ES3036687T3 - Method of producing a recombinant protein in a host cell which has a disabled rhamnose metabolism as well as expression vectors, host cells and recombinant proteins thereof - Google Patents

Method of producing a recombinant protein in a host cell which has a disabled rhamnose metabolism as well as expression vectors, host cells and recombinant proteins thereof

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ES3036687T3
ES3036687T3 ES21790425T ES21790425T ES3036687T3 ES 3036687 T3 ES3036687 T3 ES 3036687T3 ES 21790425 T ES21790425 T ES 21790425T ES 21790425 T ES21790425 T ES 21790425T ES 3036687 T3 ES3036687 T3 ES 3036687T3
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seq
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ranibizumab
host cell
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David Vikström
Nurzian Ismail
Patrik Samuelson
Kiavash Mirzadeh
Santhosh Gudise
Maria Kadow
Kathleen Szeker
Tagrid Salih
Mariusz Baraszkiewicz
Siavash Bashiri
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Xbrane Biopharma AB
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Abstract

La presente invención se refiere a una construcción de ADN adecuada para la expresión de una proteína recombinante en una célula huésped bacteriana. Dicha construcción comprende secuencias de nucleótidos que codifican: un promotor rhaBAD, un activador de la transcripción RhaR, un activador de la transcripción RhaS, un marcador de resistencia a antibióticos, un promotor unido operativamente al ácido nucleico que codifica el marcador de resistencia a antibióticos, un terminador T1 rmB, un terminador T2 rmB y un origen de replicación pMB1. La construcción de ADN también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína recombinante unida operativamente al promotor rhaBAD. La presente invención se refiere además a un vector y una célula huésped bacteriana que comprende dicha construcción de ADN, así como a un método para producir dicha proteína recombinante mediante la exposición de dicha célula huésped bacteriana a ramnosa, induciendo así la expresión de dicha proteína recombinante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método de producción de una proteína recombinante en una célula hospedadora que tiene un metabolismo de la ramnosa desactivado, así como vectores de expresión, células hospedadoras y proteínas recombinantes de la misma
Campo técnico
La presente invención se refiere a una construcción de ADN adecuada para expresar ranibizumab en una célula hospedadora bacteriana, en donde dicha construcción de ADN comprende secuencias de nucleótidos que codifican: un promotorrhaBAD,un activador de la transcripción RhaR, un activador de la transcripción RhaS, un marcador de resistencia a antibióticos, un promotor unido operativamente al ácido nucleico que codifica el marcador de resistencia a antibióticos, un terminador rrnB T1, un terminador rrnB T2 y un origen de replicación. La construcción de ADN también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab unida operativamente al promotorrhaBAD.La presente invención se refiere además a un vector y célula hospedadora bacteriana que comprende dicha construcción de ADN, así como a un método de producción de ranibizumab que expone dicha célula hospedadora bacteriana a ramnosa e induce así la expresión de ranibizumab.
Antecedentes de la invención
El metabolismo de la ramnosa implica que la L-ramnosa sea absorbida en las células a través de la permeasa RhaT y a isomerizada en L-ramnulosa por L-ramnosa isomerasa (RhaA), y la L-ramnulosa es entonces fosforilada adicionalmente por ramnulocinasa (RhaB) y finalmente hidrolizada por ramnulosa-1-fosfato aldolasa (RhaD) dando dihidroxiacetonafosfato y L-lactaldehído [1]. Los genesrhaA, rhaByrhaDforman un operón denominadorhaBADy se transcriben con la ayuda del promotorrhaBAD[1]. En comparación con otros sistemas, la vía del metabolismo de la ramnosa se distingue por el hecho de que dos activadores de la transcripción conocidos como RhaS y RhaR son requeridos para la regulación que se explica a continuación [1].
El operónrhaBADes un operón catabólico regulado positivamente que transcribe los genesrhaB, rhaAyrhaDmencionados anteriormente de forma divergente desde el operónrhaSRcon aproximadamente 240 pb de ADN que separa sus respectivos sitios de inicio de la transcripción [1]. El operónrhaSRcodifica RhaS y RhaR, en donde cada monómero de las proteínas RhaS y RhaR diméricas contiene dos motivos hélice-giro-hélice y pone en contacto dos acanaladuras de ADN principales. RhaR regula la transcripción derhaSRal unirse al ADN promotor que abarca -32 a -82 bases con respecto al sitio de inicio de la transcripciónrhaSR[1]. Posterior a la expresión derhaSR,RhaS se une al ADN aguas arriba del operónrhaBADen las bases -32 a -81 con respecto al sitio de inicio de la transcripción para aumentar la expresión derhaBAD[1]. Además, la región intergénicarhaSR-rhaBADcontiene sitios de unión CRP en las posiciones -92,5 (CRP 1) con respecto al sitio de inicio de la transcripción del operónrhaBADy los sitios de unión CRP en las posiciones -92,5 (<c>R<p>2), -115,5 (CRP 3) y -116,5 (CRP 4) con respecto al sitio de inicio de la transcripción del operónrhaSR[1]. La proteína receptora de AMP cíclico (CRP) regula la expresión de más de 100 promotores enEscherichia coli.
Se conocen en la técnica construcciones de ADN que comprenden secuencias de ADN que codifican RhaS, RhaR y el promotorrhaBAD.El documento de patente US8138324 desvela plásmidos derivados de pTACO y pLEMO (es decir, construcciones de ADN) que comprenden secuencias de ADN que codifican RhaS, RhaR y el promotorrhaBAD. Sin embargo, el documento de patente US8138324 no dice nada sobre el uso de células hospedadoras que tienen un metabolismo de la ramnosa desactivado.
También se conocen en la técnica construcciones de ADN basadas en plásmidos derivados de pRha que comprenden secuencias de ADN que codifican RhaS, RhaR y el promotorrhaBAD,por ejemplo, de Giacaloneet al.[5] o Hjelmet al.[2]. Giacaloneet al.describen, por ejemplo, los plásmidos pRha67A y pRha109A mientras que Hjelmet al.desvelan el plásmido pRha67K.
Sandomenicoet al.[7] resumen la evolución del sistema de expresión enEscherichia colien la producción de fragmentos recombinantes de anticuerpo.
Aunque las construcciones de ADN que comprenden secuencias de ADN que codifican RhaS, RhaR y el promotorrhaBADse conocen en la técnica, todavía existen muchos retos, especialmente en la producción a escala industrial de proteínas recombinantes, en particular anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos. Los principales retos son:
(i) las células hospedadoras que se someten a estrés que da como resultado daño a las macromoléculas celulares, tales como membranas, proteínas y ácidos nucleicos;
(ii) escaso crecimiento de las células hospedadoras;
(iii) escasa actividad de las proteínas recombinantes producidas; y/o
(iv) obtención de proteínas recombinantes con rendimiento bajos.
Por consiguiente, existe una necesidad de construcciones de ADN mejoradas, así como una célula hospedadora y método adecuado para la eficiente producción de proteínas recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, con un alto rendimiento, particularmente cuando dichas proteínas recombinantes están previstas para aplicaciones terapéuticas.
Objetos de la invención
Por lo tanto, el objeto de la presente invención era proporcionar construcciones de ADN mejoradas, así como una célula hospedadora bacteriana y método adecuado para la producción eficiente de ranibizumab.
Sumario de la invención
Un primer aspecto de la invención se refiere a una construcción de ADN para expresar ranibizumab en una célula hospedadora bacteriana, en donde ranibizumab comprende (i) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 3, y (ii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 4, en donde dicha construcción de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab, en donde dicha construcción de ADN comprende además al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señalizador que está unido operativamente en la dirección de transcripción a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de ranibizumab y/o la cadena pesada de ranibizumab, en donde dicha construcción de ADN comprende secuencias de nucleótidos que codifican:
• promotorrhaBAD,
•activador de la transcripción RhaR,
• activador de la transcripción RhaS,
• un marcador de resistencia a antibióticos,
• un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el marcador de resistencia a antibióticos
• terminador rrnB T1
• terminador rrnB T2, y
• un origen de replicación pMB 1.
En una realización preferida, la construcción de ADN se caracteriza por:
• el marcador de resistencia a antibióticos es un marcador de resistencia a la kanamicina, preferentemente un marcador de resistencia a la kanamicina que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 12 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
• el promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el marcador de resistencia a antibióticos es un promotor AmpR, preferentemente un promotor AmpR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 13 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
• el terminador rrnB T1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 14 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
• el terminador rrnB T2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 15 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma; y/o
• el origen de replicación pMB 1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 16 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma.
En una realización preferida, la construcción de ADN se caracteriza por:
• el marcador de resistencia a antibióticos que es un marcador de resistencia a la kanamicina que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 12;
• el promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el marcador de resistencia a antibióticos es un promotor AmpR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 13;
• el terminador rrnB T1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 14;
• el terminador rrnB T2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 15; y/o
• el origen de replicación pMB 1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 16.
En una realización preferida, la construcción de ADN se caracteriza por:
• el promotorrhaBADque comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 8 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
• el activador de la transcripción RhaR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 9 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
• el activador de la transcripción RhaS que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 11 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
• el marcador de resistencia a antibióticos es un marcador de resistencia a la kanamicina que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 12 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
• el promotor AmpR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 13 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
• el terminador rrnB T1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 14 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
• el terminador rrnB T2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 15 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma; y
• el origen de replicación pMB1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 16 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma.
