem aspektu ovoga pronalaska, koji će biti dodatno opisan, polipeptidi iz ovoga pronalaska mogu da imaju povećani polu-život u serumu (kao šta je ovde dalje opisano) u odnosu na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ili polipeptid iz kojeg su pomenuti izvedeni. Na primer, polipeptid iz ovoga pronalaska može da bude spojen (hemijski ili na neki drugi način) na jednu ili više grupa ili ostataka koji povećavaju polu-život (poput PEG-a), a sa ciljem da se obezbedi derivat polipeptida iz ovoga pronalaska sa povećanim polu-životom.

[0222] U jednom specifičnom aspektu ovoga pronalaska, polipeptid iz ovoga pronalaska mogu da imaju povećani polu-život u odnosu na odgovarajući polipeptid iz ovoga pronalaska. Neki preferirani, ali ne-ograničavajući primeri takvih polipeptida stručnjaku će biti jasni na osnovu daljnjeg opisa u ovom tekstu, a, na primer, sadrže polipeptide iz ovoga pronalaska koji su hemijski modifikovani sa ciljem da se poveća njihov polu-život (na primer, označavanjem sa PEG-om tj. pegilovanjem); polipeptidi iz ovoga pronalaska koji sadrže barem jedno dodatno vezno mesto za vezanje na neku serumsku belančevinu (poput serumskog albumina); ili polipeptidi iz ovoga pronalaska koji sadrže barem polipeptid iz ovoga pronalaska koji je spojen na barem jedan ostatak (a naročito na barem jednu amino-kiselinsku sekvencu) koja povećava polu-život polipeptida iz ovoga pronalaska. Primeri za polipeptide iz ovoga pronalaska koji sadrže takve ostatke koji povećavaju polu-život ili za imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene će postati jasni stručnjaku na osnovu daljnjeg opisa u ovom tekstu; a, na primer, uključuju, bez ograničenja, polipeptide u kojima jedan ili više polipeptida iz ovoga pronalaska su prikladno spojeni na jednu ili više serumskih belančevina ili njihovih fragmenata (poput (ljudskog) serumskog albumina ili njegovih prikladnih fragmenata) ili na jednu ili više veznih jedinica koje mogu da se vežu na serumske belančevine (poput, na primer, domena antitela, imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena koji su prikladni za primenu kao domen antitela, pojedinačni domen antitela, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni koji su prikladni za primenu kao pojedinačni domen antitela, "dAb", imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni koji su prikladni za primenu kao dAb, ili nanotela koja mogu da vežu serumske belančevine poput serumskog albumina (poput ljudskog serumskog albumina), serumski imunoglobulini poput IgG, ili transferina; opis je u daljnjem tekstu i referencama koje su ovde pomenute); ISV ili polipeptidi u kojima je neki ISV ili polipeptid iz ovoga pronalaska spojen na Fc-deo (poput ljudskog Fc) ili na neki njegov prikladni deo ili fragment; ili polipeptidi u kojima je jedan li više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena ili polipeptida iz ovoga pronalaska prikladno spojeno na jedan ili više malih belančevina ili peptida koji mogu da se vežu na serumske belančevine, poput, ali bez ograničenja, belančevina i peptida koji su opisani u dokumentima WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489, WO 08/068280, WO 09/127691 i WO 11/095545.

[0223] Uopšteno, polipeptidi iz ovog pronalaska sa povećanim polu-životom preferirano imaju polu-život koji je barem 1.5-puta, preferirano barem 2-puta, poput barem 5-puta, na primer barem 10-puta ili više od 20-puta veći od polu-života odgovarajućeg ISV ili polipeptida iz ovoga pronalaska per se. Na primer, polipeptidi iz ovog pronalaska sa povećanim polu-život mogu da imaju polu-život, na primer u ljudima, koji je povećan za više od 1 h, preferirano više od 2 h, bolje više od 6 h, kao više od 12 h, ili čak više od 24, 48 ili 72 h u odnosu na odgovarajući ISV ili polipeptid iz ovog pronalaska per se.

[0224] U jednom preferiranom, ali ne-ograničavajućem aspektu ovog pronalaska, takvi polipeptidi iz ovog pronalaska imaju serumski polu-život, na primer kod ljudi, koji je povećan za više od 1 h, preferirano više od 2 h, bolje više od 6 h, poput više od 12 h, ili čak više od 24, 48 ili 72 h u odnosu na odgovarajući polipeptid iz ovoga pronalaska per se.

[0225] U drugom preferiranom, ali ne-ograničavajućem aspektu ovoga pronalaska, takvi polipeptidi iz pronalaska pokazuju serumski polu-život u ljudima od barem oko 12 h, preferirano barem 24 h, bolje barem 48 h, čak još bolje barem 72 h ili više. Na primer, polipeptidi iz ovoga pronalaska mogu da imaju polu-život od barem 5 dana (poput oko 5 do 10 dana), preferirano barem 9 dana (poput oko 9 do 14 dana), bolje barem oko 10 dana (poput oko 10 do 15 dana), ili barem oko 11 dana (poput oko 11 do 16 dana), bolje barem oko 12 dana (poput oko 12 do 18 dana ili više), ili više od 14 dana (poput oko 14 do 19 dana).

[0226] U ovom pronalasku je bilo pokazano da uvođenje vezne jedinice (kao takve) koja cilja albumin u konstrukt nije uticalo na ostvarenu potenciju ili efikasnost. Mada je manji gubitak efikasnosti/potencije bio primećen u prisutnosti HSA, multispecifični polipeptidi sa produženim polu-životom koji vežu TCR su i dalje zadržali svoj potencijal ubijanja tumorskih ćelija. Dostava leka na bazi albumina se pokazala korisnom za postizanje poboljšane terapije protiv raka, uglavnom zbog svojeg pasivnog približavanja prema tumoru preko efekta pojačane permeabilnosti i zadržavanja i povećane potrebe za albuminom u tumorskim ćelijama kao izvora energije i amino-kiselina. Međutim, albuminu nedostaje ne samo aktivan mehanizam kako bi prevazišao barijeru ćelijske membrane, već takođe i sposobnost da penetrira u tumorska tkiva (Qianqian Guo et al.2013, Polim. Chem.4: 4584-4587).

[0227] U jednom naročito preferiranom, ali ne-ograničavajućem aspektu ovoga pronalaska, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid iz ovog pronalaska koji sadrži prvi i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV); i dodatno sadrži jedan ili više (preferirano jedan) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji veže serum kao šta je ovde opisano, na primer, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji veže serumski albumin i koji je označen kao Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG (Tabela B-3).

Tabela B-3: Imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni ISV-a i polipeptida iz ovoga pronalaska za primenu HLE

[0228] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisano u zahtevima, koji dodatno sadrži ostatak za vezanje serumske belančevine.

[0229] Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti ostatak za vezanje serumske belančevine veže serumski albumin.

[0230] Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti ostatak za vezanje serumske belančevine je neki imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen za vezanje serumskog albumina.

[0231] Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisano u zahtevima, pri čemu se pomenuti ISV koji veže serumski albumin u suštini sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4) i 3 regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3), gde CDR1 je SFGMS (SEQ ID Br.: 481), CDR2 je SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID Br.: 482), a CDR3 je GGSLSR (SEQ ID Br.: 475), pri čemu CDR je određen u skladu sa Kabat-ovom definicijom; i/ili gde CDR1 je GFTFSSFGMS (SEQ ID Br.: 472) ili GFTFRSFGMS (SEQ ID Br.: 473), CDR2 je SISGSGSDTL (SEQ ID Br.: 474), a CDR3 je GGSLSR (SEQ ID Br.: 475), pri čemu je CDR određen prema Kontermann 2010.

[0232] Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti ISV koji veže serumski albumin sadrži Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG (Tabela -B3).

[0233] U polipeptidima iz ovoga pronalaska, pomenuta dva ili više građevna bloka, ISV ili nanotela i opciono jedan ili više polipeptida, jedna ili više drugih grupa, lekova, agenasa, ostataka, ili veznih jedinica mogu da budu međusobno direktno spojeni (kao šta je, na primer, opisano u dokumentu WO 99/23221) i/ili mogu da budu međusobno spojeni preko jednog ili više prikladnih spejsera ili linkera, ili bilo koje njihove kombinacije.

[0234] Prikladni spejseri ili linkeri za primenu u multivalentnim i multispecifičnim polipeptidima su poznati stručnjaku, a, uopšteno, to može da bude bilo koji poznati linker ili spejser koji se koristi za povezivanje amino-kiselinskih sekvenca. Preferirano, pomenuti linker ili spejser je prikladan za primenu kod konstrukcije belančevina ili polipeptida koji su namenjeni za farmaceutsku upotrebu.

[0235] Neki naročito preferirani spejseri uključuju poznate spejsere i linkere koji se koriste za stajanje fragmenata ili domena antitela. To uključuje linkere koji su pomenuti u opštem stanju tehnike koje je citirano iznad, kao na primer poznate linkere koji se koriste kod konstrukcije diatela ili ScFv-fragmenata (u tom pogledu treba, međutim, da se napomene da dok kod diatela i ScFv-fragmenata korišćena linkerska sekvenca treba da ima svoju dužinu, stepen fleksibilnost i druge karakteristike koje omogućavaju relevantnim VHi VLdomenima da se spoje kako bi formirali kompletno mesto za vezanje antigena, dotle kod polipeptida iz ovoga pronalaska ne postoji neko naročito ograničenje dužine ili fleksibilnosti korišćenih linkera zbog toga šta svaki ISV ili nanotelo sami za sebe formiraju kompletno mesto za vezanje antigena).

[0236] Na primer, linker može da bude neka prikladna amino-kiselinska sekvenca, a naročito amino-kiselinske sekvence od između 1 i 50, preferirano između 1 i 30, kao između 1 i 10 amino-kiselinskih ostataka. Neki preferirani primeri takvih amino-kiselinskih sekvenca uključuju gly-ser-linkere, na primer tipa (glyxsery)z, poput (na primer, (gly4ser)3ili (gly3ser2)3, kao šta je opisano u dokumentu WO 99/42077, i GS30, GS15, GS9 i GS7 linkera opisanih u aplikacijama od Ablynx koje su ovde pomenute (vidi, na primer, dokumente WO 06/040153 i WO 06/122825), kao i regione slične dršci, poput hinge-regiona iz teškog lanca prirodnih antitela ili sličnih sekvenca (kao šta je opisano u dokumentu WO 94/04678). Preferirani linkeri su opisani u Tabeli B-4.

Tabela B-4: Linkeri

[0237] Neki drugi naročito preferirani linkeri su poli-alanin (poput AAA), kao i linkeri GS30 (SEQ ID Br.: 85 iz dokumenta WO 06/122825) i GS9 (SEQ ID Br.: 84 iz dokumenta WO 06/122825).

[0238] Drugi prikladni linkeri uopšteno sadrže organska jedinjenja ili polimere, a naročito one prikladne za upotrebu u belančevinama za farmaceutsku primenu. Na primer, poli(etilenglikol)-ostaci se koriste za povezivanje domena antitela; vidi, na primer, dokument WO 04/081026.

[0239] Dužina, stepen fleksibilnosti i/ili ostale karakteristike korišćenih linkera (mada ne toliko kritično kao šta je obično slučaj kod linkera korišćenih u ScFv-fragmentima) može da ima uticaj na karakteristike finalnog polipeptida iz ovoga pronalaska, uključujući, ali bez ograničenja uticaj samo na afinitet, specifičnost ili aviditet prema TCR, ili prema jednog ili više drugih antigena. Na bazi ovog opisa, stručnjak može da izabere optimalni linker(e) za primenu u nekom specifičnom polipeptidu iz ovoga pronalaska, opciono nakon određenih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0240] Na primer, kod multivalentnih polipeptida iz ovoga pronalaska, dužina i fleksibilnost linkera su preferirano takve da omogućavaju svakom ISV ili nanotelu iz ovoga pronalaska, koji su prisutni u polipeptidu, da se pomenuti vežu na svoju prirodnu metu, na primer, neki antigeni determinant na svaku od pomenutih meta. Ponovo, na bazu ovog opisa, stručnjak može da izabere optimalni linker(e) za primenu u nekom specifičnom polipeptidu iz ovoga pronalaska, opciono nakon određenih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0241] Korišćeni linker(i) mogu da koriste jednu ili više drugih favorizovanih karakteristika ili funkcionalnosti polipeptida iz ovoga pronalaska, i/ili obezbeđuju jedno ili više mesta za formiranje derivata i/ili za spajanje funkcionalnih grupa (na primer, kao šta je ovde opisano za derivate polipeptida iz ovoga pronalaska). Na primer, linkeri koji sadrže jedan ili više nabijenih amino-kiselinskih ostataka mogu da obezbede poboljšane hidrofilne karakteristike, dok linkeri koji formiraju ili sadrže male epitope ili priveske mogu da se koriste za detektovanje, identifikovanje i/ili prečišćavanje. Ponovo, na bazi ovog opisa, stručnjak može da izabere optimalne linkere za upotrebu u nekom specifičnom polipeptidu iz ovoga pronalaska, opciono nakon određenih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0242] Konačno, kada se u polipeptidima iz ovoga pronalaska koriste dva ili više linkera, pomenuti linkeri mogu da budu isti ili različiti. Ponovo, na bazi ovog opisa, stručnjak može da izabere optimalne linkere za upotrebu u nekom specifičnom polipeptidu iz ovoga pronalaska, opciono nakon određenih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0243] Obično, za jednostavnu ekspresiju i proizvodnju, polipeptid iz ovoga pronalaska je u formi linearnog polipeptida. Međutim, pronalazak u svojem najširem smislu nije ograničen na to. Na primer, kada neki polipeptid iz ovoga pronalaska sadrži tri ili više građevna bloka, ISV ili nanotela, moguće je da ih se poveže primenom linkera sa tri ili više "ruku", pri čemu je sa svakom "rukom" spojen na jedan građevni blok, ISV ili nanotelo, kako bi se obezbedio konstrukt u formi "zvezde". Takođe je moguće, mada obično manje preferirano, da se koriste i cirkularni konstrukti.

[0244] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV i pomenuti drugi ISV, a moguće i pomenuti treći ISV i/ili pomenuti ISV za vezanje serumskog albumina su direktno međusobno spojeni ili su spojeni preko linkera.

[0245] Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti linker je izabran iz grupe koja obuhvata linkere 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS i 35GS.

[0246] Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano u zahtevima, pri čemu pomenuti ostatak za vezanje serumske belančevine je polipeptid koji nije na bazi antitela (na primer, PEG).

[0247] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupke za pripremu polipeptida kako je definisano u zahtevima. ISV, polipeptidi i konstrukti mogu da se pripreme na način koji je poznat per se, kao šta je stručnjaku vidljivo iz daljnjeg opisa. Na primer, pomenuti ISV, polipeptidi i konstrukti mogu da se pripreme na bilo koji način koji je poznat per se, a koji se promenjuje kod pripreme antitela, a naročito kod pripreme fragmenata antitela (uključujući, ali bez ograničenja, (pojedinačne) domene antitela i ScFv-fragmenata). Neki preferirani, ali neograničavajući postupci za pripremu pomenutih polipeptida i konstrukata uključuje ovde opisane postupke i tehnike.

[0248] Pomenuti postupak za pripremu ISV, polipeptida ili proteinskog konstrukta može da obuhvata sledeće korake:

• ekspresiju, u nekoj prikladnoj ćeliji-domaćinu ili organizmu-domaćinu (ćelija domaćin prema zahtevima takođe ovde označena kao "ćelija domaćin iz ovoga pronalaska") ili u nekom drugom prikladnom sistemu za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira pomenuti ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt,

opciono praćeni sa:

• izolovanjem i/ili prečišćavanjem tako dobivenog ISV, polipeptida ili proteinskog konstrukta.

[0249] Naročito, takav postupak može da obuhvata korake:

• kultiviranja i/ili održavanja ćelije domaćina iz ovog pronalaska u uslovima koji su takvi da pomenuta ćelija domaćin iz ovog pronalaska eksprimira i/ili proizvodi barem jedan polipeptid ili iz pronalaska;

opciono praćeni sa:

• izolovanjem i/ili prečišćavanjem tako dobivenog polipeptida iz pronalaska.

[0250] Prema tome, ovaj pronalazak se takođe odnosi na nukleinsku kiselinu ili nukleotidnusekvencu koja kodira ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz ovoga pronalaska (takođe označen kao "nukleinska-kiselina iz ovoga pronalaska" ili "nukleotidna-sekvenca iz ovoga pronalaska"). Nukleinska-kiselina iz ovoga pronalaska može da bude u formi jedno-lančane ili dvo-lančane DNA ili RNA, a preferirano u formi dvo-lančane DNA. Na primer, nukleotidnesekvence iz ovoga pronalaska mogu da budu genomska DNA, cDNA ili sintetska DNA (poput DNA sa upotrebom kodona (codon usage) koji je specifično adaptiran za ekspresiju u namenjenoj ćeliji-domaćinu ili organizmu-domaćinu).

[0251] U skladu sa jednom izvedbom ovoga pronalaska, pomenuta nukleinska-kiselina iz ovoga pronalaska je u suštini izolovana forma, kao šta je ovde definisano. Pomenuta nukleinska-kiselina iz ovoga pronalaska može takođe da bude u formi, da bude prisutna u i/ili da bude deo nekog vektora, poput, na primer, nekog plazmida, kozmida ili YAC, koji ponovo mogu u suštini da budu izolovane forme.

[0252] Pomenute nukleinske-kiseline iz ovoga pronalaska mogu da se pripreme ili da se dobiju na način koji je poznat per se, na bazi informacija o polipeptidima ili proteinskim konstruktima iz ovoga pronalaska koje su ovde navedene, i/ili mogu da budu izolovane iz nekog prikladnog prirodnog izvora. Takođe, kao šta je poznato stručnjaku, sa ciljem da se pripremi nukleinskakiselina iz ovoga pronalaska, takođe nekoliko nukleotidnih sekvenca, poput barem jedne nukleotidne sekvence koja kodira neki imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen korišćen u ovom pronalasku i, na primer, nukleinskih kiselina koje kodiraju jedan ili više linkera mogu da se međusobno spoje na prikladan način.

[0253] Tehnike za generisanje nukleinskih kiselina iz ovoga pronalaska su poznate stručnjaku, a mogu, na primer, da uključuju, ali bez ograničenja, automatizovanu sintezu DNA; mestousmerenu mutagenezu; kombinovanje dve ili više prirodnih i/ili sintetičkih sekvenca (ili dva ili više njihova dela), uvođenje mutacija koje dovode do ekspresiju skraćenog ekspresionog produkta; uvođenje jednog ili više restrikcionih mesta (na primer, sa ciljem da se proizvedu kasete i/ili regioni koji mogu lako da budu digerirani i/ili ligirani uz pomoć prikladnih restrikcionih encima), i/ili uvođenje mutacija primenom PCR-reakcije uz korišćenje jednog ili više "pogrešno-sparenih" primera. Ove i druge tehnike su poznate stručnjaku, a čitatelj se upućuje na standardne priručnike, poput Sambrook et al. i Ausubel et al., koji su ovde pomenuti, kao i na primere ispod.

[0254] Pomenuta nukleinska-kiselina iz ovoga pronalaska takođe može da bude u formi konstrukta, da bude prisutna u i/ili da bude deo genetičkog konstrukta, kao šta je poznato stručnjaku. Takvi genetički konstrukti uopšteno obuhvataju barem jednu nukleinsku-kiselinu iz ovoga pronalaska koja je opciono spojena na jedan ili više elemenata iz genetičkih konstrukata koji su poznati per se, poput, na primer, jednog ili viši prikladnih regulatornih elemenata (poput nekog prikladnog promotora, enhansera, terminatora, itd.) i neke dodatne elemente iz genetičkih konstrukata koji su ovde pomenuti. Takvi genetički konstrukti koji sadrže barem jednu nukleinsku-kiselinu iz ovoga pronalaska su ovde takođe označeni kao "genetički konstrukti iz ovoga pronalaska".

[0255] Pomenuti genetički-konstrukti iz ovoga pronalaska mogu da budu DNA ili RNA, a preferirano su dvo-lančana DNA. Pomenuti genetički konstrukti iz ovoga pronalaska mogu takođe da budu u formi koja je prikladna za transformacije namenjene ćelije-domaćina ili organizma-domaćina, u formi koja je prikladna za integraciju u genomsku DNA korišćene ćelije-domaćina ili u formi koja je prikladna za nezavisnu replikaciju, održavanje i/ili nasleđivanje u namenjenom organizmu-domaćinu. Na primer, pomenuti genetički konstrukti iz ovoga pronalaska mogu da budu u formi vektora, poput, na primer, u formi plazmida, kozmida, YAC, viralnog vektora ili transpozona. Naročito, pomenuti vektor može da bude ekspresioni vektor, tj. vektor koji omogućava ekspresiju in vitro i/ili in vivo (na primer, u nekoj prikladnoj ćeliji-domaćinu, organizmu-domaćinu i/ili ekspresionom sistemu).

