ES2538122T3

ES2538122T3 - Moléculas de una sola cadena de TNFSF

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Publication number: ES2538122T3
Application number: ES09780803.4T
Authority: ES
Inventors: Oliver Hill; Christian Gieffers; Meinolf Thiemann
Original assignee: Apogenix AG
Current assignee: Apogenix AG
Priority date: 2008-07-21
Filing date: 2009-07-18
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2029-07-18
Also published as: JP5674155B2; EP2604693B1; US20140056843A1; JP2014230545A; US20200247860A1; US8921519B2; PL2604693T3; CA2910512C; SI2310509T1; US9340599B2; CA3092223A1; EP2310509B1; US20110162095A1; US11214605B2; US10519208B2; JP2017029158A; HRP20150425T1; EP2806029A1; WO2010010051A1; JP6140117B2

Abstract

Un polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende: (i) un primer dominio de citoquinas de la familia de TNF soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de citoquinas de la familia TNF soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico, y (v) un tercer dominio de citoquinas de la familia TNF soluble, en donde el polipéptido de fusión es sustancialmente no-agregante, en donde el dominio de citoquinas de la familia TNF soluble se selecciona de dominios TRAIL.

Description

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DESCRIPCIÓN

Moléculas de una sola cadena de TNFSF

La presente invención se refiere a proteínas de fusión de una sola cadena que comprenden tres dominios de citoquinas de la superfamilia del TNF soluble (TNFSF) y moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión. Las proteínas de fusión son sustancialmente no agregantes y son adecuadas para aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y/o de investigación.

Estado de la Técnica

Se sabe que se requiere una trimerización de citoquinas de TNFSF, p. ej., el ligando CD95 (CD95L), para una unión y activación eficaces del receptor. Complejos triméricos de citoquinas de la superfamilia del TNF, sin embargo, son difíciles de preparar a partir de unidades monoméricas recombinantes.

Los documentos WO 01/49866 y WO 02/09055 describen proteínas de fusión recombinantes que comprenden una citoquina TNF y un componente de multimerización, en particular una proteína de la familia de proteínas C1q o una colectina. Una desventaja de estas proteínas de fusión es, sin embargo, que el dominio de trimerización tiene habitualmente un gran peso molecular y/o que la trimerización es bastante ineficiente.

Schneider et al. (J Exp Med 187 (1989), 1205-1213) describen que trímeros de citoquinas TNF se estabilizan por motivos de estabilización situados en posición N-terminal. En CD95L, la estabilización del trímero del dominio de unión al receptor es presumiblemente provocada por dominios de aminoácidos N-terminales que están situados cerca de la membrana citoplasmática.

Shiraishi et al. (Biochem Biophys Res Commun 322 (2004), 197-202) describen que el dominio de unión al receptor de CD95L puede ser estabilizado por motivos enrollados en espiral α-helicoidal (cremallera de leucina) artificiales situados en posición N-terminal. Se encontró, sin embargo, que apenas se puede predecir la orientación de las cadenas de polipéptidos entre sí, p. ej., orientación paralela o antiparalela. Además, el número óptimo de repeticiones heptad en el motivo de cremallera enrollado en espiral son difíciles de determinar. Además, las estructuras enrolladas en espiral tienen la tendencia a formar agregados macromoleculares después de la alteración del pH y/o la fuerza iónica.

WO 01/25277 se refiere a polipéptidos oligoméricos de cadena sencilla que se unen a un dominio de unión a ligando extracelular de un receptor celular, en donde el polipéptido comprende al menos tres sitios de unión al receptor de los cuales al menos uno es capaz de unirse a un dominio de unión a ligando del receptor celular y al menos uno es incapaz de unirse con eficacia a un dominio de unión a ligando del receptor celular, por lo cual los polipéptidos oligoméricos de cadena sencilla son capaces de unirse al receptor, pero son incapaces de activar el receptor. Por ejemplo, los monómeros se derivan de ligandos de citoquinas de la familia de TNF, en particular de TNF-α.

El documento WO 2005/103077 describe polipéptidos de fusión de cadena sencilla que comprenden al menos tres monómeros de un miembro de ligando de la familia de TNF y al menos dos conectores peptídicos que unen entre sí los monómeros de los miembros de la familia de ligandos de TNF. Experimentos recientes, sin embargo, han demostrado que estos polipéptidos de fusión de cadena sencilla muestran una agregación no deseada.

Era un objeto de la presente invención proporcionar proteínas de fusión de cadena sencilla que comprendan al menos tres dominios de citoquinas TNF que permitan la fabricación recombinante eficiente combinada con una buena estabilidad relativa a la agregación.

Compendio de la Invención

La presente invención se refiere a un polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende:

(i): un primer dominio de citoquinas de la familia de TNF soluble,

(ii): un primer enlazador peptídico,

(iii) un segundo dominio de citoquinas de la familia TNF soluble,

(iv) un segundo enlazador peptídico, y

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(v) un tercer dominio de citoquinas de la familia TNF soluble

que es sustancialmente no-agregante, en donde el dominio de citoquinas de la familia TNF soluble se selecciona de dominios TRAIL. La invención se refiere, además, a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según se describe en esta memoria y a una célula o un organismo no humano transformado o transfectado 5 con una molécula de ácido nucleico según se describe en esta memoria. La invención se refiere también a una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende como agente activo una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, o una célula según se describe en esta memoria. La invención también se refiere a una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico o una célula según se describe en esta memoria para su uso en terapia, p. ej., el uso de una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, o una célula según se describe en 10 esta memoria para la preparación de una composición farmacéutica en la profilaxis y/o tratamiento de trastornos causados por, asociados con y/o acompañados de la disfunción de citoquinas de TNFSF, en particular trastornos proliferativos tales como tumores, p. ej., tumores sólidos o linfáticos; enfermedades infecciosas; enfermedades inflamatorias; enfermedades metabólicas; trastornos autoinmunes, p. ej., enfermedades reumatoides y/o artríticas; enfermedades degenerativas, p. ej., enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis múltiple; enfermedades

15 asociadas a la apoptosis o rechazos de trasplantes.

Descripción de las Figuras

Figura 1 Estructura del dominio del polipéptido de fusión de cadena sencilla de la invención. I., II., III. dominios de citoquinas de la familia de TNF solubles.

Figura 2 Imagen esquemática que representa la estructura general de proteínas de la TNF-SF. ■ ■ ■ 20 membrana celular, extremo N situado dentro de la célula, 1. Pliegue β anti-paralelo del dominio de unión al receptor (RBD), 2. Interfaz de RBD y membrana celular, 3 sitio de escisión de proteasa.

Figura 3 Imagen esquemática que representa la estructura del trímero de la TNF-SF nativo. Las estructuras cilíndricas representan RBDs, Los extremos N conectan RBD con la membrana celular.

Figura 4 Imagen esquemática que representa la estructura de tres dominios solubles que comprenden el 25 dominio de unión al receptor de una citoquina TNF. I., II., III. dominios de citoquinas de la familia TNF solubles.

Figura 5 Trimerización de los dominios solubles que comprenden el RBD de una citoquina TNF, caracterizado porque los extremos N y C de los tres dominios solubles forman una superficie.

Figura 6 Imagen esquemática que representa la estructura de la TNF-SF de una sola cadena que 30 comprende toda o una parte de la región de tallo que ilustra el requisito de enlazadores más largos para compensar la distancia al extremo N del siguiente dominio soluble.

Figura 7 Proteína de fusión scFv-TNF-SF conocida de la técnica.

Figura 8 Proteína de fusión Fc-TNF-SF conocida de la técnica.

Figura 9 9A Polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende un fragmento adicional de anticuerpo 35 Fab. 9B Polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende un fragmento adicional de anticuerpo scFv.

Figura 10 Dimerización de dos polipéptidos de fusión ScFc fusionados de forma N-terminal a través de puentes disulfuro.

Figura 11 Dimerización de dos polipéptidos de fusión ScFc fusionados de forma C-terminal a través de 40 puentes disulfuro.

Figura 12 Dimerización de polipéptidos de fusión de cadena sencilla a través de un enlazador.

Figura 13 Polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende un fragmento de anticuerpo Fab adicional fusionado adicionalmente a un segundo polipéptido de fusión o a un polipéptido de fusión scFv.

Figura 14 Dimerización de dos polipéptidos de fusión scFab a través de puentes disulfuro.

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Figura 15: Polipéptidos de fusión ScFc fusionados de forma N-terminal que comprenden adicionalmente un fragmento de anticuerpo Fv y/o Fab.

Figura 16: Polipéptidos de fusión ScFc fusionados de forma C-terminal que comprenden adicionalmente un fragmento de anticuerpo Fv y/o Fab.

5 10: Figura 17 Análisis SEC de miembros de la TNF-SF expresados de manera recombinante, purificados, en condiciones nativas. Se muestran a modo de ejemplo dos análisis SEC de los miembros de la TNF-SF purificados en una columna Superdex200 bajo condiciones nativas (p. ej.: PBS, pH 7,4). Los diagramas muestran la absorción a 280 nm (mAU) representada frente al volumen de elución (ml). La flecha en negro indica el pico de elución para la fracción que contiene proteína laq TNF-SF trimérica soluble, definida. El triángulo indica el pico de elución para la TNF-SF oligomerizada. La flecha en blanco indica el volumen vacío de la columna de la SEC que contiene agregados de proteína, que son demasiado grandes para ser separados (> 800 kDa).

15: Figura 17A: Agregación de proteína de la TNF-SF El Diagrama A muestra de modo ilustrativo un análisis de una preparación de proteína de la TNF-SF que contiene una alta cantidad de proteína oligomerizada/agregada (indicada por la alta cantidad de proteína que eluye en el volumen vacío y la alta cantidad de proteína oligomérica).

20: Figura 17 B: Proteína soluble definida por proteína de la TNF-SF El Diagrama B muestra de modo ilustrativo un análisis para un preparado de proteína de la TNF-SF que contiene casi exclusivamente proteína soluble definida (indicado por la ausencia de proteína que eluye en el volumen vacío y por la cantidad muy limitada de proteína que eluye como oligómero).

25: Figura 18 Análisis SEC de Fab-scTRAILR2-SSSS purificado por afinidad y expresado de manera recombinante. Análisis SEC de Fab-scTRAILR2-SSSS en una columna Superdex200 utilizando PBS, pH 7,4. El diagrama muestra la absorción a 280 nm (mAU) representada frente al volumen de elución (ml). La proteína eluye como un pico distinto con un volumen de elución de 14,56 ml, correspondiente a un MW (peso molecular) aparente de 68 kDa. No hay picos de proteínas adicionales con menor volumen de retención, lo que indica que se podía observar proteína oligomerizada/agregada.

30: Figura 19 Análisis SEC de Fab-scTRAILR2-SNSN purificado por afinidad y expresado de manera recombinante. Análisis SEC de Fab-scTRAILR2-SNSN en una columna Superdex200 utilizando PBS, pH 7,4. El diagrama muestra la absorción a 280 nm (mAU) representada frente al volumen de elución (ml). La proteína eluye como un pico distinto con un volumen de elución de 14,12 ml, correspondiente a un MW aparente de 87 kDa. No hay picos de proteínas adicionales con menor volumen de retención, lo que indica que se podía observar proteína oligomerizada/agregada.

35 40: Figura 20 Análisis SEC de Fab-scTRAILwt-SNSN purificado por afinidad y expresado de manera recombinante. Análisis SEC de Fab-scTRAILwt-SNSN en una columna Superdex200 utilizando PBS, pH 7,4. El diagrama muestra la absorción a 280 nm (mAU) representada frente al volumen de elución (ml). La proteína eluye como un pico distinto con un volumen de elución de 13,99 ml, correspondiente a un MW aparente de 94 kDa. Se podía observar un pequeño pico de proteína adicional en 12,00 ml. El Mw aparente de este pico corresponde a aproximadamente 270 kDa, lo que indica una trimerización definida de Fab-scTRAILwt-SNSN. La cantidad de proteína total del pico a 12,00 ml representa <3% de la proteína total. Más de 97% del Fab-scTRAILwt-SNSN analizado tiene un estado soluble definido (el ensamblaje correcto de los tres módulos de unión al receptor). El pico a 16,12 ml, que corresponde a un MW de 28 kDa, contiene polipéptido Fab de cadena ligera y no se incluyó para el análisis de áreas de los picos.

