ES3036072T3 - Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy - Google Patents

Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy

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ES3036072T3 ES19836648T ES19836648T ES3036072T3 ES 3036072 T3 ES3036072 T3 ES 3036072T3 ES 19836648 T ES19836648 T ES 19836648T ES 19836648 T ES19836648 T ES 19836648T ES 3036072 T3 ES3036072 T3 ES 3036072T3
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Abstract

La presente invención proporciona métodos mejorados y/o abreviados para expandir TIL y producir poblaciones terapéuticas de TIL, incluyendo nuevos métodos para expandir poblaciones de TIL en un sistema cerrado que conducen a una mayor eficacia, un fenotipo mejorado y una mayor salud metabólica de los TIL en un período de tiempo más corto, a la vez que permiten reducir la contaminación microbiana y los costos. Dichos TIL se utilizan en regímenes de tratamiento terapéutico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procesos para la producción de linfocitos infiltrantes de tumores y usos de los mismos en inmunoterapia
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0001]El tratamiento de cánceres voluminosos y refractarios mediante la transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) representa un potente enfoque terapéutico para pacientes con mal pronóstico. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. Para que la inmunoterapia tenga éxito se requiere un gran número de TIL, y para su comercialización se necesita un proceso sólido y fiable. Esto ha sido todo un reto debido a los problemas técnicos, logísticos y normativos de la expansión celular. La expansión de TIL basada en IL-2 seguida de un "proceso de expansión rápida" (REP) se ha convertido en el método preferido para la expansión de TIL por su rapidez y eficacia. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233 39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. El REP puede multiplicar por 1.000 los TIL en un periodo de 14 días, aunque requiere un gran exceso(p. ej.,200 veces) de células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas (PBM<c>, también conocidas como células mononucleares (MNC)), a menudo de múltiples donantes, como células alimentadoras, así como anticuerpos anti-CD3 (OKT3) y altas dosis de IL-2. Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. Los TIL que se han sometido a un procedimiento REP han producido una terapia celular adoptiva exitosa tras la inmunosupresión del huésped en pacientes con melanoma. Los parámetros actuales de aceptación de la infusión se basan en lecturas de la composición de los TIL(por ejemplo,positividad de CD28, CD8, o CD4) y en la expansión en pliegues y la viabilidad del producto REP. El documento WO2018/081473 divulga un método de expansión de linfocitos infiltrantes de tumores que incluye una expansión pre-REP en presencia de IL-2 y una expansión REP que se produce en presencia de IL-2, OKT-3 y APC durante al menos catorce días.
[0002]Los procesos actuales de fabricación de TIL están limitados por la duración, el coste, los problemas de esterilidad y otros factores descritos en el presente documento. Existe una necesidad urgente de proporcionar procesos de fabricación de TIL y terapias basadas en dichos procesos que se caractericen por una mayor rentabilidad y escalabilidad en la fabricación y fenotipos anticancerígenos más potentes de las preparaciones de TIL producidas para el tratamiento de pacientes humanos en múltiples centros clínicos. La presente invención satisface esta necesidad proporcionando un novedoso proceso de expansión de TIL que incluye células alimentadoras presentadoras de antígeno desde el inicio de la expansión, con el fin de preparar los TIL para la expansión, en lugar de una etapa tradicional de expansión previo a la PREP, permitiendo así una reducción sustancial del tiempo total del proceso de expansión.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0003]La presente invención proporciona métodos mejorados y/o abreviados para expandir TIL y producir poblaciones terapéuticas de TIL. La presente invención se define en las reivindicaciones.
[0004]La presente invención proporciona un método para expandir los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando una primera población de TIL, dicha primera población de TIL obtenible procesando una muestra tumoral de un tumor resecado de un sujeto en múltiples fragmentos tumorales, en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3, y células presentadoras de antígeno (APC) para producir una segunda población de TIL, donde la primera expansión con sensibilización se realiza en un recipiente que comprende una primera superficie permeable al gas, donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante un primer periodo de aproximadamente 1 a 7/8 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es mayor en número que la primera población de TIL;
(b) realizar una segunda expansión rápida poniendo en contacto la segunda población de TIL con un medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3, y APC adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde el número de APC en la segunda expansión rápida es al menos dos veces el número de APC en la etapa (a), en el que la segunda expansión rápida se realiza durante un segundo periodo de aproximadamente 1 a 11 días para obtener la tercera población de TIL, en el que la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en el que la segunda expansión rápida se realiza en un recipiente que comprende una segunda superficie permeable al gas; y
(c) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida en la etapa b).
[0005]También se divulga, pero no se reivindica, un método para expandir los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) obtener y/o recibir una primera población de TIL de un tumor resecado de un sujeto procesando una muestra tumoral obtenida del sujeto en múltiples fragmentos tumorales;
(b) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, opcionalmente OKT-3, y opcionalmente células presentadoras de antígeno (APC) para producir una segunda población de TIL, donde la primera expansión con sensibilización se realiza en un recipiente que comprende una primera área de superficie permeable al gas, donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante un primer periodo de 1 a 7/8 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es mayor en número que la primera población de TIL;
(c) realizar una segunda expansión rápida suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3, y APC adicionales, para producir una tercera población de TIL, donde el número de APC añadidas en la segunda expansión rápida es al menos dos veces el número de APC añadidas en la etapa (b), en donde la segunda expansión rápida se realiza durante un segundo periodo de 1 a 11 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en donde la segunda expansión rápida se realiza en un recipiente que comprende una segunda superficie permeable al gas;
(d) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida en la etapa (c); y
(e) transferir la población de TIL cosechada en la etapa d) a una bolsa de infusión.
[0006]También se divulga, pero no se reivindica, un método para expandir los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) obtener y/o recibir una primera población de TIL de un tumor resecado de un sujeto procesando una muestra tumoral obtenida del sujeto en múltiples fragmentos tumorales;
(b) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, opcionalmente OKT-3, y opcionalmente comprende células presentadoras de antígeno (APC), para producir una segunda población de TIL, donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante un primer periodo de aproximadamente 1 a 7/8 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es mayor en número que la primera población de TIL;
(c) realizar una segunda expansión rápida poniendo en contacto la segunda población de TIL con un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3, y APCs, para producir una tercera población de TIL, donde la segunda expansión rápida se realiza durante un segundo periodo de aproximadamente 1 a 11 días para obtener la tercera población de TIL, donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL; y
(d) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida en la etapa c).
[0007]En algunas realizaciones, "obtención" indica que los TIL empleados en el método y/o proceso pueden derivarse directamente de la muestra (incluyendo de una resección quirúrgica, biopsia con aguja, biopsia de núcleo, biopsia pequeña u otra muestra) como parte de las etapas del método y/o proceso. En algunas realizaciones, "recibir" puede indicar que los TIL empleados en el método y/o proceso pueden derivarse indirectamente de la muestra (incluyendo de una resección quirúrgica, biopsia con aguja, biopsia de núcleo, biopsia pequeña, u otra muestra) y luego emplearse en el método y/o proceso, (por ejemplo, cuando la etapa (a) comienza con TIL que ya se han derivado de la muestra mediante un proceso separado no incluido en la parte (a), dichos TIL podrían denominarse "recibidos").
[0008]En algunas realizaciones del método, en la etapa (b) el medio de cultivo celular comprende además células presentadoras de antígeno (APC), y en el que el número de APC en el medio de cultivo en la etapa (c) es mayor que el número de APC en el medio de cultivo en la etapa (b).
[0009]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para expandir los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando una primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, opcionalmente OKT-3, y opcionalmente comprende células presentadoras de antígeno (APC), para producir una segunda población de TIL, donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante un primer periodo de aproximadamente 1 a 7/8 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es mayor en número que la primera población de TIL;
(b) realizar una segunda expansión rápida poniendo en contacto la segunda población de TIL con un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3, y APC, para producir una tercera población de TIL, donde la segunda expansión rápida se realiza durante un segundo periodo de aproximadamente 1 a 11 días para obtener la tercera población de TIL, donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL; y
(c) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida en la etapa b).
[0010]En algunas realizaciones del método, en la etapa (a) el medio de cultivo celular comprende además células presentadoras de antígeno (APC), y en el que el número de APC en el medio de cultivo en la etapa (c) es mayor que el número de APC en el medio de cultivo en la etapa (b).
[0011]En algunas realizaciones, la relación entre el número de APC en la segunda expansión rápida y el número de APC en la primera expansión con sensibilización se selecciona entre un intervalo de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 20:1.
[0012]En algunas realizaciones, la relación entre el número de APC en la segunda expansión rápida y el número de APC en la primera expansión con sensibilización se encuentra en un intervalo de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 10:1.
[0013]En algunas realizaciones, la relación entre el número de APC en la segunda expansión rápida y el número de APC en la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 5:1.
[0014]En algunas realizaciones, la relación entre el número de APC en la segunda expansión rápida y el número de APC en la primera expansión con sensibilización se encuentra en un intervalo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 3:1.
[0015]En algunas realizaciones, la relación entre el número de APC en la segunda expansión rápida y el número de APC en la primera expansión con sensibilización es de aproximadamente 2:1.
[0016]En algunas realizaciones, el número de APC en la primera expansión con sensibilización se selecciona entre 1,0 x 106 APCs/cm2y 4,5 * 106 APCs/cm2, y en las que el número de APC en la segunda expansión rápida se selecciona entre 2,5 * 106 APCs/cm2 y 7,5 * 106 APCs/cm2.
[0017]En algunas realizaciones, el número de APC en la primera expansión con sensibilización se selecciona entre 1,5 * 106 APCs/cm2 y 3,5 * 106 APCs/cm2, y el número de APC en la segunda expansión rápida se selecciona entre 3,5 * 106 APCs/cm2 y 6,0 * 106 APCs/cm2.
[0018]En algunas realizaciones, el número de APC en la primera expansión con sensibilización se selecciona en un intervalo de aproximadamente 2,0 * 106 APCs/cm2 a aproximadamente 3,0 * 106 APCs/cm2, y en el que el número de APC en la segunda expansión rápida se selecciona en un intervalo de aproximadamente 4,0 * 106 APCs/cm2 a aproximadamente 5,5 * 106 APCs/cm2.
[0019]En algunas realizaciones, el número de APC en la primera expansión con sensibilización se selecciona en un intervalo de aproximadamente 1 * 108 APC a aproximadamente 3,5 * 108 APC, y en el que el número de APC en la segunda expansión rápida se selecciona en un intervalo de aproximadamente 3,5 * 108 APC a aproximadamente 1 * 109 APC.
[0020]En algunas realizaciones, el número de APC en la primera expansión con sensibilización se selecciona entre 1,5 * 108 APC y 3 * 108 APC, y el número de APC en la segunda expansión rápida se selecciona entre 4 * 108 APC y 7,5 * 108 APC.
[0021]En algunas realizaciones, el número de APC en la primera expansión con sensibilización se selecciona en un intervalo de aproximadamente 2 * 108 APC a aproximadamente 2,5 * 108 APC, y en el que el número de APC en la segunda expansión rápida se selecciona en un intervalo de aproximadamente 4,5 * 108 APC a aproximadamente 5,5 * 108 APC.
[0022]En algunas realizaciones, se añaden aproximadamente 2,5 * 108 APC a la primera expansión con sensibilización y 5 * 108 APC a la segunda expansión rápida.
[0023]En algunas realizaciones, la relación entre el número de TIL en la segunda población de TIL y el número de TIL en la primera población de TIL es de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 100:1.
[0024]En algunas realizaciones, la relación del número de TIL en la segunda población de TIL con respecto al número de TIL en la primera población de TIL es de aproximadamente 50:1.
[0025]En algunas realizaciones, la relación del número de TIL en la segunda población de TIL con respecto al número de TIL en la primera población de TIL es de aproximadamente 25:1.
[0026]En algunas realizaciones, la relación entre el número de TIL en la segunda población de TIL y el número de TIL en la primera población de TIL es de aproximadamente 20:1.
[0027] En algunas realizaciones, la relación del número de TIL en la segunda población de TIL con respecto al número de TIL en la primera población de TIL es de aproximadamente 10:1.
[0028] En algunas realizaciones, la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL.
[0029] En algunas realizaciones, el método comprende realizar, después de la etapa de cosechar la población terapéutica de TIL, la etapa adicional de:
transferir la población terapéutica cosechada de TIL a una bolsa de infusión.
[0030] En algunas realizaciones, los múltiples fragmentos tumorales se distribuyen en una pluralidad de recipientes separados, en cada uno de los cuales se obtiene la segunda población de TIL a partir de la primera población de TIL en la etapa de la primera expansión con sensibilización y la tercera población de TIL se obtiene a partir de la segunda población de TIL en la etapa de la segunda expansión rápida, y en el que la población terapéutica de TIL obtenida a partir de la tercera población de TIL se recoge de cada uno de la pluralidad de recipientes y se combina para producir la población de TIL cosechada.
[0031] En algunas realizaciones, la pluralidad de contenedores separados comprende al menos dos contenedores separados.
[0032] En algunas realizaciones, la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a veinte recipientes separados.
[0033] En algunas realizaciones, la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a diez recipientes separados.
[0034] En algunas realizaciones, la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a cinco recipientes separados.
[0035] En algunas realizaciones, cada uno de los contenedores separados comprende una primera superficie permeable al gas.
[0036] En algunas realizaciones, los múltiples fragmentos tumorales se distribuyen en un único contenedor.
[0037] En algunas realizaciones, el contenedor único comprende una primera superficie permeable al gas.
[0038] En algunas realizaciones, la etapa de la primera expansión con sensibilización el medio de cultivo celular comprende células presentadoras de antígenos (APC) y las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de aproximadamente una capa celular a aproximadamente tres capas celulares.
[0039] En algunas realizaciones, en la etapa de la primera expansión de imprimación, las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de aproximadamente 1,5 capas celulares a aproximadamente 2,5 capas celulares.
[0040] En algunas realizaciones, en la etapa de la primera expansión con sensibilización, las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de aproximadamente 2 capas celulares.
[0041] En algunas realizaciones, en la etapa de la segunda expansión rápida, las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor de aproximadamente 3 capas celulares a aproximadamente 5 capas celulares.
[0042] En algunas realizaciones, en la segunda expansión rápida, las APC se disponen en capas sobre la primera superficie permeable al gas con un grosor de aproximadamente 3,5 capas celulares a aproximadamente 4,5 capas celulares.
[0043] En algunas realizaciones, en la segunda expansión rápida, las APC se disponen en capas sobre la primera superficie permeable al gas con un grosor de aproximadamente 4 capas celulares.
[0044] En algunas realizaciones, la etapa de la primera expansión con sensibilización la primera expansión con sensibilización se realiza en un primer recipiente que comprende una primera superficie permeable al gas y en la etapa de la segunda expansión rápida la segunda expansión rápida se realiza en un segundo recipiente que comprende una segunda superficie permeable al gas.
[0045] En algunas realizaciones, el segundo contenedor es mayor que el primero.
[0046] En algunas realizaciones, la etapa de la primera expansión con sensibilización el medio de cultivo celular comprende células presentadoras de antígenos (APC) y las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de aproximadamente una capa celular a aproximadamente tres capas celulares.
[0047] En algunas realizaciones, en la etapa de la primera expansión de imprimación, las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de entre 1,5 capas celulares y 2,5 capas celulares.
[0048] En algunas realizaciones, en la etapa de la primera expansión con sensibilización, las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de aproximadamente 2 capas celulares.
[0049] En algunas realizaciones, en la segunda expansión rápida, las APC se disponen en capas sobre la segunda área de superficie permeable al gas con un grosor medio de entre 3 y 5 capas celulares.
[0050] En algunas realizaciones, en la segunda expansión rápida, las APC se disponen en capas sobre la segunda área de superficie permeable al gas con un grosor medio de entre 3,5 capas celulares y 4,5 capas celulares.
[0051] En algunas realizaciones, en la etapa de la segunda expansión rápida, las APC se disponen en capas sobre la segunda área de superficie permeable al gas con un grosor medio de unas 4 capas celulares.
[0052] En algunas realizaciones, para cada contenedor en el que se realiza la primera expansión con sensibilización sobre una primera población de TIL, la segunda expansión rápida se realiza en el mismo contenedor sobre la segunda población de TIL producida a partir de dicha primera población de TIL.
[0053] En algunas realizaciones, cada contenedor comprende una primera superficie permeable al gas.
[0054] En algunas realizaciones, la etapa de la primera expansión con sensibilización el medio de cultivo celular comprende células presentadoras de antígeno (APC) y las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas en un grosor medio de aproximadamente una capa celular a aproximadamente tres capas celulares.
[0055] En algunas realizaciones, en la etapa de la primera expansión de imprimación, las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de aproximadamente 1,5 capas celulares a aproximadamente 2,5 capas celulares.
[0056] En algunas realizaciones, en la etapa de la primera expansión con sensibilización, las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de aproximadamente 2 capas celulares.
[0057] En algunas realizaciones, en la etapa de la segunda expansión rápida, las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de aproximadamente 3 capas celulares a aproximadamente 5 capas celulares.
[0058] En algunas realizaciones, en la etapa de la segunda expansión rápida, las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de aproximadamente 3,5 capas celulares a aproximadamente 4,5 capas celulares.
[0059] En algunas realizaciones, en la etapa de la segunda expansión rápida, las APC se disponen en capas sobre la primera superficie permeable al gas con un grosor medio de unas 4 capas celulares.
[0060] En algunas realizaciones, en las que para cada contenedor en el que se realiza la primera expansión con sensibilización en una primera población de TIL en la etapa de la primera expansión con sensibilización, el primer contenedor comprende una primera área superficial, el medio de cultivo celular comprende células presentadoras de antígeno (APC), y las APC se colocan en capas sobre la primera superficie permeable al gas, y en el que la relación entre el número medio de capas de APC colocadas en capas en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el número medio de capas de APC colocadas en capas en la etapa de la segunda expansión rápida se selecciona en el intervalo de aproximadamente 1.:1.1 a aproximadamente 1:10.
[0061] En algunas realizaciones, la relación entre el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el número medio de capas de<a>P<c>estratificadas en la etapa de la segunda expansión de incursión se selecciona en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,2 a entre o aproximadamente 1:8 aproximadamente.
[0062] En algunas realizaciones, la relación entre el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la segunda expansión de incursión se selecciona entre 1:1,3 y 1:7 aproximadamente.
[0063] En algunas realizaciones, la relación entre el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la segunda expansión de incursión se selecciona en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,4 a entre o aproximadamente 1:6 aproximadamente.
[0064] En algunas realizaciones, la relación entre el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el número medio de capas de a Pc estratificadas en la etapa de la segunda expansión de incursión se selecciona en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,5 a entre o aproximadamente 1:5 aproximadamente.
[0065] En algunas realizaciones, la relación entre el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la segunda expansión de incursión se selecciona en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,6 a entre o aproximadamente 1:4 aproximadamente.
[0066] En algunas realizaciones, la relación entre el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la segunda expansión de incursión se selecciona en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,7 a entre o aproximadamente 1:3.5 aproximadamente.
[0067] En algunas realizaciones, la relación entre el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el número medio de capas de<a>P<c>estratificadas en la etapa de la segunda expansión de incursión se selecciona en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,8 a entre o aproximadamente 1:3 aproximadamente.
[0068] En algunas realizaciones, la relación entre el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el número medio de capas de a Pc estratificadas en la etapa de la segunda expansión de incursión se selecciona en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,9 a entre o aproximadamente 1:2.5 aproximadamente.
[0069] En algunas realizaciones, la relación entre el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la primera expansión de imprimación y el número medio de capas de APC estratificadas en la etapa de la segunda expansión rápida es de aproximadamente 1:2.
[0070] En algunas realizaciones, después de 2 a 3 días en la etapa de la segunda expansión rápida, el medio de cultivo celular se suplementa con IL-2 adicional.
[0071] En algunas realizaciones, el método comprende además crioconservar la población TIL cosechada en la etapa de cosecha de la población terapéutica de TIL usando un proceso de crioconservación.
[0072] En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de crioconservar la bolsa de infusión.
[0073] En algunas realizaciones, el proceso de criopreservación se lleva a cabo utilizando una relación 1:1 de la población de TIL cosechada con respecto al medio de criopreservación.
[0074] En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígeno son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
[0075] En algunas realizaciones, las PBMC son irradiadas y alogénicas.
[0076] En algunas realizaciones, en la etapa de la primera expansión con sensibilización, el medio de cultivo celular comprende células mononucleares de sangre periférica (PBMC), y en el que el número total de PBMC añadidas al medio de cultivo celular en la etapa de la primera expansión con sensibilización es de aproximadamente 2,5 * 108.
[0077] En algunas realizaciones, en la etapa de la segunda expansión rápida las células presentadoras de antígeno (APC) en el medio de cultivo celular son células mononucleares de sangre periférica (PBMC), y en el que el número total de PBMC añadidas al medio de cultivo celular en la etapa de la segunda expansión rápida es de aproximadamente 5 * 108.
[0078] En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígeno e son células presentadoras de antígeno artificiales.
[0079] En algunas realizaciones, la cosecha en la etapa de cosecha de la población terapéutica de TIL se realiza utilizando un sistema de procesamiento celular basado en membrana.
[0080] En algunas realizaciones, la cosecha en la etapa de cosecha de la población terapéutica de TIL se realiza utilizando un sistema de procesamiento de células LOVO.
[0081] En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 60 fragmentos por contenedor en la etapa de la primera expansión con sensibilización, en el que cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm3.
[0082]En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm3 a aproximadamente 1500 mm3.
[0083]En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1350 mm3.
[0084]En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de aproximadamente 1 gramo a aproximadamente 1,5 gramos.
[0085]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular se suministra en un contenedor seleccionado del grupo que consiste en un contenedor G y una bolsa celular Xuri.
[0086]En algunas realizaciones, la concentración de IL-2 es de aproximadamente 10.000 UI/mL a aproximadamente 5.000 UI/mL.
[0087]En algunas realizaciones, la concentración de IL-2 es de aproximadamente 6.000 UI/mL.
[0088]En algunas realizaciones, la bolsa de infusión en la etapa de transferir la población terapéutica cosechada de TIL a una bolsa de infusión es una bolsa de infusión que contiene HipoThermosol.
[0089]En algunas realizaciones, el medio de criopreservación comprende dimetilsulfóxido (DMSO).
[0090]En algunas realizaciones, el medio de criopreservación comprende de 7% a 10% de DMSO.
[0091]En algunas realizaciones, el primer período en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el segundo período en la etapa de la segunda expansión rápida se realizan cada uno individualmente dentro de un período de 5 días, 6 días o 7 días.
[0092]En algunas realizaciones, el primer período en la etapa de la primera expansión con sensibilización se realiza dentro de un período de 5 días, 6 días o 7 días.
[0093]En algunas realizaciones, el segundo período en la etapa de la segunda expansión rápida se realiza dentro de un período de 7 días, 8 días o 9 días.
[0094]En algunas realizaciones, el primer período en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el segundo período en la etapa de la segunda expansión rápida se realizan cada uno individualmente dentro de un período de 7 días.
[0095]En algunas realizaciones, las etapas de la primera expansión con sensibilización a través de la cosecha de la población terapéutica de TIL se realizan dentro de un período de aproximadamente 14 días a aproximadamente 16 días.
[0096]En algunas realizaciones, las etapas de la primera expansión con sensibilización a través de la cosecha de la población terapéutica de TIL se realizan dentro de un período de aproximadamente 15 días a aproximadamente 16 días.
[0097]En algunas realizaciones, las etapas de la primera expansión con sensibilización a través de la cosecha de la población terapéutica de TIL se realizan dentro de un período de aproximadamente 14 días.
[0098]En algunas realizaciones, las etapas de la primera expansión con sensibilización a través de la cosecha de la población terapéutica de TIL se realizan dentro de un período de aproximadamente 15 días.
[0099]En algunas realizaciones, las etapas de la primera expansión con sensibilización a través de la cosecha de la población terapéutica de TIL se realizan dentro de un período de aproximadamente 16 días.
[0100]En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de crioconservar la población terapéutica cosechada de TIL usando un proceso de crioconservación, en el que las etapas de la primera expansión con sensibilización a través de la cosecha de la población terapéutica de TIL y la crioconservación se realizan en 16 días o menos.
[0101]En algunas realizaciones, la población terapéutica de TIL cosechada en la etapa de cosecha de la población terapéutica de TIL comprende suficientes TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
[0102]En algunas realizaciones, el número de TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2,3*1010 a aproximadamente 13,7*1010
[0103]En algunas realizaciones, la tercera población de TIL en la etapa de la segunda expansión rápida proporciona mayor eficacia, mayor producción de interferón-gamma y/o mayor policlonalidad.
[0104]En algunas realizaciones, la tercera población de TIL en la etapa de la segunda expansión rápida proporciona al menos una producción de interferón-gamma de una a cinco veces o más en comparación con los TIL preparadas mediante un proceso de más de 18 días.
[0105]En algunas realizaciones, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la tercera población de TIL en la etapa de la segunda expansión rápida exhiben una expresión CD8 y CD28 aumentada en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de TIL en la etapa de la primera expansión con sensibilización.
[0106]También se divulga, pero no se reivindica, un método para tratar a un sujeto con cáncer, el método comprende administrar linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) expandidos que comprenden:
(a) obtener y/o recibir una primera población de TIL de un tumor resecado de un sujeto procesando una muestra tumoral obtenida del sujeto en múltiples fragmentos tumorales;
(b) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, opcionalmente OKT-3, y opcionalmente células presentadoras de antígeno (APC) para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión con sensibilización se realiza en un recipiente que comprende una primera área de superficie permeable al gas, en donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante aproximadamente 1 a 7/8 días para obtener la segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL;
(c) realizar una segunda expansión rápida suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3, y APC adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde el número de APC añadidas a la segunda expansión rápida es al menos dos veces el número de APC añadidas en la etapa (b), en donde la segunda expansión rápida se realiza durante aproximadamente 1 a 11 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en donde la segunda expansión rápida se realiza en un recipiente que comprende una segunda área de superficie permeable al gas;
(d) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida en la etapa c);
(e) transferir la población de TIL cosechada de la etapa (d) a una bolsa de infusión; y (f) administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL de la etapa (e).
[0107]El número de TIL suficiente para administrar una dosis terapéuticamente eficaz en la etapa (f) puede ser de aproximadamente 2,3*1010 a aproximadamente 13,7*1010
[0108]Las células presentadoras de antígeno (APC) pueden ser PBMC.
[0109]Antes de administrar una dosis terapéuticamente eficaz de células TIL en la etapa (f), puede haberse administrado al paciente un régimen de linfodepleción no mieloablativo.
[0110]El régimen de linfodepleción no mieloablativo puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
[0111]El método puede comprender además la etapa de tratar al paciente con un régimen de altas dosis de IL-2 que comienza el día después de la administración de las células TIL al paciente en la etapa (f).
[0112]El régimen de altas dosis de IL-2 puede comprender 600.000 o 720.000 UI/kg administradas como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
[0113]La tercera población de TIL en la etapa (b) puede proporcionar mayor eficacia, mayor producción de interferóngamma y/o mayor policlonalidad.
[0114]La tercera población de TIL en la etapa (c) puede proporcionar al menos una producción de interferón-gamma de una a cinco veces o más en comparación con los TIL preparadas mediante un proceso de más de 16 días.
[0115]Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas a partir de la tercera población de TIL en la etapa (c) pueden mostrar una expresión CD8 y CD28 aumentada en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas a partir de la segunda población de células en la etapa (b).
[0116]El cáncer puede ser un tumor sólido.
[0117]El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales.
[0118]El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, HNSCC, cáncer de cuello de útero, NSCLC, glioblastoma (incluido GBM) y cáncer gastrointestinal.
[0119]El cáncer puede ser un melanoma.
[0120]El cáncer puede ser HNSCC.
[0121]Puede tratarse de un cáncer de cuello de útero.
[0122]El cáncer puede ser NSCLC.
[0123]El cáncer puede ser un glioblastoma (incluido el GBM).
[0124]El cáncer puede ser un cáncer gastrointestinal.
[0125]El cáncer puede ser un cáncer hipermutado.
[0126]El cáncer puede ser un cáncer pediátrico hipermutado.
[0127]El recipiente puede ser un recipiente cerrado.
[0128]El contenedor puede ser un contenedor G.
[0129]El contenedor puede ser un GREX-10.
[0130]El recipiente cerrado puede contener un GREX-100.
[0131]El contenedor cerrado puede comprender un GREX-500.
[0132]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) producida por el método divulgado en el presente documento.
[0133]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) preparada a partir de tejido tumoral de un paciente, en la que la población terapéutica de TIL proporciona mayor eficacia, mayor producción de interferón-gamma y/o mayor policlonalidad.
[0134]La población terapéutica de TIL según se describe en el presente documento puede proporcionar una mayor producción de interferón-gamma.
[0135]La población terapéutica de TIL según se describe en el presente documento puede proporcionar una mayor policlonalidad.
[0136]La población terapéutica de TIL según se describe en el presente documento puede proporcionar una mayor eficacia.
[0137]La población terapéutica de TIL tal como se describe en el presente documento puede ser capaz de producir al menos una vez más interferón-gamma en comparación con los TIL preparadas mediante un proceso de más de 16 días.
[0138]La población terapéutica de TIL tal como se describe en el presente documento puede ser capaz de producir al menos dos veces más interferón-gamma en comparación con los TIL preparadas mediante un proceso de más de 16 días.
[0139]La población terapéutica de TIL como se describe en el presente documento puede ser capaz de al menos tres veces más producción de interferón-gamma en comparación con los TIL preparadas mediante un proceso de más de 16 días.
[0140]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), en la que la población terapéutica de TIL es capaz de producir al menos una vez más interferóngamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ninguna célula presentadora de antígeno (APC) añadida.
[0141]La población terapéutica de TIL tal como se describe en el presente documento puede ser capaz de al menos dos veces más producción de interferón-gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ninguna APC añadida.
[0142]La población terapéutica de TIL como se describe en el presente documento puede ser capaz de al menos tres veces más producción de interferón-gamma en comparación con losTIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ninguna APC añadida.
[0143]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), en la que la población terapéutica de TIL es capaz de producir al menos una vez más interferóngamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ningún OKT3 añadido.
[0144]La población terapéutica de TIL tal como se describe en el presente documento puede ser capaz de al menos dos veces más producción de interferón-gamma en comparación con los TIL preparadas mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ningún OKT3 añadido.
[0145]La población terapéutica de TIL tal como se describe en el presente documento puede ser capaz de al menos tres veces más producción de interferón-gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ningún OKT3 añadido.
[0146]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), en la que la población terapéutica de TIL es capaz de producir al menos una vez más interferóngamma en comparación con los TIL preparados por un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin células presentadoras de antígeno (APC) añadidas y sin OKT3 añadido.
[0147]La población terapéutica de TIL como se describe en el presente documento puede ser capaz de al menos dos veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparados por un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin células presentadoras de antígeno (APC) añadidas y sin o KT3 añadido.
[0148]La población terapéutica de TIL como se describe en el presente documento puede ser capaz de al menos tres veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparados por un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin células presentadoras de antígeno (APC) añadidas y sin o KT3 añadido.
[0149]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende la población terapéutica de TIL descrita en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0150]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una bolsa de infusión estéril que comprende la composición de TIL descrita en el presente documento.
[0151]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una preparación crioconservada de la población terapéutica de TIL como se describe en el presente documento.
[0152]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende la población terapéutica de TIL descrita en el presente documento y un medio de crioconservación.
[0153]El medio de criopreservación puede contener DMSO.
[0154]El medio de criopreservación puede contener 7-10% de DMSO.
[0155]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una preparación crioconservada de la composición de TIL como se describe en el presente documento.
[0156]La composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) descrita en el presente documento puede utilizarse como medicamento.
[0157]La composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) descrita en el presente documento puede utilizarse en el tratamiento de un cáncer.
[0158]La composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) descrita en el presente documento puede utilizarse en el tratamiento de un cáncer de tumor sólido.
[0159]La composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) descrita en el presente documento puede usarse en el tratamiento de un cáncer seleccionado entre melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (incluido GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer renal y carcinoma de células renales.
[0160]La composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) descrita en el presente documento puede usarse en el tratamiento de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en melanoma, HNSCC, cáncer de cuello uterino, NSCLC, glioblastoma (incluido GBM) y cáncer gastrointestinal.
[0161]La composición de TIL tal como se describe en el presente documento puede ser para uso en el tratamiento de un cáncer en el que el cáncer es melanoma.
[0162]La composición de TIL como se describe en el presente documento puede ser para uso en el tratamiento de un cáncer en el que el cáncer es HNSCC.
[0163]La composición de TIL tal como se describe en el presente documento puede utilizarse en el tratamiento de un cáncer, en particular un cáncer cervicouterino.
[0164]La composición de TIL como se describe en el presente documento puede usarse en el tratamiento de un cáncer en el que el cáncer es NSCLC.
[0165]La composición de TIL tal como se describe en el presente documento puede usarse en el tratamiento de un cáncer en el que el cáncer es glioblastoma (incluido GBM).
[0166]La composición de TIL descrita en el presente documento puede utilizarse en el tratamiento de un cáncer gastrointestinal.
[0167]La composición de TIL descrita en el presente documento puede utilizarse en el tratamiento de un cáncer hipermutado.
[0168]La composición de TIL tal como se describe en el presente documento puede usarse en el tratamiento de un cáncer en el que el cáncer es un cáncer pediátrico hipermutado.
[0169]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) como se describe en el presente documento en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que comprende la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de TIL al sujeto. El cáncer puede ser un tumor sólido. El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, HNSCC, cáncer de cuello de útero, NSCLC, glioblastoma (incluido GBM) y cáncer gastrointestinal. El cáncer puede ser un melanoma. El cáncer puede ser HNSCC. Puede tratarse de un cáncer de cuello de útero. El cáncer puede ser NSCLC. El cáncer puede ser un glioblastoma (incluido el GBM). El cáncer puede ser un cáncer gastrointestinal. El cáncer puede ser un cáncer hipermutado. El cáncer puede ser un cáncer pediátrico hipermutado.
[0170]La composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) descrita en el presente documento puede utilizarse en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que comprende la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de TIL al sujeto. El cáncer puede ser un tumor sólido. El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, HNSCC, cáncer de cuello de útero, NSCLC, glioblastoma (incluido GBM) y cáncer gastrointestinal.
[0171]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) como se describe en el presente documento.
[0172]El cáncer puede ser un tumor sólido.
[0173]El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales.
[0174]El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, HNSCC, cáncer de cuello de útero, NSCLC, glioblastoma (incluido GBM) y cáncer gastrointestinal. El cáncer puede ser un melanoma. El cáncer puede ser HNSCC.
Puede tratarse de un cáncer de cuello de útero. El cáncer puede ser NSCLC. El cáncer puede ser un glioblastoma (incluido el GBM). El cáncer puede ser un cáncer gastrointestinal. El cáncer puede ser un cáncer hipermutado. El cáncer puede ser un cáncer pediátrico hipermutado.
[0175]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método de expansión de células T que comprende:
(a) realizar una primera expansión con sensibilización de una primera población de células T obtenidas de un donante cultivando la primera población de células T para efectuar el crecimiento y sensibilizar una activación de la primera población de células T;
(b) después de que la activación de la primera población de células T sensibilizada en la etapa (a) comience a decaer, realizar una segunda expansión rápida de la primera población de células T cultivando la primera población de células T para efectuar el crecimiento y potenciar la activación de la primera población de células T para obtener una segunda población de células T; y (c) cosecha la segunda población de células T.
[0176]La primera expansión con sensibilización de la etapa (a) puede realizarse durante un periodo de hasta 7 días.
[0177]La segunda expansión rápida de la etapa (b) puede realizarse durante un periodo de hasta 11 días.
[0178]La segunda expansión rápida de la etapa (b) puede realizarse durante un periodo de hasta 9 días.
[0179]La primera expansión con sensibilización de la etapa (a) puede realizarse durante un periodo de 7 días y la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un periodo de 9 días.
[0180]La primera expansión con sensibilización de la etapa (a) puede realizarse durante un periodo de hasta 8 días.
[0181]La segunda expansión rápida de la etapa (b) puede realizarse durante un período de hasta 8 días.
[0182]La primera expansión con sensibilización de la etapa (a) puede realizarse durante un periodo de 8 días y la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un periodo de 8 días.
[0183]En la etapa (a) la primera población de células T puede cultivarse en un primer medio de cultivo que comprende OKT-3 e IL-2.
[0184]El primer medio de cultivo puede comprender OKT-3, IL-2 y células presentadoras de antígeno (APC).
[0185]En la etapa (b), la primera población de células T puede cultivarse en un segundo medio de cultivo que comprende OKT-3, IL-2 y células presentadoras de antígeno (APC).
[0186]En la etapa (a), la primera población de células T puede cultivarse en un primer medio de cultivo en un recipiente que comprende una primera superficie permeable al gas, en el que el primer medio de cultivo comprende opcionalmente OKT-3, IL-2 y opcionalmente una primera población de células presentadoras de antígeno (APC), en el que la primera población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la primera población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas, donde en la etapa (b) la primera población de células T se cultiva en un segundo medio de cultivo en el contenedor, donde el segundo medio de cultivo comprende OKT-3, IL-2 y una segunda población de APC, donde la segunda población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la segunda población de APC se estratifica sobre la primera superficie permeable al gas, y donde la segunda población de APC es mayor que la primera población de APC.
[0187]La relación entre el número de APC en la segunda población de APC y el número de APC en la primera población de APC puede ser de 2:1 aproximadamente.
[0188]El número de APC en la primera población de APC puede ser de aproximadamente 2,5 * 108 y el número de APC en la segunda población de APC puede ser de aproximadamente 5 * 108.
[0189]En la etapa (a), la primera población de APC puede estratificarse sobre la primera superficie permeable al gas con un grosor medio de 2 capas de APC.
[0190]En la etapa (b), la segunda población de APC puede colocarse en capas sobre la primera superficie permeable al gas con un grosor medio seleccionado del intervalo de 4 a 8 capas de APC.
[0191]La relación entre el número medio de capas de APC dispuestas sobre la primera superficie permeable al gas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas sobre la primera superficie permeable al gas en la etapa (a) puede ser 2:1.
[0192]Las APC pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
[0193]Las APC pueden comprender PBMC, donde las PBMC son irradiadas y exógenas al donante de la primera población de células T.
[0194]Las células T pueden ser linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
[0195]Las células T pueden ser linfocitos infiltrantes de médula ósea (MIL).
[0196]Las células T pueden ser linfocitos de sangre periférica (PBL).
[0197]El medio de cultivo celular puede ser un medio definido y/o un medio libre de suero.
[0198]El medio definido puede comprender transferrina (opcionalmente recombinante), insulina (opcionalmente recombinante) y albúmina (opcionalmente recombinante).
[0199]El medio libre de suero o definido puede comprender un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un sustituto de suero.
[0200]En algunas realizaciones, el medio celular basal incluye, entre otros, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CTS™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[0201]En algunas realizaciones, el suplemento de suero o el reemplazo de suero se selecciona del grupo que consiste en Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer y Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células T CTS™.
[0202]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende una o más albúminas o sustitutos de albúmina.
[0203]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende uno o más aminoácidos.
[0204]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina.
[0205]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina.
[0206]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende uno o más precursores de colágeno, uno o más antibióticos y uno o más oligoelementos. En
En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende albúmina.
[0207]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-0207-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ y Zr4+.
[0208]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o 2-mercaptoetanol.
[0209]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende una concentración total de sustitución de suero (vol%) de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% en volumen del medio de cultivo celular.
[0210]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende una concentración total de sustitución de suero de aproximadamentel 3%, aproximadamentel 5% o aproximadamentel 10% del volumen total del medio de cultivo celular.
[0211]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende además glutamina (es decir, GlutaMAX®) en una concentración de aproximadamente 0.1mM a aproximadamente 10mM, 0.5mM a aproximadamente 9mM, 1mM a aproximadamente 8mM, 2mM a aproximadamente 7mM, 3mM a aproximadamente 6mM, o 4mM a aproximadamente 5 mM.
[0212]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende además glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 2mM.
[0213]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende además 2-mercaptoetanol en una concentración de aproximadamente 5mM a aproximadamente 150mM, 10mM a aproximadamente 140mM, 15mM a aproximadamente 130mM, 20mM a aproximadamente 120mM, 25mM a aproximadamente 110mM, 30mM a aproximadamente 100mM, 35mM a aproximadamente 95mM, 40mM a aproximadamente 90mM, 45mM a aproximadamente 85mM, 50mM a aproximadamente 80mM, 55mM a aproximadamente 75mM, 60mM a aproximadamente 70mM, o aproximadamente 65mM.
[0214]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende además 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 55mM.
[0215]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende los medios definidos descritos en la Publicación Internacional PCT N.° WO/1998/030679.
[0216]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende glicina en un rango de aproximadamente 5-200 mg/L, L-histidina en un rango de aproximadamente 5-250 mg/L, L-isoleucina en un rango de aproximadamente 5-300 mg/L, L-metionina en un rango de aproximadamente 5-200 mg/L, L-fenilalanina en un intervalo de aproximadamente 5 400 mg/L, L-prolina en un intervalo de aproximadamente 1-1000 mg/L, L-hidroxiprolina en un intervalo de aproximadamente 1-45 mg/L, L-serina en un intervalo de aproximadamente 1-250 mg/L, L-treonina en un intervalo de aproximadamente 10-500 mg/L, L-triptófano en un rango de aproximadamente 2-110 mg/L, L-tirosina en un rango de aproximadamente 3-175 mg/L, L-valina en un rango de aproximadamente 5-500 mg/L, tiamina en un rango de aproximadamente 1-20 mg/L, glutatión reducido en un rango de aproximadamente 1-20 mg/L, ácido L-ascórbico-2-fosfato en un intervalo de 1-200 mg/L, transferrina saturada de hierro en un intervalo de 1-50 mg/L, insulina en un intervalo de 1 100 mg/L, selenito sódico en un intervalo de 0. 000001-0,0001 mg/L.000001-0,0001 mg/L, y/o albúmina (p. ej, AlbuMAX® I) en un intervalo de aproximadamente 5000-50.000 mg/L.
[0217]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende uno o más de los ingredientes de la fracción de elementos no traza en el medio definido están presentes en los rangos de concentración enumerados en la columna bajo el título "Rango de Concentración en Medio 1X" en la Tabla A proporcionada en el presente documento.
[0218]En algunas realizaciones, la osmolaridad del medio de cultivo celular está entre aproximadamente 260 y 350 mOsmol.
[0219]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende además aproximadamente 3,7 g/L, o aproximadamente 2,2 g/L de bicarbonato sódico.
[0220]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende además L-glutamina (concentración final de aproximadamente 2 mM), uno o más antibióticos, aminoácidos no esenciales (NEAA; concentración final de aproximadamente 100 μM), y/o 2-mercaptoetanol (concentración final de aproximadamente 100 j M).
[0221]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas carece de beta-mercaptoetanol (BME o pME; también conocido como 2-mercaptoetanol, CAS 60-24-2).
[0222]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende SFM de Expansión de Células T CTS OpTmizer, 3% Sustituto de Suero de Células Inmunitarias CTS, 55mM BME, y opcionalmente glutamina.
[0223]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende Medio Basal de Expansión de Células T CTS™OpTmizer™suplementado con Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (26mL/L), y 3% SR de Células Inmunitarias CTS™, y 2 mM Glutamax, opcionalmente comprendiendo además 6.000 UI/mL de IL-2.
[0224]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende Medio Basal de Expansión de Células T CTS™OpTmizer™suplementado con Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (26mL/L), y 3% SR de Células Inmunitarias CTS™, 2mM Glutamax, y opcionalmente comprende además 3.000 UI/mL de IL-2.
[0225]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende:
i) una población terapéutica de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL), y
ii) medio definido o medio libre de suero que comprenda opcionalmente transferrina (opcionalmente recombinante), insulina (opcionalmente recombinante) y albúmina (opcionalmente recombinante).
[0226]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una composición expandida de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende:
i) una población terapéutica de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL), y
ii) medio definido o medio libre de suero que comprenda opcionalmente transferrina (opcionalmente recombinante), insulina (opcionalmente recombinante) y albúmina (opcionalmente recombinante).
[0227] El medio definido o medio libre de suero puede comprender transferrina (opcionalmente recombinante), insulina (opcionalmente recombinante) y albúmina (opcionalmente recombinante).
[0228] El medio definido o medio libre de suero puede comprender un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un sustituto de suero.
[0229] El medio celular basal puede incluir, entre otros, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CTS™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (<b>M<e>), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[0230] El suplemento de suero o sustituto de suero puede seleccionarse del grupo formado por Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer y Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células T CTS™.
[0231] El medio definido o medio libre de suero puede comprender una o más albúminas o sustitutos de albúmina.
[0232] El medio definido o medio libre de suero puede comprender uno o más aminoácidos.
[0233] El medio definido o medio libre de suero puede comprender una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina.
[0234] El medio definido o medio libre de suero puede comprender uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina.
[0235] El medio definido o medio libre de suero puede comprender uno o más precursores de colágeno, uno o más antibióticos y uno o más oligoelementos.
[0236] El medio definido o medio libre de suero puede comprender albúmina.
[0237] El medio definido o medio libre de suero puede comprender albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-0237-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ y Zr4+.
[0238] El medio definido o medio libre de suero puede comprender además L-glutamina, bicarbonato de sodio y/o 2-mercaptoetanol.
[0239] El medio definido o medio libre de suero puede comprender una concentración total de sustitución de suero (vol%) de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% en volumen del medio de cultivo celular.
[0240] El medio definido o medio libre de suero puede comprender una concentración total de sustitución de suero de aproximadamentel 3%, aproximadamentel 5% o aproximadamentel 10% del volumen total del medio de cultivo celular.
[0241] El medio definido o medio libre de suero puede comprender además glutamina (es decir, GlutaMAX®) en una concentración de aproximadamente 0,1mM a aproximadamente 10mM, 0,5mM a aproximadamente 9mM, 1mM a aproximadamente 8mM, 2mM a aproximadamente 7mM, 3mM a aproximadamente 6mM, o 4mM a aproximadamente 5 mM.
[0242] El medio definido o medio libre de suero puede comprender además glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 2mM.
[0243] El medio definido o medio libre de suero puede comprender además 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 5mM a aproximadamente 150mM, 10mM a aproximadamente 140mM, 15mM a aproximadamente 130mM, 20mM a aproximadamente 120mM, 25mM a aproximadamente 110mM, 30mM a aproximadamente 100mM, 35mM a aproximadamente 95mM, 40mM a aproximadamente 90mM, 45mM a aproximadamente 85mM, 50mM a aproximadamente 80mM, 55mM a aproximadamente 75mM, 60mM a aproximadamente 70mM, o aproximadamente 65mM.
[0244]El medio definido o medio libre de suero puede comprender además 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 55mM.
[0245]El medio definido o medio libre de suero puede comprender los medios definidos descritos en la Publicación Internacional PCT N.° WO/1998/030679.
[0246]El medio definido o medio libre de suero puede comprender glicina en un rango de aproximadamente 5-200 mg/L, L-histidina en un rango de aproximadamente 5-250 mg/L, L-isoleucina en un rango de aproximadamente 5-300 mg/L, L-metionina en un rango de aproximadamente 5-200 mg/L, L-fenilalanina en un intervalo de aproximadamente 5-400 mg/L, L-prolina en un intervalo de aproximadamente 1-1000 mg/L, L-hidroxiprolina en un intervalo de aproximadamente 1-45 mg/L, L-serina en un intervalo de aproximadamente 1-250 mg/L, L-treonina en un intervalo de aproximadamente 10-500 mg/L, L-triptófano en un rango de aproximadamente 2-110 mg/L, L-tirosina en un rango de aproximadamente 3-175 mg/L, L-valina en un rango de aproximadamente 5-500 mg/L, tiamina en un rango de aproximadamente 1-20 mg/L, glutatión reducido en un rango de aproximadamente 1-20 mg/L, ácido L-ascórbico-2-fosfato en un intervalo de 1-200 mg/L, transferrina saturada de hierro en un intervalo de 1-50 mg/L, insulina en un intervalo de 1-100 mg/L, selenito sódico en un intervalo de 0. 000001-0,0001 mg/L.000001-0,0001 mg/L, y/o albúmina (p. ej, AlbuMAX® I) en un intervalo de aproximadamente 5000-50.000 mg/L.
[0247]El medio definido o medio libre de suero puede comprender uno o más de los ingredientes de la fracción de elementos no traza en el medio definido están presentes en los rangos de concentración listados en la columna bajo el título "Rango de Concentración en Medio 1X" en la Tabla A aquí provista.
[0248]La osmolaridad del medio definido o del medio libre de suero puede estar entre aproximadamente 260 y 350 mOsmol.
[0249]El medio definido o medio libre de suero puede comprender además aproximadamente 3.7 g/L, o aproximadamente 2.2 g/L de bicarbonato de sodio.
[0250]El medio definido o medio libre de suero puede comprender además L-glutamina (concentración final de aproximadamente 2 mM), uno o más antibióticos, aminoácidos no esenciales (NEAA; concentración final de aproximadamente 100 |<j>M), y/o 2-mercaptoetanol (concentración final de aproximadamente 100 μM).
[0251]El medio definido o medio libre de suero en el primer y/o segundo contenedor permeable a los gases puede carecer de beta-mercaptoetanol (BME o pME; también conocido como 2-mercaptoetanol, CAS 60-24-2).
[0252]El medio de cultivo celular puede comprender SFM de Expansión de Células T CTS OpTmizer, 3% Sustituto de Suero de Células Inmunitarias CTS, 55mM<b>M<e>, y opcionalmente glutamina.
[0253]El medio de cultivo celular puede comprender Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ suplementado con Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (26mL/L), y 3% SR de Células Inmunitarias CTS™, y 2 mM Glutamax, opcionalmente comprendiendo además 6,000 UI/mL de IL-2.
[0254]El medio de cultivo celular puede comprender Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ suplementado con Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (26mL/L), y 3% de SR de Células Inmunitarias CTS™, 2mM Glutamax, y opcionalmente comprender además 3,000 UI/mL de IL-2.
[0255]La población de TIL puede ser una población terapéutica de TIL.
[0256]La población terapéutica de TIL puede mostrar un aumento de IFN-<y>sérico, en el que el aumento de IFN-<y>es superior a 200 pg/ml, superior a 250 pg/ml, superior a 300 pg/ml, superior a 350 pg/ml, superior a 400 pg/ml, superior a 450 pg/ml, superior a 500 pg/ml, superior a 550 pg/ml, superior a 600 pg/ml, superior a 650 pg/ml, superior a 700 pg/ml, superior a 750 pg/ml, superior a 800 pg/ml, superior a 850 pg/ml, superior a 900 pg/ml, superior a 950 pg/ml, o superior a 1000 pg/ml.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0257]
Figura 1A-1C:A) Muestra una comparación entre el proceso 2A (proceso de aproximadamente 22 días) y una variante del proceso Gen 3 para la fabricación de TIL (proceso de aproximadamente 14 a 16 días).B) Gráfico Gen3 del Proceso Ejemplar que ofrece una visión general de las Etapas A a F (proceso de aproximadamente 14 a 16 días).C) Gráfico con tres procesos ejemplares de Gen 3 con un resumen de las etapas A a F (proceso de aproximadamente 14 a 16 días) para cada una de las tres variaciones del proceso.
Figura 2:Proporciona un diagrama de flujo experimental para la comparabilidad entre GEN 2 (proceso 2A) frente a GEN 3.
Figura 3A-3C:A) L4054 - Caracterización fenotípica del producto TIL en el proceso Gen 2 y Gen 3.B) L4055-Caracterización fenotípica del producto TIL en el proceso Gen 2 y Gen 3.C) M1085T-Caracterización fenotípica del producto TIL en el proceso Gen 2 y Gen 3.
Figura 4A-4C:A) L4054 - Análisis de marcadores de memoria en el producto TIL de los procesos Gen 2 y Gen 3.B) L4055 - Análisis de marcadores de memoria en el producto TIL de los procesos Gen 2 y Gen 3.C) M1085T-Análisis de marcadores de memoria en el producto TIL de los procesos Gen 2 y Gen 3.
Figura 5:L4054 Marcadores de activación y agotamiento (A) Activado en CD4+,(B) Activado en CD8+.
Figura 6:L4055 Marcadores de activación y agotamiento (A) Activado en CD4+,(B) Activado en CD8+.
Figura 7:Producción de IFNy (pg/mL): (A) L4054, (B) L4055, y (C) M1085T para los procesos Gen 2 y Gen 3: Cada barra representada aquí es la media SEM de los niveles de IFNy de las células estimuladas, no estimuladas y de control del medio. Densidad óptica medida a 450 nm.
Figura 8:Análisis ELISA de la concentración de IL-2 en el sobrenadante del cultivo celular:(A)L4054y(B)L4055.Cada barra representada aquí es la media SEM de los niveles de IL-2 en los medios gastados. Densidad óptica medida a 450 nm.
Figura 9:Cuantificación de glucosa y lactato (g/L) en medios gastados: (A) Glucosa y (B) Lactato: En las dos líneas tumorales, y en ambos procesos, se observó una disminución de la glucosa a lo largo de la expansión REP. Por el contrario, como era de esperar, se observó un aumento del lactato. Tanto la disminución de la glucosa como el aumento del lactato fueron comparables entre los procesos Gen 2 y Gen 3.
Figura 10: A) Cuantificación de L-glutamina en medios gastados para L4054 y L4055.B) Cuantificación de Glutamax en medios gastados para L4054 y L4055. C) Cuantificación del amoníaco en los medios usados para L4054 y L4055.
Figura 11:Análisis de la longitud de los telómeros. El valor de la longitud telomérica relativa (RTL) indica que la fluorescencia telomérica media por cromosoma/genoma en el proceso Gen 2 y Gen 3 de la fluorescencia telomérica por cromosoma/genoma en la línea celular de control (línea celular de leucemia 1301) utilizando el kit DAKO.
Figura 12:Análisis de la secuencia CDR3 única para el producto final TIL en L4054 y L4055 según el proceso Gen 2 y Gen 3. Las columnas muestran el número de clonotipos TCR B únicos identificados a partir de 1 * 106 células recogidas en el proceso Gen 2(p. ej.,el día 22) y Gen 3(p. ej.,el día 14-16) del día de la cosecha. El Gen 3 muestra una mayor diversidad clonal en comparación con el Gen 2 basándose en el número de CDR de péptidos únicos dentro de la muestra.
Figura 13:Frecuencia de secuencias CDR3 únicas en el producto celular final cosechado de L4054 IL (Gen 2(por ejemplo,día 22) y proceso Gen 3(por ejemplo,día 14-16)).
Figura 14:Frecuencia de secuencias CDR3 únicas en el producto celular final cosechado de L4055 TIL (Gen 2(por ejemplo,día 22) y proceso Gen 3(por ejemplo,día 14-16)).
Figura 15:Índice de diversidad para el producto final TIL en L4054 y L4055 bajo proceso Gen 2 y Gen 3. El índice de diversidad de entropía de Shanon es una métrica de comparación más fiable y común. Gen 3 L4054 y L4055 mostraron una diversidad ligeramente superior a Gen 2.
Figura 16:Los datos brutos de los recuentos celulares Día 7-Gen 3 REP iniciación se presentan en la Tabla 22 (véase el Ejemplo 5 a continuación).
Figura 17:Los datos brutos de los recuentos celulares Día 11-Inicio de Gen 2 REP y Gen 3 Scale Up se presentan en la Tabla 22 (véase el Ejemplo 5 a continuación).
Figura 18:Datos brutos de los recuentos celulares Día 16-Gen 2 Scale Up y Gen 3 Harvest(por ejemplo,día 16) presentados en la Tabla 23 (véase el Ejemplo 5 a continuación).
Figura 19:Los datos brutos de los recuentos celulares Día 22-Cosecha Gen 2(por ejemplo,día 22) se presentan en la Tabla 23 (véase el Ejemplo 5 más adelante). Para L4054 Gen 2, el recuento post LOVO se extrapoló a 4 matraces, porque era el número total del estudio. Se contaminó 1 matraz y la extrapolación se hizo para total = 6,67E+10.
Figura 20:Datos brutos de los resultados de citometría de flujo representados en las Figs. 3A, 4A y 4B.
Figura 21:Datos brutos de los resultados de citometría de flujo representados en las Figs. 3C y 4C.
Figura 22:Los datos brutos de los resultados de la citometría de flujo se muestran en las Figs. 5 y 6.
Figura 23:Los datos brutos de los resultados del ensayo de producción de IFN<y>para las muestras L4054 se muestran en la Fig. 7.
Figura 24:Los datos brutos de los resultados del ensayo de producción de IFNy para las muestras L4055 se muestran en la Fig. 7.
Figura 25:Los datos brutos de los resultados del ensayo de producción de IFNy para las muestras M1085T se muestran en la Fig. 7.
Figura 26:Los datos brutos de los resultados del ensayo ELISA de IL-2 se muestran en la Fig. 8.
Figura 27:Datos brutos del sustrato metabólico y resultados del análisis metabólico presentados en las Figs. 9 y 10.
Figura 28:Los datos brutos de los resultados del análisis de la longitud relativa de los telómeros se presentan en la Fig. 11.
Figura 29:Los datos brutos de la secuencia CD3 única y los resultados de los análisis de diversidad clonal se presentan en las Figs. 12 y 15.
Figura 30:Muestra una comparación entre varios Gen 2 (proceso 2A) y la encarnación del proceso Gen 3.1.Figura 31:Tabla en la que se describen diversas características de las realizaciones del proceso Gen 2, Gen 2.1 y Gen 3.0.
Figura 32:Visión general de las condiciones de los medios para una realización del proceso Gen 3, denominado Gen 3.1.
Figura 33:Tabla en la que se describen diversas características de las realizaciones del proceso Gen 2, Gen 2.1 y Gen 3.0.
Figura 34:Tabla comparativa de diversas características de los procesos Gen 2 y Gen 3.0.
Figura 35:Tabla que proporciona los usos de los medios en las diversas realizaciones de los procesos de expansión descritos.
Figura 36:Comparación de fenotipos: Las realizaciones Gen 3.0 y Gen 3.1 del proceso mostraron una expresión comparable de CD28, CD27 y CD57. La prueba Gen 3.1 (que incluye la adición de OKT-3 y alimentadores el Día 0) alcanzó la capacidad máxima del matraz en el momento de la cosecha.
Figura 37:Mayor producción de IFN<y>en el producto final Gen 3. Se evaluó el análisis de IFN<y>(mediante ELISA) en el sobrenadante congelado del cultivo para comparar ambos procesos. Para cada tumor, estimulación de una noche con placa recubierta anti -CD3, utilizando producto TIL fresco en cada proceso Gen 2(porejemplo,día 22) y Gen 3(por ejemplo,día 16). Cada barra representa aquí son IFNYniveles de estimulado, no estimulado y control de los medios de comunicación.
Figura 38:A) Análisis de la secuencia CDR3 única para el producto final TIL: Las columnas muestran el número de clonotipos TCR B únicos identificados a partir de 1 * 106 células recogidas en el proceso Gen 2(por ejemplo,día 22) y Gen 3(por ejemplo,día 14-16). El Gen 3 muestra una mayor diversidad clonal en comparación con el Gen 2 basándose en el número de CDR de péptidos únicos dentro de la muestra. B) Índice de diversidad del producto final TIL: El índice de diversidad de entropía de Shanon es una métrica común más fiable para la comparación. El Gen 3 mostró una diversidad ligeramente superior a la del Gen 2. C) Análisis de la secuencia CDR3 única para el producto final TIL en L4063 y L4064 bajo los procesos Gen 3, Gen 3.1 control y Gen 3.1 test. Las columnas muestran el número de clonotipos TCR B únicos identificados a partir de 1*106 células recogidas el día 16 de la cosecha, para los procesos Gen 3 y Gen 3.1. El Gen 3.1 mostró una diversidad clonal ligeramente superior en comparación con el Gen 3 basándose en el número de CDR peptídicas únicas dentro de la muestra. D) Índice de diversidad para el producto final TIL en L4063 y L4064 bajo Gen 3. Procesos de control Gen 3.1 y de prueba Gen 3.1. El índice de diversidad de la entropía de Shannon es una métrica de comparación más fiable y habitual. Las condiciones Gen 3.1 en L4063 y L4064 mostraron una diversidad ligeramente superior al proceso Gen 3.
Figura 39:199 secuencias son compartidas entre el producto final Gen 3 y Gen 2, lo que corresponde al 97,07% del 80% superior de secuencias CDR3 únicas de Gen 2 compartidas con el producto final Gen 3.
Figura 40:1833 secuencias son compartidas entre el producto final Gen 3 y Gen 2, lo que corresponde al 99,45% del 80% superior de secuencias CDR3 únicas de Gen 2 compartidas con el producto final Gen 3.
Figura 41:Esquema de una realización ejemplar del proceso Gen 3 (un proceso de 16 días).
Figura 42:Esquema de una realización ejemplar para expandir TIL de neoplasias hematopoyéticas utilizando el proceso Gen 3. En el Día 0, se aísla una fracción de células T (CD3+, CD45+) a partir de un producto de aféresis enriquecido en linfocitos, sangre total o digerido tumoral (fresco o descongelado) utilizando métodos de selección positiva o negativa, es decir , eliminando las células T utilizando un marcador de células T (CD2, CD3, etc., o eliminando otras células dejando las células T), o centrifugación en gradiente.
Figura 43:Esquema de una realización ejemplar del proceso Gen 3 (un proceso de 16 días).
Figura 44:Proporciona una visión general del proceso para una realización ejemplar (Prueba Gen 3.1) del proceso Gen 3.1 (un proceso de 16 días).
Figura 45:Proporciona datos de proliferación TIL, recuento medio total de células viables por fragmento tumoral, porcentaje de viabilidad en el día de la cosecha y recuento total de células viables (TVC) en el día de la cosecha para realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test). La prueba Gen 3.1 (que incluye la adición de OKT-3 y alimentadores el Día 0) alcanzó la capacidad máxima del matraz en el momento de la cosecha. Si se inicia un máximo de 4 matraces en el día 0, cada cosecha de TVC debe multiplicarse por 4.
Figura 46:Gráfico de barras que representa el recuento total de células viables (TVC) y el porcentaje de viabilidad para realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test), un proceso de 16 días.
Figura 47:Proporciona datos que muestran que las realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) produjeron células que mostraron una expresión comparable de CD28, CD27 y CD57.
Figura 48:Proporciona datos que muestran que los estados de memoria TIL eran comparables entre las células producidas por realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, y Gen 3.1 Test). Los estados de memoria de REP TIL se representan de la siguiente manera: Los subconjuntos de memoria TIL CD4+ o CD8+ se dividieron en diferentes subconjuntos de memoria.Na'íve(CD45RA+CD62L+), CM: Memoria central (CD45RA-CD62L+), EM: Memoria efector (CD45RA-CD62L-), TEMRA/TEFF: Memoria efector/efectores RA+ (CD45RA+CD62L+). El gráfico de barras presentado es el porcentaje positivo CD45+/-CD62L /- cuando activado en CD4+ o CD8+.
Figura 49:Proporciona datos que muestran que los marcadores de activación/agotamiento de TIL eran comparables entre las células producidas por realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, y Gen 3.1 Ensayo) cuando activado en CD4+. La activación y el agotamiento de REP TIL se determinaron mediante citometría de flujo multicolor. Las muestras de TIL cosechadas se tiñeron con anticuerpos de citometría de flujo (CD3-BUV395, PD-1-BV421, 2B4/CD244-PB, CD8-BB515, CD25-BUV563, BTLA-PE, KLRG1-PE-Dazzle 594, TIM-3-BV650, CD194/CCR4-APC, CD4-VioGreen, TIGIT-PerCP-eFluor 710, CD183-BV711, CD69-APC-R700, CD95-BUV737, CD127-PE-Cy7, CD103-BV786, LAG-3-APC-eFluor 780). El gráfico de barras presentado es el porcentaje de TIL CD4+ o CD8+ de TIL REP.
Figura 50:Proporciona datos que muestran que los marcadores de activación/agotamiento de TIL eran comparables entre las células producidas por realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1) cuando activado en CD8+. La activación y el agotamiento de REP TIL se determinaron mediante citometría de flujo multicolor. Las muestras cosechadas de TIL se tiñeron con anticuerpos de citometría de flujo (CD3-BUV395, PD-1-BV421, 2B4/CD244-PB, CD8-BB515, CD25-BUV563, BTLA-PE, KLRG1-PE-Dazzle 594, TIM-3-BV650, CD194/CCR4-APC, CD4-VioGreen, TIGIT-PerCP-eFluor 710, CD183-BV711, CD69-APC-R700, CD95-BUV737, CD127-PE-Cy7, CD103-BV786, LAG-3-APC-eFluor 780). El gráfico de barras presentado es el porcentaje de TIL CD4+ o CD8+ de TIL REP.
Figura 51:Proporciona datos que muestran una mayor producción de IFN-<y>exhibida por el producto final Gen 3.1. Se evaluó el análisis de IFNy ELISA en el sobrenadante congelado del cultivo para comparar ambos procesos. Para cada tumor, estimulación de una noche con placa recubierta anti -CD3, utilizando producto TIL fresco en cada día de cosecha. Cada barra representa aquí son los niveles de IFN-<y>de estimulado, no estimulado y control de los medios de comunicación.
Figura 52:Proporciona datos que muestran que la concentración de IL-2 en el sobrenadante era comparable en todas las realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test) utilizando medios estándar. Panel izquierdo: l4063- Medios estándar Gen 2. Panel derecho: L4064- Medio CTS Optimizer. *ELISA realizado con diluyente AIM V
Figura 53:Proporciona datos que muestran que las concentraciones de metabolitos eran comparables en los sobrenadantes de todas las realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test). Los L4063 TIL se expandieron en medios estándar. Los L4064 TIL se expandieron en medios CTS Optimizer.Figura 54:Análisis de la longitud de los telómeros en realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test). Análisis de la longitud de los telómeros para las células producidas por los números de identificación tumoral L4063 y L4064: el valor de la longitud relativa de los telómeros (RTL) indica la fluorescencia media de los telómeros por cromosoma/genoma en las células producidas por los procesos Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test sobre la fluorescencia de los telómeros por cromosoma/genoma en la línea de células control (línea celular de leucemia 1301) utilizando el kit DAKO.
Figura 55:Esquema de una realización ejemplar del proceso Gen 3.1 Test (Gen 3.1 optimizado) (un proceso de 16-17 días).
Figura 56:Esquema de una realización ejemplar del proceso Gen 3 (un proceso de 16 días).
Figura 57A-57B: Tablas comparativas de procesos ejemplares de Gen 2 y Gen 3 con diferencias ejemplares resaltadas.
Figura 58:Esquema de una realización ejemplar del calendario de preparación del proceso Gen 3 (un proceso de 16/17 días).
Figura 59:Esquema de una realización ejemplar del proceso Gen 3 (un proceso de 14-16 días).
Figura 60:Resumen de los datos del Día 16/17 de tres ejecuciones de ingeniería de una realización ejemplar del proceso Gen 3.
Figura 61:Datos relativos al fenotipo ampliado de TIL: se muestran las características de diferenciación frente a las especificaciones de identidad (ID) de TIL para células producidas por dos ejecuciones de ingeniería de una realización de proceso Gen 3 ejemplar.
Figura 62:Datos relativos al fenotipo ampliado de las células TIL expandidas a partir de tumores de pulmón: se muestran las características de diferenciación frente a las especificaciones de identidad (ID) de las células TIL producidas por dos ejecuciones de desarrollo del proceso (PD) de una realización ejemplar del proceso Gen 3 utilizando tejidos tumorales de pulmón.
Figura 63:Datos relativos al fenotipo ampliado (pureza, identidad y memoria) de los TIL expandidos a partir de tumores ováricos: se muestran las características fenotípicas de pureza, identidad y memoria de las células expandidas a partir de tumores ováricos utilizando realizaciones ejemplares del proceso Gen 2, Gen 3.1, y FR ER (Frozen tumor, Early REP); * indica condición no probada; Y indica problema de muestreo, recuento bajo de TVC o células no viables en la descongelación.
Figura 64:Se muestra la estrategia de selección para la caracterización de TIL (se muestra la jerarquía de selección) y los datos relativos a las características fenotípicas ampliadas de las células producidas por dos ejecuciones de ingeniería de una realización de proceso Gen 3 ejemplar.
Figura 65:Se muestra la estrategia de separación para la caracterización de TIL (se muestra la jerarquía de separación) y los datos relativos a las características fenotípicas ampliadas de la subpoblación CD4+ y la subpoblación CD8+ de células producidas por dos ejecuciones de ingeniería de una realización de proceso Gen 3 ejemplar.
Figura 66:Se muestran los datos relativos al análisis ELISA de la Granzima B de las células producidas por dos ejecuciones de ingeniería de una realización ejemplar del proceso Gen 3.
Figura 67A-67B: Esquema de una realización ejemplar del proceso Gen 3 (un proceso de 16 días).
Figura 68:Esquema de una realización ejemplar del proceso Gen 3 (un proceso de 16 días).
Figura 69:Comparación de Gen 2, Gen 2.1 y una realización del proceso Gen 3 (un proceso de 16 días).
Figura 70:Comparación de Gen 2, Gen 2.1 y una realización del proceso Gen 3 (un proceso de 16 días).
Figura 71:Componentes de la realización Gen 3.
Figura 72:Comparación del diagrama de flujo de la realización Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 control, Gen 3.1 Test).
Figura 73:Se presenta el recuento total de células viables y la expansión de pliegues para las realizaciones ejemplares de Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultivo celular estándar y medios de cultivo celular sin suero.
Figura 74: Puntuaciones de viabilidad en % tras la reactivación, la ampliación del cultivo y la cosecha de TIL se presentan para realizaciones ejemplares de Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero.
Figura 75:Se presenta la caracterización fenotípica del producto final TIL producido mediante el procesamiento de muestras tumorales L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular CTS sin suero.
Figura 76:Se presenta el análisis de marcadores de memoria del producto TIL producido al procesar muestras tumorales L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular CTS sin suero.
Figura 77:Se presentan los marcadores de activación y agotamiento de TIL producidos mediante el procesamiento de muestras tumorales L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS seguidos de clasificación de células ativada por CD4+.
Figura 78:Se presentan los marcadores de activación y agotamiento de TIL producidos mediante el procesamiento de muestras tumorales L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS seguidos de clasificación de células ativada por CD8+.
Figura 79:Se presentan las puntuaciones de producción de IFN-y (pg/mL) para el producto final de TIL producido mediante el procesamiento de muestras tumorales L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS.
Figura 80:Se presenta el análisis de la concentración de IL-2 (pg/mL) de los medios gastados (recogidos tras la reactivación, la ampliación del cultivo y la cosecha de TIL) del procesamiento de muestras tumorales L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS.
Figura 81:Se presenta la concentración de glucosa (g/L) en los medios gastados (recogidos tras la reactivación, la ampliación del cultivo y la cosecha de TIL) del procesamiento de muestras tumorales L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS.
Figura 82:Se presenta la concentración de lactato (g/L) en los medios gastados (recogidos tras la reactivación, la ampliación del cultivo y la cosecha de TIL) del procesamiento de muestras tumorales L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS.
Figura 83:Se presenta la concentración de glutamina (mmol/L) en los medios gastados (recogidos tras la reactivación, la ampliación del cultivo y la cosecha de TIL) del procesamiento de muestras tumorales L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS.
Figura 84:Se presenta la concentración de glutamax (mmol/L) en los medios gastados (recogidos tras la reactivación, la ampliación del cultivo y la cosecha de TIL) del procesamiento de muestras tumorales L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS.
Figura 85:Se presenta la concentración de amoníaco (mmol/L) en los medios gastados (recogidos tras la reactivación, la ampliación del cultivo y la cosecha de TIL) del procesamiento de muestras de tumor L4063 y L4064 en procesos Gen 3 ejemplares (Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS. Análisis de la longitud de los telómeros en realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test). Análisis de la longitud de los telómeros para las células producidas por los números de identificación tumoral L4063 y L4064: el valor de la longitud relativa de los telómeros (RTL) indica la fluorescencia media de los telómeros por cromosoma/genoma en las células producidas por los procesos Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test sobre la fluorescencia de los telómeros por cromosoma/genoma en la línea de células control (línea celular de leucemia 1301) utilizando el kit DAKO.
Figura 86:Análisis de la longitud de los telómeros en TIL producidos por realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS. Análisis de la longitud de los telómeros para las células producidas por los números de identificación tumoral L4063 y L4064: el valor de la longitud relativa de los telómeros (RTL) indica la fluorescencia media de los telómeros por cromosoma/genoma en las células producidas por los procesos Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test sobre la fluorescencia de los telómeros por cromosoma/genoma en la línea de células control (línea celular de leucemia 1301) utilizando el kit DAKO.
Figura 87:Resumen del repertorio de TCR Vp para TIL producido por realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test) utilizando medios de cultura celular estándar y medios de cultura celular sin suero CTS. Se describe la clonalidad de TIL para el producto final de TIL obtenido por los números de identificación de tumor L4063 y L4064 producidos por los procesos Gen 3.0, Gen 3.1 Control y Gen 3.1 Test, medida por el repertorio TCR Vp de secuencias CDR3 únicas.
Figura 88:Comparación de TIL producidos por realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test) con respecto a la frecuencia de secuencias CDR3 únicas en TIL cosechadas producto del procesamiento de muestras tumorales L4063.
Figura 89:Comparación de TIL producidos por realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test) con respecto al porcentaje de secuencias CDR3 únicas compartidas en el producto celular TIL cosechado a partir del procesamiento de muestras tumorales L4063: 975 secuencias son compartidas entre el producto final Gen 3.0 y Gen 3.1 Test, lo que equivale al 88% del 80% superior de secuencias CDR3 únicas de Gen 3.0 compartidas con el producto final Gen 3.1 Test.
Figura 90:Comparación de TIL producidos por realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test) con respecto al porcentaje de secuencias CDR3 únicas compartidas en el producto celular cosechado de TIL para el procesamiento de muestras tumorales L4064: 2163 secuencias son compartidas entre el producto final Gen 3.0 y Gen 3.1 Test, lo que equivale al 87% del 80% superior de secuencias<c>DR3 únicas de Gen 3.0 compartidas con el producto final Gen 3.1 Test.
Figura 91:Comparación de TIL producidos por realizaciones ejemplares del proceso Gen 3 (Gen 3.0, Gen 3.1 Control, Gen 3.1 Test) con respecto a la frecuencia de secuencias CDR3 únicas en TIL cosechadas producto del procesamiento de muestras tumorales L4064.
Figura 92:Se muestran los componentes de una realización ejemplar del proceso Gen 3 (Gen 3-Optimizado, un proceso de 16-17 días).
Figura 93:Tabla de criterios de aceptación.
Figura 94:Día de reactivación del recuento celular.
Figura 95:Día de la ampliación de los recuentos celulares.
Figura 96:Recuento de células Cosecha L4063.
Figura 97:Recuento de células Cosecha L4064.
Figura 98:Datos de flujo.
Figura 99:Datos de flujo.
Figura 100:Datos de flujo.
Figura 101:Datos de flujo.
Figura 102:Datos de producción de IFN-<y>Figura 7-L4063.
Figura 103:Datos de producción de IFN-<y>Figura 7-L4064.
Figura 104:Análisis ELISA de los datos de concentración de IL-2.
Figura 105:Tabla resumen de datos metabólicos.
Figura 106:Datos resumidos.
Figura 107:Datos resumidos.
Figura 108:Índice de diversidad de Shannon.
Figura 109:Ejemplo de gráfico del Proceso 2A que ofrece una visión general de las Etapas A a F.
Figura 110:En las estructuras I-A y I-B, los cilindros se refieren a dominios individuales de unión a polipéptidos. Las estructuras I-A e I-B comprenden tres dominios de unión a TNFRSF enlazados linealmente derivados de, por ejemplo, 4-1BBL o un anticuerpo que se une a 4-1BB, que se pliegan para formar una proteína trivalente, que a continuación se une a una segunda proteína trivalente a través de IgG1-Fc (incluidos los dominios CH3 y CH2) se utiliza entonces para unir dos de las proteínas trivalentes a través de enlaces disulfuro (pequeños óvalos alargados), estabilizando la estructura y proporcionando un agonista capaz de reunir los dominios de señalización intracelular de los seis receptores y proteínas de señalización para formar un complejo de señalización. Los dominios de unión a TNFRSF denotados como cilindros pueden ser dominios scFv que comprenden, por ejemplo, una cadena VH y una VL conectadas por un enlazador que puede comprender residuos hidrofílicos y secuencias Gly y Ser para flexibilidad, así como Glu y Lys para solubilidad.
Figura 111: Visión general de los procesos Gen 2 y Gen 3 utilizando muestras de biopsia.
Figura 112: Ejemplos de procesos Gen 3.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS
[0258]
SEQ ID N.°:1 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del muromonab.
SEQ ID N.°:2 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del muromonab.
SEQ ID N.°:3 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-2 humana recombinante.
SEQ ID N.°:4 es la secuencia de aminoácidos de la aldesleucina.
SEQ ID N.°:5 es la secuencia de aminoácidos de una proteína humana recombinante.
SEQ ID N.°:6 es la secuencia de aminoácidos de una proteína humana recombinante.
SEQ ID N.°:7 es la secuencia de aminoácidos de una proteína humana recombinante.
SEQ ID N.°:8 es la secuencia de aminoácidos de una proteína humana recombinante.
SEQ ID N.°:9 es la secuencia de aminoácidos del 4-1BB humano.
SEQ ID N.°:10 es la secuencia de aminoácidos del 4-1BB murino.
SEQ ID N.°:11 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566). SEQ ID N.°:12 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID N.°:13 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID N.°:14 es la región variable de la cadena ligera (VL) para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID N.°:15 es la cadena pesada CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID N.°:16 es la cadena pesada CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID N.°:17 es la cadena pesada CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID N.°:18 es la cadena ligera CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID N.°:19 es la cadena ligera CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID N.°:20 es la cadena ligera CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID N.°:21 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID N.°:22 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID N.°:23 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID N.°:24 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID N.°:25 es la cadena pesada CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513). SEQ ID N.°:26 es la cadena pesada CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513). SEQ ID N.°:27 es la cadena pesada CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513). SEQ ID N.°:28 es la cadena ligera CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513). SEQ ID N.°:29 es la cadena ligera CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513). SEQ ID N.°:30 es la cadena ligera CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513). SEQ ID N.°:31 es un dominio Fc para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID N.°:32 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:33 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:34 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:35 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:36 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:37 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:38 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:39 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:40 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:41 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:42 es un dominio Fc para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID N.°:43 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:44 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:45 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.
SEQ ID N.°:46 es una secuencia de aminoácidos del ligando 4-1BB (4-1BBL).
SEQ ID N.°:47 es una porción soluble del polipéptido 4-1BBL.
SEQ ID N.°:48 es una región variable de cadena pesada (V<h>) para el anticuerpo agonista 4-1BB 4B4-1-1 versión 1.
SEQ ID N.°:49 es una región variable de cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo agonista 4-1BB 4B4-1-1 versión 1.
SEQ ID N.°:50 es una región variable de cadena pesada (V<h>) para el anticuerpo agonista 4-1BB 4B4-1-1 versión
2.
SEQ ID N.°:51 es una región variable de cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo agonista 4-1BB 4B4-1-1 versión 2.
SEQ ID N.°:52 es una región variable de cadena pesada (V<h>) para el anticuerpo agonista 4-1BB H39E3-2.
SEQ ID N.°:53 es una región variable de cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo agonista 4-1BB H39E3-2.
SEQ ID N.°:54 es la secuencia de aminoácidos de OX40 humana.
SEQ ID N.°:55 es la secuencia de aminoácidos de la OX40 murina.
SEQ ID N.°:56 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID N.°:57 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID N.°:58 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID N.°:59 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID N.°:60 es la cadena pesada CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID N.°:61 es la cadena pesada CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID N.°:62 es la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID N.°:63 es la CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID N.°:64 es la cadena ligera CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID N.°:65 es la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID N.°:66 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista OX40 11D4.
SEQ ID N.°:67 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista OX40 11D4.
SEQ ID N.°:68 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 11D4.
X40 11D4.
SEQ ID N.°:77 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista OX40 18D8.
SEQ ID N.°:78 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 18D8.
SEQ ID N.°:79 es la región variable de cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 18D8. SEQ ID N.°:80 es la cadena pesada CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 18D8.
SEQ ID N.°:81 es la cadena pesada CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 18D8.
SEQ ID N.°:82 es la cadena pesada CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 18D8.
SEQ ID N.°:83 es la cadena ligera CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 18D8.
SEQ ID N.°:84 es la cadena ligera CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 18D8.
SEQ ID N.°:85 es la cadena ligera CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 18D8.
SEQ ID N.°:86 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) del anticuerpo monoclonal Hu119-122 agonista de OX40.
SEQ ID N.°:87 es la región variable de cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu119-122.
SEQ ID N.°:88 es la cadena pesada CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu119-122.
SEQ ID N.°:89 es la cadena pesada CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu119-122.
SEQ ID N.°:90 es la cadena pesada CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu119-122.
SEQ ID N.°:91 es la cadena ligera CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu119-122.
SEQ ID N.°:92 es la cadena ligera CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu119-122.
SEQ ID N.°:93 es la cadena ligera CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu119-122.
SEQ ID N.°:94 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) del anticuerpo monoclonal Hu106-222 agonista de OX40.
SEQ ID N.°:95 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu106-222.
SEQ ID N.°:96 es la cadena pesada CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu106-222.
SEQ ID N.°:97 es la cadena pesada CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu106-222.
SEQ ID N.°:98 es la cadena pesada CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu106-222.
SEQ ID N.°:99 es la cadena ligera CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu106-222.
SEQ ID N.°:100 es la cadena ligera CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu106-222.
SEQ ID N.°:101 es la cadena ligera CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista OX40 Hu106-222.
SEQ ID N.°:102 es una secuencia de aminoácidos del ligando OX40 (OX40L).
SEQ ID N.°:103 es una porción soluble del polipéptido OX40L.
SEQ ID N.°:104 es una porción soluble alternativa del polipéptido OX40L.
SEQ ID N.°:105 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) del anticuerpo monoclonal 008 agonista de OX40. SEQ ID N.°:106 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo monoclonal 008 agonista de OX40. SEQ ID N.°:107 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) del anticuerpo monoclonal 011 agonista de OX40. SEQ ID N.°:108 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo monoclonal 011 agonista de OX40. SEQ ID N.°:109 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) del anticuerpo monoclonal 021 agonista de OX40.
SEQ ID N.°:110 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo monoclonal 021 agonista de OX40. SEQ ID N.°:111 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) del anticuerpo monoclonal 023 agonista de OX40.
SEQ ID N.°:112 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo monoclonal 023 agonista de OX40. SEQ ID N.°:113 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40.
SEQ ID N.°:114 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40. SEQ ID N.°:115 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40. SEQ ID N.°:116 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40. SEQ ID N.°:117 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40 humanizado.
SEQ ID N.°:118 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40 humanizado.
SEQ ID N.°:119 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) para un anticuerpo monoclonal agonista OX40 humanizado.
SEQ ID N.°:120 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) para un anticuerpo monoclonal agonista OX40 humanizado.
SEQ ID N.°:121 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40 humanizado.
SEQ ID N.°:122 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40 humanizado.
SEQ ID N.°:123 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) para un anticuerpo monoclonal agonista OX40 humanizado.
SEQ ID N.°:124 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) para un anticuerpo monoclonal agonista OX40 humanizado.
SEQ ID N.°:125 es la región variable de la cadena pesada (V<h>) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40.
SEQ ID N.°:126 es la región variable de la cadena ligera (V<l>) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
I. Definiciones
[0259]Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
[0260]El término"in vivo"se refiere a un acontecimiento que tiene lugar en el cuerpo de un sujeto.
[0261]El término"in vitro"se refiere a un evento que tiene lugar fuera del cuerpo de un sujeto. Los ensayos in vitro abarcan ensayos basados en células en los que se emplean células vivas o muertas y también pueden abarcar un ensayo libre de células en el que no se emplean células intactas.
[0262]El término "exvivo"se refiere a un evento que implica tratar o realizar un procedimiento en una célula, tejido y/u órgano que ha sido extraído del cuerpo de un sujeto. De este modo, la célula, el tejido y/o el órgano pueden devolverse al cuerpo del sujeto en un método de cirugía o tratamiento.
[0263]El término "expansión rápida" significa un aumento en el número de TIL específicos de antígeno de al menos aproximadamente 3 veces (o 4, 5, 6, 7, 8, o 9 veces) durante un periodo de una semana, más preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces (o 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, o 90 veces) durante un periodo de una semana, o más preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces durante un periodo de una semana. A continuación se describen varios protocolos de expansión rápida.
[0264]Por "linfocitos infiltrantes tumorales" o "TIL" se entiende aquí una población de células obtenidas originalmente como glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo de un sujeto y migrado a un tumor. Los TIL incluyen, entre otros, células T citotóxicas CD8+ (linfocitos), células T CD4+ Th1 y Th17, células asesinas naturales, células dendríticas y macrófagos M1. Los TIL incluyen tanto TIL primarios como secundarios. Los "TIL primarios" son los que se obtienen de muestras de tejido del paciente como se describe en el presente documento (a veces denominados "recién cosechados"), y los "TIL secundarios" son cualquier población de células TIL que se haya expandido o proliferado como se describe en el presente documento, incluidos, entre otros, los TIL masivos y los TIL expandidos ("TIL REP" o "TIL post-REP"). Las poblaciones de células TIL pueden incluir TIL modificados genéticamente.
[0265]Por "población de células" (incluyendo TIL) se entiende un número de células que comparten rasgos comunes. En general, las poblaciones suelen oscilar entre 1 * 106 y 1 * 1010 en número, con diferentes poblaciones de TIL que comprenden diferentes números. Por ejemplo, el crecimiento inicial de TIL primarios en presencia de IL-2 da lugar a una población de TIL masivos de aproximadamente 1 * 108 células. La expansión REP se realiza generalmente para proporcionar poblaciones de 1,5 * 109 a 1,5 * 1010 células para infusión. En algunos casos, la expansión REP se realiza para proporcionar poblaciones de 2,3*1010 -13,7 * 1010
[0266]Por "TIL crioconservados" se entiende que los TIL, ya sean primarios, masivos, o expandidos (TIL REP), se tratan y almacenan en un intervalo de -150°C a -60°C aproximadamente. Los métodos generales de crioconservación también se describen en otras partes del presente documento, incluidos los Ejemplos. Para mayor claridad, los "TIL crioconservados" se distinguen de las muestras de tejido congeladas que pueden utilizarse como fuente de TIL primarios.
[0267]Por "TIL crioconservados descongelados" se entiende aquí una población de TIL que se crioconservó previamente y luego se trató para que volviera a temperatura ambiente o superior, incluyendo pero sin limitarse a temperaturas de cultura celular o temperaturas en las que los TIL pueden administrarse a un paciente.