En una realización preferida, la construcción de ADN se caracteriza por:
• el promotorrhaBADque comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 8;
• el activador de la transcripción RhaR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 9;
• el activador de la transcripción RhaS que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 11;
• el marcador de resistencia a antibióticos es un marcador de resistencia a la kanamicina que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 12;
• el promotor AmpR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 13;
• el terminador rrnB T1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 14;
• el terminador rrnB T2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 15; y
• el origen de replicación pMB1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 16.
En una realización preferida, la construcción de ADN comprende un sitio de clonación múltiple que comprende 17 sitios de restricción escindibles por las enzimas de restricción EcoRI, NdeI, NotI, XhoI, PspXI, PaeR71, BbsI, StyI, AvrII, BanI, Acc65I, KpnI, Eco53kI, SacI, BamHI, XbaI, SalI, AccI, PstI, SbfI, SphI y HindIII.
En una realización preferida, la construcción de ADN comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 1, o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 1.
En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab está unida operativamente al promotorrhaBAD.
En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de ranibizumab que comprende la secuencia de SEQ ID 5 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, y/o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de ranibizumab que comprende la secuencia de SEQ ID 6 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma. En una realización preferida adicional, dicha secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de ranibizumab que comprende la secuencia de SEQ ID 5, y/o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de ranibizumab que comprende la secuencia de SEQ ID 6.
En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señalizador está unida operativamente en la dirección de transcripción a una cualquiera o ambas de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 5 y SEQ ID 6.
En una realización, el péptido señalizador es PelB (peptato liasa B). En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señalizador PelB comprende una secuencia de SEQ ID 7 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma; más preferentemente la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señalizador PelB que comprende la secuencia de SEQ ID 7.
En una realización, el péptido señalizador PelB resultante comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID 18 [6]: MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA.
En una realización preferida, la construcción de ADN comprende la secuencia de SEQ ID 17 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente comprende la secuencia de SEQ ID 17.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión que comprende cualquiera de las construcciones de ADN según el primer aspecto de la invención.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a una célula hospedadora bacteriana que comprende una construcción de ADN según el primer aspecto de la invención o el vector de expresión según el segundo aspecto de la invención, en donde dicha célula hospedadora bacteriana es preferentemente una célula deEscherichia coli,más preferentemente una célula K-12 deE. coli.
En una realización preferida, dicha célula hospedadora bacteriana comprende (i) un cromosoma que comprende una mutación en la secuencia del ácido nucleico del genrhaBque inactiva RhaB, o (ii) un cromosoma en el que se deleciona la secuencia de nucleótidos que codifica RhaB.
En una realización preferida, dicha célula hospedadora bacteriana es una célula W3110 deEscherichia coli,preferentemente que comprende un cromosoma que comprende una mutación de desplazamiento del marco en la secuencia de nucleótidos que codifica RhaB.
En una realización preferida, dicha célula hospedadora bacteriana es una célula W3110 deEscherichia colique comprende un cromosoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 2 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 2, en donde opcionalmente el cromosoma de la célula hospedadora bacteriana comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica RhaT.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método de producción de ranibizumab que comprende la etapa de exponer la célula hospedadora bacteriana según el tercer aspecto de la invención a ramnosa, induciendo así la expresión de ranibizumab. En una realización preferida, el método comprende además la etapa de recuperar ranibizumab de la célula hospedadora bacteriana; y opcionalmente comprende además una o más etapas de purificar el ranibizumab recuperado, preferentemente por una o más etapas de cromatografía.
Una o más de las SEQ ID 1, 2 y 5-18 indicadas anteriormente de los diversos aspectos de la invención (y realizaciones de los mismos) se puede sustituir por una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma. El término "identidad de secuencia" como se usa en el presente documento se usa con respecto a secuencias de aminoácidos o de nucleótidos y la identidad de secuencia es con respecto a la longitud entera de la secuencia especificada. Así, una secuencia pude ser al menos 90 por ciento, al menos 92 por ciento, al menos 95 por ciento, al menos 96 por ciento, al menos 97 por ciento, al menos 98 por ciento o al menos 99 por ciento, idéntica en secuencia a la secuencia de aminoácidos o nucleótidos especificada. Dichas secuencias de la invención incluyen así alteraciones de un solo o múltiples nucleótidos o aminoácidos (adiciones, sustituciones, inserciones o deleciones) a las secuencias de la invención. Al nivel de aminoácidos, las secuencias preferidas con la identidad de secuencia definida anteriormente contienen hasta 5, por ejemplo solo 1, 2, 3, 4 o 5, preferentemente 1, 2 o 3, más preferentemente 1 o 2, aminoácidos alterados en las secuencias de la invención.
Descripción breve de los dibujos
Figura 1 - Mapa de plásmidos para KTXHIS
Figura 2 - La secuencia de nucleótidos del sitio de clonación múltiple (MCS) de KTXHIS
Figura 3 - Mapa de plásmidos de KTXHIS-PelbLC-PelbHC
Figura 4a-4d - Transferencias Western usando anticuerpo anti-FAB - Comparación de titulabilidad en experimentos a pequeña escala.
Figuras 5 - Purificación de lotes a pequeña escala a partir de muestras de lisado homogeneizado clarificado de material recogido con transferencia Western con resina Capto L usando anticuerpo anti-FAB. Carga de gel: 3 |jg de producto aplicado, excepto para XB17/67A (solo 0,2 jg de producto aplicado debido al bajo rendimiento). Marcador de 18,4-116 kDa.
Figura 6 - Resumen de datos del título de HPLC de afinidad
Figuras 7a-7c - Transferencias Western usando anticuerpo anti-FAB - Comparación del control de expresión en experimento a pequeña escala.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a regular la producción de ranibizumab basada en el promotorrhaBADde L-ramnosa.
Más específicamente, la presente invención se refiere a producir ranibizumab que comprende las etapas de: a. clonar una secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab en una construcción de ADN de forma que la secuencia de nucleótidos se una operativamente a un promotorrhaBAD,y
b. introducir la secuencia de nucleótidos resultante en una célula hospedadora bacteriana que comprende un cromosoma que comprende una mutación o modificación que desactiva el metabolismo de la ramnosa.
La construcción de ADN desvelada en el método anterior comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el promotorrhaBAD.En una realización de la invención, la secuencia de nucleótidos del promotorrhaBADcomprende la secuencia de SEQ ID 8 (y en donde la secuencia se denomina "rhaBAD" en las Figuras 1 y 3):
C AC C AC AATTC AG CAAATTG TG AAC ATC ATC ACG TTC ATC TTTCC C TG G TTG C C AA TG G C CCATTTTCTTG TCAG TAACG AG AAG G TCG CG AATCCAG G CG CTTTTTAG AC TGGTCGTA.
La construcción de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el activador de la transcripción RhaR. En una realización de la invención, la secuencia de nucleótidos del activador de la transcripción RhaR comprende una secuencia de SEQ ID 9 (y en donde la secuencia se denomina "rhaR" en las Figuras 1 y 3): ATG G C TTTC TG C AATAAC G C G AATCTTC TCAAC G TATTTG TAC G C C ATATTG CG AA TAATCAACTTCGTTCTCTG GCCG AGGTAGCC-ACGG TGGCGCATCAGTTAAAACTT CTCAAAGATGATTTTTTTG CCAG CG ACCAG CAG G CAG TCG CTG TG G CTG ACCG TT ATCC G C AAG ATG TC TTTG CTG AAC ATACAC ATG ATTTTTG TG AG CTG G TG ATTG TC TG G CGCGG TAATGGCCTGCATGTACTCAACG ATCGCCCTTATCGCATTACCCGTG G CG ATC TC TTTTACATTC ATG CTG ATG ATAAAC ACTC C TAC G C TTC C G TTAACG AT CTG G TTTTG CAG AATATTATTTATTG CCCG G AG CG TCTG AAG CTG AATCTTG ACTG GCAG GGGG CGATTCCGGGATTTAACGCCAGCGCAGGGCAACCACACTGGCGCTT AG G TAGCATG GGGATG GCGCAGG CG CG GCAGGTTATTGG TCAGCTTG AGCATGA AAG TAG TCAG CATG TG CCG TTTG CTAACG AAATG G CTG AG TTG CTG TTCG G G CAG TTG G TG ATG TTG CTG AATCG CCATCG TTACACCAG TG ATTCG TTG CCG CCAACATC CAGCGAAACG TTG CTG G ATAAG CTG ATTACCCG G CTG G CG G CTAG CCTG AAAAG T CCCTTTG CGCTGGATAAATTTTGTGATG AGG CATCG TG CAGTGAG CG CG TTTTGC G TCAG CAATTTCG CC AG CAG AC TG G AATG AC CATCAATC AATATCTG C G AC AG G T C AG AG TG TG TCATG CG CAATATCTTCTCCAG CATAG CCG CCTG TTAATCAG TG AT ATTTCG AC C G AATG TG G C TTTG AAG ATAG TAAC TATTTTTC G G TG G TG TTTAC C CG GGAAACCG G G ATG ACG CCCAG CCAG TG G CG TCATCTCAATTCG CAG AAAG AT.
La construcción de ADN puede comprender además una secuencia de nucleótidos que codifica una extensión del activador de la transcripción RhaR que está en marco con RhaR debido a la ausencia de un codón de terminación. En una realización de la invención, la secuencia de nucleótidos de la extensión del activador de la transcripción RhaR comprende la secuencia de SEQ ID 10 (y en donde la secuencia se denomina "rhaR extendido" en las Figuras 1 y 3):
AGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAG.