45: Figura 21 Glicosilación del Enlazador scTRAIL Humano

50: Figura 21 A Secuencia de aminoácidos del o de los enlazadores utilizada para combinar los módulos de unión al receptor de construcciones individuales TRAIL de cadena sencilla. Gly281 codifica el último aminoácido de un módulo de unión a receptor respectivo, la secuencia GSGN/SGN/SGS codifica la secuencia de enlazador, Arg121 codifica el primer aminoácido del siguiente dominio de unión al receptor de TRAIL. Las secuencias de enlazador diseñadas contienen dos sitios de glicosilación N-enlazadas putativas en la posición 1 ó 2 según se indica. Estas posiciones fueron permutadas según se indica (versión I, II, III).

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Figura 21 B: Combinación de posiciones de enlazador: Las moléculas scTRAIL contienen tres módulos

homólogos (barriles grises) que están conectados con enlazador 1 y 2 enlazador según se indica.

Cada uno de los dos enlazadores pueden ser diseñados para la glicosilación ligada a N según se

describe en "A". Se puede diseñar un conjunto completo de 9 proteínas diferentes que contienen

5: todas las combinaciones posibles de enlazadores sobre la base de las secuencias mostradas en B

para los enlazadores 1 y 2. (Se expresaron seis de estas proteínas -véase "C").

Figura 21 C: Nomenclatura de las construcciones scTRAIL expresadas para testar la influencia de diferentes

secuencias de enlazador sobre la glicosilación.

Figura 22: Análisis de transferencia Western de construcciones recombinantes scTRAIL

10: Proteínas TRAIL de una sola cadena con diferentes secuencias de enlazador se expresaron de

forma recombinante, se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de

PVDF. Las proteínas unidas se detectaron con un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce

Strep-Tag seguido por un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa. Diferentes

variantes TRAIL se cargaron según se indica. Obsérvese el desplazamiento del MW que indica

15: una glicosilación diferencial de variantes de enlazador scTRAIL.

Figura 23: Se recogió el sobrenadante del cultivo celular de células HEK293, que expresan transitoriamente

scCD95L (SEQ-ID NO: 27) y se utilizó para estimular células Jurkat a concentraciones variables.

El sobrenadante se utilizó ya sea directamente sin más modificaciones o se añadió un anticuerpo

anti-Streptag (2 microgramos/ml) para reticular la proteína scCD95L. Las células Jurkat se

20: incubaron con sobrenadante de cultivo celular de HEK293 durante tres horas a 37°, se lisaron y se

analizaron en cuanto a la actividad de caspasa. Sólo el sobrenadante celular que contenía

scCD95L-St reticulada aumentó la actividad de caspasa en células Jurkat, lo que indica que

scCD95L solo no forma agregados de orden superior capaz de ser pro-apoptóticos.

Figura 24: La proteína scCD95L (SEQ ID NO: 27) se puede producir por transfección transitoria de células

25: HEK293, por transfección estable de otras células eucariotas o por expresión utilizando células

procariotas. La proteína recombinante puede ser purificada por afinidad mediante el uso de la

matriz StrepTactin Sepharose. La proteína unida puede eluirse con un tampón que contiene

destio-biotina. La Figura 2 muestra una SDS-PAGE teñida con plata de las fracciones de elución

(pistas 1 a 5; la fracción 2 es positiva) de la purificación por afinidad. La fracción de elución que

30: contiene scCD95L podría aplicarse a cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se espera,

que la proteína muestre sólo un bajo contenido de agregados.

Figura 25: Se recogieron sobrenadantes de cultivo celular de las células HEK293, que expresan

transitoriamente proteínas TRAIL de una sola cadena con diferentes enlazadores (derivados de

SEQ ID 28) y se utilizaron para estimular células Jurkat a diluciones variables (a modo de ejemplo,

35: en esta figura se muestra una dilución de 1: 8). Los sobrenadantes se utilizaron ya sea

directamente sin más modificaciones o se añadió un anticuerpo anti-Streptag (2 microgramos/ml

de Strep MAB Immo) para reticular las proteínas scTRAIL. Las células Jurkat se incubaron con

sobrenadante de cultivo celular HEK293 durante tres horas a 37°, se lisaron y se analizaron en

cuanto a la actividad de caspasa. Sobrenadante de cultivo celular que contenía proteínas

40: scTRAILwt reticuladas inducía una actividad de caspasa en células Jurkat, lo que indica que las

proteínas scTRAILwt solas forman sólo una pequeña cantidad de agregados de orden superior

capaces de ser pro-apoptóticos.

Figura 26: Influencia de la sucesión del módulo de componentes de construcciones scTRAIL en su tasa de

expresión de proteínas de fusión Fab-scTRAIL. Transferencia Western de sobrenadantes de

45: cultivo de células HEK293T a partir de experimentos de expresión transitoria. Las cadenas de

polipéptidos necesarias para la formación de las proteínas Fab-scTRAIL se expresaron ya sea por

separado (pistas 1 a 10) o, alternativamente, se realizaron experimentos de co-expresión (pistas

11 -13). Después de reducir la SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a una membrana de

nitrocelulosa y se detectaron proteínas que contienen un Streptag werde, utilizando un mAB

50: (anticuerpo monoclonal) específico anti-Streptag como AB (anticuerpo) primario. Las proteínas

scTRAIL (R2-específicas) de cadena ligera se secretaron incluso en ausencia de la cadena

pesada accesoria (pistas 1-4). En contraposición, las proteínas de fusión scTRAIL de cadena

pesada (R2-específicas) no se secretaron en ausencia de la cadena ligera accesoria (pistas 5-8).

Tal como se ejemplifica en la pista 13., las proteínas de fusión scTRAIL (R2-específicas) de

55: cadena pesada solamente se secretaron en presencia de la cadena ligera.

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Figura 27 Se recogieron sobrenadantes de cultivo celular de células HEK293T, que expresan proteínas de fusión scTRAILwt-Fc transitoriamente con diferentes enlazadores y se utilizaron para estimular las células Jurkat a diferentes diluciones. Los sobrenadantes se utilizaron directamente sin más modificaciones (Figura XX-A). Las células Jurkat se incubaron con sobrenadante de cultivo de

5 células HEK293T durante tres horas a 37°, se lisaron y se analizaron en cuanto a la actividad de caspasa. Existía ya una capacidad proapoptótica pronunciada presente en los sobrenadantes que contienen scTRAILwt-Fc, lo que indica que las proteínas de fusión Fc-scTRAILwt solas forman conjuntos diméricos capaces de ser pro-apoptóticos.

Figura 28 Es bien sabido que el uso de un ligando artificialmente reticulado o unido a membrana de la

10 superfamilia de TNF tiene una bioactividad superior en comparación con un ligando homotrimérico soluble. Por lo tanto, el enriquecimiento local de construcciones TRAIL de cadena sencilla (scTRAIL) en células que expresan el antígeno Her2 a través del fragmento Fab selectivo para Her2 ("Pertuzumab") fusionado a estas proteínas scTRAIL debe incrementar su bioactividad citotóxica. Del mismo modo, el bloqueo de los sitios de unión Her2 en células mediante pre

15 incubación con el fragmento Fab específico para Her2 (Pertuzumab-Fab) sólo debe disminuir la bioactividad citotóxica de las proteínas de fusión Fab-scTRAIL. Tal como se muestra en la Figura 28A, las construcciones scTRAIL inducen la muerte de células HT1080 a medida que disminuye la viabilidad con una concentración creciente de proteínas. Por consiguiente, la preincubación de células HT1080 con el fragmento Fab (Pertuzumab-Fab), seguido de co-incubación con las

20 construcciones Fab-scTRAIL (Fab-scTRAILR2-SNSN o Fab-scTRAILwt-SNSN) durante la noche, reduce la actividad citotóxica de las construcciones Fab-scTRAIL (figura 28B), mientras que el Fab solamente inducía la no muerte celular (Pertuzumab-Fab). Esto significa que las construcciones Fab-scTRAIL se unen a células HT1080 a través del fragmento Fab, aumentando así la bioactividad citotóxica de scTRAIL.

25 Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un polipéptido de fusión sustancialmente no agregante que comprende al menos tres dominios solubles de ligandos de la familia TNF conectados por dos enlazadores peptídicos.

El término "no-agregante" se refiere a un contenido en monómeros del preparado de ≥ 50%, preferiblemente ≥ 70%

30 y más preferiblemente ≥ 90%. La relación de contenido en monómeros a contenido en agregados puede determinarse examinando la cantidad de la formación de agregados, utilizando la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). La estabilidad relativa a la agregación puede determinarse mediante SEC después de períodos de tiempo definidos, p. ej., desde unos pocos hasta varios días, a semanas y meses en diferentes condiciones de almacenamiento, p. ej., a 4°C o 25°C. Para la proteína de fusión, con el fin de ser clasificada como sustancialmente

35 no agregante, se prefiere que el contenido en monómeros sea como se define anteriormente después de un período de tiempo de varios días, p. ej., 10 días, más preferiblemente después de varias semanas, p. ej., 2, 3 ó 4 semanas, y lo más preferiblemente después de varios meses, p. ej., 2 ó 3 meses de almacenamiento a 4ºC o 25°C.

Dado que un aumento de, p. ej., el potencial de inducción de la apoptosis en el caso de scCD95L en células Jurkat humanas se correlaciona con su estado de agregación, la estabilidad del polipéptido de fusión relativo a la

40 agregación también se puede determinar examinando la actividad biológica del polipéptido de fusión.

El polipéptido de fusión de cadena sencilla puede comprender dominios adicionales que pueden estar situados en los extremos N y/o C de los mismos. Ejemplos de dominios de fusión adicionales son, p. ej., anticuerpos de cadena sencilla o fragmentos de anticuerpos u otras moléculas fijadoras de objetivo o un dominio de citoquinas adicional, p. ej., una interleuquina.

45 El polipéptido de fusión de cadena sencilla puede comprender dominios adicionales que pueden estar situados en los extremos N y/o C de los mismos. Ejemplos de dominios de fusión adicionales son, p. ej., anticuerpos de cadena sencilla o fragmentos de anticuerpos u otras moléculas fijadoras de objetivo o un dominio de citoquinas adicional, p. ej., una interleuquina. La proteína de fusión de cadena sencilla se compone de tres dominios solubles derivados de una citoquina de la superfamilia de TNF. Preferiblemente, esos dominios solubles se derivan de una citoquina de

50 mamífero, en particular ser humano, incluyendo variantes alélicas y/o derivados de los mismos. Los dominios solubles comprenden la porción extracelular de una citoquina TNFSF, incluyendo el dominio de unión al receptor sin dominios de la membrana localizados. Proteínas de la superfamilia de TNF están ancladas a la membrana a través de una porción N-terminal de 15-30 aminoácidos, la denominada región del tallo. La región del tallo contribuye a la trimerización y proporciona una cierta distancia a la membrana celular. Sin embargo, la región del tallo no es parte

55 del dominio de unión al receptor (RBD).

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Es importante destacar que el RBD se caracteriza por una localización particular de sus aminoácidos N-y Cterminales. Dichos aminoácidos son inmediatamente adyacentes y están situados centralizados con respecto al eje del trímero. Los primeros aminoácidos N-terminales del RBD forman una hebra beta anti-paralela con los aminoácidos C-terminales del RBD (Figs. 2 y 3).

Por lo tanto, la hebra beta anti-paralela del RBD forma una interfase con la membrana celular, que está conectada a y anclada dentro de la membrana celular a través de los aminoácidos de la región del tallo. Es altamente preferido que los dominios solubles de la proteína de fusión de cadena sencilla comprendan un dominio de unión al receptor de la citoquina TNF-SF que carecen de cualquiera de los aminoácidos de la región del tallo (Figs. 4 y 5). De lo contrario, se requeriría un largo enlazador que conecta el extremo C de uno de los dominios solubles con el extremo N del siguiente dominio soluble para compensar la región del tallo N-terminal del siguiente dominio soluble (Figura 6), lo cual podría resultar en una inestabilidad y/o en la formación de agregados.

Una ventaja adicional de dominios solubles de este tipo es que los aminoácidos N-y C-terminales del RBD no son accesibles para cualquiera de los anticuerpos anti-fármaco.

