ES3032321T3 - Toxicity management for anti-tumor activity of cars - Google Patents

Toxicity management for anti-tumor activity of cars

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ES3032321T3
ES3032321T3 ES24202493T ES24202493T ES3032321T3 ES 3032321 T3 ES3032321 T3 ES 3032321T3 ES 24202493 T ES24202493 T ES 24202493T ES 24202493 T ES24202493 T ES 24202493T ES 3032321 T3 ES3032321 T3 ES 3032321T3
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Carl H June
Bruce L Levine
Michael D Kalos
Stephan Grupp
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Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
University of Pennsylvania Penn
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Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer en pacientes. En una realización, el método comprende una terapia de primera línea que consiste en administrar a un paciente que lo necesite una célula T genéticamente modificada que expresa un CAR, donde el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora y un dominio de señalización CD3 zeta, y monitorizar los niveles de citocinas en el paciente tras la infusión de células T para determinar el tipo de terapia de segunda línea adecuada para el tratamiento del paciente como consecuencia de la presencia de la célula T CAR en el paciente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Gestión de la toxicidad para la actividad antitumoral de los CAR
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los pacientes con leucemia linfocítica aguda (LLA) recidivante y refractaria a la quimioterapia tienen un mal pronóstico a pesar del uso de terapias agresivas tales como el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (Barrett et al., 1994, N Engl J Med 331:1253-8; Gokbuget et al., 2012, Blood 120:2032-41) y fragmentos de anticuerpos CD19 biespecíficos (Bargou et al., 2008, Science 321:974-7). Se ha notificado que las células T modificadas con receptores de antígeno quimérico dirigidas a los antígenos específicos de linaje CD19 y CD20 son eficaces en adultos con LLC y linfomas de células B (Till et al., 2008, Blood 112:2261-71; Kochenderfer et al., 2010, Blood 116:4099-102; Brentjens et al., 2011, Blood 118:4817-28; Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-33; Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73; Savoldo et al., 2011, J Clin Invest 121:1822-5). Sin embargo, los efectos de las células T CAR en los blastos de LLA, una leucemia más inmadura y con una progresión más rápida, no se han investigado a fondo. El docuumento WO 2005/023761 se refiere a compuestos de bajo peso molecular y su uso como agentes antiinflamatorios. El documento Lipowska-Bhalla et al., 2012, Cancer Immunol Immunother 61:953-962 ofrece una revisión de la inmunoterapia del cáncer con células T CAR. El documento Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy 18:666-668 proporciona un informe de caso de un acontecimiento adverso imprevisto en un ensayo clínico de fase I de células T autólogas dirigidas genéticamente en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica.
Se ha descrito un retraso en la aparición del síndrome de lisis tumoral y la secreción de citocinas, combinado con una vigorosa expansiónin vivode células T receptoras de antígenos quiméricos (Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-33; Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73). Sin embargo, aún no se han investigado a fondo los efectos de la secreción de citocinas y los trastornos asociados a la expansiónin vivode células T con receptores de antígenos quiméricos.
Por lo tanto, existe una necesidad urgente en la técnica de composiciones y procedimientos para el tratamiento del cáncer mediante el uso de los CAR y abordando la toxicidad de los CAR. La presente invención responde a esta necesidad.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona una célula T modificada genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular (célula T CAR) para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección asociada con una expresión elevada de un antígeno tumoral, comprendiendo el procedimiento administrar una terapia de primera línea y una terapia de segunda línea a un paciente que lo necesita, en el que:
la terapia de primera línea comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de la célula T CAR por medio de infusión;
tras la administración de la terapia de primera línea, se controlan los niveles de citocinas en el paciente para determinar el tipo adecuado de terapia de segunda línea que debe administrarse, en la que se detecta un aumento del nivel de IL-6, identificando así un inhibidor de IL-6 como el tipo adecuado de terapia de segunda línea, y dicho inhibidor de IL-6 se administra al paciente; y
la enfermedad, trastorno o afección es cáncer.
La invención también proporciona un inhibidor de IL-6 para su uso en un procedimiento para reducir o evitar un efecto adverso asociado con la infusión de una célula T modificada genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular (célula T CAR), el procedimiento comprende la monitorización de los niveles de una citocina en un paciente para determinar el tipo apropiado de terapia de citocina que debe administrarse, en la que se detecta un aumento del nivel de IL-6 tras la infusión de células T CAR, para de este modo identificar un inhibidor de IL-6 como el tipo apropiado de terapia de citocina, y dicho inhibidor de IL-6 se administra al paciente.
Estas y otras realizaciones se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La información técnica expuesta a continuación puede en algunos aspectos ir más allá del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.
Cualquier referencia incidental a procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de cirugía o terapia y procedimientos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal no debe interpretarse como una reivindicación de protección para tales procedimientos como tales, sino que debe interpretarse como una referencia a productos, en particular sustancias o composiciones, para su uso en cualquiera de estos procedimientos.
La invención se refiere a tratar a un paciente que tiene una enfermedad, trastorno o afección asociada con una expresión elevada de un antígeno tumoral, comprendiendo administrar una terapia de primera línea y una terapia de segunda línea a un paciente que lo necesita, en donde la terapia de primera línea comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de una célula modificada genéticamente para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. La enfermedad, trastorno o afección es cáncer, la célula es una célula T y la célula T CAR se administra por medio de infusión.
Tras la administración de la terapia de primera línea, se controlan los niveles de citocinas en el paciente para determinar el tipo adecuado de terapia de segunda línea que debe administrarse al paciente y se administra la terapia de segunda línea adecuada al paciente que la necesite.
Un aumento del nivel de una citocina identifica un tipo de terapia inhibidora de citocinas que debe administrarse al paciente que la necesita. En la invención, se detecta un aumento en el nivel de IL-6, para de este modo identificar un inhibidor de IL-6 como el tipo apropiado de terapia de segunda línea, y dicho inhibidor de IL-6 se administra al paciente.
Otras citocinas pueden seleccionarse del grupo que consiste en IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MIP-1a, MIP-ip, MCP-1, TNFa, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, EOTAXINA, e Gf, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, la terapia inhibidora de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en un ARN interferente pequeño (ARNsi), un microARN, un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un vector de expresión que codifica un mutante negativo transdominante, un anticuerpo, un péptido, una molécula pequeña, un fármaco inhibidor de citoquinas y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, los niveles de citocina se monitorizan detectando el nivel de proteína de la citocina en una muestra biológica del paciente.
En una realización, los niveles de citocina se monitorizan detectando el nivel de ácido nucleico de la citocina en una muestra biológica del paciente.
La invención también se refiere a reducir o evitar un efecto adverso asociado con la administración de una célula modificada genéticamente para expresar un CAR, en el que el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, comprendiendo monitorizar los niveles de una citocina en un paciente para determinar el tipo apropiado de terapia de citocina que debe administrarse al paciente y administrar la terapia de citocina apropiada al paciente. La célula es una célula T, y la célula T CAR se administra por medio de infusión.
Un aumento en el nivel de una citocina identifica un tipo de terapia inhibidora de citocinas que debe administrarse al paciente.
En la invención, se detecta un aumento en el nivel de IL-6 tras la infusión de células T CAR, para de este modo identificar un inhibidor de IL-6 como el tipo apropiado de terapia de citoquinas, y dicho inhibidor de IL-6 se administra al paciente.
Otras citocinas pueden seleccionarse del grupo que consiste en IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MIP-1a, MIP-1 p, MCP-1, TNFa, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, EOTAXINA,<e>G<f>, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, la terapia inhibidora de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en un ARN interferente pequeño (ARNsi), un microARN, un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un vector de expresión que codifica un mutante negativo transdominante, un anticuerpo intracelular, un péptido, una molécula pequeña, un fármaco inhibidor de citoquinas y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, los niveles de citocina se monitorizan detectando el nivel de proteína de la citocina en una muestra biológica del paciente.
En una realización, los niveles de citocina se monitorizan detectando el nivel de ácido nucleico de la citocina en una muestra biológica del paciente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La siguiente descripción detallada de realizaciones preferentes de la invención se comprenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos las realizaciones preferentes en la actualidad. Debe entenderse, sin embargo, que la invención no se limita a los arreglos precisos e instrumentalidades de las realizaciones que se muestran en los dibujos.
La figura 1 es una imagen que muestra los niveles séricos de citocinas en cuatro pacientes diferentes. Todos los pacientes mostraron liberación de citocinas, incluida la IL-6.
La figura 2 muestra las citocinas séricas de un paciente representativo. El paciente estuvo en estado crítico los días 5 a 7, y sólo empezó a mejorar tras la administración de tocilizumab.
La Figura 3 es una imagen que demuestra que las intervenciones con anticuerpos no afectan a la funcionalidad celular de CART 19, medida por marcadores de actividad de células T (perforina e IFN-y).
La Figura 4, que comprende las Figuras 4A a 4C, es una serie de imágenes que muestran respuestas clínicas. La Figura 4A muestra a dos niños con leucemia linfoblástica aguda CD19+ de células B precursoras con múltiples recaídas y refractaria a la quimioterapia que fueron tratados con células CTL019, infundidas el Día 0. Cambios en la lactato deshidrogenasa sérica (LDH) y la temperatura corporal tras la infusión de CTL019, con la temperatura máxima por período de 24 horas demarcada con círculos. Al CHOP-100 se le administró metilprednisolona a partir del día 5 a razón de 2 mg/kg/día, reduciéndose la dosis hasta el día 12. En la mañana del día 7, se administró etanercept 0,8 mg/kg x 1. A las 6 de la tarde del día 7, se administró tocilizumab 8 mg/kg x 1. Se produjo una mejoría transitoria de la pirexia con la administración de corticosteroides el día 5 en CHOP-100, y la resolución completa de las fiebres se produjo tras la administración del tratamiento dirigido por citocinas consistente en etanercept y tocilizumab el día 8. La Figura 4B muestra las citocinas séricas y los marcadores inflamatorios medidos en puntos temporales frecuentes tras la infusión de CTL019. Los valores de citoquinas se muestran mediante un gráfico semilogarítmico con el cambio de pliegues respecto al valor basal. Los valores basales (Día 0 pre-infusión) (pg/ml de suero) para cada analito fueron (CHOP-100, CHOP-101): IL1-p: (0,9, 0,2); IL-6: (4,3, 1,9); TNF-a: (1,5, 0,4); IL2Ra: (418,8, 205,7); IL-2: (0,7, 0,4); IL-10 (9,9, 2,3); IL1Ra: (43,9; 27.9). Ambos pacientes desarrollaron elevaciones pronunciadas de varias citocinas y receptores de citocinas, incluidos los receptores solubles de interleucina 1A y 2 (IL-1RA e IL-2R), las interleucinas 2, 6 y 10 (IL-2, IL-6 e IL-10), el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) y el interferón-Y (INF-<y>). La figura 4C muestra los cambios en el recuento absoluto de neutrófilos circulantes (ANC), el recuento absoluto de linfocitos (ALC) y el recuento de glóbulos blancos (WBC). Cabe destacar que el aumento del ALC estaba compuesto principalmente por linfocitos T CT019 activados.
La Figura 5, que comprende las Figuras 5A a 5D, es una serie de imágenes que muestran la expansión y visualización de células CTL019 en sangre periférica, médula ósea y LCR. La Figura 5A muestra el análisis de citometría de flujo de sangre periférica teñida con anticuerpos para detectar CD3 y el CAR anti-CD19. Se representa el porcentaje de células CD3 que expresan el CAR en CHOP-100 y CHOP-101. La Figura 5B muestra la presencia de células T CTL019 en sangre periférica, médula ósea y LCR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se aisló ADN genómico de sangre total, aspirados de médula ósea y LCR recogidos en puntos temporales seriados antes y después de la infusión de CTL019. La Figura 5C muestra la detección por citometría de flujo de células CTL019 en el LCR recogido de CHOP-100 y CHOP-101. La Figura 5D muestra imágenes de linfocitos granulares grandes activados en frotis de sangre periférica y citoespinas de LCR teñidos con Wright.
La figura 6 es una imagen que muestra la expresión de CD19 al inicio y en la recaída en CHOP-101. Se obtuvieron muestras de médula ósea de CHOP-101 antes de la infusión de CTL019 y en el momento de la recaída 2 meses después. Las células mononucleares aisladas de las muestras de médula se tiñeron para CD45, CD34 y CD19 y se analizaron en un citómetro de flujo Accuri C6. Después de separar las células vivas, la puerta de blastos (CD45+ SSC baja) se subgectó en células CD34+ y se generaron histogramas para la expresión de CD19. La línea de división representa el umbral para la misma sincronización en los controles de isotipo. Los blastos anteriores a la terapia tienen una distribución variada de CD19, con una pequeña población de células de tinción muy tenue que se ve como la cola del histograma izquierdo en 102 en el eje X. La muestra de la recaída no presenta blastos CD19 positivos. El análisis de la expresión de CD19 en la población de blastos previa al tratamiento reveló una pequeña población de células CD19 débiles o negativas. La intensidad media de fluorescencia (IMF) de esta pequeña población de células fue de 187 (panel izquierdo), similar a la IMF de las células blásticas recidivantes teñidas con anti-CD19 (201, panel derecho). La muestra de médula previa a la terapia era hipocelular con un 10% de blastos y la muestra de médula de la recaída era normocelular con un 68% de blastos, lo que explica las diferencias en los eventos disponibles para la adquisición.
La figura 7 es una imagen que muestra la inducción de la remisión en la médula ósea en CHOP-101 en el día 23 después de la infusión de CTL019. Informe de inmunofenotipado clínico para CHOP-101 al inicio del estudio (panel superior) y en el día 23 (panel inferior). Las células se tiñeron para C<d>10, CD19, CD20, CD34, CD38 y C<d>58. La citometría de flujo se realizó tras la lisis de los hematíes. El informe del día 23 indicaba que los glóbulos blancos consistían en un 42,0 % de linfocitos, un 6,0 % de monocitos, un 50,3 % de formas mieloides, un 0,17 % de blastos mieloides y ningún progenitor linfoide viable. No hubo pruebas inmunofenotípicas convincentes de leucemia/linfoma linfoblástico de células B precursoras residuales mediante citometría de flujo. Esencialmente no se identificaron células B viables.
