ES3035714T3 - Edb targeting il-12 compositions - Google Patents

Edb targeting il-12 compositions

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ES3035714T3
ES3035714T3 ES19702649T ES19702649T ES3035714T3 ES 3035714 T3 ES3035714 T3 ES 3035714T3 ES 19702649 T ES19702649 T ES 19702649T ES 19702649 T ES19702649 T ES 19702649T ES 3035714 T3 ES3035714 T3 ES 3035714T3
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ES
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amino acid
protein
linker
seq
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Alessandra Villa
Mattia Matasci
Tiziano Ongaro
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Philogen SpA
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Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden una proteína IL-12 que tiene una primera y una segunda subunidad, un dominio de unión a EDB y un conector entre la proteína IL-12 y el dominio de unión a EDB. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de IL-12 dirigidas a EDB
Campo de la invención
La presente solicitud se refiere a composiciones que comprenden una citocina, un dominio de unión a antígeno y un conector mejorado.
Antecedentes
La IL-12 es una citocina heterodimérica que comprende dos subunidades unidas por disulfuro, p35 y p40. La IL-12 estimula la producción de IFNy por parte de linfocitos T y linfocitos citolíticos naturales, y también induce la diferenciación de linfocitos auxiliares Th1. La IL-12 es un mediador clave de la inmunidad innata y celular, con potencial antineoplásico y antimetastásico.
Como muchas otras citocinas, sin embargo, la administración de IL-12 se asocia a una toxicidad grave (Caret al.,1999), incluso a dosis tan bajas como 1 |jg por kg y día, lo que desincentiva su desarrollo como fármaco antineoplásico.
Sumario de la invención
La invención se define por las características de las reivindicaciones independientes.
La presente solicitud se refiere a composiciones y métodos mejorados que pueden usarse para tratar eficazmente diversas enfermedades y trastornos asociados con la expresión de EDB de fibronectina.
En particular, la presente solicitud se refiere a dominios de unión a EDB vinculados a IL-12 que tienen propiedades terapéuticas preferidas con respecto a las construcciones recombinantes de IL-12 conocidas. Sorprendentemente, las composiciones descritas en el presente documento son superiores a las construcciones de IL-12 previamente conocidas diseñadas para dirigirse a EDB y resolver el problema conocido desde hace tiempo de administrar IL-12 de forma segura y eficaz para el tratamiento dirigido de una enfermedad o un trastorno, p. ej., un cáncer. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento proporcionan un potencial terapéutico mejorado de la IL-12 mediante la mejora de uno o más de su perfil de biodistribución, su tolerabilidad, su ventana terapéutica y su eficacia para llegar al lugar de la enfermedad. Sorprendentemente, las construcciones descritas en el presente documento también presentan una capacidad de fabricación superior.
Sigue siendo necesario en la técnica un perfeccionamiento de la penetración tisular de los tratamientos con inmunocitocinas. También existe en la técnica la necesidad de mejorar la fabricación de los tratamientos con inmunocitocinas, ya que se trata de proteínas muy complejas y difíciles de producir.
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar versiones mejoradas de inmunocitocinas, p. ej., de opciones terapéuticas proteicas que comprenden una IL-12 y un dominio de unión a EDB de fibronectina. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar inmunocitocinas que presenten una producción más eficaz. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar inmunocitocinas con una mejora del rendimientoin vivo,p. ej., unión a la diana o penetración en el tejido.
La presente solicitud se refiere a composiciones que comprenden un dominio de unión a antígeno y una citocina que tiene tales propiedades superiores. La invención y las ventajas generales de sus características, incluidos los conectores adecuados, se analizan en detalle más adelante.
Según un aspecto de la presente solicitud, se proporciona una composición que comprende
a. una proteína IL-12 que comprende una primera subunidad de IL-12 y una segunda subunidad proteica de IL-12;
b. un péptido o una proteína que comprende un dominio de unión a EDB; y
c. un conector entre la proteína IL-12 y el péptido o la proteína que comprende el dominio de unión a EDB. Preferentemente, las dos subunidades de la IL-12 están unidas entre sí por un conector determinado, según el esquema siguiente (orientación N->C): p40-conector 1-p35.
Preferentemente, la IL-12 es IL-12 humana. Según algunas realizaciones divulgadas, el diacuerpo monocatenario se une a una isoforma de corte y empalme de la fibronectina. Preferentemente, dicho extradominio B (ED-B) de la fibronectina es el extradominio B de la fibronectina humana (UniProt: P02751).
En algunas realizaciones divulgadas, el conector entre la proteína IL-12 y el péptido o la proteína que comprende el dominio de unión a EDB comprende GSADGGSSAGGS<d>A<g>(SEQ ID<n>O: 4).
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende el dominio de unión a EDB comprende un scFv. En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende el dominio de unión a EDB es un diacuerpo. En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende el dominio de unión a EDB es un diacuerpo monocatenario.
En algunas realizaciones divulgadas, la primera subunidad de la proteína IL-12 es una p40 y la segunda subunidad es una p35.
En algunas realizaciones divulgadas, la primera subunidad de la proteína IL-12 es una p40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma, en donde la proteína IL-12 puede activar un receptor de IL-12.
En algunas realizaciones divulgadas, la segunda subunidad de la proteína IL-12 es una p35 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma, en donde la proteína IL-12 puede activar un receptor de IL-12.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende un dominio de unión a EDB es monoespecífico o biespecífico.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende un dominio de unión a EDB se une al extradominio B (ED-B) de la fibronectina.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende un dominio de unión a EDB comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con una o más de las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 28 a 33.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende un dominio de unión a EDB comprende cada una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 28 a 33.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende un dominio de unión a EDB comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con una o más de las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 7 y 5.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende un dominio de unión a EDB comprende cada una de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 7 y 5.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende un dominio de unión a EDB comprende al menos uno de
a) el par de secuencias según la descripción anterior, con la condición de que al menos uno de los dominios tenga una identidad de secuencia de >80 % con respecto a la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 5, respectivamente y/o b) el par de secuencias según la descripción anterior, con la condición de que al menos uno de los dominios tenga hasta 10 sustituciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 5, respectivamente, manteniendo a la vez su capacidad de unirse al extradominio B (ED-B) de la fibronectina.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína comprende al menos una sustitución de aminoácidos donde la al menos una sustitución de aminoácidos es una sustitución de aminoácidos conservadora.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende un dominio de unión a EDB
• tiene una afinidad de unión diana de >50 % al extradominio B (ED-B) de la fibronectina, en comparación con uno de los péptidos o proteínas que comprenden un dominio de unión anti-EDB como se ha descrito anteriormente y/o
• compite por la unión al extradominio B (ED-B) de la fibronectina con uno de los péptidos o proteínas que comprenden un dominio de unión a EDB como se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende un dominio de unión a EDB comprende dos dominios L19 VH y dos dominios L19 V<l>.
En algunas realizaciones divulgadas, los dos dominios L19 VH tienen la misma secuencia de aminoácidos; • los dos dominios L19 VH tienen secuencias de aminoácidos diferentes;
• los dos dominios L19 VL tienen la misma secuencia de aminoácidos; o
• los dos dominios L19 VL tienen secuencias de aminoácidos diferentes.
En algunas realizaciones divulgadas, el péptido o la proteína que comprende un dominio de unión a EDB comprende un dominio L19 VH y un dominio L19 VL.
En algunas realizaciones divulgadas, la composición comprende:
• un dominio p40 unido a un dominio p35 por un primer conector (también denominado "conector 1");
• un primer dominio L19 VH unido al dominio p35 por un conector SAD;
• un primer dominio L19 VL unido al primer dominio L19 VH por un tercer conector (también denominado "conector 3");
• un segundo dominio L19 VH unido al primer dominio L19 VL por un cuarto conector (también denominado "conector 4");
• un segundo dominio L19 VL unido al segundo dominio L19 VH por un quinto conector (también denominado "conector 5").
En algunas realizaciones divulgadas, el tercer conector y el quinto conector comprenden la misma secuencia de aminoácidos, y/o pueden estar sustituidos entre sí.
En algunas realizaciones divulgadas, el dominio p40 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones divulgadas, el dominio p35 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones divulgadas, el primer conector ("conector 1") es un conector GS.
En algunas realizaciones divulgadas, el primer conector comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones divulgadas, el primer dominio L19 VH, el segundo dominio L19 VH o ambos comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con al menos una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 28-30.
En algunas realizaciones divulgadas, el primer dominio L19 VL, el segundo dominio L19 VL o ambos comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con al menos una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 31-33.
En algunas realizaciones divulgadas, el primer dominio L19 VH, el segundo dominio L19 VH o ambos comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones divulgadas, el primer dominio L19 VL, el segundo dominio L19 VL o ambos comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5.
En algunas realizaciones divulgadas, el conector SAD comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones divulgadas, el tercer conector ("conector 3") es un conector GS.
En algunas realizaciones divulgadas, el tercer conector comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.
En algunas realizaciones divulgadas, el quinto conector ("conector 5") es un conector GS.
En algunas realizaciones divulgadas, el quinto conector comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.
En algunas realizaciones divulgadas, el tercer conector ("conector 3") y el quinto conector ("conector 5") comprenden la misma secuencia de aminoácidos, y/o pueden estar sustituidos entre sí.
En algunas realizaciones divulgadas, el cuarto conector ("conector 4") es un conector GS.
En algunas realizaciones divulgadas, el cuarto conector comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones divulgadas, la composición comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones divulgadas, la composición consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende
a. una proteína IL-12 humana que comprende una primera subunidad de IL-12 y una segunda subunidad proteica de IL-12;
b. una proteína que comprende un dominio de unión a EDB; y
c. un conector entre la proteína IL-12 y la proteína que comprende el dominio de unión a EDB
en donde la composición comprende:
• un dominio p40 unido a un dominio p35 por un primer conector;
• un primer dominio L19 VH unido al dominio p35 por un conector SAD;
• un primer dominio L19 VL unido al primer dominio L19 VH por un tercer conector;
• un segundo dominio L19 VH unido al primer dominio L19 VL por un cuarto conector;
• un segundo dominio L19 VL unido al segundo dominio L19 VH por un quinto conector.
y en donde la composición tiene una secuencia de longitud completa según la SEQ ID NO: 16.
Según otro aspecto de la presente invención, dicha composición se proporciona para usar en el tratamiento de un sujeto humano o animal
• al que se ha diagnosticado,
• que padece o
• que está en riesgo de
contraer una enfermedad neoplásica, o para la prevención de dicha afección.
En una realización de la presente invención, la enfermedad neoplásica se selecciona del grupo que consiste en melanoma maligno, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), carcinoma de células renales, carcinoma urotelial, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello (CECC), cáncer colorrectal metastásico con alta inestabilidad de microsatélites (A-IMS) o con alteración de la vía reparadora del ADN (AVR), cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, carcinoma epidermoide de la piel, cáncer cervicouterino y linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG).
Según otro aspecto de la presente invención, dicha composición se proporciona para usar en la inhibición de la angiogénesis en un sujeto humano o animal.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende dicha composición de acuerdo con la presente invención y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una combinación que comprende (a) dicha composición de acuerdo con la presente invención o dicha composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención y (b) uno o más compuestos terapéuticamente activos.
