ES3036077T3 - Means and methods for treating bacterial infections - Google Patents

Means and methods for treating bacterial infections

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ES3036077T3
ES3036077T3 ES17708179T ES17708179T ES3036077T3 ES 3036077 T3 ES3036077 T3 ES 3036077T3 ES 17708179 T ES17708179 T ES 17708179T ES 17708179 T ES17708179 T ES 17708179T ES 3036077 T3 ES3036077 T3 ES 3036077T3
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bacterial
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amino acids
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Klaus Brandenburg
Lena Heinbockel
Norbert Reiling
De Tejada Guillermo Martinez
Tobias Schürholz
Karl Mauss
Günther Weindl
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Abstract

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende o consiste en una combinación de (a) dos o más péptidos, cada péptido que consiste en o comprende de 17 a 23 aminoácidos, donde los aminoácidos en las posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son los siguientes: (1) G, S o ausente; (2) C o ausente; (3) K o R; (4) K o R; (5) Y, W o F; (6) K o R; (7) K o R; (8) F, W o L; (9) K o R; (10) K o L o ausente; (11) W, L o F; (12) K o R; (13) F, Y o C; (14) K o R; (15) G o Q; (16) K o R; (17) F, L o W; (18) F o W; (19) F, L o W; (20) W o F; (21) C o ausente; (22) F o G o ausente; (23) G o ausente; o (b) uno o más péptidos, cada péptido consistente en o comprendiendo de 17 a 23 aminoácidos, donde los aminoácidos en las posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son los siguientes (1) G, S o ausente; (2) C o ausente; (3) K o R; (4) K o R; (5) Y, W o F; (6) K o R; (7) K o R; (8) F, W o L; (9) K o R; (10) K o L o ausente; (11) W, L o F; (12) K o R; (13) F, Y o C; (14) K o R; (15) G o Q; (16) K o R; (17) F, L o W; (18) F o W; (19) F, L o W; (20) W o F; (21) C o faltante; (22) F o G o faltante; (23) G o faltante, y uno o más antibióticos seleccionados entre antibióticos de moléculas orgánicas pequeñas como ceftriaxona, oxacilina, amoxicilina, amikacina, ciprofloxacina, eritromicina, imipenem y tetraciclina, y antibióticos peptídicos como daptomicina y vancomicina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Medios y métodos para tratar infecciones bacterianas
La presente invención se refiere a un péptido que consiste en o que comprende de 18 a 22 aminoácidos, en donde los aminoácidos en las posiciones 1 a 22, contados desde el extremo N, son los siguientes (1) G; (2) C o ausente; (3) K; (4) K; (5) Y o F; (6) R; (7) R; (8) F; (9) K o R; (10) W; (11) K; (12) F; (13) K o R; (14) G; (15) K; (16) F, L o W; (17) F o W; (18) F, L o W; (19) W o F; (20) C o ausente; (21) F o G o ausente; (22) G o ausente
para su uso en un método de
(a) tratamiento, mejoría o prevención de una infección bacteriana de la piel;
(b) tratamiento, mejoría o prevención de una infección bacteriana de una herida; y/o
(c) estimulación de la cicatrización de heridas.
En esta memoria descriptiva, se citan varios documentos, incluyendo solicitudes de patentes y manuales de fabricantes.
Las infecciones bacterianas graves constituyen una amenaza cada vez mayor en todo el mundo. Esta situación se ve agravada, por un lado, por la continua aparición de bacterias multirresistentes y, por otro, por la falta de nuevos agentes antibióticos adecuados. Debido al número cada vez mayor de pacientes de edad avanzada, el número de infecciones bacterianas difíciles de tratar aumenta a un ritmo aún más rápido. Por ejemplo, en Alemania se producen aproximadamente 150.000 infecciones por MRSA(Staphylococcus aureusresistente a meticilina, por sus siglas en inglés), de las que aproximadamente el 10 % son mortales debido a septicemia bacteriana (de acuerdo conDeutsche Sepsis-Gesellschaft, Infection,41, Supl. 1,Weimar Sepsis Update 2013).Los expertos calculan que aproximadamente 50.000 pacientes al año mueren en los hospitales alemanes debido a una infección por bacterias resistentes. A nivel mundial, se calcula que el número anual de casos mortales de septicemia es de entre 9 y 10 millones. Otras infecciones tales comoMycobacterium tuberculosissuponen un grave problema para los sistemas de salud pública debido a las largas terapias y los enormes costes. Sin embargo, aproximadamente un millón de pacientes mueren al año por esta infección. La continua aparición de cepas resistentes (tales como las cepas MDR y XDR) complica aún más la situación.
Por otro lado, también las infecciones bacterianas no sistémicas requieren tratamientos cada vez más prolongados. La morbilidad debida a estas infecciones bacterianas no sistémicas sigue aumentando. Los ejemplos incluyen erisipela, impétigo, foliculitis, forúnculo y ántrax. Estas últimas infecciones por lo general no son potencialmente mortales, sin embargo, tienen un impacto significativo en la calidad de vida. Otras infecciones bacterianas no sistémicas que suponen un reto especial para los sistemas de salud pública son las que provocan inflamación crónica. Los ejemplos incluyen la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En particular, se sabe queHaemophilus influenzaeestá implicado en la inflamación crónica que acompaña a la EPOC.
Los documentos EP 2271 356 y EP 2108372 describen péptidos antimicrobianos con actividad antibacteriana. Estos documentos no sugieren el excelente rendimiento de los péptidos en el tratamiento de la indicación médica específica que es la infección bacteriana de las heridas que cicatrizan mal. Por otra parte, estos documentos no sugieren en absoluto una sinergia con respecto a la actividad antibacteriana cuando se combinan dos o más péptidos o se combinan uno o más péptidos con antibióticos conocidos, normalmente antibióticos de moléculas orgánicas pequeñas y, en cambio, publican efectos aditivos.
Heinbockelet al. (Antimicrobial agents and chemotherapy57, 1480-1487 (2013)) describen un péptido antimicrobiano con alta capacidad de neutralización de endotoxinas. En manos de los autores de Heinbockelet al.,el antibiótico peptídico mencionado no presentó sinergia cuando se usó junto con antibióticos de moléculas orgánicas pequeñas, incluso a las concentraciones más altas utilizadas.
Se han descrito péptidos antimicrobianos para el tratamiento de infecciones de heridas y enfermedades cutáneas en, por ejemplo, Duplantier y van Hoek,Frontierin Immunology4, 1-14 (2013), Kenshi y Richard,Eur. J. Dermatol.18, 11 21 (2008) y Mangoniet al.(doi: 10.1111/exd.12929). Los péptidos descritos son fundamentalmente diferentes en términos de estructura de los agentes de la presente invención.
Gutsmannet al. (Antimicrobial agents and chemotherapy54, 9, 3817-3824 (2010) describen el diseño de péptidos anfífilos catiónicos (péptidos sintéticos antilipopolisacáridos (anti-LPS), SALP) basado en anti-LPS deLimuluspara neutralizar endotoxinas bacterianasin vitro(células mononucleares humanas) ein vivo(ratón). Los péptidos descritos son fundamentalmente diferentes en términos de su función como estrategia terapéutica para el tratamiento clínico de pacientes con choque séptico en comparación con los agentes de la presente invención. El tratamiento, la mejoría o la prevención de una infección bacteriana de la piel y/o la estimulación de la cicatrización de heridas no se describen en este documento.
