ES3037550T3

ES3037550T3 - Dystrophin gene exon deletion using engineered nucleases

Info

Publication number: ES3037550T3
Application number: ES20189872T
Authority: ES
Inventors: Derek Jantz; James Jefferson Smith; Michael G Nicholson
Original assignee: Precision Biosciences Inc
Current assignee: Precision Biosciences Inc
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2015-03-12
Publication date: 2025-10-03
Anticipated expiration: 2035-03-12
Also published as: ES2821149T3; EP3116533A2; JP6832995B2; US20240156919A1; EP4659765A2; US20250152679A1; US20170106055A1; EP3116533A4; EP3116533B1; CA2942268A1; EP3858376C0; EP3858376B1; JP2019214609A; US20210145940A1; WO2015138739A3; JP2021088563A; US20190269762A1; AU2024202080A1; JP2017512767A; DK3116533T3

Abstract

La invención se relaciona con el campo de la biología molecular y la tecnología de ácidos nucleicos recombinantes. En particular, se refiere a un método para el tratamiento de un paciente con distrofia muscular de Duchenne que comprende la eliminación de al menos un exón del gen de la distrofina mediante nucleasas modificadas genéticamente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Deleción de exón del gen de la distrofina usando nucleasas modificadas genéticamente

Aplicaciones relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la solicitud de patente provisional U.S. Provisional Patent Application No. 61/951,648, presentada el 12 de marzo de 2014.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la biología molecular y la tecnología de ácidos nucleicos recombinantes. En particular, la invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento de un paciente con distrofia muscular de Duchenne.

Antecedentes de la invención

La distrofia muscular de Duchenne es un trastorno degenerativo muscular raro, ligado al cromosoma X, que afecta aproximadamente a 1 de cada 3500 varones en todo el mundo. La enfermedad es causada por mutaciones en el gen de la distrofina(DMD),que es el gen más grande conocido.DMDabarca 2,2 Mb del cromosoma X y codifica predominantemente un transcrito de 14 kb derivado de 79 exones. La proteína distrofina de longitud completa, como se expresa en el músculo esquelético, músculo liso, y cardiomiocitos, es 3685 aminoácidos y tiene un peso molecular de 427 kD. El fenotipo grave de Duchenne está generalmente asociado con la pérdida de la proteína distrofina de longitud completa del músculo esquelético y cardiaco, lo que lleva a la debilitante degeneración muscular y, finalmente, a la insuficiencia cardiaca. Se ha descrito un gran número de mutaciones diferentes delDMD,muchas de las cuales dan lugar a la distrofia muscular de Duchenne grave o a la distrofia muscular de Becker más leve. El Centro Médico de la Universidad de Leiden mantiene una base de datos de mutaciones en el genDMD(http://www.dmd.nl).

Hay varias estrategias terapéuticas que se persiguen para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne. En primer lugar, las estrategias de "sustitución genética" son un campo de investigación activo (Oshima,et al.).(2009)J of the Am. Soc. of Gene Ther.17:73-80; Liu,et al.(2005)Mol. Ther.11:245-256; Lai,et al. (2006) Hum Gene Ther.17:1036-1042; Odomet al.(2008)Mol. Ther.16:1539-1545). Este enfoque consiste en administrar una copia funcional del genDMDa los pacientes mediante un vector viral, normalmente un virus adenoasociado (AAV). Sin embargo, el gran tamaño del genDMDlo hace incompatible con la limitada capacidad de transporte de los vectores virales comunes. Esto necesita el uso de un gen "micro-distrofina" en el que la mayor parte de la porción central repetitiva del gen es eliminada para dejar sólo la proteína funcional mínima. No está claro, sin embargo, que la expresión de "micro-distrofina" sea suficiente para el beneficio clínico. Además, este enfoque adolece de la posibilidad de integración genética aleatoria en el genoma del paciente, lo que podría dar lugar a mutagénesis por inserción, y de la posibilidad de reacciones inmunitarias contra el vector de administración.

Un segundo enfoque para tratar la distrofia muscular de Duchenne implica el trasplante de células precursoras musculares sanas en fibras musculares del paciente (Peaultet al.).(2007)Mol. Ther.15:867-877; Skuk,et al.(2007)Neuromuscul. Disord.17:38-46). Este enfoque adolece de una migración ineficaz de los mioblastos trasplantados y del potencial de rechazo inmunológico por parte del paciente.

Un tercer enfoque implica la supresión de mutaciones sin sentido usando PTC124 (Welch,et al.).(2007)Nature447:87-91). Sin embargo, esto requeriría una dosificación permanente del fármaco, y el enfoque aún no ha demostrado ningún beneficio clínico significativo.

Un cuarto tratamiento potencial, y más prometedor, para la distrofia muscular de Duchenne se denomina "omisión de exón" (Williams,et al.).(2008)BMC Biotechnol.8:35; Jearawiriyapaisamet al.(2008) Mol Ther.

16:1624-1629; Yokota,et al.(2007)Acta Myol.26:179-184; van Deutekomet al.(2001), Hum.(Mol. Gen.

10:1547-1554; Benedettiet al.(2013)FEBS J.280:4263-80; Rodino-Klapac (2013)Curr Neurol Neurosci Rep.

13:332; Verhaart and Aartsma-Rus (2012)Curr OpinNeurol.25:588-96). En general, las porciones terminales N- y C- del gen de la distrofina son esenciales para su papel como una proteína "andamio" que mantiene la integridad de la membrana en las fibras musculares, mientras que el "dominio de varilla" central, que comprende 24 repeticiones similares a la espectrina, es al menos parcialmente prescindible. De hecho, el fenotipo grave de Duchenne está por lo general asociado con mutaciones en el gen de la distrofina que introducen cambios de marco y/o codones de terminación prematuros, resultando en una forma truncada de la proteína distrofina que carece del dominio esencial C-terminal. Las mutaciones en el dominio central de la varilla, incluidas las grandes deleciones de exones enteros, por lo general dan lugar al fenotipo Becker, mucho más leve, si mantienen el marco de lectura de forma que el dominio C-terminal de la proteína está intacto.

La distrofia muscular de Duchenne está causada más frecuentemente por la deleción de uno o más exón(es) completo(s), dando lugar a un desplazamiento del marco de lectura. Por ejemplo, el exón 45 es frecuentemente suprimido en pacientes con Duchenne. Dado que el exón 45 tiene una longitud de 176 pb, que no es divisible por tres, la eliminación del exón desplaza los exones 46-79 al marco de lectura incorrecto. Lo mismo puede decirse del exón 44, de 148 pb de longitud. Sin embargo, si se suprimen los exones 44 y 45, el tamaño total de la deleción es de 324 pb, que es divisible por tres. De esta manera, la deleción de ambos exones no da lugar a un desplazamiento del marco de lectura. Debido a que estos exones codifican una porción del dominio de varilla no esencial de la proteína distrofina, suprimirlos de la proteína se espera que resulte en un fenotipo leve tipo Becker. De esta manera, un paciente con el fenotipo de Duchenne debido a la deleción de uno o más exón(es) puede, potencialmente, ser tratado eliminando uno o más exones adyacentes para restaurar el marco de lectura. Este es el principio detrás de la "Omisión de Exón", en la que oligonucleótidos modificados son usados para bloquear los sitios aceptores de empalme en el ARNpre-m de la distrofina para que uno o más exones específicos estén ausentes de la transcripción procesada. El enfoque se ha usado para restaurar la expresión del gen de la distrofina en el modelo de ratónmdxomitiendo el Exón 23, que albergaba una mutación sin sentido inductora de la enfermedad (Mann,et al.). Proc. Nat. Acad. Sci. USA98:42-47). Los análogos de oligonucleótidos que inducen la omisión del exón 51 también se han mostrado prometedores en los primeros ensayos clínicos en humanos (Benedettiet al.).(2013)FEBS J.280:4263-80). Las principales limitaciones de este enfoque son: (1) el procedimiento de omisión de exón es ineficiente, resultando en niveles relativamente bajos de expresión de distrofina funcional; y (2) el oligonucleótido de omisión de exón tiene una semivida relativamente corta por lo que el efecto es transitorio, necesitando dosificaciones repetidas y de por vida. De esta manera, aunque los enfoques de omisión de exón han demostrado ser prometedores en los ensayos clínicos, las mejoras en la progresión de la enfermedad han sido mínimas y variables.

