ES3040433T3 - 1-(5-(2-cyanopyridin-4-yl)oxazole-2-carbonyl)-4-methylhexahydropyrrolo[3,4-b]pyrrole-5(1h)-carbonitrile as usp30 inhibitor for use in the treatment of mitochondrial dysfunction, cancer and fibrosis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilos con actividad como inhibidores de la enzima desubiquitinante USP30, que tienen utilidad en una variedad de áreas terapéuticas, incluidas afecciones que involucran disfunción mitocondrial, cáncer y fibrosis:. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo como inhibidor de USP30 para usar en el tratamiento de la disfunción mitocondrial, cáncer y fibrosis

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a los hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilos con actividad como un inhibidor de la enzima desubiquitilante ubiquitina C-terminal hidrolasa 30, también conocida como ubiquitina específica de peptidasa 30 (USP30), usos de los mismos, procesos para la preparación de los mismos y composiciones que contienen dicho inhibidor. Este inhibidor tiene utilidad en diversas áreas terapéuticas, incluidas las enfermedades con disfunción mitocondrial, cáncer y fibrosis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La ubiquitina es una pequeña proteína que consiste en 76 aminoácidos que es importante para la regulación de la función de las proteínas en la célula. La ubiquitilación y la desubiquitilación son procesos enzimáticos por los que la ubiquitina se une covalentemente a una proteína diana o es escindida de ella por enzimas desubiquitilantes (DUB), de las cuales hay aproximadamente 100 d Ub en las células humanas, divididas en subfamilias basadas en la homología de secuencia. La familia USP se caracteriza por sus cajas comunes de Cis e His comunes que contienen residuos de Cis e His críticos para sus actividades DUB. Los procesos de ubiquitilación y desubiquitilación se han visto implicados en la regulación de muchas funciones celulares, incluida la progresión del ciclo celular, apoptosis, modificación de los receptores de la superficie celular, regulación de la transcripción del ADN y la reparación del ADN. Así, el sistema de la ubiquitina está implicado en la patogénesis de numerosas enfermedades, incluida la inflamación, infección vírica, disfunción metabólica, trastornos del SNC y oncogénesis.

La ubiquitina es un regulador maestro de la dinámica mitocondrial. Las mitocondrias son orgánulos dinámicos cuyos acontecimientos de biogénesis, fusión y fisión están regulados por la regulación postraduccional vía ubiquitilación de muchos factores clave tales como las mitofusinas. En seres humanos, la USP30 es una proteína de 517 aminoácidos que se encuentra en la membrana externa mitocondrial (Nakamura et al, 2008, Mol Biol 19:1903-11). Es la única enzima desubiquitilante que tiene una señal de direccionamiento mitocondrial y se ha demostrado que desubiquita varias proteínas mitocondriales. Se ha demostrado que USP30 se opone a la mitofagia mediada por parkina y que la reducción de la actividad de USP30 puede rescatar los defectos de mitofagia mediados por parkina (Bingol et al, 2015, Nature 510:370-5; Gersch et al, 2017, Nat Struct Mol Biol 24(11): 920-930; Cunningham et al, 2015, Nat Cell Biol 17(2): 160-169). La inactivación de USP30 también puede aumentar la importación de proteínas mitocondriales, potencialmente a través de la ubiquitilación de las proteínas TOM (Jacoupy et al, 2019, Sci Rep 9(1): 11829). Una pequeña proporción de USP30 se ha localizado en los peroxisomas, que se generan mediante la fusión de vesículas mitocondriales y del RE, con USP30 antagonizando potencialmente la vía Pex2/pexofagia (Riccio et al, 2019, J Cell Biol 218(3): 798-807). La E3 Ub ligasa March5 y la desubiquitinasa USP30 se asocian a la translocasa y regulan la importación mitocondrial, mientras que March5 se opone a la importación mitocondrial y dirige la degradación de los sustratos, la USP30 desubiquitina sustratos para promover su importación (Phu et al, 2020, Molecular Cell 77, 1107 1123).

La disfunción mitocondrial puede definirse como una disminución del contenido mitocondrial (mitofagia o biogénesis mitocondrial), como una disminución de la actividad mitocondrial y de la fosforilación oxidativa, pero también como modulación de la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS). De ahí el papel de las disfunciones mitocondriales en un gran número de procesos de envejecimiento y patologías.

Por ejemplo, la enfermedad de Parkinson afecta a unos 10 millones de personas en todo el mundo (Fundación de la enfermedad de Parkinson) y se caracteriza por la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Los mecanismos exactos que subyacen a la EP no están claros; sin embargo, la disfunción mitocondrial se aprecia cada vez más como un determinante clave de la susceptibilidad neuronal dopaminérgica en la EP y es una característica tanto de la enfermedad familiar como de la esporádica, así como en el parkinsonismo inducido por toxinas. La parkina es una de las proteínas que se han relacionado con la aparición temprana de la EP. Mientras que la mayoría de los casos de EP están relacionados con defectos en la alfa-sinucleína, el 10 % de los casos de Parkinson están relacionados con defectos genéticos específicos, uno de ellos en la ubiquitina E3 ligasa parkina. La parkina y la proteína cinasa supuesta cinasa 1 inducida por PTEN (PINK1) colaboran para ubiquitilar las proteínas de la membrana mitocondrial de las mitocondrias dañadas, lo que da lugar a la mitofagia. La desregulación de la mitofagia provoca un aumento del estrés oxidativo, que se ha descrito como una característica de la EP. Por lo tanto, la inhibición de USP30 podría ser una estrategia potencial para el tratamiento de la EP. Por ejemplo, los pacientes con EP con mutaciones de la parkina que conducen a una actividad reducida podrían ser compensados terapéuticamente mediante la inhibición de USP30.

Se ha descrito que el agotamiento de USP30 aumenta el aclaramiento mitofágico de mitocondrias y también aumenta la muerte celular inducida por parkina. También se ha demostrado que USP30 regula la apoptosis dependiente de BAX/BAK independientemente de la sobreexpresión de parkina. El agotamiento de USP30 sensibiliza a las células cancerosas frente a los miméticos de BH-3 tales como ABT-737, sin necesidad de sobreexpresión de la parkina. Así, se ha demostrado que la USP30 desempeña una función antiapoptótica, por lo que USP30 es una diana potencial para la terapia contra el cáncer.

El sistema ubiquitina-proteasoma ha cobrado interés como diana para el tratamiento del cáncer tras la aprobación del inhibidor del proteasoma bortezomib (Velcade®) para el tratamiento del mieloma múltiple. El tratamiento prolongado con bortezomib está limitado por su toxicidad asociada y la farmacorresistencia. Sin embargo, estrategias terapéuticas dirigidas a aspectos específicos de la vía ubiquitina-proteasoma anteriores al proteasoma, tal como las DUB, se prevé que sean mejor toleradas (Bedford et al, 2011, Nature Rev 10:29-46).

Las enfermedades fibróticas, incluida la fibrosis renal, hepática y pulmonar, son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad y pueden afectar a todos los tejidos y sistemas orgánicos. Se considera que la fibrosis es el resultado de un estrés agudo o crónico en el tejido u órgano, caracterizada por la deposición de matriz extracelular, reducción de la permeabilidad vascular/tubular/conductos/vías respiratorias y deterioro de la función que, en última instancia, provoca un fallo orgánico. Muchas afecciones fibróticas se ven favorecidas por el estilo de vida o por factores ambientales; sin embargo, una parte de las afecciones fibróticas pueden iniciarse por factores genéticos o incluso considerarse idiopáticas (es decir, sin causa conocida). Ciertas enfermedades fibróticas, tales como la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), pueden tratarse con un inhibidor de la cinasa no específico (nintedanib) o con fármacos sin un mecanismo de acción bien caracterizado (pirfenidona). Otros tratamientos para la fibrosis de órganos, tales como la fibrosis renal o hepática, alivian la presión sobre el propio órgano (p. ej. betabloqueantes para la cirrosis, bloqueantes de los receptores de angiotensina para la enfermedad renal crónica). La atención a los factores del estilo de vida, tales como el control de la glucosa y la dieta, también pueden influir en el curso y la gravedad de la enfermedad.

La disfunción mitocondrial está implicada en varias enfermedades fibróticas, siendo el estrés oxidativo posterior a la disfunción el mediador patógeno clave, junto con una menor producción de ATP. En modelos preclínicos, la alteración de la vía de la mitofagia (mediante mutación o inactivación de la parkina o de PINK1) exacerba la fibrosis pulmonar y la fibrosis renal, con evidencia de un aumento del estrés oxidativo.

Kurita et al, 2017, Respiratory Research 18:114, divulga que la acumulación de miofibroblastos profibróticos es un proceso crucial para la remodelación fibrótica en la FPI. Recientes descubrimientos muestran la participación de la autofagia/mitofagia, parte de la maquinaria de degradación lisosómica, en la patogénesis de la FPI, y que la mitofagia interviene en la diferenciación de los miofibroblastos mediante la regulación de la activación del receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFR) mediada por especies reactivas del oxígeno (ROS) mitocondriales. Los resultados de Kurita sugirieron que la pirfenidona induce la mitofagia mediada por PARK2 y también inhibe el desarrollo de la fibrosis pulmonar en un contexto de mitofagia insuficiente, lo que puede explicar al menos en parte los mecanismos antifibróticos para el tratamiento de la FPI.

Williams et al, 2015, Pharmacol Res. Diciembre; 102: 264-269, analizan el papel de la autofagia mediada por PINK1-Parkina en la protección contra las lesiones hepáticas inducidas por el alcohol y el paracetamol mediante la eliminación de las mitocondrias dañadas mediante mitofagia. Se sugiere que la estabilización farmacológica de USP8 o la inactivación de USP15 y USP30 pueden ser dianas terapéuticas potenciales para regular positivamente la mitofagia inducida por parkina y, a su vez, proteger frente a la lesión hepática inducida por fármacos. Sin embargo, se observa que las DUB se regulan tanto transcripcional como postraduccionalmente, lo que puede dificultar, adicionalmente, el desarrollo de fármacos dirigidos a estas enzimas específicas, y además, se demostró que la ubiquitina fosforilada es resistente a las DUB. Los autores concluyen que la regular positiva de la estabilización de PINK1 o de su actividad cinasa puede ser una diana más eficaz que la inhibición de las DUB.

Williams et al, 2015, Biomolecules 5, 2619-2642, y Williams et al, 2015, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 309: G324-G340, revisan los mecanismos implicados en la regulación de la homeostasis mitocondrial en el hígado y cómo estos mecanismos pueden proteger contra las enfermedades hepáticas inducidas por el alcohol.

Luciani et al, 2020, Nat. Commun. 11, 970, describe que la desregulación de la red mitocondrial en células diferenciadas terminalmente contribuye a un amplio espectro de trastornos, incluida la acidemia metilmalónica (MMA). La MMA es uno de los trastornos metabólicos hereditarios más comunes, debido a la deficiencia de la metilmalonilcoenzima A mutasa mitocondrial (MMUT). La deficiencia de MMUT induce alteraciones metabólicas y mitocondriales que se ven exacerbadas por anomalías en la mitofagia mediada por PINK1/Parkina, provocando la acumulación de mitocondrias disfuncionales que desencadenan el estrés epitelial y, en última instancia, el daño celular. Se sugiere una relación entre la deficiencia primaria de MMUT, las mitocondrias afectadas, la disfunción de la mitofagia y el estrés epitelial, y se ofrecen posibles perspectivas terapéuticas para la MMA.

Kluge et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2018, 282655-2659, describe que los inhibidores selectivos de USP30 aceleran la mitofagia.

Se divulgan series de derivados de heterociclos N-ciano-sustituidos como inhibidores de la enzima desubiquitilante en las solicitudes PCT WO 2016/046530 (US 15/513125), US 15/894025, US 16/448066), documento WO 2016/156816 (US 15/558632, US 16/297937, US 16/419558, US 16/419747, US 16/788446), WO 2017/009650 (US 15/738900), WO 2017/093718 (US 15/776149), WO 2017/103614 (US 15/781615), WO 2017/149313 (US 16/078518), WO 2017/109488 (US 16/060299), WO 2017/141036 (US 16/070936), WO 2017/163078 (US 16/087515), WO 2017/158381 (US 16/080229), WO 2017/158388 (US 16/080506), WO 2018/065768 (US 16/336685), WO 2018/060742 (US 16/336202), WO 2018/060689 (US 16/334836), WO 2018/060691 (US 16/336363), WO 2018/220355 (US 16/615040), WO 2018/234755 (US 16/615709), WO 2020/212350, WO 2020/212351, WO 2021/043870, PCT/EP2021/059032 y PCT/EP2021/064166. La solicitud PCT WO 2019/171042 (US 16/977019) divulga el uso de N-cianopirrolidinas como inhibidores de USP30 para el tratamiento de enfermedades fibróticas.

Falgueyret et al, 2001, J.Med.Chem. 44, 94-104, y la solicitud PCT WO 01/77073 se refieren a cianopirrolidinas como inhibidores de las catepsinas K y L, con utilidad potencial en el tratamiento de la osteoporosis y otras afecciones relacionadas con la reabsorción ósea. La solicitud PCT WO 2015/179190 se refiere a inhibidores de la amidasa ácida hidrolizante de N-aciletanolamina, con utilidad potencial en el tratamiento de la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. La solicitud PCT WO 2013/030218 se refiere a compuestos quinazolin-4-ona como inhibidores de proteasas específicas de ubiquitina, tales como USP7, con utilidad potencial en el tratamiento del cáncer, enfermedades neurodegenerativas, trastornos inflamatorios e infecciones víricas. Las solicitudes PCT WO 2015/017502 y WO 2016/019237 se refieren a inhibidores de la tirosina cinasa de Bruton con utilidad potencial en el tratamiento de enfermedades tales como enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias y cáncer. Las solicitudes PCT WO 2009/026197, WO 2009/129365, WO 2009/129370, y WO 2009/129371, se refieren a cianopirrolidinas como inhibidores de la catepsina C con utilidad potencial en el tratamiento de la EPOC. La solicitud de patente de los Estados Unidos US 2008/0300268 se refiere a compuestos poliaromáticos como inhibidores del receptor de tirosina cinasa PDGFR. Las solicitudes PCT WO 2019/222468, WO 2019/071073, WO 2020/036940 y WO 2020/072964, Rusilowicz-Jones et al, 2020, bioRxiv 2020.04.16.044206 (20 de abril de 2020), y Tsefou et al, bioRxiv 2021.02.02.429344 (2 de febrero de 2021), se refieren a compuestos que contienen cianamida como inhibidores de USP30. Yue et al, 2014, Cell Research, 24, 482-496, se refiere a un derivado diterpenoide 15-oxospiramilactona como inhibidor de USP30 que inducía la fusión mitocondrial.

La solicitud PCT WO 2015/183987 se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden inhibidores de la desubiquitinasa y la albúmina sérica humana en métodos de tratamiento del cáncer, fibrosis, una enfermedad o afección autoinmunitaria, una enfermedad o afección inflamatoria, una enfermedad o afección neurodegenerativa o una infección. Cabe señalar que las desubiquitinasas, incluyendo UCHL5/UCH37, USP4, USP9X, USP11 y USP15, están implicados en la regulación de la vía de señalización del TGF-beta, cuya alteración da lugar a enfermedades neurodegenerativas y fibróticas, disfunción autoinmunitaria y cáncer.

La solicitud PCT WO 2006/067165 se refiere a un método para tratar enfermedades fibróticas utilizando inhibidores de la indolinona cinasa. La solicitud PCT WO 2007/119214 se refiere a un método para tratar la fibrosis pulmonar en fase inicial utilizando un antagonista del receptor de endotelina. La solicitud PCT WO 2012/170290 se refiere a un método para tratar enfermedades fibróticas utilizando ácidos THC. La solicitud PCT WO 2018/213150 se refiere a inhibidores de USP30 de sulfonamida con utilidad potencial en el tratamiento de afecciones que implican defectos mitocondriales. Larson-Casey et al, 2016, Immunity 44, 582-596, se refiere a la mitofagia mediada por la cinasa Akt1 de macrófagos, la resistencia a la apoptosis y la fibrosis pulmonar. Tang et al, 2015, Kidney Diseases 1, 71-79, revisa el papel potencial de la mitofagia en la fisiopatología renal.

Existe una necesidad de métodos y/o composiciones seguros, alternativos y/o mejorados para el tratamiento o la prevención de afecciones relacionadas con la disfunción mitocondrial, el cáncer y la fibrosis, y los diversos síntomas y afecciones asociados a ellos. Sin desear quedar ligado a una teoría particular sobre el mecanismo, se cree que los compuestos de la presente invención actúan inhibiendo la enzima USP30, que a su vez regula la mitofagia inducida por parkina.

La lesión renal aguda (LRA) se define como una disminución brusca de la función renal que se produce en 7 días o menos, donde la gravedad de la lesión se estadificada en función del aumento de la creatinina sérica (SCr) y la disminución de la diuresis como se describe en las directrices de Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO). La LRA se produce en aproximadamente 13,3 millones de personas al año, el 85 % de las cuales vive en países en vías de desarrollo y se cree que contribuye a aproximadamente 1,7 millones de muertes al año (Mehta et al, 2015, Lancet 385(9987): 2616-2643). Es más que probable que la LRA provoque lesiones renales permanentes (es decir, enfermedad renal crónica; ERC) y también puede provocar daños en órganos no renales. La LRA es un importante problema de salud pública, en particular si se tiene en cuenta el número absoluto de pacientes que desarrollan una ERC incidental, ERC progresiva, enfermedad renal en fase terminal y acontecimientos cardiovasculares. Se ha observado que la LRA es prevalente en los pacientes hospitalizados por COVID-19 y está fuertemente asociada a la mortalidad hospitalaria, donde se ha señalado al daño y la disfunción mitocondrial como un posible mecanismo fisiopatológico y diana terapéutica (Kellum et al, Nephrol Dial Transplant (2020) 35: 1652-1662).

La LRA y la ERC se consideran un continuo en el mismo espectro patológico (Chawla et al, 2017, Nat Rev Nephrol 13(4): 241-257). Los pacientes que se someten a un bypass aortocoronario (CABG) presentan un alto riesgo de lesión renal. Existe una evidente necesidad médica no cubierta en el desarrollo de medicamentos para el tratamiento y/o prevención de la LRA.

El riñón es un lugar de alta demanda metabólica, con altas tasas de mitofagia demostradasin vivo(McWilliams et al, 2018, Cell Metab 27(2): 439-449 (e435). Las células epiteliales de los túbulos proximales renales (<r>P<t>EC), un tipo de célula con una importante necesidad de ATP para el intercambio de solutos e iones, son ricas en mitocondrias y son las principales células efectoras de la lesión renal aguda (LRA) en el riñón. La disfunción mitocondrial se ha visto implicada en los mecanismos de la LRA y la ERC, tanto a través de múltiples líneas de evidencia de modelos preclínicos de LRA y ERC como también a través de datos que demuestran fenotipos mitocondriales anormales en biopsias de pacientes (Emma et al, 2016, Nat Rev Nephrol 12(5): 267-280; Eirin et al, 2017, Handb Exp Pharmacol 240: 229-250). Asimismo, las enfermedades mitocondriales primarias suelen manifestarse con síntomas renales, tales como la glomeruloesclerosis segmentaria focal (Kawakami et al, 2015, J Am Soc Nephrol 26(5): 1040-1052) en pacientes con MELAS/MIDD, y también patologías tubulares primarias en pacientes con deficiencias de coenzima Q. Las mutaciones en el ADNmt pueden causar una enfermedad tubulointersticial heredada por vía materna (Connor et al, 2017, PLoS Genet 13(3): e1006620).

