ES3038995T3 - Saccharomyces cerevisiae var boulardii strain for treating infections of the oral cavity - Google Patents

Saccharomyces cerevisiae var boulardii strain for treating infections of the oral cavity

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ES3038995T3 ES19832918T ES19832918T ES3038995T3 ES 3038995 T3 ES3038995 T3 ES 3038995T3 ES 19832918 T ES19832918 T ES 19832918T ES 19832918 T ES19832918 T ES 19832918T ES 3038995 T3 ES3038995 T3 ES 3038995T3
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Abstract

La invención se refiere a una cepa de levadura de Saccharomyces cerevisiae var. boulardii para el tratamiento y/o prevención de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, tales como caries dentales y enfermedades periodontales.<i /> Esta cepa se puede utilizar sola o en combinación con la forma seca inactiva de una cepa de levadura de Saccharomyces cerevisiae. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Cepa de Saccharomyces cerevisiae var boulardii para el tratamiento de infecciones de la cavidad bucal
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la salud bucal. La invención se refiere más particularmente a una cepa específica deSaccharomyces cerevisiae var boulardii,utilizada sola o junto con una levaduraSaccharomyces cerevisiaeseca inactivada, en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal, tales como caries dental y enfermedad periodontal.
Contexto de la invención
En los seres humanos, la cavidad bucal es un ecosistema complejo abierto al interior y habitado por numerosos microorganismos, incluidas más de 700 especies bacterianas detectadas (Ghannoum y col., PLoS Pathog., 2010; 6: e1000713; Marsh y col., Periodontol., 2000, 55: 16-35; Paster y col., Periodontol., 2000, 42: 80-87). Para un individuo determinado, el número de especies bacterianas residentes varía de 150 a 250. La mayoría de estas especies son comensales y necesarias para mantener el equilibrio de este ecosistema. Sin embargo, en determinadas situaciones (ingesta elevada de carbohidratos, consumo de tabaco o cambios fisiológicos tales como el envejecimiento, la pubertad o el embarazo, etc.), se produce una alteración de este equilibrio que puede conducir al desarrollo de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal.
Las principales enfermedades infecciosas de la cavidad bucal son la caries dental y la enfermedad periodontal. La caries dental es una enfermedad polibacteriana que se manifiesta como la desmineralización de los tejidos duros del diente. Esta desmineralización se debe a la producción de ácidos por parte de las bacterias fermentativas presentes en la placa dental. Los estreptococos y lactobacilos del grupoMutansse consideran las principales bacterias cariogénicas. El informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre salud bucal destaca la alta prevalencia de cavidades, particularmente entre los jóvenes. En comparación con el resto del mundo, el riesgo de cavidad infantil es muy superior en los países desarrollados (Norteamérica, Australia, Europa, Japón), debido al alto contenido de azúcar de sus dietas.
Las enfermedad periodontal son un grupo de patologías que afectan al periodonto (es decir, los tejidos que sostienen el diente: hueso y mucosa gingival). Estas enfermedades se dividen en dos categorías principales: gingivitis y periodontitis. La gingivitis es cualquier inflamación limitada al periodonto superficial. La periodontitis es una lesión infecciosa avanzada del periodonto y, frecuentemente, sigue a la gingivitis. La presencia de ciertas bacterias y una respuesta inflamatoria intensa conducen a la destrucción del periodonto. La transición de la salud a la enfermedad periodontal va acompañada de una transición gradual hacia una flora más rica en bacterias anaerobias y gramnegativas. Este fenómeno se conoce como deriva anaeróbica. Las especies bacterianas más frecuentemente implicadas en la enfermedad periodontal incluyen:Fusobacterium nucleatumyPorphyromonas gingivalis,cuya coagregación parece mejorar su supervivencia y patogenicidad (Diaz y col., Microbiology, 2002, 148: 467-472; Saito y col., FEMS Immunol. Med. Microbiol, 2008, 54: 349-355; Polak y col., J. Clin. Periodontol., 2009, 36: 406-410).
El tratamiento de la caries dental, que afecta solo al esmalte o a la dentina, comprende el empaste con una resina compuesta o amalgama de plata. Si el diente está muy dañado, el dentista lo restaura con una corona; si el nervio está dañado, se debe realizar una endodoncia en el diente. Una cavidad no tratada continúa progresando y, finalmente, las bacterias atacan el hueso alveolar que se encuentra debajo de la raíz, lo que conduce a un absceso doloroso que se debe tratar con antibióticos antes de pasar al tratamiento mecánico. Los antibióticos también se utilizan en el tratamiento de la enfermedad periodontal junto con el raspado del sarro y el alisado radicular, el curetaje, la cirugía dental o como un tratamiento único para reducir las bacterias antes y/o después de estos procedimientos periodontales comunes.
El uso intensivo de antibióticos ha introducido una presión selectiva que conduce al preocupante desarrollo de poblaciones de microorganismos resistentes a los antibióticos y a una disminución general de la eficacia terapéutica. Inicialmente esporádicas, estas resistencias se han vuelto masivas y preocupantes. Algunas cepas bacterianas se han vuelto multirresistentes, es decir, resistentes a varios antibióticos, mientras que otras se han vuelto totalmente resistentes, es decir, resistentes a todos los antibióticos disponibles. Afortunadamente, este último caso sigue siendo poco frecuente, pero el fenómeno va en aumento y deja a los médicos en un callejón sin salida terapéutico. Por lo tanto, en el contexto actual de creciente y preocupante resistencia a los antibióticos, los científicos y los profesionales de la salud buscan identificar nuevas estrategias terapéuticas, incluso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal.
La patente EP 1852 122 A1 describe composiciones que comprendenSaccharomyces cerevisiaevar.boulardii,sola o junto conEnterococcus faecium,para el tratamiento de enfermedades de la cavidad bucal. Las levaduras actúan inhibiendo las bacterias patógenas, tales comoPrevotella intermediayPorpyhromona gingivalis,y restableciendo el equilibrio de la microflora en los tejidos de la boca. Las enfermedades tratadas incluyen, por ejemplo, la gingivitis y la enfermedad periodontal.
Resumen de la invención
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que las cepas de levaduraSaccharomyces cerevisiaevar.boulardii,tales como la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiaevar.boulardiidepositada por el solicitante el 21 de agosto de 2007 en la CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex, 15, Francia) con el número I-3799, tenía una capacidad mejorada, en comparación con otros probióticos, para inhibir el crecimiento de agentes periodontopatógenos y cariogénicos.
Los presentes inventores también han demostrado una sinergia entre una cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiiy una cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiaeen forma seca e inactivada, para inhibir significativamente el crecimiento de ciertos agentes patógenos periodontales y cariogénicos. Una de tales cepas de levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiies, por ejemplo, la cepa número I-3799 ya descrita anteriormente. Tal cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaees, por ejemplo, la cepa deSaccharomyces cerevisiaedepositada por el solicitante en la CNCM el 17 de octubre de 2007 con el número I-3856.
El objeto de la presente invención es la cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiidepositada el 21 de agosto de 2007 en la CNCM con el número I-3799, o una combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae,para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa de la cavidad bucal en un sujeto, caracterizado por que la enfermedad infecciosa es la caries dental, la gingivitis o la periodontitis.
En algunas realizaciones, la levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o la cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiide la combinación está en forma seca viva.
