ES3040431T3 - Reducing systemic regulatory t cell levels or activity for treatment of disease and injury of the cns - Google Patents

Reducing systemic regulatory t cell levels or activity for treatment of disease and injury of the cns

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ES3040431T3
ES3040431T3 ES15731728T ES15731728T ES3040431T3 ES 3040431 T3 ES3040431 T3 ES 3040431T3 ES 15731728 T ES15731728 T ES 15731728T ES 15731728 T ES15731728 T ES 15731728T ES 3040431 T3 ES3040431 T3 ES 3040431T3
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mice
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cells
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Michal Eisenbach-Schwartz
Kuti Baruch
Neta Rosenzweig
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Yeda Research and Development Co Ltd
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Abstract

Se proporciona una composición farmacéutica que contiene un principio activo que reduce el nivel de inmunosupresión sistémica en un individuo para el tratamiento de enfermedades, trastornos, afecciones o lesiones del sistema nervioso central (SNC), con excepción de la esclerosis múltiple remitente-recurrente (EMRR), una enfermedad neuroinflamatoria autoinmune. La composición farmacéutica se administra mediante un régimen de dosificación que comprende al menos dos ciclos de tratamiento, cada uno de los cuales consta de una sesión de tratamiento seguida de una sesión de descanso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Reducción de la actividad o los niveles de células T reguladoras sistémicas para el tratamiento de enfermedades y lesiones del SNC
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a métodos y composiciones para tratar enfermedades, trastornos, afecciones o lesiones del sistema nervioso central (SNC) mediante la reducción transitoria del nivel de inmunosupresión sistémica en la circulación.
Antecedentes de la invención
La mayoría de las patologías del sistema nervioso central (SNC) comparten un componente neuroinflamatorio común, que forma parte de la evolución de la enfermedad, y contribuye a la intensificación de la enfermedad. Entre estas patologías está la enfermedad de Alzheimer (AD), una enfermedad neurodegenerativa relacionada con la edad caracterizada por la pérdida progresiva de la memoria y las funciones cognitivas, en la que se sugirió que la acumulación de agregados de péptidos amiloides-beta (Ap) desempeña una función clave en la cascada inflamatoria dentro del SNC, que finalmente conduce a daño neuronal y destrucción tisular (Akiyamaet al.,2000; Hardy y Selkoe, 2002; Vom Berget al.,2012). A pesar de la respuesta neuroinflamatoria crónica en las enfermedades neurodegenerativas, los estudios clínicos y preclínicos durante la última década, que investigan las terapias basadas en inmunosupresión en las enfermedades neurodegenerativas, han planteado la cuestión de por qué los fármacos antiinflamatorios no están a la altura (Breitneret al.,2009; Groupet al.,2007; Wyss-Coray y Rogers, 2012). Los presentes inventores proporcionan una novedosa respuesta que supera los inconvenientes de las terapias existentes de la AD y enfermedades y lesiones similares del sistema nervioso central; este método se basa en la singular comprensión de los presentes inventores de la función de los diferentes componentes del sistema inmunitario sistémico y central en el mantenimiento y la reparación del SNC.
Sumario de la divulgación
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnósticoin vivose refiere a los compuestos, a las composiciones farmacéuticas y a los medicamentos de la presente invención para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnósticoin vivo.
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica tal como se define en la reivindicación independiente 1 que comprende un agente activo para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un individuo, en donde el agente activo se selecciona de un anticuerpo anti-PD-1 neutralizante, un anticuerpo anti-PD-LI neutralizante, y un anticuerpo anti-TIM-3 neutralizante, y la composición farmacéutica es para su administración mediante una pauta posológica que comprende al menos dos tandas de terapia, comprendiendo cada tanda de terapia en secuencia una sesión de tratamiento que comprende la administración de la composición farmacéutica al individuo, seguida de una sesión que no es de tratamiento en la que no se administra la composición farmacéutica al individuo,
en donde
la sesión que no es de tratamiento dura entre dos semanas y seis meses, y
cuando la sesión de tratamiento comprende una administración repetida:
la composición farmacéutica se administra durante la sesión de tratamiento una vez al día, o una vez cada dos, tres, cuatro, cinco, o seis días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas;
la sesión de tratamiento dura entre 3 días y cuatro semanas; y
la sesión que no es de tratamiento es más larga que el periodo entre administraciones repetidas durante la sesión de tratamiento.
En la presente divulgación, las realizaciones referentes a una enfermedad, un trastorno, una afección o una lesión del sistema nervioso central (SNC) diferente de la enfermedad de Alzheimer, las realizaciones referentes a un agente activo diferente de un anticuerpo anti-PD-1 neutralizante, un anticuerpo anti-PD-LI neutralizante, y un anticuerpo anti-TIM-3 neutralizante y las realizaciones referentes a una pauta posológica diferente de la expuesta en el párrafo anterior no están abarcadas por la redacción de las reivindicaciones, pero se consideran útiles para la comprensión de la invención.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A-B representan la actividad del plexo coroideo (CP) a lo largo de la evolución de la enfermedad en el modelo de ratón transgénico 5XFAD de AD (AD-Tg). (A) Niveles de expresión de ARNm para los genesicaml,vcaml, cxcl10yccl2,medidos por RT-qPCR, en CP aislados de ratones AD-Tg de 1, 2, 4 y 8 meses de edad, mostrados como cambio en veces en comparación con controles WT de la misma edad (n = 6-8 por grupo; prueba de la t de Student para cada punto de tiempo). (B) Imágenes microscópicas representativas de CP de ratones AD-Tg de 8 meses de edad y controles WT de la misma edad, inmunoteñidos para la molécula de unión apretada epitelial claudina-1, tinción nuclear de Hoechst, y el ligando de integrina ICAM-1 (barra de escala, 50 pm). En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
Las figuras 2A-C muestran (A) cuantificación de la inmunorreactividad de ICAM-1 en el CP cadavérico humano de pacientes jóvenes y maduros sin enfermedad del SNC y con AD (n = 5 por grupo; ANOVA unidireccional seguido de análisisa posterioride Newman-Keuls); (B) análisis de citometría de flujo para células inmunitarias que expresan IFN-y (teñidas intracelularmente, y preseleccionadas en CD45) en los CP de ratones AD-Tg de 8 meses de edad y controles WT de la misma edad. El histograma sombreado representa el control de isotipo (n = 4-6 por grupo; prueba de la t de Student); y (C) niveles de expresión de ARNm deifn-%medidos por RT-qPCR, en tejidos del CP aislados de ratones AD-Tg de 4 y 8 meses de edad, en comparación con los controles WT de la misma edad (n = 5-8 por grupo; prueba de la t de Student para cada punto de tiempo). En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
Las figuras 3A-B representan (A) gráficos de citometría de flujo representativos de las frecuencias de esplenocitos CD4+Foxp3+ (preseleccionadas en TCRp) en ratones AD-Tg y controles WT de 8 meses de edad; y (B) análisis cuantitativo de esplenocitos de ratones AD-Tg y controles WT de 1, 2, 4 y 8 meses de edad (n = 6-8 por grupo; prueba de la t de Student para cada punto de tiempo). En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
La figura 4 muestra la estrategia de selección periódica y gráficos de citometría de flujo representativos de esplenocitos de ratones AD-Tg/Foxp3-DTR+/_, 1 día después de la última inyección de DTx. Se inyectó DTx por vía i.p. durante 4 días constitutivos, logrando ~99 % de agotamiento de células Foxp3+.
Las figuras 5A-G muestran los efectos del agotamiento transitorio de Treg en ratones AD-Tg. (A) AD-Tg/Foxp3-DTR+ (que expresan el transgén DTR) y un grupo de control de crías de la misma camada AD-Tg que no expresan DTR (AD-Tg/Foxp3-DTR‘) se trataron con DTx durante 4 días constitutivos. Niveles de expresión de ARNm del CP para los genesicaml, cxcl10yccl2,medidos por RT-qPCR, en ratones AD-Tg de 6 meses de edad tratados con DTx, 1 día después de la última inyección de DTx (n = 6-8 por grupo; prueba de la t de Student). (B-D) Análisis de citometría de flujo del parénquima cerebral (excluyendo el plexo coroideo, que fue extirpado por separado) de ratones AD-Tg de 6 meses de edad tratados con DTx y controles, 3 semanas después de la última inyección de DTx. Análisis de citometría de flujo cuantitativo que muestra el número aumentado de células T CD4+ y mo-MO CD11balto/CD45alto (B), y gráfico de citometría de flujo representativo (C) y análisis cuantitativo (D) de las frecuencias de Treg CD4+Foxp3+, en el parénquima cerebral de ratones AD-Tg/Foxp3-DTR+ y controles AD-Tg/Foxp3-DTR'tratados con DTx (n = 3-7 por grupo; prueba de la t de Student). (E) Niveles de expresión de ARNm defoxp3eil10en el parénquima cerebral de AD-Tg/Foxp3-DTR+ y controles AD-Tg/Foxp3-DTR' de 6 meses de edad tratados con DTx, 3 semanas después de la última inyección de DTx (n = 6-8 por grupo; prueba de la t de Student). (F) Análisis cuantitativo de la inmunotinción de GFAP, que muestra astrogliosis reducida en secciones hipocámpicas de ratones AD-Tg/Foxp3-DTR+ y controles AD-Tg/Foxp3-DTR' de 6 meses de edad tratados con DTx, 3 semanas después de la última inyección de DTx (barra de escala, 50 pm; n = 3-5 por grupo; prueba de la t de Student). (G) Niveles de expresión de ARNm deil-12p40ytnf-aen el parénquima cerebral, 3 semanas después de la última inyección de DTx (n = 6-8 por grupo; prueba de la t de Student). En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
Las figuras 6A-E muestran el efecto del agotamiento transitorio de Treg sobre el rendimiento de aprendizaje/memoria de placas Ap. (A) Imágenes microscópicas representativas y (B) análisis cuantitativo de los cerebros de ratones AD-Tg/Foxp3-DTR+ y controles AD-Tg/Foxp3-DTR' de 5 meses de edad tratados con DTx, 3 semanas después de la última inyección de DTx, inmunoteñidos para placas Ap y tinción nuclear de Hoechst (barra de escala, 250 pm). Se cuantificaron el área media de placas Ap y los números de placas en la circunvolución dentada (DG) hipocámpica y la 5' capa de la corteza cerebral (en cortes de cerebro de 6 pm; n = 5-6 por grupo; prueba de la t de Student). Las figuras 6C-E muestran el rendimiento de la prueba del laberinto de agua de Morris (MWM) de ratones AD-Tg/Foxp3-DTR+ y controles de 6 meses de edad tratados con DTx, 3 semanas después de la última inyección de DTx. Después del agotamiento transitorio de Treg, los ratones AD-Tg mostraron un mejor rendimiento de aprendizaje/memoria espacial en las fases de adquisición (C), sondeo (D) e inversión (E) del MWM, con respecto a los controles AD-Tg (n = 7-9 por grupo; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de análisis aposterioride Bonferroni para las comparaciones de pares individuales; *, P <0,05 para adquisición, sondeo, e inversión globales). En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
La figura 7 muestra los niveles de expresión de ARNm deifn-%medidos por RT-qPCR, en los CP aislados de ratones APP/PS1 AD-Tg de 6 y 12 meses de edad (un modelo de ratón para la enfermedad de Alzheimer (véase la sección Materiales y métodos)), en comparación con controles WT de la misma edad (n = 5-8 por grupo; prueba de la t de Student). Las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05.
Las figuras 8A-I muestran el efecto terapéutico de la administración de acetato de glatiramer (GA) semanalmente en ratones AD-Tg. (A) Representación esquemática del régimen de tratamiento con GA semanal. A los ratones (de 5 meses de edad) se les inyectó por vía s.c. GA (100 |jg), dos veces durante la primera semana (en los días 1 y 4), y una vez a la semana después de eso, durante un periodo total de 4 semanas. Los ratones se examinaron para determinar el rendimiento cognitivo, 1 semana (MWM), 1 mes (RAWM) y 2 meses (RAWM, usando diferentes configuraciones espaciales experimentales) después de la última inyección, y para determinar la inflamación hipocámpica. Las figuras 8B-D muestran los niveles de expresión de ARNm de los genes en el hipocampo de ratones AD-Tg no tratados y ratones AD-Tg tratados con GA semanal, a la edad de 6 meses, mostrando (B) una expresión reducida de citocinas proinflamatorias tales como TNF-a, IL-1p e IL-12p40, una elevación de (C) las citocinas antiinflamatorias IL-10 y TGF-p, y (D) los factores neurotrópicos IGF-1 y BDN<f>, en ratones tratados con GA semanal (n = 6-8 por grupo; prueba de la t de Student). En las figuras 8E-G, los ratones AD-Tg (de 5 meses de edad) se trataron con GA semanal o con vehículo (PBS), y se compararon con crías de la misma camada WT de la misma edad en la tarea de MWM a la edad de 6 meses. Los ratones tratados mostraron un mejor rendimiento de aprendizaje/memoria espacial en las fases de adquisición (E), sondeo (F) e inversión (G) del MWM, con respecto a los controles (n = 6-9 por grupo; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de análisisa posterioride Bonferroni para las comparaciones de pares individuales). Las figuras 8H-I muestran el rendimiento cognitivo de los mismos ratones en la tarea de RAWM, 1 mes (H) o 2 meses (I) después de la última inyección de GA (n = 6-9 por grupo; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de análisisa posterioride Bonferroni para las comparaciones de pares individuales). Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes. En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
Las figuras 9A-H muestran efectos terapéuticos adicionales de la administración de GA semanal en ratones AD-Tg. Las figuras 9A-B muestran ratones 5XFAD AD-Tg que se trataron con GA semanal, o vehículo (PBS), y se examinaron al final de la 1a semana del régimen de administración (después de un total de dos inyecciones de GA). Análisis de citometría de flujo para las frecuencias de esplenocitos CD4+Foxp3+ (A), y células inmunitarias que expresan IFN-y en el CP (B; teñidas intracelularmente y preseleccionadas en CD45), en ratones AD-Tg de 6 meses de edad tratados, en comparación con controles WT de la misma edad (n = 4-6 por grupo; ANOVA unidireccional seguido de análisisa posterioride Newman-Keuls). (C) Niveles de expresión de ARNm para los genesicaml, cxcl10yccl2,medidos por RT-qPCR, en los CP de ratones AD-Tg de 4 meses de edad, tratados con GA semanal o vehículo, y examinados al final de la 1a o 4a semana del régimen de GA semanal (n = 6-8 por grupo; ANOVA unidireccional seguido de análisisa posterioride Newman-Keuls). Las figuras 9D-E muestran imágenes representativas de secciones de cerebro de quimeras de BM AD-Tg/CX<3>CR1GFP/+ después de GA semanal. Se localizaron células CX<3>CR1GFP en el CP del tercer ventrículo (3V; i), los espacios ventriculares adyacentes (ii) y el CP de los ventrículos laterales (LV; iii) en ratones AD-Tg tratados con GA semanal (D; barra de escala, 25 jm). Proyecciones ortogonales representativas de apilamientos del eje z confocales, que muestran la colocalización de células GFP+ con el marcador mieloide CD68 en el CP de ratones AD-Tg/CX<3>CR1GFP/+ de 7 meses de edad tratados con GA semanal, pero no en ratones AD-Tg/CX<3>CR1GFP/+ tratados con PBS de control (E; barra de escala, 25 jm). (F) Las células CX3CR1<gfp>se colocalizan con el marcador mieloide IBA-1 en los cerebros de ratones AD-Tg/CX<3>CR1GFP/+ tratados con GA en las proximidades de las placas Ap, y que coexpresan el marcador mieloide IBA-1 (barra de escala, 25 jm). Las figuras 9G-H muestran gráficos de citometría de flujo representativos de células aisladas del hipocampo de ratones WT, AD-Tg no tratados y AD-Tg de 4 meses de edad, en la 2a semana del régimen de GA semanal. Se seleccionaron mo-MO CD11balto/CD45alto (G) y se cuantificaron (H, n = 4-5 por grupo; ANOVA unidireccional seguido de análisisa posterioride Newman-Keuls). En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
Las figuras 10A-H representan el efecto terapéutico de la administración de un inhibidor de p300 (C646) en ratones AD-Tg. En las figuras 10A-B, se trataron ratones maduros (de 18 meses de edad) con p300i o vehículo (DMSO) durante un periodo de 1 mes, y se examinaron un día después del cese del tratamiento. Gráficos de citometría de flujo representativos que muestran la elevación en las frecuencias de células T CD4+ que expresan IFN-y en el bazo (A), y los números de células inmunitarias que expresan IFN-y en el CP (B), después del tratamiento con p300i. Las figuras 10C-E muestran imágenes microscópicas representativas (C), y el análisis cuantitativo, de la carga de placas Ap en los cerebros de ratones AD-Tg de 10 meses de edad, que recibieron p300i o vehículo (DMSO) durante un periodo de 1 semana, y posteriormente se examinaron después de 3 semanas adicionales. Los cerebros se inmunotiñeron para placas Ap y por tinción nuclear de Hoechst (n = 5 por grupo; barra de escala, 250 jm). Se cuantificaron el área media de placas Ap y los números de placas en la DG hipocámpica (D) y la 5a capa de la corteza cerebral (E) (en cortes de cerebro de 6 jm; n = 5-6 por grupo; prueba de la t de Student). (F) Representación esquemática del régimen de administración del tratamiento con p300i (o DMSO como vehículo) para los diferentes grupos de ratones AD-Tg a la edad de 7 meses, en 1 ó 2 sesiones. Las figuras 10G-H muestran el cambio medio del porcentaje de cobertura de placas Ap de la corteza cerebral (5a capa) (G), y el cambio en los niveles medios de las proteínas Ap-M0 y Ap-M2 solubles cerebrales (H), con respecto al grupo de AD-Tg no tratados (nivel medio de Ap-M0 y Ap! .42 en el grupo no tratado, 90,5 ± 11,2 y 63,8 ± 6,8 pg/mg de porción total, respectivamente; n = 5-6 por grupo; ANOVA unidireccional seguido de análisisa posterioride Newman-Keuls). En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
Las figuras 11A-B muestran el efecto terapéutico de la administración de anticuerpo anti-PD1 en ratones AD-Tg. (A) Representación esquemática de los grupos experimentales de ratones, su edad, regímenes de administración del tratamiento, y el punto de tiempo en el que se examinaron los ratones. A los 10 meses de edad, a los ratones transgénicos (Tg) 5XFAD con enfermedad de Alzheimer (AD) se les inyectó por vía i.p. 250 |jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14) o anticuerpo IgG de control (rata), el día 1 y el día 4 del experimento, y se examinaron 3 semanas después para determinar su rendimiento cognitivo mediante la tarea de aprendizaje y memoria espacial en el laberinto de agua de brazos radiales (RAWM). Se usaron ratones AD-Tg y WT no tratados de la misma edad como controles. La figura 11B muestra el rendimiento cognitivo, tal como se evalúa mediante la tarea de aprendizaje y memoria espacial en el laberinto de agua de brazos radiales (RAWM). Los datos se analizaron usando ANOvA bidireccional de medidas repetidas, y se usó el procedimientoa posterioride Bonferroni para el seguimiento de la comparación por pares. n = 6-12 por grupo. En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
Las figuras 12A-B muestran el efecto sistémico sobre células T que producen IFN-y de la administración del anticuerpo anti-PD1 en ratones AD-Tg. (A) Representación esquemática de los grupos experimentales de ratones, su edad, regímenes de administración del tratamiento, y el punto de tiempo en el que se examinaron los ratones. A los ratones se les inyectó por vía i.p. 250 jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14) o anticuerpo IgG de control (rata), el día 1 y el día 4 del experimento, y se examinaron el día 7. (B) Análisis de citometría de flujo para las frecuencias de esplenocitos de células T CD4+IFN-y+ (células teñidas intracelularmente y preseleccionadas en CD45 y TCR-p), en ratones AD-Tg tratados con PD-1 o IgG, y controles WT y AD-Tg no tratados (n = 4-6 por grupo; ANOVA unidireccional seguido de análisisa posterioride Newman-Keuls; **, P <0,01 entre los grupos tratados indicados; las barras de error representan la media ± e.e.m.).