En cuanto al control de calidad mitocondrial en la lesión renal (Tang et al, 2018, Autophagy 14(5): 880-897) se ha demostrado que la lesión renal se agravaba tras una LRA isquémica tanto en ratones PINK1 KO como PARK2 KO, lo que sugiere que la mitofagia mediada por PINK1/PARKINA desempeña un papel protector tras la IRI en el riñón. Además, la mitofagia mediada parkina/PINK1 protege contra la lesión renal inducida por cisplatino (Wang et al, 2018, Cell Death Dis 9(11): 1113). Se dispone de modelos limitados de ERC para la investigación de la mitofagia, las pruebas que apoyan el control de calidad mitocondrial en la fibrosis proceden de estudios sobre afecciones pulmonares fibróticas tales como la EPOC y la FPI. Los animales con el gen parkina inactivado muestran una fibrosis pulmonar exacerbada en respuesta a la bleomicina (Kobayashi et al, 2016, J Immunol, 197:504-516). De forma similar, las células epiteliales de las vías respiratorias de los animales con el gen parkina inactivado (KO) muestran respuestas fibróticas y senescentes exacerbadas al humo del cigarrillo (Araya et al, 2019, Autophagy 15(3): 510-526).

Existen modelos preclínicos para estudiar posibles terapias novedosas, gracias a su capacidad para modelizar la patología de la fibrosis (por ejemplo, la depositación de colágeno) de forma coherente con la condición humana. Los modelos preclínicos pueden ser mediados por toxinas (p. ej. bleomicina para la fibrosis pulmonar y cutánea), quirúrgicos (p. ej. modelo de lesión por isquemia/reperfusión y modelo de obstrucción unilateral del uréter para la fibrosis tubulointersticial aguda), y genéticos (p. ej. ratones diabéticos (db/db) para la nefropatía diabética). Por ejemplo, los dos ejemplos dados anteriormente para tratamientos indicados para la FPI (nintedanib y pirfenidona) muestran eficacia en el modelo de fibrosis pulmonar con bleomicina.

Por consiguiente, existe la necesidad de compuestos que sean inhibidores de USP30 para el tratamiento o la prevención de afecciones en las que esté indicada la inhibición de USP30. En particular, existe la necesidad de inhibidores de USP30 que tengan propiedades adecuadas y/o mejoradas para maximizar la eficacia contra la enfermedad diana.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La presente invención también se refiere al compuesto de fórmula (I) para usar como medicamento, en particular en el tratamiento de afecciones que cursan con disfunción mitocondrial, cáncer y fibrosis, y también procesos para la preparación del mismo y composiciones farmacéuticas que contengan dicho compuesto.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a inhibidores de USP30 que tienen propiedades adecuadas y/o mejoradas para maximizar la eficacia contra la enfermedad diana. Dichas propiedades incluyen, por ejemplo, potencia, selectividad, propiedades fisicoquímicas, ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción), incluido el perfil FC (farmacocinético) y el perfil de seguridad.

Por lo general, es deseable maximizar la potencia de una molécula de fármaco frente a la enzima diana en los ensayos pertinentes para reducir la dosis efectiva/eficaz que debe administrarse a los pacientes. Los compuestos de la invención pueden probarse para determinar su afinidad por USP30 usando el ensayo bioquímico de polarización de fluorescencia (FP)in vitrodescrito en el presente documento.

La USP30 es una proteína transmembrana situada en la membrana externa de las mitocondrias, que son orgánulos productores de energía presentes en el interior de las células. Por lo tanto, es ventajoso poder demostrar la actividad celularin vitro,ya que este es uno de los diversos componentes que pueden indicar una mayor capacidad para acoplarse a la diana en su entorno fisiológico, es decir, donde el compuesto inhibidor de USP30 es capaz de penetrar en las células. El ensayo celular de USP30 mediante transferencia Western (WB) tiene como objetivo probar la actividad de compuestos contra USP30 en células utilizando una sonda de actividad irreversible para controlar la actividad de USP30. De forma análoga al ensayo celular de transferencia Western, la evaluación del acoplamiento con la diana(ex vivo)puede llevarse a cabo en muestras de tejido cerebral o renal de animales a los que se ha administrado el compuesto.

Para ampliar los conocimientos sobre la unión a la diana a la farmacodinámica en etapas posteriores, puede realizarse una evaluación de la ubiquitilación de TOM20 (una proteína de la membrana mitocondrial externa).

En general, es importante que un fármaco sea lo más selectivo posible para la enzima diana deseada; las actividades adicionales dan lugar a la posibilidad de efectos secundarios. Aún no se ha determinado totalmente la función fisiológica exacta de muchas DUB, sin embargo, independientemente del papel que desempeñen o no estas DUB, es un buen precepto de la química médica garantizar que cualquier fármaco tenga selectividad sobre las dianas mecanicistas relacionadas de función fisiológica desconocida. Ejemplos representativos de enzimas DUB frente a las que pueden examinarse los compuestos de la presente invención son UCHL1, UCHL3, UCHL5, YOD1, SENP2, SENP6, TRABID, BAP1, Cezanne, MINDY2/FAM63B, OTU1, OTUD3, OTUD5, OTUD6A, OTUD6B, OTUB1/UBCH5B, OTUB2, CYLD, VCPIP, AMSH-LP, JOSD1, JOSD2, USP1/UAF1, USP2, USP4, USP5, USP6, USP7, USP8, USP9x, USP10, USP11, USP12/UAF1, USP13, USP14, USP15, USP16, USP19, USP20, USP21, USP22, USP24, USP25, USP28, USP32, USP34, USP35, USP36, USP45, USP46/UAF1, USP47 y USP48. Preferentemente, los compuestos de la invención tienen buena selectividad para USP30 respecto a una o más de estas enzimas DUB.

Aparte de la selectividad respecto a otras enzimas DUB, es importante que un fármaco tenga poca afinidad por otras dianas, y pueden realizarse perfiles farmacológicos frente a paneles de dianas para evaluar el potencial de, y minimizar, posibles efectos no deseados. Ejemplos de dianas frente a las que se pueden analizar los compuestos de la presente invención son las del panel estándar de la industria Eurofins-Cerep SafetyScreen44, que incluye 44 dianas como selección representativa de receptores GPCR, transportadores, canales iónicos, receptores nucleares y enzimas cinasas y no cinasas. Preferentemente, los compuestos de la invención tienen una afinidad insignificante contra las dianas de este panel de cribado. Otros ejemplos de dianas contra las que pueden estudiarse los compuestos de la presente invención son las cinasas del panel de perfiles de cinasas SelectScreen de Thermo Fisher, que incluye 39 dianas como selección representativa de enzimas cinasas. Preferentemente, los compuestos de la invención tienen una afinidad insignificante contra las dianas de este panel de cribado. Adicionalmente, ejemplos de una clase enzimática en particular contra la que pueden estudiarse los compuestos de la presente invención son las catepsinas (p. ej., la catepsina A, B, C, H, K, L, L2, S, V y Z). Preferentemente, los compuestos de la invención tienen buena selectividad para USP30 respecto a una o más de estas enzimas.

También existe la necesidad de compuestos que tengan propiedades farmacocinéticas favorables de tal manera que sean adecuados para la administración oral. Un fármaco administrado por vía oral debe tener una buena biodisponibilidad; es decir, su capacidad para atravesar fácilmente el tracto gastrointestinal (GI) y no ser sometido a un metabolismo extenso a medida que pasa del tracto GI a la circulación sistémica. Una vez que un fármaco se encuentra en la circulación sistémica, la tasa de metabolismo también es importante para determinar el tiempo de permanencia del fármaco en el cuerpo.

Así, es claramente favorable que las moléculas de fármacos tengan las propiedades de atravesar fácilmente el tracto gastrointestinal y metabolizarse lentamente en el cuerpo. El ensayo Caco-2 es un modelo ampliamente aceptado para predecir la capacidad de una molécula determinada para atravesar el tracto gastrointestinal. La mayor parte del metabolismo de las moléculas de fármaco suele producirse en el hígado, y los ensayosin vitroque utilizan hepatocitos de células enteras (animales o humanas) son métodos ampliamente aceptados para medir la susceptibilidad de una molécula determinada al metabolismo en el hígado. Dichos ensayos pretenden predecir el aclaramientoin vivoa partir del valor de aclaramiento calculado para los hepatocitos.

Se predice que los compuestos que tienen un buen flujo Caco-2 y son estables frente a los hepatocitos tienen una buena biodisponibilidad oral (buena absorción a través del tracto gastrointestinal y mínima extracción del compuesto a su paso por el hígado) y un largo tiempo de residencia en el cuerpo que es suficiente para que el fármaco sea eficaz.

La solubilidad de un compuesto es un factor importante para lograr una concentración deseada del fármaco en la circulación sistémica para la respuesta farmacológica prevista. La baja solubilidad acuosa es un problema que se observa con el desarrollo de la formulación de nuevas entidades químicas y, para ser absorbido, un fármaco debe estar presente en forma de solución en el lugar de absorción. La solubilidad cinética de un compuesto puede medirse mediante un ensayo turbidimétrico de solubilidad, cuyos datos también pueden usarse junto con los datos de permeabilidad de Caco-2 para predecir la absorción intestinal humana dependiente de la dosis.

Otros parámetros que pueden medirse utilizando ensayos estándar que son indicativos del perfil de exposición de un compuesto incluyen, por ejemplo, la estabilidad plasmática (medición de la semivida), valores de AUC en sangre, Cmáx, Cmín y Tmáx.

El tratamiento de los trastornos del SNC, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y otros trastornos descritos en el presente documento, requiere que las moléculas de fármaco se dirijan al cerebro, lo cual requiere una penetración adecuada a través de la barrera hematoencefálica. Existe, por lo tanto, la necesidad de inhibidores de USP30 que posean propiedades eficaces de penetración hematoencefálica y proporcionen un tiempo de residencia adecuado en el cerebro para ser eficaces. La probabilidad de que un compuesto pueda atravesar la barrera hematoencefálica puede medirse mediante un ensayo de flujoin vitroutilizando una monocapa celular MDR1-MDCK (células de riñón canino Madin-Darby transfectadas con MDR-1 que dan lugar a la sobreexpresión del transportador de flujo de salida humano, la glicoproteína P). Adicionalmente, la exposición también puede medirse directamente en el cerebro y el plasma utilizando modelos animalesin vivo.

También se necesitan compuestos que tengan un perfil de seguridad favorable, que puede medirse mediante diversos métodos estándarin vitroein vivo.Puede usarse un contador de toxicidad celular para evaluar el efecto antiproliferativo/citotóxico en una línea celular en particular (p. ej. HCT116) mediante detección fluorométrica de la conversión de rezasurina (alamarBlue™) a resofurina en respuesta a la actividad mitocondrial.

También pueden realizarse estudios toxicológicos y de seguridad para identificar reacciones adversas en posibles órganos diana y definir el Índice Terapéuti

lo general, los requisitos normativos exigen que los estudios se realicen en al menos dos especies de animales de laboratorio, un roedor (rata o ratón) y un no roedor (conejo, perro, primate no humano u otra especie adecuada).

El ensayo de mutación inversa bacteriana (prueba de Ames) puede usarse para evaluar las propiedades mutagénicas de los compuestos de la invención, normalmente utilizando la cepa bacteriana Salmonella typhimurium, que es mutante para la biosíntesis del aminoácido histidina.

El ensayo de micronúcleos puede utilizarse para determinar si un compuesto es genotóxico evaluando la presencia de micronúcleos. Los micronúcleos pueden contener fragmentos cromosómicos producidos por rotura del ADN (clastógenos) o cromosomas enteros producidos por alteración del aparato mitótico (aneúgenos).

El ensayo predictor de hERG proporciona información valiosa sobre la posible unión de los compuestos de prueba al canal de potasio y la posible prolongación del QT en el ecocardiograma. La inhibición de la corriente hERG provoca una prolongación del intervalo QT que da lugar a una taquiarritmia ventricular potencialmente mortal (Torsades de Pointes). Normalmente, los datos de la prueba pueden generarse a partir de una plataforma automatizada de ensayo de fijación en parche de membrana(patch-clamp).

Por lo tanto, la presente invención se refiere a inhibidores de USP30 que tienen propiedades adecuadas y/o mejoradas para maximizar la eficacia contra la enfermedad diana. Dichas propiedades incluyen, por ejemplo, potencia, selectividad, propiedades fisicoquímicas, ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción), incluido el perfil FC (farmacocinético) y el perfil de seguridad.

El compuesto más preferido de la presente invención es muy potente contra USP30 como se mide en el ensayo bioquímico descrito en el presente documento y es significativamente más selectivo para USP30 que para otras d Ub y catepsinas. Las propiedades significativas e inesperadas de los compuestos de la presente invención los hacen particularmente adecuados para usar en el tratamiento y/o prevención de enfermedades relacionadas con la actividad de USP30.

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En un primer aspecto preferido, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (IA):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En un segundo aspecto preferido, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (IB):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En un tercer aspecto preferido, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (IC):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En un cuarto aspecto preferido, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (ID):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los compuestos preferidos de fórmula (I) se seleccionan de:

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; (3aS,4S,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; (3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; (3aS,4R,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; (3aR,4R,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(lH)-carbonitrilo; (3aS,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; (3aR,4S,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; y (3aS,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(lH)-carbonitrilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los compuestos más preferidos de fórmula (I) se seleccionan de:

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; (3aS,4S,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; (3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; y (3aS,4R,6aS)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

El compuesto más preferido de fórmula (I) es:

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

El ejemplo 1 es el compuesto más preferido de la invención.

Este compuesto de fórmula (I), el más preferido, existe como un único estereoisómero dextrógiro, que tiene la siguiente estructura con la configuración absoluta indicada:

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo.

El compuesto de fórmula (I) posee tres centros quirales y, por tanto, puede existir en ocho configuraciones estereoquímicas. La síntesis del anillo bicíclico, de acuerdo con el siguiente experimento, se cree que produce el sistema de anillos fusionados en cis, dando lugar a cuatro posibles estereoisómeros. La configuración estereoquímica del compuesto de fórmula (I), el más preferido, es la del Ejemplo 1, que es el compuesto más activo contra USP30 en el ensayo bioquímico.

Se han preparado cuatro estereoisómeros mediante los experimentos descritos a continuación; Ejemplos 1 a 4. Los ejemplos 1 y 3 son dextrógiros, y los ejemplos 2 y 4 son levógiros, cuando se miden en condiciones experimentales; (c = 0,05 g/100 cm3, MeOH). El ejemplo 1, cuando se preparó con dos métodos diferentes, produjo mediciones de rotación óptica de [a]D25 = 208° y 204°. La pequeña variación puede deberse a diferencias experimentales o a diferencias en la pureza óptica. El ejemplo 3 produjo una medición de la rotación óptica de [a]D25 = 166°.

La presente invención se refiere, adicionalmente, al estereoisómero fusionado en cis que es dextrógiro cuando se mide como se describe y tiene una rotación óptica aproximada en la región de 204° a 208°. En función de la pureza óptica, este estereoisómero, cuando es sustancialmente puro, puede producir una rotación óptica en la región de 190° a 220°. Dicha cifra distingue claramente este compuesto de la invención del otro estereoisómero fusionado en cis que también es dextrógiro.

La presente invención se refiere, adicionalmente, a:

(+)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo (I);

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La presente invención se refiere, adicionalmente, al estereoisómero mayoritario producido por el procedimiento experimental del Ejemplo 1.

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula (I) incluyen las sales de adición de ácidos y de bases (incluyendo las di-sales) de los mismos.

Las sales de adición de ácidos adecuadas se forman a partir de ácidos que forman sales no tóxicas. Algunos ejemplos incluyen las sales acetato, aspartato, benzoato, besilato, bicarbonato/carbonato, bisulfato, camsilato, citrato, edisilato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hibenzato, clorhidrato/cloruro, bromhidrato/bromuro, yodhidrato/yoduro, hidrógenofosfato, isetionato, D- y L-lactato, malato, maleato, malonato, mesilato, sulfato de metilo, 2-napsilato, nicotinato, nitrato, orotato, palmato, fosfato, sacarato, estearato, succinato sulfato, D-y L-tartrato, y tosilato.

Las sales de bases adecuadas se forman a partir de bases que forman sales no tóxicas. Algunos ejemplos incluyen las sales de aluminio, amonio, arginina, benzatina, calcio, colina, dietilamina, diolamina, glicina, lisina, magnesio, meglumina, olamina, potasio, sodio, trometamina y cinc.

Para una revisión de las sales adecuadas, véase Stahl y Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002).

Una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (I) puede prepararse fácilmente mezclando soluciones del compuesto de fórmula (I) y el ácido o la base deseados, según sea adecuado. La sal puede precipitar de la solución y recogerse por filtración o puede recuperarse por evaporación del disolvente.

Los solvatos farmacéuticamente aceptables de acuerdo con la invención incluyen hidratos y solvatos en donde el disolvente de cristalización puede estar sustituido isotópicamente, por ejemplo D2O, acetona-d6, DMSO-d6.

También, dentro del ámbito de la invención están los clatratos, complejos de inclusión de fármaco-hospedador en donde, a diferencia de los solvatos anteriormente mencionados, el fármaco y el hospedador están presentes en cantidades no estequiométricas. Para una revisión de dichos complejos, véase J. Pharm Sci, 64 (8), 1269-1288 de Haleblian (agosto de 1975).

A continuación en el presente documento todas las referencias a compuestos de fórmula (I) incluyen referencias a sales de los mismos y a solvatos y clatratos de compuestos de fórmula (I) y sales de los mismos.

La invención incluye todos los polimorfos de los compuestos de fórmula (I) definidos anteriormente.

Se incluyen dentro del ámbito de la presente invención todas las formas tautoméricas de los compuestos de fórmula (I).

