ES2373966T3 - Composiciones y procedimientos para el tratamiento de la angiogénesis en lesiones patológicas. - Google Patents

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Abstract

Conjugado de (i) una cadena simple Fv (scFv) específica de elemento de unión específico para la fibronectina ED-B, y (ii) Factor de Necrosis Tumoral α (TNFα).

Description

La presente invención se refiere al tratamiento de las lesiones de la angiogénesis patológica, especialmente los tumores, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, y angiomas. Aspectos de la presente invención emplean un conjugado o fusión de una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre las células diana en las lesiones y un anticuerpo dirigido contra un componente de la matriz extracelular que está presente en este tipo de lesiones. El anticuerpo está dirigido contra la fibronectina ED-B. La molécula biocida o citotóxica es factor de necrosis tumoral a (INFa). Al dirigirse a las moléculas bioactivas a un componente de la matriz extracelular, se puede lograr causar la muerte de las células diana.
Los tumores no pueden crecer más allá de una cierta masa sin la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis), y se ha informado una correlación entre la densidad de los microvasos y la capacidad invasiva del tumor de una serie de tumores (1). Moléculas capaces de dirigirse de forma selectiva a los marcadores de la angiogénesis crean oportunidades clínicas para el diagnóstico y el tratamiento de tumores y otras enfermedades caracterizadas por la proliferación vascular, como la artritis reumatoide, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad (2-8).
El dominio ED-B de la fibronectina, una secuencia de 91 aminoácidos idénticos en ratones, ratas y humanos, que se inserta por empalmado alternativo en la molécula de fibronectina, en concreto se acumula alrededor de las estructuras neovasculares y representa un objetivo de la intervención molecular (9-11). Con el uso de un anticuerpo recombinante humano (L19) para el dominio ED-B, se ha demostrado la posibilidad del marcado de neovasculatura in vivo en diferentes modelos tumorales (12,13).
La presente invención se basa en el trabajo experimental de los inventores empleando un anticuerpo dirigido contra el dominio ED-B de la fibronectina, que se encuentra en la angiogénesis en las lesiones patológicas tales como tumores, conjugado con las moléculas que ejercen efectos biocidas o citotóxicos en las células diana. Algunas de dichas moléculas pueden interactuar con un receptor unido a la membrana de la célula diana o perturbar el potencial electroquímico de la membrana celular. Moléculas ejemplares demostradas experimentalmente en este documento incluyen la interleucina-2 (IL-2), factor tisular, doxorrubicina, interleucina-12 (IL-12), interferón-y (IFN-y) y factor de necrosis tumoral a (TNF a). La presente invención se refiere a conjugados con TNFa.
El Factor de Necrosis Tumoral a (TNFa) es una citoquina producida por muchos tipos celulares, principalmente monocitos y macrófagos activados. Se expresa como un proteína precursora integral transmembrana 26 kDa de la cual se libera una proteína madura de aproximadamente 17 kDa por escisión proteolítica. El TNFa bioactivo soluble es un homotrímero que interactúa con dos receptores diferentes de la superficie celular (Tartaglia L.A., et al J. Biol. Chem., 268: 18542-18548, 1993) p55TNFR (50-60 kDa) y p75TNFR (75-80 kDa). p75TNFR es específico de especie, de hecho, el TNFa humano no se une a este receptor de ratón.
El TNFa puede inducir necrosis hemorrágica de tumores sólidos trasplantados, in vivo (Carswell EA, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3666-3670, 1975), y puede ejercer la actividad citotóxica in vitro contra algunas líneas de células tumorales (Helson L., et al, Nature, 258: 731-732. 1975).
La eficacia anti-tumoral de TNFa en algunos modelos animales abrigaban la esperanza de su posible uso como agente terapéutico en el cáncer humano. Los ensayos clínicos realizados para demostrar la eficacia antitumoral de TNFa, sin embargo, demostró que dosis terapéuticamente efectivas sistemáticamente administrado fueron acompañadas por niveles inaceptablemente altos de toxicidad sistémica, siendo la hipotensión el efecto tóxico más común que limita la dosis. Por otra parte, TNFa tiene una evacuación muy rápida de la sangre (vida media plasmática en general menor de 30 minutos) (Blick M.m et al. Cancer Res., 47: 2989, 1987), lo que disminuye la concentración hemática en los niveles terapéuticos, muy rápidamente. Se han logrado buenos resultados clínicos en los seres humanos sólo en los tratamientos loco-regional de tumores no diseminados (por ejemplo, extremidades aisladas de la perfusión para el sarcoma y el melanoma) (Franker D.L., et al, Important Adv. Oncol. 179-192, 1994).
La actividad anti-tumoral de TNFa en muchos modelos animales parece ser debida a una combinación de un efecto tóxico directo (en combinación con factores derivados de los tumores que actúan sinérgicamente con TNFa) en las células endoteliales de los vasos sanguíneos del tumor en crecimiento (Clauss M., et al. J. Biol Chem., 265:70787083, 1990a), así como a las alteraciones de las propiedades hemostáticas de la proliferación de células endoteliales en la angiogénesis tumoral (Clauss., et al J. Exp. Med. 172: 1535-1545, 1990b). También hay evidencia de un efecto citotóxico directo sobre las células tumorales. Los efectos indirectos (mediados por el huésped) de TNFa, tales como la inmunidad dependiente de la inducción de células T, puede contribuir a la regresión de tumores en modelos animales (Palladino Jr. M.A., et al. J Immunol., 138:4023-4032, 1987).
En los experimentos descritos a continuación, los inventores construyeron y expresaron en células de mamífero una proteína de fusión anticuerpo murino-TNFa (mTNFa), siendo el anticuerpo L19 dirigido contra un componente de la ECM presente en la angiogénesis en las lesiones patológicas (en particular, B-FN). Experimentos de biodistribución in vivo en ratones portadores de tumores demostraron la acumulación de la proteína de fusión en torno a la formación de nuevos vasos sanguíneos del tumor. La proteína de fusión se ha probado en experimentos terapéuticos en animales con tumores y, sorprendentemente, se encontró que induce un efecto anti-tumoral y que es activo en la reducción del crecimiento del tumor.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra una representación esquemática de la construcción ADNc TNFa L19-m scFv. ADNc TNFa L19m scFv fueron fusionados genéticamente con una codificación de ADN de unión de 15 aminoácidos (SSSSG)3 y clonado en el vector de expresión de mamíferos ADNpc utilizando los sitios de restricción HindIII y NotI. La caja rayada representa la secuencia del promotor CMV, la caja llena de la secuencia genómica del péptido líder de señal de secreción (--intrón dentro de la secuencia genómica) y las cajas en blanco el VH o VL de scFv-L19 y la secuencia mTNFa. T7, BC679, BC742 y BC749 y cebadores utilizados en las amplificaciones de PCR se describen en Materiales y Procedimientos.
