ES3035716T3

ES3035716T3 - Universal antigen presenting cells and uses thereof

Info

Publication number: ES3035716T3
Application number: ES19757670T
Authority: ES
Inventors: Sonny Ang; Enli Liu; Katy Rezvani; Elizabeth Shpall
Original assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Priority date: 2018-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2025-09-08
Anticipated expiration: 2039-02-21
Also published as: JP7591405B2; KR20200123459A; EP3755347A4; MX2020008801A; US20200390815A1; RU2020130838A3; CA3091671A1; EP3755347A1; JP2024086827A; PL3755347T3; AU2019226021A1; EP3755347B1; CN112292137A; RU2020130838A; DK3755347T3; FI3755347T3; JP2021513860A; TW202000214A; PT3755347T; TWI899050B

Abstract

Se proporcionan aquí células presentadoras de antígenos universales. También se proporcionan métodos para expandir células inmunitarias mediante las UAPC y métodos para el tratamiento de enfermedades, como el cáncer, utilizando las células inmunitarias expandidas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células presentadoras de antígenos universales y usos de las mismas

Antecedentes

1. Campo

La presente invención se refiere en general a los campos de la medicina y la inmunología. Más particularmente, se refiere a células presentadoras de antígenos y a usos de las mismas, tales como expansión de linfocitos citolíticos naturales (NK,Natural Killer).

2. Descripción de la técnica relacionada

A diferencia de los linfocitos T, las células NK (o linfocitos citolíticos naturales) no precisan exposición previa a antígenos para activarse, lo que hace que sean muy eficaces en la inmunovigilancia contra los tumores. Aunque no se requiere activación previa, la inmensa capacidad destructora de las células NK requiere controles rigurosos para prevenir la citotoxicidad y autoinmunidad no intencionadas. La generación de cantidades clínicamente suficientes y de células NK óptimamente funcionales es otro impedimento. Por tanto, es necesario centrarse en la maquinaria molecular que rige la biología de las células NK para discriminar las células diana "resistentes" de las "sensibles", con el fin de diseñar células auxiliares que mejoren la inmunoterapia contra el cáncer mediada por células NK. Shahet al.(2013) (PLOS ONE, vol. 8, no. 10, doi:10.1371/journal.pone.0076781, página e76781) divulgan que la expansión mediada por células presentadoras de antígenos de sangre de cordón umbilical humano produce expansión a escala logarítmica de linfocitos citolíticos naturales con actividad antimieloma.

Sumario de la invención

La invención proporciona una célula presentadora de antígeno universal (CPAU) genomodificada para que exprese (1) CD48 y/o CS1 (CD319), (2) interleucina-21 unida a la membrana (mbIL-21,membrane-bound interleukin-2l)y (3) ligando 41BB (41BBL,41BB ligand).La invención proporciona además un método para expandir células inmunitarias, que comprende cultivar las células inmunitarias en presencia de una cantidad eficaz de las CPAU de la invención.

En las reivindicaciones dependientes se definen otros aspectos y realizaciones preferidas de la invención. Cualquiera de los aspectos, realizaciones y ejemplos de la presente divulgación que no están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forman parte de la invención y se proporcionan únicamente con fines ilustrativos.

Visión general de la divulgación

Por consiguiente, determinados aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos y composiciones relativos a la fabricación, expansión, control de calidad y caracterización funcional de células NK de calidad clínica previstas para inmunoterapia celular.

En una primera realización, se proporciona una célula presentadora de antígeno universal (CPAU) genomodificada para que exprese (1) CD48 y/o CS1 (CD319), (2) interleucina-21 unida a la membrana (mbIL-21) y (3) ligando 41BB (41BBL). En algunos aspectos, la CPAU expresa CD48. En otros aspectos, la CPAU expresa CS1. En aspectos particulares, la CPAU expresa CD48 y CS1.

En algunos aspectos, la CPAU no expresa prácticamente HLA clase I, II, endógeno ni moléculas CD1d. En determinados aspectos, la CPAU expresa ICAM-1 (CD54) y LFA-3 (CD58).

En determinados aspectos, la CPAU se define además como una CPAa (célula presentadora de antígeno artificial) procedente de células leucémicas. En algunos aspectos, la CPAU procedente de células leucémicas se define además como una célula K562.

En algunos aspectos, genomodificado(a) se define además como transducción retrovírica. En algunos aspectos, la transducción retrovírica se define además como transducción de una construcción vírica de SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:2. En determinados aspectos, la CPAU se irradia.

En una realización adicional, se proporciona un método para expandir células inmunitarias, que comprende cultivar las células inmunitarias en presencia de una cantidad eficaz de las CPAU de las realizaciones (p. ej., una célula presentadora de antígeno universal (CPAU) genomodificada para que exprese (1) CD48 y/o CS1 (CD319), (2) interleucina-21 unida a la membrana (mbIL-21) y (3) ligando 41BB (41BBL)). En algunos aspectos, las células inmunitarias y las CPAU se cultivan en una proporción de 3:1 a 1:3, tal como de 3:1, 3:2, 1:1, 1:2 o 1:3. En aspectos particulares, las células inmunitarias y las c Pa U se cultivan en una proporción de 1:2.

En algunos aspectos, la expansión se realiza en presencia de IL-2. En aspectos específicos, la IL-2 está presente a una concentración de 10-500 U/ml, tal como 10-25, 25-50, 50-75, 75-10, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300 350, 350-400 o 400-500 U/ml. En determinados aspectos, la IL-2 está presente a una concentración de 100-300 U/ml. En aspectos particulares, la IL-2 está presente a una concentración de 200 U/ml. En algunos aspectos, la IL-2 es IL-2 humana recombinante. En aspectos específicos, la IL-2 se repone cada 2-3 días, tal como cada 2 o 3 días.

En determinados aspectos, las CPAU se añaden al menos una segunda vez. En algunos aspectos, las células inmunitarias son células NK o linfocitos T. En aspectos particulares, las células inmunitarias son células NK.

En aspectos particulares, las células inmunitarias se obtienen de sangre de cordón (SC), de sangre periférica (SP), de células madre o de médula ósea. En aspectos específicos, las células madre pluripotentes son células madre pluripotentes inducidas. En algunos aspectos, las células inmunitarias se obtienen de SC. En aspectos particulares, la SC se agrupa a partir de 2 o más unidades individuales de sangre de cordón. En aspectos específicos, la SC se agrupa a partir de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades individuales de sangre de cordón.

En algunos aspectos, las células NK son células mononucleares de SC (CMSC). En determinados aspectos, las células NK se definen además como células NK CD56+.

En determinados aspectos, el método se realiza en medios sin suero.

En aspectos adicionales, las células inmunitarias se genomodifican para que expresen un receptor quimérico para el antígeno (CAR,chimeric antigen receptor).En algunos aspectos, el CAR comprende CD19, CD123, mesotelina, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1, o dominio de unión al antígeno BCMA(B-cell maturation antigen,antígeno de maduración de linfocitos B). En algunos aspectos, el CAR es un CAR humanizado. En algunos aspectos, el CAR se coexpresa con IL-15. En determinados aspectos, el CAR se coexpresa con un gen suicida. En algunos aspectos, el gen suicida es CD20, CD52, EGFRv3, o caspasa 9 inducible.

Además, en el presente documento se proporciona, con fines ilustrativos, una población de células inmunitarias expandidas producidas de acuerdo con el método de la divulgación (p. ej., cultivando las células inmunitarias en presencia de una cantidad eficaz de las CPAU de la divulgación (p. ej., una célula presentadora de antígeno universal (CPAU) genomodificada para que exprese (1) CD48 y/o CS1 (CD319), (2) interleucina-21 unida a la membrana (mbIL-21) y (3) ligando 41BB (41BBL)).

En otro aspecto descrito en el presente documento con fines ilustrativos, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la población de células inmunitarias expandidas de la divulgación y un transportador farmacéuticamente aceptable. Además, en el presente documento se proporciona, con fines ilustrativos, una composición que comprende una cantidad eficaz de las células inmunitarias expandidas de la divulgación para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto.

Otro aspecto descrito en el presente documento con fines ilustrativos proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de las células inmunitarias expandidas de la divulgación.

En algunos aspectos, la enfermedad o trastorno es cáncer, inflamación, enfermedad injerto contra huésped, rechazo de trasplante, un trastorno autoinmunitario, una enfermedad de inmunodeficiencia, una neoplasia maligna de linfocitos B, o una infección. En aspectos particulares, el cáncer es una leucemia. En algunos aspectos, la leucemia es una leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena aguda (LMA), o una leucemia mielógena crónica (LMC). En aspectos particulares, el trastorno es la enfermedad injerto contra huésped (EICH). En algunos aspectos, el trastorno es esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide, diabetes de tipo I, lupus eritematoso sistémico, hipersensibilidad por contacto, asma o síndrome de Sjogren. En algunos aspectos, el sujeto es un ser humano.

En determinados aspectos, las células inmunitarias son alogénicas. En algunos aspectos, las células inmunitarias son autólogas. En algunos aspectos, las células inmunitarias son células NK o linfocitos T.

En aspectos adicionales, el método comprende además administrar al menos un segundo agente terapéutico. En algunos aspectos, el al menos un segundo agente terapéutico es una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente contra el cáncer, agente inmunomodulador, o un agente inmunosupresor. En determinados aspectos, el agente contra el cáncer es paclitaxel, radioterapia, genoterapia, cirugía, hormonoterapia, terapia antiangiogénica o inmunoterapia.

En algunos aspectos, el agente inmunosupresor es un inhibidor de la calcineurina, un inhibidor de mTOR, un anticuerpo, una irradiación de un agente quimioterápico, una quimiocina, una interleucina o un inhibidor de una quimiocina o una interleucina.