[0256] U jednoj preferiranoj, ali ne-ograničavajućoj izvedbi, genetički konstrukt iz ovoga pronalaska sadrži:

a) barem jednu nukleinsku kiselinu iz ovoga pronalaska; koja je operaciono vezana na b) jedan ili više regulatornih elemenata, poput promotora i opciono nekog prikladnog terminatora;

i opciono takođe

c) jedan ili više dodatnih elemenata iz genetičkih konstrukata koji su poznati per se;

pri čemu termini "regulatorni element", "promotor", "terminator" i "operaciono povezan" imaju svoja uobičajena značenja koja su poznata stanju tehnike (kao šta je dodatno ovde opisano); i pri čemu pomenuti "dodatni elementi" koji su prisutni u pomenutim genetičkim konstruktima mogu, na primer, da budu 3'- ili 5'-UTR sekvence, leader-sekvence, selekcioni markeri, ekspresijski markeri/reporter-geni, i/ili elementi koji mogu da ubrzaju ili povećaju (efikasnost) transformacije ili integracije. Ovi i drugi prikladni elementi za takve genetičke konstrukte su poznati stručnjaku, i mogu, na primer, da zavise o tipu korišćenih konstrukata; namenjenoj ćeliji-domaćina ili organizmu-domaćinu; načinu na kojem je predviđeno da se nukleotidne sekvence iz ovoga pronalaska eksprimiraju (na primer, preko konstitutivne, prolazne ili inducibilne ekspresije); i/ili korišćenih tehnika transformacije. Na primer, regulatorne sekvence, promotori i terminatori koji su poznati per se i koji su namenjeni za ekspresiju i proizvodnju antitela i fragmenata antitela (uključujući, ali bez ograničenja, (pojedinačne) domene antitela i ScFvfragmente) mogu da se koriste na, u suštini, analogan način.

[0257] Poželjno, u genetičkim konstruktima iz ovoga pronalaska, pomenuta barem jedna nukleinska-kiselina iz ovoga pronalaska i pomenuti regulatorni elementi, i opciono pomenuti jedan ili više drugih elemenata, su međusobno "operativno spojeni", pod čime se generalno misli da ostvaruju međusobnu funkcionalnu vezu. Na primer, promotor se smatra "operativno spojenim" na kodirajuću sekvencu ako je pomenuti promotor sposoban da inicira ili da na neki drugi način kontroliše/reguliše transkripciju i/ili ekspresiju kodirajuće sekvence (pri čemu za pomenutu kodirajuću sekvencu treba da se smatra da je "pod kontrolom" pomenutog promotora). Uopšteno, kada su dve nukleotidne sekvence operativno spojene, iste će se nalaziti u istoj orijentaciji i obično će, takođe, imati isti okvir čitanja. Pomenute će obično, takođe, u suštini biti kontinuirane, mada ovo takođe ne mora da bude uslov.

[0258] Nukleinske-kiseline iz ovoga pronalaska i/ili pomenuti genetički konstrukti iz ovoga pronalaska mogu da se koriste sa ciljem da se transformira neka ćelija-domaćin ili organizamdomaćin, tj. za ekspresiju i/ili proizvodnju polipeptida ili proteinskog konstrukta iz ovoga pronalaska. Pomenuti domaćin je preferirano neki ne-humani domaćin. Prikladni domaćini ili ćelije-domaćini su poznati stručnjaku, i mogu, na primer, da budu prikladne ćelije gljiva, prokariota ili eukariota ili ćelijske linije ili bilo koja prikladna gljiva, prokariotski ili eukariotski organizam, na primer:

• bacterijski soj, uključujući, ali bez ograničenja, gram-negativne sojeve poput sojeva Escherichia coli; Proteus, na primer Proteus mirabilis; Pseudomonas, na primer Pseudomonas fluorescens; i gram-pozitivne sojeve poput Bacillus, na primer Bacillus subtilis ili Bacillus brevis; Streptomyces, na primer Streptomyces lividans; Staphylococcus, na primer Staphylococcus carnosus; i Lactococcus, na primer Lactococcus lactis;

• gljivična ćelija, uključujući, ali bez ograničenja, ćelije vrsta iz roda Trichoderma, na primer Trichoderma reesei; Neurospora, na primer Neurospora crassa; Sordaria, na primer Sordaria macrospora; Aspergillus, na primer Aspergillus niger ili Aspergillus sojae; iz ili drugih filamentoznih gljiva;

• kvašćeva ćelija, uključujući, ali bez ograničenja, ćelije vrsta roda Saccharomyces, na primer Saccharomyces cerevisiae; Schizosaccharomyces, na primer Schizosaccharomyces pombe; Pichia, na primer Pichia pastoris ili Pichia metanolica; Hansenula, na primer Hansenula polimorpha; Kluyveromyces, na primer Kluyveromyces lactis; Arxula, na primer Arxula adeninivorans; Yarrowia, na primer Yarrowia lipolitica;

• ćelije ili ćelijske linije vodozemaca, poput oociota Xenopus;

• ćelija ili ćelijska linija koja je dobivena iz insekata, poput ćelija/ćelijskih linija dobivenih iz leptira (Lepidoptera), uključujući, ali bez ograničenja, ćelije Spodoptera SF9 i Sf21 ili ćelije/ćelijske linije izvedene iz roda Drosophila, poput Schneider-ove i Kc-ćelije;

• biljka ili biljna ćelija, na primer, duvana; i/ili

• ćelija ili ćelijska linija dobivena iz sisara, na primer ćelija ili ćelijska linija dobivena od ljudi, ćelija ili ćelijska linija sisara uključujući, ali bez ograničenja, CHO-ćelije, BHK-ćelije (na primer, BHK-21-ćelije) i ljudske ćelije ili ćelijske linije poput HeLa, COS (na primer, COS-7) i PER.C6-ćelije;

kao i neke druge domaćine ili ćelije-domaćine koji su poznati per se i koji služe za ekspresiju i proizvodnju antitela i fragmenata antitela (uključujući, ali bez ograničenja, (pojedinačni) domen antitela i ScFv-fragmente), koje je poznato stručnjaku. Čitatelj se upućuje na opšte reference koje su ovde navedene, kao i na, na primer, dokumente WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al. 1998 (Res. Imunol. 149: 589-99); Riechmann & Muyldermans 1999 (J. Imunol. Met.231: 25-38); van der Linden 2000 (J. Biotechnol.80: 261-70); Joosten et al.2003 (Microb. Cell Fact.2: 1); Joosten et al.2005 (Appl. Mikrobiol. Biotechnol.66: 384-92); i na dodatne ovde citirane reference.

[0259] Za ekspresiju ISV, polipeptida ili konstrukata u nekoj ćeliji, pomenuti mogu takođe da budu eksprimirani kao takozvana "intratela", kao šta je, na primer, opisano u dokumentima WO 94/02610, WO 95/22618 i US 7004940; WO 03/014960; kod autora Cattaneo & Biocca 1997 (Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag); kod autora Kontermann 2004 (Methods 34: 163-170).

[0260] U skladu sa jednom preferiranom, ali ne-ograničavajućom izvedbom ovoga pronalaska, polipeptid iz ovoga pronalaska je proizveden u bakterijskoj ćeliji, a naročito bakterijskoj ćeliji koja je prikladna za farmaceutsku proizvodnju na industrijskoj skali, poput ćelija iznad pomenutih sojeva.

[0261] U skladu sa drugom preferiranom, ali ne-ograničavajućom izvedbom ovoga pronalaska, polipeptid iz ovoga pronalaska je proizveden u ćeliji kvasca, a naročito u ćeliji kvasca koja je prikladan za farmaceutsku proizvodnju na industrijskoj skali, poput ćelija malopre pomenutih vrsta.

[0262] U skladu sa još jednom preferiranom, ali ne-ograničavajućom izvedbom ovoga pronalaska, polipeptid iz pronalaska je proizveden u ćeliji sisara, naročito u ljudskoj ćeliji ili u ćeliji iz neke ljudske ćelijske linije, a još bolje u ljudskoj ćeliji ili u ćeliji neke ljudske ćelijske liniji koja je prikladna za farmaceutsku proizvodnju na industrijskoj skali, poput ćelijskih linija pomenutih iznad.

[0263] Prikladne tehnike za transformiranje ćelije-domaćina iz ovoga pronalaska su poznate stručnjaku, a mogu da zavise o namenjenoj ćeliji-domaćinu i samog genetičkog konstrukta koji se koristi. Čitatelj je upućen na priručnike i patentne aplikacije koje su pomenute iznad.

[0264] Nakon transformacije može da se provede korak detektovanja i selekcija ćelijadomaćina koji su uspešno transformirani sa nukleotidnom sekvencom/genetičkim konstruktom iz ovoga pronalaska. To može, na primer, da bude korak na bazi selektivnog markera koji je prisutan u genetičkom konstruktu iz ovoga pronalaska ili korak koji podrazumeva detektovanje polipeptida iz ovoga pronalaska, na primer uz korišćenje specifičnih antitela.

[0265] Transformirana ćelija-domaćin (koja može da bude u formi neke prikladne ćelijske linije) formiraju dodatne aspekte ovoga pronalaska.

[0266] Preferirano, pomenute ćelije domaćini su takvi da eksprimiraju, ili su (barem) sposobni da eksprimiraju (na primer, u prikladnim uslovima), polipeptid ili iz ovoga pronalaska. Ovaj pronalazak takođe obuhvata buduće generacije, potomke i/ili mlade ćelije-domaćina iz ovoga pronalaska, na primer, koji su dobiveni deobom ćelije ili seksualnim ili aseksualnim razmnožavanjem.

[0267] Prema tome, u drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na domaćina ili ćeliju koja eksprimira (ili je u prikladnim uslovima sposobna da eksprimira) polipeptid iz ovoga pronalaska; i/ili koja sadrži nukleinsku-kiselinu koja kodira pomenute. Neki preferirani, ali neograničavajući primeri, takvih domaćina ili ćelija-domaćina uopšteno su opisani u dokumentima WO 04/041867, WO 04/041865 ili WO 09/068627. Na primer, polipeptidi iz ovoga pronalaska mogu da se prikladno eksprimiraju, proizvedu ili produciraju u nekom soju kvasca, poput nekog soja vrste Pichia pastoris. Čitatelj se takođe upućuje na dokumente WO 04/25591, WO 10/125187, WO 11/003622, i WO 12/056000 koji isto opisuju ekspresiju/proizvodnju imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena i polipeptida koji ih sadrže u ćelijama Pichia i drugim domaćinima/ćelijama-domaćinima.

[0268] Sa ciljem da se proizvede/ostvari ekspresija polipeptida iz ovoga pronalaska, ćelijadomaćin može, uopšteno, da se čuva, održava i/ili kultivira u uslovima koji omogućavaju da se (poželjni) polipeptid iz pronalaska eksprimira/proizvodi. Ti prikladni uslovi su poznati stručnjaku, a obično zavise o korišćenoj ćeliji domaćinu, kao i o regulatornim elementima koji kontrolišu ekspresiju (relevantne) nukleotidne sekvence iz ovoga pronalaska. Ponovo, čitatelj se upućuje na priručnike i patentne prijave koje su pomenute iznad u paragrafima posvećenim genetičkim konstruktima iz ovoga pronalaska.

[0269] Uopšteno, prikladni uslovi mogu da uključuju upotrebu prikladnog medijuma, prisutnost prikladnog izvora hrane i/ili prikladnih nutrienata, primenu prikladne temperature, i opciono prisutnost prikladnog faktor ili jedinjenja (na primer, kada su nukleotidne sekvence iz ovoga pronalaska pod kontrolom nekog inducibilnog promotora); pri čemu stručnjak može da izabere sve pomenute uslove. Ponovo, u takvim uslovima, polipeptidi iz ovoga pronalaska mogu da se eksprimiraju na konstitutivan način, na prolazan način, ili samo kada su prikladno indukovani.

[0270] Stručnjaku je jasno da pomenuti polipeptid iz ovoga pronalaska može (prvo) da bude generisan u nezreloj formi (kao šta je pomenuto iznad), nakon čega treba da bude podvrgnut post-translacionoj modifikaciji, u zavisnosti o korišćenoj ćeliji-domaćina. Takođe, polipeptid iz ovoga pronalaska može da bude glikozilovan, ponovo u zavisnosti o korišćenoj ćeliji domaćinu.

[0271] Polipeptid iz pronalaska može tada da bude izolovan iz ćelije-domaćina i/ili iz medijuma u kojem je kultivirana pomenuta ćelija-domaćin, uz primenu proteinske izolacije i/ili tehnika prečišćavanja koje su poznata per se, poput (preparativne) hromatografije i/ili elektroforeze, različitih tehnika precipitacije, afinitetnih-tehnika (na primer, uz korišćenje specifične amino-kiselinske sekvence koja može da se pocepa i koja je prethodno fuzionisana sa polipeptidom ili konstruktom iz ovoga pronalaska) i/ili preparativnih imunoloških tehnika (tj. uz korišćenje antitela protiv amino-kiselinske sekvence koja treba da se izoluje).

[0272] Konstrukti koji sadrže polipeptid iz ovoga pronalaska mogu, uopšteno, da se pripreme primenom postupka koji obuhvata barem jedan korak prikladnog spajanja ISV ili polipeptida iz ovoga pronalaska sa jednim ili više dodatnih grupa, ostataka, ili veznih jedinica, opciono preko jednog ili više prikladnih linkera, a sa ciljem da se obezbede konstrukti. Polipeptidi iz ovoga pronalaska mogu tada da budu dodatno modifikovani, naročito primenom hemijske i/ili biološke (na primer, encimske) modifikacije, sa jednim ili više amino-kiselinskih ostataka koji formiraju polipeptide iz pronalaska, a sa ciljem da se dobiju derivati polipeptida iz ovoga pronalaska.

[0273] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koji sadrži polipeptid iz pronalaska.

[0274] Metode za lečenje ljudskog ili životinjskog tela hirurškim putem ili terapijom kao takve su ovde opisane samo u ilustrativne svrhe. U iznad opisanim postupcima polipeptidi iz ovoga pronalaska i/ili kompozicije koje sadrže pomenute mogu da se administriraju primenom bilo kojeg prikladnog načina, u zavisnosti o specifičnoj farmaceutskoj formulacija ili kompoziciji koja je predviđena da se koristi. Tako, polipeptidi iz ovoga pronalaska i/ili kompozicije koji ih sadrže mogu, na primer, da se administriraju oralno, intraperitonealno (na primer, intravenozno, supkutano, intramišićno, ili preko neke druge rute za administriranje koja zaobilazi gastrointestinalni trakt), intranazalno, transdermalno, topikalno, uz pomoć čepića, inhalacijom, ponovo u zavisnosti o specifičnoj farmaceutskoj formulaciji ili kompoziciji koja je predviđena da se koristi. Kliničar može da izabere prikladnu rutu za administriranje i prikladnu farmaceutsku formulaciju ili kompoziciju za primenu kod takvog administriranja, u zavisnosti o bolesti ili poremećaju koji treba da se spreči ili tretirana kao i o drugim faktorima koji su poznati kliničkom radniku.

[0275] Kao šta se ovde koristi, termin "terapeutski agens" se odnosi na bilo koji agens koji može da se koristi u tretmanu i/ili upravljanju sa poremećajem hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, ili jednog ili više njegovih simptoma. U nekim izvedbama, termin "terapeutski agens" se odnosi na multispecifični polipeptid iz ovoga pronalaska. Preferirano, terapeutski agens je neki agens za kojeg se zna da je koristan kod, ili se koristio ili se trenutno koristi kod tretmana, prevencije i/ili upravljanja sa poremećajem hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, ili jednog ili više njegovih simptoma.

[0276] Kao šta se ovde koristi, "terapeutski efektiva količina" u kontekstu raka se odnosi na količinu koja se koristi u samoj terapiji, ili u kombinaciji sa drugim terapijama, a koja obezbeđuje terapeutsku korist tokom tretmana i/ili upravljanja sa tumorima. U jedom aspektu, terapeutski efektivna količina se odnosi na količinu iz neke terapije koja je dostatna da uništi, modifikuje, kontroliše ili odstrani primarno, regionalno ili metastatsko tumorsko tkivo. U drugim aspektu, terapeutski efektivna količina se odnosi na onu količinu iz neke terapije koja je dovoljna da smanji simptome raka. U drugom aspektu, terapeutski efektivna količina se odnosi na onu količinu iz neke terapije koja je dovoljna da odgodi ili minimizuje širenje raka. U jednoj specifičnoj izvedbi, terapeutski efektivna količina iz neke terapija je ona količina u terapiji koja je dovoljna da inhibira rast ili proliferaciju tumorskih ćelija, poubija postojeće tumorske ćelije (na primer, da uzrokuje povlačenje raka), i/ili da spreči širenje tumorskih ćelija na druga tkiva ili područja (na primer, da spreči metastaze). U drugoj specifičnoj izvedbi, terapeutski efektivna količina iz neke terapije je ona količina u terapiji koja je dovoljna da inhibira rast tumora za barem 5%, preferirano za barem 10%, barem 15%, barem 20%, barem 25%, barem 30%, barem 35%, barem 40%, barem 45%, barem 50%, barem 55%, barem 60%, barem 65%, barem 70%, barem 75%, barem 80%, barem 85%, barem 90%, barem 95%, ili barem 100% izmereno primenom standardnog postupka koji je poznat stanju tehnike. Ako se koristi u vezi sa količinom nekog multispecifičnog polipeptida iz ovoga pronalaska, pomenuti termin može da obuhvata količinu koja poboljšava sveukupnu terapiju, smanjuje ili izbegava neželjene efekte, ili pojačava terapeutsku efikasnost terapije ili stvara sinergiju sa drugom terapijom. U jednoj izvedbi, terapeutski efektivna količina iz neke terapije smanjuje ili izbegava neželjene efekte, ili pojačava terapeutsku efikasnost terapije ili ostvaruje sinergiju sa drugom terapijom za barem 5%, preferirano barem 10%, barem 15%, barem 20%, barem 25%, barem 30%, barem 35%, barem 40%, barem 45%, barem 50%, barem 55%, barem 60%, barem 65%, barem 70%, barem 75%, barem 80%, barem 85%, barem 90%, barem 95%, ili barem 100% u odnosu na kontrolu (na primer, negativna kontrola poput slanog rastvora puferovanog sa fosfatom) primenom ogleda koji je poznat stanju tehnike ili je ovde opisan.

[0277] Kao šta se ovde koristi, "terapeutski efektivna količina" u kontekstu poremećaja hiperproliferativnih ćelija koje nisu tumorske se odnosi na onu količinu iz neke terapije same za sebe, ili kombinovano sa drugim terapijama, koja obezbeđuje terapeutsku korist tokom tretmana i/ili upravljanju sa pomenutim poremećajem. U jednom aspektu, terapeutski efektivna količina se odnosi na onu količinu iz neke terapije koja je dovoljna da uništi, modifikuje, kontroliše ili odstrani ćelije zahvaćene sa hiperproliferativnim poremećajem koji nije rak. U drugom aspektu, terapeutski efektivna količina se odnosi na onu količinu iz neke terapije koja je dovoljna da smanji simptome hiperproliferativnog poremećaj koji nije rak. U drugom aspektu, terapeutski efektivna količina se odnosi na onu količinu iz neke terapije koja je dovoljna da odgodi ili minimizuje širenje hiperproliferativnog poremećaja koji nije rak. U jednoj specifičnoj izvedbi, terapeutski efektivna količina iz neke terapije je ona količina u terapiji koja je dovoljna da inhibira rast ili proliferaciju kod hiperproliferativnog poremećaja koji nije rak, ubije preostale hiperproliferativne ćelije koje nisu tumorske (na primer, da uzrokuje regresiju poremećaja). U jednoj drugoj specifičnoj izvedbi, terapeutski efektivna količina iz neke terapije je ona količina u terapiji koja je dovoljna da inhibira rast hiperproliferativnih ćelija koje nisu tumorske za barem 5%, preferirano za barem 10%, barem 15%, barem 20%, barem 25%, barem 30%, barem 35%, barem 40%, barem 45%, barem 50%, barem 55%, barem 60%, barem 65%, barem 70%, barem 75%, barem 80%, barem 85%, barem 90%, barem 95%, ili barem 100% izmereno primenom standardnog postupka koji je poznat stanju tehnike. Ako se koristi u vezi sa količinom nekog multispecifičnog polipeptida iz ovoga pronalaska, pomenuti termin može da obuhvata količina koju poboljšava sveukupnu terapiju, smanjuje ili izbegava neželjene efekte, ili pojačava terapeutski efikasnost terapije il ostvaruje sinergiju sa drugom terapijom. U jednoj izvedbi, terapeutski efektivna količina iz neke terapije smanjuje ili izbegava neželjene efekte, ili pojačava terapeutsku efikasnost terapije ili ostvaruje sinergiju sa drugom terapijom za barem 5%, preferirano barem 10%, barem 15%, barem 20%, barem 25%, barem 30%, barem 35%, barem 40%, barem 45%, barem 50%, barem 55%, barem 60%, barem 65%, barem 70%, barem 75%, barem 80%, barem 85%, barem 90%, barem 95%, ili barem 100% u odnosu na kontrolu (na primer, negativna kontrola poput slanog rastvora puferovanog sa fosfatom) u nekom ogledu koji je poznat stanju tehnike.

[0278] Kao šta se ovde koristi, termin "terapija" se odnosi na bilo koji protokol, postupak i/ili agens koji može da se koristi u tretmanu, prevenciji i/ili upravljanju sa poremećajem hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak. U nekim izvedbama, termini "terapije" i "terapija" se odnose na biološku terapiju, potpornu terapiju, i/ili na druge terapije koje su korisne za tretman, prevenciju i/ili upravljanju sa poremećajem hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, ili jednog ili više njegovih simptoma koje je poznato stručnjaku poput nekog člana medicinskog personala.