Según otro aspecto de la presente invención, dicha composición de acuerdo con la presente invención, dicha composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención o dicha combinación de acuerdo con la presente invención se proporcionan para usar en el tratamiento o la prevención de un trastorno o una afección asociados con la expresión o sobreexpresión de ED-B de fibronectina, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de dicha composición de acuerdo con la presente invención, dicha composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención o dicha combinación de acuerdo con la presente invención.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un kit terapéutico de piezas, que comprende:
a) dicha composición de acuerdo con la presente invención, dicha composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención o dicha combinación de acuerdo con la presente invención,
b) un aparato para administrar dicha composición, composición farmacéutica o combinación, y
c) instrucciones de uso.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1A-1B: Resultados de los experimentos de expresión de proteínas. Véase más abajo el material y los métodos.
Fig. 1A: Un conector de 15 unidades que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 (apodado "SAD" en el presente documento) muestra con diferencia los mejores rendimientos de producción de todas las variantes (también llamadas "clones" en el presente documento). El rendimiento es casi un 100 % mejor que la segunda mejor variante, DDS.
Las dos secuencias de la línea AKKAS son las SEQ ID NO: 9 y 18, las dos secuencias de la línea AP7 son las SEQ ID NO: 15 y 19, las dos secuencias de la línea DDS son las SEQ ID NO: 10 y 20, las dos secuencias de la línea AP6 son las SEQ ID NO: 14 y 21, las dos secuencias de la línea G4S son las Se Q ID NO: 11 y 22, las dos secuencias de la línea SES son las SEQ ID NO: 12 y 23, las dos secuencias de la línea alpha3 son las SEQ ID NO: 13 y 24, y las dos secuencias de la línea SAD son las SEQ ID NO: 4 y 25.
Hay restos N-terminales y C-terminales (o nucleótidos 5' o 3') en la fig. 1 que se muestran en gris. No pertenecen a la divulgación de la presente solicitud para la que es necesaria una búsqueda. Simplemente muestran el armazón en el que pueden incluirse los conectores respectivos.
Fig. 1B: La caracterización por SDS-PAGE mostró un peso molecular de aproximadamente 120 kDa para todas las variantes.
Fig. 2: Experimentos de ELISA. Todas las variantes se unen al dominio 7B89 de la fibronectina humana, tanto a la concentración de 10 pg/ml como a la de 1 pg/ml.
Fig. 3: Experimentos Biacore. Todas las variantes muestran un comportamiento de unión similar al dominio 7B89 de la fibronectina humana.
Fig. 4: Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Todas las variantes mostraron un perfil de agregación similar, con el pico principal a 13 ml correspondiente a la inmunocitocina monomérica y el pico más pequeño a 10 ml correspondiente a los agregados.
Fig. 5: Experimentos de tinción con inmunofluorescencia. Todas las variantes tiñeron específicamente la vasculatura de muestras congeladas de teratocarcinoma F9 singénico en comparación con el control negativo.
Fig. 6: Direccionamiento tumoralin vivo.Todas las variantes y un control positivo se radioyodaron con 125I y se inyectaron (4-9 pg de proteína/animal) en ratones inmunocompetentes portadores de un teratocarcinoma murino F9 implantado s.c. La radiactividad contada 24 horas después de la inyección mostró una acumulación en el tumor para todas las variantes. Sin embargo, la variante "SAD" mostró una acumulación superior en el tumor en comparación con los otros siete clones (~2,9 % DI/g (= dosis inyectada por gramo de tejido) frente al segundo mejor, que es (G4S)3 y muestra ~2,4 % DI/g).
Figs. 7 y 8: Formatos ilustrativos de inmunocitocinas que utilizan IL-12 y un anticuerpo antifibronectina.
Fig. 9: Análisis mediante SEC de las diferentes proteínas de fusión (A) huIL-12L19L19 "SAD" Lote-A (B) huIL-12L19L19 "SAD" Lote-B (C) huIL-12L19L19 "Antiguo" Lote A (D) huIL-12L19L19 "Antiguo" Lote B.
Fig. 10: Experimento Biacore. La variante "SAD" mostró una mejor afinidad aparente en comparación con la variante con el conector "antiguo" por el dominio 7B89 de la fibronectina (3,8 nM frente a 6,7 nM). Este sorprendente resultado es inesperado, ya que la variación del conector puede afectar a la estabilidad de la proteína, pero normalmente no a la afinidad con su diana.
Fig. 11: Experimento de direccionamiento tumoralin vivo.Las variantes "SAD" y "antigua" se radioyodaron con 125I y se inyectaron (10-11 pg de proteína/animal) en ratones inmunocompetentes portadores de un teratocarcinoma murino F9 implantado s.c. La variante "SAD" mostró una mejor capacidad de direccionamiento tumoral en comparación con la variante de conector "antigua".
Descripción detallada
Definiciones
Un "anticuerpo" se refiere a una molécula de la familia de las inmunoglobulinas que comprende una unidad estructural tetramérica. Cada tetrámero se compone de dos parejas idénticas de cadenas polipeptídicas, cada una con una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kD), conectadas mediante un enlace disulfuro. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante k, A, a, y, 6, £ y |j, así como los múltiples genes de regiones variables de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como k o A. Las cadenas pesadas se clasifican como y, j , a, 6 o £, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo/clase (p. ej., IgG, IgM, IgA, IgD e IgE) o de cualquier subclase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2).
Las cadenas tanto ligeras como pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se utilizan de manera estructural y funcional. El extremo N de cada cadena define una región o un dominio variable (V) de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. Las expresiones cadena ligera variable (Vl) y cadena pesada variable (Vh) se refieren a estas regiones de cadenas ligeras y pesadas respectivamente. El emparejamiento de un Vh y un Vl entre sí forma un único sitio de unión a antígeno. Además de las regiones V, tanto las cadenas pesadas como las cadenas ligeras contienen una región o dominio constante (C). Una forma secretada de la región C de inmunoglobulina se compone de tres dominios C, CH1, CH2, CH3, opcionalmente CH4 (C j) y una región bisagra. Una forma unida a la membrana de la región C de inmunoglobulina también tiene dominios de membrana e intracelulares. Cada cadena ligera tiene un V<l>en el extremo N seguido de un dominio constante (C) en su otro extremo. Los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes, tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor de Fc, unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de región constante aumenta a medida que se encuentran más distantes del sitio de unión a antígeno o del extremo amino del anticuerpo. El extremo N es una región variable y el extremo C es una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden, de hecho, los dominios carboxilo terminales de la cadena pesada y ligera, respectivamente. El VL se alinea con el VH y el CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada. Como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo" abarca las estructuras convencionales de anticuerpos y las variaciones de anticuerpos. Por lo tanto, dentro del alcance de este concepto se encuentran los anticuerpos de longitud completa, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos de los mismos.
Los anticuerpos existen como cadenas de inmunoglobulina intactas o en forma de varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. La expresión "fragmento de anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de interaccionar (p. ej., por unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) con un epítopo de un antígeno. Por lo tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región de bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab' que en sí mismo es una cadena ligera unida a Vh-Ch1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 se puede reducir en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de bisagra, convirtiendo de este modo el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región de bisagra. Paul,Fundamental Immunology3.a ed. (1993). Aunque diversos fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la técnica apreciará que dichos fragmentos se pueden sintetizarde novobien químicamente o usando metodología de ADN recombinante. Como se utiliza en el presente documento, un "fragmento de anticuerpo" se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo, ya sea producidos mediante la modificación de anticuerpos completos o sintetizadosde novomediante metodologías de ADN recombinante, que conservan la especificidad de unión y la actividad funcional. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios (ScFv), Fab, Fab', Fd (dominios Vh y CH1), dAb (Vh y una CDR aislada); diacuerpos y diacuerpos monocatenarios; y versiones multiméricas de estos fragmentos (p. ej., F(ab')2,) con la misma especificidad de unión. Los fragmentos de anticuerpos también pueden incorporarse a las proteínas con injertos de citocinas para conseguir la especificidad y actividad de unión proporcionadas en la presente divulgación.
Un dominio "Fab" como se utiliza en el presente documento comprende un dominio variable de cadena pesada, un dominio CH1 de región constante, un dominio variable de cadena ligera y un dominio CL de región constante de cadena ligera. La interacción de los dominios está estabilizada por un enlace disulfuro entre los dominios CH1 y CL. En algunas realizaciones divulgadas, los dominios de la cadena pesada del Fab están en el orden, del extremo N al extremo C, VH-CH y los dominios de cadena ligera de un Fab están en el orden, del extremo N al extremo C, VL-CL. En algunas realizaciones divulgadas, los dominios de la cadena pesada del Fab están en el orden, del extremo N al extremo C, CH-VH y los dominios de cadena ligera del Fab están en el orden CL-VL. Aunque históricamente los Fab se identificaban mediante digestión con papaína de una inmunoglobulina intacta, en el contexto de la presente divulgación, un "Fab" se produce normalmente de forma recombinante por cualquier método. Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión a antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión a antígeno.
"Dominios determinantes de la complementariedad" o "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR") se refieren indistintamente a las regiones hipervariables de Vl y Vh. Las CDR son el sitio de unión a la proteína diana de las cadenas de anticuerpos que albergan especificidad para dicha proteína diana. Hay tres CDR (CDR1-3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N) en cada V<l>o V<h>humano, que constituyen aproximadamente el 15-20 % de los dominios variables. Las CDR son estructuralmente complementarias del epítopo de la proteína diana y, por tanto, son responsables directas de la especificidad de unión. Los tramos restantes del V<L>o V<H>, las denominadas regiones estructurales (FR), presentan menos variación en la secuencia de aminoácidos (Kuby,Immunology,4.a ed., capítulo 4. W. H. Freeman & Co., Nueva York, 2000).
Las posiciones de las CDR y las regiones estructurales pueden determinarse utilizando diversas definiciones bien conocidas en la técnica, p. ej., Kabat, Chothia, base de datos internacional ImMunoGeneTics (IMGT) y AbM (véanse, p. ej., Johnsonet al., Nucleic Acids Res.,29:205-206 (2001); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothiaet al.,Nature, 342:877-883 (1989); Chothiaet al.,J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikaniet al.,J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)). Las definiciones de los sitios de combinación de antígenos también se describen en los siguientes: Ruizet al., Nucleic Acids Res.,28:219-221 (2000); y Lefranc, M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209 (2001); MacCallumet al., J. Mol. Biol.,262:732-745 (1996); y Martinet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86:9268-9272 (1989); Martinet al., Methods Enzymol.,203:121-153 (1991); y Reeset al.,en Sternberg M.J.E. (ed.),Protein Structure Prediction,Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996).
Según Kabat, los restos de aminoácidos de CDR en el Vh se numeran 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3); y los restos de aminoácidos de CDR en el Vl se numeran 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3). Según Chothia, los restos de aminoácidos de CDR en el Vh se numeran 26-32 (Hc DR1), 52-56 (Hc DR2) y 95-102 (HCDR3); y los restos de aminoácidos en Vl se numeran 26-32 (LCDR1), 50-52 (Lc Dr 2) y 91-96 (lCd R3). Al combinar las definiciones de las CDR de Kabat y Chothia, las CDR consisten en los restos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), y 95-102. (HCDR3) en el VH humano y los restos de aminoácidos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), y 89-97 (LCDR3) en el VL humano.
