ES3031233T3 - A cell mediated immune response assay - Google Patents

A cell mediated immune response assay

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ES3031233T3 ES20179689T ES20179689T ES3031233T3 ES 3031233 T3 ES3031233 T3 ES 3031233T3 ES 20179689 T ES20179689 T ES 20179689T ES 20179689 T ES20179689 T ES 20179689T ES 3031233 T3 ES3031233 T3 ES 3031233T3
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Abstract

Esta divulgación se relaciona en general con el campo de los ensayos de diagnóstico inmunológico, incluyendo un ensayo para medir la inmunorrespuesta celular. La presente divulgación describe el diagnóstico de la exposición de un sujeto a un antígeno basado en la inmunorrespuesta celular con una sensibilidad mejorada, la cual se logra añadiendo un azúcar no reductor durante la incubación de la muestra con el antígeno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Un ensayo de respuesta inmune mediada por células
Campo de la invención
Esta divulgación se relaciona en general con el campo de los ensayos con base inmunológica y describe métodos para medir la inmunorrespuesta mediada por células. La presente divulgación enseña métodos, composiciones y kits para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células con sensibilidad aumentada y estabilidad de almacenamiento mejorada.
Antecedentes de la invención
Los ensayos de diagnóstico con base inmunológica tienen una amplia aplicación en el campo médico. En particular, son herramientas importantes como una ayuda para detectar y monitorear una variedad de condiciones de la enfermedad. La eficacia de este tipo de ensayos reside, en parte, en la especificidad de los componentes del sistema inmune, tal como los linfocitos T. A pesar de esta especificidad, los diagnósticos con base inmunológica no son necesariamente siempre lo suficientemente sensibles para detectar infecciones de baja intensidad, la presencia de una infección persistente de baja intensidad, para detectar infecciones en sujetos con estadios de enfermedades infecciosas activas o latentes, o en sujetos que presentan inmunodeficiencia o cualquier forma de inmunosupresión. Las características de desempeño deseables de un ensayo de respuesta inmune mediada por células, en particular para detectar una respuesta de células T específicas del antígeno, incluyen una sensibilidad, especificidad, fiabilidad y reproducibilidad adecuadas, y además de deber ser sencillo y rápido de realizar.
Una forma establecida del ensayo de diagnóstico con base inmunológica involucra la estimulación de células T u otras células del sistema inmune con antígenos, seguida de la detección de moléculas efectoras inmunes, tal como el IFN-gamma u otras citocinas producidas en respuesta a la estimulación con el antígeno. Las moléculas efectoras inmunes se detectan utilizando técnicas bien conocidas, tal como inmunoensayos con enzimas, análisis de perlas multiplex, ELISA, ELISpot y citometría de flujo. La presencia o el aumento en el nivel de moléculas efectoras inmunes también se puede determinar con base en el nivel del ARN. Tales ensayos son útiles, por ejemplo, para detectar respuestas inmunes específicas de enfermedades, en particular respuestas inmunes específicas de patógenos. Los respectivos ensayos están disponibles comercialmente bajo la marca QuantiFERON (marca registrada; Cellestis Limited) y se pueden utilizar, por ejemplo, para diagnosticar una infección por patógeno o para monitorear la inmunidad mediada por células contra una enfermedad.
Otras aplicaciones de los respectivos ensayos de respuesta inmune mediada por células incluyen el análisis o el monitoreo de las respuestas inmunes celulares a vacunas o inmunoterapia, tal como, por ejemplo, inmunoterapia contra el cáncer.
Existe una gran demanda para ensayos respectivos con sensibilidad aumentada. Anteriormente, los métodos para medir las respuestas inmunes mediadas por células se mejoraban mediante la incubación de la muestra, tal como una muestra de sangre completa con el antígeno en la presencia de un azúcar simple tal como la dextrosa (véase, por ejemplo, WO 2004/042396 A1). Se encontró que los azúcares simples, como la dextrosa y la glucosa, aumentan la producción del IFN-gamma por las células inmunes y, por lo tanto, mejoran la sensibilidad del ensayo. Se creía que el uso de azúcares simples, como la glucosa y la dextrosa, era esencial para permitir que las células aprovecharan esta fuente de energía y, por lo tanto, se beneficiaran de la adición del azúcar durante la incubación con el antígeno. Se observaron aumentos significativos en el nivel del INF-y cuando el azúcar simple se añadió directamente a la muestra, además del antígeno. Sin embargo, para simplificar el desempeño del método, se prefiere proporcionar composiciones de reactivos listas para utilizar y evitar pasos de manipulación manual. Por lo tanto, sería deseable proporcionar una única composición que incluya el antígeno y el azúcar simple. Dicha composición se podría proporcionar en un tubo de recolección de muestra, de modo que la muestra entre en contacto directo con el antígeno y el azúcar simple en la concentración adecuada, evitando así errores de manipulación. Sin embargo, aquí se encontró que la actividad del ensayo disminuía a lo largo del tiempo cuando los respectivos tubos de recolección de muestra que comprendían el antfgeno y el azúcar simple se almacenaban a temperatura ambiente<o>a temperaturas elevadas. Esto se encontró con ciertos antígenos. Por lo tanto, la vida útil de estos componentes del kit es limitada y, después de un cierto tiempo de almacenamiento, el ensayo proporciona solamente baja sensibilidad o incluso se pierde por completo la actividad del ensayo. Por lo tanto, los respectivos kits/materiales de ensayo, en los que el antígeno se proporciona convenientemente junto con un azúcar simple en una composición, no son estables al almacenamiento y, por lo tanto, presentan el riesgo de que la sensibilidad del ensayo se reduzca o incluso se pierda a lo largo del tiempo. Esto no se observó cuando el azúcar simple no se incluyó junto con el antígeno en el tubo de recolección de muestra, sino que se añadió por separado a la muestra para la incubación con el antígeno.
EP 1312 670 A1 se refiere a métodos para inducir, mantener y expandir células T citotóxicas que tienen actividad citotóxica específica del antígeno mediante el uso como ingrediente eficaz de al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en polisacáridos ácidos, oligosacáridos ácidos, monosacáridos ácidos y sales de los mismos. Xu Zhi-Jun et al. (Archives of Pathology and Laboratory Medicine 1993, 117(11):1174-1177) pertenece al campo de las pruebas inmunocitológicas e inmunohistoquímica y describe que una solución de sacarosa-cloruro de magnesioglicerol se puede utilizar para almacenar preparaciones citológicas.
Fujita et al. (Microbiology and Immunology 1990, 34(6):523-532) se refiere a la actividad inmunomodificadora in vivo de un glicolípido micoloil, trehalosa 2,3,6'-trimicolato (GaGM) deR. aurantiacus.
Roser (Biopharm 1991, 4(8):47-53) se refiere a un método denominado "secado con trehalosa" como un novedoso sustituto para la liofilización de macromoléculas.
La base de datos WPI Week 200103 de Thomson Scientific, London, GB; AN 2001-016743 & CN 1262131 A (CHANGSHENG IND CO LTD, CHANGCHUN CITY) describe que la trehalosa se puede utilizar como protector de preparaciones biológicas.
US 4,891,319 A se refiere a la protección de proteínas y otras macromoléculas biológicas con estructuras terciarias contra la desnaturalización durante el secado en la presencia de trehalosa.
WO 98/58259 A1 tiene como objetivo mejorar los inmunoensayos que son ensayos inmunoabsorbentes y en los que se capturan anticuerpos, tal como los ensayos ELISA.
EP 1 529 536 A1 se refiere a una composición inmunogénica que tiene una capacidad mejorada para la inmunoestimulación del sistema inmune de un hospedero al que se le administra, la composición que comprende el compuesto acetato isobutirato de sacarosa (SAIB).
WO 00/56365 A1 se refiere a una composición de vacuna líquida que comprende al menos un antígeno que consistente en un polisacárido unido a una proteína transportadora y trehalosa.
El objetivo de la presente invención es superar al menos un inconveniente de los métodos de la técnica anterior. En particular, es el objetivo de la presente invención proporcionar métodos sensibles y confiables para medir la respuesta inmune mediada por células, así como kits y componentes de kits que sean estables al almacenamiento.
Sumario de la invención
La invención se puede definir mediante las reivindicaciones adjuntas. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un método para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células de acuerdo con la reivindicación 1, una composición de acuerdo con la reivindicación 14, un recipiente de recolección de muestra de acuerdo con la reivindicación 16, un kit de acuerdo con la reivindicación 17, un uso de acuerdo con la reivindicación 19, un uso de acuerdo con la reivindicación 20 y una composición de la incubación de acuerdo con la reivindicación 21.
Los inventores encontraron que añadir un azúcar no reductor durante la incubación de la muestra con el antígeno aumenta sorprendentemente los niveles de respuesta y, por lo tanto, la sensibilidad del método de una forma similar a como se observa cuando se añade un azúcar simple, tal como la dextrosa y la glucosa, durante la incubación. Esto fue inesperado, ya que anteriormente se creía que el aumento de la sensibilidad solo se podía lograr con azúcares simples y, por lo tanto, monosacáridos, los cuales representan azúcares reductores. Además, se descubrió sorprendentemente que el método puede mantener<su>sensibilidad aumentada incluso durante periodos prolongados de almacenamiento de los materiales del ensayo, incluso si el azúcar no reductor y el antígeno se proporcionan en forma de una sola composición. Por lo tanto, los inventores encontraron sorprendentemente que el uso de un azúcar no reductor en lugar de un azúcar simple aumenta significativamente la estabilidad de almacenamiento de los componentes del ensayo, a la vez que aumenta los niveles de respuesta y, por lo tanto, puede mejorar la sensibilidad del ensayo. Sin limitarse en la teoría, se cree que el azúcar no reductor aumenta la cantidad de moléculas efectoras inmunes liberadas en el caso de una respuesta inmune mediada por células, positiva, mejorando así la sensibilidad del ensayo. Aparentemente, se aumenta la producción de moléculas efectoras inmunes. Por lo tanto, el uso de un azúcar no reductor, como se describe en la presente memoria, también puede permitir la detección de la estimulación celular inmune más temprano de lo que sería posible de otro modo. La capacidad de aumentar la sensibilidad de un ensayo de respuesta inmune mediada por células también puede permitir el uso de métodos menos sensibles para la detección de moléculas efectoras y/o el uso de muestras más pequeñas. Además, estos efectos benéficos también se logran después de un almacenamiento prolongado de los materiales del ensayo, lo que mejora la fiabilidad y la reproducibilidad del ensayo.
De acuerdo con un primer aspecto, se divulga, pero no se reivindica como tal, un método para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células, dicho método comprende:
(a) proporcionar una composición de la incubación poniendo en contacto una muestra que comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno, con al menos un antígeno y con al menos un azúcar no reductor, y
(b) detectar la presencia o el nivel de una molécula efectora inmune.
Dicho método se puede utilizar, por ejemplo, con la finalidad de medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células en un sujeto, tal como un paciente. La presencia (o ausencia) o el nivel de la molécula efectora inmune detectada es indicativa del nivel o la capacidad de un sujeto para generar una respuesta inmune mediada por células contra el antígeno analizado.
Se reivindica un método para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células, de acuerdo con la reivindicación 1, dicho método comprende:
(a) proporcionar una composición de la incubación poniendo en contacto una muestra que comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno peptídico, con al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos y con al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes; y
(b) detectar la presencia o el nivel de al menos una molécula efectora inmune.
De acuerdo con un segundo aspecto, se divulga, pero no se reivindica como tal, una composición para inducir una respuesta inmune mediada por células, dicha composición comprende:
a) al menos un antígeno;
b) al menos un azúcar no reductor; y
c) opcionalmente, al menos un anticoagulante.
Una composición respectiva se puede utilizar convenientemente en el método de acuerdo con el primer aspecto con la finalidad de preparar la composición de la incubación poniendo en contacto la muestra que comprende las células inmunes con dicha composición.
Se reivindica una composición de acuerdo con la reivindicación 14, y por lo tanto una composición para inducir una respuesta inmune mediada por células, que comprende:
a) al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos;
b) al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes; y<c>) al menos un anticoagulante.
De acuerdo con un tercer aspecto, se divulga, pero no se reivindica como tal, un recipiente de recolección de muestra que comprende la composición de acuerdo con el segundo aspecto. El recipiente de recolección de muestra se puede utilizar convenientemente en el método de acuerdo con el primer aspecto. Preferiblemente, el recipiente de recolección de muestra es un tubo de recolección de sangre al vacío.
Se reivindica un recipiente de recolección de muestra de acuerdo con la reivindicación 16, y, por lo tanto, un recipiente de recolección de muestra que comprende la composición de acuerdo con la reivindicación 14 o 15.
De acuerdo con un cuarto aspecto, se divulga, pero no se reivindica como tal, un kit para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células en un sujeto, el cual comprende al menos un antígeno, al menos un azúcar no reductor, al menos un recipiente de recolección de muestra, el cual preferiblemente es un tubo de recolección de sangre y al menos un medio de detección para al menos una molécula efectora inmune. Se puede utilizar un kit respetivo para realizar el método de acuerdo con el primer aspecto.
Se reivindica un kit, de acuerdo con la reivindicación 17, y por lo tanto un kit para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células en un sujeto, que comprende al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 7 a 50 aminoácidos, al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes, al menos un recipiente de recolección de muestra y al menos un medio de detección para al menos una molécula efectora inmune.
De acuerdo con un quinto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un azúcar no reductor en un ensayo inmunológico para medir la actividad de la respuesta mediada por células, en el que la adición del azúcar no reductor aumenta la liberación de al menos una molécula efectora inmune, preferiblemente el IFN-gamma, de las células inmunes que responden al antígeno analizado en dicho ensayo. Dicho uso se reivindica en la reivindicación 19. Adicionalmente, de acuerdo con la reivindicación 20, se reivindica el uso de un azúcar no reductor en un ensayo inmunológico para medir la actividad de la respuesta mediada por células para aumentar la liberación de al menos una molécula efectora inmune de las células inmunes que responden a un antígeno analizado en dicho ensayo.
Se reivindica de acuerdo con la reivindicación 21, una composición de la incubación comprendida en un recipiente de recolección de muestra, la composición de la incubación comprende:
a) una muestra no diluida obtenida de un sujeto, la muestra comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno peptídico, preferiblemente linfocitos T;
b) al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos;
<c>) al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes; y d) opcionalmente, un anticoagulante.
Otros objetivos, características, ventajas y aspectos de la presente solicitud resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.
Descripción breve de las figuras
Fig. 1: Efecto de la adición de trehalosa en la respuesta del IFN-gamma en un ensayo QFN-CMV. (* p<0.01; * p<0.001)
Fig. 2: Efecto de la adición de trehalosa en la respuesta del IFN-gamma en un ensayo QFN-TB.
Fig. 3: Cuatro azúcares no reductores diferentes aumentan el resultado cuantitativo de QFN CMV.
Descripción detallada de la invención
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende", o variaciones tales como "que comprende" o "comprendiendo", implica la inclusión de un elemento indicado o entero o paso del método o grupo de elementos o enteros o pasos del método, pero no la exclusión de ningún otro elemento, o entero, o paso del método o grupo de elementos o enteros o pasos del método.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, las formas singulares "un", "una, uno" y "el, la" Incluyen aspectos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula T" incluye una sola célula T, así como dos o más células T; la referencia a "un antígeno" incluye un solo antígeno, así como dos o más antígenos. Asimismo, la referencia a un "agente", "reactivo", "molécula" y "compuesto" incluye entidades individuales y combinaciones de dos o más de dichas entidades. La referencia a "la divulgación" incluye aspectos individuales o múltiples enseñados por la presente divulgación, y así sucesivamente.
La invención se puede definir mediante las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con un primer aspecto, se divulga, pero no se reivindica como tal, un método para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células, dicho método comprende:
(a) proporcionar una composición de la incubación poniendo en contacto una muestra que comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno, con al menos un antígeno y con al menos un azúcar no reductor, y
(b) detectar la presencia o el nivel de una molécula efectora inmune.
Se describen en la presente memoria realizaciones y aplicaciones ventajosas de dicho método. De acuerdo con una realización del primer aspecto, se proporciona un método para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células en un sujeto, dicho método comprende:
(a) proporcionar una composición de la incubación poniendo en contacto una muestra que comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno obtenido de un sujeto, con al menos un antígeno y con al menos un azúcar no reductor, y
(b) detectar la presencia o el aumento en el nivel de una molécula efectora inmune.
La presencia (o ausencia) o el nivel elevado de la molécula efectora inmune es indicativo del nivel o la capacidad de la respuesta inmune mediada por células del sujeto. En particular, dicho método permite determinar si el sujeto se ha encontrado previamente con el antígeno o con un antígeno para el cual el antígeno analizado es representativo. De este modo, se puede determinar si el sujeto es capaz de generar una respuesta inmune mediada por células contra dicho antígeno. En ciertas realizaciones, también se puede determinar el nivel cuantitativo de la respuesta inmune mediada por células. La magnitud de la respuesta inmune mediada por células detectada en el ensayo actualmente divulgado puede, en ciertas realizaciones, correlacionarse con el estado de la enfermedad, la progresión y/o la gravedad de la enfermedad. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona medios para determinar la respuesta inmune mediada por células en un sujeto. El método descrito permite y/o apoya,inter alia,el diagnóstico de enfermedades, en particular enfermedades infecciosas, afecciones patológicas; permite determinar el nivel de inmunocompetencia y permite evaluar la respuesta de las células inmunes a agentes endógenos o exógenos, así como a tóxicos proteicos. El ensayo también permite el cribado o monitoreo de sujetos previamente expuestos a un antígeno particular, tal como un antígeno asociado con una enfermedad, infección o contaminante. Otras aplicaciones y utilidades importantes de dicho método se van a describir posteriormente.
Se reivindica un método para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células, de acuerdo con la reivindicación 1, dicho método comprende:
(a) proporcionar una composición de la incubación poniendo en contacto una muestra que comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno peptídico con al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos y con al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes; y
(b) detectar la presencia o el nivel de al menos una molécula efectora inmune.
Se explicarán con detalle los pasos individuales del método y las realizaciones preferibles del método de acuerdo con el primer aspecto y de la invención reivindicada.