Preferiblemente, el polipéptido de fusión de cadena sencilla es capaz de formar una estructura trimérica ordenada que comprende al menos un sitio de unión funcional para el receptor de citoquina respectivo.

El polipéptido de fusión puede comprender uno, dos o tres sitios funcionales de unión al receptor de citoquina, es decir, secuencias de aminoácidos capaces de formar un complejo con un receptor de citoquinas. Así, al menos uno de los dominios soluble es capaz de unirse al receptor de citoquina correspondiente. En una realización, al menos uno de los dominios solubles es capaz de la activación del receptor, con lo que se puede efectuar una actividad apoptótica y/o proliferativa. En una realización adicional, se seleccionan uno o más de los dominios solubles que no son capaces de la activación del receptor.

Se describe que el dominio soluble se puede derivar de miembros de la superfamilia del TNF, p. ej., TNFSF-1-18 humana y EDA-A1 a -A2 según se indica en la Tabla 1, preferiblemente de LTA (SEQ ID NO: 1), TNFα (SEQ ID NO: 2), LTB (SEQ ID NO: 3), OX40L (SEQ ID NO: 4), CD40L (SEQ ID NO: 5), CD27L (SEQ ID NO: 7), CD30L (SEQ ID NO: 8), CD137L (SEQ ID NO: 9), RAN KL (SEQ ID NO: 11), TWEAK (SEQ ID NO: 12), APRIL 1 (SEQ ID NO: 13), APRIL 2 (SEQ ID NO: 14), BAFF (SEQ ID NO: 15), LIGHT (SEQ ID NO: 16), TL1A (SEQ ID NO: 17), GITRL (SEQ ID NO: 18), EDA-A1 (SEQ ID NO: 19) y EDA-A2 (SEQ ID NO: 20). Dominios solubles preferidos de las proteínas respectivas se indican en la Tabla 1 (NH2-aa a COOH-aa) y, p. ej., comprende los aminoácidos 59-205, 60-205 ó 64-205 de LTA (SEQ ID NO: 1), 86-233 de TNF[alfa] (SEQ ID NO: 2), 82-244 u 86-244 de LTB (SEQ ID NO: 3), 52183 ó 55-183 de OX40L (SEQ ID NO: 4), 112-261, 117-261 ó 121-261 de CD40L (SEQ ID NO: 5), 51-193 ó 56-193 de CD27L (SEQ ID NO: 7), 97-234, 98-234 ó 102-234 de CD30L (SEQ ID NO: 8), 86-254 de CD137L (SEQ ID NO: 9), 161 -317 de RANKL (SEQ ID NO: 11), 103-249, 104-249, 105-249 ó 106-249 de TWEAK (SEQ ID NO: 12), 112247 de APRIL 1 (SEQ ID NO: 13), 112 a 250 de APRIL 2 (SEQ ID NO: 14), 140-285 de BAFF (SEQ ID NO: 15), 91251, 93-251 o 97-251 de TL1A (SEQ ID NO: 17), 52-177 de GITRL (SEQ ID NO: 18), 245-391 de EDA-A1 (SEQ ID NO: 19), 245-389 de EDA-A2 (SEQ ID NO: 20).

El dominio soluble se puede derivar, p. ej., de LIGHT. En una realización especialmente preferida, el dominio soluble se selecciona de TRAIL, en particular a partir de los aminoácidos 120-122 y comprende, en particular, los aminoácidos 120-281, 121-281 o 122-281 de SEQ ID NO: 10. Opcionalmente, el amino ácido Lys145 de SEQ ID NO: 6 puede ser reemplazado por un aminoácido no cargado, p. ej., Ser o Gly. Opcionalmente, el aminoácido Arg121 de SEQ ID NO: 10 puede ser reemplazado por un ácido amino no cargado, p. ej., Ser o Gly. Además, se describe que los dominios solubles se seleccionan de LIGHT humano, en particular partiendo de los aminoácidos 93, 94 ó 95 de SEQ ID NO: 16 y, en particular, comprenden los aminoácidos 93-240, 94-240 ó 95-240 de SEQ ID NO:

16.

Como se indicó anteriormente, los dominios solubles pueden comprender las secuencias de tipo salvaje según se indica en SEQ ID NO: 1-20. Cabe señalar, sin embargo, que es posible introducir mutaciones en uno o más de estos dominios solubles, p. ej., mutaciones que alteran (p. ej., aumentan o disminuyen) las propiedades de unión de los dominios solubles. En una realización, se pueden seleccionar los dominios solubles que no pueden unirse al receptor de citoquina correspondiente. Un ejemplo de una mutación de este tipo es una sustitución del aminoácido Y218 en CD95L humano (SEQ ID NO: 6) por otro aminoácido, p. ej., R, K, S o D. Además, se puede introducir una mutación que altere la unión a los otros componentes celulares y extracelulares, p. ej., la matriz extracelular. Un ejemplo de una mutación de este tipo es una sustitución del aminoácido K177 en CD95L (SEQ ID NO: 6) por otro aminoácido, p. ej., E, D o S.

En una realización adicional preferida de la invención, el dominio de citoquina soluble (i) comprende un mutante de la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión al receptor de la misma que se une a y/o activa el

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receptor de TRAIL-1 (TRAILR1) y/o el receptor de TRAIL-2 (TRAILR2). La unión y/o actividad del mutante puede determinarse, p. ej., por los ensayos como se describe en van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103: 8634-8639), Kelley et al. (J. Biol.Chem, 2005, 280:2205-2215) o MacFarlane et al. (Cancer Res., 2005, 65:11265-11270).

El mutante puede ser generado por cualquier técnica y es conocido por la persona experta, p. ej., las técnicas descritas en van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103: 8634-8639), Kelley et al. (J. Biol. Chem, 2005, 280:2205-2215) o MacFarlane et al. (Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270) y puede comprender cualquier tipo de mutaciones estructurales, p. ej., sustitución, deleción, duplicación y/o inserción de un aminoácido. Una realización preferida es la generación de sustituciones. La sustitución puede afectar a al menos un aminoácido de la citoquina de la superfamilia de TNF o a un dominio de unión al receptor de los mismos según se describe en esta memoria. En una realización preferida, la sustitución puede afectar a al menos uno de los aminoácidos de TRAIL, p. ej., TRAIL humano (p. ej., SEQ ID NO: 10). Sustituciones preferidas a este respecto afectan al menos a uno de los siguientes aminoácidos de TRAIL de la SEQ ID NO: 10: R130, G160, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, I266, D267, D269. Sustituciones de aminoácidos preferidas de TRAIL humano de SEQ ID NO: 10 son al menos una de las siguientes sustituciones: R130E, G160M, Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R o D269K.

La o las sustituciones de aminoácidos pueden afectar a la unión y/o actividad de TRAIL, p. ej., TRAIL humano, ya sea en TRAILR1 o TRAILR2. Alternativamente, la o las sustituciones de aminoácidos pueden afectar a la unión y/o actividad de TRAIL, p. ej., TRAIL humano, en o en ambos de TRAILR1 y de TRAILR2. La unión y/o actividad de TRAILR1 y/o TRAILR2 puede verse afectada positivamente, es decir, una unión más fuerte, más selectiva o más específica y/o más activación del receptor. Alternativamente, la unión y/o actividad de TRAILR1 y/o TRAILR2 pueden verse afectadas negativamente, es decir, una unión más débil, menos selectiva o menos específica y/o menos activación o ninguna del receptor.

Ejemplos de mutantes de TRAIL con sustitución o sustituciones de aminoácidos de la invención que afectan a la unión y/o activación tanto de TRAILR1 como de TRAILR2 pueden encontrarse, p. ej., en la Tabla 1 de MacFarlane et al. (véase más arriba) y pueden comprender un mutante TRAIL humano con las siguientes dos sustituciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 Y213W y S215D o con la siguiente sustitución de un solo aminoácido: Y189A.

Ejemplos de mutantes de TRAIL con sustitución o sustituciones de aminoácidos de la invención que afectan a la unión y/o activación de TRAILR1 se pueden encontrar, p. ej., en la Tabla 1 de MacFarlane et al. (véase más arriba) y pueden comprender un mutante TRAIL humano con las siguientes cuatro sustituciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 N199V, K201R, Y213W y S215D o con las siguientes cinco sustituciones de aminoácidos: Q193S, N199V, K201R, Y213W y S215D, o se pueden encontrar en la Tabla 2 de Kelley et al. (véase más arriba) y pueden comprender un mutante TRAIL humano con las siguientes seis sustituciones de aminoácidos: Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199V y K201R, o con Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199R y K201R.

Ejemplos de mutantes de TRAIL con sustitución o sustituciones de aminoácidos de la invención que afectan a la unión y/o activación de TRAILR2 puede encontrarse, p. ej., en la Tabla 1 de MacFarlane et al. (véase más arriba) o en la Tabla 2 de Kelley et al. (véase más arriba) y puede comprender un mutante TRAIL humano con las siguientes seis sustituciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 10: Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L y D267Q, o se pueden encontrar en la Tabla 2 de van der Sloot et al. (véase más arriba) y pueden comprender un mutante humano TRAIL con la siguiente sustitución de un solo aminoácido: D269H, o con las siguientes dos sustituciones de aminoácidos: D269H y E195R o D269H y T214R.

Por lo tanto una forma de realización preferida es una proteína de fusión según se describe en esta memoria, en la que al menos uno de los dominios solubles comprende un mutante de TRAIL o de un dominio de unión al receptor de la misma que se une y/o activa TRAILR1 y/o TRAILR2.

Ejemplos adicionales de mutantes de TRAIL, que muestran una agregación reducida del receptor inducida por TRAIL son H168 (S, T, Q), R170 (E, S, T, Q) y H177 (S, T).

Una realización preferida de una proteína de fusión que comprende un mutante de TRAIL o de un dominio de unión al receptor según se describe en esta memoria es una proteína de fusión en donde el componente (i) comprende al menos una sustitución de aminoácidos, en particular como se indica a continuación.

Una sustitución de aminoácidos de este tipo afecta al menos a una de las siguientes posiciones de aminoácidos de TRAIL humano (SEQ ID NO: 10): R130, G160, H168, R170, H177, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, I266, D267, D269.

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Una sustitución de aminoácidos de este tipo es al menos una de las siguientes: R130E, G160M, H168 (S, T, Q), R170 (E, S, T, Q), H177 (S, T) Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R o D269K.

Un dominio selectivo de TRAIL-R2 preferido comprende sustituciones de aminoácidos Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L y D267Q.

Un dominio selectivo de TRAIL-R1 preferido comprende sustituciones de aminoácidos Y189A, Q193S, N199V, K201R, Y213W y S215D.

La molécula de fusión de una sola cadena de la presente invención comprende adicionalmente tres dominios solubles de citoquinas, a saber, los componentes (i), (iii) y (v). De acuerdo con la presente invención, se encontró, sorprendentemente, que se potencia la estabilidad de un polipéptido de fusión citoquina de la familia TNF de cadena sencilla frente a la agregación, si el segundo y/o tercer dominio de citoquina de la familia TNF soluble es un dominio acortado en el extremo N que comprende opcionalmente mutaciones en la secuencia de aminoácidos. Así, preferiblemente, tanto el segundo como el tercer dominio de citoquina de la familia de TNF soluble son dominios acortados en el extremo N que comprenden opcionalmente mutaciones de secuencias de aminoácidos en las regiones N-terminales, preferiblemente dentro de los primeros cinco aminoácidos del extremo N del dominio de citoquinas soluble. Estas mutaciones pueden comprender la sustitución de aminoácidos cargados, p. ej., aminoácidos de carácter ácido o básico, por aminoácidos neutros, en particular serina o glicina.

En contraposición con ello, la selección del primer dominio de citoquinas de la familia TNF soluble no es tan crítica. Aquí, se puede utilizar un dominio soluble que tenga una secuencia N-terminal de longitud completa. Cabe señalar, sin embargo, que también el primer dominio de citoquina soluble puede tener una secuencia acortada en el extremo N y opcionalmente mutada.