En aspectos adicionales, las células inmunitarias y/o el al menos un segundo agente terapéutico se administran por vía intravenosa, intraperitoneal, intratraqueal, intratumoral, intramuscular, endoscópica, intralesional, percutánea, subcutánea, regional o mediante inyección o perfusión directa. En algunos aspectos, el segundo agente terapéutico es un anticuerpo. En determinados aspectos, el anticuerpo si es un anticuerpo monoclonal, biespecífico o triespecífico. En algunos aspectos, el anticuerpo es rituximab.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente divulgación. La presente divulgación puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos junto con la descripción detallada de realizaciones específicas mostradas en el presente documento.

FIG. 1:Modelo de cremallera de las interacciones entre los receptores de células NK (o linfocitos citolíticos naturales) humanas y los ligandos de las células diana. Las células NK humanas interactúan con las células diana a través de numerosos receptores, incluidos receptores inmunoglobulínicos de células NK (KIR,killer immunoglobulin receptors),receptores de citotoxicidad natural (NCR,natural cytotoxicity receptors),receptores de la familia NKG2, receptores de unión a nectina, receptores de la familia SLAM(Signaling Lymphocytic Activation Molecule,Molécula de Activación Linfocitaria de Señalización) y otros. Los receptores de las células NK son activadores (KIR2DL4, KIR3DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, CD94-NKG2C, DAP10, NKG2D, DAP10, CRTAM, DNAM, 2B4, NTB-A, CD3 zeta (Z), CD100, CD160) o inhibidores (KIR2DL1/2/3/5A/5B, KIR3DL1/2/3, CD94-NKG2A, TIGIT, CD96, CEACAM-1, ILT2/LILRB1, KLRG1, LAIR1, CD161, Siglec(Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins,lectinas similares a inmunoglobulinas que se unen al ácido siálico)-3/7/9)

FIGS. 2A-2E: (FIG. 2A-2B)Expansión exponencial de células NK recientes o congeladas con IL-2 o CPA.(FIG.

2C)Citometría de flujo el Día 0, Día 7 o Día 14 para la expresión de CD3 y CD56 en células NK.(FIG. 2D)Número de células NK-NT o NK-SG4 estimuladas con CPA.(FIG. 2E)Cinética de crecimiento de células NK estimuladas con CPA o CPAU del clon 9.

FIGS. 3A-3D: (FIG. 3A)Citometría de flujo de células K562 parentales para los marcadores indicados. No se observa expresión de mb-IL21, 41BBL, c D48 y SLAMF7 (CS1).(FIG. 3B)Análisis por citometría de flujo de las CPA postransducción del clon 46 (mbIL-21, 41BBL).(FIG. 3C)Análisis por citometría de flujo de las CPA postransducción de la construcción de CPAu para la expresión de CD48 (nmIL-21, 41BBL y c D48).(FIG. 3D)Análisis por citometría de flujo de las CPA postransducción de la construcción de CPAu2 para la expresión de CS1 (mbIL-21, 41BBL, y CS1).

FIGS. 4A-4D:Mapas y anotaciones de las construcciones de transferencia retrovírica del VLMM (virus de la leucemia murina de Moloney).(FIG. 4A)Vectores de transferencia retrovíricos para mb-IL21.(FIG. 4B)Vectores de transferencia retrovíricos para 41BBL.(FIG. 4C)Vectores de transferencia retrovíricos para CD48-Katushka.

(FIG. 4D)Vectores de transferencia retrovíricos para CS1-EGFP.

Descripción detallada

En los presentes estudios, las células NK se caracterizaron inicialmente con respecto a sus funciones citolíticas antitumorales y antialogénicas, distintas de las otros componentes del compartimento de la inmunidad innata. En la FIG. 1 se ilustra un gráfico de "cremallera" de numerosos inmunorreceptores que rigen los comportamientos de las células NK. El conjunto de transductores de señal puede clasificarse generalmente en 2 grandes grupos, en concreto activadores frente a inhibidores. Las modalidades estructurales y de señalización subdividen aún más las categorías en familias relacionadas de inmunorreceptores. Aunque el proteoma de membrana de las células NK aún no se ha esclarecido por completo, se aprovecharon las redundancias funcionales dentro de la "cremallera" de las células NK para modular las funciones citolíticas preservando al mismo tiempo el equilibrio complejo y dinámico entre vías complementarias y antagónicas.

Por consiguiente, determinados aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos y composiciones relativos a la fabricación, expansión, control de calidad y caracterización funcional de células NK de calidad clínica previstas para inmunoterapia celular. El crecimiento y moldeado de cantidades clínicamente relevantes de células<n>K para su infusión en pacientes, cumpliendo al mismo tiempo con las limitaciones de tiempo, es un reto incluso en las mejores circunstancias. En determinados aspectos, los métodos y composiciones divulgados detallan los procesos técnicos de fabricación de células NK, detalles y cinética de las expansiones de células NK alcanzables, y caracterización molecular para verificar el éxito del moldeado celular.

En realizaciones adicionales, en el presente documento se proporciona una tecnología de plataforma robusta materializada como células presentadoras de antígenos universales (CPAU) para acondicionar, moldear y armar a los linfocitos citolíticos naturales (células NK) contra tumores. En el presente documento, "CPAU" se refiere a células presentadoras de antígenos diseñadas para la expansión optimizada de células inmunitarias, tales como células NK. Las presentes CPAU se generaron mediante una combinación única de moléculas coestimuladoras para superar las señales inhibidoras e inducir una función citolítica óptima y específica de las células NK. Pruebas exhaustivas demostraron que las CPAU afinan la maquinaria celular de las células NK y mejoran la eliminación de tumores. Las presentes CPAu pueden usarse para la inmunoterapia contra el cáncer mediada por células NK.

Las CPA ilustrativas se generan mediante la expresión forzada de interleucina 21 unida a la membrana (mbIL-21) y ligando 4-1BB en la línea de células presentadoras de antígenos (CPA) K562, sensible a células NK (denominada clon 46). En otra realización, las CPAU se produjeron mediante la expresión forzada de mbIL-21, ligando 4-1BB y CD48 en células K562 (denominadas CPA universales (CPAU)). En otra realización, las CPAU se generaron mediante la expresión forzada de mbIL-21, ligando 4-1BB y CS1 en células K562 (denominadas CPAU2). Las CPAU pueden generarse para que expresen mbIL-21, 41BBL y un antígeno específico de células NK, tal como un antígeno de la familia SLAM (Tabla 1).

La plataforma de CPAU también puede aplicarse para expandir otros efectores inmunitarios, incluidos los linfocitos T (p. ej., linfocitos T alfa-beta y gamma-delta). Las células inmunitarias, tales como células NK y linfocitos T, pueden obtenerse de sangre periférica, de sangre de cordón umbilical, de médula ósea o de células madre (incluidas las células madre pluripotentes inducidas). Estas células inmunitarias pueden someterse a expansión y activaciónex vivoutilizando las presentes CPAU, lo cual es necesario para cultivarlas hasta alcanzar cantidades significativas para aplicaciones clínicamente relevantes tales como la inmunoterapia contra el cáncer.

Por tanto, la presente divulgación proporciona una serie de líneas celulares auxiliares diseñadas y fabricadas para acondicionar, modular, preparar y expandir células inmunitarias humanas, tales como las células NK, para la inmunoterapia contra el cáncer.

1. Definiciones

Como se utiliza en el presente documento, "prácticamente sin", en relación con un componente específico, significa que ninguno de los componentes especificados se ha formulado intencionadamente en una composición y/o está presente solo como contaminante o en cantidades mínimas. La cantidad total del componente específico resultante de cualquier contaminación no intencionada de una composición es, por lo tanto, muy inferior al 0,05 %, preferentemente inferior al 0,01 %. La más preferida es una composición en la que no se puede detectar ninguna cantidad del componente específico con métodos analíticos estándar.

Como se utiliza en el presente documento, la especificación, "un" o "uno/a" puede significar uno/a o más. Como se utiliza en la(s) reivindicación(es) del presente documento, cuando se utiliza junto con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "uno/a" pueden significar uno/a o más de uno/a.

El uso del término "o" en las reivindicaciones, se utiliza para dar a entender "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiera únicamente a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación admita una definición que se refiera únicamente tanto a alternativas como a "y/o". Como se utiliza en el presente documento, "otro/a" puede significar al menos un/a segundo/a o más. Las expresiones "alrededor de", "sustancialmente" y "aproximadamente", significan, en general, el valor indicado más o menos un 5 %.

Un "trastorno inmunitario", "trastorno relacionado con el sistema inmunitario", o "trastorno mediado por el sistema inmunitario", se refiere a un trastorno en el que la respuesta inmunitaria desempeña un papel clave en el desarrollo o avance de la enfermedad. Los trastornos mediados por el sistema inmunitario incluyen trastornos autoinmunitarios, rechazo de aloinjerto, enfermedad injerto contra huésped y afecciones inflamatorias y alérgicas.

Una "respuesta inmunitaria" es una respuesta de una célula del sistema inmunitario, tal como un linfocito B o T, o una célula inmunitaria innata, contra un estímulo. En un aspecto de la divulgación, la respuesta es específica para un antígeno particular (es decir, una "respuesta específica para un antígeno").

Una "enfermedad autoinmunitaria" se refiere a una enfermedad en la que el sistema inmunitario produce una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta de linfocitos B o T) contra un antígeno que forma parte del huésped normal (es decir, un autoantígeno), con la consiguiente lesión de los tejidos. Un autoantígeno puede obtenerse de una célula huésped o de un organismo comensal, tales como los microorganismos (conocidos como organismos comensales) que normalmente colonizan las superficies mucosas.

"Tratar" o tratamiento de una enfermedad o afección, se refiere a la ejecución de un protocolo, que puede incluir la administración de uno o más fármacos a un paciente, con la intención de aliviar los signos o síntomas de la enfermedad. Los efectos deseables del tratamiento incluyen disminuir la tasa de avance de la enfermedad, mejorar o paliar la patología y lograr la remisión o mejorar el pronóstico. El alivio puede producirse antes de la aparición de los signos o síntomas de la enfermedad o afección, así como después de su aparición. Por tanto, "tratar" o "tratamiento" puede incluir "prevenir" o "prevención" de enfermedades o afecciones no deseables. Además, "tratar" o "tratamiento" no requiere el alivio completo de los signos o síntomas, no requiere cura y, de manera específica, incluye protocolos que solo tienen un efecto leve en el paciente.