La presente invención mejora los enfoques actuales de omisión de exones corrigiendo la expresión génica a nivel del ADN genómico en lugar del ARNpre-m. La invención es una composición para su uso en el tratamiento permanente de la distrofia muscular de Duchenne que implica la escisión de exones específicos de la secuencia codificante delDMDusando un par de endonucleasas específicas de sitio modificadas genéticamente. Al dirigir un par de tales endonucleasas a sitios de las regiones intrónicas que flanquean un exón, es posible eliminar permanentemente del genoma el fragmento intermedio que contiene el exón. La célula resultante, y su progenie, expresará distrofina mutante en la que una porción del dominio de repetición de espectrina no esencial es eliminada pero los dominios esenciales N- y C-terminal están intactos.

Los procedimientos de producción de endonucleasas de ingeniería específicas del sitio son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) se pueden diseñar para que reconozcan y corten sitios predeterminados en un genoma. Las ZFN son proteínas quiméricas que comprenden un dominio de unión a ADN de dedo de zinc fusionado al dominio de nucleasa de la enzima de restricción FokI. El dominio del dedo de zinc se puede rediseñar a través de medios racionales o experimentales para producir una proteína que se une a una secuencia de ADN predeterminada de ~18 pares de bases de longitud. Al fusionar este dominio de proteína diseñado con la nucleasa FokI, es posible dirigir las roturas de ADN con especificidad a nivel del genoma. Las ZFN se han usado ampliamente para dirigir la adición, eliminación y sustitución de genes en una amplia gama de organismos eucariotas (revisado en S. Duraiet al., Nucleic Acids Res33, 5978 (2005)). Igualmente, las nucleasas efectoras de TAL (TALEN) se pueden generar para escindir sitios específicos en el ADN genómico. Al igual que una ZFN, una TALEN está compuesta por un dominio de unión al ADN específico del sitio, modificado genéticamente, fusionado con el dominio de la nucleasa FokI (revisado en Maket al.(2013) Curr Opin Struct Biol. 23:93-9). En este caso, sin embargo, el dominio de unión al ADN comprende una matriz en tándem de dominios efectores de TAL, cada uno de los cuales reconoce específicamente un solo par de bases de ADN. Una limitación de las ZFN y las TALEN es que son heterodiméricas, por lo que la producción de una sola nucleasa funcional en una célula requiere la coexpresión de dos monómeros de proteínas. Dado que el procedimiento divulgado requieredosnucleasas, una para cortar a cada lado nucleasas, una para cortar a cada lado del exón de interés, sería necesario coexpresar cuatro monómeros ZFN o TALEN en la misma célula. Esto plantea importantes retos en la administración de genes, ya que los vectores tradicionales de administración de genes tienen una capacidad de carga limitada. También introduce la posibilidad de una "dimerización errónea" en la que los monómeros se asocian de forma inapropiada para formar especies de endonucleasas diméricas no deseadas que podrían reconocer y cortar lugares fuera de la diana en el genoma. Esto puede, potencialmente, minimizarse generando heterodímeros obligatorios ortogonales en los que los dominios de la nucleasa FokI de los cuatro monómeros se modifican genéticamente de manera diferencial para dimerizar preferentemente con el monómero asociado previsto.

Las TALEN compactas son una arquitectura de endonucleasas alternativa que evita la necesidad de dimerización (Beurdeleyet al.(2013)Nat Commun.4:1762). Una TALEN compacta comprende un dominio de unión al ADN del efector TAL específico del sitio, modificado genéticamente, fusionado con el dominio de la nucleasa de la endonucleasa homing I-TevI. A diferencia de FokI, I-TevI no necesita dimerizarse para producir una rotura de doble cadena de ADN, por lo que una TALEN compacta es funcional como monómero. De esta manera, es posible coexpresar dos TALEN compactas en la misma célula.

Las endonucleasas modificadas genéticamente con base en el sistema CRISPR/Cas9 también se conocen en la técnica (Ranet al.(2013) Nat Protoc. 8:2281-2308; Maliet al.(2013)Nat Methods.10:957-63). Una endonucleasa CRISPR comprende dos componentes: (1) una nucleasa efectora de caspasas, por lo general la Cas9 microbiana; y (2) un "ARN guía" corto que comprende una secuencia de orientación de ~20 nucleótidos que dirige la nucleasa a un lugar de interés en el genoma. Al expresar varios ARN guía en la misma célula, cada uno de ellos con una secuencia de orientación diferente, es posible dirigir las roturas de ADN simultáneamente a múltiples lugares del genoma. De esta manera, las nucleasas CRISPR/Cas9 son adecuadas para la presente invención. El principal inconveniente del sistema CRISPR/Cas9 es su alta frecuencia de roturas de ADN fuera del objetivo, que podría limitar la utilidad del sistema para el tratamiento de pacientes humanos (Fuet al.(2013)Nat Biotechnol.31:822-6).

El agente inductor de rotura de ADN puede ser una endonucleasa homing modificada genéticamente (también denominada "meganucleasa"). Las endonucleasas homing son un grupo de nucleasas de origen natural que reconocen sitios de escisión de 15-40 pares de bases que se encuentran comúnmente en los genomas de plantas y hongos. Con frecuencia se asocian a elementos de ADN parásitos, tales como los intrones autoempalmados del grupo 1 y las inteínas. Promueven de forma natural la recombinación homóloga o la inserción de genes en lugares específicos del genoma del hospedador al producir una rotura de doble cadena en el cromosoma, que recluta la maquinaria celular de reparación del ADN (Stoddard (2006),Q. Rev. Biophys.

38: 49-95). Las endonucleasas homing se agrupan comúnmente en cuatro familias: la familia LAGLIDAD<g>, la familia GIY-YIG, la familia His-Cys box y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales, que afectan a la actividad catalítica y a la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, los miembros de la familia LAGLIDADG se caracterizan por tener una o dos copias del motivo LAGLIDADG conservado (véase Chevalieret al.(2001),Nucleic Acids Res.29(18): 3757-3774). Las endonucleasas homing LAGLIDADG con una sola copia del motivo LAGLIDADG forman homodímeros, mientras que los miembros con dos copias del motivo LAGLIDADG se encuentran como monómeros.

LCrel (SEQ ID NO: 1) es un miembro de la familia LAGLIDADG de endonucleasas homing que reconoce y corta una secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases en el cromosoma del cloroplasto del algaChlamydomonas reinhardtii.Se han usado técnicas de selección genética para modificar la preferencia del sitio de escisión I-CreI de tipo salvaje (Sussmanet al.(2004),J. Mol. Biol.342: 31-41; Chameset al.(2005),Nucleic Acids Res.33: e178; Seligmanet al.(2002),Nucleic Acids Res.30: 3870-9, Amouldet al.(2006), J. Mol.Biol.355: 443-58). Más recientemente, se describió un procedimiento de diseño racional de las endonucleasas homing mono-LAGLIDADG que es capaz de rediseñar exhaustivamente I-CreI y otras endonucleasas homing para dirigirse a sitios de ADN ampliamente divergentes, incluyendo sitios en genomas de mamíferos, levaduras, plantas, bacterias y virus (documento WO 2007/047859).

Como se describe por primera vez en el documento WO 2009/059195, I-CreI y sus derivados modificados genéticamente son normalmente diméricos, pero pueden fusionarse en un solo polipéptido usando un enlazante peptídico corto que une el extremo C de una primera subunidad con el extremo N de una segunda subunidad (Liet al.(2009)Nucleic Acids Res.37:1650-62; Grizotet al.(2009)Nucleic Acids Res.37:5405-19). De esta Manera, una meganucleasa funcional de "cadena sencilla" se puede expresar a partir de una única transcripción. Al suministrar genes que codifican dos meganucleasas de cadena sencilla diferentes a la misma célula, es posible cortar simultáneamente dos sitios diferentes. Además, se observó una frecuencia extremadamente baja de corte fuera del objetivo con las meganucleasas de ingeniería.