En algunas realizaciones, la cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiide la combinación es la cepa depositada el 21 de agosto de 2007 en la CNCM con el número I-3799.
En algunas realizaciones, la cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaees la cepa depositada el 17 de octubre de 2007 en la CNCM con el número I-3856.
En algunas realizaciones, la cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799, o la combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae,tal como se definió anteriormente, está comprendida en un suplemento alimenticio.
En algunas realizaciones, el suplemento alimenticio está en forma de una pastilla, un dulce, una goma de mascar, un polvo bucodispersable o un polvo para diluir en agua en forma de una barra o sobre, una tableta o un comprimido masticable, un chicle, una cápsula, un comprimido, gotas o un vial con tapón dosificador.
En algunas realizaciones, la cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799, o la combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae,tal como se definió anteriormente, está comprendida en una composición parafarmacéutica o cosmética.
En algunas realizaciones, la composición parafarmacéutica o cosmética está en forma de pasta de dientes, un colutorio, un aerosol bucal, una crema o gel bucal, una lámina bucodispersable, un polvo destinado a rociarse directamente en la cavidad bucal, un polvo bucodispersable o polvo para diluir en agua en forma de una barra o sobre o un vial con tapón dosificador, etc.
En algunas realizaciones, la cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o la combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaeestá comprendida en una composición farmacéutica, comprendiendo la composición farmacéutica una cantidad eficaz de la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o la combinación, como se definió anteriormente, y al menos un excipiente fisiológicamente aceptable.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está destinada a la administración tópica o a la administración bucal.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además al menos un ingrediente activo farmacéutico adicional que tiene un efecto calmante, antiirritante, analgésico, contra el dolor, antiinflamatorio, cicatrizante, antibiótico, antipirético o antifúngico.
En algunas realizaciones, la cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799, o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaeestá comprendida en un producto sanitario dental.
En algunas realizaciones, el producto dental es un implante dental, una corona dental, un puente dental, una incrustación dental o una prótesis dental.
En algunas realizaciones, la enfermedad infecciosa de la cavidad bucal es causada por bacterias periodontopatógenas y/o cariopatógenas.
En algunas realizaciones, las bacterias periodontopatógenas se seleccionan de entreAggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermediay/o las bacteria cariopatógena esStreptococcus mutans.
En algunas realizaciones, la enfermedad infecciosa de la cavidad bucal que se pretende prevenir o tratar según la presente invención es un efecto secundario de un tratamiento médico, o está presente o es probable que se desarrolle 0 reaparezca en un paciente que padece una inmunodeficiencia, o está presente en una mujer embarazada, una persona mayor, un niño o un paciente con un fenotipo hiperinflamatorio.
A continuación se proporciona una descripción más detallada de algunas realizaciones preferidas de la invención.
Descripción detallada de la invención
Como se mencionó anteriormente, la presente invención se refiere a una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la capacidad de inhibir el crecimiento de agentes periodontopatógenos y cariogénicos y a su uso, sola o junto con una levaduraSaccharomyces cerevisiaeseca e inactivada, en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal.
1 - Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae var boulardii
La expresión “ cepa de levadura” se refiere a una población relativamente homogénea de células de levadura. Una cepa de levadura se obtiene de un clon, siendo un clon una población de células obtenidas de una única célula de levadura.
Una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiique se puede utilizar en el contexto de la presente invención es, por ejemplo, la cepa que depositó el 21 de agosto de 2007 el presente solicitante en la CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia) con el número I-3799.
Esta cepa deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiha sido descrita previamente, por el presente solicitante, en la patente WO 2009/103884, donde se presenta como útil en la prevención y/o el tratamiento de patologías, trastornos o dolencias del intestino.
En el contexto de la presente invención, una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiestá en forma de células de levadura obtenidas al cultivar (o multiplicar) la cepa inicial. Las cepas deSaccharomyces cerevisiae var boulardiise pueden reproducir mediante cualquier método adecuado. Los métodos para cultivar una cepa deSaccharomyces cerevisiae var boulardiison conocidos en la técnica, y el experto en la técnica sabe cómo optimizar las condiciones de cultivo para cada cepa según su naturaleza. Las células de levadura pueden obtenerse, por ejemplo, multiplicando una cepa deSaccharomyces cerevisiae var boulardiien un medio de cultivo como se describe en la obra de referencia “Yeast Technology” , 2.a edición, 1991, Reed and Nagodawithana, publicada por Van Nostrand Reinhold (ISBN 0-442-31892-8).
Por lo tanto, por ejemplo, a escala industrial, la levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiique se puede utilizar en el contexto de la presente invención se puede obtener mediante un método que comprende las siguientes etapas:
- cultivar una cepa deSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) en un medio de cultivo en varias etapas, primero en condiciones de semianaerobia y después en condiciones de aerobia (medio/atmósfera ricos en oxígeno) para obtener la multiplicación de las células de levadura iniciales;
- y separar, mediante centrifugación, las células de levadura así producidas para obtener una crema de levadura líquida que contiene entre el 12 % y el 25 % de materia seca de levadura.
La levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiiutilizada en el contexto de la invención está en forma de levadura viva. El término “ levadura viva” , sinónimo de “ levadura activa” , se refiere a una población de células de levadura metabólicamente activas.
La levadura viva utilizada en el contexto de la presente invención está en forma de levadura seca. La levadura seca está caracterizada por un bajo contenido de agua, y generalmente comprende un contenido de materia seca de levadura superior al 90 %, preferiblemente un contenido de materia seca de entre el 92 % y el 98 %, por ejemplo, un contenido de materia seca de entre el 94,5%y el 96,5 %. Una de las ventajas de la levadura seca es su larga vida útil.
El método para producir la levaduraSaccharomyces cerevisiae varboulardiipuede comprender además una etapa de secado posterior, para obtener levadura en forma seca. Esta etapa de secado puede ir seguida o no de una operación de trituración. El secado puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante liofilización, secado en lecho fluidizado, secado en tambor o secado por pulverización, por ejemplo. En el caso de la liofilización, se puede utilizar un vehículo de tipo maltodextrina o lactosa.
II - Combinación de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae var boulardii y la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae seca inactivada
Como se mencionó anteriormente, los presentes inventores han demostrado una sinergia entre una cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardii(p. ej., la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiinúmero I-3799) y una cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiaeen forma seca inactivada para inhibir significativamente el crecimiento de bacterias periodontogénicas y cariogénicas. Los términos “ sinergia” y “ acción sinérgica” , que aquí se utilizan indistintamente, se refieren a una acción coordinada de las dos cepas de levadura que crea un efecto mayor que la suma de los efectos esperados si hubieran operado de forma independiente, o que crea un efecto que cada una de ellas no habría podido obtener actuando de forma aislada.
La levaduraSaccharomyces cerevisiaeutilizada junto con una levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiies una levadura seca inactivada. Los términos “ levadura inactivada” y “ levadura desactivada” , que aquí se utilizan indistintamente, se refieren a una levadura que ya no está viva, es decir, una levadura cuyo metabolismo se ha detenido de forma irreversible. Una levadura inactivada según la invención se puede obtener mediante cualquier método adecuado. Las técnicas adecuadas bien conocidas por los expertos en la técnica incluyen el tratamiento térmico de la levadura, el tratamiento por pulverización, el secado en tambor o cualquier combinación de estos. La levadura inactivada se encuentra generalmente en forma seca. La levadura seca está caracterizada por un bajo contenido de agua, y generalmente comprende un contenido de materia seca de levadura superior al 90 %, preferiblemente un contenido de materia seca de entre el 92 % y el 98 %, por ejemplo, un contenido de materia seca de entre el 94,5 % y el 96,5 %. Una de las ventajas de la levadura seca es su larga vida útil.
La cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiiutilizada en la combinación puede ser cualquier cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardii.
La cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiaeseca inactivada utilizada en la combinación puede ser cualquier cepa deSaccharomyces cerevisiae.
En algunas realizaciones particulares, la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiaeutilizada en forma seca inactivada en el contexto de la invención junto con una cepa deSaccharomyces cerevisiae var boulardiies la cepa deSaccharomyces cerevisiaedepositada en la CNCM el 17 de octubre de 2007 con el númeroI-3856.Esta cepa deSaccharomyces cerevisiae var boulardii Saccharomyces cerevisiaeha sido descrita previamente, por el presente solicitante, en la patente WO 2009/103884, donde se presenta como útil en la prevención y/o el tratamiento de patologías, trastornos o dolencias del intestino; y en la patente WO 2014/009656, donde se presenta como eficaz para controlar la proliferación vaginal deCandiday prevenir la reaparición de la candidiasis vaginal o vulvovaginal.
En algunas realizaciones particulares, la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiiutilizada en el contexto de la invención junto con la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiaeen forma seca inactivada es la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiidepositada en la CNCM el 21 de agosto de 2007 con el número I-3799.
El término “ combinación” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una mezcla deSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) ySaccharomyces cerevisiaeen forma seca inactivada (p. ej., cepa número I-3856). La mezcla se puede preparar en cualquier proporción. Por lo tanto, preferiblemente, la combinación comprende una relación deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799:Saccharomyces cerevisiaeen forma seca inactivada que varía de aproximadamente 90:10 (p/p = peso/peso) a aproximadamente 10:90 (p/p). Por lo tanto, la relación deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799:Saccharomyces cerevisiaeen forma seca inactivada puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 90:10 (p/p), aproximadamente 80:20 (p/p), aproximadamente 70:30 (p/p), aproximadamente 60:40 (p/p), aproximadamente 50:50 (p/p), aproximadamente 40:60 (p/p), aproximadamente 30:70 (p/p), aproximadamente 20:80 (p/p) o aproximadamente 10:90 (p/p). El término “ aproximadamente” , como se utiliza aquí en referencia a un número, generalmente comprende números que se encuentran dentro de un intervalo del 10 % en cualquier dirección del número (por encima o por debajo del número), excepto cuando ese número supera el 100 % de un valor posible.
En algunas realizaciones particulares de la invención, la relación deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799:Saccharomyces cerevisiaeI-3856 en forma seca inactivada es aproximadamente 50: 50 (p/p).
III - Usos de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae var boulardii y la combinación en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal
Por lo tanto, la invención se refiere a la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799 o una combinación de una cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var bourlardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856), para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades infecciosas de la cavidad bucal. También se describe en la presente memoria un método para tratar y/o prevenir una enfermedad infecciosa de la cavidad bucal en un sujeto, comprendiendo el método la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de la cepaSaccharomyces cerevisiaenúmero I-3799, o de una combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var bourlardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej. número I-3856). La invención también se refiere al uso de la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799 o una combinación de una cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var bourlardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856), para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades infecciosas del cavidad bucal.
En el contexto de la presente invención, se entiende por “tratamiento” un método cuyo objetivo es: (1) retrasar o prevenir la aparición de una enfermedad o cuadro clínico; (2) retrasar o detener la progresión, el empeoramiento o el deterioro de los síntomas de la enfermedad; (3) provocar mejoras en los síntomas de la enfermedad; y/o (4) curar la enfermedad. Se puede administrar un tratamiento antes de la aparición de la enfermedad, para una acción profiláctica (esto se denomina “ prevención” ), o se puede administrar después de la aparición de la enfermedad, para una acción terapéutica.
El término “ sujeto” se refiere aquí a un mamífero, y más específicamente a un ser humano, que tiene la posibilidad de ser víctima de una infección bucal, pero que no necesariamente padece tal infección. El término “ sujeto” no designa una edad en particular y, por lo tanto, abarca a los recién nacidos, niños, adolescentes, adultos y personas mayores. El término “ paciente” se utiliza a veces aquí, en lugar de “ sujeto” , cuando el sujeto padece (es decir, se le ha diagnosticado que padece) una enfermedad infecciosa de la cavidad bucal.
El término “ enfermedad infecciosa de la cavidad bucal” se refiere a una afección médica localizada en la boca, resultante de una infección por un microorganismo patógeno. Las enfermedades infecciosas de la cavidad bucal incluyen caries dental y enfermedad periodontal.
Se entiende por “ caries dental” o “ cavidades” una enfermedad infecciosa del diente que produce daños en el esmalte, la dentina y/o la pulpa/cemento. Las bacterias cariogénicas, es decir, las bacterias que promueven la aparición de caries, incluyen:Streptococcus mutans(que promueve cavidades superficiales lisas y proximales);Streptococcus mutansy lactobacilos (que promueven las cavidades en fisuras;Actinomycetes viscosus y Actinomycetes naeslundi(que promueven la caries radicular y la colonización de la dentina/raíz); y lactobacilos (que promueven la colonización de la dentina/raíz). La colonización dental comienza con estreptococos, después actinomicetos y, finalmente, lactobacilos. El predominio bacteriano varía con respecto a la profundidad de la lesión. ElStreptococcus mutansse asocia con lesiones iniciales, mientras que los lactobacilos aparecen más tarde en una lesión profunda. También se sabe que los siguientes agentes patógenos, por ejemplo, están relacionados con la aparición de caries dental:Streptococcus sobrinusyLactobacilli.
Se entiende por “ enfermedad periodontal” las enfermedades y afecciones patológicas que afectan a los tejidos de sostén de los dientes, es decir, los huesos y las encías. Estas son infecciones causadas por la acumulación de bacterias patógenas y sus toxinas en la línea de las encías alrededor de los dientes. Las principales enfermedades periodontales son la gingivitis y la periodontitis. La gingivitis es la inflamación de las encías alrededor de los dientes. Esta afección es reversible cuando se trata. La periodontitis, por otro lado, es una patología más grave que daña las encías y el hueso que sostiene los dientes. También se sabe que las siguientes bacterias, por ejemplo, están relacionadas con la aparición de la enfermedad periodontal:Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythensis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actinomycetes odontolyticus, Actinomycetes naeslundii, Fusobacterium Nucleatum, Campylobacter rectus, Peptostreptococcus micros, Prevotella melaninogenica, Prevotella intermedia, Capnocytophaga, Eikenella, Bacteroidetes, Eubacterium saphenum, P. endodontalis, Prevotella denticola, Parvimonas micra, Filifactor alocis,especies deDesulfobulusy especies deSynergistetes.
Según el metanálisis de Guerra y col., se han identificado 600 especies bacterianas en el microbioma bucal humano. Sin embargo, el 53 % de las especies del microbioma bucal aún no se han identificado y el 35 % no son cultivables.