Una "cadena ligera variable de anticuerpo" o una "cadena pesada variable de anticuerpo" como se utilizan en el presente documento se refieren a un polipéptido que comprende el V<l>o el V<h>, respectivamente. El V<l>endógeno está codificado por los segmentos génicos V (variable) y J (de unión), y el V<h>endógeno por V, D (diversidad) y J. Cada una de V<l>o V<h>incluye las CDR así como las regiones estructurales (FR). Las expresiones "región variable" o "región V" se refieren indistintamente a una cadena pesada o ligera que comprende FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Una región V puede ser natural, recombinante o sintética. En esta solicitud, las cadenas ligeras y/o pesadas de anticuerpos pueden, en ocasiones, denominarse colectivamente "cadenas de anticuerpos". Como se proporciona y describe en más detalle en el presente documento, una "cadena ligera variable de anticuerpo" o una "cadena pesada variable de anticuerpo" y/o una "región variable" y/o una "cadena de anticuerpo" comprende opcionalmente una secuencia polipeptídica de citocina injertada en una CDR.
La parte C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina como se ha divulgado en el presente documento, que comprende, p. ej., los dominios CH2 y CH3, es el dominio "Fc". Una "región Fc" como se utiliza en el presente documento se refiere a la región constante de un anticuerpo, excluyendo el dominio de inmunoglobulina de la primera región constante (CH1). Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante de IgA, IgD e IgG, y los tres últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM, así como la bisagra flexible N-terminal con respecto a estos dominios. Para IgA e IgM Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, Fc comprende los dominios C<y>2 y C<y>3 de inmunoglobulina y la bisagra entre C<y>1 y C<y>. Se entiende en la técnica que los límites de la región Fc pueden variar, sin embargo, generalmente se define que la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana comprende los restos C226 o P230 en su extremo carboxilo, utilizando la numeración según el índice EU como en Kabatet al.(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.). La "región Fc" puede referirse a esta región de forma aislada o a esta región en el contexto de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La "región Fc" incluye las variantes alélicas naturales de la región Fc, p. ej., en la región CH2 y CH3, incluyendo, p. ej., modificaciones que modulan la función de los efectores. Las regiones Fc también incluyen variantes que no producen alteraciones de la función biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse uno o más aminoácidos del extremo N o C de la región Fc de una inmunoglobulina sin una pérdida sustancial de función biológica. Por ejemplo, en determinadas realizaciones divulgadas se modifica, sustituye o elimina una lisina C-terminal. En realizaciones particulares divulgadas, se alteran o eliminan uno o más restos C-terminales en la región Fc. En determinadas realizaciones divulgadas se suprimen uno o más restos C-terminales en el Fc (p. ej., una lisina terminal). En algunas otras realizaciones divulgadas, se sustituyen uno o más restos C-terminales en el Fc con un aminoácido alternativo (p. ej., se sustituye una lisina terminal). Dichas variantes se seleccionan según varias reglas generales conocidas en la técnica para que tengan un efecto mínimo en la actividad (véase, p. ej., Bowie,et al., Science247:306-1310, 1990). El dominio Fc es la parte de la inmunoglobulina (Ig) reconocida por los receptores celulares, tales como el FcR, C1, y al que se une la proteína activadora del complemento. La región bisagra inferior, que está codificada en la parte 5' del exón CH2, proporciona flexibilidad dentro del anticuerpo para unirse a los receptores FcR.
Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una parte de la misma, está alterada, sustituida o intercambiada de forma que el sitio de unión al antígeno (región variable) está unida a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que transmite nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, p. ej., una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento y fármaco; o (b) la región variable, o una parte de la misma, está alterada, sustituida o intercambiada por una región variable que tiene una especificidad de antígeno diferente o alterada.
Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que conserva la reactividad (p. ej., especificidad de unión, actividad) de un anticuerpo no humano y es al mismo tiempo menos inmunogénico en seres humanos. Esto se puede lograr, por ejemplo, conservando las regiones CDR no humanas y sustituyendo las partes restantes de un anticuerpo por homólogos humanos. Véase, p. ej., Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81:6851-6855 (1984); Morrison y Oi,Adv. Immunol.,44:65-92 (1988); Verhoeyenet al., Science,239:1534-1536 (1988); Padlan,Molec. Immun,28:489-498 (1991); Padlan,Molec. Immun.,31(3): 169-217 (1994).
Un "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones estructurales como las CDR proceden de secuencias de origen humano. Por otro lado, si un anticuerpo contiene una región constante, la región constante también procede de dichas secuencias humanas, p. ej., secuencias de la línea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana o anticuerpos que contengan secuencias estructurales de consenso obtenidas mediante el análisis de secuencias estructurales humanas, por ejemplo, como se describe en Knappiket al., J. Mol. Biol.296:57-86, 2000). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (p. ej., mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específicain vitroo mediante mutación somáticain vivo, o una sustitución conservadora para promover la estabilidad o la fabricación).
El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o una proteína, indica que el ácido nucleico o la proteína están prácticamente exentos de otros componentes celulares con los que están asociados en su estado natural. Se encuentra preferentemente en estado homogéneo. Puede estar en solución seca o acuosa. La pureza y la homogeneidad se suelen determinar usando técnicas de química analítica, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida o la cromatografía líquida de alto rendimiento. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está prácticamente purificada. En particular, un gen aislado se separa de los marcos abiertos de lectura que flanquean el gen y que codifican una proteína distinta del gen de interés. El término "purificado" indica que un ácido nucleico o una proteína da lugar prácticamente a una banda en un gel electroforético. En particular, significa que el ácido nucleico o la proteína es al menos 85 % puro, más preferentemente al menos 95 % puro y lo más preferentemente al menos 99 % puro.
La expresión "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y a polímeros de los mismos en forma mono o bicatenaria. A menos que esté específicamente limitado, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservativa de la misma (p. ej., sustituciones de codones redundantes), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codones redundantes se pueden conseguir mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con restos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzeret al., Nucleic Acid Res.19:5081 (1991); Ohtsukaet al., J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); y Rossoliniet al., Mol. Cell. Probes8:91-98 (1994)).
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen sintético. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "péptido o proteína que comprende un dominio de unión a EDB" se refiere a un péptido o proteína que, en su totalidad o en virtud de una parte/fragmento de la misma, se une a EDB, es decir, fibronectina que contiene dominio extra-B.
En general, un péptido puede ser, por ejemplo, una molécula monomérica que tiene una longitud de >3 restos de aminoácidos y <50 restos de aminoácidos (por lo tanto, un oligopéptido o polipéptido), mientras que una proteína puede ser, por ejemplo, una molécula monomérica o bi- o polimérica con una o más proteínas, teniendo cada cadena una longitud de >50 restos de aminoácidos.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintético, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que actúan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, p. ej., hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica que la de un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, p. ej., homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (p. ej., norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que actúan de manera similar a un aminoácido de origen natural.
"Variantes modificadas de forma conservadora" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos concretas, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o, si el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias prácticamente idénticas. A causa de la redundancia del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina se especifica mediante un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico se denominan "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido también describe todas y cada una de las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para triptófano) se puede modificar con el fin de conseguir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia proteica que alteren, añadan o eliminen un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos de la secuencia codificada son una "variante modificada de forma conservadora" donde la alteración da lugar a la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas de forma conservadora se suman a, y no excluyen, las variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos. Cada uno de los ocho grupos siguientes contiene aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), glutamina (Q); 4) Arginina (R), lisina (K); 5) Isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); 6) Fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W); 7) Serina (S), treonina (T); y 8) Cisteína (C), metionina (M) (véase, p. ej., Creighton,Proteins(1984)).
En este contexto, una "sustitución de aminoácidos conservadora", como se utiliza en el presente documento, tiene un efecto menor sobre la función de los anticuerpos que una sustitución no conservadora. Aunque hay muchas formas de clasificar los aminoácidos, a menudo se clasifican en seis grupos principales en función de su estructura y de las características químicas generales de sus grupos R.
En algunas realizaciones divulgadas, una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Por ejemplo, se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con
cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina),
cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico),
cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y
cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
También pueden producirse otras sustituciones conservadas de aminoácidos en familias de cadenas laterales de aminoácidos, tal como cuando se sustituye un ácido aspártico por asparagina para modificar la carga de un péptido. Los cambios conservadores pueden incluir además la sustitución de aminoácidos no naturales químicamente homólogos (es decir, un aminoácido hidrófobo sintético no natural en lugar de leucina, un aminoácido aromático sintético no natural en lugar de triptófano).
El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en donde la parte de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (p. ej., un polipéptido), que no comprende ni adiciones ni supresiones, para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se encuentran la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje específico de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%o 99%de identidad de secuencia en una región específica o, cuando no se especifica, sobre toda la secuencia de una secuencia de referencia), cuando se compara y alinea para correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada como medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. La divulgación proporciona polipéptidos o polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente, como se ilustra en el presente documento. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos aproximadamente 15, 25 o 50 nucleótidos de longitud o, más preferentemente, en una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos de longitud, o en toda la longitud de la secuencia de referencia. Con respecto a las secuencias de aminoácidos, puede existir identidad o identidad sustancial en una región que tenga al menos 5, 10, 15 o 20 aminoácidos de longitud, opcionalmente al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 50, 75 o 100 aminoácidos de longitud, opcionalmente al menos aproximadamente 150, 200 o 250 aminoácidos de longitud, o sobre toda la longitud de la secuencia de referencia. Con respecto a secuencias de aminoácidos más cortas, p. ej., secuencias de aminoácidos de 20 o menos aminoácidos, existe una identidad sustancial cuando uno o dos restos de aminoácidos se sustituyen de forma conservadora, según las sustituciones conservadoras que se definen en el presente documento.
Los términos "sujeto", "paciente" e "individuo" se refieren indistintamente a un mamífero, por ejemplo, un ser humano o un mamífero primate no humano. El mamífero también puede ser un mamífero de laboratorio, p. ej., ratón, rata, conejo, hámster. En algunas realizaciones divulgadas, el mamífero puede ser un mamífero agrícola (p. ej., equino, ovino, bovino, porcino, camélido) o mamífero doméstico (p. ej., canino, felino).
Como se utilizan en el presente documento, las expresiones "tratar", "que trata" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno se refieren, en algunas realizaciones divulgadas, a mejorar la enfermedad o el trastorno (es decir, ralentizar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de sus síntomas clínicos). En otra realización divulgada, "tratar", "que trata" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico, incluyendo los que pueden no ser discernibles por el paciente. En otra realización divulgada más, "tratar", "que trata" o "tratamiento" se refieren a modular la enfermedad o el trastorno, ya sea físicamente, (p. ej., estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente, (p. ej., estabilización de un parámetro físico) o ambos. En otra realización divulgada más, "tratar", "que trata" o "tratamiento" se refiere a prevenir o retrasar el inicio o desarrollo o avance de una enfermedad o un trastorno.
El término "coadministrar" se refiere a la presencia simultánea de dos (o más) agentes activos en un individuo. Los agentes activos que se coadministran pueden suministrarse al mismo tiempo o de forma secuencial.
Como se usan en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes singulares y/o plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" salvo que se indique lo contrario. Por otra parte ha de entenderse que, en caso de que se proporcionen intervalos de parámetros delimitados por valores numéricos, se considera que los intervalos incluyen estos valores de limitación.
El término "conector GS", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un conector peptídico que consiste predominantemente, o exclusivamente, en restos de glicina y serina (también denominado "conector Gly-Ser"). En distintas realizaciones divulgadas, el conector GS es el conector mostrado en el presente documento en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6 u 8.
