ES3038390T3 - Human beta 2 defensin for use in the prevention and treatment of graft-versus-host-disease - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) tanto aguda como crónica, y en particular a métodos para disminuir la mortalidad y aumentar especialmente la supervivencia a largo plazo; complicaciones agudas asociadas con la EICH tales como diarrea, pérdida de peso y sepsis basadas en la normalización de la microbiota intestinal, hepática, pulmonar y cutánea y la defensa de las mucosas; reequilibrio del sistema inmunitario con normalización de la producción de citocinas de IFN-γ, TNF-α, 11-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10 e IL-13 y prevención y/o tratamiento de la tormenta de citocinas; complicaciones crónicas asociadas con la EICH tales como bronquiolitis obliterante y esclerodermia, comprendiendo el método la administración oral, subcutánea, intrapulmonar y/o dérmica/transdérmica de una o más defensinas de mamíferos seleccionadas del grupo de α- y β-defensinas en un paciente que ha recibido o está a punto de recibir un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Beta 2 defensina humana para su uso en la prevención y el tratamiento de la enfermedad de injerto contra hospedador

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una p-defensina humana seleccionada de hBD-2 (SEQ ID NO.: 2), hBD-2 truncada (SEQ ID NO.: 7) o una defensina modificada funcionalmente equivalente que comprende 1-4 modificaciones de aminoácidos en comparación con hBD-2 de SEQ ID NO.: 2 o hBD-2 truncada de SEQ ID NO.: 7; donde dicha(s) modificación(es) es(son) una(s) sustitución(es) o inserción(es) conservadora(s) de aminoácidos que no afecta(n) significativamente al plegamiento de la defensina; o una(s) única(s) deleción(es), para uso en la prevención o tratamiento de la enfermedad aguda de injerto contra huésped (GVHD) en un paciente que ha recibido o está a punto de recibir un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. La invención puede conducir a un tratamiento de los síntomas de la GVHD, como la diarrea y la sepsis, basado en la normalización de la microbiota intestinal y pulmonar y el reequilibrio del sistema inmunitario con una producción reducida de citoquinas, eliminando el riesgo de una tormenta de citoquinas.

Antecedentes de la invención

La enfermedad injerto contra hospedador continúa siendo una causa principal de morbilidad y mortalidad después del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. La GVH<d>gastrointestinal es la causa principal de mortalidad (Teshima, 2016). La fase inicial de GVHD aguda es desencadenada por el daño tisular y la pérdida asociada de la función de barrera de la mucosa, principalmente en el tracto gastrointestinal, lo cual es causado por los regímenes de acondicionamiento necesarios para llevar la enfermedad maligna hasta un nivel residual mínimo apropiado para el control inmune subsiguiente y para eliminar la función inmune existente, lo que permite injertar el inóculo del donador que no ha recibido terapia. El trasplante de células madre típicamente utiliza irradiación de cuerpo completo, inmunosupresión y quimioterapia para lograr estos objetivos duales; sin embargo, éstos también dan como resultado daño a la mucosa del tracto Gl y a otras células contribuyendo a la "tormenta de citoquinas", la cual se caracteriza por la liberación de citoquinas proinflamatorias; clásicamente citoquinas de Th1, IFNy , IL-2 y TNF-a y citoquinas de Th2: IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 (Henden, 2015). Las principales terapias actuales para GVHD están enfocadas en inmunosupresión amplia, lo cual puede afectar el proceso de injerto y, en algunos contextos, reducir la actividad deseada de injerto contra tumor (Nalle, 2015). Una reducción en la carga bacteriana mediante el uso de descontaminación antimicrobiana en el periodo posterior al trasplante puede reducir la gravedad de GVHD. El pulmón y la piel son los órganos blanco-primarios en GVHD crónica, que se manifiestan como fibrosis - bronquiolitis obliterante y escleroderma (Henden, 2015). La GVHD sigue siendo una causa principal de falla del tratamiento que da como resultado mortalidad en el 20 % de los receptores y el 60-80 % de los sobrevivientes experimentan algún grado de GVHD crónica (Markey, 2014).

Breve descripción de la invención

La invención se define en las reivindicaciones. Cualquier materia que quede fuera del ámbito de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo.

El inventor ha demostrado de manera sorpresiva en un modelo en ratón de enfermedad injerto contra hospedador aguda que surge de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas que una dosis profiláctica de hBD2 o HD5 oral es capaz de disminuir la mortalidad dramáticamente y en un mayor grado que la ciclosporina, el tratamiento más comúnmente utilizado de GVHD. También se demostró en este modelo que hBD2 es capaz de disminuir la producción de IL-1 p en células mieloides (células dendríticas CD11c+ y células CD11b+ Ly6FG-). Siendo IL-1 p un impulsor importante de GvHD intestinal.

El inventor también ha demostrado de manera sorpresiva en modelos en ratón tanto preventivos como terapéuticos de inflamación intestinal grave (DSS, t Nb S, transferencia de célula T), que la hBD2 mitiga la diarrea y pérdida de peso a través de salud intestinal mejorada y disminuye el índice de actividad patológica a la par con inmunosupresores estándar tales como prednisolona/dexametasona y ciclosporina así como anti-TNF-a, todos utilizados en forma rutinaria en la prevención y/o tratamiento de GVHD.

Se ha demostrado de manera sorpresiva que la hBD2 puede reequilibrar el sistema inmune a través de la<normalización de la producción de citoquina de IFN-y>,<TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13. Aunque>algunos fármacos por ejemplo anti-TNF-a pueden normalizar una o unas cuantas citoquinas, no se ha identificado ningún otro fármaco que pueda normalizar todas estas citoquinas y prevenir una tormenta de citoquinas. La liberación de citoquina inflamatoria o tormenta de citoquinas que ha sido implicada como el mediador primario de la ocurrencia y gravedad de GVHD aguda (Ball y Egeler, 2008).

Además, se ha demostrado tanto en un modelo preventivo en ratón como en un modelo terapéutico en ratón que tanto la HD5 como la hBD2 tiene una fuerte influencia sobre la composición de la microbiota. Por ejemplo, las defensinas pueden incrementar la variedad de microbios es decir mejorar/normalizar la microbiota, pero también que las defensinas pueden incrementar la abundancia de bacterias productoras de ácidos grasos de cadena corta. Los ácidos grasos de cadena corta, que juegan un papel clave en la homeostasis de célula T reguladora del colon, que se altera en GVHD aguda. Los efectos de las defensinas son diferentes de una defensina a la otra y la combinación de una a-defensina y una p-defensina es una vez más diferente de los efectos individuales.

Hyase et al (J Exp Med 2017 Vol 214, pp 3507-3518) se relaciona con el agonista Wnt R-spodin 1 (R-Spo 1) y la a-defensina de ratón cryptidin-4 (Crp4) y su uso respectivo en la restauración de la ecología microbiana intestinal y la prevención de la disbiosis mediada por la GVHD. El documento muestra que tanto la R-Spo 1 como la Crp4 administrada por vía oral tienen efectos positivos sobre el microbioma. Sin embargo, el documento concluye que el tratamiento con la a-defensina Crp4 no mostró un efecto significativo sobre la supervivencia de los ratones.

También se ha demostrado de manera sorpresiva en un modelo de asma aguda en ratón que una dosificación de beta-defensina 2 humana (hBD2 por sus siglas en inglés) administrada ya sea por vía oral o por vía intranasal es capaz de prevenir el surgimiento de una tormenta de citoquinas y el desarrollo de asma, así como de mejorar la función pulmonar dramáticamente. Contrario a la profilaxis convencional para asma, en la cual la inmunosupresión general es el objetivo, la profilaxis con hBD2 reequilibra el sistema inmune.

También se ha demostrado de manera sorpresiva en un modelo de asma aguda en ratón que una dosificación de beta-defensina 2 humana (hBD2) ya sea que se administre por vía oral o por vía intranasal también es capaz de tratar el asma normalizando la hiperreactividad y distensibilidad de las vías respiratorias.

En conclusión, el inventor ha demostrado que que HD5 y hBD2 tienen todas las propiedades requeridas para que sean un tratamiento seguro y eficaz de las complicaciones que surgen del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. Los péptidos son seguros ya que son péptidos endógenos, fisiológicos, de humano. Las defensinas se pueden utilizar en cantidades que no excedan la cantidad presente en el calostro recibido por un recién nacido que nace a término. Las defensinas se pueden administrar a través de administración oral, subcutánea o intrapulmonar. Las defensinas pueden reequilibrar el sistema inmune sin suprimir al sistema inmune. Las defensinas pueden prevenir una tormenta de citoquinas, el principal culpable de GVHD aguda. Las defensinas pueden normalizar la microbiota y el metaboloma y promover la producción de ácidos grasos de cadena corta, que preservan la homeostasis de célula T reg del colon. Las defensinas pueden tratar la inflamación grave intestinal, hepática y pulmonar.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención se refiere a una p-defensina humana seleccionada de hBD-2 (SEQ ID NO.: 2), hBD-2 truncada (SEQ ID NO.: 7) o una defensina modificada funcionalmente equivalente que comprende 1-4 modificaciones de aminoácidos en comparación con hBD-2 de SEQ ID NO.: 2 o hBD-2 truncada de SEQ ID NO. : 7; donde dicha(s) modificación(es) es(son) una(s) sustitución(es) o inserción(es) conservadora(s) de aminoácidos que no afecta(n) significativamente al plegamiento de la defensina; o una(s) única(s) deleción(es), para uso en la prevención o tratamiento de la enfermedad injerto contra huésped aguda (GVHD) en un paciente que ha recibido o está a punto de recibir un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

El paciente puede tener inflamación intestinal y hepática grave (caracterizada por ejemplo por dolor abdominal, náusea, vómito, e ictericia) y pérdida de la defensa de la mucosa, tormenta de citoquinas, pérdida de peso, o sepsis, erupción cutánea, picazón, y enrojecimiento.

El efecto del tratamiento puede comprender reequilibrio del sistema inmune y prevención o tratamiento de la tormenta de citoquinas a través de normalización de la producción de citoquina tisular.

El efecto del tratamiento puede comprender tratamiento de la permeabilidad intestinal y sepsis a través de normalización de la defensa de la mucosa o de la actividad de mieloperoxidasa en los intestinos.

El efecto del tratamiento puede comprender tratamiento de complicaciones respiratorias, inflamación pulmonar y sepsis.

El efecto del tratamiento puede comprender reducir la inflamación pulmonar histológica, inflamación peribronquial, y perivascular, así como migración celular inflamatoria hacia el líquido del lavado broncoalveolar. El efecto del tratamiento puede comprender tratamiento y/o prevención de inflamación y fibrosis de los pulmones y la piel, tal como bronquiolitis obliterante y escleroderma.

El efecto del tratamiento puede comprender incrementar la riqueza de genes, incrementar el número de phylae, incrementar la presencia bacteriana, incrementar la abundancia bacteriana y/o incrementar la producción de ácido graso de cadena corta, producción de butirato y/o disminuir la producción de acetato de la microbiota intestinal o pulmonar de dicho paciente.

El efecto del tratamiento puede comprender madurar, mantener y/o estabilizar una microbiota normal en el intestino o pulmón o piel de dicho paciente.

El efecto del tratamiento puede comprender incrementar la abundancia deAllobaculum, Alloprevotella, Akkermansia, Barnesiella, Bifidobacteriaceae, Faecalibacterium, Lachnospira, RothiayVeillonellaen el intestino o pulmón de dicho paciente.

El efecto del tratamiento puede comprender incrementar la absorción de alimento y ganancia de peso en dicho paciente.

La p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 puede seleccionarse del grupo que consiste en hBD2 o hBD-2 truncada (SEQ ID NO.: 7).

Las p-defensinas humanas para uso según la reivindicación 1 pueden administrarse solas o en una composición, en la que dicha composición comprende más de una defensina, como dos defensinas, como tres defensinas, como cuatro defensinas, como cinco defensinas. Preferiblemente, las dos defensinas son hBD2 y HD5.

La p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 puede comprender además al menos una fracción adicional seleccionada de un grupo que consiste en un péptido de penetración celular (CPP), una fracción de unión a albúmina (ABM), una fracción detectable (Z) y un péptido de prolongación de la semivida.

La p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 puede administrarse sola o en combinación con prebióticos, probióticos, triptófano, ácidos grasos de cadena corta, glucocorticoides, ciclosporina, anti TNF-a, integrinas, antibióticos, inmunosupresores, trasplante fecal, irradiación o una combinación de los mismos. Breve descripción de las figuras

Figura 1 (a modo de ilustración). Representación esquemática de la configuración experimental para investigar el efecto de las defensinas en un modelo profiláctico de colitis con sulfato de dextrano sódico.

Figura 2 (a modo de ilustración). Representación esquemática de la configuración experimental para investigar el efecto de las defensinas en un modelo terapéutico de colitis con sulfato de dextrano sódico.

Figura 3 (a modo de ilustración). Representación esquemática de la configuración experimental para investigar los efectos de las defensinas de mamífero (HD5, hBD2 y HD5+hBD2) en la composición de la microbiota en un modelo de múrido de dieta alta en grasa.

Figura 4 (a modo de ilustración). Representación esquemática de la configuración experimental para investigar los efectos de las defensinas de mamífero en un modelo sensible a esteroide en múrido para prevención de asma, en donde los ratones se inmunizan con ácaros del polvo doméstico (HDM por sus siglas en inglés) coadyuvante de Freund y se desafían con HDM.

Figura 5 (a modo de ilustración). Representación esquemática de la configuración experimental para investigar los efectos de las defensinas de mamífero en un modelo sensible a esteroide en múrido para tratamiento de asma, en donde los ratones se inmunizan con ácaros del polvo doméstico (HDM) coadyuvante de Freund y se desafían con HDM.

Figura 6A Alineación de secuencia múltiple Clustal W (2.1) de beta defensina 1-4 humana:En las alineaciones Clustal W:

* indica las posiciones que tienen un residuo completamente conservado, individual.

indica que uno de los siguientes grupos "fuertes" está completamente conservado: -S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W.

indica que uno de los siguientes grupos "más débiles" está completamente conservado: -C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y.

Figura 6B (a modo de ilustración). Alineación Clustal de HD5 y HD6.

Figura 6C. Alineación Clustal de HD5, HD6, y hBD1, hBD2, hBD3, y hBD4.

Figura 7 (a modo de ilustración). Descripción del Sistema de Puntuación del Indice de Actividad Patológica para estudios de colitis.

Figura 8 (a modo de ilustración). Descripción del Sistema de Puntuación Histológica para estudios de colitis. Figura 9 (a modo de ilustración). Puntuación histológica de colon distal en estudio profiláctico de 10 días de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico en múrido que muestra superioridad estadísticamente significativa de HBD2 (NZ39000) sobre anti TNF-a de ratón y administración subcutánea de hBD2 que muestra superioridad sobre la administración i.v. de HBD2. Leyenda:

A: Vehículo con control i.v. una vez al día

B: Anti-TNF alfa (300 pg/ratón i.p. 3 veces)

C: hBD2 (0.1 mg/kg i.v. una vez al día)

D: hBD2 (0.1 mg/kg s.c. una vez al día)

E: hBD2 (0.1 mg/kg i.v.. s.c. dos veces al día)

F: hBD2 (0.1 mg/kg s.c. s.c. dos veces al día)

K: animales que no han recibido tratamiento.

Figura 10 (a modo de ilustración). Cambio en peso corporal del animal en un estudio profiláctico de 10 días de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico en múrido que muestra un efecto conservador del peso para todas las dosis de HBD2hBD2 administrada por vía oral contra prednisolona a 1 mg/kg por vía oral. Grupos de tratamiento: A: vehículo de PBS de control dos veces al día p.o. B: prednisolona 1 mg/kg dos veces al día p.o. C: hBD2 dos veces al día a 0.05 mg/kg p.o. D: hBD2 dos veces al día a 0.5 mg/kg p.o.; E: hBD2 dos veces al día a 5 mg/kg p.o. Las diferencias significativas de los valores del grupo de control (vehículo) se muestran como **P<0.01; ***P<0.001 (prueba de Kruskal-Wallis post-prueba de Dunn para datos no paramétricos). Figura 11 (a modo de ilustración). Puntuación del índice de actividad patológica en un estudio profiláctico de 10 días de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico en múrido que muestra superioridad estadísticamente significativa de hBD2 administrada por vía oral sobre prednisolona a 1 mg/kg. Los grupos de tratamiento y la significancia se muestran igual que para la Figura 10.