Un método para tratar y/o prevenir una enfermedad infecciosa de la cavidad bucal descrita en la presente memoria comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de la cepaSaccharomyces cerevisiaenúmero I-3799, o de una combinación de una levaduraSaccharomyces cerevisiae var bourlardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de la cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej. número I-3856). La cantidad eficaz, que se puede administrar en una o más dosis, puede determinarla el médico o el dentista. La cantidad exacta a administrar puede variar de paciente a paciente, dependiendo de la edad, el peso, el estado general del paciente, la gravedad y/o la extensión de la caries dental o la enfermedad periodontal, etc. La cantidad eficaz a administrar también puede variar según el efecto terapéutico deseado (es decir, la prevención de una enfermedad infecciosa de la cavidad bucal o el tratamiento de una enfermedad infecciosa de la cavidad bucal).
Preferiblemente, la administración de la cepa número I-3799 deSaccharomyces cerevisiae var boulardii,o una combinación de la levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de la cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856), es una administración bucal con un efecto localizado en la cavidad bucal; sin embargo, en algunas realizaciones, la levadura (o combinación) se puede tragar (véase más adelante).
Por ejemplo, la dosis de la combinación de una levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiien forma seca (p. ej., cepa número I-3799) y una levaduraSaccharomyces cerevisiaeinactivada en forma seca (p. ej., cepa número I-3856) puede estar entre 1 mg y 10 g, preferiblemente entre 100 mg y 5 g de la mezcla.
La concentración recomendada de levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiiviva puede estar entre 1107 y 1,1011 UFC/g, y preferiblemente entre 5,108 y 11010 UFC/g.
Un método de tratamiento descrito en la presente memoria se puede utilizar para tratar un primer episodio de enfermedad infecciosa de la cavidad bucal, en particular gingivitis o periodontitis, o una reaparición. En cualquier caso, es posible que el paciente haya sido tratado previamente con un antibiótico estándar. Alternativamente, la levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799, o la combinación de una levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) con una levaduraSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856), puede ser el primer tratamiento prescrito al paciente.
Un método de tratamiento descrito en la presente memoria también se puede utilizar para prevenir una enfermedad infecciosa de la cavidad bucal en un paciente, ya sea que la enfermedad infecciosa de la cavidad bucal sea un primer episodio o una reaparición. Este puede ser el caso de los pacientes que reciben tratamientos médicos que se sabe que causan trastornos periodontales, tales como los inmunosupresores, la fenitoína (antiepiléptico) y los bloqueadores de los canales de calcio tales como la nifedipina (que están indicados para el tratamiento de diversos trastornos cardíacos, tales como la angina de pecho, las arritmias y la hipertensión). Este también puede ser el caso de los pacientes que padecen una inmunovulnerabilidad asociada, por ejemplo, a enfermedades tales como el síndrome de Sjogren, la infección por el VIH, la diabetes no controlada, ciertos trastornos endocrinos, la malnutrición o la malabsorción, tal como, por ejemplo, la deficiencia de vitamina B. Este también puede ser el caso de los pacientes con flujo salival reducido (p. ej., ciertas personas mayores). Este también puede ser el caso de los fumadores o de las personas sometidas a estrés. Este también puede ser el caso de las mujeres embarazadas, para quienes la prevención de las enfermedades bucales puede comenzar desde el comienzo del embarazo. Finalmente, este puede ser el caso de personas con un fenotipo hiperinflamatorio, es decir, con una propensión a provocar una reacción inflamatoria agravada al responder a una agresión de la misma intensidad, con una sobreproducción de citocinas proinflamatorias (PGE2, IL-1, TNF), factores que desempeñan un papel importante en la destrucción periodontal.
En algunas realizaciones, un tratamiento descrito en la presente memoria se administra por sí solo. En otras palabras, la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799 o la combinación de una levaduraSaccharomyces cerevisiae var bourlardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una levaduraSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856), es el único agente que se debe administrar, con la excepción de cualquier colutorio antiséptico.
En otras realizaciones, un tratamiento descrito en la presente memoria se administra junto con otra terapia, por ejemplo, con la administración de un antibiótico o antiséptico estándar, y/o con un procedimiento mecánico o quirúrgico, tal como raspado del sarro, alisado radicular, curetaje, empaste, restauración o endodoncia.
IV - Suplementos alimenticios, composiciones cosméticas y farmacéuticas
Como se mencionó anteriormente, la cepa deSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799, o la combinación de una levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856), se puede administrar tal cual o en forma de preparado o composición.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la cepa número I-3799 deSaccharomyces cerevisiae var boulardii,o la combinación de una levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856), está presente en un suplemento alimenticio en forma de una pastilla, un dulce, una goma de mascar, un polvo bucodispersable o un polvo para diluir en agua en forma de una barra o sobre, una tableta o un comprimido masticable, un chicle, una cápsula, un comprimido, gotas o un vial con tapón dosificador, etc.
En otras realizaciones, la cepa número I-3799 deSaccharomyces cerevisiae var boulardii,o la combinación de una levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., la cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej., la cepa número I-3856), está presente en una composición parafarmacéutica (o cosmética) en forma de pasta de dientes, un colutorio, un aerosol bucal, una crema o gel bucal, una lámina bucodispersable, un polvo destinado a rociarse directamente en la cavidad bucal, un polvo bucodispersable o polvo para diluir en agua en forma de una barra o sobre o un vial con tapón dosificador, etc.
En otras realizaciones más, la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799, o la combinación de una levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856), está presente en una composición farmacéutica con al menos un excipiente fisiológicamente aceptable. Por lo tanto, más específicamente, una composición farmacéutica según la invención comprende una cantidad eficaz de la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799, o de la combinación de una levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856), y al menos un excipiente fisiológicamente aceptable. Una composición farmacéutica según la invención se puede clasificar como un preparado farmacéutico disponible con receta o sin receta.
En el contexto de la presente invención, “ excipiente fisiológicamente aceptable” significa cualquier medio o aditivo que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo (aquí, cepa deSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799 o la combinación), y que no sea excesivamente tóxico para el paciente o sujeto, en las concentraciones a las que se administra. Un excipiente fisiológicamente aceptable puede ser uno adecuado para la administración a mamíferos, particularmente a seres humanos.
Las composiciones farmacéuticas según la presente invención se pueden administrar utilizando cualquier combinación de dosificación y vía de administración eficaz para lograr el efecto terapéutico/profiláctico deseado. Como se mencionó anteriormente, la cantidad exacta a administrar puede variar de paciente a paciente, dependiendo de la edad, el peso, el estado general, la gravedad y la extensión de la infección bucal y la naturaleza de la enfermedad bucal asociada (caries dental, gingivitis, periodontitis), etc. La vía de administración (tópica o sistémica) se puede elegir según la gravedad y la extensión de la infección bacteriana y/o la edad y/o la salud del paciente.
A modo de ejemplo, el objeto de la invención es una composición farmacéutica tal como se ha definido anteriormente para el uso de una combinación de levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) y la forma seca inactivada de una levaduraSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856) en una cantidad de entre 1 mg y 10 g, preferiblemente entre 100 mg y 5 g, dicha cantidad se puede administrar una o varias veces al día.
La concentración recomendada de levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiipuede estar entre 1107 y 1,1011 UFC/g, y preferiblemente entre 5,108 y 11010 UFC/g.