La expresión "beneficio terapéutico" o "terapéuticamente eficaz", como se utiliza en esta solicitud, se refiere a cualquier cosa que promueva o mejore el bienestar del sujeto con respecto al tratamiento médico de esta afección. Esto incluye, pero sin limitación, una reducción en la frecuencia o gravedad de los signos o síntomas de una enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento del cáncer puede implicar, por ejemplo, una reducción del tamaño de un tumor, una reducción de la invasividad de un tumor, reducción de la tasa de crecimiento del cáncer o prevención de metástasis. El tratamiento del cáncer también puede referirse a prolongar la supervivencia de un sujeto con cáncer.

"Sujeto" y "paciente" se refieren a un ser humano o no humano, tal como primates, mamíferos y vertebrados. En aspectos particulares de la divulgación, el sujeto es un ser humano.

La expresión "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen ninguna reacción adversa, alérgica u otra no deseada, cuando se administran a un animal, tal como un ser humano, según corresponda. La preparación de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un principio activo adicional se dará a conocer a los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por otra parte, para la administración a un animal (p. ej., un ser humano), se entenderá que las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza, según lo requerido por Oficina de Normas Biológicas de la FDA.

Como se utiliza en el presente documento, "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes acuosos (p. ej., agua, soluciones alcohólicas/acuosas, soluciones salinas, vehículos parenterales, tales como cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, etc.), disolventes no acuosos (p. ej., propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales y ésteres orgánicos inyectables, tal como etiloleato), medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (p. ej., agentes antibacterianos o antifúngicos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, fármacos, estabilizantes de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes, reponedores de líquidos y nutrientes, materiales similares y combinaciones de los mismos, como sabrá un experto familiarizado con la materia. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan de acuerdo con parámetros bien conocidos.

La expresión "haplotipificación o tipificación tisular" se refiere a un método utilizado para identificar el haplotipo o los tipos de tejido de un sujeto, por ejemplo, determinando cual es el locus (o los locus) del HLA (antígeno leucocitario humano) se expresa en los linfocitos de un sujeto en particular. Los genes del HLA se encuentran en el complejo principal de histocompatibilidad (CMH,majorhistocompatibility complex),una región en el brazo corto del cromosoma 6, y participan en la interacción entre células, en la respuesta inmunitaria, en el trasplante de órganos, en el desarrollo del cáncer y en la susceptibilidad a la enfermedad. Existen seis locus genéticos importantes en el trasplante, denominados HLA-A, HLA-B, HLA-C y HLA-DR, HLA-DP y HLA-DQ. En cada locus, puede haber cualquiera de diversos alelos diferentes.

En un método de haplotipificación muy utilizado se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR,polymerase chain reaction)para comparar el ADN del sujeto, con segmentos conocidos de los genes que codifican los antígenos del MHC. La variabilidad de estas regiones de los genes determina el tipo de tejido o el haplotipo del sujeto. También se utilizan métodos serológicos para detectar antígenos definidos serológicamente en la superficie de las células. Los determinantes HLA-A, -B y -C pueden medirse mediante técnicas serológicas conocidas. En resumen, los linfocitos del sujeto (aislados de sangre periférica reciente) se incuban con antisueros que reconocen todos los antígenos HLA conocidos. Las células se extienden en una bandeja con pocillos microscópicos que contienen diversos tipos de antisueros. Las células se incuban durante 30 minutos, seguidos de una incubación adicional de 60 minutos con complemento. Si los linfocitos presentan en su superficie antígenos reconocidos por los anticuerpos del antisuero, se produce la lisis de los linfocitos. Se puede añadir un colorante para mostrar los cambios en la permeabilidad de la membrana celular y la muerte celular. El patrón de las células destruidas por la lisis indica el grado de incompatibilidad histológica. Si, por ejemplo, los linfocitos de una persona sometida a la prueba de HLA-A3 se destruyen en un pocillo que contiene antisueros para HLA-A3, la prueba es positiva para este grupo antigénico.

La expresión "células presentadoras de antígenos (CPA) se refiere a una clase de células que pueden presentar uno o más antígenos en forma de un complejo péptido-MHC reconocible por células efectoras específicas del sistema inmunitario, y de este modo inducir una respuesta inmunitaria celular eficaz contra el antígeno o antígenos presentados. La expresión "CPA" engloba células enteras intactas, tales como macrófagos, linfocitos B, células endoteliales, linfocitos T activados y células dendríticas, o moléculas, de origen natural o sintético, que pueden presentar antígenos, tales como moléculas purificadas del MHC Clase I formando un complejo con p2 microglobulina.

II. Células Presentadoras de Antígenos Universales

Algunos aspectos de la presente divulgación se refieren a la producción y al uso de células presentadoras de antígenos universales (CPAU). Las CPAU pueden usarse para la expansión de células inmunitarias, tales como células NK y linfocitos T. Las CPAU pueden genomodificarse para que expresen IL-21 unida a la membrana (mbIL-21) y 41BBL (ligando CD137).

Las CPAU pueden genomodificarse para que expresen el ligando CD137 y/o una citocina unida a la membrana. La citocina unida a la membrana puede ser mIL-21 o mIL-15. En realizaciones particulares, las CPAU se genomodifican para que expresen el ligando CD137 y mIL-21. Las CPA pueden obtenerse de células cancerosas, tales como células leucémicas. Las CPA pueden no expresar HLA clase I, II, endógeno ni moléculas CD1d. Las CPA pueden expresar ICAM-1 (CD54) y LFA-3 (CD58). En particular, las CPA pueden ser células K562, tales como células K562 genomodificadas para que expresen el ligando CD137 y mIL-21. Las CPA pueden irradiarse. La genomodificación puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como transducción retrovírica.

Las citocinas ejercen controles muy potentes sobre clases enteras de células inmunitarias (incluidas las células NK), que afectan al destino celular, a la actividad y a la eficacia de las respuestas celulares. El poder de la estimulación con citocinas para activar células NK confirma que sus funciones efectoras "naturales" son muy susceptibles a la intervención ambiental y que la sensibilización puede regular los comportamientos de las células NKin vivo.

Para abordar el problema de adquirir cantidades clínicamente relevantes de células NK, los presentes métodos pueden usar interleucina (IL-21) como impulsor de la expansión de células NK en la presente tecnología de plataforma de CPAU. En seres humanos, la estimulación de células NK con IL-10 e IL-21 induce la expresión de NKG2D de una manera dependiente de STAT3. Aunque los receptores de citocinas comparten componentes de señalización celular similares en muchas células inmunitarias, la señalización específica de las células NK depende del nexo receptor de IL-21-STAT3 para la proliferación.

La señalización de las citocinas es importante para el mantenimiento de la supervivencia y la proliferación de los linfocitos.In vivo,la administración de IL-2 es el único método aprobado por la FDA para expandir células NK. La IL-15, otro potente activador de células NK, se encuentra en Fase I de ensayo clínico como una posible alternativa a la IL-2, pero puede presentar una toxicidad significativa tras su administración sistémica. Aparte de toxicidades significativas, estas citocinas también inducen la proliferación de linfocitos T, al tiempo que limitan la persistencia de las células NK. A pesar de compartir el mismo receptor para la transducción de señales, los receptores de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21, tienen efectos distintos y específicos en diversas células.

A. IL-21 unida a la membrana

En determinados aspectos de la divulgación, para energizar específicamente las células NK, la IL-21 puede usarse para producir las presentes CPAU. El receptor de IL-21 (IL21R), una proteína estrechamente relacionada con la cadena beta del receptor de IL-2, capaz de transducir señales a través de su dimerización con la cadena gamma común del receptor de citocinas (gamma(c)), se regula al alza en células NK humanas activadas (células listas para desencadenar la estimulación). Aunque la IL-21, una citocina de tipo I, puede modular las funciones de los linfocitos T, B y de las células NK, los presentes estudios descubrieron que únicamente las células NK humanas experimentan una expansión significativa a través de la activación de la vía de señalización del receptor de IL21 (es decir, un aumento de 1000 veces en 21 días). Por el contrario, la IL21 desempeña un papel importante en la reducción de los linfocitos T CD8+.

La señalización del IL21R está impulsada principalmente por STAT3, un activador muy fuerte de la proliferación celular. El nexo IL21R-STAT3 está dirigido por la unión del ADN de STAT3 inducida por IL-21 a GAS(Gamma-Activated Site,sitio activado por gamma) y elementos cis-inducibles, tal como se verificó mediante inmunoprecipitación y transferencia Western con anticuerpo antifosfotirosina. La base molecular de la proliferación mediada por la IL21 puede rastrearse específicamente hasta la tirosina 510 (Y510) en el IL21R, que actúa como mediador en la fosforilación de STAT1 y STAT33 inducida por la IL-21. Este mecanismo se ve reforzado por la disminución de respuestas a la IL-21 en ratones con doble inactivación(double knock-out)de Stat1/Stat3.

La señalización del IL21R es importante para la citotoxicidad de NK. La deficiencia del IL21R humano está relacionada con una citólisis deficiente de células diana K562 marcadas con 51Cr, mientras que la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos no se ve afectada. El defecto monogénico no letal embrionario (mutación de pérdida de función en IL21R) presenta una excelente oportunidad para delimitar, y por tanto resulta útil, para modelar, potenciar y dar forma a las respuestas citolíticas innatas de las<n>K.