[0279] Kao šta se ovde koriste, termini "tretira", "tretman" i "tretiranje" u kontekstu administriranja (a) terapije(a) nekom subjektu se odnose na smanjivanje ili ublažavanje napredovanja, ozbiljnosti, i/ili trajanja nekog poremećaja koji je povezan sa hiperproliferativnim ćelijama, na primer, rak, i/ili na ublažavanje jednog ili više njegovih simptoma koje su posledica administriranja jedne ili više terapija (uključujući, ali bez ograničenja, administriranje jednog ili više profilaktičkih ili terapeutskih agenasa). U jednoj specifičnoj izvedbi, termini "tretira", "tretman" i "tretiranje" u kontekstu administriranja (a) terapije(a) nekom subjektu se odnose na smanjivanje ili ublažavanje napredovanja, ozbiljnosti, i/ili trajanja nekog poremećaja hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, pri čemu se odnose na smanjivanje količine tumorskih ćelija za barem 5%, preferirano barem 10%, barem 15%, barem 20%, barem 25%, barem 30%, barem 35%, barem 40%, barem 45%, barem 50%, barem 55%, barem 60%, barem 65%, barem 70%, barem 75%, barem 80%, barem 85%, barem 90%, barem 95%, ili barem 100% u odnosu na kontrolu (na primer, negativna kontrola poput slanog rastvora puferovanog sa fosfatom). U drugim izvedbama, pomenuti termini "tretira", "tretman" i "tretiranje" u kontekstu administriranja (a) terapije(a) nekom subjektu se odnose na smanjivanje ili ublažavanje napredovanja, ozbiljnosti, i/ili trajanja nekog poremećaja hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, pri čemu se odnose na promenu broja tumorskih ćelija, smanjivanje trajanja hospitalizovanja, smanjivanje mortaliteta, ili na povećanje preživljenja subjekta koji boluje od raka.

[0280] Polipeptidi, iz ovoga pronalaska i/ili kompozicije koje ih sadrže mogu se administrirati u skladu sa režimom za tretman koji je prikladan za sprečavanje i/ili tretiranje poremećaja hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, koji treba da se spreči ili tretira. Kliničar je, generalno, sposoban da odredi prikladan režim za tretman, u zavisnosti o faktorima poput faze samog poremećaja hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, koji treba da se tretira, ozbiljnosti poremećaja hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, koji treba da se tretira i/ili ozbiljnosti njegovih simptoma, specifičnom polipeptidu iz ovoga pronalaska koji se primenjuje, specifičnoj ruti za administriranje i farmaceutskoj formulaciji ili kompoziciji koja se koristi, o dobi, polu, težini, prehrambenom režimu, opštem stanju pacijenta, i sličnih faktora koji su dobro poznati kliničkom radniku.

[0281] Uopšteno, režim tretmana obuhvata administriranje jednog ili više polipeptida, iz ovoga pronalaska, ili jednu ili više kompozicija koje sadrže pomenute, u jednoj ili više farmaceutski efektivnim količinama ili dozama. Kliničar može da odredi specifičnu količinu(e) ili doze koje su namenjene za administriranje, ponovo na bazi faktora koji su citirani iznad.

[0282] Uopšteno, za prevenciju i/ili tretman poremećaja hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, ovde pomenutih i u zavisnosti o tipu poremećaja hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, i faze bolesti koja treba da se tretira, potencijal specifičnog polipeptida iz ovoga pronalaska koji su namenjeni za upotrebu, specifična ruta za administriranje i specifična farmaceutska formulacija ili kompozicija koja se koristi, polipeptidi iz ovoga pronalaska se, uopšteno, administriraju u količini između 1 g i 0.01 mg po kg telesne težine po danu, preferirano između 0.1 g i 0.01 mg po kg telesne težine po danu, kao oko 0.1, 1, 10, 100 ili 1000 mg po kg telesne težine po danu, na primer, od 0.1 mg po kg do 25 mg po kg telesne težine subjekta; kontinuirano (na primer, pomoću infuzije), kao pojedinačna dnevna doza ili u formi višestrukih podeljenih doza tokom dana. Kliničar je, uglavnom, sposoban da odredi prikladnu dnevnu dozu, u zavisnosti o faktorima koji su ovde opisani. Podrazumeva se, takođe, da u specifičnim slučajevima, kliničar može da odluči da zaobiđe pomenute količine, na primer na bazi faktora koji su citirani iznad i na osnovu njegove stručne procene. Uopšteno, mogu da se predlože neke opšte smernice o količinama koje mogu da se administriraju na osnovu količina koje se obično administriraju u slučajevima korišćenja uporedivih konvencionalnih antitela ili fragmenata antitela protiv iste mete preko, u suštini, iste rute, uzimajući u obzir, međutim, razlike u afinitetu/aviditetu, efikasnosti, biodistribuciji, polu-životu i sličnim faktorima koji su dobro poznati stručnjaku.

[0283] Obično se u gore navedenom postupku koristi jedan polipeptid ovog pronalaska, ali se dva ili više polipeptida ovog pronalaska mogu koristiti i u kombinaciji.

[0284] Polipeptidi iz ovoga pronalaska mogu, takođe, da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih farmaceutski aktivnih jedinjenja ili principa, tj. u formi kombinovanog režima za tretman, koji može, ali ne mora da dovede do sinergijskog efekta. Ponovo, kliničar može da izabere takva dodatna jedinjenja ili principe, kao i neki prikladni kombinovani režim za tretman, na bazi faktora citiranih iznad i na bazi njegove stručne procene.

[0285] Naročito, polipeptidi iz ovoga pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim jedinjenjima ili principima koji mogu da se, ili već se koriste kod prevencije i/ili tretmana poremećaja hiperproliferativnih ćelija, na primer, rak, bolest i/ili poremećaji citirani iznad, kao posledica čega može, ali ne mora, da nastupi sinergijski efekt. Primeri takvih jedinjenja i principa, kao i ruta, postupaka i farmaceutskih formulacija ili kompozicija za administriranje pomenutih su poznati kliničaru.

[0286] Kada se dve ili više supstancija ili principa koristi kao deo nekog kombinovanog režima za tretman, pomenuti mogu da se administriraju preko iste rute za administriranje ili preko različitih ruta za administriranje, u suštini istovremeno ili u različitim periodima (na primer, u suštini istovremeno, uzastopno, ili u skladu sa nekim naizmeničnim režimom). Kada se supstancije ili principi administriraju istovremeno preko iste rute za administriranje, pomenuti mogu da se administriraju kao različite farmaceutske formulacije ili kompozicije ili kao deo neke kombinovane farmaceutske formulacije ili kompozicije, kao šta je poznato stručnjaku.

[0287] U jednom aspektu, ovaj opis obezbeđuje postupke za administriranje imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena i njihovih polipeptidnih konstrukata koji sadrže jedan ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena, polipeptida, jedinjenja i/ili konstrukata. U nekim izvedbama, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen, polipeptid, jedinjenje i/ili konstrukt se administrira kao farmaceutska kompozicija. Pomenuta farmaceutska kompozicija, osim pomenutih imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena i njihovih polipeptidnih konstrukata uključuje neki farmaceutskiprihvatljivi nosač.

[0288] Kao šta je opisano detaljnije, farmaceutske kompozicije iz ovoga opisa mogu da se specijalno formulišu za administriranje u čvrstoj ili tečnoj formi, uključujući one koje su adaptirane za sledeće: oralno administriranje, na primer, davanje velike količine leka (vodeni ili ne-vodeni rastvori ili suspenzije), tablete, na primer, one koje su namenjene za bukalnu, podjezičnu, i sistemsku apsorpciju, bolus-preparati, razni prahovi, granule, paste za pod jezik; parenteralno administriranje, na primer, uz pomoć supkutane, intramišićne, intravenozne ili epiduralne injekcije kao, na primer, neki sterilni rastvor ili suspenzija, ili formulacija za odgođeno oslobađanje; topikalna aplikacija, na primer, kao krema, mast, ili navlaka za kontrolisano oslobađanje ili sprej koji se nanosi na kožu, u pluća, ili oralnu šupljinu; intravaginalno ili intrarektalno, na primer, kao pesar, krema ili pena; suplingvalno; okularno; transdermalno; ili nazalno, pulmonalno i preko drugih mukoznih površina.

[0289] Fraza "farmaceutski prihvatljiv" ovde se odnosi na ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili dozne forme koje su, unutar okvira zdrave medicinske procene, prikladne za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, ili drugog problema ili komplikacije, imajući na umu razumni omer korist/rizik.

[0290] Fraza "farmaceutski-prihvatljivi nosač", kao šta se ovde koristi, označava neki farmaceutski-prihvatljivi materijal, kompoziciju ili prenosnik, poput neke tečnosti ili čvrstog filera, razređivača, ekscipijenta, ili materijala za kapsulaciju rastvarača, koji je uključen u prenosu ili transportu predmetnog jedinjenja iz jednog organa, ili dela tela, u drugi organ, ili deo tela. Svaki nosač mora da bude "prihvatljiv" u smislu da je kompatibilan sa ostalim sastojcima iz formulacije i da nije štetan za pacijenta. Neki primeri materijala koji mogu da služe kao farmaceutski-prihvatljivi nosioci uključuju: šećere, poput laktoze, glikoze i saharoze; razne tipove skroba, poput kukuruznog skroba i skroba iz krumpira; celulozu, i njene derivate, poput natrijum karboksimetil celuloze, etil celuloze i celuloza acetata; praškasti tragakant; slad; želatin; talk; ekscipijente, poput kakao-maslaca i voskova za čepiće; razna ulja, poput ulje kikirikija, ulje semena pamuka, suncokretovo ulje, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; glikole, poput propilen glikola; poliole, poput glicerina, sorbitola, manitola i polietilen glikola; estere, poput etil oleata i etil laurata; agar; agenasa za puferovanje, poput magnezijum hidroksida i aluminijum hidroksida; alginsku kiselinu; vodu bez pirogena; izotonični slani rastvor; Ringer-ov rastvor; etil alkohol; pH-puferovane rastvore; poliestere, polikarbonate i/ili polianhidride; i druge ne-toksične kompatibilne supstancije koje se koriste u farmaceutskim formulacijama.

[0291] Formulacije iz ovog opisa uključuju one koje su prikladne za oralno, nazalno, topikalno (uključujući bukalno i pod-jezično), rektalno, vaginalno i/ili parenteralno administriranje. Pomenute formulacije mogu prikladno da se predstave u jedinicama dozne forme i mogu da se pripreme uz pomoć bilo kojih postupaka koji su dobro poznati stanju tehnike u farmaciji.

Količina aktivnog sastojka (na primer, imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili njegovih polipeptidnih konstrukata), koji mogu da se kombinuju sa materijalom nosioca sa ciljem da se proizvede pojedinačna dozna forma, varira u zavisnosti o tretiranom domaćinu, a naročito o modusu za administriranje. Pomenuta količina aktivnog sastojaka, koja može da se kombinuje sa materijalom nosioca sa ciljem da proizvede pojedinačna dozna forma, varira zavisno o količini jedinjenja koje donosi terapeutski efekt. Uopšteno, pomenuta količina se kreće u rasponu od oko 1% do oko 99% aktivnog sastojka, preferirano od oko 5% do oko 70%, a najbolje od oko 10% do oko 30%.

[0292] U nekim izvedbama, formulacija sadrži neki ekscipijent koji je izabran iz grupe koja obuhvata ciklodekstrine, liposome, agense koji formiraju micele, na primer, žučne kiseline, i polimerne nosioce, na primer, poliestere i polianhidride. U nekim izvedbama, malopre pomenuta formulacija omogućava da neki imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ili polipeptidni konstrukt budu oralno biodostupni.

[0293] Postupci za pripremu ovih formulacija ili kompozicija uključuju korak mešanja imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptidnog konstrukta sa nekim nosiocem, i, opciono, jednim ili više pomoćnih sastojaka. Opšte uzeto, pomenute formulacije se pripremaju pomoću uniformnog i neposrednog mešanja nekog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptidnog konstrukta sa tečnim nosiocima, ili fino raspršenim čvrstim nosiocima, ili oba, a tada se, ako je potrebno, pristupa oblikovanju produkta.

[0294] Formulacije koje su prikladne za oralno administriranje mogu da budu u formi kapsula, vafl, pilula, tableta, pastila (uz korišćenje prikladnih baza, obično saharoza i akacija ili tragakant), raznih prahova, granula, ili u formi rastvora ili suspenzije u nekoj vodenoj ili nevodenoj tečnosti, ili u formi tečne emulzije tipa ulje-u-vodi ili voda-u-ulju, ili kao eliksir ili sirup, ili kao pastile (uz korišćenje inertne baze, poput želatina i glicerina, ili saharoze i akacije) i/ili kao tečnosti za ispiranje usta i slično, pri čemu svaki sadrži predodređenu količinu imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptidnog konstrukta kao aktivni sastojak. Imunoglobulin sa jednim varijabilnim domenom ili polipeptidom može se takođe primenjivati kao bolus, elektuar ili pasta..

[0295] Kod čvrstih doznih forma za oralno administriranje (kapsule, tablete, pilule, dražeje, razni prahovi, granule i slično), aktivni sastojak je pomešan sa jednim ili više farmaceutskiprihvatljivih nosioca, poput natrijum citrata ili dikalcijum fosfata, i/ili bilo kojeg od sledećih: fileri ili ekstenderi, poput skroba, laktoze, saharoze, glikoze, manitola, i/ili silicijumove kiseline; veznika, poput, na primer, karboksimetilceluloze, alginata, želatina, polivinil pirolidona, saharoze i/ili akacije; sušila, poput glicerola; agenasa za rahljenje, poput agar-agara, kalcijum karbonata, krumpirovog skroba ili tapioca-skroba, alginske kiseline, određenih silikata, i natrijum karbonata; sredstva za zadržavanje rastvora, poput parafina; akceleratora apsorpcije, poput kvaternarnih amonijumskih jedinjenja; agenasa za vlaženje, poput, na primer, ketil alkohola, glicerol monostearata, i ne-jonskih surfaktanata; absorbenata, poput kaolina i gline od bentonita; lubrikanata, poput talka, kalcijum stearata, magnezijum stearata, čvrstih polietilen glikola, natrijum lauril sulfata, i njihovih smeša; i agenasa za bojanje. U slučaju kapsula, tableta i pilula, pomenute farmaceutske kompozicije mogu, takođe, da sadrže agense za puferovanje. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu, takođe, da budu uključene kao fileri u kapsulama od mekog ili tvrdog želatina uz korišćenje ekscipijenata kao laktoza ili mlečnih šećera, kao i polietilen glikola velike molekularne težine i slično.

[0296] Tableta može da se pripremi kompresijom ili oblikovanjem, opciono sa jednim ili više pomoćnih sastojaka. Kompresovane tablete mogu da se pripreme uz korišćenje veznika (na primer, želatin ili hidroksi-propilmetil celuloze), lubrikanta, inertnog razređivača, prezervativa, agensa za rahljenje (na primer, natrijum skrob glikolata ili unakrsno-spojene natrijum karboksimetil celuloze), površinski-aktivnih agenasa ili disperzanata. Oblikovane tablete mogu da se načine primenom prikladne mašine u kojoj je smeša praškastog jedinjenja navlaženog sa nekim inertnim tečnim razređivačem.

[0297] Tablete, i druge čvrste dozne forme pomenutih farmaceutskih kompozicija, poput dražeja, kapsula, pilula i granula, mogu opciono da budu prekrivene ili pripremljene sa prelivima i omotima, poput entero-preliva i drugih preliva koji su dobro poznati stanju tehnike. Pomenuti, takođe, mogu da se formulišu tako da obezbeđuju sporo ili kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka uz korišćenje, na primer, hidroksipropilmetil celuloze u varirajućim proporcijama sa ciljem da se obezbede poželjni profil oslobađanja, drugih polimernih matrica, liposoma i/ili mikrosfera. Pomenuti mogu da budu formulisani za brzo oslobađanje, na primer, smrznuti-osušeni. Mogu da budu sterilizovani uz pomoć, na primer, filtriranja kroz filter koji zadržava bakterije, ili uz pomoć ugrađivanja agenasa za sterilizovanje u formi sterilnih čvrstih kompozicija koje mogu da budu (neposredno pre upotrebe) rastvorene u sterilnoj vodi, ili u nekim drugim sterilnim medijumima koji mogu da se injektiraju. Ove kompozicije mogu, takođe, opciono da sadrže sredstva za poboljšanje opaciteta i mogu da budu takve da oslobađaju samo aktivne sastojke, ili preferirano, u nekom delu gastrointestinalnog trakta, opciono, na odgođeni način. Primeri za ugradne kompozicije, koje takođe mogu da se koriste, uključuje polimerne supstancije i voskove. Aktivni sastojak može takođe da bude u mikroenkapsulovanoj formi, ako je prikladno, sa jednim ili više od malopre pomenutih ekscipijenata.

[0298] Tečne dozne forme za oralno administriranje uključuju farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Osim dodavanja aktivnog sastojka, pomenute tečne dozne forme mogu da sadrže inertne razređivače koji se obično koriste u stanju tehnike, poput, na primer, vode ili drugih rastvarača, agenasa za solubilizovanje i agenasa za emulziju, poput etil alkohola, izopropil alkohola, etil karbonata, etil acetata, benzil alkohola, benzil benzoata, propilen glikola, 1,3-butilen glikola, raznih ulja (a naročito, ulja semena pamuka, oraha, kukuruza, klica, masline, ricinusovog ulja i susamovog ulja), glicerola, tetrahidrofuril alkohola, raznih polietilen glikola i masno-kiselinskih estera sorbitana, i njihovih smeša.

[0299] Osim inertnih razređivača, pomenute oralne kompozicije mogu, takođe, da uključuju dodatke poput agenasa za vlaženje, agenasa za emulziju i agenasa za suspendovanje, agenasa za zaslađivanje, za ukus, boju, miris i za konzerviranje.

[0300] Suspenzije, osim aktivnih jedinjenja, mogu da sadrže agense za suspendovanje, na primer, razne etoksilovane izostearilne alkohole, polioksietilen sorbitol i sorbitanske estere, mikrokristalnu celulozu, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar i tragakant, i njihove smeše.

[0301] Formulacije farmaceutskih kompozicija za rektalno ili vaginalno administriranje mogu da se pripreme u formu čepića, koji mogu da se pripreme uz pomoć mešanja imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptidnog konstrukta sa jednim ili više prikladnih ne-iritirajućih ekscipijenata ili nosioca koji sadrže, na primer, kakao-maslac, polietilen glikol, vosak za čepiće ili salicilat, i koji su čvrsti na sobnoj temperaturi, ali tečni na temperaturi tela pa će se, prema tome, stopiti u rektumu ili vaginalnoj šupljini i osloboditi aktivno jedinjenje.

[0302] Formulacije koje su prikladne za vaginalno administriranje takođe uključuju pesare, tampone, kreme, gelove, paste, pene ili sprejove čije formulacije sadrže nosioce za koje se zna da su prikladni.

[0303] Dozne forme za topikalno ili transdermalno administriranje nekog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptidnog konstrukta uključuju razne prahove, sprejove, masti, paste, kreme, losione, gelove, rastvore, nalepnice i inhalante. Aktivno jedinjenje može da bude pomešano, u sterilnim uslovima, sa nekim farmaceutski-prihvatljivim nosiocem, i sa bilo kojim konzervansom, puferom, ili propelantom koji je neophodan.

[0304] Pomenute masti, paste, kreme i gelovi mogu da sadrže ekscipijente, poput životinjskih i biljnih masti, ulja, voskove, parafine, skrob, tragakant, celulozne derivate, polietilen glikole, silikone, bentonite, silicijumovu kiselinu, talk i cink oksid, ili njihove smeše.

[0305] Prahovi i sprejovi mogu da sadrže ekscipijente poput laktoze, talka, silicijumove kiseline, aluminijum hidroksida, raznih kalcijum silikata i poliamidni prah, ili smeše pomenutih supstancija. Sprejovi mogu dodatno da sadrže prikladne propelante, poput hlorofluorohidrokarbone i isparljive ne-supstituisane hidrokarbone, poput butana i propana.

[0306] Transdermalne nalepnice imaju dodatnu prednost jer obezbeđuju kontrolisanu dostavu pomenutog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptidnog konstrukta u telu. Takve dozne forme mogu da se pripreme uz pomoć rastvaranja ili dispergovanja pomenutih jedinjenja u odgovarajućem medijum. Pojačivači apsorpcije mogu, takođe, da se koriste sa ciljem da se poveća unos samog jedinjenja kroz kožu. Stopa takvog unosa može da se kontroliše obezbeđivanjem membrane za kontrolisanje ili dispergovanjem samog jedinjenja u polimeroj matrici ili gelu.

[0307] Oftalmičke formulacije, masi za oči, razni prahovi, rastvori i slično, su takođe predviđeni sa ovim pronalaskom.

[0308] Farmaceutske kompozicije koje su prikladne za parenteralno administriranje sadrže jedan ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena ili polipeptidnih konstrukata u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski-prihvatljivih sterilnih izotoničnih vodenih ili ne-vodenih rastvora, disperzija, suspenzija ili emulzija, ili sterilnih prahova koji mogu da se obnove u sterilnim rastvorima ili disperzijama za injektiranje neposredno pre upotrebe, pri čemu pomenuti mogu da sadrže šećere, alkohole, antioksidanse, pufere, bakteriostate, rastvorke koji čine formulaciju izotoničnom sa krvi primatelja ili agense za suspendovanje ili ugušćivanje.

[0309] Primeri prikladnih vodenih i ne-vodenih nosioca, koji mogu da se koriste u pomenutim farmaceutskim kompozicijama uključuje vodu, etanol, poliole (poput glicerola, propilen glikola, polietilen glikola, i slično), i njihove prikladne smeše, biljna ulja, poput maslinovog ulja, i organskih estera koji mogu da se injektiraju, poput etil oleata. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom materijala za omatanje, poput lecitina, uz pomoć održavanja željene veličine čestica u slučaju disperzija, i uz pomoć upotrebe surfaktanata.

[0310] Ove kompozicije mogu, takođe, da sadrže dodatke poput konzervanasa, agenasa za vlaženje, agenasa za emulziju i agenasa za dispergovanje. Prevencija od delovanja mikroorganizama na predmetna jedinjenja može da se osigura ugrađivanjem raznih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, paraben, hlorobutanol, fenol sorbinska kiselina, i slično. Takođe može da bude poželjno da se u kompozicije dodaju i izotonični agensi, poput šećera, natrijum hlorida, i slično. Osim toga, produžena apsorpcija injektabilne farmaceutske forme može da se ostvari dodavanjem agenasa koji usporavaju apsorpciju poput aluminijum monostearata i želatina.