La construcción de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el activador de la transcripción RhaS. En una realización de la invención, la secuencia de nucleótidos del activador de la transcripción RhaS comprende la secuencia de SEQ ID 11 (y en donde la secuencia se denomina "rhaS" en las Figuras 1 y 3): ATG ACCG TATTACATAG TG TG G ATTTTTTTCCG TCTG G TAACG CG TCCG TG G CG AT AGAACCCCG GCTCCCGCAGG CG GATTTTCCTGAAC A TC A T C A T G A T T TT C A T G A A
ATTG TG ATTG TCG AACATG G CACG G G TATTCATG TG TTTAATG G G CAG CCCTATA CCATCACCG G TGGCACGG TCTGTTTCGTACGCGATCATG ATCGGCATCTGTATGA ACATACCG ATAATCTG TG TCTG ACCAATG TG CTG TATCG CTCG CCG G ATCG ATTTC AG TTTCTCGCCG GGCTGAATCAGTTGCTG CCACAAGAGCTGGATGG GCAGTATCC G TCTCACTG GCGCGTTAACCACAG CG TATTGCAGCAG GTGCGACAG CTG GTTG CA C AG ATG G AACAG CAG G AAG G G G AAAATG ATTTACCCTCG ACCG CCAG TCG CG AG ATCTTG TTTATG C AATTACTG C TC TTG CTG CG TAAAAG C AG TTTG C AG G AG AAC C T G G AAAACAG CG CATCACG TCTCAACTTG CTTCTG G CCTG G CTG G AG G ACCATTTT GCCGATGAG G TG AATTG G G ATG CCG TG G CG G ATCAATTTTCTCTTTCACTG CG TA CG CTACATCG G CAG CTTAAG CAG CAAACG G G ACTG ACG CCTCAG CG ATACCTG A ACCG CCTGCGACTGATGAAAGCCCGACATCTG CTACG CCACAGCGAG GCCAGCG TTACTG ACATCG CCTATCG CTG TG G ATTCAG CG ACAG TAACCACTTTTCG ACG CTT TTTCG CCGAGAG TTTAACTG GTCACCG CG TGATATTCGCCAGGG ACGGG ATGGCT TTC TG C AATAA.
La construcción de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un "marcador de resistencia a antibióticos" o "marcador de selección". Dicho marcador es un fragmento de ADN que contiene un gen cuyo producto confiere resistencia a un antibiótico (por ejemplo, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, estreptomicina, tetraciclina, kanamicina, neomicina) o la capacidad de crecer en medios selectivos (por ejemplo, ura (uracil), leu (leucina), trp (triptófano), his (histidina)). Normalmente, los plásmidos contienen marcadores de resistencia a antibióticos para forzar a la célula bacteriana a mantener el plásmido. En una realización de la invención, la construcción de ADN puede comprender una secuencia de nucleótidos de un marcador de resistencia a la kanamicina. En una realización específica de la invención, la secuencia de nucleótidos para conferir resistencia a la kanamicina comprende la secuencia de SEQ ID 12 (y en donde la secuencia se denomina "KanR" en las Figuras 1 y 3):
ATG AG C C ATATTC AAC G G G AAAC G TC TTG CTC TAG G CC G C G ATTAAATTC C AACA TG G ATG C TG ATTTATATG G G TATAAATG G G C TC G C G ATAATG TC G G G C AATC AG G TG CG ACAATCTATCG ATTG TATG G G AAG CCCG ATG CG CCAG AG TTG TTTCTG AAA C ATG G C AAAG G TAG C G TTG C C AATG ATG TTAC AG ATG AG ATG G TC AG AC TAAACT G G CTG ACG G AATTTATG CCTCTTCCG ACCATCAAG CATTTTATCCG TACTCCTG AT G ATG CATG G TTACTCACCACTG CG ATCCCCG G G AAAACAG CATTCCAG G TATTAG AAG AATATC CTG ATTCAG G TG AAAATATTG TTG ATG C G C TG G C AG TG TTCC TG C G CCGGTTG CATTCG ATTCCTG TTTG TAATTG TCCTTTTAACAG CG ATCG CG TATTTC G TC TCG CTC AG G C G C AATC AC G AATG AATAACG G TTTG G TTG ATG C G AG TG ATTT TG ATG AC G AG C G TAATG G C TG G C C TG TTG AAC AAG TC TG G AAAG AAATG C ATAA ACTTTTG CCATTC TC AC C G G ATTC AG TC G TC AC TC ATG G TG ATTTCTC AC TTG ATA AC C TTATTTTTG AC G AG G G G AAATTAATAG G TTG TATTG ATG TTG G AC G AG TC G G AATCG CAG ACCG ATACCAG G ATCTTG CCATCCTATG G AACTG CCTCG G TG AG TTT TC TC C TTC A TTAC AG A AAC G G C TTTTTC A AA AATA TG G TATTG ATA ATC C TG ATAT G AATAAATTG C AG TTTC ATTTG ATG C TC G ATG A G TTTTTC TAA .
La construcción de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un promotor unido operativamente a la secuencia del ácido nucleico que codifica el marcador de resistencia a antibióticos. Dicho promotor puede aumentar la expresión de los marcadores de resistencia a antibióticos tratados en el párrafo previo. En una realización de la invención, el promotor para resistencia a la ampicilina es un promotor AmpR que no solo es capaz de promover la expresión de marcadores de resistencia a la ampicilina, sino también capaz de promover la expresión de marcadores de resistencia a la kanamicina. En una realización específica de la invención, la secuencia del ácido nucleico del promotor AmpR comprende la secuencia de SEQ ID 13 (y en donde la secuencia se denomina "promotor AmpR" en las Figuras 1 y 3):
C G C G G AAC C C C TATTTG TTTATTTTTC TAAATAC ATTC AAATATG TATC C G C TC AT G A G A C A A TA A C C C T G A T A A A T G C T T C A A T A A T A T T G A A A A A G G A A G A G T
La construcción de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que codifica tanto el terminador rrnB T1 como el terminador rrnB T2. Los terminadores rrnB T1 y T2 son ambos terminadores de la transcripción eficientes en formas aisladas, sin embargo, cuando se usan juntos, los terminadores rrnB T1 y T2 pueden terminar más eficientemente la transcripción.
En una realización específica de la invención, la secuencia de nucleótidos del terminador rrnB T1 comprende la secuencia de SEQ ID 14:
C AA ATAAAAC G AAAG G C TCAG TC G AAAG ACTG G G C CTTTC G TTTTATCTG TTG TT TG TCG G TG AACG CTCTCCTG AG TAG G ACAAAT
En una realización específica de la invención, la secuencia de nucleótidos del terminador rrnB T2 comprende la secuencia de SEQ ID 15:
AGAAGGCCATCCT GACGGAT GGCCTTTT
La construcción de ADN comprende además un origen de replicación pMB1 que es una secuencia de nucleótidos particular en la que se inicia la replicación de ADN. La replicación de ADN puede avanzar desde este punto bidireccionalmente o unidireccionalmente. En una realización específica de la invención, la secuencia del ácido nucleico de pMB 1 comprende la secuencia de SEQ ID 16:
TTTCC ATAG G CTCCG CCCCCCTG ACG AG CATCACAAAAATCG ACG CTCAAG TCAG AG G TG G CG AAACCCG ACAG G ACTATAAAG ATACCAG G CG TTTCCCCCTG G AAG C TCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTT TCTCCCTTCGG GAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACG CTGTAGGTATCTCAGTT CGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCC CG ACCG CTG CGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACAC G ACTTATCG CCACTG G CAG CAG CCACTG G TAACAG G ATTAG CAG AG CG AG G TAT G TAG G CG G TG CTACAG AG TTCTTG AAG TG G TG G CCTAACTACG G CTACACTAG AA G G ACAG TATTTG G TATCTG CG CTCTG CTG AAG CCAG TTACCTTCG G AAAAAG AG T TGG TAG CTCTTG ATCCG G CAAACAAACCACCG CTG G TAG CG G TG G TTTTTTTG TTT G C AA G C AG C A G ATTAC G C G C AG AAA AA AAG G ATC TC A A
En una realización alternativa de la invención, la construcción de ADN es un plásmido de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más de:
promotorrhaBAD,
activador de la transcripción RhaR,
activador de la transcripción RhaS,
un marcador de resistencia a antibióticos,
un promotor unido operativamente al ácido nucleico que codifica el marcador de resistencia a antibióticos, terminador rrnB T1,
terminador rrnB T2, y
• un origen de replicación pMB 1,
en donde la construcción de ADN comprende opcionalmente un sitio de clonación múltiple que comprende 17 sitios de restricción escindibles por las enzimas de restricción EcoRI, NdeI, NotI, XhoI, PspXI, PaeR71, BbsI, StyI, AvrII, BanI, Acc65I, KpnI, Eco53kI, SacI, BamHI, XbaI, SalI, AccI, PstI, SbfI, SphI y HindIII.
En una realización de la invención, el plásmido de expresión desvelado anteriormente comprende una secuencia de nucleótidos que codifica:
promotorrhaBAD,
activador de la transcripción RhaR,
activador de la transcripción RhaS,
un marcador de resistencia a antibióticos,
un promotor unido operativamente al ácido nucleico que codifica el marcador de resistencia a antibióticos, terminador rrnB T1,
terminador rrnB T2, y
un origen de replicación pMB1.
En una realización de la invención, el plásmido de expresión desvelado anteriormente comprende una secuencia de nucleótidos que codifica:
promotorrhaBAD,
activador de la transcripción RhaR,
activador de la transcripción RhaS,
un marcador de resistencia a la kanamicina,
promotor AmpR unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el marcador de resistencia a la kanamicina,
terminador rrnB T1,
terminador rrnB T2, y
origen de replicación pMB1.