También se describe que los dominios solubles de citoquina de la familia de TNF (i), (iii) y (v) son dominios solubles de CD95L, en particular los dominios solubles de CD95L humana. El primer dominio soluble de CD95L (i) se puede seleccionar de secuencias nativas, acortadas y/o mutadas. La secuencia N-terminal del primer dominio (i) puede comenzar, p. ej., entre el aminoácido Glu142 y Val146 de CD95L humana, en donde Arg144 y/o Lys145 pueden ser reemplazadas por un aminoácido neutro, p. ej., por Ser o Gly. Los segundo y tercer dominios solubles de CD95L (iii) y (v), sin embargo, se seleccionan de secuencias acortadas y/o mutadas. Al menos uno de los dominios solubles de CD95L, (iii) y (v), puede tiene una secuencia N-terminal que comienza entre los aminoácidos Arg144 y Val146 de CD95L humana, y donde Arg144 y/o Lys145 pueden ser reemplazadas por un aminoácido neutro, p. ej., por Ser y/o Gly. El segundo y tercer dominios solubles de CD95L pueden comenzar con una secuencia N-terminal seleccionada de:

(a): Arg144 -(Gly/Ser) 145 -Val (146)

(b): (Gly/Ser) 144 -Lys145 -VaI (146) y

(c): (Gly/Ser) 144 -(Gly/Ser) 145 -VaI (146).

Además, el dominio de CD95L puede terminar con el aminoácido Leu 281 de CD95L humana.

El dominio soluble de CD95L puede comprender una secuencia de tipo salvaje de un mamífero, p. ej., un ser humano. En determinadas realizaciones, sin embargo, la secuencia de CD95L puede comprender una mutación que resulta en una reducción o inhibición completa de la unión a la matriz extracelular, p. ej., una mutación en la posición Lys177, p. ej., Lys177 → Glu, Asp o Ser y/o una mutación que reduce y/o inhibe la unión al receptor de CD95L, p. ej., una mutación en la posición Tyr218, p. ej., Tyr218 → Arg, Lys, Ser, Asp.

Una de las tres moléculas solubles de CD95L puede ser una variante de secuencia con una unión reducida al receptor. Dos de las moléculas pueden contener mutaciones que resultan en una unión reducida al receptor.

En una realización preferida adicional de la presente invención, los dominios solubles de citoquinas de la familia de TNF (i), (iii) y (v) son dominios solubles de TRAIL, en particular dominios solubles de TRAIL humano. El primer dominio soluble TRAIL (i) se puede seleccionar de secuencias nativas, acortadas y/o mutadas. Por lo tanto, el primer dominio soluble de TRAIL (i) tiene una secuencia N-terminal que puede comenzar entre el aminoácido GIu116 y VaM 22 de TRAIL humano, y en donde Arg121 puede ser reemplazado por un aminoácido neutro, p. ej., por Ser o Gly. Los segundo y tercer dominios solubles TRAIL (iii) y (v) tienen una secuencia N-terminal acortada que comienza preferiblemente entre el aminoácido Gly120 y VaM 22 de TRAIL humano y en donde Arg121 puede ser reemplazado por otro aminoácido, p. ej., Ser o Gly.

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Preferiblemente, la secuencia N-terminal de los dominios solubles de TRAIL (iii) y (v) se selecciona de: (a) Arg121 -Val122 -Ala123 y (b) (Gly/Ser) 121.

El dominio soluble TRAIL termina preferiblemente con el aminoácido Gly281 de TRAIL humano. En determinadas realizaciones, el dominio TRAIL puede comprender mutaciones internas como se describe arriba.

Se describe que los dominios solubles de citoquinas de la familia de TNF (i), (iii) y (v) son dominios solubles LIGHT,

p. ej., dominios solubles LIGHT humanos. El primer dominio soluble LIGHT (i) se puede seleccionar de secuencias nativas, acortadas y/o mutadas. Por lo tanto, el primer dominio soluble LIGHT (i) tiene una secuencia N-terminal que puede comenzar entre el aminoácido Glu91 y Ala95 de LIGHT humano. Los segundo y tercer dominios solubles LIGHT (iii) y (v) tienen una secuencia N-terminal acortada que comienza preferiblemente entre el aminoácido Pro94 y Ala95 de LIGHT humano. El dominio soluble LIGHT termina preferiblemente con el aminoácido Val240.

Los componentes (ii) y (iv) del polipéptido de fusión de cadena sencilla son elementos enlazadores peptídicos situados entre los componentes (i) y (iii) o (iii) y (v), respectivamente. Los elementos enlazadores flexibles tienen una longitud de 3-8 aminoácidos, en particular una longitud de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. Los elementos enlazadores son preferiblemente enlazadores de glicina/serina, es decir, enlazadores peptídicos que consisten sustancialmente en los aminoácidos glicina y serina. En los casos en los que el dominio soluble de citoquina termina con S o G (Cterminal), p. ej., TRAIL humano, el enlazador comienza después de S o G. En los casos en los que el dominio soluble de citoquina comienza con S o G (N-terminal), el enlazador termina antes de esta S o G.

Cabe señalar que el enlazador (ii) y el enlazador (iv) no necesitan ser de la misma longitud. Con el fin de disminuir la inmunogenicidad potencial, puede ser preferible utilizar enlazadores más cortos. Además resultó que enlazadores más cortos conducen a moléculas de cadena sencilla con una tendencia reducida a formar agregados. Mientras que los enlazadores que son sustancialmente más largos que los descritos aquí pueden exhibir propiedades de agregación desfavorables.

Si se desea, el enlazador puede comprender un residuo asparagina que puede formar un sitio glicosilado Asn-Xaa-Ser. En determinadas realizaciones, uno de los enlazadores, p. ej., el enlazador (ii) o el enlazador (iv) comprenden un glicosilado en el sitio. En otras realizaciones, ambos enlazadores (iv) comprenden sitios de glicosilado. Con el fin de aumentar la solubilidad de las proteínas scTNF-SF y/o con el fin de reducir la inmunogenicidad potencial, se puede preferir que enlazador (ii) o el enlazador (iv), o ambos, comprendan un sitio de glicosilación.

Secuencias de enlazadores preferidos se seleccionan de GSGSGSGS (SEQ ID NO: 52), GSGSGNGS (SEQ ID NO: 53), GGSGSGSG (SEQ ID NO: 21), GGSGSG (SEQ ID NO: 22), GGSG (SEQ ID NO: 23), GGSGNGSG (SEQ ID NO: 24), GGNGSGSG (SEQ ID NO: 25) y GGNGSG (SEQ ID NO: 26).

La proteína de fusión puede comprender adicionalmente un dominio de péptido señal N-terminal que permite el procesamiento, p. ej., la secreción extracelular, en una célula huésped adecuada. Preferiblemente, el dominio del péptido señal N-terminal comprende un sitio de escisión de proteasa, p. ej., un sitio de escisión de peptidasa de señal y, por lo tanto, puede ser separado después o durante la expresión para obtener la proteína madura. Además, la proteína de fusión puede comprender adicionalmente un elemento C-terminal, que tiene una longitud de, p. ej., 150, preferiblemente 10-30 aminoácidos que pueden incluir o conectarse a un dominio de reconocimiento/purificación,

p. ej., un dominio FLAG, un dominio Strep-tag o Strep-tag Il y/o un dominio poli-His.

Además, el polipéptido de fusión puede comprender adicionalmente en el extremo N y/o el extremo C un dominio adicional, p. ej., un dominio de fijación de objetivo tal como un dominio de anticuerpo de cadena sencilla o un dominio de fragmento de anticuerpo. Ejemplos específicos de anticuerpos adecuados son anticuerpos antitumorales, tales como anticuerpos contra miembros de la familia EGFR. Ejemplos adecuados de otras moléculas fijadoras de objetivo son citoquinas tales como interleucinas.

Ejemplos de proteínas de fusión específicas de la invención son las SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 43, 45, 47, 49 y 51. Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según se describe en esta memoria. La molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN, p. ej., una molécula de ADN de doble cadena o de cadena sencilla, o una molécula de ARN. La molécula de ácido nucleico puede codificar la proteína de fusión o un precursor de la misma, p. ej., una pro-o pre-proforma de la proteína de fusión que puede comprender una secuencia señal u otras porciones de aminoácidos heterólogas para la secreción

o purificación que están situadas preferiblemente en el extremo N y/o C de la proteína de fusión. Las porciones de aminoácidos heterólogas pueden estar enlazadas al primer y/o segundo dominio a través de un sitio de escisión de proteasa, p. ej., un sitio de escisión de Factor X3, trombina o IgA de la proteasa.

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Ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos específicas de la invención son SEQ ID NOs: 30, 31 32, 44, 46, 48 y

50.

La molécula de ácido nucleico puede estar enlazada operativamente a una secuencia de control de la expresión, p. ej., una secuencia de control de expresión que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula huésped deseada. La molécula de ácido nucleico puede estar situada en un vector, p. ej., un plásmido, un bacteriófago, un vector viral, un vector de integración cromosal, etc. Ejemplos de secuencias de control de la expresión y vectores adecuados se describen, por ejemplo, por Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, y Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, o ediciones más recientes de los mismos.

Se pueden utilizar diversos sistemas de expresión de vector/célula huésped para expresar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de la presente invención. Células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a células procariotas tales como bacterias, p. ej., E. coli, células huésped eucariotas tales como células de levadura, células de insectos, células vegetales o células animales, preferiblemente células de mamífero y, más preferiblemente, células humanas.

Además, la invención se refiere a un organismo no humano transformado o transfectado con una molécula de ácido nucleico como se describe anteriormente. Tales organismos transgénicos pueden generarse por métodos conocidos de transferencia genética, incluyendo la recombinación homóloga.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende como agente activo al menos una proteína de fusión, un ácido nucleico respectivo que codifica la misma

o una célula transformada o transfectada, todo como se describe en esta memoria.

Al menos una proteína de fusión, ácido nucleico respectivo que codifica la misma o célula transformada o transfectada, todos como se describen en esta memoria se pueden utilizar en terapia, p. ej., en la profilaxis y/o tratamiento de trastornos provocados por, asociadas con y/o acompañados de la disfunción de citoquinas de TNF-SF, en particular trastornos proliferativos tales como tumores, p. ej., tumores sólidos o linfáticos; enfermedades infecciosas; enfermedades inflamatorias; enfermedades metabólicas; trastornos autoinmunes, p. ej., artritis reumatoide y/o enfermedades artríticas; enfermedades degenerativas, p. ej., enfermedades neurodegenerativas tales como la esclerosis múltiple; enfermedades asociadas a apoptosis o rechazos de trasplantes.

La expresión "disfunción de citoquinas de TNF-SF", tal como se utiliza en esta memoria, ha de entenderse como cualquier función o expresión de una citoquina de TNF-SF que se desvía de la función o la expresión normal de una citoquina de TNF-SF, p. ej., la sobre-expresión del gen o proteína de TNF-SF, la expresión reducida o abolida del gen de citoquina o proteína de TNF-SF en comparación con el nivel de expresión fisiológico normal de dicha citoquina de TNF-SF, la actividad incrementada de la citoquina de TNF-SF, la actividad reducida o abolida de la citoquina de TNF-SF, la unión incrementada de la citoquina de TNF-SF a cualquier participante en la unión, p. ej., a un receptor, particularmente un receptor de CD95 o TRAIL u otra molécula de citoquina, la unión reducida o abolida a cualquier participante en la unión, p. ej., a un receptor, particularmente un receptor de TRAIL o CD95 u otra molécula de citoquinas, en comparación con la actividad fisiológica normal o unión de dicha citoquina de TNF-SF.

La composición se puede administrar como monoterapia o como terapia de combinación con otros medicamentos, p. ej., agentes citostáticos o quimioterapéuticos, corticosteroides y/o antibióticos.

La proteína de fusión se administra a un sujeto en necesidad de la misma, particularmente un paciente humano, en una dosis suficiente para el tratamiento de las afecciones específicas por medios adecuados. Por ejemplo, la proteína de fusión se puede formular como una composición farmacéutica junto con soportes, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La eficacia terapéutica y la toxicidad pueden determinarse de acuerdo con protocolos estándares. La composición farmacéutica puede administrarse sistémicamente, p. ej., por vía intraperitoneal, intramuscular o intravenosa, o localmente, p. ej., intranasal, subcutánea o intratecal. Se prefiere la administración intravenosa.

La dosis de la proteína de fusión administrada dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, del peso del sujeto, del tipo y la gravedad de la enfermedad, de la forma de administración y del juicio del médico que prescribe. Para la administración de proteínas de fusión, es adecuada una dosis diaria de 0,001 a 100 mg/kg.

