KR20200097251A - 디펜신에 의한 이식편 대 숙주 질환의 예방 및 치료 - Google Patents
디펜신에 의한 이식편 대 숙주 질환의 예방 및 치료 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 급성 및 만성 이식편 대 숙주 질환(GVHD); 장, 간, 폐 및 피부 미생물군의 정상화 및 점막 방어에 기초한 설사, 체중 감소 및 패혈증과 같은 GVHD와 관련된 급성 합병증; IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10 및 IL-13의 사이토카인 생산의 정상화 및 사이토카인 폭풍의 예방 및/또는 치료에 의한 면역계의 재균형; 폐색성 세기관지염(bronchiolitis obliterans) 및 경피증(scleroderma)과 같은 GVHD와 관련된 만성 합병증의 치료 및/또는 예방 방법, 특히 사망률을 감소시키고 특히 장기 생존율을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식을 받았거나 막 받으려고 하는 환자에서 α- 및 β-디펜신의 군으로부터 선택된 하나 이상의 포유동물 디펜신의 경구, 피하, 폐내 및/또는 진피/경피 투여 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 하나 이상의 포유동물 디펜신의 투여에 의한 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식을 받았거나 막 받으려고 하는 환자에서 급성 및 만성 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 및 GVHD와 관련된 합병증의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 장 및 폐 미생물군의 정상화 및 사이토카인 폭풍의 위험을 제거하는 감소된 사이토카인 생산에 의한 면역계의 재균형에 기초하는 설사 및 패혈증과 같은 GVHD의 증상의 치료를 유도할 수 있다.
이식편 대 숙주 질환은 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식 후 이환율(morbidity) 및 사망률(mortality)의 주요 원인이 되고 있다. 위장 GVHD는 사망률의 주요 원인이다(Teshima, 2016). 급성 GVHD의 초기 단계는 주로 위장관에서 조직 손상 및 점막 장벽 기능의 관련 손실에 의해 유발되고, 이는 악성 질환을 후속 면역 제어에 적합한 최소 잔류 수준으로 가져오고 기존의 면역 기능을 제거하는데 필요한 조절 섭생에 의해 야기되어 나이브 공여자 접종물의 생착을 가능하게 한다. 줄기 세포 이식은 전형적으로 이러한 이중 목적을 달성하기 위해 전신 조사, 면역억제 및 화학요법을 사용하지만, 그들은 또한 전염증성 사이토카인; 전형적으로 Th1 사이토카인: IFNγ, IL-2 및 TNF-α 및 Th2 사이토카인: IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13의 방출을 특징으로 하는 "사이토카인 폭풍"에 기여하는 GI 관 점막 및 다른 세포에 손상을 일으킨다(Henen, 2015). 현재의 주력 GVHD 요법은 생착에 영향을 줄 수 있고, 일부 맥락에서, 목적하는 이식편 대 종양 활성을 감소시킬 수 있는 광범위한 면역억제에 초점을 맞춘다(Nalle, 2015). 이식후 기간에 항균성 오염제거의 사용에 의한 박테리아 부담의 감소는 GVHD 심각성을 감소시킬 수 있다. 폐 및 피부는 만성 GVHD에서 1차 표적 기관이고, 섬유증-폐색성 세기관지염 및 경피증(Henden, 2015)으로서 나타난다. 급성 GVHD는 치료 실패의 주요 원인으로 남아 수령자의 20%에서 사망률을 초래하고, 생존자의 60 내지 80%는 어느 정도의 만성 GVHD를 경험한다(Markey, 2014).
본 발명자는 놀랍게도 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식으로부터 발생하는 급성 이식편 대 숙주 질환(acute graft-versus-host disease)의 마우스 모델에서 경구 hBD2 또는 HD5의 예방적 투여량이 GVHD의 가장 일반적으로 사용되는 치료인 사이클로스포린보다 사망률을 극적으로 그리고 훨신 더 큰 정도로 감소시킬 수 있음을 입증했다. 또한, 이 모델에서 hBD2가 골수 세포(CD11c + 수지상 세포 및 CD11b + Ly6FG-세포)에서 IL-1β의 생산을 감소시킬 수 있었음이 입증되었다. IL-1β는 장 GvHD의 주요 동인이다.
본 발명자는 또한 놀랍게도 심각한 장 염증(DSS, TNBS, T-세포 전달)의 예방적 및 치료적 마우스 모델 모두에서 β-디펜신이 개선된 장 건강을 통한 설사 및 체중 감소를 완화시키고, 모두 GVHD의 예방 및/또는 치료에 통상적으로 사용되는 프레드니솔론/덱사메타손 및 사이클로스포린과 같은 표준 면역억제제 및 항 TNF-α 와 동등한 질환 활동 지수를 감소시킨다는 것을 입증하였다.
놀랍게도, β-디펜신은 IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13의 사이토카인 생산의 정상화를 통해 면역계를 재균형화할 수 있다는 것이 입증되었다. 일부 약물, 예를 들어, 항 TNF-α는 하나 또는 소수의 사이토카인을 정상화할 수 있는 반면, 이들 사이토카인 모두를 정상화하고 사이토카인 폭풍을 방지할 수 있는 다른 약물은 동정되지 않았다. 염증성 사이토카인 방출 또는 사이토카인 폭풍은 급성 GVHD의 발생 및 심각성의 주요 매개체로서 연루되어 있다(Ball & Egeler, 2008).
또한, α- 및 β-디펜신 모두가 미생물군의 조성에 강한 영향을 미친다는 것이 예방적 및 치료적 마우스 모델 모두에서 입증되었다. 예를 들어, 디펜신은 다양한 미생물을 증가시킬 수 있다. 즉, 미생물군을 개선/정상화시킬 수 있을뿐만 아니라 그 디펜신은 단쇄 지방산 생성 박테리아의 존재량을 증가시킬 수 있다. 결장 T reg 세포 항상성에 중요한 역할을 하는 단쇄 지방산은 급성 GVHD에서 교란된다. 디펜신의 효과는 서로 다르며, α- 및 β-디펜신의 조합은 또한 개별 효과와 상이하다.
더욱 놀랍게도, 경구 투여되든 비강내 투여되든 인간 β-디펜신 2(hBD2)의 용량이 사이토카인 폭풍의 상승 및 천식의 발생을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 폐 기능을 극적으로 개선시킬 수 있음이 급성 천식의 마우스 모델에서 입증되었다. 일반적인 면역 억제가 표적인 통상적인 천식 예방과 대조적으로, hBD2에 의한 예방은 면역계를 재균형화시킨다.
추가로 놀랍게도, 경구 투여되든 비강내로 투여되든 인간 β-디펜신 2(hBD2)의 용량이 또한 천식 정상화 기도 과민성 및 순응도를 치료할 수 있음이 급성 천식 마우스 모델에서 입증되었다.
결론적으로, 본 발명자는 α- 및 β-디펜신이 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식으로부터 발생하는 합병증의 안전하고 효과적인 치료이도록 요구되는 모든 특성을 갖는다는 것을 입증하였다. 펩티드는 내인성, 생리학적, 인간 펩티드이기 때문에 안전하다. 디펜신은 만기 신생아가 받은 초유에 존재하는 양을 초과하지 않는 양으로 사용될 수 있다. 디펜신은 경구, 피하 또는 폐내 투여를 통해 투여될 수 있다. 디펜신은 면역계를 억제하지 않고 재균형화할 수 있다. 디펜신은 급성 GVHD의 주요 원인인 사이토카인 폭풍을 막을 수 있다. 디펜신은 미생물군 및 대사체를 정상화할 수 있고, 결장 T reg 세포 항상성을 보존하는 단쇄 지방산의 생산을 촉진할 수 있다. 디펜신은 심각한 장, 간 및 폐 염증을 치료할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식을 받았거나 막 받으려고 하는 환자에서 급성 이식편 대 숙주 질환의 예방 또는 치료 방법으로서, 상기 방법이 α-디펜신 및 β-디펜신으로 이루어진 군으로부터의 적어도 하나의 포유동물 디펜신을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
환자는 심각한 장 및 간 염증(예를 들어, 복통(abdominal pain), 메스꺼움(nausea), 구토(vomiting) 및 황달(jaundice)을 특징으로 함) 및 점막 방어 손실, 사이토카인 폭풍, 체중 감소, 또는 패혈증, 피부 발진, 가려움, 및 홍반을 가질 수 있다.
치료 효과는 면역계의 재균형 및 조직 사이토카인 생산의 정상화를 통한 사이토카인 폭풍의 예방 또는 치료를 포함할 수 있다.
치료 효과는 장내 점막 방어 또는 미엘로퍼옥시다제 활성의 정상화를 통한 장 투과성 및 패혈증의 치료를 포함할 수 있다.
치료 효과는 호흡기 합병증, 폐 염증 및 패혈증의 치료를 포함할 수 있다.
치료 효과는 조직학적 폐 염증, 기관지 주위, 및 혈관 주위 염증 뿐만 아니라 기관지 폐포 세척액 내로의 염증 세포 이동을 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
치료 효과는 폐 및 피부의 염증 및 섬유증, 예컨대 폐색성 세기관지염 및 경피증의 치료 및/또는 예방을 포함할 수 있다.
치료 효과는 유전자 풍부함의 증가, 종족 수의 증가, 박테리아 존재의 증가, 박테리아 존재량의 증가 및/또는 단쇄 지방산 생산, 부티레이트 생산의 증가 및/또는 상기 환자의 장 또는 폐 미생물군으로부터 아세테이트 생산의 감소를 포함할 수 있다.
치료 효과는 상기 환자의 장 또는 폐 또는 피부에서 정상적인 미생물군의 성숙, 유지 및/또는 안정화를 포함할 수 있다.
치료 효과는 상기 환자의 장 또는 폐에서 알로바쿨룸(Allobaculum), 알로프레보텔라(Alloprevotella), 아커만시아(Akkermansia), 바네시엘라(Barnesiella), 비피도박테리아세아에(Bifidobacteriaceae), 페칼리박테리움(Faecalibacterium), 라크노스피라(Lachnospira), 로티아(Rothia) 및 베일로넬라(Veillonella)의 존재량의 증가를 포함할 수 있다.
치료 효과는 상기 환자에서 음식 섭취 및 체중 증가의 증가를 포함할 수 있다.
포유동물 디펜신은 HD5, HD6, hBD1, hBD2, hBD3 및 hBD4, 바람직하게는 HD5 또는 hBD2로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
디펜신은 단독으로 또는 조성물로 투여될 수 있으며, 여기서 상기 조성물은 하나 이상의 디펜신, 예를 들어, 2개의 디펜신, 예를 들어, 3개의 디펜신, 예를 들어, 4개의 디펜신, 예를 들어, 5개의 디펜신을 포함한다. 바람직하게는, 2개의 디펜신은 hBD2 및 HD5이다.
포유동물 디펜신은 세포 침투 펩티드(CPP), 알부민 결합 모이어티(ABM), 검출가능한 모이어티(Z), 및 반감기 연장 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.
포유동물 디펜신은 단독으로 또는 프리바이오틱스(prebiotics), 프로바이오틱스(probiotics), 트립토판, 단쇄 지방산, 글루코코르티코이드, 사이클로스포린, 항 TNF-α, 인테그린, 항생제, 면역억제제, 대변 이식, 조사(irradiation) 또는 이들의 조합과 함께 투여될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따르는 치료 방법에 사용하기 위한 포유동물 디펜신 폴리펩티드 및 본 개시내용에 정의된 바와 같은 장애의 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 포유동물 디펜신 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
도 1. 대장염의 덱스트란 나트륨 설페이트 예방 모델에서 디펜신의 효과를 조사하기 위한 실험 환경의 개략도.
도 2. 대장염의 덱스트란 나트륨 설페이트 치료 모델에서 디펜신의 효과를 조사하기 위한 실험 환경의 개략도.
도 3. 고지방 식이 뮤린 모델에서 미생물군의 조성에 대한 포유동물 디펜신(HD5, hBD2 및 HD5 + hBD2)의 효과를 조사하기 위한 실험 환경의 개략도.
도 4. 천식 예방을 위한 뮤린 스테로이드-민감성 모델에서 포유동물 디펜신의 효과를 조사하기 위한 실험 환경의 개략도이고, 여기서 상기 마우스는 집 먼지 진드기(HDM)+ 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)에 의해 면역화하고 HDM으로 시험감염하였다.
도 5는 천식 치료를 위한 뮤린 스테로이드-민감성 모델에서 포유동물 디펜신의 효과를 조사하기 위한 실험 환경의 개략도이고, 여기서 상기 마우스는 집 먼지 진드기(HDM)+ 프로인트 보조제에 의해 면역화하고 HDM으로 시험감염하였다.
도 6a. 인간 베타 디펜신 1-4의 Clustal W (2.1) 다중 서열 정렬:
Clustal W 정렬에서:
*는 단일, 완전 보존된 잔기를 갖는 위치를 나타낸다.
:는 다음 "강한" 군 중 하나가 완전히 보존된다는 것을 나타낸다:
-S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W.
·는 다음 "약한" 군 중 하나가 완전히 보존된다는 것을 나타낸다:
-C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y.
도 6b. HD5 및 HD6의 Clustal 정렬.
도 6c. HD5, HD6, 및 hBD1, hBD2, hBD3, 및 hBD4의 Clustal 정렬.
도 7. 대장염 연구를 위한 질환 활동 지수 스코어링 시스템의 설명.
도 8. 대장염 연구를 위한 조직학적 스코어링 시스템의 설명.
도 9. 마우스 항 TNF-α에 비해 HBD2(NZ39000)의 통계적으로 유의한 우수성을 나타내는 뮤린 10-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구 및 HBD2의 i.v. 투여에 비해 우수성을 나타내는 피하 HBD2 투여에서 원위 결장의 조직학적 스코어. 범례:
A: 1일 1회 대조군 비히클 i.v.
B: 항-TNF 알파(300㎍/마우스 i.p. 3회)
C: hBD2(1일 1회 0.1mg/kg i.v.)
D: hBD2(1일 1회 0.1mg/kg s.c.)
E: hBD2(1일 2회 0.1mg/kg i.v. + s.c.)
F: hBD2(1일 2회 0.1mg/kg s.c. + s.c.)
K: 나이브 동물.
도 10. 경구 투여된 HBD2hBD2 대 1mg/kg 경구 프레드니솔론의 모든 투여량에 대한 체중 보존 효과를 나타내는 뮤린 10-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 동물 체중 변화. 처리군: A: 1일 2회 대조군 비히클 PBS p.o.; B: 1일 2회 프레드니솔론 1mg/kg p.o.; C: 1일 2회 hBD2 0.05mg/kg p.o.; D: 1일 2회 hBD2 0.5mg/kg p.o.; E: 1일 2회 hBD2 5mg/kg p.o. 대조군(비히클) 군 값으로부터 유의한 차이는 **P<0,01: ***P<0,001로 제시되어 있다(크루스칼-왈리스 테스트(Kruskal-Wallis test) + 비모수 데이터에 대한 던(Dunn)의 테스트 후).
도 11. 프레드니솔론 1mg/kg에 비해 경구 투여된 hBD2의 통계적으로 유의한 우수성을 나타내는 뮤린 10-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 질환 활동 지수 스코어. 도 10에 대해 제시된 처리군 및 유의성.
도 12. 프레드니솔론 1mg/kg과 동등한 경구 HBD2의 모든 투여량의 통계적 유의한 효과를 나타내는 뮤린 10-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 조직학적 스코어. 도 10에 대해 제시된 처리군 및 유의성.
도 13. 프레드니솔론 10mg/kg과 동등한 0.03 및 0.1mg/kg hBD2(군 E 및 F)의 통계적 유의한 효과를 나타내는 8-일 예방적 트리니트로벤젠 설폰산 유도 대장염 연구에서 조직학적 스코어.
A: 비히클 대조군 s.c. 1 x 1일
B: 프레드니솔론 10mg/kg s.c. 1 x 1일
C: hBD2, s.c. 1 x 1일 = 1mg/kg
D: hBD2, s.c. 1 x 1일 = 0.3mg/kg
E: hBD2, s.c. 1 x 1일 = 0.1mg/kg
F: hBD2, s.c. 1 x 1일 = 0.03mg/kg
G: hBD2, s.c. 1 x 1일 = 0.1mg/kg
도 14. 사이클로스포린과 동등한 hBD2의 통계적 유의한 효과를 나타내는 뮤린 7-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 결장 길이. *P<0.05 대 DSS, 만 휘트니 테스트(Mann Whitney test).
도 15. 사이클로스포린과 동등한 hBD2의 통계적 유의한 효과뿐만 아니라 투여 경로에 관계없이 BID 투여에 비해 hBD2의 TID 투여의 우수성을 나타내는 뮤린 7-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 임상적 스코어(대변 스코어: 0 = 정상; 1 = 습윤/점착성 대변; 2 = 연질 대변; 3 = 설사; 대변 혈액 스코어: 0 = 혈액 없음; 1 = 대변 또는 항문 주위의 혈액의 증거; 2 = 심한 출혈; 마우스 외관: 0 = 정상; 1 = 주름진 털 또는 변경된 자세; 2 = 무기력). *p<0.05 대 DSS; 2원 ANOVA 및 본페로니(Bonferroni) 다중 비교 테스트.
도 16. 덱사메타손 1mg/kg과 동등하고 마우스 항 TNF-α 300㎍/마우스보다 우수한 hBD2 0.1mg/kg의 통계적 유의한 효과를 나타내는 뮤린 14-일 치료적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 조직학적 스코어.
도 17. 100㎍/마우스 항 TNF-α s.c. 주당 2회(Enbrel) 및 0.3mg/kg 덱사메타손 복강내 OD와 동등한 hBD2 1mg/kg s.c. OD의 효과를 나타내는 뮤린 14-주 치료적 SCID CD4 + CD25 + T 세포 전달 대장염 모델에서의 임상적 스코어(체중 감량, 대변 점조도 및 직장당 혈액의 존재).
도 18. 100㎍/마우스 항 TNF-α s.c. 주당 2회(Enbrel) 및 0.3mg/kg 덱사메타손 복강내 OD와 동등한 hBD2 1mg/kg s.c. OD의 효과를 나타내는 뮤린 14-주 치료적 SCID CD4 + CD25 + T 세포 전달 대장염 모델에서의 결장 중량. t-테스트에 의한 *p<0.05; **p<0.01 대 비히클.
도 19. 100㎍/마우스 항 TNF-α s.c. 주당 2회(Enbrel) 및 0.3mg/kg 덱사메타손 복강내 OD와 동등한 1mg/kg s.c. hBD2의 효과를 나타내는 뮤린 14-주 치료적 SCID CD4 + CD25 + T 세포 전달 모델에서 미엘로퍼옥시다제 활성. t-테스트에 의한 *P<0.05; **p<0.01 대 비히클.
도 20. 뮤린 고지방 식이 모델에서 경구 HD5, hBD2 및 HD5 + hBD2에 의한 예방적 치료 후 미생물 존재 및 존재량의 비가중된 및 가중된 유니프랙(unifrac) 분석.