En una realización de la invención, el plásmido de expresión desvelado anteriormente comprende secuencias de nucleótidos que codifica:
promotorrhaBADque comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 8,
activador de la transcripción RhaR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 9, activador de la transcripción RhaS que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 11, un marcador de resistencia a la kanamicina que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 12, promotor AmpR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 13,
terminador rrnB T1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 14,
terminador rrnB T2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 15, y
origen de replicación pMB1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 16.
En una realización de la invención, la construcción de ADN es un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 1 y en donde dicha construcción de ADN también se denomina KTXHIS en la presente invención.
La secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab comprende un ácido nucleico que codifica las cadenas pesadas y ligeras de ranibizumab. Ranibizumab es un fragmento de anticuerpo monoclonal (Fab) que es un antiangiogénico que ha sido autorizado para tratar la degeneración macular senil "húmeda", una forma común de la pérdida de visión relacionada con la edad.
En una realización específica de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de ranibizumab comprende la secuencia de SEQ ID 6:
GAAGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGC G TCTG AG CTG TG CAG CAAG CG G TTATG ATTTTACCCATTATG G TATG AATTG G G T1
C G TC AG G CACCG G G TAAAG G TCTG G AATG G G TTG G TTG G ATTAATACCTATACCG G TG AACCG ACCTATG CAG CAG ATTTTAAACG TCG TTTTACCTTTAG CCTG G ATACC AG CAAAAG C ACCG CATATCTG CAG ATG AATAG CCTG CG TG CAG AG G ATACCG CA G TG TATTATTG TG CAAAATATC C G TATTATTAC G G C ACC AG CC ATTG G TATTTCG A TGTTTGGGG TCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCAG CG CAAGCACCAAAGG TCCG AG CG TTTTTCCG CTGG CACCG AGCAG CAAAAGTACCAG CG GTGGCACCGCAGCA CTG G G TTG TCTG G TTAAAG ATTATTTTCCG G AACCG G TTACCG TG AG CTG G AATA GCGGTG CACTGACCAGCGGTGTTCATACCTTTCCGGCAGTTCTGCAGAGCAGCGG TCTG TATAGCCTGAG CAGCGTTGTTACCGTTCCGAGCAGCAG CCTGGG CACCCAG A C C TA TA TTTG TA A TG TTA A TC A TA A A C C G A G C A A TA C C A A A G TG G A TA A A A A A G TG G AAC C G AAAAG C TG C G ATAAAAC C C ATC TG TAA.
En una realización específica de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de ranibizumab comprende la secuencia de SEQ ID 5:
GATATTCAG CTG ACCCAG AG CCCG AG CAG CCTG AG CG CAAG CG TTG G TG ATCG TG TTAC C ATTAC C TG TAG C G C AA G C C A G G A TATTAG C AA TTA TC TG AATTG G TA TC A G C AG AAA C C G G G TAAAG C AC C G AAAG TG CTG ATCTATTTTAC C AG CAG C C TG CAT AG CG GTGTTCCG AG CCG TTTTAG CG G TAG CG G TAG TG G CACCG ATTTTACCCTG A C C ATTAG C AG CC TG C AG CC G G AAG ATTTTG CAAC C TATTATTG TC AG C AG TATAG CACCG TTCC G TG G AC C TTTG G TC AG G G C AC C AAAG TTG AAATTAAAC G TACC G TT G CAG CACCG AG CG TTTTTATCTTTCCG CCTAG TG ATG AACAG CTG AAAAG CG G CA CCG C AAG CG TTG TTTG TC TG C TG AATAAC TTTTATCC G C G TG AAG C AAAAG TTCA G TG G AAA G TTG ATAA TG C AC TG C AG A G C G G TAA TAG C C AA G AA AG C G TTAC C G A AC AG G ATAG C AAAG ATAG C AC C TATAG C C TG AG C AG C AC C C TG AC C C TG AG C AA AG CAG ATTATG AAAAAC A C A AA G TG TATG C C TG C G AA G TTA C C C A TC A G G G TC TG AG C AG TC C G G TTAC C AAAAG TTTTAATC G TG G TG AATG C TAA.
El ácido nucleico que codifica las cadenas pesadas y ligeras de ranibizumab comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señalizador unido operativamente a una cualquiera o ambas de las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de ranibizumab. La secuencia del ácido nucleico que codifica el péptido señalizador puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señalizador PelB. En una realización específica de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señalizador PelB comprende la secuencia de SEQ ID 7:
ATGAAATATCTG CTGCCGACCGCAG CAGCGGG TCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGC
CTGCAATGGCA.
La secuencia de nucleótidos resultante (es decir, el producto de la clonación de una secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab en una construcción de ADN) es preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 17 que también se denomina KTXHIS-PelbLC-PelbHC en la presente invención.
La célula hospedadora bacteriana que se van a usar para producir ranibizumab comprende un cromosoma que tiene una mutación o modificación que desactiva el metabolismo de la ramnosa. La célula hospedadora bacteriana puede ser una célula deE. coli.En una realización preferida, la célula hospedadora bacteriana es una célula K-12 deE. coli,más preferentemente la célula hospedadora bacteriana es una célula W3110 deE. coli.El metabolismo de la ramnosa desactivado se logra por una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica RhaB que inactiva RhaB. Alternativamente, el metabolismo de la ramnosa desactivado se logra usando una célula hospedadora bacteriana que tiene un cromosoma en el que se deleciona la secuencia de nucleótidos que codifica RhaB; esto se puede lograr, por ejemplo, delecionando la secuencia de nucleótidos que codifica RhaB. Preferentemente, el cromosoma de la célula hospedadora bacteriana comprende la secuencia del ácido nucleico que codifica RhaT, es decir, el gen RhaT está intacto.
En una realización de la invención, el metabolismo de la ramnosa desactivado se logra por una mutación de desplazamiento del marco en la secuencia de nucleótidos que codifica RhaB. Dicha mutación da como resultado una célula hospedadora bacteriana que tiene un cromosoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 2:
G TTG G CCCCG CTCCACGCCAGTAGCGACTCGTCCCAG TCGTCGCTATTGATATTG
ACCAG TTGCGTG GTCG TG GCGTTGGTATATTCCCAGTTCATCTTG CCGG TCAGGCG
A T A A C T G A A G T A A T CCGGC A T CAGC AG AGCGTGAGC AA TG TG T G G AATAAG TTC
AG G TTG TTG CTC C G TC AG C G C AC G C AAC TG ATAAAG C G TATTG AAG G G C AG AAA
CTG G ATG CCG CTACG TTG ATAAATATCG CG TTTG CCG AG TTG TTG TTG TG CCTG CG
CCATTAG G CCATTG G TG CG G CTATCG CG ATAAG CAACG G G CAG G CCCACACG CTG
AC C C TG TTG G TCG AG CAG CACAAAG TCCACG CCCCAG G TATCAATCCCAATG CTA
TC G CG ATACG AATCCCTTCCTCG CACACCTTG TTTAATCCAAG G CG AATG G CACTT
TC CAG G CTATCCACATCCCAG G TG ACATAG CCG TTCTG ACTATG CAG CCCATTG TT
AAAACG ATG G ATTTCG CG CAG CG TCAG G CTG CG G CATTCACG CTCG TAACG CG CC
AG CATCACG CG CCCACTG G ATG CG CCG AG ATCG ACG G CG ACACAATTG CG AAAG
G TC ATAA TG TG ATC C TG C TG AATTTC ATTAC G A C C A G TC TA AAA AG C G C C TG AA T
TCGC GACCTTC TCGTTAC TGAC AG G AAAATG G G C C ATTGG C AACC A G G G AA AG A T
GAACGTG A T G AT GTT CAC AATTTG CTG AATTG TG G TG A T GTG ATGCTC A C C .
La célula hospedadora bacteriana que tiene un cromosoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 2 se denomina en la presente invención XdevK.
En una realización de la invención, el método de desarrollo de la célula hospedadora XdevK comprende las etapas de:
a) construir el plásmido pRhaBFS, y
b) construir el mutante de desplazamiento del marco RhaB.
Para construir el plásmido pRhaBFS, los dos cebadores para amplificar por PCR partes del operónrhaBADdel cromosoma de la cepa BL21 deE. coli(nombres de cebadores entre paréntesis) son preferentemente:
• (SBamHI1680 - SEQ ID 19) 5' GTACGCTAGGATCCTGTGGCAGCAACTGATTC 3'
• (BSalI1681 - SEQ ID 20) 5' GTAGATAGGTCGACAGCGATCGTCATTGGGA 3'
La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados en los Ejemplos 1-8 en la siguiente sección de ejemplos no limitativos.
Ejemplos
El Ejemplo 1 se refiere a la construcción de célula hospedadora XdevK.
El Ejemplo 2 se refiere a la construcción del vector de expresión KTXHIS-PelbLC-PelbHC.
El Ejemplo 3 se refiere a las cadenas ligeras y las pesadas de ranibizumab expresadas por el vector de expresión en el Ejemplo 2.
El Ejemplo 4 muestra el título superior de ranibizumab producido según la presente invención cuando se comparó con el título de ranibizumab producido por el método descrito en un documento del estado de la técnica.
El Ejemplo 5 muestra que ranibizumab producido según la presente invención está libre de bacteriófagos.
El Ejemplo 6 es un experimento comparativo que muestra titulabilidad superior de la presente invención cuando se comparó con células hospedadoras y/o plásmidos del estado de la técnica.
El Ejemplo 7 es un experimento comparativo que muestra calidad, pureza y título superiores de la presente invención cuando se comparó con células hospedadoras y/o plásmidos del estado de la técnica.
El Ejemplo 8 es un experimento comparativo que muestra control de expresión superior de la presente invención cuando se comparó con células hospedadoras y/o plásmidos del estado de la técnica.