Las técnicas convencionales para la preparación/aislamiento de enantiómeros individuales incluyen síntesis quiral a partir de un precursor ópticamente puro adecuado o resolución del racemato (o el racemato de una sal o derivado) usando, por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) quiral. Como alternativa, el racemato (o un precursor racémico) puede hacerse reaccionar con un compuesto adecuado ópticamente activo, por ejemplo, un alcohol, o, en el caso en que el compuesto de fórmula (I) contiene un resto ácido o básico, una base o un ácido tal como la 1 -feniletilamina o ácido tartárico. La mezcla diastereomérica resultante se puede separar mediante cromatografía y/o cristalización fraccionada, y uno o ambos de los diastereoisómeros convertirse en el(los) correspondiente(s) enantiómero(s) puro(s) por medios bien conocidos por el experto en la materia. Pueden obtenerse compuestos quirales de la invención (y precursores quirales de los mismos) en forma enantioméricamente enriquecida usando cromatografía, normalmente HPLC, en una resina asimétrica con una fase móvil compuesta por un hidrocarburo, normalmente heptano o hexano, que contenga de 0 a 50 % en volumen de propan-2-ol, normalmente del 2 % al 20 % y del 0 al 5 % en volumen de una alquilamina, normalmente el 0,1 % de dietilamina. La concentración del eluato produce la mezcla enriquecida. La presente invención incluye todas las formas cristalinas de los compuestos de fórmula (I), incluidos los racematos y las mezclas racémicas (conglomerados) de los mismos. Los conglomerados estereoisoméricos se pueden separar mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, "Stereochemistry of Organic Compounds" de E. L. Eliel and S. H. Wilen (Wiley, Nueva York, 1994).

El compuesto más preferido de fórmula (I) de la presente invención puede existir junto con uno o más otros estereoisómeros de los compuestos preferidos de fórmula (I). Por ejemplo, el compuesto puede existir con su enantiómero, es decir, como racemato, o puede existir con un diastereómero.

Los compuestos preferidos de fórmula (I) de la presente invención existen preferentemente como un solo estereoisómero. Los compuestos preferidos de fórmula (I) se aíslan como estereoisómeros únicos y pueden existir con un exceso estereoisomérico de al menos un 60 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 95 %, por ejemplo, un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. El exceso estereoisomérico puede ser una medición de un exceso enantiomérico o puede ser una medición de una relación diasteromérica.

La presente invención incluye también todas las variaciones isotópicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto de fórmula (I). Se define como variación isotópica aquella en la que al menos un átomo es sustituido por un átomo que tiene el mismo número atómico, pero una masa atómica diferente de la masa atómica que se encuentra habitualmente en la naturaleza.

Los ejemplos de isótopos adecuados para su inclusión en los compuestos de la invención incluyen isótopos de hidrógeno, tales como 2H y 3H, carbono, tal como 13C y 14C, nitrógeno, tal como 15N, oxígeno, tal como 17O y 18O, fósforo, tal como 32P, azufre, tal como 35S, flúor, tal como 18F, y cloro, tal como 36Cl.

La sustitución de los compuestos de la invención con isótopos tal como el deuterio puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, mayor semividain vivoo menores requisitos de dosificación y, por lo tanto, pueden preferirse en algunas circunstancias.

Ciertas variaciones isotópicas de los compuestos de fórmula (I), por ejemplo, aquellos que incorporan un isótopo radiactivo, son útiles en estudios de distribución de fármacos y/o sustratos en tejidos. Los isótopos radiactivos tritio y 14C, son particularmente útiles para este fin en vista de su facilidad de incorporación y medios de detección sencillos.

Las variaciones isotópicas de los compuestos de fórmula (I) pueden prepararse generalmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia o mediante procesos análogos a los descritos en los Ejemplos y Preparados adjuntos, utilizando variaciones isotópicas adecuadas de reactivos adecuados.

Los compuestos de fórmula (I) son inhibidores de la enzima desubiquitilante USP30.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, un tautómero del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o tautómero para usar como medicamento.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) para usar en un método de tratamiento o prevención de un trastorno o afección en el que se conoce o puede demostrarse la inhibición de USP30, para producir un efecto beneficioso, en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) como se define en el presente documento, un tautómero del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o tautómero.

El trastorno o afección que se beneficia de la actividad de USP30 se selecciona de entre una afección que implica disfunción mitocondrial, cáncer y fibrosis.

En una realización preferida de todos los aspectos de la invención, el trastorno o afección que se beneficia de la actividad de USP30 es una afección que implica disfunción mitocondrial.

Las disfunciones mitocondriales son el resultado de defectos de las mitocondrias, que son compartimentos especializados presentes en todas las células del cuerpo, excepto en los glóbulos rojos. Cuando fallan las mitocondrias, cada vez se genera menos energía dentro de la célula y se producen lesiones celulares o incluso la muerte celular. Si este proceso se repite en todo el cuerpo, la vida del sujeto en el que está ocurriendo se ve gravemente comprometida. Las enfermedades de las mitocondrias aparecen con mayor frecuencia en órganos muy exigentes en energía, tal como el cerebro, corazón, hígado, músculos esqueléticos, riñón y los sistemas endocrino y respiratorio.

La afección que implica disfunción mitocondrial puede seleccionarse de una afección que implica un defecto de mitofagia, una afección que implica una mutación en el ADN mitocondrial, una afección que implica estrés oxidativo mitocondrial, una afección que implica un defecto en el potencial de membrana mitocondrial, biogénesis mitocondrial, una afección que implica un defecto en la forma o morfología mitocondrial, y una afección que implica un defecto de almacenamiento lisosómico.

En particular, la afección que implica disfunción mitocondrial puede seleccionarse de una enfermedad neurodegenerativa; esclerosis múltiple (MS); encefalopatía mitocondrial, síndrome de acidosis láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares (MELAS); diabetes de herencia materna y sordera (MIDD); neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON); cáncer (incluyendo, por ejemplo, mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, gástrico, colon, testículo, de cabeza y cuello, páncreas, cerebro, melanoma, óseo u otros cánceres de órganos de tejidos y cánceres de las células sanguíneas, tales como linfoma y leucemia, mieloma múltiple, carcinoma metastásico, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, carcinoma nasofaríngeo, cáncer colorrectal y carcinoma pulmonar no microcítico); neuropatía, ataxia, retinosis pigmentaria, síndrome de Leigh de herencia materna (NARP-MILS); enfermedad de Danon; diabetes; nefropatía diabética; trastornos metabólicos; insuficiencia cardíaca; cardiopatía isquémica conducente a infarto de miocardio; enfermedades psiquiátricas, por ejemplo esquizofrenia; deficiencia múltiple de sulfatasa (MSD); mucolipidosis II (ML II); mucolipidosis III (ML III); mucolipidosis IV (ML IV); gangliosidosis GM1 (GM1); lipofuscinosis neuronal ceroidea (NCL1); enfermedad de Alpers; síndrome de Barth; defectos de la beta oxidación; deficiencia de carnitina-acilcarnitina; deficiencia de carnitina; síndromes de deficiencia de creatina; deficiencia de coenzima Q10; deficiencia del complejo I; deficiencia del complejo II; deficiencia del complejo III; deficiencia del complejo IV; deficiencia del complejo V; deficiencia de COX; síndrome de oftalmoplegia externa progresiva crónica (CPEO); deficiencia de CPT I; deficiencia de CPT II; aciduria glutárica de tipo II; síndrome de Kearns-Sayre; acidosis láctica; deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena larga (LCHAD); enfermedad o síndrome de Leigh; variante francocanadiense del síndrome de Leigh (LSFC); miocardiopatía infantil letal (LIC); enfermedad de Luft; deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media (MCAD); síndrome de epilepsia mioclónica con fibras rojas rasgadas (MERRF); citopatía mitocondrial; síndrome de ataxia mitocondrial recesiva; síndrome de depleción del ADN mitocondrial; trastorno mioneurogastrointestinal y encefalopatía; síndrome de Pearson; deficiencia de piruvato deshidrogenasa; deficiencia de piruvato carboxilasa; mutaciones POLG; deficiencia de 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena media/corta (M/SCHAD); acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga (VLCAD); trastornos peroxisomales; acidemia metilmalónica; deficiencia de mevalonato cinasa; deterioro de la función cognitiva y la fuerza muscular dependiente de la edad; y deterioro cognitivo asociado a trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos.

La afección que implica disfunción mitocondrial puede ser un trastorno del SNC, por ejemplo, una enfermedad neurodegenerativa.

Las enfermedades neurodegenerativas incluyen, pero sin limitación, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, isquemia, ictus, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia multisistémica (MSA), parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (CBD) y demencia frontotemporal.

En particular, los compuestos de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento y la prevención de la enfermedad de Parkinson, incluyendo, pero sin limitación, EP relacionada con mutaciones en la a-sinucleína, parkina, PINK1, GBA, y LRRK2, y la enfermedad de Parkinson juvenil autosómica recesiva (AR-JP) o la enfermedad de Parkinson de aparición temprana (EOPD), donde los genes parkina o PINK1 están mutados, truncados o son delecionados.

En particular, los compuestos de la invención pueden ser útiles en el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos, incluyendo, por ejemplo, deterioro cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, formas preclínicas o prodrómicas de EA y EP, enfermedad de Huntington, demencia por enfermedad con cuerpos de Lewy, deterioro cognitivo asociado con la esquizofrenia, trastornos del estado de ánimo, trastornos bipolares y depresivos mayores.

Los compuestos de la invención o las composiciones farmacéuticas de los mismos como se describe en el presente documento pueden combinarse con uno o más agentes adicionales cuando se usan para el tratamiento o prevención de afecciones que implican disfunción mitocondrial. Los compuestos pueden combinarse junto con uno o más agentes adicionales seleccionados de entre levodopa, un agonista de la dopamina, un inhibidor de la monoamino oxigenasa (MAO) B, un inhibidor de la catecol-O-metiltransferasa (COMT), un anticolinérgico, riluzol, amantadina, un inhibidor de la colinesterasa, memantina, tetrabenazina, un antipsicótico, diazepam, clonazepam, un antidepresivo y un anticonvulsivo. Los compuestos pueden combinarse con agentes que reducen/eliminan agregados proteicos patógenos en enfermedades neurodegenerativas, tales como agentes que reducen/eliminan la alfa-sinucleína en la enfermedad de Parkinson, atrofia multisistémica o demencia con cuerpos de Lewy; agentes que reducen/eliminan la Tau en la enfermedad de Alzheimer o la parálisis supranuclear progresiva; agentes que reducen/eliminen la TDP-43 en la ELA o la demencia frontotemporal.

En otra realización preferida de todos los aspectos de la invención, el trastorno o afección que se beneficia de la actividad de la USP30 es el cáncer. El cáncer puede estar relacionado con una disfunción mitocondrial. Los cánceres preferidos incluyen, por ejemplo, mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, gástrico, colon, testículo, de cabeza y cuello, páncreas, cerebro, melanoma, óseo u otros cánceres de órganos de tejidos y cánceres de las células sanguíneas, tales como linfoma y leucemia, mieloma múltiple, carcinoma metastásico, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, carcinoma nasofaríngeo, cáncer colorrectal, cáncer colorrectal y carcinoma pulmonar no microcítico.

En particular, los compuestos de la invención pueden ser útiles en el tratamiento o la prevención del cáncer cuando las vías apoptóticas están desreguladas y, más particularmente, cuando las proteínas de la familia BCL-2 están mutadas o se expresan en exceso o en defecto.

Fibrosis se refiere a la acumulación de constituyentes de la matriz extracelular que se produce después de un traumatismo, inflamación, reparación tisular, reacciones inmunitarias, hiperplasia celular y neoplasia. Los trastornos fibróticos que se pueden tratar con los compuestos y composiciones de la presente invención incluyen, entre otros, fibrosis/trastornos fibróticos asociados a enfermedades de órganos principales, por ejemplo, enfermedad pulmonar intersticial (ILD), cirrosis hepática, esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD) y esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedad renal (fibrosis renal), lesión renal aguda (LRA), enfermedad renal aguda (ERA), enfermedad renal crónica (ERC), retraso de la función del injerto renal, enfermedades cardíacas o vasculares (fibrosis cardíaca) y enfermedades oculares; trastornos fibroproliferativos, por ejemplo, esclerodermia sistémica y local, queloides y cicatrices hipertróficas, ateroesclerosis, reestenosis y contractura de Dupuytren; cicatrices asociadas a traumatismos, por ejemplo, complicaciones quirúrgicas, fibrosis inducida por quimioterápicos (p. ej. fibrosis inducida por bleomicina), fibrosis inducida por radiación, lesiones accidentales y quemaduras); fibrosis retroperitoneal (enfermedad de Ormond); y fibrosis peritoneal/cicatrización peritoneal en pacientes que reciben diálisis peritoneal, generalmente tras un trasplante renal. Véase, por ejemplo, Wynn et al, 2004, Nat Rev Immunol. August; 4(8): 583-594. La presente invención se refiere a compuestos y composiciones utilizados en métodos de tratamiento o prevención de la fibrosis/trastornos fibróticos de y/o asociados a órganos principales, que incluyen, por ejemplo, el pulmón, hígado, riñón, corazón, piel, ojo, tubo gastrointestinal, peritoneo y médula ósea, y otras enfermedades/trastornos descritos en el presente documento.

Los compuestos pueden combinarse con agentes que se utilizan como tratamientos para la enfermedad renal, incluidos los antidiabéticos, agentes para enfermedades cardiovasculares, y nuevos agentes dirigidos a vías patológicas relevantes tales como el estrés oxidativo (incluyendo, pero sin limitación, la vía nrf2/keap-1) y las vías antiapoptóticas (incluyendo, pero sin limitación, agentes anti p53).

La enfermedad pulmonar intersticial (ILD) incluye trastornos en los que la inflamación pulmonar y la fibrosis son las vías finales comunes de la patología, por ejemplo, sarcoidosis, silicosis, reacciones farmacológicas, infecciones y enfermedades vasculares del colágeno, tales como la artritis reumatoide y la esclerosis sistémica (esclerodermia). El trastorno fibrótico del pulmón incluye, por ejemplo, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática (FPI), neumonitis intersticial habitual (UIP), enfermedad pulmonar intersticial, alveolitis fibrosante criptogénica (CFA), bronquiolitis obliterante y bronquiectasias.

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es el tipo más frecuente de enfermedad pulmonar intersticial y no tiene causa conocida.

Los compuestos pueden combinarse con agentes que son tratamientos para la FPI y potencialmente para la ILD, incluidos nintedanib y pirfenidona.

La cirrosis hepática tiene causas similares a la ILD e incluye, por ejemplo, cirrosis asociada a hepatitis vírica, esquistosomiasis y alcoholismo crónico.

La enfermedad renal puede estar asociada a la diabetes, que puede dañar y dejar cicatrices en los riñones, provocando una pérdida progresiva de su función, y también enfermedades hipertensivas. La fibrosis renal puede aparecer en cualquier fase de la enfermedad renal, desde la enfermedad renal aguda (ERA) tras una lesión y la enfermedad renal crónica (ERC), tal como la ERC incidente y la ERC progresiva, hasta la enfermedad renal terminal (ERT). La fibrosis renal puede desarrollarse como consecuencia de enfermedades cardiovasculares tales como la hipertensión o la diabetes, las cuales ejercen una enorme presión sobre la función renal, lo que favorece una respuesta fibrótica. Sin embargo, la fibrosis renal también puede ser idiopática (sin causa conocida), y ciertas enfermedades mitocondriales genéticas también presentan manifestaciones de fibrosis renal y síntomas asociados.

Las cardiopatías pueden dar lugar a tejido cicatricial que puede mermar la capacidad de bombeo del corazón.

Entre las enfermedades oculares se incluyen, por ejemplo, degeneración macular y retinopatía retiniana y vítrea, que pueden afectar a la visión.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al tratamiento o la prevención de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI).

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al tratamiento o la prevención de la fibrosis renal.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al tratamiento o la prevención de la lesión renal aguda (LRA), especialmente en pacientes de alto riesgo. Entre los ejemplos se incluye la LRA posquirúrgica, por ejemplo, el trasplante de órganos, de tal manera que se debe a una lesión por isquemia por reperfusión, función de injerto retardada; oncológicas, tales como LRA debido a la quimioterapia; nefropatía inducida por medios de contraste, tal como la citotoxicidad tubular directa, isquemia hemodinámica y efectos osmóticos; nefritis intersticial aguda, tal como debido a fármacos o infección; LRA debida a obstrucción tal como cálculos renales; y la LRA inducida por COVID-19. Un subgrupo de pacientes de alto riesgo en particular son los que se someten a cirugía cardíaca, por ejemplo, bypass aortocoronario y/o cirugía valvular. Existen factores de riesgo estáticos establecidos para la LRA, tales como la edad igual o superior a 65 años, diabetes de tipo 1, ERC (los adultos con una tasa de filtración glomerular estimada [TFGe] inferior a 60 ml/min/1,73 m2 corren un riesgo particular), insuficiencia cardíaca, hepatopatía, antecedentes de LRA.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al tratamiento o la prevención de la enfermedad renal aguda (ERA) o la enfermedad renal crónica (ERC) derivada de dicha ERA, que incluyen, por ejemplo, fibrosis tubulointersticial y nefropatía diabética.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al tratamiento o prevención de enfermedades hepáticas, incluyendo, pero sin limitación, NAFLD, NASH, cirrosis hepática, hipertensión portal, insuficiencia hepática aguda y carcinoma hepatocelular. Enfermedades hepáticas como la NAFLD y la NASH pueden asociarse a diversos trastornos metabólicos, como el síndrome metabólico y la diabetes de tipo II, lo que también aumentaría el riesgo de diversas patologías asociadas a la diabetes, incluidas la retinopatía diabética y las neuropatías periféricas.

Los compuestos de la invención o las composiciones farmacéuticas de los mismos como se describe en el presente documento pueden combinarse con uno o más agentes adicionales cuando se usan para el tratamiento o prevención de afecciones que implican enfermedad hepática y disfunción metabólica, incluyendo metformina, sulfonilureas, inhibidores de DPP-4, agonistas de GLP-1, agonistas de PPAR, inhibidores de SGLT2, inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA) y bloqueantes del receptor de angiotensina II (BRA).

El síndrome de Leigh es un trastorno neurometabólico hereditario poco frecuente que afecta al sistema nervioso central. Este trastorno progresivo comienza en lactantes de entre tres meses y dos años de edad. En raras ocasiones, se da en adolescentes y adultos. El síndrome de Leigh puede estar causado por mutaciones en el ADN nuclear que codifica proteínas mitocondriales, mutaciones en el ADN mitocondrial (síndrome de Leigh de herencia materna - MILS), o por deficiencias de una enzima llamada piruvato deshidrogenasa localizada en el brazo corto del cromosoma X (síndrome de Leigh ligado al cromosoma X). Los síntomas del síndrome de Leigh suelen progresar rápidamente. Las primeras señales pueden ser dificultad de succión y pérdida del control de la cabeza y de las habilidades motoras. Estos síntomas pueden estar acompañados por pérdida de apetito, vómitos, irritabilidad, llanto continuo y convulsiones. A medida que el trastorno progresa, los síntomas también pueden incluir debilidad generalizada, falta de tono muscular y episodios de acidosis láctica, que pueden conducir a deterioro respiratorio y de la función renal.