[0311] U nekim slučajevima, sa ciljem da se produži efekt leka, je poželjno da se uspori njegova apsorpcija iz supkutane ili intramišićne injekcije. Ovo može da se postigne upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala koji je slabo rastvorljiv u vodi. Stopa apsorpcija leka tada zavisi o njegovoj stopi rastvaranja, koja pak može da zavisi o veličini kristala i o kristalnoj formi. Alternativno, odgođena apsorpcija parenteralno-administrirane lekovite forme može da se postigne rastvaranjem ili suspendovanjem leka u nekom uljanom prenosniku.

[0312] Depot-forme koje mogu da se injektiraju se pripremaju formiranjem mikroenkapsuliranih matrica predmetnih jedinjenja u bio-raspadljivim polimerima poput polilaktidpoliglikolida. U zavisnosti o omeru leka naspram polimera, i prirodi korišćenog polimera, stopa oslobađanja leka može da se kontroliše. Primeri za druge bio-raspadljive polimere uključuju poli(ortoestere) i poli-(anhidride). Depot-formulacije koje mogu da se injektiraju su takođe moguće uz pomoć zarobljavanja leka u liposome ili mikroemulzije, koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.

[0313] Polipeptid, molekul nukleinske kiseline, vektor ili ćelija domaćin iz pronalaska mogu biti obezbeđeni kao deo kompleta koji sadrže polipeptid iz pronalaska, molekul nukleinske kiseline iz pronalaska, vektor iz pronalaska, ili ćeliju-domaćina iz ovoga pronalaska. Pomenuti komplet hemikalija može da sadrži jednu ili više bočica koje sadrže pomenuti vezni molekul i instrukcije za upotrebu. Pomenuti komplet hemikalija takođe može da sadrži pomagala za administriranje pomenutog veznog molekula iz ovoga pronalaska poput šprica, pumpe, infuzera i slično.

[0314] Ovaj pronalazak će sada biti dodatno opisan uz pomoć sledećih ne-ograničavajućih preferiranih aspekata, primera i slika.

PRIMERI

Primer 1: Materijali i postupci

1.1 TCR αβ/CD3 transfektovane ćelijske-linije

[0315] Generisane su tranzientne i stabilne ćelijske-linije CHO-K1 (ATCC: CCL-61), HEK293H (Life Technologies 11631-017), Llana (fibroblasti iz pupčane vrpce lama) sa rekombinantnom prekomernom ekspresijom svih 6 lanaca potpuno ljudskih kompleksa receptora T-ćelija. Za potrebe toga, kodirajuće sekvence TCR-alfa (α) i TCR-beta (β) lanaca su klonirane u vektoru izvedenom iz pcDNA3.1, nizvodno od CMV-promotora, a sekvenca 2A-sličnog viralnog peptida je ugrađena između oba lanaca sa ciljem indukovanja ribosomskog preskakanja tokom translacije poli-belančevina. U istom vektoru, nizvodno od dodatnog CMV-promotora su klonirane kodirajuće sekvence epsilon-, delta-, gama- i zeta-lanaca CD3-kompleksa, takođe uz korišćenje sekvenca 2A-sličnog viralnog peptida između odgovarajućih lanaca. Osim toga, stabilan HEK293H-klon sa rekombinantnom prekomernom ekspresijom 4 lanaca ljudskog CD3 je generisan kao šta je opisano iznad uz korišćenje pojedinačnog genskog vektora.

[0316] Korišćene sekvence za ljudski CD3 i ljudski TCR-α/β konstantni domen su dobivene iz UniProtKB (CD3-delta: P04234, CD3-gama: P09693, CD3-epsilon: P07766, CD3-zeta: P20963, TCR-a: P01848 i TCR-β: P01850; SEQ ID Br.: 344 do 349). Pomenute sekvence iz ljudskih TCR-α/β varijabilnih domena su dobivene iz kristalne strukture sekvenca (PDB-kodovi: 2IAN, 2XN9 i 3TOE) (ljudski TCR-α varijabilni domeni su dobiveni iz 2IAN, 2XN9 i 3TOE sa SEQ ID BR.: 393 do 395; ljudski TCR-β varijabilni domeni su dobiveni iz 2IAN, 2XN9 i 3TOE sa SEQ ID Br.: 476 do 478).

[0317] Ekspresija na površini ćelija kompleksa ljudskog receptora T-ćelija je potvrđena primenom protočne citometrije uz korišćenje funkcionalnog mišjeg IgG2b antitela protiv ljudskog TCR-α/β, klon BW242/412 (Miltenyi 130-098-219) i funkcionalnog mišjeg IgG2a PE-označenog antitela protiv CD3, klon OKT-3 (eBioscience 12-0037) (Slika 1).

1.2 Rastvorljive rekombinantne TCR-α/β belančevine

[0318] Rastvorljive ljudske TCR-α/β belančevine i TCR-α/β belančevine iz makaki rakojeda su generisane in house. Sekvence za ekstraćelijski deo konstantnog domena iz ljudskih TCR-α/β su izvedene iz UniProtKB (TCR-a: P01848 i TCR-β: P01850; SEQ ID Br.: 479 i 480). Varijabilni domeni iz ljudskog TCR-α/β su dobiveni iz kristalne strukture sekvenca (PDB kod: 2XN9, SEQ ID Br.: 394 i 477 za α- i β-lanac).

[0319] Sekvence za ekstraćelijski deo konstantnih domena TCR-α/β iz makaki rakojeda su dobivene iz GenBank-datoteke EHH63463 i AEA41868 (SEQ ID Br.: 396 i 397). Sekvence za varijabilne domene TCR-α/β iz makaki rakojeda su dobivene iz AEA41865 i AEA41866 (SEQ ID Br.: 398 i 399, za α- i β-lanac).

[0320] Ekstraćelijski domeni ljudskog TCR-α/β (2XN9) ili TCR-α/β iz makaki rakojeda su fuzionisani na kodirajuću sekvencu zipper-belančevine (O'Shea et al.1993 Curr. Biol. 3(10): 658-667), proizvedeni u CHOK1SV-ćelijama (Lonza) uz primenu GS Gene Expression System™ (Lonza), a tada su prečišćeni.

[0321] Kvalitet fuzije TCR-α/β zipper-belančevine je procenjen primenom ogleda ELISA-vezanja. Maxisorp ELISA-pločice sa 96-komorica (Nunc) su prekrivene sa 2 µg/mL rastvorljive rekombinantne fuzione ljudske TCR-α/β (2XN9)-zipper belančevine ili rastvorljive rekombinantne TCR-α/β-zipper belančevine iz makaki rakojeda. Nakon prekonoćne inkubacije, pločice su isprane i blokirane sa PBS 1% kazaina tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Sledeće, pločice su inkubirane sa serijski razblaženim funkcionalnim nanotelom označenim sa priveskom ili sa funkcionalnim mišjim IgG antitelom protiv ne-ljudskog (primat/pacov) TCR-α/β, klon R73 (eBioscience 16-5960) tokom 1 h na sobnoj temperaturi uz potresanje, isprane ponovo i inkubirane sa mišjim antitelom protiv flag-HRP (Sigma, #A8592) odnosno sa zečjim antitelom protiv mišjeg-HRP (Dako, # P0260). Nakon 1 h je dodan TMB One rastvor (Promega #G7431). Reakcija je zaustavljena uz pomoć 2 M H2SO4, a doznozavisno vezanje je određeno merenjem OD kod 450 nm uz primenu Tecan sunrise 4 (Slika 2).

Primer 2: Imunizovanje lama sa TCR/CD3, kloniranje repertoara fragmenata antitela koji sadrže samo teški lanac i priprema faga

2.1 Imunizovanje

[0322] Predviđeno je bilo da se u kamili (na primer, lama (Lama glama) i alpaka (Vicugna pacos)) generišu antitela, koja sadrže samo teški lanac, protiv konstantnih lanaca α i/ili β iz receptora T-ćelija (TCR). Mada se nativni kompleks receptora T-ćelija sastoji od oba CD3 (gama, delta, epsilon i zeta) lanaca, kao i TCR α- i β-lanaca, pretpostavili smo da će odsutnost CD3-lanaca olakšati prepoznavanje pomenutih konstantnih domena TCR. Posebno zbog toga šta CD3-lanci lateralno okružuju, i limitiraju pristup pomenutim konstantnim domenima TCR α- i β-lanaca. Suprotno našem iskustvu sa drugim metama, dobivanje imuno-odgovora protiv TCR α- ili β-lanaca nije bilo jednostavno kao šta se očekivalo.

[0323] U finalnom pristupu, nakon odobrenja Etičkog komiteta (CRIA, LA1400575, Belgija-EC2012#1), pronalazači su pokrenuli kompleksni protokol imunizovanja uz pomoć DNA koja kodira kompleks T-ćelija. Ukratko, 3 dodatne lame su bile imunizovane sa plazmidnim vektorom (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) pVAX1 koji sadrži ljudski TCR(2IAN)/CD3 (opisano u Primeru 1.2) i sa plazmidnim vektorom (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) pVAX1 koji sadrži ljudski TCR(2XN9)/CD3 (opisano u Primeru 1.2) u skladu sa standardnim protokolima. Dve lame su primile dodatno još jednu supkutanu injekciju primarnih ljudskih T-ćelija. Ljudske T-ćelije su sakupljene iz trombocitno-leukocitnog međusloja (buffy coat blood), dobivenih iz zdravih volontera (Blood bank Gent) uz korišćenje RosetteSep (StemCell Technologies, #15061) nakon čega je usledilo obogaćenje na Ficoll-Paque™ PLUS (GE Healthcare #17-1440-03) u skladu sa instrukcijama proizvođača i sve je spremljeno u tečnom azotu. Nakon rastapanja, ćelije su isprane, i re-suspendovane u D-PBS od Gibco pa su držane na ledu pre injekcije.

2.2 Kloniranje repertoara fragmenata antitela samo sa teškim lancem i priprema faga

[0324] Po životinji, primerci krvi su skupljeni nakon injektiranja jednog tipa antigena za imunizovanje. Iz ovih krvnih primeraka su pripremljeni PBMC uz korišćenje Ficoll-Hypaque u skladu sa instrukcijama proizvođača (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SAD). Za svaku imunizovanu lamu su pripremljene biblioteke uz pomoć sakupljanja ukupne RNA izolovane iz primeraka koji su poticali iz određene podgrupe protokola za imunizovanje, tj. nakon primene jednog tip antigena za imunizovanje.

[0325] Ukratko, PCR-amplifikovani VHHrepertoar je kloniran preko specifičnih restrikcionih mesta u vektor koji je dizajniran da olakša izlaganje faga iz VHH-biblioteke. Ovaj vektor je dobiven iz pUC119. U istom okviru čitanja sa VHH-kodirajućom sekvencom, vektor kodira C-terminalni 3xFLAG i His6-privesak. Fagi su pripremljeni u skladu sa standardnim protokolima (vidi, na primer, dokumente WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858 i ranije stanje tehnike i aplikacije podnete od Ablynx N.V. koje su ovde citirane).

Primer 3: Selekcija TCR/CD3-specifičnih VHH preko izlaganja faga

[0326] Veliki deo izabranih VHHje bio usmeren protiv varijabilnih regiona TCR-α ili TCR-β lanca. Prema tome, ovi pronalazači su morali da razvijenu različite strategije selekcije i kontraselekcije.

[0327] Ukratko, VHH-repertoari koji su dobiveni iz svih lama i klonirani kao fag-biblioteka su bili korišćeni u različitim strategijama za selekciju, uz primenu mnoštva selekcionih uslova. Selekcije koje koriste ćelijske-linije transfektovane sa ljudskim TCR/CD3 sa istim varijabilnim domenom kao šta je korišćeno tokom imunizovanja su rezultovale samo u veznike varijabilnog domena. Prema tome, alati koji sadrže različiti varijabilni TCRα/β domen (transfektovane ćelije (opisano u Primeru 1.1), rastvorljivu belančevinu (opisano u Primer 1.2), ili ljudske primarne T-ćelije (izolovane kao šta je opisano u Primeru 2.1)) su korišćeni tokom selekcija pri čemu se pokazalo da su kritične za identifikovanje veznika konstantnog domena. Dodatne varijable tokom selekcija uključuju postupak prezentovanja antigena (u rastvoru kada se koriste ćelije ili prekrivene pločice kada se koriste belančevine), koncentraciju antigena, korišćeni ortolog (ljudska ili rekombinantna TCR-α/β belančevina iz makaki rakojeda), i broj selekcionih rundi. Sve selekcije čvrsto-prekrivene faze su provedene u pločicama Maxisorp sa 96-komorica (Nunc, Wiesbaden, Nemačka).

[0328] Selekcije su provedene kako sledi: preparati TCRα/β-CD3-antigena sa selekcionim formatima na čvrstoj i rastvorenoj fazi su pripremljeni kao šta je opisano iznad uz korišćenje višestrukih koncentracija. Nakon inkubacije tokom 2 h sa fag-bibliotekama, nakon intenzivnog ispiranja, vezani fagi su eluirani sa tripsinom (1 mg/mL) tokom 15 min. Aktivnost tripsinske proteaze je odmah neutralizovana uz pomoć dodavanja 0.8 mM inhibitora proteaze (ABSF). Kao kontrola, paralelno su provedene selekcije bez antigena.

[0329] Fag-ishodi su korišćeni da se inficira E. coli za analizu individualnih VHH-klonova. Periplazmatski ekstrakti su pripremljeni u skladu sa standardnim protokolima (vidi, na primer, dokumente WO 03/035694, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 i ranije stanje tehnike i aplikacije podnete od Ablynx N.V. koje su ovde citirane).

Primer 4: Pretraga, analiza sekvenca i prečišćavanje

4.1 Pretraga za nanotelima koja vežu TCR/CD3 primenom ogleda protočne citometrije [0330] Periplazmatski ekstrakti su pretraženi sa ciljem lociranja ćelija na kojima je ostvareno vazanje na TCR/CD3 uz korišćenje ljudskih CHO-K1- ili HEK293H-ćelija transfektovanih sa TCR/CD3 i odgovarajućih CHO-K1- ili HEK293H-referentnih ćelijskih linija u mešanom ogledu sa ćelijskim linijama. Do tada je velika šarža referentnih ćelijskih linija bilo označeno sa 8 µM PKH26 i smrznuto. 5x10<4>PKH-označenih referentnih ćelija je pomešano sa 5x10<4>ciljanih ćelija i sve je inkubirano sa periplazmatskim ekstraktima tokom 30 min na 4° C, a tada su ćelije isprane 3 puta. Sledeće, ćelije su inkubirane sa 1 µg/ml monoklonskog antitela ANTI-FLAG<®>M2 (Sigma-Aldrich, kat.# F1804) tokom 30 min na 4° C, ponovo isprane, a tada su inkubirane tokom 30 min na 4° C sa kozjim anti-mišjim APC-označenim antitelom (Jackson Immunoresearch 115-135-164, 1:100). Primerci su isprani, re-suspendovani u FACS-puferu (D-PBS od Gibco, sa 10% FBS od Sigma i 0.05% natrijum azidom od Merck), a tada su analizirani uz pomoć BD FACSArray. Prvo je izabrana P1-populacija koja predstavlja više od 80% od totalne ćelijske populacije na bazi FSC-SSC-distribucije. U ovom pokušaju je prebrojano 20000 ćelija tokom akvizicije. Na bazi PKH26-SSC-distribucije je izabrana PKH-označena parentalna populacija i ljudska TCR/CD3-neoznačena ciljana populacija. Za ove dve populacije je izračunata srednja APC-vrednost.

4.2 Pretraga za nanotelima koja vežu TCR/CD3 primenom ogleda aktivisanja ljudskih T-ćelija

[0331] Nakon nekoliko pokušaja se pokazalo da aktivisanje prečišćenih ljudskih T-ćelija uz pomoć antitela ili nanotela u skladu sa standardnim protokolima, tj. prekrivena pločica sa 96-komorica, nije bilo dovoljno osetljivo (podaci nosu prikazani).

[0332] Sa ciljem da se proceni aktivnost, razvijen je drugačiji ogled na bazi aktivisanja T-ćelija koje su bile povezane sa kuglicama. Ukratko, kozji anti-mišji IgG-dynabeads (Life Technologies #11033) su prekriveni sa mišjim anti-flag IgG-antitelom (Sigma F1804), (15 µg/1E7 kuglica). Nakon perioda inkubacije od 2 h na 4° C, kuglice su isprane i inkubirane sa 80 µl periplazmatskog ekstrakta tokom 20 min na 4° C uz potresanje. Nanotela koja se nisu vezala su isprana pre dodavanja kompleksa sa kuglicama zajedno sa rastvorljivim mišjim antitelom protiv CD28 (Pelicluster CD28 – Sanquin #M1650) u prečišćene primarne ljudske T-ćelije (izolovane kao šta je opisano u Primeru 2.1). Kao kontrola su korišćene n-stimulisane ljudske T-ćelije. Ukratko, kozji anti-mišji IgG-dynabeads spojeni na mišji anti-flag IgG su inkubirani u 80 µl periplazmatskog ekstrakta koji je sadržavao irelevantna nanotela. Nakon odstranjivanja ne-vezanih nanotela tokom koraka ispiranja, prečišćenim primarnim ljudskim T-ćelijama je dodan kompleks irelevantno nanotelo-kuglica.

[0333] Nakon inkubacije tokom 24 h na 37° C uz 5% CO2, status aktivisanja ljudskih T-ćelija je određen merenjem nivoa ekspresije CD69 primenom protočne citometrije uz korišćenje monoklonskog mišjeg antitela protiv ljudskog CD69PE (BD Biosciences # 557050).

4.3 Analiza sekvenca dobivenih nanotela

[0334] Nanotela koja su izabrana u ogledu vezanja tokom protočne citometrije i ogledu aktivisanja T-ćelija su sekvencionirana.

[0335] Analiza sekvenca je pokazala da ISV-i protiv TCR sadrže veoma sličan CDR3. Naročito, pomenuti CDR3 sadrži amino-kiselinsku sekvencu X1SR X2X3PYX4Y, u kojoj X1je F, Y, G, L ili K, X2je I ili L, X3je Y ili W, a X4je D, N ili S.

[0336] Dodatna analiza sekvenca je omogućila identifikovanje tri različita klastera. Ovde su prikazana odgovarajuća poravnanja (Tabela A-1, Tabela A-2, Tabela A-3). Klasteriranje je bazirano na sličnosti i razlici sekvenca CDR2 i CDR3. Klaster A je najistaknutiji i sadrži 104 klonova (SEQ ID Br.: 1-104), klaster B sadrži 11 klonova (SEQ ID Br.: 105-115), a klaster C je predstavljen sa samo 3 klona (SEQ ID Br.: 116-118).

[0337] Različitim klasterima je određena varijabilnost sekvenca CDR. Za klaster A, aminokiselinska sekvenca CDR-a klona 56G05 je korišćena kao referenca sa kojom su upoređeni svi CDR-i iz svih drugih klonova iz klastera A. Varijabilnost sekvence u odnosu na 56G05 je prikazana u tabelama ispod.

[0338] Za klaster B, amino-kiselinska sekvenca CDR-a klona 55C07 je korišćena kao referenca sa kojom su upoređeni CDR-i svih klonova iz klastera B. Varijabilnost sekvenca u odnosu na 55C07 je prikazana tabelama ispod.

[0339] Za klaster C, amino-kiselinska sekvenca CDR-a iz klona 61G01 je korišćena kao referenca sa kojom su upoređeni CDR-i svih drugih klonova iz klastera C. Varijabilnost sekvenca u odnosu na 61G01 je prikazana u tabelama ispod.

[0340] Klasteriranje na bazi sekvenca otkrilo je funkcionalne razlike (vidi infra).

4.4 Prečišćavanje monovalentnih nanotela

[0341] Reprezentativna nanotela za svaki klaster su izabrana i eksprimirana u E. coli TG1 kao belančevine sa trostrukim Flag i His6-priveskom. Ekspresija je indukovana dodavanjem 1 mM IPTG i ostavljanjem da deluje tokom 4 h na 37° C. Nakon obaranja ćelija u talog, pripremljeni su periplazmatski ekstrakti uz pomoć smrzavanja-rastapanja peleta. Ovi ekstrakti su korišćeni kao početni materijal, a nanotela su prečišćena uz pomoć IMAC i hromatografije isključivanja veličina (size exclusion chromatography, SEC).

[0342] Nanotela su prečišćena do 95% čistoće kao šta je procenjeno sa SDS-STR. (podaci nisu prikazani).

Primer 5: Vezanje nanotela protiv TCR na ljudski TCR/CD3 koji je eksprimiram na površinama CHO-K1-ćelija i protiv prečišćenih primarnih ljudskih T-ćelija

[0343] Vezanje prečišćenih monovalentnih nanotela protiv TCR na ljudski TCR(2XN9)/CD3 eksprimiran na CHO-K1-ćelijama i na prečišćene primarne ljudske T-ćelije je procenjeno primenom protočne citometrije kao šta je opisano u Primeru 4.1. U ćelije su dodane serije razblaženih nanotela, 55A02 (klaster A), 56G05 (klaster A), 68G05 (klaster B) i 61G01 (klaster C), započinjući sa 1 µM.

[0344] Rezultati su prikazani na Slici 3.

[0345] Nanotela se jasno vežu na ljudski TCR/CD3 eksprimiran na CHO-K1-ćelijama. Predstavnici klastera A su pokazali najbolji afinitet, nakon čega su bili predstavnici klastera B i predstavnici klastera C. Nanotela vezana na prečišćene primarne ljudske T-ćelije, mada uz nešto manji potencijal u odnosu na ljudski TCR(2XN9)/CD3 iz CHO-K1-ćelija. Predstavnici klastera A su pokazali najbolji afinitet za vezanje ljudskih primarnih T-ćelija, što se poklapa sa podacima sa CHO-K1 (2XN9)/CD3. EC50-vrednosti koje su dobivene iz krivulja doznihodgovora su predstavljeni u Tabeli C-1.