도 21. 뮤린 고지방 식이 모델에서 경구 HD5 및 hBD2에 의한 예방적 치료 후 소장에서 알로바쿨룸의 존재량.
도 22. 뮤린 고지방 식이 모델에서 경구 HD5, hBD2 및 HD5 + hBD2에 의한 예방적 치료 후 미생물 존재량의 속 분석.
도 23. 뮤린 고지방 모델에서 경구 hBD2에 의한 예방적 치료 후 결장에서 락토바실라시에(Lactobacillaceae)의 존재량.
도 24. 뮤린 고지방 식이 모델에서 경구 hBD2에 의한 예방적 치료 4주(좌측 패널) 및 10주(우측 패널) 후 바네시엘라의 상대적 존재량.
도 25. 뮤린 고지방 식이 모델에서 HD5 또는 hBD2에 의한 치료적 치료 후 미생물 존재 및 존재량의 비가중된 유니프랙 분석. 상부 패널은 0주째 데이터를 나타낸다. 10주째 하부 패널.
도 26. 뮤린 고지방 식이 모델에서 경구 HD5 및 hBD2에 의한 치료적 개입 후 결장에서 알로프레보텔라의 상대적 존재량.
도 27. 뮤린 고지방 식이 모델에서 HD5 또는 hBD2에 의한 치료적 개입 후 소장 및 결장에서 비피도박테리아세아에의 상대적 존재량.
도 28 내지 31을 위한 도 범례. 염수 IN은 시험감염되지 않고 처리되지 않은 대조군이다. HDM/비히클은 처리되지 않았지만, HDM 시험감염된 동물을 나타낸다. HDM은 집 먼지 진드기로 시험감염된 동물이다. PO는 경구 투여이고, IN은 비강내 투여이다. *로 표지된 컬럼은 비히클 처리된 대조군과 통계적으로 유의하게 다르다.
도 28: 각각 hBD2의 예방적 비강내 및 경구 투여 후 뮤린 집 먼지 진드기 스테로이드-민감성 천식 모델에서 기도 과민성.
도 29: 각각 hBD2의 예방적 비강내 및 경구 투여 후 뮤린 집 먼지 진드기 스테로이드-민감성 천식 모델에서 폐 순응도.
도 30: hBD-2의 예방적 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 BALF 내의 호중구 세포 수. 결과는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.
도 31a-f. hBD2의 예방적 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 폐 균질물 중 TNF-α(31a), IL-4(31b), IL-5(31c), IL-6(31d), IL-9(31e) 및 IL-13(31f)의 사이토카인 농도. # p<0.05 대 HDM/비히클 PO, 만 휘트니 테스트. 결과는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.
도 32a 및 도 32b: 각각 hBD2의 치료적 비강내(도 32a) 및 경구(도 32b) 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 기도 과민성. 염수는 비-시험감염된 대조군이다. HDMA/비히클은 비히클로 처리된 집 먼지 진드기 시험감염된 대조군이다. "hBD2 IN 1.2mpk"는 1.2mg/kg으로 비강내 투여된 hBD2이다. 5mpk는 5mg/kg이다.
도 33a 및 도 33b: 각각 hBD2의 치료적 비강내(도 33a) 및 경구(도 33b) 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서의 폐 순응도.
도 34: hBD-2의 치료적 비강내 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 BALF 중 전체(34a), 호중구(34b) 및 대식세포 세포 수(34c). *p<0.05 대 비히클; 만-휘트니 테스트. 결과는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.
도 35-42. 각각 hBD2의 치료적 비강내 및 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 폐 균질물 중 IFN-γ(도 35), TNF-α(도 36), IL-4(도 37), IL-5(도 38), IL-6(도 39), IL-9(도 40), IL-10(도 41) 및 IL-13(도 42)의 사이토카인 농도. 각 도는 두 아암이 도시되어 있는 도면에서 좌측의 비강내 아암과 우측의 경구 아암으로부터의 데이터를 갖는다. 'p<005 대 상응하는 비히클; 만-휘트니 테스트. 결과는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.
도 43. 각각 hBD2의 치료적 비강내 및 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 H&E/PAS 제제에 의한 폐 조직학. 상부 좌측 패널: 처리되지 않고 시험감염되지 않은 대조군. 상부 우측 패널: 처리되지 않고 HDM 시험감염된 대조군. 하부 좌측 패널: hBD2 PO로 처리된 HDM 시험감염됨. 하부 우측 패널: hBD2 IN으로 처리된 HDM 시험감염됨. 50X 확대.
도 44. 각각 hBD2의 치료적 비강내 및 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 폐 염증 중증도. *p<0.05 대 비히클, 만 휘트니 테스트; #p<0.05 대 비히클, 윌콕스 서명 순위 테스트(Wilcox Signed Rank test).
도 45. 각각 hBD2의 치료적 비강내 및 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 혈관 주위 및 기관지 주위 염증. 호산구의 혈관주위 침윤에 대한 *p<0.05 대 비히클, 만 휘트니 테스트; 호산구 및 단핵구의 다발주위/기관지 주위 침윤에 대한 #p<0.05 대 비히클, 윌콕스 서명 순위 테스트. □ 단핵구; ◆ 호산구.
도 46. 100㎍/마우스 항 TNF-α s.c. 주당 2회(Enbrel) 및 0.3mg/kg 덱사메타손 복강내 OD와 동등한 1mg/kg s.c. hBD2의 효과를 나타내는 뮤린 14-주 치료적 SCID CD4 + CD25 + T 세포 전달 모델에서 미엘로퍼옥시다제 활성. t-테스트에 의한 *p<0.05; **p<0.01 대 비히클.
도 47. 0일째 줄기 세포 이식 및 0일째로부터 10일째(n = 15)까지 1.2mg/kg/일의 hBD2 또는 비히클(PBS 100μL/일)에 의한 치료 후 뮤린 이식편 대 숙주 질환 모델에서 극적으로 증가된 생존율(p<0.0001)을 나타내는 카플란-마이어 플롯(Kaplan-Meyer plot).
도 48.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스에서 소장, 결장 및 간의 조직학 스코어의 통계적으로 유의한 감소.
도 49.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 마우스에서 기준선으로부터 중량 손실(%)(a) 및 (그람)(b).
도 50.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스에서결장 및 소장의 고유판으로의 CD45 + 백혈구 세포 이동 감소.
도 51a-c.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스에서결장 및 소장의 고유판의 장 T 세포 및 골수 세포 침윤의 감소.
도 52a-c.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스의 혈청에서 TNF-α(a), IL-6(b) 및 IL-10(c)의 사이토카인 농도.
도 53a-c.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스에서 골수 세포에서의 IL-1β 생산 감소.
도 54a-f.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스에서 호중구의 감소된 비율(a), CD4 T 세포(b) 및 CD8 T 세포(c) 및 CD69 + CD4 T 세포(d)에서 감소된 Th1 사이토카인 생산-IFN-γ; CD4 T 세포(e) 및 CD8 T 세포(f)에서 TNF-α.
도 55.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 PBS로 처리된 10마리 마우스에서 결장에서 증가된 염증, 골수성 세포 및 백혈구 침투 뿐만 아니라 증가된 조직 회복.
도 56.
각각 사이클로스포린 및 PBS로 처리된 13마리 마우스와 비교하여 줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 7마리 마우스에서 사망률(p = 0.03)의 통계적으로 유의한 감소.
도 57.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2, 사이클로스포린 또는 PBS로 처리된 마우스에서 기준선으로부터 중량 손실(%).
도 58.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 각각 경구 hBD2, 경구 HD5 또는 PBS로 처리된 22마리 마우스에서 사망률의 유의한 감소.
도 59.
저지방 또는 서양 식이 상의 마우스와 비교하여 마우스에서 장내 라이닝으로부터 박테리아 집단(용해 영역)까지의 거리(㎛)로서 측정된 경구 투여된 HD5 및 hBD-2에 의해 발휘된 박테리아 집단 대조군. 이 실험은 마우스에서 경구 투여된 인간 HD5 및 hBD-2가 놀랍게도 그들이 주로 경구 투여 후 기대되는 바와 같이 장의 루멘에서가 아니라 마우스 자체의 상피 세포에 의해 생성된 마우스 디펜신인 것처럼 상피 표면에서 그들의 미생물군 조절 효과를 발휘한다는 것을 입증한다.
도 60.
뮤린 고지방 식이 모델에서 hBD2에 의한 예방적 치료 후 간의 헤마톡실린/에오신 얼룩. 저지방 식이 중 마우스에서는 간세포 지방 축적은 주시되지 않는 반면, 광범위한 지방증(간세포에서 지방 축적)은 서양 고지방 식이를 섭취한 마우스에서 주시되고, 최소 간세포내 지방 축적이 경구 1.2mg/kg hBD-2의 매일 예방적 투여에 의해 보충된 서양 고지방 식이를 섭취한 마우스의 군에서 주시된다.
도 2. 대장염의 덱스트란 나트륨 설페이트 치료 모델에서 디펜신의 효과를 조사하기 위한 실험 환경의 개략도.
도 3. 고지방 식이 뮤린 모델에서 미생물군의 조성에 대한 포유동물 디펜신(HD5, hBD2 및 HD5 + hBD2)의 효과를 조사하기 위한 실험 환경의 개략도.
도 4. 천식 예방을 위한 뮤린 스테로이드-민감성 모델에서 포유동물 디펜신의 효과를 조사하기 위한 실험 환경의 개략도이고, 여기서 상기 마우스는 집 먼지 진드기(HDM)+ 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)에 의해 면역화하고 HDM으로 시험감염하였다.
도 5는 천식 치료를 위한 뮤린 스테로이드-민감성 모델에서 포유동물 디펜신의 효과를 조사하기 위한 실험 환경의 개략도이고, 여기서 상기 마우스는 집 먼지 진드기(HDM)+ 프로인트 보조제에 의해 면역화하고 HDM으로 시험감염하였다.
도 6a. 인간 베타 디펜신 1-4의 Clustal W (2.1) 다중 서열 정렬:
Clustal W 정렬에서:
*는 단일, 완전 보존된 잔기를 갖는 위치를 나타낸다.
:는 다음 "강한" 군 중 하나가 완전히 보존된다는 것을 나타낸다:
-S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W.
·는 다음 "약한" 군 중 하나가 완전히 보존된다는 것을 나타낸다:
-C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y.
도 6b. HD5 및 HD6의 Clustal 정렬.
도 6c. HD5, HD6, 및 hBD1, hBD2, hBD3, 및 hBD4의 Clustal 정렬.
도 7. 대장염 연구를 위한 질환 활동 지수 스코어링 시스템의 설명.
도 8. 대장염 연구를 위한 조직학적 스코어링 시스템의 설명.
도 9. 마우스 항 TNF-α에 비해 HBD2(NZ39000)의 통계적으로 유의한 우수성을 나타내는 뮤린 10-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구 및 HBD2의 i.v. 투여에 비해 우수성을 나타내는 피하 HBD2 투여에서 원위 결장의 조직학적 스코어. 범례:
A: 1일 1회 대조군 비히클 i.v.
B: 항-TNF 알파(300㎍/마우스 i.p. 3회)
C: hBD2(1일 1회 0.1mg/kg i.v.)
D: hBD2(1일 1회 0.1mg/kg s.c.)
E: hBD2(1일 2회 0.1mg/kg i.v. + s.c.)
F: hBD2(1일 2회 0.1mg/kg s.c. + s.c.)
K: 나이브 동물.
도 10. 경구 투여된 HBD2hBD2 대 1mg/kg 경구 프레드니솔론의 모든 투여량에 대한 체중 보존 효과를 나타내는 뮤린 10-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 동물 체중 변화. 처리군: A: 1일 2회 대조군 비히클 PBS p.o.; B: 1일 2회 프레드니솔론 1mg/kg p.o.; C: 1일 2회 hBD2 0.05mg/kg p.o.; D: 1일 2회 hBD2 0.5mg/kg p.o.; E: 1일 2회 hBD2 5mg/kg p.o. 대조군(비히클) 군 값으로부터 유의한 차이는 **P<0,01: ***P<0,001로 제시되어 있다(크루스칼-왈리스 테스트(Kruskal-Wallis test) + 비모수 데이터에 대한 던(Dunn)의 테스트 후).
도 11. 프레드니솔론 1mg/kg에 비해 경구 투여된 hBD2의 통계적으로 유의한 우수성을 나타내는 뮤린 10-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 질환 활동 지수 스코어. 도 10에 대해 제시된 처리군 및 유의성.
도 12. 프레드니솔론 1mg/kg과 동등한 경구 HBD2의 모든 투여량의 통계적 유의한 효과를 나타내는 뮤린 10-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 조직학적 스코어. 도 10에 대해 제시된 처리군 및 유의성.
도 13. 프레드니솔론 10mg/kg과 동등한 0.03 및 0.1mg/kg hBD2(군 E 및 F)의 통계적 유의한 효과를 나타내는 8-일 예방적 트리니트로벤젠 설폰산 유도 대장염 연구에서 조직학적 스코어.
A: 비히클 대조군 s.c. 1 x 1일
B: 프레드니솔론 10mg/kg s.c. 1 x 1일
C: hBD2, s.c. 1 x 1일 = 1mg/kg
D: hBD2, s.c. 1 x 1일 = 0.3mg/kg
E: hBD2, s.c. 1 x 1일 = 0.1mg/kg
F: hBD2, s.c. 1 x 1일 = 0.03mg/kg
G: hBD2, s.c. 1 x 1일 = 0.1mg/kg
도 14. 사이클로스포린과 동등한 hBD2의 통계적 유의한 효과를 나타내는 뮤린 7-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 결장 길이. *P<0.05 대 DSS, 만 휘트니 테스트(Mann Whitney test).
도 15. 사이클로스포린과 동등한 hBD2의 통계적 유의한 효과뿐만 아니라 투여 경로에 관계없이 BID 투여에 비해 hBD2의 TID 투여의 우수성을 나타내는 뮤린 7-일 예방적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 임상적 스코어(대변 스코어: 0 = 정상; 1 = 습윤/점착성 대변; 2 = 연질 대변; 3 = 설사; 대변 혈액 스코어: 0 = 혈액 없음; 1 = 대변 또는 항문 주위의 혈액의 증거; 2 = 심한 출혈; 마우스 외관: 0 = 정상; 1 = 주름진 털 또는 변경된 자세; 2 = 무기력). *p<0.05 대 DSS; 2원 ANOVA 및 본페로니(Bonferroni) 다중 비교 테스트.
도 16. 덱사메타손 1mg/kg과 동등하고 마우스 항 TNF-α 300㎍/마우스보다 우수한 hBD2 0.1mg/kg의 통계적 유의한 효과를 나타내는 뮤린 14-일 치료적 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 연구에서 조직학적 스코어.
도 17. 100㎍/마우스 항 TNF-α s.c. 주당 2회(Enbrel) 및 0.3mg/kg 덱사메타손 복강내 OD와 동등한 hBD2 1mg/kg s.c. OD의 효과를 나타내는 뮤린 14-주 치료적 SCID CD4 + CD25 + T 세포 전달 대장염 모델에서의 임상적 스코어(체중 감량, 대변 점조도 및 직장당 혈액의 존재).
도 18. 100㎍/마우스 항 TNF-α s.c. 주당 2회(Enbrel) 및 0.3mg/kg 덱사메타손 복강내 OD와 동등한 hBD2 1mg/kg s.c. OD의 효과를 나타내는 뮤린 14-주 치료적 SCID CD4 + CD25 + T 세포 전달 대장염 모델에서의 결장 중량. t-테스트에 의한 *p<0.05; **p<0.01 대 비히클.
도 19. 100㎍/마우스 항 TNF-α s.c. 주당 2회(Enbrel) 및 0.3mg/kg 덱사메타손 복강내 OD와 동등한 1mg/kg s.c. hBD2의 효과를 나타내는 뮤린 14-주 치료적 SCID CD4 + CD25 + T 세포 전달 모델에서 미엘로퍼옥시다제 활성. t-테스트에 의한 *P<0.05; **p<0.01 대 비히클.
도 20. 뮤린 고지방 식이 모델에서 경구 HD5, hBD2 및 HD5 + hBD2에 의한 예방적 치료 후 미생물 존재 및 존재량의 비가중된 및 가중된 유니프랙(unifrac) 분석.
도 21. 뮤린 고지방 식이 모델에서 경구 HD5 및 hBD2에 의한 예방적 치료 후 소장에서 알로바쿨룸의 존재량.
도 22. 뮤린 고지방 식이 모델에서 경구 HD5, hBD2 및 HD5 + hBD2에 의한 예방적 치료 후 미생물 존재량의 속 분석.
도 23. 뮤린 고지방 모델에서 경구 hBD2에 의한 예방적 치료 후 결장에서 락토바실라시에(Lactobacillaceae)의 존재량.
도 24. 뮤린 고지방 식이 모델에서 경구 hBD2에 의한 예방적 치료 4주(좌측 패널) 및 10주(우측 패널) 후 바네시엘라의 상대적 존재량.
도 25. 뮤린 고지방 식이 모델에서 HD5 또는 hBD2에 의한 치료적 치료 후 미생물 존재 및 존재량의 비가중된 유니프랙 분석. 상부 패널은 0주째 데이터를 나타낸다. 10주째 하부 패널.
도 26. 뮤린 고지방 식이 모델에서 경구 HD5 및 hBD2에 의한 치료적 개입 후 결장에서 알로프레보텔라의 상대적 존재량.
도 27. 뮤린 고지방 식이 모델에서 HD5 또는 hBD2에 의한 치료적 개입 후 소장 및 결장에서 비피도박테리아세아에의 상대적 존재량.
도 28 내지 31을 위한 도 범례. 염수 IN은 시험감염되지 않고 처리되지 않은 대조군이다. HDM/비히클은 처리되지 않았지만, HDM 시험감염된 동물을 나타낸다. HDM은 집 먼지 진드기로 시험감염된 동물이다. PO는 경구 투여이고, IN은 비강내 투여이다. *로 표지된 컬럼은 비히클 처리된 대조군과 통계적으로 유의하게 다르다.
도 28: 각각 hBD2의 예방적 비강내 및 경구 투여 후 뮤린 집 먼지 진드기 스테로이드-민감성 천식 모델에서 기도 과민성.
도 29: 각각 hBD2의 예방적 비강내 및 경구 투여 후 뮤린 집 먼지 진드기 스테로이드-민감성 천식 모델에서 폐 순응도.
도 30: hBD-2의 예방적 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 BALF 내의 호중구 세포 수. 결과는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.
도 31a-f. hBD2의 예방적 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 폐 균질물 중 TNF-α(31a), IL-4(31b), IL-5(31c), IL-6(31d), IL-9(31e) 및 IL-13(31f)의 사이토카인 농도. # p<0.05 대 HDM/비히클 PO, 만 휘트니 테스트. 결과는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.
도 32a 및 도 32b: 각각 hBD2의 치료적 비강내(도 32a) 및 경구(도 32b) 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 기도 과민성. 염수는 비-시험감염된 대조군이다. HDMA/비히클은 비히클로 처리된 집 먼지 진드기 시험감염된 대조군이다. "hBD2 IN 1.2mpk"는 1.2mg/kg으로 비강내 투여된 hBD2이다. 5mpk는 5mg/kg이다.