El uso de meganucleasas modificadas genéticamente para el tratamiento de distrofia muscular de Duchenne fue divulgado previamente en el documento WO 2011/141820 (la solicitud 820). En esta solicitud de patente, los autores discuten la posibilidad de usar meganucleasas modificadas genéticamente para corregir defectos en el genDMDa través de tres mecanismos diferentes (véase el documento WO 2011/141820 Figura 1). En primer lugar, los autores contemplan el uso de una meganucleasa modificada genéticamente para insertar una copia transgénica deDMDo micro-DATD en un locus de "puerto seguro", tal como AAVS1, donde se expresará de forma constitutiva sin afectar a la expresión génica endógena. En segundo lugar, los autores proponen que se podría hacer que una meganucleasa escindiera el genoma en un sitio cercano a una mutación deletérea enDMDy que esta rotura del ADN estimularía la recombinación homóloga entre el gen mutanteDMDen el genoma y una copia sana del gen proporcionadain transde tal forma que se corregiría la mutación en el genoma. En tercer lugar, los autores de la solicitud 820 proponen que una meganucleasa diseñada puede ser hecha para insertar ADN exógeno en un intrón en el genDMDy que dicha meganucleasa podría ser usada para insertar el dominio esencial C-terminal de la distrofina en un intrón temprano corriente arriba de una mutación causante de la enfermedad. Significativamente, al contemplar los innumerables usos de las meganucleasas para manipular el genDMD,los autores de la solicitud 820 no contemplan el uso de dos meganucleasas simultáneamente en las mismas células, ni proponen la eliminación de ninguna secuencia de ADN.

Finalmente, Ousteroutet al.demostraron que se puede dirigir una rotura de ADN a la secuencia codificante del DMD usando una TALEN y que la rotura se repara frecuentemente a través de la vía mutagénica de unión final no homóloga, dando lugar a la introducción de pequeñas inserciones y/o deleciones ("indels") que pueden cambiar el marco de lectura del gen (Ousteroutet al.(2013)Mol Ther.21:1718-26). Demostraron la posibilidad de restaurar la expresión del genDMDen una parte de las células mutantes mediante una rotura del ADN en el exón inmediatamente posterior a la mutación y confiando en la reparación mutagénica del ADN para restaurar el marco de lectura en un porcentaje de células. Este enfoque usa una única nucleasa y se dirige a la secuencia codificante del gen.

Sumario de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. La presente invención es una composición para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne asociada con un cambio de marco de lectura en un gen de la distrofina en un sujeto que lo necesite. Las células así tratadas expresarán una forma acortada de la proteína distrofina en la que una porción del dominio central de repetición de espectrina está ausente pero los dominios N- y C-terminal están intactos. En muchos casos, esto reducirá la gravedad de la enfermedad al fenotipo Becker leve.

De esta manera, se divulga un procedimiento general para tratar la distrofia muscular de Duchenne usando un par de nucleasas. Se divulgan meganucleasas modificadas genéticamente adecuadas para practicar el procedimiento. Además, se divulgan TALEN compactas modificadas genéticamente adecuadas para practicar el procedimiento, CRISPR para practicar el procedimiento y vectores y técnicas para administrar nucleasas modificadas genéticamente a células de pacientes.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Estructura del genDMD.Se han dibujado 79 exones para indicar el marco de lectura. Se indican los dominios esenciales de unión a la actina y al distroglicano, que abarcan aproximadamente los exones 2-8 y 62 70, respectivamente.

Figura 2. Estrategias para suprimir exones del gen DMD usando diferentes tipos de nucleasas. 2A) Estrategia para suprimir una repetición de nucleótidos usando un par de CRISPR. Se usan un par de "ARN guía" ("ARNg") que son complementarios a un par de sitios de reconocimiento que flanquean el exón de interés. Como se dibuja en esta figura, los ARNg pueden ser complementarios a las secuencias de reconocimiento que son distales al motivo conservado "<g>G" y al sitio de escisión del ADN de Cas9. En esta orientación, las secuencias de reconocimiento CRISPR se conservan en gran medida tras la escisión del ADN, la escisión del fragmento intermedio de ADN genómico y la nueva unión de los extremos del cromosoma. 2B) Un esquema alternativo para suprimir un exón usando un par de CRISPR en el que los ARNg son complementarios a las secuencias de reconocimiento que son proximales al exón. En esta orientación, las secuencias de reconocimiento CRISPR se suprimen en gran medida tras la escisión del ADN, la escisión del fragmento intermedio de ADN genómico y la nueva unión de los extremos del cromosoma. 2C) Estrategia para suprimir un exón usando un par de TALEN compactas (cTALEN). Se usan un par de dominios de unión al ADN efectores TAL ("TALE") que se unen a un par de sitios de reconocimiento que flanquean el exón de interés. Como se dibuja en esta figura, las TALE pueden unirse a secuencias de reconocimiento distales al motivo conservado "CNNNG" que es reconocido y cortado por el dominio de escisión LTevI ("TevLCD"). En esta orientación, las secuencias de reconocimiento de cTALEN se conservan en gran medida tras la división del ADN, la escisión del fragmento intermedio de ADN genómico y la nueva unión de los extremos del cromosoma. Además, los cTALEN en esta figura se muestran con los dominios TALE y TevLCD en una orientación N- a C-. También es posible generar cTALEN con estos dos dominios en orientación C- a N-. 2D) Un esquema alternativo para suprimir una repetición de nucleótidos usando un par de cTALEN en el que los dominios TALE se unen a secuencias de reconocimiento que están próximas al exón. En esta orientación, las secuencias de reconocimiento de cTALEN se eliminan en gran medida tras la escisión del ADN, la escisión del fragmento intermedio de ADN genómico y la nueva unión de los extremos del cromosoma. Además, los cTALEN de esta figura están dibujados con los dominios TALE y TevI-CD en una orientación de C a N. 2E) Estrategia para suprimir un exón del gen DMD usando un par de meganucleasas de cadena sencilla. Las meganucleasas se dibujan como proteínas de dos dominios (MGN-N: el dominio N-terminal; y MGN-C: el dominio C-terminal) unidos por un enlazante. En la figura, el dominio C-terminal está dibujado como uniéndose a la mitad de la secuencia de reconocimiento que está más cerca al exón. Sin embargo, el dominio N-terminal puede unirse a esta mitad de la secuencia de reconocimiento. Los cuatro pares de bases centrales de la secuencia de reconocimiento se muestran como "NNNN". Estos cuatro pares de bases se convierten en "salientes" de una cadena sencilla 3' después de ser escindidos por la meganucleasa. El subconjunto de secuencias preferidas de cuatro pares de bases que comprende esta región de la secuencia se identifica en el documento WO/2010/009147. La escisión del<a>D<n>por el par de meganucleasas genera un par de salientes 3' de cuatro pares de bases en los extremos del cromosoma. Si estos salientes son complementarios, pueden hibridarse entre sí y volverse a ligar directamente, con lo que la secuencia de cuatro pares de bases queda retenida en el cromosoma tras la escisión del exón. Dado que las meganucleasas escinden cerca de la mitad de la secuencia de reconocimiento, la mitad de cada secuencia de reconocimiento se mantendrá con frecuencia en el cromosoma tras la escisión del exón. La otra mitad de cada secuencia de reconocimiento se eliminará del genoma con el exón.