[0268]Los TIL generalmente pueden definirse bioquímicamente, utilizando marcadores de superficie celular, o funcionalmente, por su capacidad para infiltrarse en tumores y efectuar el tratamiento. Los TIL pueden clasificarse generalmente por la expresión de uno o más de los siguientes biomarcadores: CD4, CD8, TCR ap, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, y CD25. Además, y de forma alternativa, los TIL pueden definirse funcionalmente por su capacidad para infiltrarse en tumores sólidos tras su reintroducción en un paciente.
[0269]El término "medio de criopreservación" o "medio de criopreservación" se refiere a cualquier medio que pueda utilizarse para la criopreservación de células. Dichos medios pueden incluir medios que contengan entre un 7% y un 10% de DMSO. Los medios ejemplares incluyen CryoStor CS10, Hyperthermasol, así como combinaciones de los mismos. El término "CS10" se refiere a un medio de criopreservación que se obtiene de Stemcell Technologies o de Biolife Solutions. El medio CS10 puede denominarse con el nombre comercial "CryoStor® CS10". El medio CS10 es un medio sin suero ni componentes animales que contiene DMSO.
[0270] El término "célula T de memoria central" se refiere a un subconjunto de células T que en el humano son CD45R0+ y expresan constitutivamente CCR7 (CCR7hi) y CD62L (CD62hi). El fenotipo de superficie de las células T de memoria central también incluye TCR, CD3, CD127 (IL-7R), e IL-15R. Los factores de transcripción de las células T de memoria central incluyen BCL-6, BCL-6B, MBD2, y BMI1. Las células T de memoria central secretan principalmente IL-2 y CD40L como moléculas efectoras tras la activación del TCR. Las células T de memoria central predominan en el compartimento CD4 de la sangre, y en el ser humano están proporcionalmente enriquecidas en los ganglios linfáticos y las amígdalas.
[0271]El término "células T efectoras de memoria" se refiere a un subconjunto de células T humanas o de mamíferos que, al igual que las células T de memoria central, son CD45R0+, pero han perdido la expresión constitutiva de CCR7 (CCR7lD) y son heterogéneas o bajas para la expresión de CD62L (CD62LlD). El fenotipo de superficie de las células T de memoria central también incluye TCR, CD3, CD127 (IL-7R), e IL-15R. Los factores de transcripción de las células T de memoria central incluyen BLIMP1. Las células T efectoras de memoria secretan rápidamente altos niveles de citocinas inflamatorias tras la estimulación antigénica, incluyendo interferón-Y, IL-4 e IL-5. Las células T efectoras de memoria predominan en el compartimento CD8 de la sangre, y en el ser humano están proporcionalmente enriquecidas en el pulmón, el hígado, y el intestino. Las células T efectoras CD8+ de memoria son portadoras de grandes cantidades de perforina.
[0272]El término "sistema cerrado" se refiere a un sistema que está cerrado al entorno exterior. Cualquier sistema cerrado apropiado para métodos de cultivo celular puede emplearse con los métodos de la presente invención. Los sistemas cerrados incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a los contenedores G cerrados. Una vez que se añade un segmento tumoral al sistema cerrado, éste no se abre al entorno exterior hasta que los TIL están listas para ser administradas al paciente.
[0273]Los términos "fragmentar" y "fragmentado", tal y como se utilizan en el presente documento para describir procesos para desorganizar un tumor, incluyen métodos de fragmentación mecánica como el aplastamiento, el corte en rodajas, la división y la morcelación del tejido tumoral, así como cualquier otro método para desorganizar la estructura física del tejido tumoral.
[0274]El término "aspirado con aguja fina" o FNA se refiere a un tipo de procedimiento de biopsia que puede emplearse para procedimientos de muestreo o diagnóstico, incluido el muestreo de tumores, en el que se toma una muestra pero no se extirpa o reseca el tumor. En la aspiración con aguja fina, se inserta una aguja hueca, por ejemplo de calibre 25-18, en el tumor o en una zona que contenga el tumor y se obtienen líquido y células (incluido tejido) para su posterior análisis o expansión, como se describe en el presente documento. Con una PAAF, las células se extraen sin preservar la arquitectura histológica de las células del tejido. Una PAAF puede incluir TIL. En algunos casos, la biopsia por aspiración con aguja fina se realiza utilizando una aguja de biopsia por aspiración con aguja fina guiada por ecografía. Las agujas FNA están disponibles comercialmente en Becton Dickinson, Covidien y similares.
[0275]El término "biopsia central" o "biopsia central con aguja" se refiere a un tipo de procedimiento de biopsia que puede emplearse para procedimientos de muestreo o diagnóstico, incluido el muestreo de tumores, en el que se toma una muestra pero no se extirpa o reseca el tumor. En una biopsia central, se inserta una aguja hueca, por ejemplo de calibre 16-11, en el tumor o en una zona que contenga el tumor y se obtienen líquido y células (incluido tejido) para su posterior análisis o expansión, tal como se describe en el presente documento. Con una biopsia con aguja gruesa, las células pueden extraerse preservando en cierta medida la arquitectura histológica de las células tisulares, dado el mayor tamaño de la aguja en comparación con una PAAF. La aguja de biopsia con aguja gruesa suele tener un calibre capaz de preservar al menos una parte de la arquitectura histológica del tumor. Una biopsia central puede incluir TIL. En algunos casos, la biopsia con aguja gruesa se realiza utilizando un instrumento de biopsia, un instrumento de biopsia con aguja gruesa asistida por vacío, un instrumento de biopsia con aguja gruesa guiada estereotácticamente, un instrumento de biopsia con aguja gruesa guiada por ultrasonido, un instrumento de biopsia con aguja gruesa guiada por resonancia magnética disponible comercialmente en Bard Medical, Becton Dickinson y similares.
[0276]Los términos "células mononucleares de sangre periférica" y "PBMC" se refieren a una célula de sangre periférica que tiene un núcleo redondo, incluyendo linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos. Cuando se utilizan como células presentadoras de antígenos (las PBMC son un tipo de células presentadoras de antígenos), las células mononucleares de sangre periférica son células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas.
[0277]Los términos "linfocitos de sangre periférica" y "PBL" se refieren a células T expandidas a partir de sangre periférica. En algunas realizaciones, los PBL se separan de la sangre total o del producto de aféresis de un donante. En algunas realizaciones, los PBL se separan de la sangre total o del producto de aféresis de un donante mediante selección positiva o negativa de un fenotipo de células T, como el fenotipo de células T CD3+ CD45+.
[0278]El término "anticuerpo anti-CD3" se refiere a un anticuerpo o variante del mismo,p. ej.,un anticuerpo monoclonal e incluyendo anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o murinos que se dirigen contra el receptor CD3 del receptor de antígeno de células T maduras. Los anticuerpos anti-CD3 incluyen el OKT-3, también conocido como muromonab. Los anticuerpos anti-CD3 también incluyen el clon UHCT1, también conocido como T3 y CD3<e>. Otros anticuerpos anti-CD3 incluyen, por ejemplo, otelixizumab, teplizumab, y visilizumab.
[0279]El término "OKT-3" (también denominado en el presente documento "OKT3") se refiere a un anticuerpo monoclonal o biosimilar o variante del mismo, incluidos anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos, o murinos, dirigidos contra el receptor CD3 del receptor de antígeno de células T maduras, e incluye formas comercialmente disponibles como OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc, San Diego,<c>A, EE.UU.) y muromonab o variantes, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, o biosimilares de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de muromonab se indican en la Tabla 1 (SEQ ID N.°:1 y SEQ ID N.°:2). Un hibridoma capaz de producir OKT-3 está depositado en la American Type Culture Collection y tiene asignado el número de acceso ATCC CRL 8001. Un hibridoma capaz de producir OKT-3 también está depositado en la Colección Europea de Cultivos Celulares Autentificados (ECACC) y se le ha asignado el número de catálogo 86022706.
TABLA 1. Secuencias de aminoácidos de muromonab.
[0280]El término "IL-2" (también denominado en el presente documento "IL2") se refiere al factor de crecimiento de células T conocido como interleucina-2, e incluye todas las formas de IL-2, incluidas las formas humanas y de mamíferos, las sustituciones conservadoras de aminoácidos, las glicoformas, los biosimilares, y sus variantes. La<i>L-2 se describe,por ejemplo,en Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 y Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79. La secuencia de aminoácidos de la IL-2 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se indica en la Tabla 2 (SEQ ID N.°:3). Por ejemplo, el término IL-2 abarca las formas recombinantes humanas de IL-2, como la aldesleucina (PROLEUKIN, disponible comercialmente a través de múltiples proveedores en viales de un solo uso de 22 millones de UI), así como la forma de IL-2 recombinante suministrada comercialmente por CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, EE.UU. (CELLGRO GMP) o ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE.UU. (Cat. N.° CYT-209-b) y otros equivalentes comerciales de otros proveedores. La aldesleucina (des-alanil-1, serina-125 IL-2 humana) es una forma recombinante humana no glucosilada de IL-2 con un peso molecular de aproximadamente 15 kDa. La secuencia de aminoácidos de la aldesleucina adecuada para su uso en la invención se indica en la Tabla 2 (SEQ ID N.°:4). El término IL-2 también abarca las formas pegiladas de IL-2, como se describe en el presente documento, incluido el profármaco pegilado de IL2 NKTR-214, disponible en Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, EE.UU.. El NKTR-214 y la IL-2 pegilada adecuados para su uso en la invención se describen en Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° US 2014/0328791 A1 y publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2012/065086 A1. Formas alternativas de IL-2 conjugada adecuadas para su uso en la invención se describen en Patentes de EE.UU. N.° 4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 y 4902,502. Las formulaciones de IL-2 adecuadas para su uso en la invención se describen en Patente de EE. UU. N.° 6,706,289.
TABLA 2. Secuencias de aminoácidos de las interleucinas.
[0281]El término "IL-4" (también referido aquí como "IL4") se refiere a la citocina conocida como interleucina 4, que es producida por células T Th2 y por eosinófilos, basófilos, y mastocitos. La IL-4 regula la diferenciación de las células T ayudantesnaive(células Th0) a células T Th2. Steinke y Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70. Tras la activación por IL-4, las células T Th2 producen posteriormente IL-4 adicional en un bucle de retroalimentación positiva. La IL-4 también estimula la proliferación de células B y la expresión del MHC de clase II, e induce el cambio de clase a la expresión de IgE e IgG<1>de las células B. La IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención está disponible comercialmente en múltiples proveedores, incluyendo ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (Cat. No. CYT-211) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteína recombinante IL-15 humana, Cat. N.° Gibco CTP0043). La secuencia de aminoácidos de la IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se indica en la Tabla 2 (SEQ ID N.°:5).
[0282]El término "IL-7" (también denominado en el presente documento "IL7") se refiere a una citocina glicosilada derivada de tejidos conocida como interleucina 7, que puede obtenerse de células estromales y epiteliales, así como de células dendríticas. Fry y Mackall,. La IL-7 puede estimular el desarrollo de células T. La IL-7 se une al receptor de IL-7, un heterodímero formado por el receptor alfa de IL-7 y el receptor de cadena gamma común, que en una serie de señales importantes para el desarrollo de las células T dentro del timo y la supervivencia dentro de la periferia. La IL-7 humana recombinante adecuada para su uso en la invención está disponible comercialmente en múltiples proveedores, incluyendo ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (Cat. No. CYT-254) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteína recombinante IL-15 humana, Cat. No. Gibco PHC0071). La secuencia de aminoácidos de la IL-7 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se indica en la Tabla 2 (SEQ ID N.°:<6>).
[0283]El término "IL-15" (también denominado en el presente documento "IL15") se refiere al factor de crecimiento de células T conocido como interleucina-15, e incluye todas las formas de IL-2, incluidas las formas humanas y de mamíferos, las sustituciones conservadoras de aminoácidos, las glicoformas, los biosimilares, y sus variantes. La IL-15 se describe, porejemplo,en Fehniger y Caligiuri,. La IL-15 comparte las subunidades p y<y>del receptor de señalización con la IL-2. La IL-15 humana recombinante es una cadena polipeptídica única, no glicosilada, que contiene 114 aminoácidos (y una metionina N-terminal) con una masa molecular de 12,8 kDa. La IL-15 humana recombinante está disponible comercialmente en múltiples proveedores, entre ellos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE.<u>U. (Cat. No. CYT-230-b) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteína recombinante IL-15 humana, Cat. N.° 34 8159-82. La secuencia de aminoácidos de la IL-15 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se indica en la Tabla 2 (SEQ ID N.°:7).
[0284]El término "IL-21" (también referido aquí como "IL21") se refiere a la proteína citocina pleiotrópica conocida como interleucina-21, e incluye todas las formas de IL-21 incluyendo formas humanas y de mamíferos, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, biosimilares, y variantes de las mismas. La IL-21 se describe,por ejemplo,en Spolski y Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95. La IL-21 es producida principalmente por los linfocitos T natural killer y los linfocitos T CD4+ humanos activados. La IL-21 humana recombinante es una cadena polipeptídica única, no glicosilada, que contiene 132 aminoácidos con una masa molecular de 15,4 kDa. La IL-21 humana recombinante está disponible comercialmente en múltiples proveedores, entre ellos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE.UU. (Cat. No. CYT-408-b) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteína recombinante IL-21 humana, Cat. N.° 14-8219-80. La secuencia de aminoácidos de la IL-21 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se indica en la Tabla 2 (SEQ ID N.°:<8>).
[0285]Cuando se indica "una cantidad efectiva antitumoral", "una cantidad efectiva inhibidora de tumores", o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención a administrar puede ser determinada por un médico con consideración de las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis, y condición del paciente (sujeto). En general, puede afirmarse que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos infiltrantes tumorales(p. ej.,TIL secundarios o linfocitos citotóxicos modificados genéticamente) descritos en el presente documento puede administrarse a una dosis de<104>a<10 11>células/kg de peso corporal(p. ej.,<10 5>a<10>6,<1 05>a<1 0>10,<10>5 a<1 0>11,<10>6 a<1 0>10,<1 0>6 a<10 11>,<10>7 a<1 0>11,<1 0>7 a<1 0>10,<10>8 a<1 0>11,<10>8 a<1 0>10,<1 0>9 a<10>11, o<10>9 a 10<10>células/kg de peso corporal), incluyendo todos los valores enteros dentro de dichos intervalos. Las composiciones de linfocitos infiltrantes de tumores (incluidos, en algunos casos, los linfocitos citotóxicos modificados genéticamente) también pueden administrarse varias veces a estas dosis. Los linfocitos infiltrantes del tumor (incluidos, en algunos casos, linfocitos citotóxicos modificados genéticamente) pueden administrarse mediante técnicas de infusión comúnmente conocidas en inmunoterapia (véase, p .ej.,Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). Un experto en medicina puede determinar fácilmente la dosis y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente concreto controlando al paciente en busca de signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.
[0286]Los términos "neoplasia hematológica", "neoplasia hematológica" o términos de significado correlativo se refieren a cánceres y tumores de mamíferos de los tejidos hematopoyéticos y linfoides, incluidos, entre otros, los tejidos de la sangre, la médula ósea, los ganglios linfáticos, y el sistema linfático. Las neoplasias hematológicas también se denominan "tumores líquidos". Las neoplasias hematológicas incluyen, entre otras, la leucemia linfoblástica aguda (ALL), el linfoma linfocítico crónico (CLL), el linfoma linfocítico pequeño (SLL), la leucemia mielógena aguda (AML), la leucemia mielógena crónica (CML), la leucemia monocítica aguda (AMoL), el linfoma de Hodgkin, y los linfomas no hodgkinianos. El término "neoplasia hematológica de células B" hace referencia a las neoplasias hematológicas que afectan a las células B.
[0287]El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que normalmente no contiene quistes ni áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término "cáncer de tumor sólido" se refiere a tumores sólidos malignos, neoplásicos, o cancerosos. Los cánceres de tumores sólidos incluyen, entre otros, sarcomas, carcinomas y linfomas, como los de pulmón, mama, próstata, colon, recto y vejiga. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos tisulares interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células estromales de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
[0288]El término "tumor líquido" se refiere a una masa anormal de células que es de naturaleza fluida. Los cánceres de tumor líquido incluyen, entre otros, leucemias, mielomas, y linfomas, así como otras neoplasias hematológicas. Los TIL obtenidos de tumores líquidos también pueden denominarse en el presente documento linfocitos infiltrantes de médula ósea (MIL). Los TIL obtenidos de tumores líquidos, incluidos los tumores líquidos que circulan en la sangre periférica, también pueden denominarse en el presente documento PBL. Los términos MIL, TIL, y PBL se utilizan indistintamente en el presente documento y sólo difieren en función del tipo de tejido del que se derivan las células.
[0289]El término "microambiente", tal como se utiliza en el presente documento, puede referirse al microambiente tumoral sólido o hematológico en su conjunto o a un subconjunto individual de células dentro del microambiente. El microambiente tumoral, tal y como se utiliza aquí, se refiere a una mezcla compleja de "células, factores solubles, moléculas de señalización, matrices extracelulares, y señales mecánicas que promueven la transformación neoplásica, apoyan el crecimiento y la invasión tumoral, protegen al tumor de la inmunidad del huésped, fomentan la resistencia terapéutica y proporcionan nichos para que prosperen las metástasis dominantes", tal y como se describe en Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473. Aunque los tumores expresan antígenos que deberían ser reconocidos por las células T, la eliminación del tumor por el sistema inmunitario es poco frecuente debido a la supresión inmunitaria por el microentorno.
[0290]Se divulga en el presente documento un método de tratamiento de un cáncer con una población de TIL, en el que un paciente se pretrata con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL. La población de TIL puede proporcionarse cuando un paciente se pretrata con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL según la presente invención. La quimioterapia no mieloablativa puede ser ciclofosfamida 60 mg/kg/d durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de TIL) y fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). Tras la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de TIL (en el día 0), el paciente puede recibir una infusión intravenosa de IL-2 a 720.000 UI/kg cada<8>horas hasta tolerancia fisiológica.
[0291]Los hallazgos experimentales indican que la linfodepleción previa a la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos de tumor desempeña un papel clave en la mejora de la eficacia del tratamiento al eliminar las células T reguladoras y los elementos competidores del sistema inmunitario ("sumideros de citocinas"). En consecuencia, se puede utilizar una etapa de linfodepleción (a veces también denominada "acondicionamiento inmunosupresor") en el paciente antes de la introducción de las rTIL de la invención.
[0292]Los términos "coadministración", "coadministración", "administrado en combinación con", "administrar en combinación con", "simultáneo" y "concurrente" tal como se utilizan en el presente documento, abarcan la administración de dos o más principios farmacéuticos activos (por ejemplo, al menos un agonista de los canales de potasio en combinación con una pluralidad de TIL) a un sujeto de modo que ambos principios farmacéuticos activos y/o sus metabolitos estén presentes en el sujeto al mismo tiempo. La administración conjunta incluye la administración simultánea en composiciones separadas, la administración en momentos diferentes en composiciones separadas o la administración en una composición en la que estén presentes dos o más principios activos farmacéuticos. Se prefiere la administración simultánea en composiciones separadas y la administración en una composición en la que estén presentes ambos agentes.
[0293]El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto o combinación de compuestos como se describe en el presente documento que es suficiente para efectuar la aplicación prevista, incluyendo, pero no limitado a, el tratamiento de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar en función de la aplicación prevista (in vitro o in vivo), o del sujeto y la enfermedad que se esté tratando(p. ej.,el peso, la edad y el sexo del sujeto), la gravedad de la enfermedad, o la forma de administración. El término también se aplica a una dosis que inducirá una respuesta particular en las células diana(p. ej.,la reducción de la adhesión de plaquetas y/o la migración celular). La dosis específica variará en función de los compuestos concretos elegidos, el régimen de dosificación a seguir, si el compuesto se administra en combinación con otros compuestos, el momento de la administración, el tejido al que se administra y el sistema físico de administración en el que se transporta el compuesto.
[0294]Los términos "tratamiento", "en tratamiento", "tratar" y similares se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se utiliza en el presente documento, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en particular en un ser humano, e incluye: (a) prevenir la aparición de la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a padecerla pero al que aún no se le ha diagnosticado; (b) inhibir la enfermedad,es decir,detener su desarrollo o progresión; y (c) aliviar la enfermedad,es decir,provocar la regresión de la enfermedad y/o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad. Por "tratamiento" también se entiende la administración de un agente con el fin de obtener un efecto farmacológico, incluso en ausencia de una enfermedad o afección. Por ejemplo, "tratamiento" abarca la administración de una composición que puede provocar una respuesta inmunitaria o conferir inmunidad en ausencia de una enfermedad,p. ej.,en el caso de una vacuna.
[0295]El término "heterólogo" cuando se utiliza con referencia a porciones de un ácido nucleico o proteína indica que el ácido nucleico o proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas para hacer un nuevo ácido nucleico funcional,p. ej.,un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente, o regiones codificantes de diferentes fuentes. Del mismo modo, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza(p. ej.,una proteína de fusión).
[0296] Los términos "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad", y "porcentaje de identidad de secuencia" (o sinónimos de los mismos,p. ej.,"99% idéntico") en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, si es necesario) para una correspondencia máxima, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad puede medirse utilizando software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen en la técnica diversos algoritmos y programas informáticos que pueden utilizarse para obtener alineaciones de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Entre los programas adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias se incluye, por ejemplo, el conjunto de programas BLAST disponible en Sitio web BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica del Gobierno de los EE.UU.. Las comparaciones entre dos secuencias pueden realizarse mediante el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se utiliza para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. a L iGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o MegAlign, disponibles en DNASTAR, son otros programas informáticos de acceso público que pueden utilizarse para alinear secuencias. Un experto en la técnica puede determinar los parámetros adecuados para una alineación máxima mediante un software de alineación concreto. En ciertas realizaciones, se utilizan los parámetros por defecto del software de alineación.
[0297] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variante" engloba pero no se limita a proteínas, anticuerpos o proteínas de fusión que comprenden una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de una proteína, anticuerpo o proteína de fusión de referencia mediante una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo, proteína o proteína de fusión de referencia o adyacentes a la misma. La variante puede incluir una o más sustituciones conservadoras en su secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de referencia. Las sustituciones conservadoras pueden implicar, por ejemplo, la sustitución de aminoácidos cargados o no cargados de forma similar. La variante conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno del anticuerpo, proteína o proteína de fusión de referencia. El término variante también incluye anticuerpos o proteínas pegilados.
[0298] Por "linfocitos infiltrantes tumorales" o "TIL" se entiende aquí una población de células obtenidas originalmente como glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo de un sujeto y migrado a un tumor. Los TIL incluyen, entre otros, células T citotóxicas CD<8>+ (linfocitos), células T CD4+ Th1 y Th17, células asesinas naturales, células dendríticas y macrófagos M1. Los TIL incluyen tanto TIL primarios como secundarios. Los "TIL primarios" son los que se obtienen a partir de muestras de tejido del paciente como se describe en el presente documento (a veces denominados "recién obtenidos" o "recién aislados"), y los "TIL secundarios" son cualquier población de células TIL que se haya expandido o proliferado como se describe en el presente documento, incluidos, entre otros, los TIL masivos, los TIL expandidos ("TIL REP"), así como los "TIL reREP" como se describe en el presente documento. Los TIL reREP pueden incluir, por ejemplo, TIL de segunda expansión o TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la Etapa D de la Figura 1, incluyendo TIL denominados TIL reREP).
[0299] Los TIL generalmente pueden definirse bioquímicamente, utilizando marcadores de superficie celular, o funcionalmente, por su capacidad para infiltrarse en tumores y efectuar el tratamiento. Los TIL pueden clasificarse generalmente por la expresión de uno o más de los siguientes biomarcadores: CD4, CD<8>, TCR ap, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, y CD25. Además, y de forma alternativa, los TIL pueden definirse funcionalmente por su capacidad para infiltrarse en tumores sólidos tras su reintroducción en un paciente. Los TIL pueden caracterizarse además por su potencia - por ejemplo, los TIL pueden considerarse potentes si, por ejemplo, la liberación de interferón (IFN) es superior a aproximadamente 50 pg/mL, superior a aproximadamente 100 pg/mL, superior a aproximadamente 150 pg/mL, o superior a aproximadamente<2 0 0>pg/mL. Los TIL pueden considerarse potentes si, por ejemplo, la liberación de interferón (IFN<y>) es superior a aproximadamente 50 pg/mL, superior a aproximadamente 100 pg/mL, superior a aproximadamente 150 pg/mL, o superior a aproximadamente 200 pg/mL, superior a aproximadamente 300 pg/mL, superior a aproximadamente 400 pg/mL, superior a aproximadamente 500 pg/mL, superior a aproximadamente 600 pg/mL, superior a aproximadamente 700 pg/mL, superior a aproximadamente 800 pg/mL, superior a aproximadamente 900 pg/mL, superior a aproximadamente<10 00>pg/mL.
[0300] Los términos "portador farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción e ingredientes inertes. El uso de tales portadores farmacéuticamente aceptables o excipientes farmacéuticamente aceptables para principios farmacéuticos activos es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier portador convencional farmacéuticamente aceptable o excipiente farmacéuticamente aceptable sea incompatible con el principio farmacéutico activo, se contempla su uso en composiciones terapéuticas de la invención. También pueden incorporarse ingredientes farmacéuticos activos adicionales, como otros fármacos, a las composiciones y métodos descritos.
[0301] El término "aproximadamente" significa dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor. Dicho rango puede estar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro del 50%, más preferiblemente dentro del 20%, más preferiblemente aún dentro del 10%, e incluso más preferiblemente dentro del 5% de un valor o rango dado. La variación admisible que abarca el término "aproximadamente" depende del sistema concreto que se esté estudiando y puede ser apreciada fácilmente por un experto en la técnica. Además, tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" significa que las dimensiones, tamaños, formulaciones, parámetros, formas y otras cantidades y características no son y no necesitan ser exactas, sino que pueden ser aproximadas y/o mayores o menores, según se desee, reflejando tolerancias, factores de conversión, redondeos, errores de medición y similares, y otros factores conocidos por los expertos en la técnica. En general, una dimensión, tamaño, formulación, parámetro, forma u otra cantidad o característica es "aproximadamente", se indique o no expresamente que lo es. Cabe señalar que las realizaciones de tamaños, formas y dimensiones muy diferentes pueden emplear las disposiciones descritas.
[0302]Los términos transitorios "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en", cuando se utilizan en las reivindicaciones anexas, en su forma original y modificada, definen el alcance de la reivindicación con respecto a qué elementos o etapas adicionales no citados de la reivindicación, si los hubiera, se excluyen del alcance de la reivindicación o reivindicaciones. El término "que comprende" pretende ser inclusivo o abierto y no excluye ningún elemento, método, etapa o material adicional no repetido. El término "compuesto de" excluye cualquier elemento, etapa o material distinto de los especificados en la reivindicación y, en este último caso, las impurezas ordinarias asociadas al material o materiales especificados. El término "que consista esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los elementos, etapas o material(es) especificados y a aquellos que no afecten materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de la invención reivindicada. Todas las composiciones, métodos, y kits aquí descritos que encarnan la presente invención pueden, en realizaciones alternativas, definirse más específicamente mediante cualquiera de los términos transitorios "que comprende", "que consiste esencialmente en", y "que consiste en".
II. Procesos de Fabricación TIL (Realizaciones de procesos GEN3, que incluyen opcionalmente medios definidos)
[0303]Sin estar limitado a ninguna teoría en particular, se cree que la primera expansión con sensibilización que sensibiliza una activación de células T seguida por la segunda expansión rápida que potencia la activación de células T como se describe en los métodos de la invención permite la preparación de células T expandidas que retienen un fenotipo "más joven", y como tal se espera que las células T expandidas de la invención exhiban mayor citotoxicidad contra células cancerosas que las células T expandidas por otros métodos. En particular, se cree que una activación de células T sensibilizada por la exposición a un anticuerpo anti-CD3(p. ej.OKT-3), IL-2 y, opcionalmente, células presentadoras de antígenos (APC) y, a continuación, se refuerza mediante la posterior exposición a un anticuerpo anti-CD-3 adicional(p. ej.OKT-3), IL-2 y APC como se enseña en los métodos de la invención limita o evita la maduración de las células T en cultivo, dando lugar a una población de células T con un fenotipo menos maduro, cuyas células T están menos agotadas por la expansión en cultivo y muestran una mayor citotoxicidad contra las células cancerosas. En algunas realizaciones, la etapa de segunda expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando células T en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente,p. ej.,un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia de las células T en el cultivo a pequeña escala a un segundo recipiente más grande que el primer recipiente,p. ej.,un recipiente G-REX 500MCS, y cultivar las células T del cultivo a pequeña escala en un cultivo a mayor escala en el segundo recipiente durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. En algunas realizaciones, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalamiento del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando células T en un primer cultivo a pequeña escala en un primer recipiente,p. ej.,un recipiente G-REX<1 0 0>MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia y distribución de las células T del primer cultivo a pequeña escala hacia y entre al menos 2, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos recipientes que son iguales en tamaño al primer recipiente, en donde en cada segundo recipiente la porción de las células T del primer cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un segundo cultivo a pequeña escala durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. En algunas realizaciones, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalamiento horizontal y vertical del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando células T en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente,p. ej.,un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia y distribución de las células T del cultivo a pequeña escala hacia y entre al menos 2, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos recipientes que son más grandes que el primer recipiente,p. ej.,recipientes G-REX 500MCS, donde en cada segundo recipiente la porción de las células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un cultivo a mayor escala por un período de aproximadamente 4 a 7 días. En algunas realizaciones, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalamiento horizontal y vertical del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando células T en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente,p. ej.,un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia y repartición de las células T del cultivo a pequeña escala hacia y entre 2, 3 o 4 segundos recipientes que son más grandes que el primer recipiente,p. ej.,recipientes G-REX 500MCS, en donde en cada segundo recipiente la porción de las células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 5 días.
[0304]En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida se lleva a cabo después de que la activación de las células T efectuada por la primera expansión con sensibilización comienza a disminuir, disminuir, decaer o disminuir.
[0305]En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida se lleva a cabo después de que la activación de células T efectuada por la primera expansión con sensibilización ha disminuido en o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,<4 3>,<4 4>,<4 5>, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,<6 6>, 67,<6 8>, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,<8 6>, 87,<8 8>, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%.
[0306] En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida se lleva a cabo después de que la activación de células T efectuada por la primera expansión con sensibilización ha disminuido en un porcentaje en el intervalo de en o aproximadamente<1>% a<1 0 0>%.
[0307] En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida se lleva a cabo después de que la activación de las células T efectuada por la primera expansión con sensibilización ha disminuido en un porcentaje en el intervalo de 1% a 10%, 10% a 20%, 20% a 30%, 30% a 40%, 40% a 50%, 50% a 60%, 60% a 70%, 70% a 80%, 80% a 90%, o 90% a 100%.
[0308] En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida se lleva a cabo después de que la activación de las células T efectuada por la primera expansión con sensibilización ha disminuido al menos en o aproximadamente<1>,<2>, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,<6 6>, 67,<6 8>, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,<8 6>, 87,<8 8>, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99%.
[0309] En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida se lleva a cabo después de que la activación de las células T efectuada por la primera expansión con sensibilización ha disminuido hasta en o aproximadamente<1>,<2>, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,<4 1>,<4 2>, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,<6 6>, 67,<6 8>, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,<8 6>, 87,<8 8>, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%.
[0310] En algunas realizaciones, la disminución en la activación de células T efectuada por la primera expansión con sensibilización se determina por una reducción en la cantidad de interferón gamma liberado por las células T en respuesta a la estimulación con antígeno.
[0311] En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de células T se realiza durante un período de hasta en o aproximadamente 7 días o aproximadamente<8>días.
[0312] En algunas realizaciones, la primera expansión de células T se lleva a cabo durante un periodo de hasta 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días, u<8>días.
[0313] En algunas realizaciones, la primera expansión de células T se realiza durante un periodo de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días, u<8>días.
[0314] En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida de células T se lleva a cabo durante un período de hasta en o aproximadamente<11>días.
[0315] En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida de células T se lleva a cabo durante un período de hasta en o aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días,<8>días, 9 días, 10 días, u 11 días.
[0316] En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un período de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días,<8>días, 9 días, 10 días, u 11 días.
[0317] En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de células T se realiza durante un periodo de entre 1 día y 7 días y la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un periodo de entre 1 día y 11 días.
[0318] En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de células T se realiza durante un período de hasta en o aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días, u<8>días y la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un período de hasta en o aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días,<8>días, 9 días, 10 días, u 11 días.
[0319] En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de células T se realiza durante un periodo de entre 1 día y<8>días y la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un periodo de entre 1 día y 9 días.
[0320] En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de células T se realiza durante un período de<8>días y la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un período de 9 días.
[0321] En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de células T se realiza durante un periodo de entre 1 día y 7 días y la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un periodo de entre 1 día y 9 días.
[0322] En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de células T se realiza durante un período de 7 días y la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un período de 9 días.
[0323] En algunas realizaciones, las células T son linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
[0324] Las células T pueden ser, aunque no se reivindiquen, linfocitos infiltrantes de médula ósea (MIL).
[0325] Las células T pueden ser, aunque no se reivindiquen, linfocitos de sangre periférica (LPS).
[0326] En algunas realizaciones, las células T se obtienen de un donante que padece cáncer.
[0327] En algunas realizaciones , las células T son TIL obtenidos de un tumor extirpado de un paciente que sufre de cáncer.
[0328] Las células T pueden ser, aunque no se reivindiquen, MIL obtenidas de la médula ósea de un paciente que padezca una neoplasia hematológica.
[0329] Las células T pueden ser, aunque no se reivindiquen, PBL obtenidas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un donante. El donante puede padecer un cáncer. El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. El donante puede padecer un tumor. El tumor puede ser líquido. El tumor puede ser un tumor sólido. El donante puede padecer una neoplasia hematológica.
[0330] En ciertos aspectos de la presente divulgación que no se reivindican, las células efectoras inmunitarias,por ejemplo,las células T, pueden obtenerse a partir de una unidad de sangre extraída de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el artesano experto, como la separación FICOLL. En un aspecto preferido, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis. El producto de aféresis suele contener linfocitos, incluidas células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos, y plaquetas. Las células recogidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción plasmática y, opcionalmente, para colocar las células en un tampón o medio apropiado para las etapas de procesamiento posteriores. Las células pueden lavarse con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La solución de lavado puede carecer de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos cationes divalentes, si no de todos. Las células T pueden aislarse a partir de linfocitos de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y eliminando los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL o por elutriación centrífuga a contracorriente.
[0331] Las células T pueden ser PBL separados de sangre entera o producto de aféresis enriquecido para linfocitos de un donante. El donante puede padecer un cáncer. El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. El cáncer puede seleccionarse del grupo formado por melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. El donante puede padecer un tumor. El tumor puede ser líquido. El tumor puede ser un tumor sólido. El donante puede padecer una neoplasia hematológica. Los PBL pueden aislarse a partir de sangre total o producto de aféresis enriquecido en linfocitos mediante métodos de selección positiva o negativa, es decir, eliminando los PBL utilizando un marcador o marcadores,p. ej.,CD3+ CD45+, para el fenotipo de células T, o eliminando las células sin fenotipo de células T, dejando los PBL. Los PBL pueden aislarse mediante centrifugación en gradiente. Una vez aislados los PBL del tejido del donante, puede iniciarse la primera expansión de PBL sembrando un número adecuado de PBL aislados (por ejemplo, aproximadamente 1*10<7>PBL) en el cultivo de primera expansión de acuerdo con la etapa de primera expansión de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.
[0332] Un proceso TIL ejemplar conocido como proceso 3 (también denominado en el presente documento GEN3) que contiene algunas de estas características se representa en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o la Figura 1C), y algunas de las ventajas de esta realización de la presente invención sobre el proceso 2A se describen en las Figuras 1, 2, 30 y 31 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C). En las figuras 1 y 30 se muestran dos realizaciones del proceso 3 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C). El proceso 2A o Gen 2 también se describe en Publicación de patente de EE.UU. n.° 2018/.0280436.
[0333] Como se discute y generalmente se describe aquí, los TIL son tomadas de una muestra de un paciente y manipuladas para expandir su número antes del transplante a un paciente usando el proceso de expansión TIL descrito aquí y referido como Gen 3. En algunas realizaciones, los TIL pueden ser opcionalmente manipulados genéticamente como se discute a continuación. En algunas realizaciones, los TIL pueden criopreservarse antes o después de la expansión. Una vez descongelados, también pueden volver a estimularse para aumentar su metabolismo antes de la infusión en un paciente.
[0334]En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (que incluye los procesos referidos en el presente documento como pre-Expansión Rápida (Pre-REP), así como los procesos mostrados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C) como Etapa B) se acorta a 1 a<8>días y la segunda expansión rápida (que incluye los procesos referidos en el presente documento como Protocolo de Expansión Rápida (REP), así como procesos mostrados en la Figura 1 (en particular, p .e j.,Figura 1B y/o Figura 1C) como Etapa D) se acorta a 1 a 9 días, como se discute en detalle a continuación así como en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (que incluye los procesos referidos en el presente documento como pre-Expansión Rápida (Pre-REP), así como los procesos mostrados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C) como Etapa B) se acorta a 1 a<8>días y la segunda expansión rápida (que incluye los procesos referidos en el presente documento como Protocolo de Expansión Rápida (REP), así como los procesos mostrados en la Figura 1 (en particular, p .e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C) como Etapa D) se acorta a 1 a<8>días, tal como se analiza en detalle a continuación, así como en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (que incluye los procesos referidos en el presente documento como pre-Expansión Rápida (Pre-REP), así como los procesos mostrados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C) como Etapa B) se acorta a 7 a 1 días y la segunda expansión rápida (que incluye los procesos referidos en el presente documento como Protocolo de Expansión Rápida (REP), así como procesos mostrados en la Figura 1 (en particular, p .e j.,Figura 1B y/o Figura 1C) como Etapa D) se acorta a 9 a 9 días, como se discute en detalle a continuación así como en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (que incluye los procesos referidos en el presente documento como pre-Expansión Rápida (Pre-REP), así como los procesos mostrados en la Figura 1 (en particular,p. ej,Figura 1B y/o Figura 1C) como Etapa B) es de 1 a 7 días y la segunda expansión rápida (que incluye los procesos referidos en el presente documento como Protocolo de Expansión Rápida (REP), así como los procesos mostrados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C) como Etapa D) es de 1 a 10 días, como se explica en detalle a continuación, así como en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) se acorta a<8>días y la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de 7 a 9 días. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de<8>días y la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de<8>a 9 días. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) se acorta a 7 días y la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de 7 a<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) se acorta a<8>días y la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de<8>días y la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de 9 días. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de<8>días y la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de 7 días y la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de 7 a 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de 7 días y la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de<8>a 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de 7 días y la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de 9 a 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) se acorta a 7 días y la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C)) es de 7 a 9 días. En algunas realizaciones, la combinación de la primera expansión con sensibilización y la segunda expansión rápida (por ejemplo, las expansiones descritas como Etapa B y Etapa D en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C) es de 14-16 días, como se discute en detalle a continuación y en los ejemplos y figuras. En particular, se considera que ciertas realizaciones de la presente invención comprenden una primera etapa de expansión con sensibilización en el que los TIL se activan mediante la exposición a un anticuerpo anti-CD3,p. e j.,OKT-3 en presencia de IL-2 o la exposición a un antígeno en presencia de al menos IL-2 y un anticuerpo anti-CD3,p. ej.OKT-3. En ciertas realizaciones, los TIL que se activan en la primera etapa de expansión con sensibilización descrito anteriormente son una primera población de TIL,es decir,una población de células primarias.
[0335]Las Designaciones de "Etapa" A, B, C,etc.,a continuación son en referencia al ejemplo no limitante en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C) y en referencia a ciertas realizaciones no limitantes descritas aquí. La ordenación de las Etapas a continuación y en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C) es ejemplar y cualquier combinación u orden de etapas, así como etapas adicionales, repetición de etapas, y/u omisión de etapas está contemplada por la presente solicitud y los métodos aquí divulgados.
A. ETAPA A: Obtener una muestra del tum or del paciente
[0336] En general, los TIL se obtienen inicialmente de una muestra de tumor de paciente ("TIL primarios") o de linfocitos circulantes, tales como linfocitos de sangre periférica, incluyendo linfocitos de sangre periférica que tienen características similares a TIL, y luego se expanden en una población más grande para manipulación adicional como se describe aquí, opcionalmente criopreservados, y opcionalmente evaluados para fenotipo y parámetros metabólicos como una indicación de la salud de TIL.
[0337] Una muestra del tumor del paciente puede obtenerse utilizando métodos conocidos en la técnica, generalmente mediante resección quirúrgica, biopsia con aguja u otros medios para obtener una muestra que contenga una mezcla de células tumorales y células TIL. En general, la muestra tumoral puede proceder de cualquier tumor sólido, incluidos tumores primarios, tumores invasivos o tumores metastásicos. La muestra tumoral también puede ser un tumor líquido, como un tumor obtenido de una neoplasia hematológica. El tumor sólido puede ser de cualquier tipo de cáncer, incluidos, entre otros, los de mama, páncreas, próstata, colorrectal, pulmón, cerebro, renal, estómago y piel (incluidos, entre otros, el carcinoma de células escamosas, el carcinoma de células basales y el melanoma). En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello de útero, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma pulmonar de células no pequeñas. En algunas realizaciones, los TIL útiles se obtienen a partir de tumores de melanoma maligno, ya que se ha informado de que estos tienen niveles particularmente altos de TIL.
[0338] Una vez obtenida, la muestra tumoral es generalmente fragmentada usando disección aguda en pequeños pedazos de entre 1 a aproximadamente<8>mm<3>, siendo particularmente útil de aproximadamente 2-3 mm<3>Los TIL se cultivan a partir de estos fragmentos utilizando digestiones tumorales enzimáticas. Tales digestiones tumorales pueden producirse por incubación en medios enzimáticos(p. ej.,tampón 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 2 mM de glutamato, 10 mcg/mL de gentamicina, 30 unidades/mL de DNasa y 1,0 mg/mL de colagenasa) seguida de disociación mecánica(p. ej.,utilizando un disociador tisular). Los digeridos tumorales pueden producirse colocando el tumor en medios enzimáticos y disociando mecánicamente el tumor durante aproximadamente<1>minuto, seguido de incubación durante 30 minutos a 37 °C en 5% de CO<2>, seguido de ciclos repetidos de disociación mecánica e incubación en las condiciones anteriores hasta que sólo queden pequeños trozos de tejido. Al final de este proceso, si la suspensión celular contiene un gran número de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación en gradiente de densidad utilizando polisacárido hidrófilo ramificado FICOLL para eliminar estas células. Pueden utilizarse métodos alternativos conocidos en la técnica, como los descritos en Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2012/0244133 A1. Cualquiera de los métodos anteriores puede utilizarse en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento para métodos de expansión de TIL.
[0339] Como se indicó anteriormente, en algunas realizaciones, los TIL se derivan de tumores sólidos. En algunas realizaciones, los tumores sólidos no están fragmentados. En algunas realizaciones, los tumores sólidos no están fragmentados y se someten a digestión enzimática como tumores enteros. En algunas realizaciones, los tumores se digieren en una mezcla enzimática que comprende colagenasa, DNasa e hialuronidasa. En algunas realizaciones, los tumores se digieren en una mezcla enzimática que comprende colagenasa, DNasa e hialuronidasa durante 1-2 horas. En algunas realizaciones, los tumores se digieren en una mezcla enzimática que comprende colagenasa, DNasa e hialuronidasa durante 1-2 horas a 37°C, 5% CO<2>. En algunas realizaciones, los tumores se digieren en una mezcla enzimática que comprende colagenasa, DNasa e hialuronidasa durante 1-2 horas a 37°C, 5% CO<2>con rotación. En algunas realizaciones, los tumores se digieren durante la noche con rotación constante. En algunas realizaciones, los tumores se digieren durante la noche a 37°C, 5% CO<2>con rotación constante. En algunas realizaciones, el tumor entero se combina con las enzimas para formar una mezcla de reacción de digestión tumoral.
[0340] En algunas realizaciones, el tumor se reconstituye con las enzimas liofilizadas en un tampón estéril. En algunas realizaciones, el tampón es HBSS estéril.
[0341] En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende colagenasa. En algunas realizaciones, la colagenasa es colagenasa IV. En algunas realizaciones, el caldo de trabajo para la colagenasa es un caldo de trabajo 10X de 100 mg/ml.
[0342] En algunas realizaciones, la mezcla enzimática comprende DNAsa. En algunas realizaciones, el caldo de trabajo para la ADNasa es un caldo de trabajo 10X de 10.000 UI/ml.
[0343] En algunas realizaciones, la mezcla enzimática comprende hialuronidasa. En algunas realizaciones, el caldo de trabajo para la hialuronidasa es un caldo de trabajo 10-mg/ml 10X.
[0344] En algunas realizaciones, la mezcla enzimática comprende 10 mg/ml de colagenasa, 1000 UI/ml de DNAsa y 1 mg/ml de hialuronidasa.
[0345] En algunas realizaciones, la mezcla enzimática comprende 10 mg/ml de colagenasa, 500 Ul/ml de ADNasa y 1 mg/ml de hialuronidasa.
[0346] En general, la suspensión celular obtenida del tumor se denomina "población celular primaria" o "población celular recién obtenida" o "recién aislada". En ciertas realizaciones, la población celular de TIL recién obtenida se expone a un medio de cultura celular que comprende células presentadoras de antígeno, IL-12 y OKT-3.
[0347] En algunas realizaciones, la fragmentación incluye fragmentación física, incluyendo por ejemplo, disección así como digestión. En algunas realizaciones, la fragmentación es física. En algunas realizaciones, la fragmentación es disección. En algunas realizaciones, la fragmentación es por digestión. En algunas realizaciones, los TIL pueden cultivarse inicialmente a partir de digestiones enzimáticas de tumores y fragmentos de tumores obtenidos de pacientes. En una realización, los TIL pueden cultivarse inicialmente a partir de digestiones enzimáticas de tumores y fragmentos de tumores obtenidos de pacientes.
[0348] En algunas realizaciones, donde el tumor es un tumor sólido, el tumor se somete a fragmentación física después de que la muestra del tumor se obtiene en, por ejemplo, la Etapa A (como se proporciona en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C)). En algunas realizaciones, la fragmentación se produce antes de la criopreservación. En algunas realizaciones, la fragmentación se produce después de la criopreservación. En algunas realizaciones, la fragmentación se produce tras la obtención del tumor y en ausencia de criopreservación. En algunas realizaciones, la etapa de fragmentación es un procesoin vitrooex vivo.En algunas realizaciones, el tumor se fragmenta y se colocan 10, 20, 30, 40 o más fragmentos o piezas en cada contenedor para la primera expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, el tumor se fragmenta y se colocan 30 o 40 fragmentos o piezas en cada contenedor para la primera expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, el tumor se fragmenta y se colocan 40 fragmentos o trozos en cada contenedor para la primera expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 fragmentos, donde cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm3. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm<3>a aproximadamente 1500 mm3. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1350 mm3. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de entre 1 gramo y 1,5 gramos. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 4 fragmentos.
[0349] En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de fragmentos tumorales. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral se obtiene mediante disección cortante. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral tiene entre 1 mm<3>y 10 mm<3>aproximadamente. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral tiene entre 1 mm<3>y<8>mm<3>aproximadamente. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 1 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 2 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 3 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 4 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 5 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente<6>mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 7 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente<8>mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 9 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 10 mm3. En algunas realizaciones, los fragmentos tumorales miden 1-4 mm x 1-4 mm x 1-4 mm. En algunas realizaciones, los fragmentos tumorales miden 1 mm x 1 mm x 1 mm. En algunas realizaciones, los fragmentos tumorales miden 2 mm x 2 mm x 2 mm. En algunas realizaciones, los fragmentos tumorales miden 3 mm x 3 mm x 3 mm. En algunas realizaciones, los fragmentos tumorales miden 4 mm x 4 mm x 4 mm.
[0350] En algunas realizaciones, los tumores se fragmentan para minimizar la cantidad de tejidos hemorrágicos, necróticos, y/o grasos en cada pieza. En algunas realizaciones, los tumores se fragmentan para minimizar la cantidad de tejido hemorrágico en cada pieza. En algunas realizaciones, los tumores se fragmentan para minimizar la cantidad de tejido necrótico en cada pieza. En algunas realizaciones, los tumores se fragmentan para minimizar la cantidad de tejido adiposo en cada pieza. En ciertas realizaciones, la etapa de fragmentación del tumor es un métodoin vitrooex vivo.
[0351] En algunas realizaciones, la fragmentación del tumor se realiza para mantener la estructura interna del tumor. En algunas realizaciones, la fragmentación del tumor se lleva a cabo sin realizar previamente un movimiento de aserrado con un bisturí. En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de digestiones tumorales. En algunas realizaciones, los digeridos tumorales se generaron por incubación en medios enzimáticos, por ejemplo pero no limitados a RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX, 10 mg/mL de gentamicina, 30 U/mL de DNasa, y 1,0 mg/mL de colagenasa, seguido de disociación mecánica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Tras colocar el tumor en un medio enzimático, se puede disociar mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. A continuación, se puede incubar la solución durante 30 minutos a 37 °C en un 5% de CO<2>y se vuelve a disgregar mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. Tras incubarlo de nuevo durante 30 minutos a 37 °C en un 5% de CO<2>, el tumor puede disgregarse mecánicamente por tercera vez durante aproximadamente 1 minuto. En algunas realizaciones, después de la tercera disociación mecánica, si había trozos grandes de tejido, se aplicaron 1 ó 2 disociaciones mecánicas adicionales a la muestra, con o sin 30 minutos adicionales de incubación a 37 °C en 5% de CO<2>. En algunas realizaciones, al final de la incubación final, si la suspensión celular contiene un gran número de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación en gradiente de densidad utilizando Ficoll para eliminar estas células.
[0352] En algunas realizaciones, la suspensión celular previa al primera etapa de expansión se denomina "población celular primaria" o población celular "recién obtenida" o "recién aislada".
[0353] En algunas realizaciones, las células pueden ser opcionalmente congeladas después del aislamiento de la muestra (p. ej., después de obtener la muestra tumoral y/o después de obtener la suspensión celular de la muestra tumoral) y almacenadas congeladas antes de entrar en la expansión descrita en la Etapa B, que se describe con más detalle a continuación, así como se ejemplifica en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C).
1. TIL derivados de biopsia con aguja gruesa/pequeña
[0354] En algunas realizaciones, los TIL se obtienen inicialmente de una muestra de tumor de paciente ("TIL primarios") obtenidos por una biopsia de núcleo o procedimiento similar y luego se expanden en una población más grande para manipulación adicional como se describe aquí, opcionalmente criopreservados, y opcionalmente evaluados para fenotipo y parámetros metabólicos.
[0355] En algunas realizaciones, una muestra de tumor de paciente puede ser obtenida usando métodos conocidos en el arte, generalmente vía biopsia pequeña, biopsia de núcleo, biopsia de aguja u otros medios para obtener una muestra que contiene una mezcla de tumor y células TIL. En general, la muestra tumoral puede proceder de cualquier tumor sólido, incluidos tumores primarios, tumores invasivos o tumores metastásicos. La muestra tumoral también puede ser un tumor líquido, como un tumor obtenido de una neoplasia hematológica. En algunas realizaciones, la muestra puede proceder de múltiples muestras tumorales pequeñas o biopsias. En algunas realizaciones, la muestra puede comprender múltiples muestras tumorales de un único tumor del mismo paciente. En algunas realizaciones, la muestra puede comprender múltiples muestras tumorales de uno, dos, tres o cuatro tumores del mismo paciente. En algunas realizaciones, la muestra puede comprender múltiples muestras tumorales de múltiples tumores del mismo paciente. El tumor sólido puede ser de cualquier tipo de cáncer, incluidos, entre otros, los de mama, páncreas, próstata, colorrectal, pulmón, cerebro, renal, estómago y piel (incluidos, entre otros, el carcinoma de células escamosas, el carcinoma de células basales y el melanoma). En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello de útero, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC). En algunas realizaciones, los TIL útiles se obtienen a partir de tumores de melanoma maligno, ya que se ha informado de que estos tienen niveles particularmente altos de TIL.
[0356] En general, la suspensión celular obtenida del núcleo o fragmento tumoral se denomina "población celular primaria" o población celular "recién obtenida" o "recién aislada". En ciertas realizaciones, la población celular de TIL recién obtenida se expone a un medio de cultura celular que comprende células presentadoras de antígeno, IL-2 y OKT-3.
[0357] En algunas realizaciones, si el tumor es metastásico y la lesión primaria ha sido eficientemente tratada/extirpada en el pasado, la extirpación de una de las lesiones metastásicas puede ser necesaria. En algunas realizaciones, el abordaje menos invasivo consiste en extirpar una lesión cutánea o un ganglio linfático del cuello o de la zona axilar, si está disponible. En algunas realizaciones, se extirpa una lesión cutánea o se extrae una pequeña biopsia de la misma. En algunas realizaciones, se extrae un ganglio linfático o una pequeña biopsia del mismo. En algunas realizaciones, se puede emplear una lesión metastásica pulmonar o hepática, o un ganglio linfático intraabdominal o torácico o una pequeña biopsia del mismo.
[0358] En algunas realizaciones, el tumor es un melanoma. En algunas realizaciones, la pequeña biopsia de un melanoma comprende un lunar o una porción del mismo.
[0359] En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia en sacabocados. En algunas realizaciones, la biopsia en sacabocados se obtiene con una cuchilla circular que se presiona contra la piel. En algunas realizaciones, la biopsia en sacabocados se obtiene con una cuchilla circular que se presiona en la piel. alrededor de un lunar sospechoso. En algunas realizaciones, la biopsia en sacabocados se obtiene con una cuchilla circular que se presiona contra la piel, y se extrae un trozo redondo de piel. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia en sacabocados y se extrae una porción redonda del tumor.
[0360] En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión. En algunos casos, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión y se extirpa todo el lunar o crecimiento. En algunos casos, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión y se extirpa todo el lunar o crecimiento junto con un pequeño borde de piel de apariencia normal.
[0361] En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia incisional. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia incisional y sólo se toma la parte más irregular de un lunar o crecimiento. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia incisional y la biopsia incisional se utiliza cuando no se pueden completar otras técnicas, como por ejemplo si un lunar sospechoso es muy grande.
[0362] En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de pulmón. En algunas realizaciones, la pequeña biopsia se obtiene mediante broncoscopia. Por lo general, en la broncoscopia se anestesia al paciente y se introduce un pequeño instrumento por la nariz o la boca, se baja por la garganta y se llega a los bronquios, donde se utilizan pequeñas herramientas para extraer parte del tejido. En algunos casos, cuando no se puede acceder al tumor o crecimiento mediante broncoscopia, se puede emplear una biopsia transtorácica con aguja. Generalmente, para una biopsia transtorácica con aguja, el paciente también está anestesiado y se introduce una aguja a través de la piel directamente en el punto sospechoso para extraer una pequeña muestra de tejido. En algunas realizaciones, una biopsia transtorácica con aguja puede requerir radiología intervencionista (por ejemplo, el uso de rayos X o tomografía computarizada para guiar la aguja). En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene mediante biopsia con aguja. En algunas realizaciones, la pequeña biopsia se obtiene por ultrasonido endoscópico (por ejemplo, un endoscopio con una luz y se coloca a través de la boca hasta el esófago). En algunas realizaciones, la pequeña biopsia se obtiene quirúrgicamente.
[0363] En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de cabeza y cuello. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia incisional. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia incisional, en la que se corta un pequeño trozo de tejido de una zona de aspecto anormal. En algunas realizaciones, si la región anormal es de fácil acceso, la muestra puede tomarse sin hospitalización. En algunos casos, si el tumor se encuentra a mayor profundidad dentro de la boca o la garganta, puede ser necesario realizar la biopsia en un quirófano, con anestesia general. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión, en la que se extirpa toda la zona. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una aspiración con aguja fina (AAF). En algunas realizaciones, la pequeña biopsia es una aspiración con aguja fina (AAF), en la que se utiliza una aguja muy fina unida a una jeringa para extraer (aspirar) células de un tumor o bulto. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia en sacabocados. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia en sacabocados, en la que se utilizan pinzas de sacabocados para extraer un trozo de la zona sospechosa.
[0364] En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia cervical. En algunas realizaciones, la pequeña biopsia se obtiene mediante colposcopia. Por lo general, los métodos de colposcopia emplean un instrumento de aumento iluminado acoplado a unos prismáticos de aumento (un colposcopio) que se utiliza para biopsiar una pequeña sección de la superficie del cuello uterino. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de conización/cono. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de conización/cono, en la que puede ser necesaria una intervención quirúrgica ambulatoria para extraer un trozo más grande de tejido del cuello uterino. En algunas realizaciones, la biopsia de cono, además de ayudar a confirmar un diagnóstico, puede servir como tratamiento inicial.
[0365] El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que normalmente no contiene quistes ni áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término "cáncer de tumor sólido" se refiere a tumores sólidos malignos, neoplásicos, o cancerosos. Los cánceres de tumores sólidos incluyen, entre otros, sarcomas, carcinomas y linfomas, como los de pulmón, mama, cáncer de mama triple negativo, próstata, colon, recto y vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello de útero, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma pulmonar de células no pequeñas. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos tisulares interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células estromales de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
[0366] En algunas realizaciones, la muestra del tumor se obtiene como un aspirado con aguja fina (FNA), una biopsia central, una biopsia pequeña (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados). En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 10. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 10 cuando hay 1 o 2 muestras de biopsia de núcleo y/o biopsia pequeña. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 100 cuando hay 3, 4, 5,<6>,<8>, 9, o 10 o más muestras de biopsia de núcleo y/o biopsia pequeña. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 500 cuando hay 3, 4, 5,<6>,<8>, 9, o 10 o más muestras de biopsia de núcleo y/o biopsia pequeña.
[0367] El FNA puede obtenerse de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pulmón, melanoma, cabeza y cuello, cervical, ovario, páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma. En algunas realizaciones, el FNA se obtiene de un tumor pulmonar, como un tumor pulmonar de un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En algunos casos, el paciente con NSCLC se ha sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
[0368] Los TIL aquí descritos pueden obtenerse a partir de una muestra de FNA. En algunos casos, la muestra de FNA se obtiene o aísla del paciente utilizando una aguja de calibre fino que va desde una aguja de calibre 18 hasta una aguja de calibre 25. La aguja de calibre fino puede ser de calibre 18, calibre 19, calibre 20, calibre 21, calibre 22, calibre 23, calibre 24, o calibre 25. En algunas realizaciones, la muestra de FNA del paciente puede contener al menos 400.000 TIL,p. ej.,400.000 TIL, 450.000 TIL, 500.000 TIL, 550.000 TIL, 600.000 TIL, 650.000 TIL, 700.000 TIL, 750.000 TIL, 800.000 TIL, 850.000 TIL, 900.000 TIL, 950.000 TIL, o más.
[0369] En algunos casos, los TIL descritos en el presente documento se obtienen a partir de una muestra de biopsia central. En algunos casos, la muestra de la biopsia central se obtiene o aísla del paciente utilizando una aguja quirúrgica o médica que puede ser desde una aguja de calibre 11 hasta una aguja de calibre 16. La aguja puede ser de calibre 11, 12, 13, 14, 15, o 16. En algunas realizaciones, la muestra de biopsia central del paciente puede contener al menos 400.000 TIL,p. ej.,400.000 TIL, 450.000 TIL, 500.000 TIL, 550.000 TIL, 600.000 TIL, 650.000 TIL, 700.000 TIL, 750.000 TIL, 800.000 TIL, 850.000 TIL, 900.000 TIL, 950.000 TIL, o más.
[0370] En general, la suspensión celular cosechada se denomina "población celular primaria" o población celular "recién cosechada".
[0371] En algunas realizaciones, los TIL no se obtienen a partir de digestiones tumorales. En algunas realizaciones, los núcleos tumorales sólidos no están fragmentados.
[0372] En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de digestiones tumorales. En algunas realizaciones, los digeridos tumorales se generaron por incubación en medios enzimáticos, por ejemplo pero no limitados a RPMI 10 mM GlutaMAX, 30 mg/mL de gentamicina, 1.0 U/mL de DNasa, y 1640,0 mg/mL de colagenasa, seguido de disociación mecánica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Tras colocar el tumor en un medio enzimático, se puede disociar mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. A continuación, se puede incubar la solución durante 30 minutos a 37 °C en un 5% de CO<2>y se vuelve a disgregar mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. Tras incubarlo de nuevo durante 30 minutos a 37 °C en un 5% de CO<2>, el tumor puede disgregarse mecánicamente por tercera vez durante aproximadamente 1 minuto. En algunas realizaciones, después de la tercera disociación mecánica, si había trozos grandes de tejido, se aplicaron 1 ó 2 disociaciones mecánicas adicionales a la muestra, con o sin 30 minutos adicionales de incubación a 37 °C en 5% de CO<2>. En algunas realizaciones, al final de la incubación final, si la suspensión celular contiene un gran número de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación en gradiente de densidad utilizando Ficoll para eliminar estas células.
2. Métodos de expansión de linfocitos de sangre periférica (PBL) a partir de sangre periférica
[0373] Método 1 de PBL. Los PBL pueden ampliarse utilizando los procesos aquí descritos. El método puede comprender la obtención de una muestra de PBMC a partir de sangre total. El método puede comprender el enriquecimiento de células T mediante el aislamiento de células T puras a partir de PBMC utilizando la selección negativa de una fracción no-CD19+. El método puede comprender el enriquecimiento de células T mediante el aislamiento de células T puras a partir de PBMC utilizando selección negativa basada en microesferas magnéticas de una fracción no CD19+.
[0374] El método 1 de PBL puede realizarse como sigue: El día 0, se descongela una muestra de PBMC criopreservada y se cuentan las PBMC. Las células T se aíslan utilizando un kit de aislamiento de células T Pan humanas y columnas LS (Miltenyi Biotec).
[0375] Método 2 de PBL. Los PBL pueden expandirse utilizando el método PBL 2, que consiste en obtener una muestra de PBMC a partir de sangre total. Las células T de las PBMC se enriquecen incubando las PBMC durante al menos tres horas a 37°C y aislando después las células no adherentes.
[0376] El método 2 de PBL puede realizarse como sigue: El día 0, se descongela la muestra de PMBC criopreservada y se siembran las células PBMC a razón de<6>millones de células por pocillo en una placa de<6>pocillos en medio CM-2 y se incuban durante 3 horas a 37 grados Celsius. Al cabo de 3 horas, se extraen y se cuentan las células no adherentes, que son los PBL.
[0377] Método 3 de PBL. Los PBL pueden expandirse utilizando el Método 3 de PBL, que comprende la obtención de una muestra de PBMC a partir de sangre periférica. Las células B se aíslan utilizando una selección CD19+ y las células T se seleccionan utilizando una selección negativa de la fracción no CD19+ de la muestra de PBMC.
[0378] El método 3 de PBL puede realizarse como sigue: El día 0, se descongelan y se cuentan las PBMC criopreservadas derivadas de sangre periférica. Las células B CD19+ se clasifican utilizando un kit CD19 Multisort Kit, Human (Miltenyi Biotec). De la fracción de células no CD19+, las células T se purifican utilizando el Human Pan T-cell Isolation Kit and LS Columns (Miltenyi Biotec).
[0379] Las PBMC pueden aislarse de una muestra de sangre total. La muestra de PBMC puede utilizarse como material de partida para expandir los PBL. La muestra puede criopreservarse antes del proceso de expansión. Se puede utilizar una muestra fresca como material de partida para ampliar los PBL. Las células T pueden aislarse a partir de PBMC utilizando métodos conocidos en la técnica. Las células T pueden aislarse utilizando un kit de aislamiento de células T Pan humanas y columnas LS. Las células T pueden aislarse a partir de PBMC utilizando métodos de selección de anticuerpos conocidos en la técnica, por ejemplo, la selección negativa de CD19.
[0380] La muestra de PBMC puede incubarse durante un periodo de tiempo a una temperatura deseada eficaz para identificar las células no adherentes. El tiempo de incubación puede ser de unas 3 horas. La temperatura puede ser de aproximadamente 37° Celsius. A continuación, las células no adherentes se expanden mediante el proceso descrito anteriormente.
[0381] La muestra de PBMC puede ser de un sujeto o paciente que ha sido opcionalmente pretratado con un régimen que comprende un inhibidor de la quinasa o un inhibidor de ITK. La muestra tumoral puede proceder de un sujeto o paciente que haya sido pretratado con un régimen que comprenda un inhibidor de la quinasa o un inhibidor de ITK. La muestra de PBMC puede proceder de un sujeto o paciente que haya sido pretratado con un régimen que comprenda un inhibidor de la quinasa o un inhibidor de ITK, haya sido sometido a tratamiento durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos<6>meses, o 1 año o más. Alternativamente, las PBMC pueden derivarse de un paciente que esté actualmente en un régimen con un inhibidor de ITK, como ibrutinib.
[0382] La muestra de PBMC puede proceder de un sujeto o paciente que ha sido pretratado con un régimen que comprende un inhibidor de la cinasa o un inhibidor de ITK y es refractario al tratamiento con un inhibidor de la cinasa o un inhibidor de ITK, como ibrutinib.
[0383] La muestra de PBMC puede ser de un sujeto o paciente que ha sido pre-tratado con un régimen que comprende un inhibidor de quinasa o un inhibidor de ITK pero que ya no está bajo tratamiento con un inhibidor de quinasa o un inhibidor de ITK. La muestra de PBMC puede proceder de un sujeto o paciente que haya sido pretratado con un régimen que comprenda un inhibidor de la quinasa o un inhibidor de ITK, pero que ya no esté en tratamiento con un inhibidor de la quinasa o un inhibidor de ITK y que no haya estado en tratamiento durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos<6>meses, o al menos 1 año o más. Las PBMC pueden proceder de un paciente que haya estado previamente expuesto a un inhibidor de ITK, pero que no haya sido tratado en al menos 3 meses, al menos<6>meses, al menos 9 meses o al menos 1 año.
[0384] En el Día 0, las células pueden ser seleccionadas para CD19+ y clasificadas en consecuencia. La selección puede realizarse utilizando perlas de unión de anticuerpos. Las células T puras pueden aislarse el Día 0 a partir de las PBMC.
[0385] Para pacientes que no son pre-tratados con ibrutinib u otro inhibidor de ITK, 10-15ml de Buffy Coat pueden producir aproximadamente 5*10<9>PBMC, que, a su vez, producirán aproximadamente 5,5*10<7>PBL.
[0386] Para pacientes pretratados con ibrutinib u otro inhibidor de ITK, el proceso de expansión puede producir aproximadamente 20*10<9>PBL. 40,3*10® PBMC pueden producir aproximadamente 4,7*10® PBL.
[0387] En cualquiera de los casos anteriores, las PBMC pueden derivarse de una muestra de sangre entera, por aféresis, de la capa leucocitaria, o de cualquier otro método conocido en el arte para obtener PBMC.
3. Métodos de expansión de linfocitos infiltrantes de médula ósea (MIL) a partir de PBMC derivadas de médula ósea
[0388] Método 3 de MIL. El método puede comprender la obtención de PBMC de la médula ósea. El Día 0, las PBMC se seleccionan para CD3+/CD33+/CD20+/CD14+ y se clasifican, y la fracción de células que no son CD3+/CD33+/CD20+/CD14+ se sonican y una parte de la fracción de células sonicadas se añade de nuevo a la fracción de células seleccionadas.
[0389] El método 3 de MIL puede realizarse como sigue: El día 0, se descongela una muestra crioconservada de PBMC y se cuentan las PBMC. Las células se tiñen con anticuerpos CD3, CD33, CD20, y CD14 y se clasifican utilizando un clasificador celular S3e (Bio-Rad). Las células se clasifican en dos fracciones: una fracción de células inmunitarias (o fracción MIL) (CD3+CD33+CD20+CD14+) y una fracción de células blásticas de AML (no CD3+CD33+CD20+CD14+).
[0390] Las PBMC pueden obtenerse de la médula ósea. Las PBMC pueden obtenerse de la médula ósea mediante aféresis, aspiración, biopsia con aguja, u otros medios similares conocidos en la técnica. Las PBMC pueden ser frescas. Las PBMC pueden criopreservarse.
[0391] Los MIL pueden expandirse a partir de 10-50 ml de aspirado de médula ósea. Se pueden obtener 10 ml de aspirado de médula ósea del paciente. Se pueden obtener 20 ml de aspirado de médula ósea del paciente. Se pueden obtener 30 ml de aspirado de médula ósea del paciente. Se pueden obtener 40 ml de aspirado de médula ósea del paciente. Se pueden obtener 50 ml de aspirado de médula ósea del paciente.
[0392] El número de PBMC que pueden haberse obtenido de aproximadamente 10-50ml de aspirado de médula ósea es de aproximadamente 5*10<7>a aproximadamente 10*10<7>PBMC. El número de PMBC producidas puede ser de aproximadamente 7*10<7>PBMC.
[0393] Aproximadamente 5*10<7>a aproximadamente 10*10<7>PBMC, pueden producir aproximadamente 0,5*10® a aproximadamente 1,5*10® MIL. Se pueden producir aproximadamente 1*10® MIL.
[0394] 12*10® PBMC derivadas de aspirado de médula ósea pueden producir aproximadamente 1,4x10<5>MILs.
[0395] Las PBMC pueden derivarse de una muestra de sangre entera, de médula ósea, por aféresis, de la capa leucocitaria, o de cualquier otro método conocido en la técnica para obtener PBMC.
B. ETAPA B: Primera Expansión con Sensibilización
[0396]En algunas realizaciones, los métodos presentes proporcionan TIL más jóvenes, que pueden proporcionar beneficios terapéuticos adicionales sobre TIL más viejos(es decir,TIL que han sufrido más rondas de replicación antes de la administración a un sujeto/paciente). Las características de los TIL jóvenes se han descrito en la literatura, por ejemplo Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, et al.,; Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005); y Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008).
[0397]Después de la disección o digestión de fragmentos tumorales y/o fragmentos tumorales, por ejemplo como se describe en la Etapa A de la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C), las células resultantes se cultivan en suero que contiene IL-2, OKT-3, y células alimentadoras(p. ej.,células alimentadoras presentadoras de antígeno), bajo condiciones que favorecen el crecimiento de TIL sobre células tumorales y otras células. En algunas realizaciones, la IL-2, OKT-3, y las células alimentadoras se añaden al inicio del cultivo junto con el digerido tumoral y/o los fragmentos tumorales(p. ej.,en el Día 0). En algunas realizaciones, los digeridos tumorales y/o fragmentos tumorales se incuban en un recipiente con hasta 60 fragmentos por recipiente y con 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, esta población de células primarias se cultiva durante un periodo de días, generalmente de 1 a<8>días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente aproximadamente 1 * 10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, esta población de células primarias se cultiva durante un periodo de días, generalmente de 1 a 7 días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente aproximadamente 1 * 10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización se produce durante un periodo de 1 a<8>días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1 * 10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización se produce durante un periodo de 1 a 7 días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1 * 10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, esta primera expansión con sensibilización se produce durante un periodo de 5 a<8>días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1 * 10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, esta primera expansión con sensibilización se produce durante un periodo de 5 a 7 días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1 * 10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, esta primera expansión con sensibilización se produce durante un periodo de aproximadamente<6>a<8>días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1 * 10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, esta primera expansión con sensibilización se produce durante un periodo de aproximadamente<6>a 7 días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1 * 10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, esta primera expansión con sensibilización se produce durante un periodo de aproximadamente 7 a<8>días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1 * 10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, esta primera expansión con sensibilización se produce durante un periodo de aproximadamente 7 días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente de aproximadamente<1>*<10 8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, esta primera expansión con sensibilización se produce durante un periodo de aproximadamente<8>días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1 * 10<8>células TIL masivas.
[0398]En una realización preferida, la expansión de TIL puede realizarse utilizando una primera etapa de expansión con sensibilización (por ejemplo, como los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular, p. ej., Figura 1B y/o Figura 1C), que puede incluir procesos denominados pre-REP o REP con sensibilización y que contiene células alimentadoras desde el Día 0 y/o desde el inicio del cultivo) como se describe a continuación y en el presente documento, seguido de una segunda expansión rápida (Etapa D, que incluye procesos denominados etapas de protocolo de expansión rápida (REP)) como se describe a continuación en la Etapa D y en el presente documento, seguido de criopreservación opcional, y seguido de una segunda Etaopa D (que incluye procesos denominados etapas de REP de reestimulación) como se describe a continuación y en el presente documento. Los TIL obtenidos de este proceso pueden caracterizarse opcionalmente para características fenotípicas y parámetros metabólicos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral tiene entre 1 mm<3>y 10 mm<3>aproximadamente.
[0399]En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, el CM para la Etapa B consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, suplementado con 10% de suero AB humano, 25 mM de Hepes, y 10 mg/mL de gentamicina.
[0400]En algunas realizaciones, hay menos o igual a 240 fragmentos tumorales. En algunas realizaciones, hay menos de o igual a 240 fragmentos tumorales colocados en menos de o igual a 4 contenedores. En algunas realizaciones, los recipientes son matraces GREX100 MCS. En algunas realizaciones, se colocan menos o igual a 60 fragmentos tumorales en 1 contenedor. En algunas realizaciones, cada envase contiene menos o igual a 500 ml de medio por envase. En algunas realizaciones, el medio comprende IL-2. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio comprende células alimentadoras presentadoras de antígeno (también denominadas en el presente documento "células presentadoras de antígeno"). En algunas realizaciones, el medio comprende 2,5 *10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por envase. En algunas realizaciones, el medio comprende OKT-3. En algunas realizaciones, el medio comprende 30 ng/mL de OKT-3 por envase. En algunas realizaciones, el recipiente es un matraz GREX100 MCS. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 ng de OKT-3 y 2,5 *10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 ng/mL de OKT-3 y 2,5 *10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por envase.
[0401]Después de la preparación de los fragmentos tumorales, las células resultantes(es decir, losfragmentos que es una población celular primaria) se cultivan en medios que contienen IL-2, células alimentadoras presentadoras de antígeno y OKT-3 en condiciones que favorecen el crecimiento de TIL sobre el tumor y otras células y que permiten la sensibilización de TIL y el crecimiento acelerado desde el inicio del cultivo en el Día 0. En algunas realizaciones, los digeridos tumorales y/o fragmentos tumorales se incuban en con 6000 UI/mL de IL-2, así como células alimentadoras presentadoras de antígeno y OKT-3. Esta población celular primaria se cultiva durante un periodo de días, generalmente de 1 a<8>días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente aproximadamente 1*10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, el medio de crecimiento durante la primera expansión con sensibilización comprende IL-2 o una variante de la misma, así como células alimentadoras presentadoras de antígeno y OKT-3. En algunas realizaciones, esta población celular primaria se cultiva durante un periodo de días, generalmente de 1 a 7 días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente aproximadamente 1*10<8>células TIL masivas. En algunas realizaciones, el medio de crecimiento durante la primera expansión con sensibilización comprende IL-2 o una variante de la misma, así como células alimentadoras presentadoras de antígeno y OKT-3. En algunas realizaciones, la IL-2 es IL-2 humana recombinante (rhIL-2). En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20-30*10® UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica 1 mg. En algunas realizaciones, solución madre de IL-2 tiene una actividad específica 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL- 2 tiene una concentración final de 4-8*10<6>UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL- 2 tiene una concentración final de 5-7*10<6>UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL- 2 tiene una concentración final de 6*10<6>UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 se prepara como se describe en el Ejemplo C. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 10.000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 9.000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 8.000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 7.000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 6.000 UI/mL de IL-2, o aproximadamente 5.000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende de aproximadamente 9.000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 5.000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende de aproximadamente 8.000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6.000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende de aproximadamente 7.000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6.000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 6.000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende además IL-2. En una realización preferida, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 UI/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 UI/mL, aproximadamente 4500 UI/mL, aproximadamente 5000 UI/mL, aproximadamente 5500 UI/mL, aproximadamente 6000 UI/mL, aproximadamente 6500 UI/mL, aproximadamente 7000 UI/mL, aproximadamente 7500 UI/mL, o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo de células de primera expansión con sensibilización comprende entre<10 00>y<2 0 0 0>UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2.
[0402]En algunas realizaciones, los medios de cultivo de primera expansión con sensibilización comprenden aproximadamente 500 UI/mL de IL-15, aproximadamente 400 UI/mL de IL-15, aproximadamente 300 UI/mL de IL-15, aproximadamente 200 UI/mL de IL-15, aproximadamente 180 UI/mL de IL-15, aproximadamente 160 UI/mL de IL-15, aproximadamente 140 UI/mL de IL-15, aproximadamente 120 UI/mL de IL-15, o aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende de aproximadamente 400 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende de aproximadamente 300 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 200 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15. En una realización, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende además IL-15. En una realización preferida, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15.
[0403]En algunas realizaciones, los medios de cultivo de primera expansión con sensibilización comprenden aproximadamente 20 UI/mL de IL-21, aproximadamente 15 UI/mL de IL-21, aproximadamente 12 UI/mL de IL-21, aproximadamente 10 UI/mL de IL-21, aproximadamente 5 UI/mL de IL-21, aproximadamente 4 UI/mL de IL-21, aproximadamente 3 UI/mL de IL-21, aproximadamente 2 UI/mL de IL-21, aproximadamente 1 UI/mL de IL-21, o aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende de aproximadamente 20 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende entre aproximadamente 15 UI/mL de IL-21 y aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende de aproximadamente 12 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende entre aproximadamente 10 UI/mL de IL-21 y aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende de aproximadamente 5 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 2 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una realización preferida, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21.
[0404]El medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende el anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende aproximadamente 0,1 ng/ml, aproximadamente 0,5 ng/ml, aproximadamente 1 ng/ml, aproximadamente 2,5 ng/ml, aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 7,5 ng/ml, aproximadamente 10 ng/ml, aproximadamente 15 ng/ml, aproximadamente 20 ng/ml, aproximadamente 25 ng/ml, aproximadamente 30 ng/ml, aproximadamente 35 ng/ml, aproximadamente 40 ng/ml, aproximadamente 50 ng/ml, aproximadamente 60 ng/ml, aproximadamente 70 ng/ml, aproximadamente 80 ng/ml, aproximadamente 90 ng/ml, aproximadamente 100 ng/ml, aproximadamente 200 ng/ml, aproximadamente 500 ng/ml, y aproximadamente 1 pg/ml de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0,1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng/mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 15 ng/ml y 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el anticuerpo OKT-3 es muromonab.
TABLA 3: Secuencias de aminoácidos de muromonab (anticuerpo OKT-3 ejemplar)
[0405]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende uno o más agonistas del TNFRSF en un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el agonista del TNFRSF comprende un agonista del 4-1BB. En algunas realizaciones, el agonista del TNFRSF es un agonista 4-1BB, y el agonista 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en urelumab, utomilumab, EU-101, una proteína de fusión, y fragmentos, derivados, variantes, biosimilares y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agonista del TNFRSF se añade a una concentración suficiente para alcanzar una concentración en el medio de cultivo celular de entre 0,1 pg/mL y 100 |jg/mL. En algunas realizaciones, el agonista del TNFRSF se añade a una concentración suficiente para alcanzar una concentración en el medio de cultivo celular de entre 20 jg/m L y 40 jg/mL.
[0406]En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas de TNFRSF, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende además IL<- 2>a una concentración inicial de aproximadamente 3000 Ul/mL y anticuerpo OKT-3 a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y donde el uno o más agonistas de TNFRSF comprende un agonista 4-1BB. En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas de TNFRSF, el medio de cultivo celular de primera expansión con sensibilización comprende además IL-2 a una concentración inicial de aproximadamente 6000 UI/mL y anticuerpo OKT-3 a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y donde el uno o más agonistas del TNFRSF comprende un agonista 4-1BB.
[0407]En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, se denomina CM1 (medio de cultivo 1). En algunas realizaciones, el CM consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, suplementado con 10% de suero AB humano, 25 mM de Hepes y 10 mg/mL de gentamicina. En algunas realizaciones, el CM es el CM1 descrito en los Ejemplos,véase,Ejemplo
A. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización se produce en un medio de cultivo celular inicial o un primer medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de primera expansión con sensibilización o el medio de cultivo celular inicial o el primer medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno (también denominadas en el presente documento células alimentadoras).
[0408]En algunas realizaciones, el medio de cultivo utilizado en los procesos de expansión aquí divulgados es un medio libre de suero o un medio definido. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido comprende un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un sustituto de suero. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido se utiliza para prevenir y/o disminuir la variación experimental debida en parte a la variación lote a lote de los medios que contienen suero.
[0409]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido comprende un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un reemplazo de suero. En algunas realizaciones, el medio celular basal incluye, entre otros, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CTS™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), Rp MI 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[0410]En algunas realizaciones, el suplemento de suero o el reemplazo de suero incluye, pero no se limita a uno o más de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer, Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células T CTS™, una o más albúminas o sustitutos de albúmina, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, uno o más antibióticos, y uno o más oligoelementos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-2-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Zr4+. En algunas realizaciones, el medio definido comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o 2-mercaptoetanol.
[0411]En algunas realizaciones, el Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células CTS™OpTmizer™ se utiliza con medios de crecimiento convencionales, incluidos, incluyendo pero no limitado a, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CST™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), Rp M i 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow
(G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI, y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[0412]En algunas realizaciones, la concentración total de reemplazo de suero (vol%) en el medio libre de suero o definido es de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,<6>%, 7%,<8>%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% en volumen del medio total libre de suero o definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 3% del volumen total del medio libre de suero o medio definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 5% del volumen total del medio libre de suero o medio definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el<10>% del volumen total del medio libre de suero o medio definido.
[0413]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido es SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific). Cualquier formulación de CTS™ OpTmizer™ es útil en la presente invención. SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ es una combinación de 1 L de Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ y 26 mL de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, que se mezclan antes de su uso. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific). En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), junto con 2-mercaptoetanol a 55mM. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y la concentración final de 2-mercaptoetanol en el medio es de 55 μM.
[0414]En algunas realizaciones, el medio definido es SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific). Cualquier formulación de CTS™ OpTmizer™ es útil en la presente invención. SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ es una combinación de 1 L de Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™y 26 mL de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, que se mezclan antes de su uso. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), junto con 2-mercaptoetanol a 55mM. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol, y 2mM de L-glutamina, y comprende además de aproximadamente 1000 UI/mL a aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina, y comprende además aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además entre aproximadamente 1000 UI/mL y aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además de aproximadamente 1000 UI/mL a aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además entre aproximadamente 1000 UI/mL y aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T c Ts ™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y la concentración final de 2-mercaptoetanol en el medio es de 55 μM.
[0415]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se suplementa con glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 0,1mM a aproximadamente 10mM, 0,5mM a aproximadamente 9mM, 1mM a aproximadamente 8 mM, 2mM a aproximadamente 7mM, 3mM a aproximadamente 6 mM, o 4mM a aproximadamente 5 mM. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se suplementa con glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 2mM.
[0416]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido es suplementado con 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 150 mM, 10 mM a aproximadamente 140 mM, 15 mM a aproximadamente 130 mM, 20 mM a aproximadamente 120 mM, 25 mM a aproximadamente 110 mM, 30 mM a aproximadamente 100 mM, 35 mM a aproximadamente 95 mM, 40 mM a aproximadamente 90 mM, 45 mM a aproximadamente 85 mM, 50 mM a aproximadamente 80 mM, 55 mM a aproximadamente 75 mM, 60 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 65 mM. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se complementa con 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 55mM. En algunas realizaciones, la concentración final de 2-mercaptoetanol en el medio es de 55 μM.
[0417]En algunas realizaciones, los medios definidos descritos en la Publicación Internacional PCT N.° WO/1998/030679 son útiles en la presente invención. En esa publicación se describen medios de cultivo de células eucariotas sin suero. El medio de cultivo de células eucariotas sin suero incluye un medio de cultivo celular basal suplementado con un suplemento sin suero capaz de soportar el crecimiento de células en cultivo sin suero. El suplemento de medio de cultivo de células eucariotas sin suero comprende o se obtiene combinando uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en una o más albúminas o sustitutos de albúmina, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, uno o más oligoelementos, y uno o más antibióticos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o beta-mercaptoetanol. En algunas realizaciones, el medio definido comprende una albúmina o un sustituto de albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, y uno o más oligoelementos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-2-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ y Zr4+. En algunas realizaciones, el medio celular basal se selecciona del grupo que consiste en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio Basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Esencial Mínimo (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), medio de crecimiento RPMI, y Medio de Dulbecco Modificado de Iscove.
[0418]En algunas realizaciones, la concentración de glicina en el medio definido está en el rango de aproximadamente 5-200 mg/L, la concentración de L-histidina es de aproximadamente 5-250 mg/L, la concentración de L-isoleucina es de aproximadamente 5-300 mg/L, la concentración de L-metionina es de aproximadamente 5-200 mg/L, la concentración de L-fenilalanina es de aproximadamente 5-400 mg/L, la concentración de L-prolina es de aproximadamente 1-1000 mg/L, la concentración de L-hidroxiprolina es de aproximadamente 1-45 mg/L, la concentración de L-serina es de aproximadamente 1-250 mg/L, la concentración de L-treonina es de aproximadamente 10-500 mg/L, la concentración de L-triptófano es de aproximadamente 2-110 mg/L, la concentración de L-tirosina es de aproximadamente 3-175 mg/L, la concentración de L-valina es de aproximadamente 5-500 mg/L, la concentración de tiamina es de aproximadamente 1-20 mg/L, la concentración de glutatión reducido es de aproximadamente 1-20 mg/L, la concentración de ácido L-ascórbico-2-fosfato es de aproximadamente 1-200 mg/L, la concentración de transferrina saturada de hierro es de aproximadamente 1-50 mg/L, la concentración de insulina es de aproximadamente 1-100 mg/L, la concentración de selenito sódico es de aproximadamente 0,000001-0,0001 mg/L, y la concentración de albúmina (p. ej, AlbuMAX® I) es de aproximadamente 5000-50.000 mg/L.
[0419]En algunas realizaciones, los ingredientes de moléculas de elementos no traza en el medio definido están presentes en los rangos de concentración enumerados en la columna bajo el título "Intervalo de Concentración en Medio 1X" en la Tabla A a continuación. En otras realizaciones, los ingredientes de la fracción no oligoelemento en el medio definido están presentes en las concentraciones finales enumeradas en la columna bajo el título "Una realización preferida del medio 1X" en la Tabla A a continuación. En otras realizaciones, el medio definido es un medio celular basal que comprende un suplemento libre de suero. En algunas de estas realizaciones, el suplemento libre de suero comprende ingredientes no traza del tipo y en las concentraciones enumeradas en la columna bajo el título "Una Realización Preferida en Suplemento" en la Tabla A a continuación.