Las figuras 13A-B muestran el efecto sobre el CP después del tratamiento con anticuerpo anti-PD1 en ratones AD-Tg. Los ratones AD-Tg a la edad de 10 meses se trataron con PD-1, IgG, o se dejaron sin tratar. A los ratones se les inyectó por vía i.p. 250 jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14) o anticuerpo IgG de control (rata), el día 1 y el día 4 del experimento, y se examinaron el día 7. (A) Niveles de IFN-yen el CP, tal como se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), correlacionados positivamente (r de Pearson = 0,6284, P <0,05) y correlacionados negativamente con las frecuencias de esplenocitos de células T CD4+IFN-y+, tal como se midieron por citometría de flujo. Se observó una tendencia negativa opuesta en los mismos ratones, cuando los niveles de IFN-y en el CP se compararon con las frecuencias de esplenocitos de Treg CD4+Foxp3+CD25+ (n = 3-4 por grupo). (B) Niveles de expresión de ARNm para los genescxcl10yccl2,medidos por RT-qPCR, en los CP de los mismos ratones (n = 3-4 por grupo; ANOVA unidireccional seguido de análisisa posterioride Newman-Keuls). En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05.
Las figuras 14A-B muestran el efecto terapéutico de la administración de anticuerpo anti-PD1 en ratones AD-Tg, cuando se comparan una frente a dos tandas de tratamiento. La mitad de los ratones en el grupo de ratones descritos en las figuras 11A-B, los cuales recibieron una tanda de tratamiento con anticuerpo anti-PD1, recibieron otra tanda de tratamiento con anticuerpo anti-PD1 tras la primera tarea de RAWM, o se dejaron sin tratar. Después de 3 semanas adicionales, todos los ratones se sometieron a prueba mediante RAWM usando configuraciones experimentales nuevas y diferentes de señales espaciales para la memoria y el aprendizaje cognitivo. (A) Representación esquemática de los grupos experimentales de ratones, su edad, regímenes de administración del tratamiento, y el punto de tiempo en el que se examinaron los ratones. Para cada tanda de tratamiento, a los ratones se les inyectó por vía i.p. 250 |jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14) o anticuerpo IgG de control (rata). La figura 14B muestra el rendimiento cognitivo, tal como se evalúa mediante la tarea de aprendizaje y memoria espacial del RAWM. Los datos se analizaron usando ANOVA bidireccional de medidas repetidas, y se usó el procedimientoa posterioride Bonferroni para el seguimiento de la comparación por pares. n = 6-12 por grupo. En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
Las figuras 15A-H muestran el efecto adverso sobre la patología de la AD de los niveles de Treg sistémicas aumentados por el ácido retinoico todo trans (ATRA). Las figuras 15A-B muestran gráficos de citometría de flujo representativos (A), y el análisis cuantitativo (B), que muestran la elevación en las frecuencias de esplenocitos de Treg CD4+/Foxp3+/CD25+ en ratones AD-Tg de 5 meses de edad, que recibieron ATRA o vehículo (DMSO) durante un periodo de 1 semana (n = 5 por grupo; prueba de la t de Student). Las figuras 15C-F muestran imágenes microscópicas representativas (C), y el análisis cuantitativo (D, E, F), de la carga de placas Ap y la astrogliosis en los cerebros de ratones AD-Tg, que a la edad de 5 meses se trataron con ATRA o vehículo (DMSO) durante un periodo de 1 semana, y posteriormente se examinaron después de 3 semanas adicionales. Los cerebros se inmunotiñeron para placas Ap, GFAP (marcaje de astrogliosis), y por tinción nuclear de Hoechst (n = 4-5 por grupo; barra de escala, 250 jm). Se cuantificaron el área media de placas Ap y los números de placas en la DG hipocámpica y la 5a capa de la corteza cerebral, y se midió la inmunorreactividad de GFAP en el hipocampo (en cortes de cerebro de 6 jm; n = 5-6 por grupo; prueba de la t de Student). (G) Niveles de AP<1-40>y AP<1-42>solubles, cuantificados por ELISA, en el parénquima cerebral de ratones AD-Tg, que a la edad de 5 meses se trataron con ATRA o vehículo (DMSO) durante un periodo de 1 semana, y posteriormente se examinaron después de 3 semanas adicionales (n = 5-6 por grupo; prueba de la t de Student). (H) Rendimiento cognitivo en la tarea de RAWM de los ratones AD-Tg que a la edad de 5 meses se trataron con ATRA o vehículo (DMSO) durante un periodo de 1 mes, y posteriormente se examinaron después de 3 semanas adicionales (n = 5 por grupo; ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido del procedimientoa posterioride Bonferroni para las comparaciones de pares individuales). En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
Las figuras 16A-F muestran el efecto adverso sobre la patología de la AD de los niveles de Treg sistémicas aumentados por la administración de GA semanal. (A) Representación esquemática del régimen de tratamiento con GA diario en comparación con el régimen de GA semanal. En el grupo tratado con GA diario, a los ratones se les inyectó por vía s.c. diariamente 100 |jg de GA durante un periodo de 1 mes. (B) Rendimiento cognitivo de los ratones AD-Tg de 7 meses de edad tratados con GA diario y con GA semanal, en comparación con los ratones AD-Tg no tratados y WT de la misma edad, tal como se evaluó por los números promedio de errores por día en la tarea de aprendizaje y memoria del RAWM (n = 6-8 por grupo; ANOVA unidireccional seguido de análisisa posterioride Newman-Keuls). (C) Imágenes microscópicas representativas de la corteza cerebral y el hipocampo (HC) de ratones AD-Tg no tratados, y ratones AD-Tg tratados con GA diario o semanalmente, inmunoteñidos para placas Ap y por tinción nuclear de Hoechst (barra de escala, 250 jm). Las figuras 16D-F muestran la cuantificación del tamaño y los números de placas Ap (en cortes de 6 jm ) en ratones AD-Tg tratados con GA (grupos tratados con GA diario o con GA semanal) y no tratados. Los ratones AD-Tg tratados con GA semanal mostraron una reducción en la carga de placas Ap como un porcentaje del área total de su circunvolución dentada (DG) hipocámpica, y en los números medios de placas Ap (n = 6 por grupo; ANOVA unidireccional seguido de análisisa posterioride Newman-Keuls). En todos los paneles, las barras de error representan la media ± e.e.m.; *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.
Descripción detallada
Se ha encontrado según la presente invención que un agotamiento transitorio a corto plazo de las células T reguladoras (Treg) Foxp3+ en un modelo de ratón de enfermedad de Alzheimer (ratones AD-Tg) da como resultado el reclutamiento mejorado de leucocitos al SNC a través del plexo coroideo del cerebro, números elevados de células T CD4+ y mo-MO de macrófagos derivados de monocitos antiinflamatorios e infiltrantes en el SNC, y un enriquecimiento notable de Treg Foxp3+ que se acumulan dentro del cerebro. Además, el efecto a largo plazo de una sola sesión de tratamiento llevó a una reducción en la gliosis hipocámpica y niveles de expresión de ARNm reducidos de citocinas proinflamatorias dentro del cerebro. De modo importante, el efecto sobre la patología de la enfermedad incluye una carga reducida de placas amiloides beta (Ap) cerebrales en la circunvolución dentada hipocámpica y la corteza cerebral (5a capa), dos regiones del cerebro que exhiben patología robusta de placas Ap en los ratones AD-Tg. De modo muy importante, el agotamiento transitorio a corto plazo de Treg va seguido de una mejora drástica en el aprendizaje y la memoria espacial, alcanzando un rendimiento cognitivo similar al de los ratones de tipo silvestre (ejemplos 2 y 3). Considerados en conjunto, estos hallazgos demuestran que una corta sesión de agotamiento de Treg, seguido de un periodo de ninguna intervención, da como resultado una interrupción transitoria de la inmunosupresión sistémica mediada por Treg en los ratones AD-Tg, lo cual permite el reclutamiento de células que resuelven la inflamación, mo-MO y Treg, al cerebro, y conduce a la resolución de la respuesta neuroinflamatoria, la depuración de Ap, y la inversión del deterioro cognitivo. Estos hallazgos se sostienen firmemente en contra del sentido común en este campo de investigación, según el cual el aumento de la inmunosupresión sistémica daría como resultado la mitigación de la respuesta neuroinflamatoria. Por el contrario, los hallazgos de los presentes inventores muestran que se necesita el refuerzo de la respuesta sistémica, mediante una reducción a corto plazo, breve y transitoria, en la supresión sistémica mediada por Treg, para lograr la acumulación de células inmunitarias que resuelven la inflamación, incluyendo las propias Treg, dentro del cerebro, combatiendo así la patología de la AD.
La especificidad del enfoque de los inventores presentado en el presente documento ha sido sustanciada mediante el uso de varios paradigmas experimentales independientes, tal como se detalla a continuación. En resumen, en primer lugar los inventores usaron un compuesto inmunomodulador en dos regímenes de administración diferentes que condujeron a efectos opuestos sobre los niveles de Treg periféricas, sobre la activación del CP, y sobre la patología de la enfermedad; un régimen de administración diario que aumenta los niveles de Treg periféricas (Weberet al.,2007), y un régimen de administración semanal, que encontraron que reducen los niveles de Treg periféricas (ejemplo 3 y ejemplo 5). Los inventores también proporcionan un vínculo funcional directo entre los niveles de Treg periféricas y la patología de la enfermedad cuando se demuestra en ratones AD-Tg, ya sea por el agotamiento genético transitorioin vivode Treg (ejemplo 2) o por la inhibición farmacológica de su función de Foxp3 (ejemplos 3 y 4), que estas manipulaciones dan como resultado la activación del CP para facilitar el tráfico de los leucocitos hacia el SNC, la acumulación de células inmunitarias que resuelven la inflamación en sitios de la patología, la depuración de las placas Ap cerebrales, y el sesgo del ambiente inmunológico del parénquima cerebral hacia la resolución de la inflamación.
Se ha encontrado además según la presente invención que la administración poco frecuente de un antígeno universal, el copolímero 1, durante un periodo de tiempo limitado (que representa una sesión de tratamiento) reduce la inmunosupresión sistémica mediada por Treg, y mejora la infiltración selectiva de los leucocitos en el SNC al aumentar la actividad de puerta de entrada del plexo coroideo del cerebro, que conduce a un efecto beneficioso drástico en la patología de la enfermedad de Alzheimer (ejemplo 3), mientras que la administración diaria del copolímero 1, que potencia la inmunosupresión de Treg (Honget al.,2005; Weberet al.,2007), no mostró ningún efecto beneficioso, o incluso cierto efecto perjudicial modesto, sobre la patología de la enfermedad (ejemplo 5). Los inventores de la presente invención muestran adicionalmente en el presente documento que la interferencia directa con la actividad de Treg Foxp3, ya sea por la inhibición de p300 con un inhibidor de molécula pequeña específico (p300i), o la interacción con el receptor PD-1 mediante un anticuerpo anti-PD-1, mejora la actividad de puerta de entrada del plexo conoideo en los ratones AD-Tg, y mitiga la patología de la enfermedad de Alzheimer (ejemplo 4).
De modo importante, cada uno de estos ejemplos proporcionados por los inventores demuestra una intervención diferente que provoca una reducción a corto plazo en la inmunosupresión sistémica: el copolímero 1 actúa como compuesto inmunomodulador, p300i como molécula pequeña que disminuye la acetilación de Foxp3 y la función de Treg, y el anticuerpo anti-PD-1 se usa como anticuerpo neutralizante para PD-1 expresado en Treg. Estos enfoques terapéuticos se usaron para una corta sesión de tratamiento que aumentó de manera transitoria la respuesta inmunitaria en la periferia, principalmente por la elevación de los niveles de IFN-y periférico y células que producen IFN-y, activando así el plexo coroideo del cerebro que permite la infiltración selectiva de células T y monocitos en el SNC, y el retorno de estas células hacia los sitios de patología y neuroinflamación. También se encontró en el presente documento que las sesiones de tratamiento repetidas interrumpidas por sesiones de intervalo que no son de tratamiento mejoran drásticamente la eficacia del tratamiento con respecto a una sola sesión de tratamiento (ejemplo 4). El siguiente intervalo de tiempo que no es de tratamiento permitió el aumento transitorio en los niveles y las actividades de Treg dentro del cerebro, facilitando la resolución de la neuroinflamación, e induciendo condiciones ambientales a favor de la curación y reparación del SNC, que conducen posteriormente a la recuperación de los tejidos. En cada uno de estos casos, el efecto sobre la patología del cerebro fue robusto, implicando la resolución de la respuesta neuroinflamatoria, la depuración de placas amiloides beta a partir del cerebro de ratones con AD, y la inversión del deterioro cognitivo. La especificidad del enfoque actual ha sido sustanciada adicionalmente usando un modelo genético de agotamiento transitorio de células T reguladoras Foxp3+, en el modelo de ratón transgénico de AD (ejemplo 2).
Así, se ha encontrado según la presente invención que la inmunosupresión mediada por Treg Foxp3+CD4+ sistémicas interfiere con la capacidad para combatir la patología de la AD, actuando al menos en parte mediante la inhibición de la activación del CP dependiente de IFN-y, necesaria para orquestar el reclutamiento de los leucocitos que resuelven la inflamación al<s>N<c>(Schwartz y Baruch, 2014b). Las Treg sistémicas son cruciales para el mantenimiento de la homeostasis autoinmunitaria y la protección frente a las enfermedades autoinmunitarias (Kimet al.,2007). Sin embargo, los hallazgos de los presentes inventores sugieren que, en condiciones neurodegenerativas, cuando se necesita una respuesta inmunitaria reparadora en el cerebro, la capacidad para montar esta respuesta es interferida por las Treg sistémicas. Sin embargo, según los resultados de los presentes inventores, las Treg son necesarias dentro del cerebro, retornan hacia los sitios de la neuropatología, y realizan localmente una actividad antiinflamatoria. La presente invención representa una solución singular e inesperada para las necesidades contradictorias aparentes a la hora de combatir la muerte neuronal progresiva como en la AD, reduciendo/inhibiendo de manera transitoria las Treg en la circulación en pro de aumentar las Treg en el cerebro enfermo. Por tanto, una reducción transitoria y a corto plazo en la inmunosupresión periférica, que permite el reclutamiento de células antiinflamatorias, incluyendo Treg y mo-MO, a los sitios de las placas cerebrales, conduce a un efecto a largo plazo sobre la patología. Notablemente, sin embargo, una reducción transitoria de los niveles o las actividades de Treg sistémicas puede contribuir a la mitigación de la enfermedad por medio de mecanismos adicionales, incluyendo el soporte de una respuesta autoinmunitaria protectora específica del SNC (Schwartz y Baruch, 2014a), o el aumento de los niveles de monocitos circulantes que desempeñan una función en la depuración de Ap vascular (Michaudet al.,2013).
Aunque las enfermedades neurodegenerativas de diferente etiología comparten un componente neuroinflamatorio local común, los resultados de los presentes inventores se sostienen firmemente contra la caracterización simplista de todas las patologías del SNC como enfermedades que se beneficiarían uniformemente de la terapia antiinflamatoria sistémica. Así, mientras que las patologías inflamatorias autoinmunitarias del cerebro, tales como la esclerosis múltiple recurrente-remitente (RRMS), se benefician de la administración sistémica continua de fármacos antiinflamatorios e inmunosupresores para lograr la inmunosupresión periférica de larga duración, será ineficaz o afectará perjudicialmente (ejemplo 5) a la patología en enfermedades neurodegenerativas crónicas tal como en el caso de la AD, la esclerosis múltiple progresiva primaria (PP-MS) y la esclerosis múltiple progresiva secundaria (SP-MS). Además, los hallazgos de los presentes inventores arrojan luz sobre la percepción errónea con respecto a la función de las Treg sistémicas frente a las asociadas con el tejido en estas patologías (He y Balling, 2013). Puesto que el eje inmuno-cerebral forma parte de la plasticidad vitalicia del cerebro (Baruchet al.,2014), y las enfermedades neurodegenerativas están predominantemente relacionadas con la edad, los hallazgos de los presentes inventores también apuntan hacia un fenómeno más general, en el que la inmunosupresión sistémica interfiere con la función del cerebro. Por consiguiente, las tandas periódicas a corto plazo de reducción de la inmunosupresión sistémica pueden representar un enfoque terapéutico o incluso preventivo, aplicable a una amplia gama de patologías del cerebro, incluyendo la AD y la demencia asociada con la edad.