La figura 8 es una imagen que muestra la expansiónin vivoy la persistencia de las células CTL019 en la sangre. Se muestra el número de glóbulos blancos (WBC), células T CD3+ y células CTL019 en sangre para CHOP-100 y CHOP-101. El número de células se muestra en un gráfico semilogarítmico.
La Figura 9, que comprende las Figuras 9A y 9B, es una serie de imágenes que demuestran que los individuos tuvieron una eliminación de células CD19 positivas en la médula ósea y la sangre en el plazo de 1 mes después de la infusión de CTL019. La figura 9A muestra la aplasia persistente de células B en CHOP-100. El panel superior muestra una población predominante de células blásticas leucémicas en la médula ósea aspirada de CHOP-100 que expresan CD19 y CD20 en el día 6. Esta población está ausente en el día 23 y a los 6 meses. La Figura 9B muestra la aplasia de células B y la aparición de células variantes de escape CD19 en CHOP-101. Análisis citométrico de flujo de aspirados de médula ósea de CHOP-101 teñidos con anti-CD45, CD34 y CD19. En la fila inferior, la dispersión lateral y las células CD45 dim positivas se utilizaron para identificar las células leucémicas que expresan cantidades variables de CD34 y CD19 en la línea de base. Sólo se detectaron blastos CD19 negativos el día 64. Los valores numéricos del panel superior representan la fracción del total de leucocitos representada en cada cuadrante. Los valores numéricos del panel inferior representan el porcentaje del total de leucocitos representados en la puerta baja CD45dim/SS.
La figura 10 es un gráfico que representa los niveles de ferritina presentes en el paciente tras la recepción de células T CAR.
La figura 11 es un gráfico que representa los niveles de mioglobina presentes en el paciente tras la recepción de células T CAR.
La figura 12 es un gráfico que representa los niveles de inhibidor-1 del activador del plasminógeno (PAI-1) presentes en el paciente tras la recepción de células T CAR.
DESCRIPCIÓN MÁS DETALLADA
La invención se refiere a composiciones para su uso en procedimientos para tratar el cáncer, incluyendo pero sin limitarse a neoplasias hematológicas y tumores sólidos. La invención también se refiere a composiciones para su uso en procedimientos de tratamiento y prevención de ciertos tipos de cáncer, incluyendo cáncer primario y metastásico, así como cánceres refractarios o resistentes a la quimioterapia convencional. Los procedimientos comprenden administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento o prevención una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una célula T transducida para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR). Los CAR son moléculas que combinan la especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un dominio intracelular activador del receptor de células T para generar una proteína quimérica que presenta una actividad inmunitaria celular antitumoral específica.
Como parte del régimen de tratamiento global, la invención abarca el manejo de ciertos cánceres (por ejemplo, prevenir o prolongar su recurrencia, o alargar el tiempo de remisión) por medio de la evaluación del perfil de factores solubles en pacientes post infusión de células T Preferentemente, el perfil de factores solubles incluye la evaluación de un perfil de citoquinas. Cuando el perfil de citocinas indica un aumento de una citocina particular después de la infusión de células T en comparación con antes de la infusión de células T, un experto en la técnica puede optar por administrar al paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de citocinas o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, clatrato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo para tratar los niveles elevados de la citocina después de la infusión de células T La invención se define en las reivindicaciones.
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que la identidad de una combinación única de factores incluyendo IL-6 cuya modulación a partir de los niveles basales o preexistentes al inicio puede ayudar a rastrear la activación de células T, la actividad diana y los posibles efectos secundarios perjudiciales tras la infusión de células T CAR a fin de ayudar a gestionar el tratamiento del cáncer. Otros factores incluyen, entre otros, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MIP-1a, MIP-1P, MCP-1, TNFa, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, EOTAXINA, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina y similares.
La presente invención se refiere a una estrategia de transferencia celular adoptiva de células T transducidas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) en combinación con la gestión de la toxicidad, en la que se genera un perfil de factores solubles de un paciente post infusión de células T y se lleva a cabo una terapia dirigida contra el factor soluble elevado para tratar el cáncer. Por ejemplo, la generación de un perfil de factores solubles en tiempo real permite intervenir sobre los factores solubles elevados con el inhibidor adecuado para reducir los niveles a niveles normales. En la invención, se detecta un aumento del nivel de IL-6 y se administra un inhibidor de IL-6 al paciente.
En una realización, el CAR usado en la invención comprende un dominio extracelular que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno que se dirige a un antígeno deseado, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático. La invención no se limita a un CAR específico. Más bien, cualquier CAR que se dirija a un antígeno deseado puede utilizarse en la presente invención. En el documento WO 2012/O79000se han descrito composiciones y procedimientos para fabricar los CAR.
En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos anteriores, los procedimientos dan como resultado una reducción medible del tamaño del tumor o evidencia de enfermedad o progresión de la enfermedad, respuesta completa, respuesta parcial, enfermedad estable, aumento o alargamiento de la supervivencia libre de progresión, aumento o alargamiento de la supervivencia global, o reducción de la toxicidad.
Definiciones
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier procedimiento y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden utilizar en la práctica para las pruebas de la presente invención, los materiales y procedimientos preferentes se describen en el presente documento. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología.
También ha de entenderse que la terminología utilizada en el presente documento es únicamente a fin de describir realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa.
Los artículos "un" y "una" se utilizan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno(es decir,al menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
"Aproximadamente" como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, se entiende que abarca variaciones de ±20% o ±10%, en algunos casos ±5%, en algunos casos ±1%, y en algunos casos ±0,1% del valor especificado, dado que tales variaciones son apropiadas para realizar los procedimientos divulgados.
"Activación", como se usa en el presente documento, se refiere al estado de una célula T que ha sido suficientemente estimulada para inducir una proliferación celular detectable. La activación también puede asociarse a la producción inducida de citoquinas y a funciones efectoras detectables. El término "células T activadas" se refiere, entre otras cosas, a células T que están experimentando división celular.
"Activadores" o "agonistas" de un factor soluble se utilizan en el presente documento para referirse a moléculas de agentes capaces de activar o aumentar los niveles del factor soluble. Los activadores son compuestos que aumentan, promueven, inducen la activación, activan o regulan al alza la actividad o expresión del factor soluble, por ejemplo, los agonistas. Los ensayos para detectar activadores incluyen, por ejemplo, la expresión del factor solublein vitro,en células o membranas celulares, la aplicación de compuestos agonistas putativos y, a continuación, la determinación de los efectos funcionales sobre la actividad del factor soluble, como se describe en el presente documento.
El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente con un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos suelen ser tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos de la presente invención pueden existir en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)<2>, así como anticuerpos de cadena simple y anticuerpos humanizados (Harlow et al., 1999, In:. Uso de anticuerpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Anticuerpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc.. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
El término "antígeno" o "Ag", como se utiliza en el presente documento, se define como una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos, la activación de células específicas inmunológicamente competentes, o ambas cosas. El experto en la técnica entenderá que cualquier macromolécula, incluidas prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos pueden derivarse de ADN recombinante o genómico. Un experto en la técnica entenderá que cualquier ADN que comprenda una secuencia de nucleótidos o una secuencia parcial de nucleótidos que codifique una proteína que provoque una respuesta inmunitaria codifica, por tanto, un "antígeno" en el sentido en que se utiliza este término en el presente documento. Además, un experto en la técnica entenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Es evidente que la presente invención incluye, pero no se limita a, el uso de secuencias parciales de nucleótidos de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos se disponen en varias combinaciones para provocar la respuesta inmunitaria deseada. Además, un experto en la técnica entenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado por un "gen". Es evidente que un antígeno puede generarse por síntesis o puede derivarse de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, entre otras, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido biológico.
El término "autoantígeno" significa, de acuerdo con la presente invención, cualquier autoantígeno que es reconocido por el sistema inmunitario como si fuera extraño. Los autoantígenos comprenden, entre otros, proteínas celulares, fosfoproteínas, proteínas de la superficie celular, lípidos celulares, ácidos nucleicos, glicoproteínas, incluidos los receptores de la superficie celular.
El término "enfermedad autoinmune", tal como se utiliza en el presente documento, se define como un trastorno que resulta de una respuesta autoinmune. Una enfermedad autoinmune es el resultado de una respuesta inapropiada y excesiva a un antígeno propio. Ejemplos de enfermedades autoinmunes son, entre otras, la enfermedad de Addision, la alopecia grave, la espondilitis anquilosante, la hepatitis autoinmune, la parotitis autoinmune, la enfermedad de Crohn, la diabetes (tipo I), la epidermólisis bullosa distrófica, la epididimitis, la glomerulonefritis, la enfermedad de Graves, el síndrome de Guillain-Barr, la enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitíligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa, entre otras.
Como se utiliza en el presente documento, el término "autólogo" se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo al que posteriormente se va a reintroducir en el mismo.
"Alogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal diferente de la misma especie.
"Xenogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.
El término "cáncer', tal como se utiliza en el presente documento, se define como una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido e incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden propagarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Ejemplos de varios tipos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello de útero, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer cerebral, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares.
Como se utiliza en el presente documento, por "terapia de combinación" se entiende que un primer agente se administra junto con otro agente. "Conjuntamente con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Como tal, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al individuo. Tales combinaciones se consideran parte de un único régimen o régimen de tratamiento.
Como se utiliza en el presente documento, el término "administración concurrente" significa que la administración de la primera terapia y la de una segunda terapia en una terapia combinada se solapan entre sí.
"Ligando coestimulador", tal como se utiliza el término en el presente documento, incluye una molécula en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una aAPC, célula dendrítica, célula B, y similares) que se une específicamente a una molécula coestimuladora afín en una célula T, para de este modo proporcionar una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptido, media una respuesta de célula T, incluyendo, pero sin limitarse a, proliferación, activación, diferenciación, y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, entre otros, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando costimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, h V e M, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitarse a, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado a función linfocitaria (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente con CD83.
Una "molécula coestimuladora" se refiere a la pareja de unión cognada en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por la célula T, tal como, pero no limitada a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, entre otras, una molécula MHC de clase I, BTLA y un receptor ligando Toll.
Una "señal coestimuladora", como se usa en el presente documento, se refiere a una señal, que en combinación con una señal primaria, tal como la ligadura de TCR/CD3, conduce a la proliferación de células T y/o a la regulación al alza o a la baja de moléculas clave.
Una "enfermedad" es un estado de salud de un animal en el que el animal no puede mantener la homeostasis, y en el que si la enfermedad no se mejora entonces la salud del animal continúa deteriorándose. Por el contrario, un "trastorno" en un animal es un estado de salud en el que el animal es capaz de mantener la homeostasis, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Si no se trata, un trastorno no provoca necesariamente una mayor disminución del estado de salud del animal.
Una "cantidad eficaz", tal como se utiliza en el presente documento, significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico.
Como se utiliza en el presente documento, "endógeno" se refiere a cualquier material procedente o producido en el interior de un organismo, célula, tejido o sistema.
Como se utiliza en el presente documento, el término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido en un organismo, célula, tejido o sistema que se produjo fuera del organismo, célula, tejido o sistema.
El término "expresión", como se utiliza en el presente documento, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por su promotor.
"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de expresión enlazadas operativamente a una secuencia nucleotídica que debe expresarse. Un vector de expresión comprende suficientes elementos cisactores para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en un sistema de expresiónin vitro.Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.
"Homólogo" se refiere a la similitud de secuencia o identidad de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácidos, por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas X 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones de dos secuencias coinciden o son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas en un 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN ATTGCC y TATGGC comparten un 50% de homología. Por lo general, la comparación se realiza cuando dos secuencias se alinean para obtener la máxima homología.
El término "inmunoglobulina" o "Ig", tal como se utiliza en el presente documento, se define como una clase de proteínas, que funcionan como anticuerpos. Los anticuerpos expresados por los linfocitos B se denominan a veces BCR (receptor de linfocitos B) o receptor de antígenos. Los cinco miembros incluidos en esta clase de proteínas son IgA, IgG, IgM, IgD e IgE. La IgA es el anticuerpo primario que está presente en las secreciones corporales, tales como la saliva, las lágrimas, la leche materna, las secreciones gastrointestinales y las secreciones mucosas de las vías respiratorias y genitourinarias. La IgG es el anticuerpo circulante más común. La IgM es la principal inmunoglobulina producida en la respuesta inmunitaria primaria en la mayoría de los individuos. Es la inmunoglobulina más eficaz en la aglutinación, la fijación del complemento y otras respuestas de anticuerpos, y es importante en la defensa contra bacterias y virus. La IgD es la inmunoglobulina que no tiene función de anticuerpo conocida, pero puede servir como receptor de antígeno. La IgE es la inmunoglobulina que media la hipersensibilidad inmediata provocando la liberación de mediadores de los mastocitos y basófilos tras la exposición al alérgeno.
Como se utiliza en el presente documento, el término "respuesta inmunitaria" incluye respuestas inmunitarias mediadas por células T y/o mediadas por células B. Las respuestas inmunitarias ejemplares incluyen respuestas de células T, por ejemplo, producción de citocinas y citotoxicidad celular. Además, el término respuesta inmunitaria incluye respuestas inmunitarias que se efectúan indirectamente por medio de la activación de células T, por ejemplo, la producción de anticuerpos (respuestas humorales) y la activación de células que responden a citocinas, por ejemplo, macrófagos. Entre las células inmunitarias que intervienen en la respuesta inmunitaria se encuentran los linfocitos, como los linfocitos B y los linfocitos T (CD4+, CD8+, Th1 y Th2); las células presentadoras de antígenos (por ejemplo, células presentadoras de antígenos profesionales, como células dendríticas, macrófagos, linfocitos B, células de Langerhans, y células presentadoras de antígenos no profesionales, como queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos, oligodendrocitos); células asesinas naturales; células mieloides, como macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos.