Tabela C-1: EC50 (M) monovalentnih nanotela protiv TCR za vezanje CHO-K1-ćelija koje eksprimiraju ljudski TCR(2XN9)/CD3 i za vezanje prečišćenih primarnih T-ćelija kao šta je određeno primenom protočne citometrije.

Primer 6: Određivanje veznog epitopa

[0346] Vezanje prečišćenih monovalentnih nanotela protiv TCR na ljudski TCR(2IAN)/CD3 eksprimiran na HEK293H-ćelijama je procenjeno i u odnosu na vezanje na HEK293H-ćelije transfektovane sa ljudskim CD3 primenom protočne citometrije, kao šta je opisano u Primeru 5. Serije razblaženih nanotela protiv TCR, započinjući sa 1 µM, su dodane u ćelije. Parentalna HEK293H ćelijska linija je imala ulogu TCR/CD3 negativne ćelijske linije.

[0347] Rezultati su prikazani na Slici 4.

[0348] Nanotela su se vidljivo vezala na ljudski TCR(2IAN)/CD3 eksprimiran na HEK293H, ali ne i na HEK293H-ćelije koje su bile transfektovane samo sa ljudskim CD3, niti na HEK293H parentalnu ćelijsku liniju. EC50-vrednosti dobivene na osnovu kriulja doznog odgovora su prikazane u Tabeli C-2.

Tabela C-2: EC50 (M) monovalentnih nanotela protiv TCR za vezanje ljudskog TCR(2IAN)/CD3 ili ljudskog CD3 eksprimiranog na HEK293H-ćelijama, kao šta je određeno primenom protočne citometrije.

[0349] Zaključno, klonovi su se specifično vezali na ljudski TCR-α/β. Vezanje nije bilo primećeno kod ljudskog CD3.

Primer 7: Vezanje nanotela protiv TCR na rastvorljivu rekombinantnu ljudsku TCR-α/β-belančevinu

7.1 Vezanje nanotela protiv TCR na belančevinu ljudskog receptora T-ćelija primenom ELISA

[0350] Vezanje prečišćenih monovalentnih TCR nanotela na rastvorljivu rekombinantnu ljudsku belančevinu TCR-α/β je procenjeno primenom ELISA (kao šta je opisano u Primeru 1.2) uz korišćenje 2 µg/ml direktno prekrivene rastvorljive rekombinantne ljudske belančevine TCR-α/β.

[0351] Rezultati su prikazani na Slici 5. EC50-vrednosti dobivene iz krivulja doznog odgovora su prikazane u Tabeli C-3.

Tabela C-3: EC50 (M) monovalentnih nanotela protiv TCR za vezanje rastvorljive rekombinantne ljudske belančevine TCR(2XN9), kao šta je određeni primenom ELISA.

[0352] Zaključno, reprezentativni klonovi iz svih klastera vežu rastvorljivu rekombinantnu ljudsku belančevinu TCR-α/β.

7.2 Vezanje nanotela protiv TCR na ljudsku belančevinu receptora T-ćelija primenom BLI

[0353] Vezni afiniteti su izmereni primenom Bio-Layer Interferometry (BLI) na instrumentu Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Rekombinantna ljudska rastvorljiva TCR(2XN9)-zipperbelančevina je kovalentno imobilizirana na amin-reaktivne senzore (ForteBio) uz pomoć NHS/EDC-spajanja (hemijski). Za potrebe kinetičke analize senzori su prvo uronjeni u radni pufer (10 mM hepes, 150 mM NaCl, 0.05% p20, pH 7.4 od GE Healthcare Life Sciences) sa ciljem da se postavi osnovno podešavanje. Nakon toga senzori su uronjeni u komorice koje su sadržavale prečišćena nanotela u različitim koncentracijama (raspon između 1.4 nM i 1 mM) za potrebe koraka asocijacije (180 s) pa su preneseni u komorice koje su sadržavale radni pufer za potrebe koraka disocijacije (15 min). Afinitetne konstante (KD) su izračunate primenom modela 1:1-interakcija uz korišćenje softvera ForteBio Data Analysis.

[0354] Rezultati su prikazani na Slici 6. Vezne karakteristike su prikazane u Tabeli C-4.

Tabela C-4: Kinetička analiza vezanja monovalentnog nanotela protiv TCR na rastvorljive rekombinantne ljudske belančevine TCR(2XN9) kao šta je određeno uz pomoć instrumenta Octet RED384.

[0355] Zaključno, vezni afinitet za predstavnike klastera A određen primenom BLI na ljudski rastvorljivi 2XN9 je pokazao korelaciju sa afinitetima određenim u CHO-K1(2XN9)/CD3-ćelijama primenom protočne citometrije (Primer 5).

Primer 8: Određivanje kapaciteta aktivisanja prečišćenih primarnih ljudskih T-ćelija

[0356] Funkcionalnost prečišćenih monovalentnih nanotela protiv TCR je procenjena primenom ogleda aktivisanja ljudskih T-ćelija. Kozji anti-mišji IgG-dynabeads (Life Technologies #11033) su prekriveni sa mišjim anti-Flag IgG-antitelima (Sigma F1804), (15 µg/1E<7>kuglica). Nakon perioda inkubacije od 2 h na 4° C, kuglice su isprane i inkubirane sa fiksnom (1 µg) količinom prečišćenog Flag-označenog nanotela tokom 20 min na 4° C uz potresanje. Ne-vezana nanotela su isprana pre dodavanja kompleksa kuglica, zajedno sa rastvorljivim mišjim antitelom protiv CD28 (Pelicluster CD28 – Sanquin #M1650), prečišćenim primarnim ljudskim T-ćelijama izolovanih (izolovane kao šta je opisano u Primeru 2.1) iz različitih zdravih donora.

[0357] Osim toga, efekt vezanja monovalentnih nanotela na TCR je procenjen uz pomoć inkubacije pomenutih nanotela sa prečišćenim primarnim ljudskim T-ćelijama bez prethodnog zarobljavanja na anti-mišje IgG-dynabeads, u prisutnosti antitela protiv CD28.

[0358] Status aktivisanja prečišćenih primarnih ljudskih T-ćelija je praćen uz pomoć merenja ekspresije CD69 uz pomoć protočne citometrije uz korišćenje monoklonskih mišjih antitela protiv ljudskog CD69PE (BD Biosciences # 557050) nakon inkubacije od 24 h na 37° C uz 5% CO2, kao šta je opisano u Primeru 4.2.

[0359] Zaključno, nanotela protiv TCR iz svih klastera su pokazala jasnu pozitivnu regulaciju CD69 nakon zarobljavanja na anti-mišje IgG-dynabeads. Irelevantno nanotelo nije pokazalo ikakvu pozitivnu regulaciju CD69 (Slika 7A). Osim toga, niti jedno od nanotela predstavljenih u rastvoru nije bilo sposobno da aktiviše prečišćene primarne ljudske T-ćelije kao šta je izmereno uz pomoć povećane ekspresije CD69 (Slika 7B).

Primer 9: Vezanje multispecifičnih polipeptida, koji vežu TCR, na kompleks receptora ljudskih T-ćelija eksprimiran na površini ćelija

[0360] Sa ciljem da se pokaže da je preusmeravanje angažiranih T-ćelija prema tumorskim ćelijama ostvariv uz pomoć pomenutih nanotela, CD20-antigen je izabran kao primer za tumorsku metu.

[0361] Različiti građevni blokovi (tj. nanotela) koji vežu TCR su formatirani u jedan multispecifični konstrukt zajedno sa nanotelom koje cilja ljudski CD20 (vidi Tabelu C-5). Efektorska i tumorska nanotela su genetički spojena sa 35GS-linkerom i naknadno eksprimirana u kvascu iz roda Pichia u skladu sa standardnim protokolima (multispecifični polipeptidi).

[0362] Irelevantni konstrukti su generisani zamenom efektorskog ili tumorskog nanotela sa irelevantnim nanotelom protiv lizozima iz jaja (cAblys) (Tabela C-5).

Tabela C-5: Oznaka primerka i opis multispecifičnih konstrukata.

[0363] Vezanje multispecifičnih konstrukata na ljudski TCR/CD3 eksprimiran na CHO-K1-ćelijama, na prečišćene primarne ljudske T-ćelije i na CD20-pozitivne Ramos-ove ćelije (ATCC: CRL-1596) je procenjeno primenom protočne citometrije kao šta je opisano u Primeru 5. Rezultati su prikazani na Slici 8.

[0364] EC50-vrednosti dobivene iz krivulja doznog odgovora su prikazane u Tabeli C-6.

[0365] Podaci pokazuju slično vezanje TCRxCD20-multispecifičnih polipeptida u odnosu na njihove monovalentne verzije. Međutim, otkriveno je smanjeno vezanje CD20xTCR-multispecifičnih polipeptida na CHO-K1-ćelije sa ljudskim TCR(2XN9)/CD3 i na prečišćene primarne ljudske T-ćelije u odnosu na njihove monovalentne verzije. Kod Ramos-ovih ćelijskih linija pozitivnih na ljudski CD20, pomenuti multispecifični polipeptid sa CD20 na svojem C-terminusu je pokazao smanjeno vezanje ako se uporedi sa polipeptidima sa CD20 na njihovom N-terminusu.

Primer 10: Funkcionalno karakterizovanje multispecifičnih polipeptida koji vežu CD20xTCR primenom protočne citometrije na bazi ogleda ubijanja

[0366] Sa ciljem da se proceni da li su multispecifični polipeptidi sposobni da ubiju tumorske ćelije, ogledi citotoksičnosti su provedeni sa izolovanim ljudskim T-ćelijama u funkciji efektorskih ćelija.

[0367] Ljudske T-ćelije su izolovane kao šta je opisano u Primeru 2.1. Kvalitet i čistoća prečišćenih ljudskih T-ćelija je proverena uz pomoć fluorescentno označenog antitela protiv CD3 (eBioscience # 12-0037-73), protiv CD8 (BD Biosciences #345775), protiv CD4 (BD Biosciences #345771), protiv CD45RO (BD Biosciences #555493), protiv CD45RA (BD Biosciences # 550855), protiv CD19 (BD Biosciences #555413), protiv CD25 (BD Pharmigen #557138) i protiv CD69 (BD Pharmigen #557050) primenom ogleda protočne citometrije. Ramos-ove ćelije koje eksprimiraju ljudski CD20 i Raji-ćelije koje eksprimiraju ljudski CD20 (ECACC: 85011429) označene sa PKH-26-membranskom bojom kao šta je opisano iznad su korišćenje kao ćelije-mete. 2.5 x 10<5>efektora i 2.5 x 10<4>ćelija-meta je ko-inkubirano u pločicama sa V-dnom i 96-komorica u omeru efektor naspram meta – 10:1. Za merenje lize ćelija zavisne o koncentraciji u primerke su dodani serijski razblaženi multispecifični polipeptidi (Tabela C-5) i sve je inkubirano tokom 18 h u atmosferi 5% CO2na 37° C. Nakon inkubacije, ćelije su sakupljene centrifugovanjem pa su isprane sa FACS-puferom. Nakon toga, ćelije su ponovo suspendovane u FACS-puferu koji je bio obogaćen sa 5 nM TOPRO3 (Molecular Probes kat.# T3605) sa ciljem da se razlikuju žive od mrtvih ćelija. Ćelije su analizirane uz pomoć protočnog citometra FACS Array (BD Biosciences). Po primerku je korišćen ukupan volumen od 80 µl. Gating je bio podešen na PKH26-pozitivne ćelije, a unutar ove populacije su određivane TOPRO3-pozitivne ćelije.

[0368] Multispecifični polipeptidi koji vežu CD20xTCR su pokazali dozno-zavisno ubijanje Ramos-ovih ćelija (Slika 9A). T017000014 (klaster A, 20CD019C07-35GS-T0170028B01-FLAG3-HIS6) je pokazao dozno-zavisno ubijanje Ramos-ovih ćelija (Slika 9A) i Raji-ćelija (Slika 9B) koje potvrđuje da primećeni citotoksični efekt nije ograničen samo na pojedinačnu tumorsku ćelijsku liniju. Nivo ekspresije tumorskog antigena CD20 je bio određen za obe ćelijske linije (Slika 10).

[0369] IC50-vrednosti i procenat (%) lize dobiveni iz kriva doznog odgovora su prikazani u Tabeli C-7 (% liza = % mrtvih ćelija kod 500 nM nanotela minus % mrtvih ćelija u kontroli bez nanotela).

[0370] Ovi rezultati pokazuju da multispecifični polipeptidi protiv TCR mogu da indukuju ubijanje ciljanih tumorskih ćelijskih linija posredstvom T-ćelija. Kada su ciljno nanotelo ili efektorsko nanotelo bili zamenjeni sa nekim irelevantnim nanotelom, nije bio primećen efekt koji menja vijabilnost Ramos-ovih ćelija. Nije primećena jasna preferencija orijentacije između individualnih veznih blokova u pomenutom multispecifičnom polipeptidu.

Primer 11: Funkcionalno karakterizovanje multispecifičnih peptida koji vežu CD20xTCR primenom ogleda ubijanja na bazi xCELLigence

[0371] Multispecifični polipeptidi koji vežu TCR su takođe testirani da li potiču ćelijsku toksičnost u ljudskim adherentnim ciljnim ćelijama, koje su bile transfektovane sa CD20, u prisutnosti ljudskih efektorskih T-ćelija primenom tehnika na bazi električne impedancije u realnom vremenu. Ovde su merene fluktuacije impedancije indukovane prianjanjem ćelija na površinu elektrode. T-ćelije ne prianjaju (nisu adherentne) pa prema tome ne utiču na merenja impedancije.

[0372] Ukratko, xCELLigence-stanica je stavljena u inkubator na 37° C uz 5% CO2. 50 µl medijuma za ogled je dodano u svaku komoricu E-pločica sa 96-komorica (ACEA Biosciences; kat.#05 232 368 001), a slepo očitanje xCELLigence-sistema je provedeno sa ciljem merenja pozadinske impedancije u odsutnosti ćelija. Nakon toga, referentne CHO-K1- ili CHO-K1-ćelije transfektovane sa ljudskim CD20 (1 x 10<4>) su posejane u E-pločice sa 96-komorica, a tada je dodano po 50 µl serijski razblaženog multispecifičnog polipeptida. Nakon 30 min na ST je dodano 50 µl ljudskih T-ćelija po komorici (3 x 10<5>) kako bi se postigao omer efektor : meta = 30:1. Pločica je stavljena u xCELLigence-stanicu, a impedancija je merena svakih 15 min tokom 3 dana. Podaci su analizirani uz korišćenje fiksnih vremenskih tačaka navedenih u rezultatima.

[0373] IC50-vrednosti su prikazane u Tabeli C-8.

Tabela C-8: IC50 (M) multispecifičnih polipeptida u ogledu ubijanja CHO-K1-CD20-ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija na bazi xCELLigence uz korišćenje omera efektor :

meta = 30:1, analizirani 44 h nakon sejanja.

[0374] Pomenuti multispecifični polipeptidi su omogućili ubijanje zavisno o tumorskom antigenu. Pomenuti multispecifični polipeptidi nisu mogli da indukuju ubijanje CHO-K1-referentnih ćelija posredstvom T-ćelija, ali su indukovali dozno-zavisno ubijanje CHO-K1-ćelija transfektovanih sa ljudskim CD20 posredstvom T-ćelija. Jedan primer je prikazan na Slici 11.

[0375] Ovi rezultati potvrđuju nalaze dobivene u ogledu ubijanja na bazi protočne citometrije iz Primera 10. Osim toga, ubijanje posredovano T-ćelijama je primećeno samo kada je bio prisutan ciljani tumorski antigen, koje pokazuje da pomenuti multispecifični polipeptidi presudno zavise o njihovoj meti kako bi indukovali citotoksičnost.

Primer 12: Procena dužine linkera u multispecifičnim polipeptidima

[0376] Sa ciljem da se proceni uticaj dužine linkera korišćenog u multispecifičnim polipeptidima koji vežu CD20/TCR na citotoksični kapacitet, efektorski i tumorski građevni blokovi su genetički spojeni sa linkerom 5GS (SEQ ID Br.: 376), 9GS (SEQ ID Br.: 378) ili 35GS (SEQ ID Br.: 385), a nakon toga su eksprimirani u Pichia u skladu sa standardnim protokolima (vidi Tabelu C-9).

Tabela C-9: Oznaka primerka i opis multispecifičnog konstrukta sa ciljem procene uticaja dužine linkera.

[0377] Uticaj dužine linkera korišćenog u multispecifičnim polipeptidima koji vežu CD20/TCR na indukovanu ćelijsku toksičnost ljudskih primarnih efektorskih T-ćelija da se adheriraju na ciljane CHO-K1-ćelije transfektovane sa ljudskim CD20 je procenjen primenom tehnike na bazi električne impedancije u realnom vremenu kao šta je opisano u Primeru 11.

[0378] Rezultati su sažeto prikazani na Slici 12.

[0379] Svi multispecifični polipeptidi, tj. sve dužine linkera ostvaruju specifično ćelijsko ubijanje. Neočekivano, pomenuti multispecifični polipeptidi koji vežu TCR sa najdužim linkerom (35GS-linker) su pokazali najbolju potenciju. U svetlu ovih rezultata su provedeni dodatni eksperimenti sa multispecifičnim polipeptidima koji sadrže 35GS-linker.

Primer 13: Uticaj omera efektor : meta na efekt ubijanja sa multispecifičnim polipeptidima

[0380] Sa ciljem da se proceni efekt različitih omera efektor : meta (E : M) na ubojite karakteristike pomenutih polipeptida, multispecifični polipeptidi koji vežu CD20xTCR su inkubirani sa 2.5 x 10<4>Ramos-ovih ćelija označenih sa PKH u prisutnosti 2.5 x 10<5>(E : T = 10 : 1), 1.25 x 10<5>(E : T = 5 : 1), 5 x 10<4>(E : T = 2 : 1) i 2.5 x 10<4>(E : T = 1 : 1) ljudskih primarnih T-ćelija kao šta je opisano u Primeru 10.

[0381] Primeri rezultata su prikazani na Slici 13. IC50-vrednosti su prikazane u Tabeli C-10.

Tabela C-10: IC50 (M) multispecifičnih polipeptida u ogledu ubijanja Ramos-ovih ćelija posredstvom T-ćelija na bazi protočne citometrije uz korišćenje različitih omera efektor:meta.

[0382] Oba konstrukta su mogla da ubiju ćelije mete (sa ljudskim CD20) u različitim E:T-omerima, čak i u omeru 1:1, nakon inkubacije u trajanju od 18 h uz malu razliku u potenciji. Mada je postojao uticaj E:T-omera na procenat (%) lize, pomenuti se takođe može povezati sa periodom inkubacije (vidi ispod).

Primer 14: Vremenski-zavisna citolitička aktivnost multispecifičnih konstrukata koji vežu CD20/TCR u posredstvom prečišćenih primarnih ljudskih T-ćelija u ogledu na bazi xCELLigence

[0383] Sa ciljem da se proceni uticaj trajanja inkubacije na ubojite karakteristike multispecifičnih konstrukata koji vežu CD20xTCR, specifična liza ciljanih ćelija je bila izračunata kod različitih vremenskih tačaka primenom xCELLigence. Ukratko, xCELLigencestanica je bila postavljena u inkubator na 37° C uz 5% CO2.50 µl medijuma za ogled je dodano u svaku komoricu E-pločice sa 96-komorica (ACEA Biosciences; kat.#05232 368 001), a slepo očitanje xCELLigence-sistema je provedeno sa ciljem da se izmeri pozadinska impedancija u odsutnosti ćelija. Nakon toga, CHO-K1- ili CHO-K1-referentne ćelije (1 x 10<4>) transfektovane sa ljudskim CD20 su posejane u pomenute E-pločice sa 96-komorica. Nakon 20 h je dodano 3 x 10<5>prečišćenih primarnih ljudskih T-ćelija (opisano supra) i 100 nM ili 1.5 nM multispecifičnih konstrukata. Ćelijski indeks (CI) je meren svakih 15 min tokom 5 dana. Uz korišćenje normalizovanog CI (normalizovani ćelijski indeks – NCI je izračunat deljenjem vrednosti ćelijskog indeksa određene vremenske tačke sa vrednosti ćelijskog indeksa vremenske tačke kada su dodane prečišćene primarne ljudske T-ćelije), specifična liza u različitim vremenskim tačkama stanja sa konstruktima je izračunata u odnosu na stanje kada konstrukt nije bio prisutan. (% specifična liza = ((NCIbez konstrukta–NCIsa konstruktom)/NCIbez

konstrukta))x100.

[0384] Rezultati su prikazani na Slici 14.

[0385] Jedan sat nakon dodavanja ljudskih primarnih T-ćelija i multispecifičnog konstrukta može da se primeti porast ćelijske lize koje se jasno povećava nakon dodatne inkubacije. Maksimalni efekt je jasno zavio o trajanju inkubacije, ali dobivene IC50-vrednosti se ne menjaju povećavanjem trajanja inkubacije. Irelevantni konstrukt nije bio sposoban ubiti CHO-K1-ćelije transfektovane sa ljudskim CD20.

Primer 15: Istraživanje mogućnosti produženja polu-života (HLE)

[0386] Pretpostavljalo se da HLE preko vezanja albumina može da bude prikladno za udovoljavanje raznim zahtevima, uključujući (i) produženje polu-života (HLE) ostatka; i (ii) efikasnost multispecifičnog polipeptida. Preferirano, HLE-funkcija ne narušava penetraciju u tumore i tkiva.