Figura 3. Escisión del exón 44 delDMDusando las meganucleasas DYS-1/2 y DYS-3/4. 3 A) Secuencia del exón 44 deDMDy regiones flanqueantes. La secuencia del exón está subrayada. Los sitios de reconocimiento de las meganucleasas DYS-1/2 y DYS-3/4 están sombreados en gris con los cuatro pares de bases centrales (que se convierten en el saliente 3' tras la escisión por la meganucleasa) en negrita. Los sitios de hibridación de un par de cebadores PCR usados para el análisis aparecen en cursiva. 3B) Análisis de electroforesis en gel de agarosa de células HEK-293 que coexpresan DYS-1/2 y DYS-3/4. Se aisló el ADN genómico de las células y se evaluó por PCR usando los cebadores indicados en (3A). Los productos de la PCR se resolvieron en un gel de agarosa y se comprobó que las células HEK-293 que coexpresaban las dos meganucleasas produjeron un par de bandas de<p>C<r>, mientras que las células HEK-293 de tipo salvaje solo produjeron la banda más grande. 3C) secuencias de tres plásmidos que albergan el producto PCR más pequeño de (3B). Las tres secuencias se muestran alineadas con la secuencia humana de tipo salvaje. Las ubicaciones de las secuencias de reconocimiento DYS-1/2 y DYS-3/4 están sombreadas en gris con los cuatro pares de bases centrales en negrita.

Figura 4. Escisión del exón 45 delDMDusando las meganucleasas DYS-5/6 y DYS-7/8. 4A) Secuencia del exón 45 deDMDy regiones flanqueantes. La secuencia del exón está subrayada. Los sitios de reconocimiento de las meganucleasas DYS-5/6 y DYS-7/8 están sombreados en gris con los cuatro pares de bases centrales (que se convierten en el saliente 3' tras la escisión por la meganucleasa) en negrita. Los sitios de hidridación de un par de cebadores PCR usados para el análisis aparecen en cursiva. 4B) Análisis de electroforesis en gel de agarosa de células HEK-293 que coexpresan DYS- 5/6 y DYS-7/8. Se aisló el ADN genómico de las células y se evaluó por PCR usando los cebadores indicados en (4A). Los productos de la PCR se resolvieron en un gel de agarosa y se comprobó que las células HEK-293 que coexpresaban las dos meganucleasas produjeron un par de bandas de p Cr , mientras que las células HEK-293 de tipo salvaje solo produjeron la banda más grande. 4C) secuencias de 16 plásmidos que albergan el producto p Cr más pequeño de (4b ). Las secuencias se muestran alineadas con la secuencia humana de tipo salvaje. Las ubicaciones de las secuencias de reconocimiento DYS-5/6 y DYS-7/8 están sombreadas en gris con los cuatro pares de bases centrales en negrita.

Figura 5. Evaluación de las meganucleasas MDX-1/2 y MDX-13/14 en un ensayo indicador en células CHO. A) Esquema del ensayo. Para cada una de las meganucleasas recombinantes, se produjo una línea celular CHO en la que un casete indicador se integró de forma estable en el genoma de la célula. El casete indicador comprendía, en orden de 5' a 3': un promotor temprano de SV40; los 5' 2/3 del gen GFP; el sitio de reconocimiento para MDX-1/2 (SEQ ID NO: 149) o el sitio de reconocimiento de MDX-13/14 (SEQ ID NO: 150); el sitio de reconocimiento de la meganucleasa CHO-23/24 (WO/2012/167192); y el 3' 2/3 del gen GFP. Las células transfectadas de manera estable con este casete no expresaban GFP en ausencia de un agente inductor de rotura de ADN. Sin embargo, cuando se indujo una rotura de ADN en cualquiera de las secuencias de reconocimiento de meganucleasa, las regiones duplicadas del gen GFP se recombinan entre sí para producir un gen GFP funcional. El porcentaje de células que expresan GFP se podría determinar por citometría de flujo como una medida indirecta de la frecuencia de escisión del genoma por las meganucleasas. B,C) Las dos líneas indicadoras CHO se transfectaron con ARNm que codificaba las meganucleasas MDX-1/2 (A), MDX-13/14 (B) o CHO-23/34 (A y B). Se transfectaron 1,5e6 células CHO con le6 copias de ARNm por célula usando un Nucleofector 2 de Lonza y el programa U-024 según las instrucciones del fabricante. A las 48 horas después de la transfección, las células se evaluaron por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células positivas a la GFP en comparación con un control negativo no transfectado (vacío). El ensayo se realizó por triplicado y se muestran las desviaciones estándar. Se observó que las meganucleasas MDX-1/2 y MDX-13/14 producían células GFP+ en sus respectivas líneas celulares en frecuencias significativamente superiores tanto al control negativo (vacío) como al control positivo CHO-23/24, lo que indica que las nucleasas son capaces de reconocer y cortar eficazmente sus secuencias diana en una célula.

Figura 6. Alineaciones de secuencias de 20 clones de mioblastos de ratón C2C12 en los que se suprimió una porción del genDMDmediante cotransfección con las meganucleasas MDX-1/2 y MDX-13/14. Se muestra la ubicación del exón 23 deDMDasí como las ubicaciones y secuencias de los sitios diana de MDX-1/2 y MDX-13/14. Cada una de las 20 secuencias (SEQ ID NO: 153- 172) se alineó con una secuencia de referencia deDMDde tipo salvaje y las deleciones relativas a la referencia se muestran como barras huecas.

Figura 7. Mapa vectorial del plásmido pAAV-MDX. Este plásmido "empaquetador" se usó junto con un plásmido ayudante Ad para producir virus AAV capaces de liberar simultáneamente los genes que codifican las meganucleasas MdX-1/2 y MDX-13/14.

Descripción detallada de la invención

1.1 Referencias y definiciones

La literatura científica y de patentes a la que se hace referencia en la presente memoria establece conocimientos que están disponibles para los expertos en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, el término "meganucleasa" se refiere a una endonucleasa que se deriva de I-CreI. El término meganucleasa, como se usa en la presente memoria, se refiere a una variante modificada genéticamente de I-Crel que se ha modificado en relación con la I-CreI natural con respecto, por ejemplo, a la especificidad de unión al ADN, la actividad de escisión del ADN, la afinidad de unión al ADN o las propiedades de dimerización. Los procedimientos de producción de tales variantes modificadas de I-Crel son conocidos en la técnica (por ejemplo, el documento WO 2007/047859). Una meganucleasa puede unirse al ADN de doble cadena como un homodímero, como es el caso de la I-CreI de tipo salvaje, o puede unirse al ADN como un heterodímero. Una meganucleasa también puede ser una "meganucleasa de cadena sencilla" en la que un par de dominios de unión al ADN derivados de I-CreI se unen en un solo polipéptido usando un enlazante peptídico.

Como se usa en la presente memoria, el término "meganucleasa de cadena sencilla" se refiere a un polipéptido que comprende un par de subunidades de meganucleasa unidas por un enlazante. Una meganucleasa de cadena sencilla tiene la organización: Subunidad N-terminal - Enlazante- Subunidad C-terminal. Las dos subunidades de meganucleasa, cada una de las cuales se deriva de I-CreI, generalmente no serán idénticas en la secuencia de aminoácidos y reconocerán secuencias de ADN no idénticas. De esta manera, las meganucleasas de cadena sencilla por lo general escinden las secuencias de reconocimiento pseudopalindrómicas o no palindrómicas. Una meganucleasa de cadena sencilla se puede denominar "heterodímero de cadena sencilla" o "meganucleasa heterodimérica de cadena sencilla" aunque no es, de hecho, dimérica. En aras de la claridad, a menos que se especifique otra cosa, la expresión "meganucleasa" se puede referir a una meganucleasa dimérica o de cadena sencilla.

Como se usa en la presente memoria, el término "TALEN compacto" se refiere a una endonucleasa que comprende un dominio de unión a ADN con 16-22 repeticiones del dominio TAL fusionadas en cualquier orientación con cualquier porción de la endonucleasa homing I-TevI.

Como se usa en la presente memoria, el término "CRISPR" se refiere a una endonucleasa basada en caspasa que comprende una caspasa, tal como Cas9, y un ARN guía que dirige la escisión del ADN de la caspasa mediante hibridación con un sitio de reconocimiento en el ADN genómico.