Ejemplos

1. Fabricación de una proteína de fusión CD95L de una sola cadena (scCD95L) (como referencia)

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En lo que sigue se muestra la estructura general de las proteínas recombinantes (Figura 1) ejemplificada para el dominio de unión al receptor del ligando CD95 humano.

1.1 Estructura del polipéptido

A) Aminoácidos Met1 -Ser21 Péptido IgKappa señal, asumida escisión de peptidasa señal después del aminoácido Gly20

B) Aminoácidos Glu22-Leu161

Primer dominio soluble de citoquinas del ligando CD95 humano (CD95L; aminoácidos 142-281 de SEQ ID NO: 6, incluyendo una mutación K145S).

C) Aminoácidos Gly162-Gly169 Primer elemento enlazador peptídico.

D) Aminoácidos Arg170-Leu307

Segundo dominio soluble de citoquina del ligando CD95 humano (CD95L; aminoácidos 144-182 de SEQ ID NO: 6, incluyendo una mutación K145S).

E) Aminoácidos Gly308-315 Segundo elemento enlazador peptídico.

F) Aminoácidos Arg316-Leu453

Tercer dominio soluble de citoquina del ligando CD95 humano (CD95L; aminoácidos 144-281 de SEQ ID NO: 6, incluyendo una mutación K145S).

G) Aminoácido Gly457-Lys472 Enlazador peptídico con un motivo Strep-tag Il.

La secuencia de aminoácidos de sc CD95L se muestra en SEQ ID NO. 27. El polipéptido de fusión comprende primero y segundo enlazadores peptídicos que tienen la secuencia GGSGSGSG (SEQ ID NO: 21). Secuencias de enlazadores preferidas adicionales son SEQ ID NOs: 22-26 según se describe anteriormente. Cabe señalar que las primera y segunda secuencias de enlazador peptídico no necesitan ser idénticas.

La secuencia del péptido señal (A) puede ser reemplazada por cualquier otra adecuada, p. ej., secuencia del péptido señal de mamífero. El motivo Strep-tag Il (G) puede ser reemplazado por otros motivos, si se desea, o puede ser eliminado.

Tal como se muestra en la Figura 23, se recogió sobrenadante de cultivo celular de células HEK293, que expresan transitoriamente scCD95L (SEQ ID NO: 27) y se utilizó para estimular células Jurkat a concentraciones variables. El sobrenadante se utilizó ya sea directamente sin más modificaciones o se añadió un anticuerpo anti-Streptag (2 microgramos/ml) para reticular la proteína scCD95L. Sólo el sobrenadante celular que contenía scCD95L-St reticulada aumentó la actividad de caspasa en células Jurkat, lo que indica que scCD95L sola no forma agregados de orden superior capaces de ser pro-apoptóticos.

1.2 Casete de genes que codifica el polipéptido

El gen sintético se puede optimizar a la vista de su uso de codón para la expresión en células huésped adecuadas,

p. ej., células de insectos o células de mamífero. Una secuencia de ácido nucleico preferida se muestra en la SEQ ID NO: 30.

1.3 Estrategia de clonación

El gen sintético puede clonarse, p. ej., por medio de una hidrólisis con enzimas de restricción en un vector de expresión adecuado.

2. Fabricación de una proteína de fusión TRAIL de una sola cadena (sc TRAIL wt)

2.1 Estructura del polipéptido

A) Aminoácidos Met1 -Gly20

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Péptido señal Ig-kappa, asumida escisión de peptidasa señal después del aminoácido Gly20

B) Aminoácidos Gln21-Gly182 Primer dominio soluble de citoquinas del ligando TRAIL humano (TRAIL; aminoácidos 120-281 de SEQ ID NO: 10).

5 C) Aminoácidos Gly183-Ser190 Primer elemento enlazador peptídico, en donde los dos aminoácidos designados X son ambos S, o uno es S y el otro es N.

D) Aminoácidos Arg191-Gly351 Segundo dominio soluble de citoquina del ligando TRAIL humano (TRAIL; aminoácidos 121-281 de SEQ ID 10 NO: 10).

E) Aminoácidos Gly352-Ser359 Segundo elemento enlazador peptídico, en donde los dos aminoácidos designados X son ambos S, o uno es S y el otro es N.

F) Aminoácidos Arg360-Lys538 15 Tercer dominio soluble de citoquina del ligando TRAIL humano (TRAIL; aminoácidos 121-Gly281 de SEQ ID NO: 10).

G) Aminoácido Gly521-Lys538 Elemento enlazador peptídico con un motivo Strep-tag Il.

La secuencia de aminoácidos de sc TRAIL wt se muestra en SEQ ID NO: 28.

20 Los enlazadores indicados pueden ser reemplazados por otros enlazadores preferidos, p. ej., como se muestra en SEQ ID NOs: 21,26. Cabe señalar que los primero y segundo enlazadores peptídicos no necesitan ser idénticos.

La secuencia del péptido señal (A) puede ser reemplazada por cualquier otra adecuada, p. ej., la secuencia del péptido señal de mamífero. El motivo Strep-tag Il (G) puede ser reemplazado por otros motivos, si se desea, o puede ser eliminado.

25 Se recogieron sobrenadantes de cultivo celular de células HEK293, que expresan transitoriamente proteínas TRAIL de una sola cadena con diferentes enlazadores (derivados de SEQ ID 28, en total nueve combinaciones de enlazadores diferentes) y se utilizaron para estimular las células Jurkat a diferentes diluciones (a modo de ejemplo, una dilución de 1:8 se muestra en la Figura 25). Los sobrenadantes se utilizaron ya sea directamente sin más modificaciones o se añadió un anticuerpo anti-Streptag (2 microgramos/ml de Strep MAB Immo) para reticular las

30 proteínas scTRAILwt. Las células Jurkat se incubaron con sobrenadante de cultivo celular HEK293 durante tres horas a 37°, se lisaron y se analizaron en cuanto a la actividad de caspasa. Sobrenadante de cultivo celular que contenía proteínas scTRAILwt reticuladas indujo una actividad incrementada de caspasa en células Jurkat (resultados que se muestran en la parte derecha del gráfico), lo que indica que las proteínas scTRAILwt solas forman sólo una baja cantidad de agregados de orden superior capaces de ser pro-apoptóticos.

35 2.2 Casete de genes que codifica el polipéptido

p. ej., células de insectos o células de mamífero. Una secuencia de ácido nucleico preferida se muestra en la SEQ ID NO: 31.

3. Fabricación de una proteína de fusión TRAIL mutada de una sola cadena (sc TRAIL (específica para R2))

40 En lo que sigue se muestra la estructura del polipéptido TRAIL de cadena sencilla que comprende una mutación para la unión selectiva al receptor R2 de TRAIL.

3.1 Estructura del polipéptido

A) Aminoácidos Met1 –Ser29 Péptido señal Ig-kappa, asumida escisión de peptidasa señal después del aminoácido Gly20 y el enlazador 45 peptídico

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B) Aminoácidos Arg29-Gly190 Primer dominio soluble de citoquinas del ligando TRAIL humano (TRAIL; aminoácidos 121-281 de SEQ ID NO: 10, incluidas las mutaciones Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L y D267Q).

C) Aminoácidos Gly191-Ser198 5 Primer elemento enlazador peptídico, en donde los dos aminoácidos designados X son como se indica en el Ejemplo 2.

D) Aminoácidos Arg199-Gly359 Segundo dominio soluble de citoquina del ligando TRAIL humano (TRAIL; aminoácidos 121-281 de SEQ ID NO: 10, incluidas las mutaciones según se indica en B).

10 E) Aminoácidos Gly360-Ser367 Segundo elemento enlazador peptídico, en donde los dos aminoácidos designados X son como se indica en el Ejemplo 2.

F) Aminoácidos Arg368-Gly528 Tercer dominio soluble de citoquina del ligando TRAIL humano (TRAIL; aminoácidos 121-Gly281 de SEQ ID 15 NO: 10, incluidas las mutaciones según se indica en B).

G) Aminoácido Gly529-Lys546 Enlazador peptídico con un motivo Strep-tag Il.

La secuencia de aminoácidos de sc TRAIL (específica para R2)se muestra en SEQ ID NO: 29.

Los enlazadores indicados pueden ser reemplazados por otros enlazadores preferidos, p. ej., como se muestra en 20 SEQ ID NOs: 21-26. Cabe señalar que los primero y segundo enlazadores peptídicos no necesitan ser idénticos.

La secuencia del péptido señal (A) puede ser reemplazada por cualquier otra adecuada, p. ej., la secuencia del péptido señal de mamífero. El motivo Strep-tag Il (G) puede ser reemplazado por otros motivos, si se desea, o puede ser suprimido.

3.2 Casete de genes que codifica el polipéptido

25 El gen sintético se puede optimizar a la vista de su uso de codón para la expresión en células huésped adecuadas,

p. ej., células de insectos o células de mamífero. Una secuencia de ácido nucleico preferida se muestra en la SEQ ID NO: 32.

4. Expresión y purificación

a) Clonación, expresión y purificación de polipéptidos de fusión

30 Células HEK293T cultivadas en DMEM + GlutaMAX (Gibco) suplementado con FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina fueron transfectadas transitoriamente con un plásmido que contenía una casete de expresión para un polipéptido de fusión. En aquellos casos, en los que es necesaria una pluralidad de cadenas de polipéptidos para lograr el producto final, p. ej., para las proteínas de fusión Fab-scTNF-SF (Figura 9A), las casetes de expresión se combinaron ya sea en un plásmido o se dispusieron en diferentes plásmidos durante la

35 transfección. Sobrenadante de cultivo celular que contiene el polipéptido de fusión recombinante se recogió tres días después de la transfección y se clarificó mediante centrifugación a 300 x g, seguido por filtración a través de un filtro estéril de 0,22 µm. Para la purificación de afinidad Streptactin Sepharose se empaquetó en una columna (lecho de gel 1 ml), se equilibró con 15 ml de tampón W (Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0) o PBS pH 7,4 y el sobrenadante de cultivo celular se aplicó a la columna con un caudal de 4 ml/min. Subsiguientemente, la columna se

40 lavó con 15 ml de tampón W y el polipéptido unido se eluyó paso a paso mediante adición de 7 x 1 ml de tampón E (Tris HCl 100 mM, NaCl 150 mM, destiobiotina 2,5 mM, pH 8,0). Alternativamente, para esta etapa puede utilizarse PBS pH 7,4 que contiene destiobiotina 2,5 mM. Se cuantificó la cantidad de proteína de las fracciones de material eluido y las fracciones pico se concentraron mediante ultrafiltración y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

45 La SEC se realizó en una columna Superdex 200 utilizando un sistema de cromatografía Akta (GE-Healthcare). La columna se equilibró con solución salina tamponada con fosfato y el polipéptido concentrado, purificado con

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streptactina se cargó en la columna de la SEC a un caudal de 0,5 ml/min. El perfil de elución del polipéptido se controló mediante absorbancia a 280 nm.

Para la determinación del peso molecular aparente del polipéptido de fusión purificado bajo condiciones nativas, una columna Superdex 200 fue cargada con proteínas estándares de peso molecular conocido. Basado en el volumen de elución de las proteínas estándares se representó gráficamente una curva de calibración estándar y se determinó el peso molecular aparente del polipéptido de fusión purificado.

5. Ensayo de la apoptosis

Se utilizó un ensayo celular con una línea de células T Jurkat A3 permanente para determinar la actividad inductora de la apoptosis de diferentes construcciones de ligando CD95 (CD95L) y construcciones de polipéptidos de fusión TRAIL. Células Jurkat se cultivaron en matraces con medio RPMI 1640 + GlutaMAX (Gibco) suplementado con FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Antes del ensayo, se sembraron 100.000 células por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos. La adición de diferentes concentraciones de péptidos de fusión a los pocillos fue seguida por una incubación durante 3 horas a 37°C. Las células se lisaron mediante la adición de tampón de lisis (HEPES 250 mM, MgCl2 50 mM, EGTA 10 mM, Triton-X-100 al 5%, DTT 100 mM, AEBSF 10 mM, pH 7,5) y las placas se pusieron en hielo durante 30 minutos a 2 horas. La apoptosis es paralela a un aumento de la actividad de caspasas, p. ej., Caspasa-3. Por lo tanto, se utilizó la escisión del sustrato de caspasa específico Ac-DEVD-AFC (Biomol) para determinar la extensión de la apoptosis. De hecho, la actividad de caspasa se correlaciona con el porcentaje de células apoptóticas determinado morfológicamente después de la tinción de las células con yoduro de propidio y Hoechst-33342. Para el ensayo de la actividad de caspasa, 20 µl de lisado celular se transfirieron a una placa de microtitulación de 96 pocillos de color negro. Después de la adición de 80 µl de tampón que contiene HEPES 50 mM, 1% de sacarosa, CHAPS al 0,1%, Ac-DEVD-AFC 50 mM y DTT 25 mM, pH 7,5, la placa se transfirió a un lector de placas de microtitulación Tecan Infinite 500 y se vigiló el aumento en la intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación 400 nm, longitud de onda de emisión 505 nm).