Tabla A: Concentraciones de ingredientes que no son elementos traza
(continuación)
[0420]En algunas realizaciones, la osmolaridad del medio definido está entre aproximadamente 260 y 350 mOsmol. En algunas realizaciones, la osmolaridad está entre 280 y 310 mOsmol. En algunas realizaciones, el medio definido se complementa con hasta aproximadamente 3,7 g/L, o aproximadamente 2,2 g/L de bicarbonato de sodio. El medio definido puede suplementarse además con L-glutamina (concentración final de aproximadamente 2 mM), uno o más antibióticos, aminoácidos no esenciales (NEAA; concentración final de aproximadamente 100 pM), 2-mercaptoetanol (concentración final de aproximadamente 100 pM).
[0421]En algunas realizaciones, los medios definidos descritos en Smith, et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement," Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31) son útiles en la presente invención. Brevemente, se utilizó RPMI o CTS™ OpTmizer™ como medio celular basal, y se suplementó con 0, 2%, 5% o 10% de Sustituto de Suero de Células Inmunitarias CTS™.
[0422]En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas no está filtrado. El uso de un medio celular no filtrado puede simplificar los procedimientos necesarios para ampliar el número de células. En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas carece de beta-mercaptoetanol (BME 0 pME; también conocido como 2-mercaptoetanol, CAS 60-24-2).
[0423]En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos tales como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,por ejemplo,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los que a veces se denominan pre-REP o REP con sensibilización) es de 1 a<8>días, como se discute en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de 2 a<8>días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de 3 a<8>días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos tales como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,por ejemplo,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los que a veces se denominan pre-REP o REP con sensibilización) es de 4 a<8>días, como se discute en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos tales como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los que a veces se denominan pre-REP o REP con sensibilización) es de 1 a 7 días, como se discute en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de 2 a<8>días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de 2 a 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (incluidos procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de 3 a<8>días, En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización (incluidos procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de 3 a<8>días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de 4 a<8>días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de 4 a 7 días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de 5 a<8>días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de 5 a 7 días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de<6>a<8>días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir los denominados a veces pre-REP o REP con sensibilización) es de<6>a 7 días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluyendo procesos como, por ejemplo, los proporcionados en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como el proceso pre-REP o REP con sensibilización) es de 7 a<8>días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluidos procesos tales como, por ejemplo, los proporcionados en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como el proceso pre-REP o REP con sensibilización) es de<8>días. En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión con sensibilización (incluidos procesos tales como, por ejemplo, los proporcionados en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), que pueden incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como el proceso pre-REP o con sensibilización) es de 7 días.
[0424]En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 1 a<8>días desde que ocurre la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 1 a 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 2 a<8>días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 2 a 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 3 a<8>días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 3 a 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 4 a<8>días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 4 a 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 5 a<8>días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 5 a 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede continuar durante<6>a<8>días desde cuando se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede continuar durante<6>a 7 días desde cuando se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede proceder durante 7 a<8>días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede continuar durante<8>días desde cuando se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de TIL puede continuar durante 7 días desde cuando se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización.
[0425]En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización de los TIL puede proceder durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días, u<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 1 a<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 1 a 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 2 a<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 2 a 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 3 a<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 3 a 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 4 a<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 4 a 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 5 a<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 5 a 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de<6>a<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de<6>a 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 7 a<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante<8>días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 7 días.
[0426]En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15, y/o IL-21 durante la primera expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, IL-2, IL-7, IL-15, y/o IL-21 así como cualquier combinación de las mismas puede incluirse durante la primera expansión con sensibilización, incluyendo, por ejemplo durante los procesos de la Etapa B según la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15, e IL-21 durante la primera expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la IL-2, la IL-15 y la IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante los procesos de la Etapa B según la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C) y según se describe en el presente documento.
[0427]En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización, por ejemplo, la Etapa B según la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor como contenedor. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX-10 o un G-REX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-10.
1.Células alimentadoras y células presentadoras de antígeno
[0428]En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en el presente documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) no requieren células alimentadoras (también denominadas en el presente documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL, sino que se añaden durante la primera expansión con sensibilización. En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en este documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) no requieren células alimentadoras (también denominadas en este documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL, sino que se agregan durante la primera expansión con sensibilización en cualquier momento durante los días 4 a<8>. En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en este documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa B de la Figura<1>(en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) no requieren células alimentadoras (también denominadas en este documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL, sino que se agregan durante la primera expansión con sensibilización en cualquier momento durante los días 4 a 7. En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en este documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) no requieren células alimentadoras (también denominadas en este documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL, sino que se agregan durante la primera expansión con sensibilización en cualquier momento durante los días 5 a<8>. En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en este documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) no requieren células alimentadoras (también denominadas en este documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL, sino que se agregan durante la primera expansión con sensibilización en cualquier momento durante los días 5 a 7. En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en este documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) no requieren células alimentadoras (también denominadas en este documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL, sino que se agregan durante la primera expansión con sensibilización en cualquier momento durante los días<6>a<8>. En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en este documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) no requieren células alimentadoras (también denominadas en este documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL, sino que se agregan durante la primera expansión con sensibilización en cualquier momento durante los días<6>a 7. En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en este documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) no requieren células alimentadoras (también denominadas en este documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL, sino que se agregan durante la primera expansión con sensibilización en cualquier momento durante los días 7 o<8>. En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en este documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa B de la Figura<1>(en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) no requieren células alimentadoras (también denominadas en este documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL, sino que se agregan durante la primera expansión con sensibilización en cualquier momento durante el día 7. En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en este documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) no requieren células alimentadoras (también denominadas en este documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL, sino que se agregan durante la primera expansión con sensibilización en cualquier momento durante el día<8>.
[0429]En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en el presente documento (por ejemplo, incluyendo expansiones como las descritas en la Etapa B de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como las denominadas pre-REP o REP con sensibilización) requieren células alimentadoras (también denominadas en el presente documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de TIL y durante la primera expansión con sensibilización. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre total estándar de donantes de sangre sanos alogénicos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación en gradiente Ficoll-Paque. En algunas realizaciones, se utilizan 2,5 * 10<8>células alimentadoras durante la primera expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, se utilizan 2,5 * 10<8>células alimentadoras por contenedor durante la primera expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, se utilizan 2,5 *10<8>células alimentadoras por GREX-10 durante la primera expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, se utilizan 2,5 *10<8>células alimentadoras por GREX-<10 0>durante la primera expansión con sensibilización.
[0430]En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos REP, como se describe en los ejemplos, que proporciona un protocolo ejemplar para evaluar la incompetencia de replicación de PBMC alogénicas irradiadas.
[0431]En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y aceptables para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables en el día 14 es menor que el número inicial de células viables puestas en cultivo en el día 0 de la primera expansión con sensibilización.
[0432]En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y aceptables para su uso en los procedimientos de expansión de TIL aquí descritos si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, en el día 7 no ha aumentado desde el número inicial de células viables puestas en cultivo en el día 0 de la primera expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/ml de IL-2.
[0433]En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y aceptables para su uso en los procedimientos de expansión de TIL aquí descritos si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, en el día 7 no ha aumentado desde el número inicial de células viables puestas en cultivo en el día 0 de la primera expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 5-60 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 1000-6000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 10-50 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 2000-5000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 20-40 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-4000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 25-35 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2500-3500 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 15 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 15 ng/ml de anticuerpo O<k>T3 y 6000 UI/ml de IL-2.
[0434]En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son PBMC. En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son células alimentadoras presentadoras de antígeno artificiales. En una realización, la relación de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400, o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la relación de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la relación de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de entre<1>a<100>y<1>a<2 0 0>.
[0435]En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos aquí requieren una relación de aproximadamente 2,5 * 10<8>células alimentadoras para aproximadamente 100 * 10<6>TIL. En otra realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 2,5 * 10<8>células alimentadoras por aproximadamente 50 * 10<6>TIL. En otra realización, la primera expansión con sensibilización descrita en el presente documento requiere aproximadamente 2,5 * 10<8>células alimentadoras para aproximadamente 25 * 10<6>TIL. En otra realización, la primera expansión con sensibilización descrita en el presente documento requiere aproximadamente 2,5 *10<8>células alimentadoras. En otra realización, la primera expansión con sensibilización requiere un cuarto, un tercio, cinco doceavos, o la mitad del número de células alimentadoras utilizadas en la segunda expansión rápida.
[0436]En algunas realizaciones, el medio en la primera expansión con sensibilización comprende IL-2. En algunas realizaciones, los medios en la primera expansión con sensibilización comprenden 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio en la primera expansión con sensibilización comprende células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio en la primera expansión con sensibilización comprende 2,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por contenedor. En algunas realizaciones, el medio en la primera expansión con sensibilización comprende OKT-3. En algunas realizaciones, el medio comprende 30 ng de OKT-3 por envase. En algunas realizaciones, el recipiente es un matraz GREX100 MCS. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 ng/mL de OKT-3 y 2,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 ng/mL de OKT-3 y 2,5 *10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por envase. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 15 |jg de OKT-3 por 2,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 15 jg de OKT-3 por envase. En algunas realizaciones, el recipiente es un matraz GREX100 MCS. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 6000 UI/mL de IL-2, 30 ng/mL ng de OKT-3 y 2,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 6000 UI/mL de IL-2, 15 jg de OKT-3, y 2,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 15 jg de OKT-3 por 2,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente.
[0437]En una realización, los procedimientos de primera expansión con sensibilización descritos aquí requieren un exceso de células alimentadoras sobre TIL durante la segunda expansión. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre total estándar de donantes de sangre sanos alogénicos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación en gradiente Ficoll-Paque. En una realización, se utilizan células artificiales presentadoras de antígeno (aAPC) en lugar de PBMC.
[0438]En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos de expansión de TIL descritos en el presente documento, incluidos los procedimientos ejemplares descritos en las figuras y ejemplos.
[0439]En una realización, las células presentadoras de antígeno artificiales se utilizan en la primera expansión con sensibilización como un reemplazo para, o en combinación con, PBMC.
2.Citocinas
[0440]Los métodos de expansión aquí descritos generalmente utilizan medios de cultivo con altas dosis de una citoquina, en particular IL-2, como es conocido en la técnica.
[0441]Alternativamente, es posible usar combinaciones de citoquinas para la primera expansión de TIL, con combinaciones de dos o más de IL-2, IL-15 e IL-21 como se describe generalmente en la Publicación Internacional N.° WO 2015/189356 y WO 2015/189357. Por lo tanto, las combinaciones posibles incluyen IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21, e IL-2, IL-15 e IL-21, siendo esta última la más utilizada en muchas realizaciones. El uso de combinaciones de citoquinas favorece específicamente la generación de linfocitos y, en particular, de células T, tal como se describe en el presente documento.
TABLA 4: Secuencias de aminoácidos de las interleucinas.
C. ETAPA C: Transición de la Primera Expansión con Sensibilización para la Segunda Expansión Rápida
[0442]En algunos casos, la población de TIL a granel obtenida de la primera expansión con sensibilización (que puede incluir expansiones a veces denominadas pre-REP), incluyendo, por ejemplo la población de TIL obtenida de, por ejemplo, la Etapa B como se indica en la Figura 1 (en particular, por ejemplo, la Figura 1B y/o la Figura 1C), puede someterse a una segunda expansión rápida (que puede incluir expansiones a veces denominadas Protocolo de Expansión Rápida (REP)) y luego criopreservarse como se discute a continuación. Del mismo modo, en el caso de que se vayan a utilizar TIL modificados genéticamente en terapia, la población TIL expandida de la primera expansión con sensibilización o la población TIL expandida de la segunda expansión rápida pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados antes de la etapa de expansión o después de la primera expansión con sensibilización y antes de la segunda expansión rápida.
[0443]En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, de la Etapa B como se indica en la Figura 1 (en particular, p. ej., la Figura 1B y/o la Figura 1C)) se almacenan hasta que se fenotipan para la selección. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión con sensibilización (por ejemplo, de la Etapa B como se indica en la Figura 1 (en particular, p. ej., la Figura 1B y/o la Figura 1C)) no se almacenan y pasan directamente a la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión con sensibilización no se criopreservan después de la primera expansión con sensibilización y antes de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce aproximadamente a los 2 días, 3 días, 4, días, 5 días, 6 días, 7 días, u 8 días desde que se produce la fragmentación del tumor y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce en aproximadamente 3 días a 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce en aproximadamente 3 días a 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce en aproximadamente 4 días a 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce en aproximadamente 4 días a 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce en aproximadamente 5 días a 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce en aproximadamente 5 días a 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce en aproximadamente 6 días a 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce en aproximadamente 6 días a 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce en aproximadamente 7 días a 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce a los 7 días aproximadamente desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce a los 8 días aproximadamente desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización.
[0444]En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida ocurre en 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, u 8 días desde que ocurre la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce entre 1 día y 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce entre 1 día y 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce entre 2 días y 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce entre 2 días y 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce entre 3 días y 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión se produce entre 3 días y 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce entre 4 y 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce entre 4 y 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce entre 5 y 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce entre 5 y 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce entre 6 y 7 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce entre 6 y 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce entre 7 y 8 días desde que se produce la fragmentación y/o cuando se inicia la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce a los 7 días de producirse la fragmentación y/o de iniciarse la primera etapa de expansión con sensibilización. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida se produce a los<8>días de producirse la fragmentación y/o de iniciarse la primera etapa de expansión con sensibilización.
[0445]En algunas realizaciones, los TIL no se almacenan después de la primera expansión primaria y antes de la segunda expansión rápida, y los TIL proceden directamente a la segunda expansión rápida (por ejemplo, en algunas realizaciones, no hay almacenamiento durante la transición de la Etapa B al Etapa D como se muestra en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C)). En algunas realizaciones, la transición se produce en un sistema cerrado, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL de la primera expansión con sensibilización, la segunda población de TIL, pasa directamente a la segunda expansión rápida sin periodo de transición.
[0446]En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida, por ejemplo, la Etapa C según la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un único biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un GREX-10 o un GREX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor de sistema cerrado es un único biorreactor. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión con sensibilización a la segunda expansión rápida implica un aumento del tamaño del recipiente. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización se lleva a cabo en un recipiente más pequeño que la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la primera expansión con sensibilización se lleva a cabo en un GREX-100 y la segunda expansión rápida en un GREX-500.
D. ETAPA D: Segunda Expansión Rápida
[0447]En algunas realizaciones, la población de células TIL se expande aún más en número después de la cosecha y la primera expansión con sensibilización, después de la Etapa A y la Etapa B, y la transición denominada Etapa C, como se indica en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C)). Esta expansión adicional se denomina en el presente documento segunda expansión rápida, que puede incluir procesos de expansión generalmente denominados en la técnica proceso de expansión rápida (Rapid Expansion Protocol o REP; así como procesos como los indicados en la Etapa D de la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C). La segunda expansión rápida se logra generalmente utilizando un medio de cultivo que comprende una serie de componentes, incluyendo células alimentadoras, una fuente de citoquinas y un anticuerpo anti-CD3, en un recipiente permeable al gas. En algunas realizaciones, 1 día, 2 días, 3 días, o 4 días después del inicio de la segunda expansión rápida(es decir,en los días<8>, 9, 10, u 11 del proceso general Gen 3), los TIL se transfieren a un contenedor de mayor volumen.
[0448]En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida (que puede incluir expansiones a veces denominadas REP; así como procesos como los indicados en la Etapa D de la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C)) de TIL puede realizarse utilizando cualquier matraz o recipiente de TIL conocido por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días,<8>días, 9 días, o 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 1 día a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 1 día a aproximadamente 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 2 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 2 días a aproximadamente 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 4 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 4 días a aproximadamente 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 5 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 5 días a aproximadamente 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente<6>días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente<6>días a aproximadamente 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente<8>días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente<8>días a aproximadamente<10>días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 9 días a aproximadamente 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente 1 día tras el inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente 2 días tras el inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente 3 días tras el inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente 4 días tras el inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente 5 días tras el inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente<6>días tras el inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente 7 días tras el inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente<8>días tras el inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente 9 días tras el inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente<10>días tras el inicio de la segunda expansión rápida.
[0449]En una realización, la segunda expansión rápida puede llevarse a cabo en un recipiente permeable al gas utilizando los métodos de la presente divulgación (incluyendo, por ejemplo, expansiones denominadas REP; así como procesos como los indicados en la Etapa D de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, los TIL se expanden en la segunda expansión rápida en presencia de IL-2, OKT-3 y células alimentadoras (también denominadas en el presente documento "células presentadoras de antígeno"). En algunas realizaciones, los TIL se expanden en la segunda expansión rápida en presencia de IL-2, OKT-3 y células alimentadoras, en las que las células alimentadoras se añaden a una concentración final que es el doble, 2,4 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces o 4 veces la concentración de células alimentadoras presentes en la primera expansión con sensibilización. Por ejemplo, los TIL pueden expandirse rápidamente utilizando la estimulación inespecífica del receptor de células T en presencia de interleucina-2 (IL-2) o interleucina-15 (IL-15). El estímulo no específico del receptor de células T puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, como aproximadamente 30 ng/ml de OKT3, un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD3 (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA) o UHCT-1 (disponible comercialmente en BioLegend, San Diego, CA, EE.UU.). Los TIL pueden expandirse para inducir una mayor estimulación de los TILin vitromediante la inclusión de uno o más antígenos durante la segunda expansión, incluyendo porciones antigénicas de los mismos, tales como epítopo(s), del cáncer, que pueden expresarse opcionalmente a partir de un vector, tal como un péptido de unión al antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2),por ejemplo,0,3 pM MART-1:26-35 (27 L) o gpl 00:209-217 (210M), opcionalmente en presencia de un factor de crecimiento de células T, como 300 UI/mL IL-2 o IL-15. Otros antígenos adecuados pueden incluir,p. ej.,NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antígeno del cáncer de tirosinasa, MAGE-A3, SSX-2, y VEGFR2, o porciones antigénicas de los mismos. Los TIL también pueden expandirse rápidamente mediante la reestimulación con el mismo antígeno o antígenos del cáncer pulsados sobre células presentadoras de antígenos que expresan HLA-A2. Alternativamente, los TIL pueden ser reestimulados adicionalmente con,por ejemplo,linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2. En algunas realizaciones, la reestimulación se produce como parte de la segunda expansión. En algunas realizaciones, la segunda expansión se produce en presencia de linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2.
[0450]En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 UI/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 UI/mL, aproximadamente 4500 UI/mL, aproximadamente 5000 UI/mL, aproximadamente 5500 UI/mL, aproximadamente 6000 UI/mL, aproximadamente 6500 UI/mL, aproximadamente 7000 UI/mL, aproximadamente 7500 UI/mL, o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o entre 8000 UI/mL de IL-2.
[0451]En una realización, el medio de cultivo celular comprende el anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0,1 ng/ml, aproximadamente 0,5 ng/ml, aproximadamente 1 ng/ml, aproximadamente 2,5 ng/ml, aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 7,5 ng/ml, aproximadamente 10 ng/ml, aproximadamente 15 ng/ml, aproximadamente 20 ng/ml, aproximadamente 25 ng/ml, aproximadamente 30 ng/ml, aproximadamente 35 ng/ml, aproximadamente 40 ng/ml, aproximadamente 50 ng/ml, aproximadamente 60 ng/ml, aproximadamente 70 ng/ml, aproximadamente 80 ng/ml, aproximadamente 90 ng/ml, aproximadamente 100 ng/ml, aproximadamente 200 ng/ml, aproximadamente 500 ng/ml, y aproximadamente 1 pg/ml del anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0,1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng/mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 30 ng/ml y 60 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 60 ng/mL de OKT-3. En algunas realizaciones, el anticuerpo OKT-3 es muromonab.
[0452]En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende IL-2. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende 7,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por contenedor. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de segunda expansión rápida comprende 500 mL de medio de cultivo y 30 |jg de OKT-3 por envase. En algunas realizaciones, el recipiente es un matraz GREX100 MCS. En algunas realizaciones, el medio de segunda expansión rápida comprende 6000 UI/mL de IL-2, 60 ng/mL de OKT-3 y 7,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 6000 UI/mL de IL-2, 30 jg de OKT-3, y 7,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente.
[0453]En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende IL-2. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio comprende entre 5 * 10<8>y 7,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por envase. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de la segunda expansión rápida comprende 500 mL de medio de cultivo y 30 jg de OKT-3 por envase. En algunas realizaciones, el recipiente es un matraz GREX100 MCS. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende 6000 UI/mL de IL-2, 60 ng/mL de OKT-3, y entre 5 * 10<8>y 7,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio de la segunda expansión rápida comprende 500 mL de medio de cultivo y 6000 UI/mL de IL-2, 30 jg de OKT-3, y entre 5 * 10<8>y 7,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno por contenedor.
[0454]En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende uno o más agonistas de TNFRSF en un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el agonista del TNFRSF comprende un agonista del 4-1BB. En algunas realizaciones, el agonista del TNFRSF es un agonista 4-1BB, y el agonista 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en urelumab, utomilumab, EU-101, una proteína de fusión, y fragmentos, derivados, variantes, biosimilares y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agonista del TNFRSF se añade a una concentración suficiente para alcanzar una concentración en el medio de cultivo celular de entre 0,1 jg/m L y 100 jg/mL. En algunas realizaciones, el agonista del TNFRSF se añade a una concentración suficiente para alcanzar una concentración en el medio de cultivo celular de entre 20 jg/m L y 40 jg/mL.
[0455]En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas del TNFRSF, el medio de cultivo celular comprende además IL-2 a una concentración inicial de aproximadamente 3000 UI/mL y anticuerpo OKT-3 a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y en donde el uno o más agonistas del TNFRSF comprende un agonista 4-1BB.
[0456]En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-7, IL-15, y/o IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo durante un proceso de la Etapa D según la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15, e IL-21 durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, la IL-2, la IL-15, y la IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante los procesos de la Etapa D según la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C) y según se describe en el presente documento.
[0457]En algunas realizaciones, la segunda expansión puede llevarse a cabo en un medio de cultivo celular suplementado que comprenda IL-2, OKT-3, células alimentadoras presentadoras de antígeno y, opcionalmente, un agonista del TNFRSF. En algunas realizaciones, la segunda expansión se produce en un medio de cultivo celular suplementado. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular suplementado comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC; también denominadas células alimentadoras presentadoras de antígeno). En algunas realizaciones, la segunda expansión se produce en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno(es decir,células presentadoras de antígeno).
[0458]En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15, aproximadamente 400 UI/mL de IL-15, aproximadamente 300 UI/mL de IL-15, aproximadamente 200 UI/mL de IL-15, aproximadamente 180 UI/mL de IL-15, aproximadamente 160 UI/mL de IL-15, aproximadamente 140 UI/mL de IL-15, aproximadamente 120 UI/mL de IL-15, o aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 500 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 400 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 300 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 200 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15.
[0459]En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 20 UI/mL de IL-21, aproximadamente 15 UI/mL de IL-21, aproximadamente 12 UI/mL de IL-21, aproximadamente 10 UI/mL de IL-21, aproximadamente 5 UI/mL de IL-21, aproximadamente 4 UI/mL de IL-21, aproximadamente 3 UI/mL de IL-21, aproximadamente 2 UI/mL de IL-21, aproximadamente 1 UI/mL de IL-21, o aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 20 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 15 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 12 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 10 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 5 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 2 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21.
[0460]En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC) son PBMC. En una realización, la relación de TIL a PBMC y/o células presentadoras de antígeno en la expansión rápida y/o la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 10, aproximadamente 1 a 15, aproximadamente 1 a 20, aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 30, aproximadamente 1 a 35, aproximadamente 1 a 40, aproximadamente 1 a 45, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 75, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400, o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la relación de TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión está entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la relación de TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión es entre 1 a 100 y 1 a 200.
[0461]En una realización, el REP y/o la segunda expansión rápida se lleva a cabo en matraces con los TIL a granel mezclados con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, en donde la concentración de células alimentadoras es al menos 1.1 veces (1.1X), 1.2X, 1.3X, 1.4X, 1.5X, 1.6X, 1.7X, 1.8X, 1.8X, 2X, 2.1X2.2X, 2.3X, 2.4X, 2.5X, 2.6X, 2.7X, 2.8X, 2.9X, 3.0X, 3.1X, 3.2X, 3.3X, 3.4X, 3.5X, 3.6X, 3.7X, 3.8X, 3.9X o 4.0X la concentración de células alimentadoras en la primera expansión con sensibilización, 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 anti-CD3 y 6000 UI/mL de IL-2 en 150 ml de medio. Se sustituyen los medios (generalmente 2/3 de los medios mediante aspiración de 2/3 de los medios gastados y sustitución por un volumen igual de medios frescos) hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. Entre las cámaras de crecimiento alternativas se incluyen los matraces G-REX y los contenedores permeables a los gases, como se explica más detalladamente a continuación.
[0462]En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida (que puede incluir procesos denominados proceso REP) es de 7 a 9 días, como se discute en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la segunda expansión es de 7 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión es de<8>días. En algunas realizaciones, la segunda expansión es de 9 días.
[0463]En una realización, la segunda expansión (que puede incluir expansiones denominadas REP, así como las denominadas en la Etapa D de la Figura 1 (en particular, p. ej., Figura 1B y/o Figura 1C) puede realizarse en matraces permeables al gas de 500 mL de capacidad con fondos de silicona permeables al gas de 100 cm (G-Rex 100, disponible comercialmente de Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, EE.UU.), 5 * 10<6>o 10 * 10<6>TIL pueden cultivarse con PBMC en 400 mL de medio 50/50, suplementado con 5% de suero AB humano, 3000 UI por mL de IL-2 y 30 ng por ml de anti-CD3 (OKT3). Los matraces G-Rex 100 pueden incubarse a 37°C en un 5% de CO<2>. El día 5, pueden extraerse 250 mL de sobrenadante y colocarse en frascos de centrífuga y centrifugarse a 1500 rpm (491 * g) durante 10 minutos. Los pellets de TIL pueden volver a suspenderse con 150 mL de medio fresco con 5% de suero AB humano, 6000 UI por mL de IL-2, y añadirse de nuevo a los matraces GREX-100 originales. Cuando los TIL se expanden en serie en matraces GREX-100, en el día 10 u 11 los TIL pueden trasladarse a un matraz más grande, como un GREX-500. Las células pueden ser cosechadas en el día 14 de cultivo. Las células pueden ser cosechadas en el día 15 de cultivo. Las células pueden ser cosechadas en el día 16 de cultivo. En algunas realizaciones, la sustitución de los medios se lleva a cabo hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. En algunas realizaciones, 2/3 de los medios se sustituyen por aspiración de los medios gastados y sustitución por un volumen igual de medios frescos. En algunas realizaciones, las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces GREX y recipientes permeables a los gases, como se explica con más detalle a continuación.
[0464]En algunas realizaciones, el medio de cultivo utilizado en los procesos de expansión aquí divulgados es un medio libre de suero o un medio definido. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido comprende un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un sustituto de suero. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido se utiliza para prevenir y/o disminuir la variación experimental debida en parte a la variación lote a lote de los medios que contienen suero.
[0465]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido comprende un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un reemplazo de suero. En algunas realizaciones, el medio celular basal incluye, entre otros, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CTS™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), Rp MI 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[0466]En algunas realizaciones, el suplemento de suero o el reemplazo de suero incluye, pero no se limita a uno o más de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer, Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células T CTS™ una o más albúminas o sustitutos de albúmina, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, uno o más antibióticos, y uno o más oligoelementos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-2-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ y Zr4+. En algunas realizaciones, el medio definido comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o 2-mercaptoetanol.
[0467]En algunas realizaciones, el Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células CTS™OpTmizer™ se utiliza con medios de crecimiento convencionales, incluidos, incluyendo pero no limitado a, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CST™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI, y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[0468]En algunas realizaciones, la concentración total de reemplazo de suero (vol%) en el medio libre de suero o definido es de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6 %, 7%, 8 %, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% en volumen del medio total libre de suero o definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 3% del volumen total del medio libre de suero o medio definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 5% del volumen total del medio libre de suero o medio definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 10 % del volumen total del medio libre de suero o medio definido.
[0469]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido es SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific). Cualquier formulación de CTS™ OpTmizer™ es útil en la presente invención. SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ es una combinación de 1 L de Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ y 26 mL de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, que se mezclan antes de su uso. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific). En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), junto con 2-mercaptoetanol a 55mM. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y la concentración final de 2-mercaptoetanol en el medio es de 55 μM.
[0470]En algunas realizaciones, el medio definido es SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific). Cualquier formulación de CTS™ OpTmizer™ es útil en la presente invención. SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ es una combinación de 1 L de Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ y 26 mL de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, que se mezclan antes de su uso. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), junto con 2-mercaptoetanol a 55mM. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol, y 2mM de L-glutamina, y comprende además de aproximadamente 1000 UI/mL a aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el s Fm de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina, y comprende además aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además entre aproximadamente 1000 UI/mL y aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además de aproximadamente 1000 UI/mL a aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además entre aproximadamente 1000 UI/mL y aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T<c>T<s>™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y la concentración final de 2-mercaptoetanol en el medio es de 55μM.
[0471]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se suplementa con glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 0,1mM a aproximadamente 10mM, 0,5mM a aproximadamente 9mM, 1mM a aproximadamente<8>mM, 2mM a aproximadamente 7mM, 3mM a aproximadamente<6>mM, o 4mM a aproximadamente 5 mM. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se suplementa con glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 2mM.
[0472]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido es suplementado con 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 150 mM, 10 mM a aproximadamente 140 mM, 15 mM a aproximadamente 130 mM, 20 mM a aproximadamente 120 mM, 25 mM a aproximadamente 110 mM, 30 mM a aproximadamente 100 mM, 35 mM a aproximadamente 95 mM, 40 mM a aproximadamente 90 mM, 45 mM a aproximadamente 85 mM, 50 mM a aproximadamente 80 mM, 55 mM a aproximadamente 75 mM, 60 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 65 mM. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se complementa con 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 55mM.
[0473]En algunas realizaciones, los medios definidos descritos en la Publicación Internacional PCT N.° WO/1998/030679 son útiles en la presente invención. En esa publicación se describen medios de cultivo de células eucariotas sin suero. El medio de cultivo de células eucariotas sin suero incluye un medio de cultivo celular basal suplementado con un suplemento sin suero capaz de soportar el crecimiento de células en cultivo sin suero. El suplemento de medio de cultivo de células eucariotas sin suero comprende o se obtiene combinando uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en una o más albúminas o sustitutos de albúmina, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, uno o más oligoelementos, y uno o más antibióticos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o beta-mercaptoetanol. En algunas realizaciones, el medio definido comprende una albúmina o un sustituto de albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, y uno o más oligoelementos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-2-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ y Zr4+. En algunas realizaciones, el medio celular basal se selecciona del grupo que consiste en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio Basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Esencial Mínimo (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), medio de crecimiento RPMI, y Medio de Dulbecco Modificado de Iscove.
[0474]En algunas realizaciones, la concentración de glicina en el medio definido está en el rango de aproximadamente 5-200 mg/L, la concentración de L-histidina es de aproximadamente 5-250 mg/L, la concentración de L-isoleucina es de aproximadamente 5-300 mg/L, la concentración de L-metionina es de aproximadamente 5-200 mg/L, la concentración de L-fenilalanina es de aproximadamente 5-400 mg/L, la concentración de L-prolina es de aproximadamente 1-1000 mg/L, la concentración de L-hidroxiprolina es de aproximadamente 1-45 mg/L, la concentración de L-serina es de aproximadamente 1-250 mg/L, la concentración de L-treonina es de aproximadamente 10-500 mg/L, la concentración de L-triptófano es de aproximadamente 2-110 mg/L, la concentración de L-tirosina es de aproximadamente 3-175 mg/L, la concentración de L-valina es de aproximadamente 5-500 mg/L, la concentración de tiamina es de aproximadamente 1-20 mg/L, la concentración de glutatión reducido es de aproximadamente 1-20 mg/L, la concentración de ácido L-ascórbico-2-fosfato es de aproximadamente 1-200 mg/L, la concentración de transferrina saturada de hierro es de aproximadamente 1-50 mg/L, la concentración de insulina es de aproximadamente 1-100 mg/L, la concentración de selenito sódico es de aproximadamente 0,000001-0,0001 mg/L, y la concentración de albúmina (p. ej, AlbuMAX® I) es de aproximadamente 5000-50.000 mg/L.
[0475]En algunas realizaciones, los ingredientes de moléculas de elementos no traza en el medio definido están presentes en los rangos de concentración enumerados en la columna bajo el título "Intervalo de Concentración en Medio 1X" en la Tabla A a continuación. En otras realizaciones, los ingredientes de la fracción no oligoelemento en el medio definido están presentes en las concentraciones finales enumeradas en la columna bajo el título "Una realización preferida del medio 1X" en la Tabla A a continuación. En otras realizaciones, el medio definido es un medio celular basal que comprende un suplemento libre de suero. En algunas de estas realizaciones, el suplemento libre de suero comprende ingredientes no traza del tipo y en las concentraciones enumeradas en la columna bajo el título "Una Realización Preferida en Suplemento" en la Tabla A a continuación.
Tabla A: Concentraciones de ingredientes que no son elementos traza
(continuación)
[0476]En algunas realizaciones, la osmolaridad del medio definido está entre aproximadamente 260 y 350 mOsmol. En algunas realizaciones, la osmolaridad está entre 280 y 310 mOsmol. En algunas realizaciones, el medio definido se complementa con hasta aproximadamente 3,7 g/L, o aproximadamente 2,2 g/L de bicarbonato de sodio. El medio definido puede suplementarse además con L-glutamina (concentración final de aproximadamente 2 mM), uno o más antibióticos, aminoácidos no esenciales (NEAA; concentración final de aproximadamente 100 pM), 2-mercaptoetanol (concentración final de aproximadamente 100 pM).
[0477]En algunas realizaciones, los medios definidos descritos en Smith, et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement," Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31) son útiles en la presente invención. Brevemente, se utilizó RPMI o CTS™ OpTmizer™ como medio celular basal, y se suplementó con 0, 2%, 5% o 10% de Sustituto de Suero de Células Inmunitarias CTS™.
[0478]En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas no está filtrado. El uso de un medio celular no filtrado puede simplificar los procedimientos necesarios para ampliar el número de células. En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas carece de beta-mercaptoetanol (BME o pME; también conocido como 2-mercaptoetanol, CAS 60-24-2).
[0479]En una realización, la segunda expansión rápida (incluidas las expansiones denominadas REP) se lleva a cabo y comprende además una etapa donde los TIL se seleccionan para una reactividad tumoral superior. Puede utilizarse cualquier método de selección conocido en la técnica. Por ejemplo, los métodos descritos en La publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2016/0010058 A1 puede utilizarse para la selección de TIL para una reactividad tumoral superior.
[0480]Opcionalmente, puede realizarse un ensayo de viabilidad celular después de la segunda expansión rápida (incluidas las expansiones denominadas expansión REP), utilizando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión con azul tripán en una muestra de TIL, que marca selectivamente las células muertas y permite evaluar la viabilidad. En algunas realizaciones, las muestras de TIL pueden contarse y determinarse su viabilidad utilizando un contador celular automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). En algunas realizaciones, la viabilidad se determina según el protocolo estándar del Contador Celular Automático del Citómetro de Imagen Cellometer K2.
[0481]Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos génicos. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión), y C (constante), determinan la especificidad de unión y las aplicaciones posteriores de las inmunoglobulinas y los receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un método para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos por el presente método muestran un aumento de la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos en la segunda expansión muestran un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o de la diversidad de receptores de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena pesada de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena ligera de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma, y delta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión de TCRab (esdecir,TCRa/p).
[0482]En algunas realizaciones, el medio de cultivo de segunda expansión rápida(p. ej.,a veces denominado CM2 o segundo medio de cultivo celular), comprende IL-2, OKT-3, así como las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se explica con más detalle a continuación. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de segunda expansión rápida(p. ej.,a veces denominado CM2 o el segundo medio de cultivo celular), comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 ug/matraz de<o>KT-3, así como 7,5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se explica con más detalle a continuación. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de segunda expansión rápida(p. ej.,a veces denominado CM2 o segundo medio de cultivo celular), comprende IL-2, OKT-3, así como las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se explica con más detalle a continuación. En algunas realizaciones, el medio de cultivo de segunda expansión rápida(p. ej.,a veces denominado CM2 o el segundo medio de cultivo celular), comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 ug/matraz de OKT-3, así como 5 * 10<8>células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se explica con más detalle a continuación.
[0483]En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida, por ejemplo, la Etapa D según la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor como contenedor. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX-100 o un G-REX-500. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-500.
1.Células alimentadoras y células presentadoras de antígeno
[0484]En una realización, los procedimientos de segunda expansión rápida descritos en el presente documento (por ejemplo, incluyendo expansión como las descritas en la Etapa D de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), así como los denominados REP) requieren un exceso de células alimentadoras durante la expansión de TIL REP y/o durante la segunda expansión rápida. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre total estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación en gradiente Ficoll-Paque.
[0485]En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos REP, como se describe en los ejemplos, que proporciona un protocolo ejemplar para evaluar la incompetencia de replicación de PBMC alogénicas irradiadas.
[0486]En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y aceptables para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables en el día 7 o 14 es inferior al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión(es decir,el día de inicio de la segunda expansión).
[0487]En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL aquí descritos si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado desde el número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión(es decir,el día de inicio de la segunda expansión). En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/ml de IL-2.
[0488]En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL aquí descritos si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado desde el número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión(es decir,el día de inicio de la segunda expansión). En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30-60 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 1000-6000 UI/ml IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30-60 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 2000-5000 UI/ml IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30-60 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 2000-4000 Ul/ml IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30-60 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 2500-3500 UI/ml IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30-60 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/ml IL-2.
[0489]En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son PBMC. En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son células alimentadoras presentadoras de antígeno artificiales. En una realización, la relación de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 10, aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400, o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la relación de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la relación de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de entre<1>a<100>y<1>a<2 0 0>.
[0490]En una realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 5 * 10<8>células alimentadoras por aproximadamente 100 * 10<6>TIL. En una realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 7,5 * 10<8>células alimentadoras por aproximadamente 100 * 10<6>TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 5 * 10<8>células alimentadoras para aproximadamente 50 * 10<6>TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 7,5 * 10<8>células alimentadoras para aproximadamente 50 * 10<6>TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren aproximadamente 5 * 10<8>células alimentadoras para aproximadamente 25 * 10<6>TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren aproximadamente 7,5 * 10<8>células alimentadoras para aproximadamente 25 * 10<6>TIL. En otra realización, la segunda expansión rápida requiere el doble de células alimentadoras que la segunda expansión rápida. En otra realización, cuando la primera expansión con sensibilización aquí descrita requiere aproximadamente 2,5 * 10<8>células alimentadoras, la segunda expansión rápida requiere aproximadamente 5 * 10<8>células alimentadoras. En otra realización, cuando la primera expansión con sensibilización aquí descrita requiere aproximadamente 2,5 * 10<8>células alimentadoras, la segunda expansión rápida requiere aproximadamente 7,5 * 10<8>células alimentadoras. en otra realización, la segunda expansión rápida requiere dos veces (2,0x), 2,5x, 3,0x, 3,5x o 4,0x el número de células alimentadoras que la primera expansión con sensibilización.
[0491]En una realización, los procedimientos de segunda expansión rápida aquí descritos requieren un exceso de células alimentadoras durante la segunda expansión rápida. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre total estándar de donantes de sangre sanos alogénicos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación en gradiente Ficoll-Paque. En una realización, se utilizan células artificiales presentadoras de antígeno (aAPC) en lugar de PBMC. En algunas realizaciones, las PBMC se añaden a la segunda expansión rápida al doble de la concentración de PBMC que se añadieron a la primera expansión con sensibilización.
[0492]En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos de expansión de TIL descritos en el presente documento, incluidos los procedimientos ejemplares descritos en las figuras y ejemplos.
[0493] En una realización, las células presentadoras de antígeno artificiales se utilizan en la segunda expansión rápida como un reemplazo para, o en combinación con, PBMC.
2.Citocinas
[0494]Los métodos de segunda expansión rápida aquí descritos generalmente utilizan medios de cultivo con altas dosis de una citoquina, en particular IL-2, como es conocido en la técnica.
[0495]Alternativamente, es posible usar combinaciones de citoquinas para la segunda expansión rápida de TIL, con combinaciones de dos o más de IL-2, IL-15 e IL-21 como se describe en general en WO 2015/189356 y W o 2015/189357. Por lo tanto, las combinaciones posibles incluyen IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21, e IL-2, IL-15 e IL-21, siendo esta última la más utilizada en muchas realizaciones. El uso de combinaciones de citoquinas favorece específicamente la generación de linfocitos y, en particular, de células T, tal como se describe en el presente documento.
E. ETAPA E: Cosecha de TIL
[0496]Después de la segunda etapa de expansión rápida, las células pueden ser cosechadas. En algunas realizaciones, los TIL se cosechan después de uno, dos, tres, cuatro o más etapas de expansión, por ejemplo, como se muestra en la Figura 1 (en particular,por ejemplo,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, los TIL se cosechan después de dos etapas de expansión, por ejemplo, como se muestra en la Figura 1 (en particular,por ejemplo,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, los TIL se cosechan después de dos etapas de expansión, una primera expansión con sensibilización y una segunda expansión rápida, por ejemplo, como se muestra en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[0497]Los TIL se pueden cosechar de cualquier manera apropiada y estéril, incluyendo, por ejemplo por centrifugación. Los métodos para la cosecha de TIL son bien conocidos en la técnica y cualquiera de estos métodos conocidos puede emplearse con el presente proceso. En algunas realizaciones, los TIL se cosechan utilizando un sistema automatizado.
[0498]Las cosechadoras de células y/o los sistemas de procesamiento celular están disponibles comercialmente de una variedad de fuentes, incluyendo, por ejemplo, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, e Inotech Biosystems International, Inc. Cualquier cosechadora basada en células puede emplearse con los presentes métodos. En algunas realizaciones, el cosechador celular y/o el sistema de procesamiento celular es un cosechador celular basado en membranas. En algunas realizaciones, la cosecha de células se realiza mediante un sistema de procesamiento celular, como el sistema LOVO (fabricado por Fresenius Kabi). El término "sistema de procesamiento celular LOVO" también se refiere a cualquier instrumento o dispositivo fabricado por cualquier proveedor que pueda bombear una solución que comprenda células a través de una membrana o filtro, como una membrana giratoria o un filtro giratorio, en un entorno de sistema estéril y/o cerrado, que permita el flujo continuo y el procesamiento celular para eliminar el sobrenadante o el medio de cultivo celular sin peletización. En algunas realizaciones, el cosechador celular y/o el sistema de procesamiento celular pueden llevar a cabo la separación celular, el lavado, el intercambio de fluidos, la concentración y/u otras etapas de procesamiento celular en un sistema cerrado y estéril.
[0499]En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida, por ejemplo, la Etapa D según la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor como contenedor. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX-100 o un G-REX-500. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-500.
[0500]En algunas realizaciones, la Etapa E según la Figura 1 (en particular,p. ej., laFigura 1B y/o la Figura 1C), se realiza según los procedimientos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, se accede al sistema cerrado mediante jeringuillas en condiciones estériles para mantener la esterilidad y la naturaleza cerrada del sistema. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado como el aquí descrito.
[0501]En algunas realizaciones, los TIL se cosechan de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL entre los días 14 y 16 se cosechan utilizando los métodos aquí descritos. En algunas realizaciones, los TIL se cosechan a los 14 días utilizando los métodos aquí descritos. En algunas realizaciones, los TIL se cosechan a los 15 días utilizando los métodos aquí descritos. En algunas realizaciones, los TIL se cosechan a los 16 días utilizando los métodos aquí descritos.
F. ETAPA F: Formulación final/ Transferencia a la bolsa de infusión
[0502]Una vez completados las Etapas A a E tal como se proporcionan en un orden ejemplar en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C) y tal como se describe en detalle anteriormente y en el presente documento, las células se transfieren a un contenedor para su uso en la administración a un paciente. En algunas realizaciones, una vez obtenido un número terapéuticamente suficiente de TIL mediante los métodos de expansión descritos anteriormente, se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente.
[0503]En una realización, los TIL expandidos utilizando los métodos de la presente divulgación se administran a un paciente como una composición farmacéutica. En una realización, la composición farmacéutica es una suspensión de TIL en un tampón estéril. Los TIL expandidos como se describe en el presente documento pueden administrarse por cualquier vía adecuada conocida en la técnica. En algunas realizaciones, los TIL se administran como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura aproximadamente de 30 a 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas son la intraperitoneal, la intratecal, y la intralinfática.
G. Ratios de células alimentadoras PBMC
[0504]En algunas realizaciones, los medios de cultivo utilizados en los métodos de expansión descritos en el presente documento (véase, por ejemplo, la Figura 1, en particular, porejemplo,la Figura 1B y/o la Figura 1C) incluyen un anticuerpo anti-CD3,por ejemplo,un anticuerpo anti-CD3. OKT-3. Un anticuerpo anti-CD3 en combinación con IL-2 induce la activación de las células T y la división celular en la población TIL. Este efecto puede observarse con anticuerpos de longitud completa, así como con fragmentos Fab y F(ab')2, prefiriéndose generalmente los primeros; véase,p. ej.,Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719.
[0505]En una realización, el número de capas alimentadoras de PBMC se calcula como sigue:
A. Volumen de una célula T (10 pm de diámetro):V= (4/3) n r<3>=523,6 pm<3>
B. Columna de G-Rex 100 (M) con una altura de 40 |jm (4 células):V =(4/3) n r3 = 4*1012 jm 3
C. Número de células necesario para rellenar la columna B: 4*1012 jm 3/ 523,6 jm 3 = 7,6*108 jm 3* 0,64 = 4,86*108
D. Número de células que pueden activarse de forma óptima en el espacio 4D: 4,86*108/ 24 = 20,25*10® E. Número de alimentadores y TIL extrapolados a G-Rex 500: TIL: 100*10® y Alimentador: 2,5*109
[0506]En este cálculo, se utiliza una aproximación del número de células mononucleares necesarias para proporcionar una geometría icosaédrica para la activación de TIL en un cilindro con una base de 100 cm2. El cálculo deriva el resultado experimental de ~5*108 para la activación umbral de las células T, que refleja fielmente los datos experimentales del NCl.(1) (C) El multiplicador (0,64) es la densidad de empaquetamiento aleatorio para esferas equivalentes calculada por Jaeger y Nagel en 1992 (2). (D) El divisor 24 es el número de esferas equivalentes que podrían entrar en contacto con un objeto similar en un espacio de 4 dimensiones "the Newton number."(3).
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283-292.
(2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20;255(5051): 1523-31.
(3) O. R. Musin (2003). "The problem of the twenty-five spheres". Russ. Math. Surv. 58 (4): 794-795.
[0507]En una realización, el número de células alimentadoras presentadoras de antígeno suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización es aproximadamente la mitad del número de células alimentadoras presentadoras de antígeno suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida. En ciertas realizaciones, el método comprende llevar a cabo la primera expansión con sensibilización en un medio de cultivo celular que comprende aproximadamente un 50% menos de células presentadoras de antígeno en comparación con el medio de cultivo celular de la segunda expansión rápida.
[0508]En otra realización, el número de células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC) suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida es mayor que el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización.
[0509]En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 20:1.
[0510]En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 10:1.
[0511]En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 9:1.
[0512]En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 8:1.
[0513]En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 7:1.
[0514]En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 6:1.
[0515]En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 5:1.
[0516]En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 4:1.
[0517] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización) está en un intervalo de 1,1:1 a 3:1 aproximadamente.
[0518] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,9:1.
[0519] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,8:1.
[0520] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,7:1.
[0521] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,6:1.
[0522] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,5:1.
[0523] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,4:1.
[0524] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,3:1.
[0525] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,2:1.
[0526] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,1:1.
[0527] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2:1.
[0528] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 10:1.
[0529] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 5:1.
[0530] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 4:1.
[0531] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 3:1.
[0532] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización se encuentra en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,9:1.
[0533] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente<2 : 1>a entre o aproximadamente<2>,<8>:<1>.
[0534] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización se encuentra en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,7:1.
[0535] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización se encuentra en un intervalo de entre o aproximadamente<2 : 1>a entre o aproximadamente<2>,<6>:<1>.
[0536] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización se encuentra en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,5:1.
[0537] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,4:1.
[0538] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización se encuentra en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,3:1.
[0539] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre al menos aproximadamente<2 : 1>a entre aproximadamente<2>,<2>:<1>.
[0540] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización se encuentra en un intervalo de entre o aproximadamente<2 : 1>a entre o aproximadamente<2>,<1>:<1>.
[0541] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización es de 2:1 o aproximadamente.
[0542] En otra realización, la relación entre el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización es de o aproximadamente 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1,2:1, 2.1:1,2.2:1,2.3:1, 2.4:1,2.5:1, 2.6:1,2.7:1, 2.8:1,2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1,4.9:1, o 5:1.
[0543] En otra realización, el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización es de o aproximadamente 1*108, 1.1x108, 1.2*108, 1.3*108, 1.4x108, 1.5*108, 1.6*108, 1.7*108, 1.8*108, 1.9*108, 2*108, 2.1*108, 2.2*108, 2.3*108, 2.4x108, 2.5*108, 2.6*108, 2.7*108, 2.8*108, 2.9*108, 3*108, 3.1*108, 3.2*108, 3.3*108, 3.4*10<8>o 3.5*10<8>APC, y el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida es de o aproximadamente 3.5*108, 3.6*108, 3.7*108, 3.8*108, 3.9*108, 4*108, 4.1*108, 4.2*108, 4.3*108, 4.4*108, 4.5*108, 4.6*108, 4.7*108, 4.8*108, 4.9*108, 5*108, 5.1*108, 5.2*108, 5.3*108, 5.4x108, 5.5*108, 5.6*108, 5.7*108, 5.8*108, 5.9*108, 6*108, 6.1*108, 6.2*108, 6.3*108, 6.4*108, 6.5*108, 6.6*108, 6.7*108, 6.8*108, 6.9*108, 7*108, 7.1*108, 7.2*108, 7.3*108, 7.4*108, 7.5*108, 7.6*108, 7.7*108, 7.8*108, 7.9*108, 8*108, 8.1*108, 8.2*108, 8.3*108, 8.4*108, 8.5*108, 8.6*108, 8.7*108, 8.8*108, 8.9*108, 9*108, 9.1*108, 9.2*108, 9.3*108, 9.4*108, 9.5*108, 9.6*108, 9.7*108, 9.8X108, 9.9X108 or 1*10<9>APC.
[0544] En otra realización, el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,5X108 APC a entre o aproximadamente 3X108 APC, y el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida está en un intervalo de entre o aproximadamente 4X108 APC a entre o aproximadamente 7,5X108 APC.
[0545] En otra realización, el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2X10<8>APC a entre o aproximadamente 2,5X108APC, y el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida está en un intervalo de entre o aproximadamente 4,5X108 APC a entre o aproximadamente 5,5X108 APC.
[0546] En otra realización, el número de APC suministradas exógenamente durante la primera expansión con sensibilización es de o aproximadamente 2,5X108 APC, y el número de APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida es de o aproximadamente 5X108 APC.
[0547] En una realización, el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) añadidas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización es aproximadamente la mitad del número de PBMC añadidas en el día 7 de la primera expansión con sensibilización(p. ej.,día 7 del método). En ciertas realizaciones, el método comprende añadir células presentadoras de antígeno en el día 0 de la primera expansión con sensibilización a la primera población de TIL y añadir células presentadoras de antígeno en el día 7 a la segunda población de TIL, en el que el número de células presentadoras de antígeno añadidas en el día<0>es aproximadamente el 50% del número de células presentadoras de antígeno añadidas en el día 7 de la primera expansión con sensibilización(p. ej.,el día 7 del método).
[0548]En otra realización, el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida es mayor que el número de PBMC suministradas exógenamente en el día 0 de la primera expansión con sensibilización.
[0549]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la primera expansión con sensibilización se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 1.0*10® APC/cm<2>a entre o aproximadamente 4.5*10® APC/cm2.
[0550]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la primera expansión con sensibilización se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 1.5*10® APC/cm<2>a entre o aproximadamente 3.5*10® APC/cm2.
[0551]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la primera expansión con sensibilización se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 2*10® APC/cm<2>a entre o aproximadamente 3*10® APC/cm2.
[0552]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la primera expansión con sensibilización se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de al menos 2*10® APC/cm2.
[0553]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la primera expansión con sensibilización se siembran en el matraz de cultivo a una densidad igual o de aproximadamente 1.0*10®, 1.1*10®, 1.2*10®, 1.3*10®, 1.4*10®, 1.5*10®, 1.®*10®, 1.7*10®, 1.8*10®, 1.9*10®, 2*10®, 2.1*10®, 2.2*10®, 2.3*10®, 2.4*10®, 2.5*10®, 2.®*10®, 2.7*10®, 2.8*10®, 2.9*10®, 3*10®, 3.1*10®, 3.2*10®, 3.3*10®, 3.4*10®, 3.5*10®, 3.®*10®, 3.7*10®, 3.8*10®, 3.9*10®, 4*10®, 4.1*10®, 4.2*10®, 4.3*10®, 4.4*10® o 4.5*10® APC/cm2.
[0554]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada en un intervalo de entre o aproximadamente 2,5*10® APC/cm<2>a entre o aproximadamente 7,5*10® APC/cm2.
[0555]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 3,5*10® APC/cm<2>a entre o aproximadamente ®,0*10® APC/cm2.
[0556]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 4,0*10® APC/cm<2>a entre o aproximadamente 5,5*10® APC/cm2.
[0557]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 4,0*10® APC/cm2.
[0558]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de entre o aproximadamente 2.5*10® APCs/cm2, 2.®*10® APCs/cm2, 2.7*10® APCs/cm2, 2.8*10®, 2.9*10®, 3*10®, 3.1*10®, 3.2*10®, 3.3*10®, 3.4*10®, 3.5*10®, 3.®*10®, 3.7*10®, 3.8*10®, 3.9*10®, 4*10®, 4.1*10®, 4.2*10®, 4.3*10®, 4.4*10®, 4.5*10®, 4.®*10®, 4.7*10®, 4.8*10®, 4.9*10®, 5*10®, 5.1*10®, 5.2*10®, 5.3*10®, 5.4*10®, 5.5*10®, 5.®*10®, 5.7*10®, 5.8*10®, 5.9*10®, ®*10®, ®.1*10®, ®.2*10®, ®.3*10®, ®.4*10®, ®.5*10®, ®.®*10®, ®.7*10®, ®.8*10®, ®.9*10®, 7*10®, 7.1*10®, 7.2*10®, 7.3*10®, 7.4*10® or 7.5*10® APCs/cm2.
[0559]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la primera expansión con sensibilización se siembran en el matraz de cultivo a una densidad igual o de aproximadamente 1.0*10®, 1.1*10®, 1.2*10®, 1.3*10®, 1.4*10®, 1.5*10®, 1.®*10®, 1.7*10®, 1.8*10®, 1.9*10®, 2*10®, 2.1*10®, 2.2*10®, 2.3*10®, 2.4*10®, 2.5*10®, 2.®*10®, 2.7*10®, 2.8*10®, 2.9*10®, 3*10®, 3.1*10®, 3.2*10®, 3.3*10®, 3.4*10®, 3.5*10®, 3.®*10®, 3.7*10®, 3.8*10®, 3.9*10®, 4*10®, 4.1*10®, 4.2*10®, 4.3*10®, 4.4*10® o 4.5*10® APC/cm<2>y las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad igual o de aproximadamente 2.5*10® APCs/cm2, 2.®*10® APCs/cm2, 2.7*10® APCs/cm2, 2.8*10®, 2.9*10®, 3*10®, 3.1*10®, 3.2*10®, 3.3*10®, 3.4*10®, 3.5*10®, 3.®*10®, 3.7*10®, 3.8*10®, 3.9*10®, 4*10®, 4.1*10®, 4.2*10®, 4.3*10®, 4.4*10®, 4.5*10®, 4.®*10®, 4.7*10®, 4.8*10®, 4.9*10®, 5*10®, 5.1*10®, 5.2*10®, 5.3*10®, 5.4*10®, 5.5*10®, 5.®*10®, 5.7*10®, 5.8*10®, 5.9*10®, ®*10®, ®.1*10®, ®.2*10®, ®.3*10®, ®.4*10®, ®.5*10®, ®.®*10®, ®.7*10®, ®.8*10®, ®.9*10®, 7*10®, 7.1*10®, 7.2*10®, 7.3*10®, 7.4*10®o 7.5*10® APC/cm2.
[0560]En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la primera expansión con sensibilización se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 1.0*10® APC/cm<2>a 4.5*10® APC/cm2, y las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 2.5*10® APC/cm<2>a entre o aproximadamente 7,5*10® APC/cm2.
[0561] En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la primera expansión con sensibilización se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 1.5*10® APC/cm<2>a 3.5*10® APC/cm2, y las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 3.5*10® APC/cm<2>a entre o aproximadamente ®*10® APC/cm2.
[0562] En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la primera expansión con sensibilización se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 2*10® APC/cm<2>a 3*10® APC/cm2, y las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad en un intervalo de entre o aproximadamente 4*10® APC/cm<2>a entre o aproximadamente 5,5*10® APC/cm2.
[0563] En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la primera expansión con sensibilización se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de o aproximadamente 2*10® APC/cm<2>y las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de o aproximadamente 4*10® APC/cm2.
[0564] En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de PBMC suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente<1>,<1 :1>a entre o aproximadamente<2 0>:<1>.
[0565] En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de PBMC suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente<1>,<1 :1>a entre o aproximadamente<1 0>:<1>.
[0566] En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de PBMC suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente<1>,<1 :1>a entre o aproximadamente 9:1.
[0567] En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente<1>,<1 :1>a entre o aproximadamente<8>:<1>.
[0568] En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 7:1.
[0569] En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente<1>.<1 :1>a entre o aproximadamente ®:<1>.
[0570] En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 5:1.
[0571] En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1.1:1 a entre o aproximadamente 4:1.
[0572] En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1.1:1 a entre o aproximadamente 3:1.
[0573] En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1.1:1 a entre o aproximadamente 2.9:1.
[0574]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1.1:1 a entre o aproximadamente 2.8:1.
[0575]En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,7:1.
[0576]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1.1:1 a entre o aproximadamente 2.6:1.
[0577]En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,5:1.
[0578]En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,4:1.
[0579]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1.1:1 a entre o aproximadamente 2.3:1.
[0580]En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,2:1.
[0581]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1.1:1 a entre o aproximadamente 2.1:1.
[0582]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1.1:1 a entre o aproximadamente 2:1.
[0583]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 10:1.
[0584]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 5:1.
[0585]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 4:1.
[0586]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 3:1.
[0587]En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,9:1.
[0588]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente<2 : 1>a entre o aproximadamente<2>.<8>:<1>.
[0589]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2.7:1.
[0590]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente<2 : 1>a entre o aproximadamente<2>.<6>:<1>.
[0591]En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,5:1.
[0592]En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,4:1.
[0593]En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,3:1.
[0594]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente<2 : 1>a entre o aproximadamente<2>.<2>:<1>.
[0595]En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente<2 : 1>a entre o aproximadamente<2>,<1>:<1>.
[0596]En otra realización, la relación entre el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización es de<2 : 1>o aproximadamente.
[0597]En otra realización, la relación del número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida al número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización es de o aproximadamente 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1,2:1,2.1:1,2.2:1,2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1,4:1,4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1,4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1,4.9:1, o 5:1.
[0598]En otra realización, el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministrado exógenamente en el día 0 de la primera expansión con sensibilización es de o aproximadamente 1*108, 1.1x108, 1.2*108, 1.3*108, 10.4x10<1>4,<1 0>*<8>15,<1 0>*<8>16,<1 0>*<8>17,<1 0>*<8>18,<1 0>*<8>19,<1 0>*<8>2,<1 0>*<8>Z1,<1 0>*<8>22,<1 0>*<8>23,<1 0>*<8>24,<1 0>*<8>25,<1 0>*<8>26,<1 0>*<8>27,<1 0>*<8>28, 10*829, 10*83, 10*831, 10*832, 10*833, 10*8<34>o 10*8<35>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 10 de la segunda expansión rápida es igual o similar a 8*735, 10*836, 10*837, 10*838, 10*839, 10*84, 10*841, 10*842, 10*843, 10*844, 10*845, 10*846, 10*847,<1 0>*<8>48,<1 0>*<8>49,<1 0>*<8>5,<1 0>*<8>51,<1 0>*<8>52,<1 0>*<8>53,<1 0>*<8>54,<1 0>*<8>55,<1 0>*<8>56,<1 0>*<8>57,<1 0>*<8>58,<1 0>*<8>59,<1 0>*<8>6,<1 0>*<8>61,<1 0>*<8>62,<1 0>*<8>63,<1 0>*<8>64,<1 0>*<8>65,<1 0>*<8>66,<1 0>*<8>67,<1 0>*<8>68,<1 0>*<8>69,<1 0>*<8>7,<1 0>*<8>71,<1 0>*<8>72,<1 0>*<8>73,<1 0>*<8>Z4,<1 0>*<8>75,<1 0>*<8>™,<1 0>*<8>77,<1 0>*<8>™,<1 0>*<8>79,<1 0>*<8>8,<1 0>*<8>81,<1 0>*<8>82,<1 0>*<8>™,<1 0>*<8>84,<1 0>*<8>85,<1 0>*<8>™,<1 0>*<8>™,<1 0>*<8>™,<1 0>*<8>™, 10*89, 10*891, 10*892, 10*893, 10*894, 10*895, 10*896, 10*897, 10*898, 10*8<99>o 10*8<1>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC).
[0599]En otra realización, el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1*10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) a entre o aproximadamente 3,5*10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida está en un intervalo de entre o aproximadamente 3,5*10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) a entre o aproximadamente 1*10<9>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC).
[0600]En otra realización, el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,5 * 10<8>APC a entre o aproximadamente 3*10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida está en un intervalo de entre o aproximadamente 4 * 10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) a entre o aproximadamente 7,5 * 10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC).
[0601]En otra realización, el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la primera expansión con sensibilización está en un intervalo de entre o aproximadamente 2*10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) a entre o aproximadamente 2,5*10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida está en un intervalo de entre o aproximadamente 4,5*10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) a entre o aproximadamente 5,5*10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC).
[0602]En otra realización, el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización es de o aproximadamente 2,5*10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el número de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) exógenamente suministradas en el día 7 de la segunda expansión rápida es de o aproximadamente 5*10<8>APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC).
[0603]En una realización, el número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) añadidas en el día 0 de la primera expansión con sensibilización es aproximadamente la mitad del número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) añadidas en el día 7 de la segunda expansión rápida. En ciertas realizaciones, el método comprende añadir capas de células presentadoras de antígeno en el día<0>de la primera expansión con sensibilización a la primera población de TIL y añadir capas de células presentadoras de antígeno en el día 7 a la segunda población de TIL, en el que el número de capas de células presentadoras de antígeno añadidas en el día 0 es aproximadamente el 50% del número de capas de células presentadoras de antígeno añadidas en el día 7.
[0604]En otra realización, el número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida es mayor que el número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) suministradas exógenamente en el día<0>de la primera expansión con sensibilización.
[0605]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 2 capas celulares y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 4 capas celulares.
[0606]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos una capa celular y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 3 capas celulares.
[0607]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 1,5 capas celulares a al menos 2,5 capas celulares y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 3 capas celulares.
[0608]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos una capa celular y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos<2>capas celulares.
[0609]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC en capas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 1, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 3 capas celulares y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC en capas (incluidas, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9,<6>, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5,<6>.<6>, 6.7,<6>.<8>, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 o<8>capas celulares.
[0610]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 1 capa celular a al menos 2 capas celulares y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 3 capas celulares a al menos 10 capas celulares.
[0611]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 2 capa celular a al menos 3 capas celulares y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 4 capas celulares a al menos 8 capas celulares.
[0612]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 2 capas celulares y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de al menos 4 capas celulares a al menos 8 capas celulares.
[0613]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de 1, 2 o 3 capas celulares y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un grosor medio de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 capas celulares.
[0614]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1:10.
[0615] En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1:8.
[0616]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1:7.
[0617]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1:6.
[0618]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1:5.
[0619]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1:4.
[0620]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1:3.
[0621]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1:2.
[0622]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.2 a aproximadamente 1:8.
[0623]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.3 a aproximadamente 1:7.
[0624]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.4 a aproximadamente 1:6.
[0625]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.5 a aproximadamente 1:5.
[0626]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.6 a aproximadamente 1:4.
[0627]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.7 a aproximadamente 1:3.5.
[0628]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.8 a aproximadamente 1:3.
[0629]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), en donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) está en el intervalo de en o aproximadamente 1:1.9 a aproximadamente 1:2.5.
[0630]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) es igual o aproximadamente 1: 2.
[0631]En otra realización, el día 0 de la primera expansión con sensibilización se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un primer grosor medio igual a un primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida se produce en presencia de APC estratificadas (incluyendo, por ejemplo, PBMC) con un segundo grosor medio igual a un segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC), donde la relación del primer número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) al segundo número de capas de APC (incluyendo, por ejemplo, PBMC) es igual o aproximadamente 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9 o 1:10.
[0632]En algunas realizaciones, el número de APC en la primera expansión con sensibilización está en el intervalo de aproximadamente 1,0*106 APCs/cm2 a aproximadamente 4,5*106 APCs/cm2, y el número de APC en la segunda expansión rápida está en el intervalo de aproximadamente 2,5*106 APCs/cm2 a aproximadamente 7,5*106 APCs/cm2.
[0633]En algunas realizaciones, el número de APC en la primera expansión con sensibilización está en el intervalo de aproximadamente 1,5*106 APCs/cm2 a aproximadamente 3,5*106 APCs/cm2, y el número de APC en la segunda expansión rápida está en el intervalo de aproximadamente 3,5*106 APCs/cm2 a aproximadamente 6,0*106 APCs/cm2.
[0634]En algunas realizaciones, el número de APC en la primera expansión con sensibilización está en el intervalo de aproximadamente 2,0*106 APCs/cm2 a aproximadamente 3,0*106 APCs/cm2, y el número de APC en la segunda expansión rápida está en el intervalo de aproximadamente 4,0*106 APCs/cm2 a aproximadamente 5,5*106 APCs/cm2.
H. Componentes opcionales del medio celular
I .Anticuerpos anti-CD3
[0635]En algunas realizaciones, los medios de cultivo utilizados en los métodos de expansión descritos en el presente documento (véase, por ejemplo, la Figura 1 (en particular,p .ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C) incluyen un anticuerpo anti-CD3. Un anticuerpo anti-CD3 en combinación con IL-2 induce la activación de las células T y la división celular en la población TIL. Este efecto puede observarse con anticuerpos de longitud completa, así como con fragmentos Fab y F(ab')2, prefiriéndose generalmente los primeros; véase,p. ej.,Tsoukaset al., J. Immunol.1985,135,1719.
[0636]Como será apreciado por aquellos en la técnica, hay un número de anticuerpos anti CD3 humanos adecuados que encuentran uso en la invención, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales anti CD3 humanos de varios mamíferos, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos murinos, humanos, primates, ratas, y caninos. En particular, se utiliza el anticuerpo OKT3 anti-CD3 (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA).
TABLA 5: Secuencias de aminoácidos de muromonab (anticuerpo OKT-3 ejemplar)
2. 4-1BB (CD137) AGONISTS
[0637] En una realización, el medio de cultivo celular de la primera expansión con sensibilización y/o la segunda expansión rápida comprende un agonista del TNFRSF. En una realización, el agonista del TNFRSF es un agonista de 4-1BB (CD137). El agonista 4-1BB puede ser cualquier molécula de unión 4-1BB conocida en la técnica. La molécula de unión a 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión capaz de unirse a 4-1BB humano o de mamífero. Los agonistas 4-1BB o las moléculas de unión 4-1B<b>pueden comprender una cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier isotipo(porejemplo,IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clasefporejemplo,IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. El agonista 4-1BB o la molécula de unión 4-1BB puede tener tanto una cadena pesada como una ligera. Tal como se utiliza en el presente documento, el término molécula de unión también incluye anticuerpos (incluidos anticuerpos de longitud completa), anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos(p. ej.,anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos, y fragmentos de anticuerpos,por ejemplo,fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores, y formas modificadas de anticuerpos,por ejemplo,moléculas scFv, que se unen a 4-1BB. En una realización, el agonista 4-1BB es una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo totalmente humano. En una realización, el agonista 4-1BB es una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, los agonistas 4-1BB para su uso en los métodos y composiciones actualmente divulgados incluyen anticuerpos anti-4-1BB, anticuerpos humanos anti-4-1BB, anticuerpos de ratón anti-4-1BB, anticuerpos de mamífero anti-4-1BB, anticuerpos monoclonales anti-4-1BB, anticuerpos policlonales anti-4-1BB, anticuerpos quiméricos anti-4-1BB, adnectinas anti-4-1BB, anticuerpos de dominio anti-4-1BB, fragmentos anti-4-1BB de cadena simple, fragmentos anti-4-1BB de cadena pesada, fragmentos anti-4-1BB de cadena ligera, proteínas de fusión anti-4-1BB, y fragmentos, derivados, conjugados, variantes, o biosimilares de los mismos. Se sabe que los anticuerpos agonistas anti-4-1BB inducen fuertes respuestas inmunitarias. Lee,et al., PLOS One2013,8,e69677. En una realización preferida, el agonista 4-1BB es un anticuerpo monoclonal agonista, anti-4-1BB humanizado o totalmente humano(es decir,un anticuerpo derivado de una única línea celular). En una realización, el agonista 4-1BB es EU-101 (Eutilex Co. Ltd.), utomilumab, o urelumab, o un fragmento, derivado, conjugado, variante, o biosimilar del mismo. En una realización preferida, el agonista 4-1BB es utomilumab o urelumab, o un fragmento, derivado, conjugado, variante o biosimilar del mismo.
[0638] En una realización preferida, el agonista 4-1BB o la molécula de unión 4-1BB también puede ser una proteína de fusión. En una realización preferida, un agonista 4-1BB multimérico, como un agonista 4-1BB trimérico o hexamérico (con tres o seis dominios de unión al ligando), puede inducir una agrupación superior del receptor (4-1BBL) y la formación de complejos de señalización celular interna en comparación con un anticuerpo monoclonal agonista, que típicamente posee dos dominios de unión al ligando. Las proteínas de fusión triméricas (trivalentes) o hexaméricas (o hexavalentes) o mayores que comprenden tres dominios de unión a TNFRSF e IgG1-Fc y que opcionalmente unen además dos o más de estas proteínas de fusión se describen,por ejemplo,en Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47.
[0639] Se sabe que los anticuerpos 4-1BB agonísticos y las proteínas de fusión inducen fuertes respuestas inmunitarias. En una realización preferida, el agonista 4-1BB es un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión que se une específicamente al antígeno 4-1BB de manera suficiente para reducir la toxicidad. En algunas realizaciones, el agonista 4-1BB es un anticuerpo monoclonal 4-1BB agonista o una proteína de fusión que anula la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), por ejemplo la citotoxicidad de células NK. En algunas realizaciones, el agonista 4-1BB es un anticuerpo monoclonal 4-1BB agonista o una proteína de fusión que anula la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). En algunas realizaciones, el agonista 4-1BB es un anticuerpo monoclonal 4-1BB agonista o una proteína de fusión que anula la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En algunas realizaciones, el agonista 4-1BB es un anticuerpo monoclonal 4-1BB agonista o una proteína de fusión que anula la funcionalidad de la región Fc.
[0640] En algunas realizaciones, los agonistas 4-1BB se caracterizan por unirse al 4-1BB humano (SEQ ID N.°:9) con alta afinidad y actividad agonística. En una realización, el agonista 4-1BB es una molécula de unión que se une al 4-1BB humano (SEQ ID N.°:9). En una realización, el agonista 4-1BB es una molécula de unión que se une al 4-1BB murino (SEQ ID N.°:10). Las secuencias de aminoácidos del antígeno 4-1BB a las que se une un agonista 4-1BB o una molécula de unión se resumen en la Tabla 6.
TABLA 6. Secuencias de aminoácidos de los antígenos 4-1BB.
[0641] En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista 4-1BB que se une al 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 100 pM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 90 pM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 80 pM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 70 pM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 60 pM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 50 pM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 40 pM o inferior, o se une al 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 30 pM o inferior.
[0642]En algunas realizaciones, las composiciones, los procesos y los métodos descritos incluyen un agonista 4-1BB que se une al 4-1BB humano o murino con un kassoc de aproximadamente 7,5 * 105 l/M-s o más rápido, se une al 4-1BB humano o murino con un kassoc de aproximadamente 1 * 7.510 l/M-s o más rápido, se une al 4-1BB humano o murino con un kassoc de aproximadamente 5 * 18 l/M-s o más rápido, se une al 4-1BB humano o murino con un kassoc de aproximadamente 10 * 51 l/M-s o más rápido, se une al 4-1BB humano o murino con un kassoc de aproximadamente 8.5 * 1051/M-s o más rápido, se une al 4-1BB humano o murino con un kassoc de aproximadamente 9 * 105 l/M-s o más rápido, 0 se une al 1-1BB humano o murino con un kassoc de aproximadamente 1 * 9.5105/M-s o más rápido o se une al 4-1BB humano o murino con un kassoc de aproximadamente 1 * 1061/M-s o más rápido.
[0643]En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista 4-1BB que se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 2 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 2,1 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 2,2 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 2,3 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 2..4 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 2,5 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 2,6 * 10'51/s o más lento o se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 2,7 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 2,8 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 2,9 * 10'51/s o más lento, o se une al 4-1BB humano o murino con un kdissoc de aproximadamente 3 * 10'51/s o más lento.
[0644]En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista 4-1BB que se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 10 nM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 9 nM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 8 nM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 7 nM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 6 nM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 5 nM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 4 nM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 3 nM o inferior, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 2 nM o inferior, o se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 1 nM o inferior.
[0645]En una realización preferida, el agonista 4-1BB es utomilumab, también conocido como PF-05082566 o MOR-7480, o un fragmento, derivado, variante, o biosimilar del mismo. Utomilumab está disponible en Pfizer, Inc. Utomilumab es un anticuerpo monoclonal de inmunoglobulina G2-lambda, anti-[HomosapiensTNFRSF9 (miembro 9 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), 4-1BB, antígeno de células T ILA, CD137)],Homo sapiens(totalmente humano). Las secuencias de aminoácidos de utomilumab se exponen en la Tabla 7. Utomilumab comprende sitios de glicosilación en Asn59 y Asn292; puentes disulfuro intracadena pesada en las posiciones 22-96 (Vh-Vl), 143-199 (Ch1-Cl), 256-316 (Ch2) y 362-420 (Ch3); puentes disulfuro intracadena ligera en las posiciones 22'-87' (Vh-Vl) y 136'-195' (C<h>1-C<l>); puentes disulfuro cadena pesada-cadena pesada intercadena en las posiciones 218-218, 219-219, 222-222 y 225-225 de la isoforma IgG2A, en las posiciones 218-130, 219-219, 222-222 y 225-225 de la isoforma IgG2/B y en las posiciones 219-130 (2), 222-222 y 225-225 de la isoforma IgG2B; y puentes disulfuro entre cadenas pesadas y cadenas ligeras en las posiciones 130-213' (2) de la isoforma IgG2A, en las posiciones 218-213' y 130-213' de la isoforma IgG2A/B, y en las posiciones 218-213' (2) de la isoforma IgG2B. La preparación y propiedades de utomilumab y sus variantes y fragmentos se describen en Patentes de EE.UU. N.° 8.821.867; 8.337.850; y 9.468.678, y la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/032433 A1. Las características preclínicas de utomilumab se describen en Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33. Entre los ensayos clínicos actuales de utomilumab en diversas indicaciones hematológicas y de tumores sólidos se incluyen Identificadores de clinicaltrials.gov de los Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU. NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066, y NCT02554812.
[0646]En una realización, un agonista 4-1BB comprende una cadena pesada dada por SEQ ID N.°:11 y una cadena ligera dada por SEQ ID N.°:12. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:11 y SEQ ID N.°:12, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena única (scFv), variantes, o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:11 y SEQ ID N.°:12, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:11 y SEQ ID N.°:12, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:11 y<s>E<q>ID N.°:12, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:11 y SEQ ID N.°:12, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:11 y SEQ ID N.°:12, respectivamente.
[0647]En una realización, el agonista 4-1BB comprende las CDRs de cadena pesada y ligera o regiones variables (VRs) de utomilumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista 4-1BB (V<h>) comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:13, y la región variable de la cadena ligera del agonista 4-1BB (Vl) comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:14, y sustituciones aminoacídicas conservativas de la misma. En una realización, un agonista 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:13 y SEQ ID N.°:14, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:13 y SEQ ID N.°:14, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:13 y SEQ ID N.°:14, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:13 y s Eq ID N.°:14, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:13 y SEQ ID N.°:14, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende un anticuerpo scFv que comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en s Eq ID N.°:13 y SEQ ID N.°:14.
[0648]En una realización, un agonista 4-1BB comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:15, SEQ ID N.°:16, y SEQ ID N.°:17, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:18, s Eq ID N.°:19, y SEQ ID N.°:20, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.
[0649]En una realización, el agonista 4-1BB es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista 4-1BB aprobado por las autoridades reguladoras de fármacos con referencia al utomilumab. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo 4-1BB que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia,p. ej.,97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un medicamento o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el medicamento o producto biológico de referencia, donde el medicamento o producto biológico de referencia es utomilumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación, y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista 4-1BB autorizado o presentado para autorización, en el que el anticuerpo agonista 4-1BB se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en el que el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab. El anticuerpo agonista 4-1BB puede ser autorizado por una autoridad reguladora de fármacos como la FDA de los EE. UU. y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab.
TABLA 7. Secuencias de aminoácidos de los anticuerpos agonistas 4-1BB relacionados con utomilumab.
(continuación)
[0650]En una realización preferida, el agonista 4-1BB es el anticuerpo monoclonal urelumab, también conocido como BMS-663513 y 20H4.9.h4a, o un fragmento, derivado, variante o biosimilar del mismo. Urelumab está disponible en Bristol-Myers Squibb, Inc. y Creative Biolabs, Inc. Urelumab es un anticuerpo monoclonal de inmunoglobulina G4-kappa, anti-[Homo sapiensTNFRSF9 (tumor necrosis factor receptor superfamily member 9, 4-1BB, T cell antigen ILA, CD137)],Homo sapiens(totalmente humano). Las secuencias de aminoácidos de urelumab se exponen en la Tabla EE. Urelumab comprende sitios de N-glicosilación en las posiciones 298 (y 298"); puentes disulfuro intracadena de cadena pesada en las posiciones 22-95 (V<h>-V<l>), 148-204 (C<h>1-C<l>), 262-322 (C<h>2) y 368-426 (C<h>3) (y en las posiciones 22"-95", 148"-204", 262"-322" y 368"-426"); puentes disulfuro intracadena ligera en las posiciones 23'-88' (V<h>-V<l>) y 136'-196' (C<h>1-C<l>) (y en las posiciones 23m-88m y 136m-196m); puentes disulfuro cadena pesada-cadena pesada intercadena en las posiciones 227 227" y 230-230"; y puentes disulfuro cadena pesada-cadena ligera intercadena en 135-216' y 135"-216m. La preparación y las propiedades de urelumab y sus variantes y fragmentos se describen en Patentes de EE.UU. N.° 7,288,638 y 8,962,804. Las características preclínicas y clínicas de urelumab se describen en Segal, et al., Clin. Cancer Res. 2016, disponible en http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272. Entre los ensayos clínicos actuales de urelumab en diversas indicaciones hematológicas y de tumores sólidos se incluyen Identificadores de clinicaltrials.gov de los Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU. NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992 y NCT01471210.
[0651]En una realización, un agonista 4-1BB comprende una cadena pesada dada por SEQ ID N.°:21 y una cadena ligera dada por SEQ ID N.°:22. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:21 y SEQ ID N.°:22, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena única (scFv), variantes, o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:21 y SEQ ID N.°:22, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:21 y SEQ ID N.°:22, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:21 y s Eq ID N.°:22, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:21 y SEQ ID N.°:22, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:21 y SEQ ID N.°:22, respectivamente.
[0652]En una realización, el agonista 4-1BB comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de urelumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista 4-1BB (Vh) comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:23, y la región variable de la cadena ligera del agonista 4-1BB (V<l>) comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:24, y sustituciones aminoacídicas conservativas de la misma. En una realización, un agonista 4-1BB comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:23 y SEQ ID N.°:24, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:23 y SEQ ID N.°:24, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:23 y SEQ ID N.°:24, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:23 y SEQ ID N.°:24, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:23 y SEQ ID N.°:24, respectivamente. En una realización, un agonista 4-1BB comprende un anticuerpo scFv que comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:23 y SEQ ID N.°:24.
[0653]En una realización, un agonista 4-1BB comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:25, SEQ ID N.°:26, y SEQ ID N.°:27, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:28, s Eq ID N.°:29, y SEQ ID N.°:30, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.
[0654]En una realización, el agonista 4-1BB es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista 4-1BB aprobado por las autoridades reguladoras de fármacos con referencia a urelumab. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo 4-1BB que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia,por ejemplo, 97%,98%, 99% o 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un medicamento o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el medicamento o producto biológico de referencia, donde el medicamento o producto biológico de referencia es urelumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación, y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista 4-1BB autorizado o presentado para autorización, en el que el anticuerpo agonista 4-1BB se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en el que el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es urelumab. El anticuerpo agonista 4-1BB puede ser autorizado por una autoridad reguladora de fármacos como la FDA de los EE. UU. y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es urelumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es urelumab.
TABLA 8: Secuencias de aminoácidos de los anticuerpos agonistas 4-1BB relacionados con urelumab.
(continuación)
[0655]En una realización, el agonista 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591), el anticuerpo producido por la línea celular depositada como ATCC No. HB-11248 y divulgada en Patente de EE.UU. n.° 6.974.863, 5F4 (BioLegend 31 1503), C65-485 (BD Pharmingen 559446), anticuerpos divulgados en Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° US 2005/0095244, anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n.° 7.288.638 (como 20H4.9-IgGl (BMS-663031)), anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n.° 6.887.673 (como 4E9 o BMS-554271), anticuerpos divulgados en Patente de e E.UU. n.° 7.214.493, anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n.° 6.303.121, anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n.° 6.569.997, anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n.° 6.905.685 (como<4>E<9>o BMS-554271), anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n.° 6.362.325 (como 1D8 o BMS-469492; 3H3 o BMS-469497; o 3El), anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n.° 6.974.863 (como 53A2); anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n.° 6.210.669 (como 1D8, 3B8 o 3El), anticuerpos descritos en Patente de EE.UU. n.° 5.928.893, anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n.° 6.303.121, anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. N.° 6,569,997, anticuerpos divulgados en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.°WO 2012/177788, WO 2015/119923, y WO 2010/042433, y sus fragmentos, derivados, conjugados, variantes, o biosimilares.
[0656]En una realización, el agonista 4-1BB es una proteína de fusión agonista 4-1BB descrita en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.°WO 2008/025516 A1,W O 2009/007120 A1,W O 2010/003766 A1,WO 2010/010051 A1, y WO 2010/078966 A1; Publicación de la Solicitud de Patente de EE.UU. N°. US 2011/0027218 A1, US 2015/0126709 A1, US 2011/0111494 A1, US 2015/0110734 A1, y US 2015/0126710 A1; y Patentes de EE.UU. N.° 9.359.420, 9,340,599, 8,921,519, y 8,450,460.
[0657]En una realización, el agonista 4-1BB es una proteína de fusión agonista 4-1BB como se representa en la Estructura I-A (proteína de fusión de fragmento Fc-anticuerpo C-terminal) o Estructura I-B (proteína de fusión de fragmento Fc-anticuerpo N-terminal), o un fragmento, derivado, conjugado, variante o biosimilar de la misma, como se proporciona en laFigura 110: En las estructuras I-A y I-B, los cilindros se refieren a dominios individuales de unión a polipéptidos. Las estructuras I-A y I-B comprenden tres dominios de unión de TNFRSF unidos linealmente derivados de, por ejemplo, 4-1BBL (ligando 4-1BB, ligando CD137 (CD137L) o miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral 9 (TNFSF9)) o un anticuerpo que se une a 4-1BB, que se pliegan para formar una proteína trivalente, que luego se une a una segunda proteína trivalente a través de IgG1-Fc (incluidos los dominios C<h>3 y C<h>2) que luego se utiliza para unir dos de las proteínas trivalentes a través de enlaces disulfuro (óvalos alargados pequeños), estabilizando la estructura y proporcionando un agonista capaz de reunir los dominios de señalización intracelular de los seis receptores y proteínas de señalización para formar un complejo de señalización. Los dominios de unión a TNFRSF denotados como cilindros pueden ser dominios scFv que comprenden,por ejemplo,una cadena V<h>y una V<l>conectadas por un enlazador que puede comprender residuos hidrofílicos y secuencias Gly y Ser para flexibilidad, así como Glu y Lys para solubilidad. Puede utilizarse cualquier diseño de dominio scFv, como los descritos en de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44; Ahmad, et al., Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250; Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208; o en referencias incorporadas en otras partes del presente documento. Las estructuras de proteínas de fusión de esta forma se describen en Patentes de EE.UU. N.° 9.359.420, 9,340,599, 8,921,519, y 8,450,460.
[0658]Las secuencias de aminoácidos para los otros dominios polipeptídicos de la estructura I-A se indican en la Tabla 9. El dominio Fc comprende preferentemente un dominio constante completo (aminoácidos 17-230 de SEQ ID N.°:31) el dominio bisagra completo (aminoácidos 1-16 de SEQ ID N.°:31) o una porción del dominio bisagra(por ejemplo,aminoácidos 4-16 de SEQ ID N.°:31). Los enlazadores preferidos para conectar un anticuerpo Fc C-terminal pueden seleccionarse a partir de las formas de realización dadas en SEQ ID N.°:32 a SEQ ID N.°:41, incluyendo enlazadores adecuados para la fusión de polipéptidos adicionales.
TABLA 9: Secuencias de aminoácidos para proteínas de fusión agonistas TNFRSF, incluidas las proteínas de fusión agonistas 4-1BB, con diseño de proteína de fusión de fragmento Fc-anticuerpo C-terminal (estructura I-A).
[0659]Las secuencias de aminoácidos para los otros dominios polipeptídicos de la estructura I-B se indican en la Tabla 10. Si se fusiona un fragmento de anticuerpo Fc con el extremo N-terminal de una proteína de fusión de agonista TNRFSF como en la estructura I-B, la secuencia del módulo Fc es preferiblemente la que se muestra en SEQ ID N.°:42, y las secuencias enlazadoras se seleccionan preferiblemente de entre las realizaciones expuestas en SED ID N.°:43 a SEQ ID N.°:45.