Como se usa en la presente memoria, con respecto a una proteína, el término "recombinante" significa que tiene una secuencia de aminoácidos alterada como resultado de la aplicación de técnicas de ingeniería genética a los ácidos nucleicos que codifican la proteína, y a las células u organismos que expresan la proteína. Con respecto a un ácido nucleico, el término "recombinante" significa que tiene una secuencia de ácido nucleico alterada como resultado de la aplicación de técnicas de ingeniería genética. Las técnicas de ingeniería genética incluyen, pero no se limitan a, PCR y tecnologías de clonación de ADN; transfección, transformación y otras tecnologías de transferencia de genes; recombinación homóloga; mutagénesis dirigida al sitio; y fusión de genes. De acuerdo con esta definición, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a una proteína de origen natural, pero producida por clonación y expresión en un hospedador heterólogo, no se considera recombinante.

Como se usa en la presente memoria, el término "de tipo salvaje" se refiere a cualquier forma de origen natural de una meganucleasa. El término "tipo salvaje" no pretende indicar la variante alélica más común de la enzima en la naturaleza sino, más bien, cualquier variante alélica encontrada en la naturaleza. Las endonucleasas homing de tipo salvaje se distinguen de las meganucleasas recombinantes o de origen no natural.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "secuencia de reconocimiento" se refiere a una secuencia de ADN que está unida y escindida por una endonucleasa. En el caso de una meganucleasa, una secuencia de reconocimiento comprende un par de "medios sitios" invertidos de 9 pares de bases que están separados por cuatro pares de bases. En el caso de una meganucleasa de cadena sencilla, el dominio N-terminal de la proteína contacta con un primer semisitio y el dominio C-terminal de la proteína contacta con un segundo semisitio. La escisión por una meganucleasa produce cuatro "salientes" de pares de bases en 3'. Los "salientes" o "extremos adhesivos" son segmentos cortos de ADN de cadena sencilla que se pueden producir mediante la escisión por endonucleasa de una secuencia de ADN de doble cadena. En el caso de meganucleasas y meganucleasas de cadena sencilla derivadas de I-CreI, el saliente comprende las bases 10-13 de la secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases. En el caso de una TALEN compacta, la secuencia de reconocimiento comprende una primera secuencia CNNNGN que es reconocida por el dominio I-TevI, seguido de un espaciador no específico de 4-16 pares de bases de longitud, seguido de una segunda secuencia de 16-22 pb de longitud que es reconocida por el dominio efector TAL (esta secuencia por lo general tiene una base de T en 5'). La escisión por una TALEN compacta produce dos salientes de pares de bases en 3'. En el caso de una CRISPR, la secuencia de reconocimiento es la secuencia, por lo general de 16-24 pares de bases, a la que el ARN guía se une a la escisión directa de Cas9. La escisión mediante CRISPR produjo extremos romos.

Como se usa en la presente memoria, el término "sitio diana" o "secuencia diana" se refiere a una región del ADN cromosómico de una célula que comprende una secuencia de reconocimiento para una meganucleasa.

Como se usa en la presente memoria, el término "recombinación homóloga" o "HR" se refiere al procedimiento celular natural en el que se repara una rotura de ADN de doble cadena usando una secuencia de ADN homóloga como plantilla de reparación (véase, por ejemplo, Cahillet al.(2006),Front. Biosci.11:1958-1976). La secuencia de ADN homóloga puede ser una secuencia cromosómica endógena o un ácido nucleico exógeno que fue administrado a la célula.

Como se usa en la presente memoria, el término "unión final no homóloga" o "NHEJ" se refiere al procedimiento celular natural en el que se repara una rotura de ADN de doble cadena mediante la unión directa de dos segmentos de ADN no homólogos (véase, por ejemplo, Cahillet al.(2006),Front. Biosci.11:1958-1976). La reparación del ADN mediante uniones de extremos no homólogos es propensa a errores y con frecuencia da como resultado la adición o eliminación no secuenciada de secuencias de ADN en el sitio de reparación.

Como se usa en la presente memoria, el término "religación" se refiere a un procedimiento en el que dos extremos de ADN producidos por un par de roturas de doble cadena de ADN se unen covalentemente entre sí con la pérdida de la secuencia intermedia de ADN, pero sin la ganancia o pérdida de ninguna secuencia de ADN adicional. En el caso de un par de roturas de ADN que se producen con salientes de cadena sencilla, la religación puede proceder a través de la hibridación de salientes complementarios seguido de la unión covalente de los extremos 5' y 3' por una ADN ligasa. La religación se distingue de la NHEJ en que no da lugar a la adición o eliminación no prevista de ADN del sitio de reparación.

Como se usa en la presente memoria, a menos que se indique específicamente de otro modo, la palabra "o" se usa en el sentido inclusivo de "y/o" y no en el sentido exclusivo de "cualquiera/o".

2.1 Principio de deleción de exones

La presente invención se basa, en parte, en la hipótesis de que determinadas deleciones en el genDMDque dan lugar al fenotipo de Duchenne pueden compensarse suprimiendo (un) exón(es) adicional(es) inmediatamente corriente arriba o corriente abajo de la mutación. La base de datos DMD-Leiden indica que la mayoría de las mutaciones que causan la distrofia muscular de Duchenne son deleciones de uno o más exones completos que causan un cambio en el marco de lectura. En muchos casos, el marco de lectura puede restaurarse eliminando el exón inmediatamente anterior o posterior a la mutación. Como se muestra en la tabla 1, 29 mutaciones diferentes causantes de Duchenne, que representan el ~65 % de los pacientes, pueden ser compensadas suprimiendo un solo exón adyacente a la mutación. Por ejemplo, un paciente con enfermedad debida a la deleción del Exón 45 deDMD,que ocurre en aproximadamente el 7 % de los pacientes, puede ser tratado con un agente terapéutico que suprima el Exón 46. En particular, una terapia capaz de eliminar el exón 51 o el exón 45 podría usarse para tratar al 15 % y al 13 % de los pacientes, respectivamente.

Tabla 1

2.2 Nucleasas para suprimir exones

Se sabe en la técnica que es posible usar una nucleasa específica de sitio para hacer una rotura de ADN en el genoma de una célula viva y que tal rotura de ADN puede dar como resultado una modificación permanente del genoma a través de la reparación NHEJ mutagénica o a través de HR con una secuencia de ADN transgénico. El método divulgado, sin embargo, implica la coexpresión de un par de nucleasas en la misma célula. Sorprendentemente, se descubrió que un par de nucleasas dirigidas a sitios de ADN muy próximos entre sí (separados por menos de 10.000 pares de bases) pueden escindir del genoma el fragmento intermedio de ADN. También sorprendentemente, se encuentra que la escisión del ADN usando un par de nucleasas frecuentemente procede a través de un mecanismo que involucra los salientes de ADN de cadena sencilla generados por las nucleasas. En experimentos que implican un par de meganucleasas que generan salientes de ADN complementarios (es decir, idénticos), se encontró que la secuencia saliente se conservaba frecuentemente después de la escisión del fragmento y la reparación de los extremos cromosómicos resultantes (véanse, los ejemplos 1 y 2). El mecanismo de reparación del ADN, en este caso, parece ser la religación directa de los extremos rotos, lo que no se ha observado en las células de mamíferos. No se observó una deleción y religación tan precisa cuando se usó un par de meganucleasas que generaron salientes no idénticos (véase el ejemplo 3). De esta manera, en una realización preferida, el par de nucleasas usado para la escisión de repeticiones de nucleótidos se selecciona para generar salientes complementarios.

Para escindir un exón eficientemente, el par de sitios de corte de la nucleasa debe estar relativamente cerca. En general, cuanto más cerca estén los dos sitios, más eficiente será el procedimiento. De esta manera, se puede usar un par de nucleasas que cortan secuencias que tienen menos de 10.000 pares de bases o, más preferentemente, 5.000 pares de bases o, aún más preferentemente, menos de 2.500 pares de bases o, más preferentemente, menos de 1.500 pares de bases.