Una "sustitución de aminoácidos conservadora", como se utiliza en el presente documento, tiene un efecto menor sobre la función de los anticuerpos que una sustitución no conservadora. Aunque hay muchas formas de clasificar los aminoácidos, a menudo se clasifican en seis grupos principales en función de su estructura y de las características químicas generales de sus grupos R.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "afinidad de unión a la diana" se refiere a la afinidad de una molécula de unión de acuerdo con la invención, por su diana, y se expresa numéricamente mediante valores "KD". En general, un valor KD más alto corresponde a una unión más débil. En algunas realizaciones divulgadas, la "KD" se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (MA) o ensayos de resonancia de plasmones superficiales (RPS), usando, p. ej., un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000. En determinadas realizaciones divulgadas, también se determina una "tasa de activación" o "tasa de asociación" o "kon" y una "tasa de desactivación" o "tasa de disociación" o "koff" con la técnica de resonancia de plasmones superficiales (RPS). En realizaciones divulgadas adicionales, la "KD", "kon" y "koff' se miden con los sistemas Octet®.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "compite por la unión" se utiliza en referencia a uno de los anticuerpos definidos por las secuencias antes mencionadas, lo que significa que el anticuerpo real tiene una actividad que se une a la misma diana, o epítopo o dominio o subdominio diana, al igual que dicho anticuerpo de secuencia definida, y es una variante de este último. La eficiencia (p. ej., cinética o termodinámica) de la unión puede ser igual, mayor o menor que la eficiencia de este último. Por ejemplo, la constante de unión en equilibrio para la unión al sustrato puede ser diferente para los dos anticuerpos.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "mantener la capacidad de unirse a una diana determinada" significa, por ejemplo, que la variante respectiva tiene una afinidad de unión a la diana de >50 % en comparación con la del péptido sin modificar.
EDB de fibronectina
La fibronectina (UniProt: P02751) es una glucoproteína de alto peso molecular (~440 kDa) de la matriz extracelular que se une a proteínas receptoras transmembrana denominadas integrinas. De forma similar a las integrinas, la fibronectina se une a componentes de la matriz extracelular tales como el colágeno, la fibrina y los proteoglucanos de sulfato de heparano (p. ej. sindecanos).
La fibronectina se ha sido implicado en el desarrollo de carcinomas. En el carcinoma de pulmón, aumenta la expresión de fibronectina, especialmente en el carcinoma de pulmón no microcítico. La adhesión de células de carcinoma pulmonar a la fibronectina aumenta la tumorigenicidad y confiere resistencia a los agentes quimioterápicos inductores de la apoptosis. La fibronectina puede promover el crecimiento/supervivencia de los tumores de pulmón y la resistencia a la terapia, y se ha considerado que representa una nueva diana para el desarrollo de nuevos fármacos antineoplásicos.
La fibronectina existe como un dímero proteico, que consiste en dos monómeros casi idénticos unidos por un par de enlaces disulfuro. La proteína fibronectina se produce a partir de un único gen, pero se produce corte y empalme alternativo de su ARNm precursor, producido a partir de una sola copia del gen de la fibronectina, en tres lugares que codifican los dominios EDA, EDB y IIICS y da lugar a la creación de varias isoformas.
Las isoformas de fibronectina que comprenden los dominios EDA o EDB se conocen como formas oncofetales debido a su importancia en el desarrollo embrionario y a su presencia restringida en tejidos adultos normales. Estas isoformas también se reconocen como marcadores importantes de la angiogénesis, un proceso fisiológico crucial en el desarrollo y requerido por las células tumorales en el avance del cáncer. La fibronectina ED-B se expresa en tejidos tumorales, en particular en los carcinomas de mama, tumores cerebrales, células de linfoma y cánceres de próstata. Debido a su perfil de expresión específico para cada tejido, el ED-B de fibronectina es un antígeno tumoral atractivo para su utilización en tratamientos dirigidos.
IL-12
La interleucina-12 es una citocina heterodimérica con múltiples efectos biológicos sobre el sistema inmunitario. Se compone de dos subunidades, p35 y p40, ambas necesarias para la secreción de la forma activa de IL-12, p70. La interleucina-12 actúa sobre las células dendríticas (CD), lo que conduce a una mayor maduración y presentación de antígeno, lo que puede permitir el inicio de una respuesta de linfocitos T a antígenos tumorales específicos. También impulsa la secreción de IL-12 por CD, creando un mecanismo de retroalimentación positiva para amplificar la respuesta. Una vez que se inicia una respuesta, la IL-12 desempeña una función fundamental en la dirección del sistema inmunitario hacia un perfil de citocinas de Th1, que induce a los linfocitos T CD4+ a secretar interferón-gamma (IFN-<y>) y provoca una respuesta de linfocitos T citotóxicos CD8+.
La IL-12 también es una fuerte citocina proinflamatoria que lleva a la secreción de otras citocinas, incluido el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) que, junto con IFN-y, es un requisito previo para el desarrollo de linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) CD4+. Por otro lado, la IL-12 puede promover la activación de células inmunitarias innatas, tales como los macrófagos y los eosinófilos a través de su inducción de IFN-y y otras citocinas. Esta activación lleva, a continuación, a la secreción de IL-12 por estas células y a una mayor amplificación de las respuestas tanto innatas como adquiridas. Sin embargo, altos niveles de IL-12, y por consiguiente de IFN-y, también se han asociado con la inducción de moléculas antagonistas tales como IL-10 y el agotamiento de las moléculas de señalización posteriores a IL-12, tales como STAT4.
Los intentos anteriores de utilizar la IL-12 como agente terapéutico no tuvieron éxito, ya que la IL-12 mostró, en el mejor de los casos, efectos antitumorales modestos que a menudo iban acompañados de efectos secundarios inaceptablemente tóxicos, incluyendo fiebre, cansancio, cambios hematológicos, hiperglucemia y/o disfunción orgánica.
"p35", como se utiliza en el presente documento, significa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un ochenta por ciento (80 %) de identidad con la secuencia de aminoácidos indicada a continuación:
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEA
CLPLELTKNESCLNSRETS FITNGSCLASRKTS FMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLL
MDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVT
IDRVMSYLNAS (SEQ ID NO: 3).
"p40", como se utiliza en el presente documento, significa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un ochenta por ciento (80 %) de identidad con la secuencia de aminoácidos indicada a continuación:
IWELKKDVYWELDWYPDAPGEMWLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGD
AGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLT
TISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPI
EVMVDAVHKLKYENYTSS FFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFS
LT FCVQVQGKSKREKKDRVFTDKT SATVICRKNASISVRAQDRYYS SSWSEWASVPCS (SEQ
ID N O :l).
"IL-12", como se utiliza en el presente documento, significa un polipéptido que (i) comprende ambos de:
(a) p35 o un fragmento del mismo, en donde p35 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un ochenta por ciento (80 %) de identidad con la secuencia de aminoácidos indicada a continuación:
(b)
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEA
CLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLL
MDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVT
I DRVMSYLNAS (SEQ ID NO:3)
y
(b) p40, o un fragmento del mismo, en donde p40 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un ochenta por ciento (80 %) de identidad con la secuencia de aminoácidos indicada a continuación:
IWELKKDVYWELDWYPDAPGEMWLTCDTPEEDGI TWTLDQSSEVLGSGKTLT IQVKEFGD
AGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLT
TISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPI
EVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFS
LTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS (SEQ
ID N O :l)
y (ii) puede activar un receptor de IL-12.
Conectores
En determinadas realizaciones divulgadas, uno o más conectores peptídicos se seleccionan de forma independiente de una secuencia (Gly<n>-Ser)<m>, una secuencia (Gly<n>-Ala)<m>o cualquier combinación de una secuencia (Gly<n>-Ser)<m>/(Gly<n>-Ala)<m>, en donde cada n, de forma independiente, es un número entero de 1 a 5 y cada m es, de forma independiente, un número entero de 0 a 10. En algunas realizaciones divulgadas, un conector peptídico es (Gly4-Ser)<m>en donde m es un número entero de 0 a 10. En algunas realizaciones divulgadas, un conector peptídico es (Gly4-Ala)<m>en donde m es un número entero de 0 a 10. Entre los ejemplos de conectores se incluyen, pero sin limitación, determinadas realizaciones divulgadas, en donde uno o más conectores incluyen repeticiones G<4>S, p. ej., el conector Gly-Ser GGGGS (SEQ ID NO: 34) o (GGGGS)<m>en donde m es un número entero positivo igual o mayor que 1. Por ejemplo, m = 1, m = 2, m = 3, m = 4, m = 5 y m = 6, m = 7, m = 8, m = 9 y m =10. En algunas realizaciones divulgadas, el conector incluye múltiples repeticiones de GGGGS (SEQ ID NO: 34), incluyendo, pero sin limitación, (GGGGS)3 o (GGGGS)4. En algunas realizaciones divulgadas, Ser puede sustituirse por Ala, p. ej., conectores G/A tales como (GGGGA) (SEQ ID NO: 35) o (GGGGA)m en donde m es un número entero positivo igual o mayor que 1. En algunas realizaciones divulgadas, el conector incluye múltiples repeticiones de GGGGA (SEQ ID NO: 35). En otras realizaciones divulgadas, un conector incluye combinaciones y múltiplos de GGGGS (SEQ ID NO: 34) y GGGGA (SEQ ID NO: 35).
En algunas realizaciones divulgadas, un conector comprende la secuencia de aminoácidos GGGGS GGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones divulgadas un conector comprende la secuencia de aminoácidos GSADGGSSAGGSDAG (SEQ ID NO: 4). En algunas realizaciones divulgadas, un conector comprende la secuencia de aminoácidos GSSGG (SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones divulgadas, un conector comprende la secuencia de aminoácidos SSSSGSSSSGSSSSG (SEQ ID NO: 8). En algunas realizaciones divulgadas, un conector comprende la secuencia de aminoácidos GGGAKGGGGKAGGGS (SEQ ID NO: 9). En algunas realizaciones divulgadas, un conector comprende la secuencia de aminoácidos GGGGDGGGGDGGGGS (SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones divulgadas, un conector comprende la secuencia de aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones divulgadas, un conector comprende la secuencia de aminoácidos GGGGSGGGGEGGGGS (SEQ ID NO: 12). En algunas realizaciones divulgadas, un conector comprende la secuencia de aminoácidos AEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 13). En algunas realizaciones divulgadas, un conector comprende la secuencia de aminoácidos APAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 14). En algunas realizaciones divulgadas, un conector comprende la secuencia de aminoácidos APAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 15).
IL-12 ligado a anti-EDB
La presente solicitud se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con la expresión de EDB-fibronectina, incluyendo cánceres. En el presente documento se describen nuevas composiciones y métodos que utilizan la fibronectina como diana para lograr la administración de IL-12 dirigida al cáncer. Este enfoque promete aprovechar totalmente el potencial terapéutico de la IL-12, reduciendo al mismo tiempo la toxicidad sistémica y aumentando la ventana terapéutica de la IL-12.
Aunque anteriormente se han descrito otras construcciones que contienen IL-12 y un dominio dirigido a EDB de fibronectina, las composiciones divulgadas por la presente son sorprendentemente superiores.
El documento WO2006/119897 divulga tres formatos moleculares diferentes de IL-12 junto con un anticuerpo dirigido al EDB de fibronectina denominado "L19".