5.1 Ensayo de la muerte de la célula

Para la determinación de la muerte celular en células de fibrosarcoma HT1080 15.000 células se sembraron en placas de 96 pocillos durante la noche en medio RPM1 1640-+ GlutaMAX (Gibco) suplementado con FBS al 10% (Biochrom). Las células se co-incubaron con cicloheximida (Sigma) a una concentración final de 2,5 g/ml. La muerte de la célula se cuantificó mediante tinción con tampón KV (0,5% de cristal violeta, 20% de metanol). Después de la tinción, los pocillos se lavaron con agua y se secaron al aire. El colorante se eluyó con metanol y la densidad óptica a 595 nm se midió con un lector de ELISA.

6. Ensayo de Estabilidad/Agregación

6.1. Principio del análisis de agregación (Definición de proteína soluble)

El contenido de monómeros (conjunto trimérico definido de los módulos de unión al receptor de TNF-SF) y agregados se determina mediante SEC analítica según se describe en el Ejemplo 4. Para este propósito particular, el análisis se realiza en tampones que contienen concentraciones salinas fisiológicas a pH fisiológico (p. ej., NaCl al 0,9%, pH 7,4; PBS pH 7,4). Un análisis típico de agregación se realiza sobre una columna Superdex200 (GE Healthcare). Esta columna separa proteínas en el intervalo entre 10 y 800 kDa.

Para la determinación del peso molecular aparente de polipéptido de fusión purificado bajo condiciones nativas, una columna Superdex 200 se carga con proteínas estándares de peso molecular conocido. Basado en el volumen de elución de las proteínas estándares se traza una curva de calibración y se calcula el peso molecular aparente del polipéptido de fusión purificado basándose en el volumen de elución.

Análisis SEC de proteínas solubles, no agregadas – p. ej., TNF-SF trimérica, muestra típicamente un pico de proteína única distinta a un volumen de elución definido. Este volumen de elución corresponde al peso molecular aparente nativo de la proteína particular y obedece aproximadamente al peso molecular teórico calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos primaria.

Si se produce la agregación de proteínas, el análisis SEC muestra picos de proteínas adicionales con volúmenes de retención inferiores. Para miembros de la familia TNF-SF la agregación de proteínas solubles se produce de una manera característica. Las proteínas tienden a formar oligómeros de los "trímeros", formando nonámeros (3 x 3) y 27meros (3 x 9). Estos oligómeros sirven como semillas de agregación y un alto contenido de oligómeros conduce en potencia a la agregación de la proteína. Oligómeros de gran peso molecular y los agregados eluyen en el volumen vacío de la columna Superdex200 y no pueden ser analizados mediante SEC con respecto a su peso

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molecular nativo. En la Figura 17 se muestran ejemplos para el análisis SEC de un trimérico soluble definido y un preparado oligomerizado/agregado de proteínas de TNF-SF.

Debido a la inducción de la agregación (completa), preparados purificados de proteínas de fusión de TNF-SF deberían contener preferiblemente sólo proteínas triméricas definidas y sólo una muy baja cantidad de proteína oligomerizada.

El grado de agregación/oligomerización de un preparado de proteína TNF-SF particular se determina en base al análisis SEC mediante el cálculo de las áreas de los picos del diagrama de OD280 para el trimérico definido y la fracción de oligómero/agregado, respectivamente. Basado en el área del pico total el porcentaje de proteína trimérica definida se calcula como sigue:

(% de contenido en trímero = [Trímero del área pico] / [Área total de pico] x 100)

La definición de la proteína soluble, tal como se utiliza en este texto, describe un preparado de proteína de la proteína TNF-SF purificada en un tampón de concentraciones salinas fisiológicas a pH fisiológico que contiene un contenido en proteína soluble definido (conjunto trimérico de dominios de TNF-SF) de > 90 % dentro de un intervalo de concentraciones de proteínas típico de 0,2 a 10,0 mg/ml.

6.2 Análisis de agregación mediante SEC de variantes sc-TRAIL purificadas

Tres variantes sc-TRAIL diferentes fueron transfectadas y purificadas por afinidad según se describe. Las proteínas purificadas se analizaron subsiguientemente en cuanto a su contenido de proteína soluble definida utilizando el análisis SEC según se describe en 6.1. En el caso particular de proteínas de fusión de cadena sencilla un trímero describe un conjunto trimérico de tres dominios de TNF-SF codificados por una cadena polipeptídica sencilla. (Proteínas de TNF-SF formalmente de cadena sencilla son monómeros, ya que los conjuntos de cadena sencilla sólo forman interacciones intramoleculares [todos los dominios de proteínas son codificados por una sola cadena polipeptídica] y no forman interacciones intermoleculares entre cadenas de polipéptidos individuales distintos).

Las proteínas analizadas mediante SEC eran:

1.) Fab-sc-TRAIL (específica para R2) -SNSN (Figura 19):

Proteína de fusión que comprende un dominio Fab fusionado N-terminal a una proteína de fusión de

cadena sencilla de TRAIL específica para la interacción con el receptor 2 de TRAIL, glicosilada

2.) Fab-sc-TRAIL (específica para R2) -SSSS (Figura 18):

cadena sencilla de TRAIL específica para la interacción con el receptor 2 de TRAIL, no glicosilada

3.) Fab-sc-TRAIL-wt-SNSN (Figura 20):

Proteína de fusión que comprende un dominio Fab fusionado N-terminal a una cadena sencilla de

TRAIL, glicosilada

El análisis SEC para las tres construcciones Fab-sc purificadas de TRAIL reveló un solo pico de proteína para todas las proteínas que indican fracciones definidas solubles de proteínas (> 95% de trímeros). El MW aparente calculado para las proteínas (basado en la calibración de la columna) indica fuertemente una asociación trimérica de los dominios de TNF-SF para las proteínas purificadas. Ninguna de las proteínas analizadas mostró indicios de agregación (Figuras 18, 19, 20).

Comparando el "Fab-sc-TRAIL-R2-SNSN" potencialmente glicosilado con el "Fab-sc-TRAIL-R2-SSSS" no glicosilado indica una diferencia significativa del MW nativo evidente que se debe a la glicosilación de Fab-sc-TRAIL -SNSN (específico para R2).

Se conoce la expresión de los miembros sc-TNF-SF como proteína de fusión con un fragmento fv de anticuerpo para facilitar la agregación de la proteína. El principio de construcción de las variantes de Fab-sc-TRAIL no reveló agregación alguna de las variantes TRAIL expresadas y, por lo tanto, es beneficioso con respecto a la solubilidad de la proteína.

6.3 Glicosilación diferencial de variantes de sc-TRAIL-enlazador

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La glicosilación de proteínas puede ser beneficiosa para construcciones de sc-TNF-SF recombinantes con respecto a la inmunogenicidad y la estabilidad potenciales. Con el fin de obtener la glicosilación de la construcción sc-TRAIL, se diseñaron secuencias de enlazador específicas que contenían putativos sitios glicosilados enlazados a N en las posiciones definidas (véase la Figura 21-A). La expresión recombinante y el subsiguiente análisis de transferencia Western revelaron que la posición respectiva de la asparagina (N) dentro de la secuencia de enlazador es importante para la subsiguiente glicosilación de la proteína. Sorprendentemente, se identificó que la posición de enlazador preferencial de la asparagina glicosilada estaba en la posición "2" según se describe en la Figura 21-A, (G SGSG N G S). Si la asparagina se localiza en otras posiciones (p. ej., la posición "1" [G S G N G S G S] véase la Figura 21-A), se abole la glicosilación de la o las asparaginas respectivas. Este aspecto podría ser confirmado por análisis de transferencia Western de las diferentes variantes sc-TRAIL. Si las dos asparaginas de enlazador 1 y enlazador 2 se localizaron en la posición "2", se podía observar una glicosilación significativa dependiente del desplazamiento del MW para la respectiva variante sc-TRAIL (Figura 22). Un desplazamiento del MW de la variante de enlazador sc-TRAIL glicosilada también se pudo confirmar mediante el cálculo del MW aparente después del análisis SEC (Figura 18, 19). El Fab-sc-TRAIL(específico para R2)SSSS no glicosilada tiene un MW claramente inferior (68 kDa) en comparación con Fab-sc-TRAIL(específico para R2)SNSN (87 kDa).

Basado en este análisis los autores de la invención reivindican la glicosilación diferencial de las construcciones sc-TRAIL mediante la modificación de la posición de los asparaginas dentro de la o las secuencias de enlazador. La glicosilación protege la secuencia de enlazador hacia la degradación proteolítica y podría estabilizar la proteína. Además, la glicosilación de la secuencia de enlazador potencialmente impide el reconocimiento de la secuencia de enlazador por parte del sistema inmune y reduce potencialmente la inmunogenicidad de la proteína. Por lo tanto, la glicosilación de la secuencia de enlazador es beneficiosa con respecto a la inmunogenicidad y la estabilidad proteolítica de las construcciones sc-TRAIL y tiene una influencia potencial sobre la semivida de la proteína. La glicosilación diferencial específica para el enlazador se puede utilizar para modificar la inmunogenicidad y la estabilidad de los miembros de TNF-SF recombinantes.

6.3. Expresión y análisis de un sc-TRAIL con secuencia de enlazador prolongada y residuos de tallo Nterminales (sc-TRAIL-(95-281)-long)

En el documento WO/2005/103077 se describe un polipéptido TRAIL-fusión de cadena sencilla, denominado en esta memoria sc-TRAIL-(95-281)-long, en el que cada uno de los módulos TRAIL comprenden los residuos 95 a 281 de SEQ ID NO: 10. Los módulos TRAIL están enlazados mediante el enlazador Glicina Serina que comprende al menos 12 aminoácidos (GGGSGGGSGGGS). En comparación con los módulos de TRAIL de la presente invención (que comprende los residuos 121 -281 de SEQ ID NO: 10), 25 aminoácidos adicionales, incluyendo la región del tallo, están presentes en cada uno de los módulos de TRAIL adyacentes.

Con el fin de analizar la influencia de la secuencia de enlazador en construcciones-sc TRIAL, se analiza sc-TRAIL(95-281)-long. La expresión, purificación y subsiguiente análisis SEC revela que sc-TRAIL-(95-281)-long con el enlazador de 12 aa y la secuencia de tallo adicional se expresa y se secreta al sobrenadante de cultivo celular de células HEK293T. Sin embargo, el análisis SEC de la proteína purificada indica que sc-TRAIL-(95-281)-long muestra múltiples picos que comprenden una gran cantidad de proteína en una forma oligomerizada o agregada. La agregación de sc-TRAIL-(95-281)-long es un efecto directo de las secuencias de enlazador prolongadas en combinación con los residuos adicionales del tallo N-terminal. Los resultados indican que el enlazador más largo utilizado en esta construcción conduce a propiedades de agregación incrementadas de la construcción.

7. Construcción de polipéptidos de fusión de cadena sencilla que comprenden uno o más dominios adicionales

7.1. Ensamblaje de fragmentos solubles de TNF-SF y de anticuerpos conocidos de la técnica

Se conoce de la técnica que dominios de citoquinas de TNF-SF solubles pueden fusionarse a fragmentos de anticuerpos con el fin de obtener una trimerización y/o dimerización de trímeros. Se han construido proteínas de fusión scFv-TNF-SF de cadena sencilla que consisten en un anticuerpo de cadena única y que comprende un dominio soluble de TNF-RBD y la región del tallo. Los trímeros correspondientes consisten en tres anticuerpos de cadena sencilla y tres dominios solubles (Fig. 7).