[0387] Alb11 (SEQ ID Br.: 404), nanotelo koje veže albumin iz ljudskog seruma (human serum albumin, HSA), je spojeno sa multispecifičnim polipeptidima koji vežu CD20xTCR sa ciljem da se poveća in vivo polu-život formatiranih molekula (WO 06/122787). Generisano je mnogo formata na bazi građevnog bloka koji cilja tumorsku metu CD20 na N-terminusu, TCRα/β koji regrutuju građevni blok u sredini i nanotelo za ciljanje albumina na C-terminusu uz korišćenje 35GS-linkera i eksprimiranje kao šta je navedeno iznad. Pregled istraživanog formata je prikazan u Tabeli C-11.

Tabela C-11: Oznaka primerka i opis HLE-konstrukata.

[0388] Budući da dodavanje Alb11-nanotela može da deluje na afinitet ili potenciju konstrukta, a vezanje HSA na Alb11-nanotelo može da deluje na afinitet ili na potenciju konstrukata sa produženim polu-životom, konstrukti sa produženim polu-životom su karakterizovani za vezanje na CHO-K1 koje prekomerno eksprimiraju TCR i na primarne ljudske T-ćelije. Osim toga, potencija u ogledu ubijanja Ramos-ovih B-ćelija zavisnog o funkcionalnim T-ćelijama je procenjena u prisutnosti i odsutnosti HSA (opisano u 15.1 i 15.2 ispod).

15.1 Uticaj Alb11-građevnog bloka na vezne karakteristike

[0389] Analogno sa eksperimentima opisanim u Primeru 5, procenjeno je i vezanje anti-TCR polipeptida sa produženim polu-životom na CHO-K-ćelije sa ljudskim TCR(2XN9)/CD3, na primarne ljudske T-ćelije i na Ramos-ove ćelije u ogledu na bazi protočne citometrije u odsutnosti HSA.

[0390] Rezultati su prikazani na Slici 15. EC50-vrednosti dobivene u ovom ogledu su navedene u Tabeli C-12.

[0391] Uporedba CD20-35GS-TCR HLE-konstrukta sa ne-HLE-konstruktima je otkrila slično vezanje na sve testirane ćelijske linije. Podaci su pokazali da spajanje Alb11-građevnog bloka nije uticalo na vezne karakteristike.

15.2 Uticaj ljudskog serumskog albumina na potencijal u ogledu ubijanja B-ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija

[0392] Funkcionalnost anti-TCR polipeptida sa produženim polu-životom je procenjena u ogledu ubijanja Ramos-ovih ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija kao šta je opisano u Primeru 10 u prisutnosti i odsutnosti 30 µM HSA i upoređeno sa funkcionalnosti ne-HLE multispecifičnih konstrukata.

[0393] Rezultati su prikazani na Slici 16. IC50-vrednosti dobivene u ovom ogledu su navedene u Tabeli C-13.

Tabela C-13: IC50 (M) i procenat (%) lize uz pomoć HLE-polipeptida u ogledu ubijanja B-ćelija (Ramos-ove ćelije) zavisno o T-ćelijama sa ciljem evaluiranja efekta HLE.

[0394] Rezultati pokazuju da ugradnja nanotela, koje cilja albumin, u pomenuti konstrukt ne uspostavlja neki esencijalni uticaj na dobiveni potencijal ili efikasnost. Mada je manji gubitak efikasnosti/potencijala primećen u prisutnosti HSA, anti-TCR multispecifični polipeptidi sa produženim polu-životom su još uvek potentni za ubijanje tumorskih ćelija.

Primer 16: Funkcionalno karakterizovanje multispecifičnih polipeptida u xCELLigenceogledu ubijanja HER2-pozitivnih tumorskih ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija

[0395] Sa ciljem da se proceni opšta primenjivost TCR-građevnog bloka za usmeravanje T-ćelija na tumorske ćelije, građevni blokovi koji vežu TCR su spojeni sa građevnim blokom koji veže neki različit TAA, a u ovom slučaju nanotelo koje veže HER2.

[0396] Pomenuti anti-TCR građevni blok je spojen sa nanotelom, koje veže HER2-antigen iz čvrstog tumora, u dve orijentacije (Tabela C-14), a konstrukt je karakterizovan u xCELLigenceogledu ubijanja HER2-pozitivnog tumora posredstvom ljudskih T-ćelija kao šta je opisano u Primeru 11 uz korišćenje dve ćelijske linije koje eksprimiraju HER2 (SKBR3 (ATCC: HTB-30), MCF-7 (ATCC: HTB-22)) i referentne ćelijske linije koja je HER2-negativna (MDA-MB-468 (ATCC HTB-132)) koje su služile kao populacija sa ciljanim ćelijama. Ljudski ekspresijski nivoi HER2 su potvrđeni uz korišćenje 100 nM monovalentnog anti-HER2 nanotela HER2005F07 (SEQ ID Br.: 350) primenom protočne citometrije kao šta je opisano u Primeru 5. Rezultati su prikazani na Slici 17.

Tabela C-14: Oznaka primerka i opis polipeptida koji vežu HER2/TCR.

[0397] Ukratko, ćelije SKBR3 (4 x 10<4>ćelija/komorici), MDA-MB-468 (4 x 10<4>ćelija/komorici) ili MCF-7 (2 x 10<4>ćelija/komorici) su posejane u E-pločice sa 96-komorica i inkubirane sa 6 x 10<5>ili 3 x 10<5>ljudskih primarnih T-ćelija (omer efektor : meta = 15 : 1) u prisutnosti ili odsutnosti pomenutih multispecifičnih konstrukata, a sve je praćeno tokom vremena. Podaci su analizirani nakon 18 h, a prikazani su na Slici 18.

[0398] IC50-vrednosti dobivene u ovom ogledu su navedene u Tabeli C-15.

[0399] Podaci ukazuju na specifično ubijanje HER2-pozitivnih tumorskih ćelija usmeravanjem ljudskih primarnih T-ćelija na pomenute tumorske ćelije preko anti-TCR nanotela. Tako, građevni blokovi koji vežu TCR su široko primenjivi za usmeravanje citotoksičnih T-ćelija na tumore. Unatoč velikih razlika u gustini tumorskog antigena na SKBR3- i MCF-7-ćelijama, obe linije su efikasno poubijane nakon dodavanja konstrukata sa multispecifičnim polipeptidom.

Primer 17: Efekt polipeptida koji vežu HER2/TCR na oslobađanje IFN-γ posredstvom ljudskih T-ćelija u ogledu ubijanja HER2-pozitivnih tumorskih ćelija

[0400] Sa ciljem da se dodatno evaluira široka primenjivost građevnih blokova koji vežu TCR, indukcija oslobađanja citokina je praćena u xCELLigence-ogledu ubijanja SKBR3-ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija. Oslobađanje citokina IFN-γ je izmereno uz pomoć ELISA. Ukratko, SKBR3-ćelije su posejane u E-pločicu sa 96-komorica u prisutnosti prečišćenih ljudskih primarnih T-ćelija sa ili bez multispecifičnih peptida koji vežu HER2/TCR ili irelevantnih polipeptida kao šta je opisano u Primeru 16. 72 h nakon dodavanja ljudskih primarnih T ćelija/polipeptida u E-pločice je izmerena proizvodnja IFN-γ od strane ljudskih primarnih T-ćelija. Maxisorp ELISA-pločice sa 96-komorica (Nunc) su prekrivene sa antitelom protiv ljudskog IFN-γ (BD Biosciences #551221). Nakon preko-noćne inkubacije, pločice su isprane i blokirane sa PBS 2% BSA tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Sledeće, pločice su inkubirane sa 100 µl supernatanta (razređeni 2-puta) i 1 µg/ml biotinilovanog antitela protiv ljudskog IFN-γ (BD Biosciences, #554550) tokom 2 h i 30 min uz potresanje, ponovo isprane i inkubirane sa streptavidin-HRP (Dakocytomation #P0397). Nakon 30 min je dodan rastvor TMB One (Promega #G7431). Reakcija je zaustavljena uz pomoć 2M H2SO4, a dozno-zavisna proizvodnja polipeptida IFN-γ je određena merenjem OD kod 405 nm uz korišćenje Tecan sunrise 4.

[0401] Rezultati su prikazani na Slici 19. EC50-vrednosti dobivene u ovom ogledu su navedene u Tabeli C-16.

[0402] Pomenuti multispecifični polipeptidi koji vežu HER2/TCR su indukovali doznozavisnu proizvodnju citokina IFN-γ koje pokazuje da su ljudske T-ćelije bile aktivisane samo u prisutnosti relevantnog polipeptida.

Primer 18: Unakrsna-reaktivnost anti-TCR nanotela u makaki rakojeda

[0403] Procenjena je unakrsna-reaktivnost građevnih blokova koji vežu TCR u odnosu na TCR iz makaki rakojeda.

18.1 Funkcionalno karakterizovanje multispecifičnih polipeptida u ogledu ubijanja Ramosovih tumorskih ćelija pozitivnih na CD20 posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda

[0404] U prvom eksperimentu je uspostavljen ogled za ubijanje na bazi protočne citometrije, kao šta je u suštini opisano u Primeru 10, uz korišćenje 2.5 x 10<5>primarnih T-ćelija iz makaki rakojeda (izolovane uz pomoć Pan T Cell Isolation Kit MACS#130-091-993) kao efektorske ćelije i 2.5 x 10<4>Ramos-ovih ćelija pozitivnih na ljudski CD20 kao ciljane ćelije.

[0405] IC50-vrednosti i procenat (%) lize dobiveni iz krivulje sa doznim odgovorom su prikazane u Tabeli C-17. Rezultati su prikazani na Slici 20.

[0406] Pomenuti multispecifični polipeptidi koji vežu TCR koji sadrže građevni blok koji veže TCR koji pripadaju klasteru A su uspostavile dozno-zavisno ubijanje Ramos-vih ćelija posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda.

18.2 Funkcionalno karakterizovanje multispecifičnih polipeptida u ogledu ubijanja CHO-K1-ćelija pozitivnih na ljudski CD20 posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda

[0407] Sa ciljem da se dodatno proceni unakrsna-reaktivnost građevnih blokova koji vežu TCR u multispecifičnim konstruktima koji vežu TCR/CD20 je korišćen ogled na bazi xCELLigence uz korišćenje prečišćenih primarnih T-ćelija iz makaki rakojeda kao šta je u suštini opisano u Primeru 11.

[0408] Ovaj ogled je primenjivao omer efektor : meta od 30 : 1, tj.3 x 10<5>efektorskih T-ćelija iz makaki rakojeda (izolovane primenom Pan T Cell Isolation Kit MACS#130-091-993) i 1 x 10<4>ciljane CHO-K1-ćelije sa ljudskim CD20.

[0409] IC50-vrednosti dobivene u ovom ogledu navedene su u Tabeli C-18. Rezultati su sažeto prikazani na Slici 21.

[0410] Može da se zaključi da multispecifični polipeptidi, koji vežu TCR i koji sadrže građevni blok koji veže TCR koji pripadaju klasteru A, uspostavljaju dozno-zavisno ubijanje CHO-K1-ćelija transfektovanih sa CD20 uz korišćenje T-ćelija iz makaki rakojeda. Tako, nanotela iz klastera A unakrsno-reaguju sa primarnim T-ćelijama iz makaki rakojeda i mogu da potaknu snažno ubijanje posredstvom pomenutih T-ćelija iz makaki rakojeda.

18.3 Vezanje anti-TCR nanotela na belančevinu receptora T-ćelija iz makaki rakojeda (ELISA)

[0411] Vezanje prečišćenih monovalentnih anti-TCR nanotela na rastvorljivu rekombinantnu belančevinu TCR-α/β iz makaki rakojeda je procenjeno uz pomoć ELISA-ogleda (kao šta opisano u Primeru 1.2) uz korišćenje 2 µg/ml direktno prekrivene rekombinantne rastvorljive zipper-belančevine TCR-α/β iz makaki rakojeda.

[0412] EC50-vrednosti dobivene iz krivulja doznog odgovora su prikazane u Tabeli C-19.

[0413] Primeri za rezultate su prikazani na Slici 22.

Tabela C-19: EC50 (M) monovalentnog anti-TCR nanotela za vezanje na rastvorljivu rekombinantnu belančevinu TCR/CD3 iz makaki rakojeda određeno na osnovu ELISA-ogleda.

[0414] Rezultati pokazuju da nanotela protiv TCR iz klastera A i klastera B vežu rekombinantnu rastvorljivu zipper-belančevinu TCR-α/β iz makaki rakojeda.

18.4 Procena unakrsne-reaktivnosti u makaki rakojedu primenom Bio-Layer Interferometry

[0415] Vezni afiniteti monovalentnih anti-TCR nanotela su izmereni primenom Bio-Layer Interferometry (BLI) na instrumentu Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.) kao šta je u suštini opisano u Primeru 7.1 uz korišćenje zipper-belančevine TCR-α/β iz makaki rakojeda. Rezultati su prikazani na Slici 23, a vezne karakteristike anti-TCR nanotela su navedene u Tabeli C-20.

Tabela C-20: Vezne karakteristike monovalentnih anti-TCR nanotela određenih u aparatu Octet uz korišćenje direktno prekrivene zipper-belančevine TCR iz makaki rakojeda.

[0416] Nanotela iz klastera A vežu rastvorljivu rekombinantnu zipper-belančevinu TCR-α/β iz makaki rakojeda sa 10-puta nižim afinitetom u odnosu na ljudsku rastvorljivu rekombinantnu zipper-belančevinu TCR-α/β.

18.5 Funkcionalno karakterizovanje multispecifičnih polipeptida sa produženim poluživotom u ogledu ubijanja Ramos-ovih tumorskih ćelija pozitivnih na CD20 posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda

[0417] Analogno sa opisom u Primeru 18.1, polipeptidi sa produženim polu-životom koji vežu TCR su procenjeni u ogledu ubijanja Ramos-ovih ćelija posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda.

[0418] IC50-vrednosti dobivene u ovom ogledu su navedene u Tabeli C-21. Rezultati su prikazani na Slici 24.

Tabela C-21: IC50 i procenat (%) lize sa HLE-multispecifičnim polipeptidima u ogledu ubijanja B-ćelija (Ramos-ove ćelije) posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda sa ciljem evaluiranja efekta HLE.

[0419] Multispecifični polipeptidi sa produženim polu-životom (HLE-multispecifični polipeptidi) koji vežu TCR, koji sadrže građevni blok koji veže TCR i koji pripadaju klasteru A su omogućili dozno-zavisno ubijanje Ramos-ovih ćelija uz korišćenje prečišćenih primarnih T-ćelija iz makaki rakojeda. Ugrađivanje ALB11 u ovakvom konstruktu nije uticalo na potencijal (preklapajući CI). Nakon dodavanja HSA, mali pad efikasnosti je bio primećen dok je potencijal ostao nepromenjen.

18.6 Funkcionalno karakterizovanje multispecifičnih polipeptida sa produženim poluživotom koji vežu CD20xTCR u ogledu ubijanja tumorskih ćelija pozitivnih na CHO-CD20 posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda

[0420] Sa ciljem da se potvrde podaci iz ogleda na bazi protočne citometrije, HLE-konstrukti su bili testirani u xCELLigence-ogledu ubijanja CHO-K1-ćelija pozitivnih na ljudski CD20 posredstvom prečišćenih primarnih T-ćelija iz makaki rakojeda kao šta je opisano u Primeru 11.

[0421] Rezultati su prikazani na Slici 25. IC50-vrednosti dobivene iz krivulja doznog-odgovora su prikazani u Tabeli C-22.

Tabela C-22: IC50 vrednosti (M) multispecifičnih polipeptida koji vežu TCR/CD20 i HLE-konstrukata u ogledu ubijanja CHO-K1-tumorskih ćelija pozitivnih na ljudski CD20 posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda sa ciljem evaluiranja efekta ALB11 i

HSA.

[0422] HLE-multispecifični polipeptidi koji vežu TCR pokazuju dozno-zavisno ubijanje CHO-K1-ćelija transfektovanih sa ljudskim CD20 posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda, koje pokazuje da ALB11 ne utiče na unakrsnu-reaktivnost građevnog bloka za vezanje TCR u makaki rakojedu.

18.7 Funkcionalno karakterizovanje multispecifičnih polipeptida u ogledu ubijanja tumorskih ćelija pozitivnih na HER2 posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda

[0423] Pomenuti multispecifični polipeptidi su bili funkcionalno karakterizovani u ogledu ubijanja tumorskih ćelija pozitivnih na HER2 posredstvom T-ćelija iz makaki rakojeda. Ukratko, pomenuti multispecifični polipeptidi koji vežu TCR/HER2 su procenjeni primenom xCELLigence-ogleda ubijanja tumorskih ćelija kao šta je, u suštini, opisano u Primeru 16, uz korišćenje 6 x 10<5>T-ćelija iz makaki rakojeda, koje su služile kao efektorske ćelije, i 4 x 10<4>SKBR3-ćelija koje su služile kao ciljane ćelije (omer efektor : meta = 30 : 1). Podaci su analizirani nakon 18 h.

[0424] Rezultati su prikazani na Slici 26. IC50-vrednosti dobivene u ovom ogledu su navedene u Tabeli C-23.

[0425] Unakrsna-reaktivnost građevnog bloka koji veže TCR iz makaki rakojeda je potvrđena uz pomoć multispecifičnih konstrukata koji vežu HER2/TCR.

Primer 19: In vivo dokaz koncepta primenom modela trošenja Ramos-ovih B-ćelija

[0426] U ovom modelu trošenja B-ćelija, Ramos-ove ćelije (ćelijska linija Burkitt-ovog limfoma) i ljudske PBMC-ćelije su injektirane intravenozno i intraperitonealno u NOG-miševe. Procenjeno je ubijanje Ramos-ovih B-ćelija i PBMC-izvedenih B-ćelija uz pomoć regrutovanja T-ćelija (posredstvom pomenutog nanotela) prisutnih u PBMC-populaciji koje reflektuje potencijal multispecifičnih polipeptida da aktivišu T-ćelije uz pomoć direktnog spajanja T-ćelija (preko TCR) sa ciljanim B-ćelijama (preko CD20), koje rezultuje ubijanjem ciljanih ćelija.

[0427] Procenjena je in vivo efikasnost bi-specifičnog polipeptida T017000083 (veže CD20xTCR) u trošenju B-ćelija u modelu Ramos-ovih ćelija u NOG-mišu pa je upoređena sa irelevantnim multispecifičnim polipeptidom T017000088 (irelevantno nanotelo nanotelo koje veže TCR). Studija je pokazala statistički značajan efekt na trošenje Ramos-ovih B-ćelija u koštanoj srži i slezini i u trošenju PBMC-izvedenih B-ćelija u slezini.

[0428] Detaljno, trošenje B-ćelija je procenjeno u miševima koji su intravenozno primili 10<6>Ramos-ovih ćelija u 200 µL RPMI-medijuma 1640 (Roswell Park Memorial Institute, RPMI) tokom prvog dana (D1). Ova injekcija je nastupila 24 h nakon zračenja celog tela miša sa γizvorom (1.44 Gy,<60>Co) (DO).10<7>PBMC-ćelija (500 µL u PBS) je injektirano tokom D3 (tj. dva dana nakon injektiranja tumorskih ćelija) nakon randomizovanja miševa u grupe od kojih je svaka sadržavala 24 životinje. Tretman je započeo tokom D3 jedan sat nakon PBMC-injekcije, a ponovljen je tokom pet uzastopna dana ili u totalu do D7 (Slika 27). Testirana su tri dozna nivoa polipeptida koji vežu TCR/CD20 (0.5 mg/kg, 5 mg/kg i 23 mg/kg).

[0429] Tokom D20 ili D21, miševi su žrtvovani, a slezina i koštana srž (iz femura) su ekstrahovane za potrebe FACS-analize (mCD45, hCD45, hCD19, hCD20, hCD10) sa ciljem da se analizira i kvantifikuje prisutnost Ramos-ovih B-ćelija (hCD19+ hCD20+ hCD45+ mCD45- hCD10+) i PBMC-izvedenih B-ćelija (hCD19+ hCD20+ hCD45+ mCD45- hCD10-).

[0430] Rezultati za trošenje Ramos-ovih B-ćelija su predstavljeni na Slici 28A i Slici 28B. Miševi koji su bili tretirani sa irelevantnim multispecifičnim polipeptidom u analizi su služili kao kontrolna grupa. Iz Slike 28A je vidljivo da je obrazac doznog-odgovora vidljiv kod koštane srži uz korišćenje T017000083 (CD20/TCR) naspram korišćenja irelevantnog multispecifičnog polipeptida za smanjivanje broja Ramos-ćelija. Dva najviša dozna nivoa za multispecifični polipeptid koji veža CD20/TCR su statistički značajno različita od istih kod irelevantnog multispecifičnog polipeptida. Statistička analiza je provedena uz pomoć F-testova iz ANOVA-analize pomešanih-efekata. Kod slezine, svi testirani dozni nivoi T017000083 su bili statistički značajno različiti od istih kod irelevantnog multispecifičnog polipeptida, kao šta je prikazano na Slici 28B. Obrazac doznog-odgovora kod slezine je manje izražen jer su sve doze bile slične ili je bilo procenjeno da su blizu maksimalnog efekta tj. vrlo slične.

[0431] Rezultati za trošenje PBMC-izvedenih B-ćelija su predstavljeni na Slici 28C i Slici 28D. Kod koštane srži, obrazac doznog-odgovora je primećen kod T017000083 kao šta je prikazano na Slici 28C. Procenjena razlika u broju ljudskih B-ćelija kod T017000083 u odnosu na irelevantni multispecifični polipeptid za dva najveća dozna nivoa je statistički značajno različita sa nivoom značaja od 5%. U slučaju slezine, brojevi B-ćelija su statistički značajno različiti u odnosu na grupu koja je tretirana sa irelevantnim multispecifičnim polipeptidom u svim grupama tretiranim sa T017000083 i to na svim testiranim doznim nivoima. Obrazac doznog-odgovora je manje izražen jer su sve doze bliske ili je procenjeno da daju maksimalni efekt pa su zato slične, mada je povećanje utvrđene razlike sa porastom doze bilo primećeno.