TABLA 10: Secuencias de aminoácidos para proteínas de fusión agonistas TNFRSF, incluidas las proteínas de fusión agonistas 4-1BB, con diseño de proteína de fusión de fragmento Fc-anticuerpo N-terminal (estructura I-B).
[0660]En una realización, una proteína de fusión agonista 4-1BB según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión a 4-1BB seleccionados del grupo que consiste en una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de utomilumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de urelumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de utomilumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable seleccionadas entre las cadenas pesadas variables y las cadenas ligeras variables descritas en la Tabla 10, cualquier combinación de una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de las anteriores, y fragmentos, derivados, conjugados, variantes, y biosimilares de las mismas.
[0661]En una realización, una proteína de fusión agonista 4-1BB según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión 4-1BB que comprenden una secuencia 4-1BBL. En una realización, una proteína de fusión agonista 4-1BB según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión 4-1BB que comprenden una secuencia según SEQ ID N.°:46. En una realización, una proteína de fusión agonista 4-1BB según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión 4-1BB que comprenden una secuencia soluble 4-1BBL. En una realización, una proteína de fusión agonista 4-1BB según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión 4-1BB que comprenden una secuencia según SEQ ID N.°:47.
[0662]En una realización, una proteína de fusión agonista 4-1BB según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión 4-1BB que es un dominio scFv que comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:13 y SEQ ID N.°:14, respectivamente, en las que los dominios V<h>y V<l>están conectados por un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista 4-1BB según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión 4-1BB que es un dominio scFv que comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:23 y SEQ ID N.°:24, respectivamente, en las que los dominios V<h>y V<l>están conectados por un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista 4-1BB según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión 4-1BB que es un dominio scFv que comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias V<h>y V<l>dadas en la Tabla 11, en la que los dominios Vh y Vl están conectados por un enlazador.
TABLA 11: Dominios polipeptídicos adicionales útiles como dominios de unión 4-1BB en proteínas de fusión o como anticuerpos agonistas 4-1BB scFv.
continuación
[0663]En una realización, el agonista 4-1BB es un polipéptido de fusión de cadena única agonista 4-1BB que comprende (i) un primer dominio de unión 4-1BB soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de unión 4-1BB soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico, y (v) un tercer dominio de unión 4-1BB soluble, que comprende además un dominio adicional en el extremo N-terminal y/o C-terminal, y en el que el dominio adicional es un dominio de fragmento Fab o Fc. En una realización, el agonista 4-1BB es un polipéptido de fusión de cadena única agonista 4-1BB que comprende (i) un primer dominio de unión 4-1BB soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de unión 4-1BB soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico, y (v) un tercer dominio de unión 4-1BB soluble, que comprende además un dominio adicional en el extremo N-terminal y/o C-terminal, en el que el dominio adicional es un dominio de fragmento Fab o Fc, en el que cada uno de los dominios solubles 4-1BB carece de una región peduncular (que contribuye a la trimerización y proporciona una cierta distancia a la membrana celular, pero no forma parte del dominio de unión 4-1BB) y el primer y el segundo enlazador peptídico tienen independientemente una longitud de 3-8 aminoácidos.
[0664]En una realización, el agonista 4-1BB es un polipéptido de fusión de cadena simple agonista 4-1BB que comprende (i) un primer dominio de citocina de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de citocina de la superfamilia del TNF soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico, y (v) un tercer dominio soluble de citocina de la superfamilia TNF, en el que cada uno de los dominios solubles de citocina de la superfamilia TNF carece de una región peduncular y el primer y el segundo enlazador peptídico tienen independientemente una longitud de 3-8 aminoácidos, y donde cada dominio de citocina de la superfamilia TNF es un dominio de unión a 4-1BB.
[0665]En una realización, el agonista 4-1BB es un anticuerpo scFv agonista 4-1BB que comprende cualquiera de los dominios V<h>anteriores unido a cualquiera de los dominios V<l>anteriores.
[0666]En una realización, el agonista 4-1BB es el anticuerpo agonista 4-1BB de BPS Bioscience catálogo n.° 79097-2, disponible comercialmente en BPS Bioscience, San Diego, CA, EE.UU.. En una realización, el agonista 4-1BB es el anticuerpo agonista 4-1BB de Creative Biolabs n.° de catálogo. MOM-18179, disponible comercialmente en Creative Biolabs, Shirley, NY, EE.UU.
3.OX40 (CD134) AGONISTAS
[0667]En una realización, el agonista TNFRSF es un agonista OX40 (CD134). El agonista de OX40 puede ser cualquier molécula de unión a OX40 conocida en la técnica. La molécula de unión a OX40 puede ser un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión capaz de unirse a OX40 humano o de mamífero. Los agonistas de OX40 o las moléculas de unión a OX40 pueden comprender una cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier isotipo(p. ej.,IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase(p. ej.,IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. El agonista de OX40 o la molécula de unión a OX40 puede tener una cadena pesada y una ligera. Tal como se utiliza en el presente documento, el término molécula de unión también incluye anticuerpos (incluidos anticuerpos de longitud completa), anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos(p. ej.,anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos, y fragmentos de anticuerpos,por ejemplo,fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores, y formas modificadas de anticuerpos,por ejemplo,moléculas scFv, que se unen a OX40. En una realización, el agonista OX40 es una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo totalmente humano. En una realización, el agonista OX40 es una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, los agonistas de OX40 para uso en los métodos y composiciones divulgados actualmente incluyen anticuerpos anti-OX40, anticuerpos humanos anti-OX40, anticuerpos de ratón anti-OX40, anticuerpos de mamífero anti-OX40, anticuerpos monoclonales anti-OX40, anticuerpos policlonales anti-OX40, anticuerpos quiméricos anti-OX40, adnectinas anti-OX40, anticuerpos de dominio anti-OX40, fragmentos anti-OX40 de cadena simple, fragmentos anti-OX40 de cadena pesada, fragmentos anti-OX40 de cadena ligera, proteínas de fusión anti-OX40, y fragmentos, derivados, conjugados, variantes, o biosimilares de los mismos. En una realización preferida, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal agonista, anti-OX40 humanizado o totalmente humano(es decir,un anticuerpo derivado de una única línea celular).
[0668]En una realización preferida, el agonista OX40 o la molécula de unión OX40 también puede ser una proteína de fusión. Las proteínas de fusión OX40 que comprenden un dominio Fc fusionado a OX40L se describen, por ejemplo, en Sadun, et al., J. Immunother. 2009, 182, 1481-89. En una realización preferida, un agonista multimérico de OX40, como un agonista trimérico o hexamérico de OX40 (con tres o seis dominios de unión a ligando), puede inducir una agrupación superior del receptor (OX40L) y la formación de complejos de señalización celular interna en comparación con un anticuerpo monoclonal agonista, que típicamente posee dos dominios de unión a ligando. Las proteínas de fusión triméricas (trivalentes) o hexaméricas (o hexavalentes) o mayores que comprenden tres dominios de unión a TNFRSF e IgG1-Fc y que opcionalmente unen además dos o más de estas proteínas de fusión se describen,por ejemplo,en Gieffers, et al., Mol. Cáncer Therapeutics 2013, 12, 2735-47.
[0669]Se sabe que los anticuerpos OX40 agonísticos y las proteínas de fusión inducen fuertes respuestas inmunitarias. Curti, et al., Cancer Res. 2013, 73, 7189-98. En una realización preferida, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión que se une específicamente al antígeno OX40 de manera suficiente para reducir la toxicidad. En algunas realizaciones, el agonista OX40 es un anticuerpo monoclonal OX40 agonista o una proteína de fusión que anula la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), por ejemplo la citotoxicidad de células NK. En algunas realizaciones, el agonista OX40 es un anticuerpo monoclonal OX40 agonista o una proteína de fusión que anula la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 o una proteína de fusión que anula la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En algunas realizaciones, el agonista OX40 es un anticuerpo monoclonal OX40 agonista o una proteína de fusión que anula la funcionalidad de la región Fc.
[0670]En algunas realizaciones, los agonistas de OX40 se caracterizan por unirse a OX40 humano (SEQ ID N.°:54) con alta afinidad y actividad agonística. En una realización, el agonista de OX40 es una molécula de unión que se une a OX40 humano (SEQ ID N.°:54). En una realización, el agonista de OX40 es una molécula de unión que se une a OX40 murino (SEQ ID N.°:55). Las secuencias de aminoácidos del antígeno OX40 a las que se une un agonista OX40 o una molécula de unión se resumen en la Tabla 12.
TABLA 12: Secuencias de aminoácidos de los antígenos OX40.
[0671]En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de OX40 que se une a OX40 humano o murino con una K<d>de aproximadamente 100 pM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una Kd de aproximadamente 90 pM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una Kd de aproximadamente 80 pM o inferior, se une a la OX40 humana o murina con una Kd de aproximadamente 70 pM o inferior, se une a la OX40 humana o murina con una K<d>de aproximadamente 60 pM o inferior, se une a la OX40 humana o murina con una K<d>de aproximadamente 50 pM o inferior, se une a la OX40 humana o murina con una K<d>de aproximadamente 40 pM o inferior, o se une a la OX40 humana o murina con una Kd de aproximadamente 30 pM o inferior.
[0672]En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de OX40 que se une a OX40 humano o murino con un kassoc de aproximadamente 7,5 * 1051/M-s o más rápido, se une a OX40 humano o murino con un kassoc de aproximadamente 7,5 *1051/M-s o más rápido, se une a OX40 humano o murino con un kassoc de aproximadamente 8 * 1051/M-s o más rápido, se une a OX40 humano o murino con un kassoc de aproximadamente 8,5 * 1051/M-s o más rápido, se une a la OX40 humana o murina con un kassoc de aproximadamente 9 * 1051/M-s o más rápido, se une a la OX40 humana o murina con un kassoc de aproximadamente 9,5 * 1051/M-s o más rápido, o se une a la OX40 humana o murina con un kassoc de aproximadamente 1 * 1061/M-s o más rápido.
[0673]En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de OX40 que se une a OX40 humano o murino con una kdissoc de aproximadamente 2 * 10'51/s o más lenta, se une a OX40 humano o murino con una kdissoc de aproximadamente 2,1 * 10'51/s o más lenta, se une a OX40 humano o murino con una kdissoc de aproximadamente 2,2 * 10-51/s o más lenta, se une a OX40 humano o murino con una kdissoc de aproximadamente 2,3 * 10-51/s o más lenta, se une a OX40 humano o murino con una kdissoc de aproximadamente 2,4 * 10-51/s o más lenta, se une a OX40 humano o murino El OX40 murino con una kdissoc de aproximadamente 2,5 * 10-51/s o más lento, se une al OX40 humano o murino con una kdissoc de aproximadamente 2,6 * 10-51/s o más lento o se une al OX40 humano o murino con una kdissoc de aproximadamente 2,7 * 10-51/s o más lento, se une al OX40 humano o murino con una kdissoc de aproximadamente 2,8 * 10-51/s o más lento, se une al OX40 humano o murino con una kdissoc de aproximadamente 2,9 * 10-51/s o más lento, o se une al OX40 humano o murino con una kdissoc de aproximadamente 3 * 10-51/s o más lento.
[0674]En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de OX40 que se une a OX40 humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 10 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 9 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 8 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 7 nM o inferior, se une a la OX40 humana 0 murina con una IC<50>de aproximadamente 6 nM o inferior, se une a la OX40 humana o murina con una IC<50>de aproximadamente 5 nM o inferior, se une a la OX40 humana o murina con una IC<50>de aproximadamente 4 nM o inferior, se une a la OX40 humana o murina con una IC<50>de aproximadamente 3 nM o inferior, se une a la OX40 humana o murina con una IC<50>de aproximadamente 2 nM o inferior, o se une a la OX40 humana o murina con una IC<50>de aproximadamente 1 nM o inferior.
[0675]En algunas realizaciones, el agonista OX40 es tavolixizumab, también conocido como MEDI0562 o MEDI-0562. Tavolixizumab está disponible en la filial MedImmune de AstraZeneca, Inc. Tavolixizumab es una inmunoglobulina G1-kappa,anti-[Homo sapiensTNFRSF4 (receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) superfamilia miembro 4, OX40, CD134)], anticuerpo monoclonal humanizado y quimérico. Las secuencias de aminoácidos del tavolixizumab se exponen en la Tabla 13. El tavolixizumab comprende sitios de N-glicosilación en las posiciones 301 y 301", con glicanos complejos bi-antenarios fucosilados de tipo CHO; puentes disulfuro intracadena de cadena pesada en las posiciones 22-95 (V<h>-V<l>), 148-204 (C<h>1-C<l>), 265-325 (C<h>2) y 371-429 (C<h>3) (y en las posiciones 22"-95", 148"-204", 265"-325", y 371"-429"); puentes disulfuro intracadena ligera en las posiciones 23'-88' (V<h>-V<l>) y 134'-194' (C<h>1-C<l>) (y en las posiciones 23m-88m y 134m-194m); puentes disulfuro cadena pesada-cadena pesada intercadena en las posiciones 230-230" y 233-233"; y puentes disulfuro cadena pesada-cadena ligera intercadena en las posiciones 224-214' y 224"-214m Entre los ensayos clínicos actuales de tavolixizumab en diversas indicaciones de tumores sólidos se incluyen los de Identificadores NCT02318394 y NCT02705482 de clinicaltrials.gov de los Institutos Nacionales de Salud. de Ee .UU.
[0676]En una realización, un agonista OX40 comprende una cadena pesada dada por SEQ ID N.°:56 y una cadena ligera dada por SEQ ID N.°:57. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:56 y SEQ ID N.°:57, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena única (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:56 y SEQ ID N.°:57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:56 y SEQ ID N.°:57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:56 y SEQ ID N.°:57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:56 y SEQ ID N.°:57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:56 y SEQ ID N.°:57, respectivamente.
[0677]En una realización, el agonista OX40 comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de tavolixizumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada (V<h>) del agonista de OX40 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:58, y la región variable de la cadena ligera (V<l>) del agonista de OX40 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:59, y sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:58 y SEQ ID N.°:59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:58 y SEQ ID N.°:59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:58 y SEQ ID N.°:59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:58 y SEQ ID N.°:59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:58 y s Eq ID N.°:59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende un anticuerpo scFv que comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias que se muestran en SEQ ID N.°:58 y SEQ ID N.°:59.
[0678]En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:60, SEQ ID N.°:61, y SEQ ID N.°:62, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:63, SEQ ID N.°:64, y SEQ ID N.°:65, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.
[0679]En una realización, el agonista OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de fármacos con referencia al tavolixizumab. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia, por ejemplo, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación, y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista OX40 autorizado o presentado para autorización, donde el anticuerpo agonista OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en el que el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab. El anticuerpo agonista OX40 puede ser autorizado por una autoridad reguladora de fármacos como la FDA de los EE. UU. y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab.
TABLA 13: Secuencias de aminoácidos de los anticuerpos agonistas OX40 relacionados con tavolixizumab.
(continuación)
(continuación)
[0680]En algunas realizaciones, el agonista OX40 es 11D4, que es un anticuerpo totalmente humano disponible en Pfizer, Inc. La preparación y las propiedades del 11D4 se describen en Patentes de EE.UU. N.° 7,960,515; 8,236,930; y 9,028,824. Las secuencias de aminoácidos de 11D4 se exponen en la Tabla 14.
[0681]En una realización, un agonista OX40 comprende una cadena pesada dada por SEQ ID N.°:66 y una cadena ligera dada por SEQ ID N.°:67. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:66 y SEQ ID N.°:67, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena única (scFv), variantes, o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:66 y SEQ ID N.°:67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:66 y SEQ ID N.°:67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:66 y SEQ ID N.°:67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:66 y SEQ ID N.°:67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:66 y SEQ ID N.°:67, respectivamente.
[0682]En una realización, el agonista OX40 comprende las CDRs de cadena pesada y ligera o regiones variables (VRs) de 11D4. En una realización, la región variable de la cadena pesada (Vh) del agonista de OX40 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:68, y la región variable de la cadena ligera (Vl) del agonista de OX40 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:69, y sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:68 y s Eq ID N.°:69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:68 y SEQ ID N.°:69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:68 y SEQ ID N.°:69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:68 y SEQ ID N.°:69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:68 y SEQ ID N.°:69, respectivamente.
[0683]En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:70, SEQ ID N.°:71, y SEQ ID N.°:72, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:73,<s>E<q>ID N.°:74, y SEQ ID N.°:75, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.
[0684]En una realización, el agonista OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de fármacos con referencia a 11D4. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia,por ejemplo,97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es 11D4. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación, y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista OX40 autorizado o presentado para autorización, donde el anticuerpo agonista OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en el que el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es 11D4. El anticuerpo agonista OX40 puede ser autorizado por una autoridad reguladora de fármacos como la FDA de los EE. UU. y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es 11D4. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es 11D4.
TABLA 14: Secuencias de aminoácidos para anticuerpos agonistas OX40 relacionados con 11D4.
(continuación)
[0685]En algunas realizaciones, el agonista OX40 es 18D8, que es un anticuerpo totalmente humano disponible en Pfizer, Inc. La preparación y las propiedades del 18D8 se describen en Patentes de EE.UU. N.° 7,960,515; 8,236,930; y 9,028,824. Las secuencias de aminoácidos de 18D8 se exponen en la Tabla 15.
[0686]En una realización, un agonista OX40 comprende una cadena pesada dada por SEQ ID N.°:76 y una cadena ligera dada por SEQ ID N.°:77. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:76 y SEQ ID N.°:77, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena única (scFv), variantes, o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:76 y SEQ ID N.°:77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:76 y SEQ ID N.°:77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:76 y SEQ ID N.°:77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:76 y SEQ ID N.°:77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:76 y SEQ ID N.°:77, respectivamente.
[0687]En una realización, el agonista OX40 comprende las CDRs de cadena pesada y ligera o regiones variables (VRs) de 18D8. En una realización, la región variable de la cadena pesada (V<h>) del agonista de OX40 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:78, y la región variable de la cadena ligera (V<l>) del agonista de OX40 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:79, y sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones VH y VL que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:78 y<s>E<q>ID N.°:79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:78 y SEQ ID N.°:79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:78 y SEQ ID N.°:79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:78 y SEQ ID N.°:79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:78 y SEQ ID N.°:79, respectivamente.
[0688]En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:80, SEQ ID N.°:81, y SEQ ID N.°:82, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:83, s Eq ID N.°:84, y SEQ ID N.°:85, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.
[0689]En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de fármacos con referencia a 18D8. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia,p. ej.,97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es 18D8. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación, y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista OX40 autorizado o presentado para autorización, donde el anticuerpo agonista OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en el que el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es 18D8. El anticuerpo agonista OX40 puede ser autorizado por una autoridad reguladora de fármacos como la FDA de los EE. UU. y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es 18D8. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es 18D8.
TABLA 15: Secuencias de aminoácidos de los anticuerpos agonistas OX40 relacionados con 18D8.
(continuación)
[0690]En algunas realizaciones, el agonista OX40 es Hu119-122, que es un anticuerpo humanizado disponible de GlaxoSmithKIine plc. La preparación y las propiedades de Hu119-122 se describen en Patentes de EE.UU. N.° 9.006.399 y 9.163.085, y en la Publicación de Patente Internacional n° WO 2012/027328.Las secuencias de aminoácidos de Hu119-122 se exponen en la Tabla 16.
[0691]En una realización, el agonista OX40 comprende las CDRs de cadena pesada y ligera o regiones variables (VRs) de Hu119-122. En una realización, la región variable de la cadena pesada (V<h>) del agonista de OX40 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:86, y la región variable de la cadena ligera (V<l>) del agonista de OX40 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:87, y sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:86 y SEQ ID N.°:87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:86 y SEQ ID N.°:87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:86 y SEQ ID N.°:87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:86 y SEQ ID N.°:87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:86 y SEQ ID N.°:87, respectivamente.
[0692]En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:88, SEQ ID N.°:89, y SEQ ID N.°:9o, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:91, s Eq ID N.°:92, y SEQ ID N.°:93, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.
[0693]En una realización, el agonista OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de fármacos con referencia a Hu119-122. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia,p. ej.,97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación, y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista OX40 autorizado o presentado para autorización, donde el anticuerpo agonista OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en el que el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122. El anticuerpo agonista OX40 puede ser autorizado por una autoridad reguladora de fármacos como la FDA de los EE. UU. y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122.
TABLA 16: Secuencias de aminoácidos para anticuerpos agonistas OX40 relacionados con Hu119-122.
(continuación)
[0694]En algunas realizaciones, el agonista OX40 es Hu106-222, que es un anticuerpo humanizado disponible de GlaxoSmithKIine plc. La preparación y las propiedades de Hu106-222 se describen en Patentes de EE.UU. N.° 9.006.399 y 9.163.085, y en la Publicación Internacional de Patentes n.° WO 2012/027328. Las secuencias de aminoácidos de Hu106-222 se exponen en la Tabla 17.
[0695]En una realización, el agonista OX40 comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de Hu106-222. En una realización, la región variable de la cadena pesada (V<h>) del agonista de OX40 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:94, y la región variable de la cadena ligera (Vl) del agonista de OX40 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID N.°:95, y sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:94 y s Eq ID N.°:95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:94 y SEQ ID N.°:95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:94 y SEQ ID N.°:95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:94 y SEQ ID N.°:95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:94 y SEQ ID N.°:95, respectivamente.
[0696]En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:96, SEQ ID N.°:97, y SEQ ID N.°:98, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en SEQ ID N.°:99, SEQ ID N.°:100, y SEQ ID N.°:101, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.
[0697]En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de fármacos con referencia a Hu106-222. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia,p. ej.,97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación, y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista OX40 autorizado o presentado para autorización, donde el anticuerpo agonista OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en el que el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222. El anticuerpo agonista OX40 puede ser autorizado por una autoridad reguladora de fármacos como la FDA de los EE. UU. y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222.
TABLA 17: Secuencias de aminoácidos para anticuerpos agonistas OX40 relacionados con Hu106-222.
(continuación)
[0698]En algunas realizaciones, el anticuerpo agonista OX40 es MEDI6469 (también denominado 9B12). MEDI6469 es un anticuerpo monoclonal murino. Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585. En algunas realizaciones el agonista OX40 es un anticuerpo producido por el hibridoma 9B12, depositado en Biovest Inc. (Malvern, MA, EE.UU.), como se describe en Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende las secuencias CDR de MEDI6469. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de MEDI6469.
[0699]En una realización, el agonista OX40 es L106 BD (Pharmingen Producto #340420). En algunas realizaciones, el agonista OX40 comprende las CDR del anticuerpo L106 (BD Pharmingen Producto #340420). En algunas realizaciones, el agonista OX40 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y/o una secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo L106 (BD Pharmingen Producto #340420). En una realización, el agonista OX40 es ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catálogo #20073). En algunas realizaciones, el agonista OX40 comprende las CDR del anticuerpo ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catálogo #20073). En algunas realizaciones, el agonista OX40 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y/o una secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catálogo #20073). En una realización, el agonista OX40 es el anticuerpo monoclonal murino anti-mCD134/mOX40 (clon OX86), disponible comercialmente en InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NH.
[0700]En una realización, el agonista OX40 se selecciona de entre los agonistas OX40 descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.°WO 95/12673, WO 95/21925, WO 2006/121810, WO 2012/027328, WO 2013/028231, WO 2013/038191, y WO 2014/148895; Solicitud de Patente Europea EP 0672141; Publicación de la Solicitud de Patente de EE.UU. N°. US 2010/136030, US 2014/377284, US 2015/190506 y US 2015/132288 (incluidos los clones 20E5 y 12H3); y Patentes de EE.UU. N.° 7,504,101, 7,550,140, 7,622,444, 7,696,175, 7,960,515, 7,961,515, 8,133,983, 9,006,399, y 9,163,085.
[0701]En una realización, el agonista OX40 es una proteína de fusión agonista OX40 como se representa en la Estructura I-A (proteína de fusión fragmento Fc-anticuerpo C-terminal) o Estructura I-B (proteína de fusión fragmento Fc-anticuerpo N-terminal), o un fragmento, derivado, conjugado, variante, o biosimilar de la misma. Las propiedades de las estructuras I-A e I-B se describen anteriormente y en Patentes de EE.UU. N.° 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519, y 8,450,460. Las secuencias de aminoácidos de los dominios polipeptídicos de la estructura I-A figuran en la Tabla 9. El dominio Fc comprende preferentemente un dominio constante completo (aminoácidos 17-230 de SEQ ID N.°:31) el dominio bisagra completo (aminoácidos 1-16 de SEQ ID N.°:31) o una porción del dominio bisagra(p. ej.,aminoácidos 4-16 de SEQ ID N.°:31). Los enlazadores preferidos para conectar un anticuerpo Fc C-terminal pueden seleccionarse a partir de las formas de realización dadas en SEQ ID N.°:32 a SEQ ID N.°:41, incluyendo enlazadores adecuados para la fusión de polipéptidos adicionales. Asimismo, las secuencias de aminoácidos de los dominios polipeptídicos de la estructura I-B se indican en la Tabla 10. Si se fusiona un fragmento de anticuerpo Fc con el extremo N-terminal de una proteína de fusión TNRFSF como en la estructura I-B, la secuencia del módulo Fc es preferiblemente la que se muestra en SEQ ID N.°:42, y las secuencias enlazadoras se seleccionan preferiblemente de entre las realizaciones expuestas en SED ID N.°:43 a SEQ ID N.°:45.
[0702]En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 seleccionados del grupo que consiste en una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de tavolixizumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de 11D4, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de 18D8, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de Hu119-122, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de Hu106-222, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable seleccionadas de las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables descritas en la Tabla 17, cualquier combinación de una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de las anteriores, y fragmentos, derivados, conjugados, variantes, y biosimilares de las mismas.
[0703]En una realización, una proteína de fusión agonista OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión OX40 que comprenden una secuencia OX40L. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión a OX40 que comprenden una secuencia según SEQ ID N.°:102. En una realización, una proteína de fusión agonista OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión OX40 que comprenden una secuencia OX40L soluble. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión a OX40 que comprenden una secuencia según SEQ ID N.°:103. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión a OX40 que comprenden una secuencia según SEQ ID N.°:104.
[0704]En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión a OX40 que es un dominio scFv que comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:58 y SEQ ID N.°:59, respectivamente, en las que los dominios V<h>y Vl están conectados por un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión a OX40 que es un dominio scFv que comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:68 y SEQ ID N.°:69, respectivamente, en las que los dominios V<h>y V<l>están conectados por un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión a OX40 que es un dominio scFv que comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:78 y SEQ ID N.°:79, respectivamente, en las que los dominios V<h>y V<l>están conectados por un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión a OX40 que es un dominio scFv que comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:86 y s Eq ID N.°:87, respectivamente, en las que los dominios Vh y Vl están conectados por un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión a OX40 que es un dominio scFv que comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID N.°:94 y SEQ ID N.°:95, respectivamente, en las que los dominios Vh y Vl están conectados por un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 según las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión a OX40 que es un dominio scFv que comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95% idénticas a las secuencias V<h>y V<l>dadas en la Tabla 14, en la que los dominios Vh y Vl están conectados por un enlazador.
TABLA 18: Dominios polipeptídicos adicionales útiles como dominios de unión a OX40 en proteínas de fusión(por ejemplo,estructuras I-A y I-B) o como anticuerpos agonistas de OX40 scFv.
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
[0705]En una realización, el agonista de OX40 es un polipéptido de fusión de cadena simple agonista de OX40 que comprende (i) un primer dominio soluble de unión a OX40, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio soluble de unión a OX40, (iv) un segundo enlazador peptídico, y (v) un tercer dominio soluble de unión a OX40, que comprende además un dominio adicional en el extremo N-terminal y/o C-terminal, y en el que el dominio adicional es un dominio de fragmento Fab o Fc. En una realización, el agonista de OX40 es un polipéptido de fusión de cadena simple agonista de OX40 que comprende (i) un primer dominio soluble de unión a OX40, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio soluble de unión a OX40, (iv) un segundo enlazador peptídico, y (v) un tercer dominio soluble de unión a OX40, que comprende además un dominio adicional en el extremo N-terminal y/o C-terminal, en el que el dominio adicional es un dominio de fragmento Fab o Fc en el que cada uno de los dominios solubles de unión a OX40 carece de una región peduncular (que contribuye a la trimerización y proporciona una cierta distancia a la membrana celular, pero no forma parte del dominio de unión a OX40) y el primer y el segundo enlazador peptídico tienen independientemente una longitud de 3-8 aminoácidos.
[0706]En una realización, el agonista de OX40 es un polipéptido de fusión de cadena simple agonista de OX40 que comprende (i) un primer dominio de citocina de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de citocina de la superfamilia del TNF soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico, y (v) un tercer dominio soluble de citocina de la superfamilia TNF, en el que cada uno de los dominios solubles de citocina de la superfamilia TNF carece de una región peduncular y el primer y el segundo enlazador peptídico tienen independientemente una longitud de 3-8 aminoácidos, y donde el dominio de citocina de la superfamilia TNF es un dominio de unión a OX40.
[0707]En algunas realizaciones, el agonista OX40 es MEDI6383. MEDI6383 es una proteína de fusión agonista de OX40 y puede prepararse como se describe en Patente de EE.UU. N.° 6,312,700.
[0708]En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo scFv agonista de OX40 que comprende cualquiera de los dominios Vh anteriores unido a cualquiera de los dominios Vl anteriores.
[0709]En una realización, el agonista OX40 es el anticuerpo monoclonal agonista OX40 de Creative Biolabs MOM-18455, disponible comercialmente de Creative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USA.
[0710]En una realización, el agonista OX40 es el anticuerpo agonista OX40 clon Ber-ACT35 comercialmente disponible de BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA.
I. Análisis Opcionales de Viabilidad Celular
[0711]Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la primera expansión con sensibilización (a veces denominada expansión inicial a granel), utilizando ensayos estándar conocidos en la técnica. Así, en ciertas realizaciones, el método comprende la realización de un ensayo de viabilidad celular posterior a la primera expansión con sensibilización. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión con azul tripán en una muestra de TIL, que marca selectivamente las células muertas y permite evaluar la viabilidad. Otros ensayos para comprobar la viabilidad pueden ser, entre otros, el ensayo del azul de Alamar; y el ensayo MTT.
1.Recuento de células, Viabilidad, Citometría de flujo
[0712]En algunas realizaciones, se miden los recuentos celulares y/o la viabilidad. La expresión de marcadores tales como, entre otros, CD3, CD4, CD8, y CD56, así como cualquier otro divulgado o descrito en el presente documento, puede medirse mediante citometría de flujo con anticuerpos, por ejemplo, entre otros, los disponibles comercialmente en BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA) utilizando un citómetro de flujo FACSCanto™ (BD Biosciences). Las células pueden contarse manualmente utilizando un hemocitómetro desechable c-chip (VWR, Batavia, IL) y la viabilidad puede evaluarse utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, la tinción con azul tripán. La viabilidad celular también puede ensayarse basándose en USSN 15/863,634. La viabilidad celular también puede ensayarse en base a la Publicación de patente de EE.UU. n.° 2018/0280436 o Publicación de patente internacional n.° WO/2018/081473.
[0713]En algunos casos, la población a granel de TIL puede ser criopreservada inmediatamente, usando los protocolos discutidos a continuación. Alternativamente, la población de TIL a granel puede someterse a REP y luego criopreservarse como se explica a continuación. Del mismo modo, en el caso de que los TIL modificados genéticamente vayan a utilizarse en terapia, las poblaciones de TIL a granel o REP pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados.
2.Cultivos celulares
[0714]En una realización, un método para expandir TIL, incluyendo aquellos discutidos anteriormente así como ejemplificados en la Figura 1, en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C, puede incluir el uso de aproximadamente 5,000 mL a aproximadamente 25,000 mL de medio celular, aproximadamente 5,000 mL a aproximadamente 10,000 mL de medio celular, o aproximadamente 5,800 mL a aproximadamente 8,700 mL de medio celular. En algunas realizaciones, el medio es un medio libre de suero. En algunas realizaciones, el medio de la primera expansión con sensibilización no contiene suero. En algunas realizaciones, el medio de la segunda expansión está libre de suero. En algunas realizaciones, los medios de la primera expansión con sensibilización y de la segunda expansión (también denominada segunda expansión rápida) no contienen suero. En una realización, la expansión del número de TIL no utiliza más de un tipo de medio de cultivo celular. Puede utilizarse cualquier medio de cultivo celular adecuado,por ejemplo,el medio de cultivo celular AIM-V (L-glutamina, 50 pM de sulfato de estreptomicina y 10 pM de sulfato de gentamicina (Invitrogen, Carlsbad CA). En este sentido, los métodos inventivos reducen ventajosamente la cantidad de medio y el número de tipos de medio necesarios para ampliar el número de TIL. En una realización, la expansión del número de TIL puede comprender la alimentación de las células con una frecuencia no superior a cada tercer o cuarto día. La ampliación del número de células en un contenedor permeable al gas simplifica los procedimientos necesarios para ampliar el número de células al reducir la frecuencia de alimentación necesaria para ampliar las células.
[0715]En una realización, el medio de cultivo celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas no está filtrado. El uso de un medio celular no filtrado puede simplificar los procedimientos necesarios para ampliar el número de células. En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas carece de betamercaptoetanol (BME).
[0716]En una realización, la duración del método puede comprender la obtención de una muestra de tejido tumoral del mamífero; cultivar la muestra de tejido tumoral en un primer recipiente permeable a los gases que contiene medio celular que incluye IL-2, células alimentadoras presentadoras de antígeno 1X, y OKT-3 durante una duración de aproximadamente 1 a 8 días,p. ej.,aproximadamente 8 días como una primera expansión de cebado; transferir los TIL a un segundo recipiente permeable a los gases y expandir el número de TIL en el segundo recipiente permeable a los gases que contiene medio celular que incluye IL-2, células alimentadoras presentadoras de antígeno 2X, y OKT-3 durante una duración de aproximadamente 7 a 9 días,p. ej.,aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, o aproximadamente 9 días.
[0717]La duración del método puede comprender la obtención de una muestra de tejido tumoral del mamífero; el cultivo de la muestra de tejido tumoral en un primer recipiente permeable a los gases que contiene un medio celular que incluye IL-2, células alimentadoras presentadoras de antígeno 1X y OKT-3 durante una duración de aproximadamente 1 a 7 días,p. ej.,aproximadamente 7 días como una primera expansión de cebado; transferir los TIL a un segundo recipiente permeable al gas y expandir el número de TIL en el segundo recipiente permeable al gas que contiene un medio celular que incluye IL-2, 2X células alimentadoras presentadoras de antígeno y OKT-3 durante un periodo de aproximadamente 7 a 9 días, porejemplo,aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días o aproximadamente 9 días.
[0718]En una realización, la duración del método puede comprender la obtención de una muestra de tejido tumoral del mamífero; cultivar la muestra de tejido tumoral en un primer recipiente permeable a los gases que contiene medio celular que incluye IL-2, células alimentadoras presentadoras de antígeno 1X, y OKT-3 durante una duración de aproximadamente 1 a 7 días,p. ej.,aproximadamente 7 días como una primera expansión con sensibilización; transferir los TIL a un segundo recipiente permeable a los gases y expandir el número de TIL en el segundo recipiente permeable a los gases que contiene medio celular que incluye IL-2, células alimentadoras presentadoras de antígeno 2X, y OKT-3 durante una duración de aproximadamente 7 a 10 días,p. ej.,aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días o aproximadamente 10 días.
[0719]En una realización, los TIL se expanden en recipientes permeables al gas. Se han utilizado contenedores permeables al gas para expandir TIL utilizando PBMC mediante métodos, composiciones, y dispositivos conocidos en la técnica, incluidos los descritos en Publicación de solicitud de patente de EE. UU n.° 2005/0106717 A1. En una realización, los TIL se expanden en bolsas permeables al gas. En una realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). En una realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el WAVE Bioreactor System, también conocido como Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). En una realización, el sistema de expansión celular incluye una bolsa celular permeable al gas con un volumen seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente aproximadamente 100 ml, aproximadamente 200 ml, aproximadamente 300 ml, aproximadamente 400 ml, aproximadamente 500 ml, aproximadamente 600 ml, aproximadamente 700 ml, aproximadamente 800 ml, aproximadamente 900 ml, aproximadamente 1 l, aproximadamente 2 l, aproximadamente 3 l, aproximadamente 4 l, aproximadamente 5 l, aproximadamente 6 l, aproximadamente 7 l, aproximadamente 8 l, aproximadamente 9 l, y aproximadamente 10 l.
[0720]En una realización, los TIL pueden expandirse en matraces G-Rex (disponibles comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing). Tales realizaciones permiten que las poblaciones celulares se expandan desde aproximadamente 5 *105 células/cm2 hasta entre 10 ><106 y 30 *10® células/cm2. En una realización esto es sin alimentación. En una realización, esto es sin alimentación mientras el medio resida a una altura de aproximadamente 10 cm en el matraz G-Rex. En una realización, esto es sin alimentación pero con la adición de una o más citoquinas. En una realización, la citoquina puede añadirse como un bolo sin necesidad de mezclar la citoquina con el medio. Dichos recipientes, dispositivos y métodos son conocidos en la técnica y se han utilizado para expandir TIL, e incluyen los descritos en Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° US 2014/0377739A1, publicación internacional n.° WO 2014/210036 A1, Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° us 2013/0115617 A1, publicación internacional de EE.UU. n.° WO 2013/188427 A1, Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° US 2011/0136228 A1, Patente de EE.UU. n.° US 8,809,050 B2, Publicación internacional n.° WO 2011/072088 A2, Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° US 2016/0208216 A1, Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° US 2012/0244133 A1, Publicación internacional n.° WO 2012/129201 A1, Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° US 2013/0102075 A1, Patente de EE.UU. n.° US 8,956,860 B2, Publicación internacional n.° WO 2013/173835 A1, Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° US 2015/0175966 A1. Tales procesos también se describen en Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.
J. Ingeniería Genética Opcional de TIL
[0721]En algunas realizaciones, los TIL expandidos de la presente invención se manipulan adicionalmente antes, durante o después de una etapa de expansión, incluso durante procesos de fabricación cerrados y estériles, cada uno como se proporciona en el presente documento, con el fin de alterar la expresión de proteínas de manera transitoria. En algunas realizaciones, la expresión proteica transitoriamente alterada se debe a la edición transitoria de genes. En algunas realizaciones, los TIL expandidos de la presente invención se tratan con factores de transcripción (TF) y/u otras moléculas capaces de alterar transitoriamente la expresión de proteínas en los TIL. En algunas realizaciones, los TF y/u otras moléculas que son capaces de alterar transitoriamente la expresión de proteínas proporcionan una expresión alterada de antígenos tumorales y/o una alteración en el número de células T específicas de antígeno tumoral en una población de TIL.
[0722]En ciertas realizaciones, el método comprende editar genéticamente una población de TIL. En ciertas realizaciones, el método comprende editar genéticamente la primera población de TIL, la segunda población de TIL y/o la tercera población de TIL.
[0723]En algunas realizaciones, la presente invención incluye la edición genética a través de la inserción de nucleótidos, tal como a través de la inserción de ácido ribonucleico (ARN), incluyendo la inserción de ARN mensajero (ARNm) o ARN interferente pequeño (o corto) (siARN), en una población de TIL para la promoción de la expresión de una o más proteínas o la inhibición de la expresión de una o más proteínas, así como combinaciones simultáneas de la promoción de un conjunto de proteínas con la inhibición de otro conjunto de proteínas.
[0724]En algunas realizaciones, los TIL expandidos de la presente invención sufren una alteración transitoria de la expresión proteica. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de la proteína se produce en la población de TIL a granel antes de la primera expansión, incluyendo, por ejemplo en la población de TIL obtenida de, por ejemplo, la Etapa A como se indica en la Figura 1 (en particular la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se produce durante la primera expansión, incluyendo, por ejemplo en la población de TIL expandida en, por ejemplo, la Etapa B como se indica en la Figura 1 (por ejemplo, la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se produce después de la primera expansión, incluyendo, por ejemplo en la población de TIL en transición entre la primera y la segunda expansión(p. ej.,la segunda población de TIL como se describe en el presente documento), la población de TIL obtenida de, por ejemplo, la etapa B e incluida en la etapa C como se indica en la Figura 1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de la proteína se produce en la población de TIL a granel antes de la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo en la población de TIL obtenida de, por ejemplo, la Etapa C y antes de su expansión en la Etapa D como se indica en la Figura 1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se produce durante la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo en la población de TIL expandida en, por ejemplo, la Etapa D como se indica en la Figura 1(p. ej.,la tercera población de TIL). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se produce después de la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo en la población de TIL obtenida de la expansión en, por ejemplo, la Etapa D como se indica en la Figura 1.
[0725]En una realización, un método para alterar transitoriamente la expresión de proteínas en una población de TIL incluye la etapa de electroporación. Los métodos de electroporación son conocidos en la técnica y se describen,por ejemplo,en Tsong, Biophys. J. 1991,60, 297-306, y Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2014/0227237 A1. En una realización, un método para alterar transitoriamente la expresión de proteínas en una población de TIL incluye la etapa de transfección de fosfato de calcio. Los métodos de transfección con fosfato cálcico (precipitación del ADN con fosfato cálcico, recubrimiento de la superficie celular y endocitosis) son conocidos en la técnica y se describen en Graham y van der Eb,; Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376; y Chen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752, y en Patente de EE.UU. N.° 5,593,875. En una realización, un método para alterar transitoriamente la expresión de proteínas en una población de TIL incluye la etapa de transfección liposomal. Los métodos de transfección liposomal, como los métodos que emplean una formulación liposomal 1:1 (p/p) del lípido catiónico W-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-n,n,n-trimetilamonio cloruro (DOTMA) y dioleoil fophotidiletanolamina (DOPE) en agua filtrada, son conocidos en la técnica y se describen en Rose, et al., y Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417 y en Patentes de EE.UU. N.° 5,279,833; 5,908,635; 6,056,938; 6,110,490; 6,534,484; y 7,687,070. En una realización, un método para alterar transitoriamente la expresión de proteínas en una población de TIL incluye la etapa de transfección utilizando métodos descritos en Patentes de EE.UU. N.° 5,766,902; 6,025,337; 6,410,517; 6,475,994; y 7,189,705.
[0726]En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de la proteína resulta en un aumento de las Células T Madre con Memoria (TSCM). Las TSCM son progenitores tempranos de células T de memoria central experimentadas en antígenos. Por lo general, las TSCM muestran las capacidades de supervivencia a largo plazo, autorrenovación y multipotencia que definen a las células madre, y suelen ser deseables para la generación de productos TIL eficaces. Las TSCM han demostrado una mayor actividad antitumoral en comparación con otros subconjuntos de células T en modelos de ratón de transferencia celular adoptiva (Gattinoni et al.; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieri et al. Blood 2013). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica da lugar a una población de TIL con una composición que comprende una alta relación de TSCM. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica produce un aumento de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95% del porcentaje de TSCM. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de la proteína da como resultado un aumento de al menos 1, 2, 3, 4, 5, o 10 veces de las TSCM en la población de TIL. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una población de TIL con al menos al 5%, al menos al 10%, al menos al 10%, al menos al 20%, al menos al 25%, al menos al 30%, al menos al 35%, al menos al 40%, al menos al 45%, al menos al 50%, al menos al 55%, al menos al 60%, al menos al 65%, al menos al 70%, al menos al 75%, al menos al 80%, al menos al 85%, al menos al 90%, o al menos al 95% de TSCMs. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una población de TIL terapéuticos con al menos al 5%, al menos al 10%, al menos al 10%, al menos al 20%, al menos al 25%, al menos al 30%, al menos al 35%, al menos al 40%, al menos al 45%, al menos al 50%, al menos al 55%, al menos al 60%, al menos al 65%, al menos al 70%, al menos al 75%, al menos al 80%, al menos al 85%, al menos al 90%, o al menos al 95% de TSCMs.
[0727]En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en el rejuvenecimiento de las células T experimentadas en antígenos. En algunas realizaciones, el rejuvenecimiento incluye, por ejemplo, un aumento de la proliferación, un aumento de la activación de las células T y/o un aumento del reconocimiento de antígenos.
[0728]En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de la proteína altera la expresión en una gran fracción de las células T para preservar el repertorio TCR derivado del tumor. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica no altera el repertorio TCR derivado del tumor. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica mantiene el repertorio TCR derivado del tumor.
[0729]En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la proteína resulta en la expresión alterada de un gen particular. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a un gen que incluye pero no se limita a PD-1 (también denominado PDCD1 o CC279), TGFBR2, CCR4/5, CBLB (CBL-B), CISH,<c>C<rs>(receptores coestimuladores quiméricos), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFp, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP1-p), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, C<d>44, PIK3CD, S<o>C<s>1, y/o cAMP proteína quinasa A (PKA). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a un gen seleccionado del grupo que consiste en PD-1, TGFBR2, CCR4/5, CBLB (CBL-B), CISH, CCRs (receptores coestimuladores quiméricos), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFp, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP1-P), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1, y/o cAMP proteína quinasa A (PKA). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a PD-1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a TGFBR2. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCR4/5. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CBLB. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CISH. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a los CCR (receptores coestimuladores quiméricos). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a la IL-2. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a la IL-12. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a la IL-15. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a la IL-21. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a NOTCH 1/2 ICD. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a TIM3. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a LAG3. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a TIGIT. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a TGFp. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCR1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCR2. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCR4. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCR5. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CXCR1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CXCR2. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CSCR3. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCL2 (MCP-1). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCL3 (MIP-1a). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCL4 (MIP1-p). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCL5 (RANTES). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CXCL1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CXCL8. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCL22. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CCL17. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a VHL. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a CD44. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a PIK3CD. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a SOCS1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se dirige a la proteína cAMP quinasa A (PKA).
[0730] En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en un aumento y/o sobreexpresión de un receptor de quimioquinas. En algunas realizaciones, el receptor de quimioquinas que se sobreexpresa mediante la expresión transitoria de proteínas incluye un receptor con un ligando que incluye pero no se limita a CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP1-p), CCL5 (RANTES), CXCL1, CXCL8, CCL22, y/o CCL17.
[0731] En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una disminución y/o reducción de la expresión de PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT, TGFpR2, y/o TGFp (incluso resultando en, por ejemplo, el bloqueo de la vía TGFp). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de la proteína resulta en una disminución y/o reducción de la expresión de CBLB (CBL-B). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una disminución y/o reducción de la expresión de CISH.
[0732] En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en un aumento y/o sobreexpresión de receptores de quimioquinas para, por ejemplo, mejorar el tráfico o movimiento de TIL al sitio del tumor. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica da lugar a un aumento y/o sobreexpresión de un CCR (receptor coestimulador quimérico). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en un aumento y/o sobreexpresión de un receptor de quimioquinas seleccionado del grupo que consiste en CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, y/o CSCR3.
[0733] En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en un aumento y/o sobreexpresión de una interleucina. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en un aumento y/o sobreexpresión de una interleucina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-12, IL-15, y/o IL-21.
[0734] En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de la proteína resulta en un aumento y/o sobreexpresión de NOTCH 1/2 ICD. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de la proteína resulta en un aumento y/o sobreexpresión de VHL. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de la proteína resulta en un aumento y/o sobreexpresión de CD44. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de la proteína resulta en un aumento y/o sobreexpresión de PIK3CD. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica da lugar a un aumento y/o sobreexpresión de SOCS1,
[0735]En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de la proteína cAMP quinasa A (PKA).
[0736]En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de una molécula seleccionada del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de dos moléculas seleccionadas del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de PD-1 y una molécula seleccionada del grupo que consiste en LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en la disminución y/o reducción de la expresión de PD-1, LAG-3, CISH, CBLB, TIM3, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de PD-1 y uno de LAG3, CISH, CBLB, TIM3, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de PD-1 y LAG3. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de PD-1 y CISH. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de PD-1 y CBLB. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de LAG3 y CISH. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de LAG3 y CBLB. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de CISH y CBLB. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de TIM3 y PD-1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de TIM3 y LAG3. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de TIM3 y CISH. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de TIM3 y CBLB.
[0737]En algunas realizaciones, una molécula de adhesión seleccionada del grupo que consiste en CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, y combinaciones de las mismas, se inserta mediante un método gammaretroviral o lentiviral en la primera población de TIL, segunda población de TIL, o población cosechada de TIL(p. ej.,se aumenta la expresión de la molécula de adhesión).
[0738]En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica resulta en una expresión disminuida y/o reducida de una molécula seleccionada del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), y combinaciones de las mismas, y expresión aumentada y/o mejorada de CCR2, CCR4, c CR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de una molécula seleccionada del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, CISH, CBLB, y combinaciones de las mismas, y una expresión aumentada y/o mejorada de CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, y combinaciones de las mismas.
[0739]En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de aproximadamentel 5%, aproximadamentel 10%, aproximadamentel 10%, aproximadamentel 20%, aproximadamentel 25%, aproximadamentel 30%, aproximadamentel 35%, aproximadamentel 40%, aproximadamentel 45%, aproximadamentel 50%, aproximadamentel 55%, aproximadamentel 60%, aproximadamentel 65%, aproximadamentel 70%, aproximadamentel 75%, aproximadamentel 80%, aproximadamentel 85%, aproximadamentel 90%, o aproximadamentel 95%. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, se produce una reducción de la expresión de al menos aproximadamente el 80%, el 85%, el 90%, o el 95%. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 80 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 85%, En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 90%. En algunas realizaciones, hay una reducción de la expresión de al menos aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, hay una reducción de la expresión de al menos aproximadamente el 99%.
[0740]En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de aproximadamentel 5%, aproximadamentel 10%, aproximadamentel 10%, aproximadamentel 20%, aproximadamentel 25%, aproximadamentel 30%, aproximadamentel 35%, aproximadamentel 40%, aproximadamentel 45%, aproximadamentel 50%, aproximadamentel 55%, aproximadamentel 60%, aproximadamentel 65%, aproximadamentel 70%, aproximadamentel 75%, aproximadamentel 80%, aproximadamentel 85%, aproximadamentel 90%, o aproximadamentel 95%. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión de al menos aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, o el 95%. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 80%. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 85%. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 90%. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 99%.
[0741]En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica se induce mediante el tratamiento de los TIL con factores de transcripción (TF) y/u otras moléculas capaces de alterar transitoriamente la expresión proteica en los TIL. En algunas realizaciones, la plataforma microfluídica sin vectores SQZ se emplea para la administración intracelular de los factores de transcripción (Tf ) y/u otras moléculas capaces de alterar transitoriamente la expresión proteica. Tales métodos demuestran la capacidad de administrar proteínas, incluidos factores de transcripción, a una variedad de células humanas primarias, incluidas las células T (Sharei et al. PNAS 2013, así como Sharei et al. PLOS ONE 2015 y Greisbeck et al. J. Immunology vol. 195, 2015); véanse, por ejemplo, las publicaciones de patentes internacionales WO 2013/059343A1, WO 2017/008063A1, y WO 2017/123663A1. Tales métodos como los descritos en las publicaciones de patentes internacionales WO 2013/059343A1, WO 2017/008063A1, y WO 2017/123663A1 pueden emplearse con la presente invención para exponer una población de TIL a factores de transcripción (TFs) y/u otras moléculas capaces de inducir la expresión transitoria de proteínas, en los que dichos TF y/u otras moléculas capaces de inducir la expresión transitoria de proteínas proporcionan un aumento de la expresión de antígenos tumorales y/o un aumento del número de células T específicas de antígenos tumorales en la población de TIL, dando lugar así a la reprogramación de la población de TIL y a un aumento de la eficacia terapéutica de la población de TIL reprogramada en comparación con una población de TIL no reprogramada. En algunas realizaciones, la reprogramación da como resultado una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la población inicial o previa(es decir,antes de la reprogramación) de TIL, como se describe en el presente documento.
[0742]En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) incluye pero no se limita a TCF-1, NOTCH 1/2 ICD, y/o MYB. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) es TCF-1. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) es NOTCH 1/2 ICD. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) es MYB. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) se administra con el cultivo de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), como el sustituto de suero KNOCKOUT disponible comercialmente (Gibco/ThermoFisher), para inducir la reprogramación adicional de TIL. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) se administra con un cóctel de iPSC para inducir la reprogramación adicional de TIL. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) se administra sin un cóctel de iPSC. En algunas realizaciones, la reprogramación resulta en un aumento del porcentaje de TSCMs. En algunas realizaciones, la reprogramación da lugar a un aumento del porcentaje de TSCMs de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, o aproximadamente 95% de TSCMs.
[0743]En algunas realizaciones, un método de alteración transitoria de la expresión de proteínas, como se ha descrito anteriormente, puede combinarse con un método de modificación genética de una población de TIL incluye la etapa de incorporación estable de genes para la producción de una o más proteínas. En ciertas realizaciones, el método comprende una etapa de modificar genéticamente una población de TIL. En ciertas realizaciones, el método comprende modificar genéticamente la primera población de TIL, la segunda población de TIL y/o la tercera población de TIL. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transducción retroviral. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transducción lentiviral. Los sistemas de transducción lentiviral son conocidos en la técnica y se describen,p. ej.,en Levine, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77; Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75; Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463 71, y Patente de EE. UU. N.° 6,627,442. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transducción gamma-retroviral. Los sistemas de transducción gamma-retroviral son conocidos en la técnica y se describen,p. ej.,en Cepko y Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transferencia de genes mediada por transposones. Los sistemas de transferencia de genes mediados por transposones son conocidos en la técnica e incluyen sistemas en los que la transposasa se proporciona como vector de expresión de ADN o como un ARN expresable o una proteína tal que la expresión a largo plazo de la transposasa no se produce en las células transgénicas, por ejemplo, una transposasa proporcionada como un ARNm(por ejemplo,un ARNm que comprende una caperuza y una cola poli-A). Los sistemas adecuados de transferencia de genes mediada por transposones, incluida la transposasa tipo Tel de tipo salmónido (SB o transposasa de la Bella Durmiente), como SB 10, SB10, y SB SB11, y las enzimas de ingeniería con mayor actividad enzimática, se describen en,p. ej.,Hackett, et al. Patente de EE. UU. N.° 6,489,458.
[0744]En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión proteica es una reducción de la expresión inducida por ARN de interferencia autodifusor (ARNsd), que es un dúplex de ARNsi asimétrico sintetizado químicamente con un alto porcentaje de sustituciones 2'-OH (típicamente flúor u -OCH<3>) que comprende una cadena antisentido (guía) de 20 nucleótidos y una cadena sentido (pasajero) de 13 a 15 bases conjugada con colesterol en su extremo 3' mediante un enlazador de tetraetilenglicol (TEG). En algunas realizaciones, el método comprende la alteración transitoria de la expresión de proteínas en una población de TIL, que comprende el uso de ARN de interferencia autodifusor (ARNsd), que es un dúplex de ARNsi asimétrico sintetizado químicamente con un alto porcentaje de sustituciones 2'-OH (típicamente flúor u -OCH<3>) que comprende una cadena antisentido (guía) de 20 nucleótidos y una cadena sentido (pasajero) de 13 a 15 bases conjugada con colesterol en su extremo 3' mediante un enlazador de tetraetilenglicol (TEG). Los métodos para utilizar ARNsd se han descrito en Khvorova y Watts, Nat. Biotechnol. 2017, 35, 238-248; Byrne, et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013, 29, 855-864; y Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018, in press. En una realización, la administración de ARNsd a una población de TIL se logra sin usar electroporación, SQZ, u otros métodos, usando en su lugar un periodo de 1 a 3 días en el que una población de TIL se expone a ARNsd a una concentración de 1 pM/10.000 TIL en medio. En ciertas realizaciones, el método comprende administrar ARNsd a una población de TIL que comprende exponer la población de TIL a ARNsd a una concentración de 1 pM/10.000 TIL en medio durante un periodo de entre 1 y 3 días. En una realización, la administración de ARNsd a una población TIL se logra usando un periodo de 1 a 3 días en el que una población TIL se expone a ARNsd a una concentración de 10 pM/10.000 TIL en medio. En una realización, la administración de ARNsd a una población TIL se logra usando un periodo de 1 a 3 días en el que una población TIL se expone a ARNsd a una concentración de 50 pM/10.000 TIL en medio. En una realización, la administración de ARNsd a una población TIL se logra usando un periodo de 1 a 3 días en el que una población TIL se expone a ARNsd a una concentración de entre 0,1 pM/10.000 TIL y 50 pM/10.000 TIL en medio. En una realización, la administración de ARNsd a una población de TIL se logra usando un periodo de 1 a 3 días en el que una población de TIL se expone a ARNsd a una concentración de entre 0,1 pM/10.000 TIL y 50 pM/10.000 TIL en el medio, en el que la exposición a ARNsd se realiza dos, tres, cuatro, o cinco veces mediante la adición de ARNsd fresco al medio. Otros procedimientos adecuados se describen, por ejemplo, en Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° US 2011/0039914 A1, US 2013/0131141 A1, y US 2013/0131142 A1, y Patente de EE.UU. N.° 9,080,171.
[0745]En algunas realizaciones, el ARNsd se inserta en una población de TIL durante la fabricación. En algunas realizaciones, el ARNsd codifica ARN que interfiere con NOTCH 1/2 ICD, PD-1, CTLA-4 TIM-3, LAG-3, TIGIT, TGFp, TGFBR2, cAMP proteína quinasa A (PKA), BAFF BR3, CISH, y/o CBLB. En algunas realizaciones, la reducción de la expresión se determina basándose en un porcentaje de silenciamiento génico, por ejemplo, evaluado por citometría de flujo y/o qPCR. En algunas realizaciones, hay una reducción de la expresión de aproximadamentel 5%, aproximadamentel 10%, aproximadamentel 10%, aproximadamentel 20%, aproximadamentel 25%, aproximadamentel 30%, aproximadamentel 35%, aproximadamentel 40%, aproximadamentel 45%, aproximadamentel 50%, aproximadamentel 55%, aproximadamentel 60%, aproximadamentel 65%, aproximadamentel 70%, aproximadamentel 75%, aproximadamentel 80%, aproximadamentel 85%, aproximadamentel 90%, o aproximadamentel 95%. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, se produce una reducción de la expresión de al menos aproximadamente el 80%, el 85%, el 90%, o el 95%. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 80 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 85%, En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 90%. En algunas realizaciones, hay una reducción de la expresión de al menos aproximadamente el 95%. En algunas realizaciones, hay una reducción de la expresión de al menos aproximadamente el 99%.
[0746]La tecnología de ARNi autoadministrable basada en la modificación química de ARNsi puede emplearse con los métodos de la presente invención para administrar con éxito ARNsd a los TIL como se describe en el presente documento. La combinación de modificaciones de la columna vertebral con la estructura asimétrica del ARNsi y un ligando hidrófobo(véase,por ejemplo, Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018 y US20160304873) permiten que ARNsd penetren en células de mamífero cultivadas sin formulaciones ni métodos adicionales mediante la simple adición a los medios de cultivo, capitalizando la estabilidad de las nucleasas de ARNsd. Esta estabilidad permite mantener niveles constantes de reducción de la actividad del gen diana mediada por ARNi simplemente manteniendo la concentración activa de ARNsd en el medio. Sin estar atado por la teoría, la estabilización de la columna vertebral del ARNsd proporciona una reducción prolongada de los efectos de la expresión génica que puede durar meses en las células que no se dividen.
[0747]En algunas realizaciones, se produce una eficiencia de transfección de TIL superior al 95% y una reducción de la expresión de la diana por varios ARNsd específicos. En algunas realizaciones, los ARNsd que contienen varios residuos de ribosa no modificados se sustituyeron por secuencias totalmente modificadas para aumentar la potencia y/o la longevidad del efecto del ARNi. En algunas realizaciones, el efecto de reducción de la expresión se mantiene durante 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 5 días, 6 días, 7 días, u 8 días o más. En algunas realizaciones, el efecto de reducción de la expresión disminuye a los 10 días o más tras el tratamiento con ARNsd de los TIL. En algunas realizaciones, se mantiene una reducción de más del 70% en la expresión de la diana. En algunas realizaciones, se mantiene una reducción de más del 70% en la expresión de la diana TIL. En algunas realizaciones, una reducción de la expresión en la vía PD-1/PD-L1 permite que los TIL exhiban un efecto in vivo más potente, que es en algunas realizaciones, debido a la evitación de los efectos supresores de la vía PD-1/PD-L1. En algunas realizaciones, una reducción en la expresión de PD-1 por ARNsd resulta en un aumento de la proliferación de TIL.
[0748]El ARN de interferencia pequeño (ARNsi), a veces conocido como ARN de interferencia corto o ARN silenciador, es una molécula de ARN de doble cadena, generalmente de 19-25 pares de bases de longitud. El ARNsi se utiliza en la interferencia de ARN (ARNi), donde interfiere con la expresión de genes específicos con secuencias de nucleótidos complementarias.
[0749]El ADN bicatenario (ARNds) puede utilizarse generalmente para definir cualquier molécula que comprenda un par de cadenas complementarias de a Rn , generalmente una cadena sentido (pasajero) y una cadena antisentido (guía), y puede incluir regiones voladizas monocatenario. El término ARNds, en contraste con el ARNsi, se refiere generalmente a una molécula precursora que incluye la secuencia de una molécula de ARNsi que se libera de la molécula de ARNds más grande por la acción de sistemas enzimáticos de escisión, incluido Dicer.
[0750]Los ARNsd (ARN autoliberables) son una nueva clase de compuestos de ARNi modificados covalentemente que no requieren un vehículo de liberación para entrar en las células y tienen una farmacología mejorada en comparación con los ARNsi tradicionales. El "ARN autoadministrado" o "ARNsd" es un híbrido de ARN interferente-antisentido modificado hidrofóbicamente, que ha demostrado ser altamente eficazin vitroen células primarias e in vivo tras su administración local. Se ha demostrado una captación robusta y/o silenciamiento sin toxicidad. Los sdARN son generalmente moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente asimétricas con regiones bicatenarias mínimas. Las moléculas de sdARN normalmente contienen regiones monocatenarias y bicatenarias, y pueden contener una variedad de modificaciones químicas dentro de las regiones monocatenarias y bicatenarias de la molécula. Además, las moléculas de ARNsd pueden unirse a un conjugado hidrófobo como una molécula de tipo esterol convencional y avanzada, como se describe en el presente documento. Los ARNsd y los métodos asociados para fabricar dichos ARNsd también se han descrito ampliamente en, por ejemplo, US20160304873, WO2010033246, WO2017070151, WO2009102427, WO2011119887, WO2010033247A2, WO200904 5457, WO2011119852. Para optimizar la estructura, la química, la posición de orientación, las preferencias de secuencia, y similares del ARNsd, se ha desarrollado y utilizado un algoritmo propio para la predicción de la potencia del ARNsd(véase,por ejemplo, US 20160304873). Basándose en estos análisis, las secuencias de ARNsd funcionales se han definido generalmente como aquellas que tienen más de un 70% de reducción en la expresión a una concentración de 1 μM, con una probabilidad superior al 40%.
[0751]En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción del 70% en la expresión del gen diana. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción del 75% en la expresión del gen diana.
En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción del 80% en la expresión del gen diana. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción del 85% en la expresión del gen diana. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción del 90% en la expresión del gen diana. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción del 95% en la expresión del gen diana. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción del 99% en la expresión del gen diana. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 0,25 jM a aproximadamente 4 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 0,25 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 0,5 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 0,75 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 1,0 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 1,25 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 1,5 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 1,75 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 2,0 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 2.25 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 2,5 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 2,75 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 3,0 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 3.25 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 3,5 jM . En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 3,75 pM. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNsd utilizadas en la invención muestran una reducción de la expresión del gen diana cuando se administran a una concentración de aproximadamente 4,0 pM.
[0752]En algunas realizaciones, los agentes oligonucleótidos comprenden una o más modificaciones para aumentar la estabilidad y/o efectividad del agente terapéutico, y para efectuar una entrega eficiente del oligonucleótido a las células o tejido a tratar. Dichas modificaciones pueden incluir una modificación 2'-O-metilo, una modificación 2'-O-fluro, una modificación difosforotioato, un nucleótido modificado 2' F, un nucleótido modificado 2'-O-metilo y/o un nucleótido 2'deoxi. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se modifica para incluir una o más modificaciones hidrofóbicas que incluyen, por ejemplo, esterol, colesterol, vitamina D, naftilo, isobutilo, bencilo, indol, triptófano, y/o fenilo. En una realización particular adicional, los nucleótidos modificados químicamente son combinaciones de fosforotioatos, 2'-O-metilos, 2'deoxi, modificaciones hidrofóbicas y fosforotioatos. En algunas realizaciones, los azúcares pueden ser modificados y los azúcares modificados pueden incluir pero no se limitan a D-ribosa, 2'-O-alquilo (incluyendo 2'-O-metilo y 2'-0-etilo),es decir,2'-alcoxi, 2'-amino, 2'-S-alquilo, 2'-halo (incluyendo 2'-fluoro), T-metoxietoxi, 2'-aliloxi (-OCH<2>CH=CH<2>), 2'-propargilo, 2'-propilo, etinilo, etenilo, propenilo, y ciano y similares. En una realización, la fracción de azúcar puede ser una hexosa e incorporarse a un oligonucleótido como se describe (Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res. 18:4711 (1992)).
[0753]En algunas realizaciones, el oligonucleótido bicatenario de la invención es bicatenario en toda su longitud, es decir , sin secuencia monocatenario sobresaliente en ninguno de los extremos de la molécula, es decir, es de extremo romo. En algunas realizaciones, las moléculas individuales de ácido nucleico pueden ser de diferentes longitudes. En otras palabras, un oligonucleótido bicatenario de la invención no es bicatenario en toda su longitud. Por ejemplo, cuando se utilizan dos moléculas de ácido nucleico separadas, una de las moléculas,p. ej.,la primera molécula que comprende una secuencia antisentido, puede ser más larga que la segunda molécula que hibrida con ella (dejando una parte de la molécula monocatenaria). En algunas realizaciones, cuando se utiliza una única molécula de ácido nucleico, una parte de la molécula en cualquiera de sus extremos puede permanecer monocatenaria.
[0754]En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario de la invención contiene desajustes y/o bucles o protuberancias, pero es bicatenario en al menos aproximadamente el 70% de la longitud del oligonucleótido. En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario de la invención es bicatenario en al menos aproximadamente el 80% de la longitud del oligonucleótido. En otra realización, un oligonucleótido bicatenario de la invención es bicatenario en al menos aproximadamente el 90%-95% de la longitud del oligonucleótido. En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario de la invención es bicatenario en al menos aproximadamente el 96%-98% de la longitud del oligonucleótido. En algunas realizaciones, el oligonucleótido bicatenario de la invención contiene al menos o hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 desajustes.
[0755]En algunas realizaciones, el oligonucleótido puede protegerse sustancialmente de las nucleasas,p. ej.,modificando los enlaces 3' o 5'(p. ej.,Pat. de EE.UU. N.° 5,849,902 y WO 98/13526). Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden hacerse resistentes mediante la inclusión de un "grupo bloqueador". El término "grupo bloqueador", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a sustituyentes(p. ej.,distintos de grupos OH) que pueden unirse a oligonucleótidos o nucleómeros, ya sea como grupos protectores o grupos de acoplamiento para síntesis(p. ej.,FITC, propil (CH<2>-CH<2>-CH<3>), glicol (-O-CH<0>-CH<2>-O-) fosfato (PO<2>3"), fosfonato de hidrógeno, o fosforamidito). "Grupos bloqueadores" también pueden incluir "grupos bloqueadores de extremos" o "grupos bloqueadores de exonucleasas" que protegen los extremos 5' y 3' del oligonucleótido, incluyendo nucleótidos modificados y estructuras resistentes a exonucleasas no nucleotídicas.
[0756]En algunas realizaciones, al menos una porción de los polinucleótidos contiguos dentro del ARNsd están unidos por un enlace sustitutivo,p. ej.,un enlace fosforotioato.
[0757]En algunas realizaciones, la modificación química puede conducir a al menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 aumentos en la captación celular. En algunas realizaciones, al menos uno de los residuos C o U incluye una modificación hidrofóbica. En algunas realizaciones, una pluralidad de Cs y Us contienen una modificación hidrófoba. En algunas realizaciones, al menos el 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o al menos el 95% de los Cs y Us pueden contener una modificación hidrófoba. En algunas realizaciones, todos los Cs y Us contienen una modificación hidrófoba.
[0758]En algunas realizaciones, el ARNsd o sd-rxARNs exhiben una liberación endosomal mejorada de moléculas de sd-rxARN a través de la incorporación de aminas protonables. En algunas realizaciones, las aminas protonables se incorporan en la cadena de sentido (en la parte de la molécula que se descarta tras la carga de RISC). En algunas realizaciones, los compuestos de ARNsd de la invención comprenden un compuesto asimétrico que comprende una región dúplex (necesaria para la entrada eficiente de RISC de 10-15 bases de longitud) y una región monocatenaria de 4-12 nucleótidos de longitud; con un dúplex de 13 nucleótidos. En algunas realizaciones, se emplea una región monocatenaria de 6 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región monocatenaria del ARNsd comprende 2-12 enlaces intemucleotídicos de fosforotioato (denominados modificaciones de fosforotioato). En algunas realizaciones, se emplean enlaces intemucleótidos de 6-8 fosforotioatos. En algunas realizaciones, los compuestos de ARNsd de la invención también incluyen un patrón de modificación química único, que proporciona estabilidad y es compatible con la entrada RISC.
[0759]La cadena guía, por ejemplo, también puede ser modificada por cualquier modificación química que confirme la estabilidad sin interferir con la entrada de RISC. En algunas realizaciones, el patrón de modificación química en la cadena guía incluye la mayoría de nucleótidos C y U modificados en 2' F y el extremo 5' fosforilado.
[0760]En algunas realizaciones, al menos el 30% de los nucleótidos en el ARNsd o sd-rxARN están modificados. En algunas realizaciones, al menos el 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de los nucleótidos en el ARNsd o sd-ARNrx están modificados. En algunas realizaciones, el 100% de los nucleótidos en el ARNsd o sd-rxARN están modificados.
[0761]En algunas realizaciones, las moléculas de ARNsd tienen regiones de doble cadena mínimas. En algunas realizaciones, la región de la molécula que es de doble cadena tiene una longitud de 8-15 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región de la molécula que es de doble cadena tiene una longitud de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región bicatenaria tiene una longitud de 13 nucleótidos. Puede haber una complementariedad del 100% entre las hebras guía y pasajera, o puede haber una o más discordancias entre las hebras guía y pasajera. En algunas realizaciones, en un extremo de la molécula bicatenaria, la molécula está despuntada o tiene un saliente de un nucleótido. En algunas realizaciones, la región monocatenaria de la molécula tiene una longitud de entre 4 y 12 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región monocatenaria puede tener una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región monocatenaria también puede tener menos de 4 o más de 12 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, la región monocatenaria tiene una longitud de 6 o 7 nucleótidos.
[0762]En algunas realizaciones, las moléculas de ARNsd tienen una mayor estabilidad. En algunos casos, una molécula de ARNsd o sd-ARNrx modificada químicamente tiene una semivida en medios que es superior a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más de 24 horas, incluyendo cualquier valor intermedio. En algunas realizaciones, el sd-rxARN tiene una semivida en el medio superior a 12 horas.
[0763]En algunas realizaciones, el ARNsd se optimiza para aumentar la potencia y/o reducir la toxicidad. En algunas realizaciones, la longitud nucleotídica de la cadena guía y/o pasajera, y/o el número de modificaciones fosforotioato en la cadena guía y/o pasajera, pueden en algunos aspectos influir en la potencia de la molécula de ARN, mientras que la sustitución de modificaciones 2'-fluoro (2'F) por modificaciones 2'-0-metil (2'OMe) puede en algunos aspectos influir en la toxicidad de la molécula. En algunas realizaciones, se predice que la reducción del contenido de 2'F de una molécula reduce la toxicidad de la molécula. En algunas realizaciones, el número de modificaciones de fosforotioato en una molécula de ARN puede influir en la captación de la molécula en una célula, por ejemplo la eficiencia de la captación pasiva de la molécula en una célula. En algunas realizaciones, el ARNsd no tiene modificación 2'F y sin embargo se caracterizan por igual eficacia en la captación celular y la penetración tisular.
[0764]En algunas realizaciones, una cadena guía tiene aproximadamente 18-19 nucleótidos de longitud y tiene aproximadamente 2-14 modificaciones de fosfato. Por ejemplo, una cadena guía puede contener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más de 14 nucleótidos fosfatemodificados. La cadena guía puede contener una o más modificaciones que confieran una mayor estabilidad sin interferir en la entrada de RISC. Los nucleótidos modificados con fosfato, como los nucleótidos modificados con fosforotioato, pueden estar en el extremo 3', en el extremo 5' o repartidos por toda la cadena guía. En algunas realizaciones, los 10 nucleótidos terminales 3' de la cadena guía contienen 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos modificados con fosforotioato. La cadena guía también puede contener modificaciones 2'F y/o 2'OMe, que pueden localizarse en toda la molécula. En algunas realizaciones, el nucleótido en la posición uno de la cadena guía (el nucleótido en la posición más 5' de la cadena guía) está 2'OMe modificado y/o fosforilado. Los nucleótidos C y U de la cadena guía pueden modificarse en 2'F. Por ejemplo, los nucleótidos C y U en las posiciones 2-10 de una cadena guía de 19 nt (o las posiciones correspondientes en una cadena guía de una longitud diferente) pueden modificarse en 2'F. Los nucleótidos C y U de la cadena guía también pueden modificarse con 2'OMe. Por ejemplo, los nucleótidos C y U en las posiciones 11-18 de una cadena guía de 19 nt (o las posiciones correspondientes en una cadena guía de longitud diferente) pueden modificarse en 2'OMe. En algunas realizaciones, el nucleótido en el extremo más 3' de la cadena guía no está modificado. En ciertas realizaciones, la mayoría de Cs y Us dentro de la cadena guía están modificados en 2'F y el extremo 5' de la cadena guía está fosforilado. En otras realizaciones, la posición 1 y los Cs o Us en las posiciones 11 18 están modificados 2'OMe y el extremo 5' de la cadena guía está fosforilado. En otras realizaciones, la posición 1 y los Cs o Us en las posiciones 11-18 están modificados 2'OMe, el extremo 5' de la cadena guía está fosforilado, y los Cs o Us en la posición 2-10 están modificados 2'F.
[0765]La tecnología de ARNi autodifundible proporciona un método para transfectar directamente las células con el agente de ARNi, sin necesidad de formulaciones o técnicas adicionales. La capacidad de transfectar líneas celulares difíciles de transfectar, la alta actividadin vivo,y la simplicidad de uso, son características de las composiciones y métodos que presentan ventajas funcionales significativas sobre las técnicas tradicionales basadas en ARNsi, y como tales, los métodos de ARNsd se emplean en varias realizaciones relacionadas con los métodos de reducción de la expresión del gen diana en los TIL de la presente invención. Los métodos sdARNi permiten la administración directa de compuestos sintetizados químicamente a una amplia gama de células y tejidos primarios, tantoex vivocomoin vivo.Los ARNsd descritos en algunas realizaciones de la invención están disponibles comercialmente en Advirna LLC, Worcester, MA, USA.
[0766]Los ARNsd se forman como estructuras híbridas de ARNsi-antisentido modificadas hidrofóbicamente, y se divulgan, por ejemplo en Byrne et al., diciembre de 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864.
[0767]En algunas realizaciones, los oligonucleótidos de ARNsd se pueden administrar a los TIL descritos aquí usando electroporación estéril. En ciertas realizaciones, el método comprende la electroporación estéril de una población de TIL para administrar oligonucleótidos de ARNsd.
[0768]En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden administrarse a las células en combinación con un sistema de administración transmembrana. En algunas formas de realización, este sistema de administración transmembrana comprende lípidos, vectores virales y similares. En algunas realizaciones, el agente oligonucleótido es un agente de ARNi de autoentrega, que no requiere ningún agente de entrega. En ciertas realizaciones, el método comprende el uso de un sistema de administración transmembrana para administrar oligonucleótidos de ARNsd a una población de TIL.
[0769]Los oligonucleótidos y las composiciones de oligonucleótidos se ponen en contacto con(p. ej.,se ponen en contacto con, también denominado en el presente documento administrado o entregado a) y son captados por los TIL descritos en el presente documento, incluso mediante captación pasiva por los TIL. El ARNsd puede añadirse a los TIL como se describe en el presente documento durante la primera expansión, por ejemplo la Etapa B, después de la primera expansión, por ejemplo, durante la Etapa, antes o durante la segunda expansión, por ejemplo antes o durante la Etapa D, después de la Etapa D y antes de la cosecha en la Etapa E, durante o después de la cosecha en la Etapa F, antes o durante la formulación final y/o la transferencia a la bolsa de infusión en la Etapa F, así como antes de cualquier etapa opcional de crioconservación en la Etapa F. Además, el ARNsd puede añadirse después de la descongelación de cualquier etapa de crioconservación en la Etapa F. En una realización, uno o más ARNsd dirigidos a genes como se describe en el presente documento, incluyendo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, y CBLB, pueden añadirse a medios de cultivo celular que comprenden TIL y otros agentes a concentraciones seleccionadas del grupo que consiste en 100 nM a 20 mM, 200 nM a 10 mM, 500 nm a 1 mM, 1 pM a 100 pM, y 1 pM a 100 pM. En una realización, uno o más ARNsd dirigidos a genes según se describe en el presente documento, incluyendo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, y CBLB, pueden añadirse a medios de cultivo celular que comprenden TIL y otros agentes en cantidades seleccionadas del grupo que consiste en de 0,1 pM de ARNsd/10000 TIL/100 pL de medio, 0,5 pM de ARNsd/10 000 TIL/100 pL de medio, 0,75 pM de ARNsd/10000 TIL/100 pL de medio, 1 pM de ARNsd/10000 TIL/100 pL de medio, 1,25 pM de ARNsd/10000 TIL/100 pL de medio, 1,5 pM de ARNsd/10000 TIL/100 pL de medio, 2 pM de ARNsd/10 000 TIL/100 pL de medio, 5 pM de ARNsd/10000 T il /100 pL de medio, o 10 pM ARNsd/10000 TIL/100 pL de medio. En una realización, uno o más ARNsd dirigidos a genes como los descritos en el presente documento, incluidos PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH, y CBLB, pueden añadirse a cultivos de TIL durante las fases pre-REP o REP dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, o cada siete días.
[0770]Las composiciones de oligonucleótidos de la invención, incluyendo ARNsd, pueden ponerse en contacto con TIL como se describe en el presente documento durante el proceso de expansión, por ejemplo disolviendo ARNsd a altas concentraciones en medios de cultivo celular y dejando tiempo suficiente para que se produzca la captación pasiva. En ciertas realizaciones, el método de la presente invención comprende poner en contacto una población de TIL con una composición de oligonucleótidos como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el método comprende disolver un oligonucleótido,p. ej.,ARNsd, en un medio de cultivo celular y poner en contacto el medio de cultivo celular con una población de TlL. Los TIL pueden ser una primera población, una segunda población y/o una tercera población como se describe en el presente documento.
[0771]En algunas realizaciones, el suministro de oligonucleótidos a las células puede mejorarse mediante métodos adecuados reconocidos en la técnica, incluyendo fosfato de calcio, DMSO, glicerol o dextrano, electroporación, o mediante transfección,p. ej.,utilizando composiciones lipídicas catiónicas, aniónicas o neutras o liposomas utilizando métodos conocidos en la técnica(véase, p. ej.,WO 90/14074; WO 91/16024; WO 91/17424; Pat. de EE.UU. N° 4.897.355; Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21:3567).
[0772]En algunas realizaciones, se utiliza más de un ARNsd para reducir la expresión de un gen diana. En algunas realizaciones, uno o más de los ARNsd PD-1, TIM-3, CBLB, LAG3 y/o CISH diana se utilizan juntos. En algunas realizaciones, una ARNsd PD-1 se utiliza con uno o más de TIM-3, CBLb , LAG3 y/o CISH para reducir la expresión de más de un gen diana. En algunas realizaciones, un ARNsd LAG3 se utiliza en combinación con un ARNsd diana CISH para reducir la expresión génica de ambas dianas. En algunas realizaciones, los ARNsd dirigidos a uno o más de PD-1, TIM-3, CBLB, La G3 y/o CISH están disponibles comercialmente en Advirna LLC, Worcester, MA, USA.
[0773]En algunas realizaciones, el ARNsd se dirige a un gen seleccionado del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, Ct LA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el ARNsd se dirige a un gen seleccionado del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un ARNsd se dirige a PD-1 y otro ARNsd se dirige a un gen seleccionado del grupo que consiste en LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3), y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el ARNsd se dirige a un gen seleccionado entre PD-1, LAG-3, CISH, CBLB, TIM3, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el ARNsd se dirige a un gen seleccionado de PD-1 y uno de LAG3, CISH, CBLB, TIM3, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un ARNsd se dirige a PD-1 y un ARNsd se dirige a LAG3. En algunas realizaciones, un ARNsd se dirige a PD-1 y un ARNsd se dirige a CISH. En algunas realizaciones, un ARNsd se dirige a PD-1 y un ARNsd se dirige a CBLB. En algunas realizaciones, un ARNsd se dirige a LAG3 y un ARNsd se dirige a CISH. En algunas realizaciones, un ARNsd se dirige a LAG3 y un ARNsd se dirige a CBLB. En algunas realizaciones, un ARNsd se dirige a CISH y un ARNsd se dirige a CBLB. En algunas realizaciones, un ARNsd tiene como diana TIM3 y un ARNsd tiene como diana PD-1. En algunas realizaciones, un ARNsd se dirige a TIM3 y un ARNsd se dirige a LAG3. En algunas realizaciones, un ARNsd se dirige a TIM3 y un ARNsd se dirige a CISH. En algunas realizaciones, un ARNsd se dirige a TIM3 y un ARNsd se dirige a CBLB.
[0774]Como se discutió anteriormente, las realizaciones de la presente invención proporcionan linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que han sido modificados genéticamente a través de la edición de genes para mejorar su efecto terapéutico. Las realizaciones de la presente invención abarcan la edición genética mediante la inserción de nucleótidos (ARN o ADN) en una población de TIL tanto para la promoción de la expresión de una o más proteínas como para la inhibición de la expresión de una o más proteínas, así como combinaciones de las mismas. Las realizaciones de la presente invención también proporcionan métodos para expandir los TIL en una población terapéutica, en los que los métodos comprenden la edición genética de los TIL. Existen varias tecnologías de edición genética que pueden utilizarse para modificar genéticamente una población de TIL, que son adecuadas para su uso de acuerdo con la presente invención.
[0775]En algunas realizaciones, el método comprende un método de modificación genética de una población de TIL que incluye la etapa de incorporación estable de genes para la producción de una o más proteínas. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transducción retroviral. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transducción lentiviral. Los sistemas de transducción lentiviral son conocidos en la técnica y se describen,p. ej.,en Levine, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77; Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75; Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71, y Patente de EE. UU. N.° 6,627,442. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transducción gamma-retroviral. Los sistemas de transducción gamma-retroviral son conocidos en la técnica y se describen,p. ej.,en Cepko y Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transferencia de genes mediada por transposones. Los sistemas de transferencia de genes mediados por transposones son conocidos en la técnica e incluyen sistemas en los que la transposasa se proporciona como vector de expresión de ADN o como un ARN expresable o una proteína tal que la expresión a largo plazo de la transposasa no se produce en las células transgénicas, por ejemplo, una transposasa proporcionada como un ARNm(por ejemplo,un ARNm que comprende una caperuza y una cola poli-A). Los sistemas adecuados de transferencia de genes mediada por transposones, incluida la transposasa tipo Tel de tipo salmónido (SB o transposasa de la Bella Durmiente), como SB 10, SB10, y SB SB11, y las enzimas de ingeniería con mayor actividad enzimática, se describen en,p. ej.,Hackett, et al. Patente de EE. UU. N.° 6,489,458.
[0776]En una realización, el método comprende un método de modificación genética de una población de TIL,p. ej.,una primera población, una segunda población y/o una tercera población como se describe en el presente documento. En una realización, un método de modificación genética de una población de TIL incluye la etapa de incorporación estable de genes para la producción o inhibición(p. ej.,silenciamiento) de una o más proteínas. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de electroporación. Los métodos de electroporación son conocidos en la técnica y se describen,por ejemplo,en Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306, y Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2014/0227237 A1. Otros métodos de electroporación conocidos en la técnica, como los descritos en Patentes de EE.UU. N.° 5,019,034; 5,128,257; 5,137,817; 5,173,158; 5,232,856; 5,273,525; 5,304,120; 5,318,514; 6,010,613 y 6,078,490 pueden utilizarse. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación estéril. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada que comprende las etapas de tratar TIL con campos eléctricos pulsados para alterar, manipular, o causar cambios definidos y controlados, permanentes o temporales en los TIL, comprendiendo la etapa de aplicar una secuencia de al menos tres pulsos eléctricos de CC únicos, controlados por el operador, programados independientemente, que tienen intensidades de campo iguales o superiores a 100 V/cm, a los TIL, donde la secuencia de al menos tres pulsos eléctricos de CC tiene una, dos, o tres de las siguientes características: (1) al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en amplitud de pulso; (2) al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en anchura de pulso; y (3) un primer intervalo de pulso para un primer conjunto de dos de los al menos tres pulsos es diferente de un segundo intervalo de pulso para un segundo conjunto de dos de los al menos tres pulsos. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada que comprende las etapas de tratar TIL con campos eléctricos pulsados para alterar, manipular, o causar cambios definidos y controlados, permanentes o temporales, en los TIL, comprendiendo la etapa de aplicar una secuencia de al menos tres pulsos eléctricos de CC únicos, controlados por el operador, programados independientemente, que tienen intensidades de campo iguales o superiores a 100 V/cm, a los TIL, en los que al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en amplitud de pulso. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada que comprende las etapas de tratar TIL con campos eléctricos pulsados para alterar, manipular, o causar cambios definidos y controlados, permanentes o temporales, en los TIL, comprendiendo la etapa de aplicar una secuencia de al menos tres pulsos eléctricos de CC únicos, controlados por el operador, programados independientemente, con intensidades de campo iguales o superiores a 100 V/cm, a los TIL, en los que al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en anchura de pulso. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada que comprende las etapas de tratar TIL con campos eléctricos pulsados para alterar, manipular, o causar cambios definidos y controlados, permanentes o temporales en los TIL, comprendiendo la etapa de aplicar una secuencia de al menos tres pulsos eléctricos de CC únicos, controlada por el operador, programada independientemente, pulsos eléctricos de CC, con intensidades de campo iguales o superiores a 100 V/cm, a los TIL, en la que un primer intervalo de pulsos para un primer conjunto de dos de los al menos tres pulsos es diferente de un segundo intervalo de pulsos para un segundo conjunto de dos de los al menos tres pulsos. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada que comprende las etapas de tratar TIL con campos eléctricos pulsados para inducir la formación de poros en los TIL, comprendiendo la etapa de aplicar una secuencia de al menos tres pulsos eléctricos de CC, con intensidades de campo iguales o superiores a 100 V/cm, a los TIL, donde la secuencia de al menos tres pulsos eléctricos de CC tiene una, dos o tres de las siguientes características: (1) al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en amplitud de pulso; (2) al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en anchura de pulso; y (3) un primer intervalo de pulso para un primer conjunto de dos de los al menos tres pulsos es diferente de un segundo intervalo de pulso para un segundo conjunto de dos de los al menos tres pulsos, de forma que los poros inducidos se mantienen durante un periodo de tiempo relativamente largo, y de forma que se mantiene la viabilidad de los TIL. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transfección de fosfato de calcio. Los métodos de transfección con fosfato cálcico (precipitación del ADN con fosfato cálcico, recubrimiento de la superficie celular y endocitosis) son conocidos en la técnica y se describen en Graham y van der Eb,; Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376; y Chen and Okayarea, Mol. Cell. Biol.