La figura 2 muestra una variedad de diferentes tipos de nucleasas. Las figuras 2A y 2B muestran ejemplos de cómo puede practicarse el método divulgado usando un par de nucleasas CRISPR. En este caso, se pueden administrar tres genes a la célula: un gen que codifica la proteína Cas9 y un gen que codifica cada uno de los dos ARN guía. Las CRISPR escinden el ADN y dejan extremos romos que, generalmente, no se vuelven a ligar limpiamente, por lo que generalmente el producto final tendrá mutaciones de inserción y/o deleción ("indel") en la secuencia. Como alternativa, se puede usar una “CRISPR Nickasa”, como se informó en, Ranet al.(2013)Cell.154:1380-9. Para poner en práctica esto, es necesario expresar cuatro ARN guía en la célula, dos de los cuales son complementarios a la secuencia corriente arriba del exón y dos de los cuales son complementarios a la secuencia corriente abajo del exón. En esta, los dos pares de ARN guía se hibridan con cadenas complementarias en la región diana y cada miembro del par produce una muesca de ADN de cadena sencilla en una de las cadenas. El resultado es un par de muescas (equivalentes a una rotura de doble cadena) que pueden desplazarse entre sí para producir un saliente de cadena sencilla. Los procedimientos para fabricar CRISPR y CRISPR Nickasas que reconocen sitios de ADN predeterminados son conocidos en la técnica, por ejemplo, Ranet al.(2013)Nat Protoc.8:2281-308.

Alternativamente, como se muestra en la figura 2C y 2D, el par de nucleasas puede ser TALEN compactas. Una TALEN compacta comprende un dominio de unión al ADN del efector TAL (TALE) fusionado en su extremo N o C al dominio de escisión de I-TevI, que comprende al menos los residuos 1-96 y preferentemente los residuos 1-182 de I-TevI. El dominio de escisión de I-TevI reconoce y corta secuencias de ADN de la forma 5'-CNbNNtG-3', donde "b" representa el sitio de escisión de la cadena inferior y "t" representa el sitio de escisión de la cadena superior, y donde "N" es cualquiera de las cuatro bases. Una TALEN compacta, de esta manera, se escinde para producir dos pares de bases 3' salientes. El par TALEN compacta usado para la escisión del exón puede seleccionarse para que tenga salientes complementarios que puedan volver a ligarse directamente. Los procedimientos para fabricar dominios TALE que se unen a sitios predeterminados del ADN son conocidos en la técnica, por ejemplo, Reyonet al.(2012)Nat Biotechnol.30:460-5.

Como se esquematiza en la figura 2E, las nucleasas usadas pueden ser un par de meganucleasas de cadena sencilla. Una meganucleasa de cadena sencilla comprende un dominio N-terminal y un dominio C-terminal unidos por un péptido enlazante. Cada uno de los dos dominios reconoce la mitad de la secuencia de reconocimiento y el sitio de escisión del ADN está en el medio de la secuencia de reconocimiento cerca de la interfaz de las dos subunidades. Las roturas de la cadena de ADN están desplazadas cuatro pares de bases, de modo que la escisión del ADN por una meganucleasa genera un par de salientes de la cadena sencilla 3', de cuatro pares de bases. Pueden seleccionarse meganucleasas de cadena sencilla que corten secuencias de reconocimiento con salientes complementarios, como en los ejemplos 1 y 2. En las tablas 2-7 se enumeran ejemplos de secuencias de reconocimiento para los exones 44, 45 y 51 deDM D. Para escindir el exón 44, por ejemplo, puede seleccionarse una primera meganucleasa que corte una secuencia de reconocimiento de la tabla 2, que enumera las secuencias de reconocimiento corriente arriba del exón 44. A continuación, puede seleccionarse una segunda meganucleasa que corte una secuencia de reconocimiento de la tabla 3, que enumera las secuencias de reconocimiento corriente abajo del exón 44. La coexpresión de las dos meganucleasas en la misma célula extirpará, de esta manera, el exón 44. Preferiblemente, se seleccionan meganucleasas que cortan el ADN para dejar salientes complementarios de cadena sencilla. Por ejemplo, SEQ ID NO: 19, si es cortada por una meganucleasa, deja la secuencia del saliente: 5/GTAC-3'. Del mismo modo, SEQ ID NO: 42 si es cortada por una meganucleasa, deja la secuencia en saliente: 5/GTAC-3'. De esta manera, la coexpresión de una primera meganucleasa que escinde SEQ ID NO: 19 con una segunda meganucleasa que escinde la SEQ ID NO:42 extirpará el exón 44 deDMDdel genoma de una célula humana de forma que se produzcan salientes complementarios que puedan repararse mediante religación directa.

Tabla 2. Ejemplo de secuencias de reconocimiento de meganucleasas ubicadas corriente arriba del exón 44 del DMD

Tabla 3. Ejemplo de secuencias de reconocimiento de meganucleasa corriente abajo del exón 44 del DMD

Tabla 4. Ejemplo de secuencias de reconocimiento de meganucleasas ubicadas corriente arriba del exón 45 del DMD

Tabla 5. Ejemplo de secuencias de reconocimiento de meganucleasa corriente abajo del exón 45 del DMD

Tabla 6. Ejemplo de secuencias de reconocimiento de meganucleasas ubicadas corriente arriba del exón 51 del DMD

(continuación)

Tabla 7. Ejemplo de secuencias de reconocimiento de meganucleasa corriente abajo del exón 51 del DMD

2.3 Procedimientos de administración y expresión de las nucleasas

Los tratamientos del cuerpo humano divulgados en la presente memoria no forman parte de la invención. El tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne como se divulga en la presente memoria requiere que un par de nucleasas se expresen en una célula muscular. Las nucleasas pueden administrarse como proteína purificada o como ARN o ADN que codifica las nucleasas. Las proteínas nucleasas o el ARNm o el vector que codifica las nucleasas pueden administrarse a las células musculares mediante inyección intramuscular (Maltzahn,et al.(2012),Proc Natl Acad Sci USA.109:20614-9) o la inyección hidrodinámica (Taniyamaet al.(2012)Curr Top Med Chem.12:1630-7; Heggeet al.(2010)Hum Gene Ther.21:829-42). Para facilitar la captación celular, las proteínas o los ácidos nucleicos pueden acoplarse a un péptido de penetración celular para facilitar la captación por las células musculares. Los ejemplos de péptidos penetrantes de células conocidos en la técnica incluyen poliarginina (Jearawiriyapaisarn,et al.(2008)Mol Ther.16:1624-9), péptido TAT del virus VIH (Hudeczet al.(2005),Med. Res. Rev.25: 679-736), MPG (Simeoni,et al.(2003)Nucleic Acids Res.31:2717-2724), Pep-1 (Deshayeset al.(2004)Biochemistry43: 7698-7706, y HSV-1 VP-22 (Deshayeset al.(2005)Cell Mol Life Sci.62:1839-49. Alternativamente, la penetración celular puede facilitarse mediante la encapsulación de liposomas (véase, por ejemplo, Lipofectamine™, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). La formulación del liposoma puede usarse para facilitar la fusión de la bicapa lipídica con una célula diana, permitiendo así que el contenido del liposoma o las proteínas asociadas a su superficie se introduzcan en la célula.

Los genes que codifican un par de nucleasas pueden administrarse usando un vector viral. Tales vectores son conocidos en la técnica e incluyen vectores lentivíricos, vectores adenovíricos y vectores de virus adenoasociados (AAV) (revisados en Vannucci,et al.(2013New Microbiol.36:1-22). Los vectores virales pueden inyectarse directamente en el tejido muscular. Alternativamente, los vectores virales se administran por vía sistémica. El ejemplo 3 describe una situación en la que el músculo se inyecta con un virus AAV recombinante que codifica un par de meganucleasas de cadena sencilla. Es conocido en la técnica que diferentes vectores AAV tienden a ubicarse en diferentes tejidos. Los serotipos de AAV musculotrópicos incluyen AAV1, AAV9 y AAV2.5 (Bowleset al.(2012)Mol Ther.20:443-55). De esta manera, estos serotipos son los preferidos para la administración de nucleasas en el tejido muscular.