Figura 12 (a modo de ilustración). Puntuación histológica en un estudio profiláctico de 10 días de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico en múrido que muestra efecto estadísticamente significativo de todas las dosis de HBD2 oral a la par con prednisolona a 1 mg/kg. Los grupos de tratamiento y la significancia se muestran igual que para la Figura 10.

Figura 13 (a modo de ilustración). Puntuación histológica en un estudio profiláctico de 8 días de colitis inducida con ácido trinitrobencensulfónico que muestra efecto estadísticamente significativo de hBD2 a 0.03 y 0.1 mg/kg (Grupo E y F) a la par con prednisolona a 10 mg/kg.

A: Control con vehículo s.c. una vez al día

B: prednisolona a 10 mg/kg s.c. una vez al día

C: hBD2, s.c. una vez al día = 1 mg/kg

D: hBD2, s.c. una vez al día = 0.3 mg/kg

E: hBD2, s.c. una vez al día = 0.1 mg/kg

F: hBD2, s.c. una vez al día = 0.03 mg/kg

G: hBD2, s.c. una vez al día = 0.1 mg/kg

Figura 14 (a modo de ilustración). Longitud del colon en un estudio profiláctico de 7 días de colitis inducida con sulfato de dextrano sódico en múrido que muestra efecto estadísticamente significativo de hBD2 a la par con ciclosporina. *p<0.05 vs DSS, prueba de Mann Whitney.

Figura 15 (a modo de ilustración). Puntuación clínica (Puntuación de heces: 0= normal; 1= heces húmedas/pegajosas; 2= heces blandas; 3= diarrea; Puntuación de sangre en heces: 0= sin sangre; 1 = evidencia de sangre en heces o alrededor del ano; 2= sangrado grave; Aspecto del ratón: 0= normal; 1= pelaje rizado o postura alterada; 2= letárgico) en un estudio profiláctico de 7 días de colitis inducida con sulfato de dextrano sódico en múrido que muestra efecto estadísticamente significativo de hBD2 a la par con ciclosporina así como superioridad de dosificación tres veces al día de hBD2 sobre dosificación dos veces al día independientemente de la vía de dosificación. *p<0.05 vs. DSS; ANOVA de dos vías y prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni.

Figura 16 (a modo de ilustración). Puntuación histológica en un estudio terapéutico de 14 días de colitis inducida con sulfato de dextrano sódico en múrido que muestra efecto estadísticamente significativo de hBD2 a 0.1 mg/kg a la par con dexametasona a 1 mg/kg y superior a anti-TNF-a de ratón a 300 pg/ratón.

Figura 17 (a modo de ilustración). Puntuación clínica (pérdida de peso corporal, consistencia de las heces y presencia de sangre por recto) en un modelo terapéutico de 14 semanas de colitis por transferencia de célula T CD4+CD25+ en múridos SCID que muestra el efecto de hBD2 a 1 mg/kg s.c. una vez al día a la par con anti-TNF-a a 100 pg/ratón s.c. dos veces a la semana (Enbrel) y dexametasona a 0.3 mg/kg por vía intraperitoneal una vez al día.

Figura 18 (a modo de ilustración). Peso del colon en un modelo terapéutico de 14 semanas de colitis por transferencia de célula T CD4+CD25+ en múridos SCID que muestra el efecto de hBD2 a 1 mg/kg s.c. una vez al día a la par con anti TNF-a a 100 pg/ratón s.c. dos veces a la semana (Enbrel) y dexametasona a 0.3 mg/kg por vía intraperitoneal una vez al día. *p<0.05; **p<0.01 vs vehículo mediante la prueba t.

Figura 19 (a modo de ilustración). Actividad de mieloperoxidasa en un modelo terapéutico de 14 semanas por transferencia de célula T CD4+CD25+ en múridos SCID que muestra el efecto de hBD2 a 1 mg/kg s.c. a la par con anti-TNF-a a 100 pg/ratón s.c. dos veces a la semana (Enbrel) y dexametasona a 0.3 mg/kg por vía intraperitoneal una vez al día. *p<0.05; **p<0.01 vs vehículo mediante la prueba t.

Figura 20 (a modo de ilustración). Análisis unifrac no ponderado y ponderado de la presencia y abundancia microbiana después del tratamiento profiláctico con HD5, hBD2 y HD5+hBD2 orales en un modelo de múrido con dieta alta en grasa.

Figura 21 (a modo de ilustración). Abundancia deAllobaculumen el intestino delgado después del tratamiento profiláctico con HD5 y hBD2 orales en un modelo de múrido con dieta alta en grasa.

Figura 22 (a modo de ilustración). Análisis de géneros de abundancia microbiana después del tratamiento profiláctico con HD5, hBD2 y HD5+hBD2 orales en un modelo de múrido con dieta alta en grasa.

Figura 23 (a modo de ilustración). Abundancia deLactobacillaceaeen colon después del tratamiento profiláctico con hBD2 oral en un modelo de alto contenido de grasa en múrido.

Figura 24 (a modo ilustrativo). Abundancia relativa de Barnesiella en el colon tras 4 (panel izquierdo) y 10 semanas (panel derecho) de tratamiento profiláctico con hBD2 oral en un modelo murino con dieta rica en grasas.

Figura 25 (a modo ilustrativo). Análisis Unifrac no ponderado de la presencia y abundancia microbiana tras el tratamiento terapéutico con HD5 o hBD2 en un modelo murino con dieta rica en grasas. El panel superior muestra los datos de la semana 0. El panel inferior, los de la semana 10.

Figura 26 (a modo ilustrativo). Abundancia relativa de Alloprevotella en el colon tras la intervención terapéutica con HD5 y hBD2 por vía oral en un modelo murino con dieta rica en grasas.

Figura 27 (a modo ilustrativo). Abundancia relativa de Bifidobacteriaceae en el intestino delgado y el colon tras la intervención terapéutica con HD5 o hBD2 en un modelo murino con dieta rica en grasas.

Leyenda de la Figura para las Figuras 28 a 31. Solución salina IN es el control no desafiado y no tratado. HDM/Vehículo representa los animales no tratados pero desafiados con HDM. HDM son los animales desafiados con ácaros del polvo doméstico. PO es administración peroral e IN es administración intranasal. Las columnas marcadas con * estadísticamente son significativamente diferentes del control tratado con vehículo.

Figura 28 (a modo de ilustración). Hiperreactividad de las vías respiratorias en el modelo de asma sensible a esteroide por ácaros del polvo doméstico en múrido después de la administración profiláctica intranasal y oral de hBD2 respectivamente.

Figura 29 (a modo de ilustración). Distensibilidad pulmonar en el modelo de asma sensible a esteroide por ácaros del polvo doméstico en múrido después de la administración profiláctica intranasal y oral de hBD2 respectivamente.

Figura 30 (a modo de ilustración). Cuenta celular de neutrófilo en BALF en el modelo de asma sensible a esteroide por ácaros del polvo doméstico en múrido después de la administración profiláctica oral de hBD-2. Los resultados se muestran como promedio /- SEM.

Figura 31A-F (a modo ilustrativo). Concentraciones de citocinas TNF-a (31 A), IL-4 (31B), IL-5 (31C), IL-6 (31D), IL-9 (31E) e IL-13 (31F) en el homogeneizado pulmonar en el modelo murino de asma sensible a los esteroides por ácaros del polvo doméstico tras la administración oral profiláctica de hBD-2. # p<0.05 frente a HDM/vehículo PO, prueba de Mann Whitney. Los resultados se muestran como media /- SEM.

Figuras 32A y 32B (a modo de ilustración). Hiperreactividad de vías respiratorias en el modelo de asma sensible a esteroide por ácaros del polvo doméstico en múrido después de la administración terapéutica intranasal (Figura 32A) y oral (Figura 32B) de hBD2 respectivamente. Solución salina es el control no desafiado. HDM/Vehículo es el control desafiado con ácaros del polvo doméstico tratado con vehículo. "hBD2 IN 1.2 mpk" es hBD2 administrada por vía intranasal a 1.2 mg/kg. 5 mpk es 5 mg/kg.

Figuras 33A y 33B (a modo de ilustración). Distensibilidad pulmonar en el modelo de asma sensible a esteroide por ácaros del polvo doméstico en múrido después de la administración terapéutica intranasal (Figura 33A) y oral (Figura 33B) de hBD2 respectivamente.

Figura 34 (a modo ilustrativo): Recuento total (34a), de neutrófilos (34b) y de macrófagos (34c) en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) en el modelo murino de asma sensible a esteroides provocado por ácaros del polvo doméstico tras la administración intranasal terapéutica de hBD-2. *p<0,05 frente al vehículo; prueba de Mann-Whitney. Los resultados se muestran como media /- SEM.

Figuras 35-42 (a modo ilustrativo). Concentraciones de citocinas de IFN-y (Figura 35), TNF-a (Figura 36), IL-4 (Figura 37), IL-5 (Figura 38), IL-6 (Figura 39), IL-9 (Figura 40), IL-10 (Figura 41) e IL-13 (Figura 42) en el homogeneizado pulmonar en el modelo murino de asma sensible a los esteroides por ácaros del polvo doméstico tras la administración terapéutica intranasal y oral de hBD-2, respectivamente. Cada figura muestra los datos del grupo intranasal a la izquierda y del grupo oral a la derecha en aquellas figuras en las que se muestran ambos grupos. «p<0,05 frente al vehículo correspondiente; prueba de Mann-Whitney. Los resultados se muestran como media /- SEM.

Figura 43 (a modo de ilustración). Histología pulmonar con preparación de H&E/PAS en el modelo de asma sensible a esteroide por ácaros del polvo doméstico en múrido después de la administración terapéutica intranasal y oral de hBD2 respectivamente. Panel superior izquierdo: control no tratado y no desafiado. Panel superior derecho: control no tratado y desafiado con HDM. Panel inferior izquierdo: desafiado con HDM tratado con hBD2 PO. Panel inferior derecho: desafiado con HDM tratado con hBD2 IN. Aumento 50X.

Figura 44 (a modo de ilustración). Gravedad de inflamación pulmonar en el modelo de asma sensible a esteroide por ácaros del polvo doméstico en múrido después de la administración terapéutica intranasal y oral de hBD2 respectivamente. *p<0.05 vs vehículo, prueba de Mann Whitney; #p<0.05 vs vehículo, Prueba de rangos con signo de Wilcox.

Figura 45 (a modo de ilustración). Inflamación perivascular y peribronquial en el modelo de asma sensible a esteroide por ácaros del polvo doméstico en múrido después de la administración terapéutica intranasal y oral de hBD2 respectivamente. *p<0.05 vs vehículo para infiltración perivascular de eosinófilos, prueba de Mann Whitney; #p<0.05 vs vehículo para infiltración perivascular/peribronquial de eosinófilos y monocitos, Prueba de rangos con signo de Wilcox. □ monocitos; ♦ eosinófilos.

Figura 46 (a modo de ilustración). Actividad de mieloperoxidasa en un modelo terapéutico de 14 semanas de transferencia de célula T CD4+CD25+ en múridos SCID que muestra el efecto de hBD2 a 1 mg/kg s.c. a la par con anti TNF-aa 100pg/ratón s.c. dos veces a la semana (Enbrel) y dexametasona a 0.3 mg/kg por vía intraperitoneal una vez al día. *p<0.05; **p<0.01 vs vehículo mediante la prueba t.

Figura 47. Gráfica de Kaplan-Meyer que muestra supervivencia dramáticamente incrementada (p<0.0001) en un modelo de enfermedad injerto contra hospedador en múrido después del trasplante de células madre en el día 0 y tratamiento con hBD2 de 1.2 mg/kg/día o vehículo (PBS 100 pL/día) desde el día 0 hasta el día 10 (n=15).

Figura 48.

Una reducción estadísticamente significativa de la puntuación de histología del intestino delgado, colon e hígado en 10 ratones tratados con hBD-2 oral durante 10 días a partir del trasplante de células madre.

Figura 49.

Pérdida de peso en % con respecto al valor inicial (a) y en gramos (b) en ratones tratados con hBD-2 oral durante 10 días a partir del día del trasplante de células madre.

Figura 50.

Migración celular reducida de leucocito CD45+ hacia la lámina propia del colon e intestino delgado en 10 ratones tratados con hBD-2 oral durante 10 días a partir del trasplante de células madre.

Figuras 51A-C.

Reducción de infiltración intestinal de célula T y célula mieloide de la lámina propia del colon e intestino delgado en 10 ratones tratados con hBD-2 oral durante 10 días a partir del trasplante de células madre.

Figura 52A-C.

Concentraciones de citoquina de TNF-a (Figura 52A), IL-6 (Figura 52B) e IL-10 (Figura 52C) en suero de 10 ratones tratados con hBD-2 oral durante 10 días a partir del trasplante de células madre.

Figuras 53A-C.

Producción reducida de IL-1p en células mieloides en 10 ratones tratados con hBD-2 oral durante 10 días a partir del trasplante de células madre.

Figuras 54A-F.

Proporción reducida de neutrófilos (Figura 54A) y producción de citoquina de Th1 - IFN-y en células T CD4 (Figura 54B) y células T CD8 (Figura 54C) células T CD69+CD4 (Figura 54D); TNF-a en células T CD4 (Figura 54E) células T CD8 (Figura 54F) en 10 ratones tratados con hBD-2 oral durante 10 días a partir del trasplante de células madre.

Figura 55.

Inflamación incrementada, infiltración de célula mieloide y leucocito, así como reparación tisular incrementada en colon en 10 ratones tratados con PBS oral durante 10 días a partir del trasplante de células madre.

Figura 56.

Una reducción estadísticamente significativa de mortalidad (p = 0.03) en 7 ratones tratados con hBD-2 oral durante 10 días a partir del trasplante de células madre comparado con 13 ratones tratados con ciclosporina y PBS respectivamente.

Figura 57.

Pérdida de peso en % desde la línea basal en ratones tratados con hBD-2, ciclosporina o PBS orales durante 10 días a partir del trasplante de células madre.

Figura 58.

Una reducción significativa de mortalidad en 22 ratones tratados con hBD-2 oral, HD5 oral (a modo de ilustración) o PBS respectivamente durante 10 días a partir del trasplante de células madre.

Figura 59 (a modo de ilustración).

Control de la población bacteriana ejercido por HD5 y hBD-2 administradas por vía oral medido como la distancia desde el revestimiento intestinal hasta la población bacteriana (zona de lisis) en pm en ratones comparado con ratones en una dieta baja en grasa o dieta occidental. Este experimento demuestra que HD5 y hBD-2 humanas administradas por vía oral en un ratón ejercen de manera sorpresiva su efecto modulador de microbiota en la superficie epitelial como si éstas fueran defensinas de ratón producidas por las células epiteliales del propio ratón y no principalmente en el lumen del intestino como sería de esperar después de la administración oral.

Figura 60 (a modo de ilustración).

Tinción con hematoxilina/eosina del hígado después del tratamiento profiláctico con hBD2 en un modelo de múrido con dieta alta en grasa. No se observa acumulación de grasa en los hepatocitos en los ratones con dieta baja en grasa mientras que en los ratones alimentados con una dieta occidental alta en grasa se observa esteatosis extensa (acumulación de grasa en los hepatocitos) y se observa acumulación mínima de grasa intrahepatocito en el grupo de ratones alimentados con una dieta occidental alta en grasa suplementada mediante administración profiláctica diaria de hBD-2 a 1.2 mg/kg oral.

Descripción detallada de la invención

Definiciones:

Defensina: El término "defensina" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a polipéptidos que pertenecen a la clase defensina de péptidos antimicrobianos. Las defensinas representan una de las defensas innatas dominantes del hospedador que sirven para mantener un microbioma saludable y defender contra posibles patógenos (Wehkamp et al.et al., 2002 y Salzman et al., 2007). Las defensinas son péptidos que poseen actividad antimicrobiana contra bacterias Gram positivas y negativas, hongos y archaea y ejercen también actividad antinflamatoria.