Ejemplo 1 - Desarrollo de cepas
La célula hospedadora XdevK es un derivado de W3310 deE. colicon un desplazamiento del marco en la copia cromosómica de RhaB que lo hace incapaz de utilizar la ramnosa como fuente de carbono. La célula hospedadora XdevK se desarrolló como cepa para un sistema inducible de ramnosa, donde la secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab se clona en el plásmido KTXHIS y se expresa bajo el control de un promotor inducible de ramnosa.
La cepa de partida para la célula hospedadora XdevK era W3110 deE. coliy un método de producción similar de la célula hospedadora XdevK se describe en Wilms et al. en la sección titulada "Construction of the Production Strain E. coli BW3110" [3].
El método de desarrollo de la célula hospedadora XdevK comprende las etapas de:
c) construir el plásmido pRhaBFS, y
d) construir el mutante de desplazamiento del marco RhaB.
Etapa (a) - Construcción del plásmido pRhaBFS:
Los siguientes dos cebadores se usaron para amplificar por PCR partes del operónrhaBADdesde el cromosoma de la cepa BL21 deE. coli(nombres de cebadores entre paréntesis):
• (SBamHI1680) 5' GTACGCTAGGATCCTGTGGCAGCAACTGATTC 3'
• (BSal11681) 5' GTAGATAGGTCGACAGCGATCGTCATTGGGA 3'
El producto de PCR se purificó y dirigió con BamHI y Sal I y se ligó en un plásmido pLemo (tal como pLemo descrito en el documento de patente US8138324) que había sido digerido con BamHI y Sal I. El plásmido pLemo con la inserción se digirió entonces con ClaI. El digesto se incubó con T4 polimerasa para hacer romos los extremos y entonces se ligó. El plásmido pLemo resultante con la región genómica del operónrhaBADinsertada con dos bases adicionales se incubó con BamHI y SalI. El fragmento que contenía la región genómica del operónrhaBADcon 2 bases adicionales se purificó y ligó con el plásmido pmak705 digerido con BamHI y SalI. El plásmido resultante de la ligación se llamó pRhaBFS y la secuencia se verificó por secuenciación.
Etapa (b) - Construcción del mutante de desplazamiento del marco RhaB.
Se transformaron células W3110 deE. colicon el plásmido de sustitución de gen pRhaBFS y a continuación se sembró en agar LB vegitone que contenía cloranfenicol (20 |jg/ml) y se incubó a 30 °C durante 20 horas. Se recogió una única colonia y se dispuso en LB vegitone y se cultivó a 30 °C hasta que la DO<600>alcanzó 0,5. Se transfirieron 5 |jl del cultivo a una placa de agar LB vegitone que contenía cloranfenicol (20 |jg/ml) y se incubó a 43 °C durante 16 horas. Las colonias se probaron para la inserción correcta en el cromosoma usando PCR. Las colonias con inserción correcta se cultivaron tres veces en LB vegitone que contenía cloranfenicol (20 jg/m l) hasta la saturación y a continuación se dejaron crecer durante 20 horas en LB vegitone. A continuación, se sembró un j l sobre una placa de LB vegitone. La placa de LB vegitone se usó como plantilla para replicar la siembra en placa de agar McConkey complementado con 1 % de ramnosa para verificar que las células no pueden utilizar ramnosa como fuente de carbono. Se recogió una colonia y se hizo crecer en LB vegitone (Sigma) y a continuación se tomaron alícuotas y se llamó la cepa de expresión XdevK. La copia cromosómica del genrhaBde XdevK se amplificó por medio de PCR. El producto de PCR se secuenció y se confirmó la inserción correcta de dos bases (CG) (véanse subrayadas las bases CG en SEQ ID 2):
GTTGGCCCCGCT CC ACGCC AG T AGCGACTCGTCCC AG TCGTCGCT ATTG AT ATTG
ACCAG TTGCGTG GTCG TG GCGTTGGTATATTCCCAGTTCATCTTG CCGG TCAGGCG
ATA AC TG AA G TAATC C G G C ATC AG C AG AG C G TG AG C AATG TG TG G AATAAG TTC
AG G TTG TTG C TC C G TC AG C G C AC G C AAC TG ATAAAG C G TATTG AAG G G C AG AAA
CTG G ATG CCG CTACG TTG ATAAATATCG CG TTTG CCG AG TTG TTG TTG TG CCTG CG
CCATTAGG CCATTG G TG CG G CTATCG CG ATAAG CAACG G G CAG G CCCACACG CTG
ACCCTG TTG G TC G AG C AG C AC AAAG TC CAC G C CC C AG G TATC AATC C C AATG C TA
TC G CG ATACG AATCCCTTCCTCG CACACCTTG TTTAATCCAAG G CG AATG G CACTT
TC CAG G CTATCCACATCCCAG G TG ACATAG CCG TTCTG ACTATG CAG CCCATTG TT
AAAACG ATG G ATTTCG CG CAG CG TCAG G CTG CG G CATTCACG CTCG TAACG CG CC
AG CATCACG CG CCCACTG G ATG CG CCG AG ATCG ACG G CG ACACAATTG CG AAAG
G TC ATAA TG TG ATC C TG C TG AATTTC ATTAC G A C C A G TC TA AAA AG C G C C TG AA T
TC G C G AC C TTC TC G TTAC TG AC AG G AAAATG G G C C ATTG G C AACC AG G G AAAG AT
G AAC G TG ATG ATG TTCAC AATTTG C TG AATTG TG G TG ATG TG ATG C TCAC C
Ejemplo 2 - KTXHIS-PelbLC-PelbHC
El péptido señalizador PelB que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 7 se fusionó delante de los ácidos nucleicos que codificaban tanto las cadenas ligeras como las pesadas de ranibizumab y a continuación se clonaron en el plásmido de expresión KTXHIS. La secuencia de nucleótidos resultante comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID 17 y se denomina KTXHIS-PelbLC-PelbHC en la presente invención. Además, el mapa de plásmido de KTXHIS-PelbLC-PelbHC se ilustra en la Figura 3.
La secuencia de nucleótidos de SEQ ID 17 se desvela a continuación y la secuencia del ácido nucleico que codifica la cadena ligera fusionada con la secuencia señalizadora PelB está subrayada y la secuencia del ácido nucleico que codifica la cadena pesada fusionada con la secuencia señalizadora PelB está en negrita (véase también la Figura 3 para la disposición de PelB con respecto a cadenas ligeras y pesadas de ranibizumab): ATCTTTCTGCGAATTGAG ATGACG CCACTGG CTGG GCGTCATCCCGGTTTCCCG G G TA A AC AC C AC C G AA AA ATAG TTA C TA TC TTC AAA G C C AC ATTC G G TC G AA ATAT CACTG ATTAACAG G CG G CTATG CTG G AG AAG ATATTG CG CATG ACACACTCTG AC CTG TCG CAG ATATTG ATTG ATG G TCATTCCAG TCTG CTG G CG AAATTG CTG ACG C AAAACG CG CTC AC TG C AC G ATG C CTC ATC AC AAAATTTATC C AG CG CAAAG G G AC TTTTCAGGCTAGCCGCCAGCCGGGTAATCAGCTTATCCAGCAACG TTTCGCTGGA TG TTG G CG G CAACG AATCACTG G TG TAACG ATG G CG ATTCAG CAACATCACCAAC TG CCCG AACAG CAACTCAG CCATTTCG TTAG CAAACG G CACATG CTG ACTACTTT CATG CTCAAG CTGACCAATAACCTGCCGCGCCTGCGCCATCCCCATGCTACCTAA GCGCCAGTGTGGTTGCCCTGCGCTGGCGTTAAATCCCGGAATCGCCCCCTGCCAG TC AAG ATTC A G C TTC AG AC G C TC C G G G C AATAAATAATATTC TG C AAAAC C AG AT C G TTAAC G G AAG C G TAG G AG TG TTTATC ATC AG C ATG AATG TAAAAG AG ATC G C C ACGGGT A ATG CG AT AAGGGCGATCG TT GAGT AC AT GC AGGCC ATTACCGCGCCA G AC AATC AC C AG C TC AC AAAAATC ATG TG TATG TTC AG C AAAG AC ATC TTG C G G A TAACG G TCAG CCACAG CG ACTG CCTG CTG G TCG CTG G CAAAAAAATCATCTTTG A G A A G TTTT A ACT G AT GCGCC ACCGTGGCT ACCTCGGCC AG AG AAC G AAG TTG A T T ATTC G C AATATG G C G TAC AAATAC G TTG AG AAG ATTC G C G TTATTG C AG AAAG C C ATCCCG TCCCTG G CG AATATCACG CG G TG ACCAG TTAAACTCTCG G CG AAAAAG C G TCG AAAAG TG G TTACTG TCG CTG AATCCACAG CG ATAG G CG ATG TCAG TAACG C TGGCCTCGCTGTGGCGTAGCAGATGTCGGGCTTTCATCAGTCGCAGGCGGTTCAG GTATCGCTGAGGCGTCAGTCCCGTTTGCTGCTTAAGCTGCCGATGTAGCGTACGC AG TG AAA G AG AAA ATTG ATC C G C C AC G G C ATC C C AATTC AC C TCATCG G C AAAAT G G TCCTCCAGCCAGGCCAGAAGCAAGTTGAG ACGTGATG CG CTGTTTTCCAGGTT C TCC TG C AAAC TG C TTTTACG CAG C AAG AG C AG TAATTG C ATAAAC AAG ATC TC G CGACTGGCGG TCG AGGG TAAATCATTTTCCCCTTCCTGCTGTTCCATCTG TG CAAC CAG CTG TCGCACCTGCTG CAATACGCTGTGG TTAACGCGCCAGTGAGACGG ATAC TG CCCATCCAG CTCTTG TG G CAG CAACTG ATTCAG CCCG G CG AG AAACTG AAATC G ATCCG G C G AG C G ATACAG C AC ATTG G TC AG AC AC AG ATTATC G G TATG TTC ATA C AG ATG CCG ATCATG ATCG CG TACG AAACAG ACCG TG CCACCG G TG ATG G TATA GGG CTG CCCATTAAACACATG AATACCCG TG CCATG TTCG ACAATCACAATTTCA TGAAAATCATG ATGATG TTCAG GAAAATCCGCCTG CG GGAGCCG GGGTTCTATCG CCACG G ACG CG TTACCAG ACG G AAAAAAATCCACACTATG TAATACG G TCATACT GGCCTCCTGATGTCGTCAACACGGCGAAATAGTAATCACGAGGTCAGGTTCTTAC C