Paso (a)
En el paso (a), una muestra que comprende células Inmunes capaces de producir moléculas efectoras Inmunes después de la estimulación con un antígeno se pone en contacto con al menos un antígeno y con al menos un azúcar no reductor. Las células Inmunes y/o la muestra completa se pueden obtener, por ejemplo, de un sujeto cuya respuesta Inmune mediada por células se va a determinar.
La referencia a un "sujeto" incluye, por ejemplo, una especie humana o no humana, incluyendo primates, animales de granja (por ejemplo, ovejas, vacas, cerdos, caballos, burros, cabras), animales de prueba de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cobayas, hámsteres), animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos), especies aviares (por ejemplo, aves de corral, aves de aviario), reptiles y anfibios. El método divulgado en la presente memoria tiene aplicabilidad en investigación, medicina humana, así como en aplicaciones ganaderas, veterinarias y de vida silvestre. Preferiblemente, el sujeto es un humano y el método de la respuesta inmune mediada por células descrito en la presente memoria se utiliza en el cribado para la respuesta a microorganismos patogénicos, virus y parásitos, condiciones de la enfermedad, potencial para el desarrollo o el monitoreo de afecciones autoinmunes, monitoreo de la respuesta de un sujeto al reto oncológico o inmunoterapia, monitoreo de la inmunidad mediada por células contra una enfermedad y para determinar la presencia de cualquier inmunodeficiencia o inmunosupresión. Esta última puede ocurrir, por ejemplo, debido a ciertos medicamentos, incluyendo diversos agentes quimioterapéuticos. Alternativamente, la exposición a tóxicos y contaminantes proteínicos ambientales se puede determinar utilizando el método de acuerdo con la presente invención.
La muestra comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno adecuado. Las "células inmunes" incluyen, pero no se limitan a, linfocitos, incluyendo células asesinas naturales (NK), células T, células B, macrófagos y monocitos, células dendríticas o cualquier otra célula inmune que sea capaz de producir una o más moléculas efectoras inmunes en respuesta a la estimulación por antígeno, directa o indirecta. Preferiblemente, la muestra comprende linfocitos, más preferiblemente linfocitos T. Los términos "células T" y "linfocitos T" se utilizan indistintamente en la presente memoria. Las células T son capaces de provocar una respuesta inmune fuerte si reconocen el antígeno administrado. Si las células T han sido expuestas previamente al antígeno analizado o a un antígeno para el cual el antígeno analizado es representativo, se produce una rápida reestimulación de las células T con memoria específica de dicho antígeno. Estas células T específicas del antígeno responden secretando moléculas efectoras inmunes, tal como en particular el interferón gamma. El interferón gamma, o una molécula efectora inmune liberada en respuesta al interferón gamma liberado, se puede medir entonces como un marcador específico de la respuesta inmune frente al antígeno analizado. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, la muestra comprende linfocitos T, preferiblemente células T auxiliares CD4+ y/o células T citotóxicas CD8+. Preferiblemente, la muestra también comprende las células estimuladoras correspondientes, en particular las células presentadoras del antígeno, las cuales son capaces de presentar el antígeno analizado a las células T. Sin embargo, también se pueden añadir por separado a la composición de la incubación células presentadoras del antígeno adecuadas. Las células presentadoras del antígeno (APC) añadidas respectivas incluyen células o partículas presentadoras del antígeno naturales y artificiales. Por ejemplo, se pueden añadir opcionalmente por separado a la composición de la incubación células estimuladoras, tal como células presentadoras del antígeno autólogas irradiadas o células presentadoras del antígeno con HLA pareado, las cuales posteriormente presentan el antígeno a las células T. Esta realización es viable, por ejemplo, si la muestra no comprende las células estimuladoras respectivas necesarias para inducir una respuesta de células T. Las realizaciones de células presentadoras del antígeno artificiales incluyen, pero no se limitan a, partículas o vesículas lipídicas con moléculas o péptidos del MHC recombinantes asociados y moléculas coestimuladoras recombinantes.
Preferiblemente, la muestra se obtiene de un sujeto. De acuerdo con una realización, la muestra es un fluido corporal que comprende células inmunes o es una porción que contiene células inmunes derivada de un fluido corporal respectivo. De acuerdo con una realización preferible, la muestra es sangre completa. Por "sangre completa" se entiende sangre de un sujeto que no ha sido diluida ni fraccionada sustancialmente. De acuerdo con una realización, la muestra de sangre completa es sangre periférica, SI bien la sangre completa es la muestra preferible y más conveniente para determinar la actividad de la respuesta inmune mediada por células, también se pueden utilizar otras muestras que contengan células inmunes, Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, fluido linfático, líquido cefalorraquídeo, fluido tisular (tal como médula ósea o fluido del timo) y líquido respiratorio, incluyendo líquido nasal y pulmonar, y lavado broncoalveolar, También se pueden utilizar como muestra porciones o derivados de las muestras mencionadas anteriormente, por ejemplo, muestras desprovistas de células innecesarias para medir la respuesta inmune mediada por células, y se pueden obtener mediante el procesamiento de muestras, Por ejemplo, la sangre completa se puede tratar para eliminar componentes innecesarios para la respuesta CMI, tal como glóbulos rojos y/o plaquetas, mediante métodos conocidos en la técnica, o se puede procesar para enriquecer los glóbulos blancos, También se pueden obtener células de la capa leucocítica o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante métodos conocidos en la técnica y utilizarse como muestra, De acuerdo con una realización, las células inmunes cultivadas se utilizan como muestra, Además, también se pueden utilizar células criopreservadas, por ejemplo, células PBMC criopreservadas, como fuente de células inmunes del sujeto y, por lo tanto, como muestra, Por ejemplo, las células PBMC descongeladas se pueden poner en contacto con un medio de cultivo para proporcionar la muestra que comprende células inmunes, la cual posteriormente se pone en contacto y se incuba con un antígeno y el azúcar no reductor, que preferiblemente se añaden en forma de una sola composición, De acuerdo con una realización, la muestra comprende todas las células inmunes necesarias para mediar una respuesta inmune celular, Sin embargo, como se describió anteriormente, también está dentro del alcance de la presente invención añadir por separado células estimuladoras, en particular células presentadoras del antígeno, De acuerdo con una realización, la muestra comprende al menos células T (linfocitos T) y células NK (linfocitos NK). De acuerdo con una realización, la muestra no se diluye en más del 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o 3% antes de poner la muestra en contacto con el antígeno y/o el azúcar no reductor,
La muestra que se va a analizar se pone en contacto con al menos un antígeno y con al menos un azúcar no reductor para proporcionar una composición de la incubación,
El término "antígeno", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere en particular a cualquier molécula o agente que es capaz de estimular o reestimular una respuesta inmune, y en particular es capaz de estimular o reestimular una respuesta inmune celular, Por lo tanto, el término "antígeno" se utiliza en un sentido amplio, El termino en particular se refiere a cualquier molécula o agente que se pueda unir por un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y se puede presentar a un receptor de células T, o se puede unir por un anticuerpo, El termino también se puede referir a cualquier molécula o agente que se pueda unir por proteínas MHC no clásicas, tal como, por ejemplo, CD1d u otros miembros de la familia CD1, De acuerdo con una realización, el antígeno es un inmunógeno, De acuerdo con una realización, el antígeno no es un inmunógeno, Los antígenos incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, haptenos, alérgenos o toxinas, o cualquier molécula natural o sintética, o partes de los mismos, De acuerdo con una realización, el antígeno es un patógeno inactivo o una porción o lisado del mismo, De acuerdo con una realización, el antígeno se selecciona del grupo que consiste en péptidos, proteínas, incluyendo glucoproteínas, carbohidratos, fosfolípidos, fosfoproteínas, fosfolipoproteínas y fragmentos de los anteriores, El término "péptido", tal como se utiliza en la presente memoria, también incluye polipéptidos y proteínas, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, El término "proteína" también incluye formas modificadas tal como glucoproteínas y fosfoproteínas, De acuerdo con una realización, el antígeno comprende uno o más péptidos de longitud completa o parcial, De acuerdo con una realización, el antígeno está proporcionado por un péptido, De acuerdo con una realización, el uno o más péptidos utilizados como antígeno tienen una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 7 a 50 aminoácidos, De acuerdo con una realización, el antígeno está proporcionado por un conjunto de péptidos de uno o más péptidos diferentes de longitud completa o parcial, Un conjunto de péptidos comprende al menos dos péptidos e incluye, en una realización, una serie de péptidos superpuestos o no superpuestos, Un conjunto respectivo de péptidos puede cubrir la longitud total o parcial de un antígeno proteico natural, Sin embargo, los péptidos no necesariamente tienen que superponerse,<o>se pueden superponer en un aminoácido<o>en múltiples aminoácidos. De acuerdo con una realización, se utiliza un conjunto de péptidos que abarca de 80%-100% de un péptido o antígeno proteico natural.
De acuerdo con una realización, el antígeno está proporcionado por al menos un péptido que es reconocido por una célula T citotóxica CD8+. Para esta realización, el antígeno está proporcionado preferiblemente por al menos un péptido que tiene una longitud inferior a 15 aminoácidos, preferiblemente 13 aminoácidos o menos, 12 aminoácidos o menos, 11 aminoácidos o menos, o 10 aminoácidos o menos. Los intervalos de tamaño adecuado para un péptido respectivo que es reconocido por una célula T citotóxica CD8+ incluyen de 7-14 residuos de aminoácidos, de 7-13 residuos de aminoácidos, de 8 a 12 residuos de aminoácidos, de 8-11 residuos de aminoácidos y de 8 a 10 residuos de aminoácidos. También se puede utilizar un conjunto de péptidos que comprende o consiste en péptidos que son reconocidos por las células T citotóxicas CD8+. Dichos péptidos pueden abarcar la totalidad o parte de un antígeno proteico, tal como un antígeno proteico natural. Se ha encontrado que los ensayos que incorporan péptidos cortos respectivos como antígeno muestran una disminución significativa en la actividad del ensayo durante el almacenamiento en la presencia de azúcares simples tal como glucosa o dextrosa. Esto no se observa cuando se utilizan azúcares no reductores, como se enseña en la presente invención. Aquí, la sensibilidad del ensayo aún queda por ser aumentada debido a la incorporación del azúcar no reductor, incluso después del almacenamiento prolongado de los componentes del ensayo. Esta es una ventaja importante cuando se utiliza una composición que comprende un antígeno peptídico que es reconocido por una célula T citotóxica CD8+ y un azúcar no reductor, por ejemplo, como compuesto del kit, componente respectivo.
De acuerdo con una realización, el antígeno se proporciona mediante al menos dos conjuntos de péptidos, un primer conjunto que comprende al menos un péptido de alrededor de 7 a 14 residuos de aminoácidos de longitud y un segundo conjunto que comprende al menos un péptido de 15 residuos de aminoácidos o más, cuyos péptidos abarcan la totalidad o parte de un antígeno proteico. Cada conjunto respectivo comprende desde al menos un péptido hasta una serie de péptidos superpuestos o no superpuestos. La coincubación de los péptidos de 7 a 14 aminoácidos y los péptidos de >15 aminoácidos derivados de o correspondientes a un antígeno proteico representativo de la enfermedad o afección que se va a analizar con las células inmunes comprendidas en la muestra resulta en un ensayo más sensible, lo que permite una detección más temprana de la estimulación de las células inmunes, y en particular de los linfocitos, de lo que sería posible de otro modo. La capacidad de aumentar la sensibilidad de un ensayo de respuesta inmune mediada por células reduce ventajosamente el límite de detección y/o permite el uso de métodos menos sensibles para detectar las moléculas efectoras. Por lo tanto, resulta benéfico utilizar al menos dos conjuntos de péptidos respectivos en combinación con un azúcar no reductor. Sin limitarse a la teoría ni al modo de acción, se cree que los dos conjuntos de péptidos, los péptidos de 7 a 14 meros y los péptidos de > 15 meros, permiten la detección tanto por células T CD4+ como CD8+. Las células T CD4+ reconocen los péptidos de > 15 meros y las células T CD8+ reconocen los péptidos de 7 a 14 meros. Estos péptidos se pueden denominar en la presente memoria como "péptidos CD4+" (péptidos de >15 meros) o "péptidos CD8+" (péptidos de 7 a 14 meros). Cada conjunto comprende al menos un péptido e incluye, en una realización, una serie de péptidos superpuestos. Por lo tanto, un primer conjunto puede contener una serie de péptidos superpuestos de entre 7 a 14 residuos de aminoácidos de longitud. Estos péptidos son reconocidos por las células T CD8+ (péptidos CD8+). Un segundo conjunto puede contener una serie de péptidos superpuestos de más de 15 residuos de aminoácidos de longitud. Estos péptidos son reconocidos por las células T CD4+ citotóxicas (péptidos CD4+). Ambos conjuntos de péptidos pueden cubrir la longitud total o parcial de un antígeno proteico, por ejemplo, un antígeno proteico natural representativo de la enfermedad o afección que se va a analizar. Los péptidos no tienen por qué necesariamente superponerse, o se pueden superponer en un aminoácido o en múltiples aminoácidos. Los péptidos incluyen cápsulas de péptidos, las cuales abarcan y, por lo tanto, cubren de 80%-100% de un antígeno proteico. De "80-100%" significa 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%. La referencia a una serie de péptidos superpuestos de alrededor de 7 a 14 residuos de aminoácidos de longitud que abarcan la totalidad<o>parte de un antígeno proteico, de acuerdo con una realización, se refiere a un péptido de alrededor de 7 residuos de aminoácidos de longitud hasta un máximo de 14 residuos de aminoácidos, los cuales en total abarcan desde cada residuo de aminoácido, los cuales en total abarcan residuos de aminoácidos de hasta 6 residuos de aminoácidos de un antígeno proteico desde su N terminal hasta su C terminal o parte del mismo. Por lo tanto, si la longitud de un péptido determinado es de x residuos de aminoácidos de longitud, en el que x de alrededor de 7 a 14, entonces el grado de superposición entre dos péptidos consecutivos es de x-1 a x-6. En una realización, la superposición de cada péptido consecutivo es x-1. Una serie de péptidos superpuestos de > 15 residuos de aminoácidos de longitud también abarcan la totalidad o parte de un antígeno proteico, en el que cada péptido tiene al menos 15 residuos de aminoácidos de longitud o hasta la longitud completa del antígeno proteico.
En una realización, un péptido de >15 residuos de aminoácidos de longitud tiene de 15 a 50 aminoácidos, tal como 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 residuos de aminoácidos.
La presente divulgación incluye el caso donde cada péptido en la serie o conjunto de péptidos tiene la misma longitud (es decir, x). Sin embargo, la serie de péptidos o el conjunto de péptidos puede comprender una mezcla de péptidos x1, x2, xj... xi, donde, de acuerdo con una realización, cada uno de los péptidos xi tiene una longitud de alrededor de 7 a 14 residuos de aminoácidos o de >15 residuos de aminoácidos de longitud. Los péptidos CD4+ y/o CD8+ se pueden dividir en grupos de péptidos separados. Se pueden añadir por separado a la muestra o se pueden incluir en una composición, preferiblemente junto con el azúcar no reductor. Esta composición se puede poner en contacto con la muestra para preparar la composición de la incubación.
En algunas realizaciones, se emplean uno o más antígenos que imitan uno o más de los efectos de los antígenos presentados al sistema inmunein vivo.De acuerdo con una realización, el antígeno se selecciona de un autoantígeno, un antígeno derivado de o que presenta reactividad cruzada con un antígeno de un organismo patogénico, una molécula metálica o inorgánica que estimula la respuesta inmune o un antígeno asociado a un tumor. De acuerdo con una realización, el antígeno se deriva de, y por lo tanto presenta reactividad cruzada con un antígeno de un patógeno asociado con una condición de la enfermedad, o es un antígeno asociado a un tumor asociado con un cáncer, o es o se deriva de un tóxico. De acuerdo con una realización, la muestra se pone en contacto con un antígeno que es específico para la enfermedad o afección para la que se va a evaluar la respuesta inmune mediada por células, por ejemplo, un antígeno asociado o representativo de la enfermedad o afección que se va a evaluar. De acuerdo con una realización, el antígeno es un antígeno específico de la enfermedad, en particular un antígeno específico del patógeno. En algunas realizaciones, el patógeno es una bacteria, un virus, un parásito o un hongo. En una realización ilustrativa, el antígeno es un antígeno de una micobacteria, en particularMycobacteriumtuberculosis. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el antígeno es un antígeno específico de la tuberculosis (TB). Por ejemplo, el antígeno puede ser un derivado proteico purificado de Mycobacterium tuberculosis o M. avium. En algunas realizaciones, el antígeno simula proteínas micobacterianas tal como ESAT-6, CFP- 10 y TB7, respectivamente TB7.7. En otra realización ilustrativa, el antígeno proviene de o es especifico de un virus, tal como el citomegalovirus (CMV).