Las defensinas humanas son péptidos catiónicos pequeños divididos en a-defensinas y p-defensinas tomando como base la topología de sus tres puentes de disulfuro de cisteína intramoleculares (Figura 6). Las defensinas de mamífero tienen características estructurales bien definidas: los péptidos maduros son pequeños (3-6 kDa, 28-42 aminoácidos de longitud), catiónicos (carga neta 1 a 11), anfipáticos y tienen una estructura terciaria altamente conservada de una lámina p de cadena triple antiparalela. La conservación de la estructura entre las defensinas es algo sorpresivo considerando la variabilidad en la secuencia de aminoácido y se debe a seis residuos de cisteína conservados a través de toda la familia defensina. Estos seis residuos de cisteína forman tres puentes de disulfuro, lo cual estabiliza la estructura central de la lámina p de triple cadena (Mammalian Antimicrobial Peptides; Defensins and Cathelicidins Dorin et al, en Molecular Medical Microbiology (Segunda edición), 2015.

Las a-defensinas son aquellas expresadas por las células de Paneth en las criptas del intestino delgado (HD5 y HD6 o DEFA5 y DEFA6). Las p-defensinas (DEFBn) son producidas principalmente por células epiteliales en diversos tejidos y órganos incluyendo la piel, ojo, oído medio, boca, tráquea, pulmones, tracto gastrointestinal, sistema urogenital, riñones, vagina, hígado, páncreas y glándulas mamarias. Los ejemplos de defensinas incluyen alfa defensina 5 intestinal humana (HD5; SEQ ID NO: 5); alfa defensina 6 intestinal humana (HD6; SEQ ID NO: 6); ambas pertenecientes a la clase de alfa defensina; y también beta defensina 1 humana (hBD1; SEQ ID NO: 1); beta defensina 2 humana (hBD2; SEQ ID NO: 2); beta defensina 3 humana (hBD3; SEQ ID NO: 3); beta defensina 4 humana (hBD4; SEQ ID NO: 4); beta defensina 2 truncada humana (S<e>Q ID NO: 7). Las defensinas son expresadas como precursores y son procesadas mediante corte del péptido de señal y en algunos casos también pro-péptidos antes de la secreción en el espacio extracelular. Algunas de las defensinas humanas por ejemplo hBD1 son producidas de manera constitutiva, mientras que otras por ejemplo hBD2, hBD3 y hBD4 son inducidas por citoquinas proinflamatorias o productos microbianos exógenos. Las secuencias identificadas anteriormente representan las defensinas bioactivas maduras predichas. El experto en la técnica entenderá que el procesamiento puede diferir de célula a célula y que el péptido maduro secretado resultante puede diferir en uno o dos aminoácidos C-terminales o N-terminales de las secuencias predichas y aún retener bioactividad.

Identidad: La relación entre dos secuencias de aminoácido o entre dos secuencias de nucleótido se describe mediante el parámetro "identidad". El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácido se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970,J. Mol. Biol.48: 443-453) como está implementado en el programa de Needle del paquete EMBOSS (Riceetal.,2000, http://emboss.org), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son castigo por hueco abierto de 10, castigo por extensión de hueco de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle etiquetada "identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción "nobrief') se utiliza como el por ciento de identidad y se calcula de la siguiente manera: (Residuos idénticos * 100)/(Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación).

Microbiota normal: El término "microbiota normal" se utiliza en la presente solicitud para indicar una microbiota que no es disbiótica. La microbiota normal se caracteriza por tener gran riqueza de genes. La microbiota intestinal normal se caracteriza por comprender bacterias que pertenecen a los génerosBacteriodetes, Faecalibacterium, Roseburia, Blautia, Ruminococcus, Coprococcus, Bifidobacterium, Methanobrevibacter, Lactobacillus, Coprococcus, Clostridium, Akkermansia, Eubacterium.

La microbiota pulmonar normal se caracteriza por comprender bacterias que pertenecen a los génerosBacteroidetes, Firmicutes,y Proteobacteria con la microbiota central que consta dePseudomonas, Streptococcus, Prevotella, Fusobacteria, Veillonella, Haemophilus, NeisseriayPorphyromonas.

Tratamiento: Los términos "tratamiento" y "tratar" tal como se utilizan en la presente invención se refieren al manejo y cuidado de un paciente para los propósitos de combatir una condición, enfermedad o trastorno. El término pretende incluir el espectro completo de tratamientos para una condición dada que está siendo padecida por el paciente, tal como administración del compuesto activo para el propósito de: aliviar o mitigar los síntomas o complicaciones; retrasar el avance de la condición, enfermedad o trastorno; curar o eliminar la condición, enfermedad o trastorno; y/o prevenir la condición, enfermedad o trastorno, en el cual se debe entender que "prevenir" o "prevención" se refieren al manejo y cuidado de un paciente para el propósito de obstaculizar, reduciendo los compuestos activos para prevenir o reducir el riesgo del inicio de síntomas o complicaciones. El paciente para tratar es un mamífero, en particular un ser humano.

Paciente: Un paciente es un individuo, el cual ha sido tratado con o está por recibir un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

Alfa defensinas de mamífero y beta defensinas de mamífero

Esta divulgación se refiere a una p-defensina humana seleccionada de hBD-2 (SEQ ID NO.: 2), hBD-2 truncada (SEQ ID NO.: 7) o una defensina modificada funcionalmente equivalente que comprende 1-4 modificaciones de aminoácidos en comparación con hBD-2 de SEQ ID NO.: 2 o hBD-2 truncada de SEQ ID NO. : 7; donde dicha(s) modificación(es) es(son) una(s) sustitución(es) o inserción(es) conservadora(s) de aminoácidos que no afecta(n) significativamente al plegamiento de la defensina; o una(s) única(s) deleción(es), para uso en la prevención o tratamiento de la enfermedad injerto contra huésped aguda (GVHD) en un paciente que ha recibido o está a punto de recibir un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

En otra realización, una defensina difiere de una de las SEQ ID NO: 2, o 7 en menos de 5, tal como menos de 4, por ejemplo menos de 3, tal como menos de 2 aminoácidos. En una realización preferida, las defensinas consisten en beta defensina 2 humana (SEQ ID NO: 2) y beta defensina 2 humana truncada (SEQ ID NO: 7).

En una realización preferida, las defensinas beta humanas consisten en defensina beta humana 2 (SEQ ID NO: 2).

Preferentemente, las p-defensinas humanas consisten en beta defensina 2 humana, beta defensina 2 humana truncada, y variantes funcionalmente equivalentes de las mismas como se describe en la reivindicación 1. Más preferiblemente, las p-defensinas humanas consisten en beta defensina 2 humana, y variantes funcionalmente equivalentes como se describe en la reivindicación 1.

Una "variante funcionalmente equivalente" de una alfa o beta defensina de mamífero (por ejemplo, humano) es una alfa o beta defensina de mamífero modificada que exhibe aproximadamente el mismo efecto en la microbiota en el pulmón o el intestino o la piel que el de las alfa y/o beta defensinas de mamífero progenitoras. Una variante funcionalmente equivalente de una defensina de mamífero (por ejemplo, humano) puede comprender preferiblemente 1-4 modificaciones de aminoácido, de manera más preferida 1-3 modificaciones de aminoácido, de manera más preferida 1-2 modificaciones de aminoácido, y en particular una modificación de aminoácido, en comparación con la secuencia de aminoácido (por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NO 1-6) de la defensina de mamífero (por ejemplo, humano). Preferiblemente, para beta defensinas de mamífero, en comparación con beta defensina 2 humana, que tiene SEQ ID NO: 2 y para alfa defensinas comparado con HD5 (SEQ ID NO: 5).

El término "modificación" de una p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 significa, preferiblemente, que las modificaciones de aminoácidos son de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento y/o actividad del polipéptido; deleciones únicas; pequeñas extensiones amino o carboxilo-terminales; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, como una etiqueta de poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión. En una realización, la pequeña extensión, como una etiqueta de poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión se une a la defensina alfa o beta de mamífero (por ejemplo, humana) a través de un pequeño péptido enlazador de hasta unos 20-25 residuos y dicho enlazador puede contener un sitio de corte de enzima de restricción.

Las alineaciones Clustal W en las Figura 6 se pueden utilizar para predecir qué residuos de aminoácido pueden ser sustituidos sin afectar sustancialmente la actividad biológica de la proteína. Las secuencias se alinean utilizando Clustal W 2.1 (http://www.geno.me.ip/tools/clustalw/) y los siguientes parámetros: castigo por hueco abierto: 10, castigo por extensión de hueco: 0.05, transición de peso: NO, residuos hidrofílicos para proteínas: GPSNDQE, huecos hidrofílicos: SI, matriz de peso: BLOSUM (para PROTEÍNA). Las sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación "fuerte") se deben considerar como sustituciones conservadoras:

-S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W. Las sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación "débil") deben ser consideradas como sustituciones semiconservadoras: -C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y.

Los ejemplos de sustituciones conservadoras son sustituciones hechas dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácido que no alteran de manera general la actividad específica son conocidas en la técnica. Los intercambios que ocurren de manera más común son Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly.

Los "aminoácidos no naturales" han sido modificados después de la síntesis de proteína, y/o tienen una estructura química en su cadena o cadenas secundarias diferente de la de los aminoácidos estándar. Los aminoácidos no naturales se pueden sintetizar químicamente, y preferiblemente, están comercialmente disponibles, e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidin-carboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, y 3,3-dimetilprolina.

Los aminoácidos esenciales en una alfa y/o beta defensina de mamífero pueden ser identificados de conformidad con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis por barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989,Science244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones de alanina individual en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se examinan respecto a la actividad biológica (es decir, actividad contra una hiperreactividad de vías respiratorias o supresión de citoquinas por ejemplo actividad de TNF-alfa) para identificar los residuos de aminoácido que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hiltonet al.,1996,J. Biol. Chem.

271: 4699-4708. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden inferir a partir del análisis de identidades con polipéptidos que están relacionados con alfa y/o beta defensinas de mamífero (véase alineación Clustal W en la Figura 5).

Se pueden hacer sustituciones de aminoácido individual o múltiple y examinar utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o reacomodo, seguido por un procedimiento de tamizaje relevante, tal como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988,Science241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen PCR propensa a error, despliegue en fago (por ejemplo, Lowmanet al.,1991,Biochem.30:10832-10837; patente E.U.A No. 5,223,409; WO 92/06204), y mutagénesis dirigida a región (Derbyshireet al.,1986,Gene46:145; Neret al.,1988, DNA 7:127). Cuando el resultado de una sustitución dada no puede ser predicho con certeza, los derivados pueden ser analizados fácilmente de conformidad con los métodos descritos anteriormente en la presente solicitud para determinar la presencia o ausencia de actividad biológica.

Defensinas de acción prolongada

La semivida de una p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 puede prolongarse fusionando o conjugando la defensina con otra fracción, es decir, construyendo una defensina biológicamente activa de acción prolongada unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporcione una semivida plasmática in vivo de la defensina, que se incremente sustancialmente en comparación con la semivida plasmática in vivo de la defensina administrada de la misma manera que la defensina.

Una p-defensina humana biológicamente activa de acción prolongada según la reivindicación 1 que comprende la defensina unida a una molécula farmacéuticamente aceptable seleccionada del grupo que consiste en una molécula con unión a un receptor Fc neonatal (FcRn), transferrina, albúmina (HAS), XTE<n>® o PEG, un polímero de homoaminoácido (HAP), un polímero de prolina-alanina-serina (PAS), o un péptido similar a la elastina (ELP), ácido hialurónico, un péptido altamente siasilado cargado negativamente como el péptido carboxiterminal (CTP) de la cadena p de la gonadotropina coriónica (CG), IgG humana, y CH3(CH2)nCO- donde n es 8 a 22.

La p-defensina humana se puede ligar a la molécula farmacéuticamente aceptable en diversas maneras como se describe en la literatura de la técnica antecedente, tal como sin limitación copulación química a través de un enlazador bifuncional, gen tecnológicamente acoplando el extremo N-terminal o C-terminal de la defensina, tal como a-defensina o p-defensina, a la molécula farmacéuticamente aceptable, tal como albúmina o un análogo de albúmina. En particular, el extremo N-terminal de la albúmina o un análogo de albúmina, por ejemplo, la albúmina humana, puede acoplarse al C-terminal de la defensina, o al N-terminal de la defensina; o el C-terminal de la albúmina, por ejemplo, la albúmina humana, puede acoplarse al C-terminal de la defensina, o al N-terminal de la defensina. Puede insertarse una secuencia enlazadora entre la albúmina y la cadena de defensina.

La p-defensina humana puede unirse a la molécula farmacéuticamente aceptable mediante un enlazador estable o uno más lábil. Se conocen varios enlazadores en la técnica, incluyendo moléculas PEG bifuncionales (por ejemplo, véase Paige et al. Pharmaceutical Research, vol. 12, n.° 12, 1995), enlazadores hidrolizables (Shechter et al. Bioconjugate Chem. 2005,16: 913- 920 e International Journal of Peptide Research and Therapeutics, vol. 13, n.° 1-2, junio de 2007 y WO2009095479), PDPH y EMCH, véase, por ejemplo, WO2010092135. En el caso especial en que la conjugación química (unión de dos o más moléculas) de la defensina a la molécula farmacéuticamente aceptable reduzca considerablemente la actividad funcional de la defensina, puede ser preferible utilizar un enlazador más lábil que pueda liberar la defensina funcional.

La extensión del tiempo de vida media también se puede lograr a través de acilación de la cadena principal del péptido con un espaciador por ejemplo espaciador de Y-L-glutamilo y una cadena de di-ácido graso de C-18 a lisina. La cadena del sitio de di-ácido graso y el espaciador median una unión fuerte pero reversible a la albúmina, desacelerando la liberación desde el sitio de inyección y reduciendo la depuración renal.

Métodos de uso

Beta defensina 2 humana y HD5 han sido examinadas en modelos animales tanto preventivos como terapéuticos de inflamación intestinal grave y disbiosis (sulfato de dextrano sódico, ácido trinitrobencensulfónico t transferencia de célula T CD4+CD25+). Las a- y p-defensinas ya sea que se administren por vía oral o subcutánea mitigan la diarrea y pérdida de peso inducidas por estos compuestos químicos a través de salud intestinal mejorada. De manera importante las defensinas disminuyen el índice de actividad patológica y la actividad de mieloperoxidasa como un marcador de inflamación a la par con inmunosupresores de GVHD estándar fuertes tal como prednisolona/dexametasona y ciclosporina, así como anti-TNF-a, todos utilizados de manera rutinaria en el tratamiento de GVHD. Por lo tanto, las defensinas muestran potente actividad como un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de pacientes que han tenido o que están a punto de tener un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

Se ha demostrado que la hBD-2 puede reequilibrar el sistema inmune a través de normalización de las<concentraciones de IFN-y>,<TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13 en tejido previniendo o tratando por lo>tanto la tormenta de citoquinas que lleva a GVHD aguda y mostrando por lo tanto potente actividad como un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de pacientes que han tenido o que están a punto de recibir un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

Se ha demostrado en un modelo tanto preventivo como terapéutico de dieta alta en grasa en ratón que tanto el HD5 y la hBD-2 tienen una fuerte influencia sobre la composición de la microbiota incrementando la variedad de los microbios es decir preservar/normalizar/reinstalar la microbiota, así como promover la abundancia de bacterias comensales clave, presentando por lo tanto un método para tratar disbiosis, una característica común de GVHD aguda.

Se ha demostrado que la hBD-2 puede normalizar la salud, inflamación y función intestinal a través de un decremento de la actividad de mieloperoxidasa, presentando por lo tanto un método para mejorar la salud intestinal en pacientes que han tenido un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

También se ha demostrado en un modelo de asma alérgica aguda en ratón que una dosificación de betadefensina 2 humana (hBD2) ya sea que se administre por vía oral o intranasal es capaz de prevenir el desarrollo de asma, presentando por lo tanto un método para la prevención de complicaciones pulmonares y capacidad pulmonar disminuida con frecuencia asociadas con GVHD aguda y crónica.