La señalización de IL-21 moldea selectivamente subconjuntos de células NK, aun cuando ambas poblaciones de células CD56dim(dim= tenue o débil expresión de CD56) y CD56bright(bright= brillante o intensa expresión de CD56) presentan cantidades similares de IL21R en su superficie. La inducción de la fosforilación de STAT1 y STAT3 por IL-21, es mayor en las células NK CD56bright que en las CD56dim. En cambio, la IL-21 no tiene ningún efecto sobre la activación de STAT5, una vía de activación de la IL-2 que también conduce a la expansión de linfocitos T. Además de la activación de STAT3, la señalización de la IL-21 también implica las vías MAPK y PI3K e induce la expresión de genes de respuesta inmunitaria innata, incluyendo IFN-gamma, T-bet, IL-12Rbeta2 e IL-18R en células NK, sensibilizándolas para destruir células tumorales.

Para una utilización eficaz de la IL-21, la expresión de la IL-21 unida a la membrana (mbIL) (FIG. 4A) puede usarse para concentrar y localizar la interacción trans con el IL21R en células NK. La proximidad de la mbIL21 a la membrana garantiza su disponibilidad inmediata donde se necesita, por tanto, puede mantener una proliferación celular óptima sin requerir grandes cantidades ni concentraciones de IL-21 suministrada de forma exógena. Los cocultivos con K562-mb15-41BBL irradiadas indujeron una expansión media de 21,6 veces de células NK CD56+CD3- procedentes de sangre periférica. Esta expansión es mayor en comparación con la estimulación solo con citocinas solubles de la familia yc compartida, que incluye IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 en solitario o en combinaciones. En comparación, las presentes CPAU puede expandir células NK al menos 1000 veces (3 log) en un periodo de 14 a 21 días. La expresión de mbIL21 en las CPAU también puede obviar la necesidad de citocinas exógenas de calidad clínica.

B. 4-1BBL (ligando 4-1BB, ligando CD137, CD137L, TNFSF9)

Además del concepto de sensibilización de la función de las células NK con citocinas, las interacciones físicas directas con moléculas activadoras en las células NK dan lugar a una mayor respuesta proliferativa celular. CD137 (4-1BB) es un miembro de la familia de genes de los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF-R), que actúa como mediador en la proliferación, diferenciación celular y muerte celular programada (apoptosis). Primero se caracterizó el receptor murino y después el homólogo humano, que comparte una identidad de aminoácidos del 60 %, con una conservación significativa en el dominio citoplasmático/de señalización. CD137 se expresa principalmente en linfocitos T activadas y en células NK, con niveles variables detectables en los timocitos, células mieloides y endoteliales en los focos de inflamación. La señalización fisiológica de CD137 está mediada por 1) NF-<k>B, que promueve la supervivencia a través de la activación de Bcl-XL, y 2) la vía PI3K/ERK1/2, que impulsa específicamente el avance del ciclo celular.

En células NK activadas, CD137 es una molécula coestimuladora inducible por citocinas, que, a su vez, impulsa la respuesta antitumoral de las células NK al aumentar la proliferación celular y la secreción de iFN-y. Estudios realizados usando ratones con inactivación(knockout)de CD137L-/- (deleción de ambos alelos), aclararon la importancia de la señalización CD137/CD137L en el desarrollo de células inmunitarias antitumorales. Los ratones con inactivación de CD137-/- presentaron una frecuencia 4 veces mayor de metástasis tumorales en comparación con los ratones de control.

El ligando CD137 (CD137L, ligando 4-1BB), una glucoproteína de 34 kDa, miembro de la superfamilia del TNF, se detecta principalmente en las células presentadoras de antígenos (CPA) activadas, incluyendo linfocitos B, macrófagos y células dendríticas, además de expresarse transitoriamente a niveles bajos en linfocitos T activados. El CD137L humano tiene solo una homología del 36 % en comparación con su homólogo murino. En línea con la eficacia antitumoral de los anticuerpos CD137 agonistas, se ha demostrado que la unión de CD137L suscita actividades de CTL(Cytotoxic T Lymphocytes,linfocitos T citotóxicos) y antitumorales.

Por consiguiente, las presentes CPAU pueden genomodificarse para que expresen el ligando 4-1BB, el contrarreceptor fisiológico de CD137 para la estimulación.

C. SLAM/CD48

Aparte del acondicionamiento con citocinas y la coestimulación con 4-1BBL, las interacciones físicas directas entre las células NK y las células diana también influyen en las respuestas celulares, es decir, en la destrucción de las células diana. La familia de receptores inmunoglobulínicos homólogos denominada molécula de activación linfocitaria de señalización (SLAM, anteriormente también conocida como superfamilia CD2), que se expresa ampliamente y desempeña funciones críticas en el sistema inmunitario, es especialmente importante en cuanto a interacciones intercelulares.

Por consiguiente, las CPAU de la presente divulgación pueden expresar uno o más antígenos de la familia SLAM. Entre los miembros de la familia SLAM se incluye CD2, CD48, CD58 (LFA-3), CD244 (2B4), CD229 (Ly9), CD319 (CS1 (subconjunto CD2 1); CRACC (células citotóxicas activadoras de receptores similares a CD2)), y CD352 (NTB-A (antígeno NK-T-B)). En aspectos particulares, las CPAU expresan CD48 y/o CS1. Las células NK expresan al menos tres miembros de la familia SLAM (SLAMF). Estos son 2B4, NK, antígeno de linfocitos T y B (NTB-A), y células citotóxicas activadoras de receptores similares a CD2 (CRACC), que reconocen sus respectivos ligandos CD48, NTB-A y CRACC en las células diana y posiblemente en otras células NK. Mientras que SLAMF1, 3, 5, 6, 7, 8 y 9 son receptores homófilos (autoligandos), SLAMF2 y SLAMF4 son contrarreceptores (heterófilos) entre sí. El amplio intervalo (tres órdenes de magnitud) en las afinidades homófilas conocidas (constante de disociación, Kd, de <1 pM a 200 pM) apunta a una base mecanicista para los mecanismos de señalización superpuestos, pero distintos, de las glucoproteínas SLAM.

Tabla 1: Afinidades de unión de los miembros de la familia SLAM.

continuación

En realizaciones particulares, las presentes CPAU se genomodifican para que expresen CD48 para reforzar la interacción célula a célula y potenciar las respuestas de las células NK. CD48 es una proteína anclada a glicosilfosfatidilinositol (GPI-AP,glycosylphosphatidylinositol-anchored protein)que se encuentra en la superficie de las células NK, linfocitos T, monocitos y basófilos, y participa en las vías de adhesión y activación de estas células. A pesar de carecer de un dominio intracelular, la estimulación de CD48 induce la reorganización de factores de señalización en balsas lipídicas, la actividad de la cinasa Lck y fosforilación de tirosina. Como molécula de adhesión y coestimuladora, CD48 induce numerosos efectos en linfocitos B y T, células NK, mastocitos y eosinófilos. En células NK humanas, CD48 es el contrarreceptor de 2B426, un importante activador de células NK. Se cree que la interacción heterófila compite por la interacción de CD244 con el MHC-I. De este modo, la interacción 2B4/CD48 induce señales de activación en las células NK humanas, mientras que en las células NK murinas envía señales inhibidoras.

Aunque las interacciones 2B4-CD48 entre células de la misma población, es decir, interacciones entre células NK o entre linfocitos T, conduce a una mayor activación, a través de la expresión de CD48 en las CPA, tal como la línea de células mieloides K562 que normalmente está desprovista de CD48, las CPAU pueden activar la potente vía de señalización 2B4 en las células NK en trans.

D. SLAM/CS1

En algunas realizaciones, las presentes CPAU se genomodifican para que expresen CS1, otro miembro de la familia SLAM, como molécula coestimuladora para activar el poder citotóxico de las células NK. A diferencia de CD48 que se une como contrarreceptor a 2B4, las interacciones CS1 son homófilas y pueden caracterizarse en el contexto de las interacciones cis frente a las trans. Las células K562, normalmente sin CS1, pueden genomodificarse para que expresen CS1.

E. Suministro de ácidos nucleicos

La mbIL-21, el 41BBL y el antígeno coestimulador, pueden genomodificarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. El ácido nucleico se administra normalmente en forma de vector de expresión, tal como un vector de expresión vírico. En algunos aspectos, el vector de expresión es un vector de expresión retrovírico, un vector de expresión adenovírico, un vector de expresión de plásmido de ADN o un vector de expresión de AAV. En algunos aspectos, el suministro se realiza mediante el suministro de uno o más vectores, uno o más transcritos de los mismos y/o una o más proteínas transcritas a partir de los mismos, se suministra a la célula.

Se conocen métodos para introducir una construcción de polinucleótidos en células animales e incluyen, como ejemplos no limitativos, métodos de transformación estable en donde la construcción de polinucleótidos se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en donde la construcción de polinucleótidos no está integrada en el genoma de la célula y métodos mediados por virus. En algunos aspectos de la divulgación, los polinucleótidos pueden introducirse en la célula mediante, por ejemplo, mediante vectores víricos recombinantes (p. ej., retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Por ejemplo, en algunos aspectos, los métodos de transformación transitoria incluyen microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. En algunas realizaciones, los polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente en plásmidos o virus, con vistas a expresarse en las células.

Como métodos de suministro no vírico de ácidos nucleicos se incluyen lipofección, nucleofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o conjugados de lípido:ácido nucleico, ADN libre, viriones artificiales y captación de ADN potenciada por un agente. La lipofección se describe (p. ej., en las patentes de EE.UU. N.° 5.049.386, 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se comercializan (p. ej., Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros adecuados para una lipofección eficaz de polinucleótidos con reconocimiento de receptores incluyen los de Feigner, documentos WO 91117424 y WO 91116024. El suministro puede ser a células (p. ej., administraciónin vitrooex vivo)o a tejidos diana (p. ej., administraciónin vivo).

En algunos aspectos de la divulgación, el suministro se realiza utilizando sistemas basados en ARN o ADN vírico para el suministro de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, los vectores víricos pueden administrarse directamente a los pacientes(in vivo)o pueden usarse para tratar célulasin vitrooex vivo,y después administrarse a los pacientes. En algunas realizaciones, los sistemas basados en virus para la transferencia de genes incluyen vectores retrovíricos, lentivíricos, adenovíricos, dependoparvovíricos y del herpes simple.