De modo importante, el enfoque y los hallazgos de los presentes inventores que se presentan en el presente documento en los modelos de ratón con AD no seleccionan como diana directamente ningún factor específico de la enfermedad en la AD, tal como la patología amiloide beta o tau, sino más bien demuestran un enfoque novedoso que se espera sea clínicamente aplicable en una amplia gama de patologías del sistema nervioso central: una reducción transitoria de la inmunosupresión mediada por Treg sistémicas para aumentar el reclutamiento de células inmunitarias que resuelven la inflamación a los sitios de patología dentro del SNC.
En vista de los resultados inesperados descritos anteriormente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente activo que provoca la reducción del nivel de inmunosupresión sistémica en un individuo para su uso en el tratamiento de una enfermedad, un trastorno, una afección o una lesión del SNC que no incluye la enfermedad neuroinflamatoria autoinmunitaria, esclerosis múltiple recurrente-remitente (RRMS), en donde dicha composición farmacéutica es para su administración mediante una pauta posológica que comprende al menos dos tandas de terapia, comprendiendo cada tanda de terapia en secuencia una sesión de tratamiento, seguida de una sesión de intervalo que no es de tratamiento.
En determinadas realizaciones, la pauta posológica se calibra de tal manera que el nivel de inmunosupresión sistémica se reduce de manera transitoria.
El término “tratar”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a medios para obtener un efecto fisiológico deseado. El efecto puede ser terapéutico en cuanto a curar parcial o completamente una enfermedad y/o los síntomas atribuidos a la enfermedad. El término se refiere a inhibir la enfermedad, es decir, detener o retardar su desarrollo; o mejorar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad.
El término “sesión que no es de tratamiento” se usa de manera intercambiable en el presente documento con el término “periodo sin tratamiento”, y se refiere a una sesión durante la cual no se administra ningún agente activo al individuo que está tratándose.
El término “presencia sistémica” de células T reguladoras, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la presencia de las células T reguladoras (tal como se mide por su nivel o actividad) en el sistema inmunitario circulante, es decir, la sangre, el bazo y los ganglios linfáticos. Es un hecho bien conocido en el campo de la inmunología que el perfil de la población de células en el bazo se refleja en el perfil de la población de células en la sangre (Zhaoet al.,2007).
El presente tratamiento es aplicable a los pacientes que muestran elevación de la inmunosupresión sistémica, así como a los pacientes que no muestran dicha elevación. A veces, el individuo que necesita tratamiento según la presente invención tiene un cierto nivel de inmunosupresión periférica, que se refleja por frecuencias o números elevados de Treg en la circulación, y/o su actividad funcional potenciada y/o una disminución en los leucocitos que producen IFN-y y/o una proliferación disminuida de leucocitos en respuesta a la estimulación. La elevación de las frecuencias o los números de Treg puede ser en números totales o como porcentaje de las células CD4 totales. Por ejemplo, se ha encontrado según la presente invención que un modelo animal de enfermedad de Alzheimer tiene mayores frecuencias de Foxp3 de entre las células CD4 en comparación con los ratones de tipo silvestre. Sin embargo, incluso si los niveles de células Treg sistémicas no son elevados, su actividad funcional no está potenciada, el nivel de leucocitos que producen IFN-y no es reducido o la proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación no está disminuida, en dicho individuo, el método de la presente invención que reduce el nivel o la actividad de la inmunosupresión sistémica es eficaz en el tratamiento de enfermedades, trastornos, afecciones o lesiones del SNC que no incluye la enfermedad neuroinflamatoria autoinmunitaria RRMS. De modo importante, dicha inmunosupresión sistémica también puede implicar tipos de células inmunitarias adicionales salvo las Treg, tales como células supresoras de origen mieloide (MDSC) (Gabrilovich y Nagaraj, 2009).
El nivel de inmunosupresión sistémica puede detectarse por varios métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el nivel de Treg puede medirse por análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica o linfocitos T, inmunoteñidos para marcadores de la superficie celular o marcadores intracelulares nucleares de Treg (Chen y Oppenheim, 2011), marcadores de CD45, TCR-beta, o CD4 de linfocitos, y midiendo la cantidad de anticuerpo que se une específicamente a las células. La actividad funcional de las Treg puede medirse mediante varios ensayos; por ejemplo, el ensayo de incorporación de timidina está usándose comúnmente, en el que la supresión de la proliferación estimulada por AcM anti-CD3 de células T CD4+CD25' (células T convencionales) se mide por la incorporación de [3H]timidina o usando CFSE (éster succinimidílico de diacetato de 5-(y 6)-carboxifluoresceína, que es capaz de entrar en las células; la división celular se mide como la reducción a la mitad sucesiva de la intensidad de fluorescencia del CFSE). El número de leucocitos que producen IFN-y o su actividad o su capacidad de proliferación puede evaluarse fácilmente por el experto usando métodos conocidos en la técnica; por ejemplo, el nivel de leucocitos que producen IFN-y puede medirse por análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica, después de la estimulación cortaex vivoe interrupción del aparato de Golgi, e inmunotinción por tinción intracelular de IFN-y (usando, por ejemplo, el kit de fijación/permeabilización Cytofix/Cytoperm™ de BD Biosciences), recogiendo los medios de acondicionamiento de estas células y cuantificando el nivel de citocinas secretadas usando ELISA, o comparando la razón de diferentes citocinas en los medios de acondicionamiento, por ejemplo, IL2/IL10, IL2/IL4, IFN-y/TGF-p, etc. Los niveles de MDSC en la sangre periférica humana pueden evaluarse por el experto, por ejemplo, usando análisis de citometría de flujo de la frecuencia de células DRVLINVCD11b+, DRVLINVCD15+, DRVLINVCD33+ y DR(-/bajo)/CD14+, tal como se describe (Kotsakiset al.,2012).
En seres humanos, la inmunosupresión periférica/sistémica puede considerarse elevada cuando el número total de Treg en la circulación es mayor del 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 % o más que en una población de control sana, el porcentaje de células Treg de entre las células CD4+ totales se eleva en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 % o más que en una población de control sana, o la actividad funcional de Treg se eleva en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100% o más que en una población de control sana. Alternativamente, la inmunosupresión periférica/sistémica puede considerarse elevada cuando el nivel de leucocitos que producen IFN-y o su actividad se reduce con respecto al de una población de control sana en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 90 ó 100%; o la proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación se reduce con respecto a la de una población de control sana en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 8090 ó 100 %.
Un agente puede ser considerado como un agente que provoca la reducción del nivel de la inmunosupresión sistémica cuando, tras administrar el agente a un individuo, el número total de Treg en la circulación de este individuo se reduce en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100% en comparación con el nivel antes de administrar el agente, el porcentaje de células Treg de entre las células CD4+ totales se reduce en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 % con respecto al de una población de control sana, o la actividad funcional de Treg se reduce en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 % en comparación con el nivel antes de administrar el agente. Alternativamente, un agente puede ser considerado como un agente que provoca la reducción del nivel de la inmunosupresión sistémica cuando, tras administrar el agente a un individuo, el número total de leucocitos que producen IFN-y o su actividad se aumenta en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 %; o la proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación se aumenta con respecto a la de una población de control sana en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 8090 ó 100 %.
El agente usado según la presente invención puede ser cualquier agente que regule por disminución el nivel o la actividad de células T reguladoras o que interfiera con su actividad, pero alternativamente puede limitarse a un grupo de tales agentes excluyendo un agente seleccionado del grupo que consiste en: (i) dopamina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; (ii) un precursor de dopamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (iii) un agonista de la familia del receptor de dopamina de tipo 1 (agonista de D1-R) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y (iv) un antagonista de la familia del receptor de dopamina de tipo 2 (antagonista de D2-R) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, aunque estos agentes no sean conocidos para su uso según la tanda de terapia según la presente invención.
En determinadas realizaciones, la sesión de tratamiento comprende administrar la composición farmacéutica al individuo y la sesión de tratamiento se mantiene al menos hasta que el nivel caiga por debajo de una referencia, la administración se detiene durante la sesión de intervalo, y la sesión de intervalo se mantiene siempre que el nivel esté por debajo de la referencia. La referencia puede seleccionarse de (a) el nivel de presencia o actividad sistémica de células T reguladoras o células supresoras de origen mieloide medido en la muestra de sangre más reciente obtenida de dicho individuo antes de dicha administración; o (b) el nivel de presencia o actividad sistémica de células T reguladoras o células supresoras de origen mieloide característico de una población de individuos que padecen una enfermedad, un trastorno, una afección o una lesión del SNC.
Alternativamente, la sesión de tratamiento comprende administrar la composición farmacéutica al individuo y la sesión de tratamiento se mantiene al menos hasta que la presencia o el nivel sistémico de leucocitos que producen IFN-y, o la tasa de proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación, se eleve por encima de una referencia, la administración se detiene durante la sesión de intervalo, y la sesión de intervalo se mantiene siempre que dicho nivel esté por encima de dicha referencia, en donde la referencia se selecciona de (a) el nivel de presencia o actividad sistémica de leucocitos que producen IFN-y, o la tasa de proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación, medido en la muestra de sangre más reciente obtenida de dicho individuo antes de dicha administración; o (b) el nivel de presencia o actividad sistémica de leucocitos que producen IFN-y, o la tasa de proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación, característico de una población de individuos que padecen una enfermedad, un trastorno, una afección o una lesión del SNC.
La duración de las sesiones de tratamiento y de intervalo puede determinarse por los médicos en ensayos clínicos dirigidos a una cierta población de pacientes, y entonces aplicarse de manera consistente a esta población de pacientes, sin la necesidad de monitorizar el nivel de inmunosupresión de manera personal.
En determinadas realizaciones, la sesión de tratamiento puede durar entre 3 días y cuatro semanas, por ejemplo, entre una y cuatro semanas.
En determinadas realizaciones, la sesión de intervalo puede durar entre una semana y seis meses, por ejemplo, entre dos semanas y seis meses, en particular entre 3 semanas y seis meses.
En la sesión de tratamiento, la administración de la composición farmacéutica puede ser administración repetida, por ejemplo, la composición farmacéutica puede administrarse una vez al día, o una vez cada dos, tres, cuatro, cinco o seis días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas. Estas frecuencias son aplicables a cualquier agente activo, pueden basarse en prácticas usadas comúnmente en la técnica, y pueden determinarse finalmente por los médicos en ensayos clínicos. Alternativamente, la frecuencia de la administración repetida en la sesión de tratamiento podría adaptarse según la naturaleza del agente activo, en donde, por ejemplo, una molécula pequeña puede administrarse una vez al día; un anticuerpo puede administrarse una vez cada 3 días; y el copolímero 1 se administra una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas. Debe entenderse que cuando un agente, tal como el copolímero 1, se administra durante una sesión de tratamiento a una frecuencia relativamente baja, por ejemplo, una vez a la semana durante una sesión de tratamiento de un mes, o una vez al mes durante una sesión de tratamiento de seis meses, esta sesión de tratamiento va seguida de una sesión de intervalo que no es de tratamiento, cuya duración es más larga que el periodo entre las administraciones repetidas durante la sesión de tratamiento (es decir, más larga que una semana o un mes, respectivamente, en este ejemplo). La pausa de una semana o un mes entre las administraciones durante la sesión de tratamiento en este ejemplo no se considera una sesión de intervalo.
Las duraciones de la sesión de tratamiento y la sesión de intervalo pueden ajustarse a la frecuencia de la administración de tal manera que, por ejemplo, una frecuencia de administración del agente activo una vez cada 3 días puede dar como resultado una sesión de tratamiento de 6 ó 9 días y una sesión de intervalo que se comienza por consiguiente.
Como una alternativa a un régimen de tratamiento general predeterminado, el nivel de inmunosupresión puede calibrarse a un nivel deseado para cada paciente que está tratándose (medicina personalizada), monitorizando el nivel o la actividad de células Treg (o leucocitos que producen IFN-y o la tasa de proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación) de manera individual, y ajustando la sesión de tratamiento, la frecuencia de administración y la sesión de intervalo de manera empírica y personal tal como se determina a partir de los resultados de la monitorización.
Así, la duración de la sesión de tratamiento puede determinarse (a) monitorizando el nivel de presencia o actividad sistémica de células T reguladoras en el individuo midiendo el nivel en una muestra de sangre obtenida del individuo dentro de un periodo de tiempo predeterminado después de dicha administración; (b) comparando el nivel medido en (a) con la referencia mencionada anteriormente y determinando si el nivel es diferente de la referencia; (c) decidiendo, basándose en la relación de dicho nivel medido en (a) para dicha referencia, si continuar la sesión de tratamiento repitiendo la administración o iniciando la siguiente sesión de intervalo absteniéndose de repetir la administración; y (d) repitiendo la administración o iniciando la siguiente sesión de intervalo según la decisión en (c). Alternativamente, el nivel de leucocitos que producen IFN-y o la tasa de proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación puede monitorizarse y compararse con una referencia apropiada tal como se mencionó anteriormente. De manera similar, la duración de la sesión de intervalo puede determinarse (a) monitorizando el nivel de presencia o actividad sistémica de células T reguladoras en el individuo midiendo el nivel en una muestra de sangre obtenida del individuo dentro de un periodo de tiempo predeterminado después de dicha administración; (b) comparando el nivel medido en (a) con la referencia mencionada anteriormente y determinando si el nivel es diferente de la referencia; (c) decidiendo, basándose en la relación de dicho nivel medido en (a) para dicha referencia, si iniciar una nueva tanda de terapia repitiendo la administración y las etapas (a) y (b) o prolongar la sesión de intervalo repitiendo sólo las etapas (a) y (b); y (d) repitiendo la administración y las etapas (a) y (b) o sólo las etapas (a) y (b) según la decisión en (c). Alternativamente, el nivel de leucocitos que producen IFN-y o la tasa de proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación puede monitorizarse y compararse con una referencia apropiada tal como se mencionó anteriormente.
En cualquier caso, la pauta posológica, es decir, la duración de la sesión de tratamiento y la sesión de intervalo, se calibra de tal manera que la reducción en el nivel de inmunosupresión, por ejemplo, tal como se mide por una reducción en el nivel de presencia o actividad sistémica de las células T reguladoras en el individuo, es transitoria. En determinadas realizaciones, el periodo de tiempo predeterminado, es decir, el tiempo transcurrido entre la administración más reciente del agente activo y la etapa de monitorización, es de entre 2 días y seis meses.
En determinadas realizaciones, las células T reguladoras que se monitorizan son células CD4+ seleccionadas de células FoxP3+ que expresan uno o más de CD25, CD127, GITR, CTLA-4 o PD-1; o células FoxP3‘ que expresan una o más de las moléculas de superficie CD25, CD127, GITR, CTLA-4 o PD-1. En particular, un fenotipo común de las células T reguladoras es células CD4+CD25+FoxP3+ o células CD4+CD25+FoxP3-En la técnica se conocen agentes capaces de reducir el nivel de células T reguladoras (Colombo y Piconese, 2007), y estos agentes pueden usarse según la presente invención.
Así, el agente puede seleccionarse de, pero no se limita necesariamente a: (i) un anticuerpo tal como: (a) anti-PD-1, (b) anti-PD-L1, (c) anti-PD-L2 (Coyne y Gulley, 2014; Duraiswamyet al.,2014; Zenget al.,2013); (d) anti-CTLA-4 (Simpsonet al.,2013; Termeet al.,2012); (e) anti-PD-1 en combinación con interferón a (Terawakiet al.,2011); (f) anti-PD-1 en combinación con anti-CTLA4; (g) anti-CD47 (Tsenget al.,2013); (h) anti-OX40 (Vooet al.,2013); (i) anti-VEGF-A (bevacizumab) (Termeet al.,2013); (j) anti-CD25 (Zhouet al.,2013); (k) anti-GITR (AcM que desencadena GITR) (DTA-1) (Colombo y Piconese, 2007); (l) anti-cCR4; (m) anti-TIM-3/galectina9 (Juet al.,2014); (n) anti-receptores similares a inmunoglobulina de linfocitos citolíticos naturales (KIR); (o) anti-LAG-3; o (p) anti-4-1BB; (ii) cualquier combinación de (a) a (p); (iii) cualquier combinación de (a) a (p) en combinación con un adyuvante, por ejemplo, anticuerpo anti-CTLA-4 en combinación con un anticuerpo anti-OX40 y un ligando de TLR9 tal como CpG (Marabelleet al.,2013); (iv) una molécula pequeña seleccionada de: (a) un inhibidor de p300 (Liuet al.,2013), tal como gemcitabina (baja dosis) (Shevchenkoet al.,2013), o C646 o análogos del mismo, es decir, un compuesto de la fórmula I:
en donde:
Ri se selecciona de H, -CO<2>R<6>, -CONR<6>R<7>, -SO<3>H, o -SO<2>NR<6>R<7>;
R<2>se selecciona de H, -CO<2>R<6>, o halógeno, preferiblemente Cl;
R<3>se selecciona de halógeno, preferiblemente F, -NO<2>, -CN, -CO<2>R<6>, preferiblemente CO<2>CH<3>o CO<2>CH<2>CH<3>, o -CH2OH;
R<4>y R<5>son cada uno independientemente H o -alquilo C<1>-C<6>, preferiblemente metilo;
R6 es H o -alquilo C<1>-C<6>, preferiblemente H, metilo o etilo; y
R<7>es H o -alquilo C<1>-C<6>, preferiblemente H o metilo [véase (Bowerset al.,2010)];
(b) sunitinib (Termeet al.,2012); (c) polioxometalato-1 (POM-1) (Ghiringhelliet al.,2012); (d) 5’-difosfato de a,pmetilenadenosina (APCP) (Ghiringhelliet al.,2012); (e) trióxido de arsénico (As<2>O<3>) (Thomas-Schoemannet al.,2012); (f) GX15-070 (Obatoclax) (Kimet al.,2014); (g) un antagonista de ácido retinoico tal como Ro 41-5253 (un retinoide sintético y antagonista selectivo de molécula pequeña) (Galvinet al.,2013) o LE-135 (Baiet al.,2009); (h) un antagonista de SIRPa (CD47), tal como CV1-hIgG4 (variante de SIRPa) como agente único o en combinación con un anticuerpo anti-CD47 (Weiskopfet al.,2013); (i) un antagonista de CCR4, tal como AF399/420/18025 como agente único o en combinación con un anticuerpo anti-CCR4 (Pereet al.,2011); (j) un antagonista del receptor de adenosina A2B, tal como PSB603 (Nakatsukasaet al.,2011); (k) un antagonista de indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO); o (l) un regulador de HIF-1; (iv) una proteína seleccionada de: (a) la glucoproteína de las hojas de Neem (NLGP) (Royet al.,2013); o (b) sCTLA-4 (isoforma soluble de CTLA-4) (Wardet al.,2013); (vi) una molécula de silenciamiento tal como miR-126 antisentido (Qinet al.,2013) y anti-galectina-1 (Gal-1) (Dalotto-Morenoet al.,2013); (vii) OK-432 (preparación liofilizada deStreptococcus pyogenes)(Hirayamaet al.,2013); (viii) una combinación de IL-12 y anticuerpo anti-CTLA-4; (ix) copolímero 1 o un copolímero que modula la actividad o el nivel de Treg; (x) un agente antibiótico, tal como vancomicina (Brestoff y Artis, 2013; Smithet al.,2013); o (xi) cualquier combinación de (i) a (x).