Además, se han construido proteínas de fusión Fc-TNF-SF, en donde cada una de las proteínas de fusión comprende un dominio Fc intramolecular N-terminal y un dominio soluble C-terminal (Figura 8). La dimerización de los dominios solubles se logra mediante el ensamblaje de dos dominios Fc a través de puentes disulfuro. Subsiguientemente se obtienen trímeros mediante una combinación de dos dominios solubles de una proteína de fusión Fc-TNF-SF y un dominio soluble de otra proteína de fusión Fc-TNF-SF. Como se puede deducir a partir de la Fig. 4, la dimerización de trímeros también está mediada por la fusión del Fc-TNF-SF N-terminal. En conclusión, por

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cada uno de los dímeros del trímero están presentes tres fragmentos de anticuerpo Fc. Sin embargo, tales proteínas de fusión son propensas a formar agregados de peso molecular más alto, lo que representa una desventaja importante.

7.2 Las proteínas de fusión de la invención que comprenden uno o más dominios adicionales

Las proteínas de fusión de la invención que comprenden uno o más dominios adicionales se pueden construir de varias maneras. En lo que sigue, la construcción de proteínas de fusión con dominios adicionales se ilustra con el anticuerpo pertuzumab dirigido contra el antígeno de superficie celular ErbB2.

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada se muestra en la SEQ ID NO: 33:

imagen1

10 La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera se muestra en SEQ ID NO: 34

imagen2

7.2.1

En una realización, el polipéptido de fusión de la invención comprende, además, un fragmento de anticuerpo Fab N

o C-terminal (Fig. 9A).

15 La fusión de un fragmento de anticuerpo Fab al extremo N del polipéptido de fusión scTNF-SF puede realizarse mediante las dos estrategias siguientes:

(i) La secuencia de la cadena pesada se extiende por otros aminoácidos de la región bisagra de IgG1 y se fusiona a la proteína de fusión de TNF-SF de cadena sencilla.

La región bisagra de IgGI comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35:

20 ....KSC1DKTHTC2PPC3PAPE ...

En una realización preferida, el dominio Fab se elige de modo que la cisteína C-terminal de la cadena pesada (C1 de la región bisagra) termina en el dominio CH1. Se requiere este cisteína para formar un enlace disulfuro a la cadena ligera.

El subsiguiente enlazador comprende porciones de la región bisagra de IgG (p. ej., DKTHT o DKT), sin embargo sin

25 cisteínas adicionales de la región bisagra. Alternativamente, se utiliza un enlazador de glicina/serina. Debido a la ausencia de cisteínas adicionales, se obtiene una proteína de fusión monomérica que comprende dos cadenas de polipéptidos. El enlazador tiene preferiblemente una longitud de 3-15 aminoácidos. Más preferiblemente, el enlazador se selecciona del enlazador 1-7 según se muestra a continuación.

1. DKTHTG(S)a(G)b; (a = 0-5; b = 0 ó 1)

30 2. DKTHTGS(S)a(GS)BG(S)c (a, b = 0,1-6; c = 0 ó 1)

3.: DKTG(S)a(G)b; (a = 0-5; b = 0 ó 1)

4.: DKTG(S)a(GS)BG(S)c (a, b = 0,1-6; c = 0 ó 1)

5.: SSG(S)a(GS)BG(S) c (a, b = 0,1 -6; c = 0 ó 1)

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6.: SS(GGGS)aG(S)b (a = 0, 4.1, b = 0 ó 1)

7.: GSPGSSSSSS(G)a (a = 0 o

Secuencias de aminoácidos preferidas con el módulo de cadena pesada situado N-terminal al módulo scTNF-SF se muestra en la SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 49. Para fines de producción, estas cadenas polipeptídicas se coexpresan con el polipéptido de cadena ligera de Fab (SEQ ID NO: 40) para finalmente lograr los polipéptidos de fusión Fab-scTRAIL, (ii) la secuencia de la cadena ligera está fusionada a la proteína de fusión de TNF-SF de cadena sencilla.

La región constante de la cadena ligera (p. ej., SEQ ID NO: 34) termina con un residuo cisteína C-terminal. Este residuo puede ser puenteado de forma covalente con la cisteína C1 bisagra de la cadena pesada. Preferiblemente, los enlazadores 1-7 como se muestra a continuación se utilizan para la conexión entre la secuencia de la cadena ligera y la proteína de fusión TNF-SF. Se prefieren los enlazadores 5-7 (véase arriba).

Preferiblemente, el último aminoácido en el enlazador adyacente al módulo de citoquina es Gly o Ser. En lo siguiente, se muestran secuencias de enlazadores preferidas:

Además, el enlazador puede comprender motivos de N-glicosilación (NXS/T, en donde X puede ser cualquier aminoácido).

Una realización de las secuencias de aminoácidos con el módulo de cadena ligera situado N-terminal al módulo scTNF-SF se muestra en la SEQ ID NO: 51.

En el caso de las proteínas de fusión Fab-scTNF-SF, es necesaria la co-expresión de dos cadenas de polipéptidos para lograr el correcto ensamblaje del módulo de Fab además del módulo scTNF-SF (véase la figura 9A). Los módulos de cadena pesada y ligera de Pertuzumab (SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34) estaban equipados con un péptido señal, retro-traducido y los genes sintéticos resultantes (SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42) estaban genéticamente fusionados aguas arriba de los módulos de genes específicos para scTRAILwt o scTRAILR2 (SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32). Ejemplos para las casetes de genes resultantes se muestran en SEQ ID NO: 46, 48 y 50. Después de la subclonación en vectores de expresión apropiados, se utilizó una selección de los plásmidos resultantes para la expresión de proteína transitoria en células HEK293T. Los plásmidos de expresión TRAIL de cadena pesada o TRAIL de cadena ligera fueron transfectados ya sea solos o en combinación con los vectores codificadores de la cadena ligera o de la cadena pesada necesarios del fragmento Fab (FIGURA 26). Sorprendentemente, la combinación de módulos dentro de las proteínas de fusión influyó en la estabilidad relativa de la proteína scTRAIL durante la expresión basada en la secreción. Si el módulo de la cadena ligera del dominio Fab está fusionado N-terminal al dominio scTRAIL (ejemplificado en la SEQ ID NO: 51), el producto de expresión es estable por sí mismo y es secretado, cuando se expresa por separado (pistas 1-4, figura 26). Se puede por lo tanto esperar que, cuando un polipéptido de fusión de este tipo se coexpresa con un módulo de cadena pesada, se formarán dos especies de proteínas principales durante un proceso de producción potencial: (1) la proteína de fusión Fab-scTRAIL que consiste en dos cadenas polipeptídicas y (2) como contaminación una proteína de fusión scTRAIL de cadena ligera sin un dominio Fab funcional. Por lo tanto, fusionando el módulo de la cadena pesada N-terminal al módulo scTNF-SF para la expresión se prefiere evitar esta desventaja técnica.

Un análisis funcional de proteínas de fusión scTRAIL recombinantes que comprenden Fab de la invención con el módulo de cadena pesada fusionado en posición N-terminal al módulo scTRAIL (Fab-scTRAILR2-SNSN o Fab-scTRAILwt-SNSN) se muestra en la figura 28. Como etapa de purificación final se empleó la cromatografía de exclusión por tamaño tal como se ilustra en las figuras 19 y 20.

Puede lograrse fácilmente una bioactividad superior en comparación con ligandos homotriméricos solubles mediante el uso de ligando de la superfamilia de TNF artificialmente reticulado o unido a la membrana. Por lo tanto, el enriquecimiento local de construcciones TRAIL de cadena sencilla (scTRAIL) en células que expresan el antígeno Her2 a través del fragmento Fab selectivo para Her2 ("Pertuzumab") fusionado a estas proteínas scTRAIL debería incrementar su bioactividad citotóxica. Del mismo modo, el bloqueo de los sitios de unión Her2 en las células mediante pre-incubación con el fragmento Fab específico para Her2 (Pertuzumab-Fab) sólo debería disminuir la bioactividad citotóxica de proteínas de fusión Fab-scTRAIL. Tal como se muestra en la Figura 28A, construcciones scTRAIL inducen la muerte de células HT1080, ya que la viabilidad disminuye con el aumento de la concentración de proteína. Por consiguiente, la pre-incubación de células HT1080 con el fragmento Fab (Pertuzumab-Fab), seguido por la co-incubación con las construcciones Fab-scTRAIL (Fab-scTRAILR2-SNSN o Fab-scTRAILwt-SNSN) durante la noche, redujo la actividad citotóxica de las construcciones Fab-scTRAIL (figura 28B), mientras que el Fab solamente indujo ninguna muerte celular.

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Un efecto técnico incrementado puede lograrse mediante el uso de ligandos artificialmente reticulados o unidos a una membrana de la superfamilia de TNF, lo cual resulta especialmente en una bioactividad superior en comparación con un ligando homotrimérico soluble. Por lo tanto el enriquecimiento local de ligandos o ligandos de cadena sencilla tal como se ilustra por TRAIL de cadena sencilla (scTRAIL) en células o en células vecinas debería 5 aumentar la bioactividad de estas proteínas de fusión. El enriquecimiento local (o fijación como objetivo) de estos ligandos de cadena sencilla puede ser inducido específicamente, por ejemplo mediante la fusión de los ligandos de cadena sencilla con secuencias de aminoácidos que se unen a cualquier antígeno presente en las células tal como, por ejemplo, células tumorales. Ejemplos de secuencias de unión a antígeno se pueden derivar de anticuerpos tales como fragmentos scFv o Fab. Ejemplos de antígenos expresados sobre células diana pueden ser receptores tales

10 como de la familia EGFR o cualquier otro antígeno al que se pueden generar un anticuerpo de unión. De especial interés en este contexto son los antígenos de superficie de células específicos para las células tumorales o cancerosas.

7.2.2

En otra realización, el polipéptido de fusión de la invención comprende, además, un fragmento de anticuerpo scFv N15 o C-terminal adicional (Fig. 9b).

En esta realización se pueden utilizar enlazadores 5-7 según se describe anteriormente. Además, los enlazadores pueden comprender motivos de N-glicosilación.

Un fragmento Fv-pertuzumab de cadena sencilla preferido para la fusión a la proteína de fusión de citoquina de cadena sencilla puede comprender aminoácidos GIu1-Ser119 de SEQ ID NO: 33 y Asp-Lys107 o Thr109 de SEQ ID 20 NO: 34. Los fragmentos VH y VL pueden estar conectados por un enlazador.

Una realización de un dominio scFv de pertuzumab se muestra en el siguiente SEQ ID NO: 36:

imagen3

Los aminoácidos 1 -20 (subrayado) constituyen un péptido señal secretor N-terminal.

7.2.3

25 En una realización adicional, el polipéptido de fusión de la invención comprende un fragmento de anticuerpo Fc N-o C-terminal adicional (Figs. 10 y 11).

Preferiblemente, el dominio del fragmento de anticuerpo Fc se deriva de una cadena pesada de inmunoglobulina G humana, en particular de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG1 humana. En una realización especialmente preferida, la secuencia de aminoácidos del dominio Fc se muestra en la SEQ ID NO: 37.

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Los aminoácidos Lys1-Glu16 definen la región bisagra.

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Para una fusión C-terminal (Fig. 11) el dominio Fc comprende preferiblemente el dominio constante completo (aminoácidos 17-230 de SEQ ID NO: 37) y una parte o la región bisagra completa, p. ej., la región bisagra completa

o la región de bisagra a partir del aminoácido Asp4. Enlazadores preferidos para la conexión de un fragmento de anticuerpo Fc C-terminal (p. ej., Fig. 11) se muestran

en lo que sigue: Enlazador 8 scCD95L/scTRAIL....GG(P/S)a(GS)b(G/S)cKSCDKTHTCPPCPAPE ... (a = 0 ó1, b = 0-8; c = 0-8) Enlazador 9 scCD95L/scTRAIL....GG(P/S)a(GSSGS)bGS(G/S)cDKTHTCPPCPAPE... (a = 0 ó1, b = 0-8; c = 0-8) Enlazador 10 scCD95L/scTRAIL....GG(P/S)a(S)b(GS)c(G/S)dDKTHTCPPCPAPE ... (a = 0 ó 1, b = 0-8; c = 0-8; d = 0-8)

Todos los enlazadores comienzan con GIyGIy, teniendo en cuenta, sin embargo, que el aminoácido C-terminal de TRAIL es una Gly. En la posición 3 del enlazador, alternativamente están presentes Pro o Ser. El enlazador 8 comprende la cisteína Cys1 de la cadena pesada.