1987, 7, 2745-2752, y en Patente de EE.UU. N.° 5,593,875. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transfección liposomal. Los métodos de transfección liposomal, como los métodos que emplean una formulación liposomal 1:1 (p/p) del lípido catiónico W-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-n,n,n-trimetilamonio cloruro (DOTMA) y dioleoil fophotidiletanolamina (DOPE) en agua filtrada, son conocidos en la técnica y se describen en Rose, et al., y Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417 y en Patentes de EE.UU. N.° 5,279,833; 5,908,635; 6,056,938; 6,110,490; 6,534,484; y 7,687,070. En una realización, un método de modificar genéticamente una población de TIL incluye la etapa de transfección usando métodos descritos en Patentes de EE.UU. N.° 5,766,902; 6,025,337; 6,410,517; 6,475,994; y 7,189,705. Los TIL pueden ser una primera población, una segunda población y/o una tercera población de TIL como se describe en el presente documento.
[0777]Según una realización, el proceso de edición genética puede comprender el uso de una nucleasa programable que media la generación de una rotura de doble cadena o de cadena simple en uno o más genes de punto de control inmunitario. Estas nucleasas programables permiten la edición precisa del genoma mediante la introducción de roturas en loci genómicos específicos, es decir , se basan en el reconocimiento de una secuencia específica de ADN dentro del genoma para dirigir un dominio de nucleasa a esta ubicación y mediar en la generación de una rotura de doble cadena en la secuencia diana. Una rotura de doble cadena en el ADN recluta posteriormente maquinaria de reparación endógena en el lugar de la rotura para mediar en la edición del genoma mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR). Así, la reparación de la rotura puede dar lugar a la introducción de mutaciones de inserción/deleción que alteran(por ejemplo,silencian, reprimen o potencian) el producto génico diana.
[0778]Las principales clases de nucleasas que se han desarrollado para permitir la edición genómica de sitios específicos incluyen nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas similares a activadores de transcripción (TALEN), y nucleasas asociadas a CRISPR(p. ej.,CRISPR/Cas9). Estos sistemas de nucleasas pueden clasificarse a grandes rasgos en dos categorías en función de su modo de reconocimiento del ADN: Las ZFN y las TALEN se unen específicamente al ADN mediante interacciones proteína-ADN, mientras que los sistemas CRISPR, como Cas9, se dirigen a secuencias de ADN específicas mediante una molécula guía de ARN corta que se empareja directamente con el ADN diana y mediante interacciones proteína-ADN.Véase, por ejemplo,Cox et al., Nature Medicine, 2015, vol. 21, n.° 2.
[0779]Ejemplos no limitantes de métodos de edición de genes que pueden usarse de acuerdo con los métodos de expansión de TIL de la presente invención incluyen métodos CRISPR, métodos TALE y métodos ZFN, que se describen con más detalle a continuación. De acuerdo con una realización, un método para expandir los TIL en una población terapéutica puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier realización de los métodos descritos en el presente documento(p. ej.,proceso GEN 3) o como se describe en PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, o PCT/US2018/012633, donde el método comprende además editar genéticamente al menos una porción de los TIL mediante uno o más de un método CRISPR, un método TALE o un método ZFN, con el fin de generar TIL que puedan proporcionar un efecto terapéutico mejorado. Según una realización, los TIL editados genéticamente pueden evaluarse para un efecto terapéutico mejorado comparándolas con los TIL no modificadosin vitro, por ejemplo,evaluando la función efectorain vitro,los perfiles de citocinas, etc. en comparación con los TIL no modificados. En ciertas realizaciones, el método comprende la edición génica de una población de TIL utilizando métodos CRISPR, TALE y/o ZFN.
[0780]En algunas realizaciones de la presente invención, la electroporación se utiliza para la entrega de un sistema de edición de genes, como los sistemas CRISPR, TALEN, y ZFN. En algunas realizaciones de la presente invención, el sistema de electroporación es un sistema de electroporación en flujo. Un ejemplo de un sistema de electroporación por flujo adecuado para su uso con algunas realizaciones de la presente invención es el sistema MaxCyte STX disponible comercialmente. Existen varios instrumentos de electroporación alternativos disponibles comercialmente que pueden ser adecuados para su uso con la presente invención, como el sistema AgilePulse o ECM 830 disponible en BTX-Harvard Apparatus, Cellaxess Elektra (Cellectricon), Nucleofector (Lonza/Amaxa), GenePulser MXcell (BIORAD), iPorator-96 (Primax) o siPORTer96 (Ambion). En algunas realizaciones de la presente invención, el sistema de electroporación forma un sistema cerrado y estéril con el resto del método de expansión de TIL. En algunas realizaciones de la presente invención, el sistema de electroporación es un sistema de electroporación pulsada como se describe en el presente documento, y forma un sistema cerrado y estéril con el resto del método de expansión de TIL.
[0781]Un método para expandir los TIL en una población terapéutica puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier realización de los métodos descritos en el presente documento(p. ej.,el proceso GEN 3) o como se describe en PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605 o PCT/US2018/012633, en el que el método comprende además editar genéticamente al menos una parte de los TIL mediante un método CRISPR(p. ej.,CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1). Según realizaciones particulares, el uso de un método CRISPR durante el proceso de expansión de TIL hace que la expresión de uno o más genes de punto de control inmunitario se silencie o reduzca en al menos una parte de la población terapéutica de TIL. Alternativamente, el uso de un método CRISPR durante el proceso de expansión de TIL hace que la expresión de uno o más genes de punto de control inmunitario se potencie en al menos una parte de la población terapéutica de TIL.
[0782]CRISPR son las siglas de "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats". Un método de uso de un sistema CRISPR para la edición de genes también se denomina en el presente documento método CRISPR. Existen tres tipos de sistemas CRISPR que incorporan ARN y proteínas Cas, y que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención: Tipos I, II y
III. El CRISPR de tipo II (ejemplificado por Cas9) es uno de los sistemas mejor caracterizados.
[0783]La tecnología CRISPR se adaptó a partir de los mecanismos de defensa naturales de bacterias y arqueas (el dominio de los microorganismos unicelulares). Estos organismos utilizan ARN derivado de CRISPR y varias proteínas Cas, incluida Cas9, para frustrar los ataques de virus y otros cuerpos extraños troceando y destruyendo el a Dn de un invasor extraño. Una CRISPR es una región especializada de a Dn con dos características distintas: la presencia de repeticiones de nucleótidos y de espaciadores. Las secuencias repetidas de nucleótidos se distribuyen a lo largo de una región CRISPR con segmentos cortos de ADN extraño (espaciadores) intercalados entre las secuencias repetidas. En el sistema CRISPR/Cas de tipo II, los espaciadores se integran dentro de los loci genómicos CRISPR y se transcriben y procesan en ARN CRISPR corto (ARNcr). Estos ARNcr se unen a los ARNcr transactivadores (ARNcrtra) y dirigen el corte y silenciamiento del ADN patógeno por las proteínas Cas. El reconocimiento de la diana por parte de la proteína Cas9 requiere una secuencia "semilla" dentro del ARNcr y una secuencia conservada con dinucleótidos que contenga un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) antes de la región de unión al ARNcr. De este modo, el sistema CRISPR/Cas puede reorientarse para cortar prácticamente cualquier secuencia de ADN rediseñando el ARNcr. El ARNcr y el ARNtracr en el sistema nativo pueden simplificarse en un único ARN guía (ARNsg) de aproximadamente 100 nucleótidos para su uso en ingeniería genética. El sistema CRISPR/Cas se transporta directamente a las células humanas mediante la distribución conjunta de plásmidos que expresan la endo nucleasa Cas9 y los componentes necesarios del ARNcr. Se pueden utilizar diferentes variantes de las proteínas Cas para reducir las limitaciones de orientación(p. ej.,ortólogos de Cas9, como Cpf1).
[0784]Ejemplos no limitantes de genes que pueden silenciarse o inhibirse mediante edición génica permanente de TIL a través de un método CRISPR incluyen PD-1, CTLA-4, LAG-3, HAVCR2 (TIM-3), Cish, TGFp, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, y GUCY1B3.
[0785]Ejemplos no limitantes de genes que pueden mejorarse editando permanentemente genéticamente TIL mediante un método CRISPR incluyen CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15, e IL-21.
[0786]Ejemplos de sistemas, métodos y composiciones para alterar la expresión de una secuencia génica diana mediante un método CRISPR, y que pueden utilizarse de acuerdo con las realizaciones de la presente invención, se describen en Patentes de EE.UU. N.° 8,697,359; 8,993,233; 8,795,965; 8,771,945; 8,889,356; 8,865,406; 8,999,641; 8,945,839; 8,932,814; 8,871,445; 8,906,6 16; y 8,895,308. Los recursos para llevar a cabo los métodos CRISPR, como los plásmidos para expresar CRISPR/Cas9 y CRISPR/Cpf1, están disponibles comercialmente en empresas como GenScript.
[0787]En una realización, las modificaciones genéticas de poblaciones de TIL, como se describe en el presente documento, pueden llevarse a cabo utilizando el sistema CRISPR/Cpf1 como se describe en Patente de EE.u U. n.° US 9790490.
[0788]Un método para expandir los TIL en una población terapéutica puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier realización de los métodos descritos en el presente documento(p. ej.,el proceso 2A) o como se describe en PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605 o PCT/US2018/012633, en el que el método comprende además la edición genética de al menos una parte de los TIL mediante un método TALE. Según realizaciones particulares, el uso de un método TALE durante el proceso de expansión de TIL hace que la expresión de uno o más genes de punto de control inmunitario se silencie o reduzca en al menos una parte de la población terapéutica de TIL. Alternativamente, el uso de un método TALE durante el proceso de expansión de TIL hace que la expresión de uno o más genes de punto de control inmunitario se potencie en al menos una parte de la población terapéutica de TIL.
[0789]TALE significa proteínas "Efectores de Actividad Similar a Activador de la Transcripción ", que incluyen los TALEN ("Nucleasa Efectora de Actividad Similar a Activador de la Transcripción"). Un método de utilización de un sistema TALE para la edición de genes también puede denominarse en el presente documento método TALE. Los TALE son proteínas naturales de las bacterias fitopatógenas del géneroXanthomonasy contienen dominios de unión al ADN compuestos por una serie de dominios repetidos de 33-35 aminoácidos que reconocen cada uno un único par de bases. La especificidad de TALE viene determinada por dos aminoácidos hipervariables que se conocen como di-residuos de repetición variable (RVD). Las repeticiones modulares TALE están unidas entre sí para reconocer secuencias contiguas de ADN. Un RVD específico en el dominio de unión al ADN reconoce una base en el locus diana, proporcionando una característica estructural para ensamblar dominios de unión al ADN predecibles. Los dominios de unión al ADN de uno TALE se fusionan con el dominio catalítico de una endonucleasa FokI de tipo IIS para crear una nucleasa TALE seleccionable. Para inducir la mutación específica del sitio, dos brazos TALEN individuales, separados por una región espaciadora de 14-20 pares de bases, acercan los monómeros FokI para que dimericen y produzcan una rotura de doble cadena.
[0790]Varios estudios amplios y sistemáticos que utilizan varios métodos de ensamblaje han indicado que las repeticiones TALE pueden combinarse para reconocer virtualmente cualquier secuencia definida por el usuario. Las matrices TALE diseñadas a medida también están disponibles comercialmente a través de Cellectis Bioresearch (París, Francia), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, EE.UU.) y Life Technologies (Grand Island, NY, EE.UU.). Los métodos TALE y TALEN adecuados para su uso en la presente invención se describen en Publicación de la Solicitud de Patente de EE.UU. N°. US 2011/0201118 A1; US 2013/0117869 A1; US 2013/0315884 A1; US 2015/0203871 A1 y US 2016/0120906 A1.
[0791]Ejemplos no limitantes de genes que pueden silenciarse o inhibirse mediante edición génica permanente de TIL a través de un método TALE incluyen PD-1, CTLA-4, LAG-3, HAVCR2 (TIM-3), Cish, TGFp, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, y GUCY1B3.
[0792]Ejemplos no limitantes de genes que pueden mejorarse mediante la edición genética permanente de TIL a través de un método TALE incluyen CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15, e IL-21.
[0793]Ejemplos de sistemas, métodos, y composiciones para alterar la expresión de una secuencia génica diana mediante un método TALE, y que pueden utilizarse de acuerdo con las realizaciones de la presente invención, se describen en Patente de EE. Uu . N.° 8,586,526.
[0794]Un método para expandir las TIL en una población terapéutica puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier realización de los métodos descritos en el presente documento(p. ej.,el proceso GEN 3) o como se describe en PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605 o PCT/US2018/012633, en el que el método comprende además la edición génica de al menos una porción de las TIL mediante un método de dedo de zinc o nucleasa de dedo de zinc. Según realizaciones particulares, el uso de un método de dedos de zinc durante el proceso de expansión de TIL hace que la expresión de uno o más genes de punto de control inmunitario se silencie o reduzca en al menos una parte de la población terapéutica de TIL. Alternativamente, el uso de un método de dedos de zinc durante el proceso de expansión de TIL hace que la expresión de uno o más genes de punto de control inmunitario se potencie en al menos una parte de la población terapéutica de TIL.
[0795]Un dedo de zinc individual contiene aproximadamente 30 aminoácidos en una configuración ppa conservada. Varios aminoácidos de la superficie de la a-hélice suelen entrar en contacto con 3 bp del surco principal del ADN, con distintos niveles de selectividad. Los dedos de zinc tienen dos dominios proteicos. El primer dominio es el de unión al ADN, que incluye factores de transcripción eucarióticos y contiene el dedo de zinc. El segundo dominio es el de la nucleasa, que incluye la enzima de restricción FokI y es responsable de la escisión catalítica del ADN.
[0796]Los dominios de unión al ADN de ZFNs individuales contienen típicamente entre tres y seis repeticiones individuales de dedos de zinc y pueden reconocer cada uno entre 9 y 18 pares de bases. Si los dominios de los dedos de zinc son específicos para el lugar al que se dirigen, entonces incluso un par de ZFN de 3 dedos que reconozcan un total de 18 pares de bases pueden, en teoría, dirigirse a un único locus en el genoma de un mamífero. Un método para generar nuevos conjuntos de dedo de zinc consiste en combinar "módulos" más pequeños de dedo de zinc de especificidad conocida. El proceso de ensamblaje modular más común implica la combinación de tres dedos de zinc separados que pueden reconocer cada uno una secuencia de ADN de 3 pares de bases para generar un conjunto de 3 dedos que puede reconocer un sitio diana de 9 pares de bases. Alternativamente, se pueden utilizar enfoques basados en la selección, como la ingeniería de grupos oligomerizados (OPEN), para seleccionar nuevos conjuntos de dedos de zinc a partir de bibliotecas aleatorias que tengan en cuenta las interacciones dependientes del contexto entre dedos vecinos. Los dedos de zinc de ingeniería están disponibles comercialmente; Sangamo Biosciences (Richmond, CA, EE.UU.) ha desarrollado una plataforma propia (CompoZr®) para la construcción de dedos de zinc en colaboración con Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).
[0797]Ejemplos no limitantes de genes que pueden silenciarse o inhibirse mediante edición génica permanente de TIL a través de un método de dedo de zinc incluyen PD-1, CTLA-4, LAG-3, HAVCR2 (TIM-3), Cish, TGFp, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, y GUCY1B3.
[0798]Ejemplos no limitantes de genes que pueden mejorarse mediante la edición génica permanente de TIL a través de un método de dedo de zinc incluyen CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15, e IL-21.
[0799]Ejemplos de sistemas, métodos y composiciones para alterar la expresión de una secuencia génica diana mediante un método de dedos de zinc, que pueden utilizarse de acuerdo con las realizaciones de la presente invención, se describen en Patentes de e E.UU. N.° 6,534,261, 6,607,882, 6,746,838, 6,794,136, 6,824,978, 6,866,997, 6,933,113, 6,979,539, 7,013,219, 7,030,215, 7,220,7 19, 7,241,573, 7,241,574, 7,585,849, 7,595,376, 6,903,185, y 6,479,626.
[0800]Otros ejemplos de sistemas, métodos y composiciones para alterar la expresión de una secuencia génica diana mediante un método de dedos de zinc, que pueden utilizarse de acuerdo con realizaciones de la presente invención, se describen en Beane, et al., Mol. Therapia, 2015, 23 1380-1390.
[0801]En algunas realizaciones, los TIL son opcionalmente modificados genéticamente para incluir funcionalidades adicionales, incluyendo, pero no limitado a, un receptor de células T de alta afinidad (TCR),p. ej.,un TCR dirigido a un antígeno asociado a tumor como MAGE-1, HER2, o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de superficie celular asociada a tumor(p. ej.,mesotelina) o molécula de superficie celular restringida a linaje(p. ej.,CD19). En ciertas realizaciones, el método comprende la ingeniería genética de una población de TIL para incluir un receptor de células T (TCR) de alta afinidad,p. ej.,un TCR dirigido a un antígeno asociado al tumor como MAGE-1, HER2 o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de superficie celular asociada al tumor(p. ej.,mesotelina) o a una molécula de superficie celular restringida al linaje(p. ej.,CD19). Apropiadamente, la población de TIL puede ser una primera población, una segunda población y/o una tercera población como se describe en el presente documento.
K. Sistemas Cerrados para la Fabricación de TIL
[0802]La presente invención prevé el uso de sistemas cerrados durante el proceso de cultivo de TIL. Estos sistemas cerrados permiten prevenir y/o reducir la contaminación microbiana, utilizar menos matraces y reducir costes. En algunas realizaciones, el sistema cerrado utiliza dos contenedores.
[0803]Tales sistemas cerrados son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm y https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/G uidances/Blood/ucm076779.htm.
[0804]Los dispositivos de conexión estériles (STCD) producen soldaduras estériles entre dos piezas de tubos compatibles. Este procedimiento permite la conexión estéril de diversos recipientes y diámetros de tubo. En algunas realizaciones, los sistemas cerrados incluyen sistemas luer lock y termosellados como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo G. En algunas realizaciones, se accede al sistema cerrado mediante jeringas en condiciones estériles para mantener la esterilidad y la naturaleza cerrada del sistema. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado como el descrito en el Ejemplo G. En algunas realizaciones, los TIL se formulan en un recipiente de formulación final del producto según el método descrito en el Ejemplo G, sección "Formulación final y llenado".
[0805]En algunas realizaciones, el sistema cerrado utiliza un contenedor desde el momento en que se obtienen los fragmentos tumorales hasta que los TIL están listos para su administración al paciente o su crioconservación. En algunas realizaciones cuando se utilizan dos contenedores, el primer contenedor es un contenedor G cerrado y la población de TIL se centrifuga y se transfiere a una bolsa de infusión sin abrir el primer contenedor G cerrado. En algunas realizaciones, cuando se utilizan dos contenedores, la bolsa de infusión es una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol. Un sistema cerrado o sistema cerrado de cultura de células TIL se caracteriza porque una vez que se ha añadido la muestra tumoral y/o los fragmentos tumorales, el sistema se sella herméticamente desde el exterior para formar un entorno cerrado libre de la invasión de bacterias, hongos, y/o cualquier otra contaminación microbiana.
[0806]En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está comprendida entre aproximadamente 5% y aproximadamente 100%. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana se sitúa entre aproximadamente 5% y aproximadamente 95%. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana se sitúa entre aproximadamente 5% y aproximadamente 90%. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana se sitúa entre aproximadamente 10% y aproximadamente 90%. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana se sitúa entre aproximadamente 15% y aproximadamente 85%. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana es de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, o 100%.
[0807]El sistema cerrado permite el crecimiento de TIL en ausencia y/o con una reducción significativa de la contaminación microbiana.
[0808]Además, el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del entorno de cultivo de células TIL varían a medida que se cultivan las células. Por consiguiente, aunque se haga circular un medio apropiado para la cultura celular, el entorno cerrado debe mantenerse constantemente como un entorno óptimo para la proliferación de TIL. Para ello, es deseable que los factores físicos de pH, presión parcial de dióxido de carbono y presión parcial de oxígeno dentro del líquido de cultivo del entorno cerrado se controlen mediante un sensor, cuya señal se utilice para controlar un intercambiador de gas instalado en la entrada del entorno de cultivo, y que la presión parcial de gas del entorno cerrado se ajuste en tiempo real en función de los cambios en el líquido de cultivo para optimizar el entorno de cultivo celular. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un sistema de cultivo celular cerrado que incorpora en la entrada al entorno cerrado un intercambiador de gases equipado con un dispositivo de monitorización que mide el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del entorno cerrado, y optimiza el entorno de cultivo celular ajustando automáticamente las concentraciones de gas basándose en las señales del dispositivo de monitorización.
[0809]En algunas realizaciones, la presión dentro del ambiente cerrado es controlada continua o intermitentemente. Es decir, la presión en el entorno cerrado puede variarse mediante un dispositivo de mantenimiento de la presión, por ejemplo, garantizando así que el espacio sea adecuado para el crecimiento de los TIL en un estado de presión positiva, o promoviendo la exudación de fluido en un estado de presión negativa y promoviendo así la proliferación celular. Además, aplicando presión negativa de forma intermitente, es posible sustituir de forma uniforme y eficaz el líquido circulante en el entorno cerrado mediante una contracción temporal del volumen del entorno cerrado.
[0810]En algunas realizaciones, los componentes de cultivo óptimos para la proliferación de los TIL pueden ser sustituidos o añadidos, e incluyendo factores tales como IL-2 y/o OKT3, así como la combinación, pueden ser añadidos.
L. Criopreservación Opcional de TIL
[0811]La población de TIL en masa (por ejemplo, la segunda población de TIL) o la población expandida de TIL (por ejemplo, la tercera población de TIL) pueden criopreservarse opcionalmente. En algunas realizaciones, la criopreservación tiene lugar en la población terapéutica de TIL. En algunas realizaciones, la criopreservación se produce en los TIL cosechados después de la segunda expansión. En algunas realizaciones, la crioconservación tiene lugar en los TIL en la Etapa F ejemplar de la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan en la bolsa de infusión. En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan antes de colocarlos en una bolsa de infusión. En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan y no se colocan en una bolsa de infusión. En algunas realizaciones, la criopreservación se lleva a cabo utilizando un medio de criopreservación. En algunas realizaciones, el medio de criopreservación contiene dimetilsulfóxido (DMSO). Esto se consigue generalmente poniendo la población de TIL en una solución de congelación, por ejemplo, 85% de suero AB inactivado por complemento y 15% de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80 °C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para su criopreservación. See, Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.
[0812]Cuando sea apropiado, las células son removidas del congelador y descongeladas en un baño de agua a 37 °C hasta que aproximadamente 4/5 de la solución esté descongelada. Por lo general, las células se resuspenden en medios completos y, opcionalmente, se lavan una o más veces. En algunas realizaciones, los TIL descongelados pueden contarse y evaluarse para determinar su viabilidad como se conoce en la técnica.
[0813]En una realización preferida, una población de TIL es criopreservada usando el medio de criopreservación CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions). En una realización preferida, una población de TIL se criopreserva utilizando un medio de criopreservación que contiene dimetilsulfóxido (DMSO). En una realización preferida, una población de TIL se criopreserva utilizando una relación 1:1 (vol:vol) de CS10 y medio de cultura celular. En una realización preferida, una población de TIL se criopreserva utilizando una relación de aproximadamente 1:1 (vol:vol) de CS10 y medio de cultura celular, que comprende además IL-2 adicional.
[0814]Como se discutió anteriormente, y ejemplificado en las Etapas A a E como se proporciona en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), la criopreservación puede ocurrir en numerosos puntos a lo largo del proceso de expansión de TIL. En algunas realizaciones, la población expandida de TIL después de la segunda expansión (como se proporciona, por ejemplo, según la Etapa D de la Figura 1 (en particular, p. ej., la Figura 1B y/o la Figura 1C) puede criopreservarse. La criopreservación puede realizarse generalmente colocando la población de TIL en una solución de congelación,p. ej., 85%de suero AB inactivado con complemento y 15% de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80 °C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para su criopreservación. Véase Sadeghi, et al.,. En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan en DMSO al 5%. En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan en medios de cultura celular más 5% de DMSO. En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan de acuerdo con los métodos proporcionados en el Ejemplo D.
[0815]Cuando sea apropiado, las células son removidas del congelador y descongeladas en un baño de agua a 37 °C hasta que aproximadamente 4/5 de la solución esté descongelada. Por lo general, las células se resuspenden en medios completos y, opcionalmente, se lavan una o más veces. En algunas realizaciones, los TIL descongelados pueden contarse y evaluarse para determinar su viabilidad como se conoce en la técnica.
[0816]En algunos casos, la población TIL de la Etapa B puede ser criopreservada inmediatamente, usando los protocolos discutidos abajo. Alternativamente, la población de TIL a granel puede someterse al Etapa C y al Etapa D y luego criopreservarse después de la Etapa D. De manera similar, en el caso en que los TIL modificados genéticamente se utilizarán en terapia, las poblaciones de TIL de la Etapa B o de la Etapa D pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados.
M. Características fenotípicas de los TIL expandidos
[0817]En alguna realización, los TIL se analizan para la expresión de numerosos marcadores de fenotipo después de la expansión, incluidos los descritos en el presente documento y en los Ejemplos. En una realización, se examina la expresión de uno o más marcadores fenotípicos. En algunas realizaciones, las características fenotípicas de los TIL se analizan después de la primera expansión en la Etapa B. En algunas realizaciones, las características fenotípicas de los TIL se analizan durante la transición en la Etapa C. En algunas realizaciones, las características fenotípicas de los TIL se analizan durante la transición según la Etapa C y después de la criopreservación. En algunas realizaciones, las características fenotípicas de los TIL se analizan después de la segunda expansión según la Etapa D. En algunas realizaciones, las características fenotípicas de los TIL se analizan después de dos o más expansiones según la Etapa D.
[0818]En algunas realizaciones, el marcador se selecciona del grupo que consiste en CD8 y CD28. En algunas realizaciones, se examina la expresión de CD8. En algunas realizaciones, se examina la expresión de CD28. En algunas realizaciones, la expresión de CD8 y/o CD28 es mayor en las TIL producidas según el proceso de la presente invención, en comparación con otros procesos(p. ej.,el proceso Gen 3 proporcionado por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), en comparación con el proceso 2A proporcionado por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la expresión de CD8 es mayor en las TIL producidas según el proceso de la presente invención, en comparación con otros procesos(p. ej.,el proceso Gen 3 proporcionado por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), en comparación con el proceso 2A proporcionado por ejemplo en la Figura 1 (en particular, porejemplo,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la expresión de CD28 es mayor en TIL producidos según el proceso de la presente invención, en comparación con otros procesos(p. ej.,el proceso Gen 3 como se proporciona por ejemplo en la Figura 1 (en particular,porejemplo, la Figura 1B y/o la Figura 1C), en comparación con el proceso 2A como se proporciona por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1A)). En algunas realizaciones, la expresión elevada de CD28 es indicativa de un fenotipo de TIL más joven y presisitente. En una realización, se mide la expresión de uno o más marcadores reguladores.
[0819]En una realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, segunda población de TIL, tercera población de TIL, o población de TIL cosechada basada en la expresión de CD8 y/o CD28 durante cualquiera de las etapas para el método para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) descritos aquí.
[0820]En algunas realizaciones, el porcentaje de células de memoria central es mayor en TILs producidas según el proceso de la invención actual, en comparación con otros procesos(p. ej.,el proceso Gen 3 como se proporciona por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), en comparación con el proceso 2A como se proporciona por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1A)). En algunas realizaciones, el marcador de memoria para las células centrales de memoria se selecciona del grupo formado por CCR7 y CD62L.
[0821]En algunas realizaciones, los subconjuntos de memoria TIL CD4+ y/o CD8+ pueden dividirse en diferentes subconjuntos de memoria. En algunas realizaciones, los TIL CD4+ y/o CD8+ comprenden los TILnaive(CD45R<a>+CD62L+). En algunas realizaciones, los TIL CD4+ y/o CD8+ comprenden los TIL de memoria central (CM; CD45RA-CD62L+). En algunas realizaciones, los TIL CD4+ y/o CD8+ comprenden los TIL de memoria efectora (EM; CD45RA-CD62L-). En algunas realizaciones, los TIL CD4+ y/o CD8+ comprenden los TIL de memoria/efectores de AR+ (TEMRA/TEFF; CD45RA+CD62L+). En algunas realizaciones, hay un mayor % de CD8+ en comparación con la población CD4+.
[0822]En algunas realizaciones, los TIL expresan uno más marcadores seleccionados del grupo que consiste en granzima B, perforina y granulisina. En algunas realizaciones, los TIL expresan granzima B. En algunas realizaciones, los TIL expresan perforina. En algunas realizaciones, los TIL expresan granulisina.
[0823]En una realización, los TIL reestimulados también pueden evaluarse para la liberación de citoquinas, utilizando ensayos de liberación de citoquinas. En algunas realizaciones, los TIL pueden evaluarse para la secreción de interferón-Y (IFN-y). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y se mide mediante un ensayo ELISA. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y se mide mediante un ensayo ELISA después de la segunda etapa de expansión rápida, después de la Etapa D, como se indica, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular,p. ej., en laFigura 1<b>y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la salud de los TIL se mide por la secreción de IFN-gamma (IFN-<y>). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>es indicativa de TIL activos. En algunas realizaciones, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-y. La producción de IFN-y es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-y puede medirse determinando los niveles de la citocina IFN-<y>en los medios de TIL estimulados con anticuerpos frente a CD3, CD28 y CD137/4-1BB. Los niveles de IFN-<y>en el medio de estos TIL estimulados pueden determinarse midiendo la liberación de IFN-y. En algunas realizaciones, un aumento en la producción de IFN-y en, por ejemplo, la Etapa D en el proceso Gen 3 tal como se proporciona en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C) TIL en comparación con, por ejemplo, la Etapa D en el proceso 2A tal como se proporciona en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1A) es indicativo de un aumento en el potencial citotóxico de los TIL de la Etapa D. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>aumenta una, dos, tres, cuatro, o cinco veces o más. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>se multiplica por uno. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y se multiplica por dos. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>se triplica. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>se multiplica por cuatro. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>se multiplica por cinco. En algunas realizaciones, el IFN-<y>se mide utilizando un kit Quantikine ELISA. En algunas realizaciones, el IFN-<y>se mide en TILex vivo.En algunas realizaciones, el IFN-<y>se mide en los TILex vivo,incluidos los TIL producidos por los métodos de la presente invención, incluidos, por ejemplo, los métodos de la Figura 1B.
[0824]En algunas realizaciones, los TIL capaces de al menos una, dos, tres, cuatro, o cinco veces o más secreción de IFN-y son TIL producidos por los métodos de expansión de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, los métodos de la Figura 1B y/o la Figura 1C. En algunas realizaciones, los TIL capaces de secretar al menos una vez más IFN-<y>son TIL producidos por los métodos de expansión de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, los métodos de la Figura 1B y/o la Figura 1C. En algunas realizaciones, los TIL capaces de secretar al menos dos veces más IFN-y son TIL producidos por los métodos de expansión de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, los métodos de la Figura 1B y/o la Figura 1C. En algunas realizaciones, los TIL capaces de secretar al menos tres veces más IFN-<y>son TIL producidos por los métodos de expansión de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, los métodos de la Figura 1B y/o la Figura 1C. En algunas realizaciones, los TIL capaces de secretar al menos cuatro veces más IFN-y son TIL producidos por los métodos de expansión de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, los métodos de la Figura 1B y/o la Figura 1C. En algunas realizaciones, los TIL capaces de secretar al menos cinco veces más IFN-<y>son TIL producidos por los métodos de expansión de la presente invención, incluidos, por ejemplo, los métodos de la Figura 1B y/o la Figura 1C.
[0825]Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos génicos. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión), y C (constante), determinan la especificidad de unión y las aplicaciones posteriores de las inmunoglobulinas y los receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un método para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos por el presente método muestran un aumento de la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, las células TIL obtenidas por el presente método muestran un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con las células TIL recién cosechadas y/o las células TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,por ejemplo,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, los TIL obtenidos por el presente método muestran un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién cosechados y/o los TIL preparados usando métodos a los que se hace referencia como proceso 2A, como se ejemplifica en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1A). En algunas realizaciones, las células TIL obtenidas en la primera expansión muestran un aumento de la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o de la diversidad de receptores de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena pesada de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena ligera de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma, y delta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión de TCRab(es decir,TCRa/p). En algunas realizaciones, el proceso descrito en el presente documento(p. ej.,el proceso Gen 3) muestra una mayor diversidad clonal en comparación con otros procesos, por ejemplo el proceso denominado Gen 2 basado en el número de CDR peptídicas únicas dentro de la muestra(véanse,por ejemplo, las Figuras 12-14).
[0826]En algunas realizaciones, la activación y el agotamiento de TIL pueden determinarse examinando uno o más marcadores. En algunas realizaciones, la activación y el agotamiento pueden determinarse mediante citometría de flujo multicolor. En algunas realizaciones, la activación y el agotamiento de marcadores incluyen pero no se limitan a uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD3, PD-1, 2B4/CD244, CD8, CD25, BTLA, KLRG, TIM-3, CD194/CCR4, CD4, TIGIT, CD183, CD69, CD95, CD127, CD103, y/o LAG-3). En algunas realizaciones, la activación y el agotamiento de marcadores incluyen, entre otros, uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en BTLA, CTLA-4, ICOS, Ki67, LAG-3, PD-1, TIGIT, y/o TIM-3. En algunas realizaciones, la activación y el agotamiento de marcadores incluyen pero no se limitan a uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en BTLA, CTLA-4, ICOS, Ki67, LAG-3, CD103+/CD69+, CD103+/CD69-, PD-1, TIGIT, y/o TIM-3. En algunas realizaciones, los marcadores de células T (incluidos los marcadores de activación y agotamiento) pueden determinarse y/o analizarse para examinar la activación, inhibición o función de las células T. En algunas realizaciones, los marcadores de células T pueden incluir, entre otros, uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en TIGIT, CD3, FoxP3, Tim-3, PD-1, CD103, CTLA-4, LAG-3, BTLA-4, ICOS, Ki67, CD8, CD25, CD45, CD4, y/o CD59.
[0827]En algunas realizaciones, la caracterización fenotípica se examina después de la criopreservación.
N. Otras realizaciones del proceso
[0828]Se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende: (a) obtener una primera población de TIL a partir de un tumor resecado de un sujeto procesando una muestra de tumor obtenida del sujeto en múltiples fragmentos de tumor; (b) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 y OKT-3, en donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante aproximadamente 1 a 8 días para obtener la segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es mayor en número que la primera población de TIL; (c) realizar una segunda expansión rápida poniendo en contacto la segunda población de TIL con un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno exógenas (APC) para producir una tercera población de TIL, donde la segunda expansión rápida se realiza durante aproximadamente 1 a 10 días para obtener la tercera población de TIL, donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL; y (d) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (c). La Etapa de la segunda expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr un escalado del cultivo mediante: (1) realizar la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 2 a 4 días, y a continuación (2) efectuar la transferencia de la segunda población de TIL desde el cultivo a pequeña escala a un segundo contenedor mayor que el primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 500MCS, donde en el segundo contenedor la segunda población de TIL del cultivo a pequeña escala se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de aproximadamente 4 a 8 días. La Etapa de expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr un escalado del cultivo mediante: (1) llevar a cabo la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un primer cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 3 a 4 días, y a continuación (2) efectuar la transferencia y reparto de la segunda población de TIL desde el primer cultivo a pequeña escala a y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos recipientes de igual tamaño que el primer recipiente, en los que en cada segundo recipiente la porción de la segunda población de TIL del primer cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un segundo cultivo a pequeña escala durante un periodo de aproximadamente 4 a 8 días. La Etapa de expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación y una ampliación del cultivo mediante: (1) llevar a cabo la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 2 a 4 días, y a continuación (2) efectuar la transferencia y el reparto de la segunda población de TIL desde el primer cultivo a pequeña escala a y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos contenedores de mayor tamaño que el primer contenedor,p. ej.,contenedores G-REX 500MCS, en los que en cada segundo contenedor la porción de la segunda población de TIL transferida desde el cultivo a pequeña escala a dicho segundo contenedor se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de aproximadamente 4 a 8 días. La Etapa de expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación y una ampliación del cultivo mediante: (1) realizar la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente,p. ej.,un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (2) efectuar la transferencia y repartición de la segunda población de TIL desde el primer cultivo a pequeña escala hacia y entre 2, 3 o 4 segundos recipientes que son más grandes en tamaño que el primer recipiente, por ejemplo, recipientes G-REX 500MCS, en donde en cada segundo recipiente la porción de la segunda población de TIL transferida desde el cultivo a pequeña escala a dicho segundo recipiente se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 5 a 7 días.
[0829]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende: (a) obtener una primera población de TIL a partir de un tumor resecado de un sujeto procesando una muestra de tumor obtenida del sujeto en múltiples fragmentos de tumor; (b) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 y OKT-3, en donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante aproximadamente 1 a 8 días para obtener la segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es mayor en número que la primera población de TIL; (c) realizar una segunda expansión rápida poniendo en contacto la segunda población de TIL con un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno exógenas (APC) para producir una tercera población de TIL, donde la segunda expansión rápida se realiza durante aproximadamente 1 a 8 días para obtener la tercera población de TIL, donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL; y (d) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (c). La Etapa de la segunda expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr un escalado del cultivo mediante: (1) realizar la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 2 a 4 días, y a continuación (2) efectuar la transferencia de la segunda población de TIL desde el cultivo a pequeña escala a un segundo contenedor mayor que el primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 500MCS, donde en el segundo contenedor la segunda población de TIL del cultivo a pequeña escala se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de aproximadamente 4 a 8 días. La Etapa de expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr un escalado del cultivo mediante: (1) llevar a cabo la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un primer cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 2 a 4 días, y a continuación (2) efectuar la transferencia y reparto de la segunda población de TIL desde el primer cultivo a pequeña escala a y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos recipientes de igual tamaño que el primer recipiente, en los que en cada segundo recipiente la porción de la segunda población de TIL del primer cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un segundo cultivo a pequeña escala durante un periodo de aproximadamente 4 a 6 días. La Etapa de expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación y una ampliación del cultivo mediante: (1) llevar a cabo la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 2 a 4 días, y a continuación (2) efectuar la transferencia y el reparto de la segunda población de TIL desde el primer cultivo a pequeña escala a y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos contenedores de mayor tamaño que el primer contenedor,p. ej.contenedores G-REX 500MCS, en los que en cada segundo contenedor la porción de la segunda población de TIL transferida desde el cultivo a pequeña escala a dicho segundo contenedor se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de aproximadamente 4 a 6 días. La Etapa de expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación y una ampliación del cultivo mediante: (1) realizar la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (2) efectuar la transferencia y repartición de la segunda población de TIL desde el primer cultivo a pequeña escala hacia y entre 2, 3 o 4 segundos recipientes que son más grandes en tamaño que el primer recipiente, por ejemplo, recipientes G-REX 500MCS, en donde en cada segundo recipiente la porción de la segunda población de TIL transferida desde el cultivo a pequeña escala a dicho segundo recipiente se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 4 a 5 días.
[0830]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende: (a) obtener una primera población de TIL a partir de un tumor resecado de un sujeto procesando una muestra de tumor obtenida del sujeto en múltiples fragmentos de tumor; (b) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 y OKT-3, en donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante aproximadamente 1 a 7 días para obtener la segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es mayor en número que la primera población de TIL; (c) realizar una segunda expansión rápida poniendo en contacto la segunda población de TIL con un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno exógenas (APC) para producir una tercera población de TIL, donde la segunda expansión rápida se realiza durante aproximadamente 1 a 11 días para obtener la tercera población de TIL, donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL; y (d) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (c). La Etapa de la segunda expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr un escalado del cultivo mediante: (1) realizar la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 3 a 4 días, y a continuación (2) efectuar la transferencia de la segunda población de TIL desde el cultivo a pequeña escala a un segundo contenedor mayor que el primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 500MCS, donde en el segundo contenedor la segunda población de TIL del cultivo a pequeña escala se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de aproximadamente 4 a 7 días. La Etapa de expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr un escalado del cultivo mediante: (1) llevar a cabo la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un primer cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 3 a 4 días, y a continuación (2) efectuar la transferencia y reparto de la segunda población de TIL desde el primer cultivo a pequeña escala a y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos recipientes de igual tamaño que el primer recipiente, en los que en cada segundo recipiente la porción de la segunda población de TIL del primer cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un segundo cultivo a pequeña escala durante un periodo de aproximadamente 4 a 7 días. La Etapa de expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación y una ampliación del cultivo mediante: (1) llevar a cabo la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 3 a 4 días, y a continuación (2) efectuar la transferencia y el reparto de la segunda población de TIL desde el primer cultivo a pequeña escala a y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos contenedores de mayor tamaño que el primer contenedor,p. ej.contenedores G-REX 500MCS, en los que en cada segundo contenedor la porción de la segunda población de TIL transferida desde el cultivo a pequeña escala a dicho segundo contenedor se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de aproximadamente 4 a 7 días. La Etapa de expansión rápida puede dividirse en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación y una ampliación del cultivo mediante: (1) realizar la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 4 días, y luego (2) efectuar la transferencia y repartición de la segunda población de TIL desde el primer cultivo a pequeña escala hacia y entre 2, 3 o 4 segundos recipientes que son más grandes en tamaño que el primer recipiente, por ejemplo, recipientes G-REX 500MCS, en donde en cada segundo recipiente la porción de la segunda población de TIL transferida desde el cultivo a pequeña escala a dicho segundo recipiente se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 5 días.
[0831] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables modificados anteriormente de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza poniendo en contacto la primera población de TIL con un medio de cultivo que comprende además células presentadoras de antígeno (APC) exógenas, en el que el número de APC en el medio de cultivo en la etapa (c) es mayor que el número de APC en el medio de cultivo en la etapa (b).
[0832] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (c) el medio de cultivo se complementa con APC exógenas adicionales.
[0833] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 20:1.
[0834] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 10:1.
[0835] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 9:1.
[0836] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 8:1.
[0837] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida con respecto al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 7:1.
[0838] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 6:1.
[0839] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 5:1.
[0840] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 4:1.
[0841] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 3:1.
[0842] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,9:1.
[0843] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,8:1.
[0844]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,7:1.
[0845]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,6:1.
[0846]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,5:1.
[0847]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,4:1.
[0848]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,3:1.
[0849]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,2:1.
[0850]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2,1:1.
[0851]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,1:1 a entre o aproximadamente 2:1.
[0852]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 10:1.
[0853]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 5:1.
[0854]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 4:1.
[0855]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 3:1.
[0856]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,9:1.
[0857] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,8:1.
[0858] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,7:1.
[0859] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,6:1.
[0860] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,5:1.
[0861] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación entre el número de APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,4:1.
[0862] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,3:1.
[0863] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según sea aplicable, modificado de tal manera que la relación entre el número de APC añadidos en la segunda expansión rápida y el número de APC añadidos en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,2:1.
[0864] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida con respecto al número de APC añadidas en la etapa (b) está en un intervalo de entre o aproximadamente 2:1 a entre o aproximadamente 2,1:1.
[0865] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida con respecto al número de APC añadidas en la etapa (b) es de 2:1 o aproximadamente.
[0866] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC añadidas en la segunda expansión rápida con respecto al número de APC añadidas en la etapa (b) es en o aproximadamente 1,1:1, 12:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1,2:1,2.1:1,2.2:1,2.3:1,2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1,4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1,4.7:1, 4.8:1, 4.9:1 o 5:1.
[0867] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el número de APC añadidas en la primera expansión primaria es en o aproximadamente 1*108, 1.1*108, 1.2*108, 1.3*108, 1.4*108, 1.5*108, 1.6*108, 1.7*108, 1.8*108, 1.9*108, 2*108, 2.1*108, 2.2*108, 2.3*108, 2.4*108, 2.5*108, 2.6*108, 2.7*108, 2.8*108, 2.9*108, 3*108, 3.1*108, 3.2*108, 3.3*108, 3.4*108 u 3.5*108APC, y de tal manera que el número de APC añadidas en la segunda expansión rápida sea de o aproximadamente 3.5*108, 3.6*108, 3.7*108, 3.8*108, 3.9*108, 4*108, 4.1*108, 4.2*108, 4.3*108, 4.4*108, 4.5*108, 4.6*108, 4.7*108, 4.8*108, 4.9*108, 5*108, 5.1*108, 5.2*108, 5.3*108, 5.4*108, 5.5*108, 5.6*108, 5.7*108, 5.8*108, 5.9*108, 6*108, 6.1*108, 6.2*108, 6.3*108, 6.4*108, 6.5*108, 6.6*108, 6.7*108, 6.8*108, 6.9*108, 7*108, 7.1*108, 7.2*108, 7.3*108, 7.4*108, 7.5*108, 7.6*108, 7.7*108, 7.8*108, 7.9*108, 8*108, 8.1*108, 8.2*108, 8.3*108, 8.4*108, 8.5*108, 8.6*108, 8.7*108, 8.8*108, 8.9*108, 9*108, 9.1*108, 9.2*108, 9.3*108, 9.4*108, 9.5*108, 9.6*108, 9.7*108, 9.8*108, 9.9*108 u 1*109 APC.
[0868] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que el número de APC añadidas en la primera expansión primaria está en un intervalo de entre o aproximadamente 1*10® APC a entre o aproximadamente 3,5*10® APC y en el que el número de APC añadidas en la segunda expansión rápida está en un intervalo de entre o aproximadamente 3,5*108 APC a entre o aproximadamente 1*109 APC.
[0869]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el número de APC añadidas en la primera expansión primaria está en un intervalo de entre o aproximadamente 1,5*10® APC a entre o aproximadamente 3*10® APC, y en el que el número de APC añadidas en la segunda expansión rápida está en un intervalo de entre o aproximadamente 4*10® APC a entre o aproximadamente 7,5*10® APC.
[0870]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que el número de APC añadidas en la primera expansión primaria está en un intervalo de entre o aproximadamente 2*10® APC a entre o aproximadamente 2,5*10® APC, y en el que el número de APC añadidas en la segunda expansión rápida está en un intervalo de entre o aproximadamente 4,5*10® APC a entre o aproximadamente 5,5*10® APC.
[0871]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que se añaden al menos 2,5*10® APC a la primera expansión primaria y al menos 5*10® APC a la segunda expansión rápida.
[0872]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según se aplica anteriormente modificado de tal manera que las células presentadoras de antígeno son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
[0873]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que los múltiples fragmentos tumorales se distribuyen en una pluralidad de recipientes separados, en cada uno de los cuales recipientes separados se obtiene la primera población de TIL en la etapa (a), la segunda población de TIL en la etapa (b), y la tercera población de TIL en la etapa (c), y las poblaciones terapéuticas de TIL de la pluralidad de recipientes en la etapa (c) se combinan para producir la población de TlL cosechada de la etapa (d).
[0874]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que los tumores múltiples se distribuyen uniformemente en la pluralidad de recipientes separados.
[0875]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la pluralidad de recipientes separados comprende al menos dos recipientes separados.
[0876]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a veinte recipientes separados.
[0877]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a quince recipientes separados.
[0878]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a diez recipientes separados.
[0879]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a cinco recipientes separados.
[0880]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la pluralidad de recipientes separados comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, ®, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1®, 19, o 20 recipientes separados.
[0881]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que para cada contenedor en el que se realiza la primera expansión con sensibilización sobre una primera población de TIL en la etapa (b) la segunda expansión rápida en el paso (c) se realiza en el mismo contenedor sobre la segunda población de TIL producida a partir de dicha primera población de TIL.
[0882]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada uno de los recipientes separados comprende una primera
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área de superficie permeable al gas.
[0883] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los múltiples fragmentos tumorales se distribuyen en un único recipiente.
[0884] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el recipiente único comprende una primera área de superficie permeable al gas.
[0885] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que en la etapa (b) las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de al menos una capa celular a al menos tres capas celulares.
[0886] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 1,5 capas celulares a al menos aproximadamente 2,5 capas celulares.
[0887] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 2 capas celulares.
[0888] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 1, 1.1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 o 3 capas celulares.
[0889] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 3 capas celulares a al menos aproximadamente 10 capas celulares.
[0890] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 4 capas celulares a al menos aproximadamente 8 capas celulares.
[0891] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (c) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 capas celulares.
[0892] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (c) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor promedio de en o aproximadamente 4, 4.1,4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 u 8 capas celulares.
[0893] La presente divulgación proporciona un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión con sensibilización se realiza en un primer recipiente que comprende una primera área de superficie permeable al gas y en la etapa (c) la segunda expansión rápida se realiza en un segundo recipiente que comprende una segunda área de superficie permeable al gas.
[0894] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el segundo recipiente es más grande que el primer recipiente.
[0895] Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que en la etapa (b) las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de al menos una capa celular a al menos tres capas celulares.
[0896] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 1,5 capas celulares a al menos aproximadamente 2,5 capas celulares.
[0897] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 2 capas celulares.
[0898] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor promedio de en o aproximadamente 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1.1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 o 3 capas celulares.
[0899] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (c) las APC se estratifican sobre la segunda área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 3 capas celulares a al menos aproximadamente 10 capas celulares.
[0900] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (c) las APC se estratifican sobre la segunda área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos unas 4 capas celulares a al menos unas 8 capas celulares.
[0901] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (c) las APC se estratifican sobre la segunda área de superficie permeable al gas a un grosor medio de entre o aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 capas celulares.
[0902] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (c) las APC se estratifican sobre la segunda área de superficie permeable al gas a un grosor promedio de entre o aproximadamente 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 u 8 capas celulares.
[0903] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión con sensibilización se realiza en un primer recipiente que comprende una primera superficie permeable al gas y en la etapa (c) la segunda expansión rápida se realiza en el primer recipiente.
[0904] Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que en la etapa (b) las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de al menos una capa celular a al menos tres capas celulares.
[0905] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 1,5 capas celulares a al menos aproximadamente 2,5 capas celulares.
[0906] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de entre o aproximadamente 2 capas celulares.
[0907] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor promedio de entre o aproximadamente 1, 1.1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 o 3 capas celulares.
[0908] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 3 capas celulares a al menos aproximadamente 10 capas celulares.
[0909] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de al menos aproximadamente 4 capas celulares a al menos aproximadamente 8 capas celulares.
[0910]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (c) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor medio de entre o aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 capas celulares.
[0911]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (c) las APC se estratifican sobre la primera área de superficie permeable al gas a un grosor promedio de entre o aproximadamente 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 u 8 capas celulares.
[0912]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,1 a entre o aproximadamente 1:10.
[0913]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,1 a entre o aproximadamente 1:9.
[0914]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,1 a entre o aproximadamente 1:8.
[0915]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,1 a entre o aproximadamente 1:7.
[0916]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,1 a entre o aproximadamente 1:6.
[0917]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,1 a entre o aproximadamente 1:5.
[0918]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,1 a entre o aproximadamente 1:4.
[0919]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,1 a entre o aproximadamente 1:3.
[0920]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,1 a entre o aproximadamente 1:2.
[0921]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,2 a entre o aproximadamente 1:8.
[0922]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,3 a entre o aproximadamente 1:7.
[0923]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,4 a entre o aproximadamente 1:6.
[0924] Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,5 a aproximadamente 1:5.
[0925]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,6 a aproximadamente 1:4.
[0926]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,7 a aproximadamente 1:3.5.
[0927]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,8 a aproximadamente 1:3.
[0928]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:1,9 a aproximadamente 1:2.5.
[0929]Se divulga en el presente documento un método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) está en un intervalo de entre o aproximadamente 1:2.
[0930] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza suplementando el medio de cultivo celular de la primera población de TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en el que el número de APC añadidas en la etapa (c) es mayor que el número de APC añadidas en la etapa (b), y en el que la relación entre el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (b) y el número medio de capas de APC dispuestas en la etapa (c) se selecciona de entre o aproximadamente 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9 o 1:10.
[0931] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de TIL en la segunda población de TIL con respecto al número de TIL en la primera población de TIL es de al menos aproximadamente 1,5:1 a al menos aproximadamente 100:1.
[0932] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de TIL en la segunda población de TIL con respecto al número de TIL en la primera población de TIL es de al menos aproximadamente 50:1.
[0933] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de TIL en la segunda población de TIL con respecto al número de TIL en la primera población de TIL es de al menos aproximadamente 25:1.
[0934] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de TIL en la segunda población de TIL con respecto al número de TIL en la primera población de TIL es de al menos aproximadamente 20:1.
[0935] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de TIL en la segunda población de TIL con respecto al número de TIL en la primera población de TIL es de al menos aproximadamente 10:1.
[0936] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la segunda población de TIL es al menos o aproximadamente 50 veces mayor en número que la primera población de TIL.
[0937] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que la segunda población de TIL es al menos en o aproximadamente 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-, 21-, 22-, 23-, 24-, 25-, 26-, 27-, 28-, 29-, 30-, 31-, 32-, 33-, 34-, 35-, 36-, 37-, 38-, 39-, 40-, 41-, 42-, 43-, 44-, 45-, 46-, 47-, 48-, 49- o 50 veces mayor en número que la primera población de TIL.
[0938] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en o aproximadamente 2 días o en o aproximadamente 3 días después del comienzo del segundo periodo en la etapa (c), el medio de cultivo celular se suplementa con IL-2 adicional.
[0939] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado para comprender además la etapa de crioconservar la población TIL cosechada en la etapa (d) usando un proceso de crioconservación.
[0940] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado para comprender realizar después de la etapa (d) la etapa adicional de (e) transferir la población TIL cosechada de la etapa (d) a una bolsa de infusión que contiene opcionalmente HipoThermosol.
[0941] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado para comprender la etapa de crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población TIL cosechada en la etapa (e) utilizando un proceso de crioconservación.
[0942] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el proceso de criopreservación se realiza utilizando una relación 1:1 de población TIL cosechada a medio de criopreservación.
[0943]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que las células presentadoras de antígeno son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
[0944]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que las PBMC son irradiadas y alogénicas.
[0945]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según se aplica anteriormente modificado de tal manera que el número total de APC añadidas al cultivo celular en la etapa (b) es 2,5*108.
[0946]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el número total de APC añadidas al cultivo celular en la etapa (c) es 5*108
[0947]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que las APC son PBMC.
[0948]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que las PBMC son irradiadas y alogénicas.
[0949]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que las células presentadoras de antígeno son células presentadoras de antígeno artificiales.
[0950]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la cosecha en la etapa (d) se realiza utilizando un sistema de procesamiento celular basado en membrana.
[0951]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la cosecha en la etapa (d) se realiza utilizando un sistema de procesamiento de células LOVO.
[0952]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 5 a entre o aproximadamente 60 fragmentos por envase en la etapa (b).
[0953]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 10 a entre o aproximadamente 60 fragmentos por envase en la etapa (b).
[0954]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 15 a entre o aproximadamente 60 fragmentos por envase en la etapa (b).
[0955]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 20 a entre o aproximadamente 60 fragmentos por envase en la etapa (b).
[0956]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 25 a entre o aproximadamente 60 fragmentos por envase en la etapa (b).
[0957]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 30 a entre o aproximadamente 60 fragmentos por envase en la etapa (b).
[0958]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 35 a entre o aproximadamente 60 fragmentos por envase en la etapa (b).
[0959]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 40 a entre o aproximadamente 60 fragmentos por envase en la etapa (b).
[0960]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 45 a entre o aproximadamente 60 fragmentos por envase en la etapa (b).
[0961]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 50 a entre o aproximadamente 60 fragmentos por envase en la etapa (b).
[0962]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden en o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 fragmento(s) por recipiente en la etapa (b).
[0963]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada fragmento tiene un volumen de entre o aproximadamente 27 mm3
[0964]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada fragmento tiene un volumen de entre o aproximadamente 20 mm3 a entre o aproximadamente 50 mm3.
[0965]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada fragmento tiene un volumen de entre o aproximadamente 21 mm3 a entre o aproximadamente 30 mm3.
[0966]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada fragmento tiene un volumen de entre o aproximadamente 22 mm3 a entre o aproximadamente 29,5 mm3.
[0967]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada fragmento tiene un volumen de entre o aproximadamente 23 mm3 a entre o aproximadamente 29 mm3.
[0968]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada fragmento tiene un volumen de entre o aproximadamente 24 mm3 a entre o aproximadamente 28,5 mm3.
[0969]En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada fragmento tiene un volumen de entre o aproximadamente 25 mm3 a entre o aproximadamente 28 mm3.
[0970]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada fragmento tiene un volumen de entre o aproximadamente 26,5 mm3 a entre o aproximadamente 27,5 mm3.
[0971]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada fragmento tiene un volumen de entre o aproximadamente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 mm3.
[0972]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 30 a entre o aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de entre o aproximadamente 1300 mm3 a entre o aproximadamente 1500 mm3.
[0973]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de entre o aproximadamente 1350 mm3.
[0974]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que los fragmentos múltiples comprenden de entre o aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de de entre o aproximadamente 1 gramo a entre o aproximadamente 1,5 gramos.
[0975]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el medio de cultivo celular se proporciona en un contenedor que es un contenedor G o una bolsa celular Xuri.
[0976] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según se aplica anteriormente modificado de tal manera que la concentración de IL-2 en el medio de cultivo celular es de aproximadamente 10.000 UI/mL a aproximadamente 5.000 UI/mL.
[0977] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la concentración de IL-2 en el medio de cultivo celular es de aproximadamente 6.000 UI/mL.
[0978] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el medio de criopreservación comprende dimetilsulfóxido (DMSO).
[0979] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el medio de criopreservación comprende de 7% a 10% de DMSO.
[0980] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el primer periodo en la etapa (b) se realiza dentro de un periodo de entre o aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, o 7 días.
[0981] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el segundo periodo en la etapa (c) se realiza dentro de un periodo de entre o aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días u 11 días.
[0982] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el primer periodo en la etapa (b) y el segundo periodo en la etapa (c) se realizan cada uno individualmente dentro de un periodo de entre o aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, o 7 días.
[0983] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el primer periodo en la etapa (b) y el segundo periodo en la etapa (c) se realizan cada uno individualmente dentro de un periodo de entre o aproximadamente 5 días, 6 días, o 7 días.
[0984] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el primer periodo en la etapa (b) y el segundo periodo en la etapa (c) se realizan cada uno individualmente dentro de un periodo de entre o aproximadamente 7 días.
[0985] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 14 días a en o aproximadamente 18 días.
[0986] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 15 días a en o aproximadamente 18 días.
[0987] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 16 días a en o aproximadamente 18 días.
[0988] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 17 días a en o aproximadamente 18 días.
[0989] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 14 días a en o aproximadamente 17 días.
[0990] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 15 días a en o aproximadamente 17 días.
[0991] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 16 días a en o aproximadamente 17 días.
[0992] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 14 días a en o aproximadamente 16 días.
[0993] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 15 días a en o aproximadamente 16 días.
[0994] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 14 días.
[0995] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 15 días.
[0996] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 16 días.
[0997] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 17 días.
[0998] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de en o aproximadamente 18 días.
[0999] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de entre o aproximadamente 14 días o menos.
[1000] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de entre o aproximadamente 15 días o menos.
[1001] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de entre o aproximadamente 16 días o menos.
[1002] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de entre o aproximadamente 17 días o menos.
[1003] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de entre o aproximadamente 18 días o menos.
[1004] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la población terapéutica de TIL cosechada en la etapa (d) comprende suficientes TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
[1005] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el número de TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz es de entre o aproximadamente 2,3*1010 a entre o aproximadamente 13,7*1010
[1006] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la tercera población de TIL en la etapa (c) proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón-gamma, y/o una mayor policlonalidad.
[1007] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la tercera población de TIL en la etapa (c) proporciona al menos una producción de interferón-gamma de una a cinco veces o más en comparación con los TIL preparados mediante un proceso de más de 16 días.
[1008] La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la tercera población de TIL en la etapa (c) proporciona al menos una producción de interferón-gamma de una a cinco veces o más en comparación con los TIL preparados mediante un proceso de más de 17 días.
[1009]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la tercera población de TIL en la etapa (c) proporciona al menos una producción de interferón-gamma de una a cinco veces o más en comparación con los TIL preparados mediante un proceso de más de 18 días.
[1010]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la tercera población de TIL etapa (c) exhiben una mayor expresión de CD8 y CD28 en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células etapa (b).
[1011]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada contenedor recitado en el método es un contenedor cerrado.
[1012]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que cada contenedor recitado en el método es un contenedor G.
[1013]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que cada contenedor recitado en el método es un GREX-10.
[1014]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que cada recipiente recitado en el método es un g ReX-100.
[1015]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que cada contenedor recitado en el método es un GREX-500.
[1016]La presente divulgación proporciona la población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) fabricada por el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda.
[1017]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparada a partir de tejido tumoral de un paciente, en la que la población terapéutica de TIL proporciona mayor eficacia, mayor producción de interferón-gamma y/o mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin células presentadoras de antígenos (APC) u OKT3 añadidas.
[1018]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparada a partir de tejido tumoral de un paciente, en la que la población terapéutica de TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón gamma, y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin células presentadoras de antígenos (APC) añadidas.
[1019]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparada a partir de tejido tumoral de un paciente, en la que la población terapéutica de TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón-gamma, y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin OKT3 añadido.
[1020]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparada a partir de tejido tumoral de un paciente, en la que la población terapéutica de TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón gamma, y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin células presentadoras de antígenos (APC) añadidas y sin OKT3 añadido.
[1021]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparada a partir de tejido tumoral de un paciente, en la que la población terapéutica de TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón-gamma y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso de más de 16 días.
[1022]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparada a partir de tejido tumoral de un paciente, en la que la población terapéutica de TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón-gamma y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso de más de 17 días.
[1023]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparada a partir de tejido tumoral de un paciente, en la que la población terapéutica de TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón-gamma y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso de más de 18 días.
[1024]La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente que proporciona un aumento de la producción de interferón-gamma.
[1025]La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente que proporciona policlonalidad aumentada.
[1026]La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente que proporciona una eficacia aumentada.
[1027]La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificada de tal manera que la población terapéutica de TIL es capaz de al menos una vez más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparadas mediante un proceso de más de 16 días. La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificada de tal manera que la población terapéutica de TIL es capaz de al menos una vez más producción de interferón-gamma en comparación con<t>I<l>preparadas mediante un proceso de más de 17 días. La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificada de tal manera que la población terapéutica de TIL es capaz de al menos una vez más producción de interferón-gamma en comparación con t Il preparadas mediante un proceso de más de 18 días. En algunas realizaciones, los TIL se vuelven capaces de producir al menos una vez más interferóngamma debido al proceso de expansión descrito en el presente documento, por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1028]La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificada de tal manera que la población terapéutica de TIL es capaz de al menos dos veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparadas mediante un proceso de más de 16 días. La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificada de tal manera que la población terapéutica de TIL es capaz de al menos dos veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparadas mediante un proceso de más de 17 días. La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificada de tal manera que la población terapéutica de TIL es capaz de al menos dos veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparadas mediante un proceso de más de 18 días. En algunas realizaciones, los TIL se vuelven capaces de producir al menos dos veces más interferón-gamma debido al proceso de expansión descrito en el presente documento, por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1029]La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificada de tal manera que la población terapéutica de TIL es capaz de al menos tres veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparadas mediante un proceso de más de 16 días. La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificada de tal manera que la población terapéutica de TIL es capaz de al menos tres veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparadas mediante un proceso de más de 17 días. La presente divulgación proporciona la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificada de tal manera que la población terapéutica de TIL es capaz de al menos tres veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparadas mediante un proceso de más de 18 días. En algunas realizaciones, los TIL se vuelven capaces de producir al menos tres veces más interferón-gamma debido al proceso de expansión descrito en el presente documento, por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1030]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que es capaz de producir al menos una vez más interferón-gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ninguna célula presentadora de antígeno (APC) añadida. En algunas realizaciones, los TIL se vuelven capaces de producir al menos una vez más interferón-gamma debido al proceso de expansión descrito en el presente documento, por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1031]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) que es capaz de al menos una vez más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparados por un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ningún OKT3 añadido. En algunas realizaciones, los TIL se vuelven capaces de producir al menos una vez más interferón-gamma debido al proceso de expansión descrito en el presente documento, por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1032]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de TIL que es capaz de al menos dos veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparadas mediante un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ninguna APC añadida. En algunas realizaciones, los TIL se vuelven capaces de producir al menos dos veces más interferón-gamma debido al proceso de expansión descrito en el presente documento, por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1033]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de TIL que es capaz de al menos dos veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparados por un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ningún OKT3 añadido. En algunas realizaciones, los TIL se vuelven capaces de producir al menos dos veces más interferón-gamma debido al proceso de expansión descrito en el presente documento, por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1034]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de TIL que es capaz de al menos tres veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparados por un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ninguna APC añadida. En algunas realizaciones, los TIL se vuelven capaces de producir al menos una vez más interferón-gamma debido al proceso de expansión descrito en el presente documento, por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1035]La presente divulgación proporciona una población terapéutica de TIL que es capaz de al menos tres veces más producción de interferón-gamma en comparación con TIL preparados por un proceso en el que la primera expansión de TIL se realiza sin ningún OKT3 añadido. En algunas realizaciones, los TIL se vuelven capaces de producir al menos tres veces más interferón-gamma debido al proceso de expansión descrito en el presente documento, por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1036]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que los fragmentos tumorales son biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias de núcleo, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina.
[1037]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que los fragmentos tumorales son biopsias de núcleo.
[1038]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que los fragmentos tumorales son aspirados con aguja fina.
[1039]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que los fragmentos tumorales son biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados).
[1040]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que los fragmentos tumorales son biopsias con aguja gruesa.
[1041]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según sea aplicable, modificado de tal manera que (i) el método comprende obtener la primera población de TIL a partir de una o más biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias centrales, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del sujeto, (ii) el método comprende realizar la etapa de cultivar la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 durante un periodo de aproximadamente 3 días antes de realizar la etapa de la primera expansión con sensibilización, (iii) el método comprende realizar la primera expansión con sensibilización durante un periodo de aproximadamente 8 días, y (iv) el método comprende realizar la segunda expansión rápida durante un periodo de aproximadamente 11 días. En algunas de las realizaciones anteriores, las etapas del método se completan en aproximadamente 22 días.
[1042]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según sea aplicable, modificado de tal manera que (i) el método comprende obtener la primera población de TIL a partir de una o más biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias centrales, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del sujeto, (ii) el método comprende realizar la etapa de cultivar la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 durante un periodo de aproximadamente 3 días antes de realizar la etapa de la primera expansión con sensibilización, (iii) el método comprende realizar la primera expansión con sensibilización durante un periodo de aproximadamente 8 días, y (iv) el método comprende realizar la segunda expansión rápida cultivando el cultivo de la segunda población de TIL durante aproximadamente 5 días, dividiendo el cultivo en hasta 5 subcultivos y cultivando los subcultivos durante aproximadamente 6 días. En algunas de las realizaciones anteriores, cada uno de los hasta 5 subcultivos se cultiva en un recipiente del mismo tamaño o mayor que el recipiente en el que se inicia el cultivo de la segunda población de TIL en la segunda expansión rápida. En algunas de las realizaciones anteriores, el cultivo de la segunda población de TIL se divide por igual entre los hasta 5 subcultivos. En algunas de las realizaciones anteriores, las etapas del método se completan en aproximadamente 22 días.
[1043]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1 a aproximadamente 20 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias centrales, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del sujeto.
[1044]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1 a aproximadamente 10 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias centrales, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del sujeto.
[1045]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias centrales, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del sujeto.
[1046]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias centrales, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del sujeto.
[1047]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene de 1 a aproximadamente 20 biopsias de núcleo de tejido tumoral del sujeto.
[1048]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene de 1 a aproximadamente 10 biopsias de núcleo de tejido tumoral del sujeto.
[1049]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 biopsias de núcleo de tejido tumoral del sujeto.
[1050]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 biopsias centrales de tejido tumoral del sujeto.
[1051]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene de 1 a aproximadamente 20 aspirados con aguja fina de tejido tumoral del sujeto.
[1052]párrafos aplicables modificados de tal manera que la primera población de TIL se obtiene de 1 a aproximadamente 10 aspirados con aguja fina de tejido tumoral del sujeto.
[1053]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aspirados con aguja fina de tejido tumoral del sujeto.
[1054]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aspirados con aguja fina de tejido tumoral del sujeto.
[1055]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene de 1 a aproximadamente 20 biopsias con aguja gruesa de tejido tumoral del sujeto.
[1056]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene de 1 a aproximadamente 10 biopsias con aguja gruesa de tejido tumoral del sujeto.
[1057]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 biopsias con aguja gruesa de tejido tumoral del sujeto.
[1058]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 biopsias con aguja gruesa de tejido tumoral del sujeto.
[1059]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1 a aproximadamente 20 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados) de tejido tumoral del sujeto.
[1060]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene de 1 a aproximadamente 10 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados) de tejido tumoral del sujeto.
[1061]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados) de tejido tumoral del sujeto.
[1062]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de TIL se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados) de tejido tumoral del sujeto.
[1063]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que (i) el método comprende obtener la primera población de TIL a partir de 1 a aproximadamente 10 biopsias de núcleo de tejido tumoral del sujeto, (ii) el método comprende realizar la etapa de cultivar la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 durante un periodo de aproximadamente 3 días antes de realizar la etapa de la primera expansión con sensibilización, (iii) el método comprende realizar la etapa de la primera expansión con sensibilización cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo que comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) durante un periodo de aproximadamente 8 días para obtener la segunda población de TIL, y (iv) el método comprende realizar la etapa de la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de TIL en un medio de cultivo que comprende IL-2, OKT-3 y APC durante un periodo de aproximadamente 11 días. En algunas de las realizaciones anteriores, las etapas del método se completan en aproximadamente 22 días.
[1064]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que (i) el método comprende obtener la primera población de TIL de 1 a aproximadamente 10 biopsias de núcleo de tejido tumoral del sujeto, (ii) el método comprende realizar la etapa de cultivar la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 durante un periodo de aproximadamente 3 días antes de realizar la etapa de la primera expansión con sensibilización, (iii) el método comprende realizar la etapa de la primera expansión con sensibilización cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo que comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) durante un periodo de aproximadamente 8 días para obtener la segunda población de TIL, y (iv) el método comprende realizar la segunda expansión rápida cultivando el cultivo de la segunda población de TIL en un medio de cultivo que comprende IL-2, OKT-3 y APC durante aproximadamente 5 días, dividiendo el cultivo en hasta 5 subcultivos y cultivando cada uno de los subcultivos en un medio de cultivo que comprende IL-2 durante aproximadamente 6 días. En algunas de las realizaciones anteriores, cada uno de los hasta 5 subcultivos se cultiva en un recipiente del mismo tamaño o mayor que el recipiente en el que se inicia el cultivo de la segunda población de TIL en la segunda expansión rápida. En algunas de las realizaciones anteriores, el cultivo de la segunda población de TIL se divide por igual entre los hasta 5 subcultivos. En algunas de las realizaciones anteriores, las etapas del método se completan en aproximadamente 22 días.
[1065]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que (i) el método comprende obtener la primera población de TIL a partir de 1 a aproximadamente 10 biopsias de núcleo de tejido tumoral del sujeto, (ii) el método comprende realizar la etapa de cultivar la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende 6000 UI IL-2/ml en 0,5 L de medio de cultivo CM1 en un matraz G-Rex 100M durante un periodo de aproximadamente 3 días antes de realizar la etapa de la primera expansión con sensibilización.5 L de medio de cultivo CM1 en un matraz G-Rex 100M durante un periodo de aproximadamente 3 días antes de realizar la etapa de la primera expansión con sensibilización, (iii) el método comprende realizar la primera expansión con sensibilización añadiendo 0,5 L de medio de cultivo CM1 que contiene IL-2/ml.5 L de medio de cultivo CM1 que contiene 6000 UI/ml de IL-2, 30 ng/ml de OKT-3, y aproximadamente 108 células alimentadoras y cultivar durante un periodo de aproximadamente 8 días, y (iv) el método comprende realizar la segunda expansión rápida (a) transfiriendo la segunda población de TIL a un matraz G-Rex 500MCS que contiene 5 L de medio de cultivo CM2 con 3000 UI/ml de IL-2, 30 ng/ml OKT-3, y 5*109 células alimentadoras y cultivar durante aproximadamente 5 días (b) dividir el cultivo en hasta 5 subcultivos transfiriendo 109 TIL a cada uno de hasta 5 matraces G-Rex 500MCS que contienen 5 L de medio AIM-V con 3000 UI/ml IL-2, y cultivar los subcultivos durante aproximadamente 6 días. En algunas de las realizaciones anteriores, las etapas del método se completan en aproximadamente 22 días.
[1066]La presente divulgación proporciona un método de expansión de células T que comprende: (a) realizar una primera expansión con sensibilización de una primera población de células T obtenida de un donante cultivando la primera población de células T para efectuar el crecimiento y sensibilizar una activación de la primera población de células T; (b) después de que la activación de la primera población de células T sensibilizada en la etapa (a) comienza a decaer, realizar una segunda expansión rápida de la primera población de células T cultivando la primera población de células T para efectuar el crecimiento y sensibilizar la activación de la primera población de células T para obtener una segunda población de células T; y (c) cosechar la segunda población de células T. En otra realización, la etapa de la segunda expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalado del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej. ,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 3 a 4 días, y después (b) efectuar la transferencia de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala a un segundo contenedor mayor que el primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 500MCS, y cultivar la primera población de células T del cultivo a pequeña escala en un cultivo a mayor escala en el segundo contenedor durante un periodo de aproximadamente 4 a 7 días. En otra realización, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalado del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un primer cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 3 a 4 días, y a continuación (b) efectuando la transferencia y reparto de la primera población de células T desde el primer cultivo a pequeña escala a y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos recipientes de igual tamaño que el primer recipiente, en los que en cada segundo recipiente la porción de la primera población de células T del primer cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un segundo cultivo a pequeña escala durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. En otra realización, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalado y un aumento de escala del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y a continuación (b) efectuar la transferencia y distribución de la primera población de células T desde el cultivo a pequeña escala a y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos contenedores de mayor tamaño que el primer contenedor,p. ej.,contenedores G-REX 500MCS, en los que en cada segundo contenedor la porción de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo contenedor se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. En otra realización, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalado y un aumento de escala del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 4 días, y después (b) efectuar la transferencia y reparto de la primera población de células T desde el cultivo a pequeña escala a y entre 2, 3 o 4 segundos contenedores que son mayores en tamaño que el primer contenedor,p. ej.,contenedores G-REX 500MCS, en los que en cada segundo contenedor la porción de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo contenedor se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de aproximadamente 5 días.
[1067]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que la etapa de la segunda expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalado del cultivo mediante: (a) realizando la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente,p. ej.,un recipiente G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 2 a 4 días, y a continuación (b) efectuando la transferencia de la primera población de células T desde el cultivo a pequeña escala a un segundo recipiente mayor que el primer recipiente,p. ej.,un recipiente G-REX 500MCS, y cultivando la primera población de células T desde el cultivo a pequeña escala en un cultivo a mayor escala en el segundo recipiente durante un periodo de aproximadamente 5 a 7 días.
[1068]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalado del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un primer cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, p. ej., un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 2 a 4 días, y a continuación (b) efectuando la transferencia y el reparto de la primera población de células T desde el primer cultivo a pequeña escala a y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segundos recipientes de igual tamaño que el primer recipiente, en los que en cada segundo recipiente la porción de la primera población de células T del primer cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un segundo cultivo a pequeña escala durante un período de aproximadamente 5 a 7 días.
[1069]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalado y ampliación del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente,p. ej.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 2 a 4 días, y a continuación (b) efectuar la transferencia y distribución de la primera población de células T desde el cultivo a pequeña escala a y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 segundos contenedores de mayor tamaño que el primer contenedor,p. ej.,contenedores G-REX 500MCS, en los que en cada segundo contenedor la porción de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo contenedor se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 5 a 7 días.
[1070]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación y ampliación del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. e j.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 3 a 4 días, y después (b) efectuar la transferencia y reparto de la primera población de células T desde el cultivo a pequeña escala a y entre 2, 3 o 4 segundos contenedores que son mayores en tamaño que el primer contenedor,p. ej.,contenedores G-REX 500MCS, en los que en cada segundo contenedor la porción de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo contenedor se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de aproximadamente 5 a 6 días.
[1071]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación y ampliación del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 3 a 4 días, y después (b) efectuar la transferencia y reparto de la primera población de células T desde el cultivo a pequeña escala a y entre 2, 3 o 4 segundos contenedores que son mayores en tamaño que el primer contenedor,p. ej.,contenedores G-REX 500MCS, en los que en cada segundo contenedor la porción de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo contenedor se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de unos 5 días.
[1072]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalado y un aumento de escala del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 3 a 4 días, y a continuación (b) efectuar la transferencia y reparto de la primera población de células T desde el cultivo a pequeña escala a y entre 2, 3 o 4 segundos contenedores que son mayores en tamaño que el primer contenedor,p. ej.,contenedores G-REX 500MCS, en los que en cada segundo contenedor la porción de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo contenedor se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de aproximadamente 6 días.
[1073]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalado y un aumento de escala del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer contenedor,p. ej.,un contenedor G-REX 100MCS, durante un periodo de aproximadamente 3 a 4 días, y a continuación (b) efectuar la transferencia y reparto de la primera población de células T desde el cultivo a pequeña escala a y entre 2, 3 o 4 segundos contenedores que son mayores en tamaño que el primer contenedor,p. ej.,contenedores G-REX 500MCS, en los que en cada segundo contenedor la porción de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo contenedor se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un periodo de aproximadamente 7 días.
[1074]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera expansión con sensibilización de la etapa (a) se realiza durante un periodo de hasta 7 días.
[1075]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicable anteriormente modificado de tal manera que la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un periodo de hasta 8 días.
[1076]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicable anteriormente modificado de tal manera que la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un periodo de hasta 9 días.
[1077]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un periodo de hasta 10 días.
[1078]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicable anteriormente modificado de tal manera que la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un periodo de hasta 11 días.
[1079]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la primera expansión con sensibilización de la etapa (a) se realiza durante un periodo de 7 días y la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un periodo de hasta 9 días.
[1080]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera expansión con sensibilización de la etapa (a) se realiza durante un periodo de 7 días y la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un periodo de hasta 10 días.
[1081]La presente divulgación proporciona un método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificado de tal manera que la primera expansión con sensibilización en la etapa (a) se realiza durante un período de 7 días u 8 días y la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un período de hasta 9 días.
[1082]La presente divulgación proporciona un método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificado de tal manera que la primera expansión con sensibilización en la etapa (a) se realiza durante un período de 7 días u 8 días y la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un período de hasta 10 días.
[1083]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera expansión con sensibilización de la etapa (a) se realiza durante un periodo de 8 días y la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un periodo de hasta 9 días.
[1084]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la primera expansión con sensibilización de la etapa (a) se realiza durante un periodo de 8 días y la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un periodo de hasta 8 días.
[1085]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de células T se cultiva en un primer medio de cultivo que comprende OKT-3 e IL-2.
[1086]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que el primer medio de cultivo comprende agonista 4-1BB, OKT-3 e IL-2.
[1087]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que el primer medio de cultivo comprende OKT-3, IL-2 y células presentadoras de antígeno (APC).
[1088]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que el primer medio de cultivo comprende agonista 4-1BB, OKT-3, IL-2 y células presentadoras de antígeno (APC).
[1089]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la primera población de células T se cultiva en un segundo medio de cultivo que comprende OKT-3, IL-2 y células presentadoras de antígeno (APC).
[1090]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que el segundo medio de cultivo comprende agonista 4-1BB, OKT-3, IL-2 y células presentadoras de antígeno (APC).
[1091]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de células T se cultiva en un primer medio de cultivo en un recipiente que comprende una primera superficie permeable al gas, en el que el primer medio de cultivo comprende OKT-3, IL-2 y una primera población de células presentadoras de antígeno (APC), en el que la primera población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la primera población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas, donde en la etapa (b) la primera población de células T se cultiva en un segundo medio de cultivo en el contenedor, donde el segundo medio de cultivo comprende OKT-3, IL-2 y una segunda población de APC, donde la segunda población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la segunda población de APC se estratifica sobre la primera superficie permeable al gas, y donde la segunda población de APC es mayor que la primera población de APC.
[1092]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de células T se cultiva en un primer medio de cultivo en un recipiente que comprende una primera superficie permeable al gas, en el que el primer medio de cultivo comprende un agonista 4-1BB, OKT-3, IL-2 y una primera población de células presentadoras de antígeno (APC), en el que la primera población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la primera población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas, donde en la etapa (b) la primera población de células T se cultiva en un segundo medio de cultivo en el contenedor, donde el segundo medio de cultivo comprende OKT-3, IL-2 y una segunda población de APC, donde la segunda población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la segunda población de APC se estratifica sobre la primera superficie permeable al gas, y donde la segunda población de APC es mayor que la primera población de APC.
[1093]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de células T se cultiva en un primer medio de cultivo en un recipiente que comprende una primera superficie permeable al gas, en el que el primer medio de cultivo comprende OKT-3, IL-2 y una primera población de células presentadoras de antígeno (APC), en el que la primera población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la primera población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas, donde en la etapa (b) la primera población de células T se cultiva en un segundo medio de cultivo en el contenedor, donde el segundo medio de cultivo comprende agonista 4-1BB, OKT-3, IL-2 y una segunda población de APC, donde la segunda población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la segunda población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas, y donde la segunda población de APC es mayor que la primera población de APC.
[1094]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de células T se cultiva en un primer medio de cultivo en un recipiente que comprende una primera superficie permeable al gas, en el que el primer medio de cultivo comprende un agonista 4-1BB, OKT-3, IL-2 y una primera población de células presentadoras de antígeno (APC), en el que la primera población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la primera población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas, donde en la etapa (b) la primera población de células T se cultiva en un segundo medio de cultivo en el contenedor, donde el segundo medio de cultivo comprende agonista 4-1BB, OKT-3, IL-2 y una segunda población de APC, donde la segunda población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la segunda población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas, y donde la segunda población de APC es mayor que la primera población de APC.
[1095]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número de APC en la segunda población de APC con respecto al número de APC en la primera población de APC es de aproximadamente 2:1.
[1096]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que el número de APC en la primera población de APC es de aproximadamente 2,5 x 108 y el número de APC en la segunda población de APC es de aproximadamente 5 x 108.
[1097]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de APC se estratifica sobre la primera superficie permeable al gas a un grosor medio de 2 capas de APC.
[1098]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la segunda población de APC se estratifica sobre la primera superficie permeable al gas a un grosor medio en el intervalo de 4 a 8 capas de APC.
[1099]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la relación del número medio de capas de APC estratificadas sobre la primera superficie permeable al gas en la etapa (b) con respecto al número medio de capas de APC estratificadas sobre la primera superficie permeable al gas en la etapa (a) es 2:1.
[1100]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad en el intervalo de entre o aproximadamente 1,0*106 APC/cm2 a entre o aproximadamente 4,5*106 APCs/cm2.
[1101]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad en el intervalo de entre o aproximadamente 1,5*106 APCs/cm2 a entre o aproximadamente 3,5*106 APCs/cm2.
[1102]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad en el intervalo de entre o aproximadamente 2,0*106 APCs/cm2 a entre o aproximadamente 3,0*106 APCs/cm2.
[1103]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad de entre o aproximadamente 2,0*106 APC/cm2.
[1104]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad en el intervalo de entre o aproximadamente 2,5*106 APCs/cm2 a entre o aproximadamente 7,5*106 APCs/cm2.
[1105]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad en el intervalo de entre o aproximadamente 3,5*10® APCs/cm2 a entre o aproximadamente 6,0*10® APCs/cm2.
[1106]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad en el intervalo de entre o aproximadamente 4,0*10® APCs/cm2 a entre o aproximadamente 5,5*10® APCs/cm2.
[1107]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad de entre o aproximadamente 4,0*10® APC/cm2
[1108]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable a gas a una densidad en el intervalo de entre o aproximadamente 1,0*10® APCs/cm2 a entre o aproximadamente 4,5*10® APCs/cm2 y en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad en el intervalo de aproximadamente 2,5*10® APCs/cm2 a entre o aproximadamente 7,5*10® APCs/cm2.
[1109]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable a gas a una densidad en el intervalo de entre o aproximadamente 1,5*10® APCs/cm2 a entre o aproximadamente 3,5*10® APCs/cm2 y en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad en el intervalo de entre o aproximadamente 3,5*10® APCs/cm2 a entre o aproximadamente ®,0*10® APCs/cm2.
[1110]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes como aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable a gas a una densidad en el intervalo de entre o aproximadamente 2,0*10® APCs/cm2 a entre o aproximadamente 3,0*10® APCs/cm2 y en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad en el intervalo de aproximadamente 4,0*10® APCs/cm2 a entre o aproximadamente 5,5*10® APCs/cm2.
[1111]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad de entre o aproximadamente 2,0*10® APCs/cm2 y en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad de entre o aproximadamente 4,0*10® APC/cm2.
[1112]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que las APC son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
[1113]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que las PBMC son irradiadas y exógenas al donante de la primera población de células T.
[1114]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que las células T son linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
[1115]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que las células T son linfocitos infiltrantes de médula (MlL).
[1116]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que las células T son linfocitos de sangre periférica (PBL).
[1117]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene por separación de la sangre total del donante.
[1118]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene por separación del producto de aféresis del donante.
[1119]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se separa de la sangre total o producto de aféresis del donante mediante selección positiva o negativa de un fenotipo de células T.
[1120]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que el fenotipo de células T es CD3+ y CD45+.