También se ha demostrado en un modelo de asma alérgica aguda en ratón que una dosificación de betadefensina 2 humana (hBD2) ya sea que se administre por vía oral o intranasal también es capaz de tratar asma, presentando por lo tanto un método para tratar complicaciones pulmonares y capacidad pulmonar reducida con frecuencia asociadas con GVHD aguda y crónica.

En otros aspectos, la divulgación se refiere a una p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 en un método de tratamiento según cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.

La p-defensina humana proporcionada para uso según la reivindicación 1 puede tratar o prevenir la inflamación pulmonar y/o intestinal y/o la inflamación hepática mediante el cambio de los fenotipos bacterianos a través de un cambio a nivel transcripcional, así como de la estructura y composición de la flora bacteriana pulmonar y/o intestinal y/o hepática o del metaboloma pulmonar y/o intestinal en un sujeto que ha sido tratado o está a punto de ser tratado con un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

Sin estar limitado a la teoría, los efectos que se observan utilizando administración oral pueden ser atribuidos a un cambio en la microflora intestinal y el metaboloma intestinal que pueden tener un efecto en los pulmones a través del denominado eje intestino-pulmón. Los trastornos pulmonares crónicos, como el asma, la EPOC y la EICH crónica, presentan todos ellos un componente de manifestación de enfermedad intestinal, lo que indica que existe una interacción vital entre estas dos mucosas del cuerpo humano, y se ha asociado una variedad de enfermedades respiratorias con una disbiosis no solo de la microbiota de las vías respiratorias, sino también de la microbiota intestinal.

Los microbios comensales calibran las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas e influyen en los umbrales de activación de los estímulos patógenos, en gran parte mediante la producción de pequeñas moléculas que median las interacciones entre el huésped y los microbios (Donia y Fishback, 2015). Si bien la barrera epitelial garantiza que los microorganismos permanezcan confinados en gran medida en el intestino, los metabolitos microbianos pueden penetrarla, lo que les permite entrar y acumularse en el sistema circulatorio del huésped, donde son detectados por las células inmunitarias (Dorrestein, 2014). Trompette, 2013 demostró en ratones que las fibras fermentables de la dieta cambiaban la composición no solo del intestino, sino también de la microbiota pulmonar, en particular la proporción de Firmicutes y Bacteriodetes, lo que provocaba un aumento de los niveles locales y sistémicos de ácidos grasos de cadena corta, que a su vez influían en la hematopoyesis y la funcionalidad de las células dendríticas, configurando así el entorno inmunológico del pulmón e influyendo en la gravedad de la inflamación alérgica. Schirmer et al (2016) demostraron además en el Proyecto de Genómica Funcional Humana que la variación interindividual en la respuesta de las citocinas está relacionada con organismos microbianos específicos, así como con funciones microbianas. La mayoría de las asociaciones detectadas son específicas tanto de la citoquina como del estímulo, lo que sugiere que el sistema inmune reconoce e interactúa con los organismos microbianos y los productos con alta especificidad y que estos factores microbianos están asociados con un fenotipo inmunológico particular. La capacidad de producción de TNF-a e IFN-<y>parece estar influida más fuertemente por el microbioma, mientras que otras citoquinas tales como IL-1p, IL-6 e IL-17 e IL-22 derivadas de Th17 exhiben menos asociaciones, pero más efectivas, con la microbiota intestinal.

La p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 puede administrarse en combinación con prebióticos, probióticos, triptófano, glucocorticoides, ciclosporina, anti TNF-a, integrinas, antibióticos, inmunosupresores, trasplante fecal o una combinación de éstos. Las defensinas pueden administrarse por separado o junto con una o más de estas terapias. Las defensinas también pueden administrarse junto con otros medicamentos que pueden utilizarse en el tratamiento de pacientes que han tenido o están a punto de tener un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

La normalización de la microbiota intestinal y/o pulmonar también puede implicar el cambio del metaboloma a uno que produzca relativamente más butirato o triptófano y relativamente menos acetato.

Síntesisin vitro

Los péptidos antimicrobianos de mamífero incluyendo alfa defensinas de mamífero y beta defensinas de mamífero se pueden preparar mediante síntesisin vitro,utilizando métodos convencionales como los conocidos en la técnica. Están disponibles diversos aparatos de síntesis comerciales, por ejemplo, sintetizadores automatizados de Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Mediante el uso de sintetizadores, los aminoácidos que ocurren de manera natural pueden ser sustituidos con aminoácidos no naturales, particularmente los isómeros D (o formas D) por ejemplo D-alanina y D-isoleucina, diastereoisómeros, cadenas secundarias que tienen diferentes longitudes o funcionalidades, y similares. La secuencia particular y manera de preparación quedarán determinadas por la conveniencia, economía, pureza requerida, y similares. El enlazamiento químico se puede proveer a diversos péptidos o proteínas que comprenden funcionalidades convenientes para unión, tal como grupos amino para la formación de amida o amina sustituida, por ejemplo, aminación reductiva, grupos tiol para formación de tioéter o disulfuro, grupos carboxilo para formación de amida, y similares. Si se desea, se pueden introducir grupos diversos en el péptido durante la síntesis o durante la expresión, que permitan el enlazamiento a otras moléculas o a una superficie. De este modo se pueden utilizar cisteínas para hacer tioéteres, histidinas para enlazar a un complejo de ión metálico, grupos carboxilo para formar amidas o ésteres, grupos amino para formar amidas, y similares.

Los péptidos antimicrobianos de mamífero incluyendo alfa defensinas de mamífero, beta defensinas de mamífero, o equivalentes funcionales de las mismas, también se pueden aislar y purificar de conformidad con métodos convencionales de síntesis recombinante. La síntesis recombinante se puede realizar utilizando vectores de expresión apropiados y un sistema de expresión eucariota o procariota. Se puede preparar una solución del hospedador de expresión y los medios y las defensinas presentes se purifican utilizando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, u otra técnica de purificación. Los métodos para expresión recombinante de beta defensina 2 humana enE. colise describen en el documento WO 2010/007166 (Novozymes).

Las alfa y beta defensinas de mamífero, también pueden ser inducidas mediante administración del ARNm correspondiente.

Dosis

La p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 se emplea preferiblemente en una cantidad que es eficaz para prevenir o tratar la enfermedad de injerto contra huésped en un paciente que ha tenido un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas preferiblemente con una toxicidad aceptable para el paciente. Una p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 también se emplea preferiblemente en una cantidad que es eficaz para mantener una composición de microbiota normal en el pulmón y/o el intestino o para tratar o normalizar una microbiota disbiótica en el pulmón y/o el intestino, preferiblemente con toxicidad aceptable para el paciente que necesita el tratamiento.

Para dichos tratamientos, la dosis apropiada variará, desde luego, dependiendo de, por ejemplo, la naturaleza química y los datos de farmacocinética de un compuesto utilizado, del hospedador individual, del modo de administración y de la naturaleza y gravedad de las condiciones que están siendo tratadas.

En una realización, una dosis diaria indicada de una p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 es preferiblemente es de aproximadamente 0.1 mg de hBD2/kg de peso corporal hasta aproximadamente 10 mg de hBD2/kg de peso corporal, de manera más preferida de aproximadamente 0.5 mg de hBD2/kg de peso corporal hasta aproximadamente 10 mg de hBD2/kg de peso corporal; tal como 1 mg de hBD2/kg de peso corporal hasta 10 mg de hBD2/kg de peso corporal, de manera más preferida de aproximadamente 1.2 mg de hBD2/kg de peso corporal hasta aproximadamente 10 mg de hBD2/kg de peso corporal, preferiblemente de aproximadamente 1.2 mg de hBD2/kg de peso corporal hasta aproximadamente 5 mg de hBD2/kg de peso corporal, de manera incluso más preferida 1.2 mg de hBD2/kg de peso corporal, por ejemplo, administrada en dosis divididas hasta una, dos o tres veces al día.

Cuando se administran dos defensinas diferentes en una dosis, la dosis puede comprender cantidades iguales o aproximadamente iguales de las dos defensinas determinadas en una base en peso o en una base molar. La relación también puede diferir de manera que la relación de alfa defensina a la beta defensina humana varíe de 10:1 a 1:10, tal como 5:1 a 1:5, por ejemplo 2:1 a 1:2 determinada en una base en peso o molar.

Los compuestos de las realizaciones preferidas se pueden administrar a mamíferos, por ejemplo, humanos, mediante modos de administración similares a dosificaciones similares a las utilizadas convencionalmente. En una realización, la dosis diaria la dosis diaria de la defensina para uso según la reivindicación 1 está entre 0.1 y 10 mg de defensina/kg, tal como entre 0.5 y 5 mg de defensina/kg, tal como entre 1 y 2 mg de defensina/kg, tal como 1.2 mg de defensina/kg por día.

En ciertas realizaciones, la beta defensina humana para el uso de la reivindicación 1 puede usarse en una cantidad de aproximadamente 0.1 mg o menos a aproximadamente 1500 mg o más por forma de dosificación unitaria, preferiblemente de aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, o 0.5 mg a aproximadamente 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 mg, y más preferiblemente de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o 25 mg a aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg. En ciertas realizaciones, sin embargo, pueden preferirse dosis más bajas o más altas que las mencionadas anteriormente. Un experto en la materia puede determinar fácilmente las concentraciones y dosis adecuadas. En una realización, la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 se administra al menos una vez al día, por ejemplo al menos dos veces al día, por ejemplo al menos 3 veces al día o continuamente.

Administración

En una realización, la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 se administra a un paciente durante un periodo previo a que el paciente reciba un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. En este caso, la administración de defensina puede continuarse durante el trasplante y puede administrarse además una vez finalizado el trasplante. En una realización, la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 se administra a un paciente en el momento de recibir el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. Por ejemplo, la defensina puede administrarse en la misma fecha del trasplante. La administración de p-defensina humana puede continuarse después del trasplante.

En una realización, la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 se administra después del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. En esta realización, la administración de la defensina puede continuarse una vez completado el trasplante de células madre hematopoyéticas alogénicas. Por ejemplo, la defensina puede administrarse el mismo día del trasplante y una o más veces cada día posterior al trasplante. En una realización, el tratamiento continúa después del trasplante mediante la administración a intervalos tales como cada día, cada segundo día, cada tercer día, cada cuarto día, cada quinto día, cada sexto día o cada séptimo día. Como se ejemplifica en el ejemplo 13, el tratamiento puede iniciar el día del trasplante y continuar durante días después del trasplante, tal como 1 día o más, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días después del trasplante. El tratamiento también pudo haber comenzado antes del trasplante y se continúa durante días después del trasplante, tal como 1 día o más, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días después del trasplante.

Formulaciones para administración oral o parenteral

Las p-defensinas humanas para uso según la reivindicación 1 pueden formularse para su administración por cualquier vía convencional.

En una realización, la administración es oral, bucal, sublingual, rectal, vaginal, intratraqueal, intrapulmonar, intranasal, intracraneal, subcutánea, intravenosa, dérmica o transdérmica. Preferiblemente, la administración es oral.

En una realización, la administración de la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1, es oral.

En una realización, la administración de la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1, es generalmente intranasal o intrapulmonar. La administración intranasal e intrapulmonar es normal para la administración pulmonar del fármaco.

En una realización, la administración de la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1, es subcutánea o intravenosa.

En algunas realizaciones, la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 puede formularse como un liofilizado, utilizando excipientes apropiados que proporcionan estabilidad como un liofilizado, y posterior rehidratación. En una realización preferida, la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 se formula como una solución estéril e isotónica. Los portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables son conocidos por los expertos en la materia. En el caso de las p-defensinas humanas para uso según la reivindicación 1 formuladas como soluciones líquidas, deben incluirse portadores y/o diluyentes aceptables como solución salina y agua estéril, y la composición puede incluir opcionalmente antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y otros aditivos comunes.

La p-defensina humana divulgada para uso según la reivindicación 1 puede formularse en una amplia variedad de formulaciones para administración oral. Las preparaciones en forma sólida pueden incluir polvos, comprimidos, gotas, cápsulas, cachets, pastillas y gránulos dispersables. Otras formas adecuadas para la administración oral pueden incluir preparaciones en forma líquida, como emulsiones, jarabes, elixires, soluciones acuosas, suspensiones acuosas, dentífricos, dentífricos en gel, chicles o preparaciones en forma sólida destinadas a convertirse poco antes de su uso en preparaciones en forma líquida, como soluciones, suspensiones y emulsiones.

La p-defensina humana divulgada para uso según la reivindicación 1 puede formularse en una amplia variedad de formulaciones para administración bucal, sublingual, oral, rectal, vaginal, dérmica, transdérmica, intracraneal, subcutánea o intravenosa. La formulación puede contener (además de una alfa defensina de mamífero y/o una beta defensina de mamífero y otros principios activos opcionales) portadores, cargas, desintegrantes, acondicionadores de flujo, azúcares y edulcorantes, fragancias, conservantes, estabilizantes, humectantes, emulgentes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica, tampones, diluyentes, agentes dispersantes y tensioactivos, aglutinantes, lubricantes y/u otros excipientes farmacéuticos conocidos en la técnica. Un experto en la materia puede formular además la p-defensina humana de manera apropiada y de acuerdo con prácticas aceptadas, como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro (1990).

La p-defensina humana para uso según la reivindicación 1, puede usarse sola, o en terapias de combinación con uno, dos o más compuestos farmacéuticos o sustancias farmacológicas, por ejemplo con prebióticos, probióticos, glucocorticoides, ciclosporina, anti TNF-a, integrinas, antibióticos, inmunosupresores o una combinación de los mismos y/o con uno o más excipiente(s) farmacéuticamente aceptable(s).

Administración por vía respiratoria

Se puede utilizar la administración por vía respiratoria para administrar la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 de la invención. Con administración intrapulmonar se quiere decir administración tópica a los pulmones. Cuando se utilizan en la presente solicitud los términos "administración intratraqueal, intrabronquial o intra-alveolar" incluyen todas las formas de dicha administración mediante las cuales se aplica una defensina a la tráquea, los bronquios o los alvéolos, respectivamente, ya sea mediante instilación de una solución de una defensina, aplicando una defensina en una forma en polvo, o permitiendo que una defensina llegue a la parte relevante de la vía respiratoria mediante inhalación de una defensina como una solución o suspensión en aerosol o nebulizada o polvo inhalado o gel, con o sin estabilizadores u otros excipientes añadidos.

Los métodos de administración intrabronquial/alveolar incluyen, pero no se limitan a, lavado bronqueoalveolar con sonda (BAL por sus siglas en inglés) de conformidad con métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, utilizando como un fluido de lavado con sonda una composición fisiológicamente aceptable en la cual se ha disuelto la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 o de hecho mediante cualquier otra forma efectiva de administración intrabronquial incluyendo el uso de polvos inhalados que contienen defensinas en forma seca, con o sin excipientes, o la aplicación directa de una defensina, en solución o suspensión o forma en polvo durante la broncoscopia. Los métodos para administración intratraqueal incluyen, pero no se limitan a, lavado traqueal ciego con una solución similar de defensinas disueltas o una suspensión de defensina, o la inhalación de gotas minúsculas de fluido nebulizado que contienen defensinas disueltas o una suspensión de defensinas obtenida mediante el uso de cualquier aparato nebulizador adecuado para este propósito.

En otra realización, la administración intratraqueal, intrabronquial o intraalveolar no incluye la inhalación del producto sino la instilación o aplicación de una solución de defensina o un polvo o un gel que contiene defensina a la tráquea o vías respiratorias inferiores.

Otros métodos de administración preferidos pueden incluir utilizando los siguientes dispositivos:

1. Nebulizadores presurizados utilizando mezcla de aire comprimido/oxígeno

2. Nebulizadores ultrasónicos

3. Nebulizadores de microbomba electrónica

4. Inhalador de dosis medida (MDI por sus siglas en inglés)

5. Sistemas de inhalador de polvo seco (DPI por sus siglas en inglés),

El aerosol se puede suministrar mediante a) mascarillas o b) mediante tubos endotraqueales en pacientes entubados durante ventilación mecánica (dispositivo 1, 2 y 3). Los dispositivos 4 y 5 también pueden ser utilizados por el paciente sin asistencia con la condición de que el paciente sea capaz de activar por sí mismo el dispositivo de aerosol.