Posteriormente se describen ejemplos adicionales de antígenos, en particular antígenos específicos de enfermedades. Además, la muestra se pone en contacto en el paso a) con un azúcar no reductor. Un "azúcar no reductor" se refiere, en particular, a un azúcar que no reacciona con un reactivo de detección para azúcares reductores, como la solución de Fehling, el reactivo de Benedict o el reactivo de Tollens. Un azúcar no reductor no comprende un extremo reductor libre y, por lo tanto, no comprende un grupo libre de aldehído o libre de cetona. El azúcar no reductor puede tener cualquier longitud y puede ser lineal o ramificado. En ciertas realizaciones, el azúcar no reductor comprende al menos dos unidades de monosacárido. De acuerdo con una realización, en todas y cada una de las unidades de monosacárido del azúcar no reductor, los átomos de carbono vecinos al átomo de oxígeno en la estructura del anillo no comprenden un grupo hidroxilo y, por lo tanto, no comprenden un grupo hidroxilo anomérico. De acuerdo con una realización, las estructuras de anillo de las unidades de monosacárido del oligosacárido no reductor no comprenden un grupo hemiaeetal<o>hemieetal. De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor es un oligosaoárido que comprende 10 unidades de monosacárido o menos, más preferiblemente 8 unidades de monosacárido o menos, 6 unidades de monosacárido o menos, 5 unidades de monosacárido o menos, 4 unidades de monosacárido o menos, 3 unidades de monosacárido o menos o 2 unidades de monosacárido. Preferiblemente, el azúcar no reductor es un disacárido. De acuerdo con una realización, los enlaces glucosídicos se forman entre las unidades de monosacárido uniendo el extremo reductor de una unidad de monosacárido al extremo reductor de otra unidad de monosacárido. Los ejemplos preferibles de azúcar no reductor son la sacarosa y la trehalosa. Además, como se muestra en los ejemplos, el manitol y la rafinosa también se pueden utilizar como azúcar no reductor. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, el azúcar no reductor se selecciona entre trehalosa, manitol, sacarosa y rafinosa. Como se demuestra en los ejemplos, estos azúcares no reductores ejemplares aumentan la magnitud de la respuesta. La trehalosa es particularmente preferible porque los experimentos demuestran que la trehalosa aumenta la magnitud de la respuesta y, por lo tanto, puede aumentar la sensibilidad del ensayo y adicionalmente, una composición que comprende trehalosa y un antígeno muestra una excelente estabilidad de almacenamiento. Como se demuestra en los ejemplos, entre los azúcares no reductores analizados, el efecto de aumento de la respuesta fue más fuerte con trehalosa. Sin embargo, el azúcar no reductor también puede ser un monosacárido, en el que, por ejemplo, el extremo reductor está acoplado y por lo tanto bloqueado por otra entidad química. Por consiguiente, el azúcar no reductor se puede derivatizar. Los ejemplos de derivados de azúcar son los aminoazúcares en los que uno o más grupos hidroxilo están sustituidos por un grupo amino o un grupo acetilamino. En realizaciones preferibles el azúcar no reductor no está sustituido y, en particular, no está derivatizado. De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor no es un polisacárido. En ciertas realizaciones, el azúcar no reductor no está unido a una proteína, un péptido o lípido u otra macromolécula. De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor no está comprendido en un medio de cultivo celular ni en otro medio. De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor no está comprendido en un líquido. El azúcar no reductor es metabolizable por las células inmunes comprendidas en la muestra. De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor es un azúcar no reductor que, cuando está presente en una concentración adecuada en la composición de la incubación que comprende la muestra y el antígeno, es capaz de aumentar la liberación del interferón gamma por las células T reestimuladas.
Al poner en contacto la muestra con el antígeno, el azúcar no reductor y, opcionalmente, aditivos adicionales, se proporciona una composición de la incubación. Preferiblemente, dicha composición de la incubación se incuba por encima de la temperatura ambiente y, por lo tanto, a temperaturas elevadas. Preferiblemente, la temperatura de incubación es superior a 30 °C, preferiblemente superior a 35 °C. Los intervalos adecuados para la temperatura de incubación incluyen 30 °C a 40 °C, preferiblemente 35 °C a 40 °C. Convenientemente, la composición de la incubación se incuba a 37 °C /- 1 °C. Preferiblemente, la composición de la incubación se incuba durante al menos 2 horas a temperaturas elevadas tales que permitan la estimulación de las células inmunes por el antígeno y la producción de moléculas efectoras inmunes. El paso de la incubación puede ser de 2 a 50 horas, tal como de 2 a 40 horas, 5 a 30 horas, 8 a 24 horas, 16 a 24 horas, o un período de tiempo intermedio incluyendo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 horas. En algunas realizaciones, después de un paso de mezcla inicial opcional para distribuir el/los antígeno(s), el azúcar no reductor y la muestra en toda la composición de la incubación, la incubación se lleva a cabo sin mezclar adicionalmente.
En la composición de la incubación, el azúcar no reductor está presente en una concentración en la que es efectiva para mejorar la estimulación y la reestimulación respectiva de las células del sistema inmune por el antígeno. Por lo tanto, el azúcar no reductor se añade en una concentración en la que, en una muestra positiva, es decir, una muestra la cual es inmunorresponsiva al antígeno, la adición del azúcar no reductor a la composición de la incubación aumenta el nivel de moléculas efectoras inmunes producidas, preferiblemente interferón gamma, en comparación de cuando no se añade el azúcar no reductor. Por lo tanto, el azúcar no reductor se añade en una concentración en la que aumenta la magnitud de la respuesta de la molécula efectora Inmune, ya que se producen más moléculas efectoras Inmunes en una muestra que muestra una respuesta Inmune mediada por células. Preferiblemente, el azúcar no reductor se utiliza en una concentración en la que aumenta la respuesta de la molécula efectora Inmune al menos 1.1 veces, preferiblemente al menos 1.2 veces, más preferiblemente al menos 1.3 veces. De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor mantiene la capacidad de las células Inmunes comprendidas en la muestra para mediar una respuesta respectiva durante períodos de tiempo prolongados. De acuerdo con una realización, la concentración del azúcar no reductor en la composición de la Incubación es de al menos 1 mg/ml, al menos 1.5 mg/ml, preferiblemente al menos 1.75 mg/ml, más preferiblemente al menos 2 mg/ml. Los Intervalos ejemplares Incluyen, pero no se limitan a 1 mg/ml a 20 mg/ml, 1.5 mg/ml a 17.5 mg/ml, 2 mg/ml a 15 mg/ml, 3 mg/ml a 15 mg/ml, 4 mg/ml a 12.5 mg/ml y 5 mg/ml a 10 mg/ml. Como se muestra en los ejemplos, estos Intervalos son adecuados, por ejemplo, para trehalosa. También son adecuados para otros azúcares no reductores, tal como sacarosa, manitol y rafinosa, como se demuestra en los ejemplos. De acuerdo con una realización, la concentración del azúcar no reductor en la composición de la Incubación se encuentra en un Intervalo de 1.5 mg/ml a 10 mg/ml, por ejemplo, de 1.75 mg/ml a 7.5 mg/ml o de 2 mg/ml a 5 mg/ml. Las concentraciones adecuadas también pueden ser determinadas por la persona experta siguiendo las enseñanzas descritas en la presente memoria.
Se pueden añadir uno o más aditivos adicionales y por lo tanto Incluirse en la composición de la Incubación. Por ejemplo, se pueden añadir uno o más aditivos que son necesarios o ventajosos para la preparación de la muestra y/o la preservación de la muestra, tal como por ejemplo un anticoagulante adecuado si la muestra es una muestra de sangre. Preferiblemente, el anticoagulante es heparina. Los aditivos no deben estar comprendidos en una concentración en la que puedan interferir con la respuesta inmune mediada por células. De acuerdo con una realización, no se añade ningún azúcar simple a la composición de la incubación además del azúcar no reductor. De acuerdo con una realización, no se añade ningún azúcar reductor a la composición de la incubación, en particular ningún monosacárido reductor, además del azúcar no reductor.
De acuerdo con una realización, la muestra se pone en contacto con una composición que comprende el antígeno y el azúcar no reductor. Esta realización es particularmente ventajosa, ya que el usuario no tiene que añadir el azúcar no reductor por separado a la composición de la Incubación. El proporcionar estas composiciones listas para utilizar evita errores de manipulación y ahorra tiempo de trabajo. Opcionalmente, la composición que comprende el antígeno y el azúcar no reductor, comprende un diluyente o disolvente. Además, se pueden Incluir uno o más aditivos en dicha composición si se van a incluir en la composición de la incubación. Los aditivos no deben de interferir con la respuesta mediada por células. De acuerdo con una realización, la composición comprende adicionalmente un anticoagulante, preferiblemente heparina. De acuerdo con una realización, la composición no comprende un azúcar simple. De acuerdo con una realización, la composición no comprende un azúcar reductor, en particular, no comprende un monosacárido reductor.
Para preparar la composición de la Incubación, la composición que comprende el antígeno, el azúcar no reductor y, opcionalmente comprende uno o más aditivos adicionales, tal como un anticoagulante en el caso de una muestra de sangre, se pone en contacto con la muestra. La muestra se puede añadir a la composición o viceversa. Para preparar la composición de la incubación, se mezclan preferiblemente la muestra, el antígeno, el azúcar no reductor y el aditivo adicional (si está presente).
Los ejemplos de las formas de composiciones adecuadas incluyen composiciones líquidas, composiciones semilíquidas, composiciones gelatinosas y composiciones sólidas, en particular composiciones secas. De acuerdo con una realización, la composición que comprende el antígeno, el azúcar no reductor y, opcionalmente, un aditivo adicional está comprendida en un recipiente de recolección de muestra, preferiblemente un tubo de recolección de muestra, tal como un tubo de recolección de sangre. Esto resulta particularmente conveniente, ya que la muestra entra en contacto directo con la composición después de la recolección. De acuerdo con una realización, la composición que comprende el antígeno, el azúcar no reductor y, opcionalmente, un aditivo adicional se seca por pulverización en el interior del recipiente de recolección de muestra. L<os>métodos de secado por pulverización son bien conocidos en el estado de la técnica y, por lo tanto, no requieren una descripción detallada aquí.
De acuerdo con una realización, la muestra se obtiene de un sujeto y no se diluye tal como, por ejemplo, con cultivo tisular, medio, excipientes u otros agentes líquidos, antes del contacto con el azúcar no reductor y/o el antígeno. De acuerdo con una realización, la composición de la incubación comprende al menos 10% del volumen de la muestra.
El término "al menos 10% del volumen" incluye volúmenes de muestra de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y 100% por volumen, del volu de la incubación total.
Como se muestra en los ejemplos, la adición de un azúcar no reductor en el paso a) aumenta sorprendentemente la liberación de moléculas efectoras inmunes, como en particular el interterón gamma, lo que aumenta la sensibilidad del ensayo. Este efecto fue muy sorprendente, ya que hasta entonces se creía que este efecto solo se podía lograr con azúcares simples y, por lo tanto, mediante monosacáridos reductores. Además, se ha encontrado que las composiciones que comprenden el antígeno y un azúcar no reductor presentan una mejor estabilidad durante el almacenamiento, incluso a temperaturas elevadas. El efecto observado con los azúcares reductores, que disminuye la sensibilidad y la calidad del ensayo con el tiempo, no se observa con los azúcares no reductores. Por lo tanto, la presente invención realiza una importante contribución al estado de la técnica al proporcionar un ensayo sensible y estable durante el almacenamiento que mantiene el desempeño del ensayo incluso durante periodos de almacenamiento prolongados. La enseñanza de la presente invención permite convenientemente proporcionar el antígeno y el azúcar no reductor en una composición estable durante el almacenamiento. En la presente invención, el azúcar no reductor no se utiliza como estabilizador para el antígeno. Se mostró experimentalmente, que los antígenos, en particular los antígenos peptídicos, son muy estables durante el almacenamiento. Por lo tanto, no se observa ninguna disminución en el desempeño del ensayo si el antígeno se almacena en ausencia de un azúcar. Por lo tanto, el azúcar no reductor se utiliza para aumentar la sensibilidad del ensayo, en particular, aumentando la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes, en particular citocinas como el interterón gamma.
Paso (b)
En el paso (b), se detecta la presencia o el aumento en el nivel de una molécula efectora inmune. Como se describió anteriormente, la presencia (lo cual incluye la ausencia) o el nivel de una molécula efectora inmune es indicativa del nivel o la capacidad de respuesta inmune mediada por células del sujeto frente al antígeno analizado. En particular, dicho método permite determinar si el sujeto se ha encontrado previamente con el antígeno analizado o un antígeno que presente reactividad cruzada con el antígeno analizado, tal como el patógeno a detectar. De este modo, se puede determinar si el sujeto es capaz de generar una respuesta inmune mediada por células contra dicho antígeno, respectivamente el antígeno, patógeno o enfermedad para la que el antígeno analizado es representativo.
La detección de la molécula efectora inmune puede ocurrir a nivel de péptidos o proteínas, o a nivel de ácidos nucleicos, en particular, a nivel de expresión del ARNm de la molécula efectora inmune. En consecuencia, la referencia para la detección de la/el "presencia o nivel" de la molécula efectora inmune incluye datos directos e indirectos. Por ejemplo, la presencia o cantidad de moléculas efectoras inmunes se puede determinar directamente utilizando métodos de detección adecuados, tales como ELISA o ELISpot. Sin embargo, en una realización, la presencia o el nivel de la molécula efectora inmune se mide con base en su nivel de expresión de ARN. Los niveles elevados del ARNm de la molécula efectora inmune son datos indirectos que muestran niveles elevados de la molécula efectora inmune. Los métodos adecuados para determinar el nivel de expresión del ARNm de un gen diana son bien conocidos en el estado de la técnica y, por lo tanto, no requieren una descripción detallada. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la molécula efectora inmune se puede detectar utilizando ligandos o moléculas de unión, tal como anticuerpos específicos para la molécula efectora,<o>midiendo el nivel de expresión de I<os>genes que codifican para la molécula efectora inmune.
Las moléculas efectoras inmunes que se van a detectar pueden ser cualquiera de una variedad de moléculas, las cuales son producidas en respuesta a la activación, estimulación o reestimulación celular por un antígeno. Además, en el paso (b) se puede detectar más de una molécula efectora inmune o un patrón de moléculas efectoras inmunes liberadas al entrar en contacto la muestra con el antígeno analizado. La molécula efectora inmune que se va a medir puede ser producida por células inmunes, en particular se puede producir por linfocitos, tal como las células T, en particular las células T auxiliares CD4+ y/o las células T citotóxicas CD8+. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el método se basa en la medición de la producción de una o más moléculas efectoras inmunes por las células del sistema inmune, en particular las células T, en respuesta a la estimulación antigénica. Sin embargo, las células no inmunes también pueden liberar moléculas efectoras inmunes en respuesta a la estimulación, la reestimulación respectiva de las células inmunes por el antígeno, ya que son estimuladas por las moléculas efectoras inmunes que son liberadas por las células inmunes, en particular por moléculas efectoras inmunes tal como el IFN-gamma liberado por las células T reestimuladas. Estas moléculas efectoras inmunes también pueden ser una fuente importante de información. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, la molécula efectora inmune que se va a detectar puede ser la molécula efectora inmediata producida por las células T efectoras en respuesta a la reestimulación del antígeno. En otras realizaciones, se mide una molécula efectora inmune corriente abajo. Por ejemplo, el IFN-gamma u otras moléculas efectoras inmunes inmediatas producidas por células inmunes, en particular por las células T que son (re)estimuladas por el antígeno analizado, se pueden medir en el paso (b). Sin embargo, como se describió anteriormente, estas moléculas a menudo inducen o aumentan la producción de moléculas efectoras inmunes adicionales por otras células. La producción de estas moléculas efectoras inmunes adicionales (corriente abajo) también se puede medir en el paso (b). La presente invención también abarca la detección de más de un tipo de molécula efectora inmune en el paso (b). De acuerdo con una realización, la presencia o el nivel de un patrón de moléculas efectoras inmunes se detecta en el paso (b), ya sea solo o junto con moléculas efectoras inmunes inmediatas, tal como el IFN-gamma. Un patrón respectivo comprende más de dos, preferiblemente más de tres, moléculas efectoras inmunes diferentes. El análisis de un patrón respectivo puede proporcionar información valiosa sobre el estado inmune del sujeto. Por ejemplo, moléculas efectoras inmunes específicas o patrones de moléculas efectoras inmunes pueden ser característicos de enfermedades específicas.
De acuerdo con una realización, la molécula efectora inmune que se va a medir en el paso (b) es una citocina, tal como una linfocina, una interleucina o una quimiocina. Un interferón (IFN), tal como el IFN-gamma, es particularmente útil como molécula efectora inmune a determinar. Otros ejemplos de moléculas efectoras inmunes incluyen, pero no se limitan a una gama de citocinas tal como las interleucinas (IL), por ejemplo: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-10, IL-12, IL-13, IL-16 (LCF) o IL-17, IL-1 a (IL-1F1), IL-1 p (IL-1 F2), IL-1 ra (IL-1 F3), Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a), Factor de Crecimiento Transformante beta (TGF-p), un Factor Estimulante de Colonias (CSF) tal como Granulocitos (G)-CSF o Granulocitos Macrófagos (GM)-CSF, componente del complemento 5a (C5a), Groa (CXCL1), sICAM-1 (CD54), IP-10 (CXCL10), I-TAC (CXCL11), MCP-1 (CCL2), MIF (GIF), MIP-1a (CCL3), MIP-1 p (CCL4), Serpina E1 (PAI-1), RANTES (CCL5) o MIG (CXCL9). En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos en los que la molécula efectora inmune que se va a detectar en el paso (b) es una citocina, un componente del sistema del complemento, perforina, defensina, catelicidina, granzima, ligando Fas, ligando CD-40, exotaxina, una citotoxina, una quimiocina o una monocina. En realizaciones preferibles, la molécula efectora inmune detectada en el paso (b) es el IFN-gamma. Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferible, la presente divulgación proporciona un método para medir la respuesta inmune mediada por células en un sujeto, dicho método comprende la recolección de una muestra de dicho sujeto en un recipiente de recolección, en el que dicha muestra comprende células del sistema inmune que son capaces de producir IFN-gamma después de la estimulación con un antígeno, la incubación de dicha muestra con un antígeno y un azúcar no reductor, y la medición posterior de la presencia o el aumento en el nivel del ÍFN-gamma, en el que la presencia<o>el nivel del IFN-gamma es Indicativo de la capacidad de dicho sujeto para generar una respuesta inmune mediada por células.