La figura 2 muestra la actividad biológica de la porción mTNFa de la proteína de fusión (_) y de mTNPa recombinante (.), medido mediante el ensayo de citotoxicidad en fibroblastos de ratón L-M (ver Materiales y Procedimientos en el ejemplo 1).
La figura 3 es un gráfico (en función del tiempo) del volumen de carcinoma de colon murino C51 implantado por vía subcutánea en ratones Balb/C, que se inyecta por vía intravenosa, ya sea con scFv (L19)-mTNFa o PBS (como control negativo). La inyección es indicada por la flecha y se realizó cuando los tumores eran de aproximadamente 100 a 200 mm3. Los errores estándar se indican.
La invención proporciona el uso de un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre las células diana mediante interacción celular, es decir Factor-a de Necrosis Tumoral (TNFa), y (ii) una sola cadena Fv específica uniéndose a elementos específicos para un componente de la matriz extracelular que está presente en la angiogénesis en las lesiones patológicas, es decir, fibrorectina ED-B, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la angiogénesis patológica.
En otro aspecto, la invención proporciona un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre las células diana por interacción celular, es decir, TFNa y (ii) una sola cadena FV específica que se une a un elemento específico de un componente de la matriz extracelular que está presente en la angiogénesis en las lesiones patológicas, es decir, fibrorectina ED-B, para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano
o animal mediante terapia. Dicho tratamiento puede ser de lesiones patológicas que comprenden la angiogénesis.
Un aspecto adicional de la invención proporciona un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre las células diana mediante interacción celular, es decir, TNFa y (ii) una sola cadena Fv que se une específicamente a un elemento específico de un componente de la matriz extracelular que está presente en la angiogénesis en las lesiones patológicas, es decir, fibrorectina ED-B. Dicho conjugado de preferencia comprende una proteína de fusión que comprende la molécula biocida o citotóxica y un dicho elemento de unión específico.
El elemento de unión específica es una molécula de cadena simple Fv del anticuerpo, es decir, scfv. Así, un aspecto adicional de la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende la molécula biocida o citotóxica y una molécula de anticuerpo de cadena simple Fv específica para un componente de la matriz extracelular que está presente en las lesiones que comprenden la angiogénesis, especialmente un componente de la matriz extracelular asociado a los tumores.
El componente que permite el marcado discriminatorio de la matriz extracelular de las lesiones patológicas en comparación con lo normal es la fibronectina ED-B.
El elemento de unión específica es un anticuerpo de cadena simple Fv. Esto permite la producción conveniente de una proteína de fusión que comprende una sola cadena de anticuerpo y la molécula biocida o citotóxica.
El elemento de unión específica es específico para la fibronectina ED-B.
Un sitio de unión antígeno-anticuerpo utilizado en un elemento de unión específica de acuerdo con la presente invención puede incluir los dominios VH y/o VL del anticuerpo L19 o un anticuerpo que compita con L19 de la unión a ED-B. Las secuencias de dominio L19 VH y L19 VL se exponen en Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 2176921776.
Como se ha señalado, de preferencia el elemento de unión específica se conjuga con la molécula de biocida o citotóxica por medio de un enlace peptídico, es decir, dentro de un polipéptido de fusión que comprende dicha molécula y el elemento de unión específica o un componente de la cadena polipeptídica del mismo.
Otros medios para la conjugación incluyen conjugación química, especialmente de entrecruzamiento usando un reactivo bifuncional (por ejemplo, el empleo de ADOUBLE-REAGENTS™ @ Cross-linking Reagents Selection Guide, Pierce).
Cuando es deseable una liberación lenta, por ejemplo, cuando la molécula de biocida o citotóxica es doxorrubicina u otra molécula que perturba el potencial electroquímico de la membrana celular, la conjugación química puede ser por medio de la formación de una base de Schiff (imina) entre un amino grupo primario del elemento de unión específica (un polipéptido tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) y un resto de azúcar oxidado (daunosamina) de la molécula biocida o citotóxica como la doxorrubicina.
La lesión tratada, puede ser un tumor, incluyendo, sin limitación, cualquiera uno o más de los siguientes: el melanoma, neuroblastoma, carcinoma colorrectal, carcinoma renal, carcinoma de pulmón, metástasis pulmonares, carcinoma de mama, astrocitoma de alto grado (grado III, grado IV), meningioma, angioma.
La lesión ocular puede ser, por ejemplo, derivada de la degeneración macular relacionada con la edad, en el que la angiogénesis surge a partir de vasos coroideos.
Elemento de unión específica
Esto describe un elemento de un par de moléculas que tienen la especificidad de unión uno por el otro. Los elementos de un par de unión específica pueden ser de origen natural o total o parcialmente producidos sintéticamente. Uno de los elementos de la pareja de moléculas tiene un área de su superficie, o una cavidad, que se une específicamente y por lo tanto es complementaria a una determinada organización espacial y polar del otro elemento de la pareja de moléculas. Así, los elementos de la pareja tienen la propiedad de unirse específicamente al otro.
Anticuerpo
Esto describe una inmunoglobulina ya sea natural o parcial o totalmente producida sintéticamente. El término también incluye cualquier polipéptido o proteína que tiene un dominio de unión que es, o es sustancialmente homólogo a, un dominio anticuerpo-antígeno de unión. Estos pueden ser derivados a partir de fuentes naturales, o pueden ser parcial o totalmente producidos sintéticamente. Ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulina y sus subclases isotípicas; fragmentos que componen un dominio de unión al antígeno, como Fab, scFv, Fv, DAB, Fd, y diacuerpos.
Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y utilizar técnicas de la tecnología del ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que conservan la especificidad del anticuerpo original. Estas técnicas pueden implicar la introducción de ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina o regiones determinantes de complementariedad (CDRs), de un anticuerpo a las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de estructura, de una inmunoglobulina diferente. Véase, por ejemplo, los documentos EPA-184187, GB 2188638A o EP-A-239400. Un hibridoma u otras células que producen un anticuerpo pueden estar sujetos a la mutación genética u otros cambios, que pueden o no alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.
Como los anticuerpos pueden ser modificados en un número de maneras, el término "anticuerpo" debe ser interpretado cubriendo cualquier elemento de unión específica con un dominio de unión anticuerpo-antígeno de dominio de unión con la especificidad necesaria. Por lo tanto, este término abarca fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo cualquier polipéptido que comprende un dominio de unión de inmunoglobulina, ya sea natural o total o parcialmente sintética. Las moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión de inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro polipéptido son por lo tanto incluidas. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023.
Se ha demostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de los antígenos de unión. Ejemplos de fragmentos de unión son: (i) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo, (iv) el fragmento de dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544 a 546 (1989)), que consta de un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas, (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos (vii) moléculas Fv de cadena simple (scFv), en que un dominio VH y un dominio VL están unidos por un péptido de unión que permite a los dos dominios asociarse para formar un sitio de unión al antígeno (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988, Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988), (viii) dímeros Fv biespecíficos de cadena simple (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión de genes (WO94/13804, P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6.444-6.448, 1993). Fv, scFv o moléculas diacuerpo pueden ser estabilizados mediante la incorporación de puentes de disulfuro que unen los dominios VH y VL (Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 también pueden hacerse (S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3.055-3061, 1996).
Dominio de unión al antígeno
Esto describe la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente y es complementaria a la totalidad o parte de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse sólo a una parte específica del antígeno, dicha parte se denomina epítopo. Un dominio de unión al antígeno puede ser proporcionada por uno o más dominios variables de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo llamado Fd que consiste en un dominio VH). Preferiblemente, un dominio de unión al antígeno comprende una región variable de anticuerpo de cadena ligera (VL) y una región variable de anticuerpo de cadena pesada (VH).
Específico
Esto puede ser usado para referirse a la situación en la que un elemento de un par de unión específico no muestra ninguna unión significativa a otras moléculas aparte de su(s) socio(s) de unión específica. El término también es aplicable cuando por ejemplo, un dominio de unión al antígeno es específico para un epítope particular que es llevado a cabo por una serie de antígenos, en cuyo caso el elemento de unión específica que lleva el dominio de unión al antígeno será capaz de unirse a los diversos antígenos que lleva el epítopo.
Comprende
Se utiliza generalmente en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o más características o componentes.
Aislado
Se refiere al estado en el que elementos específicos de la unión de la invención, o un ácido nucleico que codifica dichos elementos de unión, por lo general se emplearán de acuerdo con la presente invención. Los elementos y el ácido nucleico estarán libres o sustancialmente libres del material con el que se asocian naturalmente, como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentran en su entorno natural, o el entorno en el que son preparados (por ejemplo, cultivo celular), cuando dicha preparación es mediante tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los elementos y ácido nucleico se pueden formular con diluyentes o adyuvantes y todavía, a efectos prácticos, ser aislados - por ejemplo, los elementos normalmente se mezclarán con gelatina u otros portadores si se utilizan para revestir las placas de microtitulación para su uso en inmunoensayos, o se mezclarán con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se utilizan en el diagnóstico o tratamiento. Elementos de unión específicos pueden ser células eucariotas heterólogas glicosiladas, ya sea naturalmente o mediantes sistemas (por ejemplo, células CHO o NS0 (ECACC 85110503), o pueden ser (por ejemplo si se produce mediante la expresión en una célula procariota) no glicosiladas.
Como se ha señalado, en donde se va a emplear un antígeno-anticuerpo dirigido contra el dominio de unión fibronectina ED-B en las realizaciones de la presente invención, un dominio como tal preferido comprende los dominios L19 anticuerpo VH y VL. Formas modificadas de uno u otro de estos dominios pueden ser empleados en otras realizaciones, por ejemplo, el dominio de L19 VH o L19 VL en los que 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituciones de aminoácidos se han hecho en un CDR, por ejemplo, CDR3, y/o FR, cuyos elementos específicos de unión retienen capacidad de unir la fibronectina ED-B. Tales sustituciones de aminoácidos son generalmente "conservadoras", por ejemplo, la sustitución de un residuo hidrófobo como la isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, como la arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o la glutamina por asparagina. En ciertas posiciones son permitidas sustituciones no conservadoras.
La presente invención también se extiende a emplear un elemento de unión específica que compite con el anticuerpo L19 para la unión a la fibronectina ED-B. La competencia entre los elementos de unión puede ser analizada fácilmente in vitro, por ejemplo mediante el etiquetado de una molécula reportera específica a un elemento de unión que se puede detectar en la presencia de otro(s) elemento(s) de unión sin etiquetar, para permitir la identificación de determinados elementos de unión que se unen al mismo epítopo o un epítopo superpuesto.
Además de las secuencias de anticuerpos, un elemento de unión específica empleado de conformidad con la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, la formación de un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o impartir a la molécula otra de las características funcionales, además de la capacidad para unirse al antígeno. Elementos de unión específica de la invención pueden llevar una marca detectable.
Elementos de unión específica de acuerdo con la invención pueden ser utilizados en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal, como un procedimiento de tratamiento (que puede incluir el tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno en un paciente humano que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un elemento de unión específica de la invención. Condiciones tratables, de acuerdo con la presente invención se describen más adelante en este documento.
Por consiguiente, aspectos adicionales de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los elementos de la unión específica, y el uso de un elemento de unión específica en la fabricación de un medicamento para la administración, por ejemplo, en un procedimiento de fabricación de un medicamento o composición farmacéutica que comprenda la formulación del elemento de unión específica con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Siempre que las composiciones se puedan administrar a las personas. La administración es preferiblemente en una "cantidad terapéuticamente efectiva", siendo esto suficiente para demostrar un beneficio a un paciente. Dicho beneficio puede ser por lo menos la mejoría de al menos un síntoma. La cantidad real administrada y la frecuencia y el curso temporal de la administración, dependerá de la naturaleza y la gravedad de lo que se está tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificación, etc., se encuentra dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros médicos. Las dosis adecuadas de anticuerpo son bien conocidas en la técnica, ver Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe
K.D. et al. (1991) Antibody, Inmunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922.
Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultánea o secuencialmente dependiendo de la condición a tratar.
Elementos de unión específica de la presente invención, incluidos los que comprenden un dominio de unión antígeno-anticuerpo, se puede administrar a un paciente en necesidad de tratamiento a través de cualquier vía adecuada, por lo general mediante una inyección en el torrente sanguíneo y/o directamente en el sitio de tratar, por ejemplo, el tumor. La dosis exacta dependerá de una serie de factores, la vía de tratamiento, el tamaño y la ubicación de la zona a tratar (tumor, por ejemplo), la naturaleza precisa de los anticuerpos (por ejemplo, todo el anticuerpo, molécula scFv), y la naturaleza de cualquier marca detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis típica de anticuerpos estará en el rango de 10-50 mg. Esta es una dosis para un único tratamiento de un paciente adulto, que puede ser ajustada proporcionalmente para niños y bebés, y también ser ajustada a los formatos de otros anticuerpos en proporción a su peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse a intervalos de una vez al día, dos veces por semana, semanales o mensuales, según el criterio del médico.
Los elementos de unión específica de la presente invención por lo general se administran en forma de una composición farmacéutica, que puede incluir al menos uno de los componentes, además de los elementos de unión específica.
Así, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y para su uso de acuerdo con la presente invención, pueden comprender, además del ingrediente activo, un excipiente farmacéuticamente aceptable, portador, tampón, estabilizador u otros materiales bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador o cualquier otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral o mediante inyección, por ejemplo, por vía intravenosa.
Para la inyección intravenosa, o la inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, que esté libre de pirógenos y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos relevantes en la técnica son capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de lactato de Ringer. Se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario.
Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultánea o secuencialmente dependiendo de la condición a tratar. Otros tratamientos pueden incluir la administración de dosis adecuadas de medicamentos para aliviar el dolor, como fármacos anti-inflamatorios no-esteroides (por ejemplo aspirina, paracetamol, ibuprofeno o quetoprofeno) u opiáceos tales como morfina, o antieméticos.
La presente invención proporciona un procedimiento que comprende causar o permitir la unión de un elemento de unión específica según lo aquí establecido a un componente de la matriz extracelular que está presente en la angiogénesis en las lesiones patológicas. Como se ha señalado, tal unión puede tener lugar in vivo, por ejemplo, tras la administración de un elemento específico de unión, o ácido nucleico que codifica un elemento de unión específica.
Otros aspectos y realizaciones de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la materia, dada la presente descripción. Aspectos y realizaciones de la invención se ilustran en la siguiente sección experimental.
EXPERIMENTAL
Ejemplo 1
Construcción y actividad antitumoral in vivo de la fusión de anticuerpos mTNPa.
Materiales y Procedimientos
Construcción y expresión de la proteína de fusión L19-M TNFA. El ADNc 119-m TNFa fue construido por la fusión de una secuencia sintética que codifica TNFa del ratón (Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6060-6064, 1985) para el extremo 3' de la secuencia codificante para el scFV L19. La representación esquemática de la construcción de ADNc L19-mTNFa se muestra en la Figura 1. TNFA ADNc fue amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores BC742 y BC749 y, como modelo el m-TNFa ADNc (producido por la reacción en cadena de polimerasa transcriptasa reversa RT-PCR) a partir de ARN obtenido a partir del bazo de los ratones inmunizados.
El cebador directo (BC742) para el ratón TNFA (secuencia: 5'CTCGAATTCTCTTCCTCATCGGGTAGTAGCTCTTCCGGCTCATCGTCCAGCGGCCTCAG ATCATCTTCTCAAAAT3') contenía la secuencia de la enzima de restricción EcoRI, una 45 pb codificando 15 amino ácidos de unión (Ser,-Gly)3 y 21 bases de la secuencia TNFa de ratón madura (Pennica et al., 1985).
El cebador inverso AC-749 (secuencia 5'CTCGCGGCCGCTCATCACAGAGCAATGACTCCAAAGTA3') contenía 21 bases de TNFa de ratón maduro (Penca et al., 1985, dos codones de terminación y la secuencia de la enzima de restricción Not I.
El scFv L19, que contenía en su extremo 5' la secuencia genómica del péptido de secreción de señal según lo informado por Li et al (Protein Engineering, 10:731, 1996 o 1997), fue amplificado mediante PCR usando el cebador T7 en el vector pcADN3.1 (Invitrogen, Croningen, Países Bajos) y el cebador BC 679 (secuencia: CTCGAATTCtttgatttccaccttggtccc) que contiene 21bp del extremo 3' de la L19 y la secuencia de la enzima de restricción EcoRI.
El gen de fusión fue secuenciado, introducido en el vector pcADN3.1 que contiene el citomegalovirus (CMV) y se expresa en las células p3U1 en presencia de G418 (750 mg/ml, Calbiochem, San Diego, CA). Clones de células resistentes a G418 fueron seleccionados para la secreción de la proteína de fusión L19-mTNFa mediante ELISA utilizando el dominio recombinante de ED-B de la fibronectina humana (FN) como antígeno para L19 y anticuerpo policlonal TNFa anti-murino de conejo (Pepro Tech, Reino Unido) como reactivos específicos para mTNFa inmunorreactivo.
Fragmentos recombinantes FN, inmunoensayo ELISA y purificación de la proteína de fusión L19-mTNFa
El fragmento recombinante ED-B FN se produjo según lo descrito por Carnemolla et al (Int. J. Cancer, 68:397, 1996). El inmunoensayo ELISA se realizó según lo informado por Carnemolla et al (1996). La proteína de fusión L19-M TNFA se purificó a partir del medio acondicionado de un clon positivo utilizando el fragmento ED-B de fibronectina humana recombinante conjugado con Sefarosa, mediante cromatografía de afinidad, según lo informado por Carnemolla et al (1996). El tamaño de la proteína de fusión se analizó en condiciones de reducción en SDS-PAGE y en condiciones nativas mediante FPLC en una columna de cromatografía Superdex S-200 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia).