III. Células inmunitarias

Algunas realizaciones de la presente divulgación se refieren al aislamiento y a la expansión de células inmunitarias, tales como células NK o linfocitos T, tal como para la inmunoterapia contra el cáncer.

En determinadas realizaciones, las células inmunitarias se obtienen de células mononucleares de sangre periférica (PBMC,peripheral blood mononuclear cells)humana, de productos de leucocitaféresis no estimulados (PBSC), de células madre embrionarias humanas (hESC,human embryonic stem cells),de células madre pluripotentes inducidas (iPSC,induced pluripotent stem cells),de médula ósea o de sangre de cordón umbilical, mediante métodos bien conocidos en la técnica. Específicamente, las células inmunitarias pueden aislarse de sangre de cordón (SC), de sangre periférica (SP), de médula ósea o de células madre. En realizaciones particulares, las células inmunitarias se aíslan de SC agrupada. La SC puede agruparse a partir de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 o más unidades. Las células inmunitarias pueden ser autólogas o alogénicas. Las células inmunitarias aisladas pueden corresponder al haplotipo del sujeto al que se va a administrar la terapia celular. Las células NK pueden detectarse mediante marcadores de superficie específicos, tales como CD16, CD56 y CD8 en seres humanos.

En determinados aspectos, las células NK se aíslan mediante el método descrito anteriormente de expansiónex vivode células NK (Spanholtzet al.,2011; Shahet al.,2013). En este método, células mononucleares de SC se aíslan por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll. El cultivo celular puede reducirse de cualquier célula que exprese CD3 y puede caracterizarse para determinar el porcentaje de células CD56+/CD3- o de células NK. En otros métodos, la SC umbilical se utiliza para obtener células NK mediante el aislamiento de células CD34+. El método puede comprender la reducción de células que son positivas (que expresan) CD3, CD14 y/o CD19.

Las células inmunitarias aisladas pueden expandirse en presencia de las presentes CPAU. La expansión puede durar aproximadamente 2-30 días, tal como 3-20 días, en particular 12-16 días, tal como 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 días, específicamente aproximadamente 14 días. Las células inmunitarias y las CPAU pueden estar presentes en una proporción de aproximadamente 3:1-1:3, tal como 2:1, 1:1, 1:2, específicamente aproximadamente 1:2. Para promover la expansión, el cultivo de expansión puede comprender además citocinas, tal como IL-2. La IL-2 puede estar presente a una concentración de aproximadamente 10-500 U/ml, tal como 100-300 U/ml, en particular de aproximadamente 200 U/ml. La IL-2 puede reponerse en el cultivo de expansión, tal como cada 2-3 días. Las CPAU pueden añadirse al cultivo al menos una segunda vez, tal como a aproximadamente 7 días de expansión.

Tras la expansión, las células inmunitarias pueden infundirse inmediatamente o conservarse, tal como por crioconservación. En determinados aspectos, las células pueden propagarse durante días, semanas, o mesesex vivocomo población masiva en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 días.

Las células NK expandidas pueden secretar citocinas de tipo I, tal como interferón-Y, factor de necrosis tumoral-a y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), que activan tanto células inmunitarias innatas como adaptativas, así como otras citocinas y quimiocinas. La medición de estas citocinas puede usarse para determinar el estado de activación de las células NK. Además, para determinar la activación de células NK pueden usarse otros métodos conocidos en la técnica para caracterizar las células NK de la presente divulgación.

IV. Receptores quiméricos para el antígeno

En determinadas realizaciones, las presentes células inmunitarias, tales como linfocitos T o células NK, se genomodifican para que expresen un receptor quimérico para el antígeno (CAR,chimeric antigen receptor).En algunas realizaciones, el CAR comprende: a) un dominio de señalización intracelular, b) un dominio transmembrana y c) un dominio extracelular que comprende una región de unión a antígeno.

Un CAR reconoce antígenos tumorales asociados en la superficie de la célula, independientemente del antígeno leucocitario humano (HLA), y emplea una o más moléculas de señalización para activar células NK modificadas genéticamente para la destrucción, proliferación y producción de citocinas. En determinadas realizaciones, las presentes células NK pueden modificarse genéticamente mediante métodos que comprenden (i) la transferencia génica no vírica utilizando un dispositivo de electroporación (p. ej., un nucleofector), (ii) CAR que señalizan a través de endodominios (p. ej., CD28/CD3-Z, CD137/CD3-Z, u otras combinaciones), (iii) CAR con longitudes variables de dominios extracelulares que conectan el dominio de reconocimiento de antígeno con la superficie celular, y, en algunos casos, (iv) células presentadoras de antígenos artificiales (CPAa) obtenidas de K562 para poder expandir robusta y numéricamente células NK CAR+ (Singhet al.,2011).

Las realizaciones de la presente divulgación se refieren al uso de ácidos nucleicos, incluyendo ácidos nucleicos que codifican un polipéptido CAR específico de antígeno, incluyendo un CAR que se ha humanizado para reducir la inmunogenicidad (hCAR), que comprende un dominio de señalización intracelular, un dominio transmembrana y un dominio extracelular que comprende uno o más motivos de señalización. En determinadas realizaciones, el CAR puede reconocer un epítopo que comprende el espacio compartido entre uno o más antígenos. En determinadas realizaciones, la región de unión puede comprender regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo monoclonal, regiones variables de un anticuerpo monoclonal, y/o fragmentos de unión a antígeno del mismo. En otra realización, esas especificidad se obtiene de un péptido (p. ej., una citocina) que se une a un receptor.

Se contempla que los ácidos nucleicos CAR humanos puedan ser genes humanos usados para mejorar la inmunoterapia celular de pacientes humanos. En una realización específica, los presentes métodos usan un ADNc o una región codificante de CAR de longitud completa. Las regiones o dominio de unión a antígeno pueden comprender un fragmento de las cadenas V<h>y V<l>de un fragmento variable monocatenario (scFv,single-chain variable fragment)obtenido de un anticuerpo monoclonal humano particular, tales como los descritos en la patente de EE. UU. 7.109.304. El fragmento también puede ser cualquier de los distintos dominios de unión a antígeno de un anticuerpo humano específico de antígeno. En una realización más específica, el fragmento es un scFv específico de antígeno codificado por una secuencia que está optimizada con respecto al uso de codones humanos para la expresión en células humanas.

La disposición podría ser multimérica, tal como un diacuerpo o multímeros. Lo más probable es que los multímeros se formen por emparejamiento cruzado de la parte variable de las cadenas ligeras y pesadas en un diacuerpo. La parte bisagra de la construcción puede tener múltiples alternativas, desde estar totalmente delecionada, a conservar la primera cisteína, a sustituir una serina por una prolina, a estar truncada hasta la primera cisteína. La parte Fc puede estar delecionada. Cualquier proteína que sea estable y/o dimerice puede servir para este propósito. Uno de los dominios Fc, p. ej., el dominio CH2 o<c>H3 de la inmunoglobulina humana puede utilizarse. Puede utilizarse la región bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana que se haya modificado para mejorar la dimerización. En otros aspectos, puede utilizarse solo la parte bisagra de una inmunoglobulina o parte de CD8a.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico CAR comprende una secuencia que codifica otros receptores costimuladores, tal como un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular CD28 modificado. Entre otros receptores costimuladores se incluyen, pero sin limitación, uno o más de CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10 y 4-1BB (CD137). Además de una señal primaria iniciada por CD3Z, una señal adicional proporcionada por un receptor costimulador humano insertado en un CAR humano es importante para la activación completa de las células NK y podría ayudar a mejorar la persistenciain vivoy el éxito terapéutico de la inmunoterapia adoptiva.

El dominio de señalización intracelular de un receptor quimérico para el antígeno es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se ha colocado dicho receptor. La función efectora es una función especializada de una célula diferenciada, tal como una célula NK. En realizaciones específicas, los dominios de señalización del receptor intracelular en el CAR incluyen los del complejo receptor de antígeno de linfocitos T, tal como la cadena zeta de CD3, también dominios de señalización costimuladores F<cy>RIII, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2, en solitario o en serie con CD3zeta, por ejemplo. En realizaciones específicas, el dominio intracelular (que puede denominarse dominio citoplasmático) comprende parte o la totalidad de uno o más de la cadena zeta del TCR, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, F<ce>RI<y>, ICOS/CD278, IL-2Rbeta/CD122, IL-2Ralfa/CD132, DAP10, DAP12 y CD40. Cualquier parte del complejo del receptor de linfocitos T endógeno puede usarse en el dominio intracelular. Pueden emplearse uno o varios dominios citoplasmáticos, ya que los denominados CAR de tercera generación tienen al menos dos o tres dominios de señalización fusionados para lograr un efecto aditivo o sinérgico, por ejemplo.

En determinadas realizaciones del CAR, la parte específica de antígeno del receptor (que puede denominarse dominio extracelular que comprende una región de unión a antígeno) comprende un antígeno asociado a tumor o un dominio de unión a antígeno específico de patógeno. Los antígenos incluyen antígenos de hidratos de carbono reconocidos por receptores de reconocimiento de patrones, tal como la Dectina-1. Un antígeno asociado a un tumor puede ser de cualquier tipo siempre que se exprese en la superficie celular de las células tumorales. El dominio de unión al antígeno tumoral puede ser, pero sin limitación, CD19, CD20, antígeno carcinoembrionario, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno tumoral epitelial, antígeno asociado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de unión a folato, glucoproteína gp120 de la envoltura del VIH-1, glucoproteína gp41 de la envoltura del VIH-1, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, mesotelina, GD3, HERV-K, IL-11Ralfa, cadena kappa, cadena lambda, CSPG4, ERBB2, EGFR<v>III o VEGFR2. El CAR puede comprender un scFv humanizado, tal como CD19 o CD123 humanizado.