La formulación de una composición farmacéutica según la presente invención puede variar basándose en la vía de administración y la dosificación para la que se pretende utilizar la composición. Después de la formulación con al menos un excipiente fisiológicamente aceptable, una composición farmacéutica de la invención puede estar en cualquier forma adecuada para la administración a un ser humano, p. ej., en forma de barras, comprimidos, píldoras recubiertas de azúcar, cápsulas, perlas, jarabes, emulsiones, ungüentos, pastas, geles, polvos, sobres, soluciones inyectables, etc. Los expertos en la técnica saben cómo seleccionar los vehículos y excipientes más adecuados para preparar un tipo determinado de formulación. Una composición según la invención puede también comprender aditivos tales como conservantes, edulcorantes, sabores, agentes de viscosidad, colorantes, humectantes, disgregantes, aceleradores de absorción, lubricantes, etc.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica según la invención contiene solo un ingrediente activo: la cepa de levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799, o la combinación de una levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una levaduraSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856). En particular, tal composición farmacéutica no contiene ningún otro microorganismo vivo o combinación de microorganismos vivos.
En otras realizaciones, una composición farmacéutica según la invención contiene además al menos un ingrediente activo farmacéutico adicional (es decir, además de la(s) levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 de la combinación). Por “ ingrediente farmacéutico activo” se entiende cualquier compuesto o sustancia cuya administración tiene un efecto terapéutico, o cuya administración tiene un efecto beneficioso sobre la salud o el estado general de un paciente o sujeto al que se administra.
Por lo tanto, un ingrediente activo farmacéutico puede ser activo contra una infección bacteriana de la cavidad bucal que se debe prevenir o tratar mediante la administración de la composición farmacéutica; o puede ser activo contra una afección o síntoma asociado con la enfermedad infecciosa de la cavidad bucal (p. ej., dolor, fiebre o halitosis); o puede aumentar la disponibilidad y/o la actividad del ingrediente activo o ingredientes activos de la composición farmacéutica.
Los ejemplos de ingredientes farmacéuticos activos que pueden estar presentes en una composición de la presente invención incluyen, aunque no de forma limitativa, ingredientes activos que tienen un efecto calmante, antiirritante, analgésico, contra el dolor, antiinflamatorio, cicatrizante, antibiótico, antipirético o antifúngico (sin efecto sobre la cepa de levadura número I-3799 deSaccharomyces cerevisiae var boulardiio sobre la combinación de una levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) con una levaduraSaccharomyces cerevisiaeen forma seca inactivada (p. ej., cepa número I-3856)), etc.
En otras realizaciones más, la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799, o la combinación de una cepa deSaccharomyces cerevisiae var boulardii(p. ej., cepa número I-3799) con la forma seca inactivada de una cepa deSaccharomyces cerevisiae(p. ej., cepa número I-3856), está presente sobre/en un producto sanitario dental: por ejemplo, un implante dental, una corona dental, un puente dental, una incrustación dental, una prótesis dental, etc.
Salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la Descripción tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un especialista ordinario en el campo al que pertenece esta invención.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos describen ciertas realizaciones de la presente invención. Sin embargo, se entiende que los ejemplos y las figuras tienen únicamente fines ilustrativos y no limitan en modo alguno el alcance de la invención.
Leyendas de las figuras
Figura 1:Resultados de halo obtenidos(A)con la cepa deSaccharomyces cerevisiaenúmero I-3856, en presencia de especies patógenas:Fusobacterium nucleatum(Fn),Prevotella intermedia(Pi),Aggregatibacter actinomycetemcomitans(Aa),Porphyromonas gingivalis(Pg)(B)con cepa deSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799, en presencia de las especies patógenas:Fusobacterium nucleatum(Fn),Prevotella intermedia(Pi),Aggregatibacter actinomycetemcomitans(Aa) yPorphyromonas gingivalis(Pg);(a)aeróbicamente o(b)anaeróbicamente.
Figura 2:Efectos de la cepa deSaccharomyces cerevisiaenúmero I-3856 (I-3856); cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799 (Boulardii); y un control (Control) sobre diferentes especies bacterianas de una biopelícula de 14 especies, incluidos 4 periodontopatógenos (AaD) y 2 cariopatógenos (EyF):(A)Aggregatibacter actinomycetemcomitans(Aa),(B)Fusobacterium nucleatum(Fn),(C)Porphyromonas gingivalis(Pg),(D)Prevotella intermedia(Pi),(E)Streptococcus mutans(Sm),(F)Streptococcus sobrinus.Los valores representan el promedio ± EE de triplicados (N = 3). *p<0,05 frente al Control; **p<0,01 frente al Control; ***p<0,001 frente al Control; ****p<0,0001 frente al Control.
Figura 3:Efectos de la forma seca inactivada de la cepa deSaccharomyces cerevisiaenúmero I-3856 (IY)); cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799 (Boulardii); la combinación de la forma seca inactivada de la cepaSaccharomyces cerevisiaenúmero I-3856 y cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799 (IY+Boulardii); y un control (Control) sobre diferentes especies bacterianas de una biopelícula de 14 especies, incluidos 4 periodontopatógenos (AaD) y 2 cariopatógenos (EyF):(A)Aggregatibacter actinomycetemcomitans(Aa),(B)Fusobacterium nucleatum(Fn),(C)Porphyromonas gingivalis(Pg),(D)Prevotella intermedia(Pi),(E)Streptococcus mutans(Sm),(F)Streptococcus sobrinus.Los valores representan el promedio ± EE de triplicados (N = 3). *p<0,05 frente al Control; **p<0,01 frente al Control; ***p<0,001 frente al Control; ****p<0,0001 frente al Control. n.° p<0,05 frente a Nutri. $ p<0,05 frente aBoulardii.
Figura 4:Curvas dosis-respuesta de la levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiiCNCM I-3799 sobre la secreción de los siguientes parámetros inflamatorios: (A) IL-6, (B) IL-8, (C) IL-10, (D) MCP-1, (E) PGE-2, and (F) isoprostano, por monocitos humanos primarios después de exposición a LPS. Los valores se expresan como promedio ± EE de experimentos duplicados realizados con tres donantes (n = 6). *** p<0,001 frente al Control, **** p<0,0001 frente al Control.
Figura 5:Curvas dosis-respuesta de la levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiiCNCM I-3799 sobre la secreción de los siguientes parámetros inflamatorios: (A) IL-6, (B) IL-8, (C) PGE-2 y (D) isoprostano, por fibroblastos gingivales humanos primarios. Los valores se expresan como promedio ± EE para tres experimentos (n = 3). *** p<0,001 frente al Control, **** p<0,0001 frente al Control.
Efectos de diferentes probióticos sobre las bacterias periodontopatógenas y cariogénicas
A. Probióticos ensayados y bacterias periodontopatógenas o cariogénicas
Productos de levadura.En los estudios descritos a continuación, se evaluaron 2 levaduras secas vivas y una levadura seca inactivada.
Las dos levaduras vivas son:
- CepaSaccharomyces cerevisiaenúmero CNCM I-3856 (depositada por el solicitante en la CNCM el 17 de octubre de 2007) y
- cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero CNCM I-3799 (ya descrita anteriormente).