Ensayo de citotoxicidad L-M
La actividad biológica mTNFa de la proteína de fusión L19-mTNFa se determinó mediante el ensayo de citotoxicidad con fibroblastos de ratón LM como se describe por Corti et al (J. Immunol. Methods, 177: 191-194, 1994). Diluciones seriadas de la proteína de fusión L19-mTNFa y de mTNFa recombinante (2 x 107 unidades/mg) en las concentraciones de 1000 a 0,4 pg/ml se utilizaron en el ensayo citotóxico. Los resultados se expresan como un porcentaje de células viables con respecto a los controles negativos.
Animales y líneas celulares
Ratones machos y hembras 129 y Balb-C (8 semanas de edad) se obtuvieron de Harlan Italia (Correzzana, Milano, Italia). F9, un carcinoma embrionario del ratón, fibroblastos de ratón LM y células de mieloma de ratón p3UI se adquirieron de ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), se utilizó C51, una línea celular de adenocarcinoma de colon de ratón derivada de ratones Balb/C (Colombo et al., Cancer metastasis Rev., 16:421-432, 1997).
Biodistribución de proteína de fusión L19-mTNFa
L19-mTNFa purificada fue radiomarcada con yodo-125 utilizando el procedimiento de Iodogen (Salacinski et al., Anal. Biochem., 117: 136, 1981) (Pierce, Rockford, IL). Después del etiquetado, la inmunoreactividad fue superior al 90%. 129 ratones con F9 teratocarcinoma murino implantado por vía subcutánea fueron inyectados por vía intravenosa con 41g (21Ci) de proteínas en solución salina 1001l. Tres animales fueron utilizados para cada momento. Los ratones fueron sacrificados a las 3, 6, 24 y 48 horas después de la inyección. Los órganos fueron pesados y se contó la radioactividad. Todos los órganos y los tumores se colocaron en fijador para el análisis histológico y microautoradiografico. Los resultados de focalización de los órganos de representación se expresan como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% ID/g).
Tratamiento in vivo con proteína de fusión L19 mTNFa
El tratamiento con L19-mTNFa proteína de fusión purificada fue preformada en grupos de 3 ratones Balb.C inyectados cada uno por vía subcutánea con 106 células de C51. En el día 12 después de la inyección de células C51, 0,8 1g/g de proteína de fusión L19-TNFa se inyecta en la vena de la cola de cada animal. Un grupo similar de tres animales fue inyectado con tampón fosfato salino, pH 7,4 (PBS). Los animales fueron seguidos para toxicidad sistémica (pérdida de peso) y el crecimiento del tumor diariamente durante 6 días. Al final, los animales fueron sacrificados y los tumores se colocaron en fijador para el análisis histológico y se congelaron para el análisis inmunohistoquímico.
Análisis de microautoradiografía e inmunohistoquímica
Las muestras de tumor y de órganos fueron procesados para microautoradiografía para evaluar el patrón de distribución de las proteínas de fusión 125I-L19TNFa dentro de los tumores u órganos descritos por Tarli et al (Blood,
94: 192-198, 1999). Procedimientos de inmunohistoquímica se llevaron a cabo según lo informado por Castellani et al (Int. J. Cancer, 59: 612-618, 1994).
Resultados
La construcción L19-mTNFa y selección de clones que expresan la proteína de fusión L19-mTNFa clones resistentes G418 fueron seleccionadas para la especificidad de anticuerpos de los sobrenadantes de la secuencia ED-B y para mTNFa inmunorreactiva mediante ELISA, tal como se describe en Materiales y Procedimientos.
Los sobrenadantes de los clones que muestran especificidad inmunológica para la secuencia ED-B y mTNFa inmunorreactiva se ensayaron para la actividad biológica de TNFA en el ensayo de citotoxicidad LM (ver Materiales y Procedimientos).
La proteína de fusión L19-mTNFa se purifica en un procedimiento de dos pasos:
a) mediante cromatografía de inmunoafinidad, la columna de sefarosa ED-B seguida por
b) cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200, Pharmacia)
En SDS-PAGE, la proteína de fusión mostró una masa molecular aparente de aproximadamente 42 kDa, como se esperaba. Tanto la actividad inmunológica del componente scFv L19 y la actividad biológica del componente mTNFa en la proteína purificada se pusieron a prueba.
Biodistribución de radiomarcado de proteína de fusión L19-mTNFa en ratones portadores de tumores
Para investigar si la proteína de fusión L19-mTNFa fue capaz de localizarse de manera eficiente en los vasos tumorales, como se informó para scFv L19 por Tarli et al (Blood, 94: 192-198, 1999), los experimentos de biodistribución se realizaron en ratones portadores de teratocarcinoma F9.
La proteína de fusión L19-mTNFa se mostró mediante inmunohistoquímica para teñir fuertemente los vasos sanguíneos del tumor glioblastoma. La proteína de fusión L19-mTNFa radioyodada se inyecta en la vena de la cola de los ratones por vía subcutánea con tumores F9 implantados, y la distribución de la proteína de fusión L19-TNFa se obtuvo en diferentes momentos: 3, 6, 24 y 48 horas. Como se informó en la Tabla I, el 22% de la dosis inyectada por gramo de tejido (% ID/g) se localizó en el tumor 3 horas después de la inyección y después de 48 horas más del 9% ID/g todavía estaba en el tumor. La localización de la proteína de fusión L19-mTNFa en la vasculatura tumoral fue confirmada por análisis microradiografico. La acumulación de la proteína de fusión radiomarcada se demostró en los vasos sanguíneos del tumor del ratón F9. No se ha detectado acumulación de la proteína de fusión radiomarcada en los vasos de los demás órganos de los ratones portadores del tumor.