En determinadas realizaciones, el CAR puede coexpresarse con una citocina para mejorar la persistencia cuando hay una cantidad baja de antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, el CAR puede coexpresarse con IL-15.

La secuencia del marco abierto de lectura que codifica el receptor quimérico puede obtenerse de una fuente de ADN genómico, una fuente de ADNc, o puede sintetizarse (es decir, mediante PCR), o combinaciones de los mismos. En función del tamaño del ADN genómico y del número de intrones, puede ser deseable utilizar ADNc o una combinación de los mismos, ya que se ha descubierto que los intrones estabilizan el ARNm. Además, puede ser aún más ventajoso utilizar regiones no codificantes endógenas o exógenas para estabilizar el ARNm.

Se contempla que la construcción quimérica pueda introducirse en las células NK como ADN libre o en un vector adecuado. En la técnica se conocen métodos de transfección estable de células por electroporación utilizando ADN libre. Véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.° 6.410.319. ADN libre se refiere generalmente al ADN que codifica un receptor quimérico contenido en un vector de expresión plasmídico en la orientación adecuada para su expresión.

Como alternativa, para introducir la construcción quimérica en las células NK puede utilizarse un vector vírico (p. ej., un vector retrovírico, un vector adenovírico, un vector dependoparvovírico o un vector lentivírico). Los vectores adecuados para su uso de acuerdo con el método de la presente invención no se replican en las células NK. Se conoce una gran cantidad de vectores basados en virus, donde el número de copias del virus mantenido en la célula es lo suficientemente bajo como para mantener la viabilidad de la célula, tal como, por ejemplo, vectores basados en el VIH, SV40, VEB, VHS o VPB.

La célula que expresa el CAR puede expresar un gen suicida, tal como CD20, CD52, EGFRv3, o caspasa 9 inducible.

El CAR puede comprender un dominio de unión al antígeno tumoral. El dominio de unión al antígeno tumoral puede ser, pero sin limitación, CD19, CD20, antígeno carcinoembrionario, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno tumoral epitelial, antígeno asociado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de unión a folato, glucoproteína gp120 de la envoltura del VIH-1, glucoproteína gp41 de la envoltura del VIH-1, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, mesotelina, GD3, HERV-K, IL-11Ralfa, cadena kappa, cadena lambda, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII o VEGFR2. El CAR puede comprender un scFv humanizado, tal como CD19 humanizado, CD123, mesotelina, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1 o BCMA.

V. Métodos de uso

Los aspectos de la presente divulgación se refieren a métodos de uso de células inmunitarias, tales como células NK o linfocitos T, proporcionadas en el presente documento (p. ej., expandidas por las presentes CPAU) para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno médico mediante la transferencia de una población de células inmunitarias que suscite una respuesta inmunitaria. El método incluye la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de las células inmunitarias expandidas, tratando o previniendo, de este modo, el trastorno en el sujeto. En determinados aspectos de la presente divulgación, el cáncer o la infección se tratan transfiriendo una población de células inmunitarias que suscitan una respuesta inmunitaria. Debido a su liberación de citocinas proinflamatorias, las células inmunitarias pueden invertir el microambiente tumoral antiinflamatorio y aumentar las respuestas inmunitarias adaptativas promoviendo la diferenciación, activación y/o reclutamiento de células inmunitarias accesorias en los focos de neoplasia maligna.

Los tumores para los que los presentes métodos de tratamiento son útiles, incluyen cualquier tipo de célula neoplásica maligna, tales como las que se encuentran en un tumor sólido o un tumor hemático. Tumores sólidos ilustrativos pueden incluir, pero sin limitación, un tumor de un órgano seleccionado del grupo que consiste en páncreas, colon, ciego, estómago, cerebro, cabeza, cuello, ovario, riñón, laringe, sarcoma, pulmón, vejiga, melanoma, próstata y mama. Tumores hemáticos ilustrativos incluyen tumores de la médula ósea, neoplasias malignas de linfocitos T o B, leucemias, linfomas, blastomas, mielomas y similares. Otros ejemplos de cánceres que pueden tratarse utilizando los métodos proporcionados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma epidermoide de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal), cáncer de páncreas, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, varios tipos de cáncer de cabeza y cuello y melanoma.

El cáncer puede ser específicamente del siguiente tipo histológico, aunque no se limita a estos: neoplasia, maligno; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de células gigantes y fusiformes; carcinoma microcítico; carcinoma papilar; carcinoma epidermoide; carcinoma linfoepitelial; carcinoma de células basales; carcinoma pilomatricial; carcinoma de células transicionales; carcinoma papilar de células transicionales; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinados; adenocarcinoma trabecular; carcinoma adenoideo quístico; adenocarcinoma en pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, poliposis familiar del colon; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma bronquioloalveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma cortical suprarrenal; carcinoma endometrioide; carcinoma de anejos cutáneos; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma papilar seroso; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células en forma de anillo de sello; carcinoma ductal infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget, mamaria; carcinoma de células acinares; carcinoma escamocelular; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor del estroma ovárico, maligno; tecoma, maligno; tumor de células de la granulosa, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor de células de Leydig, maligno; tumor de lipocitos, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamario, maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelánico; melanoma de diseminación superficial; melanoma maligno lentigo; melanomas lentigosos acrales; melanomas nodulares; melanoma maligno en nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso, maligno; mixosarcoma; liposarcoma; liomiosarcoma; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor mixto, maligno; tumor mixto mulleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumores filoides, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma, maligno; struma ovarii, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical; condrosarcoma; condroblastoma, maligno; condrosarcoma mesenquimatoso; tumor óseo de células gigantes; sarcoma de Ewing; tumor odontogénico, maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma, maligno; fibrosarcoma ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebeloso; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogénico olfativo; meningioma, maligno; neurofibrosarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de células granulares, maligno; linfoma maligno; enfermedad de Hodgkin; de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno, pequeño linfocítico; linfoma maligno, de células grandes, difuso; linfoma maligno, folicular; micosis fungoide; otros linfomas no Hodgkin especificados; linfoma de linfocitos B; linfoma no Hodgkin (NHL, por sus siglas en inglés) folicular/de bajo grado; NHL linfocítico de células pequeñas (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado; NHL con gran masa tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; macroglobulinemia de Waldenstrom; histiocitosis maligna; mieloma múltiple; sarcoma de mastocitos; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basófila; leucemia eosinófila; leucemia monocítica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; tricoleucemia; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia mieloide aguda (LMA); y leucemia mieloblástica crónica.

Aspectos particulares de la divulgación se refieren a métodos de tratamiento de la leucemia. La leucemia es un cáncer de la sangre o de la médula ósea y se caracteriza por una proliferación anómala (producción por multiplicación) de glóbulos sanguíneos, generalmente glóbulos blancos (leucocitos). Forma parte del amplio grupo de enfermedades denominadas neoplasias hemáticas. Leucemia es un término amplio que abarca un espectro de enfermedades. La leucemia se divide clínica y patológicamente en sus formas aguda y crónica.

La leucemia aguda se caracteriza por la rápida proliferación de glóbulos sanguíneos inmaduros. Esta aglomeración hace que la médula ósea sea incapaz de producir glóbulos sanguíneos sanos. Las formas agudas de leucemia pueden aparecer en niños y adultos jóvenes. En la leucemia aguda se requiere un tratamiento inmediato debido al rápido avance y acumulación de las células neoplásicas malignas, que después pasan al torrente sanguíneo y se extienden a otros órganos del cuerpo. La afectación del sistema nervioso central (SNC) es infrecuente, aunque la enfermedad puede causar ocasionalmente parálisis de los nervios craneales. La leucemia crónica se caracteriza por la acumulación excesiva de glóbulos sanguíneos relativamente maduros, pero aún anómalos. Normalmente tarda meses o años en avanzar, las células se producen a un ritmo mucho mayor que las células normales, dando lugar a una gran cantidad de muchos glóbulos blancos anómalos en la sangre. La leucemia crónica se da sobre todo en personas mayores, pero teóricamente puede darse en cualquier grupo de edad. Mientras que la leucemia aguda debe tratarse inmediatamente, las formas crónicas a veces se controlan durante algún tiempo antes del tratamiento para garantizar la máxima eficacia de la terapia.

Asimismo, las enfermedades se clasifican en linfocíticas o linfoblásticas, lo que indica que el cambio canceroso tuvo lugar en un tipo de célula de la médula ósea que normalmente pasa a formar linfocitos, y mielógena o mieloide, lo que indica que el cambio canceroso se produjo en un tipo de célula de la médula ósea que normalmente pasa a formar glóbulos rojos, algunos tipos de glóbulos blancos y plaquetas.

La leucemia linfocítica aguda (también conocida como leucemia linfoblástica aguda o LLA) es el tipo de leucemia más frecuente en niños pequeños. Esta enfermedad también afecta a los adultos, especialmente a los mayores de 65 años. La leucemia linfocítica crónica (LLC) afecta con mayor frecuencia a adultos mayores de 55 años. A veces se da en adultos jóvenes, pero casi nunca afecta a los niños. La leucemia mielógena aguda (también conocida como leucemia mieloide aguda o LMA) es más frecuente en adultos que en niños. Este tipo de leucemia se denominaba anteriormente leucemia aguda no linfocítica. La leucemia mielógena crónica (LMC) se presenta principalmente en adultos.

El linfoma es un tipo de cáncer que se origina en los linfocitos (un tipo de glóbulo blanco del sistema inmunitario de los vertebrados). Existen muchos tipos de linfoma. De acuerdo con el Instituto Nacional de Ciencias de la Salud de Estados Unidos, los linfomas representan alrededor del cinco por ciento de todos los casos de cáncer en Estados Unidos, y el linfoma de Hodgkin en particular representa menos del uno por ciento de todos los casos de cáncer en Estados Unidos. Dado que el sistema linfático forma parte del sistema inmunitario del cuerpo, pacientes con un sistema inmunitario debilitado, tal como infección por el VIH o determinados fármacos o medicamentos, también tienen una mayor incidencia de linfoma.