Un formato fue sc(IL-12)-scFv(L19), como se ilustra en la fig. 7A. Este formato, que consiste en un heterodímero de IL-12 en el que las dos subunidades se unen mediante un conector peptídico (en consecuencia, IL-12 "monocatenaria", o sc(IL-12)), y, a continuación, dicha IL-12 se une, a través de un segundo conector peptídico, al anticuerpo L19 que también tiene el formato Fv monocatenario (en consecuencia, scFv(L19)). Este formato mostró una moderada capacidad de direccionamiento tumoral, coherente con las conclusiones del estado de la técnica.
Otro formato fue un homodímero de sc(IL-12)-SIP(L19), como se ilustra en la fig. 7B. El formato SIP ("proteína inmunitaria pequeña") ha sido desarrollado por los solicitantes en el documento W02003/076469 y también recibe el apodo de "minianticuerpo". La SIP es un homodímero que comprende dos subunidades que comprenden un scFv unido al dominio CH4. Los dos dominios CH4 están unidos entre sí por un enlace disulfuro. A pesar de que en la técnica anterior se indicaba que las propiedades de direccionamiento tumoral de L19 podían mejorarse usando el formato SIP, no se observó una mayor captación tumoral de este conjugado.
Otro formato era un heterodímero de las subunidades p40 y p35 de IL-12 unidas entre sí por un enlace disulfuro, y cada subunidad fusionada con scFv(L19), formando un heterodímero scFv(L19)-p35/p40-scFv(L19), como se ilustra en la fig. 7C. Con este formato heterodimérico se consiguió una mejora notable de la captación tumoral de la composición.
En el documento WO2013/014149, el solicitante ha divulgado dos nuevos formatos moleculares alternativos de IL-12 unida al anticuerpo anti-EDA de fibronectina dirigido contra tumores denominado "F8".
En el mismo, otro formato de inmunoconjugados de IL-12 comprende un "diacuerpo monocatenario". Consiste esencialmente en dos anticuerpos scFv con un conector corto de cinco aminoácidos (formando así un "diacuerpo") unidos entre sí por un conector peptídico más largo, de quince aminoácidos.
Se demostró que un formato molecular con IL-12 fusionada a un diacuerpo monocatenario F8 monoespecífico (véase la fig. 8B) era superior en términos de direccionamiento tumoral a (i) un heterodímero scFv(F8)-p35/p40-scFv(F8) (fig.
8A) que, en su variante L19, demostró ser el mejor formato divulgado en el documento WO2006/119897 o (ii) dos moléculas de IL-12 unidas a un diacuerpo (fig. 8C).
L19
"Anticuerpo L19", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier anticuerpo que se une al EDB de fibronectina o a cualquier parte del mismo y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un setenta y cinco por ciento (75 %) de identidad con una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos:
L19 VH (SEQ ID NO: 7) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYAD
SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSS
L19 VL (SEQ ID NO: 5) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDR
FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK
CDR1 VH (SEQ ID NO: 28)
SFSMS
CDR2 VH (SEQ ID NO: 29)
SISGSSGTTYYADSVKG
CDR3 VH (SEQ ID NO: 30)
PFPYFDY
CDR1 VL (SEQ ID NO: 31)
RASQSVSSSFLA
CDR2 VL (SEQ ID NO: 32)
YASSRAT
CDR3 VL (SEQ ID NO: 33)
QQTGRIPPT
Diacuerpo L19 (SEQ ID NO: 36) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYAD
SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGSSGGEIV
LTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK
Composiciones farmacéuticas
Un aspecto más de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicha composición de la invención y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden normalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de acuerdo con la invención y opcionalmente sustancias auxiliares tales como excipientes farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones farmacéuticas se preparan de una manera bien conocida en la técnica farmacéutica. Un portador o excipiente puede ser un material líquido que puede actuar como vehículo o medio para el principio activo. Los portadores o excipientes adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, estabilizantes, antioxidantes, sustancias reguladoras del pH, excipientes de liberación controlada.
La preparación farmacéutica de la invención se puede adaptar, por ejemplo, para uso parenteral y pueden administrarse al paciente en forma de soluciones o similares. Se pueden administrar a un paciente composiciones que comprenden la composición de la presente invención. La administración está preferentemente en una "cantidad terapéuticamente eficaz", siendo esta suficiente para generar beneficio al paciente. Dicho beneficio puede ser al menos la mejoría de al menos un síntoma. La cantidad real administrada y la velocidad y la evolución temporal de la administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se trate. La prescripción del tratamiento, p. ej., las decisiones sobre la posología, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos de cabecera y otros médicos. Los tratamientos pueden repetirse a intervalos diarios, dos veces a la semana, semanales o mensuales a discreción del médico.
Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden ser en forma de comprimido, cápsula, polvo o líquido. Un comprimido puede comprender un vehículo sólido, tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un vehículo líquido, tal como agua, vaselina, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, o inyección en el sitio afectado, el principio activo estará preferentemente en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, sin pirógenos y con pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos pertinentes en la técnica serán capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos, tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de lactato de Ringer. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario.
En general, dicha composición de la presente invención es capaz de unirse a estructuras diana específicas en una célula, tejido, órgano o paciente, cuyas estructuras diana se definen por la especificidad de la proteína que comprende el dominio de unión a EDB.
Una vez en la diana, la IL-12 estimula la producción de IFNy por parte de linfocitos T y linfocitos citolíticos naturales, y también induce la diferenciación de linfocitos auxiliares Th1. La IL-12 es un mediador clave de la inmunidad innata y mediada por linfocitos. Si el péptido o proteína que comprende el dominio de unión a EDB en la construcción es específico para una estructura diana, p. ej., un receptor o una proteína de la matriz extracelular, que caracteriza una neoplasia, p. ej., un tumor, una enfermedad hematológica, o células en proceso de transformación en cáncer, la unión de la composición induce una potente actividad anticancerígena y antimetastásica mediada por la IL-12.
Los solicitantes han descubierto sorprendentemente que cuando se usa un conector que comprende un motivo de aminoácidos que comprende GSADGGSSAGGSDAG para conectar IL-12 a un péptido o proteína que comprende un dominio de unión a e Db (es decir, un diacuerpo como se ha divulgado en el documento WO2013/014149), se puede conseguir un mejor rendimiento de direccionamiento tumoral, así como un rendimiento de producción superior. Al mismo tiempo, el comportamiento de unión de esta variante es superior al del conector GSADGG más corto, apodado aquí "antiguo" y divulgado en el documento WO2013/014149.
Los solicitantes han evaluado y caracterizado en primer lugar ocho clones de IL-12 humana unida al anticuerpo L19 en formato de diacuerpo monocatenario (huIL-12L19L19) con diferentes conectores polipeptídicos entre la citocina y el diacuerpo monocatenario L19.
Cinco clones apodados: (i) "AKKAS" (ii) "DDS" (iii) "(G4S)3" (iv) "SAD" y (v) "SES" contienen conectores para la conjugación de inmunocitocinas con anticuerpos recombinantes y se han elegido debido a su diferente característica de carga eléctrica (neutra, carga positiva, carga negativa).
Se desarrollaron tres clones adicionales apodados (vi) Alpha3 (vii) AP6 y (viii) AP7. Con respecto a estos tres clones, se tuvieron en cuenta y se pusieron en práctica los principios descritos en Chenet al.(2013). Esta revisión sugiere que los conectores rígidos podrían tener una mayor estabilidad y podrían mantener la distancia correcta entre la citocina y el anticuerpo, aumentando así la eficacia terapéutica.
Ninguno de los conectores (i)-(viii) fue probado previamente en esta inmunocitocina específica.
Sorprendentemente, se descubrió que el conector "SAD" mejora en gran medida (i) el rendimiento de direccionamiento tumoral y (ii) el rendimiento de producción de IL-12 unida a un péptido o proteína que comprende el dominio de unión a EDB, sin (iii) alterar el comportamiento de unión a ED-B en comparación con los otros clones. Esto es bastante sorprendente, ya que a pesar de la consideración de los principios notificados por Chen, solo el conector SAD dio lugar a una composición con una serie de propiedades superiores en comparación tanto con el clon "antiguo" (descrito con más detalle a continuación) como con las otras nuevas variantes descritas en el presente documento.
Finalmente, un noveno clon apodado "antiguo" que comprende un conector divulgado en el documento WO2013/014149 se comparó con el conector "SAD". Sorprendentemente, se descubrió que el conector "SAD", a pesar de compartir la primera parte de la secuencia con el conector "antiguo", tiene una afinidad de unión superior por ED-B.
Por otro lado, tras la cromatografía de exclusión por tamaño, el conector "SAD" muestra una mayor parte monomérica en comparación con el conector "antiguo", es decir, que el ensamblaje de todo el conjugado es más eficiente. Cabe esperar que la mayor parte monomérica proporcionada por el conector "SAD" aumente el rendimiento global de fabricación.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "diacuerpo monocatenario" se refiere a una construcción de dos anticuerpos Fv monocatenarios (scFv) con un conector corto, preferentemente de 3-10 aminoácidos de longitud, más preferentemente de 5 aminoácidos de longitud (también conocidos como "diacuerpos"), unidos entre sí por un conector más largo, preferentemente de 5-20 aminoácidos de longitud, más preferentemente de 15 aminoácidos de longitud, según el esquema siguiente (orientación N->C): L19VH-conector3-L19VL-conector4-L19VH-conector3-L19VL.
De acuerdo con la presente invención, la primera subunidad de la proteína IL-12 heterodimérica es p40 y la segunda subunidad es p35.
Como se ha analizado anteriormente, las isoformas de fibronectina que comprenden los dominios EDA o EDB se conocen como formas oncofetales debido a su importancia en el desarrollo y a su reexpresión en tumores, en contraste con la presencia restringida en tejidos adultos normales.
Estas isoformas también se reconocen como marcadores importantes de la angiogénesis, un proceso fisiológico crucial en el desarrollo y requerido por las células tumorales en el avance del cáncer.
Por consiguiente, el extradominio B (ED-B) de la fibronectina es una diana atractiva para la terapia antineoplásica, incluido el uso de inmunocitocinas como se analiza en el presente documento.
Según algunas realizaciones divulgadas, el diacuerpo monocatenario puede comprender un sitio de unión a antígeno que tiene las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o los dominios VH y/o VL de un anticuerpo capaz de unirse específicamente a un antígeno de interés, por ejemplo, una o más CDR o dominios VH y/o VL de un anticuerpo capaz de unirse específicamente a un antígeno del extradominio B de la fibronectina.
Se puede proporcionar un sitio de unión a antígenos mediante la disposición de regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La estructura para portar una CDR o un conjunto de CDR será generalmente una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una parte sustancial de la misma en la que la CDR o el conjunto de CDR está situado en una ubicación correspondiente a la CDR o al conjunto de CDR de dominios variables de anticuerpos VH y VL naturales codificados por genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y localizaciones de los dominios variables de las inmunoglobulinas pueden determinarse por referencia a Kabatet al.(1987) (Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4.a edición. US Department of Health and Human Services), y las actualizaciones de la misma, ya disponible en Internet (en immuno.bme.nwu.edu o buscando "Rabat" en cualquier motor de búsqueda).
Por CDR o región CDR, se entienden las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, como las definen Rabatet al.(1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4.a edición, US Department of Health and Human Services (Rabatet al.,(1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a edición, US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington, y ediciones posteriores). Normalmente, un anticuerpo contiene 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El término CDR se utiliza en el presente documento para indicar, según el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones que contienen la mayoría de los restos de aminoácidos responsables de la unión por afinidad del anticuerpo al antígeno o al epítopo que reconoce.