"Inhibidores" o "antagonistas" de un factor soluble se utilizan en el presente documento para referirse a moléculas de agentes capaces de inhibir, inactivar o reducir los niveles del factor soluble. Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen, bloquean parcial o totalmente la actividad, disminuyen, impiden, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan a la baja la actividad o expresión del factor soluble, por ejemplo, los antagonistas. Los inhibidores incluyen inhibidores polipeptídicos, tales como anticuerpos, receptores solubles y similares, así como inhibidores de ácidos nucleicos como ARNsi o ARN antisentido, versiones modificadas genéticamente del factor soluble, por ejemplo, versiones con actividad alterada, así como antagonistas del factor soluble naturales y sintéticos, pequeñas moléculas químicas y similares. Los ensayos para detectar inhibidores incluyen, por ejemplo, la expresión del factor solublein vitro,en células o membranas celulares, la aplicación de compuestos antagonistas putativos y, a continuación, la determinación de los efectos funcionales sobre la actividad del factor soluble, tal como se describe en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, un "material instructivo" incluye una publicación, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda utilizarse para comunicar la utilidad de las composiciones para uso de la invención. El material de instrucción del kit de la divulgación puede, por ejemplo, adherirse a un recipiente que contenga el ácido nucleico, el péptido y/o la composición o enviarse junto con un recipiente que contenga el ácido nucleico, el péptido y/o la composición. Alternativamente, el material didáctico puede enviarse separado del contenedor con la intención de que el material didáctico y el compuesto sean utilizados conjuntamente por el destinatario.
"Aislado" significa alterado o apartado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o totalmente de los materiales coexistentes de su estado natural sí está "aislado". Un ácido nucleico o una proteína aislados pueden existir en forma sustancialmente purificada, o pueden existir en un entorno no nativo como, por ejemplo, una célula huésped.
Un "lentivirus", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus por su capacidad de infectar células que no se dividen; pueden introducir una cantidad significativa de información genética en el ADN de la célula huésped, por lo que son uno de los procedimientos más eficaces de vector de administración de genes. El VIH, el VIS y el VISF son ejemplos de lentivirus. Los vectores derivados de lentivirus ofrecen los medios para lograr niveles significativos de transferencia de genesin vivo.
La frase "nivel de un factor soluble " en una muestra biológica como se usa en el presente documento se refiere típicamente a la cantidad de proteína, fragmento de proteína o niveles de péptido del factor soluble que está presente en una muestra biológica. No es necesario cuantificar un "nivel de un factor soluble", sino que puede simplemente detectarse, por ejemplo, una detección subjetiva y visual por parte de un humano, con o sin comparación con un nivel de una muestra de control o un nivel esperado de una muestra de control.
Por el término "modulador", como se usa en el presente documento, se entiende mediar un aumento o disminución detectable en el nivel de una respuesta en un individuo en comparación con el nivel de una respuesta en el individuo en ausencia de un tratamiento o compuesto, y/o en comparación con el nivel de una respuesta en un individuo por lo demás idéntico pero no tratado. El término abarca la perturbación y/o afectación de una señal o respuesta nativa, para de este modo mediar una respuesta terapéutica beneficiosa en un individuo, preferentemente, un ser humano.
La administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, por ejemplo, inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, o técnicas de infusión.
Los términos "paciente", "individuo", "individuo" y similares se utilizan indistintamente en el presente documento, y se refieren a cualquier animal, o células del mismo ya seain vitrooin situ,susceptible de los procedimientos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones no limitantes, el paciente, individuo o individuo es un ser humano.
El término "administración simultánea", como se utiliza en el presente documento, significa que una primera terapia y una segunda terapia en una terapia combinada se administran con una separación temporal de no más de aproximadamente 15 minutos, tal como no más de aproximadamente cualquiera de 10, 5 o 1 minutos. Cuando la primera y la segunda terapias se administran simultáneamente, la primera y la segunda terapias pueden estar contenidas en la misma composición (por ejemplo, una composición que comprende tanto una primera como una segunda terapia) o en composiciones separadas (por ejemplo, una primera terapia en una composición y una segunda terapia está contenida en otra composición).
El término "administración simultánea", como se utiliza en el presente documento, significa que una primera terapia y una segunda terapia en una terapia combinada se administran con una separación temporal de no más de aproximadamente 15 minutos, tal como no más de aproximadamente cualquiera de 10, 5 o 1 minutos. Cuando la primera y la segunda terapias se administran simultáneamente, la primera y la segunda terapias pueden estar contenidas en la misma composición (por ejemplo, una composición que comprende tanto una primera como una segunda terapia) o en composiciones separadas (por ejemplo, una primera terapia en una composición y una segunda terapia está contenida en otra composición).
Por el término "se une específicamente", tal como se utiliza en el presente documento con respecto a un anticuerpo, se entiende un anticuerpo que reconoce un antígeno específico, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de una especie también puede unirse a ese antígeno de una o más especies. Pero esta reactividad entre especies no altera por sí misma la clasificación de un anticuerpo como específico. En otro ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno también puede unirse a diferentes formas alélicas del antígeno. Sin embargo, dicha reactividad cruzada no altera por sí misma la clasificación de un anticuerpo como específico. En algunos casos, los términos "unión específica" o "unión específica" pueden utilizarse en referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, para significar que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica específica en lugar de a proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para el epítopo "A", la presencia de una molécula que contenga el epítopo A (o A libre, no marcado), en una reacción que contenga "A" marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.
Por el término "estimulación" se entiende una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) con su ligando cognado mediando así un evento de transducción de señal, tal como, pero no limitado a, transducción de señal a través del complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar la expresión alterada de ciertas moléculas, como la regulación a la baja del TGF-p, y/o la reorganización de las estructuras citoesqueléticas, y similares.
Una "molécula estimuladora", tal como se usa el término en el presente documento, significa una molécula en una célula T que se une específicamente con un ligando estimulador afín presente en una célula presentadora de antígeno.
Un "ligando estimulador", como se usa en el presente documento, significa un ligando que cuando está presente en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una aAPC, una célula dendrítica, una célula B, y similares) puede unirse específicamente con un compañero de unión afín (denominado en el presente documento "molécula estimuladora") en una célula T, mediando de ese modo una respuesta primaria por la célula T, incluyendo, pero sin limitación, activación, iniciación de una respuesta inmunitaria, proliferación, y similares. Los ligandos estimuladores son bien conocidos en la técnica y abarcan, entre otros, una molécula MHC de clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo superagonista anti-CD28 y un anticuerpo superagonista anti-CD2.
El término "individuo" pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Ejemplos de individuos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas no humanas de los mismos.
Como se utiliza en el presente documento, una célula "sustancialmente purificada" es una célula que está esencialmente libre de otros tipos celulares. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que ha sido separada de otros tipos celulares con los que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a células que han sido separadas de las células con las que están naturalmente asociadas en su estado natural. En algunas realizaciones, las células se cultivanin vitro.En otras realizaciones, las células no se cultivanin vitro.
El término "terapéutico", como se utiliza en el presente documento, significa un tratamiento y/o profilaxis. Un efecto terapéutico se obtiene por medio de la supresión, remisión o erradicación de un estado de enfermedad.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto en cuestión que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema o individuo que busca el investigador, veterinario, médico u otro clínico. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" incluye aquella cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar en cierta medida, uno o más de los signos o síntomas del trastorno o enfermedad que se está tratando. La cantidad terapéuticamente eficaz variará en función del compuesto, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc., del individuo a tratar.
Un "trasplante", como se utiliza en el presente documento, se refiere a células, tejido o un órgano que se introduce en un individuo. La fuente del material trasplantado pueden ser células cultivadas, células de otro individuo o células del mismo individuo (por ejemplo, después de cultivar las células in vitro). Algunos ejemplos de trasplantes de órganos son los de riñón, hígado, corazón, pulmón y páncreas.
"Tratar" una enfermedad, como se utiliza el término en el presente documento, significa reducir la frecuencia o gravedad de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno experimentado por un individuo.
El término "transfectado" o "transformado" o "transducido", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un proceso mediante el cual se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno en la célula huésped. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es aquella que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula sujeta primaria y su progenie.
Intervalos: a lo largo de la presente divulgación, diversos aspectos de la invención pueden presentarse en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha revelado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo como de 1 a 6 debe considerarse que ha revelado específicamente subintervalos como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de dicho intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud de la gama.
Descripción
La presente divulgación proporciona composiciones para su uso en procedimientos para tratar el cáncer en un paciente. En un caso, el procedimiento de tratamiento comprende una terapia de primera línea que comprende administrar al paciente el CAR definido en las reivindicaciones para inducir una respuesta inmunitaria antitumoral y monitorizar los niveles de factores solubles en el paciente tras la infusión de células T para determinar el tipo de terapia de segunda línea adecuada para tratar al paciente como consecuencia de la terapia de primera línea.
En un caso, la segunda línea de terapia comprende evaluar el perfil de factores solubles en un paciente tras la recepción de una infusión del CAR T apropiado (denominado en el presente documento "post infusión de células T") donde cuando el perfil de factor soluble indica un aumento en un factor soluble particular post infusión de células T en comparación con pre infusión de células T, un artesano experto puede optar por administrar al paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor del factor soluble con el fin de controlar los niveles elevados del factor soluble tras la infusión de células T En consecuencia, la terapia de segunda línea en un caso incluye la administración de un tipo de terapia inhibidora del factor soluble para controlar los niveles elevados de ciertos factores solubles resultantes de la terapia de primera línea de usar células T CAR.
En la invención, las composiciones para uso de la divulgación son como se definen en las reivindicaciones.
En otra realización más, la terapia de segunda línea relativa a la administración de un compuesto inhibidor del factor soluble al paciente puede combinarse con otras terapias utilizadas convencionalmente para tratar, prevenir o gestionar enfermedades o trastornos asociados con, o caracterizados por, angiogénesis no deseada. Ejemplos de tales terapias convencionales incluyen, pero no se limitan a, cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia biológica e inmunoterapia.
En una realización, el CAR para uso en la invención puede diseñarse para comprender un dominio extracelular que tiene un dominio de unión a antígeno que se dirige a antígeno tumoral fusionado a un dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo receptor de antígeno de células T (por ejemplo, CD3 zeta). Un antígeno tumoral de células B ejemplar es el CD19 porque este antígeno se expresa en las células B malignas. Sin embargo, la invención no se limita a dirigirse a CD19. Más bien, la invención incluye cualquier fracción de unión a antígeno tumoral. La fracción de unión al antígeno se fusiona preferentemente con un dominio intracelular de una o más de las moléculas coestimuladoras y de la cadena zeta. Preferentemente, la fracción de unión a antígeno se fusiona con uno o más dominios intracelulares seleccionados del grupo de un dominio de señalización CD137 (4-1BB), un dominio de señalización CD28, un dominio de señalización CD3zeta y cualquier combinación de los mismos.
En una realización, el CAR para uso en la invención comprende un dominio de señalización CD137 (4-1BB). Esto se debe a que la presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que las respuestas de células T mediadas por CAR pueden mejorarse aún más con la adición de dominios costimuladores. Por ejemplo, la inclusión del dominio de señalización CD137 (4-1BB) aumentó significativamente la actividad mediada por CAR y la persistenciain vivode las células T CAR en comparación con una célula T CAR idéntica no diseñada para expresar CD137 (4-lBB). Sin embargo, la invención no se limita a un CAR específico. Más bien, cualquier CAR que se dirija a un antígeno tumoral puede utilizarse en la presente invención. En el documento WO 2012/079000se han descrito composiciones y procedimientos para fabricar y utilizar CAR.
Procedimientos
El régimen de tratamiento de la invención da como resultado una reducción medible del tamaño del tumor o evidencia de enfermedad o progresión de la enfermedad, respuesta completa, respuesta parcial, enfermedad estable, aumento o alargamiento de la supervivencia libre de progresión, aumento o alargamiento de la supervivencia global, o reducción de la toxicidad.
Como parte del régimen de tratamiento global, la invención abarca una terapia de primera línea y una terapia de segunda línea, en la que la terapia de primera línea comprende administrar una célula T CAR como se define en las reivindicaciones al paciente que la necesita. El régimen de tratamiento de la invención permite la gestión del cáncer y su tratamiento por medio de la evaluación del perfil de factores solubles en pacientes tras la infusión de células T. Una terapia de segunda línea apropiada comprende la administración de un inhibidor del factor soluble apropiado al paciente para reducir los niveles elevados del factor soluble resultantes de la terapia de primera línea.
En la invención, un inhibidor de la IL-6 se identifica como el tipo apropiado de terapia de segunda línea.
En una realización, una terapia de segunda línea apropiada comprende administrar un inhibidor de citocina apropiado al paciente a fin de reducir los niveles elevados de la citocina resultante de la terapia de primera línea.
En la invención, se administra al paciente un inhibidor de la IL-6.
En una realización, los niveles diferenciales son sobreexpresión (alta expresión) o infraexpresión (baja expresión) en comparación con el nivel de expresión de una célula normal o de control, una población de pacientes dada, o con un control interno. En algunas realizaciones, los niveles se comparan entre el paciente y un individuo normal, entre el paciente tras la infusión de células T y antes de la infusión de células T, o entre el paciente tras la infusión de células T en un primer momento y en un segundo momento.
En una realización, la invención incluye evaluar niveles diferenciales de una o más citoquinas para generar un perfil de citoquinas en un paciente post infusión de células T a fin de determinar el tipo de terapia de citoquinas a aplicar al paciente con el fin de regular el nivel de citoquinas de nuevo a niveles normales. Por lo tanto, la invención puede aplicarse para identificar los niveles de citoquinas elevados como resultado de la presencia de las células T CAR de la invención en el paciente, lo que permite el tratamiento especializado del paciente con inhibidores de citoquinas para disminuir los niveles elevados de la citoquina.
En la invención, se detecta un aumento en el nivel de IL-6, para de este modo identificar un inhibidor de IL-6 como el tipo apropiado de terapia de segunda línea, y dicho inhibidor de IL-6 se administra al paciente.
En una realización, los niveles de citoquinas que también se elevan como resultado de recibir una infusión de células T CAR incluyen pero no se limitan a IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5,
IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IL-2R, IFN-a, IFN-y, MIP-1a, MIP-ip, MCP-1, TNFa, GM-CSF, G-CSF, CXCL9, CXCL10, factores CXCR, VEGF, RANTES, EOTAXIN, EGF, HGF, FGF-p, CD40, CD40L, ferritina, y similares. Sin embargo, la invención no debe limitarse a estas citocinas enumeradas. Más bien, la invención incluye cualquier otra citocina identificada como elevada en un paciente como resultado de recibir una infusión de células T CAR.