Tratamiento de ratones portadores del tumor con la proteína de fusión L19-mTNFa. La eficacia de la proteína de fusión L19-mTNFa en la supresión del crecimiento tumoral fue probada en un modelo experimental de tumor de adenocarcinoma de ratón, C51. Para la inducción de tumores, 106 de células C51 fueron inyectados por vía subcutánea en ratones Balb/animales C. Después de 12 días (cuando el tumor alcanza aproximadamente 100200mm3) los animales recibieron inyecciones intravenosas de PBS (3 animales) o proteína de fusión L19-mTNFa (3 animales). Los animales fueron controlados mediante el peso y el crecimiento del tumor diariamente durante 6 días. Los resultados, resumidos en la figura 3, muestran una disminución en el crecimiento del tumor en el grupo de animales tratados con la proteína de fusión L19-mTNFa con respecto a los animales inyectados con PBS (las barras representan SE). La pérdida de peso fue siempre inferior al 6% durante todo el tiempo del experimento.
Referencias
1) Folkman Nat. Med. 1, 27, 1995. 2) O'Reilly et al. Nat. Med. 2: 689, 1996. 3) O'Reilly et al. Cell, 88, 277, 1997. 4) Friedlander et al. Science, 270: 1500, 1995. 5) Pasqualini et al. Nat. Biotechnol. 15: 542, 1997. 6) Huang et al. Science, 275: 547, 1997. 7) Kim et al. Nature, 362: 841, 1993. 8) Schmidt-Erfurth et al. Br. J. Cancer, 75: 54, 1997. 9) Zardi et al. EMBO J., 6, 2331 a 2342 (1987). 10) Carnemolla et al. J. Cell., 108, 2139-1148 (1989). 11) Castellani et al. Int. J. Cencer, 59, 612-618 (1994). 12) Tarli et al. Brood, 94: 192-198, 1999. 13) Viti et al. Cancer Res. 59: 347, 1999. 14) Taniguchi et al. Cell 73:5-8, 1993. 15) Rosenberg J. Clin. Oncol. 10:180-199, 1992. 16) Siegel and Puri interleukin-2 toxicity. J. Clin. Oncol. 9:694-704, 1991. 17) Lode et al. Pharmacol. Ther. 80:277-292, 1998. 18) Meazza et al. Br. J. Cancer, 74: 788-795, 1996. 19) Li et al. Proteins Engineering, 10: 731, 1997. 20) Carnemolla et al. Int. J. Cancer 68:397, 1996. 21) Colombo et al. Cancer Metastasis Rev. 16:421-432, 1997. 22) Salacinski et al. Anal. Biochem. 117:136, 1981. 23) Neri et al. Nat. Biotechnol. 15:1271, 1997. Tabla 1 Biodistribución de la proteína de fusión L19-TNFa radiomarcada en ratones portadores de tumores
% ID/g
Tiempo (h)
Tumor Sangre Piel Hígado Bazo Riñón Vejiga Tiroides Corazón Pulmón Músculo
22,02 ± 2,3
8,39 ± 5,0 2,83 ± 1,3 8,42 ± 1,9 9,08 ± 2,0 7,96 ± 3,0 37,52 ± 26,7 3,21 ± 0,8 2,69 ± 0,7 6,56 ± 1,7 1,33 ± 0,3
6
11,57 ± 2,7 2,13 ± 0,9 1,68 ± 0,9 2,39 ± 0,9 3,29 ± 0,9 6,06 ± 5,2 18,14 ± 9,1 2,91 ± 1,8 1,32 ± 0,5 2,79 ± 1,4 0,76 ± 0,2
24
9,77 ± 1,4 0,09 ± 0,0 0,03 ± 0,0 0,15 +0,0 0,13 ± 0,0 0,18 +0,0 2,9 ± 2,2 1,93 ± 0,5 0,06 ± 0,0 0.198 ± 0,1 0,05 ± 0,0
48
9,55 ± 1,7 O, 01 ± 0,0 0,01 ± 0,0 0,02 ± 0,0 0,01 ± 0,0 0,05 +0,0 0,08 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,01 ± 0,0 0,02 ± 0,0 0,0 ± 1,0
Los estudios de biodistribución se realizaron como se describe en Materiales y Procedimientos Abreviatura: % ID/g por ciento de dosis de la proteína de fusión L19-TNFa inyectada por gramo de tejido

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Conjugado de
    (i)
    una cadena simple Fv (scFv) específica de elemento de unión específico para la fibronectina ED-B, y
    (ii)
    Factor de Necrosis Tumoral a (TNFa).
  2. 2.
    Conjugado según la reivindicación 1, en el que el elemento de unión específica se conjuga con el TNFa por medio de un enlace peptídico.
  3. 3.
    Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el elemento de unión específica compite con el anticuerpo L19 para la unión a la fibronectina ED-B, siendo la secuencia de aminoácidos de L19 revelada en Pini et al (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776.
  4. 4.
    Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el elemento de unión específica comprende uno o más dominios de anticuerpo L19 VH y/o VL, siendo las secuencias de aminoácidos de los dominios de anticuerpos L19 VH y VL revelada en Pini et al (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776.
  5. 5.
    Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el elemento de unión específica comprende los dominios del anticuerpo L19 VH y VL.
  6. 6.
    Conjugado según la reivindicación 1, que comprende una proteína de fusión de (a) dicho elemento de unión específica y (b) TNFa o una cadena de polipéptidos de TNFa que se asocia con una segunda cadena de polipéptidos de TNFa.
  7. 7.
    Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo de una persona humana o un animal mediante terapia.
  8. 8.
    Conjugado según la reivindicación 7 para su uso en un procedimiento de tratamiento de la angiogénesis en lesiones patológicas.
  9. 9.
    Conjugado según la reivindicación 8 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un tumor.
  10. 10.
    Uso de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la angiogénesis en las lesiones patológicas.
  11. 11.
    Uso según la reivindicación 10, en el que dicho medicamento es para el tratamiento de un tumor.
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Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6749853B1 (en) * 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
US5965132A (en) * 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US6678669B2 (en) 1996-02-09 2004-01-13 Adeza Biomedical Corporation Method for selecting medical and biochemical diagnostic tests using neural network-related applications
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
ES2221717T3 (es) 1997-12-08 2005-01-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general.