En determinados aspectos de la presente divulgación, las células inmunitarias se suministran a un individuo que lo necesite, tal como un individuo que tiene cáncer o una infección. A continuación, las células refuerzan el sistema inmunitario del individuo para que ataque a las células cancerosas o patógenas correspondientes. En algunos casos, el individuo recibe una o más dosis de células inmunitarias. En los casos en que el individuo reciba dos o más dosis de las células inmunitarias, la duración entre las administraciones debe ser suficiente para permitir el tiempo de propagación en el individuo, y en aspectos específicos de la divulgación, la duración entre dosis es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o más días.

La fuente de células inmunitarias preactivadas y expandidas puede ser de cualquier tipo, pero en aspectos específicos, las células se obtienen de un banco de sangre de cordón umbilical, de sangre periférica, de células madre o de células madre pluripotentes inducidas, por ejemplo. Las dosis adecuadas para un efecto terapéutico serían al menos 105 o entre aproximadamente 105 y aproximadamente 1010 células por dosis, por ejemplo, preferentemente en una serie de ciclos de dosificación. Una pauta posológica ilustrativa consiste en cuatro ciclos de una semana de dosis escalonadas, comenzando al menos a aproximadamente 105 células el Día 0, por ejemplo, aumentando incrementalmente hasta una dosis específica de aproximadamente 1010 células en varias semanas desde el inicio de un esquema de escalado de dosis intra-paciente. Los modos de administración ilustrativos incluyen administración intravenosa, subcutánea, intracavitaria (por ejemplo, mediante un dispositivo de acceso al depósito), intraperitoneal, e inyección directa en una masa tumoral.

En un método ilustrativo, las células NK pueden obtenerse de una muestra biológica, tal como de una o más unidades de sangre de cordón. La unidad de sangre de cordón puede ser una unidad de sangre de cordón congelada. La unidad de sangre de cordón puede descongelarse y someterse a un gradiente de Ficoll para obtener células mononucleares. Las células mononucleares pueden reducirse de células positivas para CD3, CD14 y CD19, tal como por CliniMAS(Clínica! Magnetic Cell Separation System,sistema clínico automatizado de separación celular magnética). Después, las células NK seleccionadas negativamente pueden cultivarse en presencia de CPA e IL-2 (p. ej., 200 U/ml). A continuación, las células NK pueden transducirse con sobrenadante retrovírico que exprese un CAR y cultivarse con CPA irradiadas con y e IL-2. Por último, las células pueden clasificarse para la expresión positiva del CAR, tales como CD56, CD16, CD3, CD19, CD14 o CD45.

Las células inmunitarias generadas según los métodos presentes tienen muchos usos posibles, incluidos usos experimentales y terapéuticos. En particular, se contempla que dichas poblaciones celulares sean extremadamente útiles para suprimir respuestas inmunitarias no deseables o inapropiadas. En dichos métodos, una pequeña cantidad de células inmunitarias se extrae de un paciente y a después se manipulan y expandenex vivoantes de reinfundirlas en el paciente. Ejemplos de enfermedades que pueden tratarse de este modo son las enfermedades autoinmunitarias y las afecciones en las que es deseable suprimir la actividad inmunitaria, p. ej., para la tolerancia al alotrasplante. Un método terapéutico podría comprender proporcionar un mamífero, obtener células inmunitarias del mamífero; expandir las células inmunitariasex vivode acuerdo con los métodos de los presentes métodos descritos anteriormente; y administrar las células inmunitarias expandidas al mamífero que se va a tratar.

Una composición farmacéutica de la presente divulgación puede usarse sola o junto con otros agentes bien establecidos útiles para tratar el cáncer. Ya sea suministrada en solitario o junto con otros agentes, la composición farmacéutica de la presente divulgación puede suministrarse por diversas vías y en diversos lugares del cuerpo de un mamífero, particularmente un ser humano, para conseguir un efecto en particular. Un experto en la materia reconocerá que, aunque puede utilizarse más de una vía de administración, una vía en particular puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra. Por ejemplo, el suministro intradérmico puede utilizarse ventajosamente sobre la inhalación para el tratamiento del melanoma. El suministro local o sistémico puede llevarse a cabo mediante una administración que comprende la aplicación o instilación de la formulación en cavidades corporales, inhalación o insuflación de un aerosol, o por introducción parenteral, que comprende la administración intramuscular, intravenosa, intraportal, intrahepática, peritoneal, subcutánea o intradérmica.

Determinados aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos de tratamiento o prevención de un trastorno mediado por el sistema inmunitario. En una realización, el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria. Los ejemplos no limitativos de enfermedades autoinmunitarias incluyen: alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad autoinmunitaria de Addison, enfermedades autoinmunitarias de las glándulas suprarrenales, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, ooforitis y orquitis autoinmunitarias, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, enfermedad celíaca con dermatitis, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmunitaria (SFCDI), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome CREST, enfermedad por crioaglutininas, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP, por sus siglas en inglés), neuropatía por IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, diabetes mellitus de tipo 1 y mediada por el sistema inmunitario, miastenia grave, síndrome nefrótico (tal como enfermedad de cambios mínimos, glomeruloesclerosis focal o nefropatía mebranosa), pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis (tal como poliarteritis nodosa, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes o vasculitis por dermatitis herpetiforme), vitíligo y granulomatosis de Wegener. Por tanto, algunos ejemplos de una enfermedad autoinmunitaria que puede tratarse utilizando los métodos divulgados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus de tipo I, enfermedad de Crohn; colitis ulcerosa, miastenia grave, glomerulonefritis, espondilitis anquilosante, vasculitis o psoriasis. El sujeto también puede tener un trastorno alérgico tal como Asma.

En otro aspecto más de la divulgación, el sujeto es el receptor de un órgano o células madre trasplantados y las células inmunitarias se usan para prevenir y/o tratar el rechazo. En aspectos particulares de la divulgación, el sujeto tiene o corre el riesgo de desarrollar la enfermedad injerto contra huésped. La EICH es una posible complicación de cualquier trasplante que utilice o contenga células madre de un donante emparentado o no emparentado. Existen dos tipos de EICH, aguda y crónica. La EICH aguda aparece en los tres primeros meses tras el trasplante. Los signos de EICH aguda incluyen una erupción cutánea rojiza en manos y pies que puede extenderse y agravarse, con descamación o ampollas en la piel. La EICH aguda también puede afectar al estómago y al intestino, en cuyo caso aparecen calambres, náuseas y diarrea. El color amarillento de la piel y los ojos (ictericia) indica que la EICH aguda ha afectado al hígado. La EICH crónica se clasifica en función de su gravedad: un estadio/grado 1 es leve; un estadio/grado 4 es grave. La EICH crónica se desarrolla tres meses o más después del trasplante. Los síntomas de la EICH crónica son similares a los de la EICH aguda, pero además, la EICH crónica puede afectar también a las glándulas mucosas de los ojos, a las glándulas salivales de la boca y a las glándulas que lubrican el revestimiento del estómago y del intestino. Puede utilizarse cualquiera de las poblaciones de células inmunitarias divulgadas en el presente documento. Entre los ejemplos de órganos trasplantados se incluye el trasplante de órganos sólidos, tales como riñón, hígado, piel, páncreas, pulmón y/o corazón, o un trasplante celular tal como el de islotes, hepatocitos, mioblastos, médula ósea, o células madre hematopoyéticas o de otro tipo. El trasplante puede ser un trasplante compuesto, tal como el de los tejidos de la cara. Pueden administrarse células inmunitarias antes del trasplante, al mismo tiempo que el trasplante, o después del trasplante. En algunas realizaciones, las células inmunitarias se administran antes del trasplante, tal como al menos 1 hora, al menos 12 horas, al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, o al menos 1 mes antes del trasplante. En un ejemplo específico no limitativo, la administración de la cantidad terapéuticamente eficaz de células inmunitarias tiene lugar entre 3 y 5 días antes del trasplante.

En determinados aspectos de la divulgación, las células inmunitarias se administran junto con un segundo agente terapéutico. Por ejemplo, el segundo agente terapéutico puede comprender linfocitos T, un agente inmunomodulador, un anticuerpo monoclonal, o un agente quimioterápico. En ejemplos no limitativos, el agente inmunomodulador es lenolidomida, el anticuerpo monoclonal es rituximab, ofatumab o lumiliximab, y el agente quimioterápico es fludarabina o ciclofosfamida.

Una composición de la presente divulgación puede proporcionarse en una forma farmacéutica unitaria, en donde cada unidad de dosificación, p. ej., una inyección, contiene una cantidad predeterminada de la composición, sola o en combinación apropiada con otros principios activos. La expresión forma farmacéutica unitaria, como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente distintas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composición de la presente divulgación, sola o junto con otros principios activos, calculada en cantidad suficiente para producir el efecto deseado, en asociación con un diluyente, transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable, cuando sea apropiado. Las especificaciones de las nuevas formas farmacéuticas unitarias de la presente invención, dependen de la farmacodinámica particular asociada a la composición farmacéutica en el sujeto en particular.

De manera deseable, una cantidad eficaz o un número suficiente de las células inmunitarias transducidas aisladas está presente en la composición y se introduce en el sujeto de tal manera que se establezcan respuestas antitumorales específicas y a largo plazo para reducir el tamaño de un tumor o eliminar el crecimiento o re-crecimiento tumoral, lo cual no ocurriría en ausencia de dicho tratamiento. De manera deseable, la cantidad de células inmunitarias reintroducidas en el sujeto provoca una disminución de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % del tamaño del tumor en comparación con las mismas condiciones en donde las células inmunitarias no están presentes.