En el síndrome de Leigh de herencia materna (MILS), las mutaciones genéticas en el ADN mitocondrial (en una proporción elevada de >90 %) interfieren con las fuentes de energía que hacen funcionar las células de una zona del cerebro que desempeña un papel en los movimientos motores. Las mutaciones genéticas en el ADN mitocondrial provocan una falta crónica de energía en estas células, que a su vez afecta al sistema nervioso central y provoca una degeneración progresiva de las funciones motoras. Cuando las mutaciones genéticas en el ADN mitocondrial que causan el MILS son menos abundantes (menos del 90 %), la enfermedad es conocida como neuropatía, ataxia y retinosis pigmentaria (NARP). Existe también una forma de enfermedad de Leigh (denominada enfermedad de Leigh ligada al cromosoma X) que es el resultado de mutaciones en un gen que produce otro grupo de sustancias importantes para el metabolismo celular. Existe otra variante del síndrome de Leigh que se denomina variante francocanadiense, caracterizada por mutaciones en un gen denominado LRPPRC. Se manifiestan síntomas neurológicos similares a los del síndrome de Leigh, aunque la esteatosis hepática también suele observarse en la variante francocanadiense.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al tratamiento o la prevención del síndrome o la enfermedad de Leigh, que incluyen, por ejemplo, enfermedad de Leigh ligada al cromosoma X, variante francocanadiense del síndrome de Leigh y/o los síntomas asociados a la enfermedad de Leigh.

Los compuestos pueden combinarse con agentes novedosos que pueden usarse como tratamientos para la enfermedad mitocondrial, incluyendo, pero sin limitación, ribósido de nicotinamida.

Las referencias a "tratamiento" incluyen medios para mejorar, aliviar síntomas, eliminar la causa de los síntomas de forma temporal o permanente. Los compuestos de la invención son útiles en el tratamiento de las enfermedades divulgadas en el presente documento en seres humanos y otros mamíferos.

En otra realización, la invención abarca la terapia profiláctica de las enfermedades divulgadas en el presente documento e incluye medios para impedir o ralentizar la aparición de los síntomas del trastorno o afección mencionados. Los compuestos de la invención son útiles en la prevención de las enfermedades divulgadas en el presente documento en seres humanos y otros mamíferos.

Un paciente que necesite tratamiento o prevención puede, por ejemplo, ser un ser humano u otro mamífero que padezca la afección o corra el riesgo de padecer la afección.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) como se define en el presente documento, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o tautómero, junto con un diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden cualquiera de los compuestos de la invención junto con cualquier transportador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de transportadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitación, agentes conservantes, cargas, agentes disgregantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, agentes perfumantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes lubricantes y agentes dispersantes, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y las formas farmacéuticas. Las composiciones pueden estar en forma de, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, elixires, pastillas para chupar, supositorios, jarabes y preparados líquidos, incluidas suspensiones y soluciones. La expresión "composición farmacéutica" en el contexto de esta invención significa una composición que comprende un agente activo y que comprende adicionalmente uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables. La composición puede contener además ingredientes seleccionados de entre, por ejemplo, diluyentes, adyuvantes, excipientes, vehículos, agentes conservantes, cargas, agentes disgregantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, agentes perfumantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes lubricantes y agentes dispersantes, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y las formas farmacéuticas.

Los compuestos de la invención o las composiciones farmacéuticas de los mismos, como se describen en el presente documento, pueden usarse solos o junto con uno o más agentes farmacéuticos adicionales. Los compuestos pueden combinarse con un agente terapéutico antitumoral adicional, por ejemplo, fármacos quimioterapéuticos o inhibidores de otras proteínas reguladoras. En una realización, el agente terapéutico antitumoral adicional es un mimético de BH-3. En una realización adicional, los miméticos de BH-3 pueden seleccionarse, pero sin limitación, de uno o más de ABT-737, ABT-199, ABT-263 y Obatoclax. En una realización adicional, el agente antitumoral adicional es un agente quimioterápico. Los agentes quimioterápicos pueden seleccionarse, pero sin limitación, de, olaparib, mitomicina C, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, radiación ionizante (RI), camptotecina, irinotecán, topotecán, temozolomida, taxanos, 5-fluoropirimidinas, gemcitabina y doxorrubicina.

Para el tratamiento o la prevención de trastornos fibróticos, por ejemplo, los compuestos de la invención o las composiciones farmacéuticas de los mismos, como se describen en el presente documento, pueden usarse solos o junto con uno o más agentes farmacéuticos adicionales seleccionados del grupo que consiste en agentes anticolinérgicos, beta-2 miméticos, esteroides, inhibidores de PDE-IV, inhibidores de la p38 MAP cinasa, antagonistas de NK1, antagonistas de LTD4, inhibidores del EGFR y antagonistas de la endotelina.

En particular, los compuestos de la invención o las composiciones farmacéuticas de los mismos, como se describen en el presente documento, pueden usarse solos o junto con uno o más agentes farmacéuticos adicionales seleccionados del grupo que consiste en fármacos inmunosupresores generales, tal como un corticoesteroide, agentes inmunosupresores o citotóxicos, o antifibróticos, tales como pirfenidona o un inhibidor no específico de la cinasa (p. ej. nintedanib).

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse de cualquier manera convenientemente eficaz, tal como la administración oral, parenteral, tópica, inhalada, intranasal, rectal, intravaginal, ocular y auditiva. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración de los compuestos de la presente invención y los métodos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Se pueden encontrar dichas composiciones y métodos para su preparación, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 19a Edición (Mack Publishing Company, 1995).

Administración oral

Los compuestos de la invención pueden administrarse por vía oral. La administración oral puede implicar la deglución, para que el compuesto entre en el tracto gastrointestinal, o puede emplearse la administración bucal o sublingual, por la que el compuesto entra en el torrente sanguíneo directamente desde la boca.

Las formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen formulaciones sólidas tales como comprimidos, cápsulas que contienen material en partículas, líquidos o polvos, pastillas para chupar (incluidas las rellenas de líquido), chicles, multi y nanopartículados, geles, películas (incluidas las mucoadhesivas), óvulos, aerosoles y formulaciones líquidas.

Las formulaciones líquidas incluyen suspensiones, soluciones, jarabes y elixires. Tales formulaciones pueden emplearse como carga en cápsulas blandas o duras y normalmente comprenden un transportador, por ejemplo, agua, etanol, propilenglicol, metilcelulosa, o un aceite adecuado, y uno o más agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión. Las formulaciones líquidas también pueden prepararse mediante la reconstitución de un sólido, por ejemplo, de un sobre.

Los compuestos de la invención también pueden usarse en formas farmacéuticas de disolución rápida, de disgregación rápida tales como las descritas en Expelí Opinion in Therapeutic Patents, 11 (6), 981-986 por Liang y Chen (2001).

Un comprimido típico puede prepararse mediante procesos estándar conocidos por un químico especialista en formulación, por ejemplo, por compresión directa, granulación (seca, húmeda o de fusión), solidificación en estado fundido o extrusión. La formulación del comprimido puede comprender una o más capas y puede estar recubierto o no.

Ejemplos de excipientes adecuados para la administración oral incluyen transportadores, por ejemplo, celulosa, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico, manitol y citrato sódico, aglutinantes de granulación, por ejemplo, polivinilpirrolidona, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y gelatina, disgregantes, por ejemplo, almidón glicolato sódico y silicatos, agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio y ácido esteárico, agentes humectantes, por ejemplo, laurilsulfato sódico, conservantes, antioxidantes, aromas y colorantes.

Las formulaciones sólidas para la administración oral pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, sostenida, pulsada, doble controlada, dirigida y programada. Detalles de tecnologías adecuadas de liberación modificada, tales como dispersiones de alta energía, partículas osmóticas y recubiertas se encuentran en Verma et al., Pharmaceutical Technology On-line, 25 (2), 1-14 (2001). Otras formulaciones de liberación modificada se describen en la patente US-6.106.864.

Administración parenteral

Los compuestos de la invención también pueden administrarse directamente en el torrente sanguíneo, en el músculo, o en un órgano interno. Los medios adecuados para la administración parenteral incluyen la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular y subcutánea. Los dispositivos adecuados para la administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluidas microagujas), inyectores sin aguja y técnicas de infusión.

Las formulaciones parenterales suelen ser soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, hidratos de carbono y agentes tampón (preferentemente a un pH de 3 a 9) pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse de forma más adecuada como una solución no acuosa estéril o como una forma seca para utilizar junto con un vehículo adecuado, tal como agua apirógena, estéril.

La preparación de formulaciones parenterales en condiciones estériles, por ejemplo, mediante liofilización, puede lograrse fácilmente usando técnicas farmacéuticas convencionales bien conocidas por los expertos en la materia.

La solubilidad de los compuestos de fórmula (I) utilizados en la preparación de soluciones parenterales puede aumentarse mediante un procesamiento adecuado, por ejemplo, el uso de dispersiones secadas por pulverización de alta energía y/o mediante el empleo de técnicas de formulación adecuadas, tales como el uso de agentes potenciadores de la solubilidad.

Las formulaciones para la administración parenteral pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, sostenida, pulsada, doble controlada, dirigida y programada.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también incluyen composiciones y métodos conocidos en la técnica para eludir la barrera hematoencefálica o pueden inyectarse directamente en el cerebro. Entre las zonas adecuadas para la inyección se incluye la corteza cerebral, cerebelo, cerebro medio, tronco encefálico, hipotálamo, médula espinal y tejido ventricular, y zonas del SNP que incluyen el cuerpo carotídeo y la médula suprarrenal.

Dosificación

La magnitud de una dosis efectiva de un compuesto, por supuesto, varía en función de la naturaleza de la gravedad de la afección a tratar y de la vía de administración. La selección de las dosis adecuadas está dentro de las competencias del médico. El intervalo de dosis diaria es de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal de un animal humano y no humano y, en general, puede ser de aproximadamente 10 pg a 30 mg por kg de peso corporal por dosis. La dosis anterior puede administrarse de una a tres veces al día.

Por ejemplo, la administración oral puede requerir una dosis diaria total de 5 mg a 1000 mg, tal como de 5 a 500 mg, mientras que una dosis intravenosa puede requerir solo de 0,01 a 30 mg/kg de peso corporal, tal como de 0,1 a 10 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 1 mg/kg de peso corporal). La dosis diaria total puede administrarse en dosis únicas o divididas.

El experto también apreciará que, en el tratamiento o la prevención de determinadas afecciones, los compuestos de la invención pueden tomarse como dosis única "según se requiera" (es decir, según se necesite o se desee).

Metodologías sintéticas

Los compuestos de fórmula (I) pueden prepararse por los métodos que se describen a continuación en los esquemas generales de reacción y en los ejemplos representativos. Cuando sea apropiado, las transformaciones individuales dentro de un esquema pueden completarse en un orden diferente. La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitativos en los que se utilizan las siguientes abreviaturas y definiciones. Los compuestos se caracterizaron por cromatografía líquida-espectroscopia de masas (LCMS) o RMN de 1H o ambas.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (I) que comprende la desprotección del compuesto de fórmula (III) utilizando métodos estándar para dar la amina (II) que puede hacerse reaccionar a continuación con bromuro de cianógeno para dar el compuesto correspondiente de fórmula (I):

en donde PG es un grupo protector.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto, que se selecciona de entre las fórmulas (II) y (III), en donde PG es un grupo protector, o una sal de dicho compuesto.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un compuesto, que se selecciona de entre las fórmulas (IIA) y (IIIA):

en donde PG es un grupo protector, o una sal de dicho compuesto.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (III) que comprende la oxidación del compuesto de fórmula (IV) utilizando métodos estándar, tal como con ácido m-cloroperbenzoico, para dar N-óxido (V) que a continuación puede hacerse reaccionar con cianuro de trimetilsililo y cloruro de dimetilcarbamoílo para dar el correspondiente compuesto de fórmula (III):

en donde PG es un grupo protector.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto, que se selecciona de entre las fórmulas (IV) y (V), en donde PG es un grupo protector, o una sal de dicho compuesto.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un compuesto, que se selecciona de entre las fórmulas (IVA) y (VA):

en donde PG es un grupo protector, o una sal de dicho compuesto.

Los grupos protectores se seleccionan preferentemente de ferc-butiloxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBz), pmetoxibencilcarbonilo (MeOZ), 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), acetilo (Ac), benzoílo (Bz), bencilo (Bn), carbamato, p-metoxibencilo (PMB), 3,4-dimetoxibencilo (DMPM), p-metoxifenilo (PMP), tosilo (Ts), tricloroetoxicarbonilo (Troc), 4-nitrobencenosulfonilo (Nosil) y 2-nitrofenilsulfenilo (Nps). Lo más preferidos son BOC y Cbz.

Abreviaturas

s a singlete ancho (señal de RMN) MeOH metanol

CO monóxido de carbono min minuto o minutos

d doblete (señal de RMN) MsCl cloruro de metanosulfonilo dba dibencilacetona N2 nitrógeno

(L)-DBTA ácido dibenzoil-L-tartárico monohidratado NMP N-metilpirrolidona

DCM diclorometano p-TSA ácido 4-toluenosulfónico

DMF N,N-dimetilformamidaracracémico

DMSO dimetilsulfóxido ta temperatura ambiente

r.d. relación diastereomérica Rf factor de retención

e.e. exceso enantiomérico s singlete (señal de RMN)

ES electronebulización SFC cromatografía de fluidos supercríticos EtOAc acetato de etilo SOCl2 cloruro de tionilo

h hora u horas TBD 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno H2 hidrógeno TEA trietilamina

HPLC<cromatografía de líquidos de alto>

rendimientoTFA ácido trifluoroacético IPA propan-2-ol THF tetrahidrofurano

LCMS<cromatografía líquida - espectrometría de>

masasTMSCN cianuro de trimetilsililo m multiplete (señal de RMN) vol volúmenes

MeCN acetonitrilo

Métodos LCMS / HPLC / SFC

Método C

Método C1

Método E

Método F

Método H

Método H1

Método H3

Método X

Método X2

Método Y4

Método Y11

Método Y13

Método Y15

Método Y17

Método Y20

Método Y22

Método Y23

Método Y24

Método Y25

Método Y26

Método Y28

Intermedio A

5-(Piridin-4-il)isoxazol-2-carboxilato de etilo

(i) i-PrMgCl, THF, ta; (ii) TFA, DCM, 0 °C a ta; (Ni) TEA, DCM, 0 °C a ta.

Etapa (i)

(2-Oxo-2-(piridin-4-il)etil)carbamato de terc-butilo

El clorhidrato de 4-bromopiridina (CAS 19524-06-2, de CombiBlocks, 8,0 g, 41,2 mmol) se trató con Na2CO3 acuoso al 5 % (300 ml) y se extrajo con DCM (2 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida. El residuo se disolvió inmediatamente en THF seco (50 ml) y se añadió cloruro de isopropilmagnesio (2 M en THF, 20,57 ml, 41,2 mmol) gota a gota a ta en N2. La solución oscura resultante se agitó a ta durante 1,5 h, tiempo durante el cual se formó un precipitado. Al mismo tiempo, a una suspensión agitada de (2-(metoxi(metil)amino)-2-oxoetil)carbamato de terc-butilo (7,1 g, 32,9 mmol) en THF (50 ml) se añadió cloruro de isopropilmagnesio (2 M en THF, 16,4 ml, 32,9 mmol) gota a gota a 0 °C. La solución se agitó durante 10 min antes de añadirla gota a gota a ta al piridil Grignard. La mezcla se agitó a ta durante 16 h y, a continuación, se vertió en agua (200 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (EtOAc 30 % en nhexanos) para obtener 2-oxo-2-(piridin-4-il)etil)carbamato de terc-butilo (4,8 g, 20,3 mmol, rendimiento del 49 %). LCMS: Método C, 1,40 min, MS: ES+ 237,1; RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8 ppm: 8,88-8,89 (d,J =5,6 Hz, 2H), 7,77 7,79 (d,J =6,8 Hz, 2H), 5,49 (s a, 1H), 4,69-4,71 (d,J =4,4 Hz, 2H), 1,52 (s, 9H).

Etapa (ii)

2-Amino-1-(piridin-4-il)etan-1-ona Sal TFA

A una solución agitada de (2-oxo-2-(piridin-4-il)etil)carbamato de terc-butilo (4,8 g, 20,34 mmol) en DCM (50 ml) se añadió TFA (2,4 ml, 5 vol) gota a gota a 0 °C. La mezcla se calentó lentamente hasta ta y se agitó durante 2 h, a continuación se concentró a presión reducida con DCM (3 x 100 ml) para obtener la sal TFA de 2-amino-1-(piridin-4-il)etan-1-ona (7,0 g, rendimiento cuantitativo).

LCMS: Método C, 0,29 min, MS: ES+ 136,96; RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm: 8,91-8,93 (d,J= 6,0 Hz, 2H), 8,36 (s a, 3H), 7,92-7,94 (d,J= 6,0 Hz, 2H), 4,68 (t,J= 5,2 Hz, 2H).

Etapa (iii)

5-(Piridin-4-il)isoxazol-2-carboxilato de etilo

Esta reacción se realizó por duplicado. A una solución agitada de sal TFA de 2-amino-1-(piridin-4-il)etan-1-ona (3,0 g, 12 mmol) en DCM (80 ml) se añadió TEA (3,75 g, 5,17 ml, 37,2 mmol) gota a gota a ta. Se añadió clorooxalato de etilo (1,63 g, 1,33 ml, 12 mmol) gota a gota a 0 °C. La mezcla se calentó lentamente a ta y se agitó durante 24 h. Los dos lotes se combinaron y se vertieron en agua (200 ml) y se extrajo con DCM (2 x 200 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (EtOAc 40 % en n-hexanos) para obtener 5-(piridin-4-il)oxazol-2-carboxilato de etilo (0,45 g, 2,06 mmol, 10 % de rendimiento en 2 etapas).

LCMS: Método C, 1,29 min, MS: ES+ 219,25; RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm: 8,74-8,75 (d,J= 5,6 Hz, 2H), 8,29 (s, 1H), 7,79-7,80 (d,J= 6,0 Hz, 2H), 4,40-4,45 (c,J= 7,2, Hz, 2H), 1,37 (t,J =6,8 Hz, 3H).

Intermedio B

rac-(3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo

(i) EtOC(O)Cl, NaOH, DCM, 0 °C a ta; (ii) NaH, DMF, 3-clorobut-1-eno, 0 °C a ta; (iii) HCO2H, 0 °C y a continuación I 00 °C; (iv) N-bencilglicina, tolueno, 110 °C; (v) HClconc.,110 °C; (vi) (BOC)2O, TEA, 4-dimetilaminopiridina, DCM, 0 °C a ta; (vii) separación cromatográfica;

(viii) Pd(OH)2, MeOH, H2, ta.

Etapa (i)

(2,2-Dimetoxietil)carbamato de etilo

A una solución agitada de 2,2-dimetoxietano-1-amina (CAS 22483-09-6, de Combi-blocks, 12,5 g, 118,9 mmol) en DCM (100 ml) se añadió una solución acuosa de hidróxido sódico (5,2 g, 130,8 mmol) en agua (31 ml) gota a gota a 0 °C. Se añadió cloroformiato de etilo (14,2 g, 130,8 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 16 h. Esta mezcla y una mezcla de reacción duplicada se vertieron en agua (500 ml) y se extrajeron con DCM (3 x 500 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida para producir (2,2-dimetoxietil)carbamato de etilo (36,5 g, rendimiento cuantitativo).

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 8 ppm: 7,15 (s, 1H), 4,34 (t,J= 5,2 Hz, 1H), 3,98 (c,J= 7,2 Hz, 2H), 3,24 (s, 6H), 3,05 (t,J= 5,6 Hz, 2H), 1,15 (t,J =7,2 Hz, 3H).