Sunet al., (Mediators of Inflammation,(2015), ID de artículo: 167572), es un artículo de revisión científica que describe péptidos antimicrobianos (AMP, por sus siglas en inglés), en particular aquellos que neutralizan los lipopolisacáridos y eliminan las bacterias gramnegativas, así como la inhibición de la producción de citocinas inflamatorias para reducir la inflamación. Aunque la revisión describe la estimulación de la cicatrización de heridas mediante AMP, no se describe el tratamiento de la infección bacteriana de la piel ni el efecto sinérgico de un AMP con otro péptido o compuesto como se describe en la presente invención.
El documento WO 00/12528 describe péptidos catiónicos que tienen actividad antimicrobiana, que difieren en secuencia de aquellos descritos en la presente divulgación. Los péptidos de este documento se describen para tratar afecciones resultado de una infección bacteriana gramnegativa y su uso adicional para acelerar la cicatrización de heridas en un sujeto, sin embargo, no describen infecciones bacterianas de la piel. La naturaleza catiónica de los AMP no es una indicación general de una posible eficacia en la estimulación de la cicatrización de heridas, ya que también hay péptidos catiónicos que no presentan un efecto positivo en la estimulación de la cicatrización de heridas, por lo tanto, los AMP del documento WO 00/12528 A1 no sugieren la eficacia de los agentes de la presente invención en la cicatrización de heridas.
El problema técnico subyacente a la presente invención puede verse en la provisión de medios y métodos mejorados para el tratamiento de infecciones bacterianas, en particular las infecciones por bacterias multirresistentes, incluyendo las infecciones de heridas, las infecciones cutáneas y la septicemia.
Este problema técnico se ha resuelto mediante la materia objeto de las reivindicaciones adjuntas al presente documento.
La presente divulgación se refiere a un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (GKKYRRFRWKFKGKLFLFG). El péptido que consiste en esta secuencia también se conoce como péptido 19-4LF o Aspidasept II.
El término "péptido" describe generalmente cadenas moleculares lineales de aminoácidos que contienen hasta 30 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El número total de aminoácidos comprendidos en el péptido puede aumentar preferentemente hasta 30 si se añaden uno o más aminoácidos a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 en el extremo N y/o C. Dichos aminoácidos pueden contribuir o no a la funcionalidad del péptido. En otras palabras, el aminoácido o aminoácidos añadidos pueden o no conferir una función distinta al péptido, ya sea su actividad antimicrobiana u otra función.
El número de aminoácidos puede aumentar aún más si el péptido de la divulgación se fusiona con otro péptido o con un polipéptido. Se describen construcciones de fusión en el documento EP 2271 356. Los péptidos pueden formar oligómeros que consisten en al menos dos moléculas idénticas o diferentes. Las correspondientes estructuras de orden superior de dichos multímeros se denominan, correspondientemente, homo o heterodímeros, homo o heterotrímeros, etc.
Las abreviaturas de código de una letra utilizadas para identificar los aminoácidos a lo largo de la presente invención corresponden a las utilizadas habitualmente para los aminoácidos.
El péptido de la presente divulgación puede producirse de forma sintética.
La síntesis química de péptidos es bien conocida en la técnica. Habitualmente se usa la síntesis en fase sólida y existen diversos sintetizadores comerciales, por ejemplo, sintetizadores automatizados de Applied Biosystems Inc, Foster City, CA; Beckman; o MultiSyntech, Bochum, Alemania. También pueden usarse métodos de síntesis en fase de solución. Por ejemplo, la síntesis de péptidos puede realizarse usando N-a-9-fluoreniletoxicarbonil aminoácidos y una resina de tritilo precargada o una resina de poliestireno aminometilado con un enlazador de p-carboxitrilalcohol. Los acoplamientos pueden realizarse en dimetilformamida usando N-hidroxibenzotriazol y hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio. Los grupos protectores de cadena lateral habitualmente utilizados son terebutilo para N, Q, S y T; 2,2,4,6,7-pentametildihidroxibenzofurano-5-sulfonilo para R; y butiloxicarbonilo para K. Después de la síntesis, los péptidos se desprotegen y se escinden del soporte polimérico, por ejemplo, mediante tratamiento con, por ejemplo, ácido trifluoroacético al 92 %/trietilsilano al 4 %/H2O al 4 %. Los péptidos pueden precipitarse mediante la adición de tercbutiléter/pentano (8:2) y pueden purificarse mediante HPLC de fase inversa. Los péptidos se analizan habitualmente mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción láser asociada a la matriz. Mediante el uso de estas técnicas convencionales, los aminoácidos naturales también pueden sustituirse por aminoácidos no naturales, tales como los D-estereoisómeros, y también por aminoácidos con cadenas laterales que tengan longitudes o funcionalidades diferentes. Durante la síntesis química pueden introducirse en la molécula grupos funcionales para conjugar con moléculas pequeñas, restos marcadores, péptidos o proteínas. Además, durante el proceso de síntesis pueden añadirse moléculas pequeñas y restos marcadores. Preferentemente, la introducción de los grupos funcionales y la conjugación con otras moléculas afectan mínimamente a la estructura y la función del péptido en cuestión.
Los extremos N y C del péptido, así como cualquier aminoácido comprendido en el péptido aparte de los aminoácidos terminales, pueden derivatizarse usando métodos químicos de síntesis convencionales. Los péptidos de la divulgación pueden contener un grupo acilo, preferentemente acilo C1 a C4, tal como un grupo acetilo. Los métodos para acilar, y específicamente para acetilar el grupo amino libre en el extremo N son bien conocidos en la técnica. Para el extremo C, el grupo carboxilo puede modificarse mediante esterificación con alcoholes, preferentemente alcanos C1 a C4, o puede amidarse para formar -CONH2 o CONHR, siendo R preferentemente alquilo C1 a C4. Los métodos de esterificación y amidación son bien conocidos en la técnica.
El péptido de la divulgación también puede producirse de forma semisintética, por ejemplo, mediante una combinación de producción recombinante y sintética. En el caso de que los fragmentos del péptido se produzcan de forma sintética, la parte restante del péptido tendría que producirse de otro modo, por ejemplo, de forma recombinante, y después unirse al fragmento para formar el péptido de la divulgación. La producción recombinante se describe en el documento EP 2271 356.
La secuencia específica de la SEQ ID NO: 1 se incluye en el género de péptidos desvelados en el documento EP 2 271 356. Este documento, sin embargo, no individualiza esta secuencia específica, ni reconoce sus propiedades antibióticas especialmente destacadas.
La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende o que consiste en un péptido de acuerdo con la divulgación.
De acuerdo con la presente divulgación, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una composición para la administración a un paciente, preferentemente un paciente humano. La composición farmacéutica de la invención comprende preferentemente el péptido de la invención. Puede comprender, opcionalmente, otras moléculas capaces de alterar las características del péptido de la invención, por ejemplo, estabilizando, modulando y/o activando de este modo su función. La composición puede estar en forma sólida, líquida o gaseosa y puede estar, entre otras cosas, en forma de uno o más polvos, uno o más comprimidos, una o más soluciones o uno o más aerosoles. La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender, opcional y adicionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende una carga, diluyente, material encapsulante o adyuvante de formulación o excipiente de cualquier tipo, no tóxico sólido, semisólido o líquido. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, soluciones orgánicas, disolventes orgánicos incluyendo DMSO. Las composiciones que comprenden dichos vehículos pueden formularse mediante procedimientos convencionales bien conocidos. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada. La pauta posológica será determinada por el médico responsable y los factores clínicos. Como es bien sabido en la técnica médica, las dosis para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que ha de administrarse, el sexo, el momento y la vía de administración, el estado de salud general y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente.