En determinadas realizaciones, el agente es un anticuerpo anti-PD-1, es decir, un anticuerpo específico para PD-1. En la técnica se conocen muchos anticuerpos anti-PD-1. Por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 usado según la presente invención puede seleccionarse de los dados a conocer en Ohaegbulamet al.(Ohaegbulamet al.,2015), es decir, CT-011 (pidilizumab; IgG1 humanizada; Curetech), MK-3475 (lambrolizumab, pembrolizumab; IgG4 humanizada; Merck), BMS-936558 (nivolumab; IgG4 humana; Bristol-Myers Squibb), AMP-224 (proteína de fusión de PD-L2 e IgG2a; AstraZeneca), BMS-936559 (IgG4 humana; Bristol-Myers Squibb), MEDI4736 (IgG humanizada; AstraZeneca), MPDL3280A (IgG humana; Genentech), MSB0010718C (IgG1 humana; Merck-Serono); o el anticuerpo usado según la presente invención puede ser MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca), un AcM IgG4 humanizado.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo CT-011 puede administrarse a un ser humano a una dosificación de 0,2-6 mg/kg o entre 1,5-6 mg/kg; el anticuerpo MK-3475 puede administrarse a un ser humano a una dosificación de 1-10 mg/kg; BMS-936558 puede administrarse a un ser humano a una dosificación de 0,3-20 mg/kg, 0,3-10 mg/kg, 1-10 mg/kg o a 1 ó 3 mg/kg; BMS-936559 puede administrarse a un ser humano a una dosificación de 0,3-10 mg/kg; MPDL3280A puede administrarse a un ser humano a una dosificación de 1-20 mg/kg; MEDI4736 puede administrarse a un ser humano a una dosificación de 0,1-15 mg/kg; y MSB0010718C puede administrarse a un ser humano a una dosificación de 1-20 mg/kg.
El anticuerpo anti-CTLA4 puede ser tremelimumab (Pfizer), un anticuerpo monoclonal IgG2 completamente humano; o ipilimumab, un anticuerpo monoclonal IgG1 completamente humano.
El anticuerpo anti-receptores similares a inmunoglobulina de linfocitos citolíticos naturales (KIR) puede ser lirilumab (BMS-986015; desarrollado por Innate Pharma y con licencia para Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo monoclonal completamente humano.
El anticuerpo anti-LAG-3 se dirige contra el gen 3 de activación de linfocitos. Uno de tales anticuerpos que pueden usarse según la presente invención es el anticuerpo monoclonal BMS-986016 (pembrolizumab; IgG4 humanizada; Merck).
El anticuerpo anti-4-1BB puede ser PF-05082566 (Pfizer Oncology), un anticuerpo monoclonal agonista IgG2 completamente humanizado; o urelumab (BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo monoclonal IgG4 completamente humano, que selecciona como diana 4-1BB.
En determinadas realizaciones, pueden usarse combinaciones de anticuerpos tales como, pero sin limitarse a: CT-011 en combinación con rituximab (nombres comerciales Rituxan, MabThera y Zytux), un anticuerpo monoclonal quimérico contra la proteína CD20, por ejemplo, cada uno a 3 mg/kg; BMS-936558 (por ejemplo, 1 mg/kg) en combinación con ipilimumab (por ejemplo, a 3 mg/kg); o BMS-936558 (por ejemplo, 1-10 mg/kg) en combinación con una vacuna multipeptídica restringida en HLA-A*0201 (Weberet al.,2013).
Tabla 1*
* Basado en Bowerset al.(2010).
En determinadas realizaciones, el agente es un inhibidor de p300, cuyas fórmulas se enumeran en la tabla 1, es decir, C646 (ácido 4-(4-((5-(4,5-dimetil-2-nitrofenil)furan-2-il)metilen)-3-metil-5-oxo-4,5-dihidro-1H-pirazol-1-il)benzoico), C146 (ácido 4-hidroxi-3-(((2-(3-yodofenil)benzo[d]oxazol-5-il)imino)metil)benzoico) o C375 (ácido 2-cloro-4-(5-((2,4-dioxo-3-(2-oxo-2-(p-tolilamino)etil)tiazolidin-5-iliden)metil)furan-2-il)benzoico). En particular, el inhibidor de p300 es C646.
En determinadas realizaciones, el inhibidor de molécula pequeña de la ruta de la indolamina-2,3-dioxigenasa puede ser indoximod (NLG-9189; NewLink Genetics), INCB024360 (Incyte) o NLG-919 (NewLink Genetics).
El regulador de HIF-1 puede ser M30, 5-[N-metil-N-propargilaminometil]-8-hidroxiquinolina, descrito en Zhenget al.(Zhenget al.,2015).
En determinadas realizaciones, el agente puede derivarse de un amplio espectro de antibióticos que seleccionan como diana bacterias gram-positivas y gram-negativas, facilitando de ese modo la inmunomodulación de Treg, por ejemplo, la vancomicina que selecciona como diana bacterias gram-positivas, y se ha demostrado que reduce los niveles/la actividad de Treg (Brestoff y Artis, 2013; Smithet al.,2013).
En determinadas realizaciones, el agente puede ser cualquier copolímero que en un cierto régimen conduzca a la regulación por disminución de Treg, tal como YFAK, VYAK, VWAK, VEAK, FEAK, FAK, VAK o WAK. Tal como se usa en el presente documento, los términos “cop 1” y “copolímero 1” se usan de manera intercambiable.
La composición farmacéutica de la invención puede comprender como agente activo un copolímero al azar que modula la actividad o el nivel de Treg que comprende una cantidad adecuada de un aminoácido cargado positivamente tal como lisina o arginina, en combinación con un aminoácido cargado negativamente (preferiblemente en una cantidad menor), tal como ácido glutámico o ácido aspártico, opcionalmente en combinación con un aminoácido neutro no cargado tal como alanina o glicina, que actúa como material de relleno, y opcionalmente con un aminoácido adaptado para conferir en el copolímero propiedades inmunógenas, tal como un aminoácido aromático como tirosina o triptófano. Tales composiciones pueden incluir cualquiera de los copolímeros dados a conocer en el documento WO 00/05250.
Más específicamente, la composición para su uso en la presente invención comprende al menos un copolímero seleccionado del grupo que consiste en copolímeros al azar que comprenden un aminoácido seleccionado de cada uno de al menos tres de los siguientes grupos: (a) lisina y arginina; (b) ácido glutámico y ácido aspártico; (c) alanina y glicina; y (d) tirosina y triptófano.
Los copolímeros para su uso en la presente invención pueden estar compuestos por L-aminoácidos o D-aminoácidos o mezclas de los mismos. Tal como conocen los expertos en la técnica, los L-aminoácidos se producen en la mayoría de las proteínas naturales. Sin embargo, los D-aminoácidos están disponibles comercialmente y pueden sustituir a algunos o todos los aminoácidos usados para preparar los terpolímeros y otros copolímeros usados en la presente invención. La presente invención contempla el uso de copolímeros que contienen D-aminoácidos y L-aminoácidos, así como copolímeros que consisten esencialmente en L-aminoácidos o D-aminoácidos.
En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica de la invención comprende el copolímero 1, una mezcla de polipéptidos al azar que consiste esencialmente en los aminoácidos ácido L-glutámico (E), L-alanina (A), L-tirosina (Y) y L-lisina (K) en una razón aproximada de 1,5:4,8:1:3,6, que tiene una carga eléctrica positiva global neta y un peso molecular de aproximadamente 2 KDa a aproximadamente 40 KDa. En determinadas realizaciones, el cop 1 tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2 KDa a aproximadamente 20 KDa, de aproximadamente 4,7 KDa a aproximadamente 13 KDa, de aproximadamente 4 KDa a aproximadamente 8,6 KDa, de aproximadamente 5 KDa a 9 KDa, o de aproximadamente 6,25 a 8,4 KDa. En otras realizaciones, el cop 1 tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 13 KDa a aproximadamente 20 KDa, de aproximadamente 13 KDa a aproximadamente 16 KDa, o de aproximadamente 15 KDa a aproximadamente 16 KDa. Otros pesos moleculares promedio para el cop 1, inferiores a 40 KDa, también están abarcados por la presente invención. El copolímero 1 de dichos intervalos de peso molecular puede prepararse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante los procedimientos descritos en la patente estadounidense n.° 5.800.808. El copolímero 1 puede ser un polipéptido que comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 100, o de aproximadamente 40 a aproximadamente 80, aminoácidos de longitud. En determinadas realizaciones, el cop 1 está en forma de su sal de acetato conocida bajo el nombre genérico de acetato de glatiramer, que ha sido aprobado en varios países para el tratamiento de la esclerosis múltiple (MS) bajo el nombre comercial Copaxone® (una marca comercial de Teva Pharmaceuticals Ltd., Petach Tikva, Israel). Se espera que permanezca la actividad del copolímero 1 para la composición farmacéutica dada a conocer en el presente documento si se realizan una o más de las siguientes sustituciones: ácido aspártico por ácido glutámico, glicina por alanina, arginina por lisina, y triptófano por tirosina. En determinadas realizaciones de la invención, el copolímero que modula la actividad o el nivel de Treg es un copolímero de tres aminoácidos diferentes, cada uno de uno de tres grupos diferentes de los grupos (a) a (d). Estos copolímeros se denominan en el presente documento terpolímeros.
En una realización, el copolímero que modula la actividad o el nivel de Treg es un terpolímero que contiene tirosina, alanina y lisina, designado en lo sucesivo como YAK, en el que la fracción molar promedio de los aminoácidos puede variar: la tirosina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,05-0,250; la alanina en una fracción molar de aproximadamente 0,3-0,6; y la lisina en una fracción molar de aproximadamente 0,1-0,5. Las razones molares de tirosina, alanina y lisina pueden ser de aproximadamente 0,10:0,54:0,35, respectivamente. Es posible sustituir la arginina por lisina, la glicina o alanina, y/o el triptófano por tirosina.
En determinadas realizaciones, el copolímero que modula la actividad o el nivel de Treg es un terpolímero que contiene tirosina, ácido glutámico y lisina, designado en lo sucesivo como YEK, en el que la fracción molar promedio de los aminoácidos puede variar: el ácido glutámico puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005-0,300, la tirosina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005 0,250, y la lisina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,3-0,7. Las razones molares de ácido glutámico, tirosina y lisina pueden ser de aproximadamente 0,26:0,16:0,58, respectivamente. Es posible sustituir el ácido aspártico por ácido glutámico, la arginina por lisina, y/o el triptófano por tirosina.
En determinadas realizaciones, el copolímero que modula la actividad o el nivel de Treg es un terpolímero que contiene lisina, ácido glutámico y alanina, designado en lo sucesivo como KEA, en el que la fracción molar promedio de los aminoácidos puede variar: el ácido glutámico puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005-0,300, la alanina en una fracción molar de aproximadamente 0,005-0,600, y la lisina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,2-0,7. Las razones molares de ácido glutámico, alanina y lisina pueden ser de aproximadamente 0,15:0,48:0,36, respectivamente. Es posible sustituir el ácido aspártico por ácido glutámico, la glicina por alanina, y/o la arginina por lisina.
En determinadas realizaciones, el copolímero que modula la actividad o el nivel de Treg es un terpolímero que contiene tirosina, ácido glutámico y alanina, designado en lo sucesivo como YEA, en el que la fracción molar promedio de los aminoácidos puede variar: la tirosina puede estar presente en una fracción molar de aproximadamente 0,005-0,250, el ácido glutámico en una fracción molar de aproximadamente 0,005-0,300, y la alanina en una fracción molar de aproximadamente 0,005-0,800. Las razones molares de ácido glutámico, alanina y tirosina pueden ser de aproximadamente 0,21:0,65:0,14, respectivamente. Es posible sustituir el triptófano por tirosina, el ácido aspártico por ácido glutámico, y/o la glicina por alanina.
El peso molecular promedio de los terpolímeros YAK, YEK, KEA y YEA puede variar entre aproximadamente 2 KDa y 40 KDa, preferiblemente entre aproximadamente 3 KDa y 35 KDa, más preferiblemente entre aproximadamente 5 KDa y 25 KDa.
El copolímero 1 y los otros copolímeros que modulan la actividad o el nivel de Treg pueden prepararse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, en condiciones de condensación usando la razón molar deseada de aminoácidos en disolución, o mediante procedimientos de síntesis en fase sólida. Las condiciones de condensación incluyen las condiciones apropiadas de temperatura, pH y disolvente para la condensación del grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino de otro aminoácido para formar un enlace peptídico. Pueden usarse agentes de condensación, por ejemplo diciclohexilcarbodiimida, para facilitar la formación del enlace peptídico. Pueden usarse grupos bloqueadores para proteger los grupos funcionales, tales como los restos de cadena lateral y algunos de los grupos amino o carboxilo frente a reacciones secundarias no deseadas.
Por ejemplo, los copolímeros pueden prepararse mediante el procedimiento dado a conocer en la patente estadounidense n.° 3.849.550, en donde los N-carboxianhídridos de tirosina, alanina, y-bencilglutamato y N-gtrifluoroacetil-lisina son polimerizados a temperaturas ambientales (20 °C-26 °C) en dioxano anhidro con dietilamina como iniciador. El grupo y-carboxilo del ácido glutámico puede desbloquearse por bromuro de hidrógeno en ácido acético glacial. Los grupos trifluoroacetilo se eliminan de la lisina por piperidina 1 M. El experto en la técnica entiende fácilmente que el procedimiento puede ajustarse para preparar péptidos y polipéptidos que contengan los aminoácidos deseados, es decir, tres de los cuatro aminoácidos en el copolímero 1, eliminando selectivamente las reacciones que se refieren a uno cualquiera de ácido glutámico, alanina, tirosina, o lisina.
El peso molecular de los copolímeros puede ajustarse durante la síntesis de los polipéptidos o después de haber preparado los copolímeros. Para ajustar el peso molecular durante la síntesis de los polipéptidos, las condiciones de síntesis o las cantidades de aminoácidos se ajustan de modo que la síntesis se detenga cuando el polipéptido alcance la longitud aproximada que se desee. Después de la síntesis, los polipéptidos con el peso molecular deseado pueden obtenerse mediante cualquier procedimiento de selección de tamaño disponible, tal como cromatografía de los polipéptidos sobre un gel o una columna de dimensionamiento de peso molecular, y la recogida de los intervalos de peso molecular deseados. Los copolímeros también pueden hidrolizarse parcialmente para eliminar las especies de alto peso molecular, por ejemplo, por hidrólisis ácida o enzimática, y luego purificarse para eliminar el ácido o las enzimas.
En una realización, los copolímeros con un peso molecular deseado pueden prepararse mediante un procedimiento que incluye hacer reaccionar un polipéptido protegido con ácido bromhídrico para formar un polipéptido trifluoroacetilado que tiene el perfil de peso molecular deseado. La reacción se realiza durante un tiempo y a una temperatura predeterminada por una o más reacciones de prueba. Durante la reacción de prueba, se varían el tiempo y la temperatura y se determina el intervalo de peso molecular de un lote dado de polipéptidos de prueba. Para el lote se usan las condiciones de prueba que proporcionan el intervalo de peso molecular óptimo para ese lote de polipéptidos. Así, un polipéptido trifluoroacetilado que tenga el perfil de peso molecular deseado puede producirse mediante un procedimiento que incluye hacer reaccionar el polipéptido protegido con ácido bromhídrico durante un tiempo y a una temperatura predeterminada por la reacción de prueba. El polipéptido trifluoroacetilado con el perfil de peso molecular deseado se trata entonces adicionalmente con una disolución acuosa de piperidina para formar un polipéptido de baja toxicidad que tiene el peso molecular deseado.
En determinadas realizaciones, una muestra de prueba de polipéptido protegido de un lote dado se hace reaccionar con ácido bromhídrico durante aproximadamente 10-50 horas a una temperatura de aproximadamente 20-28 °C. Las mejores condiciones para ese lote se determinan mediante la ejecución de varias reacciones de prueba. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido protegido se hace reaccionar con ácido bromhídrico durante aproximadamente 17 horas a una temperatura de aproximadamente 26 °C.
Puesto que se conocen motivos de unión del cop 1 a moléculas de HLA-DR asociadas con MS (Fridkis-Hareliet al.,1999), polipéptidos que tienen una secuencia definida pueden prepararse y someterse a prueba fácilmente para la unión a la ranura de unión al péptido de las moléculas de HLA-DR tal como se describe en la publicación de Fridkis-Hareliet al.(1999). Ejemplos de tales péptidos son los dados a conocer en los documentos WO 00/05249 y WO 00/05250, e incluyen los péptidos de las<s>E<q>ID NO. 1-32 (tabla 2).
Se esperaría que tales péptidos y otros péptidos similares tengan una actividad similar a la del cop 1. También se considera que tales péptidos y otros péptidos similares están dentro de la definición de los copolímeros que reaccionan de forma cruzada con antígenos de mielina del SNC, y se considera que su uso forma parte de la presente invención.