US20030045681A1 (en) * 1998-05-11 2003-03-06 Anthony J. Zelano Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
US20030176663A1 (en) * 1998-05-11 2003-09-18 Eidgenossische Technische Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2001010912A1 (en) * 1999-08-09 2001-02-15 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
JP5179689B2 (ja) * 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
US8623373B2 (en) 2000-02-24 2014-01-07 Philogen S.P.A. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
EP1259548A1 (en) * 2000-02-24 2002-11-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
CZ2003214A3 (cs) * 2000-06-29 2003-08-13 Merck Patent Gmbh Zesílení odpovědi mediovaných fúzním proteinem protilátka-cytokin kombinovanou léčbou pomocí činidel zvyšujících uptake imunocytokinu
US20020197700A1 (en) * 2000-09-07 2002-12-26 Schering Ag Receptor of the EDb-fibronectin domains
DK1366067T3 (da) * 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
US20030129193A1 (en) * 2001-09-27 2003-07-10 Board Of Regents, The University Of Texas System And Peregrine Pharmaceuticals, Inc. Combined methods for tumor vasculature coaguligand treatment
EP1454138B1 (en) * 2001-12-04 2012-01-18 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
ES2337566T3 (es) 2002-03-11 2010-04-27 Philogen S.P.A. Anticuerpos derivados de anti ed-b l19 y vasculatura tumoral objetivo.
GB0209896D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
GB0209893D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
US7927840B2 (en) 2006-09-11 2011-04-19 Gen Probe Incorporated Method for detecting West Nile Virus nucleic acids in the 3′ non-coding region
AU2003298605B2 (en) 2002-10-16 2007-10-18 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting west nile virus
ATE471946T1 (de) * 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
EP1514561A1 (en) 2003-09-10 2005-03-16 Philogen S.p.A. Targeting of tumor vasculature using radiolabelled antibody L19 against fibronectin ED-B
KR101163424B1 (ko) 2003-12-30 2012-07-13 메르크 파텐트 게엠베하 Ｉｌ－７ 융합 단백질
EP1699821B1 (en) * 2003-12-31 2012-06-20 Merck Patent GmbH Fc-ERYTHROPOIETIN FUSION PROTEIN WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS
CA2552590A1 (en) * 2004-01-05 2005-07-21 Emd Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
JP4438054B2 (ja) * 2004-05-31 2010-03-24 キヤノン株式会社 通信システム、通信装置、アクセスポイント、通信方法およびプログラム
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
US7785591B2 (en) 2004-10-14 2010-08-31 Morphosys Ag Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies
CN101072793B (zh) * 2004-12-09 2012-06-20 默克专利有限公司 具有降低的免疫原性的il-7变体
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
EP1842553A1 (en) * 2006-04-07 2007-10-10 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Combination of an anti-EDb fibronectin domain antibody/IL2 fusion protein and a further small molecule
US20090110680A1 (en) * 2006-04-07 2009-04-30 Stephanie Sieger Combination of an anti ED-B fibronectin domain antibody and gemcitabine
JP2009536170A (ja) * 2006-05-08 2009-10-08 フィロジェン・エッセペア 治療用の抗体標的指向サイトカイン
US9513296B2 (en) 2006-08-21 2016-12-06 Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich Specific and high affinity binding proteins comprising modified SH3 domains of Fyn kinase
US9689879B2 (en) 2006-08-21 2017-06-27 Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich Specific and high affinity binding proteins comprising modified SH3 domains of Fyn kinase
EP1917980A1 (en) * 2006-10-31 2008-05-07 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Use of a fusion protein between a cytokine and an antibody targeting the ED-B fibronectin domain for the treatment of atherosclerosis
EP1925664A1 (en) 2006-11-15 2008-05-28 Scil proteins GmbH Artificial binding proteins based on a modified alpha helical region of ubiquitin
CA2682851C (en) 2007-04-02 2017-01-17 Philogen S.P.A. A novel antigen associated with the neovasculature of tumour metastases
EA017995B1 (ru) 2007-07-25 2013-04-30 Филоджен С.П.А. Антиген, связанный с вариантами рака легкого и лимфомами
EP2209805B1 (en) 2007-10-30 2017-09-06 Philogen S.p.A. An antigen associated with rheumatoid arthritis
US8253725B2 (en) * 2007-12-28 2012-08-28 St. Jude Medical, Atrial Fibrillation Division, Inc. Method and system for generating surface models of geometric structures
EP2085095B1 (en) * 2008-01-17 2012-03-07 Philogen S.p.A. Combination of an anti-EDb fibronectin antibody-IL-2 fusion protein, and a molecule binding to B cells, B cell progenitors and/or their cancerous counterpart
EP2116555A1 (en) 2008-05-08 2009-11-11 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Use of a radioactively labelled molecule specifically binding to ED-B fibronectin in a method of treatment of Hodgkin lymphoma
WO2010078916A1 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Philogen S.P.A. Immunocytokines for tumour therapy with chemotherapeutic agents
EP2379116B1 (en) 2009-01-07 2015-08-26 Philogen S.p.A. Antigens associated with endometriosis
AU2010238858A1 (en) * 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites
RU2583876C2 (ru) 2009-08-17 2016-05-10 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты направленного действия
BR112012014417B1 (pt) 2009-12-14 2021-11-09 Scil Proteins Gmbh Proteínas ubiquitinas modificadas tendo uma atividade de ligação específica para o extradomínio b de fibronectina
RU2013139267A (ru) 2011-02-10 2015-03-20 Рош Гликарт Аг Улучшенная иммунотерапия
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
DK2721152T3 (da) 2011-06-15 2019-07-01 Navigo Proteins Gmbh Dimere bindingsproteiner baseret på modificerede ubiquitiner
WO2012171541A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins
US9549981B2 (en) 2011-07-19 2017-01-24 Philogen S.P.A. Sequential antibody therapy
ES2872964T3 (es) 2011-07-27 2021-11-03 Philogen Spa Inmunoconjugado de IL-12
ES2762179T3 (es) 2011-09-26 2020-05-22 Philogen Spa Terapia de combinación de inmunocitocinas
EP2861616A1 (en) 2012-06-13 2015-04-22 Scil Proteins GmbH Human fusion proteins comprising single chain tnfalpha and targeting domains
EP2903629B1 (en) 2012-10-03 2019-07-10 Philogen S.p.A. Antibody conjugate for use in treating inflammatory bowel disease