La cantidad terapéuticamente eficaz para una situación dada puede determinarse fácilmente mediante experimentación rutinaria y está dentro de las habilidades y el criterio del médico o clínico habitual. Generalmente, la pauta como administración regular de la composición farmacéutica debe estar en el intervalo de 1 |jg a 5 g de unidades por día. Sin embargo, una dosificación más preferida podría estar en el intervalo de 0,01 mg a 100 mg, incluso más preferentemente de 0,01 mg a 50 mg y mucho más preferentemente de 0,01 mg a 10 mg al día.
La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía sistémica, por vía tópica o por vía parenteral. El término "parenteral", como se usa en el presente documento, se refiere a modos de administración que incluyen la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular. Las vías tópicas de administración incluyen la dérmica, nasal y por inhalación.
En una primera realización, la presente invención proporciona un péptido que consiste en o que comprende de 18 a 22 aminoácidos, en donde los aminoácidos en las posiciones 1 a 22, contados desde el extremo N, son los siguientes (1) G; (2) C o ausente; (3) K; (4) K; (5) Y o F; (6) R; (7) R; (8) F; (9) K o R; (10) W; (11) K; (12) F; (13) K o R; (14) G; (15) K; (16) F, L o W; (17) F o W; (18) F, L o W; (19) W o F; (20) C o ausente; (21) F o G o ausente; (22) G o ausente, para su uso en un método de (a) tratamiento, mejoría o prevención de una infección bacteriana de la piel; (b) tratamiento, mejoría o prevención de una infección bacteriana de una herida; y/o (c) estimulación de la cicatrización de heridas.
La definición del péptido de acuerdo con la primera realización abarca la secuencia peptídica específica de acuerdo con el primer aspecto. Se entiende que, si no se indica explícitamente lo contrario, los péptidos de acuerdo con cualquier aspecto de la presente invención son lineales y no cíclicos.
La presente invención pone por primera vez a disposición la clase de péptidos anterior para las indicaciones específicas de acuerdo con los puntos (a), (b) y (c), en concreto, infecciones bacterianas de la piel, infecciones bacterianas de heridas y, además, con el fin de estimular la cicatrización de heridas. Esto se basa en el sorprendente hallazgo de los presentes inventores de que los péptidos de acuerdo con el tercer aspecto, incluyendo el péptido de la SEQ ID NO: 2 (como se desvela adicionalmente a continuación), permiten combatir las infecciones bacterianas de una herida mal cerrada en la que fracasaron numerosos intentos de terapia antibiótica establecida. En consecuencia, la técnica anterior no sólo guarda silencio sobre la utilidad de los péptidos de acuerdo con el tercer aspecto para los fines de acuerdo con el tercer aspecto, sino que además dichos péptidos se caracterizan por unas propiedades excepcionales. En vista del hecho de que cualquier otro tratamiento antibiótico de la mencionada herida mal curada fracasó, se ha de concluir que los péptidos de acuerdo con el tercer aspecto son de hecho únicos en comparación con lo que ha estado disponible anteriormente en términos de opciones de tratamiento. A este respecto, se hace referencia en particular al Ejemplo 5.
Las siguientes realizaciones preferidas de la primera realización se refieren a péptidos preferidos, bacterias preferidas, indicaciones médicas preferidas y mecanismos subyacentes previstos.
En consecuencia, en una realización preferida, (a) dicho péptido (i) comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1; o (ii) comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 2 (GCKKYRRFRWKFKGKFWFWG); y/o (b) dicho uso es tópico.
El péptido que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 2 también se conoce como péptido 19-2,5 o Aspidasept®.
El término "tópico" tiene su significado establecido en la técnica y se refiere a la administración de un péptido de acuerdo con el tercer aspecto al área afectada por la infección bacteriana y/o el área en la que se desea estimular la cicatrización de heridas y/o en la proximidad de las áreas respectivas.
Las formulaciones adecuadas para aplicaciones tópicas incluyen pomadas, soluciones y pulverizaciones. Cada una de estas formulaciones puede comprender uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los compuestos y composiciones adecuados como vehículos, diluyentes y excipientes son bien conocidos por el experto, se han descrito anteriormente, y están disponibles en diversos fabricantes.
Además, las formulaciones para aplicación tópica pueden comprender un potenciador del suministro. En la técnica se conocen potenciadores del suministro; véase, por ejemplo, el documento WO 2011/064316. En una realización preferida adicional, dicha infección bacteriana de la piel o dicha infección bacteriana de una herida es una infección por bacterias grampositivas y/o gramnegativas, preferentemente por uno o más de estafilococos tales comoStaphylococcus aureusincluyendo MRSA, estreptococos p-hemolíticos incluyendo los estreptococos del grupo A, tales comoStreptococcus pyogenes,parvimonas, incluyendoParvimonas miera,pseudomonas tales comoPseudomonas aeruginosaincluyendo MDRPA, hemófilos, incluyendoHaemophilus influenza,clostridios, incluyendoClostridium difficile,enterococos, incluyendo el enterococo resistente a la vancomicina (VRE, por sus siglas en inglés), porfiromonas, incluyendoPorphyromonas gingivalis,propionibacterias, incluyendoPropionibacterium acne,y acinetobacterias, incluyendoAcinetobacter baumannii.
Los péptidos de la presente invención son útiles para combatir, en particular, cepas multirresistentes, independientemente del tipo de mecanismo de resistencia, véanse los Ejemplos 1, 2 y 4.
En una realización preferida adicional, dicha infección bacteriana de la piel o dicha infección bacteriana de una herida se selecciona de erisipela, impétigo, foliculitis, forúnculo, celulitis y ántrax y/o es una infección nosocomial.
Las indicaciones específicas mencionadas anteriormente son conocidas en la técnica. En resumen, la erisipela es una infección aguda de la piel que afecta predominantemente a la dermis superior y a los vasos linfáticos superficiales. Las bacterias típicas son estreptococos del grupo A, en particular,Streptococcus pyogenes.Los estreptococos no del grupo A también pueden ser agentes causales, pero también micobacterias de crecimiento rápido, tales comoM. fortuitum,grupochelonae-abscessus.Por ejemplo,Streptococcus agalactiaees un estreptococo no del grupo A. La celulitis, que también es una infección bacteriana, afecta a las capas internas de la piel, especialmente a la dermis y la grasa subcutánea. Una bacteria típica esStaphylococcus aureus.Especialmente preocupantes son las formas resistentes a antibióticos de la misma, tales comoStaphylococcus aureusresistente a meticilina (MRSA). La foliculitis es una infección de los folículos pilosos. Las especies bacterianas pertinentes incluyenStaphylococcus aureusyPseudomonas aeruginosa.El impétigo, en particular el impétigo contagioso, es una enfermedad altamente infecciosa de la piel que se produce predominantemente en niños y recién nacidos. Las bacterias típicas sonStaphylococcus aureusyStreptococcus pyogenes.
En cuanto al mecanismo, se prevé que dicho péptido (a) inactive las bacterias causantes de dicha infección; (b) se una y/o inactive las toxinas producidas por las bacterias causantes de dicha infección; y/o (c) actúe como antiinflamatorio.