[1121]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que antes de realizar la primera expansión con sensibilización de la primera población de células T, las células T se separan de las células NK. En otra realización, las células T se separan de las células NK en la primera población de células T mediante la eliminación de las células CD3- CD56+ de la primera población de células T. En otra realización, las células CD3- CD56+ se eliminan de la primera población de células T sometiendo la primera población de células T a clasificación celular utilizando una estrategia de separación que elimina la fracción de células CD3- CD56+ y recupera la fracción negativa. En otra realización, el método anterior se utiliza para la expansión de células T en una primera población de células T caracterizada por un alto porcentaje de células NK. En otra realización, el método anterior se utiliza para la expansión de células T en una primera población de células T caracterizada por un alto porcentaje de células CD3- CD56+. En otra realización, el método anterior se utiliza para la expansión de células T en tejido tumoral caracterizado por la presencia de un elevado número de células NK. En otra realización, el método anterior se utiliza para la expansión de células T en tejido tumoral caracterizado por un elevado número de células CD3- CD56+. En otra realización, el método anterior se utiliza para la expansión de células T en tejido tumoral obtenido de un paciente que padece un tumor caracterizado por la presencia de un elevado número de células NK. En otra realización, el método anterior se utiliza para la expansión de células T en tejido tumoral obtenido de un paciente que padece un tumor caracterizado por la presencia de un elevado número de células CD3- CD56+. En otra realización, el método anterior se utiliza para la expansión de células T en tejido tumoral obtenido de una paciente que padece cáncer de ovario.
[1122]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que en o aproximadamente 1x107 células T de la primera población de células T se siembran en un contenedor para iniciar el cultivo primario de primera expansión en dicho contenedor.
[1123]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se distribuye en una pluralidad de contenedores, y en cada contenedor se siembran en o aproximadamente 1*107 células T de la primera población de células T para iniciar el cultivo primario de primera expansión en dicho contenedor.
[1124]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la segunda población de células T cosechadas en la etapa (c) es una población terapéutica de TIL.
[1125]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables modificados de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de una o más biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias con aguja gruesa, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del donante.
[1126]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1 a 20 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias de núcleo, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del donante.
[1127]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1 a 10 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias con aguja gruesa, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del donante.
[1128]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias centrales, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del donante.
[1129]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados), biopsias centrales, biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina de tejido tumoral del donante.
[1130]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de una o más biopsias de núcleo de tejido tumoral del donante.
[1131]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene de 1 a 20 biopsias de núcleo de tejido tumoral del donante.
[1132]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene de 1 a 10 biopsias de núcleo de tejido tumoral del donante.
[1133]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 biopsias de núcleo de tejido tumoral del donante.
[1134]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 biopsias de núcleo de tejido tumoral del donante.
[1135]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de uno o más aspirados con aguja fina de tejido tumoral del donante.
[1136]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1 a 20 aspirados con aguja fina de tejido tumoral del donante.
[1137]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1 a 10 aspirados con aguja fina de tejido tumoral del donante.
[1138]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aspirados con aguja fina de tejido tumoral del donante.
[1139]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aspirados con aguja fina de tejido tumoral del donante.
[1140]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables modificados de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de una o más biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados) de tejido tumoral del donante.
[1141]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables modificados de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1 a 20 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados) de tejido tumoral del donante.
[1142]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables modificados de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1 a 10 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados) de tejido tumoral del donante.
[1143]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados) de tejido tumoral del donante.
[1144]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 biopsias pequeñas (incluyendo, por ejemplo, una biopsia en sacabocados) de tejido tumoral del donante.
[1145]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de una o más biopsias con aguja gruesa de tejido tumoral del donante.
[1146]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene de 1 a 20 biopsias con aguja gruesa de tejido tumoral del donante.
[1147]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene de 1 a 10 biopsias con aguja gruesa de tejido tumoral del donante.
[1148]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 biopsias con aguja gruesa de tejido tumoral del donante.
[1149]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que la primera población de células T se obtiene a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 biopsias con aguja gruesa de tejido tumoral del donante.
[1150]La presente divulgación proporciona un método para expandir linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende: i) obtener y/o recibir una primera población de TIL a partir de una muestra tumoral obtenida de una o más biopsias pequeñas, biopsias de núcleo, o biopsias de aguja de un tumor en un sujeto cultivando la muestra tumoral en un primer medio de cultivo celular que comprende IL-2 durante aproximadamente 3 días; (ii) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando la primera población de TIL en un segundo medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3, y células presentadoras de antígeno (APC) para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión con sensibilización se realiza en un contenedor que comprende una primera área de superficie permeable al gas, en donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante un primer periodo de aproximadamente 7 u 8 días para obtener la segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es mayor en número que la primera población de TIL; (iii) realizar una segunda expansión rápida suplementando el segundo medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3, y APC adicionales, para producir una tercera población de TIL, donde el número de APC añadidas en la segunda expansión rápida es al menos el doble del número de APC añadidas en la etapa (ii), en donde la segunda expansión rápida se realiza durante un segundo periodo de aproximadamente 11 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en donde la segunda expansión rápida se realiza en un recipiente que comprende una segunda área de superficie permeable al gas; (iv) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida en la etapa (iii); y (v) transferir la población de TIL cosechada en la etapa (iv) a una bolsa de infusión.
[1151]La presente divulgación proporciona un método para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende: (i) obtener y/o recibir una primera población de TIL a partir de una muestra tumoral obtenida de una o más biopsias pequeñas, biopsias de núcleo, o biopsias con aguja de un tumor en un sujeto cultivando la muestra tumoral en un primer medio de cultivo celular que comprende IL-2 durante aproximadamente 3 días; (ii) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando la primera población de TIL en un segundo medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3, y células presentadoras de antígeno (APC) para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante un primer periodo de aproximadamente 7 u 8 días para obtener la segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es mayor en número que la primera población de TIL; (iii) realizar una segunda expansión rápida poniendo en contacto la segunda población de TIL con un tercer medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3, y APC, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión rápida se realiza durante un segundo periodo de aproximadamente 11 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL; y (iv) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (iii).
[1152]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que después del día 5 del segundo periodo el cultivo se divide en 2 o más subcultivos, y cada subcultivo se suplementa con una cantidad adicional del tercer medio de cultivo y se cultiva durante aproximadamente 6 días.
[1153]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificado de tal manera que después del día 5 del segundo periodo el cultivo se divide en 2 o más subcultivos, y cada subcultivo se suplementa con un cuarto medio de cultivo que comprende IL-2 y se cultiva durante aproximadamente 6 días.
[1154]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificado de tal manera que después del día 5 del segundo periodo el cultivo se divide en hasta 5 subcultivos.
[1155]La presente divulgación proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificado de tal manera que todas las etapas del método se completen en aproximadamente 22 días.
[1156]La presente divulgación proporciona un método de expansión de células T que comprende: (i) realizar una primera expansión con sensibilización de una primera población de células T a partir de una muestra tumoral obtenida de una o más biopsias pequeñas, biopsias de núcleo o biopsias con aguja de un tumor en un donante cultivando la primera población de células T para efectuar el crecimiento y sensibilizar una activación de la primera población de células T; (ii) después de que la activación de la primera población de células T sensibilizada en la etapa (a) comience a decaer, realizar una segunda expansión rápida de la primera población de células T cultivando la primera población de células T para efectuar el crecimiento e impulsar la activación de la primera población de células T para obtener una segunda población de células T; y (iv) cosechar la segunda población de células T. En algunas realizaciones, la muestra tumoral se obtiene a partir de una pluralidad de biopsias de núcleo. En algunas realizaciones, la pluralidad de biopsias de núcleo se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 biopsias de núcleo.
111. Procesos de Fabricación de TIL (Realizaciones del Proceso 2A con Medios Definidos)
[1157]En las figuras 1A y 109 se representa un proceso TIL ejemplar conocido como proceso 2A que contiene algunas de estas características (dicho proceso también se describe en la publicación de patente internacional WO/2018/182817).
[1158]Como se discute en el presente documento, la presente invención puede incluir un paso relacionado con la reestimulación de TIL criopreservados para aumentar su actividad metabólica y, por lo tanto, su salud relativa antes del trasplante a un paciente, y métodos para probar dicha salud metabólica. Como se describe en general en el presente documento, los TIL se toman generalmente de una muestra del paciente y se manipulan para aumentar su número antes del trasplante a un paciente. En algunas realizaciones, los TIL pueden ser opcionalmente manipulados genéticamente como se discute a continuación.
[1159]En algunas realizaciones, los TIL pueden criopreservarse. Una vez descongelados, también pueden volver a estimularse para aumentar su metabolismo antes de la infusión en un paciente.
[1160]En algunas realizaciones, la primera expansión (incluyendo procesos referidos como preREP así como procesos mostrados en la Figura 109 como Etapa A) se acorta a 3 a 14 días y la segunda expansión (incluyendo procesos referidos como REP así como procesos mostrados en la Figura 109 como Etapa B) se acorta a 7 a 14 días, como se discute en detalle a continuación así como en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la primera expansión (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 109) se acorta a 11 días y la segunda expansión (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa D en la Figura 109) se acorta a 11 días. En algunas realizaciones, la combinación de la primera expansión y la segunda expansión (por ejemplo, las expansiones descritas como Etapa B y Etapa D en la Figura 109) se acorta a 22 días, como se discute en detalle a continuación y en los ejemplos y figuras.
[1161]Las designaciones de "Etapa" A, B, C,etc.,a continuación son en referencia a la Figura 109 y en referencia a ciertas realizaciones aquí descritas. El orden de las etapas a continuación y en la Figura 109 es ejemplar y cualquier combinación u orden de etapas, así como etapas adicionales, repetición de etapas y/u omisión de etapas se contempla en la presente solicitud y en los métodos aquí divulgados.
A. ETAPA A: Obtener una muestra del tumor del paciente
[1162]En general, los TIL se obtienen inicialmente de una muestra de tumor de paciente ("TIL primarios") y luego se expanden en una población más grande para manipulación adicional como se describe en el presente documento, opcionalmente criopreservados, reestimulados como se describe en el presente documento y opcionalmente evaluados para fenotipo y parámetros metabólicos como una indicación de la salud de TIL.
[1163]Una muestra del tumor del paciente puede obtenerse utilizando métodos conocidos en la técnica, generalmente mediante resección quirúrgica, biopsia con aguja u otros medios para obtener una muestra que contenga una mezcla de células tumorales y células TIL. En general, la muestra tumoral puede proceder de cualquier tumor sólido, incluidos tumores primarios, tumores invasivos o tumores metastásicos. La muestra tumoral también puede ser un tumor líquido, como un tumor obtenido de una neoplasia hematológica. El tumor sólido puede ser de cualquier tipo de cáncer, incluidos, entre otros, los de mama, páncreas, próstata, colorrectal, pulmón, cerebro, renal, estómago y piel (incluidos, entre otros, el carcinoma de células escamosas, el carcinoma de células basales y el melanoma). En algunas realizaciones, los TIL útiles se obtienen a partir de tumores de melanoma maligno, ya que se ha informado de que estos tienen niveles particularmente altos de TIL.
[1164]El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que normalmente no contiene quistes ni áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término "cáncer de tumor sólido" se refiere a tumores sólidos malignos, neoplásicos, o cancerosos. Los cánceres de tumores sólidos incluyen, entre otros, sarcomas, carcinomas y linfomas, como los de pulmón, mama, cáncer de mama triple negativo, próstata, colon, recto y vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma de pulmón de células no pequeñas. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos tisulares interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células estromales de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
[1165]El término "neoplasia hematológica" hace referencia a los cánceres y tumores de mamíferos de los tejidos hematopoyéticos y linfoides, incluidos, entre otros, los tejidos de la sangre, la médula ósea, los ganglios linfáticos y el sistema linfático. Las neoplasias hematológicas también se denominan "tumores líquidos". Las neoplasias hematológicas incluyen, entre otras, la leucemia linfoblástica aguda (ALL), el linfoma linfocítico crónico (CLL), el linfoma linfocítico pequeño (SLL), la leucemia mielógena aguda (AML), la leucemia mielógena crónica (CML), la leucemia monocítica aguda (AMoL), el linfoma de Hodgkin, y los linfomas no hodgkinianos. El término "neoplasia hematológica de células B" hace referencia a las neoplasias hematológicas que afectan a las células B.
[1166]Una vez obtenida, la muestra tumoral es generalmente fragmentada usando disección aguda en pequeños pedazos de entre 1 a aproximadamente 8 mm3, siendo particularmente útil de aproximadamente 2-3 mm3 Los TIL se cultivan a partir de estos fragmentos utilizando digestiones tumorales enzimáticas. Tales digestiones tumorales pueden producirse por incubación en medios enzimáticos(p. ej.,tampón 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 2 mM de glutamato, 10 mcg/mL de gentamicina, 30 unidades/mL de DNasa y 1,0 mg/mL de colagenasa) seguida de disociación mecánica(p. ej.,utilizando un disociador tisular). Los digeridos tumorales pueden producirse colocando el tumor en medios enzimáticos y disociando mecánicamente el tumor durante aproximadamente 1 minuto, seguido de incubación durante 30 minutos a 37 °C en 5% de CO<2>, seguido de ciclos repetidos de disociación mecánica e incubación en las condiciones anteriores hasta que sólo queden pequeños trozos de tejido. Al final de este proceso, si la suspensión celular contiene un gran número de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación en gradiente de densidad utilizando polisacárido hidrófilo ramificado FICOLL para eliminar estas células. Pueden utilizarse métodos alternativos conocidos en la técnica, como los descritos en Publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2012/0244133 A1. Cualquiera de los métodos anteriores puede utilizarse en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento para métodos de expansión de TIL o métodos de tratamiento de un cáncer.
[1167]En general, la suspensión celular cosechada se denomina "población celular primaria" o población celular "recién cosechada".
[1168]En algunas realizaciones, la fragmentación incluye fragmentación física, incluyendo por ejemplo, disección así como digestión. En algunas realizaciones, la fragmentación es física. En algunas realizaciones, la fragmentación es disección. En algunas realizaciones, la fragmentación es por digestión. En algunas realizaciones, los TIL pueden cultivarse inicialmente a partir de digestiones enzimáticas de tumores y fragmentos de tumores obtenidos de pacientes. En una realización, los TIL pueden cultivarse inicialmente a partir de digestiones enzimáticas de tumores y fragmentos de tumores obtenidos de pacientes.
[1169]En algunas realizaciones, donde el tumor es un tumor sólido, el tumor se somete a fragmentación física después de que la muestra del tumor se obtiene en, por ejemplo, la Etapa A (como se proporciona en la Figura 109). En algunas realizaciones, la fragmentación se produce antes de la criopreservación. En algunas realizaciones, la fragmentación se produce después de la criopreservación. En algunas realizaciones, la fragmentación se produce tras la obtención del tumor y en ausencia de criopreservación. En algunas realizaciones, el tumor se fragmenta y se colocan 10, 20, 30, 40 o más fragmentos o piezas en cada contenedor para la primera expansión. En algunas realizaciones, el tumor se fragmenta y se colocan 30 o 40 fragmentos o piezas en cada contenedor para la primera expansión. En algunas realizaciones, el tumor se fragmenta y se colocan 40 fragmentos o piezas en cada contenedor para la primera expansión. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 fragmentos, donde cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm3. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm3 a aproximadamente 1500 mm3. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1350 mm3. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de entre 1 gramo y 1,5 gramos. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 4 fragmentos.
[1170]En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de fragmentos tumorales. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral se obtiene mediante disección cortante. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral tiene entre 1 mm3 y 10 mm3 aproximadamente. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral tiene entre 1 mm3 y 8 mm3 aproximadamente. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 1 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 2 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 3 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 4 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 5 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 6 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 7 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 8 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 9 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 10 mm3.
[1171]En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de digestiones tumorales. En algunas realizaciones, los digeridos tumorales se generaron por incubación en medios enzimáticos, por ejemplo pero no limitados a RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX, 10 mg/mL de gentamicina, 30 U/mL de DNasa, y 1,0 mg/mL de colagenasa, seguido de disociación mecánica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Tras colocar el tumor en un medio enzimático, se puede disociar mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. A continuación, se puede incubar la solución durante 30 minutos a 37 °C en un 5% de CO<2>y se vuelve a disgregar mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. Tras incubarlo de nuevo durante 30 minutos a 37 °C en un 5% de CO<2>, el tumor puede disgregarse mecánicamente por tercera vez durante aproximadamente 1 minuto. En algunas realizaciones, después de la tercera disociación mecánica, si había trozos grandes de tejido, se aplicaron 1 ó 2 disociaciones mecánicas adicionales a la muestra, con o sin 30 minutos adicionales de incubación a 37 °C en 5% de CO<2>. En algunas realizaciones, al final de la incubación final, si la suspensión celular contiene un gran número de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación en gradiente de densidad utilizando Ficoll para eliminar estas células.
[1172]En algunas realizaciones, la suspensión celular cosechada antes del primer etapa de expansión se denomina "población celular primaria" o población celular "recién cosechada".
[1173]En algunas realizaciones, las células pueden ser opcionalmente congeladas después de la cosecha de la muestra y almacenadas congeladas antes de la entrada en la expansión descrita en la Etapa B, que se describe con más detalle a continuación, así como se ejemplifica en la Figura 109.
B. ETAPA B: Primera Ampliación
1. TIL Jóvenes
[1174]En algunas realizaciones, los métodos presentes proporcionan para obtener TIL jóvenes, que son capaces de ciclos de replicación aumentados sobre la administración a un sujeto/paciente y como tal pueden proporcionar beneficios terapéuticos adicionales sobre TIL más viejos(es decir,TIL que han experimentado más rondas de replicación antes de la administración a un sujeto/paciente). Las características de los TIL jóvenes se han descrito en la literatura, por ejemplo Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, et al.,; Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005); y Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008).
[1175]Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos génicos. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión), y C (constante), determinan la especificidad de unión y las aplicaciones posteriores de las inmunoglobulinas y los receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un método para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos por el presente método muestran un aumento de la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, las células TIL obtenidas por el presente método muestran un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con las células TIL recién cosechadas y/o las células TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 109. En algunas realizaciones, las células TIL obtenidas en la primera expansión muestran un aumento de la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o de la diversidad de receptores de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena pesada de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena ligera de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma, y delta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión de TCRab(es decir,TCRa/p).
[1176]Después de la disección o digestión de fragmentos tumorales, por ejemplo como se describe en la Etapa A de la Figura 109, las células resultantes se cultivan en suero que contiene<i>L-2 bajo condiciones que favorecen el crecimiento de TIL sobre el tumor y otras células. En algunas realizaciones, los digeridos tumorales se incuban en pocillos de 2 mL en medios que comprenden suero AB humano inactivado con 6000 UI/mL de IL-2. Esta población celular primaria se cultiva durante un periodo de días, generalmente de 3 a 14 días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1*108 células TIL masivas. En algunas realizaciones, esta población de células primarias se cultiva durante un periodo de 7 a 14 días, dando lugar a una población de TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1*108 células TIL masivas. En algunas realizaciones, esta población de células primarias se cultiva durante un periodo de 10 a 14 días, dando lugar a una población de TIL masiva, generalmente de aproximadamente 1*108 células TlL masivas. En algunas realizaciones, esta población de células primarias se cultiva durante un periodo de aproximadamente 11 días, dando lugar a una población de TlL masiva, generalmente de aproximadamente 10*88 células TlL masivas.
[1177]En una realización preferida, la expansión de TlL puede realizarse utilizando una etapa de expansión de TlL masiva inicial (por ejemplo como los descritos en la Etapa B de la Figura 109, que puede incluir procesos denominados pre-REP) como se describe a continuación y en el presente documento, seguido de una segunda expansión (Etapa D, incluyendo procesos denominados etapas de protocolo de expansión rápida (REP)) como se describe a continuación en la Etapa D y en el presente documento, seguido de criopreservación opcional, y seguido de una segunda Etapa D (incluyendo procesos denominados etapas de re-estimulación REP) como se describe a continuación y en el presente documento. Los TlL obtenidos de este proceso pueden caracterizarse opcionalmente para características fenotípicas y parámetros metabólicos como se describe en el presente documento.
[1178]En las realizaciones en las que los cultivos de TIL se inician en placas de 24 pocilios, por ejemplo, utilizando el grupo de cultivo celular Costar de 24 pocillos, fondo plano (Corning Incorporated, Corning, NY, cada pocillo puede sembrarse con 1 * 106 células de digestión tumoral o un fragmento tumoral en 2 mL de medio completo (CM) con IL-2 (6000 UI/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA). En algunas realizaciones, el fragmento tumoral tiene entre 1 mm3 y 10 mm3 aproximadamente.
[1179]En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, el CM para la Etapa B consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, suplementado con 10% de suero AB humano, 25 mM de Hepes, y 10 mg/mL de gentamicina. En las realizaciones en las que los cultivos se inician en matraces permeables al gas con una capacidad de 40 mL y un fondo de silicona permeable al gas de 10 cm2 (por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Fig. 1), cada matraz se cargó con 10-40 * 106 células viables de digestión tumoral o 5-30 fragmentos tumorales en 10-40 mL de CM con IL-2. Tanto las placas G-Rex10 como las de 24 pocillos se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C con un 5% de CO<2>y, 5 días después del inicio del cultivo, se retiró la mitad de los medios y se sustituyeron por CM e IL-2 frescos y, después del día 5, se cambió la mitad de los medios cada 2-3 días.
[1180]Después de la preparación de los fragmentos tumorales, las células resultantes(es decir, losfragmentos) se cultivan en suero que contiene IL-2 bajo condiciones que favorecen el crecimiento de TIL sobre el tumor y otras células. En algunas realizaciones, los digeridos tumorales se incuban en pocillos de 2 mL en medios que comprenden suero AB humano inactivado (o, en algunos casos, como se describe en el presente documento, en presencia de una población de células aAPC) con 6000 UI/mL de IL-2. Esta población celular primaria se cultiva durante un periodo de días, generalmente de 10 a 14 días, dando lugar a una población TIL masiva, generalmente aproximadamente 1*108 células TIL masivas. En algunas realizaciones, los medios de crecimiento durante la primera expansión comprenden IL-2 o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la IL es IL-2 humana recombinante (rhIL-2). En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20-30*106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20*106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 25*106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 30*106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL- 2 tiene una concentración final de 4-8*106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 5-7*106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL- 2 tiene una concentración final de 6*106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 se prepara como se describe en el Ejemplo 4. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 10.000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 9.000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 8.000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 7.000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 6.000 UI/mL de IL-2 o aproximadamente 5.000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 9.000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 5.000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 8.000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6.000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 7.000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6.000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 6.000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de<i>L-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 Ul/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 Ul/mL, aproximadamente 4500 Ul/mL, aproximadamente 5000 Ul/mL, aproximadamente 5500 Ul/mL, aproximadamente 6000 Ul/mL, aproximadamente 6500 Ul/mL, aproximadamente 7000 Ul/mL, aproximadamente 7500 Ul/mL, o aproximadamente 8000 Ul/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 Ul/mL, entre 2000 y 3000 Ul/mL, entre 3000 y 4000 Ul/mL, entre 4000 y 5000 Ul/mL, entre 5000 y 6000 Ul/mL, entre 6000 y 7000 Ul/mL, entre 7000 y 8000 Ul/mL, o aproximadamente 8000 Ul/mL de IL-2.
[1181]En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 Ul/mL de IL-15, aproximadamente 400 Ul/mL de IL-15, aproximadamente 300 Ul/mL de IL-15, aproximadamente 200 Ul/mL de IL-15, aproximadamente 180 Ul/mL de IL-15, aproximadamente 160 Ul/mL de IL-15, aproximadamente 140 Ul/mL de IL-15, aproximadamente 120 Ul/mL de IL-15, o aproximadamente 100 Ul/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 500 Ul/mL de IL-15 a aproximadamente 100 Ul/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 400 Ul/mL de IL-15 a aproximadamente 100 Ul/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 300 Ul/mL de IL-15 a aproximadamente 100 Ul/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 200 Ul/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 Ul/mL de IL-15. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 Ul/mL de IL-15.
[1182]En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 20 Ul/mL de IL-21, aproximadamente 15 Ul/mL de IL-21, aproximadamente 12 Ul/mL de IL-21, aproximadamente 10 Ul/mL de IL-21, aproximadamente 5 Ul/mL de IL-21, aproximadamente 4 Ul/mL de IL-21, aproximadamente 3 Ul/mL de IL-21, aproximadamente 2 Ul/mL de IL-21, aproximadamente 1 Ul/mL de IL-21, o aproximadamente 0,5 Ul/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 20 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 15 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 12 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 10 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende entre aproximadamente 5 UI/mL de IL-21 y aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 2 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21.
[1183]En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, se denomina CM1 (medio de cultivo 1). En algunas realizaciones, el CM consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, suplementado con 10% de suero AB humano, 25 mM de Hepes y 10 mg/mL de gentamicina. En las realizaciones en las que los cultivos se inician en matraces permeables al gas con una capacidad de 40 mL y un fondo de silicona permeable al gas de 10cm2 (por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Fig. 1), cada matraz se cargó con 10-40x 106 células viables de digestión tumoral o 5-30 fragmentos tumorales en 10-40mL de CM con IL-2. Tanto las placas G-Rex10 como las de 24 pocillos se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C con un 5% de CO<2>y, 5 días después del inicio del cultivo, se retiró la mitad de los medios y se sustituyeron por CM e IL-2 frescos y, después del día 5, se cambió la mitad de los medios cada 2-3 días. En algunas realizaciones, el CM es el CM1 descrito en los Ejemplos,véase,Ejemplo 5. En algunas realizaciones, la primera expansión se produce en un medio de cultivo celular inicial o en un primer medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular inicial o el primer medio de cultivo celular comprende IL-2.
[1184]En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión (incluyendo procesos como por ejemplo los descritos en la etapa B de la Figura 109, que pueden incluir los que a veces se denominan pre-REP) se acorta a 3-14 días, como se discute en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la primera expansión (incluyendo procesos tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 109, que pueden incluir los que a veces se denominan pre-REP) se acorta a 7 a 14 días, como se discute en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4 y 5, así como incluyendo, por ejemplo, una expansión como la descrita en la etapa B de la Figura 109. En algunas realizaciones, la primera expansión de la etapa B se acorta a 10-14 días, como se discute en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4 y 5. En algunas realizaciones, la primera expansión se acorta a 11 días, además de incluir, por ejemplo, una expansión como la descrita en la etapa B de la Figura 109.
[1185]En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 1 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 2 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 3 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 4 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 5 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 6 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 7 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 8 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 9 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 10 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 11 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 12 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 13 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 1 a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 2 a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 3 a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 4 a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 5 a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 6 a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 7 a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 8 a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 9 a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 10 a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 11 días.
[1186]En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 durante la primera expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-7, IL-15, y/o IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante la primera expansión, incluyendo, por ejemplo, durante un proceso de la Etapa B según la Figura 109, así como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15, e IL-21 durante la primera expansión. En algunas realizaciones, la IL-2, la IL-15 y la IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante los procesos de la Etapa B según la Figura 109 y como se describe en el presente documento.
[1187]En algunas realizaciones, el proceso de primera expansión (incluyendo los procesos denominados pre-REP; por ejemplo, el Etapa B según la Figura 109) se acorta de 3 a 14 días, como se discute en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la primera expansión de la etapa B se acorta de 7 a 14 días, como se discute en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4 y 5. En algunas realizaciones, la primera expansión de la etapa B se acorta de 10 a 14 días, como se discute en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4, 5 y 27. En algunas realizaciones, la primera expansión se acorta a 11 días.
[1188]En algunas realizaciones, la primera expansión, por ejemplo, la Etapa B según la Figura 109, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un único biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas realizaciones, el biorreactor de sistema cerrado es un único biorreactor.
C. ETAPA C: Transición de la primera a la segunda ampliación
[1189]En algunos casos, la población de TIL a granel obtenida de la primera expansión, incluyendo por ejemplo la población de TIL obtenida de, por ejemplo, la Etapa B como se indica en la Figura 109, puede criopreservarse inmediatamente, usando los protocolos que se discuten a continuación. Alternativamente, la población de TIL obtenida de la primera expansión, denominada segunda población de TIL, puede someterse a una segunda expansión (que puede incluir expansiones denominadas a veces REP) y luego criopreservarse como se expone más adelante. Del mismo modo, en el caso de que se vayan a utilizar TIL modificados genéticamente en la terapia, la primera población TIL (a veces denominada población TIL masiva) o la segunda población TIL (que en algunas realizaciones puede incluir poblaciones denominadas poblaciones TIL REP) pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados antes de la expansión o después de la primera expansión y antes de la segunda expansión.
[1190]En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión (por ejemplo, de la Etapa B como se indica en la Figura 109) se almacenan hasta que se fenotipan para la selección. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión (por ejemplo, de la Etapa B como se indica en la Figura 109) no se almacenan y se procede directamente a la segunda expansión. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión no se criopreservan después de la primera expansión y antes de la segunda. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce aproximadamente a los 3 días, 4, días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, o 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 3 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 4 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 4 y 10 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 7 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce a los 14 días aproximadamente desde que se produce la fragmentación.
[1191]En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, o 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 1 día y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede durar de 2 a 14 días. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 3 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 4 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 5 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 6 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 7 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 8 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 9 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 10 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 11 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 12 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 13 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce a los 14 días de producirse la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 1 día y 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 2 días y 11 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 3 y 11 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 4 y 11 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 5 y 11 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 6 y 11 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 7 y 11 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 8 y 11 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 9 y 11 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce entre 10 y 11 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda se produce 11 días después de que se produzca la fragmentación.
[1192]En algunas realizaciones, los TIL no se almacenan después de la primera expansión y antes de la segunda expansión, y los TIL proceden directamente a la segunda expansión (por ejemplo, en algunas realizaciones, no hay almacenamiento durante la transición de la Etapa B al Etapa D como se muestra en la Figura 109). En algunas realizaciones, la transición se produce en un sistema cerrado, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL de la primera expansión, la segunda población de TIL, pasa directamente a la segunda expansión sin periodo de transición.
[1193]En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión, por ejemplo, la Etapa C según la Figura 109, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un único biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas realizaciones, el biorreactor de sistema cerrado es un único biorreactor.
[1194]En algunas realizaciones, el medio de cultivo utilizado en los procesos de expansión aquí divulgados es un medio libre de suero o un medio definido. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido comprende un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un sustituto de suero. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido se utiliza para prevenir y/o disminuir la variación experimental debida en parte a la variación lote a lote de los medios que contienen suero.
[1195]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido comprende un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un reemplazo de suero. En algunas realizaciones, el medio celular basal incluye, entre otros, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CTS™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), R<p>MI 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[1196]En algunas realizaciones, el suplemento de suero o el reemplazo de suero incluye, pero no se limita a uno o más de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer, Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células T CTS™, una o más albúminas o sustitutos de albúmina, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, uno o más antibióticos, y uno o más oligoelementos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-2-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Zr4+. En algunas realizaciones, el medio definido comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o 2-mercaptoetanol.
[1197]En algunas realizaciones, el Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células CTS™OpTmizer™ se utiliza con medios de crecimiento convencionales, incluidos, incluyendo pero no limitado a, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CST™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), Rp M i 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI, y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[1198]En algunas realizaciones, la concentración total de reemplazo de suero (vol%) en el medio libre de suero o definido es de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% en volumen del medio total libre de suero o definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 3% del volumen total del medio libre de suero o medio definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 5% del volumen total del medio libre de suero o medio definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 10% del volumen total del medio libre de suero o medio definido.
[1199]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido es SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific). Cualquier formulación de CTS™ OpTmizer™ es útil en la presente invención. SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ es una combinación de 1 L de Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ y 26 mL de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, que se mezclan antes de su uso. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), junto con 2-mercaptoetanol a 55mM.
[1200]En algunas realizaciones, el medio definido es SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific). Cualquier formulación de CTS™ OpTmizer™ es útil en la presente invención. SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ es una combinación de 1 L de Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™y 26 mL de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, que se mezclan antes de su uso. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), junto con 2-mercaptoetanol a 55mM. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol, y 2mM de L-glutamina, y comprende además de aproximadamente 1000 UI/mL a aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el s Fm de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina, y comprende además aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además entre aproximadamente 1000 UI/mL y aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además de aproximadamente 1000 UI/mL a aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además entre aproximadamente 1000 UI/mL y aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T<c>T<s>™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2.
[1201]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se suplementa con glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 0,1mM a aproximadamente 10mM, 0,5mM a aproximadamente 9mM, 1mM a aproximadamente 8mM, 2mM a aproximadamente 7mM, 3mM a aproximadamente 6mM, o 4mM a aproximadamente 5 mM. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se suplementa con glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 2mM.
[1202]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido es suplementado con 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 150 mM, 10 mM a aproximadamente 140 mM, 15 mM a aproximadamente 130 mM, 20 mM a aproximadamente 120 mM, 25 mM a aproximadamente 110 mM, 30 mM a aproximadamente 100 mM, 35 mM a aproximadamente 95 mM, 40 mM a aproximadamente 90 mM, 45 mM a aproximadamente 85 mM, 50 mM a aproximadamente 80 mM, 55 mM a aproximadamente 75 mM, 60 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 65 mM. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se complementa con 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 55mM.
[1203]En algunas realizaciones, los medios definidos descritos en la Publicación Internacional PCT N.° WO/1998/030679 son útiles en la presente invención. En esa publicación se describen medios de cultivo de células eucariotas sin suero. El medio de cultivo de células eucariotas sin suero incluye un medio de cultivo celular basal suplementado con un suplemento sin suero capaz de soportar el crecimiento de células en cultivo sin suero. El suplemento de medio de cultivo de células eucariotas sin suero comprende o se obtiene combinando uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en una o más albúminas o sustitutos de albúmina, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, uno o más oligoelementos, y uno o más antibióticos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o beta-mercaptoetanol. En algunas realizaciones, el medio definido comprende una albúmina o un sustituto de albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, y uno o más oligoelementos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-2-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ y Zr4+. En algunas realizaciones, el medio celular basal se selecciona del grupo que consiste en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio Basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Esencial Mínimo (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), medio de crecimiento RPMI, y Medio de Dulbecco Modificado de Iscove.
[1204]En algunas realizaciones, la concentración de glicina en el medio definido está en el rango de aproximadamente 5-200 mg/L, la concentración de L-histidina es de aproximadamente 5-250 mg/L, la concentración de L-isoleucina es de aproximadamente 5-300 mg/L, la concentración de L-metionina es de aproximadamente 5-200 mg/L, la concentración de L-fenilalanina es de aproximadamente 5-400 mg/L, la concentración de L-prolina es de aproximadamente 1-1000 mg/L, la concentración de L-hidroxiprolina es de aproximadamente 1-45 mg/L, la concentración de L-serina es de aproximadamente 1-250 mg/L, la concentración de L-treonina es de aproximadamente 10-500 mg/L, la concentración de L-triptófano es de aproximadamente 2-110 mg/L, la concentración de L-tirosina es de aproximadamente 3-175 mg/L, la concentración de L-valina es de aproximadamente 5-500 mg/L, la concentración de tiamina es de aproximadamente 1-20 mg/L, la concentración de glutatión reducido es de aproximadamente 1-20 mg/L, la concentración de ácido L-ascórbico-2-fosfato es de aproximadamente 1-200 mg/L, la concentración de transferrina saturada de hierro es de aproximadamente 1-50 mg/L, la concentración de insulina es de aproximadamente 1-100 mg/L, la concentración de selenito sódico es de aproximadamente 0,000001-0,0001 mg/L, y la concentración de albúmina (p. ej, AlbuMAX® I) es de aproximadamente 5000-50.000 mg/L.
[1205]En algunas realizaciones, los ingredientes de moléculas de elementos no traza en el medio definido están presentes en los rangos de concentración enumerados en la columna bajo el título "Intervalo de Concentración en Medio 1X" en la Tabla A a continuación. En otras realizaciones, los ingredientes de la fracción no oligoelemento en el medio definido están presentes en las concentraciones finales enumeradas en la columna bajo el título "Una realización preferida del medio 1X" en la Tabla A a continuación. En otras realizaciones, el medio definido es un medio celular basal que comprende un suplemento libre de suero. En algunas de estas realizaciones, el suplemento libre de suero comprende ingredientes no traza del tipo y en las concentraciones enumeradas en la columna bajo el título "Una Realización Preferida en Suplemento" en la Tabla A a continuación.
Tabla A: Concentraciones de ingredientes que no son elementos traza
(continuación)
[1206]En algunas realizaciones, la osmolaridad del medio definido está entre aproximadamente 260 y 350 mOsmol. En algunas realizaciones, la osmolaridad está entre 280 y 310 mOsmol. En algunas realizaciones, el medio definido se complementa con hasta aproximadamente 3,7 g/L, o aproximadamente 2,2 g/L de bicarbonato de sodio. El medio definido puede suplementarse además con L-glutamina (concentración final de aproximadamente 2 mM), uno o más antibióticos, aminoácidos no esenciales (NEAA; concentración final de aproximadamente 100 pM), 2-mercaptoetanol (concentración final de aproximadamente 100 pM).
[1207]En algunas realizaciones, los medios definidos descritos en Smith, et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement," Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31) son útiles en la presente invención. Brevemente, se utilizó RPMI o CTS™ OpTmizer™ como medio celular basal, y se suplementó con 0, 2%, 5% o 10% de Sustituto de Suero de Células Inmunitarias CTS™.
[1208]En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas no está filtrado. El uso de un medio celular no filtrado puede simplificar los procedimientos necesarios para ampliar el número de células. En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas carece de beta-mercaptoetanol (BME o pME; también conocido como 2-mercaptoetanol, CAS 60-24-2).
D. ETAPA D: Segunda Expansión
[1209]En algunas realizaciones, la población de células TIL se expande en número después de la cosecha y el procesamiento a granel inicial, por ejemplo, después de la Etapa A y la Etapa B, y la transición denominada Etapa C, como se indica en la Figura 109). Esta expansión adicional se denomina en el presente documento segunda expansión, que puede incluir procesos de expansión generalmente denominados en la técnica proceso de expansión rápida (REP; así como procesos como los indicados en la etapa D de la figura 109). La segunda expansión se realiza generalmente utilizando un medio de cultivo que comprende una serie de componentes, incluyendo células alimentadoras, una fuente de citoquinas y un anticuerpo anti-CD3, en un recipiente permeable al gas.
[1210]En algunas realizaciones, la segunda expansión o segunda expansión de TIL (que puede incluir expansiones a veces denominadas REP; así como procesos como se indica en la Etapa D de la Figura 109) de TIL puede realizarse utilizando cualquier matraz o recipiente de TIL conocido por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 8 días a aproximadamente 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 9 días a aproximadamente 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 10 días a aproximadamente 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 11 días a aproximadamente 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 12 días a aproximadamente 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante aproximadamente 13 días a aproximadamente 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante aproximadamente 14 días.
[1211]En una realización, la segunda expansión puede ser realizada en un contenedor permeable a gas usando los métodos de la presente divulgación (incluyendo por ejemplo, expansiones referidas como REP; así como procesos como los indicados en la Etapa D de la Figura 109). Por ejemplo, los TIL pueden expandirse rápidamente utilizando la estimulación inespecífica del receptor de células T en presencia de interleucina-2 (IL-2) o interleucina-15 (IL-15). El estímulo no específico del receptor de células T puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, como aproximadamente 30 ng/ml de OKT3, un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD3 (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, c A) o UHCT-1 (disponible comercialmente en BioLegend, San Diego, CA, EE.UU.). Los TIL pueden expandirse para inducir una mayor estimulación de los TILin vitromediante la inclusión de uno o más antígenos durante la segunda expansión, incluyendo porciones antigénicas de los mismos, tales como epítopo(s), del cáncer, que pueden expresarse opcionalmente a partir de un vector, tal como un péptido de unión al antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2),por ejemplo,0,3 pM Ma RT-1:26-35 (27 L) o gpl 00:209-2l7 (210M), opcionalmente en presencia de un factor de crecimiento de células T, como 300 UI/mL IL-2 o IL-15. Otros antígenos adecuados pueden incluir, por ejemplo, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antígeno del cáncer de tirosinasa, MAGE-A3, SSX-2, y VEGFR2, o porciones antigénicas de los mismos. Los TIL también pueden expandirse rápidamente mediante la reestimulación con el mismo antígeno o antígenos del cáncer pulsados sobre células presentadoras de antígenos que expresan HLA-A2. Alternativamente, los TIL pueden ser reestimulados adicionalmente con,p. ej.,linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2. En algunas realizaciones, la reestimulación se produce como parte de la segunda expansión. En algunas realizaciones, la segunda expansión se produce en presencia de linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2.
[1212]En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 UI/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 UI/mL, aproximadamente 4500 UI/mL, aproximadamente 5000 UI/mL, aproximadamente 5500 UI/mL, aproximadamente 6000 UI/mL, aproximadamente 6500 UI/mL, aproximadamente 7000 UI/mL, aproximadamente 7500 UI/mL, o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o entre 8000 UI/mL de IL-2.
[1213]En una realización, el medio de cultivo celular comprende el anticuerpo OKT3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 30 ng/mL de anticuerpo OKT3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0,1 ng/ml, aproximadamente 0,5 ng/ml, aproximadamente 1 ng/ml, aproximadamente 2,5 ng/ml, aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 7,5 ng/ml, aproximadamente 10 ng/ml, aproximadamente 15 ng/ml, aproximadamente 20 ng/ml, aproximadamente 25 ng/ml, aproximadamente 30 ng/ml, aproximadamente 35 ng/ml, aproximadamente 40 ng/ml, aproximadamente 50 ng/ml, aproximadamente 60 ng/ml, aproximadamente 70 ng/ml, aproximadamente 80 ng/ml, aproximadamente 90 ng/ml, aproximadamente 100 ng/ml, aproximadamente 200 ng/ml, aproximadamente 500 ng/ml, y aproximadamente 1 pg/ml del anticuerpo OKT3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0,1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng/mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo OKT33.
[1214]En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-7,<i>L-15, y/o IL-21 así como cualquier combinación de las mismas puede incluirse durante la segunda expansión, incluyendo por ejemplo durante un proceso de la Etapa D según la Figura 109, así como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15, e IL-21 durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, la IL-2, la IL-15 y la IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante los procesos de la Etapa D según la Figura 109 y como se describe en el presente documento.
[1215]En algunas realizaciones, la segunda expansión puede llevarse a cabo en un medio de cultivo celular suplementado que comprenda IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, la segunda expansión se produce en un medio de cultivo celular suplementado. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular suplementado comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC; también denominadas células alimentadoras presentadoras de antígeno). En algunas realizaciones, la segunda expansión se produce en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno(es decir,células presentadoras de antígeno).
[1216]En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15, aproximadamente 400 UI/mL de IL-15, aproximadamente 300 UI/mL de IL-15, aproximadamente 200 UI/mL de IL-15, aproximadamente 180 UI/mL de IL-15, aproximadamente 160 UI/mL de IL-15, aproximadamente 140 UI/mL de IL-15, aproximadamente 120 UI/mL de IL-15, o aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 500 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 400 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 300 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 200 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15.
[1217]En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 20 UI/mL de IL-21, aproximadamente 15 UI/mL de IL-21, aproximadamente 12 UI/mL de IL-21, aproximadamente 10 UI/mL de IL-21, aproximadamente 5 UI/mL de IL-21, aproximadamente 4 UI/mL de IL-21, aproximadamente 3 UI/mL de IL-21, aproximadamente 2 UI/mL de IL-21, aproximadamente 1 UI/mL de IL-21, o aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 20 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 15 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 12 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 10 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de aproximadamente 5 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 2 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0,5 UI/mL de IL-21. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21.
[1218]En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC) son PBMC. En una realización, la relación de TIL a PBMC y/o células presentadoras de antígeno en la expansión rápida y/o la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400, o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la relación de TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión está entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la relación de TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión es entre 1 a 100 y 1 a 200.
[1219]En una realización, lo REP y/o la segunda expansión se lleva a cabo en matraces con los TIL a granel mezclados con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, 30 mg/mL de anticuerpo OKT3 anti-CD3 y 3000 UI/mL de IL-2 en 150 ml de medio. Se realiza la sustitución de los medios (generalmente 2/3 de sustitución de los medios mediante respiración con medios frescos) hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. Entre las cámaras de crecimiento alternativas se incluyen los matraces G-REX y los contenedores permeables a los gases, como se explica más detalladamente a continuación.
[1220]En algunas realizaciones, la segunda expansión (que puede incluir procesos denominados proceso REP) se acorta a 7-14 días, como se discute en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la segunda expansión se acorta a 11 días.
[1221]En una realización, el REP y/o la segunda expansión pueden llevarse a cabo utilizando matraces T-175 y bolsas permeables al gas como se ha descrito previamente (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) o material de cultivo permeable a los gases (matraces G-Rex). En algunas realizaciones, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas expansiones rápidas) se lleva a cabo en matraces T-175, y pueden añadirse a cada matraz T-175 aproximadamente 1 * 106 TIL suspendidos en 150 mL de medio. Los TIL pueden cultivarse en una mezcla 1 a 1 de CM y medio AIM-V, suplementada con 3000 UI por mL de IL-2 y 30 ng por ml de anti-CD3. Los matraces T-175 pueden incubarse a 37 °C en un 5% de CO<2>. La mitad del medio puede cambiarse el día 5 utilizando un medio 50/50 con 3000 UI por mL de IL-2. En algunas realizaciones, en el día 7 las células de dos matraces T-175 pueden combinarse en una bolsa de 3 L y 300 mL de AIM V con 5% de suero AB humano y 3000 UI por mL de IL-2 se añadieron a los 300 ml de suspensión de TIL. El número de células de cada bolsa se contaba cada uno o dos días y se añadía medio fresco para mantener el recuento celular entre 0,5 y 2,0 * 106 células/mL.
[1222]En una realización, la segunda expansión (que puede incluir expansiones referidas como REP, así como las referidas en la Etapa D de la Figura 109) puede realizarse en matraces permeables al gas de 500 mL de capacidad con fondos de silicona permeables al gas de 100 cm (G-Rex 100, disponible comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, EE.UU.), pueden cultivarse 5 * 106 o 10 * 106 TIL con PBMC en 400 mL de medio 50/50, suplementado con 5% de suero AB humano, 3000 UI por mL de IL-2 y 30 ng por ml de anti-CD3 (OKT3). Los matraces G-Rex 100 pueden incubarse a 37°C en un 5% de CO<2>. El día 5, pueden extraerse 250 mL de sobrenadante y colocarse en frascos de centrífuga y centrifugarse a 1500 rpm (491 * g) durante 10 minutos. Los pellets de TIL pueden volver a suspenderse con 150 mL de medio fresco con 5% de suero AB humano, 3000 UI por mL de IL-2, y añadirse de nuevo a los matraces G-Rex 100 originales. Cuando los TIL se expanden en serie en matraces G-Rex 100, el día 7 los TIL de cada G-Rex 100 pueden suspenderse en los 300 mL de medio presentes en cada matraz y la suspensión celular puede dividirse en 3 alícuotas de 100 mL que pueden utilizarse para sembrar 3 matraces G-Rex 100. A continuación, se pueden añadir 150 mL de AIM-V con 5% de suero AB humano y 3000 UI por mL de IL-2 a cada matraz. Los matraces G-Rex 100 pueden incubarse a 37° C en 5% CO<2>y después de 4 días pueden añadirse 150 mL de AIM-V con 3000 UI por mL de IL-2 a cada matraz G-REX 100. Las células pueden ser cosechadas en el día 14 de cultivo.
[1223]En una realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se realiza en matraces con los TIL a granel mezclados con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, 30 mg/mL de anticuerpo anti-CD3 OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2 en 150 ml de medio. En algunas realizaciones, la sustitución de los medios se lleva a cabo hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. En algunas realizaciones, 2/3 del medio se sustituye por respiración con medio fresco. En algunas realizaciones, las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces G-REX y recipientes permeables a los gases, como se explica con más detalle a continuación.
[1224]En una realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se lleva a cabo y comprende además una etapa donde los TIL se seleccionan para una reactividad tumoral superior. Puede utilizarse cualquier método de selección conocido en la técnica. Por ejemplo, los métodos descritos en La publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2016/0010058 A1 puede utilizarse para la selección de TIL para una reactividad tumoral superior.
[1225]Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas expansión REP), utilizando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión con azul tripán en una muestra de TIL, que marca selectivamente las células muertas y permite evaluar la viabilidad. En algunas realizaciones, las muestras de TIL pueden contarse y determinarse su viabilidad utilizando un contador celular automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). En algunas realizaciones, la viabilidad se determina según el protocolo del Contador Celular Automático del Citómetro de Imagen Cellometer K2 descrito, por ejemplo, en el Ejemplo 15.
[1226]En algunas realizaciones, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) de TIL puede llevarse a cabo utilizando matraces T-175 y bolsas permeables al gas como se ha descrito previamente (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751, y Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother, 26:332-342) o matraces G-Rex permeables al gas. En algunas realizaciones, la segunda expansión se lleva a cabo utilizando matraces. En algunas realizaciones, la segunda expansión se lleva a cabo utilizando matraces G-Rex permeables al gas. En algunas realizaciones, la segunda expansión se lleva a cabo en matraces T-175, y se suspenden aproximadamente 1 * 106 TIL en aproximadamente 150 mL de medio y se añade a cada matraz T-175. Los TIL se cultivan con PBMC alogénicas irradiadas (50 Gy) como células "alimentadoras" en una relación de 1 a 100 y las células se cultivaron en una mezcla 1 a 1 de CM y medio AIM-V (medio 50/50), suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 y 30 ng/mL de anti-CD3. Los matraces T-175 se incuban a 37°C en un 5% de CO<2>. En algunas realizaciones, la mitad del medio se cambia en el día 5 utilizando un medio 50/50 con 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el día 7, las células de 2 matraces T-175 se combinan en una bolsa de 3 L y se añaden 300 mL de AIM-V con 5% de suero AB humano y 3000 UI/mL de IL-2 a los 300 mL de suspensión de TIL. El número de células en cada bolsa puede contarse cada uno o dos días y puede añadirse medio fresco para mantener el recuento de células entre 0,5 y 2,0 *106 células/mL aproximadamente.
[1227]En algunas realizaciones, la segunda expansión (incluyendo las expansiones denominadas REP) se llevan a cabo en matraces de 500 mL de capacidad con fondos de silicona permeables al gas de 100 cm2 (G-Rex 100, Wilson Wolf) (Fig. 1), se cultivan aproximadamente 5*106 o 10*106 TIL con PBMC alogénicas irradiadas en una relación de 1 a 100 en 400 mL de medio 50/50, suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 y 30 ng/ mL de anti-CD3. Los matraces G-Rex 100 se incuban a 37 °C en un 5% de CO<2>. En algunas realizaciones, el día 5, se extraen 250mL de sobrenadante y se colocan en frascos de centrífuga y se centrifugan a 1500 rpm (491g) durante 10 minutos. A continuación, los pellets de TIL pueden resuspenderse con 150 mL de medio 50/50 fresco con 3000 UI/ mL de IL-2 y añadirse de nuevo a los matraces G-Rex 100 originales. En las realizaciones en las que los TIL se expanden en serie en matraces G-Rex 100, en el día 7 los TIL de cada G-Rex 100 se suspenden en los 300 mL de medio presentes en cada matraz y la suspensión celular se divide en tres alícuotas de 100 mL que se utilizan para sembrar 3 matraces G-Rex 100. A continuación, se añaden 150 mL de AIM-V con 5% de suero AB humano y 3000 UI/mL de IL-2 a cada matraz. Los matraces G-Rex 100 se incuban a 37°C en 5% CO<2>y después de 4 días se añaden 150 mL de AIM-V con 3000 UI/mL de IL-2 a cada matraz G-Rex 100. Las células se cosechan el día 14 de cultivo.
[1228]Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos génicos. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión), y C (constante), determinan la especificidad de unión y las aplicaciones posteriores de las inmunoglobulinas y los receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un método para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos por el presente método muestran un aumento de la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos en la segunda expansión muestran un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o de la diversidad de receptores de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena pesada de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena ligera de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma, y delta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión de TCRab (esdecir,TCRa/p).
[1229]En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión(p. ej.,a veces referido como CM2 o el segundo medio de cultivo celular), comprende IL-2, OKT-3, así como las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se discute en más detalle a continuación.
[1230]En algunas realizaciones, la segunda expansión, por ejemplo, la Etapa D según la Figura 109, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un único biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas realizaciones, el biorreactor de sistema cerrado es un único biorreactor.
[1231]En algunas realizaciones, el medio de cultivo utilizado en los procesos de expansión aquí divulgados es un medio libre de suero o un medio definido. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido comprende un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un sustituto de suero. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido se utiliza para prevenir y/o disminuir la variación experimental debida en parte a la variación lote a lote de los medios que contienen suero.
[1232]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido comprende un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un reemplazo de suero. En algunas realizaciones, el medio celular basal incluye, entre otros, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CTS™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), R<p>MI 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[1233]En algunas realizaciones, el suplemento de suero o el reemplazo de suero incluye, pero no se limita a uno o más de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer, Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células T CTS™, una o más albúminas o sustitutos de albúmina, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, uno o más antibióticos, y uno o más oligoelementos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-2-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Zr4+. En algunas realizaciones, el medio definido comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o 2-mercaptoetanol.
[1234]En algunas realizaciones, el Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células CTS™OpTmizer™ se utiliza con medios de crecimiento convencionales, incluidos, incluyendo pero no limitado a, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CST™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), Rp M i 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI, y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[1235]En algunas realizaciones, la concentración total de reemplazo de suero (vol%) en el medio libre de suero o definido es de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% en volumen del medio total libre de suero o definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 3% del volumen total del medio libre de suero o medio definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 5% del volumen total del medio libre de suero o medio definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 10% del volumen total del medio libre de suero o medio definido.
[1236]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido es SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific). Cualquier formulación de CTS™ OpTmizer™ es útil en la presente invención. SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ es una combinación de 1 L de Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ y 26 mL de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, que se mezclan antes de su uso. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), junto con 2-mercaptoetanol a 55mM.
[1237]En algunas realizaciones, el medio definido es SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific). Cualquier formulación de CTS™ OpTmizer™ es útil en la presente invención. SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ es una combinación de 1 L de Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ y 26 mL de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, que se mezclan antes de su uso. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), junto con 2-mercaptoetanol a 55mM. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol, y 2mM de L-glutamina, y comprende además de aproximadamente 1000 UI/mL a aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el s Fm de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina, y comprende además aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además entre aproximadamente 1000 UI/mL y aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además de aproximadamente 1000 UI/mL a aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además entre aproximadamente 1000 UI/mL y aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T<c>T<s>™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2.
[1238]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se suplementa con glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 0,1mM a aproximadamente 10mM, 0,5mM a aproximadamente 9mM, 1mM a aproximadamente 8mM, 2mM a aproximadamente 7mM, 3mM a aproximadamente 6mM, o 4mM a aproximadamente 5 mM. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se suplementa con glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 2mM.
[1239]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido es suplementado con 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 150 mM, 10 mM a aproximadamente 140 mM, 15 mM a aproximadamente 130 mM, 20 mM a aproximadamente 120 mM, 25 mM a aproximadamente 110 mM, 30 mM a aproximadamente 100 mM, 35 mM a aproximadamente 95 mM, 40 mM a aproximadamente 90 mM, 45 mM a aproximadamente 85 mM, 50 mM a aproximadamente 80 mM, 55 mM a aproximadamente 75 mM, 60 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 65 mM. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se complementa con 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 55mM.
[1240]En algunas realizaciones, los medios definidos descritos en la Publicación Internacional PCT N.° WO/1998/030679 son útiles en la presente invención. En esa publicación se describen medios de cultivo de células eucariotas sin suero. El medio de cultivo de células eucariotas sin suero incluye un medio de cultivo celular basal suplementado con un suplemento sin suero capaz de soportar el crecimiento de células en cultivo sin suero. El suplemento de medio de cultivo de células eucariotas sin suero comprende o se obtiene combinando uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en una o más albúminas o sustitutos de albúmina, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, uno o más oligoelementos, y uno o más antibióticos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o beta-mercaptoetanol. En algunas realizaciones, el medio definido comprende una albúmina o un sustituto de albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, y uno o más oligoelementos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-2-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ y Zr4+. En algunas realizaciones, el medio celular basal se selecciona del grupo que consiste en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio Basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Esencial Mínimo (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), medio de crecimiento RPMI, y Medio de Dulbecco Modificado de Iscove.
[1241]En algunas realizaciones, la concentración de glicina en el medio definido está en el rango de aproximadamente 5-200 mg/L, la concentración de L-histidina es de aproximadamente 5-250 mg/L, la concentración de L-isoleucina es de aproximadamente 5-300 mg/L, la concentración de L-metionina es de aproximadamente 5-200 mg/L, la concentración de L-fenilalanina es de aproximadamente 5-400 mg/L, la concentración de L-prolina es de aproximadamente 1-1000 mg/L, la concentración de L-hidroxiprolina es de aproximadamente 1-45 mg/L, la concentración de L-serina es de aproximadamente 1-250 mg/L, la concentración de L-treonina es de aproximadamente 10-500 mg/L, la concentración de L-triptófano es de aproximadamente 2-110 mg/L, la concentración de L-tirosina es de aproximadamente 3-175 mg/L, la concentración de L-valina es de aproximadamente 5-500 mg/L, la concentración de tiamina es de aproximadamente 1-20 mg/L, la concentración de glutatión reducido es de aproximadamente 1-20 mg/L, la concentración de ácido L-ascórbico-2-fosfato es de aproximadamente 1-200 mg/L, la concentración de transferrina saturada de hierro es de aproximadamente 1-50 mg/L, la concentración de insulina es de aproximadamente 1-100 mg/L, la concentración de selenito sódico es de aproximadamente 0,000001-0,0001 mg/L, y la concentración de albúmina (p. ej, AlbuMAX® I) es de aproximadamente 5000-50.000 mg/L.
[1242]En algunas realizaciones, los ingredientes de moléculas de elementos no traza en el medio definido están presentes en los rangos de concentración enumerados en la columna bajo el título "Intervalo de Concentración en Medio 1X" en la Tabla A a continuación. En otras realizaciones, los ingredientes de la fracción no oligoelemento en el medio definido están presentes en las concentraciones finales enumeradas en la columna bajo el título "Una realización preferida del medio 1X" en la Tabla A a continuación. En otras realizaciones, el medio definido es un medio celular basal que comprende un suplemento libre de suero. En algunas de estas realizaciones, el suplemento libre de suero comprende ingredientes no traza del tipo y en las concentraciones enumeradas en la columna bajo el título "Una Realización Preferida en Suplemento" en la Tabla A a continuación.
Tabla A: Concentraciones de ingredientes que no son elementos traza
(continuación)
[1243]En algunas realizaciones, la osmolaridad del medio definido está entre aproximadamente 260 y 350 mOsmol. En algunas realizaciones, la osmolaridad está entre 280 y 310 mOsmol. En algunas realizaciones, el medio definido se complementa con hasta aproximadamente 3,7 g/L, o aproximadamente 2,2 g/L de bicarbonato de sodio. El medio definido puede suplementarse además con L-glutamina (concentración final de aproximadamente 2 mM), uno o más antibióticos, aminoácidos no esenciales (NEAA; concentración final de aproximadamente 100 pM), 2-mercaptoetanol (concentración final de aproximadamente 100 pM).
[1244]En algunas realizaciones, los medios definidos descritos en Smith, et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement," Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31) son útiles en la presente invención. Brevemente, se utilizó RPMI o CTS™ OpTmizer™ como medio celular basal, y se suplementó con 0, 2%, 5% o 10% de Sustituto de Suero de Células Inmunitarias CTS™.
[1245]En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas no está filtrado. El uso de un medio celular no filtrado puede simplificar los procedimientos necesarios para ampliar el número de células. En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas carece de beta-mercaptoetanol (BME o pME; también conocido como 2-mercaptoetanol, CAS 60-24-2).
1. Células alimentadoras y células presentadoras de antígeno
[1246]En una realización, los procedimientos de segunda expansión descritos en el presente documento (por ejemplo, incluyendo expansiones como las descritas en la Etapa D de la Figura 109, así como las denominadas REP) requieren un exceso de células alimentadoras durante la expansión REP TIL y/o durante la segunda expansión. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre total estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación en gradiente Ficoll-Paque.
[1247]En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos REP, como se describe en los ejemplos, en particular en el ejemplo 14, que proporciona un protocolo ejemplar para evaluar la incompetencia de replicación de PBMC alogénicas irradiadas.
[1248]En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL aquí descritos si el número total de células viables en el día 14 es menor que el número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión(es decir,el día de inicio de la segunda expansión). Véase, por ejemplo, el ejemplo 14.
[1249]En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL aquí descritos si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado desde el número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión(es decir,el día de inicio de la segunda expansión). En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/ml de IL-2. Véase, por ejemplo, el ejemplo 13.
[1250]En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL aquí descritos si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado desde el número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión(es decir,el día de inicio de la segunda expansión). En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 5-60 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 1000-6000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 10-50 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 2000-5000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 20-40 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 2000-4000 UI/ml de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 25-35 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 2500-3500 UI/ml de IL-2.
[1251]En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son PBMC. En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son células alimentadoras presentadoras de antígeno artificiales. En una realización, la relación de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400, o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la relación de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la relación de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de entre 1 a 100 y 1 a 200.
[1252]En una realización, los segundos procedimientos de expansión aquí descritos requieren una relación de aproximadamente 2,5x109 células alimentadoras por aproximadamente 100x106 TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 2,5x109 células alimentadoras por aproximadamente 50*10® TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren aproximadamente 2,5x109 células alimentadoras para aproximadamente 25*10® TIL.
[1253]En una realización, los procedimientos de segunda expansión aquí descritos requieren un exceso de células alimentadoras durante la segunda expansión. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre total estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación en gradiente Ficoll-Paque. En una realización, se utilizan células artificiales presentadoras de antígeno (aAPC) en lugar de PBMC.
[1254]En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos de expansión de TIL aquí descritos.
[1255]En una realización, las células presentadoras de antígeno artificiales son usadas en la segunda expansión como un reemplazo para, o en combinación con, PBMC.
2. Citocinas
[1256]Los métodos de expansión aquí descritos generalmente utilizan medios de cultivo con altas dosis de una citoquina, en particular IL-2, como es conocido en la técnica.
[1257]Alternativamente, el uso de combinaciones de citoquinas para la expansión rápida y/o segunda expansión de TIL es adicionalmente posible, con combinaciones de dos o más de IL-2, IL-15 e IL-21 como se describe generalmente en la Publicación Internacional N.° WO 2015/18935® y W Publicación Internacional N.° WO 2015/189357. Por lo tanto, las combinaciones posibles incluyen IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21 e IL-2, IL-15 e IL-21, siendo esta última la que se utiliza especialmente en muchas realizaciones. El uso de combinaciones de citoquinas favorece específicamente la generación de linfocitos y, en particular, de células T, tal como se describe en el presente documento.
3. Anticuerpos anti-CD3
[1258]En algunas realizaciones, los medios de cultivo utilizados en los métodos de expansión descritos en el presente documento (incluidos los denominados REP, véase, por ejemplo, la Figura 109) también incluyen un anticuerpo anti-CD3. Un anticuerpo anti-CD3 en combinación con IL-2 induce la activación de las células T y la división celular en la población TIL. Este efecto puede observarse con anticuerpos de longitud completa, así como con fragmentos Fab y F(ab')2, prefiriéndose generalmente los primeros; véase,p. ej.,Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719.
[1259]Como será apreciado por aquellos en la técnica, hay un número de anticuerpos anti CD3 humanos adecuados que encuentran uso en la invención, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales anti CD3 humanos de varios mamíferos, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos murinos, humanos, primates, ratas, y caninos. En particular, se utiliza el anticuerpo OKT3 anti-CD3 (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA).
E. ETAPA E: Cosecha de TIL
[1260]Después de la segunda etapa de expansión, las células pueden ser cosechadas. En algunas realizaciones, los TIL se cosechan después de uno, dos, tres, cuatro o más etapas de expansión, por ejemplo, como se muestra en la Figura 109. En algunas realizaciones, los TIL se cosechan después de dos etapas de expansión, por ejemplo, como se muestra en la Figura 109.
[1261]Los TIL se pueden cosechar de cualquier manera apropiada y estéril, incluyendo, por ejemplo por centrifugación. Los métodos para la cosecha de TIL son bien conocidos en la técnica y cualquiera de ellos puede emplearse en el presente proceso. En algunas realizaciones, los TIL se cosechan utilizando un sistema automatizado.
[1262]Las cosechadoras de células y/o los sistemas de procesamiento celular están disponibles comercialmente de una variedad de fuentes, incluyendo, por ejemplo, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, e Inotech Biosystems International, Inc. Cualquier cosechadora basada en células puede emplearse con los presentes métodos. En algunas realizaciones, el cosechador celular y/o los sistemas de procesamiento celular son cosechadores celulares basados en membranas. En algunas realizaciones, la cosecha de células se realiza mediante un sistema de procesamiento celular, como el sistema LOVO (fabricado por Fresenius Kabi). El término "sistema de procesamiento celular LOVO" también se refiere a cualquier instrumento o dispositivo fabricado por cualquier proveedor que pueda bombear una solución que comprenda células a través de una membrana o filtro, como una membrana giratoria o un filtro giratorio, en un entorno de sistema estéril y/o cerrado, que permita el flujo continuo y el procesamiento celular para eliminar el sobrenadante o el medio de cultivo celular sin peletización. En algunas realizaciones, el cosechador celular y/o el sistema de procesamiento celular pueden llevar a cabo la separación celular, el lavado, el intercambio de fluidos, la concentración y/u otras etapas de procesamiento celular en un sistema cerrado y estéril.
[1263]En algunas realizaciones, la cosecha, por ejemplo, la Etapa E según la Figura 109, se realiza desde un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un único biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas realizaciones, el biorreactor de sistema cerrado es un único biorreactor.
F. ETAPA F: Formulación final/ Transferencia a la bolsa de infusión
[1264]Una vez completados las Etapas A a E según se indica en un orden ejemplar en la Figura 109 y según se detalla anteriormente y en el presente documento, las células se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente. En algunas realizaciones, una vez obtenido un número terapéuticamente suficiente de TIL mediante los métodos de expansión descritos anteriormente, se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente.
[1265]En una realización, los TIL expandidos utilizando APC de la presente divulgación se administran a un paciente como una composición farmacéutica. En una realización, la composición farmacéutica es una suspensión de TIL en un tampón estéril. Los TIL expandidos utilizando PBMC de la presente divulgación pueden administrarse por cualquier vía adecuada conocida en la técnica. En algunas realizaciones, las células T se administran como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura aproximadamente de 30 a 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas son la intraperitoneal, la intratecal, y la intralinfática.
1. Composiciones farmacéuticas, dosis, y regímenes de dosificación
[1266]En una realización, los TIL expandidos utilizando los métodos de la presente divulgación se administran a un paciente como una composición farmacéutica. En una realización, la composición farmacéutica es una suspensión de TIL en un tampón estéril. Los TIL expandidos utilizando PBMC de la presente divulgación pueden administrarse por cualquier vía adecuada conocida en la técnica. En algunas realizaciones, las células T se administran como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura aproximadamente de 30 a 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas incluyen la administración intraperitoneal, intratecal e intralinfática.
[1267]Puede administrarse cualquier dosis adecuada de TIL. En algunas realizaciones, se administran de aproximadamente 2,3*101° a aproximadamente 13,7*101° TIL, con una media de aproximadamente 7,8*101° TIL, particularmente si el cáncer es melanoma. En una realización, se administran entre 1,2*1010y 4,3*1010 de TIL. En algunas realizaciones, se administran entre 3*1010y 12*1010 TIL. En algunas realizaciones, se administran entre 4*1010 y 10*1010
TIL. En algunas realizaciones, se administran entre 5*1010 y 8*1010 TIL. En algunas realizaciones, se administran entre 6*1010 y 8*1010 TIL. En algunas realizaciones, se administran entre 7*1010 y 8*1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2,3*1010 a aproximadamente 13,7*1010. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 7,8*1010 TIL, particularmente si el cáncer es melanoma. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1,2*1010 a aproximadamente 4,3*1010
TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 3*1010 a aproximadamente 12*1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 4*1010 a aproximadamente 10*1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 5*1010 a aproximadamente 8*1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 6*1010 a aproximadamente 8*1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 7*1010 a aproximadamente 8*1010 TIL.
[1268]En algunas realizaciones, el número de TIL proporcionado en las composiciones farmacéuticas de la invención es de aproximadamente 1*106, 2*106, 3*106, 4*106, 5*106, 6*106, 7*106, 8*106, 9*106, 1*107, 2*107, 3*107, 4*107, 6*107, 7*107, 8*107, 9*107, 1*108, 2*108, 3*108, 4*108, 5*108, 6*108, 7*108, 8*108, 9*108, 1*109, 2*109, 3*109, 5*109, 6*109, 7*109, 8*109, 9*109, 1*101° 2*1010, 3*101° 4*101° 5*101° 6*101° 7*101° 8*101° 9*1010, 1*1011, 2*1011, 3*1011, 4*1011, 5*1011, 6*1011, 7*1011, 8*1011, 9*1011, 1*1012, 2*1012, 3*1012, 4*1012, 5*1012, 6*1012, 7*1012, 8*1012, 9*1012, 1*1013, 2*1013, 3*1013, 4*1013, 5*1013, 6*1013, 7*1013, 8*1013, y 9*1013. En una realización, el número de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el intervalo de 1*106to 5*106, 5*106to 1*107, 1*107to 5*107, 5*107to 1*108, 1*108to 5*108, 5*108to 1*109, 1*109to 5*109, 5*109to 1*101° 1*1010 to 5*101° 5*1010 to 1*1011, 5*1011 to 1*1012, 1*1012to 5*1012, y 5*1012 a 1*1013.
[1269]En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es inferior a, por ejemplo, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% o 0.0001% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
[1270]En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es superior al 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% o 0.0001% p/p, p/v, o v/v de la composición farmacéutica.
[1271]En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el intervalo de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 50%, aproximadamente 0,001% a aproximadamente 40%, aproximadamente 0,01% a aproximadamente 30%, aproximadamente 0,02% a aproximadamente 29%, aproximadamente 0,03% a aproximadamente 28%, aproximadamente 0,04% a aproximadamente 27%, aproximadamente 0,05% a aproximadamente 26%, aproximadamente 0,06% a aproximadamente 25%, aproximadamente 0,07% a aproximadamente 24%, aproximadamente 0,08% a aproximadamente 23%, aproximadamente 0,09% a aproximadamente 22%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 21%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 20%, aproximadamente 0,3% a aproximadamente 19%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 18%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 17%, aproximadamente 0,6% a aproximadamente 16%, aproximadamente 0,7% a aproximadamente 15%, aproximadamente 0,8% a aproximadamente 14%, aproximadamente 0,9% a aproximadamente 12%, o aproximadamente 1% a aproximadamente 10% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
[1272]En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el intervalo de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,02% a aproximadamente 4,5%, aproximadamente 0,03% a aproximadamente 4%, aproximadamente 0,04% a aproximadamente 3,5%, aproximadamente 0,05% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,06% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 0,07% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,08% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,09% a aproximadamente 1%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,9% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
[1273]En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es igual o inferior a 10 g, 9,5 g, 9,0 g, 8,5 g, 8,0 g, 7,5 g, 7,0 g, 6,5 g, 6,0 g, 5,5 g, 5,0 g, 4,5 g, 4,0 g, 3,5 g, 3,0 g, 2,5 g, 2,0 g, 1,5 g, 1,0 g, 0,95 g, 0,9 g, 0,85 g, 0,8 g, 0,75 g, 0,7 g, 0,65 g, 0,6 g, 0,55 g, 0,5 g, 0,45 g, 0,4 g, 0,35 g, 0,3 g, 0,25 g, 0,2 g, 0,15 g, 0,1 g, 0,09 g, 0,08 g, 0,07 g, 0,06 g, 0,05 g, 0,04 g, 0,03 g, 0,02 g, 0,01 g, 0,009 g, 0,008 g, 0,007 g, 0,006 g, 0,005 g, 0,004 g, 0,003 g, 0,002 g, 0,001 g, 0,0009 g, 0,0008 g, 0,0007 g, 0,0006 g, 0,0005 g, 0,0004 g, 0,0003 g, 0,0002 g, o 0,0001 g.
[1274]En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es superior a 0,0001 g, 0,0002 g, 0,0003 g, 0,0004 g, 0,0005 g, 0,0006 g, 0,0007 g, 0,0008 g, 0,0009 g, 0,001 g, 0,0015 g, 0,002 g, 0,0025 g, 0,003 g, 0,0035 g, 0,004 g, 0,0045 g, 0,005 g, 0,0055 g, 0,006 g, 0,0065 g, 0,007 g, 0,0075 g, 0,008 g, 0,0085 g, 0,009 g, 0,0095 g, 0,01 g, 0,015 g, 0,02 g, 0,025 g, 0,03 g, 0,035 g, 0,04 g, 0,045 g, 0,05 g, 0,055 g, 0,06 g, 0,065 g, 0,07 g, 0,075 g, 0,08 g, 0,085 g, 0,09 g, 0,095 g, 0,1 g, 0,15 g, 0,2 g, 0,25 g, 0,3 g, 0,35 g, 0,4 g, 0,45 g, 0,5 g, 0,55 g, 0,6 g, 0,65 g, 0,7 g, 0,75 g, 0,8 g, 0,85 g, 0,9 g, 0,95 g, 1 g, 1,5 g, 2 g, 2,5, 3 g, 3,5, 4 g, 4,5 g, 5 g, 5,5 g, 6 g, 6,5 g, 7 g, 7,5 g, 8 g, 8,5 g, 9 g, 9,5 g, o 10 g.
[1275]Los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención son eficaces en un amplio intervalo de dosis. La dosis exacta dependerá de la vía de administración, la forma en que se administre el compuesto, el sexo y la edad del sujeto a tratar, el peso corporal del sujeto a tratar y la preferencia y experiencia del médico que lo atienda. También pueden utilizarse, si procede, las dosis clínicamente establecidas de los TIL. Las cantidades de las composiciones farmacéuticas administradas mediante los métodos aquí descritos, como las dosis de TIL, dependerán del ser humano o mamífero tratado, la gravedad del trastorno o afección, la velocidad de administración, la disposición de los principios activos farmacéuticos y la discreción del médico prescriptor.
[1276]En algunas realizaciones, los TIL pueden administrarse en una dosis única. Dicha administración puede realizarse mediante inyección, por ejemplo, intravenosa. En algunas realizaciones, los TIL pueden administrarse en dosis múltiples. La dosificación puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis veces al año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o una vez cada dos días. La administración de los TIL puede continuar mientras sea necesario.
[1277]En algunas realizaciones, una dosis eficaz de TIL es de aproximadamente 1*10®, 2*10®, 3*10®, 4*10®, 5*10®, 6x10®, 7*10®, 8*10®, 9*10®, 1*107, 2*107, 3*107, 4*107, 5*107, ®*107, 7*107, 8*107, 9*107, 1*108, 2*108, 3*108, 5*108, ®*108, 7*108, 8*108, 9*108, 1*109, 2*109, 3*109, 4*109, 5*109, ®*109, 7*109, 8*109, 9*109, 1*1010, 3*1010, 4*1010, 5*1010, ®*1010, 7*1010, 8*1010, 9*1010, 1*1011, 2*1011, 3*1011, 4*1011, 5*1011, ®*1011, 7*1011, 8*1011, 9*1011, 1*1012, 2*1012, 3*1012, 4*1012, 5*1012, ®*1012, 7*1012, 8*1012, 9*1012, 1*1013, 2*1013, 3*1013, 4*1013, 5*1013, ®*1013, 7*1013, 8*1013, y 9*1013. En algunas realizaciones, una dosis eficaz de TIL está en el intervalo de 1*10® a 5*10®,
5*10® a 1*107, 1*107 a 5*107, 5*107 a 1*108, 1*108to 5*108, 5*108 a 1*109, 1*109 a 5*109, 5*109 a 1*1010, 1*1010a 5*1010, 5*1010 a 1*1011, 5*1011 a 1*1012, 1*1012 a 5*1012, y 5*1012 a 1*1013.
[1278]En algunas realizaciones, una dosis efectiva de TIL está en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 4,3 mg/kg, aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 3,® mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg a aproximadamente 3,2 mg/kg, aproximadamente 0,35 mg/kg a aproximadamente 2,85 mg/kg, aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 2,85 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg a aproximadamente 2,15 mg/kg, aproximadamente 0,45 mg/kg a aproximadamente 1,7 mg/kg, aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 1,3 mg/kg, aproximadamente
0,3 mg/kg a aproximadamente 1,15 mg/kg, aproximadamente 0,45 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente
0. 55 mg/kg a aproximadamente 0,85 mg/kg, aproximadamente 0,®5 mg/kg a aproximadamente 0,8 mg/kg, aproximadamente 0,7 mg/kg a aproximadamente 0,75 mg/kg, aproximadamente 0,7 mg/kg a aproximadamente 2,15 mg/kg, aproximadamente 0,85 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 1,85 mg/kg, aproximadamente 1,15 mg/kg a aproximadamente 1,7 mg/kg, aproximadamente 1,3 mg/kg a aproximadamente
1, ® mg/kg, aproximadamente 1,35 mg/kg a aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 2,15 mg/kg a aproximadamente 3,® mg/kg, aproximadamente 2,3 mg/kg a aproximadamente 3,4 mg/kg, aproximadamente 2,4 mg/kg a aproximadamente 3,3 mg/kg, aproximadamente 2,® mg/kg a aproximadamente 3,15 mg/kg, aproximadamente 2,7 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 2,8 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, o aproximadamente 2,85 mg/kg a aproximadamente 2,95 mg/kg.
[1279]En algunas realizaciones, una dosis eficaz de TIL está en el intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 20 mg a aproximadamente 250 mg, aproximadamente 25 mg a aproximadamente 200 mg, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 45 mg, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 40 mg, aproximadamente 15 mg a aproximadamente 35 mg, aproximadamente 20 mg a aproximadamente 30 mg, aproximadamente 23 mg a aproximadamente 28 mg, aproximadamente 50 mg a aproximadamente 150 mg, aproximadamente ®0 mg a aproximadamente 140 mg, aproximadamente 70 mg a aproximadamente 130 mg, aproximadamente 80 mg a aproximadamente 120 mg, aproximadamente 90 mg a aproximadamente 110 mg, o aproximadamente 95 mg a aproximadamente 105 mg, aproximadamente 98 mg a aproximadamente 102 mg, aproximadamente 150 mg a aproximadamente 250 mg, aproximadamente 1®0 mg a aproximadamente 240 mg, aproximadamente 170 mg a aproximadamente 230 mg, de aproximadamente 180 mg a aproximadamente 220 mg, de aproximadamente 190 mg a aproximadamente 210 mg, de aproximadamente 195 mg a aproximadamente 205 mg, o de aproximadamente 198 a aproximadamente 207 mg.
[1280]Una cantidad eficaz de los TIL puede administrarse en dosis únicas o múltiples por cualquiera de los modos aceptados de administración de agentes que tienen utilidades similares, incluidas las vías intranasal y transdérmica, por inyección intraarterial, intravenosa, intraperitoneal, parenteral, intramuscular, subcutánea, tópica, por trasplante, o por inhalación.
IV. Composiciones farmacéuticas, dosis, y regímenes de dosificación
[1281]En una realización, los TIL expandidos utilizando los métodos de la presente divulgación se administran a un paciente como una composición farmacéutica. En una realización, la composición farmacéutica es una suspensión de TIL en un tampón estéril. Los TIL expandidos utilizando PBMC de la presente divulgación pueden administrarse por cualquier vía adecuada conocida en la técnica. En algunas realizaciones, las células T se administran como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura aproximadamente de 30 a ®0 minutos. Otras vías de administración adecuadas incluyen la administración intraperitoneal, intratecal e intralinfática.
[1282] Puede administrarse cualquier dosis adecuada de TIL. En algunas realizaciones, se administran de aproximadamente 2,3*101° a aproximadamente 13,7*1010 TIL, con una media de aproximadamente 7,8*1010 TIL, particularmente si el cáncer es melanoma. En una realización, se administran entre 1,2*1010y 4,3*1010 de TIL. En algunas realizaciones, se administran entre 3*1010y 12*1010 TIL. En algunas realizaciones, se administran entre 4*1010 y 10*1010
TIL. En algunas realizaciones, se administran entre 5*1010 y 8*1010 TIL. En algunas realizaciones, se administran entre ®*1010 y 8*1010 TIL. En algunas realizaciones, se administran entre 7*1010 y 8*1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2,3*1010 a aproximadamente 13,7*1010. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 7,8*1010 TIL, particularmente si el cáncer es melanoma. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1,2*1010 a aproximadamente 4,3*1010
TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 3*1010 a aproximadamente 12*1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 4*1010 a aproximadamente 10*1010TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 5*1010
a aproximadamente 8*1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente ®*1010 a aproximadamente 8*1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 7*1010 a aproximadamente 8*1010 TIL.
[1283]En algunas realizaciones, el número de los TIL proporcionadas en las composiciones farmacéuticas de la invención es de aproximadamente 1*10®, 2*10®, 3*10®, 4*10®, 5*10®, 6*10®, 7*10®, 8*10®, 9*10®, 1x107, 2*107, 3*107, 5*107, ®*107, 7*107, 8*107, 9*107, 1*108, 2*108, 3*108, 4*108, 5*108, ®*108, 7*108, 8*108, 9*108, 1*109, 2*109, 3*109, 4*109, 5*109, ®*109, 7*109, 8*109, 9*109, 1*1010, 2*1010, 3*1010, 4*1010, 5*1010, ®*1010, 7*1010, 8*1010, 9*1010, 1*1011, 2*1011, 3*1011, 4*1011, 5*1011, ®*1011, 7*1011, 8*1011, 9*1011, 1*1012, 2*1012, 3*1012, 4*1012, 5*1012, ®*1012, 7*1012, 8*1012, 9*1012, 1*1013, 2*1013, 3*1013, 4*1013, 5*1013, ®*1013, 7*1013, 8*1013, y 9*1013. En una realización, el número de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el intervalo de 1*10® to 5*10®, 5*10®to 1*107, 1*107to 5*107, 5*107to 1*108, 1*108to 5*108, 5*108to 1*109, 1*109to 5*109, 5*109to 1*1010, 1*1010 to 5*1010, 5*1010 to 1*1011, 5*1011 to 1*1012, 1*1012 to 5*1012, y 5*1012 a 1*1013.
[1284]En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es inferior a, por ejemplo, 100%, 90%, 80%, 70%, ®0%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 1®%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, ®%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.0®%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.00®%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.000®%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% o 0.0001% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
[1285]En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es superior al 90%, 80%, 70%, ®0%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 1®.75%, 1®.50%, 1®.25% 1®%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, ®.75%, ®.50%, ®.25% ®%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%,
2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.0®%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.00®%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.000®%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% o 0.0001% p/p, p/v, o v/v de la composición farmacéutica.
[1286]En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el intervalo de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 50%, aproximadamente 0,001% a aproximadamente 40%, aproximadamente 0,01% a aproximadamente 30%, aproximadamente 0,02% a aproximadamente
29%, aproximadamente 0,03% a aproximadamente 28%, aproximadamente 0,04% a aproximadamente 27%, aproximadamente 0,05% a aproximadamente 2®%, aproximadamente 0,0®% a aproximadamente 25%, aproximadamente
0,07% a aproximadamente 24%, aproximadamente 0,08% a aproximadamente 23%, aproximadamente 0,09% a aproximadamente 22%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 21%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente
20%, aproximadamente 0,3% a aproximadamente 19%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 18%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 17%, aproximadamente 0,®% a aproximadamente 1®%, aproximadamente
0,7% a aproximadamente 15%, aproximadamente 0,8% a aproximadamente 14%, aproximadamente 0,9% a aproximadamente 12%, o aproximadamente 1% a aproximadamente 10% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
[1287]En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el intervalo de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,02% a aproximadamente 4,5%, aproximadamente 0,03% a aproximadamente
4%, aproximadamente 0,04% a aproximadamente 3,5%, aproximadamente 0,05% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,0®% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 0,07% a aproximadamente 2%, aproximadamente
0,08% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,09% a aproximadamente 1%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,9% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
[1288]En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es igual o inferior a 10 g, 9,5 g, 9,0 g, 8,5 g, 8,0 g, 7,5 g, 7,0 g, ®,5 g, ®,0 g, 5,5 g, 5,0 g, 4,5 g, 4,0 g, 3,5 g, 3,0 g, 2,5 g, 2,0 g, 1,5 g, 1,0 g, 0,95 g, 0,9 g, 0,85 g, 0,8 g, 0,75 g, 0,7 g, 0,®5 g, 0,® g, 0,55 g, 0,5 g, 0,45 g, 0,4 g, 0,35 g, 0,3 g, 0,25 g, 0,2 g, 0,15 g, 0,1 g, 0,09 g, 0,08 g, 0,07 g, 0,0® g, 0,05 g, 0,04 g, 0,03 g, 0,02 g, 0,01 g, 0,009 g, 0,008 g, 0,007 g, 0,00® g, 0,005 g, 0,004 g, 0,003 g, 0,002 g, 0,001 g, 0,0009 g, 0,0008 g, 0,0007 g, 0,000® g, 0,0005 g, 0,0004 g, 0,0003 g, 0,0002 g, o 0,0001 g.
[1289]En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es superior a 0,0001 g, 0,0002 g, 0,0003 g, 0,0004 g, 0,0005 g, 0,000® g, 0,0007 g, 0,0008 g, 0,0009 g, 0,001 g, 0,0015 g, 0,002 g, 0,0025 g, 0,003 g, 0,0035 g, 0,004 g, 0,0045 g, 0,005 g, 0,0055 g, 0,00® g, 0,00®5 g, 0,007 g, 0,0075 g, 0,008 g, 0,0085 g, 0,009 g, 0,0095 g, 0,01 g, 0,015 g, 0,02 g, 0,025 g, 0,03 g, 0,035 g, 0,04 g, 0,045 g, 0,05 g, 0,055 g,
0,0® g, 0,0®5 g, 0,07 g, 0,075 g, 0,08 g, 0,085 g, 0,09 g, 0,095 g, 0,1 g, 0,15 g, 0,2 g, 0,25 g, 0,3 g, 0,35 g, 0,4 g, 0,45 g,
0,5 g, 0,55 g, 0,® g, 0,®5 g, 0,7 g, 0,75 g, 0,8 g, 0,85 g, 0,9 g, 0,95 g, 1 g, 1,5 g, 2 g, 2,5, 3 g, 3,5, 4 g, 4,5 g, 5 g, 5,5 g, ® g, ®,5 g, 7 g, 7,5 g, 8 g, 8,5 g, 9 g, 9,5 g, o 10 g.
[1290]Los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención son eficaces en un amplio intervalo de dosis. La dosis exacta dependerá de la vía de administración, la forma en que se administre el compuesto, el sexo y la edad del sujeto a tratar, el peso corporal del sujeto a tratar y la preferencia y experiencia del médico que lo atienda.
También pueden utilizarse, si procede, las dosis clínicamente establecidas de los TIL. Las cantidades de las composiciones farmacéuticas administradas mediante los métodos aquí descritos, como las dosis de TIL, dependerán del ser humano o mamífero tratado, la gravedad del trastorno o afección, la velocidad de administración, la disposición de los principios activos farmacéuticos y la discreción del médico prescriptor.