TTAAATTTTC G AC G G AAAAC C AC G TAAAAAAC G TC G ATTTTTCAAG ATAC AG C G TG AATTTTCAG G AAATG CG G TG AG CATCACATCACCACAATTCAG CAAATTG TG A ACATCATCACG TTCATCTTTCCCTGGTTGCCAATGGCCCATTTTCTTGTCAGTAAC GAGAAGGTCGCGAATCCAG GCGCTTTTTAG ACTGGTCGTAATG AAATTCAGGAG G A A TTC C 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C TTTTA A A TTA A A A A TG A A G TTTTA A A TC A A TC TA A A G TA TA TA TG A G TA A A C T TGGTCTGAC AGTT AG AA A A ACTC ATCGAGCATC A A ATG A A ACTGCA ATTT ATTCA T ATC AG G ATT ATC A A T ACC AT ATTTTTG A A A AAGCCGTTTCTGT AATG AAG G AG A A A A C IC ACCGAGGCAG l'TCC A l A G G A IG G C A A G A T C C IG G T A I CGGTCTGCGA í 1' CCG ACTCG TCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCG TCAAAAATAAG G T TATC AA G TG AG AAA TC A C C A TG AG TG A C G AC TG AA TC C G G TG AG A ATG G C A AAA G TTTATG CATTTCTTTCCAG ACTTG TTCAACAG G CCAG CCATTACG CTCG TCATCA AAATCAC TC G C ATC AAC C AAAC C G TTATTCATTC G TG ATTG C G C CTG AG C G AG AC G AAATAC G C G ATC G C TG TTA AA AG G A C AATTAC A AAC A G G AA TC G AATG C A AC C G G C G C AG G AAC AC TG C CAG C G C ATC AACAATATTTTCAC CTG AATC AG G ATATTC TTCTAATACCTG G AATG CTG TTTTCCCG G G G ATCG CAG TG G TG AG TAACCATG CA TC ATC AG G AG T ACG G AT AA AA TG C TTGATGGTC GGAAGAGGC A TA A A T T C CGTC A G CCAG TTTAG TCTG ACCATCTCATCTG TAACATCATTG G CAACG CTACCTTTG CCA TG TTTCAG 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Ejemplo 3 - Proteína recombinante - ranibizumab
La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de ranibizumab expresada por el vector de expresión KTXHIS-PelbLC-PelbHC comprende la secuencia de SEQ ID 3:
D1QLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNW YQQKPGKAPKVL1YFTSSLHSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QYSTVPW TFG QGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQ LKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQ W KVDNALQ SG NSQ ESVTEQ DSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ G LSSPVTKSFNRG EC
La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de ranibizumab expresada por el vector de expresión KTXHIS-PelbLC-PelbHC comprende la secuencia de SEQ ID 4:
EVQ LVESG G G LVQ PG G SLR LSC AASG YDFTH YG M N W VRQ APG KG LEW VG W IN TYT G E PTYA AD FKR R FTFSLD TSKSTAYLQ M N SLR AED TAVYYC AKYPYYYG TSH W YFD VW GQG TLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
D K TH L
Además, el péptido señalizador PelB resultante comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID 18 [6]: MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA
Ejemplo 4 - Título superior de ranibizumab producido según la presente invención en comparación con el título del estado de la técnica
Se produjeron 3 lotes diferentes que comprenden ranibizumab según el método descrito a continuación.
Se preparó medio mínimo y se inoculó con cultivo durante la noche de la célula hospedadora XdevK que comprende el vector de expresión KTXHIS-PelbLC-PelbHC de un matraz oscilante. La temperatura de fermentación se estableció en 30 °C y los cultivos se cultivaron durante 22 h en fase discontinua. Esta fase fue seguida de una fase de crecimiento durante 10 h. La temperatura se ajustó a 28,5 °C y la tasa de crecimiento se redujo entonces controlando la alimentación de glucosa. El cultivo se indujo con 500 |<j>M de ramnosa inyectados en el fermentador. La alimentación de glucosa también se complementó con ramnosa para la inducción continua durante toda la fase de inducción. El material se recogió después de 36 h de inducción. El tiempo de fermentación total fue 68 h y el volumen recogido fue 8530 ml.
Después de la recogida, se homogeneizaron todo el material, medios y células. Se almacenaron 5500 ml en -80 °C y se clarificaron 3000 ml y se lavaron usando TFF. Las células se lavaron con un volumen de tres veces el volumen inicial para la elevada liberación del producto. El producto resultante que comprende ranibizumab se purificó usando cromatografía de afinidad en capto L que también es el método de cromatografía usado en Kumaret al.
[4](véanse las secciones 2.4 y 3.2 en Kumaret al.)y luego se determinó la concentración de ranibizumab purificado.
El primer, segundo y tercer lotes comprendieron un título de ranibizumab de 531 mg/l, 487 mg/l y 518 mg/l, respectivamente.
Como comparación, en el documento del estado de la técnica Kumaret al.(que desvela métodos de purificación similares), el título de ranibizumab varía de 5 mg/l a 25 mg/l como se indica en la Figura 6 y el Resumen de este documento [4].
Por consiguiente, el método según la presente invención (así como el uso de células hospedadoras XdevK y el vector de expresión KTXHIS-PelbLC-PelbHC) proporciona niveles inesperadamente altos del título de ranibizumab cuando se compara con los métodos del estado de la técnica.
Ejemplo 5 - Banco de células
XdevK se transformó con KTXHIS-PelbLC-PelbHC. Se recogió una única colonia y se hizo crecer en medio de biorreactor definido (DBM) durante la noche, al día siguiente se añadió glicerol al 20 %, el cultivo se tomó en alícuotas y se almacenó a -80 °C. Se usó una alícuota (50 |jl) para inocular 100 ml de medio de biorreactor definido (DBM) y se cultivó durante 24 h a 30 °C, la temperatura se desplazó a 35 °C y las células se cultivaron durante 6 h adicionales para aumentar la DO. DO A600nm = 4,44. Se añadió glicerol al 20 %, el cultivo se separó en alícuotas (alícuotas de 100 j l) y se congelaron a -80 °C como RCB100.
Se enviaron alícuotas de la cepa para la prueba de fagos y la prueba de pureza microbiana en Charles River Laboratories. El informe indicaba: "Se concluyó que RCB100 está libre de bacteriófagos cuando se somete a pruebas tanto para profagos lisogénicos como para bacteriófagos libres. El límite del número de bacteriófagos libres es inferior a 1 unidad formadora de placa por ml de cultivo durante la noche".
Ejemplo 6 - Experimentos comparativos que muestran titulabilidad superior
Materiales y métodos
Se usaron las tres siguientes cepas en los experimentos comparativos:
1. Células hospedadoras XdevK descritas en el Ejemplo 1 anterior; en otras palabras, es una cepa que:
o tiene un acervo de cepa W3110 que tienen un genotipo de: F-, A-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1); o es un derivado de la cepa K y contiene una mutación en el gen RhaB, que lo hace incapaz de degradar ramnosa y usar ramnosa como fuente de carbono.
2. XB210 descrito en Hjelmet al.[2] que:
o es una cepa de BL21 (DE3) que tiene un genotipo: F- dompt hsdSB (rB-, mB-) gal dcm (DE3)); o es un derivado de la cepa B y contiene una mutación en el gen RhaB y una deleción del gen transportador de ramnosa (RhaT), que lo hace incapaz de transportar activamente, degradar ramnosa y usar ramnosa como fuente de carbono;
o contiene partes del profago DE3 insertado en el cromosoma y no expresa la proteasa lon o la proteasa OmpT; y
3. MG1655 descrito en Giacaloneet al.[5] que es una cepa K natural deE. coli.
Se usaron los cuatro siguientes plásmidos de expresión para expresar la secuencia del ácido nucleico para ranibizumab, es decir, se clonaron secuencias que codifican las cadenas pesadas y ligeras de ranibizumab en los siguientes plásmidos de expresión:
1. KTXHIS;
2. pRha109A descrito en Giacaloneet al.[5];
3. pRha67A descrito en Giacaloneet al.[5]; y
4. pRha67K descrito en Hjelmet al.[2].
Los vectores de expresión resultantes se confirmaron por secuenciación completa.
Además, los vectores de expresión resultantes se introdujeron en las cepas XdevK, XB201 y MG1655 (es decir, las células hospedadoras) para probar las diferentes combinaciones de cepas y plásmidos para entender la influencia sobre la titulabilidad, título, calidad y control de expresión.