La levadura seca inactivada es:
- La forma seca inactivada de la cepa deSaccharomyces cerevisiaenúmero I-3856 (ya descrita anteriormente). Composición de una biopelícula compleja de 14 especies:
Bacterias periodontopatógenas y cariogénicas.Las bacterias periodontopatógenas utilizadas incluyen:
-Prevotella intermedia(antes conocida comoBacteroides intermedius)es una bacteria patógena gramnegativa anaerobia estricta que participa en infecciones periodontales, incluida la gingivitis y la periodontitis, y que se encuentra frecuentemente en la gingivitis ulcerosa necrotizante aguda;
-Porphyromonas gingivalis,que es una bacteria patógena anaerobia, non móvil, gramnegativa y con forma de bastón que se encuentra en la cavidad bucal, donde está implicada en ciertas formas de enfermedad periodontal;
-Fusobacterium nucleatum,que es una bacteria anaerobia, invasiva, adherente e inflamatoria, ajena a la cavidad bucal humana, y que desempeña un papel en la enfermedad periodontal al ser un componente clave de la placa periodontal debido a su abundancia y capacidad para asociarse con otras especies de la cavidad bucal; y
-Aggregatibacter actinomycetemcomitans,que es una bacteria gramnegativa pequeña, de crecimiento lento, facultativamente aero-anaerobia, belonging perteneciente a la flora bucal fisiológica de los seres humanos y que desempeña un papel en la enfermedad periodontal.
Las bacterias cariogénicas utilizadas incluyen:
-Streptococcus mutans,que es una bacteria cocos grampositiva, parte de la flora comensal de la cavidad bucal, where es responsable de la caries dental junto con el azúcar de la dieta, que transforma en ácido láctico; y
-Streptococcus sobrinus,que es una bacteria gramnegativa, no móvil y anaerobia que se encuentra en grandes cantidades en la placa dental de pacientes con cavidades.
Bacterias comensales de la cavidad bucal.Las bacterias comensales de la cavidad bucal utilizadas en el presente estudio incluyen:Streptococcus sanguinis; Streptococcus gordonii; Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis; Streptococcus oralis; Actinomyces viscosus; Actinomyces naeslundii;yVeillonella parvula.
B. Actividad antibacteriana de levaduras contra 6 especies patógenas
Protocolo.La técnica del halo se utilizó para detectar y cuantificar la tasa de inhibición de las bacterias comensales y patógenas en las placas de agar. Esta técnica es un ensayo competitivo, que consiste en inocular dos puntos, próximos entre sí y cada uno con una especie bacteriana diferente, en una placa de agar. Después, se puede evaluar la capacidad de uno para inhibir el crecimiento del otro.
Las placas de agar se sembraron con el cultivo de una de las 2 levaduras (vivas) ajustado a una densidad óptica a 600 nm (OD<600>) de 0,5, lo que corresponde a una concentración de alrededor de 108 UFC/ml; las placas de agar BHI-2 no contienen hemina, menadiona ni sangre. Cada punto contenía 7 pl del cultivo de una de las 2 levaduras vivas a una concentración de 108 UFC/ml.
Después de 24 horas de incubación aeróbica o anaeróbica, las placas de agar se volvieron a sembrar durante 24 horas con 7 |jl de un cultivo de una especie patógena(Fusobacterium nucleatum(Fn),Prevotella intermedia(Pi),Aggregatibacter actinomycetemcomitans(Aa) yPorphyromonas gingivalis(Pg)), en las proximidades del punto que contiene las especies de levadura.
Las placas de agar se incubaron durante un total de 48 horas en condiciones de anaerobia o aerobia. Después de 48 horas de incubación, se inspeccionó y calibró la superficie de inhibición (con una regla) (Tabla 1) y se tomó una fotografía estandarizada (distancia entre la placa de agar y la cámara) de cada una de las placas de agar (Figura 1). Los agentes patógenos analizados con las 2 levaduras vivas son los siguientes:Fusobacterium nucleatum(Fn),Prevotella intermedia(Pi),Aggregatibacter actinomycetemcomitans(Aa) yPorphyromonas gingivalis(Pg),
Resultados.Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 1 y se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Tasa de inhibición (media ± desviación estándar, N = 3) inducida por la especie de levadura Saccharomyces cerevisiae var. boulardii I-3799 sobre el crecimiento de ciertas bacterias patógenas bucales.
La Tabla 1 muestra las distancias de inhibición medidas para los casos en los que se inhibió significativamente el crecimiento de ciertos agentes patógenos bucales.
Los resultados obtenidos muestran que la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiiinduce una inhibición significativa del crecimiento de las especies patógenasPrevotella intermedia, AggregatibacteractinomycetemcomitansyPorphyromonas gingivalisen condiciones de anaerobia.
Por añadidura, el crecimiento deAggregatibacter actinomycetemcomitanstambién fue inhibido por la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiien condiciones de aerobia.
La Tabla 1 muestra que el mayor orden de magnitud de inhibición se observó en el crecimiento dePrevotella intermediaen condiciones anaerobias en comparación con otras bacterias y agentes patógenos.
La Figura 1 también muestra queSaccharomyces cerevisiaeCNCM I-3856 no mostró una inhibición significativa de las especies patógenas.
Conclusión.Solo la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiiinhibió el crecimiento de agentes patógenos bucales en las placas de agar.
C. Evaluación del efecto de los productos de levadura en la composición de una biopelícula compleja que comprende 14 especies.
1) Efectos de las levaduras vivas estudiadas
Protocolo de biorreactor.Se estableció una comunidad multiespecie en un reactor BIOSTAT B TWIN<®>(Sartorius, Alemania). Se añadió al biorreactor un medio que contenía 750 ml de BHI-2 (infusión de cerebro y corazón (BHI) suplementado con 2,5 g/l de mucina, 1,0 g/l de extracto de levadura, 0,1 g/l de cisteína, 2,0 g/l de bicarbonato de sodio y ácido glutámico al 0,25 % (v/v)), junto con 5,0 mg/ml de hemina, 1,0 mg/ml de menadiona y 200 pl/l de antiespumante Y-30 (Sigma, St. Louis, EE. UU.). La mezcla se redujo previamente durante 24 horas a 37 °C haciendo burbujear un 100 % de nitrógeno (N<2>) y un 5 % de dióxido de carbono (CO<2>) en la mezcla mientras se agitaba continuamente a 300 rpm, a un pH establecido en 6,7 ± 0,1. Después de 24 horas, se añadieron cultivos deStreptococcus mutans (E), Streptococcus sobrinus (F), Prevotella intermedia (D), Porphyromonas gingivalis (C), Fusobacterium nucleatum (B)yAggregatibacter actinomycetemcomitans (A)a una densidad óptica de 1,4 y se añadieron a la mezcla del biorreactor. El medio no se reemplazó durante las primeras 48 horas, después se reemplazó a una tasa de 200 ml/24 horas.