도 33a 및 도 33b: 각각 hBD2의 치료적 비강내(도 33a) 및 경구(도 33b) 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서의 폐 순응도.
도 34: hBD-2의 치료적 비강내 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 BALF 중 전체(34a), 호중구(34b) 및 대식세포 세포 수(34c). *p<0.05 대 비히클; 만-휘트니 테스트. 결과는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.
도 35-42. 각각 hBD2의 치료적 비강내 및 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 폐 균질물 중 IFN-γ(도 35), TNF-α(도 36), IL-4(도 37), IL-5(도 38), IL-6(도 39), IL-9(도 40), IL-10(도 41) 및 IL-13(도 42)의 사이토카인 농도. 각 도는 두 아암이 도시되어 있는 도면에서 좌측의 비강내 아암과 우측의 경구 아암으로부터의 데이터를 갖는다. 'p<005 대 상응하는 비히클; 만-휘트니 테스트. 결과는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.
도 43. 각각 hBD2의 치료적 비강내 및 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 H&E/PAS 제제에 의한 폐 조직학. 상부 좌측 패널: 처리되지 않고 시험감염되지 않은 대조군. 상부 우측 패널: 처리되지 않고 HDM 시험감염된 대조군. 하부 좌측 패널: hBD2 PO로 처리된 HDM 시험감염됨. 하부 우측 패널: hBD2 IN으로 처리된 HDM 시험감염됨. 50X 확대.
도 44. 각각 hBD2의 치료적 비강내 및 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 폐 염증 중증도. *p<0.05 대 비히클, 만 휘트니 테스트; #p<0.05 대 비히클, 윌콕스 서명 순위 테스트(Wilcox Signed Rank test).
도 45. 각각 hBD2의 치료적 비강내 및 경구 투여 후 집 먼지 진드기 뮤린 스테로이드-민감성 천식 모델에서 혈관 주위 및 기관지 주위 염증. 호산구의 혈관주위 침윤에 대한 *p<0.05 대 비히클, 만 휘트니 테스트; 호산구 및 단핵구의 다발주위/기관지 주위 침윤에 대한 #p<0.05 대 비히클, 윌콕스 서명 순위 테스트. □ 단핵구; ◆ 호산구.
도 46. 100㎍/마우스 항 TNF-α s.c. 주당 2회(Enbrel) 및 0.3mg/kg 덱사메타손 복강내 OD와 동등한 1mg/kg s.c. hBD2의 효과를 나타내는 뮤린 14-주 치료적 SCID CD4 + CD25 + T 세포 전달 모델에서 미엘로퍼옥시다제 활성. t-테스트에 의한 *p<0.05; **p<0.01 대 비히클.
도 47. 0일째 줄기 세포 이식 및 0일째로부터 10일째(n = 15)까지 1.2mg/kg/일의 hBD2 또는 비히클(PBS 100μL/일)에 의한 치료 후 뮤린 이식편 대 숙주 질환 모델에서 극적으로 증가된 생존율(p<0.0001)을 나타내는 카플란-마이어 플롯(Kaplan-Meyer plot).
도 48.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스에서 소장, 결장 및 간의 조직학 스코어의 통계적으로 유의한 감소.
도 49.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 마우스에서 기준선으로부터 중량 손실(%)(a) 및 (그람)(b).
도 50.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스에서결장 및 소장의 고유판으로의 CD45 + 백혈구 세포 이동 감소.
도 51a-c.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스에서결장 및 소장의 고유판의 장 T 세포 및 골수 세포 침윤의 감소.
도 52a-c.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스의 혈청에서 TNF-α(a), IL-6(b) 및 IL-10(c)의 사이토카인 농도.
도 53a-c.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스에서 골수 세포에서의 IL-1β 생산 감소.
도 54a-f.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 10마리 마우스에서 호중구의 감소된 비율(a), CD4 T 세포(b) 및 CD8 T 세포(c) 및 CD69 + CD4 T 세포(d)에서 감소된 Th1 사이토카인 생산-IFN-γ; CD4 T 세포(e) 및 CD8 T 세포(f)에서 TNF-α.
도 55.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 PBS로 처리된 10마리 마우스에서 결장에서 증가된 염증, 골수성 세포 및 백혈구 침투 뿐만 아니라 증가된 조직 회복.
도 56.
각각 사이클로스포린 및 PBS로 처리된 13마리 마우스와 비교하여 줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2로 처리된 7마리 마우스에서 사망률(p = 0.03)의 통계적으로 유의한 감소.
도 57.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 경구 hBD2, 사이클로스포린 또는 PBS로 처리된 마우스에서 기준선으로부터 중량 손실(%).
도 58.
줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 각각 경구 hBD2, 경구 HD5 또는 PBS로 처리된 22마리 마우스에서 사망률의 유의한 감소.
도 59.
저지방 또는 서양 식이 상의 마우스와 비교하여 마우스에서 장내 라이닝으로부터 박테리아 집단(용해 영역)까지의 거리(㎛)로서 측정된 경구 투여된 HD5 및 hBD-2에 의해 발휘된 박테리아 집단 대조군. 이 실험은 마우스에서 경구 투여된 인간 HD5 및 hBD-2가 놀랍게도 그들이 주로 경구 투여 후 기대되는 바와 같이 장의 루멘에서가 아니라 마우스 자체의 상피 세포에 의해 생성된 마우스 디펜신인 것처럼 상피 표면에서 그들의 미생물군 조절 효과를 발휘한다는 것을 입증한다.
도 60.
뮤린 고지방 식이 모델에서 hBD2에 의한 예방적 치료 후 간의 헤마톡실린/에오신 얼룩. 저지방 식이 중 마우스에서는 간세포 지방 축적은 주시되지 않는 반면, 광범위한 지방증(간세포에서 지방 축적)은 서양 고지방 식이를 섭취한 마우스에서 주시되고, 최소 간세포내 지방 축적이 경구 1.2mg/kg hBD-2의 매일 예방적 투여에 의해 보충된 서양 고지방 식이를 섭취한 마우스의 군에서 주시된다.
상세한 설명
정의:
디펜신: 본원에 사용된 용어 "디펜신"은 항균 펩티드의 디펜신 부류에 속하는 폴리펩티드를 지칭한다. 디펜신은 건강한 마이크로바이옴(microbiome)을 유지하고 잠재적인 병원체를 막는 작용을 하는 우성의 선천적인 숙주 방어 중의 하나를 나타낸다[참조: Wehkamp et al, 2002 및 Salzman et al, 2007]. 디펜신은 그램 양성 및 음성 박테리아, 진균 및 고세균에 대한 항균 활성을 보유할 뿐만 아니라 항-염증 활성을 발휘하는 펩티드이다. 인간 디펜신은 이들의 3개의 분자내 시스테인 디설파이드 결합의 위상을 기준으로 α- 및 β-디펜신으로 분리된 작은 양이온성 펩티드이다(도 6). 포유동물 디펜신은 잘 정의된 구조적 특징을 갖는다: 성숙한 펩티드는 작은(3-6 kDa, 28-42 아미노산 길이), 양이온성(순 전하 +1 내지 +11), 양친매성이고, 삼중 역평행 가닥 β-시트의 고도로 보존된 3차 구조를 갖는다. 디펜신 사이의 구조의 보존은 아미노산 서열에서 가변성을 고려하여 다소 놀라운 것이며, 디펜신 패밀리 전반에 걸쳐 6개의 보존된 시스테인 잔기로 인한 것이다. 이들 6개의 시스테인 잔기는 3개의 디설파이드 결합을 형성하며, 이는 삼중-가닥 β-시트 코어 구조를 안정화시킨다(참조: Mammalian Antimicrobial Peptides; Defensins and Cathelicidins Dorin et al, in Molecular Medical Microbiology (Second Edition), 2015). α-디펜신은 소장의 움(crypt)에서 파네트 세포에 의해 발현된 것들(HD5 및 HD6 또는 DEFA5 및 DEFA6)이다. β-디펜신(DEFBn)은 주로 피부, 눈, 중이, 입, 기관지, 폐, 위장관, 비뇨생식계, 신장, 질, 간, 췌장 및 유선을 포함한 다양한 조직 및 기관 중의 상피 세포에 의해 생성된다. 디펜신의 예는 모두 알파 디펜신 부류에 속하는 인간 장내 알파 디펜신 5(HD5; 서열번호 5); 인간 장내 알파 디펜신 6(HD6; 서열번호 6); 및 또한 인간 베타 디펜신 1(hBD1; 서열번호 1); 인간 베타 디펜신 2(hBD2; 서열번호 2); 인간 베타 디펜신 3(hBD3; 서열번호 3); 인간 베타 디펜신 4(hBD4; 서열번호 4); 절단형(truncated) 인간 베타 디펜신 2(서열번호 7)를 포함한다. 디펜신은 전구체로서 발현되고, 신호 펩티드 및 또한 몇몇 경우에 세포외 공간으로 분비 전의 전구-펩티드의 절단에 의해 처리된다. 인간 디펜신의 일부, 예를 들어, hBD-1은 구성적으로 생성되는 반면, 다른 것들, 예를 들어, hBD2, hBD-3 및 hBD-4는 전염증성 사이토카인 또는 외인성 미생물 산물에 의해 유도된다. 상기 동정된 서열은 예측된 성숙 생물활성 디펜신을 나타낸다. 당업자는, 처리가 세포마다 상이할 수 있고 생성되는 분비된 성숙 펩티드가 예측된 서열과 하나 또는 2개의 C- 또는 N-말단 아미노산에 의해 상이할 수 있으며 생물활성을 여전히 유지한다는 것을 이해할 것이다.
동일성: 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 뉴클레오티드 서열간의 관련성은 "동일성"이란 파라미터에 의해 기재된다. 2개의 아미노산 서열간의 동일성 정도는 EMBOSS 팩키지(Rice et al., 2000, http://emboss.org), 바람직하게는 버전 3.0.0 또는 그 이후의 니들(Needle) 프로그램으로 실행되는 바와 같은 니들맨-분취 알고리즘(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 결정한다. 사용되는 임의의 파라미터는 갭 개방 페널티 10, 갭 확장 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "최장 동일성"의 출력(nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)은 동일성 퍼센트로서 사용되며, 하기와 같이 계산된다: (동일한 잔기 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬 중 갭의 총 수).
정상 미생물군: 용어 "정상 미생물군"은 본원에서 장내 불균형이 아닌 미생물군을 나타내기 위해 사용된다. 정상 미생물군은 거대 유전자 풍부함을 갖는 것을 특징으로 한다. 정상 장내 미생물군은 속 박테리오데테스(Bacteriodetes), 페칼리박테리움(Faecalibacterium), 로세부리아(Roseburia), 블라우티아(Blautia), 루미노콕쿠스(Ruminococcus), 코프로콕쿠스(Coprococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter), 락토바실루스(Lactobacillus), 코프로콕쿠스(Coprococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 아커만시아(Akkermansia), 유박테리움(Eubacterium)에 속하는 박테리아를 포함함을 특징으로 한다.
정상 폐 미생물군은 속 박테로이데테스, 피르미쿠테스(Firmicutes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)에 속하는 박테리아를 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 프레보텔라(Prevotella), 푸소박테리아(Fusobacteria), 베일로넬라(Veillonella), 헤모필루스(Haemophilus), 네이세리아(Neisseria) 및 포르피로모나스(Porphyromonas)로 이루어진 코어 미생물군과 함께 포함함을 특징으로 한다.
치료: 본원에 사용된 용어 "치료" 및 "치료하는"은 상태, 질환 또는 장애를 방지할 목적으로 환자를 관리하고 보살피는 것을 지칭한다. 상기 용어는 상기 환자가 앓고 있는 소정의 상태에 대한 전체 치료 스펙트럼, 예를 들어, 증상 또는 합병증의 개선 또는 완화; 상기 상태, 질환 또는 장애의 진행의 지연; 상기 상태, 질환 또는 장애의 치유 또는 제거; 및/또는 상기 상태, 질환 또는 장애의 예방을 위한 활성 화합물의 투여를 포함하고자 하며, 여기서 "예방하는" 또는 "예방"은 증상 또는 합병증의 개시 위험을 방지하거나 감소시키기 위해 상기 활성 화합물을 저해, 감소시킬 목적으로 환자를 관리하고 보살피는 것을 지칭하는 것으로 이해되야 한다. 치료될 환자는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
환자: 환자는 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식으로 치료받았거나 또는 이를 막 받으려고 하는 대상체이다.
포유동물 알파 디펜신 및 포유동물 베타 디펜신.
본 개시내용은 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식에 의해 치료를 받았거나 또는 막 치료를 받으려고 하는 대상체의 치료 또는 예방에서, 포유동물 알파 디펜신 및/또는 베타 디펜신, 예를 들어, 인간 알파 및 베타 디펜신, 보다 바람직하게는 호미니데(Hominidae)의 용도에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7의 아미노산 서열 중의 어느 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 정도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 디펜신은 10개 미만, 예를 들어, 8개 미만, 예를 들어, 5개 미만, 예를 들어, 4개 미만, 예를 들어, 3개 미만, 예를 들어, 2개 미만의 아미노산에 의해 서열번호 1 내지 7 중 하나와 상이하다.
바람직한 구현예에서, 인간 알파 디펜신은 알파 디펜신 5(서열번호 5) 및/또는 알파 디펜신 6(서열번호 6)으로 이루어진다. 바람직한 구현예에서, 포유동물 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 1(서열번호 1), 인간 베타 디펜신 2(서열번호 2), 절단형 인간 베타 디펜신 2(서열번호 7), 인간 베타 디펜신 3(서열번호 3) 및/또는 인간 베타 디펜신 4(서열번호 4)로 이루어진다. 바람직한 구현예에서, 인간 알파 디펜신은 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 정도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 인간 포유동물 알파 디펜신은 알파 디펜신 5(서열번호 5)로 이루어진다. 바람직한 구현예에서, 인간 베타 디펜신은 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 정도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 인간 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 2(서열번호 2)로 이루어진다.
또 다른 구현예에서, 포유동물 알파 디펜신은 인간 알파 디펜신 및/또는 마우스 알파 디펜신, 및 이의 기능적 등가 변이체로 구성된다. 바람직하게는, 포유동물 알파 디펜신은 인간 알파 디펜신 5, 인간 알파 디펜신 6 및 이의 기능적 등가 변이체로 이루어진다. 보다 바람직하게는, 포유동물 알파 디펜신은 인간 알파 디펜신 5 및, 이의 기능적 등가 변이체 또는 오르톨로그(orthologue)로 이루어진다.
추가의 구현예에서, 포유동물 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 및/또는 마우스 베타 디펜신, 및 이의 기능적 등가 변이체로 이루어진다. 바람직하게는, 포유동물 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 1, 인간 베타 디펜신 2, 절단형 인간 베타 디펜신 2, 인간 베타 디펜신 3, 인간 베타 디펜신 4, 및 이의 기능적 등가 변이체로 이루어진다. 보다 바람직하게는, 포유동물 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 2, 및 이의 기능적 등가 변이체 또는 오르톨로그로 이루어진다.
포유동물(예: 인간) 알파 또는 베타 디펜신의 "기능적 등가 변이체"는 폐 또는 장내 또는 피부의 미생물군에 대해 부모 포유동물(예: 인간) 알파 및/또는 베타 디펜신과 대략 동일한 효과를 나타내는 변형된 포유동물(예: 인간) 알파 또는 베타 디펜신이다. 포유동물(예: 인간) 디펜신의 기능적 등가 변이체는, 포유동물(예: 인간) 디펜신 아미노산 서열(예: 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나)과 비교하여, 1 내지 5개의 아미노산 변형, 바람직하게는 1 내지 4개의 아미노산 변형, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 변형, 가장 바람직하게는 1 내지 2개의 아미노산 변형(들), 특히 1개의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 베타 포유동물 디펜신의 경우에는 서열번호 2를 갖는 인간 베타 디펜신 2와 비교되고, 알파 디펜신의 경우에는 HD5(서열번호 5)와 비교된다.
용어 "변형"은 본원에서 포유동물(예: 인간) 디펜신의 임의의 화학적 변형을 의미한다. 변형(들)은 아미노산(들)의 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)일 뿐만 아니라, 아미노산 측쇄(들)의 치환(들); 또는 아미노산 서열에서 유사한 특징을 갖는 비천연 아미노산의 사용일 수 있다. 특히, 변형(들)은 아미드화, 예를 들어, C-말단의 아미드화일 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 변형은 경미한 성질의 것, 즉 폴리펩티드의 폴딩 및/또는 활성에 유의적으로 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환 또는 삽입; 단일 결실; 작은 아미노- 또는 카복실-말단 신장; 또는 순전하 또는 또 다른 기능을 변화시킴으로써 정제를 용이하게 하는 작은 신장부, 예를 들어, 폴리-히스티딘 태그, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인이다. 하나의 구현예에서, 작은 신장부, 예를 들어, 폴리-히스티딘 태그, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인은 최대 약 20-25개 잔기의 작은 링커 펩티드를 통해 포유동물(예: 인간) 알파 또는 베타 디펜신에 부착되고, 상기 링커는 제한 효소 절단 부위를 함유할 수 있다.
도 6의 Clustal W 정렬을 사용하여, 어떠한 아미노산 잔기가 단백질의 생물학적 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않고 치환될 수 있는지를 예측할 수 있다. 서열은 Clustal W 2.1(http://www.geno,me.jp/tools/clustalw/) 및 하기 설정을 사용하여 정렬되었다: 갭 개방 페널티: 10, 갭 신장 페널티: 0,05, 중량 전이: 없음, 단백질의 친수성 잔기: GPSNDQE, 친수성 갭: 있음, 중량 매트릭스: BLOSUM(단백질용). 하기 군 내의 치환(Clustal W, '강력한' 보존 군)은 보존적 치환으로 간주되어야 한다: -S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W. 하기 군 내의 치환(Clustal W, '약한' 보존 군)은 반-보존적 치환으로 간주되어야 한다: -C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y.
보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(류신, 이소류신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 군 내에서 이루어진 치환이다. 일반적으로 특정 활성을 변경하지 않는 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있다. 가장 일반적으로 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly이다.
20개의 표준 아미노산 이외에, 비-표준 아미노산(예: 4-하이드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린 및 알파-메틸 세린)은 야생형 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 제한된 수의 비-보존적 아미노산, 유전자 코드에 의해 코딩되지 않은 아미노산, 및 비천연 아미노산은 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. "비천연 아미노산"은 단백질 합성 후에 변형되고/되거나, 이들의 측쇄(들)에 표준 아미노산의 것과 상이한 화학적 구조를 갖는다. 비천연 아미노산은 화학적으로 합성될 수 있고, 바람직하게는 상업적으로 입수가능하며, 피페콜산, 티아졸리딘 카복실산, 데하이드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린 및 3,3-디메틸프롤린을 포함한다.