La inactivación de las bacterias incluye una ralentización del crecimiento bacteriano, la inhibición del crecimiento bacteriano, la reducción de la viabilidad bacteriana, la eliminación parcial de las bacterias y la eliminación completa de las bacterias.
Los péptidos de acuerdo con la invención son péptidos antilipopolisacáridos sintéticos (SALP). Los lipopolisacáridos (LPS) forman parte de la membrana exterior de las bacterias gramnegativas. Actúan como antígenos. Se liberan productos de descomposición de los mismos al morir las bacterias. Estos productos de descomposición también se conocen como endotoxinas. Las endotoxinas contribuyen a los síntomas de una infección bacteriana. Los SALP de acuerdo con la invención se unen con alta afinidad a LPS y endotoxinas. Esto contribuye significativamente a los efectos beneficiosos de los péptidos. En otras palabras, el efecto de las endotoxinas es neutralizado por los péptidos de la invención.
En una segunda realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende o que consiste en una combinación de (a) dos o más péptidos, consistiendo en o comprendiendo cada péptido de 17 a 23 aminoácidos, en donde los aminoácidos en las posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son los siguientes (1) G, S o ausente; (2) C o ausente; (3) K o R; (4) K o R; (5) Y, W o F; (6) K o R; (7) K o R; (8) F, W o L; (9) K o R; (10) K 0 L o ausente; (11) W, L o F; (12) K o R; (13) F, Y o C; (14) K o R; (15) G o Q; (16) K o R; (17) F, L o W; (18) F o W; (19) F, L o W; (20) W o F; (21) C o ausente; (22) F o G o ausente; (23) G o ausente; o (b) uno o más péptidos, consistiendo en o comprendiendo cada péptido de 17 a 23 aminoácidos, en donde los aminoácidos en las posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son los siguientes (1) G, S o ausente; (2) C o ausente; (3) K o R; (4) K o R; (5) Y, W o F; (6) K o R; (7) K o R; (8) F, W o L; (9) K o R; (10) K o L o ausente; (11) W, L o F; (12) K o R; (13) F, Y o C; (14) K o R; (15) G o Q; (16) K o R; (17) F, L o W; (18) F o W; (19) F, L o W; (20) W o F; (21) C o ausente; (22) F o G o ausente; (23) G o ausente, y uno o más antibióticos seleccionados de antibióticos de molécula orgánica pequeña tales como ceftriaxona, oxacilina, amoxicilina, amikacina, ciprofloxacino, eritromicina, imipenem y tetraciclina, y antibióticos peptídicos tales como daptomicina y vancomicina.
Esta realización de la invención se refiere a combinaciones binarias, ternarias o de orden superior de péptidos o péptidos con antibióticos conocidos.
Cabe señalar que se conocen determinados péptidos que caen bajo los términos de la definición genérica proporcionada en la parte (a) de la segunda realización, así como los antibióticos citados en la segunda parte del punto (b) de la segunda realización. Lo que fue totalmente inesperado, sin embargo, es el rendimiento que proporcionan las combinaciones definidas de acuerdo con el cuarto aspecto. Los ejemplos adjuntos al presente documento contienen pruebas del buen rendimiento de una pluralidad de combinaciones que cumplen los términos de la segunda realización. La diferencia entre las combinaciones y los agentes individuales no sólo es asombrosa en sentido cuantitativo, como evidencian las medidas de efecto sinérgico establecidas en la técnica, sino también en términos cualitativos. Por ejemplo, mientras que los agentes individuales simplemente reducen el crecimiento bacteriano, las combinaciones de acuerdo con el cuarto aspecto son capaces de anular por completo el crecimiento bacteriano.
En una realización preferida de la segunda realización, dicha composición farmacéutica es un antibiótico de amplio espectro.
La actividad antibacteriana puede determinarse mediante cualquiera de las medidas establecidas en la técnica. Por ejemplo, para el crecimiento bacteriano y la suspensión, puede usarse la cuantificación fotométrica. Esto ya se ha hecho, por ejemplo, en el Ejemplo 2. Además, la actividad antibacteriana puede determinarse mediante el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en un nutriente.
Las combinaciones de acuerdo con la invención no sólo se caracterizan por un rendimiento sobresaliente y un alto grado de actividad sinérgica, sino además porque son activos contra un gran número de bacterias. En ese sentido, las combinaciones de acuerdo con la segunda realización son antibióticos de amplio espectro. Como consecuencia, las combinaciones de acuerdo con la segunda realización son la primera opción, especialmente en los casos en que el diagnóstico, por ejemplo, la determinación de qué bacterias son responsables de una infección dada, es engorroso o lleva demasiado tiempo. Esto se aplica, por ejemplo, a la septicemia. Los ejemplos adjuntos al presente documento contienen pruebas de la actividad de las combinaciones de acuerdo con la invención contra la pluralidad de bacterias altamente problemáticas. En particular, las pruebas se refieren a E.colimultirresistente ESBL (beta lactamasa de espectro extendido) como se muestra en el Ejemplo 1,Staphylococcus aureusmultirresistente (MRSA) como se muestra en el Ejemplo 2 yPseudomonas aeruginosamultirresistente PS-4.
Para evaluar la sinergia entre péptidos, se calculó el índice de Concentración inhibidora fraccionaria (CIF) de cada combinación de acuerdo con la siguiente fórmula: [(A)/CIMA] [(P)/CIMP] = CIFA CIFP = índice de C iF donde CIMA y CIMP son las CIM de los dos agentes determinadas por separado. Lo mismo se aplica, con los cambios correspondientes, a las combinaciones ternarias o de orden superior. Los valores inferiores a 1 indican sinergia, un valor de 1 indica aditividad y valores superiores a 1 indican antagonismo.
Sorprendentemente, se ha descubierto que incluso concentraciones subinhibidoras de péptidos de acuerdo con la presente invención proporcionan un efecto sinérgico con antibióticos establecidos en la técnica, tales como gentamicina, levofloxacino u oxacilina. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría específica, se considera que dichas concentraciones subinhibidoras (así como concentraciones superiores) inducen una entrada masiva de antibióticos en las células bacterianas.
En una realización preferida adicional de la segunda realización, dicha combinación es (a) una combinación binaria de (i) un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 2; (ii) un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y un antibiótico como se define de acuerdo con la segunda realización; o (iii) un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 2 y un antibiótico como se define de acuerdo con la segunda realización; o (b) una combinación ternaria de un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1, un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 2 y un antibiótico como se define de acuerdo con la segunda realización.
Entre los antibióticos que pueden combinarse con péptidos de acuerdo con la presente invención, se prefieren particularmente la ceftriaxona y la oxacilina.
Los péptidos que comprenden o que consisten en las secuencias de las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, son agentes particularmente preferidos de acuerdo con la presente invención.
En un caso preferido adicional como parte de la divulgación, (a) dicha composición farmacéutica comprende un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable; y/o (b) los agentes farmacéuticamente activos citados son los únicos agentes farmacéuticamente activos comprendidos en dicha composición farmacéutica.
Como es habitual en la técnica, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden contener, además de agentes farmacéuticamente activos, también agentes farmacéuticamente inactivos, incluyendo vehículos, diluyentes y/o excipientes. Se han descrito vehículos, diluyentes y excipientes de ejemplo anteriormente en el presente documento.