Tabla 2
SE Q ID N O . S ecu en cia de péptido
1A A A Y A A A A A A K A A A A
2A E K Y A A A A A A K A A A A
3 A K E Y A A A A A A K A A A A
4 A K K Y A A A A A A K A A A A
5 A E A Y A A A A A A K A A A A
6 K E A Y A A A A A A K A A A A
7 A E E Y A A A A A A K A A A A
8 A A E Y A A A A A A K A A A A
9 EK A Y A A A A A A K A A A A
10 A A K Y E A A A A A K A A A A
11 A A K Y A E A A A A K A A A A
12 E A A Y A A A A A A K A A A A
13 E K K Y A A A A A A K A A A A
14 E A K Y A A A A A A K A A A A
15 A E K Y A A A A A A A A A A A
16 A K E Y A A A A A A A A A A A
17 A K K Y E A A A A A A A A A A
18 A K K Y A E A A A A A A A A A
19 A E A Y K A A A A A A A A A A
20 K E A Y A A A A A A A A A A A
21 A E E Y K A A A A A A A A A A
22 A A E Y K A A A A A A A A A A
23 EK A Y A A A A A A A A A A A
24 A A K Y E A A A A A A A A A A
25 A A K Y A E A A A A A A A A A
26 E K K Y A A A A A A A A A A A
27 E A K Y A A A A A A A A A A A
28 A E Y A K A A A A A A A A A A
29 A E K A Y A A A A A A A A A A
30 EK Y A A A A A A A A A A A A
31 A Y K A E A A A A A A A A A A
32 A K Y A E A A A A A A A A A A
La definición de un “copolímero que modula la actividad o el nivel de Treg” según la invención significa que abarca otros copolímeros de aminoácidos sintéticos tales como los copolímeros al azar de cuatro aminoácidos descritos por Fridkis-Hareliet al.,2002 y la patente estadounidense 8.017.125 (como candidatos para el tratamiento de la esclerosis múltiple), concretamente los copolímeros VFAK que comprende los aminoácidos valina (V), fenilalanina (F), alanina (A) y lisina (K); VYAK que comprende los aminoácidos valina (V), tirosina (Y), alanina (A) y lisina (K); VWAK que comprende los aminoácidos valina (V), triptófano (W), alanina (A) y lisina (K); VEAK que comprende los aminoácidos valina (V), ácido glutámico (E), alanina (A) y lisina (K); FEAK que comprende los aminoácidos fenilalanina (F), ácido glutámico (E), alanina (A) y lisina (K); FAK que comprende los aminoácidos fenilalanina (F), alanina (A) y lisina (K); VAK que comprende los aminoácidos valina (V), alanina (A) y lisina (K); y WAK que comprende los aminoácidos triptófano (W), alanina (A) y lisina (K).
La composición farmacéutica según la presente invención puede ser para el tratamiento de una enfermedad, un trastorno o una afección del SNC, es decir, una enfermedad, un trastorno o una afección neurodegenerativo seleccionado de enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple progresiva primaria; esclerosis múltiple progresiva secundaria, degeneración corticobasal, síndrome de Rett, un trastorno de degeneración de la retina seleccionado del grupo que consiste en degeneración macular relacionada con la edad y retinitis pigmentaria; neuropatía óptica isquémica anterior; glaucoma; uveítis; depresión; estrés asociado con trauma o trastorno de estrés postraumático, demencia frontotemporal, demencia con cuerpos de Lewy, deterioros cognitivos leves, atrofia cortical posterior, afasia progresiva primaria o parálisis supranuclear progresiva. En determinadas realizaciones, la afección del SNC es demencia relacionada con la edad.
En determinadas realizaciones, la afección del SNC es enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson o enfermedad de Huntington.
La composición farmacéutica según la presente invención puede ser además para el tratamiento de una lesión del SNC seleccionada de lesión de la médula espinal, lesión cerrada de la cabeza, traumatismo cerrado, traumatismo penetrante, accidente cerebrovascular hemorrágico, accidente cerebrovascular isquémico, isquemia cerebral, lesión del nervio óptico, infarto de miocardio, envenenamiento por organofosfatos y lesión provocada por extirpación de tumor.
Tal como se indicó anteriormente, los inventores han encontrado que la presente invención mejora la función cognitiva en ratones que emula la enfermedad de Alzheimer. Así, la composición farmacéutica puede ser para su uso en la mejora de la función cognitiva y/o motora del SNC, por ejemplo, para su uso en el alivio de la pérdida de función cognitiva asociada con la edad, que puede producirse en individuos libres de una enfermedad diagnosticada, así como en personas que padecen una enfermedad neurodegenerativa. Además, la composición farmacéutica puede ser para su uso en el alivio de la pérdida de función cognitiva resultante de estrés agudo o un episodio traumático. La función cognitiva mencionada anteriormente en el presente documento puede comprender el aprendizaje, la memoria, o ambos.
El término “función del SNC”, tal como se usa en el presente documento, se refiere, entre otras cosas, a recibir y procesar la información sensitiva, pensar, aprender, memorizar, percibir, producir y comprender el lenguaje, controlar la función motora y las respuestas visuales y auditivas, mantener el balance y el equilibrio, la coordinación del movimiento, la conducción de la información sensitiva y el control de funciones autónomas tales como la respiración, la frecuencia cardiaca y la digestión.
Los términos “capacidad intelectual”, “función cognitiva” y “rendimiento cognitivo” se usan en el presente documento de manera intercambiable y se refieren a cualquier proceso o estado mental que implica, pero no se limita a, el aprendizaje, la memoria, la creación de imágenes, la actividad mental, la conciencia, el razonamiento, la capacidad espacial, las habilidades del habla y el lenguaje, el desarrollo del lenguaje y la capacidad de atención al sentido de la realidad. La capacidad intelectual se forma en múltiples zonas del cerebro, tales como el hipocampo, la corteza y otras estructuras del cerebro. Sin embargo, se supone que los recuerdos a largo plazo se almacenan al menos en parte en la corteza, y se sabe que la información sensitiva es adquirida, consolidada y recuperada por una estructura cortical específica, la corteza gustativa, que reside dentro de la corteza insular.
En seres humanos, la función cognitiva puede medirse por cualquier método conocido, por ejemplo y sin limitación, por la impresión clínica global de escala de cambio (escala CIBIC-plus); el miniexamen del estado mental (MMSE); el inventario neuropsiquiátrico (NPI); la escala de valoración clínica de la demencia (CDR); la batería automatizada de la prueba neuropsicológica de Cambridge (CANTAB) o la evaluación clínica geriátrica de Sandoz (SCAG). La función cognitiva puede medirse también indirectamente usando técnicas de formación de imágenes tales como la tomografía por emisión de positrones (PET), la formación de imágenes por resonancia magnética funcional (fMRI), la tomografía computarizada por emisión de fotones individuales (SPECT), o cualquier otra técnica de formación de imágenes que permita medir la función cerebral.
Una mejora de uno o más de los procesos que afectan a la capacidad intelectual en un paciente significará una mejora de la función cognitiva en dicho paciente; así, en determinadas realizaciones, la mejora de la capacidad intelectual comprende la mejora del aprendizaje, la plasticidad, y/o la memoria a largo plazo. Los términos “mejorar” y “potenciar” pueden usarse de manera intercambiable.
El término “aprendizaje” se refiere a la adquisición u obtención de nuevos conocimientos, comportamientos, habilidades, valores o preferencias, o la modificación y el refuerzo de los ya existentes.
El término “plasticidad” se refiere a la plasticidad sináptica, la plasticidad del cerebro o la neuroplasticidad asociada con la capacidad del cerebro para cambiar con el aprendizaje, y cambiar la memoria ya adquirida. Un parámetro medible que refleja la plasticidad es la extinción de la memoria.
El término “memoria” se refiere al proceso en el que la información es codificada, almacenada, y recuperada. La memoria tiene tres categorías distinguibles: memoria sensitiva, memoria a corto plazo, y memoria a largo plazo. El término “memoria a largo plazo” es la capacidad para mantener la información durante un periodo de tiempo largo o ilimitado. La memoria a largo plazo comprende dos divisiones principales: la memoria explícita (memoria declarativa) y la memoria implícita (memoria no declarativa). La memoria a largo plazo se logra mediante la consolidación de la memoria, que es una categoría de procesos que estabilizan una huella de memoria después de su adquisición inicial. La consolidación se distingue en dos procesos específicos: la consolidación sináptica, que se produce en el plazo de las primeras horas después del aprendizaje, y la consolidación del sistema, donde los recuerdos dependientes del hipocampo se vuelven independientes del hipocampo durante un periodo de semanas a años.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para tratar una enfermedad, un trastorno, una afección o una lesión del sistema nervioso central (SNC) que no incluye la enfermedad neuroinflamatoria autoinmunitaria esclerosis múltiple recurrente-remitente (RRMS), comprendiendo dicho método administrar a un individuo que lo necesita una composición farmacéutica según la presente invención tal como se definió anteriormente, en donde dicha composición farmacéutica se administra mediante una pauta posológica que comprende al menos dos tandas de terapia, comprendiendo cada tanda de terapia en secuencia una sesión de tratamiento seguida de una sesión de intervalo.
En determinadas realizaciones, la sesión de tratamiento comprende administrar la composición farmacéutica al individuo y la sesión de tratamiento se mantiene al menos hasta que el nivel caiga por debajo de una referencia, la administración se detiene durante la sesión de intervalo, y la sesión de intervalo se mantiene siempre que el nivel esté por debajo de la referencia. La referencia puede seleccionarse de (a) el nivel de presencia o actividad sistémica de células T reguladoras o células supresoras de origen mieloide medido en la muestra de sangre más reciente obtenida de dicho individuo antes de dicha administración; o (b) el nivel de presencia o actividad sistémica de células T reguladoras o células supresoras de origen mieloide característico de una población de individuos que padecen una enfermedad, un trastorno, una afección o una lesión del SNC.
Alternativamente, la sesión de tratamiento comprende administrar la composición farmacéutica al individuo y la sesión de tratamiento se mantiene al menos hasta que la presencia o el nivel sistémico de leucocitos que producen IFN-y, o la tasa de proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación, se eleva por encima de una referencia, la administración se detiene durante la sesión de intervalo, y la sesión de intervalo se mantiene siempre que dicho nivel esté por encima de dicha referencia, en donde la referencia se selecciona de (a) el nivel de presencia o actividad sistémica de leucocitos que producen IFN-y, o la tasa de proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación, medido en la muestra de sangre más reciente obtenida de dicho individuo antes de dicha administración; o (b) el nivel de presencia o actividad sistémica de leucocitos que producen IFN-y, o la tasa de proliferación de leucocitos en respuesta a la estimulación, característico de una población de individuos que padecen una enfermedad, un trastorno, una afección o una lesión del SNC.
Las realizaciones anteriores que describen las diferentes características de la composición farmacéutica de la presente invención también son relevantes para el método de la invención, porque el método emplea la misma composición farmacéutica.
En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad, un trastorno, una afección o una lesión del SNC que no incluye la enfermedad neuroinflamatoria autoinmunitaria RRMS, comprendiendo dicha composición farmacéutica un agente activo que provoca la reducción del nivel de inmunosupresión sistémica en un individuo seleccionado de: (i) un anticuerpo específico para: (a) CD47; (b) OX40; (c) VEGF-A (bevacizumab); (d) CD25; (e) GITR (AcM que desencadena GiTr (DTA-1)); (f) CCR4; o (g) TIM-3/galectina9; (h) un anticuerpo anti-receptor similar a inmunoglobulina de linfocitos citolíticos naturales; (i) un anticuerpo anti-LAG-3; o (j) un anticuerpo anti-4-1BB; (ii) cualquier combinación de (a) a (j); (iii) cualquier combinación de (a) a (j) en combinación con un adyuvante tal como un ligando de TLR9 tal como CpG; (iv) una proteína seleccionada de: (a) la glucoproteína de las hojas de Neem (NLGP); o (b) sCTLA-4; (v) una molécula pequeña seleccionada de: (a) sunitinib; (b) polioxometalato-1 (POM-1); (c) 5'-difosfato de a,pmetilenadenosina (APCP); (d) trióxido de arsénico (As<2>O<3>); (e) GX15-070 (Obatoclax); (f) un antagonista de ácido retinoico tal como Ro 41-5253 o LE-135; (g) un antagonista de SIRPa (CD47), tal como CV1-hIgG4 como agente único o en combinación con el anticuerpo anti-CD47; (h) un antagonista de CCR4, tal como AF399/420/18025 como agente único o en combinación con el anticuerpo anti-CCR4; o (i) un antagonista del receptor de adenosina A2B, tal como PSB603; (j) un antagonista de indolamina-2,3-dioxigenasa; (k) un regulador de HIF-1; (vi) una molécula de silenciamiento tal como miR-126 antisentido y anti-galectina-1 (Gal-1); (vii) OK-432; (viii) una combinación de IL-12 y anticuerpo anti-CTLA-4; (ix) un agente antibiótico, tal como vancomicina; o (x) cualquier combinación de (i) a (ix). Las composiciones farmacéuticas para su uso según la presente invención pueden formularse de manera convencional usando uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. El portador debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demás componentes de la composición y no perjudicial para el receptor del mismo.
La siguiente ejemplificación de portadores, modos de administración, formas de dosificación, etc., se enumeran como posibilidades conocidas de las cuales pueden seleccionarse los portadores, los modos de administración, las formas de dosificación, etc., para su uso con la presente invención. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que cualquier formulación dada y modo de administración seleccionado debe someterse a prueba en primer lugar para determinar que logra los resultados deseados.
Los métodos de administración incluyen, pero no se limitan a, la vía parenteral, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, mucosa (por ejemplo, oral, intranasal, bucal, vaginal, rectal, intraocular), intratecal, tópica e intradérmica. La administración puede ser sistémica o local.
El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el agente activo. Los portadores en la composición farmacéutica pueden comprender un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona (polividona o povidona), goma tragacanto, gelatina, almidón, lactosa o lactosa monohidratada; un agente disgregante, tal como ácido algínico, almidón de maíz, y similares; un lubricante o tensoactivo, tal como estearato de magnesio o laurilsulfato de sodio; y un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal.
Para la administración oral, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, como disoluciones, jarabes o suspensiones, o puede presentarse como un producto farmacológico para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); materiales de relleno (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse por métodos bien conocidos en la técnica.
Las preparaciones para administración oral pueden formularse adecuadamente para dar una liberación controlada del compuesto activo.
Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formulados de manera convencional.
Las composiciones pueden formularse para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril, antes de su uso.
Las composiciones también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Para la administración por inhalación, las composiciones para su uso según la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de pulverización de aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono, u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula que administre una cantidad dosificada. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para su uso en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
La determinación de las dosis del principio activo que van a usarse para su uso en seres humanos se basa en las prácticas usadas comúnmente en la técnica, y se determinará finalmente por los médicos en ensayos clínicos. Una dosis equivalente aproximada esperada para su administración a un ser humano puede calcularse basándose en las evidencias experimentalesin vivodadas a conocer en el presente documento a continuación, usando fórmulas conocidas (por ejemplo, Reagan-Showet al.(2007) Dose translation from animal to human studies revisited. The FASEB Journal 22: 659-661). Según este paradigma, la dosis equivalente para seres humanos adultos (mg/kg de peso corporal) es igual a una dosis administrada a un ratón (mg/kg de peso corporal) multiplicada por 0,081.
La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Materiales y métodos
Animales. Se adquirieron de The Jackson Laboratory ratones transgénicos 5XFAD (Tg6799) que cosobreexpresan formas mutantes de AD familiar de los transgenes humanos APP (la mutación sueca, K670N/M671L; la mutación de Florida, I716V; y la mutación de Londres, V717I) y PS1 (M146L/L286V) bajo el control transcripcional del promotor Thy-1 de ratón específico de neuronas (Oakleyet al.,2006), y ratones transgénicos dobles con AD B6.Cg-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J (Borcheltet al.,1997). El genotipado se realizó mediante análisis por PCR del ADN de la cola, tal como se describió previamente (Oakleyet al.,2006). Se usaron ratones heterocigóticos mutantes cx3cr1GFP/+ (Junget al.,2000)(B6.129P-cxcr1tm1Litt/J,en los que uno de los alelos del receptor de quimiocinas CX<3>CR<1>se reemplazó por un gen que codifica para GFP) como donantes para quimeras de BM. Se criaron ratones Foxp3.LuciDTR (Suffneret al.,2010) con ratones 5XFAD para permitir el agotamiento condicional de Treg Foxp3+. Los animales se criaron y mantuvieron por el Centro de Cría de Animales del Instituto de Ciencia Weizmann. Todos los experimentos detallados en el presente documento cumplen con las normas formuladas por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) del Instituto de Ciencia Weizmann.
Purificación de ARN, síntesis de ADNc, y análisis por PCR cuantitativa en tiempo real. El ARN total de la circunvolución dentada (DG) hipocámpica se extrajo con el reactivo TRI (Molecular Research Center) y se purificó a partir de los lisados usando un kit RNeasy (Qiagen). El ARN total del plexo coroideo se extrajo usando un kit RNA MicroPrep (Zymo Research). El ARNm (1 |jg) se convirtió en ADNc usando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La expresión de ARNm específicos se sometió a ensayo usando PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) basada en fluorescencia. Se realizaron reacciones de RT-qPCR usando la mezcla maestra de PCR Fast-SYBR (Applied Biosystems). Se realizaron reacciones de cuantificación por triplicado para cada muestra usando el método de la curva de calibración. Se eligió peptidilprolil isomerasa A(ppia)como gen de referencia (mantenimiento). Los ciclos de amplificación fueron 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 20 s, y 72 °C durante 15 s. Al final del ensayo, se construyó una curva de fusión para evaluar la especificidad de la reacción. Para el análisis de los genesifn-yy ppia,el ADNc amplificó previamente en 14 ciclos de PCR con cebadores de PCR no aleatorios, aumentando de ese modo la sensibilidad del posterior análisis por PCR en tiempo real, según el protocolo del fabricante (kit de mezcla maestra PreAmp; Applied Biosystems). La expresión del ARNm se determinó usando RT-qPCR TaqMan, según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems). Todas las reacciones de RT-qPCR se realizaron y analizaron usando el software StepOne V2.2.2 (Applied Biosystems). Se usaron las siguientes sondas TaqMan Assays-on-Demand™: Mm02342430_g1 (ppia) y Mm01168134_m1 (ifn-y).