Configuración experimental para las comparaciones de titulabilidad
Los vectores de expresión que comprenden las cadenas pesadas y ligeras de ranibizumab se transformaron en XdevK, XB201 y MG1655 usando protocolos convencionales. Se prepararon cultivos durante la noche inoculando una única colonia en 3 ml de medio líquido LB-veg que contenía l0o |jg/ml de ampicilina o 50 |jg/ml de kanamicina dependiendo de la construcción. Los cultivos se incubaron en un tubo Falcon de 15 ml a 37 °C con agitación durante 16 horas. A continuación, los cultivos se diluyeron por retroceso (1:50) en 5 ml de LB-veg más antibióticos en una placa de crecimiento de 24 pocillos, y se incubaron como antes hasta que se alcanzó una DO600 de aproximadamente 0,3-0,5. La expresión se indujo mediante la adición de ramnosa 5, 50, 100, 250, 500, 5000 jM y siguió una incubación durante 5 horas a 30 °C con agitación. Se recogió un volumen de células correspondientes a una DO600 de 0,2 unidades, se resuspendieron en 20 j l de 2x tampón de carga Laemlli, se hirvieron durante 5 min después de que se analizaron 7,5 j l por 12 % de mini SDS-PAGE. A continuación, el gel se transfirió inmediatamente a una membrana de nitrocelulosa/PVDF y se sondó usando anticuerpo anti-Fab para el análisis de transferencia Western.
Resultados y discusión - titulabilidad
Las Figuras 4a, 4b, 4c y 4d muestran las transferencias Western para las comparaciones de titulabilidad. Cada uno de los carriles de control se carga con ranibizumab purificado.
La Figura 4a muestra:
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC; y
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa XdevK en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha67K (67K).
La Figura 4b muestra:
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa XB201 en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha67K (67K); y
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa XdevK en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha67A (67A).
La Figura 4c muestra:
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa XdevK en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha109A (109A); y
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa MG1655 en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha67A (67A).
La Figura 4d muestra:
• repetición del experimento que muestra la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa XdevK en combinación con KTXHlS-PelbLC-PelbHC para visualizar la titulabilidad en el uso combinado de XdevK y la configuración KTXHIS-PelbLC-PelbHC.
Las Figuras 4a, 4b, 4c y 4d muestran clara e inequívocamente que la configuración con XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC tiene un efecto técnico superior a las otras configuraciones cuando se compara la titulabilidad debido a que:
• la expresión de ranibizumab aumenta gradualmente para cada adición de XdevK/KTXHIS-PelbLC-PelbHC de ramnosa 5, 50, 100, 250, 500, 5000 |<j>M; y
• la expresión de ranibizumab no aumenta gradualmente en ninguna otra combinación - véase, por ejemplo la combinación de XB201/67K que da lugar a un "hombro", es decir, aumento gradual, pero luego disminución gradual.
Además, las Figuras 4a, 4b, 4c también muestran que las células que albergan los vectores de expresión basados en los plásmidos pRha109A o pRha67A acumularon muy poco ranibizumab, al menos 100 veces menos que las otras configuraciones usando KTXHIS-PelbLC-PelbHC o el vector de expresión basado en el plásmido pRha67K (en donde dicho cambio en veces se observó comparando la cantidad de control positivo cargada).
Se debe observar que las combinaciones de:
• MG1655 y los vectores de expresión basados en el plásmido pRha109A (véase la Figura 6),
• MG1655 y los vectores de expresión basados en el plásmido pRha67K (véase la Figura 7b),
• MG1655 y KTXHIS-PelbLC-PelbHC (véase la Figura 7b),
no dieron lugar a la producción detectable de ranibizumab y, por lo tanto, no se realizaron experimentos de titulabilidad para dichas combinaciones.
Por tanto, en conclusión, XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC proporciona una titulabilidad superior en comparación con las configuraciones conocidas del estado de la técnica. Por lo tanto, esto permite un ajuste preciso de las tasas de producción de ranibizumab y, por lo tanto, las tasas de producción de ranibizumab pueden establecerse con precisión y establemente.
Ejemplo 7 - Experimentos comparativos que muestran calidad y título superiores
Configuración experimental para los experimentos de título y calidad
Los vectores de expresión que comprenden las cadenas pesadas y ligeras de ranibizumab se transformaron en XdevK, XB201 y MG1655 usando protocolos convencionales para producir un banco de células de investigación (RCB) de combinación respectiva de cepa y plásmido. Se inoculó un precultivo (en matraz oscilante) de un único vial de RCB y se hizo crecer durante la noche (O/N) en medios de reactor definidos; dihidrogenofosfato de potasio (KH<2>PO<4>) 4,5 g/l, hidrogenofosfato de dipotasio (K<2>HPO<4>) 3,0 g/l, sulfato de amonio ((NH4)2SO4) 3,75 g/l, citrato de tri-sodio dihidratado (HOC(COONa)(CH<2>COONa)<2 2>H<2>O) 1,88 g/l, cloruro de hierro (III) hexahidratado (FeCl3-6H2O) 0,0525 g/l, sulfato de cinc heptahidratado (ZnSO4-7H2O) 0,0158 g/l, sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4-5H2O) 0,00397 g/l, sulfato de manganeso monohidratado (MnSO4-1H2O) 0,0198 g/l, cloruro de calcio dihidratado (CaCh-2H2O) 0,0207 g/l, añadir 17,1 ml de disolución estéril de glucosa al 60 % (v/p), 2,432 ml de MgSO4-7H2O 2,5 M, 1 ml de 50 mg/ml de disolución de kanamicina.
El pH se ajustó añadiendo 1,5 ml de disolución al 25 % de hidróxido de amonio (hasta aprox. 6,95). Se preparó un fermentador de caja DAS con medios de reactor definidos y se inoculó con precultivo O/N. El crecimiento de las células se controló alimentando el cultivo con glucosa estéril al 60 % (v/p). La fase de producción se inició mediante la adición de ramnosa como inductor. Si fuera necesario, el perfil de alimentación se ajustó y se añadieron sales al cultivo. Las células se recogieron después de 20-42 h de inducción seguido por purificación discontinua. Las muestras recogidas se añadieron a una placa de microtitulación de pocillos profundos de 96 pocillos que contenía pocillos con agua previamente congelada para garantizar el enfriamiento de la muestra. Se llenaron los pocillos vacíos con agua MilliQ (MQ). La sonicación se realizó usando una sonda de 24 elementos en un dispositivo Vibra-Cell de Sonics durante 3 ciclos de 20 s cada uno a una amplitud de 40 % con una pausa de 30 s entre ciclos. Las muestras sonicadas se transfirieron a tubos de centrifugación de 2 ml y se centrifugaron durante 20 min a 20.000 x g a 4 °C en una centrifugadora 5430 R. El sobrenadante se retiró cuidadosamente pipeteando y se añadió a una suspensión al 50 % de la resina de afinidad Capto L previamente equilibrada. El equilibrado se había realizado tres veces con fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 (EQ). Se usaron 1,9 ml de sobrenadante para cargar 100 j l de suspensión Capto L, que corresponde a una tasa de carga de 9,5 ml/ml de resina. El sobrenadante y la resina se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente (TA) mientras se agitaba a 1500 rpm en una ThermoMixer C seguido de centrifugación durante 1 min a 2000 x g a TA. Los sobrenadantes se desecharon. La resina se lavó dos veces añadiendo 500 j l de EQ y separando la resina por centrifugación a 2000 x g, como antes. Durante la tercera etapa de lavado usando 300 j l de EQ, la resina se transfirió a copas giratorias de filtro de acetato de celulosa adecuadas para 400 j l y se centrifugaron como antes. La cuarta etapa de lavado se realizó con 150 j l de EQ. Las copas giratorias se transfirieron a nuevos tubos de recogida y se realizó la elución con acetato sódico 50 mM a pH 3,0 en tres ciclos usando 0,4 j l de por j l resina en total (por ejemplo 3 * 40 j l para 50 j l de suspensión usada).
La concentración de proteína en los eluatos se analizó usando una configuración de HPLC de afinidad. La calidad de las muestras se analizó por SDS-PAGE y SCX-HPLC.
Resultados y discusión para los experimentos de título y calidad
Las muestras se analizaron usando SDS-PAGE como se ilustra en la Figura 5. No se pudieron detectar diferencia de calidad detectable, ningún aumento en el patrón de bandas o aumento de las cantidades de cadena ligera o cadena pesada libres. Sin embargo, la configuración usando la cepa XdevK en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha67A dio muy poco material y no se pudo detectar ninguna banda. Además, la configuración usando la cepa XdevK en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha109A creció muy poco y, por lo tanto, se recogió después de un tiempo de inducción más corto (de 20 horas mientras que todas las otras muestras se recogieron después de 42 horas).
La cantidad de material producido se evaluó usando HPLC de afinidad y se resume en la Figura 6 que indica claramente que la configuración que produjo el mayor rendimiento era la cepa XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC.
La calidad del material purificado del lote se evaluó con SCX-HPLC y se resume en la Tabla 1. El material analizado a partir de la configuración con la cepa XdevK en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha67A no es fiable, puesto que esta configuración produce tan poco material que es difícil para analizar. El material de la configuración con la cepa XdevK en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha109A se recogió después de un tiempo de inducción más corto, puesto que las células crecieron muy lentamente en comparación con las otras células. Los datos de SCX HPLC resumidos en la Tabla 1 muestran claramente que la calidad del material producido en y purificado de la cepa XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC es de pureza superior (es decir, calidad) en comparación con las otras configuraciones.
Tabla 1. Resumen de los datos de pureza por SCX HPLC.
Por tanto, en conclusión, la cepa XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC es superior en comparación con las otras configuraciones, tanto en la calidad del ranibizumab producido como el rendimiento del ranibizumab producido.