Protocolo de cultivo.Los cultivos de la cepaSaccharomyces cerevisiaenúmero I-3856 (I-3856) y la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiinúmero I-3799(Boulardii)(realizados durante la noche) se ajustaron a una densidad óptica a 600 nm (OD<600>) de 0,5 (~1x10<8>UFC/ml) en BHI-2 (véase la composición más arriba). Se inocularon alícuotas de 1800 pl de estos cultivos ajustados en placas de 24 pocillos que contenían discos de hidroxiapatita en el fondo de cada pocillo. Se añadieron 200 pl de la mezcla de biopelícula de 14 especies del biorreactor a cada pocillo. Los controles contenían 200 pl de muestras de las 14 especies y 1800 pl de BHI-2. Las placas de 24 pocillos se incubaron en condiciones de microaerobia (6 % de oxígeno) durante 24 horas. A continuación, se retiraron los sobrenadantes y las biopelículas unidas a los discos de hidroxiapatita se lavaron con PBS (solución salina tamponada con fosfato). Las biopelículas se separaron con 1500 pl de tripsina-EDTA al 0,05 % durante 45 minutos a 37 °C y 230 rpm, después se transfirieron a tubos Eppendorf y se centrifugaron (6010 x g, durante 5 minutos). Después de eliminar la tripsina, el sedimento de la biopelícula se resuspendió en 500 pl de PBS, y la extracción del ADN se realizó según las instrucciones de Qiagen y se analizó mediante qPCR.
Resultados obtenidos con levaduras vivas.Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2 (A-F).
Se demostró que la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiiinhibe significativamente los siguientes periodontopatógenos:Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A), Fusobacterium nucleatum (B), Porphyromonas gingivalis(C) yPrevotella intermedia(D), así como el cariopatógenoStreptococcus mutans(E).
Conclusión.Los experimentos con biopelículas confirmaron, en comunidades multiespecie, la actividad inhibidora de la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiicontra los agentes patógenos bucales, que se había destacado anteriormente en los experimentos con placas de agar.
2) Efectos de la cepa Saccharomyces cerevisiae var boulardii I-3799 (levadura Boulardii), cepa Saccharomyces cerevisiae I-3856 en forma seca inactivada (levadura IY) y combinación de las mismas
Los productos de levadura(Boulardiie IY) se disolvieron cada uno en 100 ml de PBS a 37 °C y se mezclaron en vórtex durante 3 minutos. Se centrifugaron 10 ml de estas soluciones a 6010 x g durante 10 minutos. Se retiraron los sobrenadantes y el sedimento de levadura “Boulardirse suspendió en BHI-2, ajustando la concentración a un promedio de 5x108 UFC/ml. El sedimento de la levadura “ IY” se suspendió en una solución que contenía una muestra de la mezcla del biorreactor diluida 1:5.
- En un primer pocillo se colocó lo siguiente: 1 ml de solución de levadura “Boulardii” suspendida en BHI-2 y 1 ml de mezcla del biorreactor diluida 1:5 sin “ IY” (condición de solo “Boulardii”)
- En un segundo pocillo se colocó lo siguiente: 1 ml de solución de levadura “ IY” y mezcla del biorreactor diluida 1:5 y 1 ml de BHI-2 sin“ Boulardir(condición de solo IY).
- En un tercer pocillo se colocó lo siguiente: 1 ml de solución de levadura“ Boulardirsuspendida en BHI-2 y 1 ml de solución de levadura “ IY” y mezcla del biorreactor diluida 1:5 (condición de combinaciónBoulardii+ IY).
- En un cuarto pocillo se colocó lo siguiente: 1 ml de mezcla del biorreactor diluida 1:5 y 1 ml de BHI-2. Este pocillo es un pocillo de control.
Las placas de 24 pocillos se incubaron en condiciones de microaerobia (6 % de oxígeno) durante 24 horas. A continuación, se retiraron los sobrenadantes y las biopelículas unidas a los discos de hidroxiapatita se lavaron con PBS. Las biopelículas se separaron con 1500 pl de tripsina-EDTA al 0,05 % durante 45 minutos a 37 °C y 230 rpm, después se transfirieron a tubos Eppendorf y se centrifugaron (6010 x g, durante 5 minutos). Después de eliminar la tripsina, el sedimento de la biopelícula se resuspendió en 500 pl de PBS, y la extracción del ADN se realizó según las instrucciones de Qiagen y se analizó mediante qPCR.
Resultados.Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3 y se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Desviación entre los valores de control y los valores de especies de biopelículas patógenas (a continuación en la memoria, 8) en presencia de la cepa Saccharomyces cerevisiae var boulardii I-3799 (Boulardii), la forma seca inactivada de la cepa Saccharomyces cerevisiae 1-3856 (IY)y la combinación de las mismas.
Estos resultados muestran que cada una de las dos cepas individualmente(Saccharomyces cerevisiae var boulardii (Boulardii)ySaccharomyces cerevisiaeinactivada (IY)) y la combinación de las mismas son capaces de inhibir significativamente el crecimiento de dos agentes patógenos periodontales,Aggregatibacter actinomycetemcomitanso Aa (A) yFusobacterium nucleatumo Fn (B) y la bacteria cariogénicaStreptococcus mutanso Sm (E). Asimismo, la Tabla 2 muestra que 8 de la combinación IYBoulardiies mayor que la suma de 8 IY y 8Boulardiiindividuales.
Según la Figura 3 (C), el crecimiento dePorphyromonas gingivaliso Pg (C) fue inhibido por la levaduraSaccharomyces cerevisiaeinactivada (IY), así como por la combinación, pero no significativamente por la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardii(Boulardii). Asimismo, se puede observar una diferencia significativa en la inhibición entre la levadura inactivada (IY) y la combinaciónBoulardii+ IY, lo que demuestra una acción sinérgica de la combinación sobre la inhibición del crecimiento dePorphyromonas gingivalis(C), que se confirma en la Tabla 2.
Según la Figura 3 (D), el crecimiento dePrevotella intermedia oPi (D) fue inhibido por la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardii,así como por la combinación, pero no significativamente por la levadura inactivada (IY). Asimismo, se puede observar una diferencia significativa en la inhibición entre la cepaBoulardiiy la combinaciónBoulardii+ IY, lo que demuestra una acción sinérgica de la combinación sobre la inhibición del crecimiento dePrevotella intermedia(D), que se confirma en la Tabla 2.
Conclusión.Por lo tanto, se ha demostrado que la combinación deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiy la levaduraSaccharomyces cerevisiaeseca inactivada induce la inhibición del crecimiento de la mayoría de los agentes patógenos en el modelo multiespecie utilizado, a diferencia de la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiiy la levaduraSaccharomyces cerevisiaeinactivada tomadas individualmente, que tienen un espectro de inhibición del crecimiento de los agentes patógenos bucales inferior.
Efectos antiinflamatorios de Saccharomyces cerevisiae var. boulardii I-3799
El objetivo del estudio que se presenta a continuación es evaluar los posibles efectos antiinflamatorios de la levaduraSaccharomyces cerevisiae var. boulardiiCNCM I-3799 sobre los parámetros inflamatorios de los monocitos humanos primarios y los fibroblastos gingivales.
A. Evaluación del potencial antiinflamatorio en monocitos primarios humanos
Estimulación y determinación de parámetros inflamatorios en monocitos primarios humanos.Los monocitos humanos primarios se aislaron y enriquecieron a partir de capas leucoplaquetarias de donantes de sangre humana sanos. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos (aproximadamente 500000 células/ml en 1 ml) para experimentos ELISA. Las células se incubaron con LPS (10 ng/ml) durante 24 horas. Muestras de levadura (5 dosis que varías de 4,3E6 UFC a 4,3E8 UFC/ml), o: 0,1 mg/ml; 1 mg/ml; 2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 10 mg/ml) se añadieron 30 minutos antes del tratamiento con LPS directamente al cultivo celular. La dexametasona se usó como control positivo (2 dosis, 1 |<j>M y 10<j>M). Después de 24 horas, se retiraron los sobrenadantes, se centrifugaron y se evaluaron las concentraciones de MCP-1, IL-8, IL-6, IL-10, isoprostano y PGE2. Las concentraciones en EIA (PGE2 e isoprostano, de Cayman) o ELISA (MCP-1, IL-6 e IL-8, de eBioscience) se evaluaron según los protocolos del fabricante. Cada dosis se estudió 6 veces utilizando capas leucoplaquetarias de 3 donantes diferentes (n = 2 por capa leucoplaquetaria, n = 6 en total).
