ES3032995T3 - Biomarkers of traumatic brain injury - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para diagnosticar y/o monitorear una lesión cerebral traumática leve (LCT) o una conmoción cerebral en un sujeto. El método comprende la determinación del nivel de al menos un miARN en una muestra de saliva del sujeto. También se proporciona un elemento sensor, un sistema de detección, una composición y un kit para diagnosticar y/o monitorear una LCT, y un método para determinar el tratamiento adecuado para un sujeto con sospecha de LCT o conmoción cerebral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcadores de lesión cerebral traumática

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones, kits, sistemas y métodos para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de una lesión cerebral traumática (TBI). Más particularmente, la presente invención se refiere al diagnóstico y seguimiento de TBI utilizando biomarcadores de miARN.

Antecedentes de la invención

La lesión cerebral traumática (TBI) es la principal causa de muerte y discapacidad en menores de 45 años en los países occidentales. Se espera que su carga sanitaria y sus costes sociales sigan aumentando y, para 2020, la Organización Mundial de la Salud prevé que la<t>B<i>se convertirá en la tercera causa principal de discapacidad en todo el mundo.

A pesar de muchos estudios, no se han encontrado biomarcadores fiables para evaluar la gravedad de la TBI y predecir la recuperación. Esto es especialmente cierto para la mTIB (mTBI), que actualmente sigue siendo difícil de evaluar en la práctica clínica. Aunque los pacientes con TBI son evaluados inicialmente mediante la puntuación de coma de Glasgow (GCS) y técnicas de neuroimagen, que requieren equipos costosos, las herramientas de diagnóstico actuales carecen de capacidad para definir y cuantificar con precisión la gravedad real de la lesión cerebral, lo que conduce a una fácil detección de las lesiones graves pero no de las mTIB, que representa la gran mayoría de los casos (75-90%).

El diagnóstico correcto de la mTIB es particularmente importante en pacientes, tales como atletas, soldados y niños, que tienen un mayor riesgo de mTIB repetitiva y una forma catastrófica de lesión cerebral conocida como síndrome del segundo impacto (SIS) donde los efectos sinérgicos de la TBI repetida producen daños profundos e incluso la muerte. Por lo tanto, el diagnóstico temprano y la evaluación de la gravedad de la TBI se vuelven cruciales para el bienestar de los pacientes y, en última instancia, para salvarles la vida.

La búsqueda de biomarcadores de TBI ha recibido un impulso significativo por el mayor perfil de la conmoción cerebral deportiva en los medios. En los últimos años, muchos estudios se han centrado en biomarcadores que pueden respaldar la toma de decisiones clínicas en el campo o en una clínica deportiva. Sin embargo, los biomarcadores de proteínas descritos en la bibliografía carecen de especificidad o sensibilidad, o no son detectables durante algún tiempo después de la lesión. Esto puede deberse al hecho de que después de una conmoción cerebral, que es una forma de TBI, los compuestos derivados del cerebro se liberan solo en cantidades muy pequeñas y la barrera hematoencefálica permanece mayoritariamente cerrada.

Los microARN (miARN) son una clase abundante de moléculas de ARN no codificantes altamente conservadas de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que inducen la degradación del ARNm, la represión traduccional o ambas por medio del emparejamiento con sitios parcialmente complementarios en la 3'UTR de los genes diana. El genoma humano codifica más de 2000 miARN, que pueden dirigirse a aproximadamente el 60% de todos los genes. Sin embargo, a pesar de la abundancia de miARN, sus funciones biomoleculares y su participación en la patología todavía no se han dilucidado por completo. Desempeñan un papel central en muchos procesos biológicos, incluido el ciclo celular, metabolismo celular, apoptosis y respuestas inmunitarias, y están atrayendo un interés cada vez mayor en la investigación clínica como posibles biomarcadores para la detección, identificación y clasificación de cánceres y otras enfermedades, incluidas las enfermedades neurodegenerativas.

El documento WO 2015/134551 A1 (BANYAN BIOMARKERS INC [US]) 11 de septiembre de 2015(2015-09-11) se refiere a la identificación en la saliva de marcadores de una condición o trastorno neurológico, lesión cerebral traumática (TBI) o lesión multiorgánica.

El documento WO 2015/196191 A1 (JACKSON HM FOUND MILITARY MED [EE. UU.]; UNIV FLORIDA [EE. U U .]; ORLANDO HEALTH) 23 de diciembre de 2015(2015-12-23) se relaciona con métodos de diagnóstico de lesión cerebral traumática (TBI) en la saliva de un sujeto.

La presente invención se ideó teniendo estas cuestiones en mente.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona un método para diagnosticar y/o monitorizar una mTIB en un sujeto, el método comprende determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra de saliva obtenida del sujeto, en donde el al menos un miARN es miR-142-3p, En realizaciones, un nivel regulado al alza del al menos un miARN es indicativo de mTIB. En algunas realizaciones, se diagnostica que el sujeto tiene una mTIB si el nivel del al menos un miARN está por encima de un umbral predeterminado o aumentado en relación con un control. En realizaciones, el umbral predeterminado es equivalente a un cambio de pliegue de 2 o más en el método 2-delta delta CT (2-AACT).

En algunas realizaciones, el método comprende determinar un nivel de al menos dos miARN en una muestra de saliva obtenida del sujeto. En realizaciones, los al menos segundos miARN se seleccionan entre miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-107 o miR-135b-5p. En realizaciones, un nivel aumentado de al menos dos miARN es indicativo de mTIB. En algunas realizaciones, se diagnostica que el sujeto tiene una mTIB si el nivel de al menos dos miARN supera un umbral predeterminado o aumenta en relación con un control. En realizaciones, el umbral predeterminado es equivalente a un cambio de pliegue de 1,5 o más en el método 2-delta delta CT (2-AACT).

En algunas realizaciones, la muestra de saliva se obtiene entre 24 horas y 15 días después de la lesión. En algunas realizaciones, la muestra de saliva se obtiene entre 24 horas y 7 días después de la lesión o entre 2 y 5 días después de la lesión. En otras realizaciones, se puede obtener más de una muestra de saliva. Las muestras de saliva pueden obtenerse en diferentes puntos temporales para permitir el seguimiento del sujeto, o el seguimiento de la mTIB, o el seguimiento de la recuperación del sujeto.

En algunas realizaciones, el método comprende determinar un nivel de cada uno de los miARN miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p.

Los métodos pueden comprender, además, la determinación de un nivel de uno o más miARN adicionales seleccionados entre let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, y miR-424-5p, miR-30a-5p, miR-107, miR-135b-5p, miR-199b-5p, miR-324-5p, o miR-652-3p.

Esta invención también proporciona el uso de sensores de detección y sistemas de detección en el diagnóstico y / o seguimiento de mTIB. También se divulga, pero no forma parte de la invención, un elemento sensor para un sistema de detección para diagnosticar y/o monitorear mTIB, comprendiendo el elemento sensor un sustrato funcionalizado con una sonda específica para al menos uno de miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 o miR-135b-5p. En realizaciones, la sonda comprende un ácido nucleico capaz de unirse al menos a un miARN. En realizaciones, la sonda comprende un ácido nucleico que tiene al menos un 70 % de identidad con una secuencia que es el complemento de la secuencia del miARN objetivo. En algunas realizaciones, la sonda comprende un ácido nucleico que tiene al menos un 70% de identidad con una secuencia que es el complemento de SEQ ID NO: 25, 26, 35, 39 o 40.

Esta invención también divulga el uso de un sistema de detección para diagnosticar y/o monitorear mTIB, que comprende un elemento sensor como se describe en este documento, y un dispositivo de detección capaz de detectar la unión de un miARN objetivo a la sonda. En algunas realizaciones, el sistema de detección comprende, además, un medio para determinar si el miARN objetivo está regulado positivamente.

También se divulga, pero no forma parte de la información, un método para determinar un curso de acción para un sujeto sospechoso de tener mTIB, que comprende aplicar una muestra de saliva obtenida del sujeto a un sistema de detección como el descrito en el presente documento, si se detecta un nivel regulado al alza del al menos un miARN proporcionar un tratamiento para la mTIB.

También se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para tratar a un sujeto con sospecha de mTIB, comprendiendo el método i) determinar si un nivel regulado positivamente de al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p es detectable en una muestra de saliva obtenida del sujeto, y ii) si se detecta un nivel regulado positivamente de al menos un miARN, proporcionar tratamiento para mTIB al sujeto.

Figuras

Figura 1: Expresión de miR-425-5p y miR-502 en 3 categorías diferentes de traumatismo y HV

Expresión de MiR-425-5p y miR-502 en pacientes 10 HV, 10 mTIB+CE (1 día), 10 mTIB+CE (15 días), 10 CE (1 día), 10 CE (15 días), 10 sTIB CE (1 día) y 10 sTIB CE (15 días), detectada por análisis de qRT-PCR. Se encontró que la expresión de MiR-425-5p estaba notablemente disminuida en mTIB+CE (1 día) en comparación con HV (p<0,01), mTIB+CE (15 dis) (p<0,001) y sTIB CE (1 día) (p <0,01) (Figura 1A). Se encontró que la expresión de MiR-502 estaba notablemente disminuida en mTIB+CE (1 día) en comparación con HV (p<0,05), mTIB+CE (15 días) (p<0,01) y sTIB CE (1 día) (p<0,05)(Figura 1B).

Figura 2: Expresión de miR-21 y miR-335 en 3 categorías diferentes de traumatismo y HV Expresión de MiR-21 y miR-335 en pacientes 10 HV, 10 mTIB+CE (1 día), 10 mTIB+CE (15 días), 10 CE (1 día), 10 CE (15 días), 10 sTIB CE (1 día) y 10 sTIB CE (15 días), detectada por análisis de qRT-PCR. Se encontró que la expresión de MiR-21 estaba significativamente regulada por aumento en sTIB CE (1 día y 15 días) en comparación con HV (p<0,01) (Figura 2A). Se encontró que la expresión de MiR-335 estaba notablemente regulada por aumento en sTIB c E (1 día) en comparación con HV (p<0,001), CE (15 días) (p<0,001) y mTIB+CE (1 día) (p< 0,05) (Figura 2B).

Figura 3: Evolución temporal de la expresión de miR-425-5p (Figura 3A) y miR-502 (Figura 3B) en 3 categorías diferentes de traumatismos y HV

Expresión de miR-425-5p y miR-502 en 30 pacientes HV, 30 mTIB+CE, 30 CE, 30 sTIB CE en diferentes puntos temporales desde la lesión (T0, T4-12h, T48-72h, 15días) detectada mediante análisis qRT-PCR. Se encontró que la expresión de MiR-425-5p estaba notablemente disminuida en mTIB+CE en T0 y T4-12 h en comparación con HV, sTIB CE y CE (p<0,05). Se encontró que la expresión de MiR-502 estaba notablemente disminuida en mTIB+CE en T0 y T4-12 h en comparación con HV, sTIB CE y CE (p<0,05). Los valores de P se determinaron mediante la prueba post-hoc de Tukey.