Además, se prefiere que en la composición farmacéutica no haya agentes farmacéuticamente activos adicionales presentes más allá de aquellos citados explícitamente. Una vez mencionado esto, también se prevé que haya agentes farmacéuticamente activos no mencionados explícitamente adicionales presentes. Entre esos agentes no mencionados explícitamente adicionales, hay preferencia por los antibióticos.
En una tercera realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica de la segunda realización para su uso en (a) un método de tratamiento, mejoría o prevención de una o más afecciones seleccionadas de septicemia, infecciones bacterianas del aparato respiratorio, infecciones bacterianas del aparato gastrointestinal, infecciones bacterianas del aparato urogenital, fascitis necrotizante, infecciones bacterianas de quemaduras, infecciones bacterianas de heridas e infecciones bacterianas de la piel; o (b) un método de estimulación de la cicatrización de heridas.
Como se ha indicado anteriormente, la septicemia es una indicación particularmente preferida de acuerdo con la presente invención. Las combinaciones, debido a su elevada actividad antibiótica contra un amplio espectro de bacterias, son la primera elección cuando se requiere una acción rápida contra las enfermedades que, de otro modo, se volverían incontrolables. Por ello, las combinaciones de la invención son útiles en el tratamiento de infecciones sistémicas. Una vez mencionado esto, los trastornos no sistémicos también están entre las indicaciones susceptibles de tratamiento.
Con respecto a la estimulación de la cicatrización de heridas de acuerdo con el punto (b) anterior, se observa que, independientemente de la presencia de bacterias o de sus toxinas, los péptidos de la invención son capaces de estimular metaloproteinasas tales como las ADAM y son capaces de reclutar factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico EGF.
En realizaciones preferidas de la tercera realización, (a) la infección bacteriana del aparato respiratorio es tuberculosis, fibrosis quística o EPOC; (b) la infección bacteriana del aparato gastrointestinal es la enfermedad de Crohn; o (c) dicha afección está provocada por bacterias grampositivas y/o gramnegativas, especialmente por uno o más de estafilococos tales comoStaphylococcus aureusincluyendo MRSA, micobacterias tales comoMycobacterium tuberculosisincluyendo las cepas MDR y XDR, pseudomonas tales comoPseudomonas aeruginosaincluyendo MDRPA, enterococos, incluyendo el enterococo resistente a la vancomicina (VRE), hemófilos, incluyendoHaemophilus influenzae, E. coliincluyendo ESBL, klebsiela incluyendoKlebsiella pneumonia,estreptococos p-hemolíticos incluyendo los estreptococos del grupo A, tales comoStreptococcus pyogenes,y acinetobacterias, incluyendoAcinetobacter baumannii.
Las demás implementaciones de acuerdo con la presente divulgación, como se describen a continuación, se refieren al hallazgo de que los péptidos individuales, así como las combinaciones de acuerdo con la presente invención, son agentes útiles contra las biopelículas. Las biopelículas son capas de bacterias sobre diversos tipos de superficies, especialmente en hospitales y/o sobre dispositivos cuyas capas de bacterias son muy indeseables. Los ejemplos adjuntos al presente documento contienen pruebas de que los agentes de acuerdo con la presente invención son capaces de reducir significativamente las biopelículas.
En consecuencia, en una realización adicional, la presente invención proporciona un método de prevención o reducción de la formación de una biopelícula sobre un dispositivo de uso intracorpóreo o sobre una superficie de un hospital y/o de eliminación de una biopelícula de un dispositivo de uso intracorpóreo o de una superficie en un hospital, en donde dicho dispositivo no está presente en un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicho método poner dicho dispositivo o superficie en contacto con una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente o un péptido como se ha definido anteriormente.
El término "biopelícula" se conoce en la técnica y se refiere a una capa de moco con microorganismos incluidos en la misma. Las biopelículas se forman por los microorganismos en las superficies y se adhieren a la superficie. En otras palabras, una biopelícula también puede denominarse agregado multicelular unido a una superficie. Los microorganismos pueden comprender o consistir en bacterias de una especie o de una pluralidad de especies.
La prevención o la reducción de la formación de biopelículas y la eliminación de una biopelícula pueden ser, dependiendo del caso, una aplicación cosmética o médica. Cualquier método de prevención, reducción o eliminación puede incluir medidas adicionales tales como el fregado.
El requisito citado anteriormente de que el dispositivo intracorpóreo no esté presente en un cuerpo humano o animal garantiza que los métodos de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal no estén dentro del ámbito del aspecto respectivo de la invención. En la medida en que los métodos de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal no se excluyen de la patentabilidad, esta característica negativa es prescindible.
En una realización adicional, la presente invención proporciona un uso de una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente o un péptido como se ha definido anteriormente para prevenir o reducir la formación de una biopelícula sobre un dispositivo de uso intracorpóreo o sobre una superficie de un hospital y/o para eliminar una biopelícula de un dispositivo de uso intracorpóreo o superficie de un hospital, en donde dicho dispositivo no está presente en un cuerpo humano o animal.
En una realización adicional, la presente divulgación proporciona un dispositivo intracorpóreo o una superficie en un hospital que está recubierta y/o cargada con una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente o un péptido como se ha definido anteriormente.
El término "recubierto" se refiere a una capa sobre la superficie del dispositivo intracorpóreo o la superficie en un hospital que comprende o consiste en uno o más péptidos y/o composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención. Dicha capa puede cubrir la totalidad o partes de la superficie o el dispositivo intracorpóreo.
El término "cargado" se refiere a un dispositivo o superficie intracorpórea, en donde dicho dispositivo o superficie en su totalidad o partes del mismo están hechos de un material que comprende uno o más péptidos y/o composiciones farmacéuticas como se han definido anteriormente en el presente documento.
En un caso preferido, como parte de la divulgación relativa al control de las biopelículas, (a) dicho dispositivo de uso intracorpóreo se selecciona de catéteres, implantes, endoscopios, drenajes, lentes de contacto y audífonos; o (b) dicha superficie en un hospital es un accesorio.
Las Figuras muestran:
Figura 1:Crecimiento bacteriano en presencia y ausencia de agentes de la invención.
Figura 2:Inactivación de una biopelícula dePseudomonas aeruginosacon bacterias marcadas con GFP (GFP:
Proteína fluorescente verde). Bacterias vivas: blanco, bacterias inactivadas: oscuro.
Figura 3:Péptido 19-2,5/Péptido 9-4LF/levofloxacino (A). Péptido 19-2,5/Péptido 9-4LF/levofloxacino (B). El área bajo la curva (ABC) es una medida de la eficacia antimicrobiana de los fármacos, presentando los valores más bajos, los efectos más fuertes.
Figura 4:Herida antes y después del tratamiento diario a t = 0, 3 meses y 6 meses.