Las concentraciones preferidas para la p-defensina humana para uso según la reivindicación 1, cuando dicha defensina se encuentra en una solución están en el intervalo de aproximadamente 0.1 pg a 1000 pg por ml de solución, como por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 0.1 pg a 250 pg por ml de solución.

Composición farmacéutica para administración intrapulmonar

La p-defensina humana para uso según la reivindicación 1, puede estar comprendida en una formulación en combinación con, preferiblemente disuelta en, un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso o diluyente, o transportado a las vías respiratorias inferiores como una preparación pegilada o como una preparación liposomal o nanopartícula administrada como un aerosol por inhalación, o como un fluido de lavado administrado a través de un broncoscopio como un lavado broncoalvelar o como un lavado o lavado intratraqueal ciego. Pueden utilizarse diversos portadores acuosos, como solución salina al 0.9%, solución salina tamponada, tampones fisiológicamente compatibles y similares. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para uso o filtrarse en condiciones asépticas y liofilizarse, disolviéndose la preparación liofilizada en una solución acuosa estéril antes de su administración.

En una realización una preparación de defensina secada por congelación se puede pre-envasar por ejemplo en unidades de dosis individual. En una realización incluso más preferida la unidad de dosis individual está ajustada al paciente.

La p-defensina humana para el uso según la reivindicación 1 puede combinarse con sustancias auxiliares o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables, incluyendo, sin limitación, agentes para ajuste de pH y amortiguadores y/o agentes para ajuste de la tonicidad, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc.

La p-defensina humana para uso según la reivindicación 1 puede formularse con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables incluyendo microesferas, liposomas, microcápsulas, nanopartículas o similares. Los liposomas convencionales típicamente están compuestos por fosfolípidos (neutros o cargados negativamente) y/o colesterol. Los liposomas son estructuras vesiculares basadas en bicapas de lípido que rodean los compartimientos acuosos. Estos pueden variar en sus propiedades fisicoquímicas tal como tamaño, composición de lípido, carga de superficie y número y fluidez de las bicapas de fosfolípidos. Los lípidos más frecuentemente utilizados para formación de liposoma son: 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-distearoil-snglicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DMPE), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato (sal monosódica) (DMPA), 1,2-dipalmitoil-snglicero-3-fosfato (sal monosódica) (DPPA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfato (sal monosódica) (DOPA), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (sal sódica) (DMPG), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (sal sódica) (DPPG), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (sal sódica) (D<o>PG), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-[fosfo-L-serina] (sal sódica) (DMPS), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-L-serina) (sal sódica) (DPPS), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfo-L-serina] (sal sódica) (DOPS), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(glutarilo) (sal sódica) y 1,1',2,2'-tetramiristoil cardiolipina (sal de amonio). Se prefieren las formulaciones constituidas por DPPC en combinación con otros lípidos o modificadores de liposomas por ejemplo en combinación con colesterol y/o fosfatidilcolina.

Los liposomas de circulación larga se caracterizan por su capacidad de extravasación en sitios del cuerpo en donde está incrementada la permeabilidad de la pared vascular. La forma más popular de producir liposomas de circulación larga es unir el polímero hidrófilo polietilenglicol (PEG) covalentemente a la superficie externa del liposoma. Algunos de los lípidos preferidos son: 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi-(polietilenglicol)-2000] (Sal de amonio), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000] (sal de amonio), 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (sal de cloruro) (DOTAP). Los posibles lípidos aplicables para liposomas son suministrados por Avanti, Polar Lipids, Inc, Alabaster, AL. De manera adicional, la suspensión de liposoma puede incluir agentes protectores de lípidos los cuales protegen a los lípidos contra daño por radicales libres y daño peroxidativo de lípidos en almacenamiento. Se prefieren los extinguidores de radicales libres lipofílicos, tal como alfa-tocoferol y quelantes específicos de hierro solubles en agua, tal como ferrioxianina.

Están disponibles una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), Patentes EE. UU. N.° 4,235,871,4,501,728 y 4,837,028. Otro método produce vesículas multi-laminares de tamaños heterogéneos. En este método, los lípidos formadores de vesícula se disuelven en un solvente orgánico o sistema de solvente apropiado y se secan al vacío o en un gas inerte para formar una película de lípido delgada. Si se desea, la película se puede volver a disolver en un solvente apropiado, tal como butanol terciario, y después se liofiliza para formar una mezcla lipídica más homogénea la cual está en una forma tipo polvo más fácilmente hidratada. Esta película se cubre con una solución acuosa del fármaco dirigido y el componente para direccionamiento y se deja hidratar, típicamente en el transcurso de un periodo de 15-60 minutos con agitación. La distribución de tamaño de las vesículas multilaminares resultantes se puede cambiar hacia tamaños más pequeños hidratando los lípidos bajo condiciones de agitación más vigorosa o agregando detergentes solubilizantes tal como desoxicolato.

Las micelas se forman mediante agentes tensoactivos (moléculas que contienen una porción hidrofóbica y uno o más grupos iónicos o de otro modo fuertemente hidrofílicos) en solución acuosa.

Los agentes tensoactivos comunes bien conocidos por un experto en la técnica se pueden utilizar en las micelas de la presente invención. Los agentes tensoactivos apropiados incluyen laureato de sodio, oleato de sodio, laurilsulfato de sodio, éter monododecílico de octaoxietilenglicol, octoxinol 9 y PLURONIC F-127 (Wyandotte Chemicals Corp.). Los agentes tensoactivos preferidos son detergentes de polioxietileno y polioxipropileno no iónicos compatibles con inyección intravenosa tal como, TWEEN-80, PLURONIC F-68, noctil-beta-D-glucopiranósido, y similares. Además, los fosfolípidos, tales como aquellos descritos para ser utilizados en la producción de liposomas, también se pueden utilizar para formación de micela.

Ejemplos

Ejemplo 1(a modo de ilustración).

Efecto antiinflamatorio de administración de hBD2 s.c. e i.v. contra anti-TNF-a intraperitoneal de ratón en un modelo profiláctico en ratón, de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico, oral, de 10 días Régimen de tratamiento:

La Figura 1 ilustra el diseño del estudio.

70 ratones C57BL/6, de género masculino alojados en grupos de cinco por jaula se asignan a 7 grupos de tratamiento diferentes. Todos los animales tienen su agua para beber suplementada con DSS al 2 % durante 7 días para inducir colitis lo que da como resultado inflamación significativa y daño del tejido del colon. Los animales se tratan con hBD2 dosificada por vía intravenosa en la vena de la cola o por vía subcutánea bajo la piel dorsal, con anti-TNF-a de ratón por vía intraperitoneal o PBS como vehículo durante 10 días.

Pruebas:

Se aplica un sistema de puntuación del índice de la actividad patológica (DAI por sus siglas en inglés) para la evaluación clínica (Figura 7). Los animales se sacrifican el día 10 y se retira el colon para evaluación histológica empleando un sistema de puntuación histológica (Figura 8).

Resultados:

l efecto más significativo se obtuvo cuando se administró hBD2 por vía subcutánea, una o dos veces al día, pero la administración intravenosa de hBD2 también produjo una reducción significativa del DAI. Tanto el anti TNFa como el hBD2 mostraron un efecto similar y estadísticamente significativo sobre el DAI. El hBD2, especialmente cuando se administró por vía s.c. dos veces al día, tuvo un efecto altamente significativo desde el punto de vista estadístico sobre la puntuación histológica, mientras que el anti TNF-a no mostró ningún efecto significativo sobre esta puntuación (Figura 9).

La GVHD aguda se caracteriza por la necrosis de las células de la cripta y, en casos graves, por la pérdida total del epitelio en todo el intestino. El modelo DSS murino inducido químicamente, que provoca la pérdida de epitelio, parece por tanto pertinente para probar el efecto profiláctico de los compuestos en la GVHD. Los resultados del ejemplo 1 demuestran que especialmente la administración s.c. de hBD2 es tan eficaz como el tratamiento anti TNF-a. Algunas publicaciones han informado de un efecto positivo del anti-TNF-a en la GVHD.

Ejemplo 2(a modo de ilustración).

Efecto antiinflamatorio de administración oral de hBD2 contra prednisolona oral en un modelo profiláctico en ratón, de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico, de 10 días

Régimen de tratamiento:

50 ratones C57BL/6, de género masculino alojados en grupos de cinco por jaula se asignan a 5 grupos de tratamiento diferentes. Todos los animales tienen su agua para beber suplementada con DSS al 2 % durante 7 días para inducir colitis lo que da como resultado inflamación significativa y daño del tejido del colon. Los animales se tratan con hBD2 oral dosificada a tres niveles de dosis diferentes dos veces por día o prednisolona 1 mg/kg dos veces por día o PBS como vehículo durante 10 días.

Pruebas:

Se aplica un sistema de puntuación del índice de la actividad patológica (DAI) para la evaluación clínica (Figura 7). Los animales se sacrifican el día 10 y se retira el colon para evaluación histológica empleando un sistema de puntuación histológica (Figura 8).

Resultados:

Se observa una pérdida de peso corporal dramáticamente reducida lo que indica que estos animales comen más y experimentan un mejor estado de salud, para los tres niveles de dosis de hBD2, pero más pronunciada en el grupo con dosis alta que recibe 5 mg/kg dos veces al día (Figura 10). Los dos niveles de dosis de hBD2 más bajos tienen un efecto estadísticamente significativo sobre el DAI a la par con Prednisolona, mientras que la hBD2 de dosis alta (5 mg/kg dos veces al día) tiene un efecto significativamente mejor sobre el DAI que estas (Figura 11). Tanto Prednisolona como hBD2 muestran un efecto estadísticamente significativo sobre la puntuación histológica pero el efecto de los tres grupos de dosis de hBD2 es significativamente mejor que Prednisolona (Figura 12).

La GVHD aguda se caracteriza por necrosis de célula de la cripta y en casos graves por la pérdida total del epitelio a lo largo de los intestinos. El modelo de DSS en ratón, inducido químicamente, que ocasiona la pérdida del epitelio, por tanto, parece relevante para analizar el efecto profiláctico de los compuestos en la GVHd . Los resultados del ejemplo 2 demuestran que la administración oral de hBD2 es tan efectiva como el tratamiento profiláctico de GVHD estándar con prednisolona oral.

Ejemplo 3(a modo de ilustración).

Efecto antiinflamatorio de la administración s.c. de hBD2 contra prednisolona s.c. en un modelo profiláctico en ratón de colitis inducida por ácido trinitrobencensulfónico, de 8 días

Régimen de tratamiento:

105 ratones BALB/cByJ, de género masculino alojados en grupos de cinco por jaula se asignan a 7 grupos de tratamiento diferentes. Se induce colitis mediante administración intracolon de ácido trinitrobencensulfónico en el día 0 bajo anestesia ligera lo que da como resultado inflamación significativa y daño del tejido del colon. Los animales se tratan con hBD2 a cuatro niveles de dosificación diferentes una vez al día (1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.1 mg/kg, y 0.03 mg/kg) o Prednisolona 10 mg/kg una vez al día dosificada por vía subcutánea bajo la piel dorsal o PBS como vehículo durante 7 días.

Pruebas:

Se aplica un sistema de puntuación del índice de la actividad patológica (DAI) para la evaluación clínica (Figura 7). Los animales se sacrifican el día 10 y se retira el colon para evaluación histológica empleando un sistema de puntuación histológica (Figura 8).

Resultados:

Se observa un incremento en el peso corporal altamente significativo desde el punto de vista estadístico lo que indica que estos animales comen más y experimentan un mejor estado de salud para los dos niveles de dosis más bajos (0.03 y 0.1 mg/kg una vez al día) de hBD2. Tanto Prednisolona como hBD2 (a 0.1, 0.3 y 1 mg/kg) muestran un efecto clínico altamente significativo desde el punto de vista estadístico sobre la puntuación histológica (Figura 13).

La GVHD aguda se caracteriza por necrosis de célula de la cripta y en casos graves por la pérdida total del epitelio a lo largo de los intestinos. El modelo en ratón de TNB<s>inducido químicamente, que ocasiona una pérdida severa del epitelio, por tanto, parece relevante para analizar el efecto profiláctico de los compuestos en la GVHD. Los resultados del ejemplo 3 demuestran que la administración s.c. de hBD2 es tan efectiva como el tratamiento preventivo estándar con prednisolona.

Ejemplo 4(a modo de ilustración).

Efecto antiinflamatorio de administración oral y s.c. de hBD2 contra ciclosporina oral en un modelo profiláctico, en ratón de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico, de 7 días

Régimen de tratamiento:

80 ratones C57BL/6, de género masculino alojados en grupos de cinco por jaula se asignan a 7 grupos de tratamiento diferentes. Todos los animales tienen su agua para beber suplementada con DSS al 3% durante 7 días para inducir colitis caracterizada por daño epitelial, disrrupción de la arquitectura de cripta y una inflamación moderada caracterizada por la acumulación de mononucleares neutrófilos en la mucosa y submucosa. Los animales se tratan con hBD2 oral dosificada a 0.6 mg/kg dos veces al día o 0.4 mg/kg tres veces al día; hBD2 dosificada s.c. a 0.15 mg/kg dos veces al día o 0.1 mg/kg tres veces al día; o ciclosporina 50 mg/kg una vez al día o agua durante 7 días.

Pruebas:

La evaluación clínica se lleva a cabo de conformidad con un sistema de puntuación (0=sin sangre en las heces; 1=evidencia de sangre en las heces y 2=sangrado grave). Los animales se sacrifican el día 7 y se retira el colon para evaluación histológica.

Resultados:

Se observa una mejora altamente significativa desde el punto de vista estadístico en el mantenimiento de la longitud del colon (Figura 14) y puntuaciones clínicas (Figura 15) para los cuatro grupos de dosificación de hBD2, así como para ciclosporina. La dosificación tres veces al día de hBD2 es más eficaz que la dosificación dos veces al día con ambas vías de administración y la dosificación s.c. parece ser más eficaz que la dosificación oral (Figura 15).

La GVHD aguda se caracteriza por necrosis de célula de la cripta y en casos graves por la pérdida total del epitelio a lo largo de los intestinos. El modelo de DSS en ratón, inducido químicamente, que ocasiona pérdida grave del epitelio, por tanto, parece relevante para analizar el efecto profiláctico de los compuestos en la GVHD. Los resultados del ejemplo 4 demuestran que la administración tanto s.c. como oral de hBD2 es tan efectiva especialmente en la evaluación clínica como el tratamiento profiláctico de GVHD estándar con ciclosporina.

Ejemplo 5(a modo de ilustración).

Efecto antiinflamatorio de la administración s.c. de hBD2 contra anti-TNF- a intraperitoneal y dexametasona intraperitoneal en un modelo terapéutico, en ratón de colitis inducida por sulfato de dextrano sódico, de 14 días Régimen de tratamiento:

70 ratones C57BL/6, de género masculino alojados en grupos de cinco por jaula se asignan a 7 grupos de tratamiento diferentes. Todos los animales tienen su agua para beber suplementada con DSS al 2 % durante 14 días para inducir colitis lo que da como resultado inflamación significativa y daño del tejido del colon. Los animales se tratan con hBD2, 0.1 mg/kg s.c. dos veces al día; 0.1 mg/kg s.c. una vez al día o 1.2 mg/kg i.v. una vez al día desde el día 8 hasta el día 14 o con anti-TNFa de ratón 250 pg/ratón por vía intraperitoneal el día 8, 10 y 13 o con dexametasona 1 mg/kg por vía intraperitoneal una vez al día o p Bs s.c. como vehículo. Pruebas:

Se aplica un sistema de puntuación del índice de la actividad patológica (DAI) para la evaluación clínica (Figura 7). Los animales se sacrifican el día 14 y se retira el colon para evaluación histológica empleando un sistema de puntuación histológica (Figura 8)

Resultados:

Se observa un efecto estadísticamente significativo sobre el DAI para hBD20.1 mg s.c. una vez al día y para dexametasona 1 mg/kg i.p. una vez al día. De manera similar, se observa un efecto estadísticamente significativo sobre la puntuación histológica (Figura 16) tanto para hBD2 0.1 mg/kg s.c. una vez al día como para dexametasona.