También se puede detectar una combinación de moléculas efectoras inmunes en el paso (b), Por lo tanto, el paso (b) comprende en particular la detección de una molécula efectora inmune<o>una combinación de moléculas efectoras inmunes, en particular citocinas, liberadas en respuesta a la estimulación con el antígeno y característico de la enfermedad<o>afección que se va a analizar, Además, el nivel de una<o>más moléculas efectoras inmunes se puede cribar de forma individual<o>en combinación con otros biomarcadores<o>indicadores de la enfermedad,
De acuerdo con una realización, la molécula efectora inmune se detecta utilizando un ligando que se une específicamente a la molécula efectora inmune, Los ligandos de los efectores inmunes son particularmente útiles para detectar y/o cuantificar estas moléculas, Las células comprendidas en la composición de la incubación se pueden eliminar antes de detectar la molécula efectora inmune, Las técnicas para los ensayos de detección que se pueden utilizar en el paso (b) son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayos, ensayos de sándwich, ELISA y ELISpot. Los anticuerpos contra los efectores inmunes son particularmente útiles como ligandos, La referencia a "anticuerpos" incluye partes de anticuerpos que se unen específicamente a la molécula efectora inmune, tal como fragmentos Fab, anticuerpos mamíferoizados (por ejemplo, humanizados), anticuerpos desinmunizados, anticuerpos recombinantes o sintéticos, y anticuerpos híbridos y de cadena sencilla, Tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales se pueden obtener mediante inmunización con moléculas efectoras inmunes o fragmentos antigénicos de las mismas, y ambos tipos son utilizables en inmunoensayos, Los métodos para obtener ambos tipos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica, Los anticuerpos policlonales son menos preferibles, pero se preparan con relativa facilidad mediante la inyección de una cantidad efectiva del efector inmune,<o>la parte antigénica del mismo, en un animal de laboratorio adecuado, recolectando suero del animal y aislando sueros específicos mediante cualquiera de las técnicas de inmunoadsorción conocidas, Aunque los anticuerpos producidos por este método se pueden utilizar en prácticamente cualquier tipo de inmunoensayo, generalmente son menos recomendables debido a la posible heterogeneidad del producto, El uso de anticuerpos monoclonales en un inmunoensayo es particularmente útil debido a la capacidad para producirlos en grandes cantidades y a la homogeneidad del producto, La preparación de líneas celulares del hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales derivados de la fusión de una línea celular inmortal y linfocitos sensibilizados contra la preparación inmunogénica se puede realizar mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, También están disponibles comercialmente anticuerpos contra moléculas efectoras inmunes específicas,
De acuerdo con una realización, el paso (b) comprende poner en contacto la composición de la incubación o una porción de la misma, tal como, por ejemplo, una porción depletada de células de la misma, con un anticuerpo<o>un fragmento del mismo específico para la molécula efectora inmune que se va a detectar, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un complejo anticuerpo-efector, y posteriormente la detección de dicho complejo, Como se describió anteriormente, las células comprendidas en la composición de la incubación se pueden eliminar, por ejemplo, mediante centrifugación, antes de la detección, Por ejemplo, cuando se utiliza sangre como muestra, las células se pueden separar de la composición de la incubación después de la incubación y, por lo tanto, producir y liberar moléculas efectoras inmunes antes de la detección, proporcionando así básicamente una muestra de plasma,
Está disponible una amplia gama de técnicas de inmunoensayo, como se puede observar por referencia a las patentes US Nos, 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653, Los ensayos respectivos que se pueden utilizar junto con las pruebas de la respuesta inmune mediada por células descritas en la presente memoria para detectar a las moléculas efectoras inmunes producidas también se describen en W02004/042396, W02008/113119, W02010/009494 y W02011/075773, Asimismo, Clayet al, " Assays for monitoring celular immune responses to active immunotherapy of cáncer; Clinical Cáncer Research 2001; 7: 1127-1135", describen diversos métodos para monitorear las respuestas inmunes celulares, describiendo así también ensayos adecuados para detectar las moléculas efectoras inmunes producidas en respuesta a la (re)estimulación antigénioa. En ellos, por ejemplo, se describen ensayos basados en ELISA, ensayos ELISpot y ensayos basados en ácidos nucleicos, tal como la medición de los niveles del ARNm de citocinas mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Opcionalmente, cuando se determina el nivel de una molécula efectora inmune con base en su nivel de expresión del ARN, los datos obtenidos se pueden normalizar a la expresión de un gen control, como por ejemplo CD8. También se pueden utilizar los métodos respectivos junto con la presente invención para detectar las moléculas efectoras inmunes producidas. De acuerdo con una realización, se utiliza un ensayo basado en ácidos nucleicos para detectar la presencia o el nivel de una molécula efectora inmune. Los ácidos nucleicos, en particular ARN, se pueden aislar de la composición de la incubación o de la porción celular de la misma utilizando métodos estándar bien conocidos en la técnica anterior. Preferiblemente, la presencia o el aumento de la expresión de la molécula efectora inmune se detecta en esta realización utilizando ensayos basados en amplificación, preferiblemente ensayos basados en PCR. El ARN aislado se puede primero transcribir de forma reversa a ADNc antes de la amplificación utilizando cebadores y/o sondas específicas para la molécula efectora inmune que se va a detectar.
Preferiblemente, la detección es cuantitativa. Un método adecuado es la PCR de RT (transcripción reversa) cuantitativa en tiempo real.
Preferiblemente, la detección de la molécula efectora inmune en el paso (b) es una detección cuantitativa.
Realizaciones específicas
Realizaciones específicas y preferibles del método y los componentes utilizados en el mismo se van a describir a continuación.
Como se describió anteriormente, en el paso (a), se pueden incluir uno o más aditivos adicionales en la composición de la incubación. De acuerdo con una realización, se añade un agente a la composición de la incubación para modular la actividad de las células T reguladoras (células T-reg). Esto último incluye la inhibición de la función supresora de las células T-reg. Los agentes que modulan a las células T-reg contemplados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a un ligando CD25, un oligonucleótido sentido o antisentido para material genético que codifica para JAK1 o TYK2, un anticuerpo neutralizante, un oligonucleótido que contiene CpG, un oligonucleótido que actúa como un agente modulador del receptor tipo Toll (TLR) y otros agentes moduladores de TLR. En una realización particular, las células T-reg son células supresoras de la respuesta inmune cuya actividad es inhibida por el agente modulador. Una "molécula CpG" significa un oligonucleótido que comprende una secuencia o motivo CpG. Los ejemplos de inhibidores o moduladores de la función T-reg incluyen los ligandos de CD25, incluyendo, pero no limitado a un anticuerpo policlonal o monoclonal para CD25 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, anticuerpos policlonales o monoclonales para CD25 humanizados o desinmunizados, o una forma recombinante o sintética de los anticuerpos policlonales o monoclonales. Otros ejemplos de agentes incluyen ácidos nucleicos con sentido o antisentido y moléculas dirigidas al ARNm o ADN que codifica para Tirosina Cinasa Janus 1 (JAK1) o Tirosina Cinasa 2 (TYK2), o inhibidores de moléculas pequeñas de las proteínas JAK1 o TYK2. La referencia a "moléculas pequeñas" incluye los receptores de nuevos antígenos de inmunoglobulina (lgNARs), como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO 2005/118629. Aun otros ejemplos adicionales de agentes estimulantes adecuados tal como las moléculas CpG que actúan a través de los receptores tipo Toll (TLRs) u otros mecanismos. Por lo tanto, los oligonucleótidos que contienen CpG y un oligonucleótido que actúa como agente modulador de TLR también forman parte de la presente divulgación. Se puede utilizar un solo tipo de agente o se pueden utilizar dos o más tipos de agentes para modular a las células T-reg. Por ejemplo, el ensayo se puede realizar con un ligando CD25 y un oligonucleótido sentido o antisentido de JAK1/TYK2; un ligando CD25 y un agente modulador de TLR; un oligonucleótido sentido o antisentido de JAK1/TYK2 y un agente modulador de TLR; o un ligando CD25, un oligonucleótido sentido o antisentido de JAK1/TYK2 y un agente modulador de TLR. Alternativamente, se emplea solo un tipo de agente. En otra alternativa, se utiliza un oligonucleótido que comprende CpG y un agente modulador de TLR. L<os>respectivos agentes moduladores de T reg se pueden añadir por separado a la muestra y/o a la composición de la incubación,<o>se pueden incluir en la composición que comprende el antígeno y/o el azúcar no reductor.
De acuerdo con una realización, el método comprende
(a) preparar una composición de la incubación poniendo en contacto una muestra de sangre completa obtenida de un sujeto humano con una composición que comprende al menos un antígeno peptídico y al menos un disacárido no reductor, preferiblemente trehalosa<o>sacarosa, e incubando la composición de la incubación durante al menos 2 horas por encima de la temperatura ambiente; y
(b) detectar la presencia<o>el nivel del IFN-gamma;
en el que la presencia o el nivel del IFN-gamma es indicativo del nivel de respuesta inmune mediada por células del sujeto humano.
Preferiblemente, el antígeno peptídico es un antígeno específico para una enfermedad<o>patógeno. Se describen ejemplos no limitativos de patógenos en la presente memoria. De acuerdo con una realización, el patógeno es un virus y el método permite determinar si el sujeto humano tiene la capacidad de generar una respuesta inmune mediada por células antiviral.
De acuerdo con una realización, el método comprende adicionalmente
(c) comparar el nivel detectado de la molécula efectora inmune<o>un valor derivado del mismo con un nivel de referencia.
El paso (c) comprende comparar el nivel determinado de la molécula efectora inmune o un valor derivado del mismo con un nivel de referencia. Esta realización es particularmente útil para diagnosticar una infección por un patógeno para la cual el antígeno es representativo. Si dicho sujeto está infectado con el patógeno, el nivel determinado de la molécula efectora inmune o un valor derivado del mismo está por encima del nivel de referencia y si dicho sujeto no está infectado con el patógeno, el nivel determinado de la molécula efectora inmune o un valor derivado del mismo está por debajo del nivel de referencia. El mismo principio se aplica para determinar si dicho sujeto es capaz de generar una respuesta inmune mediada por células contra un patógeno para el cual el antígeno es representativo.
De acuerdo con una realización, la muestra se divide en al menos dos fracciones y en el paso (a), la primera fracción de la muestra se pone en contacto con un antígeno y un azúcar no reductor para generar una muestra de respuesta, y en la que la segunda fracción de la muestra se pone en contacto con una solución inactiva para generar una muestra de control negativo (nula). En el paso (b) de esta realización, se determina la presencia<o>el nivel de la molécula efectora inmune en las dos fracciones. En el paso (c), la respuesta de la molécula efectora inmune dependiente del antígeno de la muestra se determina restando el nivel de la molécula efectora inmune determinado en la muestra de control negativo del nivel de la molécula efectora inmune determinado en la muestra de respuesta. La respuesta de la molécula efectora inmune dependiente del antígeno, o un valor derivado la misma, se compara entonces con un nivel de referencia, proporcionando así ayuda para determinar si el sujeto se ha expuesto previamente al antígeno. De este modo, se puede, por ejemplo, determinar si el sujeto ha generado reactividad inmunológica al antígeno, si corre el riesgo de desarrollar una enfermedad y/o si es susceptible a una infección con un patógeno.
Opcionalmente, el método puede comprender adicionalmente dividir la muestra en al menos tres fracciones e incubar la tercera fracción de la muestra con un activador de células T, tal como un mitógeno, para generar una muestra de control positivo. Aquí, las células inmunes se pueden incubar en, por ejemplo, tres poblaciones separadas: muestra de control negativo (por ejemplo, salina), muestra de respuesta estimulada por antígeno y muestra de control positivo (utilizando, por ejemplo, un activador de células T, por ejemplo, un mitógeno tal como fitohemaglutinina). Por lo tanto, de acuerdo con una realización, la muestra se divide en al menos tres fracciones. En el paso (a), la primera fracción de la muestra se pone en contacto con un antígeno y un azúcar no reductor para generar una muestra de respuesta; la segunda fracción de la muestra se pone en contacto con una solución inactiva para generar una muestra de control negativo; y la tercera fracción de la muestra se pone en contacto con una solución estimulante (que comprende, por ejemplo, un mitógeno) para generar una muestra de control positivo. En el paso (b) de esta realización, se determina la presencia<o>el nivel de la molécula efectora Inmune en las tres fracciones. En el paso (<c>), la respuesta de la molécula efectora Inmune dependiente del antfgeno de la muestra de respuesta se determina restando el nivel de la molécula efectora inmune determinado en la muestra de control negativo del nivel de la molécula efectora inmune determinado en la muestra de respuesta y comparando la respuesta de la molécula efectora inmune dependiente del antígeno<o>un valor derivado la misma con un nivel de referencia; la respuesta de la molécula efectora inmune de la muestra de control positivo se determina restando el nivel de la molécula efectora inmune determinado en la muestra de control negativo del nivel de la molécula efectora inmune determinado en la muestra de control positivo y comparando la respuesta efectora inmune resultante con un nivel de referencia o un valor derivado del mismo. De este modo, se puede determinar si el sujeto se ha encontrado previamente con el antígeno analizado o a un antígeno que muestra reactividad cruzada del mismo y, por lo tanto, ha generado reactividad inmunológica al antígeno. Esto proporciona una valiosa ayuda para determinar, por ejemplo, si el sujeto tiene una infección activa, reciente<o>latente,<o>si el sujeto está respondiendo al tratamiento, va a desarrollar una infección<o>enfermedad,<o>si está inmunodeprimido. Por ejemplo, si la respuesta de la molécula efectora inmune dependiente del antígeno es superior al nivel de referencia, el resultado se puede evaluar como positivo, es decir, que el sujeto es capaz de una respuesta mediada por células contra dicho antígeno. Si la respuesta de la molécula efectora inmune dependiente del antígeno es inferior al nivel de referencia y la respuesta de la molécula efectora inmune dependiente del control positivo es superior al nivel de referencia, el resultado se puede evaluar como negativo, es decir, que el sujeto no es capaz de generar una respuesta mediada por células contra dicho antígeno.
Los mitógenos que se pueden utilizar en la presente invención como control positivo abarcan todos los mitógenos conocidos por la persona experta, y pueden incluir, pero no se limitan a fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (conA), lipopolisacárido (LPS) y el mitógeno de la hierba carmín (PWM). Otros ejemplos de inmunoestimulantes, además de los mitógenos, que se pueden utilizar para proporcionar un control positivo incluyen, pero no se limitan a, compuestos químicos tales como R848.
Como se describió anteriormente, en algunas realizaciones, el recipiente en el cual se coincuban la muestra, el antígeno y el azúcar no reductor es también el recipiente de recolección utilizado para recolectar la muestra del sujeto. Se puede utilizar cualquiera de los numerosos recipientes disponibles diferentes, siempre que proporcionen dimensiones de muestra adecuadas. En algunas realizaciones, el recipiente es un tubo que comprende un vacío para facilitar la recolección de la muestra, como sangre, de un sujeto. Los respectivos tubos de recolección de sangre al vacío son bien conocidos en el estado anterior de la técnica y, por lo tanto, no requieren una descripción detallada en la presente memoria. En otras realizaciones, el recipiente es un tubo capilar. En algunas realizaciones, se utiliza un tubo capilar para recolectar sangre de la superficie de la piel por acción capilar. En algunas realizaciones, la muestra se recolecta de un sujeto en un recipiente de recolección que contiene al menos un antígeno, al menos un azúcar no reductor y al menos un anticoagulante, preferiblemente heparina, o al cual posteriormente se le añaden un antígeno, un azúcar no reductor y un anticoagulante, preferiblemente heparina. En algunas realizaciones, se toma una muestra de sangre utilizando un dispositivo de muestreo capilar, tal como un dispositivo de punción con aguja, y la sangre se recolecta en un recipiente de recolección heparinizado y posteriormente se transfiere a un recipiente adecuado para su coincubación con el antígeno y el azúcar no reductor. Preferiblemente, el antígeno, el azúcar no reductor y, opcionalmente, el anticoagulante, se proporcionan en forma de una sola composición, como se describió anteriormente. En algunas realizaciones, se recolecta sangre completa de un sujeto en un recipiente que contiene el antígeno, el azúcar no reductor y, opcionalmente, el anticoagulante. En otras realizaciones, el antígeno, el azúcar no reductor y/o el anticoagulante se añaden a la muestra de sangre completa después de la recolección.
La presente invención es particularmente útil para cribar para la exposición a patógenos, en particular micobacteria tal comoM. tuberculosis.Por lo tanto, la presente divulgación enseña un método para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células en un sujeto, el método comprende poner en contacto una muestra que comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno, con un antfgeno específico para la tuberculosis y con un azúcar no reductor, EI(I<os>) péptido(s) utilizados como antfgeno pueden abarcar la totalidad o parte de un antígeno proteico deM. tuberculosis.Después de la incubación, se determina el nivel de una molécula efectora inmune, preferiblemente interferón gamma, producido por las células inmunes, en el que el nivel de molécula efectora inmune es indicativo del nivel de la inmunorrespuesta mediada por células del sujeto aM. tuberculosis.
ESAT-6 es una diana antigénica de secreción temprana de seis kDa deM. tuberculosis.La proteína ESAT-6 (diana antigénica de secreción temprana 6) es un antígeno principal secretado que se ha purificado a partir de filtrados de cultivos a corto plazo de M. tuberculosis. Como se menciona en la presente memoria, ESAT-6, CFP-10 (proteína 10 del filtrado de cultivo) y 85B se pueden obtener a partir de lisado celular y purificación mediante técnicas recombinantes o producirse como péptidos sintéticos. Por ejemplo, ESAT6 se puede obtener como una proteína recombinante del Statens Serum Institute (SSI, Copenhague, Dinamarca). Otros antígenos proteicos diana adecuados paraM. tuberculosisincluyen TB7.7 y TB37.6. CFP10 también se conoce como proteína similar a ESAT-6 eesxB y proteína antigénica secretada MTSA-10.
La tuberculina o el PPD (derivado proteico purificado) difiere de ESAT-6 (diana antigénica de secreción temprana 6), CFP-I0 (proteína 10 del filtrado de cultivo) y TB7.7, que están codificadas por genes (en la región RD-I) ubicadas únicamente en el genoma deM. tuberculosisy no están presentes en BCG (el bacilo de Calmette et Guerin). Se diferencia del PPD porque el PPD también contiene otros antígenos que están compartidos, por ejemplo, con subcepas de BCG y con diversas especies de micobacterias no tuberculosas con baja o nula patogenicidad. De acuerdo con una realización, se utiliza el PDD como antígeno. Específicamente, como se utiliza en la presente memoria, el término Derivado Proteico Purificado (PPD o tuberculina) es un precipitado de moléculas no específicas de la especie. El PPD o la tuberculina se obtiene extrayendo proteínas de una mezcla de M. tuberculosis u otras micobacterias tal como M. avium. El PPD se emplea comúnmente para evaluar la presencia de inmunidad celular o la respuesta ThI generada contra ya sea BCG o contraM. tuberculosis.Por ejemplo, se puede obtener de TubersolB de Connaught Laboratories Limited, preparado a partir de un lote maestro grande, Tuberculina de Connaught (CT68), o en forma de RT23, obtenida del Statens Serum Institute (SSI, Copenhague, Dinamarca).