Si los genes de la nucleasa se administran en forma de ADN (por ejemplo, plásmido) y/o a través de un vector viral (por ejemplo, AAV) deben unirse de manera operativa a un promotor. Este puede ser un promotor vírico tal como promotores endógenos del vector vírico (por ejemplo, el LTR de un vector lentivírico) o los promotores tempranos conocidos de citomegalovirus o virus SV40. Los genes de la nucleasa pueden unirse de manera operativa a un promotor que dirija la expresión génica preferentemente en células musculares. Los ejemplos de promotores específicos del músculo incluyen C5-12 (Liu,et al.(2004)Hum Gene Ther.15:783-92), el promotor de creatina quinasa (MCK) específico de músculo (Yuasa,et al.(2002)Gene Ther.9:1576-88), o el promotor del músculo liso 22 (SM22) (Haase,et al.(2013)BMC Biotechnol.73:49-54). Los genes nucleasa pueden estar bajo el control de dos promotores distintos. Alternativamente, los genes están bajo el control de un único promotor y están separados por un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) o una secuencia peptídica 2A (Szymczak and Vignali (2005),Expert Opin Biol Ther.5:627-38).

Se prevé que un único tratamiento suprima permanentemente las repeticiones de nucleótidos de un porcentaje de células del paciente. Estas células serán preferentemente mioblastos u otras células precursoras de músculo que son capaces de replicarse y dar lugar a fibras musculares enteras que expresan distrofina funcional (o semifuncional). Sin embargo, si la frecuencia de deleción de exón es baja, puede ser necesario realizar múltiples tratamientos en cada paciente, tales como múltiples rondas de inyecciones intramusculares.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no deben interpretarse como limitativos. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de averiguar, usando únicamente la experimentación rutinaria, numerosos equivalentes a las sustancias y procedimientos específicos descritos en la presente memoria.

Ejemplo 1

Deleción del exón 44 del DMD mediante un par de meganucleasas de cadena sencilla modificadas genéticamente.

1. Meganucleasas que reconocen la SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 42

Se produjo una meganucleasa modificada genéticamente (SEQ ID NO: 135) que reconoce y escinde la SEQ ID NO: 19. Esta meganucleasa se denomina "DYS-1/2". Se produjo una segunda meganucleasa modificada genéticamente (SEQ ID NO: 136) que reconoce y escinde la SEQ ID NO: 42. Esta meganucleasa se denomina "DYS-3/4" (Figura 3A). Cada meganucleasa comprende una señal de ubicación de nucleasa N-terminal derivada de SV40, una primera subunidad de meganucleasa, una secuencia enlazante y una segunda subunidad de meganucleasa.

2. Deleción del exón 44 del genDMDen células HEK-293

Las células de riñón embrionario humano (HEK-293) fueron cotransfectadas con ARNm que codifica DYS-1/2 y DYS-3/4. El ARNm se preparó produciendo primero una plantilla de PCR para una reacción de transcripciónin vitro(SEQ ID NO: 139 y SEQ<i>D NO: 140. Cada producto de la PCR incluía un promotor T7 y 609 pb de la secuencia del vector corriente abajo del gen de la meganucleasa. El producto de la PCR se purificó en gel para garantizar una plantilla única. El ARN tapado (m7G) se generó usando el kit RiboMAX T7 (Promega) según las instrucciones del fabricante y, se incluyó el análogo de caperuza Ribo m7G (Promega) en la reacción y se usaron 0,5 ug del producto de PCR de meganucleasa purificada como la plantilla de ADN. El ARN tapado se purificó usando el sistema de aislamiento de ARN total SV (Promega) según las instrucciones del fabricante.

1,5<x>106<células>HEK-293 se nucleofectaron con 1,5xl012 copias de ARNm de DYS-1/2 y 1,5x1012 copias de ARNm de DYS-3/4 (2xl06 copias/célula) usando un dispositivo Amaxa Nucleofector II (Lonza) según las instrucciones del fabricante. 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico de las células usando un kit FlexiGene (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. A continuación, el ADN genómico se sometió a la PCR usando cebadores que flanquean los sitios de corte DYS-1/2 y DYS-3/4 (SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 142). Cuando los productos de la PCR se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa, se observó que las células que coexpresaban DYS-1/2 y DYS-3/4 producían dos productos de la PCR con longitudes aparentes de 1079 y 233 pares de bases, mientras que el ADN genómico de las células HEK-293 no transfectadas sólo producía el producto mayor (Figura 3B). El producto más grande es consistente con el tamaño esperado de un fragmento PCR de células con el exón 44 delDMDintacto. El producto más pequeño es coherente con el tamaño esperado de un fragmento de PCR de células en las que se ha escindido el exón 44 del genDMD.

Los productos de PCR más pequeños se aislaron del gel y se clonaron en un plásmido bacteriano (pUC-19) para el análisis de la secuencia. Se secuenciaron tres clones de plásmido, en todos los cuales se encontró que se había suprimido el exón 44 (Figura 3C). Sorprendentemente, dos de los tres plásmidos llevaban productos de PCR de células en las que la deleción consistía precisamente en la región intermedia en las roturas de ADN inducidas por DYS-1/2 y DYS-3/4 esperadas. Parece que las dos meganucleasas escindieron sus sitios de reconocimiento previstos, dejando salientes 5'-GTAC-3' compatibles, el fragmento intermedio que comprende el exón 44 se perdió y los dos extremos cromosómicos se volvieron a ligar. El tercer clon de plásmido contenía un producto de PCR de una célula en la que se había eliminado la región intermedia los dos sitios de escisión junto con 10 bases adicionales.

3. Conclusiones

Se ha demostrado que es posible usar un par de meganucleasas de cadena sencilla modificadas genéticamente para escindir un fragmento del genoma humano en una línea celular cultivada. El procedimiento de eliminación y reparación del ADN parece haberse producido a través de un mecanismo en el que intervienen los salientes 3' producidos por las nucleasas, lo que sugiere que el procedimiento es más eficaz cuando los salientes son complementarios y pueden hibridarse entre sí.

Ejemplo 2

Deleción del exón 45 del DMD mediante un par de meganucleasas de cadena sencilla modificadas genéticamente.

1. Meganucleasas que reconocen la SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 74

Se produjo una meganucleasa modificada genéticamente (SEQ ID NO: 137) que reconoce y escinde la SEQ ID NO: 62. Esta meganucleasa se denomina "DYS-5/6". Se produjo una segunda meganucleasa modificada genéticamente (SEQ ID NO: 138) que reconoce y escinde la SEQ ID NO: 74. Esta meganucleasa se denomina "DYS-7/8" (Figura 4A). Cada meganucleasa comprende una señal de localización de nucleasa N-terminal derivada de SV40, una primera subunidad de meganucleasa, una secuencia enlazante y una segunda subunidad de meganucleasa.

2. Deleción del exón 45 delDMDen células HEK-293

Las células de riñón embrionario humano (HEK-293) fueron cotransfectadas con ARNm que codifica DYS-5/6 y DYS-7/8. El ARNm se preparó produciendo primero una plantilla de PCR para una reacción de transcripciónin vitro(SEQ ID NO: 143(20) y SEQ ID NO: 144(21). Cada producto de la PCR incluía un promotor T7 y 609 pb de la secuencia del vector corriente abajo del gen de la meganucleasa. El producto de la PCR se purificó en gel para garantizar una plantilla única. El ARN tapado (m7G) se generó usando el kit RiboMAX T7 (Promega) según las instrucciones del fabricante y, se incluyó el análogo de caperuza Ribo m7G (Promega) en la reacción y se usaron 0,5 ug del producto de PCR de meganucleasa purificada como la plantilla de ADN. El ARN tapado se purificó usando el sistema de aislamiento de ARN total SV (Promega) según las instrucciones del fabricante.

1,5x106 células HEK-293 se nucleofectaron con 1,5x1012 copias de ARNm de DYS-5/6 y 1,5x1012 copias de ARNm de DYS-7/8 (2x106 copias/célula) usando un dispositivo Amaxa Nucleofector II (Lonza) según las instrucciones del fabricante. 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico de las células usando un kit FlexiGene (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. A continuación, el ADN genómico se sometió a la PCR usando cebadores que flanquean los sitios de corte DYS-5/6 y DYS-7/8 (SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146). Cuando los productos de la PCR se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa, se observó que las células que coexpresaban DYS-5/6 y DYS-7/8 producían dos productos de la PCR con longitudes aparentes de 1384 y 161 pares de bases, mientras que el ADN genómico de las células HEK-293 no transfectadas sólo producía el producto mayor (Figura 4B). El producto más grande es consistente con el tamaño esperado de un fragmento PCR de células con el exón 45 delDMDintacto. El producto más pequeño es coherente con el tamaño esperado de un fragmento de PCR de células en las que se ha escindido el exón 45 del genDMD.