La GVHD aguda se caracteriza por necrosis de célula de la cripta y en casos graves por la pérdida total del epitelio a lo largo de los intestinos. El modelo de DSS en ratón, inducido químicamente, que ocasiona pérdida grave del epitelio, por tanto, parece ser relevante para analizar el efecto del tratamiento de los compuestos en la GVHD. Los resultados del ejemplo 5 demuestran que la administración s.c. de hBD2 es tan efectiva como el tratamiento estándar de GVHD con dexametasona.

Ejemplo 6 (a modo de ilustración).

Eficacia de la administración de hBD2 s.c. contra anti-TNF-a s.c. (Enbrel) y dexametasona intraperitoneal en un modelo terapéutico, en ratón, de colitis inducida por transferencia de célula T CD4+CD25+, de 14 semanas Régimen de tratamiento:

70 ratones BALB/c, de género femenino alojados en grupos de cinco por jaula se asignan a 7 grupos de tratamiento diferentes. La colitis se induce en ratones SCID mediante transplante de células T CD4+CD25+ provenientes de ratones BALB/c. Los linfocitos aislados a partir del bazo y nódulos linfáticos de ratones BALB/c se someten a selección negativa de células T CD4+. Después de esto, las células CD4+CD25+ se aíslan positivamente ligándolas a los glóbulos a partir de las suspensiones de célula T CD4+ y las CD4+CD25-se recolectan a partir del sobrenadante. Los animales se tratan con hBD2, 0.1 mg/kg s.c. una vez al día; 1 mg/kg s.c. una vez al día o 3 mg/kg s.c. una vez al día o con anti-TNFa de ratón 100 pg/ratón s.c. dos veces a la semana o con dexametasona 0.3 mg/kg por vía intraperitoneal una vez al día o<p>B<s>s.c. como vehículo desde el día 7 y 86 días consecutivos.

Pruebas:

La evaluación clínica se basa en la pérdida de peso corporal, consistencia de las heces y la presencia de sangre por recto. Los animales se sacrifican en el día 95 y el colon se retira para la evaluación del peso y de la actividad de mieloperoxidasa.

Resultados:

Se observa un efecto estadísticamente significativo y similar en la puntuación clínica para hBD2 1 mg/kg s.c. una vez al día, para dexametasona 0.3 mg/kg i.p. una vez al día y para Enbrel (Figura 17). De manera similar estos tres regímenes de dosificación muestran un efecto estadísticamente significativo y similar sobre el peso del colon (Figura 18) y la actividad de mieloperoxidasa (Figura 19).

Se cree que la GVHD aguda es un síndrome mediado por célula T caracterizado por necrosis de célula de la cripta y en casos graves por la pérdida total del epitelio a lo largo de los intestinos y especialmente las células T reg CD4+CD25+ han recibido mucha atención como parte de la patogénesis de GVHD aguda (Ball & Egeler, 2008). El modelo en ratón de transferencia de célula T CD4+CD25+, que ocasiona pérdida grave del epitelio, por tanto, parece ser relevante para analizar el efecto del tratamiento de los compuestos en GVHD grave y persistente.

La mieloperoxidasa es una enzima humana, que juega un papel importante en el inicio y avance de la inflamación y es un biomarcador del estrés oxidativo e inflamación y recientemente ha sido reportado como un biomarcador potencial de GVHD (Ge y Ye, 2013). Los resultados del ejemplo 6 demuestran que la administración de hBD2 es tan efectiva como el tratamiento antiinflamatorio estándar de GVHD con dexametasona, pero también como el tratamiento menos establecido con anti-TNF-a.

Ejemplo 7(a modo de ilustración).

Protección y conservación de la microbiota del intestino mediante tratamiento profiláctico con defensinas.Ratones:Los ratones se alojan en tríos, 4 jaulas por grupo. La ingesta de alimento se registra diariamente justo antes de que las luces se apaguen a las 6 pm. Los ratones individuales se someten a procedimientos experimentales en orden alterado tanto en forma grupal como por jaula. Los ratones se mantienen a temperatura ambiente bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas en condiciones de SPF estándar.

Dietas: Para la dosificación, se estima que el peso promedio es de 25 gramos por ratón. Los ratones ingieren aproximadamente 3 gramos de alimento por ratón por día.

Régimen de tratamiento: Los ratones son alimentados ya sea con una dieta alta en grasa (HFD por sus siglas en inglés) o una dieta de control baja en grasa (LF por sus siglas en inglés). La HFD contiene 4 subgrupos; 1 hBD2, 1 HD5, 1 hBD2/HD5 y 1 HFD estándar sin suplementación de defensinas (Figura 3). La concentración de defensina es de 1.2 mg de hBD2 por kg de ratón por día. Se administra HD5 en concentración equimolar con respecto a hBD2. Al grupo combinatorio se administra hBD2 al 50 % HD5 al 50 %, por lo tanto, una cantidad total de defensinas equivalente a los grupos de prueba restantes.

Pruebas:

Se llevan a cabo análisis microbianos para estudiar la microbiota del intestino.

Se efectúa caracterización 16S longitudinal en 4 muestras pareadas provenientes de 60 ratones, 240 muestras en total. Se toma muestra de cada ratón antes del cambio de dieta, 1 semana después del cambio de dieta, 4 semanas después del cambio de dieta y en la finalización, asegurando de esta manera una caracterización exhaustiva de la microbiota fecal como resultado del tratamiento con defensina.

Resultados

Cambio en el peso. Mientras que la ingesta de alimento es similar en los tres grupos de dieta experimentales, ambos grupos con dieta alta en grasa (HFD) ganan significativamente más peso que el grupo de referencia con dieta baja en grasa (LFD) en el transcurso del periodo de estudio de 10 semanas (*p<0.0001, ANOVA de 2 vías, prueba post de Tukey). Sin embargo, el grupo de HFD más hBD2, gana significativamente menos peso que el grupo de referencia con HFD (*p= 0.0028).

Microbiota. La hBD2 afecta principalmente la presencia microbiana, mientras que HD5 y hBD2+HD5 afectan principalmente la abundancia microbiana (Figura 20). Se observa un incremento estadísticamente significativo de la abundancia de Allobaculum en el intestino delgado después de profilaxis con HD5 (p<0.02; Figura 21). Allobaculum es una especie productora de ácido graso de cadena corta. Los ácidos grasos de cadena corta juegan un papel importante en la regulación de la homeostasis de célula T reg de colon mediada a través de GPCR43. La hipoplasia de célula T y la homeostasis perturbada de célula T es una parte central de GVHD tanto aguda como crónica. La Figura 22 es un análisis de género que muestra la abundancia relativa de especies en los diferentes grupos de tratamiento e ilustra el efecto de hBD2 y HD5 sobre la flora intestinal. Se observa un incremento estadísticamente significativo en la abundancia deBarnesiellaen el colon después de tratamiento profiláctico con hBD2 (p<0.03; Figura 24).Barnesiellaes una bacteria que es capaz de eliminar y proteger contra el dominio intestinal de bacterias patógenas resistentes a antibióticos que se pueden observar en pacientes hospitalizados. La abundancia deBarnesiellacorresponde con la cantidad de varias células inmunorreguladoras. Entre mayor sea el nivel deBarnesiellaen el colon, más serán las células B de zona marginal y células T asesinas naturales invariantes enumeradas en el bazo e hígado. En el desarrollo de colitis en ratones IL-10-/-, los niveles más altos de un filotipo deBarnesiellase correlacionan con niveles de actividad más bajos de la enfermedad. Se observa una tendencia hacia abundancia más baja deLactobacillaceaeen el colon después de tratamiento profiláctico con hBD2 (p=0.1; Figura 23).

El grupo de ratones con HFD desarrollan esteatosis extensa (acumulación de grasa intra-hepatocítica) mientras que el grupo de ratones con HFD tratados de manera profiláctica con hBD-2 desarrollan esteatosis mínima (Figura 60).

La microbiota parece jugar un papel importante en el desarrollo de GVHD especialmente después de la descontaminación bacteriana dramática llevada a cabo justo después del transplante de células madre. En particular, la microbiota parece jugar un papel importante en el desarrollo de GVHD especialmente después de la descontaminación bacteriana dramática llevada a cabo justo antes del transplante de células madre. Este ejemplo 7 demuestra que las defensinas tienen una influencia profunda sobre la composición de la microbiota en términos del número de especies presentes, así como el número total de bacterias y por lo tanto al parecer protegen y conservan una microbiota sana. De manera más específica al parecer las defensinas promueven las bacterias productoras de ácidos grasos de cadena corta, SCFA que juegan un papel clave en la homeostasis de célula T reg de colon. Además, al parecer las defensinas protegen contra inflamación y esteatosis hepática.

Ejemplo 8(a modo de ilustración).Tratamiento de disbiosis mediante tratamiento intervencionista con defensinas

Ratones y dietas. El experimento dilucida el efecto de hBD2 y HD5 sobre la microbiota en ratones obesos inducidos por dieta. Un periodo de pre-inclusión de 13 semanas en el cual los ratones son alimentados con una HFD muy alta (60 % de energía proveniente de grasa) precede la intervención. Solamente los ratones que satisfacen los criterios de un mínimo de 12 gramos de ganancia de peso (aproximadamente 50 % del peso corporal inicial) durante el periodo de pre-inclusión son incluidos en los análisis finales. Los ratones que no satisfacen dichos criterios permanecen en sus jaulas respectivas como "vigilantes" de la jerarquía. Éstos son expuestos a todas las pruebas experimentales, pero son excluidos de los análisis.

Régimen de tratamiento. Antes de la intervención todos los ratones se someten a barrido por MR. Las jaulas de los ratones se asignan a grupos experimentales tomando como base su masa grasa. Todas las medidas posteriores se parean con datos provenientes del mismo ratón antes de la intervención. Se corre un grupo de referencia LFD (dieta baja en grasa) en paralelo. Como controles para la intervención se incluyen 2 grupos adicionales: 1 HFD muy alta y 1 LFD. Los ratones experimentales permanecen en la HFD muy alta durante la intervención (Figura 3). Los ratones están en la dieta experimental durante 10 semanas. Éstos son co-alojados a lo largo del experimento, 4 ratones por jaula, 3 jaulas por grupo. Todas las pruebas se corren durante 3 días, 1 jaula por grupo por día.

Pruebas. Se llevan a cabo análisis microbianos para estudiar la microbiota del intestino. Se efectúa caracterización 16S longitudinal en 4 muestras pareadas provenientes de 60 ratones, 240 muestras en total. Cada ratón se muestrea antes del cambio de dieta, 1 semana después del cambio de dieta, 4 semanas después del cambio de dieta y en la finalización, asegurando de esta manera una caracterización exhaustiva de la microbiota fecal como resultado del tratamiento con defensina.

Resultados

Cambio de peso - hBD2. Los grupos alimentados con dieta alta en grasa (HFD) estándar tienen una ingesta de alimento igual a lo largo del periodo de estudio completo y tienen el mismo desarrollo de peso con masa grasa y magra iguales las primeras 13 semanas, teniendo por tanto el mismo punto de partida antes de la intervención dietética. La ganancia de peso es significativamente más grande que en el grupo alimentado con la dieta baja en grasa (LFD) (*p<0.05 ANOVA de 2 vías). Después de la intervención dietética los grupos con HFD continúan aumentando de peso, sin embargo, el grupo con HFD más hBD2 tiende a ganar menos peso las primeras 4 semanas después de la intervención dietética, aunque no es significativo (*p=0.07, ANOVA de 2 vías). Desde la semana 4 hasta el final del periodo de estudio el grupo con HFD más hBD2 gana peso similar al del grupo con HFD estándar (*p=0.82, ANOVA de 2 vías).

Cambio de peso - HD5. Todos los grupos alimentados con HFD tienen la misma ingesta de alimento durante el periodo de estudio y ganancia de peso igual durante el periodo de pre-inclusión de 13 semanas. Después de la intervención dietética el grupo alimentado con HFD más HD5 gana significativamente menos peso que el control con HFD (*p<0.05, ANOVA de 2 vías). Además, se observa una tendencia de reducir el porcentaje de grasa en el grupo de HFD más HD5, y se mide un porcentaje de grasa significativamente más bajo en el grupo con HFD más HD54 semanas después del cambio dietético en comparación con el control con HFD (*p=0.009 ANOVA de 2 vías).

Microbiota.

Se demuestra que ambas defensinas tienen una influencia profunda sobre la presencia bacteriana, así como la ausencia bacteriana (Figuras 25). HD5 incrementa la abundancia deAlloprevotellade manera estadísticamente significativa en el colon (p<0.02) (Figura 26) mientras que hBD2 no tiene ninguna influencia sobre la abundancia deAlloprevotella.hBD2 incrementa de manera dramática y estadísticamente significativa la abundancia relativa deBifidobacteriaceaetanto en el intestino delgado como en el colon (p<0.0001 y p<0.04 respectivamente; Figuras 27A). Hay una tendencia hacia HD5 incrementando la abundancia deBifidobacteriaceaeen el intestino delgado (Figuras 27).La microbiota parece jugar un papel importante en GVHD especialmente después de la descontaminación bacteriana dramática llevada a cabo justo después del transplante de células madre. El tratamiento experimental con transplantes fecales actualmente está en curso en un número de centros alrededor del mundo por ejemplo con el Prof. Holler en Regensburg, Alemania para intentar reinstalar una microbiota normal después de la descontaminación bacteriana. Este ejemplo 8 demuestra que las defensinas tienen una influencia profunda sobre la composición de la microbiota en términos del número de especies presentes y el número total de bacterias y por lo tanto parecen ser capaces de tratar una condición disbiótica y reinstalar una microbiota normal, que es clave para conservar por ejemplo la homeostasis de célula T reg de colon.

Ejemplo 9(a modo de ilustración).

Determinación y evaluación de la eficacia del tratamiento profiláctico con defensinas intranasales (IN) contra orales en un modelo de asma alérgica generada por ácaros del polvo doméstico en múrido

Materiales y métodos

Régimen de tratamiento: Ratones BALB/c de 7-10 semanas de edad, de género femenino se asignan de manera aleatoria en 5 grupos de estudio un día antes del inicio del estudio y se sensibilizan por vía subcutánea (SC) a ácaros del polvo doméstico (100 pg de HDM en 200 pL de solución salina más coadyuvante completo de Freund en solución salina al 0.9 %). Los ratones se tratan con hBD2 por vía oral y por vía intranasal respectivamente a una dosis de 1.2 mg/kg/día (0.4 mg/kg tres veces al día) iniciando en el día 12 en la mañana y se continúa tres veces al día a intervalos de aproximadamente 6 horas. La última dosis se administra en el día 14 una hora antes del desafío. El número total de dosis es 8 dosis o un total de 2 mg/kg de hBD2. Los ratones después se desafían por vía intranasal (IN) con HDM en el día 14 (HDM 25 pg en 50 pL de solución salina) (Figura 4).

Pruebas:

Inflamación de vías respiratoriasA las 48 horas después del desafío, se efectúa lavado bronqueoalveolar con sonda lavando los pulmones con 3 volúmenes de PBS fría (0.4; 0.3 y 0.3 mL, 1 mL en total). Las cuentas totales y diferenciales de leucocitos se determinan en un analizador hematológico automatizado Sysmex XT-2000iV.

Función pulmonarIniciando 48 horas después del desafío con HDM, se llevan a cabo las mediciones de resistencia pulmonar y distensibilidad pulmonar después de desafío con metacolina (3.125 MCH1; 6.25 MCH2; 12.5 MCH3 y 25 mg/mL de MCH4) en ratones anestesiados, canulados utilizando el sistema Buxco Finepoint RC de DSI. Los datos se representan como resistencia de las vías respiratorias a 10 mg/kg de metacolina y como curvas de dosis-respuesta.

Muestreo pulmonar para análisis de citoquinaDespués de la finalización de cada BAL, los pulmones se retiran del tórax, se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenan congelados a -80 grados Celsius hasta el análisis de la concentración de citoquina de TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13 e IL-33 en homogeneizados de pulmón mediante ELISA.