* significativamente diferente de HV

Figura 4: Evolución temporal de la expresión de miR-21 (Figura 4A) y miR-335 (Figura 4B) en 3 categorías diferentes de traumatismos y HV

Expresión de miR-21 y miR-335 en 30 pacientes HV, 30 mTIB+CE, 30 CE y 30 sTIB CE en diferentes momentos de la lesión (T0, T4-12h, T48-72h, 15días) detectada mediante análisis qRT-PCR. Se encontró que la expresión de MiR-21 estaba significativamente regulada por aumento en sTIB CE en T4-12h, T48-72h y 15 días en comparación con HV (p<0,01). Se encontró que la expresión de MiR-335 estaba notablemente regulada por aumento en sTIB CE en T0, T4-12h, T48-72h y 15 días en comparación con HV y mTIB+CE (p<0,001), pero no solo en CE. Los valores de P se determinaron mediante la prueba post-hoc de Tukey.

* significativamente diferente de HV

Figura 5: Diagrama de caja de la expresión relativa de los 5 microARNs que mostraron una regulación positiva significativa (p<0,05) en el grupo de validación y evaluados mediante RT-PCR. Se utilizó una prueba no paramétrica (prueba U de Mann-Whitney) para comparar el nivel de microARN en los dos grupos independientes.

Figura 6: Curva característica operativa del receptor (ROC) y estadísticas correspondientes del área bajo la curva (AUC) para los biomarcadores identificados en la cohorte de validación.

Descripción detallada de la invención

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para diagnosticar y/o monitorizar una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto, el método comprende determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra de saliva obtenida del sujeto, en donde el al menos un miARN comprende miR-142- 3p.

Para evitar dudas, se entenderá que "el al menos un miARN se selecciona de un grupo de miARN", como se usa en el presente documento, significa que el método en cuestión ya sea que se lleve a cabo para un fin de diagnóstico, pronóstico o terapéutico, se puede llevar a cabo con uno cualquiera de los miARN indicados o con cualquier pluralidad de los miARN indicados (p. ej., dos, tres, cuatro o más de los miARN enumerados). De ello se deduce que uno cualquiera o más de los miARN indicados pueden excluirse explícitamente. El método puede incluir la detección y/o evaluación del nivel de cualquier combinación de miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21 y miR-let-7g con exclusión de miR-335.

Por ejemplo, según un aspecto de la invención, se proporciona un método para diagnosticar y/o monitorizar una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto, el método comprende determinar un nivel de al menos dos miARNs en una muestra del sujeto, en donde el miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p.

La lesión cerebral traumática ocurre cuando una fuerza externa daña de forma traumática el cerebro. Existen diferentes sistemas para clasificar la TBI basados, por ejemplo, en la gravedad, el tipo de lesión y el pronóstico. El sistema más comúnmente utilizado para clasificar la<t>B<i>es la Escala de Coma de Glasgow (GCS), que clasifica el nivel de conciencia de una persona en una escala de 3-15 basada en reacciones verbales, motoras y de apertura de ojos ante estímulos. En general, una TBI con una puntuación de GCS de 13 o más se define como leve, de 9-12 como moderada y de 8 o menos como grave. Otro sistema, el Sistema de Clasificación de Mayo, tiene tres clasificaciones principales que incluyen TBI moderada-grave definida, mTIB probable y TBI posible. Se utilizan múltiples criterios en cada diagnóstico, incluyendo la pérdida del conocimiento, amnesia postraumática, fractura de cráneo y evidencia de anomalías neurorradiológicas que incluyen hematoma subdural, contusión cerebral y contusión hemorrágica. Los expertos en la técnica conocerán la clasificación de la TBI utilizando los sistemas GCS o Mayo.

Como se utiliza en el presente documento, las referencias a TBI "leve", "moderada" y "grave" se hacen de acuerdo con la GCS. Las referencias en el presente documento a TBI "moderada a grave" abarca TBI tanto moderada como grave de acuerdo con la GCS.

Como se utiliza en este documento, una referencia a un mTIB (mTBI) también es una referencia a una conmoción cerebral.

Se espera que el diagnóstico y/o seguimiento de la TBI utilizando los biomarcadores de la presente invención respalde la toma de decisiones clínicas y los regímenes de tratamiento en una variedad de contextos, incluidas las siguientes situaciones: como parte de la evaluación inicial por paramédicos para determinar si los pacientes deben ser transportados a un centro con experiencia en neurocirugía, un centro de traumatología principal o una unidad de traumatología local; en el servicio de urgencias de los hospitales para determinar el tratamiento adecuado, incluida la necesidad de una exploración por CT del cerebro; en el campo, para ayudar en la toma de decisiones sobre la retirada de un jugador del juego y la evaluación de la necesidad de llevar a un jugador al hospital; en clínicas deportivas, para confirmar un suceso de conmoción cerebral y permitir la toma de decisiones con respecto al regreso al juego; en situaciones de combate, para determinar la necesidad de enviar un equipo de rescate y evacuar a una víctima. Por lo tanto, los sujetos para quienes la presente invención proporciona un beneficio particular incluyen víctimas de accidentes, deportistas y personal militar.

En cualquier caso, pero quizás particularmente cuando el sujeto tiene un mayor riesgo de sufrir una TBI (p. ej., cuando el sujeto es un atleta profesional o está alistado en el ejército), se puede obtener una muestra del sujeto en un momento anterior a cualquier traumatismo conocido o reciente (p. ej., cerca del comienzo de una carrera deportiva o antes de un despliegue militar) y se puede evaluar cualquier miARN de interés en ese momento o más tarde, cuando el sujeto haya experimentado una TBI posible. De este modo, dichas muestras pueden proporcionar una referencia interna.

En algunas realizaciones, el sujeto es humano.

El TBI puede ser un mTIB (mTBI), un TBI moderado o un sTIB (sTBI). En algunas realizaciones, la TBI es una TBI de moderada a grave (m-sTBI).

El nivel del miARN o de cada miARN en la muestra se puede determinar de forma cuantitativa o semicuantitativa. Por "cuantitativamente", se entenderá que se determina la cantidad o concentración absoluta del miARN o de cada miARN en la muestra. La cantidad absoluta del miARN o de cada miARN en la muestra se puede comparar luego con un umbral predeterminado (p. ej., un valor publicado en la bibliografía para niveles normales esperados), un nivel conocido del mismo miARN o uno de referencia en una muestra de control tomada de un sujeto sano, o la cantidad de un miARN de referencia en la muestra tomada del sujeto. En algunas realizaciones, se diagnostica al sujeto que tiene una TBI cuando el nivel del miARN está por debajo del umbral predeterminado, o disminuye con respecto a una muestra de referencia o de control. En otras realizaciones, se diagnostica al sujeto que tiene una TBI cuando el nivel del miARN aumenta en comparación con el umbral predeterminado.

Por "semicuantitativamente", se entenderá que el nivel del o cada miARN de interés se mide con respecto a una referencia.

La referencia puede ser un miARN invariante, es decir, un miARN que tiene un nivel de expresión que permanece sustancialmente sin cambios entre sujetos sanos y aquellos que tienen una TBI. Se puede diagnosticar a un sujeto que padece una TBI si el nivel del miARN o de cada miARN de interés aumenta o disminuye con respecto al de un miARN invariante. Los miARN invariantes adecuados incluyen miR-331, miR-223*, miR-23a-3p y miR148b-3p. miR-23a-3p y miR148b-3p son invariantes solo en la saliva.

En algunas realizaciones, el nivel del miARN o de cada miARN en la muestra obtenida del sujeto puede ser de aproximadamente 0,01 veces a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 0,05 veces a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 0,1 veces a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3 veces, o de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 2,0 veces menor o mayor que el nivel en la muestra de control, el nivel de referencia o el valor publicado.

Cuando se emplea un dispositivo o método para generar un valor, podemos calificar ese valor con el término "aproximadamente" con el fin de capturar el valor indicado y cualquier variación de ese valor inherente al dispositivo o método empleado. Cuando se describen específicamente valores o intervalos de valores, "aproximadamente" puede significar más o menos 10% del valor o intervalo indicado. Por ejemplo, aproximadamente 10 minutos puede significar 9-11 minutos.

El nivel del miARN o de cada miARN de interés se puede determinar usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, determinar el nivel del miARN o de cada miARN de interés comprende amplificar el miARN. En algunas realizaciones, el miARN total se puede aislar primero de la muestra usando técnicas convencionales, por ejemplo usando el mini kit miRNeasy (Qiagen). Luego se puede determinar la cantidad de miARN de interés. En algunas realizaciones, el nivel del miARN o de cada miARN de interés en la muestra se determina mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Por ejemplo, se puede usar PCR cuantitativa para la determinación cuantitativa del nivel del miARN o de cada miARN de interés. La PCR también se puede utilizar para la determinación semicuantitativa, comparando el nivel del miARN o de cada miARN de interés en la muestra con el de una referencia (p. ej., un miARN invariante).

Las técnicas adecuadas para la detección y/o cuantificación de miARN, que serán conocidas por los expertos en la técnica, incluyen qPCR, ensayos de miARN, secuenciación de nueva generación (NGS) y ensayos de perfiles de miARN múltiplex.

En algunas realizaciones, el nivel del miARN o de cada miARN de interés se determina usando hibridaciónin situ,por ejemplo usando una sonda (p. ej., una sonda marcada) específica para el miARN.

El nivel de miARN se puede determinar en una muestra que se obtuvo del sujeto inmediatamente después de la lesión (es decir, menos de 1 hora después de la lesión), y/o en una muestra obtenida en uno o más puntos de tiempo unas pocas horas o días después de la lesión. Por lo tanto, se pueden detectar los cambios en el nivel de miARN a lo largo del tiempo para permitir el seguimiento de una<t>B<i>. En el caso de que los niveles de miARN cambien a lo largo del tiempo, los métodos descritos en el presente documento para el seguimiento de la TBI se pueden ampliar para incluir el mantenimiento o ajuste del régimen de tratamiento del sujeto en consecuencia.

Dependiendo del miARN específico y el tipo de TBI, el nivel de miARN en el sujeto puede cambiar significativamente a lo largo del tiempo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, puede ser ventajoso medir el miARN relativamente pronto después de la lesión para permitir un diagnóstico preciso. En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto no más de 72 horas, no más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, no más de 12 horas, no más de 6 horas, no más de 4 horas, no más de 2 horas o no más de 1 hora después de la lesión.

El nivel de algunos miARN es sustancialmente estable a lo largo del tiempo, lo que permite realizar un diagnóstico unas pocas horas, días o incluso semanas después de la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto hasta 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5 o 2 días desde la lesión.

En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto inmediatamente después de la lesión (por ejemplo, a T= 0h), a las 4-12 horas después de la lesión, a las 48-72 horas después de la lesión o a los 15 días después de la lesión.