De este modo, el diacuerpo monocatenario puede comprender un sitio de unión a antígeno que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR, o los dominios VH y/o VL del anticuerpo L19.
De acuerdo con la presente invención, el diacuerpo monocatenario comprende un sitio de unión a antígeno que tiene las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo L19 expuestas en las SEQ ID NO: 28-33. El sitio de unión al antígeno comprende dominios VH y/o VL del anticuerpo L19 expuestos en las SEQ ID NO: 7 y 5, respectivamente.
Un sitio de unión a antígeno divulgado puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR del anticuerpo L19. Las secuencias de aminoácidos de las CDR de L19 son:
SEQ ID NO: 28 (CDR1 VH);
SEQ ID NO: 29 (CDR2 VH);
SEQ ID NO: 30 (CDR3 VH);
SEQ ID NO: 31 (CDR1 VL);
SEQ ID NO: 32 (CDR2 VL) y/o
SEQ ID NO: 33 (CDR3 VL).
Las SEQ ID NO: 28-30 son las secuencias de aminoácidos de las regiones CDR VH (1-3, respectivamente) del anticuerpo monoclonal humano L19. Las SEQ ID NO: 31-33 son los aminoácidos de las regiones CDR VL (1-3, respectivamente) del anticuerpo monoclonal humano L19. La secuencia de aminoácidos de los dominios VH y VL del anticuerpo L19 corresponde a las SEQ ID NO: 7 y 5, respectivamente.
Según algunas realizaciones divulgadas, el diacuerpo monocatenario comprende al menos uno de
a) un conjunto que comprende las 3 CDR de cadena pesada definidas en el presente documento como SEQ ID NO:
28-30 y las 3 CDR de cadena ligera definidas en el presente documento como SEQ ID NO: 31-33
b) un conjunto de 3 CDR de cadena pesada en el VH definido en el presente documento como SEQ ID NO: 7 y un conjunto de 3 CDR de cadena ligera en el VL definido en el presente documento como SEQ ID NO: 5 c) una combinación de CDR de cadena pesada y CDR de cadena ligera de a) o b), con la condición de que al menos una de las CDR tenga hasta 3 sustituciones de aminoácidos con respecto a la CDR respectiva, como se especifica en a) o b), manteniendo a la vez su capacidad de unirse al extradominio B (ED-B) de la fibronectina, d) una combinación de CDR de cadena pesada y CDR de cadena ligera de a) o b), con la condición de que al menos una de las CDR tenga una identidad de secuencia de >66 % con respecto a la CDR respectiva, como se especifica en a) o b), manteniendo a la vez su capacidad de unirse al extradominio B (ED-B) de la fibronectina, en donde las CDR están incluidas en un armazón proteico adecuado para poder unirse al extradominio B (ED-B) de la fibronectina.
En algunas realizaciones divulgadas, al menos una de las CDR tiene una identidad de secuencia >67, preferentemente >68, más preferentemente una cualquiera de >69, >70, >71, >72, >73, >74, >75, >76, >77, >78, >79, >80, >81, >82, >83, >84, >85, >86, >87, >88, >89, >90, >91, >92, >93, >94, >95, >96, >97, >98 o lo más preferentemente >99 % de identidad de secuencia con respecto a las CDR respectivas.
En otra realización divulgada, al menos una de las CDR se ha modificado mediante maduración por afinidad u otras modificaciones, lo que ha dado lugar a una modificación de la secuencia en comparación con las secuencias divulgadas anteriormente.
En algunas realizaciones divulgadas, al menos una de las CDR tiene hasta 2, y preferentemente 1, sustituciones de aminoácidos con respecto a la CDR respectiva, como se especifica en a) o b).
Según algunas realizaciones divulgadas, el diacuerpo monocatenario comprende al menos uno de
a) los dominios VH y VL del anticuerpo L19 expuestos en las SEQ ID NO: 7 y 5
b) el par de secuencias de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera de a), con la condición de que al menos uno de los dominios tenga una identidad de secuencia de >80 % con respecto a la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 5, respectivamente y/o
c) el par de secuencias de dominio variable de cadena pesada/cadena ligera de a), con la condición de que al menos uno de los dominios tenga hasta 10 sustituciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 5, respectivamente,
manteniendo a la vez su capacidad de unirse al extradominio B (ED-B) de la fibronectina.
En algunas realizaciones divulgadas, al menos uno de los dominios tiene una identidad de secuencia >81, preferentemente >82, más preferentemente >83, >84, >85, >86, >87, >88, >89, >90, >91, >92, >93, >94, >95, >96, >97, >98 o lo más preferentemente >99 % con respecto a la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 5, respectivamente.
En algunas realizaciones divulgadas, al menos uno de los dominios tiene hasta 9, preferentemente hasta 8, más preferentemente hasta 7, 6, 5, 4, 3 o 2 y lo más preferentemente hasta 1 sustituciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 5, respectivamente.
Según algunas realizaciones divulgadas, al menos una sustitución de aminoácidos en el diacuerpo monocatenario es una sustitución de aminoácidos conservadora.
De acuerdo con la presente invención, la composición tiene la estructura de longitud completa "[p40]-[conector1]-[p35]-[conectorSAD]-[L19VH]-[conector3]-[L19VL]-[conector4]-[L19VH]-[conector3]-[L19VL]".
De acuerdo con la presente invención, la composición tiene una secuencia de longitud completa según la SEQ ID NO: 16.
Trastornos
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona dicha composición de acuerdo con la presente invención para usar en el tratamiento de un sujeto humano o animal
• al que se ha diagnosticado,
• que padece o
• que está en riesgo de
contraer una enfermedad neoplásica, o para la prevención de dicha afección.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona dicha composición de acuerdo con la presente invención para usar en la inhibición de la angiogénesis en un sujeto humano o animal.
Por lo tanto, se proporciona un conjugado como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica o para su uso en la inhibición de la angiogénesis dirigiendo la IL-12 a la neovasculaturain vivo.
La expresión "enfermedad neoplásica" engloba las transformaciones malignas y los cánceres, incluidos tumores y hemopatías.
La presente solicitud se refiere al direccionamiento de un agente, en particular un agente terapéutico, p. ej., IL-12, a la neovasculatura de un paciente. Entre las afecciones tratables con la composición como se describe en el presente documento se incluye el cáncer, otros tumores y afecciones neoplásicas. La composición puede proporcionarse para usar en la inhibición de la angiogénesis y de este modo tratar la artritis reumatoide, la retinopatía diabética, la degeneración muscular asociada a la edad, los angiomas, los tumores y el cáncer. El tratamiento puede incluir tratamiento profiláctico. La composición también puede proporcionarse para usar en métodos de diagnóstico, p. ej., el direccionamiento y el diagnóstico de la angiogénesis, que pueden asociarse a cualquiera de las afecciones anteriores. También pueden diagnosticarse y tratarse otras enfermedades y afecciones, según la naturaleza del agente proteico terapéutico o de diagnóstico contenido en la composición y la especificidad de la parte de direccionamiento.
Los cánceres adecuados para el tratamiento como se describe en el presente documento incluyen cualquier tipo de cáncer sólido o no sólido o linfoma maligno y especialmente cáncer de hígado, linfoma, leucemia (p. ej., leucemia mieloide aguda), sarcomas, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer cervicouterino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer de estómago y cáncer cerebral. Los cánceres pueden ser familiares o esporádicos. Los cánceres pueden ser metastásicos o no metastásicos.
Preferentemente, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de cáncer de riñón, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, sarcoma (p. ej., tumor del estroma gastrointestinal), cáncer de piel (p. ej., melanoma), cáncer colorrectal y tumores neuroendocrinos.
En algunas realizaciones divulgadas, la enfermedad neoplásica se caracteriza por la expresión o sobreexpresión de fibronectina ED-B.
Las composiciones divulgadas en la presente solicitud para usar en el tratamiento pueden administrarse a un paciente que las necesite por cualquier vía adecuada, normalmente mediante inyección en el torrente sanguíneo y/o directamente en el lugar que se va a tratar, p. ej., tumor o vasculatura tumoral. La dosis justa y su frecuencia de administración dependerán de una serie de factores, la vía de tratamiento, el tamaño y la ubicación del área que se va a tratar (p. ej., tumor).
Con respecto a la capacidad de respuesta, un sujeto responde al tratamiento si un parámetro de un cáncer (p. ej., un cáncer hemático, p. ej., crecimiento, proliferación y/o supervivencia de células cancerosas) en el sujeto se retrasa o reduce en una cantidad detectable, p. ej., aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90% o más, determinado por cualquier medición adecuada, p. ej., en masa, recuento celular o volumen. En un ejemplo, un sujeto responde al tratamiento si experimenta una prolongación de la esperanza de vida de aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más con respecto a la esperanza de vida prevista si no se administra ningún tratamiento. En otro ejemplo, un sujeto responde al tratamiento, si el sujeto tiene una mayor supervivencia sin enfermedad, supervivencia general o mayor tiempo hasta el avance. Se pueden usar varios métodos para determinar si un paciente responde a un tratamiento, incluidos, por ejemplo, criterios proporcionados por las NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines®).
Combiterapia
Una composición puede administrarse sola o junto con otros tratamientos, ya sea de manera simultánea o secuencial dependiendo de la afección que ha de tratarse. Otros tratamientos pueden incluir la administración de dosis adecuadas de fármacos analgésicos, tales como fármacos antiinflamatorios no esteroideos (p. ej., aspirina, ibuprofeno o ketoprofeno) u opiáceos, tales como morfina o antieméticos.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una combinación de dicha composición o dicha composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención y uno o más compuestos terapéuticamente activos.
La presente solicitud se refiere además a composiciones para usar en el tratamiento o la prevención de un trastorno o una afección asociados con la expresión o sobreexpresión de fibronectina ED-B, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de la composición, la composición farmacéutica o la combinación según la descripción anterior.
Kits
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un kit de piezas que comprende: a) dicha composición, dicha composición farmacéutica o dicha combinación de acuerdo con la presente invención, b) un aparato para administrar la composición, composición o combinación, y
c) instrucciones de uso.
En algunas realizaciones divulgadas, dicho kit de piezas comprende una jeringa precargada provista de un prospecto adecuado para el paciente. En otra realización divulgada, dicho kit de piezas comprende un frasco de infusión con instrucciones de uso adecuadas.
Los componentes de un kit son preferentemente estériles y están en viales sellados u otros recipientes.
Un kit puede también comprender instrucciones de uso de los componentes en un método descrito en el presente documento. Los componentes del kit pueden estar comprendidos o envasados en un recipiente, por ejemplo, una bolsa, caja, tarro, lata o envase alveolado.
Ejemplos
En las reivindicaciones, la expresión "que comprende" no excluye otros elementos o etapas, y el artículo indefinido "un" o "una" no excluye una pluralidad. El mero hecho de que ciertas medidas se citen en reivindicaciones dependientes mutuamente diferentes no indica que no pueda aprovecharse una combinación de estas medidas. No se debería interpretar ningún signo de referencia en las reivindicaciones como limitante del alcance.
Todas las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento se muestran del extremo N al extremo C; todas las secuencias de ácidos nucleicos desveladas en el presente documento se muestran en dirección 5'->3'.