Detección de una citoquina y tratamiento de la misma
Aunque esta sección describe la detección de una citocina y el tratamiento de la misma como parte de la terapia de segunda línea, la invención abarca la detección de cualquier factor soluble y el tratamiento del mismo como parte de la terapia de segunda línea. Por lo tanto, la descripción en el contexto de una "citoquina" puede aplicarse igualmente a un "factor soluble".
Como parte de la terapia de segunda línea, la invención incluye procedimientos de detección de los niveles de una citocina en un paciente que ha recibido la infusión de una célula T CAR para su uso en la invención. La presencia o el nivel de una citocina se utiliza para seleccionar un tratamiento candidato. En algunas realizaciones, la presencia o los niveles de la citocina pueden utilizarse para determinar el éxito durante el curso o después del tratamiento de primera línea, de segunda línea o tanto de primera como de segunda línea. En la invención, se detecta un aumento en el nivel de IL-6, para de este modo identificar un inhibidor de IL-6 como el tipo apropiado de terapia de segunda línea.
Las muestras biológicas en las que puede detectarse la citocina incluyen, por ejemplo, suero. En algunas realizaciones, las muestras biológicas incluyen una biopsia de tejido que puede o no tener un componente líquido.
Los inmunoensayos pueden utilizarse para analizar cualitativa o cuantitativamente los niveles de citoquinas en una muestra biológica. Puede encontrarse una visión general de la tecnología aplicable en varios manuales de fácil acceso, por ejemplo, Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Using Antibodies: Un manual de laboratorio (1999).
Además de utilizar inmunoensayos para detectar los niveles de citoquinas en una muestra biológica de un paciente, la evaluación de la expresión y los niveles de citoquinas puede realizarse en base al nivel de expresión génica de las citoquinas particulares. Las técnicas de hibridación de a Rn para determinar la presencia y/o el nivel de expresión de ARNm son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden utilizarse para evaluar la presencia o el nivel de expresión génica de la citocina de interés.
En algunas realizaciones, la presente invención utiliza socios de unión selectivos de la citocina para identificar la presencia o determinar los niveles de la citocina en una muestra biológica. La pareja de unión selectiva que se utilizará con la presente invención puede ser, por ejemplo, un anticuerpo. En algunos aspectos, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales contra la citocina en cuestión. En algunos otros aspectos, pueden emplearse anticuerpos policlonales contra la citocina particular para poner en práctica la presente invención.
Los anticuerpos comerciales contra la citocina están disponibles y pueden usarse con la presente invención. Es bien sabido por los expertos en la técnica que el tipo, la fuente y otros aspectos de un anticuerpo a utilizar es una consideración que debe hacerse a la luz del ensayo en el que se utiliza el anticuerpo. En algunos casos, los anticuerpos que reconocerán su antígeno diana en un Western blot podrían no ser aplicables a un ensayo ELISA o ELISpot y viceversa.
En algunas realizaciones, los anticuerpos que van a usarse para los ensayos pueden producirse mediante el uso de técnicas para producir anticuerpos monoclonales o policlonales que son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986); y Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975). Tales técnicas incluyen la preparación de anticuerpos mediante selección de anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores fago o similares, así como la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales por medio de inmunización de conejos o ratones (véase, por ejemplo, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)). Dichos anticuerpos pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas y diagnósticas, por ejemplo, en el tratamiento y/o detección de cualquiera de las enfermedades o afecciones específicas asociadas a citocinas descritas en el presente documento.
Los procedimientos de detección que emplean inmunoensayos son particularmente adecuados para la práctica en el punto de atención al paciente. Dichos procedimientos permiten el diagnóstico inmediato y/o la evaluación pronóstica del paciente. Los sistemas de diagnóstico en el punto de atención se describen, por ejemplo, en U.S. Pat. No.
6,267,722.
También existen otros formatos de inmunoensayo que permiten realizar una evaluación de la muestra biológica sin tener que enviar la muestra a un laboratorio para su evaluación. Normalmente, estos ensayos tienen formato de ensayos sólidos en los que se utiliza un reactivo, por ejemplo, un anticuerpo, para detectar la citoquina. Dispositivos de ensayo ejemplares adecuados para su uso con inmunoensayos tales como ensayos de la presente invención se describen, por ejemplo, en Pat.EE.UU. Nos. 7.189.522; 6.818.455 y 6.656.745.
En algunos aspectos, la presente invención utiliza procedimientos para la detección de secuencias polinucleotídicas que codifican para la citocina en una muestra biológica. Como se ha indicado anteriormente, una "muestra biológica" se refiere a una célula o población de células o a una cantidad de tejido o fluido de un paciente. Lo más frecuente es que la muestra haya sido extraída de un paciente, pero el término "muestra biológica" también puede referirse a células o tejidos analizadosin vivo,es decir, sin extraerlos del paciente. Normalmente, una "muestra biológica" contendrá células del paciente, pero el término también puede referirse a material biológico no celular.
En una realización, se utilizan ensayos basados en amplificación para medir el nivel de una citocina deseada. En dicho ensayo, las secuencias de ácido nucleico de la citocina deseada actúan como molde en una reacción de amplificación (por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR). En una amplificación cuantitativa, la cantidad de producto de amplificación será proporcional a la cantidad de molde en la muestra original. La comparación con los controles apropiados proporciona una medida del número de copias del gen asociado a la citocina. Los procedimientos de amplificación cuantitativa son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se proporcionan protocolos detallados para la PCR cuantitativa, por ejemplo, en Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y). Los procedimientos de RT-PCR son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., supra). En algunas realizaciones, se utiliza RT-PCR cuantitativa, por ejemplo, un ensayo TaqMan™, permitiendo así la comparación del nivel de ARNm en una muestra con una muestra o valor de control. Las secuencias de ácido nucleico conocidas para una citocina deseada son suficientes para permitir a un experto en la técnica seleccionar rutinariamente cebadores para amplificar cualquier porción del gen. Pueden diseñarse cebadores adecuados para la amplificación de secuencias específicas mediante el uso de principios bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: Un manual de laboratorio (1995)).
En algunas realizaciones, pueden usarse ensayos basados en hibridación para detectar la cantidad de una citoquina deseada en las células de una muestra biológica. Dichos ensayos incluyen el análisis dot blot del ARN, así como otros ensayos, por ejemplo, la hibridación fluorescentein situ,que se realiza en muestras que comprenden células. Existen otros ensayos de hibridación fácilmente disponibles en la técnica.
En numerosas realizaciones de la presente invención, se detectará el nivel y/o la presencia de un polinucleótido o polipéptido de citocina en una muestra biológica, para de este modo detectar la expresión diferencial de la citocina para generar un perfil de citocina a partir de una muestra biológica derivada de un paciente infundido con una célula T CAR de la invención en comparación con la muestra biológica de control.
La cantidad de un polinucleótido o polipéptido de citocina detectado en la muestra biológica indica la presencia de una citocina para generar un perfil de citocina con el fin de clasificar al paciente para el tratamiento de citocina apropiado. Por ejemplo, cuando el perfil de citocinas indica un aumento de una citocina concreta tras la infusión de células T en comparación con el control (p. ej., antes de la infusión de células T), un experto puede optar por administrar al paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de citocinas. Alternativamente, cuando el perfil de citocinas indica una disminución de una citocina concreta tras la infusión de células T en comparación con el control (p. ej., antes de la infusión de células T), un experto en la técnica puede optar por administrar al paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto activador de citocinas.
En algunas realizaciones, la diferencia en los niveles de citoquinas entre la muestra post infusión de células T y la muestra de control y ser al menos aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2, 5, 10, 100, 200, 500, 1000 veces.
Los presentes procedimientos también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de un curso de tratamiento. Por ejemplo, en un paciente post infusión de células T que contiene una cantidad elevada de una citocina IL-6, la eficacia de un tratamiento anti-IL-6 puede evaluarse monitorizando, a lo largo del tiempo, la IL-6. Por ejemplo, una reducción de los niveles de polinucleótidos o polipéptidos de IL-6 en una muestra biológica tomada de un paciente después de un tratamiento, en comparación con un nivel en una muestra tomada del mamífero antes, o al principio, del tratamiento, indica un tratamiento eficaz.
En una realización, un régimen de tratamiento puede basarse en neutralizar la citocina elevada. Por ejemplo, se pueden seleccionar antagonistas de una citocina para el tratamiento. Los anticuerpos son un ejemplo de antagonista adecuado e incluyen anticuerpos de ratón, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido, normalmente por ingeniería genética, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulina pertenecientes a especies diferentes (véase, por ejemplo, Boyce et al., Annals of Oncology 14:520-535 (2003)). Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes (C) humanos. De este modo, un anticuerpo quimérico típico es una proteína híbrida formada por el dominio V o de unión al antígeno de un anticuerpo de ratón y las regiones C o efectoras de un anticuerpo humano. En la invención, un inhibidor de IL-6 se identifica como el tipo apropiado de terapia de citoquinas.
Los anticuerpos humanizados tienen residuos marco de región variable sustancialmente de un anticuerpo humano (denominado anticuerpo aceptor) y regiones determinantes de complementariedad sustancialmente de un anticuerpo de ratón, (denominado inmunoglobulina donante). Véase Queen et al., Proc. NatL. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) yW O 90/07861, U.S. Pat. No. 5,693,762, Pat. de EE.UU.. No. 5,693,761, Pat. de EE.UU. No. 5,585,089, Pat. de EE.UU. No. 5.530.101 yWinter, U.S. Pat. No. 5,225,539. La(s) región(es) constante(s), si está(n) presente(s), también procede(n) sustancial o totalmente de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden obtenerse por medio de enfoques de hibridoma convencionales, visualización de fagos (véase, por ejemplo, Dower et al., WO 91/17271 y McCafferty et al., WO 92/01047), uso de ratones transgénicos con sistemas inmunitarios humanos (Lonberg et al., WO93/12227 (1993)), entre otras fuentes. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas de inmunoglobulinas pueden obtenerse a partir de hibridomas o líneas celulares productoras de anticuerpos, o basarse en secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de inmunoglobulinas de la bibliografía publicada.
También pueden utilizarse otros antagonistas de una citoquina deseada con fines de tratamiento. Por ejemplo, una clase de antagonistas que pueden utilizarse para los fines de la presente invención, son las formas solubles de los receptores para la citocina. A título meramente ilustrativo, un antagonista de la IL-6 es un anticuerpo anti-IL-6 que se une específicamente a la IL-6. Un anticuerpo específico tiene la capacidad de inhibir o antagonizar la acción de la IL6 sistémicamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a la IL-6 e impide que interactúe con sus receptores o los active (por ejemplo, IL-6Ra o IL-6Rp). En algunas realizaciones, la actividad de la IL-6 puede antagonizarse mediante el uso de un antagonista de los receptores de la interleucina-6 (IL-6R). La solicitud de EE.UU. número 2006251653 describe procedimientos para tratar enfermedades relacionadas con la interleucina-6 y divulga una serie de antagonistas de interleucina-6 incluyendo, por ejemplo, anticuerpos humanizados anti-IL-6R y anticuerpos quiméricos anti-IL-6R. En algunas realizaciones, se puede utilizar un derivado de IL-6 o IL-6R para bloquear y antagonizar la interacción entre IL-6/IL-6R.
La invención no se limita a las citocinas y sus correspondientes activadores e inhibidores descritos en el presente documento. Más bien, la invención incluye el uso de cualquier activador y/o inhibidor de citoquinas que se utilice en la técnica para modular la citoquina. Esto se debe a que la invención se basa en la gestión del tratamiento del cáncer en un paciente que recibe la infusión de células T CAR de la invención, en el que las células T CAR infundidas producen un aumento y una disminución de los niveles de diversas citocinas. Un experto en la técnica basado en la divulgación presentada en la presente memoria de que los niveles de expresión diferenciales de una citocina en una muestra posterior a la infusión de células T en comparación con una muestra de control pueden ser objeto de tratamiento para que el nivel de citocina aumente o disminuya a niveles normales.
En la invención, se utiliza un inhibidor de la IL-6.
Aplicación terapéutica
La presente invención abarca el uso de una célula T transducida con un vector lentiviral (LV). Por ejemplo, el VI codifica un CAR que combina un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con un dominio intracelular de CD3-zeta, CD28, 4-1BB, o cualquier combinación de los mismos. Por lo tanto, en algunos casos, la célula T transducida puede provocar una respuesta de células T mediada por CAR.
La invención proporciona el uso de un CAR para redirigir la especificidad de una célula T primaria a un antígeno tumoral. De este modo, la presente invención también proporciona para estimular una respuesta inmune mediada por células T a una población celular diana o tejido en un mamífero que comprende el paso de administrar al mamífero una célula T que expresa un CAR, en el que el CAR comprende una fracción de unión que interactúa específicamente con una diana predeterminada, una porción de cadena zeta que comprende por ejemplo el dominio intracelular de CD3zeta humano, y una región de señalización coestimuladora.
La presente invención incluye un tipo de terapia celular en la que las células T se modifican genéticamente para expresar una CAR y la célula T CAR se infunde a un receptor que la necesita. La célula infundida es capaz de destruir las células tumorales del receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, las células T CAR son capaces de replicarsein vivo,lo que se traduce en una persistencia a largo plazo que puede conducir a un control sostenido del tumor.
En una realización, las células T CAR usadas en la invención pueden someterse a una expansiónin vivorobusta de células T y pueden persistir durante una cantidad de tiempo prolongada. En otra realización, las células T CAR utilizadas en la invención evolucionan hacia células T de memoria específicas que pueden reactivarse para inhibir cualquier formación o crecimiento tumoral adicional. Por ejemplo, fue inesperado que las células CART19 usadas en la invención puedan experimentar una expansiónin vivorobusta de células T y persistir a niveles altos durante un periodo de tiempo prolongado en sangre y médula ósea y formar células T de memoria específicas. Sin querer ceñirme a ninguna teoría en particular, las células T CAR pueden diferenciarsein vivoen un estado similar a la memoria central tras el encuentro y posterior eliminación de las células diana que expresan el antígeno sustituto.