Para todos los demás genes examinados, se usaron los siguientes cebadores:
ppiadirecto 5'-AGCATACAGGTCCTGGCATCTTGT-3' (SEQ ID NO: 33) e inverso 5'-CAAAGACCACATGCTTGCCATCCA-3' (SEQ ID NO: 34);
icamldirecto 5'-AGATCACATTCACGGTGCTGGCTA-3' (SEQ ID NO: 35) e inverso 5'-AGCTTTGGGATGGTAGCTGGAAGA-3' (SEQ ID NO: 36);
vcamldirecto 5'-TGTGAAGGGATTAACGAGGCTGGA-3' (SEQ ID NO: 37) e inverso 5'-CCATGTTTCGGGCACATTTCCACA-3' (SEQ ID NO: 38);
cxcl10directo 5'-AACTGCATCCATATCGATGAC-3' (SEQ ID NO: 39) e inverso 5'-GTGGCAATGATCTCAACAC-3' (SEQ ID NO: 40);
ccl2directo 5'-CATCCACGTGTTGGCTCA-3' (SEQ ID NO: 41) e inverso 5'-GATCATCTTGCTGGTGAATGAGT-3' (SEQ ID NO: 42);
tnf-ydirecto 5'-GCCTCTTCTCATTCCTGCTT-3' (SEQ ID NO: 43) e inverso CTCCTCCACTTGGTGGTTTG-3' (SEQ ID NO: 44);
il-1pdirecto 5'-CCAAAAGATGAAGGGCTGCTT-3' (SEQ ID NO: 45) e inverso 5'-TGCTGCTGCGAGATTTGAAG-3' (SEQ ID NO: 46);
il-12p40directo 5'-GAAGTTCAACATCAAGAGCA-3' (SEQ ID NO: 47) e inverso 5'-CATAGTCCCTTTGGTCCAG-3' (SEQ ID NO: 48);
il-10directo 5'-TGAATTCCCTGGGTGAGAAGCTGA-3' (SEQ ID NO: 49) e inverso 5'-TGGCCTTGTAGACACCTTGGTCTT-3' (SEQ ID NO: 50);
tgfp2directo 5'-AATTGCTGCCTTCGCCCTCTTTAC-3' (SEQ ID NO: 51) e inverso 5'-TGTACAGGCTGAGGACTTTGGTGT-3' (SEQ ID NO: 52);
igf-1directo 5'-CCGGACCAGAGACCCTTTG-3' (SEQ ID NO: 53) e inverso 5'-CCTGTGGGCTTGTTGAAGTAAAA-3' (SEQ ID NO: 54); y
bdnfdirecto 5'-GATGCTCAGCAGTCAAGTGCCTTT-3' (SEQ ID NO: 55) e inverso 5'-GACATGTTTGCGGCATCCAGGTAA-3' (SEQ ID NO: 56).
Inmunohistoquímica. La inmunohistoquímica y el procesamiento de tejidos se realizaron en cerebros seccionados de ratón (6 pm de grosor) y ser humano (10 pm de grosor) incluidos en parafina. Para la tinción de ICAM-1 de ser humano, se usó el anticuerpo primario de ratón anti-ICAM (1:20, Abcam; ab2213). Los portaobjetos se incubaron durante 10 min con H<2>O<2>al 3 %, y se usó un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con biotina, seguido de amplificación con biotina/avidina con el kit Vectastain ABC (Vector Laboratories). Posteriormente, se aplicó 3,3'-diaminobencidina (substrato DAB) (kit de Zytomed); los portaobjetos se deshidrataron y se montaron con disolución de montaje a base de xileno. Para la tinción de tejidos, a los ratones se les perfundió por vía transcardiaca PBS antes de la extirpación y fijación de tejidos. Los tejidos del CP se aislaron bajo un microscopio de disección (Stemi DV4; Zeiss) a partir de los ventrículos lateral, tercero y cuarto del cerebro. Para la tinción del CP del montaje entero, los tejidos se fijaron con paraformaldehído (PFA) a 2,5 % durante 1 hora a 4 °C, y posteriormente se transfirieron a PBS que contenía azida de sodio al 0,05 %. Antes de la tinción, los tejidos disecados se lavaron con PBS y se bloquearon (suero de caballo al 20 %, Triton X-100 al 0,3 %, y PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. La tinción del montaje entero con anticuerpos primarios (en PBS que contenía suero de caballo al 2 % y Triton X-100 al 0,3 %), o anticuerpos secundarios, se realizó durante 1 h a temperatura ambiente. A cada etapa le siguieron tres lavados en PBS. Los tejidos se aplicaron a portaobjetos, se montaron con Immu-mount (9990402, de Thermo Scientific), y se sellaron con cubreobjetos. Para la tinción de cerebros seccionados, se aplicaron dos protocolos de preparación de tejido diferentes (secciones de flotación libre microtomizadas o incluidas en parafina), tal como se describió previamente (Baruchet al.,2013; Kuniset al.,2013). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo de ratón anti-Ap (1:300, Covance, #SIG-39320); anticuerpo de conejo anti-GFP (1:100, MBL, #598); anticuerpo de rata anti-CD68 (1:300, eBioscience, #14-0681); anticuerpo de rata anti-ICAM-1 (1:200, Abcam, #A<b>2213); anticuerpo de cabra anti-GFP (1:100, Abcam, #ab6658); anticuerpo de conejo anti-IBA-1 (1:300, Wako, #019-19741); anticuerpo de cabra anti-IL-1l0 (1:20, R&D Systems, #AF519); anticuerpo de rata anti-Foxp3 (1:20, eBioscience, #13-5773-80); anticuerpo de conejo anti-CD3 (1:500, Dako, #IS503); anticuerpo de ratón anti-ZO-1, anticuerpo de ratón anti-E-cahedrina y anticuerpo de conejo anti-claudina-1 (todos 1:100, Invitrogen, #33-9100, #33-4000, #51-9000); anticuerpo de conejo anti-GFAP (1:200, Dako, #Z0334). Los anticuerpos secundarios incluían: anticuerpos de burro anti-IgG de ratón/cabra/conejo/rata conjugados con Cy2/Cy3/Cy5 (1:200; todos de Jackson ImmunoResearch). Los portaobjetos se expusieron a tinción nuclear de Hoechst (1:4000; Invitrogen Probes) durante 1 min. De manera rutinaria, se usaron dos controles negativos en los procedimientos de inmunotinción, tinción con anticuerpo de control de isotipo seguido de anticuerpo secundario, o tinción con anticuerpo secundario solo. Para la tinción intracelular de Foxp3, la recuperación del antígeno a partir de portaobjetos incluidos en parafina se realizó usando el kit Retreivagen (#550524, #550527; BD Pharmingen™). El análisis microscópico se realizó usando un microscopio de fluorescencia (E800; Nikon) o un microscopio confocal de exploración con láser (Carl Zeiss, Inc.). El microscopio de fluorescencia estaba equipado con una cámara digital (DXM 1200F; Nikon), y con una lente objetivo 20x NA 0,50 o 40x NA 0,75 (Plan Fluor; Nikon). El microscopio confocal estaba equipado con capacidad de exploración con láser LSM 510 (tres láseres: Ar 488, HeNe 543 y HeNe 633). Los registros se hicieron en tejidos fijados posteriormente usando el software de adquisición (NIS-Elements, F3 [Nikon] o LSM [Carl Zeiss, Inc.]). Para la cuantificación de la intensidad de tinción, se midió la tinción de fondo y celular total usando el software ImageJ (NIH), y se calculó la intensidad de tinción específica, tal como se describió previamente (Burgesset al.,2010). Las imágenes se recopilaron, fusionaron, y optimizaron usando Photoshop CS613.0 (Adobe), y se organizaron usando Illustrator CS5 15.1 (Adobe).
Secciones de CP humano incluidas en parafina. Se obtuvieron secciones de cerebro humano de individuos jóvenes y maduros cadavéricos sin enfermedad del SNC, así como de pacientes con AD, del Oxford Brain Bank (anteriormente conocido como Thomas Willis Oxford Brain Collection (TWOBC)) con el consentimiento apropiado y la aprobación del Comité de Ética (TW220). Los experimentos que implican estas secciones fueron aprobados por el Comité de Bioética del Instituto de Ciencia Weizmann.
Citometría de flujo, preparación y análisis de muestras. A los ratones se les perfundió por vía transcardiaca PBS, y los tejidos se trataron tal como se describió previamente (Baruchet al.,2013). Los cerebros se disecaron y las diferentes regiones del cerebro se retiraron bajo un microscopio de disección (Stemi DV4; Zeiss) en PBS, y los tejidos se disociaron usando el disociador gentleMACS™ (Miltenyi Biotec). Los tejidos del plexo coroideo se aislaron a partir de los ventrículos lateral, tercero y cuarto del cerebro, se incubaron a 37 °C durante 45 min en PBS (con Ca2+/Mg2+) que contenía 400 U/ml de colagenasa tipo IV (Worthington Biochemical Corporation), y luego se homogeneizaron manualmente por pipeteo. Los bazos se trituraron con el émbolo de una jeringa y se trataron con tampón de lisis ACK (cloruro de amonio y potasio) para eliminar los eritrocitos. En todos los casos, las muestras se tiñeron según los protocolos de los fabricantes. Todas las muestras se filtraron a través de una malla de nailon de 70 |jm, y se bloquearon con anticuerpo anti-Fc CD16/32 (1:100; BD Biosciences). Para la tinción intracelular de IFN-y, las células se incubaron con para-metoxianfetamina (10 ng/ml; Sigma-Aldrich) e ionomicina (250 ng/ml; Sigma-Aldrich) durante 6 h, y se añadió brefeldina-A (10 pg/ml; Sigma-Aldrich) durante las últimas 4 h. El marcaje intracelular de las citocinas se realizó con el kit de fijación/permeabilización Cytofix/Cytoperm™ Plus de BD (n.° de catálogo 555028). Para la tinción de Treg, se usó un equipo de tampón de tinción de FoxP3 de eBioscience (n.° de catálogo 00-5523-00). Los siguientes anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromo se adquirieron de BD Pharmingen, BioLegend, R&D Systems o eBiosciences, y se usaron según los protocolos de los fabricantes: anticuerpo anti-CD4 conjugado con PE o Alexa Fluor 450; anticuerpo anti-CD25 conjugado con PE; anticuerpo anti-CD45 conjugado con PerCP-Cy5.5; anticuerpo anti-TCRp conjugado con FITC; anticuerpo anti-IFN-y conjugado con APC; anticuerpo anti-FoxP3 conjugado con APC; y anticuerpo anti-CD45 conjugado con violeta brillante. Las células se analizaron en un citómetro LSRII (BD Biosciences) usando el software FlowJo. En cada experimento, se usaron grupos de control negativo relevantes, controles positivos, y muestras teñidas individuales para cada tejido para identificar las poblaciones de interés y para excluir otras poblaciones.
Preparación de quimeras de BM. Se prepararon quimeras de BM tal como se describió previamente (Shechteret al.,2009; Shechteret al.,2013). En resumen, se sometieron ratones receptores del mismo género a irradiación letal de todo el cuerpo (950 rad) mientras se protegía la cabeza (Shechteret al.,2009). A los ratones se les inyectó por vía intravenosa 5x106 células de BM de donantes CX3CR1GFP/+. Los ratones se dejaron durante 8-10 semanas después del trasplante de BM para permitir la reconstitución del linaje hematopoyético, antes de su uso en los experimentos. El porcentaje de quimerismo se determinó mediante análisis por FACS de muestras de sangre según los porcentajes de células que expresan GFP de entre los monocitos circulantes (CD11b+). En este modelo con protección de cabeza, se logró un promedio del 60 % de quimerismo, y se verificó que las células mieloides GFP+ que se infiltran en el SNC eran CD45alto/CD11balto, que representan macrófagos derivados de monocitos y no microglía (Shechteret al.,2013).
Laberinto de agua de Morris. Se realizaron tres ensayos por día en los ratones, durante 4 días consecutivos, para que aprendieran a encontrar una plataforma escondida situada 1,5 cm por debajo de la superficie del agua en una piscina (1,1 m de diámetro). La temperatura del agua se mantuvo entre 21-22 °C. El agua se hizo opaca con leche en polvo. Dentro de la sala de pruebas, sólo estaban disponibles para los ratones señales visuales distales de formas y objetos para facilitar la localización de la plataforma sumergida. La latencia de escape, es decir, el tiempo requerido para encontrar y trepar a la plataforma, se registró durante un máximo de 60 s. Se dejó que cada ratón permaneciera en la plataforma durante 15 s, y luego se llevó del laberinto a su jaula. Si el ratón no encontraba la plataforma en el plazo de 60 s, se colocaba manualmente en la plataforma y se devolvía a su jaula después de 15 s. El intervalo entre ensayos para cada ratón fue de 10 min. El día 5, se retiró la plataforma, y se realizó una sola prueba en los ratones que duraba 60 s sin escapatoria posible. Los días 6 y 7, la plataforma se colocó en el cuadrante opuesto al cuadrante de entrenamiento original, y volvió a entrenarse al ratón durante tres sesiones cada día. Los datos se registraron usando el sistema de seguimiento automatizado Etho Vision V7.1 (Noldus Information Technology). El análisis estadístico se realizó usando el análisis de varianza (ANOVA) y la pruebaa posterioride Bonferroni. Todas las pruebas de MWM se realizaron entre las 10 a.m. y las 5 p.m. durante la fase de luces apagadas.
Laberinto de agua de brazos radiales. El laberinto de agua de brazos radiales (RAWM) se usó para someter a prueba el aprendizaje y la memoria espacial, tal como se describió previamente en detalle (Alamedet al.,2006). En resumen, se colocaron seis inserciones de acero inoxidable en el depósito, formando seis brazos de natación que irradian desde un área central abierta. La plataforma de escape estaba situada en el extremo de un brazo (el brazo objetivo), 1,5 cm por debajo de la superficie del agua, en una piscina de 1,1 m de diámetro. La temperatura del agua se mantuvo entre 21-22 °C. El agua se hizo opaca con leche en polvo. Dentro de la sala de pruebas, sólo estaban disponibles para los ratones señales visuales distales de formas y objetos para facilitar la localización de la plataforma sumergida. La ubicación del brazo objetivo se mantuvo constante para un ratón dado. El día 1, los ratones fueron entrenados durante 15 pruebas (espaciadas por 3 h), con pruebas alternando entre una plataforma visible y oculta, y las últimas 4 pruebas con plataforma oculta solamente. El día 2, los ratones fueron entrenados durante 15 pruebas con la plataforma oculta. La entrada en un brazo incorrecto, o la falla para seleccionar un brazo en el plazo de 15 s, se calificó como un error. El aprendizaje y la memoria espacial se midieron contando el número de errores de entrada en brazos o la latencia de escape de los ratones en cada ensayo. Los datos del entrenamiento se analizaron como errores medios o latencia de escape, para bloques de entrenamiento de tres pruebas consecutivas.
Administración de GA. A cada ratón se le inyectó por vía subcutánea (s.c.) una dosis total de 100 |jg de GA (lote n.° P53640; Teva Pharmaceutical Industries, Petaj Tikva, Israel) disueltos en 200 j l de PBS. A los ratones se les inyectó según un régimen de GA semanal (Butovskyet al.,2006), o administración de GA diario (figura 8 y figura 16). Los ratones se sacrificaron 1 semana después de la última inyección de GA, o 1 mes después del tratamiento, tal como se indica para cada experimento.
Ablación condicional de Treg. Se inyectó por vía intraperitoneal (i.p.) toxina diftérica (DTx; 8 ng/g de peso corporal; Sigma) diariamente durante 4 días consecutivos a ratones Foxp3.LuciDTR (Suffneret al.,2010). La eficiencia de la DTx se confirmó por análisis de citometría de flujo de las células inmunitarias en la sangre y el bazo, logrando el agotamiento casi completo (> 99 %) de las células Treg FoxP3+ CD4+ que expresan GFP (figura 4).
Inhibición de p300. La inhibición de p300 en ratones se realizó de manera similar a la descrita previamente (Liuetal., 2013). Se disolvió p300i (C646; Tocris Bioscience) en DMSO y se inyectó por vía i.p. (8,9 mg kg_1 d'1) cada dos días durante 1 semana. A los ratones tratados con vehículo se les inyectó de manera similar DMSO.
Tratamiento con ATRA. Se realizó la administración de ácido retinoico todo trans (ATRA) a los ratones de manera similar a la descrita previamente (Walshet al.,2014). Se disolvió ATRA (Sigma) en DMSO y se inyectó por vía i.p. (8 mg kg'1 d_1) cada dos días durante 1 semana. A los ratones tratados con vehículo se les inyectó de manera similar DMSO.
Aislamiento y cuantificación de la proteína Ap soluble (sAp). La homogeneización del tejido y la extracción de la proteína sAp se realizó tal como se describió previamente (Schmidtet al.,2005). En resumen, el parénquima cerebral se disecó y ultracongeló y se mantuvo a -80 °C hasta su homogeneización. Las proteínas se extrajeron de forma secuencial a partir de las muestras para obtener fracciones separadas que contienen proteínas de diferente solubilidad. Las muestras se homogeneizaron en 10 volúmenes de tampón de homogeneización de tejidos helado, que contiene sacarosa 250 mM, base de Tris 20 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM y ácido etilenglicol-tetraacético 1 mM (pH 7,4), usando una mano de mortero de vidrio esmerilado en un homogeneizador Dounce. Después de seis golpes, el homogeneizado se mezcló 1:1 con dietilamina (DEA) al 0,4 % en una disolución de NaCl 100 mM antes de seis golpes adicionales, y luego se centrifugó a 135.000 g a 4 °C durante 45 min. Se recogió el sobrenadante (fracción soluble en DEA que contiene proteínas extracelulares y citosólicas) y se neutralizó con el 10% de Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8). Se midieron individualmente Api<.40>y AP<1-42>mediante el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) de la fracción soluble usando kits disponibles comercialmente (BioLegend; #SIG-38954 y #SIG-38956, respectivamente), según las instrucciones del fabricante.
Cuantificación de placas Ap. De cada cerebro, se recogieron cortes frontales de 6 pm, y se inmunotiñeron ocho secciones por ratón, de cuatro profundidades predeterminadas diferentes a lo largo de la región de interés (circunvolución dentada o corteza cerebral). La segmentación basada en el histograma de pixeles con tinción positiva se realizó usando el software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EE. UU.). El algoritmo de segmentación se aplicó manualmente a cada imagen, en el área de la circunvolución dentada o en la capa V cortical, y se determinó el porcentaje del área ocupada por la inmunotinción de Ap total. Los números de placas se cuantificaron de los mismos cortes de cerebro frontales de 6 pm, y se presentan como número promedio de placas por región del cerebro. Antes de la cuantificación, se codificaron los cortes para enmascarar la identidad de los grupos experimentales, y se cuantificó la carga de placas por un observador con enmascaramiento con respecto a la identidad de los grupos.