[0432] Zaključno, ovi rezultati pokazuju da su multispecifični polipeptidi koji vežu CD20/TCR sposobni da značajno smanje broj Ramos-ovih B-ćelija i PBMC-izvedenih B-ćelija u slezini i Ramos-ovih B-ćelija u koštanoj srži u ovom modelu. To potvrđuje očekivano polipeptidomindukovano aktivisanje T-ćelija uz pomoć unakrsnog spajanja T-ćelija sa ciljanim B-ćelijama i njihovo kasnije ubijanje.

Primer 20: In vivo dokaz koncepta u modelu trošenja PBMC-izvedenih B-ćelija

[0433] U ovom modelu trošenja B-ćelija, ljudski PBMC su injektirani intraperitonealno u NOG-miševe. Ubijanje PBMC-izvedenih B-ćelija polipeptidom-posredovanim regrutovanjem T-ćelija koje su prisutne u PBMC-populaciji je procenjeno u odnosu na potencijal polipeptida iz ovoga pronalaska da aktivišu T-ćelije direktnim spajanjem pomenutih T-ćelija (preko TCR) na ciljane B-ćelije (preko CD20), koje rezultuje ubijanjem pomenutih ciljanih ćelija.

[0434] Procenjena je in vivo efikasnost multispecifičnog polipeptida T017000083 (vezanje na CD20xTCR) u trošenju B-ćelija u modelu PBMC-populacije NOG-miša pa je upoređena sa slučajem irelevantnog polipeptida T017000088. Studija je pokazana jasan efekt na trošenje PBMC-izvedenih B-ćelija u slezini.

[0435] Detaljno, trošenje B-ćelija je procenjeno u miševima koji su intraperitonealno primili 3 x 10<7>PBMC-ćelija u 500 µL PBS trećeg dana (D3) nakon zračenja celog tela miša sa γ-izvorom (1.44 Gy,<60>Co) (D0) i randomizovanja miševa u grupe od koja svaka sadrži 12 životinja. Tretman je započeo D3 jedan sat nakon PBMC-injekcije pa je ponavljan tokom pet uzastopnih dana, a u totalu do dana 7 (D7) (Slika 29). Testirana su tri dozna nivoa polipeptida koji veže CD20/TCR (0.5 mg/kg, 5 mg/kg i 23 mg/kg).

[0436] Tokom dana 18 (D18), miševi su žrtvovani, a slezina je odstranjena za FACS-analizu (mCD45, hCD45, hCD19, hCD20) sa ciljem da se analizira i kvantifikuje prisutnosti PBMC-izvedenih ljudskih B-ćelija (hCD19+ hCD20+ hCD45+ mCD45-).

[0437] Rezultati za trošenje PBMC-izvedenih B-ćelija su predstavljeni na Slici 30. U slezini, broj B-ćelija je uočljivo različit od onog u grupi koja je tretirana sa irelevantnim polipeptidom u svim grupama koje su bile tretirane sa T017000083 i na svim testiranim doznim nivoima. Obrazac doznog-odgovora nije izražen jer su sve doze bliske maksimumu ili je procenjeno da su ostvarile maksimalni efekt pa su vrlo slične.

[0438] Zaključno, ovi rezultati pokazuju da je multispecifični polipeptid koji veže CD20/TCR sposoban da značajno smanji broj PBMC-izvedenih B-ćelija u slezini u ovom modelu. To potvrđuje očekivano polipeptidom-indukovano aktivisanje T-ćelija preko unakrsnog-spajanja T-ćelija na ciljane B-ćelija i njihovo naknadno ubijanje.

Primer 21: Ciljanje tumorskih ćelija sa multispecifičnim polipeptidima koji angažuju T-ćelije

[0439] Terapeutska aktivnost strategije angažovanja T-ćelija može da se poboljša uz pomoć istovremenog ciljanja više tumorskih antigena. Tumorske ćelije često izgrade escapemehanizam negativnom regulacijom ciljanih antigena tokom terapije. Istovremeno ciljanje više antigena će očekivano da smanji verovatnoću pojave tumorski escape-varijanata. Individualni afinitet odgovarajućih nanotela za ciljanje tumora može da se promeni tako da se ostvari preferirano vezanje na pojedinačni marker ili istovremeno vezanje na oba tumorska markera.

Antigeni koji postoje u različitim ćelijskim populacijama mogu da se kombinuju ili čak mogu da ciljaju rastvorljive belančevine zajedno sa tumorskim antigenom.

[0440] Budući da je platforma nanotela idealno prikladna za kombinovanje različitih specifičnosti u neki multispecifičan format, anti-TCR nanotela korišćena u pronalasku su kombinovana u formate koji ilustruju pomenute koncepte, tj. sa nanotelima koja vežu različiti tumorski antigen u nekom multispecifičnom polipeptidu.

[0441] Za koncept ciljanja dvostrukog tumorskog antigena, nanotelo koje je reaktivno prema prvom tumorskom antigenu (TA1, tj. CEA) je spojeno na drugo nanotelo sa različitom specifičnosti (TA2, na primer EGFR), koji je različit od TA1, u kombinaciji sa nanotelom, koje je reaktivno sa TCR. Specifični redosled građevnog bloka varira unutar pomenutog formata kao i dužina korišćenog linkera između različitih građevnih blokova. Kombinacije TA1 i TA2 koje su testirane su prikazane u Tabeli C-24.

Tabela C-24: Kombinacija TCR, TA1, TA2 i Alb veznih građevnih blokova u multispecifičnim polipeptidima.

[0442] Sa ciljem da se testira produženje polu-života, u polipeptide iz Tabele C-24 je uključeno i Alb-nanotelo.

[0443] Sa ciljem da se dokaže specifično ubijanje, korišćen je ogled mešane ćelijske-kulture pri čemu su ko-inkubirane pojedinačne TA1-pozitivne (na primer, MC38-huCEA ili MKN45) i pojedinačne TA2-pozitivne tumorske ćelije (na primer, Hela ili Her14). Nivo ekspresije odgovarajućih tumorskih antigena je određeno u različitim ćelijskim linijama, a predstavljen je na Slici 31. Nakon dodavanja polipeptida iz ovoga pronalaska, primarnih ljudskih T-ćelija i albumina ako je potrebno, T-ćelija posredovana citotoksičnost je praćena uz pomoć citometrije. Uporedba je ostvarena u odnosu na dvostruko negative ćelije ili formate koji sadrže jedno ili više irelevantnih nanotela.

[0444] Sa ciljem da se verifikuje pomenuto specifično ubijanje, indukovano ubijanje dvostruko-pozitivnih tumorskih (za TA1 i TA2, na primer LS174T ili LoVo) ćelija je upoređeno sa indukovanim ubijanjem pojedinačnih pozitivnih tumorskih ćelija. Za to je korišćen ogled citotoksičnosti posredovane sa T-ćelijama kao šta je opisano iznad uz korišćenje pojedinačnog tipa tumorskih ćelija koje su bile pozitivne za oba markera (Primer 19).

Primer 22: Ciljanje tumorskih ćelija angažovanjem T-ćelija uz pomoć multispecifičnih polipeptida

[0445] Kao šta je pomenuto iznad, terapeutska aktivnost strategije angažovanja T-ćelija može da se poboljša uz pomoć istovremenog ciljanja više tumorskih antigena. Ne samo šta tumorske ćelije razvijanju escape-mehanizam uz pomoć negativne regulacije ciljanih antigena tokom terapije, već takođe i uvođenjem (tačkastih) mutacija. Takođe u tom smislu, istovremeno ciljanje više epitopa na antigenu je očekivano da smanji verovatnoću pojave tumorskih escapevarijanata. Štaviše, ciljanje više epitopa na pojedinačnom antigenu može da poveća afinitet vezanja (efekt aviditeta).

[0446] Budući da je platforma nanotela idealno prikladna za kombinovanje različitih specifičnosti u jedan multivalentni format, anti-TCR nanotela korišćena u pronalasku su spojena u formate koji ilustruju pomenute koncepte, tj. sa nanotelima koja vežu različiti tumorski antigen u nekom multispecifičnom polipeptidu.

[0447] Za koncept ciljanja više (multivalentno) tumorskih antigena, spojena su dva nanotela koja su bila reaktivna prema jednom antigenu (TA1 i TA2), a nakon toga je usledilo i nanotelo koje je reaktivno prema TCR. Specifični redosled građevnih blokova može da varira unutar formata kao i dužine korišćenog linkera između različitih građevnih blokova. Kombinacije TA1 i TA2 koje su testirane su prikazane u Tabeli C-25.

Tabela C-25: Kombinacija TCR, TA1, TA2 i građevnog bloka koji veže Alb u multispecifičnim polipeptidima.

[0448] Sa ciljem da se testira produženje polu-života, u polipeptide iz Tabele C-25 je uključeno nanotelo koje veže albumin.

[0449] Procenjeni su potencijal i efikasnost ovih multivalentnih formata i upoređeni sa odgovarajućim bispecifičnim formatima u in vitro ogledu ubijanja tumorski ćelija koji može da se uporedi sa ogledom koji je opisan u Primeru 10, ali uz relevantne ćelijske linije (na primer, Hela, Her14, Ls174T, SKBR3, MCF7). Dodatno, omer efektor : meta je variran tako da je procenjeno da li multivalentni/multispecifični polipeptid ima višu efikasnost kod manjeg omera efektor : meta.

Primer 23: Vezanje monovalentnog nanotela i multispecifičnih polipeptida na ćelije iz protočne citometrije

[0450] Kao šta je ranije opisano, strategije angažovanja T-ćelija terapeutskim aktivisanjem može da bude poboljšana istovremenima ciljanjem više tumorskih antigena, jer tumorske ćelije često uspostave escape-mehanizam uz pomoć negativne regulacije ciljanih antigena tokom terapije. Očekivano je da će istovremeno ciljanje više antigena smanjiti pojavu tumorskih escape-varijanata.

[0451] Za pomenuti koncept ciljanja dvostrukog tumorskog antigena, nanotelo koje je reaktivno prema prvom tumorskom antigenu (EGFR) je spojeno na drugo nanotelo sa različitom specifičnosti (CEACAM5), zajedno sa nanotelom koje je reaktivno prema TCR. Specifični redosled građevnih blokova je bio variran unutar formata. Efektorsko i tumorsko nanotelo su genetički spojena sa 35GS-linkerom, a tada su eksprimirana u kvascu Pichia u skladu sa standardnim protokolima. Irelevantni konstrukti su generisani zamenom tumorskog nanotela sa irelevantnim nanotelom protiv lizozima iz jaja (cAblys) (Tabela C-26).

Tabela C-26: Oznaka primerka i opis multispecifičnih polipeptida.

[0452] Dozno-zavisno vezanje monovalentnog nanotela i multispecifičnih polipeptida na tumorske ćelijske linije koje eksprimiraju CEACAM5 i EGFR (LoVo; ATCC CCL-229 i LS174T; ECACC 87060401), ćelijska linija koja eksprimira EGFR (HER14; NIH3T3 (ATCC CRL-1658) transfektovana sa EGFR), i prečišćene primarne ljudske T-ćelije (izolovane kao šta je opisano u Primeru 2.1) je procenjeno uz pomoć protočne citometrije kao šta je opisano u Primeru 5. Rezultati su prikazani na Slici 32.

[0453] Nivo ekspresije odgovarajućih tumorskih antigena u različitim ćelijama je određen primenom protočne citometrije uz korišćenje 100 nM monovalentnog anti-EGFR nanotela (EGFR038G07) i monovalentnog anti-CEA nanotela, kao šta je opisano u Primeru 5. Rezultati su prikazani na Slici 33.

[0454] EC50-vrednosti dobivene iz krivulja doznog-odgovora za vezanje HER14-ćelija su prikazane u Tabeli C-27. EC50-vrednosti dobivene iz krivulja doznog-odgovora za vezanje LS174T- i LoVo-ćelija su prikazane u Tabeli C-28.

Tabela C-27: EC50 (M) monovalentnih nanotela i multispecifičnih polipeptida za vezanje HER14-ćelija kao šta je određeno primenom protočne citometrije.

Tabela C-28: EC50 (M) monovalentnih nanotela i multispecifičnih polipeptida za vezanje LoVo- i LS174T-ćelija kao šta je određeno primenom protočne citometrije.

[0455] Podaci su pokazali vezanje EGFR-monovalentnog nanotela i multispecifičnih polipeptida koji sadrže EGFR-građevni blok na HER14-ćelije koje eksprimiraju samo EGFR. Nije primećeno vezanje CEACAM-monovalentnog nanotela i multispecifičnih polipeptida koji sadrže samo CEACAM5-tumor usidreni građevni blok. Kao šta je bilo očekivano, svi monovalentni i multispecifični polipeptidi su ostvarili vezanje na EGFR, CEACAM5-dvostruko-pozitivnih ćelijskih linija LS174T i LoVo. Takođe, primećeno je i vezanje pomenutih multispecifičnih polipeptida na ljudske primarne T-ćelije. Primećen je pad afiniteta pomenutih multispecifičnih polipeptida naspram monovalentnog građevnog bloka koji prepoznaje TCR zbog C-terminalne pozicije građevnog bloka koji prepoznaje TCR.

Primer 24: Vezanje monovalentnih nanotela na ljudske belančevine EGFR i CEACAM5 (SPR)

[0456] Afinitet vezanja prečišćenog EGFR monovalentnog nanotela je procenjen uz pomoć određivanja afiniteta primenom površinske plazmonske rezonance (SPR) uz korišćenje instrumenta Biacore T100. hEGFR (Sino Biological, #10001-H08H) je imobiliziran na CM5-čip uz pomoć aminskog-kuplovanja, uz korišćenje EDC- i NHS-hemije. Prečišćena nanotela su injektirana tokom 2 min u različitim koncentracijama (između 1.37 i 3000 nM) pa su ostavljena da disociraju tokom 15 min kod stope protoka od 45 µl/min. Injekcijama između primeraka, površine su regenerisane uz pomoć 50 mM NaOH. HBS-EP+ (Hepes-pufer pH 7.4) je korišćen kao radni pufer.

[0457] Afiniteti vezanja prečišćenog CEACAM5-monovalentnog nanotela su procenjeni uz pomoć određivanja afiniteta na bazi SPR na aparatu Biacore T100. hCEACAM-5 (R&D Systems, # 4128-CM) je imobiliziran na CM5-čip uz pomoć aminskog kuplovanja, uz korišćenje EDC- i NHS-hemije.

Prečišćena nanotela su bila injektirana tokom 2 min u različitim koncentracijama (između 0.31 i 2000 nM) pa su ostavljena da disociraju tokom 15 min uz stopu protoka od 45 µl/min. Injekcijama između primeraka, površine su regenerisane sa 10 mM glicinom, pH 1.5. HBS-EP+ (Hepes-pufer pH 7.4) je korišćen kao radni pufer.

[0458] Kinetičke konstante su izračunate iz senzorgrama uz korišćenje softvera BIAEvaluation (interakcija 1 : 1). Afinitetne konstante (KD) su izračunate iz rezultujućih konstanti stopa asocijacije i disocijacije, koni koff, a prikazane su u Tabeli C-29.

Tabela C-29: Afinitetne konstante monovalentnih nanotela za vezanje hEGFR i hCEACAM5 određene na Biacore direktno prekrivenim pomenutim belančevinama.

Primer 25: Preusmereno ubijanje ćelija uz pomoć multispecifičnih polipeptida posredstvom ljudskih efektorskih T-ćelija primenom xCELLigence-ogleda

[0459] Multispecifični polipeptidi su funkcionalno karakterizovani primenom ogleda ubijanja tumorskih ćelija pozitivnih za EGFR/CEACAM posredstvom ljudskih T-ćelija. Ukratko, pomenuti multispecifični konstrukti su procenjeni primenom xCELLigence-ogleda ubijanja ćelija koji je u suštini opisan u Primeru 16, uz korišćenje 6 x 10<5>ljudskih T-ćelija kao efektorske ćelije i 4 x 10<4>LS174T-ćelija (ECACC 87060401) ili LoVo-ćelija (ATCC CCL-229) kao ciljane ćelije (omer efektor : meta = 15 : 1). Podaci su analizirani nakon 30-40 h i nakon 50-60 h.

[0460] Rezultati su prikazani na Slici 34. IC50-vrednosti dobivene u ovom ogledu su navedene u Tabelama 30 i 31.

Tabela 30: IC50 (M) multispecifičnih polipeptida u xCELLigence-ogledu ubijanja posredstvom ljudskih T-ćelija uz korišćenje omera efektor : meta od 15. Podaci su bili analizirani nakon 30-40 h.

[0461] Podaci dobiveni sa ćelijama EGFR+/CEA+ LoVo su pokazali ~28-puta veću razliku u potenciji između CEACAM5-konstrukata i EGFR-CEA-multispecifičnih konstrukata i ~8-puta veću razlika u potenciji EGFR-konstrukata i EGFR-CEA-multispecifičnih konstrukata. Sa ćelijama EGFR+/CEA+ LS174T je primećena ~7-puta veća razlika u potenciji između CEACAM5-konstrukata i EGFR-CEA-multispecifičnih konstrukata i ~2-puta veća razliku između EGFR-konstrukata i EGFR-CEA-multispecifičnih konstrukata. Ovi rezultati su pokazali da su pojačanja potencije dobiveni uz pomoć multispecifičnih konstrukata koji su bili reaktivni protiv dva različita antigena prisutna na ćeliji.

Primer 26: In vivo trošenje B-ćelija uz pomoć polipeptida sa produženim polu-životom (HLE) u modelu trošenja Ramos-ovih B-ćelija

[0462] U ovom modelu trošenja B-ćelija, Ramos-ove ćelije Burkitt-ovog limfoma i ljudske PBMC-ćelije su injektirane intravenozno i intraperitonealno u miševe nakon čega je procenjeno ubijanje Ramos-ovih B-ćelija i PBMC-izvedenih B-ćelija uz pomoć nanotelom-posredovanog regrutovanja T-ćelija prisutnih u PBMC-populaciji: tj. potencijal nanotela, HLE i ne-HLE (NHLE), da aktivišu T-ćelije uz pomoć direktnog spajanja T-ćelija (preko TCR) na ciljane B-ćelije (preko CD20), koje rezultuje ubijanjem ciljanih ćelija.

[0463] Korišćeni polipeptidi u ovoj studiji su opisani u Tabeli 32:

Tabela 32: Oznaka primerka i opis multispecifičnih polipeptida korišćenih u in vivo studiji.

[0464] Pomenuta in vivo efikasnost HLE-bispecifičnog nanotela, T017000104 (TCR- i CD20-specifično kuplovano na građevni blok za ciljanje albumina) u modelu Ramos-ovih ćelija u NOG-mišu je procenjena i upoređena sa irelevantnim nanotelom T017000106. Nanotelo T017000105 (TCR- i CD20-specifično) kojemu nije produžen polu-život (NHLE) i T0107000083 (TCR- i CD20-specifično) su upoređeni sa NHLE-irelevantnim nanotelom T017000088 (irelevantno i TCR-specifično). Studija je otkrila efekt koji je statistički značajan u slučaju koštane srži i slezine kada je reč o trošenju PBMC-izvedenih B-ćelija uz pomoć T017000104 i T017000105 upoređeno sa njihovim odgovarajućim irelevantnim kontrolnim nanotelima. Ramos-ove ćelije su značajno redukovane u miševima tretiranim sa T017000104 i T017000105, i to u slučaju slezine i takođe koštane srži.

[0465] Detaljno, trošenje B-ćelija je procenjeno na miševima koji su intravenozno primili Ramos-ove ćelije tokom prvog dana (D1), intraperitonealno PBMC-ćelije tokom D3. Miševi su tretirani u razdoblju od D3 do D7 (Slika 35).

[0466] Tumori su indukovani uz pomoć intravenozne injekcije sa 10<6>Ramos-ovih ćelija u 200 µL RPMI-medijuma 1640 (D1) 24 h nakon zračenja celog tela miša sa γ-izvorom (1.44 Gy,<60>Co) (D0). PBMC-ćelije su injektirane tokom D3 (tj. dva dana nakon injekcije tumorskih ćelija) nakon randomizovanja miševa u grupe od kojih je svaka sadržavala 12 životinja (11 životinja kod grupe br. 6) na bazi telesne težine. Životinje su primile pojedinačnu intraperitonealnu (IP) injekciju sa 10<7>PBMC-ćelija (500 µL u PBS). Tretman je započeo tokom D3 jedan sat nakon PBMC-injekcije, a ponavljan je tokom pet uzastopnih dana u totalu za grupe 1-4 i 6, dok je grupa 5 primila samo dve injekcije (D3 i D5).

[0467] Tokom D20 ili D21, miševi su žrtvovani, a slezina i koštana srž (iz femura) su odstranjeni za potrebe FACS-analize (mCD45, hCD45, hCD19, hCD20, hCD10) i analizirani na prisutnost Ramos-ovih B-ćelija u PBMC-izvedenim B-ćelijama.

[0468] Rezultati za trošenje Ramos-ovih B-ćelija su predstavljeni na Slici 36. Testirani T017000083 i T017000105, i T017000104 su upoređeni sa njihovim odgovarajućim kontrolnim grupama (grupe 1 i 2) na bazi prisutnosti/odsutnosti HLE. Kod koštane srži je vidljiva statistički značajna razlika u broju Ramos-ovih B-ćelija između kontrolnih nanotela i NHLE-nanotela T017000083 i T017000105 (Slika 36A). Kod slezine, pomenuta razlika je bila značajna samo za T017000105 (Slika 36B). HLE-nanotelo T017000104 značajno smanjuje broj Ramos-ćelija u slezini i u koštanoj srži bez obzira na doznu frekvenciju koja je primenjena (Slike 36A i B). Statistička analiza je bila provedana uz pomoć F-testova iz ANOVA-analize pomešanih efekata.