Preferiblemente, el antígeno se selecciona entre CFP10, ESAT-6, TB7.7 y TB37.6 deMycobacterium tuberculosis.De acuerdo con una realización, el antígeno está proporcionado por péptidos correspondientes a estos antígenos proteicos y/o muestran reactividad cruzada a los mismos.
En una realización, la muestra se pone en contacto con una combinación de péptidos CD4+ y CD8+, los cuales se describieron en detalle anteriormente. Nos remitimos a la divulgación anterior.
Las células del sistema inmune pierden la capacidad de generar una respuesta inmune mediada por células en sangre completa después de períodos prolongados posteriores a la extracción de sangre del sujeto, y las respuestas sin intervención suelen estar gravemente reducidas o ausentes a las 24 horas posteriores a la extracción de sangre. La reducción de la mano de obra y la necesidad de equipo especializado en la presente invención permite que la estimulación de la respuesta inmune mediada por células con antígenos se realice en el punto de atención, tal como consultorios médicos, clínicas, centros ambulatorios y clínicas veterinarias, o en granjas. Una vez completada la estimulación con antígenos, ya no se requieren células frescas y activas. El IFN-gamma y otras citocinas o moléculas efectoras inmunes liberadas debido a la estimulación con el antígeno son estables en fluidos libres de células o depletados de células, como el plasma, y, por lo tanto, la muestra se puede almacenar o enviar sin condiciones especiales ni requisitos de tiempo rápidos, de forma similar a las muestras estándar de plasma o suero utilizadas para el diagnóstico de otras enfermedades infecciosas u otras enfermedades. Por lo tanto, se prefiere la detección de las moléculas efectoras inmunes realmente liberadas. Sin embargo, las células comprendidas en la composición de la incubación, o la composición de la incubación completa, se pueden poner en contacto, después de la incubación, con una composición estabilizadora de ácidos nucleicos la cual comprende reactivos que estabilizan el patrón de expresión del ARN si la presencia o el nivel de la molécula efectora inmune se determina con base en el nivel de expresión del ARN de la molécula efectora Inmune, Existen diversas composiciones establllzadoras disponibles comerclalmente. Por ejemplo, PreAnalytiX proporciona composiciones que contienen reactivos para la estabilización inmediata del perfil de expresión génica del ARN en sangre, Las composiciones respectivas también se pueden utilizar para estabilizar el perfil de expresión génica del ARN de las células comprendidas en la composición de la incubación, La composición de estabilización permite el transporte y el almacenamiento a temperatura ambiente sin riesgo de cambios en el perfil del ARN mediante inducción génica y degradación de la transcripción (véase, por ejemplo, US 6,617,170 y US 7,270,953, Kruhofferet al,,2007), Las composiciones respectivas se comercializan bajo el nombre de Tubo de ARN en sangre PAXgene,
Aplicaciones, enfermedades y afecciones
A continuación, se describirán aplicaciones no limitantes, incluyendo usos, enfermedades y afecciones, Como se desprende de esto, el método de acuerdo con la invención, así como las composiciones y kits descritos en la presente memoria, se pueden utilizar ampliamente en el campo médico y de diagnóstico y, por ejemplo, se pueden utilizar en ensayosin vitroadecuados para analizar la respuesta mediada por células de los pacientes, Además, el método de acuerdo con la invención, así como las composiciones y kits descritos en la presente memoria, son valiosas herramientas analíticas con la finalidad de evaluar la capacidad de agentes tales como, por ejemplo, inmunoterapéuticos contra el cáncer para estimular y, por lo tanto, aumentar la inmunidad mediada por células, El método que se enseña en la presente memoria permite, por ejemplo, la detección de la presencia o ausencia o el nivel o estadio de una enfermedad o afección en un sujeto, tal como una infección por un agente patogénico, una enfermedad autoinmune, cáncer, exposición a un agente inflamatorio, exposición a un medicamento, exposición a un agente proteínico tóxico y afecciones de inmunodeficiencia o inmunosupresión, tal como las inducidas por la condición de la enfermedad o inducidas por agentes farmacéuticos, La capacidad para medir de forma confiable y sensible la inmunidad mediada por células es importante, por ejemplo, para evaluar la capacidad de un sujeto para responder a una infección por un agente patógeno tal como un microorganismo, virus o parásito, para generar una respuesta autoinmune, para responder a una vacuna o un inmunoterapéutico, para proteger contra cánceres u otras afecciones oncológicas, para detectar una afección inflamatoria o para detectar la exposición o sensibilidad de un sujeto a un agente tóxico como el berilio o los agentes ambientales, El ensayo descrito en la presente memoria permite una detección temprana y/o más sensible de la inmunorrespuesta, El ensayo descrito en la presente memoria también permite y facilita la detección de las condiciones de la enfermedad que conducen a inmunosupresión o para detectar una inmunosupresión inducida por medicamentos, En consecuencia, la “medición de una respuesta inmune mediada por células en un sujeto”, como se enseña en la presente memoria tiene numerosas aplicaciones útiles en el campo médico, cuyos usos y aplicaciones no limitantes se describirán posteriormente,
Por ejemplo, el método descrito en la presente memoria se puede utilizar para el diagnóstico inmune de enfermedades infecciosas y autoinmunes, como marcador para la inmunocompetencia, así como un marcador de enfermedades inflamatorias, alérgenos, cáncer, el efecto de inmunoterapias y como un marcador de agentes tóxicos, Además, el método es generalmente útil para la detección de respuestas de células T a antígenos endógenos y/o exógenos (incluyendo la medición de la eficacia de una vacuna),
Los ensayos de respuesta inmune funcional basados en células también han ganado aceptación como marcadores indirectos de eficacia en el desarrollo de vacunas, inmunoterapéuticos y biológicos que impactan las respuestas inmunes, Los ensayos se pueden utilizar en entornos académicos, en entornos farmacéuticos y en la investigación y el desarrollo de vacunas y biológicos, La evaluación de la capacidad funcional de las células inmunes es fundamental para comprender diversas condiciones de la enfermedad y la eficacia de las estrategias terapéuticas dirigidas a ellas, Las células inmunes son responsables ya sea por la prevención o por la terapia, por ejemplo, en enfermedades infecciosas como VIH, o responsables de la propia condición de la enfermedad, por ejemplo, en condiciones de las enfermedades autoinmunes, La reactividad específica del autoantígeno se puede medir en pacientes que padecen una enfermedad autoinmune, como la esclerosis múltiple, utilizando el método de acuerdo con la presente Invención, La presente invención proporciona ensayos útiles para estos fines,
Las numerosas estrategias de inmunoterapia contra el cáncer se están probando actualmente en ensayos clínicos, Aunque la eficacia clínica será la prueba final de estas aproximaciones, el largo y complejo proceso de desarrollo de estos productos requiere la evaluación de las respuestas inmunológicas como marcadores intermediarios de los candidatos con mayor probabilidad de éxito, Esto ha puesto énfasis en la necesidad de ensayos que detecten y cuantifiquen con precisión las respuestas inmunes específicas del antígeno mediadas por células T. Para los respectivos agentes inmunoterapéuticos, los cuales, por ejemplo, no se espera necesariamente que causen regresión tumoral, pero que aun así tengan un efecto benéfico sobre la enfermedad, se debe elegir un marcador biológico con base en el presunto modo de actividad, Para la inmunoterapia, dicho marcador es la estimulación de la respuesta inmune específica del antígeno tumoral detectable mediante uno o más ensayos inmunológicos. Aquí, se utilizan preferentemente ensayos que evalúan la función de las células T citotóxicas CD8+, que reconocen directamente los péptidos tumorales presentados por las moléculas MHC en la superficie de una célula tumoral como un desencadenante para la citólisis directa, y las células T auxiliares CD4+, en particular las respuestas de T auxiliares tipo 1, que conducen a la generación de células T citotóxicas, La presente invención proporciona ensayos que son útiles para este fin debido a su sensibilidad y confiabilidad, Por lo tanto, el método, los kits y las composiciones descritos en la presente memoria se pueden utilizar para analizar si un agente farmacéutico, como por ejemplo un inmunoterapéutico contra el cáncer, es capaz de mejorar la inmunidad mediada por células, Esto se puede probar, por ejemplo, a un nivel general utilizando células inmunes disponibles, por ejemplo, estandarizadas (los ejemplos se describieron anteriormente), o también se puede probar en un paciente individual con la finalidad de analizar si el inmunoterapéutico específico, como por ejemplo un inmunoterapéutico contra el cáncer, es capaz de mejorar la inmunidad mediada por células en dicho paciente, Dicho ensayo es valioso para el desarrollo clínico, así como en el contexto terapéutico posterior, con la finalidad de analizar si un paciente se beneficia de una terapia con un inmunoterapéutico, Los ejemplos de inmunoterapéuticos incluyen, pero no se limitan a biológicos, tales como anticuerpos terapéuticos que aumentan la actividad de las células T, en particular las células T citotóxicas, El mecanismo de acción no es relevante siempre que produzca o se suponga que produzca una estimulación/aumento de la inmunidad mediada por células, Por ejemplo, la actividad se puede aumentar mediante la estimulación directa de las células inmunes o mediante la reducción o desactivación de los mecanismos inhibidores que afectan negativamente la actividad de dichas células T, estimulando/aumentando así indirectamente la inmunidad mediada por células, Un ejemplo es el anticuerpo inmunoterapéutico contra el cáncer Ipilimumab,
Además, el método de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para detectar la presencia, ausencia, el nivel o estadio de una enfermedad o afección en un sujeto, en el que la presencia o el nivel de la molécula efectora inmune detectada utilizando el método de acuerdo con la presente invención es indicativa de la enfermedad o afección, Además, el método de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para determinar si un agente o una condición de la enfermedad induce o está asociado con la inmunosupresión en un sujeto, en el que la presencia o el nivel de la molécula efectora inmune detectada utilizando el método de acuerdo con la presente invención es indicativo del grado de la inmunosupresión inducida por el agente o inducida por o asociada con la condición de la enfermedad, Un aspecto de la presente solicitud incluye métodos que demuestran la respuesta inmune mediada por células de un sujeto midiendo la respuesta a un antígeno particular utilizando el método de acuerdo con la presente invención, En una realización, se puede obtener una muestra, tal como sangre completa, una fracción enriquecida de glóbulos blancos o un lavado broncoalveolar, de un sujeto que padece o se sospecha que desarrolle una enfermedad particular (por ejemplo, una enfermedad autoinmune, una enfermedad causada por una infección con un agente patogénico o la exposición a un agente tóxico), y la respuesta inmune se mide utilizando el método de la presente invención, por ejemplo, mediante la detección de moléculas efectoras inmunes liberadas por las células T efectoras (por ejemplo, células T CD4+ y/o células T citotóxicas CD8+) en respuesta a la estimulación del antígeno,
El método de la presente invención es particularmente útil para detectar y/o monitorear una enfermedad<o>afección, incluyendo el nivel o estadio de la enfermedad o afección en un sujeto, tal como una infección por un agente patogénico, una enfermedad autoinmune, cáncer o una afección inflamatoria. Otras afecciones incluyen la exposición a agentes tóxicos tal como berilio. El ensayo de la presente invención también es útil para el monitoreo de protocolos terapéuticos.
La presencia o el nivel de la molécula efectora inmune producida en respuesta al antígeno analizado es indicativo del nivel de la respuesta mediada por células del sujeto. En particular, el nivel de la respuesta es indicativo de la presencia o ausencia, o el nivel o estadio de una enfermedad o afección seleccionada de la lista que comprende una infección por un agente patogénico, una enfermedad autoinmune, un cáncer, una afección inflamatoria y la exposición a un agente tóxico. En particular, la presencia o el nivel de la molécula efectora inmune es indicativo de la presencia, ausencia, el nivel o estadio de una enfermedad o afección para la cual el antígeno analizado es representativo. El método también se puede utilizar para monitorear la respuesta a un protocolo terapéutico para una enfermedad o afección en un sujeto. La presencia, el nivel o patrón de la molécula efectora inmune producida puede ser indicativo de la eficacia del protocolo terapéutico.
El método de la presente invención también se puede denominar como un “ensayo”. El método es un métodoex vivo.El ensayo descrito en la presente memoria es útil,inter alia,para evaluar la respuesta inmune general de un sujeto o es útil para detectar la respuesta a condiciones de la enfermedad específicas, tal como enfermedades autoinmunes, enfermedad celíaca, cáncer o infección por un organismo o agente patogénico, exposición a un agente o medicamento tóxico y condiciones de inmunodeficiencia o inmunosupresión, tales como las inducidas por una condición de la enfermedad o por un agente terapéutico.
En una realización, el sujeto es un humano y el ensayo de la respuesta inmune mediada por células se utiliza para cribar la respuesta a microorganismos patogénicos, virus y parásitos, el potencial para el desarrollo o el monitoreo de una afección autoinmune, enfermedad celíaca, el monitoreo de la respuesta de un sujeto a un reto oncológico y para determinar la presencia de cualquier inmunodeficiencia o inmunosupresión. Esta última puede ocurrir, por ejemplo, debido a ciertos medicamentos, incluyendo diversos agentes quimioterapéuticos. Alternativamente, se puede evaluar la exposición a tóxicos y contaminantes ambientales. En una realización, las condiciones de la enfermedad que conducen a la inmunosupresión incluyen infecciones crónicas y cáncer. Otras condiciones de la enfermedad que pueden conducir a la inmunosupresión incluyen condiciones de las enfermedades inflamatorias. Los medicamentos que pueden conducir a la inmunosupresión incluyen aquellos que se utilizan para tratar la artritis reumatoide, el cáncer y la enfermedad inflamatoria intestinal, o aquellos que se administran junto con el trasplante de órganos.
En una realización, el método descrito en la presente memoria se puede utilizar para o como una ayuda en el diagnóstico o el monitoreo de sujetos con sospecha de tuberculosis (por ejemplo, infección por TB activa, latente o reciente) y, en particular, de pacientes con mayor riesgo de progresión de tuberculosis latente a activa, por ejemplo, en pacientes que reciben medicación inmunosupresora (es decir, tratamiento con anticuerpo monoclonal (anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, Rituximab®) o tratamiento bloqueador del TNF-alfa (por ejemplo, Remicade®, Enbrel®, Humira®))), o esteroides o quimioterapia contra el cáncer, o pacientes que padecen de afecciones inmunosupresoras (por ejemplo, infección por VIH, cáncer, IDDM, o diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM), afecciones autoinmunes, desnutrición, vejez, consumo de drogas por vía intravenosa (IVDU) o trastornos inmunes hereditarios), y en individuos que han sido infectados recientemente.
En una realización, el método descrito en la presente memoria se puede utilizar para el monitoreo de sujetos diagnosticados con infecciones u otras condiciones de la enfermedad. Esto puede, por ejemplo, ayudar a evaluar la eficacia del tratamiento durante y después de la finalización del tratamiento, por ejemplo, mediante el monitoreo y la predicción de una posible recurrencia de la infección.
De acuerdo con una realización, el método es para determinar si un sujeto está infectado con y/o es capaz de generar una respuesta inmune mediada por células contra un patógeno para el cual el antígeno es representativo.
L<os>agentes patogénicos<o>infecciosos incluyen bacterias, parásitos y virus. L<os>ejemplos de bacterias incluyen microorganismos Grampositivos y Gramnegativos tales como especies deMycobacterium,especies deStaphylococcus, especies deStreptococcus,Escherichia coli, especies deSalmonella, especies deClostridium, especies deShigella, especies deProteus,especies deBacillus, especies deHemophilus, especies deBorrelia, entre otras.Mycobacterium tuberculosises una diana particularmente útil, así como afecciones derivadas de la infección por M.tuberculosis, tal como tuberculosis (TB). Los ejemplos de virus incluyen el virus de la hepatitis (virus de la hepatitis B y virus de la hepatitis C), el virus del herpes, el virus del CMV y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), así como las enfermedades resultantes de los mismos. Los parásitos incluyen especies dePlasmodium, tiña, parásitos hepáticos y similares. Otros agentes patogénicos incluyen células eucariotas como levaduras y hongos. Generalmente, es importante evaluar el potencial de la respuesta mediada por células, potencial o real, en sujetos expuestos a estas entidades infecciosas. El método de la presente divulgación también se puede utilizar para detectar la presencia<o>ausencia de estas infecciones, así como el nivel<o>estadio del proceso patológico.
El método también se puede utilizar para monitorear el nivel de la inmunidad mediada por células contra ciertas enfermedades y/o agentes infecciosos en personas con riesgo de desarrollar una respectiva enfermedad. Un ejemplo es la infección por CMV en pacientes inmunodeprimidos, como los pacientes de trasplante de órganos. Las infecciones por CMV se producen frecuentemente como complicación de la inmunodepresión, especialmente después del trasplante, y contribuyen significativamente a la morbilidad y la mortalidad en los receptores de trasplantes. Las terapias inmunosupresoras actuales, utilizadas para prevenir el rechazo de órganos trasplantados, tienen efectos perjudiciales sobre los linfocitos T y, por lo tanto, sobre la respuesta inmune mediada por células, lo que resulta en una mayor susceptibilidad a las infecciones virales después del trasplante. La importancia de la función de las células T y la supresión de la replicación del CMV también se destaca por el hecho de que los linfocitos T citotóxicos (CTLs) CD8+ específicos del CMV pueden proteger contra la patogénesis asociada al virus. Otro ejemplo de pacientes inmunodeprimidos son los pacientes con infección por VIH. El método de la presente invención se puede utilizar para monitorear en serie el nivel de inmunidad frente a enfermedades, como la inmunidad anti-CMV, en personas con riesgo de desarrollar una respectiva enfermedad, ya que la pérdida de esta función inmune puede estar asociada con el desarrollo de la enfermedad, como la causada por la enfermedad por CMV. Preferiblemente, el interferón gamma se determina como molécula efectora en una respectiva prueba. El estado inmune del receptor del trasplante puede influenciar la (re)activación del CMV en los receptores de trasplante. Por ejemplo, una respuesta robusta al interferón gamma inducida por un antígeno específico del CMV indica un menor riesgo de enfermedad por CMV, ya que el paciente presenta una fuerte respuesta mediada por células y, por lo tanto, protección contra el virus. Una respuesta mínima al interferón gamma indica un mayor riesgo de enfermedad por CMV, ya que la inmunidad mediada por células es nula<o>muy baja. L<os>datos muestran que los pacientes con una prueba positiva para CMV permanecen libres de enfermedades por CMV con una frecuencia significativamente mayor y durante más tiempo que los pacientes con una prueba negativa después de la interrupción de la profilaxis antiviral. Por lo tanto, los pacientes que presentan una respuesta inmune celular al CMV al final de la profilaxis tienen un riesgo significativamente menor de desarrollar enfermedad por CMV que aquellos que no presentan una respuesta inmune detectable. Por lo tanto, el método de acuerdo con la presente invención puede predecir el desarrollo de enfermedad por CMV de inicio tardío en receptores de trasplantes y, por lo tanto, es muy útil en el manejo de los pacientes.