Análisis estadístico. Las pruebas específicas usadas para analizar cada serie de experimentos se indican en las leyendas de las figuras. Los datos se analizaron usando una prueba de la t de Student bilateral que compara entre dos grupos, se usó ANOVA unidireccional para comparar varios grupos, seguido del procedimientoa posterioride Newman-Keuls para la comparación por pares de los grupos después de rechazar la hipótesis nula (P < 0,05). Los datos de las pruebas de comportamiento se analizaron usando ANOVA de medidas repetidas bidireccional, y se usó el procedimientoa posterioride Bonferroni para el seguimiento de la comparación por pares. Los tamaños de muestra se eligieron con la potencia estadística adecuada basándose en la bibliografía y la experiencia pasada, y los ratones se asignaron a grupos experimentales según la edad, el género, y el genotipo. Los investigadores presentaban enmascaramiento con respecto a la identidad de los grupos durante los experimentos y la evaluación de los resultados. Todos los criterios de inclusión y exclusión fueron preestablecidos según las normas del IACUC. Los resultados se presentan como medias ± e.e.m. En los gráficos, las barras de error del eje y representan el e.e.m. Los cálculos estadísticos se realizaron usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA).
Introducción. La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa relacionada con la edad caracterizada por daño neuronal, formación de placas amiloides beta (Ap), e inflamación crónica dentro del sistema nervioso central (SNC), que conduce a la pérdida gradual de la función cognitiva y la destrucción del tejido cerebral (Akiyamaet al.,2000; Hardy y Selkoe, 2002). En estas condiciones, las células mieloides circulantes, y las células mieloides residentes del SNC, la microglía, desempeñan funciones no redundantes en la mitigación de la respuesta neuroinflamatoria (Britschgi y Wyss-Coray, 2007; Cameron y Landreth, 2010; Lai y McLaurin 2012). Específicamente, mientras que la microglía no puede depurar en última instancia los depósitos de Ap, los macrófagos derivados de monocitos que se infiltran en el SNC (mo-MO) desempeñan una función beneficiosa en la limitación de la formación de placas Ap y en el combate de la patología similar a AD (Butovskyet al.,2007; Koronyo-Hamaouiet al.,2009; Mildneret al.,2011; Simardet al.,2006; Townet al.,2008). El plexo coroideo (CP) del cerebro, cuyas capas epiteliales forman la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BCSFB), ha sido identificado como una puerta de entrada selectiva para el ingreso de leucocitos al SNC, lo que permite el reclutamiento de las células T y mo-MO después del daño del tejido neural (Kuniset al.,2013; Shechteret al.,2013). En este caso, los presentes inventores formularon la hipótesis de que, en la AD, el reclutamiento subóptimo de las células inmunitarias que resuelven la inflamación al parénquima enfermo es un resultado de la insuficiencia inmunitaria sistémica, que implica disfunción de la puerta de entrada del CP.
Ejemplo 1. Actividad de la puerta de entrada del plexo coroideo (CP) a lo largo de la evolución de la enfermedad en el modelo de ratón de AD.
Los presentes inventores examinaron en primer lugar la actividad del CP a lo largo de la evolución de la enfermedad en el modelo de ratón transgénico 5XFAD de AD (AD-Tg); estos ratones coexpresan cinco mutaciones asociadas con la AD familiar y desarrollan patología Ap cerebral y gliosis tan tempranamente como a los 2 meses de edad (Oakleyet al.,2006). Se encontró que a lo largo de las etapas evolutivas de la patología de la enfermedad, el CP de los ratones AD-Tg, en comparación con los controles de tipo silvestre (WT) de la misma edad, expresaba niveles significativamente menores de determinantes de tráfico y retorno de leucocitos, incluyendoicaml, vcaml, cxcl10yccl2(figura 1A), que se muestra que están regulados por incremento por el CP en respuesta al daño agudo del SNC, y son necesarios para la migración transepitelial de los leucocitos (Kuniset al.,2013; Shechteret al.,2013). La tinción inmunohistoquímica para el ligando de integrina, ICAM-1, confirmó su expresión reducida por el epitelio del CP de los ratones AD-Tg (figura 1B). Además, la tinción para ICAM-1 en cerebros cadavéricos humanos mostró su reducción asociada con la edad en el epitelio del CP, en línea con las observaciones previas de los presentes inventores (Baruchet al.,2014), y la evaluación cuantitativa de este efecto reveló una mayor disminución en los pacientes con AD en comparación con los individuos maduros sin enfermedad del SNC (figura 2A). Dado que la inducción de los determinantes de tráfico de leucocitos por el CP depende de la señalización epitelial de interferón (IFN)-y (Kuniset al.,2013), los presentes inventores sometieron a prueba entonces si los efectos observados podrían reflejar la pérdida de disponibilidad de IFN-y en el CP. El examen del CP de los ratones 5XFAD AD-Tg usando tinción intracelular por citometría de flujo reveló números significativamente menores de células que producen IFN-y en este compartimiento (figura 2B), y el análisis por PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) confirmó menores niveles de expresión de ARNm deifn-yenel CP de los ratones AD-Tg en comparación con los controles WT de la misma edad (figura 2C).
Ejemplo 2. Relaciones funcionales entre la inmunosupresión sistémica mediada por Treg, la actividad de la puerta de entrada del CP, y la patología de la AD.
Las células T reguladoras (Treg) desempeñan una función fundamental en la supresión de las respuestas inmunitarias efectoras sistémicas (Sakaguchiet al.,2008). Los presentes inventores previeron que la inmunosupresión sistémica mediada por Treg afecta a la disponibilidad de IFN-y en el CP y, por tanto, se enfocaron en la participación de las Treg en la patología de la AD. Según los informes previos de los niveles elevados de Treg y las actividades de supresión en los pacientes con AD (Rosenkranzet al.,2007; Saresellaet al.,2010; Torreset al.,2013), la evaluación de las frecuencias de Treg Foxp3+ en los esplenocitos de ratones 5XFAD AD-Tg, con respecto a sus compañeros de camada WT de la misma edad, reveló sus niveles elevados a lo largo de la evolución de la enfermedad (figuras 3A, B). Para el estudio de las relaciones funcionales entre la inmunosupresión sistémica mediada por Treg, la actividad de la puerta de entrada del CP, y la patología de la AD, se cruzó a los ratones 5XFAD AD-Tg con ratones Foxp3-receptor de toxina diftérica (DTR+), permitiendo el agotamiento condicional transitorioin vivode las Treg Foxp3+ en los ratones AD-Tg/DTR+ mediante la administración de toxina diftérica (DTx) (figura 4). El agotamiento transitorio de las Treg dio como resultado una expresión elevada de ARNm de las moléculas de tráfico de leucocitos por el CP de los ratones AD-Tg/DTR+ con respecto a sus compañeros de camada AD-Tg/DTR-tratados con DTx (figura 5A). El análisis del efecto a largo plazo del agotamiento transitorio de Treg en el parénquima cerebral (3 semanas más tarde) reveló la acumulación de células inmunitarias en el cerebro, incluyendo números elevados de células mieloides CD45alto/CD11balto, lo que representa la infiltración de células mo-MO (Shechteret al.,2013) y células T CD4+ (figura 5B). Además, el agotamiento corto y transitorio de las Treg dio como resultado un enriquecimiento notable de Treg Foxp3+ entre las células T CD4+ que se acumularon dentro del cerebro, tal como se evaluó por citometría de flujo (figuras 5C, D). El análisis por RT-qPCR del hipocampo mostró una mayor expresión de ARNm defoxp3eil10(figura 5E).
Se examinó entonces si el agotamiento a corto plazo de Treg, al que le siguió la acumulación de células inmunorreguladoras en los sitios de patología del cerebro, condujo a un efecto a largo plazo sobre la función cerebral. Se observó reducción en la gliosis hipocámpica (figura 5F), y niveles reducidos de expresión de ARNm de citocinas proinflamatorias, tales comoil-12p40ytnf-a(figura 5G). Además, se redujo la carga de placas Ap cerebrales en la circunvolución dentada hipocámpica y la corteza cerebral (5a capa), dos regiones del cerebro que exhiben patología robusta de placas Ap en los ratones 5XFAD AD-Tg (Oakleyet al.,2006) (figuras 6A, B). La evaluación del efecto sobre la función cognitiva, usando la prueba del laberinto de agua de Morris (MWM), reveló una mejora significativa en el aprendizaje y la memoria espacial en los ratones AD-Tg/DTR+ después del agotamiento de Treg, con respecto a los ratones AD-Tg/DTR' de la misma edad tratados con DTx, alcanzando un rendimiento similar al de los ratones WT (figuras 6C-E). Considerados en conjunto, estos datos demuestran que la interrupción transitoria de la inmunosupresión sistémica mediada por Treg en los ratones AD-Tg dio como resultado la acumulación de células que resuelven la inflamación, incluyendo mo-MO y Treg, en el cerebro, y a lo que le siguió la resolución de la respuesta neuroinflamatoria, la depuración de Ap, y la inversión del deterioro cognitivo.
Ejemplo 3. La administración semanal del copolímero 1 reduce la inmunosupresión sistémica mediada por Treg, mejora la actividad de la puerta de entrada del CP, y mitiga la patología de la AD.
Para fundamentar adicionalmente la naturaleza causal de la relación inversa entre la inmunosupresión sistémica, la función del CP y la patología de la AD, se hizo uso entonces del compuesto inmunomodulador acetato de glatiramer (GA; también conocido como copolímero 1, o Copaxone®), que se encontró que en un régimen de administración semanal tiene un efecto terapéutico en el modelo de ratón APP/PS1 de AD (Butovskyet al.,2006); este efecto estaba asociado funcionalmente con el reclutamiento de mo-MO a los sitios cerebrales de patología de la enfermedad (Butovskyet al.,2007). En este caso, los presentes inventores analizaron en primer lugar si el CP en los ratones APP/PS1 AD-Tg, de manera similar a su observación en los ratones 5XFAD AD-Tg, también es deficiente con respecto a los niveles de expresión de IFN-y. Se encontró que, en los ratones APP/PS1 AD-Tg, los niveles de IFN-yen el CP se redujeron con respecto a los controles WT de la misma edad (figura 7A). Estos resultados alentaron a los presentes inventores a someter a prueba si el efecto terapéutico de GA semanal en los ratones APP/PS1 (Butovskyet al.,2006) podría reproducirse en los ratones 5XFAD AD-Tg, y si era así, si afectaría a las Treg sistémicas y a la activación del CP para el tráfico de mo-MO. Por tanto, los presentes inventores trataron a los ratones 5XFAD AD-Tg con un régimen de administración de GA semanal durante un periodo de 4 semanas (en lo sucesivo, “GA semanal”; representado esquemáticamente en la figura 8A). Se encontró que los ratones 5XFAD AD-Tg tratados con GA semanal mostraron una neuroinflamación reducida (figuras 8B-D), y un rendimiento cognitivo mejorado, que duró hasta 2 meses después del tratamiento (figuras 8E-I). Al examinar por citometría de flujo el efecto de GA semanal sobre la inmunidad sistémica y sobre el CP, se encontraron niveles reducidos de Treg Foxp3+ de esplenocitos (figura 9A), y un aumento en las células que producen IFN-y en el CP de los ratones 5XFAD AD-Tg tratados, alcanzando niveles similares a los observados en los controles WT (figura 9B). El nivel elevado de células que expresan IFN-y en el CP en los ratones tratados con GA semanal estuvo acompañado de la expresión epitelial regulada por incremento de las moléculas de tráfico de leucocitos (figura 9C).
Para detectar la entrada de mo-MO infiltrantes hacia el SNC, se usaron ratones quiméricos de médula ósea (BM) 5XFAD AD-Tg/CXaCR1GFP/+ (preparados usando protección de la cabeza), lo que permite la visualización de las células mieloides circulantes (marcadas con proteína fluorescente verde (GFP)+) (Shechteret al.,2009; Shechteret al.,2013). Se encontró un retorno aumentado de mo-MO GFP+ hacia el CP, así como hacia los espacios ventriculares adyacentes, después del tratamiento con GA semanal, en comparación con controles AD-Tg/CX3CR1GFP/+ tratados con vehículo (figuras 9D-E). La inmunohistoquímica del parénquima cerebral reveló la presencia de acumulación de mo-MO GFP+ en los sitios de formación de placa cerebral (figura 9F), y la cuantificación de células mieloides infiltrantes, por análisis de citometría de flujo del hipocampo en los ratones AD-Tg no quiméricos, mostró números aumentados de células que expresan CD11baltoCD45alto (figuras 9G, H). En conjunto, estos resultados fundamentaron el vínculo funcional entre el reclutamiento de mo-MO a los sitios de patología de la AD, la reducción de los niveles de Treg sistémicas, y la activación del CP dependiente de IFN-y.
Ejemplo 4. Una interferencia directa a corto plazo con la actividad de Treg mejora la actividad de la puerta de entrada del CP, y mitiga la patología de la AD.
4.1 Interferencia con la actividad de Treg usando un inhibidor de histona acetiltransferasa de molécula pequeña.Los hallazgos anteriores, que sugirieron que la inmunosupresión sistémica mediada por Treg interfiere con la capacidad para combatir la patología de la AD, son una reminiscencia de la función atribuida a las Treg en la inmunoterapia del cáncer, en la que estas células obstaculizan la capacidad del sistema inmunitario para montar una respuesta antitumoral eficaz (Bos y Rudensky, 2012; Nishikawa y Sakaguchi, 2010). Por tanto, los presentes inventores consideraron que un tratamiento que interfiere directamente con la actividad de las células Treg Foxp3+ podría ser ventajoso en la AD. Los presentes inventores sometieron a prueba p300i (C646 (Bowerset al.,2010)), un inhibidor no peptídico de p300, una histona acetiltransferasa que regula la función de las Treg (Liuet al.,2013); se mostró que este inhibidor afecta a las actividades supresoras de las Treg, mientras que deja intactas las respuestas protectoras de las células T efectoras (Liuet al.,2013). Se encontró que los ratones tratados con p300i, en comparación con los controles tratados con vehículo (DMSO), mostraron niveles elevados de células sistémicas que expresan IFN-yen el bazo (figura 10A), así como en el CP (figura 10B). Entonces trataron a los ratones AD-Tg con p300i o vehículo durante 1 semana, y los examinaron 3 semanas más tarde para determinar la carga de placas Ap cerebrales. El análisis inmunohistoquímico reveló una reducción significativa en la carga de placas Ap cerebrales en los ratones AD-Tg tratados con p300i (figuras 10C-E). También se sometió a prueba si el efecto sobre la patología de las placas después de una tanda de tratamiento duraría más allá de las 3 semanas, y si era así, si las tandas de tratamiento adicionales contribuirían a un efecto de larga duración. Por tanto, se compararon los ratones AD-Tg que recibieron una sola tanda de tratamiento con p300i y se examinaron 2 meses más tarde, con un grupo de la misma edad que recibió dos tandas de tratamiento durante este periodo, con un intervalo intermedio de 1 mes (mostrado esquemáticamente en la figura 10F). Se encontró que la reducción de la carga de placas cerebrales fue evidente incluso dos meses después de una sola tanda de tratamiento, pero fue más fuerte en los ratones que recibieron dos tandas de tratamiento con un intervalo intermedio de 1 mes (figura 10G). Puesto que el deterioro de la plasticidad sináptica y la memoria en la AD está asociado con niveles cerebrales elevados de AP<1>-<40>/AP<1-42>solubles (sAp) (Shankaret al.,2008), también se midieron los niveles de sAp después de un solo ciclo o ciclos repetidos de tratamiento con p300i. Una vez más, se encontró que tanto una como dos tandas (con un intervalo intermedio de 1 mes) fueron eficaces en la reducción de sAp cerebral; sin embargo, este efecto fue más fuerte después de tandas repetidas con respecto al efecto sobre sAp-M<2>(figura 10H). Estos resultados indican que, mientras que una sola tanda de tratamiento a corto plazo es eficaz, tandas de tratamiento repetidas serían ventajosas para mantener un efecto terapéutico de larga duración, de manera similar a las observaciones de los presentes inventores después del tratamiento con GA semanal.
4.2 Interferencia con la actividad de Treg usando un anticuerpo anti-PD1.A los 10 meses de edad, a ratones transgénicos (Tg) 5XFAD con enfermedad de Alzheimer (AD) se les inyectó por vía i.p. 250 |jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14; #BE0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) o anticuerpo IgG de control (IgG2a; #BE0089; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.), el día 1 y el día 4 del experimento, y se examinaron 3 semanas después (representado esquemáticamente en la figura 11A) para determinar su rendimiento cognitivo mediante la tarea de aprendizaje y memoria espacial del laberinto de agua de brazos radiales (RAWM), tal como se describió previamente en detalle (Alamedet al.,2006). En resumen, el día 1 de la tarea de RAWM, los ratones fueron entrenados durante 15 pruebas (espaciadas por 3 h), con pruebas alternando entre una plataforma visible y oculta, y las últimas 4 pruebas con plataforma oculta solamente. El día 2, los ratones fueron entrenados durante 15 pruebas con la plataforma oculta. La entrada en un brazo incorrecto, o la falla para seleccionar un brazo en el plazo de 15 s, se calificó como un error. El aprendizaje y la memoria espacial se midieron contando el número de errores de entrada en brazos o la latencia de escape de los ratones en cada prueba. Se usaron ratones AD-Tg y WT no tratados de la misma edad como controles. Se encontró que los ratones 5XFAD AD-Tg tratados con una sesión de tratamiento que incluía dos inyecciones de anticuerpo anti-PD1 (el día 1 y el día 4) mostraron, tal como se evaluó 3 semanas más tarde, un rendimiento cognitivo espacial significativamente mejorado en el RAWM (figura 11B).
Entonces se examinó si el efecto sobre la patología de la enfermedad estaba asociado con una reducción de la inmunosupresión sistémica. Se repitió el experimento descrito anteriormente, esta vez examinando a los ratones al final de la sesión de tratamiento (día 7 del experimento; representado esquemáticamente en la figura 12A). Se observó que, en este punto de tiempo, la atenuación de la inmunosupresión sistémica en los ratones AD-Tg tratados con PD-1 estuvo acompañada de un efecto sistémico de elevación de esplenocitos CD4 que producen IFN-y (figura 12B), que se correlacionó con un efecto local en el CP de elevación de los niveles de ARNm de IFN-y (figura 13A), y elevación en la expresión de moléculas de tráfico de leucocitos del CP, las quimiocinas CCL2 y CXCL10 (figura 13B). Estos datos mostraron que la sesión corta de tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 en los ratones AD-Tg estaba asociada con una respuesta sistémica de atenuación de la inmunosupresión mediada por Treg, tal como se esperaba (Naidooet al.,2014), y la activación de la actividad de la puerta de entrada del CP para el tráfico de leucocitos hacia el SNC.