Por consiguiente, la cantidad de células inmunitarias administradas debe tener en cuenta la vía de administración y debe ser de tal que se introduzca un número suficiente de células inmunitarias para lograr la respuesta terapéutica deseada. Asimismo, las cantidades de cada agente activo incluidas en las composiciones descritas en el presente documento (p. ej., la cantidad por cada célula a contactar o la cantidad por determinado peso corporal) pueden variar en diferentes aplicaciones. En general, deseablemente, la concentración de células inmunitarias debe ser suficiente para proporcionar en el sujeto tratado al menos entre aproximadamente 1 * 106 y aproximadamente 1 * 109 células inmunitarias, incluso más deseablemente, entre aproximadamente 1 * 107 y aproximadamente 5 * 108 células inmunitarias, aunque puede utilizarse cualquier cantidad adecuada, ya sea por encima, p. ej., superior a 5 * 108 células, o por debajo, p. ej., inferior a 1 * 107 células. El esquema de dosificación puede basarse en terapias celulares bien establecidas (véase, p. ej., Topalian y Rosenberg, 1987; patente de EE.u U. n.° 4.690.915), o puede emplearse una estrategia alternativa de infusión continua.

Estos valores proporcionan una orientación general del intervalo de células inmunitarias que debe utilizar el profesional al optimizar el método de la presente invención para llevarla a la práctica. En el presente documento, la mención de dichos intervalos no excluye en absoluto el uso de una cantidad mayor o menor de un componente, que pueda estar justificada en una aplicación particular. Por ejemplo, la dosis y el esquema reales pueden variar dependiendo de si las composiciones se administran junto con otras composiciones farmacéuticas, o dependiendo de las diferencias interindividuales en farmacocinética, disposición del fármaco y metabolismo. Un experto en la materia puede realizar fácilmente los ajustes necesarios de acuerdo con las exigencias de cada situación particular.

VI. Kits

En algunos aspectos de la divulgación, se proporciona un kit que puede incluir, por ejemplo, uno o más medios y componentes para la producción de CPAU y/o células inmunitarias. Dichas formulaciones pueden comprender un combinación de factores, en una forma adecuada para combinarse con CPA y/o células inmunitarias. El sistema reactivo puede envasarse en medio acuoso o en forma liofilizada, cuando sea apropiado. El medio de contención de los kits incluirá generalmente al menos un vial, un tubo de ensayo, un matraz, un frasco, una jeringuilla u otro medio de contención, en el que pueda colocarse un componente y, preferentemente, dividirse en partes alícuotas adecuadamente. Cuando exista más de un componente en el kit, éste también contendrá generalmente un segundo, tercer u otro recipiente adicional en el que pueden colocarse los componentes adicionales por separado. Sin embargo, en un vial pueden incluirse diversas combinaciones de componentes. Los componentes del kit pueden proporcionarse como polvo(s) deshidratado(s). Cuando los reactivos y/o los componentes se proporcionan como un polvo deshidratado, éste puede reconstituirse mediante la adición de un disolvente adecuado. Se contempla que el disolvente también pueda proporcionarse en otro medio de contención. Normalmente, los kits también incluyen medios para contener el/los componente(s) del kit en un envase compacto para su comercialización. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o por soplado, en los que se alojan los viales deseados. El kit también puede incluir instrucciones de uso, tal como en formato impreso o electrónico, tal como en formato digital.

VII. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la materia deberían apreciar que las técnicas divulgadas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por el inventor para que funcionen bien en la práctica de la invención, y por tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica.

Ejemplo 1 - Combinación de mbIL21, 4-1BBL y SLAM (CD48/CS1)

Se generaron células presentadoras de antígenos universales (CPAU) mediante la transducción de células K562 con construcciones retrovíricas para IL-21 unida a la membrana y 41BBL (ligando CD137) con CD48-Katushka (proteína fluorescente roja) o CS1-EGFP(enhanced green fluorescent protein,proteína fluorescente verde mejorada). Los mapas y anotaciones de la construcción retrovírica con VLMM se muestran en las FIGS. 4A-4D. El clon 46 (FIG. 3B) se produjo a partir de la expresión forzada de mbIL-21 y 41BBL en CPS K562 sensibles a células NK (HLA-A-, HLA-B-) (FIG. 3A). La CPAU se generó mediante la expresión forzada de mbIL-1, 41BBL y CD48 en células K562 (FIG.

3C). La CPAU2 se generó mediante la expresión forzada de mbIL-21, 41BBL y CS1 en células K562 (FIG. 3D).

La expansión numérica de células NK se realizó con activación por el clon 46, CPAU o CPAU2. La proliferación y expansión de células NK mediante cocultivo de CPA mostró que el Clon 46 era superior en cuanto a su capacidad de expansión tanto de células NK no transducidas (NK-NT) como transducidas con CAR (NK-SG4) en comparación con el clon 9 publicado anteriormente (FIG. 2B).

La expansión de células NK mediante cocultivo con CPAU demostró ser superior en cuanto a su capacidad para reducir el tiempo de duplicación de células NK a 31,38 horas en comparación con el clon 9 previamente publicado (tiempo de duplicación de 33 horas), produciendo una ventaja proliferativa del 44 % (expansión de 1671 veces para CPAU frente a expansión de 1161 veces para el clon 9) durante 2 semanas (FIG. 2E). La relación entre el tiempo de duplicación, la expansión exponencial y la población de células inicial se resume con la siguiente fórmula:

dondeNfes el número final de células,Nbes la célula inicial, e=2,71828 (constante matemática conocida también como número de Euler),Tes el intervalo de tiempo de cultivo en horas,Tdes el tiempo de duplicación en horas. El tiempo de duplicación afecta al número final de células de forma exponencial, lo que potencia la ventaja proliferativa durante el periodo de cultivo celular designado, permitiendo obtener cantidades clínicamente relevantes de células en un plazo reducido. Por lo tanto, los presentes métodos permiten la producción eficaz de células NK mediante cocultivo con las CPAU.

La presente tecnología de plataforma aprovecha vías terapéuticas combinatorias específicas para proporcionar métodos prácticos para la fabricación de grandes cantidades de células NK de calidad clínica sumamente funcionales y citotóxicas previstas para la inmunoterapia del cáncer. Las células expandidas son 100 % células NK, sin linfocitos T detectables, evitando efectos secundarios no deseados de injerto contra huésped comunes en muchas preparaciones de células inmunitarias.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Las siguientes referencias bibliográficas, se ofrecen en la medida en que proporcionan detalles de procedimientos ilustrativos u otros detalles complementarios a los expuestos en el presente documento.

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Olssonet al.J. Clin. Invest. 1990;86:981-985.

Taitanoet al.,The Journal of Immunology, 196, 2016.

Patente de EE. UU. n.° 5.939.281

Patente de EE. UU. n.° 6.218.132

Patente de EE. UU. n.° 6.264.951

Patente de EE. UU. n.° 7.488.490

Publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0078113

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula presentadora de antígeno universal (CPAU) genomodificada para que exprese (1) CD48 y/o CS1 (CD319), (2) interleucina-21 unida a la membrana (mbIL-21) y (3) ligando 41b B (41BBL).

2. La CPAU de la reivindicación 1, en donde:

(a) la CPAU es una CPAU procedente de células leucémicas, opcionalmente, en donde la CPAU procedente de células leucémicas se define además como una célula K562;

(b) la CPAU se ha genomodificado mediante transducción retrovírica, opcionalmente, en donde la transducción retrovírica se define además como una transducción que utiliza una construcción vírica de SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:2;

(c) la CPAU no expresa prácticamente HLA clase I, II, endógeno ni moléculas CD1d; o

(d) la CPAU expresa ICAM-1 (CD54) y LFA-3 (CD58).

3. La CPAU de la reivindicación 1 o 2, en donde la CPAU expresa CD48.

4. La CPAU de la reivindicación 1 o 2, en donde la CPAU expresa CS1.

5. La CPAU de la reivindicación 1 o 2, en donde la CPAU expresa CD48 y CS1.

6. La CPAU de la reivindicación 1 o 2, en donde la CPAU se irradia.

7. Un método para expandir células inmunitarias, que comprende cultivar las células inmunitarias en presencia de una cantidad eficaz de las CPAU de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. El método de la reivindicación 7, en donde:

(a) las células inmunitarias y las CPAU se cultivan en una proporción de 3:1 a 1:3, opcionalmente de 1:2;

(b) las CPAU se añaden al menos una segunda vez; o

(c) el método se realiza en medios sin suero.

9. El método de la reivindicación 7, en donde la expansión se realiza en presencia de IL-2.

10. El método de la reivindicación 9, en donde:

(a) la IL-2 está presente en una concentración de 10-500 U/ml, opcionalmente de 100-300 U/ml o 200 U/ml; (b) la IL-2 es IL-2 humana recombinante; o

(c) la IL-2 se repone cada 2-3 días.

11. El método de la reivindicación 7, en donde las células inmunitarias son:

(a) células NK, opcionalmente, en donde las células NK son células mononucleares de sangre de cordón (CMSC) o en donde las células NK se definen además como células NK CD56+;

(b) linfocitos T;

(c) procedentes de SC, de sangre periférica (SP), de células madre o de médula ósea, opcionalmente, en donde las células madre son células madre pluripotentes inducidas; o

(d) se obtienen de SC, opcionalmente, en donde la SC se agrupa a partir de 2 o más unidades individuales de sangre de cordón, opcionalmente, en donde la SC se agrupa a partir de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades individuales de sangre de cordón.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en donde las células inmunitarias se genomodifican para que expresen un receptor quimérico para el antígeno (CAR).

13. El método de la reivindicación 12, en donde el CAR comprende:

(a) un dominio humanizado de unión al antígeno; o

(b) CD19, CD123, mesotelina, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1, o dominio de unión al antígeno BCMA.

14. El método de la reivindicación 12, en donde el CAR comprende un dominio de unión al antígeno CD19 o CD123.

15. El método de la reivindicación 12, en donde las células inmunitarias expresan:

(a) IL-15; o

(b) un gen suicida, en donde el gen suicida es CD20, CD52, EGFRv3, o caspasa 9 inducible.