Etapa (ii)

But-3-en-2-il-(2,2-dimetoxietil)carbamato de etilo

A una disolución agitada de (2,2-dimetoxietil)carbamato de etilo (12,1 g, 68,3 mmol) en DMF (50 ml) se añadió NaH (60 % en aceite mineral, 6,84 g, 170,9 mmol) en porciones durante 2 h a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 2 h, a continuación se añadió 3-clorobut-1-eno (7,6 ml, 75,2 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 20 h. Esta mezcla y dos mezclas de reacción duplicadas se lavaron con agua helada (300 ml) y se extrajeron con EtOAc (3 x 500 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua fría (3 x 150 ml) y salmuera (2 x 150 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (óxido de aluminio básico, EtOAc 5 % en n-hexanos) para producir but-3-en-2-il-(2,2-dimetoxietil)carbamato de etilo (15,5 g, 67,0 mmol, 28 % de rendimiento en dos etapas).

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 8 ppm: 5,88-5,94 (m, 1 H), 5,08-5,11 (m, 2H), 4,41-4,48 (m, 2H), 4,05-4,06 (m, 2H), 3,18-3,35 (m, 8H), 1,18-1,24 (m, 6H).

Etapa (í¡¡)

But-3-en-2-il(2-oxoetil)carbamato de etilo

A una disolución agitada de but-3-en-2-il(2,2-dimetox¡et¡l)carbamato de etilo (15,5 g, 67,0 mmol) se le añadió ácido fórmico (36 ml) gota a gota a 0 °C. La mezcla se calentó a 100 °C durante 2 h y a continuación se enfrió hasta ta, se vertió en agua helada (200 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 300 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución saturada de NaHCO3 (3 x 100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida para producir but-3-en-2-il-(2-oxoetil)carbamato de etilo (11,3 g, 61,1 mmol, 91 % de rendimiento). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 8 ppm: 9,47 (s, 1H), 5,75-5,85 (m, 1H), 5,10-5,15 (m, 2H), 4,65-4,77 (m, 1H), 3,80 4,07 (m, 4H), 1,10-1,18 (m, 6H).

Etapa (iv)

rac-(3aR,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de etilo

A una solución agitada de but-3-en-2-il-(2-oxoetil)carbamato de etilo (4,7 g, 25,4 mmol) en tolueno (100 ml) se añadió W-bencilglicina (CAS 17136-36-6, de Combi-blocks, 4,2 g, 25,4 mmol) a ta. La mezcla se calentó a 110 °C durante 16 horas y a continuación se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (óxido de aluminio básico, EtOAc 7 % en n-hexanos) para producir rac-(3aR,6aR)-1-benc¡l-4-met¡lhexah¡drop¡rrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de etilo (3,2 g, 11,1 mmol, 43 % de rendimiento).

LCMS: Método C, 1,33 min, dos amplios picos se fusionaron, sin separación de base de los dos diastereómeros, MS: ES+ 289,3.

Etapa (v)

rac-(3aR,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol sal HCl

Una solución agitada de rac-(3aR,6aR)-1-benc¡l-4-met¡lhexah¡drop¡rrolo[3,4-b]p¡rrol-5(1H)-carbox¡lato de etilo (3,2 g, 11,1 mmol) en HCl concentrado (40 ml, 12,5 vol) se calentó a 100 °C durante 16 h. La mezcla se enfrió a ta y se concentró a presión reducida para producirrac-(3aR,6aR)-1-benc¡l-4-met¡loctah¡drop¡rrolo[3,4-b]p¡rrol sal HCl (3,72 g, rendimiento cuantitativo).

LCMS: Método F, 4,45 min y 4,92 min, dos diastereómeros, MS: ES+ 217,3.

Etapa (vi)

rac-(3aR,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo

A una solución agitada de rac-(3aR,6aR)-1-benc¡l-4-met¡loctah¡drop¡rrolo[3,4-b]p¡rrol sal HCl (3,7 g, 14,65 mmol) en DCM (40 ml) se añadió trietilamina (10,3 ml, 73,5 mmol), 4-dimetilaminopiridina (0,09 g, 0,73 mmol) y dicarbonato de di-terc-butilo (3,83 g, 17,58 mmol) a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 5 h, a continuación se vertió en agua (100 ml) y se extrajo con DCM (2 x 150 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron a presión reducida. El residuo se sometió a la separación cromatográfica en la etapa (vii).

Etapa (vii)

rac-(3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo(isómero mayoritario) y

rac-(3aR,4S,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo(isómero minoritario)

El residuo de la etapa (vi) se purificó mediante cromatografía en columna (óxido de aluminio básico, EtOAc al 2 % en n-hexanos) para obtener dos fracciones separadas en una proporción de 4,2:1.

La primera fracción de elución, Fracción 1, el rac-(3aR,4S,6aR)-1-benc¡l-4-met¡lhexah¡drop¡rrolo[3,4-b]p¡rrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (isómero minoritario, 0,50 g) se aisló como un aceite incoloro. TLC: Rf 0,5 (EtOAc 30 %/nhexanos).

LCMS: Método C, 1,46 min, MS: ES+ 317,4 y Método X, 13,70 min, MS: ES+ 317,3.

La segunda fracción de elución, Fracción 2, el rac-(3aR,4R,6aR)-1-benc¡l-4-met¡lhexah¡drop¡rrolo[3,4-b]p¡rrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (isómero mayoritario, 2,10 g, 6,63 mmol, 45 % de rendimiento) se aisló como un aceite incoloro. TLC: Rf 0,4 (EtOAc 30 %/n-hexanos).

LCMS: Método C, 1,46 min, MS: ES+ 317,4 y Método X, 13,37 min, MS: ES+ 317,3; r.d. 99:1 por el método X. La fracción 2 se llevó a la etapa (viii).

Etapa (viii)

rac-(3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo

A una solución agitada derac-(3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]-pirrol-5(1H)-carboxilato de tercbutilo (Fracción 2, isómero principal, 0,50 g, 1,58 mmol) en MeOH (10 ml) se añadió Pd(OH)220 % (50 % de humedad, 250 mg, 50 % p/p) y se purgó con gas H2 durante 4 h a ta. La mezcla se filtró a través de un lecho de Celite, se lavó con MeOH (50 ml) y se concentró a presión reducida para obtener rac-(3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (0,33 g, 1,46 mmol, 92 % de rendimiento).

LCMS: Método C, 1,29 min, MS: ES+ 227,32.

Intermedio C

(3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo

(2,2-Dimetoxietil)-D-alaninato de metilo

A una mezcla agitada de 2,2-dimetoxiacetaldehído (97,01 g, 931,89 mmol) en MeOH (100 ml) se añadió HCl de D-alaninato de metilo (100,0 g, 716,84 mmol) a 0 °C. La mezcla se agitó a ta durante 2 h. Se añadió cianoborohidruro sódico (58,52 g, 931,89 mmol) en porciones en atmósfera de N2 a 0 °C y se agitó a ta durante 18 h. La mezcla se filtró sobre Celite y se lavó con MeOH (2 x 200 ml). El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se vertió en agua (1000 ml) y se extrajo con DCM (2 x 1000 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron a presión reducida a 40 °C para proporcionar (2,2-dimetoxietil)-D-alaninato de metilo como un aceite amarillo pálido (135,0 g, 705,95 mmol, 98 % de rendimiento).

RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8 ppm: 4,41-4,54 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,47-3,50 (m, 1H), 3,38-3,46 (m, 6H), 2,76-2,81 (m, 1H), 2,64-2,68 (m, 1H), 1,31-1,35 (d,J= 7,2 Hz, 3H).

El método se repitió tres veces de manera idéntica usando D-alaninato de metilo HCl (escala de 500 g, 1200 g y 1200 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente, 680 g, 1625 g y 1625 g). Peso combinado de los tres lotes: 4065 g, 21,25 mol.

Etapa (ii)

N-(2,2-dimetoxietil)-N-(etoxicarbonil)-D-alaninato de metilo

A una mezcla agitada de bicarbonato sódico (88,95 g, 1058 mmol) en agua (810 ml) se añadió una solución de (2,2-dimetoxietil)-D-alaninato de metilo (135 g, 705,95 mmol) en THF (810 ml) a ta. Se añadió cloroformiato de etilo (91,93 g, 847,14 mmol) a la solución bifásica enfriada (-5 a 5 °C) y la mezcla se agitó a ta durante 2 h. La mezcla se vertió en agua (1,35 l) y se extrajo con EtOAc (2 x 675 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución saturada de KHSO4 (675 ml), se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron a presión reducida a 40 °C para obtener N-(2,2-dimetoxietil)-N-(etoxicarbonil)-D-alaninato de metilo como un aceite (150,0 g, 569,71 mmol, rendimiento del 80 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8 ppm: 4,52 (m, 2H), 4,15-4,27 (m, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,40-3,63 (m, 9H), 1,50 1,52 (d,J= 6,8 Hz, 2H), 1,23-1,39 (m, 3H).

El método se repitió cuatro veces de manera idéntica utilizando (2,2-dimetoxietil)-D-alaninato de metilo (escala de 680 g, 1000 g, 1000 g y 1250 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 775 g, 1360 g, 1365 g y 1375 g). Peso combinado de los tres lotes: 5025 g, 19,09 mol.

Etapa (¡ii)

(R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamato de etilo

A una mezcla agitada de N-(2,2-dimetoxietil)-N-(etoxicarbonil)-D-alaninato de metilo (100 g, 379,8 mmol) en etanol (1,8 l) y THF (200 ml) se añadió LiBH4 (2 M en THF, 949,5 ml, 1899,04 mmol) gota a gota a 0 °C. La mezcla se agitó a ta durante 18 h, a continuación se inactivó añadiendo dos veces una solución fría de cloruro de amonio (50 g) en agua (500 ml) y se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente orgánico más volátil. El residuo se recogió en EtOAc (500 ml). La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato sódico y se concentró a presión reducida a 40 °C para obtener (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamato de etilo como un aceite (72,0 g, 306,01 mmol, 81 % de rendimiento).

RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8 ppm: 4,85-4,86 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,15-4,24 (m, 3H), 3,71-3,72 (m, 2H), 3,41-3,56 (m, 6H), 3,14-3,19 (m, 1H), 2,99-3,05 (m, 2H), 1,28-1,34 (m, 3H), 1,13-1,15 (m, 1H), 1,03-1,05 (m, 1H).

El método se repitió cinco veces de manera idéntica usando N-(2,2-dimetoxietil)-N-(etoxicarbonil)-D-alaninato de metilo (escala de 500 g, 500 g,1200 g, 1200 g y 1200 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 336 g, 336 g, 929 g, 930 g y 930 g). Peso combinado de los tres lotes: 3533 g, 15,01 mol.

Etapa (iv)

(R)-(2,2-dimetoxietil)(1-oxopropan-2-il)carbamato de etilo

A una mezcla agitada de (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamato de etilo (400,0 g, 1700,1 mmol) en DCM: agua (1,04 l, 1:1) se añadieron NaHCO3 (428 g, 5100 mmol) y Te Mp O (2,6 g, 17,0 mmol) a ta. Se añadió una solución de hipoclorito sódico (solución de NaOCl 1 M recién preparada a partir de NaOCl sólido: 5H2O, 391,1 g, 2210,13 mmol, diluido con 4,98 l de agua) la solución bifásica a 0 °C. La mezcla se calentó a ta y se agitó durante 18 h, a continuación se inactivó cuidadosamente con una solución acuosa de tiosulfato sódico al 10 % (p/v) (2,8 l) y se extrajo con DCM (2 x 4,0 l). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se concentró a presión reducida a 40 °C para obtener (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamato de etilo como un aceite (360 g, 1543,3 mmol, 90,78 % de rendimiento).

RMN de 1H (400 MHz, CDCta) 8 ppm: 9,59 (s, 1H), 4,46-4,48 (m, 1H), 4,16-4,24 (m, 2H), 3,84-3,89 (m, 1H), 3,52-3,56 (m, 1H), 3,42-3,47 (m, 6H), 3,30-3,40 (m, 1H), 1,38-1,41 (m, 3H), 1,22-1,34 (m, 3H).

El método se repitió tres veces de manera idéntica usando (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamato de etilo (1100 g, 840 g y 1200 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 1026 g, 820 g y 1020 g). Peso combinado de los tres lotes: 3226 g, 13,83 mol.

Etapa (v)

(R)-but-3-en-2-il(2,2-dimetoxietil)carbamato de etilo

A una mezcla agitada de bromuro de metiltrifenilfosfonio (137,7 g, 385,8 mmol) en THF (1,8 l) se añadió KHMDS (1 M en THF, 401,26 ml, 401,2 mmol) gota a gota a 0 °C. La mezcla se agitó a ta durante 1 h, a continuación se añadió una solución de (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamato de etilo (72,0 g, 308,6 mmol) en THF (576 ml) gota a gota a -78 °C en atmósfera de N2. La mezcla se agitó a ta durante 18 h, a continuación se inactivó con MeOH (2,2 ml) y se agitó durante 30 min a ta. La mezcla se concentró, se destiló conjuntamente con hexano (3 x 1500 ml), se enfrió a 0 °C y se filtró para eliminar el MePPh2O y el PPh3O precipitados. La fase orgánica se concentró, se enfrió y se volvió a filtrar. El filtrado resultante se concentró a presión reducida a 40 °C para obtener (R)-but-3-en-2-il(2,2-dimetoxietil)carbamato de etilo (65 g, 1543,3 mmol, 91 % de rendimiento) como un aceite de color marrón claro.

RMN de 1H (400 MHz, CDCh) ppm: 85,92-6,03 (m, 1H), 5,11-5,16 (m, 1H), 4,52 (s, 2H), 4,17-4,23 (m, 2H), 3,45 (s, 6H), 3,27 (m, 2H), 2,67-2,72 (m, 1H), 1,26-1,33 (m, 6H).

El método se repitió tres veces de manera idéntica usando (R)-(2,2-dimetoxietil)(1-hidroxipropan-2-il)carbamato de etilo (735 g, 1417 g y 1020 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 644 g, 1262 g y 860 g). Peso combinado de los tres lotes: 2831 g, 12,24 mol.

Etapa (vi)

(R)-but-3-en-2-il(2-oxoetil)carbamato de etilo

A una mezcla agitada de (R)-but-3-en-2-il(2,2-dimetoxietil)carbamato de etilo (300,0 g, 1297,07 mmol) en acetona (6,0 l) y agua (600 ml) se añadió ácido p-tolueno sulfónico monohidratado (78,9 g, 415,06 mmol) a ta. La mezcla se calentó a 60 °C durante 18 h, se dejó enfriar hasta ta y se concentró a presión reducida. La mezcla se concentró y el residuo se vertió en una solución saturada de NaHCO3 (1500 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 1000 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida para obtener (R)-but-3-en-2-il(2-oxoetil)carbamato de etilo como un aceite amarillo pálido (230 g, 1242,5 mmol, 96% de rendimiento).

RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8 ppm: 9,55 (s, 1H), 5,79-5,86 (m, 1H), 5,05-5,25 (m, 2H), 5,00-5,05 (m, 1H), 4,12-4,22 (m, 2H), 3,70-3,92 (m, 2H), 1,24-1,31 (m, 6H).

El método se repitió tres veces de manera idéntica usando (R)-but-3-en-2-il(2,2-dimetoxietil)carbamato de etilo (1020 g, 670 g y 860 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 795 g, 480 g, 605 g). Peso combinado de los tres lotes: 2110 g, 11,39 mol.

Etapa (vii)

(3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de etilo, mezcla con (3aS,4R,6aS)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de etilo (mezcla ~70:30 de diastereómeros)

En un matraz de fondo redondo de 10 l, equipado con aparato Dean-Stark, se agitó a ta una mezcla de (R)-but-3-en-2-il-(2-oxoetil)carbamato de etilo (200,0 g, 1079,7 mmol) en tolueno (7,2 l, 36 vol). Se añadió A/-bencilglicina (214,02 g, 1295,7 mmol) a la mezcla, que a continuación se calentó a 120 °C durante 18 h, se dejó enfriar hasta ta y se concentró a presión reducida. El residuo se vertió en una solución saturada de NaHCO3 (2000 ml) y se extrajo con DCM (2 x 1000 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida para producir los compuestos del subtítulo (mezcla ~70:30 de diastereómeros) como un aceite marrón (306,0 g, 1061,06 mmol, 98 % de rendimiento).

LCMS: Método H3, 3,46 min, mezcla de diastereómeros, MS: ES+ 289,2; RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 ppm: 7,16 7,40 (m, 5H), 4,16 (m, 2H), 3,91 (m, 2H), 3,65 (m, 1H), 3,49 (m, 1H), 3,32 (m, 1H), 3,18 (m, 1H), 2,92 (m, 1H), 2,64 2,72 (m, 1H), 2,40 (s, 1H), 2,33 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,30 (t, 3H), 1,20 (d,J= 5,2 Hz, 3H); HPLC quiral: Método Y26, 5,23 min - pico principal; 5,61 min - pico menor.

El método se repitió tres veces de manera idéntica utilizando (R)-but-3-en-2-il-(2-oxoetil)carbamato de etilo (515 g, 600 g y 760 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 751 g, 880 g y 970 g). Peso combinado de los cuatro lotes: 2907 g, 10,09 mol.

Etapa (viii)

(3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol, mezcla con (3aS,4R,6aS)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol

Una mezcla agitada del producto de la Etapa (vii) (mezcla ~70:30 de diastereómeros, 300,0 g, 1040,25 mmol) en HBr acuoso (48 % en peso, 1988 ml 16644,12 mmol) se calentó a reflujo durante 6 h. La mezcla se vertió en agua (1,5 l, 5 vol) y se lavó con tolueno (3 x 600 ml, 2 vol). La capa acuosa se basificó con K2CO3 (~2,0 kg, 14563,5 mmol) hasta pH ~10 y se extrajo con DCM (3 x 1,5 l). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se disolvió en DCM (500 ml) y se lavó a fondo con solución de NaOH 1 N (150 ml). La capa acuosa se extrajo con DCM (200 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida para producir los compuestos del subtítulo (mezcla ~70:30 de diastereómeros) como un aceite marrón (155,0 g, 716,49 mmol, 69 % de rendimiento). LCMS: Método F, 3,05 min, mezcla de diastereómeros, MS: ES+ 217,2; RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 ppm: 7,21-7,40 (m, 5H), 3,63-3,87 (m, 1H), 3,42-3,59 (m, 1H), 3,08-3,23 (m, 1H), 2,83-3,09 (m, 3H), 2,77 (m, 1H), 2,65 (s, 1H), 2,20-2,36 (m, 2H), 1,99 (m, 1h ), 1,49 (m, 1H), 1,02-1,21 (m, 3h ); h PlC quiral: Método Y26, 4,98 min y 5,55 min, solo se observan dos picos discretos.

El método se repitió dos veces de manera idéntica usando (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de etilo (mezcla ~70:30 de diastereómeros, 1100 g, y 1700 g) para proporcionar los compuestos del subtítulo (respectivamente 575 g y 838 g). Peso combinado de los tres lotes: 1568 g, 7,24 mol.