En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto al menos 24 horas después de la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto 15 días o menos después de la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto entre 24 horas y 15 días después de la lesión, o entre 24 horas y 10 días después de la lesión, o entre 24 horas y 7 días después de la lesión, o entre 48 horas y 5 días después de la lesión.

En algunas realizaciones, el TBI es mTIB (mTBI) o TBI de moderado a grave (m-sTBI) y el al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* y miR-671-3p.

En algunas realizaciones, la TBI es una mTIB (mTBI) y el miARN se selecciona del grupo formado por miR-425-5p y miR-502. Se puede diagnosticar que el sujeto tiene mTIB si se determina que el nivel de miR-425-5p y/o miR-502 está por debajo de un umbral predeterminado o disminuido con respecto a una referencia.

En algunas realizaciones, un nivel de miR-425-5p y/o miR-502 que esté por debajo de un umbral predeterminado, o disminuido en relación con una referencia, es diagnóstico de mTIB cuando el nivel se determina en una muestra obtenida menos de 48 horas después de la lesión.

En algunas realizaciones, la TBI es una TBI de moderada a grave (m-sTBI) y el miARN se selecciona del grupo formado por miR-21 y miR-335. Se puede diagnosticar que el sujeto tiene una TBI de moderada a grave si se determina que el nivel de miR-21 y/o miR-335 está por encima de un umbral predeterminado, o aumentado en relación con una referencia.

En algunas realizaciones, un nivel de miR-21 y/o miR-335 que está por encima de un umbral predeterminado, o aumentado en relación con una referencia, es diagnóstico de TBI de moderada a grave cuando el nivel se determina en una muestra obtenida hasta 15 días después de la lesión.

En algunas realizaciones, la TBI es una TBI de moderada a grave (m-sTBI) y el al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629.

Se puede diagnosticar que el sujeto tiene m-sTBI si se determina que el nivel de miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642 y/o miR-99a está por encima un umbral predeterminado o aumentado con respecto a una referencia.

Sepuede diagnosticar que el sujeto tiene m-sTBI si se determina que el nivel de miR-192, miR-429, miR-520D-3p y/o miR-629 está por debajo de un umbral predeterminado o disminuido con respecto a una referencia.

Los miARN se pueden usar individualmente para diagnosticar TBI. Por ejemplo, en una conmoción cerebral deportiva, se podrían utilizar miR-502 o miR-425-5p para confirmar que se ha producido una lesión cerebral traumática.

También se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para determinar la gravedad de la TBI, y los pasos de este método pueden repetirse para monitorizar al sujeto a lo largo del tiempo. Se apreciará que un resultado positivo para un único miARN (p. ej., se determina que el nivel de un único miARN está por encima/por debajo de un umbral predeterminado o aumentado/disminuido con respecto a una referencia) es suficiente para determinar la gravedad de la TBI. Por ejemplo, si el nivel de miR-425-5p está por debajo de un umbral predeterminado o disminuido con respecto a una referencia, se determina que la gravedad de la TBI es leve (mTBI). Sin embargo, puede resultar conveniente combinar diferentes miARN (p. ej., en un panel de ensayo) para facilitar la evaluación de la gravedad de la TBI.

En algunas realizaciones, el método comprende determinar un nivel de una pluralidad (p. ej., dos o más) miARN en la muestra. En algunas realizaciones, los dos o más miARN se seleccionan del grupo que consiste en: miR-425-5p; miR-502; miR-21; y miR-335.

En algunas realizaciones, el método comprende determinar el nivel de:

(i) un primer miARN seleccionado de miR-425-5p y miR-502; y

(ii) un segundo miARN seleccionado entre miR-21 y miR-335.

Se puede diagnosticar a un sujeto que tiene una TBI si se determina que el nivel de miR-425-5p o miR-502 está por debajo de un umbral predeterminado o disminuido con respecto a una referencia, o el nivel de miR-21 o miR-335 se determina que está por encima de un umbral predeterminado o aumentado con respecto a una referencia.

En algunas realizaciones la TBI es mTIB (mTBI) y el al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miRmmiR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-424-5p, miR-30a-5p, miR-107, miR-135b-5p, miR-199b-5p, miR-324-5p, y miR-652-3p, o una combinación de los mismos. Se puede diagnosticar que el sujeto tiene mTIB si hay un cambio de al menos 0,5, al menos 1,0, al menos 1,5, al menos 2,0, al menos 2,5, al menos 3,0, al menos 3,5 o al menos 4,0 veces en el nivel de la microARN comparado con una referencia. En algunas realizaciones, se diagnostica al sujeto que tiene mTIB si el(los) nivel(es) de microARN aumenta(n) en comparación con una referencia.

En algunas realizaciones, el TBI es mTIB o conmoción cerebral y el al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un nivel regulado al alza del al menos un miARN, un aumento por encima de un umbral predeterminado o un aumento en relación con un control es indicativo de mTIB o conmoción cerebral.

Las secuencias y números de acceso para los miARN descritos en el presente documento se proporcionan en la Tabla 1:

Tabla 1

miARN Secuencia N.° de acceso de

Convenientemente, la muestra puede ser cualquier fluido apropiado o muestra de tejido obtenida del sujeto. Por ejemplo, la muestra biológica puede comprender al menos uno del grupo que consiste en: orina, saliva, sangre entera, plasma, suero, esputo, semen, heces, un hisopo nasal, lágrimas, un hisopo vaginal, un hisopo rectal, un frotis cervical, una biopsia de tejido y un hisopo uretral. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de fluido. De manera adecuada, la muestra es una que se puede obtener fácilmente del individuo, tal como orina, saliva, sangre y esputo. En algunas realizaciones, la muestra comprende saliva, sangre, plasma o suero. Se apreciará que en algunas realizaciones el proceso de obtención de la muestra no forma parte de la invención descrita en el presente documento.

En algunas realizaciones, la muestra comprende o está constituida por suero. El suero no solo tiene ventajas prácticas, sino que también está exento de anticoagulantes tales como heparina, un potencial inhibidor de las reacciones de PCR. El suero también puede estar menos afectado por la hemólisis en comparación con el plasma.

En algunas realizaciones, la muestra es saliva. La saliva se puede obtener fácilmente del paciente (por ejemplo, al costado del campo o en el terreno de juego), sin necesidad de capacitación especializada o equipo médico.

Los miARN que se ha descubierto que son indicativos de mTIB en la saliva incluyen: hsa-let-7ca-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-1421-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-424-5p; miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b se selecciona del grupo que consiste en -5p; miR-324-5p; y miR-652-3p.

Los miARN que se han encontrado como indicativos de mTIB en la saliva incluyen: miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p.

En algunas realizaciones, un nivel regulado al alza en la saliva del al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p es indicativo de mTIB o conmoción cerebral. En algunas realizaciones, se diagnostica que el sujeto tiene una mTIB si el nivel del al menos un miARN está por encima de un umbral predeterminado o aumentado en relación con un control.

Un nivel regulado al alza indicativo de mTIB puede ser equivalente a un cambio de pliegue de 2,0 o más obtenido mediante el método 2-ññCT. En algunas realizaciones, un nivel regulado al alza indicativo de mTIB puede ser equivalente a un cambio de pliegue de 2,0 o más obtenido mediante el método 2-ññCT para al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p.

El método de diagnóstico y/o monitorización de la mTIB en un sujeto puede comprender el contacto de una muestra de saliva obtenida del sujeto con al menos una sonda oligonucleótida específica de miARN que tenga al menos un 70% de identidad con el complemento de una secuencia seleccionada de SEQ ID Nos: 25, 26, 35, 39 o 40.

El método puede comprender, además, la cuantificación de la al menos una sonda oligonucleotídica específica de miARN y la comparación de dicho nivel de expresión con un miARN de referencia o un nivel de expresión de control obtenido o derivado de un sujeto sano. Una diferencia de 1,5 veces o más, como por ejemplo una diferencia de 2,0 veces o más, entre el sujeto y el control es indicativa de mTIB.

Los métodos de la presente invención pueden comprender determinar un nivel de al menos un segundo miRNA en la muestra de saliva obtenida del sujeto.

Los métodos de la presente invención pueden comprender la determinación de un nivel de al menos dos miARN en la muestra de saliva obtenida del sujeto. En las realizaciones, el primero de los al menos dos miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p. En algunas realizaciones, los al menos dos miARN se seleccionan del grupo formado por miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p.

Opcionalmente, los al menos dos miRNA son let-7i-5p y miR-142-3p.

En otras realizaciones, los al menos dos miARN son miR-142-3p y miR-27b-3p. Opcionalmente, los al menos dos miARN son miR-142-3p y miR-107.

Alternativamente, los al menos dos miARN son miR-142-3p y miR-135b-5p.

En realizaciones, el método incluye determinar un nivel de los miARN miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p.

En realizaciones, el método comprende, además, determinar un nivel de uno o más miARN adicionales seleccionados del grupo que consiste en let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, y miR-424-5p, miR-30a-5p, miR-107, miR-135b-5p, miR-199b-5p, miR-324-5p y miR-652-3p.

Un nivel regulado al alza de dos o más miARN indicativos de mTIB puede ser equivalente a un cambio de pliegue de 1,5 o más, o de 2,0 o más obtenido mediante el método 2-ññCT

En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra de saliva obtenida del sujeto al menos 24 horas después de la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra de saliva obtenida del sujeto 15 días o menos después de la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra de saliva obtenida del sujeto entre 24 horas y 15 días después de la lesión, o entre 24 horas y 10 días después de la lesión, o entre 24 horas y 7 días después de la lesión, o entre 48 horas y 5 días después de la lesión.

Se pueden usar niveles de miARN para realizar el seguimiento de la recuperación de un sujeto de una lesión. Por lo tanto, la presente invención abarca el seguimiento de la recuperación de un sujeto de la TBI, como alternativa o, además, del diagnóstico inicial.

En algunas realizaciones, el método comprende hacer el seguimiento de la TBI y el nivel de al menos un miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 7, al menos 10 o al menos 14 días después de la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de al menos un miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto 15 días después de la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de al menos un miARN se determina en al menos dos muestras obtenidas en diferentes intervalos de tiempo después de la lesión, permitiendo así seguir la recuperación. Por ejemplo, los niveles de miARN podrían determinarse a los 7 y 14 días después de la lesión, o a los 5, 10 y 15 días después de la lesión. Un retorno de los niveles de miARN a la normalidad puede ser indicativo de la recuperación del sujeto de la TBI.

En algunas realizaciones, se determina que un sujeto se ha recuperado de una mTIB si el nivel de miR-425-5p y/o miR-502 ya no está por debajo de un umbral predeterminado o ya no ha disminuido en relación con una referencia.

En algunas realizaciones, se determina que un sujeto se ha recuperado de una TBI de moderada a grave si el nivel de miR-21 y/o miR-335 ya no está por encima de un umbral predeterminado o ya no ha aumentado en relación con una referencia.