El sujeto puede alternativamente tener o ser sometido a pruebas para detectar una condición de la enfermedad seleccionada de: enfermedad celíaca, diabetes autoinmune, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmune, esclerosis múltiple, enfermedad autoinmune de la glándula suprarrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis y orquitis autoinmunes, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, dermatitis por esprúe celiaco, síndrome de fatiga crónica (CFIDS), desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de la cresta, enfermedad por crioaglutininas, enfermedad de Crohn, dermatitis herpetiforme, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, diabetes insulinodependiente (Tipo I), liquen plano, lupus, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia gravis, miocarditis, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo y enfermedad inflamatoria intestinal.
El sujeto puede alternativamente tener o ser examinado para un cáncer. La terapia contra el cáncer también depende en cierta medida de la inmunidad mediada por células, y el propio cáncer o los fármacos utilizados para tratar el cáncer pueden provocar inmunosupresión. Los cánceres contemplados en la presente memoria incluyen: un grupo de enfermedades y trastornos que se caracterizan por un crecimiento celular descontrolado (por ejemplo, la formación de tumores) sin ninguna diferenciación de dichas células en células especializadas y diferentes. Dichas enfermedades y trastornos incluyen el protooncogén ABL1, cánceres relacionados con el SIDA, neuroma acústico, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenoquístico, cáncer adrenocortical, metaplasia mieloide agnogénica, alopecia, sarcoma alveolar de partes blandas, cáncer anal, angiosarcoma, anemia aplásica, astrocitoma, ataxiatelangiectasia, carcinoma basal celular (piel), cáncer de vejiga, cánceres óseos, cáncer de intestino, glioma del tronco encefálico, tumores cerebrales y del CNS, cáncer de mama, tumores del CNS, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, tumores cerebrales infantiles, cáncer infantil, leucemia infantil, sarcoma de tejidos blandos infantil, condrosarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cánceres colorrectales, linfoma cutáneo de células T, dermatofibrosarcoma protuberante, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, carcinoma ductal, cánceres endocrinos, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer de vías biliares extrahepáticas, cáncer ocular, ojo: melanoma, retinoblastoma, cáncer de trompas de Falopio, anemia de Fanconi, fibrosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cánceres gastrointestinales, tumor carcinoide gastrointestinal, cánceres genitourinarios, tumores de células germinales, enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, cánceres ginecológicos, neoplasias hematológicas, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, cáncer de mama hereditario, histiocitosis, enfermedad de Hodgkin, virus del papiloma humano, mola hidatiforme, hipercalcemia, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, cáncer de células de islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, leucemia, síndrome de Li-Fraumeni, cáncer de labio, liposarcoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfedema, linfoma, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama masculino, tumor rabdoide maligno de riñón, meduloblastoma, melanoma, cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer metastásico, cáncer de boca, neoplasia endocrina múltiple, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, mieloma, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasal, cáncer nasofaríngeo, nefroblastoma, neuroblastoma, neurofibromatosis, síndrome de rotura de Nijmegen, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cánceres oculares, cáncer esofágico, cáncer de cavidad oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, ostomía, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer paranasal, cáncer de paratiroides, cáncer de glándula parótida, cáncer de pene, tumores neuroectodérmicos periféricos, cáncer pituitario, policitemia vera, cáncer de próstata, cánceres raros y trastornos asociados, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, síndrome de Rothmund-Thomson, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, schwannoma, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, tumores de médula espinal, carcinoma de células escamosas (piel), cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, cáncer del timo, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales (vejiga), cáncer de células transicionales (renal-pélvica/uretra), cáncer trofoblástico, cáncer de uretra, cáncer del sistema urinario, uroplaquinas, sarcoma uterino, cáncer de útero, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
Alternativamente, el sujeto puede estar expuesto o ser examinado para la exposición a un toxico proteico.
Las enfermedades autoinmunes contempladas en la presente memoria para la detección y/o el monitoreo incluyen,inter alia,alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmune, esclerosis múltiple, enfermedad autoinmune de la glándula suprarrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis y orquitis autoinmunes, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, dermatitis por esprúe celiaco, síndrome de fatiga crónica (CFIDS), desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de la cresta, enfermedad por crioaglutininas, enfermedad de Crohn, dermatitis herpetiforme, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, diabetes insulinodependiente (Tipo I), liquen plano, lupus, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia gravis, miocarditis, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis y vitíligo.
Otras condiciones de la enfermedad contempladas incluyen las enfermedades inflamatorias, ya que pueden provocar inmunosupresión. Los ejemplos de enfermedades inflamatorias contempladas en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, aquellas enfermedades y trastornos que provocan una respuesta de enrojecimiento, hinchazón, dolor y sensación de calor en ciertas zonas, con la finalidad de proteger los tejidos afectados por una lesión o enfermedad. Las enfermedades inflamatorias que se pueden tratar utilizando los métodos de la presente divulgación incluyen, sin limitarse a, acné, angina, artritis, neumonía por aspiración, enfermedad, empiema, gastroenteritis, inflamación, gripe intestinal, NEC, enterocolitis necrotizante, enfermedad inflamatoria pélvica, faringitis, PID, pleuresía, garganta irritada, enrojecimiento, rubor, dolor de garganta, gripe estomacal e infecciones del tracto urinario, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica. En cuanto a las aplicaciones no humanas, la presente divulgación se extiende a la detección de ElPH en caballos y diversas afecciones en animales, tales como la enfermedad tumoral facial en el demonio de Tasmania.
En los aspectos anteriores, el antígeno se puede derivar del agente patogénico, estar asociado con la condición de la enfermedad o el cáncer, o ser un tóxico. Alternativamente, la infección, condición de la enfermedad, cáncer o tóxico puede suprimir la inmunidad mediada por células, en cuyo caso se podría emplear cualquier antígeno al que el sujeto haya estado expuesto previamente.
A continuación, se describen nuevamente realizaciones particularmente ventajosas descritas en la descripción y las reivindicaciones del método de acuerdo con el primer aspecto. De acuerdo con el primer aspecto, la presente divulgación proporciona un método para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células, dicho método comprende:
(a) proporcionar una composición de la incubación poniendo en contacto una muestra que comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno, con al menos un antígeno y con al menos un azúcar no reductor, y
(b) detectar la presencia o el nivel de al menos una molécula efectora inmune.
Este método no se reivindica como tal. Se reivindica un método de acuerdo con la reivindicación 1.
De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor es un disacárido no reductor, preferiblemente seleccionado entre trehalosa y sacarosa. La concentración del azúcar no reductor en la composición de la incubación es, de acuerdo con una realización, al menos 1.5 mg/ml, preferiblemente al menos 2 mg/ml. L<os>intervalos adecuados para la concentración del azúcar no reductor en la composición de la incubación también se describieron anteriormente y se hace referencia a la divulgación anterior.
De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor se selecciona entre trehalosa, manitol, sacarosa y rafinosa. Como se demuestra en los ejemplos, estos azúcares no reductores aumentan los niveles de respuesta. La trehalosa es particularmente preferible porque aquí, se observó el mayor aumento en el nivel de respuesta. Además, el efecto potenciador se puede conservar durante el almacenamiento.
De acuerdo con una realización, en el paso (a), la muestra se pone en contacto con una composición que comprende el antígeno y el azúcar no reductor. De acuerdo con una realización, en la que la muestra es una muestra de sangre completa, la composición comprende además un anticoagulante, preferiblemente heparina. De acuerdo con una realización, la composición que comprende el antígeno, el azúcar no reductor y, opcionalmente, un anticoagulante está comprendido en un recipiente de recolección de muestra. Como se describe en la presente memoria, dicho recipiente de recolección de muestra puede ser, por ejemplo, un recipiente de recolección de sangre al vacío. De acuerdo con una realización, la composición es una composición secada por pulverización. En la presente memoria se describen realizaciones adecuadas.
De acuerdo con una realización, la muestra presenta una o más de las siguientes características:
i) la muestra se obtuvo de un sujeto humano;
ii) la muestra se obtuvo de un sujeto humano que esta inmunodeprimido o es inmunodeficiente;
iii) la muestra comprende células inmunes seleccionadas del grupo que consiste en células NK, células T, células B, células dendríticas, macrófagos y monocitos; y/o
iv) la muestra es sangre completa.
De acuerdo con una realización, el antígeno se selecciona del grupo que consiste en péptidos, proteínas, incluyendo glucoproteínas, fosfoproteínas y fosfolipoproteínas, carbohidratos, fosfolípidos y fragmentos de los anteriores, y preferiblemente es proporcionado por uno o más péptidos.
De acuerdo con una realización, se utilizan dos o más antígenos diferentes en el paso (a) y/o se detectan dos o más moléculas efectoras diferentes en el paso (b).
De acuerdo con una realización, se utilizan como antígeno uno o más péptidos que tienen una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos o de 7 a 50 aminoácidos. De acuerdo con una realización ventajosa, el antígeno está proporcionado por uno o más péptidos reconocidos por una célula T citotóxica CD8+. Preferiblemente, en esta realización, el antígeno está proporcionado por uno o más péptidos que tienen una longitud inferior a 15 aminoácidos, preferiblemente que tienen una longitud seleccionada de 7-14 aminoácidos. Los detalles de los respectivos péptidos se describieron anteriormente y se refieren a la divulgación anterior.
De acuerdo con una realización, el antígeno está proporcionado por al menos dos conjuntos de péptidos, un primer conjunto que comprende al menos un péptido de alrededor de 7 a 14 residuos de aminoácidos de longitud y un segundo conjunto que comprende al menos un péptido de alrededor de 15 residuos de aminoácidos o más, cuyos péptidos abarcan la totalidad o parte de un antígeno proteico. Los detalles de los respectivos conjuntos de péptidos se describieron anteriormente y se refieren a la divulgación anterior.
De acuerdo con una realización ventajosa, el antígeno está proporcionado por uno o más péptidos sintéticos. Los detalles del(los) péptido(s) se describieron anteriormente y se refieren a la divulgación respectiva.
De acuerdo con una realización, la muestra se pone en contacto con un antígeno asociado o representativo de una enfermedad o afección para la que se va a evaluar la respuesta inmune mediada por células. De acuerdo con una realización ventajosa, el antígeno es un antígeno específico de la enfermedad, en particular un antígeno específico de un patógeno. Por ejemplo, el antígeno se puede derivar de y, por lo tanto, presentar reactividad cruzada con un antígeno de un patógeno asociado con una condición de la enfermedad, o ser un antígeno asociado a un tumor asociado con un cáncer. Como se describió anteriormente, el patógeno puede ser una bacteria, un virus, un parásito, una levadura<o>un hongo, A continuación, se describirán ejemplos no limitativos. Por ejemplo, la bacteria se puede seleccionar entre microorganismos Grampositivos y Gramnegativos, en particular especies deMycobacteriumtal comoMycobacterium tuberculosis,especies deStaphylococcus,especies deStreptococcus, Escherichia coli,especies deSalmonella,especies deClostridium,especies deShigella,especies deProteus,especies deBacillus,especies deHemophilusy especies deBorrelia,El virus se puede seleccionar del virus de la hepatitis, como el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C, el virus del herpes, el virus del CMV y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), El parásito se puede seleccionar entre especies dePlasmodium,tiña y parásitos hepáticos,
De acuerdo con una realización, el antígeno proviene de o es específico un virus, preferiblemente citomegalovirus (CMV), Preferiblemente, dicho antígeno está compuesto por uno o más péptidos que tienen una longitud de 7 a 14 residuos de aminoácidos, 7 a 13 residuos de aminoácidos u 8 a 12 residuos de aminoácidos, Como se describió anteriormente, los uno<o>más péptidos pueden ser péptidos sintéticos,
De acuerdo con una realización, la molécula efectora inmune detectada en el paso (b) presenta una o más de las siguientes características:
) es una citocina;
i) es una quimiocina;
ii) se produce en respuesta a la activación, estimulación o reestimulación celular por el antígeno;
v) se selecciona del grupo que consiste en interferones, interleucinas (IL), Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a), Factor de Crecimiento Transformante beta (TGF-p), un Factor Estimulante de Colonias (CSF) tal como Granulocitos (G)-CSF o Granulocitos Macrófagos (GM)-CSF, componente del complemento 5a (C5a), Groa (CXCL1), slCAM-1 (CD54), IP-10 (CXCL10), I-TAC (CXCL11), MCP-1 (CCL2), MIF (GIF), MIP-1a (CCL3), MIP-1 p (CCL4), Serpina E1 (PAI-1), RANTES (CCL5) o MIG (CXCL9); y/o
v) la molécula efectora inmune es IFN-gamma,
De acuerdo con una realización del método, la presencia<o>el nivel de una molécula efectora inmune se determina con base en la molécula efectora inmune<o>se determina con base en el nivel de expresión del ARN de la molécula efectora inmune, Se describieron anteriormente realizaciones adecuadas,
De acuerdo con una realización, el método, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, sirve para monitorear o determinar la presencia, ausencia, el nivel o estadio de una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en una infección por un agente patogénico, una enfermedad autoinmune, un cáncer, una afección inflamatoria, la exposición a un agente tóxico, la respuesta a un agente terapéutico, una inmunodeficiencia y una inmunosupresión, Preferiblemente, la magnitud de la respuesta inmune mediada por células se correlaciona con el estado, la progresión y/o la gravedad de la condición de la enfermedad, De acuerdo con una realización, el método, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, sirve para detectar o monitorear una enfermedad, una infección y/o la respuesta a la terapia, en particular inmunoterapia<o>una terapia con agentes inmunosupresores, De acuerdo con una realización, el método, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, comprende (a) proporcionar una composición de la incubación poniendo en contacto una muestra de sangre completa obtenida de un sujeto humano con una composición que comprende al menos un antígeno peptídico y al menos un disacárido no reductor, preferiblemente trehalosa<o>sacarosa, e incubando la composición de la incubación durante al menos 2 horas; y
(b) medir la presencia o el nivel del IFN-gamma liberado debido a la estimulación con el antígeno;
en el que la presencia<o>cantidad detectada del IFN-gamma es indicativa del nivel de respuesta inmune mediada por células del sujeto humano,
De acuerdo con una realización, el método, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, comprende (c) comparar el nivel determinado de la molécula efectora inmune<o>un valor derivado del mismo con un nivel de referencia,
Composiciones, kits y usos
De acuerdo con un segundo aspecto, se divulga, pero no se reivindica como tal, una composición para inducir una respuesta inmune mediada por células en una muestra, que comprende:
a) al menos un antígeno aislado;
b) al menos un azúcar no reductor;
c) opcionalmente, al menos un anticoagulante.
Se reivindica una composición de acuerdo con la reivindicación 14 y, por lo tanto, una composición para inducir una respuesta inmune mediada por células, que comprende:
a) al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos;
b) al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes; y c) al menos un anticoagulante.
Los detalles sobre la composición, la forma de la composición, antígenos adecuados, azúcares no reductores y anticoagulantes se describieron anteriormente junto con el método y se refieren a la divulgación anterior. Dicha composición se puede utilizar, por ejemplo, en el método de acuerdo con el primer aspecto. Las aplicaciones adecuadas, incluyendo usos/propósitos, enfermedades y afecciones que se pueden analizar utilizando dicha composición y, en consecuencia, los usos adecuados de dicha composición se describieron en detalle anteriormente y se refieren a la divulgación anterior. La composición de acuerdo con el segundo aspecto es particularmente adecuada para su uso en los métodos, aplicaciones y usos descritos anteriormente. De acuerdo con una realización, la composición no comprende un azúcar simple. De acuerdo con una realización, la composición no comprende un azúcar reductor. Preferiblemente, la composición es una composición semilíquida, gelatinosa o sólida. Preferiblemente, es una composición seca. De acuerdo con una realización, la composición es una composición secada por pulverización.
A continuación, se describen nuevamente realizaciones ventajosas, no limitantes:
El azúcar no reductor puede tener las características como se describió anteriormente junto con el método de acuerdo con el primer aspecto, y se refieren a la divulgación respectiva, lo cual también aplica aquí. Como se describió anteriormente, el azúcar no reductor no se utiliza como estabilizador para el antígeno, sino que se utiliza para aumentar el nivel de respuesta. Como se muestra en los ejemplos, los azúcares no reductores como la trehalosa, el manitol, la sacarosa y la rafinosa aumentan los niveles de respuesta.
De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor es un disacárido no reductor. El disacárido no reductor se puede seleccionar de trehalosa y sacarosa. La concentración del azúcar no reductor en la composición, de acuerdo con el segundo aspecto, es, de acuerdo con una realización, tal que, cuando dicha composición entra en contacto con la cantidad de muestra deseada, la composición de la incubación resultante comprende el azúcar no reductor en una concentración de al menos 1.5 mg/ml, preferiblemente al menos 2 mg/ml. Los intervalos adecuados para la concentración del azúcar no reductor en la composición de la incubación también se describieron anteriormente, junto con el método, de acuerdo con el primer aspecto, y se hace referencia a la divulgación anterior. Los materiales de muestra adecuados y preferibles también se describieron anteriormente, junto con el método, de acuerdo con el primer aspecto, y se hace referencia a la divulgación anterior.