Etapa (ix)

(3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol. 0,5 (l)-Sal DBTA

Al producto de la etapa (viii) (mezcla ~70:30 de diastereómeros, 2,5 g, 11,56 mmol) se añadió agua 2,5% en THF (19,2 ml). Se añadió una solución de ácido (2R,3R)-2,3-b/s(benzoiloxi)succínico hidrato (1,28 g, 3,57 mmol, de Angene) a ta en agua al 2,5 % en THF (6,8 ml, 2,75 vol) y la solución se agitó a ta durante 2,5 h. El sólido precipitado se recogió por filtración a presión reducida y la torta de filtración se lavó con agua al 2,5 % en THF (2 x 10 ml) para producir un sólido blanco (3,0 g).

Una suspensión del sólido blanco (3,0 g) en agua al 2,5 % en THF (36 ml) se calentó a reflujo durante 1 h para obtener una solución transparente. A continuación, la mezcla se dejó enfriar a ta durante 1 h, a continuación, se mantuvo sin agitar durante 1 h a ta. El sólido cristalizado se recogió por filtración a presión reducida y la torta de filtración se lavó con agua al 2,5 % en THF (2 x 10 ml) y se secó a presión reducida a 40 °C para producir (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol.0,5 l-DBTA como un sólido blanco (2,4 g, 3,03 mmol, 26 % de rendimiento).

HPLC quiral: Método Y22, 5,35 min.

Etapa (ix): alternativa

Al producto de la etapa (viii) (mezcla ~70:30 de diastereómeros, 150,0 g, 693,38 mmol) se añadió agua al 2,5 % en THF (1,2 l). La solución se sembró con (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol.0,5 (l)-Sal DBTA del lote sintetizado previamente (700 mg). Se añadió una solución de ácido (2R,3R)-2,3-bis(benzoiloxi)succínico hidrato (79,50 g, 221,88 mmol, de Angene) en agua al 2,5 % en THF (412 ml, 2,75 vol) a temperatura ambiente y la disolución se agitó a ta durante 3 h. La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 3 h. El sólido precipitado se recogió por filtración a presión reducida y la torta de filtración se lavó con agua al 2,5 % en THF (2 x 1500 ml) para producir un sólido amarillo (178,0 g).

Primera cristalización: Una suspensión del sólido amarillo (178,0 g) en agua al 2,5 % en THF (2670 ml) se calentó a reflujo durante 1 h para obtener una solución transparente. A continuación, la mezcla se dejó enfriar a ta durante 1 h, a continuación se mantuvo tal como estaba, sin agitar, durante 1 h a temperatura ambiente. El sólido cristalizado se recogió por filtración a presión reducida y la torta de filtración se lavó con agua al 2,5 % en THF (2 x 1780 ml) y se secó a presión reducida a 40 °C para producir (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol.0,5 L-DBTA como un sólido blanco (113,0 g, 142,0 mmol).

Segunda cristalización: El sólido de la primera cristalización (113,0 g) se resuspendió en agua al 2,5% en THF (1695 ml) y se calentó a reflujo durante 1 h para formar una solución. A continuación, la mezcla se dejó enfriar hasta ta y se mantuvo tal como estaba, sin agitación, durante 1 h a temperatura ambiente. El sólido cristalizado se recogió por filtración a presión reducida y la torta de filtración se lavó con agua al 2,5 % en THF (2 x 1130 ml) y se secó a presión reducida a 40 °C para producir (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol.0,5 l-sal DBTA como un sólido blanco (103,0 g, 130,22 mmol, 18 % de rendimiento).

HPLC quiral: Método Y22, 5,31 min.

El método se repitió dos veces de manera idéntica usando (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol (mezcla ~70:30 de diastereómeros, 570 g y 838 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 478 g y 778 g). Peso combinado de los tres lotes: 1359 g, 1,72 mol.

Etapa (x)

(3aR,4R,6aR)-1-bendl-4-met/lhexah/drop/rrolo[3,4-b]p/rrol-5(1H)-carbox/lato de tere-butilo

Una mezcla agitada de (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo-[3,4-b]pirrol.0,5 L-sal DBTA (100,0 g, 126,42 mmol) en THF: agua (1800 ml, 1:1,25) se calentó a 50 °C. Se añadió NaHCO3 (31,86 g, 379,28 mmol) en porciones a 50 °C. La mezcla se enfrió a 25 °C, se añadió dicarbonato de di-tercbutilo (66,14 g, 303,42 mmol) y la mezcla bifásica se agitó vigorosamente a ta durante 16 h. La mezcla se vertió en agua (500 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 1 l). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución acuosa saturada de NaHCO3 (2 x 300 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (100-200 gel de sílice, EtOAc 20% en n-hexanos) para obtener (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de tere-butilo como un aceite viscoso gris (45,0 g, 142,20 mmol, 61 % de rendimiento).

LCMS: Método H3, 3,96 min, MS: ES+ 317,2; RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8 ppm: 7,23-7,36 (m, 5H), 3,79 (s, 1H), 3,62 (s, 1H), 3,42 (s, 2H), 3,09-3,14 (m, 1H), 3,02-3,05 (m, 1H), 2,81 (s, 1H), 2,34 (s, 1H), 2,18-2,25 (m, 1H), 1,96-2,04 (m, 1H), 1,46-1,55 (m, 1H), 1,40 (s, 9H), 1,08-1,10 (d,J =6,0 Hz, 3H); HPLC quiral: Método Y23, 4,31 min, 99,6 % e.e., 99,5:0,5 r.d.

El método se repitió dos veces de manera idéntica usando (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo-[3,4-b]pirrol.0,5 sal L-DBTA (200 g y 1000 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 134 g y 685 g). Peso combinado de los tres lotes: 864 g, 2,73 mol.

Etapa (xi)

(3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-earboxilato de tere-butilo

A una mezcla agitada de (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de tere-butilo (200,0 g, 632,01 mmol) en etanol (1,6 l) se añadió un Pd/C al 10% (50% de humedad, 100,0 g, 0,5% p/p), a continuación se purgó con gas H2 durante 4 h a ta. La mezcla se filtró a través de un lecho de Celite Hyflow®, se lavó con MeOH (2 x 500 ml) y se concentró a presión reducida para obtener (3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de tere--butilo como un aceite incoloro (134,0 g, 592,08 mmol, 96 % de rendimiento).

LCMS: Método H3, 2,22 min, MS: ES+ 227,2; RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 8 ppm: 3,75-3,82 (m, 1H), 3,48-3,49 (m, 2H), 3,04-3,08 (m, 1H), 2,85-2,91 (m, 1H), 2,32-2,38 (m, 1H), 2,22 (s, 2H), 2,00-2,05 (m, 1H), 1,64-1,70 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,15-1,19 (d,J =6,4 Hz, 3H); HPLC quiral: Método Y13, 4,55 min.

El método se repitió de manera idéntica usando (3aR,4R,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato detere-butilo (570 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (400 g). Peso combinado de dos lotes: 534 g, 2,36 mol.

Ejemplo 1

(+)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-earbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-earbonitriloy

Ejemplo 2

(-)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-earbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-earbonitrilo

(i) TBD, THF, 0 °C a ta; (ii) m-CPBA, 0 °C a ta; (iii) TMSCN, cloruro de dimetilcarbamoílo, MeCN, 0 °C a ta; (iv) TFA, DCM, 0 °C a ta; (v) K2CO3, BrCN, THF, 0 °C a ta; (vi) purificación quiral por HPLC preparativa.

Etapa (i)

rac-(3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de tercbutilo

A una solución agitada de 5-(piridin-4-il)oxazol-2-carboxilato de etilo (5,0 g, 22,93 mmol) y rac-(3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (4,15 g, 18,35 mmol) en THF (50 ml) se añadió TBD (4,78 g, 34,39 mmol) en porciones a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 1 h, después se vertió en agua (50 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea (gel de sílice, MeOH al 2% en DCM) para obtener rac-(3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (5,5 g, 13,82 mmol, 60 % de rendimiento). LCMS: Método C1, 1,14 min, MS: ES+ 399,4.

Etapa (ii)

rac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terc-Butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridina 1-óxido

A una solución agitada de rac-(3aR,4R,6aR)-4-metiM-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (5,5 g, 13,82 mmol) en DCM (60 ml) se añadió ácido m-cloroperbenzoico (4,77 g, 27,64 mmol) en porciones a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 24 h. La mezcla de reacción se vertió en una solución saturada de NaHCO3 (200 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 300 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución saturada de NaHCO3 (3 x 100 ml), tiosulfato sódico al 10 % (200 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida para obtener rac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terc-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridina 1-óxido (4,80 g, 11,58 mmol, 83 % de rendimiento).

LCMS: Método C1, 1,15 min, MS: ES+ 415,6.

Etapa (¡ii)

rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo

A una solución agitada de rac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terc-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridina 1-óxido (4,80 g, 11,58 mmol) en acetonitrilo (50 ml) se añadió cloruro de dimetilcarbamoílo (3,11g, 2,68 ml, 28,97 mmol) y TMSCN (3,45 g, 34,74 mmol) gota a gota a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 16 h, después se vertió en agua (200 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 300 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea (gel de sílice, MeOH 2 % en DCM) para producir rac-(3aR,4R,6aR)-1- (5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b] pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (5,1 g, 12,05 mmol, rendimiento cuantitativo).

LCMS: Método C1, 1,28 min, MS: ES+ [M+18] 441,4.

Etapa (iv)

rac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-Metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitrílo

A una solución agitada de rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopindin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (5,1 g, 2,16 mmol) en DCM (50 ml) se añadió TfA (10 ml, 2 vol) gota a gota a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 2 h, a continuación se concentraron a presión reducida para producir rac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitrilo sal TFA (5,0 g, 11,44 mmol, 98 % de rendimiento en dos etapas).

LCMS: Método C1, 0,91 min, MS: ES+ 324,3.

Etapa (v)

rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitriloA una solución agitada de rac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil) oxazol-5-il)picolinonitrilo sal TFA (0,14 g, 0,33 mmol) en THF (6 ml) se añadió K2CO3 (0,14 g, 1,00 mmol) a ta y se agitó durante 10 min. Se añadió bromuro de cianógeno (0,03 g, 0,27 mmol) a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 15 min, después se vertió en agua (10 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 10 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante trituración usando n-pentano (2 x 10 ml) para producir rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]-pirrol-5(1H)-carbonitrilo (0,08 g, 0,23 mmol, rendimiento del 88 %, en dos etapas).

LCMS: Método H, 2,49 min, MS: ES+ 349,1; RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 8 ppm: 8,89 (d,J= 4,8 Hz, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,36 (s, 0,7H), 8,34 (s, 0,3H), 8,05 (d,J= 5,2 Hz, 1H), 5,11-5,19 (m, 0,4H), 4,57-4,63 (m, 0,7H), 4,24-4,29 (m, 0,8H), 3,89-4,01 (m, 2H), 3,42-3,57 (m, 2,6H), 2,51-2,61 (m, 0,5H, ocultado), 1,85-2,05 (m, 2H), 1,30 (d,J =6,4 Hz, 3H), mezcla de rotámeros.

El compuesto del subtítulo (1,9 g, 5,45 mmol, 47 % de rendimiento) también se preparó análogamente a partir delrac-4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)-oxazol-5-il)picolinonitrilo sal TFA (5,0 g).

Etapa (vi)

Ejemplo1: (+)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitriloy

Ejemplo 2:(-)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo

Separación del racemato en los enantiómeros Ejemplo 1 y Ejemplo 2

Cada uno de los dos enantiómeros se aisló del compuesto racémico rac-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2- carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo (1,5 g) mediante separación cromatográfica HPLC usando un instrumento Shimadzu LC-20AP acoplado a un detector UV, con una columna Chiralpak IC 250 mm x 21,0 mm, 5 micrómetros. El caudal se fijó en 20,0 ml/min. La fase móvil fue (A) DEA 0,1 % en n-hexanos y (B) DEA 0,1 % en 70:30 IPA/MeCN. Los espectros UV se registraron a 295 nm lambda máx. La cromatografía se realizó durante un período de 70 minutos con fase móvil isocrática 40:60 B/A para proporcionar los dos enantiómeros descritos a continuación, con tiempos de elución respectivamente de 40,0 min y 55,6 min.

Fracción de elución más rápida (Ejemplo 2)

(-)-(3aR*,4R*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopirídin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitriloRendimiento (0,44 g, 1,26 mmol), sólido blanco.

LCMS: Método H, 2,56 min, MS: ES+ 349,2.

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 8,89 (d,J = 4,8 Hz,1H), 8,51 (s, 1H), 8,35-8,37 (m, 1H), 8,06-8,07 (m, 1H), 5.12- 5,17 (m, 0,4H), 4,59-4,62 (m, 0,7H), 4,25-4,29 (m, 0,7H), 3,91-4,02 (m, 2H), 3,42-3,59 (m, 2,7H), 2,57-2,61 (m, 0,5H, ocultado), 1,85-2,05 (m, 2H), 1,31 (d,J =6,4 Hz, 3H), mezcla de rotámeros.

HPLC quiral: Método Y11, 12,89 min; >99 % ee.

Punto de fusión = 142 °C a 146 °C.

[a]D25 = -208° (c = 0,05 g/100 cm3, MeOH).

Fracción de elución más lenta (Ejemplo 1)

(+)-(3aR*, 4R*, 6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitriloRendimiento (0,48 g, 1,38 mmol), sólido blanco.

LCMS: Método H, 2,56 min, MS: ES+ 349,2.

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 5 ppm: 8,89 (d,J= 4,4 Hz, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,36-8,38 (m, 1H), 8,06-8,07 (m, 1H), 5.12- 5,16 (m, 0,4H), 4,57-4,65 (m, 0,7H), 4,22-4,30 (m, 0,7H), 3,91-4,02 (m, 2H), 3,41-3,58 (m, 2,7H), 2,61-2,63 (m, 0,5H, ocultado), 1,82-2,07 (m, 2H), 1,31 (d,J =6,0 Hz, 3H), mezcla de rotámeros.

HPLC quiral: Método Y11, 15,09 min; >99 % ee.

[a]D25 = 208° (c = 0,05 g/100 cm3, MeOH).

Lote de material preparado mediante un método análogo: Punto de fusión = 144 °C a 146 °C.

Ejemplo 1 Síntesis alternativa.

(+)-(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo

(3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butiloA una mezcla agitada de 5-(piridin-4-il)oxazol-2-carboxilato de etilo (37,0 g, 169,72 mmol) y (3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (30,70 g, 135,64 mmol) en THF (370 ml) a 0 °C se añadió TBD (28,32 g, 203,47 mmol) en porciones. La mezcla se dejó calentar a ta y se agitó durante 2 h, después se vertió en agua (370 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 370 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea (gel de sílice, MeOH 5 % en DCM) para obtener (3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo como un sólido pálido (29,0 g, 72,78 mmol, 43 % de rendimiento).

LCMS: Método H3, 2,79 min, MS: ES+ 399,2; RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 5 ppm: 8,72-8,82 (m, 2H), 8,20-8,24 (m, 1H), 7,76-7,77 (m, 2H), 5,10-5,11 (m, 1H), 4,56 (s, 1H), 4,03 (s, 1H), 3,57-3,85 (m, 4H), 2,09-2,14 (m, 1H), 1,73-1,86 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,21-1,10 (m, 3H); HPLC quiral: Método Y24, 5,35 min.

El método se repitió dos veces de manera idéntica usando (3aS,4R,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (165 g y 457 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 255 g y 620 g). Peso combinado de los tres lotes: 904 g, 2,27 mol.

Etapa (ii)

4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terc-Butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)1-óxido de piridina

A una mezcla agitada de (3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-but¡lo (29,0 g, 72,82 mmol) en DCM (435 ml) se añad¡ó ác¡do m-cloroperbenzo¡co (37,69 g, 218,46 mmol) en porciones a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 20 h, a continuación se vertió en una solución saturada de NaOH (725 ml, 25 vol) y se extrajo con DCM (2 x 290 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con tiosulfato sódico al 10 % (290 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para obtener 4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terc-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridina 1-óxido como un sólido amarillo (28,30 g, 68,32 mmol, 94 % de rendimiento).

LCMS: Método H3, 2,41 min, MS: ES+ 259,0 (M-56); RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 8 ppm: 8,25-8,26 (m, 2H), 8,08 8,11 (m, 1H), 7,78-7,79 (m, 2H), 5,08-5,09 (m, 0,4 H), 4,54 (m, 0,6 H), 4,02-4,09 (m, 1H), 3,66-3,82 (m, 4H), 2,07-2,12 (m, 2H), 1,64-1,84 (m, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,15-1,19 (m, 3H); HPLC quiral: Método Y25, 6,13 min.

El método se repitió dos veces de manera idéntica usando (3aR,4R,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (255 g y 620 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 235 g y 550 g). Peso combinado de los tres lotes: 813,3 g, 1,96 mol.

Etapa (iii)

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo-[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo

A una mezcla agitada de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terc-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]-pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridina 1-óxido (28,30 g, 68,32 mmol) en acetonitrilo (1132 ml) se añadió cloruro de dimetilcarbamoílo (22,04 g, 18,87 ml, 204,96 mmol) y TMSCN (20,33 g, 204,96 mmol) gota a gota a 0 °C. La mezcla se calentó a 80 °C durante 2 h, se dejó enfriar hasta ta y a continuación se vertió en agua (280 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 280 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida para producir (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo-[3,4-b]-pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo como un aceite marrón (28,0 g, 66,16 mmol, 97 % de rendimiento).

LCMS: Método H3, 3,06 min, MS: ES+ 368,0 (M-56); RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 8 ppm: 8,87-8,88 (m, 1H), 8,48 (s, 1H), 8,34-8,36 (m, 1H), 8,03-8,05 (m, 1H), 4,55 (s, 1H), 4,02 (s, 1H), 3,55-3,84 (m, 3H), 2,74 (s, 2H), 2,08-2,13 (m, 1H), 1,75-1,83 (m, 1H), 1,38 (s, 9H), 1,16-1,20 (m, 3H); HPLC quiral: Método Y4, 4,67 min.

El método se repitió dos veces de manera idéntica usando 4-(2-((3aR,4R,6aR)-5-(terc-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)1-óxido de piridina (235 g y 550 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (respectivamente 180 g y 470 g). Peso combinado de los tres lotes: 678 g, 1,60 mol.

Etapa (iv)

4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-Metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitrilosalp-TSA

A una mezcla agitada de (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo [3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (28,0 g, 66,16 mmol) en acetonitrilo (560 ml) se añadió p-TSA (66,07 g, 383,72 mmol) en porciones a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 5 h, a continuación se concentró a presión reducida para obtener 4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitrilo sal p-TSA como un aceite amarillo (115,0 g, rendimiento cuantitativo).

LCMS: Método H3, 1,97 min, MS: ES+ 324,0; HPLC quiral: Método Y20, 5,17 min.