El diagnóstico de un sujeto que sufre una TBI, y en particular el diagnóstico de una mTIB o una TBI de moderada a grave, puede facilitar la determinación de un tratamiento apropiado. Por lo tanto, la presente invención proporciona un ensayo que permite a los trabajadores de la salud, tales como médicos, clínicos, paramédicos e incluso personal no médico (p. ej., profesores, entrenadores deportivos, personal militar) decidir sobre la acción apropiada para un sujeto que se sospecha que tiene una TBI. Por lo tanto, un sujeto que se ha determinado que tiene una TBI puede recibir el tratamiento más adecuado como resultado de que se ha hecho un diagnóstico. El método puede comprender, además, dirigir la terapia apropiada a un sujeto diagnosticado con una TBI.

Un sujeto diagnosticado de TBI puede ser evaluado adicionalmente, p. ej., mediante exploración por CT. En algunas realizaciones, el sujeto ingresa en un hospital. En algunas realizaciones, si se puede descartar la TBI de moderada a grave, es posible que no sea necesario ingresar al sujeto en el hospital para su evaluación. Un sujeto diagnosticado de TBI de moderada a grave puede ser ingresado en un hospital o en un centro especializado con experiencia en neurotrauma.

Un sujeto diagnosticado de una TBI (particularmente mTIB) fuera de un entorno hospitalario, por ejemplo, en un evento deportivo, durante un combate o durante un juego, puede ser retirado del juego o del combate inmediatamente. El sujeto posteriormente puede empezar con un regreso gradual al juego o al combate.

En otro aspecto, también divulgado pero que no forma parte de la invención, es un método para determinar si es apropiado administrar a un sujeto una terapia para aliviar la TBI, el método comprende:

determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra del sujeto; y

determinar si es apropiado o no administrar una terapia para aliviar la TBI, basándose en el nivel de al menos un miARN.

Se apreciará que la etapa de administrar la terapia al sujeto no forma parte del método reivindicado, a menos que se indique específicamente.

En algunas realizaciones, el método puede comprender, además, la administración al sujeto de un tratamiento adecuado. En algunas realizaciones, el tratamiento puede comprender una terapia para aliviar la TBI. Por consiguiente, la invención presenta métodos para diagnosticar y tratar la TBI en un sujeto, comprendiendo el método las etapas de (a) obtener una muestra (p. ej., una muestra de sangre, plasma, orina o saliva) del sujeto; (b) detectar uno o más miARN (seleccionados de los descritos en el presente documento); diagnosticar que el paciente tiene una TBI cuando el(los) nivel(es) de miARN difiere(n) de un patrón de referencia (como se describe en el presente documento); y administrar un tratamiento para la TBI.

En otro aspecto, también divulgado pero que no forma parte de la invención es un método para determinar un tratamiento apropiado a un sujeto sospechoso de padecer una TBI, el método comprende identificar si el sujeto padece o no una TBI determinando un nivel de al menos un miARN en una muestra del sujeto.

Si se identifica que un sujeto tiene una TBI, un tratamiento apropiado puede incluir uno o más de los siguientes: evaluación adicional del sujeto, por ejemplo mediante pruebas adicionales (p. ej., pruebas verbales, cognitivas, motoras y/u ópticas), exploración por CT y/o MRI; retirar al sujeto de la actividad (p. ej., la actividad durante la cual se produjo la TBI); ingresar al sujeto en un hospital o una clínica especializada; cirugía; y administrar una terapia para aliviar la TBI al sujeto.

La terapia para aliviar la TBI puede incluir fármacos neuroprotectores, p. ej., fármacos para tratar la inflamación cerebral tales como manitol y solución salina hipertónica, y/u otras medidas neuroprotectoras, tales como evitar la reanimación hipertensiva y el uso de sedación.

En algunas realizaciones, posteriormente se puede hacer un seguimiento de la recuperación del paciente, por ejemplo, en un hospital o clínica.

De acuerdo con otro aspecto que no forma parte de la invención, se proporciona un método para detectar y/o determinar un nivel de un miARN diana en un sujeto, comprendiendo el método los pasos de (a) obtener una muestra del sujeto; y (b) detectar y/o determinar el nivel del miARN diana en la muestra poniendo en contacto la muestra con una sonda que es específica para el miARN diana.

La muestra puede ser cualquier muestra de tejido o fluido apropiado obtenida del sujeto, como se define anteriormente. En algunas realizaciones, la muestra es sangre, suero, plasma, orina o saliva.

En algunas realizaciones, el método puede comprender la determinación del nivel de dos o más miARN diana en la muestra.

Según otro aspecto que no forma parte de la invención, se proporciona una terapia para aliviar la TBI para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que la necesita, en donde se identifica que dicho sujeto tiene una TBI mediante la determinación de un nivel de al menos un miARN en una muestra del sujeto.

La etapa de determinar el nivel del miARN diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sustrato funcionalizado con la sonda, por ejemplo, un chip que comprende la sonda. El sustrato o chip puede incluir convenientemente múltiples sondas, cada una específica para un miARN diana diferente.

El sujeto puede haber sufrido una lesión, en particular una lesión en la cabeza. Se puede sospechar que el sujeto tiene una TBI. Se puede sospechar que el sujeto padece de mTIB o conmoción cerebral. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene no más de 72 horas, no más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, no más de 12 horas, no más de 6 horas, no más de 4 horas, no más de 2 horas o no más de 1 hora después de la lesión. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene 24 horas o más después de la lesión. En otras realizaciones, la muestra se obtiene del sujeto 15 días o menos después de la lesión. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene del sujeto entre 24 horas y 15 días después de la lesión, o entre 24 horas y 10 días después de la lesión, o entre 24 horas y 7 días después de la lesión, o entre 48 horas y 5 días después de la lesión.

En algunas realizaciones, el método comprende, además, tratar al sujeto. El tratamiento puede incluir uno o más de los siguientes: evaluación adicional del sujeto, por ejemplo mediante pruebas adicionales (p. ej., pruebas verbales, cognitivas, motoras y/u ópticas), exploración por CT y/o MRI; retirar al sujeto de la actividad (p. ej., la actividad durante la cual se produjo la TBI); ingresar al sujeto en un hospital o una clínica especializada; y administrar una terapia para aliviar la TBI al sujeto. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz de un fármaco neuroprotector.

Así, en otro aspecto más, también divulgado pero que no forma parte de la invención, es un método de tratamiento de TBI, el método comprende:

determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra del sujeto; y si el nivel del al menos un miARN es indicativo de mTIB, administrar un tratamiento apropiado para la mTIB; o

si el nivel del al menos un miARN es indicativo de m-sTBI, administrar un tratamiento apropiado para la msTBI.

Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden usar diferentes vías de tratamiento para la mTIB y msTBI.

En otro aspecto más, también divulgado pero que no forma parte de la invención, es un método para tratar a un sujeto con sospecha de mTIB, el método comprende:

i) determinar si un nivel aumentado de al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p es detectable en una muestra de saliva obtenida del sujeto, y

ii) si se detecta un nivel aumentado de al menos un miARN que proporcione un tratamiento para el mTIB al sujeto.

Un sujeto con mTIB puede ser tratado de la siguiente manera:

• Un atleta diagnosticado con mTIB generalmente comenzaría un protocolo de retorno gradual al juego (según lo definido por la Conferencia de Consenso de Berlín sobre Conmociones Cerebrales y las autoridades deportivas individuales, por ejemplo, la RFU). Esto implicaría un período de descanso seguido de un aumento gradual del nivel de esfuerzo y exposición al contacto. Un atleta con mTIB normalmente no podría jugar durante un período que varía entre 6 y 23 días, dependiendo del nivel de supervisión médica y la edad. Por el contrario, si se excluyera un mTIB, el atleta no tendría ninguna restricción y podría entrenar con normalidad al día siguiente.

• Si se diagnostica en un entorno prehospitalario, el mTIB sería una indicación para que el paciente busque atención médica (por ejemplo, en el hospital o en atención primaria), mientras que, si se excluye el mTIB, no estaría indicada ninguna revisión médica.

• Una persona con mTIB no debe quedar sin supervisión durante 24 a 48 horas y no debe conducir ni operar una carretilla elevadora ni maquinaria abierta hasta que se recupere.

• El personal militar diagnosticado con mTIB sería retirado del quirófano y descansaría, mientras que, si se pudiera descartar el mTIB, esa persona continuaría en servicio activo.

• En el NHS, una persona con mTIB puede permanecer hospitalizada para observación o puede someterse a una tomografía computarizada según las directrices emitidas por NICE, mientras que si se pudiera excluir el mTIB, ese paciente podría recibir el alta inmediatamente.

• A una persona diagnosticada con mTIB generalmente se le pedirá que no regrese a trabajar ni a estudiar durante un período de tiempo determinado.

• Una persona diagnosticada con mTIB puede ser derivada a una clínica de mTIB, a una clínica de neurología o a una clínica de neurocirugía. Las intervenciones típicas para el mTIB consisten en educación, asesoramiento con respecto al trabajo, el estudio y la conducción, tratamiento médico de las secuelas típicas como dolor de cabeza o ansiedad o trastorno del estado de ánimo o trastorno de estrés postraumático con medicación y/o intervención psicológica si es necesario y derivación a otros servicios según esté indicado, por ejemplo, neuropsicología, neurovestibular u oftalmología.

• Un paciente con mTIB necesitaría ser monitoreado para detectar disfunción pituitaria postraumática tardía de acuerdo con la guía emitida por la Sociedad de Cirujanos Neurológicos Británicos.

En el contexto médico-legal, el diagnóstico de mTIB a menudo es poco claro y especulativo, ya que las investigaciones radiológicas suelen ser normales y los síntomas no son específicos. La confirmación objetiva de una mTBI puede dar lugar a una indemnización por daños y perjuicios y necesidades asistenciales. La confirmación objetiva de una mTBI puede dar lugar a una indemnización por daños y perjuicios y necesidades de asistencia; tratamientoin situoen la comunidad; evaluación adicional del sujeto en el hospital sin ingreso nocturno (típicamente los pacientes con mTIB son dados de alta pronto con asesoramiento sobre lesiones en la cabeza); o ingreso en el hospital durante un período de observación (normalmente 1-2 días). El sujeto se puede evaluar adicionalmente usando pruebas (p. ej., pruebas verbales, cognitivas, motoras y/u ópticas). Generalmente, la exploración por CT solo se requiere si existen ciertas indicaciones, incluyendo la sospecha de fractura de cráneo, convulsiones postraumáticas, déficit neurológico focal, vómitos repetidos, una puntuación de GCS de menos de 13 en la evaluación inicial (menos de 14 para niños, o menos de 15 para bebés menores de 1 año), de acuerdo con las directrices del NICE.