De acuerdo con una realización, la muestra presenta una o más de las siguientes características:
i) la muestra se obtuvo de un sujeto humano;
ii) la muestra se obtuvo de un sujeto humano que está inmunodeprimido o es inmunodeficiente.
iii) la muestra comprende células inmunes seleccionadas del grupo que consiste en células NK, células T, células B, células dendríticas, macrófagos y monocitos; y/o
iv) la muestra es sangre completa.
De acuerdo con una realización, el antfgeno comprendido en la composición se selecciona del grupo que consiste en péptidos, proteínas, incluyendo glucoproteínas, fosfoproteínas y fosfolipoproteínas, carbohidratos, fosfolípidos y fragmentos de los anteriores, y preferiblemente es proporcionado por uno o más péptidos.
De acuerdo con una realización, la composición comprende dos o más antígenos diferentes.
De acuerdo con una realización, la composición comprende uno o más péptidos como antígeno, en el que uno o más péptidos tienen una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos o 7 a 50 aminoácidos. De acuerdo con una realización ventajosa, la composición comprende como antígeno uno o más péptidos reconocidos por una célula T citotóxica CD8+. Preferiblemente, en esta realización, el antígeno se proporciona mediante uno o más péptidos que tiene una longitud inferior a 15 aminoácidos, preferiblemente que tienen una longitud seleccionada de 7-14 aminoácidos. Los detalles de los respectivos péptidos se describieron anteriormente junto con el método de acuerdo con el primer aspecto y se hace referencia a la divulgación anterior.
De acuerdo con una realización, la composición comprende un antígeno que es proporcionado por al menos dos conjuntos de péptidos: un primer conjunto comprende al menos un péptido con una longitud de alrededor de 7 a 14 residuos de aminoácidos y un segundo conjunto comprende al menos un péptido de 15 residuos de aminoácidos o más, cuyos péptidos abarcan la totalidad o parte de un antígeno proteico.
Los detalles de los respectivos conjuntos de péptidos se describieron anteriormente junto con el método de acuerdo con el primer aspecto y se hace referencia a la divulgación anterior.
De acuerdo con una realización ventajosa, la composición comprende un antígeno que es proporcionado por uno o más péptidos sintéticos. Los detalles del(los) péptido(s) se describieron anteriormente y se hace referencia a la divulgación respectiva.
De acuerdo con una realización, la composición comprende un antígeno asociado con o representativo de una enfermedad o afección para la cual se va a evaluar la respuesta inmune mediada por células.
De acuerdo con una realización ventajosa, el antígeno comprendido en la composición es un antígeno específico de la enfermedad, en particular un antígeno específico de un patógeno. Por ejemplo, el antígeno se puede derivar de y, por lo tanto, presentar reactividad cruzada con un antígeno de un patógeno asociado a una condición de la enfermedad o ser un antígeno asociado a tumor asociado con un cáncer.
Como se describió anteriormente, el patógeno puede ser una bacteria, un virus, un parásito, una levadura o un hongo. A continuación, se describirán ejemplos no limitativos. Por ejemplo, la bacteria se puede seleccionar entre microorganismos Grampositivos y Gramnegativos, en particular especies deMycobacteriumtal comoMycobacterium tuberculosis,especies deStaphylococcus,especies deStreptococcus, Escherichia coli,especies deSalmonella,especies deClostridium,especies deShigella,especies deProteus,especies deBacillus,especies deHemophilusy especies deBorrelia.El virus se puede seleccionar del virus de la hepatitis, como el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C, el virus del herpes, el virus del CMV y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El parásito se puede seleccionar entre especies dePlasmodium,tiña y parásitos hepáticos.
De acuerdo con una realización, la composición comprende un antígeno que es de o es específico de un virus, tal como el citomegalovirus (CMV). Preferiblemente, dicho antígeno se obtiene mediante uno o más péptidos que tienen una longitud de 7 a 14 residuos de aminoácidos, 7 a 13 residuos de aminoácidos u 8 a 12 residuos de aminoácidos. Como se describió anteriormente, los uno o más péptidos pueden ser péptidos sintéticos.
La composición puede estar comprendida en un recipiente de recolección de muestra; en la presente memoria se describen realizaciones adecuadas y ventajosas de dicho recipiente, tal como un recipiente de recolección de sangre al vacío, y se hace referencia a la divulgación respectiva.
También se divulga, pero no se reivindica como tal, una composición de la incubación que comprende al menos un antígeno aislado, al menos un azúcar no reductor, células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno, preferiblemente linfocitos T, y opcionalmente al menos un anticoagulante.
Se reivindica una composición de la incubación comprendida en un recipiente de recolección de muestra, de acuerdo con la reivindicación 21, la composición de la incubación comprende:
a) una muestra no diluida obtenida de un sujeto, la muestra comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno peptídico, preferiblemente linfocitos T;
b) al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos;
c) al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes; y d) opcionalmente, un anticoagulante.
Preferiblemente, la composición de la incubación se preparó a partir de una muestra de sangre completa y, por lo tanto, la comprende. De acuerdo con una realización, la composición de la incubación se preparó poniendo en contacto una composición, de acuerdo con el segundo aspecto, con una muestra. Los materiales de la muestra adecuados y preferibles se describieron anteriormente junto con el método, de acuerdo con el primer aspecto, y se hace referencia a la divulgación anterior. De acuerdo con una realización, la muestra presenta una o más de las siguientes características:
i) la muestra se obtuvo de un sujeto humano;
ii) la muestra se obtuvo de un sujeto humano que esta inmunodeprimido o es inmunodeficiente;
iii) la muestra comprende células inmunes seleccionadas del grupo que consiste en células NK, células T, células B, células dendríticas, macrófagos y monocitos; y/o
iv) la muestra es sangre completa.
Preferiblemente, la composición de la incubación se obtiene poniendo en contacto una composición de acuerdo con el segundo aspecto con una muestra de sangre completa obtenida de un sujeto, preferiblemente obtenida de un humano. Los detalles sobre la composición de acuerdo con el segundo aspecto, la composición de la incubación, su preparación, antígenos adecuados, azúcares no reductores y anticoagulantes se describieron anteriormente junto con el método de acuerdo con la presente divulgación y la composición de acuerdo con el segundo aspecto, y se hace referencia a la divulgación anterior. El anticoagulante es preferiblemente heparina. De acuerdo con una realización, la composición de la incubación comprende el azúcar no reductor en una concentración de al menos 1.5 mg/ml, preferiblemente al menos 2 mg/ml. Los intervalos adecuados para la concentración del azúcar no reductor en la composición de la incubación también se describieron anteriormente junto con el método de acuerdo con el primer aspecto, y se hace referencia a la divulgación anterior. De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor se selecciona entre trehalosa, manitol, sacarosa y rafinosa. Como se describió anteriormente, de acuerdo con una realización ventajosa, el azúcar no reductor es un disacárido no reductor, preferiblemente siendo seleccionado entre trehalosa y sacarosa.
También se divulga, pero no se reivindica como tal, un recipiente de recolección de muestra, en particular un tubo de recolección de muestra, que comprende una composición respectiva que comprende:
a) al menos un antígeno aislado;
b) al menos un azúcar no reductor;
c) opcionalmente, al menos un anticoagulante.
La composición comprendida en el recipiente de recolección de muestra es preferiblemente la composición de acuerdo con el segundo aspecto. Se reivindica un recipiente de recolección de muestra de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende la composición de acuerdo con las reivindicaciones 14 o 15. Los detalles sobre la composición, los antígenos adecuados, los azúcares no reductores y los anticoagulantes se describieron anteriormente y se hace referencia a la divulgación anterior. Dicho recipiente de recolección de muestra se puede utilizar, por ejemplo, en el método de acuerdo con el primer aspecto. Las aplicaciones adecuadas, incluyendo usos/propósitos, enfermedades y afecciones que se pueden analizar utilizando dicho recipiente de recolección de muestra, se describieron en detalle anteriormente y se hace referencia a la divulgación anterior. El recipiente de recolección de muestra de acuerdo con el tercer aspecto es particularmente adecuado para<uso>en I<os>métodos, aplicaciones y<usos>descritos anteriormente. Preferiblemente, la composición se pulveriza sobre el interior del recipiente, el cual es preferiblemente un tubo de recolección de sangre al vacío, Al utilizar estos recipientes de recolección listos para usar en el método de la presente divulgación, se optimizan y estandarizan las condiciones del método y se simplifica su manejo,
El método de acuerdo con la invención se realiza preferiblemente utilizando un kit que proporciona los materiales necesarios para ejecutar los pasos del método, Dicho kit preferiblemente comprende material estandarizado que garantiza que el método se realice bajo condiciones óptimas, asegurando así la comparabilidad de los resultados obtenidos de diferentes muestras o pacientes, o por diferentes profesionales, Por lo tanto, en un cuarto aspecto, divulgado, pero no reivindicado como tal, es un kit para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células en un sujeto, que comprende al menos un antígeno, al menos un azúcar no reductor, al menos un recipiente de recolección de muestra y al menos un medio de detección para detectar al menos una molécula efectora inmune, Se reivindica un kit, de acuerdo con la reivindicación 17, y por lo tanto un kit para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células en un sujeto, que comprende al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 7 a 50 aminoácidos, al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes, al menos un recipiente de recolección de muestras y al menos un medio de detección para al menos una molécula efectora inmune,
Preferiblemente, el antígeno y el azúcar no reductor se proporcionan en forma de una sola composición, Para este propósito, se puede utilizar la composición de acuerdo con el segundo aspecto, y se hace referencia a la divulgación anterior para los detalles de dicha composición, Los detalles sobre la composición, el antígeno y el azúcar no reductor también se describieron anteriormente junto con el método y la composición de acuerdo con la presente invención, y se hace referencia a la divulgación anterior, De acuerdo con una realización, el kit comprende un recipiente de recolección de muestra, como un tubo de recolección de sangre, el cual comprende la composición que comprende el antígeno y el azúcar no reductor, Preferiblemente, la composición comprende adicionalmente un anticoagulante como la heparina, Como se describe, la composición comprendida en el recipiente de recolección de muestra puede ser la composición de acuerdo con el segundo aspecto, Preferiblemente, el medio de detección es un reactivo de inmunodetección, tal como un anticuerpo etiquetado, Sin embargo, para ensayos que están basados en la detección del nivel de expresión del ARNm, el medio de detección se puede proporcionar mediante cebadores y/o sondas específicas para la molécula efectora inmune que se va a detectar, Las personas expertas en la técnica conocen ensayos y medios de detección adecuados, y también se describieron anteriormente,
La reivindicación 19 define el uso de un azúcar no reductor en un ensayo inmunológico para medir la actividad de la respuesta mediada por células, en el que la adición del azúcar no reductor aumenta la liberación de una molécula efectora inmune de las células inmunes que responden al antígeno analizado en dicho ensayo,
De acuerdo con una realización, el uso es el uso de un azúcar no reductor en un ensayo inmunológico para medir la actividad de la respuesta mediada por células, en el que la adición del azúcar no reductor durante la incubación de la muestra con el antígeno aumenta la liberación de una molécula efectora inmune de las células inmunes que responden al antígeno analizado en dicho ensayo,
Los detalles sobre el azúcar no reductor, las concentraciones preferibles, el ensayo inmunológico y las aplicaciones de los mismos en el campo médico, los antígenos adecuados y preferibles, las moléculas efectoras inmunes y las células inmunes se describieron anteriormente junto con el método de acuerdo con la presente invención y se hace referencia a la divulgación anterior, El azúcar no reductor puede tener una o más de las siguientes características: i) el azúcar no reductor es un disacárido;
ii) el azúcar no reductor se selecciona entre trehalosa y sacarosa;
iii) el azúcar no reductor se utiliza en una concentración de al menos 1 mg/ml, preferiblemente 2 mg/ml, en la composición de la incubación que comprende la muestra a analizar y el antígeno; y/o
¡<v>) el azúcar no reductor se proporciona en la forma de una composición que comprende además el antfgeno a analizar y, opcionalmente, un anticoagulante.
De acuerdo con una realización, el azúcar no reductor se selecciona entre trehalosa, manitol, sacarosa y rafinosa. Reivindicado de acuerdo con la reivindicación 20, es el uso de un azúcar no reductor en un ensayo inmunológico para medir la actividad de la respuesta mediada por células para aumentar la liberación de al menos una molécula efectora inmune de las células inmunes que responden a un antígeno analizado en dicho ensayo.
El uso de un azúcar no reductor, como se describe en la presente memoria, por ejemplo, trehalosa, en un ensayo para determinar o monitorear la inmunidad mediada por células ofrece ventajas significativas. Como se describió anteriormente, preferiblemente el azúcar no reductor se proporciona junto con el antígeno en forma de una única composición que se pone en contacto con la muestra. De acuerdo con una realización, no se añade azúcar reductor para la incubación y/o está comprendido en la composición que comprende el azúcar no reductor y el antígeno. Como se describió anteriormente, el azúcar no reductor no se utiliza como estabilizador para el antígeno. De acuerdo con una realización ventajosa, el antígeno está proporcionado por uno o más péptidos, preferiblemente péptidos sintéticos, que son reconocidos por una célula T citotóxica CD8+. Preferiblemente, en esta realización, el antígeno está proporcionado por uno o más péptidos, preferiblemente péptidos sintéticos, que tienen una longitud inferior a 15 aminoácidos, preferiblemente que tienen una longitud seleccionada de 7-14 aminoácidos.
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente divulgación se refiere al uso de la composición, de acuerdo con el segundo aspecto, un recipiente de recolección de muestra, de acuerdo con el tercer aspecto, y/o un kit, de acuerdo con el cuarto aspecto, en un ensayo para medir la actividad de la respuesta mediada por células.
Los detalles sobre los usos y aplicaciones adecuados y preferibles se describieron anteriormente y se hace referencia a la divulgación anterior. De acuerdo con una realización, el ensayo es para monitorear o determinar la presencia, ausencia, el nivel o estadio de una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en una infección por un agente patogénico, una enfermedad autoinmune, un cáncer, una afección inflamatoria, la exposición a un agente tóxico, la respuesta a un agente terapéutico, una inmunodeficiencia y una inmunosupresión. De acuerdo con una realización, el ensayo es para detectar o monitorear una enfermedad, una infección y/o la respuesta a la terapia, en particular inmunoterapia o terapia con agentes inmunosupresores. De acuerdo con una realización, la composición de acuerdo con el segundo aspecto, un recipiente de recolección de muestra de acuerdo con el tercer aspecto y/o un kit de acuerdo con el cuarto aspecto se utilizan en el método de acuerdo con el primer aspecto, lo cual se describe en detalle anteriormente y en las reivindicaciones.
Los intervalos numéricos descritos en la presente memoria son inclusivos de los números que definen el intervalo. Los encabezados proporcionados en la presente memoria no son limitantes de los diversos aspectos o realizaciones de esta divulgación, los cuales se pueden leer por referencia a la memoria descriptiva como un conjunto. De acuerdo con una realización, el tema descrito en la presente memoria, que comprende ciertos pasos en el caso de métodos, o que comprende ciertos ingredientes en el caso de, por ejemplo, composiciones, soluciones y/o mezclas, se refiere a el tema que consiste en los respectivos pasos o ingredientes. Es preferible seleccionar y combinar las realizaciones preferibles descritas en la presente memoria, y el tema específico que surge de una combinación respectiva de realizaciones preferibles también forma parte de la presente divulgación.
La invención se ¡lustrará a continuación con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Los ejemplos que no pertenecen a la invención reivindicada son únicamente con fines ilustrativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Efectos de la trehalosa en la sensibilidad del ensayo del virus de Epstein-Barr
Las investigaciones utilizando la tecnología QuantiFERON para medir las respuestas al antígeno modelo EBNA-1 del virus de Epstein-Barr se realizaron con la finalidad de evaluar aumentos en la sensibilidad del ensayo inducido por la adición de azúcares no reductores a la mezcla de incubación. En resumen, se añadieron los péptidos EBNA-1 a un tubo de recolección de sangre, más/menos 3 concentraciones de una solución de trehalosa (0.5, 1.0 o 2.0 mg/ml de trehalosa}. El ensayo QuantiFERÜN, que mide la respuesta Inmune celular anti-EBV, se corrió de acuerdo con las Instrucciones del fabricante. Se determinó y comparó la respuesta del ÍFN-gamma dependiendo de la concentración de trehalosa. Se observó un aumento en la respuesta del ÍFN-gamma al aumentar la concentración de trehalosa. Una concentración de 2 mg/ml de trehalosa proporcionó los mejores resultados en este ensayo de prueba.
Estos estudios demuestran que la adición de un azúcar no reductor, tal como trehalosa, al análisis de sangre completa resulta en un aumento significativo de la respuesta del ÍFN-gamma en un ensayo de respuesta inmune mediada por células. Debido al aumento en la respuesta del ÍFN-gamma que es inducido por la adición del azúcar no reductor, se mejora la sensibilidad del ensayo.
Ejemplo 2: Estabilidad de almacenamiento de un ensayo de la técnica anterior
En este ejemplo, se realizó una prueba de respuesta inmune mediada por células contra el CMV y se analizó la estabilidad de almacenamiento de los componentes del ensayo. Como antígeno, se utilizaron péptidos sintéticos, de 8-12 aminoácidos de longitud, de antígenos asociados al citomegalovirus. Los péptidos sintéticos asociados al CMV se formularon en una solución que contenía un azúcar simple (glucosa}, y se pulverizaron sobre el interior de un tubo de recolección de sangre y se secaron. Por lo tanto, el antígeno y el azúcar simple se comprendieron en una composición. Las pruebas de estabilidad de dicha composición comprendida en el tubo de recolección de sangre indicaron que la actividad del ensayo disminuyó con el tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente. Además, la actividad del ensayo del dispositivo del CMV se perdió cuando el dispositivo de recolección de sangre, que comprendía la composición secada por pulverización que comprendía el antígeno y la glucosa, se almacenó a 55 °C durante un período superior a 3 semanas (21 días}. Por lo tanto, las respectivas composiciones y, en consecuencia, los tubos de recolección que comprenden las composiciones respectivas no eran adecuados para uso como componentes de kit listo para usar debido a su escasa estabilidad durante el almacenamiento. La eliminación de la glucosa de la composición restauró la estabilidad y la función del ensayo. Por lo tanto, no fue posible incluir el azúcar simple junto con el antígeno en una composición. En su lugar, para aumentar la sensibilidad del ensayo, el azúcar simple se tuvo que añadir por separado a la muestra durante la preparación de la composición de la incubación. Por el contrario, las composiciones que comprenden el antígeno y un azúcar no reductor, como se enseña en la presente memoria, pueden mantener la sensibilidad aumentada del ensayo incluso durante períodos de almacenamiento prolongados.