[1291]En algunas realizaciones, los TIL pueden administrarse en una dosis única. Dicha administración puede realizarse mediante inyección, por ejemplo, intravenosa. En algunas realizaciones, los TIL pueden administrarse en dosis múltiples.
La dosificación puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis veces al año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o una vez cada dos días. La administración de los TIL puede continuar mientras sea necesario.
[1292]En algunas realizaciones, una dosis eficaz de TIL es de aproximadamente 1*10®, 2*10®, 3*10®, 4*10®, 5*10®, 6x10®, 7*10®, 8*10®, 9*10®, 1*107, 2*107, 3*107, 4*107, 5*107, ®*107, 7*107, 8*107, 9*107, 1*108, 2*108, 3*108, 4*108, 5*108, ®*108, 7*108, 8*108, 9*108, 1*109, 2*109, 3*109, 4*109, 5*109, ®*109, 7*109, 8*109, 9*109, 1*1010, 3*1010, 4*1010, 5*1010, ®*1010, 7*1010, 8*1010, 9*1010, 1*1011, 2*1011, 3*1011, 4*1011, 5*1011, ®*1011, 7*1011, 8*1011, 9*1011, 1*1012, 2*1012, 3*1012, 4*1012, 5*1012, ®*1012, 7*1012, 8*1012, 9*1012, 1*1013, 2*1013, 3*1013, 4*1013, 5*1013, ®*1013, 7*1013, 8*1013, y 9*1013. En algunas realizaciones, una dosis eficaz de TIL está en el intervalo de 1*10® a 5*10®,
5*10® a 1*107, 1*107 a 5*107, 5*107 a 1*108, 1*108to 5*108, 5*108 a 1*109, 1*109 a 5*109, 5*109 a 1*1010, 1*1010a 5*1010, 5*1010 a 1*1011, 5*1011 a 1*1012, 1*1012 a 5*1012, y 5*1012 a 1*1013.
[1293]En algunas realizaciones, una dosis efectiva de TIL está en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 4,3 mg/kg, aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 3,® mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg a aproximadamente 3,2 mg/kg, aproximadamente 0,35 mg/kg a aproximadamente 2,85 mg/kg, aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 2,85 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg a aproximadamente 2,15 mg/kg, aproximadamente 0,45 mg/kg a aproximadamente 1,7 mg/kg, aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 1,3 mg/kg, aproximadamente
0,3 mg/kg a aproximadamente 1,15 mg/kg, aproximadamente 0,45 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente
0. 55 mg/kg a aproximadamente 0,85 mg/kg, aproximadamente 0,®5 mg/kg a aproximadamente 0,8 mg/kg, aproximadamente 0,7 mg/kg a aproximadamente 0,75 mg/kg, aproximadamente 0,7 mg/kg a aproximadamente 2,15 mg/kg, aproximadamente 0,85 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 1,85 mg/kg, aproximadamente 1,15 mg/kg a aproximadamente 1,7 mg/kg, aproximadamente 1,3 mg/kg a aproximadamente
1, ® mg/kg, aproximadamente 1,35 mg/kg a aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 2,15 mg/kg a aproximadamente 3,® mg/kg, aproximadamente 2,3 mg/kg a aproximadamente 3,4 mg/kg, aproximadamente 2,4 mg/kg a aproximadamente 3,3 mg/kg, aproximadamente 2,® mg/kg a aproximadamente 3,15 mg/kg, aproximadamente 2,7 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 2,8 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, o aproximadamente 2,85 mg/kg a aproximadamente 2,95 mg/kg.
[1294]En algunas realizaciones, una dosis eficaz de TIL está en el intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 20 mg a aproximadamente 250 mg, aproximadamente 25 mg a aproximadamente 200 mg, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 45 mg, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 40 mg, aproximadamente 15 mg a aproximadamente 35 mg, aproximadamente 20 mg a aproximadamente 30 mg, aproximadamente 23 mg a aproximadamente 28 mg, aproximadamente 50 mg a aproximadamente 150 mg, aproximadamente ®0 mg a aproximadamente 140 mg, aproximadamente 70 mg a aproximadamente 130 mg, aproximadamente 80 mg a aproximadamente 120 mg, aproximadamente 90 mg a aproximadamente 110 mg, o aproximadamente 95 mg a aproximadamente 105 mg, aproximadamente 98 mg a aproximadamente 102 mg, aproximadamente 150 mg a aproximadamente 250 mg, aproximadamente 1®0 mg a aproximadamente 240 mg, aproximadamente 170 mg a aproximadamente 230 mg, de aproximadamente 180 mg a aproximadamente 220 mg, de aproximadamente 190 mg a aproximadamente 210 mg, de aproximadamente 195 mg a aproximadamente 205 mg, o de aproximadamente 198 a aproximadamente 207 mg.
[1295]Una cantidad eficaz de los TIL puede administrarse en dosis únicas o múltiples por cualquiera de los modos aceptados de administración de agentes que tienen utilidades similares, incluidas las vías intranasal y transdérmica, por inyección intraarterial, intravenosa, intraperitoneal, parenteral, intramuscular, subcutánea, tópica, por trasplante, o por inhalación.
[1296]La presente divulgación proporciona una bolsa de infusión que comprende la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda.
[1297]La presente divulgación proporciona una composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda y un portador farmacéuticamente aceptable.
[1298]La presente divulgación proporciona una bolsa de infusión que comprende la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda.
[1299]La presente divulgación proporciona una preparación crioconservada de la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda.
[1300]La presente divulgación proporciona una composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda y un medio de crioconservación.
[1301]La presente divulgación proporciona la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificada de tal manera que el medio de crioconservación contiene DMSO.
[1302]La presente divulgación proporciona la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente modificada de tal manera que el medio de crioconservación contiene 7-10% de DMSO.
[1303]En algunas realizaciones, la invención proporciona las composiciones TIL que comprenden TIL en medio libre de suero o un medio definido. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido comprende un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un sustituto de suero. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido se utiliza para prevenir y/o disminuir la variación experimental debida en parte a la variación lote a lote de los medios que contienen suero.
[1304]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido comprende un medio celular basal y un suplemento de suero y/o un reemplazo de suero. En algunas realizaciones, el medio celular basal incluye, entre otros, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CTS™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[1305]En algunas realizaciones, el suplemento de suero o el reemplazo de suero incluye, pero no se limita a uno o más de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer, Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células T CTS™, una o más albúminas o sustitutos de albúmina, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, uno o más antibióticos, y uno o más oligoelementos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-2-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ y Zr4+. En algunas realizaciones, el medio definido comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o 2-mercaptoetanol.
[1306]En algunas realizaciones, el Sustituto de Suero de Células Inmunitarias de Células CTS™OpTmizer™ se utiliza con medios de crecimiento convencionales, incluidos, incluyendo pero no limitado a, Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, Medio AIM-V CTS™, SFM de AIM-V CST™, Medio de Expansión de Células T Libre de Compuestos Xenogénicos LymphoONE™, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Medio Mínimo Esencial (MEM), Medio Basal Eagle (BME), Rp M i 1640, F-10, F-12, Medio Mínimo Esencial (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), Medio de Crecimiento RPMI, y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove.
[1307]En algunas realizaciones, la concentración total de reemplazo de suero (vol%) en el medio libre de suero o definido es de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% en volumen del medio total libre de suero o definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 3% del volumen total del medio libre de suero o medio definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 5% del volumen total del medio libre de suero o medio definido. En algunas realizaciones, la concentración total de sustitución de suero es de aproximadamente el 10% del volumen total del medio libre de suero o medio definido.
[1308]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o definido es SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific). Cualquier formulación de CTS™ OpTmizer™ es útil en la presente invención. SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ es una combinación de 1 L de Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ y 26 mL de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, que se mezclan antes de su uso. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), junto con 2-mercaptoetanol a 55mM.
[1309]En algunas realizaciones, el medio definido es SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific). Cualquier formulación de CTS™ OpTmizer™ es útil en la presente invención. SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ es una combinación de 1 L de Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™y 26 mL de Suplemento de Suero de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, que se mezclan antes de su uso. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), junto con 2-mercaptoetanol a 55mM. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol, y 2mM de L-glutamina, y comprende además de aproximadamente 1000 UI/mL a aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific), 55mM de 2-mercaptoetanol y 2mM de L-glutamina, y comprende además aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además entre aproximadamente 1000 UI/mL y aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y 55mM de 2-mercaptoetanol, y comprende además de aproximadamente 1000 UI/mL a aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además entre aproximadamente 1000 UI/mL y aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™se suplementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el SFM de Expansión de Células T<c>T<s>™ OpTmizer™ se complementa con aproximadamente un 3% del Sustituto de Suero (SR) de Células Inmunitarias CTS™ (ThermoFisher Scientific) y aproximadamente 2mM de glutamina, y comprende además aproximadamente 6000 UI/mL de IL-2.
[1310]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se suplementa con glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 0,1mM a aproximadamente 10mM, 0,5mM a aproximadamente 9mM, 1mM a aproximadamente 8mM, 2mM a aproximadamente 7mM, 3mM a aproximadamente 6mM, o 4mM a aproximadamente 5 mM. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se suplementa con glutamina (es decir, GlutaMAX®) a una concentración de aproximadamente 2mM.
[1311]En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido es suplementado con 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 150 mM, 10 mM a aproximadamente 140 mM, 15 mM a aproximadamente 130 mM, 20 mM a aproximadamente 120 mM, 25 mM a aproximadamente 110 mM, 30 mM a aproximadamente 100 mM, 35 mM a aproximadamente 95 mM, 40 mM a aproximadamente 90 mM, 45 mM a aproximadamente 85 mM, 50 mM a aproximadamente 80 mM, 55 mM a aproximadamente 75 mM, 60 mM a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 65 mM. En algunas realizaciones, el medio libre de suero o medio definido se complementa con 2-mercaptoetanol a una concentración de aproximadamente 55mM.
[1312]En algunas realizaciones, los medios definidos descritos en la Publicación Internacional PCT N.° WO/1998/030679 son útiles en la presente invención. En esa publicación se describen medios de cultivo de células eucariotas sin suero. El medio de cultivo de células eucariotas sin suero incluye un medio de cultivo celular basal suplementado con un suplemento sin suero capaz de soportar el crecimiento de células en cultivo sin suero. El suplemento de medio de cultivo de células eucariotas sin suero comprende o se obtiene combinando uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en una o más albúminas o sustitutos de albúmina, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, uno o más oligoelementos, y uno o más antibióticos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende además L-glutamina, bicarbonato sódico y/o beta-mercaptoetanol. En algunas realizaciones, el medio definido comprende una albúmina o un sustituto de albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en uno o más aminoácidos, una o más vitaminas, una o más transferrinas o sustitutos de transferrina, uno o más antioxidantes, una o más insulinas o sustitutos de insulina, uno o más precursores de colágeno, y uno o más oligoelementos. En algunas realizaciones, el medio definido comprende albúmina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, tiamina, glutatión reducido, ácido L-ascórbico-2-fosfato, transferrina saturada de hierro, insulina, y compuestos que contengan oligoelementos Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ y Zr4+. En algunas realizaciones, el medio celular basal se selecciona del grupo que consiste en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio Basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio Esencial Mínimo (aMEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), medio de crecimiento RPMI, y Medio de Dulbecco Modificado de Iscove.
[1313]En algunas realizaciones, la concentración de glicina en el medio definido está en el rango de aproximadamente 5-200 mg/L, la concentración de L-histidina es de aproximadamente 5-250 mg/L, la concentración de L-isoleucina es de aproximadamente 5-300 mg/L, la concentración de L-metionina es de aproximadamente 5-200 mg/L, la concentración de L-fenilalanina es de aproximadamente 5-400 mg/L, la concentración de L-prolina es de aproximadamente 1-1000 mg/L, la concentración de L-hidroxiprolina es de aproximadamente 1-45 mg/L, la concentración de L-serina es de aproximadamente 1-250 mg/L, la concentración de L-treonina es de aproximadamente 10-500 mg/L, la concentración de L-triptófano es de aproximadamente 2-110 mg/L, la concentración de L-tirosina es de aproximadamente 3-175 mg/L, la concentración de L-valina es de aproximadamente 5-500 mg/L, la concentración de tiamina es de aproximadamente 1-20 mg/L, la concentración de glutatión reducido es de aproximadamente 1-20 mg/L, la concentración de ácido L-ascórbico-2-fosfato es de aproximadamente 1-200 mg/L, la concentración de transferrina saturada de hierro es de aproximadamente 1-50 mg/L, la concentración de insulina es de aproximadamente 1-100 mg/L, la concentración de selenito sódico es de aproximadamente 0,000001-0,0001 mg/L, y la concentración de albúmina (p. ej, AlbuMAX® I) es de aproximadamente 5000-50.000 mg/L.
[1314]En algunas realizaciones, los ingredientes de moléculas de elementos no traza en el medio definido están presentes en los rangos de concentración enumerados en la columna bajo el título "Intervalo de Concentración en Medio 1X" en la Tabla A a continuación. En otras realizaciones, los ingredientes de la fracción no oligoelemento en el medio definido están presentes en las concentraciones finales enumeradas en la columna bajo el título "Una realización preferida del medio 1X" en la Tabla A a continuación. En otras realizaciones, el medio definido es un medio celular basal que comprende un suplemento libre de suero. En algunas de estas realizaciones, el suplemento libre de suero comprende ingredientes no traza del tipo y en las concentraciones enumeradas en la columna bajo el título "Una Realización Preferida en Suplemento" en la Tabla A a continuación.
Tabla A: Concentraciones de ingredientes que no son elementos traza
(continuación)
[1315]En algunas realizaciones, la osmolaridad del medio definido está entre aproximadamente 260 y 350 mOsmol. En algunas realizaciones, la osmolaridad está entre 280 y 310 mOsmol. En algunas realizaciones, el medio definido se complementa con hasta aproximadamente 3,7 g/L, o aproximadamente 2,2 g/L de bicarbonato de sodio. El medio definido puede suplementarse además con L-glutamina (concentración final de aproximadamente 2 mM), uno o más antibióticos, aminoácidos no esenciales (NEAA; concentración final de aproximadamente 100 pM), 2-mercaptoetanol (concentración final de aproximadamente 100 pM).
[1316]En algunas realizaciones, los medios definidos descritos en Smith, et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement," Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31) son útiles en la presente invención. Brevemente, se utilizó RPMI o CTS™ OpTmizer™ como medio celular basal, y se suplementó con 0, 2%, 5% o 10% de Sustituto de Suero de Células Inmunitarias CTS™.
[1317]En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas no está filtrado. El uso de un medio celular no filtrado puede simplificar los procedimientos necesarios para ampliar el número de células. En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo contenedor permeable al gas carece de beta-mercaptoetanol (BME o pME; también conocido como 2-mercaptoetanol, CAS 60-24-2).
[1318]La presente divulgación proporciona una preparación crioconservada de la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente.
V. Métodos de tratamiento de los pacientes
[1319]Los métodos de tratamiento comienzan con la recogida inicial de TIL y el cultivo de TIL. Tales métodos han sido descritos en la técnica por, por ejemplo, Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292. Los métodos de tratamiento se describen en las secciones siguientes, incluidos los Ejemplos.
[1320]Los TIL expandidos producidos según los métodos descritos en el presente documento, incluyendo, por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 (en particular, por ejemplo, la Figura 1B y/o la Figura 1C) encuentran un uso particular en el tratamiento de pacientes con cáncer (por ejemplo, como se describe en Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239, así como el contenido suplementario. En algunas realizaciones, los TIL se cultivaron a partir de depósitos resecados de melanoma metastásico como se ha descrito previamente (véase, Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342. El tumor fresco puede diseccionarse en condiciones estériles. Se puede recoger una muestra representativa para un análisis patológico formal. Pueden utilizarse fragmentos individuales de 2 mm3 a 3 mm3. En algunas realizaciones, se obtienen 5, 10, 15, 20, 25 o 30 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 20, 25, o 30 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 20, 22, 24, 26, o 28 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 24 muestras por paciente. Las muestras pueden colocarse en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos, mantenerse en medio de crecimiento con altas dosis de IL-2 (6.000 UI/mL) y monitorizarse para detectar la destrucción del tumor y/o la proliferación de TIL. Cualquier tumor con células viables restantes tras el procesamiento puede ser digerido enzimáticamente en una suspensión unicelular y criopreservado, tal y como se describe en el presente documento.
[1321]En algunas realizaciones, los TIL cultivados con éxito pueden ser muestreados para análisis de fenotipo (CD3, CD4, CD8, y CD56) y probados contra tumor autólogo cuando esté disponible. Los TIL pueden considerarse reactivos si en el cocultivo de una noche se obtienen niveles de interferón-gamma (IFN-<y>) > 200 pg/mL y el doble del fondo. (Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847). En algunas realizaciones, los cultivos con evidencia de reactividad autóloga o patrones de crecimiento suficientes pueden seleccionarse para una segunda expansión (por ejemplo, una segunda expansión según el Etapa D de la Figura 1 (en particular, p. ej., la Figura 1B y/o la Figura 1C), incluyendo segundas expansiones que a veces se denominan expansión rápida (REP). En algunas realizaciones, los TIL expandidos con alta reactividad autóloga (por ejemplo, alta proliferación durante una segunda expansión), se seleccionan para una segunda expansión adicional. En algunas realizaciones, los TIL con alta reactividad autóloga (por ejemplo, alta proliferación durante la segunda expansión según se proporciona en la etapa D de la Figura 1 (en particular, por ejemplo, la Figura 1B y/o la Figura 1C), se seleccionan para una segunda expansión adicional según el Etapa D de la Figura 1 (en particular, por ejemplo, la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1322]El paciente puede no pasar directamente a la ACT (transferencia celular adoptiva), por ejemplo, tras la extracción del tumor y/o una primera expansión, las células no se utilizan inmediatamente. Las TIL pueden criopreservarse y descongelarse 2 días antes de su administración a un paciente. Las TIL pueden criopreservarse y descongelarse 1 día antes de su administración al paciente. Las TIL pueden criopreservarse y descongelarse inmediatamente antes de su administración a un paciente.
[1323]Los fenotipos celulares de las muestras criopreservadas de TIL de bolsa de infusión pueden analizarse por citometría de flujo (p. ej., FlowJo) para los marcadores de superficie CD3, CD4, CD8, CCR7, y CD45RA (BD BioSciences), así como por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Las citocinas séricas pueden medirse mediante técnicas estándar de ensayo inmunoenzimático. Un aumento del IFN-g sérico puede definirse como >100 pg/mL y al menos 4 veces o al menos 3 veces o al menos 2 veces o al menos 1 vez mayor que los niveles basales de IFN-g sérico. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >1000 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >200 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >250 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >300 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >350 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >400 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >450 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >500 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >550 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >600 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >650 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >700 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >750 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >800 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >850 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >900 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >950 pg/mL. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-g sérico se define como >1000 pg/mL.
[1324]En algunas realizaciones, los TIL producidos por los métodos aquí proporcionados, por ejemplo los ejemplificados en la Figura 1 (en particular, por ejemplo, la Figura 1B y/o la Figura 1C), proporcionan una mejora sorprendente en la eficacia clínica de los TIL. En algunas realizaciones, los TIL producidos por los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo los ejemplificados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), muestran una eficacia clínica aumentada en comparación con los TIL producidos por métodos distintos de los descritos en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los ejemplificados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, los métodos distintos de los aquí descritos incluyen métodos denominados proceso 1C y/o Generación 1 (Gen 1). En algunas realizaciones, el aumento de la eficacia se mide por DCR, ORR, y/u otras respuestas clínicas. En algunas realizaciones, los TIL producidos por los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo los ejemplificados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), presentan un tiempo de respuesta y un perfil de seguridad similares en comparación con los TIL producidos por métodos distintos de los descritos en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los ejemplificados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), por ejemplo el proceso Gen 1.
[1325]En algunas realizaciones, el IFN-gamma (IFN-y) es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o de una mayor eficacia clínica. En algunas realizaciones, el IFN-<y>en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas realizaciones, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-<y>. La producción de IFN-<y>es otra medida del potencial citotóxico. La producción de iFN-y puede medirse determinando los niveles de la citocina IFN-y en la sangre, el suero o los TILex vivode un sujeto tratado con TIL preparados por los métodos de la presente invención, incluidos los descritos por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, un aumento del IFN-<y>es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, el IFN-y se multiplica por uno, por dos, por tres, por cuatro o por cinco o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>se multiplica por uno en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y se multiplica por dos en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y se multiplica por tres en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y se multiplica por cuatro en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>se multiplica por cinco en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, el IFN-<y>se mide utilizando un kit Quantikine ELISA. En algunas realizaciones, el IFN-y se mide en TILex vivode un sujeto tratado con TIL preparados por los métodos de la presente invención, incluyendo los descritos por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, el IFN-<y>se mide en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados por los métodos de la presente invención, incluyendo los descritos por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, el IFN-<y>se mide en el suero de TIL de un sujeto tratado con TIL preparados por los métodos de la presente invención, incluyendo los descritos por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C).
[1326]En algunas realizaciones, los TIL preparadas por los métodos de la presente invención, incluyendo las descritas por ejemplo en la Figura 1 (en particular, p. ej ., la Figura 1B y/o la Figura 1C), exhiben mayor policlonalidad en comparación con los TIL producidas por otros métodos, incluyendo los no ejemplificados en la Figura 1 (en particular, p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C), tales como, por ejemplo, los métodos denominados métodos del proceso 1C. En algunas realizaciones, la policlonalidad significativamente mejorada y/o la policlonalidad aumentada es indicativa de la eficacia del tratamiento y/o de la eficacia clínica aumentada. En algunas realizaciones, la policlonalidad se refiere a la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, un aumento de la policlonalidad puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento con respecto a la administración de los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por uno, dos, diez, cien, quinientos o mil veces en comparación con los TIL preparados usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por uno en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por dos en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por diez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por 100 en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se incrementa 500 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. e j.,Figura 1B y/o Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se incrementa 1000 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C).
[1327]Las medidas de eficacia pueden incluir la tasa de control de la enfermedad (DCR) así como la tasa de respuesta global (ORR), como se conoce en la técnica así como se describe en el presente documento.
1. Métodos de Tratamiento del Cáncer y Otras Enfermedades
[1328]Las composiciones y métodos aquí descritos pueden utilizarse en un método para tratar enfermedades. Pueden utilizarse en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos. También pueden utilizarse en el tratamiento de otros trastornos descritos en el presente documento y en los párrafos siguientes.
[1329]En algunas realizaciones, el trastorno hiperproliferativo es cáncer. En algunas realizaciones, el trastorno hiperproliferativo es un cáncer de tumor sólido. En algunas realizaciones, el cáncer de tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma (GBM), cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. En algunas realizaciones, el trastorno hiperproliferativo es una neoplasia hematológica. En algunas realizaciones, el cáncer de tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de células B grandes, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma folicular y linfoma de células del manto.
[1330]En algunas realizaciones, el cáncer es un fenotipo de cáncer hipermutado. Los cánceres hipermutados se describen ampliamente en Campbell, et al. (Cell, 171:1042-1056 (2017)). En algunas realizaciones, los tumores hipermutados comprenden entre 9 y 10 mutaciones por megabase (Mb). En algunas realizaciones, los tumores pediátricos hipermutados comprenden 9,91 mutaciones por megabase (Mb). En algunas realizaciones, los tumores adultos hipermutados comprenden 9 mutaciones por megabase (Mb). En algunas realizaciones, los tumores hipermutados mejorados comprenden entre 10 y 100 mutaciones por megabase (Mb). En algunas realizaciones, los tumores pediátricos hipermutados mejorados comprenden entre 10 y 100 mutaciones por megabase (Mb). En algunas realizaciones, los tumores adultos hipermutados mejorados comprenden entre 10 y 100 mutaciones por megabase (Mb). En algunas realizaciones, los tumores ultrahipermutados comprenden más de 100 mutaciones por megabase (Mb). En algunas realizaciones, los tumores pediátricos ultrahipermutados comprenden más de 100 mutaciones por megabase (Mb). En algunas realizaciones, los tumores adultos ultrahipermutados comprenden más de 100 mutaciones por megabase (Mb).
[1331]En algunas realizaciones, los tumores hipermutados tienen mutaciones en las vías de reparación de la replicación. En algunas realizaciones, los tumores hipermutados tienen mutaciones en las ADN polimerasas asociadas a la reparación de la replicación. En algunas realizaciones, los tumores hipermutados presentan inestabilidad de microsatélites. En algunas realizaciones, los tumores ultrahipermutados tienen mutaciones en las ADN polimerasas asociadas a la reparación de la replicación y presentan inestabilidad de microsatélites. En algunas realizaciones, la hipermutación en el tumor se correlaciona con la respuesta a los inhibidores de puntos de control inmunitarios. En algunas realizaciones, los tumores hipermutados son resistentes al tratamiento con inhibidores de puntos de control inmunitarios. En algunas realizaciones, los tumores hipermutados pueden tratarse utilizando los TIL de la presente invención. En algunas realizaciones, la hipermutación en el tumor está causada por factores ambientales (exposiciones extrínsecas). Por ejemplo, la luz ultravioleta puede ser la causa principal del elevado número de mutaciones en el melanoma maligno(véase,por ejemplo, Pfeifer, G.P., You, Y.H., y Besaratinia, A. (2005). Mutat. Res. 571, 19-31.; Sage, E. (1993). Photochem. Photobiol. 57, 163-174.). En algunas realizaciones, la hipermutación en el tumor puede ser causada por los más de 60 carcinógenos presentes en el humo del tabaco para los tumores de pulmón y laringe, así como otros tumores, debido a la exposición directa al mutágeno(véase,por ejemplo, Pleasance, E.D., Stephens, P.J., O'Meara, S., McBride, D.J., Meynert, A., Jones, D., Lin, M.L., Beare, D., Lau, K.W., Greenman, C., et al. (2010). Nature 463, 184-190). En algunas realizaciones, la hipermutación en el tumor es causada por la desregulación de la enzima de edición de ARNm de apolipoproteína B, miembros de la familia de polipéptidos catalíticos (APOBEC), que se ha demostrado que da lugar a un aumento de los niveles de transiciones de C a T en una amplia gama de cánceres (véase, por ejemplo, Roberts, S.A., Lawrence, M.S., Klimczak, L.J., Grimm, S.A., Fargo, D., Stojanov, P., Kiezun, A., Kryukov, G.V., Carter, S.L., Saksena, G., et al. (2013). Nat. Genet. 45, 970-976). En algunas realizaciones, la hipermutación en el tumor está causada por una reparación defectuosa de la replicación del ADN por mutaciones que comprometen la corrección de pruebas, que es realizada por las principales enzimas replicativas Pol3 y Pold1. En algunas realizaciones, la hipermutación en el tumor está causada por defectos en la reparación de errores de emparejamiento del ADN, que están asociados con la hipermutación en el cáncer colorrectal, de endometrio y otros tipos de cáncer (véase, por ejemplo, Kandoth, C., Schultz, N., Cherniack, A.D., Akbani, R., Liu, Y., Shen, H., Robertson, A.G., Pashtan, I., Shen, R., Benz, C.C., et al.; (2013). Nature 497, 67-73.; Muzny, D.M., Bainbridge, M.N., Chang, K., Dinh, H.H., Drummond, J.A., Fowler, G., Kovar, C.L., Lewis, L.R., Morgan, M.B., Newsham, I.F., et al.; (2012). Nature 487, 330-337). En algunas realizaciones, las mutaciones de reparación de la replicación del ADN también se encuentran en síndromes de predisposición al cáncer, como la deficiencia constitucional o bialélica de reparación de desajustes (CMMRD), el síndrome de Lynch y la poliposis asociada a la corrección de la polimerasa (PPAP).
[1332]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método de tratamiento de un cáncer con una población de TIL, en el que el cáncer es un cáncer hipermutado. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar un cáncer con una población de TIL, en el que el cáncer es un cáncer hipermutado mejorado. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método de tratamiento de un cáncer con una población de TIL, en el que el cáncer es un cáncer ultrahipermutado.
[1333]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método de tratamiento de un cáncer con una población de TIL, en el que un paciente se pretrata con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL según la presente divulgación. En una realización, la quimioterapia no mieloablativa es ciclofosfamida 60 mg/kg/d durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de TIL) y fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). Tras la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de TIL (en el día 0) según la presente divulgación, el paciente puede recibir una infusión intravenosa de IL-2 por vía intravenosa a 720.000 UI/kg cada 8 horas hasta tolerancia fisiológica.
[1334]La eficacia de los compuestos y combinaciones de compuestos descritos en el presente documento para tratar, prevenir y/o controlar las enfermedades o trastornos indicados puede probarse utilizando diversos modelos conocidos en la técnica, que proporcionan orientación para el tratamiento de enfermedades humanas. Por ejemplo, los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de ovario se describen, por ejemplo, en Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; y Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos del cáncer de páncreas se describen en Herreros- Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos contra el cáncer de mama se describen,p. ej.,en Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos del melanoma se describen,p. ej.,en Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos contra el cáncer de pulmón se describen, p. ej., en Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos contra el cáncer de pulmón se describen,p. ej.,en Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60; y Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32.
[1335]En algunas realizaciones, el IFN-gamma (IFN-y) es indicativo de la eficacia del tratamiento del trastorno hiperproliferativo. En algunas realizaciones, el IFN-y en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas realizaciones, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-<y>. La producción de IFN-<y>es otra medida del potencial citotóxico. La producción de<i>FN-<y>puede medirse determinando los niveles de la citocina IFN-<y>en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparadas por los métodos de la presente invención, incluyendo los descritos por ejemplo en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, los TIL obtenidos por el presente método proporcionan un aumento de IFN-y en la sangre de sujetos tratados con los TIL del presente método en comparación con sujetos tratados con TIL preparados usando métodos denominados proceso Gen 3, como se ejemplifica en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C) y a lo largo de esta solicitud. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-y es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, el IFN-<y>se multiplica por uno, por dos, por tres, por cuatro o por cinco o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y se multiplica por uno en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y se multiplica por dos en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y se incrementa tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la secreción de<i>FN-<y>se multiplica por cuatro en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>se multiplica por cinco en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, el IFN-y se mide utilizando un kit Quantikine ELISA. En algunas realizaciones, el IFN-y se mide utilizando un kit Quantikine ELISA. En algunas realizaciones, el IFN-y se mide en los TILex vivode un paciente tratado con los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, el IFN-y se mide en sangre en un paciente tratado con los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, el IFN-<y>se mide en suero en un paciente tratado con los TIL producidos por los métodos de la presente invención.
[1336]En algunas realizaciones, los TIL preparadas por los métodos de la presente invención, incluyendo las descritas por ejemplo en la Figura 1 (en particular, p. ej., la Figura 1B y/o la Figura 1C), exhiben mayor policlonalidad en comparación con los TIL producidas por otros métodos, incluyendo los no ejemplificados en la Figura 1 (en particular, p. ej., la Figura 1B y/o la Figura 1C), como por ejemplo, los métodos denominados métodos del proceso 1C. En algunas realizaciones, la policlonalidad significativamente mejorada y/o la policlonalidad aumentada es indicativa de la eficacia del tratamiento y/o de la eficacia clínica aumentada para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, la policlonalidad se refiere a la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, un aumento de la policlonalidad puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento con respecto a la administración de los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por uno, dos, diez, cien, quinientos o mil veces en comparación con los TIL preparados usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por uno en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por dos en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por diez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por 100 en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se incrementa 500 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C). En algunas realizaciones, la policlonalidad se incrementa 1000 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparadas usando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1 (en particular,p. ej.,Figura 1B y/o Figura 1C).
2. Métodos de coadministración
[1337]En algunas realizaciones, los TIL producidos como se describe en el presente documento, incluyendo, por ejemplo TIL derivados de un método descrito en las Etapas A a F de la Figura 1 (en particular, por ejemplo, la Figura 1B y/o la Figura 1C), pueden ser para administración en combinación con uno o más reguladores de punto de control inmune, tales como los anticuerpos descritos a continuación. Por ejemplo, los anticuerpos que se dirigen a PD-1 y que pueden coadministrarse con los TIL de la presente invención incluyen, p. ej, pero no se limitan a nivolumab (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), pembrolizumab (lambrolizumab, MK03475 o MK-3475, Merck; Keytruda®), anticuerpo humanizado anti-PD-1 JS001 (ShangHai JunShi), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 TSR-042 (Tesaro, Inc.), Pidilizumab (mAb anti-PD-1 CT-011, Medivation), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 BGB-A317 (BeiGene), y/o anticuerpo anti-PD-1 SHR-1210 (ShangHai HengRui), anticuerpo monoclonal humano REGN2810 (Regeneron), anticuerpo monoclonal humano MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb), y/o anticuerpo humanizado anti-PD-1 IgG4 PDR001 (Novartis). En algunas realizaciones, el anticuerpo p D-1 es del clon: RMP1-14 (rat IgG) - BioXcell cat# BP0146. Otros anticuerpos adecuados para su uso en métodos de coadministración con TIL producidos según las Etapas A a F descritos en el presente documento son los anticuerpos anti-PD-1 divulgados en el documento Patente de EE.UU. N.° 8,008,449. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se une específicamente a PD-L1 e inhibe su interacción con PD-1, aumentando así la actividad inmunitaria. Cualquier anticuerpo conocido en la técnica que se una a PD-L1 e interrumpa la interacción entre PD-1 y PD-L1, y estimule una respuesta inmunitaria antitumoral, es adecuado para su uso en métodos de coadministración con TIL producidos según las Etapas A a F descritas en el presente documento. Por ejemplo, entre los anticuerpos dirigidos contra PD-L1 y en fase de ensayo clínico se encuentran BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) y MPDL3280A (Genentech). Otros anticuerpos adecuados dirigidos contra PD-L1 se describen en Patente de EE.<u>U. N.° 7,943,743. Se entenderá por alguien con conocimientos ordinarios que cualquier anticuerpo que se una a PD-1 o PD-L1, interrumpa la interacción PD-1/PD-L1, y estimule una respuesta inmunitaria antitumoral, es adecuado para su uso en métodos de coadministración con TIL producidos según las Etapas A a F como se describe en el presente documento. El sujeto al que se administra la combinación de TIL producidas según las Etapas A a F puede coadministrarse con un anticuerpo anti-PD-1 cuando el paciente tiene un tipo de cáncer que es refractario a la administración del anticuerpo anti-PD-1 solo. Al paciente se le pueden administrar TIL en combinación con anti-PD-1 cuando el paciente tiene melanoma refractario. Al paciente se le pueden administrar TIL en combinación con y anti-PD-1 cuando el paciente tiene carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM).
3. Preacondicionamiento opcional de los pacientes por linfodepleción
[1338]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método de tratamiento de un cáncer con una población de TIL, en el que un paciente se pretrata con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL según la presente divulgación. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población de TIL para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que ha sido pretratado con quimioterapia no mieloablativa. La población de TIL puede ser para administración por infusión. La quimioterapia no mieloablativa puede ser ciclofosfamida 60 mg/kg/d durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de TIL) y fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). Tras la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de TIL (en el día 0) según la presente divulgación, el paciente puede recibir una infusión intravenosa de IL-2 (aldesleukina, disponible comercialmente como PROLEUKIN) por vía intravenosa a 720.000 UI/kg cada 8 horas hasta tolerancia fisiológica. La población de TIL puede ser para su uso en el tratamiento del cáncer en combinación con IL-2, en el que la IL-2 se administra después de la población de TIL.
[1339]Los hallazgos experimentales indican que la linfodepleción previa a la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos de tumor desempeña un papel clave en la mejora de la eficacia del tratamiento al eliminar las células T reguladoras y los elementos competidores del sistema inmunitario ("sumideros de citocinas"). En consecuencia, puede utilizarse una etapa de linfodepleción (a veces también denominada "acondicionamiento inmunosupresor") en el paciente antes de la introducción de los TIL de la invención.
[1340]En general, la linfodepleción se consigue mediante la administración de fludarabina o ciclofosfamida (la forma activa se denomina mafosfamida) y sus combinaciones. Tales métodos se describen en Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol.
2008, 26, 5233-5239, and Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357.
[1341]La fludarabina puede administrarse a una concentración de 0,5 pg/mL -10 pg/mL de fludarabina. La fludarabina puede administrarse a una concentración de 1 pg/mL de fludarabina. El tratamiento con fludarabina puede administrarse durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días o más. La fludarabina puede administrarse a una dosis de 10 mg/kg/día, 15 mg/kg/día, 20 mg/kg/día, 25 mg/kg/día, 30 mg/kg/día, 35 mg/kg/día, 40 mg/kg/día o 45 mg/kg/día. El tratamiento con fludarabina puede administrarse durante 2-7 días a razón de 35 mg/kg/día. El tratamiento con fludarabina puede administrarse durante 4-5 días a razón de 35 mg/kg/día. El tratamiento con fludarabina puede administrarse durante 4-5 días a razón de 25 mg/kg/día.
[1342]La mafosfamida, la forma activa de la ciclofosfamida, puede obtenerse a una concentración de 0,5 pg/mL -10 pg/mL mediante la administración de ciclofosfamida. La mafosfamida, la forma activa de la ciclofosfamida, puede obtenerse a una concentración de 1 pg/mL mediante la administración de ciclofosfamida. El tratamiento con ciclofosfamida puede administrarse durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días o más. La ciclofosfamida puede administrarse a una dosis de 100 mg/m2/día, 150 mg/m2/día, 175 mg/m2/día, 200 mg/m2/día, 225 mg/m2/día, 250 mg/m2/día, 275 mg/m2/día o 300 mg/m2/día. La ciclofosfamida puede administrarse por vía intravenosa(i.v.) El tratamiento con ciclofosfamida puede administrarse durante 2-7 días a razón de 35 mg/kg/día. El tratamiento con ciclofosfamida puede administrarse durante 4-5 días a 250 mg/m2/día i.v. El tratamiento con ciclofosfamida puede administrarse durante 4 días a 250 mg/m2/día i.v.
[1343]La linfodepleción puede realizarse administrando la fludarabina y la ciclofosfamida juntas a un paciente. La fludarabina puede administrarse a 25 mg/m2/día i.v. y la ciclofosfamida a 250 mg/m2/día i.v. durante 4 días.
[1344]La linfodepleción puede realizarse mediante la administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días, seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
4. Regímenes IL-2
[1345]El régimen de IL-2 puede comprender un régimen de IL-2 de dosis alta, en el que el régimen de IL-2 de dosis alta comprende aldesleucina, o un biosimilar o variante de la misma, administrada por vía intravenosa a partir del día siguiente a la administración de una porción terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de TIL, en el que la aldesleucina o un biosimilar o variante de la misma se administra a una dosis de 0,037 mg/kg o 0,044 mg/kg UI/kg (masa corporal del paciente) mediante infusiones intravenosas en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.037 mg/kg o 0,044 mg/kg UI/kg (masa corporal del paciente) mediante infusiones intravenosas en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta tolerancia, para un máximo de 14 dosis. Tras 9 días de descanso, este esquema puede repetirse para otras 14 dosis, hasta un máximo de 28 dosis en total.
[1346]El régimen de IL-2 puede comprender un régimen de IL-2 decrescendo. Los regímenes de IL-2 decrecientes se han descrito en O'Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 y Eton, et al., Un régimen decrescendo de IL-2 puede comprender 18 x 106 IU/m2 administradas por vía intravenosa durante 6 horas, seguidas de 18 x 106 IU/m2 administradas por vía intravenosa durante 12 horas, seguidas de 18 x 106 IU/m2 administradas por vía intravenosa durante 24 horas, seguidas de 4,5 x106 IU/m2 administradas por vía intravenosa durante 72 horas. Este ciclo de tratamiento puede repetirse cada 28 días hasta un máximo de cuatro ciclos. Un régimen de IL-2 decrescendo puede comprender 18.000.000 UI/m2 el día 1, 9.000.000 UI/m2 el día 2, y 4.500.000 UI/m2 los días 3 y 4.
[1347]El régimen de IL-2 puede comprender la administración de IL-2 pegilada cada 1, 2, 4, 6, 7, 14 o 21 días a una dosis de 0,10 mg/día a 50 mg/día.
5. Transferencia Celular Adoptiva
[1348]La transferencia celular adoptiva (ACT) es una forma eficaz de inmunoterapia y consiste en la transferencia de células inmunitarias con actividad antitumoral a pacientes con cáncer. El ACT es un enfoque terapéutico que implica la identificación,in vitro,de linfocitos con actividad antitumoral, la expansión in vitro de estas células hasta alcanzar grandes cantidades y su infusión en el huésped portador del cáncer. Los linfocitos utilizados para la transferencia adoptiva pueden derivarse del estroma de tumores resecados (linfocitos infiltrantes de tumores o TIL). Las TIL para ACT pueden prepararse como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL se preparan, por ejemplo, según un método como el descrito en la Figura 1 (en particular,p. ej.,la Figura 1B y/o la Figura 1C). También pueden derivarse o proceder de la sangre si se modifican genéticamente para que expresen receptores de células T antitumorales (TCR) o receptores de antígenos quiméricos (CAR), se enriquecen con cultivos mixtos de células tumorales linfocitarias (MLTC) o se clonan utilizando células presentadoras de antígenos autólogas y péptidos derivados del tumor. El TCA en el que los linfocitos proceden del huésped canceroso que se va a infundir se denomina TCA autólogo. la La publicación n° 2011/0052530 se refiere a un método para realizar terapia celular adoptiva para promover la regresión del cáncer, principalmente para el tratamiento de pacientes que sufren melanoma metastásico. Las TIL pueden administrarse como se describe en el presente documento. Los TIL pueden administrarse en una dosis única. Dicha administración puede realizarse mediante inyección, por ejemplo, intravenosa. Los TIL y/o los linfocitos citotóxicos pueden administrarse en dosis múltiples. La dosificación puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis veces al año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o una vez cada dos días. La administración de TIL y/o linfocitos citotóxicos puede continuar tanto tiempo como sea necesario.
6. Métodos adicionales de tratamiento
[1349]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda.
[1350]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda.
[1351]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que antes de administrar la dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, o la dosis terapéuticamente eficaz de la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, se ha administrado al sujeto un régimen de linfodepleción no mieloablativo.
[1352]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, modificado de tal manera que el régimen de linfodepleción no mieloablativo comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días, seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
[1353]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado para comprender además la etapa de tratar al sujeto con un régimen de IL-2 de dosis alta que comienza el día después de la administración de las células TIL al sujeto.
[1354]También se divulga aquí, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que el régimen de IL-2 de dosis alta comprende 600.000 o 720.000 UI/kg administradas como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
[1355]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea un tumor sólido.
[1356]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea melanoma, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (incluido GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer renal o carcinoma de células renales.
[1357]También se divulga aquí, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea melanoma, HNSCC, cáncer cervical, NSCLC, glioblastoma (incluyendo GBM) y cáncer gastrointestinal.
[1358]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea melanoma.
[1359]También se divulga aquí pero no se reivindica el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea HNSCC.
[1360]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea un cáncer cervicouterino.
[1361]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea NSCLC.
[1362]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea glioblastoma (incluido GBM).
[1363]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea gastrointestinal.
[1364]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea un cáncer hipermutado.
[1365]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, modificado de tal manera que el cáncer sea un cáncer pediátrico hipermutado.
[1366]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente para su uso en un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la población TIL terapéutica.
[1367]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda para su uso en un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de TIL.
[1368]También se divulga en el presente documento pero no se reivindica la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda o la composición TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda modificada de tal manera que antes de administrar al sujeto la dosis terapéuticamente eficaz de la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda o la composición TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, se ha administrado al sujeto un régimen de linfodepleción no mieloablativo.
[1369]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificada de tal manera que el régimen de linfodepleción no mieloablativo comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
[1370]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente o la composición TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente modificada para comprender además la etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta que comienza el día después de la administración de las células TIL al paciente.
[1371]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificada de modo que el régimen de IL-2 de dosis alta comprenda 600.000 o 720.000 UI/kg administradas como infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
[1372]También se divulga en el presente documento pero no se reivindica la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda o la composición TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda modificada de tal manera que el cáncer sea un tumor sólido.
[1373]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda o la composición TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda modificada de tal manera que el cáncer sea melanoma, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (incluido GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer renal o carcinoma de células renales.
[1374]También se divulga en el presente documento pero no se reivindica la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda o la composición TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda modificada de tal manera que el cáncer sea melanoma, HNSCC, cánceres cervicales, NSCLC, glioblastoma (incluido GBM) y cáncer gastrointestinal.
[1375]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda o la composición TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda modificada de tal manera que el cáncer sea melanoma.
[1376]También se divulga aquí, pero no se reivindica, la población TIL terapéutica o la composición TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea HNSCC.
[1377]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea un cáncer cervicouterino.
[1378]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea NSCLC.
[1379]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea glioblastoma (incluido GBM).
[1380]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea cáncer gastrointestinal.
[1381]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea un cáncer hipermutado.
[1382]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea un cáncer pediátrico hipermutado.
[1383]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la población TIL terapéutica.
[1384]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes aplicables anteriormente en un método para tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de TIL.
[1385]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, o la composición TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, en un método de tratamiento de cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto un régimen de linfodepleción nolinfodepleción no mieloablativo y a continuación administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente o una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según sea aplicable anteriormente.
[1386]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificada de tal manera que antes de administrar al sujeto la dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de TIL o la dosis terapéuticamente eficaz de la composición de TIL, se ha administrado al sujeto un régimen de linfodepleción no mieloablativo.
[1387]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes según corresponda, modificada de tal manera que el régimen de linfodepleción no mieloablativo comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
[1388]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población TIL terapéutica descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, o el uso de la composición TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda, modificada para comprender además la etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta que comienza el día después de la administración de las células TIL al paciente.
[1389]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos precedentes, según corresponda, modificada de modo que el régimen de IL-2 de dosis alta comprenda 600.000 o 720.000 UI/kg administradas como infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
[1390]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea un tumor sólido.
[1391]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea melanoma, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (que incluye el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales..
[1392]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea melanoma, HNSCC, cáncer cervical, NSCLC, glioblastoma (incluido GBM) y cáncer gastrointestinal.
[1393]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea melanoma.
[1394]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea HNSCC.
[1395]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea un cáncer cervicouterino.
[1396]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea NSCLC.
[1397]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea glioblastoma (incluido GBM).
[1398]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea cáncer gastrointestinal.
[1399]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea un cáncer hipermutado.
[1400]También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de TIL o la composición de TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, según corresponda, modificada de tal manera que el cáncer sea un cáncer pediátrico hipermutado.
EJEMPLOS
[1401]Las formas de realización incluidas en el presente documento se describen ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no debe interpretarse que la divulgación aquí contenida se limita a estos ejemplos, sino que debe interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que se hagan evidentes como resultado de las enseñanzas aquí contenidas.
EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS PARA LOS PROCESOS DE PRERREP Y REP
[1402]Este Ejemplo describe el procedimiento para la preparación de medios de cultivo de tejidos para su uso en protocolos que implican el cultivo de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) derivados de varios tipos de tumores incluyendo, pero no limitado a, melanoma metastásico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), carcinoma de ovario, carcinoma de mama triple negativo y adenocarcinoma de pulmón. Este medio puede utilizarse para la preparación de cualquiera de los TIL descritos en la presente solicitud y en los Ejemplos.
Preparación de CM1
[1403]Sacar los siguientes reactivos de la cámara frigorífica y calentarlos en un baño de agua a 37°C: (RPMI1640, suero AB humano, 200mM L-glutamina). Preparar el medio CM1 de acuerdo con la Tabla 19 siguiente, añadiendo cada uno de los ingredientes en la sección superior de una unidad de filtrado de 0,2 pm adecuada al volumen a filtrar. Conservado a 4°C.
TABLA 19: Preparación de CM1
[1404]El día de uso, precaliente la cantidad requerida de CM1 en un baño de agua a 37°C y agregue 6000 lU/ml de IL-2.
[1405]Suplementación adicional - según sea necesario de acuerdo con la Tabla 20.
TABLA 20: Suplemento adicional de CM1, según sea necesario.
Preparación de CM2
[1406]Retire el CM1 preparado del refrigerador o prepare CM1 fresco según la Tabla 19 anterior. Sacar AIM-V® del frigorífico y preparar la cantidad de CM2 necesaria mezclando CM1 preparado con un volumen igual de AIM-V® en un frasco estéril de medios. Se añadieron 3000 UI/ml de IL-2 al medio<c>M2 el día de su utilización. Hizo suficiente cantidad de CM2 con 3000 UI/ml de IL-2 el día de uso. Etiquetar el frasco de medio CM2 con su nombre, las iniciales del preparador, la fecha en que se filtró/preparó, la fecha de caducidad de dos semanas y guardarlo a 4°C hasta que se necesite para el cultivo de tejidos.
Preparación de CM3
[1407]Preparado CM3 el día que se requería para su uso. El CM3 era el mismo que el medio AIM-V®, suplementado con 3000 UI/ml de IL-2 el día de su utilización. Preparar una cantidad de CM3 suficiente para las necesidades experimentales añadiendo la solución madre de IL-2 directamente a la botella o bolsa de AIM-V. Mezclar bien agitando suavemente. Etiquetar el frasco con "3000 UI/ml IL-2" inmediatamente después de añadirlo al AIM-V. Si sobraba CM3, guárdelo en frascos a 4°C etiquetados con el nombre del medio, las iniciales del preparador, la fecha de preparación del medio y su fecha de caducidad (7 días después de la preparación). Medios desechados suplementados con IL-2 tras 7 días de almacenamiento a 4°C.
Preparación de CM4
[1408]CM4 fue igual que CM3, con el suplemento adicional de 2mM GlutaMAX™ (concentración final). Por cada 1L de CM3, añadir 10ml de 200mM G1utaMAX™. Preparar una cantidad de CM4 suficiente para las necesidades experimentales añadiendo solución madre de IL-2 y solución madre de GlutaMAX™ directamente a la botella o bolsa de AIM-V. Mezclar bien agitando suavemente. Etiquetar el frasco con "3000 IL/nil IL-2 y GlutaMAX" inmediatamente después de añadirlo al AIM-V. Si sobraba CM4, se almacenaba en frascos a 4°C etiquetados con el nombre del medio, "GlutaMAX", y su fecha de caducidad (7 días después de la preparación). Medios desechados suplementados con IL-2 tras 7 días de almacenamiento a 4°C.
EJEMPLO 2: USO DEL CÓCTEL DE CITOCINAS IL-2, IL-15, E IL-21
[1409]Este ejemplo describe el uso de las citoquinas IL-2, IL-15, e IL-21, que sirven como factores adicionales de crecimiento de células T, en combinación con el proceso de TIL de los Ejemplos A a G.
[1410]Utilizando los procesos aquí descritos, se cultivaron TIL a partir de tumores colorrectales, de melanoma, de cuello uterino, de mama triple negativo, de pulmón y renales en presencia de IL-2 en un brazo del experimento y, en lugar de IL-2, una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 en otro brazo al inicio del cultivo. Una vez finalizado el pre-REP, se evaluaron la expansión, el fenotipo, la función (CD107a+ e IFN-y) y el repertorio TCR Vp de los cultivos. La IL-15 y la IL-21 se describen en otra parte del presente documento y en Gruijl, et al., IL-21 promueve la expansión de linfocitos CD27+CD28+ infiltrantes de tumores con alto potencial citotóxico y baja expansión colateral de células T reguladoras, Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/).
[1411]Los resultados mostraron que se observó una mayor expansión de TIL (>20%), tanto en células CD4+ como CD8+ en las condiciones de tratamiento con IL-2, IL-15 e IL-21 en múltiples histologías en relación con las condiciones de IL-2 solamente. Se observó una inclinación hacia una población predominantemente CD8+ con un repertorio TCR Vp sesgado en los TIL obtenidos a partir de los cultivos tratados con IL-2, IL-15, e IL-21 en relación con los cultivos tratados únicamente con IL-2. IFN-y y CD107a se elevaron en los TIL tratados con IL-2, IL-15 e IL-21, en comparación con los TIL tratados únicamente con IL-2.
EJEMPLO 3: PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN MADRE DE IL-2 (CELLGENIX)
[1412]Este Ejemplo describe el proceso de disolución de interleucina-2 humana recombinante purificada y liofilizada en muestras madre adecuadas para su uso en otros protocolos de cultivo tisular, incluidos todos los descritos en la presente solicitud y en los Ejemplos, incluidos los que implican el uso de rhIL-2.
Procedimiento
[1413]Solución preparada de ácido acético al 0,2% (HAc). Transferir 29 mL de agua estéril a un tubo cónico de 50 mL. Añadir 1 mL de ácido acético 1N al tubo cónico de 50mL. Mezclar bien invirtiendo el tubo 2-3 veces. Esterilizar la solución de HAc por filtración utilizando un filtro Steriflip.
[1414]Preparado 1% HSA en PBS. Se añadieron 4 mL de solución madre de HSA al 25% a 96 mL de PBS en una unidad de filtración estéril de 150 mL. Solución filtrada. Conservado a 4°C. Para cada vial de rhIL-2 preparado, rellene los formularios.
[1415]Se preparó una solución madre de rhIL-2 (concentración final de 6 *10® UI/mL). Cada lote de rhIL-2 era diferente y requería información que se encontraba en el Certificado de Análisis (COA) del fabricante, como por ejemplo: 1) Masa de rhIL-2 por vial (mg), 2) Actividad específica de rhIL-2 (UI/mg) y 3) Volumen de reconstitución de HAc al 0,2% recomendado (mL).
[1416]Se calculó el volumen de HSA al 1% necesario para el lote de rhIL-2 mediante la ecuación siguiente:
ra í efeHAc(mL) =vol. de HSAal 1 % (mL)
[1417]Por ejemplo, según el lote 10200121 COA de rhIL-2 de CellGenix, la actividad específica para el vial de lmg es de 25 * 10® UI/mg. Recomienda reconstituir la rhIL-2 en 2 mL de HAc al 0,2%.
[1418]Se limpió el tapón de goma del vial de IL-2 con una toallita con alcohol. Utilizando una aguja 16G conectada a una jeringa de 3mL, inyectar el volumen recomendado de HAc al 0,2% en el vial. Tenga cuidado de no desplazar el tapón al retirar la aguja. Invertir el vial 3 veces y agitar hasta que se haya disuelto todo el polvo. Retire con cuidado el tapón y déjelo sobre una toallita con alcohol. Añadir al vial el volumen calculado de HSA al 1%.
[1419]Almacenamiento de la solución de rhIL-2. Para almacenamiento a corto plazo (<72hrs), conservar el vial a 4°C. Para almacenamiento a largo plazo (>72hrs), alícuota del vial en volúmenes más pequeños y almacenados en crioviales a - 20°C hasta su uso. Evita los ciclos de congelación/descongelación. Fecha de caducidad registrada de 6 meses después de la fecha de preparación. Las etiquetas de Rh-IL-2 incluían el número de proveedor y de catálogo, el número de lote, la fecha de caducidad, las iniciales del operador, la concentración y el volumen de la alícuota.
EJEMPLO 4: PROCESO DE CRIOPRESERVACIÓN
[1420]Este ejemplo describe el método de proceso de criopreservación para TIL preparados con el procedimiento abreviado y cerrado descrito en el Ejemplo G usando el Congelador de Tasa Controlada CryoMed, Modelo 7454 (Thermo Scientific).
[1421]El equipo utilizado fue el siguiente: soporte de aluminio para casetes (compatible con las bolsas de congelación CS750), casetes de crioconservación para bolsas de 750 mL, tanque de nitrógeno líquido de baja presión (22 psi), refrigerador, sensor termopar (tipo cinta para bolsas) y bolsas de congelación CryoStore CS750 (OriGen Scientific).
[1422]El proceso de congelación preveía una velocidad de 0,5 °C desde la nucleación hasta -20 °C y una velocidad de enfriamiento de 1 °C por minuto hasta -80 °C de temperatura final. Los parámetros del programa eran los siguientes: Etapa 1 - esperar a 4 °C; Etapa 2: 1,0 °C/min (temperatura de la muestra) a -4 °C; Etapa 3: 20,0 °C/min (temperatura de la cámara) hasta -45 °C; Etapa 4: 10,0 °C/min (temperatura de la cámara) hasta -10,0 °C; Etapa 5: 0,5 °C/min (temperatura de la cámara) hasta -20 °C; y Etapa 6: 1,0 °C/min (temperatura de la muestra) a -80 °C.
EJEMPLO 5: GEN 3 PROCESO EJEMPLAR
[1423]El ejemplo ofrece una comparación entre los procesos Gen 2 y Gen 3. Este ejemplo describe el desarrollo de una sólida plataforma de expansión TIL. Las modificaciones del proceso Gen 2 reducen el riesgo y agilizan el proceso de fabricación al disminuir el número de intervenciones de los operarios, reducir el tiempo total de fabricación, optimizar el uso de reactivos y facilitar un proceso flexible de producción celular semicerrado y semiautomatizado susceptible de fabricación de alto rendimiento a escala comercial.
[1424]Los TIL de proceso Gen 2 y Gen 3 se componen de TIL autólogos derivados de un paciente individual mediante resección quirúrgica de un tumor y luego expandidos ex vivo. La etapa de primera expansión con sensibilización del proceso Gen 3 consistió en un cultivo celular en presencia de interleucina-2 (IL-2) y del anticuerpo monoclonal OKT3, dirigido al correceptor de células T CD3 en un andamiaje de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) irradiadas.
[1425]La fabricación de productos Gen 2 TIL consistió en dos fases: 1) pre-Expansión Rápida (Pre-REP) y 2) Protocolo de Expansión Rápida (REp ). Durante la Pre-REP los tumores resecados se cortaron en < 50 fragmentos de 2-3 mm en cada dimensión que se cultivaron con medio de cultivo que contenía suero (medio RPMI 1640 que contenía un 10% de HuSAB suplementado) y 6.000 UI/mL de Interleucina-2 (IL-2) durante un periodo de 11 días. El día 11 se cosecharon los TIL y se introdujeron en la expansión secundaria de REP a gran escala. La REP consiste en la activación de <200*10® de las células viables de la pre-REP en un co-cultivo de 5*109 células alimentadoras de PBMC alogénicas irradiadas cargadas con 150 |jg de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT3) en un volumen de 5L de CM2 suplementado con 3000 UI/mL de rhIL-2 durante 5 días. El día 16 se reduce el volumen del cultivo en un 90% y se divide la fracción celular en múltiples matraces G-REX-500 a > 1*109 linfocitos viables/matraz y se QS a 5L con CM4. Los TIL se incuban 6 días más. El<r>E<p>se cosecha el día 22, se lava, se formula y se crioconserva antes de enviarlo a -150°C al centro clínico para su infusión.
[1426]La fabricación de productos Gen 3 TIL consistió en tres fases: 1) Primer Protocolo de Expansión 2) Protocolo de Segunda Expansión Rápida (también denominado fase de expansión rápida o REP) y 3) Subdivisión del cultivo. Para llevar a cabo la propagación de Priming First Expansion TIL, el tumor resecado se cortó en < 120 fragmentos de 2-3 mm en cada dimensión. En el día 0 de la primera expansión con sensibilización, se estableció una capa de alimentación de aproximadamente 2,5 *108 células alimentadoras de PBMC alogénicas irradiadas cargadas con OKT-3 en una superficie de aproximadamente 100 cm2 en cada uno de los 3 vasos de 100 MCS. Los fragmentos tumorales se distribuyeron y cultivaron en los 3 vasos de 100 MCS cada uno con 500 mL de medio de cultivo CM1 que contenía suero y 6.000 UI/mL de interleucina-2 (IL-2) y 15 jg de OKT-3 durante un periodo de 7 días. El día 7, se inició la REP incorporando una capa adicional de células alimentadoras de aproximadamente 5 * 108 células alimentadoras PBMC alogénicas irradiadas cargadas con OKT-3 en la fase de cultivo fragmentada del tumor en cada uno de los 3 vasos de 100 MCS y cultivando con 500 mL de medio de cultivo CM2 y 6.000 UI/mL de IL-2 y 30 jg de OKT-3. La iniciación de la REP se mejoró activando todo el cultivo de primera expansión con sensibilización en el mismo recipiente utilizando un sistema cerrado de transferencia de fluidos de células alimentadoras cargadas con OKT3 al recipiente de 100MCS. Para el Gen 3, la ampliación o división de TIL implicó etapas del proceso en los que todo el cultivo celular se amplió a un recipiente más grande mediante transferencia de fluidos en sistema cerrado y se transfirió (de un matraz de 100 M a uno de 500 M) y se añadieron 4 L adicionales de medio CM4. Las células REP se cosecharon el día 16, se lavaron, se formularon y se criopreservaron antes de enviarlas a -150°C al centro clínico para su infusión.
[1427]En general, el proceso Gen 3 es una plataforma de expansión más corta, más escalable y fácilmente modificable que se adaptará a una fabricación robusta y a la comparabilidad de los procesos.
Tabla 21: Comparación del proceso de producción Gen 2 ilustrativo y Gen 3 ilustrativo
(continuación)
(continuación)
[1428]En el día 0, para ambos procesos, el tumor se lavó 3 veces y los fragmentos fueron aleatorizados y divididos en dos pools; un pool por proceso. Para el Proceso Gen 2, los fragmentos se transfirieron a un matraz GREX 100MCS con 1 L de medio CM1 que contenía 6.000UI/mL de rhIL-2. Para el proceso Gen 3, los fragmentos se transfirieron a un matraz GREX100MCS con 200-500 mL de CM1 que contenía 6.000 UI/mL de rhIL-2, opcionalmente 15 |jg de OKT-3 y 2,5 * 108 células alimentadoras.
[1429]La siembra de TIL para el día de iniciación de Rep se produjo en días diferentes según cada proceso. Para el Proceso Gen 2, en el que el matraz G-REX 100MCS se redujo en volumen en un 90%, la suspensión celular recogida se transfirió a un nuevo G-REX 500MCS para iniciar la REP el día 11 en medio CM2 que contenía IL-2 (3000 UI/mL), más 5e9 células alimentadoras y OKT-3 (30 ng/mL). Las células se expandieron y se dividieron el día 16 en múltiples matraces GREX 500 MCS con medio CM4 con IL-2 (3000 UI/mL) según protocolo. A continuación, se cosechó el cultivo y se criopreservó el día 22 según el protocolo.
[1430]Para el proceso Gen 3, la iniciación REP se produjo el día 7, en el que se utilizó el mismo G-REX 100MCS para la iniciación REP. Brevemente, se añadieron 200-500 mL de medio CM2 que contenía IL-2 (6000 UI/mL) y 5 * 108 células alimentadoras con 30 jg de OKT-3 a cada matraz. El día 9-11 se amplió el cultivo. Todo el volumen del G-Rex100M (1L) se transfirió a un G-REX 500MCS y se añadieron 4L de CM4 que contenía IL-2 (3000 UI/mL). Los matraces se incubaron durante 5 días. Los cultivos se cosecharon y criopreservaron el día 16.
[1431]En particular, la siembra de TIL para el día de iniciación de Rep ocurrió en días diferentes según cada proceso. Para el Proceso Gen 2, en el que el matraz G-REX 100MCS se redujo en volumen en un 90%, la suspensión celular recogida se transfirió a un nuevo G-Rex 500MCS para iniciar la REP el día 11 en medio CM2 que contenía IL-2 (3000 UI/mL), más 5e9 células alimentadoras y OKT-3 (30 ng/mL). Las células se expandieron y se dividieron el día 16 en múltiples matraces G-Rex 500 MCS con medio CM4 que contenía IL-2 (3000 UI/mL) según el protocolo. A continuación, se cosechó el cultivo y se criopreservó el día 22 según el protocolo.
[1432]En particular, la siembra para el proceso Gen 3, la iniciación REP se produjo el día 7, en el que el mismo G-Rex 100MCS utilizado para la iniciación REP. Brevemente, se añadieron 800 mL de medio CM2 que contenía IL-2 (6000 UI/mL) y 1e9 células alimentadoras con 30ug de OKT-3 a cada matraz. El día 11 se amplió el cultivo para las tres series. Todo el volumen del G-Rex100MCS se transfirió a un G-Rex 500MCS y se añadieron 4 L de CM4 que contenía IL-2 (3000 UI/mL). Los cultivos se cosecharon y criopreservaron el día 16. Se incubaron 5 días.
[1433]En la comparación se incluyeron tres tumores diferentes, dos de pulmón (L4054 y L4055) y uno de melanoma (M1085T).
[1434]Los medios CM1 (medio de cultivo 1), CM2 (medio de cultivo 2) y CM4 (medio de cultivo 4) se prepararon con antelación y se mantuvieron a 4°C para L4054 y L4055. Los medios CM1 y CM2 se prepararon sin filtración para comparar el crecimiento celular con y sin filtración de los medios.
[1435]Los medios se calentaron a 37°C con hasta 24 horas de antelación para el tumor L4055 en la iniciación y ampliación de REP.
Resumen de resultados
[1436]Gen 3 se situó dentro del 30% de Gen 2 en cuanto al total de células viables alcanzadas. El producto final Gen 3 mostró una mayor producción de INF-y tras la reestimulación. El producto final Gen 3 mostró una mayor diversidad clonal medida por el total de secuencias CDR3 únicas presentes. El producto final Gen 3 mostró una mayor longitud media de los telómeros.
Resultados obtenidos
Recuento de células y%de viabilidad:
[1437]La expansión pre REP y REP en los procesos Gen 2 y Gen 3 siguió los detalles descritos anteriormente.
[1438] Tabla 22: Recuento de células pre-REP.Para cada tumor, los dos grupos contenían el mismo número de fragmentos. Debido al pequeño tamaño de los tumores, no se alcanzó el número máximo de fragmentos por matraz. Se cosecharon y contaron las células pre-REP totales (TVC) en el día 11 para el proceso Gen 2 y en el día 7 para el proceso Gen 3. Para comparar los dos brazos pre-REP, el recuento de células se dividió entre el número de fragmentos proporcionados en el cultivo con el fin de calcular una media de células viables por fragmento. Como se indica en la tabla siguiente, el proceso Gen 2 cultivó sistemáticamente más células por fragmento en comparación con el proceso Gen 3. Un cálculo extrapolado del número de TVC esperadas para el proceso Gen 3 en el día 11, que se calculó dividiendo la TVC pre-REP por 7 y luego multiplicada por 11.
Tabla 22: Recuentos de células pre-REP
* L4055, medio sin filtrar
[1439] Tabla 23: Recuento total de células viables y expansión de pliegues en el producto final TIL:Para los procesos Gen 2 y Gen 3, se contó las TVC por condición de proceso y se generó el porcentaje de células viables para cada día del proceso. En la cosecha, se recogieron células del día 22 (Gen 2) y del día 16 (Gen 3) y se estableció el recuento de TVC. A continuación, se dividió las TVC por el número de fragmentos proporcionados el día 0, para calcular una media de células viables por fragmento. La expansión de pliegues se calculó dividiendo las TVC de cosecha por sobre las TVC de inicio de REP. Como se muestra en la tabla, comparando el Gen 2 y el Gen 3, las expansiones de pliegues fueron similares para L4054; en el caso de L4055, la expansión de pliegues fue mayor para el proceso Gen 2. Concretamente, en este caso, los medios se calentaron 24 antes del día de iniciación<r>E<p>. También se observó una mayor expansión de pliegues en Gen 3 para M1085T. Un cálculo extrapolado del número de TVC esperados para el proceso Gen 3 en el día 22, que se calculó dividiendo la TVC REP por 16 y multiplicándolo por 22.
Tabla 23: Recuento total de células viables y expansión de pliegues en el producto final TIL
* L4C55. medio sin filtrar.
[1440] Tabla 24:%Viabilidad del producto final TIL:Tras la cosecha, los productos REP TIL finales se compararon con los criterios de liberación para el % de viabilidad. Todas las condiciones de los procesos Gen 2 y Gen 3 superaron el criterio de viabilidad del 70% y fueron comparables entre procesos y tumores.
Tabla 24: % de viabilidad de REP
* L4G55, medio sin filtrar.
[1441] Tabla 25: Estimación del número de células por matraz adicional para el proceso Gen 3.Debido a que el número de fragmentos por matraz era inferior al número máximo requerido, se calculó un recuento celular estimado en el día de la cosecha para cada tumor. La estimación se basó en la expectativa de que los tumores clínicos fueran lo suficientemente grandes como para sembrar 2 o 3 matraces el día 0.
Tabla 25: Cálculo del recuento celular estimado extrapolado a matraces a escala real 2 y 3 en el proceso Gen 3
INMUNOFENOTIPADO:
Comparación de marcadores fenotípicos en el producto final TIL:
[1442]Tres tumores L4054, L4055, y M1085T sufrieron expansión de TIL en los procesos Gen 2 y Gen 3. Tras la cosecha, los productos finales REP TIL se sometieron a análisis de citometría de flujo para comprobar su pureza, diferenciación y marcadores de memoria. En todas las condiciones, el porcentaje de células TCR a/b+ fue superior al 90%.
[1443]Los TIL cosechados del proceso Gen 3 mostraron una mayor expresión de CD8 y CD28 en comparación con los TIL cosechados del proceso Gen 2. El proceso Gen 2 mostró un mayor porcentaje de CD4+.Véase la figura 3 (A, B, C). Comparación de marcadores de memoria en el producto final TIL:
[1444]Los TIL cosechados del proceso Gen 3 mostraron una mayor expresión en los compartimentos de memoria central en comparación con los TIL del proceso Gen 2.Véase la figura 4 (A, B, C).
Comparación de marcadores de activación y agotamiento en el producto final TIL:
[1445]Se analizaron los marcadores de activación y agotamiento en TIL de dos tumores, L4054 y L4055, para comparar el producto final TIL de los procesos de expansión Gen 2 y Gen 3 TIL. Los marcadores de activación y agotamiento fueron comparables entre los procesos Gen 2 y Gen 3.Véase la figura 5 (A, B) y la figura 6 (A, B).
SECRECIÓN DE INTERFERÓN GAMMA TRAS LA REESTIMULACIÓN:
[1446]El día de la cosecha, el día 22 para el Gen 2 y el día 16 para el Gen 3, los TIL se sometieron a una nueva estimulación durante la noche con placas recubiertas anti -CD3 para L4054 y L4055. La reestimulación en M1085T se realizó utilizando microesferas anti-CD3, CD28 y CD137. El sobrenadante se recogió tras 24 horas de reestimulación en todas las condiciones y se congeló. El análisis de IFN<y>mediante ELISA se evaluó en el sobrenadante de ambos procesos al mismo tiempo utilizando la misma placa ELISA. Se observó una mayor producción de IFNy del proceso Gen 3 en los tres tumores analizados.Véase la figura 7 (A, B, C).
MEDICIÓN DE LOS NIVELES DE IL-2 EN LOS MEDIOS DE CULTIVO:
[1447] Para comparar el consumo de IL-2 entre los procesos Gen 2 y Gen 3, se recogió sobrenadante celular el día de inicio de REP, de ampliación y de cosecha, en los tumores L4054 y L4055. La cantidad de IL-2 en el sobrenadante del cultivo celular se midió mediante el kit Quantitate ELISA de I+D. La tendencia general indica que la concentración de IL-2 sigue siendo superior en el proceso Gen 3 en comparación con el proceso Gen 2. Esto se debe probablemente a la mayor concentración de IL-2 al inicio de la REP (6000 uI/mL) para el Gen 3 junto con el arrastre de los medios durante todo el proceso.Véase la figura 8 (A, B).
ANÁLISIS DE SUSTRATOS METABÓLICOS Y METABOLITOS
[1448]Los niveles de sustratos metabólicos como la D-glucosa y la L-glutamina se midieron como sustitutos del consumo total de medios. Se midieron sus metabolitos recíprocos, como el ácido láctico y el amoníaco. La glucosa es un azúcar simple presente en los medios de comunicación que es utilizado por las mitocondrias para producir energía en forma de ATP. Cuando se oxida la glucosa, se produce ácido láctico (el lactato es un éster del ácido láctico). El lactato se produce en gran medida durante la fase de crecimiento exponencial de las células. Los altos niveles de lactato tienen un impacto negativo en los procesos de cultivo celular.Véase la figura 9 (A, B).
[1449]Los medios usados para L4054 y L4055 se recogieron en los días de inicio de REP, ampliación y cosecha tanto para el proceso Gen 2 como Gen 3. La recogida de medios gastados fue para el Gen 2 el día 11, el día 16 y el día 22; para el Gen 3 fue el día 7, el día 11 y el día 16. El sobrenadante se analizó en un bioanalizador CEDEX para determinar las concentraciones de glucosa, ácido láctico, glutamina, glutamax, y amoníaco.
[1450]La L-glutamina es un aminoácido esencial inestable necesario en las formulaciones de los medios de cultivo celular. La glutamina contiene una amina, y este grupo estructural amida puede transportar y suministrar nitrógeno a las células. Cuando la L-glutamina se oxida, la célula produce un subproducto tóxico amoniaco. Para contrarrestar la degradación de la L-glutamina, los medios para los procesos Gen 2 y Gen 3 se complementaron con Glutamax, que es más estable en soluciones acuosas y no se degrada espontáneamente. En las dos líneas tumorales, el brazo Gen 3 (proceso de 16 días) mostró una disminución de L-glutamina y Glutamax durante el proceso y un aumento de amoníaco a lo largo de la REP. En el brazo Gen 2 (proceso de 22 días) se observó una concentración constante de L-glutamina y Glutamax, y un ligero aumento de la producción de amoníaco. Los procesos Gen 2 y Gen 3 fueron comparables el día de la cosecha (22 para Gen 2; 16 para Gen 3) para el amoníaco y mostraron una ligera diferencia en la degradación de L-glutamina.Véase la figura 10 (A, B, C).
REPETICIONES DE TELÓMEROS POR FLUJO - PECES:
[1451]Se utilizó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud media de la repetición de los telómeros en L4054 y L4055 en el proceso Gen 2 y Gen 3. La determinación de la longitud telomérica relativa (RTL) se calculó utilizando el kit Telomere PNA/FITC para análisis por citometría de flujo de DAKO. El Gen 3 mostró una longitud de telómeros comparable a la del Gen 2.
Análisis CD3
[1452]Para determinar la diversidad clonal de los productos celulares generados en cada proceso, el producto final TIL cosechado para L4054 y L4055, fue muestreado y ensayado para el análisis de diversidad clonal a través de la secuenciación de la porción CDR3 de los receptores de células T.
[1453]Tabla 26: Comparación de Gen 2 y Gen3 del porcentaje de secuencias CDR3 únicas compartidas en L4054 en el producto celular cosechado de TIL. 199 secuencias son compartidas entre el producto final Gen 3 y Gen 2, lo que corresponde al 97,07% del 80% superior de secuencias CDR3 únicas de Gen 2 compartidas con el producto final Gen 3.
Tabla 26: Comparación de secuencias uCDR3 compartidas entre procesos Gen 2 y Gen 3 en L4054.
[1454] Tabla 27: Comparación de Gen 2 y Gen3 del porcentaje de secuencias CDR3 únicas compartidas en L4055 en el producto celular cosechado de TIL.1833 secuencias son compartidas entre el producto final Gen 3 y Gen 2, lo que corresponde al 99,45% del 80% superior de secuencias CDR3 únicas de Gen 2 compartidas con el producto final Gen 3.
Tabla 27: Comparación de secuencias uCDR3 compartidas entre procesos Gen 2 y Gen 3 en L4055.
[1455]Los medios CM1 y CM2 se prepararon en avanzado sin filtración y se mantuvieron a 4°C hasta su uso para el tumor L4055 a utilizar en el proceso Gen 2 y Gen 3.
[1456]Los medios se calentaron a 37°C durante 24 horas por adelantado para el tumor L4055 el día de iniciación REP para el proceso Gen 2 y Gen 3.
[1457]No se midió LDH en los sobrenadantes recogidos en los procesos.
[1458]El recuento de células M1085T TIL se realizó con el contador celular K2 cellometer.
[1459]En el tumor M1085T, no se dispuso de muestras como el sobrenadante para el análisis metabólico, el producto TIL para el análisis de marcadores de activación y agotamiento, la longitud de los telómeros y el análisis CD3 - TCR vb.
CONCLUSIONES
[1460]Este ejemplo compara 3 tejidos tumorales de donantes independientes en términos de atributos de calidad funcional, además de la caracterización fenotípica ampliada y el consumo de medios entre los procesos Gen 2 y Gen 3.
[1461]La comparación de la expansión pre-REP y REP de Gen 2 y Gen 3 se evaluó en términos de células viables totales generadas y viabilidad de la población total de células nucleadas. La dosis de células TVC en el día de la cosecha no fue comparable entre Gen 2 (22 días) y Gen 3 (16 días). Las dosis de células del Gen 3 fueron inferiores a las del Gen 2, en torno al 40% del total de células viables recogidas en la cosecha.
[1462]Se calculó un número extrapolado de células para el proceso Gen 3 que suponía que la cosecha pre-REP ocurría en el día 11 en lugar del día 7 y la cosecha REP en el día 22 en lugar del día 16. Ambos casos mostraron números más cercanos de TVC utilizando el proceso Gen 3 en comparación con el proceso Gen 2, lo que indicaba que la activación temprana permitía un mejor rendimiento general en el crecimiento de TIL. Véanse las Tablas 4 y 5, fila inferior.
[1463]En el caso del valor extrapolado para matraces extra (2 o 3) en el proceso Gen 3 asumiendo un mayor tamaño de tumor procesado, y alcanzando el número máximo de fragmentos requeridos por proceso según lo descrito. Se observó que se puede alcanzar una dosis similar en TVC en el día 16 de cosecha para el proceso Gen 3 en comparación con el proceso Gen 2 en el día 22. Esta observación es importante e indica que una activación temprana del cultivo puede permitir un mejor rendimiento de los TIL en menos tiempo de procesamiento.
[1464]Las comparaciones Gen 2 y Gen 3 pre-REP y expansión REP se evaluaron en términos de células viables totales generadas y viabilidad de la población total de células nucleadas. La dosis de células TVC en el día de la cosecha no fue comparable entre Gen 2 (22 días) y Gen 3 (16 días). Las dosis de células del Gen 3 fueron inferiores a las del Gen 2, en torno al 40% del total de células viables recogidas en la cosecha.
[1465]En cuanto a la caracterización fenotípica, se observó una mayor expresión de CD8+ y CD28+ en tres tumores del proceso Gen 3 en comparación con el proceso Gen 2. Estos datos indican que el proceso Gen 3 ha mejorado los atributos del producto final TIL en comparación con Gen 2.
[1466]El proceso Gen 3 mostró compartimentos de memoria central ligeramente superiores en comparación con el proceso Gen 2.
[1467]Los procesos Gen 2 y Gen 3 mostraron marcadores de activación y agotamiento comparables, a pesar de la menor duración del proceso Gen 3.
[1468]La producción de IFN gamma (IFNy) fue 3 veces superior en el producto final Gen 3 en comparación con Gen 2 en los tres tumores analizados. Estos datos indican que el proceso Gen 3 generó un producto TIL altamente funcional y
más potente en comparación con el proceso Gen 2, posiblemente debido a la mayor expresión de CD8 y CD28 en Gen 3. La producción de IFN-y fue 3 veces superior en el producto final Gen 3 en comparación con Gen 2 en los tres tumores analizados, lo que sugiere que el proceso Gen 3 generó TIL altamente funcionales. La caracterización fenotípica sugirió tendencias positivas en el Gen 3 hacia la expresión CD8+, CD28+ en tres tumores en comparación con el proceso Gen 2.
[1469]La longitud de los telómeros en el producto final TIL entre Gen 2 y Gen 3 era comparable.
[1470]Los niveles de glucosa y lactato fueron comparables entre el producto final de Gen 2 y Gen 3, lo que sugiere que los niveles de nutrientes en los medios del proceso Gen 3 no se vieron afectados debido a la no ejecución de la eliminación de reducción de volumen en cada día del proceso y a un menor volumen total de medios en el proceso, en comparación con Gen 2.
[1471]En general, el proceso Gen 3 mostró una reducción de casi el doble del tiempo de procesamiento en comparación con el proceso Gen 2, lo que supondría una reducción sustancial en el coste de los bienes (COG) para el producto TIL ampliado por el proceso Gen 3.
[1472]El consumo de IL-2 indica una tendencia general de consumo de IL-2 en el proceso Gen 2, y en el proceso Gen 3 la IL-2 fue mayor debido a la no eliminación de los medios antiguos.
[1473]El proceso Gen 3 mostró una mayor diversidad clonal medida por el análisis de la secuencia CDR3 TCRab.
[1474]La adición de alimentadores y OKT-3 en el día 0 del pre-REP permitió una activación temprana de TIL y, en general, un mejor rendimiento de TIL de crecimiento utilizando el proceso Gen 3.
[1475]La Tabla 28 describe varias realizaciones y resultados del proceso Gen 3 en comparación con el proceso Gen 2 actual:
Tabla 28: Proceso ejemplar Gen 3.
continuación
(continuación)
EJEMPLO 6: UNA REALIZACION EJEMPLAR DE LA SELECCION Y EXPANSION DE PBL A PARTIR DE PBMC EN PACIENTES CON CLL.
[1476]Las PBMC se obtienen de los pacientes y se congelan para su uso posterior o se utilizan frescas. Se recoge un volumen suficiente de sangre periférica para obtener al menos 400.000.000 (400 *106) PBMC como material de partida en el método de la presente invención. El día 0 del método, la IL-2 a 6 * 106 UI/mL se prepara fresca o descongelada, y se almacena a 4°C o en hielo hasta que esté lista para su uso. Se preparan 200 mL de medio CM2 combinando 100 mL de medio CM1 (que contiene GlutaMAX®) y diluyéndolo después con 100 mL (1:1) con AIM-V para hacer CM2. El CM2 se protege de la luz y se cierra herméticamente cuando no se utiliza.
[1477]Todas las etapas siguientes se realizan en condiciones estériles de cultivo celular. Una alícuota de CM2 se calienta en un tubo cónico de 50 mL en un baño de agua a 37°C para su uso en la descongelación y/o lavado de una muestra congelada de PBMC. Si se utiliza una muestra de PBMC congelada, la muestra se retira del congelador y se mantiene en hielo seco hasta que esté lista para descongelarse. Cuando esté listo para descongelar el criovial de PBMC, se colocan 5 mL de medio c M2 en un tubo cónico estéril de 50 mL. El criovial de la muestra de PBMC se coloca en un baño de agua a 37°C hasta que sólo queden unos pocos cristales de hielo. Se añade medio CM2 calentado, gota a gota, al vial de muestra en una relación de volumen 1:1 de muestra:medio (aproximadamente 1 mL). Se extrae todo el contenido del criovial y se transfiere al medio CM2 restante en el tubo cónico de 50 mL. Se utilizan 1-2 mL adicionales de medio CM2 para enjuagar el criovial y se extrae todo el contenido del criovial y se transfiere al tubo cónico de 50 mL. A continuación, se ajusta el volumen del tubo cónico con medio CM2 adicional hasta 15 mL y se agita suavemente para enjuagar las células. A continuación, se centrifuga el tubo cónico a 400 g durante 5 minutos a temperatura ambiente para recoger el sedimento celular.
[1478]Se retira el sobrenadante del pellet, se tapa el tubo cónico y luego se rompe el pellet celular, por ejemplo, raspando el tubo a lo largo de una superficie rugosa. Se añade aproximadamente 1mL de medio CM2 al sedimento celular y se aspiran el sedimento y el medio arriba y abajo 5-10 veces con una pipeta para romper el sedimento celular. Se añaden otros 3-5 mL de medio CM2 al tubo y se mezclan con una pipeta para suspender las células. En este punto, se registra el volumen de la suspensión celular. Extraer 100 pl de la suspensión celular del tubo para el recuento celular con un contador celular automático, por ejemplo, un Nexcelom Cellometer K2. Determine el número de células vivas en la muestra y regístrelo.
[1479]Reservar un mínimo de 5 *106 células para fenotipado y otros experimentos de caracterización. Centrifugar las células reservadas a 400 g durante 5 minutos a temperatura ambiente para recoger el sedimento celular. Resuspender el sedimento celular en medio de congelación (FBS estéril inactivado por calor con un 20% de DMSO). Congelar una o dos alícuotas de las células reservadas en medio de congelación, y congelar lentamente las alícuotas en un congelador de células (Mr. Frosty™) en un congelador a -80°C. Trasladar al almacenamiento en nitrógeno líquido después de un mínimo de 24 horas a -80°C.
[1480]Para las siguientes etapas, utilice soluciones preenfriadas, trabaje rápidamente y mantenga las células frías. La siguiente etapa consiste en purificar la fracción de células T de la muestra de PBMC. Para ello se utiliza un kit de aislamiento de células T Pan (Miltenyi, catálogo n° 130-096-535). Preparar las células para la purificación lavándolas con un tampón de lavado filtrado estéril que contenga PBS, 0,5% de B<s>A y 2 mM de EDTA a pH 7,2. La muestra de PBMC se centrifuga a 400 g durante 5 minutos para recoger el sedimento celular. Se aspira el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular en 40 uL de tampón de lavado por cada 107 células. Añadir 10 pl de Pan T Cell Biotin-Antibody Cocktail por cada 107 células. Mezclar bien e incubar durante 5 minutos en el frigorífico o en hielo. Añadir 30 pl de tampón de lavado por cada 107 células. Añadir 20 uL de Pan T-cell MicroBead Cocktail por cada 107 células. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos en el frigorífico o en hielo. Preparar una columna LS y separar magnéticamente las células de las microperlas. La columna LS se coloca en el campo magnético QuadroMACS. La columna LS se lava con 3 mL de tampón de lavado frío, y el lavado se recoge y se desecha. La suspensión celular se aplica a la columna y se recoge el flujo (células no marcadas). Este flujo es la fracción enriquecida de células T (PBL). Lavar la columna con 3 mL de tampón de lavado y recoger el flujo en el mismo tubo que el flujo inicial. Tapar el tubo y colocarlo en hielo. Se trata de la fracción de células T, o PBL. Retire la columna LS del campo magnético, lave la columna con 5 mL de tampón de lavado y recoja la fracción de células no T (células marcadas magnéticamente) en otro tubo. Centrifugar ambas fracciones a 400 g durante 5 minutos para recoger los gránulos celulares. Se aspiran los sobrenadantes de ambas muestras, se rompe el precipitado y se resuspenden las células en 1 mL de medio c M2 suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 en cada precipitado, y se pipetea arriba y abajo 5-10 veces para romper los precipitados. Añadir 1-2 mL de CM2 a cada muestra, y mezclar bien cada muestra, y guardar en la incubadora de cultivo de tejidos para las siguientes etapas. Extraer una alícuota de 50 |jl de cada muestra, contar las células y registrar el recuento y la viabilidad.