포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신의 필수 아미노산은 당업계에 공지된 절차, 예를 들어, 부위-지시된 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 따라 동정될 수 있다(참조: Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). 후자의 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이는 분자 중의 모든 잔기에 도입하고, 생성되는 돌연변이체 분자는 생물학적 활성(즉, 기도 과민성 또는 억제 사이토카인에 대한 활성, 예를 들어, TNF-알파 활성)에 대해 시험하여 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 동정한다(참조: Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708). 필수 아미노산의 동일성은 또한 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신과 관련되는 폴리펩티드에 의한 동일성 분석으로부터 추론될 수 있다(참조: 도 5의 Clustal W 정렬).
단일 또는 다중 아미노산 치환은 돌연변이유발, 재조합 및/또는 셔플링의 공지된 방법에 이어서, 문헌(참조: Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625)에 기재된 것들과 같은 관련 스크리닝 절차를 사용하여 수행되고 시험될 수 있다. 사용될 수 있는 기타 방법은 에러-유발 PCR, 파지 디스플레이(참조: Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; 미국 특허 제5,223,409호; WO 92/06204) 및 영역-지시된 돌연변이유발(참조: Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127)을 포함한다. 소정의 치환의 결과가 확실하게 예측될 수 없는 경우, 유도체를 상기 본원에 기재된 방법에 따라 용이하게 검정하여 생물학적 활성의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.
장시간-작용형 디펜신
포유동물 α- 또는 β-디펜신의 반감기는 α- 또는 β-디펜신을 또 다른 모이어티와 융합 또는 접합시킴으로써, 즉 약제학적으로 허용되는 분자에 결합된 장시간 작용하는 생물학적 활성 α- 또는 β-디펜신을 작제함으로써 연장시켜 α- 또는 β-디펜신의 생체내 혈장 반감기를 제공할 수 있고, 이는 α- 또는 β-디펜신과 동등한 방식으로 투여된 α- 또는 β-디펜신의 생체내 혈장 반감기와 비교하여 상당히 증가된다.
포유동물 α-디펜신 또는 이의 유사체 또는 포유동물 β-디펜신 또는 이의 유사체를 포함하는 장시간 작용하는 생물학적 활성 α- 또는 β-디펜신은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 분자, 트랜스페린, 알부민(HAS), 엑스텐(XTEN®) 또는 PEG, 호모-아미노산 중합체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 중합체(PAS), 또는 엘라스틴-유사 펩티드(ELP), 히알루론산, 음으로 하전된 고도로 시아실화된(siacylated) 펩티드, 예를 들어, 융모성 고나도트로핀(CG) β-쇄의 카복시-말단 펩티드(CTP), 인간 IgG 및 CH3(CH2)nCO-(여기서, n은 8 내지 22이다)로 이루어진 군으로부터 선택된 약제학적으로 허용되는 분자에 결합된다.
α- 또는 β-디펜신 유사체는 또한 비-포유동물 기원의 것일 수 있고, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질로부터 선택될 수 있다.
α- 또는 β-디펜신 작용제는 선행 기술 문헌에 기재된 다양한 방식, 예를 들어, 제한 없이, 기술적으로 디펜신의 N-말단 또는 C-말단, 예를 들어, α-디펜신 또는 β-디펜신을 알부민 또는 알부민 유사체와 같은 약제학적으로 허용되는 분자에 커플링시킴으로써 이작용성 링커, 유전자를 통한 화학적 커플링으로 약제학적으로 허용되는 분자에 결합시킬 수 있다. 특히, 알부민 또는 알부민 유사체, 예를 들어, 인간 알부민의 N-말단은 α- 또는 β-디펜신의 C-말단 또는 α- 또는 β-디펜신의 N-말단에 커플링시킬 수 있거나; 알부민, 예를 들어, 인간 알부민의 C-말단은 α-디펜신 또는 β-디펜신의 C-말단 또는 α- 또는 β-디펜신의 N-말단에 커플링시킬 수 있다. 링커 서열은 알부민과 α- 또는 β-디펜신 쇄 사이에 삽입될 수 있다. α- 또는 β-디펜신 작용제는 안정한 링커 또는 보다 불안정한 링커를 통해 약제학적으로 허용되는 분자에 결합시킬 수 있다. 이작용성 PEG 분자(참조: Paige et.al Pharmaceutical Research, vol. 12, no. 12, 1995), 가수분해가능한 링커(참조: Shechter et al. Bioconjugate Chem. 2005,16: 913- 920 and International Journal of Peptide Research and Therapeutics, Vol. 13, Nos. 1-2, June 2007 and W02009095479), PDPH 및 EMCH(참조: W02010092135)를 포함하여 몇몇 링커가 당업계에 공지되어 있다. 약제학적으로 허용되는 분자에 대한 α- 또는 β-디펜신 작용제의 화학적 접합(2개 이상의 분자의 결합)이 기능적 α- 또는 β-디펜신 활성을 강력하게 감소시키는 특별한 경우에, 기능적 α- 또는 β-디펜신 작용제를 방출할 수 있는 보다 불안정한 링커를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
반감기 연장은 또한 스페이서, 예를 들어, γ-L-글루타밀 스페이서 및 C-18 지방 이산 쇄에 의한 펩티드 골격의 리신으로의 아실화를 통해 달성될 수 있다. 지방 이산 부위 쇄 및 스페이서는 알부민에 대해 강력하지만 가역적인 결합을 매개하여 주입 부위로부터의 방출을 늦추고 신장 클리어런스를 감소시킨다.
방법 및 용도
인간 베타 디펜신-2 및 HD5는 심각한 장내 염증 및 장내 불균형(덱스트란 나트륨 설페이트, 트리니트로벤젠 설폰산 및 CD4 + CD25 + T-세포 전달)의 예방 및 치료 동물 모델 모두에서 시험되었다. 경구 투여되든 피하 투여되든 α- 및 β-디펜신은 개선된 장내 건강을 통해 이들 화학물질에 의해 유도된 설사 및 체중 감소를 완화시킨다. 중요하게는, 디펜신은 강력한 표준 GVHD 면역억제제, 예를 들어, 모두 GVHD의 치료에 일상적으로 사용되는 프레드니솔론/덱사메타손 및 사이클로스포린 및 항 TNF-α와 동등한 염증의 마커로서 질환 활동 지수 및 미엘로퍼옥시다제 활성을 감소시킨다. 따라서, 디펜신은 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식을 받았거나 막 받으려고 하는 환자의 예방적 및/또는 치료적 치료로서 강력한 활성을 나타낸다.
β-디펜신은 IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13 조직 농도의 정상화를 통해 면역계를 재균형화하여 급성 GVHD를 유도하는 사이토카인 폭풍을 예방 또는 치료할 수 있음이 입증되었고, 따라서 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식을 받았거나 막 받으려고 하는 환자의 예방적 및/또는 치료적 치료로서 강력한 활성을 나타냈다.
α- 및 β-디펜신 모두가 다양한 미생물을 증가시키는 미생물군의 조성에 강력한 영향을 미친다, 즉, 미생물군을 보존하고/표준화하고/재설치할뿐만 아니라 중요한 공생 박테리아의 존재량을 촉진하여 급성 GVHD의 일반적인 특징인 장내 불균형을 치료하는 방법을 제시한다는 것이 예방적 및 치료적 고지방 식이 마우스 모델 둘 다에서 입증되었다. β-디펜신은 미엘로퍼옥시다제 활성의 감소를 통해 장 건강, 염증 및 기능을 정상화할 수 있고, 따라서 동종 이계 조혈 간세포 이식을 받은 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제시한다는 것이 입증되었다.
또한, 급성 알레르기성 천식의 마우스 모델에서, 경구 투여되든 비강내 투여되든 인간 β-디펜신 2(hBD2)의 용량이 천식의 발생을 방지할 수 있고, 따라서 급성 및 만성 GVHD와 종종 관련되는 폐 합병증 및 감소된 폐 용량의 예방 방법을 제시한다는 것이 입증되었다.
또한, 급성 알레르기성 천식의 마우스 모델에서, 경구 투여되든 비강내 투여되든 인간 β-디펜신 2(hBD2)의 용량이 또한 천식을 치료할 수 있고, 따라서 급성 및 만성 GVHD와 종종 관련되는 폐 합병증 및 감소된 폐 용량의 치료 방법을 제시한다는 것이 입증되었다.
따라서, 한 측면에서, 심각한 장 염증 및 사이토카인 폭풍의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은 하나 이상의 포유동물 디펜신의 경구 또는 피하 투여를 포함하며, 여기서 상기 대상체는 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식에 의해 치료되었거나 막 치료를 받으려고 한다.
따라서, 한 측면에서, 주요 공생 박테리아. 예를 들어, 비피도박테리아세아에의 증가된 존재 및 존재량을 포함하는 장 미생물군의 보존/정상화/재설치 방법이 제공되며, 상기 방법은 하나 이상의 포유동물 디펜신의 경구 투여를 포함하며, 여기서 상기 대상체는 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식에 의해 치료되었거나 치료될 것이다.
다른 측면에서, 폐색성 세기관지염 및 경피증을 예방하는 폐 및 장의 염증 및 섬유증을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 적어도 하나의 디펜신의 경구, 피하, 폐내, 진피 또는 경피 투여를 포함하며, 여기서 상기 대상체는 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식에 의해 치료되었거나 치료될 것이다.
추가로, 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식에 의해 치료되었거나 치료될 대상체의 폐 조직에서 IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13의 조직학적 폐 염증, 혈관주위 및 기관지혈관 염증, BALF 염증성 세포 수 및/또는 염증성 사이토카인 생산을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 적어도 하나의 디펜신을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따르는 치료 방법에서 사용하기 위한 디펜신, 및 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식에 의해 치료되었거나 치료될 대상체의 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 디펜신의 용도에 관한 것이다.
제공된 방법은 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식에 의해 치료되었거나 치료될 대상체에서 폐 및/또는 장 및/또는 간 박테리아 식물군 또는 폐 및/또는 장 대사체의 구조 및 조성뿐만 아니라 전사 수준에서 변화를 통해 박테리아 표현형을 변화시켜 폐 및/또는 장 염증 및/또는 간 염증을 치료 또는 예방할 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 경구 투여를 사용하여 관찰된 효과는 소위 장-폐 축을 통해 폐에 영향을 미칠 수 있는 장 미생물총 및 장 대사체의 변화에 기인할 수 있다. 만성 폐 장애, 예를 들어, 천식, COPD 및 만성 GVHD는 모두 인간 신체의 이러한 2개의 점막 부위 사이에 바이탈 크로스 토크(vital cross talk)가 존재하고 다양한 호흡기 질환이 기도 미생물군 뿐만 아니라 장 미생물군의 장내 불균형과 연관되어 있다는 것을 나타내는 장 질환 징후의 구성 요소를 나타낸다. 공생 미생물은 숙주-미생물 상호작용을 매개하는 작은 분자를 생성함으로써 선천적 및 적응성 면역 반응을 교정하고, 큰 부분에서 병원성 자극에 대한 활성화 역치에 영향을 미친다(참조: Donia and Fishback, 2015). 상피 장벽은 미생물이 장에 크게 한정된다는 것을 보장하지만, 미생물 대사물은 상피 장벽을 관통할 수 있어 그들이 면역 세포에 의해 감지되는 숙주 순환계 내에 들어가서 축적될 수 있도록 한다(참조: Dorrestein, 2014). 문헌(참조: Trompette, 2013)은 식이에서 발효가능한 섬유가 장 뿐만 아니라 폐 미생물군의 조성, 특히 피르미쿠테스(Firmicutes) 대 박테리오데테스(Bacteriodetes)의 비율을 변경했음을 마우스에서 입증하였고, 후자는 단쇄 지방산의 국소 및 전신 수준의 증가를 유도하고, 이는 또한 수지상 세포의 조혈 및 기능에 영향을 미치고, 따라서 폐의 면역학적 환경을 형성하고 알레르기성 염증의 중증도에 영향을 미친다. 문헌(참조: Schirmer et al(2016))은 추가로 인간 작용성 게놈 프로젝트(Human Functional Genomics Project)에서 사이토카인 반응의 개체간 변동이 미생물 기능 뿐만 아니라 특정 미생물 유기체와 관련된다는 것을 입증했다. 검출된 연관성의 대다수는 사이토카인 및 자극 특이적 둘 다였고, 이는 면역계가 미생물 유기체 및 생성물과 고도의 특이성으로 인식 및 상호작용하고, 이들 미생물 인자가 특정 면역학적 표현형과 연관되는 것을 시사한다. TNF-α 및 IFN-γ 생산 능력은 마이크로바이옴에 의해 보다 강력하게 영향을 받는 것으로 나타난 반면, 기타 사이토카인, 예를 들어, IL-1β, IL-6 및 Th17 유래된 IL-17 및 IL-22는 장 미생물군과의 보다 적지만 더욱 특이적인 연관성을 나타냈다.
본원에 기재된 치료 방법은 적어도 하나의 포유동물 α- 및/또는 β-디펜신을 프리바이오틱스, 프로바이오틱스, 트립토판, 글루코코르티코이드, 사이클로스포린, 항 TNF-α, 인테그린, 항생제, 면역억제제, 대변 이식 또는 이들의 조합과 함께 포함하는 조성물을 투여함으로써 수행될 수 있다. 디펜신은 개별적으로 또는 하나 이상의 이들 요법과 함께 투여될 수 있다. 디펜신은 또한 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식을 받았거나 막 받으려고 하는 환자의 치료에 사용될 수 있는 다른 의약과 함께 투여될 수 있다.
중요하게는, 개시된 방법은 항생제 치료, 미생물 오염 제거 또는 면역억제 요법, 또는 폐 또는 장 미생물군에 부정적인 영향을 미치는 다른 치료를 수행하였고/하였거나 수행하고 있는 대상체의 장 및/또는 폐에서 장내 불균형 미생물군/대사체의 치료, 재설치 또는 정상화를 위해 사용될 수 있다.
장 및/또는 폐 미생물군을 정상화하는 것은 또한 대사체를 상대적으로 더 많은 부티레이트 또는 트립토판 및 상대적으로 적은 아세테이트를 생성하는 것으로 변화시키는 것을 포함할 수 있다.
시험관내 합성
포유동물 알파 디펜신 및 포유동물 베타 디펜신을 포함하는 포유동물 항균성펩티드는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 시험관내 합성에 의해 제조될 수 있다. 다양한 상업적인 합성 장치, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드(Applied Biosystems Inc.), 벡크만(Beckman) 등에 의한 자동화된 합성기를 이용 가능하다. 합성기를 사용함으로써, 천연 아미노산은 비천연 아미노산, 특히 D-이성체 (또는 D-형태), 예를 들어, D-알라닌 및 D-이소류신, 부분입체이성체, 상이한 길이 또는 작용기를 갖는 측쇄 등으로 치환될 수 있다. 특정한 서열 및 제조 방식은 편의성, 경제성, 필요한 순도 등에 의해 결정될 것이다. 화학적 결합이, 결합에 편리한 작용기, 예를 들어, 아미드 또는 치환된 아민 형성, 예를 들어, 환원성 아민화를 위한 아미노 기, 티오에테르 또는 디설파이드 형성을 위한 티올 기, 아미드 형성을 위한 카복실 기 등을 포함하는 다양한 펩티드 또는 단백질에 제공될 수 있다. 경우에 따라, 다양한 기들이 합성 중 또는 발현 중 펩티드에 도입될 수 있으며, 이는 다른 분자 또는 표면에의 결합을 허용한다. 따라서, 시스테인을 사용하여 티오에테르, 금속 이온 착체에의 결합을 위한 히스티딘, 아미드 또는 에스테르 형성을 위한 카복실 기, 아미드를 형성하기 위한 아미노 기 등을 제조할 수 있다.
포유동물 알파 디펜신 및 포유동물 베타 디펜신, 또는 이의 기능적 등가물을 포함하는 포유동물 항균성 펩티드는 또한 통상적인 재조합 합성 방법에 따라 단리 및 정제될 수 있다. 재조합 합성은 적합한 발현 벡터 및 진핵생물 또는 원핵생물 발현 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 용액은 발현 숙주 및 배지로 제조될 수 있고, 존재하는 디펜신은 HPLC, 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 또는 다른 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 이. 콜라이(E. coli)에서 인간 베타 디펜신-2의 재조합 발현 방법은 WO 2010/007166(Novozymes)에 개시되어 있다.
포유동물 알파 및 베타 디펜신은 또한 상응하는 mRNA의 투여에 의해 유도될 수 있다.
용량
포유동물 알파 디펜신 또는 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어, 인간 알파 디펜신 또는 인간 베타 디펜신은 바람직하게는 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식을 받은 환자에서 이식편 대 숙주 질환을 예방 또는 치료하기에 효과적인 양으로, 바람직하게는 환자에게 허용되는 독성으로 약제학적 조성물에 사용된다. 포유동물 알파 디펜신 및 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어, 인간 알파 디펜신 및 인간 베타 디펜신은 또한 바람직하게는 폐 및/또는 장에서 정상 미생물군 조성물을 유지하거나 폐 및/또는 장에서 장내 불균형 미생물군을 치료 또는 정상화하기에 효과적인 양으로, 바람직하게는 치료를 필요로 하는 환자에게 허용되는 독성으로 약제학적 조성물에 사용된다.
이러한 치료를 위해, 적합한 용량은 물론, 예를 들어, 사용되는 화합물의 화학적 성질 및 약동학적 데이터, 개별적인 숙주, 투여 방식 및 치료될 상태의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다.
그러나, 일반적으로, 포유동물, 예를 들어, 인간에서 만족스런 결과를 위해, 인간 알파 디펜신의 지시된 1일 용량은 바람직하게는 약 0.1㎎ HD5/㎏ 체중 내지 약 10㎎ HD5/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 약 0.5㎎ HD5/㎏ 체중 내지 약 10㎎ HD5/㎏ 체중; 예를 들어, 1㎎ HD5/㎏ 체중 내지 10㎎ HD5/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 약 1.2㎎ HD5/㎏ 체중 내지 약 10㎎ HD5/㎏ 체중, 바람직하게는 약 1.2㎎ HD5/㎏ 체중 내지 약 5㎎ HD5/㎏ 체중, 훨씬 더 바람직하게는 1.2㎎ HD5/㎏ 체중으로, 예를 들어, 1일 최대 1, 2 또는 3회 분할 투여량으로 투여된다.
하나의 구현예에서, 인간 베타 디펜신의 지시된 1일 용량은 바람직하게는 약 0.1㎎ hBD2/㎏ 체중 내지 약 10㎎ hBD2/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 약 0.5㎎ hBD2/㎏ 체중 내지 약 10㎎ hBD2/㎏ 체중; 예를 들어, 1㎎ hBD2/㎏ 체중 내지 10㎎ hBD2/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 약 1.2㎎ hBD2/㎏ 체중 내지 약 10㎎ hBD2/㎏ 체중, 바람직하게는 약 1.2㎎ hBD2/㎏ 체중 내지 약 5㎎ hBD2/㎏ 체중, 더욱 더 바람직하게는 1.2㎎ hBD2/㎏ 체중으로, 예를 들어, 최대 1일 1, 2 또는 3회의 분할 용량으로 투여된다.