El método se repitió de manera idéntica usando (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (650 g) para proporcionar el compuesto del subtítulo (1000 g). Peso combinado de dos lotes: 1115 g, 3,44 mol.

Etapa (v)

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo

A una solución agitada de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)-oxazol-5-il)picolinonitrilo sal p-TSA (180,0 g, 363,22 mmol) en THF: agua (5,4 l, 2:1) se añadió K2CO3 (145,26 g, 1052,63 mmol) a ta y se agitó durante 5 min. Se añadió bromuro de cianógeno (26,0 g, 245,61 mmol) a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 1 h, a continuación, la mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se vertió en agua helada (2 l) para formar un precipitado. El sólido se recogió por filtración a presión reducida. El sólido se suspendió de nuevo en agua (2 l) y se agitó durante 2 h a ta, a continuación se filtró a presión reducida. El material sólido se lavó con agua fría (1 l), seguido de n-hexanos (500 ml), éter dietílico (100 ml) e IPA (100 ml) para obtener (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo, (40,0 g, 114,83 mmol, 32% de rendimiento).

LCMS: Método H3, 2,50 min, MS: ES+ 349,0; RMN de 1H (400 MHz, DMSO-da) 8 ppm: 8,89 (d,J =5,2 Hz, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,35-8,37 (m, 1H), 8,05-8,06 (m, 1H), 5,12-5,13 (m, 0,4H), 4,57-4,61 (m, 0,6H), 4,23-4,28 (m, 0,7H), 3,89-4,00 (m, 2H), 3,41-3,58 (m, 2,4H), 2,54-2,67 (m, 1H, ocultado), 1,89-2,06 (m, 2H), 1,27-1,30 (m, 3H), mezcla de rotámeros; HPLC: Método X2, 19,78 min, 99,96%; HPLC quiral: Método Y15, 15,29 min; > 99 % e.e.; Punto de fusión = 147 °C a 149 °C; [a]D25 = 202° (c = 0,05 g/100cm3, MeOH).

Etapa (v) (síntesis alternativa)

(3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrílo

A una solución agitada de 4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)-oxazol-5-il)picolinonitrilo sal p-TSA (115,0 g, 232,06 mmol) en THF: agua (804 ml, 9:5) se añadió K2CO3 (98,22 g, 711,76 mmol) a ta y se agitó durante 10 min. Se añadió bromuro de cianógeno (18,86 g, 177,94 mmol) a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 2 h, después se vertió en agua (1150 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 1150 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida. El residuo se suspendió en IPA (575 ml) y se calentó a 80 °C durante 2 h para formar una solución transparente. La mezcla se dejó enfriar lentamente hasta ta para formar un sólido cristalino, que se recogió por filtración a presión reducida, se lavó con IPA frío (115 ml) y se secó a presión reducida para obtener (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]-pirrol-5(1H)-carbonitrilo (15,0 g, 43,08 mmol, 19 % de rendimiento).

El método se repitió de manera idéntica usando 4-(2-((3aR,4R,6aR)-4-metil-octahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)-oxazol-5-il)picolinonitrilo sal p-TSA (1000 g) para proporcionar el compuesto del título (288 g). Una solución de 288 g y 15 g de (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]-pirrol-5(1H)-carbonitrilo en THF (909 ml, 3 vol) se agitó a ta durante 2 h para formar una solución transparente. Los disolventes se eliminaron a presión reducida para producir un sólido de color blanco, que se lavó de nuevo con pentano (300 ml, 1 vol) y se secó a presión reducida durante 4 h a menos de 45 °C para obtener (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]-pirrol-5(1H)-carbonitrilo (303,0 g).

LCMS: Método H3, 2,52 min, MS: ES+ 349,0; RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 8 ppm: 8,87 (d,J= 3,6 Hz, 1H), 8,48 (s, 1H), 8,30-8,38 (m, 1H), 8,04-8,05 (m, 1H), 5,12-5,13 (m, 0,4H), 4,59-4,60 (m, 0,6H), 4,23-4,27 (m, 0,6H), 3,91-4,02 (m, 2H), 3,41-3,56 (m, 2,4H), 2,54-2,61 (m, 1H, ocultado), 1,84-2,04 (m, 2H), 1,30 (d,J =6,4 Hz, 3H), mezcla de rotámeros; HPLC quiral: Método Y15, 15,11 min; HPLC: Método E, 27,87 min; > 99% e.e., 99,5:0,5 r.d.; Punto de fusión = 161 °C a 162 °C; [a]D25 = 204° (c = 0,05 g/100cm3, MeOH).

Ejemplo 3 y Ejemplo 4

(+)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo, y

(-)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo

Etapa (i)

rac-(3aR,4S,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo(isómero minoritario) yrac-(3aR,4R,aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo(isómero mayoritario) A una solución agitada de rac-(3aR,6aR)-1-bencil-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol sal HCl ((Etapa (v) producto hacia el Intermedio B, 68,0 g, 269,31 mmol) en DCM (700 ml) se añadió trietilamina (136,0 g, 187,3 ml, 1346,55 mmol), 4-dimetilpiridina (1,64 g, 13,46 mmol) y dicarbonato de di-terc-butilo (70,51 g, 323,17 mmol) a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 6 h, a continuación se vertió en agua (1000 ml) y se extrajo con DCM (2 x 1000 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (gel de sílice, tamaño n.° 100-200, EtOAc 7 a 9 % en n-hexanos) para obtener los compuestos del subtítulo en dos fracciones separadas, Fracción 1 (isómero minoritario, 0,8 g, 2,53 mmol, 0,94 % de rendimiento) y Fracción 2 (isómero mayoritario, 38,0 g, 120,25 mmol, 45 % de rendimiento.

Fracción 1 LCMS: Método H1, 4,19 min, MS: ES+ 317,2. Fracción 2 LCMS: Método H1, 3,87 min, MS: ES+ 317,0. El isómero minoritario Fracción 1 se llevó a la Etapa (ii).

Etapa (ii)

rac-(3aS,4S,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo

A una solución agitada de rac-(3aR,4S,6aR)-1-bencil-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]-pirrol-5(1H)-carboxilato de tercbutilo (Fracción 1, isómero secundario, 0,8 g, 2,53 mmol) en etanol (10 ml) se añadió Pd/C al 10 % (50 % de humedad, 0,8 g) y se purgó con gas hidrógeno durante 16 h a ta. La mezcla se filtró a través de Celite®, se lavó con etanol (50 ml) y se concentró a presión reducida para obtener rac-(3aS,4S,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (0,42 g, 1,85 mmol, 73 % de rendimiento).

LCMS: Método H1, 2,25 min, MS: ES+ 227,2.

Etapa (¡ii)

rac-(3aR,4S,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo

Una solución agitada de 5-(piridin-4-il)oxazol-2-carboxilato de etilo (0,49 g, 2,25 mmol) y rac-(3aS,4S,6aR)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (0,41 g, 1,79 mmol) en tolueno (7 ml) se calentó a 40 °C durante 1o min para disolver ambos materiales de partida, a continuación se enfrió a 0 °C, seguido de la adición de una solución de TBD (0,15 g, 1,12 mmol) en tolueno (2 ml) gota a gota a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 3 h, después se vertió en agua (50 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea (gel de sílice, EtOAc 80 a 90 % en n-hexanos) para obtenerrac-(3aR,4S,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (0,43 g, 1,09 mmol, 48 % de rendimiento).

LCMS: Método H1, 2,88 min, MS: ES+ 399,2.

Etapa (iv)

rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-5-(terc-Butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridina 1-óxido

A una solución agitada de rac-(3aR, 4S,6aR)-4-metil-1-(5-(piridin-4-il)oxazol-2-carbonil)hexahidropirrolo[3,4-b] pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (0,43 g, 1,08 mmol) en d Cm (7 ml) se añadió ácido m-cloroperbenzoico (0,37 g, 2,16 mmol) en porciones a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 16 h. La mezcla se vertió en agua (100 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución saturada de NaHCO3 (2 x 100 ml), tiosulfato sódico al 10 % (2 x 100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para obtener rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-5-(terc-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridina 1-óxido (0,39 g, 0,95 mmol, 87 % de rendimiento).

LCMS: Método H1, 2,50 min, MS: ES+ [M-56] 359,0.

Etapa (v)

rac-(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo

A una solución agitada de rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-5-(terc-butoxicarbonil)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)piridina 1-óxido (0,39 g, 0,94 mmol) en MeCN (7 ml) se añadió cloruro de dimetilcarbamoílo (0,30 g, 0,26 ml, 2,83 mmol) y trimetilsililcianuro (0,28 g, 0,36 ml, 2,83 mmol) gota a gota a ta. La mezcla se calentó a 80 °C durante 2 h, a continuación se vertió en una solución de Na2CO3 al 10 % en agua (50 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea (gel de sílice, EtOAc 80-90 % en nhexanos) para obtener rac-(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]-pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (0,38 g, 0,89 mmol, rendimiento del 95 %).

LCMS: Método H1, 3,15 min, MS: ES+ [M-56] 368,0.

Etapa (vi)

rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-4-Metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitrilo

A una solución agitada de rac-(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carboxilato de terc-butilo (0,38 g, 0,89 mmol) en DCM (10 ml) se añadió ácido p-toluenosulfónico monohidratado (0,84 g, 4,45 mmol) en porciones a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 6 h, a continuación se concentró a presión reducida para obtener rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitrilo sal p-TSA (0,52 g, rendimiento cuantitativo).

LCMS: Método H1, 1,93 min, MS: ES+ 324,0.

Etapa (vii)

rac-(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitriloA una solución agitada de rac-4-(2-((3aR,4S,6aR)-4-metiloctahidropirrolo[3,4-b]pirrol-1-carbonil)oxazol-5-il)picolinonitrilo sal p-TSA (0,52 g, 1,01 mmol) en THF (10 ml) y agua (5 ml) se añadió K2CO3 (0,70 g, 5,05 mmol) a ta y se agitó durante 5 min. Se añadió bromuro de cianógeno (0,13 g, 1,21 mmol) a 0 °C. La mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 1 h, después se vertió en agua (50 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea (gel de sílice, EtOAc 90 a 95%en n-hexanos) para producir rac-(3aR,4S,6aR)-1- (5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo (0,18 g, 0,52 mmol, 57 % de rendimiento, en dos etapas).

LCMS: Método H1, 2,48 min, MS: ES+ 349,0; RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 6 ppm 8,88 (d,J= 5,2 Hz, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,35 (d,J =3,6 Hz, 1H), 8,05 (dd,J= 5,2, 1,2 Hz, 1H), 5,06-5,10 (m, 0,6H), 4,56-4,60 (m, 0,7H), 4,16-4,21 (m, 0,7H), 3,44-3,95 (m, 4H), 2,81-2,93 (m, 1H), 1,77-1,99 (m, 2H), 1,25 (d,J =6,4 Hz, 3H), mezcla de rotámeros; HPLC: Método E, 28,58 min; 98,8:1,2 r.d.

Etapa (viii)

Ejemplo 3:(+)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo,y

Ejemplo 4:(-)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo

Cada uno de los dos enantiómeros se aisló del compuesto racémico rac-(3aR,4S,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2- carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo (0,10 g, 0,29 mmol) mediante separación cromatográfica utilizando un instrumento Shimadzu LC-20AP acoplado a un detector UV, con una columna Chiralpak IG 250 mm x 21,0 mm, 5 micrómetros. El caudal se fijó en 20,0 ml/min. La fase móvil fue (A) DEA 0,1 % en MeOH y (B) DEA 0,1 % en MeCN. Los espectros UV se registraron a 292 nm lambda máx. La cromatografía se realizó durante 35 minutos con fase móvil isocrática 50:50 B/A para obtener los dos enantiómeros descritos a continuación, con tiempos de elución respectivamente de 8,03 min y 12,95 min.

Fracción de elución más rápida (Ejemplo 3)

(+)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitriloRendimiento (23 mg, 0,07 mmol). LCMS: Método H1, 2,49 min, MS: ES+ 349,0; RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 6 ppm 8,88 (d,J= 4,8 Hz, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,35 (d,J= 3,6 Hz, 1H), 8,05 (dd,J= 5,2, 1,2 Hz, 1H), 5,06-5,11 (m, 0,6H), 4.56- 4,61 (m, 0,7H), 4,16-4,22 (m, 0,7H), 3,43-3,95 (m, 4H), 2,81-2,95 (m, 1H), 1,77-1,98 (m, 2H), 1,25 (d,J= 6,4 Hz, 3H), mezcla de rotámeros; HPLC quiral: Método Y17, 8,11 min.

Fracción de elución más lenta (Ejemplo 4)

(-)-(3aR*,4S*,6aR*)-1-(5-(2-Cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitriloRendimiento (19 mg, 0,05 mmol). LCMS: Método H1, 2,49 min, MS: ES+ 349,0; RMN de 1H (400 MHz, DMSO-de) 6 ppm 8,88 (d,J =4,8 Hz, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,35 (d,J =3,2 Hz, 1H), 8,05 (d,J= 4,8, 1,2 Hz, 1H), 5,06-5,11 (m, 0,6H), 4.56- 4,60 (m, 0,7H), 4,16-4,21 (m, 0,7H), 3,43-3,95 (m, 4H), 2,81-2,95 (m, 1H), 1,77-1,99 (m, 2H), 1,25 (d,J= 6,4 Hz, 3H), mezcla de rotámeros; HPLC quiral: Método Y17, 13,17 min.

Ejemplo 3: Sólido de color blanco; HPLC quiral: Método Y17, 8,11 min; > 99 % e.e.; 99,5:0,5 r.d.; punto de fusión = 206 °C a 207 °C; [a]o25 = 166° (c = 0,05 g/100cm3, MeOH).

Ejemplo 4: Sólido de color blanco; HPLC quiral: Método Y17, 13,17 min; > 99 % e.e.; 99,5:0,5 r.d.; punto de fusión = 206 °C a 207 °C; [a]o25 = -156° (c = 0,05 g/100cm3, MeOH).

HPLC quiral de los Ejemplos 1 a 4.

Los ejemplos 1 a 4 se analizaron mediante métodos de HPLC y HPLC quiral. No se observó separación de base para estos cuatro isómeros en un único sistema, de modo que la HPLC quiral (método Y28) se utilizó para determinar la pureza enantiomérica, mientras que la HPLC aquiral (método E) se utilizó para determinar la proporción diastereomérica.

Actividad biológica de los compuestos de la invención

Abreviaturas:

TAMRA carboxitetrametilrodamina

PCR reacción en cadena de la polimerasa

PBS solución salina tamponada con fosfato

EDTA ácido etilendiaminotetraacético

Tris 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol

NP-40 Nonidet P-40, octilfenoxipolietoxietanol

SAB seroalbúmina bovina

SNP sistema nervioso periférico

BH3 Dominio de homología 3 de Bcl-2

PTEN homólogo de fosfatasa y tensina

SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico

DMSO Dimetilsulfóxido

YFP proteína fluorescente amarilla

VME Vinil metil éster

HA hemaglutinina

Ahx ácido aminohexanoico

Ensayo bioquímico de la Ckn de USP30

Se prepararon placas de dilución a 21 veces la concentración final (2100 j M para una concentración final de 100 j M) en DMSO al 50 % en una placa de fondo en V de polipropileno de 96 pocillos (Greiner n.° 651201). Una serie típica de dilución en 8 puntos sería 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03<j>M final. Las reacciones se realizaron por duplicado en placas negras de 384 pocillos (pequeño volumen, Greiner 784076) en un volumen final de reacción de 21 jl. Se añadió a la placa 1 j l de DMSO al 50 % o del compuesto diluido. Se diluyó USP30 (Boston Biochem n.° E582) en tampón de reacción (Tris 40 mM, pH 7,5, Tween 20 0,005 %, SAB 0,5 mg/ml, beta-mercaptoetanol 5 mM para alcanzar una concentración final de ensayo de 4 nM, y se añadieron 10 j l de USP30 diluida al compuesto. La enzima y el compuesto se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 50 nM de péptido marcado con TAMRA unido a ubiquitina mediante un enlace isopéptido como sustrato de polarización de fluorescencia. Las reacciones se leyeron inmediatamente después de añadir el sustrato y tras una incubación de 2 horas a temperatura ambiente. Las lecturas se realizaron en un Pherastar Plus (BMG Labtech). A de excitación 540 nm; A de emisión = 590 nm.

Actividad de compuestos ilustrativos en el ensayo bioquímico de la CI50 de USP30:

Ejemplos de referencia

Actividad de compuestos ilustrativos en el ensayo bioquímico de la CI50 de USP30:

Farmacología inespecífica

El Ejemplo 1 se sometió a un perfil farmacológico en el panel Eurofins CEREP SafetyScreen44. A una concentración final de 10 j M, se observó una inhibición de la unión o de la actividad enzimática inferior al 50 % frente a todas las dianas del panel. El Ejemplo 1 tiene una baja probabilidad de interacciones inespecíficas debido a la baja afinidad por las dianas en este ensayo.

Farmacología de seguridad

Se evaluaron los efectos del Ejemplo 1 sobre el canal de potasio hERG, en células CHO expresadas de forma estable a concentraciones entre 0,01 y 30 j M. El ejemplo 1 produjo un valor máximo de inhibición del 27 % de la amplitud de la corriente hERG a 30 j M, lo que indica poca propensión a afectar al intervalo QT.

Toxicología genética

El Ejemplo 1 se evaluó en el ensayo de mutación inversa bacteriana (Ames) y en el ensayo de micronúcleosin vitro.Todas las pruebasin vitrose realizaron con y sin activación metabólica exógena utilizando concentraciones hasta las limitadas por citotoxicidad o insolubilidad. El Ejemplo 1 no indujo mutaciones cuando se probó hasta 5000 jg/placa con y sin activación metabólica en el ensayo de mutación inversa en cepas TA98 de Salmonella typhimurium, TA100, TA1535 y TA97a y la cepa WP2 uvrA pKM101 de Escherichia Coli.

La inducción de daños cromosómicos se evaluó mediante el ensayo de micronúcleosin vitroen células TK6. El Ejemplo 1 fue negativo para la inducción de micronúcleos cuando se incubó durante 3 horas en presencia de activación metabólica exógena seguida de 27 horas de recuperación, y también cuando se incubó durante 27 horas en ausencia de activación metabólica exógena seguida de 27 horas de recuperación.

Ensayo de ubiquitilación de TOM20

Las líneas celulares humanas pueden ser estimuladas con agentes despolarizantes mitocondriales (ionóforos (por ejemplo, CCCP, valinomicina), inhibidores del complejo mitocondrial (oligomicina, antimicina A)) para inducir la ubiquitilación de TOM20, que a continuación se promueve aún más en presencia de inhibidores de USP30. La ubiquitilación de TOM20 se evalúa posteriormente mediante transferencia Western de los lisados celulares, con la detección de posibles aductos de ubiquitilación de TOM20 debido a un aumento de peso de la molécula de 8 kDa por cada molécula de ubiquitina añadida, dando lugar a la formación de una banda inmunorreactiva de TOM20. Los niveles de subiquitilación de TOM20 pueden cuantificarse mediante densitometría de quimioluminiscencia de bandas inmunorreactivas escalonadas.