Cabe señalar que los enlazadores 8-10 son también adecuados para la fusión C-terminal de otros polipéptidos, p.

ej., una proteína de fusión scTNF-SF adicional. En detalle, el módulo scTRAILwt (SEQ ID NO: 28), el módulo scTRAIL(específico para R2) (SEQ ID NO: 29) y el módulo scCD95L (SEQ ID NO: 27) se fusionaron en posición N-terminal al dominio Fc de IgGI humana, comenzando con Asp4 de SEQ ID NO: 37 que emplea cuatro elementos de enlazador como se muestra en la Tabla 2.

Fusión Fc: Secuencia de aminoácido del elemento enlazador

FC01: …(G)GSPGSSSSSSGSDKTH…

FC02: …(G)GSPGSSSSGSDKTH…

FC03: …(G)GSPGSSGSDKTH…

FC04: …(G)GSSDKTH….

Tabla 2: Secuencias que enlazan el dominio Fc de modo C-terminal al módulo de scTNF-SF. Está subrayado el ácido amino N-terminal del dominio CH2 de IgG1. La glicina N-terminal de la secuencia de enlace se muestra entre paréntesis. Para las proteínas TNF-SF con una glicina como el aminoácido C-terminal (p. ej., TRAIL), la glicina Nterminal de la secuencia de enlace pertenece formalmente al módulo de scTNF-SF.

Para la purificación y caracterización, una Strep-tag Il (secuencia de aminoácidos WSHPQFEK) se colocó en posición C-terminal con respecto al dominio Fc. Esta etiqueta de afinidad estaba enlazada al dominio CH3 por un elemento enlazador flexible (secuencia de aminoácidos SSSSSSA), en sustitución del residuo de lisina C-terminal de la secuencia CH3. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión scTNF-SF, así como para los módulos de proteínas descritos se retro-tradujeron y su uso de codones se optimizó para la expresión basada en células de mamífero. La síntesis de genes fue realizada por ENTELECHON GmbH (Regensburg, Alemania). Las casetes de expresión para proteínas de fusión mayores fueron ensambladas por procedimientos de clonación de ADN comunes que comienzan con módulos de ADN de tamaño adecuado y el patrón de enzima de restricción adecuado. A modo de ejemplo, la casete de gen resultante para la proteína de fusión TRAILwt FC01 de cadena sencilla (scTRAILwt-FC01) se muestra en SEQ ID NO: 44 y la secuencia de la proteína codificada se muestra en la SEQ ID NO: 43. Los casetes de genes que codifican las variantes de enlazador acortadas (Tabla 1) se generaron mediante estrategias de subclonación basadas en PCR, partiendo de SEQ ID NO: 44. Los casetes de expresión finales se liberaron de vectores de clonación intermedios y se subclonaron en pCDNA4-HisMax-cadena principal, utilizando sitios del plásmido únicos Hind-III, Not-I o Xba-I. Para el ensamblaje de las proteínas de fusiones Fab y Fc, se introdujo un sitio único SgS-I en la cadena principal del vector, reemplazando al sitio Not-l. Todas las casetes de expresión se verificaron rutinariamente mediante secuenciación de ADN. Las proteínas se expresaron transitoriamente en células HEK293T y los sobrenadantes de cultivo de células se vigilaron con respecto a su actividad pro-apoptótica. Tal como se muestra en la figura 27, las proteínas de fusión scTRAIL-Fc de la invención fueron capaces de inducir un aumento pronunciado en la actividad de caspasa, lo que confirma la potencia de la dimerización basada en Fc de

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dos módulos scTRAILwt. Se obtuvieron resultados similares para las proteínas de fusión Fc scTRAIL(específico paraR2) (datos no mostrados).

Si un fragmento de anticuerpo Fc se fusiona al extremo N de una proteína de fusión scTNF-SF (véase la Fig. 10), la secuencia de aminoácidos del módulo Fc es, preferiblemente, como se muestra en SEQ ID NO: 38:

imagen5

Los aminoácidos 1-20 (subrayados) constituyen un péptido señal secretor N-terminal.

Para conectar el módulo Fc a la proteína de fusión ScTNF-SF, preferiblemente se utilizan enlazadores Gly/Ser. Todos los enlazadores comienzan preferiblemente con una serina y terminan preferiblemente con glicina o serina. Secuencias de enlazadores preferidos 11-12 se muestran en lo que sigue:

11.: (S)a(GS)bG(S)c (a, b = 0,1-6; c = 0 ó 1)

12.: S(GGGS)aGb(S)c (a, b = 0,1-6; c = 0 ó 1)

7.3 Dimerización de las proteínas de fusión de cadena sencilla de la invención

7.3.1 Polipéptidos de fusión de cadena única que comprenden un dominio adicional

Las proteínas de fusión triméricas de la invención pueden además ser dimerizadas.

En una realización, la dimerización se obtendrá si el extremo C de una primera proteína de fusión está conectado directamente al extremo N de una segunda proteína de fusión a través de una estructura de enlazador como se define en esta memoria (Fig. 12).

En otra realización, una proteína de fusión de la invención que comprende un fragmento de anticuerpo Fab como un dominio adicional, puede ser conectada a través de un enlazador como se define en esta memoria directamente con una proteína de fusión de la invención o indirectamente a través de un fragmento de anticuerpo scFv fusionado a una proteína de fusión de la invención (Fig. 13). Con ello, se lleva a cabo la dimerización de las proteínas de fusión triméricas de la invención.

En otra realización, la dimerización de trímeros se puede obtener a través del ensamblaje de dos proteínas de fusión de la invención que comprende un fragmento de anticuerpo Fab como un dominio adicional (Fig. 14). En este caso, se forman puentes disulfuro intermoleculares.

Para la construcción de fragmentos Fab dimerizantes en posición N-terminal al dominio scTNF-SF (p. ej., Fig. 14), se utilizan preferiblemente los residuos cisteína naturales de la región bisagra de IgG (SEQ ID NO: 35).

Preferiblemente, la cisteína C-terminal de la secuencia de Fab corresponde al residuo C1 de la región bisagra, el cual forma un enlace disulfuro con la cadena ligera. La segunda cisteína C2 se puede utilizar para el enlace covalente de dos módulos de Fab. Un tercer residuo cisteína C3 puede estar abierto o estar enlazado con el C3 de la cadena vecina. Enlazadores preferidos entre la secuencia de la cadena pesada de Fab y el extremo N del dominio scTNF-SF son enlazadores 13-22 tal como se muestra a continuación.

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Además, los enlazadores pueden ser modificados mediante la incorporación de motivos de N-glicosilación según se describe anteriormente.

En una realización adicional, la dimerización de las proteínas de fusión de la invención que comprende un fragmento

5 de anticuerpo Fc como un dominio N-y/o C-terminal adicional, se puede obtener mediante la formación de puentes disulfuro intermoleculares entre dos de dichas proteínas de fusión. En ese caso, sólo un fragmento de anticuerpo Fc está presente por dímero de una proteína de fusión trimérica. De este modo, en contraposición con las proteínas de fusión con fragmento de anticuerpo Fc de la técnica, no es muy probable la formación de agregados de mayor peso molecular.

10 7.3.2 Polipéptidos de fusión de cadena sencilla que comprenden una pluralidad de dominios adicionales

El polipéptido de fusión de cadena sencilla puede comprender uno o más dominios adicionales, p. ej., un fragmento de anticuerpo adicional y/o un dominio de fijación como objetivo adicional y/o un dominio de citoquinas adicional.

Una proteína de fusión de la invención que comprende un fragmento de anticuerpo Fc como un dominio adicional puede ser conectada a una mayor fragmento de anticuerpo Fab o scFv a través del extremo N de un fragmento de

15 anticuerpo Fc fusionado en el extremo N (Fig. 15) o directamente a través de su extremo N-terminal a través de una estructura de enlazador adicional (Fig. 16), si el fragmento de anticuerpo Fc está conectado a la proteína de fusión de la invención a través de su extremo C.

Además de un fragmento de anticuerpo adicional o en lugar del fragmento de anticuerpo adicional, una citoquina adicional, preferiblemente una interleuquina, puede estar conectada a la proteína de fusión. De este modo, es

20 posible obtener una combinación de un scCD95L agonista y una molécula scCD95L antagonista o, alternativamente, combinaciones de scTRAIL (específico para R1) y scTRAIL (específico para R2).

Dichas proteínas de fusión son especialmente útiles para la inducción de la apoptosis.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende:

(i)

un primer dominio de citoquinas de la familia de TNF soluble,

(ii)

un primer enlazador peptídico,

(iii) un segundo dominio de citoquinas de la familia TNF soluble,

(iv)

un segundo enlazador peptídico, y

(v)

un tercer dominio de citoquinas de la familia TNF soluble,

en donde el polipéptido de fusión es sustancialmente no-agregante, en donde el dominio de citoquinas de la familia TNF soluble se selecciona de dominios TRAIL.
2.

El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el segundo y/o el tercer dominio de citoquinas de la familia TNF soluble, es un dominio acortado de modo N-terminal, que opcionalmente comprende mutaciones en las secuencias de aminoácidos.
3.

El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde al menos uno de los dominios de citoquinas de la familia TNF soluble, particularmente al menos uno de los dominios (iii) y (v) de citoquinas de la familia TNF soluble es un dominio soluble TRAIL, con una secuencia que comienza entre el aminoácido Gln120 y Val122 de TRAIL humano, y en donde Arg121 puede ser reemplazado por un aminoácido neutro, p. ej., Ser o Gly.
4.

El polipéptido de la reivindicación 3, en donde al menos uno de los dominios de citoquinas de la familia TNF soluble, particularmente al menos uno de los dominios (iii) y (v) de citoquinas de la familia TNF soluble es un dominio soluble TRAIL con una secuencia N-terminal seleccionada de

(a)

Arg121 – Val122 – Ala123 y

(b)

(Gly/Ser)121 – Val122 – Ala 123.
5.

El polipéptido de las reivindicaciones 3 ó 4, en donde el dominio soluble TRAIL termina con el aminoácido Gly281 de TRAIL humano y/o comprende opcionalmente una mutación en las posiciones R130, G160, H168, R170, H177, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, I266, D267 o D269 o en dos o más de dichas posiciones.
6.

El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el primer y segundo enlazadores peptídicos, independientemente, tienen una longitud de de 3-8 aminoácidos, particularmente una longitud de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos, y preferiblemente son enlazadores de glicina/serina que comprenden opcionalmente un residuo asparagina que puede estar glicosilado.
7.

El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que adicionalmente comprende un dominio de péptido señal N-terminal, que puede comprender un sitio de escisión de proteasa, y/o que adicionalmente comprende un elemento C-terminal que puede comprender y/o conectarse a un dominio de reconocimiento/purificación.
8.

El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que adicionalmente comprende en posición Nterminal y/o C-terminal un dominio adicional, p. ej., un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cadena sencilla tal como un dominio Fab o de fragmento Fc.
9.

Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 18, preferiblemente en enlace operativo con una secuencia del control de la expresión.
10.

Una célula o un organismo no humano, transformado o transfectado con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9, en donde la célula es, p. ej., una célula procariota o una célula eucariota, preferiblemente una célula de mamífero, o más preferiblemente una célula humana.
11.

Una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende, como agente activo, una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9, particularmente para uso en terapia, más particularmente para la profilaxis y/o tratamiento de trastornos causados por, asociados con y/o acompañados de la disfunción de citoquinas TNF, en particular trastornos proliferativos tales como tumores,

p. ej., tumores sólidos o linfáticos; enfermedades infecciosas; enfermedades inflamatorias; enfermedades

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metabólicas; trastornos autoinmunes, p. ej., enfermedades reumatoides y/o artríticas; enfermedades degenerativas,

p. ej., enfermedades neurodegenerativas tales como la esclerosis múltiple; enfermedades asociadas a la apoptosis o rechazos de trasplantes.

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