2개의 상이한 디펜신이 하나의 용량으로 투여되는 경우, 용량은 중량 기준 또는 몰 기준으로 결정된 2개 디펜신의 동등하거나 대략 동등한 양을 포함할 수 있다. 상기 비율은 또한 알파 디펜신 대 베타-디펜신의 비율이 중량 또는 몰 기준으로 결정된 10:1 내지 1:10, 예를 들어, 5:1 내지 1:5, 예를 들어, 2:1 내지 1:2로 변하도록 상이할 수 있다.
바람직한 구현예의 화합물은 포유동물, 예를 들어, 인간에게 종래 사용되는 것과 유사한 용량으로 유사한 투여 방식으로 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 방법이 본원에 기재된 바와 같이 제공되며, 여기서 1일 용량은 1일당 0.1 내지 10mg 디펜신/kg, 예를 들어 0.5 내지 5mg 디펜신/kg, 예를 들어, 1 내지 2mg 디펜신/kg, 예를 들어, 1.2mg 디펜신/kg이다.
특정 구현예에서, 바람직한 구현예의 약제학적 조성물은 포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어, 인간 알파 디펜신 및/또는 인간 베타 디펜신을 단위 투여 형태당 약 0.1mg 이하 내지 약 1500mg 이상, 바람직하게는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5mg 내지 약 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000mg, 보다 바람직하게는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25mg 내지 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100mg의 양으로 포함할 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 상기 언급된 것들보다 낮거나 높은 투여량이 바람직할 수 있다. 적절한 농도 및 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 바람직한 구현예의 약제학적 조성물은 포유동물 알파 디펜신, 예를 들어, 인간 알파 디펜신을 포함한다. 다른 구현예에서, 바람직한 구현예의 약제학적 조성물은 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어, 인간 베타 디펜신을 포함한다. 추가의 구현예에서, 바람직한 구현예의 약제학적 조성물은 포유동물 알파 디펜신 및 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어, 인간 알파 디펜신 및 인간 베타 디펜신을 포함하고, 여기서 상기 알파 및 베타 디펜신은 몰 농도 기준 또는 mg/mL 기준으로 동일한 양으로 존재한다.
하나의 구현예에서, 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신은 1일 적어도 1회, 예를 들어, 1일 적어도 2회, 예를 들어, 1일 적어도 3회 또는 연속적으로 투여된다.
투여
하나의 구현예에서, 포유동물 디펜신은 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식을 받고 있는 환자 이전의 기간 동안 환자에게 투여된다. 이 경우, 디펜신의 투여는 이식 동안 계속될 수 있고, 이식이 완료된 후에 추가로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따르는 포유동물 디펜신은 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식을 받을 시점에 환자에게 투여된다. 예를 들어, 디펜신은 이식과 동등한 이식 일짜에 투여될 수 있다. 디펜신 투여는 이식 후 계속될 수 있다.
하나의 구현예에서, 포유동물 디펜신은 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식 후에 투여된다. 이 구현예에서, 디펜신의 투여는 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식이 완료되면 계속될 수 있다. 예를 들어, 디펜신은 이식과 동등한 이식 일짜에 투여될 수 있고, 이식 후 각 후속 일에 1회 이상 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료는 간격을 투고, 예를 들어, 매일, 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다, 5일 마다, 6일 마다 또는 7일 마다 투여에 의한 이식 후 계속된다. 실시예 13에 예시된 바와 같이, 치료는 이식 일에 개시할 수 있고, 이식 후 몇일 동안, 예를 들어, 이식 후 1일 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 동안 계속될 수 있다. 치료는 또한 이식 전에 시작될 수 있고, 이식 후 몇일 동안, 예를 들어, 이식 후 1일 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 동안 계속될 수 있다.
경구 또는 비경구 투여용 제형
포유동물 알파 디펜신 및 베타 디펜신은 임의의 통상적인 경로에 의한 투여용으로 제형화된 조성물에 치료적으로 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 투여는 경구, 구강, 설하, 직장, 질, 기관내, 폐내, 비강내, 두개내, 피하, 정맥내, 진피 또는 경피이다. 바람직하게는, 투여는 경구이다.
하나의 구현예에서, 개시된 방법에 따르는 적어도 하나의 포유동물 α-디펜신 및/또는 적어도 하나의 포유동물 β-디펜신의 투여는 경구이다.
하나의 구현예에서, 개시된 방법에 따르는 적어도 하나의 포유동물 β-디펜신의 투여는 일반적으로 비강내 또는 폐내이다.
비강내 및 폐내 투여는 폐 약물 전달에 일반적이다.
하나의 구현예에서, 개시된 방법에 따르는 적어도 하나의 포유동물 α-디펜신 및/또는 적어도 하나의 포유동물 β-디펜신의 투여는 피하 또는 정맥내이다.
일부 구현예 내에서, 바람직한 구현예의 조성물은 동결건조물로서 안정성을 제공하고 재수화로 이어지는 적합한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다. 포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어, 인간 알파 디펜신 및/또는 인간 베타 디펜신을 함유하는 약제학적 조성물은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어, 혼합, 과립화, 코팅, 용해 또는 동결건조 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신을 함유하는 약제학적 조성물은 멸균 및 등장성 용액으로서 제형화된다.
약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제는 당업자에게 친숙하다. 액체 용액으로서 제형화된 조성물의 경우, 허용가능한 담체 및/또는 희석제는 염수를 포함하고, 멸균수가 포함되어야 하며, 상기 조성물은 항산화제, 완충제, 정균제 및 기타 통상의 첨가제를 임의로 포함할 수 있다.
개시된 화합물은 경구 투여를 위한 매우 다양한 제형으로 제형화될 수 있다. 고체 형태 제제는 분말, 정제, 점적제, 캡슐제, 카세제, 로젠지제 및 분산성 과립제를 포함할 수 있다. 경구 투여용으로 적합한 다른 형태는 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 수용액, 수성 현탁액, 치약, 겔 치약, 츄잉검을 포함하는 액체 형태 제제, 또는 용액, 현탁액 및 에멀젼과 같은 액체 형태 제제로 사용 직전에 전환되도록 의도되는 고체 형태 제제를 포함할 수 있다.
개시된 조성물은 구강, 설하, 경구, 직장, 질, 진피, 경피, 두개내, 피하 또는 정맥내 투여를 위한 매우 다양한 제형으로 제형화될 수 있다. 제형은 (포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신 및 다른 임의의 활성 성분 이외에)담체, 충전제, 붕해제, 유동 조정제, 당 및 감미제, 방향제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 가용화제, 삼투압을 조절하기 위한 염, 완충제, 희석제, 분산제 및 표면활성제, 결합제, 윤활제 및/또는 당업계에 공지된 다른 약제학적 부형제를 함유할 수 있다. 당업자는 포유동물 알파 디펜신, 포유동물 베타 디펜신을 적절한 방식으로, 그리고 문헌[참조: Remington's pharmaceutical Sciences, Gennaro(1990)]에 기재된 것들과 같은 허용되는 관행에 따라 추가로 제형화할 수 있다.
포유동물 알파 디펜신 또는 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어, 인간 알파 디펜신 또는 인간 베타 디펜신은 단독으로 또는 1, 2 또는 그 이상의 다른 약제학적 화합물 또는 약물 물질, 예를 들어, 프리바이오틱스, 프로바이오틱스, 글루코코르티코이드, 사이클로스포린, 항 TNF-α, 인테그린, 항생제, 면역억제제 또는 이들의 조합 및/또는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(들)와 함께 병용 요법으로 사용될 수 있다.
기도 투여
기도 투여가 본 발명의 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 폐내 투여란 폐로의 국소 투여를 의미한다. 본원에 사용되는 경우, 용어 "기관내, 기관지내 또는 폐포내 투여"는 이러한 투여의 모든 형태를 포함하고, 이에 의해 디펜신은, 디펜신 용액의 점적 주입에 의해서든지, 디펜신을 분말 형태로 적용하든지, 부가된 안정화제 또는 기타 부형제의 존재 또는 부재하에, 에어로졸화 또는 분무화 용액 또는 현탁액 또는 흡입 분말 또는 겔로서 디펜신의 흡입에 의해 디펜신을 기도의 관련 부분에 도달하게 함으로써 기관, 기관지 또는 폐포에 각각 적용된다.
기관지내/폐포 투여 방법은 부형제의 존재 또는 부재하에, 건조 형태로 디펜신을 함유하는 흡입 분말의 사용 또는 기관지내시경 검사 동안 용액 또는 현탁액 또는 분말 형태로 디펜신의 직접 적용을 포함하여, 세정액으로서, 디펜신이 용해되어 있는 생리학적으로 허용되는 조성물을 사용하거나 실제로 임의의 다른 유효한 형태의 기관지내 투여에 의해 당업자에게 익히 공지된 방법에 따르는 기관지폐포 세정(BAL)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 기관내 투여 방법은 용해된 디펜신의 유사한 용액 또는 디펜신 현탁액을 사용한 블라인드 기관 세척, 또는 이러한 목적에 적절한 임의의 분무 장치의 사용으로 수득된 용해된 디펜신 또는 디펜신 현탁액을 함유하는 분무된 유체 액적의 흡입을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 기관내, 기관지내 또는 폐포내 투여는 생성물의 흡입을 포함하지 않지만, 디펜신의 용액 또는 디펜신을 함유하는 분말 또는 겔의 기관 또는 하부 기도로의 점적 주입 또는 적용을 포함한다.
다른 바람직한 투여 방법은 하기 장치를 사용함을 포함할 수 있다:
1. 압축 공기/산소 혼합물을 사용하는 가압 네불라이저(nebulizer)
2. 초음파 네불라이저
3. 전자 마이크로펌프 네불라이저
4. 정량 흡입기(MDI)
5. 건조 분말 흡입기 시스템(DPI).
에어로졸은 기계적 환기 동안 삽관된 환자에서 a) 페이스마스크를 통해 또는 b) 기관내 관을 통해 전달될 수 있다(장치 1, 2 및 3). 장치 4 및 5는 또한 환자가 에어로졸 장치를 자체 활성화할 수 있는 한 도움 없이 환자에 의해 사용될 수 있다.
디펜신 및/또는 디펜신의 기능적 상동체 또는 변이체를 포함하는 용액의 바람직한 농도는 용액 ml당 약 0.1㎍ 내지 1000㎍의 범위, 예를 들어, 용액 ml당 약 0.1㎍ 내지 250㎍의 범위이다.
폐내 투여용 약제학적 조성물
본 개시에 사용하기 위한 약제학적 조성물 또는 제형은 디펜신을 약제학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체 또는 희석제와 조합하여, 바람직하게는 그 중에 용해되거나, 페길화된 제제로서 또는 흡입을 통한 에어로졸로서 투여되는 리포좀 또는 나노입자 제제로서, 또는 기관지폐포 세정 또는 블라인드 기관내 세척 또는 세정으로 기관지내시경을 통해 투여되는 세정액으로서 하부 기도에 운반된 디펜신을 포함한다. 0.9% 염수, 완충 염수, 생리학적으로 적합한 완충제 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 수성 담체가 사용될 수 있다. 조성물은 당업자에게 익히 공지된 종래의 기술에 의해 멸균될 수 있다. 생성되는 수용액은 사용을 위해 팩키징하거나, 멸균 조건하에서 여과하여 동결건조시킬 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액에 용해시킨다.
하나의 구현예에서, 동결-건조된 디펜신 제제는, 예를 들어, 단일 투여 단위로 사전-팩키징될 수 있다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 단일 투여 단위는 환자에 맞게 조정된다.
조성물은, 제한 없이, pH 조정제 및 완충제 및/또는, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 등과 같은 등장성 조정제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 보조 물질 또는 보조제를 함유할 수 있다.
제형은 미소구체, 리포좀, 마이크로캡슐, 나노입자 등을 포함하는 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 함유할 수 있다. 종래의 리포좀은 전형적으로 인지질(중성 또는 음으로 하전됨) 및/또는 콜레스테롤로 구성된다. 리포좀은 수성 구획을 둘러싸는 지질 이중층에 기초하는 소포 구조이다. 그들은 물리화학적 특성, 예를 들어, 인지질 이중층의 크기, 지질 조성, 표면 전하 및 수 및 유동성이 달라질 수 있다. 리포좀 형성용으로 가장 빈번히 사용되는 지질은 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트(일나트륨 염)(DMPA), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트(일나트륨 염)(DPPA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(일나트륨 염)(DOPA), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](나트륨 염)(DMPG), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](나트륨 염)(DPPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](나트륨 염)(DOPG), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](나트륨 염)(DMPS), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린)(나트륨 염)(DPPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](나트륨 염)(DOPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(글루타릴)(나트륨 염) 및 1,1',2,2'-테트라미리스토일 카디올리핀(암모늄 염)이다. 기타 지질 또는 리포좀의 개질제와 함께, 예를 들어, 콜레스테롤 및/또는 포스파티딜콜린과 함께 DPPC로 구성된 제형이 바람직하다.
장기-순환 리포좀은 혈관 벽의 투과성이 증가되는 신체 부위에서 관외로 일출시키 능력을 특징으로 한다. 장기-순환 리포좀을 생성하는 가장 일반적 방법은 친수성 중합체 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 리포좀의 외부 표면에 공유 결합시키는 것이다. 일부 바람직한 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄 염), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-5000](암모늄 염), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(염화물 염)(DOTAP)이다.
리포좀에 적용가능한 가능한 지질은 아반티, 폴라 리피드 인코포레이티드(Avanti, Polar Lipids, Inc, Alabaster, AL)에 의해 공급된다. 추가로, 리포좀 현탁액은 저장시 유리-라디칼 및 지질-과산화성 손상으로부터 지질을 보호하는 지질-보호제를 포함할 수 있다. 친유성 유리-라디칼 퀀쳐(quencher), 예를 들어, 알파-토코페롤 및 수용성 철-특이적 킬레이트제, 예를 들어, 페리옥시아닌이 바람직하다.
예를 들어, 문헌[참조: Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호 및 제4,837,028호, 모두 본원에서 참조로 도입된다]에 기재된 바와 같은 다양한 방법이 리포좀의 제조에 이용가능하다. 또 다른 방법은 불균일한 크기의 다층 소포를 생성한다. 이 방법에서, 소포-형성 지질은 적합한 유기 용매 또는 용매 시스템에 용해되고, 진공 또는 불활성 기체하에 건조되어 얇은 지질 필름을 형성한다. 필요에 따라, 필름은 적합한 용매, 예를 들어, 3급 부탄올에 재용해시킨 다음, 동결건조시켜 보다 용이하게 수화된 분말-유사 형태인 보다 균질한 지질 혼합물을 형성할 수 있다. 이 필름은 표적화 약물 및 표적화 구성 요소의 수용액으로 피복되고, 전형적으로 진탕시키면서 15 내지 60분에 걸쳐 수화되도록 한다. 생성되는 다중층 소포의 크기 분포는 보다 격렬한 진탕 조건하에 지질을 수화시킴으로써 또는 데옥시콜레이트와 같은 가용화 세제를 첨가함으로써 더 작은 크기로 이동될 수 있다.
미셀은 수용액 중의 계면활성제(소수성 부분 및 하나 이상의 이온성 또는 달리 강력한 친수성 기를 함유하는 분자)에 의해 형성된다.
당업자에게 익히 공지된 일반적인 계면활성제는 본 발명의 미셀에 사용될 수 있다. 적합한 계면활성제는 나트륨 라우레에이트, 나트륨 올레에이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 옥타옥시에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 옥톡시놀 9 및 PLURONIC F-127(Wyandotte Chemicals Corp.)을 포함한다. 바람직한 계면활성제는 TWEEN-80, PLURONIC F-68, n-옥틸-베타-D-글루코피라노사이드 등과 같은 IV 주사에 적합한 비이온성 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌 세제이다. 또한, 인지질, 예를 들어, 리포좀의 생산에 사용하기 위해 기재된 것들이 또한 미셀 형성에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1.
예방적, 뮤린, 10일, 경구 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 모델에서 hBD2의 s.c. 및 i.v. 투여 대 복강내 마우스 항 TNF-α의 항염증 효과
치료 섭생:
도 1은 연구 설계를 예시한다.
케이지당 5개의 군으로 수용된 70마리의 수컷 C57BL/6 마우스를 7개의 상이한 처리군에 할당하였다. 모든 동물은 대장염을 유도하여 결장 조직의 상당한 염증 및 손상을 유도하기 위해 7일 동안 DSS 2%가 보충된 음용수를 복용했다. 동물을 10일 동안 마우스 항 TNF-α 복강내 또는 비히클로서 PBS와 함께 꼬리 정맥에 정맥내로 또는 등 피부 아래 피하로 투여된 hBD2로 처리하였다.
시험:
질환 활동 지수(DAI) 스코어링 시스템을 임상 평가를 위해 적용하였다(도 7). 동물은 10일째에 희생시키고, 조직학적 스코어링 시스템을 사용하여 조직학적 평가를 위해 결장을 제거했다(도 8).
결과:
hBD2가 1일 1회 또는 2회 피하 경로를 통해 투여될 때 가장 중요한 효과가 수득되었지만, hBD2의 정맥내 투여는 또한 DAI의 상당한 감소를 초래하였다. 항 TNFα 및 hBD2는 모두 DAI에 대해 유사하며 통계적으로 유의한 효과를 나타내었다. hBD2는 특히 1일 2회 s.c. 투여될 때 조직학 스코어에 대해 매우 통계적 유의한 효과를 나타낸 반면, 항 TNF-α는 이 스코어에 대해 유의한 효과를 나타내지 않았다(도 9).
급성 GVHD는 움 세포 괴사(crypt cell necrosis) 및 심한 경우 장 전반에 걸쳐 상피의 전체 손실을 특징으로 한다. 따라서, 상피의 손실을 야기하는 화학적으로 유도된 뮤린 DSS 모델은 GVHD에서 화합물의 예방 효과를 시험하는 것과 관련이 있는 것으로 보인다. 실시예 1의 결과는, 특히 hBD2의 s.c. 투여가 항 TNF-α 치료로서 효과적이다는 것을 입증한다. 일부 공보는 GVHD에서 항-TNF-α의 긍정적인 효과를 보고했다.
실시예 2.
예방적 뮤린, 10일, 경구 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 모델에서 hBD2의 경구 투여 대 경구 프레드니솔론의 항염증 효과
치료 섭생:
케이지당 5개의 군으로 수용된 50마리의 수컷 C57BL/6 마우스를 5개의 상이한 처리군에 할당하였다. 모든 동물은 대장염을 유도하여 결장 조직의 상당한 염증 및 손상을 유도하기 위해 7일 동안 DSS 2%가 보충된 음용수를 복용했다. 동물을 10일 동안 1일 2회 3개의 상이한 투여량 수준으로 투여된 경구 hBD2 또는 1일 2회 프레드니솔론 1mg/kg 또는 비히클로서 PBS로 처리하였다
시험:
질환 활동 지수(DAI) 스코어링 시스템을 임상 평가를 위해 적용하였다(도 7). 동물을 10일째에 희생시키고, 조직학적 스코어링 시스템을 사용하여 조직학적 평가를 위해 결장을 제거했다(도 8).