Ejemplo 8 - Experimentos comparativos que muestran control de expresión superior
Configuración experimental para evaluar el control de expresión
Se transformaron los vectores de expresión que comprendían las cadenas pesadas y ligeras de ranibizumab en XdevK y MG1655 usando protocolos convencionales. Los cultivos durante la noche se prepararon inoculando una única colonia en 3 ml de medio líquido LB-veg que contenía 100 |jg/ml de ampicilina o 50 |jg/ml de kanamicina dependiendo del plásmido usado. Los cultivos se incubaron en un tubo Falcon de 15 ml a 37 °C con agitación durante 16 horas. A continuación, los cultivos se diluyeron por retroceso (1:50) en 5 ml de LB-veg más antibióticos en una placa de crecimiento de 24 pocillos, y se incubaron como antes hasta que se alcanzó una DO600 de aproximadamente 0,3-0,5 y se analizaron diferentes condiciones de expresión. Se cultivó un conjunto de cultivos en presencia de glucosa al 0,2 %. La expresión se indujo mediante la adición de ramnosa 250 jM en un subconjunto de los cultivos y se incubaron a 30 °C con agitación. Se recogió un volumen de células correspondiente a una DO600 de 0,2 unidades (centrifugado) después de 24 horas, se resuspendió en 20 j l de 2x tampón de carga Laemlli, se hirvió durante 5 min y se analizó (7,5 j l) por 12 % de mini SDS-PAGE. A continuación, el gel se transfirió inmediatamente a una membrana de nitrocelulosa/PVDF y se sondó usando anticuerpo anti-Fab.
Resultados y discusión para el control de expresión
Las Figuras 7a, 7b y 7c muestran las transferencias Western para la comparación del control de expresión. Cada uno de los carriles de control se carga con ranibizumab. Las muestras en el carril 1 de cada configuración se cultivaron en presencia de glucosa al 0,2 % y se indujeron con ramnosa 250 jM . Las muestras en el carril 2 de cada configuración se hicieron crecer en presencia de glucosa al 0,2 %. Las muestras en el carril 3 de cada configuración se indujeron con ramnosa 250 jM . Las muestras en el carril 4 de cada configuración se cultivaron sin adiciones.
La Figura 7a muestra:
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC; y
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa XdevK en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha67K (67K); y
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa XdevK en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha67A (67A).
La Figura 7b muestra:
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa XdevK en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha109A (109A);
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa MG1655 en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC;
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa MG1655 en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha67K (67K).
La Figura 7c muestra:
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa MG1655 en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha67A (67A); y
• la acumulación de ranibizumab expresado en la cepa MG1655 en combinación con el vector de expresión basado en el plásmido pRha109A (109A).
Cuando la acumulación de ranibizumab se compara entre las diferentes configuraciones en las Figuras 7a-7c, es evidente que la mayor expresión de ranibizumab, inducida mediante la adición de ramnosa 250 |<j>M como se indica en los carriles 3, se detectó en la cepa XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC.
Es interesante señalar que, como se indica en los carriles 3 en las Figuras 7b y 7c, ninguna de las configuraciones que implica a la cepa MG1655 produjo la expresión visible de ranibizumab.
Además de las configuraciones que produjeron la expresión de ranibizumab en los carriles 3 (es decir, las configuraciones en las que se usó la cepa XdevK), la cepa XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC produjo la menor expresión de ranibizumab cuando se hizo crecer en presencia de glucosa al 0,2 % como se indica en los carriles 2. Esto indica que la cepa XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC es menos propensa a la expresión defectuosa en ausencia de inductor. La expresión defectuosa puede tener un efecto negativo sobre el crecimiento de las células que conducen a un menor rendimiento global. La expresión defectuosa también puede afectar a la calidad del material producido que conduce a una mezcla de diferentes especies de la proteína acumulada expresada que puede ser problemática de manipular en la etapa aguas abajo de la purificación y, por lo tanto, conducen a un menor rendimiento y un proceso de purificación complicado.
Por tanto, el control de expresión de ranibizumab en la cepa XdevK en combinación con KTXHIS-PelbLC-PelbHC es superior cuando se compara con las otras configuraciones.
En conclusión, los resultados experimentales mostrados en los Ejemplos 4, 6, 7 y 8 demuestran que la presente invención proporciona los siguientes efectos ventajosos e inesperados cuando se comparan con los vectores de expresión del estado de la técnica y/o células hospedadoras y, por lo tanto, en particular es adecuada para la producción industrial de ranibizumab
• titulabilidad superior (Ejemplo 6);
• pureza y calidad superiores (Ejemplo 7);
• título superior (Ejemplos 4, 7 y 8); y
• control de expresión superior (Ejemplo 8).
Referencias
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4. Kumar, D. et al. QbD Based Media Development for the Production of Fab Fragments in E. coli. Bioengineering 2019; 6, 29.
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7. Sandomenico A. et al. Evolution of Escherichia coli Expression System in Producing Antibody Recombinant Fragments. Int. J. Mol. Sci. 2020: 21:6324

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Construcción de ADN para expresar ranibizumab en una célula hospedadora bacteriana, en donde ranibizumab comprende (i) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 3, y (ii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 4, en donde dicha construcción de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab, en donde dicha construcción de ADN comprende además al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señalizador que está unido operativamente en la dirección de transcripción a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de ranibizumab y/o la cadena pesada de ranibizumab,
en donde dicha construcción de ADN comprende además secuencias de nucleótidos que codifican:
- promotorrhaBAD,
- activador de la transcripción RhaR,
- activador de la transcripción RhaS,
- un marcador de resistencia a antibióticos,
- un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el marcador de resistencia a anti bióticos
- terminador rrnB T1
- terminador rrnB T2, y
- un origen de replicación pMB1.
2. Construcción de ADN según la reivindicación 1, en donde
- el marcador de resistencia a antibióticos es un marcador de resistencia a la kanamicina, preferentemente a marcador de resistencia a la kanamicina que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 12 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
- el promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el marcador de resistencia a antibióticos es un promotor AmpR, preferentemente un promotor AmpR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 13 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
- el terminador rrnB T1 comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID 14 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma;
- el terminador rrnB T2 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 15 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma; y/o
- el origen de replicación pMB1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 16 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma.
3. Construcción de ADN según la reivindicación 1 o 2, en donde
- el marcador de resistencia a antibióticos es un marcador de resistencia a la kanamicina que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 12;
- el promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el marcador de resistencia a antibióticos es un promotor AmpR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 13;
- el terminador rrnB T1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 14;
- el terminador rrnB T2 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 15; y/o
- el origen de replicación pMB1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 16.
4. Construcción de ADN según la reivindicación 1 o 2, en donde:
- el promotorrhaBADcomprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 8 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 8;
- el activador de la transcripción RhaR comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 9 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 9;
- el activador de la transcripción RhaS comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 11 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 11;
- el marcador de resistencia a antibióticos es un marcador de resistencia a la kanamicina que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 12 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 12;
- el promotor AmpR comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 13 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 13;
- el terminador rrnB T1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 14 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 14;
- el terminador rrnB T2 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 15 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 15; y
- el origen de replicación pMB 1 comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 16 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 16.
5. Construcción de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab está unida operativamente al promotorrhaBAD.
6. Construcción de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de ranibizumab que comprende la secuencia de SEQ ID 5 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, y/o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de ranibizumab que comprende la secuencia de SEQ ID 6 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma.
7. Construcción de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica ranibizumab comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de ranibizumab que comprende la secuencia de SEQ ID 5, y/o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de ranibizumab que comprende la secuencia de SEQ ID 6.
8. Construcción de ADN según la reivindicación 7, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señalizador está unida operativamente en la dirección de transcripción a una cualquiera o ambas de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID 5 y SEQ ID 6.
9. Construcción de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el péptido señalizador es PelB.
10. Construcción de ADN según la reivindicación 9, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señalizador PelB comprende la secuencia de SEQ ID 7 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señalizador PelB comprende la secuencia de SEQ ID 7.
11. Construcción de ADN según la reivindicación 9 o 10, en donde dicha construcción de ADN comprende la secuencia de SEQ ID 17 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente comprende una secuencia de SEQ ID 17.
12. Vector de expresión que comprende la construcción de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 11.
13. Célula hospedadora bacteriana que comprende la construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o el vector de expresión según la reivindicación 12, en donde dicha célula hospedadora bacteriana es preferentemente una célula deEscherichia coli,más preferentemente una célula K-12 deE. coli.
14. Célula hospedadora según la reivindicación 13, en donde dicha célula hospedadora comprende (i) un cromosoma que comprende una mutación en la secuencia de nucleótidos del genrhaBque inactiva RhaB, o (ii) un cromosoma en el que se deleciona la secuencia de nucleótidos que codifica RhaB.
15. Célula hospedadora según la reivindicación 13 o 14, en donde dicha célula hospedadora es una célula W3110 deEscherichia coli,preferentemente que comprende un cromosoma que comprende una mutación de desplazamiento del marco en la secuencia de nucleótidos que codifica RhaB.
16. Célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicha célula hospedadora es una célula W3110 deEscherichia colique comprende un cromosoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 2 o una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 2; en donde opcionalmente, el cromosoma de la célula hospedadora comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica RhaT.
17. Método de producción de ranibizumab que comprende la etapa de exponer la célula hospedadora bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 13-16 a ramnosa, induciendo así la expresión de ranibizumab.
18. Método según la reivindicación 17, que comprende además la etapa de recuperar ranibizumab de la célula hospedadora bacteriana; opcionalmente que comprende además una o más etapas de purificar el ranibizumab recuperado, preferentemente por una o más etapas de cromatografía.
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