[1481]A continuación, las células T (PBL) se cultivan con Dunabeads™ Human T-Expander CD3/CD28. Un vial de Dynabeads se agita en vórtex durante 30 segundos a velocidad media. Se extrae una alícuota necesaria de microesferas del vial de reserva y se introduce en un microtubo estéril de 1,5 ml. Las microesferas se lavan con solución de lavado de microesferas añadiendo 1 mL de lavado de microesferas al microtubo de 1,5 mL que contiene las microesferas. Mezclar suavemente. Coloque el tubo en el imán DynaMag™-2 y déjelo reposar durante 30 minutos mientras las perlas atraen hacia el imán. Aspirar la solución de lavado de las microesferas y retirar el tubo del imán. Se añade a las microesferas 1mL de medio CM2 suplementado con 3000 UI/mL de IL-2. Todo el contenido del microtubo se transfiere a un tubo cónico de 15 o 50 ml. Llevar las microesferas a una concentración final de unas 500.000/mL utilizando medio CM2 con IL-2.
[1482]Las células T (PBL) y las perlas se cultivan juntas de la siguiente manera. El día 0: En una placa G-Rex de 24 pocillos, en un total de 7mL por pocillo, añadir 500.000 células T, 500.000 CD3/CD28 Dynabeads, y Cm 2 suplementado con IL-2. La placa G-Rex se coloca en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO<2>hasta el siguiente etapa del proceso (el día 4). Las células restantes se congelan en medio de criopreservación CS10 utilizando un congelador de células Mr. Frosty™. La fracción de células no T se congela en medio de criopreservación CS10 utilizando un congelador de células Mr. Frosty. El día 4, se cambia el medio. Se retira la mitad del medio (aproximadamente 3,5 mL) de cada pocillo de la placa G-rex. Se añade un volumen suficiente (aproximadamente 3,5 mL) de medio CM4 suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 calentado a 37°C para sustituir el medio extraído de cada pocillo de muestra. La placa G-rex se devuelve a la incubadora.
[1483]El día 7, las células se preparan para la expansión por REP. Se saca la placa G-rex de la incubadora y se retira la mitad del medio de cada pocillo y se desecha. Las células se resuspenden en el medio restante y se transfieren a un tubo cónico de 15 ml. Los pocillos se lavan con 1 mL cada uno de CM4 suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 calentado a 37°C y el medio de lavado se transfiere al mismo tubo de 15 mL con las células. Se extrae una muestra representativa de células y se cuenta utilizando un contador celular automatizado. Si hay menos de 1 * 106 células vivas, se repite el proceso de expansión de Dynabead en el Día 0. El resto de las células se congela para una expansión de reserva o para estudios de fenotipado y otros estudios de caracterización. Si hay 1 * 106 células vivas o más, la expansión REP se establece en réplicas según el protocolo del Día 0. Alternativamente, con suficientes células, la expansión puede establecerse en un matraz de cultivo G-rex 10M utilizando 10-15 * 106 PBL por matraz y una relación 1:1 de Dynabeads:PBL en un volumen final de 100 mL/pocillo de medio CM4 suplementado con 3000 UI/mL de IL-2. La placa y/o el matraz se devuelven a la incubadora. El exceso de PBL puede alicuotarse y congelarse lentamente en un congelador de células Mr. Frosty™ en un congelador a -80°C, y transferirse al almacenamiento en nitrógeno líquido tras un mínimo de 24 horas a -80°C. Estos PBL pueden utilizarse como muestras de reserva para la expansión o para el fenotipado u otros estudios de caracterización.
[1484]El día 11, se cambia el medio. Se retira la mitad del medio de cada pocillo de la placa G-rex o del matraz y se sustituye por la misma cantidad de medio CM4 fresco suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 a 37°C.
[1485]El día 14, se cosechan los PBL. Si se utiliza la placa G-rex, se retira aproximadamente la mitad del medio de cada pocillo de la placa y se desecha. Los PBL y las perlas se suspenden en el medio restante y se transfieren a un tubo cónico estéril de 15 mL (Tubo 1). Los pocillos se lavan con 1-2 mL de medio AIM-V fresco calentado a 37°C, y el lavado se transfiere al Tubo 1. Se tapa el tubo 1 y se coloca en el imán DynaMag™-15 durante 1 minuto para permitir que las microesferas sean atraídas por el imán. La suspensión celular se transfiere a un nuevo tubo de 15 mL (Tubo<2>), y las microesferas se lavan con 2 mL de AIM-V fresco a 37°C. Se vuelve a colocar el Tubo 1 en el imán durante 1 minuto más y, a continuación, se transfiere el medio de lavado al Tubo 2. Los pocillos pueden combinarse si se desea, después de la etapa final de lavado. Extraer una muestra representativa de células y contar, registrar el recuento y la viabilidad. Los tubos pueden colocarse en la incubadora mientras se realiza el recuento. Puede añadirse medio AIM-V adicional al Tubo 2 si las células parecen muy densas. Si se utiliza un matraz, el volumen de éste debe reducirse a aproximadamente 10 mL. Se mezcla el contenido del matraz y se transfiere a un tubo cónico de 15 mL (Tubo A). El matraz se lava con 2 mL del medio AIM-V como se ha descrito anteriormente y el medio de lavado también se transfiere al Tubo A. El Tubo A se tapa y se coloca en el Imán DynaMag™-15 durante 1 minuto para permitir que las microesferas sean atraídas hacia el imán. La suspensión celular se transfiere a un nuevo tubo de 15 mL (Tubo B), y las microesferas se lavan con 2 mL de AIM-V fresco a 37°C. Se vuelve a colocar el Tubo A en el imán durante 1 minuto más y, a continuación, se transfiere el medio de lavado al Tubo B. Si se desea, se pueden combinar los pocillos después de la última etapa de lavado. Extraer una muestra representativa de células y contar, registrar el recuento y la viabilidad. Los tubos pueden colocarse en la incubadora mientras se realiza el recuento. Se puede añadir medio AIM-V adicional al Tubo B si las células aparecen muy densas. Las células pueden utilizarse frescas o congeladas en medio de conservación CS10 a las concentraciones deseadas.
EJEMPLO 7: UNA REALIZACIÓN EJEMPLAR DE EXPANSIÓN DE CÉLULAS T DE NEOPLASIAS HEMATOPOYÉTICAS UTILIZANDO LA PLATAFORMA DE EXPANSIÓN GEN 3.
[1486]En el Día 0, una fracción de células T (CD3+,CD45+) es aislada de un producto de aféresis enriquecido para linfocitos, sangre entera, o digerido de tumor (fresco o descongelado) usando métodos de selección positiva o negativa, es decir removiendo las células T usando un marcador de células T (CD2,CD3,etc, o removiendo otras células dejando las células T), o centrifugación en gradiente.
[1487] El proceso Gen 3.1 se inicia sembrando ~1*107 células/ matraz según el proceso Gen3 descrito en el presente documento.
[1488] En el Día 7, las células se reactivan según el proceso Gen 3.1.
[1489] En el día 9-11, las células se escalan según el proceso Gen 3.1.
[1490] En el día 14-16, las células son cosechadas según el proceso Gen 3.1.
[1491] La Figura 42 proporciona un diagrama esquemático de una realización ejemplar para expandir TIL de neoplasias hematopoyéticas usando el proceso Gen 3.
EJEMPLO 8: UNA REALIZACIÓN EJEMPLAR DE LA PLATAFORMA DE EXPANSIÓN GEN 3 EN EL DÍA 0
[1492] Preparado medio de lavado tumoral. Medios calentados antes del inicio. Se añaden 5 mL de gentamicina (50mg/mL) a la botella de 500 mL de HBSS. Añadir SmL de Medio de Lavado de Tumores a un cónico de 15mL que se utilizará para la dilución de OKT3. Conservar a temperatura ambiente (RT)
[1493] Bolsas de células alimentadoras preparadas. Se transfieren estérilmente las células alimentadoras a bolsas de células alimentadoras y se almacenan a 37°C hasta su uso o congelación. Recuento de células alimentadoras si a 37°C. Descongelación y recuento de las células alimentadoras si están congeladas.
[1494] El intervalo óptimo para la concentración de células alimentadoras está entre 5*104 y 5*10® células/mL. Preparar cuatro tubos cónicos con 4,5mL de AIM-V. Añadir 0,5 mL de fracción celular para cada recuento celular.
[1495] Si el número total de células alimentadoras viables era > 1 * 109 células, se procedió al siguiente etapa para ajustar la concentración de células alimentadoras. Calcular el volumen de células alimentadoras que hay que retirar de la primera bolsa de células alimentadoras para añadir 1 *109 células a una segunda bolsa de células alimentadoras.
[1496] Usando la micropipeta p1000, transfiera 900 jl de medio de lavado tumoral a la alícuota OKT3 (100|jL). Utilizando una jeringa y una técnica estéril, se extraen 0,6 mL de OKT3 y se añaden a la segunda bolsa de células alimentadoras. Ajuste del volumen del medio a un volumen total de 2L. Transfirió la segunda bolsa de células alimentadoras a la incubadora.
[1497] Detalles de la formulación OKT3: OKT3 puede ser alicuotado y congelado en la concentración original del vial (1mg/mL) en alícuotas de 100ul. ~10X alícuotas por vial de 1mL. Almacenado a -80C. Día 0: 15ug/matraz,es dec ir30ng/mL en 500mL - 60ul máx ~ 1 alícuota.
[1498] Muestras tumorales preparadas. Obtención de placas de 6 pocillos y placas Petri de 100 mm (4 en total). Etiquetar la placa de 6 pocillos "Piezas tumorales sobrantes". Etiquetar una de cada una de las cuatro placas de Petri de 100 mm como "Lavado_01", "Lavado_02", "Lavado_03", "Lavado_04" y "Mantenimiento".
[1499] Se añadieron 5 mL de Medio de Lavado Tumoral en todos los pocillos de la placa de 6 pocillos etiquetada como Exceso de Piezas Tumorales. Mantuvo el medio de lavado del tumor disponible para su uso posterior para mantener el tumor hidratado durante la disección.
[1500] Se añadieron 50 mL de Medio de Lavado de Tumores a cada placa Petri de 100 mm etiquetadas como Lavado_01, Lavado_02, Lavado_03 y Mantenimiento (Lavado_04). Con un rotulador, rotula cada placa de Petri como Disección 1 a Disección 4. Incubar el tumor a temperatura ambiente en Lavado_01 durante > 3 min. Incubar el tumor a temperatura ambiente en Lavado_02 durante > 3 min. Se incubó el tumor a temperatura ambiente en Lavado_03 durante > 3 min. Lavado_04 fue para mantener el tumor después de completar tres lavados. Una vez finalizados los lavados, se trasladó el tumor a la placa de "Mantenimiento" para garantizar que el tejido se mantuviera hidratado.
[1501] Mientras se realizaban las incubaciones tumorales, se transfirieron 10 mL de medio de envío tumoral a un tubo etiquetado como Medio de Lavado Tumoral. Extraer 10mL del medio de envío de tumores en una jeringa e inocular una cada botella de esterilidad anaeróbica y aeróbica con 5 mL de medio de envío de tumores.
[1502] Colocó la regla bajo la tapa de la placa de Petri durante todo el proceso de disección. Medición y registro de la longitud del tumor y del número de fragmentos. Diseccionar el tumor en cuatro piezas intermedias o agrupar en cuatro grupos de volumen equivalente y conservando la estructura tumoral de cada pieza intermedia. Mantenga hidratadas las piezas tumorales.
[1503] Transfirió los trozos de tumor intermedios que no se estaban disecando activamente al plato de Mantenimiento para mantener el tejido hidratado.
[1504]Diseccionó el tumor en fragmentos de 27 mm3 (3x3x3mm), utilizando como referencia la regla situada bajo la tapa del plato de disección. Se diseccionan los fragmentos intermedios hasta alcanzar los 60 fragmentos. Se contó el número total de fragmentos finales y se prepararon matraces G-Rex 100MCS según el número de fragmentos finales generados (generalmente 60 fragmentos por matraz).
[1505]Retención de fragmentos de tejido favorables en los tubos cónicos etiquetados como Tubo de fragmentos 1 a Tubo de fragmentos 4. Se calculó el número de matraces G-Rex 100MCS para sembrar con suspensión de células alimentadoras en función del número de tubos de fragmentos originados.
[1506]Se retira la bolsa de células alimentadoras de la incubadora y se siembra el G-Rex 100MCS. Etiquetar como D0 (Día 0).
CULTIVO DE ADICIÓN DE FRAGMENTOS TUMORALES EN G-REX100MCS
[1507]En condiciones estériles, desenrosque la tapa del G-Rex 100MCS etiquetado como Cultivo de fragmentos tumorales (D0) 1 y el tubo cónico de 50 mL etiquetado como Tubo de fragmentos. Agite el Tubo de Fragmentos 1 abierto y, al mismo tiempo, levante ligeramente la tapa del G-Rex100MCS. Se añade el medio con los fragmentos al G-Rex100MCS mientras se agita. Registro del número de fragmentos transferidos al G-Rex100MCS.
[1508]Una vez localizados los fragmentos en el fondo del matraz GREX, se extrajeron 7 mL de medio y se crearon siete alícuotas de 1 mL - 5 mL para la caracterización ampliada y 2 mL para las muestras de esterilidad. Se almacenaron las 5 alícuotas (sobrenadante final del cultivo de fragmentos) para su caracterización prolongada a -20°C hasta que se necesitaron.
[1509]Se inoculó un frasco de BacT/Alert anaeróbica y un frasco de BacT/Alert aeróbica cada una con 1mL de sobrenadante final del cultivo de fragmentos. Repetir para cada matraz muestreado.
EJEMPLO 9: UNA REALIZACIÓN EJEMPLAR DE LA PLATAFORMA DE EXPANSIÓN GEN 3 EN EL DÍA 7-8
[1510]Bolsas de células alimentadoras preparadas. Descongelar las bolsas de alimentación durante 3-5 minutos en un baño de agua a 37°C cuando estén congeladas. Recuento de células alimentadoras si están congeladas.
[1511]El intervalo óptimo para la concentración de células alimentadoras está entre 5*104 y 5*10® células/mL. Preparar cuatro tubos cónicos con 4,5mL de AIM-V. Añadir 0,5 mL de fracción celular para cada recuento celular en un nuevo tubo criovial. Se mezclaron bien las muestras y se procedió al recuento celular.
[1512]Si el número total de células alimentadoras viables era > 2 * 109 células, se procedió al siguiente etapa para ajustar la concentración de células alimentadoras. Calcular el volumen de células alimentadoras que hay que retirar de la primera bolsa de células alimentadoras para añadir 2 *109 células a la segunda bolsa de células alimentadoras.
[1513]Usando la micropipeta p1000, transfieran 900|jl de HBSS a una alícuota de 100|jl de OKT3. Mezclar pipeteando arriba y abajo 3 veces. Prepara dos alícuotas.
[1514]Detalles de la formulación OKT3: OKT3 puede alicuotarse y congelarse en la concentración original del vial (1 mg/mL) en alícuotas de 100ul. ~10X alícuotas por vial de 1mL. Almacenado a -80C. Día 7/8: 30ug/matraz,es decir60ng/mL en 500mL - 120ul máx ~ 2 alícuotas.
[1515]Usando una jeringa y una técnica estéril, se extrajeron 0.6 mL de OKT3 y se agregaron a la bolsa de células alimentadoras, asegurando que todo se agregara. Ajuste del volumen del medio a un volumen total de 2L. Repetir con la segunda alícuota de OKT3 y añadir a la bolsa de células alimentadoras. Transfirió la segunda bolsa de células alimentadoras a la incubadora.
PREPARAR EL MATRAZ G-REX100MCS CON LA SUSPENSIÓN DE CÉLULAS ALIMENTADORAS
[1516]Se registra el número de matraces G-Rex 100MCS a procesar según el número de matraces G-Rex generados el Día 0. Se retira el matraz G-Rex de la incubadora y se retira la segunda bolsa de células alimentadoras de la incubadora.
Eliminación del sobrenadante antes de añadir la suspensión de células alimentadoras:
[1517]Se conecta una jeringa de 10 mL al matraz G-Rex100 y se extraen 5 mL de medio. Creó cinco alícuotas de 1 mL -5 mL para la caracterización extendida y almacenó las 5 alícuotas (sobrenadante final del cultivo de fragmentos) para la caracterización extendida a -20°C hasta que lo solicitara el patrocinador. Etiquetado y repetido para cada matraz G-Rex100.
[1518]5-20 X 1 mL muestras para caracterización, dependiendo del número de matraces:
5mL = Imatraz
10mL = 2 matraces
15 mL = 3 matraces
20 mL =4 matraces
[1519]Se continuó sembrando células alimentadoras en el G-Rex100 MCS y se repitió para cada matraz G-Rex100 MCS. Utilizando métodos de transferencia estériles, se transfirieron por gravedad 500 mL de la segunda bolsa de células alimentadoras por peso (suponiendo que 1g = 1mL) a cada matraz G-Rex 100MCS y se recortó la cantidad. Etiquetado como cultivo de Día 7 y repetido para cada matraz G-Rex100. Transfirió los matraces G-Rex 100MCS a la incubadora.
EJEMPLO 10: UNA REALIZACIÓN EJEMPLAR DE LA EXPANSIÓN GEN 3
PLATAFORMA EN EL DÍA 10-11
[1520]Se extrajo el primer matraz G-Rex 100MCS y utilizando condiciones estériles se extrajeron 7 mL de Sobrenadante de Cultivo Preprocesado utilizando una jeringa de 10 mL. Creó siete alícuotas de 1 mL - 5 mL para caracterización ampliada y 2 mL para muestras de esterilidad.
[1521]Se mezcla el matraz con cuidado y, utilizando una jeringa nueva de 10 mL, extraer 10 mL de sobrenadante y transferirlos a un tubo de 15 mL etiquetado como D10/11 Mycoplasma Supernatant.
[1522]Mezclar cuidadosamente el matraz agitándolo suavemente para poner las células en suspensión. Con una nueva jeringa, extraiga el volumen indicado a continuación en función del número de matraces que vaya a procesar y añádalo a un tubo cónico de 50 ml. Las muestras extraídas de cada matraz se mantuvieron separadas y no se mezclaron.
1 matraz = 40mL
2 matraces = 20mL/matraz
3 matraces = 13,3 ml/matraz
4 matraces = 10mL/matraz
[1523]Etiquetado cada tubo cónico Día 10/11 Matraz de Muestra QC #. Almacenado en la incubadora hasta que se necesite en la sección 14. Repetir para cada matraz.
[1524]Debe extraerse un total de 40 mL de todos los matraces y juntarse en un tubo cónico de 50 mL etiquetado "Muestra QC Día 10/11" y guardarse en la incubadora hasta que se necesite. Realizado un recuento de células y asignado las células.
[1525]Se almacena las 5 alícuotas (sobrenadante de cultivo preprocesado) para su caracterización prolongada a <-20°C hasta su necesidad. Inocular un frasco de BacT/Alert anaerobio y un frasco de BacT/Alert aerobio cada uno con 1mL de sobrenadante de cultivo preprocesado.
[1526]Se continúa con la suspensión celular transferida al G-Rex 500MCS y se repite para cada G-Rex 100MCS. Utilizando condiciones estériles, transfirió el contenido de cada G-Rex 100MCS a un G-Rex 500MCS, controlando aproximadamente 100 mL de transferencia de fluido cada vez. Detener la transferencia cuando el volumen del G-Rex 100MCS se redujera a 500 mL (o en algunos casos a aproximadamente 100 mL).
[1527]Durante la etapa de transferencia, se utilizó una jeringa de 10 mL y se extrajeron 10 mL de suspensión celular en la jeringa desde el G-Rex 100MCS. Siga las instrucciones según el número de matrmatracesazs en cultivo. Si sólo 1 matraz: Extrajo 20 mL en total utilizando dos jeringas. Si son 2 matraces: retirar 10 mL por matraz. Si son 3 matraces: retirar 7 mL por matraz. Si son 4 matraces: retirar 5 mL por matraz. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico común de 50 mL. Mantener en la incubadora hasta la etapa de recuento celular y la muestra de QC. El número total de células necesarias para el QC fue de ~ 20e6 células: 4 * 0,5 mL de recuentos celulares (los recuentos celulares se realizaron primero sin diluir).
[1528]Células necesarias para los ensayos:
10e6 células como mínimo para el ensayo IFN-G
1e6 células para micoplasma
5e6 células fluyen CD3+/CD45+
[1529]Se transfiere los matraces G-Rex 500MCS a la incubadora.
Muestras QC preparadas
[1530]Se necesitaba al menos 15 *108. Ensayos incluidos: Recuento celular y viabilidad; Micoplasma (1 * 106 células/ concentración media viable;) Citometría de flujo y fenotipado (5 * 106 células/ concentración media viable;) y ensayo IFN-g(5 x 106 células -1 x 106 células;se requieren 8-10 * 106 células para el ensayo IFN-y.
[1531]Se calcula el volumen de la fracción de células para la crioconservación a 10 *106 células/mL y calculado el número de viales a preparar.
EJEMPLO 11: UN EJEMPLO DE EXPANSIÓN GEN 3
PLATAFORMA DÍA 16-17
Preparación del tampón de lavado (1% HAS PLASMALYTE A)
[1532]Transferencia de HSA y PLasmalyte a una bolsa de 5L para hacer tampón de lavado LOVO. Utilizando condiciones estériles, transfiera un volumen total de 125 mL de HSA al 25% a la bolsa de 5L. Conservado a temperatura ambiente.
[1533]Se retiraron y transfirieron 10 mL o 40 mL de tampón de lavado en el tubo "IL-26 *104 UI/mL" (10 mL si la IL-2 se preparó con antelación o 40 mL si la IL-2 se preparó fresca). Cuando la IL-2 se preparó en fresco: Mezclar la bolsa de tampón de lavado LOVO y, utilizando una jeringa del tamaño adecuado, extraer y transferir 40mL de tampón de lavado al tubo 'IL-26 *<10 4>UI/mL'. Cuando la IL- 2 se preparó por adelantado, la alícuota de IL-2 fue de 6 * 104 UI/mL.
[1534]Volumen calculado de IL-2 reconstituida para añadir a Plasmalyte+ 1% HSA: volumen de IL-2 reconstituida = (Concentración final de IL-2 * Volumen final)/ actividad específica de la IL-2 (basada en ensayo estándar y protocolo de fabricación). La concentración final de IL-2 fue de 6 *104 UI/mL. El volumen final fue de 40 ml.
[1535]Se elimina el volumen inicial calculado de IL-2 necesario de la IL-2 reconstituida y se transfiere al tubo 'IL-26*104 UI/mL'. Añadir 100|jL de IL-26*106 UI/mL de la alícuota preparada previamente al tubo etiquetado 'IL-26*104 UI/mL' que contiene 10mL de tampón de lavado LOVO.
[1536]Se eliminaron aproximadamente 4500 mL de sobrenadante de los matraces G-Rex 500MCS. Agitar el sobrenadante restante y transferir las células a la bolsa del Cell Collection Pool. Se repite con todos los matraces G-Rex 500MCS.
[1537]Se retiran 60 mL de sobrenadante y se añaden a tubos de sobrenadante para ensayos de control de calidad, incluida la detección de micoplasma. Almacenado a 2-8°C.
Recogida de células
[1538]Células contadas. Preparar cuatro conicals de 15mL con 4,5mL de AIM-V. Pueden prepararse con antelación. El intervalo óptimo = se sitúa entre 5*104 y 5*106 células/mL. (se recomienda una dilución de 1:10). Para la dilución 1:10, a 4500j L de AIM V preparado previamente, añadir 500j L de CF. Factor de dilución registrado.
Se calculó el TC (Total de células) pre-LOVO (vivas muertas) =
Total de células promedio
Concentración (conc TC pre LOVO)
(vivas muertas)
X
Volumen de la bolsa de fuente
Se calculó el TVC (Total de células viables) pre-LOVO (vivas)
Total de células viables promedio
Concentración (TVC pre LOVO)
(vivas)
X
Volumen de la bolsa de fuente LOVO
[1539]Cuando el número total de células (CT) era > 5 *109, extraer 5 *108 células para criopreservarlas como muestras de retención de MDA. 5 * 108 concentración media de TC (etapa 14,44) = volumen a eliminar
[1540]Cuando el número total de células (CT) era < 5 *109, retirar 4 *106 células para criopreservarlas como muestras de retención de MDA. 4 *106 concentración media de CT = volumen a eliminar.
[1541]Se utilizó una jeringa del tamaño adecuado para extraer el volumen necesario de la bolsa de origen LOVO. Se mantiene en la incubadora hasta las etapas de criopreservación.
[1542]Cuando se determinó el número total de células, el número de células a eliminar debía permitir la retención de 150*109 células viables. Confirmar TVC pre-LOVO 5 *108 o 4 * 106 o no aplicable. Calculado el volumen de células a eliminar.
[1543]Se calcula el total de células que quedan en la bolsa. Calculado el TC (Total de células) pre-LOVO. [Avg. Concentración celular total X Volumen restante = TC pre-LOVO restante].
[1544]Según el Número total de celdas restantes, seleccione el proceso correspondiente en la siguiente tabla:
[1545]Elija el volumen de IL-2 a añadir correspondiente al proceso utilizado. Volumen calculado como: Volumen de retenido * 2 * 300 UI/mL = UI de IL-2 necesarias. UI de IL-2 requerida / 6 *104 UI/mL = Volumen de IL-2 a añadir Bolsa post LOVO. Registrados todos los volúmenes añadidos. Obtención de muestras en criovial para análisis posteriores.
[1546]Se mezcla bien el producto celular. Sellado de todas las bolsas para su posterior procesamiento, incluida la crioconservación cuando proceda.
[1547]Realización de ensayos de Enodxoton, IFN-y, esterilidad y otros según fuera necesario en las muestras crioviales obtenidas.
EJEMPLO 12: PROCESO GEN 3 EJEMPLAR (TAMBIÉN DENOMINADO GEN 3.1)
PROPÓSITO
[1548]Este ejemplo describe otros estudios relativos a la "Comparabilidad entre los procesos Gen 2 y Gen 3 para la expansión de TIL". El proceso Gen 3 se modificó para incluir una etapa de activación al principio del proceso con el objetivo de aumentar la producción final de células viables totales (TVC) para que fuera comparable (o mejor) a la de Gen 2, manteniendo al mismo tiempo los perfiles fenotípicos y funcionales como se había visto anteriormente.
ALCANCE
[1549]Se evaluó la producción de TVC mediante la introducción de una etapa de activación en los fragmentos tumorales cultivados en el Día 0.
[1550]Demostrada comparabilidad en términos de caracterización funcional y fenotípica ampliada con el estándar Gen 3, así como un brazo de control, a través de dos tumores de pacientes independientes.
[1551]Se analizó el consumo de medios y la producción de metabolitos para confirmar que los parámetros de procesamiento se mantenían en condiciones fisiológicas.
[1552]Todas las ejecuciones de este ejemplo se realizaron en la plataforma a escala real utilizando tejido tumoral de donantes comerciales como material de partida.
INFORMACIÓN
[1553]La realización Gen 3 del proceso se modificó como una realización adicional y se denomina en este ejemplo Gen 3.1.
[1554]El concepto de fabricación Gen 3.1 TIL tiene cuatro intervenciones del operario:
1. Aislamiento y activación de fragmentos tumorales: El día 0 del proceso se disecó el tumor y se generaron los fragmentos finales awe~240*3x3mm cada uno (hasta 1-4 fragmentos en total) y se cultivaron en matraces 1-4 G-Rex100MCS. Cada matraz contenía hasta 60 fragmentos, 500 mL de medio CM1 o DM1 y suplementado con 6.000 UI de rhIL-2, 15 |jg de OKT3 y 2,5*10® células mononucleares alogénicas irradiadas. El cultivo se incubó a 37°C durante 6-8 días.
2. Reactivación de cultivos TIL: El día 7-8, el cultivo se suplementó mediante la adición lenta de medios CM2 o DM1 suplementados con 6.000 UI de rhIL-2, 30 jg de OKT3 y 5*10® células mononucleares alogénicas irradiadas en ambos casos. Se tuvo cuidado de no alterar las células existentes en el fondo del matraz. El cultivo se incubó a 37°C durante 3-4 días.
3. Ampliar la cultura: Ocurre el día 10-11. Durante el escalado del cultivo, todo el contenido del G-Rex100MCS se transfirió a un matraz G-Rex500MCS que contenía 4L de CM4 o DM2 suplementado con 3.000 UI/mL de IL-2 en ambos casos. Los matraces se incubaron a 37°C durante 5-6 días hasta la cosecha.
4. Cosecha/Lavado/Formulado: El día 16-17 se reduce el volumen de los matraces y se agrupan. Las células se concentraron y se lavaron con PlasmaLyte A pH 7,4 que contenía un 1% de HSA. La suspensión celular lavada se formuló en una relación 1:1 con CryoStor10 y se complementó con rhIL-2 hasta una concentración final de 300 UI/mL.
[1555]La DP se crioconservó con un congelador de velocidad controlada y se almacenó en nitrógeno líquido en fase vapor. *Los medios TIL estándar completos 1, 2 o 4 (CM1, CM2, CM4) podían sustituirse por el medio de expansión sin suero de células T CTS™OpTmizer™, denominado Medio Definido (DM1 o DM2), como se ha indicado anteriormente. Para una visión general del proceso, véanse, por ejemplo, las figuras 70 y 71.
Descripción del proceso
[1556]El día 0, el tumor se lavó 3 veces y se fragmentó en fragmentos finales de 3x3x3. Una vez fragmentado todo el tumor, los fragmentos finales se aleatorizaron por igual y se dividieron en tres pools. Se introdujo un conjunto de fragmentos aleatorios en cada brazo, añadiendo el mismo número de fragmentos por las tres matrices experimentales.
[1557]La expansión del tumor L4063 se realizó con medios estándar y la expansión del tumor L4064 se realizó con medios definidos (CTS OpTmizer) para todo el proceso de expansión de TIL. En el presente documento se describen los componentes del medio.
CM1 Medios completos 1: RPMI+ Glutamina suplementado con 2mM Glutamax, 10% Suero AB Humano, Gentamicina (50ug/mL), 2-Mercaptoetanol (55uM). Formulación final del medio suplementada con 6000UI/mL de IL-2
CM2 Medios completos 2: 50% medio CM1 50% medio AIM-V. Formulación final del medio suplementada con 6000UI/mL de IL-2
CM4 Medios completos 4: AIM-V suplementado con Glutamax (2mM). Formulación final del medio suplementada con 3000UI/mL de IL-2
Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ suplementado con Suplemento de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (26mL/L).
DM1: Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ suplementado con Suplemento de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (26mL/L), y SR de Células Inmunitarias CTS™ (3%), con Glutamax (2mM). Formulación final suplementada con 6.000 UI/mL de IL-2.
DM2: Medio Basal de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ suplementado con Suplemento de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™ (26mL/L), y SR de Células Inmunitarias CTS™ (3%), con Glutamax (2mM). Formulación final suplementada con 3.000 UI/mL de IL-2.
[1558]Todos los tipos de medios utilizados,es decir,los medios Completos (CM) y Definidos (DM), se prepararon con antelación, se mantuvieron a 4°C hasta el día anterior a su uso y se calentaron a 37°C en una incubadora hasta 24 horas antes del día del proceso.
[1559]La reactivación del cultivo de TIL ocurrió el día 7 para ambos tumores. La ampliación se produjo el día 10 para el L4063 y el día 11 para el L4064. Ambos cultivos se cosecharon y criopreservaron el día 16.
Resultados esperados
[1560]El Gen 3.1 puede alcanzar un mayor número total de células viables en la cosecha del día 16-17 en comparación con el Gen 3.0.
[1561]El Gen 3.1 puede producir niveles similares de IFNy tras la reestimulación, en relación con el Gen 3.0.
[1562]Gen 3.1 y Gen 3.0 pueden tener una diversidad clonal similar, medida por el total de secuencias CDR3 únicas presentes en el producto final TIL.
[1563]Las características fenotípicas en el proceso Gen 3.1 pueden ser similares a las de Gen 3.0.
RESULTADOS OBTENIDOS
[1564]Se contaron las células y se determinó el % de viabilidad de los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1. Expansión en todas las condiciones seguidas detalles descritos en este ejemplo.
Recuento total de células viables y aumento del número de pliegues
[1565]Para cada tumor, los fragmentos se dividieron en tres grupos de igual número. Debido al pequeño tamaño de los tumores, no se alcanzó el número máximo de fragmentos por matraz. Para los tres procesos diferentes, se evaluó el total de células viables y la viabilidad celular para cada condición. Los recuentos celulares se determinaron como TVC el día 7 para la reactivación, TVC el día 10 (L4064) o el día 11 (L4063) para la ampliación, y TVC en la cosecha el día 16/17.
[1566]Los recuentos celulares para el Día 7 y el Día 10/11 se tomaron FIO. La expansión de pliegues se calculó dividiendo la TVC del día 16/17 de la cosecha por la TVC del día 7 de la reactivación. Para comparar los tres brazos, se dividió la TVC del día de la cosecha por el número de fragmentos añadidos en el cultivo el día 0, con el fin de calcular una media de células viables por fragmento.
[1567]Se realizaron recuentos celulares y ensayos de viabilidad para L4063 y L4064. Como se indica en la Figura 73, el proceso Gen 3.1-Test produjo más células por fragmento que el proceso Gen 3.0 en ambos tumores.
[1568]Figura 74: Recuento total de células viables y expansión de pliegues
% Viabilidad durante el proceso
[1569]En la reactivación, la ampliación y la cosecha, el porcentaje de viabilidad se realizó en todas las condiciones. El día 16/17 de la cosecha, se compararon las TVC finales con los criterios de liberación para el % de viabilidad. Todas las condiciones evaluadas superaron el criterio de viabilidad del 70% y fueron comparables entre procesos y tumores, como se muestra en la Figura 74.
Inmunofenotipado
[1570]Caracterización fenotípica del producto final TIL.
[1571]Los productos finales se sometieron a análisis de citometría de flujo para comprobar su pureza, diferenciación y marcadores de memoria. Los porcentajes de población fueron coherentes para las células TCRa/p, CD4+ y CD8+ en todas las condiciones.
[1572]Se realizó un análisis fenotípico ampliado de REP TIL. El producto TIL mostró un mayor porcentaje de células CD4+ para las condiciones Gen 3.1 en comparación con Gen 3.0 en ambos tumores, y un mayor porcentaje de células CD28+ de la población CD8+ para Gen 3.0 en comparación con Gen 3.1 en ambas condiciones.
[1573]Los TIL cosechados de los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1 mostraron marcadores fenotípicos comparables como la expresión de CD27 y CD56 en las células CD4+ y CD8+, y una expresión comparable de CD28 en la población de células<c>D4+ activadas. La Figura 75 muestra los marcadores fenotípicos del producto final TIL para los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1. Figura 75: Caracterización fenotípica del producto final de TIL para L4063 y L4064.
Comparación de marcadores de memoria en el producto final TIL:
[1574]La Figura 76 muestra los marcadores de memoria del producto final TIL que se determinaron mediante citometría de flujo multicolor. Las muestras congeladas de TIL recogidas el día 16 se tiñeron para su análisis. El estado de la memoria TIL era comparable entre los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1. Figura 76: Análisis de marcadores de memoria del producto TIL para L4063 y L4064.
Comparación de marcadores de activación y agotamiento en el producto final TIL:
[1575]Las Figuras 77 y 78 muestran la activación y el agotamiento del producto final de TIL que se determinaron mediante citometría de flujo multicolor. Los marcadores de activación y agotamiento fueron comparables entre los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1 activados en células CD4+ (Figura 77) y CD8+ (Figura 78). Figura 77: Marcadores de activación y agotamiento activados en células CD4+ para L4063 y L4064. Tabla 78: Marcadores de activación y agotamiento activados en células CD8+ para L4063 y L4064.
Secreción de interferón gamma tras la reestimulación:
[1576]Los TIL cosechados se sometieron a una nueva estimulación durante la noche con placas recubiertas de anti-CD3 para L4063 y L4064. Se observó una mayor producción de IFN<y>a partir del proceso Gen 3.1 en los dos tumores analizados en comparación con el proceso Gen 3.0. La producción de IFN<y>en cada condición se muestra en la Figura 79. Figura 79: Producción de IFN-<y>(pg/mL) para el producto final en los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1.
Medición de los niveles de IL-2 en los medios de cultivo
[1577]Para comparar los niveles de consumo de IL-2 entre todas las condiciones y procesos, se recogieron sobrenadantes celulares al inicio de la reactivación en el Día 7, en el Día 10 de ampliación (L4064) / 11 (L4063), y en el Día 16 de cosecha, y se congelaron. Posteriormente se descongelaron los sobrenadantes y se analizaron. La cantidad de IL-2 en el sobrenadante del cultivo celular se midió según el protocolo del fabricante. Los datos se muestran en la figura 80.
[1578]En general, los procesos Gen 3 y Gen 3.1 fueron comparables en términos de consumo de IL-2 durante el proceso completo evaluado en las mismas condiciones de medios. Figura 80: Análisis de la concentración de IL-2 (pg/mL) en los medios usados recogidos para L4063 y L4064.
Análisis de metabolitos
[1579]Se recogieron sobrenadantes de medios gastados de L4063 y L4064 al inicio de la reactivación en el día 7, a escala en el día 10 (L4064) o en el día 11 (L4063), y en la cosecha en los días 16/17 para L4063 y L4064, para cada condición. Los sobrenadantes se analizaron en un bioanalizador CEDEX para determinar las concentraciones de glucosa, lactato, glutamina, glutamax y amoníaco. La Figura 81 muestra la concentración de glucosa en los medios usados recogidos para los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1 para los tumores L4063 y L4064.
[1580]Los medios definidos tienen una mayor concentración de glucosa de 4,5 g/L en comparación con los medios completos (2g/L). En general, la concentración y el consumo de glucosa fueron comparables para los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1 dentro de cada tipo de medio. Figura 81: Concentración de glucosa (g/L) en los medios usados para L4063 y L4064.
[1581]Se observó un aumento del lactato en ambos tumores, L4063 y L4064, en todas las condiciones de ensayo. El aumento del lactato fue comparable entre las condiciones Gen 3.0 y Gen 3.1 y entre los dos medios utilizados para la expansión de la reactivación (medio completo para L4063 y medio definido para L4064).
[1582]La Figura 82 muestra la concentración de lactato en los medios usados recogidos para las condiciones de los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1 para ambos tumores L4063 y L4064. Figura 82: Concentración de lactato (g/L) en los medios usados para L4063 y L4064.
[1583]En el caso del L4063, el medio basal estándar contenía 2 mM de L-glutamina y se complementó con 2 mM de glutamax para compensar la degradación natural de la L-glutamina en condiciones de cultivo a L-glutamato y amoníaco.
[1584]Para el tumor L4064, el medio definido (libre de suero) utilizado no contenía L-glutamina en el medio basal, y se suplementó únicamente con glutamax hasta una concentración final de 2mM. Glutamax es un dipéptido de L-alanina y L-glutamina, es más estable que la L-glutamina en soluciones acuosas y no se degrada espontáneamente en glutamato y amoníaco. En su lugar, el dipéptido se disocia gradualmente en los aminoácidos individuales, manteniendo así una concentración menor pero suficiente de L-glutamina para sostener un crecimiento celular robusto. La Figura 83 y la Figura 84 muestran la concentración de glutamina y glutamax respectivamente en los medios usados recogidos en condiciones de proceso Gen 3.0 y Gen 3.1 para ambos tumores L4063 y L4064.
[1585]Para el L4063, la concentración de glutamina y glutamax disminuyó ligeramente en el día de escalado, pero en el día de cosecha mostró un aumento a niveles similares o más cercanos en comparación con el día de reactivación. En el caso del L4064, la concentración de glutamina y glutamax mostró una ligera degradación a un ritmo similar entre las diferentes condiciones, durante todo el proceso. Figura 83: Concentración de glutamina (mmol/L) en los medios usados para L4063 y L4064. Figura 84: Concentración de glutamax (mmol/L) en los medios usados para L4063 y L4064.
[1586]La Figura 85 muestra la concentración de amoníaco en los medios usados recogidos para los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1 para los tumores L4063 y L4064. Como era de esperar, las concentraciones de amoníaco fueron mayores para L4063 (cultivado en medio estándar con 2 mM de glutamina 2 mM de glutamax) que para L4064 (cultivado en medio definido con 2 mM de glutamax). Además, como era de esperar, se produjo un aumento o acumulación gradual de amoníaco a lo largo del cultivo. No hubo diferencias en las concentraciones de amoníaco en las tres condiciones de ensayo. Figura 85: Concentración de amoníaco (mmol/L) en los medios usados para L4063 y L4064.
Repeticiones de telómeros por Flow - FISH:
[1587]Se utilizó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud media de la repetición telomérica en L4063 y L4064 bajo los procesos Gen 3 y Gen 3.1. La determinación de la longitud telomérica relativa (RTL) se calculó utilizando el kit Telomere PNA/FITC para análisis por citometría de flujo de DAKO. Se realizó el ensayo de los telómeros.
[1588]La longitud de los telómeros en muestras de L4063 y L4064, se compararon con una línea celular de control (1301 leucemia). La línea celular de control es una línea celular tetraploide con telómeros largos estables, que permite calcular una longitud telomérica relativa. Los procesos Gen 3 y Gen 3.1 evaluados en ambos tumores mostraron una longitud de telómeros comparable, como se muestra en la Figura 86. Figura 86: Resumen de la longitud relativa de los telómeros (RTL) en comparación con la línea celular de control (1301).
Análisis del repertorio TCR Vp
[1589]Para determinar la diversidad clonal de los productos celulares generados en cada proceso, se ensayaron los productos finales de TIL para el análisis de la diversidad clonal mediante la secuenciación de la porción CDR3 de los receptores de células T.
[1590]Se compararon tres parámetros entre las tres condiciones:
Índice de diversidad de CDR3 únicas (uCDR3)
% compartido uCDR3
Para el 80% superior de uCDR3:
o Comparar el % de copias uCDR3 compartidas
o Comparar la frecuencia de clonotipos únicos
[1591]Figura 87: Resumen del repertorio TCR Vp para L4063 y L4064. Describe la clonalidad de TIL para el producto final de TIL en el tumor L4063 y L4064 en condiciones Gen 3 y Gen 3.1 medida por el repertorio TCR Vp.
[1592]Figura 89: Comparación entre Gen 3 y Gen3.1 Control y Gen 3.1 Test, porcentaje de secuencias CDR3 únicas compartidas en L4063 en el producto celular cosechado de TIL para: 975 secuencias son compartidas entre Gen 3 y Gen 3.1 producto final de prueba, lo que equivale al 88% del 80% superior de secuencias CDR3 únicas de Gen 3 compartidas con Gen 3.1 producto final de prueba.
[1593]Figura 88: L4063 Comparación de frecuencia de secuencias CDR3 únicas en el producto celular final cosechado de TIL entre los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1.
[1594]Figura 90: Comparación entre Gen 3 y Gen3.1 Control y Gen 3.1 Test, porcentaje de secuencias CDR3 únicas compartidas en L4064 en el producto celular cosechado de TIL para: 2163 secuencias son compartidas entre Gen 3 y Gen 3.1 producto final de prueba, lo que equivale al 87% del 80% superior de secuencias CDR3 únicas de Gen 3 compartidas con Gen 3.1 producto final de prueba.
[1595]Figura 91: L4064 Comparación de frecuencias de secuencias CDR3 únicas en el producto celular final cosechado de TIL entre los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1.
[1596]Número de secuencias CD3 únicas identificadas a partir de 1*10® células recogidas el día 16 de la cosecha, para los diferentes procesos. La condición de prueba Gen 3.1 mostró una diversidad clonal ligeramente superior en comparación con Gen 3.0 basándose en el número de CDR de péptidos únicos dentro de la muestra.
[1597]El índice de diversidad de entropía de Shanon es una métrica más fiable y común para la comparación, para las condiciones Gen 3.1 en ambos tumores mostró una diversidad ligeramente mayor que el proceso Gen 3, lo que sugiere que el repertorio TCR Vp para la condición de prueba Gen 3.1 es más policlonal que el proceso Gen 3.0.
[1598]Además, el repertorio TCR Vp para la condición de prueba Gen 3.1 mostró más de un 87% de solapamiento con el repertorio correspondiente para el proceso Gen 3.0 tanto en el tumor L4063 como en el L4064.
INFORMACIÓN ADICIONAL
[1599]El valor de la concentración de IL-2 en los medios usados para la prueba Gen 3.1 L4064 el día de la reactivación estaba por debajo del valor esperado (similar al control Gen 3.1 y a la condición Gen 3.0).
[1600]El bajo valor podría deberse a un error de pipeteo, pero debido a la mínima muestra tomada no fue posible repetir el ensayo.
[1601]No se recogieron los medios usados del día 10/11 en la muestra L4064 y no se incluyeron en el análisis de la concentración de IL-2 ni en el análisis de metabolitos en el sobrenadante.
CONCLUSIONES
[1602]La condición de prueba Gen 3.1 incluyendo alimentadores y OKT-3 en el día 0 mostró un mayor TVC de dosis de células en el día de cosecha 16 comparado con el Gen 3.0 y el Gen 3.1 control. La TVC del producto final para la condición de prueba Gen 3.1 fue unas 2,5 veces superior al de Gen 3.0.
[1603]La condición de prueba Gen 3.1 con la adición de OKT-3 y alimentadores en el día 0, para ambos tumores L4063 y L4064, alcanzó una capacidad máxima del matraz en la cosecha. En estas condiciones, si se inicia un máximo de 4 matraces en el día 0, la dosis final de células podría estar entre 80 - 100E+09 TIL.
[1604]Todos los atributos de calidad tales como la caracterización fenotípica incluyendo pureza, agotamiento, activación y marcadores de memoria en el producto final TIL se mantuvieron y fueron comparables entre la prueba Gen 3.1 y el proceso Gen 3.0. La longitud de los telómeros en el producto final TIL y el consumo de IL-2 en los medios usados fueron comparables entre los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1.
[1605]La producción de IFN gamma en el producto final de TIL fue 3 veces superior en Gen 3.1 con adición de alimentador y OKT-3 en el día 0, en comparación con Gen 3.0 en los dos tumores analizados, lo que sugiere que el proceso Gen 3.1 generó un potente producto de TIL.
[1606]No se observaron diferencias en los niveles de glucosa o lactato en las distintas condiciones de prueba. No se observaron diferencias en la glutamina y el amoníaco entre los procesos Gen 3.0 y Gen 3.1 en todas las condiciones de los medios. Los bajos niveles de glutamina en los medios no limitan el crecimiento celular y sugieren que la adición de glutamax sólo en los medios es suficiente para aportar los nutrientes necesarios para que las células proliferen.
[1607]El día de escalado para L4063 y L4064 fue el día 11 y el día 10 respectivamente y no mostraron grandes diferencias en cuanto al número de células alcanzado el día de cosecha del proceso y el consumo de metabolitos fue comparable en ambos casos durante todo el proceso. Esta observación sugiere que el proceso optimizado Gen 3.0 puede tener flexibilidad en los días de procesamiento, facilitando así la flexibilidad en el programa de fabricación.
[1608]El proceso Gen 3.1 con adición de alimentador y OKT-3 el día 0 mostró una mayor diversidad clonal medida por el análisis de la secuencia CDR3 TCRab en comparación con el Gen 3.0.
[1609]La Figura 92 describe una realización del proceso Gen 3 (proceso optimizado Gen 3). Los medios estándar y los medios sin suero CTS Optimizer pueden utilizarse para la expansión de TIL del proceso Gen 3 Optimized. En el caso del CTS Optimizer se recomienda utilizar un medio sin suero para aumentar el glutamax en el medio hasta la concentración final de 4mM.
Viabilidad y comparabilidad:
Viabilidad:
[1610]Se estableció la viabilidad para todas las condiciones de estudio en todos los experimentos. En todos los experimentos y condiciones y entre el tejido tumoral donante, todos los experimentos se realizaron utilizando los mismos lotes de materia prima crítica como IL-2, suero humano-AB, células alimentadoras alogénicas, OKT-3.
Comparabilidad:
[1611]La comparabilidad se determinó por la capacidad de cualquier brazo del estudio para cumplir los criterios de liberación de nuestro producto clínico según Linfocitos Infiltrantes en Tumores (TIL) Autólogos LFP-002 criopreservados Día 22, como se indica en la Figura 93.
EJEMPLO 13: PROCESOS DE EXPANSIÓN TUMORAL CON MEDIO DEFINIDO.
[1612]Los procesos divulgados en los Ejemplos 5 a 12 se realizan sustituyendo los medios CM1 y CM2 por un medio definido según la presente invención (p. ej., s Fm de Expansión de Células T CTS™ OpTmizer™, ThermoFisher, incluyendo por ejemplo DM1 y DM2).
EJEMPLO 14: EXPANSIÓN DE LINFOCITOS INFILTRANTES TUMORALES PROCEDENTES DE BIOPSIA DE NÚCLEO DE TEJIDO DE UN SUJETO CON CÁNCER DE PÁNCREAS
[1613]Este ejemplo describe un estudio realizado para expandir TIL a partir de una biopsia de núcleo de tumor de cáncer de páncreas obtenida de un paciente (P7055). El ejemplo proporciona una realización ejemplar para un método de expansión de TIL a partir de muestras de biopsias de núcleo de tejido.
[1614]Se obtuvo una biopsia de núcleo de tumor pancreático que incluía 3 fragmentos tumorales y se procesó de acuerdo con el método de procesamiento de tumores tipo Gen 2 descrito a continuación. La Figura 111 muestra las etapas del proceso de un protocolo de tipo Gen 2 ejemplar.
Día 0 - Procesamiento del tumor
[1615]La biopsia de núcleo tumoral se recibió y lavó como se describe en el presente documento en el Día 0 del método. La longitud y la masa teórica del núcleo de tejido se midieron con una regla y se registraron.
Día 0 - Tipo Gen 2 (Pre-REP)
[1616]Se etiquetó un G-Rex 100M con el "ID del tumor, Gen 2, iniciales, formulación del medio y fecha". Se añadieron al G-Rex 100M 0,5 L de CM1 6000 UI/mL de IL-2 que se calentó a 37°C (durante al menos 24-30 h). Se utilizó una placa de 6 pocillos y se añadieron 5 mL de tampón de lavado tumoral a tres pocillos etiquetados como "#1", "#2" y "#3". Brevemente, todo el contenido de la solución del recipiente de biopsia de núcleo se transfirió a una placa de Petri (como una de 100 mm o 150 mm).
[1617]La muestra se lavó tres veces transfiriendo el espécimen de biopsia de núcleo al pocillo 1 utilizando una pipeta pasteur. La muestra se incubó durante 3 min. A continuación, las muestras se transfirieron al pocillo n.° 2 durante 3 min y después se transfirieron las muestras al pocillo n.° 3 durante 3 min.
[1618]Usando una pipeta de transferencia o fórceps, los especímenes de biopsia se agregaron directamente del pozo #3 al G-Rex 100M etiquetado que contenía 0.5 L de Cm 1 6000 UI/mL IL-2 preparado en la etapa anterior. El G-Rex 100M se colocó en una incubadora a 37°C / 5% CO<2>hasta el día 11.
Día 3 - Tipo Gen 2 (Cosecha/Activación de Pre-REP)
[1619]El día 3 del proceso de tipo Gen 2 se realizó de la siguiente manera. Las células alimentadoras (células alimentadoras PBMC alogénicas) se prepararon a partir de una población conjunta de PBMC de 2 o más donantes diferentes. Las células alimentadoras se manipularon mínimamente y se congelaron hasta que se necesitaron. Se descongelaron viales de 2 * 1mL de alimentadores (células PBMC alogénicas) y se pipetearon en 48 mL de CM-1 6000 UI/mL de IL-2 que se calentó a 37°C.
[1620]Los alimentadores de PBMC se mezclaron bien utilizando una pipeta serológica y se extrajeron alícuotas de 4 * 1mL. Los piensos descongelados se contaron sin dilución según los procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia. A continuación, se calculó el volumen necesario para 100e6 alimentadores de PBMC según la ecuación: 100e6 / concentración media de células vivas = Volumen necesario para 100e6 PBMC.
[1621]Los matraces G-Rex 100M que contenían el cultivo Pre-REP se sacaron de la incubadora y se colocaron en una Cabina de Seguridad Biológica (CSB).
[1622]Se agregó el volumen calculado de arriba y 30 pL de OKT3 madre (30 ng/mL) a cada matraz G-Rex 100M que contenía 500 mL de CM1 6000 UI/mL de IL-2. Cantidad suficiente (QS) volumen total a 1 L: 500 mL - volumen calculado de PPBMC añadidos a cada matraz = volumen total de CM1 6000 UI/mL de IL-2 se añadió al matraz.
Día 11 - Tipo Gen 2 (REP)
[1623]El día 11 del proceso de tipo Gen 2 se realizó de la siguiente manera. Para la cosecha de Pre-REP TIL, se utilizó un matraz de sistema abierto. El matraz G-Rex 100M que contenía el cultivo se sacó de la incubadora y se extrajeron alícuotas de 2 * 1mL de sobrenadante para el análisis de metabolitos y se almacenaron a -80°C. Se pesó un frasco estéril de 150 ml y se registró el peso. Se aspiraron aproximadamente 900 mL de sobrenadante del matraz G-Rex 100M. Se utilizó una pipeta serológica para transferir el cultivo Pre-REP TIL al matraz estéril de 150 mL pesado.
[1624]El cultivo Pre-REP TIL se mezcló bien con pipeta serológica y se recogieron alícuotas de 4 * 1 mL para el recuento celular. Se realizaron cuatro recuentos celulares sin dilución según los procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia. El cultivo Pre-REP TIL se colocó en la incubadora mientras se realizaban los recuentos.
[1625]Las células que excedían la cantidad máxima (200e6 TIL) que se sembrarían en el cultivo REP se extrajeron del cultivo Pre-REP TIL utilizando una jeringa de 100 mL con una pipeta Ashton. Se transfirieron 200e6 TIL a una bolsa EV-1000N a través del puerto azul NIS.
[1626]La bolsa EV-1000N que contenía el TIL Pre-REP se soldó estérilmente a la línea ROJA del G-Rex 500MCS y los TIL se drenaron por gravedad al matraz. Tras el vaciado, se selló térmicamente la línea roja.
[1627]Se descongelaron 5e9 células alimentadoras PBMC como se ha descrito anteriormente. Tras realizar 4 recuentos celulares, se ajustó el volumen del cultivo alimentador en función del recuento celular para añadir 5e9 células alimentadoras en la bolsa EV1000N Feeder. Después de añadir las células alimentadoras, se añadieron 150 uL de OKT3 a la bolsa alimentadora. La bolsa alimentadora se soldó estérilmente a la línea roja del G-Rex 500MCS y las 5e9 células alimentadoras se drenaron por gravedad en el G-Rex. Se añadieron 4,5 L de CM2 y 3.000 UI/mL de IL-2 al G-Rex 500MCS.
Día 16 - Tipo Gen 2 (División)
[1628]El Día 16 del proceso de tipo Gen 2 se realizó según el método Gen 2 Día 16 (véase, por ejemplo, la Tabla 21 del Ejemplo 5).
[1629]En primer lugar, se extrajeron alícuotas de 2 * 1mL del sobrenadante para el análisis de metabolitos y se almacenaron a -80°C. Brevemente, se redujo el volumen y el cultivo celular REP se dividió en hasta 5 G-REX 500MCS. En cada G-REX 500MCS, el volumen de cultivo fue de 4,5 L de medio CM4 IL-2 (3000 UI/mL) y > 1 * 109 TVC / matraz.
Día 22 - Tipo Gen 2 (Cosecha)
[1630]El Día 22 del proceso de tipo Gen 2 se realizó según el método Gen 2 Día 22 (véase, por ejemplo, la Tabla 21 del Ejemplo 5).
[1631]Las células del día 22 se cosecharon, se procesaron mediante el LOVO (TIL Harvest 2cy) y se congelaron en crioviales de 30 * 1 mL (en 1:1 CS10/PLLA 1% HSA) utilizando el programa CRF n° 1. En algunos casos, sólo había 1 matraz y los matraces hijos adicionales se extrapolaron para el rendimiento hipotético.
[1632]Se guardaron 10e6 células post-LOVO para la tinción de Identidad antes de congelarlas. Antes de desechar los residuos del sobrenadante, se extrajeron alícuotas de 2 * 1mL del sobrenadante para el análisis de metabolitos y se almacenaron a -80°C.
Resultados
[1633]El recuento de TVC el día 11 (Activación) arrojó 47,3e6 células. El recuento de TVC en el día 22 (REP) post LOVO arrojó 10,4e9 células con un 93% de viabilidad. Así, se produjeron 8,4 duplicaciones celulares desde el día 11 hasta el día 22 del proceso de tipo Gen 2.
EJEMPLO 15: PROCESOS DE TIPO GEN 2 Y GEN 3 PARA LA EXPANSIÓN DE LINFOCITOS INFILTRANTES DE TUMORES A PARTIR DE BIOPSIAS DE NÚCLEO DE TEJIDO
[1634]Este ejemplo describe un estudio en el que se compara la expansión de TIL a partir de muestras de biopsia de núcleo de tumores de cáncer de páncreas utilizando un proceso de tipo Gen 2 y un proceso Gen 3. El estudio utiliza una biopsia de núcleo tumoral de un paciente con cáncer de páncreas (P7057). Esta muestra tumoral incluye 3 núcleos y los productos TIL se producen de acuerdo con el proceso de tipo Gen 2 aquí descrito. El estudio también utiliza una biopsia de núcleo tumoral de un paciente con cáncer de páncreas (P7058). Esta muestra tumoral incluye 8 núcleos y los productos TIL se producen a partir de 4 núcleos según el proceso de tipo Gen 2 y 4 núcleos según el proceso Gen 3 descrito en el presente documento.
Introducción
[1635]Las biopsias con aguja gruesa son procedimientos estándar de diagnóstico preliminar utilizados para tomar muestras de crecimientos tisulares aberrantes en el diagnóstico del cáncer. El procedimiento utiliza agujas de gran calibre (18, 16, 14, etc.) por vía percutánea para tomar muestras de la zona sospechosa, que posteriormente se analizan y prueban para determinar si el tejido es canceroso. Dado que la biopsia con aguja gruesa no requiere incisión ni cirugía, es un medio mucho menos intrusivo de obtener muestras tumorales. Por lo tanto, es deseable ver si las biopsias de núcleo podrían utilizarse como alternativa al tumor resecado para el material de partida en los procesos de fabricación de TIL esbozados.
Antecedentes
[1636]Se han desarrollado dos procesos de fabricación (Gen 2 y Gen 3), que se utilizan en la fabricación clínica, para la expansión ex vivo de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) autólogos derivados de tumores recién resecados. Los procesos Gen 2 y Gen 3 utilizan los mismos biorreactores (G-Rex100 MCS y G-Rex500 MCS). El proceso Gen 2 incluye una etapa de Protocolo de pre-Expansión Rápida (pre-REP), y esta etapa ha sido sustituida por una etapa de Activación en el proceso Gen 3. La expansión rápida (REP) y la ampliación del cultivo de TIL en los procesos de expansión de cultivos celulares Gen 2 y Gen 3 se realizan en presencia de interleucina-2 (IL-2), el anticuerpo monoclonal OKT3 y células mononucleares de sangre periférica irradiadas ("alimentadores"), todos los cuales promueven la expansión de TIL. La Gen 3 tiene una duración de proceso más corta que la Gen 2. Los procesos Gen 2 y Gen 3 se utilizaron como base de diseño para un proceso de biopsias con aguja gruesa.
Propósito
[1637]El propósito de este estudio es desarrollar un proceso de fabricación de TIL utilizando muestras de biopsia de núcleo como material de partida. El diseño de este proceso de fabricación se basa en los diseños de los procesos de fabricación clínica de tipo Gen 2 y Gen 3 descritos en el presente documento.
Alcance
[1638]Los estudios a escala real se realizan utilizando el proceso de tipo Gen 2 y los procesos Gen 3 (véanse, por ejemplo, los Ejemplos anteriores). Hay dos cambios en el proceso de tipo Gen 2 comparado con el proceso Gen 2, incluyendo 3 días Pre-REP (vs 11 días para Gen 2), y una etapa de Activación en el Día 3 añadiendo Feeders y OKT- 3 en el Día 3.
[1639]Las principales diferencias de diseño del proceso entre tipo Gen 2 y Gen 3 son las siguientes. La presencia de un Protocolo de pre-Expansión Rápida (Pre-REP) en el proceso de tipo Gen 2 en el que las células se extravasan del tejido del núcleo o de la biopsia durante un periodo de incubación de 3 días en presencia de IL-2, pero en ausencia de OKT-3 y de células alimentadoras. La etapa correspondiente en el proceso Gen 3 combina la extravasación de TIL del tumor en combinación con su activación mediante la adición de OKT-3, y células alimentadoras en el Día 0.
[1640]El Protocolo de Expansión Rápida en el proceso Gen 2 incluye la activación única mediante la adición de OKT3, Feeders a la TIL pre-REP durante un periodo de 11 días con la división en el Día 16. La REP correspondiente en el proceso Gen 3 también utiliza OKT3 y alimentadores añadidos el día 7/8 con la ampliación el día 11.
[1641]El proceso Gen 2 utiliza G-Rex 100 MCS para Pre-REP y G-Rex 500 MCS para REP. El proceso Gen 3 utiliza G-Rex 100 MCS para la activación y la reactivación y G-Rex 500 MCS para la ampliación.
[1642]La duración del proceso Gen 3 es de 16-17 días frente a los 22 días del proceso Gen 2 (por ejemplo, Gen 3 es 5 6 días más corto que Gen 2).
[1643]El proceso Gen 3 utiliza un medio definido (es decir, sin suero AB humano) mientras que el proceso Gen 2 utiliza un medio completo que contiene suero AB humano.
[1644]La Figura 111 muestra una comparación de los procesos de tipo Gen 2 y Gen 3 aquí descritos.
Procedimientos
[1645]Esta sección del ejemplo describe el proceso de tipo Gen 2 que se utilizará para producir producto TIL a partir de núcleos de la muestra de biopsia de núcleo de tumor pancreático P7057. El proceso de tipo Gen 2 y el proceso Gen 3 descritos a continuación se utilizan para producir producto TIL a partir de núcleos de la muestra de biopsia de núcleo de tumor pancreático P7058.
[1646]Este estudio utiliza núcleos de tejido/muestras de biopsias tumorales procedentes de proveedores comerciales, colaboradores o socios. Las células alimentadoras PBMC alogénicas se mezclan a partir de 2 o más donantes diferentes. Las células alimentadoras se manipulan mínimamente y se añaden directamente al cultivo de TIL en la matriz de criopreservación consistente en células mononucleares suspendidas en CS10.
Visión general del proceso de tipo Gen 2
Día 0 - Tipo Gen 2 (Procesamiento tumoral)
[1647]El procesamiento de tumores del método de tipo Gen 2 se realiza de la siguiente manera. Se reciben las biopsias de núcleos tumorales y se lavan 3 veces. La longitud y la masa teórica de cada núcleo de tejido se miden con una regla y se registran.
Día 0 - Tipo Gen 2 (Pre-REP)
[1648]En el Día 0 del proceso de tipo Gen 2, la fase Pre-REP se inicia de la siguiente manera. Etiquetar G-Rex 100M con "Tumor ID, Gen 2, iniciales, formulación del medio y fecha". Añadir 0,5 L de CM1 6000 UI/mL de IL-2 calentada a 37°C (durante al menos 24-30 h) a un G-Rex 100M. Utilice una placa de 6 pocillos y añada 5 mL de tampón de lavado tumoral a 3 pocillos etiquetados como 1, 2 y 3. Brevemente, transfiera todo el contenido de la solución del recipiente de biopsia de núcleo a una placa de Petri (100 mm o 150 mm). Lavar la muestra 3 veces transfiriendo la muestra de biopsia de núcleo al pocillo 1 utilizando una pipeta pasteur. Incubar durante 3 min. A continuación, transfiera las muestras al pocillo 2 durante 3 min y luego transfiera las muestras al pocillo 3 durante 3 min. Con una pipeta de transferencia o unas pinzas, añada las muestras de biopsia directamente del pocillo 3 al G-Rex 100M etiquetado que contiene 0,5 L de CM1 6000 UI/mL de IL-2 preparado en la etapa anterior. Coloque el G-Rex 100M en la incubadora a 37°C / 5% CO<2>hasta el Día 11.
Día 3 - Tipo Gen 2 (Cosecha/Activación de Pre-REP)
[1649]En el Día 3 del proceso de tipo Gen 2, la cosecha/activación Pre-REP se realiza de la siguiente manera. Descongelar 2 viales * 1mL de PBMC y pipetear en 48 mL de CM-1 6000 UI/mL IL-2 que se calienta a 37°C. Mezclar bien con pipeta serológica y extraer alícuotas de 4 * 1mL y contar los piensos descongelados según métodos estándar sin dilución. Calcular el volumen necesario para 100e6 PBMC: (100e6 / concentración media de células vivas = Volumen necesario para 100e6 PBMC). Sacar de la incubadora los matraces G-Rex 100M que contienen el cultivo y colocarlos en el BSC. Añadir el volumen calculado de arriba y 30 pL de OKT3 madre (30 ng/mL) a cada matraz que contenga 500 mL de CM1 6000 UI/mL de IL-2 QS volumen total a 1 L: Se añadieron 500 mL - volumen añadido en 10.5.6. = volumen total de CM1 6000 UI/mL de IL-2 al matraz.
Día 11 - Tipo Gen 2 (REP)
[1650]En el Día 11 del proceso de tipo Gen 2, la fase REP se inicia según el proceso Gen 2 Día 11, con la excepción de la cosecha de TIL Pre-REP y la siembra en el G-Rex 500MCS. Para la cosecha de Pre-REP TIL, se utiliza un matraz de sistema abierto. Retirar el matraz de la incubadora y extraer alícuotas de 2 * 1mL del sobrenadante para el análisis de metabolitos y almacenar a - 80°C. Pesar un frasco estéril de 150 mL y registrar el peso. Aspirar ~900 mL de sobrenadante. Utilice una pipeta serológica para transferir el Pre-REP TIL al matraz estéril de 150 mL pesado. Mezclar bien con pipeta serológica y obtener alícuotas de 4 * 1 mL para el recuento de células. Realice 4 recuentos de células sin dilución en NC-200 como métodos estándar. Mantenga Pre-REP TIL en la incubadora mientras se realiza el recuento celular.
[1651]Si es necesario, retire un volumen apropiado del matraz para dejar 200e6 TIL (la cantidad máxima que se sembrará en la REP) y utilice una jeringa de 100 mL con una pipeta Ashton para transferir los TIL restantes (200e6 TIL) a una bolsa EV-1000N a través del puerto azul NIS. Suelde estérilmente la bolsa EV-1000N que contiene Pre-REP TIL en la línea ROJA del G-Rex 500MCS y drene por gravedad el TIL en el matraz. Tras el vaciado, retire la línea roja del precinto térmico.
[1652]Descongelar los alimentadores 5e9 según el método descrito anteriormente. Después de realizar 4 recuentos de células, ajuste el volumen si es necesario para conseguir 5e9 células en la bolsa del alimentador EV1000N. Añadir 150 uL de OKT3 a la bolsa de alimentación. Suelde estérilmente la bolsa del alimentador a la línea roja del G-Rex 500MCS y drene por gravedad los alimentadores 5e9 en el G-Rex. Añadir 4,5 L de CM2 3000 UI/mL de IL-2 al G-Rex 500MCS.
Día 16 - Tipo Gen 2 (División)
[1653]En el Día 16 del proceso de tipo Gen 2 se realiza la etapa de división según la etapa Gen 2 Día 16 (ver, Tabla 21 del Ejemplo 5). Se extrajeron alícuotas de 2 * 1mL de sobrenadante para el análisis de metabolitos y se almacenaron a -80°C. El Día 16 del proceso de tipo Gen 2 se realiza según el proceso Gen 2 Día 16, con la siguiente excepción. Si sólo se avanza 1 matraz para la ampliación/división, se añade el número de matraces hijos en la cosecha para extrapolar para la ampliación completa. Por ejemplo, si se necesitan 5 matraces, sólo se avanza 1 y el TVC del producto final se multiplica por 5 para extrapolar el rendimiento esperado a escala real.
Día 22 - Tipo Gen 2 (Cosecha)
[1654]En el Día 22 del proceso de tipo Gen-2, la etapa de cosecha se realiza según el proceso Gen 2 Día 22 (ver, por ejemplo, Tabla 21 del Ejemplo 5). Las células del día 22 para de tipo Gen 2 se cosechan, se procesan mediante el sistema de procesamiento de células LOVO y se congelan en crioviales de 30 * 1 mL (en CS10/PLLA 1:1 1% HSA). En algunos casos, sólo hay 1 matraz y los matraces hijos adicionales se extrapolan para el rendimiento hipotético. Se guardan 10e6 células post-LOvO para la tinción de identidad antes de la congelación. Antes de desechar los residuos del sobrenadante, se extraen alícuotas de 2 * 1mL del sobrenadante para el análisis de metabolitos y se almacenan a -80°C.
Visión General del Proceso Gen 3
Día 0 - Gen 3 (Procesamiento del tumor)
[1655]El procesamiento de tumores del método Gen 3 se realiza como se describe aquí. Se reciben las biopsias de núcleos tumorales y se lavan 3 veces. La longitud y la masa teórica de cada núcleo de tejido se miden con una regla y se registran.
Día 0 - Gen 3 (Activación)
[1656]El Día 0 del Gen 3 se realiza según el proceso descrito (véanse, p. ej., los Ejemplos 5-8). Repartir las muestras de biopsia restantes como se ha mencionado anteriormente en un matraz G-Rex 100M que contenga 500 mL de DM 6000 UI/mL de IL-2 que se calienta a 37°C. Para cada matraz utilizado, descongelar 4 viales * 1 mL de PBMC irradiada en un baño de agua a 37°C. Utilizar una pipeta de transferencia para transferir las PBMC a un tubo cónico de 50 mL con 46 mL de DM caliente 6000 UI/mL de IL-2. Mezclar bien con pipeta serológica y extraer alícuotas de 4 * 1mL y contar a una dilución 1:10 en NC-200 según el protocolo aquí descrito. Calcular el volumen necesario para 250e6 PBMC: (250e6 / concentración media = Volumen necesario para 250e6 PBMC). Añadir el volumen calculado de la etapa anterior a cada matraz que contenga 500 mL de DM+6000 UI/mL de IL-2 y fragmentos tumorales. Añadir 15 uL de OKT-3 madre (1mg/mL) a cada matraz que contenga 500 mL de DM+6000 UI/mL de IL-2, fragmentos tumorales y alimentadores de PBMC. Etiquete cada matraz con "Tumor ID, Gen 3, número de matraz, iniciales, fecha". Colocar en incubadora a 37°C / 5% CO<2>hasta el Día 8.
Día 7/8 - Gen 3 (Reactivación)
[1657]El día 7/8 del proceso Gen 3 se realiza como se describe, p. ej., en los Ejemplos 5-9. Sacar de la incubadora los matraces G-Rex 100M que contienen el cultivo y colocarlos en el BSC. Extraer alícuotas de 2 * 1mL del sobrenadante para el análisis de metabolitos y almacenar a -80°C. Añadir 500 mL de DM 6000 UI/mL de IL-2 calentada a 37°C al matraz G-Rex 100M. Añadir 25 mL de DM 6000 UI/mL de IL-2 calentada a 37°C a un tubo cónico de 50 mL. Descongelar 1 * 25 mL de bolsa de PBMC en un baño de agua a 37°C, pinchar la bolsa con un juego de extensión de plasma, extraer los 25 mL con una jeringa y dispensar en el tubo cónico de 50 mL preparado. Realizar 4 recuentos de células en una proporción de 1:10 (100 uL de PBMC en 900 uL de AIM-V) o de 1:100 (hacer un recuento de 1:10 como se describe y luego transferir 100 uL a otros 900 uL de AIM-V) descongeladas según los métodos estándar. Calcular el volumen necesario para 500e6 PBMC: (500e6 / concentración media = Volumen necesario para 500e6 PBMC). Añadir el volumen calculado de PBMC las etapas anteriores a la G-Rex 100M que contiene 1L DM 6000 UI/mL IL-2 y biopsias de núcleo. Añadir 30 uL de OKT3 madre (30 ng/mL) al matraz. Colocar el matraz en la incubadora a 37°C / 5% CO<2>.
Día 10/11 - Gen 3 (Ampliación)
[1658]Día 10/11 El escalado para el proceso Gen 3 se realiza como se describe, p. ej., en los Ejemplos 5-10. Se retiran los matraces de la incubadora y se extraen alícuotas de 2 * 1mL del sobrenadante para el análisis de metabolitos y se almacenan a -80°C. Suelde estérilmente un juego de transferencia de fluidos en la línea ROJA de un G-Rex 500MCS, enrosque el juego de transferencia de fluidos a través de la bomba Baxter y conecte asépticamente una pipeta Ashton al otro extremo dentro de un BSC. Transfiera ~700mL de medio del G-Rex 100MCS al G-Rex 500MCS, detenga la bomba, agite para alterar la capa celular y transfiera el cultivo celular restante al G-Rex 500MCS. Una vez transferidas todas los TIL, soldar estérilmente la línea ROJA del G-Rex a una bolsa de 5 L o 10 L de DM 3K UI/mL de IL-2 calentada a 37°C. Drene por gravedad el medio hasta la marca de 5 L del G-Rex 500MCS. Una vez finalizado el drenaje, volver a colocar el matraz en la incubadora.
Día 16/17 - Gen 3 (Cosecha)
[1659]El día 16/17 del proceso Gen 3 se realizó como se describe, por ejemplo, en los Ejemplos 5-1. Las células del día 17 para el Gen 3 se cosechan, se procesan a través del LOVO (TIL Harvest 5cy), y se congelan en crioviales de 30 * 1 mL (en una relación 1:1 de CS10:Plasmalyte con 1% HSA) utilizando el Programa CRF # 1. En algunos casos, sólo hay 1 o 2 matraces para la cosecha, dependiendo del número de fragmentos sembrados en el día 0. Se guardan 10e6 células post-LOVO para la tinción de Pureza antes de la congelación.
Caracterización del Producto Final y del Material de Partida:
[1660]Pueden evaluarse los materiales de partida y los productos TIL finales fabricados según los procesos de tipo Gen 2 y Gen 3. La identidad (% CD45+/CD3+) se mide en el producto TIL fresco antes de la congelación utilizando protocolos estándar. Por ejemplo, se mide la función de los TIL en términos de producción de interferón-gamma y liberación de granzima B. La estimulación de los TIL se mide en función de la liberación de IFN-gamma. La estimulación de TIL se mide en función de la liberación de Granzima B mediante ELISA. Se puede evaluar el fenotipo CD107a, el fenotipo extendido, la tinción de antígenos de superficie de los TIL utilizando un panel de diferenciación y/o un panel de activación/agotamiento. Se puede realizar la secuenciación de TCRvp. Se puede realizar la actividad de la telomerasa y la longitud de los telómeros. Los metabolitos pueden medirse en el sobrenadante del cultivo mediante el bioanalizador CEDEX.
Resultados Esperados o Criterios de Aceptación
[1661]Los resultados esperados de las células Pre-REP y el Producto Final del proceso de tipo Gen 2, así como el Producto Final del proceso Gen 3 se proporcionan en las Tablas 30 y 31.
Tabla 30. Pruebas pre-REP y resultados esperados para el proceso de tipo Gen 2
Tabla 31. Pruebas del producto final y criterios de aceptación (procesos de tipo Gen 2 y Gen 3)
[1662]En algunas realizaciones, las pruebas de producto final congelado se llevan a cabo en los productos producidos en el método descrito en el presente documento, como los métodos de tipo Gen 2 y Gen 3. En algunas realizaciones, las pruebas comprenden la evaluación de uno o más de los siguientes: marcadores de diferenciación, activación y agotamiento, granzima B, CD107A, secuenciación de TCR vp, longitud de los telómeros, actividad de la telomerasa y metabolitos. En algunos casos, la diferenciación se evalúa mediante citometría de flujo, por ejemplo mediante citometría de flujo de un panel TIL 1. En algunos casos, los marcadores de activación y agotamiento se evalúan mediante citometría de flujo, por ejemplo mediante citometría de flujo de un panel TIL 2. En algunos casos, la granzima B se evalúa mediante estimulación con microesferas y ELISA. En algunos casos, CD107A se evalúa mediante estimulación mitógena y citometría de flujo intracelular. En algunos casos, la secuenciación del TCR vp se realiza mediante secuenciación profunda. En algunos casos, la longitud de los telómeros se mide mediante un ensayo TAT. En algunos casos, la actividad de la telomerasa se determina mediante Q-TRAP. En algunos casos, la longitud de los telómeros se mide mediante un ensayo TAT. En algunos casos, el metabolito se determina utilizando un analizador de metabolitos CEDEX.
[1663]Los ejemplos expuestos anteriormente se proporcionan para dar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo hacer y utilizar las realizaciones de las composiciones, sistemas y métodos de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas de los niveles de destreza de los expertos en la técnica a la que pertenece la invención.
[1664]Todos los encabezamientos y designaciones de secciones se utilizan únicamente a efectos de claridad y referencia y no deben considerarse limitativos en modo alguno.

Claims (35)

REIVINDICACIONES
1. Un método para expandir los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) realizar una primera expansión con sensibilización cultivando una primera población de TIL, dicha primera población de TIL obtenible procesando una muestra tumoral de un tumor resecado de un sujeto en múltiples fragmentos tumorales, en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3, y células presentadoras de antígeno (APC) para producir una segunda población de TIL, donde la primera expansión con sensibilización se realiza en un recipiente que comprende una primera superficie permeable al gas, donde la primera expansión con sensibilización se realiza durante un primer periodo de 1 a 7/8 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es mayor en número que la primera población de TIL;
(b) realizar una segunda expansión rápida poniendo en contacto la segunda población de TIL con un medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3, y APC adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde el número de APC en la segunda expansión rápida es al menos dos veces el número de APC en la etapa (a), en el que la segunda expansión rápida se realiza durante un segundo periodo de 1 a 11 días para obtener la tercera población de TIL, en el que la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en el que la segunda expansión rápida se realiza en un recipiente que comprende una segunda superficie permeable al gas; y
(c) cosechar la población terapéutica de TIL obtenida en la etapa b).
2. El método de la reivindicación 1, en el que:
(i) la relación entre el número de TIL en la segunda población de TIL y el número de TIL en la primera población de TIL es de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 100:1;
(ii) la relación entre el número de TIL en la segunda población de TIL y el número de TIL en la primera población de TIL es de aproximadamente 50:1;
(iii) la relación entre el número de LTI de la segunda población de LTI y el número de LTI de la primera población de LTI es de aproximadamente 25: 1;
(iv) la relación entre el número de TIL de la segunda población de TIL y el número de TIL de la primera población de TIL es de aproximadamente 20:1;
(v) la relación entre el número de TIL en la segunda población de TIL y el número de TIL en la primera población de TIL es de aproximadamente 10:1;
(vi) la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL; o (vii) el método comprende realizar, después de la etapa de cosechar la población terapéutica de TIL, la etapa adicional de:
transferir la población terapéutica cosechada de TIL a una bolsa de infusión.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que los múltiples fragmentos tumorales se distribuyen en una pluralidad de recipientes separados, en cada uno de los cuales se obtiene la segunda población de TIL a partir de la primera población de TIL en la etapa de la primera expansión con sensibilización, y la tercera población de TIL se obtiene a partir de la segunda población de TIL en la etapa de la segunda expansión rápida, y en el que la población terapéutica de TIL obtenida a partir de la tercera población de TIL se recoge de cada uno de la pluralidad de recipientes y se combina para obtener la población de TIL cosechada.
4. El método de la reivindicación 3, en el que la pluralidad de recipientes separados comprende al menos dos recipientes separados, por ejemplo, de dos a veinte recipientes separados, por ejemplo, de dos a diez recipientes separados, por ejemplo, de dos a cinco recipientes separados, en el que opcionalmente cada uno de los recipientes separados comprende una primera superficie permeable al gas.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los múltiples fragmentos tumorales se distribuyen en un único recipiente, en el que opcionalmente el único recipiente comprende una primera superficie permeable al gas.
6. El método de las reivindicaciones 4 a 5, en el que en la etapa de la primera expansión con sensibilización el medio de cultivo celular comprende células presentadoras de antígeno (APC) y las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor medio de aproximadamente una capa celular a aproximadamente tres capas celulares, por ejemplo, de aproximadamente 1,5 capas celulares a aproximadamente 2,5 capas celulares, por ejemplo, aproximadamente 2 capas celulares.
7. El método de la reivindicación 6, en el que en la etapa de la segunda expansión rápida las APC se disponen en capas sobre la primera área de superficie permeable al gas con un grosor de aproximadamente 3 capas celulares a aproximadamente 5 capas celulares.8
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que en la etapa de la primera expansión con sensibilización la primera expansión con sensibilización se realiza en un primer recipiente que comprende una primera área de superficie permeable al gas y en la etapa de la segunda expansión rápida la segunda expansión rápida se realiza en un segundo recipiente que comprende una segunda área de superficie permeable al gas.
9. El método de la reivindicación 8, en el que el segundo recipiente es mayor que el primero.
10. El método de las reivindicaciones 8 a 9, en el que en la etapa de la segunda expansión rápida las APC se disponen en capas sobre la segunda área de superficie permeable a los gases con un grosor medio de aproximadamente 3 capas celulares a aproximadamente 5 capas celulares.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que para cada recipiente en el que se realiza la primera expansión con sensibilización sobre una primera población de TIL se realiza la segunda expansión rápida en el mismo recipiente sobre la segunda población de TIL producida a partir de dicha primera población de TIL, en el que opcionalmente cada recipiente comprende una primera superficie permeable al gas.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 8 a 9 y 11, en el que para cada contenedor en el que se realiza la primera expansión con sensibilización sobre una primera población de TIL en la etapa de la primera expansión con sensibilización, el primer contenedor comprende una primera área de superficie, el medio de cultivo celular comprende células presentadoras de antígeno (APC), y las APC se colocan en capas sobre la primera superficie permeable al gas, y en el que la relación entre el número medio de capas de APC colocadas en capas en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el número medio de capas de APC colocadas en capas en la etapa de la segunda expansión rápida se encuentra en un intervalo de aproximadamente 1:1.1 a aproximadamente 1:10, p. ej. aproximadamente1:1.2 a aproximadamente 1:8 p. ej. aproximadamente1:1.3 a aproximadamente 1:7, p. ej. aproximadamente1:1.4 a aproximadamente 1:6, p. ej. aproximadamente1:1.5 a aproximadamente 1:5, p. ej. aproximadamente1:1.6 a aproximadamente 1:4, p. ej. aproximadamente1:1.7 a aproximadamente 1:3.5, p. ej. aproximadamente1:1.8 a aproximadamente 1:3, p. ej. aproximadamente1:1.9 a aproximadamente 1:2.5, p. ej. aproximadamente1:2.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que después de 2 a 3 días en la etapa de la segunda expansión rápida, el medio de cultivo celular se suplementa con IL-2 adicional.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además crioconservar la población de TIL cosechada en la etapa de cosechar la población terapéutica de TIL utilizando un proceso de crioconservación.
15. El método según la reivindicación 2, que comprende además la etapa de crioconservar la bolsa de infusión, opcionalmente en el que el proceso de crioconservación se realiza utilizando una relación 1:1 de la población de TIL cosechada con respecto al medio de crioconservación.
16. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células presentadoras de antígeno son células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en el que opcionalmente las PBMC son irradiadas y alogénicas.
17. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa de la primera expansión con sensibilización el medio de cultivo celular comprende células mononucleares de sangre periférica (PBMC), y en el que el número total de PBMC añadidas al medio de cultivo celular en la etapa de la primera expansión con sensibilización es de aproximadamente 2..5 *108 y/o en la que, en la etapa de la segunda expansión rápida, las células presentadoras de antígenos (APC) del medio de cultivo celular son células mononucleares de sangre periférica (PBMC), y en la que el número total de PBMC añadidas al medio de cultivo celular en la etapa de la segunda expansión rápida es de aproximadamente 5 *108.
18. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que las células presentadoras de antígeno son células presentadoras de antígeno artificiales.
19. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cosecha en la etapa de cosecha de la población terapéutica de TIL se realiza utilizando un sistema de procesamiento celular basado en membrana y opcionalmente un sistema de procesamiento celular LOVO.
20. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los fragmentos múltiples comprenden de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm3 a aproximadamente 1500 mm3.
21. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 60 fragmentos por recipiente en la etapa de la primera expansión con sensibilización, en el que cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm3.
22. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los fragmentos múltiples tienen una masa total de aproximadamente 1 gramo a aproximadamente 1,5 gramos.
23. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de cultivo celular se suministra en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un contenedor G y una bolsa celular Xuri.
24. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de IL-2 es de aproximadamente 10.000 UI/mL a aproximadamente 5.000 UI/mL.
25. El método según la reivindicación 2, en el que la bolsa de infusión en la etapa de transferir la población terapéutica cosechada de TIL a una bolsa de infusión es una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol.
26. El método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en el que el medio de crioconservación comprende dimetilsulfóxido (DMSO), en el que opcionalmente el medio de crioconservación comprende de 7% a 10% de DMSo .
27. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer período en la etapa de la primera expansión con sensibilización y el segundo período en la etapa de la segunda expansión rápida se realizan cada uno individualmente dentro de un período de 5 días, 6 días o 7 días, en el que opcionalmente el segundo período en la etapa de la segunda expansión rápida se realiza dentro de un período de 7 días, 8 días o 9 días.
28. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en el que las etapas de la primera expansión con sensibilización a través de la cosecha de la población terapéutica de TIL se realizan dentro de un periodo de aproximadamente 14 días a aproximadamente 16 días, p. ej., dentro de un periodo de aproximadamente 16 días, p. ej., dentro de un periodo de aproximadamente 15 días, p. ej., dentro de un periodo de aproximadamente 14 días.
29. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-26, que comprende además la etapa de crioconservar la población terapéutica cosechada de TIL usando un proceso de crioconservación, en el que las etapas de la primera expansión con sensibilización a través de la cosecha de la población terapéutica de TIL y la crioconservación se realizan en 16 días o menos.
30. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que la población terapéutica de TIL cosechada en la etapa de cosecha de la población terapéutica de TIL comprende suficientes TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
31. El método según la reivindicación 30, en el que el número de TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2,3*1010 a aproximadamente 13,7*1010.
32. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en el que la tercera población de TIL en la etapa de la segunda expansión rápida proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón-gamma y/o una mayor policlonalidad.
33. El método según las reivindicaciones 1 a 31, en el que la tercera población de TIL en la etapa de la segunda expansión rápida proporciona al menos una producción de interferón-gamma de una a cinco veces mayor en comparación con los TIL preparadas mediante un proceso de más de 18 días.
34. El método según las reivindicaciones 1 a 31, en el que las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas a partir de la tercera población de TIL en la etapa de la segunda expansión rápida exhiben una mayor expresión de CD8 y CD28 en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas a partir de la segunda población de TIL en la etapa de la primera expansión con sensibilización.
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en el que la muestra tumoral es una o más biopsias pequeñas, biopsias de núcleo o biopsias con aguja del tumor en el sujeto.
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