Sin querer estar limitado por ninguna teoría particular, la respuesta inmunitaria antitumoral provocada por las células T modificadas con CAR puede ser una respuesta inmunitaria activa o pasiva. Además, la respuesta inmunitaria mediada por CAR puede formar parte de un enfoque de inmunoterapia adoptiva en el que las células T modificadas con CAR inducen una respuesta inmunitaria específica a la fracción de unión al antígeno en el CAR. Por ejemplo, una célula CART19 provoca una respuesta inmunitaria específica contra las células que expresan CD19.
Aunque los datos divulgados en el presente documento divulgan específicamente vector lentiviral que comprende scFv anti-CD19 derivado de anticuerpo monoclonal murino FMC63, bisagra CD8a humana y dominio transmembrana, y dominios de señalización 4-1BB y CD3zeta humanos, debe interpretarse que la invención incluye cualquier número de variaciones para cada uno de los componentes de la construcción como se describe en otra parte del presente documento. Es decir, la invención incluye el uso de cualquier fracción de unión a antígeno en el CAR para generar una respuesta de células T mediada por CAR específica para la fracción de unión a antígeno. Por ejemplo, la fracción de unión a antígeno del CAR puede dirigirse a un antígeno tumoral para tratar el cáncer.
Los cánceres que pueden tratarse incluyen tumores no vascularizados, o aún no sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cáncer a tratar con los CAR utilizados en la invención incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma, y ciertas leucemias o neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos, y neoplasias malignas, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. También se incluyen los tumores/cánceres de adultos y los tumores/cánceres pediátricos.
Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre o de la médula ósea. Ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) son las leucemias, incluidas las leucemias agudas (tales como la leucemia linfocítica aguda, la leucemia mielocítica aguda, la leucemia mielógena aguda y la mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), las leucemias crónicas (tales como la leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.
Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que no suelen contener quistes ni zonas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los distintos tipos de tumores sólidos reciben su nombre del tipo de células que los forman (tales como sarcomas, carcinomas y linfomas). Ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, neoplasia linfoide, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma y tumores del SNC (como un glioma (como un glioma de tronco encefálico y gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, Schwannoma craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales).
En una realización, la porción de fracción de unión a antígeno del CAR usado en la invención está diseñada para tratar un cáncer particular. Por ejemplo, el CAR diseñado para dirigirse a CD19 puede utilizarse para tratar cánceres y trastornos que incluyen, entre otros, la LLA pre-B (indicación pediátrica), la LLA en adultos, el linfoma de células del manto, el linfoma difuso de células B grandes, el rescate tras un trasplante alogénico de médula ósea y similares.
En otra realización, el CAR puede diseñarse para dirigirse a CD22 para tratar linfoma difuso de células B grandes.
En una realización, los cánceres y trastornos incluyen pero no se limitan a LLA pre-B (indicación pediátrica), LLA en adultos, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, salvamento post trasplante alogénico de médula ósea, y similares pueden tratarse mediante el uso de una combinación de los CAR que se dirigen a CD19, CD20, CD22, y ROR1.
En una realización, el CAR puede diseñarse para dirigirse a mesotelina para tratar mesotelioma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, y similares.
En una realización, el CAR puede diseñarse para dirigirse a CD33/IL3Ra para tratar leucemia mielógena aguda y similares.
En una realización, el CAR puede diseñarse para dirigirse a c-Met para tratar cáncer de mama triple negativo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, y similares.
En una realización, el CAR puede diseñarse para dirigirse a PSMA para tratar el cáncer de próstata y similares.
En una realización, el CAR puede diseñarse para dirigirse al glicolípido F77 para tratar el cáncer de próstata y similares.
En una realización, el CAR puede diseñarse para dirigirse a EGFRvIII para tratar gliobastoma y similares.
En una realización, el CAR puede diseñarse para dirigirse a GD-2 para tratar neuroblastoma, melanoma y similares.
En una realización, el CAR puede diseñarse para dirigirse al TCR NY-ESO-1 para tratar mieloma, sarcoma, melanoma y similares.
En una realización, el CAR puede diseñarse para dirigirse al TCR MAGE A3 para tratar mieloma, sarcoma, melanoma y similares.
Sin embargo, no debe interpretarse que la invención se limita únicamente a las dianas de antígeno y enfermedades divulgadas en el presente documento. Más bien, debe interpretarse que la invención incluye cualquier diana antigénica que esté asociada con una enfermedad en la que pueda utilizarse un CAR para tratar la enfermedad.
Las células T modificadas con CAR usadas en la invención también pueden servir como un tipo de vacuna parainmunización ex vivoy/oterapia in vivoen un mamífero. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.
Con respecto a la inmunizaciónex vivo,al menos uno de los siguientes procedimientos tiene lugarin vitroantes de administrar la célula a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un CAR a las células, y/o iii) crioconservación de las células.
Los procedimientosex vivoson bien conocidos en la técnica y se discuten más ampliamente a continuación. Brevemente, se aíslan células de un mamífero (preferentemente humano) y se modifican genéticamente (es decir, se transducen o transfectanin vitro)con un vector que expresa un CAR divulgado en el presente documento. La célula modificada con CAR puede administrarse a un receptor mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor mamífero puede ser un humano y la célula modificada con c Ar puede ser autóloga con respecto al receptor. Alternativamente, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.
El procedimiento para la expansiónex vivode células madre y progenitoras hematopoyéticas descrito en U.S. Pat. N° 5.199.942 pueden aplicarse a las células utilizadas en la presente invención. Se conocen otros procedimientos adecuados en la técnica, por lo que la presente invención no se limita a ningún procedimiento particular de expansiónex vivode las células. Brevemente, el cultivo y expansiónex vivode células T comprende: (1) recogida de células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ de un mamífero a partir de la extracción de sangre periférica o de explantes de médula ósea; y (2) expansión de dichas célulasex vivo.Además de los factores de crecimiento celular descritos en el documento U.S. Pat. N° 5.199.942, pueden utilizarse otros factores como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando ckit, para el cultivo y expansión de las células.
Además de usar una vacuna basada en células en términos de inmunizaciónex vivo,la presente divulgación también proporciona composiciones y procedimientos para inmunizacióninvivo para provocar una respuesta inmunitaria dirigida contra un antígeno en un paciente.
Generalmente, las células activadas y expandidas como se describe en el presente documento pueden utilizarse en el tratamiento y prevención de enfermedades que surgen en individuos que están inmunocomprometidos. En particular, las células T modificadas con CAR utilizadas en la invención se emplean en el tratamiento de la LCC. En ciertas realizaciones, las células utilizadas en la invención se emplean en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar LCC. De este modo, la presente invención proporciona para el tratamiento o prevención de CCL que comprende administrar a un individuo en necesidad de la misma, una cantidad terapéuticamente eficaz de las células T modificadas con CAR.
Las células T modificadas con CAR usadas en la presente invención pueden administrarse solas, o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares. Brevemente, las composiciones farmacéuticas utilizadas en la presente invención pueden comprender una población celular diana como se describe en el presente documento, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina neutra tamponada, solución salina fosfatada tamponada y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes(ej.,hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones utilizadas en la presente invención se formulan preferentemente para administración intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención pueden administrarse de una manera apropiada a la enfermedad a tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de administración vendrán determinadas por factores tales como el estado del paciente y el tipo y gravedad de su enfermedad, aunque las dosis adecuadas pueden determinarse por medio de ensayos clínicos.
Cuando se indica "una cantidad inmunológicamente eficaz", "una cantidad eficaz antitumoral", "una cantidad eficaz inhibidora de tumores", o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención a administrar puede ser determinada por un médico con consideración de las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis, y estado del paciente (individuo). En general, puede afirmarse que una composición farmacéutica que comprende las células T descritas en el presente documento puede administrarse a una dosis de 104 a 109 células/kg de peso corporal, preferentemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de dichos intervalos. Las composiciones de células T también pueden administrarse varias veces a estas dosis. Las células pueden administrarse por medio de técnicas de infusión comúnmente conocidas en inmunoterapia (véase,ej.,Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). Un experto en medicina puede determinar fácilmente la dosis y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente concreto controlando al paciente en busca de signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.
En ciertas realizaciones, puede desearse administrar células T activadas a un individuo y posteriormente volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar células T de la misma de acuerdo con la presente invención, y reinfundir al paciente con estas células T activadas y expandidas. Este proceso puede realizarse varias veces cada varias semanas. En ciertas realizaciones, las células T pueden activarse a partir de extracciones de sangre de entre 10cc y 400cc. En ciertas realizaciones, las células T se activan a partir de extracciones de sangre de 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc o 100cc. Para no limitarnos a la teoría, el uso de este protocolo de múltiples extracciones de sangre y múltiples reinfusiones puede servir para seleccionar ciertas poblaciones de células T.
La administración de las composiciones del individuo puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa(i.v.)o intraperitoneal. En una realización, las composiciones de células T utilizadas en la presente invención se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En otra realización, las composiciones de células T utilizadas en la presente invención se administran preferentemente mediante inyeccióni.v.Las composiciones de células T pueden inyectarse directamente en un tumor, un ganglio linfático o un foco de infección.
En ciertas realizaciones de la presente invención, las células activadas y expandidas mediante el uso de los procedimientos descritos en el presente documento, u otros procedimientos conocidos en la técnica en los que las células T se expanden a niveles terapéuticos, se administran a un paciente junto con(ej.,antes, simultáneamente o después) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo pero no limitándose al tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con natalizumab para pacientes con EM o tratamiento con efalizumab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP En otras realizaciones, las células T utilizadas en la invención pueden utilizarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente del calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opinen. Inmune. 5:763-773, 1993). En otra realización, las composiciones celulares usadas en la presente invención se administran a un paciente junto con(ej.,antes, simultáneamente o después) trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T mediante el uso de agentes quimioterapéuticos como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos como OKT3 o CAMPATH. En otra realización, las composiciones celulares usadas en la presente invención se administran tras terapia ablativa de células B, tales como agentes que reaccionan con CD20,ej.,Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los individuos pueden someterse a un tratamiento estándar con altas dosis de quimioterapia seguido de un trasplante de células madre de sangre periférica. En ciertas realizaciones, tras el trasplante, los individuos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.
La dosis de los tratamientos anteriores que se administrará a un paciente variará con la naturaleza precisa de la afección tratada y el receptor del tratamiento. El escalado de las dosis para la administración humana puede realizarse de acuerdo con las prácticas aceptadas en el arte. La dosis para CAMPATH, por ejemplo, estará generalmente en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, normalmente administrada diariamente durante un periodo de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferente es de 1 a 10 mg al día, aunque en algunos casos pueden utilizarse dosis mayores, de hasta 40 mg al día (descritas en Patente de EE.UU. n° 6.120.766).
Tratamiento del síndrome de liberación de citoquinas (SRC)
La invención se basa en parte en el descubrimiento de que la proliferaciónin vivode células CART19 y la potente actividad antitumoral asociada a la misma también está asociada a la RSC, dando lugar a linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH), también denominada síndrome de activación de macrófagos (MAS). Sin querer ceñirnos a ninguna teoría en particular, se cree que el MAS/HLH es un biomarcador único que se asocia y puede ser necesario para la potente actividad antitumoral de CART19.
Por consiguiente, la invención proporciona una primera línea de terapia que comprende administrar el CAR en el paciente y una segunda línea de terapia que comprende administrar un tipo de terapia para gestionar los niveles elevados de ciertos factores solubles resultantes de la primera línea de terapia de usar células T CAR, como se define en las reivindicaciones.
En una realización, la terapia de segunda línea comprende el tratamiento de la RSC. Los síntomas del SRC incluyen fiebres altas, náuseas, hipotensión transitoria, hipoxia, etc. La presente invención se basa en la observación de que las células CART19 indujeron niveles elevados de factores solubles en el paciente, incluidos, entre otros, IFN-y, TNFa, IL-2 e IL-6. Por lo tanto, la segunda línea de terapia comprende compuestos y procedimientos para neutralizar los efectos contra las citoquinas elevadas resultantes de la administración de las células CART19. En una realización, los agentes neutralizantes son capaces de contrarrestar el estallido concertado no deseado de expresión/actividad de citoquinas y, por lo tanto, son útiles para la prevención, mejora y tratamiento del SRC asociado con la terapia CART19.
En la invención, un inhibidor de la IL-6 se identifica como el tipo apropiado de terapia de segunda línea.
En una realización, el tratamiento de la RSC se realiza alrededor del día 10-12 post-infusión de células CART19.
En una realización, la segunda línea de terapia comprende además administrar un esteroide al paciente. En otra realización, la segunda línea de tratamiento comprende además la administración de un esteroide y/o un inhibidor del TNFa.
Un ejemplo de inhibidor del TNFa es el etanercept. Un ejemplo de inhibidor de la IL-6 es el Tocilizumab (toc).
EJEMPLOS EXPERIMENTALES
La invención se describe además en detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se facilitan a título meramente ilustrativo y no pretenden ser limitativos, a menos que se especifique lo contrario. De este modo, la invención no debe interpretarse en modo alguno como limitada a los siguientes ejemplos.
Sin descripción adicional, se cree que una persona de habilidad ordinaria en la técnica puede, mediante el uso de la descripción precedente y los siguientes ejemplos ilustrativos, hacer y utilizar los compuestos de la presente invención y practicar los procedimientos reivindicados. Los siguientes ejemplos de trabajo, por lo tanto, señalan específicamente las realizaciones preferentes de la presente invención, y no deben interpretarse como limitativos en modo alguno del resto de la divulgación.