결과:
이들 동물이 더 많이 섭취하였고 더 양호한 건강 상태를 경험하였음을 나타내는 급격히 감소된 체중 손실은 3개의 hBD2 투여량 수준 모두에 대해 관찰되었지만, 5mg/kg BID를 복용한 높은 투여량 군에서 가장 뚜렷했다(도 10). hBD2의 2개의 더 낮은 투여량 수준은 프레드니솔론과 동등한 DAI에 대한 통계적으로 유의한 효과를 갖는 반면, 높은 투여량 hBD2(5mg/kg BID)는 이들보다 DAI에 대해 상당히 더 우수한 효과를 가졌다(도 11). 프레드니솔론 및 hBD2는 모두 조직학적 스코어에 대해 통계적으로 유의한 효과를 나타내었지만, 3개의 hBD2 투여량 군 모두의 효과는 프레드니솔론보다 상당히 더 우수하였다(도 12).
급성 GVHD는 움 세포 괴사 및 심한 경우 장 전반에 걸쳐 상피의 전체 손실을 특징으로 한다. 따라서, 상피의 손실을 야기하는 화학적으로 유도된 뮤린 DSS 모델은 GVHD에서 화합물의 예방 효과를 시험하는 것과 관련이 있는 것으로 보인다. 실시예 2의 결과는, 경구 hBD2 투여가 경구 프레드니솔론에 의한 표준 GVHD 예방 치료만큼 효과적임을 입증한다.
실시예 3.
예방적 뮤린, 8일 트리니트로벤젠 설폰산 유도 대장염 모델에서 hBD2의 s.c. 투여 대 s.c. 프레드니솔론의 항염증 효과
치료 섭생:
케이지당 5개의 군으로 수용된 105마리의 수컷 BALB/cByJ 마우스를 7개의 상이한 처리군에 할당하였다. 대장염은 가벼운 마취하에 0일째에 트리니트로벤젠 설폰산의 결장내 투여로 유도되어 결장 조직의 상당한 염증 및 손상을 초래했다. 동물을 1일 1회 4개의 상이한 투여 수준(1mg/kg, 0.3mg/kg, 0.1mg/kg, 및 0.03mg/kg)의 hBD2 또는 등 피부하에 피하 투여된 프레드니솔론 10mg/kg 1일 1회 또는 비히클로서 PBS로 7일 동안 처리하였다.
시험:
질환 활동 지수(DAI) 스코어링 시스템을 임상 평가를 위해 적용하였다(도 7). 동물을 10일째에 희생시키고, 조직학적 스코어링 시스템을 사용하여 조직학적 평가를 위해 결장을 제거했다(도 8).
결과:
이들 동물이 더 섭취하였고 더 양호한 건강 상태를 경험하였음을 나타내는 매우 통계적으로 유의한 체중 증가가 2개의 최저(0.03 및 0.1mg/kg OD) hBD2 투여량 수준에 대해 관찰되었다. 프레드니솔론 및 hBD2 모두(0.1, 0.3 및 1mg/kg)는 조직학적 스코어에 대해 매우 통계적으로 유의한 임상 효과를 나타내었다(도 13).
급성 GVHD는 움 세포 괴사 및 심한 경우 장 전반에 걸쳐 상피의 전체 손실을 특징으로 한다. 따라서, 상피의 심각한 손실을 야기하는 화학적으로 유도된 뮤린 TNBS 모델은 따라서 GVHD에서 화합물의 예방 효과를 시험하는 것과 관련이 있는 것으로 보인다. 실시예 3의 결과는, hBD2의 s.c. 투여가 프레드니솔론에 의한 표준 예방 치료만큼 효과적임을 입증한다.
실시예 4.
예방적, 뮤린, 7일 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 모델에서 hBD2의 경구 및 s.c. 투여 대 경구 사이클로스포린의 항염증 효과
치료 섭생:
케이지당 5개의 군으로 수용된 80마리의 수컷 C57BL/6 마우스를 7개의 상이한 처리군에 할당하였다. 모든 동물은 7일 동안 DSS 3%가 보충된 음용수를 복용하여 상피 손상, 움 구조의 파괴 및 점막 및 점막하에서 단핵구 및 호중구의 축적을 특징으로 하는 중등도 염증을 특징으로 하는 대장염을 유도하였다. 동물을 0.6mg/kg BID 또는 0.4mg/kg TID로 투여된 경구 hBD2; 0.15mg/kg BID 또는 0.1mg/kg TID로 s.c. 투여된 hBD2; 또는 사이클로스포린 50mg/kg OD 또는 물로 7일 동안 처리하였다.
시험:
스코어링 시스템(0 = 대변에 혈액 없음; 1 = 대변 내의 혈액의 증거 및 2 = 심각한 출혈)에 따라 임상 평가를 수행하였다. 동물을 7일째에 희생시키고, 조직학적 평가를 위해 결장을 제거하였다.
결과:
결장 길이(도 14)및 임상 스코어(도 15)의 유지에서 매우 통계적으로 유의한 개선이 4개의 hBD2 투여군 모두 및 사이클로스포린에 대해 관찰되었다. hBD2의 TID 투여는 두 투여 경로에 의한 BID 투여보다 더 효과적이었고, s.c. 투여는 경구 투여보다 더 효과적인 것으로 보였다(도 15).
급성 GVHD는 움 세포 괴사 및 심한 경우 장 전반에 걸쳐 상피의 전체 손실을 특징으로 한다. 따라서, 상피의 심각한 손실을 야기하는 화학적으로 유도된 뮤린 DSS 모델은 따라서 GVHD에서 화합물의 예방 효과를 시험하는 것과 관련이 있는 것으로 보인다. 실시예 4의 결과는, s.c. 및 경구 hBD2 투여 모두가 사이클로스포린에 의한 표준 GVDH 예방 치료만큼 임상 평가에 특히 효과적임을 입증한다.
실시예 5.
치료적, 뮤린, 14일, 덱스트란 나트륨 설페이트 유도 대장염 모델에서 hBD2의 s.c. 투여 대 복강내 항 TNF-α 및 복강내 덱사메타손의 항염증 효과
치료 섭생:
케이지당 5개의 군으로 수용된 70마리의 수컷 C57BL/6 마우스를 7개의 상이한 처리군에 할당하였다. 모든 동물은 대장염을 유도하여 결장 조직의 상당한 염증 및 손상을 유도하기 위해 14일 동안 DSS 2%가 보충된 음용수를 복용했다. 동물을 8일째로부터 14일째까지 hBD2, 0.1mg/kg s.c. BID;0.1mg/kg s.c. OD 또는 1.2mg/kg i.v. OD 또는 8일, 10일 및 13일째에 마우스 항 TNFα 250㎍/마우스 복강내로, 또는 덱사메타손 1mg/kg 복강내 OD 또는 비히클로서 PBS s.c.로 처리하였다.
시험:
질환 활동 지수(DAI) 스코어링 시스템을 임상 평가를 위해 적용하였다(도 7). 동물을 14일째에 희생시키고, 조직학적 스코어링 시스템을 사용하여 조직학적 평가를 위해 결장을 제거했다(도 8).
결과:
DAI에 대한 통계적으로 유의한 효과가 hBD2 0.1mg s.c. OD 및 덱사메타손 1mg/kg i.d. OD에 대해 관찰되었다. 유사하게, 조직학적 스코어(도 16)에 대한 통계적으로 유의한 효과가 hBD2 0.1mg/kg s.c. OD 및 덱사메타손 모두에 대해 관찰되었다.
급성 GVHD는 움 세포 괴사 및 심한 경우 장 전반에 걸쳐 상피의 전체 손실을 특징으로 한다. 따라서, 상피의 심각한 손실을 야기하는 화학적으로 유도된 뮤린 DSS 모델은 따라서 GVHD에서 화합물의 치료 효과를 시험하는 것과 관련이 있는 것으로 보인다. 실시예 5의 결과는, hBD2의 경구 투여가 덱사메타손에 의한 GVDH의 표준 치료만큼 효과적임을 입증한다.
실시예 6.
치료적, 뮤린, 14주, CD4 + CD25 + T 세포 전달 유도된 대장염 모델에서 hBD2의 s.c. 투여 대 s.c. 항 TNF-α(Enbrel) 및 복강내 덱사메타손의 효능
치료 섭생:
케이지당 5개의 군으로 수용된 70마리의 암컷 BALB/c 마우스를 7개의 상이한 처리군에 할당하였다. 대장염은 BALB/c 마우스로부터의 CD4 + CD25 + T 세포의 이식에 의해 SCID 마우스에서 유도하였다. BALB/c 마우스의 비장 및 림프절로부터 단리된 림프구를 CD4 + T 세포의 음성 선별에 적용하였다. 그 후, CD4 + CD25+ 세포를 CD4 + T 세포 현탁액으로부터의 비드에 결합시킴으로써 긍정적으로 단리시키고, CD4 + CD25-를 상청액으로부터 수집하였다. 동물을 hBD2, 0.1mg/kg s.c. OD; 1mg/kg s.c. OD 또는 3mg/kg s.c. OD로 또는 주당 2회 마우스 항 TNFα 100 ㎍/마우스 s.c.로 또는 덱사메타손 0.3mg/kg 복강내 OD 또는 비히클로서 PBS s.c.로 7일째로부터 86일 연속으로 처리하였다.
시험:
임상 평가는 체중 손실, 대변 점조도 및 직장당 혈액의 존재에 기초하였다. 동물은 95일째에 희생시키고, 중량 및 미엘로퍼옥시다제 활성의 평가를 위해 결장을 제거했다.
결과:
임상 스코어에 대한 통계적으로 유의하고 유사한 효과가 hBD2 1mg/kg s.c. OD, 덱사메타손 0.3mg/kg i.p. OD 및 Enbrel(도 17)에 대해 관찰되었다. 유사하게 이들 3개의 투여 섭생은 결장 중량(도 18) 및 미엘로퍼옥시다제 활성(도 19)에 대해 통계적으로 유의하고 유사한 효과를 나타내었다.
급성 GVHD는 움 세포 괴사, 심한 경우에는 장 전반에 걸쳐 상피의 전체 손실을 특징으로 하는 T-세포 매개 증후군인 것으로 여겨지며, 특히 CD4 + CD25 + T reg 세포는 급성 GVHD의 병인의 일부로서 많은 관심을 받고 있다(참조: Ball & Egeler, 2008). 따라서, 상피의 심각한 손실을 유발하는 뮤린 CD4 + CD25 + T 세포 전달 모델은 심각하고 지속적인 GVHD에서 화합물의 치료 효과를 시험하는 것과 관련이 있는 것으로 보인다.
미엘로퍼옥시다제는 염증의 개시 및 진행에 중요한 역할을 하고, 산화적 스트레스 및 염증의 바이오마커이고 최근에 GVHD의 잠재적 바이오마커로서 보고되고 있는 인간 효소이다(참조: Ge and Ye, 2013). 실시예 6의 결과는, hBD2 투여가 덱사메타손에 의한 GVHD의 표준 항염증 치료로서 효과적이지만, 또한 항 TNF-α에 의한 덜 확립된 치료라는 것을 입증한다.
실시예 7.
디펜신에 의한 예방적 치료에 의한 장 미생물군의 보호 및 보존.
마우스: 마우스는 군당 4개의 케이지로 트리오로 수용되었다. 음식 섭취량은 오후 6시에 조명이 꺼지기 직전에 매일 등록했다. 개별 마우스를, 군 및 케이지 모두에서 변경된 순서로 실험 절차를 수행했다. 마우스를 SPF 표준 조건에서 12시간 명/암 사이클하에 실온에서 유지시켰다.
식이: 투여를 위해, 평균 중량은 마우스당 25g인 것으로 추정되었다. 마우스는 1일 마우스당 대략 3g의 음식를 먹었다.
치료 섭생: 마우스는 고지방 식이(HFD) 또는 저지방(LF) 대조군 식이를 공급했다. HFD는 다음 4개의 하위군을 함유했다: 1개의 hBD2, 1개의 HD5, 1개의 hBD2/HD5 및 디펜신을 보충하지 않은 1개의 표준 HFD(도 3). 디펜신 농도는 1일당 마우스 1kg당 1.2mg hBD2였다. HD5는 hBD2와 등몰 농도로 제공되었다. 조합 군은 50% hBD2 + 50% HD5를 제공했고, 따라서 디펜신의 총량은 나머지 시험 군과 동등하다.
시험:
장의 미생물군을 연구하기 위해 미생물 분석을 수행했다. 종방향 16S 특성화는 60마리 마우스로부터의 4쌍의 샘플, 총 240 샘플에 대해 수행했다. 각 마우스는 식이 교환 전, 식이 교환 1주일 후, 식이 교환 4주 후 및 종료시에 샘플링하고, 따라서 디펜신 치료의 결과로서 대변 미생물군의 완전한 특성화를 보장했다.
결과
중량 변화. 음식 섭취량은 세 가지 실험 식이 군 모두에서 유사했지만, 두 고지방 식이(HFD) 군은 10주간의 연구 기간 동안 저지방 식이(LFD) 참조군보다 유의하게 더 많은 중량을 획득했다(*p<0.0001, 2원 ANOVA, Tukey Post Test). 그러나, HFD + hBD2 군은 HFD 참조군보다 유의하게 적은 중량을 획득했다(*p = 0.0028).
미생물군. hBD2는 주로 미생물의 존재에 영향을 미쳤지만, HD5 및 hBD2+HD5는 주로 미생물 존재량에 영향을 미쳤다(도 20). 알로바쿨룸의 존재량의 통계적으로 유의한 증가는 HD5에 의한 예방 후의 소장에서 관찰되었다(p<0.02; 도 21). 알로바쿨룸은 단쇄 지방산 생산 종이다. 단쇄 지방산은 GPCR43을 통해 매개된 결장 Treg 세포 항상성을 조절하는데 중요한 역할을 한다. T 세포 형성 부전 및 교란된 T 세포 항상성은 급성 및 만성 GVHD의 중심 부분이다. 도 22는 상이한 처리군에서 종의 상대적 존재량을 나타내고 장 식물상에 대한 hBD2 및 HD5의 효과를 예시하는 속 분석이다. 결장에서 바네시엘라의 존재량의 통계적으로 유의한 증가는 hBD2에 의한 예방적 치료 후에 관찰되었다(p<0.03; 도 24). 바네시엘라는 입원 환자에서 관찰될 수 있는 항생물질 내성 병원성 박테리아의 장내 우세를 제거하고 보호할 수 있는 박테리아이다. 바네시엘라의 존재량은 몇몇 면역조절 세포의 양에 상응한다. 결장에서 바네시엘라의 수준이 높을수록, 비장 및 간에서 열거된 한계 영역 B 세포 및 불변 자연 살해 T 세포가 증가한다. IL-10-/- 마우스에서 대장염의 발달에서, 바네시엘라 표현형의 보다 높은 수준은 질환의 보다 낮은 활성 수준과 관련이 있었다. 락토바실라시에의 보다 낮은 존재량으로 향하는 경향은 hBD2에 의한 예방적 치료 후 결장에서 관찰되었다(p=0.1; 도 23). 마우스의 HFD 군은 광범위한 지방증(간세포내 지방 축적)을 발생시키는 반면, hBD-2로 예방적으로 처리된 마우스의 HFD 군은 최소 지방증을 발생시켰다(도 60).
미생물군은 특히 줄기 세포 이식 직후에 수행된 극적인 박테리아 오염 제거 후 GVHD의 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 특히, 미생물군은 특히 줄기 세포 이식 직전에 수행된 극적인 박테리아 오염 제거 후 GVHD의 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 이 실시예 7은, 디펜신이 존재하는 종의 수 및 전체 박테리아 수의 측면에서 미생물군 구성에 심오한 영향을 미치고, 따라서 건강한 미생물군을 보호하고 보존하는 것으로 보인다는 것을 입증한다. 보다 구체적으로, 디펜신은 결장 Treg 세포 항상성에서 중요한 역할을 하는 단쇄 지방산 생산 박테리아, SCFA를 촉진하는 것으로 보인다. 또한, 디펜신은 간 염증 및 지방증으로부터 보호하는 것으로 보인다.
실시예 8. 디펜신을 사용하는 개입 치료에 의한 장내 불균형의 치료
마우스 및 식이. 실험은 식이-유도된 비만 마우스에서 미생물군에 대한 hBD2 및 HD5의 효과를 설명한다. 마우스에게 고도의 HFD(지방으로부터 60% 에너지)를 제공한 13주간의 도입기(run-in period)가 개입을 선행했다. 도입기 동안 최소 12g의 중량 증가(초기 체중의 대략 50%)의 기준을 충족시키는 마우스만을 최종 분석에 포함시켰다. 이러한 기준을 충족시키지 못한 마우스는 계층 "키퍼"로서 그들 각각의 케이지에 체류시켰다. 그들은 모든 실험적 시험에 노출되었지만, 분석으로부터 제외되었다.
치료 섭생. 개입 전에, 모든 마우스는 MR 스캔했다. 마우스의 케이지를 이들의 체지방량에 기초하여 실험군으로 할당했다. 모든 후속 조치는 개입 전의 동일한 마우스로부터의 데이터와 쌍을 형성했다. LFD(저지방 식이) 참조군은 동시에 실행하였다. 개입의 대조군으로서, 2개의 추가 군을 포함시켰다: 1개의 고도의 HFD 및 1개의 LFD. 실험 마우스는 개입 동안 고도의 HFD에 유지시켰다(도 3). 마우스는 10주 동안 실험 식이를 제공했다. 그들은 실험 전반에 걸쳐 케이지당 4마리, 군당 3개 케이지로 공동 수용되었다. 모든 시험은 3일에 걸쳐 1일당 군당 1개 케이지로 실행했다.
시험. 장의 미생물군을 연구하기 위해 미생물 분석을 수행했다. 종방향 16S 특성화는 60마리 마우스로부터의 4쌍의 샘플, 총 240개 샘플에 대해 수행했다. 각 마우스는 식이 교환 전, 식이 교환 1주 후, 식이 교환 4주 후 및 종료시에 샘플링하여 디펜신 치료의 결과로서 대변 미생물군의 완전한 특성화를 보장했다.
결과
중량 변화- hBD2. 표준 고지방 식이(HFD) 공급군은 전체 연구 기간에 걸쳐 동일한 음식 섭취량을 가졌고, 처음 13주 동안 동일한 체지방량 및 제지방량과 함께 동일한 중량 발달을 가졌으며, 따라서 식이 개입 전에 동일한 출발점을 갖는다. 체중 증가는 저지방 식이 공급(LFD) 군(*p<0.05 2-원 ANOVA)에서보다 유의하게 더 컸다. 식이 개입 후, HFD 군은 계속 중량이 증가하였지만, HFD + hBD2 군은 식이 개입 후 처음 4주 동안 적은 중량을 획득하는 경향이 있지만, 유의적이지는 않다(*p = 0.07, 2-원 ANOVA). 4주차부터 연구 기간 말기까지 HFD + hBD2 군은 표준 HFD 군과 유사한 중량을 획득했다(*p = 0.82, 2-원 ANOVA).