Figura 5:Inhibición dependiente de la dosis de la formación de TNF inducida porM. tuberculosisde células mononucleares de sangre periférica humana por el Péptido 19.2,5. Se dejaron sobrenadantes de bacteriasM. tuberculosistratadas con isoniazida (0,1 pg/ml; 72 h) sin tratar o se incubaron durante 30 min con los péptidos X, Y, Z a las concentraciones indicadas. Posteriormente, se añadieron cantidades iguales a PBMC humanas (1*106/ml) y se incubaron durante 24 h adicionales. La formación de TNF se midió mediante ELISA (R&D Systems). ;;Figura 6:Aspidasept® inhibe la maduración y migración de MoDC. ;;Figura 7:Aspidasept® y Aspisasept II reducen la liberación de IL-8 en queratinocitos activados por TLR2/6. ;Figura 8:Inhibición de la formación de biopelículas. ;;Figura 9:Efecto sinérgico de la combinación de levofloxacino con un péptido de la invención. Los datos se obtuvieron a partir de experimentos de crecimiento en Mueller-Hinton (ajustado a cationes) con agitación continua a 37 °C usando Bioscreen C, Labsystem, Helsinki, Finlandia. Las concentraciones se ajustaron después del análisis en tablero de ajedrez, una vez se calcularon las Concentraciones inhibidoras fraccionarias (CIF). En todos los casos se obtuvo un índice CIF < 0,5, lo que indica un efecto sinérgico. Los resultados muestran el promedio de tres experimentos independientes. ;Figura 10:Efecto sinérgico de la combinación de gentamicina (A) y oxacilina (B), respectivamente, con un péptido de la invención. ;;Figura 11:Combinación sinérgica de péptidos de la invención. ;;Los Ejemplos ilustran la invención. ;;Ejemplo 1;;Crecimiento deEscherichia coliESBL (CUN E20) en presencia de combinaciones de ceftriaxona y péptidos de la invención ;;La capacidad de los péptidos para inducir la sensibilización bacteriana a los antibióticos se determinó mediante un método convencional de titulación en tablero de ajedrez en placas de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos [Eliopoulos GM, Moellering, RC:Antimicrobial combinations.EnAntibiotics in Laboratory Medicine,4.a edición. Editado por: Lorian V. Baltimore: The Williams and Wilkins Co; 1996:330-396]. Para este fin, se mezclaron diluciones en serie de los dos agentes antimicrobianos en una placa de microtitulación, de manera que cada fila contuviera una cantidad fija de un agente y cantidades crecientes del otro. Los inóculos consistieron en 1 * 105 UFC/ml, aproximadamente en medio Mueller-Hinton (MH) (Difco Laboratories, Sparks, MD, EE.UU.). Para evaluar la sinergia entre péptidos, se calculó el índice de Concentración inhibidora fraccionaria (CIF) de cada combinación de acuerdo con la siguiente fórmula: [(A)/CIMA] [(P)/CIMP] = CIFA CIFP = índice CIF, donde CIMA y CIMP son las CIM de los dos agentes determinadas por separado, y (A) y (P) son las CIM de los agentes cuando se determinan en combinación. Una combinación péptido-péptido dada se consideró sinérgica si su índice CIF era < 0,5. A los péptidos con una CIM superior a la concentración máxima sometida a ensayo (250 pg/ml) se les asignó arbitrariamente un valor de CIM de 500 pg/ml.
Los valores de CIM para los agentes individuales son los siguientes: Péptido 19-4LF: 16 ug/ml; Péptido 19-2,5: 128 ug/ml; Ceftriaxona: 16 ug/ml.
El índice de Concentración inhibidora fraccionada (CIF) se usa como medida de sinergia. Se encontró sinergia doble y triple, respectivamente, para las siguientes combinaciones:
Combinación binaria Cef Péptido 19-2,5 : CIF 0,375; combinación binaria Cef Péptido 19-4LF : CIF 0,5; combinación binaria Péptido 19-4LF Péptido 19-2,5 : CIF 0,5; y combinación ternaria Cef Péptido 19-2,5 Péptido 19-4LF : CIF 0,375.
Ejemplo 2
Efectos sinérgicos sobre el crecimiento de MRSA
En la Figura 1 se muestran curvas de crecimiento deStaphylococcus aureusresistente a meticilina ATCC 43300 (MRSA) expuesto en el momento 0 a combinaciones de Pép 19-2,5 (8 pg/ml), Pép 19-4LF (2 pg/ml) y oxacilina (4 pg/ml).
La actividad inhibidora de las combinaciones se determinó mediante un sistema automatizado basado en turbidimetría (Bioscreen C, Labsystem, Helsinki, Finlandia), que mide la absorbancia del cultivo a intervalos regulares. Los ensayos se realizaron en caldo MH usando placas Bioscreen de poliestireno alveolar de 100 pocillos. Los inóculos consistieron en 1 x 105 UFC/ml, aproximadamente en medio Mueller-Hinton (MH) (Difco Laboratories, Sparks, MD, EE.UU.). Las suspensiones celulares se cultivaron a 37 °C con agitación (control ajustado en posición "r.p.m. medias") y la absorbancia se determinó cada 15 min durante al menos 48 h.
La absorbancia de los cultivos se midió cada 15 minutos usando un sistema automatizado Bioscreen C.
Ejemplo 3
Inactivación de la biopelícula
Los datos mostrados en la Figura 2 indican que ya después de un tratamiento de corta duración (1 h) la mayoría de las bacterias están inactivadas. Los datos representativos mostrados en la Figura 2 indicaron que después de un breve período de adición del péptido 19-4LF (1 h) la mayoría de las bacterias están inactivadas. Las micrografías muestran que sólo una pequeña fracción de la superficie estaba cubierta por bacterias vivas que formaban una biopelícula después de 1 h (B) en comparación con la sin tratar (A). El grado de reducción de las bacterias vivas era muy evidente, lo que sugiere que el péptido 19-4LF puede penetrar en la matriz de la sustancia polimérica extracelular (EPS) y eliminar las bacterias después de un breve período de tiempo.
Los datos mostrados en la Figura 8 se obtuvieron en experimentos realizados usando el Reactor de Biopelículas (CBR) del Centro para el Control de Enfermedades (CDC). En este caso, la cepa clínicaPseudomonas aeruginosaPS4 se incubó en TSB bajo agitación continua durante 24 horas, seguido de 24 horas adicionales de crecimiento con un flujo de TSB diluido. Las muestras recibieron tratamientos durante otras 24 horas disueltas en tampón de fosfato a 37 °C. Las biopelículas se rasparon y se diluyeron en serie antes de la siembra en placa y el recuento. Para la microscopía confocal, las biopelículas se tiñeron con Live/Death BacLight (Life technologies, Carlsbad, California, EE.UU.). Los resultados muestran el promedio de dos experimentos independientes.
Ejemplo 4
Cinética de la acción sinérgica inhibidora: péptidos antibióticos de la invención en combinación con levofloxacino
Se han sometido a ensayo combinaciones de Péptido 19-2,5 y Péptido 19-4LF con el antibiótico levofloxacino (fármaco de tercera generación del grupo de las fluoroquinolonas) y combinaciones de Péptido 19-2,5 y Péptido 19-4LF solos en bacterias multirresistentes dePseudomonas aeruginosaPS4.
En particular, la actividad inhibidora de las combinaciones se determinó mediante un sistema automatizado basado en turbidimetría (Bioscreen C, Labsystem, Helsinki, Finlandia), que mide la absorbancia del cultivo a intervalos regulares. Los ensayos se realizaron en caldo MH usando placas Bioscreen de poliestireno alveolar de 100 pocillos. Los inóculos consistieron en 1 x 105 UFC/ml, aproximadamente en medio Mueller-Hinton (MH) (Difco Laboratories, Sparks, MD, EE.UU.). Las suspensiones celulares se cultivaron a 37 °C con agitación (control ajustado en posición "r.p.m. medias") y la absorbancia se determinó cada 15 min durante al menos 48 h. Cada experimento se repitió tres veces independientemente y los resultados se analizaron con el programa Prism. Para este fin, en primer lugar se obtuvo el área bajo la curva para cada triplicado y el resultado promedio se analizó estadísticamente usando la U no paramétrica de Mann-Whitney complementada con el ensayo de Kruskal Wallis para comparaciones por pares.