Ejemplo 1: Terapia de citoquinas en combinación con infusión de células T CAR
Los resultados presentados en la presente memoria demuestran que los pacientes tras la infusión de células T CAR presentan niveles de expresión diferenciales de diversas citocinas. En algunos casos, los niveles elevados de algunas citocinas son consecuencia de la toxicidad de las células T CAR infundidas (Figura 1). Se observó que tocilizumab (anti-IL6) puede mejorar la toxicidad de los CAR y aparentemente preservar los efectos antitumorales en 2 de 2 pacientes (Figura 2). Sin querer ceñirnos a ninguna teoría en particular, se cree que la anakinra y otros reactivos que bloquean la IL-1 también pueden ser útiles a este respecto. Los datos presentados en la presente memoria también demuestran que la IL-1 está elevada en los pacientes, y esto puede provocar el posterior aumento de la IL-6. La anakinra es una proteína recombinante de la IL-1Ra que se une a los receptores de la IL1 y bloquea tanto la señalización de la IL-1 alfa como de la beta. Anakinra tiene una vida 1/2 corta. Resulta ventajoso utilizar Anakinra para iniciar el tratamiento de los pacientes, dado que se bloquearían tanto la IL-1 alfa como la beta y, además, se aliviaría la tormenta de citoquinas y se mantendría el efecto antitumoral.
También se observó que las intervenciones de anticuerpos no impartieron funcionalidad celular CART19 medida por Perforina e IFN-y (Figura 3).
Ejemplo 2: Las células T receptoras de antígenos quiméricos (CART19) dirigidas por CD19 inducen un síndrome de liberación de citoquinas (CRS) y la inducción de un síndrome de activación de macrófagos (MAS) tratable que puede controlarse con el antagonista de IL-6 tocilizumab (toc)
La infusión de células CART19 da lugar a una proliferaciónin vivode 100 a 100.000x, síndrome de lisis tumoral seguido de actividad antitumoral duradera y persistencia prolongada en pacientes con tumores de células B. Los resultados aquí presentados demuestran que la proliferaciónin vivode las células CART 19 y la potente actividad antitumoral de las mismas se asocian a la RSC, dando lugar a la linfohistiocitosis hemofagocítica (h Lh ), también denominada MAS. Sin querer ceñirnos a ninguna teoría en particular, se cree que MAS/HLH es un biomarcador único que se asocia a una potente actividad antitumoral y que puede ser necesario para ello.
Las células T autólogas se transdujeron lentiviralmente con un CAR compuesto de scFv anti-CD19/4-1BB/CD3-zeta, se activaron/expandieron ex vivo con microesferas anti-CD3/anti-CD28, y después se infundieron en pacientes con LLA o LLC con enfermedad persistente después de 2-8 tratamientos previos. También se modeló la actividad anti-LLA de CART19 en un modelo de ratón xenoinjertado con alto nivel de injerto de LLA humana/células T humanas y detección simultánea de células T CAR y LLA mediante el uso de imágenes bioluminiscentes de 2 colores.
Los resultados presentados en la presente memoria proporcionan resultados actualizados de 10 pacientes que recibieron células CART19, incluyendo 9 pacientes con LLC y 1 paciente pediátrico con LLA refractaria recidivante.
6/9 pacientes evaluables tuvieron una recuperación completa (RC) o parcial (RP), incluyendo 4 RC sostenidas. Aunque no hubo toxicidad infusional aguda, todos los pacientes que respondieron también desarrollaron RSC. Todos tenían fiebres altas, así como hipotensión/hipoxia de grado 3 o 4. La RSC precedió al pico de expresión sanguínea de células CART19, y luego aumentó en intensidad hasta el pico de células CART19 (D10-31 después de la infusión). El paciente con LLA experimentó la toxicidad más significativa, con hipotensión de grado 4 e insuficiencia respiratoria. El tratamiento con corticoides del día 6 no produjo ninguna mejoría. En D9, observando niveles elevados de TNFa e IL-6 (aumentos máximos por encima del valor basal: IFNy a 6040x; IL-6 a 988x; IL-2R a 56x, IL-2 a 163x y TNFa a 17x), se administraron antagonistas del TNFa y la IL-6 (etanercept y toc). El resultado fue la resolución de la fiebre y la hipotensión en 12 horas y una rápida retirada del soporte ventilatorio al aire ambiente. Estas intervenciones no tuvieron un impacto aparente en la expansión o eficacia de las células CART19: el pico de células T CAR (2539 células CAR+/uL; 77% de células CD3 por flujo) se produjo el día 11, y la médula ósea del día 23 mostró RC con enfermedad mínima residual (EMR) negativa, en comparación con la médula inicial del estudio, que mostró un 65% de blastos. Aunque no tenía antecedentes de LLA del SNC, el líquido cefalorraquídeo mostró células CART19 detectables (21 linfocitos/mcL; 78% CAR+). A los 4 meses de la infusión, este paciente seguía en RC, con 17 células CART19/uL en la sangre y un 31% de células CD3 CAR+ en la médula.
La evaluación clínica de los pacientes respondedores posteriores muestra que todos tenían evidencia de MAS/HLH incluyendo elevaciones dramáticas de ferritina y evidencia histológica de HLH. Los niveles máximos de ferritina oscilan entre 44.000 y 605.000, precediendo y continuando con el pico de proliferación de células T. Otros hallazgos consistentes incluyen hepatoesplenomegalia de aparición rápida no relacionada con la enfermedad y CID moderada.
Posteriormente, 3 pacientes con LLC también han sido tratados con toc, también con resolución rápida y sorprendente de fiebres altas, hipotensión e hipoxia. Un paciente recibió toc el día 10 y logró una RC acompañada de una expansión de CART19. Otro paciente tuvo una rápida resolución de la RSC tras la administración de toc el día 9 y el seguimiento de la respuesta es demasiado corto. Un 3er paciente con LLC recibió toc con D3 por fiebres tempranas y no tuvo proliferación de CART-19 ni respuesta.
A fin de modelar el momento del bloqueo de citoquinas, se establecieron xenoinjertos mediante el uso de LLA pediátrica primaria bioluminiscente y después se trataron con células adicionales de la fabricación clínica. Las células CART19 proliferaron y dieron lugar a una supervivencia prolongada. El bloqueo de citocinas antes de la infusión de células T con toc y/o etanercept anuló el control de la enfermedad con una menor proliferaciónin vivode las células CART19 infundidas, confirmando el resultado observado en el único paciente al que se administró toc temprano (D3).
Las células T CART19 pueden producir expansión masivain vivo,persistencia a largo plazo y eficacia antitumoral, pero también pueden inducir RSC significativa con características sugestivas de MAS/HLH que responde rápidamente al bloqueo de citoquinas. Si se administra antes de que se inicie una proliferación significativa de CART19, el bloqueo del TNFa y/o la IL-6 puede interferir con la proliferación y la función efectora, pero si se administra en un momento en el que la proliferación celular está en marcha, el toc puede mejorar los síntomas que se han observado y que se correlacionan con respuestas clínicas sólidas.
Ejemplo 3 Remisión de la LLA por medio de células T que expresan receptores de antígenos quiméricos:
Los resultados presentados en la presente memoria demuestran que las células T CAR tienen actividad clínica en la leucemia linfocítica aguda (LLA). Brevemente, dos pacientes pediátricos con LLA de células pre-B en recaída y refractaria fueron tratados con 106 a 107/kg de células T transducidas con anticuerpo anti-CD19 y una molécula de señalización de células T (células T CAR CTL019; también denominadas CART19). Las células T CTL019 se multiplicaron por más de 1.000 en ambos pacientes y se dirigieron a la médula ósea. Además, las células T CAR fueron capaces de atravesar la barrera hematoencefálica y persistieron en niveles elevados durante al menos 6 meses, medidos en el líquido cefalorraquídeo. Se observaron ocho acontecimientos adversos graves. Ambos pacientes desarrollaron un síndrome de liberación de citoquinas (SRC) y aplasia de células B. En un niño, el SRC fue grave y el bloqueo de citocinas con etanercept y tocilizumab fue eficaz para revertir el síndrome, pero no impidió la expansión de las células T CAR ni la eficacia antileucémica. Se observó una remisión completa en ambos pacientes, que continúa en uno de ellos 9 meses después del tratamiento. El otro paciente recayó con blastos que ya no expresaban CD19 aproximadamente 2 meses después del tratamiento.
Los resultados presentados en la presente memoria demuestran que las células T modificadas con CAR son capaces de matarin vivoincluso células de leucemia aguda agresiva refractaria al tratamiento. La aparición de células tumorales que ya no expresan la diana indica la necesidad de dirigirse a otras moléculas además de CD19 en algunos pacientes con LLA.
Se ha notificado la expansiónin vivoy los efectos antileucémicos robustos de las células CTL019 (CART19) en 3 pacientes con LLC (Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-33; Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73). CTL019 es un CAR que incluye un dominio de señalización CD137 (4-1BB) y se expresa mediante tecnología de vectores lentivirales (Milone et al., 1009, Mol Ther 17:1453-64). Los resultados presentados en la presente memoria demuestran el uso de CTL019 en 2 pacientes pediátricos con LLA refractaria y recidivante. Ambos pacientes presentaron remisión de la leucemia, acompañada de una expansión robusta de CTL019in vivocon tráfico a la médula y al SNC. Los efectos antileucémicos fueron potentes, dado que un paciente tenía una enfermedad refractaria a la quimioterapia que impedía el trasplante alogénico de células madre de donantes y el otro paciente recayó tras el trasplante alogénico de sangre de cordón umbilical y era resistente al tratamiento con blinatumomab (anti-CD3 y anti-CD19 biespecíficos quiméricos).
A continuación se describen los materiales y procedimientos empleados en estos experimentos.
Materiales y procedimientos
CART19
Se ha informado previamente de la producción de CTL019 (CART19) (Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-33; Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73). CTL019 se detectó y cuantificó en muestras de pacientes como se informó anteriormente (Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-33; Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73).
Extracción y tratamiento de muestras
Las muestras (sangre periférica, médula ósea) se recogieron en tubos vacutainer con tapón lavanda (K2EDTA,) o tapón rojo (sin aditivo) (Becton Dickinson). Los tubos con tapón de lavanda se entregaron en el laboratorio en las 2 horas siguientes a la extracción, o se enviaron durante la noche a temperatura ambiente en recipientes aislados esencialmente como se describe (Olson et al., 2011, J Transl Med 9:26) antes del procesamiento. Las muestras se procesaron en los 30 minutos siguientes a su recepción de acuerdo con los procedimientos normalizados de trabajo del laboratorio. Las células mononucleares de sangre periférica y médula ósea se purificaron, procesaron y almacenaron en nitrógeno líquido como se describe (Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73). Los tubos con tapón rojo se procesaron en las 2 horas siguientes a la extracción, incluido el tiempo de coagulación; el suero se aisló por centrifugación, se alicuotó en alícuotas de 100 pl de un solo uso y se almacenó a -80 °C. El LCR se entregó al laboratorio en los 30 minutos siguientes a la aspiración y las células del LCR se recogieron por centrifugación del líquido del LCR y se procesaron para ADN y citometría de flujo.
Análisis Q-PCR
Las muestras de sangre total o de médula ósea se recogieron en tubos vacutainer BD con tapón lavanda (K2EDTA) (Becton Dickinson). El ADN genómico se aisló directamente de la sangre total y el análisis Q-PCR en muestras de ADN genómico se realizó a granel mediante el uso de la tecnología ABI Taqman y un ensayo validado para detectar la secuencia transgénica integrada CD19 CAR como se describe (Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73) mediante el uso de 200 ng de ADN genómico por punto temporal para muestras de sangre periférica y médula, y 18-21,7 ng de ADN genómico por punto temporal para muestras de LCR. A fin de determinar el número de copias por unidad de ADN, se generó una curva estándar de 8 puntos consistente en 5 a 106 copias del plásmido lentivirus CTL019 vertidas en 100 ng de ADN genómico de control no transducido. Cada punto de datos (muestra, curva estándar) se evaluó por triplicado con un valor Ct positivo en 3/3 réplicas con un % CV inferior al 0,95% para todos los valores cuantificables. Se realizó una reacción de amplificación paralela para controlar la calidad del ADN interrogado mediante el uso de 20 ng de ADN genómico de entrada procedente de sangre periférica y médula (2-4,3 ng para muestras de LCR), y una combinación de cebador/sonda específica para la secuencia genómica no transcrita corriente arriba del gen CDKN1A, tal como se describe (Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73). Estas reacciones de amplificación generaron un factor de corrección (FC) para corregir la entrada de ADN calculada frente a la real. Las copias del transgén por microgramo de ADN se calcularon de acuerdo con la fórmula: copias calculadas a partir de la curva estándar CTL019 por ADN de entrada (ng) x CF x 1000 ng. La precisión de este ensayo se determinó por la capacidad de cuantificar el marcaje del producto celular infundido mediante Q-PCR. Estas determinaciones ciegas generaron valores de Q-PCR y de marcaje de flujo del 11,1% y el 11,6%, respectivamente, para el CHOP-100 y del 20,0% y el 14,4%, respectivamente, de marcaje para los productos de infusión CHOP-101.
Análisis de factores solubles
La sangre total se recogió en tubos vacutainer BD de tapa roja (sin aditivo) (Becton Dickinson), se procesó para obtener suero mediante el uso del PNT de laboratorio establecido, se alicuotó para un solo uso y se almacenó a -80 °C. La cuantificación de los factores de citoquinas solubles se llevó a cabo mediante el uso de la tecnología de arrays de microesferas Luminex y kits adquiridos a Life Technologies (Invitrogen). Los ensayos se llevaron a cabo según el protocolo del fabricante con una curva estándar de 9 puntos generada mediante el uso de una serie de diluciones triple. Los 2 puntos de patrón externo se evaluaron por duplicado y los 5 patrones internos por separado; todas las muestras se evaluaron por duplicado en dilución 1:2; el % CV calculado para las medidas por duplicado fue inferior al 15%. Los datos se adquirieron en un FlexMAP-3D por ciento y se analizaron mediante el uso del software XPonent 4.0 y un análisis de regresión logística de 5 parámetros. Los intervalos de cuantificación de la curva estándar se determinaron por el intervalo 80-120% (valor observado/valor esperado). Los valores notificados incluyeron los comprendidos en el intervalo de la curva estándar y los calculados por medio del análisis de regresión logística.