Análisis estadístico.ANOVA unidireccional con ensayos de comparación múltiple de Dunnett a un nivel de significación de 0,5.
Resultados.Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4. Estos resultados muestran que la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiiCNCM I-3799 tiene un efecto antiinflamatorio dependiente de la dosis en los monocitos humanos primarios. Más específicamente, S.boulardiiCNCM I-3799 es capaz de inhibir la secreción de IL-6, IL-10, MCP-1,<p>G<e>-2 e isoprostano a una dosis de entre 2,5 mg/ml (1E8 UFC/ml) y 10 mg/ml (4,3E8 UFC/ml), mientras que la citocina IL-8 se inhibe a una dosis mínima de 10 mg/ml (4,3E8 UFC/ml). En dosis bajas (0,1 a 1 mg/ml o 4,3E6 a 4,3E7 UFC/ml), S.boulardiiCNCM I-3799 es capaz de estimular la secreción de la citocina antiinflamatoria IL-10, lo que sugiere un efecto de “ entrenamiento inmunitario” . En dosis superiores, la inhibición de las citocinas proinflamatorias y los marcadores de PGE-2/isoprostano indica un efecto antiinflamatorio y la inhibición de la vía de las prostaglandinas implicada en la aparición del dolor y la destrucción ósea.
B. Evaluación del potencial antiinflamatorio en fibroblastos gingivales primarios humanos
Medición de IL-8, IL-6, isoprostano y PGE2 en fibroblastos gingivales humanos primarios.Los cultivos de fibroblastos gingivales humanos primarios suministrados por Provitro (Berlín, Alemania) se mantuvieron según el protocolo del proveedor. Antes de la estimulación, las células se sembraron en placas de 24 pocillos para los experimentos ELISA. Las células se incubaron sin (control no estimulado) o con IL-1p (10 U/ml) durante 24 horas. Las muestras de levadura se añadieron 30 minutos antes del tratamiento con IL-1p en 5 dosis (0,1 mg/ml); 1 mg/ml; 2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 10 mg/ml) (n = 3). La dexametasona se usó como control positivo (1 dosis, 1 j M). Después de 24 horas, se recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron y las concentraciones de IL-6, IL-8, isoprostano y PGE2 se evaluaron mediante EIA (PGE2 e isoprostano, de Cayman) o ELISA (IL-6 e IL-8, de eBioscience) siguiendo el protocolo del fabricante. Cada dosis se estudió al menos 3 veces.
Resultados.Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 5. Estos resultados muestran que la cepaSaccharomyces cerevisiae var boulardiiCNCM I-3799 tiene un efecto antiinflamatorio dependiente de la dosis en los fibroblastos gingivales humanos primarios. Más específicamente, S.boulardiiCNCM I-3799 es capaz de inhibir la secreción de IL-6, IL-8, PGE-2 e isoprostano a una dosis de entre 1 mg/ml (4,3E7 UFC/ml) y 10 mg/ml (4,3E8 UFC/ml). La inhibición de las citocinas proinflamatorias y los marcadores de PGE-2/isoprostano indica un efecto antiinflamatorio y la inhibición de la vía de las prostaglandinas implicada en la aparición del dolor y la destrucción ósea.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae varboulardiidepositada el 21 de agosto de 2007 en la CNCM con el número I-3799, o
    combinación de dicha cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae,
    para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa de la cavidad bucal en un sujeto,caracterizada porquela enfermedad infecciosa es la caries dental, la gingivitis o la periodontitis.
  2. 2. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae,para su uso según la reivindicación 1,caracterizada porquela levaduraSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o la cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiide la combinación está en forma seca viva.
  3. 3. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2,caracterizada porquela cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiide la combinación es la cepa depositada el 21 de agosto de 2007 con la CNCM con el número I-3799.
  4. 4. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,caracterizada porquela cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaees la cepa depositada el 17 de octubre de 2007 en la CNCM con el número I-3856.
  5. 5. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,caracterizada porquela cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o la combinación está comprendida en un suplemento alimenticio.
  6. 6. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según la reivindicación 5,caracterizada porqueel suplemento alimenticio está en forma de una pastilla, un dulce, una goma de mascar, un polvo bucodispersable o un polvo para diluir en agua en forma de una barra o sobre, una tableta o un comprimido masticable, una goma de mascar, una cápsula, un comprimido, gotas o un vial con tapón dosificador.
  7. 7. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,caracterizada porquela cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o la combinación está comprendida en una composición parafarmacéutica o cosmética.
  8. 8. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según la reivindicación 7,caracterizada porquela composición parafarmacéutica o cosmética está en forma de pasta de dientes, un colutorio, un aerosol bucal, una crema o gel bucal, una lámina bucodispersable, un polvo destinado a rociarse directamente en la cavidad bucal, un polvo bucodispersable o un polvo para diluir en agua en forma de una barra o sobre, un vial con tapón dosificador, etc.
  9. 9. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,caracterizada porquela cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o la combinación está comprendida en una composición farmacéutica, comprendiendo la composición farmacéutica una cantidad eficaz de la cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardii1-3799, o la combinación definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un excipiente fisiológicamente aceptable.
  10. 10. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según la reivindicación 9,caracterizada porquela composición farmacéutica está destinada a la administración tópica o a la administración bucal.
  11. 11. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según la reivindicación 9 o la reivindicación 10,caracterizada porquela composición farmacéutica comprende además al menos un ingrediente activo farmacéutico adicional que tiene un efecto calmante, antiirritante, analgésico, contra el dolor, antiinflamatorio, cicatrizante, antibiótico, antipirético o antifúngico.
  12. 12. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,caracterizada porquela cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o la combinación está comprendida en un producto sanitario dental.
  13. 13. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según la reivindicación 12,caracterizada porqueel producto sanitario dental es un implante dental, una corona dental, un puente dental, una incrustación dental o una prótesis dental.
  14. 14. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13,caracterizada porquela enfermedad infecciosa de la cavidad bucal está causada por bacterias periodontopatógenas y/o cariopatógenas.
  15. 15. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según la reivindicación 14,caracterizada porquelas bacterias periodontopatógenas se seleccionan de entreAggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermediay/o la bacteria cariopatógena esStreptococcus mutans.
  16. 16. Cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiiI-3799 o combinación de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiae var boulardiicon la forma seca inactivada de una cepa de levadura deSaccharomyces cerevisiaepara su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15,caracterizada porquela enfermedad infecciosa de la cavidad bucal es un efecto secundario de un tratamiento médico, oporquela enfermedad infecciosa de la cavidad bucal está presente o es probable que se desarrolle o reaparezca en un paciente que padece inmunovulnerabilidad, oporqueel sujeto es una mujer embarazada, una persona mayor, un niño o un paciente con un fenotipo hiperinflamatorio.
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