Finalmente, se examinó el efecto sobre la patología de la enfermedad en los ratones AD-Tg, y si una sesión de tratamiento adicional era ventajosa en su efecto sobre la patología. Para este fin, los ratones AD-Tg de 10 meses de edad recibieron 1 sesión de tratamiento con anticuerpo anti-PD-1, tal como se describió anteriormente, o un tratamiento adicional con un intervalo de 3 semanas. Los grupos de control se trataron con IgG o no se trataron, y se sometieron a prueba todos los grupos de ratones para determinar su rendimiento cognitivo 3 semanas más tarde (representado esquemáticamente en la figura 14A). Se encontró que, mientras que los ratones AD-Tg tratados con 1 sesión de anticuerpo anti-PD-1 (“AD-Tg PD-1 X1”) y examinados 2 meses más tarde mostraron una mejora cognitiva significativa en comparación con los ratones AD-Tg tratados con IgG y no tratados, el efecto fue menos robusto que cuando los mismos ratones se evaluaron para el rendimiento cognitivo un mes antes. Por el contrario, los ratones AD-Tg que recibieron una segunda sesión de tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 (“AD-Tg PD-1 X2”) mostraron capacidades de aprendizaje y memoria espacial significativamente mejores en el RAWM en comparación con los ratones AD-Tg que recibieron 1 sesión, así como en comparación con los ratones AD-Tg tratados con IgG o no tratados (figura 14B). Estos hallazgos revelaron que, para mantener un efecto terapéutico de larga duración, se necesitan sesiones de tratamiento repetidas.
4.3 Interferencia con la actividad de Treg usando una combinación de anticuerpo anti-PD1 y anticuerpo anti-CTLA4.A los 10 meses de edad, a ratones transgénicos (Tg) 5XFAD con enfermedad de Alzheimer (AD) se les inyectó por vía i.p. 250 |jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14; #Be0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) y 250 |jg de anticuerpo anti-CTLA4 (AcM anti-mcD152in vivo;#BE0131; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) o anticuerpo IgG de control (IgG2a, #BE0089 o IgG policlonal de hámster sirio, #BE0087; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.), el día 1 y el día 4 del experimento, y se examinaron 3 semanas más tarde para determinar su rendimiento cognitivo mediante la tarea de aprendizaje y memoria espacial del laberinto de agua de brazos radiales (RAWM), tal como se describió anteriormente.
Algunos ratones reciben una sesión de tratamiento adicional con una sesión de intervalo de 3 semanas. Los grupos control se tratan con IgG o no se tratan, y todos los grupos de ratones se someten a prueba para determinar su rendimiento cognitivo 3 semanas más tarde.
Se espera que los ratones tratados con la combinación de anticuerpos muestren una mejora cognitiva significativa en comparación con los ratones AD-Tg tratados con IgG y no tratados, así como una reducción significativa de la carga de placas cerebrales.
Ejemplo 5. El aumento de la actividad de Treg tiene un efecto adverso sobre la patología de la AD.
Para fundamentar la función negativa de la inmunosupresión sistémica mediada por Treg en la AD, se investigó entonces si el aumento de los niveles de Treg sistémicas podría tener un efecto adverso opuesto sobre la patología de la AD. Para someter a prueba esto, se potenció la función supresora de las Treg en ratones AD-Tg mediante la administración de ácido retinoico todo trans (ATRA), que induce la diferenciación de las Treg (Mucidaet al.,2007), estabiliza el fenotipo de las Treg (Zhouet al.,2010), y hace que las Treg sean más supresoras (Zhouet al.,2010). Se usaron ratones 5XFAD AD-Tg en las etapas relativamente tempranas de evolución de la enfermedad, y se trataron con ATRA o vehículo (DMSO). Los ratones AD-Tg tratados con ATRA mostraron frecuencias de esplenocitos significativamente mayores de Treg Foxp3+CD25+ (figuras 15A, B). El examen de los ratones 3 semanas después de la última inyección de ATRA reveló una mayor carga de placas Ap cerebrales y gliosis (aumento de aproximadamente 2-3 veces.; figuras 15C-E), y la evaluación de sAp reveló niveles cerebrales aumentados de sAp<1-40>y sAp<1-42>después del aumento de las Treg sistémicas (figuras 15F-G). La evaluación del rendimiento cognitivo, usando el RAWM, mostró un empeoramiento de las deficiencias de memoria espacial en los ratones AD-Tg tratados con ATRA, con respecto a los ratones AD-Tg tratados con vehículo (figura 15H).
Dados los presentes hallazgos del efecto negativo de las Treg sistémicas sobre la patología de la AD, junto con el hecho de que se sabe que la administración diaria de GA induce a las Treg y se usa en la clínica para el tratamiento de la esclerosis múltiple (MS) (Haaset al.,2009; Honget al.,2005; Weberet al.,2007), los presentes inventores han sometido a prueba si GA en el régimen diario (durante un periodo de 1 mes), a diferencia de GA semanal, podría tener un efecto negativo sobre la patología de la enfermedad en los ratones AD-Tg. Se comparó el efecto de la administración diaria frente a semanal de GA (representado esquemáticamente en la figura 16A) en ratones 5XFAD AD-Tg. La evaluación del rendimiento cognitivo mediante la tarea de RAWM reveló que, a diferencia del efecto beneficioso del tratamiento con GA semanal, no se observó ningún efecto beneficioso sobre la memoria espacial, o se observó una tendencia hacia un efecto de empeoramiento, en los ratones AD-Tg que recibieron GA diario (figura 16B). Además, a diferencia del efecto robusto de la administración de GA semanal sobre la depuración de las placas, los ratones AD-Tg tratados con GA diario no mostraron ningún efecto beneficioso, o mostraron un efecto adverso moderado sobre la carga de placas (figuras 16C-F). Estos hallazgos enfatizan cómo la MS y la AD, dos patologías del SNC asociadas con la neuroinflamación, podrían verse afectadas de manera opuesta y distinta por el mismo tratamiento inmunomodulador con GA diario (Schwartz y Baruch, 2014a).
Ejemplo 6. La interferencia directa con la actividad de Treg mejora la actividad de la puerta de entrada del CP y previene o mitiga la patología del PTSD.
Las condiciones gravemente estresantes o el estrés crónico pueden conducir a trastorno de estrés postraumático (PTSD) y depresión. Los presentes inventores sugirieron previamente que la actividad de la puerta de entrada del CP puede ser crítica para hacer frente al estrés mental, y en el caso de la función subóptima del CP, el episodio traumático mental puede conducir a trastorno de estrés postraumático (Schwartz y Baruch, 2012). Además, los presentes inventores formularon la hipótesis de que la intervención sistémica oportuna después del trauma, que ayudará a modificar la respuesta del CP, puede prevenir el desarrollo de afecciones crónicas del PTSD. Los hallazgos de los presentes inventores de que una atenuación a corto plazo de la inmunosupresión sistémica mediada por Treg tiene un efecto a largo plazo sobre la patología del cerebro sugieren que esta intervención, inmediatamente después del evento traumático, impediría el desarrollo del PTSD.
Para someter a prueba la hipótesis de trabajo de los presentes inventores de que el CP está implicado en hacer frente al estrés traumático y que podría mostrar disfunción en casos en los que el estrés traumático conduce al desarrollo del PTSD, adoptaron un modelo animal de tipo PTSD fisiológico en el que los ratones exhiben un comportamiento de hipervigilancia, un deterioro de la atención, un aumento de la evaluación de riesgos, y falta de sueño (Lebowet al.,2012). En este modelo experimental de inducción de PTSD, los ratones se habitúan durante 10 días a un ciclo inverso de día/noche, se les infligen dos episodios de choques eléctricos (el trauma y el desencadenante), denominados “inducción de PTSD”, y se evalúan en diferentes puntos de tiempo posteriores al trauma. Después del evento traumático, a los ratones se les inyecta dicho compuesto que reduce de manera transitoria la inmunosupresión periférica. Los ratones se tratan según uno o más de los siguientes regímenes:
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. 250 |jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14; #BE0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) o anticuerpo IgG de control (IgG2a; #BE0089; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd ), el día 1 y el día 4 después del evento traumático, y se examinan después de una sesión de intervalo adicional de dos semanas;
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. 250 jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14; #BE0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) y 250 jg de anticuerpo anti-CTLA4 (AcM anti-mCD152in vivo;#BE0131; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) o anticuerpo IgG de control (IgG2a, #BE0089 o IgG policlonal de hámster sirio, #BE0087; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.), el día 1 y día 4 del experimento, y se examinan después de una sesión de intervalo de dos semanas;
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. GA semanal tal como se describió anteriormente después del evento traumático, y se examinan después de una sesión de intervalo de dos semanas;
• los ratones se tratan con p300i o vehículo durante 1 semana después del evento traumático, y se examinan 3 semanas más tarde tal como se describió anteriormente.
Algunos ratones reciben una sesión de tratamiento adicional con una sesión de intervalo apropiada.
Se espera que los ratones que reciben el tratamiento no muestren comportamiento de ansiedad asociado con el PTSD en este modelo experimental, tal como se evalúa por el tiempo dedicado a explorar y evaluar el riesgo en el laberinto de luz/oscuridad o las otras tareas de comportamiento descritas en (Lebowet al.,2012).
Ejemplo 7. La reducción transitoria de la inmunosupresión sistémica mitiga la patología de la enfermedad de Parkinson.
Se usan ratones transgénicos (Tg) con enfermedad de Parkinson (PD) en estos experimentos. Los ratones se tratan en las etapas evolutivas de la enfermedad según uno o más de los siguientes regímenes:
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. 250 jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14; #BE0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) o anticuerpo IgG de control (IgG2a; #BE0089; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.), el día 1 y el día 4 después del evento traumático, y se examinan después de una sesión de intervalo adicional de dos semanas;
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. 250 jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14; #BE0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) y 250 jg de anticuerpo anti-CTLA4 (AcM anti-mCD152in vivo;#BE0131; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) o anticuerpo IgG de control (IgG2a, #BE0089 o IgG policlonal de hámster sirio, #BE0087; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.), el día 1 y el día 4 del experimento, y se examinan después de una sesión de intervalo de dos semanas;
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. GA semanal tal como se describió anteriormente después del evento traumático, y se examinan después de una sesión de intervalo de dos semanas;
• los ratones se tratan con p300i o vehículo durante 1 semana después del evento traumático, y se examinan 3 semanas más tarde tal como se describió anteriormente.
Algunos ratones reciben una sesión de tratamiento adicional con una sesión de intervalo apropiada (de aproximadamente 3 semanas a un mes).
Las funciones neurológicas motoras se evalúan usando, por ejemplo, la prueba de rendimiento en barra giratoria, que evalúa la capacidad de los ratones para permanecer en una barra giratoria.
Se espera que los ratones PD-Tg tratados con una sesión de tratamiento muestren un rendimiento motor significativamente mejorado, en comparación con el grupo de control tratado con vehículo o tratado con IgG, o el grupo no tratado. Se espera que los ratones PD-Tg que reciben dos tandas de terapia, y se examinan después de una sesión de intervalo apropiada, muestren un efecto terapéutico de larga duración. Para mantener este efecto terapéutico, se someten los ratones a una sesión de tratamiento activa con una sesión de intervalo apropiada entre cada sesión.
Ejemplo 8. La reducción transitoria de la inmunosupresión sistémica mitiga la patología de la enfermedad de Huntington
El modelo usado en estos experimentos puede ser el sistema de prueba de ratones transgénicos (Tg) R6/2 con enfermedad de Huntington (HD). Los ratones transgénicos R6/2 sobreexpresan el gen mutado de la huntingtina humana que incluye la inserción de múltiples repeticiones CAG en los ratones en las etapas evolutivas de la enfermedad. Estos ratones muestran deficiencias conductuales-motoras progresivas que inician tan pronto como a las 5-6 semanas de edad, y conducen a la muerte prematura a las 10-13 semanas. Los síntomas incluyen bajo peso corporal, asimiento, temblores, y convulsiones.
Los ratones se tratan según uno o más de los siguientes regímenes cuando tienen 45 días de edad:
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. 250 |jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14; #BE0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) o anticuerpo IgG de control (IgG2a; #BE0089; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd ), el día 1 y el día 4 después del evento traumático, y se examinan después de una sesión de intervalo adicional de dos semanas;
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. 250 jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14; #BE0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) y 250 jg de anticuerpo anti-CTLA4 (AcM anti-mCD152in vivo;#BE0131; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) o anticuerpo IgG de control (IgG2a, #BE0089 o IgG policlonal de hámster sirio, #BE0087; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.), el día 1 y el día 4 del experimento, y se examinan después de una sesión de intervalo de dos semanas;
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. GA semanal tal como se describió anteriormente después del evento traumático, y se examinan después de una sesión de intervalo de dos semanas;
• los ratones se tratan con p300i o vehículo durante 1 semana después del evento traumático, y se examinan 3 semanas más tarde tal como se describió anteriormente.
Algunos ratones reciben una sesión de tratamiento adicional con una sesión de intervalo apropiada (de aproximadamente 3 semanas a un mes).
Las funciones neurológicas motoras se evalúan usando, por ejemplo, la prueba de rendimiento en barra giratoria, que evalúa la capacidad de los ratones para permanecer en una barra giratoria.
Se espera que los ratones HD-Tg tratados con una sesión de tratamiento muestren un rendimiento motor significativamente mejorado, en comparación con el grupo de control tratado con vehículo o tratado con IgG, o el grupo no tratado. Se espera que los ratones HD-Tg que reciben dos tandas de terapia, y se examinan después de una sesión de intervalo apropiada, muestren un efecto terapéutico de larga duración. Para mantener este efecto terapéutico, se someten los ratones a una sesión de tratamiento activa con una sesión de intervalo apropiada entre cada sesión.
Ejemplo 9. La reducción transitoria de la inmunosupresión sistémica mitiga la patología de la esclerosis lateral amiotrófica.
El modelo usado en este experimento puede ser los ratones transgénicos que sobreexpresan el alelo mutante humano defectuoso SOD1 que contiene el gen Gly93^Ala (G93A) (B6SJL-TgN (SOD1-G93A)1Gur (en el presente documento, “ratones con<a>L<s>”). Este modelo desarrolla la enfermedad de las motoneuronas, y así constituye un modelo animal aceptado para las pruebas de ALS.
Los ratones se tratan según uno o más de los siguientes regímenes cuando tienen 75 días de edad:
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. 250 jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14; #BE0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) o anticuerpo IgG de control (IgG2a; #BE0089; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.), el día 1 y el día 4 después del evento traumático, y se examinan después de una sesión de intervalo adicional de dos semanas;
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. 250 jg de anticuerpo anti-PD1 (RMP1-14; #BE0146; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) y 250 jg de anticuerpo anti-CTLA4 (AcM anti-mCD152in vivo;#BE0131; Bioxcell Lifesciences Pvt. Ltd.) o anticuerpo IgG de control (IgG2a, #BE0089 o IgG policlonal de hámster sirio, #BE0087; Bioxcell Lifesciences Pvt.
Ltd.), el día 1 y el día 4 del experimento, y se examinan después de una sesión de intervalo de dos semanas;
• a los ratones se les inyecta por vía i.p. GA semanal tal como se describió anteriormente después del evento traumático, y se examinan después de una sesión de intervalo de dos semanas;
• los ratones se tratan con p300i o vehículo durante 1 semana después del evento traumático, y se examinan 3 semanas más tarde tal como se describió anteriormente.
Algunos ratones reciben una sesión de tratamiento adicional con una sesión de intervalo apropiada (de aproximadamente 3 semanas a un mes).
Las funciones neurológicas motoras se evalúan usando, por ejemplo, la prueba de rendimiento en barra giratoria, que evalúa la capacidad de los ratones para permanecer en una barra giratoria, o se permite que los ratones se sujeten y se mantengan en un alambre vertical (2 mm de diámetro) con un pequeño bucle en el extremo inferior. Un alambre vertical permite a los ratones usar sus patas delanteras y traseras para agarrarse al alambre. El alambre se mantiene en un movimiento circular verticalmente orientado (el radio del círculo era de 10 cm) a 24 rpm. El tiempo que el ratón es capaz de colgarse en el alambre se registra con un cronómetro.
Se espera que los ratones con ALS tratados con una sesión de tratamiento muestren un rendimiento motor significativamente mejorado, en comparación con el grupo de control tratado con vehículo o tratado con IgG, o el grupo no tratado. Se espera que los ratones con ALS que reciben dos tandas de terapia, y se examinan después de una sesión de intervalo apropiada, muestren un efecto terapéutico de larga duración. Para mantener este efecto terapéutico, se someten los ratones a una sesión de tratamiento activa con una sesión de intervalo apropiada entre cada sesión.
Referencias
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Claims (8)

REIVINDICACIONES
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la sesión que no es de tratamiento dura entre dos semanas y seis meses, y
cuando la sesión de tratamiento comprende una administración repetida:
la composición farmacéutica se administra durante la sesión de tratamiento una vez al día, o una vez cada dos, tres, cuatro, cinco, o seis días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas;
la sesión de tratamiento dura entre 3 días y cuatro semanas; y
la sesión que no es de tratamiento es más larga que el periodo entre administraciones repetidas durante la sesión de tratamiento.
2. Composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 1, en donde cuando la sesión de tratamiento comprende una administración repetida, la sesión de tratamiento dura 3 días.
3. Composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde cuando la sesión de tratamiento comprende una administración repetida, la composición farmacéutica se administra durante la sesión de tratamiento una vez cada tres días.
4. Composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente activo es el anticuerpo anti-PD-L1 neutralizante.
5. Composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente activo es el anticuerpo anti-PD-1 neutralizante.
6. Composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente activo es el anticuerpo anti-TIM-3 neutralizante.
7. Composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho tratamiento de la enfermedad de Alzheimer mejora la función cognitiva.
8. Composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 7, en donde dicha función cognitiva es aprendizaje, memoria, creación de imágenes, actividad mental, conciencia, razonamiento, capacidad espacial, habilidades del habla y el lenguaje, desarrollo del lenguaje y/o capacidad de atención al sentido de la realidad.
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