중량 변화- HD5. 모든 HFD 공급군은 연구 기간 동안 동일한 음식 섭취량 및 13주의 도입기 동안 동일한 중량 증가를 가졌다. 식이 개입 후, HFD + HD5가 공급된 군은 HFD 대조군(*p<0.05, 2-원 ANOVA)보다 상당히 적은 중량을 획득했다. 또한, HFD + HD5 군에서 지방 비율을 감소시키는 경향이 관찰되었고, HFD + HD5 에서 상당히 더 낮은 지방 비율이 HFD 대조군과 비교하여 식이 변화 4주 후에 측정되었다(*p = 0.009, 2-원 ANOVA).
미생물군
두 디펜신은 박테리아 존재 뿐만 아니라 박테리아 부재에 대해 심오한 영향을 미치는 것으로 나타났다(도 25). HD5는 결장에서 통계적으로 유의하게 알로프레보텔라의 존재량을 증가시킨(p<0.02)(도 26) 반면에, hBD2는 알로프레보텔라 존재량에 영향을 미치지 않았다. hBD2는 소장 및 결장에서 모두 비피도박테리아세아에의 상대적 존재량을 극적이고 통계적으로 유의하게 증가시켰다(각각 p<0.0001 및 p<0.04; 도 27). 소장에서 비피도박테리아세아에의 존재량을 증가시키는 HD5에 대한 경향이 있었다(도 27). 미생물군은 특히 줄기 세포 이식 직후에 수행된 극적인 박테리아 오염 제거 후 GVHD에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 대변 이식체에 의한 실험적 치료는 현재 전세계의 여러 센터, 예를 들어, 독일 레젠스버그(Regensburg)의 Prof Holler로 진행되어 박테리아 오염 제거 후에 정상적인 미생물군을 재설치하려고 시도한다. 이 실시예 8은, 디펜신이 존재하는 종의 수 면에서 및 박테리아의 전체 수 면에서 미생물군 조성에 심오한 영향을 미치고, 따라서 장내 불균형 상태를 치료하고, 예를 들어, 결장 T reg 세포 항상성을 보존하는데 중요한 정상적인 미생물군을 재설치할 수 있는 것으로 보인다.
실시예 9.
알레르기성 천식의 뮤린 집 먼지 진드기 구동 모델에서 비강내(IN) 대 경구 디펜신에 의한 예방적 치료의 효능 결정 및 평가.
재료 및 방법
치료 섭생: 7 내지 10주령 암컷 BALB/c 마우스를 연구 시작 하루 전에 5개 연구 군에 무작위로 할당하고, 집 먼지 진드기(200μL 염수 중 100㎍ HDM + 0.9% 염수 중 프로인트 완전 보조제)로 피하(SC) 감작시켰다. 마우스를 12일째 아침에 시작하여 1.2mg/kg/일(0.4mg/kg TID)의 투여량으로 각각 hBD2 경구 및 비강내로 처리하고, 대략 6기간 간격으로 TID를 계속했다. 최종 투여량을 14일째 시험감염 1시간 전에 투여했다. 총 투여량의 수는 8회 투여량 또는 총 2mg/kg hBD2였다. 이어서, 마우스는 14일째에 HDM으로 비강내(IN) 시험감염시켰다(50μL 염수 중 HDM 25㎍)(도 4).
시험:
기도 염증: 시험감염 후 48시간에, 기관지 폐포 세정을 수행하여 3개 용적의 차가운 PBS(0.4; 0.3 및 0.3mL, 총 1mL)로 폐를 세척하였다. 전체 및 차등 백혈구 세포 수를 자동 혈액학적 분석기 Sysmex XT-2000iV 상에서 결정하였다.
폐 기능: HDM 시험감염 후 48시간에 시작하여 저항 및 폐 순응도 측정은 DSI의 Buxco Finepoint RC 시스템을 사용하여 마취되고 캐뉼라화된 마우스에 의해 메타콜린 시험감염(3.125 MCH1; 6.25 MCH2; 12.5 MCH3 및 25mg/mL MCH4) 후에 수행하였다. 데이터는 10mg/kg 메타콜린에서 기도 저항으로, 그리고 용량 반응 곡선으로 나타낸다.
사이토카인 분석을 위한 폐 샘플링: 모든 BAL의 완료 후, 폐를 흉곽으로부터 제거하고, 액체 질소에서 스냅 동결시키고, ELISA에 의해 폐 균질물에서 TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13 및 IL-33의 사이토카인 농도의 분석까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.
결과
염수-시험감염된(비-천식) 마우스와 비교하여 HDM-시험감염 비히클 처리된 동물에서 폐 저항 값의 증가 및 폐 순응도 값의 감소가 관찰되었다. 마우스(경구 및 비강내)의 두 비히클-처리된 군에서의 염증 반응은 HDM으로 감작화 후 14일에 단일 HDM 시험감염에 의해 유도되었다. 그것은 염수-시험감염 대조군과 비교할 때 BALF(p<0.05)에서의 전체 세포, 호산구, 호중구, 대식세포 및 림프구 수의 통계적으로 유의한 증가를 특징으로 하였다. 또한, 폐 조직 균질물에서 7개의 사이토카인 TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13 및 IL-33의 농도 분석은 염수-시험감염 대조군과 비교하여 HDM-시험감염 동물에서 유의하게 더 높은 수준을 나타냈다.
TID의 경구 및 비강내 적용 후, 12일 내지 14일(8회 투여에서 총 2.0mg/kg)에 투여된 hBD2는 HDM 시험감염 비히클 처리된 동물과 비교하여 기도 저항의 증가(도 28) 및 폐 순응도의 감소(도 29)를 효과적으로 억제하였다. 호중구 수를 상당히 억제하는 BALF에서의 세포 유입에 대한 효과가 경구 투여 후 관찰되었다(도 30). 폐 조직 균질물에서 사이토카인 농도의 완전한 정상화에 의한 면역계의 재균형이 경구 투여 후 TNF-α(도 31a), IL-4(31b), IL-5(31c), IL-6(31d), IL-9(31e) 및 IL-13(31f) 사이토카인 수준에서 관찰되었다. 비강내 투여된 hBD2에 이어서 TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 및 IL-13의 감소 경향이 있었지만, 이는 대조군과 통계적으로 유의하게 상이하지 않았다. 모든 수득된 결과는 알레르기성 천식의 집 먼지 진드기 구동 마우스 모델에서 hBD2의 명백한 예방 및 항염증 효과를 나타낸다.
폐는 장, 간 및 피부 다음으로 GVHD에 관여하는 제4 기관이다. 본 실시예는, 디펜신이 온전한 면역계를 보존할 수 있을 뿐만 아니라, 급성 GVHD의 특징인 모든 주요 GVHD 사이토카인, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 및 IL-13의 사이토카인 폭풍의 상승을 결정적으로 막을 수 있다는 것을 입증한다. 염증성 사이토카인 방출 또는 사이토카인 폭풍은 급성 GVHD의 발생 및 중증도의 1차 매개체로서 관련되어 있다(참조: Ball & Egeler, 2008).
실시예 10.
알레르기성 천식의 뮤린 집 먼지 진드기 모델에서 디펜신에 의한 IN 대 경구 치료적 개입의 효능 결정 및 평가.
재료 및 방법
치료 섭생: 7 내지 10주령 암컷 BALB/c 마우스를 연구 시작 하루 전에 7개 연구 군에 무작위로 할당하고, 집 먼지 진드기(200μL 염수 중 100㎍ HDM + 0.9% 염수 중 프로인트 완전 보조제)로 피하(SC) 감작시켰다. 이어서, 마우스를 14일째에 HDM으로 비강내(IN) 시험감염시켰다(50μL 염수 중 HDM 25㎍). 덱사메타손을 14일째에 경구 투여했다(1mg/kg BID; 50μL 인산염 완충 염수(PBS)). hBD2를 14일째에 IN 또는 경구 투여했다(1.7mg/kg TID IN; 0.4mg/kg TID IN; 0.4mg/kg TID 경구, 50μL 인산염 완충 염수). 초기 용량을 시험감염 60분 전에 투여하였고, 대략 6시간 간격으로 후속 투여량을 투여했다(도 5).
시험:
기도 염증: 시험감염 후 48시간에, 기관지 폐포 세정을 수행하여 3개 용적의 차가운 PBS(0.4; 0.3 및 0.3mL, 총 1mL)로 폐를 세척하였다. 전체 및 차등 백혈구 세포 수를 자동 혈액학적 분석기 Sysmex XT-2000iV 상에서 결정하였다.
폐 기능: HDM 시험감염 후 48시간에 시작하여, 폐 저항 및 폐 순응도의 측정은 DSI의 Buxco Finepoint RC 시스템을 사용하여 마취되고 캐뉼라화된 마우스에 의해 메타콜린 시험감염(3.125 MCH1; 6.25 MCH2; 12.5 MCH3 및 25mg/mL MCH4) 후에 수행하였다. 데이터는 10mg/kg 메타콜린에서 기도 저항으로, 그리고 용량 반응 곡선으로 나타낸다.
사이토카인 분석을 위한 폐 샘플링: 모든 BAL의 완료 후, 폐를 흉곽으로부터 제거하고, 액체 질소에서 스냅 동결시키고, ELISA에 의한 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFNγ의 사이토카인 농도의 분석까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.
결과
염수-시험감염(비-천식) 마우스와 비교하여 HDM-시험감염 비히클 처리된 동물에서 폐 저항 값의 증가 및 폐 순응도 값의 감소가 관찰되었다. 마우스(경구 및 비강내)의 두 비히클-처리된 군에서의 염증 반응은 HDM 및 보조제로 감작화 후 14일에 단일 HDM 시험감염에 의해 유도되었다. 그것은 염수-시험감염 대조군과 비교할 때 BALF(p<0.05)에서의 전체 세포, 호산구, 호중구, 대식세포 및 림프구 수의 통계적으로 유의한 증가를 특징으로 하였다. 또한, 폐 조직 균질물에서 5개의 사이토카인 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFNγ의 농도 분석은 염수-시험감염 대조군과 비교하여 HDM-시험감염 동물에서 유의하게 더 높은 수준을 나타냈다.
덱사메타손 치료는 BALF에서 총 세포 및 호산구 수를 유의하게 억제하였으나 호중구, 대식세포 및 림프구 수는 억제하지 못했다. 세포 데이터에 따르면, 덱사메타손은 HDM/비히클 대조군과 비교하여 폐 조직 균질물에서 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-γ의 수준에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 그것은 호산구 수와 관련된 AHR 측정에 영향을 미쳤다. 수득된 결과는 이 모델이 어느 정도 스테로이드 내성임을 나타낸다.
TID의 경구 및 비강내 적용 후 모두, 14일째에 hBD2는 HDM 시험감염 비히클 처리된 동물과 비교하여 기도 저항의 증가(도 32a 및 32b) 및 폐 순응도의 감소(도 33a 및 33b)를 효과적으로 억제하였다. BALF에서의 세포 유입과 같은 비강내 적용 후 일부 측정된 파라미터에 대해 보다 현저한 효과가 관찰되었으며, 여기서 두 IN 투여량(0.4mg/kg/일 TID 및 1.7mg/kg/일 TID)은 전체, 호중구 및 대식세포 세포수(도 34a, b 및 c) 및 호산구의 감소 경향을 상당히 억제하였지만, 스테로이드 표준 덱사메타손은 이들을 억제하지 못하였다. 폐 조직 균질물에서 IFN-γ(도 35), IL-4(도 37), IL-5(도 38), IL-6(도 39), IL-9(도 40)및 IL-10(도 41) 사이토카인 수준에 대한 유사한 유의한 효과가 양 투여 경로로 관찰되었다. 경구 투여된 hBD2는 TNF-α를 유의하게 감소시켰지만(도 36), 비강내 투여된 hBD2는 대조군과 상이하지만 유의적이지는 않았다. 모든 수득된 결과는 알레르기성 천식의 집 먼지 진드기/프로인트 완전 애쥬반트 구동 마우스 모델에서 hBD2의 명백한 항염증 효과를 나타낸다. 폐는 장, 간 및 피부 다음으로 GVHD에 관여하는 제4 기관이다. 이 실시예 10은 디펜신이 면역계를 재균형화할 수 있을 뿐만 아니라, 급성 GVHD의 특징인 주요 GVHD 사이토카인 IFN-γ, TNF-α 및 IL-6의 사이토카인 폭풍을 결정적으로 치료하거나 예방할 수 있다는 것을 보여준다. 사실, 염증성 사이토카인 방출 또는 사이토카인 폭풍은 급성 GVHD의 발생 및 중증도의 1차 매개체로서 관련되어 있다(참조: Ball & Egeler, 2008).
실시예 11
알레르기성 천식의 뮤린 집 먼지 진드기 모델에서 디펜신의 투여에 의한 IN 대 경구 치료적 개입의 효능 결정 및 평가.
재료 및 방법
치료 섭생: 연구 개시 1일 전에 4개의 연구 군에 무작위로 할당된 7 내지 10주령 암컷 BALB/c 마우스를 집 먼지 진드기(200μL 염수 중 100㎍ HDM + 0.9% 식염* 중 프로인트 완전 보조제)로 피하(SC) 감작시켰다. 마우스는 14일째에 HDM으로 비강내(In) 시험감염시켰다(50μL 염수 중 HDM 25㎍). hHBD2를 14일째에 IN 또는 경구(0.4mg/kg TID IN; 0.4mg/kg TID 경구, 50μL 인산염 완충 염수) 투여하였다. 초기 투여량을 시험감염 60분 전에 투여하였고, 대략 6시간 간격으로 후속 투여량을 투여하였다.
시험:
폐 조직 샘플링: 폐를 흉곽으로부터 제거하고, 액체 질소에서 스냅 냉동시키고, ELISA에 의해 폐 균질물에서 IL-4, IL-5, IL-8(KC), IL-9 및 IL-13의 사이토카인 농도의 분석까지 -80℃에서 냉동 저장하였다. 폐를 10% 완충된 포르말린 중에서 원위치로 팽창시키고, 흉곽으로부터 제거하고, 10% 완충된 포르말린에 개별적으로 위치시키고, 완전히 파라핀 매립시키고, 섹션화하고 H&E/PAS로 염색하였다.
혈액 샘플링: 모든 말단 혈액 샘플을 경정맥 출혈을 통해 수집하였다. 혈액을 Li-헤파린 튜브로 샘플링하고, 얼음 위에 놓고 즉시 4℃에서 원심분리하였다. 혈장을 분리하고, 잠재적인 SCFA 분석 때까지 -80℃에서 저장하였다.
폐 조직 샘플링: 폐는 흉곽을 부드럽게 개방하고 흉골과 갈비뼈 중 어느 한 측면을 절단하고 다시 트리밍함으로써 노출시키고 절단하였다. 군당 처음 6마리 동물로부터의 폐를 흉곽으로부터 제거하고, 액체 질소에서 스냅 냉동시키고, ELISA에 의한 사이토카인 농도의 분석 때까지 -80℃에서 냉동 저장하였다.
군당 다른 8마리의 동물로부터의 폐를 10% 완충된 포르말린으로 원위치로 팽창시키고, 흉곽으로부터 제거하고, 10% 완충된 포르말린에 개별적으로 위치시키고, 완전히 파라핀 매립시키고, 섹션화하고 H&E/PAS 염색하였다. 파라핀 블록은 IHC 분석을 위해 유지시켰다.
판독
· 조직병리학(H&E; PAS)(N = 8/군; 총 N = 32)
· 폐 조직 균질물 중 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-8(KC), IL-9 및 IL-13)(N = 6/군; 총 N = 24)
조직병리학
세포 유입(단핵구, 호산구, 호중구)을 다음과 같이 기관지 주위/기관지 및 혈관 주위 공간에 대해 개별적으로 H&E 염색된 슬라이드에 대해 반-정량적으로 평가하였다:
0 부재
1 분산된 염증성 세포가 거의 없음
2 더 큰 응집체
3 마킹된 세포의 축적
염증에 대한 전체 스코어는 모든 개별 스코어의 합으로 계산되었다.
큰 기도와 말단 기도의 수준에서 개별적으로 배상 세포 화생(Goblet cell metaplasia)을 PAS-염색된 슬라이드에서 다음과 같이 평가하였다:
0 기저막을 따라 세포를 함유하는 점액 없음
1 세포질의 75% 미만이 염색된 기저막을 따라 양성 세포가 거의 없음
2 세포질의 75% 이상이 염색된 기저막을 따라 양성 세포가 거의 없음
3 세포질의 75% 미만이 염색된 기저막을 따라 다수의 양성 세포
4 세포질의 75% 이상이 염색된 기저막을 따라 다수의 양성 세포
통계적 평가
데이터는 MS 엑셀(Excel)을 사용하여 처리되었다. 통계적 분석은 그래프패드 프리즘 소프트웨어(버전 5.04)를 사용하여 수행하였다. 군 사이의 차이는 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
선택된 조직학적 스코어-값 데이터의 통계적 분석은 중앙값 및 비모수 만-휘트니 테스트를 사용하여 수행되었다.
결과
마우스의 두 비히클-처리 군(경구 및 비강내)에서의 염증 반응은 HDM 및 애쥬반트로 감작화 후 14일에 단일 HDM 시험감염에 의해 유도되었다. 그것은 폐 조직 균질물에서 5개의 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-8, IL-9 및 IL-13의 농도의 통계적으로 유의한 증가 및 염수-시험감염 대조군과 비교하여 HDM-시험감염 동물에서 폐 조직의 심각한 조직학적 염증 변화를 특징으로 하였다.
TID의 경구 및 비강내 투여 후 모두, hBD2는 14일째에 HDM 시험감염 비히클 처리 동물과 비교하여 폐 조직의 조직학적 염증의 증가를 효과적으로 억제하였다(도 43, 44, 45). 경구 투여 후 폐 조직 균질물에서 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13 사이토카인 수준 및 IN 투여 후 IL-9 및 IL-13에 대해 유의한 효과가 관찰되었다. 모든 수득된 결과는 알레르기성 천식의 집 먼지 진드기/프로인트 완전 애쥬반트 구동 마우스 모델에서 hBD2의 명백한 항염증 효과를 나타낸다.
폐는 장, 간 및 피부 다음으로 GVHD에 관여하는 제4 기관이다. 이 실시예는, 디펜신이 면역계를 재균형화할 수 있을 뿐만 아니라, 급성 GVHD의 특징인 주요 GVHD 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-8, IL-9 및 IL-13의 사이토카인 폭풍을 결정적으로 치료 또는 예방할 수 있다는 것을 보여준다. 사실, 염증성 사이토카인 방출 또는 사이토카인 폭풍은 급성 GVHD의 발생 및 중증도의 1차 매개체로서 관련되어 있다(참조: Ball & Egeler, 2008).
실시예 12.
실시예 13.