Un tratamiento apropiado para m-sTBI puede incluir: exploración por MRI o CT (particularmente en el plazo de 1 hora de la lesión); ingreso en el hospital (que puede incluir ingreso en cuidados intensivos y/o el traslado a una clínica especializada o a un centro de traumatología principal con instalaciones neuroquirúrgicas); neuromonitorización; cirugía; administrar una terapia para aliviar la TBI, tal como administrar fármacos neuroprotectores, p. ej. fármacos para tratar la inflamación cerebral tales como manitol y solución salina hipertónica, y/u otras medidas neuroprotectoras, tales como evitar la reanimación hipertensiva y el uso de sedación.

Por lo tanto, el presente método permite estratificar rápidamente a los sujetos con TBI en mTIB o m-sTBI, de modo que puedan recibir el tratamiento más adecuado.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un sistema de detección para diagnosticar y/o monitorear TBI, comprendiendo el sistema de detección un elemento sensor que comprende un sustrato funcionalizado con una sonda específica para un miARN objetivo. El sistema de detección puede comprender, además, un dispositivo de detección que es capaz de detectar la unión de un miARN objetivo a la sonda.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un elemento sensor para uso en un sistema de detección para diagnosticar y/o monitorear TBI, comprendiendo el elemento sensor un sustrato funcionalizado con una sonda específica para un miARN objetivo.

El elemento sensor puede comprender, además, una zona de adición de muestra para recibir una muestra (p. ej., una muestra de fluido) sobre la misma.

La sonda es capaz de unirse selectivamente al miARN de interés. El sustrato puede funcionalizarse con una pluralidad de sondas. Las sondas pueden ser todas iguales o pueden proporcionarse dos o más sondas diferentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sustrato puede funcionalizarse con una primera sonda específica para un primer miARN y una segunda sonda específica para un segundo miARN. La primera y segunda sondas pueden agruparse entre sí, por ejemplo, en diferentes partes del elemento sensor.

En otro aspecto que no forma parte de la invención, se proporciona una composición para su uso en un método de diagnóstico y/o seguimiento de una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto, comprendiendo la composición una sonda específica para un miARN diana. La composición puede comprender uno cualquiera de los miARN indicados o cualquier pluralidad de los miARN indicados (p. ej., dos, tres, cuatro o más de los miARN indicados).

En algunas realizaciones, el miARN diana se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p, miR-424-5p, miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629.

En algunas realizaciones, el miARN diana se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* y miR-671-3p. Se ha descubierto que estos microARN son biomarcadores expresados en todos los pacientes con TBI (leve o grave).

En algunas realizaciones, el miARN diana se selecciona del grupo formado por miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g y miR-335.

En algunas realizaciones, el miARN diana se selecciona del grupo formado por let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, y miR-424-5p; miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p.

En algunas realizaciones, el miARN diana se selecciona del grupo formado por miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p. En algunas realizaciones, al menos dos miARN diana se seleccionan del grupo formado por miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p.

En algunas realizaciones, el miARN diana se selecciona del grupo que consiste en miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629.

En algunas realizaciones, el miARN diana se selecciona del grupo que consiste en miR-425-5p, miR-502, miR21 y miR-335.

La sonda puede comprender una molécula biológica tal como una proteína (p. ej., un anticuerpo) o un ácido nucleico. En algunas realizaciones, la sonda comprende un ácido nucleico. El ácido nucleico puede comprender una secuencia que sea al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% idéntica a una secuencia que sea el complemento de la secuencia de longitud completa del miARN diana. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende una secuencia que es 100% idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia del miARN diana (es decir, el receptor comprende una secuencia de ácido nucleico que es el complemento exacto de la secuencia de miARN diana).

Las sondas se pueden unir a una superficie del sustrato mediante cualquier medio adecuado, tal como por química de acoplamiento conocida por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, cada sonda se une a una superficie del sustrato mediante un conector. En algunas realizaciones, la sonda comprende un resto para inmovilizar la sonda sobre el sustrato, o para unir la sonda a un conector inmovilizado sobre el sustrato.

Alternativamente o además, la sonda puede comprender un marcador detectable. El marcador detectable puede ser, por ejemplo, radiactivo, fluorescente, luminiscente o basado en anticuerpos (p. ej., puede constituir un anticuerpo tetramérico convencional o un fragmento detectable del mismo).

El sustrato del elemento sensor puede formarse a partir de cualquier material adecuado. En algunas realizaciones, el sustrato comprende o está formado de metal, plástico, vidrio, sílice, silicio, grafito, grafeno o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el sustrato comprende múltiples capas. Por ejemplo, se puede preparar un sustrato formando una superficie o capa de grafeno sobre una capa de carburo de silicio o sílice. La superficie del grafeno puede modificarse químicamente, por ejemplo, a óxido de grafeno (GO) o amina de grafeno (GA). Los expertos en la técnica conocerán métodos para formar capas de grafeno, tales como crecimiento epitaxial y crecimiento por sublimación.

Convenientemente, las sondas que comprenden o están constituidas por un ácido nucleico pueden unirse a una superficie de GO mediante un conector, usando un reactivo de acoplamiento de amida (p. ej., hexafluorofosfato de (O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N,N'-tetrametiluronio (HATU)). Luego se puede usar un elemento sensor que comprende una superficie funcionalizada con una sonda de ácido nucleico para detectar selectivamente su miARN complementario.

Los conectores adecuados pueden comprender un resto de anilina (o un derivado del mismo), un resto de ácido benzoico (o un derivado del mismo) o un resto de etendiamina (o un derivado del mismo). Se puede formar un conector de anilina uniendo una molécula de nitrobenceno (o derivado) a una superficie de grafeno (p. ej., usando una sal de diazonio) y reduciendo el nitrobenceno a anilina. Luego se puede utilizar el grupo amina de la anilina para unirlo a la sonda.

De manera similar, se puede usar una sal de diazonio (p. ej., tetrafluoroborato de diazonio del ácido 4-benzoico) para unir un ácido benzoico o derivado del ácido benzoico a una superficie de grafeno. Se puede unir un resto de etanodiamina al grafeno carboxilado o al óxido de grafeno.

El elemento sensor puede estar comprendido dentro de una tira reactiva. La tira reactiva puede ser desechable.

El dispositivo de detección puede configurarse para detectar la unión de un miARN diana al receptor por cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo detectando cambios en la impedancia eléctrica, la concentración de iones de hidrógeno o cambios conformacionales que resultan de la hibridación.

El dispositivo de detección puede incluir, además, una interfaz de usuario para enviar datos a un usuario.

En algunas realizaciones, el dispositivo de detección incluye una base de datos de información de tratamiento. El dispositivo puede ser capaz de identificar opciones de tratamiento adecuadas a partir de la base de datos dependiendo de los niveles de cada miARN de interés. La información del tratamiento puede proporcionarse al usuario a través de la interfaz de usuario.

Convenientemente, el dispositivo de detección puede ser portátil, p. ej. manual. El dispositivo de detección puede comprender una unidad de almacenamiento de datos para almacenar niveles de miARN y otra información relacionada con el sujeto. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende un medio de comunicación de datos para comunicar datos a otros dispositivos. Por ejemplo, el dispositivo puede comunicar datos de forma inalámbrica a través de WiFi, 3G, 4G, Bluetooth o mediante una aplicación móvil. Esto puede permitir convenientemente que los profesionales médicos accedan fácilmente a los datos si es necesario.

Por lo tanto, se prevé que el dispositivo de detección de la invención proporcione un medio de diagnóstico inmediato asequible y portátil para diagnosticar y hacer el seguimiento de la TBI de forma no invasiva. El dispositivo puede ser utilizado por equipos de ambulancias, militares, escuelas, clubes deportivos y profesionales de la salud, lo que permite la evaluación y clasificación correcta de pacientes con sospecha de TBI.

Un aspecto adicional de la presente invención es un sistema para detectar y/o monitorear mTIB en un sujeto.

Un tipo de sistema de detección se basa en la complementariedad entre un miARN objetivo y una sonda de ácido nucleico, generalmente una sonda de oligonucleótidos. Por lo tanto, la presente invención abarca un sistema de detección para detectar y/o monitorizar mTIB en un sujeto que comprende un sustrato funcionalizado con un oligonucleótido capaz de unirse a al menos uno de miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 o miR-135b-5p. El oligonucleótido puede tener una secuencia complementaria a al menos una porción de al menos uno de miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 o miR-135b-5p, o el oligonucleótido puede tener una secuencia complementaria a al menos una porción de SEQ ID NO: 25, 26, 35, 39 o 40. La región complementaria o de apareamiento de bases puede tener 7 u 8 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la región complementaria o de emparejamiento de bases puede tener 9, 10, 12, 15 o más nucleótidos de longitud o la región complementaria o de emparejamiento de bases puede tener toda la longitud del miARN. El sustrato funcionalizado con un oligonucleótido puede ser una perla o una nanopartícula. El sistema de detección puede tener componentes adicionales capaces de convertir la sonda de ácido nucleicomiARN unida en una señal detectable.

Otro tipo de sistema de detección se basa en RT-PCT Por lo tanto, la presente invención abarca un sistema de detección para detectar y/o monitorizar la mTIB en un sujeto que comprende un par de cebadores diseñados para la amplificación de un complemento de ADNc de al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 o miR-135b-5p.

En otro aspecto que no forma parte de la invención, se proporciona un kit para su uso en los presentes métodos. El kit puede comprender al menos una sonda (p. ej., una proteína, tal como un anticuerpo o un ácido nucleico) que sea capaz de unirse selectivamente al miARN de interés. En algunas realizaciones, el kit comprende una matriz que comprende una pluralidad de sondas. En algunas realizaciones, la al menos una sonda es un cebador para llevar a cabo la PCR. El kit puede comprender, además, instrucciones de uso, por ejemplo instrucciones de uso en el diagnóstico y/o seguimiento de la TBI. El kit puede comprender, además, tampones y reactivos adecuados, tales como cebadores de amplificación y enzimas (p. ej.,<a>D<n>polimerasa, transcriptasa inversa para la conversión de miARN en ADNc).

Se apreciará que las declaraciones hechas en el presente documento con respecto a cualquier aspecto de la invención pueden aplicarse igualmente a cualquier otro aspecto de la invención, según corresponda.

Ejemplos

Las realizaciones de la invención se describirán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las Figuras adjuntas.

Dado que los miARN están surgiendo como biomarcadores prometedores en una variedad de patologías diferentes, los autores de la presente invención intentaron explorar su papel en la TBI.

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Pacientes y recogida de muestras

Los participantes del estudio fueron reclutados del Centro de Investigación de Microbiología y Reconstrucción Quirúrgica (SRMRC) en el Hospital Queen Elizabeth de Birmingham (Reino Unido) como parte del estudio de biomarcadores cerebrales después de traumatismo (The Golden Hour Study) (Ethics Ref. 13/WA /0399).