Reactivos de anticuerpos
Para estos estudios se utilizaron los siguientes anticuerpos: MDA-CAR (Jena y Cooper, 2013, L. Anticuerpo antiidiotípico para CD19.). PlosONE 2013; en prensa), un anticuerpo murino contra<c>D19 CAR conjugado con Alexa647. Anticuerpos para inmunofenotipado multiparamétrico: Paneles de detección de células T: anti-CD3-FITC, anti-CD8-PE, anti-CD14-PE-Cy7, anti-CD16-PE-Cy7, anti-CD19-PE-Cy7 anti-CD16-PE-Cy7. Paneles de detección de células B: anti CD20-FITC, anti-CD45-PE, anti-CD45-APC, anti-CD19-PE-Cy7, anti-CD19-PE, anti-CD34-PCP-e710 y anti CD34-APC se obtuvieron de e-Biosciences.
Citometría de flujo multiparamétrica
Las células se evaluaron por medio de citometría de flujo directamente después del procesamiento de Ficoll-Paque, con la excepción de la muestra de referencia CHOP-101 que se evaluó inmediatamente después de la descongelación de una muestra crioconservada. El inmunofenotipado multiparamétrico para muestras de sangre periférica y médula ósea se realizó mediante el uso de aproximadamente 0,2-0,5 x106 células totales por condición (dependiendo del rendimiento celular en las muestras), y para muestras de LCR mediante el uso de cantidades traza de células recogidas tras la centrifugación del líquido de LCR, y mediante el uso de tinciones de fluorescencia menos uno (FMO) como se describe en el texto. Las células se tiñeron en 100 pl de PBS durante 30 minutos en hielo mediante el uso de las concentraciones de anticuerpos y reactivos recomendadas por el fabricante, se lavaron, se resuspendieron en paraformaldehído al 0,5% y se adquirieron mediante el uso de un citómetro Accuri C6 equipado con un láser azul (488) y rojo (633 nm). Los archivos Accuri se exportaron en formato de archivo FCS y se analizaron con el software FlowJo (versión 9.5.3, Treestar). Los valores de compensación se establecieron mediante el uso de tinciones de anticuerpos únicos y perlas de compensación BD (Becton Dickinson) y fueron calculados por el software. La estrategia de gating para las células T fue la siguiente: Células vivas (FSC/SSC) > canal de descarga (CD14+CD16+CD19-PECy7) vs CD3+ > CD3+. La estrategia general para las células B fue la siguiente: Células vivas (FSC/SSC) > SSC eventos bajos > CD19+. En las Figuras individuales se describen más detalles sobre las muestras CHOP-100 y CHOP-101.
Análisis molecular MRD
El análisis molecular de MRD fue realizado por Adaptive Biotechnologies (Seattle, WA) y la secuenciación de próxima generación de alto rendimiento de la región BCR IGH CDR3 mediante el uso del ensayo inmunoSEQ basado en la plataforma Illumina HiSeq/MiSeq (Larimore et al., 2012, J Immunol 189:3221-30). Para estos análisis, se sometieron 701-6.000 ng (aproximadamente 111.000- 950.000 equivalentes genómicos) de ADN genómico aislado de muestras de sangre total o de médula ósea obtenidas de pacientes a PCR multiplex combinada y secuenciación, seguidas de análisis algorítmicos para cuantificar las secuencias individuales IGH CDR3 en las muestras. Se realizaron amplificaciones paralelas y secuenciación de la región TCRB CDR3 (Robins et al., 2009, Blood 114:4099-107) en cada muestra para evaluar la calidad de las muestras de ADN. Para cada paciente, las secuencias de nucleótidos IGH CDR3 ensayadas a partir de muestras de diferentes puntos temporales se alinearon mediante el uso de la herramienta de alineación de secuencias múltiples EMBL-EBI (Goujon et al., 2010, Nucleic Acids Res 38:W695-9; Sievers et al., 2011, Mol Syst Biol 7:539). El clon dominante de la primera muestra de punto temporal se rastreó bioinformáticamente a través de las secuencias IGH CDR3 ensayadas en las siguientes muestras de punto temporal para identificar la presencia de secuencias con un 95% o más de identidad de secuencia por pares. El total de lecturas de secuenciación de las secuencias similares al clon dominante se indica para cada punto temporal.
A continuación se describen los resultados de los experimentos.
Casos clínicos
CHOP-100 era una niña de 7 años en su segunda recurrencia de LLA. Fue diagnosticada 2 años antes y alcanzó una remisión negativa de la enfermedad mínima residual (EMR), recayendo 17 meses después del diagnóstico. Volvió a entrar en remisión tras la quimioterapia de reinducción, pero recidivó 4 meses después, tras lo cual no respondió a la quimioterapia con eclofaribina/etopósido/ciclofosfamida. Su cariotipo inicial era 48, XX, del (9) (p21.3),+11, del (14) (q2?q24),+16/46, XX [4]. Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se recogieron por medio de aféresis antes de la quimioterapia intensiva, anticipando que podría haber insuficientes células T circulantes disponibles para la fabricación de células después de un tratamiento tan intensivo. A este paciente se le infundieron células CTL019 que habían sido expandidas anti-CD3/CD28 y transducidas lentiviralmente para expresar el CAR anti-CD19 en una dosis total de 3,8x108 células/kg (1,2x107 células CTL019/kg) administradas durante 3 días consecutivos como se ha descrito previamente (Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-33; Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73). No recibió quimioterapia linfodepletora antes de las infusiones de CTL019, y la terapia citotóxica más reciente se administró 6 semanas antes de la infusión de CTL019. No se observaron toxicidades infusionales inmediatas, pero fue hospitalizada por fiebres de bajo grado que evolucionaron a fiebres altas el día 4, y el día 5 la paciente fue trasladada a la UCI pediátrica (CHOP-100, Figura 4A). Esto fue seguido de una rápida progresión a un compromiso respiratorio y cardiovascular significativo que requirió ventilación mecánica y soporte de la presión arterial.
La segunda paciente con LLA era una niña de 10 años (CHOP-101) que había experimentado su segunda recaída después de un trasplante de cordón umbilical no emparentado 4/6 compatible 28 meses después del diagnóstico y 10 meses antes de la infusión de CTL019. Tras el trasplante había padecido la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), que se resolvió con tratamiento; en el momento de la recaída había dejado la inmunosupresión. Posteriormente no volvió a entrar en remisión a pesar de múltiples terapias citotóxicas y biológicas. Su cariotipo basal era 46 XX, del(1)(p13), t(2;9)(q?21;q?21), t(3;17)(p24;q23), del(6)(q16q21), del(9)(q13q22), der(16)t(1;?;16)(p13;?p13.3)[9],//46, Xy[1]. Antes de la recogida de PBMC, fue tratada con dos ciclos de blinatumomab (Bargou et al., 2008, Science 321:974-7) sin respuesta. Sus células de sangre periférica procedían en un 68% de donantes en el momento de la recogida de PBMC. Las células T CTL019 se fabricaron e infundieron en una dosis total de 107 células/kg (1,4x106 células CTL019/kg) en una dosis única, tras la quimioterapia con etopósido/ciclofosfamida administrada para linfodepleción la semana anterior. Su médula ósea el día anterior a la infusión de CTL019 fue sustituida por una población de células de LLA CD19+/CD34+, con expresión variable de CD19 mediante citometría de flujo clínica estándar (Figura 7). No presentó toxicidades infusionales inmediatas, pero desarrolló fiebre el día D+6 y fue ingresada en el hospital. No experimentó toxicidades cardiopulmonares y no recibió glucocorticoides ni terapia anticitoquinas. CHOP-101 experimentó fiebre de origen desconocido, sospechosa de deberse a la liberación de citocinas (Figura 4B), mialgias y dos días de confusión (grado 3), que se resolvieron espontáneamente. No presentó signos de EICH tras la infusión de las células CTL019. Aunque estas células se habían extraído del paciente, eran en gran parte de origen donante (sangre del cordón umbilical).
Inducción de la remisión en ambos individuos
Ambos individuos tuvieron un aumento de linfocitos y neutrófilos circulantes en las 2 semanas siguientes a la infusión de CTL019, como muestran los gráficos que representan el total de WBC, ALC y ANC en relación con el momento de la infusión de CTL019 (Figura 4C). La mayoría de los linfocitos eran células T que expresaban el receptor de antígeno quimérico (Figura 8), que se muestra con más detalle en la Figura 5. En ambos individuos se documentaron fiebres no infecciosas de alto grado, seguidas de elevaciones de la LDH (Figura 4A). Las elevaciones de LDH y las fiebres de alto grado fueron similares a las descritas previamente en pacientes con LLC tras la infusión de CTL019 (.Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-33; Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73). Aproximadamente un mes después de la infusión, se alcanzó la remisión morfológica de la leucemia con ERM negativa (<0,01%) en ambos individuos (Tabla 1).
La remisión clínica en CHOP-100 se asoció con una remisión molecular profunda que ha persistido durante al menos 9 meses a partir de enero de 2013 (Tabla 1). La secuenciación de ADN de alto rendimiento del locus IGH reveló una disminución pronunciada de las lecturas totales de IGH en D+23 en la sangre y la médula de CHOP-100. El clon maligno no se detectó en la sangre ni en la médula en más de 1 millón de equivalentes celulares que se secuenciaron en D+180. Por el contrario, las secuencias de receptores de células T se detectaron fácilmente en sangre y médula, lo que indica la integridad del ADN analizado en todos los puntos temporales.
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Se llevó a cabo un análisis molecular de la enfermedad mínima residual en ADN aislado de sangre completa o médula ósea
Toxicidad de CTL019
Los acontecimientos adversos de grado 3 y 4 se resumen en la Tabla 2. En ambos pacientes se observó una toxicidad aguda que consistió en fiebre y un síndrome de liberación de citoquinas (SRC) que evolucionó a un síndrome de activación de macrófagos (SAM). Ambos pacientes fueron monitorizados y recibieron profilaxis para el síndrome de lisis tumoral. Ambos experimentaron elevaciones sustanciales de LDH, cuyas causas fueron probablemente multifactoriales pero podrían haber incluido el síndrome de lisis tumoral. Cada valor de ácido úrico en CHOP-100 estaba por debajo de lo normal o en el intervalo normal, y recibió alopurinol sólo los días 5-6. CHOP-101 recibió alopurinol profiláctico los días 0-14 y presentó valores anormales de ácido úrico de 4,8-5,7 los días 8-10, consistentes con un síndrome de lisis tumoral leve.
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Los eventos adversos se clasificaron de acuerdo con los criterios de terminología común para eventos adversos
3.0
En CHOP-100, se administraron glucocorticoides en D+5 con una breve respuesta en la curva de fiebre pero sin remisión de la hipotensión. El día D+8 se le administró un único ciclo de tratamiento anticitocinas consistente en etanercept y tocilizumab, que tuvo efectos clínicos rápidos: en pocas horas mejoró su estado de salud, se le retiró la medicación vasoactiva y la asistencia respiratoria y se resolvió su SDRA clínico y radiológico. No tenía pruebas de laboratorio de un síndrome de lisis tumoral; sin embargo, se observaron pruebas bioquímicas de SMA con elevación de la ferritina a 45.529ng/dl en D+11, coagulopatía con dímero d elevado e hipofibrinogenemia, hepatoesplenomegalia, elevación de las transaminasas, LDH elevada (Figura 4C) y triglicéridos elevados, así como un perfil de citocinas compatible con SMA. Su ferritina disminuyó a 2.368 en D+26 y las anomalías clínicas y de laboratorio del SAM se resolvieron.
En CHOP-101, aunque no había evidencia directa de un síndrome de lisis tumoral aparte de fiebre y cambios en LDH (Figura 4C), también desarrolló características de MAS con elevaciones en ferritina a 33,360 en D+7, alcanzando un máximo de 74,899 en el día 11, transaminasas que alcanzaron el grado 4 durante 1 día, y un dímero d elevado en suero. Estos cambios bioquímicos fueron reversibles, dado que las transaminasas mejoraron a grado 1 y la ferritina disminuyó a 3.894 en D+21. Fue dada de alta el día D+16.
Ambos individuos desarrollaron elevaciones prominentes en una serie de citocinas y receptores de citocinas en el suero (Figura 1B). En ambos pacientes, las elevaciones de interferón-Y e IL-6 fueron las más destacadas. Estas observaciones son similares al patrón observado previamente en pacientes con LLC que también experimentaron remisión de la leucemia tras la infusión de CTL019 (Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73). Las elevaciones máximas de las citocinas se correlacionaron temporalmente con la inflamación sistémica, a juzgar por los cambios en la temperatura corporal central (Figura 4C).
Expansión in vivo de CTL019 en pacientes con LLA
La fracción de células T CTL019 en circulación aumentó progresivamentein vivohasta el 72% (CHOP-100) y el 34% (CHOP-101) de las células T (Figura 5A). La eficacia de transducción inicial fue del 11,6% y del 14,4% en las células T infundidas en CHOP-100 y -101, respectivamente. Dado que el ALC total aumentó sustancialmente en ambos pacientes (Figura 4C), y que la frecuencia de células CTL019 aumentó progresivamente in vivo a partir de la frecuencia basal (Figura 8), se produjo una expansión robusta y selectiva de células CTL019 en ambos pacientes. El aumento selectivo de células T que expresan CTL019 en ambos pacientes es coherente con un mecanismo antileucémico que implica una expansión impulsada por CD19, y con la posterior eliminación de células que expresan CD19 en ambos pacientes (Figura 6 y Figura 9).
El análisis molecular de secuencia profunda de los TCR en las muestras de sangre periférica y médula ósea en CHOP-100 obtenidas en D+23, cuando >65% de las células CD3+ en sangre periférica y médula ósea mostraron ser CTL019+ por citometría de flujo, reveló la ausencia de un clonotipo TCR de células T dominante en cualquiera de los compartimentos, con las 10 células T más abundantes presentes en frecuencias entre 0.18 - 0,7% en médula ósea y 0,19 a 0,8% en sangre periférica. Seis de los 10 clones dominantes fueron compartidos entre los dos compartimentos. Además, están presentes células T CAR CD4 y CD8. De este modo, las células T CAR parecen proliferar tras una expansión estimulada por CD19, y no por señales de TCR o eventos específicos del clon como la activación por integración del lentivirus.