EJEMPLO 1
Los solicitantes han descubierto sorprendentemente que cuando se utilizan determinados conectores para unir la IL-12 a un diacuerpo monocatenario (es decir, el formato superior divulgado en el documento WO2013/014149), se puede lograr un mejor rendimiento de direccionamiento tumoral, así como un rendimiento de producción superior.
Los solicitantes han evaluado y caracterizado ocho clones de IL-12 humana unida al anticuerpo L19 en formato de diacuerpo monocatenario (hulL-12L19L19) con diferentes conectores polipeptídicos entre la citocina y el diacuerpo monocatenario L19.
Cinco clones apodados: (i) "AKKAS" (ii) "DDS" (iii) "(G4S)3" (iv) "SAD" y (v) "SES" contienen conectores para la conjugación de inmunocitocinas con anticuerpos recombinantes y se han elegido debido a su diferente característica de carga eléctrica (neutra, carga positiva, carga negativa).
Se desarrollaron tres clones adicionales apodados (vi) Alpha3 (vii) AP6 y (viii) AP7. Con respecto a estos tres clones, se tuvieron en cuenta y se pusieron en práctica las enseñanzas descritas en Chenet al.(2013). Esta revisión sugiere que los conectores rígidos podrían tener una mayor estabilidad y podrían mantener la distancia correcta entre la citocina y el anticuerpo, aumentando así la eficacia terapéutica.
Ninguno de los conectores (i)-(viii) fue probado previamente en esta inmunocitocina específica.
Sorprendentemente, se descubrió que el conector "SAD" mejora en gran medida el rendimiento de la IL-12 unida a un diacuerpo monocatenario, mientras que es igualmente capaz de unirse a ED-B en comparación con los otros clones.
Materiales y métodos
Las variantes probadas en los ejemplos tienen la siguiente estructura común:
Las distintas variantes (también denominadas "clones" en el presente documento) difieren entre sí en la secuencia del conector 2, como se detalla en la tabla 2:
Clonación de las ocho proteínas de fusión con diferentes conectores
La secuencia codificante huIL-12L19L19 se ha generado ensamblando diferentes fragmentos de PCR: el anticuerpo L19 y la carga útil de IL12. El gen de L19 se amplificó mediante PCR a partir de una plantilla de proteína de fusión L19-IL2 generada previamente utilizando cebadores adecuados. Se amplificó un segundo gen L19 mediante PCR con cebadores adecuados.
Al mismo tiempo, parte del gen del dominio p35 de la IL-12 se amplificó mediante PCR a partir de una inmunocitocina basada en IL12 generada previamente utilizando cebadores adecuados. Los dos fragmentos intermedios se ensamblaron mediante PCR (para generar un fragmento P35-L19), se digirieron dos veces con BamHI/BspEI y se clonaron en el vector de doble digestión que contenía un p35. El vector p35-L19 recién generado se digirió posteriormente dos veces con BspEI/NotI-HF y se ligó con un segundo gen de fragmento de diacuerpo L19. El fragmento p35-L19L19 se digirió con BamHI/NotI-HF y se clonó en el vector de expresión celular de mamífero pcDNA3.1 (+), previamente digerido dos veces y portador del gen de la subunidad p40, lo que dio lugar a la IL12-L19L19 de longitud completa.
Se insertaron diferentes conectores entre los fragmentos de IL12 y del diacuerpo monocatenario L19 mediante el ensamblaje por PCR de los fragmentos "A" (que codifican una parte de p35 con el conector) y el fragmento "B" (que codifica el conector y una parte del anticuerpo). Los diferentes fragmentos "A" y fragmentos "B" se amplificaron a partir de IL12-L19L19 como molde utilizando cebadores adecuados.
La estrategia de clonación diseñada para el clon AP7 condujo a la generación de un clon mutante (denominado AP6). Todos los productos de la PCR se digirieron dos veces con las enzimas de restricción BamHI-HF y BspEI y se ligaron a un plásmido pcDNA3.1 P35-L19L19. Los plásmidos resultantes se amplificaron, se digirieron dos veces con las enzimas de restricción NotI-HF y BamHI-HF y el inserto se subclonó en un plásmido pcDNA3.1 que contenía IL12. Los plásmidos de ADN resultantes se amplificaron y usaron para la transfección celular.
Purificación de la expresión de las ocho proteínas de fusión con diferentes conectores
Para la producción de las distintas fusiones de IL-12 humana, se usaron células CHO-S en suspensión. Las variantes huIL-12L19L19 se expresaron mediante expresión génica transitoria. Para 1 ml de producción, se centrifugaron 4 x 106 células CHO-S en suspensión y se resuspendieron en 1 ml de un medio adecuado para CHO-S. A continuación se añadieron a las células 0,625 |jg de ADN plasmídico seguido de 2,5 |jg de polietilenimina (PEI; 1 mg/ml de solución en agua a pH 7,0) por millón de células y se mezclaron suavemente. Los cultivos transfectados se incubaron en una incubadora con agitación a 31 °C durante 6 días.
Finalmente, las proteínas de fusión producidas por expresión génica transitoria se purificaron a partir del medio de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad con proteína A y, a continuación, se dializaron contra PBS.
SDS-PAGE
El peso molecular correcto de las proteínas de fusión se analizó en condiciones reductoras y no reductoras mediante SDS-PAGE al 10 % y SDS-PAGE al 12 %.
ELISA
Para comprobar la correcta unión de las distintas fusiones de IL-12, se recubrieron placas de Elisa durante una noche con 50 ug/ml del dominio de fibronectina 7B89 (véase el documento W02001/062800 A1). Las inmunocitocinas se analizaron a 10 ug/ml y 1 ug/ml. Como reactivo secundario, se utilizó peroxidasa de rábano picante de proteína A. El ensayo se reveló con el sustrato soluble BM- Blue POD. La reacción colorimétrica se detuvo mediante la adición de H2SO4333 mM y la absorbancia se midió a longitudes de onda de 450 nm y 650 nm utilizando un lector de placas de microtitulación.
Cromatografía de exclusión por tamaño y BIAcore
La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó en un sistema ÁKTAFPLC utilizando la columna de Superdex 200 increase. Las mediciones de afinidad de los experimentos de resonancia de plasmones superficiales se realizaron mediante el instrumento Biacore X100 con clones de huIL-12L19L19 purificados en una microplaca CM5 recubierta de dominio 7B89 de fibronectina. Las muestras se inyectaron como dilución en serie, en un intervalo de concentración entre 1 pM y 250 nM.
Inmunofluorescencia
Para confirmar la capacidad de las distintas fusiones huIL-12 para unirse a las células cancerosas, se realizó inmunofluorescencia en secciones criostáticas congeladas de muestras de ensayo de teratocarcinoma F9 singénico (8 um). Los cortes tumorales se fijaron con acetona helada (5 min). Después de la fijación, se lavaron los cubreobjetos y se bloquearon con suero bovino fetal al 20 % en PBS durante 45 min. Se añadieron clones HuIL-12L19L19 a una concentración de 5 pg/ml en una solución al 2 % de BSA/PBS durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron los cubreobjetos dos veces con PBS y anticuerpo secundario de ratón anti-interleucina-12 humana, se añadió una dilución final 1:1000 en una solución al 2 % de BSA/PBS a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, los cubreobjetos se lavaron de nuevo dos veces con PBS y se añadió anticuerpo terciario de cabra antirratón, dilución final 1:500. Se utilizó DAPI para contrateñir los núcleos.
Radiomarcaje y direccionamiento tumoral in vivo
Para confirmar la capacidad de las distintas fusiones de IL-12 para unirse al tumorin vivo,su capacidad de fijación se evaluó mediante un análisis de biodistribución. Se radioyodaron 100 pg de cada clon de IL-12L19L19 con 125I e hidrato de cloramina T y se purificaron en una columna PD10. Se inyectaron proteínas radiomarcadas en la vena lateral de la cola de ratones inmunocompetentes portadores de un teratocarcinoma murino F9 implantado por vía s.c. La dosis inyectada por ratón varió entre 4 y 9 pg. Los ratones se sacrificaron 24 h después de la inyección. Se pesaron los órganos y se contó la radiactividad utilizando un contador gamma Packard Cobra. El contenido de radiactividad de los órganos representativos se expresó como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% Dl/g ± error estándar).
RESULTADOS
Clonación, expresión y SDS-PAGE
Las ocho variantes de proteínas de fusión huIL-12L19L19 se clonaron con éxito, cada una con un conector polipeptídico diferente entre la citocina y el diacuerpo monocatenario L19. La caracterización por SDS-PAGE mostró un peso molecular de aproximadamente 120 kDa para todas las variantes, lo que confirma el tamaño esperado de la proteína (aproximadamente 109 kDa no glucosilada). Los rendimientos de expresión (mediante expresión génica transitoria en células CHO-S) oscilaron para todas las variantes entre 3,5 y 5 mg/l. Sorprendentemente, el clon apodado "SAD" mostró un rendimiento de 9 mg/l, notablemente superior al de los otros 7 clones. Los resultados se muestran en la fig. 1.
ELISA
En ELISA, los ocho clones Alpha3, AP6, AP7, DDS, SES, AKKAS, (G4S)3 y SAD confirmaron la unión (tanto a una concentración de 10pg/ml como de 1 pg/ml) con el dominio 7B89 de la fibronectina humana. Los resultados se muestran en la fig. 2.
BiaCore
Se realizó una determinación más precisa de la constante de afinidad mediante análisis Biacore en una microplaca recubierta de dominio 7B89 de fibronectina humana (fig. 3). Las muestras se inyectaron como dilución en serie, con una concentración igual a 1000 nM, 750 nM, 500 nM y 250 nM (fig. 3). La KD aparente se estimó mediante el software de evaluación Biacore X100.
Cromatografía de exclusión por tamaño
Los ocho clones Alpha3, AP6, AP7, DDS, SES, AKKAS, (G4S)3y SAD se caracterizaron en cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-200increase), donde todos los clones mostraron un perfil comparable con el pico principal correspondiente a la inmunocitocina monomérica (fig. 4).
Inmunofluorescencia
Se realizó un experimento de inmunofluorescencia con los clones Alpha3, AP6, AP7, DDS, SES, AKKAS, (G4S)3 y SAD sobre una sección criostática de muestra de ensayo de teratocarcinoma F9 singénico congelado (8 um). Todos los clones mostraron una unión específica en la vasculatura en comparación con el control negativo (fig. 5).
Direccionamiento tumoral in vivo
El direccionamientoin vivose evaluó mediante análisis de biodistribución. Los ocho clones Alpha3, AP6, AP7, DDS, SES, AKKAS, (G4S)3 y SAD, así como el control positivo (el diacuerpo monocatenario L19 unido a IL-12 murina) se radioyodaron con 125I y se inyectaron (4-9 |jg de proteína/animal) en ratones inmunocompetentes portadores de un teratocarcinoma murino F9 implantado por vía s.c. La radiactividad contada 24 horas después de la inyección mostró una acumulación en el tumor para todos los clones, sin embargo, el clon "SAD" mostró una acumulación superior en el tumor en comparación con los otros siete clones. (Fig. 6).
EJEMPLO 2
En un conjunto adicional de experimentos comparativos, se descubrió sorprendentemente que el conector "SAD" también es superior al conector antiguo (y más corto) GSADGG (SEQ ID NO: 26) divulgado en el documento WO2013/014149 con respecto a su capacidad de unión, perfil monomérico y la capacidad de direccionamiento tumoral.