줄기 세포 이식 후 급성 이식편 대 숙주 질환의 뮤린 모델에서 경구 hBD-2에 의한 예방적 치료의 효능 결정 및 평가.
재료 및 방법
치료 섭생: 12마리의 암컷 BALB/c 마우스를 0일째에 적어도 4시간 간격으로 4.5Gy(2 x 498초)로 조사하였다. 골수를 채취하였다: 뒷다리는 2마리의 암컷 WT C57BL/6 마우스로부터 무균으로 채취했다. 골격근(Skeletal muscle)을 제거하고 골단을 잘라 냈다. 뼈의 루멘을 PBS로 플러슁하고, 세포를 펠렛화하여 취하였다. T-세포의 채취: 2마리의 암컷 WT c57BL/6 마우스의 비장을 100μM 세포 여과기를 통해 PBS 충전된 접시로 메싱했다. 세포를 PBS에 용해시키고, 50mL 팔콘 튜브로 옮기고 스핀 다운시켰다. 세포를 PBS 1mL에 용해시키고, 4℃에서 20분 동안 배양을 위해 비장당 20μL의 CD4 마이크로비드 + 20μL의 CD8 마이크로비드를 첨가했다. 세포를 PBS로 세척하고, CD4+ 및 CD8+ 세포를 양성으로 선택하기 위해 MACS 분리에 적용하였다. 양성으로 선택된 T-세포를 계수하여 취하였다. 이식: 2차 조사 직후, 모든 WT BALB/c 수용체 마우스는 5 x 1.000.000 BM 세포(50μL)를 이소플루란 마취하에 후안와 정맥총으로 i.v. 주입했다. 15마리 BALB/c 마우스를 0 내지 10일째에 경구 위관 영양법을 통해 1일당 100μL PBS 중 1.2mg의 hBD2/kg BW/일로 처리하였다.
15 BALB/c 마우스는 0 내지 10일째에 경구 위관 영양법을 통해 1일당 비히클 100μL PBS를 복용했다.
시험:
마우스를 초기 7일 동안 매일 칭량하고, 생존을 100일 동안 모니터링하였다.
결과
비히클 군 중 모두 15마리 마우스는 35일째에 죽었지만, hBD2 처리된 마우스의 단지 4마리 또는 30% 미만이 35일째에 죽었고, 8마리는 100일째까지 여전히 살아있었다, p<0.0001(도 47). 소장, 결장 및 간의 조직학 스코어는 PBS와 비교하여 hBD2 처리된 군에 대해 모두 매우 통계적으로 더 낮았다(도 48). hBD2 처리된 마우스는 골수 이식 후 처음 7일 동안 통계적으로 유의하게 적은 중량을 손실하여 개선된 장 건강 및 장 완전성을 시사했다(도 49). hBD2에 의한 치료는 CD45 + 백혈구에 의한 침윤(도 50의 FACS 분석); 결장의 고유판에서 장 T 세포 및 골수 세포 침윤(도 51a 내지 c)을 감소시켰다. hBD2에 의한 예방적 치료는 또한 TNF-α 및 IL-6 농도의 감소 및 IL-10 농도의 증가를 나타내었다(도 52a 내지 c). hBD2 치료는 골수 세포로부터 IL-1β의 감소를 추가로 나타내었다(도 53a 내지 c의 비장의 FACS 분석). 비장의 FACS 분석은 또한 호중구 수의 감소(도 54a); 특히 TNF-α 및 IFN-γ의 Th1 사이토카인 생산의 감소를 나타내었다(도 54b 내지 f). 결장 샘플의 마이크로어레이 분석은 hBD2 처리 군 대 PBS에서 감소된 염증, 백혈구 및 골수 세포 이동 및 조직 리모델링을 나타냈다(도 55).
결론
이 실시예 13은, 줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 hBD2에 의한 예방적 치료가 사망률을 감소시키고 장기간 생존율을 극적으로 증가시킨다는 것을 입증한다.
실시예 14.
줄기 세포 이식 후 급성 이식편 대 숙주 질환의 뮤린 모델에서 경구 hBD2 대 사이클로스포린에 의한 예방적 치료의 효능 결정 및 평가.
재료 및 방법
치료 섭생: 20마리의 암컷 BALB/c 마우스를 0일째에 적어도 4시간 간격으로 4.5Gy(2 x 498초)로 조사하였다. 골수를 채취하였다: 뒷다리는 2마리의 암컷 WT C57BL/6 마우스로부터 무균으로 채취했다. 골격근을 제거하고 골단을 잘라 냈다. 뼈의 루멘을 PBS로 플러슁하고, 세포를 펠렛화하여 취하였다. T-세포의 채취: 2마리의 암컷 WT C57BL/6 마우스의 비장을 100μM 세포 여과기를 통해 PBS 충전된 접시로 메싱했다. 세포를 PBS에 용해시키고, 50mL 팔콘 튜브로 옮기고 스핀 다운시켰다. 세포를 PBS 1mL에 용해시키고, 4℃에서 20분 동안 배양을 위해 비장당 20μL의 CD4 마이크로비드 + 20μL의 CD8 마이크로비드를 첨가했다. 세포를 PBS로 세척하고, CD4+ 및 CD8+ 세포를 양성으로 선택하기 위해 MACS 분리에 적용하였다. 양성으로 선택된 T-세포를 계수하여 취하였다. 이식: 2차 조사 직후, 모든 WT BALB/c 수용체 마우스는 5 x 1.000.000 BM 세포(50μL)를 이소플루란 마취하에 후안와 정맥총으로 i.v. 주입했다. 20마리 BALB/c 마우스를 1.2mg의 hBD2/kg BW/일(n=7); 0일, 3일, 6일 및 9일째에 50mg 사이클로스포린/kg BW(n=7) 또는 0 내지 10일째에 경구 위관 영양법을 통해 1일당 100μL PBS(n=6)로 처리했다.
시험:
마우스를 연구 동안 규칙적인 간격으로 칭량하고, 생존을 90일 동안 모니터링하였다.
결과
PBS 처리된 마우스 중 한 마리를 제외하고 모두 90일까지 죽었지만, hBD2 처리된 동물 중 1마리만 90일까지 죽었고(p = 0.03, 도 56), 사이클로스포린 처리된 동물 중 3마리가 죽었다(p=0.16, 도 56). hBD2 및 사이클로스포린 처리된 마우스는 PBS 처리된 마우스와 비교하여 골수 이식 후 통계적으로 유의하게 적은 중량을 손실하여 개선된 장 건강 및 장 완전성을 시사했다(도 57).
결론
이 실시예 14는, 줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 hBD-2에 의한 예방적 치료가 사망률을 적어도 사이클로스포린에 의한 표준 항-GVHD 치료와 동등하게 감소시킨다는 것을 입증하는 역할을 한다.
실시예 15
줄기 세포 이식 후 급성 이식편 대 숙주 질환의 뮤린 모델에서 경구 HD5에 의한 예방적 치료의 효능 결정 및 평가.
재료 및 방법
치료 섭생: 22마리의 암컷 BALB/c 마우스를 0일째에 적어도 4시간 간격으로 4.5Gy(2 x 498초)로 조사하였다. 골수를 채취하였다: 뒷다리는 2마리의 암컷 WT C57BL/6 마우스로부터 무균으로 채취했다. 골격근을 제거하고 골단을 잘라 냈다. 뼈의 루멘을 PBS로 플러슁하고, 세포를 펠렛화하여 취하였다. T-세포의 채취: 2마리의 암컷 WT C57BL/6 마우스의 비장을 100μM 세포 여과기를 통해 PBS 충전된 접시로 메싱했다. 세포를 PBS에 용해시키고, 50mL 팔콘 튜브로 옮기고 스핀 다운시켰다. 세포를 PBS 1mL에 용해시키고, 4℃에서 20분 동안 배양을 위해 비장당 20μL의 CD4 마이크로비드 + 20μL의 CD8 마이크로비드를 첨가했다. 세포를 PBS로 세척하고, CD4+ 및 CD8+ 세포를 양성으로 선택하기 위해 MACS 분리에 적용하였다. 양성으로 선택된 T-세포를 계수하여 취하였다. 이식: 2차 조사 직후, 모든 WT BALB/c 수용체 마우스는 5 x 1.000.000 BM 세포(50μL)를 이소플루란 마취하에 후안와 정맥총으로 i.v. 주입했다. 22마리 BALB/c 마우스를 1.2mg의 HD5/kg BW/일; 1.2mg의 hBD-2/kg BW/일 또는 0 내지 10일째에 경구 위관 영양법을 통해 1일당 100μL PBS로 처리했다.
시험:
생존을 60일 동안 모니터링하였다.
결과
PBS 처리된 마우스 8마리 중 6마리가 60일까지 죽었지만, HD5 처리된 동물 8마리 중 2마리가 죽었고(p= 0.06, 도 58), hBD-2 처리된 동물은 60일까지 죽지 않았다(p= 0.008, 도 58).
결론
이 실시예 15는, 줄기 세포 이식 일로부터 10일 동안 HD5 또는 hBD-2에 의한 예방적 치료가 사망률을 극적으로 감소시킨다는 것을 입증하는 역할을 한다.
실시예 16.
경구 투여된 디펜신(HD5 및 hBD-2)의 항균 효과.
방법:
FISH에 의한 뮤신의 면역염색 및 박테리아의 국소화
점액 면역염색은 장 점막의 표면에서 박테리아 국소화를 분석하기 위해 전술한 바와 같이 형광 원위치 하이브리드화(FISH)와 쌍을 이루었다. 간단하게, 대변 물질이 없는 결장 조직(근위 결장, 맹장으로부터 2nd cm)을 실온에서 최소 3시간 동안 메탄올-카노이 고정 용액(60% 메탄올, 30% 클로로포름, 10% 빙초산)에 넣었다. 이어서, 조직을 메탄올 2 x 30분, 에탄올 2 x 15분, 에탄올/크실렌(1:1), 15분 및 크실렌 2 x 15분으로 세척하고, 이어서 수직 배향으로 파라핀에 매립시켰다. 60℃에서 10분 동안 예열하고, 이어서 크실렌에 의해 60℃에서 10분 동안, 크실렌에 의해 10분 동안, 그리고 99.5% 에탄올로 10분 동안 예열함으로써 5㎛ 섹션을 수행하여 밀랍 제거하였다. 하이브리드화 단계는 하이브리드화 완충액(20mM 트리스-HCl, pH 7.4, 0.9M NaCl, 0.1% SDS, 20% 포름아미드)에서 최종 농도 10㎍/mL로 희석된 EUB338 프로브(5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3', Alexa 647을 사용하는 5' 표지화 포함)로 50℃에서 밤새 수행하였다. 세척 완충액(20mM 트리스-HCl, pH 7.4, 0.9M NaCl)으로 10분 및 PBS로 3 x 10분 세척 후, PAP 펜(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 사용하여 섹션 주위를 마킹하고, 블록 용액(PBS 중의 5% 태아 소 혈청)을 4℃에서 30분 동안 첨가하였다. 뮤신-2 1차 항체(토끼 H-300, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)를 블록 용액으로 1:1500으로 희석하고, 4℃에서 밤새 적용하였다. PBS로 3 x 10분 세척한 후, 1:1500으로 희석된 항-토끼 Alexa 488 2차 항체 및 팔로이딘-테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트(시그마-알드리치) 1㎍/mL 및 훽스트(Hoechst) 33258(시그마-알드리치) 10㎍/mL를 함유하는 블랙 용액을 2시간 동안 섹션에 적용하였다. PBS로 3 x 10분 세척한 후, 슬라이드를 Prolong 항페이드 장착 배지(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 장착시켰다. 소프트웨어 Zen 2011 버전 7.1이 장착된 Zeiss LSM 700 공초점 현미경을 사용하여 관찰을 수행하였다. 이 소프트웨어를 사용하여 박테리아 및 상피 세포 단층 사이의 거리 및 점액 두께를 결정하였다.
결과:
장 벽과 박테리아 집단 사이의 용해 영역에서 매우 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다. 이 거리는 저지방 식이 뿐만 아니라 서양 식이 모두가 공급된 마우스에 대해 작았지만, HD5 및 특히 hBD-2는 거리에 대해 심오한 영향을 미쳤다(도 59).
결론
이 실험은, 마우스에서 경구 투여된 인간 HD5 및 hBD-2가 경구 투여 후 예상되는 바와 같이 주로 장의 루멘에서가 아니라 마우스 자체의 상피 세포에 의해 생성된 것처럼 마우스의 상피 표면에서 그들의 미생물군 조절 효과를 발휘한다는 것을 입증한다.
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WO 92/06204
WO 95/17413
WO 95/22625
US 5,223,409
SEQUENCE LISTING
<110> Defensin Therapeutics ApS
<120> Prevention and treatment of graft-versus-host-disease with
defensins
<130> IPA200547-DK
<150> EP 17203527.1
<151> 2017-11-24
<150> EP 18191954.9
<151> 2018-08-31
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 36
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
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35
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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Cys Cys Lys Lys Pro
35
Claims (33)
- 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation)을 받았거나 막 받으려고 하는 환자에서 급성 이식편 대 숙주 질환(acute graft-versus-host disease)의 예방 또는 치료 방법으로서, 상기 방법이 β-디펜신 및 α-디펜신으로 이루어진 군으로부터의 적어도 하나의 포유동물 디펜신을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 급성 이식편 대 숙주 질환의 예방 또는 치료 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 디펜신이 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 7 및, 서열번호와 5개 미만, 예를 들어, 4개 미만, 예를 들어, 3개 미만, 예를 들어, 2개 미만의 아미노산으로 상이한 서열 변이체로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포유동물 디펜신이 hBD2, HD5, HD6, hBD1, 절단형(truncated) hBD2, hBD3 및 hBD4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 디펜신이 hBD2, 절단형 hBD2 또는 HD5인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디펜신이 조성물 내에 포함되고, 상기 조성물이 하나 이상의 디펜신, 예를 들어, 2개의 디펜신, 예를 들어, 3개의 디펜신, 예를 들어, 4개의 디펜신, 예를 들어, 5개의 디펜신을 포함하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 2개의 디펜신이 hBD2 및 HD5인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 디펜신을 상기 환자에게 투여하는 단계가 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식 일에 개시되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디펜신을 환자에게 투여하는 단계가 GVDH의 증상이 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식 후 나타날 때 개시되는, 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 디펜신의 투여가, 환자가 동종 이계 조혈 줄기 세포 이식에 의해 야기되는 증상이 없을 때까지, 예를 들어, 적어도 1주, 예를 들어, 적어도 2주, 예를 들어, 적어도 3주, 예를 들어, 적어도 4주, 예를 들어, 적어도 2개월, 예를 들어, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 6개월 동안 계속되는, 방법.
- 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적 조성물인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 디펜신이 세포 침투 펩티드(CPP), 알부민 결합 모이어티(ABM), 검출가능한 모이어티(Z), 및 반감기 연장 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 모이어티를 추가로 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 추가의 모이어티가 반감기 연장 펩티드인, 방법.
- 제18항에 있어서, 반감기 연장 펩티드가 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합할 수 있는 분자, 트랜스페린, 알부민(HAS), XTENR 또는 PEG, 호모-아미노산 중합체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 중합체(PAS), 또는 엘라스틴-유사 펩티드(ELP), 히알루론산, 음으로 하전된 고도로 시아실화된 펩티드, 예를 들어, 융모성 고나도트로핀(CG) β-쇄의 카복시-말단 펩티드(CTP), 인간 IgG 및 CH3(CH2)nCO-(여기서, n은 8 내지 22이다)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 디펜신이 프리바이오틱스(prebiotics), 프로바이오틱스(probiotics), 트립토판, 단쇄 지방산, 글루코코르티코이드, 사이클로스포린, 항 TNF-α, 인테그린, 항생제, 면역억제제, 대변 이식, 조사(irradiation) 또는 이들의 조합과 함께 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 1일 투여량이 1일당 0.1 내지 10mg 디펜신/kg, 예를 들어, 0.5 내지 5mg 디펜신/kg, 예를 들어, 1 내지 2mg 디펜신/kg, 예를 들어, 1.2mg 디펜신/kg인, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디펜신이 1일 적어도 1회, 예를 들어, 1일 적어도 2회, 예를 들어, 1일 적어도 3회, 예를 들어, 1일 적어도 4회, 예를 들어, 1일 5회 또는 연속적으로 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 경구, 구강, 설하, 직장, 질, 기관내, 폐내, 비강내, 두개내, 피하, 정맥내, 진피 또는 경피 투여인, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 경구, 피하, 폐내 또는 진피/경피 투여인, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐내, 기관내 또는 비강내 투여가 흡입기, 네불라이저(nebulizer) 또는 기화기에 의한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 심각한 장 및 간 염증(예를 들어, 복통(abdominal pain), 메스꺼움(nausea), 구토(vomiting)및 황달(jaundice)을 특징으로 함) 및 점막 방어 손실, 사이토카인 폭풍, 체중 감소, 패혈증, 피부 발진, 가려움, 및 홍반으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 갖는, 방법.
- 제20항에 있어서, 하나 이상의 상기 증상이 치료 후 개선되는, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 사망률을 감소시키고 장기 생존율을 증가시키는, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 면역계 및 예방을 재균형화하거나, 조직 사이토카인 생산의 정상화를 통해 사이토카인 폭풍을 치료하는, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 장 투과성 및 패혈증이 장내 점막 방어 또는 미엘로퍼옥시다제 활성의 정상화를 통해 치료되는, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡기 합병증, 폐 용량, 폐 염증 및 패혈증이 치료되는, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 조직학적 폐 염증, 기관지 주위 및 혈관 주위 염증뿐만 아니라 기관지 폐포 세정액 내로의 염증성 세포 이동이 감소되는, 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 폐 및 피부의 염증 및 섬유증, 예를 들어, 폐색성 세기관지염(bronchiolitis obliterans) 및 경피증(scleroderma)이 치료되거나 예방되는, 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 풍부함, 종족(phylae)의 수, 박테리아 존재, 박테리아 존재량(bacterial abundance) 및/또는 단쇄 지방산 생산, 및/또는 부티레이트 생산이 증가되고/되거나 상기 환자의 장 또는 폐 미생물군으로부터의 아세테이트 생산이 감소되는, 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자의 장 또는 폐 또는 피부에서 정상 미생물군이 성숙되거나, 유지되거나 안정화되는, 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자의 장 또는 폐에서 알로바쿨룸(Allobaculum), 알로프레보텔라(Alloprevotella), 아커만시아(Akkermansia), 바네시엘라(Barnesiella), 비피도박테리아세아에(Bifidobacteriaceae), 페칼리박테리움(Faecalibacterium), 라크노스피라(Lachnospira), 로티아(Rothia) 및 베일로넬라(Veillonella)의 존재량이 증가되는, 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자의 음식 섭취량 및 체중 증가가 증가되는, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따르는 치료 방법에 사용하기 위한 디펜신 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 정의된 장애를 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 디펜신 폴리펩티드의 용도.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17203527 | 2017-11-24 | ||
| EP17203527.1 | 2017-11-24 | ||
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