WO2014094799A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Scil-Proteins-Gmbh Ubiquitin moieties as a means for prolonging serum half-life
EP2988784A1 (en) * 2013-04-25 2016-03-02 Philogen S.p.A. Antibody-drug conjugates
EP3029065B1 (en) * 2013-06-06 2020-05-27 Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. Human antibody against ed-b domain of fibronectin and uses thereof
CN110251683A (zh) * 2013-06-24 2019-09-20 Abl生物公司 具有改进的稳定性的抗体-药物缀合物及其用途
US9636340B2 (en) 2013-11-12 2017-05-02 Ayyappan K. Rajasekaran Kinase inhibitors
EP3253785B1 (en) 2015-02-06 2019-04-10 Navigo Proteins Gmbh Novel egfr binding proteins
DK3322721T3 (da) 2015-07-16 2022-03-14 Navigo Proteins Gmbh Nye immunglobulin-bindende proteiner og deres anvendelse i affinitetsoprensning
JP2018520675A (ja) 2015-07-20 2018-08-02 ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ ジユビキチン変異タンパク質をベースとした新規結合タンパク質及びその生成方法
EP3378947B1 (en) * 2015-11-16 2024-01-24 Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. Use of ed-b protein in diagnosis of tissue hyperplasia
WO2017107914A1 (zh) * 2015-12-21 2017-06-29 合肥立方制药股份有限公司 一种药物设计方法和获得的药物及其应用
AU2017260274A1 (en) 2016-05-04 2018-11-01 Navigo Proteins Gmbh Targeted compounds for the site-specific coupling of chemical moieties comprising a peptide linker
GB201612317D0 (en) 2016-07-15 2016-08-31 Philogen Spa Antibody compositions
US11230576B2 (en) 2016-08-11 2022-01-25 Navigo Proteins Gmbh Alkaline stable immunoglobulin-binding proteins
IL310865A (en) * 2016-10-17 2024-04-01 Pfizer Antibodies against EDB and antibody-drug conjugates
US11103592B2 (en) 2016-11-09 2021-08-31 Philogen S.P.A. IL2 and TNF mutant immunoconjugates
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
EP3634999A1 (en) 2017-06-07 2020-04-15 Philogen S.p.A. Vascular endothelial growth factor/anti-fibronectin antibody fusion proteins
WO2019091918A1 (en) 2017-11-07 2019-05-16 Navigo Proteins Gmbh Fusion proteins with specificity for ed-b and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer
TWI844524B (zh) * 2018-02-09 2024-06-11 義大利商費洛根公司 靶向edb之il-12組合物
WO2019185792A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Philogen S.P.A Cancer treatment using immunoconjugates and immune check-point inhibitors
WO2020047333A1 (en) * 2018-08-30 2020-03-05 HCW Biologics, Inc. Single-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CN112996805A (zh) 2018-08-30 2021-06-18 Hcw生物科技公司 多链嵌合多肽和其用途
WO2020070150A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Philogen S.P.A Il2 immunoconjugates
EP3660039A1 (en) 2018-11-30 2020-06-03 Philogen S.p.A. Il2 immunoconjugates
CA3118692A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 Alsatech, Inc. Cell-based gene therapy for neurodegenerative diseases
KR20210104106A (ko) 2018-12-18 2021-08-24 나피고 프로타인스 게엠베하 암 진단 및 치료를 위한 신규 folr1 특이적 결합 단백질
WO2020249757A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Philogen S.P.A Immunoconjugates comprising a single chain diabody and interleukin-15 or interleukin-15 and a sushi domain of interleukin-15 receptor alpha
AU2020294797B2 (en) 2019-06-21 2025-12-18 Immunitybio, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CN116670163A (zh) 2020-02-11 2023-08-29 Hcw生物科技公司 治疗年龄相关疾病和炎性疾病的方法
CA3169243A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 HCW Biologics, Inc. Methods of activating regulatory t cells
WO2021163299A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 HCW Biologics, Inc. Chromatography resin and uses thereof
AU2021262794B2 (en) 2020-04-29 2026-06-18 Immunitybio, Inc. Anti-CD26 proteins and uses thereof
ES2987329T3 (es) * 2020-05-22 2024-11-14 Philogen Spa Terapia con el inmunoconjugado de TNF-a para el tratamiento de tumores cerebrales
US12024545B2 (en) 2020-06-01 2024-07-02 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
WO2022214664A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Philogen S.P.A. Improved interferon-gamma mutant
US20250161475A1 (en) 2022-03-21 2025-05-22 Philogen S.P.A Tnfalpha immunoconjugate preparation
MX2024011514A (es) 2022-03-23 2024-09-24 Philogen Spa Preparacion de un inmunoconjugado de il2.
US12594323B2 (en) 2022-04-13 2026-04-07 Immunitybio, Inc. Methods of reducing neuroinflammation
WO2024028258A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Philochem Ag Conjugates of psma-binding moieties with cytotoxic agents
AU2023332212A1 (en) 2022-09-01 2025-04-10 Philogen S.P.A. Tnf alpha and interleukin-2 combination therapy for non-melanoma skin cancer
CA3266566A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Philochem Ag MULTIVALENT FIBROBLAST ACTIVATING PROTEIN LIGANDS FOR TARGETED DELIVERY APPLICATIONS
EP4780495A1 (en) 2023-09-19 2026-07-29 Philochem AG Therapeutic combination of an anti-edb fibronectin domain antibody il2 or il12 fusion protein and a lutetium-177 radioconjugate
WO2026003203A1 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Philogen S.P.A. Combination of an immunocytokine comprising targeted il2 and a jak inhibitor

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
IT1217724B (it) 1988-05-26 1990-03-30 Ist Naz Ric Sul Cancro Anticorpo monoclonale specifico per una sequenza di fibronettina espressa in cellule trasformate ibridoma secernente tale anticorpo e impiego dell'anticorpo monoclonale per la diagnosi di tumori
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
EP1306095A3 (en) 1992-03-05 2003-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
EP0771216B9 (en) * 1994-07-11 2003-01-02 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the specific coagulation of tumoral vasculature
GB9610967D0 (en) * 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
TWI259837B (en) * 1998-05-11 2006-08-11 Eidgenossische Tech Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
IT1317835B1 (it) * 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
EP1259548A1 (en) 2000-02-24 2002-11-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
US8623373B2 (en) 2000-02-24 2014-01-07 Philogen S.P.A. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions

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