Estos resultados también se confirmaron mediante experimentos adicionales. Los tubos del CMV con o sin glucosa se almacenaron durante tres semanas a 4 °C, 22 °C, 37 °C y 55 °C y posteriormente se analizaron con muestras de sangre de 4 donadores reactivos y 1 donador no reactivo. La Tabla 1 muestra los resultados promedio obtenidos con los donadores reactivos. A las temperaturas indicadas, los tubos del CMV con glucosa son menos reactivos que los almacenados ya sea a 4 °C o 22 °C y muestran una marcada disminución en la respuesta en relación con la formulación líquida (estándar de referencia} utilizada para preparar los tubos del CMV. Por el contrario, los tubos sin glucosa no mostraron una pérdida respectiva de la reactividad.
Tabla 1: Efecto de la glucosa durante el almacenamiento. Se muestra la diferencia de veces en la retención (ÍU/ml promedio}.
Ejemplo 3: Efecto de la adición de trehalosa en la respuesta del IFN-gamma en un tubo QFN-CMVQuantiFERON (QFN) CMV es un ensayo con registro CE que monitorea la memoria inmune de las células T dirigida contra antígenos derivados del Citomegalovirus. Los tubos de sangre QFN-CMV contienen péptidos diseñados para activar específicamente las células T CD8+ para producir interferón gamma (ÍFN-gamma). Estos tubos contienen únicamente péptido y heparina, sin añadir ninguna molécula de azúcar.
Este experimento tuvo como objetivo investigar el efecto en la respuesta del IFN-gamma cuando se añade el azúcar no reductor, trehalosa, a los tubos QFN-CMV.
Se añadieron 0, 1, 5 o 10 mg/ml de una solución de trehalosa (en agua) a los tubos de recolección de sangre QFN-CMV. Se añadió entonces 1 ml de sangre de 17 donadores sanos con una respuesta conocida de células T anti-CMV a cada uno de los cuatro tubos, y, además, se corrieron como controles un tubo Nulo y un tubo con Mitógeno. El ensayo QFN se corrió entonces de acuerdo con el prospecto del paquete. A todos los valores se les restó el valor Nulo. Los niveles del IFN-gamma en IU/ml se normalizaron frente a la respectiva QFN-CMV 0 mg/ml de trehalosa (control sin tratamiento) para generar una unidad de "cambio de veces"; para controlar la variación interdonador en la magnitud de la respuesta. Se incluyeron donadores sanos sin una respuesta inmune anti-CMV detectable para controlar la inducción inespecífica del IFN-gamma por trehalosa.
La adición de trehalosa resultó en un aumento dependiente de la concentración en el nivel medio del IFN-gamma (expresado como el cambio de veces del IFN-gamma frente al control sin tratamiento emparejado). Se observó un aumento significativo en el efecto con la adición de 5 y 10 mg/ml de trehalosa; prueba de Friedmans con prueba de comparaciones múltiples de Dunns. Los resultados se muestran en la Fig. 1. No se observó un aumento significativo en el nivel basal del IFN-gamma en los donadores del control negativo para CMV (datos no mostrados).
La adición de trehalosa a un ensayo QFN aumenta significativamente el nivel del IFN-gamma producido en respuesta al/los antígeno(s) específico(s) contenido(s) en el tubo de recolección de sangre sin aumentar inespecíficamente el nivel basal del IFN-gamma.
Ejemplo 4: Efecto de la adición de trehalosa en la respuesta del IFN-gamma en un tubo QFN-TB
Para confirmar la observación de que la adición del azúcar no reductor, trehalosa, a un ensayo que evalúa la inmunidad celular específica de péptidos, como el ensayo QuantiFERON (QFN), aumenta el resultado cuantitativo de la prueba, se fabricaron tubos QFN con la adición de un azúcar no reductor. Los tubos QFN de recolección de sangre se fabricaron para contener péptidos sintéticos de los antígenos ESAT-6 y CFP-10 de Mycobacterium tuberculosis (MTB), ya sea sin la adición de ningún azúcar o con la adición del azúcar no reductor, trehalosa.
Se analizó sangre completa de 20 sujetos con evidencia de infección por MTB, confirmada utilizando el ensayo QuantiFERON Gold en tubo, utilizando la tecnología establecida de la plataforma QuantiFERON, sin embargo, se emplearon los tubos QFN TB modificados descritos anteriormente, los cuales se fabricaron sin azúcar (libres de azúcar) o con un azúcar no reductor (Trehalosa). El ensayo se corrió de acuerdo con el prospecto del paquete de QFT Gold, el cual es un ensayo establecido. En este análisis clínico pareado, la inclusión del azúcar no reductor, trehalosa, en el tubo para antígeno TB aumentó significativamente la respuesta cuantitativa del ensayo (P = 0.0005), como se muestra en la Fig. 2. Los valores de los tubos (eje y) se muestran como valores IU/ml de IFN-gamma transformados Log (con los valores nulos del tubo restados). Se realizó una prueba de t pareada de una cola para demostrar la significancia estadística entre las dos cohortes. Los resultados demuestran claramente que la adición de trehalosa aumenta la respuesta del interferón gamma, como se observó en sujetos con infección por TB.
Ejemplo 5: La adición de diferentes azúcares no reductores aumenta la respuesta cuantitativa del IFN-gamma.
El efecto potenciador observado también se demostró con azúcares no reductores adicionales. Para este experimento, se añadieron cuatro azúcares no reductores diferentes a tubos de antígeno QFN CMV y un tubo Nulo correspondiente. Para alcanzar una concentración de sangre final de 2 mg/ml, se añadió una solución correspondiente de sacarosa, trehalosa, manitol y rafinosa en PBS a sangre completa obtenida de 5 donadores. Por lo tanto, se realizó un ensayo QFN en sangre de 5 donadores, utilizando tubos QFN CMV sin (N/S) o con la adición de un azúcar no reductor (sacarosa, trehalosa, manitol o rafinosa). El ensayo se corrió de acuerdo con el prospecto del paquete de QFN, el cual es un ensayo establecido. Los resultados se muestran en la Fig. 3. El eje x (véase la Fig. 3) indica las condiciones de prueba. El fondo (valor de los tubos Nulos con/sin la adición del azúcar respectivo) se restó del tubo del CMV correspondiente y se calculó el aumento porcentual del valor del IFN-gamma (IU/ml) sobre el tubo sin aditivo (eje y).
L<os>resultados demuestran una mayor respuesta a I<os>antfgenos del CMV, medida mediante el valor cuantitativo del IFN-gamma (IU/ml), con Ios cuatro azúcares no reductores.
Por lo tanto, todos Ios azúcares no reductores analizados tuvieron un efecto benéfico sobre la respuesta del IFN-gamma. Con la trehalosa se observó el mayor aumento, seguido del manitol, sacarosa y rafinosa.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un método para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células, dicho método comprende:
(a) proporcionar una composición de la incubación poniendo en contacto una muestra que comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno peptídico con al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos y con al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes; y
(b) detectar la presencia o el nivel de al menos una molécula efectora inmune.
2. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que
(i) el azúcar no reductor es un disacárido no reductor, preferiblemente seleccionado entre trehalosa y sacarosa, y/o (ii) en el que, en el paso (b), la detección de la presencia o el nivel de al menos una molécula efectora inmune comprende detectar la presencia o el nivel del interferón gamma y/o una molécula efectora inmune cuya producción es inducida o aumentada por el interferón gamma.
3. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 o 2, en el que la concentración del azúcar no reductor en la composición de la incubación es de al menos 1.5 mg/ml, preferiblemente de al menos 2 mg/ml.
4. El método de acuerdo con una o más de las Reivindicaciones 1 a 3, en el que, en el paso (a), la muestra se pone en contacto con una composición, la cual comprende el antígeno y el azúcar no reductor, y en el que opcionalmente i) dicha composición está comprendida en un recipiente de recolección de muestra, y/o
ii) dicha composición es una composición semilíquida, gelatinosa o sólida, o la composición es una composición seca, opcionalmente secada por pulverización.
5. El método de acuerdo con la Reivindicación 4, en el que la composición comprende adicionalmente un anticoagulante, preferiblemente heparina, y en el que la muestra es una muestra de sangre completa.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra tiene una o más de las siguientes características:
i) la muestra se obtuvo de un sujeto humano;
ii) la muestra se obtuvo de un sujeto humano que está inmunodeprimido o es inmunodeficiente;
iii) la muestra comprende células inmunes seleccionadas del grupo que consiste en células NK, células T, células B, células dendríticas, macrófagos y monocitos; y/o
iv) la muestra es sangre completa.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en el que el antígeno tiene una o más de las siguientes características:
i) se utilizan como antígeno uno o más péptidos, en el que los uno o más péptidos tienen una longitud seleccionada de 7 a 50 aminoácidos;
ii) el antígeno está proporcionado por uno o más péptidos sintéticos;
iii) el antígeno está proporcionado por al menos dos conjuntos de péptidos: un primer conjunto comprende al menos un péptido de alrededor de 7 a 14 residuos de aminoácidos de longitud y un segundo conjunto que comprende al menos un péptido de desde 15 residuos de aminoácidos o más, cuyos péptidos abarcan la totalidad o parte de un antígeno proteico;
iv) el antígeno está proporcionado por uno o más péptidos que son reconocidos por una célula T citotóxica CD8+; y/o v) el antígeno está proporcionado por uno o más péptidos que son reconocidos por una célula T citotóxica CD8+, y en el que los uno o más péptidos tienen una longitud inferior a 15 aminoácidos, preferiblemente que tienen una longitud seleccionada de 7-14 aminoácidos.
8. El método de acuerdo con una o más de las Reivindicaciones 1 a 7, en el que en el paso (a) se utilizan dos o más antígenos diferentes y/o en el que en el paso (b) se detectan dos o más moléculas efectoras diferentes.
9. El método de acuerdo con una<o>más de las Reivindicaciones 1 a 8, en el que el antfgeno es un antfgeno específico de la enfermedad, en particular un antígeno específico del patógeno.
10. El método de acuerdo con una o más de las Reivindicaciones 1 a 9, en el que el antígeno presenta una o más de las siguientes características:
i) el antígeno está asociado con o es representativo de una enfermedad o afección para la que se va a evaluar la respuesta inmune mediada por células;
ii) el antígeno se deriva de, y por lo tanto presenta reactividad cruzada con, un antígeno de un patógeno asociado con una condición de la enfermedad o es un antígeno asociado a un tumor asociado con un cáncer;
iii) el antígeno es un antígeno específico de un patógeno, y en el que el patógeno es una bacteria, un virus, un parásito, una levadura o un hongo;
iv) el antígeno es un antígeno específico del patógeno, es decir, un antígeno específico de bacteria, y en el que la bacteria se selecciona entre microorganismos Grampositivos y Gramnegativos, en particular especies de Mycobacterium, tal como Mycobacterium tuberculosis, especies de Staphylococcus, especies de Streptococcus, Escherichia coli, especies de Salmonella, especies de Clostridium, especies de Shigella, especies de Proteus, especies de Bacillus, especies de Hemophilus y especies de Borrelia;
v) el antígeno es un antígeno específico del patógeno, es decir, un antígeno específico del virus, y en el que el virus se selecciona entre virus de la hepatitis, tal como el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C, el virus del herpes, el virus del CMV y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH); y/o
vi) el antígeno proviene de o es especifico de un virus, preferiblemente citomegalovirus (CMV), y está proporcionado por uno o más péptidos que tienen una longitud de 7 a 14 residuos de aminoácidos, de 7 a 13 residuos de aminoácidos o de 8 a 12 residuos de aminoácidos.
11. El método, de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10, para monitorear o determinar la presencia, ausencia, el nivel o estadio de una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en una infección por un agente patogénico, una enfermedad autoinmune, un cáncer, una afección inflamatoria, la exposición a un agente tóxico, la respuesta a un agente terapéutico, una inmunodeficiencia y una inmunosupresión.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, que comprende:
(a) proporcionar una composición de la incubación poniendo en contacto una muestra de sangre completa obtenida de un sujeto humano con una composición que comprende al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos y al menos un disacárido no reductor, preferiblemente trehalosa o sacarosa, e incubar la composición de la incubación durante al menos 2 horas; y
(b) medir la presencia o el nivel del IFN-gamma liberado debido a la estimulación con el antígeno; en el que la presencia o la cantidad detectada del IFN-gamma es indicativa del nivel de respuesta inmune mediada por células del sujeto humano.
13. El método de acuerdo con una o más de las Reivindicaciones 1 a 12, en el que el azúcar no reductor se selecciona entre trehalosa, manitol, sacarosa y rafinosa, y en el que preferiblemente, el azúcar no reductor es trehalosa.
14. Una composición para inducir una respuesta inmune mediada por células, que comprende:
a) al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos;
b) al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes; y c) al menos un anticoagulante.
15. La composición de acuerdo con la Reivindicación 14, que tiene una o más de las siguientes características: i) el azúcar no reductor es un disacárido no reductor, preferiblemente seleccionado entre trehalosa y sacarosa; ii) el azúcar no reductor se selecciona entre trehalosa, manitol, sacarosa y rafinosa, o es trehalosa;
iii) el antígeno es un antígeno peptídico aislado;
iv) el antígeno presenta una o más de las características como se define en una o más de las Reivindicaciones 7 a 10; v) el antfgeno está proporcionado por uno o más péptidos, preferiblemente péptidos sintéticos, que tienen una longitud inferior a 15 aminoácidos, preferiblemente que tienen una longitud seleccionada de 7-14 aminoácidos;
vi) el antígeno es específico de la enfermedad o un antígeno asociado a la enfermedad;
vii) el anticoagulante es heparina; y/o
viii) la composición es una composición semilíquida, gelatinosa o sólida, o la composición es una composición seca, opcionalmente secada por pulverización.
16. Un recipiente de recolección de muestra, que comprende la composición de acuerdo con la Reivindicación 14 o 15.
17. Un kit para medir la actividad de la respuesta inmune mediada por células en un sujeto, que comprende al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 7 a 50 aminoácidos, al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes, al menos un recipiente de recolección de muestra y al menos un medio de detección para al menos una molécula efectora inmune.
18. El kit de acuerdo con la Reivindicación 17, en el que
(i) el recipiente de recolección de muestra tiene las características del recipiente de recolección de muestra de acuerdo con la Reivindicación 16;
(ii) el kit comprende un anticoagulante, preferiblemente heparina, y/o
(iii) la molécula efectora inmune es interferón gamma y/o una molécula efectora inmune cuya producción está inducida o aumentada por el interferón gamma.
19. Uso de un azúcar no reductor en un ensayo inmunológico para medir la actividad de la respuesta mediada por células, en el que la adición del azúcar no reductor aumenta la liberación de una molécula efectora inmune de las células inmunes que responden al antígeno analizado en dicho ensayo, y en el que opcionalmente, el uso tiene una o más de las siguientes características:
i) el azúcar no reductor es un disacárido;
ii) el azúcar no reductor se selecciona entre trehalosa y sacarosa;
iii) el azúcar no reductor se selecciona entre trehalosa, manitol, sacarosa y rafinosa, o es trehalosa;
iv) el azúcar no reductor es capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o es capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes; v) el azúcar no reductor se utiliza en una concentración de al menos 1 mg/ml, preferiblemente 2 mg/ml, en la composición de la incubación que comprende la muestra a analizar y el antígeno;
vi) el azúcar no reductor se proporciona en la forma de una composición, la cual además comprende el antígeno a analizar, y opcionalmente un anticoagulante, opcionalmente en la que la composición es una composición de acuerdo con la reivindicación 14 o 15;
vii) la adición del azúcar no reductor durante la incubación de la muestra con el antígeno aumenta la liberación de la molécula efectora inmune de las células inmunes que responden al antígeno analizado en dicho ensayo;
viii) el antígeno es un antígeno peptídico, en el que opcionalmente el antígeno es un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos o 7 a 50 aminoácidos;
ix) la adición del azúcar no reductor aumenta la liberación del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno analizado en dicho ensayo.
20. Uso de un azúcar no reductor en un ensayo inmunológico para medir la actividad de la respuesta mediada por células para aumentar la liberación de al menos una molécula efectora inmune de las células inmunes que responden a un antígeno analizado en dicho ensayo, opcionalmente en el que:
(i) el antígeno es un antígeno peptídico, en el que opcionalmente el antígeno es un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos;
(¡<í>) el antfgeno y/o el azúcar no reductor tienen una o más de las características definidas en la reivindicación 15; (III) el azúcar no reductor se proporciona en la forma de una composición, la cual comprende adicionalmente el antígeno a analizar y opcionalmente un anticoagulante, en el que opcionalmente la composición es una composición de acuerdo con la reivindicación 14 o 15; y/o
(iv) el uso es para aumentar la liberación del interferón gamma de las células inmunes que responden a un antígeno analizado en dicho ensayo.
21. Una composición de la incubación comprendida en un recipiente de recolección de muestra, la composición de la incubación comprende:
a) una muestra no diluida obtenida de un sujeto, la muestra comprende células inmunes capaces de producir moléculas efectoras inmunes después de la estimulación con un antígeno peptídico, preferiblemente linfocitos T;
b) al menos un antígeno peptídico que tiene una longitud seleccionada de 5 a 100 aminoácidos;
c) al menos un azúcar no reductor capaz de aumentar la respuesta del interferón gamma de las células inmunes que responden al antígeno y/o capaz de aumentar la producción y/o liberación de moléculas efectoras inmunes; y d) opcionalmente, un anticoagulante.
22. La composición de la incubación de acuerdo con la reivindicación 21, que tiene una o más de las siguientes características:
í) la muestra es un fluido corporal;
¡í) la muestra es sangre completa y la composición de la incubación comprende un anticoagulante, preferiblemente heparina; y/o
í¡¡) el antígeno y/o el azúcar no reductor tienen una o más de las características definidas en la reivindicación 15, iv) el antígeno es un antígeno peptídico aislado.
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