Tráfico y morfología de las células T CAR CTL019 en la médula y el SNC
Las células CTL019 se expandieron más de 1000 veces en la sangre periférica y la médula ósea (Figura 5). La frecuencia de células CTL019 aumentó a más del 10% de las células T circulantes en D+20 en ambos individuos (Figura 8), siendo la magnitud absoluta de la expansión de CTL019 similar a la observada en pacientes con LLC (Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73). Inesperadamente, las células en el lCr también mostraron un alto grado de marcaje del gen CTL019 y también persistieron en alta frecuencia hasta los 6 meses (Figura 5B). El tráfico de células CTL019 al LCR fue sorprendente, dado que ninguno de los pacientes presentaba leucemia detectable en el SNC mediante citospin en el momento de la infusión o en la evaluación de 1 mes tras el tratamiento. Además, en informes anteriores de terapia CAR para neoplasias de células B no se ha observado tráfico de células T CAR al SNC (Till et al., 2008, Blood 112:2261-71; Brentjens et al., 2011, Blood 118:4817-28; Savoldo et al., 2011, J Clin Invest 121:1822-5; Jensen et al., 2010, Biol Blood Marrow Transplant 16:1245-56; Till et al., 2012, Blood 119:3940-50; Kochenderfer et al., 2012, Blood 119:2709-20). La morfología de los linfocitos en sangre y LCR se muestra para CHOP-100 y 101 en la Figura 5D. Dado que >70% de los linfocitos en circulación en D+10 eran células CTL019 (Figuras 5A y 5B), la mayoría de los linfocitos granulares grandes mostrados en el panel izquierdo de la Figura 5D son probablemente células CTL019. Del mismo modo, dado que muchos linfocitos en el LCR obtenido de CHOP-101 en D+23 eran células CTL019 (Figuras 5B y 5C), la citoespinilla de linfocitos del LCR en la Figura 5D muy probablemente representa la morfología de las células CTL019in vivoque han traficado al SNC.
Inducción de aplasia de células B
Ambos individuos tuvieron una eliminación de células CD19 positivas en médula ósea y sangre en el plazo de 1 mes después de la infusión de CTL019 (Figura 6, y Figura 9). En CHOP-100, una gran proporción de las células que permanecían en la médula en D+6 tras la infusión eran blastos leucémicos CD19+CD20+. Esta población de células no era detectable en D+23, un efecto que se mantiene más allá de los 9 meses en este paciente (Figura 9A). Dado que CHOP-100 no recibió quimioterapia en las 6 semanas anteriores a la infusión de CTL019, esto indica que las células CTL019 fueron suficientes para ablacionar las células B normales y leucémicas en este caso.
Aparición de la variante de escape CD19 en CHOP-101
CHOP-101 experimentó una recaída clínica aparente en la sangre periférica a los 2 meses después de la infusión de CTL019, evidenciada por la reaparición de células blásticas en la circulación. Estas células eran CD45dim positivas, CD34 positivas y no expresaban CD19 (Figura 6). La ausencia de las células CD34dim+CD34+CD19dim+ dominantes originales es coherente con una potente presión selectiva antileucémica de las células T CAR CTL019 dirigidas a CD19 (Figura 9B). La secuenciación profunda de IGH reveló la presencia del clon maligno en sangre periférica y médula ósea ya en D+23 (Tabla 1), a pesar de una evaluación clínica de negatividad de MRD por citometría de flujo en este punto temporal (Figura 7). Además, la secuenciación profunda del material obtenido en la recaída clínica reveló que las células CD45dimCD34+CD19- están relacionadas clonalmente con las células CD45dim+CD34+CD19dim+ dominantes iniciales, ya que comparten la misma secuencia IGH.
Remisión de la LLA mediante células T que expresan receptores de antígenos quiméricos
Los resultados presentados en la presente memoria demuestran la inducción de la remisión de la leucemia recidivante y refractaria en los dos primeros pacientes tratados con este protocolo. La remisión se ha mantenido en un individuo y se acompañó de recaída debido a la aparición de blastos CD19 negativos en el otro individuo. Las células CTL019 modificadas genéticamente traficaron al SNC a altos niveles en ambos pacientes. Se observaron elevaciones de las citocinas que estaban en el objetivo, eran reversibles y estaban temporalmente acompañadas por la eliminación de células blásticas que expresaban CD19 en ambos individuos. La inducción de la remisión completa en la LLA CD19 positiva refractaria tras la infusión de células T CAR es alentadora, sobre todo teniendo en cuenta la baja frecuencia de remisiones tras la infusión de infusiones de linfocitos de donantes alogénicos que no expresan CAR (Kolb et al., 1995, Blood 86:2041-50; Collins et al., 1997, J Clin Oncol 15:433-44; Collins et al., 2000, Bone Marrow Transplant 26(5):511-6). La tecnología de secuenciación profunda indicó que la infusión de CTL019 CAR se asoció con una reducción sostenida de 5 log en la frecuencia de células B malignas en CHOP-100, lo que indica además potentes efectos antitumorales en la leucemia refractaria a la quimioterapia.
La desafortunada aparición de células blásticas CD19 negativas en un individuo es coherente con informes anteriores que documentan la existencia de células precursoras CD19 negativas en algunos casos de LLA (Hotfilder et al., 2005, Cancer Research 65:1442-9; le Viseur et al., 2008, Cancer Cell 14:47-58). Es posible que la coinfusión de células T CAR redirigidas a nuevas especificidades además de CD19 pueda disminuir la probabilidad de este evento. Hasta ahora, no se han observado recaídas con células de escape CD19 negativas en adultos con LLC tras el tratamiento con células CTL019 (Kalos et al., 2011, Science Translational Medicine 3:95ra73), lo que sugiere que este problema puede ser específico de un subconjunto de leucemias agudas. La inducción de la remisión en CHOP-100 no requirió quimioterapia concomitante, y es coherente con un informe anterior que mostraba que las remisiones en LLC podían retrasarse varias semanas tras la quimioterapia (Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-33). Por lo tanto, la administración concomitante de quimioterapia citotóxica puede no ser necesaria para los efectos antitumorales mediados por CAR.
Ambos pacientes pediátricos con LLA experimentaron una toxicidad sustancial tras la infusión de CTL019. Se observó la inducción de aplasia de células B, lo que indica que las células T CAR pueden funcionar en el contexto de la leucemia aguda recidivante. Ambos pacientes también han desarrollado evidencias clínicas y de laboratorio del síndrome de liberación de citoquinas y del síndrome de activación de macrófagos a la semana de la infusión. El perfil de citocinas observado en estos pacientes es similar a informes previos de patrones de citocinas en niños con hemafagocitosis y síndrome de activación de macrófagos o linfohistiocitosis hemofagocítica (Tang et al., 2008, Br J Haematol 143:84-91; Behrens et al., 2011, J Clin Invest 121(6):2264-77). El síndrome de activación macrofágica se caracteriza por hiperinflamación con fiebre prolongada, hepatoesplenomegalia y citopenias. Los hallazgos de laboratorio característicos de este síndrome son ferritina, triglicéridos, transaminasas, bilirrubina (sobre todo conjugada) y cadena a del receptor soluble de interleucina-2 elevados, y fibrinógeno disminuido (Janka et al., 2012, Annu Rev Med 63:233-46). Estudios recientes indican que tocilizumab (anti-IL6) es prometedor para la EICH resistente a glucocorticoides (Drobyski et al., 2011, Biol Blood Marrow Transplant 17(12):1862-8; Le Huu et al., 2012, J Invest Dermatol 132(12):2752-61; Tawara et al., 2011, Clinical Cancer Research 17:77-88), y los resultados aquí presentados concuerdan con estos datos.
La vigorosa expansión in vivo de CTL019, la aplasia persistente de células B y la prominente actividad antileucémica implican funciones efectoras sustanciales y sostenidas de las células CTL019 en pacientes pediátricos con LLA avanzada. La alta eficacia del tráfico de células T CAR al SNC es alentadora como mecanismo de vigilancia para prevenir la recaída en un lugar santuario como el SNC (Pullen et al., 1993, J Clin Oncol 11(5):839-49), y apoya el ensayo de terapias dirigidas con células T CAR para linfomas del SNC y neoplasias malignas primarias del SNC. Con la excepción de la aplasia de células B, cuya duración no está definida en la actualidad, se cree que el uso de terapias basadas en la inmunidad como CTL019 puede tener un perfil favorable de efectos adversos a largo plazo en comparación con las altas dosis de quimioterapia y radiación que se emplean como estándar actual de tratamiento para la mayoría de los casos de leucemia pediátrica (García-Manero y Thomas, 2001, Hematol Oncol Clin North Am 15(1):163-205).
Inducción de remisiones completas de la LLA por medio de células T que expresan receptores de antígenos quiméricos
Tocilizumab (anti-IL6) es prometedor para la EICH resistente a glucocorticoides, y los resultados presentados en la presente memoria son coherentes con estos datos. Además, es interesante señalar que en el CHOP 100, el SRC que se manifestó como fiebre alta, hipotensión y fallo multiorgánico fue resistente a las altas dosis de glucocorticoides administradas durante los 2 días previos a la terapia dirigida con citocinas. Por último, en CHOP-100 los cambios bifásicos en IL-1p, IL-1RA e IL-2 mostrados en la Figura 4B pueden haber estado relacionados con la terapia dirigida a citocinas con etanercept y tocilizumab.
La inducción de la remisión en un paciente refractario a la terapia con blinatumomab destaca aún más la potencia de las células CTL019. La alta eficiencia del tráfico de células T CAR al SNC es alentadora como mecanismo de vigilancia para prevenir la recaída en un lugar santuario como el SNC, y apoya el ensayo de terapias dirigidas a células T CAR para linfomas del SNC y neoplasias malignas primarias del SNC. Ninguno de los pacientes ha experimentado efectos cognitivos que pudieran atribuirse al tráfico de células T al SNC.
Ejemplo 4: Información resumida
Se midieron diversos marcadores en pacientes que recibieron células T CAR. Como ejemplo no limitativo, se midieron la ferritina, la mioglobina y el inhibidor-1 del activador del plasminógeno (PAI-1); véanse las figuras 10, 11 y 12, respectivamente. Los niveles elevados de estos marcadores se correlacionaron con el resultado. Los pacientes designados como -01, -03, -09, -100 y -101 se clasificaron como respondedores completos. Los pacientes designados como -02, -05, -10 (segunda infusión y respuesta en torno a D70) y -12 se clasificaron como respondedores parciales. Los pacientes designados como -06, -07 y -14 se clasificaron como no respondedores.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una célula T modificada genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular (célula T CAR) para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección asociada a una expresión elevada de un antígeno tumoral, comprendiendo el procedimiento la administración de una terapia de primera línea y una terapia de segunda línea a un paciente que lo necesite, en el que:
la terapia de primera línea comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de la célula T CAR por medio de infusión;
tras la administración de la terapia de primera línea, se controlan los niveles de citocinas en el paciente para determinar el tipo adecuado de terapia de segunda línea que debe administrarse, en la que se detecta un aumento del nivel de IL-6, identificando así un inhibidor de iL-6 como el tipo adecuado de terapia de segunda línea, y dicho inhibidor de IL-6 se administra al paciente; y
la enfermedad, trastorno o afección es cáncer.
2. La célula T CAR para uso de la reivindicación 1, en la que el inhibidor de IL-6 se administra para controlar la toxicidad resultante de la infusión de la célula T CAR.
3. Un inhibidor de IL-6 para uso en un procedimiento de reducción o evitación de un efecto adverso asociado con la infusión de una célula T modificada genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular (célula T CAR), el procedimiento comprende la monitorización de los niveles de una citocina en un paciente para determinar el tipo apropiado de terapia de citocina que debe administrarse, en la que se detecta un aumento del nivel de IL-6 tras la infusión de células T CAR, identificando así un inhibidor de IL-6 como el tipo apropiado de terapia de citocina, y dicho inhibidor de IL-6 se administra al paciente.
4. El inhibidor de IL-6 para uso de la reivindicación 3, en el que dicha infusión de células T CAR es para tratar el cáncer en el paciente.
5. La célula T CAR para uso de la reivindicación 1 o 2, o el inhibidor de IL-6 para uso de la reivindicación 3 o 4, en el que el cáncer es una neoplasia hematológica.
6. La célula T CAR para uso de la reivindicación 5, o el inhibidor de IL-6 para uso de la reivindicación 5, en donde la neoplasia hematológica se selecciona del grupo que consiste en leucemia aguda (tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), la leucemia crónica (como la leucemia mielocítica crónica (granulocítica), la leucemia mielógena crónica y la leucemia linfocítica crónica), la policitemia vera, el linfoma, la enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.
7. La célula T CAR para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 o 6, o el inhibidor de IL-6 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en el que el dominio de unión a antígeno se dirige a CD19, opcionalmente en el que el cáncer es pre-LLA-B (indicación pediátrica), LLA de adultos, linfoma de células del manto o linfoma difuso de células B grandes.
8. La célula T CAR para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5-7, o el inhibidor de IL-6 para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que el dominio de unión a antígeno se fusiona con uno o más dominios intracelulares seleccionados del grupo que consiste en un dominio de señalización CD137 (4-1BB), un dominio de señalización CD28, un dominio de señalización CD3zeta, y cualquier combinación de los mismos, opcionalmente en el que el dominio de unión a antígeno es de un anticuerpo específico y la célula T se transduce con un vector lentiviral que codifica la CAR.
9. La célula T CAR para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5-8, o el inhibidor de IL-6 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que los niveles de citocina se monitorizan detectando el nivel de proteína o el nivel de ácido nucleico de la citocina en una muestra biológica del paciente.
10. La célula T CAR para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5-9, o el inhibidor de IL-6 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3-9, en el que el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo.
11. La célula T CAR para uso de la reivindicación 10, o el inhibidor de IL-6 para uso de la reivindicación 10, en el que el inhibidor de IL-6 es:
(i) un anticuerpo anti-IL-6 que se une específicamente a la IL-6, o
(ii) un anticuerpo humanizado o quimérico contra el receptor de IL-6.
12. La célula T CAR para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5-9, o el inhibidor de IL-6 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3-9, en el que el inhibidor de IL-6 es tocilizumab.
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