En las Figuras 3 y 9, se representa gráficamente el crecimiento de las bacterias (medido ópticamente: densidad óptica) frente al tiempo (en horas). Ambas combinaciones, los péptidos con el antibiótico, así como los péptidos solos, son combinaciones sinérgicas potentes, evidenciadas por valores de CIF inferiores a 0,5 (CIF = 0,31 en la Figura 9).
Los péptidos solos así como con antibióticos (además de levofloxacino también gentamicina) actúan sinérgicamente contra cepas multirresistentes dePseudomonas aeruginosa,así como deAcinetobacter baumanii.
Cinética de la acción sinérgica inhibidora: péptidos antibióticos de la invención en combinación con gentamicina y oxacilina, respectivamente.
Los datos mostrados en la Figura 10 se obtuvieron en experimentos de crecimiento en Mueller-Hinton (ajustado a cationes) con agitación continua a 37 °C usando Bioscreen C, Labsystem, Helsinki, Finlandia. Las concentraciones se ajustaron después del análisis en tablero de ajedrez, una vez se calcularon las Concentraciones inhibidoras fraccionarias (CIF). En todos los casos se obtuvo un índice CIF < 0,5, lo que indica un efecto sinérgico. Los resultados muestran el promedio de tres experimentos independientes.
Ejemplo 5
Intento de curación de acuerdo con la ley alemana Arzneimittelgesetz §4b con un fármaco no autorizado.
Un paciente varón (78 años) tenía, debido a un tumor curado en la espalda, una herida abierta (véase la imagen en t = 0). Debido a las malas condiciones de los tejidos blandos después de la radioterapia, se decidió realizar una operación de rehabilitación que, sin embargo, no tuvo éxito. Por lo tanto, se inició un tratamiento conservador de la herida. La ubicación de la herida requirió la implicación de un servicio de enfermería ambulante que se hizo cargo de los cuidados diarios. No obstante, en intervalos esporádicos, se produjeron infecciones de la herida que inhibieron el proceso de cicatrización. Un análisis microbiológico mostró la presencia deStaphylococcus aureus, Parvimonas miera,estreptococos p-hemolizantes yPseudomonas aeruginosa.A lo largo de 6 años, fracasaron todos los enfoques terapéuticos con diferentes antibióticos y formulaciones de bálsamos de aplicación tópica. En noviembre de 2014 se informó al paciente de la posibilidad de un "intento de curación", a lo que accedió. La terapia se inició con Pép19-2,5 al 0,1 % (Aspidasept®) en bálsamo (BACHEM Lote 1053821 en crema de base DAC del farmacéutico), que no mostró ningún efecto. Sólo después de aumentar la concentración al 1 % se observó un efecto significativo (véase la imagen a continuación en t = 3 meses en febrero de 2015), relacionado con un aumento de la cicatrización de la herida. Después de 2 meses, el diámetro de la herida se había reducido en un 50 %, y se había curado totalmente después de 6 meses; véase la Figura 4. Este efecto terapéutico sólo puede explicarse por el uso del bálsamo Aspidasept®, puesto que los demás parámetros no se habían modificado. La herida ya está totalmente cerrada.
Ejemplo 6
Inhibición de la respuesta inflamatoria inducida por compuestos de la pared celular deMycobacterium tuberculosis
Las bacteriasM. tuberculosisse trataron con los antibióticos de primera línea anti-Mtb isoniazida (INH) o rifampicina (RIF) durante 3 días a 37 °C. Posteriormente, el sobrenadante de las células bacterianas se añadió a células mononucleares humanas (5 x 105 células/mi) en ausencia o presencia de los péptidos Pép19-2,5, Pép19-12 y Pép19-2,5 Acilo (resto hexanoico). La respuesta inflamatoria se controló midiendo la formación de factor de necrosis tumoral a (TNFa) en un ELISA. Se observó que el compuesto Pép19-2,5 presenta la mayor actividad anti-TNFa, ya a una concentración bastante baja de 10 pg/ml se inhibió la formación de TNFa (Figura de la izquierda) en más del 50 %. Otros péptidos con variaciones de secuencia mostraron una actividad inhibidora más débil. Como control, se presenta la inactivación de la producción de TNFa inducida por LPS para los tres péptidos investigados en el lado derecho de la figura, con una inhibición muy eficiente, como describieron previamente T. Gutsmannet al.(Gutsmannet al., New antiseptic peptides to protect against endotoxin-mediated shock, AAC54, 3817-3824 (2010)). Véase la Figura 5.
Ejemplo 7
Aspidasept® inhibe la maduración y la migración de MoDC
La maduración y la migración de células dendríticas inmaduras son etapas clave en el inicio de la inmunidad adaptativa contra patógenos. Sin embargo, las respuestas inflamatorias sostenidas y excesivas mediadas por linfocitos T activados pueden contribuir a la inflamación crónica y al retraso en la cicatrización de heridas.
En células dendríticas derivadas de monocitos (MoDC), Pép19-2,5 inhibió la regulación positiva mediada por LPS del marcador de maduración CD83 y de la molécula coestimuladora CD80 a una relación de peso péptido:LPS de 1000:1. Además, la migración de MoDC inducida por LPS y la expresión del gen de CCR7 fueron totalmente bloqueadas por Pép19-2,5; véase la Figura 6.
Ejemplo 8
Aspisasept® y Aspisasept II reducen la liberación de IL-8 en queratinocitos activados por TLR2/6
Se ha demostrado que los queratinocitos de la piel humana no reaccionan a la endotoxina gramnegativa (LPS), aparentemente debido a la falta del receptor TLR4 y al hecho de que la mayoría de las bacterias de la piel son de origen grampositivo. Por lo tanto, se comprobó el efecto de Pép19-2,5 y Pép19-4LF sobre la toxina (factor de patogenicidad) FSL-1 (lipopéptido estimulante de fibroblastos), un compuesto activador de TLR-2/6.
Se pudo demostrar que la actividad inductora de IL-8 de FSL-1 se redujo considerablemente mediante la adición de los péptidos ya a una relación de peso de 10:1, mientras que el péptido de control Pép19-2,5gek, que carece del extremo C terminal de los dos péptidos, fue totalmente inactivo; véase la Figura 7.
Ejemplo 9
Supresión de respuestas inflamatorias en células de la piel y estimulación de la migración de queratinocitos
Se ha investigado el potencial del Péptido 19-2,5 y del compuesto estructuralmente relacionado Péptido 19-4LF para determinar su aplicación terapéutica en infecciones cutáneas bacterianas. Los queratinocitos humanos primarios respondieron a la activación de TLR2 (FSL-1) pero no a la de TLR4 (LPS) mediante un aumento de la producción de IL-8 que se determinó con ELISA. Ambos SALP inhibieron la fosforilación de NF-<k>B p65 y p38 MAPK inducida por FSL-1 y redujeron significativamente la liberación de IL-8 y la expresión génica de IL-1p, CCL2 (MCP-1) y hBD-2. Para detectar la fosforilación de las proteínas intracelulares se realizó una transferencia Western. La expresión génica se evaluó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. En el ensayo de MTT se observó citotoxicidad a concentraciones de SALP inferiores a 10|jg/ml. En células dendríticas derivadas de monocitos estimuladas por LPS, los péptidos bloquearon la secreción de IL-6, regularon negativamente la expresión de los marcadores de maduración CD83 y CD86, detectados con citometría de flujo, e inhibieron la capacidad de migración dependiente de CCR7. De forma similar, las células similares de Langerhans derivadas de monocitos y activadas con LPS y citocinas proinflamatorias mostraron una reducción de los niveles de IL-6 y de la expresión de CD83/CD86 en presencia de SALP. Además de la inflamación aguda, las infecciones bacterianas con frecuencia provocan una alteración de la cicatrización de heridas. Puesto que la reepitelización es una etapa crítica en la reparación de heridas, los presentes inventores sometieron a ensayo si el Péptido 19-2,5 afecta a la migración de los queratinocitos. En un ensayo de rascado, el péptido estimuló notablemente la migración celular y aceleró el cierre artificial de heridas a concentraciones tan bajas como de 1 ng/ml y fue equipotente al TGF-p.