[0469] Rezultati za trošenje PBMC-izvedenih B-ćelija su predstavljeni na Slici 37. Kod koštane srži je primećena redukcija apsolutnog broja B-ćelija u svim tretiranim grupama ako se uporedi sa irelevantnim kontrolnim nanotelom, a ovaj efekt je bio značajan kod nanotela T017000083 i T017000104 (Slika 37 A). Kod slezine, pomenuti efekt je više izražen, a značajan je za sve tretirane grupe (Slika 37 B).

[0470] Zaključno, ovi rezultati pokazuju da oba polipeptida, anti-CD20/anti-TCR-polipeptid i HLE anti-CD20/anti-TCR-polipeptid, mogu da značajno smanje broj Ramos-ovih B-ćelija i PBMC-izvedenih B-ćelija u slezini i u koštanoj srži u ovom modelu trošenja B-ćelija. To potvrđuje predviđeno nanotelom-indukovano aktivisanje T-ćelija uz pomoć unakrsnogspajanja T-ćelija na ciljane B-ćelije i njihovo kasnije ubijanje.

Primer 27: Uloga ljudskih efektorskih ćelija CD4+ i CD8+ T-ćelija kod aktivisanja T-ćelija

[0471] Sa ciljem da se istraži uloga CD4+, odnosno CD8+, ljudskih T-ćelija u preusmerenom ubijanju, ciljanje tumorskih ćelija uz pomoć angažovanja T-ćelija sa multispecifičnim polipeptidima je provedeno uz korišćenje podgrupa T-ćelija. U tom smislu, korišćeni su HER2-pozitivna ćelijska linija SKBR3 i nanotelo T017000102 (ciljanje HER2 i TCR).

27.1 Preusmereno ćelijsko ubijanje uz pomoć multispecifičnih polipeptida preko ljudskih efektorskih CD4+ i CD8+ T-ćelija u xCELLigence-ogledu

[0472] Ljudske T-ćelije su sakupljene kao šta je opisano u Primeru 2.1. Nakon rastapanja, ljudske CD4+, odnosno CD8+, T-ćelije su izolovane uz pomoć kompleta hemikalija za izolovanje CD4+ (Miltenyi Biotec #130-096-533), odnosno CD8+ (Miltenyi Biotech #130-096-495), T-ćelija. SKBR3-ćelije su posejane u E-pločice sa 96-komorica (2 x 10<4>ćelija/komorici) i inkubirane zajedno sa 3 x 10<5>ljudskih primarnih efektorskih T-ćelija, ljudskih primarnih efektorskih CD4+ T-ćelija ili ljudskih primarnih efektorskih CD8+ T-ćelija (omer efektor : meta = 15 : 1) u prisutnosti ili odsutnosti multispecifičnih konstrukata uz praćenje tokom vremena, kao šta je opisano u Primeru 16. Podaci su analizirani nakon 40 h.

[0473] Rezultati su prikazani na Slici 38. IC50-vrednosti su prikazane u Tabeli 33.

Tabela 33: IC50 (M) multispecifičnih polipeptida u xCELLigence-ogledu ubijanja SKBR3-ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija uz korišćenje omera efektor : meta od 15 :

1.

[0474] Podaci su pokazali dozno-zavisno specifično ubijanje HER2-pozitivnih tumorskih ćelijskih linija uz pomoć usmeravanja ljudskih primarnih T-ćelija, ljudskih CD4+ ili ljudskih CD8+ T-ćelija prema tumorskim ćelijama uz pomoć TCR-polipeptida.

27.2 Efekt polipeptida koji vežu HER2/TCR na ekspresiju CD69 i CD25 u ljudskim efektorskim CD4+ i CD8+ T-ćelijama u ogledu ubijanja HER2-pozitivnih tumorskih ćelija

[0475] Sup-populacije primarnih ljudskih T-ćelija i CD4+ i CD8+ T-ćelija su izolovane pa je proveden ogled preusmerenog ubijanja HER2-pozitivnih tumorskih ćelija uz korišćenje SKBR3-ćelija kao šta je opisano u Primeru 27.1. Aktivisanje T-ćelija je određeno uz pomoć merenja pozitivne regulacije CD69 i CD25 nakon 24 h i 72 h inkubacije u populacijama ljudskih primarnih T-ćelija i u CD4+ i CD8+ ljudskih T-ćelija. Ekspresija CD69 i CD25 je izmerena primenom protočne citometrije, uz korišćenje monoklonskog mišjeg antitela protiv ljudskog CD69PE (BD Biosciences # 557050) i mišjeg antitela protiv ljudskog CD25PE (BD Pharmigen #557138) za potrebe merenja CD69, odnosno CD25.

[0476] Primeri sa rezultatima su prikazani na Slici 39.

[0477] Podaci su pokazali dozno-zavisnu pozitivnu regulaciju CD69 i CD25 na ljudskim primarnim T- ćelijama, ljudskim CD4+ i ljudskim CD8+ T-ćelijama.

27.3 Efekt polipeptida koji vežu HER2/TCR na oslobađanje IFN-γ i IL-6 u ljudskim efektorskim CD4+ i CD8+ T-ćelijama u ogledu ubijanja HER2-pozitivnih tumorskih ćelija

[0478] Sup-populacije primarnih ljudskih T-ćelija i CD4+ i CD8+ T-ćelija su izolovane, a ogled preusmerenog ubijanja HER2-pozitivnih tumorskih ćelija uz korišćenje SKBR3-ćelija je proveden kao šta je opisano u Primeru 27.1. Oslobađanje citokina IFN-γ je izmereno primenom ELISA kao šta je opisano u Primeru 17, a oslobađanje IL-6 je izmereno primenom ELISA uz korišćenje human IL-6 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, #D6050) u skladu sa instrukcijama proizvođača.

[0479] Primeri sa rezultatima su prikazani na Slici 40.

[0480] Podaci ukazuju na dozno-zavisno oslobađanje IFN-γ i IL-6 u ljudskim primarnim T-ćelijama, ljudskim CD4+ i ljudskim CD8+ T-ćelijama.

Primer 28: Istraživanje produženja polu-života (HLE)

[0481] Pretpostavilo se da HLE preko vezanja albumina može da bude prikladan način da se pomire različiti zahtevi, uključujući (i) ekstenziju polu-života (HLE) ostatka; i (ii) efikasnost samog multispecifičnog polipeptida. Preferirano, HLE-funkcija ne bi smela da utiče na penetraciju u tumore i tkiva.

[0482] Alb11 (SEQ ID Br.: 404), nanotelo koje veže ljudski serumski albumin (HSA), je spojeno na multispecifični polipeptid koji veže EGFRxCEAxTCR sa ciljem da se poveća in vivo polu-život formatiranog molekula (WO 06/122787). Generisan je format koji na svom C-terminusu sadrži nanotelo za ciljanje albumina uz korišćenje 35GS-linkera, a tada je eksprimiran kao šta je navedeno iznad. Ispitivani format je prikazan u Tabeli 34.

Tabela 34: Oznaka primerka i opis multispecifičnog HLE-polipeptida.

[0483] Budući da dodavanje Alb11-nanotela može da utiče na afinitet ili potenciju konstrukta, multispecifični polipeptid sa produženim polu-životom je karakterizovan za vezanje na ćelijske linije koje eksprimiraju EGFR i CEA i na primarne ljudske T-ćelije. Osim toga, procenjen je i potencijal primenom ogleda ubijanja LS174T-ćelija posredstvom funkcionalnih T-ćelija (opisano u 28.1 i 28.2 ispod).

28.1 Uticaj Alb11-građevnog bloka na vezne karakteristike

[0484] Dozno-zavisno vezanje multispecifičnog HLE-polipeptida na ćelije tumorske linije koje eksprimiraju CEACAM5 i EGFR (ćelije LS174T i LoVo), na ćelijsku liniju koja eksprimira EGFR (HER14; NIH3T3-ćelije transfektovane sa EGFR), i na prečišćene primarne ljudske T-ćelije (izolovane kao šta je opisano u Primeru 2.1) je procenjeno primenom protočne citometrije kao šta je opisano u Primeru 5, u odsutnosti HSA.

[0485] Rezultati su prikazani na Slici 41. EC50-vrednosti dobivene iz krivulja doznog-odgovora za vezanje na HER14-ćelije su prikazane u Tabeli 35. EC50-vrednosti dobivene iz kriva doznog-odgovora za vezanje na LS174T- i LoVo-ćelije su prikazane u Tabeli 36.

Tabela 35: EC50 (M) T017000108 za vezanje na HER14-ćelije kao šta je određeno primenom protočne citometrije.

Tabela 36: EC50 (M) T017000108 za vezanje na LoVo- i LS174T-ćelije kao šta je određeno primenom protočne citometrije.

[0486] Uporedba HLE-konstrukata sa ne-HLE-konstruktom je pokazala slično vezanje na sve tri testirane ćelijske linije. Podaci su pokazali da kuplovanje Alb11-građevnog bloka nije uticalo na vezne karakteristike.

28.2 Uticaj Alb11-nanotela na preusmereno ubijanje ćelija posredstvom ljudskih efektorskih T-ćelija primenom xCELLigence-ogleda

[0487] Funkcionalnost multispecifičnog polipeptida sa produženim polu-životom je procenjeno u odsutnosti HSA u ogledu ubijanja LS174T-ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija kao šta je opisano u Primeru 10 i upoređeno sa funkcionalnosti ne-HLE multispecifičnih konstrukata.

[0488] Rezultati su prikazani na Slici 42. Dobivene IC50-vrednosti su navedene u Tabeli 37.

Tabela 37: IC50 (M) multispecifičnih polipeptida u xCELLigence-ogledu ubijanja tumorskih ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija uz korišćenje omera efektor : meta od 15. Podaci su analizirani nakon 40-50 h.

[0489] Rezultati pokazuju da uvođenje nanotela za ciljanje albumina u pomenuti konstrukt nije esencijalno uticalo na njegov potencijal ili efikasnost.

TABELE

[0490]

Tabela A-4: Sekvence CDR-a i okvira, plus preferirane kombinacije kao šta je navedeno u formuli I, naime FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. "SEQ" se odnosi na određeni SEQ ID Br. Prva kolona se odnosi na SEQ ID Br. sa kompletnim ISV, tj. FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. CDR1, CDR2 i CDR3 su određeni od strane autora Kontermann, 2010.

Tabela A-5: Sekvence multispecifičnih polipeptida (sa i bez privesaka). "SEQ" se odnosi na određeni SEQ ID Br.; "Oznaka" se odnosi na identifikacionu oznaku;

"Sekvenca" se odnosi na amino-kiselinsku sekvencu

Tabela A-6: Sekvence komponenata TCR-kompleksa. "SEQ" se odnosi na određeni SEQ ID Br.; "Oznaka" se odnosi na identifikacionu oznaku; "Sekvenca" označava amino-kiselinsku sekvencu

Tabela A-7: Sekvence građevnih blokova koji vežu TAA i kontrolnog nanotela. "SEQ" se odnosi na određenu SEQ ID Br.; "SEQ" se odnosi na određenu SEQ ID Br.;

"Sekvenca" se odnosi na amino-kiselinsku sekvencu

Tabela C-6: EC50 (M) multispecifičnih polipeptida koji vežu TCR za vezanje na CHO-K1-ćelije sa ljudskim TCR(2XN9)/CD3, na prečišćene primarne ljudske T-ćelije i na Ramos-ove ćelije kao šta je određeno primenom protočne citometrije.

Tabela C-7: IC50 (M) multispecifičnih polipeptida u ogledu (protočna citometrija) ubijanja Ramos-ovih ćelija posredstvom T-ćelija uz korišćenje omera efektor : meta od

10 : 1.

Tabela C-12: EC50-vrednosti polipeptida sa produženim polu-životom u ogledu vezanja CHO-K1-ćelija sa ljudskim TCR(2XN9)/CD3, primarnih ljudskih T-ćelija i Ramos-ovih ćelija kao šta je određeno primenom protočne citometrije.

Tabela C-15: IC50-vrednosti polipeptida koji vežu HER2/TCR u ogledu ubijanja HER2-pozitivnih tumorskih ćelija posredstvom T-ćelija.

[0491] Tabela C-16: IC50 (M) polipeptida koji vežu HER2/TCR i uzrokuju IFN-sekreciju od strane ljudskih T-ćelija u xCELLigence-ogledu ubijanja HER2-pozitivnih ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija.

Tabela C-17: IC50 (M) i procenat (%) lize uz pomoć multispecifičnih konstrukata koji vežu TCR/CD20 u makaki rakojeda u ogledu ubijanja B-ćelija (Ramos-ove ćelije) posredstvom T-ćelija sa ciljem da se evaluira funkcionalnost građevnog bloka koji veže TCR u makaki rakojedu.

Tabela C-18: IC50 (M) multispecifičnih polipeptida koji vežu TCR/CD20 u makaki rakojedu u xCELLigence-ogledu ubijanja CHO-K1-ćelija sa ljudskim CD20 posredstvom T-ćelija.

Tabela C-23: IC50 (M) multispecifičnih polipeptida za vezanje TCR/Her2 u makaki rakojedu u xCELLigence-ogledu ubijanja SKBR3-ćelija posredstvom T-ćelija.

Tabela 31: IC50 (M) multispecifičnih polipeptida u xCELLigence-ogledu ubijanja tumorskih ćelija posredstvom ljudskih T-ćelija uz korišćenje omera efektor : meta od 15. Podaci su analizirani nakon 50-60 h.

Claims

Patentni zahtevi

1. Polipeptid, naznačen time, što sadrži prvi i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), pri čemu

- pomenuti prvi ISV ima visoki afinitet za/veže se na konstantni domen receptora T-ćelija (TCR) koji je prisutan na T-ćelijama;

- pomenuti drugi ISV ima visoki afinitet za/veže se na prvi antigen na ciljanoj ćeliji;

pri čemu pomenuti prvi antigen je različit od pomenutog TCR; i

pri čemu pomenuta ciljana ćelija je različita od pomenute T-ćelije,

pri čemu pomenuti prvi ISV u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4) i 3 regiona za određivanje komplementarnosti (CDR1 do CDR3), u kojima:

(i) CDR1 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(a) SEQ ID Br.: 119-123, 125-127, 129, 132 i 133; i

(b) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 123; i/ili (ii) CDR2 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(c) SEQ ID Br.: 134-141, 143-144, 146-156, 159-163; ili

(d) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 153; i/ili (iii) CDR3 je izabran iz grupe koja obuhvata:

(e) SEQ ID Br.: 164-166, 169-171, 173-174; ili

(f) amino-kiselinske sekvence koje sadrže 4, 3, 2, ili 1 amino-kiselinsku razliku u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID Br.: 170.

2. Polipeptid u skladu sa zahtevom 1, naznačen time, što dodatno sadrži treći ISV, koji ima visoki afinitet za/veže se na drugi antigen na ciljanoj ćeliji, pri čemu pomenuti drugi antigen je različit od pomenutog prvog antigena.

3. Polipeptid u skladu sa zahtevom 1 ili 2, naznačen time, što pomenuti prvi antigen na ciljanoj ćeliji je neki tumorski antigen, preferirano antigen povezan sa tumorom (tumour associated antigen, TAA).

4. Polipeptid u skladu sa zahtevom 2 ili 3, naznačen time, što pomenuti drugi antigen na ciljanoj ćeliji je neki tumorski antigen, preferirano antigen povezan sa tumorom (TAA).

5. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 2 do 4, naznačen time, što su navedeni prvi antigen i navedeni drugi antigen prisutni na istoj ciljnoj ćeliji.

6. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 2 do 4, naznačen time, što su navedeni prvi antigen i navedeni drugi antigen prisutni na različitim ciljnim ćelijama.

7. Polipeptid u skladu sa bilo kojim od zahteva 3 do 6, naznačen time, što pomenuti TAA (je) su nezavisno izabrani iz grupe koja obuhvata hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP), receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), belančevinu za aktivisanje fibroblasta (FAP), MART-1, karcinoembrionski antigen (CEA), gp100, MAGE-1, HER-2, Lewis<Y>-antigene, CD123, CD44, CLL-1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3, CD25, TAG-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, GD2, GD3, CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD147, receptore faktora rasta uključujući ErbB3 i ErbB4, citokinske receptore uključujući gama lanac receptora interleukin-2 (CD132 antigen), alfa lanac receptora interleukin-10 (IL-10R-A), beta lanac receptora interleukin-10 (IL-10R-B), beta-1 lanac receptora interleukin-12 (IL-12R-beta1), beta-2 lanac receptora interleukin-12 (beta-2 receptora IL-12), alfa-1 lanac receptora interleukin-13 (IL-13R-alfa-1) (CD213a1 antigen), alfa-2 lanac receptora interleukin-13 (belančevina koja veže interleukin-13), receptor interleukin-17 (receptor IL-17), receptor interleukin-17B (receptor IL-17B), prekursor receptora interleukin 21 (IL-21R), tip I receptora interleukin-1 (IL-1R-1) (CD121a); tip II receptora interleukin-1 (IL-1R-beta) (CDw121b), belančevinu antagonist receptora interleukin-1 (IL-1ra), alfa lanac receptora interleukin-2 (CD25-antigen), beta lanac receptora interleukin-2 (CD122-antigen), alfa lanac receptora interleukin-3 (IL-3R-alfa) (CD123-antigen), CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosijalin), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, klaudin 6, klaudin 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nektin-4, SLITRK6, mezotelin, folatni receptor, tkivni faktor, aksl, glipikan-3, CA9, kripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, peptidni receptor oslobađanja gastrina, PAP, CEACAM5, CEACAM6, CXCR7, N-kaderin, FXYD2 gama a, CD21, CD133, Na/K-ATPazu, mIgM (IgM vezan na membranu), mIgA (IgA vezan na membranu), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6, DcR3 i CAIX, uključujući slične polimorfne varijante i izoforme.

8. Polipeptid u skladu sa bilo kojim od zahteva 3 do 7, naznačen time, što pomenuti prvi antigen i pomenuti drugi antigen su izabrani iz grupe koja obuhvata:

- EGFR kao prvi antigen i CEA kao drugi antigen;

- CD19 kao prvi antigen i CD20 kao drugi antigen;

- CD19 kao prvi antigen i CD22 kao drugi antigen;

- CD123 kao prvi antigen i Tim-3 kao drugi antigen; i

- CD123 kao prvi antigen i CD69 kao drugi antigen.

9. Polipeptid u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 do 8, naznačen time, što dodatno sadrži ostatak koji veže neku serumsku belančevinu.

10. Polipeptid u skladu sa zahtevom 9, naznačen time, što pomenuti ostatak za vezanje serumske belančevine je neki ISV koji veže serumski albumin.

11. Nukleinska-kiselina ili sekvenca nukleinske-kiseline, naznačena time, što kodira polipeptid kao šta je definisano u bilo kojem od zahteva 1 do 10 ili neki vektor koji sadrži pomenutu nukleinsku kiselinu ili sekvencu nukleinske-kiseline.

12. Ćelija-domaćin, naznačena time, što je transformisana ili transfektovana sa nukleinskom-kiselinom ili sekvencom nukleinske-kiseline ili sa vektorom kao šta je definisano u zahtevu 11.

13. Proces za proizvodnju polipeptida u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 do 10, naznačen time, što pomenuti proces podrazumeva kultiviranje ćelije-domaćina kao šta je definisano u zahtevu 12 u uslovima koji omogućavaju ekspresiju polipeptida kao šta je definisano u bilo kojem od zahteva 1 do 10 i obnavljanje proizvedenog polipeptida iz pomenute kulture.

14. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži polipeptid u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 do 10, ili polipeptid proizveden u skladu sa procesom iz zahteva 13.

15. Polipeptid u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 do 10, ili je proizveden u skladu sa procesom iz zahteva 13, naznačen time, što je namenjen tretmanu nekog subjekta u potrebi.

16. Polipeptid u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 do 10, ili je proizveden u skladu sa procesom iz zahteva 13, naznačen time, što je namenjen prevenciji, tretmanu ili ublažavanju neke bolest izabrane iz grupa koja obuhvata proliferativne bolesti, upalne bolesti, infektivne bolesti i autoimune bolesti.

17. Polipeptid za upotrebu u skladu sa zahtevom 16, naznačen time, što pomenuta proliferativna bolest je rak.

18. Polipeptid za upotrebu u skladu sa zahtevom 17, naznačen time, što pomenuti rak je izabran iz grupe koja obuhvata karcinome, gliome, mezoteliome, melanome, limfome, leukemije, adenokarcinome: rak dojke, rak jajnika, rak vrata materice, glioblastom, multipli mijelom (uključujući monoklonsku gamopatiju neodređenog značaja, asimptomatski i simptomatski mijelom), rak prostate, i Burkitt-ov limfom, rak glave i vrata, rak debelog creva, kolorektalni rak, ne-sitnoćelijski rak pluća, sitnoćelijski rak pluća, rak jednjaka, rak želuca, rak pankreasa, hepatobilijarni rak, rak žučne kese, rak tankog creva, rak rektuma, rak bubrega, rak bešike, rak prostate, rak penisa, rak uretre, rak testisa, rak vagine, rak materice, rak štitaste žlezde, rak paraštitaste žlezde, rak nadbubrežne žlezde, endokrini rak pankreasa, karcinoidni rak, rak kosti, rak kože, retinoblastome, Hodgkin-ov limfom, ne-Hodgkin-ov limfom, Kaposi-ev sarkom, multicentričnu Castleman-ovu bolest ili primarni efuzijski limfom povezan sa AIDS-om, neuroektodermalne tumore, rabdomiosarkom; kao i bilo koju metastazu iznad pomenutih tumora, uključujući indikacije koje nisu rak poput nazalne polipoze.