Los productos de PCR más pequeños se aislaron del gel y se clonaron en un plásmido bacteriano (pUC-19) para el análisis de la secuencia. Se secuenciaron 16 clones de plásmidos, en todos los cuales se observó la deleción del exón 45 (Figura 4C). Sorprendentemente, 14 de los 16 plásmidos llevaban productos de PCR de células en las que la deleción consistía precisamente en la región intermedia en las roturas de ADN inducidas por DYS-5/6 y DYS-7/8 esperadas. Parece que las dos meganucleasas escindieron sus sitios de reconocimiento previstos, dejando salientes 5'-GTAC-3' compatibles, el fragmento intermedio que comprende el exón 45 se perdió y los dos extremos cromosómicos se volvieron a ligar. Los dos clones de plásmidos restantes transportaron el producto de PCR de células en las que se había escindido la región intermedia entre los dos sitios de escisión junto con 36 bases adicionales.

3. Conclusiones

Se ha demostrado que es posible usar un par de meganucleasas de cadena sencilla modificadas genéticamente para escindir un fragmento del genoma humano en una línea celular cultivada El procedimiento de eliminación y reparación del ADN parece haberse producido a través de un mecanismo en el que intervienen los salientes 3' producidos por las nucleasas, lo que sugiere que el procedimiento es más eficaz cuando los salientes son complementarios y capaces de unirse entre sí.

Ejemplo 3

Deleción del exón 23 delDMDen un ratón usando meganucleasas administradas por AAV.

1. Desarrollo de nucleasas para suprimir el exón 23 delDMDde ratón

El modelo de ratón estándar de DMD es el ratón mdx, que tiene una mutación puntual en el exón 23 que introduce un codón de parada prematuro (Sicinskiet al.(1989)Science.244:1578-80). En el ratón, el exón 23 delDMDtiene 213 pares de bases, equivalentes a 71 aminoácidos. De esta manera, se razonó que debería ser posible suprimir el exón 23 en su totalidad y, así, eliminar el codón de parada manteniendo el marco de lectura del genDMD. Para ello, se desarrolló un par de meganucleasas de cadena sencilla denominadas "MDX-1/2" (SEQ ID NO: 147) y “MDX-13/14” (SEQ ID NO: 148). El primero reconoce una secuencia de ADN corriente arriba del exón 23 delDMDde ratón (SEQ ID NO: 149) mientras que este último reconoce una secuencia de ADN corriente abajo del exón 23 delDMDde ratón (SEQ ID NO: 150). Las nucleasas se probaron, inicialmente, usando un ensayo indicador llamado "iGFFP" en células CHO, como se muestra en la figura 5. Ambas nucleasas cortaron eficazmente los sitios de ADN a los que estaban destinadas mediante este ensayo.

2. Deleción del exón 23 delDMDde ratón en células mioblásticas de ratón

Una línea celular de mioblastos de ratón (C2C12) se cotransfectó con ARNm transcritoinvitro que codificaba las nucleasas MDX-1/2 y MDX-13/14. El ARNm se produjo usando el kit RiboMAX T7 de Promega. Se nucleofectaron las células C2C12 Ie6 con un total de 2e6 copias/célula de ARNm que codifican cada par de enzimas MDX (le6 copias de cada ARNm) usando un dispositivo Amaxa 2b y el programa B-032. Transcurridas 96 horas, las células se clonaron por dilución limitante en placas de 96 pocillos. Tras aproximadamente 2 semanas de crecimiento, se cosecharon las células y se aisló el ADN genómico usando un kit FlexiGene de Qiagen. A continuación, se generó un producto PCR para cada clon usando un cebador directo en el intrón 22 delDMD(SEQ ID NO: 151) y un cebador inverso en el intrón 23 (SEQ ID NO: 152). A continuación, se clonaron y secuenciaron 60 de los productos de la PCR. 20 de las secuencias tenían deleciones consistentes con la escisión inducida por meganucleasas del genDMDseguida de reparación mutagénica del ADN (Figura 6, SEQ ID NO: 153- 172). A 11 de las secuencias les faltaba al menos una parte de los sitios de reconocimiento MDX-1/2 y MDX-13/14, así como el exón 23 (SEQ ID NO: 153-163). Es probable que estas secuencias procedan de células en las que ambas nucleasas cortaron los lugares previstos y se eliminó la secuencia intermedia. A 4 de las secuencias les faltaba el exón 23 pero tenían una secuencia de reconocimiento MDX-1/2 intacta (SEQ ID NO: 164-167). Estas parecen deberse a la escisión del ADN por MDX-13/14 sola seguida de la deleción de una gran cantidad de secuencia. Cinco de las secuencias tenían un sitio de reconocimiento MDX-1/2 intacto y todo o parte del exón 23, pero les faltaba todo o parte del sitio de reconocimiento MDX-13/14 (SEQ ID NO: 168 172). Estas secuencias parecen deberse a la escisión del ADN sólo por MDX-13/14 seguida de la deleción de una cantidad menor de secuencia insuficiente para eliminar todo el exón 23. En marcado contraste con los experimentos de los ejemplos 1 y 2, no se obtuvo una secuencia de ADN consistente tras la deleción del Exón 23 delDMDen las células de ratón. Esto se debe probablemente a que las dos meganucleasas MDX no generan roturas de ADN con salientes 3' compatibles. MDX-1/2 genera un saliente con la secuencia 5'-GTGA-3' y MDX-13/14 genera un saliente con la secuencia 5'-ACAC-3'. De esta manera, se concluyó que los

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne asociada con un cambio de marco de lectura en un gen de la distrofina en un sujeto que la necesita, comprendiendo la composición

(i) una primera nucleasa que corta una primera secuencia de reconocimiento o ARN o ADN que codifica dicha primera nucleasa; y

(ii) una segunda nucleasa que corta una segunda secuencia de reconocimiento o ARN o ADN que codifica dicha segunda nucleasa;

en la que dicha primera secuencia de reconocimiento está corriente arriba de un primer exón en el gen de la distrofina de una célula muscular de dicho sujeto;

en la que dicha segunda secuencia de reconocimiento está corriente abajo de dicho primer exón en el gen de la distrofina de una célula muscular de dicho sujeto;

en la que dicha primera secuencia de reconocimiento y dicha segunda secuencia de reconocimiento tienen salientes complementarios cuando son cortadas por dicha primera nucleasa y dicha segunda nucleasa; y

en la que dicha primera nucleasa y dicha segunda nucleasa son capaces de eliminar al menos un exón adicional de dicho gen de la distrofina en dicha célula muscular de tal manera que el marco de lectura normal de dicho gen de la distrofina es restaurado.

2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en la que la composición comprende un virus adenoasociado recombinante (AAV) que contiene un gen que codifica dicha primera nucleasa y un gen que codifica dicha segunda nucleasa.

3. La composición para el uso de la reivindicación 2, en la que dicho AAV recombinante tiene un serotipo de AAV9.

4. La composición para el uso de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en la que dicho gen que codifica dicha primera nucleasa y dicho gen que codifica dicha segunda nucleasa están unidos de manera operativa a un único promotor.

5. La composición para el uso de la reivindicación 4, en la que dicho promotor es un promotor específico del músculo.

6. La composición para el uso de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en la que dicho gen que codifica dicha primera nucleasa y dicho gen que codifica dicha segunda nucleasa están separados por un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) o una secuencia peptídica 2A.

7. La composición para el uso de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en la que dicho gen que codifica dicha primera nucleasa y dicho gen que codifica dicha segunda nucleasa están unidos de manera operativa a dos promotores separados.

8. La composición para el uso de la reivindicación 7, en la que dichos promotores son promotores específicos de músculo.