Ejemplo 10
Acción sinérgica de dos péptidos de la invención en otras bacterias
La Figura 11 muestra datos obtenidos en experimentos de crecimiento en Mueller-Hinton (ajustado a cationes) con agitación continua a 37 °C usando Bioscreen C, Labsystem, Helsinki, Finlandia. Las concentraciones se ajustaron después del análisis en tablero de ajedrez, una vez se calcularon las Concentraciones inhibidoras fraccionarias (CIF). En todos los casos se obtuvo un índice CIF < 0,5, lo que indica un efecto sinérgico. Los resultados muestran el promedio de tres experimentos independientes.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un péptido que consiste en o que comprende de 18 a 22 aminoácidos, en donde los aminoácidos en las posiciones 1 a 22, contados desde el extremo N, son los siguientes (1) G; (2) C o ausente; (3) K; (4) K; (5) Y o F; (6) R; (7) R; (8) F; (9) K o R; (10) W; (11) K; (12) F; (13) K o R; (14) G; (15) K; (16) F, L o W; (17) F o W; (18) F, L o W; (19) W o F; (20) C o ausente; (21) F o G o ausente; (22) G o ausente para su uso en un método de (a) tratamiento, mejoría o prevención de una infección bacteriana de la piel; (b) tratamiento, mejoría o prevención de una infección bacteriana de una herida; y/o (c) estimulación de la cicatrización de heridas.
  2. 2. El péptido para el uso de la reivindicación 1, en donde (a) dicho péptido (i) comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o (ii) comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 2; y/o (b) dicho uso es tópico.
  3. 3. El péptido para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha infección bacteriana de la piel o dicha infección bacteriana de una herida es una infección por bacterias grampositivas y/o gramnegativas, preferentemente por uno o más de estafilococos tales comoStaphylococcus aureusincluyendo MRSA, estreptococos p-hemolíticos incluyendo los estreptococos del grupo A, tales comoStreptococcus pyogenes,parvimonas, incluyendoParvimonas miera,pseudomonas tales comoPseudomonas aeruginosaincluyendo MDRPA, hemófilos, incluyendoHaemophilus influenza,clostridios, incluyendoClostridium difficile,enterococos, incluyendo el enterococo resistente a la vancomicina (VRE), porfiromonas, incluyendoPorphyromonas gingivalis,propionibacterias, incluyendoPropionibacterium acne,y acinetobacterias, incluyendoAcinetobacterbaumannii.
  4. 4. El péptido para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha infección bacteriana de la piel o dicha infección bacteriana de una herida se selecciona de erisipela, impétigo, foliculitis, forúnculo, celulitis y ántrax.
  5. 5. Una composición farmacéutica que comprende o que consiste en una combinación de (a) dos o más péptidos, consistiendo en o comprendiendo cada péptido de 17 a 23 aminoácidos, en donde los aminoácidos en las posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son los siguientes (1) G, S o ausente; (2) C o ausente; (3) K o R; (4) K o R; (5) Y, W o F; (6) K o R; (7) K o R; (8) F, W o L; (9) K o R; (10) K o L o ausente; (11) W, L o F; (12) K o R; (13) F, Y o C; (14) K o R; (15) G o Q; (16) K o R; (17) F, L o W; (18) F o W; (19) F, L o W; (20) W o F; (21) C o ausente; (22) F o G o ausente; (23) G o ausente; o (b) uno o más péptidos, consistiendo en o comprendiendo cada péptido de 17 a 23 aminoácidos, en donde los aminoácidos en las posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son los siguientes (1) G, S o ausente; (2) C o ausente; (3) K o R; (4) K o R; (5) Y, W o F; (6) K o R; (7) K o R; (8) F, W o L; (9) K o R; (10) K o L o ausente; (11) W, L o F; (12) K o R; (13) F, Y o C; (14) K o R; (15) G o Q; (16) K o R; (17) F, L o W; (18) F o W; (19) F, L o W; (20) W o F; (21) C o ausente; (22) F o G o ausente; (23) G o ausente y uno o más antibióticos seleccionados de antibióticos de molécula orgánica pequeña tales como ceftriaxona, oxacilina, amoxicilina, amikacina, ciprofloxacino, eritromicina, imipenem y tetraciclina, y antibióticos peptídicos tales como daptomicina y vancomicina; en donde dicha combinación es sinérgica, y en donde la sinergia se produce con respecto a la actividad antibacteriana.
  6. 6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en donde dicha composición farmacéutica es un antibiótico de amplio espectro.
  7. 7. La composición farmacéutica de la reivindicación 5 o 6, en donde dicha combinación es (a) una combinación binaria de (i) un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 2; (ii) un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y un antibiótico como se define en la reivindicación 6; o (iii) un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 2 y un antibiótico como se define en la reivindicación 6; o (b) una combinación ternaria de un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1, un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 2 y un antibiótico como se define en la reivindicación 6.
  8. 8. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para su uso en (a) un método de tratamiento, mejoría o prevención de una o más afecciones seleccionadas de septicemia, infecciones bacterianas del aparato respiratorio, infecciones bacterianas del aparato gastrointestinal, infecciones bacterianas del aparato urogenital, fascitis necrotizante, infecciones bacterianas de quemaduras, infecciones bacterianas de heridas e infecciones bacterianas de la piel; o (b) un método de estimulación de la cicatrización de heridas.
  9. 9. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8, en donde (a) la infección bacteriana del aparato respiratorio es tuberculosis, fibrosis quística o EPOC; (b) la infección bacteriana del aparato gastrointestinal es la enfermedad de Crohn; o (c) dicha afección está provocada por bacterias grampositivas y/o gramnegativas, especialmente por uno o más de estafilococos tales comoStaphylococcus aureusincluyendo MRSA, micobacterias tales comoMycobacterium tuberculosisincluyendo las cepas MDR y XDR, pseudomonas tales comoPseudomonas aeruginosaincluyendo MDRPA, enterococos, incluyendo el enterococo resistente a la vancomicina (VRE), hemófilos, incluyendoHaemophilus influenzae, E. coliincluyendo ESBL, klebsiela incluyendoKlebsiella pneumonia,estreptococos p-hemolíticos incluyendo los estreptococos del grupo A, tales comoStreptococcus pyogenes,y acinetobacterias, incluyendoAcinetobacter baumannii.
  10. 10. Uso de una composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 o un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para prevenir o reducir la formación de una biopelícula sobre un dispositivo de uso intracorpóreo o sobre una superficie en un hospital y/o para eliminar una biopelícula de un dispositivo de uso intracorpóreo o de una superficie en un hospital, en donde dicho dispositivo no está presente en un cuerpo humano o animal.
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