Resultados

Se observa un incremento de los valores de resistencia pulmonar y reducción de los valores de distensibilidad pulmonar en animales tratados con vehículo desafiados con HDM en comparación con ratones desafiados con solución salina (no asmáticos). Se induce una respuesta inflamatoria en ambos grupos de ratones tratados con vehículo (oral e intranasal) mediante un solo desafío con HDM 14 días después de sensibilización con HDM. Ésta se caracteriza por un incremento estadísticamente significativo en las cuentas de células, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos y linfocitos totales en BALF (p<0.05) cuando se compara con controles desafiados con solución salina. Además, el análisis de la concentración de siete citoquinas TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13 e IL-33 en homogeneizados de tejido pulmonar revela niveles significativamente más altos en animales desafiados con HDM en comparación con controles desafiados con solución salina.

hBD2, después de administración tanto oral como intranasal tres veces al día, administrada desde el día 12 hasta el día 14 (un total de 2.0 mg/kg en 8 administraciones), inhibe de manera efectiva el incremento de la resistencia de las vías respiratorias (Figura 28) y reduce la distensibilidad pulmonar (Figura 29) en comparación con animales tratados con vehículo desafiados con HDM. Se observa un efecto sobre el influjo celular en BALF después de la aplicación oral, lo cual inhibe de manera significativa las cuentas de neutrófilos (Figura 30). Un reequilibrio del sistema inmune con una normalización completa de las concentraciones de citoquina en homogeneizados de tejido pulmonar se observa en los niveles de las citoquinas TNF-a (Figura 31A), IL-4 (Figura 31B), L-5 (Figura 31C), IL-6 (Figura 31D), IL-9 (Figura 31E) e IL-13 (Figura 31F) después de administración oral. Hay una tendencia hacia la reducción de TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 e IL-13 después de hBD2 administrada por vía intranasal, pero esto no es diferente de manera estadísticamente significativa del control. Todos los resultados obtenidos indican efectos claramente preventivos y antiinflamatorios de hBD2 en el modelo en ratón de asma alérgica generada por ácaros del polvo doméstico.

El pulmón es el cuarto órgano implicado en GVHD después del intestino, el hígado y la piel. Este ejemplo demuestra que las defensinas no solamente son capaces de conservar un sistema inmune intacto, sino que previenen de manera crucial una generación de una tormenta de citoquinas de todas las citoquinas de GVH<d>claves, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 y IL-13, que es una característica distintiva de GVHD aguda. La liberación de citoquina inflamatoria o tormenta de citoquinas ha sido implicada como el mediador primario de la ocurrencia y gravedad de GVHD aguda (Ball & Egeler, 2008).

Ejemplo 10(a modo de ilustración).

Determinación y evaluación de la eficacia de la intervención terapéutica IN contra oral con defensinas en un modelo en ratón de asma alérgica generada por ácaros del polvo doméstico

Materiales y métodos

Régimen de tratamiento: Ratones BALB/c de 7-10 semanas de edad, de género femenino se asignan de manera aleatoria en 7 grupos de estudio un día antes del inicio del estudio y se sensibilizan por vía subcutánea (SC) a ácaros del polvo doméstico (100 pg de HDM en 200 pL de solución salina más coadyuvante completo de Freund en solución salina al 0.9 %). Los ratones después se desafían por vía intranasal (IN) con HDM en el día 14 (HDM 25 pg en 50 pL de solución salina). Se administra dexametasona por vía oral (1 mg/kg dos veces al día; 50 pL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS)) en el día 14. Se administra hBD2 IN o por vía oral (1.7 mg/kg tres veces al día IN; 0.4 mg/kg tres veces al día IN; 0.4 mg/kg tres veces al día por vía oral, 50 pL de solución salina amortiguada con fosfato) en el día 14. La dosis inicial se administra 60 minutos antes del desafío, y las dosis subsiguientes aproximadamente con 6 horas de diferencia (Figura 5).

Pruebas:

Inflamación de vías respiratorias: A las 48 horas después del desafío, se efectúa lavado bronqueoalveolar con sonda lavando los pulmones con 3 volúmenes de PBS fría (0.4; 0.3 y 0.3 mL, 1 mL en total). Las cuentas totales y diferenciales de leucocitos se determinan en un analizador hematológico automatizado Sysmex XT-2000iV. Función pulmonarIniciando: 48 horas después del desafío con HDM, se llevan a cabo mediciones de resistencia pulmonar y distensibilidad pulmonar después de desafío con metacolina (3.125 MCH1; 6.25 MCH2; 12.5 MCH3 y 25 mg/mL de MCH4) en ratones anestesiados, canulados utilizando el sistema Buxco Finepoint RC de DSI. Los datos se representan como resistencia de las vías respiratorias a 10 mg/kg de metacolina y como curvas de dosis-respuesta.

Muestreo pulmonar para análisis de citoquina: Después de la finalización de cada BAL, los pulmones se retiran del tórax, se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenan congelados a -80 grados Celsius hasta el análisis de la concentración de citoquina de IL-1p, TNF-a, IL-6, IL-10 e IFNy mediante ELISA.

Resultados

Se observa un incremento de los valores de resistencia pulmonar y reducción de los valores de distensibilidad pulmonar en animales tratados con vehículo desafiados con HDM en comparación con ratones desafiados con solución salina (no asmáticos). Se induce una respuesta inflamatoria en ambos grupos de ratones tratados con vehículo (oral e intranasal) mediante un solo desafío con HDM 14 días después de sensibilización con HDM y coadyuvante. Ésta se caracteriza por un incremento estadísticamente significativo en las cuentas de células, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos y linfocitos totales en BALF (p<0.05) cuando se compara con controles desafiados con solución salina. Además, el análisis de la concentración de cinco citoquinas IL-1p, TNF-a, IL-6, IL-10 e IFN-y en homogeneizados de tejido pulmonar revela niveles significativamente más altos en animales desafiados con HDM en comparación con controles desafiados con solución salina.

El tratamiento con dexametasona inhibe significativamente las cuentas de células y eosinófilos totales, pero no las cuentas de neutrófilos, macrófagos y linfocitos en BALF. De conformidad con los datos celulares, la dexametasona no influye en los niveles de IL-1 p, TNF-a, IL-6, IL-10 e IFN-y en homogeneizados de tejido pulmonar en comparación con HDM/control con vehículo. Sin embargo, ésta influye en las mediciones de AHR relacionadas con las cuentas de eosinófilos. Los resultados obtenidos indican que este modelo es resistente a los esteroides hasta un cierto grado.

hBD2, después de aplicación tanto oral como intranasal tres veces al día, en el día 14, inhibe de manera efectiva el incremento de la resistencia de las vías respiratorias (Figuras 32A y 32B) y reduce la distensibilidad pulmonar (Figuras 33A y 33B) en comparación con animales tratados con vehículo desafiados con HDM. Se observa un efecto más prominente en algunos parámetros medidos después de aplicación intranasal, tal como influjo celular en BALF, en las cuales ambas dosis de IN (0.4 mg/kg/día tres veces al día y 1.7 mg/kg/día tres veces al día) inhiben significativamente las cuentas celulares de neutrófilos y macrófagos totales (Figuras 34 A, B y C) y una tendencia hacia la reducción de eosinófilos, mientras que el esteroide estándar dexametasona falla para inhibirlas. Se observan efectos similares significativos sobre los niveles de las citoquinas IFN-y (Figuras 35A), IL-4 (Figura 37), IL-5 (Figura 38), IL-6 (Figura 39), IL-9 (Figura 40), e IL-10 (Figura 41) en homogeneizados de tejido pulmonar con ambas rutas de dosificación. La hBD2 administrada por vía oral reduce significativamente TNF-a (Figuras 36A), mientras que la hBD2 administrada por vía intranasal difiere del control, pero no de manera significativa. Todos los resultados obtenidos indican efectos claramente antiinflamatorios de hBD2 en el modelo en ratón de asma alérgica generada por ácaros del polvo doméstico/coadyuvante completo de Freund.El pulmón es el cuarto órgano implicado en GVHD después del intestino, el hígado y la piel. Este ejemplo 10 muestra que las defensinas no solamente son capaces de reequilibrar el sistema inmune sino de tratar o prevenir de manera crucial una tormenta de citoquinas de las<citoquinas de GVHD claves IFN-y>,<TNF-a e IL-6, que es una característica distintiva de GVHD aguda. De hecho,>la liberación de citoquina inflamatoria o tormenta de citoquinas ha sido implicada como el mediador primario de la ocurrencia y gravedad de GVHD aguda (Ball & Egeler, 2008).

Ejemplo 11(a modo de ilustración).

Determinar y evaluar la eficacia de la IN frente a la intervención terapéutica oral con administración de defensinas en un modelo murino de asma alérgica provocada por ácaros del polvo doméstico Materiales y métodos

Régimen de tratamiento: Ratones BALB/c de 7-10 semanas de edad, de género femenino asignados de manera aleatoria en 4 grupos de estudio un día antes del inicio del estudio se sensibilizan por vía subcutánea (SC) a ácaros del polvo doméstico (100 pg de HDM en 200 pL de solución salina más coadyuvante completo de Freund en solución salina al 0.9 %). Los ratones se desafían por vía intranasal (IN) con HDM en el día 14 (HDM 25 pg en 50 pL de solución salina). Se administra hBD2 IN o por vía oral (0.4 mg/kg tres veces al día IN; 0.4 mg/kg tres veces al día por vía oral, 50 pL de solución salina amortiguada con fosfato) en el día 14. La dosis inicial se administra 60 minutos antes del desafío, y las dosis subsiguientes aproximadamente con 6 horas de diferencia.

Pruebas:

Muestreo del tejido pulmonar: Los pulmones se retiran del tórax, se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenan congelados a -80 °C hasta el análisis de la concentración de citoquina de IL-4, IL-5, IL-8 (KC), IL-9 e IL-13 en homogeneizados de pulmón mediante ELISA.Los pulmones se inflanin situcon formalina al 10 % amortiguada, se retiran del tórax, se colocan individualmente en formalina al 10 % amortiguada, se incrustan en parafinain toto,se seccionan y se tiñen con H&E/PAS.

Muestreo de sangre: Todas las muestras de sangre terminales se recolectan mediante sangrados de la vena yugular. Se toman muestras de sangre en tubos con Li-heparina, se colocan en hielo y se centrifugan inmediatamente a 4 °C. El plasma se separa y se almacena a -80 °C hasta el análisis de SCF<a>potencial. Muestreo del tejido pulmonar: Los pulmones se exponen y se extirpan abriendo suavemente el tórax y cortando cualquier lado del esternón y costillas y recortando hacia atrás. Los pulmones de los primeros 6 animales por grupo se retiran del tórax, se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenan congelados a -80 °C hasta el análisis de la concentración de citoquina mediante ELISA.

Los pulmones provenientes de los otros 8 animales por grupo se inflanin situcon formalina al 10 % amortiguada, se retiran del tórax, se colocan individualmente en formalina al 10 % amortiguada, se incrustan en parafinain toto,se seccionan y se tiñen con H&E/PAS. Los bloques de parafina se retienen para los análisis de IHC.

Lecturas

• Histopatología (H&E; PAS) (N=8/grupo; total N=32)

• Citoquinas en homogeneizados de tejido pulmonar (IL-4, IL-5, IL-8 (KC), IL-9 e IL-13) (N=6/grupo; total N=24) Histopatología

El influjo celular (mononucleares, eosinófilos, neutrófilos) se evalúa semi-cuantitativamente en portaobjetos teñidos con H&E por separado respecto al espacio peri-bronquial/bronquiolar y perivascular de la siguiente manera:

0 ausentes

1 unas pocas células inflamatorias dispersas

2 agregados más grandes

3 marcada acumulación de células

La puntuación general para la inflamación se calcula como la suma de todas las puntuaciones individuales.Se evalúa la metaplasia de células caliciformes, por separado a un nivel de vías respiratorias grandes y vías respiratorias distales, en portaobjetos teñidos con PAS de la siguiente manera:

0 células que no contienen moco a lo largo de la membrana basal

1 unas pocas células positivas a lo largo de la membrana basal con menos del 75 % del citoplasma teñido 2 unas pocas células positivas a lo largo de la membrana basal con más del 75 % del citoplasma teñido 3 numerosas células positivas a lo largo de la membrana basal con menos del 75 % del citoplasma teñido 4 numerosas células positivas a lo largo de la membrana basal con más del 75 % del citoplasma teñido Evaluación estadística

Los datos se procesan utilizando MS Excel. El análisis estadístico se evalúa utilizando el software GraphPad Prism (versión 5.04). Las diferencias entre los grupos se consideran estadísticamente significativas cuando p<0.05.

El análisis estadístico de los datos de valores de puntuación histológica seleccionados se efectúa utilizando la mediana y la prueba no paramétrica de Mann-Whitney.

Resultados

Se induce una respuesta inflamatoria en ambos grupos de ratones tratados con vehículo (oral e intranasal) mediante un solo desafío con HDM 14 días después de sensibilización con HDM y coadyuvante. Ésta se caracteriza por un incremento estadísticamente significativo en la concentración de cinco citoquinas IL-4, IL-5, IL-8, IL-9 e IL-13 en homogeneizados de tejido pulmonar y por cambios inflamatorios histológicos graves del tejido pulmonar en animales desafiados con HDM en comparación con controles desafiados con solución salina.

hBD2, después de administración tanto oral como intranasal tres veces al día, en el día 14, inhibe de manera efectiva el incremento en la inflamación histológica del tejido pulmonar en comparación con animales tratados con vehículo desafiados con HDM (Figura 43, 44 y 45). Se observan efectos significativos sobre los niveles de citoquina de IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13 en homogeneizados de tejido pulmonar después de administración oral y sobre IL-9 e IL-13 después de administración IN. Todos los resultados obtenidos indican efectos claramente antiinflamatorios de hBD2 en el modelo en ratón de asma alérgica generada por ácaros del polvo doméstico/coadyuvante completo de Freund.

El pulmón es el cuarto órgano implicado en GVHD después del intestino, el hígado y la piel. Este ejemplo muestra que las defensinas no solamente son capaces de reequilibrar el sistema inmune sino de tratar o prevenir de manera crucial una tormenta de citoquinas de las citoquinas de GVHD claves IL-4, IL-5, IL-8, IL-9 y IL-13, que es una característica distintiva de GVHD aguda. De hecho, la liberación de citoquina inflamatoria o tormenta de citoquinas ha sido implicada como el mediador primario de la ocurrencia y gravedad de GVHD aguda (Ball & Egeler, 2008).

Ejemplo 12.

Secuencias

Ejemplo 13.

Determinación y evaluación de la eficacia del tratamiento profiláctico con hBD-2 oral en un modelo en ratón de enfermedad aguda de injerto contra hospedador después de transplante de células madre

Materiales y métodos

Régimen de tratamiento: 12 ratones BALB/c de género femenino se irradian con 4.5 Gy (2 * 498 s) a intervalos de por lo menos 4 horas en el día 0. Se recolecta la médula ósea: se recolectan asépticamente los miembros posteriores a partir de 2 ratones C57BL/6 WT de género femenino. Se retira el músculo esquelético y se corta la epífisis. El lumen del hueso se enjuaga con PBS y las células se sedimentan y se disuelven. Recolección de células T: los bazos provenientes de 2 ratones C57BL/6 WT de género femenino se hacen pasar por malla a través de un colador celular de 100 pM hacia una caja de Petri llena con PBS. Las células se disuelven en PBS y se transfieren a un tubo falcon de 50 mL y se centrifugan. Las células se disuelven en 1 mL de PBS y se agregan 20 pL de microglóbulos de CD4 más 20 pL de microglóbulos de CD8 por bazo para incubación durante 20 minutos a 4 grados C. Las células se lavan con PBS y se aplican a separación por MACS con el fin de seleccionar positivamente células CD4+ y CD8+. Las células T seleccionadas positivamente se cuentan y se disuelven. Transplante: directamente después de la segunda irradiación, todos los ratones BALB/c WT receptores se inyectan con 5 * 1,000,000 células BM (50 pL) i.v. en el plexo venoso retro-orbital bajo anestesia con isoflurano. Se tratan 15 ratones BALB/c con 1.2 mg de hBD2/kg de BW/día en 100 pL de PBS por día mediante gavaje oral desde el día 0-10.

15 ratones BALB/c reciben vehículo 100 pL de PBS por día mediante gavaje oral desde el día 0-10.