Primero, se llevó a cabo el cribado de 754 miARN en 5 pacientes de mTBI con lesión extracraneal (CE), 5 pacientes con lesión sTBI+CE y voluntarios sanos (HV) el día 1 y a los 15 días de la lesión con el objetivo de seleccionar biomarcadores candidatos específicos capaces de discriminar la mTIB de la grave y predecir la recuperación de la mTBI después de 15 días. Basándose en esta información (Tabla 2), después se podían confirmar los resultados del estudio en una cohorte ampliada de pacientes de 40 individuos agrupados en 4 categorías diferentes: HV (n=10), CE (n=10), mTIB+CE (n=10), sTIB+CE (n=10). Los voluntarios sanos dieron su consentimiento y se inscribieron en el estudio RECOS. Los pacientes con lesiones CE tenían fracturas confirmadas radiográficamente, no tenían traumatismo craneoencefálico, ni infección, ni antecedentes de trastornos neurológicos o psiquiátricos y no tenían dependencia de alcohol o drogas. La mTIB con CE incluía a aquellos con un traumatismo craneoencefálico no penetrante y una puntuación en la Escala de Coma de Glasgow (GCS) >13. La sTIB con CE incluía a pacientes con una puntuación de GCS de 8 o menos. Todos los pacientes fueron emparejados por sexo y edad con los HV.

Procesamiento de muestras

Se tomaron muestras de sangre periférica al día 1 y 15 días después de la lesión en cada paciente. Las muestras de sangre se procesaron para el aislamiento del suero en el plazo de 2 h posteriores a la extracción. La sangre completa se dejó reposar durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente antes de centrifugar a 3000 rpm durante 10 min a 4°C. El suero se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80°C hasta el análisis.

Aislamiento de ARN, transcripción inversa y perfilado de miARN mediante matriz de baja densidad TaqMan (TLDA)

Se llevó a cabo un cribado inicial (conjunto de descubrimiento) en 5 pacientes con mTIB+CE y 5 sTIB CE, que se compararon con los HV en los dos puntos temporales diferentes (1 día y 15 días desde la lesión). El suero de estos pacientes se utilizó para el perfilado del transcriptoma de 754 miARN. Las muestras de suero se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min para sedimentar y eliminar cualquier célula o residuo circulante. Los miARN se extrajeron de 400 pl de muestras de suero utilizando el mini kit miRNeasy de Qiagen (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemania), de acuerdo con el protocolo complementario de Qiagen para la purificación de ARN pequeños de suero y plasma y finalmente se eluyeron en un volumen de 30 pl de agua exenta de ARNasa. La concentración y pureza del ARN resultante se determinó con un espectrofotómetro UV-Vis ND-1000 (NanoDrop). Se retrotranscribieron y preamplificaron 20 ng de ARN séricos, según las instrucciones del fabricante. Los productos preamplificados se cargaron en TLDA, matriz de microARN humano TaqMan v3.0 A y B (Applied Biosystems LifeTechnologies™). Las PCR en las TLDA se realizaron en el sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT (Applied Biosystem, LifeTechnologies™).

Análisis de datos

Para obtener un perfil de miARN preciso, los autores de la invención usaron el método de normalización de la mediana global. De manera similar al análisis de micromatrices, los valores de Ct de cada muestra se normalizaron respecto a la mediana de Ct de la matriz. Además, al calcular la correlación de Pearson entre las medianas y medias de Ct de cada matriz y el Ct de cada miARN, se identificaron dos miARN que mostraron un perfil de expresión cercano a la mediana y la media de las TLDA, es decir, miR-331 y miR-223*. También se confirmó que estos miARN se encuentran entre los más estables en las TLDA aplicando dos métodos diferentes [el software DataAssistv.3 (AppliedBiosystem Life Technologies™)] y el algoritmo geNorm. Por consiguiente, se utilizaron miR-331 y miR-223* como genes de referencia para la validación mediante ensayos TaqMan individuales. Los cambios en la expresión se calcularon por el método 2-AACT. Los miARN expresados diferencialmente (miARN DE) se identificaron mediante la significación del análisis de micromatrices (SAM) calculada por el Multi experiment Viewer v4.8.1, aplicando una prueba para datos no pareados de dos clases entre ACts y utilizando un valor p basado en 100 permutaciones; motor de imputación: K-vecinos más cercanos (10 vecinos); se utilizó una tasa de descubrimiento falso <0,15 como corrección para comparaciones múltiples. Se aceptaron como fiables solo los miARN DE concordantes usando todos los controles endógenos.

Ensayos TaqMan individuales

Se eligieron diez miARN expresados diferencialmente de las matrices como posibles biomarcadores candidatos con el objetivo de discriminar la mTIB de grave y hacer el seguimiento de la recuperación de la leve. Estos candidatos se utilizaron para validar los datos en una cohorte ampliada de 30 pacientes (conjunto de validación) agrupados en 3 categorías diferentes (mTIB+CE, sTIB CE y CE únicamente) y 10 controles (HV) en dos puntos temporales diferentes (1 y 15 días desde la lesión) mediante ensayos TaqMan individuales (AppliedBiosystems, Life Technologies™). Las muestras se extrajeron y retrotrascribieron como se describe anteriormente y el análisis de RT-qPCR se realizó en el sistema de detección de PCR en tiempo real Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad, C<a>, EE. UU.). Los cambios en la expresión se calcularon por el método 2-AACT.

Análisis estadístico

Se verificó la distribución normal de los datos y se transformaron para realizar pruebas paramétricas. Las comparaciones entre grupos en cada momento y dentro de los grupos a lo largo del tiempo se realizaron mediante el análisis de varianza de una via y la prueba post-hoc de Tukey en datos transformados. Se utilizó un análisis de las características operativas del receptor para calcular la sensibilidad y especificidad de cada biomarcador en el diagnóstico de mTIB o sTIB expresado como área bajo la curva (AUC). Todos los análisis se realizaron en SPSS v.20 (IBM). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con un valor de p <0,05.

Resultados

Perfiles de expresión por matrices de baja densidad TaqMan (TLDA)

A partir de 754 miARN cribables de la TLDA, se identificaron diez miARN circulantes el día 1 y 13 a los 15 días en mTIB+CE, 19 el 1 día y 22 a los 15 días en sTIB CE expresados diferencialmente (Tabla 2). De esta lista, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* y miR-671-3p se excluyeron para análisis adicionales porque se expresaban en la mayoría de los pacientes, por lo que no eran biomarcadores candidatos adecuados solo para traumatismos leves o graves. Sin embargo, los microARN anteriores pueden identificar TBI de cualquier gravedad y, por lo tanto, son biomarcadores de TBI útiles. Por otro lado, miR-184, miR-301b, miR-502 y miR-505 expresados de forma única y diferencial en mTIB+CE el día 1, se seleccionaron como biomarcadores candidatos tempranos de la mTIB. Además, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p y miR-655 expresados diferencialmente 15 días después de mTIB+CE se seleccionaron como biomarcadores candidatos capaces de seguir la recuperación de la mTIB.

Finalmente, se seleccionaron dos miARN, miR-21 y miR-335, expresados constantemente en ambos puntos temporales en sTIB CE, para estudios adicionales.

Tabla 2:Cambio ede los microARN expresados diferencialmente en pacientes 5 de mTIB+CE (1 y 15 días) y 5 de sTIB CE (1 y 15 días), en comparación con 5 HV y detectados por TLDA.

Ensayo TaqMan individual para biomarcadores candidatos de mTIB

Con el fin de validar estos hallazgos, posteriormente los autores de la invención ensayaron la expresión de los miARN seleccionados en tres grupos separados e independientes (10 mTIB CE, 10 sTIB CE, 10 CE) en los dos puntos de tiempo elegidos (1 y 15 días desde la lesión) usando ensayos TaqMan individuales. Los resultados se compararon con 10 HV. Los cambios en número de veces se calcularon por el método 2-AACT, utilizando miR-331 y miR-223* como genes de referencia.

Entre los biomarcadores candidatos de mTIB en ambos puntos temporales (miR-184, miR-301b, miR-502, miR-505, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p y miR-655), dos mostraron resultados interesantes y se expresaban de manera significativa y diferencial en las tres categorías diferentes en comparación con HV. En particular, miR-425-5p y miR-502 mostraban una tendencia similar (Fig 1). Ambos eran regulados por disminución de manera significativa en mTIB+CE (media de 0,387 ± 0,201 y 0,314 ± 0,146) respectivamente el día 1 desde la lesión en comparación con HV (p<0,001), CE (p<0,001) y sTIB CE (p<0,001). A los 15 días desde la lesión leve, miR425-5p y miR-502 volvieron a los niveles normales (0,886 ± 0,310 y 1,157 ± 0,258). La expresión de miR-425-5p y miR-502 se encontró que también era similar a la de HV en muestras de CE tanto 1 día como 15 días desde la lesión, lo que sugiere que estos dos biomarcadores se expresan de manera diferencial solo en pacientes con lesión cerebral. Además, ninguno de ellos mostraba ninguna diferencia significativa en sTIB CE en comparación con HV en ambos puntos temporales. Por lo tanto, miR-425-5p y miR-502 podrían considerarse los biomarcadores candidatos más prometedores para el diagnóstico temprano y el seguimiento de la mTIB a los 15 días después del traumatismo. Las AUC de estos biomarcadores se muestran en la Tabla 3.

Ensayo TaqMan individual para biomarcadores candidatos de sTIB

miR-21 y miR-335 se analizaron como posibles biomarcadores de sTIB ya que ambos aparecían regulados por aumento en ambos puntos temporales de sTIB CE en el cribado inicial. Mostraron que también eran buenos candidatos en el segundo conjunto de datos de pacientes (Fig 2). Mir-21 era regulado por aumento de manera significativa en ambos puntos temporales en sTIB con CE (7,106 ± 4,192 y 4,012 ± 1,577) con respecto a HV (p <0,001), CE (p <0,001) y mTIB (p <0,001). En el resto de categorías no se encontraron diferencias significativas en comparación con HV. miR-335 mostró regulación por aumento en sTIB CE y en ambos puntos temporales (16,824±14,195 y 12,324±8,931, respectivamente). El día 1, este grupo era significativamente diferente de los controles (p=0,001) y mTIB+CE (p=0,031), pero no de CE. Es interesante que se encontró una regulación por aumento significativa en los pacientes con CE al día 1 (7,951 ± 4,870), pero no a los 15 días desde la lesión (1,260 ± 0,531). Por esta razón, el día 15, miR335 era significativamente mayor en el grupo de sTIB CE con respecto a HV (p=0,002), CE (p=0,007) y mTIB+CE (p=0,001). miR-335 no mostró ninguna diferencia significativa en mTIB+CE en ambos puntos temporales en comparación con HV. Las AUC de estos biomarcadores también se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: Área bajo la curva

Discusión

El presente estudio investigó si los cambios en los niveles de miARN se pueden aplicar al diagnóstico de la TBI y evaluar su gravedad. Se identificaron cuatro miARN que se expresaban diferencialmente en la TBI; miR-425-5p, miR 502, miR-21 y miR-335.

miR-425-5p mostró resultados significativos el día 1 en mTIB+CE en comparación con HV y se obtuvieron resultados similares en todas las demás categorías. Su regulación por disminución en el plazo de las primeras 24 h desde la lesión leve y su regreso a niveles normales después de 15 días hacen de miR-425-5p un biomarcador candidato adecuado de traumatismo leve.