Ensayo de unión a la diana celular endógena USP30

Las células HeLa que sobreexpresan de forma estable YFP-Parkina se sembraron en placas de 6 pocillos. Una vez adheridas, las células se trataron con concentraciones adecuadas de los compuestos de prueba o con el vehículo de control durante 1 hora a 37 °C, CO2 al 5 %. Los lisados de células enteras se prepararon raspando las células en PBS frío, centrifugación y lisis en tampón de lisis (Tris-base 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, NP-401 %/Igepal CA-630, MgCh 2 mM, glicerol 10%, beta-mercaptoetanol 5 mM, cOmplete™ minicomprimidos sin EDTA (Roche), comprimidos PhosStop (Roche)) durante 10 minutos. El equivalente a 20 jg de proteína del lisado celular limpio se incubó con una conc. final de 2,5<j>M de sonda de HA-Ahx-Ahx-Ub-VME a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de tampón de carga de muestras SDS 5x y las proteínas se separaron mediante SDS PAGE y transferencia Western. La USP30 se detectó utilizando un anticuerpo anti-USP30 de oveja S746D (MRC PPU Reagents and Services) y una IgG secundaria de conejo anti-oveja (H+L) conjugado con peroxidasa de rábano picante (Thermo n.° 31480) y se visualizó utilizando el reactivo ECL (Ge n.° RPN2109) en un generador de imágenes GE lAs 4000. La unión a la diana se midió mediante la cuantificación de las bandas correspondientes a USP30 y USP30 unidas a la sonda Ub-VME y la expresión de esta proporción se comparó con el control tratado con vehículo.

Citotoxicidadin vitro(Tox Cel): Medida en células de carcinoma colorrectal humano HCT116 utilizando alamarBlue™ como criterio de valoración del ensayo. La citotoxicidad del compuesto se midió durante un período de 96 horas de exposición continua al compuesto.

Estudios adicionales

log P: coeficiente de partición; medición de la lipofilia.

log D: coeficiente de distribución; medición de la lipofilia.

TPSA: superficie polar topológica.

Solubilidad turbidimétrica: Solución del compuesto de prueba preparada en DMSO diluida en tampón acuoso.

La turbidimetría se utiliza como criterio de valoración midiendo la absorbancia a 620 nm.

FaSSIF: fluido intestinal simulado en ayunas medido a pH 6,5.

Acl Hep ratón: aclaramiento de hepatocitosin v itroen células de ratón.

Acl Hep humano: aclaramiento de hepatocitosin v itroen células humanas.

Plasma fu,p: La fracción libre de un compuesto en un preparado plasmático determinada mediante diálisis de equilibrioin v itro .Se entiende que solo el compuesto no unido (libre) es capaz de interactuar con la diana. Cerebro fu,br: La fracción libre de un compuesto en una preparación de homogeneizado cerebral determinada mediante diálisis de equilibrioin v itro .Se entiende que solo el compuesto no unido (libre) es capaz de interactuar con la diana.

Clu: aclaramientoin v itro .Clu, tal como se define aquí, es el aclaramiento escalonado, calculado a su vez a partir del aclaramiento intrínseco. El aclaramiento intrínseco es el aclaramiento previsto debido a las reacciones metabólicas hepáticas, determinado a partir de la incubación de un compuesto en una preparación de hepatocitos. Cuanto más bajo sea el valor en ml/min/kg, más estable será el compuesto.

Cl aclaramientoin v ivo :Medición farmacocinética del volumen de plasma (o de cualquier matriz) desde el que se elimina completamente una sustancia por unidad de tiempo. Cuanto más bajo sea el valor en ml/min/kg, más estable será el compuesto.

F oral: Biodisponibilidad oral.

Ensayo de flujo MDR1-MDCK (monocapa de células renales caninas Madin-Darby)(in v itro ).

Flujo de WT-MDCK (tipo silvestre)in v itro .

Kpuu es la relación entre el fármaco no unido en el cerebro y el fármaco no unido en el plasma y puede ser indicativo del potencial para tratar indicaciones periféricas y/o del SNC.

El Ejemplo 1 posee propiedades beneficiosas que demuestran una potencial superioridad sobre otros compuestos. Por ejemplo, el aclaramiento plasmático IV observado de 19 ml/min/kg, medido en el ratón, es bajo, demostrando una valiosa estabilidad plasmática, y el compuesto tiene una biodisponibilidad oral excepcional del 87 %.

El ejemplo 1 muestra una elevada distribución en el SNCin v ivotras una dosis oral, determinado mediante muestreo por microdiálisis de regiones cerebrales tras una dosis de 30 mg/kg en ratones y ratas. Se observaron altas concentraciones de no unión del Ejemplo 1 durante varias horas tras la dosis, lo que condujo a una duración estimada adecuada de la cobertura diana en el SNC. Además, El ejemplo 1, cuando se administra por vía oral a perros a 30 mg/kg, presentó una alta distribución en el líquido cefalorraquídeo (LCR).

Datos comparativos

Los ejemplos de referencia A, B, C, D y E son conocidos inhibidores de DUB que se han identificado como activos como inhibidores de USP30 y comparten cierta similitud estructural con los compuestos de la presente invención, que poseen la característica estructural de la cianamida. Los ejemplos de referencia D y E se divulgan en el documento WO 2016/046530 por tener actividad inhibidora de UCHL1.

El Ejemplo 1 muestra una mejora significativa de la estabilidad metabólica de los hepatocitos (medida en hepatocitos de ratón) en comparación con los Ejemplos de referencia A, B y C. El ejemplo 1 muestra una mejora significativa de la estabilidad plasmática (al menos de 2 a 8 veces, medida en plasma de ratón) en comparación con los Ejemplos de referencia A, B y C.

Potencia para USP30

El Ejemplo 1 de la presente invención es significativamente más potente frente a USP30 que los Ejemplos de referencia A, B, C, D y E, según las mediciones del ensayo bioquímico. El Ejemplo 1 es más de 6 veces más potente que los Ejemplos de referencia B y C, más de 24 veces más potentes que los Ejemplos de referencia A y D, y 400 veces más potentes que el Ejemplo de referencia E.

Selectividad por USP30 respecto a otras DUB

Los datos proporcionados demuestran que el Ejemplo 1 es significativamente más selectivo para USP30 que para siete DUB (USP2, USP6, USP10, USP16 , USP21, USP25 y USP28) en comparación con los Ejemplos de referencia A, Banda C. El ejemplo 1 es más de 2260 veces más potente contra USP30 que contra cada una de las siete DUB. Se trata de una ventaja selectiva significativa con respecto a los Ejemplos de referencia A y B, que son entre 3,3 veces y 7,7 veces más potentes, respectivamente. El ejemplo de referencia C es más selectivo que A y B, pero 56 veces más potente contra USP30 que contra otra DUB, sigue siendo significativamente inferior al ejemplo 1.

Selectividad para USP30 respecto a UCHL1

Los datos proporcionados demuestran que el Ejemplo 1 es significativamente más selectivo para USP30 que para UCHL1 en comparación con los Ejemplos de referencia D y E. El Ejemplo 1 es más de 27000 veces más potente contra USP30 que contra UCHL1, mientras que los Ejemplos de referencia D y E son sólo 0,8 y 1,5 veces más potentes, respectivamente.

Selectividad para USP30 respecto a las catepsinas B, K, L, S y V

Los datos proporcionados demuestran que el Ejemplo 1 es significativamente más selectivo para USP30 que para las catepsinas (B, K, L, S y V) en comparación con los Ejemplos de referencia A, B y C. El ejemplo 1 es más de 3800 veces más potente contra USP30 que contra cada una de las catepsinas. Se trata de una ventaja de selectividad significativa con respecto a los Ejemplos de referencia A, B y C.

Concretamente, el ejemplo 1 es más de 18000 veces más potente contra la USP30 que contra la catepsina B, en comparación con los Ejemplos de referencia B y C, que son solo 20 y 16,7 veces más potentes, respectivamente. El ejemplo 1 es más de 9900 veces más potente contra USP30 que contra la catepsina K, en comparación con los Ejemplos de referencia A y C, que son solo 2 y 6,1 veces más potentes, respectivamente.

Las ventajas identificadas anteriormente del Ejemplo 1 de la invención sobre los ejemplos de referencia de la técnica anterior son significativas e inesperadas. Por separado, y en particular en combinación, esta superioridad hace que el compuesto sea particularmente adecuado para usar en el tratamiento o prevención de enfermedades relacionadas con la actividad de USP30.

Modelos preclínicosin vivo

Puede probarse la eficacia de los compuestos de la invención en modelos representativos de enfermedadesin vivo,utilizando procedimientos de estudio estándar de la bibliografía publicada, incluyendo, por ejemplo:

(a) Modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina, que es un destacado modelo preclínicoin vivode fibrosis pulmonar idiopática. [Kobayashi et al, 2016, J Immunol, 197(2):504-516].

(b) Modelo de NAFLD inducido por dieta y homeostasis de la glucosa. [Nishida et al, 2013, Lab Invest; Feb;93(2):230-41].

(c) Modelo MPTP de la enfermedad de Parkinson, que es un paradigma comúnmente utilizado para estudiar la neurodegeneración en el sistema dopaminérgico del cerebro, desencadenada por una disfunción mitocondrial inducida químicamente. [Karuppagouner et al, 2014, Sci Rep. 2 de mayo de 2014;4:4874].

(d) Modelo de síndrome de Leigh Ndufs4KO. [Kruse et al, 2008, Cell Metab. Apr;7(4):312-20].

(e) Modelo de roedor envejecido: efectos en el hipocampo, función cognitiva y motora. [Kobilo et al, 2014, Learn Mem. Jan 17;21(2):119-26; Creed et al, 2019, Neuroscience. Jun 15;409:169-179; Van Skike et al, 2020, Aging Cell. 19; e13057].

Los roedores envejecidos desarrollan neurodegeneración del hipocampo de forma natural, sustentando los cambios bioquímicos y funcionales de la capacidad cognitiva. El eje glutamina/glutamato puede tomarse como sustituto de la salud del hipocampo dada la estrecha relación entre la utilización de glutamina en las neuronas como parte de la producción de energía mitocondrial.

(f) El modelo de enfermedad renal obstructiva ureteral unilateral (UUO). [Chevalier et al, 2009, Kidney Int 75(11): 1145 1152].

La UUO provoca una lesión renal caracterizada por la lesión de las células tubulares, inflamación intersticial y fibrosis. Sirve como modelo de lesión renal aguda (LRA) posrenal irreversible. La UUO experimental ha ilustrado los mecanismos moleculares de la apoptosis, la inflamación y la fibrosis, todos ellos procesos clave en la lesión renal, independientemente de la lesión principal. En consecuencia, el modelo de UUO proporciona a los investigadores información más allá de la obstrucción (Chevalier et al, 2009, Kidney Int 75(11): 1145-1152).

El Ejemplo 1 se evaluó en el modelo UUO para determinar la capacidad del compuesto para atenuar la fibrosis tubulointersticial progresiva y la enfermedad renal crónica (ERC).

En el día 1 del estudio, la administración de los ratones C57BL/6 adultos por vía oral fue de acuerdo con uno de los siguientes regímenes de dosificación; Vehículo, 1,5 o 5 mg/kg Ejemplo 1 (p.o.) dos veces al día. Dos horas después de la dosis del día 1, los ratones del estudio fueron sometidos a cirugía para ligar el uréter izquierdo en dos puntos. El éxito de la cirugía UUO se confirmó posteriormente por la observación de la dilatación de la pelvis renal debido a la hidronefrosis. La administración de los animales fue de acuerdo con el régimen prescrito durante 10 días, momento en el que se recogieron los riñones o se realizó una evaluación histopatológica y una evaluación de proteínas/ARN. Se realizó una tinción con rojo Picrosirius para evaluar el grado de depositación de colágeno y se empleó la IHC para evaluar la expresión relativa de a-actina de músculo liso (a-SMA).

Los resultados demostraron que tanto 1,5 como 5 mg/kg de Ejemplo 1 (p.o.) administrados dos veces al día, redujeron estadísticamente la depositación de colágeno, evidenciada por la reducción de la tinción con rojo Picrosirius en los riñones ligados. La evaluación de la tinción de a-SMA, reveló que la administración oral de 1,5 mg/kg del Ejemplo 1 dos veces al día produjo una reducción estadística de los niveles de a-SMA en los riñones lesionados por UUO en comparación con los controles tratados con vehículo.

(g) La LRA puede ser inducida por pinzamiento del pedículo renal bilateral que produce lesión por isquemia reperfusión (IRI) con pérdida grave de la función renal daño tubular e inflamación [Luet al.2012. J Nephrol. 25 (5): 738-45].

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (I):

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la fórmula (IA):

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. 3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la fórmula (IB):

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. 4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es: (3aR,4R,6aR)-1-(5-(2-cianopiridin-4-il)oxazol-2-carbonil)-4-metilhexahidropirrolo[3,4-b]pirrol-5(1H)-carbonitrilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
5. 5. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso como un medicamento.
6. 6. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para usar en el tratamiento o prevención de una afección que implique disfunción mitocondrial, un cáncer, o fibrosis.
7. 7. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la afección que implica disfunción mitocondrial se selecciona de entre un trastorno del SNC; enfermedad neurodegenerativa; enfermedad de Parkinson; enfermedad de Alzheimer; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de Huntington; isquemia; ictus; demencia con cuerpos de Lewy; demencia frontotemporal; esclerosis múltiple; encefalopatía mitocondrial, síndrome de acidosis láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares; diabetes y sordera de herencia materna; neuropatía óptica hereditaria de Leber; neuropatía, ataxia, retinosis pigmentaria-síndrome de Leigh de herencia materna; enfermedad de Danon; diabetes; nefropatía diabética; trastornos metabólicos; insuficiencia cardíaca; cardiopatía isquémica conducente a infarto de miocardio; enfermedades psiquiátricas, esquizofrenia; deficiencia de sulfatasa múltiple; mucolipidosis II; mucolipidosis III; mucolipidosis IV; gangliosidosis GMl; lipofuscinosis neuronal ceroidea; enfermedad de Alpers; síndrome de Barth; defectos de la beta oxidación; deficiencia de carnitina-acilcarnitina; deficiencia de carnitina; síndromes de deficiencia de creatina; deficiencia de coenzima Q10; deficiencia del complejo I; deficiencia del complejo II; deficiencia del complejo III; deficiencia del complejo IV; deficiencia del complejo V; deficiencia de COX; síndrome de oftalmoplegia externa progresiva crónica; deficiencia de CPT I; deficiencia de CPT II; aciduria glutárica de tipo II; síndrome de Kearns-Sayre; acidosis láctica; deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena larga; enfermedad o síndrome de Leigh; variante francocanadiense del síndrome de Leigh; miocardiopatía infantil letal; enfermedad de Luft; deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media; síndrome de epilepsia mioclónica con fibras rojas rasgadas; citopatía mitocondrial; síndrome de ataxia mitocondrial recesiva; síndrome de depleción del ADN mitocondrial; trastorno mioneurogastrointestinal y encefalopatía; síndrome de Pearson; deficiencia de piruvato deshidrogenasa; deficiencia de piruvato carboxilasa; mutaciones POLG; deficiencia de 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena media/corta; deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga; trastornos peroxisomales; acidemia metilmalónica; deficiencia de mevalonato cinasa; deterioro de la función cognitiva y la fuerza muscular dependiente de la edad; y deterioro cognitivo asociado con todos los trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos.
8. 8. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la enfermedad neurodegenerativa se selecciona de entre enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, isquemia, ictus, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia multisistémica, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, demencia frontotemporal; y enfermedad de Parkinson relacionada con mutaciones en la a-sinucleína, parkina, PINK1, GBA, y LRRK2, y enfermedad de Parkinson juvenil autosómica recesiva o enfermedad de Parkinson de aparición temprana (EOPD), donde los genes parkina o PINK1 están mutados, truncados o son delecionados.
9. 9. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la enfermedad neurodegenerativa es el síndrome o enfermedad de Leigh, enfermedad de Leigh ligada al cromosoma X, variante francocanadiense del síndrome de Leigh y/o los síntomas asociados a la enfermedad de Leigh.
10. 10. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el cáncer se selecciona de entre mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, gástrico, colon, testículo, de cabeza y cuello, páncreas, cerebro, melanoma, hueso, hígado, tejido blando, cánceres de órganos tisulares, cánceres de las células sanguíneas, LMC, LMA, linfoma de células del manto, neuroblastoma, sarcoma de tejidos blandos, liposarcoma, sarcoma fibroblástico, leiomiosarcoma, carcinoma hepatocelular, osteosarcoma, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, carcinoma metastásico, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, carcinoma nasofaríngeo, cáncer colorrectal, carcinoma pulmonar no microcítico, cáncer en el que las vías apoptóticas están desreguladas, y cáncer en el que las proteínas de la familia BCL-2 están mutadas, o sobreexpresadas o infraexpresadas.
11. 11. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la fibrosis se selecciona de entre: fibrosis o un trastorno fibrótico asociado a la acumulación de componentes de la matriz extracelular que se produce tras un traumatismo, inflamación, reparación tisular, reacciones inmunitarias, hiperplasia celular o neoplasia; fibrosis o un trastorno fibrótico asociado a enfermedades de órganos principales, trastornos fibroproliferativos o cicatrices asociadas a traumatismos; fibrosis o un trastorno fibrótico asociado a una enfermedad pulmonar intersticial, cirrosis hepática, esteatosis hepática no alcohólica y esteatohepatitis no alcohólica, nefropatía, enfermedad renal aguda, lesión renal aguda, nefropatía crónica, retraso de la función del injerto renal, enfermedad cardíaca o vascular, enfermedades oculares, esclerodermia sistémica y local, queloides, cicatrices hipertróficas, ateroesclerosis, reestenosis, contractura de Dupuytren, complicaciones quirúrgicas, fibrosis inducida por fármacos quimioterápicos, fibrosis inducida por radiación, lesiones accidentales y quemaduras, fibrosis retroperitoneal, y fibrosis peritoneal/cicatrización peritoneal; y fibrosis asociada a una enfermedad pulmonar intersticial seleccionada de entre sarcoidosis, silicosis, reacciones farmacológicas, infecciones, enfermedades vasculares por colágeno, artritis reumatoide, esclerosis sistémica, esclerodermia, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, neumonitis intersticial habitual, enfermedad pulmonar intersticial, alveolitis fibrosante criptogénica, bronquiolitis obliterante y bronquiectasias.
12. 12. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
13. 13. Un compuesto, que se selecciona de entre las fórmulas (II), (III), (IV) y (V):

    o una sal de dicho compuesto; y en donde PG es un grupo protector, que se selecciona de entre terc-butiloxicarbonilo, benciloxicarbonilo, p-metoxibencilcarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo, acetilo, benzoílo, bencilo, carbamato, pmetoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo, p-metoxifenilo, tosilo, tricloroetoxicarbonilo, 4-nitrobencenosulfonilo y 2-nitrofenilsulfenilo.
14. 14. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 13, que se selecciona de entre las fórmulas (IIA), (IIIA), (IVA) y (VA):

    o una sal de dicho compuesto.