Pruebas:

Los ratones se pesan diariamente durante los 7 días iniciales y la supervivencia se monitorea durante 100 días. Resultados

Los 15 ratones en el grupo con vehículo mueren para el día 35 mientras que solamente 4 o menos del 30 % de los ratones tratados con hBD2 mueren para el día 35 y 8 ratones aún siguen vivos para el día 100 p<0.0001 (Figura 47). La puntuación de histología del intestino delgado, colon e hígado son todos estadísticamente muy bajos para el grupo tratado con hBD-2 en comparación con PBS (Figura 48). Los ratones tratados con hBD2 pierden de manera estadísticamente significativa menos peso los primeros 7 días después de transplante de médula ósea lo que sugiere salud intestinal e integridad intestinal mejoradas (Figura 49). El tratamiento con hBD2 reduce la infiltración con leucocitos CD45+ (análisis FACS en la Figura 50); infiltración intestinal de célula T y célula mieloide (Figuras 51A-C) en lalámina propriadel colon. El tratamiento profiláctico con hBD2 también muestra reducción de concentraciones de TNF-a e IL-6 y concentración incrementada de IL-10 (Figuras 52A-C). El tratamiento con hBD-2 muestra adicionalmente una reducción de IL-1p a partir de células mieloides (análisis FACS del bazo en las Figuras 53A-C). El análisis FACS del bazo también muestra un número reducido de neutrófilos (Figura 54A); reduce la producción de citoquina Th1 especialmente de TNF-a e IFN-y (Figuras 54B-F). El análisis de microarreglo de las muestras de colon muestra inflamación reducida, migración de leucocito y célula mieloide y remodelado del tejido en el grupo tratado con hBD-2 contra PBS (Figura 55). Conclusión

Este ejemplo 13 demuestra que el tratamiento profiláctico con hBD-2 durante 10 días desde el día del transplante de células madre reduce la mortalidad e incrementa dramáticamente la supervivencia a largo plazo.

Ejemplo 14.

Determinación y evaluación de la eficacia del tratamiento profiláctico con hBD-2 oral contra ciclosporina en un modelo en ratón de enfermedad aguda de injerto contra hospedador después de transplante de células madre Materiales y métodos

Régimen de tratamiento: 20 ratones BALB/c de género femenino se irradian con 4.5 Gy (2 * 498 s) a intervalos de por lo menos 4 horas en el día 0. Se recolecta la médula ósea: se recolectan asépticamente los miembros posteriores a partir de 2 ratones C57BL/6 WT de género femenino. Se retira el músculo esquelético y se corta la epífisis. El lumen del hueso se enjuaga con PBS y las células se sedimentan y se disuelven. Recolección de células T: los bazos provenientes de 2 ratones C57BL/6 WT de género femenino se hacen pasar por malla a través de un colador celular de 100 pM hacia una caja de Petri llena con PBS. Las células se disuelven en PBS y se transfieren a un tubo falcon de 50 mL y se centrifugan. Las células se disuelven en 1 mL de PBS y se agregan 20 pL de microglóbulos de CD4 20 pL de microglóbulos de CD8 por bazo para incubación durante 20 minutos a 4 grados C. Las células se lavan con PBS y se aplican a separación por MACS con el fin de seleccionar positivamente células CD4+ y CD8+. Las células T seleccionadas positivamente se cuentan y se disuelven. Transplante: directamente después de la segunda irradiación, todos los ratones BALB/c WT receptores se inyectan con 5 * 1,000,000 células BM (50 pL) i.v. en el plexo venoso retro-orbital bajo anestesia con isoflurano. 20 ratones BALB/c se tratan con 1.2 mg de hBD2/kg de BW/día (n=7); 50 mg de ciclosporina/kg de BW en los días 0, 3, 6 y 9 (n=7) o 100 pL de PBS por día mediante gavaje oral (n=6) desde el día 0-10.

Pruebas:

Los ratones se pesan a intervalos regulares durante el estudio y la supervivencia se monitorea durante 90 días. Resultados

Todos excepto uno de los ratones tratados con PBS mueren para el día 90, mientras que solamente 1 de los animales tratados con hBD-2 mueren para el día 90 (p = 0.03, Figura 56) y 3 animales de los animales tratados con ciclosporina han muerto (p=0.16, Figura 56). Los ratones tratados con hBD2 y ciclosporina pierden de manera estadísticamente significativa menos peso después de transplante de médula ósea en comparación con los ratones tratados con PBS lo que sugiere salud intestinal e integridad intestinal mejoradas (Figura 57). Conclusión

Este ejemplo 14 sirve para demostrar que el tratamiento profiláctico con hBD-2 durante 10 días desde el día del transplante de células madre reduce la mortalidad por lo menos a la par con tratamiento anti-GVHD estándar con ciclosporina.

Ejemplo 15.

Determinación y evaluación de la eficacia del tratamiento profiláctico con HD5 oral en un modelo en ratón de enfermedad aguda de injerto contra hospedador después de transplante de células madre

Materiales y métodos

Régimen de tratamiento: 22 ratones BALB/c de género femenino se irradian con 4.5 Gy (2 * 498 s) a intervalos de por lo menos 4 horas en el día 0. Se recolecta la médula ósea: se recolectan asépticamente los miembros posteriores a partir de 2 ratones C57BL/6 WT de género femenino. Se retira el músculo esquelético y se corta la epífisis. El lumen del hueso se enjuaga con PBS y las células se sedimentan y se disuelven. Recolección de células T: los bazos provenientes de 2 ratones C57BL/6 WT de género femenino se hacen pasar por malla a través de un colador celular de 100 pM hacia una caja de Petri llena con PBS. Las células se disuelven en PBS y se transfieren a un tubo falcon de 50 mL y se centrifugan. Las células se disuelven en 1 mL de PBS y se agregan 20 pL de microglóbulos de CD4 20 pL de microglóbulos de CD8 por bazo para incubación durante 20 minutos a 4 grados C. Las células se lavan con PBS y se aplican a separación por MACS con el fin de seleccionar positivamente células CD4+ y CD8+. Las células T seleccionadas positivamente se cuentan y se disuelven. Transplante: directamente después de la segunda irradiación, todos los ratones BALB/c WT receptores se inyectan con 5 * 1,000,000 células BM (50 pL) i.v. en el plexo venoso retro-orbital bajo anestesia con isoflurano. 22 ratones BALB/c se tratan con 1.2 mg de HD5/kg de BW/día; 1.2 mg de hBD-2/kg de BW/día o 100 pL de PBS por día mediante gavaje oral desde el día 0-10.

Pruebas:

La supervivencia se monitorea durante 60 días.

Resultados

Seis de los ocho ratones tratados con PBS mueren para el día 60, mientras que 2 de los 8 animales tratados con HD5 han muerto (p=0.06, Figura 58) y ninguno de los animales tratados con hBD-2 mueren para el día 60 (p=0.008, Figura 58).

Conclusión

Este ejemplo 15 sirve para demostrar que el tratamiento profiláctico durante 10 días desde el día del transplante de células madre con cualquiera de HD5 o hBD-2 reduce dramáticamente la mortalidad.

Ejemplo 16(a modo de ilustración).

Efecto antimicrobiano de defensinas (HD5 y hBD-2) administradas por vía oral

Método:

Inmunotinción de mucinas y localización de bacterias mediante FISH

La inmunotinción de moco se parea con hibridación fluorescentein situ(FISH por sus siglas en inglés), como se describió previamente con el fin de analizar la localización de las bacterias en la superficie de la mucosa intestinal. Brevemente, se colocan tejidos de colon (colon proximal, 2do cm desde el ciego) sin material fecal en solución fijadora de Carnoy-metanol (60% de metanol, 30% de cloroformo, 10% de ácido acético glacial) durante un mínimo de 3 horas a temperatura ambiente. Los tejidos después se lavan en metanol 2 * 30 minutos, etanol 2 * 15 minutos, etanol/xileno (1:1), 15 minutos y xileno 2 * 15 minutos, seguido por incrustación en parafina con una orientación vertical. Se realizan secciones de cinco |jm y se des-enceran mediante calentamiento previo a 60°C durante 10 minutos, seguido por xileno a 60°C durante 10 minutos, xileno durante 10 minutos y etanol al 99.5% durante 10 minutos. El paso de hibridación se lleva a cabo a 50°C durante la noche con la sonda EUB338 (5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3', con una marcación 5' utilizando Alexa 647) diluido hasta una concentración final de 10 jg/m L en solución amortiguadora para hibridación (Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 0.9 M, SDS al 0.1%, formamida al 20%). Después de lavar 10 minutos en solución amortiguadora para lavado (Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 0.9 M) y 3 * 10 minutos en PBS, se utiliza una pluma PAP (Sigma-Aldrich) para marcar alrededor de la sección y se agrega solución de bloqueo (suero fetal de bovino al 5% en PBS) por 30 minutos a 4°C. El anticuerpo primario de Mucina-2 (conejo H-300, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.) se diluye 1:1500 en solución de bloqueo y se aplica toda la noche a 4°C. Después de lavar 3 * 10 minutos en PBS, se aplica solución de bloqueo que contiene anticuerpo secundario anti-Alexa 488 de conejo diluido 1:1500, se aplica faloidina-isotiocianato de tetrametilrodamina B (Sigma-Aldrich) a 1 jg/m L y Hoechst 33258 (Sigma- Aldrich) a 10 jg/m L a la sección por 2 horas. Después de lavar 3 * 10 minutos en p Bs se montan los portaobjetos utilizando medios de montaje anti-desvanecimiento Prolong (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las observaciones se efectúan con un microscopio confocal Zeiss LSM 700 con software Zen 2011 versión 7.1. Este software se utiliza para determinar la distancia entre las bacterias y la monocapa de célula epitelial, así como el espesor del moco.

Resultados:

Se observa una diferencia altamente significativa desde el punto de vista estadístico en la zona de lisis entre la pared intestinal y la población bacteriana. La distancia es pequeña para ratones alimentados tanto con una dieta baja en grasa como con una dieta occidental, mientras que HD5 y en particular hBD-2 tiene un efecto profundo sobre la distancia (Figura 59).

Conclusión

Este experimento demuestra que HD5 y hBD-2 humana administradas por vía oral en un ratón ejercen su efecto modulador de microbiota en la superficie epitelial del ratón como si fueran producidas por las células epiteliales del ratón y no principalmente en el lumen del intestino como sería de esperar después de administración oral.

Referencias

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WO 2010/007166

WO 92/06204

WO 95/17413

WO 95/22625

US 5,223,409

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una p-defensina humana seleccionada entre hBD-2 (SEQ ID NO.: 2), hBD-2 truncada (SEQ ID NO.: 7) o una defensina modificada funcionalmente equivalente que comprenda 1-4 modificaciones de aminoácidos en comparación con hBD-2 de SEQ ID NO.: 2 o hBD-2 truncada de SEQ ID NO. : 7; donde dicha(s) modificación(es) es(son) una(s) sustitución(es) o inserción(es) conservadora(s) de aminoácidos que no afecta(n) significativamente al plegamiento de la defensina; o una(s) única(s) deleción(es), para uso en la prevención o tratamiento de la enfermedad injerto contra huésped aguda (GVHD) en un paciente que ha recibido o está a punto de recibir un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

2. La p-defensina humana para uso según la reivindicación 1, en la que la p-defensina humana se selecciona de hBD-2 (SEQ ID NO: 2), hBD-2 truncada (SEQ ID NO: 7) o una defensina modificada funcionalmente equivalente de la misma que comprende 1 modificación de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO.: 2 o SEQ ID NO.: 7.

3. La p-defensina humana para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha pdefensina humana es hBD2 (SEQ ID NO: 2) o hBD2 truncada (SEQ ID NO: 7).

4. La p-defensina humana para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha defensina está comprendida en una composición, en la que dicha composición comprende más de una defensina, tal como dos defensinas, tal como tres defensinas, tal como cuatro defensinas, tal como cinco defensinas.

5. La p-defensina humana para uso según la reivindicación 4, en la que dichas dos defensinas son hBD2 y HD5.

6. La p-defensina humana para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la administración de dicha p-defensina humana al paciente se inicia el día del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas, o se inicia cuando aparecen síntomas de GVHD después del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

7. La p-defensina humana para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la administración de p-defensina humana se continúa hasta que el paciente está libre de síntomas causados por el trasplante de células madre hematopoyéticas alogénico, tal como durante al menos una semana, por ejemplo al menos dos semanas, tal como al menos 3 semanas, por ejemplo al menos 4 semanas, tal como al menos 2 meses, por ejemplo al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 6 meses.

8. La p-defensina humana para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha p -defensina humana comprende además al menos una fracción adicional seleccionada de un grupo que consiste en un péptido penetrante celular (CPP), una fracción de unión a albúmina (ABM), una fracción detectable (Z) y un péptido prolongador de la semivida.

9. La p-defensina humana para uso según la reivindicación 8, en la que la al menos una fracción adicional se selecciona del grupo que consiste en una molécula capaz de unirse a un receptor Fc neonatal (FcRn), transferrina, albúmina (HSA), XTEN o PEG, un polímero de homoaminoácido (HAP), un polímero de prolinaalanina-serina (PAS), o un péptido similar a la elastina (ELP), ácido hialurónico, un péptido sialilado cargado negativamente como el péptido carboxi-terminal (CTP) de la cadena p de la gonadotropina coriónica (CG), IgG humana, y CH3(CH2)nCO- donde n es de 8 a 22.

10. La p-defensina humana para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la pdefensina humana se administra en combinación con prebióticos, probióticos, triptófano, ácidos grasos de cadena corta, glucocorticoides, ciclosporina, anti TNF-a, integrinas, antibióticos, inmunosupresores, trasplante fecal, irradiación o una combinación de los mismos.

11. La p-defensina humana para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la dosis diaria está comprendida entre 0.1 y 10 mg defensina/kg, tal como entre 0.5 y 5 mg defensina/kg, tal como entre 1 y 2 mg defensina/kg, tal como 1.2 mg defensina/kg al día.

12. La p-defensina humana para uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha pdefensina humana se administra al menos una vez al día, tal como al menos dos veces al día, tal como al menos tres veces al día, tal como al menos cuatro veces al día, tal como cinco veces al día o continuamente.

13. La p-defensina humana para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la administración es oral, bucal, sublingual, rectal, vaginal, intratraqueal, intrapulmonar, intranasal, intracraneal, subcutánea, intravenosa, dérmica o transdérmica.

14. La p-defensina humana para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el paciente presenta uno o más síntomas seleccionados entre: inflamación intestinal y hepática grave (por ejemplo, caracterizada por dolor abdominal, náuseas, vómitos e ictericia) y pérdida de defensas de las mucosas, tormenta de citoquinas, pérdida de peso, sepsis, erupción cutánea, picor y enrojecimiento.

15. La p-defensina humana para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el tratamiento

a. mejora los síntomas definidos en la reivindicación 14;

b. disminuye la mortalidad y aumenta la supervivencia a largo plazo;

c. reequilibra el sistema inmunitario y previene o trata la tormenta de citoquinas mediante la normalización de la producción tisular de citoquinas;

d. trata la permeabilidad intestinal y la sepsis mediante la normalización de la defensa de la mucosa o la actividad mieloperoxidasa en los intestinos;

e. trata las complicaciones respiratorias, la capacidad pulmonar, la inflamación pulmonar y la sepsis;

f. reduce la inflamación pulmonar histológica, la inflamación peribronquial y perivascular, así como la migración de células inflamatorias al líquido de lavado broncoalveolar;

g. trata o previene la inflamación y la fibrosis de los pulmones y la piel, como la bronquiolitis obliterante y la esclerodermia;

h. aumenta la riqueza genética, el número de filos, la presencia bacteriana, la abundancia bacteriana y/o la producción de ácidos grasos de cadena corta, y/o la producción de butirato

i. disminuye la producción de acetato de la microbiota intestinal o pulmonar de dicho paciente

j. madura, mantiene o estabiliza una microbiota normal en el intestino o el pulmón o la piel de dicho paciente k. aumenta la abundancia deAllobaculum, Alloprevotella, Akkermansia, Bamesiella, Bifidobacteriaceae, Faecalibacterium, Lachnospira, Rothia y Veillonellaen el intestino o pulmón de dicho paciente; y/o l. aumenta la ingesta de alimentos y el aumento de peso de dicho paciente.