También se encontró que miR-502 se expresaba diferencialmente en mTIB+CE. La tendencia de este miARN era muy similar a la de miR-425-5p. Mostraba especificidad para pacientes con lesión cerebral y también podría usarse para realizar un seguimiento de la recuperación, ya que vuelve al valor normal después de 15 días desde la lesión leve.

Después de sTBI, se observó que 2 miARN (miR-21, miR-335) se expresaban tanto el día 1 como a los 15 y, por lo tanto, se seleccionaron como posibles biomarcadores para sTB i. miR-21 y miR-335 eran regulados por aumento significativamente en ambos puntos temporales en comparación con los controles en sTBI+CE. Por lo tanto, la sobreexpresión confirmó los resultados de la matriz y mostró el potencial de estas moléculas como biomarcadores de la sTIB.

El panel seleccionado de miARN tiene el potencial de diagnosticar la TBI con precisión y permitir la estratificación de pacientes según la gravedad, lo que, a su vez, permite administrar el tratamiento más adecuado.

Ejemplo 2

Pacientes y recogida de muestras

Los participantes en el estudio fueron reclutados en el Centro de Investigación de Reconstrucción Quirúrgica y Microbiología (SRMRC) del Hospital Queen Elizabeth de Birmingham (Reino Unido) como parte del estudio SIR (The Steroids y Immunity from injury through to Rehabilitation) (Ref. Ética 11/SW/0177), el estudio ReCoS (The REpetitive COncussion in Sport) (Ref. Ética 11-0429AP28) y el estudio Golden Hour (Ref. Ética 13/WA/0399). Se recibió el consentimiento informado por escrito de los participantes o de un apoderado válido (familiar o un profesional no involucrado directamente en el estudio) antes de la inclusión en el estudio.

El segundo conjunto de datos de muestras utilizó muestras de suero de un total de 120 individuos agrupados en 4 categorías diferentes: HV (n=30), CE (n=30), mTIB+CE (n=30), sTIB CE (n=30) y se extrajo sangre en diferentes puntos temporales (T0-1h, T4-12h, T48-72h, 15 días) en cada paciente. Los voluntarios sanos dieron su consentimiento y se inscribieron en el estudio ReCoS. Los pacientes con lesiones CE tenían fracturas ortopédicas confirmadas radiográficamente, no tenían traumatismo craneoencefálico, ni infección, ni antecedentes de trastornos neurológicos o psiquiátricos y no tenían dependencia de alcohol o drogas. La mTIB con CE incluía a aquellos con un traumatismo craneoencefálico no penetrante y una puntuación en la Escala de Coma de Glasgow (GCS) >13. La sTIB con CE incluía pacientes con GCS<8.

Procesamiento de muestras

Las muestras de sangre se procesaron para aislar el suero en el plazo de 2 h posteriores a la extracción. La sangre completa se dejó reposar durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente antes de centrifugar a 3000 rpm durante 10 min a 4°C. El suero se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80°C hasta el análisis.

El aislamiento del ARN, el análisis de datos, los ensayos y el análisis estadístico se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 1.

Resultados

Ensayo TaqMan individual para biomarcadores candidatos de mTIB

Con el fin de validar los hallazgos del Ejemplo 1, se midió la expresión de los miARN seleccionados en 3 grupos separados e independientes (30 mTIB Ce , 30 sTIB CE, 30 CE) en diferentes puntos de tiempo (T0, T4-12h, T48-72h y 15 días desde la lesión) usando ensayos TaqMan individuales. Los resultados se compararon con 10 HV. Los cambios en número de veces se calcularon por el método 2-AACT, utilizando miR-331 y miR-223* como referencia.

Entre los biomarcadores candidatos de mTIB en ambos puntos temporales (miR-184, miR-502, miR-505, miR-301b, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p y miR-655), solo dos mostraron resultados interesantes y se expresaban de manera significativa y diferencial en las 3 categorías diferentes en comparación con HV. Específicamente, miR-425-5p y miR-502 mostraban una tendencia similar (Figura 3). Ambos eran regulados por disminución de manera significativa en mTIB+CE, miR-425-5p en T0-1h (p=0,01845) y en T4-12h (p=0,01962), respectivamente, en comparación con HV, o CE y sTIB CE (p<0,05), y miR-502 en T0-1h y en T4-12h en comparación con HV (p=0,02538 y p=0,03718 respectivamente), o C<e>y sTIB CE (p<0,01). Después de 48 h desde la lesión leve, miR425-5p y miR-502 volvían a sus niveles normales. La expresión de miR-425-5p y miR-502 también se encontró en el grupo CE a un nivel comparable al de HV, lo que sugiere que estos dos biomarcadores están regulados por disminución solo en pacientes con lesión cerebral. Además, ninguno de ellos mostró ninguna regulación por disiminución significativa en sTIB CE en comparación con HV en todos los puntos temporales. Por lo tanto, miR-425-5p y miR-502 podrían considerarse los biomarcadores candidatos más prometedores para el diagnóstico temprano y el seguimiento de la mTIB. Las AUC de estos biomarcadores en los puntos de tiempo más relevantes se muestran en la Tabla 4.

Ensayo TaqMan individual para biomarcadores candidatos de sTIB

MiR-21 y miR-335 se analizaron como posibles biomarcadores de sTIB ya que ambos aparecían regulados por aumento en ambos puntos temporales de sTIB CE en el cribado inicial. Mostraron que eran buenos candidatos en el segundo conjunto de datos de pacientes (Figura 4). Mir-21 era regulado por aumento de manera significativa en sTIB con CE en todos los puntos temporales después de 4 h desde la lesión con respecto a HV, CE y mTIB+CE (p=0,00306 en T4-12h, p=0,00844 en T48-72h y p=0,00077 a los 15 días). En el resto de las categorías no se encontraron diferencias significativas respecto a HV. MiR-335 mostró regulación por aumento en sTIB CE y en todos los puntos temporales en comparación con HV (p=0,00109 en T0-1h, p=0,00284 en T4-12h, p=0,00012 T48-72h y p=0,01284 a los 15 días) y mTIB+ CE, pero no se encontró regulación por aumento significativa en comparación con CE. Las AUC de estos biomarcadores también se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Área bajo la curva de los cuatro biomarcadores candidatos de TBI en diferentes puntos temporales.

Discusión

Este estudio validó el hallazgo anterior de que los cambios en los niveles de miARN se pueden aplicar al diagnóstico de la TBI y evaluar su gravedad. El estudio confirmó que los siguientes cuatro miARN se expresan diferencialmente en la TBI; miR-425-5p, miR 502, miR-21 y miR-335.

miR-425-5p mostró resultados significativos en T0 y T4-12h en mTIB+CE en comparación con HV y se obtuvieron resultados similares en todas las demás categorías. Su regulación por disminución vuelve a los niveles normales después de T48-72h, lo que confirma que miR-425-5p es un biomarcador candidato adecuado para el traumatismo leve.

También se confirmó que miR-502 se expresaba diferencialmente en mTIB+CE. La tendencia de este miARN era muy similar a la de miR-425-5p. Mostraba especificidad para pacientes con lesión cerebral y también podía usarse para realizar un seguimiento de la recuperación, ya que vuelve al valor normal después de T48-72h desde la lesión leve.

Después de sTIB, se observó que 2 miARN (miR-21, miR-335) se expresaban en todos los puntos temporales analizador y por lo tanto se confirmaron como posibles biomarcadores para sTIB. miR-21 y miR-335 eran regulados por aumento significativamente en comparación con los controles en sTIB CE. Por lo tanto, la sobreexpresión confirmó el potencial de estas moléculas como biomarcadores de la sTIB.

Ejemplo 3

Se recogieron muestras de saliva de atletas profesionales que sufrieron una conmoción cerebral después de 2-3 días de la lesión y se analizaron los microARN presentes en la saliva. A los atletas se les diagnosticó clínicamente mTIB.

Materiales y métodos

Se analizaron los microARN utilizando tecnología nCounter (nanoString Technologies®), que utiliza "códigos de barras" moleculares e imágenes microscópicas para detectar y contar hasta varios cientos de transcritos únicos en una reacción de hibridación. Cada código de barras codificado por colores está unido a una única sonda específica de la diana correspondiente a un microARN de interés.

El análisis se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante que incluye los siguientes pasos:

Hibridación:La tecnología emplea dos sondas de ~20 bases por microARN que se hibridan en solución. Una sonda informadora transporta la señal, mientras que una sonda de captura permite inmovilizar el complejo para la recogida de datos.

Purificación e inmovilización:Después de la hibridación, se elimina el exceso de sondas y los complejos sonda/destino se alinean e inmovilizan en el cartucho nCounter.Recogida de datos:Los cartuchos denmuestras se colocan en un instrumento analizador digital para la recogida de datos. Los códigos de color en la superficie del cartucho se cuentan y tabulan para cada molécula diana.

Resultados

La Tabla 4 a continuación es una lista de microARN que se encontró que se expresaban significativa y diferencialmente en atletas con conmoción cerebral en comparación con voluntarios sanos. La tabla muestra el cambio en la expresión de los microARN en los pacientes en comparación con el grupo de control. Los cambios en los pliegues se calcularon utilizando miR-23a-3p y miR-148b-3p como genes de referencia. expresados diferencialmente en atletas con conmoción cerebral en comparación con voluntarios sanos. La tabla muestra el cambio en la expresión de los microARN en los pacientes en comparación con el grupo de control. Los cambios se calcularon utilizando miR-23a-3p y miR-148b-3p como genes de referencia.

Tabla 5

Discusión

Este estudio muestra que los microARN presentes en la saliva son un indicador de conmoción cerebral/mTIB. Esto es importante porque la saliva se obtiene más fácilmente que la sangre y, por lo tanto, la detección de microARN salivales ofrece un medio rápido y conveniente para diagnosticar la TBI, particularmente en el campo.

Ejemplo 4

Materiales y métodos

Aprobación del estudio

Los participantes en el estudio fueron reclutados a través del Surgical Reconstruction y Microbiology Research Centre (SRMRC), con sede en el Queen Elizabeth Hospital de Birmingham (Reino Unido), como parte del estudio ReCoS (The REpetitive COncussion in Sport) (Ref. Ética 11-0429AP28). Se recibió el consentimiento informado por escrito de los participantes antes de su inclusión en el estudio.