Materiales y métodos
Las variantes probadas en este ejemplo tienen la siguiente estructura común:
Las distintas variantes (también denominadas "clones" en el presente documento) difieren entre sí en la secuencia del conector 2:
Clonación de proteínas de fusión
Las proteínas de fusión que comprenden huIL-12 fusionado, a través de un conector de 6 o 15 aminoácidos, con el anticuerpo L19 en formato de diacuerpo monocatenario (en concreto, las variantes huIL-12L19L19 "antigua" y hulL-12L19L19 "SAD", respectivamente) se clonaron siguiendo las líneas descritas anteriormente.
Expresión de proteínas de fusión
Las proteínas de fusión que comprenden huIL-12 fusionado, a través de un conector de 6 o 15 aminoácidos, con el anticuerpo L19 en formato de diacuerpo monocatenario (en concreto, las variantes huIL-12L19L19 "antigua" y huIL-12L19L19 "SAD", respectivamente) se produjeron mediante expresión génica transitoria en cultivos celulares CHO adaptados a suspensión. Tras la transfección, las células se mantuvieron en medio ProCHO-4 (complementado con ultraglutamina 4 mM), durante 6 días a 31 °C en condiciones de agitación, tras lo cual se recogió el sobrenadante del cultivo por centrifugación y se procesó de nuevo para purificar la proteína de fusión.
Purificación de proteínas de fusión mediante resina de proteína A
Los cultivos en suspensión de células CHO transfectadas se centrifugaron durante 30 minutos a 5000 rpm a 4 °C. El sobrenadante se clarificó adicionalmente mediante filtración con filtros de 0,45 um. Se añadió resina de proteína A al sobrenadante filtrado y la mezcla se incubó en condiciones de agitación durante aproximadamente 1 hora. A continuación, la resina se recogió en una columna de cromatografía líquida y se lavó con "tampón A" (NaCl 100 mM, EDTA 0,5 mM, Tween 20 0,1 % en PBS a pH 7,4) seguido de un segundo lavado con "tampón B" (NaCl 500 mM, EDTA 0,5 mM en PBS a pH 7,4). Las proteínas de fusión que comprenden huIL-12 se eluyeron por flujo de gravedad utilizando TEA 100 mM. Se recogieron alícuotas y fracciones que contenían la proteína de fusión, como se confirma mediante espectrometría UV, se agruparon y se dializaron durante una noche en PBS.
Cromatografía de exclusión por tamaño de proteínas de fusión
La cromatografía de exclusión por tamaño de las proteínas de fusión se realizó utilizando una columna Superdex 200 increase 10/300 GL con PBS como tampón de ejecución en un sistema AKTA-FPLC. Se inyectaron 100 pl de soluciones proteicas en una espira y se inyectaron automáticamente en la columna. Se evaluó la absorbancia UV a 280 nm a lo largo del tiempo. Los perfiles de SEC de las proteínas de fusión se analizaron utilizando la función de integración de picos del software UNICORN para cuantificar el porcentaje de la fracción monomérica con respecto al % de área total o al % de área del pico. Para excluir los artefactos de pico debidos a la carga de la muestra o a las sales presentes en los tampones de muestra, solo se consideró para la cuantificación el intervalo entre el volumen de retención 5-17,5 ml.
BIACore
Las mediciones de afinidad de los experimentos de resonancia de plasmones superficiales se realizaron mediante el instrumento BiacoreX100 con los clones purificados "antiguo" y "sA d " en una microplaca CM5 recién recubierta con dominio 7B89 de fibronectina. Las muestras se inyectaron como dilución en serie, con concentración igual a 250 nM, 125 nM y 62,5 mM (fig. 10). La KD aparente se estimó mediante el software de evaluación Biacore X100.
Radiomarcaje y direccionamiento tumoral in vivo
Las muestras de proteína purificada huIL-12L19L19 "SAD" (con conector GSADGGSSAGGSDAG, SEQ ID NO: 4) y huIL-12L19L19 "antiguo" (con conector GSADGG, SEQ ID NO: 26) (100 pg) se radioyodaron con 125I e hidrato de cloramina T y se purificaron en una columna PD10. Las proteínas se radioyodaron tras la cromatografía de afinidad con proteína A. Las proteínas se inyectaron en la vena lateral de la cola de ratones inmunocompetentes (129/Sv) portadores de un teratocarcinoma murino F9 implantado por vía subcutánea. La dosis inyectada por ratón varió entre 10 y 11 pg. Los ratones se sacrificaron 24 horas después de la inyección. Se pesaron las muestras de órganos y se contó la radiactividad utilizando un contador gamma Packard Cobra. Se calculó la captación de proteínas en los distintos órganos y se expresó como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% Dl/g ± error estándar). La captación de proteínas en el tumor se ajustó en función del crecimiento tumoral según Tarliet al.(1999).
RESULTADOS
Expresión y purificación de proteínas de fusión y cromatografía de exclusión por tamaño
Las dos variantes huIL-12L19L19 "SAD" y huIL-12L19L19 "antigua" se produjeron mediante expresión génica transitoria en células CHO. Los experimentos se realizaron por duplicado, donde se realizaron dos series de experimentos de producción en días diferentes que dieron lugar a los lotes A y B respectivamente. Tras la purificación en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad con proteína A y diálisis frente a PBS, la homogeneidad de las muestras proteicas se evaluó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (fig. 9). Ambas variantes proteicas mostraron un cierto grado de agregación proteica, como pone de manifiesto la presencia de variantes de alto peso molecular que eluyen en un volumen de retención temprano. El huIL-12L19L19 "SAD" mostró en ambos casos un perfil mejor, como se confirmó mediante la cuantificación de la parte monomérica de las proteínas utilizando la función de integración de picos del software UNICORN. De hecho, la variante huIL-12L19L19 "SAD" mostró una menor tendencia a la agregación en comparación con la huIL-12L19L19 "antigua", considerando el área del pico monomérico como porcentaje del área total bajo la curva por encima del valor inicial (valores medios: 54,57 % frente a 46,69 %, respectivamente), o el área del pico monomérico como porcentaje de la suma de todos los picos integrados (valores medios: 58,83 % frente a 52,74 %, respectivamente) (tabla 1).
Tabla 1: Cuantificación de la fracción monomérica de las diferentes proteínas de fusión evaluada mediante la función de integración de picos del software UNICORN. (*) Área máxima como porcentaje del área total bajo la curva por encima del valor inicial. (°) Área del pico como porcentaje de la suma de todos los picos integrados.
Biacore
La KD aparente se estimó mediante el software de evaluación Biacore X100 en 6,7 nM para el clon "antiguo" (huIL-12L19L19 "antiguo" con el conector GSADGG) y en 3,8 nM para el clon "SAD" (huIL-12L19L19 "SAD" con el conector GSADGGSSAGGSDAG) (fig. 10).
Direccionamiento tumoral in vivo
La radiactividad contada 24 horas después de la inyección mostró que el clon "SAD" tiene una captación tumoral inesperadamente superior en comparación con el clon "antiguo" (fig.11).
EJEMPLO 3
Se evalúa la eficacia de la variante huIL-12L19L19 "SAD" en pacientes humanos que tienen melanoma maligno, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), carcinoma de células renales, carcinoma urotelial, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello (CECC), cáncer colorrectal metastásico con alta inestabilidad de microsatélites (A-IMS) o con alteración de la vía reparadora del ADN (AVR), cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, carcinoma epidermoide de la piel, cáncer cervicouterino y linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG). Al menos una cohorte de pacientes demuestra avance de la enfermedad con un régimen basado en terapia de bloqueo de puntos de control inmunitarios administrado como tratamiento previo inmediato.
Los pacientes reciben la variante huIL-12L19L19 "SAD" por administración intravenosa una vez a la semana durante 8 semanas. Los pacientes reciben dosis de 4 pg/kg; 8 pg/kg; 12 pg/kg; 16 pg/kg; o 20 pg/kg. Se realiza un seguimiento de los pacientes durante 6 meses desde el inicio del tratamiento o hasta la retirada del consentimiento o el avance de la enfermedad.
El análisis farmacocinético de IL12-L19L19L19-L12 se evalúa mediante captura de tipo sándwich de la molécula de fusión y la fracción de IL12. Los anticuerpos antiproteína de fusión humana (HAFA) se probarán mediante análisis de resonancia de plasmones superficiales y mediante captura de tipo sándwich. La actividad antitumoral, p. ej., la eficacia, se evaluará en la semana 8, la semana 16 y la semana 24 utilizando RECIST (versión 1.1) para tumores sólidos o los criterios de LUGANO para la evaluación de linfomas malignos.
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Tarliet al.,Blood (1999), 94(1), 192-198.
SECUENCIAS
Las siguientes secuencias forman parte de la divulgación de la presente solicitud. Esta solicitud va acompañada de un listado electrónico de secuencias compatible con la norma ST 25 de la OMPI, también. Para disipar cualquier duda, si existen discrepancias entre las secuencias de la tabla siguiente y el listado electrónico de secuencias, las secuencias de esta tabla se considerarán las correctas.
(continuación)
(continuación)

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende
a) una proteína IL-12 humana que comprende una primera subunidad de IL-12 y una segunda subunidad proteica de IL-12;
b) una proteína que comprende un dominio de unión a EDB; y
c) un conector entre la proteína IL-12 y la proteína que comprende el dominio de unión a EDB
en donde la composición comprende:
• un dominio p40 unido a un dominio p35 por un primer conector;
• un primer dominio L19 VH unido al dominio p35 por un conector SAD;
• un primer dominio L19 VL unido al primer dominio L19 VH por un tercer conector;
• un segundo dominio L19 VH unido al primer dominio L19 VL por un cuarto conector; y
• un segundo dominio L19 VL unido al segundo dominio L19 VH por un quinto conector;
y en donde la composición tiene una secuencia de longitud completa según la SEQ ID NO: 16.
2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1 para usar en el tratamiento de un sujeto humano o animal
• al que se ha diagnosticado;
• que padece; o
• que está en riesgo de
contraer una enfermedad neoplásica, o para la prevención de dicha afección.
3. Composición de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la enfermedad neoplásica se selecciona del grupo que consiste en melanoma maligno, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), carcinoma de células renales, carcinoma urotelial, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello (CECC), cáncer colorrectal metastásico con alta inestabilidad de microsatélites (A-IMS) o con alteración de la vía reparadora del ADN (AVR), cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, carcinoma epidermoide de la piel, cáncer cervicouterino y linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG).
4. Composición de acuerdo con la reivindicación 1 para usar en la inhibición de la angiogénesis en un sujeto humano o animal.
5. Una composición farmacéutica que comprende la composición de acuerdo con la reivindicación 1 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
6. Una combinación que comprende:
a) la composición de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5; y
b) uno o más compuestos terapéuticamente activos.
7. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 o combinación de acuerdo con la reivindicación 6 para usar en el tratamiento o la prevención de un trastorno o una afección asociados con la expresión o la sobreexpresión de la fibronectina ED-B, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de dicha composición de acuerdo con la reivindicación 1, dicha composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 o dicha combinación de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Un kit de piezas terapéutico que comprende:
a) la composición de acuerdo con la reivindicación 1, la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 o la combinación de acuerdo con la reivindicación 6;
b) un aparato para administrar la composición, composición o combinación; y
c) instrucciones de uso.
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