Se analizaron muestras de saliva de un total de 20 sujetos (grupo de descubrimiento). En particular, se utilizaron muestras de saliva de 10 atletas conmocionados y 10 atletas no conmocionados para analizar proteínas, y de 6 atletas conmocionados y 6 atletas no conmocionados para analizar microARN. La saliva de los jugadores conmocionados se recogió entre 48 y 72 horas después de la conmoción cerebral, certificada por el equipo de atención mejorada presente de acuerdo con el protocolo actual para el deporte pertinente. A partir de estos datos, calculamos el tamaño muestral necesario para la validación en una cohorte más amplia de pacientes, con un alfa de 0,05 y una potencia de 0,9. El tamaño muestral requerido fue de 29 sujetos, basándose en el miARN con mayor variante identificado en el grupo de descubrimiento.

Se obtuvo un segundo conjunto de muestras (grupo de validación) de un total de 22 jugadores con conmoción cerebral y 10 jugadores sin conmoción cerebral. Las muestras se recogieron entre 2 y 5 días después de la conmoción cerebral.

Procesamiento de muestras

Se recogieron cinco ml de saliva en un tubo de plástico universal estéril de 50 ml que se mantuvo en hielo durante no más de 30 minutos. Luego las muestras se centrifugaron a 2600xg durante 15 minutos a 4°C. Luego la saliva se dividió en alícuotas y a cada ml de saliva se agregó inhibidor de ARNasa (500 unidades/mL) para el análisis de miARN.

Las muestras se almacenaron a -80°C hasta su uso.

Aislamiento de ARN

El ARN total se aisló a partir de 400 pl de saliva utilizando Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemania), según el Protocolo suplementario de Qiagen para la purificación de ARN (incluidos los ARN pequeños) a partir de suero o plasma. Finalmente, el ARN se eluyó en 200 pl de agua libre de ARNasa y posteriormente se precipitó añadiendo 20 pg de glucógeno, 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2,5 volúmenes de etanol 100% helado. Después de la incubación a -80 °C durante la noche, el ARN se centrifugó y se lavó dos veces en etanol al 75 % helado y se resuspendió en 7 pl de agua libre de ARNasa. El ARN se cuantificó mediante Nanodrop.

Perfilado de miARN circulante mediante tecnología NanoString

El perfil de expresión de los miARN de la saliva se realizó mediante la tecnología NanoString utilizando los kits de ensayo de expresión de miARN nCounter Human v3 (NanoString Technologies) en un nCounter FLEX (estación de preparación y analizador digital) (NanoString Technologies), según las instrucciones del fabricante. Se realizó un perfil de 6 atletas con conmoción cerebral y 6 atletas sin conmoción cerebral. Se utilizaron tres pl (aproximadamente 150 ng) de ARN total para la preparación de la muestra. El análisis de los datos se realizó mediante el software nSolver 2.6; los miARN utilizados como controles endógenos se seleccionaron mediante el método de normalización de la mediana global (GMN): se calculó la correlación de Pearson entre las medias de recuento de cada carril y los recuentos de cada miARN, identificando aquellos miARN cuya expresión estaba más próxima a la media de recuento del cartucho (miR-23a-3p, miR-29b-3p, miR-148b-3p). El análisis estadístico se realizó a través del Análisis de Significancia de Microarrays (SAM) (http://www.tm4.org), utilizando un valor p basado en 100 permutaciones; motor de imputación: K vecinos más cercanos (10 vecinos); tasa de falsos descubrimientos (FDR) < 0,05.

Ensayos TaqMan individuales

Se eligieron 21 miARN expresados de forma diferencial a partir de las matrices como posibles biomarcadores candidatos de conmoción cerebral. Estos candidatos se utilizaron para validar los datos en una cohorte ampliada de 22 atletas con conmoción cerebral y 10 atletas sin conmoción cerebral (grupo de validación). La saliva se recogió entre 2 y 5 días después de la lesión y se analizó mediante ensayos TaqMan individuales (AppliedBiosystems, Life Technologies™). Las muestras se extrajeron como se ha descrito anteriormente, se retrotranscribieron (AppliedBiosystems, Life Technologies™) y el análisis RT-qPCR se realizó en un sistema de detección de PCR en tiempo real Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad, CA, EE. UU.). Los cambios en los pliegues de expresión se calcularon mediante el método 2-ññCT utilizando miR-23a-3p y miR-148b-3p como genes de referencia.

Análisis estadístico

Se utilizó una prueba no paramétrica (prueba U de Mann-Whitney) para comparar el nivel de miARN en los dos grupos independientes. Se aceptó como significativo un valor p < 0,05.

Además, se utilizó un análisis Receiver Operating Characteristic (ROC) para calcular la sensibilidad y especificidad de cada biomarcador en el diagnóstico de la conmoción cerebral, expresada como área bajo la curva (AUC). Todos los análisis se realizaron en SPSS v.22 (IBM).

Resultados

Perfilado de nanocuerdas

Entre los 800 microARN analizados pornCounter NanoStringen la saliva de atletas conmocionados y no conmocionados, se seleccionaron 21 miARN que se expresaron de forma diferencial en las dos poblaciones: hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-20a-5p+ hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-135b-5p, hsamiR-142-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-199b-5p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-324-5p, hsamiR-424-5p, hsa-miR-652-3p. Los resultados mostraron una regulación positiva significativa para todos los miARN mencionados anteriormente.

Ensayo TaqMan individuales

Para validar estos hallazgos, posteriormente probamos la expresión de los 21 miARN seleccionados en un grupo separado e independiente, compuesto por 22 atletas con conmoción cerebral y 10 atletas sin conmoción cerebral. La saliva se recogió entre 2 y 5 días después de la lesión, mediante ensayos TaqMan individuales. Los cambios en los pliegues se calcularon mediante el método 2-ññCT (método 2 - delta delta CT), utilizando miR-23a-3p y miR-148b-3p como marcadores de referencia.

Entre estos biomarcadores candidatos para la conmoción cerebral, 5 se regularon positivamente de manera significativa en el grupo de validación. Específicamente, miR-27b-3p (p=0,02), let-7i-5p (p=0,001), miR-142-3p (p=0,008), miR-107 (p=0,03), miR-135b-5p (p=0,02) confirmaron los resultados obtenidos mediante el análisis de nanocuerdas (Figura 5). Estos resultados también se muestran en la Tabla 6, que muestra que el grupo de control tiene un cambio de pliegue de entre 0,6 y 1,4. Un cambio de pliegue por encima de este se considera indicativo de conmoción cerebral. El cambio de pliegue medio observado en los atletas conmocionados es un cambio de pliegue de aproximadamente 2,5 para cada uno de los 5 miARN identificados. Un valor de cambio de pliegue calculado mediante el método 2-ññCT de 2,0 o mayor para cualquiera de estos 5 biomarcadores identificados daría un diagnóstico de conmoción cerebral.

Tabla 6

Los gráficos de caja de la expresión relativa y las AUC de estos biomarcadores (0,755, 0,845, 0,791, 0,732 y 0,755 respectivamente) se muestran en la Figura 6 y en la Tabla 7.

Tabla 7: Área bajo la curva (AUC) de los miARN seleccionados como biomarcadores de conmoción cerebral

Discusión

En este estudio, examinamos la saliva, un fluido potencialmente novedoso para el examen de biomarcadores en el contexto de traumatismo craneoencefálico y conmoción cerebral (mTBI).

Se encontraron cinco miARN significativamente regulados positivamente solo en la saliva de la población conmocionada. Cada uno de miARN-27b-3p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-107 y miR-135b-5p se regularon positivamente de forma significativa en atletas con conmoción cerebral. Cada uno de estos cinco biomarcadores tiene la capacidad de distinguir a los atletas conmocionados de los atletas no conmocionados, especialmente después de 2 a 5 días de la lesión.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar y/o monitorizar lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI) en un sujeto, el método comprende determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra de saliva obtenida del sujeto, donde el al menos un miARN comprende miR-142-3p.

2. El método de la reivindicación 1, en donde un nivel regulado al alza del al menos un miARN es indicativo de mTIB.

3. El método de la reivindicación 1, en donde se diagnostica que el sujeto tiene una mTIB si el nivel del al menos un miARN está por encima de un umbral predeterminado o aumentado en relación con un control, preferentemente en donde el umbral predeterminado es equivalente a un cambio de pliegue de 2 o más en el método 2-delta delta CT (2-AACT).

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el método comprende determinar un nivel de al menos dos miARN en una muestra de saliva obtenida del sujeto, preferentemente en donde los al menos dos miARN se seleccionan de:

a. miR-142-3p y let-7i-5p;

b. miR-142-3p y miR-107;

c. miR-142-3p y miR-135b-5p; o

d. miR-142-3p y miR-27b-3p.

5. El método de la reivindicación 4, en donde un nivel regulado al alza de al menos dos miARN es indicativo de mTIB.

6. El método de la reivindicación 4, en donde se diagnostica que el sujeto tiene mTIB si el nivel de los al menos dos miARNs está por encima de un umbral predeterminado o aumentado en relación con un control.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el umbral predeterminado equivale a un cambio de pliegue de 1,5 o más en el método 2-delta delta CT (2-AACT).

8. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde el método comprende determinar un nivel de tres, cuatro o más miARN en una muestra de saliva obtenida del sujeto.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el método comprende determinar un nivel de los miARN miR-142-3p, miR-27b-3p, let-7i-5p, miR-107 y miR-135b-5p.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la muestra de saliva se obtiene: a. hasta 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5 o 2 días desde la lesión;

b. no más de 72, 48, 36, 24, 12, 6, 4, 2 o 1 horas después de la lesión;

c. al menos 24 horas desde la lesión;

d. hasta 15 días después de la lesión;

e. entre 24 horas y 15 días después de la lesión;

f. entre 24 horas y 10 días después de la lesión;

g. entre 24 horas y 7 días después de la lesión; o

h. 2 a 5 días después de la lesión.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el método comprende, además, determinar un nivel de uno o más miARN adicionales seleccionados de let-7c-5p, let-7i-5p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, y miR-424-5p, miR-30a-5p, miR-107, miR-135b-5p, miR-199b-5p, miR-324-5p, o miR-652-3p. 12. Uso de un sistema de detección en el método para diagnosticar y/o monitorizar mTIB en el método de la reivindicación 1, que comprende un elemento sensor que comprende un sustrato funcionalizado con una sonda específica para miR-142-3p, en donde la sonda comprende un ácido nucleico que tiene al menos un 70% de identidad con una secuencia que es el complemento de la secuencia de miR-142-3p, preferentemente en donde la sonda comprende un ácido nucleico que tiene al menos un 70% de identidad con una secuencia que es el complemento de SEQ ID NO: 35, y

- un dispositivo de detección capaz de detectar la unión de un miARN diana a la sonda.

13. Uso del sistema de detección según la reivindicación 12, que comprende, además, medios para determinar si el miARN diana está regulado al alza.

14. Un fármaco neuroprotector o un sedante para su uso en un método de tratamiento de mTIB en un sujeto, en donde se ha identificado que dicho sujeto tiene un mTIB mediante la determinación del nivel de miR-142-3p en una muestra de saliva obtenida del sujeto.